Tersedia online di http://journal.ipb.ac.id/index.php/jhi

## Respon Pertumbuhan Kultur Tunas Kelor ( Moringa oleifera Lam.) terhadap Benziladenin dan Modifikasi Hara Nitrogen
Growth Response of Moringa oleifera Lam. Shoot Culture to Benzyladenine and Nitrogen Modification
Tri Handayani 1* , Aryani Leksonowati 1 , Indira Riastiwi 1 , Ridwan 1 , Witjaksono 1
Diterima 24 Desember 2020/Disetujui 15 April 2021

## ABSTRACT
In plant micropropagation, cytokinin and nitrogen are the essensial components that affect plant growth and morphogenesis. In this research, we evaluated the effect of BA concentration and modification of MS medium with variation in total nitrogen concentration and NO 3 - :NH 4 + ratio on the growth of moringa plant. The treatments tested were (1) BA concentrations of 0.00, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 mg L -1 ; (2) the total N concentrations of 20, 40, 60, 80 mM; (3) the NO 3 - :NH 4 + ratio of 1:0, 1:3,  1:1,  3:1,  0:1.  The  experimental  design  used  was  a  completely  randomized  design  with  10 replications.  The  results  showed  that  the  treatment  of  0.25  mg  L -1 BA  produced  the  best  shoot proliferation with the highest number of nodes (8.07 ± 3.48). The shoot growth response to nitrogen level tended to be parabolic with an optimum concentration of 40-60 mM. Modification of MS medium with different NO 3 - :NH 4 + ratio showed differences in the growth and biomass of moringa shoots, and the  optimal  growth  was  obtained  at  the  3:1  ratio.  Therefore,  MS  medium  with  total  nitrogen concentration  of  40-60  mM  with  NO 3 - :NH 4 + ratio  of  3:1  can  be  used  for  in  vitro  propagation  of Moringa selected genotypes.
Keywords : Benzyladenine, Moringa oleifera, nitrate/ammonium ratio, shoot, total N

## ABSTRAK
Pada perbanyakan tanaman secara in vitro , sitokinin dan hara nitrogen merupakan beberapa komponen utama yang mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis tanaman. Pada penelitian ini, komponen  utama  tersebut  diuji  untuk  optimasi  pertumbuhan  kultur  tunas  kelor  dengan  perlakuan berikut:  (1)  konsentrasi  BA  yaitu  0.00, 0.05, 0.10, 0.25,  0.50, 1.00  mg  L -1 , (2) total  konsentrasi N dalam medium yakni 20, 40, 60, 80 mM; (3) perlakuan nisbah NO 3 - :NH 4 + yakni 0:1, 1:3, 1:1, 3:1, 1:0. Rancangan yang digunakan adalah acak lengkap dengan 10 ulangan.  Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan BA 0.25 mg L -1 menghasilkan proliferasi tunas terbaik dengan jumlah buku tertinggi (8.07±3.48). Respon pertumbuhan tunas terhadap perbedaan konsentrasi nitrogen cenderung bersifat parabolik dengan konsentrasi optimum 40–60 mM pada medium standar MS. Perlakuan nisbah nitrat/ amonium menunjukkan pertumbuhan dan biomassa tunas in vitro yang optimal pada nisbah NO 3 - :NH 4 + 3:1. Medium MS dengan modifikasi total konsentrasi nitrogen 40-60 mM dengan nisbah NO 3 - :NH 4 +
3:1 dapat digunakan untuk proliferasi tunas kelor secara in vitro untuk tujuan perbanyakan klonal dari genotipe terpilih.
Kata kunci: Benzyladenin , in vitro , kelor, nisbah nitrat/ amonium, total N
1 Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Jl. Raya Bogor Km. 46, Cibinong, Kabupaten Bogor 16911, Indonesia E-mail : trihandayani08@gmail.com (*penulis korespondensi)

## PENDAHULUAN
Kelor  ( Moringa  oleifera Lam.)  adalah tanaman  yang  memiliki  kandungan  anti- oksidan dan anti-mikrobia yang tinggi (Khor et al .,  2018)  dan  digunakan  untuk  bahan  baku dalam  industri  kosmetik  (Baldisserotto et  al ., 2018).  Daun  dan  polong  muda  kelor  banyak dimanfaatkan sebagai sumber pangan sayuran dan diketahui bernutrisi tinggi (Aminah et al ., 2015).  Daun  dari  tanaman  kelor  tetraploid hasil  induksi  memiliki  kandungan  gizi  yang lebih  tinggi  dari  kelor  biasa  (Ridwan  dan Witjaksono, 2020).
Tanaman  kelor  mudah  dibudidayakan dan  dapat  diperbanyak  dengan  menggunakan biji atau stek batang (Wasonowati et al ., 2018), namun perbanyakan dengan biji menimbulkan ketidakseragaman pertumbuhan tanaman. Teknik  kultur  jaringan  dapat  menjadi  satu alternatif  dalam  produksi  bibit  kelor  terpilih secara klonal, serta  dapat diaplikasikan untuk anggota  genus  Moringa  lain  yang  terancam punah  (Stephenson  dan  Fahey,  2004),  dan dapat  dimanfaatkan  untuk  tujuan  pemuliaan tanaman melalui induksi poliploidi (Poerba et al , 2017), mutasi (Witjaksono dan
Leksonowati,  2012),  ataupun  transfer  gen (Dalton, 2020). Medium  MS  (Murashige  dan  Skoog, 1962)  merupakan  salah  satu  medium  dasar yang  banyak  digunakan  untuk  perbanyakan secara in  vitro pada  berbagai  jenis  tanaman, namun modifikasi hara makro, mikro, vitamin, ataupun  sumber  karbon  dapat  memperbaiki pertumbuhan  biak  anggrek  (Romeida et  al ., 2013).  Optimasi  pertumbuhan  dan  proliferasi tunas in  vitro banyak  dilakukan  dengan modifikasi komponen medium tumbuh, misalnya  zat  pengatur  tumbuh  (ZPT)  seperti auksin,  sitokinin,  giberelin  maupun  dengan ZPT  lainnya. Benzyladenin (BA)  merupakan ZPT  sintetik  dari  golongan  sitokinin  yang memiliki aktivitas tinggi dan murah, umumnya digunakan  untuk  menginduksi  pembentukan tunas  samping  dan  mengurangi  dominasi apikal  sehingga  biasa  digunakan  untuk mikropropagasi pada berbagai jenis tumbuhan (George, 1993). Perbanyakan tunas kelor  pada  medium MS standar dengan total nitrogen 60 mM yang diperkaya  dengan  2.5  µM  BA  selama  3 minggu menunjukkan gejala vitrifikasi, terhambatnya pembentukan tunas, serta
nekrosis pada  pucuk  tunas  (Hassanein et  al .,
2018). Kondisi ini menunjukkan kemungkinan kurang  optimalnya  formulasi  medium  yang digunakan.  Modifikasi  sederhana  seperti mengurangi  konsentrasi  hara  atau  merubah nisbah nitrat dan amonium dapat memperbaiki pertumbuhan  kultur  tunas  seperti  pada  kultur tunas  apokat  (Witjaksono et  al .,  1999). Nitrogen (N) merupakan salah satu hara utama pada medium MS yang tersedia bagi tanaman dalam bentuk ion amonium (NH 4 + )  dan  nitrat (NO 3 - ).  Di  dalam  medium  MS,  total konsentrasi  nitrogen  dan  nisbah  antara  ion NH 4 + dan NO 3 - diketahui berperan besar dalam mempengaruhi pertumbuhan
tunas, morfogenesis dan pertumbuhan kultur embriogenik  apokat  (Witjaksono  dan  Litz, 1999) ataupun  produksi  metabolit primer  dan sekunder (Gonda et al ., 2014). Pada penelitian ini,  dipelajari  pengaruh  konsentrasi  ZPT  BA serta  modifikasi  medium  MS  dengan  variasi total konsentrasi N dan nisbah nitrat/amonium dalam  medium  terhadap  pertumbuhan  dan biomassa tunas kelor in vitro .

## BAHAN DAN METODE

## Bahan Tanaman dan Kondisi Kultur
Bahan tanaman yang digunakan berasal dari  pertanaman kelor aksesi Sumba  berumur 2  tahun  yang  ditanam  di  kebun  percobaan Pusat  Penelitian  Biologi  LIPI.  Eksplan  yang digunakan  yaitu  buku  tunas  ke  1-3  yang diambil  dari  bagian  pucuk  tunas  muda berwarna hijau dari tanaman induk  yang sehat.
Eksplan  buku  tunas  direndam  dalam larutan  campuran  bakterisida  dan  fungisida (masing-masing 2 g L -1 ) selama 30 menit dan dibilas  akuades  steril.  Di  dalam  laminar eksplan  kemudian  direndam  dalam  20%  dan 10%  larutan  pemutih  (bahan  aktif  NaOCl 5.25%) masing-masing selama 5 dan 10 menit, selanjutnya  dibilas  akuades  steril,  dan direndam  dalam  alkohol  70%  selama  5-10 menit.  Eksplan  yang  telah  steril  dipotong dengan  ukuran  1-1.5  cm  dan  dikulturkan  di medium  antibiotik  selama  3  hari.  Medium antibiotik  mempunyai  komposisi  medium dasar  MS  yang  diperkaya  dengan  antibiotik (dalam  mg  L -1 ):  400 Streptomycin ,  150
Rifampicin , dan 400 Cefotaxime ). Selanjutnya eksplan  disubkultur  ke  medium  inisiasi  tunas yang  terdiri  dari  medium  dasar  MS  yang
diperkaya  dengan  0.1  mg  L -1 BA.  Subkultur tunas pada medium yang baru dilakukan setiap 4  minggu  dengan  menanam  inokulum potongan  buku  tunas.  Tunas  yang  tumbuh digunakan untuk percobaan selanjutnya.
Medium  dasar  yang  digunakan  adalah MS dengan hara makro, mikro dan vitamin MS (dalam  mg  L -1 ) thiamine HCl  0.1, Pyridoxin HCl  0.5, nicotinic  acid 0.5,  glisin  2.0, myo- Inositol 100,  sukrosa  30000,  0.3%  gelrite sebagai pemadat, keasaman media diatur pada pH  5.7-5.8  dengan  penambahan  1N  NaOH atau  HCl.  Medium  kemudian  dibagikan  ke dalam  botol  kultur  masing-masing  sebanyak 25 ml ditutup dengan 2 lembar plastik bening dan diamankan dengan karet gelang, diautoklaf  pada  121  °C  selama  20  menit  dan selanjutnya  disimpan  di  ruang  penyimpanan sebelum digunakan.

## Rancangan Perlakuan
Penelitian  terdiri  dari  tiga  perlakuan sebagai berikut: (1) beberapa taraf konsentrasi BA  yaitu:    0.00;  0.05;  0.10;  0.25;  0.50;  dan 1.00 mg L -1 pada medium dasar MS; (2) total konsentrasi  N  yaitu  20,  40,  60,  dan  80  mM pada  medium  dasar  MS  dengan  kandungan KNO 3 ,  NH 4 NO 3 tiap  taraf  konsentrasi  sesuai dalam medium (Tabel 1); dan (3) nisbah NO 3 -
:  NH 4 + yaitu  0:1,  1:3,  1:1,  3:1,  1:0  dengan tingkat  N  total  60  mM  yang  diatur menggunakan  senyawa    KNO 3 , NH 4 NO 3 dan (NH 4 ) 2 SO 4 sebagai sumber ion NO 3 - atau NH 4 + seperti  dalam  medium  (Tabel  1).  Misal  pada perlakuan  NO 3 - :  NH 4 + = 0:1 maka digunakan (NH 4 ) 2 SO 4 sebagai  sumber  N,  sedangkan
untuk rasio NO 3 - : NH 4 + = 1:0 maka sumber N hanya  ditambahkan  dari  KNO 3 (Tabel  1). Untuk senyawa makro elemen yang lain tetap sesuai dengan komposisi standar medium MS yakni  (dalam  mg  L -1 )  CaCl 2 332.02,  MgSO 4 180.54  dan  KH 2 PO 4 170.00.  Medium perlakuan-perlakuan nitrogen di atas diperkaya dengan BA 0.25 mg L -1 . Selanjutnya dilakukan  evaluasi  dengan  membandingkan dua  medium  terbaik  dari  percobaan  ke  3 terhadap  medium  MS  standar  (MS  dengan nisbah NO 3 - : NH 4 + 2:1).

## Rancangan Percobaan dan Pengamatan
Percobaan disusun menggunakan
Rancangan Acak Lengkap, dengan 10 ulangan. Setiap ulangan terdiri dari 1 botol yang diisi 6 potongan  buku  ruas.  Botol  kultur  disusun  di dalam  rak  kultur  dan  disimpan  dalam  ruang inkubasi dengan intensitas cahaya 46 µmol m -
2 detik -1 selama 16 jam pada kisaran suhu 22 -
25°C dan kelembaban udara 60%.
Pengamatan  respon  pertumbuhan  dan perkembangan tunas dilakukan pada 4 minggu setelah tanam (MST) meliputi meliputi jumlah tunas,  tinggi  tunas,  jumlah  daun  dan  jumlah buku.  Pada perlakuan total konsentrasi N dan pengaruh  nisbah  NO 3 - :  NH 4 + pengamatan ditambah  dengan  peubah  bobot  basah  dan bobot  kering  secara  total  (tajuk  dan  kalus), dengan  sampling  sebanyak  4  ulangan  untuk masing-masing perlakuan. Selain itu disajikan data  kadar  air  yang  dihitung  dengan formula: 𝐾𝐴 (%) =
( 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎𝑠𝑎ℎ−𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑘𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎𝑠𝑎ℎ ) 𝑥 100% .
Tabel  1.  Konsentrasi  ion  NO 3 - dan  NH 4 + dalam  satuan  mM  dan  g  L -1 pada perlakuan  modifikasi medium dasar MS dengan perbedaan total N dan Nisbah NO 3 - :NH 4 + Perlakuan Ion N Total N (mM) Konsentrasi dalam mM (g L -1 ) NO 3 - NH 4 +
KNO 3 NH 4 NO 3 (NH 4 ) 2 SO 4 Total Konsentrasi N 20 MS 13.3 6.7 20 6.7 (0.68) 6.7(0.54) - 40 MS 26.7 13.3 40 13.3 (1.34) 13.3(1.06) - 60 MS 41.2 18.8 60 18.8 (1.90) 20.6 (1.65) - 80 MS 53.3 26.7 80 26.6 (2.68) 26.6(2.12) - Nisbah NO 3 - : NH 4 +
(% NO 3 - )
0:1 (0%) 0 60 60 - - 30 (3.97) 1:3 (25%) 15 45 60 - 15 (1.20) 15 (1.99) 1:1 (50%) 30 30 60 - 30 (2.40) - 3:1 (75%) 45 15 60 30 (3.03) 15 (1.20) - 1:0 (100%) 60 0 60 60 (6.06) - - MS Standard 2:1 (66.7%) 41.2 18.8 60 18.8 (1.90) 20.61(1.65) -
Medium  dasar  yang  digunakan  adalah  MS  dengan  kandungan  nitrogen  (NH 4 NO 3 dan  KNO 3 ) disesuaikan dengan sumber nitrogen sesuai perlakukan.
Analisis data Data yang didapatkan dianalisis menggunakan ANOVA untuk melihat pengaruh  nyata  /  tidak  nyata  perlakuan,  dan jika  perlakuan  berpengaruh  nyata  maka dilakukan  analisis  uji  lanjut  DMRT  untuk pengelompokkan  respon  pertumbuhan  karena perlakuan.  Nilai  rata-rata  disajikan  bersama nilai standard  error (SE)  sebagai  grafik maupun dalam tabel.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh Konsentrasi BA terhadap Pertumbuhan dan Proliferasi Tunas Kelor Regenerasi in vitro tanaman kelor  dari berbagai  eksplan  telah  banyak  dilaporkan, diantaranya  dari  buku  tunas  juvenil  tanaman kelor  dewasa  (Marfori,  2010),  tunas  asal
kecambah  dan  embrio  muda  (Stephenson  & Fahey,  2004),  buku  kotiledon  (Steinitz et  al .,
2009), daun  muda (Jun-jie et al ., 2018). Pada percobaan  ini,  eksplan  buku  tunas  dari tanaman kelor dewasa mengalami pertumbuhan  dan  proliferasi.  Eksplan  buku ruas dari batang tanaman kelor dewasa berhasil tumbuh  pada  medium  inisiasi  setelah  melalui medium antibiotik selama 3 hari (Gambar 1a). Pada  ketiak  daun  pada  buku  batang  tumbuh beberapa tunas aksilar (Gambar 1b). Beberapa tunas aksilar yang tumbuh sebagian membentuk percabangan (Gambar 1c). Tunas aksilar  membentuk  daun  majemuk  yang berukuran  kecil  dengan  jumlah  anak  daun tidak  lebih  dari  9  satuan  (Gambar  1d).  Pada pangkal  eksplan  yang  bersentuhan  dengan medium,  kalus  terbentuk  secara  ekstensif (Gambar 1d).
Gambar 1.  Pertumbuhan tunas kelor in vitro . a) eksplan  buku tunas  muda asal tanaman  dewasa  (3 HST); b) tunas baru muncul setelah inisiasi pada medium pertumbuhan (4 MST); c) tunas yang  tumbuh  dari  eksplan  setelah  pemindahan  ke  medium  proliferasi  (4  MST);  d) proliferasi tunas dari buku tunas di medium proliferasi, (4 MST)
Tabel 2. Pertumbuhan tunas in vitro tanaman kelor pada perlakuan konsentrasi BA (4 MST)
Konsentrasi
BA (mg L -1 ) Jumlah tunas Tinggi tunas (cm) Jumlah daun Jumlah buku 0.00 1.11 ±  0.212 b 3.22 ±  0.423 c 1.76 ±  1.914 b 4.89 ±  2.851 b 0.05 1.11 ±  0.320 b 3.45 ±  0.514 abc 2.32 ±  2.225 b 5.57 ±  2.802 b 0.10 1.18 ±  0.376 ab 3.98 ±  0.907 a 4.85 ±  3.423 a 8.12 ±  3.579 a 0.25 1.34 ±  0.616 a 3.81 ±  0.906 ab 5.47 ±  4.132 a 8.32 ±  4.144 a 0.50 1.40 ±  0.710 a 2.59 ±  1.136 c 4.80 ±  3.833 a 7.49 ±  4.257 a 1.00 1.25 ±  0.585 ab 1.90 ±  0.839 d 2.12 ±  2.487 b 4.52 ±  2.724 b
Keterangan: Nilai merupakan rata-rata ± SE; huruf yang sama pada kolom dan perlakuan yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf 5%
Respon  pertumbuhan  kultur  yang ditunjukkan  oleh  jumlah  tunas  aksilar,  tinggi tunas,  jumlah  daun  dan  jumlah  buku  tunas bersifat  parabolik  terhadap  konsentrasi  BA dalam  medium,  yaitu  meningkat  dengan meningkatnya konsentrasi BA dengan puncak pada  konsentrasi  0.25  mg  L -1 ,  lalu  menurun pada  konsentrasi  1.0  mg  L -1 (Tabel  2).  BA dengan konsentrasi 0.5 – 1.0 mg L -1 digunakan untuk menginduksi proliferasi dan perbanyakan  tunas  kelor in  vitro (Ravi et  al ., 2019).  Pada  penelitian  ini,  BA  dengan konsentrasi rendah yakni 0.25 mg L -1 optimum untuk  memacu  pertumbuhan  tunas  dan perbanyakan  karena  panjang  ruas  antar  buku memudahkan subkultur. Pada konsentrasi BA rendah  kalus  yang  tumbuh  pada  dasar potongan ruas buku juga berkurang (Afolabi et al ., 2018; Hassanein et al ., 2019), sedangkan pada konsentrasi yang lebih tinggi (3 mg L -1 ), BA  dapat  menginduksi  organogenesis  tidak langsung melalui pembentukan kalus (Gupta et al ., 2020).

## Pengaruh  Konsentrasi  Total  N  dalam Medium  terhadap  Pertumbuhan  Tunas Kelor
Perlakuan total N dalam medium dasar MS  menunjukkan  pengaruh  parabolik,  yaitu meningkatkan  pertumbuhan  tunas  dengan meningkatnya konsentrasi dari 20 ke 40 dan 60 mM  kemudian  menurun  pada  konsentrasi  80
mM  untuk  peubah  pertumbuhan  rata-rata tinggi  tunas,  jumlah  buku  dan  jumlah  daun (Tabel 3). Bobot basah (Gambar 2a) dan bobot kering tunas (Gambar 2b) in vitro menunjukkan  pola  respon  yang  sama  yaitu parabolik,  bobot  meningkat  dari  konsentrasi 20  mM  ke  40-60  mM  dan  menurun  pada konsentrasi 80 mM N (Gambar 2a, 2b). Kadar air (KA) tunas menunjukkan respon yang tidak berbeda  nyata  antar  perlakuan,  akan  tetapi pada  %KA  secara  total  (tunas  dan  kalus) menunjukkan bahwa perlakuan total N 40 mM mempunyai  kadar  air  yang  lebih  tinggi (Gambar 2c). Kadar air yang tinggi berkorelasi dengan tingkat hiperhidrik  dan  vigor tunas in vitro (Gao et al. , 2017). Tunas hiperhidrik pada kultur  jaringan  tidak  bertahan  hidup  pada tahap  aklimatisasi  dan  karena  itu  merupakan kegagalan dalam perbanyakan tanaman.
Tunas kelor in vitro pada penelitian ini dapat tumbuh baik pada medium dengan total nitrogen 40 mM, walaupun tunas tumbuh lebih vigor  pada  konsentrasi  60  mM,  namun pertumbuhan  menjadi  kurang  optimal  pada konsentrasi  nitrogen  80  mM.    Konsentrasi  N 40-60 mM merupakan konsentrasi yang umum digunakan  untuk  berbagai  jenis  tumbuhan, walaupun  pada  tanaman  tertentu,  misalnya apokat,  gejala  seperti  keracunan  amonium, dapat  terjadi  pada  konsentrasi  N  tersebut (Witjaksono et al ., 1999).
Tabel 3. Pertumbuhan tunas kelor in vitro pada perlakuan konsentrasi total N (4 MST)
Total N (mM) Jumlah tunas Tinggi tunas (cm) Jumlah daun Jumlah buku 20 MS 1.36 ±  0.763 2.52 ±  1.393 c 3.89 ±  2.855 b 4.94 ±  2.619 b 40 MS 1.35 ±  0.658 3.96 ±  1.669 a 6.00 ±  3.027 a 7.25 ±  3.149 a 60 MS 1.43 ±  0.619 3.87 ±  1.619 a 6.68 ±  3.133 a 8.07 ±  3.485 a 80 MS 1.20 ±  0.448 3.30 ±  1.587 c 4.37 ±  2.569 b 5.59 ±  2.475 b
Keterangan: Nilai merupakan rata-rata ± SE; Huruf yang sama pada kolom dan perlakuan yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf 5%
(a) (a) Total N (mM) 20 40 60 80 Bobot B as ah (m g) 0 100 200 300 400 500 Total Tunas a a a b a a b b (b) (b) a a Total N (mM) 20 40 60 80 Bobot Kering (m g) 0 10 20 30 40 50 Total Tunas a a a b b b a a (c) (c) (c) N Total (mM) 20 40 60 80 Ka dar air ( %) 80 82 84 86 88 90 92 94 Total Tunas b a ab ab a a a a
Gambar 2. Pengaruh total N dalam medium MS terhadap bobot basah (a), bobot kering (b) dan kadar air (c) tunas dan total biomasa in vitro kultur jaringan kelor.
Pengaruh  Nisbah  Nitrat  dan  Amonium terhadap Pertumbuhan Tunas Kelor Perlakuan nisbah NO 3 - :NH 4 + pada taraf konsentrasi  N  60  mM berpengaruh  nyata  dan menunjukkan  pengaruh  parabolik  terhadap variabel rata-rata tinggi tunas, jumlah daun dan jumlah  buku,  tetapi  tidak  berpengaruh  nyata terhadap  jumlah  tunas  yang  terbentuk. Medium  dengan  konsentrasi NH 4 + yang  lebih tinggi  (NO 3 - :NH 4 + =  1:3)  menghasilkan pertumbuhan  tunas in  vitro tanaman  kelor yang  kurang  vigor.  Tunas  yang  hanya mendapat  N  dalam  satu  jenis  ion,  yaitu  NO 3 - (MS  1:0)  atau  NH 4 + saja  (MS  0:1),  juga menunjukkan pertumbuhan tinggi serta jumlah daun  yang  lebih  rendah  dibandingkan  tunas yang  tumbuh  pada  medium  dengan  nisbah lainnya (Tabel 4).
Data  bobot  basah  dan  bobot  kering tunas in vitro menunjukkan  pola respon  yang sama dengan dengan pola respon jumlah buku, yaitu  parabolik  terhadap  bobot  basah  dan bobot  kering  tunas,  yaitu  meningkat  dari nisbah  NO 3 - :NH 4 + =  1:0  ke  nisbah  3:1  dan mencapai puncaknya pada nisbah 1:1 kemudian  menurun  pada  nisbah  1:3  dan mencapai  nilai  terendah  pada  nisbah  0:1 (Gambar 3a, 3b). Pengaruh nisbah N terhadap berat  kering  dan  berat  basah  total  (tunas  dan kalus)  juga  nyata  dan  menunjukkan  pola
parabolik  pada  berat  basah  dan  berat  kering tunas (Gambar 3a, 3b). Penghitungan terhadap kadar air total menunjukkan respon yang tidak berbeda  nyata  antar  perlakuan  nisbah  NO 3 - :NH 4 + , sehingga nisbah  nitrat/ amonium  tidak banyak berpengaruh terhadap tingkat hiperhidrik pada tanaman kelor (Gambar 3c). Hasil percobaan pengaruh nisbah nitrat/ amonium  menunjukkan  bahwa  tunas  kelor tumbuh  lebih  vigor  pada  media  dengan konsentrasi  ion  nitrat  (NO 3 - )  sama  atau  lebih tinggi  dibandingkan  amonium  (NH 4 + ).  Hasil evaluasi  media  dengan  MS1:1  dan  MS3:1 yang dibandingkan dengan media MS standar (Nisbah NO 3 - :NH 4 + =2:1) menunjukkan bahwa pertumbuhan tunas in vitro yang diamati tidak berbeda  nyata  (Tabel  5).  Akan  tetapi, parameter  bobot  basah  menunjukkan  nilai yang  secara  nyata  lebih  tinggi  pada  nisbah NO 3 - :NH 4 + =3:1  daripada  nisbah  NO 3 - :NH 4 + =1:1  dan  kontrol  NO 3 - :NH 4 + =2:1  (Gambar 4a), tetapi perbedaan nilai yang nyata itu tidak teramati  pada  variabel  bobot  kering  tunas (Gambar 4b). Penghitungan terhadap kadar air tunas  menunjukkan  perlakuan  nisbah  NO 3 - :NH 4 + =3:1  mempunyai  kadar  air  yang tertinggi  dibanding  medium  lainnya  yang sejalan  dengan  tingkat  pertumbuhan  tunas serta  bobot  basah  dan  bobot  keringnya (Gambar 4c).
Tabel 4. Pertumbuhan tunas kelor in vitro pada perlakuan nisbah NO 3 - : NH 4 + (4 MST) Nisbah NO 3 - :
NH 4 + Jumlah tunas Tinggi tunas (cm) Jumlah daun Jumlah buku MS 0:1 1.00 ±  0.000 1.31 ±  0.097 c 1.04 ±  0.583 b 2.21 ±  0.516 c MS 1:3 1.00 ±  0.136 2.83 ±  0.499 b 5.71 ±  2.029 a 6.92 ±  1.908 b MS 1:1 0.96 ±  0.083 4.39 ±  0.973 a 6.33 ±  2.819 a 8.04 ±  2.753 ab MS 3:1 0.96 ±  0.250 4.42 ±  1.262 a 7.42 ±  2.817 a 9.46 ±  3.256 a MS 1:0 0.96 ±  0.083 1.47 ±  0.420 c 0.92 ±  0.752 b 2.88 ±  1.212 c
Keterangan: Nilai merupakan rata-rata ± SE; Huruf yang sama pada kolom dan perlakuan yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf 5%
Tabel 5. Pertumbuhan tunas in vitro kelor pada perlakuan modifikasi medium MS (4 MST)
Medium Jumlah Tunas Tinggi tunas (cm) Jumlah Daun Jumlah Buku 60 MS 1:1 1.46 ±  0.776 a 4.17 ±  2.193 a 6.17 ± 3.843 a 7.48 ±  4.137 a 60 MS 2:1 1.63 ±  0.928 a 3.48 ±  1.293 b 5.49 ±  2.501 a 6.82 ±  2.074 a 60 MS 3:1 1.73 ±  0.828 a 3.41 ±  1.393 b 6.03 ±  2.883 a 7.17 ±  3.196 a
Keterangan: Nilai merupakan rata-rata ± SE; Huruf yang sama pada kolom dan perlakuan yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf 5%
NO3 - (%) [Nisbah nitrat : amonium] 0 25 50 75 100 Bob ot Basa h (mg) 0 100 200 300 400 500 600 Total Tunas (a) a a a b b a b bc c c [0:1] [1:3] [1:1] [3:1] [1:0]
NO3 - (%) [Nisbah nitrat : amonium]
0 25 50 75 100 Bob ot K er in g (mg) 0 10 20 30 40 50 Total Tunas (b) [0:1] [1:3] [1:1] [3:1] [1:0] a a a b b a b b c c NO3 - (%) [Nisbah nitrat : amonium] 0 25 50 75 100 Kad ar a ir ( % ) 80 82 84 86 88 90 92 94 96 Total Tunas (c) [0:1] [1:3] [1:1] [3:1] [1:0] a ab ab ab b a a a a a Gambar 3. Pengaruh Nisbah NO 3 - : NH 4 + terhadap bobot basah (a), bobot kering (b) dan kadar air (c) tunas dan total biomasa in vitro kultur jaringan kelor .
50 66,67 75 bobot Bas ah ( m g) 0 100 200 300 400 500 600 Total Tunas (a) a ab b a b b [1:1] [2:1] [3:1] NO 3 - (%) [Nisbah nitrat : amonium] [1:1] [2:1] [3:1] NO 3 - (%) [Nisbah nitrat : amonium] 50 66,67 75 Bobot Kering ( m g) 0 10 20 30 40 50 Total Tunas (b) a a b a a a [1:1] [2:1] [3:1] NO 3 - (%) [Nisbah nitrat : amonium] 50 66,67 75 Kadar air ( %) 75 80 85 90 95 100 105 Total Tunas (c) a b b a b ab
Gambar 4. Pengaruh modifikasi N medium terhadap bobot basah (a), bobot kering (b) dan kadar air (c) tunas dan total biomasa in vitro kultur jaringan kelor.
Pertumbuhan  tunas  yang  ditunjukkan dengan  jumlah  buku  tunas  dan  biomassa (bobot  basah  dan  bobot  kering)  dari  tunas in vitro kelor  yang  lebih  baik  pada  medium dengan  nisbah  nitrat/  amonium  yang  lebih tinggi (NO 3 - :NH 4 + = 3:1) dibandingkan nisbah yang  lebih  rendah  (2:1  atau  1:1)  juga ditunjukkan pada kultur tunas apokat (Witjaksono et  al .,  1999)  dan  biak  suspensi embriogenik  apokat  (Witjaksono  dan  Litz, 1999).  Keunggulan  medium  dengan  nisbah nitrat/ amonium 3:1 mungkin berkaitan dengan pH  medium  selama  pertumbuhan.  Nisbah nitrat/  amonium  memengaruhi  pH  medium setelah  pertumbuhan  sel  embriogenik  apokat, yaitu  pH  medium  berubah  mencapai  7  pada medium  dengan  sumber  N  hanya  nitrat  dan mencapai 4.2 pada medium  dengan amonium sebagai  satu-satunya  sumber  N,  dan  pada nisbah 3:1 pH medium tetap 5.6-5.7 seperti pH awal  medium  dibuat  (Witjaksono  dan  Litz, 1999).  Penyerapan  nitrat  yang  lebih  efektif akan  lebih  mendorong  pertumbuhan  tunas (Máximo et  al .,  2015).  Faktor  lainnya  yakni ion  nitrat  diketahui  merupakan  jenis  pasokan N  yang  lebih  sesuai  dan  dibutuhkan  lebih
banyak  untuk  kebanyakan  spesies  tanaman, dan merupakan bentuk N yang mudah diserap oleh  tanaman  (Jamshidi et  al .,  2016), sedangkan  kadar  ion  amonium  yang  tinggi dapat  menghambat  pertumbuhan  panjang/ tinggi tunas akibat penurunan nitrat reduktase dan enzim sintesis glutamat dalam memproduksi  asam  amino  (Shirdel et  al ., 2011).
Konsentrasi  ion  NH 4 + yang  tinggi terutama pada medium NO 3 - :NH 4 + = 1:3  pada percobaan ini menunjukkan pertumbuhan dan biomassa tanaman  yang lebih rendah. Hal ini mungkin  karena  efek  penghambatan  yang signifikan  dari  NH 4 + pada  serapan  ion  lain seperti Ca, Mg, K dan P (Kubota et al ., 2000), menyebabkan gangguan fisiologis dan morfologis (Jamshidi et al .,  2016), dan  dapat memengaruhi akumulasi biomassa dan metabolit sekunder pada kultur akar Hypericum  perforatum L  (Cui et  al .,  2010). Keseimbangan  ion  NO 3 - dan  NH 4 + dalam medium  diperlukan  untuk  penyerapan  ion NO 3 - yang  lebih  baik  dan  menghambat toksisitas NH 3 di dalam jaringan (Shirdel et al ., 2011). Kadar NH 4 + yang tinggi pada medium
pertumbuhan dicatat sebagai penyebab hiperhidrisitas  dalam  berbagai  penelitian (Wada et al ., 2015). Pada penelitian ini NO 3 - : NH 4 + dengan  nisbah 3:1  menunjukkan  nisbah yang  optimal  untuk  pertumbuhan,  proliferasi dan biomassa tunas aksilar dari tanaman kelor.

## KESIMPULAN
Aplikasi  ZPT  BA  dengan  konsentrasi 0.25  mg  L -1 merupakan  perlakuan  terbaik dalam  proliferasi  tunas  kelor in  vitro . Modifikasi medium MS dengan total konsentrasi N 40-60 mM dengan nisbah NO 3 - :NH 4 + 3:1  menunjukkan  hasil  pertumbuhan dan  biomassa  tunas in  vitro kelor  yang  lebih baik  dibandingkan  medium  MS  standar  dan dapat digunakan untuk perbanyakan bibit kelor in  vitro dari  pohon  induk  terpilih  secara in vitro .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didanai  dari  kegiatan INSINAS  dari  Kementerian  Riset  Teknologi dan  Pendidikan  Tinggi  tahun  anggaran  2018 dengan tema ‘Pengembangan Tanaman Kelor sebagai  Nutrisi  Tambahan  untuk  Pangan Fungsional’.  Ucapan  terima  kasih  juga disampaikan  kepada  Hasrat  Enggal  Prayogi, SP atas bantuan teknisnya.

## DAFTAR PUSTAKA
Afolabi,  J.O.,  D.B.  Olomola,  O.A.  Osunlaja, E.O.  Oloyede,  I.O.  Bolanle-Ojo. 2018.  Effect  of  different  media  on seed  germination  and  in  vitro propagation of Moringa oleifera L. J.
For. Res. Management. 15(1): 13-21.
Aminah,  S.,  T.  Ramdhan,  M.  Yanis.  2015.
Kandungan Nutrisi dan Sifat Fungsional Tanaman Kelor ( Moringa oleifera ). Buletin Pertanian Perkotaan Nomor 5 Volume 2. Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Jakarta.
Baldisserotto,  A.,  P.  Buso,  M.  Radice,  V. Dissette, I. Lampronti, R. Gambari, S. Manfredini, S. Vertuani. 2018. Moringa  oleifera leaf  extracts  as multifunctional ingredients for “natural and organic” sunscreens and photoprotective preparations. Molecules. 23(3). https://doi.org/10.3390/molecules230 30664.
Cui, X.H., H.N., Murthy, C.H. Wu, K.Y. Paek. 2010.  Adventitious  root  suspension cultures  of Hypericum  perforatum : Effect of nitrogen source on production of biomass and secondary metabolites. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 46(5): 437–444. https://doi.org/10.1007/s11627-010- 9310-y.
Dalton,  S.J.  2020.  A  reformulation  of
Murashige and Skoog medium (WPBS medium) improves
embryogenesis,  morphogenesis  and transformation efficiency in temperate and tropical grasses and cereals. Plant Cell  Tiss.  Org.  Cult.  141:257–273. https://doi.org/10.1007/s11240-020- 01784-8.
Gao, H., X. Xia, L. An, X. Xin, Y. Liang. 2017. Reversion  of  hyperhydricity  in  pink ( Dianthus  chinensis L.)  plantlets  by AgNO3 and its associated mechanism during in vitro culture. Plant Sci. 254: 1-11.
George,  E.F.  1993.  Plant  Propagation  by Tissue Culture Part 1 In Practice. 2nd edition.  Exegetic  Limited,  England. 574p.
Gonda,  S.,  A.  Kiss-Szikszai,  Z.  Szucs,  C. Máthé,  G.  Vasas.  2014.  Effects  of  N source  concentration  and  NH 4 + /NO 3 - ratio  on  phenylethanoid  glycoside pattern in tissue cultures  of Plantago lanceolata L.: A metabolomics driven full-factorial  experiment  with  LC- ESI-MS3.  Phytochemistry.  106  (3): 44–54.
Gupta S., S. Kachhwaha, S.L. Kothari, R. Jain. 2020. Synergistic effect of cytokinins and  auxins  enables  mass  clonal multiplication  of  drumstick  tree ( Moringa oleifera Lam.): a wonder. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 56: 458- 469. http://doi.org/10.1007/s11627- 020-10065-0.
Hassanein, A.M., J.M. Salem, F.A. Faheed, A. El-nagish.  2018.  Effect  of  anti- ethylene  compounds  on  isoenzyme patterns  and  genome  stability  during long term culture of Moringa oleifera . Plant  Cell  Tiss.  Org.  Cult. 132(1): 201–212.
Hassanein,  A.,  J.  Salem,  F.  Faheed,  A.  El- Nagish. 2019. Some important aspects in Moringa oleifera Lam. micropropagation.  Acta  Agric.  Slov. 113(1): 13–27. https://doi.org/10.14720/aas.2019.11 3.1.02.
Jamshidi, S., A. Yadollahi, H. Ahmadi, M.M. Arab,  M.  Eftekhari.  2016.  Predicting in  vitro  culture  medium  macro- nutrients composition for pear rootstocks  using  regression  analysis and  neural  network  models.  Front.
Plant Sci.. 7: 1–12.
Jun-jie, Z., Y. Yue-sheng, L. Meng-fei, L. Shu- qi,  T.  Yi,  C.  Han-bin,  C.  Xiao-yang. 2017.  An  efficient  micropropagation protocol  for  direct  organogenesis from leaf explants of an economically valuable  plant,  drumstick  ( Moringa oleifera Lam.).  Industrial  Crops  and Products. 103: 59–63. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.201 7.03.028.
Kubota  S.,  K.  Yoneda,  Y.  Suzuki.  2000. Effects  of  ammonium  to  nitrate  ratio in  culture  medium  on  growth  and nutrient  absorption  of Phalaenopsis seedling  in  vitro.  Env.  Contr.  Biol. 38(4): 281-284.
Khor, K. Z., V. Lim, E. J. Moses, N. A. Samad. 2018.  The  in  vitro  and  in  vivo anticancer  properties  of Moringa oleifera. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.
https://doi.org/10.1155/2018/107124 3.
Marfori,  E.C.  2010.  Clonal  micropropagation of Moringa  oleifera L.  Philippine Agric. Scientist. 93(4): 454–457.
Máximo,  W.  P.  F.,  P.A.A.  Santos,  E.G. Mendonça,  B.R.  Santos,  L.V.  Paiva. 2015.  Nitrate  (NO 3 - )  and  ammonium (NH 4 + )  ratios  for  propagation  of Eucalyptus hybrid in two different in vitro  cultivation  systems.  Austr.  J. Crop Sci. 9(12): 1242–1248.
Murashige,  T.,  F.  Skoog.    1962.  A  revised medium  for  rapid  growth  and  bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol  Plant. 15 (3):  473– 497.
Poerba, Y.S., T. Handayani, Witjaksono. 2017. Karakterisasi pisang rejang tetraploid hasil  induksi  dengan  oryzalin.  Berita Biologi. 16 (1): 85 – 93.
Ravi, R.S.D., E.A. Siril, B.R. Nair. 2019. The effect of silver nitrate on micropropagation of Moringa oleifera Lam.  an  important  vegetable  crop  of tropics  with  substantial  nutritional value.  Physiol.  Mol.  Biol.  Plants. 25(5):
1311–1322. https://doi.org/10.1007/s12298-019- 00689-x. Ridwan,  Witjaksono.  2020.  Induction  of autotetraploid Moringa plant ( Moringa  oleifera )  using  oryzalin. Biodiversitas. 21(9): 4086-4093.
Romeida,  A.,  S.H.  Sutjahjo,  A.  Purwito,  D. Sukma,  Rustikawati.  2015.  Optimasi pertumbuhan  dan  multiplikasi  lini klon  PLBs  Anggrek Spathoglottis plicata Blume  melalui  modifikasi komposisi medium MS dan sitokinin.
J. Hort. Indonesia. 4(1): 1-8. https://doi.org/10.29244/jhi.4.1.1-8.
Shirdel, M., A. Motallebi-Azar, S. Masiha, N. Mortazavi,  M.  Matloobi,  Y.  Sharafi. 2011.  Effects  of  inorganic  nitrogen source  and  NH 4 + :  NO 3 - ratio  on proliferation  of  dog  rose  ( Rosa canina ). J. Medicin. Plant Res. 5(18):
4605–4609.
Stephenson, K.K., J.W. Fahey. 2004. Development of tissue culture methods for the rescue and propagation  of  endangered Moringa spp.  germplasm.  Economic  Botany 58(Supplement): S116–S124.
Steinitz, B., Y. Tabib, V. Gaba, T. Gefen, Y. Vaknin.  2009.  Vegetative  micro- cloning  to  sustain  biodiversity  of threatened  Moringa  species.  In  Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 45: 65–71. DOI 10.1007/s11627-008-9162-x.
Wada,  S.,  R.P.  Niedz,  B.M.  Reed.  2015. Determining  nitrate  and  ammonium requirements  for  optimal  in  vitro response  of  diverse  pear  species.  In Vitro  Cell.  Dev.  Biol.  Plant.  51(1): 19–27.
Wasonowati,  C.,  E.  Sulistyaningsih,  D. Indradewa,  D.  Kurniasih.  2018. Pertumbuhan  bibit  kelor  ( Moringa Oleifera Lamk)  dari  biji  dan  stek dengan  interval  pemberian  air  yang Berbeda. Prosiding Seminar Nasional Dalam Rangka Dies Natalis UNS Ke 42 Tahun 2018 “Peran Keanekaragaman Hayati untuk Mendukung Indonesia sebagai
Lumbung  Pangan  Dunia”.  2(1):  175- 181.
Witjaksono,  B.A.  Schaffer,  A.M.  Colls,  R.E. Litz,  P.A.  Moon.  1999.  Avocado shoot  culture,  plantlet  development and  net  CO  2  assimilation  in  an ambient and CO 2 enhanced environment. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 35:238-244.
Witjaksono,  R.E.  Litz.  1999.  Maturation  of avocado  somatic  embryos  and  plant recovery.  Plant  Cell  Tiss.  Org.  Cult. 58: 141–148.
Witjaksono,  A.  Leksonowati.  2012.  Iradiasi sinar γ pada biak tunas kentang hitam ( Solanostemon  rotundifolius )  efektif untuk  menghasilkan  mutan.  J.  Biol. Indonesia. 8(1): 167-179.