Kontruksi dan Ekspresi Protein Rekombinan Wee1 pada Escherichia coli strain BL21 (DE3)
Construction and expression of Wee1 recombinant protein in Escherichia coli strain BL21 (DE3)
Ladefa Primana Oktapan 1 , Ardela Alief Maulani 1 , Netty Ermawati 2 , Bambang Sugiharto 3,4*)
1 Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Jember
2 Jurusan Produksi Pertanian, Politeknik Negeri Jember
3 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember
4 UPT Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi CDAST, Universitas Jember *E-mail: sugiharto.fmipa@unej.ac.id

## ABSTRACT
Wee1 is a gene encoding for protein kinase that is located in the nucleus and it plays an essential role in determining the timing of mitosis. Overexpression of Wee1 in rice is resulting in increased plant size. However, the increasing plant size due to the increase of Wee1 protein expression is not elucidated.  Immunodiagnostic using specific antibodies against Wee1 protein should be conducted to determine the role of the protein on cell division. This experiment was directed to construct Wee1 in  an  expression  vector  for  synthesis  of  recombinant  Wee1  protein  using  three  strategies  of construction. The three strategies were construction of full length (FL), deletion of putative binding site (BS), and deletion of N-terminal domain (ΔN) of Wee1. Restriction analysis with BamH1/Sal1 of  FL-Wee1,  BS-Wee1,  and  ΔN-Wee1  construct  resulted  in  the  different  DNA  fragments  with molecular size at 1239, 1176, and 960bp, respectively. This result indicated that the Wee1 fragments have been successfully inserted in the expression plasmid which was further confirmed using DNA sequencing.  Colony  PCR  analysis  showed  that Escherichia  coli strain  BL21  (DE3)  has  been transformed  with  the  constructs.  The  protein  analysis  using  SDS-PAGE  revealed  that  the recombinant protein of Wee1 synthesized in the E.coli containing ΔN-Wee1 construct, but not in FL-Wee1 and BS-Wee1 constructs. The ΔN-Wee1 protein was synthesized in an insoluble fraction with  a  molecular  size  of  38.8  kDa  which  is  the  same  as  the  size  estimated  using  the  software ExPASy.  Interestingly,  the  level  of  synthesized  ΔN-Wee1  protein  was  not  induced  by  IPTG concentration. Collectively, the results indicated that the DNA construct of ΔN-Wee1 is suitable for recombinant protein production.
Keywords: Weel, construction, synthesis, recombinant protein, Escherichia coli .

## PENDAHULUAN
Wee1 merupakan protein kinase yang berperan penting sebagai negatif regulator pada regulasi pembelahan  sel  ((Ko et  al., 2018;  Nurse  & Thuriaux,  1980).  Protein  Wee1  berpengaruh pada  ukuran  sel  dengan  menghambat  regulasi pembelahan  sel  pada  saat check  point fase mitosis. Peran Wee1 dipengaruhi oleh regulasi post-translasi  yaitu  protein  Wee1  terfosforilasi untuk menjalankan fungsinya (Qiu et al., 2017). Saat  proses  pembelahan  sel,  protein  Wee1 memphosphorilasi  Cyclin-dependent  kinase (CDKs)  dalam  kompleks  CDKs-Cyclin  B  dan berdampak pada penghambatan proses pembelahan sel (Lucena et al., 2017). Protein Wee1 dilaporkan mempunyai peranan  penting  dalam  perkembangan  biji jagung  (Sun et  al .,  1999).  Overekspresi  gen pengkode Wee1 diketahui menyebabkan peningkatan  ukuran  sel  meristem  akar  pada
Arabidopsis (Siciliano  et  al., 2019)  dan meningkatkan  ekspansi  sel  selama  proses perkembangan  buah  pada  tanaman  tomat (Gonzalez et  al., 2007).  Pada  tanaman  padi dihipotesiskan  bahwa  overeskpresi  gen  Wee1 dapat meningkatkan produksi, sehingga dilakukan  isolasi  gen  Wee1  (Ermawati  & Wibisono,  2017).  Lebih  lanjut,  over  ekspresi gen Wee1 menghasilkan tanaman padi transgenik  dengan  morfologi  daun  berwarna hijau pekat dan ukuran tanaman lebih besar dari pada tanaman padi non-transgenik (Prasetyo et al., 2018)
Untuk  mengetahui  analisis  dan  regulasi protein  Wee1  diperlukan  analisa  pada  tingkat protein  Wee1.  Analisis  molekuler  dapat dilakukan pada tingkat transkripsi atau ekspresi gen,  maupun  pada  tingkat  translasi  atau proteinnya.  Analisis  biokimia  tingkat  protein perlu  dilakukan  untuk  menentukan  hubungan antara  perubahan  morfologi  fenotipik  dengan
ekspresi  pada  tingkat  translasi  protein  Wee1. Analisa tingkat translasi dapat dilakukan dengan analisis  immunoblot  menggunakan  antibodi untuk  deteksi  protein  Wee1.  Oleh  karena  itu diperlukan antibodi, dengan menginjeksi protein Wee1 sebagai antigen ke dalam  hewan coba  untuk  memicu  terbentuknya  antibodi poliklonal (Ishii et al., 2021) Antibodi  poliklonal  merupakan  serum immunoglobulin  yang  disintesis  oleh  hewan sebagai  respon  terhadap  substansi  asing  yang masuk  dalam  tubuh.  Setiap  antibodi  memiliki afinitas  spesifik  terhadap  materi  asing  yang memicu  sintesis  antibodi  tersebut.  Suatu makromolekul  asing  yang  mampu  memicu pembentukan antibodi disebut antigen
(Emantoko,  2001).  Bagian  dari  antigen menginduksi  terbentuknya  respon  antibodi disebut  dengan  epitop  (Akbar et  al., 2021). Dalam  proses  pembuatan  antibodi  poliklonal, antigen dapat diperoleh secara cepat dan dalam jumlah yang cukup banyak dengan memanfaatkan teknik protein rekombinan. Protein rekombinan merupakan protein yang disintesis menggunakan teknik
DNA rekombinan dalam sel organisme. DNA sebagai materi  genetik  bila  dikonstruksikan  pada plasmid vektor ekspresi dapat digunakan untuk sintesis  protein  rekombinan.  Banyak  sel organisme  yang  bisa  digunakan  untuk  sintesis protein  rekombinan,  tetapi  sel  bakteri E.  coli lebih  banyak  digunakan  karena  mudah  dan cepat pertumbuhanya. Akan tetapi tidak semua DNA dapat diekspresikan dan sering ditemukan beberapa  masalah,  seperti  ekspresi  protein rekombinan  yang  fungsinya  berhubungan dengan  proses  pembelahan  sel  berdampak terhadap  proses  pertumbuhan  sel  inang.  Tidak ada  metode  universal  yang  dapat  digunakan, tetapi ada beberapa strategi untuk memperbaiki tingkat  ekspresinya  (Gopal  &  Kumar,  2013). Diantara  strategi  tersebut  antara  lain  dengan cara mengubah urutan nukleotida DNA  seperti menghilangkan sisi aktif (Rosano & Ceccarelli, 2014) dan menghilangkan ujung N-terminalnya (Sawitri et al., 2016). Produksi protein rekombinan dapat dilakukan  dengan  menyisipkan  DNA  target  ke vektor ekspresi dan mentransformasikannya ke sel host (Sumirasih,  2018).  Plasmid  yang digunakan  dalam  proses  penyisipan  dapat mengandung  6xHis  tag  (asam  amino  histidine sebanyak  enam  kali)  untuk  mempermudah proses
purifikasi menggunakan resin kromatografi afinitas NiNTA. Namun
demikian, transformasi gen target dalam vektor ekspresi  ke  sel E.coli belum  tentu  dapat mengekspresikan protein rekombinan. Bebererapa  masalah  sering  muncul  sehingga gen  tidak  bisa  diekspresikan  membentuk protein.  Teknik  rekayasa  gen  agar  dapat diekspresikan  merupakan  langkah  penting untuk mendapatkan protein rekombinan.
Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi reombinan protein Wee1  yang akan digunakan sebagai  antigen  untuk  pembuatan  antibodi poliklonal  pada  hewan  coba.  Gen  Wee1  yang berada  dalam  vektor  kloning  dapat  di subkloning  pada  vektor  ekspresi  sehingga protein target dapat diekspresikan (Schumann & Ferreira,  2004).  Oleh  karena  itu,  perlu  adanya strategi  pembuatan  konstruk  Wee1  agar  dapat digunakan  untuk  produksi  rekombinan  protein Wee1. Pada penelitian ini, strategi penghilangan domain  N-terminal  Wee1  terbukti  dapat mengekspresikan protein rekombinan Wee1.

## METODE

## Bahan
Gen  Wee1  yang  diisolasi  dari  tanaman  padi digunakan  sebagai  bahan  konstruksi  pada  vektor ekspresi  (Ermawati  &  Wibisono,  2017).  Konstruksi dilakukan  dengan  menggunakan  plasmid  pET28a (Novagen, Madison, USA) yang mempunyai 6x His- Tag.  Konstruk  DNA  yang  terbentuk  kemudian ditransformasikan  ke  sel E.  coli strain  BL21  (DE3) (Novagen,  Madison,  USA)  untuk  sintesis  protein rekombinan.  Protein  rekombinan  ini  nantinya  akan diproduksi dan digunakan untuk pembuatan antibodi poliklonal spesifik protein Wee1.

## Strategi konstruksi Wee1 pada plasmid pET28a
Strategi  konstruksi  Wee1  pada  vektor  ekspresi pET28a dilakukan dengan tiga macam strategi, yaitu menggunakan:  (1) full  length (FL-Wee1),  (2)  delesi (penghilangan)  domain putative  kinase  binding  site (delesi BS-Wee1), (3) delesi domain N-terminal (ΔN- Wee1).  Konstruksi  FL-Wee1  dilakukan  dengan mengamplifikasi gen Wee1 menggunakan primer F1 yang  disisipi  situs  pemotongan  untuk  BamH1  pada ujung  5’  dan  primer  R1  yang  disisipi  situs pemotongan  untuk  Sal1  pada  ujung  3’  (Tabel  1). DNA hasil PCR selanjutnya dipotong dengan enzim restriksi  BamH1  dan  Sal1,  kemudian  diinsersikan pada plasmid pET28a (dinamakan konstruk 1). Delesi BS-Wee1 dilakukan  dengan  mengamplifikasi  Wee1 pada  ujung  5’  menggunakan  primer  F2  yang mengandung  situs  pemotongan  untuk SacI pada urutan  basa  ke  616  dan  primer  R1  (Tabel  1).  DNA hasil  PCR  dipotong  dengan  enzim  Sac1  dan  Sal1. Hasil  pemotongan  kemudian  diinsersikan  pada konstruk  1  yang  telah  dihilangkan  domain binding site dengan Sac1 dan Sal1 (dinamakan Konstruk 2). Konstruk
ΔN-Wee1 dilakukan dengan mengamplifikasi konstruk 1 menggunakan primer F3
yang  mengandung  situs  pemotongan  untuk BamH1 pada posisi urutan nukleotida ke 283 dan primer R1 (Tabel  1).  DNA  hasil  PCR  selanjutnya  dipotong dengan  BamH1  dan  Sal1,  selanjutnya  diinsersikan pada  plasmid  pET28a  pada  situs  yang  sama (dinamakan  Konstruk  3).  Insersi  gen  WeeI pada plasmid pET28a dilakukan  menggunakan Kit Rapid DNA  ligation  (Roche,  Germany)  dengan  inkubasi pada  suhu  16 o C  selama  overnight.  Metode  ligase dilakukan sesuai manual kit.
Transformasi  Wee1  pada  plasmid  pET28a  ke sel E. coli BL21 (DE3) Plasmid  mengandung  gen  Wee1  hasil  ligasi ditransformasikan  ke  sel  kompeten E.  coli BL21 (DE3)  menggunakan  metode heat  shock ,  (Green  & Sambrook,  2012).  Sel  transforman  ditumbuhkan  ke media  padat  LB  (Luria  Bertani)  yang  mengandung antibiotik  50  mg/L  kanamisin.  Identifikasi  bakteri positif transforman mengandung gen target dilakukan dengan  analisis  PCR  koloni.  Koloni  transforman selanjutnya  ditumbuhkan  di  media  LB  cair mengandung antibiotik selama 16 jam dan dilakukan isolasi  plasmid  menggunakan  kit  isolasi  plasmid (Tianggen, China). Konfirmasi keberadaan konstruk Wee1 pada sel E.coli dilakukan dengan analisis PCR, analisis  pemotongan  enzim  restriksi  dan  DNA sequencing .

## Analisis PCR dan restriksi enzim
Analisis PCR dilakukan untuk memperbanyak urutan DNA spesifik sesuai dengan urutan primer yang telah ditentukan.  Analisa  PCR  pada  koloni  bakteri  dan plasmid hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan pasangan primer F1-R1 dan F2-R1 (Tabel 1). Reaksi PCR dilakukan menggunakan Kit (Roche, Germany) dengan  tahapan predenaturasi 95 o C  selama  3  menit, dilanjutkan dengan 35 siklus reaksi denaturasi 95 o C selama  30  detik,  annealing  55 o C  selama  30  detik, extension 72 o C selama 1 menit, dan satu siklus final extension 72 o C selama 5 menit.
Plasmid  hasil  isolasi  dari  masing  masing  koloni bakteri positif mengandung gen Wee1 (FL, BS, dan Δ N-Wee1)  dipotong  dengan  enzim  restriksi  BamHi dan  SalI  selama  3  jam  pada  suhu  37 o C.  Hasil pemotongan dengan enzim restriksi dan analisa PCR selanjutnya  divisualisasi  menggunakan  1%  gel agarose  mengandung  ethidium  bromide  (EtBr). Elektroforesis  dilakukan  dengan  aliran  tegangan listrik  sebesar  100  volt  selama  30  menit.  Hasil pemisahan  DNA  dengan  elektroforesis  divisualisasi menggunakan GelDoc (Major Science, USA).
Ekspresi  protein  rekombinan  pada E.coli BL21 (DE3)
Pengujian  ekspresi  gen  Wee1  dilakukan  sesuai dengan  Septian et  al., (2021)  yaitu  menumbuhkan bakteri E.coli BL21  (DE3)  transforman  pada  5  mL media LB cair mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L,  digojok  selama  semalam  pada  suhu  37ºC. Bakteri  yang  tumbuh  digunakan  sebagai  starter  dan disubkultur  ke  50  mL  media  LB  cair  mengandung
antibotik  kanamisin  50  mg/L  dengan  perbandingan 1:50.  Bakteri  ditumbuhkan  dengan  penggojokan sampai  OD  0,5  pada  suhu  37 o C.  Setelah  mencapai OD  0,5  ditambahkan  inducer  0.1  mM  IPTG  dan pertumbuhan  dilanjutkan  selama  12  jam.  Panen  sel bakteri  dilakukan  dengan  cara  sentrifugasi  pada kecepatan  6000  rpm  dengan  suhu  4ºC  selama  10 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel bakteri yang diperoleh digunakan untuk ekstraksi protein.
Ekstraksi protein
dilakukan dengan menambahkan  dan  meresuspensi  pellet  bakteri dengan  3x  volume  buffer  sonikasi  mengandung 50mM Na 2 HPO 4 dan 300 mM NaCl. Pemecahan sel bakteri  dilakukan  dengan  sonikasi  selama  30  detik sebnayak  6  kali  pada  suhu 4 o C. Setelah  sentrifugasi pada  kecepatan  14.000  rpm,  suhu  4ºC  selama  15 menit,  supernatan  diambil  sebagai  protein  terlarut ( soluble ) dan pellet diresuspensi kembali dengan 2x volume  buffer  yang  mengandung  50mM  Na 2 HPO 4 , 300mM  NaCl,  8M  Urea.  Protein  tidak  terlarut ( insoluble )  diekstraksi  dengan  cara  sonikasi  selama 30  detik  x  6  kali  dan  disentrifugasi  pada  kecepatan 14.000  rpm  selama  15  menit  pada  suhu  ruang. Supernatan  yang  diperoleh  merupakan  protein  tidak terlarut  ( insoluble ).    Konsentrasi  protein  ditentukan menggunakan metoda Bradford.

## Visualisasi protein dengan SDS-PAGE
Untuk melihat profil protein hasil ekspresi gen Wee1, ekstrak protein total, protein terlarut dan protein tidak terlarut  dipisahkan  dengan  SDS-PAGE  ( sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis , 12,5%  acrylamide).  Sebanyak  15  µg  protein ditambahkan  loading  buffer  SDS-PAGE,  kemudian didenaturasi  dengan  pemanasan  pada  suhu  95ºC selama  3  menit.  Protein  dipisahkan  dengan elektroforesis  pada  80-volt  selama  3  jam.  Protein yang  telah  terpisah  diberi  pewarnaan  dengan Commasie  Briliant  Blue (CBB)  untuk  mengetahui profil pita protein.
Tabel 1. Primer yang digunakan untuk konstruksi gen Wee1 ke vektor ekspresi
F1-BamH1 5’-GGATCCTTATCGTGGCAAAC-3’
F2-Sac1 5’-CAGAGCTCTCCTAGATGACAAC-3’ F3-BamH1 5’-AGTGGATCCGATCAACGTG-3’ R1-Sal1
5’-GCTTGTCGACTTATCGTGG-3’

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Konstruksi gen Wee1 pada plasmid pET28a
Untuk sintesis rekombinan protein Wee1 diperlukan konstruksi DNA pada vektor ekspresi menggunakan tiga jenis strategi konstruk. Strategi yang dilakukan bertujuan untuk memdapatkan rekombinan protein, mengingat  tidak  semua  DNA  yang  diekspresikan dalam  sel E.coli dapat  membentuk  protein. Pembuatan DNA konstruk 1 (FL-Wee1), konstruk 2 (BS-Wee1),  dan  konstruk  3  (ΔN-Wee1)  dilakukan menggunakan  rancangan  sesuai  peta  kontruk  yang diilustrasikan pada Gambar 1A.
Gambar  1.  Diagram  peta  konstruk  gen  Wee1
pada  plasmid  pET28a  (A)  dan visualisasi elektroforesis gel agarose  (1%)  hasil  pemotongan enzim BamH1/Sal1  pada konstruk pET28a-Wee1  (B).  Peta  konstruk digambarkan
menggunakan
software SnapGene FL-Wee1, BS-
Wee1  dan  ΔN-Wee1 masing-masing adalah  konstruk full  length Wee1, delesi  putative  kinase binding  side dan,  delesi  N-terminal.  M,  marker DNA  1  Kb  Ladder,  tanda  panah menunjukan posisi fragment DNA.
Hasil  pemotongan  konstruk  1,2  dan  3 menggunakan  enzim BamH1/Sal1 menghasilkan fragmen DNA yang berbeda dengan ukuran masing- masing  1239  (Ermawati  &  Wibisono,  2017; Prasetyo et al ., 2018), 1176 dan 960 bp (Gambar 1B).  Hal itu menunjukan bahwa DNA Wee1 telah berhasil  disisipkan  pada  vektor  plasmid  ekspresi sesuai  dengan  rancangannya.  Untuk  konfirmasi kebenaran konstruk juga telah dilakukan penentuan urutan  nukleotida  dengan sequencing yang menunjukan  ketepatan design konstruk  1,  2, dan 3 (data tidak disajikan).

## Transformasi dan koloni PCR
Transformasi  konstruk  1,  2,  dan  3  pada  sel E.  coli BL21  (DE3)  dilakukan  dengan  metode heat shock . Pertumbuhan koloni bakteri putative transforman  pada  media  LB  agar  mengandung antibiotik kanamycin menunjukan bahwa koloni yang  paling  banyak  tumbuh  yaitu  pada E.coli yang ditransformasi dengan konstruk ΔN-Wee1 yaitu ± 250 koloni, disusul oleh konstruk delesi BS-Wee1  ±  25  koloni,  dan  paling  sedikit konstruk  FL-Wee1  ±  10  koloni  (Gambar  2A). Analisis koloni PCR dilakukan untuk mengkonfirmasi  ada  tidaknya  gen insert pada E.coli .  Hasil  PCR  menunjukan  bahwa  semua koloni  yang  dianalisis  memiliki  pita  DNA
sesuai  dengan  ukuran  yang  ditargetkan.  FL- Wee1, delesi BS-Wee1, dan ΔN-Wee1 berturut- turut memiliki pita DNA berukuran 1239, 1176, dan  960bp.    Hasil  ini  menunjukan  bahwa konstruk gen Wee1 telah berhasil tertransformasi  pada  sel E.coli .  Perbedaan jumlah  koloni  pada  masing-masing  konstruk mungkin disebabkan akibat adanya ekspresi gen Wee1  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan E.coli transforman utamanya pada konstruk FL- Wee1. Sedangkan konstruk 2 delesi BS jumlah koloninya  juga  sedikit  diduga  prediksi domain putative  kinase  binding  site (BS)  kurang  tepat dan  protein  Wee1  masih  memiliki  aktivitas memphosphorilasi  CDKs  dan  menghambat terjadinya pembelahan sel sehingga menyebabkan pertumbuhan jumlah koloni pada bakteri  sedikit.  Namun  konstruk  3  ΔN-Wee1 melalui  penghilangan  N-terminal  domain diduga  dapat  menghilangkan  fungsi  protein Wee1,  sehingga  protein  Wee1  tidak  dapat memphosphorilasi  CDKs  dan  menginduksi terjadinya  pembelahan  sel  sehingga  banyak koloni E.coli yang  tumbuh  pada  mutan  ΔN- Wee1. N-terminal pada protein berperan sangat krusial dan berkorelasi terhadap fungsi protein.
Gambar  2.  Pertumbuhan  koloni  bakteri E.coli BL21 (DE3) pada media seleksi LB padat
(A) visualisasi dari elektroforesis hasil PCR  koloni (B).
Pertumbuhan koloni dilakukan dengan  menghitung  jumlah  koloni yang  muncul  sesudah  24  jam inkubasi  suhu  37 o C  sebanyak  3 ulangan.  Sebanyak  20µl  DNA  hasil PCR dipisahkan dengan elektroforesis gel agarose (1%). Line 1  s/d  5  adalah  koloni  1  s/d  5  untuk masing masing jenis konstruk Wee1. M,  marker  DNA  1  kb  Ladder,  (-) kontrol negatif koloni bukan transforman.
Contoh  lain  juga  terjadi  pada coat -protein seperti  yang  dilaporkan  oleh  Apriasti et  al.
(2018),  penghilangan  N-terminal  pada coat protein mengakibatkan pengurangan efektivitas resistensi tanaman transgenik terhadap serangan virus.
Analisis  ekspresi  protein  rekombinan  Wee1 menggunakan SDS-PAGE.
Untuk  melihat  ekspresi  rekombinan  protein Wee1  yang  dihasilkan  oleh  3  macam  konstruk Wee1, bakteri E.coli transforman ditumbuhkan pada  media  LB  cair  yang  mengandung antibiotik    kanamicin  50  mg/L  dan  diinduksi dengan 0,1mM IPTG setelah OD mencapai 0.5. Pertumbuhan  bakteri  dilanjutkan  pada  suhu 37 o C  selama  16  jam.  Pengamatan  menunjukan bahwa  pertumbuhan E.coli FL  dan  delesi  BS lambat  dan  hanya  mencapai  OD600  masing masing  0,3  dan  0,8  sesudah  ditumbuhkan  16 jam.  Namun E.coli ΔN-Wee1  menunjukan pertumbuhan normal dengan  OD600 mencapai 1.8. Perbedaan pertumbuhan bakteri disebabkan oleh adanya regulasi phosphorilasi dari protein Wee1  yang  diekspresikan  di  sel  bakteri.  Saat bakteri  mengekspresikan  protein  rekombinan Wee1 full-length dan deletion  binding  Site , kedua protein tersebut masih memiliki aktivitas memphosphorilasi CDKs pada kompleks CDKs-Cyclin  (Qiu et  al., 2018;  Lucena et  al., 2017).  CDKs-cyclin  yang  terphosphorilasi tersebut  tidak  dapat  melanjutkan  siklus  sel  ke fase mitosis sehingga menyebabkan terhambatnya  proses  pembelahan  sel  yang berdampak  pada  rendahnya  OD  pertumbuhan bakteri. Menariknya, bakteri transforman mutan ΔN-Wee1  menunjukkan  pertumbuhan  bakteri yang  normal.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa protein  ΔN-Wee1  yang  diekspresikan  oleh E.coli telah  kehilangan  fungsi  (kehilangan  sisi aktif) yang berperan dalam proses phosphorilasi CDKs,  sehingga  ekspresi  ΔN-Wee1  tidak mempengaruhi pertumbuhan bakteri.
Setelah  sel  bakteri  dipanen,  selanjutnya diekstraksi  dan  ditentukan  pola  pita  (profil) proteinnya  dengan  SDS-PAGE.  SDS  PAGE bertujuan  untuk  membedakan  ekpsresi  protein dari  3  konstruk  DNA  Wee1.  Profil  protein dilihat pada 3 fraksi ekstraksi yaitu total protein, protein terlarut dan protein tidak terlarut. Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  profil  protein terlihat  tidak  berbeda  antara  bakteri  kontrol mengandung  plasmid  pET28a  tanpa insert dan bakteri  yang  mengandung  plasmid  pET28a dengan insersi FL-Wee1, baik pada fraksi total,
protein terlarut dan protein tidak terlarut. Hasil yang  serupa  juga  didapatkan  dari  ekspresi protein  konstruk  BS-Wee1. Profil protein dari fraksi  total,  terlarut  dan  tidak  terlarut  terlihat sama  antara  bakteri  kontrol  dan  bakteri transforman (Gambar 3A). Penambahan pengiduksi  IPTG  juga  tidak  mengubah  pola protein  yang  dihasilkan.  Akan  tetapi,  ekpsresi konstruk  ΔN-Wee1  terlihat  jelas  adanya perbedaan  profil  protein  antara  bakteri  kontrol dan  transforman.  Satu  pita  protein  baru berukuran  sekitar  38,8  kDa,  muncul  pada ekstrak  protein  total  dan  protein  tidak  terlarut, tetapi tidak muncul pada protein terlarut.
Gambar  3.  Pemisahan  protein  rekombinan dengan    SDS  -PAGE.  (A)
Visualisasi protein terlarut ( soluble ) dan tidak terlarut ( insoluble )  dan  (B)  Pengaruh induksi IPTG terhadap kandungan protein rekombinan. Protein diekstraksi  dari  sel  bakteri E.coli transforman dan dipisahkan dengan SDS-PAGE (12.5%
acrylamide ),  kemudian  diwarnai dengan  CBB.  FL,  BS  dan  ΔN berturut-turut adalah profil protein dari konstruk FL-Wee1, BS-Wee1 dan ΔN-Wee1. M, adalah marker protein,  tanda  (-)  protein  dari E.  coli kontrol  mengandung pET28a tanpa insersi gen Wee1.
Ukuran  protein  tersebut  sama  dengan prediksi ukuran protein menggunakan software ExPASy  (https://web.expasy.org/compute_pi/), yaitu  38,8  kDa.  Ukuran  protein  Wee1  sebesar 38.8  kDa  merupakan  ekspresi  parsial  dari  FL- Wee1,  dimana  ukuran  protein  FL-Wee1  yaitu sekitar 45.6 kDa pada Jagung (Sun et al., 1999). Pemberian penginduksi IPTG 0.1, 0.3, 0.5 dan 1mM tidak meningkatkan ekspresi protein yang dihasilkan, tetapi jelas bahwa kontruk ΔN-Wee1 diekspresikan  dan  menghasilkan  protein  baru. Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  pemberian IPTG  pada  konsentrasi  0.1mM mampu menginduksi  ekspresi  protein  rekombinan dengan optimal sehingga pemberian konsentrasi yang lebih tinggi tidak  memberikan perubahan ekspresi protein yang signifikan.
Hasil  penelitian  ini  menyatakan  bahwa penghilangan ( sequence nukleotida) domain N- terminal dapat mengekspresikan protein
rekombinan Wee1 pada E.coli . Protein rekombinan  ini  yang  akan  diproduksi  dan dipurifikasi  untuk  digunakan  sebagai  antigen dalam  pembuatan  antibodi  poliklonal  Wee1. Selain  itu,  penelitian  ini  dapat  dikembangkan untuk  mengeksplorasi  dan  mengkarakterisasi protein Wee1 untuk  mengetahui  asam  amino yang  berperan  dalam  regulasi  pembelahan  sel terutama  pada  proses  phosphorilasi  dan dephosphorilasi CDKs.

## KESIMPULAN
Konstruk plasmid ΔN-Wee1 dapat
diekspresikan pada sel E.coli BL21 (DE3) dan menghasilkan rekombinan protein Wee1
dengan  ukuran  sekitar  38.8  kDa.  Akan  tetapi konstruk plasmid FL-Wee1 dan BS-Wee1 tidak menghasilkan  protein.  Walaupun  rekombinan protein  target  diekspresikan  dalam  bentuk protein  tidak  terlarut,  tetapi  protein  ini  dapat dipurifikasi  dan  digunakan  sebagai  antigen untuk  induksi  antibodi  poliklonal  pada  hewan coba.

## DAFTAR PUSTAKA
Akbar R, Robert PA, Pavlović M, Jeliazkov JR, Snapkov  I,  Slabodkin  A,  Weber  CR, Scheffer  L,  Miho  E,  Haff  IH,  Haug  DTT, Lund-Johansen F, Safonova Y, Sandve GK & Greiff V. 2021. A Compact Vocabulary of Paratope-Epitope Interactions Enables Predictability of Antibody-Antigen Binding.
Cell Reports . 34 (11): 108856.
Apriasti  R,  Widyaningrum  S,  Hidayati  WN, Sawitri  WD,  Darsono  N,  Hase  T  &
Sugiharto  B.  2018.  Full  Sequence  of  The Coat  Protein  Gene  is  Required  for  The Induction  of  Pathogen-Derived  Resistance Against  Sugarcane  Mosaic  Virus  in Transgenic  Sugarcane. Molecular  Biology Reports . 45 (6): 2749-2758.
Emantoko  S.  2001.  Antibodi  Rekombinan:
Perkembangan  Terbaru  dalam  Teknologi Antibodi. Unitas . 9 (2): 29-43.
Ermawati  N  &  Wibisono  Y.  2017.  Early
Isolation  of  Cell  Cycle-Associated  Protein Kinase (Oswee) Gene in Rice ( Oryza Sativa L.). Biotechnol . 14 (1): 71-76.
Gonzalez  N,  Gévaudant  F,  Hernould  M,
Chevalier  C  &  Mouras  A.  2007.  The  Cell Cycle-Associated  Protein  Kinase  Wee1
Regulates  Cell  Size  in  Relation  to Endoreduplication  in  Developing  Tomato Fruit:  Wee1  and  Cell  Size  Control  in Tomato. The Plant Journal . 51 (4): 642-655. Gopal GJ & Kumar A. 2013. Strategies for the
Production  of  Recombinant  Protein  in Escherichia  coli . The  Protein  Journal .
32 (6): 419-425.
Green  M  &  Sambrook  J.  2012. Molecular cloning: A  laboratory  manual.  4th  Edition, Vol  II .  Cold  Spring  Harbor  Laboratory Press.
Ishii  M,  Nakakido  M,  Caaveiro  JMM,  Kuroda
D,  Okumura  CJ,  Maruyama  T,  Entzminger K & Tsumoto K. 2021. Structural Basis for Antigen Recognition by Methylated Lysine– Specific  Antibodies. Journal  of  Biological Chemistry . 296 : 100176.
Ko C, Ma J, Bartnik R, Haney MH & Kang M.
2018.  Ethical  Leadership:  An  Integrative Review and Future Research Agenda. Ethics
& Behavior . 28 (2): 104-132.
Lucena R, Alcaide-Gavilán M, Anastasia SD & Kellogg  DR.  2017.  Wee1  and  Cdc25  are Controlled  by  Conserved  PP2A-dependent Mechanisms  in  Fission  Yeast. Cell  Cycle . 16 (5): 428-435.
Nurse P & Thuriaux P. 1980. Regulatory Gene
Controlling  Mitosis  In  The  Fission  Yeast S chizoasaccharomyces  pombe . Genetics .
96 (3): 627-637.
Prasetyo  FHH,  Sugiharto  B  &  Ermawati  N.
2018. Cloning, Transformation and Expression of Cell Cycle-Associated Protein
Kinase OsWee1 in Indica Rice ( Oryza sativa L.). Journal  of  Genetic  Engineering  and Biotechnology . 16 (2): 573-579.
Qiu C, Yi Y, Lucena R, Wu M, Sun J, Wang X, Jin  Q  &  Wang  Y.  2017.  SCFPof3  and
SCFPof1  Regulate  Wee1  Degradation  and Mitotic  Entry  in  Fission  Yeast. Journal  of Cell Science . jcs.202895 . Rosano GL & Ceccarelli EA. 2014. Recombinant protein expression in
Escherichia  coli:  Advances  and  challenges. Frontiers in Microbiology . 5 . Sawitri  WD,  Narita  H,  Ishizaka-Ikeda  E, Sugiharto B, Hase T & Nakagawa A. 2016.
Purification and Characterization of
Recombinant Sugarcane Sucrose Phosphate
Synthase Expressed in E. coli and insect Sf9 cells:  An  Importance  of  The  N-terminal Domain  for  an  Allosteric  Regulatory Property. Journal  of  Biochemistry . 159 (6): 599-607.
Schumann W & Ferreira LCS. 2004. Production of  Recombinant  Proteins  in Escherichia coli . Genetics and Molecular Biology . 27 (3): 442-453.
Septian  A,  Neliana  IR,  Kusumawardani  B  & Sugiharto  B.  2021.  Pengujian  Potensi
Alergenitas Coat Protein Sugarcane Mosaik Virus  Pada  Tanaman  Tebu  transgenik. Jurnal  Bioteknologi  &  Biosains  Indonesia , 8 (2): 2008-2019.
Siciliano  I,  Lentz  Grønlund  A,  Ševčíková  H,
Spadafora ND, Rafiei G, Francis D, Herbert RJ,  Bitonti  MB,  Rogers  HJ  &  Lipavská  H.
2019.  Expression  of  Arabidopsis  Wee1  in Tobacco Induces Unexpected Morphological and Developmental Changes. Scientific Reports . 9 (1): 8695.
Sumirasih  T.  2018.  Kajian  DNA  Rekombinan pada  Vaksin  DNA  dan  Vaksin  Subunit Protein. Pharma Medika . 10 (2): 108-128. Sun Y, Dilkes BP, Zhang C, Dante RA, Carneiro NP,  Lowe  KS,  Jung  R,  Gordon-Kamm  WJ
&  Larkins  BA.  1999.  Characterization  of maize ( Zea mays L.) Wee1 and Its Activity in  Developing  Endosperm. Proceedings  of the  National  Academy  of  Sciences . 96 (7):
4180-4185.
158                                                       Konstruksi dan Ekspresi …                             (Oktapan, dkk)