Pengaruh  Nutrisi  pada  Produksi  dan  Karakterisasi  Protease  dari  Bakteri  Termofilik  Isolat  LS-1  Lumpur Sidoarjo
Achmad Toto Poernomo*, Isnaeni, Sugianto, Djoko Agus Purwanto, Ayu Chandra Dewi, Digdo Suryagama Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya
*Corresponding author: achmad-t-p@ff.unair.ac.id

## Abstract
Background : Production of protease by thermophilic bacteria isolate LS-1 cultured in sodium citrate containing liquid media has been carried out. Objective : This study was aimed at getting  optimum the condition of protease product in the thermophilic bacterial isolates of the Sidoarjo mud. Methods : Protease production is carried out at  different  times,  temperature,  carbon,  and  nitrogen  sources. Results : The  enzyme  production  reachs  a maximum after incubation for  10  hours  with activity of  1.85U/mg of  protein. Some carbon sources needed for protease  production  in  this  study  have  been  optimized.  The  soluble  starch  is  the  best  substrate,  followed  by sodium citrate, citric acid  and sucrose.  NH 4 NO 3 was the best  among various  source of organic and inorganic used. Protease characterization studies performed in this study indicate that the optimum temperature is 60ºC. The enzyme was stable for 2 hours at 30ºC, while at 40ºC and 80ºC it decreased by 16% and 86% respectively from the initial activity. Achievement of the optimum pH of the enzyme is known to be 8.0. After incubation of a crude enzyme solution for 24 hours at pH 5.5; 8.0 and 9.0, there was a decrease of about 49%, 15% and 63%, respectively, from previous activities. Effect of K + , Hg 2+ and Cu 2+ at a concentration of 1mM as a strong inhibitor resulting in loss of activity, was also observed in this study. The ions that contribute to influencing activity are Mn 2+ and Ca 2+ , which indicates that these ions have a functional role in the molecular structure of the enzymes. Conclusion : Optimum  protease  production  by  thermophilic  bacteria  at  10  hours.  Dissolved  starch  is  the  best substrate for protease production. The optimum temperature and pH of  protease activity were at  60ºC and pH 8.0. Protease activity is influenced by Mn 2+ and Ca 2+ metal ions.
Keywords : protease, thermophilic bacteria, nutrition effect

## Abstrak
Pendahuluan :  Telah  dilakukan  produksi  protease  dari  bakteri  termofilik  isolat  LS-1  yang  dikulturkan  dalam media cair  mengandung natrium  sitrat. Tujuan : Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan kondisi optimum produksi  protease  pada  isolat  bakteri  termofilik  lumpur  Sidoarjo. Metode :  Produksi  protease  dilakukan  pada berbagai waktu, sumber karbon dan nitrogen.  Karakterisasi protease dilakukan dengan  menggunakan  substrat azokasein  dengan  pengaruh  berbagai  suhu,  pH  dan  pengaruh  ion  logam. Hasil :  Produk  enzim  mencapai maksimum  pada 10  jam dengan aktivitas 1,85U/mg protein. Beberapa sumber karbon  yang dibutuhkan untuk produksi  protease  dalam  penelitian  ini  telah  dioptimasi. Amilum  adalah  substrat terbaik,  diikuti  oleh  natrium sitrat,  asam  sitrat  dan  sukrosa.  Di  antara  berbagai  sumber  nitrogen  organik  dan  anorganik NH 4 NO 3 telah diketahui  yang  terbaik.  Studi  karakterisasi  protease  yang  diperoleh  dalam  penelitian  ini  menunjukkan  suhu optimum pada 60ºC. Enzim stabil selama 2 jam pada suhu 30ºC, sementara pada suhu 40ºC dan 80ºC, menurun masing masing 16% dan 86% dari aktivitas awal. Pencapaian pH optimum enzim diketahui 8,0. Setelah  larutan enzim kasar dinkubasi selama 24 jam pada pH 5,5; 8,0 dan 9,0, terjadi penurunan sekitar masing-masing 49%, 15% dan 63% dari aktivitas sebelumnya. Pengaruh K + , Hg 2+ dan Cu 2+ pada konsentrasi 1mM sebagai inhibitor kuat sehingga mengakibatkan hilangnya aktivitas. Ion yang berkontribusi mempengaruhi aktivitas adalah Mn 2+ dan  Ca 2+ ,  yang  menunjukkan  bahwa  ion  ini  memiliki  peran  fungsional  dalam  struktur  molekul  enzim. Kesimpulan :  Produksi  protease  optimum  oleh  bakteri  termofilik  isolat  LS-1  pada  waktu  10  jam.  Amilum adalah  substrat  terbaik  untuk  produksi  protease.  Suhu  dan  temperatur  optimum  aktivitas  protease  masing masing pada suhu 60ºC dan pH 8,0. Aktivitas Protease dipengaruhi oleh ion logam Mn 2+ dan Ca 2+ .
Kata kunci : protease, bakteri termofilik, pengaruh nutrisi

## PENDAHULUAN
Enzim yang berasal dari mikroba biasanya banyak digunakan  untuk  industri.  Penggunaan  bakteri  untuk menghasilkan  suatu  enzim  memiliki  keuntungan  baik secara  teknik  maupun  ekonomi  (Shumi  dkk.,  2004). Diantaranya  keuntungan  penggunaan  mikroba  sebagai penghasil  enzim  protease  adalah  waktu  yang dibutuhkan  dalam  proses  produksi  lebih  pendek, tingkat  pertumbuhan  relatif  lebih  cepat,  lebih  mudah untuk  ditumbuhkan,  hasil  lebih  mudah  ditingkatkan melalui pengaturan  kondisi pertumbuhan dan rekayasa genetik,  biaya  produksi  relatif  rendah,  kondisi  selama produksi, dan tidak tergantung oleh adanya pergantian musim  (Naidu  &  Devi,  2005).  Salah  satu  enzim  yang penting  dan  memiliki  nilai  ekonomi  tinggi  adalah protease,  karena  aplikasinya  sangat  luas,  diantaranya adalah  untuk  industri  makanan,  detergen,  farmasi, kulit,  dan  pengolahan  limbah.  Protease  dapat disekresikan pada bakteri  termofilik sehingga semakin berguna  dalam  berbagai  aplikasi  komersial.  Oleh karena  itu,  tidak  mengherankan  apabila  protease digunakan  mencapai  60%  dari  total  enzim  yang diperjualbelikan di seluruh dunia.
Protease merupakan salah satu enzim yang mampu memecah  protein  secara  spesifik  dengan  mekanisme hidrolisis  (Abou-Elela  dkk.,  2011).  Penelitian  yang mengarah  pada  produksi  protease  telah  banyak dilakukan, terutama yang dihasilkan oleh mikroba, baik dari  golongan  jamur, yeast maupun  bakteri.  Bakteri termofilik  juga  merupakan  salah  satu  jenis  mikroba yang  telah  dilaporkan  memproduksi  protease  (Imachi dkk.,  2000;  Chen  &  Chen,  2004).  Oshima  telah mengisolasi mikroba termofilik Thermus thermophillus pada  tahun  1974  yang  hidup  pada suhu  di  atas 80°C. Temuan  ini  membuka peluang  untuk  mendapatkan protease  termostabil  yaitu  protease  yang  stabil  pada suhu  tinggi  (Maehara  dkk . ,  2008;  Ohtani  dkk . ,  2010). Jika  dibandingkan  protease  bakteri  mesofil  maupun penggunaan  reagen  katalisator  kimia,  protease termostabil  yang  dihasilkan  oleh  bakteri  termofilik memiliki  beberapa keuntungan antara lain  menghasil kan  reaksi yang lebih cepat,  menurunkan  kontaminasi mikroba  lain,  dan  enzim  akan tetap stabil pada temperatur tinggi.  Temperatur  yang  tinggi  diperlukan untuk  meningkatkan  kelarutan  bahan  dan  menurunkan viskositas  sehingga  akan  memudahkan  transfer  dalam proses  produksi  (Chen  &  Chen,  2004).  Bakteri termofilik  dapat  hidup  dan  tumbuh  pada  suhu  30°C sampai  80°C,  biasanya  tumbuh  optimum  pada  suhu 50°C  sampai  65°C  (Guangrong  dkk . ,  2006).  Bakteri termofilik  mampu  hidup  di  lingkungan  yang  panas
diantaranya  adalah  gunung  berapi,  kawah  geotermal, dan sumber air panas.

## BAHAN DAN METODE Mikroorganisme
Galur mikroba yang digunakan pada penelitian ini adalah  bakteri  termofilik  LS-1  isolat  lumpur  Lapindo Sidoarjo,  yang  diambil  pada  tahun  2010.  Isolasi dilakukan  menggunakan  media  Nutrient  agar,  dengan menimbang  10  g  tanah  disuspensikan  dalam  90  mL media nutrient  broth ,  dikocok  selama  10  menit, selanjutnya  diinokulasikan  pada  media  Nutrien  agar dengan  cara pour  plate .  Setelah  diinkubasi  pada berbagai  suhu,  diperoleh  suhu  optimum  pertumbuhan adalah 60 0 C.

## Produksi protease
Media  yang  digunakan  untuk  produksi  protease dalam  penelitian  ini  mengandung  (g/L  air  suling) 1,5  K 2 HPO 4 ,  9,5  NH 4 NO 3 ,  0,25  KCl,  0,45  MgSO 4 ,
0,9 pepton, 9 Na sitrat. Nilai pH diatur 6,9 - 7,0 dengan 1,0  M  NaOH  dan  disterilkan  dengan  autoklaf  pada suhu 121ºC selama 15 menit. Pepton disterilkan secara terpisah dan setelah dingin, secara aseptik ditambahkan ke  Erlenmeyer  yang  berisi  larutan  berisi  komponen media  lain.  Sebanyak  50  mL  media  produksi  dalam labu  Erlenmeyer  250  mL  diinokulasi  dengan  1  mL inokulum  bakteri  termofilik  berumur  24  jam  dan diinkubasi  pada  suhu  50ºC  dalam rotary  shaker 150  rpm  selama  12  jam.  Pada  interval  waktu  24  jam, kekeruhan  inokulum  diukur  dan  dinyatakan  sebagai optical  density pada  470 nm dengan spektrofotometer. Sebelum  uji,  suspensi  disentrifugasi  pada  15.000  g selama 15 menit dan supernatan yang jernih digunakan untuk analisis enzim kasar.

## HASIL DAN DISKUSI
Pengaruh nutrisi inokulum pada produksi protease Media  inokulum  telah  ditambahkan  dengan trace element berikut  (mg/  L)  0,21  CaCl 2 ,  0,2  NiCl 3 .6H 2 O, 0,025 FeCl 3 .6H 2 O, 0,15 MnCl 2 .4H 2 O, 0,024
COCl 2 .6H 2 O,  0,025  ZnO,  0,085  CuCl 2 .2H 2 O,  0,003 H 3 BO 3 dan  0,001  Na 2 Mo 4 .  Efek  sumber  karbon  1% (b/v)  pada  produksi  juga    diteliti  dengan  penambahan natrium  sitrat,  gliserol,  D  (+)  galaktosa,  laktosa, sukrosa,  maltosa,  amilum,  D  (+)  glukosa,  D  (+) manose, L (+) arabinosa, kasein, D (+) xilosa dan asam sitrat.  Sumber  nitrogen  yang  berbeda  termasuk NH 4 NO 3 ,  pepton,  ekstrak  ragi,  ekstrak  daging,  kasein, (NH 4 ) 2 SO 4 , (NH 4 ) 2 HPO 4 , NH 4 Cl, KNO 3 , urea dan NH 4 sitrat juga diteliti untuk produksi protease ekstraseluler.

## Uji aktivitas protease
Aktivitas  protease  diuji  replikasi  tiga  kali  dengan mengukur  pelepasan  peptida  yang  larut.  Asam trikloroasetat  0,4%  (b/v),  azocasein  di  50  mM  dalam dapar  Hepes  (4-(2- hydroxyethyl) -1- piperazineethane sulfonic acid )  dalam NaOH (pH 7,5) pada 50ºC selama 10 menit. Reaksi 1 mL dihentikan dengan penambahan 0,5  mL  15%  asam  trikloroasetat  dan  kemudian disentrifugasi  pada  10.000  rpm  selama  10  menit.  Satu unit  (U)  aktivitas  enzim  didefinisikan  sebagai  jumlah enzim yang diperlukan untuk menghidrolisis menghasilkan  peningkatan  produk  pada  absorbansi panjang  gelombang  425  nm  selama  60  menit.  Protein diukur  dengan  metode  Lowry,  yang  dimodifikasi  oleh Petterson.
Pengaruh  pH  terhadap  aktivitas  dan  stabilitas protease
pH optimum ditentukan dengan substrat  azocasein 1%  (b/v)  yang  dilarutkan  dalam  dapar  berbeda  (fosfat sitrat, pH (5 - 6), natrium fosfat, pH 7,0, Tris-HCl, pH 8,0  dan  glisin-NaOH,  pH  (9  -  13).  Pengaruh  pH terhadap  stabilitas  enzim  ditentukan  dengan  pre- inkubasi  enzim  tanpa  substrat  pada  pH  yang  berbeda (5,5  -  9,0)  selama  24  jam  pada  suhu  kamar  dan mengukur aktivitas akhir pada suhu 60ºC.
Pengaruh  suhu  pada  aktivitas  dan  stabilitas protease
Pengaruh  suhu  pada  aktivitas  enzim  ditentukan dengan  melakukan  prosedur  uji  standar  pada  pH  7,5 dalam  rentang  suhu  dari  40  sampai  80 0 C.  Stabilitas termal  ditentukan  dengan  inkubasi  enzim  kasar  pada suhu mulai dari 30 - 100 0 C untuk 2 jam dalam bak air suhu  konstan.  Setelah  perlakuan,  aktivitas  enzim  sisa diuji.

## Pengaruh ion logam pada aktivitas protease
Pengaruh  ion  logam  yang  berbeda  pada  aktivitas protease  ditentukan  dengan  penambahan  ion  yang sesuai  pada  konsentrasi  akhir  1,0  mM  ke  dalam campuran  reaksi,  dan  diuji  dalam  kondisi  standar. Pengukuran  aktivitas  enzim  dilakukan  dengan  adanya pengaruh  KCl,  CaCl 2 ,  MgSO 4 ,  FeSO 4 ,  CoCl 2 ,  ZnCl 2 , MnSO 4 , HgCl 2 , CuSO 4 dan NaCl.

## Pengaruh kondisi inokulum pada sekresi enzim
Pola  pertumbuhan  bakteri  termofilik  isolat  LS-1 dan  produksi  protease  diamati  selama  12  jam  dalam media cair dengan 1% trisodium sitrat sebagai sumber karbon  dalam  250  mL  labu  Erlenmeyer  (Gambar.  1a). Bakteri  tumbuh  sangat  cepat  dan  pembentukan protease dimulai dari 5 jam pertumbuhan dan mencapai
maksimum  di  10  jam  (1,83  U/mg  Protein)  kemudian setelah  itu  aktivitasnya  mulai  turun.  Hal  ini menunjukkan bahwa produksi protease langsung terkait dengan  inokulum  menjadi  aktif  secara  metabolik. Seperti telah dilaporkan oleh Ghorbel,  bahwa Bacillus cereus BG1  biasanya  menghasilkan  protease  selama akhir  fase  eksponensial.  Fungsi  enzim  ini  tidak  jelas, tetapi  produksinya  berkaitan  dengan  terjadinya perubahan  menjadi protein selama sporulasi  (Ghorbel- Frikha dkk., 2005).
Pemberian suplemen pada media inokulum dengan larutan trace  element meningkat  secara  bersamaan antara  pertumbuhan  bakteri  termofilik  isolat  LS-1  dan produksi  enzim  (Gambar.  1b),  sehingga  menunjukkan persyaratan  dari  beberapa  bahwa  ion  logam  untuk produksi  protease  oleh  bakteri  ini.  Hasil  ini menguatkan temuan sebelumnya ion logam meningkatkan  aktivitas  protease  (Veerapandian  dkk . , 2016).  Ferrero  dkk . (1996)  melaporkan  penggunaan natrium  sitrat bersama dengan MgSO 4 , CaCl 2 , MnSO 4 dan  ZnSO 4 untuk  produksi  protease  dengan Bacillus licheniformis MIR  29.  Meskipun  penambahan  larutan trace element untuk media meningkatkan pertumbuhan bakteri  termofilik  isolat  LS-1  dan  aktivitas  protease, hilangnya aktivitas enzim ini pada inokulum fase diam telah  diamati.  Hasil  ini  mirip  dengan  temuan  Janssen dkk . (1994),  yang  mengamati  penurunan  aktivitas proteinase dalam kultur Thermus sp. Rt41A. Ion  Ca 2 + memiliki efek stabilisasi yang signifikan pada protease maka    khelator  dan  fosfat  dapat  menurunkan  ion  Ca 2+ dalam  kultur.  Dengan  demikian,  memodifikasi  media akan  menghilangkan  khelators,  menurunkan  kadar fosfat  anorganik  dan  meningkatkan  konsentrasi  Ca 2  + tanpa menimbulkan penurunan tingkat pertumbuhan sel bakteri.  Bakteri  termofilik  isolat  LS-1  mampu memanfaatkan berbagai sumber karbon, namun sumber karbon  terbaik  dalam  penelitian  ini  untuk  sekresi protease  adalah  amilum  dan  natrium  sitrat  (Tabel  1). Dalam  penelitian  serupa,  Johnvesly  &  Naik  (2001) menunjukkan bahwa asam sitrat, amilum  dan natrium sitrat merupakan sumber karbon terbaik untuk produksi protease  dengan Bacillus sp.  JB-99.  Menurunnya aktivitas enzim dengan adanya glukosa sebagai sumber karbon dalam penelitian tersebut, menunjukkan  bahwa pembiakan organisme ini dalam 1% glukosa (b/v) akan menyebabkan  produksi  protease  alkali  ditekan sepenuhnya. Sebaliknya  pada  penelitian  ini ditemukan bahwa  glukosa  menjadi  sumber  karbon  yang  relatif baik.
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 0 3 6 9 12 Ak tivi tas p rot eas e (U/m g P rot ein ) Op tical d en sit y (OD 478 n m ) Waktu (Jam) Aktivitas Enzim Pertumbuhan sel -0.3 0.1 0.5 0.9 1.3 1.7 2.1 2.5 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 0 3 6 9 12 A k tivit as pr ot eas e (U /m g
P rot ein ) Op tical d en sit y (OD 478 n m ) Waktu (Jam) Aktivitas Enzim Pertumbuhan Sel
Gambar 1. Pertumbuhan  dan produksi protease sebagai fungsi waktu fermentasi oleh bakteri termofilik isolat LS-1 tumbuh di 1,0% natrium sitrat (a) dan ditambah dengan trace element logam (b) dalam shaker incubator pada pH awal 7,0 dan pada 50ºC.
Tabel 1. Pertumbuhan dan aktivitas protease oleh bakteri termofilik isolat LS-1 menggunakan sumber karbon yang berbeda. Kepadatan inokulum dan aktivitas protease ekstraseluler ditentukan setelah inkubasi 10 jam pada suhu 50ºC dan pH awal 7,0
Sumber karbon Densitas kultur ( OD λ 470nm) Aktivitas protease (U/mg Protein) Natrium sitrat 0,98 1,11 Asam sitrat 0,47 0,78 Arabinosa 0,42 0,15 Fruktosa 0,52 0,22 Galaktosa 0,35 0,25 Xylosa 0,34 0,29 Laktosa 0,38 0,31 Kasein 0,42 0,33 Gliserin 0,92 0,36 Maltosa 0,23 0,45 Glukosa 0,54 0,53 Manosa 0,75 0,74 Sukrosa 0,68 0,76 Amilum 1,23 1,14

## Jenis sumber nitrogen
Di  antara  berbagai  sumber  nitrogen  organik  dan anorganik,  aktivitas  protease  maksimum  (1,1  U/mg protein)  diperoleh  ketika  amonium  nitrat  digunakan dalam    media  (Tabel  2).  Sedang  untuk  tingkat  yang baik  dari  aktivitas  enzim  diperoleh  ketika  amonium klorida,  amonium  sitrat  dan  kalium  nitrat  digunakan sebagai sumber nitrogen.
Ketika  berbagai  sumber  nitrogen  organik  diuji untuk produksi protease, ditemukan bahwa pembentukan  protease  oleh  bakteri  termofilik  isolat LS-1  justru  ditekan,  meskipun pertumbuhan  sel  dalam beberapa  penelitian  sudah  dapat  meningkatkan produksi. Hasil yang sama diperoleh oleh Zacaria dkk .
(2010)  ke Aeromonas  hydrophila dan  oleh  Slapikoff dkk . (1971)  untuk Bacillus  brevis. Di  sisi  lain, Phadatare  dkk . (1993)  melaporkan  peningkatan produksi protease oleh sumber nitrogen organik seperti tripton,  pepton  dan  ekstrak  ragi.  Sumber  nitrogen organik  telah  ditemukan  untuk  menjadi  sumber nitrogen  yang  lebih  baik  untuk  pertumbuhan  dan produksi  protease  dalam  beberapa  organisme    dan sumber  nitrogen  anorganik  (amonium  sulfat  dan kalium nitrat) memberikan hasil enzim yang lebih baik (Jani  dkk.,  2012;  Ghorbel-Frikha  dkk . ,  2005; Boominadhan dkk . , 2009)
Tabel 2. Pertumbuhan dan produksi protease dengan bakteri termofilik isolat LS-1 menggunakan sumber nitrogen yang berbeda. Kepadatan kultur dan aktivitas protease ekstraseluler ditentukan setelah inkubasi 10
jam di 50ºC dan pH awal 7,0 Sumber Nitrogen Densitas Kultur aktivitas enzim (U / mg Protein) Tanpa tambahan 0,24 0,26 Pepton (1,0%) 1,47 0,06 Kasein (1,0%) 0,64 0,12 ekstrak yeast (1,0%) 1,42 0,14 (NH 4 )2SO 4 (1,0%) 0,22 0,17 (NH 4 )2HPO 4 (1,0%) 0,42 0,19 Pepton (0,1%) 0,61 0,26 Pepton (0,3%) 1,51 0,28 Pepton (0,2%) 1,12 0,42 Pepton (0,5%) 1,48 0,21 KNO 3 (1,0%) 0,51 0,57 NH 4 sitrat (1,0%) 0,56 0,72 NH 4 Cl (1,0%) 1,00 0,77 NH 4 NO 3 (1,0%) 0,63 1,11 ekstrak daging (1,0%) 1,88 Tidak ada
(a) (b)
Optical de n sit y ( OD 478 n m ) Optical de n sit y ( OD 478 n m )
Gambar 2. pH optimum dan stabilitas  dari protease dengan bakteri termofilik isolat LS-1 tumbuh pada 50ºC selama 10 jam. Aktivitas relatif dinyatakan sebagai persentase maksimum (100% dari aktivitas enzim = 0,8 U/mg Protein)

## Pengaruh  pH  terhadap  aktivitas  dan  stabilitas protease
Berbagai  pH  antara  5,5  dan  9,0  digunakan  untuk mempelajari  pengaruh  pH  pada  aktivitas  protease (Gambar. 2). pH optimum ditemukan menjadi 8,0. Pada pH  6,5  hanya  29%  dari  aktivitas  enzim  maksimum diperoleh,  meningkat  menjadi  53%  dan  59%  pada  pH 7,0  dan  7,5,  masing-masing.  Setelah  inkubasi  larutan enzim kasar pada suhu  kamar selama 24 jam pada pH 5,5; 8,0 dan 9,0, diamati penurunan sekitar 51%, 18% dan  66%  dari  aktivitas  semula,  masing-masing. Sookkheo  dkk.  (2000)  melaporkan  tiga  protease, S,  N dan  B  dari  termofilik Bacillus  stearothermophilus TLS33,  nilai  pH  optimum  8,5;  7,5  dan  7,0  masing- masing.  Protease  aktif  pada  rentang  pH  yang  sangat luas,  dan  sekitar  60%  dari  aktivitas  proteolitik  masih terdeteksi  pada  pH  6  dan  10  dalam  5  mM  CaCl 2 . Sebaliknya,  protease  N  dan  B  dipertahankan  aktivitas yang relatif sedikit di atas pH 9,0.
Pengaruh  suhu  terhadap  aktivitas  dan  stabilitas protease
Aktivitas  protease  diuji  selama  proses  produksi enzim  pada  media  produksi  pada  suhu  30  -  90ºC  dan
pada  pH  konstan  7,5  (Gambar.  3).  Aktivitas  enzim meningkat  pada  kisaran  suhu  30  -  60ºC  dan  menurun pada suhu di atas 60 o C. Suhu optimum protease dicapai pada  60ºC  dan  hasil  ini  mirip  dengan  yang  dijelaskan oleh  Beg  dkk . (2003)  untuk  protease  dari Bacillus sp. lainnya. Termostabilitas  protease  kasar  yang  diperoleh setelah  proses  pemisahan  juga  diuji  dengan  mengukur aktivitasnya  pada  60ºC,  setelah  inkubasi  enzim  tanpa substrat pada berbagai suhu antara 30 - 90ºC selama 2 jam. Profil thermostabilitas menunjukkan bahwa enzim stabil  pada  suhu  30ºC  selama  2  jam  sementara  pada 40ºC dan 80ºC, masing-masing turun menjadi 14% dan 84%  dari  aktivitas  semula.  Berbeda  dengan  hasil penelitian  Johnvesly  &  Naik  (2001),  protease  dari Bacillus sp.  JB-99  tetap  63%  dan  25%  dibandingkan aktivitas semula setelah perlakuan  selama 1 jam pada suhu  70 o C  dan  80ºC,  namun  dengan  adanya  10  mM Ca 2+ ,  enzim  dapat  dipertahankan  masing-masing  83% dan 74% dari aktivitas awal.
0 20 40 60 80 100 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 p er se rn tas e ak tivi tas pH pH optimum Stabilitas
Gambar 3. Suhu optimum dan stabilitas dari protease dengan bakteri termofilik isolat LS-1 tumbuh pada 50ºC selama 10 jam. Aktivitas relatif dinyatakan sebagai persentase maksimum (100% dari aktivitas enzim = 0,6 U/mg protein)

## Pengaruh ion logam pada aktivitas protease
Pengaruh  ion  logam  yang  berbeda  pada  protease ditunjukkan  pada  Tabel  3.  Efek  penghambatan  kuat diamati dengan adanya ion K + , Cu 2+ dan Zn 2+ . Ion Hg 2+ menghambat  sepenuhnya  enzim  pada  konsentrasi 1  mM.  Protease  yang  disekresi  oleh Bacillus  brevis juga  dihambat  oleh  Hg 2+ ,  Zn 2+ dan  Cu 2+ (Slapikoff dkk . ,  1971).  Efek  penghambatan  ion  logam  berat didokumentasikan  dalam  literatur.  Hal  ini  diketahui bahwa  ion  merkuri,  kadmium  dan  timbal  bereaksi dengan  kelompok  protein  thiol  (mengkonversikan  ke mercaptides ) serta dengan histidin dan residu triptofan. Selain  itu,  dengan  aksi  perak  dan  merkuri,  ikatan disulfida  yang  bersifat  hidrolitik  terdegradasi (Adinarayana  dkk.,  2003).  Aktivitas  protease distimulasi oleh Mn 2+ dan Ca 2+ . Hasil ini menunjukkan bahwa  ion  logam  ini  tampaknya  melindungi  enzim terhadap  denaturasi  panas  dan  memainkan  peran penting  dalam  menjaga  konformasi  aktif  enzim  pada suhu yang lebih tinggi (Beg & Gupta, 2003). Efek yang sama  dari  Mn 2+ pada  aktivitas  protease  juga  diamati oleh  Rahman  dkk . (1994).  Aktivitas  ini  dinyatakan sebagai  persentase  dari  tingkat  aktivitas  tanpa  adanya ion  logam.  Enzim  dipreinkubasi  dengan  ion  logam (60ºC,  5  min.)  kosong  terpisah  dengan  ion  logam individu disiapkan.
Tabel 3. Pengaruh berbagai ion logam pada aktivitas protease Ion logam Aktivitas protease sisa (%) Kontrol 100 CaCl 2 133 KCl 4 ZnCl 2 18 HgCl 2 0 CoCl 2 88 NaCl 23 FeSO 4 54 MgSO 4 61 MnSO 4 129 CuSO 4 12

## KESIMPULAN
Produksi  protease  optimum  oleh  bakteri termofilik  isolat  LS-1  dicapai  pada  waktu  10  jam. Amilum  adalah  substrat  terbaik  untuk  produksi protease.  Suhu  dan  temperatur  optimum  aktivitas protease masing-masing pada suhu  60ºC  dan pH 8,0. Aktivitas  protease  dipengaruhi  oleh  ion  logam  Mn 2+ dan Ca 2+ . 0 20 40 60 80 100 30 43 50 60 73 80 90 100 p er se rn tas e ak tivi tas Suhu 0 C Suhu optimum
Stabilitas

## DAFTAR PUSTAKA
Abou-Elela,  G.  M., Ibrahim,  H. A.  H.,  Hassan,  S. W., Abd-Elnaby, H. & El-Toukhy, N. M. K. (2011). Alkaline  Protease  Production  by  Alkaliphilic Marine  Bacteria  Isolated  from  Marsa-Matrouh (Egypt)  with  Special  Emphasis  on Bacillus cereus Purified  Protease. African  Journal  of Biotechnology; 10; 4631–4642.
Adinarayana,  K.,  Poluri,  E.  &  Davuluri,  S.  (2003).
Purification  and  Partial  Characterization  of ThermostablecSerine  Alkaline  Protease  from  a Newly Isolated Bacillus  subtilis PE-11. Journal of The American Association of Pharmaceutical Scientists; 4; 1–9.
Beg,  Q.  &  Gupta,  R.  (2003).  Purification  and Characterization  of  an  Oxidation-Stable,  Thiol- Dependant  Serine  Alkaline  Protease  from Bacillus  mojavensis . Enzyme  and  Microbial Technology; 32; 294–304.
Boominadhan,  Udandi,  Rajendran,  R.,  Palanivel,  K., Vinayaga,  S.  &  Manoharan,  M.  (2009). Optimization  of  Protease  Enzyme  Production Using Bacillus sp.  Isolated  from  Different Wastes. International  Journal  of  Botany  and Research ; 2; 83–87.
Chen,  K.  &  Chen,  Z.  (2004).  Heat  Shock  Proteinscof Thermophilic  and  Thermotolerant  Fungi  from Taiwan. Botanical  Bulletin-  Academia  Sinica Taipei; 45; 247–257.
Ferrero, M. A., Castro, C. M., Abate, M. D., Baigori & Siñeriz,  F.  (1996).  Thermostable  Alkaline Proteases  of Bacillus  licheniformis MIR  29: Isolation,  Production  and  Characterization. Applied  Microbiology  and  Biotechnology;  45; 327–332.
Ghorbel-Frikha,  B.,  Sellami-Kamoun,  A.,  Fakhfakh, N.,  Haddar, A.,  Manni,  L.  &  Nasri,  M.  (2005). Production  and  Purification  of  a  Calcium- Dependent  Protease  from Bacillus  cereus BG1. Journal  of  Industrial  Microbiology  and Biotechnology; 32; 186–194.
Guangrong, H., Tiejing, Y., Po, H. & Jiaxing, J. (2006). Purification  and  Characterization  of  a  Protease from  Thermophilic  Bacillus  Strain  HS08. African  Journal  of  Biotechnology;  5; 2433– 2438.
Imachi, H., Sekiguchi, Y., Kamagata, Y., Ohashi, A. &
Harada,  H.  (2000).  Cultivation  and  In  Situ Detection of a Thermophilic Bacterium Capable of  Oxidizing  Propionate  in  Syntrophic Association  with  Hydrogenotrophic  Methano
gens  in  a Thermophilic  Methanogenic  Granular Sludge. Applied  and  Environmental  Microbio logy; 66; 3608–3615.
Jani,  S.  A.,  Chaitanya,  Chudasama,  J.,  Deval,  B.  P., Parul,  S.  B.  &  Harshad,  N.  P.  (2012).
Optimization of Extracellular Protease
Production  from  Alkali  Thermo  Tolerant Actinomycetes : Saccharomonospora  viridis SJ- 21. Bulletin of Environment, Pharmacology and Life Sciences Online; 1; 84–92.
Janssen,  P.  H.,  Peek,  K.  &  Morgan,  H.  W.  (1994).
Effect  of  Culture  Conditions  on  the  Production of  an  Extracellular  Proteinase  by Thermus Sp. Rt41A. Applied Microbiology and Biotechnology; 41; 400–406.
Johnvesly,  B.  &  Naik  G.  R.  (2001).  Studies  on Production  of  Thermostable  Alkaline  Protease from Thermophilic and Alkaliphilic Bacillus sp. JB-99  in  a  Chemically  Defined  Medium. Process Biochemistry; 37; 139–144. Maehara,  Tomoko,  Takayuki,  H.  &  Akira,  N.  (2008). Characterization  of  Three  Putative  Lon Proteases  of  Thermus  Thermophilus  HB27  and Use  of  Their  Defective  Mutants  as  Hosts  for
Production of Heterologous Proteins.
Extremophiles; 12; 285–296.
Naidu, K. S. B. & Devi, K. L. (2005). Optimization of Thermostable  Alkaline  Protease  Production from  Species  of  Bacillus  Using  Rice  Bran. African Journal of Biotechnology; 4;; 724–726.
Ohtani,  Naoto,  Masaru, T.  &  Mitsuhiro,  I.  (2010). An Extreme Thermophile, Thermus thermophilus , Is a Polyploid Bacterium. Journal of Bacteriology; 192; 5499–5505.
Phadatare, Sangita, U., Vasanti, V. D. & Mandyam, C. S. (1993). High Activity Alkaline Protease from Conidiobolus coronatus (NCL 86.8.20): Enzyme Production  and  Compatibility  with  Commercial Detergents. Enzyme  and  Microbial  Technology; 15; 72–76.
Rahman,  Raja,  N.  Z.,  Che,  N.  R.,  Kamaruzaman,  A., Mahiran,  B.,  Wan,  M.  Z.  Y.  &  Abu,  B.  S. (1994).  Applied  Microbiology  Biotechnology Purification  and  Characterization  of  a  Heat- Stable  Alkaline  Protease  from Bacillus stearothermophilus F1. Applied  Microbiology and Biotechnology; 40; 822–827. Shumi,  W.,  Towhid,  H.  &  Anwar,  M.  N.  (2004). Proteolytic  Activity  of  a  Bacterial  Isolate Bacillus  fastidiosus Den  Dooren  de  Jong.
Journal of Biological Science; 4; 370–374.
Slapikoff,  S.,  Spitzer,  J.  L.  &  Vaccaro,  D.  (1971).
Sporulation  in Bacillus  brevis :  Studies  and Protein Turnover
Protease. Journal of Bacteriology; 106; 739–44.
Sookkheo,  B.,  Supachok,  S.,  Suree,  P.  &  Shui,  T.  C.
(2000).  Purification  and  Characterization  of  the Highly  Thermostable  Proteases  from Bacillus stearothermophilus TLS33. Protein  Expression and Purification; 20; 142–151.
Veerapandian, B., Ponnusami, V. &  Sugumaran, K. R. (2016). Enhanced Thermo-Stability of  Bacterial Alkaline  Protease  by  Calcium  Ions. Der Pharmacia Lettre; 8; 192–96.
Zacaria,  J.,  Delamare,  A.  P.  L.,  Costa,  S.  O.  P.  & Echeverrigaray,  S.  (2010).  Diversity  of Extracellular  Proteases  among  Aeromonas Determined  by  Zymogram Analysis. Journal  of Applied Microbiology ; 109; 212–219.