Hasil Penelitian
AKTIVITAS ANTIBAKTERI PROTEIN KAPANG Xylaria psidii KT30

## TERHADAP

## Escherichia coli DAN Bacillus subtilis
[Antibacterial Activity of Protein Fungus Xylaria psidii KT30 on Escherichia coli and Bacillus subtilis]
Aris Munandar 1,2) , A. Zaenal Mustopa 3) , Kustiariyah Tarman 2) * dan Tati Nurhayati 2)
1) Jurusan Perikanan, Fakultas Pertanian, Universitas Sultan Ageng Tirtayasa, Cilegon
2) Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Bogor 3) Laboratorium Protein Rekombinan, Vaksin, dan Sistem Pengantaran Terarah, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bioteknologi, Bogor
Diterima 01 Agustus 2013 / Disetujui 15 September 2014

## ABSTRACT
A  previous  research  shows  that  extracellular  protein  of  an  algicolous  fungus  Xylaria  psidii  KT30  inhibited  Bacillus  pumilus,  Listeria  sp., Salmonella  typhi,  Staphylacoccus  aureus,  and  Pseudomonas  sp.  with  an  average  clear  zone  diameter  of  7  mm.  To  enhance  the  potential antibacterial  activity  of  the  extra  cellular  protein  of  Xylaria  psidii  KT30,  this  present  research  demonstrated  fungal  growth  optimization  and purification  of  its  secreted  extra  cellular  protein.  The  fungal  growth  optimization  was  performed  by  addition  of  various  NaCl  concentration  and cultivation time. The protein was precipitated using saturated ammonium sulphate (60-90%), purified through gel chromatography filtration using Sephadex G-50, and eluted with 30% methanol. The active fraction possessing antibacterial activity was then determined resulting supernatant, pellet, and protein fraction. The optimum fungal growth obtained after 15 days of cultivation using fresh water.The highest protein yield was 1.67%, resulted over 90% saturation. Fractions 11 and 12 were the most active against Escherichia coli dan Bacillus subtilis with clear zone diameters of 8 mm. Three bands of those fractions were detected through SDS-PAGE analysis, revealing proteins with molecular weights of 23.42, 20.09, and 14.33 kDa.
Keywords: antibacterial, marine fungi, protein purification, Xylaria psidii

## ABSTRAK
Protein  ekstra  seluler  kapang Xylaria  psidii KT30  telah  diketahui  memiliki  aktivitas  antibakteri  dengan  rataan  zona  hambatan  yang  masih rendah yaitu sebesar 7 mm terhadap Bacillus pumilus, Salmonella typhii , Staphylacoccus aureus , Pseudomonas sp., dan Listeria sp. Oleh karena itu, untuk meningkatkan potensi aktivitas antibakteri dari protein ekstra selular ini maka perlu dilakukan optimasi pertumbuhan kapang Xylaria psidii KT30 dan purifikasi protein yang dihasilkannya. Optimasi pertumbuhan dilakukan dengan kombinasi perlakuan variasi penambahan NaCl dengan berbagai  konsentrasi  dan  waktu  panen.  Pengendapan  protein  dilakukan  menggunakan  amonium  sulfat  dengan  saturasi  60-90%,  dan  purifikasi dilakukan dengan kromatografi filtrasi gel pada Sephadex G-50 sebagai fase diam dan fase geraknya adalah metanol 30%. Supernatan,  pelet, fraksi  protein  kapang Xylaria  psidii KT30  diujikan  kemampuan  antibakterinya.  Pertumbuhan  kapang Xylaria  psidii KT30  paling  optimum  pada perlakuan tanpa NaCl dengan waktu panen hari ke-15. Bobot pelet protein paling tinggi terdapat pada saturasi amonium sulfat 90%, yaitu sebesar 1.67 g/100 mL. Fraksi 11 dan 12 merupakan fraksi aktif yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dan Bacillus subtilis sebesar 8 mm. Fraksi 11-12 memiliki tiga pita pada analisis SDS-PAGE dengan perkiraan bobot molekul 23.42, 20.09, dan 14.33 kDa.
Kata kunci: antibakteri, kapang laut, pemurnian protein, Xylaria psidii

## PENDAHULUAN
1
Kapang  dapat  ditemukan  pada  aneka  substrat,  baik lingkungan  darat,  perairan,  maupun  udara.  Salah  satu lingkungan yang sering ditemukan adanya kapang adalah laut. Kapang  laut  dapat  bersifat  obligat  yaitu  kapang  yang  tumbuh dan  bersporulasi  hanya  di  lingkungan  laut  dan  estuari,  dan fakultatif yaitu kapang dari lingkungan air tawar atau darat yang mampu  tumbuh  dan  bersporulasi  di  laut.  Kapang  laut  yang bersimbion  dengan  biota  laut  seperti  spons,  ascidia,  rumput laut,  dan  pohon  mangrove  disebut  sebagai  kapang  endofit.
*Penulis Korespondensi; Email: kustya@gmail.com
Kapang endofit dari lingkungan laut yang berhasil diisolasi dari rumput laut merah Kappaphycus alvarezii , salah satunya adalah Xylaria psidii KT30 (Tarman, 2011).
Kapang X. psidii KT30 merupakan kapangyang diisolasi dari rumput laut K.alvarezii BRKA-1 dari Desa Labuange, Kabupaten Barru, Sulawesi  Selatan.  Kapang X. psidii KT30 menghasilkan pigmen berwarna merah pada media malt ekstrak dan hagem, intensitas  warna  pada  media  malt  ekstrak  lebih  tinggi dibandingkan pada media  Hagem (Tarman, 2011). Ekstrak etil asetat  dari  kapang X.  psidii KT30  dapat  menghambat  per- tumbuhan  bakteri Escherichia  coli,  Bacillus  subtilis, Pseudomonas  aeruginosa, dan  bakteri  patogen  pada  ikan seperti Vibrio  anguillarum,  Aeromonas  salmonicida ,  dan Yersinia ruckeri (Tarman et al. 2011).
Hasil Penelitian
Menurut  Tarman et  al. (2012),  protein  ekstraseluler  dari kapang X.  psidii KT30  juga  memiliki  aktivitas  antibakteri terhadap Bacillus  pumilus,  Salmonella  typhii , Staphylacoccus aureus , Pseudomonas sp.,  dan Listeria sp.  Hasil  tersebut menunjukkan adanya potensi protein dari Kapang X. psidii KT30 sebagai  antibakteri,  namun  aktivitasnya  masih  rendah  yaitu zona hambatan sebesar 7 mm. Oleh karena itu, perlu dilakukan peningkatan  aktivitas  mulai  dari  tahap  awal  yaitu  optimasi pertumbuhan  dan  purifikasi  protein.  Optimasi  pertumbuhan dilakukan  untuk  mengetahui  kondisi  optimum  pertumbuhan kapang X.  psidii KT30.  Kondisi  tersebut  ditunjukkan  oleh biomassa  dan  aktivitas  antibakteri  kapang X.  psidii KT30. Purifikasi  dilakukan  untuk  meningkatkan  kemurnian  protein yang  bertindak  komponen  aktif  sehingga  dapat  meningkatkan aktivitas antibakterinya.
Purifikasi  protein  merupakan  tahap  yang  harus  dilakukan untuk  mempelajari  sifat  dan  fungsi  protein  yang  berhubungan dengan sisi aktifnya yang memiliki aktivitas antibakteri. Protein dapat  dipisahkan  dari  molekul  lainnya  berdasarkan  ukuran, kelarutan,  muatan  dan  afinitas  ikatannya  (Winarno,  2008). Protein  memiliki  beberapa  keunggulan  diantaranya  dapat diterima  baik  oleh  tubuh,  efek  sampingnya  relatif  sedikit,  dan dapat  dikloning  gennya  sehingga  dapat  diproduksi  secara besar-besaran (Anand et al . 2012; Arifudin, 2001). Tahap awal pemurnian  protein  kapang X.  psidii KT30  dilakukan  melalui pengendapan  dengan  amonium  sulfat.  Proses  pemurnian selanjutnya dilakukan melalui kromatografi filtrasi gel sehingga diperoleh fraksi protein dengan aktivitas yang lebih tinggi.
Protein memiliki aktivitas biologis sehingga dapat dijadikan sumber  bahan  obat  alami.  Kapang Penicillium sp.  dilaporkan bersifat bakteriostatik terhadap E. coli , Bacillus sp., S. aureus , dan Pseudomonas  aeruginosa (Selim et  al. 2012).  Tujuan penelitian  ini  adalah  menentukan  pertumbuhan  optimum  dan aktivitas  antibakteri  kapang X.  psidii KT30  terhadap  bakteri E. coli dan B.  subtilis ,  rendemen  protein  dan  fraksi  paling  aktif, serta menentukan bobot molekul proteinnya.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  isolat kapang X. psidii KT30 (Labotarorium Mikrobilogi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor), E. coli NBRC 14237 , B. subtilis BTCC 2530.
Optimasi pertumbuhan kapang X. psidii KT30 Kapang X.  psidii KT30  dikultur  pada  50  mL  media Potato Dextrose  Broth (PDB)  pH  7.4  dan  diinkubasi  pada  pengocok orbital dengan kecepatan 120 rpm dan suhu ruang (Ilyas et al. 2009).  Optimasi  pertumbuhan  dilakukan  dengan  kombinasi perlakuan konsentrasi NaCl dan waktu panen. Konsentrasi NaCl yang  digunakan  pada  media  kultur  adalah  0,  1,  dan  3%, sedangkan panen dilakukan setiap 3 hari selama 21 hari (hari ke-3,  6,  9,  12,  15,  18,  dan  21).  Biomassa  dan  supernatan kapang X. psidii KT30 dipisahkan menggunakan kertas saring. Sebanyak  1  mL  supernatan  diambil  dari  dalam  tabung  dan diujikan  aktivitas  antibakterinya  dengan  metode  difusi  agar
(Aboaba et  al. 2011).  Bobot  biomassa  ditimbang  setelah pengeringan dengan oven (Frolaibo SAS, Lyon, Prancis) pada suhu  60°C  selama  24  jam  (Handajani  dan  Purwoko,  2008). Bobot biomassa dihitung berdasarkan persamaan berikut:
Bobot  biomassa  =  (bobot  biomassa+bobot  kertas  saring)  – bobot kertas saring
Pengendapan protein kapang X. psidii KT30 Pengendapan  dilakukan  berdasarkan  metode  Onsori et  al. (2005)  dengan  saturasi  60,  70,  80,  dan  90%  pada  setiap  100 mL  supernatan  kapang X.  psidii KT30.  Amonium  sulfat  di- tambahkan secara perlahan ke dalam supernatan pada kondisi diaduk dengan stirer bar hingga larut sempurna dan supernatan diendapkan  selama  semalam  pada  suhu  4°C.  Supernatan disentrifugasi  (Hermle  Z326K,  Gosheim,  Jerman)  pada  10.000 rpm  selama  30  menit  pada  suhu  4°C.  Pelet  yang  diperoleh dilarutkan  dengan  bufer  Tris-HCl  10  mM  pH  7.4  dengan perbandingan  1:1.  Pelet  protein  dan  supernatan  kapang X. psidii KT30  diujikan  aktivitas  antibakterinya  menurut  metode Aboaba et al. (2011).
Uji aktivitas antibakteri (Aboaba et al. 2011) Bakteri  yang  digunakan  dalam  uji  aktivitas  antibakteri adalah B.  subtilis dan E.  coli .  Bakteri  yang  ditumbuhkan  pada media Nutrient Broth (NB) (Difco) ( beef extract 0.3 g, pepton 1 g,  NaCl  0.5  gdalam  100  mL  akuades)  diencerkan  dengan menggunakan  standar  McFarland  2  (Laboratorium  Protein Rekombinan,  Vaksin,  dan  Sistem  Pengantaran  Terarah, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bioteknologi) (6 x 10 8 CFU/mL) dan diukur pada spektrofotometer (GE Healthcare, Genequant,  New  Jersey,  Amerika  Serikat)  (600  nm).  Bakteri yang sudah disesuaikan dengan standar McFarland ditambah- kan sebanyak 3 mL ke dalam 17 mL Nutrient Agar (NA) ( beef extract 0.3  g,  pepton  1  g,  NaCl  0.5  g,  bakto  agar  (Difco)  2  g dalam  100  mL  akuades),  dan  didiamkan  hingga  padat.  Kertas cakram  (diameter  6  mm)  yang  sudah  ditambahkan  20  μL sampel  protein  dimasukkan  dalam  media  NA.  Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama ±24 jam, kemudian diameter zona hambat (mm) yang dihasilkan diukur pada setiap cakram kertas. Kloramfenikol digunakan sebagai kontrol positif.
Kromatografi  filtrasi  gel  protein  kapang X.  psidii KT30 (Wachirathiancai et al. 2004) Kolom  yang  digunakan  dalam  kromatografi  filtrasi  gel adalah  Sephadex  G-50  (Ge  Healthcare,  New  Jersey,  Amerika serikat)  sebagai  fase  diam  dan  fase  geraknya  adalah  metanol (Merck)  30%.  Kolom  yang  digunakan  dicuci  terlebih  dahulu menggunakan akuades steril. Fraksi yang dihasilkan ditampung dalam tube masing-masing  sebanyak  1  mL  dan  bufer  yang digunakan  adalah  Tris-HCl  pH  7.4.  Fraksi  sampel  diuji antibakteri  berdasarkan  metode  Aboaba et  al. (2011)  untuk menentukan fraksi aktifnya.
Sodium  Dodecyl  Sulfate-Polyacrylamide  Gel  Electro- Phoresis (SDS-PAGE)
Sampel  dimasukkan  dengan  volume  10  μL,  lalu  diatur kondisi running sesuai  dengan  tipe  gel,  SDS-PAGE  dimulai
Hasil Penelitian
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 3 6 9 12 15 18 21 Bo bo t B io m as sa (g /5 0 m L) Waktu Panen (Hari)
NaCl 3% NaCl 1%
NaCl 0%
pada 30 V dan dipertahankan tegangan hingga sampel setelah melewati stacking gel.  Setelah  selesai running gel,  gel dikeluarkan  dengan  hati-hati  untuk  dilakukan  pewarnaan  gel. Pewarnaan gel dilakukan dengan metode silver staining meng- gunakan kit.
Konsentrasi  gel  pemisah  ( separating )  yang  digunakan adalah  16%.  Sampel  yang  digunakan  untuk  analisis  bobot molekul  adalah  pelet  protein  dan  fraksi  aktif  hasil  pemurnian. Marka  (penanda)  yang  digunakan  adalah  standar  protein berwarna  ganda  ( Bio-rad, California,  Amerika  Serikat)  dengan rentang  10-250  kDa.  Sampel  dimasukkan  dengan  volume  10 μL,  lalu  alat  dijalankan  sesuai  dengan  tipe  gel,  SDS-PAGE (ATTO,  Tokyo,  Jepang)  dimulai  pada  30  V  dan  tegangan dipertahankan  hingga  sampel  sampai  pada  ujung  gel.  Setelah selesai  dijalankan,  gel  dikeluarkan  dengan  hati-hati  untuk dilakukan  pewarnaan  gel  pada  tahap  selanjutnya.  Pewarnaan gel  dilakukan  dengan  metode  pewarnaan  perak  nitrat  meng- gunakan kit (Thermo, Wisconsin, Amerika Serikat) (Todorov et al . 2007).

## Analisis data
Rancangan  yang  digunakan  untuk  optimasi  pertumbuhan adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial dengan 3 kali  ulangan.  Perlakuan  terdiri  atas  2  faktor  percobaan  yaitu konsentrasi  NaCl  dengan  taraf  0,  1,  dan  3  dan  waktu  panen dengan taraf 3, 6, 9, 12, 15, 18, dan 21 hari. Rancangan untuk optimasi  pengendapan  adalah  RAL  sederhana  dengan  3  kali ulangan (Mattjik dan Sumertawijaya, 2002).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kurva  pertumbuhan  dan  aktivitas  antibakteri  kapang X. psidii KT30 Kapang X.  psidii KT30  merupakan  kapang  yang  berhasil diisolasi  dari  rumput  laut Kappaphycus  alvarezii. Kapang tersebut pertama kali berhasil disolasi dari buah jambu ( Psidium guajava ).  Protein  kapang X.  psidii KT30  memiliki  aktivitas antibakteri  terhadap  bakteri Bacillus  pumilus , Listeria sp., Salmonella  typhi , Staphylacoccus  aureus ,  dan Pseudomonas sp.  dengan  zona  hambat  7  mm.  Oleh  karena  itu,  aktivitasnya harus  ditingkatkan  mulai  dari  optimasi  pertumbuhan  hingga pemurniannya.
Optimasi  pertumbuhan  kapang X.  psidii KT30  dilakukan dengan  tingkat  salinitas  yang  berbeda,  dimana  media  di- tambahkan  NaCl.  Hal  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  kondisi pertumbuhan  kapang X.  psidii KT30  yang  diisolasi  dari Kappaphycus alvarezii. Konsentrasi NaCll (salinitas) ditentukan berdasarkan  salinitas  rata-rata  perairan  Indonesia  yaitu  3%. Gambar 1 menunjukkan bahwa kapang X. psidii KT30 pada tiap perlakuan  mengalami  fase  eksponensial  sampai  hari  ke-6. Perlakuan NaCl 0% memiliki bobot biomassa paling tinggi yaitu 0.96  g/50  mL.  Bobot  biomassa  pada  waktu  panen  selanjutnya relatif sama karena sudah mengalami fase stasioner.
Hasil  uji  statistik  menunjukkan  bahwa  interaksi  antara konsentrasi NaCl dan waktu panen berpengaruh nyata ( p <0.05) terhadap bobot biomassa kapang X. psidii KT30. Hal ini diduga karena X. psidii merupakan kapang terestrial yang pertama kali
diisolasi  dari  buah  jambu  ( Psidium  guajava )  (Rodgers et  al. 1992). Oleh karena itu, kapang X. psidii KT30 pada perlakuan tanpa NaCl dapat tumbuh lebih baik. Menurut Chasanah et al. (2012),  beberapa  kapang  terestrial  dapat  beradaptasi  dengan lingkungan  laut  dan  optimal  pada  konsentrasi  4%  NaCl. Biomassa  kapang X.  psidii KT30  pada  salinitas  yang  berbeda dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1.  Biomassa  kapang X.  psidii KT30  pada  berbagai  tingkat salinitas (Pertumbuhan dilakukan pada suhu 25°C dan pH 7.4).  (Konsentrasi  supernatan  114.31  µg/ disc ,  kloram- fenikol 30 µg/kertas cakram)
Kondisi  lingkungan  secara  signifikan  mempengaruhi karakteristik  kultur  kapang  yang  meliputi  bobot  biomassa, diameter  koloni,  jumlah  spora,  dan  warna  (Zain et  al .  2009). Habitat  laut  memiliki  peran  yang  kuat  dalam  adaptasi  kapang terhadap  konsentrasi  garam.  Kapang  laut  ada  yang  bersifat fakultatif, dapat tumbuh pada garam dengan konsentrasi rendah dan  karena  pengaruh  lingkungan,  ada  yang  terbawa  ke  laut sehingga bersifat halotoleran setelah beradaptasi (Jingjing et al. 2011).
Metabolit  sekunder  yang  dihasilkan  oleh  organisme  di- pengaruhi oleh faktor lingkungan. Metabolit sekunder yang telah diisolasi  dan  dikarakterisasi  dari  kapang  genus Xylaria adalah sitokalasin,  fitotoksin,  siloketal,  amanitin,  lakton,  xanthones, sesquiterpene,  dan  turunan  aromatik  (Song et  al. 2012). Metabolit sekunder tersebut terdapat pada supernatan kapang, maka  supernatan  kapang X.  psidii KT30  yang  dihasilkan  diuji aktivitas  antibakterinya.  Konsentrasi  supernatan  yang  diguna- kan  untuk  uji  antibakteri  adalah  114.31  μg/kertas  cakram. Kontrol  positif  yang  digunakan  adalah  kloramfenikol  dengan konsentrasi 30 μg/kertas cakram.
Aktivitas  antibakteri  dari  kapang X.  psidii KT30  tertinggi terdapat pada perlakuan tanpa NaCl (0%) dan waktu panen 15 hari  dengan  diameter  zona  hambat  yang  dihasilkan  sebesar 8.33  mm  ( E.  coli )  dan  7.33  mm  ( B.  subtilis ).  Pada  perlakuan NaCl 3%, aktivitas antibakteri paling tinggi terdapat pada waktu panen 9 hari dengan diameter zona hambat sebesar 7.67  mm pada E. coli dan 8.00 mm pada B. subtilis . Aktivitas antibakteri pada  perlakuan  NaCl  1%  dan  waktu  panen  9  hari  memiliki diameter zona hambat tertinggi sebesar 7 mm pada E. coli dan tidak ada aktivitas pada B. subtilis . Hasil tersebut sesuai dengan aktivitas  antibakteri  dari  ekstrak  etil  asetat  kapang X.  psidii
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
0 5 10 15 20 25 Zo na H am ba t ( m m ) B. subtilis (Jam ke-4) B. subtilis (Jam ke-20) E. coli (Jam ke-4) E. coli (Jam ke-20) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Zo na H am ba t (m m ) Fraksi B. subtilis E. coli
KT30 yang dilaporkan Tarman et al. (2011). Aktivitas antibakteri tertinggi  dari  ekstrak  etil  asetat  terhadap E . coli terdapat  pada kultur air tawar (NaCl 0%). Aktivitas ekstrak etil asetat tertinggi dari kapang X. psidii KT30 terhadap bakteri B . subtilis terdapat pada kultur air laut (NaCl 3%).
Senyawa  metabolit  sekunder  yang  dihasilkan  kapang, biasanya dipanen setelah memasuki fase stasioner (Samuel et al. 2011). Pada saat fase tersebut, metabolit sekunder dihasil- kan  sebagai  pertahanan  diri.  Kapang X.  psidii KT30  yang dikultur dengan NaCl 0% memiliki aktivitas antibakteri tertinggi pada  waktu  panen  hari  ke-15,  dimana  pertumbuhannnya  telah mengalami  fase  stasioner.  Sedangkan  menurut  Miao et  al. (2006), tingkat salinitas kapang berada pada batas toleransi dari inangnya, konsentrasi NaCl diluar toleransi dapat meningkatkan efek stres pada kapang tersebut. Efek stres tersebut biasanya diikuti dengan produksi metabolit sekunder sebagai pertahanan diri.  Oleh  karena  itu,  kapang X.  psidii KT30  dengan  perlakuan NaCl 3% memiliki aktivitas tertinggi pada waktu panen hari ke-9.
Hasil pengendapan protein kapang X. psidii KT30 Rendemen  pelet  protein  tertinggi  dihasilkan  pada  saturasi amonium sulfat 90% yaitu sebesar 1.67 g (1.67%). Rendemen pelet protein kapang X. psidii KT30 pada saturasi yang berbeda dapat  dilihat  pada  Tabel  1.  Hasil  uji  statistik  menunjukkan bahwa  perbedaan  saturasi  amonium  sulfat  tidak  berpengaruh nyata  ( p >0.05)  terhadap  rendemen  pelet  protein  kapang X. psidii KT30. Menurut Tarman et al. (2012), protein ekstra-seluler kapang X.  psidii KT30  yang  diperoleh  jumlahnya  sedikit  tapi protein  paling  stabil  setelah  diendapkan  dengan  amonium sulfat. Menurut Wang (2006), kelarutan protein tergantung pada konsentrasi  amonium  sulfat  dalam  larutan.  Konsentrasi amonium sulfat tidak boleh menurun dalam larutan agar protein dapat  mengendap,  maka  harus  dilakukan  pengadukan  selama proses pengendapan berlangsung.
Tabel 1.  Rendemen  pelet  protein  kapang X.  psidii KT30  pada saturasi berbeda
Saturasi Ammonium Sulfat Bobot Pelet Protein (g) Rendemen Pelet 60% 1.63±0.02 a 1.63% 70% 1.55±0.08 a 1.55% 80% 1.59±0.13 a 1.59% 90% 1.67±0.07 a 1.67%
Keterangan:  Volume  supernatan  untuk  pengendapan  adalah  100  mL  nilai  a menunjukkan tidak berbeda nyata ( p >0.05)
Pelet  protein  dan  supernatan  kapang X.  psidii KT30  diuji antibakteri.  Konsentrasi  pelet  protein  adalah  180.25  µg/kertas cakram, dan kontrol positif yang digunakan adalah kloramfenikol dengan konsentrasi 30 µg/kertas cakram. Gambar 2 menunjuk- kan aktivitas antibakteri pelet protein dan supernatan kapang X. psidii KT30  pada  saturasi  yang  berbeda.  Pelet  protein  hasil pengendapan amonium sulfat 90% memiliki aktivitas antibakteri tertinggi dengan diameter zona hambat 8 mm terhadap bakteri B.  subtilis dan E.  coli .  Diameter  zona  hambat  yang  dihasilkan dapat  bertahan  hingga  jam  ke-20,  hal  tersebut  menunjukkan bahwa pelet 90% bersifat bakteriosidal.
Malik et  al. (2008)  menyatakan  protein  bioaktif  yang memiliki  aktivitas  antibakteri  biasanya  diisolasi  pada  fase eksponensial akhir atau stasioner. Protein bioaktif yang dilepas-
kan  ke  lingkungan  secara  perlahan  dan  terus  menerus  dapat mencegah  kolonisasi  ruang  yang  berdekatan  dengan  pesaing. Mikroorganisme laut yang menghasilkan protein antibiotik dapat berkontribusi  untuk  proses  inaktivasi  alami  mikroorganisme pada lingkungan laut. Hal tersebut telah dilaporkan oleh Barja et al. (1989)  bahwa Alteromonas spp.  yang  diisolasi  dari  air  laut dapat menghambat mikroorganisme laut seperti staphylacoccus epidermis , Micrococcus luteus , E. coli , Salmonella typhimurium , Vibrio  harveyi , Enterobacter  aerugenes dengan  kisaran  zona hambat 10-20 mm.
Gambar 2.  Aktivitas antibakteri pelet protein dan supernatan kapang X. psidii KT30 pada berbagai tingkat saturasi (Konsentrasi pelet  180.25  µg/kertas  cakram,  kloramfenikol  30  µg/ kertas cakram)
Fraksi aktif protein X. psidii KT30 Fraksi  yang  dihasilkan  pada  kromatografi  filtrasi  gel  diuji aktivitas  antibakterinya.  Aktivitas  antibakteri  fraksi  protein kapang X. psidii KT30 dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3.  Aktivitas  antibakteri  fraksi  protein  kapang X.  psidii KT30 terhadap bakteri, B. subtilis dan) E. coli (Konsentrasi fraksi protein 12.08 µg/kertas cakram)
Fraksi  1-7  dan  17-25  tidak  memiliki  aktivitas  antibakteri terhadap bakteri E.coli dan B. subtilis . Aktivitas antibakteri dari fraksi  protein  kapang  KT30  terhadap  bakteri B.  subtilis
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Pelet 0%                   M                       Fraksi 11-12 10 15 25 250 20 37 50 14.33 kDa 23.42 kDa 20.09 kDa
dihasilkan pada fraksi 8-16. Hasil tersebut menunjukkan adanya puncak  utama  pada  fraksi  11  dan  12  yang  menghasilkan diameter zona hambat sebesar 8 mm. Aktivitas antibakteri dari fraksi protein kapang KT30 terhadap E. coli terdapat pada fraksi 8, 10-13, dan 16. Gambar 3 menunjukkan adanya dua puncak utama  pada  fraksi  11-12  yang  menghasilkan  diameter  zona hambat  sebesar  8  mm.  Secara  keseluruhan,  fraksi  11-12 memiliki  senyawa  protein  yang  paling  aktif  dengan  aktivitas antibakteri  tertinggi  di-bandingkan  dengan  fraksi  aktif  yang lainnya.
Penelitian Huang et al. (2006) menunjukkan bahwa protein dari kepiting bakau ( Scylla serrata ) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Micrococcusleuteus . Minn et al. (1998) juga melapor- kan bahwa protein antibakteri katak raksasa ( Rana catesbiana ) dari  hasil  pemurnian  memiliki  aktivitas  terhadap B . subtilis , E . coli , Staphylacoccus  aureus , Serratia sp., Streptococcus mutans , dan Streptococcus typimurium .

## Bobot molekul protein KT30
Bobot  molekul  protein  kapang X.  psidii KT30  dapat  dilihat pada  Gambar  4.  Berdasarkan  hasil  SDS-PAGE,  fraksi  11-12 menunjukkan adanya 3 pita protein yang dengan bobot molekul pada  pita  ke-1  23.42  kDa,  pita  ke-2  20.09  kDa,  dan  pita  ke-3 14.33 kDa. Secara keseluruhan, hasil SDS-PAGE menunjukkan bahwa  sampel  yang  diperoleh  masih  harus  dimurnikan.  Hal tersebut  dapat  terlihat  dari  sampel  protein  dari  hasil  pe- ngendapan  yang  menunjukkan  masih  banyaknya  beberapa senyawa  protein  dari  pita  yang  dihasilkan,  sedangkan  protein hasil  pemurnian  (fraksi  11-12)  menunjukkan  tingkat  kemurnian lebih tinggi yang dapat dilihat dari pita yang dihasilkan.
Gambar 4.  Bobot molekul protein yang diisolasi dari kapang X. psidii KT30
Bobot  molekul  protein  yang  dihasilkan  pada  setiap organisme  sangat  bervariasi,  misalnya  protein  yang  dihasilkan kapang Cordyceps  militaris (CMP)  memiliki  bobot  molekul  12 kDa pada gel 15% (Park et al. 2009). Kapang Clitocybe sinopica memiliki  bobot  molekul  44  kDa  dari  hasil  pemurnian  dengan kromatografi  filtrasi  gel  menggunakan  kolom  Superdex  75. Fraksi  protein  tersebut  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap
Pseudomonas  batatae,  Erwinia  herbicola,  E.  coli ,  dan Staphylococcus aureus (Zheng et al . 2010).

## KESIMPULAN
Pertumbuhan  kapang X.  psidii KT30  paling  optimum  ter- dapat  pada  perlakuan  tanpa  NaCl  (0%)  dengan  waktu  panen hari  ke-15.  Konsentrasi  ammonium  sulfat  90%  merupakan konsentrasi  terbaik  untuk  pengendapan  protein  dan  memiliki aktivitas  antibakteri  tertinggi.  Protein  kapang X.  psidii KT30 memiliki  aktivitas  yang  sama  setelah  pemurnian.Fraksi  protein 11  dan  12  dari  kapang X.  psidii KT30  memiliki  aktivitas antibakteri  tertinggi  terhadap B.  subtilis dan E.  coli .  Tiga  pita protein yang dominan terdapat pada fraksi 11-12 dengan bobot molekul 23.42, 20.09, dan 14.33 kDa.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Kementerian Riset  dan  Teknologi  RI  melalui  program  Insentif  Riset  SINas 2012 yang telah mendanai penelitian ini (RD-2012-718).

## DAFTAR PUSTAKA
Aboaba  OO,  Ezeh  AR,  Anabuike  CL.  2011.  Antimicrobial activities of some Nigerian spices on some pathogens. Agric Biol  J  N  Am  2:  1187–1193.  DOI:  10.5251/abjna.2011. 2.8.1187.1193.
Anand  TP,  Chellaram  C,  Kuberan  G,  Archana  H.  2012. Bioactive  peptides  from  marine  sources-a  review.  Indian  J Innov Dev 1: 61-64.
Arifudin,  Patong  R,  Ahmad  A.  2001.  Penelusuran  protein bioaktif  dalam  makroalga  sebagai  bahan  antibakteri  dan antijamur. Mar Chim Acta 2: 11-18.
Chasanah E, Pratitis A, Mangunwardoyo W. 2012. Identification and cultivation of MFW 23-08 isolated from marine sponges for bioactive compound production. Squalen 7: 59-66.
Handajani  NS,  Purwoko  T.  2008.  Aktivitas  ekstrak  rimpang lengkuas  ( Alpinia  galangal )  terhadap  pertumbuhan  jamur Aspergillus spp.  penghasil  aflatoksin  dan Fusarium moniliforme . Biodiversitas 9: 161-164. DOI: 10.13057/biodiv/
d090301.
Huang WS, Wang KJ, Yang M, Cai JJ, Li SJ, Wang GZ. 2006.
Purification and part characterization of a novel antibacterial protein scygonadin, isolated from the seminal plasmaof mud crab, Scylla  serrata (Forskål,  1775).  J  Exp  Mar  Biol  Ecol 339: 37-42. DOI: 10.1016/j.jembe. 2006.06.029.
Jingjing  H,  Chunhua  L,  Xiaoming  Q,  Yaojian  H,  Zhonghui  Z,
Yuemao  S.  2011.  Effect  of  salinity  on  the  growth,  biology activity  and  secondary  matabolites  of  some  marine  fungi. Acta  Oceanol  Sin  30:  118-123.  DOI:  10.1007/s13131-011- 0126-3.
Ilyas M, Kanti A, Jamal Y, Hertina, Agusta A. 2009. Biodiversity of endophytic fungi associated with Uncaria gambier Roxb.
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
( Rubiaceae )  from  west  Sumatra.  Biodiversitas  10:  23-28. DOI: 10.13057/biodiv/d100105.
Malik H, Sur B, Singhar N, Bihari V. 2008. Antimicrobial protein from Streptomyces  fulvissimus inhibitory  to  metichilin resistant Staphylacoccus  aureus .  Indian  J  Experimen  Biol 46: 254-257.
Mattjik  AA,  Sumertajaya  IM.  2002.  Perancangan  Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab . IPB Press, Bogor.
Miao L, Kwong TFN, Qian PY. 2006. Effect of culture conditions on  mycelia  growth,  antibacterial  activity,  and  metabolite profiles  of  the  marine-derived  fungus Arthrinium c.f. saccharicola .  Appl  Micribiol  Biot  72:  1063-1073.  DOI: 10.1007/s00253-006-0376-8.
Minn I, Kim HS,  Kim  SC. 1998.  Antimicrobial peptides derived from  pepsinogens  in  the  stomach  of  the  bullfrog, Rana catesbeiana. Biochim  Biophys  Acta  -  Molecular  Basis  of Disease 1407: 31-39. DOI: 10.1016/S0925-4439(98)00023- 4.
Onsori  H,  Zamani  MR,  Motallebi  M,  Zarghami  N.  2005. Identification  of  over  producer  strain  of  endo-β-1,4- glucanase in Aspergillus Species: characterization of crude carboxymethyl cellulase. Afr J Biotechnol 4: 26-30.
Park BT, Na KH, Jung EC, Park JW, Kim HH. 2009. Antifungal and  anticancer  activities  of  a  protein  from  the  mushroom Cordyceps militaris . Korean J Physiol Pharmacol 13: 49-54. DOI: 10.4196/kjpp.2009.13.1.49.
Rodgers  JD,  Ju  YM.  1992. Hypoxylon  rectangulosporum sp. Nov., Xylaria  psidii sp.  Nov.,  and  comments  on  taxa  of Podosordaria and Stromatoneurospora . Mycologia 84: 166- 172.
Samuel  P,  Prince L,  Prabakaran P. 2011.  Antibacterial activity of  marine  derived  fungi  collected  from  south  east  coast  of Tamilnadu, India. J Microbiol Biotechnol Res 1: 86-94.
Selim  KA,  El-beih  AA,  Abdel-rahman  TM,  El-diwany  AI.  2012. Biology of endophytic fungi. Curr Res Env Appl Mycol 2: 31- 82. DOI: 10.5943/cream/2/1/3.
Song Y, Wang J, Huang H, Ma L, Wang J, Gu Y, Liu L, Lin Y. 2012.  Four  eremophilane  sesquiterpenes  from  mangrove endhophytic fungus Xylaria sp. BL.321. Mar Drugs 10: 340- 348. DOI: 10.3390/md10020340.
Tarman  K.  2011.  Biological  and  Chemical  Investigations  of Indonesian  Marine-derived  Fungi  and  Their  Secondary Metabolites  [Disertasi].  Greifswald:  Ernst-Moritz-Arndt University Greifswald.
Tarman  K,  Lindequist  U,  Wende  K,  Porzel  A,  Arnold  N, Wessjohan LA. 2011. Isolation of a new natural product and cytotoxic and antimicrobial activities of extracts from fungi of Indonesian  marine  habits.  Mar  Drugs  9:  294-306.  DOI: 10.3390/md9030294.
Tarman  K,  Mustopa  AZ,  Safithri  M.  2012.  Antibacterial  and Cytotoxic Avtivities of An Algicolous Xylaria psidii KT30. Di dalam:  Setyahadi  S,  Amar  A,  Nikmatullah  A,  Malik  A, Hermansyah  H,  Gozan  M,  Sahlan  M,  Ernawati  NML, Sauriasari  R,  Pinontoan  R,  Pardal  S,  Subandi,  Depamede S,  Mangunwardoyo  W,  Hadisaputra  W,  Sudiyani  Y,  editor. The  5 th Indonesia  Biotechnology  Conference  an International  Forum;  2012  Jul  4-7;  Mataram,  Indonesia. Mataram  (ID):  Indonesian  Biotechnology  Consortium.  p. 938-945.
Todorov  SD,  Nyati  H,  Meincken  M,  Dicks  LMT.  2007.  Partial characterization  of  bacteriocin  AMA-K  isolated  from naturally  fermented  milk  from  Zimbabwe.  Food  Control  18: 456-464. DOI: 10.1016/j.foodcont.2006.03.003.
Zain  ME,  Razak  AA,  El-Sheikh  HH,  Soliman  HG,  Khalil  AM. 2009. Influence of growth medium on diagnostic characters of aspergillus and penicillium species. Afr J Microbiol Res 3: 280-286.
Zheng S, Liu Q, Zhang G, Wang H, Ng TB. 2010. Purification and characterization of an antibacterial protein from deried fruiting  bodies  of  the  wild  mushroom Clitocybe  sinopica .
Acta Biochim Pol 57: 43-48.
Wachirathiancai  S,  Bhumiratana  A,  Udomsopagit  S.  2004.
Isolation,  purification,  and  characterization  of  l-glutamate oxidase  from Streptomyces sp.  18G.  J  Biotechnol  7:  274- 281. DOI: 10.2225/vol7-issue3-fulltext-14.
Wang  S.  2006.  Enzyme  purification  by  salt  (ammonium sulphate)  precipitation.  http//www.glue.umd.edu.htm  [30 Agustus 2013].
Winarno  FG.  2008.  Kimia  Pangan  dan  Gizi.  M-Brio  Press,
Bogor.