Bioeskperimen Volume 1 No. 1, (Maret 2015) ISSN 2460­1373
Produksi Lipase Kapang Lipolitik Pada Limbah Ampas Kelapa

## Lipase production from lipolytic fungi in coconut oil cake
Eko Suyanto 1) , Endang Sutariningsih Soetarto 1) , Muhammad Nur Cahyanto 2)
1 Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Jl. Teknika Selatan, Bulaksumur Yogyakarta 55281
2 Laboratorium Pengelolaan Limbah dan Lingkungan, Fakultas Teknologi Terapan, Universitas Gadjah Mada, Jl. Flora no. 1Bulaksumur Yogyakarta 55281
E­mail korespondensi: 01.suyanto.31@gmail.com
Abstract – Lipase has any important functions for industry. The research aims were to  found lipolytic  fungi  be  able  growth  and  produce  highest  activity  in  coconut  oil cake using solid state fermentation. Isolates of fungi were puriﬁ ed and done selection of lipolytic fungi for produce of lipase using coconut cake oil as substrate. The  result showed that 8 isolates of lipolytic fungi can growth in substrate with sporulation and change  of  pH substrate.  Isolate  KLC­33  had produced  highest activity is 13.33  U/ml and enzyme volume is 46 ml. Biosynthesis reaction and lipase production inﬂ uenced by one of the factor is nutrients in coconut oil cake.
Keywords: lipase, lipolytic fungi, hydrolisis, KLC­33
Abstrak – Lipase memiliki manfaat penting di bidang industri. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan kapang lipolitik yang mampu tumbuh dan menghasilkan aktivitas  lipase  tinggi  pada  limbah  ampas  kelapa  menggunakan  metode solid  state fermentation .  Isolat  kapang uji  dipuriﬁ kasi kemudian dilakukan  skrining  dan  seleksi kapang  lipolitik  dan  dilanjutkan  dengan  produksi  lipase  menggunakan  substrat ampas  kelapa  yang  sebelumnya  diukur  kandungan  biokimia.  Hasil  menunjukkan bahwa 8 isolat kapang lipolitik mampu tumbuh baik pada substrat ampas kelapa yang ditunjukkan  dengan  adanya  sporulasi  dan  perubahan  pH  medium  selama  reaksi. Diantara  kapang  lipolitik  tersebut,  isolat  kapang  KLC­333  diketahui  menghasilkan aktivitas  hidrolisis  lipase  terbesar  yaitu  13,33  U/ml  dan  volume  produksi  46  ml. Biosintesis dan peningkatan produksi lipase dipengaruhi oleh kandungan nutrien di dalam substrat ampas kelapa.
Kata kunci : lipase, kapang lipolitik, hidrolisis, KLC­33

## PENDAHULUAN
Lipase  ( triacyl  glycerol  acyl  hydrolases , E.C  3.1.1.3)  merupakan  enzim  yang melakukan katalis reaksi hidrolisis senyawa ester  antara  lain  triasilgliserol  menjadi
gliserol dan asam lemak. Lipase juga bekerja secara  reversible,  berperan  dalam  reaksi esteriﬁ kasi  maupun  transesteriﬁ kasi  dari gliserol dan asam lemak (Sharma et al ., 2001; Pera et al ., 2006). Lipase berperan mengkatalis

## Bioeskperimen
Volume 1 No. 1, (Maret 2015) ISSN 2460­1373
reaksi  hidrolisis  bila  berada  pada  medium dengan  ketersediaan  air  tinggi  sedangkan dalam  kondisi  ketersediaan  air  rendah pada  medium  maka  lipase  cenderung mengkatalis reaksi esteriﬁ kasi. Oleh karena lipase  mampu  melakukan  berbagai  jenis reaksi  membuat  lipase  bermanfaat  secara luas  dalam  industri  aplikasi  bioteknologi. Namun  terkendala  oleh  harga  lipase  yang mahal dan produksi enzim didominasi oleh negara Eropa (Sharma et al ., 2001).
Lipase  ditemukan  sebagai  enzim ekstraseluler yang dihasilkan oleh berbagai macam  organisme,  mulai  dari  tanaman, hewan  serta  mikrobia  antara  lain  bakteri, aktinomisetes, yeast ,  dan  kapang  (Falony et  al .,  2006).  Kapang  lipolitik  diketahui mampu  menghasilkan  lipase  ekstraseluler dengan  aktivitas  lipolitik  cukup  tinggi sehingga merupakan sumber utama dalam industri  karena  kemampuannya  yang dapat  digunakan  dalam  berbagai  hal  dan kemudahan  dalam  produksi.  Salah  satu kapang  yang  banyak  menghasilkan  lipase berasal dari genus Aspergillus (Sharma et al ., 2001).
Reaksi biosintesis lipase oleh mikrobia  dapat  dilakukan  pada  medium tanpa  lipid  sebagai  induser  namun  untuk meningkatkan  produksi  lipase  dapat ditambahkan  senyawa  induser  yaitu  lipid pada  medium  seperti  triasilgliserol  (Weete et  al. ,  2008),  dan olive  oil (Pera et  al .,  2006). Ampas  kelapa  yang  merupakan  limbah proses  produksi  minyak kelapa cenderung hanya  dimanfaatkan  sebagai  pakan  ternak padahal  diketahui  bahwa  ampas  kelapa masih  memiliki  kandungan  lipid  yang cukup tinggi sekitar 10­16%, protein 4,11%, serat kasar 30,58%, karbohidrat 79,34% dan abu 0,66% (Rindengan et al ., 1997) sehingga berpotensi  dimanfaatkan  sebagai  substrat pertumbuhan  kapang  lipolitik  untuk menghasilkan lipase tinggi yang didukung dengan  keberadaan  lipid  dalam  limbah
tersebut.  Tujuan  penelitian  adalah  untuk mendapatkan kapang lipolitik yang mampu tumbuh  dan  menghasilkan  aktivitas  lipase tinggi pada substrat limbah ampas kelapa.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  dilakukan  di  laboratorium mikrobiologi  Pusat  Studi  Pangan  dan  Gizi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

## Subjek penelitian
Kultur  21  isolat  kapang  yang digunakan  diperoleh  dari  hasil  isolasi yang  belum  murni.  Limbah  ampas  kelapa diperoleh  dari  industri  minyak  kelapa  UD Barepan, Moyudan, Sleman.

## Desain penelitian
1.  Puriﬁ kasi isolat kapang
Kultur 21 isolat kapang dipuriﬁ kasi pada  medium  PDA  dengan  metode koloni  sel  tunggal  secara  berjenjang sampai  diperoleh  kultur  isolat  kapang murni  yang  selanjutnya  disimpan  pada cool room 4 o C sebagai isolat uji.
2.  Skrining kapang lipolitik
Skrining kapang lipolitik dideteksi secara bioassay menurut Singh et. al . (2010). Medium tributyrin agar test mengandung tributyrin oil 2% digunakan untuk deteksi kapang lipolitik. Isolat yang tumbuh dan membentuk zona jernih disekitar koloni kapang  merupakan  kapang  lipolitik (Gupta et  al .,  2003)  dan  digunakan sebagai  isolat  uji  selanjutnya.  Nilai indeks  lipolitik  (IL)  dinyatakan  sebagai nisbah  antara  diameter  zona  jernih yang  terbentuk  dengan  diameter  koloni (Zusfahair et al ., 2010).
3.  Seleksi kapang lipolitik Seleksi dilakukan terhadap kapang lipolitik  melalui  inokulasi  1  ml  spora kapang  dari  suspensi  konsentrasi  spora sebesar 1x10 6 spora/ml ke dalam substrat ampas kelapa dan diinkubasi pada suhu
Bioeskperimen Volume 1 No. 1, (Maret 2015) ISSN 2460­1373
30 o C  selama  7  hari.  Parameter  seleksi meliputi  kemampuan  tumbuh  isolat pada substrat berdasarkan sporulasi dan perubahan pH medium.
4.  Analisis proksimat limbah ampas kelapa
Analisis proksimat limbah ampas kelapa dilakukan sebelum fermentasi  meliputi  penentuan  kadar air,  kandungan  protein,  lipid  (minyak), karbohidrat,  kadar  abu,  rasio  C/N,  dan rasio  C/P.  Analisis  proksimat  substrat fermentasi  menjadi  hal  penting  dalam upaya  peningkatan  produksi  enzim (Salihu et al ., 2012).
5.  Produksi lipase
Spora  kapang  lipolitik  dipanen pada  larutan  Tween­80  0,01%  lalu konsentrasi  diatur  hingga  1x10 6 spora/ ml.  Produksi  lipase  dilakukan  pada limbah ampas kelapa tidak segar ukuran 250 µm menggunakan metode solid state fermentation . Sebanyak 1 ml spora kapang diinokulasikan  ke  dalam  erlenmeyer berisi  5  gr  ampas  kelapa  kadar  air  60% dan diinkubasi pada suhu 30 o C selama 7 hari.
6.  Ekstraksi lipase
Ekstraksi lipase ekstraseluler dilakukan menurut  metode  Gutarra et  al .  (2009) menggunakan  50  ml  larutan  pengekstrak enzim  lalu  disentrifuse  pada  4000  rpm selama 30 menit pada suhu 4 o C. Supernatan dan pelet dipisahkan. Supernatan berisi lipase ekstraseluler yang masih kasar.
7.  Pengukuran  kadar  protein  enzim  dan aktivitas hidrolisis
Penentuan  kadar  protein  terlarut menggunakan  metode  Bradford  pada λ  595  nm  (Kristanti,  2001).  Aktivitas hidrolisis lipase diukur secara titrimetri. Aktivitas hidrolisis lipase diukur dalam medium  emulsi  minyak  kelapa  (gum arab : buﬀ er fosfat 0.2  M pH 7 : minyak
kelapa = 2 : 1 : 1). Sebanyak 0,1 ml emulsi minyak  kelapa  dimasukkan  ke  dalam erlenmeyer,  kemudian  ditambahkan  10 ml akuades, 1 ml larutan CaCl 2 1 M, dan 0,01 ml enzim kasar lipase ekstraseluler.
Campuran enzim substrat ini diinkubasi dalam shaker dengan kecepatan 150 rpm, suhu  30 o C  selama  1  jam.  Setelah  waktu inkubasi  tercapai  segera  campuran substrat  enzim  di­inaktifasi  dengan penambahan  campuran  aseton­etanol 1:1  sebanyak  5  ml  dan  digojog  secara sempurna.
Kemudian
campuran ditambah  indikator  pp  (penoftalein)  1% sebanyak  2  tetes  dan  dititrasi  dengan larutan 0,01 N NaOH. Titrasi dihentikan jika  sudah  terbentuk  warna  merah muda.  Satu  unit  (U)  aktivitas  hidrolisis dideﬁ nisikan  sebagai  sejumlah  enzim yang  digunakan  untuk  menghasilkan satu  µmol  asam  lemak  dari  hidrolisis lemak (minyak) per menit per ml dalam kondisi  spesiﬁ k  pengukuran.  Untuk mengukur  aktivitas  lipase  digunakan rumus  sebagai  berikut  (ul­Haq et  al ., 2002),
Aktivitas lipase (U/ml) = ( ) 1000 A B x NNaOH x V xT �
A= ml NaOH titrasi sampel; B=ml NaOH titrasi  blangko;  V=  volume  enzim  yang digunakan; T=waktu inkubasi (60 menit).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Skrining dan Seleksi kapang lipolitik Skrining  isolat kapang  lipolitik dilakukan  terhadap  21  isolat  kapang yang  diisolasi  dari  serasah  di  hutan Biologi,  Fakultas  Biologi  UGM  dan  telah dipuriﬁ kasi.  Berdasarkan  hasil  penelitian secara  kualitatif  diperoleh  8  isolat  kapang yang  memberikan  hasil  positif  memiliki aktivitas lipolitik dengan adanya zona jernih disekitar  koloni  kapang  pada  medium  uji trybutitn yaitu isolat kapang KLA­78, KLA­

## Bioeskperimen
Volume 1 No. 1, (Maret 2015) ISSN 2460­1373

## 41, KLC­33, KLC­35, KLA­50, KLA­48, KLC­
26, dan KLT­68.
Gambar 1. Indeks lipolitik (IL) dari 8 isolat kapang yang tumbuh dan menghasilkan lipase pada medium tributyrin agar.
Pada  gambar  1  menjelaskan  bahwa indeks  lipolitik  terbesar  dihasilkan  oleh kapang  KLC­26  sebesar  0,67  sedangkan indeks  lipolitik  terkecil  dihasilkan  oleh kapang KLC­35 sebesar 0,0625. Isolat kapang lipolitik  mampu  tumbuh  pada  medium dengan  menggunakan  sumber  karbon berupa  tributyrin  sehingga  menghasilkan eksoenzim  (lipase  ekstraseluler)  yang menunjukkan keberadaaan aktivitas lipase. Nilai indeks lipolitik secara kualitatif sangat tergantung  pada  jenis  kapang  dan  ukuran koloni kapang sehingga belum tentu linear dengan aktivitas enzim secara kuantitatif.
Hasil  seleksi  menunjukkan  bahwa  8  isolat kapang  lipolitik  mampu  tumbuh  pada substrat  ampas  kelapa  sebagai  sumber karbon  terutama  lemak  (minyak)  untuk sintesis  lipase  yang  dicirikan  dengan adanya  pertambahan  biomassa  spora (gambar  2)  dan  perubahan  pH  selama reaksi  (gambar  3).  ahwa  isolat  KLA­78 mengalami  pertumbuhan  dan  sporulasi yang  cukup  cepat  pada  substrat  ampas kelapa dibandingkan dengan isolat lain.
Gambar 3. Perubahan pH selama reaksi solid state fermentation yang diukur sebelum (pH 4,85) dan sesudah inkubasi pada suhu 30 o C.

## Komposisi biokimia ampas kelapa
Kemampuan kapang lipotik
tumbuh  pada  substrat  limbah  ampas kelapa  didukung  dengan  kandungan komposisi  biokimia  ampas  kelapa  yang berdasarkan  hasil  uji  mengandung  lemak (minyak)  23,88%  sebagai  sumber  karbon selain  senyawa  lain  untuk  mendukung metabolisme dan pertumbuhan sel kapang.  Kehadiran minyak  dalam substrat fermentasi  akan  memberikan  dukungan lingkungan  yang  sesuai  bagi  mikrobia penghasil  lipase  sehingga  lipase  akan mudah  terinduksi.
Tabel 1.   Kandungan senyawa dalam limbah ampas
kelapa. Analisa Kadar (%) Air 9,61 Abu 1,56 Total protein 5,79 Lemak (minyak) 23,88 Serat kasar 49,54 Karbohidrat 9,61 Energi (kal/100 gr) 277,90 C organik 61,34 Nitrogen 0,93 Rasio C/N 66,12 Phospor 0,09 Ratio C/P 650,02
Rasio  C/N  ampas  kelapa  sebesar 66,12%  dan  rasio  C/P  sebesar  650,02% yang  menunjukkan  bahwa  ampas  kelapa kekurangan  nitrogen  dan  fosfor.  Nitrogen
Bioeskperimen
Volume 1 No. 1, (Maret 2015) ISSN 2460­1373
dan  fosfor  dibutuhkan  dalam  jumlah besar  untuk  sintesis  protein  dan  enzim. Di  industri,  peningkatan  produksi  enzim umumnya  dilakukan  dengan  menambah corn step liquor (Stanburry et al ., 1995).

## Produksi, kadar protein dan aktivitas hidrolisis
Tabel  2  menunjukkan  bahwa  isolat kapang lipolitik yang mampu menghasilkan aktivitas  hidrolisis  terbesar  adalah  isolat kapang  KLC­33  secara  berurutan  sebesar 13,33  U/ml,  kadar  protein  terlarut  yang dihasilkan  sebesar  0,063  mg/ml  dan volume  produksi  lipase  kasar  sebesar  46 ml.  Aktivitas  hidrolisis  yang  dihasilkan oleh  kapang  lipolitik  pada  substrat  padat memiliki  aktivitas  hidrolisis  bervariasi sebagaimana  dilaporkan  oleh  Singh et  al . (2012)  bahwa  aktivitas  lipase  (hidrolisis) dari  kapang Rhizopus  pusilus sebesar  10,8 U/ml  yang  ditumbuhkan  pada  substrat ampas  zaitun­bagase  sedangkan  kapang Aspergillus  carneu menghasilkan  aktivitas lipase  sebesar  12,7  U/ml  pada  substrat bunga  matahari.  Hal  ini  menunjukkan bahwa isolat kapang KLC­33 yang ditumbuhkan  pada  substrat  ampas  kelapa menghasilkan aktivitas hidrolisis yang lebih besar dibandingkan dengan kedua kapang tersebut. Kemampuan produksi dan aktivitas  hidrolisis  dipengaruhi  oleh  jenis kapang,  kondisi  lingkungan  pertumbuhan kapang  dan  substrat  pertumbuhan  yang mengandung  nutrien  cukup  (Salihu et  al. , 2012).
Tabel  2.  Produksi,  kadar  protein dan  aktivitas  hidrolisis  tiap  lipase  yang dihasilkan  oleh  masing­masing  kapang lipolitik.
Kode isolat Vol. enzim (ml) Aktivitas hidrolisis (U/ml) Kadar protein (mg/ml) KLA-78 4,5 10 0,166
KLA-48 40,5 4,17 0,058 KLC-33 46 13,33 0,063 KLC-35 34 3,33 0,256 KLT-68 42 12,5 0,068 KLC-26 36 9,17 0,063 KLA-41 47 11,67 0,168 KLA-50 35,5 7,5 0,065
Aktivitas  hidrolisis  yang  dihasilkah oleh  tiap  kapang  lipolitik  tidak  berkaitan erat  dengan  kemampuan  kapang  dalam menghasilkan spora (gambar 2 dan tabel 2). Aktivitas hidrolisis terkecil dihasilkan oleh isolat KLA­48 sebesar 4,17 U/ml. Tabel 2 juga menunjukkan  pola  yang  menarik  dimana kadar  protein  terlarut  dalam  supernatan (ekstrak  kasar  lipase)  belum  tentu  linear dengan  aktivitas  hidrolisis.  Kadar  protein yang  terukur  merupakan  kadar  protein terlarut  dalam  supernatan  berdasarkan metode Bradford.

## SIMPULAN
Limbah ampas kelapa menjadi medium  efektif  pertumbuhan  kapang lipolitik  secara solid  state  fermentation sehingga  mampu  meningkatkan  produksi dan aktivitas lipase. Delapan isolat kapang lipolitik mampu tumbuh dan menghasilkan lipase pada limbah tersebut. Kapang lipolitik yang  menghasilkan  aktivitas  hidrolisis tertinggi  adalah  isolat  KLA­33  sebesar 13,33 U/ml dengan volume produksi lipase sebanyak 46 ml.
Disarankan untuk melakukan penelitian lebih lanjut mengenai identiﬁ kasi kapang dan perlakuan pengaruh penambahan senyawa nitrogen dan faktor  lingkingan  pertumbuhan  untuk peningkatan produksi

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis ucapkan terimakasih
kepada  Direktorat  Jenderal  Pendidikan Tinggi  Kementerian  Pendidikan  Republik Indonesia  atas  bantuan  dana  untuk melaksanakan kegiatan penelitian ini.
Bioeskperimen Volume 1 No. 1, (Maret 2015)
ISSN 2460­1373

## DAFTAR PUSTAKA
Falony, G., Armas, JC., Mendoza,
JCD.,  Hernandez,  JLM.  2006. Production  of  extracellular  lipase from Aspergillus  niger by  solid­ state  fermentation. Food  Technol. Biotechnol . 44 :235­240
Gupta,  R.,  Rathi,  P.,  Gupta,  N.,  Bradoo,  S. 2003. Lipase assay for conventional and  molecular  screening:  an overview. Biotechnol. Appl. Biochem . 37 :63­71
Gutarra, M.L.E., Godoy, M.G., Maugeri, F., Rodrigues,  M.I.,  Freire,  D.M.G., Castilho,  L.R.  2009.  Production of  an  acidic  and  thermostabel lipase  of  the  mesophilic  fungus Penicillium  simplicissimum by  solid state fermentation. Bioresource . 100 : 5249­5254
Kristanti,  ND.  2001. Pemurnian  parsial  dan karakterisasi enzim lipase ekstraseluler dari  kapang  Rhizopus  oryzae TR32.
Thesis. Intitut Pertanian Bogor
Pera,  LM.,  Romero,  CM.,  Baigori,  MD.,
Castro, GR. 2006. Catalytic properties  of  lipase  extracts  from
Aspergillus  niger . Food  Technol. Biotechnol. 44 : 247­252
Rindengan,  B.,  Kembuan,  Lay,  A.  1997. Pemanfaatan  ampas  kelapa  untuk bahan  makanan  rendah  kalori. Jurnal  Penelitian  Tanaman  Industri .
3:56­63
Salihu,  A.,  Alam,  M.Z.,  AbdulKarim, M.I.,  Salleh,  H.M.  2012.  Lipase production:  an  insight  in  the utilization of renewable agricultural residues. Resource, Conservation and
Recycling . 58 : 36­44
Sharma,  R.,  Chisti,  Y.,  Banerjee,  C.U.
2001. Production, puriﬁ cation,
characterization,  and  applications
of  lipases. Biotechnol.  Advan . 19 :
627­662
Singh,  A.K  and  Mukhopadhyay,  M.  2012. Overview  of  fungal  lipase  :  A review. Appl.  Biochem.  Biotechnol . 166:486­520
Singh,  M.,  Saurav,  K.,  Srivastava,  N.,
Kannabiran, K. 2010. Lipase production by Bacillus subtilis OCR­ 4 in solid­state fermentation using groung  nut  oil  cakes  as  substrate. Cur. Res. Journal of Biological Sci. 2 : 241­245
Stanbury, P.F., Whi� aker, A, Hall, S.J. 1995.
Principles of fermentation technology . Elsevier science: Great Britanian ul­Haq,  I.,  Idrees,  S.,  Rajoka,  M.I.  2002.
Production of lipases by Rhizopus oligosporus by solid state fermentation. Process. Biochem . 37 :637­641
Weete,  JD.,  Oi­ming,  L,  Akoh,  CC.  2008.
Microbial  lipase. In :  Akoh,  CC and  Min,DB. Food  lipid  chemistry, nutrition  and  biotechnology  3 rd ed . CRC  Press.  Taylor  and  Francis Group. New York
Zusfahair,  Setyaningtyas,  T.,  Fatoni,  A. 2010.  Isolasi,  pemurnian  dan karakterisasi  lipase  bakteri  hasil skrining dari tanah tempat pembuangan  akhir  (TPA)  gunung Tugel  Banyumas. Jurnal  Natur Indonesia . 12 :124­129