## Efektivitas Ekstrak Daun Murbei dalam Menstimulasi Peningkatan Kandungan Ekdisteroid Hemolimph dan Molting
Kepiting Bakau (Scylla olivacea)
Effectivity of mulberry leaf extract on stimulating ekdisteroid hemolimph content and molting of mud crab ( Scylla olivacea )
Yushinta Fujaya 1  , Dody Dharmawan Trijuno 1 , Haryati 1 , Hasnidar 2 , Muhammad Rusdi 3 , Zainal Usman 4
1 Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan Universitas Hasanuddin Jl. Perintis Kemerdekaan Km 10 Tamalanrea Makassar 90245
2 Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Muslim Indonesia, Makassar, Indonesia
3 Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Alauddin, Makassar, Indonesia 4 Politeknik Kelautan dan Perikanan, Bone, Indonesia
 correspondent author: yushinta.fmuskar@gmail.com

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  mempelajari  kinerja  fitoekdisteroid  dari  daun  murbei  dalam  menstimulasi  molting kepiting bakau.  Penelitian dilaksanakan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau Fakultas Ilmu  Kelautan  dan  Perikanan  Universitas  Hasanuddin  yang  terletak  di  Desa  Bojo,  Kecamatan  Mallusetasi, Kabupaten Barru, Propinsi Sulawesi Selatan.  Kepiting bakau ( Scylla olivacea ) dengan berat 45-55 g dan lebar karapas 60-65 mm digunakan sebagai hewan uji.  Ada lima dosis ekstrak daun murbei yang diaplikasi melalui pakan,  yakni  :  A)  1,1  mg/g  pakan,  B)  1,9  mg/g  pakan,  C)  2,7  mg/g  pakan,  D)  3,5  mg/g  pakan.    Kepiting dipelihara  secara  individu  dalam  kotak  plastik  yang  diapungkan  di  atas  permukaan  tambak.    Selama pemeliharaan, kepiting diberi pakan ikan rucah kering sebanyak 3% berat badan per hari yang telah diperkaya dengan  ekstrak  daun  murbei.    Parameter  yang  diamati  adalah  senyawa  ekdisteroid  yang  terkandung  dalam ekstrak daun murbei, kandungan ekdisteroid hemolimph sebelum dan sesudah aplikasi ekstrak daun murbei, dan  persentase  molting.    Identifikasi  senyawa  ekdisteroid  yang  terkandung  dalam  ekstrak  daun  murbei dilakukan menggunakan Thin Layer Chromatography (TLC) dan Pengukuran kandungan ecdysteroid dalam hemolimph  kepiting  dilakukan  menggunakan  Ultra  Fast  Liquid  Chromatography  (UFLC).    Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  dosis  3.5  mg  ekstrak  daun  murbei/g  pakan  memberikan  peningkatan  ekdisteroid hemolimph tertinggi yaitu kurang lebih sebanyak 1760 ng ekdisteroid per mL hemolimph, sedangkan dosis 1.1 mg/g pakan hanya memberikan peningkatan sebesar 100 ng ekdisteroid per mL hemolimph.  Semakin tinggi dosis ekstrak daun murbei dalam pakan semakin tinggi pula peningkatan konsentrasi ekdisteroid hemolimph, namun  konsentrasi  ekdisteroid  yang  tinggi  dalam  hemolimph  tidak  menjamin  terjadinya  molting.    Dosis optimal ekstrak daun murbei dalam pakan untuk menstimulasi molting adalah 2.4 mg/g pakan.
Kata kunci: murbei, fitoekdisteroid, kepiting, molting, budidaya

## Abstract
This study aims to study the performance of phytoecdisteroids from mulberry leaves in molting stimulating of mangrove crabs. The research was carried out at the Research and Development Center for Aquaculture at the Faculty  of  Marine  Sciences  and  Fisheries  at  Hasanuddin  University,  located  in  Bojo  Village,  Mallusetasi District, Barru Regency, South Sulawesi  Province. Mangrove crabs ( Scylla olivacea ) weighing 45-55 g and carapace widths 60-65 mm were used as test animals. There were five doses of mulberry leaf extract applied through feed, namely: A) 1.1 mg / g feed, B) 1.9 mg / g feed, C) 2.7 mg / g feed, D) 3.5 mg / g feed. Crabs were kept individually in plastic boxes that are floated above the surface of the pond. During rearing, crabs are fed 3% dry fish per day which has been enriched with mulberry leaf extract. The parameters observed were ecdysteroid compounds contained in mulberry leaf extract, ecdysteroid content in hemolymph before and after application  of  mulberry  leaf  extract,  and  molting  percentage.  Identification  of  the  ekdisteroid  compounds contained in mulberry leaf extract was carried out using Thin Layer Chromatography (TLC) and Measurement of  the  content  of  ecdysteroids  in  crab  hemolymh  was  carried  out  using  Ultra  Fast  Liquid  Chromatography (UFLC).  The results showed that the 3.5 mg dose of mulberry leaf extract / g feed gave the highest increase in ecdysteroid hemolymph, which was approximately 1760 ekdisteroid per mL hemolimph, while the dose of 1.1
mg  /  g  feed  only  provided  an  increase  of  100  ng  ekdisteroid  per  mL  hemolymph.  The  higher  the  dose  of mulberry leaf extract in the feed, the higher the increase in the concentration of hemolymph ecdysteroids, but the  high  concentration  of  ecdystoid  in  the  hemolymph  does  not  guarantee  molting.    The  optimal  dose  of mulberry leaf extract in the feed stimulating molting was 2.4 mg / g of feed.
Keywords: mulberry, phytoecdysteroid, molting, crab, aquaculture

## Pendahuluan
Kepiting cangkang lunak atau populer disebut SOKA sesungguhnya adalah kepiting bakau  (Scylla  spp)  yang  dibudidaya  secara  khusus  hingga  mereka  melepaskan  kulitnya yang  keras.    Budidaya  Kepiting  soka  dewasa  ini  sangat  diminati  karena  mampu meningkatkan nilai jual kepiting.  Sayangnya, bahan baku untuk memproduksi kepiting soka masih di tangkap dari alam dan karena umum menggunakan ukuran kecil sekitar 70- 100  gram  sebagai  bibit  maka  budidaya  ini  sangat  rentan  mengancam  kelestarian sumberdaya kepiting di alam.
Keberhasilan pembibitan kepiting diharapkan mampu mengatasi masalah tersebut. Masalah  pembenihan  untuk  bibit  kepiting  soka  tidak  hanya  terbatas  pada  pembenihan dipanti benih pada fase zoea hingga juvenil yang hingga saat ini masih memiliki mortalitas yang sangat tinggi, namun juga pembesaran dari juvenile hingga ukuran ±70 gram.
Molting  adalah  salah  satu  faktor  penting  dalam  budidaya  karena  terkait  dengan pertumbuhan dan produksi.  Molting pada arthropoda, mulai dari insekta hingga krustasea adalah  esensial  untuk  pertumbuhan  (Kuballa  dan  Elizur,  2007).    Molting  akan  terjadi setelah  terjadi  pertumbuhan  jaringan  tubuh  yang  terbungkus  eksoskeleton  yang  keras. Demi memperbesar dimensi tubuh maka penggantian eksoskeleton lama yang keras perlu dilakukan  (Luppi  et  al.,  2004).    Pertumbuhan  jaringan  terjadi  secara  kontinu  pada krustacea, namun peningkatan dimensi eksternal adalah diskontinu.  Proses pertumbuhan tersebut haruslah melewati serangkaian proses molting atau ekdisis (Hartnoll, 1983).
Penggunaan  vitomolt  yang  mengandung  fitoekdisteroid  diharapkan  mampu memacu  pertumbuhan  dan  molting  kepiting.    Fitoekdisteroid  adalah  ekdisteroid  yang diisolasi  dari  tumbuhan.    Senyawa  ini  ditemukan  sejak  1966  dan  dilaporkan  berperan menstimulasi  sintesis  protein  pada  hewan  dan  manusia,  juga  bersifat  adaptogenic, antimutagenic, hypocholesterolemic, Imunostimulating, nutritive, dan penambah stamina (Lafont dan Dinan, 2003).  Fitoekdisteroid memiliki struktur yang analog dengan hormon molting  insekta  yakni  ecdyson  (Klein,  2004).    Proses  molting  dimulai  ketika  sel-sel epidermal  merespon  perubahan  hormonal  melalui  peningkatan  laju  sintesis  protein (Meyer, 2007).
Penggunaan fitoekdisteroid dari tanaman bayam dalam produksi kepiting soka telah dilakukan sejak tahun 2008 dan secara siginfikan mampu menstimulasi molting kepiting (Fujaya,  2011).    Melalui  berbagai  riset  penyempurnaan,  formula  vitomolt  yang
mengandung  fitoekdisteroid  dikembangkan  tidak  saja  bersumber  dari  tanaman  bayam namun  juga  dari  tanaman  murbei  yang  lebih  mudah  didapatkan  dengan  harga  murah (Fujaya et al., 2012).
Aplikasi vitomolt melalui penyuntikan cukup efektif dalam produksi kepiting soka, namun  untuk  produksi  bibit  kepiting  soka,  cara  ini  kurang  efisien.    Aplikasi  vitomolt melalui pakan diduga dapat mengatasi masalah tersebut.  Namun karena fitoekdisteroid dapat mudah larut dalam air maka masih diperlukan pencarian dosis optimal dan upaya menghambat larutnya fitoekdisteroid  tersebut.   Chitosan  diduga dapat  membantu  untuk berperan sebagai coating.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mempelajari  kandungan  fitoekdisteroid  pada  daun murbei dan efektivitas kinerja ekstrak daun murbei yang diaplikasi melalui pakan dalam menstimulasi molting dalam rangka produksi bibit kepiting soka.  Aplikasi ekstrak daun murbei  melalui  pakan  diharapkan  dapat  lebih  efisien  dalam  pelaksanaannya  secara massal.

## Bahan dan Metode

## Hewan uji
Kepiting bakau (Scylla olivacea  Herbst, 1979),  sebanyak 120 ekor  berukuran berat 45-55 g dan lebar karapas 60-65 cm.  Selama pemeliharaan kepiting diberi pakan ikan rucah sebanyak  3%  berat  badan  per  hari.    Pakan  yang  diberikan  telah  diperkaya  ekstrak  daun murbei dengan dosis sesuai perlakuan.  Kepiting dipelihara hingga molting.

## Pengkayaan pakan dengan ekstrak daun murbei
Pakan  berupa  ikan  rucah  kering  ditimbang  sesuai  kebutuhan  (250  g  per  perlakuan). Sejumlah ekstrak daun murbei sesuai perlakuan (A=274 mg, B=475 mg, C=675 mg, D=875 mg) dilarutkan dalam etanol 80% sebanyak 20 mL.  Selanjutnya pakan disemprot dengan larutan ekstrak secara merata kemudian dikering anginkan.  Untuk mencegah ekstrak larut dalam  air  saat  pemberian  pakan  maka  pakan  selanjutnya  dicoating  menggunalan  larutan chitosan 1%.  Larutan chitosan disiapkan dengan cara melarutkan 10 g chitosan dalam 1000 mL  larutan  cuka  2%.    Coating  dilakukan  dengan  cara  menyemprot  pakan  dengan  20  mL larutan chitosan.

## Koleksi dan ekstraksi hemolimph
Koleksi hemolimph dilakukan dua kali selama penelitian, yakni: 1) sebelum perlakuan ekstrak  daun  murbei,  dan  2)  pada  6  hari  aplikasi  masing-masing  terhadap  tiga  sampel kepiting.  Hemolimph kepiting  diambil dari pangkal kaki jalan kelima menggunakan syringe 1-mL dengan jarum suntik berukuran 27-gauge. Hemolimph sebanyak 1 mL disimpan dalam
eppendoft dan dicampur dengan antikuagulan dengan perbandingan 1:1, selanjutnya sampel disimpan di lemari pendingin (freezer) dengan suhu -20 o C, hingga siap untuk diekstraksi. Prosedur  ekstraksi  yakni  3mL  dietil  ether  ditambahkan  ke  dalam  1mL  hemolimph, dihomogenkan  menggunakan  vortex  selama  30  detik,  lalu  didiamkan  selama  2  menit. Lapisan bagian atas merupakan fase ether yang mengandung steroid.  Residu yang tertinggal diekstraksi kembali sebanyak 3 kali kemudian dikumpulkan dan dikisatkan hingga kering pada suhu 40 o C.

## Pengukuran kandungan ekdisteroid
Identifikasi kandungan ekdisteroid ekstrak daun murbei dilakukan menggunakan Thin Layer Chromatography sedangkan pengukuran kandungan ekdisteroid hemoliph dilakukan menggunakan Ultra Fast Liquid Chromatography (UFLC) Shimadzu LC-20 AD.  Kolom: Shim-Pack  ODS  C18  250x4.6  mm.    Sistem  Fase  Terbalik.    Fase  gerak  =  Metanol  –  Air (80:20 v/v).  Laju Alir 1 mL/menit.  Suhu kolom 40oC.  Detektor Photodiode array (UV) 246  nm.    Volume  injeksi  20  µL.    Kuantifikasi  ekdisteroid  menggunakan  seri  standar  20- hydroxyecdyson (Sigma).

## Rancangan percobaan
Percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan empat perlakuan dan tiga ulangan.  Ada emapt perlakuan dosis ekstrak daun murbei yang dicobakan, yakni: A (1,1 mg /g pakan), B (1,9 mg /g pakan), C (2,7 mg /g pakan), dan D (3.5 mg /g pakan).  Masing- masing perlakuan diulang tiga kali dan setiap unit percobaan terdiri atas 10 kepiting.

## Analisis data
Data  kadar  hormon  ekdisteroid  dan  persentase  molting,  dianalisis  menggunakan analisis  ragam  (ANOVA).    Kromatogram  Lapis  Tipis  dan  UFLC  senyawa  ekdisteroid ditampilkan dalam bentuk gambar dan dianalisis secara deskriptif.  Dosis optimal ekstrak daun murbei dalam pakan diduga menggunakan persamaan regresi.

## Hasil dan Pembahasan
Ekdisteroid yang dikandung ekstrak daun murbei sebagaimana yang terkandung dalam ekstrak bayam (Fujaya et al., 2011) dapat dimanfaatkan oleh kepiting.  Meskipun berasal dari tanaman, namun kelompok senyawa ekdisteroid keduanya, baik pada bayam dan murbei maupun  pada  kepiting  memiliki  kemiripan.    Fitoekdisteroid  adalah  senyawa  kimia  yang disintesis oleh tanaman untuk melindungi diri dari insekta yang memakan tanaman (Klein, 2004).    Komponen  senyawanya  sama  dengan  ekdisteroid,  suatu  hormon  yang  digunakan oleh arthropoda  dan keluarga krustasea untuk proses molting yang dikenal dengan istilah
ekdisis.  Banyak jenis ekdisteroid yang ditemukan pada hewan, misalnya pada ulat sutera (Bombyx  mori)  terdapat  sedikitnya  19  ecdysteroid.    Sedangkan  pada  tanaman  telah diidentifikasi  lebih  dari  250  ecdysteroid  analog.    Bahkan,  lebih  dari  1000  struktur  yang mungkin muncul secara alami (Dinan, 2001).  Diantara banyak ekdisteroid tersebut, umum terdapat  pada  tanaman  maupun  hewan  adalah  20-hydroxyecdysone  (20-HE).        Hasil pengamatan  senyawa  ekdisteroid  pada  tanaman  bayam  dan  murbei  menggunakan Kromatografi  Lapis  Tipis  menunjukkan  kelompok  senyawa  yang  mirip  dengan  20-HE (Gambar 1)
Gambar 1. Kromatogram  kelompok  senyawa dari Tanaman Bayam  (a), Murbei (b), dan 20-hydroxyecdyson (c)  menggunakan Silika Gel 60 F254 untuk fase diam dan Diklorometan:Etanol = 5:1 untuk fase gerak.  I, pengamatan pada UV 254 dan II pada UV 366
Hasil ini menunjukkan bahwa sistem signal hormonal tidak dibatasi oleh perbedaan phyla.  Sebagai contoh, beberapa spesies echinodermata menunjukkan bahwa hormon tiroid eksogen  dapat  merangsang  perkembangan  dan  metamorfosis  larva  dan    data  terbaru menunjukkan pengaruh yang kuat dalam sintesis endogenous hormon tiroid bulu babi (sea urchin).  Sumber endogenous hormon tiroid adalah ketika larva mengkonsumsi fitoplankton. Selain itu, sterol dari tanaman adalah esensial untuk sintesis ekdisteroid (Miller dan Heyland, 2010).
Meskipun belum dapat dipastikan struktur ekdisteroid dari bayam dan murbei, namun dapat dijelaskan bahwa senyawa tersebut merupakan kelompok senyawa yang sama dengan 20-HE.  Dari data kromatogram TLC menunjukkan bahwa ada bercak noda yang memiliki kesamaan nilai Rf antara fraksi daun dan fraksi bayam yaitu 0,25 dan 0,67. Selain itu bercak noda  tersebut  memiliki  warna  yang  sama  ketika  disinari  lampu  UV  254,  366  nm  dan penyemprotan  H2SO4  10  %.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  bercak  tersebut  adalah  sama.
Setelah disemprot dengan vanilin H2SO4, bercak noda berubah warna menjadi warna merah jambu  dan coklat-oranye  yang  menunjukkan  golongan  terpenoid/steroid.  Akan  tetapi  jika dibandingkan  dengan  standar  20  HE  yang  memiliki  nilai  Rf  0,25,  bercak  noda  tersebut berbeda. Hal ini dibuktikan adanya perbedaan warna penampakan ketika disinari UV 366, penyemprotan  H2SO4  10  %  dan  vanilin  H2SO4..  akan  tetapi  kepolaran  senyawa  antara senyawa  20  HE  dengan  bercak  noda  (fraksi  daun  murbei  dan  fraksi  bayam)  memiliki kedekatan tingkat kepolaran. Ini menunjukkan senyawa terpenoid/steroid yang terdapat pada sampel (murbei dan bayam) termasuk golongan ekdisteroid.
Dari hasil kromatogram UFLC menunjukkan bahwa ada kesamaan nilai retention time (RT)  antara  ekstrak  fraksi  bayam  dan fraksi  murbei  yaitu  1,69.  Hal ini membuktikan  ada kesamaan senyawa yang terkandung di dalam fraksi daun murbei dan fraksi bayam. Selain itu senyawa tersebut memiliki nilai RT yang sama 1,69 pada kromatogram hemolimph. Akan tetapi senyawa tersebut (fraksi daun murbei dan fraksi bayam) berbeda dengan 20-HE karena nilai RTnya yang berbeda yaitu 1,9 (Gambar 2, 3, 4, 5).
Gambar 2. Kromatogram Ultra Fast Liquid Chromatografi (UFLC) Fraksi Bayam
Gambar 3. Kromatogram Ultra Fast Liquid Chromatografi (UFLC) Fraksi Murbei
Gambar 4. Kromatogram Ultra Fast Liquid Chromatografi (UFLC) 20-hydroxyecdysone (HE)
Gambar 5. Kromatogram Ultra Fast Liquid Chromatografi (UFLC) Hemolimph Kepiting
Lebih  dari  300  ekdisteroid  berbeda  telah  diisolasi  dari  hewan  dan  tanaman  (semua strukturnya  dapat  ditemukan  pada  Ecdybase,  http://ecdybase.org).    Perbedaan  ditentukan pada  jumlah,  lokasi,  dan  posisi  gugus  hidroxylnya  (Lafont  dan  Dinan,  2003).  Pada zooecdysteroids,  umum  ditemukan  lima  atau  enam  gugus  hidroksil,  sedangkan  pada phytoecdysteroid  terdapat  enam  hingga  delapan  gugus  hidroxyl  (Bathori  dan  Pongracz, 2005).    Data  dari  ecdybase  mengelompokkan  ecdysteroid  dari  murbei  dan  dari  keluarga bayam adalah Inokosterone yang juga identik dengan callinecdysone A yang ditemukan pada kepiting Callinectes sapidus.
Peranan  fitoekdisteroid  dalam  menstimulasi  molting  crustacea  belum  sepenuhnya dipahami.  Telah dilaporkan bahwa hormon molting pada krustasea dibentuk pada organ Y dalam bentuk ekdison.  Di dalam Hemolimph, hormon ini dikonversi menjadi hormon aktif, 20-HE oleh enzim 20-hydoxylase yang terdapat di epidermis organ Y dan jaringan tubuh lainnya (Huberman, 2000).  Selain 20-HE, dilaporkan bahwa Ponasterone  A (25—deoxy- 20-hydroxyecdysone atau 25d20E) juga merupakan komponen aktif utama yang dikonversi di jaringan tepi.  Ekdisteroid utama yang diidentifikasi pada hemolimph decapoda crustacea adalah ecdysone, 20-E atau 20-HE, 3D20E, dan Ponasterone A (PA).  Selama fase transisi juvenil,  prepubertal,  dan  fase  dewasa  didapatkan  bahwa  PA  merupakan  komponen ekdisteroid  utama.    Namun  Titer  PA  secara  signifikan  lebih  tinggi  pada  fase  juvenil dibandingkan 20HE dan lebih rendah pada fase prepubertal dan dewasa (Mykles, 2011).  Hal ini  menunjukkan  bahwa  sangat  banyak  variasi  yang  mungkin  timbul  dalam  metabolisme ekdisteroid.  Selain dipengaruhi oleh siklus hidup juga dipengaruhi oleh siklus molting dan oleh  berbagai  kondisi  lingkungan.    Dilaporkan  bahwa  pelepasan  neurohormon  mungkin ditrigger oleh radiasi elektromagnetik dan atau gaya gravitasi bulan (Zimecki, 2006).  Pada kepiting, hal ini mungkin merupakan penyebab adanya fenomena molting yang tinggi pada fase sebelum atau sesudah bulan purnama dan bulan gelap.  Molting  terendah terjadi pada bulan purnama dan bulan gelap (Fujaya et al., 2012).
Titer  ekdisteroid  total  dalam  hemolimph  sangat  bervariasi  selama  siklus  molting. Secara umum, titer ekdisteroid rendah selama intermolt dan post molt, selama fase premolt, konsentrasi  meningkat  dan  mencapai  puncak  beberapa  saat  sebelum  molting  (ecdysis), namun bervariasi tergantung spesies. Pada kepiting dungeness (Cancer magister) Ppuncak konsentrasi ekdisteroid adalah ± 2.000 ng/mL (Thompton et al., 2006).  Pada kepiting bakau ditemukan  konsentrasi  tertinggi  selama  fase  premolt  2.005-2.821  ng/mL  (Fujaya  dan Trijuno, 2007).  Pada kepiting Tanner, konsentrasi terendah pada fase intermolt mencapai 500 ng/mL hemolimph (Chang dan Mykles, 2011).
Kontrol  hormonal  terhadap  molting  sangat  kompleks  (Chang  dan  Mykles,  2011). Selama beberapa tahun diyakini bahwa endokrinologi krustasea memiliki model yang sangat sederhana.    Ada  hubungan  timbal  balik  antara  Molting  Inhibiting  Hormon  (MIH)  dan
Molting Stimulating Hormon yang juga dikenal dengan ekdisteroid.  Bila level ekdisteroid tinggi selama fase premolt maka level MIH rendah demikian pula sebaliknya.  Kenyataannya ditemukan  bahwa  pola  seperti  itu  tidak  selalu  terjadi.    Selama  intermolt  level  MIH  tidak selalu tinggi dan selama premolt level MIH dapat lebih tinggi dibanding intermolt.
Hasil  pengukuran  kandungan  ekdisteroid  dalam  hemolimph  kepiting  sebelum  dan setelah  aplikasi  menunjukkan  bahwa  aplikasi  ekstrak  daun  murbei  melalui  pakan  dapat meningkatkan kandungan ekdisteroid kepiting.  Semakin tinggi dosis ekstrak daun murbei maka semakin tinggi pula kandungan ekdisteroidnya.  Dosis 3.5 mg ekstrak daun murbei per gram  pakan  memberikan  peningkatan  ekdisteroid  hemolimph  tertinggi  yaitu  kurang  lebih sebanyak  1700  ng  ekdisteroid  per  mL  hemolimph,  sedangkan  dosis  1.1  mg  ekstrak  daun murbei per gram pakan hanya memberikan peningkatan sebesar 100 ng ekdisteroid per mL hemolimph  (Gambar 6).
Gambar 6. Dinamika  Kandungan  Hormon  Ekdisteroid  dalam  Hemolimph  Kepiting  pada  Berbagai  Dosis ekstrak daun murbei Setelah 6 Hari Aplikasi. P<0.05
Kandungan  ekdisteroid  yang  tinggi  dalam  sirkulasi  tidak  menjamin  bahwa  molting kepiting akan tinggi pula.  Pada Tabel 1 dapat dilihat bahwa perlakuan dosis ekstrak daun murbei  tertinggi  pada  kepiting,  yakni  sebanyak  3,5  mg  per  g  pakan  menghasilkan peningkatan  ekdisteroid  hemolimph  tertinggi  pula,  yakni  2660  ng  ekdisteroid  per  mL hemolimph,  namun  hanya  menghasilkan  rata-rata  40%  molting.    Total  molting  tertinggi didapatkan  pada  perlakuan  2,7  mg  per  g  pakan  yang  hanya  menstimulasi  peningkatan kandungan  ekdisteroid  sebesar  1.593  µg  per  mL  hemolimph,  yakni  sebanyak  60%. Demikian pula waktu molting setelah aplikasi paling lambat dicapai oleh perlakuan 3,5 mg per  g  pakan,  yakni  setelah  hari  ke  45,  sedangkan  pada  perlakuan  lainnya,  molting  sudah mulai terjadi setelah 30 hari aplikasi ekstrak daun murbei.
Tabel 1. Waktu Molting Kepiting pada Berbagai Dosis Ekstrak Daun Murbei Selama 60 Hari Pemeliharaan
Perlakuan (mg ekstrak daun murbei per gram pakan) Persen molting pada hari ke Total molting (%) 15 30 45 60 A (1.1) 0.00 3.33 33.33 13.33 50.00 B(1.9) 0.00 6.67 16.67 33.33 56.67 C(2.7) 0.00 6.67 20.00 33.33 60.00 D(3.5) 0.00 0.00 30.00 10.00 40.00
Diduga konsentrasi ekdisteroid yang sangat tinggi menimbulkan umpan balik negatif. Akibatnya,  respon  penghambatan  molting  yang  terjadi.    Beberapa  organisme  melakukan respon  umpan  balik  negatif  melalui  berbagai  cara,  yakni  pengurangan  reseptor  atau melakukan inaktivasi pada hormon yang ada (Mykles, 2011).
Krustasea  memiliki  mekanisme  unik  dalam  mengatur  keseimbangan  level hormonalnya termasuk level ekdisteroid yang mengontrol molting.  Kelebihan konsentrasi hormon dalam hemolimnya dapat diekskresi melalui urine dan feces.  Ada dua organ utama yang bertanggungjawab dalam pengeluaran ekdisteroid dari hemolimph yaitu antenal gland dan hepatopankreas.  Inaktivasi dilakukan melalui konversi metabolit menjadi lebih polar dan  atau  membuat  formasi  konjugasi  (Mykles,  2011).    Keragaman  dalam  jalur  inaktivasi pada  krustasea  digunakan  oleh  insekta  untuk  detosifikasi  ekdisteroid  yang  dimakan  dari tanaman.
Fitoecdysteroid yang disuplementasi pada pakan kepiting guna menstimulasi molting dapat  mengalami  proses  inaktivasi  sebagaimana  dikemukakan  oleh  Mykles.    Karena  itu, dosis optimal sangat penting diketahui.  Pada penelitian ini, dosis ekstrak daun murbei yang optimal  menstimulasi  peningkatan  ekdisteroid  dan  molting  kepiting,  berdasarkan  analisis regresi diduga adalah 2,4 mg per gram pakan (Gambar 7)
Gambar 7. Persamaan  regresi  yang  digunakan  menentukan  dosis  optimal  ekstrak  daun  murbei  yang  dapat menstimulasi molting tertinggi pada kepiting. Tanda panah menunjukkan dosis optimal
y = -7.5x 2 + 35.7x + 18 R² = 0.9496 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 % molting dosis (mg vitomolt per g pakan) jum la h m ol ti ng (%)

## Simpulan
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa senyawa terpenoid/steroid yang terdapat pada sampel  (murbei  dan  bayam)  termasuk  golongan  ekdisteroid.    Ekstrak  daun  murbei  yang mengandung ekdisteroid  ini  dapat  mempengaruhi molting  pada  kepiting.    Semakin  tinggi dosis  ekstrak  daun  murbei  dalam  pakan  semakin  tinggi  pula  peningkatan  konsentrasi ekdisteroid hemolimph.  Namun konsentrasi ekdisteroid yang tinggi dalam hemolimph tidak menjamin  terjadinya  molting.    Terdapat  konsentrasi  ekdisteroid  tertentu  yang  mampu menstimulasi molting.  Hal ini harus menjadi pertimbangan dalam menentukan dosis ekstrak daun murbei yang optimal dalam pakan.

## Daftar Pustaka
Bathori,  M.,  Pongracz,  Z.,  (2005),  Phytoecdysteroids-  from  isolation  to  their  effects  on humans.  Current Medicinal Chemistry, 12: 153-172
Chang,  ES.,  Mykles,  DL.,  (2011),  Regulation  of  crustacean  molting:  A  review  and  our perspectives.  General and Comparative Endocrinology, 172:323-330
Dinan, L., (2001), Phytoecdysteroids: biological aspects.  Phytochemistry, 57:325-339
Fujaya, Y., Trijuno, DD., (2007), Haemolymph ecdysteroid profile of mud crab during molt and reproductive cycles.  Torani 17(5): 415-421.
Fujaya, Y., S Aslamyah, L Fudjaja., N Alam. (2012).  Budidaya dan Bisnis Kepiting Lunak. Brillian Internasional. Surabaya
Fujaya, Y., (2011). Pertumbuhan dan Molting Kepiting Bakau yang Diberi Dosis Vitomolt Berbeda.  Jurnal Akuakultur Indonesia, 10(1), 24-28.
Hartnoll, RG., (1983), Strategies of Crustacean Growth.  Dalam Papers from the Conference on the Biology and Evolution of Crustacea.  James K. Lowry (editor).  Trustees of the Australian Museum. Sydney, Australia
Huberman. (2000). Shrimp endocrinology: a review. Aquaculture, 191, 191-208.
Klein R., (2004), Phytoecdysteroids.  Journal of the American Herbalist Guild, 18-28.
Kuballa, A., Elizur, A., (2007), Novel molecular approach to study moulting in crustaceans. Bull. Fish. Res. Agen.  20:53-57
Lafont R., Dinan, L., (2003), Practical uses for ecdysteroids in mammals including humans: and update.  Journal of insect science, 3(7): 1-21.
Luppi, TA., Spivak, ED., Bas, CC., Anger, K., (2004), Molt and growth of an estuarine crab, Chasmagnathus  granulates  (Brachyura:Varunidae),  in  Mar  Chiquita  coastal  lagoon, Argentina.  J. Appl. Ichthyol, 20:333-344
Meyer,  JR.,  (2007).  Morphogenesis.  Department  of  entomologi  NC  State  University. Retrieved from www.morphogenesis .htm. DL 27 September 2007.
Miller,  AEM.,  Heyland,  A.,  (2010),  Endocrine  interaction  between  plants  and  animals: implications of exogenous hormone sources for the evolution of hormone  signaling. General and Comparative Endocrinology, 166:455-461.
Mykles,  DL.,  (2011),  Ecdysteroid  metabolism  in  crustaceans.    Journal  of  Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 127:196-203
Thompton, JD., Tamone, SL., Atkinson, S., (2006), Circulating ecdysteroid concentration in Alaskan Dungesess crab (Cancer magister). Journal of crustacean biology, 26(2), 176- 181
Zimecki, M., (2006), The lunar cycle: effects on human and animal behavior and physiology. Postepy Hig Med Dosw (online), 60:1-7.