## PRODUKSI ENZIM KITINASE DARI  Aspergillus niger MENGGUNAKAN LIMBAH CANGKANG RAJUNGAN SEBAGAI INDUSER
Purkan Purkan 1* , Afaf Baktir 1 , Arju Rohmah Sayyidah 1
1 Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga
* email: purkan@fst.unair.ac.id

## Abstrak
Kitinase  merupakan  enzim  hidrolitik  yang  dapat  menghidrolisis  kitin  pada  ikatan  β-1,4- glikosidiknya  dengan  menghasilkan  derivat-derivat  kitin  seperti  oligomer  kitin  yang mempunyai  banyak  manfaat.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  melakukan  pengembangan produksi  enzim  kitinase  dari  sumber  lokal  yang  melimpah  di  alamserta  murah  dengan melakukan  optimasi  substrat  dalam  hal  ini  digunakan  substrat  tetes  tebu  (molase)  dan limbah  cangkang  rajungan  untuk  produksi  enzim  kitinase  dari Aspergillus  niger . Sebelumnya, dilakukan  kultivasi  isolat  kapang Aspergillus  niger dengan  membuat  kurva pertumbuhan menggunakan metode masa sel kering dimana dari hasil penelitian inokulasi optimal adalah 22 jam. Pada proses produksi, diperoleh waktu fermentasi optimal adalah 52 jam dengan menentukan uji aktivitasnya menggunakan metode turbidimetri. Hasil optimasi substrat menunjukkan bahwa enzim kitinase  yang maksimal diperoleh pada penambahan molase 0,5% (b/v) dengan unit aktivitas enzim 0,14726 (U/mL) dan cangkang rajungan 2% (b/v) dengan unit aktivitas enzim yang dihasilkan 0,12826 (U/mL). Kitinase dari Aspergillus niger ini mempunyai pH optimal 6 dan suhu optimal 40 o C.
Kata kunci: Aspergillus  niger,  kitinase,  cangkang  rajungan,  molase

## Abstract
Chitinase  is  a  hydrolytic  enzyme  that  hydrolyzes  chitin  on  β-1,4-glycosidic  bond  and thereby producing chitin derivatives such as chitin oligomers that have multiple benefits. The purpose of this research was to develop the production of chitinase enzyme from cheap and are abundant local nature sources, by optimizations substrate in this case the substrate used molasses and crab shell waste for the production of chitinase enzyme from Aspergillus niger . Previously, isolates of Aspergillus niger cultivated by creating a growth curve using dry cell mass method which from the results of research inoculation optimal are 22 hours. In the production process, obtained the optimum fermentation time is 52 hours to determine the activity test using turbidimetry method. Result of substrate optimizations indicate that chitinase enzyme maximum by addition of molasses obtained in 0.5% (w/v) with enzyme activity units 0.14726 (U/mL) and crab shells 2% (w/v) with enzyme activity units 0.12826 (U/mL). Chitinase from Aspergillus niger has a pH optimum 6 and temperature optimum 40 o C.

## Keywords: Aspergillus niger, chitinase, crab shells, molasses

## Pendahuluan
Salah satu penerapan bioteknologi yang terus  berkembang  adalah  pemanfaatan
enzim dari mikroorganisme untuk biodegradasi.  Dalam  biodegradasi,  enzim dari  mikroorganisme  berperan  untuk
memecah  molekul-molekul  besar  atau polimer yang ada di alam menjadi produk yang  dapat  dimanfaatkan.  Salah  satu polimer  alam  yang  keberadaannya melimpah  adalah  kitin  dimana  secara umum  enzim  yang  mendegradasi  kitin adalah jenis enzim kitinase.
Kitinase  merupakan  enzim  hidrolitik yang  dapat  menghidrolisis  kitin  pada ikatan β-1,4-glikosidiknya dengan menghasilkan derivat-derivat kitin seperti oligomer  kitin.  Beberapa  penelitian  telah mencoba  menghidrolisis  kitin  dengan enzim yang dihasilkan oleh Aspergillus sp , Bacillus  sp,  Clostridium  sp,  Serratia  sp , Aeromonas  sp ,  dan Trichoderma  sp . (Maggadani,  2012). Aspergillus  niger merupakan  jenis  kapang  yang  dapat mensekresikan enzim selulase, kitinase, α- amilase, α-amilase, glukoamilase, katalase,  pektinase,  lipase,  laktase, invertase, dan asam protease.
Kitinase  mempunyai  banyak  manfaat antara  lain  sebagai  antihama  karena sifatnya  yang  dapat  mematikan  serangga (entomopatogenisitas), kitinase dari bakteri  dilaporkan  pula  oleh  Regev et  al.
(1996)  bersinergi  dengan  endotoksin  dari
B.  thuringiensis dalam  menekan  larva
Spodoptera littoralis pada tebu (Toharisman, 2007). Hasil hidrolisis kitin oleh  kitinase  juga  menghasilkan  N- asetilglukosamin  yang  digunakan  untuk pengawet,  substrat  untuk  perbaikan jaringan dan reaksi antiinflamasi, meningkatkan kelembaban dan keelastisan kulit,  penyembuhan  luka  (Chen et  al. ,
2010),  terapi  pengobatan  osteoarthritis (nyeri  sendi)  dan  sebagai  makanan suplemen  (Sashiwa et  al. ,  2002).  N- asetilglukosamin  juga  dapat  dikonversi menjadi  hexa-N-kitobiosa  yaitu  suatu oligosakarida  yang  memiliki  aktivitas antitumor (Patil et al. , 2000). Banyaknya manfaat enzim kitinase dan senyawa  turunan  kitin  mengakibatkan meningkatnya  kebutuhan  enzim  kitinase sehingga  perlu  dilakukan  pengembangan produksi enzim kitinase dari sumber lokal yang  melimpah  di  alam  serta  harganya
yang  relatif  murah.  Salah  satunya  adalah penggunaan  limbah  yang  mengandung kitin. Kitin merupakan komponen penyusun  peptodoglikan  dinding  sel mikroba  yang  banyak  ditemukan  pada eksoskeleton  serangga,  krustasea,  dan dinding sel jamur (Chen et al. , 2010). Di Indonesia  udang  dan  kepiting  merupakan komoditas  yang  memainkan  peranan penting sebagai sumber kitin karena hasil pengolahannya  banyak  menghasilkan limbah. Menurut Peniston (1982) pengolahan udang dan kepiting menghasilkan  limbah  50-60%  dari  berat utuh  dengan  kandungan  kitin  20-30%. Substrat  fermentasi  yang  melimpah  dan mudah  didapat  lainnya  adalah  molase (tetes tebu) yang merupakan hasil samping pembuatan  gula  dan  pemanfaatannya masih  sedikit.  Menurut  Dellweg  (1983) kandungan gula dalam molase pada 75 % bahan  kering  sebesar  62  %  (Widyanti, 2010).  Sehingga  penelitian  ini  bertujuan untuk  melakukan  optimasi  produksi  dan karakterisasi enzim kitinase dari Aspergillus  niger menggunakan  substrat molase (tetes tebu) dan kitin dari cangkang rajungan  yang  melimpah  di  alam Indonesia ini.

## Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: limbah cangkang rajungan,  HCl  5%,  NaOH  5%,  PDA, kapas, kasa, aluminium foil, MgSO 4  7H 2 O, KH 2 PO 4 ,  CaCl 2  2H 2 O, yeast ekstrak, glukosa, molase, Na 2 HPO 4  7H 2 O, NaH 2 PO 4 ,  asam  sitrat,    dan  akuades. Sedangkan peralatan terdiri dari termometer,  magnetik  stirer,  tabung falcon, tabung Eppendorf, jarum ose, pipet tetes, lemari pendingin Toshiba Glacio dan Sanyo, mikropipet, tube, dan orbital shaker TS-330A.  Instrumen  yang  digunakan diantaranya  timbangan  analitik  Mettler Toledo  AL204 ,  sentrifuge Beckman  (tipe TJ-6), laminar air flow cabinet Kottermann  8580 , pH  meter  Mettler Toledo,  inkubator  Memmert,  Sanstat
Water  Bath  type  SYK-382-M  dan Gerhardt,  autoclave  electric  model  No. 25X,  vortex  meter  VM-300,  dan spektrofotometer UV-VIS Shimadzu UV- 1800.

## Prosedur Penelitian Pembuatan media
Media  padat  untuk  peremajaan  isolat Aspergillus niger digunakan media Potato Dextrose  Agar  (PDA).  Untuk  media pertumbuhan  terdiri  dari  (g/L  air): MgSO 4  7H 2 O 1,0; KH 2 PO 4 1,5;
CaCl 2  2H 2 O  0,2; yeast ekstrak  0,2, glukosa,  molase,  ditambahkan  dengan akuades, sedangkan untuk media produksi seperti  media  pertumbuhan  dengan ditambah induser cangkang rajungan.

## Kultivasi isolat penghasil enzim kitinase
Isolat Aspergillus  niger diremajakan dengan cara memindahkan satu ose koloni dari stok biakan kedalam media padat yang telah disiapkan kemudian diinkubasi pada
Untuk  membuat  kurva  pertumbuhan dilakukan dengan metode masa sel kering. Isolat Aspergillus  niger yang  telah diremajakan  dalam  media  padat  diambil dengan  kawat  ose  kemudian  dimasukkan kedalam media pertumbuhan. Selanjutnya dilakukan  inkubasi  pada  suhu  ruang dengan  penggojokan  pada  170  rpm. Sampling dilakukan tiap 4 jam kemudian disaring  dan  dicuci  dengan  aquadest selanjutnya  dikeringkan  dengan  oven sampai  diperoleh  masa  sel  kering  yang konstan.

## Produksi enzim kitinase
Sebanyak 1 mL inokulum ditambahkan kedalam  100  mL  media  produksi, kemudian  di  inkubasi  pada  suhu  30 o C dengan  penggojokan  170  rpm  selama    6 hari,  setelah  itu  disentrifugasi  pada  3500 rpm  selama  20  menit  dengan  suhu  4 o C. Supernatan  yang  terbentuk  setelah disentrifugasi  adalah  ekstrak  kasar  enzim kitinase atau crude enzyme chitinase yang selanjutnya  diuji  aktivitasnya.  Penentuan
Aktivitas  Enzim  dilakukan  dengan  cara, 400  µL  enzim  kitinase  ditambah  dengan 1600 µL substrat kitin (1% koloidal kitin b/v  dalam  50  mM  buffer  fosfat  pH  7). Campuran  diinkubasi  pada  suhu  37 o C selama  30  menit,  kemudian  dilakukan pengukuran  aktivitas  kitinase  dengan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada λ 660 nm.

## Optimasi waktu fermentasi
Sebanyak 1 mL inokulum ditambahkan kedalam  100  mL  media  produksi kemudian  diinkubasi  pada  suhu  30 o C dengan  penggojokan  170  rpm  selama  6 hari. Sampel di ambil tiap 4 jam. Sampel disentrifugasi untuk di ambil supernatannya yang selanjutnya di lakukan uji aktivitas.

## Optimasi  konsentrasi  molase  untuk produksi enzim kitinase
Sebanyak 1 mL inokulum ditambahkan kedalam  100  mL  media  produksi  dengan variasi  konsentrasi  molase  0,2;  0,4;  0,5; 0,6; 0,8; dan 1 (% b/v) dengan konsentrasi limbah  cangkang  rajungan  dibuat  sama sebesar  1%.  Media  produksi  kemudian diinkubasi  pada  suhu  30 o C  dengan penggojokan  170  rpm  selama  waktu fermentasi  optimal  yang  telah  diperoleh, kemudian  enzim  yang  diperoleh  diuji aktivitasnya.

## Optimasi  konsentrasi  cangkang  rajungan untuk produksi enzim kitinase
Sebanyak 1 mL inokulum ditambahkan kedalam  100  mL  media  produksi  dengan variasi  konsentrasi  limbah  cangkang rajungan  sebesar  0,5%,  1%,  1,5%,  2%, 2,5%,  dan  3%.  Konsentrasi  molase  yang ditambahkan besarnya disesuaikan dengan hasil  optimasi  yang  telah  diperoleh sebelumnya  kemudian  di  inkubasi  pada suhu 30 o C dengan penggojokan 170 rpm selama  waktu  fermentasi  optimal  yang telah  diperoleh,  setelah  itu  enzim  yang diperoleh diuji aktivitasnya.

## Karakterisasi pH enzim kitinase
Penentuan  pH  optimum  dilakukan dengan memasukkan ekstrak kasar enzim kitinase  sebanyak  400  µl,  dan  ditambah dengan 1600 µl substrat kitin (1% koloidal kitin b/v dalam 50 mM buffer). Masing  - masing tabung  diinkubasi  30  menit  pada pH yang berbeda-beda, yaitu 3, 4, 5, 6, 7 dan 8. Dalam hal ini untuk pH 3, 4, 5, 6, dan  7  digunakan  buffer  fosfat  sitrat sedangkan untuk pH 6, 7 dan 8 digunakan buffer fosfat.

## Karakterisasi suhu enzim kitinase
Penentuan  suhu  optimum  dilakukan dengan memasukkan ekstrak kasar enzim kitinase  sebanyak  400  µl,  dan  ditambah dengan  1600  µL  substrat  kitin  (1% koloidal  kitin  b/v  dalam  50  mM  buffer). Masing - masing tabung diinkubasi selama 30 menit pada suhu yang berbeda - beda, yaitu 20 o C, 30ºC, 40ºC,  50ºC dan 60ºC.

## Hasil dan Pembahasan
Kultivasi Isolat Kapang Aspergillus niger Aspergillus  niger yang  telah  menjadi koleksi laboratorium Biokimia Universitas Airlangga  diremajakan  dengan  menanam kembali pada media padat Potato Dextrose Agar  (PDA).  Pertumbuhan  ini  diamati dengan  munculnya  spora  berwarna  hitam menyerupai  bubuk  kopi  yang  mulai terlihat pada hari ketiga.
Isolat yang telah diremajakan digunakan untuk pembuatan starter untuk menghasilkan sel-sel yang lebih aktif yang biasa  disebut  dengan  inokulum.  Untuk membuat  inokulum  ini  perlu  mengetahui pertumbuhan  optimal  kapang  sehingga dilakukan pembuatan kurva pertumbuhan. Pada penelitian ini digunakan perhitungan massa  sel  kering  untuk  pembuatan  kurva pertumbuhan.  Untuk  menghitung  massa sel kering dilakukan inokulasi A spergillus niger pada  media  pertumbuhan  selama  3 hari,  disampling  tiap  4  jam  disaring  lalu dioven  untuk  mendapatkan  massa  sel kering  yang  konstan.  Grafik  hubungan antara  waktu  dan  masa  sel  kering ditampilkan pada Gambar 1.
Dari  Gambar  1  dapat  diketahui  bahwa pada  waktu  inkubasi  0  sampai  4  jam merupakan  fase  adaptasi  (lag)  yang merupakan  tahap  penyesuaian  terhadap lingkungan  baru.  Pada  waktu  inkubasi  4 sampai 12 jam merupakan fase initial log, fase  dimana  sel-sel  mulai  membelah. Selanjutnya  mulai  waktu  inkubasi  12 sampai  24  jam  kapang  mengalami mengalami fase log, fase dimana mikroba membelah  dengan  cepat  dan  konstan mengikuti kurva logaritmik.
Waktu inkubasi (jam) Gambar 1. Profil pertumbuhan

## Aspergillus niger
Pada waktu inkubasi 24 jam merupakan puncak  namun  sudah  memasuki  fase stasioner  sampai  waktu  inkubasi  36  jam yang  menunjukkan  penurunan.  Pada  fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang  mati.  Ukuran  sel  pada  fase  ini menjadi  lebih  kecil-kecil  karena  sel  tetap membelah meskipun zat-zat nutrisi sudah habis.  Karena  kekurangan  zat  nutrisi,  sel kemungkinan  mempunyai  komposisi berbeda dengan sel yang tumbuh pada fase logaritmik (Fardiaz, 1989).
Pada  fase  stationer  ini  juga  dihasilkan metabolit  sekunder  seperti  biosintesis koenzim,  hormon,  nukleotida,  pigmen, toksin, enzim dan lain - lain. Berdasarkan kurva  pertumbuhan  tersebut  didapatkan bahwa waktu inokulasi optimal Aspergillus niger adalah 22 jam.

## Produksi dan uji aktivitas enzim kitinase
Enzim  kitinase  merupakan  enzim ekstraseluler  yang  disekresikan  kapang pada  media  produksinya.  Enzim  ini
Ma sa s el k er in g (g ) 0,035 0,030 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 Waktu inkubasi (jam)
diperoleh  dengan  cara  memisahkan  sel kapang  dengan  media  pertumbuhannya melalui sentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm  dan  suhu  4°C  sampai  koloni  yang terbentuk  terpisah  dari  supernatan. Supernatan  yang  dihasilkan  merupakan ekstrak kasar enzim kitinase.
Uji aktivitas kemudian dilakukan untuk membuktikan  bahwa  supernatan  yang dihasilkan dari proses sebelumnya adalah ekstrak  kasar  enzim  kitinase,  serta  untuk mengetahui  unit  aktivitas  enzim  kitinase yang  dihasilkan.  Uji  aktivitas  kitinase dilakukan dengan menambahkan 1600 µL substrat koloidal kitin 1% dengan 400 µL ekstrak  enzim  kasar  kitinase,  kemudian diukur absorbansinya menggunakan Spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang 660 nm (Kholifah, 2013). Unit aktivitas  enzim  didefinisikan  sebagai jumlah  enzim  yang  menghidrolisis  kitin per  mg  per  mL  per  menit  pada  kondisi percobaan.

## Optimasi waktu fermentasi
Untuk mendapatkan jumlah enzim yang maksimal,  perlu  diketahui  aktivitas Aspergillus  niger  dalam  menghasilkan enzim  kitinase.  Dalam  penelitian  ini dilakukan  uji  aktivitas  yang  disampling tiap  4  jam  sekali  untuk  mendapatkan waktu  fermentasi  optimal  sehingga  dapat diketahui  kapan  enzim  dapat  dipanen. Grafik hubungan antara waktu fermentasi dengan  absorbansi  ditunjukkan  pada Gambar 2.
Dari  Gambar  2  menunjukkan  bahwa produktivitas  kitinase  terus  mengalami peningkatan  seiring  bertambahnya  waktu fermentasi hingga mencapai titik optimum yaitu  52  jam.  Dalam  produksi  enzim  ini kapang  berasa  pada  fase  stasioner,  yakni kurang  lebih  1,5  hari  setelah  fase pertumbuhan.  Singkatnya  kapang  dalam produksi  enzim  kitinase  ini  karena  tidak diperlukan lagi waktu adaptasi yang cukup lama  akibat  nutrien  yang  tersedia  dan kondisi  lingkungan  yang  baru  tidak berbeda  dengan  sebelumnya,  sehingga tidak diperlukan waktu penyesuaian yang
lama  untuk  mensintesis  enzim-enzim. Setelah  mencapai  titik  optimum  secara perlahan aktivitas enzim kitinase semakin menurun.  Hal  tersebut  karena  sel  telah banyak  yang  mati  sehingga  berdampak pada menurunnya enzim yang dihasilkan.
Waktu inkubasi (jam) Gambar  2 .  Profil  produktivitas  enzim kitinase dari Aspergillus niger

## Optimasi konsentrasi molase
Berdasarkan hasil dari Balai Penelitian Tanaman  dan  Sayuran  (2010)  molase memiliki kandungan MgO, Fe, Mn, dan Zn masing-masing 0,37 %, 226 ppm, 31 ppm, dan 10 ppm serta kadar gula total sebesar 43,98 % (Widyanti, 2010). Kandungan ion logam  dan  gula  ini  diperlukan  dalam proses  fermentasi  untuk  memberikan nutrien  kepada  kapang  agar  bisa  hidup, namun  jika  ditambahkan  dalam  keadaan berlebih juga akan mengganggu produktivitas  enzim  sehingga  dalam penelitian  ini  dilakukan  optimasi  jumlah molase  yang  akan  ditambahkan.  Grafik hubungan  antara  konsentrasi  molase  dan unit  aktivitas  enzim  ditampilkan  Gambar 3.
Molase (%)
Gambar  3. Profil  penentuan  konsentrasi molase optimum.
U ni t a kt iv it as e nz im (U /m L ) 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02  0  4  8    12   16   20   24   28   32   36   40   44   48   52   56   60   64   68   72 U ni t a kt iv it as e nz im ( U /m L ) 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0,2
0,4 0,6 % Molase 0,8 1
Dari  Gambar  3  dapat  dilihat  bahwa enzim kitinase yang dihasilkan meningkat seiring  dengan  meningkatnya  konsentrasi molase  yang  ditambahkan  sampai  pada konsentrasi  0,5%  dengan  aktivitas  enzim
0,14726  (U/mL)  namun  setelah  itu mengalami penurunan. Hal ini dikarenakan  apabila  jumlah  molase  yang ditambahkan terlampau  besar  Aspergillus niger  akan  lebih  menggunakan  molase Untuk proses metabolismenya dibandingkan dengan menggunakan cangkang  rajungan  untuk  menghasilkan metabolit sekunder enzim kitinase.

## Optimasi konsentrasi cangkang rajungan
Enzim  kitinase  dari  Aspergillus  niger merupakan  golongan  enzim  induktif, dimana  proses  biosintesinya  memerlukan induser. Jika kitin yang berfungsi sebagai induser  tersebut  tersedia,  maka  induser akan mengikat protein repressor sehingga protein  repressor  mengalami  perubahan alosterik yang dapat mengubah bentuk dan menyebabkan  represor  tidak  lagi  mampu mengikat  ke  operator.  Akibatnya  RNA polimerase dapat mentranskripsi gen yang dibutuhkan  untuk  degradasi  kitin  dan bakteri  mampu  mensintesis  enzim  yang diperlukan untuk metabolismenya. Dalam hal  ini  digunakan  cangkang  rajungan sebagai sumber kitin karena melimpahnya kandungan yang dimiliki. Grafik hubungan  antara  konsentrasi  cangkang rajungan  dan  unit  aktivitas  enzim ditampilkan Gambar 4. Dari  Gambar  4  diperoleh  bahwa peningkatan konsentrasi induser berabanding  lurus  dengan  tingginya produksi enzim kitinase. Tahap ini hanya berlangsung hingga tercapainya konsentrasi optimum induser sebesar 2,0% dengan  aktivitas  enzim  0,12826  (U/mL), selebihnya produktivitas enzim mengalami penurunan. Konsentrasi
induser  yang  kecil  menyebabkan  afinitas pengikat  repressor  oleh  induser  rendah. Begitu  pula  sebaliknya,  konsentrasi induser  yang  terlalu  besar  menyebabkan kejenuhan  pada  produktivitas  enzim
kitinase. Karena konsentrasi induser yang terlampau  besar  dapat  menghambat terbentuknya  kompleks  enzim  substrat sehingga  produksi  enzim  tidak  berjalan maksimal.
Gambar  4. Profil  penentuan  konsentrasi cangkang rajungan

## Penentuan pH optimum enzim kitinase
Salah  satu  faktor  yang  mempengaruhi aktivitas  enzim  adalah  pH,  karena pengikatan  enzim  dengan  substrat  dan reaksi  katalisisnya  bergantung  pada interaksi  antara  substrat  dengan  rantai samping asam amnino penyusun sisi aktif enzim (Bender, 2002). Untuk mengetahui pH  optimum  enzim  kitinase,  dilakukan penambahan bufer dengan pH 3; 4; 5; 6; 7; dan  8  menggunakan  suhu  37 o C.  Kurva hubungan  antara  pH  dengan  aktivitas enzim ditampilkan pada Gambar 5.
Gambar  5. Pengaruh  pH  terhadap aktivitas enzim
Berdasarkan  Gambar  5  diperoleh  pH optimum  enzim  kitinase  adalah  6  karena menunjukkan  absorbansi  yang  terbesar dibanding  yang  lain  dengan  aktivitas enzim  0,1554  (U/mL).  Dalam  penelitian
U ni t a kt iv it as e nz im (U /m L ) 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 % Cangkang rajungan U ni t a kt iv it as e nz im (U /m L ) 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02  3 4 5 6 7 8
pH
ini  dilakukan  uji  pada  pH  3-7 menggunakan bufer sitrat fosfat dan pH 6- 8 menggunakan bufer fosfat.

## Penentuan suhu optimum enzim kitinase
Aktivitas  enzim  dipengaruhi  oleh beberapa  faktor,  salah  satunya  adalah suhu.  Hal  ini  dikarenakan  seperti  halnya pada reaksi kimia lainnya, tingkat katalisis reaksi oleh enzim akan meningkat seiring dengan  peningkatan  suhu  (Polgar,  1990).
Bertambahnya  suhu  sampai  dengan  suhu optimum menyebabkan terjadinya kenaikan  kecepatan  reaksi  enzim  karena bertambahnya energi kinetik yang mempercepat  gerak  enzim  dan  substrat.
Namun apabila enzim berada di atas suhu optimumnya maka aktivitas akan menurun.  Hal  ini  terjadi  karena  enzim termasuk  jenis  protein  yang  dapat mengalami  denaturasi  pada  suhu  tinggi. Denaturasi  ini  menyebabkan  perubahan pada  konformasi  enzim  akibat  adanya perenggangan  ikatan  hidrogen  yang bersifat reversibel sehingga dapat mempengaruhi  sisi  aktif  enzim  untuk berikatan  dengan  substrat  (Mulyani  dkk., 2009).
Untuk  mengetahui  suhu  optimum enzim  kitinase  dilakukan  penentuan  suhu optimum  pada  rentang  antara  20  –  60 o C dan menggunakan buffer pH 6, yakni pH optimum yang telah didapatkan sebelumnya.  Grafik  nilai  absorbansi hubungan  antara  suhu  dengan  aktivitas enzim ditampilkan Gambar 6.
Suhu ( o C )
Gambar  6. Pengaruh  suhu  terhadap aktivitas enzim
Dalam  penelitian  ini  diperoleh  suhu optimum  enzim  kitinase  40 o C  karena menunjukkan  absorbansi  yang  terbesar dibanding  menggunakan  suhu  inkubasi yang lain, dengan aktivitas enzim 0, 1377 (U/mL).  Suhu  optimum  enzim  kitinase dari Aspergillus niger ini tergolong cukup tinggi.  Hal  ini  dikarenakan Aspergillus niger bersifat  mesofilik  (Fardiaz,  1989) sehingga  enzim  yang  dihasilkan  juga bersifat tahan terhadap panas.

## Kesimpulan
Dari  penelitian  ini  didapatkan  bahwa jumlah  optimum  substrat  molase  yang ditambahkan  dalam  produksi  enzim kitinase dari Aspergillus niger adalah 0,5% (b/v)  dengan  aktivitas  enzim  yang dihasilkan  0,13776  (U/mL).  Sedangkan jumlah  optimum  substrat  cangkang rajungan  yang  ditambahkan  dalam produksi  enzim  kitinase  dari Aspergillus niger adalah  2,0%  (b/v)  dengan  unit aktivitas  enzim  yang  dihasilkan  0,07682 (U/mL).  Enzim  kitinase  dari Aspergillus niger yang  dihasilkan  mempunyai  pH optimum 6 dan suhu optimum 40 o C.

## Ucapan Terima Kasih
Terima  kasih  disampaikan  kepada Direktorat  Jenderal  Pendidikan  Tinggi yang  membiayai  penelitian  ini,  melalui Kontrak  Nomor:  004/SP2H/KPM/DIT. LITABMAS/V/2013

## Daftar Pustaka
Chen,  J.  K.,  Shen,  C.  R.  and  Liu,  C.  L. (2010). N-acetylglucosamine:
Production and Applications, Journal of Marine Drugs , 8, 2493 – 2516
Fardiaz,  S.  (1989). Fisiologi  Fermentasi , Pusat Antar Universitas ITB, Bandung Kholifah,  A.  (2013).  Pemurnian  Parsial dan Uji Stabilitas Enzim Kitinase dan β-1,3-Glukanase  dari  Cairan  Digestif Achatina  fulica, Skripsi ,  Jurusan Kimia  Fakultas  Sains  dan  Teknologi Universitas Airlangga, Surabaya
U ni t a kt iv it as e nz im (U /m L ) 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 20 30 40
Suhu (  C) 50 60
Maggadani,  B.  P.  (2012).  Optimasi Produksi  N-asetilglukosamin  dari Kitin  Menggunakan  Kitinase  Hasil Isolasi  Bakteri, Tesis ,  Pasca  Sarjana Universitas Indonesia, Depok Mulyani,  N.  S.,  Asy’ari,  M.  dan
Prasetiyoningsih, H. (2009). Penentuan Konsentrasi Optimum Oat
Spelt  Xylan Pada  Produksi  Xilanase dari Aspergillus  niger Dalam  Media PDB  ( Potato  Dextrose  Broth ), Journal Kimia Sains & Aplikasi , XII, 1 – 10 Patil, R. S., Ghormade, V. and Deshpande, M.  V.  (2000).  Chitinolytic  Enzymes Exploration, Enzyme  and  Microbial Technology , 26, 473 – 483 Sashiwa,  H.,    Fujishima,  S.,  Yamano,  N. Kawasaki,  N.,    Nakayama,  A., Muraki,  E.,  Hiraga,  K.,  Oda,  K.  and Aiba,  S.  (2002).  Production  of  N- Acetyl-D- glucosamine from α-Chitin by  Crude  Enzymes  from Aeromonas hydrophila H2330, Carbohydrate
Research, 337, 761  –  763.
Toharisman, A. (2007). Peluang Pemanfaatan  Enzim  Kitinase  Di Industri Gula, L aporan Hasil Penelitian , P3GI Pasuruan.
Widyanti,  E.  M.  (2010).  Produksi  Asam
Sitrat  Dari  Substrat  Molase  pada
Pengaruh  Penambahan  VCO  (Virgin
Coconut Oil) Terhadap Produktivitas Aspergillus Niger Itbcc L74 Terimobilisasi, Tesis ,  Universitas Diponegoro, Semarang