## Pengaruh Nutrisi Dan Suhu Terhadap Selektivitas Potensi Antibakteri Dari Bakteri Yang Berasosiasi Dengan  Spons

## Tutik Murniasih, Joko Tri Wibowo, Masteria Yunovilsa Putra, Febriana Untari dan Mery Maryani
Pusat Penelitian Oseanografi –Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Jl. Pasir Putih no. 1 Ancol Timur Jakarta 14430 Email : tuti007@lipi.go.id

## Abstract

## The Influence of nutrient and temperature to the  antibacterial selectivity of  Sponge Associated- Bacteria
Production  of  pharmacological  activity  by  marine  microorganism  is  strongly  influenced  by nutrition and environmental conditions. In this study  would  discuss about the influence of several type  of  media  to  the  production  of  antibacterial  agent  by  sponge-.  associated  microorganisms. About 3 sponges tissue Theonella sp , Callispongia sp. and Lithistide sp. collected from Seribu Island will be used for the host of associated microorganism. Agar medium used for isolation were M1 that contained  amylum,    yeast  extract  and  peptone,  M2  (10%  marine  broth  media)  contained  yeast extract and peptone, M3 only sea water without adding any nutrients. Beside the nutrient variation, heat  sock  treatment  at  50 o C  toward  the  sponge  solution  also  apply  to  this  study.  The  bacterial isolation data indicated that bacterial density in (CFU/100µL) of  Theonella sp, Callispongia sp. and Lithistide sp.  were  minimum  when  spreading  in  M3  medium  with  heat  sock  treatment.  This  data showed that limiting in nutrient and heating could increasing bacterial selectivity. The antibacterial activity capability of bacterial strains isolated using M1, M2 and M3 respectively in range were 81,8- 90,9%; 50-87,5% and; 66,7 -100%. This results showed that less nutrient of media will rise the number of  antibacterial  activity  strains,and  decreasing  of  bacterial  density.  This  study  reported  that  the minimum  nutrient  of  isolation  media  and  heat  shock  treatment  could  be  used  for  selecting  the antibacterial strains of sponge associated bacteria.
Keywords : isolation media, antibacterial, nutrient, microbial symbiont

## Abstrak
Aktifitas farmakologi yang dihasilkan oleh mikroorganisme laut sangat dipengaruhi oleh nutrisi dan  kondisi  lingkungan.  Hal  tersebut  mendorong  untuk  digali  lebih  dalam  tentang  aspek-aspek yang  mempengaruhi  seleksi  mikroba  potensial  pada  spons.  Metode  isolasi  mikroba  dari  jaringan spons  menjadi  kunci  dalam  menguak  potensi  mikroba  simbionnya.  Dalam  penelitian  ini  akan membahas  pengaruh  berbagai  media  isolasi  bakteri  yang  berasosiasi  dengan  spons  asal  Kep. Seribu. Terhadap 3 specimen spons Theonella sp., Callispongia sp. dan Lithistide sp. dilakukan isolasi bakteri  dengan  metode direct  sampling menggunakan  media  M1,  M2  dan  M3.  Media  M1 mengandung  nutrisi  antara  lain  amilum,  ekstrak  khamir  dan  pepton,  sedangkan  media  M2 mengandung  sumber  nutrisi  ekstrak  khamir  dan pepton  dan  M3  hanya media  agar  dan  air  laut. Selain  variasi  nutrien  dalam  media,  perlakuan  pemanasan  pada  suhu  50 o C  juga  akan  dilakukan terhadap  larutan  sampel  spons  sebelum  dilakukan  penyebaran  pada  media  isolasi.  Hasil  isolasi bakteri  yang  diisolasi  spons Theonella sp, Callispongia sp.  dan Lithistide sp.  menunjukkan  bahwa kepadatan  minimum  diperoleh  dengan  menggunakan  media  M3  dengan  perlakuan pemanansan.  Dari  data  isolasi  bakteri  menunjukkan  bahwa  selain  kandungan  nutrien  yang minimum,  perlakuan  pemanasan  akan  menurunkan  kepadatan  jumlah  bakteri  yang  tumbuh, sehingga  pemanasan  merupakan  salah  satu  cara  dalam  seleksi  isolasi  bakteri  yang  berasosiasi
dengan  spons.  Hasil  analisis  aktivitas  antibakteri  menunjukkan  bahwa  persentase  strain-strain bakteri  yang  aktif  terhadap  antimikroba Vibrio  eltor,  Eschericia  coli  dan  Bacillus  subtilis dengan variasi media M1 berkisar antara 81,8-90,9%;  M2 berkisar 50-87,5% dan M3 berkisar 66,7-100%. Dari data tersebut disimpulkan bahwa semakin sedikitnya nutrisi media isolasi maka semakin tingginya mikroba-mikroba  potensial  penghasil  antibiotik.  Media  M3  merupakan  media  yang  selektif  untuk isolasi  mikroba  potensial  dari  spons,  terbukti  dengan  tingginya  prosentase  bakteri  yang  aktif  dan berkurangnya jumlah koloni yang tumbuh.
Kata kunci : media isolasi, antibakteri, nutrisi, mikroba simbion

## PENDAHULUAN
Spons  merupakan  biota  laut  yang menduduki peringkat tertinggi untuk produksi senyawa bahan alam yang sangat potensial mempunyai  aktifitas  farmakologi.  Dengan tekstur  tubuh  yang  berpori  dan  system  filter feedernya,  spons  merupakan  reservoir  bagi mikroba  laut.  Kurang  lebih  40  %  dari  volume tubuh  spons  merupakan  mikroba  yang berasosiasi  (Vacelet  dan  Donadey,  1977). Adanya  hubungan  biosintesis  metabolit sekunder antara spons dengan mikroba yang berasosiasi  telah  dilaporkan  dari  beberapa studi  sebelumnya  (Thomas et  al .,  2010).  Acid Homoserine  Lactone(AHL)  sinyal  merupakan media  untuk  komunikasi  genetik  antar  spons dan  bakteri  simbion  (Taylor et  al .,  2004). Hubungan  simbiosis  antara  spons  dan mikroba laut dapat terjadi secara mutualisme, komensalisme maupun parasitisme. Salah satu hubungan mutualisme yang  terjadi  adalah  kerjasama  dalam pemenuhan  nutrisi.  Sebagai  contoh  yang terjadi  pada  sianobakteri,  selain  membantu spons  dalam  pemenuhan  energi  melalui proses fotosintesis, sianobakteri juga berfungsi membantu proses fiksasinitrogen. Hampir 50% kebutuhan  energi  spons  disuplai  oleh sianobakteri,  terutama  untuk  spons-spons yang  hidup  didaerah  tropis.  Sedangkan tubuh  spons  digunakan  sebagai  tempat hidup  bagi  sianobakteri  (Eid  dan  Larsen, 2008).
Seleksi  mikroba  yang  bersimbiosis dengan  spons,  dipengaruhi  oleh  kandungan nutrien  dan  kondisi  lingkungan  seperti  suhu, salinitas  dan  pH.Selain  itu,  jenis  biota  inang dan  perbedaan  kandungan  nutrien  menjadi kunci  dalam  seleksi  mikroba  penghasil metabolit sekunder yang potensial (Hassan et al. ,  2015).  Kondisi  stress  (suhu,  kekurangan
nutrien,  tekanan  dll)  akan  memicu  bakteri untuk menghasilkan metabolit spesifik. Perlakuan  ―heat  shock‖  akan  menyebabkan bakteri  memproduksi  protein  heat  shock (phs)(Bukau,  1993).  Sedangkan  perlakuan pemberian minimum nutrien, akan menginduksi  bakteri  dalam  pertahanan terhadap  panas,  osmotic  dan  peroksida (Koga et al ., 1996) dan suhu dingin (Jiang et al. ,  1996;    Wong et  al. ,  2002).  Pada  studi  ini akan  dilakukan  variasi  nutrien  pada  media isolasi  bakteri  yang  diisolasi  dari  spons  asal Kepulauan  Seribu.  Media  dengan  nutrien rendah,  sedang  dan  tinggi  digunakan  untuk mengetahui media optimum dalam mendapatkan  bakteri  potensial  penghasil senyawa  aktif.  Selain  itu  juga  diperlakukan stress suhu (heat shock) untuk memicu bakteri memproduksi senyawa aktifnya.

## MATERI DAN METODE
Sampel  spons  diambil  dari  perairan Untung  Jawa  Kepulauan  Seribu.  Sebanyak  3 spesimen  spons Theonella sp, Callispongia sp. dan Lithistide sp.  kemudian  diisolasi  bakteri simbionnya.  Media  yang  digunakan  untuk isolasi  adalah  :  M1  dengan  komposisi  tiap liternya  adalah  16  g  agar,  10  g  amilum,  4  g ekstrak  khamir,  2  g  pepton  dan  50  mg nystatin dalam air laut. Media M2 merupakan 10% media marine(pronadisa) yang mengandung  1,94  g  natrium  klorida,  0,8g magnesium  klorida,  0,5  g  pepton,  3,24  g natrium  sulfat,  0,18g  kalsium  klorida,  0,1  g ekstrak khamir, 0,055 g kalium klorida, 0,016 g sodium bikarbonat, 0,01g Fe (II) sitrat, 0,008 g kalium  bromide,  0,0034  g  stronsium  klorida, 0,0022  g  asam  borat,  0,0008  g  disodium fosfat, 0,0004 g natrium silikat, 0,00024 natrium fluoride,  0,00016  amonium  nitrat  dan  16  g agar. Media M3 terdiri dari agar dan air laut tanpa  penambahan  nutrien.  Bahan  kimia
yang  digunakan  untuk  ekstraksi  adalah  etil asetat (Merck), aseton dan methanol (Merck)
Isolasi Bakteri .
Metode isolasi yang digunakan adalah metode ―direct sampling‖. Terdapat perlakuan  suhu  terhadap  sampel  sebelum dilakukan isolasi yaitu tanpa pemanasan dan dengan  pemanasan /heat shock pada suhu 50 o C, selama 40 menit sebelum penyebaran dengan  pengenceran  seri  (10 -0 ,  10 -1 ,  10 -2 ,  10 - 3 ).  Adapun  media  yang  digunakan  adalah media  M1,  media  M2  dan  media  M3. Sesudah dilakukan inokulasi, inokulum diinkubasi  pada  suhu  28 o C.  Isolasi  koloni mulai  dilakukan  sesudah  7-14  hari  masa inkubasi. Sebelum diisolasi dilakukan penghitung  koloni  untuk  dikonfirmasikan menjadi  satuan  CFU.  Isolasi  bakteri  dilakukan dengan pengambilan
single
koloni menggunakan  ose.  Koloni  diperbanyak menggunakan  media  yang  sama  dengan media  saat  isolasi.  Untuk  preservasi,  1  ose koloni  ditanam  pada  media  20%  gliserol dalam  media  marine  broth  dan  disimpan dalam suhu dingin(-80 o C).

## Fermentasi dan Ekstraksi
Strain mikroba sesudah diisolasi dilakukan
kultur sebanyak 100 µL, menggunakan medium  air laut, yeast (0,1 g) dan  pepton  (0,5  g).  Sebelum  diinokulasi, masing-masing isolat diprakultur sebanyak 10 mL. Selanjutnya dilakukan inkubasi menggunakan  shaker  incubator  suhu  28 o C, 150  rpm  selama  72  jam.  Kultur  dipanen  dan dilakukan  sentrifugasi.  Pellet  di  ekstrak menggunakan  aseton  dan  supernatant diekstrak dengan etil asetat. Ekstrak dikeringkan menggunakan rotavapor, sesudah  kering  dilarutkan  dalam  1  mL
methanol  dan  disimpan  di  lemari  pendingin sebelum dilakukan uji antibakteri.

## Uji Antibakteri
Metode  yang  digunakan  adalah metode  difusi  agar  (Bauer,  1996).  Terhadap esktrak  bakteri  dilakukan  uji  antibakteri dengan  kandungan  ekstrak  disetiap  kertas cakram  adalah  50µg/20µL.  Bakteri  yang digunakan  sebagai  bioindikator  adalah Bacillus  subtillis  (Bs),  Vibrio  eltor  (Ve) dan Eschericia  coli  (Ec) dengan  konsentrasi 1,0x10 6 . Media  yang  digunakan  adalah Muller  Hinton  Agar  (MHA)  untuk  Bs  ,  Ve.  Dan untuk  Ec  digunakan  Nutrien  Agar.  Masing- masing  bakteri  diinkubasi  pada  suhu  30 0 C selama 12 Jam.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  inokulasi  bakteri2  yang  berasosiasi dengan  spons Theonella sp., Callispongia sp. dan Lithistide sp. pada M1. M2 dan M3. Isolasi bakteri  spons Theonella sp.  menunjukkan kepadatan  tertinggi  dengan  menggunakan media  M1,  sedangkan  dengan  pemanasan kepadatan  tertinggi  menggunakan  media M2  (Tabel  1).  Sedangkan  kepadatan terendah  dengan  menggunakan    media isolasi  M3  dengan  pemanasan.  Sedangkan isolasi  bakteri  spons Callispongia sp.  tanpa pemanasan    maupun  dengan  pemanasan menunjukkan  kepadatan  tertinggi  pada media  M1.  Untuk  kepadatan  terendah dengan  menggunakan  media  M3  dengan pemanasan. Isolasi bakteri spons Lithistide sp. pada perlakuan tanpa pemanasan menujukkan  kepadatan  tertinggi  pada media  isolasi  M3,  namun    dengan pemanasan menunjukkan kepadatan tertinggi  pada  media  M1.  Kepadatan terendah dengan menggunakan media M3
Tabel 1 . Kepadatan bakteri spons dalam berbagai media isolasi
Perlakuan Sampel Nilai CFU/100 µL dalam media M1 M2 M3 Tanpa pemanasan Theonella sp. 1,0x10 4 7,4x10 2 5,1x10 3 Callispongia sp.  2,4x10 4 1,6x10 2 - Lithistide sp. 4,0x10 3 1,3x10 3 1,8x10 4
Dengan pemanasan 50 o C Theonella sp. 3,4x10 1 3,3x10 2 6,0x10 Callispongia sp.  - 3,1x10 2 1,0x10 Lithistide sp. 2,9x10 3 1,8x10 3 4,0x10 2
dengan  pemanasan.  Dari  hasil  isolasi  ketiga spons  menunjukkan  bahwa  rata-rata  koloni terbanyak  didapatkan  dengan  media  isolasi M1  tanpa  pemanasan  dan  koloni  terendah didapatkan mengunakan media M3 dengan pemanasan.  Jika  ditelaah  media  M1 mengandung  nutrisi  yang  lengkap  sumber karbon  dan  nitrogennya,  sedangkan  media M3  mengandung  media  yang  miskin  sumber karbon  dan  nitrogen.    Komposisinya  media M3  mengandung  air  laut  dan  agar,  media M2  mengandung  agar,  yeast  dan  pepton, sedangkan  media  M1  mengandung  agar, yeast,  pepton  dan  amilum.  Studi  optimasi media  kultivasi  pada  isolasi  mikroba  yang berasosiasi  dengan    spons Cymbastela concentrica , Tedania sp.  dan Scopalina sp menunjukkan  bahwa  media  dengan  kaya nutrisi  akan  menghasilkan  bakteri  dengan keragaman  morfologi  dan  genetik  yang tinggi (Taylor et al. , 2007).
Kepadatan bakteri dari spons Theonella sp. untuk ketiga media M1, M2 dan M3 tanpa dilakukan  pemanasan  berkisar  7,4x10 2 –
1,0x10 4 , Dengan adanya perlakuan pemanasan  kisaran  kepadatan  bakteri berkisar antara
6,0x10-3,3x10
2 . Kisaran kepadatan  bakteri  yang  diisolasi  dari  spons Callispongia sp. tanpa perlakuan pemanasan berkisar  1,0x10 2 -1,0x10 4 ,  sedangkan  dengan pemanasan  berkisar  antara  1,0x10-3,1x10 2 . Untuk  kepadatan  bakteri  yang  diisolasi  dari spons Callispongia sp.  tanpa  pemanasan berkisar  1,3x10 3 -1,3x10 4 ,  dengan  pemanasan
adalah  4,0x10 2 -2,9x10 3 .  Dari  data  isolasi bakteri  menunjukkan  bahwa  perlakuan pemanasan  akan  menurunkan  kepadatan jumlah  bakteri  yang  tumbuh,  sehingga pemanasan  ―heat  shock‖  merupakan  salah satu  cara  dalam  seleksi  isolasi  bakteri  yang berasosiasi  dengan  spons.  Hal  ini  sesuai dengan tujuan perlakuan ―heat shock‖  yaitu untuk mendapatkan bakteri yang mempunyai metabolit spesifik. Selain itu profil kepadatan  bakteri  akan  menurun,  sehingga akan  memudahkan  dalam  perlakuan  isolasi nya.
Dari data tersebut menunjukkan bahwa kombinasi  perlakuan  nutrisi  yang  rendah dengan  pemanasan  akan  menurunkan kepadatan  bakteri  yang  diisolasi  dari  spons. Selain  kepadatannya,  bagaimana  dengan pengaruh aktivitas antibakterinya.
Isolasi bakteri
spons dengan menggunakan  media  M3  media  dengan nutrien  minimum  akan  menghasilkan  strain- strain  bakteri  yang  potensial  (Gambar  1). Terutama  terhadap Vibrio  eltor dan Bacillus subtilis aktivitasnya  mencapai  100%  dari bakteri  yang  diuji.  Salah  satu  cara  untuk memicu  produksi  antibiotik  pada  mikroba adalah  dengan  mengurangi  nutrisinya (Demain  dan  Carlo,  2006).  Kurangnya asupan  energi  akan  menyebabkan  bakteri beradaptasi  dengan  perubahan  fungsi fisiologinya  (Murinova  dan  Dercova,  2014). Kemampuan bakteri dalam menjaga
Gambar  1 .  Prosentasi  koloni  bakteri  yang  mempunyai  aktivitas  antibakteri  dengan  variasi  media tumbuh
fungsi  biologi  pada  kondisi  stress  akan mengakibatkan perubahan kandungan protein,  sterol,  hopanoid  dan  karotenoid, namun  mayoritas  perubahan  terjadi  pada komposisi  membrane  lipid  (Heipieper et  al ., 1994; Weber dan DeBont, 1996). Berdasarkan data-data  di  atas  disimpulkan  bahwa kurangnya  nutrisi  pada  media  isolasi,  akan memicu tingginya mikroba-mikroba potensial penghasil antibiotik, walaupun tingkat viabilitas  pertumbuhannya rendah.

## KESIMPULAN
Jenis  media  isolasi  sangat  berkorelasi dengan kandungan nutrien didalamnya dan hal  tersebut  sangat  berpengaruh  terhadap kepadatan  dan  produktivitas  metabolit sekundernya. Kandungan nutrien yang tinggi akan  menghasilkan  jumlah  koloni  yang banyak  atau  viabilitas  tinggi,  namun kemampuan  aktivitas  antibakteri  dari  bakteri yang  tumbuhnya  kecil.  Dengan  perlakuan kekurangan  nutrien  baik  sumber  karbon maupun sumber nitrogen pada media isolasi, maka  koloni  yang  tumbuh  lebih  sedikit namun  kemampuan  aktifitas  antibakterinya lebih  tinggi.  Perlakuan  pemberian  nutrien yang  minimum  dapat  digunakan  sebagai salah  satu  cara  dalam  menyeleksi  bakteri yang  potensial  menghasilkan  substasi  aktif antibakteri.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  sangat  berterima  kasih  kepada Prof.  Peter  Schupp,  atas  kontribusinya  dalam training  metode  isolasi  mikroba  laut  dan Lembaga  Ilmu  Pengetahuan  Indonesia  yang telah  memberikan  dana  penelitian  melalui program Unggulan Pangan dan Obat.

## DAFTAR PUSTAKA
Bauer,  A.W., Kirby, W.M., Sherris, J.C.  &  Turek, M.  1996.  Antibiotic  Susceptibility  Testing by  a  Standardized  Single  Disk  Method. Am. J. Clin. Pathol . 45(4):493-498.
Bukau,  B.  1993.  Regulation  of  the Escherichia coli Heat-Shock Response. Mol. Microbiol . 9(4):671-680.
Eid,  M.,  &  Larsen,  R.  J.  2008. The  science  of subjective well-being . Guilford Press. Hassan, S.W.M., Raouf, U.M. & Ali, M.A.R. 2015.
Antagonistic Interactions and
Phylogenetic  Diversity  of  Antimicrobial Agents  Producing  Marine  Bacteria  in Suez  Bay. Egyp.  J.  Aqua.  Res. 41:57-67.
DOI : 10.1016/j.ejar.2015.02.005.
Heipieper,  H.  J.,  Weber,  F.  J.,  Sikkema,  J., Keweloh,  H.,  &  de  Bont,  J.  A.  1994. Mechanisms  of  resistance  of  whole  cells to  toxic  organic  solvents. Trends  in Biotechnol. 12(10):409-415.
Jiang, X., &  Chai, T.  J.  1996.  Survival  of Vibrio parahaemolyticus  at  low  temperatures under
starvation
conditions and subsequent  resuscitation  of  viable, nonculturable cells. App. Environ. Microbiol. 62(4):1300-1305.
Koga,  T.,  Nakajyo,  Y.,  &  Komoto,  A.  1996. Detection of Hsp60 (GroEL) ‐ like proteins in Vibrio  parahaemolyticus  and  vibrio species  by  Western  immunoblotting analysis. Lett.  App.  Microbiol. 23(5):295- 298.
Murinova,  S  &  Dercova,  K.  2014.  Response Mechanisms  of  Bacterial  Degrades  to Environmental Contaminants on the level of Cell walls and cytoplasmis membrane. Int. J. Microbiol. 2014:1-16  DOI : 10.1155/ 2014/873081
Taylor,  M.W.,  Schupp,  P.J.,  Baillie,  H.J., Charlton,  T.S.,  De  Nys,  R.,  Kjelleberg,  S.  & Steinberg,  P.D.  2004.  Evidence  for  acyl homoserine  lactone  signal  production  in bacteria associated with marine
sponges.
App. Environ. Microbiol.
70(7):4387-4389.  DOI  :  10.1128/AEM.70.7. 4387.4389.2004.
Taylor, M. W., Radax, R., Steger, D., & Wagner, M. 2007. Sponge-associated microorganisms:  evolution,  ecology,  and biotechnological  potential. Microbiol. Molecul Biol. Rev. 71(2):295-347.
Thomas,  T.  R.  A.,  Kavlekar,  D.P.  & LokaBharathi,  P.A.  2010.  Marine  drugs from  sponge-microbe  association—A review. Mar.  Drugs 8(4):1417-1468.  DOI  : 10.3390/md 8041417.
Vacelet,  J.,  &  Donadey,  C.  1977.  Electron microscope  study  of  the  association between some sponges and bacteria. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 30(3):301-314. Weber, F.J., & de Bont, J.A. 1996. Adaptation mechanisms  of  microorganisms  to  the toxic  effects  of  organic  solvents  on membranes. Biochimica  et  Biophysica
Acta  (BBA)-Reviews  on  Biomembranes .
1286(3): 225-245.
Wong,  H.C.,  Peng,  P.Y.,  Lan,  S.L.,  Chen,  Y.C., Lu,  K.H.,  Shen,  C.T.,  &  Lan,  S.F.  2002.
Effects of
heat
shock on the
thermotolerance,  protein  composition, and toxin production of Vibrio parahaemolyticus . J.  Food  Protect.
65(3):499-507.