## EFEK ANTIFUNGAL KITINASE AKAR SEMAI TUSAM YANG TERINFEKSI EKTOMIKORIZA (CHIT 52) TERHADAP
R. SOLANI dan FUSARIUM SP.

## Alfina Handayani
Balitbang Provinsi Jawa Tengah

## ABSTRACT
Tusam  is  a  fast  growing  tree,  adaptable  and  useful  in  industry.  Mycorrhizal association protect tusam from root pathogen. Disease protection by mycorrhizal fungi has been  associated  with  several  mechanism,  one  of  which,  antifungal  substances  chitinase. However,  chitinase  accumulation  in  tusam  during  mycorrhizal  symbiosis  is  not  fully understand. The objective of the research was to determine the effect of chitinase antifungal activity  of  CHIT  52  that  purified  from  4  weeks  age  of  tusam  seedling  root.  Tusam inoculated  with  tusam  stands  soil  from  Kaliurang  as  fungi  inoculate.  The  enzyme  was purified  by  ammonium  sulfat  precipitation,  dialysis,  followed  by  gel  filtration chromatography.  Purified  enzyme  applied  in  R.  Solani  dan  Fusarium  sp.  mycelia.  The results  showed  that  CHIT  52  can  block  fusarium  sp.  mycelia  but  in  same  enzyme concentration, CHIT 52 cannot block R. solani mycelia.
Keywords: Chitinase, Tusam, R. solani, Fusarium sp, mycorrhiza

## PENDAHULUAN
Tusam ( Pinus merkusii Jungh. et de  Vries) merupakan  komoditas  hutan yang cukup penting untuk dikembangkan di  Indonesia.  Tusam  memiliki  beberapa kelebihan antara lain: kemampuan
tumbuhnya yang cepat, mampu beradaptasi pada tanah yang kurang subur dan  mampu  tumbuh  di  dataran tinggi. Tusam  juga  mempunyai  nilai  ekonomis yang  cukup  tinggi  dalam  bidang  industri (Soerianegara  dan  Lemmens,  1996). Kendala  utama  yang  dihadapi  dalam pengembangan  tusam  berkaitan  dengan masih  rendahnya  kualitas  dan  kuantitas semai  tusam.  Persemaian  tusam  banyak mengalami  kegagalan  akibat  serangan patogen  peyebab  penyakit  rebah  semai ( damping off ). Patogen penyebab penyakit  rebah  semai  yang  banyak menyerang  tusam  antara  lain  jamur Fusarium  sp. dan R.  solani .    Penelitian yang  dilakukan  Sumardi  dan  Widyastuti
(2000)  menunjukkan  bahwa  kegagalan penyediaan  bibit  tusam  di  Indonesia khususnya  di  Jawa  Tengah  banyak disebabkan  oleh  jamur  patogen  tular tanah Fusarium sp.,  dengan  tingkat serangan mencapai 45%.
Inokulasi mikoriza ternyata mampu  melindungi  semai  tusam  dari serangan patogen terutama patogen penyebab penyakit rebah semai ( dumping off) seperti R.  solani dan Fusarium sp. Jamur-jamur  ini  bersifat  fakulatif  dapat hidup  di  atas  permukaan  tanah  secara sapofit dan dapat  berubah sebagai  parasit apabila kondisinya memungkinkan. Mekanisme  perlindungan  tanaman  oleh jamur  mikoriza-ekto  berkaitan  dengan kemampuannya  dalam:  1)  barier  fisik yaitu adanya mantel jamur yang menyelimuti perakaran  tanaman,  2) antibiosis, 3) sintesis substansi antifungal (Duschene, 1996).
Respon  tanaman  akibat  adanya jamur  mikoriza  salah  satunya  melalui akumulasi patogen  related  protein yaitu kitinase.  Infeksi  mikoriza  pada  akar tanaman  mampu  meningkatkan  aktivitas kitinase  (Albrecth et  al .,  1994,  Pozo, et al., 1998).  Kitinase  (EC  3.2.1.14) merupakan  enzim  yang  berperan  dalam mekanisme  ketahanan  tanaman.  Kitinase berfungsi dalam hidrolisis kitin, homopolimer linear  -1,4 N - acetilglukosamin  (Cabib,  1987,  Hunyh, 2002).
Enzim  kitinase  yang  terimbas akibat  adanya  respon  masuknya  hifa jamur  mikoriza  pada  tanaman  tusam sudah  dikarakterisasi  yaitu  CHIT  52 (Handayani, et.al., 2005).  CHIT  52 diduga berperan penting dalam mengimbas  reaksi  ketahanan pada tusam. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh  aktivitas antifungal kitinase CHIT  52  secara  invitro  pada  jamur penyebab penyakit damping off, R. solani dan Fusarium sp.  Apabila terbukti  secara invitro  kitinase    yang  dimurnikan  dari semai tusam yang terinfeksi ektomikoriza mampu  menghambat  koloni  jamur R. solani dan Fusarium sp  maka  penelitian ini  dapat  memberikan  informasi  lebih jauh  mengenai  peran  mikoriza  dalam mengimbas  mekanisme  ketahanan  pada tanaman.
BAHAN DAN METODA Inokulasi. Jamur mikoriza diinokulasi dengan menggunakan campuran    inokulum  tanah  bermikoriza yang  berasal  dari  tanah  tegakan  tusam  di Kaliurang dan pasir steril dengan perbandingan  30%  dan  70%.  Semai tusam  yang berumur 4  minggu kemudian diekstraksi.
Ekstraksi. Prosedur ekstraksi berdasar  metode  Vannini, et  al. (1999) Semua  prosedur  kerja  dilakukan  pada suhu 4 o C kecuali disebutkan lain. Sampel
akar sebanyak 50 g yang telah dimasukkan  dalam  –80 o C  ditumbuk dengan  menggunakan  mortar  sampai menjadi  serbuk,  kemudian  ditambahkan larutan bufer 100 ml 0,05 M Tris HCl pH 8,2 yang mengandung 15 ml 0,5 M NaCl 5%  Polyvynilpirolidone  dan  15  ml  7,5% mercaptoetanol  selama  satu  jam  setelah itu  disentrifugasi  3500  rpm  selama  35 menit.
Uji  aktivitas  kitinase. Volume ekstrak protein sebanyak 0,1 ml ditambahkan  ke  dalam  campuran  0,05% glikol  kitin  dalam  50  mM  bufer  asam asetat pH 5 sampai volume 1 ml (Hou et al., 1998).  Campuran  diinkubasikan dalam  waterbath  pada  suhu  37 o C  selama 30  menit.  Reaksi  dihentikan  dengan sssspenambahan  0,5  ml  DNS  selanjutnya campuran dimasukkan dalam air mendidih  selama  15  menit  (Wen et  al ., 2002).  Absorbansi  sampel  dilihat  pada OD540  nm,  visible.  Hasil  pembacaan absorbansi  dihitung  menggunakan  kurva standar  N-acetylglukosamin.  Satu  Unit aktivitas  kitinase  didefinisikan  sebagai jumlah  enzim  yang  diperlukan  untuk melepaskan  1  l    gula  reduksi  selama  1 menit pada suhu 37 o C.
Pemisahan protein. Crude protein dipekatkan  dengan  menggunakan amonium  sulfat  70%,  disentrifugasi dengan  kecepatan  3500  rpm  selama  30 menit.  Pelet diresuspensi dengan aquades kemudian didialisis menggunakan 20 mM bufer  tris  HCl  pH  8,2  selama  semalam. Hasil  dialisis  dipekatkan  dengan  PEG 35.000. Protein  dalam dialisat  dipisahkan lebih lanjut dengan menggunakan kromatografi  gel  filtrasi  dengan  matriks Sepachril S-300 HR (Pharmacia, biotech) pada  kolom  dengan  ukuran  1x  60  cm. Start  bufer dan  bufer  elusi  yang digunakan  adalah  20  mM  bufer  tris  HCl pH  8,2.  Fraksi  dikoleksi  setiap  2  ml dengan  kecepatan  alir  6  ml/jam  dengan tekanan pompa 20. Fraksi yang
menunjukkaan
aktivitas kitinase
dipekatkan dengan PEG (Hartman, et  al., 1993).
Karakterisasi kitinase. SDS PAGE  12,5%  mengacu  kepada  metode dasar Laemmli (1970). Protein divisualisasikan menggunakan silver stain. Berat molekul kitinase didapat dari
persamaan  regresi  log  berat  molekul standar dengan mobilitas relatif (rf). Suhu optimal diketahui
dengan menginkubasikan  enzim  substrat  pada kisaran  20-80  C.  Nilai  pH  optimal  dicari pada  kisaran  pH  3-8  dalam  larutan  bufer asam  sitrat,  asam  asetat  dan  phosphat sampai  diperoleh  kisaran  pH  yang dikehendaki.
Uji  aktivitas  antifungal  kitinase terhadap  Fusarium  sp.  dan R.  solani. Uji aktivitas antifungal kitinase dilakukan dengan  menggunakan  metode cup  plate . Medium water  agar (WA)  disiapkan dengan  konsentrasi  agar  3%  (w/v).  WA dicairkan terlebih dahulu kemudian sebanyak  5  ml  dituang  ke  dalam  cawan Petri.  Setelah  beku  empat  ring  plastik dengan  diameter  5  mm  diletakkan  pada keempat  jari-jari  cawan  Petri  dengan jarak sama. Setelah semua silinder tertata rapi water  agar sebanyak  10  ml  dituang di atas lapisan sebelumnya dan kemudian setelah membeku keempat silinder diambil,  sehingga  diperoleh  lubang  pada permukaan dengan ukuran dan jarak yang seragam.  Potongan  koloni Fusarium sp. dan R.  solani ditumbuhkan  di  tengah- tengah  cawan  Petri.  Setelah  biakan berumur  kurang  lebih  dua  hari  atau  pada saat  miselia  jamur  sudah  mencapai  jarak ±  1  cm  dari  lubang  tiap  lubang  diisi larutan enzim. Selain dengan metode cup plate pengujian  dilakukan  pula  dengan menggunakan kertas  saring Whatman  No 4 . Medium  PDA  dicairkan,  kemudian  5 ml  media  diletakkan  pada  cawan  Petri steril  dan  diratakan.  Potongan  koloni Fusarium sp.  diletakkan  pada  tengah
cawan  Petri.  Setelah  miselia  jamur berkembang kurang lebih 2 hari, potongan  kertas  saring  steril  yang  sudah dipotong  bulat-bulat  dan  diaplikasikan larutan  enzim  dalam  buffer  asetat  pH  5 diletakkan  pada  keempat  jari-jari  cawan. Zona  penghambatan  diamati  setelah  3 hari.
Pengamatan mikroskopi.
Miselia  jamur  diambil  dari    kultur R.
solani dan Fusarium sp. yang ditumbuhkan pada suhu 30 o C selama tiga hari pada medium PDA. Miselia ditumbuhkan  pada water  agar 3%  (w/v) yang diletakkan pada gelas benda cekung dan  dijaga  dalam  kondisi  lembab  selama semalam.  Setelah  inokulasi  selama  24 jam  pada  gelas  benda,  protein  dengan konsentrasi  0,156  g/ml  sebanyak  10  l enzim kitinase dalam buffer asetat pH 5,6 hasil  pemisahan  kromatografi  gel  filtrasi diteteskan  pada water  agar 3%  (w/v). Slide selanjutnya  diamati  tiap  interval waktu  30  menit  dengan  menambahkan laktofenol  blue menggunakan  mikroskop phase contrast dan divisualisasikan menggunakan kamera Nikon.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemurnian kitinase.
Pemisahan kitinase diawali dengan  pengendapan  protein  dengan menggunakan  amonium  sulfat  70%. Fraksi-fraksi hasil elusi selanjutnya diukur  serapannya  pada  OD 280  nm untuk melihat gambaran pola pemisahan protein sampel.  Fraksi-fraksi  yang  membentuk puncak pada OD 280  nm yaitu fraksi  nomor 17 sampai fraksi 39 (Gambar 1). Gambar 1 juga menunjukkan bahwa setelah proses elusi  dengan  menggunakan  bufer  Tris- HCl  pH  8,2,  protein  yang  terikat  pada matriks  setelah  fraksi  ke  26  semakin berkurang.  Hal  ini  dapat  dilihat  dari penurunan  nilai  absorbansi  280  nm  pada fraksi  berikutnya.  Fraksi-fraksi  yang membentuk  puncak  tersebut  selanjutnya
dianalisis  aktivitas  kitinasenya.  Aktivitas kitinase  tertinggi  pada  fraksi  no  21,  22
dan 23.
Rekapitulasi  pemisahan  dengan kromatografi  gel  filtrasi  menghasilkan tingkat  pemisahan  yang  lebih  baik  jika dibandingkan dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat dan dialisis seperti dirujuk pada Tabel 2. Kromatografi gel filtrasi mampu
mengurangi  jumlah  protein  total  cukup banyak  dari  0,01943  menjadi  0,00093 (kurang  lebih  20  kali  dari  tahap sebelumnya), sedangkan aktivitas kitinase berkurang mencapai kurang lebih 6,8 kali dari tahap sebelumnya.
Tabel 1 . Rekapitulasi pemisahan kitinase akar semai tusam
Langkah Pemurnian Protein Kitinase Tingkat pemurnian Recovery (%) Vol (ml) Protein total (mg) Konsentrasi (unit/ml) Aktv. spesifik (unit.mg -1 ) Jumlah total (unit tot) Crude protein 100 0,12930 0,00106 0,008198 0,10600 1 100,00 Pengendapan amonium sulfat dan dialysis 25 0,01943 0,00090 0,046641 0,02265 5,69 21,37 Sephacril S-300 HR 6 0,00093 0,00055 0,594624 0,00332 72,53 3,13 Sumber:  Data Primer (diolah)
Gambar 1 . Profil Elusi Protein kolom kromatografi gel filtrasi dan aktivitas kitinase. Aktivitas kitinase tertinggi pada fraksi  ke 21,22,23.
Pemisahan  dan  berat  molekul protein  dicari  dengan  menggunakan  SDS
PAGE 12,5% dan divisualisasikan menggunakan  silver  stain  kemudian dihitung  menggunakan  kurva  kalibrasi mobilitas  relatif  polipeptida  standar. Kurva  kalibrasi  diukur  dari  jarak  migrasi protein  standar  mulai  dari  sumuran tempat  migrasi  protein  yang  selanjutnya digunakan  sebagai  sumbu  x.  Ukuran fragmen protein standar dibuat logaritmanya dan nilai logaritma dijadikan sebagai nilai sumbu y. Persamaan kurva kalibrasi tersebut menunjukkan berat molekul kitinase yang dihasilkan sekitar 52 kDa yang selanjutnya  disingkat  menjadi  CHIT  52 (Handayani ,et.al. 2005)
Uji  Aktivitas  Antifungal  CHIT  52 Terhadap Pertumbuhan Koloni
R. solani.
Uji  aktivitas  antifungal  kitinase menggunakan  metode cup  plate dengan medium water  agar 3%.  Kitinase  yang diaplikasikan  adalah  hasil  kromatografi gel  filtrasi  yang  mempunyai  aktivitas kitinase tertinggi. Fraksi yang mempunyai
aktivitas  kitinase  tertinggi  dijadikan  satu dan  diukur  konsentrasinya  yaitu  sebesar 0,156  g  ml -1 .  Sampel  protein  dengan volume  1  ml  ditambah  0,25  ml  bufer asetat  pH  5  digunakan  untuk  uji antiifungal dengan variasi volume protein 50,  75  dan  100  l.  Sebagai  kontrol digunakan bufer tanpa larutan enzim.
Aktivitas antifungal kitinase terhadap  pertumbuhan  miselium  jamur R.  solani diamati  tiap  interval  waktu  12 jam  sampai  seluruh  media  ditumbuhi miselium jamur (3 hari). Hasil pengamatan  yang  disajikan  pada  Gambar 3A,  tidak  menunjukkan  adanya  zona penghambatan  di  sekitar cup  plate yang diaplikasikan  larutan  enzim  kitinase. Aplikasi kitinase dengan volume tertinggi 100  l  tetap  sama  seperti  kontrol.
Pengamatan lebih lanjut enzim diaplikasikan dengan menggunakan paper disk. Konsentrasi  protein  dipekatkan menjadi
0,312
 g ml -1 . Zona penghambatan  diamati  setiap  12  jam, setelah  tiga  hari  pengamatan  disekitar paper  disk tetap  tidak  menunjukkan adanya zona penghambatan,
Gambar 2. Aktivitas penghambatan CHIT 52 terhadap perkembangan koloni R. solani .     A. Medium water agar 3%. Konsentrasi protein yang digunakan adalah:  0 (kontrol), 50,  75,  100  l. B. Hifa jamur R.solani tidak mengalami  perubahan setelah aplikasi CHIT 52. (Pembesaran 100 x).
(bar : 10  m)
kontrol
50  l 100  l 75  l
B
A
Pengamatan  mikroskopi  terhadap pertumbuhan  hifa R.  solani dengan pembesaran 100 x dilakukan dengan cara menumbuhkan  miselium  jamur R.  solani pada water agar 3% yang diletakkan pada gelas  benda  cekung  selanjutnya  ditetesi dengan  10  l  sampel  protein  dalam  50 mM bufer asetat pH 5. Reaksi dihentikan dengan  penambahan lactofenol  blue . Pengamatan dilakukan tiap interval waktu 30,  60,  90,  120  menit  dan  7  jam  aplikasi enzim.  Pada  30  menit  awal  setelah aplikasi      CHIT  52  pada  kontrol  maupun slide yang  diaplikasikan  enzim  tidak menunjukkan adanya perubahan morfologi pertumbuhan hifa. Pengamatan dilanjutkan  setelah  inkubasi  selama  7 jam,  pertumbuhan  hifa  juga  tetap  normal (Gambar 2.B.). Berdasarkan hasil tersebut menunjukkan  bahwa  CHIT  52  tidak efektif dalam menghambat R. Solani .
Penelitian  pendahuluan  yang dilakukan Widyaningsih (2003) menunjukkan  secara invivo ketahanan semai  tusam  relatif  tinggi  terhadap penyakit  rebah  semai  oleh R.  solani. Penelitian  secara invitro menunjukkan hasil  yang  berbeda,  enzim  kitinase ternyata tidak mampu menghambat pertumbuhan miselium R. Solani dan juga tidak menyebabkan abnormalitas pertumbuhan hifa . Ketidakaktifan aktifitas  antifungal  CHIT  52  terhadap R. solani ada  tiga  kemungkinan,  pertama konsentrasi  CHIT  52  yang  diaplikasikan belum tepat untuk menghambat petumbuhan  koloni R.  solani, kedua diduga  CHIT  52  ini  memang  kurang spesifik  untuk  menghambat R.  solani
karena  pengaruh  senyawa  tertentu  yang dikeluarkan  oleh R.  solani sehingga kitinase  menjadi  tidak  aktif . Kerja  enzim kitinase kurang optimal dapat pula karena tidak  ada  kerjasama  dengan  enzim  lain seperti  ,1-3 glukanase. Kitin dan glukan merupakan  komponen  utama  penyusun dinding  sel  jamur  sehingga  adanya kitinase  dan  ,1-3  glukanase  akan meningkatkan  degradasi  dinding  sel jamur  lebih  efisien.  Penelitian  yang dilakukan  oleh  Ji  and  Kuc  (1996) menunjukkan  enzim  kitinase  bekerja secara  sinergis  dengan  ,1-3  glukanase dalam menghambat perkecambahan spora jamur patogen Coletrotichum lagenarium , sedangkan kitinase sendiri atau glukanase sendiri  tidak  begitu  efektif  menghambat pertumbuhan jamur tersebut.
Uji  aktivitas  antifungal  CHIT  52 terhadap pertumbuhan koloni Fusarium sp.
Uji  aktivitas  antifungal  CHIT  52 terhadap  miselium  jamur Fusarium sp. disajikan    pada  Gambar  3.  Pengamatan dilakukan  tiap  interval  waktu  12  jam, zona penghambatan mulai terlihat setelah 3  hari  aplikasi  enzim.  Miselium  jamur memenuhi  media  selama  5  hari.  Berbeda dengan R.  solani, miselium Fusarium sp. lebih  lambat  perkembangannya.  Zona penghambatan mulai terlihat pada aplikasi  kitinase  dengan  volume  100  l , meskipun  pada  volume  50  dan  75  l. belum menunjukkan adanya zona penghambatan  atau  relatif  sama  dengan kontrol.
Gambar 3. Aktivitas penghambatan CHIT 52 terhadap perkembangan koloni Fusarium sp. pada medium water agar 3%. Tampak dari depan berlawanan arah dengan jarum jam: kontrol,  50, 75 dan  100  l. Tanda panah menunjukkan zona penghambatan.
Gambar 4. Aktivitas penghambatan CHIT 52 terhadap perkembangan koloni Fusarium sp. dengan menggunakan paper disk . Konsentrasi protein yang digunakan dipekatkan menjadi 0,312  g ml -1 ,berlawanan arah dengan jarum jam kontrol, 50, 75 dan 100  l. Tanda panah menunjukkan zona penghambatan.
Pengamatan  lebih  lanjut  enzim diaplikasikan dengan menggunakan paper disk (Gambar  4.) . Konsentrasi  protein dipekatkan  menjadi  0,312  g  ml -1 .  Zona penghambatan  diamati  setiap  12  jam, setelah  tiga  hari  pengamatan  disekitar paper  disk miselium  mulai  terhambat.
Pada kontrol  maupun crude protein tidak
menujukkan  adanya  zona  penghambatan, sedangkan pada aplikasi CHIT 52 dengan volume  50  l  dan  75  l  mulai  sedikit terlihat adanya zona penghambatan. Zona penghambatan  terlihat  jelas  pada  aplikasi 100  l.

## kontrol
100  l
75  l 50  l A kontrol 75  l 50  l 100  l
Gambar  5. Miselium Fusarium sp.  A.  Hifa  normal  tanpa  aplikasi  CHIT  52.  B.    Pembengkakan ujung hifa C. Hifa normal tanpa aplikasi CHIT 52, D. Hifa mengalami lisis. Pengamatan dilakukan setelah 7 jam aplikasi CHIT 52. (Pembesaran 100 x).
Pengamatan  mikroskopi  terhadap pertumbuhan  hifa  dengan  pembesaran 100  x  menunjukkan  adanya  abnormalitas pertumbuhan  hifa  pada  preparat  yang diaplikasikan  CHIT  52.  Pengamatan dilakukan  secara  bertahap  yaitu  :  30,  60, 90,  120  menit  dan  7  jam.  Pada  interval waktu 30 sampai 2 jam belum menunjukkan adanya perubahan morfologi  hifa  jamur  jika  dibandingkan dengan  kontrol.  Perubahan  morfologi terlihat  dengan  adanya  pembengkakan yang terjadi pada ujung hifa setelah 7 jam aplikasi  (Gambar  5.B).  Hasil  penelitian ini  juga  menunjukkan  CHIT  52  mampu melisiskan  ujung  hifa  (Gambar  5.  D.). Lisisnya  ujung  hifa  ini  terjadi  akibat
terhidrolisisnya  kitin  yang  terdapat  pada dinding  sel  jamur.  Hifa  yang  mengalami abnormalitas  pertumbuhan  kurang  lebih mencapai   40 % dari total pengamatan.

## KESIMPULAN
Secara invitro aktivitas  antifungal CHIT  52  dapat  menghambat  patogen penyebab penyakit rebah semai Fusarium sp dengan melisiskan ujung hifa.

## SARAN
Pengaruh  CHIT  52  terhadap R. solani perlu  dikaji  lebih  lanjut  melalui peningkatan  konsentrasi  protein  dan kombinasi dengan enzim  ,1-3 glukanase.
A C B D (bar:10  m)

## DAFTAR PUSTAKA
Albrecth, C., Asselin, A., Piche, Y. and Lapeyrie F. 1994. Chitinase Activities are Induced in Eucaliptus globulus Roots by Ectomycorrhizal or Phatogenic Fungi During Early Colonization. Physiol. Plantarum. 91: 104 –110. Cabib, E. 1987. The Synthesis and Degradation of Chitin dalam A. Meister (Ed). Advances in
Enzymology and Related Areas of Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York. 59: 59-101.
Duschene, L.C. 1996. Role of Mychorrhizae Fungi in Biocontrol dalam . Pfleger, F.L. and Linderman,  R.G.  Mychorrhizae and  Plant  Health.  APS  Press.  St Paul, Minesota. 334.
Handayani,  A,  S.M.  Widyastuti,  S.
Margino, 2005. Isolasi Dan Karakterisasi Kitinase Akar Tusam    ( Pinus  merkusii Jungh. et de  Vriese)    Yang  Bersimbiosis Dengan  Jamur  Mikoriza-Ekto. Jurnal  Perlindungan  Tanaman, Vol. 11 (2), 2005: 96 - 104. Hartman,  G.E.,  Hayes,  C.K.,  Lorito,  M., Broadway,  R.M.,  Diepitro  A.,
Peterbeauer,  C.  and  Tronsmo,  A. 1993.  Chitynolityc  Enzymes  of Trichodherma harzianum : Purification  Chitobiosidase  and Endochitinase.  Phitopathol.  83:
313-318.
Hou,  W.C.,  Chen,  Y.C.  and  Lin, Y.H.  1998.  Chitinase  Activity  of Sweet  Potato (Ipomoea  batatas [L.]  Lam var  Tainong  57 ). Bot. Bull. Acad. Sin. 39: 93-97.
Huynh, N.V. 2002. Volarization of Chitin with  the  Aim  of  Production  of Biofungicides.  VAR  Venterinary and Agrochemical Research Centre. Ji,  C.  and  Kuc,  J.  1996.  Antifungal Activity of Cucumbar  -1,3 Glucanase and Chitinase. Physiol. and  Mol.  Plant.  Pathol.  49:  257- 265.
Pozo,  M.J.,  Aguilar,  C.A.,  Gaudot,  E.D. and  Barea,  J.M.  1998.  Chitonase and Chitinase Activities in Tomato Roots  During  Interactions  with Arbuscular Mycorrhizal  Fungi  or Phytophthora parasitica .
Experimen.  Botan.  49  (327): 1729-1739.
Sorionegara, I. dan Lemmens, M.J. 1996 . PROSEA.  Plant  Resourcesh  of South  –East  Asia 5:  (1)  Timber Trees; Major Commercial Timbers. Prosea Fondation, Bogor. 349-357. Sumardi  dan  Widyastuti,  S.M.  2000. Identifikasi
Gangguan pada Persemaian Pinus penanggulangan Serta  Pencegahannya.  Laporan Penelitian    Kerjasama    Fakultas Kehutanan UGM-Perhutani. Vannini,  A.,  Coruso,  C.,  Leonardi,  L., Rugini,  E.,  Chiarot,  E.,  Caporale, C.  and  Buonocore,  V.  1999. Antifungal Properties of Chitinase from Castenea  sativa against Hypovirulent  and Virulent  Strains of  the  Chesnut  Blight  Fungus Crryponectria parasitica. Physiol. Mol. Plant. Pathol. 55: 29- 35. Widyaningsih,
S. 2003. Produksi
Fitoaleksin  pada  Tusam  ( Pinus merkusii Jungh .  et de  Vriese) sebagai  Respon  Infeksi  Jamur Mikorisa.
Tesis.Fakultas kehutanan UGM, Yogyakarta. Wen, M., Sheng, T., Yu, C. and Kuen, L. 2002. Purification, Characterization and Cloning of a Chitinase from Bacillus sp. NCTU2. Biotehnol. Appl. Biochem. 35: 213-219.