Majalah Farmaseutik Vol. 13 No. 2: 65-78 ISSN-p : 1410-590x
ISSN-e : 2614-0063
Preparasi  Nanopartikel  Senyawa  Pentagamavunon-0 Menggunakan Matriks Polimer Kitosan Rantai Sedang dan Pengait  Silang  Natrium  Tripolifosfat  Melalui  Mekanisme Gelasi Ionik Sebagai Kandidat Obat Antiinflamasi
Nanoparticle  Preparation  of  Pentagamavunon-0  Using  Medium  Viscous Chitosan  Matrix  Cross  Linked  by  Sodium  Tripolyphosphate  Through  Ionic Gelation Mechanism as Anti-Inflammatory Candidate
Adhyatmika 1* , Ronny Martien 1 , Rochmadi 2 , Hilda Ismail 3
1. Departemen Farmasetika Fakultas Farmasi UGM
2. Jurusan Teknik Kimia Fakultas Teknik UGM
3. Departemen Kimia Farmasi Fakultas Farmasi UGM
Corresponding author: Adhyatmika: Email: adhyatmika@ugm.ac.id
ABSTRAK
Pentagamavunon-0  (disingkat  PGV-0),  suatu  senyawa  turunan  kurkumin  dengan rumus  molekul  2,5- bis(4’ -hidroksi- 3’ -metoksibenzilidin)  siklopentanon,  telah  terbukti memiliki  aktivitas  anti  inflamasi  tanpa  menimbulkan  efek  ulcerogenik.  Namun,  pada penggunaan oral, bioavailabilitas PGV-0 rendah  karena kelarutannya yang rendah. Salah satu  strategi  untuk  meningkatkan  kelarutan  PGV-0  adalah  menggunakan  preparasi nanopartikel. Penelitian ini bertujuan untuk memformulasikan nanopartikel kitosan-PGV- 0  melalui  mekanisme  gelasi  ionik  menjadi  nanopartikel,  dengan  pengait  silang tripolifosfat.  Nanopartikel  PGV-0  yang  dihasilkan  selanjutnya  dikarakterisasi  ukuran partikel, morfologi partikel, potensial zeta, entrapment efficiency , serta stabilitasnya dalam cairan  lambung  dan  usus  buatan.  Nanopartikel  PGV-0  kemudian  diuji  aktivitas  anti inflamasinya  dengan  metode  penghambatan  volume  udem  terinduksi  karagenin,  serta afinitas enzimatiknya terhadap siklooksigenase (COX) 1 dan 2. Nanopartikel kitosan-PGV- 0  diformulasikan  dari  kombinasi  PGV-0  0,05  %,  kitosan  rantai  sedang  0,05%,  dan  TPP 0,002%. Nanopartikel berukuran 144,37 + 17,41 nm dengan bentuk amorf. Jumlah PGV-0 yang  terkompleks  sebesar  99,40  +  0,08  %  dengan  zeta  potensial  +3,8  +  0,27  mV.  Studi stabilitas dalam cairan lambung dan usus buatan menunjukkan 99,64-99,74 % (AGF) dan 99,54-99,69  %  (AIF)  PGV-0  masih  stabil  dalam  nanopartikel.  Nanopartikel  PGV-0  pada dosis 5 mg/kgBB menunjukkan daya anti inflamasi sebesar 35,47 % dan memiliki afinitas enzimatik terhadap siklooksigenase, spesifik terhadap COX-2.
Kata kunci: nanopartikel, PGV-0, kitosan rantai sedang, TPP, anti inflamasi

## ABSTRACT
Pentagamavunon-0  (PGV-0,  abbreviated),  a  curcumin  analogue  with  chemical structure as 2,5- bis(4’ -hydroxy- 3’ -methoxybenzilidin)cyclopentanone, has proven to have anti-inflammatory  activity  and  non-ulcerogenic.  However,  orally  PGV-0  has  low bioavailability because of its low solubility. One of the strategy to improve PGV-0 solubility in order to increase bioavailability is using nanoparticle carrier. The aim of the study is to formulate chitosan-PGV-0 nanoparticles through ionic gelation mechanism cross-linked by tripolyphosphate.  PGV-0  nanoparticle  produced  was  then  characterized  for  its  particle size,  morphology,  zeta  potential, entrapment  efficiency ,  and  stability  against  artificial
gastric  and  intestinal  fluids  (AGF  and  AIF).  PGV-0  nanoparticle  was  tested  for  its  anti- inflammatory  activity  by  carrageenan  induced  inflammatory  method,  and  its  enzymatic affinity against enzyme cyclooxygenase (COX)-1 and COX-2. Chitosan-PGV-0 nanoparticles were formulated in the combination of 0,05% PGV-0, 0,05% medium-viscous chitosan and 0,002% TPP. The nanoparticles were 144,37 + 17,41 nm amorphous particles. Amount of PGV-0 entrapped was 99,40 + 0,08 % with +3,8 + 0,27 mV in zeta potential. Stability study in AGF and AIF was shown that 99,64-99,74 % (AGF) and 99,54-99,69 % (AIF) of PGV-0 remains  in  nanoparticles.  Chitosan-PGV-0  nanoparticles  at  5  mg/kg  body  weight  was obtain 35,47 % anti-inflammatory activity and has found to have self-affinity against COX enzyme, relatively selective to COX-2.
Keywords: Extract, Z.zerumbet ,  larvisidal, Ae.aegypti , LC 50
PENDAHULUAN Inflamasi atau peradangan merupakan  suatu  respon  umum  sistem tubuh  akibat  terjadinya  luka  atau masuknya  benda  asing  yang  kemudian menimbulkan  gejala-gejala  panas,  nyeri, kemerahan,  pembengkakan,  atau  kelainan fungsi.  Oleh  karena  itu,  inflamasi  dapat terjadi  di  berbagai  bagian  organ  atau sistem  organ,  dan  memiliki  spektrum identifikasi  yang  luas  serta  berpotensi menjadi  penyebab  kejadian  patologis  lain jika  tidak  diatasi  (Katzung et  al. ,  1986). Saat  ini  terapi  inflamasi  yang  umum digunakan  pada  kasus-kasus  non-spesifik adalah  menggunakan  obat-obat  anti- inflamasi  non-steroid  (OAINS)  yang memiliki efek samping ulcerogenik (Asosiasi  Rheumatologi  Australia,  2008).
Sebagai  alternatif  yang  lebih  aman  adalah kurkumin,  dimana  pada  studi  toksisitas kronis  terhadap  hewan  uji  tikus  terbukti aman  pada  lambung  (Chavalittumrong et al. , 2002) karena selektif pada enzim COX- 2  (Jurenka et      al .,      2009).
Permasalahannya adalah penggunaan kurkumin          ini      masih  sangat    terbatas karena    bioavailabilitasnya  yang  sangat rendah di dalam darah, di samping karena adanya gugus metilen aktif yang menyebabkan kurkumin mudah terdekomposisi. Dalam usaha meningkatkan bioavailabilitas kurkumin ini,  Tim  Molekul Nasional  Fakultas  Farmasi  Universitas Gadjah  Mada  telah  mensintesis  berbagai senyawa  analog  baru.  Salah  satunya  yang telah  berhasil  disintesis  oleh  Sardjiman (2000),  2,5  - bis  (4’ – hidroksi  - 3’ metoksibenzilidin)  siklopentanon,  suatu senyawa  analog  kurkumin  yang  secara trivial disebut pentagamavunon-0 (disingkat  PGV-0)  yang  lebih  stabil  dari kurkumin  karena  hanya  memiliki  satu gugus  karbonil.  Pentagamavunon-0  telah dibuktikan memiliki aktivitas anti- inflamasi pada uji  pra-klinis secara in vivo pada  tikus  (Sardjiman,  2000).  Untuk  itu,
PGV-0  sebagai  senyawa  analog  kurkumin merupakan  salah  satu  alternatif  lain  yang potensial.
Kekurangan  dari  senyawa  PGV-0 yang utama adalah kelarutannya dalam air yang  sangat  rendah,  sehingga  berimbas pada absorpsi yang buruk (MOLNAS, 2001) jika digunakan secara oral. Uji farmakokinetika menunjukkan profil kadar PGV-0  dalam  darah  yang  sangat  eratik (naik-turun) (Kustaniah, 2001). Pentagamavunon-0  cepat  hilang  dari peredaran  darah  dan  profil  kadarnya mengalami  fluktuasi  pada  pemberian  oral (Amalia,  2001).  Oleh  karena  itu,  perlu dicarikan  formulasi  yang  tepat  untuk mengatasi masalah absorpsi tersebut. Salah  satu  strategi  potensial  yang dapat diaplikasikan adalah dengan memformulasikannya         dengan       suatu
polimer menjadi sediaan nanopartikel yang bersifat  lebih  mudah  terdispersi  stabil dalam  air  (Saha et  al. ,  2010).  Salah  satu metode  pembuatan  nanopartikel  adalah melalui  mekanisme  gelasi  ionik  yang distabilkan  dengan  suatu  pengait  silang ( cross-linker ,  bahasa  Inggris)  (Martien et al. , 2006). Gelasi ionik melibatkan interaksi suatu  senyawa  dengan  polimer  yang memiliki gugus-gugus dengan muatan yang berlawanan.
Pentagamavunon-0  yang  bermuatan negatif  dalam  air  karena  adanya  gugus karbonil  dan  hidroksil  dapat  mengadakan interaksi  ionik  dengan  gugus-gugus bermuatan  positif.  Kitosan  merupakan polimer  kationik  dengan  adanya  gugus amonium dari ikatan D-glukosamin dan N- asetil-D- glukosamin yang berikatan β(1,4) - glikosidik,  terionisasi  positif  di  dalam asam.  Polimer  ini  dapat  mengadakan mekanisme gelasi ionik dengan PGV-0.
Sebagai  penelitian  pendahuluan, polimer  kitosan  dengan  panjang  rantai sedang menjadi pilihan normatif yang ideal untuk  melihat  karakter  partikel  yang dihasilkan.  Sebagai  stabilisator  partikel yang  terbentuk,  digunakan  pengait  silang bermuatan  negatif,  dimana  natrium tripolifosfat  (TPP)  merupakan  senyawa yang  saat  ini  telah  banyak  digunakan. Anion  TPP  yang  memiliki  muatan  negatif lima  akan  mengait  sisa  gugus  amonium dalam  satu  polimer  yang  tidak  digunakan berinteraksi dengan PGV-0. Sifat kitosan yang biokompatibel dan biodegradabel (Tiyaboonchai, 2003) menjadikannya  menjadi  pilihan  yang  baik dalam  preparasi  nanopartikel  PGV-0, khususnya  dalam  formulasinya  sebagai kandidat  obat  anti  inflamasi  yang  aman. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian preparasi, karakterisasi, hingga uji aktivitas  sistem  yang  dihasilkan  sebagai suatu  kandidat  obat  anti  inflamasi  yang potensial. Pada  akhirnya  diharapkan  akan diperoleh  suatu  alternatif  baru  dalam terapi inflamasi yang efektif dan aman.

## METODOLOGI
Alat
Alat-alat  gelas  dan  alat ukur  volume yang  lazim  digunakan,  timbangan  elektrik (Sartorius BP 310 P), tabung mikro 1,5 mL
(Eppendorf)  dan  2,0  mL  (Axygen), membran  pH-meter  (Hanna  HI  8314), pengaduk vortex (Maxi Mix I Type 16700), pengaduk  pemanas  dan  batang  pengaduk magnet  (Stuart  Heat-stir  CB162),  penguap putar  dan  penangas  digital  (Stuart  RE300 dan RE300DB), fibrator ultrasonic (Transsonic  T570  Elma),  homogenizer Ultra-Turrax  (Janke  dan  Kunkel  -  Ika- Werk), spektrofotometer sinar tampak dan
UV  (Genesys  10  UV  Scanning),  mikroskop elektron  transmisi  (JEOL  JEM  1400), analisator  ukuran  partikel  dan  potensial zeta  (Nicomp  PSS  380),  ultrasentrifugator (Eppendorf  5804  R),  Plethysmometer (UGO  Basile),  plat  sumuran  mikro (Nunclon  96-well  plate),  pembaca  plat mikro  (Biorad  -  model  680  S/N  18721), penangas putar (Orbit).

## Bahan
Pentagamavunon-0, murni KLT (CRC Fakultas  Farmasi  UGM),  kitosan  rantai sedang,  viskositas  200-800  cps  (Sigma- Aldrich),  natrium  tripolifosfat  teknis  85% (Sigma-Aldrich),  akuades,  etanol  teknis 96%,  aseton  teknis  (CV  General  Labora), asam  asetat,  natrium  asetat,  dan  NaOH glasial (Merck), etil asetat p.a. (Merck), HCl dan garam-garam cairan lambung dan usus buatan (Merck), dimetil sulfoksida (DMSO) (Merck),  kalium  diklofenak  (Cataflam), NaCl  0,9%  pro  injeksi  (Otsuka),  Natrium karboksi  metil  selulosa  (CMC-Na  atau tilosa) (Merck), karagenin (Merck), Colorimetric COX ( ovine ) inhibitor screening assay  kit (Cayman),  tikus  ( Rattus norvegicus ) putih betina galur wistar.
Metode Penelitian

## Optimasi
Sejumlah  seri  kadar  larutan  PGV-0 dalam     pelarut    organik   dikombinasikan
dengan  sejumlah  seri  kadar  larutan kitosan  rantai  sedang.  Masing-masing kadar  PGV-0  dicampurkan  dengan  seri kadar  larutan  kitosan  rantai  sedang (volume  1:1).  Campuran  di  dalam  tabung mikro  kemudian  dilakukan  pencampuran menggunakan vortex  mixer (Maxi  Mix  I) selama  20  detik. Selanjutnya  ditambahkan sejumlah  larutan  natrium  tripolifosfat hingga  kadarnya  dalam  larutan  sebesar 0,01%  dan  0,001%.  Campuran  ini divorteks  kembali  selama  20  detik.  Pada tahap  akhir  tutup  tabung  dibuka  dan masing-masing  pelarut  organik  dibiarkan menguap  selama  semalam.  Pengamatan fisik  dispersi  yang  terbentuk  dilakukan setelah  volume  sisa  hanya  menyisakan separuh  dari  volume  campuran  awal, dimana  pelarut  organik  PGV-0  awal seluruhnya menguap dan tidak mempengaruhi  polaritas  sistem  dispersi. Keadaan  fisik  sistem  dispersi  yang  paling stabil  (formula  terpilih)  selanjutnya dilakukan scaling  up pada  volume  30  mL dan  100  mL.  Formula  terpilih  ini  dibuat dengan cara yang sama, pada wadah 30 mL dan  100  mL.  Volume  PGV-0  dan  kitosan tetap  1:1.  Pada  tahap  akhir,  penguapan dilakukan  dengan  menuangkan  campuran pada  cawan  petri,  agar  penguapan  yang terjadi menjadi lebih cepat (kontak dengan udara  luar  lebih  besar).  Formula  terpilih dari tahap ini kemudian diproduksi dalam skala 500 mL.
Evaluasi kecepatan pengenapan Berbagai  kombinasi  formula  yang telah dilakukan optimasi formula sebelumnya  dibuat  lagi  masing-masing dengan  metode  pembuatan  yang  sesuai pada  volume  30  mL.  Dispersi  yang terbentuk kemudian dimasukkan ke dalam tabung  reaksi  yang  telah  diberi  skala ukuran  panjang  dengan  menggunakan kertas  millimeter  blok.  Selanjutnya  semua dispersi  dalam  tabung  reaksi  didiamkan pada  rak  secara  tegak,  dan  diamati kecepatan   pengendapannya   pada    menit
ke-5, 10, 20,  30, 45, 60, 90, 120, serta jam ke-24,  48,  dan  72.  Pengukuran  dilakukan terhadap  tinggi  lapisan  paling  atas endapan.

## Produksi nanopartikel
Dibuat  masing-masing  500  mL larutan  PGV-0  dalam  pelarut  organik terpilih  dan  kitosan  rantai  sedang  dalam dapar asetat 0,1 M pH 4,0 pada kadar yang dipilih  dari  hasil  optimasi.  Keduanya dicampurkan  dalam  gelas  beaker  ukuran satu liter dengan pengadukan menggunakan  pengaduk  magnetik  (Stuart heat-stir CB162)  pada  skala  tujuh  tanpa pemanasan  selama  20  menit.  Selanjutnya ditambahkan  TPP  dengan  kadar  dalam campuran dari formula hasil optimasi, dan pengadukan  dilanjutkan  kembali  selama 20  menit.  Kemudian  campuran  yang dihasilkan diuapkan dengan menggunakan rotary  evaporator (Stuart  RE300)  pada pemanasan penangas air (Stuart RE300DB) suhu  50 o C.  Setelah  volume  mencapai setengah  dari  volume  campuran  semula (pelarut  organik  menguap  seluruhnya), dispersi  yang  terbentuk  diberi  perlakuan ultrasonikasi  (Transsonic  T570  Elma) selama 75 menit. Untuk lebih menghaluskan  ukuran  partikel  yang terdispersi, dilakukan homogenisasi menggunakan  homogenizer  ultra-turrax (Janke  dan  Kunkel – Ika  Werk)  selama  60 menit. Karakterisasi morfologi Untuk mengetahui morfologi nanopartikel  kitosan-PGV-0  digunakan mikroskop  elektron  transmisi  (JOEL  JEM- 1400). Sampel nanopartikel ditetesi diatas copper  grid kemudian  dilapisi  karbon dengan  alat Auto  Carbon  Coated selama  5 detik  setelah  itu  dikeringkan  pada  suhu ruang  selama  24  jam.  Setelah  sampel nanopartikel  kering  dilapisi  lagi  dengan carbon seperti tersebut di atas lalu copper grid dimasukkan  ke  dalam holder dan sampel siap  dianalisis  dengan  percepatan
voltage 120 kV dan magnifikasi 120.000.

## Entrapment efficiency
Perhitungan  PGV-  0  dalam  sistem nanopartikel  dilakukan  dengan  metode ekstraksi.  Nanopartikel  PGV-0  hasil preparasi dengan kitosan dilarutkan dalam akuades  dan  di-vorteks  sampai  terbentuk larutan nanopartikel yang terdispersi. PGV- 0  bebas  yang  tidak  terenkapsulasi  dalam dispersi  nanopartikel  diekstraksi  dengan menggunakan  etil  asetat,  dengan  cara ditambahkan  10  mL  etil  asetat,  lalu dikocok bolak-balik selama satu menit dan dipisahkan        fase      air    dan    f  ase    etil asetat.  PGV-0  yang  tidak  terenkapsulasi dari  formulasi  nanopartikel  ditetapkan dengan  menggunakan  spektrofotometer dengan  cara  mengukur  serapannya  pada panjang gelombang 420 nm dan dibandingkan dengan kontrol. Ukuran partikel dan potensial zeta Untuk  mengetahui  ukuran  sediaan nanopartikel  dan  potensial  zeta  dilakukan pengukuran ukuran dan distribusi nanopartikel  menggunakan  alat particle size  analyzer (Nicomp  PSS  380).  Sebanyak
2  tetes  sampel  nanopartikel,  masing- masing  ditambahkan  5  mL  akuades,  dan dicampur  dengan  cara  membolak-balik. Setelah itu diambil 3 mL dan dianalisis.
Entrapment stability pada AGF dan AIF Formula nanopartikel PGV-0 diinkubasi  dalam  cairan  lambung  buatan (campuran NaCl 0,2% dan HCl 0,26% pada pH 1,2) dan cairan usus buatan (campuran
20 mM bikarbonat, 139 mM klorida, 5 mM kalium,  140  mM  natrium,  4  mM  kalsium, dan  3  mM  magnesium  pada  pH  7,0), kemudian  dimasukkan  ke  dalam  alat shaker  waterbath (Orbit),  pada  suhu  37 o C, dengan  kecepatan  pengadukan  100  rpm. Sampel  diambil  tiap  jam  selama  4  jam untuk  pengujian  dalam  cairan  lambung buatan  dan  5  jam  untuk  pengujian  dalam cairan  usus  buatan.  Cuplikan  sampel diambil  sebanyak  4  x  1,6  mL  kemudian
diendapkan  dengan  ultrasentrifugasi  pada kecepatan  12.000  rpm,  suhu  10 ° C,  selama 15  menit.  PGV-0  bebas  yang  tidak terenkapsulasi  berada  dalam  supernatan diekstraksi  dengan  menggunakan  etil asetat, dengan cara       ditambahkan     4 ml        etil          asetat,  lalu    dikocok    dan dipisahkan    fase      air      dan  fase          etil asetat.      Fase     etil         asetat ditetapkan kandungan PGV-0-nya dengan menggunakan  spektrofotometer  dengan pada panjang gelombang 400 nm.
Uji penghambatan inflamasi Sebanyak  18  ekor  tikus  ( Rattus norvegicus ) putih betina galur wistar dibagi ke dalam enam kelompok, dengan masing- masing  kelompok  berjumlah  tiga  tikus, berdasar  perhitungan  jumlah  sampel mengikuti  rumus  Federer  (David  dan Arkeman,  2008).  Selanjutnya  pada  kaki belakang  sebelah  kanan  tiap  tikus  diberi tanda  batas  di  atas  tumit,  dan  diukur volumenya  menggunakan  plethysmometer (UGO  Basile).  Kemudian  kaki  tersebut diinjeksi dengan karagenin 1,0% intraplantar,  dan  langsung  diukur  kembali volumenya sebagai volume udem menit ke- 0,      dan      dilanjutkan      secara      berkala pada  menit  ke-30,  60,  90,  120,  150,  180, 210, dan 240. Data yang muncul pada layar dicatat dalam satuan mL.

## Afinitas  enzimatik  terhadap  COX:
Disiapkan  sebuah  plat  mikro  96  sumuran (Nunclon  96- well  plate ).  Masing-masing kelompok dibuat triplikasi. Pertama, untuk blanko reagen (kelompok B/W) berisi 160 μL  dapar  assay  ditambah  10  μL  heme. Kelompok aktivitas 100% enzim berisi 150 μL dapar assay ,    10 μL heme, dan10  μL masing  -  masing  COX-1  atau COX-2. Pada kelompok perlakuan (inhibitor)  berisi  150  μL dapar assay , 10 μL heme,   dan 10 μL masing - masing              COX-1          atau  COX-2.  Semua sumuran  yang  telah  berisi  semua komponen tersebut selanjutnya ditambahkan 10 μL pelarut masing-masing
akuades HPLC  grade ,  DMSO,  dan  dapar asetat  pH  4,0  (untuk  kelompok  B/W  dan aktivitas  100%),  atau  10  μL  obat masing- masing  kontrol  positif  kalium  diklofenak, kontrol pembanding PGV-0, dan perlakuan nanopartikel  PGV-0  (kelompok  inhibitor). Selanjutnya  microplate  digoyang  pelan selama beberapa menit hingga komponen- komponen  di  dalam  sumuran  tercampur baik.        Kemudian      microplate      ditutup dan  diinkubasi  selama  5  menit  pada  suhu ruang.  Setelah  inkubasi,  pada  masing- masing sumuran ditambahkan 20 μL TMPD (substrat  kolorimetrik,  terdapat  di  dalam kit)  dan  20  μL  asam  arakhidonat. Plate digoyangkan  beberapa  menit  hingga komponen  di  dalam  sumuran  tercampur homogen,  dan  kemudian  diinkubasi tertutup pada suhu ruang selama 5 menit. Kemudian  segera  dilakukan  pembacaan serapan menggunakan pembaca plat mikro (Biorad 680) pada panjang gelombang 595 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi Hasil  optimasi  tahap  awal  dari kombinasi  kadar  PGV-0  pada  pelarut etanol  dan  aseton  dengan  kitosan  rantai sedang  menghasilkan  enam  formula  yang stabil, yaitu pada kombinasi PGV-0:kitosan (%)  0,025:  0,025,  0,05:  0,025, 0,01:  0,025, 0,025:0,05, 0,05:0,05, dan 0,01:0,05. Dapar asetat  merupakan  pelarut  ionik  yang  jelas memiliki polaritas yang mutlak. Sedangkan pelarut      organik      merupakan    pelarut non-polar. Ketika masing-masing komponen       terlarut       pada   pelarutnya
masing-masing, kelarutan itu akan terganggu  dengan  perubahan  polaritas media  di  sekitarnya.  Pada  saat  PGV-0  dan kitosan dicampurkan, maka akan terbentuk media dengan polaritas gabungan  antara  dapar  dan  pelarut organik. Dapar asetat dan aseton memiliki polaritas  dengan  margin  yang  lebih  lebar dibandingkan  dapar  asetat  dengan  etanol.
Akibatnya,  pada  saat  pencampuran, perubahan  polaritas  dari  polaritas  pelarut asal  menjadi  polaritas  gabungan  akan menjadi  lebih  lunak  pada  pencampuran etanol  dengan  dapar  asetat,  dan  bersifat lebih  ekstrim  pada  pencampuran  dapar asetat  dengan  aseton.  Hasilnya,  setelah pelarut organik diuapkan seluruhnya, pada formula  yang  mengandung  aseton  akan langsung  mengendap  karena  perubahan polaritas  yang  lebih  bermakna,  sedangkan pada penggunaan etanol, hal ini lebih tidak terlihat. Dari keenam formula yang menunjukkan  kestabilan  sistem  dispersi, kemudian  dilakukan  pengukuran  tinggi endapan  relatif  (H R ).  Nilai  HR  ditampilkan pada  (Tabel  Ia  dan  Tabel  Ib),  masing- masing untuk penggunaan TPP 0,02% dan 0,002%.
Dari nilai tinggi endapan relatif (HR) pada  tabel,  kemudian  dipilih  dua  formula dengan  HR  terbaik,  yakni  pada  kombinasi PGV-0:  kitosan  (%)  0,05:0,05,  masing- masing  pada  TPP  0,02%  dan  0,002% karena  keduanya  tidak  berbeda  secara signifikan  (p>0,05).  Kedua  formula  ini kemudian  dipilih  untuk  dilanjutkan  pada karakterisasi tahap selanjutnya.
Kelompok Perlakuan 1 Blanko CMC-Na 0,5% 2 Blanko matriks kitosan rantai sedang-TPP 3 Kontrol positif kalium diklofenak dosis 2,25 mg/kgBB 4 Kontrol pembanding PGV-0 dosis 20 mg/kgBB 5 Kontrol pembanding PGV-0 dosis 5 mg/kgBB 6 Perlakuan nanopartikel PGV-0 setara dosis 5 mg/kgBB
Produksi Produksi nanopartikel PGV-0 menggunakan  matriks  kitosan  rantai sedang  dan  TPP  menghasilkan  dispersi yang  lebih  stabil  dibandingkan  dengan PGV-0  tanpa  preparasi.  Hasil  produk nanopartikel        (NCP-M)  (Gambar  2), dibandingkan dengan PGV-0 tanpa preparasi  (PGV-0).  Produksi  dilakukan pada skala 500 mL tiap batch.
Karakterisasi  ukuran  partikel,  indeks polidispersitas, potensial zeta
Hasil  analisis  ukuran  partikel nanopartikel  PGV-0  dari  formula  terpilih yang  merupakan  keluaran  dari  analisator ukuran                  partikel            (Nicomp
PSS380)  (Tabel  II). Pan et  al., (2002) melaporkan  bahwa  nanopartikel  kitosan dalam formulasinya untuk menghantarkan insulin  secara per  oral ,  pada  ukuran  rata- rata sekitar 300 nm telah terbukti mampu secara efektif menurunkan gula darah tikus diabetes, dan peningkatan dosis mengakibatkan  peningkatan  penurunan gula  darah  tikus.  Sejalan  dengan  itu, Fernandez-Urusunno et  al., (1999)  juga melaporkan bahwa hasil formulasi nanopartikel kitosan untuk insulin melalui gelasi  ionik  pada  ukuran  antara  300-400 nm  dengan  TPP  sebagai  stabilisator menghasilkan  partikel  bermuatan  positif yang  secara in  vivo mampu  menurunkan gula  darah  pada  kelinci  sebesar  40%
Tabel Ia. Tinggi endapan relatif TPP 0,02% Konsen-trasi PGV-0 Konsentrasi kitosan 0,025% 0,05% 0,025% 0,168 0,124 0,05% 0,115 0,412 0,10% 0,042 0,172 Tabel Ib. Tinggi endapan relatif TPP 0,002% Konsen-trasi PGV-0 Konsentrasi kitosan 0,025% 0,05% 0,025% 0,061 0,096 0,05% 0,078 0,414 0,10% 0,018 0,185
Gambar 1. Interaksi kimia yang terbentuk antara PGV-0, kitosan, dan TPP
intranasal.  Obat-obat  yang  lebih  lipofil seperti  siklosporin  A  yang  diformulasi menggunakan  nanopartikel  kitosan  pada ukuran  sekitar  150  nm  dan  muatan  +30 mV  juga  terbukti  dapat  mempertahankan konsentrasi  plasma  siklosporin  A  dalam dara h pada 2,8 μg/mL selama tiga jam saat diadministrasikan per  oral pada  anjing (Bowman  dan  Leong,  2006).  Oleh  karena itu,  ukuran  nanopartikel  PGV-0  ini  telah cukup  ideal  untuk  sistem  penghantaran obat yang potensial, meskipun pembuktian yang  pasti  perlu  dilakukan  melalui pengujian aktivitasnya secara in vivo . Selain  data  ukuran  partikel,  pada (Tabel  II)  juga  dipaparkan  data  indeks polidispersitas  ( polydispersity  index ,  PI), dimana  pada  NCP-M  0,002T,  nilai  PI tersebut  sebesar  0,41  +  0,03.  Indeks  ini menggambarkan distribusi ukuran partikel dalam  sistem  dispersi,  semakin  kecil  nilai indeks  berarti  ukuran  partikel  semakin homogen. Nilai ini menjadi penting karena
jika rentang distribusi ukuran partikel luas, maka  profil  absorpsi  secara  keseluruhan menjadi  sulits  untuk  dianalisis,  karena karakter  partikel  yang  sangat  beragam. Selain  itu,  nilai  indeks  ini  juga  dapat digunakan  untuk  mengetahui  seberapa jauh partikel telah teragregasi. Jika nilai ini terus  berubah-ubah  dari  waktu  ke  waktu, maka hal ini menunjukkan proses agregasi telah  terjadi.  Jika  digunakan  batas  variasi sebesar  10%,  maka  nilai  PI  nanopartikel masih  cukup  besar,  karena  mencapai 41,1%.  Artinya,  meski  tetap  pada  rentang ukuran  nano,  nanopartikel  PGV-0  dalam sistem  masih  kurang  homogen.  Hal  ini disebabkan  karena  pada  ukuran  partikel yang  semakin  kecil,  akan  sangat  sulit diperoleh  variasi  pada  batas  yang  sama pada  partikel  makro,  karena  nilai  variasi ini  bersifat  relatif  terhadap  rerata.  Oleh karena  itu,  pada  ukuran  partikel  sebesar 144,4  +  17,4  nm,  nilai  PI  sebesar  0,41  +
0,03  ini  masih  cukup  baik  dan  dapat
Gambar 2. Perbandingan produk NCP-M dengan PGV-0
Tabel II. Ukuran partikel, indeks polidispersitas, dan potensial zeta formula
Formula Karakter keluaran dari PSA Ukuran partikel (nm) Indeks polidispersitas Potensial zeta (mV) NCP-M 0,002T 144,4+17,4 0,41+0,03 3,80+0,27 NCP-M 0,02T 3.109,3+1.258,5 16,97+3,53 4,19+0,21 Tabel III. Nilai entrapment efficiency Formula Rep EE (%) Rerata (%) CV (%) NCP-M 1 99,37 99,40 0,08 2 99,34 3 99,49
diterima.  Dengan  indeks  ini,  berarti ukuran  partikel  berkisar  antara  85,03 hingga  203,71  nm.  Pada  ukuran  partikel yang terdistribusi normal, nilai maksimum dan minimum ini jumlahnya sangat kecil.
Meskipun  dalam  formulasi  akhirnya kebanyakan  gugus  amonium  ini  berikatan dengan  PGV-0  dan  TPP,  namun  karena kitosan merupakan polimer, gugus amonium  yang  dimilikinya  tetap  tersisa dan menyebabkan densitas muatan positif. Muatan positif ini bagus untuk penghantaran obat, didukung dengan  nilai muatannya  yang  tidak  terlalu  besar, sehingga  cukup  aman  bagi  sel.  Menurut Couvreur et al., (2002), muatan yang hanya sebesar + 3,80 + 0,27 mV ini menyebabkan sistem nanopartikel menjadi kurang stabil,
karena nilainya masih jauh di bawah +30,0 mV.  Gaya  tolakan  elektrostatis  antar partikel  tidak  terlalu  besar.  Usaha peningkatan  nilai  potensial  zeta  dapat dilakukan  dengan  penambahan  komposisi kitosan  dalam  campuran,  namun  hal  ini berpotensi  menyebabkan  pembentukan partikel  yang  lebih  besar.  Oleh  karena  itu, nilai  optimal  potensial  zeta  untuk  sistem dispersi  secara  umum  adalah  bersifat spesifik  untuk  tiap  tujuan  penghantaran obat.  Nilai  muatan  yang  pasti  untuk nanopartikel  sediaan  obat  secara  umum tidak  dapat  dijustifikasi  hanya  dari  sisi kestabilannya. Potensial zeta yang bernilai positif  ini  selanjutnya  berperan  dalam menjaga  stabilitas  nanopartikel  PGV-0 dalam sistem  dispersi,  meski  pada  ukuran
Grafik 1. Profil Entrapment stability
Grafik 2. Daya hambat inflamasi (DHI)
partikel mikro (lebih besar dari 1000 nm). Hal  ini  tampak  pada  formula  dengan penggunaan  TPP  pada  kadar  0,02%.  Jika kita  tilik  dari  awal  proses  optimasi formula,  dapat  dikatakan  bahwa  dari  nilai H R formula ini stabil, sama dengan formula dengan  penggunaan  TPP  0,002%  (p  > 0,05). Jika diasumsikan bahwa mikropartikel  ini  telah  terbentuk  sejak awal pembuatan, maka semestinya pengendapannya  akan  berlangsung  jauh lebih  cepat,  namun  hal  ini  tidak  terjadi.
Alasan utama dari terjadinya fenomena ini adalah  karena  gaya  tolak  menolak  antar partikel yang timbul karena potensial zeta yang  cukup  besar  untuk  menjaga  dispersi cukup  stabil  berada  dalam  kondisi terdispersi, yang akan dibahas selanjutnya pada pembahasan karakter potensial zeta.
Entrapment efficiency Tabel  III  menunjukkan  hasil  analisis EE  pada  nanopartikel  PGV-0.  Nilai  EE
sebesar  99,40  +  0,08  %  menunjukkan metode  pembuatan  nanopartikel  PGV-0 yang  dilakukan  sudah  sangat  efektif, sehingga mampu mengikat hampir keseluruhan PGV-0 yang diformulasikan ke dalam  bentuk  kompleks  nanopartikel. Reaksi  gelasi  ionik  secara  umum  memang dapat  terjadi  secara  spontan  dalam pencampuran  yang  homogen,  sehingga memungkinkan untuk pengikatan zat  aktif ke  dalam  matriks  dengan  efisien  (Bisht et al. ,  2007;  Kafshgari et  al. ,  2011). Penambahan  TPP  sebagai  pengait  silang juga  berperan  dalam  menjaga  kestabilan nanopartikel,  sehingga  pada  proses pemisahan  PGV-0  bebas  tidak  terjadi kerusakan   kompleks   nanopartikel dalam waktu singkat selama proses analisis, yang dapat menurunkan EE.
Entrapment stability pada AGF dan AIF Profil  kestabilan  nanopartikel  dalam cairan lambung dan usus buatan (AGF dan
Grafik 3. Daya anti-inflamasi (DAI)
Grafik 4. Afinitas enzimatik terhadap COX
AIF) (Grafik 1). Dari hasil analisis statistik diperoleh hasil bahwa kompleks nanopartikel dalam AGF maupun AIF tidak berbeda  signifikan  dengan  EE.  Dari  sini dapat  disimpulkan  bahwa  nanopartikel stabil di dalam AGF maupun AIF.
Kestabilan  nanopartikel  di  dalam
AGF  dan  AIF  ini  tidak  terlepas  dari kesetimbangan  kompleks  nanopartikel yang dibentuk          oleh             masing- masing  komponennya.  Pada  saat  suasana asam di dalam AGF, kecenderungan kitosan untuk  melarut              dan            meninggalkan kompleks  distabilkan  oleh  adanya  TPP.
Selanjutnya,  pada  suasana  relatif  basa, kitosan  cenderung  melemah  muatan positifnyadan melemahkan ikatannya dengan      PGV-0.      Pada       kondisi        ini, TPP  kembali  berperan  untuk  tetap mengaitkan  kitosan  satu  sama  lain, sehingga meski        ikatannya      dengan PGV-0 melemah, tidak sampai menimbulkan  kerusakan  berarti  pada nanopartikel yang telah terbentuk.
Aktivitas penghambatan inflamasi Aktivitas  penghambatan  inflamasi nanopartikel  PGV-0  dapat  dilihat  dari berbagai  parameter  yang  dapat  diperoleh dari analisis hasil pengujian menggunakan penghambatan radang terinduksi karagenin  ini.  Di  antaranya  adalah  nilai daya  hambat  inflamasi  (DHI)  pada  tiap waktu  pengujian  serta  daya  anti-inflamasi (DAI)  (Grafik  2  dan  3).  Dari  kedua parameter  tersebut,  dapat  disimpulkan bahwa pada dosis yang sama, nanopartikel berhasil  meningkatkan  nilai  DHI  secara signifikan  (p<0,05),  dan  setara  dengan dosis PGV-0 tanpa preparasi hingga empat kalinya.
Keberhasilan  preparasi  nanopartikel menggunakan  matriks  kitosan-TPP  untuk meningkatkan  efektivitas  PGV-0  dalam penghambatan  inflamasi  secara in  vivo dapat  disebabkan  oleh  beberapa  faktor. Beberapa  faktor  ini  merupakan  aspek- aspek  komprehensif,  mengingat  studi in vivo merupakan  studi  hubungan  antara
perlakuan  dan/atau  dosis  dengan  efek yang timbul     pada    subjek    uji.    Karena itu,  semua  hal  yang  dapat  dimodifikasi pada semua tahapan mulai dari memasukkan  obat  ke  dalam  saluran pencernaan,  hingga  obat  mengalami proses      absorpsi, distribusi, metabolisme, dan  menimbulkan  efek,  dapat  menjadi faktor yang berpengaruh. Pertama, sediaan nanopartikel menggunakan kitosan ini mampu merusak protein  yang  mengikat  celah  antar  sel (disebut tight  junction atau t-junction ) secara  temporer/sementara  (Bhardwaj dan Kumar, 2006), sehingga memungkinkan obat untuk masuk melintasi  celah  tersebut.  Peruraian t- junction ini  bersifat  reversal/temporal (tidak permanen), karena hanya melibatkan mekanisme redistribusi protein claudin-4 ( Cldn4 ) dari membran sel ke sitosol sehingga t-junction terbuka. Saat kitosan  telah  lewat,  maka  protein Cldn4 akan  disintesis  untuk  memperbaiki t- junction (Yeh et al. , 2011). Kedua, potensial zeta  nanopartikel  PGV-0  yang  bermuatan positif (+3,8 mV) memungkinkan interaksi ionik  antara  ion  NH 3+ dari  kitosan  dengan gugus  asam  sialat  yang  bermuatan  negatif pada  membran  saluran  cerna  (Vllasaliu et al , 2010), sehingga partikel dapat tertahan lebih  lama  di  dalam  saluran  usus,  dan memberikan  waktu  yang  lebih  lama  bagi obat  untuk  terabsorpsi.  Selain  itu, nanopartikel kitosan juga memiliki kemampuan  penetrasi  intraseluler  yang baik  (Chabib et  al. ,  2011),  sehingga memberikan  alternatif  absorpsi  melalui mekanisme  endositosis.  Akhirnya,  secara umum,  nanopartikel  PGV-0  ini  dapat terabsorpsi  menembus  membran  usus melalui dua jalur, baik paraseluler maupun transeluler.  Sedangkan  pada  PGV-0  tanpa preparasi  nanopartikel,  hanya  dapat terabsorpsi  secara  transeluler,  dimana karena  kelarutannya  yang  rendah  (Hakim et  al. ,  2006)  menyebabkan  proses  difusi pasif  ini  menjadi  kurang  optimal  dan berjalan  lambat.  Kemudian  dari  aspek
metabolisme, nanopartikel PGV-0 memberikan  perlindungan  pada  PGV-0  di dalam  darah  terhadap  metabolisme  lintas pertama  ( first  pass  effect )  oleh  enzim- enzim  sitokrom  P450  dalam  liver.  Salah satu  mekanisme  kerja  yang  utama  dari metabolisme oleh enzim ini adalah dengan mengenali senyawa-senyawa yang cenderung  non-polar,  untuk  dikonjugasi menjadi  senyawa  baru  yang  lebih  polar dan  kemudian  dapat  dibuang  melalui ginjal. Preparasi menjadi bentuk nanopartikel menyebabkan kompleks bersifat polar, sehingga dapat mengelabuhi sistem  metabolisme  ini,  meskipun  tidak dapat  sepenuhnya  terhindar  karena  liver memiliki fungsi deaminasi (menyingkirkan gugus  nitrogen)  dari  amina  (Waugh  dan Grant,  2010),  yang  dalam  hal  ini  akan mempengaruhi stabilitas kitosan yang kaya gugus.  Setidaknya  PGV-0  akan  dibebaskan secara  bertahap  di  dalam  darah,  karena pada  dasarnya  kemampuan  metabolisme oleh  enzim sitokrom P450 bersifat partisi, sehingga  pada  nanopartikel  jumlah  PGV-0 dalam  darah  menjadi  lebih  terkontrol  dan stabil  karena  tidak  langsung  mengalami metabolisme  secara  bersamaan.  Hal  ini memberikan  keuntungan  efek  yang  relatif lebih lama.  Nilai DHI  dari waktu ke waktu membuktikan  hal  ini,  dimana  pada  PGV-0 tanpa  preparasi  nanopartikel  kemampuan untuk  menghambat  terjadinya  inflamasi lebih  cepat  menurun,  sedangkan  pada nanopartikel  PGV-0  kemampuan  ini mampu terjaga lebih lama.
Kombinasi dari peningkatan absorpsi dan penghambatan proses metabolisme ini kemudian  secara  komprehensif  akan meningkatkan ketersediaan hayati (bioavailabilitas)  PGV-0  dalam  darah. Ketersediaan  hayati  yang  meningkat  dan terjaga  (stabil)  akan  menyebabkan  kadar obat  dapat  melampaui  kadar  efektif minimum dalam waktu yang lebih panjang, atau  dalam  farmakokinetika  disebut meningkatkan durasi terapi. Selain durasi
yang  meningkat,  puncak  kadar  kurva ketersediaan hayati PGV-0 juga meningkat, sehingga dapat meningkatkan respon efek, dalam hal ini penghambatan volume udem sebagai manifestasi dari kejadian inflamasi dalam  tubuh.  Artinya,  dapat  disimpulkan bahwa peningkatan aktivitas in vivo secara signifikan  ini  merupakan  salah  satu parameter            peningkatan          absorpsi obat, karena secara langsung berhubungan dengan  ketersediaan  obat  dalam  darah untuk  mencapai  konsentrasi  efektif (Bowman dan Leong, 2006).

## Afinitas enzimatik terhadap COX
Profil afinitas enzimatik nanopartikel terhadap COX-1 dan COX-2 (Grafik 4). Dari grafik  diperoleh  data  bahwa  PGV-0  baik dalam  bentuk  asalnya  maupun  setelah dipreparasi menjadi nanopartikel, memiliki afinitas yang relatif lebih selektif terhadap COX-2  dibandingkan  terhadap  COX-1.  Dari hasil  ini  diperoleh  kesimpulan  bahwa nanopartikel  PGV-0  masih  aman  terhadap lambung,  dan  seperti  halnya  PGV-0  tidak menimbulkan efek samping ulcerogenik.

## KESIMPULAN
Nanopartikel  PGV-0  dengan  matriks kitosan rantai sedang dan TPP merupakan kandidat agen anti-inflamasi yang potensial, ditandai dengan kemampuannya meningkatkan aktivitas anti-inflamasi secara  in  vivo,  serta  selektivitasnya  pada COX-2  sehingga  tidak  menimbulkan  efek samping  ulcerogenik.  Namun  demikian, masih  perlu  adanya  pengembangan penelitian  lebih  lanjut  pada  tahap penentuan  nilai  dosis  efektifnya  pada jumlah hewan uji per kelompok yang lebih besar  ( power lebih  kuat).  Selanjutnya, perlu  dicarikan  solusi  untuk  tahap liofilisasi nanopartikel sehingga memungkinkan diperoleh kadar yang lebih tinggi. Perlu juga dipertimbangkan penggunaan  bahan  baku  lokal  untuk mendapatkan    sistem   yang   lebih   murah
sehingga  lebih  ekonomis  jika  diterapkan pada skala industri.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih penulis ucapkan pada  Biro  Oktroi  Rossenno  (BOR  dan Akademi  Ilmu  Pengetahuan  Indonesia (AIPI)  atas  hibah  yang  diberikan  untuk mendanai  penelitian  ini.  Ucapan  terima kasih juga kami ucapkan pada Laboratorium              Biofarmasetika Fakultas  Farmasi  UGM  dan  Laboratorium Polimer  Jurusan  Teknik  Kimia  Fakultas Teknik UGM atas dukungan dan kerjasamanya dalam penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Asosiasi  Rheumatologi  Australia,  2008,
Patient  information  on  NSAIDs ,
Arthritis Australia.
Amalia E., 2001, Profil kadar senyawa 2,5- bis- (4’ -hidroksi- 3’ -metoksi benzilidin)  siklopentanon  dalam darah setelah pemberian secara oral pada  tikus  jantan  SD, Skripsi , Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta. Bhardwaj  V.  dan  Kumar  MNVR.,  2006, Polymeric nanoparticles for oral durg delivery on  Nanoparticle  technology for  drug  delivery:  Drug  and  the pharmaceutical  science,  chapter  IX, Taylor dan Francis Group, New York, pp. 231-262. Bisht  S.,  Feldmann,  G.,  Soni,  S.,  Ravi,  R., Karikar, C., Maitra, A., dan Maitra, A., 2007, Polymeric Nanoparticle- Encapsulated Curcumin ("nanocurcumin"):  a  Novel  Strategy for  Human  Cancer  Therapy, J. Biomater.  Sci.  Polymer  Edn ,  18(2):
205 – 221. Bowman  K.,  Leong  KW.,  2006,  Chitosan nanoparticles for oral drug and gene delivery, a Review, Int. J. Nanomedicine , 1(2): 117-128. Chabib  L.,  Banne  Y.,  Martien  R.,  Ismail  H.,
2011,  Formulasi  nanokurkumin  dan uji  cellular  uptake  pada  sel  kanker,
laporan  penelitian ,  Proyek  I-MHERE Fakultas Biologi UGM. Chavalittumrong P., Chivapat S., Rattanajarasroj  S.,  Punyamong  S., Chuthaputti  A.,  Phisalaphong  C., 2002,  Chronics  toxicity  study  of curcuminoids in rats, Songklanakarin
J. Sci. Technol ., 24(4): 633-647. Couvreur, P., Barrat, G., Fattal, E., Legrand,
P.,  Vauthier,  C.,  2002,  Nanocapsule
Technology: a Review, Crit. Rev. Ther.
Drug Carrier Syst , 19: 99-134. David, Arkeman H., 2008, Evaluation of the oral toxicity of formaldehyde in rats, Universa Medicina , 27(3): 106-112. Fernandez-Urussumo R., Calvo P., Remunant-Lopez  C., et  al. ,  1999, Enhancement  of  nasal  absorption  of insulin  using  chitosan  nanoparticles,
Pharm. Res ., 16: 1576-1581. Hakim  AR.,  Nugroho  AE.,  Hakim  L.,  2006, Profil farmakokinetika Pentagamavunon -0 setelah pemberian kalium pentagamavunonat  -0  secara  oral pada  tikus, Indon.  J.  Pharm .,  17(4): 204-211.
Jurenka  J  S.,  2009,  Anti-inflammatory properties  of  curcumin,  a  major constituent  of Curcuma  longa :  A review  of  preclinical  and  clinical research, Alt.  Med.  Rev. ,  14(2):  141- 153/
Kafshgari MH., Khorram M., Khodadoost M., Khavari  S.,  2011,  Reinforcement  of chitosan  nanoparticles  obtained  by an  ionic  cross-linking  process, Iran. Polymer J. , 20(5): 445-456. Katzung BG., 1986, Farmakologi Dasar dan
Klinik ,  edisi  3,  diterjemahkan  oleh
Binawati    HK.,  Penerbit  Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Kustaniah, 2001, Profil kadar senyawa 2,5- bis- (4’ -  hidroksi  - 3’ -    metoksi benzilidin)  siklopentanon  dalam darah setelah pemberian secara oral pada  tikus  betina  SD, Skripsi , Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta.
Martien R., Loretz B., Bernkop- Schnűrch A.,
2006 1 , Oral Gene Delivery: Design of polymeric  carrier  systems  shielding toward  intestinal  enzymatic  attack, Biopolymers , 83: 327-336. MOLNAS, 2001, Laporan Penelitian Farmakokinetika PGV-0 setelah pemberian  injeksi  intravena,  peroral, dan intraperitoneal pada Tikus Jantan dan  Betina ,  Proyek  MOLNAS  1, Kerjasama  PT  Indofarma,  PT  Kalbe Farma,  dan  Fakultas  Farmasi  UGM, Buku IV, Yogyakarta. Pan Y., Li Y., Zhao H., Zheng J., Xu H., Wei G., Hao  J.,  Cui  F.,  2002,  Bio-adhesive polysaccharide  in  protein  delivery system: chitosan nanoparticles improve  the  intestinal  absorption  of insulin  in  vivo, Int.  J.  Pharm. ,  249: 139-147.
Saha  P.,  Goyal  AK.,  Rath  G.,  2010,
Formulation  and  evaluation  of chitosan-based  ampicillin  trihydrate nanoparticles, Tropic.  J.  Pharmaceut. Res. , 9(5): 483-488. Sardjiman, 2000, Synthesis of new series of curcumin analogues, biological
activities,  and  qualitative  structure- activity    relationships, dissertation , Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Tiyaboonchai W., 2003, Chitosan nanoparticles:  A  promising  system for drug delivery, Naresuan Univ. J. ,
11(3): 51-66. Vllasaliu  D.,  Exposito-Harris  R.,  Heras  A., Casettari L., Garnett M., Illum L., dan Stolnik  S.,  2010,  Tight  junction modulation by chitosan nanoparticles:  Comparison  with chitosan  solution, Int.  J.  of  Pharm.,
400(1-2): 183-193.
Waugh A., Grant A., 2010, Ross and Wilson Anatomy  and  Physiology  in  Health and  Illness  10 th Ed .,  diadaptasi  oleh Nurachmah  E.,  Angriani  R.,  Dasar- dasar Anatomi dan Fisiologi, Penerbit Salemba Medika, Jakarta. Yeh  TH.,  Hsu  LW.,  Tseng  MT.,  Lee  PL., Sonjae  K.,  Ho  YC.,  dan  Sung  HW., 2011,  Mechanism  and  consequence of chitosan-mediated reversible epithelial  tight  junction  opening, Biomaterials, 36(26): 6164-73.