Gambaran Mikroskopis Nekrosa Sel dan Deplesi Folikel Limfoid Bursa Fabricius Ayam Broiler Pasca Pemberian Probiotik B-mix dan Infeksi

## Salmonella enteritidis
Eni Rohyati
Program Studi Kesehatan Hewan Politeknik Pertanian Negeri Kupang Jl. Adi Sucipto Penfui, P. O. Box. 1152, Kupang 85011

## ABSTRACT
Profile of Microscopic Necrosis Cells and Depilation of Lymphoid Follicle of Bursa  of  Broiler  after  Probiotic  B  Mix  Administration  and  Enteritic salmonella  Infection .  Research  to  determine  the  incidence  of  necrosis  cells  and depletion  of  lymphoid  follicles  of  bursa  of  fabricius  after  administration  of  B-mix probiotic and infection of Salmonella enteritidis (SE) was performed on 16 of broiler chickens strain abor acress divided into 4 groups; control group (IA), infected by SE (IB),  Probiotics  without  SE  infection  (2A)  and  probiotic  with  infected  SE  (2B). Probiotic was daily administered at a dose 2 ml/litre of drinking water start at DOC (day  old  chick)  to  6  weeks  old  chicken.  Infection  performed  at  the  4  weeks  old chicken with dose 10 8 CFU/ml of drinking water. Observation and statistical tests has  indicate  that  the  groups  were  administration  with  B-mix  probiotic  could  be increase  the  proliferation  of  lymphocyte  cell  so  that  cells  of  lymphoid  follicles  is more  dense  than  in  the  control  group,  while  administration  of  B-mix  probiotic  in chickens  had  been  infected  by  SE,  can  reduce  the  incidence  of  depletion  of lymphoid follicles and nekrosa cells.
Key words: Bacillus, probiotic, Salmonella enteritidis, bursa fabricius, depletion

## PENDAHULUAN
Dewasa  ini  pemakaian  antibiotik  didunia  peternakan  ayam  sangat  tinggi dengan  tujuan  mengatasi  penyakit  yang  disebabkan  oleh  mikroba  yang  peka terhadap  antibiotikadan  dengan  tujuan  penggunaan  sebagai  pemacu pertumbuhan  ( antibiotic  growth  promotor )  yang  disebut  AGP.  Pemakaian antibiotik  sebagai  antimikrobial  dikalangan  peternak  dilakukan  untuk mengatasi  infeksi  primer  maupun  sekunder  penyakit-penyakit  ayam  yang semakin  kompleks,  sedangkan  tingginya  pemakaian  antibiotik  sebagai  AGP dilakukan  sebagai  pilihan  untuk  memacu  pertumbuhan  ayam  guna mengimbangi  naiknya  harga  pakan.  Menurut  Sudarwanto  (2000)  pemakian antibiotik  secara  terus  menerus  dan  berlebihan  akan  menimbulkan  masalah baru  yaitu  terjadinya  peningkatan  resistensi  mikroba  pathogen  dalam  tubuh ternak  dan  adanya  residu  antibiotik  dalam  produk  peternakan  yang  dapat membahayakan  konsumen.    Selain  itu,  menurut  Adil et  al (2011)  pemakaian antibiotik  sebagai  pemacu  pertumbuhan  juga  sangat  dekat  hubungannya
dengan resistensi antibiotik, karena itu beberapa tahun belakangan ini beberapa Negara telah melarang pemakaian AGPs.
Tingginya  perhatian  terhadap  masalah  resistensi  antibiotik  beberapa strain bakteri dan residu antibiotik dalam beberapa produk pangan asal hewan menyebabkan  terpacunya  para  peneliti  untuk  mencari  alternatif.  Salah  satu alternatif  adalah  mengefektifkan  pemakaian  makanan  imbuhan  ( feed  additive ) dengan  menggunakan  bakteri.  Menurut  Utomo  (2002)  dan  Adil et  al (2011), sistem  pengendalian  bakteri  dalam  tubuh  sebagai  alternatif  pengganti  AGPs sebenarnya  ada  Empat  cara  yaitu  prebiotik,  probiotik,  acidifier  dan  enzim. Alternatif yang paling mudah dilakukan dengan biaya yang relatif murah adalah probiotik.  Hal  ini  didukung  oleh  Fuller  (1992)  dan  Gibson et  al (1997)  yang menyatakan  bahwa  probiotik  merupakan  makanan  tambahan  berupa mikroorganisme  yang  mempunyai  pengaruh  menguntungkan  bagi  induk semangnya  melalui  peningkatan  keseimbangan  mikroorganisme  usus. Penggunaan  probiotik  akan  memberikan  pengaruh  seperti  terjadinya peningkatan  berat  badan  dan  efisiensi  pakan,  nafsu  makan,  keseimbangan mikroorganisme usus, sintesis vitamin dan peningkatan sistem kekebalan tubuh atau bersifat immunostimulan.
Bursa  fabricius  adalah  organ  limfoid  yang  menjadi  sistem  immune humoral spesies unggas dan burung melalui sekresi immunoglobulin (antibodi) oleh limfosit B dan merupakan organ yang berisi sel plasma dan makrofag yang sangat  memegang  peranan  penting  dalam  respon  pertahan  tubuh  terhadap benda  asing  yang  masuk  tubuh  serta  merupakn  organ  yang  digunakan  untuk membedakan  gen  immunoglobin  (Toivanen et  al .,  1987;  Riddel,  1987;  Tizard, 1987).
Salmonella  enteritidis (SE)  merupakan  salah  satu  strain Salmonella yang menyebabkan  salmonellosis  yang  bersifat  zoonosis  dan  merupakan  penyakit yang sering menyerang ternak ayam (Gast, 1997).
Tujuan penelitian ini adalah mengetahui efek pemberian probiotik B-mix dan infeksi SE terhadap gambaran nekrosa sel dan deplesi folikel limfoid bursa fabricius dan mengetahui pengaruh pemberian probiotik B-mix terhadap SE.

## METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan  penelitian  yang  digunakan  dikelompokkan  dalam  4  kelompok bahan yaitu hewan percobaan, preparat probiotik, isolat Salmonellla dan bahan- bahan lain.
Hewan  percobaan  yang  digunakan  adalah  ayam  broiler  strain  Abor arcres 16 ekor yang berumur ±1 hari dan dipelihara sampai 6 minggu. 16 ekor ini  dibagi  dalam  4  kelompok  dengan  distribusi  masing-masing  4  ekor. Pemliharaan  dilakukan  dengan  cara  mengkondisikan  ayam  sesuai  dengan keadaan  di  peternakan  komersial  dan  diberi  makan  dan  minum  sesuai  aturan pemeliharaan ayam.
Preparat  probiotik  yang  adalah  probiotik  B-mix  yang  merupakan campuran dari 6 jenis Bacillus yang berbeda dan dengan kontribusi dosis yang berbeda-beda yang diisolasi dari saluran pencernaan ayam.  Jenis Bacillus dan dosis  (Colony  Forming  Unit  =  CFU.  mL -1 )  serta  komposisi  masing-masing  jenis yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Jenis Bacillus dan komposisinya dalam B-mix
Jenis Bacillus Dosis (CFU. mL -1 ) Bacillus apiaries 0.6 x 10 7 Bacillus alvei 6 x 10 7 Bacillus brevis 2 x 10 7 Bacillus circulans 5 x 10 7 Bacillus laterophilus 5 x 10 7 Bacillus coagulans 4 x 10 7 Total 2.26 x 10 8
Salmonella  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  Salmonella enteritidis  (SE)  10 8 CFU/ml  yang  diisolasi  dari  saluran  pencernaan  ayam. Bahan-bahan  lain  yang  digunakan  adalah  BNF  (buffer  netral  formalin) 10%,bahan  pembuat  preparat  histopatologi,  bahan  pewarnaan  hematoksilin (HE),  kertas  label  dan  kertas  tissue.  Alat-alat  yang  digunakan  adalah  kandang pemeliharaan,  temapt  makan,  tempat  minum,  pisau  potong,  pin  penomoran ayam,  tabung  film  untuk  menyimpan  organ,  timbangan,  peralatan  pembuatan dan pewarnaan preparat histopatologi dan micrometer.

## Metode Penelitian
Penelitian  dilaksanakan  dalam  beberapa  tahap  kegiatan  yaitu  persiapan dan  pengelompokkan  ayam,  pemberian  preparat  probiotik  dan  infeksi Salmonella,  nekropsi  dan  pemeriksaan  patologi  anatomi,  pembuatan  dan pewarnaan preparat histopatologi, pengamatan preparat hitopatologi dan analisa data.
Kegiatan  persiapan  ayam  dilaksanakan  melalui  pemeliharaan  DOC  (day old  chick)  sejumlah  400  ekor  yang  dikelompokkan  dalam  40  kelompok  dengan distribusi  masing-masing  10  ekor.  Pada  tiap  kelompok  diambil  96  ekor  secara acak dan dipisahkan serta dikelompokkan dalam 12 kelompok dengan distribusi masing-masing  8  ekor.  Pada  penelitian  ini  diambil  secara  acak  4  kelompok, kemudian dari tiap kelompok yang terpilih diambil secara acak sebanyak 4 ekor, maka  kelompok  ayam  yang  digunakan  adalah  4  kelompok  dengan  distribusi masing-masing  4  ekor.  4  kelompok  tersebut  terdiri  dari  kelompok  kontrol  (IA), kelompok yang diinfeksi dengan SE (IB), kelompok probiotik tanpa SE (2A) dan kelompok probiotik yang diinfeksikan SE (2B).
Ayam pada kelompok 2A dan 2B diberikan probiotik B-mix 10 8 CFU. mL -1 dengan cara dicampurkan kedalam air minum dengan dosis 2 cc. L -1 air minum tiap  hari  mulai  dari  DOC  sampai  6  minggu.  Ayam  pada  kelompok  IB  dan  2B pada  umur  ±4  minggu  diinfeksikan  dengan  SE  10 8 CFU/ml  dengan  dosis  0.5 cc/ekor per oral.
Nekropsi atau pembedahan setelah mati dilakukan 2 kali yaitu 1 minggu pasca  infeksi  (PI)  dan  2  minggu  pasca  infeksi  (PI)  dengan  terlebih  dahulu dilakukan  penimbangan  berat  hidup.  Setelah  nekropsi  dilakukan  pengamatan perubahan  patologi  anatomi,  pengambila/pengakatan  dan  penimbagan  organ bursa fabricius.  Selanjutnya bursa fabricius dimasukkan dalam tabung sampel dan  difiksasi  dengan  BNF  10  %  dan  selanjutnya  dibuat  preparat  histopatologi dan diberi pewarnaan hematoksilin eosin (HE).
Pengamatan  terhadap  reparat  histopatlogi  bursa  fabricius  dengan pewarnaan HE dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran obyektif 10x dan 40x dan dengan okuler 2.5x. Pengamatan dilakukan dengan cara memilih 3 plika  bursa  fabricius  secara  acak  dari  tiap  preparat,  kemudian  jumlah  folikel limfoid  dalam  tiap  plika  tersebut  dihitung  dan  dilakukan  pengamatan  dan
Ʃ a
Ʃ c = ̶ x 100 % Ʃ b
perhitungan  secara  teliti  terhadap  kejadian/parameter  nekrosa  sel  dan  deplesi folikel limfoid. Kedua parameter pengamatan ini dianggap ada jika kehadirannya dalam  folikel  limfoid  adalah  >30  %  dan  sebaliknya,  jika  kehadirannya  <30  % dalam  tiap  folikel  limfoid  maka  parameter  tersebut  dianggap  tidak  ada. Keberadaan parameter tersebut dalam tiap plika ditentukan dengan rumus; Keterangan;
a = jumlah keberadaan parameter tersebut dalam tiap plika b = jumlah folikel limfoid dalam 1 plika c = total keberadaan parameter pengamatan dalam 1 plika
Data  hasil  pengamatan  histopatologi  atau  mikroskopis  di  analisa  lebih lanjut dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dan Uji Beda Nilai Tengah Tukey.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengamatan mikroskopis dan analisis statistik pengaruh pemberian probiotik  B-mix  dan  infeksi Salmonella  enteritidis terhadap  nekrosa  sel  dan deplesi folikel limfoid bursa fabricius dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Gambaran Nekrosa Sel Dan Deplesi Folikel Limfoid Bursa Fabricius
Kelompok Nekrosa Sel Deplesi Folikel Limfoid 1 Minggu PI 2 Minggu PI 1 Minggu PI 2 Minggu PI IA 6.167 c 5.037 c 3.91 b 4.58 b IB 77.990 a 91.08 a 3.26 b 45.33 a 2A 1.670 c 40.840 b 1.30 b 12.70 ab 2B 37.335 b 44.032 b 5.67 b 18.47 ab
Keterangan: 1).  Huruf yang berbeda pada kelompok dan waktu pada kolom dan baris yang sama menunjukkan berbeda nyata (p<0.05), 2). Kelompok; Kontrol (IA), yang diinfeksi SE (IB), probiotik tanpa infeksi SE (2A), probiotik dengan infeksi SE (2B) dan 3). PI berarti pasca infeksi
Hasil pengamatan mikroskopis dan analisa statistik terhadap jumlah nekrosa sel dalam  folikel  limfoid  bursa  fabricius  menunjukkan  bahwa  antara  kelompok  IA dan  2A  pada  1  minggu  PI  secara  statistik  tidak  berbeda  nyata  (p>0.05), sedangkan pada minggu yang sama antara kedua kelompok (IA dan 2A) dengan kelompok  IB  dan  2B  menunjukkan  perbedaan  nyata  (p<0.05).  Kelompok  2A,
selain  terlihat  tidak  berbeda  nyata  dengan  IA  juga merupakan  kelompok  dengan  rataaan  nekrosa  sel  yang paling  kecil  dan  bahkan  secara  numerik  lebih  sedikit dari  kelompok  IA  sebagai  kelompok  kontrol.  Hal  ini
disebabkan  karena  probiotik  B-mix  dapat  meningkatkan  jumlah  Bakteri  Asam Laktat  (BAL)  dalam  saluran  pencernaan  yang  pada  aktifitasnya  mempunyai kemampuan memodulasi produksi sitokin sebagai metabolit penghasil antibody dari makrofag monosit, mitogen dan antigen yang mendorong proliferasi limfosit dan  sel natural  killer (NK)  (Famularc et  al .,1997).  Ditambahkan  pula  oleh Perdigon and Alvarez (1992), bahwa BAL juga memumpunyai fungsi merangsang sel T untuk melepaskan limfokin yang sangat penting peranannya dalam proses proliferasi dan diferensiasi sel B. Menurut Roitt (1972) dan Vertel (2002), sel B merupakan sel yang dihasilkan bursa fabricius dan bertangggung jawab dalam sintesa antibodi.  Tiga pernyataan diatas dapat menjelaskan mengapa  kejadian nekrosa paling sedikit terjadi pada kelompok probiotik. Proliferasi sel B tersebut menyebabkan  sel-sel  dalam  folikel  limfoid  secara  mikroskopis  terlihat  kompok
dan padat, sehingga menyebabkan jaringan interstitium antara folikel limfoid  menjadi  tipis  dan  jarak antar  folikel  limfoid  terlihat hampir  bersentuhan,  sehingga gambaran mikroskopis proliferasi sel dalam folikel lifoid kelompok  probiotik  (Gambar  1)
akan  terlihat  hampir  sama dengan  gambaran  mikroskopis proliferasi  sel  dalam  folikel limfoid  kelompok  kontrol  (IA) (Gambar  2).  Selain  itu  agen
infeksius  seperti Salmonella ini dapat menyebabkan inang menjadi  stress.  Tubuh  dalam keadaan stress akan memberikan respon dengan jalan  merangsang  kerja  pusat kelenjar adrenal pituitary Gambar. 2   Bursa  fabricius  kelompok  probiotik;  sel-sel dalam  folikel  limfoid  terlihat  kompak  dan padat ( ). Pewarnaan HE (300x) Gambar. 1   Bursa  fabricius  kelompok  probiotik;  sel-sel dalam  folikel  limfoid  terlihat  kompak  dan padat ( ). Pewarnaan HE (300x)
hipotalamus,  termasuk  tanggapan  dari  otak  dengan  melepaskan  corticotrophin releasing factor (CRF) di hipotalamus dan vasopresi yang menstimulasi pituitary anterior untuk mensekresi adenocorticotropic hormone (ACTH). Sirkulasi ACTH akan  menyebabkan  korteks  adrenal  memproduksi  glucocorticoid  (GC)  yang mempunyai  efek  sitotoksin  terhadap  sel  limfosit,  sehingga  sel-sel  dalam  folikel limfoid  lebih  cepat  mengalami  nekrosa  yang  pada  akhirnya  menyebabkan
terjadinya  immonosupresi  (Dohms dan Metz, 1991). Tingginya  level  GC  juga terjadi pada kondisi stress emosional seperti yang terjadi pada kelompok 2B 2 minggu pascainfeksi yang  mengalami  stress  akibat pengaruh pengambilan contoh/sampel  ayam  pada  minggu pertama pascainfeksi, sehingga secara  statistik  terjadi  peningkatan jumlah  rataan  sel  nekrosa  secara nyata  (P<0.05)  pada  kelompok  2B dua minggu pascainfeksi. Hasil pengamatan mikroskopis  dan  analisa  statistik terhadapa  kejadian  deplesi  folikel limfoid  menunjukkan  bahwa  pada minggu  pertama  pascainfeksi  tidak ada  perbedaan  nyata  (P>0.05) antara  semua  kelompok.  Pada  2 minggu  pascainfeksi  kelompok  1B
secara numerik lebih banyak dibanding  kelompok  lain  baik  di minggu  pertama  atau  kedua  pascainfeksi  dan  secara  statistik  berbeda  nyata (p<0.05) dengan kelompok IA 1 dan 2 minggu pascainfeksi dan dengan kelompok
Gambar. 5.  Bursa  Fabricius,  Kelompok  probiotik yang  SE  Dua  Minggu  PI;  folikel  limfoid mengalami deplesi ringan (D). Pewarnaan HE (300x).
Gambar. 3.  Bursa  Fabricius  kelompok  SE  Dua minggu  PI;  sel-sel  dalam  folikel limfoid  mengalami  deplesi  (D)  dan nekrosa sel (  ).Pewarnaan HE (750 x)
Gambar.  4.  Bursa  Fabricius  kelompok  SE  Dua minggu PI; sel-sel dalam folikel limfoid mengalami deplesi (D) dan nekrosa sel (  ).Pewarnaan HE (750 x)
IB, 2A serta 2B 1 minggu pascainfeksi, sedangkan dengan kelompok 2A dan 2B 2 minggu pascainfeksi kelompok ini tidak berbeda nyata (P>0.05).
Banyaknya  sel  yang  mengalami  nekrosa  akan  sangat  mempengaruhi tingkat keparahan deplesi yang diderita folikel limfoid tersebut, karena menurut Nakamura et  al (1986),  Deplesi  merupakan  peluruhan  sel-sel  dalam  folikel limfoid bursa fabricius. Pada hasil pengamatan terhadap folikel limfoid kelompok yang  diinfeksi Salmonella  enteritidis terlihat  adanya  proses  peluruhan  dan pengurangan sel-sel dalam folikel limfoid yang biasanya dimulai dan diawali dari dari bagian medulla, kemudian berlanjut pada bagiankorteks dan pada akhirnya terjadi peluruhan secara total yang berakibat atrofi dan hilangnya folikel lomfoid tersebut.  Hal  ini  akan  menyebabkan  jumlah  total  folikel  limfoid  dalam  bursa
fabricius  tersebut  menjadi berkurang, sedangkan menurut  Toivanen et  al , (1987),  jumlah  total  folikel limfoid dalam bursa fabricius pada  ayam  dewasa  dalam kondisi normal berkisar antara 8000-12000.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
1. Pemberian Probiotik B-mix secara mandiri dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit sehingga sel-sel folikel limfoid lebih padat dari pada kelompok kontrol.
2. Pemberian  probiotik  B-mix  pada  ayam  yang  dinfeksi  SE,  dapat mengurangi kejadian deplesi dan nekrosa sel.
Gambar. 6.   Bursa  Fabricius,  Kelompok  probiotik  yang  SE Dua  Minggu  PI;  folikel  limfoid  mengalami deplesi ringan (D). Pewarnaan HE (300x).

## Saran
Disarankan  untuk  melakukan  penelitian  lanjutan  dengan  mengatur komposisi  mikroba  probiotik  B-mix  atau  mengguanakan  probiotik  yang  berisi mikroba jenis lain.

## DAFTAR PUSTAKA
Adil S., M. T. Banday, G. A. Bhat and M. S. Mir.  2011. Alternative Strategies to Antibiotic Growth Promoters - A review. Vol. 6 No. 1, Article 76. Department of  Livestock  Production  and  Management.  Department  of  Veterinary Pathology  Faculty  of  Veterinary  Sciences  and  Animal  Husbandry  Sher-e- Kashmir  University  of  Agricultural  Sciences  &  Technology  of  Kashmir, Shuhama-190006, India
Dohns,  J.  E  dan  A  Metz,  1991. Stress  Mechanism  of  Immunosupression. Vet. Immune and Immunophatol. 30: 89-109
Fuller, R. 1992. History and Development of Probiotics. In, Probiotics the Scientific Basis. Edited by R. Fuller. Champman & Hall. Pp:135-157.
Gast,  R.K.  1997. Salmonella  Infection.  In.  Diseases  Poultry .  10 nd Ed.  Edited  by B.W. Calnek. Iowa State University Press. Ames, Iowa. USA. Pp; 8-96
Gibson,  G.R,  J.M.  Saavendra,  S.  Macfarlane.  1997. Probiotics  and  Intestinal Infections.  In.  Probiotics  2;  Aplication  and  Practical  Aspect. Edited  by  R. Fuller. Champman & Hall. Pp; 10-39
Jawetz, E., J.L.Manick, dan E.A. Adelberg. 1980 . Review of Medical Microbiology.
14 nd Edition Printed. Hunstman offset printing Pte Ltd, Singapure. Perdigon G dan S. Alvarez, 1992. Probiotics and the Immune State. In Probiotic the Scientific Basis. Edited by R. Fuller. Chapman & Hall. Pp. 145-180 Nakamura,  K.,  Y.  Imada,  and  M.Maeda.  1986. Lymphocytic  Depletion  of  Bursa Fabricius  and  Thymus  in  Chicken  Inoculated  With  E.  coli. Vet.  Pathol. 23;712-717
Riddel,  C.  1987. Avian  Histopathology. American  Association  of  Avian Pathologists.  University  of  pennyslavia,  New  Boston  Center.  Pennyslavia. Pp: 390-393
Roitt, I. M. 1972. Essensial Immunology . 2 nd Printing,London Sudarwanto,  M.  2000. Mastitis  Ditinjau  dari  Kesehatan  Masyarakat  Konsumen. Ed ke-2. Dunia Veteriner Indonesia.
Tizard,  I.  1988. Pengantar  Immunologi  Veteriner. Cetakan  ke-2.  Penerjemah Partadireja. M. Airlangga Universitas Press, Surabaya. Pp; 497
Toivanen, P., A. Naukkarinen dan O. Vanio. 1987. What is the Function of Bursa of Fabricius?. In Avian Immunology: Basic and Practice Vol.I . Edited by A.A. Toivanen. CRC Press, Florida. Pp: 79-94
Utomo,  D.  B.  2002. Apakah  Probiotik  itu; Pemanfaatan  Bakteri  untuk Kesejahteraan Hewan Ternyata Banyak Ragamnya. Infovet. Ed 094