## ALCHEMY : JOURNAL OF CHEMISTRY

## Artikel Penelitian
Aktivitas Imunostimulan Ekstrak Metanol Biji Kurma ( Phoenix dactylifera ) secara In Silico terhadap Reseptor GIF dan COX-2 serta Uji In Vitro melalui Proliferasi Sel Limfosit Mencit
Siti Warnasih 1 *, Tamimah Shafwatul Ishlah 1 , Novitasari 1 , Dianda Namira Azzahra 1 , Gita Syahputra 2 * 1 Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan, Bogor, Indonesia, 16144
2 Pusat Riset Vaksin dan Obat, Badan Riset dan Inovasi Nasional, Bogor, Indonesia, 16911 INFO ARTIKEL ABSTRAK Sejarah Artikel Diterima 24 November 2021 Direvisi 04 Juli 2022 Tersedia online 04 Januari 2023
* Penulis korespondensi: siti.warnasih@unpak.ac.id; Dates  (Phoenix  dactylifera)  is  one  of  the  very  useful  plants,  but  the  date  palm seeds that become waste have not been widely used. Based on studies, it is known that  date  palm  seeds  contain  bioactive  compounds  that  can  be  suspected  as antioxidants,  antimicrobials,  and  anti-inflammatory.  However,  research  on immunostimulants from dates, especially in silico and in vitro, has not been widely carried out. Therefore, the purpose of this research is to determine the potential of date  seed  bioactive  compounds  as  immunostimulants  in  silico  against  Human Glycosylation-Inhibiting  Factor  (GIF)  (ID:  1GIF)  and  Human  Cyclooxygenase-2 (COX-2)  (ID:  5IKR)  receptors  as  well  as  in  vitro  through  the  proliferation  of lymphocyte cells of male mice (Mus musculus) balb/c strains with the MTT Assay methods. The results of the in silico study showed that 5-O-caffeoylshikimic acid had the highest interaction and stability, Gibbs free energy with 1GIF and 5IKR receptors, at -6.68 kcal/mol and -8.58 kcal/mol, respectively. This value is known to be higher than that of caffeic acid as a control ligand. The results of in vitro research obtained methanol extract of date seeds at a concentration series of 6.25, 12.5, and 25 µg/mL had higher lymphocyte cell proliferation activities, which were indicated by an increasing OD value, and at a concentration of 25 μg/mL produces the highest immunostimulant activity. Therefore, date seed extract containing the compound 5-O-caffeoylshikimic acid can potentially be an immunostimulant agent.
Keywords: 5-O-caffeoylsikimic acid, date palm seeds, immunostimulant, in silico,
in vitro
Kurma  ( Phoenix  dactylifera )  merupakan  salah  satu  tanaman  yang  sangat bermanfaat,  akan  tetapi  biji  kurma  yang  menjadi  limbah  belum  banyak dimanfaatkan.  Berdasarkan  data  penelitian  diketahui  bahwa  pada  biji  kurma terdapat senyawa bioaktif yang berpotensi sebagai antimikroba, antioksidan, dan antiinflamasi. Tetapi penelitian tentang imunostimulan dari biji kurma khususnya secara in silico dan in vitro belum banyak dilakukan. Maka dari itu, tujuan penelitian ini adalah menentukan potensi senyawa bioaktif biji kurma sebagai imunostimulan secara in silico terhadap reseptor Human Glycosylation-Inhibiting Factor (GIF) (ID: 1GIF)  dan Human  Cyclooxygenase-2 (COX-2)  (ID:  5IKR)  serta  in  vitro menggunakan metode MTT Assay melalui aktivitas proliferasi sel limfosit mencit jantan ( Mus musculus ) galur balb/c. Hasil penelitian in silico diperoleh ligan 5-O- caffeoylshikimic acid memiliki interaksi dan kestabilan paling tinggi, energi bebas Gibbs dengan reseptor 1GIF dan 5IKR berturut-turut bernilai -6,68 kcal/mol dan - 8,58 kkal/mol. Nilai tersebut diketahui lebih tinggi dari pada ligan kontrol c affeic acid .  Hasil  penelitian  in  vitro  diperoleh  ekstrak  metanol  biji  kurma  pada  seri konsentrasi 6,25; 12,5; dan 25 µg/mL memiliki aktivitas proliferasi sel limfosit yang semakin  tinggi  ditandai  dengan  nilai  OD  ( Optical  Density )  yang  semakin meningkat, dan pada konsentrasi 25 µg/mL menghasilkan aktivitas imunostimulan

## 1. Pendahuluan
Penyakit infeksi merupakan salah satu masalah dalam bidang kesehatan yang terus berkembang, dapat disebabkan oleh mikroorganisme patogen, seperti bakteri, virus, parasit, atau jamur. Saat ini penyakit infeksi yang sedang merebak adalah  penyakit  akibat Coronavirus  Disease 2019  (COVID-19).  Pada  tanggal  14  Maret  2020,  COVID-19  diumumkan sebagai  pandemi  oleh World Health  Organization (WHO)  [1].  Di  Indonesia kasus  positif  COVID-19  yang  terkonfirmasi sebanyak 4.251.076 orang dengan kasus kematian sebanyak 143.670 orang [2]. Sistem kekebalan tubuh menjadi salah satu faktor yang berpengaruh dalam penyebaran mikroba seperti COVID-19. Sistem kekebalan tubuh merupakan sistem perlindungan  tubuh  terhadap  penyakit  yang  disebabkan  oleh  mikroba.  Pada  kondisi  normal,  tubuh  dapat  menangkal paparan  mikroba  patogen  karena  adanya  sistem  kekebalan  tubuh.  Pada  saat  sistem  kekebalan  tubuh  dalam  kondisi minimal,  paparan  mikroba  patogen  dapat  mengakibatkan  penyakit.  Oleh  karena  itu,  perlu  adanya  cara  agar  sistem kekebalan  tubuh  dapat  bekerja  optimal  dalam  melawan  paparan  mikroba  patogen  [3].  Ada  2  jenis  sel  dalam  sistem kekebalan tubuh yaitu sel limfosit B dan sel limfosit T. Sel limfosit B merupakan sel yang dihasilkan oleh sumsum tulang belakang, sedangkan sel limfosit T merupakan sel yang dihasilkan oleh timus. Adapun cara untuk merangsang aktivitas dan perkembangan sel limfosit T yaitu dengan menambahkan suatu imunomodulator [4]. Imunomodulator adalah zat yang dapat merubah aktivitas dan fungsi sistem imunitas. Terdapat tiga kelompok imunomodulator, yaitu imunostimulan yang dapat meningkatkan aktivitas dan fungsi sistem imunitas, imunoregulator yang mampu mengatur sistem imunitas, dan imunosupresan  sebagai  penghambat  aktivitas  sistem  imun.  Imunomodulator  banyak  digunakan  untuk  pasien  dengan gangguan imunitas seperti kanker, malagizi, dan lain-lain. Penggunaan imunomodulator banyak mengakibatkan dampak negatif seperti gangguan saluran cerna, racun pada jaringan hati, dan sebagainya [3]. Oleh karena itu, diperlukan alternatif imunomodulator yang berasal dari tanaman obat yang memiliki dampak negatif yang relatif kecil terhadap tubuh.
Salah satu tanaman yang dikenal sebagai tanaman obat adalah kurma ( Phoenix dactilyfera L.) yang merupakan salah satu tanaman tertua yang banyak tumbuh di daerah Timur Tengah dan Afrika Utara [5]. Penganut agama Islam meyakini bahwa kurma bermanfaat bagi kesehatan. Pada tahun 2020, Indonesia yang mayoritas penduduknya muslim menjadi salah satu negara pengimpor kurma terbesar kelima di dunia [6]. Selain bisa dikonsumsi langsung, kurma dijadikan bahan baku industri sari kurma dengan limbah berupa biji, limbah biji kurma yang dihasilkan dari berbagai proses industri bisa mencapai 6,10–11,47% [7]. Biji kurma banyak mengandung senyawa aktif seperti saponin, antrakuinon, fenolik, dan flavonoid yang bermanfaat sebagai antioksidan, antiinflamasi, antimikroba, dan antiplasmolitik [8, 9, 10]. Golongan asam fenolat yang termasuk dalam senyawa fenolik pada biji kurma yaitu asam ferulat, asam m-koumarat, asam p-hidroksibenzoat, asam galat, dan asam  o-koumarat  [11].  Berdasarkan  penelitian  sebelumnya  diketahui  bahwa ekstrak  etanol biji  kurma yang mengandung senyawa aktif yaitu asam 3,4-dihidroksifenil asetat, asam sinamat, asam o-koumarat, asam celidonat, asam p-koumarat, asam p-hidroksibenzoat, dan pirogalol mampu menginhibisi enzim α-glukosidase dan terbukti secara in silico dan in vitro berpotensi sebagai antibakteri [12, 13]. Selain itu biji kurma dapat menjadi inhibitor enzim alosterik secara campur [14]. Ekstrak aseton biji kurma mampu menghambat infeksi Pseudomonas phage ATCC 14209-B1 pada sel inang Pseudomonas aeruginosa ATCC 25668 [15].
Biji  kurma  yang  mengandung  senyawa  metabolit  sekunder  seperti caffeic  acid,  ferulic  acid,  o-coumaric  acid,  p- coumaric acid, cholesterol,  5-O-caffeoylshikimic acid, dan  lain-lain  [16]  diketahui  belum banyak  dikaji  terkait  penelitian dengan  menggunakan  metode in  silico dan in  vitro khususnya  potensinya  sebagai  imunostimulan.  Metode in  silico merupakan suatu pengujian yang dilakukan dengan metode simulasi komputer untuk memprediksi, memberi hipotesis, dan penemuan baru dalam suatu pengobatan [17]. Uji in silico yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan dua reseptor berupa protein yang ditambahkan dengan senyawa aktif dari biji kurma, yaitu Human Glycosylation-Inhibiting Factor (GIF) (ID: 1GIF) dan Human Cyclooxygenase-2 (COX-2) (ID: 5IKR). Reseptor 1GIF memiliki aktivitas pengaturan fungsi makrofag dalam pertahanan sel inang melalui efek antiinflamasi glukokortikoid, sedangkan reseptor 5 IKR merupakan suatu enzim yang mampu mengkatalisis pembentukan prostaglandin sebagai mediator dalam jalur inflamasi [18, 19]. Pada uji in vitro, aktivitas imunostimulan ekstrak metanol biji kurma terhadap proliferasi sel limfosit dilakukan dengan metode MTT (3- (4,5- dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium  bromide) Assay .  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  menentukan  aktivitas imunostimulan senyawa bioaktif yang terdapat pada ekstrak metanol biji kurma secara in silico terhadap protein GIF dan COX-2 serta aktivitas imunostimulan secara in vitro dengan metode MTT Assay melalui proliferasi sel limfosit mencit jantan ( Mus musculus ) galur balb/c .
tertinggi. Dengan demikian, ekstrak biji kurma yang mengandung senyawa 5-O- caffeoylshikimic acid dapat berpotensi sebagai agen imunostimulan.
Kata Kunci: 5-O-caffeoylsikimic acid, biji kurma, imunostimulan, in silico, in vitro

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1. Bahan
Biji kurma yang digunakan berasal dari pabrik sari kurma di Kota Bogor, Jawa Barat, Indonesia. Bahan kimia yang digunakan adalah metanol teknis, mencit jantan ( Mus musculus ) galur balb/c usia 8-10 minggu, medium Roswell Park Memorial  Institute (RPMI)  1640  (Gibco), 20%  (v/v)  RPMI 1640  media komplit  +  FBS  ( Fetal  Bovine  Serum )  (Caisson), Phosphate  Buffered  Saline (PBS)  (Gibco),  2%  Giemsa  (v/v)  (Merck), imboost ®  (SOHO),  penicillin  100  U/mL  dan streptomycin 100 ug/mL (Gibco), stopper 10% SDS ( Sodium Dodecyl Sulphate ), DMSO (Dimetil Sulfoksida) (Merck), MMT [3-(4,5-dimetillthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida] (Sigma), dan etanol p.a (Merck).
Pada analisis in silico secara komputasi menggunakan perangkat lunak dan perangkat keras yang terlibat dalam persiapan senyawa, docking molekuler, dan analisis. Persiapan senyawa untuk molekul ligan menggunakan database PubChem dan  database Bank  Data  Protein (PDB)  untuk  protein.  Tahap  persiapan  untuk  menghilangkan  molekul  air, menambahkan atom hidrogen, dan menentukan lokasi docking ligan-reseptor menggunakan perangkat lunak AutoDock Tools (ADT) 1.5.6. Molecular docking dilakukan menggunakan AutoDock Vina, dan hasilnya divisualisasikan menggunakan Discovery Studio 2021 dan Ligplot [20].
2.2. Metode
2.2.1. Analisis In Silico
2.2.1.1. Persiapan Ligan dan Reseptor
Virtual screening senyawa aktif biji kurma sebagai ligan melalui situs IJAH Analytics (http://ijah.apps.cs.ipb.ac.id/). Sebanyak  10  senyawa  aktif  biji  kurma  dan  1  senyawa  kontrol  diunduh  dari website PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), piranti lunak MarvinSketch digunakan untuk menggambar struktur 2 dimensi (2D) dan 3  dimensi  (3D)  dari  ligan.  Molekul  reseptor/protein Human  Glycosylation-Inhibiting  Factor (GIF)  dan Human Cyclooxygenase-2 (COX-2) diunduh melalui Protein Data Bank (PDB) (https://www.rcsb.org) dengan kode ID: 1GIF dan ID: 5IKR. Program Discovery Studio digunakan untuk memisahkan reseptor dari ligan atau residu non standar dan pelarut. Hasil pemisahan disimpan dalam format .pdb. yang kemudian digunakan untuk analisis docking . Sebelum analisis docking dilakukan, data struktur molekul ligan dan reseptor serta data lainnya disimpan pada satu folder dalam satu direktori kerja. Ligan yang digunakan juga dianalisis untuk toksisitas dan kelarutan menggunakan aturan Lipinski menggunakan Protox II (https://tox-new.charite.de/protox_II/), serta analisis toksisitas menggunakan SwissADME (http://www.swissadme.ch/) [21].

## 2.2.1.2. Molecular Docking
Persiapan docking antara ligan dan reseptor dilakukan dengan program ADT 1.5.6 dan AutoDock Vina 4.2. Docking molekuler dapat membantu dalam skrining virtual dengan menghasilkan energi bebas Gibbs (∆G). Ligan dengan berpotensi maksimal  akan  mempunyai  nilai  ∆G  paling  negatif. Discovery  Studio digunakan  untuk  memvisualisasikan docking molekuler antara ligan dan reseptor.
Sebelum dilakukan molecular docking , validasi dilakukan dengan cara minimalisasi energi, penentuan fleksibilitas ligan, dan penentuan grid box pada reseptor. Tiap ligan yang digunakan kemudian dilakukan pengecekan dan penentuan titik fleksibilitas dengan menggunakan Autodock Tools , yaitu berupa pengaturan number of active torsion . Adapun, untuk reseptor dilakukan pengecekan grid box tempat penambatan molekul, adapun grid box yang digunakan sebesar (40 x 40 x 40) Å dengan nilai koordinat x, y, z berturut-turut adalah: 18,380; 46,030; dan 39,176 untuk reseptor 1GIF, sedangkan untuk reseptor 5 IKR grid box yang digunakan sebesar (72 x 60 x 68) Å dengan nilai koordinat x, y, z berturut-turut adalah: 33,291; 9,217; dan 58,073. Selain itu, pada reseptor hasil pemisahan juga dilakukan penambahan atom hidrogen. Hasil optimasi ligan dan reseptor disimpan dengan format .pdbqt. kemudian disalin pada folder Vina. Pada notepad, diketik konfigurasi file Vina, lalu disimpan menggunakan nama ‘conf.txt’ Vina, kemudian dijalankan melalui Command Prompt Gambar 1 .

## Gambar 1. Konfigurasi file Vina
Hasil analisis docking dapat dilihat melalui output dalam format notepad . Pemilihan konformasi ligan dengan ∆G terendah digunakan untuk penentuan konformasi ligan hasil docking . Perangkat lunak Discovery Studio 2021 dan Ligplot digunakan untuk memvisualisasikan posisi dan orientasi ligan pada reseptor serta asam-asam amino yang terikat pada ligan.

## 2.2.2. Pembuatan Simplisia Biji Kurma
Biji  kurma  dibersihkan  dari  kotoran  yang  masih  menempel  dengan  air,  dilakukan  sortasi  dari  biji  kurma  yang kualitasnya tidak baik, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 50oC. Biji kurma yang telah kering digiling dengan mesin penggiling sampai halus dan disimpan pada plastik kedap air.

## 2.2.3. Ekstraksi Simplisia Biji Kurma
Simplisia biji kurma sebanyak 2 kg diekstraksi dengan pelarut metanol 1:1 dengan maserasi selama 4 x 24 jam, kemudian  filtrat  disaring  dan dikentalkan  dengan rotary  evaporator pada suhu  50oC hingga  didapatkan ekstrak kental berwarna coklat pekat.

## 2.2.4. Uji Aktivitas Imunostimulan secara In Vitro
Isolasi sel limfosit dari organ limpa mencit dilakukan sesuai dengan metode Ernis et al. dengan modifikasi. Sel limfosit  hasil  isolasi  kemudian  dikultur  pada  suhu  inkubator  37˚C,  kemudian  ditentukan  aktivitasnya.  Sel  limfosit ditumbuhkan dengan jumlah 50.000 sel dalam 100 µl media penumbuh (RPMI 1640, FBS 20%, penicillin 100 U/mL, dan streptomycin 100  ug/mL).  Larutan  uji  diambil  dari  ekstrak  metanol  biji  kurma  dan imboost sebagai  kontrol  dengan konsentrasi 6,25; 12,5; 25; 50 dan 100 µg/mL, masing-masing ditambahkan setelah sel diinkubasi 3 jam pada suhu 37°C dan CO2 5%. Setelah inkubasi selama 48 jam kemudian dilakukan uji MTT Assay dengan cara menambahkan MTT (5 mg/mL) sebanyak 10 µl ke dalam tiap sumur, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 4 jam. Kristal formazan yang terbentuk dilarutkan dengan penambahan 100 µl etanol per sumur. Pembacaan nilai absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 595 nm. Analisis dilakukan masing-masing sebanyak 3 kali ulangan [22].

## 3. Hasil dan Pembahasan
Senyawa aktif yang ada pada tanaman kurma ( Phoenix dactylifera ) yang digunakan dalam penelitian ini memiliki aplikasi  farmasi  yang  potensial. Tabel  1 merangkum  berbagai  kelas  senyawa  yang  telah  ditemukan,  seperti  terpena, steroid, lipid, dan fenol yang didapat dari situs IJAH Analytics (http://ijah.apps.cs.ipb.ac.id/).
Tabel 1. Senyawa aktif pada tanaman kurma Nama Senyawa Struktur Kimia Nama Senyawa Struktur Kimia Resveratrol 5-O-caffeoylshikimic acid Lupeol acetate Gallic acid Isoprene Ferulic acid Estrone Chlorogenic acid Cholesterol 4-hydroxy benzoic acid
Beberapa penelitian terdahulu telah menyatakan bahwa kurma mengandung berbagai senyawa metabolit sekunder yang  mempunyai  efek  farmakologi.  Asam  fenolat  yang  terdeteksi  pada  biji  kurma,  seperti  asam  galat,  asam  p- hidroksibenzoat,  asam  ferulat,  asam  o-koumarat,  dan  asam  m-koumarat  [11]  dapat  berpotensi  sebagai  antioksidan, antiinflamasi, antibakteri, dan lain-lain.

## 3.1. Analisis In Silico
3.1.1. Struktur dan Stabilitas Reseptor
Reseptor hasil pengunduhan dari Protein Data Bank yaitu Human Glycosylation-Inhibiting Factor dengan PDB ID 1GIF mempunyai resolusi 1,9 Å dengan 115 sekuen asam amino, protein Human Cyclooxygenase-2 dengan PDB ID 5IKR mempunyai resolusi 2,34 Å dengan 551 sekuen asam amino. Reseptor-reseptor tersebut masih terikat dengan molekul lain seperti molekul air, ligan, ataupun residu non standar lainnya. Residu-residu tersebut harus dikeluarkan dari reseptor agar tidak mengganggu analisis docking . Sisi aktif reseptor yang mengandung ligan mengakibatkan ligan lain sulit untuk berikatan dengan reseptor, selain itu molekul air terdapat di sekeliling reseptor akan menghambat ikatan pada analisis docking seperti terjadinya ikatan hidrogen antara ligan dengan molekul air. Protein reseptor 1GIF dan 5 IKR memiliki sub unit lebih dari 1, 1GIF memiliki 3 subunit yaitu A, B, dan C, sedangkan 5KIR memiliki 2 subunit yaitu A dan B, masing- masing sub unit dari kedua protein tersebut memiliki struktur dan komposisi asam amino yang sama. Oleh karena itu dilakukan  pemotongan  dengan  menggunakan Discovery  Studio sehingga  didapatkan  hasil  murni  untuk  kedua  protein tersebut  yaitu  subunit  A  yang  digunakan  untuk  simulasi docking [23,  24].  Struktur  protein  1GIF,  5IKR,  dan  hasil pemotongannya ditampilkan pada Gambar 2 .
(A) (B) (C) (D) Gambar 2. Struktur protein reseptor: (A) 1GIF, (B) 1GIF-A, (C) 5IKR, (D) 5IKR-A

## 3.1.2. Kelarutan dan Analisis Lipinski pada Ligan
Semua  ligan  yang  akan  dilakukan molecular  docking strukturnya  dioptimalkan  dengan Marvin  Sketch  20.12, optimasi geometri dilakukan pada semua ligan untuk memperoleh konformasi molekul yang stabil dan mempunyai energi potensial  rendah, kemudian  dilakukan  analisis  kelarutan  dan  permeabilitas.  Sifat  fisiko  kimia  struktur  ligan  dapat menggambarkan kelarutan dan permeabilitas dari kandidat obat. Telah dilaporkan bahwa ada lima aturan Lipinski yang dapat  memprediksi  kelarutan  dan  permeabilitas  ligan,  yaitu:  1)  ligan  tidak  boleh  memiliki  lebih  dari  lima  donor  ikatan hidrogen, 2) ligan tidak memiliki lebih dari 10 akseptor ikatan hidrogen, 3) ligan tidak memiliki berat molekul lebih dari 500 Da, 4) ligan seharusnya tidak memiliki nilai log P kurang dari lima, 5) ligan seharusnya tidak memiliki polar surface area (PSA) lebih dari 140 Å dengan ikatan rotasi ligan kurang dari 10-30. Studi ini menggunakan empat parameter: berat molekul, donor H, akseptor H, dan log P seperti yang ditampilkan pada Tabel 2 .
Tabel 2. Sifat ligan berdasarkan aturan Lipinski Nama Struktur Berat Molekul (Da) Log P Jumlah Donor Ikatan Hidrogen Jumlah Akseptor Ikatan Hidrogen Lipinski Resveratrol 228,24 2,48 3 3 Ya Lupeol acetate 468,75 4,15 0 2 Ya Isoprene 68,12 1,83 0 0 Ya Estrone 270,37 3,33 1 2 Ya Cholesterol 386,65 4,15 1 1 Ya 5-O-caffeoylshikimic acid 336,29 0,03 5 8 Ya Gallic acid 170,12 0,21 4 5 Ya Ferulic acid 194,18 1,36 2 4 Ya Chlorogenic acid 354,31 -0,38 6 9 Tidak 4-hidroxy benzoic acid 138,12 1,05 2 3 Ya Caffeic acid ( kontrol ) 180,16 0,93 3 4 Ya
Berdasarkan analisis fisiko kimia ligan sebagai kandidat imunostimulan, diketahui berat molekul teringan yaitu 68,12 Da dan yang terberat yaitu 468,75 Da. Senyawa yang memiliki berat molekul kurang dari 500 Da akan lebih mudah untuk dijadikan kandidat obat karena lebih stabil. Nilai log P berkisar antara  -4 dan 5, jumlah donor ikatan hidrogen berada diantara 0 sampai 6, dan untuk jumlah akseptor ikatan hidrogen berada diantara 0 sampai 9. Maka berdasarkan analisis ligan dengan aturan Lipinski didapatkan 1 ligan yang tidak memenuhi aturan Lipinski yaitu chlorogenic acid yang memiliki jumlah donor ikatan hidrogen lebih dari 5.

## 3.1.3. Analisis Toksisitas pada Ligan
Analisis toksisitas ligan dengan menggunakan protox II bertujuan untuk menentukan tingkat toksisitas dari ligan. Tingkat toksisitas dinyatakan dengan nilai Lethal Dose 50 (LD50) pada satuan mg/kg berat badan. LD50 merupakan rata- rata dosis yang dapat menyebabkan kematian yaitu dosis dimana subjek tes mengalami kematian sebanyak 50% setelah paparan zat. Globally Harmonized System (GHS) mengklasifikasikan bahan kimia menjadi enam kategori dengan tingkat toksisitas yang berbeda. Keenam kategori toksisitas tersebut adalah kelas I (LD50 ≤ 5 mg/kg) dengan kategori sangat fatal jika tertelan, kelas II (5 mg/kg < LD50 ≤ 50 mg/kg) dengan kategori fatal jika tertelan, kelas III (50 mg/kg < LD50 ≤ 300 mg/kg) dengan kategori beracun jika tertelan, kelas IV (300 mg/kg < LD50 ≤ 2000 mg/kg) dengan kategori berbahaya jika ditelan, kelas V (2000 mg/kg < LD50 ≤ 5000 mg/kg) dengan kategori mungkin berbahaya jika tertelan, dan kelas VI (LD50 > 5000 mg/kg) dengan kategori tidak beracun.
Tabel 3. Toksisitas ligan menggunakan Protox II Nama struktur LD50 (mg/kg) Kelas Kategori Resveratrol 1560 4 Berbahaya Lupeol acetate 5000 5 Mungkin berbahaya Isoprene 1800 4 Berbahaya Estrone 5000 5 Mungkin berbahaya Cholesterol 890 4 Berbahaya 5-O-caffeoylshikimic acid 3800 5 Mungkin berbahaya Gallic acid 2000 4 Berbahaya Ferrulic acid 1772 4 Berbahaya Chlorogenic acid 5000 5 Mungkin berbahaya 4-hidroxy benzoic acid 2200 5 Mungkin berbahaya Caffeic acid ( kontrol ) 2980 5 Mungkin berbahaya
Pada penelitian ini diketahui tingkat toksisitas setiap ligan berada di kelas 4 dan 5, yaitu sebagai senyawa tingkat toksisitas berbahaya dan mungkin berbahaya jika tertelan ( Tabel 3 ). Berdasarkan hasil penelitian didapatkan nilai LD50 paling tinggi yaitu dimiliki oleh ligan lupeol acetate, estrone, chlorogenic acid, 5-O-caffeoylshikimic acid, dan 4-hidroxy benzoic acid yang termasuk kategori mungkin berbahaya jika tertelan, sedangkan yang memiliki LD50 terendah adalah cholesterol yang termasuk berbahaya jika tertelan. Berdasarkan kajian ini diketahui bahwa senyawa-senyawa yang ada pada tanaman kurma mempunyai tingkat toksisitas yang berbeda, sehingga diharapkan kajian ini dapat digunakan sebagai dasar ilmiah ketika akan melakukan formulasi dari senyawa-senyawa tersebut jika ingin digunakan sebagai obat.

## 3.1.4. Analisis Energi Bebas Gibbs
Parameter yang digunakan untuk menganalisis hasil docking adalah nilai ∆G, Root Mean Square Deviation (RMSD), dan  interaksi  antara  ligan-residu  reseptor.  Nilai  ∆G  diperingkatkan  dari  nilai  terkecil  sampai  nilai  terbesar,  nilai  ini menunjukkan konformasi dari masing-masing ligan hasil docking . Pada penelitian ini terdapat 11 ligan yang ditambatkan pada reseptor, dimana dari 11 ligan tersebut akan menghasilkan masing-masing 9 konformasi ligan dengan nilai ∆G yang berbeda-beda yang diperingkatkan berdasarkan yang terendah. Konformasi yang dipilih adalah konformasi peringkat paling atas dengan nilai ∆G dan RMSD yang paling rendah (terbaik). RMSD merupakan parameter penting dalam melakukan validasi program docking , nilai RMSD menjadi penentu dalam memprediksi keberhasilan modus ikatan yang terjadi di antara  ligan  dan  reseptor.  Nilai  RMSD  dikatakan  baik  jika  ≤  2 Å. Besarnya  nilai  RMSD  ini  menunjukkan  keakuratan perhitungan, nilai RMSD < 2 Å dapat diartikan bahwa kesalahan dari hasil perhitungan semakin kecil yang menunjukkan perhitungan  lebih  akurat,  sedangkan  nilai  RMSD  >  2  Å  dapat  diartikan  bahwa  penyimpangan/kesalahan  dari  hasil perhitungan lebih besar. Hal ini menyebabkan terjadinya kesalahan yang semakin besar pula dalam memprediksi interaksi antara ligan dengan reseptor [25].
Ulangan yang dilakukan pada penelitian ini dalam sekali docking adalah sebanyak 6 kali running . Proses running yang  dilakukan  berulang-ulang  akan  berpengaruh  pada  nilai  ∆G,  sehingga  pada  penelitian  ini  diperoleh  6  pose  ligan dengan ∆G yang berbeda-beda. Energi bebas Gibbs pada interaksi antara ligan dan reseptor menunjukkan energi yang diperlukan untuk terjadinya ikatan antara reseptor dengan ligan. Ikatan kompleks antara reseptor-ligan akan semakin stabil ketika energi yang diperlukan semakin kecil [26]. Berdasarkan hasil simulasi docking , ligan dengan nilai ∆G paling kecil (negatif) terhadap dua reseptor 1GIF dan 5 IKR adalah 5-O-caffeoylshikimic acid , chlorogenic acid, lupeol acetate, estrone, dan cholesterol dengan caffeic acid sebagai kontrol yang digunakan sebagai komparator ( Tabel 4 ). Senyawa caffeic acid merupakan ligan alami pada reseptor yang terdapat pada database , selain itu juga pada penelitian sebelumnya dinyatakan bahwa senyawa tersebut menunjukkan efek imunomodulator karena aktivitas antioksidannya [27].
Parameter lain yang diamati dari hasil docking adalah interaksi yang terbentuk diantara residu pada reseptor dengan ligan. Berdasarkan analisis interaksi antara reseptor dan ligan bahwa terbentuknya beberapa ikatan diantara keduanya, seperti ikatan hidrofobik, ikatan van der waals, dan ikatan hidrogen. Banyaknya interaksi yang terbentuk antara reseptor dan ligan seperti adanya interaksi hidrofobik dan ikatan hidrogen akan berpengaruh terhadap aktivitas. Terbentuknya ikatan hidrogen  pada  interaksi  antara  reseptor  dan  ligan  akan  berkontribusi  pada  stabilitas  struktur  kompleks,  jumlah  ikatan hidrogen yang semakin banyak akan menyebabkan struktur yang terbentuk di antara reseptor dan ligan akan semakin kompleks [28]. Selain itu, ikatan hidrofobik dan ikatan hidrogen akan mempengaruhi kestabilan ikatan antara ligan dan target. Banyaknya ikatan hidrogen dan terbentuknya interaksi hidrofobik akan menghasilkan interaksi yang cukup kuat diantara kedua molekul [29].
Tabel 4. Nilai energi bebas Gibbs (kkal/mol)
Ligan ∆G (kkal/mol) Reseptor 1GIF Reseptor 5IKR 5-O-caffeoylshikimic acid -6,68 -8,58 Chlorogenic acid -6,66 -8,14 Lupeol acetate -6,22 -8,02 Estrone -6,08 -7,98 Cholesterol -5,90 -7,52 Resveratrol -5,82 -6,46 Ferulic acid -5,24 -6,46 Gallic acid -4,64 -6,24 4-hidroxy benzoic acid -4,52 -6,18 Isoprene -3,70 -3,94 Caffeic acid ( Kontrol ) -5,22 -6,18
Pada  analisis  ikatan  hidrogen  menunjukkan  bahwa  reseptor  1GIF  memiliki interaksi antara  ligan dan  beberapa residu asam amino, seperti Tyr37 dan Met1, sedangkan untuk  residu asam amino Arg44, Gly45, Glu465, dan Tyr385 sebagian besar berinteraksi dengan ligan pada reseptor 5IKR ( Tabel 5 ). Ikatan hidrogen terpanjang terdeteksi untuk Tyr385 pada reseptor 5IKR dengan panjang 3,25 Å dan terpendek untuk Gly108 pada reseptor 1GIF dengan panjang 2,71 Å.
Tabel 5. Interaksi reseptor dengan ligan berdasarkan analisis ikatan hidrogen Ligan Reseptor 1GIF 5IKR Resveratrol Pro2 (3,10) Cys41 (2,91) Arg44 (3,04) Gly45 (3,17) Cholesterol Asn73 (3,13) - Estrone - Glu524 (2,79) 5-O-caffeoylshikimic acid Tyr37 (3,00) Gly108 (2,71) Glu465 (2,73), (2,90), (2,94) Cys36 (2,88) Gallic acid Tyr37 (2,99) Met1 (3,18) His388 (3,06) Ferulic acid - Tyr385 (2,91) Arg120 (2,97) Tyr355 (2,99), (3,10) Chlorogenic acid Ser77 (2,89), (2,99) Ile97 (2,88), (3,22) Arg44 (3,15), (2,92) Glu465 (3,12) Gly45 (3,01) Cys47 (2,84) 4-hidroxy benzoic acid Met1 (3,20) Tyr37 (3,23) - Caffeic acid ( kontrol ) Gln36 (3,06) Met1 (3,23) Arg20 (2,96) Tyr385 (3,25)
Berdasarkan analisis yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa senyawa 5-O-caffeoylshikimic acid adalah senyawa yang paling berpotensi sebagai kandidat imunostimulan. Senyawa tersebut berhasil tertambat pada binding site protein reseptor dengan nilai energi Gibbs dan konformasi paling baik serta pada titik yang tepat. Senyawa 5-O-caffeoylshikimic acid termasuk  dalam  senyawa  fenolik  yang  ditemukan  pada  tumbuhan palmae seperti  kurma  [30].  Senyawa  fenolik diketahui  dapat  meningkatkan  proliferasi  sel  limfosit  dan  aktivasi  makrofag  [8,  9],  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa senyawa fenolik berpotensi sebagai imunostimulan. Konformasi, interaksi, dan orientasi 5-O-caffeoylshikimic dan caffeic acid (kontrol) diilustrasikan pada Gambar 3 dan 4 .

## A

## B
Gambar 3. Analisis konformasi dan interaksi ikatan hidrogen antara ligan dan reseptor dengan jarak < 5 Å. A. 1GIF- 5-O- caffeoylshikimic acid ; B. 5IKR- 5-O-caffeoylshikimic acid
A
B
Gambar 4. Analisis konformasi dan interaksi ikatan hidrogen antara ligan dan reseptor dengan jarak < 5 Å. A. 1GIF- caffeic acid ; B. 5IKR- caffeic acid

## 3.2. Aktivitas Imunostimulan secara In Vitro
Aktivitas  imunostimulan  ekstrak  metanol  biji  kurma  secara  in  vitro  dilakukan  dengan  mengamati  proliferasi  sel limfosit mencit dengan menggunakan metode MTT Assay . Prinsip metode ini merupakan terjadinya reaksi redoks di dalam sel,  di  dalam  mitokondria  sel  hidup  diketahui  mengandung  enzim  suksinat  dehidrogenase  yang  akan  mereduksi  MTT
menjadi garam formazan, kemudian senyawa tersebut dianalisis menggunakan ELISA ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ) reader menghasilkan data absorbansi ( Optical Density (OD) ). Semakin tinggi nilai OD maka semakin banyak sel limfosit yang hidup [22] yang menunjukkan bahwa aktivitas imunostimulannya semakin baik. Sel limfosit merupakan sel yang berperan dalam respon imun tubuh yang dapat melindungi tubuh dari paparan mikroba dan tumor melalui sistem imunitas spesifik [31]. Nilai OD dari aktivitas proliferasi sel limfosit mencit dengan pemberian ekstrak metanol biji kurma dan imboost (kontrol) dengan berbagai konsentrasi ditampilkan pada Tabel 6 .
Tabel 6. Nilai OD dari proliferasi sel limfosit mencit dengan pemberian ekstrak metanol biji kurma dan imboost pada berbagai konsentrasi Konsentrasi (µg/mL) Sampel Ekstrak Metanol Biji Kurma Imboost (kK control) 6,25 0,108 0,232 12,5 0,126 0,191 25 0,132 0,263 50 0,062 0,196 100 0,111 0,135
Berdasarkan Tabel 6 diketahui bahwa nilai Optical Density (OD) mengalami peningkatan seiring bertambahnya konsentrasi hingga mencapai konsentrasi 25 µg/mL. Pada produk imunostimulan ( imboost ) sebagai kontrol diketahui pula memiliki nilai OD paling tinggi pada pemberian konsentrasi 25 µg/mL. Konsentrasi 25 µg/mL sel limfosit mencit mempunyai aktivitas proliferasi paling tinggi jika dibandingkan dengan konsentrasi lainnya. Adanya peningkatan aktivitas proliferasi sel limfosit pada pemberian sampel hingga variasi 6,25; 12,5; dan 25 µg/mL menunjukkan bahwa sampel ekstrak metanol biji kurma memiliki aktivitas sebagai imunostimulan. Hal ini sesuai dengan penelitian sebelumnya pada uji in vivo bahwa kurma mempunyai aktivitas imunostimulan karena pemberian ekstrak kurma menyebabkan jumlah limfosit dan leukosit total pada mencit jantan ( Mus musculus ) galur balb/c mengalami peningkatan [32].
Kandungan senyawa kimia yang terdapat dalam ekstrak dapat mempengaruhi aktivitas proliferasi sel limfosit dari sampel uji. Pada penelitian sebelumnya telah dideteksi bahwa dalam ekstrak metanol biji kurma mengandung senyawa golongan  asam  fenolat,  flavonoid,  karotenoid,  dan  sterol.  Senyawa-senyawa  tersebut  diantaranya  adalah caffeic  acid, ferulic acid, p-coumaric acid, 5-O-caffeoylshikimic acid, o-coumaric acid, dan cholesterol [16]. Ekstrak echinacea purpurea yang terdapat pada imboost juga mengandung senyawa turunan caffeic acid yang termasuk golongan asam fenolat dan dapat berfungsi sebagai imunostimulan serta mempunyai aktivitas antiinflamasi [33]. Menurut  Cholakova et al. (2002), senyawa terpenoid dan flavonoid juga dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit [34].

## 4. Kesimpulan
Skrining virtual telah berhasil dilakukan pada 10 senyawa metabolit sekunder terhadap dua reseptor penting yang berperan dalam sistem imun yaitu Human Glycosylation-Inhibiting Factor (1GIF) dan Human Cyclooxygenase-2 (5IKR) melalui docking molekuler, toksisitas, ADME, dan Lipinski . Hasil analisis diperoleh bahwa ligan terbaik yang dapat dijadikan sebagai kandidat obat imunostimulan adalah 5-O-caffeoylshikimic acid yang merupakan senyawa golongan asam fenolat. Hasil ini diperkuat juga oleh uji in vitro yang membuktikan bahwa pemberian ekstrak metanol biji kurma sampai konsentrasi 25 µg/mL dapat meningkatkan aktivitas proliferasi sel limfosit. Oleh karena itu, kami merekomendasikan untuk dilakukan penelitian lebih lanjut terkait potensi biji kurma sebagai imunostimulan.

## Ucapan Terima Kasih
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan yang memberikan pendanaan melalui Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) Riset 2021 dan Yayasan Pakuan Siliwangi melalui Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM) Universitas Pakuan.

## Daftar Pustaka
[1] World Health Organization. WHO Director-General’s opening remarks at the media briefing on COVID-19 – March 11 th  2020.  Available:  https://www.who.int/dg/speeches/detail/who  director  generals  opening  remarks  at  the  media briefing on covid-19---11-march2020. (Diakses 16 November 2021)
[2] Badan Nasional Penanggulangan Bencana. Available: https://covid19.go.id/ (Diakses 16 November 2021)
[3] K. Baratawidjaja, and I. Rengganis, I, Imunologi Dasar (10th ed), Jakarta: Badan Penerbit FK UI, 2012.
[4] A. E. Sukmayadi, S. A. Sumiwi, M. I. Barliana, and A. D. Aryanti, “The Immunomodulatory Activity of Ethanol Extract of Tempuyung Leaves ( Sonchus arvensis Linn .)”, Indonesian Journal of Pharmaceutical   Science and Technology , vol. 1, no. 2, 65–72, 2014. https://doi.org/10.15416/ijpst.v1i2.7515
[5] A. Rahmadi, Kurma , Samarinda: Food Technologist, Neurobiologist, and Pharmacologist, pp. 1-10, 2010.
[6] M.  A.  Rizaty,  “Indonesia  Masuk  Daftar  Negara  Pengimpor  Kurma  Terbesar”,  2022.  Available: https://databoks.katadata.co.id/datapublish/2022/05/05/indonesia-masuk-daftar-negara-pengimpor-kurma-terbesar. (Diakses 14 Juni 2022)
[7] H.  Habib,  W.  Ibrahim,  “Nutritional  quality  evaluation  of  eighteen  date  pit  varieties”, International  Journal  of  Food Sciences and Nutrition , vol. 60, no. 1, 99−111, 2009.
[8] K. Bone, and S. Mills, Principles and Practice of Phytotherapy: Modern Herbal Medicine, USA: Elsevier, 2013.
[9] M. R. Takaeidi, A. Jahangiri, M. J. Khodayar, A. Siahpoosh, H. Yaghooti, S. Rezaei, et al ., “The Effect of Date Seed ( Phoenix dactylifera ) Extract on Paraoxonase and Arylesterase Activities in Hypercholesterolemic Rats”, Jundishapur Journal National Pharmacology , vol. 9, no. 1, 30-34, 2014.
[10] M. Abiola, Adeosun, O. Sarah, M. Osasenaga, H. D. Okikiola, M. O. Omotayo MO, “Phytochemical, minerals, and free radical scavenging profiles of Phoenix dactylifera L. seed extract”, Journal of Taibah University Medical Science , pp. 1-6, 2015.
[11] Afiq, M. J. Abdul, R. Abdul Rahman, Y. B. Che Man, H. A. Al-Kahtani, and T. S.T. Mansor, “Date seed and date seed oil”, International Food Research Journal , vol. 20, no. 5,pp. 2036-2037, 2013.
[12] L.  Giovanny,  L.  Ambarsari,  S.  Warnasih,  “Potensi  ekstrak  etanol  biji  kurma  ( Phoenix  dactylifera L.)  sebagai antidiabetes dengan parameter kinetika inhibisi α-glukosidase” Current Biochemistry, vol. 6, no. 2, pp 1-10, 2019.
[13] A. K. Astari, “Potensi Ekstrak Etanol Biji Kurma ( Phoenix dactylifera L.) sebagai Antibakteri Secara In Silico dan In Vitro”, Skripsi, Departemen Biokimia, FMIPA, Institut Pertanian Bogor, Bogor, 2020.
[14] H. Ding, X. Hu, X. Xu, G. Zhang, D. Gong, “Inhibitory mechanism of two allosteric inhibitors, oleanic acid, and ursolic acid  on  α-glucosidase”, International  Journal  of  Biological  Macromolecules ,  pp.  1-12,  2013.  DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.10.040.
[15] S. A. A. Jassim, and M. A. Naji, “In vitro Evaluation of the Antiviral Activity of an Extract of Date Palm ( Phoenix dactylifera L.) Pits on a Pseudomonas Phage ”, eCAM , vol. 7, no. 1, pp 57–62, 2010. doi:10.1093/ecam/nem160 [16] S.  Warnasih,  S.  Salam,  U.  Hasanah,  L.  Ambarsari,  P.  Sugita,  “Total  Phenolic,  flavonoid  content  and  metabolite profiling of methanol extract of date ( Phoenix dactylifera ) seeds by LC-QTOF-MS”, AIP Conference Proceedings, vol. 2243, No. 030029, 2020. Available: https://doi.org/10.1063/5.0001436.
[17] S. Hardjono, “Sintesis dan Uji Aktivitas Antikanker Senyawa 1-(2-Klorobenzoiloksi) Urea dan 1-(4-Klorobenzoiloksi) Urea”, Berkala Ilmiah Kimia Farmasi , vol. 2, no. 1, pp. 1, 2013.
[18] Biosource,  “ MIF  active  protein:  Macrophage  Migration  Inhibitory  Factor  (MIF)  Active  Protein ”,  2006. Available:https://www.mybiosource.com/active-protein/macrophage-migration-inhibitory-factor-if/2105112.  (Diakses tanggal 23 Agustus 2021)
[19] Y.  Loganathan,  M.  Jain,  S.  Thiyagarajan,  S.  Shanmuganathan,  S.  K.  Mariappan,  M.  P.  J.  Kizhakedathil,  and  T. Saravanakumar,  “An  In  Silico  evaluation  of  phytocompounds  from  Albizia  amara  and  Phyla  nodiflora  as cyclooxygenase-2 enzyme inhibitors” DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 2021.
[20] O. Trott, A. J. Olson, “AutoDock Vina: Improving the Speed and Accuracy of Docking with a New Scoring Function, Efficient Optimization, and Multithreading”, Journal of Computational Chemistry, vol. 31, no. 2, pp 455–461, 2010. Available: https://doi.org/10.1002/jcc.21334
[21] C. A. Lipinski, “Lead- and Drug-Like Compounds: The Rule-of-Five Revolution”, Drug Discovery Today: Technol, vol. 1, no. 4, pp. 337–341, 2004. Available: https:// doi.org/10.1016/j.ddtec.2004.11.007
[22] G. Ernis, D. Notriawan, D. Fitriani, E. Yunita, I. Cantika, “Uji in vitro aktivitas imunomodulator minyak atsiri serai dapur (Cymbopogon citratus) terhadap proliferasi sel limfosit mencit”, Bioedusains , vol. 4, no. 2, pp. 129-135, 2021.
[23] Y. Kato, T. Muto, T. Tomura, H. Tsumura, H. Watarai, T. Mikayama, K. Ishizaka, R. Kuroki, “The crystal structure of human glycosylation-inhibiting factor is a trimeric barrel with a three 6-stranded beta-sheets”, PNAS , vol. 93, no. 7, pp. 3007-3010, 1996. Available: https://doi.org/10.1073/pnas.93.7.3007
[24] B. J. Orlando, M. G. Malkowski, “Substrate-selective Inhibition of Cyclooxygenase-2 by Fenamic Acid Derivatives Is Dependent on Peroxide Tone”, J Biol Chem, vol. 291, no. 29, pp. 15069-81, 2016.
[25] S. Ferwadi, R. Gunawan, dan W. Astuti, “Studi docking molekular senyawa asam sinamat dan derivatnya sebagai inhibitor protein 1j4x pada sel kanker serviks”, Jurnal Kimia Mulawarman , vol. 14, no. 2, pp. 84-90, 2017.
[26] T. Joshi, P. Sharma, T. Joshi, and S. Chandra, “In Silico Screening of Anti-inflammatory Compounds from Lichen by Targeting Cyclooxygenase-2”, Journal of Biomolecular Structure and Dynamics , vol. 38, no. 12, pp. 3544-3562, 2019.
[27] S. Kilani-Jaziri, I. Mokdad-Bzeouich, M. Krifa, N. Nasr, K. Ghedira & L. Chekir-Ghedira, “Immunomodulatory and cellular  antioxidant  activities  of  caffeic,  ferulic,  and p -coumaric  phenolic  acids:  a  structure-activity  relationship study”, Drug and Chemical Toxicology , 40(4), 416-424, 2017. Available:  DOI: 10.1080/01480545.2016.1252919
[28] W. F. de Azevedo Jr., Docking Screens for Drug Discovery, New York: Humana Press, 2019.
[29] R. Patil, S. Das, A. Stanley, L. Yadav, A. Sudhakar, and A. K. Varma, “Optimized Hydrophobic Interactions and Hydrogen Bonding at the Target-Ligand Interface Leads the Pathways of Drug-Designing”, Plos One , vol. 5, no. 8, e12029, 2010.
[30] A. Mansouri, G. Embarek, E. Kokkalou, and P. Kefalas, “Phenolic Profile and Antioxidant Activity of the Algerian Ripe Date  Palm  Fruit ( Phoenix  dactylifera )”, Food  Chemistry,  vol. 89,  no.  3,  pp.  411  –  420,  2005.  Available: doi:10.1016/j.foodchem. 2004.02.051.
[31] F. R. S. Prakoeswa, “Peranan Sel Limfosit Dalam Imunologi: Artikel Review”, J. Sains Kes. , vol.  2, no. 4, pp. 525- 537, 2020.
[32] Rosnizar, K. Eriani, I. M. Ramli, and F. Muliani, “Uji Efek Imunostimulan Buah Kurma ( Phoenix dactylifera ) Pada Mencit Jantan ( Mus musculus ) Galur Balb/c”, Prosiding Seminar Nasional Biotik , pp. 292–297, 2015.
[33] A. Manayi, M. Vazirian, S. Saeidnia, “ Echinacea purpurea : Pharmacology, phytochemistry and analysis methods”, Pharmacogn Rev,vol. 9, no. 17, pp. 63–72, 2015. Available: DOI: 10.4103/0973-7847.156353
[34] M. Cholakova, V. Christov, D. Dimitrova, L. Evstatieva, R. Alexandrova, E. Nikolova, “Flavonoid and terpenoid isolated from Loranthus  europaeus with  stimulatory  effect  on  the  lymphocyte  proliferation”, Experimental  Pathology  and Parasitology , vol. 5, no. 9, pp. 45-8, 2002.