Optimasi Suhu Annealing Primer Degenerate untuk Mengamplifikasi Fragmen Gen Arginine Decarboxylase (ADC) Genom Ubi Kayu Lokal

## Maluku Tenggara
Optimization Of The Annealing Temperature With Degenerate Primer For Amplification Of Arginine Decarboxylase (ADC) Fragment Gene From Genomic DNA of Maluku Tenggara Local Cassava
Siti Kurniawati *) , N. Sri Hartati Puslit Bioteknologi LIPI, Jl. Raya Bogor KM 46 Cibinong, 16911
* E-mail: kurniawatie@gmail.com

## ABSTRACT
Arginine decarboxylase (ADC) is a key enzyme responsible for polyamines biosynthesis and has been shown to increase resistance to biotic and abiotic stress. Cassava (Manihot esculenta Crantz.) is able to grow and produce storage roots well on marginal land. The purpose of this study was to optimize  annealing  temperature of  primers  in  PCR  reaction  to  amplify  candidate  cassava  ADC gene fragments. Annealing temperature is a crucial factor in PCR reaction affecting product (gene fragments) specificity. Four pairs of primers; MeADC1, MeADC2, MeADC3, andMeADC4, were designed  using  degenerate  method  from  several  plants  species  such  as  Jatropa  curcas  (Acc XM_022220421), Populus trichocarpa (Acc XM_002306105.2), Capsicum annuum cv Nockwang (Acc KC160547.1) and Lycopersicon esculentum (Acc L16582.1). All primer pairs successfully amplified  DNA  fragments  from  local  cassava  genotypes  (Maluku  Tenggara/Malra)  including Malra012 and Malra016. The MeADC1 primer amplified DNA fragment with less than 1,000 base pairs (bp) at annealing temperature of 46°C, 47°C and 48°C. However, analysis of PCR product sequencing results using NCBI BLAST method showed that the amplified DNA fragment encodes for ribosomal protein S3 of Oryza minuta (Acc YP_009242005.1).
Keywords: arginine decarboxylase, annealing, ADC, cassava, Maluku Tenggara, PCR

## PENDAHULUAN
Teknik  rekayasa  genetika  semakin  maju  dan banyak  diaplikasikan  dalam  peningkatan kualitas  varietas  tanaman.  Ubi  kayu  ( Manihot esculenta Crantz.) sebagai salah satu komoditas tanaman  pangan  sumber  karbohidrat  masih memiliki  banyak  kekurangan  namun  juga memiliki  banyak  keunggulan.  Kandungan nutrisi  ubi  kayu  relatif  kurang  jika dibandingkan  dengan  sumber  karbohidrat lainnya,  namun  tanaman  ubi  kayu  memiliki keunggulan  dari  segi  ketahanan  terhadap cekaman baik biotik maupun abiotik. Tanaman ubi  kayu  dapat  tumbuh  dan  berproduksi  baik pada  lahan  suboptimum. Menurut  Fan et  al ., (2016),  meskipun ubi  kayu  terlihat  tahan terhadap cekaman kekeringan tetapi mekanisme  terkait  sifat  toleransi  terhadap kekeringan  masih  sangat  sedikit  diketahui  dan dipelajari. Salah satu genotipe ubi kayu adaptif terhadap  lahan  marginal  yaitu  genotipe  ubi kayu  lokal  yang banyak  tumbuh  di  daerah Maluku  Tenggara  (Malra).  Wilayah  Malra dikenal dengan lahan kering, berkarang dengan
lapisan topsoil tipis.  Menurut  Susanto  dan Sirappa  (2007),  desa  debut  di  kepulauan  Kei Kecil  yang  merupakan  salah  satu  sumber koleksi keragaman ubi kayu lokal daerah Malra adalah  daerah  dengan  kondisi  lahan  bertipe karst, tanah secara umum terbentuk dari bahan batu  kapur  koral  dan  alluvium/kolovium Diperlukan  usaha  yang  tinggi  dalam  budidaya tanaman  pertanian  atau  hanya  jenis  dan genotipe tertentu yang mampu tumbuh dengan baik  di  Malra.  Ubi  kayu  genotipe  lokal  yang tumbuh  baik  di  Malra  berpotensi  sebagai sumber daya genetik yang dapat dikembangkan lebih  lanjut  baik  sebagai  bahan  informasi genetik  ataupun  menghasilkan  varietas tanaman unggul.
Arginine  decarboxylase (ADC)  merupakan enzim  yang  berperan  dalm  proses  biosintesis poliamin,  dan  poliamin  yang  terdiri  dari putresin,  spermidin  dan  spermin  telah  terbukti dapat meningkatkan toleransi tanaman terhadap cekaman (Gupta et al. 2013). Menurut Kusano et al. (2008),  poliamin  pada  tanaman  juga berperan  dalam  banyak  proses  fisiologis, seperti  organogenesis,  embryogenesis,  inisiasi
dan pembungaan, penuaan daun, perkembangan  dan  pemasakan  buah  serta respon  tanaman  ketika  terjadi  cekaman  biotik dan  abiotik.  Karena  perannya  yang  sangat kompleks,  oleh  karena  itu  telah  banyak dilakukan penelitian terutama melalui pendekatan  melokuler  terkait  manipulasi biosintesis  poliamin.  Runutan  lengkap  basa nukleotida  dari  genome  tanaman Arabidopsis telah dipakai sebagai sarana/alat menggunakan pendekatan ‘omic’ untuk mengidentifikasi gen target  yang  terlibat  dalam  jalur  sinyal  dan biosintesis  poliamin  (Alcázar et  al. 2010). Peremarti et  al. (2010)    telah  melakukan cloning gen  ADC  dari  tanaman  padi,  Zhao et al. (2017),  melakukan cloning gen  SAMDC dari tanaman karet ( Hevea brasiliensis
), namun demikian,  informasi  mengenai  runutan  basa nukleotida  dan  fungsi  dari  gen  ADC  pada tanaman  ubi  kayu  masih  belum  banyak dilakukan. Oleh karena itu sebagai tahap awal, telah  dilakukan  desain  primer  untuk memperoleh runutan basa nukleotida pengkode enzim poliamin dari tanaman ubi kayu genotipe lokal Malra.
Reaksi  PCR  merupakan  salah  satu  bagian dari  kegiatan  dalam  analisis  molekuler  DNA.
Menurut  Polz  &  Cavanaugh  (1998),  PCR merupakan  alat  yang sangat  berharga  karena kecepatan,  sederhana  dan  efisien  dalam mengamplifikasi  segmen  DNA  spesifik  dari latar  belakang  genome  yang  kompleks.  Untuk mendapatkan  amplifikasi  fragmen  gen  target dalam  hal  ini  gen  ADC,  maka  keberhasilan amplifikasi  sangat  tergantung  pada  pemilihan primer  yang  tepat  dan  pada  saat  proses  PCR yaitu  tahap annealing (penempelan)  primer pada DNA (Zein & Prawiradilaga, 2013).Optimasi  suhu  penempelan  empat pasang  primer degenerate dilakukan  untuk mendapatkan fragmen gen arginine decarboxylase dari  cetakan  gDNA  ubi  kayu asal Malra.

## METODE
Penelitian  dilaksanakan  mulai  bulan  Juni  sampai dengan  September  2017di  Laboratorium  Genetika Molekuler  dan  Modifikasi  Jalur  Biosintesa Tanaman,  Pusat  Penelitian  Bioteknologi,  Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Cibinong-Bogor.

## Isolasi DNA Genom
Isolasi DNA genome  dari daun muda tanaman ubi kayu  dilakukan  menggunakan  metode  yang dikembangkan  oleh  Doyle  &  Doyle  (1990)  yang telah dimodifikasi. Perancangan Primer Degenerate gen ADC Perancangan primer diawali dengan mengumpulkan
informasi mengenai sekuen gen ADC dari beberapa tanaman  yang  telah  terdeposit  pada  database GenBank ( http://www.ncbi.nml.nih.gov/ ).  Primer dirancang  sebanyak  empat  pasang.  Sekuen  yang dipilih  berasal  dari  daerah coding DNA sequence (CDS) di mana CDS merupakan bagian dari sekuen DNA  yang  tersusun  atas exon dan  mengkodekan protein tertentu (Twyman, 2003) Amplifikasi  DNA  Genome  dengan  Primer Degenerate ADC Amplifikasi  DNA  dengan  teknik  PCR  dilakukan sesuai  dengan  prosedur  Kurniawati  (2013) menggunakan  empat  pasang  primer degenerate untuk  mendapatkan  fragmen  gen  ADC. Pasangan primer  degenerate  pertama  yaitu  MeADC1 (Forward): 5’-ATG CCK GCC YTR GST TGT TG-3’ dan  MeADC1  (Reverse):  5’-TCA  AGC  ASA  GTK HMR  TAG  GA-3’. Pasangan  primer degenerate kedua  yaitu MeADC2 (Forward):  5’-DTK  GGY GGR GGR YTB CA-3’ dan MeADC2 (Reverse): 5’- TCA GGR ATT GWR GTR AAM AS-3’. Pasangan primer degenerate ketiga yaitu MeADC3 (Forward): 5’-DTK  GGY  GGR  YTB  CA-3’  dan MeADC3 (Reverse):  5’-WMR  MRS  ASW  KHM  RTA  GGA YC-3’,  dan  pasangan  primer degenerate keempat yaitu MeADC4 (Forward): 5’-ATG CCK GCC YTR GST  TGT  TG-3’  dan MeADC4 (Reverse):  5’-TCA SCA CAN GAY GGD CCR GG-3’. Optimasi suhu annealing  dilakukan  mulai  dari  suhu  yang  rendah yaitu  40 o C hingga  50 o C selama  45  detik.  Proses PCR  dilakukan  dengan  35  siklus  dengan  suhu pemanjangan/ekstensi pada 72 o C selama 90 detik. Visualisasi Hasil Amplifikasi DNA Hasil  PCR  menggunakan  primer degenerate divisualisasi  dengan  elektroforesis  gel  agarosa  1% pada  1.0x  buffer  TAE  (Tris  Acetate  Acid-EDTA). Sebanyak  5.0  µl  produk  PCR  dari  masing-masing sampel  ditambahkan  0.2  µl  loading  dye  dan dicampur  sempurna,  kemudian  dimasukkan  ke dalam  sumur  di  dalam  gel.  Untuk  menentukan ukuran  dari  produk  PCR  disertakan  juga  DNA standart  (1  kb  plus  ladder  universal,  KAPPA) sebagai  pembanding.  Sampel  DNA  dielektroforesis dengan  tegangan  95  volt  selama  1  jam  15  menit. Migrasi DNA pada gel agarose, setelah itu diwarnai pada larutan etidium bromide (10 mg L -1 ) selama 10 menit  dan  dicuci  dengan  1x  TAE  selama  20-30 menit.  Gel  agarose  kemudian  divisualisasi menggunakan alat geldoc.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penilaian Kualitas dan Kuantitas DNA Kualitas  masing-masing  dari  sampel  DNA genome  daun  ubi  kayu  yang  diekstraksi diverifikasi secara spektrofotometri menggunakan  instrument  NanoDrop  dan elektroforesis  gel  agarose.  Visualisasi  hasil ekstraksi DNA genom dari daun ubi kayu lokal Malra  terdiri  dari  dua  genotipe  dapat  dilihat pada  gambar  1.  Genotipe  Malra012  dan
Malra016  menunjukkan  hasil  yang  baik, terlihat  dari  pendaran  yang  kuat  dan  keutuhan pita DNA genome kedua genotipe  pada kedua ulangan  sampel.Nilai  absorbansi  nanodrop berguna  untuk  mendeteksi  kontaminan  seperti protein,  garam  dan  polisakarida  yang  dapat menghambat  amplifikasi  DNA.  Rasio  pada pembacaan  panjang  gelombang  260/280  nm sebesar  1.8  menunjukkan bahwa  DNA  yang diekstraksi  memiliki  kemurnian  tinggi  dengan tidak adanya protein dan fenol (Abdel-Latif & Osman, 2017).
Gambar  1.  Elektroforegram  gDNA  daun  ubi kayu genotipe Malra012 (1 dan 2) dan Malra016 (3 dan 4) Hasil  keseluruhan  DNA  genom  berada dalam  kisaran  >  1.000  ng/µl  dengan  rasio 260/280 sebesar 1.94 - 1.97 (tabel 1). Menurut
Pervaiz et al . (2011), rasio A260/A280 dengan rentang  mulai  dari  1.8  hingga  2.0  tidak menunjukkan  tingkat  kontaminasi  yang signifikan.
Tabel 1. Nilai kuatitas DNA genome daun ubi kayu  hasil  isolasi  menggunakan spektrofotometer No. DNA genome ID Konsentra si (ng/µl) Kemurnian (A260/A280 ) 1. Malra012 ul.1 1.097 1.948 2. Malra012 ul.2 1.374 1.972 3. Malra016 ul.1 1.888 1.955 4. Malra016 ul.2 1.556 1.942
Amplifikasi  Fragmen MeADC pada Beberapa Suhu Annealing Untuk mendapatan pita atau fragmen gen ADC dari  gDNA  ubi  kayu  lokal  asal  Malra,  maka dilakukan  amplifikasi  PCR  menggunakan empat  pasang  primer degenerate yaitu MeADC1, MeADC2, MeADC3 dan MeADC4 .Hasil perhitungan Suhu melting (Tm dalam o C)  berdasarkan  runutan  basa  keempat primer  dengan  dikurangi  sebesar  2 o C - 5 o C untuk  mendapatkan  suhu  penempelan  primer (Ta),  maka  dilakukan  optimasi  suhu penempelan  keempat  pasang  primer  berkisar antara 44.0 – 53.9 o C. Keberhasilan amplifikasi sekuen  DNA    dengan  keempat  primer ditunjukkan  dengan adanya pita yang terdapat pada  beberapa  suhu annealing untuk  keempat pasangan primer (gambar 2). Pasangan primer MeADC1 dapat mengamplifikasi cetakan gDNA pada beberapa suhu annealing yaitu pada suhu rendah 44.0 o C, 46.6 o C  dan  48.3 o C  sedangkan  suhu annealing diatas 50 o C tidak menghasilkan pita. Demikian halnya  pada  pasangan  primer MeADC2 ,  dapat mengamplifikasi  cetakan  gDNA  dengan  suhu annealing  mulai  dari  44.0 o C  hingga  suhu
52.6 o C.  Pasangan  primer MeADC3 menghasilkan  banyak  pita  tidak  spesifik  pada suhu  53.9 o C  dan MeADC4 menghasilkan banyak pita pada semua suhu annealing. Suhu annealing  yang  terlalu  rendah,  akan pengamplifikasi  fragmen  DNA  yang  tidak spesifik,  hal  ini  ditandai  dengan  munculnya banyak pita (Rychlik et al. 1990). Beberapa  pita  DNA  masih  terbentuk  dari hasil amplifikasi menggunakan suhu annealing dengan  rentang  47.5 o C hingga  50 o C (gambar 4),  meskipun  pasangan  primer MeADC1 menunjukkan  pita  yang  lebih  tajam  dan spesifik  pada  Ta  44.0 o C hingga  48.3 o C (gambar3),  namun  hasil  yang  tidak  kosisten terjadi  ketika  dilakukan  pengulangan  pada  Ta 47 o C (gambar 4). Suhu pemanjangan umumnya berkisar antara 70 o C-72 o C selama 0.5 – 3 menit tergantung pada  besarnya  produk  PCR  yang ditargetkan atau sekitar satu menit cukup untuk mengamplifikasi  runutan  basa  nukleotida sebesar  2.000  pasang  basa  (Innis  &  Gelfand, 1990).
Gambar  2.  Elektroforegram  hasil  optimasi  suhu  annealing  pasangan  primer  MeADC1 (a),
MeADC2  (b),  MeADC3  (c)  dan  MeADC4  (d)pada  suhu  44.0 o C  (1),  46.6 o C  (2), 48.3 o C (3), 50.2 o C (4), 52.6 o C (5) dan 53.9 o C (6),  M,:1 kbplus ladder
Gambar 3. Elektroforegram hasil optimasi suhu annealing pasangan primer MeADC1 pada suhu 44.0 o C (1), 45.1 o C (2), 46.2 o C (3), 47.1 o C (4), 48.3 o C (5) dan 48.9 o C (6),   M : 1 kbplus ladder
Gambar 4. Elektroforegram hasil optimasi suhu annealing pasangan primer MeADC2 pada suhu 47.5 o C (1), 48.0 o C (2), 48.5 (3), dan 49.0 (4); pasangan primer MeADC3 pada suhu
48.5 o C (5), 49.0 o C (6), 49.5 (7), dan 50.0 (8);  dan pasangan primer MeADC4 pada suhu 48.5 o C (9), 49.0 o C (10), 49.5 (11), 50.0 (12), dan pasangan primer MeADC1 pada suhu 47 o C (13),  M :  1 kbplus ladder
Gambar  5.  Runutan  basa  nukleotida  hasil  amplifikasi    cetakan  gDNA  Malra016  yang  diperoleh dengan primer MeADC1
Tabel 2. Hasil analisis penyejajaran fragmen MeADC dengan gen atau DNA yang telah terdeposit pada Genbank menggunakan program BLAST Description Max score Total score Query cover E value Ident Accession ribosomal protein S3 [Oryza minuta] 70.5 70.5 36% 8e-10 49% YP_009242005.1 ribosomal protein S3 [Oryza minuta] 70.1 70.1 17% 9e-10 75% YP_009241985.1 hypothetical protein AEK19_MT0893 [Utricularia reniformis] 58.2 58.2 9% 2e-07 96% YP_009381295.1 PREDICTED: uncharacterized protein LOC105852994 [Cicer arietinum] 50.8 50.8 9% 0.002 89% XP_012575409.1 hypothetical protein T459_26246 [Capsicum annuum] 40.0 40.0 8% 2.1 68% PHT71142.1 Berdasarkan  beberapa  hasil  penelitian untuk mendapatkan  fragmen  gen  ADC  dari beberapa  tanaman  menggunakan  suhu annealing berkisar lebih dari 50 o C, yaitu 51 o C pada Poncirus  trifoliate (Wang et  al., 2011), 55 o C  pada  tanaman  padi  (Peremarti etal., 2010), dan 58 o C pada Hevea brasiliensis (Zhao et  al., 2017).  Belum  diperolehnya  pita amplifikasi  yang  spesifik  dan  tajam menggunakan  keempat  pasang  primer  diduga karena  suhu  annealing  yang  digunakan  masih terlalu  rendah  sehinggga  banyak  pita amplifikasi yang dihasilkan. Menurut Green et al., (2015) reaksi PCR merupakan reaksi yang sensitif terhadap ketidaksesuaian antara primer dan  cetakan,  dan  ketidakcocokan  dapat menyebabkan  amplifikasi  yang  tidak  efisien pada daerah cetakan DNA yang ditargetkan. Pita  dengan  ukuran  terbesar  hasil amplifikasi  menggunakan  pasangan  primer MeADC1 dengan  ukuran  >1.000  pb  yang diperoleh pada suhu annealing 47 o C dilakukan proses perunutan basa nukleotida/ sequencing sebesar 839 pasang basa (Gambar 5). Analisis penyejajaran menggunakan  program  BLAST  pada  database GenBank menunjukkan kemiripan 49% dengan ribosomal  protein  S3  tanaman Oryza  minuta
(Acc  YP_009242005.1)(gambar  6)  dan  bukan fragmen DNA target yaitu ADC. Menurut  Gao  dan  Hardwidge  (2011), ribosomal  protein  S3  (RPS3)  merupakan komponen  subunit  ribosom  40S  eukariotik. Fungsi  RPS3  selain  berperan  pada  translasi protein,  juga  berperan  pada  banyak  aktifitas ektraribosomal  (Blumentha  dan  Carmichael, 1979)  termasuk  pada  perbaikan  DNA, kematian  sel,  inflamasi,  tumor  dan  regulasi transkripsi (Warner dan McIntosh, 2009).

## KESIMPULAN
Amplifikasi sekuen DNA genom ubi kayu asal Malra  dengan  menggunakan  empat  pasang primer degenerate yang  dirancang  berdasarkan sekuen gen ADC telah menghasilkan pita DNA hasil  amplifikasi.  Namun  demikian    kondisi PCR  perlu  dioptimasi  lebih  lanjutuntuk memperoleh  pita  DNA  yang  spesifik.  Hasil analisis  penyejajaran  runutan  basa  nukleotida menggunakan  program  BLAST  terhadap fragmen  runutan  basa  nukleotida  berukuran 839 pasang basayang diperoleh dengan primer MeADC1tidak  menunjukkan  fragmen    gen penyandi    ADC.  Untuk  memperoleh  fragmen sekuen DNA ubi kayu yang memiliki homologi tinggi  dengan  gen  ADC,  Selain  optimasi
kondisi  PCR  khususnya  suhu  annealing  baik pada  pasangan  primer MeADC1 maupun primer  lainnya,  juga  perlu  didesain  primer lainnya yang memiliki sekuen consensus clamp yang lebih panjang dan menurunkan persentase degenerasi nukleotidanya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didukung  oleh  kegiatan Unggulan LIPI Tahun Anggaran 2017. Ucapan terima kasih  disampaikan  kepada  Husni Ahmad  Sidiq  (Mahasiswa Universitas  Negeri Semarang) untuk inisiasi dan preparasi analisis molekuler ubi kayu asal Malra di Laboratorium Genetika  Molekuler  dan  Modifikasi  Jalur Biosintesa Tanaman.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Latif, A., G. Osman. 2017. Comparison of Three Genomic  DNA Extraction Methods  to Obtain High  DNA Quality from Maize. Plant Methods 13(1):1-9. Alcázar,  R.,  T.  Altabella.,  F.  Marco.,  C. Bortolotti.,  M.  Reymond.,  C.  Konez.,  P. Carrasco.,  A.  F.  Tiburcio.  2010. Polyamines: Molecule  with Regulatory Functions  in Plant Abiotic Stress Tolerance. Planta 231:1237-1249. Blumenthal,  T.,  G.G.  Carmichael.  1979.  RNA Replication: Function  and Structure  of Qbeta-replicase. Annu.  Rev.  Biochem. 48: 525–548. Doyle, J.J., J.L. Doyle. 1990. Isolation of Plant DNA from Fresh Tissue. Focus .12:13-15. Gao,  X.,  P.R.  Hardwidge.  2011.  Ribosomal Protein  S3: A Multifunctional Target  of Attaching/Effacing Bacterial Pathogens. Front. Microbio. 2 :137. doi: 10.3389/fmicb.2011.00137 Green,  S.  J.,  R.  Venkatramanan.,  A.  Naqib. 2015.  Deconstructing  the Polymerase Chain Reaction: Understanding  and Correcting Bias Associated  with Primer Degeneracies and Primer-template Mismatches. PlosOne 10(5):e0128122. Gupta,  K.,  A.  Dey.,  B.  Gupta.  2013.  Plant
Polyamines  in Abiotic Stress Responses.
Acta Physiol Plant .35:2015-2036. Innis,  M.  A.,  D.  H.  Gelfand.  1990.
Optimization  of  PCRs. Pp  3-12  in:  PCR
Protocols  (Innis,  Gelfand,  Sninsky  and White, eds.); Academic Press, New York.
Kusano,  T.,  T.  Berberich.,  C.  Tateda.,  Y. Takahashi.  2008.  Polyamines: Essensial
Factors for Growth  and Survival. Planta
228:367-381.
Peremarti,  A.,  L.  Bassie.,  C.  Zhu.,  T.  Capell. 2010.  Molecular Characterization  of The Arginine Decarboxylase Gene Family  in Rice. Transgenic Res 19:785-787. Pervaiz, Z., N. Turi.,I. Khaliq., M. Rabbani., S. A. Malik.  2011.  Modified Method Forhigh-Quality  DNA Extraction  for Molecular Analysis  in Cereal Plants.
Genet Mol Res J . 10:1669–1673. Polz,  M  F.,  C.  M.  Cavanaugh.  1998.  Bias  in Template-to-Product Ratios in Multitemplate  PCR. Applied  and Environmental Microbiology .  64:3724- 3730. Rychlik,  W.,  W.  J.  Spencer.,  R.  E.  Rhoads. 1990.  Optimization  of The Annealing Temperature  for  DNA Amplification In Vitro . Nucleic Acids Research 18(21):6409-6412. Susanto,  A.N.,  M.P.  Sirappa.  2007. Karakteristik  dan Ketersediaan Data Sumber Daya Lahan Pulau-pulau Kecil Untuk Perencanaan Pembangunan Pertanian  di  Maluku. Jurnal  Litbang Pertanian 26(2): 41-53.
Waas, E.D., J.B. Alfons. 2012. The Evaluation of  Land  Suitability  to  Support  the  Food Crops  Farming  on  Dry  Land  Agriculture at Debut Village, Kei Kecil Sub District, Southeast  Maluku  District – Maluku Province. Jurnal  Budidaya  Pertanian 8:
109-116. Wang, J., P. P. Sun., C. L. Chen., Y. Wang., X. Z.  Fu.,  J.  H.  Liu.  2011.  An Arginine Decarboxylase Gene  PtADC  from Poncirus Trifoliate Confers Abiotic Stress Tolerance  and Promotes Primary Root Growth  in Arabidopsis . Journal  of Experimental Botany 62(8):2899-2914. Warner,  J.  R.,  K.B.  McIntosh.  2009.  How Common Are Extraribosomal Functions of Ribosomal Proteins? Mol  Cell. 34:  3–
11.
Zein,  M..S..A.,  D.  M.  Prawiradilaga.
2013. DNA Barcoding  Fauna  Indonesia . Kencana Press, Jakarta, pp. 9-21. Zhao,  M.,  H.  Liu.,  Z.  Deng.,  J.  Chen.,  H. Yang.,  H.  Li.,  Z.  Xia.,  D.  Li.  2017. Molecular Cloning and Characterization of S-adenosylmethionine Decarboxylase Gene in Rubber Tree  ( Hevea Brasiliensis ). Physiol  Mol  Biol  Plants .:  1-11. DOI 10.1007/s12298-017-0417-z.