2023 Jurnal Bahana Kesehatan Masyarakat (Bahana of Journal Public Health) Vol 7 No 2 p-ISSN: 2580-0590/ e-ISSN: 2621-380X doi: https://doi.org/10.35910/jbkm.v6i1.537

## PENGGUNAAN HOTPLATE SUHU 60°C  SELAMA 10 MENIT SEBAGAI ALTERNATIF PEMANASAN PROSES  FIKSASI SEDIAAN HISTOLOGI
Burhannudin 1* , Warida 1 , dan Indah Puspita 2
1 Prodi Diploma III Teknologi Laboratorium Medis, Poltekkes Kemenkes Jakarta III
2 Mahasiswa S.Tr Teknologi Laboratorium Medis, Poltekkes kemenkes Jakarta III
*Korespondensi penulis: mr.burhan88@gmail.com

## ABSTRAK
Latar  belakang :  Proses  fiksasi  mendominasi  keseluruhan  proses  pada  pembuatan  sediaan  histologi. Waktu  fiksasi  telah berhasil  diperpendek  menggunakan  bantuan  pemanasan microwave pada  suhu  60°C menjadi  2  –  10  menit.  Namun,  pemanfaatan hotplate masih  terbatas  dalam  penggunaannya  sehingga penelitian  difokuskan  untuk  mengetahui  waktu  optimal  penggunaan hotplate suhu  60°C  pada  proses fiksasi.
Metode :  Penelitian  dilakukan  secara  eksperimental  murni  dengan post-test  only  control  group  design menggunakan  masing-masing  20  sediaan  histologi  dari  2  kelompok  kontrol,  konvensional  (K)  dan microwave (M), serta 3 kelompok perlakuan hotplate 60°C selama  3 menit (W1), 5 menit (W2) dan 10 menit  (W3).  Hasil  sediaan  dinilai  secara  mikroskopis  berdasarkan  hasil  pewarnaan  Hematoksilin  Eosin (HE)  dan  skoring  hasil  pewarnaan  HE  yang  mengacu  pada  penelitian  sebelumnya.  Hasil  skoring  diuji menggunakan tes Kruskal-Wallis dan Mann-Whitney dengan nilai p<0,05 dinyatakan signifikan. Hasil: Hasil  mikroskopik  sediaan  menunjukkan  warna  HE  yang  gelap  pada  kelompok  W2  dan  W3. Namun,  kelompok  W1  menujukkan  hasil  yang  sama  (p>0,05)  sedangkan  kelompok  W2  dan  W3 menunjukkan hasil yang berbeda (p<0,05) dibandingkan kelompok K.
Kesimpulan: Penggunaan  hotplate  suhu  60°C  selama  10  menit  terbukti  mampu  menjadi  alternatif pemanasan untuk mempercepat proses fiksasi dengan tetap mempertahankan kualitas hasil pewarnaan HE sediaan histologi. Namun, penggunaan suhu lain dan penggunaan alternatif pemanas oven perlu dilakukan telusur lebih lanjut.
Kata kunci: fiksasi, histologi, hotplate, suhu , waktu

## AN ALTERNATIVE TO FIXATING HISTOLOGY SPECIMENS BY USING HOTPLATE AT 60°C FOR 10 MINUTES

## ABSTRACT
Background:  The  fixation  process  in  histological  preparation  has  been  shortened  by  using  microwave heating  at  60°C  for  2-10  minutes  while  maintaining  the  quality.  However,  the  use  of  hotplates  in  this process is still limited. The study aims to determine the optimal duration of hotplate heating at 60°C for fixation.
Method:  An  experimental  study  was  conducted  using  a  post-test-only  control  group  design.  The  study includes  20  histological  specimens  from  two  control  groups  (conventional  and  microwave)  and  three treatment  groups  with  hotplate  heating  durations  of  3  minutes  (W1),  5  minutes  (W2)  and  10  minutes (W3). Histological slides were evaluated based on staining results and scored using a scoring system (0- 3). The scoring was tested using the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests, with a significance level of p<0.05.
Result: microscopic evaluation of the specimens revealed dark staining with Haematoxylin and Eosin in the W2 and W3 groups. However, the W1 group showed similar results (p>0.05) compared to the control group,  while  the  W2  and  W3  groups  indicated  significantly  different  results  (p<0.05)  compared  to  the control group.
Conclusion: using a hotplate at 60°C for 10 minutes effectively accelerated the fixation process without compromising the quality of Haematoxylin and Eosin staining in histological specimens.
Keywords: fixation, histology, hotplate, heating, time

## PENDAHULUAN
Penggunaan sediaan histologi masih menjadi  standar  penentuan  prognosis dan  terapi  pada  pasien  kanker.  Sediaan yang baik harus mampu menggambarkan  kondisi  jaringan  yang serupa  dengan  kondisi  pada  waktu masih hidup. Namun, pembuatan sediaan  histologi  memerlukan  waktu yang  lama  karena  melalui  berbagai tahapan  dalam  prosesnya (1) (2) (3). Bahkan, beberapa Rumah Sakit
menyatakan  bahwa  hasil  pemeriksaan patologi  anatomi  menggunakan  sediaan histologi  memerlukan  1  –  2  minggu untuk  dapat  diinformasikan  kepada pasien (4) (5) (6).
Fiksasi  merupakan  satu  dari  sekian tahapan  yang  harus  dilakukan  dalam pengerjaan
pembuatan
sediaan histologi.  Fiksasi  memegang  peranan penting  karena  merupakan  tahapan pertama  dalam  pembuatan  sediaan histologi,  mencegah  lisis  jaringan  dan menentukan keberhasilan tahapan- tahapan  selanjutnya.  Selain  itu,  fiksasi juga menggunakan alokasi waktu terbesar dalam pengerjaan hingga memakan 24 jam (3) (7) sehingga upaya untuk memangkas waktu fiksasi menjadi penting.
Proses  fiksasi  dipengaruhi  oleh penggunaan  suhu  dan  waktu  tertentu. Penggunaan microwave pada  suhu  60 0 C  selama  1  –  10  menit  untuk membantu  proses  fiksasi  telah  terbukti dapat  mempersingkat  alokasi  waktu fiksasi  dan  tetap  menghasilkan  kualitas hasil  pewarnaan  sediaan  yang  baik (8) (9). Namun, penggunaan hotplate belum pernah  dilakukan  sebelumnya  padahal keberadaan hotplate melimpah di hampir  semua  laboratorium.  Selain  itu, permukaan hotplate yang datar mempermudah  jalannya  proses  fiksasi dan  pengadukan (7) (10).  Penggunaan hotplate sebagai  alternatif  pengganti microwave perlu  dilakukan  dalam
membantu proses fiksasi untuk menguji kualitas  hasil  sediaan  histologi  yang dihasilkan sehingga pemrosesan sediaan histologi mampu dilakukan pada laboratorium  dengan  pengaturan  yang lebih  sederhana  namun  menghasilkan kualitas yang baik dan cepat.

## METODE
Penelitian  ini  merupakan  studi ekperimental murni dengan menggunakan post-test  only  control group design . Penelitian dilakukan pada lima  kelompok  perlakuan  yang  terdiri atas dua kelompok kontrol, konvensional  (K)  dan microwave (M), serta  tiga  kelompok  perlakuan hotplate dengan  variasi  suhu  berbeda,  selama  3 menit (W1), 5 menit (W2) dan 10 menit (W3).  Setiap  kelompok  terdiri  atas  20 sediaan  histologi  dari  hepar  satu  ekor Tikus Wistar ( Rattus norvegicus ) jantan dengan bobot 200 gram dan berumur 10 –  12  minggu.  Tikus  Wistar  didapatkan dari iRatco, Bogor dan sudah dipastikan galur murninya.
Tikus  dieuthanasia  dan  dilakukan pembedahan  untuk  mendapatkan  hepar. Hepar  yang  didapatkan  direndam  ke dalam  larutan  fiksasi  FineFix  yang dinilai  aman  untuk  dipanaskan  sesuai dengan kelompok perlakuan dan kontrolnya masing-masing. Proses dilanjutkan dengan pematangan jaringan  dengan  merendam  hepar  ke dalam  larutan  dehidrasi  diikuti  dengan proses  penjernihan  menggunakan  xylol, infiltrasi dan embedding parafin, pemotongan tipis menggunakan mikrotom dan diakhiri dengan pewarnaan  rutin  Hematoksilin  Eosin (HE) sesuai dengan penelitian sebelumnya (11) (12).  Seluruh  tahapan dan  proses  penelitian  yang  dilakukan sudah  mendapatkan  surat  persetujuan etik dari komite etik penelitian kesehatan  (non  kedokteran)  Universitas Muhammadiyah  Prof.  Dr.  Hamka  no.
03/23.05/02516. Skematis jalannya penelitian ditunjukkan pada gambar 1.
Jaringan Hepar Tikus  Fiksasi Konvensional (K) Microwave (M) Hotplate FineFix tanpa pemanasan 24 jam FineFix pemanasan 50°C 20 menit Finefix pemanasan 60°C 3 menit (W1) 5 menit (W2) 10 menit (W3)  Dehidrasi 
Pembeningan
(clearing) 
Infiltrasi
 Embedding  Mikrotomi  Pewarnaan
Hematoksilin
Eosin (HE) 

## Pengamatan

## Gambar 1. Skematis jalannya penelitian.
Jaringan  hepar  tikus  yang  didapatkan direndam ke dalam larutan fiksasi sesuai dengan kelompoknya. Proses dilanjutkan dengan merendam  ke  dalam  alcohol  bertingkat  70%- 96%-absolut  (dehidrasi),  xylol  (pembeningan), infiltrasi  dan  embedding  parafin,  dilakukan pemotongan  tipis  menggunakan  mikrotom (mikrotomi),  pewarnaan  Hematoksilin  Eosin (HE) dan diakhiri dengan pengamatan mikroskopis terhadap hasil pewarnaan HE.
Hasil  pewarnaan  HE  dinilai  oleh empat  orang blinded  observer s  dengan sistem  skoring  berdasarkan  penelitian sebelumnya (12).  Untuk  mengetahui hasil keseragaman dari keempat observers ,  tes Kappa dilakukan  dari hasil  pembacaan  skoring observers dengan  nilai  dinyatakan  baik  jika
mendekati  0,8.  Hasil  skoring  disajikan dalam  tabel  dilengkapi  dengan  gambar hasil  pewarnaan  HE  dan  diuji  dengan tes Kruskall-Wallis dilanjutkan  dengan tes Mann-Whitney karena  data  tidak normal.  Nilai  uji  dinyatakan  signifikan jika nilai p<0,05.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Fiksasi sangat mempengaruhi kualitas hasil pewarnaan sediaan histologi. Fiksasi harus dilakukan secara tepat  karena  fiksasi  yang belum sempurna  ( under  fixation )  dan  fiksasi yang  berlebihan  ( over  fixation )  dapat merusak  sediaan  histologi  yang  dibuat (13).  Lamanya  proses  fiksasi  telah berhasil dipersingkat dengan penggunaan microwave dan  penelitian terbaru  difokuskan  untuk  menggunakan alternatif hotplate .
Sebanyak  100  sediaan  histologi yang  dibagi  rata  ke  dalam  lima kelompok  digunakan  dalam  penelitian untuk mengamati kualitas hasil perlakuan berdasarkan perbedaan perlakuan  setiap  kelompok,  kontrol (konvensional  dan microwave )  dan pemanasan menggunakan hotplate suhu 60°C  selama  3  menit  (W1),  5  menit (W2)  dan  10  menit  (W3).  Hasil  data pengamatan menunjukkan adanya perbedaan kualitas hasil sediaan berdasarkan
hasil
pewarnaan
Hematoksilin Eosin (HE). Hasil pewarnaan HE hepar secara mikroskopi setiap kelompok perlakuan dapat diamati pada gambar 2.
Hasil  pewarnaan  HE  menunjukkan bahwa  kelompok  W3  memberikan  skor 3  sedangkan  kelompok  yang  lain memiliki  skor  2.  Untuk  mengetahui perbandingan hasil setiap perlakuan, tes Kruskal-Wallis dan Mann-Whitney dilakukan  dari  hasil  skoring  yang diberikan  pada  setiap  sediaan.  Hasil analisis statistik secara singkat ditunjukkan pada tabel 1.
Tabel 1.  Hasil  analisis  skor  pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE) setiap kelompok perlakuan Kelompok n Median (nilai batas bawah-batas atas) p
Kontrol konvensional (K) 20 2 (1,5 – 2,2) a,b Kontrol Microwave (M) 20 2 (2 – 2,5) Hotplate 60°C 3 menit (W1) 20 2 (2 – 2,5) p<0,05 Hotplate 60°C 5 menit (W2) 20 2 (2,1 – 2,8) a Hotplate 60°C 10
menit (W3) 20 3 (2,3 – 2,7) b
* a,b menyatakan adanya perbedaan signifikan antara 2 kelompok yang berbeda
Fiksasi menggunakan
metode pemanasan  sudah  banyak  dijadikan alternatif  untuk  memperpendek  waktu fiksasi (8) (9).  Penelitian  terbaru  juga menunjukkan hasil serupa. Hasil pemanasan  3  menit  telah  menghasilkan kualitas sediaan yang menyerupai metode konvensional. Bahkan,
pemanasan  yang  lebih  lama  (10  menit) memiliki  skor  yang  mendekati  3  (tabel
1).
Proses  pemanasan  dalam  tahap fiksasi dapat membantu penetrasi larutan  jaringan  lebih  cepat  ke  dalam jaringan (14). Pemanasan mampu menurunkan viskositas larutan sehingga meningkatkan  permeabilitas  membrane sel.  Selain  itu,  jaringan  lemak  yang umumnya mengganggu dan
menghasilkan artefak pada hasil
pewarnaan  dapat  diminimalisir  dengan penggunaan  pemanasan (3) (9).  Hal  ini yang  memungkinkan  kualitas  hasil pemanasan  setara  dengan  penggunaan metode konvensional
bahkan menghasilkan  skor  yang  lebih  bagus pada  perlakuan  pemanasan  yang  lama (gambar  2  dan  tabel  1).  Namun demikian,  penggunaan  pemanasan  yang berkepanjangan  perlu  dipantau  karena pemanasan memungkinkan adanya fenomena denaturasi protein pada jaringan  yang  memungkinkan  rusaknya
jaringan  sebelum  sempat  terfiksasi secara  sempurna (3) (15).  Hal  ini  dapat teramati  pada  kelompok  W3  yang mengalami perlubangan pada jaringannya (gambar 2). (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h)
(i) (j) Gambar  2.  Perbandingan  hasil  pewarnaan Hematoksilin  Eosin  (HE)  hepar  tikus  secara mikroskopi.
a)  kelompok hotplate 60°C  3  menit  (W1) dengan perbesaran 10X dan b) perbesaran 40X. c)  kelompok hotplate 60°C  5  menit  (W2) perbesaran  10X  dan  d)  perbesaran  40X.  e) kelompok hotplate 60°C  10  menit  (W3) perbesaran  10X  dan  f)  perbesaran  40X.  g) kelompok  kontrol  konvensional  (K)  perbesaran 10X  dan  h)  perbesaran  40X.  i)  kelompok kontrol microwave perbesaran  10X  dan  h) perbesaran  40X.  kelompok  W1  memiliki gambaran  inti  sel yang  gelap,  sitoplasma  pekat, warna  preparat  kurang  seragam  (skor  2). Kelompok  W2,  K  dan  M  memiliki  gambaran yang  menyerupai  kelompok  W1.  Di  lain  pihak, kelompok W3 memiliki gambaran skor sempurna  dengan  inti  sel  berwarna  ungu, sitoplasma  merah,  kromatin  jelas  dan  warna preparat  terlihat  seragam  (skor  3).  Pengukuran skor  didasarkan  pada  penelitian  sebelumnya (12).
Meskipun penggunaan hotplate telah  membuktikan  dapat  mempercepat waktu fiksasi, suhu pemanasan menggunakan hotplate sangat
dipengaruhi  oleh  suhu  lingkungan. Pemantauan suhu secara kontinyu harus selalu  dilakukan  dengan  menggunakan thermometer  untuk  mengetahui  dan mengkondisikan  suhu  agar  stabil  (16).
Selain itu, penggunakan proses pengadukan  sangat  memegang  peranan penting  untuk  menyebarkan  panas
hotplate  ke  seluruh  larutan  fiksasi  yang digunakan.

## KESIMPULAN
Penggunaan hotplate suhu  60°C selama 10 menit dapat menjadi alternatif  pemanasan  untuk  membantu proses  fiksasi  dalam  menghasilkan sediaan histologi hepar tikus yang baik. Namun,  penggunaan hotplate harus disertai  dengan  pengawasan  yang  lebih ketat karena kecenderungan suhu hotplate yang  berubah-ubah  karena terpengaruh  oleh  suhu  lingkungannya. Penggunaan suhu lain atau alat pemanasan  lain  seperti  oven  mungkin dapat digunakan untuk mencari alternatif  pemanasan  lain  yang  dapat diaplikasikan  dalam  membantu  proses fiksasi  dengan  tetap  memperhatikan luaran hasil sediaan histologi yang tetap baik.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Peneliti mengucapkan terimakasih kepada  Michael  Alfian  Grey,  PLP Laboratorium Sitohistoteknologi, Poltekkes  Kemenkes  Jakarta  III  yang telah membantu mempersiapkan peralatan  yang  dibutuhkan  selama penelitian.  Selain  itu,  penelitian  juga didanai  oleh  dana  DIPA  Poltekkes Kemenkes Jakarta III Tahun 2023.

## DAFTAR PUSTAKA
1.   Mescher, A. L. and Janqueira, L. C. U. 2013. Janqueira's Basic Histology:  Text  and  Atlas  (13th Ed.). s.l. : McGraw-Hill Education.
2.   Koesoemah,  H.  A.  and  Dwiastuti, S.  A.  P.  2017. Histologi  dan Anatomi  Fisiologi  Manusia. s.l. : http://bppsdmk.kemkes.go.id.
3.   Suvarna,  K.,  Layton,  C.  and Bancroft,  J.  D.  2019. Bancroft's
Theory and Practice of
HIstological  Techniques  (8th  ed.).
s.l. : ELSEVIER. 4.   RSAP.  2018. Standar  Pelayanan Instalasi  Laboratorium  Patologi Anatomi Rumah Sakit Umum Anutapura Palu. Kota Palu : RSAP. 5.   Muntilan,  RSUD.  2018. Standar Pelayanan  Publik  pada  Rumah
Sakit  Umum  Daerah  Muntilan, Standar Pelayanan Instalasi Laboratorium  Patologi  Anatomi. Muntilan, Magelang : RSUD Muntilan.
6.   Kartini,  RSUD  RA.  2019. Standar Pelayanan  Laboratorium  Patologi Anatomi RSUD RA Kartini
Kabupaten  Jepara. Jepara :  RSUD RA Kartini.
7.   Khristian, E. and Inderiati, D. 2017. Sitohistoteknologi.
Jakarta : BPPSDM  Kesehatan,  Kementerian Kesehatan. 8.   Tripathi, M., et al. 2013. Comparison of Routine
Fixation  of  Tissue  with  Rapid Tissue Fixation . Journal  of Clinical and  DIagnostic  Research,  7.  2768- 2773.
9.   Adam,  M.,  et  al.  2022. Evaluation of  The  Effect  of  Time  of  Fixation and  Microwave  Treatment  on Quality  of  Fatty  Tissue  Fixation  in Breast  Cancer  Specimens. SPR,  2. 402-408.
10.  Torlakovic, E. E., et al. 2015. ICSH Guidelines  for  The  Standarization of Bone Marrow Immunohistochemistry. International  Journal  of  Laboratory Hematology, 37. 431-449.
11.  Burhannudin, et al. 2018.
Chemopreventive  Effects  of  Edible Canna (Canna edulis Kerr.) Against Colorectal Carcinogenesis: Effects on Expression
of Adenomatous  Polyposis  Coli  and Inducible  Nitric  Oxide  Synthase  in Rat  Inflammatory  Model. Asian
Pacific Journal of Cancer Prevention, 19. 839-844. 12.  Ariyadi,  T.  and  Suryono,  H.  2017. Kualitas  Sediaan  Jaringan  Kulit Metode Microwave dan Conventional Histoprocessing Pewarnaan  Hematoxylin  Eosin. Jurnal Labora Medika, 1. 7-11. 13.  Dey,  P.  2018. Basic  and  Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Citology.
Singapore : Springer. 14. R ao,  M.,  et  al.  2020. Microwave- assisted  Tissue  Proessing,  Fixation and  Staining  in  Tissue  of  Different Thicknesses:  A  Comparative  Study. Journal  of  Oral  and  Maxillofacial Pathology, 24. 186.
15.  Rastogi,  V.,  et  al.  2013. Artefacts: A  Diagnostic  Dillema  -  A  Review. Journal  of  Clinical  and  Diagnostic Research, 7. 2408-2413.
16.  Alfita,  R.,  et  al.  2021. Hotplate Magnetic  Stirrer  Pengatur  Panas
Automatis  dan  Kecepatan  Air Berbasis  PID  (Proportion  Integral Derivative). Sidoarjo :  Universitas Muhammadiyah Sidoarjo.