Pengaruh Penambahan Berbagai Jenis Sumber Karbon, Nitrogen Dan Fosforpada  Medium deMan, Rogosa and Sharpe (MRS) Terhadap Pertumbuhan  Bakteri Asam Laktat  Terpilih Yang Diisolasi Dari Intestinum Udang Penaeid
Subagiyo 1,2* , Sebastian Margino 2 , dan Triyanto 2
1 Jurusan Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. Soedarto, SH. Kampus UNDIP Tembalang, Semarang 50275
2 Program Studi Bioteknologi Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada Jl. Teknika Utara, Pogung, Sleman, Yogyakarta, 55281 Email :subagiyo_kelautan@yahoo.co.id

## Abstrak
Bakteri  asam  laktat  merupakan fastidious  organisms ,  tumbuh  dengan  baik  pada medium kompleks. Salah satu medium yang telah diakui baik untuk produksi sel bakteri asam laktat  adalah  medium    deMan,  Rogosa  and  Sharpe  (MRS).  Pada  penelitian  ini  telah dilakukan  penelitian  pengaruh  penambahan  komponen  nutrisi  pada  medium  MRS  terkait upaya  untuk  mendapatkan  komposisi  medium  yang  lebih  baik  untuk  produksi  massa  sel. Selain  itu  juga  dilakukan  pengamatan  pertumbuhan  pada  berbagai  nilai  pH  dan  suhu. Eksperimen  penambahan  komponen  nutrisi  pada  medium  MRS  meliputi  sumber  karbon (glukosa  dan  fruktosa)  sebanyak  1%,  sumber  nitrogen  (amonium  klorida,    amonium  nitrat, amonium  sulfat  dan  pepton)  sebanyak  0,2  %,  dan  sumber  fosfor  (K 2 HPO 4 danKH 2 PO 4 ) sebanyak  0,1  %.    Pengamatan  pertumbuhan  dilakukan  dengan  metode  spektrofotometri berdasarkan  perubahan  optical  density  kultur  bakteri.  Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa penambahan  glukosa  maupun  fruktosa  memberikan  pengaruh  menurunkan  produksi  sel pada  awal  waktu  pertumbuhan  (pengamatan  6  jam  pertama),  tetapi  memberikan pengaruh  meningkatkan  produksi  sel  setelah  waktu  pertumbuhan  18  jam  dan  24  jam. Perlakuan  penambahan  sumber  nitrogen  menunjukan  bahwa  penambahan  pepton memberikan  pengaruh  meningkatkan  produksi  sel  paling  tinggi  pada  6  jam  kultivasi, selanjutnya  mulai  18  jam  kultivasi  menunjukan  penambahan  amonium  klorida  memberikan pengaruh  yang  paling  besar  terhadap  peningkatan  produksi  sel.  Perlakuan  penambahan K 2 HPO 4 maupun  KH 2 PO 4 memberikan  pengaruh  peningkatan  pertumbuhan  yang  tinggi hanya pada 6 jam waktu kultivasi.
Kata kunci : bakteri asam laktat, MRS, nutrisi, pH, suhu, pertumbuhan

## PENDAHULUAN
Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri  yang  telah  banyak  dipelajari  dan dikembangkan  sebagai  probiotik.Hal  ini didasarkan  pada    (1)  bakteri  asam  laktat merupakan    mikroorganisme  yang  secara genetik  adalah  aman  (memiliki  status GRAS).  (2)  dijumpai  melimpah  di  dalam intestinum,  (3)  mampu  hidup  dan  melekat di  dalam  sistem  mukosa  intestinum,  (4) mampu  berkompetisi  dengan  pathogen untuk  reseptor  pelekatan  di  epithelium intestinum,    (5)  mampu  berkompetisi terhadap nutrient esensial, (6) menghasilkan  asam  organik,  hidrogen
peroksida  dan  bakteriosin  yang  bersifat antagonis terhadap pathogen, (7) menghasilkan  produk  bermanfaat  lain seperti  enzim  ekstraseluler,  (8)  bersifat noninvasif, nonkarsinogenik dan nonpathogenik, (8) memiliki sejarah panjang digunakan sebagai  starter produk makanan  dan  minuman  serta  probiotik untuk manusia dan ternak.
Hasil  isolasi  dan  seleksi  BAL  dari berbagai  jenis  udang  penaeid  telah berhasil diperoleh isolat-isolat yang memiliki aktivitas anti vibrio.Bakteri vibrio merupakan
jenis  bakteri  utama  yang  menyerang udang.  Pertumbuhan  dipengaruhi  oleh banyak  faktor  baik  faktor  genetik,  nutrisi (Todorov  &  Diks,  2005b  ;  Park et  al. 2010) maupun lingkungan terutama pH dan suhu (Messens et  al. 2003  ;  Zhang et  al. 2012).Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang bersifat fastidious, membutuhkan  medium  yang  kompleks untuk pertumbuhannya.
Salah  satu  medium  yang  biasa digunakan  untuk  kultivasi  bakteri  asam laktat adalah medium MRS (Pal et al , 2010). Meskipun MRS merupakan medium kultivasi  untuk  bakteri  asam  laktat  masih diperlukan untuk dilakukan modifikasi guna mendapatkan  formulasi  yang  optimum sesuai  dengan  jenis  bakterinya.  Selaion  itu jumlah  nutrien  yang  ada  pada  medium pertumbuhan awal potensial untuk membentuk  biomassa  akhir.  Sehingga perubahan ketersediaan nutrien ini berpengaruh  pada  pertumbuhan  dan produk biomasa ( Leroy &de Vuyst, 2001).
Pada penelitian ini
dikaji penambahan  komponen  nutrisi  pada medium MRS untuk meningkatkan pertumbuhan  dan  produksi  sel    bakteri asam laktat serta optimasi kondisi lingkungan kultivasi (pH dan suhu).

## MATERI DAN METODE

## Isolat bakteri
Isolat bakteriyang    digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  adalah  isolat  BAL yang  diisolasi  dari  udang  penaeid  dan diseleksi  berdasarkan  aktivitas  anti  vibrio terhadap  bakteri V.harveyii.  V.  anguilarum dan V. parahaemolitycus.

## Media
Media  yang    digunakan  untuk produksi  BAL    adalah  medium  MRS (Triptone  (10.0  g/l),  ekstrak  khamir  (5.0  g/l), Glukosa  (20.0  g/l),  K 2 HPO 4 (2.0  g/l),  sodium acetate  (5.0  g/l),  MgSO 4 -7H 2 O  (0.2  g/l), MnSO 4 -H 2 O (0.05 g/l), ammonium sulfat (2.0 g/l),  Tween  80  (1ml/l)).  Komponen  nutrisi ditambahkan  ke  dalam  medium  MRS meliputi  sumber  karbon  (glukosa  dan
fruktosa),  sumber  nitrogen  (ammonium klorida, ammonium nitrat, ammonium sulfat dan  pepton)  dan  sumber  P  (K 2 HPO 4 danKH 2 PO 4 ).

## 1. Preparasi inokulum
Satu ose biakan miring diinokulasikan ke  dalam  20  mL  medium  MRS  cair,  pH  7 dalam  100  mL  erlenmeyer.  Inkubasi  pada suhu  kamar    selama  20  jam.  5  %  inokulum dipindahkan  ke  dalam  200  mL  médium eksperiment.  Inkubasi  pada  suhu  kamar (Sreekumar & Krishnan, 2010)

## 2. Prosedur pengukuran pertumbuhan
Prosedur  pengukuran  pertumbuhan  dan produksi biomassa
Pertumbuhan dan produksi  biomassa BAL  ditentukan  berdasarkan    kepadatan sel melalui pengukuran OD pada A 600 .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kepadatan  sel    bakteri  asam  laktat pada  perlakuan    penambahan  glukosa dan  fruktosa  pada  pengamatan  jam  ke  6 menunjukan  nilai  yang  lebih  rendah daripada  kepadatan  di  medium  MRS tanpa  penambahan  sumber  karbon. Respon peningkatan kepadatan sel cenderung  terjadi  setelah  12  jam  kultivasi. Isolat L-12 memberikan respon peningkatan kepadatan  sel  yang  lebih  baik  terhadap penambahan    glukosa  daripada  fruktosa. Sebaliknya isolate L-14 memberikan respon peningkatan  kepadatan  sel  yang  lebih baik pada penambahan fruktosa daripada glukosa.  Hasil  penelitian  penambahan glukosa  dan  fruktosa  ditunjukan  pada Gambar 1
Penambahan  ammonium  klorida pada pada awal kultivasi tidak memberikan pengaruh meningkatkan kepadatan  sel.  Pengaruh  meningkatkan kepadatan muncul mulai pengamatan jam ke  18.  Sebaliknya  penambahan  pepton memberikan pengaruh meningkatkan kepadatan  sel  yang  tinggi  pada  awal kultivasi  (pengamatan  jam  ke  6)  tetapi kemudian  cenderung  menurun  besarnya pengaruh  mulai  pengamatan  jam  ke  12. Secara grafis ditunjukan pada Gambar 2.
Gambar 1 .  Kepadatan sel (Optical density) pada kultur bakteri asam laktat :  a)  isolate  L12  ;  b)  isolate  L14 dalam  media  MRS  dengan penambahan glukosa dan fruktosa
Penambahan  KH2PO4  dan  K2HPO4 memberikan pengaruh meningkatkan kepadatan  sel  terjadi  hanya  pada  awal kultivasi yaitu pada pengamatan jam ke 6. Fenomena  ini  terjadi  pada  ke  tiga  isolate BAL  uji.Secara  grafis  ditunjukan  pada Gambar 3.
De  Man  Rogosa  and  Sharpe  (MRS) merupakan  media  standard  untuk  kultivasi bakteri  asam  laktat  (BAL)  (Han et  al. 2011) dan merupakan media  yang paling sesuai untuk  media  pertumbuhan  dan  produksi bakteriosin  (Arokiyamary  &  Sivakumaar, 2011  ;  Meng, et  al. 2012).  Pada  medium MRS  digunakan  glukosa  sebagai  sumber karbon  dengan  konsentrasi  20  g/L. Karbohidrat  merupakan  sumber  C  dan energy  utama  pertumbuhan  bakteri  asam laktat. Sehingga pertumbuhan dan aktivitas  metabosimenya  dipengaruhi  oleh sumber  C  tersedia.Jenis-jenis  bakteri  asam laktat memiliki perbedaan dalam kebutuhan gulanya.Oleh karena itu meskipun MRS merupakan media standard untuk  kultivasi  bakteri  asam  laktat  perlu untuk dilakukan modifikasi guna mendapatkan  formulasi  yang  optimum
untuk pertumbuhan dan aktivitas metabolism bakteri asam laktat.
Pada  penelitian  ini  penambahan glukosa  memberikan  efek  meningkatan kepadatan  sel.  Hal  ini  menunjukan  bahwa konsentrasi  glukosa  yang  ada  di  dalam medium  MRS  (20  g/L)    bukan  merupakan konsentrasi yang optimum untuk pertumbuhan  ke  3  isolat  uji  yang digunakan  untuk  penelitian  ini.    Hasil penelitian  yang  serupa  dilakukan  oleh Hujanen et al (2001) mendapatkan bahwa konsentrasi optimum glukosa untuk produksi asam  laktat  oleh  bakteri L.  casei NRRL  B41 adalah  160  g/L.  Penelitian  yang  lain dilakukan  oleh  Sheeladevi  &  Ramanatha (2011)  mendapatkan  konsentrasi  optimum glukosa  untuk  L  plantarum  dan L  casei sebesar 15 %.
Gambar 2. Kepadatan sel (Optical density) pada kultur bakteri asam laktat :  a)  isolate  L12  ;  b)  isolate  L14 dalam  media  MRS  dengan penambahan berbagai sumber nitrogen
Gambar 3. Kepadatan sel (Optical density) pada kultur bakteri asam laktat :  a)  isolate  L12  ;  b)  isolate  L14 dalam  media  MRS  dengan penambahan berbagai sumber phosphat
Menurut  hasil  penelitian  Polak  & Berecka (2010) glukosa merupakan sumber karbon yang paling baik dibandingkan monosakarida  dan  gula-gula  yang  lain dengan  urutan  dari  yang  terbaik  adalah sebagai berikut, glukosa, fruktosa, galaktosa,  lactulose,  saccharosa  dan maltose.
Seperti  halnya  dengan  sumber karbon,  pertumbuhan  bakteri  asam  laktat dan aktivitas metabolism  dipengaruhi oleh jenis  dan  konsentrasi  sumber  nitrogen. Sebagian besar penelitian terkait modifikasi medium  MRS  terkaait  dengan  penyediaan sumber N dilakukan dengan penambahan atau penggantian dengan sumber nitrogen  organic  seperti  pepton,  ekstrak khamir dan ekstrak daging serta kombinasi diantaranya.  Pada  penelitian  ini  seain menggunakan  sumber  nitrogen  organic yaitu  pepton  juga  dikaji  penggunaan
penambahan  sumber  nitrogen  anorganik seperti  ammonium  nitrat,  ammonium  sulfat dan  ammonium  klorida.  Hasil  penelitian menunjukan bahwa penambahan nitrogen anorganik  ammonium  klorida  memberikan efek meningkatkan kepadatan sel. Kejadian  ini  terjadi  pada  ke-3  isolat uji.Penelitian  penggunaan  garam  nitrogen untuk  kultur  bakteri  asam  laktat  juga dilakukan  oleh  Nancib et  al (2001)  yaitu menggunakan  ammonium  sulfat  yang dikombinasi dengan ekstrak khamir dengan  ratio  4:1.    Elena et  al (2006) menambahkan  garam  ammonium  ke dalam medium berbasis whey.
Fosfat  anorganik  secara  umum digunakan  sebagai  buffer  demikian  juga .di  dalam  medium  MRS  K2PO4  berperan sebagai  buffer.    Pada  penelitian  ini dilakukan  penambahan  sumber  P  dalam bentuk
KH2PO4 dan K2HPO4.Hasil penelitian
menunjukan terjadi efek meningkatkan  kepadatan  sel  pada  awal waktu  kultivasi.  Efek    yang  terjadi  pada penambahan  garam  fosfat  ini  terjadi melalui mekanisme buffering yaitu pengendalian    nilai  pH.  Menurut  Hayek& Ibrahim  (2013)  bakteri  asam  laktat menghasilkan  asam  terutama  asam  laktat selama pertumbuhannya, sehingga menyebabkan penurunan pH dan mengakibatkan  kecepatan  pertumbuhan menurun.  Berdasarkan  mekanisme  kerja buffer  maka  dimungkinkan  terjadinya  efek meningkatkan  kepadatan  sel  pada  awal kultivasi oleh penambahan K2HPO4. Produksi  asam  organic  oleh  bakteri  asam laktat  adalah  bergantung  pertumbuhan atau  kepadatan  sel.  Semakin  tinggi kepadatan sel semakin banyak asam yang dihasilkan  dan  dilepas  ke  lingkungan, sehingga  suatu  saat  dapat  melampaui kapasitas  buffering  medium  dan  terjadi penurunan  pH  yang  nyata,  akibatnya pertumbuhan menjadi melambat.

## KESIMPULAN
Medium MRS adalah medium standard untuk kultivasi bakteri asam laktat. Kondisi  optimum  formulasi  medium  dan faktor  lingkungan  untuk  pertumbuhan dapat  berbeda  dan  bersifat  spesifik  pada berbagai  jenis  bakteri  asam  laktat.

## a
Berdasarkan hasil penelitian ini menunjukan bahwa medium MRS dengan komposisinya belum  merupakan  medium  yang  optimum untuk  pertumbuhan  dan  produksi  sel  dari ke 3 isolat bakteri asam laktat yang diuji. Penambahan komponen nutrisi baik sebagai  suber  C,  N  dan  P    menghasilkan peningkatan
pertumbuhan
dan kepadatan sel.
Pada kondisi penelitian
ini penamabhan  glukosa  memberikan  efek lebih baik dibandingkan fruktosa, penambahan
ammonium
klorida memberikan efek yang lebih baik dibandingkan sumber nitrogen lain (pepton,  amoniumsulfat  dan  ammonium nitrat),  penambahan  mineral  fosfat  baik dalam  bentuk  KH2PO4  mauoun  K2HPO4 menyebabkan  peningkatan pertumbuhan dan kepadatan sel.

## DAFTAR PUSTAKA
Todorov S. D.,  L. M.  T. Dicks, 2005, Effect of
Growth
Medium on Bacteriocin Production by Lactobacillus plantarum ST194BZ,  a  Strain  Isolated  from  Boza, Food Technol. Biotechnol.43:165–173. Hayek, S.A., Salam A. Ibrahim, 2013, Current Limitations  and  Challenges  with  Lactic Acid  Bacteria:  A  Review, Food  and Nutrition Sciences ,  4: 73-87 Hujanen .M. S. Linko . Y.-Y. Linko ,  M. Leisola, 2001,  Optimisation  of  media  and cultivation  conditions  for  L(+)(S)-lactic acid production by Lactobacillus casei NRRL B-441  Appl Microbiol Biotechnol : 56:126–130
Meng, Q., Q. Cai, B.Shi, R. Fu, J. Li, X. Chen,
K. Qi  , M. Zhang, 2012,  Optimization of medium composition for production of lacticin  LLC518  by Lactococcus  lactis subsp. lactis LLC518  using  response surface methodology,  Journal of Food, Agriculture & Environment 10 : 137-142.
Messens.  W,  J.  Verluyten,  F.  Leroy,  L.  De Vuyst,  2003,    Modelling  growth  and bacteriocin production
by
Lactobacillus  curvatus LTH  1174  in response  to  temperature  and  pH values  used  for  European  sausage fermentation  processes.  Int  J  Food Microbiol. 81:41-52.
Nancib  N,  Nancib  A,  Boudjelal  A, Benslimane  C,  Blanchard  F,  Boudrant J., 2001, The effect of supplementation by  different  nitrogen  sources  on  the production  of  lactic  acid  from  date juice  by  Lactobacillus  casei  subsp. rhamnosus.  Bioresour  Technol.  78:149- 53.
Elena  Mondragón-Parada,  M.,  M.  Nájera- Martínez, C. Juárez-Ramírez, J.
Galíndez-Mayer,  N.  Ruiz-Ordaz,  E. Cristiani-Urbina,  2006,  Lactic  acid bacteria production from whey,
Applied Biochemistry
and
Biotechnology ,  134: 223-232
Pal  .  A.,    Ramana  K.  V.  .  Bawa  A.  S.,  2010,
Simplifi  cation  and  optimization  of deMan  Rogosa  Sharpe(MRS)  medium for enhanced
production
of bacteriocin by Weissella paramesenteroides DFR-8,  J  Food  Sci Technol : 47:258–265.
Leroy,  F.,  L.  de  Vuyst,  2001,  Growth  of  the Bacteriocin-Producing Lactobacillus sakei Strain  CTC  494  in  MRS  Broth  Is Strongly  Reduced  Due  to  Nutrient Exhaustion: a Nutrient Depletion Model for the Growth of Lactic Acid Bacteria,
Applied and Environmental Microbiology,67:4407-4413
Park, Y.L., N.K. Lee, K. K.  Park, Y. Park, J. M. Kim, H. M. Nam, S. J. Jung, H. D.  Paik,
2010, Medium Optimization for Pediocin SA131 Production
by
Pediococcus
pentosaceus SA131 against  Bovine  Mastitis  Using  Response Surface Methodology , Korean J. Food Sci. Ani. Resour. 30 : 66~72.
Sheeladevi, A. N.Ramanathan, 2011, Lactic Acid  Production  Using  Lactic  Acid Bacteria  under  Optimized  Conditions,
International Journal of
Pharmaceutical  &  Biological  Archives 6:1686-1691
Van  den  Berghe  E.,  G.  Skourtas,  E. Tsakalidouand  L.  De  Vuyst  2006, Streptococcus  macedonicus ACA-DC 198 produces the lantibiotic, macedocin,  at  temperature  and  pH conditions  that  prevail  during  cheese manufacture. Int.  J.  Food  Microbiol. 107, 138-47
Wee, Y.J, J.M. Kim, J.S. Yun, H.W.  Ryu , 2005, Optimum  conditions  for  the  biological production  of  lactic  acid  by  a  newly
isolated lactic acid bacterium, Lactobacillus sp. RKY2, Biotechnology and Bioprocess Engineering :23-28 Zhang J, Y. Zhang, S.N.Liu, Y. Han , Z.J.Zhou , 2012, Modelling growth and bacteriocin production by Pediococcus  acidilactici PA003  as  a function of temperature and pH value, Appl  Biochem  Biotechnol.166  :1388- 400.