Optimasi  Kondisi  Fermentasi  pada  Produksi  Metabolit  Antibakteri  dari  Bacillus  tequilensis  BSMF  Simbiotik Halichondria panicea
Optimization  of  Fermentation  Condition  on  Antibacterial  Production  from  Bacillus  tequilensis  BSMF  Symbiotic Halichondria panicea
Nindya Pramesti Wardani 1 , Achmad Toto Poernomo 2 *, Isnaeni 2
1 Program Studi Pendidikan Apoteker, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
2 Departemen Ilmu Kefarmasian, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
*Corresponding author: achmad-t-p@ff.unair.ac.id
Submitted: 6 Februari 2021 Accepted: 25 Mei 2021 Published: 29 Agustus 2021

## Abstract
Background:  Exploration  of  antibacterial  substances  from  new  sources  such  as  plants,  animals,  and microorganisms, both living and symbiotic, is an alternative solution to overcome potential antibacterial needs. Microorganisms  in  bacteria  are  targeted  as  a  sustainable  source  of  antibacterial  substances  because  of  their ability to  propagate easily. Bacteria  living  in  symbiosis are known to  produce antibacterial metabolites with a wider spectrum than  whole-cell bacteria. They can symbiosis with various living  things including  multicellular organisms such as sponges. The isolate of Bacillus tequilensis BSMF symbiotic with Halichondria panicea from Cabbiya Madura Coast has been reported to produce antibacterial metabolites. Objective: To determinate the  pH and temperature on antibacterial metabolite production from Bacillus tequilensis BSMF symbiotic Halichondria panicea using Potato Dextrose Agar (PDA) media. Methods: The production of the antibacterial metabolites was carried out by solid fermentation method on PDA media with adjusted pH (5 - 8) and temperature (28, 32, 37 o C) using Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Eschericia coli ATCC 25922  as test  bacteria. The antibacterial activity was determined by measuring the inhibition zone diameter. Results: The optimal pH media and incubation temperature  Bacillus  tequilensis  BSMF  antibacterial  activity  against  Staphylococcus  aureus  ATCC  25923  and Eschericia  coli  ATCC  25922  were  8  ±  0.5  and  32  ±  1 o C  respectively.  The  average  antibacterial  activity  index against  the  test  bacteria  were  2.74  ±  0.07  and  3.39  ±  0.07  respectively.  Conclusion:  The  production  of antibacterial metabolites from Bacillus tequilensis BSMF could be performed optimally at pH 8 ± 0.5 and 32 ± 1 o C.
Keywords: antibacterial metabolites, Bacillus tequilensis BSMF, Halichondria panicea, pH, temperature

## Abstrak
Pendahuluan : Resistensi antibakteri merupakan masalah kesehatan global yang dialami hampir di seluruh negara. Eksplorasi  antibakteri  dari  sumber  baru  seperti  tumbuhan,  hewan,  dan  mikroorganisme  baik  yang  hidup  bebas maupun  bersimbiosis  menjadi  solusi  alternatif  untuk  mengatasi  resistensi  antibakteri.  Mikroorganisme  berupa bakteri ditargetkan sebagai sumber antibakteri yang berkelanjutan karena jumlahnya melimpah dan mudah dalam proses  pembiakan.  Bakteri  yang  hidup  bersimbiosis  diketahui  dapat  memproduksi  metabolit  antibakteri berspektrum  lebih  luas  dibandingkan  bakteri  yang  hidup  bebas.  Bakteri  dapat  bersimbiosis  dengan  berbagai makhluk hidup termasuk organisme multiseluler seperti spons. Isolat Bacillus tequilensis BSMF yang bersimbiosis dengan Halichondria  panicea dari  Perairan  Cabbiya  Madura menunjukkan  adanya  produksi  metabolit  yang memiliki aktivitas antibakteri. Tujuan : Menentukan pH dan suhu optimum untuk produksi metabolit antibakteri dari Bacillus  tequilensis BSMF  simbiotik Halichondria  panicea.  Metode :  Produksi  metabolit  antibakteri dilakukan  dengan  metode  fermentasi  padat  pada media Potato  Dextrose  Agar (PDA)  yang  telah  diatur  pH  dan suhu inkubasinya, sedangkan uji aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Eschericia
coli ATCC 25922 dilakukan menggunakan metode difusi agar. Penentuan aktivitas antibakteri dilakukan melalui pengukuran diameter zona hambat. Hasil :  pH media yang menunjukkan aktivitas antibakteri  optimum Bacillus tequilensis BSMF terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Eschericia coli ATCC 25922 adalah 8 ± 0,5 pada suhu inkubasi 32 ± 1 o C dengan rata- rata indeks aktivitas antibakteri berturut- turut 2,74 ± 0,07 dan 3,39 ± 0,07. Kesimpulan : pH dan suhu optimum yang diperoleh adalah pH 8 ± 0,5 dan suhu 32 ± 1 o C.
Kata kunci : Bacillus tequilensis BSMF, Halichondria panicea, metabolit antibakteri, pH, suhu

## PENDAHULUAN
Peningkatan bakteri patogen yang resisten terhadap antibakteri  saat  ini  menyebabkan  meningkatnya  pula kebutuhan akan antibakteri  baru. Bakteri  yang resisten akan  tahan  terhadap  efek  bakterisidal  maupun bakteristatik dari sediaan antibakteri sehingga efektivitasnya menurun (Hasan & Al-harmoosh, 2020). Eksplorasi sumber antibakteri baru dari mikroorganisme dapat  menjadi  jawaban  dari  persoalan  tersebut. Eksplorasi  terhadap  biota  yang  ada  di  darat  masih menjadi  pilihan  dibandingkan  biota  laut  yang  saat  ini sedang  dalam  perkembangan  (Cuadrat  dkk . ,  2020). Potensi metabolit antibakteri dari laut perlu dikembangkan karena wilayah Indonesia 2/3 bagiannya adalah  lautan  salah  satunya  Perairan  Madura.  Perairan Madura  dipilih  sebagai  daerah  penelitian  sebab memiliki kualitas perairan yang baik dan biota laut yang beragam diantaranya udang, ikan, dan spons (Browijoyo & Syifania, 2019).
Spons  merupakan  invertebrata  dengan  kerangka skeleton  dan  lapisan  lunak  seperti  jeli.  Kerangka skeleton ini tersusun dari silikat, kalsium karbonat, dan protein  sedangkan  lapisan  lunak  merupakan  asam lemak, kolagen sebagai nutrisi bagi makhluk hidup lain (Rajendran,  2019).  Oleh  karena  itu,  mikroorganisme contohnya  bakteri  dapat  bersimbiosis  dengan  spons. Bakteri  yang  hidup  bersimbiosis  diketahui  dapat memproduksi  metabolit  antibakteri  berspektrum  lebih luas  dibandingkan  bakteri  yang  hidup  bebas  sehingga bakteri  ditargetkan  sebagai  sumber  antibakteri.  Selain itu,  bakteri  tergolong  dalam  sumber  antibakteri  yang berkelanjutan  karena  jumlahnya  melimpah  dan  mudah dalam proses pembiakan.
Penelitian  sebelumnya  (Damar,  2019)  berhasil mengisolasi Bacillus tequilensis BSMF yang bersimbiosis  dengan Halichondria  panicea dari Perairan  Cabbiya  Madura  sehingga  pada  penelitian  ini akan  diuji  apaka  isolat  tersebut memiliki  aktivitas antibakteri  terhadap Staphylococcus  aureus ATCC 25923 dan Eschericia coli ATCC 25922. Penelitian ini tergolong baru karena B. tequilensis BSMF diisolasi dari hasil  simbiosis  dengan  spons  perairan  Madura.
Penelitian terkait uji aktivitas antibakteri B. tequilensis telah  dilaporkan  untuk  isolat  dari  tanah  dan  air, sedangkan  isolat  dari  spons  di  Indonesia  belum dilaporkan.  Kiran  dkk.  (2018)  menguji  aktivitas antimikroba pirolo[1,2-a] pirazin-1,4-dion yang diisolasi  dari B.  tequilensis MSI45  asal  laut  India. Protease  alkali  dari B.  tequilensis ZMS-2  asal  tanah Pakistan sebagai sumber antibakteri terhadap Staphylococcus aureus telah dilaporkan oleh (Khan dkk. 2019).  Perbedaan  karakteristik  habitat  tersebut  akan mempengaruhi antibakteri yang dihasilkan.
Senyawa  metabolit  dengan  aktivitas  antibakteri dihasilkan  oleh  bakteri  melalui  proses  fermentasi. Pembentukan  metabolit  antibakteri  dalam  prosesnya dipengaruhi  oleh  stabilitas  enzim Non  Ribosomal Peptide  Synthetase (NRPS)  dan Polyketide  Synthase (PKS) sebagai biokatalisator yang menjembatani proses fermentasi.  Faktor  fisikokimia  lingkungan  yang  dapat mempengaruhi  kinerja  enzim  dalam  bakteri  juga  akan mempengaruhi  proses  fermentasi  untuk  menghasilkan metabolit antibakteri (Lorío et al. , 2019). Faktor tersebut diantaranya  pH  media,  suhu  inkubasi,  ketersediaan oksigen,  dan  waktu  inkubasi.  Melakukan  optimasi  pH media  dan  suhu  inkubasi  proses  produksi  menjadi penting untuk mendapatkan metabolit antibakteri secara optimum.
Pada  penelitian  ini,  kondisi  produksi  metabolit antibakteri  menggunakan  media Potato  Dextrose Agar (PDA).  Derajat  keasaman  media  PDA  diatur  ke  arah basa  agar  dapat  digunakan  untuk  pertumbuhan  bakteri (Yoghiapiscessa dkk., 2016). Media PDA dengan pH 5, 6, 7, 8 dan diinkubasi pada suhu 28 o C, 32 o C, dan 37 o C selama  72  jam  sesuai  hasil  orientasi  pada  skala laboratorium  yang  menunjukkan  pertumbuhan B. tequilensis BSMF optimum pada rentang tersebut.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Isolat Bacillus  tequilensis BSMF simbiosis Halichondria  panicea ini  telah  dilakukan  dan diidentifikasi  oleh  Damar  (2019).  Bakteri  tersebut diisolasi  dari  Perairan  Desa  Cabbiya,  Kecamatan
Talango, Kabupaten Sumenep, Madura pada koordinat 7 o 06’03.9”  LS,  113 o 58’33.6”  BT,  media Potato Dextrose  Agar digunakan  sebagai  media  pertumbuhan dan media kultur persediaan, larutan NaCl p.a 0,9% (E. Merck), dapar fosfat KH 2 PO 4 dan K 2 HPO 4 p.a (pH 5 - 8),  media Nutrient  Agar (Merck)  untuk  uji  aktivitas antibakteri,  bakteri  uji Escherichia  coli ATCC  25922 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 diperoleh dari Unit  Layanan  Pengujian  (ULP)  Fakultas  Farmasi Universitas Airlangga.
Alat
Autoclave (HL-340 series  vertical  type  stream sterilizer) ,  inkubator  ( Memmet IN110®), vortex (II IKA®  Genius  3),  spektrofotometer  UV-Vis  (Lambda EZ201  Perkin  Elmer),  pH  meter  ( Handylab pH  11 Schott®),  jangka  sorong  ( Sketmat  Vernier  Caliper Triangle  6  Brand ),  dan  timbangan  digital  ( Sartorius Type BP 22IS®).
Metode

## Peremajaan isolat Bacillus tequilensis BSMF
Langkah  awal  dalam  peremajaan  bakteri  adalah dengan cara satu Öse isolat B. tequilensis BSMF diambil dari  tabung  reaksi  dan  digoreskan  pada  media  PDA miring  ( slant  agar )  10  mL.  Media  PDA  dibuat  dari larutan  infusa  100  g  kentang,  10  g  agarosa,  dan  9  g dekstrosa dalam 500 mL air suling. Selanjutnya, media PDA miring diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam (Atlas, 2010). Pertumbuhan koloni B. tequilensis BSMF yang terbentuk diamati . Produksi biomassa Bacillus tequilensis BSM-F
Biomassa  dibuat  dari  kultur B.  tequilensis BSMF ditambahkan  dengan  larutan  NaCl  0,9%  kemudian dicampur  dengan  bantuan  vortex  hingga  terbentuk suspensi. Sebanyak 100 μL suspensi isolat B. tequilensis BSMF (transmitan  25%  pada  panjang  gelombang 580  nm)  diambil  menggunakan  mikropipet.  Jumlah bakteri  yang  hidup  dihitung  secara  ALT  (Angka Lempeng  Total)  minimal  sejumlah  10 6 cfu/  ml  dan dicampurkan pada 20 mL media PDA yang telah diatur menggunakan dapar fosfat 0,05 M menjadi pH 5, 6, 7, dan 8.
Pengukuran pH dilakukan menggunakan pH meter dengan replikasi  3 kali. Campuran media dan suspensi isolat B.  tequilensis BSM-F divortex  dan  diinkubasi pada suhu 28 o C, 32 o C, dan 37 o C selama 72 jam. Maka akan  diperoleh  biomassa  sel  yang  akan  menghasilkan metabolit.  Metode  produksi  ini  merupakan  fermentasi padat  ( solid  state  fermentation )  modifikasi  dari  El- Naggar dkk. (2009) menggunakan plate agar. Pada jam ke-72  dilakukan sampling untuk  menguji  aktivitas antibakteri.

## Pengujian aktivitas antibakteri
Pada  pengujian  aktivitas  antibakteri  diperlukan media uji yang terdiri dari 2 lapis media Nutrient Agar yaitu 12 mL sebagai  lapisan dasar atau base layer dan 8  mL seed  layer .  Lapisan  atas  yaitu  8  mL seed  layer dibuat  dari  3  μL  suspensi  bakteri  uji  yaitu Staphylococcus  aureus ATCC  25923 dan Escherichia coli ATCC 25922 BSM-F diukur persen transmitannya mencapai  25%  transmitan  pada  panjang  gelombang 580  nm  dengan  spektrofotometer  visibel.  Penggunaan transmitan 25% sesuai dipersyaratkan dalam Farmakope Indonesia  VI  yakni  dikarenakan  pada  transmitan tersebut jumlah bakteri sekitar 10 7 - 10 9 cfu/mL sehingga apabila  bakteri  nantinya  ditumbuhkan  pada  media, bakteri dapat mencapai fase logaritma dan dapat diamati (Kemenkes  RI,  2020).  Selanjutnya  100  μL  suspensi bakteri  diambil  dengan  pipet  ke  dalam  8  mL Nutrient Agar hangat  dan  dicampur  dengan  bantuan  vortex kemudian,  dituangkan  diatas base  layer hingga memadat.
Uji  aktivitas  antibakteri  dilakukan  dengan  metode difusi  agar  modifikasi  (El-Naggar  dkk.,  2009). Pengujian  dilakukan  dengan  cara  menyiapkan  media fermentasi yang telah ditumbuhi biomassa B. tequilensis BSMF,  kemudian  dicongkel  menggunakan  silinder pencetak  berdiameter  7,50  mm  dan  diletakkan  di  atas permukaan  media  yang  sudah  diinokulasi  dengan bakteri  uji.  Selanjutnya,  diinkubasi  pada  suhu  37 o C selama  72  jam  dan  diamati  setiap  24  jam. Zona  jernih yang tampak di sekitar agar yang mengandung koloni B. tequilensis BSMF diukur menggunakan jangka sorong. Penentuan  aktivitas  antibakteri  dinyatakan  dalam zona  hambat  dan  indeks  aktivitas  antibakteri.  Zona hambat  adalah  daerah  jernih  disekitar  koloni B. tequilensis BSMF  akibat  terhambatnya  pertumbuhan bakteri  uji  oleh  aktivitas  antibakteri  yang  dihasilkan. Sedangkan  indeks  aktivitas  antibakteri  adalah  nilai perbandingan  antara  diameter  zona  hambat  dengan diameter koloni (Surjowardojo dkk. 2016).
Indeks aktivitas = diameter zona hambat (mm) diameter koloni (mm)

## Analisis uji statistik
Penelitian ini menggunakan variabel  bebas berupa pH media PDA dan suhu produksi metabolit antibakteri. pH diatur menggunakan dapar fosfat 0,05 M menjadi pH 5, 6, 7, dan 8. Suhu inkubasi dilakukan pada 28 o C, 32 o C, dan  37 o C.  Setelah  72  jam  diuji  aktivitas  antibakteri terhadap bakteri patogen Staphylococcus aureus ATCC 25923  dan Escherichia  coli ATCC  25922.  Hasil
pengujian  berupa  indeks  aktivitas  antibakteri  sebagai variabel  tergantung  yang  diperoleh  akan  diolah berdasarkan uji statistik melalui aplikasi IBM Statistical Package  for  the  Social  Sciens (SPSS)  versi  24  dengan metode Two-way ANOVA ( Analysis of Variance ) agar diketahui  adanya  perbedaan  pH  media  dan  suhu inkubasi  pada  proses  produksi  metabolit  antibakteri yang optimum.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  penelitian  ini,  digunakan  PDA  yang mengandung  sumber  karbon  berupa  dekstrosa  dan sumber  nitrogen  dalam  infusa  kentang  sebagai  media produksi  metabolit  antibakteri.  Karbon  merupakan sumber energi bagi bakteri untuk melakukan biosintesis metabolit,  sedangkan  nitrogen  merupakan  unsur penyusun asam amino pada biokatalisator pembentukan metabolit  antibakteri  seperti  enzim  NRPS  dan  PKS.
Metabolit  yang  dihasilkan  isolat B.  tequilensis BSMF simbiotik Halichondria panicea diuji aktivitas antibakterinya  terhadap Staphylococcus  aureus ATCC 25923 sebagai bakteri gram positif dan Eschericia coli ATCC  25922  sebagai  bakteri  gram  negatif  sehingga diperoleh  antibakteri  yang  efektif menghambat  bakteri gram positif maupun gram negatif.
Hasil  pengujian  aktivitas  antibakteri  terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923
Aktivitas  antibakteri  dari B.  tequilensis BSMF terhadap Staphylococcus  aureus ATCC  25923  diamati tiap 24 jam dalam kurun waktu 7 hari. Hasil pengujian aktivitas antibakteri dikatakan positif apabila terbentuk daerah  jernih  di  sekitar  koloni B.  tequilensis BSMF (Gambar  1).  Hal  tersebut  menunjukkan  pertumbuhan bakteri  uji  terhambat  sehingga  disebut  zona  hambat. Zona hambat kemudian dihitung diameternya menggunakan jangka sorong dengan ketelitian 0,05 mm.
Gambar 1. Hasil pengamatan uji aktivitas antibakteri Bacillus tequilensis BSMF terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 pada media PDA pH 5 ± 0,5; 6 ± 0,5; 7 ± 0,5; dan 8 ± 0,5 suhu inkubasi 28 ± 1 o C (A), 32 ± 1 o C (B), dan
37 ± 1 o C(C)
Pengamatan terhadap zona hambat sebagai indikasi aktivitas antibakteri dilakukan pada pH media 5 - 8 dan suhu inkubasi 28 ± 1 0 C, 32 ± 1 o C, dan 37 ± 1 o C. Suhu inkubasi  tersebut  menyesuaikan  rentang  suhu  tumbuh bagi  bakteri  mesofil  yaitu  25  -  50 o C  karena B. tequilensis BSMF termasuk bakteri mesofil.  Pemilihan suhu  merupakan  salah  satu  parameter  yang  akan mempengaruhi  kinerja  enzim  PKS  dan  NRPS  untuk melakukan sintesis metabolit sekunder dengan aktivitas antibakteri  (Moreira  dkk . ,  2020).  Suhu  terlalu  tinggi dapat  mengakibatkan  denaturasi  sedangkan  suhu  yang terlampau rendah akan menginaktivasi enzim.
Pada  saat  suhu  inkubasi  28  ±  1 o C,  zona  hambat mulai terbentuk di sekitar koloni setelah 3 hari (72 jam), sedangkan ketika suhu 32±1 o C dan 37±1 o C zona hambat terbentuk setelah 2 hari (48 jam). Ukuran diameter zona hambat  terus  meningkat  selama  6  hari  (144  jam)  dan mulai  menurun  setelah  7  hari  (168  jam)  (Gambar  2). Berdasarkan  hasil  pengukuran  diameter  zona  hambat tersebut,  dapat  diketahui  aktivitas  antibakteri  isolat B. tequilensis BSMF  pada  suhu  inkubasi  28  ±  1 o C,  32  ± 1 o C,  dan  37  ±  1 o C  mencapai  maksimal  setelah  6  hari (144 jam).
Gambar 2. Profil aktivitas antibakteri Bacillus tequilensis BSMF terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 (A = suhu 28 ± 1 o C; B = suhu 32 ± 1 o C; C = suhu 37 ± 1 o C)
Gambar 3. Hasil pengamatan uji aktivitas antibakteri Bacillus tequilensis BSMF terhadap Eschericia coli ATCC 25922 pada media PDA pH 5 ± 0,5; 6 ± 0,5; 7 ± 0,5; dan 8 ± 0,5 suhu inkubasi 28 ± 1 o C (A), 32 ± 1 o C (B), dan 37 ± 1 o C (C)
Data  hasil  pengukuran  diameter  zona  hambat maksimum yaitu setelah 6 hari (144 jam) dipergunakan untuk  memperoleh  nilai  indeks  aktivitas  antibakteri isolat B.  tequilensis BSMF  terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923. Nilai indeks aktivitas antibakteri diperoleh  melalui  pembagian  antara  diameter  zona hambat dengan diameter koloni isolat (7,50 mm).
Berdasarkan  hasil  perhitungan  indeks  aktivitas antibakteri,  saat  suhu  inkubasi  28  ±  1 o C aktivitas
antibakteri  tertinggi  dari  isolat B.  tequilensis BSMF terhadap Staphylococcus  aureus ATCC  25923  terjadi pada pH 7 ± 0,5 sedangkan saat suhu 32 ± 1 o C dan 37 ± 1 o C tertinggi  pada  pH  8 (Tabel  1)  namun  belum dapat ditentukan  pH  dan  suhu  yang  optimum  sehingga selanjutnya  dilakukan  analisis  melalui  pengujian statistik.
Tabel 1 . Indeks aktivitas antibakteri isolat Bacillus tequilensis BSMF terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 di hari ke-6 pH media PDA Indeks Aktivitas Antibakteri Suhu 28 ± 1 o C Suhu 32 ± 1 o C Suhu 37 ± 1 o C pH 5 ± 0,5 1,95 ± 0,08 2,08 ± 0,07 1,58 ± 0,05 pH 6 ± 0,5 1,66 ± 0,06 1,89 ± 0,02 1,64 ± 0,03 pH 7 ± 0,5 2,76 ± 0,05 2,20 ± 0,12 1,52 ± 0,07 pH 8 ± 0,5 2,49 ± 0,06 2,74 ± 0,07 1,86 ± 0,07
Hasil uji Two-way ANOVA memberikan nilai F = 39,348 > F tabel (3,28) dan nilai signifikan = 0,000 < α =  0,05  menunjukkan  ada  perbedaan  indeks  aktivitas antibakteri  antara  kelompok  pH  media  dan  suhu
inkubasi. pH dan suhu yang memiliki pengaruh terbesar pada aktivitas antibakteri B. tequilensis BSMF terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 diuji melalui Post
A
B C
Hoc  Multiple  Comparisons diperoleh mean  difference terbesar pada pH 8,0 dan suhu 32 ± 1 o C.
Hasil  pengujian  aktivitas  antibakteri  terhadap Eschericia coli ATCC 25922
Pengamatan aktivitas antibakteri isolat B. tequilensis BSMF  terhadap Eschericia  coli ATCC 25922 dilakukan setiap 24 jam selama 7 hari. Aktivitas antibakteri  berupa  ukuran  diameter  zona  hambat dibandingkan  pada  berbagai  kondisi  pengaturan  suhu inkubasi (28 ± 1 o C, 32 ± 1 o C, 37 ± 1 o C) dan pH media (5,6,7,8)  seperti  pada  Gambar  3.  Rentang  pH  media yang  digunakan  disesuaikan  pH  produksi  metabolit antibakteri  dari Bacillus sp.  seperti  penelitian  yang dilakukan  Afriyanto  dkk.  (2019) yaitu  pada  pH  5  –  9. Kondisi  pH  yang  terlampau  asam  atau  basa  dapat menghambat metabolisme sel bakteri melalui mekanisme  kesetimbangan  gradien  konsentrasi  [H + ]
pada  transpor  membran.  Hal  ini  akan  berpengaruh terhadap  pertumbuhan  dan  pembentukan  metabolit antibakteri.
Pada ketiga suhu inkubasi yaitu 28 ± 1 o C, 32 ± 1 o C, dan  37  ±  1 o C  zona  hambat  terbentuk  setelah  2  hari (48  jam).  Ukuran  dari  diameter  zona  hambat  semakin meningkat sampai hari ke-6 (144 jam). Ukuran diameter zona hambat yang meningkat maka aktivitas antibakteri juga  semakin  meningkat.  Setelah  7  hari  (168  jam), terjadi penurunan diameter zona hambat seperti tampak pada  Gambar  4.  Penurunan  dapat  berlangsung  sebab pertumbuhan B.  tequilensis BSMF  telah  memasuki death  phase yakni  fase  ketika  bakteri  yang  hidup jumlahnya lebih sedikit dibandingkan bakteri yang mati, akibatnya  metabolit  antibakteri  yang  diproduksi menurun  sehingga  mengakibatkan  diameter  zona hambat menurun pula.
Gambar 4. Profil aktivitas antibakteri Bacillus tequilensis BSMF terhadap Eschericia coli ATCC 25922 (A = suhu 28 ± 1 o C; B = suhu 32 ± 1 o C; C = suhu 37 ± 1 o C)
Berdasarkan  data  yang  diperoleh,  dapat  diketahui antibakteri  dari B.  tequilensis BSMF  memiliki  daya hambat  kuat  terhadap Eschericia  coli ATCC  25922 dengan rata- rata diameter zona hambat 12,12 ± 0,30 - 25,38  ±  0,56  mm  sebab  Surjowardojo  dkk.  (2016) menyatakan  diameter  zona  hambat  11  –  20  mm merupakan  salah  satu  parameter  daya  hambat  yang poten.  Data  pada  hari  ke-6  (144  jam)  diolah  untuk memperoleh  nilai  indeks  aktivitas  antibakteri  isolat B. tequilensis BSMF  terhadap Eschericia  coli ATCC 25922.  Nilai  indeks  aktivitas  antibakteri  diperoleh
melalui pembagian antara diameter zona hambat dengan diameter koloni isolat (7,50 mm).
Hasil  perhitungan  indeks  aktivitas  antibakteri tampak  pada  Tabel  2.    Nilai  indeks  berbanding  lurus dengan  zona  hambat  sehingga  semakin  tinggi  indeks maka  semakin  besar  zona  hambat  sehingga  potensi aktivitas antibakteri semakin tinggi. Aktivitas antibakteri  tertinggi  dari  isolat B.  tequilensis BSMF terhadap Eschericia coli ATCC 25922 terjadi pada pH media 8±0,5 dengan suhu inkubasi 32±1 0 C. Penentuan pH dan suhu yang optimum dilakukan melalui analisis uji statistik.
Tabel 2. Indeks aktivitas antibakteri isolat Bacillus tequilensis BSMF terhadap Eschericia coli ATCC 25922 di hari ke-6 pH media PDA Indeks Aktivitas Antibakteri Suhu 28 ± 1 o C
Suhu 32 ± 1 o C Suhu 37 ± 1 o C pH 5 ± 0,5 2,00 ± 0,03 3,34 ± 0,09 2,23 ± 0,03 pH 6 ± 0,5 1,62 ± 0,03 3,06 ± 0,02 2,99 ± 0,03 pH 7 ± 0,5 2,17 ± 0,05 3,04 ± 0,06 2,02 ± 0,04 pH 8 ± 0,5 2,43 ± 0,07 3,39 ± 0,07 3,36 ± 0,05
Hasil uji Two-way ANOVA memberikan nilai F = 142,244 > F tabel (3,28) dan nilai signifikan = 0,000 < α  =  0,05  menunjukkan  ada  perbedaan  indeks  aktivitas antibakteri  antara  kelompok  pH  media  dan  suhu inkubasi. pH dan suhu yang memiliki pengaruh terbesar pada aktivitas antibakteri B. tequilensis BSMF terhadap Eschericia  coli ATCC  25922diuji  melalui Post  Hoc Multiple  Comparisons diperoleh mean  difference terbesar  pada pH  8,0  dan  suhu  32  ±  1 o C.  Sehingga berdasarkan hasil analisa statistik menunjukkan terdapat pengaruh  antara  pH  dan  suhu  terhadap  aktivitas antibakteri  isolat B.  tequilensis BSMF  terhadap Eschericia coli ATCC 25922.

## KESIMPULAN
Sesuai hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan  bahwa B.  tequilensis BSMF simbiotik Halichondria  panicea asal  Perairan  Desa  Cabbiya Madura  dapat  memproduksi  metabolit  yang  memiliki aktivitas  antibakteri.  Kondisi  pH  media  dan  suhu inkubasi  optimum  dalam  proses  produksi  metabolit antibakteri isolat B. tequilensis BSMF pada media PDA yaitu  pada  pH  8  ±  0,5  serta  suhu  32  ±  1 o C.  Penelitian selanjutnya  dapat  dilakukan  purifikasi  dan  identifikasi senyawa  aktif  metabolit  antibakteri  yang  dihasilkan B. tequilensis BSMF.

## DAFTAR PUSTAKA
Afriyanto,  R.,  Radjasa,  S.  K.  &  Crews,  P.  (2019).
Exploration  Culturable  Bacterial  Symbionts  of Sponges from Ternate  Islands Indonesia. Biodiversitas ; 20 ; 776–782.
Atlas, R. (2010). Handbook of Microbiological Media,
Fourth Edition. Washington D.C: CRC Press. Browijoyo, M. & Syifania, S. (2019). Water Quality in
The North Madura : Is It Suitable For Vannamei
Shrimp Farming or Not?. Aquasains ; 8 ; 753–758.
Cuadrat,  R.  R.  C.,  Sorokina,  M.A.,  Andrade,  M.R.D.,
Bruno  G.  &  Goris,  T.  (2020).  Global  Ocean Resistome  Revealed :  Exploring  Antibiotic
Resistance  Gene  Abundance  and  Distribution  in TARA Oceans Samples. Giga Science Oxford ; 9 ;
1–12.
Damar,  G.  (2019).  Penapisan  dan  Identifikasi  Bakteri
Laut Penghasil Antibakteri Simbiotik Halichondria  panicea dari  Pantai  Cabbiya Madura dengan Analisis Gen 16S rRNA. Skripsi ; Fakultas Farmasi Universitas Airlangga,
Surabaya.
El-Naggar, M. Y., El-Assar, S. A. & Abdul-Gawad, S.
M.  (2009).  Solid-state  Fermentation  for  the Production  of  Meroparamycin  by Streptomyces sp.  strain  MAR01. Journal  of  Microbiology  and Biotechnology ; 19 ; 468–473.
Hasan, T. H. & Al-harmoosh, R. A. (2020). Mechanisms of  Antibiotics  Resistance  in  Bacteria. Systematic Review Pharmacy ; 11 ;  817–823.
Kemenkes RI (2020). Farmakope Indonesia VI. Jakarta:
Kementerian Kesehatan RI.
Khan, Z., Shafique, M. & Nawaz, H. R. (2019). Bac i llus tequilensis ZMS-2:  A  Novel  Source  of  Alkaline Protease  with  Antimicrobial,  Anti-coagulant, Fibrinolytic  and  Dehairing  Potentials. Pakistan Journal  of  Pharmaceutical  Science ; 32 ;  1913- 1918.
Kiran, G. S., Priyadharsini, S. & Sajayan, A. (2018). An Antibiotic Agent Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4- dione,  Hexahydro  Isolated  from  A  Marine Bacteria Bacillus  tequilensis MSI45  Effectively Controls  Multi-drug  Resistant Staphylococcus aureu s. Royal  Society of Chemistry Advances ; 8 ; 17837–17846.
Lorío, L. U., Alió, C. P., Brenes-guillén, L. A. & Walter, H. M. (2019). The Influence of Temperature and pH  on  Bacterial  Community  Composition  of Microbial Mats in  Hot Springs from  Costa Rica. Microbiology Open ; 8 ; 1–26.
Moreira, S. M., Mendes, T. A., Oliveira S., Mateus, F. H., Sharon, A. C., Christopher J. & Mantovani, H. C.  (2020).  Genomic  and  Gene  Expression Evidence of Nonribosomal Peptide and Polyketide Production Among Ruminal Bacteria: A  Potential  Role  in  Niche  Colonization?. FEMS Microbiology Ecology ; 96 ; 107–120.
Rajendran, S. (2019). Marine Sponges: Repositories of
Bioactive Compounds with Medicinal.
International  Journal  of  Chemical  Technology Research ; 12 ; 26–48.
Surjowardojo,  P.,  Susilorini,  T.  E.  &  Benarivo,  V. (2016). Daya Hambat Dekok Kulit Apel Manalagi ( Malus  sylvestris Mill )  terhadap  Pertumbuhan Escherichia  coli dan Streptococcus  agalactiae Penyebab Mastitis pada Sapi Perah. Jurnal Ternak Tropika ; 17 ;  11–21.
Yoghiapiscessa,  D.,  Batubara,  I.  &  Wahyudi,  A.  T. (2016). Antimicrobial and Antioxidant Activities of  Bacterial  Extracts  from  Marine  Bacteria Associated  with  Sponge  Stylotella  sp. American Journal  of  Biochemistry  and  Biotechnology; 12 ; 36–46.