Pemurnian Ekstraseluler Hyaluronidase Streptococcus agalactiae (Streptokokus Grup B ) (Extracellular Hyaluronidase Purification of Streptococcus agalactiae (Group B of Streptococus)
Wendry Setiyadi Putranto 1) , Sri Budiarti 2) , Maggy T Suhartono 3) , I Wayan T Wibawan 4) , Zainatul Hayati 5)
1) Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran
1) Jurusan Biologi Fakultas MIPA Institut Pertanian Bogor
2) Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor
3) Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor
5) Fakultas Kedokteran Universitas Syah Kuala

## Abstrak
Hyaluronidase  (EC  4.2.2.1)  merupakan  enzim  ekstraseluler  yang  dihasilkan Streptococcus agalactiae  (Streptokokus  Grup  B). Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  aktivitas spesifik  dari  hyaluronidase S. agalactiae dan  berat  molekul proteinnya.  Pemurnian  enzim dengan  sentrifugasi,  pengendapan  amonium  sulfat  45%  dan  kromatographi  kolom  dengan Sephadex  G-100  dan Sodiumdodecyl  sulfate  polyacrylainide  gel  electrophoresis (SDS PAGE).  Enzim  hyaluronidase dari S.  Agalactiae memiliki  aktivitas  spesifik  sebesar  0,0012 U/mg (ekstrak kasar), 0,0125 U/mg (pengendapan dengan 45% ammonium sulfate) and 0,032 U/mg (Gel Filtration). Berat molekul protein hyaluronidase adalah 102 - 106 kD. Kata kunci : hyaluronidase, aktivitas spesifik, pemurnian

## Abstract
Hyaluronidase (EC 4.2.21) was extracelluler enzyme from Streptococcus agalactiae (Grup B Streptococcus). The  aim  of  research  was  to find  out specific activity  of  hyaluronidase and molecular weight of the enzyme. This enzyme  was purified  using  centrifugation,  45% ammonium sulfate precipitation, column chromatography using Sephadex G-100 and Sodiumdodecyl  sulfate  polyacrylamide  gel  electrophoresis (SDS  PAGE).  The  hyaluronidase from S.  agalactiae had  specific  activity  of 0,0012  U/mg (crude  extract),  0,0125 U/mg (purified  using  45%  ammonium  sulfate  precipitation)  and  0,032  U/mg  (Gel Filtration).  The molecular weight of hyaluronidase was about 102-106 kD.
Keywords: hyaluronidase, specific activity, purification
'

## Pendahuluan
Hyaluronidase  (EC  4.2.2.1)  merupakan enzim ekstraselluler  yang  menghidrolisa asam hyaluronat,  yaitu  semen  jaringan  yang  merekatkan sel-sel hidup menjadi satu. Hyaluronidase dihasilkan oleh kebanyakan streptokokus,dan merupakan faktor  virulensi  bakteri  tersebut  untuk melakukan invasi. Streptokokus Grup B (SGB) atau Streptococcus  agalactie merupakan agen penyakit yang menyebabkan  mastitis  sapi  atau  infeksi neonatal pada manusia seperti septicemia dan meningitis  (Baker,1980). Bakteri  tersebut  dapat pula  menginfeksi  anjing, kelinci  dan  merpati (Butter,dkk.1967).  Pada  manusia Streptococcus agalactie dapat  menyebabkan  kematian  pada  bayi (neonatal  septicemi)  , peradangan  selaput  otak (meningitis), endocarditis (radang jantung), peritonitis, pleuritis, dan arthritis (Wilkinson, 1978).
Hyaluronidase  dihasilkan oleh berbagai
organisme, antara lain: hyaluronidase yang diisolasi dari  bisa  ular,  seperti  yang dilaporkan  oleh Kudo,dkk.
(2001),
menyatakan bahwa hyaluronidase dari Agkistrodon contortrix contortrix (Southern  lopperhead)  memiliki  berat molekul  berdasarkan Assited  laser  desorption ionization  mass  spectroscopy diperoleh  sebesar 59.290  Da, sedangkan  menggunakan  SDS- PAGE  berat  molekul  sebesar  61.000  Da. Spesifik pada  subtrat  asam  hyaluronat  dan  tidak menghidrolisa  polisakarida  lain  seperti  chondroitin 4 - sulfate,  chondroitin - 6- sulfate,  dernatan sulfate,  keratan  sulfate, dan  heparin.  Enzim tersebut  merupakan  endo - glycosidase  tanpa aktivitas  exo - glycosidase,  sehingga  tidak dapat menghidrolisa p - nitrophenyl - D - glucuronide atau p - nitrophenyl - N - acetyl - β - D - glucosaminide. Produk utama dari hidrolisa asam hyaluronat adalah hexa  dan  tetrasacharida  N - acetylglucosamine
de ngan  titik  potong  pada  rantai  β 1,4 - gycosidic, dan  bukan pada  rantai β 1,3 - glycosidic,  jadi hyaluronidase dari bisa ular merupakan endo β - N - acetylhexasaminidase  dan  spesifik  untuk  asam hyaluronat. Enzim  tersebut memiliki  pH  optimum 6, suhu  optimum  37°C,  dan  kehilangan  aktivitas pada suhu  60°C. Konsentrasi  NaCl 0,2  M  dalam larutan memberikan aktivitas tertinggi.
Hyaluronidase dari serum manusia dilaporkan  oleh  Afify,dkk.(1993) menyatakan bahwa  enzim  tersebut  memiliki  pH  optimum  3,7. Toida,dkk. (1999) melaporkan  bahwa  dengan menggunakan  metoda  baru  FIA (Flow  Injection Assay) dapat  diukur aktivitas  hyaluronidase  dan pengaruh inhibitor dari O- sulfonated glycosaminoglycans terhadap enzim tersebut. Produk  hasil  dapat  dideteksi  oleh  FIA  dengan fluorometric  detection  menggunakan  fluorogenic reagent 2-cyanoacetamide. Hyaluronidase dari urine manusia  memiliki  aktivitas  46 - 59 TRU/mg (Turbidity  Reducing Unit/  mg  protein  ). Satu  TRU didefinisikan  sebagai jumlah  enzim  hyaluronidase yang menyebabkan penurunan turbidity - producing capacity  dari  0,2  mg - 0,1  mg  asam hyaluronat  dalam  30  menit  pada  suhu 37 ° C. Diantara  glycosaminoglycan  hanya  O- sulfanated dari  heparin  yang  menghambat hyaluronidase secara  non  kompetitif, sedangkan O- sulfanated dari  asam hyaluronat  menghambat  hyaluronidase secara kuat baik kompetitif maupun nonkompetitif.
Sedangkan hyaluronidase yang berasal dari bakteri, enzim tersebut merupakan enzim ekstrasellular  yang  dihasilkan  oleh  kebanyakan streptokokus.  Enzim  tersebut  merupakan  faktor vinilensi untuk  merusak  asam  hyaluronat jaringan konektif  untuk  memudahkan  penvebaran  bakteri tersebut,  sehingga  enzim  tersebut  disebut  juga sebagai spreading factor Hyaluronidase dari bakteri dikenal juga dengan nama hyaluronat lyase.
Hynes,dkk.(2000)  menyatakan  bahwa  gen hyaluronidase (hyl  A) dari Streptococcus  Group  A (SGA) atau Streptococcus pyogenes terdiri dari 868 asam  amino  dan  ukuran  protein  enzimnya  sebesar 99.636  Da. Terdapat  homologi  yang  cukup  tinggi pada  tingkat  gen  penyandi  hyaluronidase antara Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, dan Staphylococcus aureus. Sedangkan Pritchard  dkk.  (1994)  melaporkan  bahwa  dengan SDS PAGE  menunjukkan  satu band hyaluronidase dengan berat molekul 100 kD.
Hyaluronate  lyase  dari Staphylococcus aureus memiliki pH optimum 7,8 dalam bufer yang mengandung  NaCI. Satu  aktivitas  hyaluronidase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalis  pelepasan  1  nmol  disakarida  2-
acetamido - 2 - deoxy - 3-( β - D - gluco - 4 - enepyranosyluronic  acid  )  D - glucose  dari asam hyaluronat per menit (Pritchard,dkk.1994).

## Metode

## Lokasi penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PAU
Bioteknologi  IPB,  Laboratorium  Immunologi  dan Produksi Bahan Hayati, FKH IPB, dan Laboratorium Terpadu FKH.

## Test Agar Hyaluronidase (Christ,1989)
Uji  ini  bertujuan  untuk  menentukan  isolat yang  menghasilkan  hyaluronidase. Media  tumbuh adalah  terdiri  dari  100  ml  BHI  ditambahkan 1  g Nobel  Agar, kemudian  disteril  dengan  autoklaf. Selanjutnya  ditambahkan  50  mg  asam hyaluronat dalam  25  ml  akuades  dan  1,25  g  BSA, dituangkan dalam cawan. Inkubasi selama 24 jam, 37°C. Selanjutnya SGB diinokulasikan dalam media tersebut  dan  diinkubasi  selama  24  jam suhu 37 °C. Empat  isolat SGB  yang  digunakan  merupakan koleksi  dari  dr.Zinatul  Hayati,M.Kes.,Sp.MK., kemudian dilakukan penggenangan dengan asetat 2 M sebanyak 5 ml dan terlihat zona bening disekitar koloni  SGB  (zona  bening  mengindikasikan  isolat SGB tersebut mengekskresikan hyaluronidase).
Isolasi Hyaluronidase pada Supernatan
Setelah diperoleh isolat SGB yang menghasilkan hyaluronidase maka bakteri ditumbuhkan  pada 50  ml  THB , diinkubasi  pada suhu  37 ° C,  selama  kurang  lebih 5  jam  (nilai absorbansi  0,8  pada λ 650  nm). Selanjutnya diinokulasikan  kembali dalam  500  ml  THB (mengandung 0,2% asam hyaluronat), dan diinkubasi  semalam  pada  suhu  37 ° C.  Untuk mengamati  pertumbuhan  Streptokokus Grup B, dilakukan  pengamatan  dengan  melihat  nilai optical density ( λ 650  nm)  selama masa  inkubasi. Dilakukan  pengujian  pula  terhadap  aktivitas hyaluronidase  dan kadar  protein (Bradford  1976), sehingga  berdasarkan  data  tersebut  dapat  kita tentukan  waktu  produksi  hyaluronidase  dari  SGB, sebagai patokan untuk produksi selanjumya.
Hyaluronidase diperoleh dengan memisahkan enzim dengan sel bakteri SGB tersebut menggunakan  sentrifugasi  4000  rpm,  selama  15 menit, suhu  4°C. Supernatan  merupakan  enzim kasar hyaluronidase. Selanjutnya dilakukan pengujian  aktivitas  hyaluronidase  dan  penentuan kadar protein enzim (Bradford, 1976).
Pengukuran Konsentrasi Protein (Bradford, 1976)
Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan  standar  protein  Bovine  Serum Albumin  (BSA)  dengan  konsentrasi  0,1 hingga  1
mg/ml. Setiap  100 µ l konsentrasi BSA ditempatkan pada tabung reaksi dan ditambahkan  5  ml  pereaksi Bradford  dan diinkubasi  selama  5  menit,  suhu  37  °C,  kemudian diukur absorbansinya  pada λ 595  nm.  Sehingga didapat kurva  standar  yang  merupakan persamaan garis regresi ( y = ax + b, dengan nilai r mendekati satu ) antara  nilai absorbansi  sebagai  ordinat  dan konsentrasi protein BSA sebagai absis.
Dengan  metoda  yang  sama  untuk  sampel hyaluronidase, yaitu sebanyak 100 µl hyaluronidase ditambahkan 5 mi pereaksi Bradford dan diinkubasi 37 °C, 5 menit, dan dilihat nilai absorbansinya pada λ 595  nm. Selanjutnya untuk mendapatkan  kadar protein hyaluronidase tersebut, dengan memasukkan nilai absorbansi  tersebut  ke  dalam  persamaan  daris yang telah dibuat.
Pengukuran  Aktivitas  Hyaluronidase  (Bergmeyer, 1987)
Aktivitas
hyaluronidase diukur berdasarkan  jumlah  2-acetamido-2-deoxy3-0- ( β - D - gluco - 4 - enepyranosyluronic  acid) - D - glucose dari asam hyaluronat.
Bahan yang diperlukan:
1. Bufer  phospat  (67  mmol/liter,  pH  6,4), pembuatannya  dengan  melarutkan 66  ml Na 2 H P O 4 2H 2 O  (11,876  g/liter)  dengan KH 2 PO 4 (9,078g/liter) dalam  volume  250 ml.
2. Sodium  Chloride  (0,15  mol/liter) dengan  melarutkan  0,877  g  NaCl dengan 100 ml air.
3. Perhloric acid (20%w/v) dengan melarutkan 13  ml  HC1O 4 (70%  w/v) dengan 75 ml air.
4. Hyaluronate lyase standar (1 mg protein/ml;  100 U/liter)  7  mg  enzim dalam 7 ml larutan NaCl.
5. Asam  hyaluronate  200  mg  dalam  1000 ml bufer posat.

## Pengendapan dengan Amonium Sulfat
Pengendapan  protein  dengan  amonium sulfat  dilakukan  dengan  metoda Scope (1982). Sebanyak  10  ml  supernatan  enzim  ditambahkan amonium sulfat dengan berbagai kadar berdasarkan  kejenuhan  (40%,  45%,  55%, 65%,  75%,  85%)  untuk mendapatkan  kadar amonium  sulfat  yang  optimum. Penambahan amonium  sulfat dilakukan  sedikit  demi  sedikit dengan  magnetic  stirer  pada  suhu  dingin. Setelah semua amonium sulfat larut, didiamkan semalam pada suhu 4°C. Endapan yang terbentuk dipisahkan  dari  supernatan  dengan  sentrifius  4000 rpm, 15  menit,  4°C. Endapan  ditambahkan  bufer
pospat pH  6,4  satu  kali  volume. Selanjutnya dilakukan  pengujian  aktivitas  hyaluronidase  dan kadar  proteinnya.  Pengandapan amonium  sulfat yang  menghasilkan  aktivitas  tertinggi  pada endapan  dan  aktivitas yang  rendah  pada supernatan  digunakan  sebagai  patokan  untuk pengendapan selanjutnya..

## Dialisis
Dialisis  dilakukan  untuk  menghilangkan garam yang tersisa  pada  proses pengendapan. Kantong dialisis (10.000 MW) dipanaskan selama 30  menit  dalam 1  mM  EDTA,  selanjutnya dilakukan  pencucian  dengan  air  bebas  ion. Sebanyak 10  ml  sampel  enzim  dimasukkan kedalam  kantung  dialisis  dan  diikat dengan benang pada kedua ujungnya. Kantung dimasukkan dalam bufer pospat pH 6,4 dengan volume 100 kali sampel,  diagitasi  secara  perlahan  selama 1  jam suhu dingin.

## Kromatografi Filtrasi Gel
Pemurnian  dengan  filtrasi  gel  bergantung pada  perbedaan  kemampuan  dari  berbagai  molekul protein  enzim  memasuki  pori-pori yang  terdapat pada  fase diam.  Preparasi  kolom  yaitu,  sebanyak 1,7 gram Sephadex G-100 direndam pada air bebas ion  steril  dan  diaduk  secara  perlahan selama  30 menit,  kemudian  didiamkan  semalam  pada  suhu 4°C.  Air  bebas ion  dibuang  dan  diganti  dengan bufer  pospat  pH  6,4  sebanyak  tiga  kali  dan didiamkan satu jam. Kolom kromatografi menggunakan  tabung  kromatografi  diameter  1  cm, secara perlahan gel dituang kedalam tabung hingga mencapai  tinggi  40  cm,  diusahakan  tidak  terjadi gelembung  yang  terdapat  dalam  kolom. Kolom diekuilibrasi  dengan mengalirkan  bufer  pospat  pH 6,4 sebanyak 200 ml selama semalam, suhu dingin (4°C).
Sebanyak  2  ml hyaluronidase  yang  telah melalui  proses  dialisis dimasukkan dengan pipet ke dalam kolom tepat diatas permukaan gel. Bufer yang digunakan untuk  elusi  ialah  bufer  posfat  pH  6,4, dilakukan fraksinasi dan volume tiap fraksi adalah 2 ml.  Selanjutnya  dilakukan  pengujian  aktivitas hyaluronidase  dan  kadar  proteinnya  pada  setiap fraksinya, sehingga diketahui pada fraksi ke berapa yang  memiliki  aktivitas  hyaluronidase  yang tertinggi.

## SDS-PAGE
Protein hasil pemurnian  dianalisa dengan Sodium Dodecyl Sulphate polyachrilamide  Gel Electroforesis (SDS-PAGE). Peralatan elektroforesis  yang digunakan  adalah  tipe  vertikal. Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan sistem gel diskontinue  yang  terdiri  dari stacking  gel dan separating  gel. Marker  yang digunakan  adalah
High  molecular  Weight. Sampel  sebanyak  15 µl ditambahkan buffer sampel 10 µl dididihkan selama satu  menit  sebelum  diinjeksikan  kedalam  sumur. Elektroforesis  dijalankan  dengan  arus  20  mA  dan voltage  50  volt.  Elektroforesis  dihentikan  bila pewarna  sampel  mencapai batas  0,3 - 0,5  cm dibagian bawah gel. Gel direndam didalam pewarna commasie  brilliant  blue sambil  diagitasi  perlahan selama  dua  jam, selanjutnya  dilakukan  pencucian dengan  merendam  gel  pada  larutan  destainning, sehingga  gel  bening  dan  pita terlihat  jelas. Pengukuran berat molekul protein enzim hyaluronidase  didasarkan pada  kurva  standar  yang diperoleh dari persamaan garis antara berat molekul protein standar dengan nilai mobilitas relatif (Rf)nya. (Smith 1984).

## Hasil dan Pembahasan

## Penentuan Isolat Streptokokus Grup B (SGB)
Isolat  yang  telah  dideteksi  menunjukkan  aktivitas hyaluronidase (menunjukkan zona bening) menggunakan test agar hyaluronidase (Christ,1989), selanjutnya  dipilih  salah  satu  isolat untuk  produksi enzim. Untuk  kemudian  dilakukan tahap-tahap pemurnian  dan  karakterisasi  dari  hyaluronidase yang dihasilkan oleh Streptokokus Grup B tersebut.

## Pertumbuhan dan Produksi Hyaluronidase SGB
Pertumbuhan  dan  produksi  hyaluronidase  SGB diamati  pada  media cair  THB (ditambah  2%  asam hyaluronat).  Dilakukan  pengamatan  terhadap  data turbiditas suspensi sel (panjang gelombang 650 nm) yang  diukur  tiap  selang  waktu tertentu,  disamping itu  pula  dilakukan  pengambilan  suspensi  sel  untuk pengukuran aktivitas  hyaluronidase  dan  kadar proteinnya.
0 0.5 1 1.5 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 jam ke- A b s o rb a n s i 6 5 0 n m 0 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.001 0.0012 0.0014 0.0016 A k ti v it a s s p e s if ik
h y a lu ro n id a s e ( U /m g )
Absorbansi 650 nm Aktivitas spesifik hyaluronidase (U/mg)
Gambar 1.Pertumbuhan Isolat SV 14 dan aktivitas spesifik hyaluronidase pada media cair THB suhu 37°C.
Perkembangan
produksi protein ekstrasellular  mengikuti pola  pertumbuhan bakteri SGB  tersebut. Terdapat  asosiasi antara  kurva pertumbuhan  dan  kurva pembentukan  produk
dalam  hal  ini  pembentukan  protein  ektraselular (enzim). Hubungan antara kinetika pertumbuhan sel dengan  pembentukan produk tergantung  peranan produk  dalam  metabolisme sel, dalam  hal ini- laju pembentukan produk berbanding secara proporsional dengan laju pertumbuhan (Mangunwidjaja,dkk.1994).
Streptokokus  Grup  B  mengekskresikan hyaluronidase dengan  aktivitas  tertinggi  (0,0012 U/mg)  adalah  pada  saat  jam  ke-20  masa pertumbuhan  bakteri  tersebut  (fase  logaritma pertumbuhan).  Data  waktu  produksi  tersebut  dapat kita  gunakan  untuk  melakukan  produksi  enzim dalam  skala  yang  lebih  besar.  Demikian  pula yang dilakukan Pitchard,dkk.
(1994) yaitu menumbuhkan  Streptokokus  Grup  B  pada  media cair  selama  semalam  pada  suhu  37°C  untuk mendapatkan hyaluronidase dari bakteri tersebut.

## Hyaluronidase SGB pada Supernatan
Isolasi  hyaluronidae  SGB  dengan  cara memisahkan sel  dengan  media  tumbuh, karena hyaluronidase  merupakan  enzim  ekstraseluler. Hyaluronidase pada supernatan memiliki aktivitas spesifik  sebesar  0,0012 - 0,0018  U/mg.  Sebagai pembanding,  hasil  penelitian  yang  dilakukan Afify,dkk.(1993)  dilaporkan  bahwa  ekstrak  kasar hyaluronidase  dari  serum  manusia  memiliki aktivitas spesifik sebesar 0,009 U/mg.

## Pengendapan Amonium Sulfat dan Dialisa
Sebelum  dilakukan  pemurnian  dengan filtrasi  gel,  hyaluronidase  SGB terlebih  dahulu dipekatkan  menggunakan  garam  amonium  sulfat. Pengendapan menggunakan  garam  didasarkan pada  kelarutan  protein  yang  berinteraksi  polar dengan  molekul  air,  interaksi  jonik  protein  dengan garam,  dan  daya  tolak  menolak  protein  yang bermuatan  sama. Kelarutan  protein  (pada  pH  dan suhu tertentu) meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in). Kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan  kekuatan  ion  larutan. Penambahan garam tertentu akan menyebabkan kelarutan protein menurun (salting  out). Molekul air yang berikatan dengan  ion-ion  garam  semakin  banyak  yang akhirnya menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan protein, sehingga menyebabkan protein saling berinteraksi , beragregasi,  dan  kemudian  mengendap. Amonium sulfat  merupakan  garam  yang  paling  sering digunakan  untuk  mengendapkan  protein  karena memiliki daya larut tinggi didalam air, relatif tidak mahal (Scopes, 1987).
0.0067 0.0125 0.011 0.0095 0.007 0.005 0 0.005 0.01 40 45 55 65 75 85 Kelarutan amonium sulfat (%) A k ti v it a s s p e s if ik h y a lu ro n id a s e ( U /m g ) Gambar.2. Pengendapan hyaluronidase SGB dengan amonium sulfat
Pengendapan  hyaluronidase  SGB  dengan amonium sulfat 45% menunjukkan  aktifitas  yang tertinggi  pada  endapan  (pelet)  yang  dihasilkan. Hal ini  diperkirakan  hyaluronidase SGB  sudah terendapkan (salting  out). Sedangkan dengan semakin bertambahnya kadar garam  dalam  larutan sampai pada kelarutan 85% amonium sulfat terjadi kejenuhan yang tinggi, dan mengakibatkan rendahnya endapan  dan  aktifitas  enzim  yang diperoleh.
Hyaluronidase  SGB  hasil  pengendapan 45%  amonium  sulfat  digunakan untuk  pemurnian tahap  selanjutnya. Pengaruh  garam  mineral  dan kelebihan amonium sulfat dalam enzim dihilangkan dengan menggunakan  metoda  dialisa. Proses penghilangan  garam (desalting) menggunakan metoda  dialisa  dilakukan  dalam  waktu  yang  tidak terlalu  lama  (kurang  lebih  60  menit)  untuk menghindari terjadinya penurunan aktivitas hyaluronidase. Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan aktivitas  hyaluronidase  sebesar  0,0732  U/ml  dan kadar proteinnya 5,67  mg/ml, hal ini berarti terjadi penurunan  aktivitas  spesifik  hyaluronidase  sebesar 4% dari hasil pengendapan 45% amonium sulfat.

## Kromatografi Filtrasi Gel
Pemilihan  metode  kromatografi  kolom didasarkan pada sifat protein  enzim yang dipisahkan.  Sehingga  perlu  dilakukan  pencarian informasi  tentang  karakterisasi  enzim tersebut, antara  lain  perkiraan  berat  molekul,  derajat hidrofobisitas, dan adanya ikatan sulfidril.
Hyaluronidase  SGB  merupakan  enzim yang  tergolong memilki  berat  molekul  tinggi, menLirut  Pitchard,dkk.  (1994)  berat  molekul  SGB adalah  sekitar 100  kD.  Berdasarkan  informasi tersebut  maka  dipilih  salah  satu  teknik  pemurnian yaitu kromatografi filtrasi gel. Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein berdasarkan pada ukuran molekul. Matrik filtrasi gel merupakan  gel  yang  berpori  yang  dikemas  dalam
kolom . Pori-pori  matrik  dapat menampung molekul  yang  berukuran  kecil  dan  memisahkannya dari molekul yang mempunyai berat molekul tinggi, sehingga  teknik  ini  dapat  pula  digunakan untuk estimasi  berat  molekul  (Scopes,  1987). Protein  yang berukuran  besar  akan keluar  terlebih  dahulu daripada protein yang berukuran lebih kecil.
Gambar.3.  Profil  hasil  pemurnian  dengan filtrasi gel Sephadex G-100
Hasil kolom Sephadex G-100 menghasilkan satu  puncak  protein  yang melebar. Fraksi  yang memiliki  aktivitas  hyaluronidase  yang  tertinggi adalah fraksi ke-5 dengan aktivitas spesifik sebesar 0,032 U/mg. Pemurnian hyaluronidase SGB dengan kolom  Sephadex  G-100  memberikan  tingkat kemumian  sampai  26,8  kali  ekstrak  kasar  dengan perolehan 12,3%. Perolehan dibawah 50% diperkirakan karena  kadar  protein  yang  memiliki aktivitas  hyaluronidase  lebih  rendah  daripada protein  lain yang  diekskresikan sel. Kehilangan protein  selama  pemurnian dapat  terjadi  karena autolisis  (Scopes 1987),  dan  hal  ini  terjadi  karena pengaruh pengenceran enzim.

## SDS-PAGE
Tingkat  kemurnian enzim dapat diketahui dengan menggunakan teknik  elektroforesis  gel poliakrilmida,  SDS-PAGE. Gel  disusun  oleh akrilamida  dan N,N ’ -metilen - bis - akrilamida yang  berpolimerisasi  melalui  mekanisme  radikal bebas  dengan  bantuan  katalisator N,N,N’,N’ ,- tetrametilen  diamina  (TEMED)  dan inisiator amoniumpersulfat  (APS)  (Dunn,1989). Prinsip analisis  SDS-PAGE  yaitu pemisahan  protein berdasarkan ukuran molekul.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 Fraksi K a d a r p ro te in ( m g /m l) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 A k ti v it a s h y a lu ro n id a s e ( U /m l) Kadar protein (U/ml)
Aktivitas hyaluronidase (U/ml)
Deterjen ionik (SDS) akan bereaksi dengan protein dan membentuk komplek yang mengandung muatan negatif, sehingga pergerakan  protein  dalam  medan listrik hanya didasrakan  pada  ukuran  molekul. Protein  yang berukuran  kecil  akan bergerak  lebih  cepat dibandingkan dengan protein berukuran besar. Berat molekul protein dapat diukur dengan menggunakan protein standar yang telah diketahui berat  molekulnya  dengan  cara  membandingkan nilai mobilitas relatif (Rf) (Smith, 1984).
1          2          3        4 5 Marker (kD)
Gambar 4. SDS-PAGE hyaluronidase SGB. Fraksi ke  5  pemurnian Sephadex  G-100 (1), hyaluronat  standar (2), hyaluronidase pada supernatan (3), pengendapan 45%
(NH4)zSO4 (4), Dialisa (5).
Berdasarkan hasil SDS-PAGE, pada sumur ketiga  (3)  merupakan hyaluronidase  SGB  yang diisolasi  dari  supernatan,  terlihat  masih banyak terdapat  pita-pita  protein  baik  protein yang merupakan  hyaluronidase  maupun  protein  dari enzimenzim  yang  lain. Hal  ini  terindikasi  dengan masih rendahnya aktivitas hyaluronidase.
Selanjutnya pada sumur keempat (4) dan kelima (5) merupakan hasil pengendapan dengan 45% (NH 4 ) 2 SO 4 (amonium sulfat) dan dialisa. Pengandapan  ini  bertujuan  untuk  memisahkan enzim dari senyawa-senyawa yang tidak dikehendaki. Hasil elektroforesis menunjukkan hasil pita-pita  yang  lebih jelas  dibandingkan  dengan ekstrak  kasar. Hal  ini  diperkirakan dengan meningkatnya  tingkat  kemurnian  protein enzim  tersebut  maka  terjadi  reaksi  yang lebih optimum  antara  protein  enzim  dengan  pewarna coomassie briliant blue.
Sedangkan  hasil  pemurnian  dengan  kolom Sephadex  G-100  menujukkan hasil  dua  pita  yang tersisa  (1)  dengan  berat  molekul  sekitar  106  kD dan  102 kD. Pita-pita  tersebut  diperkirakan merupakan  hyaluronidase SGB,  hal  mi  ditandai dengan  tingginya  aktivitas  hyaluronidase  pada
fraksi  tersebut.  Enzim  standar hyaluronat  lyase (sumur  kedua)  menunjukkan satu pita dengan berat molekul yaitu sekitar 100 kD. Hal ini didukung pula dengan  hasil  penelitian  Pitchard,dkk.(1994)  bahwa hyaluronidase dari  SGB menunjukkan  satu  pita protein 100 kD. dengan menggunakan SDS-PAGE.

## Kesimpulan
Enzim hyaluronidase  dari S.  agalactiae memiliki aktivitas spesifik sebesar 0,0012 U/mg (ekstrak kasar), 0,0125 U/mg (pengendapan dengan 45% ammonium  sulfate)  and  0,032  U/mg  (Gel Filtration). Berat  molekul  protein hyaluronidase adalah 106 - 102 kD

## Ucapan Terimakasih
Terimaksih  yang  sebesarnya  kepada  dr.Zainatul Hayati.M.Kes.,Sp.MK yang telah mendanai penelitian  ini  melalui  Program  Hibah  Bersaing DIKTI  dan  kepada semua  pihak  yang  telah membantu kelancaran penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Afify.A.M.,Stem.  M., G. Markus., S. Robert.  1993. Purification and  Characterization of  Human  Serum Hyaluronidase. Archives of Biochem and Biophysics.305(2):434 -441.
Bradford, MM. 1976. A rapid and sensitive  method for quantitation  of  microgram quantitaties of  protein in utilizing the principle  of  protein-dye binding. Anal. Biochem.72:248-254.
Bergmeyer, H.U.  1987. Method  of  Enzymatic  Analysis. VCH.Vo1.IV:45-49.
Butter,M.N.W  and  DeMoor,C.E.1967. Streptococcus agalactie as Acause of Meningitis in the Newborn and bacteremia in Adults. Antonie van Leeuwenhoek.33;439-450.
Christ.D.1989, Untersuchungen an Streptococcus uberis unter besonder Berucksichtigung  mutmaBlicher pathogenitatsfatoren.  Aus  der  professur  fur Bakteriologie  und  immunologie  der  Justus- Universitat GiBen.33-34.
Hynes.  W.  L.,Dixon. A.  R, Walton S.R.  Aridgides. L. J .2000. The Extracellular hyaluronidase  gene (hyl A) o f Streptococcus pyogenes. FEMS
Microbiology Letter 184.109-112.
Kudo.K.Anthony. T.Tu.200L Characterization of Hyaluronidase Isolated from Agkistrodon contortrix  contortrix (Southern  Copperhead) Venom. Archives of  Biochem  and  Biophysics. 386(2):154-162.
Mangunwidjaja.D,Suryani.A,1994.Teknologi Bioproses.Penebar Swadaya.Jakarta.
Pritchard.D.G.BoLin.Willingham.T.R,Baker.J.R,1994.Ch aracterization of The Group B  Streptococcal Hyaluronate Lyase. Archives of  Biochem  and Biophysic.315 (2):431-437.
200
116
97.4
66 45
Scopes  RK.1987.  Protein  Purification  Principles  and
Practice. Edisi ke-2. New York: SpringerVerlag. Smith  BJ.1984.SDS  polyacrylamide  gel  electrophoresis of proteins. Di dalam Walker JM,editor. Proteins. Methoda  in  Molecular  Biology.  Volume  ke-1.
Clifton:Humana Pr.hlm 41-55.
Stephanie M. Borchardt, Betsy  Foxman, Donald  O. Chaffin, Craig  E. Rubens,Patricia  A.  Tallman, Shannon  D.  Manning,Carol  J.  Baker,  and  Carl F. Marrs.20D4.  Comparison  of  DNA  Dot  Blot Hybridization and Lancefield Capillary Precipitin Methods  for  Group  B  Streptococcal  Capsular Typing. J Clin Microbiol. 42(1):146-150. Toida. T, Ogita Y. Suzuki. A. Toyoda H. Imanari. T. 1999. Inhibition of Hyaluronidase by O-Sulfonated Glycosaminoglycans.  Archives o f Biochemistry and Biophysics. 3 70(2):176-182.
Wilkinson, H. W. 1978. Group B Streptococcal Infection in Humans. Ann. Rev. Microbio1.32:41-57.