## PENGARUH OSMOLIT TERHADAP MATURASI EMBRIO SOMATIK JERUK (Citrus reticulata Blanco.)

## Nurul Hidayahti, Wahyu Widoretno dan Retno Mastuti
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang Email; nurulcintabunda@gmail.com

## ABSTRAK
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh osmolit (PEG dan agar) terhadap maturasi  embrio  somatik  (ES)  jeruk  keprok  batu  55.  Embrio  somatik  diinduksi  dari jaringan  nuselus  buah  muda  jeruk  keprok  batu  55  pada  media  MT  padat  yang  ditambah ekstrak malt 500 mg/L, gula 50 g/L dan BAP 3 mg/L. Embrio somatik fase globular hasil induksi  diperbanyak  pada  media  MT  tanpa  ekstrak  malt  dan  zat  pengatur  tumbuh. Maturasi ES fase globular diinduksi pada media MS yang mengandung agar (10, 12.5, 15, 17.5,  dan  20  g/L)  atau  PEG  (0,  2.5,  5,  7.5,  dan  10%).  Setelah  delapan  minggu  dihitung persentase  setiap  fase  perkembangan  ES.  Hasil  penelitian  menunjukkan  eksplan  nuselus dapat  berkembang  menjadi  ES  fase  globular,  hati,  torpedo  dan  kotiledon.  Penambahan PEG dan peningkatan konsentrasi agar menurunkan persentase ES fase globular.
Kata kunci: agar, embrio somatik, osmolit, zat pengatur tumbuh

## ABSTRACT
This  research  was  conducted  to  evaluate  the  effect  of  osmolit  (PEG  and  agar)  on maturation of citrus somatic embryos (SE). Somatic embryos induction was carried out by culturing  nucellus  explants  of  young  citrus  fruit  on  MT  medium,  added  with  500  mg/L extract  malt,  50  g/L  sugar  and  3  mg/L  BAP.  Globular  SE’s  were  multiplicated  by subculturing  them  on  MT  media  without  plant  growth  regulators.  Maturation  of  SE  was done  by  culturing  globular  SEs  on  MS  media  containing  (10,  12.5,  15,  17.5  and  20  g/L) agar or (2.5, 5, 7.5 and 10 %) PEG. After eight weeks, the percentage of each stage of SE development. The results showed that the nucellus explants of jeruk keprok batu 55 could developed into stages of SE include globular, heart, torpedo and cotyledon. The addition of PEG in the medium and the increased concentration of agar decreased globular stage SE.
Key Words: agar, somatic embryo, osmolite, temperature, plant growth regulator

## PENDAHULUAN
Kendala  utama  yang  membatasi  produksi jeruk keprok lokal adalah sedikitnya ketersediaan bibit bermutu dan bebas penyakit. Pengembangan  bibit  unggul  dan  bermutu penting  dalam  upaya  pengembangan  tanaman jeruk  keprok  lokal  yang  memiliki  beberapa varietas salah satunya adalah jeruk keprok batu 55. Jeruk keprok batu 55 banyak diminati oleh masyarakat, karena memiliki keunggulan yaitu daging buahnya berasa manis agak masam dan bertekstur  lembut  (Mukhtar  et  al,  2005),  biji sedikit, banyak mengandung air dan aromanya segar (Agrimas Kapitalindo, 2007).
Upaya yang telah dilakukan untuk meningkatkan  produksi  jeruk  keprok  batu  55 adalah  peningkatan  budidaya  jeruk,  perluasan area  tanam,  penyediaan  bibit  dalam  jumlah
banyak dan bebas penyakit serta meningkatkan produktivitas  buah  jeruk  (Hardiyanto  dan Suprianto,  2010).  Teknik  kultur  jaringan  in vitro  dapat  dilakukan  untuk  memperoleh  bibit dalam  jumlah  banyak  dan  mempermudah regenerasi  tanaman  jeruk  keprok  batu  55. Keberhasilan untuk mendapatkan bibit tanaman  secara  massal,  tingkat  keseragaman tinggi  dan  bersifat  klonal  atau  sama  dengan induknya dapat dilakukan melalui embriogenesis  somatik  in  vitro  (Lengkong, 2009).  Embriogenesis  somatik  merupakan proses  perkembangan  sel  somatik  membentuk tanaman  baru  melalui  tahap  perkembangan embrio  tanpa  melalui  fusi  gamet  (Lengkong, 2009).
Menurut  Ricci  et  al.  (2002)  perbanyakan tanaman  jeruk  dapat  dilakukan  melalui
embriogenesis  somatik  in  vitro  dengan menggunakan  eksplan  nuselus  yang  diinduksi pada media MT (Murashige dan Tucker, 1969) ditambah  ekstrak  malt  pada  medium  kultur. Maturasi  embrio  somatik  (ES)  merupakan salah  satu  tahapan  yang  penting  dalam regenerasi  tanaman  melalui  embriogenesis somatik.  Selama  tahap  maturasi,  embrio somatik  mengalami  perubahan  morfologi  dan biokimia.  Maturasi  yang  tidak  lengkap  dari embrio  somatik  merupakan  faktor  yang menentukan rendahnya tingkat konversi embrio menjadi tanaman (Hussein et al, 2006). Hambatan dalam menginduksi maturasi merupakan  salah  satu  penghambat  utama dalam  keberhasilan  embriogenesis  somatik, bukan hanya pada tanaman kedelai tetapi juga tanaman  lain  (Korbes  dan  Droste,  2005). Dengan  demikian,  penelitian  ini  dilakukan untuk  meningkatkan  maturasi  ES  jeruk menggunakan  beberapa  konsentrasi  osmolit agar dan PEG.
Perkembangan  ES  dipengaruhi  oleh ketersediaan  air  pada  medium.  Potensial  air yang rendah pada medium dapat meningkatkan maturasi  ES  (Ali  et  al,  2010).  Salah  satu senyawa  osmolit  yang  berpengaruh  terhadap rendahnya  potensial  air  adalah  polyethylene glycol  (PEG)  dan  gelling  agent  seperti  agar atau gelrite. Agar pada konsentrasi tinggi dapat mengurangi  ketersediaan  air,  sehingga  dapat menurunkan  potesial  air  di  dalam  media (Steuter,  1981).  Peningkatan  konsentrasi  agar sebesar  10  g/L  mampu  meningkatkan  jumlah maturasi  ES  Persea  americana  dibanding dengan  7,5  g/L  agar  (Martin  et  al,  2011). Penambahan  PEG  pada  media  kultur  telah terbukti  mampu  meningkatkan  persentase  ES Citrus macroptera dibanding pada media tanpa penambahan PEG (Miah et al, 2002).
Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan untuk mengetahui  pengaruh osmolit (agar dan PEG) terhadap maturasi ES jeruk keprok Batu 55.

## BAHAN DAN METODE
Bahan Uji. Sumber eksplan yang digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  buah muda  jeruk  keprok  batu  55  (80-90  minggu setelah  anthesis)  yang  berasal  dari  Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika (Balitjestro), Malang.
Induksi dan Multiplikasi ES. Induksi ES dengan  eksplan  nuselus  yang  diisolasi  dari
buah  jeruk  muda  dilakukan  pada  media  MT, ditambah  ekstrak  malt  500  mg/L,  gula  50  g/L dan  BAP  3  mg/L  selama  satu  bulan.  Setiap botol berisi empat eksplan nuselus.
Selanjutnya  ES  fase  globular  yang  dihasilkan disubkultur  pada  media  multiplikasi  yakni media  MT  tanpa  penambahan  ZPT  selama empat  minggu  untuk  perbanyakan  ES  fase globular  yang  akan  digunakan  pada  tahap selanjutnya.
Maturasi  ES.  Maturasi  ES  fase  globular hasil  multiplikasi  diinduksi  pada  media  MS yang ditambah dengan agar (10, 12.5, 15, 17.5, dan  20  g/L)  atau  PEG  (0,  2.5,  5,  7.5,  dan  10 %). Kultur diinkubasi dibawah sinar lampu TL dengan  intensitas  cahaya  35,39  watt/m 2 pada suhu 25 ± 1 ° C. Setelah delapan minggu kultur, diamati persentase masing-masing fase perkembangan  ES  (embrio  globular,  hati, torpedo  dan  kotiledon)  dan  persentase  ES matur.
Analisis  Data.  Data  kuantitatif  yang diperoleh  diolah  dan  diuji  menggunakan  uji Analysis  of  variance  (ANOVA)  menggunakan program  statistik  SPSS  Release  For  Windows 15.  Apabila  hasil  uji  ANOVA  berbeda signifikan  dilanjutkan  dengan  uji  BNJ  pada tingkat  kepercayaaan  95  %  untuk  mengetahui perlakuan yang memberikan pengaruh signifikan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh Agar dan PEG pada Maturasi ES.  Setelah  delapan  minggu  kultur  eksplan nuselus menghasilkan empat fase perkembangan ES yang meliputi fase globular, hati,  torpedo  dan  kotiledon.  Embrio  somatik jeruk  fase  globular  berbentuk  bulat,  bertekstur lebih  lunak  dan  berwarna  putih  (Gambar  1A). Embrio somatik fase hati berbentuk menyerupai  hati,  berwarna  hijau  kekuningan dan  sedikit  keras  (Gambar  1B).  Embrio somatik  fase  torpedo  berbentuk  tabung (Gambar  1C).  Fase  akhir  perkembangan  ES adalah  fase  kotiledon  yang  berukuran  paling besar  diantara  ketiga  fase  perkembangan embrio  somatik,  memiliki  dua  kotiledon, berwarna  hijau  dan  bertekstur  lebih  keras (Gambar  1D).    Media  maturasi  dengan penambahan PEG dan peningkatan konsentrasi agar mampu menunjang perkembangan eksplan  nuselus  jeruk  keprok  batu  55  manjadi ES  dari  fase  globular  hingga  menjadi kotiledon.  Hasil  penelitian  ini  sesuai  dengan
hasil  penelitian  sebelumnya  yang  melaporkan bahwa  konsentrasi  agar  dan  PEG  yang semakin meningkat dapat menurunkan ketersediaan  air  pada  media  dan  menghambat perbanyakan  ES  namun  memicu  perubahan dalam  perkembangan  ES,  yakni  dari  ES  fase globular kemudian berkembang menjadi kotiledon (Ravindra et al, 2004).
Gambar  1.  Fase  perkembangan  ES  jeruk keprok  batu  55  setelah  dikultur selama  8  minggu  pada  media maturasi  ES.  (A)  globular,  (B) hati, (C) torpedo, (D) kotiledon.
Pada  medium  dengan  penambahan  agar 20  g/L  persentase  ES  fase  globular  menurun signifikan  menjadi  93 ± 0.1  %  (Gambar  2A). Persentase ES fase hati dan torpedo menunjukkan  respon  dengan  pola  yang  sama terhadap  perlakuan  konsentrasi  agar,  yaitu tidak  berbeda  signifikan  pada  konsentrasi  10 dan  12.5  g/L  kemudian  meningkat  pada  15 g/L,  menurun  pada  17.5  g/L  dan  kembali meningkat pada 20 g/L. Sedangkan persentase ES  fase  kotiledon  meningkat  seiring  dengan bertambahnya konsentrasi agar yaitu dari 0.1 ± 0.02  %  pada  kontrol  (10  g/L)  menjadi  0.7 ± 0.11  pada  penambahan  agar  20  g/L  (Gambar 2A).  Agen  pemadat  seperti  agar  yang ditambahkan pada media mampu meningkatkan perkembangan ES. Agar dengan konsentrasi  tinggi  menyebabkan  akumulasi cadangan  protein  dan  pati  yang  mendukung perkembangan  ES  (Ibrahim  et  al,  2004; Ramarosandratana  et  al,  2001;  Tewary  et  al, 2000).
Gambar  2.  Pengaruh  konsentrasi  osmolit terhadap persentase ES jeruk keprok batu 55. (A) Agar ; (B) PEG
Pada  medium  dengan  penambahan PEG  10  %  ES  fase  globular  turun  signifikan menjadi  90 ± 2.4  %  (Gambar  2B).  Persentase ES  fase  hati  meningkat  signifikan  sampai penambahan  PEG  5  %,  menurun  pada  7.5  % dan  kembali  meningkat  pada  10  %  PEG. Persentase ES fase torpedo semakin meningkat dari  0.5 ± 0.4  %  pada  kontrol  (tanpa  PEG) menjadi 1.8 ± 0.7 % pada penambahan PEG 10
%,  sedangkan  persentase  fase  kotiledon  pada medium  kontrol  maupun  dengan  penambahan PEG 2.5 – 10 % tidak berbeda nyata (Gambar 2B).  Hasil  penelitian  ini  mendukung  apa  yang telah dilaporkan sebelumnya yang melaporkan bahwa  PEG  merupakan  polimer  etilen  oksida yang  mengontrol  air.  Atom  oksigen  pada monomer  tersebut  dapat  mengikat  molekul  air melalui  ikatan  hidrogen  sehingga  terjadi penurunan  potensial  air  pada  media  (Steuter, 1981). Selain itu, penurunan potensial air pada media dapat mempengaruhi kandungan poliamin  endogen  (Stasolla  et  al,  2003)  dan meningkatkan sintesis enzim protease (Gardner,  1991).  Poliamin  berperan  dalam percepatan  perkecambahan  ES  pada  proses embriogenesis  somatik  pada  tanaman  Picea glauca  (Stasolla  et  al,  2003).  Sementara  itu enzim protease yang semakin aktif menyebabkan akumulasi prolin semakin tinggi sehingga  menstimulasi  sintesis  asam  absisat (ABA)  yang  dapat  mempercepat  maturasi  ES (Gardner, 1991).

## KESIMPULAN
Penambahan  PEG  dan  peningkatan konsentrasi agar pada media maturasi menurunkan  persentase  ES  jeruk  keprok  batu 55 fase globular.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  hibah Kerjasama  Kemitraan  Penelitian  Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T) 2011.

## DAFTAR PUSTAKA
Agrimas Kapitalindo. 2007. Prospek dan Arah Pengembangan Agribisnis: Jeruk, diunduh 10 Agustus 2011, <http://www.agrimaskapitalindo.com>. Ali,  S.B.G.M.,  Kourosh  V.,  Hassan  B.  S.,
Siamak  K.  and  Charles  L.  2010.
‘Enhancement Of Maturation and Germination  Of  Somatic  Embryos  in Persian  walnut  (Juglans  regia  l.)  Using Osmolites, Hormones and Cold Treatments’,  African  Journal  of  Food Science., vol. 4, no.12, pp. 735 –743.
Gardner,  F.P.,  Pearce  R.B.  and  Mitchell  R.  L.
1991.  Fisiologi  Tanaman  Budidaya. Terjemahan:  Herawati  Susilo.  UI  Press. Jakarta.
Hardiyanto.  and    Suprianto  A.  2010.  Jeruk Keprok Variety Batu 55. Balai Penelitian Tanaman  Jeruk  dan  Buah  Subtropik. Malang.
Hussein,  S.,  Ibrahim  R.  and  Kiong  A.  2006.
Somatic Embryogenesis: An Alternative Method  for  In  Vitro  Micropropagation. Iranian  Journal  Of  Biotechnology,  vol. 4, no. 3
Ibrahim,  M.S.D.,  Rostiana  O.  and  Khumaida
N.  2010.  Pengaruh  Umur  Eksplan terhadap Keberhasilan Pembentukan Kalus Embriogenik pada Kultur
Meristem  Jahe    (Zingiber  officinale Rosc). Jurnal  Litri,  vol.    16,  no.  01,  pp. 37-42.
Korbes,  A.P.  and  Droste  A.  2005.  Carbon Sources  and  Polyethylene  glycol  on Soybean  Somatic  Embryo  Conversion.
Pesquisa  Agropecuaria  Brasileira,  vol.
40, no 3
Lengkong,  E.F.  2009.  Regenerasi  Tanaman
Melalui  Embriogenesis  Somatik  pada Kentang  Unggul  Lokal  Siperjohn  Asal
Minahasa Selatan. Formas, vol. 2, no. 4, pp. 244-249.
Martin,  B.M.,  Sesmero  R.,  Quesada  M.A., Alfaro  F.P.  and  Romero  C.S.  2011. Water  Relations  in  Cilture  Media Influence Maturation Of Avocado Somatic  Embryos.  Journal  Of  Plant Physiology, vol. 168, pp. 2028-2034.
Miah,  M.N.,  Sahina  I.  and  Hadiuzzaman  S.
2002.  Regenaration  of  Planlets  Through Somatic  Embryogenesis  from  Nucellus Tissue of Citrus macroptera, vol. 12, no.
2, pp.167-172. Mukhtar, R., Khan M.M., Rafiq R., Shahid A. and Khan F.A. 2005. In Vitro Regeneration and Somatic Embryogenesis  in  (Citrus  aurantifolia and Citrus sinensis). International Journal Of Agriculture and Biology, vol. 7, pp. 3.
Murashige,  T.  and  Tucker  D.P.H.  1969.
Growth  Factor  Requirements  Of  Citrus Tissue  Culture,  In:  International  Citrus symposium. Riverside. Proceeding. Riverside:  University  Of  California,  pp. 1155-1161.
Ramarosandratana,  A.,  Harvengt  L.,  Bouvet
A.,  Calvayrac  R.  and  Paques  M.  2001.
Effects Of Carbohydrate Source, Polyethylene  Glycol  and  Gellan  Gum Concentration  on  Embryonal-Suspensor Mass (Esm) Proliferation and Maturation of  Maritime  Pine  Somatic  Embryos.  In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, vol. 37, pp. 29-34.
Ravindra  B.,  Choundhury  H.  and  Tandon  P. 2004. Initiation, Maintenance and Maturation  of  Somatic  Embryos  from Thin  Apical  Dome  Sections  in  Pinus kesiya  (Royle  ex.  Gord)  Promoted  by Partial  Desiccation  and  Gellan  Gum, Scientia  Hortikultura.  vol.102,  pp.449- 459.
Ricci, A.P., Filho F.D.A.A.M., Mendes B.M.J. and  Piedade  S.M.D.S.  2002.  Somatic Embryogenesis  In  Citrus  sinensis,  C. reticulata  dan  C.  nobilis  x  C.  deliciosa, Scientia  Agricola,  vol.  59,  no.1,  pp.  41- 46.
Stasolla, C., Egertsdotter U., Craig D., Liu W. and  Sederoff  R.R.  2003.  The  Effects  of Polyethylene Glycol on Gene Expression of  Developing  White  Spruce  Somatic Embryos. Plant Physiology, vol. 131, pp. 49–60.
Steuter,  A.A.  1981.  Water  Potential  of Aqueous  Polyethylene  Glycol.  Plant Physiol, vol. 67, pp. 64-67. Tewary,  A.S.,  Raghunath  M.K.  and  Sarkar  A.
2000.  In  vitro  Response  of  Promising
Mulberry  (Morus  sp.)  Genotypes  for Tolerance  to  Salt  and  Osmotic  Stresses, Plant  Growth  Regulation,  vol.  30,  pp. 17–2.