## EVALUASI PRIMER GEN COI SEBAGAI BIOMARKER KETERTELUSURAN IKAN MENGGUNAKAN BIOINFORMATIKA

## Roni Nugraha, Puspita Sari Dewi, Mala Nurilmala
Departemen Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB University, Jalan Agatis Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680 Jawa Barat
Diterima: 1 Oktober 2021/Disetujui: 17 Maret 2022 *Korespondensi:  rnugraha@apps.ipb.ac.id
Cara sitasi : Nugraha R, Dewi PS, Nurilmala M. 2022. Evaluasi primer gen COI sebagai biomarker ketertelusuran ikan menggunakan bioinformatika. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia. 25(1):67-
79.

## Abstrak
Gen cytochrome oxidase I (COI) merupakan bagian dari bahan genetik mitokondria yang sering digunakan sebagai penanda spesies pada system ketertelusuran produk perikanan. Gen COI ini diperbanyak dari jaringan ikan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan primer universal. Akan tetapi, ikan merupakan spesies yang memiliki keragaman yang tinggi, sehingga primer universal ini tidak sepenuhnya cocok dengan gen COI ikan. Oleh karena itu, penelitian yang bertujuan untuk mengevaluasi kecocokan primer universal di berbagai gen COI ikan perlu untuk dilakukan. Pada penelitian ini, primer universal dicocokkan dengan 33 sekuen spesies ikan dari GenBank NCBI. Sekuen dianalisis dengan membuat Percent Identity Matrix (PIM) dan pohon filogenetik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak semua primer memiliki kualitas yang baik. Primer CO1shark25 dan CO1shark315 sejajar dengan 31-32 sekuen, namun belum memenuhi parameter ideal sebuah primer. Oleh karena itu, didesain beberapa primer universal baru yang sesuai dengan kriteria primer ideal . Desain primer baru dibuat dan dievaluasi menggunakan program PerlPrimer dan OligoEvaluator. Primer mini-barcode universal ikan dari sekuen Lagocephalus lagocephalus, Takifugu vermicularis, Arothron hispidus, Hypanus americanus, Isurus oxyrhyncus, dan Katsuwonus pelamis telah dirancang dan dievaluasi untuk alternatif biomarker. Kata kunci: DNA barcoding, in silico , primer, traceability

## Evaluation of COI Gene Primer as a Biomarker Traceability using Bioinformatics

## Abstract
Traceability is carried out to provide information for tracking fish species, especially of high economic value and vulnerable to extinction. Bioinformatics can predict biomarker for fish traceability. This study was aimed to evaluate widely used primer sequences of COI gene for fish traceability and identify new universal primer sequences. Primers used in previous researches were evaluated and aligned with 33 fish species sequences from the NCBI GenBank. The relationship of those 33 fish species was evaluated using Percent Identity Matrix (PIM) and phylogenetic trees. The results showed not all primers have a good qual- ity. CO1shark25 and CO1shark315 primer can be aligned to 31-32 fish sequences but did not fulfilled the ideal primer parameters. Therefore, several new universal primers were designed that fit the ideal criteria. The primer was designed and evaluated by using PerlPrimer and OligoEvaluator software. Fish universal mini-barcode primers from Lagocephalus lagocephalus, Takifugu vermicularis, Arothron hispidus, Hypanus americanus, Isurus oxyrhyncus and Katsuwonus pelamis sequences successfully designed and evaluated for alternative biomarkers.
Key word: DNA barcoding, in silico, primer, traceability
Available online: journal.ipb.ac.id/index.php/jphpi
Evaluasi primer gen COI sebagai biomarker, Nugraha et al.

## PENDAHULUAN
Insiden mislabeling dan substitusi ilegal produk perikanan disebabkan karena motif ekonomi yang dapat dilakukan secara sengaja maupun tidak disengaja. Kasus ini marak terjadi pada beberapa tahun terakhir. Kasus substitusi produk ditemukan pada beberapa penelitian. Sultana et al. (2017) dalam penelitiannya menemukan substitusi surimi ikan label Alaska pollock dengan ikan nila dan lele. Spencer dan Bruno (2019) menemukan kasus mislabeling pada ikan kakap merah yang sebenarnya adalah ikan nila. Kesalahan label juga ditemukan pada produk ikan seabass (kakap) yang sebenarnya merupakan ikan patin ( Pangasionodon hypopthalmus ) pada penelitian Minoudi et al. (2020).   Ajitama (2017)  menemukan kerupuk udang yang tidak mengandung udang. Produk roasted fillet berlabel ikan cod  berdasarkan hasil penelitian Wen et al. (2017) ternyata  menggunakan ikan buntal yang beracun ( Lagocephalus spp.). Kasus mislabeling fillet tongkol s ebagai tuna sirip biru juga ditemukan pada penelitian Maralit et al. (2013). Jual beli dan konsumsi ikan hiu di Indonesia yang terdaftar dalam red list International Union for Conservation of Nature (IUCN) juga ditemukan dalam penelitian Muttaqin et al. (2019) dan Mopay et al. (2017). Penjaminan terhadap kualitas dan mutu serta sistem ketertelusuran terpadu terhadap produk perikanan telah menjadi suatu kewajiban yang harus dipenuhi oleh pihak produsen produk pangan di era globalisasi. Beberapa metode identifikasi spesies berbasis morfologis dan protein telah dicoba untuk mendeteksi ikan namun metode tersebut dinilai kurang efektif. Identifikasi spesies ikan yang dilakukan secara tradisional tergantung pada karakteristik morfologis seperti bentuk tubuh, jumlah sisik atau sirip, dan pola warna. Karakteristik tersebut tidak cukup untuk identifikasi oleh para non-spesialis atau pada kasus sampel yang tidak lengkap dan spesies yang samar (Panprommin et al. 2019). Sampai saat ini telah banyak metode identifikasi spesies ikan yang berbasis protein biomarker, misalnya metode elektroforesis (Ataman
et al. 2006), teknik imunologi (Fernández et al. 2002), dan pendekatan kromatografi (Horstkotte dan Rehbein 2003), tetapi metode-metode tersebut tidak cocok untuk ikan komersial karena degradasi protein yang disebabkan oleh panas (Chin et al . 2016). Metode berbasis DNA dapat menjadi solusi alternatif bagi permasalahan tersebut. Metode tersebut dipilih untuk identifikasi spesies karena memiliki beberapa keunggulan jika dibandingkan dengan teknik berbasis protein, yaitu keberadaan DNA yang mudah ditemukan pada setiap jenis sel, stabilitas molekul DNA yang tinggi, dan spesifisitas yang tinggi. Metode berbasis protein memiliki keterbatasan pada produk olahan,  misalnya kemungkinan denaturasi protein dan modifikasi epitop spesifik yang terkait dengan proses pengolahan. Metode PCR merupakan metode berbasis DNA yang paling umum untuk digunakan karena kesederhanaan, ketahanan, spesifisitas dan kepekaannya (Costa et al. 2016). Metode DNA barcoding yang berdasar pada urutan nukleotida parsial dari gen mitokondria sitokrom oksidase I (COI) dapat berfungsi sebagai inti dari sistem bioidentifikasi global untuk hewan (Hebert et al . 2003a). Metode DNA barcoding saat ini dikenal sebagai teknik untuk mengidentifikasi dan menentukan suatu jenis atau spesies. Metode ini  tergantung pada urutan nukleotida pendek atau sekuen yang didapatkan dari GenBank, misalnya NCBI, BOLD dan INSDC (Govender et al. 2019). Jenis gen yang umum digunakan dalam DNA barcoding kelompok hewan yaitu gen mitokondria cytochrome oxsidase 1 (COI) (Wallace et al. 2012). Saat ini, telah banyak primer universal yang dibuat untuk mengampilifikasi gen COI. Primer- primer tersebut diambil dari bagian yang lestari. Namun, mayoritas spesies-spesies yang digunakan untuk analisis kelestarian primer tersebut berasal dari daerah subtropis dan merupakan ikan bertulang sejati. Oleh karena itu, penelitian bertujuan untuk menentukan kelestarian primer-primer tersebut di ikan- ikan daerah tropis dan juga ikan-ikan Elasmobranchii .

## METODE
Alat dan Bahan
Penelitian ini menggunakan perangkat lunak MEGA X versi 10.0.5 (Kumar et al. 2018), PerlPrimer, situs ClustalOmega (https://www. ebi.ac.uk/Tools/msa/) (Li et al. 2015), situs
OligoEvaluator™ (https://www.oligoevaluator.
com/LoginServlet/) (Mehta et al. 2015) dan situs heatmap (https://www.heatmapper.ca/).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 33 sekuen DNA ikan gen COI parsial yang diunduh dari database National Center for Biotechnology (NCBI) (https:// www.ncbi.nih.gov/) dan delapan pasang primer ikan dengan gen pengkode COI yang diambil dari penelitian Ward et al. (2005), Mikkelsen et al. (2006), Baldwin et al. (2009),
Sultana et al. (2017), Govender et al. (2019),
Fotedar et al. (2019), Jennings et al. (2019), dan Abdullah et al. (2019).
Identifikasi dan evaluasi primer dari pustaka
Primer-primer yang berasal dari penelitian sebelumnya dikumpulkan dan dievaluasi. Primer yang dikumpulkan adalah primer dengan gen COI, baik universal ikan maupun spesifik ikan. Panjang produk primer yang dikumpulkan beragam, mulai dari DNA mini barcode sampai full length . Terdapat delapan pasang primer yang berhasil dikumpulkan. Primer- primer tersebut dievaluasi spesifisitasnya dengan menggunakan situs BLAST-NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) kemudian dievaluasi spesifikasinya menggunakan situs OligoEvaluator™ (http://www.oligoevaluator. com/LoginServlet/). Hasil analisis spesifisitas dianalisis lebih lanjut untuk dibuat data
heatmap. Data evaluasi spesifikasi atau kriteria primer yang didapatkan kemudian disajikan dalam bentuk tabel.
Pengumpulan sekuen
Sekuen dikumpulkan dari situs GenBank
NCBI (https://www.ncbi.nih.gov/) untuk diunduh dalam bentuk fasta dan digunakan dalam penelitian ini. Terdapat 33 total sekuen ikan dengan gen COI parsial. Sekuen-sekuen yang diunduh adalah sekuen ikan yang terancam punah, ikan dengan nilai ekonomi
tinggi dan ikan buntal yang beracun. Sekuen- sekuen tersebut diunduh untuk dilakukan analisis lebih lanjut seperti Percent Identity Matrix (PIM), pembuatan pohon filogenetik, pembuatan primer, dan analisis keragaman primer. Profil sekuen-sekuen yang digunakan disajikan dalam bentuk tabel.
Pembuatan pohon filogenetik (Tamura et al. 2004) Pohon filogenetik dibuat dengan melakukan tiga tahapan utama. Tahap pertama yaitu memperoleh sekuen. Sekuen yang tidak dipilih dengan baik maka akan menghasilkan pohon yang tidak valid. Sejumlah 33 sekuen digunakan dalam pembuatan pohon filogenetik ini. Tahap kedua yaitu penjajaran ( alignment) sekuen. Tahap ini juga dilakukan untuk mengedit nama-nama sekuen yang terlalu panjang menjadi lebih singkat yaitu nama spesies dan kode akses. Setelah penjajaran selesai dilakukan, data disimpan dalam bentuk fasta. Tahap ketiga yaitu membuat pohon filogenetik. Ada beberapa metode yang dapat digunakan untuk memperkirakan pohon yaitu Neighbor Joining, UPGMA Maximum
Parsimony, Inferensi Bayesian, dan Maximum
Likelihood (ML). Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah Neighbor Joining .
Metode Neighbor Joining dipilih pada menu
“ Analysis preferences ”, kemudian “ statistical method ”. Tahap selanjutnya yaitu penentuan jumlah bootstrap 1000 pada menu “ no. of bootstrap replication ”, kemudian pada menu “ substitution model” dipilih Kimura 2-parameter model. Pilihan menu yang lainnya disesuaikan dengan default .
Desain primer dan evaluasi primer (Davidovic et al. 2014)
Perancangan primer membutuhkan sekuen ikan gen COI yang diunduh dari pangkalan data NCBI. Primer dibuat menggunakan perangkat lunak PerlPrimer dan dievaluasi dengan BLAST-NCBI serta OligoEvaluator. Primer yang dibuat adalah primer universal ikan mini-barcode dengan gen COI. Primer tersebut dibuat dengan menggunakan perangkat lunak PerlPrimer
Evaluasi primer gen COI sebagai biomarker, Nugraha et al.
dengan cara memasukkan salah satu sekuen ikan. Karakteristik primer seperti panjang produk amplikon, suhu Tm, dan persen GC diatur sebelum memasukkan sekuen. Perangkat lunak PerlPrimer akan memberikan beberapa kandidat primer lengkap dengan karakteristik masing-masing primer seperti suhu lebur (Tm), panjang primer, %GC, dan panjang amplikon. Kandidat primer dievaluasi kembali satu persatu menggunakan website OligoEvaluator dan BLAST-NCBI untuk mengetahui primer yang terbaik. Primer yang baik dapat dinilai dari spesifikasi karakteristik primer dan analisis spesifisitas primer.

## Penentuan kualitas spesifikasi  primer
Calon primer yang didapatkan dari PerlPrimer dianalisis menggunakan website OligoEvaluator. Penentuan kualitas primer bertujuan untuk mengetahui spesifikasi primer berdasarkan karakteristik tertentu. Karakteristik primer yang harus diperhatikan yaitu persen GC, suhu lebur (T m ), perbedaan Tm primer forward dan reverse , secondary structure, dan primer dimer . Persen GC terbaik berkisar antara 40-60%, suhu T m berkisar antara 50-62 ºC dengan perbedaan Tm primer forward dan reverse tidak lebih dari 5 ºC, tidak terbentuk struktur sekunder dan tidak terjadi primer dimer. Hasil evaluasi yang didapatkan disajikan dalam bentuk tabel.

## Analisis spesifisitas primer
Analisis spesifisitas dilakukan untuk menentukan keunikan primer yang dibuat . Analisis spesifisitas primer dilakukan dengan alignment menggunakan BLAST- NCBI dengan melihat daftar nama spesies yang ditampilkan. Data hasil alignment BLAST berupa daftar spesies yang memiliki kecocokan dengan urutan basa (sekuen) primer yang diuji. Primer universal akan menampilkan daftar nama spesies ikan yang beragam, sedangkan primer yang bersifat spesies-spesifik akan menampilkan daftar nama ikan tertentu. Data yang didapatkan diolah menjadi bentuk tabel untuk dilakukan analisis keragaman primer yaitu dalam bentuk heatmap.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Evaluasi Primer yang Berasal dari Pustaka
Primer yang berasal dari pustaka, diidentifikasi untuk mengetahui jenis primer, apakah primer tersebut bersifat spesifik atau universal. Primer juga dievaluasi spesifikasinya berdasarkan kriteria ideal primer. Primer yang dipilih adalah primer ikan dengan gen pengkode COI . Evaluasi primer dilakukan dengan memperhatikan beberapa karakteristik seperti suhu lebur primer (T m ), konten GC, struktur sekunder, dan primer dimer. Hasil evaluasi primer dapat dilihat pada Table 1 . Hasil yang didapatkan berdasarkan Table 1 , terdapat delapan pasang primer forward dan reverse yang berasal dari beberapa pustaka. Panjang sekuen atau urutan basa nukleotida berkisar antara 20-26 panjang basa (pb). Wu et al. (2004) menyatakan bahwa panjang suatu primer berkisar antara 16-28 pb, dengan perbedaan panjang antara primer forward dan reverse tidak lebih dari tiga nukleotida. Suhu lebur primer atau nilai T m yang tertinggi diperoleh pada primer Fish F1 dan Fish R1 yaitu sebesar 71,0 dan 73,1°C, sedangkan nilai Tm terendah didapatkan pada primer COIF-ALT dengan nilai 44,1°C. Suhu lebur atau melting temperature (T m ) merupakan faktor kritis dalam keberhasilan proses PCR. Umumnya, primer memiliki nilai Tm berkisar antara 50–62 ° C. Perbedaan suhu Tm antara primer F dan primer R sebaiknya tidak lebih dari 5°C. (Chuang et al. 2013). Primer Mikkelsen et al. (2006)  dan  primer Baldwin et al. (2009) tidak sesuai dengan kriteria karena memiliki perbedaan suhu Tm lebih dari 5°C. Komposisi GC pada primer adalah nilai persentase yang menunjukkan rasio nukleotida ‘G’ dan ‘C’ yang muncul pada sekuen primer. Persentase konten GC pada primer Mikkelsen et al. (2006), Baldwin et al.
(2009), primer F Govender et al. (2019) dan Jennings et al. (2019) berkisar antara 25- 34.6%. Hal ini tidak sesuai dengan pernyataan Chuang et al. (2013), yaitu proporsi GC yang tepat untuk primer pada umumnya adalah 40-

## Table 1 Chemical characteristics of snakehead murrel
Primer Code Sequence Product Length (bp) Tm (°C) GC% Secondary structure Primer dimer Ref Fish F1 (F) TCAACCAACCACAA 655 73.1 46.2 Moderate No Ward et al. (2005) AGACATTGGCAC Fish R1 (R) TAGACTTCTGGGTGG 655 71.0 46.2 Weak No Ward et al. (2005) CCAAAGAATCA COIF-ALT ACAAATCAYAARGA 657 44.1 25.0 None No Mikkelsen et al. (2006) YATYGG COIR-ALT TTCAGGRTGNCCRAA 657 51.8 33.3 None No Mikkelsen et al. (2006) RAAYCA FISH-BCL TCAACYAATCAYAA 655 58.2 30.8 Very weak No Baldwin et al. (2009) AGATATYGGCAC FISH-BCH TAAACTTCAGGGTG 655 66.9 34.6 Very weak No Baldwin et al. (2009) ACCAAAAAATCA Forward (F) ATCACAAAGACATT 295 66.6 45.5 None No Sultana et al. (2017) GGCACCCT Reverse (R) AATGAAGGGGGGAG 295 69.8 52.2 Very weak No Sultana et al. (2017) GAGTCAGAA Lobster Minibar (F) GGWGATGAYCAAAT 313-319 53.7 27.3 None No Govender et al . (2019) TTAYAAGT Lobster Minibar (R) CCWACTCCTCTTTCT 313-319 56.2 43.5 None No Govender et al . (2019) ACTATTCC CO1shark25 (F) AGCAGGTATAGTTG 248 66.2 52.2 None No Fotedar et al. (2019) GAACAGCCC CO1shark315 (R) GCTCCAGCTTCTACT 248 63.2 60.0 Weak No Fotedar et al. (2019) CCAGC FISH-F6 ACYAAYCACAAAGA 740 57.7 31.8 None No Jennings et al. (2019) YATTGGCA FISH-R7 TARACTTCTGGRTGD 740 57.1 34.6 Weak No Jennings et al. (2019) CCRAAGAAYCA FCOI- T. lepturus TGAAACCTGCGGCC 212 66.5 50.0 None No Abdullah et al. (2019) ATTACT RCOI- T. lepturus TGGGTGGCCGAAGA 212 69.7 50.0 None No Abdullah et al. (2019) ATCAAA
Evaluasi primer gen COI sebagai biomarker, Nugraha et al.
60% Analisis struktur sekunder menunjukkan hasil yang beragam yaitu none, very weak, weak, dan moderate. Struktur sekunder dapat terjadi dimungkinkan karena nilai Tm yang terlalu tinggi pada suatu primer (Borah 2011). Ozturk dan Can (2017) menyatakan bahwa struktur sekunder pada primer dapat menghambat proses PCR dan dapat menurunkan kualitas hasil PCR, sehingga harus dihindari. Karakteristik primer dimer berdasarkan Table 2 menunjukkan tidak terjadi primer dimer pada seluruh primer.
Vallone dan Butler (2004) mengemukakan bahwa penempelan dari kedua primer akan menghasilkan dimer. Terjadinya dimer dapat memberi efek negatif terhadap hasil PCR, sehingga hibridisasi kedua primer harus dihindari. Kriteria primer selanjutnya adalah repeats . Repeats merupakan dinukleotida yang berulang dalam primer, adanya repeats dapat menyebabkan terjadinya penempelan primer di tempat yang tidak diinginkan ( mispriming ) (Borah et al. 2011). Pengulangan nukleotida tunggal atau runs dan repeats sebaiknya dihindari karena dapat menyebabkan tergelincir di sepanjang segmen DNA dan juga menyebabkan terbentuknya struktur hairpin loop . Jika tidak dapat menghindari repeats dan runs karena template DNA, maka batas maksimum yang disarankan adalah 4 basa nukleotida (Lorenz 2012). Primer FISH- BCH Baldwin et al. (2009) dan primer reverse Sultana et al. (2017) terindikasi adanya runs, yaitu pengulangan ‘AAAAAA’ dan ‘GGGGGG’.

## Evaluasi keragaman primer pada berbagai jenis ikan
Primer-primer yang didapatkan dari berbagai pustaka dievaluasi keragamannnya pada 33 sekuen gen COI dari berbagai jenis ikan yang diunduh melalui database NCBI
( Table 2 ). Sekuen-sekuen tersebut terdiri atas sepuluh ordo berbeda yaitu Myliobatiformes,
A n g u i l l i f o r m e s , Te t r a o d o n t i f o r m e s , Siluriformes, Rhinopristiformes,Lamniformes, Carcharhiniformes,Orectolobiformes, Pristiformes, dan Scombriformes.
Hasil yang didapatkan berdasarkan Figure 1 menunjukkan adanya pengelompokan atau
clustering . Pengelompokan dan percabangan yang terbentuk didukung dengan nilai bootstrap yang tinggi yang menentukan kestabilan dari pembentukan kelompok. Pengelompokan dan kedekatan antar spesies tersebut didukung oleh nilai jarak genetik dan perbedaan nukleotida. Sebuah kelompok organisme yang anggota-anggotanya memiliki banyak kesamaan karakter atau ciri dianggap memiliki hubungan yang sangat dekat dan diperkirakan diturunkan dari satu nenek moyang; pola genetik yang sama akan memiliki kecenderungan menjalani jalur evolusi yang sama (Li dan Graur 1991). Pohon filogenetik selain menunjukkan kekerabatan antar spesies yang diperbandingkan, juga menggambarkan perubahan yang terjadi pada gen penanda untuk masing-masing spesies. Panjang cabang mewakili sejumlah besar perubahan evolusi yang terjadi pada suatu spesies. Semakin panjang cabang maka semakin banyak perubahan evolusi yang terjadi (Parks dan Goldman 2014). Dua klaster besar yaitu pada bagian atas merupakan klaster ikan bertulang rawan ( Elasmobranchii ) dan pada bagian bawah merupakan klaster ikan bertulang sejati ( Teleostei ). Klaster bagian atas ditempati oleh anggota ordo Carcharhiniformes, Orectolobiformes, Lamniformes, Pristiformes, Rhinopristiformes dan Myliobatiformes dengan nilai bootstrap sebesar 29-100%. Klaster di bagian bawah pohon filogenetik ditempati oleh anggota ordo Siluriformes,
Anguilliformes, Tetraodontiformes, dan Scombriformes dengan nilai bootstrap sebesar 44-100%. Pengelompokan dalam satu klaster untuk ordo yang sama menggambarkan kedekatan kekerabatannya. Semakin banyak sekuen DNA yang memiliki tingkat homologi yang tinggi maka posisinya di dalam percabangan pohon filogeni akan berdekatan.

## Keragaman Primer Pustaka
Analisis keragaman primer pustaka dilakukan untuk mengetahui hasil penjajaran antara primer dengan 33 sekuen yang digunakan. Analisis keragaman primer dilakukan untuk mengetahui terjadinya kecocokan atau sebaliknya, primer dapat tidak
Table 2 Sequence of COI from fish species used for primer conservation analysis Accession ID Species Common name Length (bp) JF493866.1 Manta birostris Giant oceanic manta ray 652 MH235670.1 Mobula japanica Spinetail mobula 658 MH235672.1 Mobula tarapacana Chilean devil ray 658 HQ575830.1 Hypanus americanus Southern stingray 652 KU692247.1 Anguilla bicolor Indonesian shortfin eel 652 MK572031.1 Anguilla bengalensis Mottled eel 655 KM610420.1 Anguilla nebulosa Mottled eel 648 MG816649.1 Arothron hispidus White-spotted puffer 655 JF730882.1 Lagocephalus lagocephalus Oceanic puffer 655 JQ681820.1 Takifugu pardalis Puffer fish 677 KY514079.1 Takifugu vermicularis Purple puffer 682 KC959930.1 Tetraodon nigroviridis Green spotted puffer 652 MG837968.1 Pangasianodon hypophthalmus Siamese shar 652 KY118584.1 Pangasianodon gigas Mekong giant catfish 639 KM232630.1 Pangasius pangasius Pangas catfish 655 MK422139.1 Rhynchobatus australiae Whitespotted guitarfish 634 MG837943.1 Isurus oxyrinchus Shortfin mako shark 652 KP193429.1 Alopias pelagicus Pelagic thresher shark 652 MG837909.1 Carcharhinus falciformis Silky shark 652 JQ365585.1 Sphyrna lewini Scalloped hammerhead 652 FJ519544.1 Sphyrna zygaena Smooth hammerhead 652 JN312505.1 Prionace glauca Blue Shark 652 HQ171611.1 Carcharhinus amblyrhynchos Grey reef shark 652 JN989316.1 Sphyrna mokarran Great hammerhead 652 FJ519251.1 Rhincodon typus Whale shark 652 MF977764.1 Pristis pristis Largetooth sawfish 567 KT307170.1 Cetorhinus maximus Basking shark 635 EU398627.1 Carcharhinus longimanus Oceanic whitetip shark 655 KT074158.1 Thunnus thynnus Atlantic bluefin tuna 629 JN653476.1 Katsuwonus pelamis Skipjack tuna 618 JN312307.1 Thunnus albacares Yellow fin tuna 652 KP975847.1 Thunnus alalunga Tuna albacore 651 KY372230.1 Thunnus obesus Bigeye tuna 634
Evaluasi primer gen COI sebagai biomarker, Nugraha et al.
dapat disejajarkan dengan sekuen. Analisis keragaman primer dilakukan menggunakan situs BLAST-NCBI. Data hasil BLAST analisis keragaman primer diolah dalam bentuk .csv untuk dibuat visualisasi gambar berupa heatmap. Data heatmap dibuat menggunakan situs heatmapper.ca kemudian file bentuk .csv diunggah ke dalam situs tersebut, pengaturan disesuaikan dengan default sehingga didapatkan heatmap seperti pada Figure 2 . Berdasarkan Figure 2 dapat dilihat bahwa terdapat dua klaster utama yaitu klaster atas dan klaster bawah. Klaster atas terdiri dari primer- primer yang dapat mendeteksi (sejajar) dengan banyak sekuen yaitu 22-33 sekuen (universal ikan) sedangkan klaster bawah adalah primer yang dapat sejajar hanya pada sedikit sekuen yaitu 5-10 sekuen. Berdasarkan hasil heatmap dapat dikatakan bahwa diperlukan primer alternatif mini-barcode yang dapat mendeteksi seluruh sekuen dengan spesifikasi primer yang baik yang sesuai dengan kriteria primer yang ideal. Primer forward Baldwin et al.
(2009) dan Govender et al. (2019) berada pada klaster bawah (biru) yang dapat sejajar dengan sedikit spesies (6 dan 7 spesies), sedangkan primer reverse Baldwin et al. (2009) dan Govender et al. (2019) berada pada klaster atas (kuning) yang sejajar terhadap banyak spesies (27 dan 30 spesies). Perbedaan jumlah spesies yang sejajar terhadap primer dapat disebabkan karena pemilihan wilayah sekuen yang tidak lestari ( conserve ) pada primer forward Baldwin et al. (2009)  dan Govender et al. (2019) sehingga primer tersebut hanya dapat mendeteksi sedikit spesies. Sunarno dan Novriani (2016) menemukan masalah pada pembuatan primer, yaitu tidak didapatkan daerah yang 100% lestari ( conserve ).
Hasil analisis keragaman primer menunjukkan adanya ketidaksesuaian klaim pada beberapa primer terhadap hasil penjajaran yang dilakukan dengan 33 sekuen ikan yang digunakan. Hal ini dapat disebabkan karena gen COI memiliki wilayah lestari yang luas, sehingga mampu mendeteksi

## Figure 1 Phylogenetic tree of fish species used for primer conservation analysis
banyak sekuen ikan. Penyebab lainnya adalah homologi sekuen yang tinggi dan variasi sekuen yang tinggi intraspesies. Gen mitokondria COI memiliki tingkat konservasi yang tinggi dan memiliki tingkat variabilitas genetik yang sederhana di antara spesies yang berbeda-beda (Bingpeng et al. 2018). Hebert et al. (2003b) menyatakan, gen COI memiliki banyak bagian yang bersifat lestari sehingga dapat digunakan sebagai DNA barcoding pada sebagian besar spesies. Kelebihan dari gen ini yaitu hanya terjadi sedikit insersi atau delesi pada sekuennya.
Profil Rancangan Primer Primer-primer yang terdapat pada Table 2 , rata-rata memiliki tingkat spesifisitas yang kurang baik karena masih terdapat ketidaksesuaian klaim dengan hasil penjajaran dengan sekuen ikan. Hasil analisis spesifikasi atau kriteria primer dan spesifisitas primer berdasarkan Table 1 , terdapat banyak primer yang memiliki kekurangan untuk dijadikan sebagai primer ketertelusuran ikan. Oleh
karena itu, diperlukan alternatif primer yang baik, yang sesuai dengan kriteria primer pada umumnya. Primer dirancang dengan menggunakan perangkat lunak PerlPrimer kemudian dievaluasi dengan situs OligoEvaluator. Hasil rancangan primer beserta analisis spesifikasi berdasarkan karakteristik suhu lebur, persentase GC, struktur sekunder, primer dimer dan analisis spesifisitas dapat dilihat pada Table 3. Sekuen yang digunakan dalam pembuatan primer adalah sekuen dengan gen penyandi COI. Gen ini mempunyai sifat-sifat yang memenuhi persyaratan untuk menentukan identitas spesies pada hampir semua binatang tingkat tinggi. Gen COI dipilih untuk mempelajari karakteristik genetik karena sedikit mengalami delesi dan insersi pada sekuennya, serta bersifat lestari pada bagian sekuennya (Hebert et al. 2003a). Kriteria primer ideal untuk primer adalah primer harus sesuai dengan gen dari semua organisme yang diketahui dalam kelompok yang diminati, dan harus dapat menargetkan

## Figure 2 Analysis of primer conservation using heatmap
Evaluasi primer gen COI sebagai biomarker, Nugraha et al.
gen dari organisme yang tidak diketahui di tingkat sub-taksonomi, selanjutnya pasangan primer harus memiliki suhu leleh yang seimbang dan menghasilkan amplifikasi yang kuat (Green et al. 2015). Perancangan atau desain primer bertujuan untuk memperoleh primer yang tepat digunakan dalam amplifikasi DNA dengan metode PCR (Diss 2003). Primer dibuat dengan menggunakan enam jenis sekuen ikan yaitu Lagocephalus lagocephalus, Takifugu vermicularis, Arothron hispidus, Hypanus americanus, Isurus oxyrhyncus dan Katsuwonus pelamis. Panjang produk (ukuran amplikon) yang diinginkan berkisar antara 165-261 bp atau mini-barcodes. Hasil rancangan primer yang didapatkan memiliki suhu lebur (Tm), %GC, struktur sekunder, dan primer dimer yang baik. Suhu lebur primer berdasarkan Table 3 adalah sebesar 57-59°C. Chuang et al. (2013) dalam penelitiannya mengatakan bahwa
pada umumnya, primer memiliki nilai Tm berkisar antara 50-62°C. Persentase GC yang didapatkan yaitu sebesar 40-55%, hasil ini sesuai dengan pernyataan Chuang et al. (2013) yang menyebutkan bahwa komposisi GC pada urutan nukleotida primer berkisar antara 40- 60%. Primer dengan persentase GC tinggi lebih stabil jika dibandingkan dengan primer GC rendah (Mammedov et al. 2008). Primer dengan kandungan GC yang rendah diperkirakan tidak dapat menempel  secara  efektif  pada  target  DNA. Chuang et al. (2013) menyebutkan bahwa saat primer bertempelan dengan dirinya sendiri akan membentuk struktur sekunder bernama hairpin. Hasil pada Table 3 menunjukkan tidak ada primer dimer . Primer dimer merupakan proses saling berikatannya primer yang teramplifikasi sehingga menghasilkan data false-positive (Vallone dan Butler 2004).
Hasil rancangan primer telah sesuai dengan

## Table 3 Quality characteristic of the designed primer
Genbank ID Primer Sequence Length (bp) Tm (°C) GC% Secondary structure Primer dimer JF730882.1 Lagocephalus lagocephalus CTAGTATTTGGTGCCTGAG 213 57.0 47.3 None No CAGGTGCTCCGATTATTAG 57.1 47.3 None No KY514079.1 Takifugu vermicularis CAACATAAGCTTCTGACTGC 261 57.2 45.0 None No CACGAATAGAGGTGTTTGGT 58 45.0 None No MG816649.1 Arothtron hispidus CCTTTCTCCTTCTCCTAGC 219 58.4 52.6 None No GTTTGGTACTGAGAGATGG 56.9 47.3 None No HQ575830.1 Hypanus americanus TTTAGTCTTTGGTGCATGAG 212 58.2 40.0 None No GGGCACCAATTATTAAGGG 58.0 47.3 None No MG837943.1 Isurus oxyrhynchus ATCTCCCAATACCAAACAC 176 58.5 50.0 None No AGATGCTGGTAGAGGATAG 58.7 50.0 None No MG837943.1 Isurus oxyrhynchus CCTTCTTTCCTTCTACTCTTG 225 58.2 47.6 None No GTGTTTGGTATTGGGAGAT 57.6 50.0 None No JN653476.1 Katsuwonus pelamis CTTCCTCCATCTTTCCTTCTG 234 58.5 47.6 None No GAGGAGTTTGGTATTGGGAG 57.3 45 None No
kriteria primer dan dapat mendeteksi 30- 33 sekuen, sehingga rancangan primer ini dapat dijadikan alternatif untuk biomarker ketertelusuran ikan.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil evaluasi primer menunjukkan bahwa tidak semua primer memiliki spesifisitas dan spesifikasi yang baik. Hasil analisis keragaman primer menunjukkan, sekuen primer pustaka terbaik yang dapat digunakan untuk ketertelusuran ikan yaitu primer CO1shark25 dan
CO1shark315 yang dapat mendeteksi 31- 32 sekuen ikan, namun primer ini belum memenuhi kriteria primer yang ideal. Oleh karena itu, dibutuhkan primer universal ikan dengan spesifikasi dan spesifisitas primer yang baik. Primer mini-barcode universal ikan dari sekuen Lagocephalus lagocephalus, Takifugu vermicularis, Arothron hispidus, Hypanus americanus, Isurus oxyrhyncus dan Katsuwonus pelamis telah berhasil dirancang dan dievaluasi untuk alternatif biomarker. Primer hasil rancangan telah sesuai dengan kriteria primer yang ideal dan dapat mendeteksi 30-33 sekuen ikan.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Kami ucapkan terima kasih kepada
Program Pelaksanaan Penelitian Dasar Unggulan Perguruan Tinggi (PDUPT) dengan Judul Pendeteksi Produk Perikanan dalam Rangka Pengembangan Metode
Ketertelusuran ( Tracebility ) pada nomor 1/E1/ KP.PTNGH/2020 dan 2575/IT3.L1/PN2020.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdullah A, Sativa HA, Nurhayati T,
Nurilmala M. 2019. Pemanfaatan DNA barcoding untuk ketertelusuran label berbagai produk olahan ikan berbasis surimi komersial. Jurnal Pengolahan
Hasil Perikanan Indonesia. 22(3):508-519. Ajitama Y. 2017. Autentikasi Kerupuk Udang Dengan Metode DNA Barcoding. [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Ataman C, Çelik U, Rehbein H. 2006. Identification of some Aegean fish species by native isoelectric focussing. European
Food Research and Technology. 222(1- 2):99-104. Baldwin CC, Mounts JH, Smith DG, Weigt LA. 2009. Genetic identification and color descriptions of early life-history stages of Belizean Phaeoptyx and Astrapogon (Teleostei: Apogonidae) with comments on identification of adult Phaeoptyx . Zootaxa . 1-22. Bingpeng X, Heshan L, Zhilan Z, Chunguang W, Yanguo W, Jianjun W. 2018. DNA barcoding for identification of fish species in the Taiwan Strait. PLoS ONE . 13(6): e0198109.
Borah P. 2009. Primer designing for PCR.
Science Vision. 11(3):134-136. Chin TC, Adibah A, Hariz ZD, Azizah MS. 2016. Detection of mislabelled seafood products in Malaysia by DNA barcoding:
Improving transparency in food market.
Food Control. 64:247-256. Chuang LY, Cheng YH, Yang CH. 2013.
Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnology Letters. 35(10): 1-9. Costa H, Mafra I, Oliveira MBPP, Amaral JS. 2016. Encyclopedia of food and health.
RMFS. 177-183. Davidovic RS, Bozovic AM, Mandusic VL, Krajnovic MM. 2014. Methylation- specific PCR: four steps in primer design. Central European Journal of Biology.
9(12): 1127-1139.
Diss T. 2003. Molecular Biology in Cellular
Pathology. United Kingdom (UK): John Willey and Sons. Fernández A, García T, Asensio L, Rodríguez MÁ, González I, Lobo E, Hernández PE, Martín R. 2002. Identification of the clam species Ruditapes decussatus (grooved carpet shell), Venerupis rhomboides (yellow carpet shell) and Venerupis pullastra (pullet carpet shell) by ELISA.
Food and Agricultural Immunology. 14(1): 65-71. Fotedar S, Lukehurst S, Jackson G, Snow M. 2019. Molecular tools for identification of shark species involved in depredation incidents in Western Australian fisheries.
PLOS ONE 14(1): e0210500. Govender A, Groeneveld J, Singh S, Willows-
Evaluasi primer gen COI sebagai biomarker, Nugraha et al.
Munro S. 2019. The design and testing of mini-barcode markers in marine lobsters. PLOS ONE . 14(1): e0210492.
Green SJ, Venkatramanan R, Naqib A. 2015.
Deconstructing the polymerase chain reaction: understanding and correcting bias associated with primer degeneracies and primer-template mismatches. PLOS
ONE . 10(5):e0128122.
Hebert PDN, Ratnasingham S, deWaard JR.
2003a. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society of London . 270: 96-99. Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR. 2003b. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society of London . 270:313–321. Horstkotte B, Rehbein H. 2003. Fish species identification by means of restriction fragment length polymorphism and high‐ performance liquid chromatography. Food Science. 68(9):2658-2666.
Jennings WB, Ruschi PA, Ferraro G, Quijada CC, Silva-Malanski ACG, Prosdicimi F, Buckup PA. 2019. Barcoding the Neotropical freshwater fish fauna using a new pair of universal COI primers with a discussion of primer dimers and M13 primer tails. Genome. 0:1-7. Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K. 2018. MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution. 35(6):1547-1549. Li WH, Graur D. 1991. Fundamentals of Molecular Evolution Second Edition .
Dallas (USA): Sinauer. Lorenz TC. 2012. Polymerase Chain Reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of
Visualized Experiments. 63(3998):1-15.
Mammedov TG, Pienaar E, Whitney SE, TerMaat JR, Carvill G, Goliath R,Subramanian A, Vilijoen HJ. 2008. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates.
Computational Biology and Chemistry.
32(6): 452-457.
Maralit BA, Roselyn D, Aguila A, Minerva Fatimae H, Ventolero A, Sweedy Kay
L, Perez A, Demian A. Willette B,
Mudjekeewis D, Santos. 2013. Detection of mislabeled commercial fishery by- products in the Philippines using DNA barcodes and its implications to food traceability and safety. Food Control .
33:119-125
Mikkelsen PM, Bieler R, Kappner I, Rawlings
TA. 2006. Phylogeny of Veneroidea (Mollusca: Bivalvia) based on morphology and molecules. Zoological Journal of the Linnean Society . 148:439-521. Minoudi S, Karaiskou N, Avgeris
M, Gkagkavouzis K, Tarantili P, Triantafyllidou D. 2020. Seafood mislabeling in Greek market using DNA barcoding. Food Control. 113:107213. Mopay M, Wullur S, Kaligis E. 2017. Identifikasi molekuler sirip ikan hiu yang didapat dari pengumpul sirip di Minahasa. Jurnal
Pesisir dan Laut Tropis .1(2):1-7. Muttaqin E, Abdullah A, Nurilmala M, Ichsan
M, Simeone BM, Yulianto I, Booth H. 2019. DNA-barcoding as molecular marker for seafood forensics: Species identification of locally consumed shark fish products in the world’s largest shark fishery. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 278:1-11. Ozturk AR, Can T. 2017. A multiplex primer design algortihm for target amplifaction of continouous genomic regions. BMC
Bioinformatics. 18(306):1-9. Panprommin D, Soontomprasit K, Tuncharoen S, Pithakpol S, Keerelang J. 2019. DNA barcodes for the identification of species diversity in fish from Kwan Phayao, Thailand. Journal of Asia-Pacific Biodiversity. 12: 382-289. Parks SL, Goldman N. 2014. Maximum likelihood inference of small trees in the presence of long branches. Systematic Biology. 63(5):798-811. Spencer ET, Bruno JF. 2019. Fishy business: red snapper mislabeling along the coastline of the Southeastern United States. Frontiers in Marine Science. 6(513):1-7. Sultana S, Ali ME, Hossain MAM, Asing,
Naquiah N, Zaidul ISM. 2017. Universal mini COI barcode for the identification of fish species in processed products. Food
Research International. 105:19-28. Sunarno, Novriani H. 2016. Desain primer PCR secara manual untuk amplifikasi gen dtx bakteri penyebab difteri dengan masalah homologi sekuens DNA. The Biomedical and Basic Health Tecnology, Health Research and Development Centre. 66(12): 544-550. Tamura K, Nei M, dan Kumar S. 2004. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbr-joining method. The Proceedings of the National Academy of Sciences. 101:11030-11035. Vallone PM, Butler JM. 2004. AutoDimer: a screening tool for primer-dimer and hairpin structures. Biotechniques. 37(2):226-231. Wallace L, Boilard SMAL, Eagle SHC, Spall J. 2012. DNA Barcodes for everyday life: routine authentication of natural health products. Food Research International. 49(1):446-452. Ward RD, Zemlak TS, Innes BH, Last PR, Hebert PD. 2005. DNA barcoding Australia’s fish species. Philosophical Transactions of the Royal Society B . 360(1462):1847-1857. Wen J, Zeng L, Chen Z, Zhou Y, Xu Y, Xhen D, Sun Y, Zhao J, Zhang W, Li H. 2017. Species identification of dried scallop adductor muscle (Yao Zhu) products sold on the market. Food Control 71:83-87. Wu JS, Lee C, Wu CC, Shiue YL. 2004. Primer design using genetic algorithm.
Bioinformatics. 20(11):1710-1717.