Identifikasi Listeria monocytogenes pada Kerang Hijau, Rahayu et al.

## IDENTIFIKASI Listeria monocytogenes PADA KERANG HIJAU DAN KERANG DARAH
Identification of Listeria monocytogenes on Green Mussels and Cockle Shell Winiati Puji Rahayu 1,2 *, Ristia Rinanti 1 , Siti Nurjanah 1,2 , Caecillia Chrismie Nurwitri 1 1 Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga, Jalan Agatis, Bogor 16680 Jawa Barat Telepon (0251) 8622640 Faks. (0251) 8622986
2 SEAFAST Center Jalan Puspa No.1 Kampus IPB Darmaga Bogor 16680, Indonesia Telepon: (0251) 8629903
*Korespondensi: wini_a@hotmail.com
Diterima: 23 September 2016/ Review: 13 November 2016/ Disetujui: 20 Desember 2016
Cara sitasi: Rahayu WP, Rinati R, Nurjanah S, Nurwitri CC. 2016. Identifikasi Listeria monocytogenes pada kerang hijau dan kerang darah. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia 19(3): 329-338.
Abstrak Kerang hijau ( Perna viridis ) dan  kerang darah ( Anadara granosa ) merupakan salah satu sumber protein hewani yang banyak dibudidaya di Indonesia karena harganya yang relatif terjangkau. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan Listeria monocytogenes pada 27 sampel kerang hijau dan 3 sampel kerang darah di Bogor menggunakan real-time Polymerase Chain Reaction ( real-time PCR) dan metode biokimiawi. Gen yang dijadikan target untuk amplifikasi pada real-time PCR merupakan gen hlyA karena gen ini merupakan gen penentu virulensi yang menghasilkan listeriolysin O. Primer yang digunakan pada penelitian ini adalah primer forward DG69 (GTG CCG CCA AGA AAA GGT TA) dan primer reverse DG74 (CGC CAC ACT TGA GAT AT) serta sinyal fluorescence menggunakan SYBR Green I. Hasil analisis menggunakan real-time PCR menunjukkan hasil negatif Listeria monocytogenes pada semua sampel. Sedangkan hasil analisis menggunakan metode biokimiawi, menemukan 1 dari 30 sampel teridentifikasi sebagai Listeria welshimeri .
Kata kunci: gen hlyA, kerang, Listeria monocytogenes , Listeria spp., real-time PCR
Abstract Green mussel ( Perna viridis ) and cockle shell ( Anadara granosa ) are one of  many sources of animal protein which is many cultivated in Indonesia because their price is relatively affordable. This study was conducted to identify the presence of Listeria monocytogenes in 27 samples of green mussels and 3 samples of cockle shells using real-time Polymerase Chain Reaction ( real-time PCR) and biochemical methods. The target gene for amplification in real-time PCR was an hlyA gene because this gene was a determinant of virulence genes that produce listeriolysin O. Primers used in this study were forward primer DG69 (GTG CCG GGT AAA AGA CCA TA) and reverse primer DG74 (CGC CAC TGA GAT ACT AT) and fluorescence signals indicator using SYBR Green I. The results of analysis using real-time PCR were negative Listeria monocytogenes in all samples, while using biochemical methods there was one of 30 samples contaminated by Listeria welshimeri .
Keywords : hlyA gene, Listeria monocytogenes , Listeria spp., mussel, real-time PCR
Available online: journal.ipb.ac.id/index.php/jphpi

## PENDAHULUAN
Kerang hijau ( Perna viridis ) dan kerang darah ( Anadara granosa ) merupakan jenis binatang bertubuh lunak yang dapat tumbuh pada suhu ±30 o C, pH 7,6-8,2 dan
kedalaman antara 5-5,6 m. Kedua jenis kerang ini merupakan jenis kerang yang banyak dibudidayakan di Indonesia. Data SIDATIK (2015) menunjukkan produksi kedua kerang tersebut terus mengalami kenaikan pada tahun
2010 hingga 2012. Salah satu alasan kerang hijau banyak dikembangkan yaitu karena kerang hijau merupakan sumber protein hewani yang harganya relatif terjangkau.
Purwaningsih et al. (2011) melaporkan bahwa kandungan protein kerang hijau yaitu 9,17±0,16 dalam 100 gram bahan segar. Kerang hijau dan kerang darah sebagai salah satu pangan yang berasal dari laut ( fresh seafood ) lebih mudah mengalami kerusakan dibandingkan dengan komoditi segar lainnya (Masniyom 2011). Penelitian yang dilakukan oleh Masniyom et al. (2011) menunjukkan bahwa umur simpan kerang pada suhu 4 o C adalah 6 hari. Beberapa studi membahas tentang risiko kerang hijau dan kerang darah terhadap kesehatan karena kerang hijau dan kerang darah dapat mengakumulasikan kontaminan-kontaminan dalam air, misalnya bakteri patogen dan logam  berat  dari  area  tempat  hidupnya (Wulandari et al. 2009). Penelitian yang dilakukan oleh Papadopoulou et al. (2006) menunjukkan bahwa beberapa jenis bakteri yang mengontaminasi kerang antara lain Escherichia coli (100%), P. vulgaris (96%),
P. mirabilis (92%), Y. enterocolitica (40%),
S. aureus (56,6%), Pseudomonas fluorescens
(26,6%), dan Listeria innocua (3,3%). Bakteri patogen yang paling banyak diteliti adalah E. coli dan bakteri koliform. Sedangkan penelitian mengenai keberadaan bakteri patogen lain seperti Listeria monocytogenes pada kerang masih belum banyak dilakukan. Padahal L. monocytogenes berpotensi menjadi kontaminan pada produk perikanan  laut  (Beleneva  2011).  Kontaminan
L. monocytogenes dapat berasal dari ikan segar, kerang, ikan asap, dan makanan siap santap yang disimpan lama dalam refrigerator (Ariyanti 2010). Peningkatan kasus listeriosis di Finlandia pada tahun 2010 menunjukkan bahwa industri perikanan memiliki risiko yang tinggi terhadap kontaminasi L. monocytogenes (Nakari et al. 2014). Penelitian ini perlu dilakukan untuk menguji keberadaan L. monocytogenes pada kerang hijau dan kerang darah untuk mencegah wabah listeriosis yang disebabkan oleh kerang hijau dan kerang darah. Salah satu metode cepat, spesifik
dan sensitif membedakan L. monocytogenes
dari spesies Listeria lainnya adalah dengan menggunakan real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) (Klein 2002). Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi keberadaan L. monocytogenes dalam kerang hijau dan kerang darah di daerah Bogor menggunakan metode real-time Polymerase Chain Reaction (PCR), selain biokimiawi.

## BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan sebagai sampel di dalam penelitian ini adalah 27 sampel kerang hijau dan 3 sampel kerang darah di daerah Bogor. Alat yang digunakan yaitu rt-PCR SwiftTM Spectrum 48, sentrifuge , water bath , magnetic stirrer , oven, inkubator, dan autoklaf.
Prosedur Penelitian Penelitian ini diawali dengan membuat kurva pertumbuhan L. monocytogenes ATCC
7644 selama 24 jam dengan metode cawan sebar. Identifikasi keberadaan L. monocytogenes dilakukan dengan menggunakan real-time PCR dan metode biokimiawi.

## Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Listeria monocytogenes ATCC 7644 Tahapan persiapan kultur murni L.
monocytogenes meliputi pengecekan kultur murni L. monocytogenes ATCC 7644 dan konsentrasi kultur murni yang telah diinkubasi selama 18 jam  dengan metode overnight culture (Jones, D’Orazio 2013). Sedangkan pada pembuatan kurva pertumbuhan L. monocytogenes dilakukan dengan menyiapkan kultur murni L. monocytogenes berjumlah 10 2 CFU/mL. Sebanyak 1 mL kultur murni dikayakan pada 9 mL media LEB pada suhu 30 o C. Kemudian kultur dihitung pertumbuhannya pada 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 6; 9 dan 24 jam dengan menggunakan metode perhitungan cawan sebar.
Identifikasi Listeria monocytogenes Pada Kerang Menggunakan Real- Time PCR Identifikasi L. monocytogenes dilakukan melalui beberapa tahapan meliputi tahapan persiapan sampel, ekstraksi DNA,
Identifikasi Listeria monocytogenes pada Kerang Hijau, Rahayu et al.
Tabel 1 Identitas sampel kerang hijau dan kerang darah yang digunakan No. Sampel Kode Sampel Jenis Sampel Kondisi Asal sampel 1 RE28 Kerang hijau A Pasar Bogor 2 RE01 Kerang hijau B Rumah makan di Dramaga 3 RE02 Kerang hijau B Rumah makan di Dramaga 4 RE03 Kerang hijau B Rumah makan di Dramaga 5 RE04 Kerang hijau B Rumah makan di Dramaga 6 RE05 Kerang hijau B Rumah makan di Dramaga 7 RE06 Kerang hijau B Rumah makan di Dramaga 8 RE07 Kerang hijau C Pasar Bogor 9 RE08 Kerang hijau C Pasar Bogor 10 RE09 Kerang hijau C Pasar Bogor 11 RE10 Kerang hijau C Pasar Bogor 12 RE11 Kerang hijau C Pasar Bogor 13 RE12 Kerang hijau C Pasar Bogor 14 RE13 Kerang hijau C Pasar Bogor 15 RE14 Kerang hijau C Pasar Bogor 16 RE15 Kerang hijau C Pasar Bogor 17 RE16 Kerang hijau C Pasar Bogor 18 RE17 Kerang hijau C Pasar Bogor 19 RE18 Kerang hijau C Pasar Batu Tulis 20 RE19 Kerang hijau C Pasar Batu Tulis 21 RE20 Kerang hijau C Pasar Anyar 22 RE21 Kerang hijau C Pasar Anyar 23 RE22 Kerang hijau C Pasar Anyar 24 RE25 Kerang hijau C Pasar Anyar 25 RE29 Kerang hijau kulit A Pasar Anyar 26 RE24 Kerang hijau kulit C Pasar Anyar 27 RE27 Kerang hijau kulit C Pasar Anyar 28 RE30 Kerang darah A Pasar Anyar 29 RE23 Kerang darah C Pasar Anyar 30 RE26 Kerang darah C Pasar Anyar Keterangan: A = mentah; B = rebus bersama bumbu; C = rebus tanpa bumbu Tabel 2 Komposisi bahan pada amplifikasi real-time PCR (Choi dan Hong 2003) Bahan Jumlah DyNamo ColorFlash SYBR Green qPCR Kit 10 µL Water (Nuclease Free) 6 µL Template DNA 2 µL Primer forward DG69 (GTG CCG CCA AGA AAA GGT TA) 500 nM Primer reverse DG74  (CGC CAC ACT TGA GAT AT) 500 nM
elektroforesis, dan amplifikasi pada real-time PCR. Pada tahap persiapan sampel, 30 sampel terdiri dari 6 sampel kerang yang sudah dimasak dengan bumbu, 21 sampel direbus tanpa bumbu selama 10-20 menit, dan 3 sampel masih mentah (Tabel 1). Selanjutnya sampel dilakukan pengayaan pada media LEB yang mengacu pada metode BAM (2011) dengan modifikasi waktu pengayaan selama 18 jam. Tahapan ekstraksi DNA yang dilakukan mengacu pada penelitian Sambrook, Russel (2001), dengan menggunakan metode fenol: kloroform. Tahapan ini bertujuan memisahkan DNA dari molekul-molekul lain seperti protein, lipid, dan polisakarida. Hasil ekstraksi DNA di elektroforesis dengan menggunakan 1,5% gel agarose pada tegangan 100 volts. Setelah dimigrasi, gel berisi DNA direndam dalam larutan
Ethidium Bromida (EtBr) kemudian dicuci menggunakan air selama kurang lebih 10 menit. Setelah itu, gel dimasukkan ke dalam gelldoc untuk melihat pita DNA genom. Pada penelitian ini, hanya beberapa sampel yang dielektroforesis dan diambil secara acak.
Tahapan amplifikasi dengan real-time PCR (Bio Rad, USA) dilakukan untuk mengidentifikasi cemaran L. monocytogenes pada sampel kerang hijau dan kerang darah. Komposisi bahan dan kondisi running real- time PCR mengacu pada penelitian Choi dan  Hong (2003) yang diperlihatkan pada Tabel 2 dan Tabel 3. Pada penelitian ini, gen yang dijadikan target untuk amplifikasi pada real-time PCR merupakan gen hlyA karena gen ini merupakan gen penentu virulensi L. monocytogenes yang menghasilkan listeriolysin O. Primer yang digunakan pada
penelitian ini adalah primer forward DG69 (GTG CCG CCA AGA AAA GGT TA) dan primer reverse DG74 (CGC CAC ACT
TGA GAT AT) serta sinyal fluorescence menggunakan SYBR Green I yang mengacu pada Choi dan Hong (2003).
Identifikasi Listeria spp. Menggunakan Metode Biokimiawi Identifikasi Listeria spp. menggunakan metode biokimiawi dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu tahap isolasi pada media ALOA (FDA 2011), uji katalase (Purwohadisantoso et al. 2009), uji pewarnaan Gram (FDA 2001), uji motilitas (BSN 2009), pewarnaan spora (Sunatmo 2007), uji fermentasi karbohidrat (FDA 2011) dan uji hemolitik (FDA 2011).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kurva Pertumbuhan L. monocytogenes ATCC 7644
Kultur murni Listeria monocytogenes ATCC 7644 yang digunakan dalam penelitian ini mula-mula dicek kemurniannya sebelum diuji dan dilihat kurva pertumbuhannya. Gambar 1 menunjukkan hasil positif pengujian pertumbuhan L. monocytogenes pada media ALOA (48 jam) dan menggunakan kit immuno assay. Seluruh koloni yang tumbuh pada media ALOA berwarna biru kehijauan dengan dikelilingi halo berwarna putih. Ciri-ciri ini sesuai dengan ciri-ciri koloni
L. monocytogenes yang tumbuh pada media ALOA (Becker et al. 2006).
Agar Listeria according to Ottaviani and
Agosti (ALOA) adalah media kromogenik yang mendeteksi keberadaan Listeria spp. Komponen kromogenik yang terdapat pada
Tabel 3 Kondisi running pada amplifikasi real-time PCR (Choi dan Hong 2003) Tahap Suhu ( °C ) Waktu Jumlah Siklus Denaturasi awal 94 5 menit 1 Denaturasi 94 45 detik Annealing 55 45 detik 30 Extension 72 45 detik Entension akhir 72 7 menit 1 Tahap melting 72-94 10 detik 1 (kenaikan suhu tiap 0,5°C)  (tiap kenaikan suhu 0,5°C)
Identifikasi Listeria monocytogenes pada Kerang Hijau, Rahayu et al.
media ini, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-glucopyranoside (X-glc), bereaksi dengan aktivitas β-glucosidase yang dihasilkan oleh Listeria spp. dan menghasilkan koloni berwarna biru (Becker et al. 2006). Namun beberapa Bacillus sp. dapat tumbuh pada media ALOA dan membentuk koloni berwarna biru (Liu 2008). L. monocytogenes juga diuji menggunakan kit immuno assay menunjukkan hasil yang positif. Waktu pengayaan L. monocytogenes yang biasa digunakan untuk metode biokimiawi yang mengacu pada metode BAM (2011) adalah 48 jam. Namun, kerang merupakan salah satu pangan yang mudah rusak dimana umur simpan kerang yang disimpan pada suhu 4 o C adalah 6 hari (Masniyom et al.
2011), sedangkan L. monocytogenes sebanyak 103 CFU/mL dapat terdeteksi pada real-time PCR (Choi dan Hong 2003). Oleh karena itu, dilakukan modifikasi waktu pengayaan agar terjadi peningkatan jumlah L. monocytogenes minimal sebanyak 3 siklus log. Gambar 2
menunjukkan kurva pertumbuhan kultur murni L. monocytogenes ATCC 7644 yang ditumbuhkan pada media LEB selama 24 jam. Pada Gambar 3, terlihat bahwa selama inkubasi 9 jam, jumlah kultur murni L. monocytogenes ATCC 7644 meningkat sebanyak 3,87 siklus log. Pada penelitian ini, diasumsikan jumlah awal L. monocytogenes pada sampel berjumlah sangat kecil (± 100), oleh karena itu dipilih waktu pengayaan sehingga jumlah L. monocytogenes meningkat lebih dari 3 siklus log. Jumlah L. monocytogenes sebanyak 103 CFU/g sudah dapat dideteksi oleh real-time PCR (Choi dan Hong 2003). Berdasarkan hal tersebut, waktu inkubasi sampel yang diperlukan minimal selama 9 jam, sedangkan pada penelitian ini dipilih waktu inkubasi selama 18 jam karena waktu tersebut merupakan waktu paling paling sesuai dengan jam kerja di dalam laboratorium yang digunakan selama penelitian.
Beberapa faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri adalah suhu, tekanan
Gambar 1 Pertumbuhan kultur murni L. monocytogenes pada media ALOA  (48 jam) (a),  uji positif L. monocytogenes pada kit immuno assay (b)
Gambar 2 Kurva hubungan log jumlah mikroba dan waktu
osmotik, pH, oksigen, radiasi, dan media kultur yang digunakan. Media yang digunakan merupakan media LEB, dimana pada media tesebut ditambahkan Listeria selective enrichment supplement yang mengandung asam nalidixic dan acrilavine yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba lain selain Listeria . Sedangkan suhu pengayaan yang digunakan mengacu pada FDA (2011) adalah 30 o C. Suhu 30 o C merupakan suhu yang paling optimum untuk menumbuhkan L. monocytogenes , sedangkan mikroba kompetitor lain yang ada di dalam pangan
tidak dapat tumbuh optimum pada suhu tersebut (Liu 2008).
Keberadaan L. monocytogenes Pada Kerang Menggunakan Real-Time PCR Real-time Polymerase Chain Reaction ( real-time PCR) merupakan suatu metode yang cepat, sensitif dan spesifik untuk mendeteksi keberadaan suatu mikroba dengan memanfaatkan DNA mikroba yang dideteksi. Gambar 3 menunjukkan hasil elektroforesis pada beberapa hasil ekstraksi DNA yang memperlihatkan adanya pita yang
Gambar 3 Hasil elektroforesis DNA bakteri dari beberapa sampel
Gambar 4 Hasil amplifikasi sampel pada real-time PCR (a) sampel 1-6 (b) sampel 7-30
Identifikasi Listeria monocytogenes pada Kerang Hijau, Rahayu et al.
membuktikan tahapan ekstraksi DNA yang dilakukan berhasil. DNA tersebut kemudian siap untuk diamplifikasi pada real-time PCR untuk menguji keberadaan DNA L. monocytogenes pada sampel. Hasil amplifikasi pada real-time PCR menunjukkan tidak adanya keberadaan L. monocytogenes pada 30 sampel kerang. Hal ini dibuktikan oleh tidak terbentuknya kurva sigmoid pada pengujian menggunaka real-time PCR (Gambar 4). Kurva sigmoid hanya dibentuk oleh kontrol positif L. monocytogenes . Gambar 4a menunjukkan kurva amplifikasi untuk sampel 1 sampai 6 dimana sampel RE02 teramplifikasi dengan nilai Ct>25. Sedangkan suhu pelelehan (Tm) yang dimiliki oleh sampel tersebut sebesar 81 o C (Gambar 5). Nilai Tm  ini mendekati  nilai Tm untuk L. monocytogenes , yaitu 79 o C (Mutsyahiddan et al. 2015). Nilai Tm ini dicurigai sebagai L. monocytogenes sehingga dilakukan pengujian sampel menggunakan elektroforesis. Berdasarkan hasil pengujian menggunakan elektroforesis, pita hasil elektroforesis sampel tersebut terlihat pada ukuran <500 bp. Padahal ukuran untuk L. monocytogenes adalah 635 bp (Choi dan Hong 2003). Berdasarkan hal tersebut, maka disimpulkan bahwa sampel tersebut tidak mengandung L. monocytogenes tetapi diduga ada Listeria spp. yang lain. Selain terdapat di beberapa produk perikanan, Listeria juga dapat mengontaminasi selama proses pemasakan apabila sanitasi yang dilakukan buruk atau terjadi kontaminasi setelah proses pemasakan. Hasil negatif L. monocytogenes terhadap 30 sampel kerang menunjukkan L. monocytogenes tidak terdapat pada sampel kerang yang masih mentah dan tidak terdapat kontaminasi terhadap sampel
kerang pada saat pemasakan serta setelah proses pemasakan.
Produk perikanan atau produk kerang- kerangan terkontaminasi L. monocytogenes dengan jumlah yang rendah yaitu sekitar 4,5 atau 5,3% (Rodas -Suarez et al. 2006; Bou-m’ handi et al. 2007). Selain itu, penelitian yang dilakukan oleh Beleneva (2011) menunjukkan bahwa pada sampel kerang hijau yang ditelitinya hanya terdeteksi S. aureus dan tidak ada data yang menunjukkan keberadaan L. monocytogenes pada sampel kerang hijau. Salah satu penyebab rendahnya kontaminasi L. monocytogenes pada kerang-kerangan adalah adanya bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat yang dihasilkan oleh kerang-kerangan. Hal ini dibuktikan oleh penelitian yang dilakukan Pinto et al. (2009) yang menunjukkan keberadaan anti- Listeria bakteriosin yang diisolasi dari kerang. Pada penelitian tersebut, terdapat dua jenis bakteriosin yang diproduksi oleh Enterococcus faecium dan Pediococcus pentosaceus yang telah terbukti memiliki aktivitas penghambatan terhadap pertumbuhan L. monocytogenes .
Keberadaan Listeria spp. Menggunakan Metode Biokimiawi Deteksi keberadaan L. monocytogenes menggunakan real-time PCR menunjukkan hasil negatif pada semua sampel. Namun hasil ekstraksi DNA menunjukkan adanya DNA mikroba pada sampel. Selain itu, ada DNA yang teramplifikasi pada real-time PCR. Hal ini menunjukkan bahwa pada sampel terdapat mikroba lain selain L. monocytogenes yang mengontaminasi sampel dan terdapat kemungkinan adanya Listeria jenis lain yang mengontaminasi, oleh karena itu dilakukan
Gambar 5  Kurva pelelehan  sampel  RE02
identifikasi menggunakan metode biokimiawi untuk mendeteksi Listeria spp. yang lain.
Pengujian yang dilakukan pada 30 sampel menunjukkan terdapat 20 sampel yang diduga terkontaminasi Listeria spp. Hal ini ditandai oleh koloni berwarna biru yang tumbuh pada media ALOA. Jumlah isolat yang didapatkan dari 20 sampel yang diduga sebagai Listeria spp. yaitu 50 isolat yang selanjutnya di uji katalase, pewarnaan Gram, uji motilitas dan uji pewarnaan spora.
Hasil analisis terhadap 50 isolat yang diteliti menunjukkan terdapat 43,3% sampel yang menunjukkan katalase positif, Gram positif, dan berbentuk batang pendek atau kokus. Kemudian terdapat 20% sampel yang menunjukkan motilitas positif dan hanya  3,3% sampel yang tidak membentuk spora. Berdasarkan data tersebut, dapat dilihat bahwa dari 30 sampel  yang telah di identifikasi, hanya terdapat 3,3%  sampel yang memiliki ciri-ciri Listeria spp. (Ariyanti 2010). Selanjutnya, isolat diuji menggunakan uji fermentasi karbohidrat dan uji hemolitik. Hasil uji fermentasi karbohidrat dan uji hemolitik ditunjukkan pada Tabel 4.
Hasil uji tersebut menunjukkan bahwa isolat Listeria spp. yang telah ditemukan merupakan Listeria welshimeri . Sampel yang terkontaminasi tersebut merupakan sampel kerang hijau yang telah dihilangkan cangkangnya selama proses penjualan dan telah mengalami proses perebusan. Kontaminasi dapat terjadi akibat proses pengupasan kerang hijau yang kurang higienis, lingkungan tempat berjualan kurang bersih, atau karena  jumlah mikroba awal yang tinggi. Listeria welshimeri sendiri merupakan jenis Listeria spp. yang tidak memiliki kemampuan hemolisis (Volokhov et al. 2006). Bakteri ini juga digolongkan sebagai bakteri non-patogen (Hein et al. 2008).
Pada penelitian ini, selain ditemukan Listeria welshimeri, ditemukan pula isolat yang diduga sebagai Bacillus spp. Bacillus spp. merupakan salah satu bakteri yang dapat tumbuh pada media ALOA dan dapat membentuk koloni berwarna biru, contohnya Listeria spp. Selain itu, Bacillus spp. juga merupakan bakteri berkatalase positif. Hasil elektroforesis DNA bakteri dari beberapa sampel Gram positif dan berbentuk batang serta bersifat motil (Ariyanti 2010). Sifat-sifat tersebut sangat menyerupai sifat Listeria spp.
Hanya satu sifat yang dapat membedakan antara Bacillus spp. dan Listeria sppp. yakni pada kemampuannya dalam membentuk spora. Listeria spp. merupakan bakteri yang tidak dapat membentuk spora (Ariyanti 2010) sedangkan Bacillus spp. dapat membentuk spora (Waites et al. 2008). Penelitian ini ditemukan 20% sampel yang berkatalase positif, Gram positif, berbentuk batang, bersifat motil, dan membentuk spora yang diduga sebagai Bacillus spp.

## KESIMPULAN
Tidak ditemukan L. monocytogenes pada 30 sampel kerang hijau dan kerang darah dengan menggunakan metode real-time PCR. Sedangkan berdasarkan metode biokimiawi, ditemukan Listeria welshimeri sebanyak 3,3% dari 30 sampel yang telah dianalisis. Listeria welshimeri adalah jenis bakteri non-patogen.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Kemenristek DIKTI, yang telah mendanai penelitian ini dengan skema Hibah Kompetensi tahun 2015 dengan No. Kontrak 083/SP2H/PL/Dit. Litabmas/2015 tanggal 05 Februari 2015. Tabel 4 Hasil uji fermentasi karbohidrat dan uji hemolitik Jenis sampel Man-nitol Xylo-sa  Rham-nosa Glu-kosa Hemo-litik Kesimpulan Kerang hijau matang tan- pa cangkang - + - + - Listeria welshimeri Total  sampel terdapat Listeria welshimeri /(% sampel) 1 (3,3%)
Identifikasi Listeria monocytogenes pada Kerang Hijau, Rahayu et al.

## DAFTAR PUSTAKA
Ariyanti T. 2010. Bakteri Listeria monocytogenes sebagai kontaminan makanan asal hewan ( foodborne disease ).
Wartazoa 20 (2) : 94-102. Becker B, Schuler S, Lohneis M, Sabrowski A, Curtis GDW, Holzapfel WH. 2006.
Comparison of two chromogenic media for the detection of Listeria monocytogenes with the plating media recommended by EN/DIN 11290-1. International Journal of Food Microbiology 109: 127–131. Beleneva IA. 2011. Incidence and characteristics of Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes from the Japan and South China seas. Marine Pollution Bulletin 62: 382-387. Bou-m’handi N, Jacquet C, Marrakchi
AE, Martin P. 2007. Phenotypic and molecular characterization of Listeria monocytogenes strains isolated from a marine environment in Morocco.
Foodborne Pathogens and Disease 4 (4): 409–417.
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2009. SNI 7303:2009 Choi WS, Hong CH. 2003. Rapid enumeration of Listeria monocytogenes in milk using competitive PCR. International Journal of Food Microbiology 84: 79-85.
[FDA] Food and Drug Administration. 2001. BAM R32: Gram Stain. Bacteriological Analytical Manual Online.
[FDA] Food and Drug Administration. 2011. Listeria monocytogenes. Chapter 10 Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods. In Bacteriological Analytical Manual Online.
Hain T, Steinweg C, Kuenne CT, Billion A,
Ghai R, Chatterjee SS, Domann E, Karst U, Goesmann A, Bekel T, et al. 2006. Whole-genome sequence of Listeria welshimeri reveals common steps in genome reduction with Listeria innocua as compared to Listeria monocytogenes . Journal of Bacteriology 188(21): 74015- 7415.
Jones GS, D’Orazio SEF. 2013. Listeria monocytogenes : cultivation and laboratory
maintenance. Curr Ptotoc Microbiol 5(31): 9B.2.1-9B.2.7.
Liu D. 2008. Handbook of Listeria monocytogenes . Boca Raton: CRC Press, Taylor and Francis Group.
Masniyom P. 2011. Detrioration and shelf- life extention of fish and fishery products by modified atmosphere packaging.
Songklanakarin Journal Science Technology 33(2): 181-192. Mutsyahiddan AMA, Rahayu WP, Nurjanah S.
2016. Detection of Listeria monocytogenes in indigenous snack using real-time polymerase chain reaction. Malaysian Journal of Microbiology 12(2): 177-181. Nakari UM, Rantala L, Pihlajasaari A,
Toikkanen S, Johansson T, Hellsten C, et al. 2014. Investigation of increased listeriosis revealed two fishery production plants with persistent Listeria contamination in
Finland in 2010. Epidemiol. Infect 1–9. Papadopoulou C, Economou E, Zakas G, Salamoura C, Dontorou C,  Apostolou J. 2006. Microbiological and pathogenic contaminants of seafood in Greece. Journal of Food Quality 30: 28-42.
Pinto AL, Fernandes M, Pinto C, Albano H, Castilho F, Teixeira P, Gibbs PA. 2009. Characterization of anti- Listeria bacteriocins isolated from shellfish : Potential antimicrobials to control non- fermented seafood. International Journal of Food Microbiology 129: 50-58.
Purwaningsih S, Salamah E, Merlinda KD. 2011. Penurunan kandungan gizi mikro kerang hijau ( Perna viridis ) akibat metode pemasakan yang berbeda. Jurnal Sumberdaya Perairan 5(2): 19-22. Purwohadisantoso K, Elok Z, Ella S. 2009. Isolasi bakteri asam laktat dari sayur kubis yang memiliki kemampuan penghambatan bakteri patogen ( Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes , Escherichia coli , dan Salmonella typhimurium ). Jurnal Teknologi Hasil Pertanian 10 (1): 19-27.
Rodas-Suárez OR, Flores-Pedroche JF, Betancourt-Rule JM, Quiñones-Ramírez EI, Vázquez-Salinas C. 2006. Occurrence and antibiotic sensitivity of Listeria monocytogenes strains isolated from
oysters, ﬁsh, and estuarine water. Applied and Environmental Microbiology 72 (11) : 7410–7412. Sambrook  J,  Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Haror Laboratory Press. [SIDATIK] Sistem Informasi Diseminasi Data Statistik Kelautan dan Perikanan. 2015. Volume produksi perikanan tangkap di laut menurut jenis ikan. [Internet]. [diunduh 2015 Mei 14]. Sunatmo TI. 2007. Eksperimen Mikrobiologi Dalam Laboratorium. Bogor: Penerbit Ardy Agency. Volokhov D, George J, Anderson C, Duvall RE, Hitchins AD. 2006. Discovery of natural atypical nonhemolytic Listeria seeligeri isolates. Applied And Environmental Microbiology 72(4): 2349-2448. Waites MJ, Morgan NL, Rockey JS, Higton G. 2008. Industrial Microbiology an Introduction. London: Blackwell Publisher. Wulandari SY, Bambang Y, Gunawan WS, Ken S. 2009. Kandungan logam berat Hg dan Cd dalam air, sedimen, dan kerang darah ( Anadara granossa ) dengan menggunakan metode analisis pengaktifan neutron (APN). Jurnal Ilmu Kelautan 14 (3): 170-175. .