Effect of Garlic Extract on The Amount of Cell that Produce Interferon γ in white male BALB/c mice
Titiek Sunaryati*
*Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya

## Abstract
Common  cold  is  an  infectious  disease  that  is  caused  by  viruses.  The  purpose  of this study is to explain how garlic extract can increase body  immunity.
This was experimental study using white male BALB/c strain mice, 10 weeks old with bodyweight of 25-35 grams. Group 1 received placebo (CMC Na) for 14 days. Group  2  received  10mg/kg  BW  garlic  extract  for  14  days,  and  group  3  received 20mg/kg  BW  garlic  extract  for  14  days.  After  14  days  mice  were  sacrified  then intestines were removed and processed in the paraffin block, then were stained  with immunohistochemistry.
There was one  variable such as the amount of cell that produce interferon γ. Data were analyzed by analysis of variance Brown Forsythe, any significant different was further analyzed by using Games Howell in the significant level of 0.05. There were significant  difference  between  groups  those  received  placebo,  10mg/kgBw  garlic extract, and 20mg/kgBw garlic extract in each variables.
Garlic extract can increase body immunity via increase in the amount of  cell that produce interferon γ.
Keywords: common cold, garlic extract, IFN γ.

## PENDAHULUAN
Common  cold merupakan  penyakit  virus  yang  paling  sering  ditemukan  pada manusia.  Di  Indonesia,  Infeksi  Saluran  Pernapasan  Akut  (ISPA)  selalu  menempati urutan pertama penyebab kematian pada kelompok bayi dan balita. Survei mortalitas yang dilakukan oleh Subdit ISPA tahun 2005 menempatkan ISPA sebagai penyebab
kematian bayi terbesar di Indonesia dengan persentase 22,30% dari seluruh kematian balita (Steven, 2009).  Bawang putih tidak hanya mencegah common cold , tetapi juga dapat memperpendek gejala dan derajat keparahannya (Marta,et al, 2007).
Pada  umumnya  terapi common  cold yang  digunakan  ialah antihistamin , dekongestan,  antipiretik, dan ekspektoran .  Antibiotik  digunakan  bila  terjadi  infeksi sekunder (Boies, 1994). Teknik lain yang perlu diberikan ialah dengan meningkatkan imunitas  tubuh  menggunakan  obat immunomodulator ,  salah  satunya  ialah  bawang putih (Allium sativum Linn. ) (Marta,et al, 2007) . Bawang putih adalah tanaman yang kaya  senyawa  organosulfur,  bahan  ini  dapat  meningkatkan  imunitas  tubuh  (Eikai, 2001).  Namun  sampai  sejauh  ini  mekanisme  meningkatnya  imunitas  tubuh  akibat pemberian ekstrak bawang putih belum dapat dijelaskan.
Bawang  putih  setelah  diekstraksi  akan  menghasilkan  zat  yang  bersifat  stabil yaitu S-allylcysteine. Zat ini akan berikatan dengan reseptor  yang ada di  permukaan sel    makrofag.  Kompleks  ini  akan  mengambil  molekul  yang  berisi tumor  necrosis factor  receptor  associated  death  domain (TRADD)  yang  akan  berinteraksi  dengan Serine-Threonine kinase ribosome inhibiting protein (RIP) dan tumor necrosis factor receptor associated factor 2 (TRAF2). Keduanya mengaktifkan transforming growth factor beta activated kinase 1 (TAK1). TAK1 yang aktif berperan terhadap fosforilasi inhibitor  kinase  κappa  beta (IKκB).  IKκB  menyebabkan  degradasi inhibitor  κappa beta (IκB).  Hambatan  pada  IκB  akan  mengaktifkan nuclear  factor  κappa  beta (NFκB) sehingga terjadilah translokasi NFκB aktif ke inti sel (George, 2002). Di inti NFκB  menstimuli  proses  transkripsi  yang  menghasilkan  interferon  γ  (IFNγ)  (Neil, 1997).  IFNγ  akan  merangsang  aktifitas  sitotoksik  limfosit  (CTL)  dan  sel natural killer (sel NK). IFNγ selanjutnya merangsang aktifitas sel NK untuk membunuh virus atau  sel  yang  terinfeksi  virus  dan  membuat  blokade  reseptor  pada  sel  tetangga sehingga sel tetangga kebal terhadap infeksi virus (Anthony, 2003).

## BAHAN DAN CARA KERJA
A.Sampel penelitian
27 ekor mencit jantan  yang dibagi menjadi 3 kelompok, yaitu kelompok 1 sampai kelompok  3  masing-masing  sebanyak  9  ekor  mencit.  Mencit  pada  kelompok  1  (K) diberi  placebo  selama  14  hari.  Mencit  pada  kelompok  2  (P1)  diberi  ekstrak  bawang putih  10mg/kgBB  dengan  dosis  1x/hari  selama  14  hari,  kelompok  3  (P2)  diberi ekstrak bawang putih 20mg/kgBB dengan dosis 1x/hari selama 14 hari.

## B.Pemeriksaan imunohistokimia
Pemeriksaan jumlah sel penghasil IFN γ pada usus halus ketiga kelompok mencit dilakukan  dengan  teknik  imunohistokimia.  Setiap  satu  sampel  diamati  dan  dihitung jumlah    sel  yang  menghasilkan  IFN  γ  (sitoplasmanya  berwarna  coklat)  dengan menggunakan  mikroskop  cahaya  pembesaran  400x;  diamati  pada  sepuluh  lapangan pandang dan dihitung jumlah sel yang memberikan reaksi positif dan negatif terhadap antibodimonoklonal IFN γ.

## ANALISIS DAN HASIL PENELITIAN
Hasil  perhitungan  jumlah  sel  yang  menghasilkan  IFN  γ  pada  usus  halus  ketiga kelompok mencit dihitung persentase, dan dilihat pada tabel1.
Tabel 1 Hasil analisis jumlah sel penghasil IFN γ
Kelompok n Jumlah Sel Penghasil Interferon  (  ) Brown-
Forsythe  x SD Min Maks Kontrol(K) 9 4,00 a 0,87 3 5 F=821,45 p=0,000* Bawang Putih 10mg/kgBB(P1) 9 33,89 b 3,98 30 40 Bawang Putih 20mg/kgBB(P2) 9 63,89 c 3,59 60 70
Keterangan : * signifikan pada  =0,05 a,b,c superscript  yang  berbeda  menunjukkan  adanya  perbedaan  yang bermakna antar kelompok (berdasarkan Games-Howell test)
Berdasarkan  tabel  1  menunjukkan  bahwa  nilai  rerata±SD  kelompok  kontrol  (K)
4,00±0,87, minimum 3 dan maksimum 5; nilai rerata±SD kelompok perlakuan  yang diberi bawang putih 10mg/kgBB (P1) ialah 33,89±3,98, minimum 30 dan maksimum 40; nilai rerata±SD kelompok perlakuan  yang diberi bawang putih 20mg/kgBB (P2) ialah 63,89±3,59, minimum 60 dan maksimum 70.
Nilai  rerata  jumlah  sel  penghasil  interferon  γ  dihitung  berdasarkan  persentase, hasilnya dapat dilihat pada gambar 1.
Gambar 1 Nilai rerata jumlah sel penghasil interferon γ
Uji  Brown-Forsythe  didapatkan  nilai  p=0,000(p<0,05) artinya  ada  perbedaan jumlah sel penghasil IFNγ. Uji Games-Howell untuk beda antar kelompok didapatkan ada perbedaan yang bermakna antara K dan P1; K dan P2; P1 dan P2.
0 10 20 30 40 50 60 70 K P1 P2 Nilai Rerata Jumlah Sel Penghasil IFN γ (Dalam Persentase)
Gambar 2     Mukosa usus  halus  dengan pewarnaan imunohistokimia menggunakan antibodi monoklonal IFNγ pada kelompok yang mendapat bawang putih 20mg/kgBB.  Tampak  makrofag  dan  limfosit  yang  positif  dengan sitoplasma berwarna coklat. (Perbesaran 400x)
Gambar 3 Pengambilan jaringan usus halus mencit

## DISKUSI
Common cold adalah self-limiting disease dan sistem imun host adalah hal yang sangat  menentukan  pada  penyakit  ini.  Respon  imun  humoral  mulai  menghasilkan antibodi  spesifik  dalam  beberapa  hari  untuk  mencegah  virus  menginfeksi  sel. Leukosit tersebut juga membunuh virus melalui proses fagositosis dan membunuh sel yang  terinfeksi  untuk  mencegah  replikasi  virus.  Pada  pasien  dengan  imunitas  tubuh yang baik dapat sembuh sendiri dalam tujuh hari (Eccles, 2005).
Pada  umumnya  terapi common  cold yang  digunakan  ialah antihistamin , dekongestan,  antipiretik, dan ekspektoran .  Antibiotik  digunakan  bila  terjadi  infeksi sekunder (Boies, 1994). Teknik lain yang perlu diberikan ialah dengan meningkatkan imunitas  tubuh  menggunakan  obat immunomodulator ,  salah  satunya  ialah  bawang putih (Allium sativum Linn. ) (Marta,et al, 2007) .
Ekstraksi  bawang  putih  menghasilkan  zat  yang  bersifat  anti  oksidan  yang  tidak stabil  yaitu allicin dan  juga  zat  yang  stabil  yaitu S-allylcysteine dan S- allylmercaptocysteine. Kedua  komponen  ini  merupakan  senyawa  organosulfur (Borek, 2001). S-allylcysteine adalah immunomodulator yang efisien melalui stimuli aktivitas makrofag dan produksi sitokin oleh makrofag (Kang, 2001).
Untuk  membuktikan  pengaruh  bawang  putih  sebagai immunomodulator, maka dilakukan penelitian dengan menggunakan hewan coba yaitu mencit BALB/c jantan. Mencit  dibagi  menjadi  3  kelompok.  Kelompok  1  (K)  tidak  diberi  ekstrak  bawang putih.  Kelompok  2  (P1)  diberi  ekstrak  bawang  putih  dengan  dosis  10mg/kgBB (Yudha,  2003).    Kelompok  3  (P2)  diberi  ekstrak  bawang  putih  dengan  dosis 20mg/kgBB.  Mencit  pada  ketiga  kelompok  dikorbankan  pada  hari  ke  14  untuk dilakukan pengamatan persentase jumlah sel penghasil IFN γ.
Penelitian ini menggunakan metode imunohistokimia indirect untuk deteksi adanya IFN γ  pada mukosa usus halus mencit. Pada metode indirect ini  antibodi  sekunder yang  dilabel  enzim  akan  berikatan  dengan  antibodi  primer  yang  telah  berikatan dengan  antigen.  Untuk  menandai  adanya  suatu  reaksi  enzimatik  di  dalam  jaringan
maka  digunakan  indicator  warna  ( chromogen )  DAB  (3,3 diaminobenzidine )  yang akan memberikan warna coklat di antara  sitoplasma sel normal yang terwarnai sesuai counter stain haematoxylin , dihitung dalam persen dan dibandingkan antar kelompok (Sudiana, 2008).
Hasil  pewarnaan  imunohistokimia  pada  penelitian  ini  menunjukkan  data  jumlah sel penghasil IFN γ masing-masing kelompok berdistribusi normal (p>0,05) (Analisis dengan  Kolmogorov-Smirnov  satu  sampel)  ,  tetapi  data  tersebut  memiliki  nilai variansi yang tidak homogen antar kelompok (Levene test p<0,05). Untuk itu analisis komparasi  antar  kelompok  dilakukan  dengan  uji  Brown-Forsythe.    Uji  beda  antar kelompok menggunakan Games-Howell.
Berdasar hasil analisis  data diatas didapat bahwa pemberian ekstrak bawang putih dapat meningkatkan  jumlah sel penghasil IFN γ jaringan usus halus mencit. Hal ini disebabkan karena kandungan organosulfur dalam bawang putih yaitu S-allylcysteine (Kang, 2001).
S-allylcysteine merupakan  protein  asing  yang  dapat  menstimuli  makrofag. S- allylcysteine berikatan dengan reseptor pada permukaan sel makrofag. Kompleks ini akan mengambil molekul yang berisi tumor necrosis factor receptor associated death domain (TRADD)  yang akan berinteraksi dengan Serine-Threonine kinase ribosome inhibiting  protein (RIP) dan tumor  necrosis  factor  receptor  associated  factor  2 (TRAF2).  Keduanya  akan  mengaktifkan transforming  growth  factor  beta  activated kinase  1 (TAK1).  TAK1  yang  aktif  berperan  terhadap  fosforilasi inhibitor  kinase κappa  beta (IKκB).  IKκB  menyebabkan  degradasi inhibitor  κappa  beta (IκB). Hambatan pada IκB akan mengaktifkan nuclear factor κappa beta (NFκB) sehingga terjadilah translokasi NFκB aktif ke inti sel (George, 2002). Di inti NFκB menstimuli proses  transkripsi  yang  menghasilkan  interferon  gamma  (IFNγ)  dan interleukin  12 (IL-12)  (Neil,  1997).  Berdasarkan  penelitian  ini  dapat  dibuktikan  bahwa  bawang putih  dapat  menstimuli  makrofag  untuk  mengekspresikan  NFκB  sehingga  terjadi proses transkripsi dan menghasilkan IFNγ dan IL-12.
IFN-γ  yang  dihasilkan  sel  makrofag  dapat  meningkatkan  aktivitas  sel  NK  untuk membunuh  sel  yang  mengandung  virus  dan  membuat  blokade  reseptor  pada  sel tetangga sehingga sel tetangga kebal terhadap infeksi virus (Anthony, 2003).
Pemberian ekstrak umbi bawang putih pada mencit BALB/c jantan selama 14 hari dapat meningkatkan imunitas alami tubuh melalui peningkatan jumlah sel  penghasil IFN γ.

## PENUTUP
Pemberian  ekstrak  umbi  bawang  putih  pada  mencit  BALB/c  jantan  dapat meningkatkan imunitas tubuh melalui peningkatan jumlah sel penghasil IFN γ.

## Daftar Pustaka
Abbas  A.K,  Andrew  H.L,  1994.  Cellular  and  Molecular  Immunology.  2 nd edition, USA: W.B. Saunders Company, 18, 53, 55, 262, 208-9, 251-2, 328.
Anthony  R.F,Wayne  M.Y,  2003.  Natural  Killer  Cells  and  Viral  Infections.  Current Opinion in Immunology 15: 45-51.
Boies,  Adams,  Higler,  1994.  Buku  Ajar  Penyakit  THT  (Boies  Fundamentals  of Otolaryngology). 1 st edition, Jakarta:EGC, 206-208.
Borek  C,  2001.  Antioxidant  Health  Effect  of  Aged  Garlic  Extract.  Journal  of Nutrition American Society for Nutritional Sciences 131: 1010s-1015s.
Diah K, 2004. Bersahabat Dengan Hewan Coba. Cetakan I, Yogyakarta:Gadjah Mada University Press, 5-8, 25-37, 66-69, 82-112.
Eccles R, 2005. Understanding The Symptoms of The Common Cold and Influenza. Lancet Infect Diseases 5:718-25.
Eikai K, Naoto U, 2001.Immunomodulatory Effects of Aged Garlic Extract. Journal of Nutrition 131: 1075-1079.
Eko B,2002. Biostatistika. Cetakan I, Jakarta:EGC, 226-232.
Federer, 1955. Experimental Design, Theory and Application. 2 nd edition, New York Macmillan.
George  S,  2002.  NFκB-Dependent  Signaling  Pathways.  Experimental  Hematology 30: 285-296.
Hildebert W, 1999. Immunomodulatory Agents from Plants. Medical :274-277. Hirao  Y,  1987.  Activation  of  Immunoresponder  Cells  by  The  Protein  Fraction  from Aged Garlic Extract. Phytotherapy 1:161-164.
John D.B, Harry C.C, 1984. Manual of Histological Techniques. New York:Churcill livingstone Inc, 12-25,195-202.
Kang  N.S,  Moon  E.Y,  2001.  Immunomodulating  Effect  of  Garlic  Component, Allicin, on Murine Peritoneal Macrophages. Nutrition Research 21: 617-626.
Liang H.O, Purwanto A, 1991. Uji Toksisitas dan Aktivitas Biologi Ekstrak Bawang Putih. Cermin Dunia Kedokteran 73, 28.
Luna  L.G,  1968.  Manual  of  Histologic  Staining  Methods  of  The  Armed  Forces Institute of Pathology. 3 rd edition,USA:Mc.Graw Hill Book Company,1-32.
Marta CM, Nieves C, Mar V, 2007. Biological Properties of Onions and Garlic. Food Science  and Technology 18: 609-625.
Marcel  V,  2009.  Moral  Principles  for  Allocating  Scarce  Medical  Resources  in  an Influenza Pandemic. Bioethical Inquiry 6:159-169.
Neil  P,1997.  Achieving  Transcriptional  Specificity  with  NFκB.  Int.J.Biochem.  Cell Biology 29: 1433-1448.
Schoenborn J.R, Wilson C.B, 2007. Regulation  of  Interferon Gamma During  Innate and Adaptive Immune Responses, Immunol 96:41-101.
Schroeder  K,  Hertzog  PJ,  Ravasi  T,  2004.  Interferon  Gamma:  an  Overview  of Signals, Mechanisms and Functions, J Leukoc.Biol 75: 163-89.
Steel  R.G.D.,  Torrie  J.H,  1984.  Principles  and  Procedures  of  Statistics.  Singapore: McGraw Hill Book Co., Inc., 172-177.
Steven E,MD, 2009.Common Cold. http://www.medicineNet.com/
Sudiana IK, 2008. Patobiologi Molekuler Kanker. Jakarta: Salemba Medika, 61-88.
Sudiana  IK,  2005.  Teknologi  Ilmu  Jaringan  dan  Imunohistokimia.  Jakarta:  Sagung Seto, 1-46.
Tzou-C.H,  2009.  Diallyl  Disulphide,  but  not  Diallyl  Sulphide,  Increases  Leucocyte Function-Associated  Antigen-1  Expression  and  Cellular  Adhesion  in Monocytes. Food Chemistry 1-14.
Yudha,  JS,  2003.  The  Role  of  Garlic  (Allium  Sativum)  Antioxidant  as Hepatoprotektor. Jurnal Universitas Airlangga. 4(1):24-31.