Uji Toksisitas Bacillus thuringiensis Asal Kota Nganjuk Terhadap Larva Aedes aegypti
Erma Kusuma Pratiwi 1) , Setijono Samino 1) , Zulfaidah Penata Gama 1,2) , Nobukazu Nakagoshi 1)
1) Laboratorium Mikrobiologi, Program Studi Biologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang
2) Graduate School for International Development and Cooperation (IDEC), Hiroshima University, Japan
Alamat Korespondensi: Erma Kusuma Pratiwi (ermakusumapratiwi@yahoo.com)

## ABSTRAK
Demam  Berdarah  Dengue  (DBD)  merupakan  salah  satu  penyakit  endemik  di  Indonesia  dan  menyebabkan banyak  kematian  penduduk,  khususnya  di  Provinsi  Jawa  Timur.  Kota  Nganjuk  memiliki  tingkat  kelimpahan larva  Aedes  aegypti tertinggi di  Provinsi Jawa  Timur pada tahun 2008-2010. Kota Nganjuk  merupakan  daerah fokus utama untuk penanganan penyakit endemik DBD di Indonesia. Tujuan penelitian ini untuk mendapatkan isolat Bacillus thuringiensis asal Kota Nganjuk yang paling efektif dalam membunuh larva Aedes aegypti. Sampel sedimen dan air diambil dari 10 lokasi di Kecamatan Nganjuk. Bakteri diisolasi menggunakan media selektif B. thuringiensis  kemudian  dilakukan  karakterisasi  fenotip  (Profil  Matching  Method),  seleksi  isolat  yang  patogen dan uji toksisitas (LC 50 ) pada larva nyamuk Aedes aegypti instar III. Persentase mortalitas larva dianalisis probit (LC 50 )  dan  ragam  (ANOVA).  Hasil  isolasi  mendapatkan  dua  isolat  B.  thuringiensis  yaitu  K.K1.S.K2  dan W.Swh.S.K2 dari 26 isolat bakteri yang mampu membunuh larva Aedes aegypti instar III lebih dari 50 %. Isolat K.K1.S.K2 serta W.Swh.S.K2 dengan  umur  biakan 48 jam pada  waktu pendedahan  72 jam efektif  membunuh larva  Aedes  aegypti instar III secara berurutan yaitu 83,3 % dan  76,67 %. Isolat  W.Swh.S.K2  hasil isolasi dari sampel sedimen memiliki toksisitas tertinggi dengan nilai LC 50 48 jam sebesar 3,53x10 7 sel/ml.
Kata Kunci : Aedes aegypti, Bacillus thuringiensis , Demam Berdarah Dengue , Uji Toksisitas

## ABSTRACT
Dengue  Hemorrhagic  Fever  (DHF)    is  one  of  endemic  disease  in  Indonesia  and  increase  mortality  of  people, especially  in  East  Java.  Nganjuk  has  the  highest  density  of  Aedes  aegypti  larvae  from  all  city  in  East  Java  at 2008-2010  caused  of  it.  Nganjuk  was  the  one  of  major  DHF  epidemic  foci  in  Indonesia.  The  objective  of  this research  was  to  get  Bacillus  thuringiensis  isolates  from  Nganjuk  City  that  has  highest  toxicity  to  Aedes  aegypti larvae. The sediment and water samples were taken from 10 sites in Nganjuk. Bacterial isolation was performed using  B.  thuringiensis  selective  media.  Phenotypic  characteristics  of  the  isolates  were  obtained  with  the  simple matching  method,  and  the  toxicity  tests  were  also  performed  on  the  third  instar  larval  stage  of  Aedes  aegypti. Larvae mortality  was analyzed by using  regression probit and  value of LC 50 was analyzed using ANOVA. Two indigenous  B. thuringiensis isolates  among the 26 bacterial isolates,  K.K1.S.K2 and W.Swh.S.K2  were  toxic to the third instar larvae of A. Aegypti more than 50 % mortality. The K.K1.S.K2 and W.Swh.S.K2 isolates  at the age  of 48-hour  culture  at 72  hours  of exposure time  kill the third  instar larvae  of  Aedes aegypti at  83,3% and 76,67%,  respectively. W.Swh.S.K2  that  isolated  from  sediment  sample  has  highest  toxicity  for  killing  the  third instar larvae of Aedes aegypti at LC 50 48 h = 3,53 x10 7 cells / mL.
Key words: Aedes aegypti , Bacillus thuringiensis, Dengue Hemorrhagic Fever, Toxicity Test

## PENDAHULUAN
Demam  Berdarah Dengue (DBD)  merupakan penyakit  endemis  di  Indonesia  yang  menyebabkan banyak kematian penduduk. Penyakit DBD disebabkan  oleh  virus dengue dan  ditularkan  oleh nyamuk Aedes  aegypti L.[18].  Pada  tahun  2010 jumlah  kematian  akibat  kasus  DBD  di  Indonesia sekitar 1.317  orang, hal ini menyebabkan Indonesia menduduki  urutan  tertinggi  untuk  kasus  DBD  di ASEAN [1].
Nganjuk  merupakan  salah  satu  Kota  di  Provinsi Jawa  Timur  yang  dinyatakan  sebagai  daerah
endemis  DBD  dan  dinilai  paling  rawan,  sehingga kota  tersebut  merupakan  daerah  fokus  utama  untuk penanganan penyakit tersebut. Berdasarkan data dari Dinas  Kesehatan  Jawa  Timur  tahun  2010  [7],  Kota Nganjuk memiliki nilai kelimpahan larva A. aegypti tertinggi  dari  seluruh  kota  di  Provinsi  Jawa  Timur dari  tahun  2008-2010  yaitu  dengan  rata-rata  70,58 %. Selain itu berdasarkan analisis kasus DBD Dinas Kesehatan Jawa Timur periode Tri Bulan I (Januari- Maret  2012)  Kota  Nganjuk  mengalami  peningkatan jumlah  penderita  dan  peningkatan  angka  kematian (CFR).
Penularan  penyakit  DBD  akan  terus  meningkat apabila  tidak  adanya  upaya  pemberantasan  serta akibat  tingginya  kontak  dengan  nyamuk  vektor DBD  [5].  Pengendalian  yang  umum  dilakukan adalah  dengan  menggunakan  bahan  kimia,  namun penggunaan  secara  berlebihan  akan  menyebabkan resistensi vektor virus dengue , pencemaran lingkungan, serta terbunuhnya musuh alami (organisme  bukan  sasaran).      Oleh  karena  itu diperlukan metode pengendalian yang  lebih mengutamakan keamanan lingkungan dengan pengendalian secara biologi yaitu dengan memanfaatkan  toksin  dari B.  thuringiensis [3]. Penggunaan  bakteri B.  thuringiensis lebih  ramah lingkungan  karena  mempunyai  target  yang  spesifik (tidak  mematikan  serangga  bukan  sasaran)  dan mudah  terlarut  sehingga  tidak  terakumulasi  dan mencemari lingkungan [4, 13].

## METODE PENELITIAN
Pengambilan Sampel. Penentuan lokasi
pengambilan sampel didasarkan pada data kelimpahan  larva A.  aegypti tertinggi  dari  seluruh kota  di  Provinsi  Jawa  Timur  tahun  2008-2010 (Dinas  Kesehatan  Jawa  Timur,  2010).  Lokasi pengambilan  sampel  tersebut  adalah  di  Kelurahan Kauman  dan  Kelurahan  Werungotok,  Kecamatan Nganjuk, Kabupaten Nganjuk, Jawa Timur.
Isolasi  Bacillus  thuringiensis. Bakteri  diisolasi dengan  metode  yang  merujuk  pada  Atlas  (2004); Gama & Marwati (2005); Chatterjee dkk. (2007) [2, 6,  11].  Media  yang  digunakan  untuk  isolasi  bakteri adalah  media selektif B. thuringiensis yaitu glukosa 3  g,  (NH4) 2 SO 4 2  g, yeast  extract 2  g, K 2 HPO 4 .3H 2 O  0,5 g, MgSO 4 .7H 2 O  0,2 g, CaCl 2 .2H 2 O 0,08 g, MnSO 4 .4H 2 O 0,05 g, Agar 15 g dalam  1000  ml  akuades.  Biakan  diinkubasikan selama  ±  48-72  jam  dalam  inkubator  dengan  suhu 30 o C.  Karakter  koloni  bakteri  yang  diisolasi  yaitu berbentuk  bulat,  dengan  tepian  berkerut,  memiliki diameter 5 – 10 mm, berwarna putih, elevasi  timbul ( raised )  dan  permukaan  koloni  kasar  [16],  serta merupakan  bakteri  Gram  positif,  memiliki  sel vegetatif  berbentuk  batang  dengan  ukuran  panjang 3-5  µm  dan  lebar  1-1,2  µm,  memiliki  endospora dengan letak subterminal [19].
Isolat  yang  memiliki  karakter  mirip  dengan B. thuringiensis dimurnikan  dengan  metode streak plate secara  kuadran,  dan    diinkubasikan  selama  ± 48-72  jam  dalam  suhu  30º  C.  Isolat  yang  telah dimurnikan  disimpan  pada  media  NA  ( Nutrient Agar ) dengan suhu 4º C.
Klasifikasi bakteri berdasarkan nilai similaritas  sifat-sifat  fenotip .  Uji  biokimia  yang dilakukan  meliputi uji  katalase,  hidrolisi pati, voges proskauer ,  dan  diuji  menggunakan  API  50  CHB ( bioMerieux,  Marcyle  Etoile,  France ).  Similaritas isolat  bakteri  diketahui  dengan  menggabungkan seluruh  data  karakter  fenotip  kemudian  diolah menggunakan program CLAD97 [15]. Data tersebut diolah  menggunakan  program  CLAD97  untuk mengkonstruksikan dendogram  yang mencerminkan indeks similaritas antarstrain menggunakan algoritma  pengklasteran average  linkage (UPGMA: Unweight  Pair  Group  Method  with  Arithmatic Average ) [15].
Uji Toksisitas B. thuringiensis terhadap larva A. aegypti. Larva nyamuk A. aegypti diperoleh dari Dinas  Kesehatan  Provinsi  Jawa  Timur,  Surabaya. Larva  yang  digunakan  untuk  uji  toksisitas  adalah larva  instar  III.  Isolat  bakteri  berumur  24  jam diinokulasikan  pada  50  ml  medium  NB  ( Nutrient Broth )  yang  diinkubasi  pada  suhu  30 ⁰ C  selama  72 jam.  Pada  setiap  waktu  inkubasi  24  jam  sekali, suspensi  bakteri  diambil  sebanyak  5  ml  dan diinokulasikan pada mangkuk plastik yang sebelumnya  telah  diisi  dengan  45  ml  air  sumur steril.  Pada  setiap  mangkuk  diisi  dengan  20  ekor larva  instar  III  [23]  dan  juga  ditambah  pakan  larva berupa dogfeed . Perlakuan kontrol berupa 50 ml air sumur  yang  telah  ditambah  20  ekor  larva  dan dogfeed tanpa  suspensi  bakteri.  Mortalitas  larva dihitung pada setiap pendedahan 24, 48 dan 72 jam [10].
Isolat  bakteri  yang  dapat  membunuh  larva A. aegypti lebih dari 50% maka dilakukan uji toksisitas kembali dengan seri pengenceran antara perbandingan  suspensi  bakteri  dan  air  sumur  yaitu 50:0, 45:5, 40:10; 35:15, 30:20, dan 25:25 ml. Isolat bakteri pada umur biakan 24-48 jam diinokulasikan dalam  50  ml  NB  dan  diinkubasi  pada  suhu  30 ⁰ C sebagai  kultur  murni.  Setiap  konsentrasi  suspensi kultur  dimasukkan  dalam  mangkuk  plastik  dan ditambahkan  20  ekor  larva  instar  III  beserta dogfeed .  Perlakuan  kontrol  berupa  50  ml  air  sumur yang  telah  ditambah  20  ekor  larva  dan dogfeed tanpa  suspensi  bakteri.  Mortalitas  larva  dihitung pada setiap pendedahan 24, 48 dan 72 jam [10].
Nilai  LC 50 dihitung  berdasarkan  analisis  Probit SPSS  for  Windows release  16.0. Nilai  LC 50 setiap waktu pengamatan  dan  konsentrasi B. thuringiensis dilakukan  menggunakan  uji Independent  Sample  T Test ( α = 0,05).
Analisis  Data. Uji  toksisitas B.  thuringiensis terhadap  larva  nyamuk A.  aegypti diuji menurut Rancangan Acak Kelompok (RAK). Perlakuan pada
percobaan  ini  yaitu  isolat  bakteri  dan  waktu pendedahan.
Percobaan tersebut dilakukan sebanyak  tiga  ulangan  dengan  parameter  uji persentase kematian larva nyamuk A. aegypti .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik  Fenotip  Isolat  Nganjuk  yang Memiliki  Kemiripan  dengan  B.  thuringiensis Pengendali Larva A. aegypti
Hasil isolasi bakteri  dari Nganjuk  didapatkan 59 isolat Bacillus spp.  dan  hanya  26  isolat  yang memiliki  kemiripan  dengan B.  thuringiensis baik dari  hasil  pengamatan  morfologi  koloni,  sel  dan endospora.  Berdasarkan  hasil  seleksi  dari  26  isolat yang dapat membunuh larva A. aegypti lebih dari 50 %  diperoleh  tiga  isolat  yaitu  W.Sung.S.K3, K.K1.S.K2 dan W.Swh.S.K2.
Gambar 1. Dendogram tingkat similaritas  keempat isolat bakteri berdasarkan karakter fenotip
Similaritas  antara  W.Sung.S.K3,  K.K1.S.K2, W.Swh.S.K2  dengan B.  thuringiensis HD-567 disajikan  pada  Gambar  1.  Suatu  isolat  dapat dikatakan  dalam  satu  genus  dengan  indeks similaritas  fenotip  antara  89-98  %,  dalam  satu spesies  dengan  indeks similaritas  fenotip 99 %, dan dalam  satu strain apabila  memiliki  indeks similaritas  fenotip  100  %  [14].  Sehingga  dapat dikatakan  isolat  K.K1.S.K2  merupakan  satu strain dengan B.  thuringiensis HD-567  karena  memiliki indeks  similaritas  100  %,  sedangkan  W.Swh.S.K2 merupakan  satu  spesies  dengan B.  thuringiensis HD567  karena  memiliki  indeks  similaritas  99  %. Isolat W.Sung.S.K3 memiliki nilai indeks similaritas  79  %  dan  dianggap  tidak  dalam  satu genus  dengan B.  thuringiensis HD-567,  sehingga
tidak  dilakukan  uji  penentuan  LC 50 pada  isolat tersebut.  Isolat  W.Swh.S.K2  memiliki  similaritas dengan B.  thuringiensis HD-567  sebesar  99  % karena  memiliki  perbedaan pada salah satu  hasil uji API  50-CHB.  Isolat  W.Sung.S.K3  memiliki similaritas  dengan B.  thuringiensis HD-567  sebesar 79 % karena  memiliki perbedaan  warna koloni,  dan juga beberapa hasil uji biokimia pada API 50 CHB.
Tabel  1.  Karakter  fenotip B.  thuringiensis asal  Nganjuk yang  memiliki  patogenisitas  terhadap  larva A. aegypti instar III lebih dari 50 %
Keterangan: (+) = memiliki karakter fenotip yang bersangkutan (-)  = tidak memiliki karakter fenotip yang bersangkutan
Gambar  2.  Morfologi  endospora  dengan  pewarnaan malachite  green pada  perbesaran  1000x. Tanda  (      )  Sel  vegetatif;  (      )  Endospora dengan letak subterminal
Hasil  Uji  Toksisitas  (LC 50 )  Isolat  Nganjuk Terhadap Larva A. aegypti
Hasil  seleksi  dari  26  isolat  yang  dapat membunuh  larva A.  aegypti instar  III  diperoleh  dua isolat B.  thuringiensis yaitu  isolat  K.K1.S.K2  dan W.Swh.S.K2.  Isolat  K.K1.S.K2  serta  W.Swh.S.K2 dengan umur biakan 48 jam pada waktu pendedahan 72  jam  membunuh  larva Aedes  aegypti instar  III lebih  dari  50  %  berturut-turut  yaitu  68,3  %  dan 51,67 % (Gambar 3). Kedua isolat tersebut memiliki daya bunuh paling  efektif  dibandingkan isolat-isolat yang  lainnya  karena  memiliki  nilai  mortalitas  yang tinggi.  Perbedaan  tingkat  toksisitas  dari  26  isolat tersebut  diduga  karena  adanya  perbedaan  jenis kristal [17].
Isolat  K.K1.S.K2  dan  W.Swh.S.K2  membunuh larva  pada  umur  biakan  24  jam,  dan  menunjukkan nilai  toksisitas  tertinggi  pada  umur  biakan  48  jam, kemudian  nilai toksisitas menurun secara signifikan pada  inkubasi  biakan  72  jam.  Perbedaan  nilai toksisitas  pada  waktu  inkubasi  yang  berbeda tersebut  berhubungan  dengan  waktu  produksi toksin.
Isolat K.K1.S.K2, W.Swh.S.K2 dan
B.thuringiensis HD-567  telah  dapat  membunuh larva  pada  inkubasi  24  jam  diduga  karena  adanya senyawa  eksotoksin  yang  keluar  sebelum  fase sporulasi.  Eksotoksin  diproduksi  selama  fase  aktif pertumbuhan  vegetatif  yaitu  fase  logaritmik. Eksotoksin  merupakan senyawa  yang tersusun oleh adenine,  ribose,  glukosa  dan  asam  alarat.  Senyawa tersebut  bersifat  toksik  teradap  serangga  ordo diptera,  vertebrata  dan  mikroorganisme  lain  [8,    9, 17].
Gambar 3. Persentase mortalitas larva A. aegypti instar III oleh perlakuan isolat K.K1.S.K2, W.Swh.S.K2 dan B.  thuringiensis HD-567.  Keterangan  : huruf  kecil  yang  sama  di  atas  balok  dalam umur  biakan  yang  sama  menunjukkan  tidak terdapat perbedaan.
Isolat K.K1.S.K2, W.Swh.S.K2 membunuh larva secara  maksimal  pada  umur  biakan  48  jam  dimana telah  terjadi  fase  sporulasi  secara  maksimal.  Kedua isolat tersebut kemungkinan besar dapat menyebabkan  kematian  larva    karena  adanya δ - endotoksin yang keluar saat fase sporulasi. Senyawa δ -endotoksin merupakan jenis toksin yang berbentuk  protoksin  selama  tahap  sporulasi  dan bersifat  insektisidal  ketika  masuk  ke  dalam  saluran pencernaan larva A. aegypti [8,  9, 17].
Apabila  dibandingkan  dengan  kedua  isolat Nganjuk,  isolat B.  thuringiensis HD-567  memiliki nilai  toksisitas  terhadap  larva A.aegypti pada  umur biakan 24 jam  yang jauh lebih rendah  yaitu 6,67 %. Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan oleh Gama [10], bakteri B. thuringiensis isolat lokal mempunyai daya bunuh yang lebih besar dibandingkan  dengan B.  thuringiensis varietas israelensis serotype H-14.
Larva  hasil  uji  dengan  menggunakan  isolat K.K1.S.K2  dan  W.Swh.S.K2  terlihat  mengalami kerusakan pada bagian saluran pencernaannya. Pada Gambar  4  (a)  merupakan  larva  normal,  dimana terlihat  saluran  pencernaan  yang  masih  utuh. Sedangkan pada gambar b, c dan d merupakan larva hasil uji yang mengalami kerusakan.
Gambar  4.    Kerusakan  membran  saluran  pencernaan  larva A. aegypti (a). larva  normal; (b). hasil uji toksisitas oleh isolat K.K1.S.K2; (c). hasil uji toksisitas oleh isolat  W.Swh.S.K2;  (d).  hasil  uji  toksisitas  oleh isolat B.  thuringiensis HD567;  (    )  saluran pencernaan  yang  rusak,  (      )  saluran  pencernaan normal.
Tabel 2. Nilai LC 50 terhadap larva A. aegypti instar III
Mortalitas  larva  dengan  perlakuan  berbagai konsentrasi  bakteri  digunakan  untuk  penentuan LC 50 .  Nilai  LC 50 adalah  satuan  yang  menyatakan konsentrasi  suatu  produk  yang  mampu  membunuh
50  %  dari  organisme  uji  [21].  Isolat  yang  memiliki toksisitas  paling  baik  adalah  yang  membutuhkan konsentrasi  bakteri  paling  sedikit  dalam  membunuh 50%  larva  dengan  waktu  pendedahan  paling  cepat. Nilai  LC 50 dari  perlakuan  K.K1.S.K2, W.Swh.S.K2 dan B.thuringiensis HD-567  pada  pendedahan  24 jam  secara  berurutan  yaitu  3,92×10 7 sel/ml,  3,96 ×10 7 sel/ml,  dan    47,08×10 7 sel/ml;  pada pendedahan  48  jam  yaitu    3,83  ×10 7 sel/ml,  3,53 ×10 7 sel/ml  dan  46,66×10 7 sel/ml,  serta  pada pendedahan  72  jam  yaitu  3,66  ×10 7 sel/ml,  3,50 ×10 7 dan  19,49×10 7 sel/ml  (Tabel  2).  Sehingga diantara  isolat B.  thuringiensis yang  memiliki efektivitas  terbaik adalah W.Swh.S.K2 dengan  nilai LC 50 48  jam  sebesar  3,53  ×10 7 sel/ml.  Densitas  sel yang  dibutuhkan  W.Swh.S.K2  untuk  membunuh larva  50%  pada  pendedahan  48  jam  dan  72  tidak berbeda signifikan  yaitu 0,03 ×10 7 sel/ml, sehingga isolat  tersebut  dapat  dikatakan  memiliki  efektivitas yang  lebih  baik  dengan  waktu  pendedahan  paling cepat yaitu 48 jam.
Bedasarkan  hasil  dari  penelitian  sebelumnya yang  dilakukan  oleh  Gama  dkk  [12],  isolat B. thuringiensis yang  memiliki  potensi  terbaik  dalam membunuh  larva  adalah  isolat  indigenus  Kota Malang.  Isolat  tersebut  adalah  PWR4  32  dengan nilai  LC 50 72 jam  sebesar  22,79  x10 7 sel/ml. Sedangkan  isolat  dari  penelitian  ini  yang  memiliki potensi  terbaik  adalah  W.Swh.S.K2  dengan  nilai LC 50 48 jam sebesar 3,53 ×10 7 sel/ml. Dari hasil uji toksisitas  tersebut  dapat  disimpulkan  bahwa  isolat B.  thuringiensis indigenus  dari  Kota  Nganjuk memiliki  potensi  yang  lebih  baik  dibandingkan dengan  isolat  dari  Malang.  Hal  ini  dapat  dilihat dengan  densitas  sel  dari    isolat  Nganjuk  yang  lebih sedikit dapat membunuh larva lebih banyak.

## KESIMPULAN
Dua  isolat B.  thuringiensis yaitu  K.K1.S.K2  dan W.Swh.S.K2  asal  Nganjuk    dapat  membunuh  larva A.  aegypti instar  III  lebih  dari  50%.  Isolat W.Swh.S.K2  memiliki  toksisitas  tertinggi  dalam membunuh  larva A.  aegypti instar  III  dengan  nilai LC 50 48 jam sebesar 3,53 ×10 7 sel/ml.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terimakasih  ditujukan  kepada  Bapak  Drs. Setijono  Samino,  MS.,  D.Sc.  selaku  pembimbing yang  telah  mendampingi  dan  memberi  pengarahan serta  tambahan  ilmu  dan  saran-saran  yang  berguna dan  Ibu  Zulfaidah  Penata  Gama  S.Si,  M.Si  selaku ketua  proyek  penelitian Bacillus  thuringiensis di Provinsi  Jawa  Timur  yang  telah  membiayai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Anna, L. K. 2011. Kompas Health . http://health.kompas.com/read/2011/02/1907163 187/Kasus.DBD.di.Indonesia.tertinggi.di.ASEA N. Diakses tanggal 29 Agustus 2012
[2] Atlas, R. M.  2004.  Microbiology: Fundamentals and  Applications . 2nd  Edition.  McMillan  Publ. Co. New York.
[3] Bellows, T. S, T. W. Fisher. 1999. Handbook of Biological  Control.  Principles  and  Applications of  Biological  Control.  Academic  Press.  New York.
[4]  Blondine,  Ch.  P  &  U.  Widyastuti.  2001. Patogenisitas Isolat Bacillus thuringiensis setelah dikeringkan  pada  Suhu  Dingin  (Lyophilisasi) terhadap  Jentik Aedes  aegypti di  Laboratorium.
http://.kalbe.co
.id/.....pdf/07_PtogenisitasIsolat.html. Diakses tanggal 4 April 2012
[5]  Budiyanto,  A.  2005.  Study  Indeks  Larva Nyamuk Aedes  aegypti dan  Hubungannya dengan  PSP  Masyarakat  tentang  Penyakit  DBD di Kota Palembang Sumatra Selatan.http://www.google.con/search?H=en&q= studi+indeks+larva+nyamuk+aedes+aegypti+.....
Diakses tanggal 27 Mei 2013
[6] Chatterjee, S. N., T. Bhattacharya, T. K. Dangar &  G.  Chandra.  2007.  Ecology  and  diversity  of Bacillus  thuringiensis in  soil  Environment. African J. Biotechnol. 6 (13) : 1587-1591.
[7]  Dinas  Kesehatan  Provinsi  Jawa  Timur.  2010. Profil Kesehatan Provinsi Jawa Timur. www.dinkes.jatim.prov.go.id. Surabaya.
[8]  Dulmage  HT.  1981.  Insecticidal  activity  of isolates  of Bacillus  thuringiensis and  their potential  for  pest  control.  In:  Burges  HD,  ed. Microbial  Control  of  Pest  and  Plant  Diseases. London: Academic Press.
[9]  Faust,  P.  &  L.  Bulla.  1982.  Bacteria  and  their toxins as insecticides, pp. 75Ð208. In E. Kurstak [ed.],  Microbial  and  viral  pesticides.  Mercel Dekker, New York.
[10]  Gama,  Z.  P.,  Suharjono,  &  G.  Ekowati.  1998. Potensi Patogenitas Bacillus thuringiensis var.israelensis  serotype  H-14 dan Bacillus thuringiensis isolat  Madura  terhadap  Larva Nyamuk.  Laporan  Penelitian  Jurusan  Biologi FMIPA, Universitas Brawijaya. Malang.
[11]  Gama,  Z.  P.  dan  U.  Marwati.  2005.  Seleksi Strain Bacillus  thuringiensis Isolat  Sumenep yang  paling  Potensial  sebagai Agen  Pengendali Larva Nyamuk A . aegypti . Natural 9 (1) : 1-5.
[12]  Gama,  Z.P.,  N.  Nakagoshi,  Suharjono,  &  F. Setyowati. 2013. Toxicity studies  for indigenous
Bacillus thuringiensis isolates  from  Malang  city, East Java on Aedes aegypti larvae. Asian Pacific.
J.Tropic. Biomed . 13: 60034-9.
[13]  Nurwijayanti,  R.  2005.  Daya  Bunuh Bacillus thuringiensis Isolat  Bangkalan  Madura  terhadap Berbagai  Instar Larva Nyamuk. Jurusan Biologi.
Fakultas  MIPA.  Universitas  Brawijaya.  Malang.
Skripsi
[14]  Priest,  F  &  B.  Austin.  1993.  Modern  Bacterial Taxonomy Second Edition. Champman dan Hall. London.
[15]  Rahardi,B.  2002.  Pemrogaman  Aplikasi Konstruksi  Kekerabatan  Taksonomi  Dengan Visual C++6.0. Jurusan Biologi FMIPA Universitas Brawijaya Malang. Skripsi
[16]  Rampersad,  J.,  A.  Khan  and  D.  Ammons. 2002.  Usefulness  of  Staining  Parasporal  Bodies when  Screening  for Bacillus  thuringiensis .  J.
Invertebr. Pathol. 79:203-4
[17]  Schnepf  E,  Crickmore  N,  Van  Rie  J,  Lereclus D,  Baum  J,  Feitelson  J,  Zeigler  DR,  Dean  DH (1998). Bacillus  thuringiensis and  its  pesticidal crystal  proteins.  Microbiol.  Mol.  Biol.  Rev.,  62: 775-806.
[18] Some, H. 2007. Nyamuk Demam Berdarah dan Warna  Bak  Mandi.  http://strenkali.org.  Diakses 12 April 2012.
[19] Trizelia. 2001. Pemanfaatan Bacillus thuringiensis untuk pengendalian hama crocidotoma binotalis. IPB. Bandung.
[20]  Walther,  C.  J.,  G.  A.  Couche,  M.  A. Pfannenstiel,  S.  E.  Egan,  L.  A.  Bivin  &    K.  W. Nickerson. 1986. Analysis of mosquito larvicidal potential  exhibited  by  vegetative  cells  of
Bacillus  thuringiensis subsp.  israelensis . Appl. Environ. Microbiol . 52:650–653.
[21]  Yamamoto,  T.,  T.  Lizuka  &  J.N.  Aronson. 1983. Mosquitocidal Protein of Bacillus
thuringiensis var. israelensis : Identification and Partial  Isolation  of  the  Protein. Current. Microbiol . 9: 279-284.