AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK DAN FRAKSI HASIL FERMENTASI FUNGI ENDOFIT GENUS Cephalosporium sp. DIISOLASI DARI DAUN MENIRAN ( Phyllantus niruri Linn.)

## CYTOTOXIC ACTIVITY OF FERMENTATION EXTRACT AND FRACTION ENDOPHYTIC FUNGI GENUS  Cephalosporium sp ISOLATED FROM
MENIRAN LEAF (Phyllantus niruri Linn. ) Rollando Info Artikel Abstrak
Latar  Belakang: Mikroba  endofit  merupakan  mikroba  yang  hidup  berkoloni dalam jaringan tumbuhan yang dapat memproduksi senyawa bioaktif yang sama bahkan  identik  dengan  senyawa  yang  dihasilkan  tumbuhan  inangnya. Tujuan: Mengetahui aktivitas sitotoksik ekstrak etil asetat, fraksi n-heksana, fraksi dietil eter, dan fraksi etanol hasil fermentasi  fungi endofit  genus Cephalosporium sp yang diisolasi dari tumbuhan meniran dilakukan terhadap sel kanker jenis T47D dan sel normal jenis Vero secara in vitro. Metode: Fungi endofit diisolasi dari daun meniran dan dilakukan analisis morfologi, fungi genus Cephalosporium sp dikembangbiakkan  dengan  media potatoes  dextrose  broth .  Pemisahan  ekstrak dan  miselium  dilakukan  dengan  cara  disaring.  Ekstraksi  menggunakan  metode ekstraksi  cair-cair  dan  pemisahan  fraksi  menggunakan  metode  kromatografi kolom  menggunakan pelarut  dengan kepolaran bertingkat. Hasil: Fraksi etanol mempunyai  aktivitas  sitotoksik  tertinggi  dengan  nilai  IC 50 sebesar  15,47±0,71 µg/mL dan memiliki nilai selectivity index antara sel kanker jenis T47D dan sel normal  Vero  memenuhi  syarat  >3  dengan  nilai  sebesar  23,31. Simpulan  dan saran: Fraksi  etanol  mempunyai  aktivitas  sitotoksik  yang  poten  dan  memiliki nilai selectivity  index antara  sel  kanker  payudara  jenis  T47D  dan  sel  normal Vero memenuhi syarat >3 . Isolasi dan identifikasi senyawa aktif di dalam fraksi etanol  diperlukan  untuk  mengetahui  senyawa  yang  mempunyai  aktivitas sitotoksik secara spesifik.

## Sejarah Artikel:
Diterima 4 April 2016 Disetujui 12 Mei 2016
Dipublikasikan 16 Juni 2016
Kata Kunci: Fungi endofit, Cephalosporium sp, sitotoksik,  sel  T47D, Sel Vero Keywords: Endophytic fungi, Cephalosporium sp , cytotoxic,  T47D  cell line, Vero Cell Line

## Abstract
Background: Microbes  endophytic  can  form  a  living  microbes  colonize  the plant  tissues  can  produce  the  same  bioactive  compounds  even  identical compound  produced  by  host  plants. Objective: Determine  in  vitro  cytotoxic activity  of  the  ethyl  acetate  extract,  fraction  of  n-hexane,  diethyl  ether,  and ethanol  genus  Cephalosporium  sp  endophytic  fungi  isolated  from  meniran against  cancer  cell  lines  T47D  and  normal  cells  type  Vero. Methods : Endophyte  fungi  was  isolated  from  meniran  leaves  and  has  been  morphology analyzed,  fungi  from  genus  chephalosporium  was  growth  using  potatoes dextrose  broth  medium.  Extract  and  micelium  separation  was  conducted  by using  column  chromatography  method  and  graded  polarity  solvent. Result: Ethanol  fraction  was  highest  cytotoxic  activity  with  IC 50 values  of  15,47±0,71 µg/mL  and  selectivity  index  value  between  T47D  cell  line  and  Vero  cell  line qualify >3 with a value of 23,31. Conclusion and suggestion: Ethanol fraction was highest cytotoxic activity and selectivity index value between T47D cell line and Vero cell line qualify >3 with a value of 23,31. Isolation and identification of  active  compounds  in  the  ethanol  fraction  required  to  determine  the compounds that have specifically cytotoxic activity.
Rollando | Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Dan ….. Jurnal Wiyata, Vol. 3 No. 1 Tahun 2016

## PENDAHULUAN
Mikroba merupakan sumber senyawa bioaktif  yang  telah  banyak  diteliti  memiliki aktivitas  farmakologi  diantaranya  sebagai antibakteri,  antivirus  dan  antikankanker. Salah  satu  kelompok  mikroba  penghasil senyawa  bioaktif  adalah  mikroba  endofit. Selain senyawa bioaktif baru, mikroba endofit dapat  memproduksi  senyawa  bioaktif  yang sama  bahkan  identik  dengan  senyawa  yang dihasilkan tumbuhan inangnya 1 . Pengembangan endofit sebagai sumber  obat  merupakan  salah  satu  alternatif pengendalian  non  kimiawi  yang  terus dikembangkan dalam beberapa dekade terakhir.  Mikroba  endofit  hidup  bersimbiosis dengan  tanaman  di  dalam  jaringan  tanaman, mikroba  tersebut  mampu  menghasilkan  suatu agen biologis yang dapat memerangi penyakit 2 .
Fungi  endofit  dapat  menghasilkan senyawa  kimia  seperti  alkaloid,  flavonoid, fenolik dan terpenoid 3 . Mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa bioaktif yang karakternya mirip atau sama dengan inangnya dikarenakan  adanya  adaptasi  lingkungan hidup endofit pada inang, pengaruh lingkungan  hidup  dan  interaksi  genetik  antar keduanya 4 .  Sebagai  contoh  adalah  fungi endofit Diaporthe phaseolorum yang menghasilkan  senyawa  antibakteri,  yaitu asam  3-hidroksipropanoat  yang  dapat  juga dihasilkan  pada  daun  tumbuhan  inangnya yaitu Lagunacularia  racemosa 5 . Senyawa
piperin yang aktif terhadap bakteri Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium  smegmetis dihasilkan  oleh
fungi  endofit Periconia sp . dan  tumbuhan Piper longum Lour. sebagai tumbuhan inang 6 . Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang pengaruh  ekstrak  etil  asetat,  fraksi  heksan, dietil  eter,  dan  etanol  hasil  fermentasi  fungi
endofit  genus Cephalosporium sp. dari  daun meniran  ( Phyllantus  niruri Linn.)  dengan melihat efek antikanker secara in vitro.

## METODE PENELITIAN
Fungi endofit yang dijadikan mikroorganisme target telah berhasil diisolasi dari  daun  meniran.  Fungi  endofit  tersebut kemudian  diidentifikasi  di  Laboratorium Mikologi,  Fakultas  Pertanian,  Universitas Gadjah Mada. Hasil analisis makroskopik dan mikroskopik menunjukan bahwa fungi endofit tersebut  merupakan  genus Cephalosporium sp.
Fungi  endofit  ditumbuhkan  pada media potato  dextrose  agar (PDA)  hingga umur  9  hari.  Selanjutnya,  fungi  ditumbuhkan pada media cair potato dextrose broth (PDB) dengan  waktu  fermentasi  selama  10  hari. Miselium  fungi  dan  media  cair  PDB  hasil fermentasi  dipisahkan  dengan  cara  disaring.
Filtrat media
kemudian dipartisi menggunakan  corong  pisah  dengan  pelarut etil  asetat.  Filtrat  etil  asetat  diupakan pelarutnya  dengan  penguap  putar  vakum hingga  didapatkan  ekstrak  kasar.  Ekstrak kasar  pisahkan  lagi  menggunakan  metode kromatografi  kolom  menggunakan  pelarut bertingkat  yaitu,  n-heksana,  dietil  eter,  dan etanol.  Filtrat  n-heksana,  dietil  eter,  dan etanol  diuapkan  pelarutnya  hingga  diperoleh fraksi  n-heksana,  dietil  eter,  dan  etanol. Ekstrak  kasar  etil  asetat,  fraksi  n-heksana, fraksi  dietil  eter,  dan  fraksi  etanol  digunakan untuk uji sitotoksik.
Uji  antikanker  dilakukan  terhadap  sel kanker  payudara  jenis  T47D  dan  sel  normal jenis  Vero.  Uji  sitotoksisitas  menggunakan metode  MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide). Sel kanker payudara  T47D  ditumbuhkan  dengan  media kultur  RPMI,  sel  normal  Vero  dalam  media kultur M199, masing-masing berisi FBS 10%,
Rollando | Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Dan ….. Jurnal Wiyata, Vol. 3 No. 1 Tahun 2016
penisilin-streptomisin  1%,  dan  fungizon 0,5%. Konsentrasi larutan  uji yang digunakan adalah 7,81 ; 15,62 ; 31,25 ; 62,5 ; 125 ; 250 ; 500  µg/ml. Viabilitas  sel  ditentukan  dengan absorbansi  pada  λ  595  nm  menggunakan ELISA reader. Data  absorbansi  perlakuan dikonversi  ke  dalam  persen  viabilitas  dan digunakan untuk menghitung  IC 50 . Selectivity Index (SI)  merupakan  hasil  bagi  antara  IC 50 sel Vero dan IC 50 sel kanker payudara T47D.

## HASIL PENELITIAN
Fungi  endofit  genus Cephalosporium sp. yang  diisolasi  dari  daun  meniran (memiliki  karakteristik  yaitu  koloni  fungi berwarna putih (Gambar 1).
Gambar 1. Fungi Cephalosporium sp. umur 7 hari  pada  media  PDA  (a),  Kultur fungi Cephalosporium sp. hari ke-
10 pada media PDB (b)
Data  tabel  1  menunjukan  parameter nilai  IC 50 ,  bahwa  fraksi  etanol  mempunyai aktivitas sitotoksik yang lebih poten dari pada ekstrak  etil  asetat,  fraksi  n-heksan  dan  fraksi dietil eter terhadap sel T47D. Nilai IC 50 yang diperoleh  pada  perlakuan  fraksi  n-heksan, dietil  eter  dan  etanol  menunjukan  bahwa semua  fraksi  poten  sebagai  agen  sitotoksik karena  didapatkan  nilai  IC 50 yang  lebih  kecil dari 100 µg/mL. 8 Pada perlakuan terhadap sel normal (Vero), ekstrak etil asetat mempunyai nilai  IC 50 yang  paling  besar.  Hal  tersebut menunjukan  bahwa  ekstrak  etil  asetat mempunyai  efek  toksik  yang  kecil  terhadap sel normal.
Tabel  1.    Hasil  uji  sitotoksik  ekstrak  dan fraksi
Perlakuan IC 50 T47D (µg/ml) IC 50 Vero (µg/ml) Selectivity index (SI) Ekstrak etil asetat 139,43 ±1,23 398,98± 0,98 2,86 Fraksi n- heksan 67,91± 0,12 156,23± 0,34 2,30 Fraksi dietil eter 34,68± 1,65 232,76± 0,19 6,71 Fraksi etanol 15,47± 0,71 360,54± 0,65 23,31 Profil morfologi sel akibat perlakukan fraksi  etanol  diamati.  Perlakuan  fraksi  etanol menyebabkan  perubahan  morfologi  pada  sel T47D yaitu inti sel mengerut, terlihat sel yang mengalami kematian, dan jumlah sel berkurang  (Gambar  2a),  sedangkan  sel  tanpa perlakuan  menunjukkan  morfologi  yang normal (Gambar 2b). (a) (b) Gambar  2.  Pengamatan  dilakukan  di  bawah mikroskop inverted dengan pembesaran  100x.  (a)  kontrol  sel (tanpa  perlakuan);  (b)  perlakuan fraksi etanol 15 µg/mL. Morfologi  sel  T47D  yang  hidup ditunjukkan dengan gambar panah ( ) dan sel yang mengalami  perubahan  morfologi ditunjukkan  dengan  tanda  panah putus (       ).
Efek perlakuan fraksi etanol terhadap viabilitas sel T47D ditunjukkan pada Gambar 3.
(a) (b)
Rollando | Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Dan ….. Jurnal Wiyata, Vol. 3 No. 1 Tahun 2016
Gambar  3.  Efek  perlakuan  fraksi  etanol
terhadap  sel  T47D.  Nilai  IC 50 didapatkan  dari  perhitungan regresi linier konsentrasi dibandingkan dengan % viabilitas  sel  dengan  taraf kepercayaan 95% (p<0,05). Perlakuan fraksi etanol juga menyebabkan sel Vero mengalami perubahan morfologi,  yaitu  sel  mengecil  dan  membulat, namun  diperlukan  konsentrasi  yang  lebih tinggi  untuk  menghasilkan  efek  yang  sama terhadap  sel  T47D,  sedangkan  sel  tanpa perlakuan  menunjukkan  morfologi  yang normal (Gambar 4).
(a) (b)
Gambar  4.  Efek  perlakuan  fraksi  etanol
terhadap  sel  Vero.  Pengamatan dilakukan  di  bawah  mikroskop inverted dengan  pembesaran 100x.  (a)  kontrol  sel;  (b)  500 µg/mL.  Perubahan  morfologi sel  Vero  ditunjukkan  dengan gambar panah (       )
Efek perlakuan fraksi etanol terhadap viabilitas  sel  Vero  ditunjukkan  oleh  Gambar 5.
Gambar  5.  Efek  perlakuan  fraksi  etanol terhadap  sel  Vero.  Nilai  IC 50
didapatkan  dari  perhitungan regresi linier konsentrasi dibandingkan dengan % viabilitas  sel  dengan  taraf kepercayaan 95% (p<0,05)

## PEMBAHASAN
Fungi  endofit  genus Cephalosporium sp. yang  diisolasi  dari  daun  meniran
(memiliki  karakteristik  yaitu  koloni  fungi berwarna putih (Gambar 1). Genus Cephalosporium sp. memiliki  ciri-ciri,  yaitu:
miselium  yang  memadat,  tersusun  atas pigmen  hifa  yang  berwarna  gelap,  dan memproduksi  sklerotia  dengan  bentuk  tidak seragam. Ciri-ciri tersebut sesuai dengan yang dipaparkan  oleh  Sharma yang  menunjukan fungi genus Cephalosporium sp 7 .
Fraksi etanol mempunyai aktivitas sitotoksik  yang  lebih  poten  dari  pada ekstrak  etil  asetat,  fraksi  n-heksan  dan fraksi  dietil eter terhadap sel  T47D. Nilai IC 50 yang diperoleh pada perlakuan fraksi n-heksan, dietil eter dan etanol
menunjukan  bahwa  semua  fraksi  poten sebagai agen sitotoksik karena didapatkan nilai  IC 50 yang  lebih  kecil  dari  100 µg/mL 8 .
Rollando | Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Dan ….. Jurnal Wiyata, Vol. 3 No. 1 Tahun 2016
Prinsip  metode  MTT  assay  adalah MTT direduksi menjadi garam formazan oleh enzim suksinat  dehidrogenase  yang  terdapat di  dalam  mitokondria  sel  hidup.  Kemudian ditambahkan  reagen  stopper  yang  akan melisis  membran  sel  dan  melarutkan garam formazan.  Garam  formazan  yang  terbentuk diukur  dalam  bentuk  absorbansi.  Semakin tinggi  absorbansi,  semakin  banyak  sel  yang hidup (viabilitas sel tinggi).
Beberapa  kriteria  dalam  memilih
senyawa antikanker adalah dengan memperhatikan potensi sitotoksik,
selektivitasnya  terhadap  sel  normal,  dan ketersediaan  bahan  baku.  Potensi  antikanker dapat  dilihat  dari  nilai  IC 50 . Semakin  kecil nilai IC 50 maka potensi sitotoksiknya semakin besar.  Parameter  nilai Selectivity  index suatu senyawa ditetapkan untuk mengetahui tingkat keamanan suatu senyawa antikanker terhadap sel  normal.  Nilai Selectivity  index diperoleh dengan  membagi  nilai  IC 50 pada  sel  jenis Vero  dengan  sel jenis T47D.  Nilai selectivity index yang  disyaratkan  adalah  >3,  yang menandakan  bahwa  ekstrak  atau  fraksi mempunyai  aktivitas  sitotoksik  terhadap  sel kanker  tanpa  mempengaruhi  sel  normal,  dan dapat dikembangkan lebih lanjut sebagai agen kemopreventif 9 .
Fraksi  etanol  dan  dietil  eter  lebih selektif  membunuh  sel  kanker  payudara jenis T47D  dibandingkan  fraksi  n-heksan  dan ekstrak  etil  asetat.  Hal  tersebut  terlihat  dari nilai Selectivity  index fraksi  dietil  eter  dan fraksi  etanol  dengan  nilai  6,71  dan  23,31. Efek sitotoksis fraksi etanol terhadap sel Vero berdasarkan nilai IC 50 dan profil morfologi sel menunjukkan  efek  yang  lebih  rendah  jika dibandingkan  dengan  efeknya  terhadap  sel T47D.  Sel  menunjukkan  adanya  perubahan morfologi yang dimungkinkan karena protein yang  berperan  dalam  perlekatan  sel  tidak mengalami  polimerisasi  sehingga  ikatan  sel
terlepas  dan  membran  lipid  akan  membulat dan sitoskeleton terpotong. Penurunan viabilitas  sel  dan  kepadatan  sel  terlihat  pada semakin  tinggi  dosis    yang  digunakan,  serta dengan perubahan morfologi yang mengalami pengerutan  merupakan  penanda  sel  yang menuju kematian.
Faktor  jumlah  dan  potensi  senyawa bioaktif  yang  kompleks  dalam  ekstrak  dan fraksi bisa menjadi penyebab efek sitotoksiknya  rendah.  Salah  satu  strategi untuk  mengatasi  hal  ini  adalah  dengan melakukan  fraksinasi  dari  ekstrak  dan  isolasi senyawa dari fraksi. Senyawa yang terkandung dalam fraksi lebih sedikit dibandingkan yang terkandung dalam ekstrak sehingga  fraksi  diharapkan  memiliki  efek sitotoksik  dan  selektivitas  yang  lebih  baik dibandingkan ekstraknya.

## SIMPULAN
Berdasarkan
hasil penelitian disimpulkan  bahwa  fraksi  etanol  mempunyai aktivitas  sitotoksik  yang  poten  dengan  nilai IC 50 15,47±0,71  µg/mL  dan  memiliki  nilai selectivity  index antara  sel  kanker  payudara jenis  T47D  dan  sel  normal  Vero  memenuhi syarat >3 dengan nilai 23,31.

## SARAN
Diperlukan  isolasi  dan  identifikasi senyawa  aktif  di  dalam  fraksi  etanol  untuk mengetahui senyawa yang mempunyai aktivitas sitotoksik secara spesifik.

## REFERENSI
1. Selim,  K.  A.,  El-Beih,  A.  A.,  Abdel-
Rahman,  T.  M.,  dan  El-Diwany,  A.  I., 2012.  Biology  of  endophytic  fungi. Curr.
Res. Environ. Appl. Mycol . 2(1).
2. Wulandari, H., Zakiatulyaqin, dan Supriyanto.  2012.  Isolasi  dan  Pengujian Bakteri Endofit dari Tanaman Lada ( Piper
Rollando | Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Dan ….. Jurnal Wiyata, Vol. 3 No. 1 Tahun 2016
nigrum L.)  sebagai  Antagonis  Terhadap Patogen  Hawar  Beludru  ( Septobasidium sp.). J. Perkebunan & Lahan Tropika 2.
3. Pirttilä,  A.M.  dan  Frank,  A.C.  2011. Endophytes  of  Forest  Trees:  Biology  and Applications . Springer.
4. Cheplick,  G.P.  dan  Faeth,  S.H.  2009. Ecology  and  Evolution  of  the  Grass- Endophyte  Symbiosis .  Oxford  University Press.
5. Sebastianes, F.L.S., Cabedo, N., El Aouad, N.,  Valente,  A.M.M.P.,  Lacava,  P.T.,
Azevedo, J.L., dkk. 2012. 3-
hydroxypropionic  acid  as  an  antibacterial agent  from  endophytic  fungi Diaporthe
phaseolorum . Current microbiology 65.
6. Verma, V.C., Lobkovsky, E., Gange, A.C., Singh,  S.K.,  dan  Prakash,  S.,  2011. Piperine  production  by  endophytic  fungus Periconia  sp .  isolated  from Piper  longum
L. The Journal of antibiotics 64.
7. Sharma,  O.P.,  1898. Textbook  of  Fungi . Tata McGraw-Hill Education.
8. Suryanarayanan,  T.S.,  Thirunavukkarasu, N., Govindarajulu, M.B., Sasse, F., Jansen, R.,  and  Murali,  T.S.,  2009.  Fungal Endophytes  and  Bioprospecting. Fungal
Biology Reviews 23.
9. Prayong, P., Barusrux, S., and Weerapreeyakul,  N.,  2008.  Cytotoxic Activity  Screening  of  Some  Indigenous
Thai Plants. Fitoterapia 79.