## Pengaruh Perbedaan Metode Ekstraksi Metabolit Sekunder
Streptomyces sp. GMR22 terhadap Toksisitas pada Sel BHK-21
Effects of Extraction Methods of Secondary Metabolite Streptomyces sp. GMR22 towards BHK- 21 Cells Toxicity
Diani Mentari 1* , Mirtati Naima 2 , Riska Wulansari 3 , Jaka Widada 4 , Tri Rini Nuringtyas 3 , Tri Wibawa 5 and  Nastiti Wijayanti 3*
1 Program Studi D-3 Teknologi Transfusi Darah STIKES Guna Bangsa Yogyakarta
2 Program Studi Biologi UIN Walisongo
3 Fakultas Biologi, Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada, Indonesia
4 Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Indonesia
5 Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada, Indonesia
*E-mail: dianimentari@gmail.com and nastitiw@yahoo.com

## Abstrak
Potensi Streptomyces sebagai penghasil metabolit sekunder sudah cukup dikenal secara luas, dikarenakan Genus ini menghasilkan senyawa yang memiliki sifat multiple pleotropik action . Streptomyces. sp GMR22 merupakan isolat lokal yang diperoleh dari Hutan Wanagama I Yogyakarta, berpotensi untuk dikembangkan sebagai penghasil senyawa aktif karena diketahui memiliki gen PKS dan NRPS. Senyawa aktif hasil isolasi sangat  dipengaruhi  oleh  berbagai  macam  faktor  salah  satunya  adalah  teknik  ekstraksi.  Perbedaan  teknik ekstraksi  suatu  senyawa  alam  akan  sangat  berpengaruh  terhadap  kualitas  metabolit  sekunder  yang dihasilkan. Tujuan penelitian ini adalah untuk membandingkan efek sitotoksisitas dari metabolit sekunder Streptomyces sp.  GMR22  yang  diperoleh  dengan  dua  metode  ekstraksi  yang  berbeda.  Pada  penelitian  in ekstraksi bertingkat menggunakan metode corong pisah yaitu pertama diekstraksi dengan senyawa non polar (n-heksan) selanjutnya diektraksi kembali  menggunakan senyawa semi polar (etil asetat). Pada penelitian sebelumnya metabolit sekunder diekstraksi dengan metode corong pisah hanya menggunakan senyawa etil asetat.  Hal ini menyebabkan  dengan penggunaan konsentrasi terendah pada uji antivial virus dengue (uji lanjutan) menyebabkan 100% kematian pada sel BHK-21. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstraksi bertingkat  menghasilkan  nilai  CC 50 yang  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  penelitian  sebelumnya  yaitu 49,160 µl/ml (hasil ekstraksi n-heksan) dan 284,56 µl/ml (hasil ekstrak Etil Asetat) sedangkan ekstrak air 464,38  µl/ml. Analisis senyawa dengan FTIR menunjukkan bahwa ketiga ekstrak yang dihasilkan memiliki pola spektrum yang berbeda terutama pada ektrak n-heksan dan ekstrak etil asetat. Adanya CC 50 yang tidak terlalu tinggi diharapkan metabolit sekunder yang dihasilkan dapat digunakan untuk analisis lanjut seperti uji antivirus karena aman terhadap sel normal/sel host seperti sel BHK-21. Kata Kunci: Streptomyces sp. GMR22,  metabolit sekunder, BHK-21, FTIR, CC 50

## Abstract
Streptomyces sp. GMR22 is local isolate from Wanagama 1 Forest in Yogyakarta. They have the potential to be developed to produce active compounds because have PKS and NRPS genes.The active compounds from  isolation  are  strongly  influenced  by  various  factors,  one  of  them  is  extraction  techniques.  Effect difference  of  extraction  technique  will  be  affected  by  the  quality  of  secondary  metabolites  produced.The purpose of this study was to compare the cytotoxicity effects of secondary metabolites of Streptomyces sp. GMR22  which  have  extracted  with  different  stages  from  previous  studies.  The  extraction  technique  was carried out by multilevel separatory funnel extraction methods, which was first extracted using non-polar solvent (n-hexane) and then extracted using semi-polar solvent (ethyl acetate). This research is important because in previous studies (separatory funnel only extracted using ethyl acetate) with the use of the lowest concentration in the dengue virus antiviral test (further test) caused 100% of deaths in BHK-21 cells.This study indicate that multilevel extraction result in lower CC 50 value than previous studies. There are 49.160 µl/ml (n-hexane extract) and 284.56 µl/ml (ethyl acetate extract) while water extract is 464,38 µl/ml. FTIR compound analysis show that the three extracts produced have different spectrum patterns, especially in the n-hexane and ethyl acetate extract. Value of CC 50 is not too high, it is expected that the secondary metabolites
contained  in  the  extracts  can  be  used  for  further  analysis  such  as  antiviral  testing  because  it  is  safe  for normal host cells such as BHK-21 cells Keywords: Streptomyces sp. GMR22, secondary metabolite, BHK-21, FTIR, CC 50

## PENDAHULUAN
Genus
Streptomyces
dikenal
menghasilkan  senyawa  bioaktif  dengan spektrum cukup luas sehingga dapat berfungsi sebagai  antibiotik,  antikanker,  antiinflamasi, antifungi  dan  antivirus  (Chaudhary et  al., 2013).  Oleh  karena  itu  banyak  peneliti melakukan skrining untuk mencari isolat baru yang  berpotensi  menghasilkan  senyawa bioaktif  sehingga  memiliki  manfaat  untuk bidang farmasi (Gopinath dan Charya, 2013). Streptomyces sp.  GMR22  merupakan  isolat tanah  dari  Hutan  Wanagama  I  Yogyakarta yang  diperoleh  dari  bawah  tegakan  Kayu Putih (Nurjasmi, 2008). Isolat yang didapatkan  ternyata  memiliki  spektrum metabolit  sekunder  cukup  bervariasi.  Hal  ini dikarenakan Streptomyces sp. GMR22 memiliki  gen  PKS  dan  NRPS  (Alimuddin, 2012).  Gen  PKS  dan  NRPS  merupakan  gen yang dapat memproduksi metabolit sekunder dengan  variasi  cukup  besar,  baik  fungsi maupun  struktur  senyawanya  (Riyanti et  al., 2012).
Alimuddin (2011) melakukan uji aktivitas  antifungi,  hasil  menunjukkan  isolat Streptomyces sp.  GMR22  memiliki  efek antifungi terbaik dalam menghambat pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae, Candida    albicans,  Aspergillus  flavus dan Fusarium  oxysporum.  Streptomyces sp. GMR22  juga  memiliki  potensi  sebagai antivirus  Virus  Dengue.  Imaniar  (2013)  dan Praditya (2013) menyebutkan bahwa hasil uji WST-1  ekstrak  air  (bagian  yang  tidak  larut dalam  etil  asetat) Streptomyces sp.  GMR22 memiliki nilai CC 50 125 µg/ml, namun dengan penggunaan  konsentrasi  25  µg/ml  sudah mampu  menghambat  pertumbuhan  Virus Dengue serotipe 1 dan 2 sebesar 80%.
Imaniar (2013) dan Praditya (2013) juga menggunakan ekstrak etil asetat Streptomyces sp. GMR22 untuk uji  yang sama. Hasil nilai CC 50 ekstrak  etil  asetat Streptomyces sp .
GMR22  adalah  20,59  µg/ml.  Pada  tahapan selanjutnya  yaitu  uji  aktivitas  antivirus dengan  menggunakan beberapa variasi konsentrasi.  Namun  penggunaan  konsentrasi terendah pada ekstrak etil asetat Streptomyces sp.  GMR22  (6,25  µg/ml)  menyebabkan kematian  sel  BHK-21  (sel host )  sebesar 100%.
Sel BHK-21 merupakan sel  yang sering digunakan  untuk  propagasi  berbagai  macam jenis virus salah satunya virus dengue. Hal ini dikerenakan  BHK-21  memiliki  banyak reseptor  yang  sesuai  virus  dengue  yaitu heparansulfat,  glycoprotein  dan  DC-SIGN (Alen  dan  Schol,  2012).  Tahapan  terpenting pada  uji  antiviral  adalah  mencari  senyawa yang  tidak  menyebabkan  kematian  sel host , sehingga  perlu  cara  ekstraksi  yang  efektif untuk  menghasilkan  senyawa  aman  bagi  sel BHK-21.
Efektifitas  senyawa  yang  diperoleh  dari biosintesis metabolit sekunder sangat dipengaruhi  oleh  teknik  ekstraksi.  Imaniar (2013) melakukan ektraksi metabolit sekunder Streptomyces sp.  GMR22  dengan metode  corong  pisah  menggunakan  pelarut etil  asetat  menyebabkan  senyawa  yang dihasilkan terlalu toksik bagi sel BHK-21. Hal ini  kemungkinan  disebabkan  karena  pelarut etil  asetat  dapat  melarutkan senyawa  dengan spektrum yang cukup luas (larutan semipolar).  Maka  penelitian  ini  penting dilakukan untuk melihat perbedaan sitotoksisitas  senyawa  yang  dihasilkan  dari ekstraksi bertingkat yaitu pertama menggunakan  pelarut  n-heksan  (non  polar) yang  kedua  menggunakan  pelarut  etil  asetat (semi polar).

## METODE PENELITIAN Alat
Alat  yang  digunakan  adalah  alat-alat gelas, shaker , corong pisah (Pyrex), timbangan digital  analitik (Chyo), waterbath
Pharmacon: Jurnal Farmasi Indonesia. Vol. 16, No. 1, (2019). ISSN 1411-4283 Available online at: http://journals.ums.ac.id/index.php/pharmacon
(Memmert), sentrifuse (Beckman dan Hettich),  Inkubator, Laminar  Air  Flow , ELISA reader (Benchmark),  inkubator  CO 2 (Memmert),  pH  meter  (Metrohm), Fourier Transform Infared /FTIR (Shimadzu). Bahan Streptomyces sp.  GMR22  merupakan koleksi  dari  Dr.  Ir.  Jaka  Widada,  M.P  dari Fakultas  Pertanian  UGM  sedangkan  kultur sel  BHK-21  ( adherent  cell  line dari Baby Hamster  Kidney) berasal  dari  Lembaga Biologi Molekular Eijkman Jakarta.
Produksi metabolit sekunder Streptomyces sp.GMR22
Produksi  metabolit  sekunder  dilakukan dengan melakukan prekultivasi Streptomycess sp. GMR22 pada medium SNB ( Starch Nitrat Broth ) selama 5 hari pada suhu ± 28°C, selanjutnya dikultivasi selama 15 hari pada  media  yang  sama  untuk  menghasilkan metabolit sekunder. Hasil fermentasi kemudian di sentrifuse dengan kecepatan 3000
rpm selama 35 menit untuk memisahkan pelet dan  cairan  supernatan.  Cairan  supernatan kemudian  diekstraksi  menggunakan  corong pisah.  Ekstraksi  dilakukan  secara  bertingkat dengan  pelarut  n-heksan  terlebih  dahulu kemudian  etil  asetat  Ekstrak  yang  didapat kemudian  dipekatkan  dengan waterbath. Adapun  skema  produksi  metabolit  sekunder Streptomyces sp.  GMR22  dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Uji sitotoksik (WST-1 assay )
Sel  BHK-21  dengan  kepadatan  2x10 3 sel/ well ( microplate    96  well )  diinkubasi semalam  pada  CO 2 5%  dengan  suhu  37°C. Media  sel  selanjutnya  dibuang  dan  diberi serangkaian  seri  konsentrasi  senyawa  uji yang  telah  dilarutkan  dalam  media  DMEM 10%.  Sel  selanjutnya  diinkubasi  selama  24 jam  pada  inkubator  CO 2 5%  dengan  suhu 37°C.  Pada  jam  ke-24,  media  dibuang  dan ditambahkan media baru sebanyak 50 µl serta 5 µl larutan WST-1. Sel kemudian diinkubasi
Gambar 1. Model ekstraksi dalam produksi metabolit sekunder Streptomyces sp. GMR22. Kotak biru menunjukkan ekstraksi yang dilakukan Imaniar (2013) dan kotak orange adalah ekstraksi yang dilakukan pada penelitian ini.
kembali selama 4 jam dan dibaca absorbansinya pada jam ke 1; 2; 3; 4 dengan ELISA reader (Benchmark)  menggunakan panjang  gelombang  450  nm.  Viabilitas  sel dihitung persamaan 1.
% Sel Hidup = abs P−abs M abs K−abs M x 100% ............(1)
Keterangan : abs P : absorbansi perlakuan abs K : absorbansi kontrol sel abs M   : absorbansi kontrol media
Analisis  spektroskopi  inframerah Fourier Transform Infared (FTIR) Sampel  ekstrak/senyawa  uji  masing- masing  ditimbang  dengan  menggunakan timbangan  digital  analitik  sebanyak  0,2  mg kemudian dianalisis spektroskopi inframerah (FTIR)  (Shimadzu).  Analisis  dilakukan  di Jurusan Kimia Fakultas MIPA UGM.
Analisis Data
Nilai  CC 50 ditentukan  dengan  analisis regresi linier pada program excell. Konsentrasi sampel (ekstrak) sebagai variabel bebas  sedangkan  persentase  viabilitas  sel sebagai variabel tergantung.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Metabolit  sekunder Streptomyces sp. GMR22 dihasilkan melalui proses fermentasi selama  15  hari  pada  medium  SNB. Perubahan  warna  media  (SNB)  dari  putih menjadi  kuning  orange  setelah  proses fermentasi dapat disebabkan adanya metabolit sekunder yang dihasilkan Streptomyces sp. GMR22 sehingga terdistribusi  dalam  media.  Proses  ektraksi berbeda  dengan  penelitian  yang  dilakukan Imaniar (2013), dimana supernatan diekstraksi secara bertingkat, pertama
menggunakan  pelarut  non  polar  (n-heksan) kemudian  dilanjutkan  dengan  pengojogan dengan  etil  asetat  (semi  polar).  Senyawa dengan kepolaran menengah akan terekstrak dalam  etil  asetat,  sedangkan  bagian  yang tidak  larut  pada  pelarut  n-heksan  dan  etil asetat disebut ekstrak air. Proses pencampuran  serta  pengojokan  dilakukan sebanyak 3 kali. Ekstrak kemudian dipekatkan menggunakan waterbath. Ekstrak n-heksan pada suhu 68°C, Ekstrak etil asetat pada  suhu  76 °C dan  ekstrak  air  dan supernatan pada suhu 98°C.
Adapun  skema  produksi  metabolit sekunder Streptomyces sp.  GMR22  dapat dilihat pada Gambar 1. Hasil ektraksi masing - masing senyawa memiliki perbedaan bentuk dan  warna.  Adapun  hasil  ekstraksi  secara lengkap  dapat  dilihat  pada  Tabel  1.  Hasil ekstraksi metabolit sekunder Streptomyces sp. GMR22  (Tabel  1.)  memiliki  bentuk  dan warna yang berlaianan, maka untuk mengetahui  kandungan  senyawa  dalam ekstrak  dilakukan  analisis  spektroskopi Fourier Transform Infared (FTIR).
Fourier  Transform  Infared merupakan metode  untuk  mengamati  interaksi  molekul dengan radiasi elektromagnetik pada bilangan  gelombang  10-13.000  cm -1 .  Gugus fungsi  dapat  diketahui  melalui  pita  serapan dari interaksi tiap-tiap atom berdasarkan nilai panjang  gelombang  (cm -1 )  yang  spesifik (Harbone, 1984; Pavia et al., 2001). Analisis kualitatif  dengan  spektrometer  IR  bertujuan untuk  menentukan  gugus-gugus  fungsional dalam  sampel  yang  akan  memberikan gambaran komponen senyawa hasil fermentasi  metabolit  sekunder Streptomyces sp.  GMR22  dengan  berbagai  pelarut.  Uji
Tabel 1. Hasil metabolit sekunder dari Streptomyces sp. GMR22 Jenis Warna Bentuk ekstrak Supernatan Coklat Kental dan mengkristal Ekstrak n-heksan Kuning orange Sedikit kental Ekstrak Etil Asetat Coklat kekuningan Pasta Ekstrak Air Kehitaman Mengkristal
Pharmacon: Jurnal Farmasi Indonesia. Vol. 16, No. 1, (2019). ISSN 1411-4283 Available online at: http://journals.ums.ac.id/index.php/pharmacon

## FTIR  juga  dilakukan  pada  supernatan
Streptomyces sp.  GMR22  (hasil  metabolit sekunder  yang  belum  diekstrak)  dan  media SNB (media yang digunakan untuk produksi metabolit  sekunder).  Hasil  analisis  FTIR memperlihatkan  bahwa  ternyata  ekstrak  air memiliki  kandungan  senyawa  yang  mirip dengan supernatan Streptomyces sp. GMR22 dan  media  SNB,  ini  terlihat  dari  pola spektrum yang hampir sama (Gambar 2). Hal ini  memperlihatkan  bahwa  pada  ekstrak  air Streptomyces sp.  GMR22  masih  banyak mengandung komponen media SNB. Adanya rentangan gugus -OH dengan intensitas yang
cukup  kuat  dengan  puncak  yang  agak  lebar pada daerah 3402,43 cm -1 (pada supernatan), 3456,44 cm -1 (pada  air), 3448,72 cm -1 (pada etil  asetat)  dan  3425,58  cm -1 (pada  media SNB). Gugus -OH ini kemungkinan merupakan  gugus hidroksil dari alkohol dan fenol (Jindo et al., 2014) yang diduga berasal dari  karbohidrat,  atau  dari  molekul  air  yang teradsorpsi  (Zhu etal ,  2012;  Kennedy,  2005) oleh sampel. Pada ekstrak etil asetat terdapat peak  yang  cukup  tinggi  pada  rentangan 1.728,22  cm -1 yang  menunjukkan  gugus karbonil  dan  rentangan  1.126,43  cm -1 yang
Gambar 2. Hasil analisis FTIR medium SNB (garis coklat muda), supernatan, (garis biru muda) ekstrak air (garis biru), ekstrak etil asetat (garis merah) dan ekstrak n-heksan (garis orange) dari Streptomyces sp GMR22. Pola spektrum menunjukkan adanya perbedaan gugus fungsi.
Pharmacon: Jurnal Farmasi Indonesia. Vol. 16, No. 1, (2019). ISSN 1411-4283 Available online at: http://journals.ums.ac.id/index.php/pharmacon
menunjukkan  gugus  Sulfon  (Perumal et  al ., 2015 , Kosela, 2013).
Pada  Gambar  2  nampak  terlihat  bahwa ekstrak n-heksan dan etil asetat menghasilkan pola  spektrum  yang  berbeda.  Hasil  analisis pola serapan FTIR yang didapat dari ekstrak n-heksan Streptomyces sp. GMR22 menunjukkan  berbagai  macam  ikatan.  Pada daerah  serapan  3448,72  cm -1 menunjukkan adanya  gugus  hidroksil  (-OH).  Hal  ini
diperkuat  dengan  adanya  pita  serapan  pada bilangan gelombang 1743,65 cm -1 adalah ciri khas  adanya  C=O  suatu  keton/ester  (Rante, 2015). Serta serapan pada 3070,68 cm -1 yang menunjukkan cincin aromatik. Hossain et al. (2006)  mengungkapkan  bahwa  penggunaan FTIR  dapat  mendeteksi  senyawa  flavanoid melalui  gugus-gugus  fungsi  yang  muncul seperti  hidroksil  (OH),  karbonil  (C=O)  serta senyawa  aromatik.  Adapun    spektra  FTIR
Tabel 2. Interpretasi jenis ikatan dan gugus fungsi dari metabolit sekunder Streptomyces sp. GMR22 berdasarkan daerah serapan FTIR
Bilangan gelombang pada masing-masing Ekstrak(cm -1 ) Interpretasi Spektra umum (cm -1 ) n-heksan Etil Asetat Air Anonim (2016) Socrates (2011) Kosela  (2013) 3448,72 3417,86 3456,44 3200-3500 (Alkohol, fenol) 3070,68 3070,68 - 3000-3100 (Aromatik) 2924,09 2931,8 - 2850-3000 (Alkana) 2854,65 2862,36 - 2850-3000 (Alkana) 1743,65 1.735,93 - 1735-1750 (Ester, saturated aliphatic) 1.720- 1.740(Aldehid) 1.715-1.740 (Ester) 1.725-1.750 (δ- lakton) - 1.728,22 - 1627,92 - 1635,64 1580-1650 (1° amin) ~1650 (Amide I band, dipengaruhi oleh adanya ikatan hidrogen) 1458,18 1465,9 1342,46 1141,89 1450-1470 (Alkana) 1450-1750 (COO- vibrasi asimetrik) 1296,16 1.280,73 - 1250-1335 (Aromatic amin) 1257,59 - - 1250-1335 (Aromatic amin) 1111,00 1.126,43 1033,85 1234, 44 1020-1250 (Alifatil amin) PO2- vibrasi asimetris 1.100-1.150 (Sulfon) - 1.072,42 - Alkil fluoride (1.000-1.400) 972,12 - - 650-1000 (Alkena) 833,25 624,94 550-850 (Alkil halida) - 740,67 - 500-800 (Alkilklorida/bromi de/iodide) 725,23 - - 720-725 (Alkana) 671,23 624,94 601,79 515-690 (Alkil Halida) 500-800 (Alkilklorida/bromi de/iodide) 586,36 - - 515-690 (Alkil Halida)
Pharmacon: Jurnal Farmasi Indonesia. Vol. 16, No. 1, (2019). ISSN 1411-4283 Available online at: http://journals.ums.ac.id/index.php/pharmacon
ekstrak  n-heksan Streptomyces sp.  GMR22 memperlihatkan beberapa gugus fungsi  yang ditunjukkan oleh beberapa bilangan gelombang dan interpretasi jenis ikatan dapat dilihat pada Tabel 2.
Pita serapan kuat antara 3000-2800 cm -1 yaitu  pada  2924,09  dan  2854,65  cm -1 menunjukkan  adanya  ikatan  C-H  alifatik yang berupa metil (CH 3 ) dan metilena (CH 2 ). Hal  ini  diperkuat  dengan  adanya  vibrasi bengkokan C-H pada daerah serapan 1458,18 cm -1 .  Keberadaan  gugus  piridin  ditunjukkan pada  serapan  1627,92  cm -1 yang  diperkuat oleh serapan pada 1296,16 cm -1 yaitu serapan untuk  amina  heterosiklik.  Data  spektrum inframerah pada Tabel 2 menginterpretasikan bahwa  ekstrak  n-heksan Streptomyces  sp GMR22  mengandung  gugus  amin  (NH), fenolik,  cincin  aromatik  dan  ester/keton (C=O).  Hal  ini  sesuai  dengan  hasil  KLT ekstrak  n-heksan Streptomyces  sp. GMR22
(Mentari,  2016  Data  tidak  dipublikasikan). Hasil spektra FTIR beberapa senyawa dalam ekstrak Streptomyces sp.  GMR22  seperti fenol,  flavanoid  dan terpenoid  serta terdapat gugus  amin  dan  cincin  aromatis.  Senyawa tersebut  belum  diketahui  efek  toksisitasnya, maka  untuk  mengetahuinya,  dilakukan  uji sitotoksik terhadap sel BHK-21. Uji sitotoksik juga dilakukan pada medium SNB dan  supernatan Streptomyces sp.  GMR22 yang digunakan sebagai pembanding Viabilitas sel BHK-21 dengan pemberian beberapa  hasil  ektraksi  Metabolit  sekunder Streptomyces sp.  GMR22  dapat  dilihat  pada Tabel 3. Uji Sitotoksik merupakan tahap awal untuk melihat konsentrasi maksimum ekstrak/senyawa  yang  dapat  diberikan  pada sel  normal  ketika  digunakan  untuk  uji antivirus  (Marbawati et  al., 2014).  Dalam penelitian ini uji sitotoksik dilakukan dengan metode  WST-1.  Uji  WST-1  menggunakan
Tabel 3. Peresentase viabilitas sel BHK-21 setelah pemberian ekstrak dari metabolit sekunder
Streptomyces sp. GMR2 Perlakuan sampel Konsentrasi (µg/ml) Persentase Sel Hidup (%) Supernatan 600 50,49 300 64,3 150 73,31 75 81,82 37,5 108,74 n-heksan 50 49,23 40 58,43 30 73,13 20 80,07 Etil asetat 500 21,15 250 49,34 125 93,05 62,5 96,21 31,25 55,58 Air 160 79,90 80 85,00 40 89,60 20 96,60 10 91,80
garam  tetrazolium,  garam  ini  akan  bereaksi ketika  ada  aktivitas  mitokondria  sehingga terbentuk  formazan  yang  dapat  diukur absorbansinya (Berridge et al., 2005). Pada uji WST-1  baik  supernatan  maupun  ekstrak  n- heksan    dan  etil  asetat Streptomyces sp . GMR22  dilarutkan  dalam  pelarut  DMSO 0,5%.  Hasil  uji  sitotoksik  memperlihatkan bahwa  pemberian  tiap-tiap  ekstrak  metabolit sekunder Streptomyces sp. GMR22 memberikan  efek  yang  berbeda  terhadap viabilitas  sel  BHK-21.  Namun  secara  umum semua  sampel  menunjukkan  pola dose dependent yaitu  semakin  tinggi  konsentrasi sampel  yang  diberikan  akan  menurunkan viabilitas dari sel BHK-21.
Hasil  uji  sitotoksik  kemudian  dibuat persamaan  regresi  antara  persentase  jumlah sel  hidup  dengan  konsentrasi  supernatan untuk  mengestimasi  nilai  CC 50 (Gambar  3) . Hasil  uji  sitotoksik  memperlihatkan  bahwa seluruh  ekstrak Streptomyces sp.  GMR22 memiliki  kemampuan  sitotoksik  pada  sel BHK-21  dimana  nilai  CC 50 tertinggi  adalah
Supernatan  yaitu  547,44  µl/ml  dan  yang terendah  adalah  ekstrak  n-heksan  yaitu sebesar 49,160 µl/ml. Nilai CC 50 ekstrak etil asetat sangat berbeda dengan hasil penelitian Imaniar  (2013).  Supernatan  yang  langsung diekstrak  menggunakan  etil  asetat  memiliki nilai CC 50 yaitu 20,59 µl/ml. Pada penelitian ini, hasil fermentasi Streptomyces sp. GMR22 diekstraksi cair-cair dengan n-heksan terlebih dahulu  kemudian  dilanjutkan  ekstraksi  cair- cair  dengan  eti  asetat,  hasilnya  nilai  CC 50 ekstrak  etil  asetat  sebesar  284,56  µl/ml. Begitupula  pada  ekstrak  air  pada  penelitian sebelumnya adalah 125 µl/ml sedangkan pada penelitian  ini,  nilainya  lebih  rendah  yaitu 464,38  µl/ml.  Perbedaan  metode  ekstraksi pada  penelitian  ini  menyebabkan  senyawa akan  terdistribusi  lebih  merata  pada  ketiga pelarut tersebut (n-heksan, etil asetat dan air). Berbeda dengan metode ekstraksi sebelumnya dimana  hasil  fermentasi  langsung  diekstrak menggunakan senyawa etil asetat saja. Hal ini menyebabkan  senyawa  tidak  dapat  terlarut pada  pelarut  etil  asetat  akan  tersisa  pada
Gambar 3. Nilai CC50 dari beberapa ekstrak Streptomyces sp. GMR22 pada sel BHK-21. Tanda bintang (*), menunjukkan hasil uji sitotoksik yang dilakukan oleh Imaniar (2013).
Pharmacon: Jurnal Farmasi Indonesia. Vol. 16, No. 1, (2019). ISSN 1411-4283 Available online at: http://journals.ums.ac.id/index.php/pharmacon
ekstrak air. Akumulasi senyawa yang terdapat pada  ekstrak  air  akan  menyebabkan  nilai toksisitas  yang  cukup  tinggi  (120  µl/ml). Selain  itu,  adanya  perbedaan  toksisitas  tiap ekstrak  dapat  disebabkan  oleh  kemampuan masing-masing senyawa untuk masuk melewati  membran  sel.  Membran  sel  yang terdiri  atas  dwi  fosfolipida  akan  bersifat hidrofobik dan selektif permeabel (Alberts et al., 2008).  Hal  inilah  yang  mengakibatkan senyawa  larut  dalam  air  seperti  supernatan maupun  ekstrak  air  akan  lebih sukar   masuk ke  dalam  membran  sel  sehingga  toksisitas senyawa juga lebih rendah.

## KESIMPULAN
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstraksi  bertingkat  metabolit  sekunder Streptomyce s  sp.  GMR22  menggunakan pelarut n-heksan dan etil asetat menghasilkan senyawa dengan nilai  toskisitas lebih rendah dibandingkan penelitian sebelumnya (langsung  diekstrak  menggunakan  senyawa semi polar/etil asetat.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  Hibah  PUPT UGM.

## Daftar Pustaka
Alberts, B., Johnson A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. dan Walte, P, 2008, Molecular Biology of The Cell. USA : Gerland Science Fifth Edition.
Alen,  M.  M.  F.,  dan  Schols  D,  2012,  Review  Article:  Dengue  Virus  Entry  as  Target  for Antiviral Therapy,  Journal of Tropical Medicine. Vol 2012. pp. 1-13
Alimuddin, Widada, J, Asmara, W., dan Mustofa, 2011,  Antifungal Production of a Strain of Actinomycetes  Spp  Isolated  from  the  Rhizosphere  of  Cajuput  Plant :  Selection  and Detection  of  Exhibiting  Activity  Against  Tested  Fungi,  Indonesian    Journal  of Biotechnology, 16(1), pp. 1–10.
Alimuddin,  2012,  Actinomycetes  Penghasil  Antifungi  Rizosfer  Tegakan  Kayu  Putih  Hutan Wanagama  I  Yogyakarta  :  Isolasi,  Optimasi  dan  Karakterisasi  Actinomycetes  serta Isolasi  Senyawa  Antifungi,  (Disertasi,  Universitas  Gadjah  Mada  Yogyakarta,  Program Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana).
Anonim,  2016,  Table  of  Characteristic  IR  Absorptions.  University  of  Colorado  at  Boulder,
Department of
Chemistry and
Biochemistry.
http://orgchem.colorado.edu/Spectroscopy/specttutor/irchart.pdf.
Berridge, M.V., Herst, P.M., Tan, A,S., 2005, Tetrazolium Dyes as Tools in Cell Biology: New Insights into their Cellular Reduction, Biotechnology Annual Review, Vol  11, pp. 127- 152.
Chaudhary, H.S., Soni, B., Shrivastava, A.R., Shrivastava, S, 2013, Diversity and Versatility of  Actinomycetes  and  its  Role  in  Antibiotic  Production,  Journal  of  Applied Pharmaceutical Science, 3 :  S83-S94.
Gopinath,  B.V.,  dan  Charya,  M.A.S.,  2013,  Characterization  of  Antibacterial  Compounds Produced by The Actinomycetes using NMR Spectral Analysis, International Journal of Pharma Sciences and Research (IJPSR), 4(2), pp. 25-35.
Harborne, J.B., 1983, Metode Fitokimia :Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, ITB Prees : Bandung.
Imaniar N.I., 2014, Marine and Soil Actinomycetes Secondary Metabolite Antivirus Activity Against  Dengue  Serotype-1  Virus,  (Thesis,  Universitas  Gadjah  Mada  Yogyakarta Program Studi Bioteknologi).
Jindo, K,  Mizumoto, H.,  Sawada, Y., Sanchez-Monedero, M. A danSonoki., 2014, Physical and  Chemical  Characterizations  of  Biochars  Derived  from  Different  Agricultural Residues, Biogeosciences Discuss, 11: 11727–11746.
Kennedy,  L.  J.,  Vijaya,  J.  J.,  Sekaran,  G.  2005,  Electrical  conductivity  study  of  porous carboncomposite derived from rice husk, Mater. Chem. Phys, 91, pp. 471–476.
Marbawati  D,  Sardjiman,  Yulianti,  R.,  2014,  Efektivitas  Pentagamavunon-0  (PGV-0) padaFaseAwalInfeksi Virus Dengue-2, Aspirator, 6 (2), pp. 43-48.
Nurjasmi, R., Widada  J., Ngadiman, N, 2009, Diversity of Actinomycetes at Several Forest Types  in  Wanagama  I  Yogyakarta  and  Their  Potency  as  a  Producer  of  Antifungal Compound,  Indonesian Journal of Biotechnology, 14(2), pp. 1196–1205.
Pavia,  D.L.,  Lampman,  G.M.,  Kriz,  G.S.,  dan  Vyvyan,  J.R.,  2001,  Introduction  to Spectroscopy.  Fourth  Edition.  Departemant  of  Chemistry,  Western  Washington University Bellingham, Washington
Praditya, D.F. 2014. Potential Ethyl Asetat Extracts Of Secondary Metabolit Aktinomisetes to Againt  Virus  Dengue  Serotype-2  (DENV-2),  (Thesis,  Universitas  Gadjah  Mada Yogyakarta Program Studi Bioteknologi).
Rante  H,  2012,  Isolasi  dan  Karakterisasi  Actinomycetesasosiasi  Spons  Penghasil  Antibiotik Koleksi  Pulau  Barrang  Lompo  Makassar,  (Disertasi,  Universitas  Gadjah  Mada. Yogyakarta, Ilmu Farmasi).
Riyanti, Aziz S., Sabdono A., Radjasa, O.K., 2012, Deteksi Gen Nrps Aktinomisetes Simbion Rumput Laut Dan Karang Lunak, Prosiding Seminar Nasional ”Pengembangan Sumber Daya  Pedesaan  dan  Kearifan  Lokal  Berkelanjutan  II”  Purwokerto,  27-28  Nopember 2012, pp. 177-182.
Socrates,  G,  2007,  Infrared  and  Raman  Characteristic  Group  Freuencies  Tables  and  Charts Third Edition. John Wiley and  Sons, Ltd: United States.
Zhu, K., Fu, H., Zhan, J., Lv, X., Tang, J., Xu, X., 2012, Studies on removal of NH4–N from aqueous  solution  by  using  the  activated  carbons  derived  from  rice  husk,  Biomass Bioenergy, 43, pp.18–25.