## Efektivitas Bacillus thuringiensis dalam Pengendalian Larva Nyamuk Anopheles sp
Citra Inneke Wibowo 1
1 Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman Emai l: citrainneke01@gmail.com

## Abstract
Anopheles  mosquito  is  a  vector  of  malaria..  Malaria  vector  control  can  be  done  biologically  by  using Bacillus thuringiensis mekanism of controlling that parasite is works by producing a toxin that can kill larvae of mosquito. The purpose  of  the  study  was  to  determine  the  effectiveness  of  of Bacillus  thuringiensis concentration  in  the  control  of larvae of Anopheles sp. This research was carried out experimentally using factorial completely randomized design (RAL  Factorial)  consisting  of  two  factors:  the  concentration  of  bacteria Bacillus  thuringiensis and Anopheles larval stage with three replications. The treatment is carried out for 3 weeks at a concentration of Bacillus thuringiensis (A) will  be done  in  this  study  are as  follows:  A0: concentration of B.thuringiensis 0  CFU.mL-1,  A1:  the  concentration  of B.thuringiensis 10 2 CFU.mL -1 ,  A2:  the  concentration  of B.thuringiensis 10 4 CFU.mL -1 ,  A3:  concentration  of B.thuringiensis 10 6 CFU.mL -1 ,  A4:  the  concentration  of B.thuringiensis 10 8 CFU.mL -1 .1st  instar  larval  stages  while treatment Anopheles sp.  (B)  are  as  follows:  B1:  the  first  instar  larval  stage,  B2:  second  instar  larval  stage,  B3:  the third instar larval stage, B4: IV instar larval stage so that there are 60 experimental unit. Parameters measured were death Anopheles mosquitoes  each  experimental  unit  and  the  number  of  existing B.thuringiensis on  larvae.  The results showed the concentration of B. thuringiensis isolates CK and CC IPB most influential in controlling larvae of Anopheles sp is 10 8 CFU.mL -1 . Instar larvae are most sensitive to B. thuringiensis isolates IPB CC is instar I and II while  instar  sensitive  bacterial  isolation  results  (CK)  is  the  second  instar,  treatment  concentration  of  isolates  of B. thuringiensis and  level  instar  larvae  of  most  good  in  controlling  the  larvae  of Anopheles sp  ,  is  10 8 CFU.mL -1 ,  and instar I and II.
Keywords : Anopheles sp., Bacillus thuringiensis , biocontrol

## Abstrak
Nyamuk Anopheles sp adalah vektor penyakit malaria. Pengendalian vektor penyakit malaria dapat dilakukan secara biologis  yaitu  dengan  menggunakan Bacillus  thuringiensis. Tujuan  penelitian  adalah  untuk  mengetahui  efektivitas konsentrasi Bacillus  thuringiensis dalam  pengendalian  larva  nyamuk Anopheles sp.Penelitian  ini  dilakukan  secara eksperimental  menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap  Faktorial  (RAL  Faktorial)  yang  terdiri  atas  dua  faktor  yaitu konsentrasi Bacillus  thuringiensis dan  stadia  larva Anopheles dengan  pengulangan  tiga  kali . Perlakuan  yang dicobakan  adalahkonsentrasi Bacillus  thuringiensis (A)  yang  terdiri  atas  5  taraf:A0:  konsentrasi B.thuringiensis 0 CFU.mL -1 ,  A1:  konsentrasi B.thuringiensis 10 2 CFU.mL -1 ,  A2:  konsentrasi B.thuringiensis 10 4 CFU.mL -1 ,  A3: konsentrasi B.thuringiensis 10 6 CFU.mL -1 ,  A4:  konsentrasi B.thuringiensis 10 8 CFU.mL -1 .  Perlakuan  tahapan  instar larva Anopheles sp.  (B)  adalah  sebagai  berikut:B1:  stadia  larva  instar  I,  B2:  stadia  larva  instar  II,  B3:  stadia  larva instar III, B4: stadia larva instar IVsehingga terdapat 60 satuan percobaan. Hasil penelitian  menunjukkan konsentrasi B. thuringiensis isolat CK dan IPB CC yang paling berpengaruh dalam pengendalian larva Anopheles sp adalah 10 8 CFU.mL -1 .  Instar  larva  yang  paling  peka  terhadap B.  thuringiensis isolat  IPB  CC  adalah  instar  I  dan  II  sedangkan instar yang peka terhadap isolat CK adalah instar II, Perlakuan konsentrasi isolat B. thuringiensis dan tingkat instar larva yang paling baik dalam pengendalian larva Anopheles sp. adalah 10 8 CFU.mL -1 , dan instar I dan II.
Kata kunci: Anopheles sp., Bacillus thuringiensis , biokontrol

## Pendahuluan
Pengendalian  vektor  menggunakan  agen pengendali  hayati  mikroba  adalah  cara  yang paling tepat untuk menekan jumlah vektor malaria (Dylo  et  al,  20140  Agen  pengendali  yang  biasa digunakan  adalah Bacillus  thuringiensis karena tidak  bersifat  toksik  terhadap  organisme  non- target (Dylo et al 2014). B. thuringiensis ( B.t ) terdiri atas  berbagai  strain  yang  dilaporkan  mampu menyintesis  lebih  dari  satu  jenis  δ  –endotoksin, namun  hanya  strain  tertentu  yang  digunakan sebagai  insektisida  alami  yaitu B.t.  israelensis (Bti), B.t.  kurstaki,  B.t.  berlinier ,  dan B.t.  alesti (Ben- Dov , 2014).
B. thuringiensis bekerja  dengan  cara memproduksi  toksin  ketika  membentuk  spora
sebagai  bentuk  adaptasi  terhadap  keadaan  yang tidak  kondusif.  Larva  nyamuk  yang  memakan toksin B.  thuringiensis  israelensis maka  saluran pencernaannya akan terganggu sehingga mengakibatkan  kematian  larva  (Poopathi  and Abida,  2011).  Konsentrasi B.thuringiensis sangat berpengaruh  terhadap  toksisitas  dan  lama residunya  di  dalam  air.  Hal  ini  dimungkinkan karena semakin  tinggi  konsentrasi B.thuringiensis yang  diinokulasikan  semakin  banyak  peluang untuk  termakan  oleh  larva  semakin  besar. Konsentrasi B.  thuringiensis yang  diperlukan untuk  membunuh  larva  tergantung  pada  tempat berkembang  biak  nyamuk  (Darnely,  2010). Konsentrasi B. thuringiensis yang dapat membunuh  50%  populasi  larva  adalah  10  ng.ml -1 atau 1mg/m 3 yang mengandung ± 10 3 sel bakteri.
Semakin  tua  umur  instar  larva  nyamuk,  maka semakin  resisten  terhadap B.  thuringiensis karena terdapat  perbedaan  perkembangan  jumlah  sel penyusun  saluran  pencernaan  larva  pada  setiap instarnya (Gama et. al., 2010).
Larva mempunyai 4 tahapan dan mengalami  pergantian  kulit  (molting)  sebanyak  4 kali yang disebut instar. Larva bernapas melalui 2 lubang  yang  disebut spiracle yang  terletak  pada ruas abdomen yang  kedelapan  (pada  ujung posterior ).  Larva Anopheles spp.  Hanya  mampu berenang ke bawah permukaan air paling dalam 1 meter,  maka  ditempat-tempat  dengan  kedalaman lebih  dari  1m  tidak  ditemukan  larva  ini. Perkembangan  larva  ini  dipengaruhi  oleh  sinar matahari  dan  kondisi  air  yaitu  temperatur, pergerakan air, salinitas, dan organisme lain yang ada dalam air (Achille et al., 2010).
Penggunaan Bacillus  spp terutama  dosis efektif untuk membunuh jentik nyamuk Anopheles spp telah diteliti di Indonesia. Pengujian terhadap Anopheles  barbirostris menunjukkan  formulasi liquid  larvasida  B.sphaericus  2362  (Spherimos FC) mampu membunuh 90 % jentik dalam 24 jam pada  dosis  2  ppm.  Dosis  aplikasi  30  ppm  dapat dipertahankan  sampai  hari  ke-35  dengan  reduksi kepadatan  jentik  sampai  50  %  (Yusuf  2006, 1996). Sedangkan uji Bacillus sphaericus (vectolex WDG) terhadap Anopheles maculatus di kabupaten  Purworejo  menunjukkan  dosis  yang mampu  membunuh  50  %  jentik  dalam  24  jam pada  suhu  air  22-250C  adalah  0,0082  ppm  dan 95 % jentik adalah 0,03 ppm. Sedangkan aplikasi Bacillus  sphaericus pada  kobakan  di  sungai dengan  dosis  500  g/ha  menunjukkan  reduksi populasi  jentik  hingga  >  70  %  selama  21  hari. Reduksi  populasi  dengan  dosis  100  g/ha  secara statistik  tidak  berbeda  dengan  dosis  500  g/ha (Blondin  and  Widyastuti,  2013).  Namun  demikian pengujuan  terhadap  instar  larva  yang  berbeda belum  banyak  dilakukan  di  Indonesia,  khususnya Jawa  Tengah.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui efektivitas konsentrasi Bacillus thuringiensis dalam  pengendalian  larva  nyamuk Anopheles sp. Pada instar larva yang berbeda.

## Metode
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium Mikrobiologi  Universitas  Jenderal  Soedirman, Purwokerto  selama  7  bulan  dari  bulan  Mei- November 2016.
Metode  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu  metode  eksperimental  menggunakan Rancangan  Acak  Lengkap  Pola  Faktorial  yang terdiri  dari  dua  faktor.  Faktor  pertama  adalah konsentrasi Bacillus thuringiensis yang terdiri atas 5  taraf  yaitu  konsentrasi  0,  10 2 ,  10 4 ,  10 6 ,dan  10 8 CFU.  mL -1 .  Faktor  kedua  adalah  stadia  larva Anopheles sp. yang terdiri atas 4 taraf yaitu instar I,  instar  II,  instar  III  dan  instar  IV.Masing-masing
perlakuan  dilakukan  pengulangan  sebanyak  tiga kalisehingga terdapat 60 satuan percobaan .
1. Isolasi B. thuringiensis (Solihat, 2005) B. thuringiensis diisolasi dari tanah. Sampel tanah  diperoleh  darisekitar  area  peternakan, pembuangan  sampah  dan  selokan.  Masing- masing  sampel  tanah  sebanyak  100  gram, disimpan  dalam refrigerator yang  bersuhu  4º  C. Sebanyak  10  gram  sampel  tanah  disuspensikan ke  dalam  90  mL  akuades  steril  dalam  tabung Erlenmeyer  secara  aseptik,  dikocok  3-5  menit pada shaker  inkubator ,  dan  dipanaskan  pada suhu  80º  C  selama  5  menit.  Sebanyak  1  mL supernatant  suspense sampel  tanah  tersebut dipindahkan  ke  tabung  berisi  akuades  steril  dan diencerkan  sampai  diperoleh  seri  pengenceran 10 -5 .  Sebanyak  1  mL  supernatant  dari  seri pengenceran 10 -4 dan 10 -5 diinokulasi tuang pada medium  NA  ( Nutrient  Agar )  yang  diperkaya ekstrak  yeast  0,3%.  Cawan-cawan  tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 hari.
2.  Pemurnian Bacillus  thuringiensis (Solihat, 2005)
Sebanyak  1  ose  koloni  bakteri Bacillus sp. dari  medium Nutrient  Agar (NA)  modifikasi  yang diperkaya  ekstrak  yeast  0,3%  diinokulasikan  ke dalam  10  mL  medium  cair Luria  Bertani (LB) dapar  asetat  (0,25M,  pH  6,8).  Medium  ini merupakan  media  selektif  bagi  pertumbuhan B. thuringiensis .  Kultur  cair  tersebut  diinkubasi  pada shaker  incubator dengan  kecepatan  150  rpm pada suhu ruang selama 1 hari. Kultur selanjutnya dipanaskan  pada  suhu  80º  C  selama  5  menit. Setelah dingin, sebanyak 1 ml kultur cair tersebut diinokulasi tuang di atas media Luria Bertani (LB) padat  pH  7,2  kemudian  disimpan  pada  suhu  30º C  selama  1-2  hari.  Koloni  bakteri  yang  tumbuh dan  diduga  sebagai B.thuringiensis dimurnikan kemudian  dibuat  kultur  tunggal  pada  media  agar miring.  Ciri  koloni B.  Thuringiensis adalah  hampir menyerupai B. cereus yaitu koloni berwarna putih susu dan koloninya berbentuk rizhoid.
3.  Karakterisasi  Isolat Bacillus  thuringiensis (Solihat, 2005)
Koloni yang diduga bakteri Bacillus thuringiensis tersebut  dipindahkan  ke  media  NA ( Nutrient  Agar )  modifikasi yang  diperkaya  ekstrak yeast  0,3%  baru  dan  disimpan  dalam refrigerator bersuhu 4ºC untuk selanjutnya dilakukan pengamatan morfologi sel meliputi:

## Pewarnaan Gram
Pewarnaan  Gram  dilakukan  dengan  cara isolat  yang  diduga  bakteri Bacillus  thuringiensis terpilih  diulas  pada object  glass dan  difiksasi dengan cara dilewatkan di atas pembakar spirtus. Hal  pertama  yang  dilakukan  adalah  ulasan
ditetesi  dengan  Gram  A  ( chrystal  violet )  selama 60  detik  dan  dicuci  menggunakan  akuades kemudian  dikeringanginkan,  kemudian  ulasan ditetesi dengan Gram B ( lugol’s iodine ) selama 60 detik dan dicuci dengan akuades lalu dikeringanginkan,  lalu  ulasan  ditetesi  Gram  C ( ethanol 96%)  sampai  tetesan  berwarna  jernih dan  dicuci  menggunakan  akuades  kemudian dikeringanginkan.  Terakhir,  ulasan  ditetesi  Gram D  ( safranin )  selama  45  detik  dan  dicuci menggunakan akuades mengalir kemudian dikeringanginkan.  Selanjutnya,  ulasan  diamati menggunakan mikroskop. Bakteri Bacillus thuringiensis merupakan bakteri Gram positif yang ditandai  dengan  warna  sel  yang  berwarna  ungu, bentuk sel batang, dan endospore berbentuk oval.

## Pembuatan  standar  konsentrasi  inokulum Bacillus thuringiensis
Isolat Bacillus  thuringiensis yang  berumur 24 jam diambil sebanyak 1 ose kemudian ditanam dalam  10  ml  LB  yang  ditempatkan  pada  tabung reaksi  steril  secara  terpisah.  Tabung  diinkubasi selama  24  jam.  Penentuan  konsentrasi  inokulum dilakukan berdasarkan pengukuran nilai turbiditas menggunakan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang  660  nm  pada  setiap  nilai  OD diinokulasikan pada media NA kemudian diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu  kamar. Koloni  yang  tumbuh  dihitung  dengan  metode TPC.  Inokulum  yang  akan  diuji  pada  percobaan uji efektivitas Bacillus thuringiensis adalah konsentrasi  0,  10 2 ,  10 4 ,  10 6 ,  10 8 CFU.ml -1 . Konsentrasi B.  thuringiensis dibuat  dengan  me- nyesuaikan nilai OD yang telah dibuat sebelumnya.
Biakan murni Bacillus thuringiensis diregenerasi  dalam  tabung  reaksi  berisi  NA miring, diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Sebanyak  1  ose  kultur  murni  diambil  dan dimasukkan ke dalam 9 mL NaCl Fisiologis 0,85% dan dihitung sebagai pengenceran pertama (10 -1 ), kemudian  diambil  3  mL  untuk  spektrofotometri. Pengenceran  pertama  dihomogenisasi  dengan vortex kemudian  diambil  1  mL  kultur  dan dimasukkan ke dalam 9 mL NaCl fisiologis 0,85% dan  dihitung  sebagai  pengenceran    kedua  (10 -2 ) begitu  seterusnya  hingga  pengenceran  keenam. Hasil  dua  pengenceran  terakhir  (10 5 dan  10 6 ) kemudian diambil sebanyak 1 mL lalu dimasukkan kedalam plate dan media NA dituang kedalamnya dengan  metode  tuang,  kemudian  diinkubasi selama  24  jam  pada  suhu  37°C,  dan  dihitung jumlah  selnya.  Masing-masing  diukur  absor- bansinya  dengan  menggunakan  spektrofotometer UVVis pada panjang gelombang 660 nm. Panjang gelombang tersebut digunakan karena berdasarkan  percobaan  dapat  menunjukkan  nilai absorbansi  terhadap  kultur  bakteri Bacillus thuringiensis dengan  ketelitian  tertinggi  dibanding panjang  gelombang  lainnya.  Menurut  Dewi
(2010),  nilai  absorbansi  dapat  menunjukkan jumlah  sel  bakteri,  dengan  cara  memasukan  ke dalam persamaan garis kurva standar:
y = bx + a y = jumlah sel
x = besarnya nilai absorbansi
Konsentrasi B.  thuringiensis Isolat  IPB  CC ditentukan  menggunakaan  spektrofotometer  dan diperoleh hasil 0,206 nm, 0,314 nm, 0,492 nm dan 0,803 nm (konsentrasi 10 2 , 10 4 , 10 6 ,10 8 berturut- turut),  hasil  TPC  berturut-turut  6,9x10 2 CFU.ml -1 ,
9,4x  10 4 CFU.ml -1 ,  10,73x10 6 CFU.ml -1 ,  11,9x10 8 CFU.ml -1 untuk  hasil  spektro  isolat  hasil  isolasi tanah selokan diperoleh hasil OD 0,219 nm, 0,289 nm, 0,451 nm, dan 0,729 nm (konsentrasi 10 2 , 10 4 ,  10 6 ,10 8 berturut-turut),  hasil  TPC  berturut-turut 2,1x  10 2 CFU.ml -1 ,  10,2x10 4 CFU.ml -1 ,  5,6x10 6
CFU.ml -1 , 15,15x10 8 CFU.ml -1 .
Uji  Efektivitas Bacillus  thuringiensis terhadap Larva Anopheles sp.
Uji  efektivitas B.  thuringiensis dilakukan dengan  cara  inokulum B.thuringiensis dengan masing-masing  konsentrasi  (0,  10 2 ,  10 4 ,  10 6 ,  10 8 CFU’s.ml -1 )  diambil  sebanyak  5  ml  dilakukan untuk menguji efektifitas B. thuringiensis terhadap larva Anopheles sp.  kemudian  dimasukkan kedalam  95  ml  akuades  steril  yang  di  dalamnya terdapat 10 ekor larva nyamuk sesuai stadia larva yang digunakan yaitu stadia I, II, III, dan IV. Larva nyamuk  yang  diujikan  didapatkan  dari  hasil pemeliharaan  larva  di  laboratorium.  Pengamatan dilakukan  4x24  jam  (4  hari)  sesudah  perlakuan . Larva  yang  mati  dihitung  dan  diamati  ciri morfologinya. Larva dihitung dengan rumus :
Jumlah  larva mati sesudah aplikasi  x 100% Jumlah  larva sebelum aplikasi
Reisolasi Bacillus  thuringiensis dari  Larva Anopheles sp. (Blondine et al., 1992).
Reisolasi B. thuringiensis dilakukan dengan mengambil larva yang mati kemudian dimasukkan ke  dalam  tabung  reaksi  steril.  Larva  tersebut dimaserasi  dengan  batang  gelas  kecil  kemudian ditambahkan  9  ml  NaCl  fisiologis  0,85%  dan diinkubasi  selama  5  menit.  Sampel  diencerkan bertingkat hingga 10 -6 masing-masing dipanaskan pada suhu 80ºC selama 15 menit. Sebanyak 1 ml dari  dua  pengenceran  terakhir  diinokulasikan pada  media Nutrient  Agar (NA)  kemudian diinkubasi  selama  48  jam  pada  suhu  30º  C. Selanjutnya dilakukan penghitungan meng- gunakan metode TPC.

## Hasil dan Pembahasan
Hasil  isolasi  bakteri  dari  sampel  tanah (tempat pembuangan akhir sampah, selokan jalan gunung  slamet,  dan  exfarm  UNSOED)  di
Purwokerto  diperoleh  3  koloni  yang  diduga sebagai Bacillus spp.  yang  diberi  kode  isolat  CS (sampel  asal  sumber  dari  tanah  pembuangan akhir  sampah),  CK  (sampel  asal  sumber  dari selokan  jalan  gunung  slamet),  dan  CE  (sampel asal  dari  tanah  exfarm  UNSOED)  Koloni-koloni tersebut  berbeda  dari  koloni  spesies  bakteri lainnya berdasarkan bentuk koloni bulat, tidak ada lender,  tidak  mengkilap,  warna  putih  suram  dan permukaan  seperti  kulit  jeruk.  Berdasarkan kenampakan  pertumbuhan  koloni  pada  medium LB  padat  ketiga  koloni  tersebut  diduga  memiliki kemiripan  dengan  koloni B.  thuringiensis isolat IPB CC Kemiripan lainnya terlihat dari koloni yang tumbuh  memiliki  permukaan  yang  kasar,  agak mengkilat,  tepi  rhizoid  dan  warna  koloni  putih kekuningan  seperti  yang  terlihat  pada  gambar  1 dan 2.
Hasil pengujian awal efektivitas ketiga isolat dalam  membunuh  larva  menunjukkan  bahwa hanya  isolat  CK  yang  mampu  membunuh  larva nyamuk  dengan  hasil  yang  baik  dibandingkan deengan  isolat  lainnya.  Hasil  yang  ditunjukkan oleh  isolat  CK  sama  atau  menyerupai  seperti yang diitunjukkan oleh isolat IPB CC maka dari itu tidak  semua  isolat  hasil  isolasi  digunakan  dalam penelitian ini. Hal ini disebabkan karena pada saat pengujian  untuk  larva,  hanya  bakteri  dari  tanah selokan  (CK)  yang  menunjukkan  hasil  serupa dengan B. thuringiensis isolat IPB CC.
Gambar 1. Isolat B.  thuringiensis IPB  CC  dan  Isolat
Hasil Isolasi pada media LB padat.
Gambar 2. Isolat Bakteri Hasil Isolasi Tanah Selokan pada Media LB Dapar Asetat.
Hasil  pengujian  pada  medium  selektif  LB dapar asetat menunjukkan bahwa isolat CK pada
medium  tersebut  tidak  tumbuh  dan  hanya sporanya  saja  yang  tumbuh,  sebaliknya  spesies Bacillus sp.  lain  akan  menyebabkan  medium menjadi keruh (tumbuh). Hasil tersebut memperkuat  bahwa  isolat  CK  adalah Bacillus thuringiensis. Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan Salaki  et  al.,  (2009)  bahwa  larutan  LB  dapar asetat menunjukan hasil bening yang menandakan  bahwa  didalam  sampel  tanah selokan  mengandung  bakteri B.  thuringiensis , karena media  LB  dapar  asetat  merupakan  media selektif untuk B. thuringiensis . Hal ini dikarenakan spora B.  thuringensis tidak  mampu  bergerminasi dalam  media  yang  mengandung  natrium  asetat dengan  konsentrasi  yang  tinggi  (0,25  M), sedangkan  spora Bacillus sp.  maupun  non B.thuringiensis tetap  dapat  bergerminasi  oleh karena  itu,  koloni  yang  non B.  thuringiensis akan menyebabkan  media  LB  dapar  asetat  menjadi keruh.
Koloni-koloni dari sampel CK yang memiliki kesamaan  dengan  koloni Bacillus  thuringiensis isolat IPB CC diseleksi kembali dengan pemilihan beberapa koloni. Pengamatan kemiripan morfologi sel secara mikroskopis antara isolat CK dan  isolat  IPB  CC  menunjukkan  bahwa  kedua isolat  sangat  identik  (Gambar  3).  Hal  ini  dapat diamati  dari  hasil  pewarnaan  Gram  pada  kedua isolat  yang  menunjukkan  hasil  warna  biru  ungu pada  koloni,  koloni  berbentuk  batang  dan sporanya berbentuk oval setelah diamati dibawah mikroskop.  Pengujian  mikroskopik  ini  bertujuan untuk  melihat  karakteristik  dan  kenampakan  sel bakteri Bacillus  thuringiensis tersebut.  Berikut merupakan  hasil  pengujian  mikroskop  dengan perbesaran  50x10  pada  koloni  isolat  CK  dan B. thuringiensis IPB CC.
Gambar 3.   Kenampakan  Morfologi  Sel  Antara  Isolat
CK dan Isolat IPB CC Hasil pengamatan perlakuan B. thuringiensis isolat  CK  terhadap  Larva  nyamuk Anopheles sp.  menunjukkan  bahwa  konsentrasi 10 8 CFU. mL -1 berpengaruh secara nyata terhadap kematian semua tahapan larva, baik larva instar I sampai IV .
Tabel 1   Presentase kematian  larva nyamuk Anopheles sp .  yang diberi Bacillus thuringiensis isolat dan dosis berbeda
Isolat B.th Dosis Instar larva 1 2 3 4 Rata-rata stdev CK 10 0 12,9 % 8,8 % 7,07 % 7,07 % 8,96% 2,9 10 2 12,3 % 13,4 % 11,7 % 12,3 % 12,43% 3,31 10 4 14,6 % 17,7 % 16,8 % 15,8 % 16,23% 1,2 10 6 18,7 % 21,1 % 21,1 % 22,7 % 20,90% 1,5 10 8 21,2 % 27,7 % 26,7 % 24,1 % 24,93% 1,1 IPB CC 10 0 10,52 % 11,71 % 7,07 % 7,07 % 9,09% 3,0 10 2 15,59 % 11,71 % 12,25 % 12,25 % 12,95% 2,1 10 4 17,61 % 16,77 % 13,43 % 13,43 % 15,31% 0,9 10 6 21,67 % 19,54 % 16,77 % 14,46 % 18,11% 1,3 10 8 27,34 % 24,13 % 22,70 % 20,37 % 23,64% 1,1
Asile  et  al.  (2014)  menyatakan  bahwa waktu  pemaparan  yang  lama B.  thuringiensis dengan  konsentrasi  yang  tinggi    berpengaruh terhadap  kematian  larva.  Daya  bunuh B. thuringiensis paling tinggi dalam waktu pemaparan 4 hari dan apabila lebih dari itu toksin yang dihasilkan bakteri akan mengendap di dasar tempat hidup  larva. Waktu pemaparan  yang lama (>4 hari), efektivitas B. thuringiensis akan menurun. Hal ini disebabkan karena ketersediaan nutrisi  bakteri  pada  air  menurun,  maka  populasi bateri  juga  menurun.  Larva  pada  perlakuan kontrol  (tidak  mengandung Bacillus  thuringiensis ) ternyata menyebabkan kematian larva instar I Hal ini diduga karena sistem imun larva instar I masih lemah.  Faktor  lingkungan  juga  berpengaruh terhadap  viabilitas  larva,  seperti  temperatur, tempat  hidup,  keadaan  air  dan  kandungan  zat makanan  yang  ada  di  dalam  tempat  perindukan larva  (subrat)  semakin  tidak  sesuai  faktor lingkungan  dengan  syarat  kelangsungan  hidup larva  maka  jumlah  larva  yang  mati  akan  semakin banyak.
Hasil analisis ragam kematian larva nyamuk Anopheles sp. yang diperlakukan dengan isolat CK menunjukkan bahwa perlakuan berbagai konsentrasibakteri dan interaksi antara konsentrasi  dan  instar  larva  berpengaruh  sangat nyata  terhadaptingkat  kematian  larva Anopheles sp., sedangkan perlakuan  berbagai macam instar tidak  berpengaruh  terhadap  tingkat  kerentanan dan  kematian  larva  Hal  ini  disebabkan  karena kecepatan pertumbuhan dan perkembangan larva dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu temperatur,  tempat,  keadaan  air  dan  kandungan zat  makanan  yang  ada  di  dalam  tempat perindukan.  Oleh  karena  itu  pertumbuhan  dan perkembangan  dari  instar  1  sampai  instar  4 sangat  variatif  pada  tiap  individu  (Soegijanto, 2006).
Hasil uji BNJ menunjukkan bahwa konsentrasi B.    thuringiensis CK  sebanyak  10 8 CFU.mL -1 (A4) berpengaruh secara nyata (P<0,05)  dalam  meningkatkan  kematian  larva nyamuk Anopheles sp.  dibandingkan  dengan
perlakuan konsentrasi lainnya. Perlakuan konsentrasi  (A) B.  thuringiensis yang  berbeda menunjukkan  bahwa  tingkat  kematian  larva Anopheles sp.  bervariasi.  Tabel  2  menunjukkan bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  yang  diberikan maka  kematian  larva  juga  akan  semakin  tinggi. Hal  ini  disebabkan  karena  semakin  tinggi konsentrasi bakteri yang digunakan maka semakin banyak bakteri yang termakan oleh larva (Gama  et  al.,  2010).  Spora  yang  terbentuk  pada konsentrasi  10 8 CFU.mL -1 (tertinggi)  lebih  banyak dibandingkan dengan jumlah spora pada konsentrasi yang  lebih  rendah.  Spora B. thuringiensis semakin  banyak,  kristal  toksin  atau protein  yang  dilepaskan  untuk  membunuh  larva juga  akan  semakin  banyak  (Dambach  et  al., 2014).
Interaksi  antara  berbagai  konsentrasi B. thruingiensis isolat CK dan instar terhadap jumlah kematian larva berpengaruh sangat nyata berdasarkan  uji  BNJ  (Tabel  3).  Hasil  perlakuan Kombinasi  (Interaksi)  antara  konsentrasi  dan instar  larva  terbaik  ditunjukkan  pada  perlakuan Instar  II  dan  Konsentrasi  10 8 (B2A4).  Trizelia (2001)  menyatakan  bahwa  semakin  rendah konsentrasi  bakteri  yang  diaplikasikan  kepada larva  maka  tingkat  kematian  larva  juga  akan rendah,  begitupun  sebaliknya  jika  konsentrasi bakteri  yang  digunakan  tinggi  maka  tingkat kematian larva juga akan semakin tinggi.
Hasil  perhitungan  reisolasi B.thuringiensis dalam  tubuh  larva  menunjukkan  bahwa  kematian larva  disebabkan  oleh  infeksi B.  thuringiensis . Hasil  perhitungan  TPC  sebaliknya  menunjukkan bahwa jumlah sel bakteri tertinggi (10 8 CFU. mL -1 ) terdapat  pada  larva  instar  III.  Menurut  Darneli (2010),  larva  instar  III  merupakan  larva  yang paling  aktif  dan  paling  banyak  makan,  larva tersebut  memakan B.  thuringiensis dalam  jumlah besar  ke  dalam  sistem  pencernaannya.  Hal tersebut  menyebabkan  populasi  bakteri  dalam usus larva tinggi. Larva instar III memiliki imunitas yang lebih tinggi dibandingkan dengn larva instar I dan II sehingga ketahanannya terhadap infeksi B. thuringiensis lebih tinggi (Gama et al.,  2010).
Hasil  analisis  ragam  jumlah  kematian  larva nyamuk Anopheles sp.  yang  diberi  perlakuan isolat  IPB  CC  pada  berbagai  konsentrasi menunjukkan  bahwa  perlakuan  konsentrasi  dan instar  berbeda  sangat  nyata  terhadap  kematian larva Anopheles sp.  (Lampiran  11).  Interaksi konsentrasi  dan  instar  larva  juga  menunjukkan hasil  berbeda  nyata  yang  berarti  bahwa  terdapat interaksi  antara  konsentrasi  dan  instar  pada setiap perlakuan.
Hasil  uji  BNJ  menunjukkan B.  thuringiensis konsentrasi  10 8 CFU.mL -1 (A4)  berpengaruh paling  baik  dalam meningkatkan  jumlah  kematian larva Anopheles sp. dibandingkan dengan konsentrasi lainnya (Tabel 5). Hal ini menunjukkan  bahwa  hipotesis  diterima.  Aplikasi konsentrasi bakteri dengan kepadatan yang tinggi menyebabkan  kematian  larva  dalam  jumlah besar.  Tingginya  jumlah B.  thuringiensis yang termakan  oleh  larva  menyebabkan  kerusakan pada  larva  nyamuk  dalam  waktu  yang  singkat. Efektivitas B. thuringiensis selain dipengaruhi oleh instar larva nyamuk, makanan, periode pemaparan,  kualitas  air,  starin  bakteri,  suhu  air (Demach  et  al,  2014)  juga  oleh  adanya  toksin pada substrat dan perilaku makan larva (Jahan et la 2013).
Menurut  Dylo  et  al  (2014)  daya  bunuh B. thuringiensis  dipengaruhi  oleh  keberadaan  toksin di  tempat  perindukan  larva.  Semakin  lama  toksin pada suatu substrat maka akan terjadi pengendapan  larvasida B.  thuringiensis. Perilaku makan  larva  juga  mempengaruhi  daya  bunuh B. thuringiensis karena Anopheles sp. biasa mengambil makanan (termasuk toksin) di permukaan air (bukan di dasar perairan).
Hasil  uji  BNJ  rataan  pada  perlakuan  Instar Larva  menunjukkan  bahwa  stadia  larva  instar  I dan  II  paling  rentan  terhadap B.  thuringiensis isolat  IPB  CC.  Hal  ini  ditunjukkan  oleh  tingginya kematian  larva  instar  I  dan  II    Hasil  ini menunjukkan  bahwa  hipotesis  ditolak.  Perlakuan kontrol  (tidak  mengandung Bacillus  thuringiensis ) menyebabkan kematian pada larva instar I Hal ini disebabkan  karena  instar  muda  tersebut  memiliki sistem  imun  yang  lemah  dan  untuk  hidupnya sangat    tergantung  pada  berbagai  faktor lingkungan  seperti  ketersediaan  makanan,  udara untuk  pernafasan,  pH  habitat  atau  perairan  yang netral.  Larva  instar  4  tidak  mengalami  kematian karena  daya  tahan  tubuhnya  lebih  kuat  terhadap serangan  patogen  (Dylo  et  al,  2014,  Jahan  et  al, 2013).  Umur  instar  larva  nyamuk  semakin  tua maka  semakin  resisten  terhadap B.  thuringiensis , hal ini disebabkan adanya perbedaan perkembangan  jumlah  sel  penyusun  saluran pencernaan larva pada setiap instarnya.
Hasil  uji  BNJ  rerata  instar  yang  mati  pada perlakuan  Interaksi  konsentrasi  bakteri  dan  instar menunjukkan  bahwa  perlakuan  Instar  1  dan Konsentrasi  10 8 CFU.mL -1 (B1A4)  meningkatkan
jumlah  kematian  larva  dibandingkan  dengan perlakuan lainnya Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa  semakin rendah konsentrasi bakteri  yang  diaplikasikan  kepada  larva  maka tingkat  kematian  larva  juga  semakin  rendah, demikian  sebaliknya.  Trizelia  (2011)  menyatakan bahwa  semakin  banyak  bakteri  termakan  oleh larva  maka  akan  meningkatkan  kematian  larva. Menurut  Yusuf  (2010),  larva  tidak  bersifat pemilih dalam  cara  dan  tingkah  laku  makannya,  bakteri yang  tercampur  dengan  makanan  dalam  habitat (perairan)  akan  termakan  oleh  larva  dan  apabila terdapat  dalam  jumlah  yang  banyak  maka kemungkinan  untuk  termakan  akan  semakin besar.
Hasil  reisolasi B.  thuringiensis isolat  IPB CC  dalam  tubuh  larva  menunjukkan  bahwa  larva yang  mati  dikolonisasi  oleh  bakteri  tersebut.  Hal ini menunjukkan bahwa B. thuringiensis menginfeksi  larva  dengan  baik.  Hasil  perhitungan TPC  sebaliknya  menunjukkan  bahwa  populasi bakteri  tertinggi  didapatkan  pada  larva  instar  III. Menurut Darneli (2010), Larva instar III merupakan  larva  yang  paling  aktif  dan  paling banyak makan, maka kemungkinan larva tersebut memakan B.  thuringiensis dalam  jumlah  banyak ke  dalam  sistem  pencernaannya.  Hal  ini  memicu tingginya  populasi  bakteri  dalam  usus  larva, sehingga  ketika  direisolasi  jumlah  bakteri  tumbuh lebih besar dibandingkan dengan instar lainnya.
Ciri-ciri  larva  yang  terinfeksi  oleh  bakteri adalah berwarna coklat kehitaman dan mengalami  paralisis  usus  (Gambar  5),  indikasi lainnya  dapat  dilihat  dari  aktifitas  makan  larva yang  menurun  bahkan  dapat  berhenti,  larva menjadi  lemah  dan  kurang  tanggap  terhadap sentuhan. B. thuringiensis yang menginfeksi larva tidak  secara  langsung  dapat  mematikan  larva, larva  masih  mampu  bertahan  hidup  dan  berhasil menjadi pupa sampai serangga dewasa. Serangga  dewasa  terinfeksi  yang  terbentuk biasanya  berukuran  kecil,  cacat,  masa  hidupnya lebih pendek dan mandul (Suwahyono, 2010).
Gambar 4.   Larva Nyamuk Anopheles sp. yang terinfeksi B. thuringiensis Keterangan:  A  =  `Larva Anopheles sp.  instar  4 mengalami paralisis usus (usus rusak), B = Pupa Larva Nyamuk Anopheles sp.  yang  mati  (busuk)  karena terinfeksi B.thuringiensis ,  C  =  Usus  Larva  yang  rusak karena B. thuringiensis.
Kematian  larva  nyamuk Anopheles sp. diduga  disebabkan  oleh  paraspora  kristal  protein d-endotoksin  yang  dihasilkan  oleh B.thuringiensis isolate  CK  dan  IPB  CC . Bakteri  yang  termakan oleh  larva  akan  mengalami  lisis  karena  kondisi yang  tidak  sesuai  bagi  syarat  kehidupan B. thuringiensis, sehingga  kristal  paraspora  dan spora  terbebas.  Toxin  kemudian  akan  melisis epitel  dinding  midgut  larva  (Wabiko  et  al.,  1985). Toksin  yang  dihasilkan B.  thuringiensis (kristal protein)  berbentuk  protoksin  (tidak  aktif)  jika beradadi lingkungan (Sjamsuriputra, 1987). Toksin  akan  menjadi  aktif  jika  berada  dalam kondisi  pH  basa  antara  10-12  sesuai  dengan kondisi pada saluran pencernaan insekta.
Hasil  reisolasi B.  thuringiensis isolat  IPB CC dan isolate CK pada larva Anopheles sp. yang mati  (Lampiran  17  dan  18)  mengindikasikan bahwa  kematian  larva  instar  I,  II,  III,  dan  IV disebabkan oleh infeksi bakteri tersebut. Populasi B. thuringiensis isolat IPB CC dan isolat CK pada larva  yang  mati  berturut-turut  adalah  1,3  x  10 7 CFU.mL -1 dan 2,9 x 10 7 CFU.mL -1 . Hasil Reisolasi
pada  larva Anopheles sp.  yang  mati  dapat dikatakan  efektif,  kematian  tertinggi  dengan kepadatan  bakteri  1,3  x  10 7 sel.ml -1 .  Hasil perhitungan reisolasi tersebut membuktikan bahwa aplikasi B. thuringiensis dalam pengendalian  larva  nyamuk Anopheles sp.  dapat dikatakan efektif.

## Simpulan
Berdasarkan  hasil  dan  pembahasan,  maka dapat  disimpulkan  bahwa  (1).  Konsentrasi B. thuringiensis isolat  CK  dan  IPB  CC  yang  paling berpengaruh dalam pengendalian larva Anopheles sp  adalah  10 8 CFU.mL -1 .(2).  Instar larva  yang  paling  peka  terhadap B.  thuringiensis isolat  IPB  CC  adalah  instar  I  dan  II  sedangkan instar  yang  peka  terhadap  bakteri  hasil  isolasi adalah instar II (3).Perlakuan konsentrasi isolat B. thuringiensis dan  tingkat  instar  larva  yang  paling baik  dalam  pengendalian  larva Anopheles sp. adalah  10 8 CFU.mL -1 ,  dan  instar  I  dan  II.

## Daftar Referensi
Achille,  GN,    Christophe,HS  and    Yilian,  L.2010. Effect of Bacillus thuringiensis var. israelensis (H-14)  on  Culex,  Aedes  and Anopheles larvae (Cotonou; Benin). Journal of Stem Cell 60-66
Anggraeni,  Y.  M.,  Christina,  B.,  &  Wianto,  R., 2013.  Uji  Daya  Bunuh  Ekstrak  Kristal
Endotoksin Bacillus thuringiensis israelensis (H-14) terhadap Jentik Aedesaegypti , Anopheles  aconitus dan Culexquinquefasciatus . Journal Sain Veteriner , 31 (1).
Becker.,  1991.  Efektivitas  Vectobac  12AS  ( Bt H- 14) dan ( Bt H-14)  terhadap  Vektor  Malaria Anopheles  maculatus di  Kobakan  Desa Hargotirto,  Kecamatan  Kokap,  Kabupaten Kulon  Progo.  In:  Blondine,  Ch.P.  2004. Bul.Penel. Kes. 32: 17-28.
Ben-Dov,  E.2014. Bacillus  thuringiensis subsp. israelensis and Its Dipteran-Specific Toxins. Toxins 6 , 1222-1243.
Dambach, P, Louis, VR, Kaiser A, Ouedraogo, S, Sié,  A,  Sauerborn,  A,  and  Becker  N, 2014.Efficacy  of Bacillus  thuringiensis var. israelensis  against  malaria  mosquitoes  in northwestern  Burkina  Faso.  Parasites  & Vectors , 7:371
Dylo,  P,    Martin,C  and    Mhango,  M.  .2014. Efficacy  of Bacillus  thuringiensis  var israelinsis ( Bti )  on Culex and  Anopheline mosquito  larvae  in  Zomba.  Malawi  Journal
of Science and Technology. Vol 10 no 1 41-
52 Darnely., 2010. Penggunaan Bacillus thuringiensis israelensis untuk Memberantas Aedes  aegypti .  Majalah Kedokteran FK UKI 2010 XXVII No.4.
Yusuf,  Y. 2009.  Penggunaan  Bakteri Bacillus spp untuk Pengendalian Jentik Nyamuk Anopheles  spp  (Application  of  Bacillus  spp as Microbial Larvicides to Control Anopheles  Larvae).  Bionature  Vol.  10  (2): Hlm: 102 - 105,
Gama,  Z.P.,  Yanuwiadi,  Bagyo.,  Tri  Handayani Kurniati.  2010.  Strategi  Pemberantasan
Nyamuk Aman Lingkungan: Potensi Bacillus thuringiensis Isolat Madura Sebagai  Musuh  Alami  Nyamuk Aedes aegypti. Journal  Pembangunan  dan  Alam Lestari.
Jusniar  Ariati,  I.  N.,  2014.  Sebaran  Habitat Perkembangbiakan  Larva Anopheles  spp Di  Kecamatan  Bula,  Kabupaten  Seram Bagian  Timur  Provinsi  Maluku.  Jurnal Ekologi Kesehatan, 10-22.
Marwoto,  H..  1999.  Korelasi  Kepadatan  Populasi A.  barbirotris dengan  prevalensi  Malaria  di Kecamatan Cineam, Kabupaten Tasikmalaya. Obeidat,  Maher.,  Dhia  Hassawi,  Ihab  Ghabeish., 2004. Characterization Of
Bacillus
Thuringiensis Strains  From  Jordan  And
Their Toxicity to the Lepidoptera,   Ephestia
Kuehniella  Zeller. African Journal of Biotechnology. 3 (11): 622-22.
O’Connor,  C.T  dan  A.  Soepanto,  1999.  Kunci Bergambar  Jentik  Anopheles  di  Indonesia. Jenderal P3M DEPKES, Semarang.
Poopathi,  S  and  Abidha,  S  2011.  Mosquitocidal bacterial  toxins  (B acillus  sphaericus and Bacillus  thuringiensis  serovar  israelensis ): Mode  ofaction,  cytopathologicaleffects  and mechanism  of  resistance.  Journal  of Physiology  and  Pathophysiology  Vol.  1(3), pp. 22-38.
Sjamsuriputra, A.  A.,  I., Sastramihardja dan U.  S. Sastramihardja.  1984.  Pengaruh  Beberapa
Faktor Lingkungan Dalam Optimasi
Produksi  Insektisida Bacillus  thuringiensis . ITB., Bandung.
Soegijanto,  S.,  2006.  Demam  Berdarah  Dengue Edisi  2.  Penerbit  Airlangga  University Press, Surabaya.
Suwahyono, Untung. 2010. Biopestisida. Jakarta :
Penebar Swadaya Suwita, C. S., 2013. Efektivitas Bacillus thuringiensis israelensis dalam Pemberantasan  Larva Aedes  aegypti di Kecamatan  Cempaka  Putih, Jakarta  Pusat. eJKI.