Hasil Penelitian

## FRAKSINASI PROTEIN KAPANG LAUT

## Xylaria psidii KT30 DAN SITOTOKSISITASNYA TERHADAP SEL HeLa
[Fractionation of Proteins of Marine Fungus Xylaria psidii KT30 and their Cytotoxicity against HeLa Cells]
Mita Gebriella Inthe 1) , Kustiariyah Tarman 1) * dan Mega Safithri 2)
1) Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 22 Juli 2013 / Disetujui 03 Maret 2014

## ABSTRACT
Cervical cancer is the most common cause of death for Indonesian women after human breast cancer. One of the efforts of cancer treatment is the utilization of natural compounds. One of the microorganisms having the potential as anticancer agent is endophytic fungi. Endophytic fungi from the marine habitat can be isolated from sea weeds, sea grasses, sponges, and mangroves. Xylaria psidii KT30, a marine fungus used in this study was isolated from red seaweed Kappaphycus alvarezii. Xylaria psidii KT30 was cultivated in potato dextrose broth medium for nine days at room temperature  27-29°C  in  shaking  condition.  This  study  aimed  to  obtain  protein  fractions  from  X.  psidii  KT30  and  determine  their  toxicity  againt Chang  and  HeLa  cells.  The  fractionation  process  was  conducted  using  DEAE  Sephadex  A-50  column  chromatography  and  the  toxicity  was determined by Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). The metabolites excreted in the culture broth was extracted using 90% of ammonium sulphate. The  extract  was  then  tested  for  their  toxicity  against  HeLa  and  Chang  cells  by  Microculture  Tetrazolium  Technique  (MTT)  assay.The  results revealed that LC 50 of the protein extract of X. psidii KT30 was 104.95 ppm and IC 50 was 69.9 ppm. Based on the National Cancer Institute (NCI), this value showed moderate cytotoxicity against HeLa cells.
Keywords: BSLT, cervical cancer, fractionation, Marine fungus, MTT assay, Xylaria psidii

## ABSTRAK
Kanker serviks merupakan kanker penyebab kematian kedua terbesar pada wanita di Indonesia setelah kanker payudara. Salah satu upaya pengobatan  kanker  dilakukan  dengan  memanfaatkan  senyawa  dari  bahan  alam.  Salah  satu  mikroorganisme  yang  mempunyai  potensi  sebagai antikanker adalah kapang endofit. Kapang endofit dari lingkungan laut dapat diisolasi dari rumput laut, lamun, spons, dan mangrove. Xylaria psidii KT30 kapang laut yang digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari rumput laut merah Kappaphycus alvarezii . Xylaria psidii KT30 dikultur pada media Potato Dextrose Broth (PDB) selama sembilan hari pada suhu 27-29°C ( dishaker ). Penelitian ini bertujuan untuk menentukan sitotoksisitas ekstrak X. psidii KT30 terhadap sel Chang dan sel HeLa. Proses fraksinasi dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi DEAE Sephadex A-50  dan  toksisitas  ditentukan  dengan Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT).  Metabolit  diekstraksi  dengan  amonium  sulfat  90%.  Ekstrak  diuji aktivitasnya terhadap sel HeLa dan sel Chang dengan metode Microculture Tetrazolium Technique (MTT) assay . Hasil uji ekstrak protein X. psidii KT30  menunjukkan  nilai  LC 50 104.95  ppm  dan  IC 50 69.89  ppm.  Berdasarkan  National  Cancer  Institute  (NCI),  hasil  toksisitas  dari  kapang  laut bersifat moderat aktif terhadap sel HeLa.
Kata kunci: BSLT, fraksinasi, MTT assay , kanker serviks, kapang laut, Xylaria psidii

## PENDAHULUAN
1
Penyakit  kanker  merupakan  penyakit  yang  menjadi  salah satu  ancaman  utama  terhadap  kesehatan  karena  merupakan penyebab  kematian  kedua  setelah  penyakit  jantung.  Setiap tahunnya  sekitar  7.6  juta  orang  di  seluruh  dunia  meninggal karena kanker. Kanker serviks menduduki peringkat kedua yang diderita oleh perempuan. Setiap tahunnya sekitar 53.000 kasus kanker  serviks  terjadi,  dimana  85%  kasus  kanker  serviks  ber- asal  dari  negara  berkembang  (Asian  cancer,  2012).  Menurut Sistem  Informasi  Rumah  Sakit  (SIRS)  tahun  2008,  kanker serviks  merupakan  jenis  kanker  tertinggi  kedua  di  Indonesia dengan persentasi pasien rawat inap sebesar 10.3%. Yayasan
*Penulis Korespondensi: Email: kustya@gmail.com; Hp: 082112873434
Kanker  Indonesia  tahun  2006  menerangkan  berdasarkan patologi di 13 pusat, kanker serviks menempati urutan pertama dengan  angka  16%,  yang  kemudian  disusul  dengan  kanker payudara 15%.
Sel  kanker  leher  rahim  (sel  HeLa)  terjadi  akibat  infeksi Human  Papillomavirus  (HPV  18)  sehingga  mempunyai  sifat yang  berbeda  dengan  sel  leher  rahim  normal  (Prayitno,  2005; Shoeb,  2006;  Michael  dan  Doherty,  2005).  Selain  itu,  kanker dapat  disebabkan  oleh  beberapa  faktor  yaitu  penggunaan tembakau,  infeksi,  radiasi,  kurangnya  aktivitas  fisik,  makanan yang tidak sehat, obesitas, dan polusi lingkungan (Anand et al. 2008).  Faktor  gaya  hidup modern seperti  kebiasaan  merokok, konsumsi  alkohol,  makanan  yang  mengandung  bahan tambahan  pangan  yang  karsinogenik,  dan  makanan  berlemak trans serta obesitas, dapat meningkatkan risiko terkena kanker tersebut (Jemal, 2011).
Hasil Penelitian
Berbagai  upaya  alternatif  dilakukan  untuk  pengobatan kanker  seperti  pembedahan  atau  operasi,  radiasi,  kemoterapi, immune-terapi,  dan  masih  banyak  lagi.  Namun,  dalam prosesnya  setiap  pengobatan  yang  dilakukan  memiliki  efek samping yang dirasakan oleh penderita kanker serviks, seperti terjadinya penurunan jumlah sel-sel darah (akan kembali normal sekitar  seminggu  kemudian),  infeksi  (ditandai  dengan  panas, sakit  tenggorokan,  rasa  panas  saat  buang  air  kecil,  menggigil dan  luka  yang  memerah,  bengkak,  dan  rasa  hangat),  anemia, pendarahan  seperti  mimisan,  rambut  rontok,  kulit  gatal  dan kering, mual dan muntah, dehidrasi dan tekanan darah rendah, sembelit  atau  konstipasi,  diare,  gangguan  syaraf  (Knezevic et al . 2011).
Protein  bioaktif  menarik  perhatian  para  peneliti  karena dapat dikembangkan potensinya sebagai senyawa toksik pada imunotoksin.  Protein  dikonjugasikan  dengan  antibodi  untuk mengenal  sel  target,  sehingga  tidak  menyerang  sel  lainnya. Imunotoksin digunakan untuk perlakuan penyakit penting pada manusia seperti kanker, AIDS, dan penyakit degeneratif (Cragg dan  Newman,  2009;  Minami et  al. 1992;  Girbes et  al. 1993). Protein bioaktif dapat dihasilkan  oleh mikroorganisme (Silva et al. 2010).
Salah  satu  mikroorganisme  sumber  utama  metabolit adalah  kapang  endofit  (Strobel  dan  Daisy,  2003;  Blunt et  al. 2007;  Joseph  dan  Priya,  2011).  Kapang  endofit  adalah  fungi yang  menginfeksi  jaringan  tanaman  yang  sehat  tanpa  menye- babkan sakit (Clay, 2004; Shushni et al. 2009; Chaeprasert et al. 2010; Kohlmeyer dan Volkmann-Kohlmeyer, 2003; Sukandar et  al. 2010; Yan, 2004).  Saat  ini,  kapang  endofit  dengan keragaman  metabolit  serta  bioaktivitasnya  yang  tinggi  sangat menarik untuk diteliti. Beberapa metabolit endofit menunjukkan aktivitas  antibakteri,  antifungi,  hormon  pertumbuhan  tanaman, insektisida, imuno-supresan, dan lain-lain (Kumaran et al. 2009; Beutler,  2009;  Kuno et  al. 2012).  Salah  satu  kapang  yang memiliki aktivitas biologis adalah Xylaria sp. Metabolit sekunder dari isolat kapang endofit Xylaria sp. dapat digunakan sebagai obat antikanker dan autoimun (Hasan et al. 2007; Paulus et al. 2006; Yin et al. 2011; Chen et al. 2009; Romero et al. 2008; Xu et al. 2008; Song et al. 2012; Wu et al. 2011; Pongcharoen et al. 2008;  Silva et  al. 2010).  Penelitian  Tarman et  al. (2011) menunjukkan  bahwa  5  dari  11  isolat  kapang  endofit  yang diisolasi  dari  makroalga,  kayu,  dan  moluska,  memiliki  potensi sebagai  sumber  bahan  bioaktif.  Ekstrak  dari Xylaria  psidii (KT30)  dan Mycelium  sterilium (KT31)  menunjukkan  aktivitas antibakteri  dan  sitotoksisitas  yang  tinggi  (Tarman et  al .  2011). Sampai  sekarang  belum  ditemukan  obat  yang  memenuhi kriteria  terapi  yang  optimal  terhadap  para  penderitanya, sehingga perlu dikembangkan obat baru yang mempunyai efek terapi yang baik (Luanpitpong et al. 2012; Goyal, 2012). Xylaria psidii KT30  adalah  salah  satu  jenis  kapang  yang  dapat menghasilkan  protein  antikanker.  Akan  tetapi  stabilitas  dan mekanisme  aksi  dari  protein  antikanker  tersebut  belum diketahui.  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  karakterisasi  protein  yang  dihasilkan  oleh  kapang endofit Xylaria psidii KT30 dan toksisitasnya.

## BAHAN DAN METODE
Bahan Bahan yang digunakan adalah kapang endofit Xylaria psidii KT30 yang diisolasi dari makroalga Kappaphycus alvarezii yang berasal dari perairan Barru, Sulawesi Selatan.  Selain itu, juga digunakan sel kanker serviks (HeLa, ATCC CCL 2) dan sel hati normal (Chang, ATCC CCL 13).

## Kultivasi kapang laut KT30
Kultur  disiapkan  dengan  memindahkan  kapang  dari  media padat Potato Dextrose Agar (PDA, Difco) ke media cair Potato Dextrose Broth (PDB, Difco). Kapang dalam prekultur diinkubasi selama 7 hari. Prekultur selanjutnya digunakan sebagai biakan. Sebanyak  5%  prekultur  dimasukkan  ke  dalam  tabung Erlenmeyer yang berisi 350 mL media PDB (Difco) dan inkubasi selama  sembilan  hari  dalam  suhu  ruang  dengan  bantuan shaker (Gemmy VRN 360) dengan kecepatan 120 rpm.

## Isolasi protein
Koleksi supernatan dari hasil inkubasi selama sembilan hari kemudian diendapkan menggunakan amonium sulfat (E-Merck) dengan konsentrasi 90%. Proses berikutnya adalah pengaturan pH  hasil  pengendapan  sampai  pH  7.4.  Penyimpanan  hasil pengendapan  dilakukan  selama  satu  malam.  Supernatan  hasil pengendapan  disentrifuse  (HIMAC  CR  21  G)  pada  kecepatan 10000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang dikoleksi diguna- kan untuk uji bioassay BSLT.
Uji  toksisitas  metode Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT) (Meyer et al. 1982) Uji  toksisitas  dilakukan  berdasarkan  metode  Meyer et  al. 1982 dengan larva Artemia salina sebagai hewan uji. Mula-mula telur A. salina ditetaskan di dalam air laut buatan (38  g garam dapur  dalam  1000  mL  air  biasa)  di  bawah  lampu  TL  20  watt. Setelah  48  jam  telur  menetas  menjadi  nauplii  instar  III/IV  dan siap digunakan sebagai hewan uji. Larva A. salina dimasukkan ke dalam vial yang telah berisi larutan ekstrak sampel dengan seri dosis 50, 100, 250, 500, 750, dan 1000 ppm dengan 3 kali ulangan.  Semua  vial  diinkubasi  pada  suhu  kamar  selama  24 jam  di  bawah  penerangan  lampu  TL  20  watt.  Pengamatan dilakukan  setelah  24  jam  dengan  menghitung  jumlah Artemia salina yang mati pada tiap konsentrasi. Penentuan harga LC 50 dalam µg/mL atau ppm dilakukan menggunakan analisis probit dengan program MINITAB versi 13.2 dengan selang kepercaya- an 95%.
Pemurnian dengan kromatografi (Ustadi et al. 2005) Tahap  pemurnian  pertama  dilakukan  dengan  kromatografi penukar  ion  dengan  bahan  pengelusi  buffer  B  (buffer  gel pemisah,  Tris-HCl  2M,  pH  7.4)  (E-Merck).  Sebanyak  75  mL larutan  Tris  Cl  pH  7.4  (E-Merck)  dan  4  mL  larutan  SDS  10% (Merck) (w/v) ditambahkan dengan akuades hingga volume total 100  mL.  Matriks  menggunakan  kolom  DEAE Sephadex  A-50 (Merck)  dengan  laju  aliran  1  mL/menit.  Selain  itu  juga digunakan  NaCl  (E-Merck)  1  M  sebagai  pengelusi.  Jumlah volume  tiap  fraksi  ditampung  sebanyak  5  mL.  Masing-masing fraksi  diuji  konsentrasi  protein  dengan  spektrofotometer-uv (CECIL series 2)  =280 nm.
Hasil Penelitian
Penentuan  berat  molekul  dengan sodiumdodecyl  sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (Rosenberg, 1996)
Metode sodiumdodecyl  sulphate-polyacrylamide  gel  electro- phoresis (SDS-PAGE)  yang  dikerjakan  dalam  penelitian  ini menggunakan 4% stacking gel dan 10% gel akrilamida. Metode ini menggunakan matriks dari gel yang disusun oleh akrilamida dan N,N’-metilen-bis-akrilamida yang berpolimerisasi melalui mekanisme  radikal  bebas  dengan  bantuan  katalisator  N,N,N’N,- tetramethylene-diamine  (TEMED)  dan  inisiator  ammonium persulfat. Konsentrasi akrilamida yang digunakan dalam analisis ini adalah 10% (w/v). Pewarnaan yang digunakan adalah pewarnaan perak. Deteksi SDS-PAGE dilakukan dengan melepaskan gel hasil elektroforesis dari cetakan dan diukur jarak migrasi bromfenol blue. Gel  tersebut  dicelup  dan  direndam  dalam  larutan  fiksasi  (25% metanol (Merck) + 12% asam asetat (Merck)) selama 1 jam sambil digoyang  konstan.  Kemudian  direndam  dalam  50%  (v/v)  etanol (Merck)  selama  2x20  menit.  Larutannya  diganti  dengan  larutan pengembang  kemudian  dicuci  dengan  akuabides.  Setelah  dicuci ditambahkan larutan perak nitrat selama 30 menit kemudian dicuci lagi  dengan  akuabidestilata  2x20  detik  dan  ditambahkan  larutan campuran Na 2 CO 3 (Merck) dan formal dehida dan terakhir dengan larutan fiksasi.
Uji sitotoksisitas ekstrak protein kapang laut Xylaria psidii KT30  terhadap  sel  Chang  dan  sel  HeLa  (Hseu et  al. 2008) media sel kanker (LCAG, 2009)
Media  DMEM  (Difco)  bubuk  dimasukkan  ke  dalam  botol steril  dan  ditambahkan  3.7  gram  NaHCO3  (Merck),  antibiotik penisilinstreptomisin (Kalbe) 1%, dan 10% Fetal Bovine Serum ( FBS,  Sigma),  kemudian  dihomogenisasi  dan  ditambahkan akuabides sampai larutan media menjadi 1000 mL.
Kultur sel Chang (Li et al . 2011) Sel  Chang  ditumbuhkan  dalam flask yang  berisi  media DMEM  (Difco).  Setelah  sel  tumbuh  (menempel  pada  dinding flask ),  medianya  dibuang  dan  sel  HeLa  dalam flask dibilas dengan  larutan  PBS  (Sigma).  Setelah  itu,  dimasukkan  enzim tripsin  sebanyak  5  mL,  lalu  dinkubasikan  selama  5  menit,  dan kemudian ditambahkan media DMEM (Difco). Suspensi tersebut disentrifus pada kecepatan 700 g selama 5 menit. Supernatan yang  diperoleh  dibuang  dan  pellet  (sel  Chang)  yang  diperoleh ditambah  dengan  5  mL  DMEM  (Difco).  Setelah  itu,  dilakukan perhitungan  jumlah  sel  Chang.  Jumlah  sel  dihitung  hingga masing-masing sumur akan terisi 5.000 sel dalam 100 μL kultur sel Chang, dan dimasukkan ke dalam tiap sumur sebanyak 96 sumur. Kultur sel tersebut diinkubasi selama 24 jam ( over night ) dalam  inkubator  (MILLIPORE)  CO 2 .  Uji  yang  sama  (kultur  sel) dilakukan dengan menggunakan sel HeLa.

## Sitotoksisitas ekstrak
Setelah kultur sel Chang diinkubasi selama 24 jam media- nya  dibuang,  kemudian  dilanjutkan  dengan  perlakuan  ekstrak. Ekstrak yang diuji meliputi protein kasar, protein fraksi 53 (F3.1), 60 (F3.2) dan 69 (F4). Masing-masing larutan ekstrak terdiri dari 5  konsentrasi  akhir  pada microplate .  Tahap  awal  perlakuan ekstrak  adalah  dengan  membuat  stok  larutan  ekstrak  dengan konsentrasi  masing-masing  10000  ppm,  yang  dibuat  dengan
cara melarutkan 10 mg ekstrak dengan 50 μL DMSO (Merck), kemudian  ditambah  dengan  950  μL  DMEM  (Difco).  Masing- masing  larutan  ekstrak  kemudian  diencerkan  dengan menambahkan  DMEM  (Difco)  untuk  mendapatkan  konsentrasi akhir pada microplate . Konsentrasi akhir yang digunakan pada semua sampel adalah  7, 16, 32, 75, 150, 250, 500, dan 1000 ppm.  Sumur microplate yang  berisi  sel  Chang  dari  tahap sebelumnya  (kultur  sel  Chang),  ditambahkan  100  μL  larutan ekstrak uji di atas sebagai perlakuan, dan ditambahkan 100 μL DMEM  (Difco)  sebagai  kontrol  negatif.  Campuran  dalam microplate tersebut  diinkubasi  selama  48  jam  dalam  inkubator (MILLIPORE) CO 2 . Hal yang sama (uji sitotoksisitas) dilakukan dengan menggunakan sel HeLa.

## Uji sitotoksisitas terhadap sel Chang dan sel HeLa dengan MTT (CCRC 2000)
Setelah diinkubasi 48 jam, dimasukkan garam tetrazolium 5 mg/mL sebanyak 10 μL ke dalam tiap sumur. Warna campuran menjadi  kuning.  Diinkubasi  selama  4  jam  pada  inkubator (MILLIPORE)  CO 2 .  Setelah  diinkubasi  dan  telah  terbentuk kristal  formazan,  larutan  dibuang.  Kristal  formazan  yang  ter- bentuk dilarutkan dengan 100 μL etanol 96% pada tiap sumur. Warna larutan menjadi ungu. Nilai absorban dari formazan yang terbentuk  diukur  dengan microplate  reader (STATFAX  2100) pada panjang gelombang 595 nm. Semua perlakuan dilakukan tiga kali pengulangan.

## Morfologi sel Chang dan sel HeLa
Pengamatan  morfologi  sel  Chang  dan  sel  HeLa  dilakukan dengan  menggunakan  mikroskop  cahaya  Binokuler  (RRC  – XSZ107BN).

## Analisis data
Data  yang  diperoleh  dari  uji  sitotoksisitas  dengan  MTT berupa  nilai  absorban  tiap  sumur,  kemudian  nilai  absorban tersebut  dikonversi  menjadi  %  inhibisi  dengan  menggunakan rumus (Zhang et al . 2005):
% Inhibisi = A kontrol−A sampel x 100% A kontrol
Analisis statistik untuk membandingkan inhibisi tiap ekstrak dilakukan  dengan  menggunakan One-Way ANOVA  dengan SPSS.  Jika  terdapat  perbedaan  yang  nyata,  maka  analisis dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program SPSS.

## HASIL dan PEMBAHASAN
Hasil kultivasi kapang endofit Xylaria psidii KT30 Pertumbuhan  kapang  pada  media  padat  terlihat  dari benang-benang  putih  yang  mengelilingi  keping  inokulan. Miselium akan bertambah banyak dan mengikat keping-keping tersebut menjadi suatu bentuk yang padat terjalin kuat oleh hifa- hifa  miselium.  Pemisahan  miselium  dari  mediumnya  harus melalui  suatu  penyaringan  sebab  miselium  tidak  dapat  diambil seperti  perlakuan  pada  butir  (Gandjar et  al. 2006).  Proses penyaringan menghasilkan supernatan kapang yang kemudian
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0 20 40 60 80 100 Ab so rb an si 28 0 nm (U /m L) Nomor Tabung III IV V I II
dimurnikan  melalui  proses  pengendapan.  Volume  awal  kultur produksi adalah 350 mL. Setelah masa kultur selama sembilan hari diperoleh volume panen  sebesar 300 mL.  Biomassa tidak digunakan  karena  protein  target  selama  masa  pertumbuhan telah  disekresikan  ke  dalam  medium  pertumbuhan.  Isolat kapang X. psidii KT30 dalam media padat dan cair dapat dilihat pada Gambar 1. Rendemen protein yang dihasilkan dari proses pengendapan dengan amonium sulfat adalah 0.09%.
Gambar 1.  Kapang laut X. psidii KT30 dalam media padat PDA  (A), kapang laut X. psidii KT30 dalam media cair PDB (B)
Tingkat toksisitas ( Bioassay ) hasil pengendapan Hasil uji toksisitas menggunakan ekstrak kasar kapang laut Xylaria  psidii KT30  menunjukkan  bahwa  peningkatan  konsen- trasi  ekstrak  menyebabkan  semakin  besarnya  persentase kematian. Persamaan regresi hubungan antara log konsentrasi dengan mortalitas Artemia salina dari ekstrak kasar kapang laut X.  psidii KT30  yaitu  Y  =  1.094x  +  2.789,  Y  menunjukkan konsentrasi  mortalitas,  X  menunjukkan  log  konsentrasi  dan  R menunjukkan  koefisien  korelasi  antara  X  dan  Y.  Persamaan regresi  Y=  1.094x  +  2.789  menunjukkan  bahwa  setiap penambahan  konsentrasi  sebanyak  1  log  (5  ppm)  menyebab- kan  kenaikan  mortalitas  probit  sebesar  1.094.  Berdasarkan persamaan  tersebut  diperoleh  nilai  koefisen  korelasi  (R 2 ) sebesar  0.949.  Nilai  LC 50 ekstrak  kasar  kapang  laut X.  psidii KT30  yang  dihasilkan  dari  perhitungan  sebesar  104.95  ppm (Tabel 1).
Tabel 1.  Data hasil uji BSLT ekstrak kasar kapang laut X. psidii KT30
Konsentrasi (ppm) Log Konsentrasi Persen Mortalitas (%) Probit LC 50 50 1.69 40.00 ± 1.00 4.75 104.95 ppm 100 2.00 46.66 ± 2.30 4.90 250 2.39 66.66±1.50 5.41 500 2.69 73.33 ± 2.80 5.61 750 2.87 80.00 ± 1.70 5.84 1000 3.00 90.00 ± 2.60 6.28
Meyer et  al. (1982)  melaporkan  bahwa  suatu  ekstrak tanaman  dianggap  sebagai  bioaktif  apabila  ekstrak  tersebut memiliki  nilai  LC 50 lebih  kecil  atau  sama  dengan  1000  mg/L. Nilai  tersebut  menunjukkan  bahwa  ekstrak  kasar  dari  kapang laut X.  psidii KT30  termasuk  dalam  kategori  toksik.  Beberapa hasil  penelitian  terhadap  senyawa  bioaktif  yang  diuji  dengan Artemia  salina (BSLT)  menunjukkan  adanya  korelasi  spesifik terhadap uji antikanker bila mempunyai LC 50 <1000 ppm.
Fraksi protein ektrak kapang laut Xylaria psidii KT30 Hasil  fraksinasi  ekstrak  protein  kasar  dari  kapang  laut Xylaria psidii KT30 yang dipisahkan  kromatografi kolom  DEAE Sephadex A-50  sampai  100  fraksi.  Hasil  fraksinasi  protein disajikan  pada  Gambar  2.  Pengukuran  kandungan  protein dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm. Hal ini disebabkan protein pada umumnya menyerap cahaya pada p anjang gelombang 280 nm karena adanya residu asam amino triptofan, fenilalanin, dan tirosin (Boyer, 2000). Hasil absorbansi menghasilkan lima puncak fraksi protein yang terdiri dari fraksi I (tabung ke-2 sampai ke-12), fraksi II (tabung ke-13 sampai ke- 49), fraksi III (tabung ke-50 sampai ke-61), fraksi IV (tabung ke- 62 sampai ke-72), dan fraksi V (tabung ke-73 sampai ke-100).
Gambar 2.  Hasil  purifikasi  protein  kapang  laut X.  psidii KT30  meng- gunakan kromatografi kolom DEAE Sephadex A-50

## Berat molekul berdasarkan SDS-PAGE
Hasil penentuan bobot molekul  pada fraksi  F3.1, F3.2 dan F4 menghasilkan tiga pita protein dengan prediksi berat molekul 23.99, 32.88, dan 37.30 kDa (Gambar 3). Hasil elekrophoresis menunjukkan  bahwa  purifikasi  protein  yang  dilakukan  belum optimal,  sehingga  perlu  dilakukan  pemurnian  lanjutan  dengan menggunakan metode yang lainnya.
Gambar 3.  Hasil  SDS-PAGE  (M  (marker),  CE  (protein  kasar),  F3.1 (tabung ke-53), F3.2 (tabung ke-60), F4 (tabung ke-69))
B A
Hasil Penelitian
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 7 16 32 75
150 250 500 1000 Doxo
Pr es en ta se ( % ) Konsentrasi (ppm) 24 .5 2 ± 0. 02 b 2. 27 ± 0. 15 bc 8. 03 ± 0. 13 b 1 5.8 6 ± 0.1 3 b 2 4. 74 ± 0. 3 b 8. 03 ± 0. 15 c - 14 .7 4 ± 0. 18 d -1 4. 38 ± 0. 18 b 3 2. 45 ± 0. 32 b 3. 17 ± 0. 15 c 0. 42 ± 0. 16 cd -0 .2 1 ± 0. 16 bcd 72.52 ± 0.04 a 36 .0 6 ± 0. 27 b -6 .3 4 ± 0. 15 c -1 2.6 8 ± 0.1 6 d -1 3. 74 ± 0. 18 d 19 .7 4 ± 0. 01 b - 3.5 9 ± 0.1 6 d - 14 .8 0 ± 0. 18 d -5 .9 2 ± 0. 17 d 2 2. 60 ± 0. 32 b - 3. 17 ± 0. 15 c - 10 .1 5 ± 0. 17 d -6 .3 4 ± 0. 17 d 5.71 ± 0.02 a -9 .7 3 ± 0. 17 d 3. 18 ± 0. 15 c -3 .3 8 ± 0. 16 d 24.52 ± 0.02 a 29 .3 9 ± 0. 11 b 1 5. 01 ± 0. 13 b 12 .4 7 ± 0. 14 cd
Sitotoksisitas  protein Xylaria  psidii KT30  terhadap  sel Chang dan sel HeLa
Uji sitotoksisitas dalam penelitian ini dilakukan untuk melihat tingkat sitotoksisitas ekstrak protein fraksi F3.1, F3.2, dan fraksi F4 kapang laut X. psidii KT30 terhadap sel normal (Chang) dan sel HeLa. Uji sitotoksisitas awal dilakukan terhadap sel Chang. Penelitian  resistensi  obat  kanker  menggunakan  sel  kanker dapat  digunakan  untuk  mempelajari  mekanisme  pengaturan resistensi obat-obatan untuk penyakit kanker (Arya et al. 2011). Obat  kanker  yang  digunakan  sebagai  kontrol  positif  adalah doxorubicin.  Penggunaan  doxorubicin  dilaporkan  dapat  me- nimbulkan  risiko  efek  samping  pada  jaringan  normal  terutama
jantung  serta  menekan  sistem  imun  (Wattanapitayakul et  al. 2005).
Perlakuan  konsentrasi  1000  ppm  dan  kontrol  positif (doxorubicin)  menunjukkan  hasil  yang  signifikan  terhadap presentase  inhibisi  sel  Chang  (Gambar  4).  Nilai  IC 50 semua konsentrasi  protein  ekstrak  kasar,  fraksi  F3.1,  F3.2,  dan  fraksi F4  hasil  fraksinasi  dari  kapang  laut X.  psidii KT30  pada penelitian  ini  tidak  bisa  ditentukan  karena  pada  konsentrasi ekstrak  terbesar  (1000  ppm)  tidak  menghasilkan  presentase inhibisi  >50%  terhadap  sel  Chang.  Oleh  karena  itu,  nilai  IC 50 ekstrak  protein  fraksi  terpilih  kapang  laut  terhadap  sel  Chang disimpulkan >100 ppm.
Keterangan: Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaaan nyata ( p <0.05)
Gambar 4.  Pengaruh perlakuan konsentrasi protein terhadap inhibisi sel Chang (ekstrak kasar     , fraksi F3.1      , fraksi F3.2       dan fraksi F4      )
Keterangan: Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaaan nyata ( p <0.05)
Gambar 5. Pengaruh perlakuan konsentrasi protein terhadap sel HeLa (ekstrak kasar       , fraksi F3.1       , fraksi F3.2        dan fraksi F4      )
-20 0 20 40 60 80 100 30 60 90 180
270 360 720 1080 doxo
Pe rs en ta se (% ) Konsentrasi (ppm) 4 6. 37 ± 0. 00 d 1 6. 67 ± 0. 11 a 2 6.7 7 ± 0.0 0 ab
2 6. 77 ± 0. 00 a 47 .0 1 ± 0. 01 d - 9. 64 ± 0. 02 a - 5. 35 ± 0. 02 ab 9 .3 1 ± 0.0 1 abc 51 .5 3 ± 0. 02 c - 8. 67 ± 0. 00 6 b 4 .7 0 ± 0. 03 bcd 7 .9 1 ± 0. 00 abc 5 9. 45 ± 0. 06 c 8. 15 ± 0. 14 bc 1 6. 9 ± 0. 03 b 2 1. 30 ± 0. 00 ab 5 9. 13 ± 0. 00 c 1 4. 42 ± 0. 02 bc 1 5. 98 ± 0. 01 ab
5. 77 ± 0. 04 ab 58.43 ± 0.01 c 5. 85 ± 0. 01 c 14 .0 0 ± 0. 01 cd 8 .6 0 ± 0. 01 bc 68.01 ± 0.00 a 2 2. 86 ± 0. 04 c 17 .4 6 ± 0. 00 d 1 3. 10 ± 0. 00 bc 84.33 ± 0.02 a 3 8. 22 ± 0. 04 abc 19 .9 3 ± 0. 00 a 2 4. 22 ± 0. 00 a 70.13 ± 0.00 a
Hasil Penelitian
Nilai  IC 50 semua  ekstrak  protein  fraksi  F3.1,  F3.2,  dan  F4 terhadap sel kanker serviks (HeLa) pada penelitian ini (Gambar 5)  tidak  bisa  ditentukan  karena  pada  konsentrasi  ekstrak  ter- besar (1080 ppm) tidak menghasilkan presentase inhibisi >50% terhadap  sel  HeLa.  Oleh  karena  itu,  nilai  IC 50 ekstrak  protein kapang laut X.psidii KT30 terhadap sel HeLa disimpulkan >100 ppm.  Berdasarkan National  Cancer  Institute (NCI),  nilai  ini menunjukkan aktivitas antikanker ekstrak protein hasil purifikasi X.  psidii KT30  sangat  lemah  terhadap  sel  HeLa,  sedangkan ekstrak  kasar  protein  kapang  laut X.  psidii KT30  memiliki  nilai IC 50 69.89 ppm. Ekstrak kasar dikatakan memiliki potensi yang kuat sebagai agen antikanker jika nilai IC 50 < 30 μg/mL, moderat aktif  (30  μg/mL  ≤  IC 50 <  100  μg/mL),  tidak  aktif  (IC 50 ≥  100 μg/mL) (Itharat dan Ooraikul, 2007) .
Sitotoksisitas protein fraksi F3.1, F3.2, dan F4 yang rendah terhadap  sel  HeLa  diduga  karena  fraksi-fraksi  tersebut  bukan yang  bertanggungjawab  pada  sitotoksitas  ekstrak  protein kapang  laut X.  psidi terhadap  sel  HeLa.  Kumala  (2008)  me- laporkan kapang endofit isolat 1.3.11 yang diisolasi dari Brucea javanica terbukti  bersifat  sitotoksisitas  terhadap  sel  kanker payudara MCF-7 dan T47D dengan IC 50 berturut-turut 48 μg/mL dan 68 μg/mL dan menunjukkan sinergisme dengan doxorubicin dalam pemacuan apoptosis.  Morfologi sel Chang dan sel HeLa diamati dibawah mikroskop (Gambar 6 dan 7).
Gambar 6.  Sel Chang (a) inhibisi 0%, (b) inhibisi < 50%, (c) inhibisi > 50%; 1: sel hidup, 2: sel mati
Gambar 7.  Sel HeLa (a) inhibisi 0%, (b) inhibisi < 50%, (c) inhibisi > 50%; 1: sel hidup, 2: sel mati
Bentuk  sel  Chang  dan  sel  HeLa  yang  tanpa  perlakuan tampak  melekat  pada  bagian  permukaan  tempat  tumbuh  sel, selain  itu  sel  juga  masih  berbentuk  epithelial-like  (CLS,  2013). Sedangkan  sel  Chang  dan  sel  HeLa  yang  telah  mendapat perlakuan  dan  mengalami  inhibisi  <50%  masih  tetap  sama dengan  bentuk  sel  hidup,  namun  pada  beberapa  sel  terlihat telah mengalami kerusakan. Pada sel yang mengalami inhibisi > 50% akan jelas terlihat perubahan morfologinya diantaranya sel sudah tidak lagi terlihat berkoloni dan telah terlepas dari tempat tumbuhnya. Terlepasnya ikatan antar sel dapat disebabkan oleh beberapa  faktor  diantaranya  faktor  enzimatis  seperti  enzim tripsin, protease, colagenase (Freshey, 2000).

## KESIMPULAN
Ekstrak  kasar  protein  kapang  laut Xylaria  psidii KT30 dikategorikan  senyawa  toksik  moderat  aktif  dengan  nilai  LC 50 104.9  ppm  dan  nilai  IC 50 69.89  ppm.  Analisa  protein  dengan SDS-PAGE  pada  fraksi  terpilih  mempunyai  prediksi  berat molekul 23.99, 32.88, dan 37.30 kDa. Fraksi terpilih dari kapang laut X.  psidii KT30  tidak  bersifat  toksik  terhadap  sel  Chang dengan inhibisi kurang dari 50% yang mengindikasikan ekstrak protein kapang laut aman untuk sel normal, sedangkan fraksi F4 berpotensi sebagai agen antikanker sel HeLa.
1 2 a b c
1 2 a b c
Hasil Penelitian

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Kementerian Riset  dan  Teknologi,  Program  Insentif  Riset  Sinas,  2013  (RD- 2013-0552) yang telah mendanai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Anand P, Sundaram C, Jhurani S, Kunnumakkara AB, Aggarwal BB. 2008. Curcumin and cancer an old-age disease with an age-old solution. Cancer Lett 267: 133–164. DOI: 10.1016/j. canlet.2008.03.025.
Arya V, Kashyap CP, Tikka B, Sharma S, Kumari S, Verma P, Sharma  S.  2011.  Human  cancer  cell  lines-A  brief communication. J Chem Pharm Res 3: 514-520.
Asian  Cancer.  2012.  Kanker  serviks.  http://www.asiancancer. com/indonesian/cancer-topics/cervical-cancer/  [30  Maret 2013].
Beutler  JA.  2009.  Natural  products  as  a  foundation  for  drug discovery.  Current  Protocols  Pharmacol  46:  9.11.1-9.11.21 DOI: 10.1002/0471141755.ph0911s46.
Blunt  JW,  Copp  BR,  Hu  WP,  Munro  MHG,  Northcote  PT, Prinsep MR. 2007. Marine natural products.  Nat  Prod Rep 24: 31-86. DOI: 10.1039/B603047P.
Boyer  RF.  2000.  Modern  Experimental  Biochemistry.  San Fransisco: Addison Wesley Longman Pr.
Chaeprasert S, Piapukiew J, Whalley AJS, Sihanonth P. 2010.
Endophytic fungi from mangrove plant species of Thailand: their  antimicrobial  and  anticancer  potentials.  Bot  Mar  53: 555–564. DOI: 10.1515/bot.2010.074.
Chen WL, Qian Y, Meng WF, Pang JY, Lin YC, Guan YY, Chen SP, Liu J, Pei Z, Wang GL. 2009. A novel marine compound xyloketal B protects againt oxidized LDL-induced cell injury in  vitro .  Biochem  Pharmacol  78:  941-950.  DOI:  10.1016/ j.bcp.2009.05.029.
Clay K. 2004. Fungi and the food of the gods. Nature 427: 401- 402. DOI: 10.1038/427401a.
[CLS]  Cells  Line  Service  (DE).  2013.  Chang  liver. http://www. Cells-lines-service.de/content/e3969/e4032/e4035/index_ eng.html [01 April 2013].
Cragg GM, Newman  DJ. 2009.  Nature: a vital source of  leads for  anticancer  drug  development.  Phytochem  Rev  8:  313- 331. DOI: 10.1007/s11101-009-9123-y.
Freshey IR. 2000. Culture of Animal Cells. 4 th edition. A Manual Basic Technique. New York: John Wiley and Sons Inv, Pub. Gandjar I, Sjamsuridzal W, Zoetari A. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan. 20-60. Jakarta: Yayasan Obor Indonesia.
Goyal PK. 2012. Cancer chemoprevention by natural products: current  &  future  prospects.  J  Integr  Oncol  1:  e101.  DOI: 10.4172/2329-6771.
Hasan  AEHA.  2007.  Novel  Natural  Products  from  Endophytic Fungi of Egyptian Medicinal Plants-Chemical and Biological Sharacterization. [Disertasi]. Mesir. University Dusseldorf.
Hseu YC, Chang WH, Chen, CS, Liao JW, Huang CJ, Lu FJ.,
Chia  YC,  Hsu  HK,  Wu  JJ,  Yang  HL.  2008.  Antioxidant activities  of  toona  sinensis  leaves  extracts  using  different antioxidant models. Food Chem Toxicol Food and Chemical Toxicology 46: 105–114. DOI: 10.1016/j.fct.2007.07.003.
Jemal  A,  Bray  F,  Center  MM,  Ferlay  J,  Ward  E,  Forman  D. 2011. Global cancer statistics. CA-Cancer J Clin 61: 69–90. DOI: 10.3322/caac.20107.
Joseph  B,  Priya  RM.  2011.  Bioactive  compounds  from endophytes  and  their  potential  in  pharmaceutical  effect:  a review.  American  J  Biochem  Mol  Biol 1:  291-309. DOI: 10.3923/ajbmb.2011.291.309.
[LCAG]  Lonza  Cologne  AG.  2009.  Amaxa®  Cell  Line Nucleofector®  Kit  R  for  HeLa  Cells  [ATCC®  CCL-2™]. Jerman (DE): Lonza Cologne AG.
Li  K,  Li  Q,  Zhang  T,  Han  Z,  Li  J,  Liu  Z,  Zheng  F . 2011. Procyanidins  from Pinus  koraiensis bark  inhibits  HeLa  cell growth by inducing apoptosis and reducing survivin protein expression. Afr J Biotechnol 10: 7766-7771.
Luanpitpong  S,  Chanvorachote  P,  Nimmannit  U,  Leonard  SS, Stehlik  C,  Wang  L,  Rojanasakul  Y.  2012.  Mitochondrial superoxide  mediates  doxorubicin-induced  keratinocyte apoptosis  through  oxidase  modification  of  ERK  and  Bcl-2 ubiquitination.  Biochem  Pharmacol  83:  1643-1654.  DOI: 10.1016/J.bcp.2012.03.010.
Knezevic  AH,  Dikic  D,  Lisicic  D,  Kopjar  N,  Orsolic  Knezevic, Karabeg  S,  Benkovic  V.  2011.  Synergistic  effects  of irinotecan and flavonoids on ehrlich ascites tumour-bearing mice.  Basic  Clin  Pharmacol  Toxicol  109:  343–349.  DOI: 10.1111/j.1742-7843.2011.00735.x.
Kohlmeyer  J,  Volkmann-Kohlmeyer  B.  2003.  Fungi  from  coral reefs:  a  commentary.  Mycol  Res  107:  386–387.  DOI: 10.1017/S0953756203227775.
Kumala S, Muhammad G. 2008. Isolasi dan penapisan kapang endofit  tanaman  Secang  sebagai  penghasil  senyawa antibakteri. J Ilmu Kefarmasian Indonesia 21: 15-17.
Kumaran  RS,  Muthumary  J,  Hur  BK.  2009.  Isolation  and identification  of  an  anticancer  drug,  taxol  from Phyllosticta tabernaemontanae ,  a  leaf  spot  fungus  of  an  angiosperm, Wrightia tinctoria. The J Microbiol 47: 40-49. DOI: 10.1007/ s12275-008-0127-x.
Kuno  T,  Tsukamoto  T,  Hara  A,  Tanaka  T.  2012.  Cancer chemoprevention  through  the  induction  of  apoptosis  by natural  compounds.  J  Biophys  Chem  3:  156-173.  DOI: 10.4236/jbpc.2012.32018.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nochols DE, McLaughlin  JL.  1982.  Brine  shrimp:  a  convinient  general bioassay for active plant constituents. Planta Med 45: 31-34. DOI: 10.1055/s-2007-971236.
Michael  M,  Doherty  MM.  2005.  Tumoral  drug  metabolism: overview and its implication for cancer therapy. J Clin Oncol 23: 205-229. DOI: 10.1200/JCO.2005.02.120.
Paulus  BP,  Gadek  P,  Hyde  K.  2006.  Successional  pattern  of microfungi in fallen leaves of Ficus pleurocarpa (Moraceae) in  an  Australian  tropical  rain  forest.  Biotropica  38:  42-51. DOI: 10.1111/j.1744-7429.2006.00110.x.
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Prayitno  A.  2005.  Ekspresi  Protein  p53,  Rb,  danc-myc  pada kanker serviks uteri dengan pengecatan immuno histokimia. Biodiversitas 6: 157-59.
Pongcharoen  W,  Rukachaisirikul  V,  Phongpainchit  S,  Kuhn  T, Pelzing M, Sakayaroj J, Taylor WC. 2008. Metabolites from the endophytic fungus Xylaria sp. PSU-D14. Phytochemistry 69: 1900-1902. DOI: 10.1016/j.phytochem.2008.04.003. Romero  CJ,  Barria  EO,  Arnold  AE,  Rios  LC.  2008.  Activity againts Plasmodium falciparum of lactones isolated from the endophytic fungus Xylaria sp. Pharm Biol 46: 700-703. DOI: 10.1080/13880200802215859.
Shoeb  M.  2006.  Anticancer  agents  from  medical  plants. Bangladesh  J  Pharmacol 1:  35-41.  DOI:  10.3329/bjp.
v1i2.486.
Silva GH, Oliveira CM, Teles HL, Pauletti PM, Gamboa IC, Silva DHS, Bolzani VSB, Young MCM, Neto CMC, Pfenning LH, Berlinck  RGS,  Araujo  AR.  2010.  Sesquterpenes  from Xylaria sp.  An  endophytic  fungus  associated  with Piper aduncum (Piperaceae).  Phytochem  Lett  3:  164-167.  DOI: 10.1016/j.phytol.2010.07.001.
Strobel  GA,  Daisy  B.  2003.  Bioprospecting  for  microbial endophytes  and  their  natural  products.  Microbiology  and Mol  Biol  R  67:  491–502.  DOI:  10.1128/MMBR.67.4.491- 502.2003.
Song  YX, Wang J,  Huang  H, Ma  L,  Wang J, Gu  Y, Liu L, Lin YC.  2012.  Four  eremophilane  sesquietrpenes  from  the mangrove endophytic fungus Xylaria sp. BL321. Mar Drugs 10: 340-348. DOI: 10.3390/md10020340.
Shushni MA, Mentel R, Lindequst U, Jansen R. 2009. Balticols A–F,  naphthalenone  derivatives  with  antiviral  activity,  from an Ascomycetous fungus. Chem Biodivers 6: 127–137. DOI: 10.1002/cbdv.200800150.
Tarman  K.  2011.  Biological  and  Chemical  Investigations  of Indonesian  Marine-Derived  Fungi  and  Their  Secondary Metabolites [Disertasi]. Greifswald: Universität Greifswald.
Tarman K, Lindequist U, Wende K, Porzel A, Arnold, Ludger A.
2011. Isolation of a new natural product and cytotoxic and antimicrobial activities of  extracts  from  fungi  of  indonesian marine habitats. Mar Drugs  9: 294-306. DOI: 10.3390/md9 030294.
Ustadi, Kim KY, Kim SM. 2005. Purification and identification of a protease inhibitor from glassfish  ( Liparis tanakai) eggs. J Agr Food Chem 53: 7667-7672. DOI: 10.1021/jf0482459.
Wattanapitayakul  SK,  Chularojmontri  L,  Herunsalee  A,
Charuchongkolwongse  S,  Niumsakul  S,  Bauer  JA.  2005. Screening  of  antioxidants  from  medicinal  plants  for cardioprotective  effect  against  doxorubicin  toxicity.  Basic Clin  Pharm  Toxicol  96:  80-87.  DOI:  10.1111/j.1742-7843. 2005.pto960112.x.
Wu W, Dai H, Bao L, Ren B, Lu J, Luo Y, Guo L, Zhang L, Liu H.  2011.  Isolation  and  structural  elucidation  of  proline- containing cyclopentapeptides from an endolichenic Xylaria sp. J Nat Prod 74: 1303-1308. DOI: 10.1021/np100909y.
Xu  F,  Zhang  Y,  Wang  J,  Pang  J,  Huang  C,  Wu  X,  She  Z,
Vrijmoed  LLP,  Jones  GEB,  Lin  Y.  2008.  Benzoburan derivates from the mangrove endophytic fungus Xylaria sp. J Nat Prod 71: 1251-1253. DOI: 10.1021/np070602x.
Yan HY. 2004. Harvesting drugs from the seas and how Taiwan could contribute to thiseffort. Chonghua J Med 9: 1-6.
Yin  X,  Feng  T,  Li  ZH,  Su  J,  Li  Y,  Tan  NH,  Liu  JK.  2011. Chemical investagition on the culturus of the fungus Xylaria carpophila .  Nat  Prod  Bioprospect  1:  75-80.  DOI  10.1007/ s13659-011-0011-y.
Zhang M, Zhang JJ, Adelman RA, Liu Y, Zhang MX, Lu F, Yan M.  2005.  Inhibition  of  the  human  choroidal  microvascular endothelial  cells  proliferation  by  endostatin.  Invest Ophthalmol Vis Sci 46: 3355-3360.