PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI INHIBITOR PROTEASE DARI Chromohalobacter sp. 6A3,

## BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Xetospongia testudinaria
[Purification and Characterization of Protease Inhibitor from Chromohalobacter sp. 6A3, Bacteria-associated with Sponge Xetospongia testudinaria ]
Tati Nurhayati 1) *, Maggy T. Suhartono 2) , Lilis Nuraida 2) , Sri Budiarti Poerwanto 3)
1) Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
3) Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor
Diterima 26 November 2009/ Disetujui  15 Desember 2010

## ABSTRACT
Various sponges has been reported to  produce protease inhibitor which could inhibit protease activity of pathogenic bacteria. The previous research showed that bacteria-associated with sponge could produce bioactive compound similar to their host, including protease inhibitor. The purposes of this research were to purify protease inhibitor from Chromohalobacter sp. 6A3 and to study the characteristics of the protease inhibitor. The result showed that the protein can be extracted by 30 % (v/v) acetone, purified by gel filtration (Sephadex G-75) and finally, purified by anion exchanger (Sephadex A-50). The molecular weight of the purified protease inhibitor after gel filtration was estimated as 21,31 kDa and 17,05 kDa, but anion exchanger gave protein with estimated molecular weight of 21,31 kDa The optimum temperature and pH were 30 o C and 5 respectively. The protease inhibitor could resist heating at 30 o C for 10 minutes. Incubation of the inhibitor at 30 o C, pH 5, still retained its activity until 3 hours. The purified enzyme inhibitor was also still active after incubated at pH from 5 to 6 for 1 hour. The most susceptible substrate (enzyme) for the inhibitor was protease from P. aeruginosa. The protease inhibitor was inhibited by metal ions except Na + 1mM. Activity of the inhibitor increased twofold by SDS 5 mM. IC 50 of the protease inhibitor was 3.48 nM. The protease inhibitor inhibited the enzyme uncompetitively.
Key words : c hromohalobacter, protease inhibitor, sponge

## PENDAHULUAN
1
Bakteri patogen dalam menjalankan aksinya menggunakan beberapa  cara,  yang  dikenal  dengan  istilah  faktor  virulensi, antara  lain  dengan  protease.  Mengingat  pentingnya  protease dalam  mekanisme  penyebab  penyakit  maka  dalam  dasawarsa terakhir ini perhatian terhadap protease sebagai target senyawa obat  bagi  penyakit  asal  bakteri  (seperti  pneumonia,  kolera, typhus , gonorrhoe) ,  virus  (seperti  influenza  dan  HIV),  dan malaria  serta  kanker,  bahkan  penyakit  degeneratif  seperti Alzheimer meningkat pesat. Saat ini sudah banyak obat-obatan yang mekanisme kerjanya menghambat kerja protease. Namun peneliti  terus  melakukan  penelitian  untuk  mencari  inhibitor protease alami dari berbagai sumber seperti bakteri, fungi, juga organisme  laut,  seperti  spons,  tunikata  dan  lain-lain.  Diantara organisme  laut  yang  ada,  spons  merupakan  penghasil komponen  bioaktif  terbanyak  (Mayer  dan  Lehmann  2000), termasuk  di  dalamnya  senyawa  inhibitor  enzim  (Lee et  al., 2001).
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  bakteri  yang berasosiasi  dengan  spons  juga  menghasilkan  komponen bioaktif (Webster et al ., 2001). Hal ini dimungkinkan mengingat jumlah  antara  koloni  bakteri  dan  cyanobacteria  yang  ada  di spons,  terutama Aplysina  aerophoba, bisa  mencapai  40%  dari
*  Korespondensi penulis : E-mail : nurhayati7870@yahoo.com
biomasa  spons  (Ahn et  al., 2003).  Mikroorganisme  tersebut membentuk suatu simbiotik dengan spons baik di dalam inti sel, di dalam sel, di dalam spons, maupun di luar spons. Hubungan simbiotik ini bisa dilakukan mengingat spons merupakan hewan yang  makan  dengan  cara  menyaring  makanan  dan  dikenal dengan istilah filter feeder , dalam hal ini mikroorganisme dapat menjadi nutrisi bagi spons.
Lee et  al. (2001)  melaporkan  bahwa  metabolit  yang dihasilkan  oleh  spons  merupakan  hasil  biosintesis  simbionnya sehingga  kemungkinan  bahwa  spons  mengandung  komponen bioaktif yang sama dengan simbionnya sangat besar.  Sebagai contoh Micrococcus sp.  menghasilkan  komponen  diketopi- perazin,  yang  sebelumnya  telah  dilaporkan  dihasilkan  oleh spons  inangnya  yaitu Tedania  ignis (Stierle et  al .,  1988) . Simbion bakteri yang  lain, yaitu Vibrio sp. memproduksi bifenil eter bromina, yang juga dihasilkan oleh inangnya yaitu Dysidea sp. (Elyakov et al., 1991). Simbiotik Vibrio sp. menghasilkan komponen bioaktif berupa peptida  yang  bersifat  anti  Bacillus  yang  juga  dihasilkan  oleh inangnya yaitu ekstrak spons Hyatella sp. (Oclarit et al ., 1994). Flowers et  al. (1998)  melaporkan  bahwa  simbion  spons Oscillatoria  spongeliae ,  mengandung  senyawa  diketopiperazin klorina  yang  juga  dihasilkan  oleh  inangnya,  yaitu Dysidea herbacea .
Informasi  tersebut  menunjukkan  bahwa  sudah  cukup banyak simbion spons yang teridentifikasi positif menghasilkan komponen  bioaktif  yang  sama  dengan  inangnya,  diantaranya
adalah  inhibitor  protease  berupa  protein  yang  dihasilkan  oleh simbion  spons Xetospongia  testudinaria ,  yaitu Chromohalo- bacter sp. 6A3 (Nurhayati et al., 2006).
Aktivitas  komponen  bioaktif,  termasuk  inhibitor  protease, umumnya  menjadi  lebih  aktif  jika  berada  dalam  kondisi  murni. Oleh  karena  itu  penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan  untuk memurnikan  dan  mengkarakterisasi  inhibitor  protease  dari Chromohalobacter sp. 6A3 yang bersifat halofilik (masih dapat hidup  pada  konsentrasi  NaCl  50  %).  Disamping  itu  dalam rangka memanfaatkan potensi yang ada di perairan Indonesia, khususnya  di  Laut  Kepulauan  Seribu,  serta  dalam  rangka menyediakan  produk  biomedis  alamiah  (inhibitor  enzim)  yang terkarakterisasi  dengan  baik  dan  berpotensi  komersial  tinggi, maka  penelitian  untuk  menemukan  inhibitor  protease  yang murni merupakan suatu langkah awal yang baik.

## METODOLOGI

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  meliputi bakteri  penghasil  protease,  yaitu Pseudomonas  aeruginosa , yang  diperoleh  dari  Rumah  Sakit  Pusat  Pertamina,  Jakarta; serta Chromohalobacter sp.  6A3,  bakteri  yang  diisolasi  dari spons Xetospongia  testudinaria sebagai  penghasil  inhibitor protease.

## Produksi inhibitor protease
Media  yang  digunakan  terdiri  atas special  peptone 0,5  % (w/v), yeast extract 0,1 % (w/v), trace element 0,2 % (v/v), NaCl 2  %  (w/v),  glukosa  0,05  %  (w/v).  Tahap  propagasi  dilakukan pada suhu 30 o C dengan kecepatan 150 rpm hingga mencapai fase  logaritmik.  Setelah  itu  dilakukan  kultivasi  selama  12  jam pada kondisi yang sama.
Ekstrak  kasar  didapatkan  dengan  cara  melakukan sentrifugasi  terhadap  sampel  yang  diambil  pada  kecepatan 8.000  rpm  selama  15  menit.  Analisis  terhadap  ekstrak  kasar meliputi  penentuan  konsentrasi  protein  (metode  Bradford) (Hammond  dan  Kruger,  1988),  dan  aktivitas  inhibitor  protease (modifikasi  Imada et  al .,  1985c  diacu  dalam  Nurhayati et  al., 2006). Sebagai substrat digunakan protease dari P. aeruginosa yang diproduksi menurut Baehaki et al. (2008).

## Pemurnian inhibitor protease

## Ekstraksi inhibitor protease
Ekstrak kasar selanjutnya diekstraksi menggunakan aseton dan  ammonium  sulfat  (NH 4 ) 2 SO 4 .  Konsentrasi  aseton  yang ditambahkan 20-60 % (v/v), sedangkan konsentrasi ammonium sulfat  yang  ditambahkan  adalah  50-80  %  kejenuhan  (w/v). Proses  ekstraksi  dilakukan  pada  suhu  di  bawah  4 o C.  Ekstrak kasar yang sudah diendapkan dengan dua jenis bahan tersebut, selanjutnya disimpan selama 1 malam pada suhu 4 o C. Tahap selanjutnya  adalah  sentrifugasi  pada  suhu  4 o C,  kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit.
Pengamatan  meliputi  penentuan  konsentrasi  protein (mg/ml)  dan  aktivitas  inhibitor  protease  (U/ml)  (Imada,  1985c) baik pada supernatan maupun pada pelet.

## Pemurnian inhibitor protease
Inhibitor protease hasil pengendapan dipekatkan 100x agar memenuhi  persyaratan  konsentrasi  protein  minimum  untuk dapat  dimurnikan  dengan  kolom  kromatografi.  Pemurnian dilakukan 2 tahap, tahap pertama menggunakan metode filtrasi gel  dan  tahap  kedua  menggunakan  penukar  ion.  Pemurnian dengan  filtrasi  gel  dilakukan  dengan  bahan  pengelusi  yaitu bufer TrisHCl pH 5, sedangkan matriknya adalah Sephadex G- 75.  Fraksi  dengan  aktivitas  tinggi  dikumpulkan  untuk selanjutnya dimurnikan dengan  penukar ion.  Konsentrasi NaCl yang  digunakan  adalah  0,6  M.  Matrik  yang  digunakan Sephadex  A-50.  Masing-masing  fraksi  diuji  konsentrasi  protein (mg/ml) dengan metode Bradford dan aktivitasnya diuji dengan metode Imada et al. (1985c).

## Karakterisasi inhibitor protease
Karakterisasi dasar inhibitor protease
Karakterisasi  dasar  inhibitor  protease  meliputi  penentuan suhu optimum (10-70 o C dengan interval 10 o C), pH optimum (3- 12), kestabilan panas (10-70 o C dengan interval 10 o C selama 10  menit),  kestabilan  panas  pada  kondisi  optimum  (suhu  dan pH  optimum  selama  8  jam  dengan  interval  waktu  1  jam), ketahanan pH (3-12 dengan interval 1 selama 1 jam pada suhu 30 o C), pengaruh berbagai substrat (protease E. coli, S. aureus, S. epidermidis, A. hydrophilla, Listeria spp., dan P. aeruginosa ), dan  pengaruh  ion  logam  terhadap  aktivitas  inhibitor  protease (ion  logam  yang  digunakan  berasal  dari  garam  NaCl,  KCl, CaCl 2 , MgCl 2 , ZnCl 2 , dan FeCl 3 .6H 2 O dengan konsentrasi 1 dan 5  mM).  Pada  analisis  ini  aktivitas  inhibitor  protease  setelah diberi  perlakuan  diukur  aktivitasnya  sesuai  prosedur  Imada et al . (1985c) yang diacu dalam Nurhayati et al. (2006).
Penentuan IC 50 inhibitor protease Definisi IC 50 adalah besarnya konsentrasi inhibitor protease yang  dapat  menghambat  aktivitas  protease  sebesar  50  %. Analisis ini dilakukan dengan  assay aktivitas inhibitor protease menggunakan  substrat  (protease  dari P.  aeruginosa )  pada konsentrasi  protein  inhibitor  protease  yang  bervariasi. Prosentase  (%)  penghambatan  dihitung  menurut  Imada et  al. (1985c).

## SDS PAGE dan zimogram inhibitor protease
Penentuan  bobot  molekul  dilakukan  menggunakan  SDS PAGE (Laemmli, 1970). Konsentrasi akrilamid yang digunakan dalam  analisis  ini  adalah  10  %  (w/v).  Pewarnaan  yang digunakan  adalah  pewarnaan  perak.  Pada  penelitian  ini digunakan  marker  (penanda)  dengan  bobot  molekul  yang berbeda, yaitu meliputi phosphorilase b ( rabbit muscle ) berberat molekul  97  kDa,  albumin  ( bovine  serum )  66  kDa,  ovalbumin ( chicken  egg  white )  45  kDa, carbonic anhidrase  ( bovine erythrocyte ) 30 kDa, tripsin inhibitor ( soybean ) 20,1 kDa, dan α- lactalbumin ( bovine milk ) 14,4 kDa.
Zimogram  yang  digunakan  untuk  melihat  penghambatan adalah  menggunakan  modifikasi  metode  Granelli-Pipemo  dan Reich (1978). Perbedaan antara zimogram dengan SDS PAGE adalah pada gel akrilamid ditambah substrat kasein 2 % (w/v). Enzim  protease  direaksikan  dengan  inhibitor  protease  dengan berbagai  konsentrasi.  Pewarna  yang  digunakan  untuk keperluan ini adalah coomassie brilliant blue .
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142434445464748495051525354 A kt iv it as in h ib it o r p ro te as e (U /m l) A 2 80 n m No fraksi

## Penentuan model penghambatan
Model  penghambatan  aktivitas  protease  oleh  inhibitor ditentukan  dengan  melakukan  variasi  substrat  (kasein),  yaitu 0,75-3,0 % (w/v) dengan interval 0,25. Dengan melakukan plot antara  1/[S]  dengan  1/v,  maka  akan  didapatkan  nilai  K m dan V maks . Nilai ini akan menentukan model penghambatan inhibitor terhadap protease (Copeland, 2005).

## Mekanisme penghambatan
Penentuan  mekanisme  penghambatan  inhibitor  protease dilakukan  dengan  cara  mengamati  pertumbuhan  bakteri P. aeruginosa dalam  media  LB  yang  ditambahkan  inhibitor protease  pada  konsentrasi  berbeda.  Pada  penentuan  ini terdapat  kontrol,  yaitu  dalam  kultur  bakteri  tersebut  tidak ditambahkan  inhibitor  protease.  Pengamatan  dilakukan  1  jam sekali  sampai  pengamatan  kelima,  selanjutnya  diamati  tiap  30 menit  selama  9,5  jam.  Analisisnya  meliputi  OD  dan  aktivitas protease (Bergmeyer et al., 1983).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Ekstraks inhibitor protease
Pada  penelitian  ini  digunakan  2  bahan  pengekstrak,  yaitu amonium sulfat (50-80 % kejenuhan) dan aseton (20-60 % v/v). Berdasarkan hasil penelitian seperti disajikan pada Tabel 1 dan 2  dapat  dilihat  bahwa  ekstraksi  inhibitor  protease  dapat dilakukan baik dengan amonium sulfat maupun aseton, namun aktivitas spesifiknya jauh lebih tinggi bila menggunakan aseton.
Berdasarkan  Tabel  1  dapat  diketahui  bahwa  konsentrasi optimum  untuk  mengendapkan  inhibitor  protease  dengan amonium  sulfat  adalah  50  %  kejenuhan,  dengan  nilai  aktivitas spesifik  153,085  U/mg  dan  rendemen  sebesar  692,978  %. Pengendapan  dengan  aseton,  maksimum  pada  konsentrasi aseton  30  %  (v/v)  dengan  aktivitas  spesifik  sebesar  211,951 U/mg  dan  rendemen  sebesar  959,45  %  (Tabel  2).  Dengan demikian ekstraksi yang paling baik adalah dengan aseton 30 % (v/v).  Ini  berarti  bahwa  inhibitor  protease  dapat  diekstrak dengan baik dengan memanfaatkan sifat yang tidak saling larut antara aseton (nonpolar) dan molekul air (polar).
Penambahan  aseton  ke  dalam  larutan  protein  akan mengurangi  kelarutan  air  terhadap  residu  hidrofilik  inhibitor protease,  sehingga  terjadi  penurunan  konstanta  dielektrikum pelarut.  Posisi  air  disekitar  daerah  hidrofobik  dari  permukaan protein akan digantikan oleh pelarut aseton dan  segera terjadi interaksi  hidrofobik.  Pada  pengendapan  dengan  aseton,
peristiwa  pengendapan  terjadi  karena  adanya  interaksi elektrostatik antara muatan yang berlawanan pada permukaan protein.  Interaksi  itu  akan  menyebabkan  protein  berada  pada kondisi  isoelektrik,  kemudian  beragregasi  dan  akhirnya mengendap.  Pengendapan  dengan  aseton  ini  biasa  dilakukan untuk  mengisolasi  protein  yang  kaya  akan  residu  hidrofobik yang lokasinya di sekitar membran (Scopes, 1987).
Tabel 1. Pengendapan inhibitor protease dengan amonium sulfat
% kejenuhan Aktivitas inhibitor (U/ml) Konsentrasi protein (mg/ml) Aktivitas spesifik inhibitor (U/mg) Yield (%) 0% 1,94 0,088 22,091 100,0 50% 14,39 0,094 153,085 692,9 60% 16,92 0,150 113,177 512,3 70% 24,00 0,198 121,212 548,7 80% 12,62 0,216 58,426 264,5 Tabel 2. Pengendapan inhibitor protease dengan aseton % aseton Aktivitas inhibitor (U/ml) Konsentrasi protein (mg/ml) Aktivitas spesifik inhibitor (U/mg) Yield (%) 0% 1,944 0,088 22,091 100,0 20% 6,56 0,077 85,195 385,7 30% 17,38 0,082 211,951 959,5 40% 12,93 0,088 146,932 665,1 50% 10,72 0,094 114,043 516,2 60% 8,47 0,103 82,184 372,0

## Pemurnian inhibitor protease dengan kolom kromatografi
Pemurnian  inhibitor  protease  dilakukan  dengan  2  tahap, tahap pertama filtrasi gel menggunakan matrik Sephadex G-75 dan  tahap  kedua  penukar  ion  menggunakan  matrik  Sephadex A-50.
Prinsip  pemurnian  dengan  filtrasi  gel  adalah  pemisahan protein  berdasarkan  ukuran  partikel.  Ada  berbagai  macam matrik  yang  digunakan  untuk  keperluan  ini,  diantaranya Sephadex G-75. Melalui teknik ini diharapkan inhibitor protease akan  terpisah  dengan  baik  berdasarkan  ukuran  partikel (Jahnsen dan Ryden, 1998).
Hasil pemurnian dengan filtrasi gel disajikan pada Gambar 1.  Berdasarkan  grafik  tersebut  dapat  dilihat  bahwa  terdapat  1 puncak  aktivitas  inhibitor  protease  yaitu  pada  fraksi  7,  dengan fraksi  aktif  pada  fraksi  5-8.  Fraksi  7  mempunyai  aktivitas inhibitor  sebesar  15  U/ml.  Pada  fraksi  tersebut  konsentrasi protein sebesar 0,0089 mg/ml.
Gambar 1.  Pemurnian inhibitor protease menggunakan filtrasi gel -●- aktivitas inhibitor protease (U/ml), -■- konsentrasi protein (mg/ml)
Fraksi  aktif  (fraksi  5-8)  dicampur,  selanjutnya  dimurnikan lebih lanjut dengan kromatografi penukar ion. Fase bergeraknya adalah  buffer  TrisHCl,  sedangkan  fase  diamnya  adalah  DEAE Sephadex  A-50.  Selain  itu  juga  digunakan  NaCl  bergradien  0- 0,5 M. Penukar ion ini mempunyai matrik Sephadex G-50, dan gugus  fungsional  DEAE.  Bila  menggunakan  penukar  ion tersebut, ikatan terbesar yaitu ketika kekuatan ioniknya rendah dan  akan  menyusut  menjadi  0,5  volume  ketika  kekuatan  ion meningkat dari 0,01 menjadi 0,5M (Jahnsen dan Ryden, 1998).
Hasil  pemurnian  inhibitor  protease  dengan  kromatografi penukar  ion  disajikan  pada  Gambar  2.  Berdasarkan  gambar tersebut  dapat  dilihat  bahwa  terdapat  2  puncak,  puncak pertama  berada  pada  fraksi  2  dan  3  dengan  aktivitas  yang rendah  yaitu  sebesar  4,512  dan  4,923  U/ml,  sementara  itu puncak kedua berada pada fraksi 6-10 dengan puncak tertinggi pada fraksi 7 dengan aktivitas inhibitor sebesar 11,520 U/ml dan konsentrasi protein sebesar 0,0018 mg/ml.
Gambar 2.  Pemurnian  inhibitor  protease  menggunakan  penukar  ion ▲  OD  280  nm;  ●  aktivitas  inhibitor  protease  (U/ml);  ♦ gradien NaCl (% w/v).
Peningkatan  aktivitas  inhibitor  protease  pada  berbagai tahapan pemurnian disajikan pada Tabel 3. Ekstrak kasar yang dihasilkan mempunyai aktivitas spesifik sebesar adalah 90,546 U/mg. Ekstrak kasar selanjutnya diendapkan dengan aseton 30 % (w/v) yang dilarutkan dengan buffer pH 5. Endapan tersebut mempunyai  spesifik  sebesar  1.176,5  U/mg  dengan  kelipatan pemurnian 12,99 kali.
Endapan  selanjutnya  dimurnikan  dengan  Sephadex  G-75 sehingga  diperoleh  aktivitas  spesifik  sebesar  1.278,5  U/mg dengan kelipatan pemurnian 14,12 kali. Tahap akhir pemurnian adalah dengan penukar ion. Hasilnya menunjukkan peningkatan aktivitas  spesifik  yang  cukup  tinggi,  yaitu  menjadi  6.400  U/mg dengan kelipatan pemurnian 70,68 kali.
Imada et  al .  (1985a)  memurnikan  inhibitor  protease  dari Alteromonas sp.  jenis  monostatin  menggunakan  Sephadex  G- 100 dengan aktivitas spesifik 355,56 U/mg. Imada et al. (1986) berhasil  memurnikan  jenis  inhibitor  protease  yang  lain (marinostatin) dari bakteri yang sama. Setelah melalui beberapa
tahap  pemurnian  didapatkan  4  jenis  marinostatin,  yaitu marinostatin  B-1  (1.304,33  U/mg),  marinostatin  B-2  (2.206,80 U/mg), marinostatin C-1 (3.697,78 U/mg), dan marinostatin C-2 (3.408,89  U/mg).  Kim et  al .  (1995)  telah  berhasil  memurnikan inhibitor  protease  dari Serratia  marcescens melalui  beberapa tahap  pemurnian.  Pada  tahap  akhir  pemurniannya  dengan superose 6HR menghasilkan inhibitor protease dengan aktivitas spesifik  6.096  U/mg.  Sepcic et  al. (1997)  melaporkan  bahwa inhibitor  kolinesterase  berhasil  dimurnikan  dengan  kelipatan kemurnian  85,3  kali  dan  aktivitas  inhibitor  murni  mempunyai aktivitas spesifik 705 U/mg.

## Karakteristik inhibitor protease

## Karakteristik dasar inhibitor protease
Karakteristik  inhibitor  protease  isolat  6A3  dan  beberapa inhibitor protease lainnya disajikan pada Tabel 4. Tabel tersebut menunjukkan  bahwa  beberapa  inhibitor  protease  yang  dihasil- kan oleh mikroorganisme, mempunyai sifat serin metaloprotea- se (inhibitor asal isolat 6A3), thiol protease (inhibitor monostatin asal Alteromonas sp.), serin protease (inhibitor marinostatin asal Alteromonas sp.)  serta  metaloprotease  (inhibitor  asal S. marcescens dan Streptomyces sp.).
Senyawa tersebut mempunyai berat molekul tinggi (>10 kD) dan  beberapa  berberat  molekul  rendah  (<10kD),  mempunyai suhu optimum berkisar 20-30 o C, bekerja pada kisaran pH yang luas.
Inhibitor  protease  dari  isolat  6A3  dihambat  oleh  beberapa logam  namun  diaktifkan  oleh  satu  logam,  yaitu  Na + .  Masing- masing  inhibitor  protease  mempunyai  spesifisitas  substrat tertentu,  seperti  inhibitor  protease  dari  isolat  6A3  mempunyai substrat  spesifik,  yaitu  protease  dari P.  aeruginosa. Hal  ini dapat  dihubungkan  dengan  kekerabatan  yang  cukup  dekat antara Chromohalobacter sp.  dengan Pseudomonas sp.  yang digambarkan  dengan  pohon  filogenetik  dan  berdasarkan  uji kemiripan  DNA  antara  keduanya  menunjukkan  nilai  92  % (Nurhayati et al., 2006).
Umumnya suatu bakteri dapat menghambat bakteri lain jika masih  dekat  jenisnya.  Ternyata  ini  berlaku  pada  inhibitor protease  yang  dapat  menghambat  protease  yang  berasal  dari bakteri yang mempunyai kekerabatan yang dekat.

## Potensi  inhibitor  protease  dibandingkan  dengan  inhibitor komersial
Potensi  suatu  inhibitor  protease  dari  isolat  6A3  dapat dilakukan  dengan  cara  membandingkan  dengan  inhibitor komersial, dalam hal ini ethylene diamin tetra acetic (EDTA) dan phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF) pada konsentrasi 1 mM dan  5  mM.  Sementara  itu  konsentrasi  inhibitor  protease  dari 6A3 adalah 5x10 -4 mM.
Tabel 3.  Peningkatan aktivitas inhibitor protease pada berbagai tahapan pemurnian Tahap pemurnian Volume (ml) Protein (mg/ml) Aktivitas Inhibitor (U/ml) Total Protein (mg) Total Aktivitas (U) Akt. Spes. (U/mg) Yield (%) Kelipatan pemurnian Ekstrak kasar 1000 l 0,0641 5,804 64,1 5.804 90,546 100 1 Aseton 45 0,0520 61,18 2,34 2.753,1 1.176,5 47,43 12,99 Filtrasi gel 3 0,0089 11,336 0,0266 34,008 1.278,5 0,586 14,12 Penukar ion 2 0,0018 11,52 0,0036 23,04 6,4 0,397 70,68
Gr ad ien N aC l ( M )
Hasil pengujian menunjukkan bahwa inhibitor protease dari isolat  6A3  mempunyai  aktivitas  penghambatan  terhadap protease P.  aeruginosa 10.000-20.000x  dibandingkan  dengan PMSF,  dan  5.000-10.000x  dibandingkan  dengan  EDTA.  Data mengenai  potensi  inhibitor  protease  dari  isolat  6A3 dibandingkan dengan EDTA dan PMSF disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5.  Perbandingan  aktivitas  inhibitor  protease  dari  isolat  6A3
dengan PMSF dan EDTA No  Jenis inhibitor Konsentrasi inhibitor Aktivitas inhibitor (U/ml) 1 Inhibitor 6A3 0,5 µM 5,008 2 EDTA 1 mM 9,574 5 mM 10,538 3 PMSF 1 mM 5,141 5 mM 5,012 IC 50 inhibitor protease
Inhibitory  concentration (IC) 50 artinya  adalah  konsentrasi inhibitor  yang  dapat  menghambat  enzim  sebesar  50  % (Takasaki et al ., 2004). Gambar 3 digunakan untuk menghitung IC 50 pada inhibitor hasil filtrasi gel.
Hasil perhitungan menunjukkan persamaan Y = 53,522 X + 10,949;  dimana  Y  adalah  %  penghambatan,  sedangkan  X adalah  konsentrasi  protein  inhibitor  yang  dapat  menghambat protease.  Berdasarkan  persamaan  itu  maka  didapatkan penghambatan  50%  berada  pada  konsentrasi  73  ng/ml  atau 3,48 nM.
Inhibitor  protease  jenis  antileukoprotease  mempunyai  nilai IC 50 9,5 nM. Inhibitor protease HIV-1 yaitu KNI 122 mempunyai nilai  IC 50 100nM,  sementara  inhibitor  HIV-1,  yaitu  SP346, mempunyai nilai IC 50 600 nM (Zoilner, 1993). Inhibitor  yang  dihasilkan  oleh Chromohalobacter sp. QS3666 mempunyai nilai IC 50 kurang dari 0,4 µM. Baum et al . (2001) melaporkan inhibitor enzim yang dihasilkan oleh E. coli mempunyai  nilai  IC 50 0,2-0,9  µM  dalam  menghambat  enzim MurA yang diperlukan untuk biosintesis dinding sel.
Spons  laut  jenis Halicondria sp.  menghasilkan  inhibitor fosfatase  dengan  nilai  IC 50 sebesar  0,1-0,5  nM  terhadap
fosfatase rantai terang dari miosin yang terfosforilasi, dan 1 nM terhadap  fosfatase polycation-modulated (Bialojan  dan  Takai, 1988).
Inhibitor  HIV  reverse  transcriptase  yang  dihasilkan  oleh sponge  laut Irchinia sp.  ada  2  jenis  yaitu  2-hexaprenilhidro- kuinon  (HPH)  yang  menunjukkan  penghambatan  yang  umum terhadap  HIV  reverse  transcriptase  (HIV1,  HIV2  dan  virus leukemia murin) dengan nilai IC 50 0,8-11 µM dan mHPH (HPH yang  termetilasi)  dengan  nilai  IC 50 7,1-105  µM  (Loya et  al., 1997).
Gambar 3. Penentuan IC 50 inhibitor protease murni
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  diketahui  bahwa konsentrasi penghambatan sebesar 50 % pada hasil filtrasi gel mempunyai  nilai  yang  jauh  lebih  kecil  dibandingkan  dengan ekstrak kasar. Ini menunjukkan bahwa pemurnian menurunkan konsentrasi  yang  digunakan  untuk  menghambat  aktivitas protease, dalam hal ini protease P. aeruginosa .

## Bobot molekul inhibitor protease
Penentuan  bobot  molekul  dilakukan  dengan  teknik  SDS PAGE  ( Sodium  dedocyl  sulphates-polyacrylamide  gel  electro- phoresis ) menggunakan metode Laemlli (1970) dengan metode pewarnaan  perak.  Hasil  penentuan  bobot  molekul  disajikan pada Gambar 4 dan 5.
Tabel 4. Karakteristik umum inhibitor protease isolat 6A3 dan beberapa inhibitor protease lainnya
Karakteristik Isolat 6A3 Serratia marcescens 1 Alteromonas sp. Streptomyces sp. 4 Jenis inhibitor Inhibitor serin metallo protease SMPI Monostatin 2 Marinostatin 3 FMPI Suhu optimum 30 o C 20 o C 25 o C pH optimum 5 TD TD TD TD Kisaran pH 3-8 3-12 2-12 2-10 >11 Stabilitas panas 50 o C, 10 menit 60 o C, 30 menit 80 o C, 10 menit TD Stabilitas panas pada kondisi optimum 5 jam, 30 o C 85 o C 100 o C, 30 menit TD TD Kestabilan pH pada suhu optimum 5-6 3-12, 1 jam TD 4-6, 10 menit >11 Pengaruh logam Diaktifkan oleh Na + 1
mM, dihambat K + , Ca 2+ , Zn 2+ , Mg 2+ , Fe 3+
Tidak dihambat Zn 2+
Dihambat oleh Cu 2+ , Fe 2+
Dihambat Co 2+ dan Fe 2+ TD Spesifisitas substrat Protease P. aeruginosa Spesifik terhadap SMP Thiol protease (papain, ficin) α- chymotrypsin metalloprotease
1 Kim et al. (1995), 2 Imada et al. (1985a), 3 Imada et al. (1985b), 4 Murao et al . (1982)
y = 53,522x + 10,949 R² = 0,9941 0 20 40 60 80 100 0 0,5 1 1,5 2 Konsentrasi protein (x10-4 mg/ml) % P en gh am ba ta n
17,05 kD 97 kD 45 kD 30 kD 20,1kD 14,4kD 21,31kD M                  1              2          3           4             5          6           7
Gambar 4.  Elektroforesis  I:  (M)  Marker,  (1) Crude  extract ,  (2) Pengendapan  aseton, (3) Freeze drying , (4) Filtrasi gel ,
(5) Filtrasi gel 2, (6) Filtrasi gel 3
Gambar 5.   Elektroforesis  III:  (M)  Marker,  (1-2)  Filtrasi  gel,  (3-7) penukar ion
Berdasarkan  Gambar  4,  nampak  bahwa  inhibitor  protease masih  mempunyai  banyak  pita  (8  buah),  yang  berarti  bahwa masih  banyak  molekul  yang  terdapat  disini,  termasuk  pula protein  yang  berasal  dari  sel  dan  protein  pengotor  lainnya. Setelah  mengalami  pengendapan  terdapat  pemekatan  yang ditandai  oleh  tebalnya  pita.  Ketebalan  pita  menunjukkan konsentrasi  protein  yang  tinggi.  Proses  pemurnian  dengan filtrasi gel banyak menghilangkan protein sehingga yang tersisa adalah  protein  inhibitor  yang  lebih  murni.  Ini  ditandai  dengan jumlah  pita  pada  hasil  elektroforesis  yang  berjumlah  2  buah (Gambar  5).  Tingkat  kemurnian  yang  paling  tinggi  didapatkan setelah inhibitor protease dimurnikan dengan penukar ion, pita yang dihasilkan hanya 1 buah dengan bobot molekul 21,31 kDa (Gambar  6).  Inhibitor  ini  termasuk  dalam  inhibitor  berbobot molekul tinggi (Aoyagi dan Takeuchi, 1989).
Alteromonas sp  menghasilkan  2  jenis  inhibitor  yaitu monostatin  dan  marinostatin.  Monostatin  merupakan  inhibitor berbobot  molekul  tinggi  yaitu  20  kD  (Imada et  al., 1985a), sedangkan marinostatin merupakan inhibitor protease berbobot molekul  rendah  yaitu  1,7  dan  0,1  kD  (Imada et  al., 1985b). Spons laut Reniera sarai menghasilkan inhibitor kolinesterase 2 jenis  yaitu  yang  mempunyai  bobot  molekul  rendah  (5,52  kD) dan  berbobot  molekul  tinggi  (18,9  kD)  (Sepcic et  al., 1997). Green  Fluorescent  Protein (GFP)  yang  berasal  dari  ubur-ubur Aequorea victoria dilaporkan mempunyai bobot molekul 27 kDa
(Li et  al. 1997),  hampir  sama  dengan  bobot  molekul  inhibitor protease dari isolat 6A3.
Gambar 6.  Zimogram  inhibitor  protease:  sumur  1  dan  4  (kontrol); sumur 2 dan 5 (hasil pengendapan asetón); sumur 3 dan 6 (inhibitor protease hasil pengendapan aseton; sumur  7 (hasil  filtrasi  gel);  sumur  8  (hasil ion  exchange ).
Keterangan:  M  (Marker);  konsentrasi  protein  inhibitor protease (µg) 0 (sumur 1); 0,202 (sumur 2); 1,110 (sumur
3) ; 0(sumur 4); 0,202 (sumur 5); 1,110 (sumur 6); 0,050 (sumur 7); dan 0,011 (sumur 8)

## Zimogram inhibitor protease
Berdasarkan  Gambar  6  dapat  dilihat  perbedaan penghambatan  oleh  inhibitor  protease  hasil  pengendapan aseton  terhadap  aktivitas  protease P.  aeruginosa pada konsentrasi  protein  yang  berbeda  (0,202  µg  dan  1,110  µg)  . Semakin  tinggi  konsentrasi  protein  yang  digunakan,  maka semakin  besar  penghambatannya.  Pada  sumur  7  digunakan inhibitor  hasil  filtrasi  gel  (konsentrasi  protein  0,05  µg), sedangkan  pada  sumur  8  digunakan  inhibitor  protease  hasil pemurnian dengan ion exchange (konsentrasi protein 0,01 µg). Pada  konsentrasi  tersebut  sudah  menghambat  aktivitas protease P. aeruginosa .

## Model penghambatan
Secara  kimiawi,  suatu  inhibitor  tidak  dapat  dibedakan  dari aktivator.  Setelah  bereaksi  dengan  enzim,  baru  diketahui keadaannya.  Aktivator,  berikatan  dengan  enzim  dan menyebabkan  kenaikan  kecepatan  reaksi  enzim,  sedangkan inhibitor, berikatan dengan enzim dan menyebabkan penurunan kecepatan reaksi.
Ikatan inhibitor dengan enzim dapat mengubah kemampuan enzim  dalam  mengikat  substrat,  dan  karenanya,  mengubah kemampuan daya katalisator enzim. Hal ini disebabkan karena struktur  enzim  yang  sudah  berikatan  dengan  inhibitor mengalami  perubahan  fisik  dan  kimiawi  sedemikian  rupa, sehingga, aktivitas hayatinyapun menjadi berubah (terhambat).
Umumnya  dikenal  tiga  jenis  penghambatan,  yakni penghambatan  kompetitif,  non  kompetitif,  dan  unkompetitif. Penghambatan  kompetitif  terjadi  karena  struktur  inhibitor menyerupai  struktur  substrat,  sehingga  masing-masing  akan bersaing  untuk  berikatan  dengan  enzim.  Keadaan  ini  ditandai dengan V maks yang dicapai sama, namun nilai K m berbeda, yakni lebih  besar.  Pengaruh  inhibitor  dapat  dihilangkan  dengan meningkatkan konsentrasi substrat.
30 kD 21,31 kD 97 kD 45 kD 20,1kD 14,4kD

## M                   1               2            3             4             5            6
M                 1                          2               3               4             5          6        7          8
Pada  penghambatan  non  kompetitif,  inhibitor  akan menurunkan nilai V maks tanpa mengubah nilai K m substrat yang berikatan  dengan  enzim.  Struktur  inhibitor  berbeda  dengan substrat.  Pengikatannya  dengan  enzim  terjadi  di  luar  sisi aktifnya. Penghambatan unkompetitif menyebabkan perubahan nilai K m dan V maks .
Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim yang ditambah dengan inhibitor mempunyai kecepatan maksimum 0,0488 U/ml, dan  nilai  K m 0,3687,  sedangkan  enzim  yang  tidak  ditambah inhibitor mempunyai kecepatan maksimum 0,098 U/ml, dengan nilai  K m 1,  503.  Berdasarkan  data  tersebut  dapat  disimpulkan bahwa  inhibitor  tersebut  termasuk  ke  dalam  golongan unkompetitif,  karena  inhibitor  mempunyai  kemampuan  untuk mengubah  nilai  K m dan  V maks .  Secara  lengkap  data  tersebut disajikan pada Gambar 7.
Gambar 7. Model penghambatan inhibitor protease

## KESIMPULAN
Penelitian  ini  telah  berhasil  memurnikan  inhibitor  protease yang  berasal  dari  isolat  6A3  yang  diisolasi  dari  spons Xestospongia  testudinaria dengan  jenis Chromohalobacter sp. 6A3.  Tahap  penentu  pemurnian  adalah  kromatografi  penukar ion yang mampu meningkatkan kelipatan pemurnian hingga 70 kali dengan aktivitas spesifik sebesar 6.400 U/mg.
Inhibitor  tersebut  menunjukkan  IC 50 sebesar  3,48  nM  dan mekanisme penghambatannya ditemukan sebagai unkompetitif, serta  termasuk  inhibitor  berbobot  molekul  tinggi  (21,31  kD). Efektifitas inhibitor protease yang ditemukan  lebih efektif, yaitu mempunyai potensi penghambatan 10.000-20.000x dibandingkan  dengan  PMSF,  dan  5.000-10.000x  dibandingkan dengan  EDTA.  Inhibitor  tersebut  mempunyai  suhu  dan  pH optimum  30 o C  dan  5,  relatif  stabil  pada  kondisi  tersebut, substrat  spesifik  yaitu  protease  dari P.  aeruginosa .  Ion-ion logam menurunkan aktivitas inhibitor protease kecuali ion logam Na + 1  mM,  sebaliknya  SDS  5  mM  meningkatkan  aktivitas inhibitor hingga 100 %.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  Direktorat  Jenderal  Dikti Depdiknas RI melalui Program Hibah Bersaing.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahn  YB,  Rhee  SK,  Fennell  D,  Kerkhof  LJ,  Hentschel  U, Haggblom  MM.  2003.  Reductive  dehalogenation  of brominated  phenolic  compounds  by  microorganisms associated  with  the  marine  sponge Aplysina  aerophoba. Appl Environ Microbiol 69:4159-4166.
Aoyagi  T,  Takeuchi  T.  1989.  Low  molecular  weight  enzyme inhibitors  produced  by  microorganisms.  Di  dalam Novel Microbial Product for Medicine and Agriculture. Demain AL, Samkuti  GA,  Hunter  JC,  Rossmoore  HW,  editor.  Elsevier Science Publisher.
Baehaki  A,  Suhartono  MT,  Palupi  NS,  Nurhayati  T.  2008. Purifikasi  dan  Karakterisasi  Protease  dari  Bakteri  Patogen Pseudomonas  aeruginosa.  Jurnal  Teknol.  dan  Industri Pangan XIX(1):80-86.
Baum  EZ,  Montenegro  DA,  Licata  L,  Turchi  I,  Webb  GC, Folendo  BD,  Bush  K.  2001.  Identification  and characterization of new inhibitors of the Escherichia coli Mur A enzymes. Antimicrob Agents Chemother 45:3182-3188.
Bergmeyer  HU,  Bergmeyer  J,  Graβl  M.  1983.  Methods  of enzymatic Analysis Vol 2. Weinheim: Verlag Chemie.
Bialojan C, Takai A. 1988. Inhibitory effect of a marine-sponge toxin,  okadaic  acid,  on  protein  phosphatases. Biochem  J 256:283-290.
Copeland  RA.  2005. Evaluation  of  Enzyme  Inhibitors  in  Drug Discovery. USA: A John Wiley & Sons, Inc, Publ.
Elyakov GB, Kuznetsova T, Mikhalov VV, Maltsev II, Bionov VG, Fedoreyev  SA.  1991.  Brominated  diphenyl  ethers  from  a marine  bacterium  associated  with  the  sponge Dysidea sp.
Experintia 47:632-633.
Flowers  AE,  Garson  MJ,  Webb  RI,  Dumdei  EJ,  Charan  RD. 1998. Celluler origin of chlorinated diketopiperazines in the dictyoceratid sponge Dysidea her bacea (Keller). Cell Tissue Res 292:597-607.
Granelli-Pipemo  A,  Reich  E.  1978.  A  study  of  protease  and protease-inhibitor complexes in biological fluids. J Exp Med 148:223-234.
Hammond  JBW,  Kruger  J.  1988.  The  bradford  method  for protein  quantitation.  Di  dalam  Walker  JM,  editor. New Protein Technique . Clifton, New Jersey: Humana Press.
Imada  C,  Simidu  U,  Taga  N.  1985a.  Isolation  and characterization  of  marine  bacteria  producing  alkaline protease inhibitor. Bull Jap Soc Scient Fish 51:799-803.
Imada  C,  Maeda  M,  Taga  N.  1985b.  Purification  and characterization of the protease inhibitor ”monostastin” from a marine Alteromonas sp. with reference to inhibiton of the protease  produced  by  a  bacterium  pathogenic  to  fish. Bull Jap Soc Scient Fish 31:1089-1094.
Imada  C,  Taga  N,  Maeda  N.  1985c.  Cultivation  conditions  for subtilisin  inhibitor-producing  bacterium  and  general properties of the inhibitor “marinostatin”. Bull Jap Soc Scient Fish 51: 805-810.
y = 7,5483x + 20,472 R 2 = 0,7743 y = 15,32x + 10,193 R 2 = 0,875 0 5 10 15 20 25 30 35 0 0,5 1 1,5 [1/S] 1/v Linear (dengan inhibitor) Linear (tanpa inhibitor) tanpa inhibitor dengan inhibitor
Janson  JC,  Ryden  J.  1998.  Protein  Purification.  New  York:  A John Wiley & Sons, Inc, Publication.
Kim, KS, Kim TU, Byun SM, Shin YC. 1995. Characterization of a  metalloprotease  inhibitor  protein  (SmaPI)  of Serratia marcescens . Appl Environt Microbiol 61:3035-3041.
Laemmli  UK.  1970.  Cleavage  of  structural  protein  during  the assembly  of  the  heat  of  bacteriophag  T4. Nature 227:680- 685.
Lee YK, Lee JH, Lee HK. 2001. Microbial symbiosis in marine sponges. J Microbiol 39: 254-264.
Li  X,  Zhang  G,  Ngo  N,  Zhao  X,  Kain  SR,  Huang  CC.  1997. Deletions  of  the Aequorea  victoria Green  Fluorescent Protein define the minimal domain required for fluorescens. J Biol Chem 272:28545-28549.
Loya S, Rudi A, Kashman Y, Hizi A. 1997. Mode of inhibition of HIV reverse transcriptase by 2-hexaprenyl-hydroquinone, a novel  general  inhibitor  of  RNA-and  DNA-directed  DNA polymerases. Biochem J 324:721-727.
Mayer AMS, Lehmann VKB. 2000. Marine Pharmacology. The Pharmacol 42:62-69.
Murao S, Kasai N, Kimura Y, Oda K. 1982. Isolation of metallo- proteinase inhibitor (FMPI) producing microorganism. Agric Biol Biochem 46:2697-2703.
Nurhayati  T,  Suhartono  MT,  Nuraida  L,  Poerwanto  SB.  2006. Karakterisasi  awal  inhibitor  protease  dari  bakteri  yang
berasosiasi dengan spons asal Pulau Panggang, Kepulauan Seribu. Hayati 13(2):58-64 .
Osclarit JM, Okada H, Ohta S, Kaminura K, Yamaoka Y, Iizuka T, Miyashiro S, Ikegami S. 1994. Anti-bacillus substance in the  marine  sponge, Hyatella species,  produced  by  an associated Vibrio species bacterium. Microbiol 78:7-16. Scopes  RK.  1987. Protein  Purification,  Principles  and  Practice e disi ke-2. New York: Springer-Verlag.
Sepcic  K,  Guella  G,  Mancini  I,  Pietra  F,  Serra  MD.  1997. Characterization of anticholinesterase-active 3-alkylpyridium polymers from the marine sponge Reniera sarai in aqueous solutions. J Nat Prod 60:991-996.
Stierle  AC,  Cardellina  II  JH,  Singleton  FL.  1988.  A  marine Micrococcus produces  metabolites  ascribed  to  the  sponge Tedania ignis . Experientia 44:1021
Takasaki  J,  Saito  T,  Taniguchi  M,  Kawasaki  T,  Moritani  Y, Hayashi  K,  Kobori  M.  2004.  A  Novel  Gα q/11 -selective inhibitor. J Biol Chem 279:47438-47445.
Walker  JM.  1988.  Methods  in  Molecular  Biology  Vol  3:  New Protein Techniques. New Jersey: The Humana Press, Inc.
Webster NS, Wilson KJ, Blackall LL, Hill RT. 2001. Phylogenetic diversity  of  bacteria  associated  with  the  marine  sponge Rhopaloeides odorabile . Appl Environt Microb 67:434-444. Zoilner. 1993. Handbook of enzymes inhibitor 2 nd , Revised and enlarge edition part B. Germany: VCH Verlagsg Esellschaft.