## Peningkatan Kualitas Kit Elisa Rabies Pusvetma
Elisa Rabies Pusvetma Kit Quality Improvement
Ekky Valinia Devia Mashelli* 1 , Nur Sjolichah 2 , Febri Hartanti 3 1,2,3 Pusat Veteriner Farma; Ahmad yani 68 -70 Surabaya, (031) 8291124 e-mail: * ekkyvaliniadm@gmail.com

## ABSTRAK
Enzym  Linked  Immunosorbent  Assay (ELISA)  merupakan  salah  satu  alat  uji  untuk mendeteksi  antibody.  Teknik  pengujian  atau  pemeriksaan  berdasarkan  atas  ikatan antigen  antibodi  yang  mana  salah  satu  antigen  atau  antibodi  dilabel  dengan  Enzym tertentu  dan  reaktan  lainnya  berikatan.  Metode  yang  dilakukan  dalam  penelitian  ini yaitu persiapan mikroplate ( coating, blocking, washing ) dan pengujian kit ELISA. Hasil uji serum kontrol positif, serum kontrol negatif, serum standart dan serum sampel yang menggunakan substrat label TMB dan Konjugat Protein A-HRP menunjukkan nilai OD yang  lebih  stabil  dibanding  dengan  yang  menggunakan  substrat  PNPP  dan  Konjugat Protein A-AP ( Alkaline Phosphatase ) dengan panjang gelombang 405 nm.
Kata kunci— ELISA, substrat, konjugat

## ABSTRACT
Enzyme  Linked  Immunosorbent  Assay  (ELISA)  is  a  test  tool  for  detecting  antibodies. The  technique  of  testing  or  examination  is  based  on  the  binding  of  the  antigen  to  the antibody in which one of the antigens or antibodies is labeled with certain enzymes and other  reactants  are  bound.  The  methods  used  in  this  research  are  microplate preparation  (coating,  blocking,  washing)  and  ELISA  kit  testing.  The  test  results  of positive control serum, negative control serum, standard serum and sample serum using TMB  labeled  substrate  and  Protein  A-HRP  Conjugate  showed  more  stable  OD  values than  those  using  PNPP  substrate  and  Protein  A-AP  (Alkaline Phosphatase)  conjugate with a length of the 405 nm wave.
Keywords— ELISA, substrate, konjugat

## PENDAHULUAN
Rabies  disebabkan  oleh  virus neurotropic  genus  Lyssavirus  family Rhabdoviridae  dan  penyakit  anjing  gila adalah  infeksi  susunan  syaraf  pusat pada  hewan  yang  dapat  menular  ke manusia.  Rabies  ditularkan  melalui gigitan,  cakaran,  bahkan  air  liur  yang mengenai  luka  pada  kulit  (Kang  et  al., 2007).  Karena  bersifat  zoonosis,  maka
semua material yang dicurigai terinfeksi harus  ditangani  dengan  memperhatikan aspek  keamanan  sesuai  spesifikasi WHO (WHO, 1996).
penyakit  anjing  gila  adalah infeksi  susunan  syaraf  pusat  pada hewan yang dapat menular ke manusia. Rabies  ditularkan  melalui  gigitan, cakaran, bahkan air liur yang mengenai luka  pada  kulit  (Kang  et  al.,  2007). Vaksinasi merupakan tindakan
pencegahan yang efektif dalam mengurangi  kerjadian  rabies.  Hail vaksinasi rabies harus memenuhi standart  kebutuhan  minimal  sesuai dengan  acuan  OIE,  yaitu  sama  atau lebih  besar  dari  0,5 Equivalent  Unit (EU) (Hooper et al, 1998, WHO Expert Committee  in  Biological  standart, 1985).  Antibody  netralisasi  diyakini merupakan komponen utama dari respon imun melawan virus rabies. Gold standart uji  adalah  virus  netralisasi. Pemeriksaan  zat  kebal  (antibodi)  pada serum  dapat  dilakukan  dengan  cara Mouse  Netralization (MN), Rapid Fluorecent Focus Inhibition Test (RFFIT) dan Enzym Linked Immunosorbent Assays (ELISA). ELISA – Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan alat pertama kali  diperkenalkan  pada  awal  tahun
1970  (D.Catty,1989)  dan  salah  satu  uji untuk  mendeteksi  antibodi  yang  sangat berguna terkait dengan survey
epidemiologi  dalam  populasi  besar  (Xu et  al,  2007)  dengan  teknik  pengujian atau  pemeriksaan  berdasarkan  atas ikatan  antigen  –  antibody  yang  mana salah  satu  antigen atau  antibody  dilabel dengan  enzym  tertentu  dan  reaktan lainnya  berikatan  bersifat  resisten  yang tidak  berikatan  akan  lepas  dengan pencucian.  Lalu  ditambahkan  subsrat yang  apabila  bereaksi  dengan  enzim dapat  menimbulkan  warna.  Perubahan warna yang terjadisesuai dengan jumlah enzim  yang  diikat  dan  sesuai  pula dengan  kadar  antibodi  yang  dicari (Johnson  et  al,  2011).  Intensitas  warna yang  mencerminkan  intesitas  antigen  – antibodi  yang  diperiksa  dan      dapat  di ukur  absorbsinya  secara  kuantitatif dengan optical  density .  Makin  banyak antigen yang berinteraksi dengan antibodi makin tinggi intensitas warnanya (Sumartini et al., 2002). Nilai Equivalen Unit (EU) sebagai hasil akhir pengujian  ELISA  dianalisis  secara
deskriptif  dengan  mengacu  pada  data yang sudah disediakan dalam KIT yaitu titer dinyatakan protektif jika nilainya ≥ 0,5  EU  dan  titer  dinyatakan  tidak protektif  jika  ≤  0,5  EU  (Saputra  dkk, 2013).
Kit  ELISA  Rabies  Pusvetma
telah mendapat perhatian secara nasional dan internasional dalam perjalanan  produksinya.  Dalam  rangka meningkatkan  mutu  dan  kualitas  kit  ini dilakukan penelitian uji stabilitas dengan  membandingkan  penggunaan subsrat  label  PNPP  dan  konjugat Protein  A  -  AP  ( Alkaline  Phosphatase ) dengan substrat label TMB dan
Konjugat  Protein  A  -  HRP.  Penelitian ini  dilakukan  dengan  tujuan  untuk mengkaji  larutan  subsrat  yang  dipakai Kit  Elisa  Pusvetma  sehingga  dapat mempengaruhi  stabilitas  dan  kualitas Kit Elisa Rabies Pusvetma.

## METODE PENELITIAN
Bahan  –  bahan  yang  digunakan meliputi antigen rabies, carbonat bicarbonat buffer, bovine serum albumin,  sucrose,  phosphat  buffer saline,  tween  20,  thiomersal ,  sampel serum  lapangan,  serum  kontrol  positif, serum  kontrol  negatif,  serum  standart, phopspat  buffer  saline  tween ,  subsrat label  PNPP,  substrat  label  TMB, konjugat  Protein  A  -  AP,  konjugat Protein A - HRP, dan stopper. Peralatan yang  digunakan  meliputi  mikroplate urai,  multichannel  pipet,  single  channel pipet,  finntipe,  baker  glass,  tabung reaksi,  petri  disk,  elisa  reader  dan  elisa washer.  Metode  yang  dilakukan  dalam penelitian ini yaitu persiapan mikroplate ( coating, blocking, washing ) dan pengujian kit ELISA Persiapan mikroplate Coating antigen rabies dilakukan  pada  mikroplate  urai  dengan
menggunakan  buffer  bicarbonate  buffer pH 9,6 seratus mikroliter setiap well dan ditutup  dengan  plastik  absorbent  lalu simpan  semalam  pada  suhu  4⁰C.
Blocking mikroplate  dengan  membuka plastik absorbent dan membuang larutan coating lalu diisi dengan larutan blocking  buffer  bicarbonat  buffer  pH
9,6 bovine serum albumin, dan succrose, di isi seratus mikroliter setiap well dan  di  tutup  dengan  plastik absorbent lalu di simpan pada inkubator pada suhu 37 ⁰C selama 1 jam. Washing mikroplate  dengan  cara  membuka plastik absorbent  yang  sudah  di  simpan pada  inkubator  lalu  di  buang  cairan blocking  dan  di  cuci  dengan  phospat buffer  saline  selama  4  kali,  diisi  250 mikroliter setiap well .

## Pengujian ELISA
Uji  Elisa  dilakukan  dengan pengenceran  serum  sampel,  serum kontrol  negatif,  serum  kontrol  positif,
serum  standart  dengan  PBS tween , masukkan  ke  dalam  setiap well masing –  masing  seratus  mikroliter  dan  tutup plastik  absorbent  dan  inkubasi  pada suhu 37⁰C selama 1 jam setelah itu buka plastik  absorbent  dan  cuci  dengan  PBS tween pengenceran  1  kali,  masukan pengenceran  konjugat  dengan  PBS tween sebanyak  100  µl  setiap well lalu tutup  kembali  dengan  plastik  absorbent dan  inkubasi  kembali  pada  suhu  37⁰C selama 1 jam, lalu cuci kembali dengan PBS tween ,  tambahkan  subsrat  label PNPP  dan  Konjugat  Protein  A  -  AP dengan  Substrat  label  TMB  dan Konjugat  Protein  A  -  HRP  sebanyak 100  µl  tempatkan  pada  ruang  gelap selama  10  menit  dan  mikroplate selanjutnya  diisi  dengan  100  µl  stop solution pada semua sumur. Tiga puluh menit  kemudian  dilakukan  pembacaan optical density pada panjang gelombang 450 nm dan 405 nm (Biorad 2009).
Tabel 1. Reader dengan panjang gelombang 405 nm dan 450 nm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A K4EU K4EU K4EU K4EU S68 S68 K4EU K4EU K4EU K4EU S68 S68
B K2EU K2EU K2EU K2EU S68 S68 K2EU K2EU K2EU K2EU S68 S68 C K1EU K1EU K1EU K1EU S88 S88 K1EU K1EU K1EU K1EU S88 S88
D K0,5EU K0,5EU K0,5EU K0,5EU S88 S88 K0,5EU K0,5EU K0,5EU K0,5EU S88 S88 E K0,25E U K0,25E U K0,25E U K0,25E U S102 S102 K0,25E U K0,25E U K0,25E U K0,25E U S102 S102 F K0,125E U K0,125E U K0,125E U K0,125E U S102 S102 K0,125E U K0,125E U K0,125E U K0,125E U S102 S102
G ST ST ST ST blank blank ST ST
ST ST blank blank H K- K- K- K- blank blank K- K- K- K- blank blank Keterangan:
1. Substrat label TMB  dan Konjugat Protein A - HRP
2. Subsrat label PNPP  dan Konjugat Protein A - AP (Alkaline Phosphatase)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian  ini  dilakukan  dengan membandingan penggunaan subsrat label  PNPP  dan  Konjugat  Protein  A  - AP  dengan  Substrat  label  TMB  dan
Konjugat  Protein  A  -  HRP.  Pembacaan hasil  Elisa  dilakukan  dengan  panjang gelombang  450  nm  dan  405  nm.  Hasil pengujian Kit Elisa Rabies dapat dilihat pada tabel 2.

## Tabel 2. Hasil Optical density (OD) dengan panjang gelombang 450 nm
Measurement count: 1  Filter: 450
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 3,018 3,156 3,13 3,081 0,884 0,807 0,278 0,279 0,286 0,307 0,055 0,061 B 3,129 3,062 3,083 3,042 0,638 0,634 0,162 0,169 0,171 0,163 0,057 0,046 C 2,678 2,765 2,678 2,597 1,117 1,262 0,104 0,117 0,113 0,117 0,069 0,077 D 2,052 1,903 1,855 1,873 1,014 1,008 0,076 0,085 0,079 0,082 0,069 0,049 E 1,355 1,206 1,184 1,189 1,32 1,214 0,062 0,075 0,062 0,071 0,087 0,094 F 0,781 0,853 0,784 0,756 1,379 1,350 0,053 0,056 0,08 0,07 0,085 0,05 G 2,737 2,924 2,716 2,771 0,249 0,213 0,117 0,132 0,12 0,117 0,051 0,055 H 0,372 0,292 0,339 0,299 0,232 0,23 0,052 0,046 0,063 0,05 0,052 0,048

## Tabel 3. Hasil Optical density (OD) dengan panjang gelombang 405 nm
Measurement count: 1  Filter: 405
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1,725 1,736 1,661 1,706 0,375 0,347 1,272 1,274 1,292 1,393 0,128 0,153 B 1,42 1,362 1,352 1,371 0,286 0,242 0,649 0,7 0,707 0,676 0,126 0,065 C 1,059 1,084 1,078 1,019 0,453 0,508 0,376 0,383 0,403 0,4 0,188 0,2 D 0,778 0,734 0,709 0,71 0,412 0,342 0,226 0,226 0,23 0,232 0,18 0,069 E 0,541 0,473 0,481 0,473 0,523 0,48 0,145 0,162 0,153 0,16 0,24 0,259 F 0,336 0,371 0,34 0,326 0,539 0,441 0,107 0,112 0,14 0,128 0,244 0,174 G 1,162 1,158 1,135 1,122 0,157 0,141 0,418 0,442 0,432 0,405 0,074 0,073 H 0,198 0,164 0,18 0,164 0,144 0,141 0,086 0,078 0,094 0,086 0,074 0,071 Pengujian Kit Elisa ini dilakukan dengan penggunaan 1
mikroplate  dengan  coatingan  yang sama. Perbedaan pengujian pada penggunaan  substrat  dan  konjugat. Penggunaan  substrat  label  TMB  dan Konjugat  Protein  A  -  HRP  dimasukkan pada  sumuran  mikrokplate  nomor  1 sampai 6 sedangkan penggunaan substrat PNPP dan Konjugat Protein A-
AP dimasukkan pada sumuran mikroplate nomor 7 sampai 12. Pengenceran  konjugat  protein  A-HRP dan  Konjugat  Protein  A-AP  sama  yaitu pengenceran 16.000x.
Berdasarkan  hasil  uji  Kit  Elisa Rabies  tersebut  diatas  tampak  bahwa nilai  OD  kontrol  dan  sampel  pengujian yang  dibaca  pada  Elisa  reader  dengan panjang  gelombang  450  nm  (tabel  2) lebih  baik  dibandingkan  dengan  nilai OD  kontrol  dan  sampel  pengujian  yang dibaca  pada  Elisa  reader  dengan panjang gelombang 405 nm (tabel 3).
Hasil  uji  serum  kontrol  positif, serum  kontrol  negatif,  serum  standart dan  serum  sampel  yang  menggunakan substrat  label  TMB  dan  Konjugat Protein A - HRP menunjukkan nilai OD yang lebih stabil dibanding dengan yang menggunakan substrat PNPP dan Konjugat  Protein  A  -  AP  (Alkaline Phosphatase)  seperti  tampak  pada  tabel 2  dan  3.  Pengkajian  kit  elisa  rabies dengan  menggunakan  substrat  label TMB  dan  Konjugat  Protein  A  -  HRP menunjukkan  stabilitas  dan  kualitas yang lebih baik.

## KESIMPULAN
1. Penggunaan  substrat  label  TMB  dan Konjugat Protein A - HRP memberikan hasil yang lebih stabil.
2. Pembacaan  hasil  OD  pada  elisa reader  dengan  panjang  gelombang
405 nm memberikan hasil yang lebih stabil.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut tentang Uji Stabilitas Kit Elisa Rabies.

## DAFTAR PUSTAKA
Biorad.  2009. User's  manual  Platelia Rabies II Kit . Tersedia pada: http: //web.  oie.  Int  /VCDA/  eng/ Registre/ User's %20 manual_Platelia Rabies II. pdf .
D.  Catty.  1989. A  Practical  Approach .
Vol II Hooper, D.C., Morimoto, K., Bette, M., Weihe,  E.,  Koprowski,  H.  dan Dietzschold, B. 1998. Collaboration  of  Antibody  and Inflammation  in  Clearance  of Rabies  Virus  from  The  Central
Nervous  System. J.Virol .  72. 3711-3719.
Johnson,  G.A,  Zielger,  R.J,  Hawley,  L.
2011. Essential  Mikrobiologi  dan imunologi .  Tangerang  selatan: Binarupa Aksara Publisher.
Kang, B., J.S. Oh, C.S. Lee, B.K. Park,
Y.N.  Park,  K.S.  Hong,  K.G.  Lee,
B.K.  Cho,  D.S.  Song.  2007. Evaluation of Rapid Immunodiagnostic  Test  kit  for Rabies Virus. Journal of Virology Methods . 145: 30 – 36
OIE.  2011. Terestrial  Manual,  Rabies . Chapter 2.1.13.
Saputra,  P.N.,  D.  Estikoma.,  dan  saN. Shohchah. 2013. Kit ELISA
Rabies  Pusvetma .  Pusat  Veteriner
Farma. Surabaya. Sumartini, S., Zuas, O., Juliasmardiany, R.,  dan  Sulilawati,  E.  2002. Aplikasi Elisa Kit Untuk Mendeteksi  Adanya  Daging  Babi Dalam Makanan . Pusat Penelitian Kimia; Tangerang World  Health  Organization.  1996. Laboratory  Techniques  in  Rabies Fourth Edition, Meslin F- X.Kaplan  M.M  dan  Koprowski H.,Eds . WHO. Geneva. Switzerland. World  Health  Organization  Expert Commitee on Biological Standards.  Thirty-Fifth  Report. 1985. World  Health  Organisation
Technical  Report  Series  No.  725 .
WHO. Geneva. Switzerland.
Xu G., Weber P., Hu Q.,Xue H., Audry L.,Li  C.,  Wu  J  dan  Bourhy  H.
2007. A  Simple  Sanwich  Elisa (WELYSSA) For The Detection  of Luyssavirus Nucleocapsid in Rabies Suspected Specimens Using Mouse Monoclonal Antibodies  Biologicals .  35.  297- 302