## KONSTRUKSI TRIPLE DISRUPTAN GEN PENGKODE PROTEIN FOSFATASE DAN PROTEIN KINASE Saccharomyces cerevisiae
Hermansyah Hermansyah 1* dan Susilawati Susilawati 2
1 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Sriwijaya
2 Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya
* email: hermansyah@unsri.ac.id

## Abstrak
Konstruksi  triple  disruptan  pada Saccharomyces  cerevisiae dibuat  dengan  menyilangkan (crossing)  atau  melakukan  mating  antara strain BY4739  ( MAT  ura3  0  leu2  0  lys2  0 kin3  ::KanMX) dengan strain SH6793 ( MATa ptp2  :: CgHIS3  msg5  :: CgLEU2 ura3-52 his3- Δ 200 leu2 Δ 1 lys2 Δ 202 trp1 Δ 63). Dari 10 aski yang menghasilkan 40 koloni triple disruptan, hanya 3 koloni yang memiliki fenotip dapat tumbuh di media SC-his, SC-leu, dan YPDA  +  100  µg/mL  geniticin  disulfat.    Uji  lanjut  terhadap  tiga  koloni  tersebut menggunakan amplifikasi PCR dan pemotongan dengan enzim restriksi Nru I menghasilkan hanya satu koloni yang memiliki ptp2  . Data ini mengindikasikan bahwa kemungkinan hanya satu koloni yang memiliki triple disruptan ptp2  msg5  kin3  yaitu koloni 7B.
Kata kunci: triple disruptan, Saccharomyces cerevisiae, metode crossing (persilangan)

## Abstract
Triple disruptant were contsructed by crossing or mating between strain BY4739 ( MAT  ura3  0  leu2  0  lys2  0  kin3  ::KanMX)  and  strain  SH6793  ( MATa ptp2  :: CgHIS3 msg5  :: CgLEU2 ura3-52 his3- Δ 200 leu2 Δ 1 lys2 Δ 202 trp1 Δ 63). Out of 10 asci generating 40 colonies which have triple disruptant, only 3 colonies showed phenotypics growing on SC-his, SC-leu, and YPDA+ 100 µg/mL geniticine disulfate medium.  Further test to these three colonies by using PCR amplication and digesting by restriction enzyme NruI resulted only one colony showing ptp2  .  This data indicated that only one colony had ptp2  msg5  kin3  triple disruptant, colony 7B.

## Keywords: triple disruptant, Saccharomyces cerevisiae, crossing method

## Pendahuluan
Protein  fosfatase  dan  protein  kinase merupakan  dua  kelompok  protein  yang berperan  penting  dalam  pengendalian berbagai  proses  seluler  pada  eukariot. Kedua  protein  tersebut  masing-masing mengontrol  fosforilasi  dan  defosforilasi protein/enzim pada jalur signal transduksi (Hunter, 1995). Dengan demikian masing- masing  protein  kinase  dan  protein fosfatase  bekerja  dengan  mengaktifkan dan  menginaktifkan  protein/  enzim.
Akibat dari pengontrolan ini, protein/enzim  yang  terfosforilasi  atau terdefosforilasi dapat
mengalami peningkatan  atau  penurunan  aktivitas, sehingga  kerusakan  protein  kinase  atau protein  fosfatase  akan  menyebabkan abnormalitas  fosforilasi  protein/enzim yang dapat menyebabkan banyak penyakit (Zolnierowicz and Bollen, 2000).
Kerusakan  gen  penyandi  protein  kinase dan  protein  fosfatase  menyebabkan ketidakseimbangan reaksi fosforilasi.
Fungsi fisiologi protein fosfatase pada sistem  eukaryot  terus  dieksplor  untuk mengetahui fungsinya dalam sel.
Saccharomyces  cerevisiae merupakan salah  satu  mikroorganisme  yang  secara intensif digunakan sebagai model. Terdapat 117 protein kinase dan 38 protein fosfatase dari sekitar 6.600 gen S.cerevisiae (Sakumoto et  al ,  1999  and Sakumoto et al , 2002).   Gen S.cerevisiae mudah dilakukan analisis secara molekuler karena  seluruh  urutan  gen-gen  pengkode protein dalam S.cerevisiae telah diketahui, dipetakan, diklon, dan dibua mutan untuk mempermudah  dalam  menganalisis  dan mempelajari fungsi gen tersebut.
Kerusakan dua protein fosfatase, Ptp2p dan Msg2p menyebabkan strain memiliki fenotip sensitif terhadap kalsium (Hermansyah et al , 2009).  Pencarian gen lain  yang  dapat  menekan  fenotip  sensitif kalsium  akan  memperjelas  mekanisme fenotip  tersebut.    Ide  dasar  pembentukan triple disruptan atau merusak tiga gen pada S.cerevisiae adalah  berdasarkan  hipotesis bahwa  sensitivitas  kalsium  disebabkan oleh  dua  model.  Pertama,  sensitivitas disebabkan  oleh  akumulasi  substrat terfosforilasi  unknown  dari  Ptp2p  and Msg5p,  dan  model  kedua  sensitivitas disebabkan  oleh  kekurangan  substrat terfosforilasi pada Ptp2p and Msg5p.
Dengan  demikian  kerusakan  pkase akan  menekan  fenotip  sensitif  kalsium double  disruptan  ptp2  msg5. Pada artikel  ini  akan  dibuktikan  apakah kerusakan  gen  penyandi  protein  kinase kin3 akan menekan sifat sensitif kalsium. Protein  Kin3  adalah  protein  kinase serin/threonin non esensial yang mungkin berperan  pada  kerusakan  DNA  yang merespon  fenotip  toleran  etanol  kadar tinggi  (Jones et  al .,  1990,  Moura et  al , 2010; Pais et al. , 2010).

## Metode Penelitian
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah hot plate , termometer, PCR  dan  seperangkat  alat  gelas.  Bahan
pada  penelitian  ini  adalah  strain  SH6793 yang memiliki genotip MATa
ptp2  :: CgHIS3  msg5  :: CgLEU2 ura3-52 his3- Δ 200 leu2 Δ 1 lys2 Δ 202 trp1 Δ 63. BY4739  ( MAT  ura3  0  leu2  0  lys2  0 Pkase::KanMX). Medium
YPDA
diperkaya  dengan  suplemen  adenine  0.4 mg/ml  (Sigma-  Aldrich  Co).  Media selektif  terdiri  atas  yeast  nitrogen  base tanpa  amino  acids  0,67%,  glukosa  2%, bakto  agar  2%  dan  suplemen-suplemen auksotropi seperti  L-triptopan 20mg/L, L- histidin  (HCl)  20mg/L,  L-arginin  (HCl) 20mg/L,  L-metionin  20mg/L,  urasil 20mg/L,  L-tirosin  30mg/L,  L-isoleusin 30mg/L,  L-lisin  (HCl)  30mg/L,  L-leusin 100  mg/L,  L-valin  150mg/L,  L-treonin 200mg/L, dan adenin 400mg/L).

## Prosedur Penelitian
Konstruksi triple  disruptant dilakukan menurut  Hermansyah et  al (2010) . Persilangan atau mating dilakukan dengan metode  crossing  antara strain BY4739 ( MAT  ura3  0 leu2  0 lys2  0 kin3  ::KanMX)  dengan  strain  SH6793
yang memiliki genotip
MATa ptp2  :: CgHIS3  msg5  :: CgLEU2 ura3-52 his3- Δ 200  leu2 Δ 1  lys2 Δ 202  trp1 Δ 63 . Setelah  inkubasi  pada  30 o C  selama semalam,  sel  diploid  ditumbuhkan  pada media SPM selama 4 hingga 7 hari hingga terbentuk  aski.  Spora  aski  dipisahkan dengan  mikromanipulator  menggunakan media YPDA yang diinkubasi selama 2-3 hari.    Koloni  yang  tumbuh  dilakukan replika  plating  ke  media  sintetik  tanpa histidin  dan  leusin,  serta  media  yang mengandung  genitisin  disulfat  (Kan). Koloni yang mengandung triple disruptant ptp2  msg5  kin3  dilakukan  konfirmasi dengan  PCR.  Uji  fenotip  dilakukan  pada media yang mengandung 0,6 M CaCl 2 , 50 µg/ml calcofluor, dan 100 µg/ml genetisin disulfat.

## Hasil dan Pembahasan
Konstruksi triple  disruptant  ptp2  msg5  kin3  dibuat  dengan  metode penyilangan  ( crossing ) double  disruptant
protein  fosfatase ptp2  msg5 dengan single  disruptant protein  kinase  kin3  . Sepuluh  aski  yang  tumbuh  di  media sporulasi SPM, setelah dipisahkan dengan mikromanipulator, ditumbuhkan di media YPD  dan  diidentifikasi  di  media  :    tanpa histidin (SC-His), tanpa Leusin (SC-Leu), YPD + 100 µg/ml geneticin disulfat.  Dari 10  aski  yang  menghasilkan  40  koloni yeast,  hanya  3  koloni  yang  tumbuh  di ketiga  media  tersebut,  artinya  ketiga koloni  mengandung ptp2  :: CgHIS3  ; msg5  :: CgLEU2; dan kin3  ::KanMX  yaitu koloni 3A, 4B dan 7B seperti terlihat pada Gambar 1.  Koloni haploid yang memiliki mating type a atau mating type α.    Pada Gambar  hasil  persilangan  dengan  strain SHB  602  yang  memiliki  mating  type  a, koloni yang tumbuh adalah strain haploid dengan  mating  type  α,  sedangkan  yang tidak tumbuh adalah mating type a.
Gambar  1. Koloni  yang  dihasilkan  dari pemisahan 10 aski.  Tiga koloni memiliki fenotip ptp2  :: CgHIS3 (di  media  SC-His) ; msg5  :: CgLEU2 (di  media  SC-Leu) ; dan kin3  ::KanMX (di media YPDA genetisin disulfat)  yaitu koloni 3A, 4B, dan 7B.
Selanjutnya koloni tersebut dikonfirmasi apakah mengandung disruptant  pada ptp2  :: CgHIS3  ; msg5  :: CgLEU2; atau kin3  ::KanMX.
Pada  penelitian  ini  hanya  dilakukan konfirmasi keberadaan gen
ptp2  :: CgHIS3 ,  dengan  anggapan  bahwa triple  disruptan  yang  dihasilkan  dari persilangan strain BY4739 yang memiliki
genotif MAT  ura3  0  leu2  0  lys2  0  kin3 ::KanMX    dengan  SH6793  yang memiliki  genotip MATa  ptp2 :: CgHIS3  msg5 :: CgLEU2 ura3-52 his3- Δ 200 leu2 Δ 1  lys2 Δ 202  trp1 Δ 63 pasti  memiliki  ptp2 :: CgHIS3 .      Dengan  menggunakan pasangan primer Kfc PTP2 (-1000 to -979 of PTP2) :5’CTC AAGCTT
GGACACTCGT  TTAATTTAGC  CA3’ dan  Krc  PTP2  (+479  to  +500  of PTP2)5’CTC  AAGCTT  ATTCGGTATT GGCACAAACT  TT  ‘3  kerusakan  gen ptp2  :: CgHIS3 diverifikasi  lebih  lanjut. Hasil penelitian menunjukan bahwa hanya pada  line  6  (koloni  7B)  yang  memiliki ukuran  4,154  pb  yang  merupakan  ukuran ptp2  :: CgHIS3 ,  sedangkan  yang  lain memiliki ukuran gen PTP wild type 3,753 pb  (Gambar 2a).
(a)
(b) Gambar 2. Elektrogram produk PCR, a) Line 1= marker; line 2,3,4,5 gen PTP wild type  berukuran  3,753  pb    ;  line  6 ptp2  :: CgHIS3 berukuran  4,154  pb;  b) Line 1 = marker; line 2= PTP2 wild type; line  3 ptp2  :: CgHIS3/NruI (control  +); line 4,5 uncut ; line 6  ptp2 :: CgHIS3 dari sampel 7B
Konfirmasi  adanya ptp2  :: CgHIS3 dilakukan  dengan  menggunakan  enzim restriksi Nru I.  Gen wild type PTP2 tidak memiliki  sisi  restriksi  untuk  enzim restriksi Nru I,  sedangkan  gen  CgHIS3
memiliki satu sisi pemotongan pada urutan 1516 bp.  Hasil elektrogram elektroforesis menunjukan bahwa hanya koloni 7B yang mengkonfirmasi adanya disruptan
 ptp2 :: CgHIS3.
Kesimpulan 1. Konstruksi  triple  disruptan ptp2  msg5  kin3  berhasil  dilakukan dengan  menyilangan  single  disruptan protein  kinase kin3  dengan  double disruptan  protein  fosfatase ptp2  msg5  .
2. Dari tiga koloni yang positif memiliki fenotip yaitu tumbuh pada media SC- his, SC-leu, dan YPD mengandung 10 µg/ml  geniticin  disulfat,  berdasarkan data  amplifikasi  PCR  dan  konfirmasi menggunakan  enzim  restriksi Nru I, hanya  satu  koloni  ,  7B,    yang mengandung ptp2  .

## Ucapan Terima Kasih
Prof. Satoshi Harashima atas penggunaan strain dan fasilitas yang diberikan.

## Daftar Pustaka
Hermansyah, Laviña, W.A., Sugiyama, P., Kaneko  and  Y.,  Harashima,  S. (2010).  Identification  of  protein kinase  disruptions  as  suppressors  of the  calcium  sensitivity  of S. cerevisiae  ptp2  msg5 protein phosphatase double disruptant, Archives of microbiology 192, 157 – 165.
Hermansyah,  Sugiyama,  P.,  Kaneko,  Y. and  Harashima,  S.  (2009).    Yeast protein  phosphatase  Ptp2p  and Msg5p  are  involved  in  G1-S transition, CLN2 transcription,  and vacuole  morphogenesis, Archives  of microbiology . 191, 721 – 733.
Hunter,  T.  (1995).    Protein  kinases  and phosphatases:  the  yin  and  yang  of protein phosphorylation
and
signaling, Cell , 80, 225 – 236.
Jones,  D.  G.    and  Rosamond,  J.  (1990). Isolation  of  a  novel  protein  kinase- encoding  gene  from  yeast  by oligodeoxyribonucleotide probing, Gene , 90, 87 – 92.
Moura, D.J., Castilhos, B., Immich, B. F.,
Cañedo,  A.  D.,  Henriques,  J.  A.,
Lenz,  G.,  Saffi,  J.  (2010).  Kin3 protein,  a  NIMA-related  kinase  of Saccharomyces cerevisiae, is
involved  in  DNA  adduct  damage response, Cell Cycle , 9, 2220 – 2229. Pais,  T.  M.,  Foulquié-Moreno,  M.  R., Hubmann, G., Duitama, J., Swinnen, S.,  Goovaerts,  A.,  Yang,  Y.,
Dumortier,  F.,  and  Thevelein,  J.  M. (2010). Comparative polygenic analysis of maximal ethanol accumulation  capacity  and  tolerance to  high  ethanol  levels  of  cell proliferation in yeast, PLoS Genetics, 9 Sakumoto,  N.,  Matsuoka,  I.,  Mukai,  Y., Ogawa,  N.,  Kaneko,  Y.  and Harashima,  Y.  (2002).    A  series  of double  disruptants  for  protein phosphatase genes in Saccharomyces cerevisiae and  their  phenotypic analysis, Yeast , 19, 587 – 599. Sakumoto,  N.,  Mukai,  Y.,  Uchida,  K., Kouchi, T., Kuwajima, J., Nakagawa, Y.,  Sugioka,  S.,  Yamamoto,  E., Furuyama,  T.,  Mizubuchi,  H., Ohsugi, N., Sakuno, T., Kikuchi, K., Matsuoka, I., Ogawa, N., Kaneko, Y. and Harashima, S. (1999).  A series of protein phosphatase gene disruptants in Saccharomyces  cerevisiae , Yeast 15, 1669 – 1679.
Zolnierowicz,  S.  and  Bollen,  M.  (2000). Protein  phosphorylation  and  protein phosphatases, The  EMBO  Journal ,
19, 483 – 488.