## IDENTIFIKASI SENYAWA EKSTRAK ETANOL DAUN MIMBA (Azadirachta indica A.Juss) SEBAGAI ANTIBAKTERI SECARA KLT-BIOAUTOGRAFI TERHADAP BAKTERI Stahpylococcus aureus DAN Escherichia coli
Nurfijrin Ramadhani, Agung Giri Samudra, Jimmy Armando Akademi Farmasi Al-Fatah Bengkulu
Email: nurfijrin@gmail.com

## ABSTRAK
Rendahnya  kesadaran  masyarakat  dan  kurangnya  sarana  kesehatan membuat penyakit infeksi semakin meningkat. Pengobatan secara alami sekarang menjadi  pilihan baru sebagai  antibakteri,  salah satunya adalah mimba. Penelitian sebelumnya  menunjukkan  bahwa  daun  mimba  dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri, akan tetapi belum diketahui senyawa apa yang berperan sebagai antibakteri tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui di dalam daun mimba senyawa yang  berperan  sebagai  antibakteri.  Penelitian  dilakukan  dengan  metode  KLT Bioautografi langsung, dimana hasil maserasi esktrak etanol daun mimba yang telah dielusi ditempelkan ke media yang telah ditanami bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli . Zona hambat yang terbentuk dilakukan identifikasi senyawa dengan menggunakan pereaksi semprot Dragendorf, FeCl 3 , Sitroborat, Lieberman Bouchardat,  dan  SbCl 3 .  Hasil  uji  KLT-Bioautografi  menunjukkan  bahwa  daun mimba dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang ditandai dengan terbentuknya zona bening masing-masing dengan Rf 0,4 pada bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia  coli .  Senyawa  yang  berperan  sebagai  antibakteri  terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli diduga  adalah  senyawa  saponin dimana terbentuk warna ungu dengan pereaksi SbCl 3 .
Kata Kunci  : Daun Mimba (Azadirachta indica A.Juss), KLT Bioautografi,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli

## ABSTRACT
Low  public  awareness  and  insufficient  health  facilities  make  infectious diseases is increasing. Natural medicine is now a new option as an antibacterial, one of which is mimba.Previous studies  have shown that mimba leaf can inhibit the growth of bacteria, but is not yet known what compounds which act as antibacterial. This  research  purpose  to  know  in  mimba  leaf  that  acts  as  an  antibacterial compound.The research  conducted by method  of  direct  bioautografi  T/lC, where the results of the ethanol extract of mimba leaf maceration which has eluted affixed to the media which have been affixed Staphylococcus aureus  nd Escherichia coli bacteria.  Inhibition  zone  formed  to  identify  compounds  using  spray  reagent Dragendorf,  FeCl 3 ,  Sitroborat,  Lieberman  Bouchardat,  dan  SbCl 3 .Bioautografi TLC results indicate that mimba leaf can inhibit the growth of bacteria marked by tha formation of a clear zone with rf 0,4 in Staphylococcus aureus and Escherichia coli.  Which  act  as  antibacterial  compounds  againts  bacterial  Staphylococcus aureus and Escherichia coli is suspected saponins, which are formed purple with reagent SbCl3.
Keywords : Mimba leaf (Azadirachta indica A.Juss), Bioautografi TLC, Staphylococcus aureus, Escherichia coli

## PENDAHULUAN
Penyakit  infeksi  merupakan salah  satu  penyakit  yang  menjadi perhatian  serius  untuk  segera  diatasi (Kandhasamy dan Arunachalam, 2008).  Menurut  Profil  Kesehatan Indonesia tahun 2010, prevalensi dan jumlah  kasus  penyakit  infeksi  di Indonesia  lebih  tinggi  dibandingkan negara ASEAN yang lainnya.
Kasus  penyakit  infeksi  yang masih  banyak  terjadi  di  Indonesia diantaranya  disebabkan  oleh  bakteri Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus. Infeksi yang disebabkan oleh bakteri Eschericia coli seperti infeksi pada saluran kemih, diare, sepsis , dan meningitis (Jawetz et  al., 1995).
Sedangkan Staphylococcus aureus myebabkan  bisul,  jerawat, impetigo,  infeksi  luka, pneumonia , meningitis , osteomielitis , dan endokarditis (Plata dkk, 2009).
Tanaman  mimba  mempunyai banyak  manfaat  bagi  kehidupan manusia.  Daun  mimba  dimanfaatkan untuk penambah nafsu makan, disentri, borok, malaria dan antibakteri (Sudarsono et al ., 2002).
Pritima  dan  Pandian  (2008) menyebutkan  bahwa  ekstrak  daun mimba mampu menghambat Bacillus cereus, Enterococcus faecalis,
Eschericihia coli, Kleibsiella
pneumoniae,  Neisseria  gonohorreae,
Proteus mirabilis, dan
Staphylococcus aureus.

## METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  adalah seperangkat alat maserasi, gelas ukur, erlenmeyer, tabung reaksi, timbangan analitik,  lemari  pengering, rotary evaporator , autoklaf ,  lampu  spiritus, cawan  petri,  jarum  ose,  jangka sorong, pipa kapiler , chamber , Spray, LAF ( Laminar  Air  Flow ),  inkubator, kapas,  alumunium  foil,  lempeng silika  gel  gf  254.  Bahan  yang digunakan adalah daun mimba ( Azadirachta  indica A.  Juss),  etanol
70%,  aquadest,  Dimetil  sulfoksida (DMSO),  n-heksana,  etil  asetat, metanol, Nutrient  Agar (NA),
Nutrient  Broth (NB),  biakan  murni
Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus , Pereaksi semprot
: dragendorf,  FeCl 3 ,  SbCl 3 ,  liebarman bouchardat dan sitroborat.

## Prosedur Kerja
Maserasi  dilakukan  dengan  cara memasukkan  10  bagian  simplisia kedalam  sebuah  bejana,  dengan  75 bagian  cairan  penyari,  tutup,  biarkan selama  5  hari  terlindung  dari  cahaya sambil  sering  diaduk.  Setelah  5  hari
serkai,  peras,  cuci  ampas  dengan cairan  penyari  secukupnya  hingga diperoleh 100 bagian. Maserat diuapkan  pada  tekanan  rendah  pada suhu  tidak  lebih  dari  50 o C  (Anonim, 2010).
Pemisahan Senyawa Secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Ekstrak senyawa dengan konsentrasi  dibawah  ≤  1000  μg/mL dipisahkan secara KLT menggunakan fase diam selika gel GF 254. Ekstrak tersebut  ditotolkan  pada  plat  KLT, kemudian  dielusikan  dengan  fase gerak  berupa  Etil  asetat  :  Metanol  : Amoniak  25%    (85  :  10  :  5). Selanjutnya  diamati  di  bawah  lampu UV  254  dan  dihitung  nilai  Rf nodanya.

## Pembuatan Medium
Media  yang  digunakan  adalan media padat NA dan media cair NB. Media dibuat dengan melarutkan NA/ NB dalam aquadest kemudian dimasukan  dalam  erlenmeyer  dan ditutup dengan kapas lalu dipanaskan dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu  121ºC  dengan  tekanan  2  atm selama 15 menit
Peremajaan Bakteri
Bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherhia  coli yang  berasal  dari biakan  murni  diambil  satu  ose  lalu diinokulasikan dengan cara digoreskan  dengan  medium  NA secara  aseptic,  kemudian  diinkubasi pada suhu 37ºC selama 16-18 jam. Pembuatan Larutan Bakteri
Satu ose bakteri hasil
peremajaan  biakan  murni  dibiakkan dalam media cair NB dan dihomogenkan.  Media  cair  tersebut dibandingkan  dengan  larutan  standar kekeruhan  yang  dibuat  dari  0,5  ml 1,175  %              BaCl 2 2H 2 O  ditambah 99,5 ml H 2 SO 4 1 %.
Pengujian KLT- Bioautografi
Suspensi
Staphylococcus aureus dan Escherichia  coli di goreskan  ke  NA  menggunakan  lidi kapas steril hingga seluruh permukaan  NA  tertutup.  NA  di biarkan  selama  5-15  menit  agar suspensi  bakteri  dapat  meresap.
Setelah meresap, lempeng KLT yang telah  dielusi  diletakkan  di  atas permukaan  media  agar.  Setelah  30 menit lempeng tersebut diangkat dan dipindahkan,  kemudian  diinkubasi pada suhu 37ºC selama 16-18 jam.

## Identifikasi Senyawa Antibakteri
Noda  yang  membentuk  zona hambatan pada lempeng KLT disemprot  dengan  pereaksi  semprot untuk  menentukan  jenis  senyawa yang menghambat pertumbuhan
Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi
tumbuhan
dilakukan  di  Laboratorium  Fakultas Biologi Universitas Bengkulu.
Berdasarkan  surat  keterangan  nomor
208/UN30.28.LAB.BIOLOGI/PM/2
014  Hasil  menunjukkan  bahwa tumbuhan  uji  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah Mimba
( Azadirachta indica A.Juss)
Tabel I. Hasil karakteristik ekstrak etanol daun mimba (Azadirachta indica A.Juss)
Karakteristik Ekstrak Ekstrak EtanolDaun Mimba
a. Organoleptik
▪ Konsistensi
▪ Warna
▪ Bau
▪ Rasa Ekstrak Kental
Hitam Kehijauan Khas Pahit b. Susut Pengeringan 12 % c. Kadar Abu 5,5 %
Keterangan : * Memenuhi syarat kadar air bila < 30% (Voight, 1994) ** Memenuhi syarat kadar abu bila < 7 % (Anonim, 1989).
Sampel  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  bagian  daun mimba  ( Azadirachta  indica  A.  Juss ).
Sampel  daun  mimba  yang  telah dikumpulkan dibersihkan dari pengotor  dan  dicuci  dengan  air mengalir hingga bersih, lalu dirajang. Daun yang telah dirajang dikeringkan pada  suhu  kamar  terlindung  dari cahaya  matahari  langsung  untuk mengurangi kadar air dan
menghentikan reaksi enzimatik
sehingga  simplisia  dapat  disimpan dalam  waktu  yang  lebih  lama  tanpa terjadi penurunan mutu atau perusakan  simplisia  (Prasetyo  & Inoriah, 2013).
Ekstraksi  senyawa  kimia  yang terkandung  dalam  tumbuhan  daun mimba  ( Azadirachta  indica A.  Juss) dilakukan dengan menggunakan metode maserasi menggunakan pelarut  etanol  70% .  Proses  maserasi dilakukan  selama  5  hari  (Anonim, 2010). Selama perendaman dilakukan pengadukan  sesering  mungkin,  agar senyawa-senyawa yang terdapat pada simplisia  dapat  larut  dengan  baik. Ekstrak cair yang diperoleh kemudian diuapkan dengan menggunakan vacum  rotary  evaporator pada  suhu 50 o C,  sehingga  diperoleh  ekstrak
kental daun mimba. Tabel II. Hasil pemeriksaan kandungan ekstrak daun mimba (Azadirachta indica A.Juss) No. Senyawa Kimia Hasil Pengamatan Keterangan 1. Flavonoid Merah Jingga + 2. Saponin Terbetuknya busa + 3. Terpenoid Violet/ Biru + 4. Fenol Biru Kehitaman + 5. Steroid Biru - 6. Alkaloid Putih kuning/ jingga coklat + Keterangan : (+) menunjukkan reaksi positif (-)  menunjukkan reaksi negatif
Ekstrak  etanol  daun  mimba yang  diperoleh,  berwarna  hitam kehijauan,  memiliki  bau  khas,  rasa
yang  pahit  dan  kosistensi  berupa ekstrak  kental.  Selanjutnya,  ekstrak etanol daun mimba dilakukan
pemisahan  dengan  menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT).  Fase diam yang digunakan yaitu silica gel GF 254, sedangkan fase gerak berupa campuran pelarut etil asetat : metanol :  ammonia  (85:10:5).  Pada  awalnya fase  gerak  yang  digunakan  berupa campuran  n-heksan,  etil  asetat  dan metanol  dengan  perbandingan  2:6:1. Akan  tetapi  dengan  perbandingan tersebut  tidak  terjadi  pemisahan senyawa  sewaktu  mengelusi  ekstrak etanol  daun  mimba.  Oleh  karena  itu,
dilakukan optimasi pelarut
berdasarkan  pada  indeks  polaritas pelarut. Pada pengoptimasian pelarut/ eluen telah dilakukan optimasi dengan menggunakan beberapa perbandingan  n-heksan  :  etil  asetat  : metanol (3:2:1 ; 2:1:3 ; 1:3:2 ; 1:2:3 ; 4:1:1), n heksan : etil asetat (8:2 ; 2:8 ; 9:1 ; 1:9) Ternyata, pengoptimasian berdasarkan  indeks  polaritas  saja tidak cukup untuk dapat memisahkan senyawa  yang  terdapat  pada  ekstrak etanol  daun  mimba,  maka  perlu  ada
penambahan  sedikit  asam  etanoat atau  amonia  karena  masing-masing akan  meningkatkan  solut-solut  yang bersifat basa dan asam, dan agar dapat mengoptimasi fase gerak yang digunakan  (Sutrisno,  1993).  Oleh sebab  itu  fase  gerak  yang  digunakan menjadi  Etil  asetat  :  Metanol  : Amoniak 25%  (85 : 10 : 5).
Pada lempeng silica dibuat garis batas bawah dan batas atas. Jarak dari batas bawah adalah 2 cm dengan jarak penotolan  antar  sampel  masing- masing  2  cm  serta  jarak  tempuh pelarut dengan jarak 12 cm. Jarak 12 cm dikarenakan untuk menyesuaikan dengan cawan petri yang ada agar plat hasil elusi dapat ditempelkan. Selanjutnya  ektrak  ditotolkan  dan dielusi.  Setelah  selesai  bercak  noda diamati di bawah sinar UV 254. Hasil menunjukkan bahwa terjadi pemisahan  senyawa  dengan  terdapat 3 buah bercak noda pada Rf 0,40 Rf 0,55,  Rf  0,90  seperti  yang  terlihat pada tabel IV.
Tabel III. Hasil pemisahan senyawa ekstrak daun mimba (Azadirachta indica A.Juss) dengan kromatografi lapis tipis. Jarak Tempuh Noda Nilai Rf 4,8 cm 0,40 6,7 cm 0,55
10,9 cm 0,90 Uji Bioautografi dilakukan dengan menempelkan hasil elusi dari KLT  ke  masing-masing  permukaan agar  yang  telah  ditanami  bakteri Staphylococcus
aurus dan
Escherichia coli selama 30 menit dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam,  kemudian  diamati  zona  bening yang terbentuk. Pada bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing-masing
terdapat  zona  bening  pada  Rf  0,40. Hasil  penyemprotan  noda  yang menghambat tersebut dengan
pereaksi  SbCl 3 memberikan  warna
ungu yang  menandakan  bahwa senyawa yang besifat sebagai antibakteri  tersebut  adalah  saponin. Saponin  bekerja  sebagai  antibakteri dengan mengganggu stabilitas membran sel bakteri sehingga menyebabkan sel bakterilisis . Saponin  mengganggu  permeabilitas membran sel bakteri yang mengakibatkan  kerusakan  membran sel  dan  menyebabkan  keluarnya berbagai  komponen  penting  dari dalam sel bakteri  yaitu protein, asam nukleat  dan  nukleotida  (Ganiswarna, 1995)
Tabel IV. Hasil uji KLT- Bioautografi No Staphylococcus aureus Escherichia coli Nilai Rf Nilai Rf 1 0,40 0,40 Tabel V. Hasil identifikasi senyawa ekstrak daun mimba (Azadirachta indica A.Juss) dengan pereaksi semprot dari uji bioautografi Pereaksi Semprot Senyawa Teori Pengamatan Kandungan Kimia FeCl 3 Fenol Biru, Merah ungu, hijau, hitam kuat Orange kekuningan - dragendorff Alkaloid
Coklat jingga
Merah kecoklatan - Sitroborat Flavonoid Berpendar Putih - SbCl 3, Saponin Ungu, coklat Warna ungu pada sinar tampak Saponin Bourchad Terpenoid Biru kekuningan Merah kecoklatan -

## KESIMPULAN
Metode KLT-Bioautografi
dapat  digunakan  untuk  mengetahui kandungan  senyawa  ekstrak  etanol daun mimba yang mempunyai kemampuan
menghambat
pertumbuhan bakteri. Senyawa paling berperan  pada  daun  mimba  sebagai antibakteri  diduga  adalah  senyawa saponin.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim.,  1989, Materia  Medika Indonesia  Jilid  V ,  Departemen
Kesehatan  Republik  Indonesia,
Jakarta: 67-71.
Anonim.,  2010, Acuan  Sediaan Herbal , Badan POM RI, Jakarata: 6-8.
Anonim.,  2011, Profil  Kesehatan Indonesia  2010 ,  Kementerian Kesehatan  Republik  Indonesia, Jakarta. Ganiswarna S. G., 1995, Farmakologi dan Terapi, ed. IV , UI-Fakultas Kedokteran, Jakarta.
Jawetz  E.,  J.  L.  Melnick,  E.  A.
Adelberg,  G.  F.  Brooks,  J.  S. Butel,  L.  N.  Ornston.,  1995, Mikrobiologi  Kedokteran,  ed. XX ,  University  of  California,
San Francisco.
Kandhasamy M., Arunachalam K.D.,
2008, Evaluation  of  in  vitro antibacterial property of seaweeds  of  southeast  coast  of India , African Journal of Biotechnology  Vol  7  (12),  pp,
1958-1951. Plata,  K.,  Rosato,  A,  E.,  and Wegrzyn, G., 2009, Staphylococcus  aureus  as  an infectious  agent:  overview  of biochemistry  and  molecular genetics  of  its  pathogenicity ,
Acta  Biochimica  Polonica  56
(4): 597-612.
Prasetyo  dan  Inoriah  Entang.,  2013, Pengelolaan Budidaya Tanaman Obat-Obatan (Simplisia) ,  Badan  Penerbitan Fakultas Pertanian UNIB,
Bengkulu:   17-20. Pritima,  R.A.  and  Pandian,  R.S., 2008, Antibacterial  Potency  of Crude  Extract  of  Azadirachta indica  A.  Juss  (Leaf)  Against Mirobes  Causing  Reproductive Tract Infections Among Women , Current Biotica, vol. 2,
pp. 2-6.
Sudarsono, Gunawan, D., Wahyuono,
S., Donatus, A.I., dan Purnomo, 2002, Tumbuhan Obat II, Hasil Penelitian, Sifat-Sifat, dan Penggunaan ,  Pusat  Studi  Obat Tradisional UGM, Yogyakarta.
Sutrisno, B., 1993, Pereaksi Kromatografi Lapis Tipis, Fakultas  Farmasi  Universitas Pancasila, Jakarta. Voight,  R.,  1994, Buku  Pelajaran
Teknologi  Farmasi Edisi  V ,
Gadjah  Mada  University  Pres. Yogyakarta.