Optimasi Suhu Annealing untuk Amplifikasi DNA Padi Hasil Persilangan Varietas Tahan Terendam dengan Metode Polymerase Chain Reaction
Septi Lora Aulia 1*) , Rujito Agus Suwignyo 2 , Mery Hasmeda 3 *e-mail: septiloraauliaia2@gmail.com
1 Program Studi Ilmu Tanaman, Pasca Sarjana, Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya, Indonesia
2,3 Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya, Indonesia

## ABSTRACT
This study aims to optimize the annealing temperature for  DNA amplification from crosses of submerged resistant varieties by polymerase chain reaction method. The research  was  conducted  from  February  until  May  2021  at  the  Plant  Physiology Laboratory  of  the  Agronomy  Study  Program,  Faculty  of  Agriculture,  Sriwijaya University, Indralaya. The data obtained in this study is descriptive data by identifying the presence or absence of amplified bands from electrophoresis results. the results of this  study  can  be  concluded  that  all  primers  can  amplify  all  DNA  bands  with  good quality.  There  is  an  effect  of  annealing  temperature  on  the  PCR  program  on  the success  of  rice  DNA  amplification.  The  optimal  annealing  temperature  for  15  SSR primers for rice DNA amplification were Rm 8300 : 55 °C, Rm Sub1c173 : 55 °C, Rm 234 : 54.8 °C, Rm 3459 : 56,8°C, Rm 219: 59,5 °C, Rm 589 : 54,8 °C, Rm 258 : 56,8 °C, Rm 3701 : 55,2°C, Rm 1261: 55,2 °C, Rm 164 : 55,2 °C, Rm 443: 54,4 °C,  Rm 266 : 57,8 °C, Rm 248 : 53,5 °C, Rm 282 : 55,7 °C, Rm 241:°C: 53,9 °C.
Keyword : annealing, amplification, rice, PCR

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengoptimasi  suhu annealing untuk  amplifikasi dna padi hasil persilangan varietas tahan terendam dengan metode polymerase chain  reaction. Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan  Februari-Mei  2021    di Laboratorium  Fisiologi  Tumbuhan  Program  Studi  Agronomi,  Fakultas  Pertanian, Universitas Sriwijaya Indralaya. Data   yang   diperoleh  dalam penelitian ini adalah data  deskriptif  dengan  cara  mengidentifikasi  ada  atau    tidak  adanya  band  yang teramplifikasi  dari  hasil  elektroforesis.  Dari  hasil  penelitian  ini  dapat  disimpulkan bahwa semua primer dapat mengamplifikasi  semua  pita  DNA  dengan kualitas baik. Ada  pengaruh  suhu annealing pada  program  PCR  terhadap  keberhasilan  amplifikasi DNA padi. Suhu annealing yang optimal untuk 15 primer SSR pada amplifikasi DNA padi yaitu  Rm 8300 : 55 °C, Rm Sub1c173 : 55 °C, Rm 234 : 54.8 °C, Rm 3459 : 56,8°C, Rm 219: 59,5 °C, Rm 589 : 54,8 °C, Rm 258 : 56,8 °C, Rm 3701 : 55,2°C, Rm 1261: 55,2 °C, Rm 164 : 55,2 °C, Rm 443: 54,4 °C,  Rm 266 : 57,8 °C, Rm 248 : 53,5 °C, Rm 282 : 55,7 °C, Rm 241:°C: 53,9 °C.
Kata kunci : annealing , amplifikasi, padi, PCR

## PENDAHULUAN
Salah  satu  upaya  yang  dapat dilakukan  untuk  tetap  meningkatkan produksi  padi  yaitu  dengan  cara memanfaatkan  lahan  rawa.  Lahan  rawa merupakan lahan sub optimal yang sangat potensial  dimanfaatkan  untuk  berbagai kegiatan  pertanian.  Indonesia  memiliki 33,43  juta  ha  lahan  rawa  dan  13,29  juta ha  diantaranya  merupakan  lahan  rawa lebak  dari  total  tersebut  hanya  9,53  juta ha  yang  sesuai  untuk  kegiatan  budidaya pertanian,  dan  baru  sekitar  23,8  %  yang sudah dimanfaatkan. (Haryono, 2012) Lahan  rawa  lebak  merupakan salah  satu  alternatif  lahan  suboptimal yang dapat dimanfaatkan sebagai penyangga  ketahanan  pangan  nasional. Namun  demikian,  dibandingkan  dengan lahan  rawa  pasang  surut,  pengelolaan lahan  rawa  lebak  masih  relatif  tertinggal karena  pola  usaha  tani  yang  dilakukan masih  sangat  tergantung  pada  kondisi alam (Irmawati et al ., 2015). Lahan rawa lebak  yang  spesifik  dengan  karakternya yang  marjinal  memerlukan  penanganan yang  khusus  dan  berbeda  dengan  jenis lahan lainnya (Suwignyo, 2016).
Kendala utama pengembangan usaha tani pada  lahan  rawa  lebak  adalah  genangan pada  musim  hujan  dan  kekeringan  pada musim  kemarau  yang  belum  dapat diprediksi (Djafar, 2013).
Kendala  yang  sering  dihadapi petani dalam budidaya padi di lahan rawa lebak  adalah  sulitnya  memprediksi tingginya  genangan  air,  sehingga  petani kerap  kali  menghadapi  kondisi  dimana tanaman  padi  akan  mengalami  kondisi cekaman  terendam  pada  fase  vegetatif (Sulaiman et  al .,  2014).  Cekaman terendam akan menyebabkan terganggunya pertumbuhan serta
produksi  tanaman padi  (Suwignyo et  al ., 2012).  Salah  satu  solusi  yang  dapat diterapkan  untuk  mengatasi  masalah tersebut  adalah  menggunakan  varietas
padi  yang  adaptif  di  lahan  rawa  lebak (Dirgasari et al. , 2019).
Peningkatan  produktivitas  padi dengan  menggunakan  varietas  padi  yang adaptif  di  lahan  rawa  lebak  dapat dilakukan  melalui        pendekatan molekuler. Upaya peningkatan produktivitas     padi     dapat dilakukan melalui     pemuliaan varietas khususnya peningkatan      adaptasi-adaptasi  terhadap kondisi   lingkungan   lahan   rawa lebak. Penggunaan  varietas  padi  yang  toleran rendaman  merupakan  pilihan  yang strategis  dalam  mengatasi  permasalahan yang ditimbulkan oleh banjir pada daerah lahan rawa lebak.
Beberapa  teknik  molekuler yang dapat digunakan untuk mengetahui  genotip  suatu  individu salah  satunya  adalah  dengan  PCR (Polymerase  Chain  Reaction) .  Analisis genetik dengan menggunakan metode PCR yang memanfaatkan cara replikasi  DNA  dengan  bantuan primer yang mengapit daerah tertentu dan  optimasi  suhu  dilakukan  untuk mendapatkan  kondisi  PCR  yang optimal,  sehingga  dihasilkan  produk PCR spesifik yaitu terbentuk pita DNA tebal.  Untuk  mendapatkan  kondisi PCR  yang  optimal  secara  umum dapat dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR tersebut. Muladno (2010) mengemukakan bahwa  PCR  merupakan  reaksi  yang menggandakan jumlah molekul DNA pada  target  tertentu,  dengan  cara mensintesis molekul DNA yang  baru yang  berkomplemen  dengan  molekul DNA target tersebut.
Untuk  mendapatkan  pita  PCR yang tebal maka perlu dilakukan optimasi suhu  annealing  pada  primer  yang  akan digunakan  T m akan  menjadi  dasar  dalam menentukan  suhu  annealing  (Ta).  Ta
yang  terlalu  tinggi  akan  menyebabkan terlepasnya primer yang sudah menempel pada DNA cetakan sehingga produk PCR tidak akan terbentuk, sebaliknya Ta yang terlalu rendah akan menyebabkan terjadinya penempelan primer yang tidak spesifik  pada  DNA  cetakan.  Besarnya suhu annealing dapat ditentukan berdasarkan  nilai  T m dari  primer  yang akan  digunakan  (Asy’ari  et  al.  2005). Proses annealing merupakan  proses yang  sangat  penting  untuk  mencari suhu optimum sehingga bisa diperoleh  DNA  hasil  dalam  jumlah yang  maksimum  pada  daerah  yang ditargetkan sehingga cukup memudahkan  bagi  analisis  DNA. Penelitian ini bertujuan
untuk mengoptimasi  suhu annealing untuk amplifikasi dna padi hasil persilangan varietas  tahan  terendam  dengan metode polymerase chain reaction.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  dilaksanakan  pada bulan Februari-Mei 2021 di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Program  Studi  Agronomi,  Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya Indralaya. Bahan Penelitian Bahan tanam yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  aksesi  BC 1 F 1 ,  Inpago  5  dan Inpara  8.  Total  primer  yang  digunakan dalam penelitian ini berjumlah 15  primer SSR  yang  letaknya  tersebar  pada  12 kromosom  yang  terdiri  dari  2  primer untuk  seleksi  foreground  dan  sisanya  13 primer digunakan untuk seleksi background .  Sekuen  untuk  primer  yang digunakan  pada  seleksi foreground ditampilkan pada Tabel  1 dan sekuen 13 primer background ditampilkan  pada Tabel 2.

## 1. Isolasi DNA
Sampel  daun  tanaman  padi berusia  14  HST  diambil  daunnya  untuk
isolasi  DNA.  Isolasi  DNA  dilakukan Menggunakan  KIT  isolasi Wizard Genomic  Puryfication  System Promega. Dipilih daun padi yang muda, bersih, dan tidak  rusak.  Sampel  daun  disimpan  di dalam freezer selama  1  minggu  untuk mempermudah  penggerusan.  Daun  yang telah  dibekukan  diambil  sebanyak  0,1  g untuk kemudian digerus sampai halus dan ditambahkan Nuclei Lysis  Solution sebanyak  600  µL.  Larutan  sampel  yang terbentuk kemudian dihomogenkan menggunakan  alat vortex selama  1 sampai  3  detik.  Setelah  homogen diinkubasi  di waterbath pada  temperatur 65 o C  selama  15  menit.  Larutan  sampel selanjutnya ditambahkan 200 µL Protein Precipitation Soution , lalu dihomogenkan menggunakan  alat vortex selama  20 detik.
Larutan  sampel  yang  terbentuk kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm selama  3  menit. Supernatant yang terbentuk  selanjutnya  dipindahkan  ke microtube baru dan ditambahkan isopropanol  0,6  volume.  Selanjutnya larutan  sampel  di- mix sampai  terlihat DNA  yang  masih  berupa  benang  putih. Larutan sampel yang tebentuk selanjutnya  disentrifugasi  pada  13.000 rpm  selama  1  menit.  Selanjutnya supernatant yang  terbentuk  dibuang untuk  kemudian  endapan  sampel  yang tersisa  ditambahkan  600  µL  etanol  70%. Larutan sampel selanjutnya disentrifugasi pada  13.000  rpm  selama  1  menit. Supernatant yang  terbentuk  dibuang  dan endapan  yang  tersisa  (pelet  DNA) dikeringkan selama ± 15 menit pada suhu ruangan.  Endapan  yang  merupakan sampel DNA kemudian ditambahkan 100 µL  DNA Rehydration  Solution untuk selanjutnya  disimpan  pada  suhu  2 o -  8 o C. Hasil  isolasi  DNA  yang  diperoleh kemudian dievaluasi kualitas dan kuantitasnya.

## 2. Analisis Penanda Molekuler PCR

## Analisis Penanda Molekuler PCR
Pengamatan molekuler dilakukan dengan tahap    persiapan  template  DNA, amplifikasi  DNA,  elektroforesis  gel, kuantifikasi hasil elektroforesis gel,    dan analisis        data. Sebelum      digunakan dalam   proses   PCR    primer    (Tabel 2.)    diencerkan menggunakan aquabides steril.  Volume  yang  ditambahkan  ke masing-masing tabung   utama    dihitung dengan  berat  molekul  utama  yang tercantum    pada    setiap  tabung.    Reaksi PCR dilakukan pada volume total  12 μL untuk  setiap  mikrotube.  Setiap  reaksi PCR  terdiri  dari  6,25  μL  MyTag  DNA polymerase  red  mastermix,    0.5    μL primer    Forward  dan  Reverse,  0,5  μL DNA  template,  dan  4,75    μL aquabides (ddH 2 o).
Amplifikasi        DNA  dilakukan dengan        menggunakan  alat  PCR  (Bio- rad). Pra denaturasi  dilakukan  pada  94 °C  selama  5  menit, diikuti   oleh   35 siklus   dengan   suhu   dan waktu  setiap siklus  denaturasi  pada  94  °C selama  1 menit.  (Iftekharuddaula et,  al 2015) Annealing    telah    dilakukan  dengan menggunakan    gradien    annealing    pada 53°C, 53.2 °C, 53.5°C, 53.9 °C, 54.3 °C, 54.8  °C,    55.2  °C,  55.7  °C,  57  °C,
56.1°C, 56.5 °C, 56.8 °C, dan 60°C  yang naik secara  bertahap,  masing-masing  11 siklus  selama    1    menit,    dan    elongasi pada  72  °C  selama    2    menit.    Siklus terakhir  diikuti    oleh    pasca    elongasi pada    72    °C  selama  5    menit.        Hasil PCR    diamati menggunakan  perangkat elektroforesis dan disimpan pada -30 °C.

## 3. Deteksi Produk PCR
Lempeng  Produk  PCR  dideteksi dengan elektroforesis gel agarosa 1 % b/v (0,3  g agarosa dalam 30 mL buffer TAE 1  kali).  Larutan  agarosa  yang  sudah dipanaskan  diberikan  larutan  1  µl pewarna  dna gel  red lalu  dituangkan  ke dalam  cetakan  agar  elektroforesis  dan dibiarkan  mengeras.  Setelah  mengeras, gel  agarosa  dipasang  dalam  chamber elektroforesis  dan  sisir  pada  gel  dicabut, larutan  TAE  dituang  sampai  melebihi permukaan gel. Selanjutnya, 0,5 ladder + 1,5  µL loading  dye ,    1  µL  sampel  hasil PCR + 3 µL loading dye dimasukkan ke dalam  sumur  yang  terbentuk  dari  sisir. Kemudian dielektroforesis pada tegangan 75  volt  selama  35  menit.  Hasil elektroforesis  kemudian  divisualisasi pada UV transilluminator.
Tabel 1. Marka molekuler yang digunakan dalam Foreground Selection ( Iftekharuddaula et, al 2015)
No Marker Nucleotide
Chromosom
1 RM8300 F 20-mer oligo (25 nmole  scale, PCR  Grade, 3
OD) 9 GCT AGT GCA GGG TTG ACA CA RM8300 R 20-mer oligo (25 nmole  scale, PCR  Grade, 3
OD) CTC TGG CCG TTT CAT GGT AT
2
Sub1c173 F
19-mer oligo (25 nmole  scale, PCR  Grade, 3
OD) 9 AAC GCC AAG ACC AAC TTC C Sub1c173 R 19-mer oligo (25 nmole  scale, PCR  Grade, 3

## OD)
AGG AGG CTG TCC ATC AGG T

## Tabel 2. Marka molekuler yang digunakan dalam Background  Selection
(Susanto et al ,2014)
No Marker
Nucleotide Chromosom 1 RM234 F
19-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 7 ACA GTA TCC AAG GCC CTG G RM234 R 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) CAC GTG AGA CAA AGA CGG AG 2 RM3459 F
20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 8 ATG GAC TTT CGA GAA TGT TG RM3459 R 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) GAG TAC GAA ATG AAG GCA AG 3 RM219 F
20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 9 CGT CGG ATG ATG TAA AGC CT RM219 R 18-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) CAT ATC GGC ATT CGC CTG 4 RM589 F 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) 6 ATC ATG GTC GGT GGC TTA AC RM589 R 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) CAG GTT CCA ACC AGA CAC TG 5 RM258 F
20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 10 TGC TGT ATG TAG CTC GCA CC RM258 R 19-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) TGG CCT TTA AAG CTG TCG C 6 RM3701 F
20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 11 GAG CTA GAG GGA GGA GGT GC RM3701 R 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) TTG ACT GAT AGC CGA TTG GG 7 RM1261 F
20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 12 GTC CAT GCC CAA GAC ACA AC RM1261 R 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) GTT ACA TCA TGG GTG ACC CC 8 RM164 F
24-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 5 TCT TGC CCG TCA CTG CAG ATA TCC RM164 R 24-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) GCA GCC CTA ATG CTA CAA TTC TTC 9 RM443 F 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) 1

## GAT GGT TTT CAT CGG CTA CG
RM443 R 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) AGT CCC AGA ATG TCG TTT CG 10 RM266 F
19-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 2 TAG TTT AAC CAA GAC TCT C RM266 R 19-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) GGT TGA ACC CAA ATC TGC A 11 RM248 F
20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 7 TCC TTG TGA AAT CTG GTC CC RM248 R 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) GTA GCC TAG CAT GGT GCA TG 12 RM282 F
19-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 3 CTG TGT CGA AAG GCT GCA C RM282 R 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD) CAG TCC TGT GTT GCA GCA AG 13 RM241 F
20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3
OD) 4 GAG CCA AAT AAG ATC GCT GA RM241 R 20-mer oligo (25 nmole scale, PCR Grade, 3 OD)

## TGC AAG CAG CAG ATT TAG TG

## Analisis Data
Data      yang      diperoleh    dalam penelitian  ini  adalah  data  deskriptif dengan  cara  mengidentifikasi  ada  atau tidak  adanya  band  yang  teramplifikasi dari hasil elektroforesis.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan  hasil  amplifikasi PCR menunjukkan  pita-pita  DNA  yang jelas    dan    terang  serta  tidak  ada smear yang    signifikan    mempengaruhi visualisasi    pita    DNA  Sehingga identifikasi  pita    DNA    dilakukan. Smear terjadi  karena  RNA    dan  protein ataupun    kontaminan    lainnya    yang kemudian terbawa dalam proses elektroforesis.   Hasil analisis   PCR juga dipengaruhi    oleh    penggunaan    KIT isolasi  DNA    serta    penggunaan    larutan purifikasi  DNA.    Penggunaan    KIT
untuk isolasi DNA sangat mempengaruhi        kemurnian        DNA (Simarmata  &  Rustikawati,  2015). Primer      memiliki      tingkat      spesifitas terhadap    DNA    target.    Primer    yang tidak  spesifik      dapat      menyebabkan mispriming atau    bahkan    tidak    dapat mengamplifikasi DNA. Menurut
Hairmansis    &    Aswidinnoor  (2005), bahwa   dasar   dari   keberhasilan proses PCR terletak pada kesesuaian primer dan efisiensi    serta    optimasi    proses    PCR. Primer    yang    tidak    spesifik    dalam proses  PCR    dapat    menyebabkan teramplifikasinya daerah    lain    dalam genom        yang  tidak  dijadikan    sebagai sasaran  atau  sebaliknya tidak ada daerah genom yang teramplifikasi.
Tahap annealing pada
penelitian        ini  memerlukan        suhu yang        spesifik        dan  optimum.  Untuk mendapatkan  suhu  annealing  yang
spesifik dan optimum maka dilakukanlah optimalisasi        dengan        cara menggunakan gradien suhu yang terdapat di  mesin    PCR.    Cara    kerja    gradien suhu  yaitu dengan   cara   mencari   suhu spesifik      dan  optimum    pada    kisaran suhu    tertentu    (suhu  terendah  dan  suhu tertinggi) dimana primer dapat mengamplifikasi    DNA    target.    Suhu annealing  yang  tidak  spesifik  dan optimum dapat  menyebabkan  terjadinya mispriming yaitu primer mengamplifikasi    daerah    yang  bukan menjadi      target      atau      bahkan      tidak teramplifikasiya DNA target.Berdasarkan  penelitian  Langga et al .(2012),didapatkan bahwa proses pelekatan    primer    pada    DNA  target sangat    dipengaruhi    oleh    pengaturan suhu    pada    fase  annealing.    Perubahan suhu satu   derajat   akan   menyebabkan primer  gagal    melekat    pada    DNA target.  Menurut  Uslan          & Pharmawati,     (2015),     suhu annealing merupakan      kisaran      suhu      yang membuat          pasangan          primer menempel  dengan  komplemenya  pada DNA  target  saat  proses        PCR.       Suhu annealingsangat menentukan keberhasilan    amplifikasi.    Hal  ini disebabkan  karena  proses  pemanjangan DNA      dimulai      dari      primer.      Suhu yang  umum  digunakan  pada  saat annealing yaitu 50-60 o C. Metode   isolasi DNA      Wizard      Genome      DNA
Purification (KIT Promega) telah memenuhi      syarat      untuk      digunakan
pada    penelitian    molekuler.  Hasil amplifikasi  PCR  menggunakan  15 primer dengan berbagai suhu annealing yang  berbeda.    Annealing telah    dilakukan  dengan    menggunakan gradien  annealing  pada  53°C, 53.2 °C, 53.5°C, 53.9 °C, 54.3 °C, 54.8 °C,  55.2 °C, 55.7 °C, 57 °C, 56.1°C, 56.5 °C, 56.8 °C,  dan  60°C    yang    naik  secara bertahap,    masing-masing    11    siklus selama  1  menit,  dan  elongasi  pada 72 °C  selama    2    menit.    Siklus    terakhir diikuti    oleh    pasca    elongasi    pada    72 °C  selama  5    menit  telah  didapat  suhu annealing yang optimum untuk amplifikasi  DNA  padi  hasil  persilangan padi  varietas  tahan  rendam  (tabel  3). Suhu annealing yang  optimal  untuk  15 primer  pada  amplifikasi  DNA  padi  yaitu Rm 8300 : 55 °C, Rm Sub1c173 : 55 °C, Rm 234 : 54.8 °C, Rm 3459 : 56,8°C, Rm 219: 59,5 °C, Rm 589 : 54,8 °C, Rm 258 :  56,8  °C,  Rm  3701  :  55,2°C,  Rm  1261: 55,2 °C, Rm 164 : 55,2 °C, Rm 443: 54,4 °C,  Rm 266 : 57,8 °C, Rm 248 : 53,5 °C, Rm  282  :  55,7  °C,  Rm  241:°C:  53,9  °C Hasil  dari  setiap  elektroforesis  dengan suhu  annealing  optimum  ditunjukkan pada gambar (1-5).   Pada visualisasi  pita hasil elektroforesis disetiap primer  yang diuji ada semua band dna sehingga dapat dilanjutkan ke analisis molekuler selanjutnya yaitu forground dan background selection  DNA  padi  dengan suhu  annealing  optimum  yang  didaapat dari hasil optimasi.
Gambar 1. Hasil amplifikasi DNA  pada primer Rm 8300, Rm Sub1c173, dan Rm 234 ( Keterangan : Ta = Suhu Annealing, v1 = BC 1 F 1 , v2=Inpago 5, dan v3 = Inpara 8)
Gambar 2. Hasil amplifikasi DNA  pada primer Rm 3459, Rm 219, dan Rm 589 ( Keterangan : Ta = Suhu Annealing, v1 = BC 1 F 1 , v2=Inpago 5, dan v3 = Inpara 8)
Gambar 3. Hasil amplifikasi DNA  pada primer Rm 258, Rm 3701, dan Rm 1261 ( Keterangan : Ta = Suhu Annealing, v1 = BC 1 F 1 , v2=Inpago 5, dan v3 = Inpara 8)
Gambar 4. Hasil amplifikasi DNA  pada primer Rm 164, Rm 443, dan Rm 266 ( Keterangan : Ta = Suhu Annealing, v1 = BC 1 F 1 , v2=Inpago 5, dan v3 = Inpara 8)
Gambar 5. Hasil amplifikasi DNA  pada primer Rm 248, Rm 282, dan Rm 241 ( Keterangan : Ta = Suhu Annealing, v1 = BC 1 F 1 , v2=Inpago 5, dan v3 = Inpara 8)
Tabel 3. Suhu annealing yang optimal untuk 15 primer SSR
No  Primer Suhu Annealing yang optimal (°C) 1  RM8300 55 2  Sub1c173 55 3  RM234 54,8 4  RM3459 53 5  RM219 59,5 6  RM589 54,8 7  RM258 56,8 8  RM3701 55,2 9  RM1261 55,2 10  RM164 55,2 11  RM443 54,4 12  RM266 57,8 13  RM248 53,5 14  RM282 55,7 15  RM241 53,9
Pada  sumur  1  ( Ladder )  dan sumur 2 (sampel dari BC 1 F 1 ) sumur 2 (sampel  dari  Inpago  5),  sumur  3 (sampel  dari  Inpara  8)  terlihat  pita DNA yang terbentuk dan mengumpul (tidak  menyebar).    Tingkat ketebalan pita  DNA  ditentukan  dari  kemurnian atau  proses  ekstraksi  yang  kurang tepat  pada  sampel  yang  diamati, sehingga      menyebabkan      sampel tersebut  tidak  memiliki  kualitas  yang
bagus.  Ketebalan  pita  DNA  padi  yang paling bagus terdapat pada sampel 1, 2, dan  3  pada  optimasi  primer  Rm  589. Menurut  Irmawati  (2003)  mengatakan bahwa  pita  DNA  yang  tebal  dan mengumpul (tidak menyebar) menunjukan  konsentrasi  yang  tinggi dan  DNA  total  yang  diekstrak  dalam kondisi  utuh,  sedangkan    pita  DNA yang  terlihat  menyebar  menunjukan adanya ikatan antar molekul DNA yang
terputus  pada  saat  proses  ekstraksi berlangsung,  sehingga  genom  DNA terpotong  menjadi  bagian-bagian  yang lebih  kecil.  Terputusnya  ikatan  antar molekul tersebut dapat disebabkan oleh adanya  gerakan  fisik  yang  berlebihan yang  dapat  terjadi  dalam  proses pemipetan,  pada  saat  dibolak-balik dalam ependorf, disentrifus,  atau bahkan  karena  temperatur  yang  terlalu tinggi dan karena aktivitas bahan-bahan kimia  tertentu.  Variasi    genetik berdasarkan    pola    pita    DNA  hasil amplifikasi    ini    dapat    dijadikan    dasar dalam  proses  penyusuan  pemuliaan tanaman  atau  perakitan  varietas  unggul. Variasi  genetik  merupakan  informasi dasar    dalam    menyusun    strategi konservasi      pemuliaan,      pengelolaan, dan pemanfaatan  sumber  daya  genetik secara berkelanjutan

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  ini dapat  disimpulkan  bahwa  Semua  primer dapat  mengamplifikasi    semua    pita DNA    dengan  kualitas  baik.  Ada pengaruh  suhu annealing pada  program PCR  terhadap  keberhasilan  amplifikasi DNA padi. Suhu annealing yang optimal untuk  15  primer  pada  amplifikasi  DNA padi  yaitu    Rm  8300  :  55  °C,  Rm Sub1c173 : 55 °C, Rm 234 : 54.8 °C, Rm 3459 : 56,8°C, Rm 219: 59,5 °C, Rm 589 : 54,8 °C, Rm 258 : 56,8 °C, Rm 3701 : 55,2°C,  Rm  1261:  55,2  °C,  Rm  164  : 55,2  °C,  Rm  443:  54,4  °C,    Rm  266  : 57,8  °C,  Rm  248  :  53,5  °C,  Rm  282  : 55,7  °C,  Rm  241:°C:  53,9  °C.  suhu annealing optimal    yang  didapat  akan digunakan  pada  analisis  MABc  ( Marker Assisted  Backrosing )  dengan  analisis forground dan background seletion  pada DNA  padi  hasil  Persilangan  varietas tahan terendam

## UCAPAN TERIMA KASIH
Kami  berterimah  kasih  atas pendanaan  yang  diberikan  oleh  rektor Universitas  Sriwijaya  yang  membiayai penelitian  ini  dibawah  skema  Penelitian Unggulan  Profesi  dengan  menggunakan dana  hibah  Universitas  Sriwijaya    SP DIPA023.17.2.677515/2020,  Keputusan Rektor  No 0687/UN9/SK.BUK.KP/2.

## DAFTAR PUSTAKA
Asy’ari  M,  Noer  AS. (2005).  Optimasi konsentrasi MgCl 2 dan suhu annealing  pada  proses  amplifikasi multifragmens mtDNA dengan metode PCR. JKSA VIII(1):24-28. Dirgasari, K. D. E., M. Hasmeda., dan U. Harun.  (2019).  Pengujian  Berbagai Varietas  Padi  ( Oryza  Sativa L.) terhadap  Kondisi  Cekaman  Fe2+  di Lahan  Pasang  Surut. Agrosainstek:
Jurnal Ilmu dan Teknologi Pertanian
3(1): 30 – 35.
Djafar,  Z.R.  (2013).  Kegiatan  agronomis untuk  meningkatkan  potensilahan lebak    menjadi  sumber  pangan.
Jurnal Lahan Suboptimal 2(1): 58 – 67 Haryono.
(2012). Lahan Rawa Lumbung  Pangan  Masa  Depan Indonesia.  IAARD  Press.  Badan Penelitian dan Pengembangan
Pertanian. Jakarta.
Iftekharuddaula,  Khandakar  Md,  Ahmed,
H.  U.,  Ghosal,  S.,  Moni,  Z.  R.,
Amin,  A.,  &  Ali,  M.  S.  (2015). Development  of  New  Submergence Tolerant Rice Variety for Bangladesh  Using  Marker-Assisted
Backcrossing. Rice  Science , 22 (1),
16 – 26. https://doi.org/10.1016/j.rsci.2015.05 .003 Irmawati. (2003). Perubahan Keragaman Genetik Ikan Kerapu Tikus Generasi  Pertama  Pada  Stok Hatchery. Thesis. Bogor: IPB
Irmawati, H. Ehara,  Rujito  A.
Suwignyo,  and  Jun-Ichi  Sakagami. (2015).  Swamp  rice  cultivation  in South  Sumatera,  Indonesia:  an Overview.  Trop.  Agr.  Develop. 59(1):35-39. Muladno.  (2010). Teknologi  Rekayasa Genetik  Edisi  Kedua .  Bogor  :  IPB Press.
Sulaiman,  F.,  R.  A.  Suwignyo.,  dan  M. Hasmeda.  (2014).  Studi Peningkatan Ketahanan Bibit Padi Lebak terhadap Kondisi Cekaman Terendam melalui Perlakuan  Zn  dan  Pemupukan  N.
Jurnal  Lahan  Suboptimal. 3(2): 145 – 51.
Susanto,  Untung.,    Satoto,  Nofi  A Rohmah,  dan  Made  Jana Mejaya. (2014) . Similarity of 26 New  Released  Rice  Varieties and  Rice  Parental  Hybrids Based  on  36  SSR  Markers
. Jurnal  Penelitian  Pertanian Tanaman Pangan 33(2):71-75 Suwignyo,  R.  A.,  A.Wijaya.,  dan  H.
Sihombing. (2012). Modifikasi Aplikasi Unsur Hara Untuk Perbaikan Vigorasi Bibit Padi Dalam Cekaman  Terendam. Jurnal  Lahan
Suboptimal . 1(1): 1 – 11. Suwignyo,  R.A.  (2016). Efforts  and strategy  to  improve  productivity  of suboptimal  land  in Indonesia. ICCAE  5th  Open  Seminar  in AY2016,  December  13  2016. International  Center  for  Research and  Education  in  Agriculture (ICREA). Nagoya University,
Nagoya Japan.
Simarmata    M&    Rustikawati.    (2015).
Identifikasi      Genetik      Kultivar
Padi  Gogo    dengan    Menggunakan
Marka RAPD. Akta Agrosia, 18(2):1 – 10.
Hairmansis      A      &      AswidinnoorH. (2005).  Evaluasi    Daya    Pemulih Kesuburan  Padi    Lokal    dari Kelompok  Tropical  Japonica,  Jurnal Agronomi Indonesia 6(4):1 – 6.
Langga  I.F,  Restu  M  &  Kuswinanti T. (2012).    Optimalisasi    Suhu    dan Lama Inkubasi    Dalam    Ekstraksi DNA  Tanaman        Bitti        ( Vitex CofassusReinw )      serta      Analisis Keragaman  Genetik.  J        Sains       & Teknologi, 12(3):265 – 276.
Uslan    &    PharmawatiM.    (2015). Optimasi  Konsentrasi    DNA    dan MgCl 2 pada  Reaksi Polymerase Chain
Reaction-Random Amplified        Polymorphic DNA untuk      Analisis      Keragaman Genetik Tanaman Faloak ( Sterculia quadrifida R.Br) ( Optimization    of  DNA    and MgCl2Concentrations in Polymerase  Chain  Reaction . Jurnal
Bioslogos, 5(1):1639.