Isolasi, Identifikasi dan Karakteristik Antimicrobial Resistance Staphylococcus cohnii

## Dari Perairan Semarang
Siti Nur Kholishah(1,2), Diah Permata Wijayanti(1), Mada Triandala Sibero(1,2*)
1Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro, Jawa Tengah 2Laboratorium Natural Product, UPT Laboratorium Terpadu, Universitas Diponegoro, Jawa Tengah
sitinurkholishah@students.undip.ac.id (1), diahpermata@lecturer.undip.ac.id (2), madatriandalasibero@lecturer.undip.ac.id (Ca*)

## ABSTRAK
Resistensi bakteri terhadap antibiotik merupakan salah satu masalah utama di bidang kesehatan saat ini, salah satunya  adalah  bakteri Staphylococcus  cohnii. Bakteri  tersebut  dapat  hidup  di  berbagai  habitat  termasuk lingkungan perairan. Cemaran antibiotik di lingkungan perairan adalah salah satu faktor yang meningkatkan resistensi  bakteri.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  profil  resistensi  bakteri Staphylococcus  cohnii dari  perairan  Semarang.  Isolat  didapat  dari  koleksi  Laboratorium  Natural  Product  Universitas  Diponegoro. Isolat  kemudian  dikarakterisasi  secara  morfologi  dan  diidentifikasi  secara  molekuler.  Selanjutnya  resistensi isolat terhadap antibiotik diuji dengan metode Antimicrobial Susceptibility Test (AST). Diameter zona bening kemudian diukur setelah 24 jam dan disesuaikan dengan standar CLSI 2021.  Karakteristik morfologi koloni ATL.215  yaitu  berbentuk  cicular  atau  bulat  dengan  elevasi  convex  atau  cembung  di  bagian  tengah  dan margin  entire  atau  tepian  yang  halus.  Warna  isolat  pada  kedua  media  adalah  putih.  Isolat  diidentifikasi sebagai Staphylococcus cohnii berdasarkan identifikasi molekuler sekuens 16s rRNA dengan percent identity 99,93%  dan  query  cover  100%.  Berdasarkan  hasil  AST,  isolat  menunjukkan  resistensi  terhadap  satu  dari delapan  antibiotik  yaitu  chloramphenicol  dengan  diameter  zona  bening  8,55  mm.  Sedangkan  pada  tujuh antibiotik lain diameter zona bening yang didapatkan termasuk dalam kriteria susceptible.
Kata Kunci : antibiotik, resistensi, Staphylococcus cohnii

## ABSTRACT
Bacterial  resistance  to  antibiotics  is  one  of  the  main  problems  in  the  health  sector  today, Staphylococcus cohnii is one of them. These bacteria can live in various habitats including aquatic environments. Antibiotic contamination in the aquatic  environment is one of  the  factors that increase bacterial resistance. This  study aims  to  determine  the  resistance  profile  of Staphylococcus  cohnii bacteria  from  Semarang  waters.  The isolates  were  obtained  from  the  collection  of  the  Diponegoro  University  Natural  Products  Laboratory.  The isolates  were  then  characterized  morphologically  and  identified  molecularly.  Furthermore,  resistance  to antibiotics  was  tested  using  the  Antimicrobial  Susceptibility  Test  (AST)  method.  The  diameter  of  the  zone was then measured after 24 hours and adjusted to the 2021 CLSI standard. The morphological characteristics of  the  ATL.215  colony  were  cicular  or  round  in  shape  with  convex  or  convex  elevation  in  the  center  and smooth  margins  throughout  the  edges.  The  color  of  the  isolate  in  both  media  was  white.  The  isolate  was identified as Staphylococcus cohnii based on the molecular 16s rRNA sequence with 99.93% identity percent and  100%  query  cover.  Based  on  AST,  isolates  showed  resistance  to  one  of  eight  antibiotics,  namely chloramphenicol  with  a  clear  zone  diameter  of  8.55  mm.  Meanwhile,  for  the  other  seven  antibiotics,  the diameter of the clear zone was included in the susceptible criteria.
Keywords : antibiotic, resistance, Staphylococcus cohnii

## I. PENDAHULUAN

## 1. Latar Belakang
Staphylococcus  cohnii merupakan  bakteri  patogen  yang  bersifat  oportunistik.  Bakteri  ini adalah  salah  satu  mikroflora  yang  terdapat  pada  kulit  manusia.  Namun  pada  kondisi tertentu  juga  dapat  menyebabkan  penyakit  seperti  infeksi  pada  aliran  darah,  endokarditis dan  meningitis.  Penelitian  sebelumnya  yang  mengisolasi Staphylococcus  cohnii dari manusia  menunjukkan  bahwa  isolat  tersebut  memiliki  gen  penyandi  resistensi  antibiotik (Mendoza-Olazarán et al. , 2017). Selain pada manusia, Staphylococcus cohnii juga banyak ditemukan  di  lingkungan  termasuk  perairan.  Penelitian  Basso et  al. (2014)  menunjukkan bahwa Staphylococcus cohnii merupakan spesies yang paling banyak diisolasi dari perairan yang  tercemar  di  Brazil. Staphylococcus  cohnii yang  diisolasi  menunjukkan  resistensi terhadap tiga antibiotik. Resistensi antibiotik merupakan salah satu ancaman utama dalam dunia kesehatan saat ini. Resistensi terhadap antibiotik dipicu oleh beberapa faktor seperti peningkatan  dan  penyalahgunaan  dalam  konsumsi  antibiotik,  paparan  antibiotik  serta penyebaran gen resistensi di lingkungan. Keberadaan bakteri dan gen resisten antibiotik di lingkungan  diperkuat  oleh  penelitian-penelitian  sebelumnya  mengenai  profil  resistensi antibiotik pada bakteri lingkungan. Muara merupakan lingkungan perairan yang berpotensi menjadi reservoir gen resistensi antibiotik karena tingginya paparan limbah domestik yang juga  mengandung  antibiotik  (Hanna et  al. ,  2020).  Perairan  utara  Kota  Semarang  adalah muara  yang  berbatasan  langsung  dengan  kawasan  pantai  utara  Pulau  Jawa.  Perairan  ini menerima masukan limbah domestik maupun industri dari berbagai wilayah di sekitarnya sehingga terjadi akumulasi yang meningkatkan potensi pencemaran (Harahap et al. , 2020). Limbah  domestik  merupakan  salah  satu  perantara  masuknya  antibiotik  ke  perairan. Perairan utara Kota Semarang juga tergolong tercemar  ringan hingga sedang berdasarkan kandungan BOD, COD dan total coliform yang melebihi baku mutu (Kurnianti, 2020) dan (Pratiwi et  al. ,  2019).  Hal-hal  tersebut  meningkatkan  kemungkinan  terjadinya  paparan antibiotik di lingkungan perairan utara Kota Semarang. Selain itu, kajian mengenai profil resistensi  bakteri  di  Perairan  Semarang  belum  pernah  dilakukan  sebelumnya.  Hal  ini melatarbelakangi urgensi untuk pelaksanaan penelitian ini di Perairan Semarang.

## 2. Perumusan Masalah
Resistensi  bakteri  merupakan  masalah  utama  dalam  bidang  kesehatan  saat  ini. Staphylococcus  cohnii adalah  salah  satu  spesies  bakteri  yang  telah  menunjukkan perkembangan  resistensi.  Penelitian  sebelumnya  juga  mennujukkan  bahwa  bakteri  ini dapat  bertahan  hidup  di  berbagai  lingkungan  termasuk  perairan  tercemar.  Perairan Semarang  yang  dinyaakan  tercemar  berdasarkan  penelitian  sebelumnya  diduga  dapat menjadi reservoir bagi resistensi bakteri termasuk Staphylococcus cohnii. Oleh karena itu, penelitian  mengenai  profil  resistensi Staphylococcus  cohnii di  perairan  Semarang  perlu dilakukan.

## 3. Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian yaitu :
1. Mengidentifikasi Staphylococcus cohnii dari perairan Semarang
2. Mengetahui  profil  resistensi  antibiotik Staphylococcus  cohnii dari  perairan Semarang
4. Manfaat Penelitian
Memberikan  informasi  dalam  bidang  mikrobiologi  mengenai  karakteristik  dan  profil resistensi antibiotik Staphylococcus cohnii dari perairan Semarang.

## II. METODE Tempat dan Waktu
Pengambilan  sampel  dilakukan  di  perairan  Tambak  Lorok,  Semarang  pada  bulan  April 2021.  Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium  Natural  Product,  UPT  Laboratorium Terpadu  UNDIP  dan  Tropical  Marine  Biotechnology,  FPIK  UNDIP,  pada  bulan  April- Desember 2021.

## Bahan dan Peralatan
Sampel  air,  Cawan  Petri,  Larutan  NaCl  0,85%, Hektoen  Enteric  Agar,  Mueller  Hinton Agar,  Nutrient  Broth, Saponin,  Larutan  PBS,  Primer  27F  dan  1492R,  Agarose, Ethidium Bromide,  Cotton  Swab,  Gentamicin  10  µg,  Kanamycin  10  µg,  Streptomycin  10  µg, Ampicillin  10  µg,  Ceftriaxone  30  µg,  Ciprofloxacin  5  µg,  Tetracycline  30  µg, Chloramphenicol  30  µg,  0,5  McFarland  Standard,  Thermal  Cycler,  Elektroforesis Chamber, UV Gel Doc.

## Tahapan Penelitian Identifikasi Morfologi
Isolat  berasal  dari  koleksi  Laboratorium  Natural  Product  Universitas  Diponegoro.  Isolat kemudian  dikultur  pada  media  padat  Hektoen  dan  MacConkey  Agar.  Karakterisasi morfologi  koloni  dilakukan  dengan  pengamatan  secara  makroskopis  pada  media . Karakterisasi morfologi meliputi bentuk, margin, elevasi, ukuran, dan warna koloni bakteri (Margarida et al. , 2015).

## Identifikasi Molekuler
Identifikasi  molekuler  terdiri  dari  ekstraksi  DNA,  amplifikasi,  sekuensing  dan  konstruksi pohon  filogenetik.  Ekstraksi  DNA  bakteri  menggunakan  medode  Chelex  berdasarkan Ayuningrum et al. (2017). Amplifikasi DNA bakteri dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction dengan formulasi dan siklus berdasarkan Ayuningrum et al. (2019). Primer yang  digunakan  untuk  amplifikasi  adalah  27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3)  dan 1492R(5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3').  Hasil  amplifikasi  kemudian  divisualisasi dengan  elektroforesis  (Sibero et  al. ,  2018).  Produk  PCR  yang  telah  divisualisasi  dan muncul  pada  DNA ladder 1500  bp  kemudian  dikirim  untuk  proses  sekuensing  atau penentuan  urutan  basa  nukleotida.  Sekuensing  dilakukan  di  Laboratorium  1stBase, Selangor,  Malaysia,  menggunakan  metode  Sanger.  Sekuens  yang  didapat  kemudian dianalisis  dengan  program Basic  Local  Alignment  Search  Tool (BLAST)  pada  website NCBI.  Pohon  filogenetik  dikonstruksi  menggunakan  sekuens  isolat  dan  sekuens pembanding dari database NCBI. Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan software MEGA X menggunakan metode maximum likelihood dan bootstrap sebanyak 1000 kali. Antimicrobial Susceptibility Test Antibiotic  Susceptibility  Test (AST)  dilakukan  dengan  metode disc  diffusion berdasarkan CLSI  (2021).  Isolat  bakteri  berusia  24-48  jam  diinokulasikan  pada  media Nutrient  Broth dan kekeruhan disesuaikan dengan 0,5 McFarland Standard. Kemudian inokulum diratakan pada  permukaan  media  Mueller  Hinton  Agar  (MHA)  menggunakan cotton  swab.  Disc a ntibiotik  kemudian  diletakkan  pada  permukaan  media  menggunakan  pinset  dengan jumlah  4  antibiotik  dalam  satu  cawan  petri.  Petri  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  35 o C selama  24  jam.  Pengamatan  dilakukan  dengan  mengukur  diameter  zona  bening  yang terbentuk  di  sekitar disc menggunakan  jangka  sorong . Bakteri  digolongkan  sebagai susceptible, intermediate, dan resistant berdasarkan ukuran diameter zona hambat masing- masing antibiotik yang disesuaikan dengan standar CLSI 2021.

## III. HASIL PENELITIAN
Hasil Identifikasi Morfologi Tabel 1. Hasil Identifikasi Morfologi Kode Isolat Bentuk Elevasi Margin Warna Hektoen MacConkey ATL.215 Circular Convex Entire Putih Putih
Karakterisasi morfologi isolat dilakukan dengan mengamati bentuk, elevasi, margin, serta warna koloni pada media Hektoen Enteric Agar . Hasil karakterisasi morfologi isolat dapat dilihat pada Tabel 1. Karakteristik morfologi koloni ATL.215 yaitu berbentuk cicular atau bulat dengan elevasi convex atau cembung di bagian tengah dan margin entire atau tepian yang  halus.  Warna  isolat  pada  kedua  media  adalah  putih.  Media  yang  digunakan  yaitu Hektoen dan MacConkey merupakan media yang dikhususkan untuk bakteri gram negatif, oleh  karena  itu  media  ini  kurang  sesuai  untuk  isolat Staphylococcus  cohnii yang merupakan bakteri gram positif.

## Hasil Identifikasi Molekuler
Gambar 1. Visualisasi hasil elektroforesis
Hasil  visualisasi  menunjukkan band DNA  memiliki  panjang  1500  bp.  Hal  ini  sesuai dengan  penelitian  Wang et  al. (2018)  dan  Zhang et  al. (2020)  yang  mengidentifikasi bakteri  menggunakan  primer  27F  dan  1492R  dan  menghasilkan  DNA  dengan  panjang 1500 bp. Primer 27F dan 1492R merupakan primer yang paling banyak digunakan dalam amplifikasi region 16s rRNA.  Region ini merupakan region konservatif dan dimiliki oleh organisme prokariot sehingga bersifat ideal sebagai penanda genetik dalam identifikasi.
Tabel 2. Hasil Identifikasi Sekuens 16s rRNA dengan BLAST
Kode Isolat Closest Similarity Query Cover Percent Identity ATL.215 Staphylococcus cohnii MH591774.1 100% 99,93%
Hasil  identifikasi  sekuens  16s  rRNA  dapat  dilihat  pada  Tabel  2. Closest  similarity menunjukkan spesies yang memiliki kemiripan sekuens 16s rRNA tertinggi dengan isolat. Query  cover merupakan  persentase  panjang  sekuens  isolat  yang  selaras  dengan  sekuens pada  database  NCBI. Percent  identity adalah  persentase  kemiripan  sekuens  isolat  dengan dengan  sekuens  pada  database  NCBI. Staphylococcus  cohnii MH591774.1  merupakan spesies  yang  memiliki  kemiripan  tertinggi  terhadap  isolat  ATL.215  dengan  nilai query cover 100%  dan percent  identity 99,39%.  Nilai percent  identity yang  lebih  dari  97%
1500 bp
Nur Kholishah S, Permata Wijayanti D, Triandala Sibero M : Isolasi, Identifikasi d an Karakteristik Antimicrobial Resistance Staphylococcus cohnii dari Perairan Semarang
menunjukkan  bahwa  hasil  sekuens  dapat  dikelompokkan  sebagai  spesies  yang  sama dengan sekuens pembanding (Srinivasan et al. , 2015).

## Hasil Konstruksi Pohon Filogenetik
Konstruksi pohon filogenetik bertujuan untuk mengetahui kekerabatan antara isolat dengan spesies pembanding berdasarkan hubungan evolusi. Hal ini sebagai konfirmasi akhir dalam identifikasi molekuler. Seperti pada gambar, isolat ATL.215 berada pada satu clade dengan enam  sekuens  pembanding Staphylococcus cohnii, dan spesies  yang berbeda berada pada clade lain.  Hal  ini  mengonfirmasi  kemiripan  sekuens  ATL.215  dengan Staphylococcus cohnii. Angka di bagian kiri percabangan clade merupakan persentase kecocokan sekuens isolat  dengan  sekuens  pembanding  dalam  metode bootsrap. Nilai  96  pada clade Staphylococcus cohnii menunjukkan persentasi kecocokan yang tinggi.

## Gambar 2. Pohon fiogenetik
Hasil Antimicrobial Susceptibility Test Berikut  ini  dokumentasi  hasil Antimicrobial  Susceptibility  Test (AST) Staphylococcus cohnii pada Mueller Hinton Agar (MHA) menggunakan 8 antibiotik:

## Gambar 3. Hasil AST
Keterangan: C: chloramphenicol; K: kanamycin; CIP: ciprofloxacin; TE: tetracycline; CN: gentamicin; S: streptomycin; AMP: ampicillin; CRO: ceftriaxone\
Tabel 3. Kelas, jenis dan konsentrasi antibiotik berdasarkan CLSI (2021)
Kelas/ Golongan Antibiotik Konsentrasi (µg/disc) Kategori Interpretatif dan Breakpoint Diameter
Nur Kholishah S, Permata Wijayanti D, Triandala Sibero M : Isolasi, Identifikasi d an Karakteristik Antimicrobial Resistance Staphylococcus cohnii dari Perairan Semarang
Zona (mm) S I R Penicillins Ampicillin 10 ≥17  14-16 ≤13 Aminoglycosides Streptomycin 10 ≥15  12-14 ≤11 Gentamicin 10 ≥15  13-14 ≤12 Kanamycin 30 ≥18  14-17 ≤13 Tetracycline Tetracycline 30 ≥15  12-14 ≤11 Cephalosporin Ceftriaxone 30 ≥23  20-22 ≤19 Quinolon Ciprofloxacin 5 ≥26  22-25 ≤21 Phenicol Chloramphenicol 30 ≥18  13-17 ≤12 Keterangan: S: susceptible ; I: intermediate ; R: resistant
Tabel 4. Hasil Antimicrobial Susceptibily Test Antibiotik Diameter Zona Bening (mm) Kategori Interpretatif Ampicillin 10 38 S Streptomycin 10 18,55 S Gentamicin 10 27 S Kanamycin 30 26 S Tetracycline 30 30,55 S Ceftriaxone 30 24,25 S Ciprofloxacin 5 28,25 S Chloramphenicol 30 8,55 R Keterangan: S: susceptible ; I: intermediate ; R: resistant

## IV. KESIMPULAN
Isolat Staphylococcus cohnii yang diisolasi dari Perairan Semarang hanya bersifat resisten terhadap satu antibiotik yaitu chloramphenicol dan bersifat susceptible terhadap antibiotik ampicillin,  streptomycin,  gentamicin,  kanamycin,  tetracycline,  ceftriaxone  dan ciprofloxacin.

## DAFTAR PUSTAKA
Ayuningrum, D., R. Kristiana, M.A. Asagabaldan, A. Sabdono, O.K. Radjasa, H. Nuryadi dan  A.  Trianto.  2017.  Isolation,  Characterisation  and  Antagonistic  Activity  of Bacteria  Symbionts  Hardcoral  Pavona  sp.  Isolated  from  Panjang  Island,  Jepara Against  Infectious  Multi-drug  Resistant  (MDR)  Bacteria.  IOP  Conference  Series: Earth and Environmental Science, 55(1).
Ayuningrum,  D.,  Y.  Liu,  Riyanti,  M.T.  Sibero,  R.  Kristiana,  M.A.  Asagabaldan,  Z.G. Wuisan, A. Trianto, O.K. Radjasa, A. Sabdono dan T.F. Schäberle. 2019. Tunicate- associated  bacteria  show  a  great  potential  for  the  discovery  of  antimicrobial compounds. PLoS ONE, 14(3): 1–14.
Basso,  A.P.,  P.D.  Martins,  G.  Nachtigall,  S.  van  der  Sand,  T.M.  de  Moura  dan  A.P.G. Frazzon.  2014.  Antibiotic  resistance  and  enterotoxin  genes  in  staphylococcus  sp. Isolates  from  polluted  water  in  southern  Brazil.  Anais  da  Academia  Brasileira  de Ciencias, 86(4): 1813–1820.
Bora,  P.,  P.  Datta,  V.  Gupta,  L.  Singhal  dan  J.  Chander.  2018.  Characterization  and antimicrobial  susceptibility  of  coagulase-negative  staphylococci  isolated  from clinical samples. Journal of Laboratory Physicians, 10(04): 414–419.
CLSI. 2021. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31 ed.
Nur Kholishah S, Permata Wijayanti D, Triandala Sibero M : Isolasi, Identifikasi d an Karakteristik Antimicrobial Resistance Staphylococcus cohnii dari Perairan Semarang
Clinical and Laboratory Standards Institute.
Hanna, N., M.  Purohit, V. Diwan, S.P. Chandran, E. Riggi,  V. Parashar, A.J. Tamhankar dan  C.S.  Lundborg.  2020.  Monitoring  of  water  quality,  antibiotic  residues,  and antibiotic-resistant escherichia coli in the kshipra river in india over a 3-year period. International Journal of Environmental Research and Public Health, 17(21): 1–22.
Harahap,  M.K.A.,  S.  Rudiyanti  dan  N.  Widyorini.  2020.  Analisis  Kualitas  Perairan Berdasarkan Konsentrasi Logam Berat dan Indeks Pencemaran di Sungai. Pasir Laut, 4(2): 108–115.  DOI :
Kurnianti, L.Y. 2020. Analisis Beban Dan Status Pencemaran Bod Dan Cod Di Kali Asin, Semarang. JFMR-Journal of Fisheries and Marine Research, 4(3): 379–388.
Margarida,  A.,  M.  Olívia  dan  A.  Lourenço.  2015.  MorphoCol :  An  ontology-based knowledgebase  for  the  characterisation  of  clinically  significant  bacterial  colony morphologies. JOURNAL OF BIOMEDICAL INFORMATICS, 55: 55–63.
Mendoza-Olazarán,  S.,  J.F.  Garcia-Mazcorro,  R.  Morfín-Otero,  L.  Villarreal-Treviño,  A. Camacho-Ortiz,  E.  Rodríguez-Noriega,  P.  Bocanegra-Ibarias,  H.J.  Maldonado- Garza,  S.E.  Dowd  dan  E.  Garza-González.  2017.  Draft  genome  sequences  of  two opportunistic  pathogenic  strains  of  Staphylococcus  cohnii  isolated  from  human patients.  Standards  in  Genomic  Sciences,  12(1):  49.    DOI :10.1186/s40793-017- 0263-1.
Pratiwi, A.D., N.. Widyorini dan A. Rahman. 2019. Analisis Kualitas Perairan Berdasarkan Total  Bakteri  Coliform  Di  Sungai  Plumbon,  Semarang.  Journal  of  Maquares,  8(3): 211–220.
Roberts,  M.C.  dan  S.  Schwarz.  2017.  Tetracycline  and  Chloramphenicol  Resistance Mechanisms. Antimicrobial Drug Resistance, 231–243.
Sibero, M.T., O.K. Radjasa, A. Sabdono, A. Trianto, D.W. Triningsih dan  I.D. Hutagaol. 2018.  Antibacterial  activity  of  indonesian  sponge  associated  fungi  against  clinical pathogenic multidrug resistant bacteria. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 8(2): 088–094.
Srinivasan,  R.,  U.  Karaoz,  M.  Volegova,  J.  MacKichan,  M.  Kato-Maeda,  S.  Miller,  R. Nadarajan,  E.L.  Brodie  dan  S.  V.  Lynch.  2015.  Use  of  16S  rRNA  gene  for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE, 10(2): 1–22.
Wang,  X.,  M.  Zhang,  J.  Gao,  T.  Pu,  M.  Bilal,  Y.  Wang  dan  X.  Zhang.  2018.  Antifungal activity  screening  of  soil  actinobacteria  isolated  from  Inner  Mongolia,  China. Biological Control, 127(June): 78–84.
Xu,  Z.,  H.  V.  Mkrtchyan  dan  R.R.  Cutler.  2015.  Antibiotic  resistance  and  mecA characterization  of  coagulase-negative  staphylococci  isolated  from  three  hotels  in London, UK. Frontiers in Microbiology, 6(SEP): 1–6.
Zhang,  W.,  Y.  Chen,  Q.  Shi,  B.  Hou  dan  Q.  Yang.  2020.  Identification  of  bacteria associated  with  periapical  abscesses  of  primary  teeth  by  sequence  analysis  of  16S rDNA clone libraries. Microbial Pathogenesis, 141: 103954.
Accepted Date Revised Date Decided Date Accepted to Publish 20 Mei 2022 21 Mei 2022 22 Mei 2022 Ya