## DETERMINASI KADAR TOTAL POLIFENOL TERLARUT, HESPERETIN DAN QUERCETIN PADA DAUN, KULIT DAN ISI BUAH
Citrus aurantifolia (Christm & Panzer) Swingle

## Siti Mahyuni
Program Studi Farmasi FMIPA Universitas Pakuan Bogor Email: sitimahyuni@unpak.ac.id

## ABSTRAK
Hesperitin dan quercetin adalah senyawa bioaktif golongan polifenol yang biasa terdapat tanaman genus Citrus sp . Hesperetin dan quercetin memiliki berbagai aktifitas farmakologis seperti antioksidan, antiinflamasi, antihipertensi dan  mampu  menurunkan kadar kolesterol dalam darah. Senyawa-senyawa tersebut tersebar pada berbagai bagian tanaman Citrus dengan kadar yang berbeda-beda, sehingga untuk proses ekstraksi yang optimal, perlu diketahui pola sebaran dan kadarnya pada bagian-bagian yang berbeda dari tanaman Citrus. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kadar total polifenol terlarut, hesperetin, dan quercetin pada daun, kulit buah, dan isi buah isi buah Citrus aurantifolia . Hasil pengukuran kadar total polifenol terlarut dengan standar i menunjukan bahwa kadar total  polifenol  terlarut  paling  tinggi  terdapat  pada  kulit  buah  (6,954  mg/g  berat  basah) kemudian  daun (4,675 mg/g berat basah) dan isi buah (2,243 mg/g berat basah). Kadar hespertin  dan  quercetin  yang  diukur  menggunakan  sistem high  performance  liquid chomatograpy (HPLC)  menunjukan  pola  sebaran  yang  berbeda.  Kadar  hesperetin tertinggi  terdapat  pada  isi  buah    58,43 (µg/g  berat  kering)  kemudian  kulit  buah  (32,49 µg/g berat kering) namun tidak terdeteksi keberadaannya pada daun.  Sebaran senyawa quercetin  menunjukan  pola  sebaliknya  dimana  kadar  quercetin  tertinggi  terdapat  pada kulit buah (112,47 µg/g berat kering) dan terendah terdapat pada isi buah (89,4947 µg/g berat  kering)  sementara  pada  daun  buah  terdapat  quercetin  dengan  kadar  (92,71  µg/g berat  kering).  Dari  hasil  penelitian  ini  dapat  disimpulkan    hesperetin  dan  quercetin terakumulasi pada bagian yang berbeda  dari tanaman Citrus aurantifolia .
Kata kunci: Citrus aurantifolia, hesperetin, quercetin, total polifenol terlarut

## DETERMINATION OF TOTAL SOLUBLE POLYPHENOL, HESPERETIN
AND QUERCETIN CONTENT IN LEAVES, PEEL AND SAC OF Citrus aurantifolia (Christm & Panzer) Swingle

## ABTRACT
Hesperetin  and  quercetin  are  the  bioactive  compounds  commonly  found  on various part of Citrus sp plant.  These compounds show many pharmacological activities i.e antioxidant, antihypertension, anti-inflammatory and reduce the level of cholesterol in blood  circulation.  Hesperetin  and  quercetin  distributed  and  accumulated  at  different concentration  in  certain  part  of  plant  thus  the  distribution  pattern  of  these  compounds should be determined in order to optimize the extraction of the desired compound. This study  was  aimed  to  determine  the  content  of  total  soluble  polyphenol,  hesperetin  and quercetin in leaf, peel, and sac of Citrus aurantifolia using HPLC machine system. The results reveal that the highest total soluble polyphenol content was found in the peel of fruit (6.954 mg/g fresh weight) followed by the leaves (4.675 mg/g fresh weight) and the fruit  sac  (2.243  mg/g  fresh  weight)  respectively.  The  highest  hesperetin  content  was
detected in the fruit sac 58.43 (µg/g dry weight) followed by fruit peel (32.49 µg/g dry weight) but was not traced in the leaves.  A different pattern can be seen in the distribution of quercetin in which the highest content was detected in the fruit peel (112.47 µg/g berat kering) and the lowest found in the fruit sac (89.4947 µg/g dry weight). Quercetin also found  in  the  leaves  of C.  aurantifolia (92.71  µg/g  dry  weight).  Overall,  it  can  be concluded that hesperetin and quercetin compunds are accumulated at different levels in different parts of the C. aurantifolia.
Keywords: Citrus aurantifolia, hesperetin, quercetin, total soluble polyphenol

## PENDAHULUAN
Jeruk  nipis  atau Citrus  aurantifolia merupakan  jenis  buah  yang  mudah ditemukan  disemua  iklim,  dimanfaatkan untuk beragam keperluan khususnya bahan pangan  secara  tradisional  telah  lama digunakan  sebagai  kosmetik  dan  bahan obat  untuk  mengobati  berbagai  jenis penyakit (Grabley  dan  Thiericke,  1999). Berbagai penelitian  menunjukan  bahwa C aurantifolia memiliki  aktifitas-aktifitas anti  bakteri  (Aibinu et  al. ,  2007)  dan antioksidan yang tinggi (Anagnostopoulou et al ., 2005). Citrus aurantifolia diketahui memiliki senyawa-senyawa polifenol yang bersifat  antioksidan  termasuk  senyawa- senyawa  flavonoids  spesifik  seperti  rutin, naringenin,  hesperidin,  hesperetin,  rutin, quercetin,  dan  limonoids  (Gattuso et  al ., 2007).
Hesperetin  dan  quercetin  adalah aglikon  dari  glikosida  hesperidin  dan quercitrin.  Quercetin      dapat  ditemukan pada  beragam  sayuran  dan  buah-buahan dan  telah  lama  dimanfaatkan  dalam industri  nutraseutikal  dan  farmaseutikal sebagai  supplemen  kesehatan  dan food additives karena  aktifitas  antioksidannya yang  tinggi  (Agnes et  al .,  2008).  Hasil- hasil penelitian melaporkan bahwa quercetin  memiliki  aktifitas-aktifitas  anti inflamasi, anti hipertensif, vasodilator, anti obesitas,  menurunkan  kadar  kolestrol dalam darah dan anti ateroskerotik (David et  al .,  2016).    Hesperetin  diketahui memiliki sifat anti kanker dan anti bakteri (Aranganathan et al , 2008), serta
antioksidan dan antiinflamasi (Yang et al .,
2012).  Hesperetin  juga  memiliki  aktifitas vasolidator sehingga berpotensi menurunkan  tekanan  darah  pada  kasus- kasus  hipertensi.  Saat  ini  senyawa hesperetin  dan  quercetin  murni  banyak dimanfaatkan oleh industry-industri farmaseutikal  dan  nutraseutikal  sebagai bahan aditif pada produk-produk suplemen kesehatan. Senyawa golongan polifenol termasuk quercetin dan hesperetin tersebar pada  berbagai  bagian  tanaman  dengan konsentrasi  yang  berbeda-beda  (Gözlekçi et al ., 2011). Pola sebaran ini perlu diteliti sehingga proses ekstraksi senyawa- senyawa  yang  diinginkan  menjadi  lebih efektif  dan  efisien.  Tujuan  dari  penelitian ini adalah mengetahui konsentrasi polifenol terlarut, hesperetin dan  quercetin pada  daun,  kulit  buah,  dan  isi  buah C. aurantifolia

## METODE PENELITIAN Bahan dan Alat
Bahan  yang digunakan adalah daun, kulit, dan isi buah C. aurantifolia , metanol 70%,  bufer  tris-HCl  0.35  M, pyrogallol ,
sodium diethyl-dithiocarbamate (Na- DEDTC), HCl, trifluoroacetic acid (TFA), senyawa standar quercetin dan hesperetin. Seluruh bahan kimia dan senyawa standar yang  digunakan  berkualitas  pro  analis (Sigma, USA).
Alat  yang  digunakan  adalah  mesin pengering freeze drier (Edwards, Britain), millipore  0,45  µm  (Scheleiner  &  Schuell,
Jerman), mesin  sentrifugal  (Heraeus
Sepatech,  Jerman),  mesin  sistem  High Performance Liquid Chromatography (HPLC, Waters, Milford, USA). Penelitian dilakukan  di  laboratorium  Department  of Biochemistry  and  Microbiology,  Faculty of  Science  and  Environmental  Studies, Universiti Putra Malaysia. Alat dan bahan disediakan oleh institusi yang sama.

## Determinasi Total Polifenol Terlarut
Total  polifenol  terlarut  pada  sampel dideterminasi  bedasarkan  metode  Forest dan Bendal (1969).

## Penyiapan Larutan Stok
Dibuat larutan stok sebagai berikut:
1. 0,1  M potassium  titanium  oxalate dalam akuades
2. 0,35  M  tris-HCl  pH  6,7  dalam double deionized water
3. Metanol 70%
4. Metanol 10%

## Penyiapan Larutan Uji
Sebanyak masing-masing satu gram  sampel  segar  (daun,  kulit  buah,  isi buah C. aurantifolia )  dicampur dengan 10 mL  metanol  70%  dan  dihaluskan  dengan mortar dan pastel yang sudah didinginkan. Larutan  sampel  kemudian  disentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Ekstraksi  diulang  sebanyak  4  kali, supernatan  yang  dihasilkan  selanjutnya digunakan untuk
mendeterminasi kandungan polifenol terlarut pada sampel. Sebanyak 2  mL  larutan potassium titanium  oxalate 0,1  M,  1  mL  0,35  M larutan  bufer  tris-HCl    pH  6,7,  1,0  mL ekstrak sampel, 0,5  mL  metanol 70% dan 5,5  mL akuades sehingga didapat total 10 mL  larutan  campuran.  Larutan  campuran ini  diukur  absorbansinya  pada  panjang gelombang 445 nm dengan blanko larutan campuran  tanpa  ekstrak.  Total  polifenol terlarut dideterminasi dengan membandingkan  terhadap  kurva  standar. Kurva  standar  menggunakan  larutan
pyrogallol pada konsentrasi 0 sampai 800 µg/mL.

## Determinasi  Senyawa  Hesperitin  dan Quercetin

## Ekstraksi dan Hidrolisis Sampel
Prosedur  ekstraksi  dan  hidrolisis sampel  dilakukan  berdasarkan  metode Crozier et  al. ,  1997.    Kulit,  daun  dan  isi buah C.  aurantifolia masing-masing dikeringkan  dengan  mesin  pengering freeze  drier selama  3  hari,  kemudian dihaluskan  sehingga  diperoleh  sampel serbuk kering. Sebanyak satu gram serbuk kering  dimaserasi  dengan  metanol  60% yang  mengandung  20  mM  Na-DEDTC selama  24  jam.  Ekstrak  diambil  sebanyak 20 mL, ditambah dengan 5 mL larutan HCl 6  M  selanjutnya  direfluks  pada  suhu  90 0 selama  2  jam.  Sebanyak  500  µL  ekstrak terhidrolisis diambil dan dicampur 500 µL dengan ektrak tidak terhidrolisis, kemudian  diambil    sebanyak  250  dan diencerkan  dengan  250  µL  akuades. Larutan  diatur  pada  pH  2,5  dengan penambahan beberapa tetes TFA
selanjutnya disaring dengan millipore 0,45 µm.

## Penyiapan Larutan Standar
Masing-masing 1 mg hesperetin dan quercetin  dilarutkan  dalam  2  mL  metanol 100%.  Dari  larutan  tersebut  masing- masing  diambil  1  mL.     dan  ditambahkan dengan  20  mL  metanol  62.5%  yang mengandung  20  mM  Na-DEDTC.  Pada larutan ini ditambahkan lagi 5 mL HCl 6 M kemudian  diencerkan  dengan  50  mL akuades.

## Penggunaan HPLC
Senyawa  hesperitin  dan  quercetin pada  sampel  diuji  menggunakan  mesin system  HPLC  yang  terdiri  dari Maxima 210 chromatography manager , Water 501 HPLC  pump ,  dan Waters  486  tunable absorbance  detector. Pemisahan  senyawa dilakukan  menggunakan  kolom  100  x  8
mm  i.d.,  4  µm  C18  Nova-Pak  Radial-pak (Waters,  USA).    Sebagai  fase  gerak digunakan  larutan acetonitrile 27,5% dengan  penambahan  beberapa  tetes  TFA hingga mencapai pH 2,5. Larutan disaring dengan millipore 0,45 µm dan dihilangkan gelembung udara yang
terlarut menggunakan  ultra  sonicater  (sonicor, USA)  selama  25  menit. Untuk  analisis hesperitin  dan  quercetin,  kolom  dielusi (dialiri) dengan fase gerak pada kecepatan 1  mL/menit.  Sebanyak  20  µL  masing- masing  standard  dan  sampel  secara terpisah disuntikan kedalam mesin HPLC. Jejak  senyawa  standar  dan  seyawa- senyawa yang duiji dalam sampel dimonitor  pada  absorbansi  370  nm. Kehadiran  hesperitin  dan  quercetin  pada sampel  diketahui  dan  dihitung  dengan membandingkan  terhadap  waktu  retensi dan  tinggi  puncak  yang  diperoleh  pada standar (Gambar 1, 2, dan 3).

## HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Total Polifenol Terlarut
Uji linearitas menggunakan senyawa standar pyrogallol
pada panjang gelombang  485  nm  menghasilkan  kurva standar  dengan  persamaan  Y=0.0007X dengan  nilai  R 2 =  0,998  (Gambar  1).  Dari persamaan  ini  diperoleh  kadar  total polifenol  terlarut  pada  sampel  seperti terlihat pada Tabel 1.
Kandungan  total  polifenol  paling tinggi  yaitu  69,54  mg/g  berat  basah terdapat  pada  bagian  kulit  jeruk C. aurantifolia sedangkan  paling  rendah terdapat pada bagian isi buahnya. Rendahnya  kandungan  total  polifenol terlarut  pada  isi  buah  dapat  disebabkan
tingginya  kadar  air  pada  bagian  isi  buah karena kandungan total polifenol dihitung dari  berat  sampel  segar.  Namun  secara keseluruhan  kadar  polifenol  terlarut  pada tanaman C.  aurantifolia cukup  tinggi dibandingkan beberapa  jenis  buah  lainnya (Brat et al ., 2006).
Gambar 1. Kurva Standar Kadar Total
Polypenol Terlarut Tabel 1. Kandungan Total Polifenol Terlarut Sampel Kadar Polifenol Terlarut (mg/g berat basah) Daun 4,675 Kulit Buah 6,954 Isi Buah 2,243 Kandungan Hesperetin dan Quercetin Dari kromatogram yang dihasilkan (Gambar  2-5)  diketahui  bahwa  senyawa quercetin  paling  banyak  terdapat  pada  isi buah,  dan  senyawa  hesperetin  paling banyak terdapat pada kulit buah.
Kandungan  hesperitin  dan  quercetin  pada daun,  kulit,  dan  isi  buah C.  aurantifolia dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Kadar Senyawa Hesperetin dan Quercetin pada Daun, Kulit Buah, dan Isi Buah
C. aurantifolia Sampel Hesperitin Quercetin (µg/g berat kering) (µg/g berat kering) Daun - 92,71 Kulit Buah 32,49 112,47 Isi Buah 58,43 89,49
Gambar 2. Kromatogram standar Hesperetin dan Quercetin
Gambar 3. Kromatogram sampel ekstrak daun C. aurantifolia
Gambar 4. Kromatogram sampel ekstrak kulit buah C. aurantifolia
Gambar 5. Kromatogram sampel ekstrak isi buah C. aurantifolia
Data  pada  Tabel  2  menunjukan bahwa kandungan quercetin tertinggi (112,47 µg/g berat kering) terdapat pada sampel kulit buah dan kandungan quercetin terendah ada pada  isi  buah  (89,49  µg/g  berat  kering). Tingginya  kandungan  quercetin  pada  kulit buah  sejalan  dengan  hasil  pengukuran kandungan  total    polifenol  terlarut  dimana nilai  tertinggi  didapat  dari  pengukuran terhadap  ekstrak  kulit  buah.    Beberapa penelitian   terhadap beberapa species Citrus lainnya      juga  menunjukan  bahwa  kadar quercetin paling tinggi terdapat pada bagian kulit  buah  (Manthey dan  Grohmann,  1996) sehingga  limbah  kulit  buah  jeruk  memiliki nilai  ekonomis  tinggi  sebagai  bahan  baku yang dapat diolah menjadi produk nutraseutikal yang aman dikonsumsi (Garg et al ., 2001).
Pengukuran terhadap kandungan hesperitin  menunjukan  hasil  yang  berbeda dimana  nilai  tertinggi  (58,43  µg/g  berat kering) didapatkan dari pengukuran terhadap isi  buah C  aurantifolia .  Beberapa  referensi secara  umum  menunjukan  kadar  hesperetin yang  cukup  tinggi  terdapat  pada  jus  buah berbagai  varietas  jeruk.  Tingginya  kadar hesperitin  pada  isi  buah  jeruk  ini  dapat dikaitkan dengan tingginya aktifitas antioksidan, anti inflamasi dan hepatoprotektif sari buah jeruk (Tomar et al ., 2012).

## SIMPULAN
Dari  data-data  yang  dihasilkan  pada penelitian  ini,  dapat  disimpulkan  bahwa setiap  bagian  tanaman C.  aurantifolia mengandung  senyawa-senyawa  golongan polifenol,  hesperitin  dan  quercetin  dengan kadar yang berbeda-beda. Dengan demikian, ekstraksi  senyawa  yang  diinginkan  dapat lebih  difokuskan  pada  satu  bagian  tanaman saja sehingga proses ekstraksi menjadi lebih optimal. Hasil penelitian ini juga menunjukan  bahwa  limbah  kulit  jeruk C. aurantifolia berpotensi  menjadi  sumber
bahan  baku  penghasil  senyawa  murni quercetin  karena    dalam  kulit  jeruk mengandung  kadar  quercetin  yang  cukup tinggi.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut  untuk  mencari  metoda  ektraksi  yang lebih  efisien  dalam  mengekstrak  senyawa murni hesperetin dan quercetin dari tanaman C. aurantifolia .

## DAFTAR PUSTAKA
Aghel,  N.,  Z.  Ramezani,  dan  S.  2008.
Beiranvand  Hesperidin  from  Citrus sinensis cultivated in Dezful, Iran. Pak J Biol Sci . 11(20): 2451-2453. Aibinu, I., T. Adenipekun, T. Adelowotan, T.
Ogunsanya dan T, Odugbemi T. 2007. Evaluation of the antimicrobial properties  of  different  parts  of Citrus aurantifolia (lime fruit) as used locally.
African Journal of Traditional Complement and Alternative Medicine.
4(2): 185-90.
Anagnostopoulou,  M.A.,  P.  Kefalas,  E.
Kokkalou,  A,N.  Assimopoulou  dan V.P.  Papageorgiou.  2005.  Analysis  of antioxidant compounds in sweet orange peel  by  HPLC–diode  array  detection– electrospray ionization mass spectrometry. Biomed  Chromatogr.
19:138-148.
Aranganathan  S.,  dan  N.  Nalini.  2013.
Antiproliferative efficacy of hesperetin ( Citrus flavonoid) in 1,2- dimethylhydrazine-induced colon cancer. Phytother Res . 27: 999-1005.
Aranganathan, S., J.P. Selvam dan N. Nalini.
2008.  Effect  of  hesperetin,  a  citrus flavonoid,  on  bacterial  enzymes  and carcinogen-induced aberrant crypt foci in colon cancer rats: a dose-dependent study. J  Pharm  Pharmacol. 60(10): 1385-1392.
Boots,  W.A.  dan  R.M.  Guido.  2008.  Health effects  of  quercetin:  From  antioxidant to  nutraceutical. European  Journal  of Pharmacology. 585 (2-3): 325-337. Brat,  P.,  S.  George,  A.  Bellamy,  L.  Du Chaffaut.  A.  Scalbert,  L.  Mennen,  N. Arnault  dan  M.  J.  Amiot.  2016.  Daily Polyphenol Intake in France from Fruit and  Vegetables. The  Journal  of Nutrition. 6: 2368-2374.
Crozier, A., E. Jensen, M.E.C. Lean dan M.S. McDonald.  1997.  Qualitative  analysis of  flavonoids  by  reverse-phase  high performance  liquid  chromatogrphy. Journal of Chromatography. 761: 315- 321.
Forest,  G.I.,  dan  D.S.  Bendall.  1969.  The distribution  of  polyphenol  in  the  tea plant (Camelia sinensis L.). Biochemistry  Journal. 113(5):  741- 755.
Garg A., S. Garg, L.J.D. Zaneveld dan A.K.
Singla. 2001. Chemistry and Pharmacology
of the citrus bioflavonoid  hesperidin. Phytotherapy Research . 15: 655-669.
Gattuso,  G.,  D.  Barreca,  C.  Gargiulli,  U. Leuzzi dan C. Carist. 2007.  Flavonoid
Composition of Citrus Juices. Molecules . 12(8): 1641-1673.
Gözlekçi,  S.,  O.  Saraçoğlu,  E.  Onursal  dan M.  Özgen.  2011.  Total  phenolic distribution  of  juice,  peel,  and  seed extracts of four pomegranate cultivars. Pharmacogn Mag. 7(26): 161-164.
Grabley,  S.  dan  R.  Thiericke.  1999. Drug
Discovery from Nature . Springer.
London. Springer. Hal. 5-7.
Kawaii, S., Y. Tomono, E. Katase, K. Ogawa K, dan Yano M. 1999. Quantitation of flavonoid constituents in Citrus fruits. J  Agric  Food  Chem .  47:  3565- 3571.
Manthey, J.A.  dan  K.  Grohmann.  1996.
Concentrations of hesperidin and other orange  peel  flavonoids  in  citrus
processing  byproducts  citrus  and subtropical  products  laboratory. J. Agric. Food Chem. 44 (3): 811–814. Takumi,  H., H.  Nakamura,  T.  Simizu,  R.
Harada, T. Kometani T. Nadamoto dan R. Mukai. 2012. Bioavilability of orally administered water-dispersible hesperetin  and  its  effect  on  peripheral vasodilatation  in  human  subjects: Implication of endothelial functions of plasma conjugated metabolites. J. Food Funct. 3(4): 389-398.
Tomar,  A.,  M.  Mall  M  dan  P.  Rai.  2013. Pharmacological  Importance  of  Citrus Fruits. Int J Pharm Sci Res . 4(1): 156- 160.
Victor, A.,  A. David,  R. Arulmoli R. dan S.
Parasuraman.  2016.  Overviews  of biological  importance  of  quercetin:  A bioactive flavonoid. Pharmacogn Rev.
10(20): 84-89.
Wu,  T.,  Y.  Guan  dan  J.  Ye.  2007. Determination  of  flavonoids  and ascorbic  acid  in  grapefruit  peel  and juice  by  capillary  electrophoresis  with electrochemical detection. Food Chem. 100: 1573-1579.
Yang, H.L., S.C. Chen, K. J. S. Kumar, K.N. Yu,  S.Y.  Tsai, Y.C.  Hou  dan  Y.C. Hseu.  2012.  Antioxidant  and  anti- inflammatory  potential  of  hesperetin metabolites  obtained  from  hesperetin- administered  rat  serum:  An  ex  vivo approach.
J. Agric. Food Chem. 60 (1): 522-532.