## KARAKTERISASI ENZIM KASAR SELULASE KAPANG ENDOFIT DARI LAMUN

## CHARACTERIZATION OF CRUDE CELLULASE OF SEAGRASS ENDOPHYTIC FUNGUS
Yulia Oktavia 1 , Aulia Andhikawati 1 , Tati Nurhayati 1 , dan Kustiariyah Tarman 1,2*
1 Departemen Teknologi Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2 Divisi Bioteknologi Laut, Pusat Kajian Sumberdaya Pesisir dan Laut, LPPM-IPB
* E-mail: kustya@gmail.com

## ABSTRACT
In  this  study,  cellulase  was  produced  by  endophytic  fungus  isolated  from  seagrass.  Substrate used for incubating the fungus was the waste of agar industry. The objectives of this study were to  optimize  cellulase  production  and  to  characterize  the  highest  activity  of  fungal  crude cellulase. In our previous study, the EN isolate (isolated from Enhalus sp.) showed the highest cellulolytic  index.  Therefore,  in  this  research  we  focused  on  cellulase  activity  of  the  isolate. Cellulase activity was determined based on endoglucanase activity, total cellulase activity, and β-glucosidase  activity.  The  highest  activity  was  then  used  to  determine  cellulase  activity  in enzyme characterization. The fungus was cultured in different concentration of agar extraction algal wastes. The fungal culture was incubated for 3-21 days with 120 rpm orbital shaker. The results showed that endoglucanase activity was 0.019-0.031 U/mL, total cellulase activity was 0.007-0.013  U/mL,  and  β-glucosidase  activity  was  0.00012-0.00361  U/mL.  The  highest endoglucanase  and  total  cellulase  activity  were  obtained  from  the  fungal  culture  after  9  days incubation,  β-glucosidase  was  obtained  from  the  fungal  culture  after  15  days  incubation  with 1.5% of algal waste as substrate. The optimum pH and temperature were determined as 4 and 60 o C,  maximum  reaction  rate  (V max )  and  Michaelis-Menten  constant  (K m )  for  endoglucanase activity was determined as 0.044 U/mL and 0.103% respectively.
Keywords: algal waste, cellulase, endophytes, enzymes, seagrass

## ABSTRAK
Pada  penelitian  ini  seluase  dihasilkan  oleh  kapang  endofit  yang  diisolasi  dari  lamun.  Substrat yang digunakan untuk menghasilkan enzim ini yaitu limbah agar-agar. Penelitian ini bertujuan untuk  mengoptimalkan  produksi  selulase  dan  mengkarakterisasi  selulase  yang  memiliki aktivitas  tertinggi.  Pada  penelitian  sebelumnya,  isolat  kapang  EN  (isolat  dari Enhalus sp.) memiliki  indeks  selulolitik  tertinggi.  Sehingga  pada  penelitian  ini  hanya  difokuskan  pada aktivitas selulase isolat EN. Aktivitas selulase diukur berdasarkan pada aktivitas endoglukanase, selulase  total,  dan  β-glukosidase.  Kapang  dikultur  pada  media  yang  mengandung  berbagai konsentrasi  limbah  agar-agar.  Kultur  kapang  diinkubasi  3-21  hari  dengan  goyangan  120  rpm. Hasil penelitian menunjukkan aktivitas endoglukanase 0,19-0,031 U/mL, aktivitas selulase total 0,007-0,013  U/mL,  dan  aktivitas  β-glukosidase  0,00012-0,00361  U/mL.  Aktivitas endoglukanase  dan  selulase  total  tertinggi  terjadi  pada  hari  kesembilan  inkubasi  sedangkan  β- glukosidase  pada  hari  kelimabelas  dengan  konsentrasi  limbah  agar-agar  15%.  pH  dan  suhu optimum  endoglukanase  yaitu  4  dan  60 o C  dengan  kecepatan  reaksi  maksimum  ( V maks )  0,044 U/mL dan konstanta Michaelis-Menten ( K m ) 0,103%.
Kata kunci: endofit, enzim, lamun, limbah agar, selulase

## I.  PENDAHULUAN
Produksi  rumput  laut  pada  tahun 2009  sebesar  2.791.689  ton  dan  pada tahun 2010 mengalami peningkatan produksi  menjadi  3.399.438  ton  (KKP, 2012).  Umumnya  industri  pengolahan rumput  laut  akan  menghasilkan  limbah rumput  laut  sebesar  65-75%.  Jumlah limbah  yang  cukup  besar  jika  tidak ditangani  dengan baik  akan menyebabkan pencemaran  lingkungan.  Limbah  rumput laut mengandung selulosa yang tinggi bisa mencapai    15-25  %.  Selulosa  merupakan polisakarida linear glukosa yang dihubungkan  dengan  ikatan  β-1,  4- glikosidik (Gupta et al., 2012). Sering kali di  beberapa  industri  pengolahan  berbasis rumput laut, limbah hasil pengolahan yang tinggi kandungan selulosanya dibuang dan tidak  dimanfaatkan.  Padahal  dengan adanya  sistem  selulolitik,  selulosa  dapat dikonversi  menjadi  senyawa  yang  lebih sederhana  dan  produk  multiguna  lainnya dengan    proses  biologi  yang  aman  serta biaya  produksi  yang  murah.  Penanggu- langan limbah secara biologi yaitu dengan menguraikan  selulosa  tersebut  menggu- nakan  enzim  misalnya  selulase.    Selulase dapat  mendegradasi  selulosa  menjadi oligosakarida  kemudian  menjadi  glukosa sehingga dapat dimanfaatkan untuk berbagai industri lainnya (Subowo, 2010). Konversi  selulosa  menjadi  gula sederhana membutuhkan aktivitas mikroorganisme  yang  dapat  mempercepat degradasi.  Mikroorganisme  yang  mampu mendegradasi selulosa salah satunya yaitu kapang. Kapang tersebut mampu menghasilkan enzim selulase yang merupakan  enzim  ekstraseluler  yang terdiri atas kompleks endo-β-1,4- glukanase  (CMCase,  Cx  selulase  endose- lulase,  atau  carboxymethyl  cellulase), kompleks  ekso-β-1,4-glukanase  (avisela- se,  selobiohidrolase,  C1  selulase),  dan  β- 1,4-glukosidase atau selobiase yang mampu  memutus  ikatan  β-1,4  glikosidik
(Zhou et  al. ,  2008).  Selama  ini  kapang yang digunakan dalam sakarifikasi pembentukan gula sederhana yaitu kapang yang diisolasi dari organisme darat seperti Trichoderma  harzianum yang  diisolasi dari  tanah  dan  hasil  pelapukan  kayu  yang berasal  dari  hutan  hujan  tropis  Amazon (Delabona et  al .,  2012),  serangga  seperti rayap (isopteran), kutu buku (Lepidoptera),  ulat  bulu  dan  siput  (Gupta et  al. ,  2012),  dan Fusarium  oxysporum (Yuan et al. , 2012). Kapang yang diisolasi dari  organisme  laut  biasanya  berupa kapang  endofit  yaitu  jenis  kapang  yang tumbuh di dalam tanaman inangnya tanpa menyebabkan  gejala  penyakit  terhadap inang  dan  pertumbuhannya  di  habitat melibatkan  interaksi  yang  berjalan  terus- menerus  antara  metabolisme  kapang  dan inangnya (Schulz et al ., 2002).
Kapang endofit  yang diisolasi  dari organisme  laut  ini  juga  memiliki  potensi dalam  mendegradasi  selulosa  namun keberadaannya  belum  banyak  dikaji  lebih lanjut.  Berdasarkan  penelitian  pendahu- luan  mengenai screening kapang  laut endofit  peghasil  enzim  selulase,  diketahui bahwa  kapang  isolat  EN  yang  diisolasi dari  lamun Enhalus sp.  memiliki  indeks selulolitik  tertinggi  dibandingkan  dengan kapang endofit lainnya  yang diisolasi dari rumput  laut,  daun  mangrove,  dan  spons. Untuk itulah dilakukan penelitian ini yang difokuskan  pada  aktivitas  enzim  selulase dari  kapang  isolat  EN.  Penelitan  ini bertujuan  mengoptimasi  waktu  inkubasi dan konsentrasi sumber karbon yang tepat dalam  memproduksi  enzim  selulase  dan mengkarakterisasi  enzim  selulase  yang dihasilkan oleh Kapang isolat EN.

## II.  METODE PENELITIAN

## 2.1.  Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian  ini  meliputi  limbah  agar-agar kertas  yang  diperoleh  dari  Pameungpeuk Garut, Jawa Barat; kapang isolat EN yaitu
kapang  endofit  yang  diisolasi  dari  lamun Enhalus sp.  dari  perairan  Pulau  Karya, Kepulauan  Seribu,  media  produksi  enzim selulase  (Muthuvelayudham  dan  Virutha- giri 2006), CMC ( Carboxymethyl cellulase ) (Teknis), Potato Dextrose Agar (Difco,  USA), Potato  Dextrose  Broth (Difco,  USA),  pereaksi  DNS  (Sigma Aldrich, India), buffer sitrat, kertas saring Whatman  no  1  (China),  dan p -NPG  ( p- nitrophenyl-β-D-glycopyranosode )  Sigma Aldrich, Switzerland). Alat yang
digunakan  meliputi  sentrifuse  (Himac CR21G, Japan), spektrofotometer UV-Vis 2500  (Yamato,  Japan),  pipet  mikro (Gibson,  Germany), waterbath inkubator BT25  (Yamato,  Japan),  dan  autoklaf SM52 (Yamato, Japan).

## 2.2.  Optimasi Konsentrasi Limbah Agar-agar dan Waktu Inkubasi Kapang Penghasil  Selulase
Kapang  ditumbuhkan  pada  media PDB  diinkubasi  selama  7  hari  pada  suhu kamar  dengan  goyangan  120  rpm, kemudian dipindahkan ke labu Erlenmeyer  500  mL  yang  berisi  200  mL media  produksi  enzim  dengan  sumber karbon  yaitu  limbah  agar-agar  dalam beberapa konsentrasi (0,5; 1,0; 1,5; 2,0%) kemudian    diinkubasi  dengan  goyangan 120  rpm  selama  3-21  hari  pada  suhu kamar.    Supernatan  sebagai  enzim  kasar diperoleh  dengan  cara  sentrifugasi  pada 5000xg  selama  20  menit  pada  suhu  4 o C (Tang et al ., 2012). Aktivitas selulase total diukur  menurut  metode  Mandels et  al . (1976),  endoglukanase  (Mandels et  al .,
1976),  dan  β-glukosidase  diukur  menurut metode  Grover et  al. (1977).  Pengukuran aktivitas  enzim  dimulai  pada  hari  ketiga dengan  interval  pengamatan  setiap  tiga hari.  Konsentrasi  sumber  karbon  dan waktu  inkubasi  yang  dapat  menghasilkan aktivitas  optimum  dipakai  untuk  tahap penelitian selanjutnya.

## 2.3.  Penentuan pH Optimum
Nilai  pH  optimum  enzim  selulase ditentukan  dengan  metode  Lee et  al . (2007). Sebanyak 0,5 mL enzim
ditambahkan  0,5  mL  CMC  1%  (b/v) dalam  sediaan  50  mM  buffer  sitrat  (pH 3,0-6,0)  dan  Tris-HCl  (pH  7,0-9,0). Campuran dalam pH buffer yang beragam diinkubasi  pada  suhu  50 o C  selama  30 menit  dan  aktivitas  selulase  diuji  dengan metode DNS.

## 2.4.  Penentuan Suhu Optimum
Suhu optimum enzim untuk menghidrolisis CMC dalam 50 mM buffer pH optimum diukur dengan menggunakan metode  Lee et  al. (2007).  Campuran enzim dan CMC 1% diinkubasi selama 30 menit  dengan perbedaan suhu (30-80 o C). Larutan DNS ditambahkan untuk menghentikan reaksi. 2.5.  Kinetika Enzim Kinetika enzim ditentukan menggunakan    CMC  dengan  konsentrasi yang  berbeda  yaitu:  0,25;  0,5;  0,75;  1,0; 1,25;  1,5;  1,75;  2,0%.  Sebanyak  0,5  mL enzim dan 0,5 mL substrat  dalam 50 mM buffer  pH  optimum  diinkubasi  selama  30 menit  pada  suhu  optimum.  Jumlah  gula pereduksi  yang  dihasilkan  diukur  dengan metode  DNS.  Satu  unit  didefinisikan sebagai  jumlah  enzim  yang  dibutuhkan untuk  melepaskan  1  µmol  glukosa  per menit.  Konstanta  Michaelis-Menten  (K m ) dan kecepatan maksimum (V maks ) ditentukan dengan plot Lineweaver-Burk.

## III.  HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1.  Optimasi Sumber Karbon dan
Waktu Produksi Enzim Selulase Optimasi konsentrasi sumber karbon  dan  waktu  inkubasi  dilakukan untuk  mengetahui  konsentrasi  dan  waktu inkubasi  yang  tepat  untuk  menghasilkan enzim  selulase  dengan  aktivitas  tertinggi. Aktivitas  selulase  ditentukan  dengan
mengukur  aktivitas  enzim  endoglukanase, β-glukosidase  dan  selulase  total.  Da  silva et  al .  (2005)  menyatakan  bahwa  sistem pemecahan  selulosa  menjadi  glukosa terdiri  dari  tiga  jenis  enzim  selulase  yaitu endo-β-1,4-glukanase,  ekso-β-1,4-gluka- nase, dan β-glukosidase. Pengaruh konsentrasi  limbah  agar-agar  kertas  dan lama  waktu  inkubasi    terhadap  aktivitas endoglukanase, β-glukosidase dan selulase total  yang  dihasilkan  dari  kapang  isolat EN dapat dilihat pada Gambar 3, 4, dan 5. Aktivitas  enzim  endoglukanase  mewakili adanya aktivitas pemecahan ikatan glikosidik  secara  acak  terhadap  selulosa. Enzim β-glukosidase menunjukkan aktivi- tas pemecahan yang menghasilkan glukosa  sedangkan  selulase  total  diukur untuk  melihat  kerja  sinergis  beberapa enzim  penyusun  selulase  dalam  mengha- silkan glukosa (Deswal et al ., 2011). Aktivitas endoglukanase diuji menggunakan  substrat  CMC  dan  selulase total  menggunakan  substrat  kertas  saring Whatman  No  1.  Gambar  1  dan  2 memperlihatkan  aktivitas  optimum  endo- glukanase  dan  selulase  total  yaitu  0,031 U/mL  dan  0,013  U/mL  terjadi  pada penambahan  limbah agar-agar  1,5% dengan  lama  waktu  inkubasi  9  hari. Gambar  3  memperlihatkan  aktivitas  β- glukosidase  yang  diuji  dengan  menggu- nakan  substrat p -NPG.  Aktivitas  β- glukosidase  optimum  yaitu  0,036  U/mL terdapat pada pemberian limbah agar-agar 1,5% dengan lama waktu inkubasi 15 hari. Pemberian  konsentrasi  di  atas  1,5% menyebabkan  penurunan  aktivitas  selula- se. Hal ini diduga selulase yang dihasilkan isolat  EN  tidak  mampu  lagi  merombak limbah  agar-agar  dikarenakan  sisi  aktif enzim  telah  terisi  semua  oleh  substrat sehingga  meskipun  konsentrasi  limbah dinaikkan,  tidak  akan  meningkatkan aktivitas enzim selulase. Pemberian konsentrasi  di  bawah  1,5%  menyebabkan terbatasnya  sumber  karbon  sehingga pertumbuhan  tidak  optimal  dan  aktivitas
enzim  rendah.  Aktivitas  β-glukosidase optimum  terjadi  pada  inkubasi  15  hari. Berbeda  dengan  aktivitas  enzim  lainnya, β-glukosidase  akan  bekerja  optimum setelah  enzim-enzim  penyusun  selulase lainnya bekerja dan menghasilkan komponen selulosa yang sederhana seperti selobiosa.  Lee et  al. (2008)  menyatakan bahwa  β-glukosidase  hanya  akan  bekerja memecah  selobiosa  untuk  menghasilkan glukosa.  Oleh  sebab  itulah  pada  inkubasi sebelum  15  hari  aktivitas  β-glukosidase rendah.
Kapang  mempunyai  masa  pertum- buhan  yang  bervariasi,  dalam  aktivitas metabolismenya  kapang  memiliki  bebera- pa  fase  dalam  pertumbuhnnya.  Aktivitas metabolisme akan menurun setelah kapang  melewati  fase  puncak  pertumbu- hannya.  Fase-fase  pertumbuhan  tersebut sangat  berpengaruh  terhadap  enzim  yang dihasilkan  oleh  kapang  untuk  membantu dalam mencerna makanannya. Pemanenan enzim dapat dilakukan pada fase eksponensial  pada  pola  kurva  pertum- buhannya (Gandjar et al., 2006). Tingginya  aktivitas  enzim  pada  hari kesembilan  diduga  pada  hari  tersebut merupakan  fase  eksponensial  dari  isolat kapang  EN.  Menurunnya  aktivitas  enzim pada  hari  keduabelas  karena  pada  hari tersebut  kapang  memasuki  fase  deselerasi dan  stasioner,  sehingga  enzim  tidak diproduksi  lagi  pada fase ini. Aktivitas  β- glukosidase meningkat pada hari kelimabelas dikarenakan pada hari tersebut  substrat  enzim  tersebut  banyak tersedia  yang  dihasilkan  dari  pemecahan selulase  kompleks  oleh  enzim  penyusun selulase  lainnya  yang  aktif  bekerja  pada hari kesembilan.

## 3.2.  Penentuan pH Optimum Enzim Selulase
Berdasarkan hasil pengujian aktivitas  enzim  selulase  total  menggu- nakan substrat  kertas saring Whatman  No 1, endoglukanase menggunakan substrat
Gambar 1. Aktivitas endoglukanase pada beberapa konsentrasi limbah agar-agar kertas terhadap  lama  waktu  inkubasi; 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%. Gambar  2.  Aktivitas  selulase  total  pada  beberapa  konsentrasi  limbah  agar-agar  kertas terhadap  lama  waktu  inkubasi; 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%.
Gambar  3.  Aktivitas  β-glukosidase  pada  beberapa  konsentrasi  limbah  agar  agar  kertas terhadap  lama  waktu  produksi; 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%.
CMC, dan β-glukosidase menggunakan p - NPG  terlihat  bahwa  aktivitas  tertinggi yaitu  endoglukanase  sehingga  untuk karakterisasi  enzim  selulase  ini  menggu- nakan  CMC  sebagai  substrat.  Aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH, maka dari itu diperlukan  buffer  dengan  pH  tertentu supaya  enzim  dapat  bekerja  optimum. Enzim  merupakan  molekul  amfoter  yang mengandung  sejumlah  besar  kelompok asam  dan  basa  terutama  terdapat  pada permukaan.  Muatan-muatan  pada  kelom- pok  tersebut  akan  berubah  berdasarkan konstanta  disosiasi  asam  terhadap  pH lingkungannya.  Perubahan  yang  terjadi pada  muatan-muatan  oleh  pH  dapat berpengaruh  terhadap  aktivitas,  stabilitas struktural  dan  daya  kelarutan  enzim (Chaplin dan Bukle, 1990). Penentuan pH optimum  dilakukan  dengan  penambahan buffer  pada  rentang  pH  3-9.  Hasil pengukuran aktivitas selulase pada beberapa pH disajikan pada Gambar 4.
Berdasarkan  Gambar  4  dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan aktivitas pada pH 4 dan pH tersebut merupakan pH optimum  aktivitas  ekstrak  kasar  selulase dengan  aktivitas  0,042  U/mL.  Aktivitas ekstrak kasar selulase mengalami penurunan pada pH 5 dan menurun drastis hingga pH 9. Menurut Harshvardhan et al . (2013),  enzim  selulase  aktif  pada  kisaran pH  3-9.  Selain  itu,  hasil  penelitian Thongekkaew et  al. (2008)  menunjukkan pH  optimum  endoglukanase  yang  dihasil- kan  oleh Pichia  pastoris yaitu  3,5.  Yuan et  al (2012),  menyatakan  endoglukanase yang dihasilkan oleh Fusarium oxysporum sangat  reaktif  pada  pH  4,5-5,5.  Menurut Rastogi et  al. (2010)  enzim  yang  mampu bertahan  pada  kondisi  asam  digolongkan ke dalam enzim asidofil.

## 3.3.  Penentuan Suhu Optimum Enzim Selulase
Suhu  merupakan  faktor  yang mempengaruhui laju katalisis reaksi
enzimatis.    Kenaikan  suhu  hingga  batas tertentu  dapat  meningkatkan  aktivitas enzimatis  sampai  pada  kondisi  suhu optimum,  namun  kenaikan  suhu  yang berlebih  dapat  menyebabkan  penurunan aktivitas  enzim.  Panas  yang  ditimbulkan akibat  kenaikan  suhu  dapat  mempercepat reaksi dan meningkatkan kecepatan molekul  karena  bertambahnya  energi kinetik  yang  mempercepat  gerak  vibrasi, translasi,  dan  rotasi  enzim  dan  substrat sehingga  memperbesar  peluang  keduanya untuk  bereaksi.  Kenaikan  suhu  melebihi suhu  optimum  menyebabkan  protein enzim  dan  substrat  mengalami  perubahan konformasi  yang  bersifat  detrimental. Perubahan  konformasi  substat  mengaki- batkan gugus reaktif mengalami hambatan dan  tidak  dapat  lagi  memasuki  sisi  aktif enzim  (Suhartono,1989).  Penentuan  suhu optimum  dilakukan  pada  suhu  30-80 o C. Hasil  pengukuran  aktivitas  selulase  pada beberapa suhu disajikan pada Gambar 5.
Gambar  5  memperlihatkan  aktivi- tas  selulase  meningkat  seiring  dengan peningkatan  suhu  hingga  suhu  optimum terjadi  pada  suhu  60 o C  dengan  aktivitas 0,042  U/mL  dan  terjadi  penurunan aktivitas  dimulai  pada  suhu  70 o C. Selulase  cenderung  memiliki  aktivitas optimum  pada  suhu  30-60 o C.  Hasil penelitian Yuan et al. (2012)menunjukkan suhu  optimum  selulase  yang  dihasilkan dari    kapang  jenis Fusarium  oxysporum yaitu 60 o C dan hasil yang sama diperoleh pada  penelitian  yang  dilakukan  oleh Adekele et  al .  (2012)  yang  menyatakan aktivitas  optimum  enzim  selulase  yang diproduksi  oleh Bacillus  coagulans Co4 terjadi pada suhu 60 o C.

## 3.4 Penentuan Kinetika Enzim
Mekanisme  kerja  enzim  juga ditentukan  oleh  jumlah  atau  konsentrasi substrat  yang  tersedia.  Pada  suatu  reaksi enzimatik bila konsentrasi substrat diperbesar  sedangkan  kondisi  lainnya
tetap  maka  kecepatan  reaksi  (v)  akan meningkat sampai suatu batas kecepatan
Gambar 4. Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase.
Gambar 5. Pengaruh suhu terhadap aktivitas selulase.
maksimum ( V maks ). K m (konstanta
Michaelis) dan V maks (kecepatan maksimum reaksi) merupakan dua parameter  kinetika  enzim. V maks dapat diartikan  sebagai  kecepatan  reaksi  pada saat  enzim  telah  jenuh  oleh  substrat. Pengaruh  perubahan  konsentrasi  substrat CMC terhadap kecepatan reaksi enzimatik (Gambar  6)  terlihat  bahwa  aktivitas selulase optimum pada konsentrasi substrat 1% dengan aktivitas 0,042 U/mL.
Penentuan  nilai K m dan V maks ditentukan  dengan  menggunakan  persa- maan  Michaelis-Menten.  Penentuan K m dan V maks dengan  kurva  garis  lurus  ini dikenal  sebagai  metode  Lineweaver-Burk seperti terlihat pada Gambar 7.
Nilai K m dan V maks enzim  selulase hasil  perhitungan  menggunakan  persama- an ini masing-masing sebesar 0,103% dan
0,044  U/mL.  Kanti  (2003)  menyatakan bahwa  pada  konsentrasi  substrat  yang rendah sampai tercapai nilai km, kecepatan  reaksi  meningkat  secara  tajam. Hal ini disebabkan substrat telah berikatan dengan enzim membentuk komplek enzim-substrat  (ES),  tetapi  masih  belum jenuh  dengan  substrat.  Setelah  nilai  Km tercapai  dan  sebelum  tercapainya  nilai batas  kerja  enzim,  peningkatan  kecepatan reaksi  enzim  berjalan  secara  berlahan sampai  tercapai  kecepatan  maksimum. Setelah  titik  ini  peningkatan  konsentrasi substrat  relatif  tidak  dapat  meningkatkan kecepatan  reaksi.  Hal  ini  disebabkan  sisi katalitik  enzim  telah  jenuh  terisi  oleh substrat  sehingga  meskipun  konsentrasi substrat  dinaikkan,  aktivitas  tidak  akan terjadi kenaikan.
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0 2 4 6 8 10 Ak tiv it a s (U/m l) pH 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0.050 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Ak tiv it a s (U/m l) Suhu ( o C)
Gambar 6. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim selulase.
Gambar 7. Kurva Lineaweaver-Burk pada penentuan Km dan Vmaks .

## IV.  KESIMPULAN
Waktu  inkubasi  dan  konsentrasi limbah
agar-agar terbaik untuk
memproduksi  enzim  selulase  dengan aktivitas  tertinggi  yaitu  9  hari  inkubasi dan  konsentrasi  limbah  1,5%  dengan aktivitas  selulase  tertinggi  terdapat  pada penggunaan  substrat  CMC  (endoglu- kanase)  yaitu  0,031  U/mL.  Nilai  pH  dan suhu  optimum  kerja  enzim  selulase  yaitu pH  7  dan  60 o C.  Konsentrasi  substrat CMC  yang  digunakan  untuk  memperoleh aktivitas  optimum  adalah  1%.  Hasil perhitungan  kinetika  reaksi  menunjukkan
nilai V maks selulase  adalah  0,044  U/mL dengan K m 0,103%.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada  Direktorat  Jenderal  Pendidikan Tinggi,  Kementerian  Pendidikan  dan Kebudayaan  Republik  Indonesia  melalui Program  Penelitian  Unggulan  Perguruan Tinggi  atas  nama  Ketua  Peneliti  Dr. Kustiariyah  Tarman,  S.Pi.,  M.Si.  dengan judul  Pengembangan  Teknologi  Produksi Bioetanol  melalui  Pemanfaatan  Limbah Industri  Rumput  Laut  dengan  Kapang
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 Ak tiv it a s (U/m l) Konsentrasi Substrat (%) y = 2,329x + 22,72 R² = 0,925 0 5 10 15 20 25 30 35 0 1 2 3 4 5 1 /v 1/[S]
Endofit  Indigenous  Laut  Indonesia  (No. 58/IT3.41.2/L1/SPK/2013).

## DAFTAR PUSTAKA
Adeleke,  E.O.,  B.O.  Omafuvbe,  I.O. Adewale,  and  M.K.  Bakare.  2012. Purification and characterisation of a  cellulase  obtained  from  cocoa
( Theobroma cacao ) pod-degrading
Bacillus  coagulans Co4. Turk  J. Biochem , 37(3):222–230.
Chaplin,  M.F.  and  C.  Bukle.  1990. Enzyme  technology.  Cambridge
University Press. Cambridge. 264p.
Da  Silva,  R.,  E.S.  Lago,  C.W.  Merheb,
M.M. Machione, Y.K. Park, and E. Gomes. 2005. Production xylanase and  CMCase  on  solid  state fermentation  in  different  residues by Thermoascus auranticus miehe.
Braz J. Microbiomol , 36:235-241.
Delabona,  P.S.,  C.S.  Farinas,  M.R.  da Silva,  S.F.  Azzon,  and    J.G.  da Cruz Pradella. 2012. Use of a new
Trichoderma harzianum strain isolated from the amazon rainforest  with  pretreated  sugar cane  bagasse  for  on-site  cellulase production. J. Bioresource Technology , 107:517–521.
Deswal, D., Y.P. Khasa, and R.C. Kuhad.
2011.  Optimization  of  cellulase production  by  a  brown  rot  fungus Fomitopsis sp.  RCK2010  under solid  state  fermentation. Biore- source Technology , 102:6065-6.
Grover,  A.K.,  D.D.  Macmurchi,  and  R.J. Cushley.  1977.  Studies  on  almond emulsin β-D-glukosidase I. Isolation  and  characterization  of biofunctional isozyme. Biochimica et Biophysica Acta , 482:98-108.
Gupta, P.,  K. Samant, and A. Sahu. 2012. Isolation  of  cellulose-degrading bacteria and determination of their
cellulolytic potential. International J. of Microbiology , 2012: 1-5.
Harshvardhan,  K.,  A.  Mishr,  and  B.  Jha.
2013.  Purification  and  characteri- zation  of  cellulase  from  a  marine Bacillus  sp.  H1666:  A  potential agent  for  single  step  sacchari- fication  of  seaweed  biomass. J.  of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 93:51-56.
Kanti,  A.  2005.  Actinomycetes  selulolitik dari  tanah  hutan  Taman  Nasional Bukit  Duabelas,  Jambi. Biodiver- sitas, 6(2):85-89.
Kementrian  Kelautan  dan  Perikanan [KKP].  2012.  Sistem  informasi dan  statistik.  http://www.kkp.go. id. [27 Maret 2012].
Lee,  Y.J.,  B.K.  Kim,  B.H.  Lee,  K.I.  Jo, N.K.  Lee,  C.H.  Chung,  Y.C.  Lee, and J.W. Lee. 2007. Purification and characterization  of  cellulase  produ- ced  by Bacillus  amyoliquefaciens DL-3 utilizing rice hull. Bioresource Technology , 99:378-386.
Mandels, M., R. Andreotti, and C. Roche. 1976.  Measurment  of  sacchari- fying  cellulase. Biotechnol.  and
Bioeng. Symp. , 6:21-33.
Muthuvelayudham,  R.  and  T.  Viruthagiri. 2006 . Fermentative production and kinetics  of  cellulase  protein  on Trichoderma  reesei  using  sugar- cane  bagasse  and  rice  straw. African J. of Biotechnology,
5(20):1873-1881.
Rastogi, G., A. Bhalla, A. Adhikari, K.M.
Bischoff, R.S. Hughes, L.P. Christopher,  and  R.K.  Sani.  2010. Characterization  of  thermostable cellulases  produced  by Bacillus and Geobacillus  strains . Biore- source Technology, 101:8798– 8806.
Schulz,  B.,  C.  Boyle,  S.  Draeger,  A.K. Römmert,  and  K.  Krohn.  2002. Endophytic  fungi:  a  source  of novel  biologically  active  second-
dary metabolites. Mycol. Res. , 106 (9):996-1004.
Subowo, Y.B. 2010. Uji aktivitas selulase
dan  ligninase  dari  beberapa  jamur dan potensinya sebagai pendukung pertumbuhan tanaman terong ( Solanum melongena ). Berita Biologi , 10(1):1-6. Suhartono,  M.T.  1989.  Enzim  dan bioteknologi.  Bogor.  Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat  Jenderal  Pendidikan
Tinggi  Antar  Universitas  Biotek- nologi,  Institut  Pertanian  Bogor. 322hlm.
Tang,  B.,  H.  Pan,  W.  Tang,  Q.  Zhang,  L. Ding, and F.  Zhang.  2012.
Fermentation  and  purification  of cellulase  from  a  novel  strain
Rhizhopus  stolonifer var.  reflexus TP-02. Biomass  and  Bioenergy, 36:366-372. Thongekkaew,  J.,  H.  Ikeda,  K.  Masaki, and  H.  Iefuji.  2008. An acidic and thermostable carboxymethyl cellu- lase  from  the  yeast Cryptococcus sp. S-2: Purification, characteriza-
tion  and  improvement  of  its recombinant  enzyme  production by  high  cell-density  fermentation of Pichia pastoris . Protein
Expression  and  Purification ,  60:
140–146.
Yuan,  L.,  W.  Wang,  Y.  Pei,  and  F.  Lu. 2012.  Screening  and  identification of  cellulase-producing  strain  of Fusarium  oxysporum . Procedia Environmental  Science ,  12:  1213- 1219.
Zhou, J., Y.H. Wang, J. Chu, J.P. Zhuang,
S.L.  Zhang,  and  P.  Yin.  2008.
Identification  and  purification  of the  main  components  of  cellulases from a mutant strain of
Trichoderma  viride T  100-14.
Bioresource Technology, 99 :6826–
6833.
Diterima : 3 Maret 2014 Direview : 18 April 2014 Disetujui : 28 April 2014