Kode batang DNA ikan lais genus Kryptopterus asal Sungai Mahakam Kalimantan Timur
[Barcoding DNA of catfish species genus Kryptopterus from Sungai Mahakam Kalimantan Timur]
Jusmaldi 1,  , Dedy Duryadi 2 , Ridwan Affandi 3 , M.F. Rahardjo 3 , Rudhy Gustiano 4
1 Program Studi Biologi FMIPA Universitas Mulawarman Jln. Barong Tongkok, Kampus Gunung Kelua Samarinda 75123
2 Departemen Biologi Fakultas Matematikan Ilmu Pengetahuan Alam IPB Jln. Agatis, Kampus IPB Dramaga Bogor 16680
3 Departemen Manajemen Sumber Daya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB Jln. Agatis, Kampus IPB Dramaga Bogor 16680
4 Balai Penelitian dan Pengembangan Budi Daya Air Tawar, Badan LITBANG KP Jln. Sempur No. 1 Bogor 16129
Diterima: 3 Juni 2014; Disetujui: 23 September 2014

## Abstrak
Penelitian kode batang DNA spesies ikan lais genus Kryptopterus asal Sungai Mahakam Kalimantan Timur mengguna- kan gen COI DNA mitokondria dilakukan dengan tujuan untuk mengungkap penanda genetik (kode batang DNA), ka- rakterisasi genetik dan pohon genetik. Amplifikasi daerah gen COI DNA mitokondria dilakukan dengan menggunakan pasangan  primer  COI  FishF1  dan  COI  FishR1  terhadap  tiga  spesies  ikan  lais  yang  terdiri  atas Kryptopterus  apogon (N=3), K. micronema (N=6), dan K. limpok (N=1). Hasil penelitian menunjukkan penyejajaran berganda pada gen par- sial COI DNA mitokondria antara spesies K. apogon , K. micronema , dan K. limpok diperoleh tiga situs nukleotida spe- sifik sebagai penanda genetik (kode batang DNA). Analisis karakterisasi genetik pada genus Kryptopterus berdasarkan gen parsial COI DNA mitokondria menunjukkan situs nukleotida yang bervariasi sebesar 13,58%, substitusi nukleotida lebih besar pada kodon ketiga dan bersifat transisi dari pada transversi. Konstruksi ulang pohon genetik berdasarkan ni- lai p-distance dapat  memisahkan  kelompok  spesies K.  apogon , K.  micronema ,dan K.  limpok dengan  nilai bootstrap sempurna.
Kata penting: DNA mitokondria, gen COI, Kryptopterus

## Abstract
DNA  barcoding  of  genus Kryptopterus catfish  from  Mahakam  River,  East  Kalimantan  by  using  mitochondrial  DNA COI gene has been performed to obtain genetic marker (barcoding DNA), genetic characteristics and genetic tree. Am- plification of mitochondrial COI gene regions was conducted by  using  COI Fish F1 and COI Fish R1 primers on the three catfish species consist of Kryptopterus apogon (N=3), K . micronema (N=6), and K . limpok (N=1). Based on part- ial COI mtDNA  multiple alignment, we obtained three specific nucleotide site as genetic marker. Meanwhile, genetic characteristic analysis revealed 13.58% of nucleotide variation. Nucleotide substitution was greater at the third codon and transitional substitution was greater than transvertion. Genetic tree reconstruction based on p-distance separated the three catfish species with perfect bootstrap value.
Keywords: mitochondrial DNA, COI gene, Kryptopterus

## Pendahuluan
Ikan lais merupakan nama umum yang di- kenal  oleh  masyarakat  di  Indonesia  yang  dituju- kan  untuk  kelompok  ikan  bersungut  air  tawar anggota famili Siluridae (Kottelat et al . 1993). Di Indonesia,  ikan  lais  umumnya  dimanfaatkan  se- bagai  ikan  konsumsi  dan  diperdagangkan  teruta- ma di wilayah Sumatera dan Kalimantan, bahkan
hingga  di  negara  Thailand  dan  India  (Pagdee et al .  2007,  Elvyra  2009,  dan  Handayani et  al .
2009).  Selain  sebagai  ikan  konsumsi,  ikan  lais dari spesies Kryptopterus bicirrhis ( glass catfish )
dan K. macrocephalus ( marbled glass catfish ) di- manfaatkan sebagai ikan hias dan diekspor ke ka- wasan Asia Tenggara (Ng & Tan 1997).
Anggota famili Siluridae tersebar di Eropa hingga Asia, di kawasan Asia Tenggara dapat di- temukan  di  perairan  tawar  Indochina,  Semenan-
 Penulis korespondensi Alamat surel: aldi_jus@yahoo.co.id
jung Malaya dan Paparan Sunda ( Sundaland ) ter- utama pada sungai-sungai yang bermuara ke arah laut Cina Selatan dan Selat Malaka. Di Indonesia ikan lais terutama tersebar di Sumatera dan Kali- mantan,  lebih  dari  32  spesies  telah  dilaporkan (Kottelat et al . 1993 dan Bornbusch 1995).
Di dalam ordo Siluriformes, famili Siluri- dae dibedakan dengan famili lainnya berdasarkan ciri  kepala  dan  badan  yang  lebih  pipih,  tulang punggung  fleksibel,  dan  duri  lemah  pada  sirip dada  (Diogo  2005).  Secara  morfologis  ikan  lais sulit  dibedakan  karena  kemiripan  diantara  genus dan  spesiesnya.  Genus Kryptopterus dan Ompok memiliki bentuk tubuh dan warna yang mirip dan hanya  berbeda  pada  kehadiran  sirip  punggung (Kottelat et  al .  1993).  Analisis  morfometrik  ter- hadap  empat  spesies  ikan  lais  ( Ompok  hypop- thalmus , K.  limpok , K.  micronema , K.  bicirrhis ) menggunakan  analisis  komponen  utama  dengan 13 karakter pengukuran belum ditemukan karak- ter penciri pembeda diantara spesiesnya (Rahman 2010).
Berdasarkan  sejarah  geologi,  sungai- sungai  di  Sumatera  bagian  tengah  dan  Sungai Kapuas  di  Kalimantan  Barat  merupakan  bagian dari aliran Sungai Sunda Utara purba, sedangkan sungai-sungai  di  Kalimantan  Selatan,  Jawa  dan sebagian timur Sumatera  merupakan bagian  alir- an  Sungai  Sunda  Timur  purba  (Voris  2000  dan McConnell 2004). Sungai Mahakam di Kaliman- tan Timur bukan termasuk bagian dari kelompok Sungai  Sunda  Utara  dan  Sungai  Sunda  Timur purba, sehingga pola penyebaran komunitas ikan di Kalimantan Timur lebih mirip dengan komuni- tas  ikan  di  Kalimantan  Utara  dibandingkan  de- ngan  di  Kalimantan  Barat  dan  Kalimantan  Sela- tan (Yap 2002).
Dari sejarah geologi Sungai Mahakam bu- kan  bagian  dari  kelompok  Sungai  Sunda  Utara dan Sungai Sunda Timur purba, sehingga diduga
ini akan berkaitan dengan tingkat keragaman ge- netik  fauna  ikan  yang  menghuni  kawasan  terse- but,  khususnya  ikan  lais.  Laporan  Christensen (1992)  dan  Kottelat  (1994)  berdasarkan  identifi- kasi  morfologi  menyebutkan  bahwa  terdapat  14 spesies ikan lais dari Sungai Mahakam.
Penelitian  kode  batang  DNA  ( DNA  bar- coding )  menggunakan  runutan  gen  parsial  sub unit  1 Cytochrome  c  oxidase (COI)  DNA  mito- kondria  pada  famili  Siluridae  masih  sedikit  dila- kukan dan baru dilaporkan pada spesies O . pabo , O . pabda ,  dan O . bimaculatus dari  India  (Mala- kar et al. 2012). Selain itu informasi runutan gen COI DNA mitokondria pada genus Kryptopterus di dalam data bank gen hingga tahun 2014 masih belum tersedia.
Gen  COI DNA  mitokondria  merupakan salah satu marka molekular yang banyak diguna- kan sebagai kode batang DNA. Gen COI banyak digunakan  sebagai  kode batang DNA  karena ba- nyak  bagian  dari  runutan  nukleotidanya  yang bersifat  konservatif  dan  sedikit  variasi,  sehingga dapat dipakai untuk identitas dan pengelompokan spesies pada berbagai tingkatan taksa  hewan ter- masuk  ikan  (Hebert et  al .  2003  dan  Ward et  al .
2005). Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan runutan  gen  parsial  COI  DNA  mitokondria  ikan lais  genus Kryptopterus asal  Sungai  Mahakam untuk digunakan sebagai identitas dan pengelom- pokan spesies (kode batang DNA).

## Bahan dan metode

## Waktu dan tempat penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli sampai  Desember  2013.  Koleksi  contoh  dilaku- kan  di  kawasan  aliran  Sungai  Mahakam    (Gam- bar  1)  dan  dilanjutkan  di  Laboratorium  Biologi Molekular Hewan, Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati  &  Bioteknologi  (PPSHB),  Institut  Perta- nian Bogor untuk keperluan analisis molekuler.

## Gambar 1. Lokasi pengambilan ikan contoh di Sungai Mahakam

## Koleksi ikan contoh
Sepuluh  ikan  lais  contoh  dikoleksi  dari kawasan  aliran  Sungai  Mahakam  meliputi  (a) Mahakam  Hulu  (00 0 27 ’ 32 ’’ Selatan;  115 0 1 ’ 96 ’’
Timur): K.  apogon (N  =  3), dan K.  limpok (N  =
1);  (b)  Mahakam  Tengah  (00 0 14 ’ 51 ’’ Selatan;
116 0 31 ’ 55 ’’ Timur): K.  micronema (N  =  2),  dan (c)  anak  aliran  Sungai  Mahakam  (00 0 9 ’ 24 ’’ Se- latan; 116 0 71 ’ 55 ’’ Timur): K. micronema (N = 4).
Identifikasi spesies ikan dilakukan dengan meng- gunakan kunci identifikasi Kottelat et al. (1993).
Dalam  kegiatan  molekuler,  jaringan  otot ikan diambil dari bagian punggung dalam bentuk potongan  kecil,  dimasukkan  ke  dalam  tabung ependorf  yang  berisi  alkohol  96%  dan  diberi label. Jaringan otot contoh selanjutnya dibawa ke Laboratorium Biologi Molekular Hewan,
PPSHB, IPB Bogor.

## Isolasi dan purifikasi DNA
Jaringan otot ikan ditimbang 25 mg, dicu- ci dengan larutan low TE ( Tris-EDTA buffer ) se- banyak tiga kali untuk membebaskan alkohol da- ri  jaringan.  Contoh  yang  telah  dicuci  kemudian
dimasukkan ke dalam tabung ependorf berisi 180 µl  ATL  ( Animal  Tissue  Lysis ).  Setelah  itu  dige- rus  dengan  alat  Micro  Smash TM MS  100  merk
Tomy.  Tahapan  isolasi  DNA  selanjutnya  meng- ikuti  metode spin-column  protocol dari  Qiagen.
Kit DNA yang digunakan adalah Dneasy ®Blood dan Tissue Kit cat no 69504 (50).

## Visualisasi purifikasi DNA
Hasil  purifikasi  DNA  dimigrasikan  pada gel  agarose  1,2%  dalam  larutan  1xTBE ( Tris- borate-EDTA ) menggunakan alat Submarine Electrophoresis Hoefer, USA. DNA total divisu- alisasi  dengan  bantuan  UV transluminator (λ  =
300  nm),  menggunakan  gel  yang  diwarnai  de- ngan Etidium Bromida (0,5µgml -1 ).

## Amplifikasi DNA
DNA  total  hasil  purifikasi  digunakan  se- bagai DNA cetakan untuk proses amplifikasi de- ngan  menggunakan  teknik Polymerase  Chain Reaction  (PCR) .  Primer  yang  digunakan  adalah COI Fish  F1 5’-TCAACCAACCACAAAGACA TTGGAC-3’ (26 pb) dan COI Fish R1 5’-TAGA
CTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’  (26  pb). Target  dari  primer  menghasilkan  produk PCR gen COI sepanjang 707 pb (Ward et al. 2005).
Kondisi PCR yang  digunakan  adalah  pra PCR suhu 94 º C selama 5 menit,  denaturasi suhu 94ºC selama 30 detik, penempelan suhu 52ºC se- lama  30  detik,  pemanjangan  suhu  72ºC selama 30 detik (35 siklus) dan post PCR suhu 72 º C se- lama 5 menit.

## Perunutan DNA
Produk hasil amplifikasi selanjutnya digu- nakan  untuk  proses  perunutan  DNA.  Perunutan DNA  dilakukan  dua  arah  yaitu forward dan re- verse dengan menggunakan  mesin  ABI  Prism 3730 kapiler. Perunutan DNA dilakukan oleh 1st BASE  Malaysia  yang  dikirim  melalui  PT  Gene- tika Science Indonesia.

## Analisis data
Hasil  perunutan  nukleotida  gen  COI  dari arah forward dan reverse pada setiap spesies di- sejajarkan  untuk  mendapatkan  konsistensi  hasil runutan,  kemudian  masing-masing  ujung  frag- men  gen  COI  tempat  posisi  penempelan  primer forward dan reverse dibuang, sehingga diperoleh satu  runutan  Gen  COI  parsial  untuk  masing- masing  spesies.  Selanjutnya  runutan  nukleotida
gen COI parsial DNA mitokondria pada masing- masing  spesies  ikan  lais  dilakukan  penyejajaran berganda ( multiple aligment ).
Penyejajaran runutan gen COI DNA mito- kondria dilakukan menggunakan Clustal W , ana- lisis  karakterisasi  genetik  dan  konstruksi  ulang pohon  genetik  dilakukan  menggunakan  program MEGA versi 5 (Tamura et al . 2011). Spesies out group yang  digunakan    dalam  konstruksi  ulang pohon  genetik  adalah  runutan  gen  parsial  COI DNA  mitokondria  dari O.  bimaculatus (Siluri- dae) (kode akses Bank Gen: FJ230039.1).
Untuk  posisi  penempelan  primer,  maka dilakukan  penyejajaran  primer  COI  Fish  F1  dan COI Fish R1 pada runutan gen COI utuh Silurus glanis (Siluridae) (kode akses Bank Gen : AM398
435.2)  (Vittas et  al .  2011)  sebagai  acuan  (Gam- bar 2).

## Hasil

## Ukuran runutan gen COI Parsial DNA mitokondria ikan lais
Berdasarkan  pita  elektroforesis  dan  mar- ker DNA yang digunakan, gen COI ikan lais ha- sil amplifikasi berukuran sekitar 700 pb (Gambar 3),  tetapi  setelah  dilakukan  penyejajaran  dari runutan  nukleotida  pada  masing-masing  spesies diperoleh ukuran sebesar 707 pb.
Gambar 2. Posisi penempelan primer COI Fish F1 dan COI Fish R1 pada gen COI utuh dari Silurus glanis (famili Siluridae)
Gambar 3. Profil  pita  elektroforesis  hasil  ampli- fikasi gen COI spesies ikan lais genus Kryptopterus meng-gunakn  primer COI Fish F1dan primer COI Fish R1. (M)  Marker,  (1) K.  apogon ,  (2) K. micronema , (3 ) K. limpok

## Karakterisasi genetik spesies ikan lais genus Kryptopterus
Semua  runutan  nukleotida  gen  COI  par- sial  ikan  lais  genus Kryptopterus yang  diamati tidak  menunjukkan  adanya insersi , delesi dan kodon stop . Analisis penyejajaran  berganda pada semua  runutan  gen  COI  ikan  lais  diperoleh  nuk- leotida yang bervariasi sebesar 13,58 % dan yang konservatif sebesar 86,42% (Tabel 1). Dilihat da- ri posisi nukleotida pada kodon triplet, substitusi nukleotida  terbesar  pada  semua  spesies  secara berturut-turut berada pada nukleotida  ketiga,  nu- kleotida  kesatu  dan  nukleotida  kedua.  Substitusi nukleotida  yang  terjadi  pada  kodon  ketiga    me- nunjukkan  lebih  besar  transisi  (3,39%)  diban- dingkan  dengan  transversi  (1,55%).  Berdasarkan komposisi  basa  penyusun  runutan  gen  COI  pada semua  spesies  mulai  dari  yang  terbesar  secara berturut-turut  adalah  sitosin  (C),  timin  (C),  ade- nin (A) dan guanin (G). Pada penelitian ini kom- posisi basa GC pada semua  spesies dalam  genus Kryptopterus sebesar 46,40%.

## Penanda genetik
Pada  penelitian  ini  ditemukan  3  situs  nu- kleotida  yang  mengalami  substitusi  dari  53  situs parsimoni  informatif  dan  dapat  digunakan  seba- gai  pembeda  antara K.  apogon , K.  micronema dan K. limpok . Substitusi nukleotida tersebut ter- jadi pada situs ke 567, 573 dan 651 seperti terli- hat pada Tabel 2.

## Jarak genetik
Berdasarkan  nilai p-distance ,  jarak  gene- tik  antarindividu  dalam  satu  spesies  (intraspe- sies)  kecil  dari  2%  dan  antara  spesies  berbeda (antarspesies)  berkisar  dari  7-12%.  Dalam  pene- litian  ini  jarak  genetik  antarspesies  terjauh  dite- mukan antara K. limpok dan K. apogon (Tabel 3).

## Hubungan kekerabatan
Hasil konstruksi ulang pohon genetik dila- kukan  berdasarkan  nilai p-distance dan  metoda neighbour  joining dengan  nilai booststrap 1000 kali  pengulangan  (Gambar  4).  Topologi  pohon genetik  menunjukkan  masing-masing  individu dalam  spesies  yang  sama  membentuk  satu  ke- lompok dan terpisah dari spesies lainnya dengan nilai bootstrap sempurna (100, 97 dan 100).

## Pembahasan
Penyejajaran  runutan  gen  COI  pada  se- mua  spesies  ikan lais asal Sungai Mahakam  me- nunjukkan sedikit nukleotida yang bervariasi ser- ta  tidak  ditemukan  nukleotida  yang  mengalami insersi dan delesi . Gen COI  mempunyai runutan nukleotida  yang bersifat konservatif  serta sedikit delesi , insersi dan variasi sehingga digunakan se- bagai kode batang DNA (Hebert et al . 2003).
Dilihat dari substitusi nukleotida pada ko- don triplet dari runutan gen COI ikan lais, dalam penelitian ini paling tinggi terjadi pada posisi ko-
Tabel 1. Karakterisasi nukleotida  semua spesies ikan lais genus Kryptopterus Karakter Semua spesies Jumlah spesies 3 Jumlah runutan 10 Situs konservatif (%) 611(86,42) Situs bervariasi (%) 96 (13,58) Variasi di kodon kesatu (%) 24 (3,39) Variasi di kodon kedua (%) 15 (2,12) Variasi di kodon  ketiga (%) 57 (8,06) a. Substitusi transisi (%) 24 (3,39) b. Substitusi transversi (%) 11(1,55) Situs parsimoni (%) 53 (7,50) Situs singleton (%) 43 (6,08) Persentase Timin 28,20 Persentase Sitosin 28,80 Persentase Adenin 25,40 Persentase Guanin 17,60
Keterangan: (1) Situs parsimoni= ditemukan minimal dua jenis nukleotida, setiap jenis nukleotida dimiliki oleh minimal dua runutan, (2) Situs singleton= nukleotida yang berbeda hanya ditemukan pada satu runutan.
Tabel 2. Situs nukleotida yang mengalami substitusi pada gen COI parsial DNA Mitokondria dalam genus

## Kryptopterus
Spesies Basa nukleotida ke 567 573 651 Kryptopterus apogon D1 T G A Kryptopterus apogon D2 T G A Kryptopterus apogon D3 T G A Kryptopterus micronema M1 G C G Kryptopterus micronema M2 G C G Kryptopterus micronema M3 G C G Kryptopterus micronema M4 G C G Kryptopterus micronema K1 G C G Kryptopterus micronema K2 G C G Kryptopterus limpok D3 A A C
Keterangan: D= Mahakam Hulu; K= Mahakam Tengah; dan M= Anak Sungai Mahakam
Tabel 3. Jarak genetik antarspesies ikan lais genus Kryptopterus dari Sungai Mahakam berdasarkan runutan gen COI parsial dengan spesies pembanding O. bimaculatus dari Gen Bank 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 - 0,02 0,01 0,07 0,07 0,07 0,07 0,08 0,07 0,12 0,16 2 16 - 0,01 0,08 0,08 0,07 0,08 0,08 0.07 0,11 0,16 3 10 9 - 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07 0,11 0,15 4 52 56 50 - 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01 0,07 0,14 5 49 55 52 3 - 0,00 0,00 0,01 0,01 0,07 0,14 6 52 53 49 3 3 - 0,00 0,01 0,00 0,07 0,14 7 51 54 50 3 2 1 - 0,01 0,01 0,07 0,14 8 54 55 49 6 7 6 5 - 0,01 0,07 0,15 9 53 51 48 6 4 3 4 5 - 0,07 0,14 10 82 79 76 53 52 50 51 52 48 - 0,18 11 111 110 107 102 102 99 100 103 100 126 -
Keterangan: 1= K. apogon D1, 2 = K. apogon D2, 3 = K. apogon D3, 4 = K. micronema M1, 5 = K. micronema M2, 6 = K. micronema M3, 7 = K. micronema M4, 8 = K. micronema K1, 9 = K. micronema K2, 10 = K . limpok D3,  11 = O. bimaculatus (GB) ( out group ). Nilai di bawah diagonal =  jumlah perbedaan nukleotida, diatas diagonal = p-distance.
Gambar 4. Konstruksi ulang pohon genetik tiga spesies ikan lais genus Kryptopterus yang dianalisis berda- sarkan nilai p-distance dengan metoda neighbour joining , bootstrap 1000x
don  ketiga  dibandingkan  dengan  kodon  kesatu dan kodon kedua. Dapat  dikatakan bahwa freku- ensi  substitusi  sinonim  pada  runutan  gen  COI ikan  lais  lebih  sering  terjadi  daripada  substitusi non  sinonim.  Substitusi  nukleotida  yang  terjadi pada posisi kodon ketiga umumnya bersifat sino- nim (tidak menyebabkan perubahan aktivitas  pa- da produk  yang dikode oleh  gen) dan   substitusi nukleotida  pada  posisi  kodon  kesatu  dan  kedua bersifat non sinonim (Bofkin & Goldman 2007).
Berdasarkan  substitusi  nukleotida  yang terjadi  pada  posisi  kodon  ketiga,  substitusi  nu- kleotida  transisi  lebih  besar  daripada  transversi. Hal  yang  sama  juga  dilaporkan  oleh  Malakar et al. (2012) pada spesies O. bimaculatus , O. pabda dan  O. pabo dari  India, di  mana  dari  655 pb  ru- nutan gen COI parsial DNA mitokondria dipero- leh  0,61%  situs  yang  bervariasi  dan  substitusi transisi lebih besar daripada substitusi transversi. Substitusi transisi yang lebih besar daripada sub- stitusi  transversi  juga  dilaporkan  oleh  peneliti lainnya  (Santos et  al .  2003,  Vinson et  al .  2004, dan Ward et al . 2005).
Komposisi  basa  nukleotida  GC  pada  se- mua  spesies  dalam  genus Kryptopterus asal  Su- ngai  Mahakam  sebesar 46,40%. Hasil  yang rela- tif  sama  juga  dilaporkan  oleh  Malakar et  al.
(2012), bahwa persentase GC pada O. Bimacula- tus (45,60%), O.  pabda (49,  30%)  dan O.  pabo
(46,40%) dari 655 bp runutan gen  COI. Ward et al. (2005) juga melaporkan komposisi GC genom DNA  mitokondria  ikan  berkisar  38,40-43,20%, sedangkan pada gen COI DNA mitokondria utuh berkisar 42,20-47,10 %.
Pada  penelitian  ini  ditemukan  tiga  situs nukleotida  yang  mengalami  substitusi  dan  dapat digunakan sebagai penanda genetik (kode batang DNA)  untuk  pembeda  antara  spesies K.  apogon , K.  micronema dan K.  limpok asal  Sungai  Maha- kam.  Tiga  situs  tersebut  adalah  situs  nukleotida ke  567  pada  spesies K.  apogon dicirikan  oleh nukleotida  T,  sedangkan  pada  spesies K.  micro- nema dicirikan  oleh  nukleotida  G,  dan  pada K. limpok dicirikan  oleh  nukleotida  A.  Situs  nu- kleotida ke 573 pada spesies K. apogon dicirikan oleh  nukleotida  G,  pada  spesies K.  micronema
dicirikan  oleh  nukleotida  C,  dan  pada K.  limpok dicirikan  oleh  nukleotida  A.  Situs  nukleotida  ke 651  pada  spesies K.  apogon dicirikan  oleh  nu- kleotida  A, pada spesies K. micronema dicirikan oleh  nukleotida  G,  dan  pada K.  limpok dicirikan oleh  nukleotida  C.  Gen  COI  DNA  mitokondria dipelajari  dalam  skala  luas  sebagai  kode  batang DNA  karena  dapat  menentukan  identitas  sebuah spesies dan mampu membedakan kelompok spe- sies pada berbagai tingkatan taksa hewan, terma- suk pada ikan air tawar dan air laut (Hebert et al . 2003,  Ward et  al .  2005,  Hubert et  al .  2008,
Wong et al . 2011, dan Malakar et al. 2012,).
Jumlah K. limpok contoh dalam penelitian ini  hanya  satu  individu,  mungkin  diperlukan contoh  yang  lebih  banyak  sehingga  diperlukan penelitian  lebih  lanjut  untuk  melihat  konsistensi pada penanda genetiknya. Selain itu dalam pene- litian  ini  hanya  menggunakan  gen  COI  parsial, diperkirakan  penanda  genetik  pada  situs  lain  ke- mungkinan masih ada.
Jarak  genetik  antar  individu  dalam  satu spesies  (intraspesies)  dalam  penelitian  ini  kecil dari  2%  dan  antarspesies  berbeda  (berkisar  dari 7%  sampai  12%.  Hasil  yang  relatif  sama  juga dilaporkan  oleh  Malakar et  al. (2012)  di  mana pada spesies O.  bimaculatus , O.  Pabda ,  dan O. pabo diperoleh  nilai  rata-rata  jarak  genetik  intra spesies  sebesar  0,35%  dan  pada  antarspesies  se- besar 13,1%. Ratnasingham & Hebert (2013) ju- ga melaporkan variasi gen COI pada intra spesies kurang  dari  2%,  tetapi  jika  perbedaannya  lebih dari  4%  merupakan  kerabat  dekat  dan  terisolasi secara reproduksi.
Nilai bootstrap yang ditampilkan pada ca- bang pohon genetik antara K. micronema dan K. limpok sebesar  97,  artinya  97%  dari  1000  kali pengulangan K.  limpok memiliki  hubungan  ke- kerabatan dengan K. micronema , sedangkan pada kelompok  individu  spesies K.  apogon dan K.
micronema masing-masing  mempunyai  nilai bootstrap  100.  Cabang  pada  pohon  genetik  me- wakili hubungan antar unit yang menggambarkan hubungan  keturunan  dengan  leluhur,  sedangkan panjang  cabang  menggambarkan  jumlah  peru- bahan  evolusioner  yang  terjadi  antara  dua  nodus (Li & Graur 1991). Topologi pohon genetik yang diperoleh  pada  penelitian  ini  dapat  memisahkan kelompok ikan lais berdasarkan kelompok genus dan  spesiesnya  dengan  nilai  kepercayaan  yang cukup tinggi.

## Simpulan
Terdapat tiga situs nukleotida  sebagai pe- nanda  genetik  (kode  batang  DNA)  pembeda  an- tara  spesies K.  apogon , K.  micronema ,  dan K. limpok .  Konstruksi  ulang  pohon  genetik  meng- gunakan  runutan  COI  DNA  mitokondria  dapat memisahkan kelompok spesies K. micronema, K. limpok, dan K.  apogon dengan  nilai bootstrap sempurna.

## Daftar pustaka
Bofkin L, Goldman N. 2007. Variation in evolu- tionary  processes  at  different  codon  positi- ons. Molecular  Biology  and  Evolution ,  24 (2):513-521.
Bornbusch  AH. 1995. Phylogenetic relationships within  the  eurasian  catfish  family  Siluridae (Pisces:Siluriformes),  with  comments  on generic validities and biogeography. Zoolo- gical  Journal  of  the  Linnean  Society , 115:
1-46.
Christensen MS. 1992. Investigations on the eco- logy  and  fish  fauna  of  the  Mahakam  River in  East  Kalimantan  (Borneo),  Indonesia.
Internationale Revue  der  Gesamten  Hydro- biologie , 77(4):593-608.
Diogo  R.  2005. Morphological  evolution,  apta- tions,  homoplasies,  constraints  and  evolu- tionary trends: catfishes as a case study on general  phylogeny  and  macroevolution . Science  Publishers,  United  States  of  Ame- rica. 491 p.
Elvyra  R.  2009.  Kajian  keragaman  genetik  dan biologi reproduksi ikan lais di sungai Kam-
par  Riau. Disertasi .  Sekolah  Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor, Bogor. 126 hlm.
Handayani  T,  Buchar  T,  Anang  N.  2009.  Aspek biologi  ikan  lais/ Sheat  Fish (Siluridae)  di Danau  Batu  dan  Danau  Tehang. Journal  of Tropical Fisheries , 3(2):35-46.
Hebert  PDN,  Cywinska  A,  Ball  SL,  de  Waard JR. 2003. Biological identifications through DNA  barcodes. Proceedings  of  the  Royal Society of London , 270:313-322.
Hubert N, Hanner R, Holm E, Mandrak NE, Tay- lor  E.  2008.  Identifying  Canadian  fresh- water  fishes  through  DNA  barcodes. Plos One , 3(6): e2490.
Kottelat M, Whitten AJ, Kartikasari SN, Wirjoat- modjo  S.  1993. Freshwater  fishes  of western  Indonesia  and  Sulawesi .  Periplus Hongkong. 293 p + 84 plates.
Kottelat  M.  1994.  The  fishes  of  the  Mahakam River, east Borneo: an example of the limit- ations  of  zoogeographic  analyses  and  the need  for  extensive  surveys  in  Indonesia. Tropical Biodiversity , 2(3):401-426.
Li  WH,  Graur  D.  1991. Fundamental  of  mole- culer  evolution .  Sinauer  Associates  Inc., Sunderland. 481 p.
Malakar  AK,  Lakra WS, Goswami M, Singh M, Mishra M. 2012. Molecular identification of three ompok species  using  mitochondrial COI  gene. Mitochondrial DNA , 23(1):20- 24.
McConell  SKJ.  2004.  Mapping  aquatic  faunal exchanges  across  the  Sunda  shelf,  South-
East  Asia,  using  distributional  and  genetic data  sets  from  the  cyprinid  fish Barbodes gonionotus (Bleeker, 1850). Journal of Na- tural History , 38(5):651-670.
Ng  PKL,  Tan  HH.1997.  Freshwater  fishes  of Southeast  Asia:  potential  for  the  aquarium fish  trade  and  conservation  issues. Aquari- um Sciences and Conservation , 1(2):79-90.
Pagdee  A,  Homchuen  S,  Sangpradub  N,  Hanja- vanit  C.  2007.  Biodiversity  and  economic value  of  wetland  resources  at  Nong  Han,
Udonthani  Province,  northeast  Thailand.
Natural  History  Bulletin of  the Siam  So- ciety , 55(2):323-339.
Rahman  A.  2010.  Keragaman  struktur  morfolo- gis  dan  gen Cytochrome  b DNA  mitokon-
dria Kryptopterus spp.  dan Ompok spp.
(Siluridae)  di  DAS  Batang  Hari  Jambi. Tesis . Institut Pertanian Bogor, Bogor. 91 p.
Ratnasingham  S,  Hebert  PD  N.  2013.  A  DNA- based  registry  for  all  animal  species:  the barcode  index  number  (BIN)  system. Plos One , 8(8):e66213.
Santos S, Schneider H, Sampaio I. 2003. Genetic differentiation  of Macrodon  ancylodon (Sciaenidae,  Perciformes)  populations  in Atlantic coastal waters of South America as revealed by  mtDNA analysis. Genetics and Molecular Biology , 26(2):151-161.
Tamura  K,  Peterson  D,  Peterson  N,  Stecher  G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5: molecular evolutionary  genetics  analysis  using  maxi- mum  likelihood,  evolutionary  distance,  and maximum  parsimony  methods. Molecular Biology and Evolution , 28(10):2731-2739.
Vinson  C,  Grazielle  G,  Schneider  H,  Sampaio  I.
2004.  Sciaenidae  fish  of  the  Caete  river estuary,  Northern  Brazil:  mitochondrial DNA  suggests  explosive  radiation  for  the Western  Atlantic assemblage. Genetics and Molecular Biology , 27(2):174-180.
Vittas  S,  Drosopoulou  E,    Kappas  I,  Pantzartzi CN,  Scouras  ZG.  2011.  The  mitochondrial genome of the European catfish Silurus gla- nis (Siluriformes:Siluridae). Journal of Bio- logical Research-Thessaloniki , 15:25-35.
Voris H K. 2000. Maps of pleistocene sea-levels in  South  East  Asia:  shorelines,  river  sys- tems,  time  durations. Journal  of  Biogeo- graphy , 27(5):1153-1167.
Ward  RD,  Zemlak  TS,  Innes  BH,  Last  PR, Hebert PDN. 2005. DNA barcoding Austra- lia’s  fish  species. Philosophical  Transac- tions  of  the  Royal  Society  B ,  360(1462): 1847-1857.
Wong  LL,  Peatman  E,  Lu  J,  Kucuktas  H,  He  S, Zhou  C,  Nanakom  U,  Liu  Z.  2011.  DNA barcoding of catfish: Species authentication and  phylogenetic  assessment. Plos  One , 6(3): e17812.
Yap  SY.  2002.  On  the  distributional  patterns  of Southeast-East  Asian  freshwater  fish  and their  history. Journal  of  Biogeography , 29 (9):1187-1199.