Efek Antifertilitas Fraksi n -Heksana, Fraksi Kloroform, dan Fraksi Metanol Biji Pepaya ( Carica papaya L.) Terhadap Tikus Jantan Galur Wistar
Siti Muslichah (a)* , Wiratmo (a)
Rendahnya partisipasi pria dalam program Keluarga Berencana disebabkan karena terbatasnya pilihan kontrasepsi untuk pria. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi potensi fraksi n -heksana, fraksi kloroform, dan fraksi metanol  biji  pepaya  sebagai  bahan  kontrasepsi.  Fraksi-fraksi  tersebut  diberikan  secara  oral  dengan  dosis masing-masing 100 mg/kgBB selama 20 hari. Sebanyak 20 ekor tikus jantan dengan berat badan 200-300 g berumur 2-2,5 bulan dikelompokkan menggunakan Rancangan Acak Lengkap . Hasil penelitian menunjukkan terjadinya penurunan jumlah, motilitas, viabilitas serta peningkatan abnormalitas spermatozoa yang signifikan dibandingkan kontrol. Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak biji C. papaya mempunyai efek terhadap reproduksi pria yang menunjukkan potensi tanaman ini sebagai pengatur kesuburan pria.
Kata kunci: biji Carica papaya , motilitas sperma, jumlah sperma, antifertilitas, abnormalitas sperma .

## Antifertility Effect of n-Hexane, Chloroform and Methanol Fractions of Carica papaya Seed on Male Wistar Rats
The low participation of men in Family Planning Program is caused by the limited choices of contraception for men. This study was aimed to evaluate the contraceptive potentials of n-hexane fraction, chloroform fraction and methanol fraction of papaya seed. The organic fractions were administered orally to the male rats with 100 mg/kg body weight dose respectively for 20 days. Twenty male rats weigh 200-300 g of 2-2.5 month old are grouped using Complete Random Design. A significant decline in sperm count and viability, total inhibition of sperm motility, and increased numbers of sperm abnormalities were evident after 20 days of treatment. The result showed that C. papaya seed extract has effect on male reproduction, thereby suggesting the potential of this plant in the regulation of male fertility.
Keywords: Carica papaya seed, sperm motility, sperm count, antifertility, sperm abnormality .
(a) Fakultas Farmasi Universitas Jember , Jember , Indonesia

## PENDAHULUAN
Meningkatnya populasi manusia di seluruh dunia,  utamanya  di  negara  berkembang  dan terbelakang akan mempengaruhi sistem kehidupan di bumi. Pengaturan kesuburan melalui kontrasepsi dan manajemen infertilitas merupakan komponen penting kesehatan reproduksi (Allag dan Rangari, 2002).  Program  Keluarga  Berencana  (KB)  telah dicanangkan  oleh  pemerintah  sebagai  program nasional. Salah satu usaha yang telah dilakukan dalam  program  KB  adalah  penyediaan  sarana kontrasepsi.
Sarana kontrasepsi lebih banyak ditujukan pada kaum wanita, sedangkan pada pria pilihannya masih  sangat  terbatas.  Metode  kontrasepsi  pria yang ada saat ini antara lain adalah pantang berkala, kondom,  senggama  terputus,  dan  vasektomi (Sumaryati, 2004). Hal ini merupakan salah satu alasan rendahnya partisipasi pria dalam program KB  (Wilopo,  2006). Salah  satu  usaha  untuk meningkatkan  peran  pria  dalam  program  KB adalah dengan jalan mencari metode kontrasepsi pria  yang  dapat  diterima  dan  memenuhi  syarat kontrasepsi  yang  ideal,  yaitu  bersifat  reversibel, efektif  dan  tidak  menimbulkan  efek  samping (Prajogo et al ., 2003; Wilopo, 2006).
Pepaya merupakan jenis tanaman yang bernilai ekonomis. Hampir semua bagian tanaman pepaya, dari  daun  sampai  akarnya  dapat  dimanfaatkan dalam  kehidupan  manusia,  namun  manfaat  biji pepaya masih belum banyak diketahui masyarakat kecuali sebagai bibit.
Menurut  Wijayakusuma et  al .  (1992),  biji pepaya berkhasiat sebagai obat cacingan, peluruh haid, karminatif, gangguan pencernaan, pembesaran hati  dan  limpa,  abortivum,  dan  penyakit  kulit. Beberapa  penelitian  juga  membuktikan  bahwa biji pepaya mempunyai efek antifertilitas. Lohiya et al. (2000) menyatakan bahwa ekstrak biji pepaya dapat  mempengaruhi  fertilitas  sperma  secara in vitro. Menurut Verma dan Chinoy (2002) ekstrak biji pepaya dapat mempengaruhi respon kontraksi kauda  tubulus  epididimis  dan  menyebabkan terjadinya infertilitas. Lohiya et al . (2005) mela- porkan bahwa ekstrak metanol biji pepaya mem- punyai efek antifertilitas. Lohiya et al . (2002) juga menyatakan bahwa ekstrak kloroform biji pepaya mempunyai efek azoospermia yang bersifat rever- sibel pada kelinci.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efek antifertilitas fraksi n -heksana, fraksi kloroform, dan fraksi metanol biji pepaya terhadap kualitas spermatozoa tikus jantan.

## METODE PENELITIAN

## Alat
Rotary  evaporator , corong pisah, spuit oral 3,0 mL,  alat-alat  bedah,  mikroskop,  kamar  hitung Neubauer , dan Elisa reader .

## Bahan
Biji  pepaya  berasal  dari  buah  pepaya  Bangkok matang  diperoleh  dari  kebun  pepaya  di  desa Sukorejo Bangsalsari Jember. Testosteron kit (DRG
Instruments GmbH Jerman), metanol, kloroform p.a, n -heksana,  pewarna  eosin.  Hewan  uji  yang digunakan yaitu tikus jantan galur Wistar, umur 2-2,5  bulan  yang  diperoleh  dari  peternakan  di Malang.

## Tahapan Penelitian

## Pembuatan Ekstrak dan Fraksi Biji Pepaya
Biji pepaya dibersihkan lalu dikeringkan dan kemudian  dilakukan  pengecilan  ukuran  partikel selanjutnya ditimbang sebanyak 500 gram serbuk. Serbuk  dimaserasi  dengan  metanol  kemudian diekstraksi  dengan  cara  maserasi  menggunakan metanol sekitar 2,5 liter. Setelah 24 jam metanol ekstrak  biji  pepaya  dipisahkan  dengan  cara disaring, kemudian pada residu/ampas ditambahkan pelarut metanol yang baru untuk proses ekstraksi berikutnya. Proses ekstraksi ini dilakukan berulang kali  sampai  semua  komponen  senyawa/metabolit sekunder terekstraksi. Semua filtrat yang diperoleh diuapkan  dengan  penguap  putar  vakum  hingga mendapatkan  ekstrak  kental.  Ekstrak  metanol kental  tersebut  dilarutkan  dalam  metanol-air (7:3) kemudian difraksinasi dengan menggunakan n -heksana  dengan  perbandingan  1:1,  dikocok lalu  didiamkan  sampai  terbentuk  dua  lapisan. Lapisan n -heksana dipisahkan dan ditambahkan n -heksana baru pada lapisan metanol-air. Proses ini diulangi 3 kali. Bagian yang tidak larut n -heksana difraksinasi  lagi  dengan  kloroform  dengan  cara yang  sama  dengan  proses  fraksinasi  dengan n - heksana.  Fraksi n -heksana,  fraksi  kloroform  dan fraksi metanol diuapkan sehingga diperoleh ekstrak kental.

## Perlakuan pada Hewan Uji
Tikus diadaptasi terlebih dahulu selama seminggu serta diberi makan dan minum secara ad libitum . Tikus dikelompokkan menjadi 4 kelompok dipilih secara acak masing-masing 5 ekor. Kelompok I: pemberian  kontrol  CMC  Na  1%.  Kelompok  II: pemberian fraksi n -heksana dosis 100 mg/kgBB. Kelompok III : pemberian fraksi kloroform dosis 100  mg/kgBB.  Kelompok  IV  :  pemberian  fraksi metanol  dosis  100  mg/kg  BB.  Kontrol  CMC  Na 1%, fraksi-fraksi diberikan pada hewan uji per oral dengan spuit 2 mL setiap hari selama 20 hari. Pada hari ke-21 tiap kelompok dinarkosis dengan klo- roform, dibedah, lalu organ reproduksi yang me- liputi  testis,  epididimis,  vesika  seminalis  dan prostat diambil, dibersihkan lalu ditimbang. Sperma diambil dari kauda epididimis untuk penghitungan jumlah dan kualitas spermatozoa (motilitas, viabilitas, dan abnormalitas).

## Pengamatan Motilitas Spermatozoa
Pengamatan motilitas spermatozoa dilakukan segera ketika spermatozoa diambil dari kauda epididimis. Motilitas spermatozoa diamati dan dihitung terhadap 100 sperma dengan 6 lapang pandang yang secara berurutan digeser dari kiri ke kanan lalu dihitung persentase spermatozoa yang motil. Kategori spermatozoa yang motil adalah jika spermatozoa bergerak  cepat  dan  lurus  ke  depan  mengikuti kategori WHO. Persentase motilitas spermatozoa

## TABEL 1. Bobot Organ Reproduksi Tikus Jantan Setelah Pemberian Bahan Uji Selama 20 Hari
Keterangan : * = berbeda secara signifikan dengan kelompok kontrol (p<0,05).
TABEL 2 . Jumlah dan Kualitas Spermatozoa (Motilitas, Viabilitas, dan Abnormalitas)
dihitung dengan menghitung jumlah spermatozoa  yang  bergerak  cepat  dan  lurus dibanding jumlah total 100 spermatozoa.

## Perhitungan Jumlah Spermatozoa
Jumlah  spermatozoa  dihitung  dengan  cara menghisap  spermatozoa  dari  kauda  epididimis memakai pipet hematokrit sampai tanda 0,5 lalu diencerkan dengan larutan NaCl fisiologis sampai tanda 101 (pengenceran 200 kali), dan pipet dikocok. Beberapa tetes spermatozoa dari pipet hematokrit diteteskan  terlebih  dahulu  pada  tisu,  kemudian diteteskan pada hemositometer yang sudah ditutup dengan  kaca  penutup,  kemudian  dilakukan pengamatan dan perhitungan spermatozoa dengan menggunakan  mikroskop.  Jumlah  spermatozoa dihitung dengan menggunakan rumus :

## Pengamatan  Abnormalitas  dan  Viabilitas Spermatozoa
Melihat  abnormalitas  spermatozoa  dengan  cara 50 mikroliter cairan spermatozoa diteteskan pada kaca obyek dan ditambahkan 50 mikroliter larutan eosin-Y lalu ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali  untuk  mengetahui  apakah  ada  kelainan pada bentuk kepala dan ekor terhadap terhadap 100 sperma, lalu dihitung persentase jumlah spermatozoa yang abnormal. Proses ini juga untuk  melihat  viabilitas  spermatozoa  yaitu persentase  sperma  yang  mati  dalam  100 spermatozoa.

## Analisis Data
Hasil penghitungan jumlah, motilitas, viabilitas, dan  abnormalitas  spermatozoa  disajikan  dalam bentuk  mean  ±  SE  dan  dianalisis  dengan one- way Anova taraf kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian sebelumnya menyatakan potensi biji pepaya sebagai calon bahan kontrasepsi pria yang menjanjikan, mempengaruhi fertilitas namun bersifat  terbalikkan.  Ekstrak  air  biji  pepaya dilaporkan memiliki pengaruh terhadap fertilitas tikus (Lohiya et al. , 1999), namun pengaruh tersebut bersifat terbalikkan (Chinoy et al. , 1994). Hamman et al. (2011) juga menyatakan bahwa ekstrak etanol biji pepaya dapat menurunkan fertilitas tikus jantan yang bersifat terbalikkan. Suatu bahan antifertilitas dapat  bersifat  sitotoksik  atau  bersifat  hormonal dalam memberikan pengaruhnya.
Beberapa  parameter  yang  mempengaruhi fertilitas diantaranya adalah bobot organ reproduksi, abnormalitas sperma, jumlah, morfologi, dan motilitas  spermatozoa.  Sedangkan  yang  bersifat hormonal dapat dilakukan dengan mengukur kadar hormon yang berkaitan dengan organ reproduksi seperti testosteron, LH, dan FSH. Dalam penelitian Sari et  al .  (2014),  pemberian  biji  pepaya  pada berbagai fraksi dengan dosis 100 mg/kgBB terbukti hanya sedikit menurunkan kadar hormon testosteron (berbeda  tidak  signifikan  di  banding  kontrol). Hormon testosteron sangat penting pada pria untuk perkembangan  dan  mempertahankan  jaringan reproduksi  pria  serta  berpengaruh  terhadap libido. Berdasarkan hasil penelitian ini diperoleh data  bobot  organ  reproduksi  tikus  jantan  yang diberi  perlakuan  fraksi-fraksi  biji  pepaya menunjukkan adanya perbedaan signifikan pada bobot  organ  epididimis  namun  tidak  terdapat perbedaan yang signifikan terhadap testis, vesika seminalis, dan prostat ( Tabel 1 ).
Hasil  uji  statistik  menggunakan One-Way Anova terhadap perubahan jumlah dan motilitas spermatozoa tikus jantan menunjukkan perbedaan yang signifikan (p<0,05) setelah pemberian fraksi n -heksana,  kloroform,  dan  metanol  biji  pepaya selama 20 hari ( Tabel  2 ) Pada penelitian sebelumnya disebutkan bahwa fraksi benzen biji pepaya yang diberikan secara oral dapat menekan jumlah dan motilitas  sperma  pada  kauda  epididimis  tikus jantan (Pathak et al. , 2000). Biji pepaya mengandung alkaloid, triterpenoid, dan steroid. Hasil penelitian Udoh et al . (2005) menyebutkan bahwa alkaloid dalam biji pepaya dapat menyebabkan degenerasi sel serta menurunkan jumlah sel sperma.
Ada perbedaan yang signifikan terhadap viabilitas dan abnormalitas spermatozoa (p<0,05, Tabel  2 ).  Dari  data  tersebut  diketahui  bahwa kelompok perlakuan yang dipejani fraksi kloroform dosis 100 mg/kgBB mempunyai jumlah spermatozoa paling sedikit yaitu 20,60±0,93 juta/mL, sementara perlakuan  dengan  fraksi  metanol  dan  fraksi n - heksana mempunyai jumlah spermatozoa berturut- turut adalah 26,40±0,77 juta/mL dan 38,20±1,31 juta/mL. Untuk data motilitas terjadi penurunan motilitas  spermatozoa  pada  semua  perlakuan, namun  yang  paling  besar  penurunannya  adalah pada  pemberian  fraksi  kloroform  yaitu  11,80%. Viabilitas  setelah  perlakuan  juga  mengalami penurunan, sementara abnormalitas meningkat
Perlakuan dengan Dosis 100 mg/kgBB Bobot Organ (gram) Testis Epididimis Vesika Seminalis dan Prostat Kontrol 1,98 ± 0,39 0,66 ± 0,049 a 0,91 ± 0,35 Fraksi n-heksana 2,31 ± 0,33 0,58 ± 0,07 ac 0,79 ±0,19 Fraksi kloroform 2,11 ± 0,26 0,56 ± 0,06 b 0,91 ± 0,12 Fraksi metanol 1,94± 0,09 0,68 ± 0,09 abd 0,98 ± 0,27
Parameter Kontrol CMC-Na 1 % Fraksi n - Heksana 100 mg/kgBB Fraksi Kloroform 100 mg/kgBB Fraksi Metanol 100 mg/kgBB Jumlah (juta/mL) 67,6 ± 1,25 a 38,20 ± 1,31 b 20,60 ± 0,93 c 28,40 ± 0,77 d
Motilitas (%) 73,40 ± 1,66 a 27,20 ± 0,83 b 11,80 ± 0,57c 15,60 ± 0,95 d
Viabilitas (%) 78,00 ± 2,00 a 65,20 ± 1,69 b 44,40 ± 1,79 c 59,60 ± 1,01 bd Abnormalitas (%) 22,40 ± 1,48 a 25,20 ± 0,65 a 46,80 ± 1,08 b 38,00 ± 0,63 c
GAMBAR 1. Morfologi sperma normal dan abnormal setelah per- lakuan selama 20 hari dengan perbesaran 400x. a) sperma- zoa  normal; b) kepala  ganda; c) kepala tapered ; d) tanpa ekor; e) tanpa kepala; f) ekor melengkung; g) ekor patah; h) ekor coil.
secara bermakna setelah perlakuan ( Tabel 2 ). Proses  spermatogenesis  merupakan  siklus yang  rumit  dan  teratur  dalam  pembentukan spermatozoa. Selama proses tersebut berlangsung, aktivitas  sel  spermatogenik  sangat  tinggi  yaitu terjadi perubahan morfologi dan biokimia untuk membentuk  spermatozoa  yang  fungsional. Spermatozoa ini dalam perjalanannya menuju vas deferens tidak semuanya dapat mempertahankan kehidupannya sehingga ada sebagian yang mati. Gangguan keseimbangan hormonal selama sper- matogenesis juga akan mempengaruhi viabilitas spermatozoa.

## PEMBAHASAN
Biji pepaya mengandung protein, beberapa enzim seperti papain, karpasemin, myrosin, alkaloid caricacin, oleanolic glycoside (sinigrin), carpain, β- sitosterol, dan glukosinolat (Milind dan Gurditta,
2011). Senyawa-senyawa tersebut terlarut dalam pelarut dengan tingkat  kepolaran yang  berbeda, sehingga masing-masing fraksi menunjukkan aktivitas antifertilitas dengan kekuatan yang berbeda. Senyawa-senyawa  tersebut  kemungkinan  mem- punyai  mekanisme  yang  berbeda-beda  dalam memberikan efek antifertilitas. Pepaya juga mem- punyai  alkaloid  karpain  yang  juga  berpengaruh menurunkan jumlah spermatozoa.
Sinigrin  dalam  biji  pepaya  berefek  anti- spermatogenesis yaitu dengan terjadinya penurunan steroidogenesis dalam testis tikus yang diberi ekstrak pepaya (Laksman dan Cangamma, 2012). Papain juga  diduga  dapat  menurunkan  total  lipid  pada jaringan testis dan epididimis. Lipid adalah sumber energi bagi sel mamalia. Ekstrak pepaya  menurun- kan  aktivitas  lipase  pada  testis  dan  epididimis yang menunjukkan penghambatan aktivitas lipase lipoprotein  dan  penghambatan  absorpsi  nutrisi dari gastrointestinal (Basha dan Cangamma, 2013). Energi tersebut dibutuhkan pada proses spermato- genesis di testis dan pematangan spermatozoa di epididimis.
Hasil pengamatan terhadap kualitas sper- matozoa  tikus  menunjukkan  fraksi n -heksana, fraksi  kloroform  dan  fraksi  metanol  biji  pepaya
berpengaruh  dalam  menurunkan  motilitas, viabilitas  dan  morfologi  normal  pada  sperma- tozoa  dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol negatif.  Motilitas  spermatozoa  berasal  dari kemampuan  spermatozoa  mendorong  diri  maju ke depan akibat adanya substansi kontraktil pada bagian tubuh spermatozoa diteruskan ke seluruh bagian ekor spermatozoa. Gerakan ekor yang cepat dan kuat mampu mendorong spermatozoa masuk ke  dalam  membran  serviks  dan  menembus  sel telur (Salisbury dan Van Demark, 1985).
Spermatozoa  dapat  menjadi  motil  karena adanya energi dari leher yang disalurkan ke bagian ekor.  Bagian  inilah  yang  menyebabkan  sperma- tozoa dapat bergerak maju. Dengan demikian yang menjadi  kunci  untuk  bergeraknya  spermatozoa adalah adanya produksi energi oleh mitokondria di bagian leher spermatozoa. Ada dugaan bahwa ekstrak  biji  pepaya  menyebabkan  abnormalitas organela  sel  pada  bagian  leher  spermatozoa, yaitu  vakuolisasi  pada  mitokondria  dan  abnor- malitas struktur berupa leher bengkok (Lohiya et al ., 1999). Hal ini menyebabkan fungsi mitokondria dalam menghasilkan energi tidak maksimal dan akhirnya  berpengaruh  terhadap  motilitas  sper- matozoa.
Lohiya et al . (2005) menyatakan bahwa pengaruh  ekstrak  biji  pepaya  secara  langsung adalah pada mekanisme pembentukan spermatozoa, sedangkan  efek  pada  pematangan  di  epididimis bersifat tidak langsung. Hal ini dibuktikan dengan adanya korelasi antara jumlah dan motilitas sper- matozoa pada  kelompok perlakuan lebih sedikit bila  dibandingkan  dengan  jumlah  dan  motilitas spermatozoa kelompok kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa biji pepaya mempengaruhi spermatogenesis pada tahap metamorfosis spermatid menjadi sper- matozoa.  Bila  spermatozoa  yang  dihasilkan  menga- lami abnormalitas dalam pembentukannya, tentu hal  tersebut  akan  berpengaruh  juga  pada  saat terjadi pemasakan di epididimis.
Pada penelitian ini juga terjadi penurunan jumlah  spermatozoa  normal  setelah  perlakuan dengan biji pepaya ( Gambar  1 ). Menurut Sujoko dkk.  (2009)  bentuk  morfologi  sel  spermatozoa berpengaruh  terhadap  pembuahan,  jika  jumlah abnormalitas  spermatozoa  terlalu  tinggi  maka akan menurunkan fertilitasnya. Menurunnya sper- matozoa  normal  kemungkinan  disebabkan  oleh abnormalitas primer dan abnormalitas sekunder.
Berdasarkan  hasil  pengamatan,  abnormalitas primer yang banyak dijumpai adalah kelainan pada kepala seperti kepala ganda, tanpa ekor, tanpa kepala, dan kepala tapered , sedangkan abnormalitas sekunder yang banyak ditemukan adalah patahan pada  ekor,  ekor  melengkung,  dan  ekor coil . Ditemukannya abnormalitas primer diduga karena adanya gangguan spermatogenesis pada fase spermiogenesis, yaitu saat pembentukan sperma- tozoa  dari  spermatid  sedangkan  abnormalitas sekunder terjadi diduga karena adanya gangguan maturasi spermatozoa dalam epididimis sehingga mengakibatkan  ditemukannya  spermatozoa  ab- normal (Ermayanti et al .,  2010).
Penelitian  sebelumnya  menyebutkan kemungkinan  mekanisme  ekstrak  biji  pepaya dalam  menginduksi  inhibisi  motilitas  sperma adalah  disebabkan  kandungan  glikosinolat  yang ada pada ekstrak biji pepaya yang mempengaruhi pembentukan plasma semen. Penelitian bioassay kandungan  ekstrak  biji  papaya  menunjukkan terdapat glukosinolat dalam proporsi tinggi dari biji  pepaya  (Marfo et  al .,  2003).  Glukosinolat kemungkinan dapat menghambat pematangan spermatozoa dan mempengaruhi pembentukan plasma semen sebagai media dalam transport spermatozoa. Kemungkinan besar ekstrak biji papaya mempengaruhi proses transportasi spermatozoa, yaitu dengan menggumpalkan semen sehingga motilitas dan viabilitas spermatozoa menurun (Nuraini et al. , 2012).
Beberapa  parameter  antifertilitas  pada penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  fraksi n - heksana,  fraksi  kloroform  dan  fraksi  methanol biji  papaya  dapat  menurunkan  fertilitas  tikus jantan dengan kekuatan yang berbeda-beda karena adanya kandungan senyawa kimia yang berbeda
dalam masing-masing fraksi sehingga mekanisme penurunan fertilitasnya kemungkinan juga berbeda, namun dapat dilihat pada semua parameter bahwa pemberian fraksi kloroform dosis 100  mg/kgBB memberikan efek antifertilitas paling baik.

## KESIMPULAN
Fraksi n -heksana,  fraksi  kloroform,  dan  fraksi metanol biji pepaya dosis 100 mg/kgBB mampu menurunkan jumlah spermatozoa, motilitas, meningkatkan  abnormalitas  spermatozoa  dan menurunkan viabilitas spermatozoa secara signifikan dibandingkan kontrol. Fraksi kloroform biji pepaya memberikan  efek  antifertilitas  paling  besar dibandingkan fraksi n -heksana dan fraksi metanol.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih peneliti sampaikan kepada DIKTI  melalui  lembaga  Penelitian  Universitas Jember  yang  telah  mendanai  penelitian  ini, sesuai dengan surat perjanjian No. 819/UN25.3.1/ LT.6/2013.

## DAFTAR PUSTAKA
Allag  LS  dan  Rangari  K,  2002,  Extragenomic  Action  of Steroids on Spermatozoa, Prospect for Regulation of Fertility, Health Popul , 25(1), 38-44.
Basha  SH  dan  Cangamma  C,  2013,  Effect  of  Carica  papaya (L.)  Seed  on  Lipid  Metabolites  in  Male  Albino  Rats, Int  J Pharm Pharm Sci , 5(4).
Chinoy NJ, D’Souza JM, dan Padman P, 1994, Effect of Cr ude Aquoeous  Extract  of Carica  papaya Seed  Extract  on  Male Albino Mice, Reprod Toxicol , 8, 75-80.
Ermayanti NGA, Manik, dan Rai SNM,  2010, Kualitas Sper- matozoa Mencit ( Mus musculus L.) Setelah Perlakuan Infusa Kayu  Amargo  ( Quassia  amara Linn.)  dan  Pemulihannya, J Biol , 14 (1), 45-49.
Hamman  WO,  Musa  SA,  Ikyembe  DT,  Umana  UE,  Adelaiye AB,  Nok  AJ,  dan  Ojo  SA,  2011,  Ethanol  Extract  of Carica papaya Seeds  Induces  Reversible  Contraception  in  Adult Male Wistar Rats, Br J Pharmacol Toxicol , 2(5), 257-261.
Laksman  J  dan  Cangamma  C,  2013,  Antispermatogenic Effect  of Carica  papaya Seed  Extract  on  Steroidogenesis  in Albino Rats, Int J Pharm Pharm Sci , 5 (1).
Lohiya NK, Goyal RB, Jayaprakash D, Ansari AS, dan Sharma S,  1999,  Antifertility  Effects  of  Aquoeous  Extract  of Carica papaya Seed in Male Rats, Planta Med , 60, 400-404.
Lohiya NK, Kothari LK, Manivannan B, Mishra PK, dan Pathak N, 2000, Human Sperm Immobilization Effect of Carica papaya Seed Extracts an In Vitro Study, Asian J Androl , 2, 103-109.
Lohiya NK, Manivannan B, Mishra PK, Pathak N, Sriram S, Bhande  SS,  dan  Panerdoss  S,  2002,  Chloroform  Extract  of Carica  papaya Seeds  Induces  Long-Term  Reversible  Azoo- spermia in Langur Monkey, Asian J Androl , 4(1), 17- 26.
Lohiya NK, Pradyumna K, Mishra N, Pathak B, Manivannan S, Bhande S, Panneerdoss, dan Sriram S, 2005, Efficacy Trial on  the  Purified  Compound  of  the Carica  Papaya for  Male Contraception In Albino Rat, Repro Toxicol , 20, 135-148.
Marfo EK, Oke OL, dan Afolabi OA, 2003 , Chemical composition of papaya (Carica papaya) seeds, Food Chem , 22(4), 259-266.
Milind P and Gurditta, 2011, Basketful Benefit of Papaya, Int Res Pharm , 2(7), 6-12.
Nuraini  T,  Kusmana  D,  dan  Afifah  E,  2012,  Penyuntikan Ekstrak  Biji Carica papaya L. Varietas Cibinong pada Macaca vascicularis L.  dan  Kualitas  Spermatozoa  serta  Hormon Testosteron, Makara Kes , 16(1),  9-16.
Pathak N, Mishra PK, Manivanan B, dan Lohiya NK, 2000, Sterility due to Inhibition of Sperm Motility by Oral Administration of Benzene Chromatographic Fraction of The chloroform Extract of The Seed of Carica Papaya in Rat, Phytomedicine , 7, 325-333.
Prajogo B, Widjiati, dan Tandjung M, 2003, Pengaruh Fraksi Polifenol Gendarussa vulgaris Neespada Penurunan Aktivitas Hialuronidase Spermatozoa Mencit melalui Uji Fertilisasi in Vitro , J Penelit Med Eksakta , 4(1).
Salisbury GW dan Van Demark, 1985, Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi Buatan pada Sapi , Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
Sari DP, 2014, Pengaruh Ekstrak Metanol, Fraksi n -Heksana, dan Fraksi Metanol Biji Pepaya ( Carica papaya L.) Terhadap Kadar  Hormon  Testosteron  dan  Bobot  Organ  Reproduksi Tikus Jantan, Skripsi , Farmasi Universitas Jember
Sujoko H, Setiadi MA, dan Boediono A, 2009, Seleksi Domba Garut Dengan Metode Sentrifugasi Gradien Densitas Percoll, J Vet , 10(3), 125-134.
Sumaryati A, 2004, Tahun ini KB Pria Mulai digalakkan , Badan Koordinator Keluarga Nasional, (http://www.bkkbn.go.id/ article_detail.php).
Udoh P dan Kehinde A, 1999, Studies on Antifertility Effect of Paw-paw Seed (Carica papaya) on the Gonads of the Male Albino Rats, Phytother Res , 13, 226-228.
Udoh P, Essien I, dan Udoh F, 2005, Effect of Carica papaya (Paw- paw) Seed Extract on the Morphology of Pituitary-Gonadal Axis of Male Wistar Rats, Phytother Res , 19, 1065-1068.
Wilopo SA, 2006, Perkembangan Teknologi Kontrasepsi Pria Terkini , Gema Pria, (http://pikas.bkkbn.go.id/gemapria/ articledetail.php).
Verma  RJ  dan  Chinoy  NG,  2002,  Effect  of Carica  papaya Seed  Extract  on  Contractile  Response  of  Cauda  Epididimal Tubules, Asian J Androl , 4(1), 77-78.
Wijayakusuma,  Dalimarta,  dan  Wirian,  1992, Tanaman Berkhasiat  Obat  di  Indonesia ,  ed.  3,  Pustaka  Kartini, Jakarta.