## Jurnal Ilmu Farmasi dan Farmasi Klinik (JIFFK)
Vol. 15, No. 2, DESEMBER 2018, Hal. 8 – 12 ISSN: 1693  -7899

## UJI SITOTOKSIK DENGAN METODE BRINE SHRIMP

## LETHALITY TEST DAN PROFIL METABOLIT SEKUNDER DARI
EKSTRAK BIJI BUAH BERENUK ( Crescentia cujete Linn)
Afdhil Arel *1)
1, Universitas Muhammadiyah sumatera Barat Jalan Pasie Nan Tigo Koto Tangah Padang Email: afdhil.arel@yahoo.com

## INTISARI
Penelitian untuk mengetahui profil metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak biji (Crescentia cujete  Linn.)  Dan  uji  sitotoksik  terhadap  larva  udang  Artemia  salina  Leach  dengan  metode  BSLT.  Uji fitokimia  menunjukkan  bahwa  ekstrak  diharapkan  mengandung  senyawa  terpenoid,  alkaloid,  fenolik, senyawa  metabolit  sekunder.  Hasil  analisis  kualitatif  dengan  TLC  positif  mengandung  fenolat.  Hasil identifikasi  dengan  Spectrophotometer  UV-vis  untuk  penentuan  panjang  gelombang  maksimal  dari  ekstrak biji  berenuk  yang  terdiri  dari  3  puncak  dengan  panjang  gelombang  maksimal  326  nm,  258  nm,  222  nm diharapkan senyawa terpenoid, alkaloid, dan fenolik. Hasil uji toksisitas menggunakan larva udang (Artemia salina leach) dibagi menjadi 4 kelompok: 1 kelompok kontrol dan 3 kelompok seri konsentrasi. Konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah 1.000, 100 dan 10 μg / ml. Kematian larva udang diamati setelah 24 jam perawatan. Berdasarkan analisis dengan metode probit, nilai LC50 ekstrak biji berenuk terhadap larva udang Artemia  salina  Leach  adalah  sebesar  82,30  μg  /  ml.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak  berenuk  beri merupakan racun bagi larva udang Artemia salina Leach, adanya kandungan terpenoid, alkaloid dan fenolat dalam ekstrak biji berenuk.
Kata Kunci : Berenuk; Metabolit Sekunder; Sitotoksik .

## ABSTRACT
The purpose of this research is to find out the profile of secondary metabolite contained  in  the extract of seeds ( Crescentia cujete Linn.) And cytotoxic test against shrimp larvae Artemia salina Leach by  BSLT  method.  Phytochemical  tests  showed  that  the  extract  be  expected  contained  the  terpenoid, alkaloid,  phenolic,  secondary  metabolite  compounds.  The  results  of  qualitative  analysis  with  positive TLC contains phenolics. The result of identification with Spectrophotometer UV-vis for determination of α  max  from  berenuk  seeds  extract  consisted  of  3  peaks  with  α  max  326  nm,  258  nm,  222  nm  be expected  terpenoid  compound,  alkaloid,  and  phenolic.  The  results  of  toxicity  test  using  shrimp  larvae ( Artemia salina leach) were divided into 4 groups: 1 control group and 3 groups of concentration series. The concentration of test solution used was 1,000, 100 and 10 μg / ml. The shrimp larvae mortality was observed after 24 hours of treatment. Based on the analysis with probit method, LC 50 value of seed extract berenuk to shrimp larvae Artemia salina Leach is equal to 82,30 μg/ml. This shows that the extract of berenuk berries is toxic to shrimp larvae Artemia salina Leach, presence to terpenoid content, alkaloids and phenolics in the extract of seeds berenuk.
Keywords : Secondary metabolite; Cytotoxic; BSLT .
Corresponding author: Afdhil Arel Universitas Muhammadiyah Sumatera Barat Jalan Pasie Nan Tigo Koto Tangah Padang Email:afdhil.arel@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Pada  umumnya  senyawa  metabolit  sekunder  yang  terdapat  di  dalam  tumbuhan  adalah alkaloid, flavonoid, triterpenoid, steroid, saponin. Senyawa tersebut memiliki aktivitas biologis yang  berperan  sebagai  pelindung  pada  tumbuhan  dari  gangguan  hama  penyakit  maupun lingkungan, dan dapat digunakan dalam dunia pengobatan (Dapas et al 2014; Hariana, 2008). Salah  satu  tanaman  yang  berpotensi  dikembangkan  dalam  dunia  pengobatan  adalah tanaman  berenuk  ( Crescentia  cujete ),  tanaman  ini  tidak  pernah  dikonsumsi  oleh  masyarakat, namun  mengandung  khasiat  yang  sangat  besar  di  bidang  kesehatan.  Umumnya  tanaman berenuk  ( Crescentia  cujete )  hanya  digunakan  untuk  pembuatan alat-  alat  rumah  tangga  yang dibuat dari kulit buah dan batangnya (Imaroh,  2013).  Tanaman berenuk banyak mengandung senyawa metabolit sekunder, seperti pada daun dan batangnya terdapat senyawa polifenol dan saponin,  sedangkan  daging  buah  berenuk  terdapat  senyawa  alkaloid,  flavonoid,  dan  tannin (Rinawati, 2011).
Berenuk  merupakan  tanaman  perdu  tropis  yang  berkhasiat  sebagai  obat  berbagai penyakit.  Daun  berenuk dalam  pengobatan  tradisional  digunakan untuk  mengobati  luka  baru dan menurunkan hipertensi. Daun mudanya ditumbuk dan dijadikan pengkompres untuk sakit kepala dan luka. Sementara daging buahnya digunakan untuk mengobati diare, flu, bronkhitis, batuk,  asma,  dan  uretritis  (Heyne,  1987).  Penelitian ilmiah mengenai  berenuk  masih  sangat jarang, namun tanaman ini memiliki potensi yang cukup menjanjikan sebagai obat herbal.
Selain  itu  uji  fitokimia  yang  dilakukan  dalam  penelitian  Rinawati  (2011),  memberikan informasi  bahwa  daging  buah  berenuk  mengandung  alkaloid,  flavonoid,  saponin,  tanin,  dan polifenol. Kandungan alkaloid, saponin, tanin, dan polifenolnya berpotensi sebagai zat antibakteri.
Berdasarkan  khasiat  dan  hasil  penelitian  di  atas  maka  tanaman  berenuk (Crescentia cujete L .) potensial  untuk  dikembangkan  menjadi  suatu  obat,  terutama  bagian  biji  buah berenuk, karena belum dilakukannya penelitian terhadap biji buah tanaman ini. Penelitian ini menfokuskan  pada  penentuan  profil  metabolit  sekunder  dan  menguji  sitotoksik  ekstrak  biji buah berenuk terhadap larva  udang  laut  ( Artemia  salina Leach)  dengan  mengunakan  metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).

## METODE PENELITIAN Bahan Penelitian
Bahan-bahan  yang  digunakan  adalah  Ekstrak  kental  biji  buah  berenuk  ( Crescentia cujete ),  Plat  silika  60  GF  254,  etil  asetat,  n-heksan,  air  laut,  etanol  70%  dan  etanol  96  %, kloroform,  amoniak,  asam  sulfat,  asam  asetat  glasial,  larva Artemia  salina Leach, Dimetilsulfoksida (DMSO).

## Alat Penelitian
Metode  penelitian  meliputi  alat  yang  digunakan  adalah  :  rotary  evaporator,  desikator, vial  yang  telah  dikalibrasi,  gelas  kimia,  pipet  mikro,  media pembiakan Artemia salina Leach, aerator, lampu penerang, kertas saring, spetrofotometer UV-visible, lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm, seperangkat alat kromatografi lapis tipis.

## JALANNNYA PENELITIAN
Ekstraksi Sampel Biji Buah Berenuk (Crescentia cujete) (Departemen Kesehatan RI, 2000 ) Ekstraksi sampel  sebanyak  250  g  dilakukan  dengan  metoda  maserasi  (perendaman).  Biji  buah berenuk ( Crescentia cujete ) yang telah dikeringkan digerus dalam lumpang dimasukkan ke dalam botol berwarna  gelap,  direndam  dengan  etanol  70%  selama  3  hari  dan  disimpan  ditempat  gelap  sambil sesekali diaduk. Setelah 3 hari perendaman, disaring dan ampasnya direndam kembali dengan etanol 96 % dalam jangka waktu yang sama. Maserasi yang ketiga kali juga direndam menggunakan etanol 96%, dengan tujuan mengikat air dalam larutan. Penyarian ini dilakukan sampai diperoleh maserat yang jernih dengan cara  yang  sama  dan  seluruh  filtrat  digabung  menjadi  satu  dan  diaduk  hingga  rata,  kemudian diuapkan dengan rotary evaporator sampai didapatkan ekstrak kental.
Pengujian Sitotoksisitas Ekstrak Biji Buah Berenuk (Crescentia cujete) Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test.
Disiapkan  9  vial  untuk  tiga  konsentrasi  masing-  masing  larutan  uji  10  µg/ml,  100  µg/ml,  dan 1000  µg/ml  serta  1  vial  untuk  kontrol.  Larutan  induk  dibuat  dengan melarutkan 40  mg ekstrak  kental dalam 4 mL etanol 96 %. Larutan induk tersebut sebanyak 5 µg/ml, 50 µg/ml, dan 500 µg/ml berturut- turut  dimasukkan  kedalam  masing-masing  vial  yang  telah  disiapkan  untuk konsentrasi  1000,  100,  10 µg/ml.  Vial  yang  berisi  larutan  uji  dikeringkan  dalam  desikator  sampai  semua  pelarutnya  menguap, kemudian  ditambahkan  50  µL  DMSO  termasuk  vial  kontrol  untuk  melarutkan  sampel  kembali. Selanjutnya ditambah 3,5 mL air laut.
Larva Artemia salina Leach sebanyak 10 ekor dimasukkan kedalam setiap larutan uji dan kontrol, dicukupkan volumenya sampai 5 ml dengan air laut, diletakkan  dibawah  sinar  lampu  selama  24  jam. Setelah  24  jam  diamati  dan dihitung jumlah larva udang yang mati.

## ANALISIS DATA .
Dari data yang diperoleh, dihitung nilai LC 50 dengan analisis probit (Adfa, 2005) Apabila nilai LC 50 < 30 ppm  maka ekstrak dikatakan sangat toksik, LC 50 ≤ 1000 ppm toksik, dan LC 50 > 1000 ppm tidak toksik (Sumihe, Liwas, 2013)

## Hasil dan Pembahasan
Sampel kering  biji  berenuk  ( Crescentia  cujete Linn)  dengan  berat  250  gram,  setelah dimaserasi dan diuapkan dengan rotary  evaporator diperoleh  ekstrak  kental  etanol  sebanyak 21,831  gram  dengan  rendemen  8,732  %.  Kemudiaan  ekstrak  kental  biji  berenuk  dianalisis kandungan  senyawa  metabolit  sekunder  dengan  uji  fitokimia  yang  dilakukan  sebagai  uji pendahuluan  untuk  mengetahui  tentang  kandungan  senyawa  bioaktif  yang  terkandung  di dalam  biji  berenuk.  Hasil  uji  fitokimia  ekstrak  etanol  bijiberenuk  menunjukkan  adanya kandungan senyawa bioaktif seperti fenolat, terpenoid dan alkaloid.
Tabel I. Hasil Uji Fitokimia biji buah berenuk Uji Fitokimia Pereaksi Hasil Alkaloid Mayer Wagner Dragendorff + + + Fenolik FeCl 3 + Flavonoid Sianidin test - Saponin Forth test - Uji steroid CH 3 COOH+ H 2 SO 4 - Terpenoid CH 3 COOH+ H 2 SO 4
+
Analisis  ekstrak  biji  berenuk  mengunakan  kromatografi  lapis  tipis  dengan  eluen  n- heksan :  etil  asetat (7:3).  Hasil elusi  KLT  dimonitor dengan beberapa penampak noda  antara lain UV 254 nm, UV 365 nm, H2SO4 10 %, FeCl3, dan dragendrof.
Penampak  noda  ini  digunakan  untuk  memunculkan  noda-noda  yang  tidak  tampak dengan sinar UV dan juga untuk menunjukkan golongan dari senyawa yang terkandung dalam ekstrak biji berenuk.
Tabel II. Profil Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Biji Berenuk
No  Rf Penampak Noda UV 254 nm UV 365 nm FeCl 3 H 2 SO 4 Dragendrof 1 0.7 Ungu pekat _ _ Fluorosensi Biru terang Kuning Pekat 2 0.5 Ungu pekat _ _ Fluorosensi Biru terang Kuning Pekat 3 0.3 _ _ _ Fluorosensi Biru terang _ 4 0.2  Coklat muda  Coklat muda Coklat kehitaman Fluorosensi Biru terang _
Berdasarkan  profil  kromatografi  lapis  tipis  ekstak  biji  berenuk  dengan  eluen  dan penampak  noda  tersebut  diatas  golongan  senyawa  utama  dari  biji  berenuk  adalah  golongan fenolat.  Apabila  dilakukan  prosedur  elusi  kromatografi  lapis  tipis  mengunakan  eluen  yang berbeda bisa jadi akan diperoleh profil yang lebih baik lagi dari ekstrak biji berenuk ini.
Identifikasi  dengan  mengunakan  Spektrofotometer  UV-Vis,  dengan  menentukan panjang gelombang maksimum dari senyawa yang diduga terpenoid, alkaloid dan fenolat yang tedapat dalam ekstrak, dimana ekstrak kental dibuat dengan konsentrasi 700 µg/ml, dari hasil yang  di  peroleh  ternyata  terdapat  3  puncak  yaitu  pada  panjang  gelombang  326  nm,  258  nm, dan 222 nm, dengan absorbansi 0.230, 0.837, dan 0.718.
Gambar 1. Uji Panjang Gelombang Ekstrak Biji Berenuk dengan Spektrofotometer UV-Vis
Pengujian  aktivitas  sitotoksik  digunakan  metode Brine  Shrimp  Lethality  Test mengunakan  larva  udang Artemia  salina Leach.  Larva Artemia  salina Leach  memiliki kemampuan  berkembang  biak  yang  cepat  seperti  sel  kanker.  Kesamaan  lain  yang  dimiliki Artemia  salina Leach  adalah  membran  kulitnya  yang  tipis  seperti  sel  kanker.  Kandungan senyawa  metabolit  sekunder  yang  ada  dalam  ekstrak  biji  berenuk  diharapkan  mampu menghambat  metabolisme  pada  larva Artemia  salina Leach  dan  menyebabkan  kematian (Wardana, 2013)
Dimetil  sulfoksida  (DMSO)  digunakan  melarutkan  ekstrak.  Penambahan  DMSO  ke dalam vial uji bertujuan untuk membantu melarutkan senyawa yang sukar larut dalam air laut sehingga  terdistribusi  merata.  DMSO  yang  ditambahkan  sebanyak  50  µL  karena  di  atas  nilai tersebut DMSO dapat menyebabkan kematian pada larva (Priyanto, 2009).
Nilai  LC 50 yang  diperoleh  dari  hasil  uji  aktivitas  sitotoksik  yang  dilakukan  pada ekstrak  biji  berenuk  menunjukkan  bahwan  biji  berenuk  memiliki  aktivitas  sitotoksik,  karena nilai  LC 50 kecil  dari  1000  µg/ml.  Sitotoksik  adalah  kemampuan  suatu  senyawa  menghambat pertumbuhan sel, dimana suatu ekstrak dinyatakan aktif sitotoksik apabila nilai LC 50 kecil dari 1000  µg/ml.  Nilai  LC 50 dari  ekstrak  biji  berenuk  82,30  µg/ml  kecil  dari  1000  µg/ml  maka ekstrak biji berenuk ini dapat di kategorikan toksik (Mayer, 1982).
Tabel III. Hasil pemeriksaan aktivitas sitotoksik dari ekstrak biji berenuk
Konsentrasi (ppm) Log Konsentrasi Pengulangan  Hewan/Kmpk.  Hewan yg Mati % Kematian Nilai Probit 1000 3 1 10 9 2 10 8 83,33% 5,967 3 10 8 100 2 1 10 3 2 10 4 40% 4,747 3 10 5 10 1 1 10 3 2 10 3 30% 4,476 3 10 3

## KESIMPULAN
Berdasarkan  uji  fitokimia,  KLT,  dan  Spektrofotometer  UV-vis,  ekstrak  biji  buah berenuk  ( Crescentia  cujete Linn)  diduga  mengandung  senyawa  metabolit  sekunder  golongan alkaloid, fenolik, dan terpenoid. Biji buah  berenuk ( Crescentia  cujete Linn) memiliki potensi toksik terhadap larva Artemia salina Leach melalui uji BSLT dengan LC 50 sebesar 82,30 µg/ml.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  rekan-rekan  yang  telah  membantu  dalam  proses  penelitian  ini. Sehingga penelitian ini dapat diselesaikan. Semoga bermanfaat untuk semua.

## DAFTAR PUSTAKA
Dapas, C. C., Koleangan, H. S. J., Sangi, M, 2014, Analisis Senyawa Metabolit Sekunder dan Uji  Toksisitas  Ekstrak  Batang  Bawang  Laut  ( Proiphys  amboinensis (  L  .),  fakultas MIPA Unsrat Manado, Jurnal, 144–148.
Departemen  Kesehatan  RI,  2000, Parameter  Standar  Umum  Ekstrak  Tumbuhan  Obat ,  Edisi pertama, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta.
Hariana, 2008, Tumbuhan Obat Dan Khasiatnya Seri 2, Penebar Swadaya, Jakarta. Heyne, k., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia Jilid II .Badan Litbang Kehutanan, Jakarta. Imaroh, R., 2013, Potensi Ekstrak Daun Berenuk (Crescentia cujete ) Sebagai Terapi Alternatif  Penyakit  Jantung  Koroner  Dengan  Menurunkan  Risiko  Pembentukan Aterossklerosis. Universitas Muhammadiyah, Jakarta.
Mayer, B. N., N. R. Ferrigni, J. E. Putnam, L. B. Jacobsen, D. E. Nichols, and J. L. M., 1982, Brine Shrimps□: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituent”, J. of Medical Plant Research Planta Medica , 45 , 31–34.
Priyanto, 2009, Toksikologi: Mekanisme Terapi Antidotum dan Penilaian Resiko, Sunaryo Ed, Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi, Jakarta. Rinawati, 2011, Daya Antibakteri Tumbuhan Majapahit ( Crescentia cujete L .) Terhadap Bakteri Vibrio alginolyticus . Jurnal , 1–13.
Sumihe, G., Liwas, D., 2013, Phytochemical analysis  and  Determining  LC 50 Value of Liwas Leave Methanol Extract, 1-  4.
Wardana, luthfi, 2013, Uji bioaktivitas fraksi n-heksan ekstrak etanol kulit batang karet india, Naskah Publikasi , hal 1–17.