## UJI IN SILICO SENYAWA EMODIN SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA
Liliana *) , Enade Perdana Istyastono
Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Abstract: Breast cancer is a disease with abnormal cell proliferation at breast tissue that can invade the surrounding tissue and spread to another organ. Based on WHO (2014) at 2012, there are 48,998 breast cancer cases on women in Indonesia with 19,730 death cases. In breast cancer, overexpression estrogen receptor  alpha  (ER-α)  usually  observed.  Hence  ER-α  became  the  focus  of  prevention  and  therapy  for breast  cancer.  In  vitro  study  of  emodin  shows  IC 50 2.7  µM  and  Ki  0.77  µM  on  ER-α.  In  silico  research using docking protocol and post docking analysis protocol shown that emodin was not an active ligand on ER-α. The outcome shown as ChemPLP score with average -75.292 and PLIF bitstring. Emodin binds with LEU346,  LEU387,  and  ARG394  residue.  Currently,  the  protocol  that  used  in  this  research  has  yet identified marginal compound like emodin as an active ligand on ER-α.
Keywords: Breast cancer, estrogen receptor alpha, emodin, in silico, molecular docking, ChemPLP, PLIF bitstring.

## 1. Pendahuluan
Kanker payudara merupakan penyakit dengan pembelahan  sel  abnormal  pada  jaringan  payudara yang dapat menginvasi bagian tubuh sekitarnya dan menyebar  ke  organ  lainnya  (World  Health Organization,  2013). Pada  tahun  2014,  terdapat 48.998  kasus  kanker  payudara  pada  wanita  di Indonesia  dengan  kematian  sebesar  19.730  kasus (21,4%)  dari  seluruh  kasus  kematian  yang disebabkan oleh kanker (World
Health Organization,  2014).  Salah  satu  faktor  yang berpengaruh pada kanker payudara adalah estrogen dan  reseptor  estrogen.  Estrogen  dan  reseptornya berfungsi  untuk  memediasi  efek  biologi  seperti genesis, perkembangan malignan dan apoptosis sel. Tingkat  estrogen  yang  tinggi  dan  ekspresi  reseptor estrogen  alfa  (RE-α)  secara  berlebih  sering terobservasi  pada  sebagian  besar  kanker  payudara (Hayashi et al., 2003).
Obat  terapi  hormon  lini  utama  untuk  kanker payudara  saat  ini  adalah  tamoxifen.  Tamoxifen bekerja sebagai antagonis reseptor estrogen dengan efek  samping  seperti  penggumpalan  darah, stroke , kanker  rahim,  dan  katarak  (Senkus et  al .,  2015; Suganya,  Radha,  Naorem,  and  Nishandhini,  2014). Efek  samping  dari  obat  inilah  yang  menyebabkan kebutuhan  obat  lain  yang  memiliki  efek  samping yang  lebih  aman  (Huang et  al. ,  2013;  Suganya et al., 2014).  Fitoestrogen  alami  memiliki  potensi
yang  lebih  rendah  dibanding  estrogen  sintetis namun  memiliki  efek  samping  yang  lebih  sedikit dan lebih aman (Huang et al. , 2013).
Gambar 1. Struktur emodin (PubChem, 2015)
Emodin atau 1,3,8-trihydroxy-6-methyl- anthraquinone (Gambar  1)  merupakan  salah  satu contoh fitoestrogen yang terdapat dalam Aloe vera , Rheum  officinale , Polygonum  cuspidatum ,  dan Rheum palmatum (Huang et al ., 2013; Izhaki, 2002; Yaoxian et al .,  2013).  Berdasarkan  penelitian Matsuda,  Shimoda,  Morikawa,  and  Yoshikawa (2001),  secara in  vitro emodin  memiliki  aktivitas estrogenik  terhadap  RE-α  dengan  IC 50 2,7 µM  dan K i 0,77  µM.  Penelitian  Mysinger,  Charcia,  Irwin, and Shoichet (2012) secara in silico mendefinisikan ligan  aktif  adalah  ligan  dengan  afinitas  (IC 50 atau K i ) di bawah 1 µM. Ligan dengan afinitas diantara 1  µM  hingga  30  µM  merupakan  ligan  marginal. Ligan  dengan  afinitas  ≥  30  µM  dianggap  sebagai decoys .  Bila  dilihat  berdasarkan  K i maka  emodin dianggap  sebagai  ligan  aktif,  namun  emodin
dianggap  sebagai  ligan  marginal  berdasarkan  IC 50 . Penelitian  ini  ingin  melihat  emodin  termasuk sebagai  ligan  aktif  atau  tidak  berdasarkan  protokol yang digunakan secara in silico .
Pengujian in silico memerlukan  protokol yang telah tervalidasi untuk dapat mengidentifikasi senyawa  sebagai  ligan  bagi  reseptor  (Setiawati dkk.,  2014).  Penelitian in silico ini  mengacu  pada protokol Setiawati, Riswanto, Yuliani, and Istyastono  (2014)  untuk  penambatan  molekuler. Penelitian  Istyastono  (2015)  diacu  untuk post docking analysis dalam penelitian ini.
Tabel I. Residu yang penting menurut decision tree
(diadaptasi dari Istyastono, 2015) Nomor Bitstring Residu Terkait Jenis interaksi 320 GLY420 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 242 ARG394 Ikatan hidrogen (protein sebagai donor) 117 GLU353 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 411 GLY521 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 473 CYS530 Ikatan hidrogen (protein sebagai donor) 105 ASP351 Interaksi elektrostatik (protein sebagai anion) 201 LEU387 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 470 CYS530 Interaksi non polar 170 TRP383 Aromatik face-to-face 171 TRP383 Aromatik edge-to-face 323 MET421 Interaksi non polar

## 2. Metode Penelitian
2.1 Alat dan Bahan
Bahan  penelitian  yang  digunakan  adalah protokol  PVBS  Setiawati et  al. (2012)  untuk penambatan  senyawa  terhadap  RE-α,  protokol Istyastono  (2015)  untuk post  docking  analysis , struktur  tiga  dimensi  emodin  dalam  bentuk  .mol2 (didapatkan  dari  zinc.docking.org  dengan  kode: ZINC03824868), dan perangkat lunak penambatan: SPORES  (Brink  and  Exner,  2009),  PLANTS1.2 (Korb, Stutzle, and Exner, 2009), PyPLIF (Radifar, Yuniarti,  and  Istyastono,  2013),  PyMol  (Lill  and Danielson, 2011), R 3.2.1 (R foundation, 2015).
Instrumen penelitian berupa s erver dengan alamat internet  protocol (IP)  103.247.10.66,  dan laptop  dengan  spesifikasi  CPU  Intel (R) Core (TM) i3- 3217U @1.80 GHz, RAM 4 GB dan sistem operasi Ubuntu 14.04 LTS.

## 2.2 Tata Cara Penelitian
2.2.1 Preparasi  senyawa  uji.  Emodin  (senyawa uji)  diunduh  dalam  format  .mol2  dan  dipreparasi (modul settypes) dengan aplikasi SPORES . 2.2.2 Penambatan  molekul.  Luaran  dari  SPORES ditambatkan  menggunakan  PLANTS1.2.  Setiap penambatan  molekuler  dilakukan  tiga  kali.  Luaran penambatan  yang  diperoleh  yaitu  3  x  50  pose berupa  skor  ChemPLP  lalu  diambil  satu  pose dengan skor terbaik (terendah). Replikasi penambatan molekul dilakukan 1000 kali, sehingga diperoleh  1000  pose  terbaik  masing-masing replikasi.
2.2.3 Post docking  analysis. Data  penambatan yang  diperoleh  berupa  skor  ChemPLP  dan  PLIF bitstring . Data skor ChemPLP diambil yang terbaik dari  1000  kali  replikasi.  Data  PLIF bitstring menunjukkan  senyawa  emodin  aktif  sebagai  ligan (ditunjukkan  dengan  angka  1)  atau  tidak  aktif sebagai  ligan  (ditunjukkan  dengan  angka  0) terhadap residu (Tabel I).
Data  penambatan  dimasukkan  ke  dalam decision  tree (Gambar  2)  untuk  melihat  bahwa protokol post  docking  analysis menganggap senyawa uji bertindak sebagai ligan atau decoy . Hal ini dilakukan melalui penyesuaian antara pernyataan  pada decision  tree dengan  data penambatan.  Bila  data  penambatan  sesuai  dengan pernyataan  pada decision  tree, maka  melalui  alur yang  ke  kiri.  Bila  tidak  sesuai,  maka  melalui  alur yang  ke  kanan.  Demikian  dilakukan  seterusnya hingga mencapai akhir alur yang berupa pernyataan ligan  atau decoy. Senyawa  uji  yang  telah  dianggap sebagai  ligan  atau decoy ,  dilihat  posenya  dalam kantung  ikatan  RE-α  dengan  pengamatan  visual PyMol.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Metode in  silico merupakan  salah  satu pendekatan  untuk  menemukan  obat  baru.  Metode ini  memerlukan  protokol  yang  telah  tervalidasi. Penelitian in  silico senyawa  emodin  sebagai  ligan pada  RE-α  menggunakan  pendekatan  kimia medisinal  komputasi  dan  menggunakan  dua protokol, yaitu protokol penambatan Setiawati et al . (2014)  dan  protokol post  docking  analysis Istyastono  (2015).  Dalam  penelitian,  senyawa emodin  diharapkan  dapat  menjadi  ligan  aktif
terhadap RE-α. Penelitian in vitro senyawa emodin menunjukkan  aktivitas  emodin  terhadap  RE-α (Matsuda et  al. ,  2001).  Penelitian in  silico yang dilakukan  bertujuan  melihat  emodin  bertindak sebagai  ligan  aktif  atau  ligan  tidak  aktif  terhadap RE-α dan pose emodin dalam kantung ikatan RE-α.
Hasil  penambatan  didapatkan  dalam  bentuk ChemPLP  dan  PLIF bitstring (Tabel  II).  PLIF bitstring yang  didapatkan  menunjukkan  ikatan senyawa uji dengan residu pada kantung ikatan RE- α  (Tabel  II).  Dari  1000  kali  replikasi,  emodin memiliki  skor  ChemPLP  -75,292  dan  hanya berinteraksi dengan LEU387 sebesar 100,000% dan ARG394  sebesar  4,400%.  Dari  hasil  penelitian dengan  taraf  kepercayaan  95%,  dapat  dikatakan emodin  berikatan  dengan  residu  LEU387  dan ARG394 di dalam kantung ikatan RE-α
Penelitian Mysinger et al. (2012) mendefinisikan  ligan  aktif  adalah  ligan  dengan afinitas  dibawah  1  µM,  ligan  dengan  afinitas diantara  1  µM  hingga  30  µM  merupakan  ligan marginal  dan  ligan  dengan  afinitas  ≥  30  µM merupakan decoys .  Penelitian in  vitro aktivitas senyawa emodin menunjukkan IC 50 2,7 µM dan K i 0,77 µM pada RE-α (Matsuda, 2001). Dilihat dari
Gambar 2. Decision tree dari protokol post docking analysis (Istyastono, 2015)
IC 50, emodin  termasuk  senyawa  yang  merupakan ligan  marginal  sedangkan  K i menunjukkan  emodin termasuk  senyawa  yang  merupakan  ligan  aktif. Hasil  dari  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa protokol  yang  digunakan  menganggap  emodin sebagai decoy (Gambar 3). Untuk saat ini, protokol Setiawati et  al. (2014)  dan post  docking  analysis
Istyastono  (2015)  belum  dapat  mengidentifikasi senyawa marginal sebagai ligan aktif pada RE-α.
Penelitian in  silico senyawa  emodin  pada menghasilkan  visualisasi  ikatan  emodin  dengan reseptor  dalam  kantung  ikatan  RE-α  (Gambar  4). Pose  emodin  dalam  kantung ikatan  RE-α menunjukkan  adanya  ikatan  antara  emodin  dengan
Jenis keluaran Residu Rata-rata replikasi emodin Keterangan Skor ChemPLP - -75,292 - PLIF bitstring 105 ASP351 0,0% Tidak ada ikatan PLIF bitstring 117 GLU353 0,0% Tidak ada ikatan PLIF bitstring  170 TRP383 0,0% Tidak ada ikatan PLIF bitstring  171 TRP383 0,0% Tidak ada ikatan PLIF bitstring  201 LEU387 100,0% Berikatan PLIF bitstring  242 ARG394 4,4% Berikatan PLIF bitstring  323 MET421 0,0% Tidak ada ikatan PLIF bitstring  411 GLY521 0,0% Tidak ada ikatan PLIF bitstring  470 CYS530 0,0% Tidak ada ikatan PLIF bitstring  473 CYS530 0,0% Tidak ada ikatan
Tabel II. Luaran Penambatan Emodin Penting Dalam Decision Tree
backbone ,  yaitu  dengan  LEU346  dan  LEU387. Ikatan  emodin  dengan  residu  juga  tampak,  yaitu dengan ARG394.  Ikatan  yang berpengaruh penting terhadap  ligan  merupakan  ligan  aktif  atau  ligan tidak  aktif  adalah  ikatan  dengan  LEU387  dan ARG394.  Ikatan  emodin  dengan  LEU387  berupa ikatan  hidrogen  dengan  protein  sebagai  akseptor hidrogen. Dengan residu ARG394, emodin mengalami  interaksi  hidrogen  dengan  protein sebagai donor hidrogen.

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan dengan  protokol  Setiawati et  al .  (2014)  dan protokol post  docking  analysis Istyastono  (2015), emodin  bukan  merupakan  ligan  aktif  pada  RE-α dan  emodin  teridentifikasi  berikatan  dengan  residu LEU346,  LEU387,  dan  ARG394  dalam  kantung ikatan RE-α.

## Daftar Pustaka
American  Cancer  Society,  2015.  Breast  Cancer. American Cancer Society , Amerika.
Brink, T. T., and Exner, T. E., 2009. Influence of Protonation, Tautomeric,  and  Stereoisomeric  States  on  Protein- Ligand Docking Results, 49, 1535-1546.
Dahlman-Wright,  K.,  Cavailles,  V.,  Fuqua,  S.A.,  Jordan,  C., Katzenellenbogen,  J.  A.,  Korach,  K.S., et  al. ,  2006. Pharmacological  Reviews: Estrogen Receptors,  LXIV.
International Union of Pharmacology , USA.
Ekins,  S.,  Mestres,  J.,  and  Testa,  B.,  2007. In  silico Pharmacology  for  Drug  Discovery:  Applications  to Targets and Beyond. British Journal of Pharmacology ,
152, 21.
Fullbeck,  M.,  Huang,  X.,  Dumdey,  R.,  Frommel,  C.,  Dubiel, W.,  and  Preissner,  R.,  2005.  Novel  Curcumin-  and Emodin-related  Compounds  Identified  by in  silico 2D/3D  Conformer  Screening  Induce  Apoptosis  in Tumor Cells. BMC Cancer , 5, 97.
Hayashi, S. I., Eguchi, H., Tanimoto, K., Yoshida, T., Omoto, Y.,  Inoue,  A., et  al., 2003.  The  Expression  and Function  of  Estrogen  Receptor  α  and  β  in  Human Breast Cancer and Its Clinical Application. International  Congress  on  Hormonal  Steroids  and Hormones and Cancer , 10, 193.
Huang, P.H., Huang, C.Y., Chen, M.C., Lee, Y.T., Yue, C.H., and  Lin,  H.,  2013.  Emodin  and  Aloe-Emodin  Supress Breast  Cancer  Cell  Proliferation  through  ERα Inhibition. Evidence  Based  Complementary  and Alternative Medicine , 1-2.
Izhaki,  I.,  2002.  Emodin-A  Secondary  Metabolite  with Multiple  Ecological  Functions  in  Higher  Plants.  New Phytologist, 155, p. 207.
Istyastono,  E.P.,  2015.  Employing  Recursive  Partition  and Regression  Tree  Method  to  Increase  the  Quality  of Structure-Based  Virtual  Screening  in  the    Estrogen Receptor  Alpha  Ligands  Identification. Asian  Journal of  Pharmaceutical  and  Clinical  Research ,  8  (6),  207- 209.
Korb,  O.,  Stutzle,  T.,  and  Exner,  T.  E.,  2009.  Empirical Scoring  Function  for  Advanced  Protein-Ligand Docking  with  PLANTS, Journal  of  Chemical Information and Modeling , 49 (1), pp. 84-96. Li, F., Li, X., Shao, J., Chi, P., Chen, J., and Wang, Z., 2010.
Estrogenic  Activity  of  Anthraquinone  Derivative  In Vitro  and In  Silico Studies. Chem.  Res.  Toxicol .,  23 (8), 1349-1351.
Lill, M. A., and Danielson, M. L., 2011. Computer-aided drug design  platform  using  PyMOL. J  Comput  Aided  Mol , 25, 13-19.
Gambar 4. Pose emodin pada kantung ikatan RE-α
LILIANA, ISTYASTONO
Matsuda, H., Shimoda, H., Morikawa, T., and Yoshikawa, M., 2001. Bioorganic  &  Medicinal  Chemistry  Letters .  11, 1839.
Mysinger,  M.  M.,  Carchia,  M.,  Irwin,  J.  J.,  and  Shoichet,  B.
K.,  2012.  Directory  of  Useful  Decoys,  Enhanced (DUD-E):  Better  Ligands  and  Decoys  for  Better Benchmarking. Journal of Medicinal Chemistry , 55, p.
6591.
PubChem, 2015. Emodin, NIH ,
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/emodin, diakses tanggal 10 Mei 2015.
R foundation, 2015. R 3.2.1 is released, R foundation , www.r- statistics.com, diakses tanggal 24 November 2015.
Radifar, M., Yuniarti, N., and Istyastono, E. P., 2013. PyPLIF:
Python-based Protein-Ligand Interaction Fingerprinting. Bioinformation , 9 (6), pp. 325-328. Senkus,  E.,  Kyriakides,  S.,  Ohno,  S.,  Penault-Llorca,  F., Poortmans, P., Rutgers, E., et al , 2015. Primary Breast Cancer:  ESMO  Clinical  Practice  Guidelines,  ESMO, http://www.esmo.org/Guidelines/Breast- Cancer/Primary-Breast-Cancer,  diakses  tanggal  7 November 2015.
Setiawati, A., Riswanto, F.D.O., Yuliani, S.H., and Istyastono, E.P.,  2014.  Retrospective  Validation  of  Structure- Based  Virtual  Screening  Protocol  to  Identify  Ligands for  Estrogen  Receptor  Alpha  and  Its  Application  to Identify  the  Alpha-Mangostin  Binding  Pose. Indo.  J. Chem , 14 (2), 103-108.
Setiawati, A., Soesanto, A.M., Nata, C.D., Chandra, R.K., dan Riswanto,  F.D.O.,  Yuliani,  S.H.,  dkk.,  2014.  Simulasi Penambatan  Molekuler  Coumestrol,  Daidzein,  dan Genistein  pada  Reseptor  Estrogen  Alfa. Jurnal Penelitian , 17 (2), 91-94.
Suganya,  J.,  Radha,  M.,  Naorem,  D.L.,  and  Nishandhini,  M., 2014. In Silico Docking  Studies  of  Selected Flavonoids-Natural  Healing  Agents  Against  Breast Cancer. Asian Pac J Cancer Prev , 15 (19), 8155-8159. World  Health  Organisation,  2013.  Breast  Cancer:  Prevention and Control, World Health Organisation , http://www.who.int/cancer/detection/breastcancer/en/in dex1.html, diakses tanggal 14 April 2015.
World  Health  Organisation,  2014.  Indonesia, World  Health Organisation , http://www.who.int/cancer/country- profiles/idn_en.pdf?ua=1 , diakses  tanggal  14  April 2015.
World  Health  Organisation,  2015.  Cancer, World  Health Organisation ,
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/ , diakses tanggal 10 Mei 2015.
Yaoxian,  W.,  Hui,  Y.,  Yunyan,  Z.,  Yanqin,  L.,  Xin,  G.,  and Xiaoke,  W.,  2013.  Emodin  Induces  Apoptosis  of Human  Cervical  Cancer  Hela  Cells  via  Intrinsic Mitochondrial  and  Extrinsic  Death  Receptor  Pathway. Cancer Cell International , 13, 71.