## OPTIMASI KITOOLIGOSAKARIDA CANGKANG RAJUNGAN ( Portunus pelagicus) MENGGUNAKAN ENZIM KITOSANASE DARI Bacillus sp.
Optimization of Chitooligosacharides of Cramb Shell (Portunus pelagicus ) Using Chitosanase Enzyme from Bacillus sp.
- Septi Lilik Yuliana 1) * , Dedin Finatsiyatull Rosida 1) * , Andre Yusuf Trisna Putra 1) 1) Program Studi Teknologi Pangan, Fakultas Teknik, Universitas Pembangunan Nasional “Veteran” Jawa Timur
Jalan Rungkut Madya No. 1 Surabaya, 60294, Jawa Timur, Indonesia
* Korespondensi Penulis: septililikyuliana04@gmail.com; dedin.tp@upnjatim.ac.id

## ABSTRACT
Chitooligosaccharides (COS) are glycoprotein complex compounds derived from chitosan linked by 1,4 glucosidic bonds with chain lengths of 20 or less. Crab shell is a crustacean waste that contains 20-30% chitin as the basic material for making chitooligosaccharides. Chitooligosaccharide hydrolysis can be carried out enzymatically. Enzymatic hydrolysis is specific and controlled. Enzymes that can be used to hydrolyze chitosan into chitooligosaccharides are chitosanase enzymes. Chitosanase enzyme is a  glycosyl  hydrolase  enzyme  that  catalyzes  the  hydrolysis  of  -1,4  glycosidic  bonds  of  chitosan  to produce low molecular weight chitooligosaccharides. One of the bacteria that produces  chitosanase enzymes,  namely  Bacillus  sp.  The  purpose  of  this  study  was  to  optimize  the  production  of chitooligosaccharides  by  treating  the  enzyme  concentration,  hydrolysis  time,  and  hydrolysis temperature.  This  research  was  conducted  using  a  completely  randomized  design  (CRD)  with  the following  factors:  enzyme  concentration  (0.5%,  1%,  1.5%,  2%,  2.5%)  and  hydrolysis  temperature (30 o C, 40 o C, 50 o C, 60 o C, 70 o C, 80 o C) and time of hydrolysis (1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 7 hours, and 8 hours). This enzyme works optimally at pH 4.5. The results showed that this chitosanase enzyme had optimum activity at a concentration of 2% (w/w) chitosan, a temperature of 50 o C, and a hydrolysis time of 5 hours. The chitooligosaccharide has a reducing sugar content of 8.49 ± 0.38 mg/mL, a viscosity of 19.08 ± 0.01 cPs, and a molecular weight of 4.51 kDa.
Keywords : chitooligosaccharides, chitosanase enzyme, crab shells, hydrolysis

## PENDAHULUAN
Kitooligosakarida  ( chitooligosaccha- rides /COS)  adalah  potongan  kitin  dan kitosan  senyawa  kompleks  golongan glikoprotein  yang  memiliki  rantai  20  atau kurang  dengan  ikatan  1,4  glukosamin. Kitooligosakarida merupakan kitosan yang larut  dalam  air.  COS  dihasilkan  oleh depolimerisasi kitin atau kitosan menggunakan  hidrolisis  asam,  hidrolisis
oleh metode fisik, dan degradasi enzimatik (Aam et al. ,  2010).
Rantai ikatan kitosan ß (1,4) glikosidik dapat dipotong dengan
menggunakan enzim chitoosanase (Mourya et  al. ,  2011).  Enzim  kitosanase merupakan  salah  satu  enzim  kitinolitik yang menghidrolisis ikatan (1,4)-β glikosidik  pada  kitosan  atau  ikatan  2- amino-2-deoksi-β-D-glukosida
pada
polimer kitosan yang menghasilkan
serangkaian kitooligosakarida atau oligomer  kitosan  (kitooligomer)  dengan derajat polimerisasi yang tinggi (Chasanah et al. , 2009). Enzim kitosanase diproduksi oleh  bakteri,  fungi,  dan  tanaman  sebagai enzim  ekstraseluler  atau  intraseluler. Sebagian besar bakteri dan fungi menghasilkan  kitosanase  ekstraseluler, sedangkan  pada  tanaman  dan  fungi zygomicetes menghasilkan kitosanase intraseluler (Choi et al. , 2004).
Hidrolisis kitosan menggunakan enzim  kitosanase  menghasilkan  oligomer kitosan  dengan  derajat  polimerisasi  yang lebih  tinggi  dan  sedikit  glukosamin  yang dihasilkan serta ramah lingkungan (Sarni et al. ,  2016).  Setiap  enzim  kitosanase memiliki  kondisi  optimum  yang  berbeda. Beberapa  penelitian  tentang  kitosanase pernah  dilakukan  oleh  beberapa  peneliti. Choi et  al. (2004)  meneliti  bahwa kitosanase  dari Bacillus sp.  galur  KCTC 0377  BP  memiliki  pH  optimum  4,5  pada temperatur  30ºC  dan  digunakan  untuk produksi  oligomer  kitosan.  Pagnoncelli et al. (2010)  memproduksi  enzim  kitosanase dari Paenibacillus ehimensis dan
diaplikasikan untuk menghidrolisis kitosan pada suhu optimum 55ºC dan pH optimum 4,5. Wangtueai et al. (2007) memproduksi dan melakukan karakterisasi enzim kitosanase  dari Bacillus  cereus TP  12.24 yang memiliki pH 4,5,5 dan suhu optimum 55ºC.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  kondisi  optimum  hidrolisis kitooligosakarida  dari  cangkang  rajungan menggunakan  enzim  kitosanase  untuk menghasilkan kadar gula reduksi, viskositas,  dan  berat  molekul  optimal. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui kondisi optimum pembuatan kitooligosakarida dari cangkang rajungan.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk membuat produk  yaitu shaker  waterbath (merk Biobasa), magnetic stirrer , vortex, sentrifus (merk  Oregon),  neraca  analitik,  pH  meter, oven,  kertas  saring, beaker  glass 2  L , pemanas hotplate. Alat untuk analisis yaitu spektrofotometer UV-Vis (merk
Shimadzu),  desikator,  viskometer  (merk NDJ-8s Digital  Viscometer ),  mikropipet, tabung reaksi, pipet ukur, rak tabung reaksi, corong, pemanas hotplate , beaker glass 250 mL, dan erlenmeyer.
Bahan  yang  digunakan  meliputi cangkang  rajungan  yang  diperoleh  dari limbah  perusahaan  Kelola  Mina  Laut Gresik,  enzim  kitosanase  dari Bacillus sp. (Sigma, Korea),  akuades, buffer asetat 0,05 M pH 4,5 (Merck), larutan nelson A (Nitra Kimia),  larutan  nelson  B  (Nitra  Kimia), larutan  arsenomolibdad  (Merck),  larutan HCl  0,5  M  (Merck),  dan  larutan  NaOH 50% (Merck).

## Tahapan Penelitian
Isolasi Kitosan dari Cangkang  Rajungan
(Butarbutar, k 2018 Dimodifikasi)
Proses isolasi i kitosan i dari limbah l cangkang rajungan dilakukan secara kimiawi dengan diawali proses isolasi kitin yaitu  proses  demineralisasi cangkang rajungan dengan menambahkan i 1,5 L HCl 1,5 M ke dalam 100 g cangkang serbuk dan dipanaskan  pada hot  plate selama 4  jam pada suhu 70 o C, kemudian a residu disaring dan dicuci menggunakan a akuades i hingga pH-nya  netral.  Residu v yang  diperoleh dioven  selama 3  jam pada suhu 70 o C. Selanjutnya proses deproteinasi  dilakukan dengan cara 50 g serbuk hasil
Jurnal Agroteknologi Vol. 16 No. 01 (2022)
demineralisasi ditambah 0,5 L NaOH 3,5%; selanjutnya dipanaskan selama l 4 jam a pada suhu 70 o C,  kemudian residu  disaring dan dicuci menggunakan akuades  hingga pH i netral.  Residu yang diperoleh dioven selama 3  jam pada suhu 70 o C  sehingga dihasilkan kitin. Proses selanjutnya deasetilasi yakni 40 g kitin ditambah 0,4 L NaOH 50%, selanjutnya dipanaskan selama
4  jam  dan  suhu dijaga 100 o C  kemudian disaring dan  residu yang  tertinggal dicuci m dengan  akuades hingga  pH netral. Residu  dioven  selama 3 jam  pada suhu 70 o C dan diperoleh kitosan kering.
Optimasi  Konsentrasi  Enzim  Kitosanase Terhadap Kitooligosakarida (Fawzya et al . , 2009 Dimodifikasi)
Kitooligosakarida
diproduksi menurut  metode  Fawzya et  al .  (2009).
Persiapan  larutan  kitosan  1%  dilakukan dengan  cara  melarutkan  kitosan  ke  dalam larutan buffer asetat  pH  4,5  kemudian enzim  kitosanase  direaksikan  dengan variasi  konsentrasi  0,5%,  1%,  1,5%,  2%, 2,5% (w/w). Kitosan selanjutnya diinkubasi selama  3  jam  pada  suhu  60 o C.  Reaksi dihentikan  dengan  pemanasan  100 o C, selama  10  menit.  Kemudian  sampel disentrifuse  kecepatan  9000  rpm  sehingga diperoleh  supernatan  yang  mengandung kitooligosakarida.
Optimasi Suhu Hidrolisis Terhadap Kitooligosakarida  (Fawzya  et  al. , 2009 Dimodifikasi)
Cara  kerja  untuk  mengetahui  suhu optimum hidrolisis kitooligosakarida dengan  cara  membuat  larutan  kitosan  1% kemudian  direaksikan  dengan  enzim kitosanase 0,5% lalu diinkubasi pada suhu 30, 40, 50, 60, 70, dan 80 o C selama 3 jam.
Reaksi  dihentikan  dengan  pemanasan 100 o C, selama 10 menit. Kemudian sampel disentrifuse  dengan  kecepatan  9000  rpm sehingga diperoleh supernatan yang mengandung kitooligosakarida.
Optimasi  Waktu  Hidrolisis  Terhadap Kitooligosakarida  (Fawzya  et  al. , 2009

## Dimodifikasi)
Waktu  hidrolisis  yang  optimum merupakan  parameter  penting  hidrolisis untuk menghasilkan kitooligosakarida yang optimal. Cara kerjanya yaitu larutan kitosan 1%  direaksikan  dengan  enzim  kitosanase 0,5% kemudian diinkubasi pada suhu 60 o C dengan variasi lama hidrolisis 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 jam. Reaksi dihentikan dengan pemanasan  100 o C  selama  10  menit. Kemudian  sampel  disentrifuse  dengan kecepatan  9000  rpm  sehingga  diperoleh supernatan yang mengandung kitooligosakarida.
Produksi  Kitooligosakarida  pada  Kondisi
Optimum (Fawzya et al., 2009

## Dimodifikasi)
Kondisi  optimum  didapatkan  dari setiap  kondisi  optimum  dari  variabel konsentrasi  enzim,  suhu  hidrolisis,  dan lama  waktu  hidrolisis.    Kitooligosakarida yang  dihasilkan  pada  kondisi  optimum kemudian dianalisis gula reduksi (Sudarmaji, 2000), berat molekul (Wang et al. , 2005), dan viskositasnya (Ridho et al. , 2017).

## Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah rancangan acak lengkap (RAL) 3 faktor dan dua  kali  ulangan.  Faktor  tersebut  meliputi konsentrasi  enzim,  lama  waktu  hidrolisis,
dan  suhu  hidrolisis.  Faktor  konsentrasi enzim  (0,5%,  1%,  1,5%,  2%,  2,5%),  suhu hidrolisis  (30,  40,  50,  60,  70,  dan  80 o C), serta lama waktu hidrolisis (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,  dan  8  jam).  Data  hasil  penelitian dianalisis secara deskriptif kuantitatif. Data yang diperoleh diolah menggunakan aplikasi  Minitab  versi  19  dengan  uji ANOVA  taraf  kepercayaan  95%  dan dilanjutkan  dengan  uji  Duncan  (DMRT) taraf  kepercayaan  5%.  Hasil  pengolahan data disajikan dalam bentuk diagram.

## Metode Analisis
Bahan awal yaitu cangkang rajungan dianalisis karakteristik kadar air dan kadar abu.  Karakteristik  kitosan  dianalisis  kadar air, kadar abu, n dan viskositas. Pengukuran kadar  air  dilakukan  menggunakan  metode gravimetri    bersuhu  105 o C  dengan  sampel sebanyak  1  g  (AOAC, 2005),  kadar  abu diuji  dengan  metode  gravimetri  dengan cara  diabukan  pada  suhu  600 o C  dan  suhu oven  yang digunakan 105 o C, sampel  yang digunakan seberat 1 g (AOAC , 2005).
Larutan kitosan 1% dianalisis viskositasnya  menggunakan viscometer digital NDJ-8s (Ridho et al. , 2017). Produk akhir  yaitu  kitooligosakarida  dianalisis kadar  gula  reduksi,  viskositas,  dan  berat molekul. Kadar gula reduksi menggunakan metode Nelson  Somogy pengenceran sampel  yang  digunakan  1000  (Sudarmaji, 2000).  Hasil  viskositas  kitooligosakarida kemudian  dimasukkan  dalam  persamaan Mark-Khun  Houwing untuk  mengetahui berat  molekul  kitooligosakarida  (Wang et al. , 2005). Persamaan Mark-Khun Houwing sebagai berikut:
𝑀 = 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑜𝑔 ([𝜂] −𝑙𝑜𝑔 𝑙𝑜𝑔 𝑘) 𝛼
Keterangan:
M = berat molekul
[η] = viskositas intrinsik k = konstanta Mark-Khun Houwing (3,5 × 10-4) α = konstanta Mark-Khun Houwing
(0,76)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Cangkang Rajungan i dan Kitosan a Analisis awal yaitu pengujian cangkang  rajungan M meliputi  pengujian kadar m air  dan kadar  abu. Cangkang rajungan memiliki  kadar air  7,52%  dan kadar abu  sebesar  45,46%.  Berdasarkan Natalia e et  al. (2021),  kandungan  senyawa kimia  cangkang  rajungan  menunjukkan bahwa kadar air sebesar 10% dan kadar abu sebesar 38,12%.
Kadar  abu  dapat  dipengaruhi  oleh habitat dan lingkungan hidup dari rajungan sehingga  hal  tersebut  juga memengaruhi kandungan dari  senyawa  kimia  rajungan. Perbedaan habitat  dan  lingkungan hidup setiap lingkungan perairan dapat menyediakan asupan mineral yang berbeda-beda bagi organisme akuatik yang hidup di  dalamnya.  Setiap individu organisme juga memiliki kemampuan yang berbeda dalam meregulasi dan mengabsorbsi  mineral  sehingga akan memberikan  pengaruh  pada  kadar  abu dalam  masing-masing.  Mineral yang terdapat dalam suatu bahan berasal dari dua macam  garam  yaitu  garam  organik  dan anorganik  (Ramadhani,  2020).  Tingginya kadar mineral yang terdapat pada cangkang rajungan  sebagian  besar  adalah  Ca dan  P (Natalie et al ., 2021).
Proses pembuatan kitosan dari limbah cangkang rajungan diperoleh  melalui tiga tahapan yaitu tahap demineralisasi, deproteinasi,  dan deasetilasi.  Karakteristik kitosan tersaji pada Tabel l 1 .
Tabel a 1 .  Karakteristik a kitosan  dari  cangkang
rajungan Komponen a Nilai Kadar a air (%) 10,15±0,28 Kadar a abu (%) 2,78±0,46 Viskositas a (cPs) 118,38±0,33
Kadar air merupakan parameter penting  dalam mutu  produk  kitosan. Berdasarkan  BSN  (2013)  melalui  SNI 7949-2013 , kadar air kitosan sebesar ≤12%.
Kitosan pada penelitian ini telah memenuhi persyaratan BSN  yaitu  10,15±0,28%.
Kadar air yang rendah dapat menekan atau mengurangi kerusakan  pada kitosan, misalnya terhindar    dari adanya  aktivitas mikroorganisme akibat kelembapan. Yanti et al . (2018) menyebutkan kadar air kitosan 3,57%.  Kadar air yang terkandung  pada kitosan dipengaruhi oleh proses pengeringan,  lama pengeringan  yang dilakukan, jumlah kitosan yang dikeringkan, dan  luas permukaan  tempat kitosan dikeringkan (Agustina &
Kurniasih, 2013). Kadar abu juga merupakan parameter yang  penting dalam  menentukan mutu kitosan. Pengukuran kadar abu merupakan indikator  efektivitas proses  demineralisasi dalam menghilangkan mineral (Fernandez,
2004).  Kadar abu  kitosan  dari  cangkang rajungan berdasarkan penelitian ini sebesar 2,78±0,46%. BSN (2013) dalam SNI 7949-
2013  menunjukkan kadar  abu kitosan sebesar ≤12%.  Kadar abu  yang rendah menunjukkan  kandungan mineral  yang rendah. Mutu dan s kemurnian k kitosan akan
semakin  tinggi bila kadar abu  yang dihasilkan semakin rendah (Setha
et a al. , a 2019). Yanti et al. (2018) menyebutkan bahwa kadar abu
kitosan k 1,75%.  Kandungan  mineral  pada
crustaceae umumnya  sebanyak 30-50% dengan kadar 8-10%  dari  total bahan organik. Mineral tersebut dapat dihilangkan dari  matriks  menggunakan larutan  HCl. Garam-garam  anorganik terikat M secara fisik,  dimana m senyawa  CaCO 3 lebih mudah dipisahkan dibanding m protein. Demineralisasi  secara umum  dilakukan dengan  larutan b HCl  atau  asam  lain seperti K H 2 SO 4 M (Khor, 2010).  Pada saat pencucian dengan akuades, mineral- mineral  yang tidak terlarut  pada  proses demineralisasi  ikut  terbawa oleh air pencucian (Siregar et al. , 2016). Viskositas berhubungan M dengan berat  molekul,  dimana viskositas a kitosan pada  penelitian ini  yaitu 118,38±0,33  cPs. Kitosan  ini n tergolong  memiliki l viskositas yang  rendah l karena  viskositas  kurang dari <200 cPs (Setha et al. , 2019). Faktor a yang berpengaruh  pada nilai  viskositas  yaitu kekuatan  ion, pH, suhu  deasetilasi,  waktu proses  demineralisasi, dan  suhu  saat pengukuran (Rochima et al. , a 2018).

## Optimasi  Konsentrasi  Enzim  pada Produksi Kitooligosakarida
Hidrolisis merupakan proses pemecahan  molekul  kompleks  menjadi molekul  sederhana  dengan  bantuan  air. Bertambahnya  rasio  enzim,  menyebabkan bertambah  banyak  enzim  yang  mengatalis reaksi  pemutusan  ikatan  glikosida  pada rantai  kitosan.  Menurut  Rokhati  (2015), pembentukan  gula  reduksi  menunjukkan aktivitas  enzim  yang  memotong  ikatan glikosida  pada  kitosan.  Semakin  tinggi
konsentrasi  enzim  maka  semakin  tinggi pula  gula  reduksi  yang  dihasilkan.  Enzim pada  suatu  konsentrasi  substrat  tertentu, kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim (Wang et al., 2007).
Hasil  gula  reduksi  terendah  pada konsentrasi  0,5%  yaitu  1,03±0,48  mg/mL dan  tertinggi  pada  konsentrasi  2,5%  yaitu 5,21±0,39 mg/mL. Tetapi perlakuan konsentrasi  2,5%  hasilnya  tidak  berbeda nyata  dengan  perlakuan  konsentrasi  2% yaitu sebesar 4,86±0,09 mg/mL ( Tabel 2 ).
Tabel 2 . Pengaruh konsentrasi enzim pada produksi kitooligosakarida Konsentrasi enzim (%) Gula reduksi (mg/mL) 0,5 1,03 d ±0,48 1 2,39 c ±0,48 1,5 3,77 b ±0,48 2 4,86 ab ±0,09 2,5 5,21 a ±0,39
Keterangan:  Nilai  rata-rata  yang  diikuti  dengan huruf  berbeda  menyatakan  berbeda nyata (p≤ 0,05)
Berdasarkan Tabel 1 , semakin tinggi konsentrasi enzim maka kadar gula reduksi yang  dihasilkan  semakin  meningkat, dimana  pada  penelitian  ini  didapatkan konsentrasi  enzim  optimum  yaitu  pada konsentrasi  2%.  Hal  ini  disebabkan  pada enzim  konsentrasi  2%  memiliki  aktivitas yang  sama  dengan  konsentrasi  2,5%. Hubungan antara konsentrasi enzim dengan kadar gula reduksi tersaji pada Gambar  1 .
Gambar 1 . Hubungan konsentrasi enzim pada kadar gula reduksi
Gambar  1 menjelaskan i bahwa semakin i besar i konsentrasi i enzim i maka gula  reduksi i yang i dihasilkan i semakin besar.  Bertambahnya konsentrasi enzim, menyebabkan  bertambah i banyak i enzim yang i mengatalis i reaksi i pemutusan ikatan i glikosida i pada i rantai i kitosan.  Menurut Rokhati et  al. (2015),  pembentukan gula i reduksi menunjukkan i aktivitas i enzim i yang  memotong  ikatan  glikosida  pada kitosan.  Semakin  besar  konsentrasi  enzim maka semakin besar pula gula reduksi yang dihasilkan.  Enzim  pada  suatu konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim  (Wang et  al., 2007).
Sanchez et  al .  (2017)  menghidrolisis kitooligosakarida  udang menggunakan enzim  kitosanase  konsentrasi  1%  dapat menurunkan viskositas 76%. Roncal et  al.
(2017)  menjelaskan  bahwa  hidrolisis kitooligosakarida menggunakan 1% enzim kitosanase dari S. griseus dapat
menghasilkan gula reduksi 0,5-2,25
mg/mL.  Enzim  kitosanase  0,05%  juga mampu  menghasilkan  kitooligosakarida bermolekul rendah.
Viskositas  merupakan  salah  satu parameter yang  menunjukkan  terjadinya hidrolisis selain gula reduksi.
0 1 2 3 4 5 6 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Kad ar g u la red u k si (m g /m L )
Konsentrasi enzim (%)
Jurnal Agroteknologi Vol. 16 No. 01 (2022)
Kitooligosakarida yang telah diperoleh dari setiap kondisi hidrolisis diukur
viskositasnya  dan didapatkan hasil  pada Tabel 3 .
Tabel t 3 .  Pengaruh konsentrasi  enzim pada viskositas kitooligosakarida Konsentrasi enzim (%) Viskositas (cPs) 0,5 40,54 d ±0,03 1 30,65 c ±0,53 1,5 28,37 b ±0,49 2 18,6 ab ±0,27 2,5 15,03 a ±0,05
Keterangan:  Nilai  rata-rata  yang  diikuti  dengan huruf  berbeda  menyatakan  berbeda nyata (p≤ 0,05)
Berdasarkan pengukuran  viskositas ( Tabel a 3 ),  proses hidrolisis  berlangsung karena terjadi penurunan viskositas seiring dengan peningkatan jumlah konsentrasi enzim yang ditambahkan. Sarni et  al.
(2016) menjelaskan bahwa enzim kitosanase  mampu  menghidrolisis kitosan dengan cara  pemutusan ikatan rantai panjang kitosan, tepatnya pada ikatan β(1- 4) glukosida  membentuk rantai  kitosan yang lebih pendek.
Optimasi Suhu Hidrolisis pada Produksi Kitooligosakarida
Suhu merupakan salah satu  faktor yang  berpengaruh pada  kondisi hidrolisis kitooligosakarida. Hidrolisis t kitosan dilakukan dengan konsentrasi enzim kitosanase 0,5%  selama  3 jam  sebagai variabel tetap.  Menurut Choi , et al . (2004), enzim kitosanase dari Bacillus sp. optimum pada suhu  antara 30 o C-70 o C.  Adapun pengaruh suhu terhadap kadar gula reduksi tersaji pada Tabel 4 . e
Tabel 4 .  Pengaruh suhu hidrolisis  pada  produksi kitooligosakarida
Suhu hidrolisis ( o C) Gula reduksi (mg/mL) 30 o 0,86 de ±0,15 40 o 1,37 c ±0,19 50 o 1,68 a ±0,05 60 o 1,51 ab ±0,01 70 o 0,75 e ±0,09 80 o 0,55 f ±0,09
Keterangan: n Nilai n rata-rata  yang diikuti dengan huruf berbeda menyatakan berbeda nyata (p≤0,05)
Tabel  4 menunjukkan  bahwa  gula reduksi  cenderung naik  seiring  dengan bertambahnya suhu hidrolisis. Namun pada suhu  50ºC,  nilai  gula reduksi  yang dihasilkan  mencapai  optimum sebesar 1,68±0,05 mg/mL.  Berdasarkan hasil analisis statistik  menunjukkan bahwa perlakuan suhu  hidrolisis  berpengaruh sangat nyata  terhadap kenaikan  gula reduksi hidrolisat  kitooligosakarida.  Hasil analisis lanjut dengan uji DMRT (α=0,05) menunjukkan bahwa gula reduksi hidrolisat berpengaruh nyata pada suhu hidrolisis 30,
40, 50, 60, 70, dan 80ºC. Hubungan antara suhu hidrolisis  dengan kadar  gula reduksi tersaji pada Gambar 2 .
Semakin tinggi suhu hidrolisis maka gula  reduksi  yang  dihasilkan semakin tinggi  dimana  suhu  50 o C merupakan  suhu optimum dari proses  hidrolisis  ( Gambar 2 ).  Ismail (2019) melaporkan  bahwa hidrolisis  kitooligosakarida menggunakan enzim kitosanase dari Pseudomonas optimum  pada  suhu 50 o C . Pagnoncelli  et al. (2010)
juga memproduksi
kitooligosakarida menggunakan enzim kitosanase dari Paenibacillus ehimensis pada suhu optimum 50ºC. Enzim kitosanase dari Matsubacter chitosanotabidus optimum pada suhu  30-
40 o C (Zilda et al., 2016). Enzim kitosanase dari Bacillus cereus optimum pada suhu e 70 o C (Lestari et al. , 2019). Wangtueai et al. (2007) melaporkan enzim kitosanase dari Bacillus cereus TP t 12.24 memiliki pH 4,5 dan suhu optimum 55ºC.
Gambar 2 . Hubungan suhu hidrolisis dengan kadar gula reduksi
Setiap    enzim  memiliki karakteristik yang berbeda  disebabkan  oleh  perbedaan jenis  mikroba  yang  memproduksi  enzim tersebut.  Peningkatan  aktivitas  enzim bisa dipengaruhi  oleh  suhu  karena  menurut Nurhaeni et  al. (2019),  peningkatan suhu reaksi  sebesar 10 o C  akan meningkatkan aktivitas  enzim  50-100%.  Suhu dapat mempercepat  proses reaksi namun  pada titik suhu  tertentu,  kecepatan  reaksi  yang dikatalis  oleh enzim  akan  mulai  menurun atau bahkan tidak nampak lagi aktivitasnya. Kondisi suhu dimana enzim dapat menghasilkan aktivitas  tertinggi disebut sebagai  suhu optimum  karena  enzim berstruktur protein dan protein dapat rusak oleh panas maka pada suhu tinggi tertentu aktivitas enzim mulai menurun dan bahkan menghilang. Hal ini sangat dimungkinkan karena terjadinya denaturasi atau
kerusakan struktur enzim  yang  dapat menyebabkan kerusakan enzim  secara keseluruhan maupun sebagian  terutama pada sisi aktifnya (Wang et al., 2007).
Proses hidrolisis menyebabkan terjadinya  penurunan viskositas.  Adapun pengaruh suhu hidrolisis terhadap penurunan viskositas  hidrolisis  kitosan menjadi  kitooligosakarida tersaji  pada
Tabel 5 .
Tabel 5 .  Pengaruh suhu  hidrolisis terhadap viskositas kitooligosakarida
Suhu hidrolisis ( o C) Viskositas (cPs) 30 64,96 de ±0,93 40 57,27 c ±0,56 50 38,47 a ±0,31 60 40,55 ab ±0,03 70 41,71 e ±0,54 80 50,47 f ±0,92 Keterangan:  Nilai  rata-rata  yang  diikuti  dengan huruf  berbeda  menyatakan  berbeda nyata (p≤ 0,05)
Tabel 5 menunjukkan penurunan viskositas yang terjadi pada suhu 30-50 o C, setelah itu viskositas naik pada suhu 60 o C. Hal tersebut  menunjukkan bahwa enzim memiliki aktivitas optimal pada suhu 50 o C setelah itu aktivitas enzim berkurang akibat panas  dari lingkungan  yang  menyebabkan kenaikan  viskositas.  Kenaikan viskositas ini terjadi oleh adanya penurunan aktivitas enzim  karena hasil  hidrolisis merupakan produk  kitosan  bermolekul lebih  rendah yang  memiliki  struktur sama dengan substrat awal.  Keberadaan produk  dalam kondisi tertentu  justru akan menjadi inhibitor yang akan  menghambat  kinerja enzim sehingga dapat  terjadi  rekombinasi dua atau lebih produk hasil hidrolisis pada sisi aktif enzim (Li et al ., 2005; Rokhati et al ., 2015).
0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Kad ar g u la red u k si (m g /m L ) Suhu hidrolisis ( o C)
Optimasi Waktu Hidrolisis pada Produksi Kitooligosakarida a Waktu hidrolisis adalah  salah satu faktor yang berpengaruh dalam pembentukan  hidrolisat kitooligosakarida. Hidrolisis kitooligosakarida
dilakukan dengan konsentrasi enzim kitosanase 0,5% dan  suhu 60 o C  sebagai variabel tetap dan lama waktu hidrolisis yang digunakan yaitu
1 sampai 8 jam. Terbentuknya gula reduksi setelah  proses  hidrolisis  merupakan  salah satu  indikator  keberhasilan  hidrolisis kitooligosakarida.  Adapun pengaruh  lama waktu  hidrolisis terhadap  gula reduksi tersaji pada Tabel a 6 .
Tabel 6 . Pengaruh waktu hidrolisis terhadap kadar gula r reduksi a Waktu hidrolisis (Jam) Gula reduksi (mg/mL) 1 0,38 d ±0,44 2 0,55 cd ±0,58 3 1,09 c ±0,39 4 4,45 b ±0,48 5 7,39 a ±0,48
6
7,33 a ±0,48 7 7,26 a ±0,48 8 7,16 a ±0,43
Keterangan: n Nilai n rata-rata yang diikuti dengan huruf i berbeda menyatakan berbeda nyata (p≤0,05)
Tabel 6 menunjukkan gula reduksi cenderung naik dengan bertambahnya suhu hidrolisis. Pada lama hidrolisis 5 jam nilai gula reduksi yang dihasilkan mencapai titik optimum sebesar 7,39±0,48 mg/mL. Lama waktu hidrolisis  berpengaruh sangat nyata terhadap kenaikan gula reduksi hidrolisat kitooligosakarida. Kadar gula reduksi naik secara signifikan oleh bertambahnya waktu hidrolisis sehingga mencapai waktu hidrolisis  optimum  yaitu  pada  lama
hidrolisis 5 jam. Hubungan suhu hidrolisis dengan gula reduksi tersaji Gambar 3 .
Gambar 3 .  Pengaruh a lama a hidrolisis  terhadap a kadar gula a reduksi
Gambar 3 menunjukkan bahwa nilai gula  reduksi hasil hidrolisis enzim kitosanase meningkat ketika pada waktu 1 sampai 5 jam. Setelah 5 jam maka hidrolisis berlangsung menurun seiring dengan waktu reaksi yang bertambah.  Kenaikan kadar gula  reduksi terjadi  5 jam awal,  setelah  5 jam terjadi  penurunan  gula  reduksi  yang signifikan.  Setiap  enzim  memiliki  kondisi optimum hidrolisis  yang berbeda.  Jeon & Kim (2000) melaporkan  hasil  hidrolisis kitooligosakarida  menggunakan enzim kitosanase  dari Bacillus  pumilus optimum setelah  3  jam.  Sanchez et  al. (2017) menggunakan enzim  kitosanase  pada Streptomyces  griseus yang optimum pada jam ke-4.  Jenis  mikroorganisme  yang berbeda  menghasilkan  karakteristik  enzim yang berbeda pula  (Fawzya et al., 2009). Menurut  Dong et  al. (2014), lama  waktu hidrolisis  tidak  hanya memengaruhi  kadar gula reduksi tetapi juga terhadap rendemen yang  dihasilkan.  Aktivitas enzim akan meningkat dengan  bertambahnya waktu reaksi hingga  mencapai  waktu  optimum.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Kad ar g u la red u k si (m g /m L )
Lama hidrolisis (Jam)
Apabila waktu  optimum  telah  tercapai maka penambahan  waktu  hidrolisis  tidak akan memengaruhi reaksi hidrolisis. Waktu reaksi sangat berpengaruh  pada reaksi hidrolisis kitooligosakarida. Dimana waktu  yang lama akan menyebabkan banyak rantai kitosan  yang terdegradasi dan menghasilkan kitooligosakarida dengan berat molekul rendah (Handayani et al., 2013).
Berat molekul kitooligosakarida berhubungan dengan tingkat viskositas dari suatu la rutan tersebut. Semakin rendah viskositas kitooligosakarida menunjukkan semakin rendah  pula  berat molekulnya. Adapun  hubungan antara  lama waktu hidrolisis dengan viskositas yang terbentuk tersaji pada Tabel a 7 .
Tabel 7 .  Pengaruh waktu hidrolisis terhadap viskositas kitooligosakarida Waktu hidrolisis (Jam) Viskositas (cPs) 1 64,23 d ±0,77 2 58,57 cd ±0,69 3 40,55 c ±0,03 4 36,23 b ±0,73 5 27,44 a ±0,37 6 26,87 a ±0,26 7 26,09 a ±0,24 8 25,32 a ±0,17 Keterangan:  Nilai  rata-rata  yang  diikuti  dengan huruf  berbeda  menyatakan  berbeda nyata (p≤ 0,05)
Kitooligosakarida yang  dihasilkan dari proses hidrolisis enzim kitosanase dari Bacillus sp. mengalami penurunan viskositas  yang  signifikan pada  waktu hidrolisis 1 sampai 5 jam, namun pada jam ke-5 hingga  ke 8 viskositas  relatif stabil.
Hal  ini mengindikasikan  bahwa  aktivitas enzim  relatif meningkat pada jam  5  awal, sedangkan  pada jam  5  ke  atas  aktivitas
enzim  relatif  stabil.  Sarni et  al. (2016) melaporkan bahwa terjadi  penurunan viskositas  pada  kitooligosakarida  yang dihidrolisis menggunakan enzim kitosanase dari Klepsiella sp.  pada 3  jam  pertama. Rokhati et  al. (2016)  menyebutkan  bahwa hidrolisis kitooligosakarida  selama 4 jam menggunakan kombinasi enzim exocellulase dan endocellulase mampu menurunkan  viskositas  hingga  17,34  cPs. Semakin lama  waktu  hidrolisis  maka interaksi antara enzim dan substrat semakin tinggi yang mengakibatkan semakin banyak pemutusan ikatan ß (1,4) glikosidik pada  kitosan  menjadi  molekul lebih sederhana  dan  menyebabkan  viskositas turun.  Setiap  enzim  memiliki  karakteristik yang berbeda berdasarkan cara memperoleh enzim tersebut, mikroba yang menghasilkan, dan lainnya. Adapun faktor yang dapat  memengaruhi  aktivitas enzim diantaranya suhu,  pH,  konsentrasi, dan lama waktu hidrolisis  (Rochima et  al. ,
2018).
Hasil Hidrolisat Kitooligosakarida pada
Kondisi Optimum Hidrolisis merupakan proses pemecahan  molekul  kompleks  menjadi molekul  sederhana  dengan  bantuan  air.
Berdasarkan  data optimasi  konsentrasi enzim, suhu hidrolisis, dan lama  hidrolisis kemudian dilakukan
hidrolisis kitooligosakarida  menggunakan enzim kitosanase  dengan  konsentrasi  enzim  2%
(w/w) kitosan,  suhu hidrolisis  50 o C,  dan lama hidrolisis 5 jam. Hidrolisat kitooligosakarida  yang  dihasilkan  tersaji pada Tabel 8 .
Tabel 8 . Karakteristik kitooligosakarida rajungan Komponen Nilai Gula reduksi (mg/mL) 8,49±0,38 Viskositas (cPs) 19,08±0,01 Berat molekul (kDa) 4,51±0,44
Pada kondisi  optimum  dihasilkan kitooligosakarida  yang  memiliki  gula reduksi  sebesar  8,49±0,38 mg/mL  ( Tabel 8 ).  Pagnoncelli et al. (2010)  melaporkan bahwa  kitooligosakarida hasil  hidrolisis enzim kitosanase dari Paenibacillus ehimensis memiliki kadar gula  reduksi sebesar  1,2  mg/mL.  Kadar gula  reduksi kitooligosakarida menunjukkan terjadi proses hidrolisis karena menurut Rokhati et al. (2016)  setiap  pemutusan ikatan glikosida pada rantai kitosan akan membentuk satu gula reduksi dan satu gula non reduksi.
Viskositas  kitooligosakarida  dari cangkang rajungan yaitu sebesar 19,08±0,01 cPs ( Tabel 8 ).
Kitooligosakarida hasil hidrolisis enzimatis menghasilkan viskositas 2,15 cPs (Yawzya et  al. ,  2009).  Viskositas  yang rendah menunjukkan  bahwa  proses hidrolisis berhasil  yang  ditandai dengan  penurunan viskositas.  Viskositas  ini  akan  digunakan untuk  menentukan  berat molekul.  Berat molekul  merupakan salah  satu  parameter penting. Kitooligosakarida pada  penelitian ini memiliki berat molekul 4,51±0,44 kDa ( Tabel 8 ).  Sanchez et al. (2017)  meneliti kitooligosakarida  yang  memiliki berat molekul sebesar 5,6  kDa.  Berat molekul dari kitooligosakarida yang rendah memiliki sifat lebih mudah larut dalam air dibanding sebelum terhidrolisis (Julianti et al .,  2012).  Kemampuan  enzim  untuk mendegradasi ikatan glikosidik menyebabkan terjadinya penurunan viskositas  intrinsik  yang  berbanding  lurus
dengan  berat  molekul  sehingga  dengan menurunnya viskositas intrinsik dari oligomer  kitosan  maka  terjadi  pula penurunan  berat  molekulnya.  Hal ini mengindikasikan  bahwa  telah  terjadi pemutusan  ikatan  rantai  panjang  pada kitosan,  tepatnya  pada  ikatan  β(1-4) glukosida  membentuk  rantai  kitosan  yang lebih  pendek  (Nurhaeni et  al., 2019).
Kitooligosakarida  dengan  berat molekul rendah dilaporkan memiliki banyak aktivitas  biologi seperti  antimikroba, antikanker, antioksidan, dan efek imunostimulan  yang  tergantung  pada  sifat fisikokimianya (Qin et al., 2002).
Kitooligosakarida  memiliki  aktivitas antimikroba  karena  mampu  menghambat pertumbuhan Escherichia  coli dan L. monocytogenes (Sanchez et al. , 2017). Hal ini dikarenakan COS ( chitooligosaccharides ) memiliki muatan positif dari gugus amina. Gugus amina ini juga  mampu  menyatu dengan  empedu sehingga menghambat penyerapan kolesterol.  Dimana  Jin et al. (2017) menjelaskan  bahwa 1%  kitooligosakarida dari kepiting dapat  menurunkan kolesterol 49–64 mg/g  secara in-vitro .  Gugus amina dari COS diduga memiliki aktivitas sebagai antioksidan  sebagaimana  penelitian El- Sayed et al. (2017)  yang  menghasilkan COS  dengan aktivitas  antioksidan metode DPPH sebesar 86,97 mgAAE/g dan dengan metode FRAP sebesar 93,56 μgTE/mg atau sekitar 9,356%.

## KESIMPULAN i
Kondisi  optimal  proses  hidrolisis kitooligosakarida cangkang rajungan dengan  menggunakan  enzim  kitosanase komersial dari Bacillus sp. yaitu pada suhu hidrolisis 50 o C,  konsentrasi  enzim 2%
selama  5  jam.  Kitooligosakarida  yang dihasilkan  memiliki  kadar  gula  reduksi sebesar  8,49±0,38  mg/mL,  viskositas sebesar 19,08±0,01 cPs, dan berat molekul sebesar 4,51 kDa.

## DAFTAR PUSTAKA
Aam,  B.B,  Heggset,  E.B.,  Norberg,  A.L.,
Sorlie,  M.,  &  Eijsink,  V.G.  (2010). Production of  chitooligosaccharides  and their  potential applications in medicine. Journal of Medicine and Life , 2 (8), 1482-
1517.
Agustina,  S.,  &  Kurniasih,  Y.  (2013).
Pembuatan kitosan dari cangkang udang dan aplikasinya sebagai adsorben untuk menurunkan kadar logam Cu.
Proseding  Seminar Nasional.  IKIP
Mataram.  Matarami. 9-10  Oktober 2013.
AOAC. (2005). Official Methods of Analysis of The Association of Official Analytical Chemist. AOAC Inc., Washington.
BSN  [Badan  Standardisasi  Nasional].  (2013). Standar  Mutu  Kitosan.  SNI  7949-2013 .
Jakarta:  Badan  Standardisasi  Nasional Indonesia.
Butarbutar, E. (2018). “Uji  Aktivitas Antibakteri  Kitosan  Berbahan  Baku Cangkang Rajungan ( Portunus pelagicus ) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli” .  Skripsi.  Kimia,  Universitas Sumatra Utara, Medan.
Chasanah,  E.,  Zilda,  S.D.,  &  Uria,  A.R.
(2009).  Screening  and  characterization of  bacterial  chitosanase  from  marine environment. Journal of Coastal Development, 12 (2), 64-72.
Choi, J.Y., Kim,  E.J.,  Piao,  Z.,  Yun,  Y.C.,  & Shin,  Y.C.  (2004).  Purification  and characterization  of  chitosanase  from Bacillus sp. strain KCTC 0377BP and its
application for the production of chitosan oligosaccharides. Journal  Applied  and Environmental  Microbiology,  70 (8), 4522-4531.
Dong, H., Yaoson,  W., Liming, Z., Jiachun, Z., Quanming,  X.,  &  Yongjun,  Q.  (2014). Key technologies of enzymatic preparation for dp 6–8 chitooligosaccharides. Journal  of  Food
Process  Engineering,  38 (2015),  336– 344.
Fawzya, Y.N., Sitohang, M.N., Syarmalina, &
Pratitis,
A. (2009).
Produksi kitooligosakarida  menggunakan  enzim sellulase  dari Trichoderma  resei dan bioavalibilitas sebagai antibakteri. Jurnal  Pascapanen  dan  Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, 4 (2), 105-112.
Fernandez,  K.  (2004).  “Physicochemical  and Functional Properties of Crawfish Chitosan  as  Affected  by  Different Processing  Protocols”.  Thesis.  Food Technology,  Seoul  National  University. Seoul.
Handayani,  H.P.L.,  Paramarta,  S.R.,  & Rokhati,  N.  (2013).  Depolimerisasi kitosan  dengan  hidrolisa  enzimatik menggunakan  enzim  α-amilase. Jurnal Teknologi, Kimia, dan Industri, 2 (4), 45- 52.
Ismail,  A.S.  (2019). Microbial  valorization  of shrimp  byproduct  via  the  production  of thermostable  kitosanase and antioxidant chitooligosaccharides. Journal Biocatalysis and Agriculture Biotechnologyvol, 2 (3), 21-34.
Jeon,  Y.,  &  Kim,  S.  (2000). Production  of chitooligosaccharides using an ultrafiltration  membrane  reactor  and their  antibacterial  activity. Journal Carbohydrate Polymers, 41 (3), 133-141.
Jin, Q., Huahua, Y., Xueqin, W., Kecheng, L.,
&  Pengcheng,  L.  (2017).  Effect  of  the
Jurnal Agroteknologi Vol. 16 No. 01 (2022)
molecular  weight  of  water-soluble chitosan  on  its  fat  cholesterol  binding capacities  and  inhibitory  activities  to pancreatic  lipase. Journal  Biocatalysis and Agriculture, 4 (3), 61-84.
Julianti,  S.,  Agusnar,  H., &  Alfian,  Z.  (2012).
Pembuatan  kitosan  oligomer  melalui metode degradasi oksidatif dan pengaruhnya  terhadap  viskositas  dan berat  molekul. Jurnal  Saintia  Kimia, 1 (1), 12-23.
Khor, E. (2010). Chitin . Singapore: Singapore
Press.
Laili,  I.Z.,  Noor,  H.,  &  Sukardi.  (2019).
Karakteristik  fisik  kimia  kitosan  dari cangkang rajungan ( Portunus pelagicus ) melalui proses deasetilasi dengan
konsentrasi  NaOH  dan  waktu  ekstraksi serta  di  aplikasikan  sebagai  bahan pengawet  alami  pada  fillet  ikan  nila. Prosiding Jurnal Universitas Muhamadiyah Malang , 5 (2), 30-43.
Li,  J.,  Du,  Y.,  Yang,  J.,  Feng,  T.,  Li,  A.,    & Chen,  P.  (2005)  Preparation  and characterisation of low molecular weight chitosan  and  chitooligomers  by  a commercial
enzyme, polymer degradation and stability. Journal Chemistry, 87 (3), 441-448.
Lodhi,  G.,  Kim,  Y.S.J.,  Hwang,  W.,    Moon, S.K.S.H.,  Jeoni,  B.T.,  &  Park,  P.J. (2014).  Chitooligosaccharides  and  its derivates:  Preparation  and  biological applications. Journal  BioMed  Research International, 1 (2),45-51.
Mourya,  V.K.,  Inamdar,  N.N.,  &  Choudhar,
Y.M.  (2011).  Chitooligosaccharides:
Synthesis, characterization and applications. Journal  Polymer  Science , 53 (7), 583–612.
Natalia,  D.A,  Dharmayanti,  N.,  &  Dewi,  F.R. (2021).  Produksi  kitosan  dari  cangkang rajungan ( Portunus sp.) pada suhu ruang.
Jurnal  Pengolahan  Hasil  Perikanan Indonesia , 24 (3), 301-309 .
Nurhaeni,  N.,  Angriani,  S.,  Pasjan,  S.,  & Jusman. (2019). Penentuan suhu dan pH hidrolisis    kitosan  dari  cangkang  keong sawah ( Pila ampullacea ) terhadap berati molekul  hidrolisatnya. Jurnal  Riset Kimia, 5 (1), 90-99.
Pagnoncelli,  M.G.N.,  de-Araujo,  N.K.,  da- Silva,  N.M.P.,  &  Macedo,  G.R.  (2010).
Kitosanase production  by Paembacillusi ehimeusis and its application for chitosan hydrolysis. Journal Brazilian Archives of Biology  and Technology, 53 (6),  1461- 1468.
Purwatiningsih, S., Wukirsari, T., Sjahriza, A.,
&  Wahyono,  D.  (2009). Sumber Biomaterial  Masa  Depan .  Bogor:  IPB Press.
Qin, C., Du, Y.M., & Xiao, L. (2002). Effect of hydrogen  peroxide  treatment  on  the molecular  weight  and  structure  of chitosan. polym degradation and stability. Journal Chemistry and Biology, 7 (6), 211-218.
Rahman,  M.H., Hjeljord,  L.G., Aam,  B.B.,
So rlie,  M.,  &  Tronsmo,  A.  (2015).
Antifungal effect of
chitooligosaccharides with different degrees  of  polymerization. European Journal    of  Plant    Pathology, 141 (1),
147-158.
Ramadhani,  Z.A.  (2020).  Komposisi  kimia
(proksimat)  tepung  cangkang  kepiting bakau ( Scylla Serrata ). Jurnal
Perikanan , 13 (1), 25-31.
Ridho,  F.A.,  Bambang,  R.,  &  Uju.  (2017).
Kitooligosakarida melalui depolimerisasi  kitosan  dengan  hidrogen peroksida  untuk  aplikasi  biopreservatif pindang  tradisional. Jurnal  Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia, 20 (3), 19-24.
Rochima, E., Suhartono, M.T.,  Dahrul, S., & Sugiyono.  (2018).  Karakteristik  kitosan hasil  deasetilasi  enzimatis  oleh  kitin deasetilase  isolat Bacillus  papandayan
K29-14. Buletin Teknologi Hasil Perikanan. Universitas Padjajaran, Bandung. Rokhati, N., Bambang, P., Titik, I.,
Mohammad,  S.,  &  Luthfi,  K.  (2015).
Hidrolisis  enzimatik  kitosan  dengan kombinasi  enzim  endo  glucanase  dan cellobiohydrolase. Jurnal Reaktor,
15 (4), 261-267.
Roncal,  T.,  Oviedo,  A.,  Armentia,  I.L., Fernande,  L.,  &  Villaran,  M.C.  (2017) . High  yield  production  of  monomer  free chitosan  oligosaccharides  by  pepsin catalyzed hydrolysis of a high deacetylation  degree  chitosan. Journal Carbohydrate  Research, 342 (2),  2750- 2756.
Sanchez, A., Mengibar, M., Rivera-Rodrgueze,
Moerchbacher, G., Acosta, N., & Heras, A.  (2017). The  effect  of  preparation processeson the physicochemical
characteristics  and  antibacterial  activity of chitooligosaccharides.
Journal
Carbohydrate  Polymers,  157 (2),  251- 257.
Sarni, S., Natsir, H., & Dali, S. (2016). Chitosan oligomer  production  from  waste  tiger shrimp ( Penaeus monodon ) using enzymes  kitosanase of bacterial isolates Klebsiella sp. Journal  Chemistry,  3 (2),
283-289.
Setha,  B.,  Fitriani,  R.,  Bernita,  B.,  &  Silaban.
(2019).  Karakteristik  kitosan  dari  kulit udang  vaname  dengan  menggunakan suhu  dan  waktu  yang  berbeda  dalam proses  deasetilasi. Jurnal  Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia, 22 (3), 31-40.
Siregar,  E.C.,  Suryati,  &  Hakim,  L.  (2016).
Pengaruh  suhu  dan  waktu  reaksi  pada pembuatan  kitosan  dari  tulang  sotong
( Sepia  officinalis ). Jurnal  Teknologi Kimia Unimal, 5 (2), 37-44.
Wang,  S.,  Huang,  Q.,  &  Wang,  Q.  (2005).
Study  on  the  synergetic  degradation  of chitosan  with  ultraviolet  light  and hydrogen peroxide.
Journal
Carbohydrate  Research,  340 (4),  1143–
1147 .
Wang, Y., Zhou, P., Yu, J., Pan, X., Wang, P.,
Lan, W., & Tao, S. (2007). Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by kitosanase from Pseudomonas CUY8 Asia  Pacific. Journal  of  Clinical Nutrition , 16 (3), 132-139.
Wangtueai,  S.,  Worawattanamateekul,  W.,
Sangjindavong,  M.,  Naranong,  N.,  & Sirisansaneeyakul,
S. (2007).
Production  and  partial  characterization of  kitosanases  from  newly  isolated Bacillus  cereus . Journal  Kasetsart ,
41 (2), 346-355.
Yanti,  R.,  Drastinawati,  &  Yusnimar.  (2018).
Sintesis  kitosan  dari  limbah  cangkang kepiting dengan variasi suhu dan waktu pada  proses  deasetilasi. Jurnal  Teknik, 5 (2), 12-23.
Zilda,  D.S.,  Fawzya,  Y.N.,  &  Chasanah,  E.
(2016). Characteristic  enzym  kitosanase from Matcusuerbacter c. Jurnal Pascapanen dan Perikanan , 1 (1), 43-49.