EFEK EKSTRAK ETANOL DAUN KEMANGI ( Ocimum sanctum L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF PADA SEL

## KANKER LEHER RAHIM HELA MELALUI AKTIVITAS SITOTOKSIK DAN INDUKSI APOPTOSIS
THE EFFECT OF Ocimum sanctum L. LEAVES  ETHANOLIC EXTRACT  AS  A CHEMOPREVENTIVE AGENT IN HELA

## CERVIC CANCER CELLS THROUGH CYTOTOXIC ACTIVITY AND INDUCED APOPTOSIS

## Nur Ismiyati, Farisya Nurhaeni
Prodi D3 Farmasi Poltekkes Bhakti Setya Indonesia Yogyakarta Email: farisyanur@yahoo.co.id

## ABSTRAK
Kanker leher rahim merupakan penyebab kematian wanita akibat kanker terbesar di negara-negara berkembang. Pertumbuhan sel kanker bersifat tak terbatas karena mempunyai  kemampuan  untuk  menghindari  mekanisme  apoptosis  sehingga penemuan  agen-agen  pemacu  apoptosis  kini  terus  dikembangkan.  Kemangi ( Ocimum sanctum L.) dilaporkan memiliki potensi penghambatan perkembangan sel kanker melalui aktivitas sitotoksik, apoptosis, dan penghambatan angiogenesis pada  sel  kanker  paru  dan  payudara.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui efek  ekstrak  etanol  daun  kemangi  terhadap  aktivitas  sitotoksik  dan  proses pemacuan    apoptosis  pada  sel  kanker  leher  rahim  HeLa.  Evaluasi  viabilitas  sel melalui  nilai  IC 50 ditetapkan  dengan  MTT  assay.  Efek  pemacuan  apoptosis  oleh ekstrak  etanol  daun  kemangi  terhadap  sel  kanker  HeLa  diamati  dengan  metode pengecatan DNA menggunakan etidium bromida-akridin oranye. Hasil penelitian ini  menunjukkan  ekstrak  etanol  daun  kemangi  memiliki  potensi  sebagai  agen kemopreventif  pada  kanker  leher  rahim  HeLa  dengan  IC 50 209µg/mL. Berdasarkan  hasil  tersebut  dapat  disimpulkan  penghambatan  pertumbuhan  sel HeLa  oleh  ekstrak  etanol  daun  kemangi  terjadi  dengan  menginduksi  terjadinya apoptosis.
Kata kunci : kanker leher rahim, sel HeLa, daun  kemangi, sitotoksik, apoptosis
Efek Ekstrak Etanol Daun Kemangi

## ABSTRACT
Cervical  cancer  is  the  most  common  women  death-caused  cancer.  Ocimum sanctum  L.  is  one  of  natural  products  that  had  cytotoxic  effect  and  caused  cell death via apoptosis and angiogenesis in lung cancer and breast cancer cells. The aim of the study was to identify the cytotoxic activity and apoptosisi induction of Ocimum  sanctum  leaves  ethanolic  extract  on  HeLa  cancer  cells.  Active  contents of Ocimum sanctum L. leaves was extracted by maceration with 96% ethanol.The cytotoxicity  assay  of  Ocimum  sanctum  leaves  ethanolic  extract  were  carried  out by  using  MTT  assay.  Apoptosis  assay  was  done  using  double  staining  method using  Ethidium  Bromide-Acridine  Orange.  Ocimum  sanctum L .  leaves  ethanolic extract  inhibited  HeLa  cell  growth  with  the  IC 50 of  209µg/mL.  Detection  of apoptosis  showed  that  extract    induced  apoptosis.  These  results  suggested  that Ocimum  sanctum  L.  leaves  ethanolic  extract  has  cytotoxic  activity  by  inducing apoptosis on HeLa cervix cancer cells.
Keywords: cervix  cancer,  HeLa  cancer  cells,  Ocimum  sanctum  L.,  cytotoxic, apoptosis

## PENDAHULUAN
Kanker  leher  rahim  atau  kanker  serviks  merupakan  penyebab  kematian terbesar  ketiga  pada  wanita  di  dunia  dan  pada  negara-negara  berkembang  (Aziz, 2006).  Di  negara  Indonesia,  kanker  ini  menduduki  peringkat  kedua  penyakit kanker  yang  sering  diderita  masyarakat  setelah  kanker  payudara  (Rekam  Medis RS  Kanker  Dharmais,  2012).  Berdasarkan  kondisi  ini,  maka  pengatasan  kanker dengan menghambat dan mematikan pertumbuhan sel kanker secara selektif perlu diupayakan.
Pengobatan    kanker  dapat  dilakukan  dengan  pembedahan,  kemoterapi, maupun  dengan  radiasi.  Pembedahan  tidak  efektif  untuk  kanker  yang  telah metastasis.  Pengobatan  dengan  metode  kemoterapi  dan  radiasi  seringkali  kurang selektif. Penggunaan kemoterapi juga memiliki efek samping toksik pada jaringan normal  dan  menyebabkan  resistensi  pada  sel  kanker  (Davis et  al .,  2003). Berdasarkan alasan tersebut, maka perlu dilakukan penelitian tentang pengobatan kanker  yang  selektif  dan  aman.  Salah  satu  pengembangan  agen  kemopreventif
dari  bahan  alam  yang  dapat  memperlambat  atau  mencegah  perkembangan  sel kanker.
Beberapa  penelitian  menunjukkan  bahwa  kemangi  memiliki  aktivitas sitotoksik dan mampu menghambat pertumbuhan sel kanker. Penelitian (Nangia- Makker, et.al ., 2007) menunjukkan bahwa ekstrak air kemangi dapat menghambat proliferasi  dan  angiogenesis  pada  sel  kanker  payudara  MDA-MB-435 dan MCF10A DCIS.com yang diinjeksikan pada nude mice melalui metode xenograft. Penelitian  lain  mengenai  ekstrak  etanol  dari  kemangi  menunjukkan  aktivitas sitotoksik pada sel kanker paru A549 melalui mekanisme apoptosis (Magesh et al , 2009).  Kim et  al (2010)  juga  menyatakan  bahwa  ekstrak  etanol  daun  kemangi memiliki aktivitas sitotoksik dan anti metastatik pada sel kanker paru Lewis Lung Carcinoma (LLC) melalui aktivasi enzim oksidasi.
Aktivitas  sitotoksik  pada  kemangi  ini  terjadi  pada  mekanisme  apoptosis. Penemuan senyawa baru dengan target pada pemacuan apoptosis merupakan salah satu  strategi  untuk  pengembangan  agen  kemopreventif  dari  tanaman  sebagai alternatif pengobatan kanker.
Penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan potensi sitotoksik ekstrak etanol daun  kemangi  sebagai  agen  kemopreventif  pada  sel  kanker  leher  rahim  HeLa. Selain  itu,  dipelajari  pengaruh  ekstrak  etanol  daun  kemangi  pada  induksi apoptosis sel kanker tersebut.

## METODE PENELITIAN
Alat  ekstraksi  digunakan  seperangkat  alat  gelas,  kain  kasa,  kertas  saring, pengaduk,  corong  porselin, Rotary  Evaporator ,  alat  penyaring,  dan  flakon.  Alat uji  in  vitro  digunakan  adalah Autoclave (Hirayama), Laminar  Air  Flow  Hood (Labconco),  inkubator  CO2  (Heraeus), inverted  microscope (Zeiss  MC  80), hemocytometer ,  penangas  air,  neraca  analitik  (Sartorius),  mikropipet  (Gilson), mikroskop cahaya, centrifuge (Sorvall), ELISA reader (SLT 240 ATC), cover slip , yellow dan blue tip , Tissue culture flask (nunclon), tabung conical (Nunclon), 96- well  plate (Nunc), 24-well  plate (Nunc), shaker (MRK-  RETAC), vortex,
eppendorf steril  (plasti brand), kamera digital (Canon, Japan).
Efek Ekstrak Etanol Daun Kemangi Nur Ismiyati dan Farisya Nurhaeni 38
Bahan  utama  yaitu  daun  kemangi  yang  diperoleh  dari  daerah  Piyungan, Bantul, larutan penyari adalah etanol 96 % (Merck). Bahan uji sitotoksik dengan MTT  adalah    sel  kanker  leher  rahim  HeLa  (Koleksi Cancer  Chemoprevention Research  Center, Fakultas  Farmasi  UGM),  media  penumbuh  sel  (media  kultur), DMEM  (Dulbecco’s  Modified  Eagle  Medium),  Fungison  0,5%  (Gibco), Fetal Bovine  Serum (FBS)  10%  (Gibco),  dan  penisilin-streptomisin  1%  (Gibco).  Sel dipanen  dari tissue  culture  disk dengan  tripsin-EDTA  0,025%.  Pelarut  sampel: DMSO  (dimetil  sulfoxida),  larutan  stopper:  SDS  ( sodium  dodesil  sulfat )  10% dalam HCl 0,1N, larutan pencuci: PBS ( phospat buffer saline ).

## Jalannya Penelitian
Ekstraksi Bahan
Simplisia  dihaluskan,  selanjutnya  diremaserasi  menggunakan  etanol  96  % sebanyak tiga kali kemudian filtratnya diuapkan menggunakan rotaevaporator. Pembuatan  larutan  uji  dengan  konsentrasi  ekstrak  yang  digunakan  adalah  5 µg/mL,  25  µg/mL,  50  µg/mL,  100  µg/mL,  250  µg/mL,  500  µg/mL,  dan  750 µg/mL dengan menggunakan pelarut DMSO.

## Uji Sitotoksik
Uji sitotoksik dilakukan dengan menggunakan MTT Assay . Sel HeLa yang telah konfluen dipanen dan didistribusikan ke dalam sumuran pada 96-well plate dengan  jumlah  10  x  10 3 sel/sumuran.  Sel  diinkubasi  selama  24  jam  di  dalam inkubator  CO 2 untuk  adaptasi  sehingga  siap  untuk  perlakuan.  Setelah  24  jam ditambahkan 100 µL media kultur yang mengandung sampel dalam berbagai seri konsentrasi sebanyak 3 replikasi dan diinkubasi kembali selama 24 jam. Sebagai kontrol digunakan kontrol pelarut (DMSO), kontrol sel HeLa, dan kontrol media kultur DMEM. Pada kontrol pelarut, sel diberi DMSO sesuai dengan kadar  yang sama dengan yang terdapat dalam sampel.  Pada akhir inkubasi, media kultur yang ada dalam plate dibuang dengan cara membalikkan plate, kemudian dicuci dengan 100 µL PBS untuk tiap sumuran. Selanjutnya masing- masing  sumuran ditambah 100  µL  reagen  MTT  (stok  5  mg/mL).  Inkubasi  dilanjutkan  selama  3  jam  pada
suhu  37°C  sampai  terbentuk  formazan.  Sel  yang  hidup  akan  mengkonversikan MTT menjadi formazan yang berwarna biru tua/ ungu. Selanjutnya, ditambahkan pereaksi stopper untuk melarutkan kristal formazan dan sel diinkubasi semalam pada suhu kamar dan terlindung dari cahaya. Pada akhir inkubasi, plate digoyang secara  horisontal  dengan shaker selama  10  menit  kemudian  dibaca  dengan ELISA reader pada  panjang  gelombang  595  nm.  Hasil  absorbansi  yang  terbaca dikonversikan dalam persentase viabilitas sel.
Uji Apoptosis
Kultur  sel  HeLa  yang  telah  konfluen  dipanen  dan  didistribusikan  dengan konsentrasi 5 x 10 4 sel/sumuran dalam 1000 μL ke dalam 24 well plate yang telah diberi cover  slip .  Setelah  itu  sel  diinkubasi  selama  24  jam  dalam  inkubator  CO 2 agar  sel  teradaptasi  dan  normal  kembali.  Selanjutnya  sel  diberi  perlakuan IC 50 ekstrak, kontrol sel, dan kontrol pelarut DMSO lalu diinkubasi kembali selama 15 jam. Pada akhir inkubasi media kultur DMEM dicuci dengan PBS dan cover slip diangkat  dari  sumuran  serta  diletakkan  di  atas  obyek  gelas  lalu  ditetesi  dengan pereaksi etidium bromida-akridin oranye (EtBr-AO) sebanyak 10 μL. Pengamatan morfologi sel dilakukan dengan mikroskop fluoresensi.
Analisis Data
Ekstraksi
Ekstrak  etanol  daun  kemangi  yang  diperoleh  dibandingkan  dengan  berat serbuk  simplisia  kering,  sehingga  data  yang  didapat  adalah  berupa  rendemen (persamaan 1).
( ) (    ) (    ) .......................(1)
Uji Sitotoksik
Data  absorbansi  yang  diperoleh  dikonversi  menjadi  persen  kehidupan  sel dengan membandingkan jumlah sel hidup antara perlakuan dan kontrol.
Efek Ekstrak Etanol Daun Kemangi
Persen kehidupan sel dihitung dengan menggunakan persamaan (2):
.............................(2)
IC 50 dihitung  dari  hubungan  linearitas  antara  logaritma  konsentrasi  larutan uji  versus  persen  kehidupan  sel. IC 50 merupakan  kadar  yang  dapat  menghambat proliferasi sel sebesar 50% populasi sel (Doyle and Griffiths, 2000).

## Pengamatan Apoptosis
Pengamatan  apoptosis  dilakukan  secara  kualitatif  dengan  mengamati morfologi  sel  HeLa  di  bawah  mikroskop  fluoresensi.  Sel  hidup  akan  tampak normal,  utuh  seperti  aslinya,  dan  berfluoresensi  hijau,  sedangkan  sel  yang apoptosis  awal  akan  tampak  kondensasi,  berfluoresensi  hijau,  sel  dengan apoptosis  akhir  akan  tampak  kondensasi,  terpecah-pecah,  berfluoresensi  merah, dan  sel  yang  nekrosis  akan  tampak  normal,  berfluoresensi  oranye  sampai  merah (Ribble et al ., 2005).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembuatan ekstrak etanol daun kemangi didapatkan hasil rendemen  sebesar 9,36  %.  Uji  sitotoksisitas  dilakukan  bertujuan  untuk  konfirmasi  kemampuan sitotoksik  larutan uji terhadap sel  HeLa. Uji  sitotoksik  dilakukan dengan metode kolorimetrik  menggunakan  reagen  MTT  ( 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium  bromid  .  Uji  sitotoksik  memberikan  gambaran  potensi  senyawa  uji dalam  menghambat  pertumbuhan  sel  uji.  Parameter  yang  digunakan  adalah inhibition  concentration 50%  ( IC 50 ).  Konsentrasi  ekstrak  etanol  daun  kemangi yang digunakan dalam perlakuan terhadap sel  HeLa  adalah 5 µg/mL, 25 µg/mL, 50  µg/mL,  100  µg/mL,  250  µg/mL,  500  µg/mL,  dan  750  µg/mL.  Hasil  yang diperoleh  menunjukan  viabilitas  sel  HeLa  semakin  menurun  seiring  berdasarkan meningkatnya konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi (Gambar 1). Berdasarkan
perhitungan  dengan  menggunakan  analisis  probit  diperoleh  hasil  bahwa  pada  sel HeLa, ekstrak etanol daun kemangi memiliki nilai IC 50 sebesar 209 µg/mL.
Gambar 1. Sitotoksisitas ekstrak etanol daun kemangi terhadap sel HeLa
Gambaran  morfologi  sel  HeLa  akibat  perlakuan  ekstrak  etanol  daun kemangi  memberikan  perubahan  jika  dibandingkan  dengan  sel  tanpa  perlakuan (sel  kontrol).  Sel  HeLa  normal  berbentuk  lonjong  dan  melekat  pada  dasar sumuran. Perlakuan senyawa uji memberikan perubahan  gambaran morfologi sel HeLa  berupa  sel  yang  bentuknya  bulat  dan  mengapung  (Gambar  2).  Perubahan gambaran morfologi tersebut menunjukkan bahwa sel HeLa mengalami kematian. Perubahan gambaran morfologi pada sel HeLa tersebut mendukung data hasil uji sitotoksik  yang  telah  dilakukan  yaitu  jumlah  sel  yang  hidup  semakin  berkurang seiring dengan bertambahnya konsentrasi estrak etanol kemangi.
Efek Ekstrak Etanol Daun Kemangi Nur Ismiyati dan Farisya Nurhaeni 42
Gambar 2. Morfologi sel HeLa pada perlakuan ekstrak etanol daun kemangi.  Kelompok kontrol sel  (A),  konsentrasi  5  µg/mL  (B),  konsentrasi  50  µg/mL  (C),  konsentrasi  100  µg/mL (D),  dan  konsentrasi  500  µg/mL  (E).  Perlakuan  senyawa  uji  mampu  menurunkan viabilitas  sel  berbanding  lurus  dengan  kenaikan  konsentrasi  ekstrak  etanol  daun kemangi.
Tanda (       ) menunjukkan morfologi sel normal, tanda (         ) menunjukkan morfologi sel yang mengalami kematian.
Aktivitas  senyawa  uji  ekstrak  etanol  daun  kemangi  untuk  menghambat pertumbuhan  sel  HeLa  atau  kemampuannya  untuk  menyebabkan  kematian  sel, kemungkinan  jalur  dan  mekanismenya  bisa  berbeda.  Oleh  karena  itu,  proses selanjutnya  dilakukan  analisis  pengamatan  apoptosis  untuk  mengetahui mekanisme  penghambatan  pertumbuhan  tersebut.  Kedua  uji  tersebut  dilakukan dengan konsentrasi larutan uji berada di sekitar harga IC 50 yang diperoleh.
Pertama  dilakukan  uji  apoptosis.  Pengamatan  gambaran  morfologi  sel dilakukan  untuk  mengetahui  terjadinya  kematian  sel  berupa  apoptosis  atau nekrosis  pada  sel  HeLa  akibat  perlakuan  suatu  senyawa.  Pengamatan  apoptosis yang  terjadi  dilakukan  dengan  pengecatan  DNA  menggunakan  metode double staining ,  yaitu  pengecatan  dengan  menggunakan  akridin  oranye  dan  etidium bromida.  Deteksi  kematian  sel  dilakukan  dengan  menggunakan  mikroskop fluoresen.
B C A E D A B C D E
3 4
(a) (b)
(c)
Gambar 3. Morfologi sel HeLa setelah pengecatan dengan menggunakan double staining akridin  oranye-etidium  bromida.  Pengamatan  di  bawah  mikroskop fluoresens,  sel  hidup  akan  tampak  berbentuk  daun  atau  bulatan  dengan warna  hijau  yang  seragam  (1).  Sel  yang  mengalami early  apoptosis sel berwarna  hijau  dengan  inti  atau  bagian  tengah  berwarna  oranye  (2).  Sel apoptosis  memiliki  bentuk  yang  tidak  teratur  dengan  warna  oranye  yang tidak  seragam  (3).  Sedangkan  sel  nekrosis  berwarna  oranye  yang  seragam
(4).Pengamatan  dilakukan  terhadap  (a)  kontrol  sel  yang  berwarna  hijau terang,  (b)  sel  dengan  perlakuan  konsentrasi  150  μg/mL  mulai  tampak  sel mengalami early apoptosis , (c) sel dengan perlakuan konsentrasi 250 μg/mL menunjukkan  sel  mengalami  apoptosis  dan  nekrosis.  Pengama tan  dilakukan dengan perbesaran 40x.
Hasil pengamatan gambaran morfologi DNA dengan mikroskop fluoresen menunjukkan  pada  kontrol  sel  keseluruhan  terdapat  sel  berwarna  hijau  terang yang menunjukkan sel  yang masih hidup. Pada sel yang masih hidup, sel terlihat warna  terang  karena  adanya  cairan  sitoplasma  yang  bersifat  meneruskan  cahaya dari  mikroskop  fluoresen  (McGahon et  al .,  1995).  Sedangkan  pada  perlakuan senyawa  uji  150  µg/mL,  terlihat  sel  berwarna  hijau  dan  sebagian  sel  berwarna hijau  dengan  inti  atau  bagian  tengah  berwarna  oranye  (Gambar  3).  Keadaan tersebut  merupakan  tanda-tanda  terjadinya early  apoptosis (McGahon et  al ., 1995) . Sel  yang mengalami early apoptosis pada pengecatan double staining ini kurang jelas teramati.
Perlakuan  senyawa  uji  250  µg/mL,  telihat  beberapa  sel  berwarna  hijau namun sebagian besar sel berwarna oranye. Sel yang berwarna oranye terdiri dari sel  yang  mengalami  apoptosis  dan  nekrosis.  Sel  yang  mengalami  apoptosis berwarna oranye dengan badan-badan apoptosis yang tidak beraturan sebagai ciri khas  sel  yang  mengalami  kematian  dengan  apoptosis  ( late  apoptotic  cells) . Sedangkan pada sel yang berwarna oranye pada seluruh bagian sel dan sel tampak
Efek Ekstrak Etanol Daun Kemangi Nur Ismiyati dan Farisya Nurhaeni 44
utuh  menunjukkan  terjadinya  nekrosis.  Pengamatan  gambaran  morfologi  DNA yang  dilakukan,  dapat  diketahui  bahwa  ekstrak  etanol  daun  kemangi  dapat memacu terjadinya kematian secara apoptosis pada sel HeLa.
Uji sitotoksik ekstrak etanol daun kemangi dilakukan dengan menggunakan metode  kolorimetrik  yang  berdasarkan  pada  kemampuan  enzim  dehidrogenase mitokondria  untuk  mengkonversi  MTT  (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium  bromid  ,  suatu  substrat  berwarna  kuning  yang  tidak  larut  dalam  air, menjadi  formazan  yang  berwarna  biru  gelap  yang  juga  tidak  larut  dalam  air  dan melekat  pada  sel  (Doyle and Griffiths,  2000).  Formazan  yang  terbentuk proporsional  dengan  jumlah  sel  hidup  (Mosmann,  1983).  Metode  ini  cepat, sensitif,  akurat  serta  dapat  digunakan  untuk  menguji  sampel  dalam  jumlah  besar secara  otomatis  menggunakan  spektrofotometer  (Doyle and Griffiths,  2000). Metode  ini  juga  terbukti  lebih  terpercaya  dibandingkan  dengan  perhitungan  sel menggunakan hemositometer.
Reaksi  reduksi  MTT  menjadi  formazan  hanya  dapat  dilakukan  oleh  sel hidup. Oleh karena itu, absorbansi dari formazan yang terbentuk berbanding lurus terhadap  viabilitas  populasi  sel  (Mossman,  1983).  Kemampuan  enzimatik  ini diperkirakan  berbeda  pada  tiap  sel  yang  masih  hidup.  Kemungkinan  terdapat  sel yang masih normal, tapi juga terdapat sel yang terkena efek toksik dan belum mati karena  kemampuan  enzimatisnya  akan  menurun.  Pertimbangan  itulah  yang kemudian  mendasari  pengkonversian  data  absorbansi  menjadi  persen  kehidupan sel, bukan sebagai persen kematian sel.
Uji  sitotoksik  memberikan  gambaran  potensi  senyawa  uji  dalam menghambat pertumbuhan sel uji dengan parameter inhibition concentration 50% ( IC 50 ).  Hasil  uji  memperlihatkan  bahwa  ekstrak  etanol  daun  kemangi  memiliki aktivitas  sitotoksik  terhadap  sel  HeLa  yang  tergantung  dosis  ( dose  dependent ). Semakin  meningkat  konsentrasi  ekstrak  etanol  daun  kemangi  yang  diberikan, semakin  rendah  persen  viabilitas  sel  (Gambar  1).  Nilai IC 50 ekstrak  etanol  daun kemangi terhadap sel HeLa setelah dianalisis dengan probit diperoleh sebesar 209 µg/mL.
Aktivitas sitotoksik ekstrak etanol daun kemangi  terhadap pertumbuhan sel HeLa  yang  bersifat dose  dependent juga  dapat  teramati  pada  hasil  gambaran morfologi  sel  yang  diperoleh.  Gambaran  morfologi  sel  HeLa  akibat  perlakuan ekstrak etanol daun kemangi memberikan perubahan terhadap sel tanpa perlakuan (sel  kontrol).  Konsentrasi  ekstrak  etanol  kemangi  yang  semakin  besar menunjukkan  gambaran  morfologi  sel  HeLa  yang  mengalami  kematian  juga semakin  besar  (Gambar  2).  Penyebab  kematian  sel  HeLa  tersebut  kemungkinan melalui mekanisme apoptosis, sehingga perlu dilakukan pengamatan.
Pengamatan  apoptosis  dilakukan  secara  kualitatif  dengan  mengamati gambaran  morfologi  sel  HeLa  di  bawah  mikroskop  fluoresensi.  Hasil  yang diperoleh  menunjukkan  pada  konsentrasi  di  bawah  nilai IC 50 yaitu  150  µg/mL menunjukkan  masih  banyak  sel  yang  hidup,  namun    beberapa  sel  sudah mengalami early  apoptosis ditandai  dengan  sel  yang  berwarna  hijau  dengan  inti atau  bagian  tengah  berwarna  oranye.  Hasil  tersebut  sesuai  dengan  uji  sitotoksik dimana  sekitar  konsentrasi  150  µg/mL,  ditemukan  banyak  sel  yang  belum mengalami  kematian.  Sedangkan  pada  konsentrasi  di  atas  nilai IC 50 yaitu  250 µg/mL  menunjukkan  banyak  sel  yang  mulai  mengalami late  apoptotic dan nekrosis  (Gambar  3).  Pengamatan  gambaran  morfologi  DNA  yang  dilakukan dapat diketahui bahwa ekstrak etanol daun kemangi memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel HeLa dengan melalui induksi jalur apoptosis.
Sel  HeLa  diketahui  mengekspresikan  2  onkogen,  yaitu  E6  dan  E7.  E6 berikatan dengan p53 yang terfosforilasi  sedangkan E7 berikatan dengan protein pRb.  Protein  p53  adalah  suatu  faktor  transkripsi  yang  mengaktivasi  transkripsi bermacam-macam  gen  misalnya  p21 . Protein  p53  bertanggung  jawab  dalam menghentikan siklus sel sel ketika  terjadi kerusakan DNA. Jika kerusakan DNA tersebut  tidak  dapat  diperbaiki,  p53  akan  menginduksi  apoptosis  dengan mengaktivasi  protein-protein  pro  apoptosis.  Pengamatan  pada  sel  HeLa,  p53 menjadi  inaktif  karena  terikat  pada  protein  E6.  Ikatan  E7  dengan  pRb  akan menyebabkan  pRb  terfosforilasi  dan  mengakibatkan  lepasnya  E2F  yang menginduksi  gen-gen  esensial  untuk  proses  sintesis  dan  mitosis,  akibatnya  sel mamasuki proses cell cycle (DeFillippis et al ., 2003).
Efek Ekstrak Etanol Daun Kemangi Nur Ismiyati dan Farisya Nurhaeni 46
Daun kemangi mengandung flavonoid, terpen, dan minyak atsiri. Salah satu flavonoid polimetoksi yaitu tangeretin mampu  menginduksi ekspresi protein p53 (Pan et al , 2002). Peningkatan ekspresi p53 ini akan meningkatkan level p21 dan p27    yang  merupakan  suatu  inhibitor  Cdk,  khususnya  Cdk2  dan  Cdk4. Terhambatnya  aktivitas  Cdk2  dan  Cdk4  menyebabkan  G 1 arrest pada  daur  sel (Pan et al. , 2002). Aktivitas sitotoksik ekstrak etanol kemangi terhadap sel HeLa kemungkinan  melalui  mekanisme  ini.  Jadi,  kemungkinan  kandungan  flavonoid ekstrak  etanol  daun  kemangi  dapat    melepas  ikatan  antara  E6  dan  p53  sehingga p53  aktif    sehingga  terjadi  penghambatan  siklus  sel  yang  dilanjutkan  dengan apoptosis.
Enzim  topoisomerase  adalah  enzim  yang  dapat  mengkatalisis  pemutaran dan  relaksasi  dari  rantai  DNA,  dengan  memotong  sementara  rantai  DNA superhelik.  Topoisomerase  I  memotong  satu  rantai  sedangkan  topoisomerase  II memotong  kedua  rantai.  Inhibitor  topoisomerase  menstabilkan  kompleks topoisomerase-DNA  terpotong,  sehingga  menghasilkan  kerusakan  DNA double stranded yang  permanen  (Beck et  al. ,  2001).  Hal  ini  akan  menyebabkan kerusakan DNA, sehingga menginduksi ekspresi p53 dan meng-upregulasi protein p53 -dependent (seperti Bax, p21, Gadd45) yang merupakan tahap awal terjadinya apoptosis.  Ptaquiloside adalah suatu terpenoid yang diketahui dapat menghambat enzim  topoisomerase  I  (Nishizawa et  al., 2001).  Kemungkinan  senyawa  tersebut bertanggung jawab atas aktivitas apoptosis  melalui penghambatan aktivitas enzim topoisomerase.
Kemungkinan mekanisme apoptosis tersebut masih perlu dibuktikan melalui penelitian-penelitian  selanjutnya.  Senyawa  yang  secara  pasti  bertanggung  jawab atas mekanisme tersebut juga masih perlu diteliti lebih lanjut untuk mendapatkan dasar ilmiah yang jelas dalam pengembangan senyawa aktif dalam daun kemangi sebagai agen kemopreventif.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan,  dapat  disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun kemangi memiliki potensi sebagai agen kemopreventif melalui aktivitas sitotoksik dan induksi apoptosis terhadap sel kanker leher rahim HeLa.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih diucapkan kepada DIPA Ditlitabmas Dirjen Dikti yang telah membiayai  penelitian  ini,  Poltekkes  Bhakti  Setya  Indonesia  dan Cancer Chemoprevention  Research  Center Fakultas  Farmasi    UGM,  Yogyakarta  yang telah membantu bahan dan sarana penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Aziz,  MF.,  Andrijono,  Saifuddin  AB,  editors.,  2006.  Buku  Acuan  Nasional Onkologi  Ginekologi.  Edisi  kedua.  Jakarta:  Yayasan  Bina  Pustaka Sarwono Prawirohardjo
Beck,  W.T.,  Mo,  Y.Y.,  Bhat,  U.G.,  2001,  Cytotoxic  Signaling  by  Inhibitor  of DNA Topoisomerase II, Biochemical Society Transactions, 29 (6)
Davis,  J.M.,  Navolonic,  P.M.,  Weinstein,  C.R.,  Steelman,  L.S.,  Hu,  Konovlepa, M.,  Blagosklonny  M.V    and  McCubrey,  J.A.,  2003,  Raf-1  and  Bcl-2 Induce  Distinct  dan  Commn  Pathway  That  Contribute  to  Cancer  Drug Resistance, Clinical Cancer Research , 9, 1161-1170.
DeFillippis,  R.A.,  Goodwin,  E.C.,  Wu,  L.,  and  DiMaio,  D.,  2003,  Endogenous Human  Papillomavirus  E6  and  E7  Proteins  Differentially  Regulate Proliferation,  Senescence,  and  Apoptosis  in  Hela  Cervical  Carcinoma Cells, Journal of Virology, . 77 (2) : 1551-1563.
Doyle,  A.,    and  Griffiths,  J.B.,  2000, Cell  and  Tissue  Culture  for  Medical Research , John Willey and Sons Ltd, New York.
Kim,  S.C.,  Magesh,  V.,  Jeong,  S.J.,  Ahn,  K.S.,  Lee,  H.J.,  Lee,  E.O.,  Kim,  S.H., Lee, M.H., Kim, J.H., 2010, Ethanol Extract  of Ocimum sanctum Exerts
Anti-metastatic Activity Through Inactivation of Matrix Metalloproteinase-9  and  Enhancement  of  Anti-oxidant  Enzymes, Food Chem Toxicol 48(6):1478-1482.
Efek Ekstrak Etanol Daun Kemangi Nur Ismiyati dan Farisya Nurhaeni 48
Magesh,  V.,  Lee,  J.C.,  Ahn,  K.S.,  Lee,  H.J.,  Lee,  H.J.,  Lee,  E.O.,  Shim,  B.S.,
Jung, H.J., Kim, J.S., Kim, D.K., Choi, S.H., Ahn, K.S., Kim, S.H., 2009, Ocimum  sanctum Induces  Apoptosis  in  A549  Lung  Cancer  Cells  and Suppresses the In Vivo Growth of Lewis Lung Carcinoma Cells, Phytother Res 23(10): 1385-1391.
McGahon, A.J., Martin, S.J., Bissonnette, R.P., Mahboubi, M., Shi, Y., Mogil, R. J., Nishioka, W. K., and Green,  D. R., 1995, The End of the (Cell)  Line: Methods for the Study of Apoptosis in Vitro, in: Schwartz, L. M., Osborn, B. A., Cell Death , Academic Press, San Diego.
Mosmann,  T.R.  1983.  Rapid  colorimetric  for  cellular  growth  and  survival: application  to  proliferation  and  cytotoxic  assays. J.  Immunol.  Methods 65:55-58.
Nangia-Makker,  P.,  et.al.,  2007,  Inhibition  of  breast  tumor  growth  and angiogenesis by a medicinal herb: Ocimum sanctum, Int J Cancer . August 15; 121( 4 ): 884–894. doi:10.1002/ijc.22733.
Nishizawa,  M.,  Yasui,  Y.,  Ito,  M.,  Hirono,  I.,  and  Andoh,  T.,  2001,  New Topoisomerase I Inhibitors, TAN-1518A and Ptaquiloside: Their Mode of Action, Laboratory of Biochemistry .
Pan, M.H., Chen, W.J., Lin-Shiau, S., Ho, C.H., and  Lin,  J.K., 2002, Tangeretin Induces  Cell-Cycle  Through  Inhibiting  Cyclin-Dependent  Kinase  2  &  4 Activities  As  Well  As  Elevating  Cdk  Inhibitor  p21  in  Human  Colorectal Carcinoma  Cells, Carcinogenesis, Oxford  University  Press,  23 : 1677- 1684.
Rekam  Medis  RS  Kanker  Dharmais,  2012, Statistik  Kanker  :  10  Besar  Kanker Tersering  RSKD  Rawat  Jalan  tahun  2007 ,  diambil  dari  http://www. dharmais.co.id/index.php/cancer-statistic.htmL,  diakses  pada  bulan  Maret 2012.
Ribble, D., Goldstein, N.B., Norris, D.A., and Shellman, Y.G., 2005, A Simple Technique for Quantifying Apoptosis in 96-Well Plates, BMC Biotechnology , 5:12.