Mariyani,  M.  (2021).  Validasi  Metode  Real-Time  Polymerase  Chain  Reaction  untuk  Deteksi  DNA Babi  ( Sus  Scrofa  Domestica )  dan  Celeng  ( Sus  Barbatus )  pada  Sosis  Sapi. Syntax  Literate:  Jurnal Ilmiah Indonesia, 6 (8). http://dx.doi.org/10.36418/Syntax-literate.v6i8.3806
E-ISSN: 2548-1398 Published by: Ridwan Institute
Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia p–ISSN: 2541-0849 e-ISSN: 2548-1398 Vol. 6, No. 8, Agustus 2021
VALIDASI  METODE  REAL-TIME  POLYMERASE  CHAIN  REACTION UNTUK  DETEKSI  DNA  BABI  (SUS  SCROFA  DOMESTICA)  DAN  CELENG (SUS BARBATUS) PADA SOSIS SAPI

## Mariyani, Sismindari, Rumiyati
Universitas Gadjah Mada (UGM) Yogyakarta, Indonesia Email: mariyani@mail.ugm.ac.id, sismindari@gmail.com, rumiyaris@ugm.ac.id

## Abstrak
Babi  ( Sus  scrofa  domestica )  dan  celeng  ( Sus  barbatus )  hewan  satu  spesies  yang memiliki  kemiripan  sangat  tinggi,  perbedaan  keduanya  dilihat  dari  susunan  basa DNA  yang  dimiliki.  Metode  analisis  DNA  antara  babi  dan  celeng  banyak  yang belum  berhasil  membedakan  kedua  spesies  tersebut  seperti  pada  penelitian  yang dilakukan  Hikmah  (2019)  untuk  membedakan  babi  dan  celeng  menggunakan primer  Nk-ND1  dengan  metode real  time PCR  namun  berhasil  mendapatkan perbedaan  basa  antara  fragmen  DNA  babi  dan  celeng  dari  hasil  sekuensing sehingga  perbedaan  urutan  basa  tersebut  dijadikan  sebagai  primer  spesifik  babi untuk membedakan kedua spesies babi dan celeng dengan metode real time PCR. Lima  spesies  hewan  yang  digunakan  yaitu  babi,  celeng,  sapi,  kambing  dan  ayam, primer babi forward 5’-GATGCCCTAAAACTATTCACC-3’ dari hasil sekuensing dan  primer  babi  reverse  yaitu  5’-TAGTGCTAGGGATAAGGCTAGG-3’  desain, SsoFast™  EvaGreen®  Supermix  (Bio-Rad),  proteinase-K  (Invitrogen),  isolasi DNA  menggunakan Geneaid  Genomic  DNA  Mini  Kit . Validasi  metode real  time PCR dengan uji spesifitas primer terhadap 5 isolat DNA jaringan segar, uji efisiensi dan  sensitivitas  pada  6  konsentrasi  DNA  (50;  5;  0,5;  0,05;  0,005  dan  0,0005  ng) dan  sosis  referensi  campuran  daging  sapi:babi  (100%;  50%;  25%;  10%;  5%  dan 1%),  uji  keterulangan  dilakukan  sebanyak  5  kali  replikasi.  Hasil  analisis menunjukkan  sepasang  primer  spesifik  terhadap  DNA  babi  dan  celeng.  Efisiensi DNA  babi  yaitu  109,5%  dan  R 2 =  0,967,  efisiensi  celeng  99,1%  dan  R 2 =  0,999. Batas deteksi absolut DNA babi dan celeng yaitu 0,05 ng/µL dan 0,5 ng/µL, batas deteksi  relatif  sosis  babi  yaitu  5%  dan  sosis  celeng  1%.  Nilai  RSD  rata-rata  pada analisis keterulangan DNA babi dan celeng yaitu 4,210% dan 3,611%. Pada sampel tidak  terdteeksi  adanya  DNA  babi  dan  celeng,  secara  kuantitatif  metode  ini  tidak memenuhi persyaratan validasi.
Kata Kunci: real-time PCR; babi ( Sus scrofa domestica ); DNA celeng (Sus barbatus); validasi

## Abstract
Pigs  (Sus  scrofa  domestica)  and  boars  (Sus  barbatus)  are  animals  of  one  species that  have  a  very  high  similarity,  the  difference  between  the  two  is  seen  from  the base  arrangement  of  DNA.  Dna  analysis  method  between  pigs  and  boars  many have not managed to distinguish the two species as in the study conducted Hikmah (2019)  to  distinguish  pigs  and  boars  using  primer  Nk-ND1  with  real  time  PCR
method  but  managed  to  get  the  difference  between  the  dna  fragments  of  pigs  and boars from the results of sequencing so that the difference in the order of the base is  used  as  a  specific  primer  pig  to  distinguish  the  two  species  of  pigs  and  boars with  real  time  pcr  method.  The  five  animal  species  used  are  pigs,  boars,  cows, goats and chickens, forward pig primer 5'-GATGCCCTAAAACTATTCACC-3' from sequencing results and reverse pig primer i.e. 5'- TAGTGCTAGGGATAAGGCTAGG-3' Hikmah  design (2019), SsoFast™
EvaGreen®  Supermix  (Bio-Rad),  proteinase-K  (Invitrogen),  DNA  isolation  using Geneaid Genomic DNA Mini Kit. Validation of real time PCR method with primary specificity test against 5 isolates of fresh tissue DNA, efficiency and sensitivity tests on  6  DNA  concentrations  (50;  5;  0.5;  0.05;  0.005  and  0.0005  ng)  and  reference sausages of beef:pork mixture (100%; 50%; 25%; 10%; 5% and 1%), recurrence tests  were  conducted  5  times  replication.  The  results  of  the  analysis  showed  a specific  pair  of  primers  on  the  DNA  of  pigs  and  boars.  Pig  DNA  efficiency  is 109.5%  and  R2  =  0.967,  boar  efficiency  is  99.1%  and  R2  =  0.999.  The  absolute detection  limit  of  pig  and  boar  DNA  is  0.05  ng/μL  and  0.5  ng/μL,  the  relative detection  limit  of  pig  sausage  is  5%  and  boar  sausage  is  1%.  The  average  RSD value  in  the  analysis  of  the  recurrence  of  pig  and  boar  DNA  was  4.210%  and 3.611%.  In  the  sample  there  is  no  detectable  presence  of  dna  of  pigs  and  boars, quantitatively this method does not meet the validation requirements.
Keywords: real-time  PCR;  pig  (Sus  scrofa  domestica);  DNA  of  boars  (Sus  barbatus); Validation

## Pendahuluan
Mayoritas  penduduk  Indonesia  merupakan  umat  muslim  sehngga  pangan  yang beredar  harus  terjamin  kehlalannya  Umat  Islam  mengikuti  hukum  yang  ada  dalam Alquran. melarang umat muslim makan atau menggunakan produk apa pun yang berasal dari babi (Nakyinsige, Man, & Sazili, 2012) . Populasi manusia yang semakin meningkat dan  aktivitas  yang  semakin  padat  sehingga  dalam  hal  konsumsi  pangan  cenderung memilih  makanan  yang  siap  dimasak  maupun  siap  dimakan (Palandeng,  Mandey,  & Lumoindong, 2016) salah satunya produk olahan daging.
Maraknya  pemalsuan  daging  sapi  sering  ditemukan  seperti  yang  ditemukan  oleh Balai Besar Veteriner Wates Yogyakarta sebanyak 17,71% sampel mengandung daging babi (Gusti,  2014) .  Cemaran  daging  babi  dan  celeng  juga  ditemukan  pada  produk olahan daging (Priyanka, 2017) , (Septiani, 2019) , (Aina, Erwanto, Motalib Hossain, Ali, &  Rohman,  2019) .  Beberapa  metode  yang  dapat  digunakan  untuk  mendeteksi  adanya campuran  daging  babi  pada  produk  olahan  makanan  yaitu  metode  spektroskopi  FTIR (Guntarti,  Rohman,  Martono,  &  Yuswanto,  2017) ; (Rohman,  Erwanto,  &  Man,  2011) dan analisis berbasis protein yaitu ELISA (Cahyaningsari, Latif, & Sudarnika, 2019) . Celeng ( Sus barbatus ) merupakan nenek moyang dari babi ( Sus scrofa domestica ) sehingga  memiliki  kemiripan,  karena  hal  tersebut  daging  babi  ( Sus  scrofa  domestica ) maupun daging celeng ( Sus barbatus ) sering menjadi sasaran pemalsuan produk olahan makanan  yang  berbahan  dasar  daging,  sehingga  perlu  adanya  metode  yang  sensitive yang  mampu  medeteksi  adanya  campuran  daging  yang  tidak  diharapkan  pada  olahan
Validasi Metode Real-Time Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi DNA Babi ( Sus Scrofa Domestica ) dan Celeng ( Sus Barbatus ) pada Sosis Sapi
makanan  dan  mampu  membedakan  antara  kedua  spesies  tersebut.  Metode  analisis berbasis DNA dapat diandalkan untuk menentukan kehalalan produk karena sangat baik dalam  mengidentifikasi  cemaran  daging  yang  tidak  diinginkan.  DNA  bersifat  relatif stabil pada suhu tinggi (Aida, Man, Wong, Raha, & Son, 2005) . Metode berbasis DNA Identifikasi  cemaran  daging  babi  dengan  menggunakan real-time PCR  juga  telah dilakukan  sebelumnya (Hikmah,  2019) ; (Maryam,  Sismindari,  Raharjo,  Sudjadi,  &
Rohman, 2016) ; (Raharjo & Rohman, 2016) .
Beberapa penelitian mengenai  deteksi DNA babi dan DNA celeng telah  berhasil dilakukan  dan  mampu  membedakan  antara  kedua  spesies  babi  dan  celeng  diantaranya penggunaan  primer  CYTBWB2-wb  spesifik  terhadap  babi  hutan (Aina  et  al.,  2019) , primer spesifik spesies pada DNA babi hutan Sumatra (Mutalib et al., 2012) , perbedaan genetik antara babi dan babi hutan yang berhasil dikonfirmasi menggukan analisis PCR- RFLP (Mutalib et al., 2012) .
Selain  itu  banyak  metode  yang  belum  mampu  membedakan  antara  DNA  celeng dan DNA babi menggunakan primer spesifik babi dengan metode real time PCR seperti yang  dilakukan (Hikmah,  2019) mendesain  primer  spesifik  yang  dapat  membedakan DNA babi dan celeng, namun hasilnya belum dapat membedakan DNA babi dan celeng pada  sosis  ayam  dimana  hasil real-time PCR  masih  memberikan  respon  amplifikasi terhadap  DNA  celeng.  Dari  hasil  sekuensing  yang  dilakukan,  diperoleh  hasil pensejajaran  fragmen  DNA  babi  dan  celeng  dimana  terdapat  perbedaan  basa  antara fragmen  DNA  babi  ( Sus  scrofa  domestica )  dan  celeng  ( Sus  barbatus ).  Mengacu  hasil sekuensing yang diperoleh Hikmah pada tahun 2019, perbedaan basa pada kedua sekuen tersebut dijadikan sebagai primer yang lebih spesifik terhadap babi. Pada penelitian ini menggunakan  primer  babi  forward  yang  berbeda  dari  peneliti  sebelumnya  yaitu  5’- GATGCCCTAAAACTATTCACC-3’  diperoleh  dari  perbedaan  basa  pada  sekuen antara  babi  dan  celeng  hasil  sekuensing (Hikmah,  2019) sebagai  keterbaruan  dalam penelitian ini dan primer reverse yaitu 5’-TAGTGCTAGGGATAAGGCTAGG-3’  hasil desain primer (Hikmah, 2019) .

## Metode Penelitian
Sampel daging  celeng  ( Sus  barbatus ) diperoleh dari Provinsi  Kalimantan  Timur, daging  babi  ( Sus  scrofa  domestica )  diperoleh  dari  peternak  babi  di  D.I  Yogyakarta, daging  ayam,  sapi  dan  kambing  diperoleh  dari  pasar  tradisional  Yogyakarta.  Sampel sosis  di  peroleh  secara  acak  dari  supermarket  yang  ada  di  Provinsi  D.I  Yogyakarta. Primer babi forward 5’- GATGCCCTAAAACTATTCACC-3’ diperoleh dari perbedaan basa  pada  sekuen  antara  babi  dan  celeng  hasil  sekuensing (Hikmah,  2019) dan  primer reverse  yaitu  5’-TAGTGCTAGGGATAAGGCTAGG-3’    hasil  desain  primer  spesifik babi (Hikmah, 2019) .

## A. Isolasi DNA dan Pengukuran Kemurnian
Isolasi  DNA  dilakukan  menggunakan Geneaid  Genomic  Mini  Kit  (Tissue) GT050  sesuai  dengan  protokol.  Analisis  kemurnian  DNA  hasil  isolasi  diukur  pada panjang gelombang 260nm dan konsentrasi hasil isolasi DNA diukur absorbansinya
pada  panjang  gelombang  260  nm  (A 260 )  dikalikan  dengan  faktor  pengenceran  dan konstanta  penyerapan  (50  µl/ml) (Orbayinah,  Widada,  Hermawan,  Sudjadi,  & Rohman, 2019) .
B. Analisis amplifikasi DNA dengan real-time PCR
1. Protokol Real Time PCR
Formula campuran reaksi yang digunakan untuk running real - time PCR dengan total volume 10 µL yang terdiri dari Ssofast Evagreen® supermix 5 µL, forward  primer  babi  0,5  µL  (10  µM/µL)  ,  reverse  primer  babi  0,5  µL  (10 µM/µL),  DNA  0,5  µL  (50  ng)  dan  air  bebas  nuklease  3,5  µL,  dengan  tahap denaturasi  awal diatur pada suhu 95 o C selama 30 detik, annealing pada  54,4 o C (hasil  optimasi  suhu  penempelan  primer)  selama  30  detik  dan  elongation  pada
72 o C selama 10 detik sebanyak 25 siklus.
2. Optimasi Suhu Penempelan Primer
Optimasi  suhu  penempelan  primer  babi  yang  digunakan  berkisar  antara 53 o C hingga 60 o C berdasarkan hasil perhitungan suhu annealing primer. Dengan menggunakan  lima  suhu  yang  mewakili  dari  range  tersebut  yaitu  53,35 o C; 54,4 o C; 56 o C; 57,9 o C & 59,5 o C.

## 3. Uji Spesifitas Primer
Spesifitas  primer  dikonfirmasi  dengan  mengamplifikasi  50  ng/µL  DNA babi,  celeng,  ayam,  sapi,  dan  kambing  serta  kontrol  negative  tanpa  DNA  yang disebut  dengan  NTC  ( No  Templat  Control ).  Protokol  real  time  PCR  yang digunakan  merupakan  hasil  optimasi  suhu  annealing  primer  yang  telah dilakukan  sebelumnya.  primer  spesisifik  terhadap  spesies  babi  apabila  hanya terdapat 1 melt curve yang terbentuk.
4. Validasi Real Time PCR untuk Analisis Kuantitatif . Validasi  metode real  time PCR  secara  kuantitatif  mencakup  spesifitas, efisiensi  yang  ditentukan  dari  kurva  kalibrasi,  sensitivitas  dan  pengulangan pengujian pada analisis DNA secara real time PCR (Anonim, 2010) .
Efisiensi  diuji  berdasarkan  nilai  Ct  dri  minimal  6  seri  kadar  konsentrasi atau lebih baik pada DNA daging babi murni dan celeng (50; 5; 0,5; 0,005; dan 0,0005  ng/µL)  dan  isolate  DNA  sosis  babi  100%  dan  sosis  celeng  konsentrasi 100% (50; 5; 0,5; 0,05; 0,005; dan 0,0005 ng/µL) (Orbayinah et al., 2019) . Nilai efisiensi yang baik pada kisaran 90-105% (Bio‐Rad, 2006) .
Sensitifitas atau batas deteksi untuk melihat konsentrasi erkecil yang masih dapat  di  amplifikasi.  Batas  deteksi  absolut  diukur  dengan  amplifikasi  seri pengenceran  DNA  jaringan  segar  daging  babi  dan  celeng  (50;  5;  0,5;  0,05; 0,005;  dan  0,0005  ng/µL).  Sedangkan  untuk  sosis  referensi  LOD  relatif  diukur berdasarkan  konsentrasi  formula  sosis  sebagai  refernsi  yang  mengandung  babi (100%; 50%, 25%, 10%; 5% dan 1%).
Uji keterulangan dinilai berdasarkan nilai koefisien variasi (CV) dari 5 kali replikasi amplifikasi DNA hasil isolasi sampel yang sama pada daging babi dan daging  celeng  konsentrasi  50  ng/µL.  Syarat  keberterimaan  repeatabilitas  untuk
Validasi Metode Real-Time Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi DNA Babi ( Sus Scrofa Domestica ) dan Celeng ( Sus Barbatus ) pada Sosis Sapi
metode real-time PCR  yaitu  RSD  <25% (Luque-Perez  et  al.,  2013) .  Analisis pada  sampel  pasaran  menggunakan  4  sosis  sapi  yang  diambil  secara  acak  dari berbagai supermarket yang ada di D.I Yogyakarta.

## Hasil dan Pembahasan
Upaya  menjamin  kehalalan  dari  suatu  produk  yang  beredar  khususnya  makanan berbahan  dasar  daging  perlu  perhatian  khusus  dari  pemerintah  maupun  instansi  terkait untuk menjamin keamanan dan kehalalan produk yang berlabel halal karena maraknya produk berlebel halal palsu.
S ejalan  dengan  amanat  Undang-Undang  Nomor  33  Tahun  2014  tentang jaminan  produk  halal  yang  menyatakan  bahwa  seluruh  produk  yang  beredar dan diperdagangkan di Indonesia wajib bersertifikat halal, pada penel itian ini dilakukan identifikasi DNA babi maupun celeng dalam produk sosis dengan menggunakan primer babi  forward  5’-  GATGCCCTAAAACTATTCACC-3’  dan  primer  reverse  yaitu  5’- TAGTGCTAGGGATAAGGCTAGG-3’

## A. Isolasi DNA pada berbagai spesies
Hasil  isolat  DNA  dilakukan  pengujian  secara  kualitatif  untuk  mendeteksi adanya  DNA  dengan  melarutkan  gel  agarosa  dalam  larutan  buffer  TBE  untuk menjaga  kesetimbangan  pH  saat  migrasi  fragmen  DNA  berlangsung,  karena perubahan  pH  dapat  mendenaturasi  struktur  DNA  sehingga  mengubah elektromobilitas  DNA (Badrut  MH,  2012) . DNA  molekul  bermuatan  negatif sehingga  jika  diberikan  medan  listrik  pada  kedua  ujung  gel  maka  DNA  yang bermuatan negative akan bergerak dari kutub negative (katoda) menuju kutub positif (anoda) (Sismindari, 2012) . Hasil elektroforesis el agarosa isolate DNA seperti yang ditunjukkan pada gambar 1 terlihat adanya pita DNA yang diikuti smear pada hasil elektroforesis gel agarose. Pita DNA yang paling terang dan tebal pada sampel ayam yang menunjukkan bahwa pada isolate DNA ayam memiliki konsentrasi yang tinggi diantara isolate DNA yang lainnya.

## Gambar 1
Hasil Elektroforesis Gel Agarose Isolate Berbagai Spesies
(sapi, celeng, babi, ayam, kambing)
S C B A K DNA Smear
Pengujian  secara  kuantitatif  dengan  pengukuran  konsentrasi  dan  kemurnian DNA yang ditunjukkan pada tabel 1 menunjukkan nilai konsentrasi dan kemurnian isolat DNA yang berbeda, pada sampel isolate DNA sapi, babi, dan celeng memiliki kemurnian  DNA  1,9.  Isolat  DNA  ayam  dan  babi  memiliki  kemurnian  >2,  hal  ini menandakan  bahwa  adanya  kontaminan  RNA  karena  RNA  juga  menyerap  pada panjang gelombang 260 nm sehingga serapan DNA berkurang (Maftuchah, Winaya,
A.,  dan  Zainuddin,  2014) ; (Marín,  Castillo,  López-Lavalle,  Chalarca,  &  Pérez, 2021) . Tabel 1

## Hasil Kemurnian Isolat DNA Berbagai Spesies
Indeks Kemurnian No.        Jenis Daging                            ng/µl                      (A 260 /A 280 ) 1 2 3 4 5 Sapi                                           46.64                              1.97 Celeng                                       58.26                              1.91 Babi                                           71.24                              1.96 Ayam                                       118.21                              2.04 Kambing                                    57.09                              2.09

## B. Optimasi suhu penempelan primer
Berdasarkan  Tm  primer  hasil  BLAST  yaitu  primer  forward  54,33 o C  dan primer  reverse  57,95 o C.  Suhu  penempelan  primer  biasanya  berada  dibawah  5 o C suhu Tm diperoleh perkiraan suhu optimum 56 o C, sehingga dilakukan running real time -PCR untuk optimasi suhu penempelan primer diuji pada 5 suhu  yang berbeda dengan menggunakan range 8 yaitu 53,35 o C; 54,4 o C; 56 o C; 57,9 o C & 59,5 o C.
Optimasi  suhu  dilakukan  untuk  mengetahui  suhu  penempelan  optimum  dari primer  yang  dapat  mengamplifikasi  target,  pemilihan  suhu  berdasarkan  jumlah respon  fluoresensi  (RFU)  yang  tinggi  dan  jumlah  siklus  yang  kecil.  Hasil running real  time PCR  menunjukkan  data melt  peak pada  5  suhu  yang  mewakili  sebagai suhu  uji  coba.  Kurva  yang  memberikan  jumlah  respon  fluoresensi  (RFU)  tertinggi pada  suhu  54,4 o C  dan  pada melt  peak denaturasinya  mempunyai  puncak  tertinggi berarti  pada suhu  tersebut  jumlah amplikon  yang terbentuk  paling banyak (gambar 2).  Sehingga  suhu  54,4 o C  yang  dipilih  sebagai  suhu  optimum  untuk  penempelan primer.
Validasi Metode Real-Time Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi DNA Babi ( Sus Scrofa Domestica ) dan Celeng ( Sus Barbatus ) pada Sosis Sapi
Gambar 2 Melt Peak Hasil Optimasi Suhu Penempelan Primer Babi Pada DNA Babi 25
Siklus, Menggunakan Real Time PCR
C. Uji spesifitas primer
Pada uj i spesifitas primer digunakan suhu dari hasil optimasi sebelumnya yaitu suhu 54,4 o C menguji spesifitas primer babi terhadap spesies target DNA babi dan 4 spesies  DNA  non target yaitu  celeng,  kambing,  ayam  dan  sapi  yang  digunakan untuk memastikan bahwa primer tersebut hanya spesifik terhadap DNA babi.

## Gambar 3

## Hasil Amplifikasi Spesifitas Primer Babi Terhadap DNA Celeng, Babi, Ayam, Sapi dan Kambing 25 Siklus Menggunakan Real Time-PCR
Berdasarkan hasil amplifikasi seperti yang ditunjukkan pada gambar 3 primer yang digunakan mampu mengamplifikasi DNA babi pada siklus 15,72, selain DNA babi  ternyata  juga  mampu  memberikan  respon  amplifikasi  terhadap  DNA  celeng yang memberikan hasil  amplifikasi  di  siklus  19,70  seperti  terlihat  pada  gambar  3. Meskipun primer babi  yang digunakan ini tidak hanya spesifik terhadap DNA babi namun  juga  spesifik  terhadap  DNA  celeng,  hal  ini  menjadi  suatu  keuntungan
54,4 o C 59,5 o C 56 o C 57,9 o C 53,3 o C Babi Celeng NTC, Kambing, Ayam, Sapi
terhadap analisis non halal karena primer tersebut mampu mendeteksi adanya DNA babi  maupun  DNA  celeng  pada  produk  yang  akan  dianalisis  untuk  menjamin kehalalannya.

## D. Uji batas deteksi
Uji  efisiensi  dan batas deteksi absolut  dilakukan pada rangkaian pengenceran 10 kali lipat dengan lima seri kadar konsentrasi isolat DNA daging babi dan daging celeng  yaitu  50  ng;  5  ng;  0,5  ng,  0,05  ng;  0,005  ng  dan  0,0005  ng.  Batas  deteksi relatif merupakan kemampuan untuk mengenali rasio terendah spesies target dalam campuran  daging,  dan  batas  deteksi  absolut  yaitu  kemampuan  untuk  mengenali jumlah template terendah dari spesies target (Li, Li, Liu, Wei, & Wang, 2021) .
1) Jaringan segar babi

## Gambar 4
Hasil Amplifikasi Seri Pengenceran DNA Jaringan Segar Babi dengan Real Time- PCR. Konsentrasi DNA Babi 50; 5; 0,5; 0,05; 0,005 dan 0,0005 ng/µl
Hasil  amplifikasi  dari  lima  seri  pengenceran  DNA  babi  ditampilkan  pada gambar  5  menunjukkan  bahwa  empat  seri  pengenceran  DNA  babi  dapat teramplifikasi yaitu 50 ng, 5 ng, 0,5 ng dan 0,05 ng pada nilai Cq berturut-turut yaitu 15,58; 17,35; 20,56 dan 24,89 sedangkan pada pengenceran 0,005 ng dan 0,0005 ng sudah tidak dapat teramplifikasi dengan menggunakan 25 siklus pada real  time –  PCR.  Dapat  dikatakan  batas  deteksi  absolut  pada  DNA  babi  yaitu 0,05 ng/µL.
DNA Babi (ng/µL)
50
5 0,5 0,05 0,005 0,0005
Validasi Metode Real-Time Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi DNA Babi ( Sus Scrofa Domestica ) dan Celeng ( Sus Barbatus ) pada Sosis Sapi
Gambar 5 Kurva Baku Seri Pengenceran DNA Jaringan Segar Babi Real Time-PCR. Konsentrasi DNA Babi 50; 5; 0,5; 0,05; 0,005 Dan 0,0005 Ng/µl
Kurva  standar  memberikan  informasi  mengenai  seberapa  baik  kinerja reaksi  dengan  berbagai  parameter  reaksi  yaitu  efisiensi,  R 2 dan  slope. Berdasarkan  hasil  amplifikasi  dari  lima  seri  pengencaran  DNA  babi,  dibuat kurva  baku  yang  di  tampilkan  pada  gambar  5.  Pada  kurva  baku  DNA  babi diperoleh  nilai  E  =  109,5%,  R 2 =  0,967  dan  slope=-3,114.  Nilai  E  yang dihasilkan  memiliki  nilai  efisiensi  yang  baik  antara  90%-110%  yang  sesuai dengan nila slope yaitu antara -3,58 dan -3,10 (Tan et al., 2020) . Untuk nilai R 2 yang  diperoleh  tidak  memenuhi  nilai  keberterimaan  yaitu  R 2 >0,980.  R 2 dari kurva baku untuk melihat seberapa baik data penelitian mengikuti garis regresi, linearitas  memberikan  perubahan  pengukuran  replikasi  dan  melihat  apakah efisiensi  amplifikasi  tetap  sama  atau  tidak (Anonim,  2010) ; (Bio‐Rad,  2006) ;
(Luque-Perez et al., 2013) . Sensitivitas uji PCR bergantung pada kualitas DNA karena  adanya  inhibitor  PCR  seperti  lemak,  glikogen,  polisakarida  dan  mineral yang dapat mengganggu hasil PCR (Tan et al., 2020) .
2) Jaringan segar celeng
Uji  batas deteksi  juga dilakukan pada DNA jaringan segar celeng dengan menggunakan seri pengenceran yang sama. Hasil amplifikasi di tampilkan pada gambar 7, menunjukkan empat konsentrasi yaitu 50, 5, 0,5 dan 0,05 ng/µL yang teramplifikasi dengan nilai Cq yang diperoleh berturut-turut yaitu 14,69; 18,29; 21,46  dan  24,37  sedangkan  pada  konsentrasi  0,005  ng  dan  0,0005  ng  tidak teramplifikasi  sehingga  batas  deteksi  absolut  pada  DNA  jaringan  segar  celeng yaitu 0,5 ng/µL.

## Gambar 6
Hasil Amplifikasi Seri Pengenceran DNA Jaringan Segar Celeng  Dengan Real Time-PCR. Konsentrasi DNA Celeng 50; 5; 0,5; 0,05; Dan 0,005 Ng/µl
Berdasarkan  hasil  amplifikasi  seri  pengenceran  pada  DNA  jaringan  segar celeng  diperoleh  kurva  baku  (gambar  7)  untuk  melihat  efisiensi  dan  linearitas dari  hasil  metode real  time – PCR  yang digunakan.  Diperoleh nilai  efisiensi  = 99,1%, R 2 = 0,999 dan slope = -3,344, Nilai efisiensi yang diperoleh memberika hasil  yang  baik  dimana  reaksi  yang  baik  harus  memiliki  efisiensi  antara  90%- 110%  dan  nilai  R 2 pada  kurva  baku  menunjukkan  seberapa  baik  data eksperimental mengikuti garis regresi dan nilai R 2 yang baik yaitu >0,980 0000.

## Gambar 7
Kurva Baku Seri Pengenceran DNA Jaringan Segar Celeng  Real Time-PCR. Konsentrasi DNA Celeng 50; 5; 0,5; 0,05;  0,005 Dan 0,005 Ng/µl
3) Batas  Deteksi  Relatif  (Konsentrasi  Formula  100%,  50%,  25%,  10%,  5%  Dan 1%) Pengujian  batas  deteksi  relatif  dilakukan  untuk  mengenali  rasio  terendah spesies  target  dalam campuran daging, konsentrasi  daging babi  maupun daging
DNA Celeng (ng/µL) 50 5 0,5 0,05 0,005 0,0005
Validasi Metode Real-Time Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi DNA Babi ( Sus Scrofa Domestica ) dan Celeng ( Sus Barbatus ) pada Sosis Sapi
celeng  yang  di  tambahkan  pada  daging  sapi  dimaksudkan  dengan  meniru kemungkinan  penambahan  babi  ataupun  adanya  kontaminasi  silang (skouridou 2019) , pada sampel sosis  celeng konsentrasi  1% masih dapat  terdeteksi dengan baik (gambar 8) pada penelitian ini, pada sampel sosi babi konsentrasi 5% masih dapat  terdeteksi  sedangkan  pada  konsentrasi  1%  sudah  tidak  dapat  terdeteksi menggunakan  25  siklus  (gambar  9).  Tidak  terdeteksinya  pada  konsentrasi  1% mungkin  disebabkan  kurang  homogen  pada  saat  pencampuran  daging  pada pembuatan sosis, ataupun adanya kemungkinan konsentrasi 1% dapat terdeteksi dengan baik apabila menggunakan siklus real time -PCR yang lebih banyak (>25 siklus).  Sensitivitas  1%  campuran  daging  babi  ditunjukkan  dari  beberapa penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh  beberapa  peneliti  sebelumnya (Anonim, 2010) ; (Bio‐Rad, 2006) ; (Luque-Perez et al., 2013) .
Gambar 8
Hasil Amplifikasi Seri Pengenceran DNA Sosis Refrensi Celeng  Dengan Real Time-PCR. Konsentrasi DNA Sosis Celeng Referensi 100%, 50%, 25%, 10%, 5%
Dan 1%

## Gambar 9
Hasil Amplifikasi Seri Pengenceran DNA Sosis Refrensi Babi Dengan Real Time- PCR. Konsentrasi DNA Sosis Babi Referensi 100%, 50%, 25%, 10%, 5% Dan 1%

## E. Uji Keterulangan
Uji keterulangan atau presisi melihat kedekatan antar hasil pengukuran Ketika suatu  metode  analisis  dilakukan  secara  berulang  terhadap  sampel  yang  homogen dalam waktu  yang berbeda, presisi  dinyatakan sebagai RSD dalam persen. Metode yang  digunakan  akan  dikatakan  valid  jika  presisinya  masuk.  Presisi  dihitung berdasarkan dari nilai RSD r ( Relative repeatability standard deviation ) < 25%.
Dari  nilai  Cq  amplifikasi  DNA  babi  diperoleh  masing-masing  nilai  SD (standar  deviasi)  rata-rata  0,557  dan  DNA  celeng  0,500  dan  nilai  rata-rata  RSD r ( relative  repeatability  standar  deviation) DNA  babi  yaitu  sebesar  4,210%,  DNA celeng 3,611%. Berdasarkan nilai RSD r yang diperoleh bahwa metode analisis yang digunakan  untuk  mendeteksi  DNA  babi  dan  DNA  celeng  memenuhi  persyaratan validasi PCR yaitu <25% (Anonim, 2010) ; (Luque-Perez et al., 2013) .
Pengujian  validasi  yang  dilakukan  pada  DNA  babi  dan  DNA  celeng  tidak semua memberikan hasil efisiensi dan koefisien determinasi yang baik sehingga data yang  diperoleh  dari  persamaan  regresi  menunjukkan  hasil  yang  kurang  optimal untuk validasi analisis secara kuantitatif dengan metode real time PCR.
F. Uji pada sampel sosis pasaran
Uji untuk mendeteksi adanya DNA babi atau tidak digunakan 4 sosis berlabel halal  yang  diperoleh  dari  beberapa  supermarket  yang  ada  di  Yogyakarta  sebagai sampel.

## Gambar 10
Hasil amplifikasi sampel isolate DNA sosis pasaran dengan real time PCR
Identifikasi  DNA  babi  maupun  celeng  pada  sampel  sosis  sapi  pasaran menggunakan primer spesifik  babi  tidak memberikan hasil amplifikasi pada semua sampel dan NTC ( not template control ) seperti yang terlihat pada gambar 10 berarti ke empat sampel sosis pasaran tersebut tidak mengandung DNA babi.

## Kesimpulan
Primer babi yang digunakan yaitu forward 5’- GATGCCCTAAAACTATTCACC-3’ dan primer reverse 5’- NTC,
Sampel pasaran Kontrol positif
Validasi Metode Real-Time Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi DNA Babi ( Sus Scrofa Domestica ) dan Celeng ( Sus Barbatus ) pada Sosis Sapi
TAGTGCTAGGGATAAGGCTAGG-3’  belum  dapat  membedakan  secara  spesifik antara  DNA  babi  ( Sus  scrofa  domestica )  dan  DNA  celeng  ( Sus  barbatus )  dengan menggunakan  metode real  time PCR.  Secara  kualitatif  primer  babi  dapat  digunakan untuk  mendeteksi  adanya  DNA  babi  atau  celeng  sedangkan  secara  kuantitatif  metode real  time PCR  yang  digunakan  untuk  mendeteksi  DNA  babi  ( Sus  scrofa domestica) maupun DNA celeng ( Sus babrbatus ) belum memenuhi persyaratan validasi.

## BIBLIOGRAFI
Aida,  Azrina  A.,  Man,  Y.  B.  Che,  Wong,  CMVL,  Raha,  A.  R.,  &  Son,  R.  (2005). Analysis of raw meats  and fats  of pigs using polymerase chain  reaction for Halal authentication. Meat Science , 69 (1), 47–52. Google Scholar
Aina,  Ganea  Qorry,  Erwanto,  Yuny,  Motalib  Hossain,  Mohd  Rafie  Johan,  Ali,  Md Eaqub,  &  Rohman,  Abdul.  (2019).  The  employment  of  q-PCR  using  specific primer  targeting  on  mitochondrial  cytochrome-b  gene  for  identification  of  wild boar  meat  in  meatball  samples. Journal  of  Advanced  Veterinary  and  Animal Research , 6 (3), 300. Google Scholar
Anonim.  (2010).  Guidlines  On  Performance  Criteria  and  Validation  of  Methods  for Detection,  Identification  and  Qantification  of  Spesific  DNA  Sequences  and Spesicifc Proteins In Foods. CAC/GL , 74 , 1–22.
Badrut  MH,  T.  (2012). Pengertian  dan  Cara  Kerja  Elektroforesis .  Retrieved  from https://generasibiologi.com/2012/08/elektroforesis.html
Bio‐Rad, L. (2006). Real-time PCR applications guide. Hercules: Bio-Rad Laboratories Inc , 41. Google Scholar
Cahyaningsari, Diyan, Latif, Hadri, & Sudarnika, Etih. (2019). Identifikasi Penambahan Daging Babi pada Pangan Berbahan Dasar Daging Sapi Menggunakan ELISA dan qPCR. Acta VETERINARIA Indonesiana , 7 (2), 17–25. Google Scholar
Guntarti,  Any,  Rohman,  Abdul,  Martono,  Sudibyo,  &  Yuswanto,  Agustinus.  (2017). Authentication  of  wild  boar  meat  in  meatball  formulation  using  differential scanning  calorimetry  and  chemometrics. Journal  of  Food  and  Pharmaceutical Sciences , 5 (1), 8–12. Google Scholar
Gusti.  (2014). Pengawasan  Peredaran  Daging  Babi  sebagai  Hasil  Olahan  Bahan Pangan  Asal  Hewan  di  Daerah  Istimewa  Yogyakarta.  Positif  Mengandung  Babi, Pemalsuan Daging di DIY Kurang Diawasi, . Yogyakarta.
Hikmah,  N.  (2019). Validasi  Metode  Real  Time  PCR  dan  Analisis  Sekuensing  Untuk Deteksi  DNA  Babi  (Sus  scrofa  domesticus)  dan  Celeng  (Sus  scrofa)  Pada  Sosis Ayam . Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Li,  Jinchun,  Li,  Jiapeng,  Liu,  Ruixi,  Wei,  Yixuan,  &  Wang,  Shouwei.  (2021). Identification of eleven meat species in foodstuff by a hexaplex real-time PCR with melting curve analysis. Food Control , 121 , 107599. Google Scholar
Luque-Perez,  Encarnación,  Mazzara,  Marco,  Weber,  Thomas  P.,  Foti,  Nicoletta, Grazioli, Emanuele, Munaro, Barbara, Pinski, Gregor, Bellocchi, Gianni, Van den Eede, Guy, & Savini, Cristian. (2013). Testing the robustness of validated methods for  quantitative  detection  of  GMOs  across  qPCR  instruments. Food  Analytical Methods , 6 (2), 343–360. Google Scholar
Validasi Metode Real-Time Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi DNA Babi ( Sus Scrofa Domestica ) dan Celeng ( Sus Barbatus ) pada Sosis Sapi
Maftuchah,  Winaya,  A.,  dan  Zainuddin,  A.  (2014). Teknik  Dasar  Analaisis  Biologi Molekuler, 1st ed, 1 . Yogyakarta: Deepublish.
Marín, Diana Victoria, Castillo, Diana Katherine, López-Lavalle, Luis Augusto Becerra, Chalarca,  Jairo  Rodríguez,  &  Pérez,  Cristo  Rafael.  (2021).  An  optimized  high- quality  DNA  isolation  protocol  for  spodoptera  frugiperda  JE  smith  (Lepidoptera: Noctuidae). MethodsX , 8 , 101255. Google Scholar
Maryam,  St,  Sismindari,  Raharjo,  Tri  Joko,  Sudjadi,  &  Rohman,  Abdul.  (2016).
Determination  of  porcine  contamination  in  laboratory  prepared  dendeng  using mitochondrial  D-Loop686  and  cyt  b  gene  primers  by  real  time  polymerase  chain reaction. International  Journal  of  Food  Properties , 19 (1),  187–195. Google Scholar
Mutalib,  Sahilah  Abd,  Nazri,  Wan  Sakeenah  Wan,  Shahimi,  Safiyyah,  Yaakob, Norhayati,  Sani,  Norrakiah  Abdullah,  Abdullah,  Aminah,  Babji,  Abdul  Salam,  & Ghani,  Maaruf  Abd.  (2012).  Comparison  between  pork  and  wild  boar  meat  (Sus scrofa)  by  polymerase  chain  reaction-restriction  fragment  length  polymorphism (PCR-RFLP). Sains Malaysiana , 41 (2), 199–204. Google Scholar
Nakyinsige,  Khadijah,  Man,  Yaakob  Bin  Che,  &  Sazili,  Awis  Qurni.  (2012).  Halal authenticity  issues  in  meat  and  meat  products. Meat  Science , 91 (3),  207–214. Google Scholar
Orbayinah, Salmah, Widada, Hari, Hermawan, Adam, Sudjadi, Sismindari, & Rohman, Abdul.  (2019).  Application  of  real-time  polymerase  chain  reaction  using  species specific primer targeting on mitochondrial cytochrome-b gene for analysis of pork in meatball products. Journal of Advanced Veterinary and Animal Research , 6 (2), 260. Google Scholar
Palandeng, Feriana C., Mandey, Lucia C., & Lumoindong, Frans. (2016). Karakteristik fisiko-kimia  dan  sensori  sosis  ayam  petelur  afkir  yang  difortifikasi  dengan  pasta dari  wortel  (Daucus  carota  L). Jurnal  Ilmu  Dan  Teknologi  Pangan , 4 (2),  19–28. Google Scholar
Priyanka,  Vallery  Athalia.  (2017).  Deteksi  Cemaran  Daging  Babi  Pada  Produk  Sosis Sapi di Kota Yogyakarta Dengan Metode Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta: Universitas Atmajaya , 4 , 9–15. Google Scholar
Raharjo,  T.  J.,  &  Rohman,  A.  (2016).  Analysis  of  pork  contamination  in  Abon  using mitochondrial  D-Loop22  primers  using  real  time  polymerase  chain  reaction method. International Food Research Journal , 23 (1), 370. Google Scholar
Rohman,  A.,  Erwanto,  Y.,  &  Man,  Yaakob  B.  Che.  (2011).  Analysis  of  pork adulteration in beef meatball using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. Meat Science , 88 (1), 91–95. Google Scholar
Septiani, Triayu. (2019). Detection of Porcine DNA in Processed Beef Products Using Real  Time–Polymerase  Chain  Reaction. Indonesian  Journal  of  Halal  Research (IJHAR) , 1 (2), 31–34. Google Scholar
Sismindari. (2012). Replikasi DNA Dan Mutasi, 1st ed, Seri Biologi Molekuler Farmasi . Yogyakarta: Pustaka Pelajar, Yogyakarta.
Tan, Lee Lee, Ahmed, Siti Aminah, Ng, Siew Kit, Citartan, Marimuthu, Raabe, Carsten A., Rozhdestvensky, Timofey S., & Tang, Thean Hock. (2020). Rapid detection of porcine  DNA  in  processed  food  samples  using  a  streamlined  DNA  extraction method  combined  with  the  SYBR  Green  real-time  PCR  assay. Food  Chemistry ,
309 , 125654. Google Scholar
Copyright holder: Mariyani (2021)
First publication right: Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia
This article is licensed under: