http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati

## UJI AKTIVITAS BAKTERIOFAGE LITIK DARI LIMBAH RUMAH TANGGA TERHADAP Salmonella Typhi
Yoga Dwi Jatmiko* 1 , Agung Putra Purwanto 2 , Tri Ardyati 3
1,2,3 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Jl. Veteran, Malang 65145
e-mail: * 1 jatmiko_yd@ub.ac.id ; 2 putra.agung20@gmail.com ; 3 tri_ardyati@yahoo.com
Diterima :30 Oktober 2018 Disetujui : 18 November 2018
e-ISSN : 2541-4208 p-ISSN : 2548-1606
DOI: 10.15575/biodjati.v3i2.3471
Abstrak .  Salmonella Typhi merupakan  salah  satu  bakteri  yang  menjadi agen penyakit bawaan makanan. Bakteriofage sebagai alternatif penggu- naan  antibiotika  telah  digunakan  untuk  mengendalikan  bakteri  tersebut. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan isolat bakteriofage litik yang mampu  melisis  beberapa  bakteri  patogen  yang  diujikan  dan  mengetahui pengaruh  aktivitas  bakteriofage  litik  terhadap  pertumbuhan  Salmonella Typhi . Bakteriofage diisolasi dari limbah rumah tangga (air selokan, air sungai  dan  septic  tank).  Selanjutnya  penentuan  host  range  bakteriofage terhadap bakteri patogen lain dilakukan  dengan metode spot test. Uji ak- tivitas  bakteriofage  terhadap  Salmonella Typhi dilakukan  menggunakan metode  bacterial  challenge  test.  Berdasarkan  hasil isolasi,  didapat  enam isolat  bakteriofage,  yaitu  B2-St,  B3-St,  S1-St,  S2-St,  SL1-St,  dan  SL3-St. Semua isolat bakteriofage mampu melisiskan sel bakteri Escherichia coli dan  Salmonella Typhimurium namun  tidak  mampu  melisiskan  Bacillus cereus, Staphylococcus aureus dan Shigella disentriae. Tiga isolat bakte- riofage telah terpilih berdasarkan densitas plaque terbanyak yaitu B2-St, SL3-St dan S2-St. Kemampuan isolat bakteriofage B2-St dalam melisiskan sel Salmonella Typhi lebih tinggi (6,81 ± 0,35 log sel/mL) daripada isolat bakteriofage  SL3-St  (7,39  ±  0,31  log  sel/mL)  dan  S2-St  (7,60  ±  0,27  log sel/mL). Penurunan densitas sel inang terendah oleh ketiga isolat bakteri- ofage  terjadi  pada jam  ke-4.  Bakteriofage  B2-St  merupakan  bakteriofage terbaik dan berpotensi sebagai agen biokontrol Salmonella Typhi . Kata kunci :  bakteriofage litik, limbah rumah tangga, Salmonella Typhi
Abstract .  Salmonella Typhi is  considered  to  be  the  one  of  important  pa- thogenic bacteria that can cause food-borne diseases. The use of bacteri- ophae  for  controlling  this  pathogenic  bacterium  has  been  proposed  to substitute the use of antibiotics. The objectives of research were to obtain lytic  bacteriophage  that  capable to  inhibit  some tested  pathogenic  bacte- ria  and  to  determine  the  activity  of  isolated  lytic  bacteriophage  against the  growth  of  Salmonella Typhi .  Bacteriophages  were  isolated  from household  wastes  (sewage,  river,  and  septictank).  The  spot  test  method has been applied for host range assay towards selected pathogenic bacte- ria.  Bacteriophage  activity  test  towards  Salmonella Typhi has  been  per- formed  by  using  bacterial  challenge  test  method.  The  result  of  this  re- search  was  six  bacteriophages  have  been  succesfully  isolated  by  using double layer method, namely B2-St, B3-St, S1-St, S2-St, SL1-St, and SL3-

## http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
St. They  were  able  to  inhibit  the  growth  of  both  Eschericia  coli and  Sal- monella Typhimurium ,  shown  by  plaque  forming.  Three  bacteriophage isolates were selected based on their plaque density, namely B2-St, SL3-St and S2-St. Moreover, the activity of bacteriophage B2-St was the highest in inhibiting the Salmonella Typhi growth (6.81 ± 0,35 log cells/mL) com- pared  to  bacteriophage  SL3-St(7.39  ±  0,31 log  cells/mL)  and  S2-St  (7.60 ±0,27  log  cells/mL).  The  lowest  density  of  Salmonella Typhi has  been achieved  after  each  three  isolates  of  bacteriophage  were  incubated  for four hours. Bacteriophage B2-St was potentially to be applied as biocon- trol agent against Salmonella Typhi . Keywords: lytic bacteriophage, domestic wastewater, Salmonella Typhi

## Cara Sitasi
Jatmiko, Y. D., Purwanto, A. P. & Ardyati, T. (2018). Uji Aktivitas Bakteriofage Litik dari Limbah Rumah Tangga terhadap Salmonella Typhi. Jurnal Biodjati , 3 (2), 134-147-.

## PENDAHULUAN
Insiden  penyakit  infeksi  oleh  mikroba melalui  makanan  masih  sering  terjadi  di banyak  negara.  Menurut  data  administrasi makanan  dan  obat  (FDA)  Amerika  Serikat, penyakit  asal  pangan  yang  disebabkan  oleh kontaminasi mikroba menempati urutan pertama di antara racun alami, residu pestisida, dan  bahan  tambahan  pangan  (Winarti  & Miskiyah,  2010).  Data  rangkuman  kasus keracunan  pangan  dari  Direktorat  Surveilan dan  Penyuluhan  Keamanan  pangan,  BPOM tahun 2001-2004 menyatakan bahwa penyebab keracunan  akibat  mikroba  patogen  menempati urutan  pertama  dan  selanjutnya  diikuti  oleh akibat  senyawa  kimia,  dan  racun  alami.  Data penyebab  keracunan  akibat  mikroba  patogen tersebut  adalah  sebagai  berikut,  jumlah  kasus tahun  2001  terdapat  enam  kasus,  tahun  2002 terdapat  12  kasus,  tahun  2003  terdapat sembilan  kasus  dan  tahun  2004  terdapat  21 kasus  (Hariyadi,  2008).  Departemen  Pertanian
Amerika Serikat (USDA) tahun 1996
memperkirakan  terjadi  4000  kematian  dari lima  juta  penderita  setiap  tahunnya  sebagai akibat  mengonsumsi  produk-produk  daging yang  tercemar  empat  jenis  bakteri  patogen
yaitu Campylobacter,  Salmonella, Escherichia coli O157:H7 dan Listeria monocytogenes . Perhatian  khusus  terhadap  beberapa bakteri patogen, terutama Salmonella sp. perlu dilakukan  karena  merupakan  agen  penyakit bawaan makanan. Salmonellosis terjadi apabila  bakteri Salmonella serovar  Typhi  dan Paratyphi A, B, dan C yang hanya menginfeksi manusia  masuk  ke  dalam  tubuh  melalui makanan atau minuman yang telah terkontaminasi (Andriani & Kurniawati, 2007). Salmonella dapat  tumbuh  dan  memproduksi endotoksin yang dapat menyebabkan salmonellosis  yang  ditandai  dengan  adanya gejala  gastroenteritis  seperti  sakit  perut,  mual dan  diare,  kadang  disertai  demam  ringan  dan sakit  kepala  (Mahamuni  et  al,  2017). Salmonella menyerang  mukosa  usus  (saluran pencernaan),  jaringan  limfoid  dan  diteruskan ke  kelenjar  getah  bening  sehingga  dapat menyebabkan  gastroenteritis  dan  tifus  (Wray, 2003).
Pengobatan  infeksi Salmonella Typhi biasanya  digunakan  beberapa  antibiotika seperti ampicillin, chloramphenicol dan trimethoprim  –  sulfamethoxazole.  Namun, Salmonella Typhi  telah  menjadi  resisten  pada salah  satu  atau  lebih  dari  satu  antibiotika tersebut  (Eng  et  al,  2015).  Selain  itu,
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
penggunaan  antibiotika  dapat  meninggalkan residu  dalam  bahan  pangan  yang  sering ditemukan  pada  produk  hasil  peternakan (Sonderholm,  2008).  Salah  satu  alternatif pengendalian Salmonella Typhi  yang  relatif aman adalah penggunaan bakteriofage. Bakteriofage merupakan virus yang menginfeksi dan bereplikasi dalam sel prokariotik. Bakteriofage tipe litik menginfeksi sel  bakteri  dengan  berlipat  ganda  sampai bakteri  lisis  dan  terbentuk  bakteriofage  baru. Umumnya bakteriofage bekerja secara spesifik pada  spesies  bakteri  tertentu  (Filho  et  al, 2007).  Bakteri Salmonella Typhi  umumnya hidup  di  lingkungan  yang  kotor  misalnya limbah  rumah  tangga,  hal  ini  dapat  diindikasi bahwa  untuk  mencari musuh  alaminya terutama  virus  atau  fage  juga  dapat  diisolasi dari Salmonella Typhi  tersebut  berkembang biak.  Menurut  Kutter  &  Sulakvelidze  (2005), bakteriofage  tumbuh  dan  berkembang  biak  di dalam  bakteri,  sehingga  apabila  di  suatu lingkungan  diduga  terdapat  bakteri  tertentu dalam  jumlah  besar  maka  bakteriofage dipastikan berada di lingkungan tersebut.
Secara  umum  bakteriofage  memiliki peluang  untuk  digunakan  sebagai  alternatif pengontrolan bakteri (Sillankorva  et al,  2012). Bakteriofage litik memiliki kemampuan menurunkan  jumlah  kontaminasi Salmonella dan Campylobacter, terutama untuk mengontrol Salmonella pada  produk  ternak ayam  secara  signifikan  (Huff  et  al,  2005;  Bao et  al,  2015).  Penggunaan  bakteriofage  juga dilakukan  pada  organisme  hidup  untuk  terapi kesehatan  pada  pengendalian  bakteri  patogen yang  terdapat  di  dalam  saluran  pencernaan hewan  ternak.  Kajian  pada  bidang  pertanian, bakteriofage diaplikasikan sebagai agen pengendalian  bakteri  patogen  pada  tanaman (Strauch et al, 2007). Infeksi Salmonella Typhi menyebabkan penyakit tifus pada manusia. Hal ini  disebabkan  oleh  agen  perantara  seperti  air
minum  atau  makanan  yang  terkontaminasi oleh Salmonella Typhi  dan  perilaku  higienis yang  kurang  memadai  (Wray,  2003).  Oleh karena  itu,  penelitian  ini  dilakukan  untuk mendapatkan  isolat  bakteriofage  litik  yang mampu  melisiskan  beberapa  bakteri  patogen yang  diujikan  dan  mengetahui  pengaruh aktivitas bakteriofage litik terhadap pertumbuhan Salmonella Typhi.

## Kultur Bakteri
Kultur  bakteri  yang  digunakan  sebagai inang  untuk  isolasi  bakteriofage  adalah Salmonella enterica serovar Typhi ( Salmonella Typhi)  dan Salmonella  enterica serovar Typhimurium ( Salmonella Typhimurium). Isolat  yang  digunakan  untuk  penentuan host range terdiri  dari Escherichia  coli,  Shigella disentriae,  Staphylococcus  aureus,  Bacillus cereus dan Salmonella Typhimurium  yang diperoleh  dari  Laboratorium  Mikrobiologi, Fakultas  Kedokteran,  Universitas  Brawijaya, Malang.

## Isolasi Bakteriofage
Bakteriofage diisolasi dari limbah rumah tangga,  dalam  hal  ini  adalah  air  selokan,  air sungai  (DAS  Brantas)  dan septic  tank . Pengambilan  sampel  limbah  rumah  tangga dilakukan sebanyak dua kali pada tempat yang berbeda  di  wilayah  kota  Malang  dan sekitarnya.  Sampel  tersebut  diambil  dan dimasukkan  dalam  botol  steril  kemudian langsung dibawa ke laboratorium untuk segera dianalisis.
Setiap  jenis  limbah  rumah  tangga  (air selokan,  air  sungai,  dan  septic  tank)  sebanyak 50  mL  disentrifugasi  pada  kecepatan  4000 rpm,  pada  suhu  25 o C  selama  20  menit  untuk mendapatkan supernatan. Supernatan sebanyak 20  mL  ditambahkan  tryptic  soy  broth (TSB)  10  mL  dalam  botol  kultur  100  mL  dan kedua  kultur Salmonella ( Salmonella Typhi
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
dan Salmonella Typhimurium)  masing-masing sebanyak  5  mL  secara  aseptis,  kemudian diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  24  jam. Kedua  kultur Salmonella tersebut  sebelumnya telah  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  satu jam  yang  diperkirakan  telah  mencapai  awal fase  log  (Kocharunchitt  et  al,  2008).  Setelah diinkubasi,  suspensi  dimasukkan  ke  dalam tabung  sentrifugasi  sebanyak  15  mL  untuk dilakukan  sentrifugasi  pada  kecepatan  2500 rpm,  pada  suhu  25 o C  selama  10  menit sebanyak  tiga  kali  secara  berurutan.  Bagian supernatan diambil dan disaring menggunakan membran  filter  dengan  diameter  pori  0,45  µm sehingga didapatkan filtrat bakteriofage (O’Flynn et al, 2004).
Deteksi  keberadaan  bakteriofage  dalam sampel dilakukan menggunakan metode double-layer  (Kocharanchitt  et  al,  2008). Media tryptic soy agar (TSA) 10 mL disiapkan pada  cawan  Petri  sebagai  agar  base.  Kultur Salmonella awal  fase  log  masing-masing sebanyak  200  µL  diinokulasikan  ke  dalam  4 mL TSA 0,6% yang berbeda, dan dihomogenasi dengan cara dibolak-balik secara  perlahan.  Kemudian  filtrat  bakteriofage sebanyak 200 µL disuspensikan juga ke dalam 4  mL  TSA  0,6%  secara  aseptis  dan dihomogenasi  secara  perlahan.  Kultur  tanpa filtrat  bakteriofage  digunakan  sebagai  kontrol. Uji ini dilakukan secara duplo. Suspensi dalam media TSA 0,6% tersebut dituang di atas agar base dan  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama 24 jam. Terbentuknya plaque atau zona bening menandakan  adanya  suatu  aktivitas  lisis  oleh bakteriofage.

## Pembuatan Stok Bakteriofage
Plaque atau  zona  bening  pada top  layer agar diambil  dengan  menggunakan  dryglasky dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung  sentrifugasi yang  mengandung  buffer  SM  (s alt  of magnesium )  sebanyak  10  mL  dan  kloroform
sebanyak  dua  tetes.  Penambahan  kloroform berfungsi  untuk  melisiskan  sel  inang  yang tersisa agar fage dapat dikeluarkan.  Kemudian suspensi  dihomogensi  secara  perlahan  dan disentrifugasi  pada  kecepatan  2500  rpm  pada suhu  25 o C  selama  10  menit  untuk memisahkan  suspensi  bakteriofage.  Bagian supernatan diambil dan disaring menggunakan membran  filter  dengan  diameter  pori  0,45  µm sehingga didapatkan stok bakteriofage (O’Flynn  et  al,  2004).  Stok  bakteriofage disimpan di dalam refrigerator.
Uji  Konfirmasi  dan  Penentuan Host  Range Bakteriofage
Keberhasilan isolasi bakteriofage
dikonfirmasi  dengan  metode spot  test (Clokie & Kropinski, 2009).  Kultur Salmonella Typhi awal  fase  log  dalam  media  TSB  digoreskan pada  media  TSA  menggunakan cotton  bud steril  dan  dibiarkan  mengering  pada  suhu ruang  selama  dua  jam.  Stok  bakteriofage diambil  satu  ose  dan  diinokulasikan  pada media  TSA  yang  telah  terdapat  kultur Salmo- nella Typhi. Suspensi tersebut diinkubasi pada suhu  37 o C  selama  24  jam  dan  diamati terbentuknya plaque atau zona bening.
Penentuan  host  range  (kisaran  inang) bakteriofage  dilakukan  pada  kultur  selain Salmonella Typhi  yaitu E. coli , Sh. disentriae , St.  aureus , B.  cereus dan Salmonella Typhimurium dengan metode spot test (Clokie &  Kropinski,  2009).  Isolat  bakteriofage  yang diujikan  adalah  semua  isolat  yang  berhasil dikonfirmasi melalui uji konfirmasi sebelumnya. Kultur sel inang disiapkan sampai mencapai  awal  fase  log  dalam  media  TSB. Tiap  kultur  diambil  2  mL  dan  digoreskan menggunakan cotton bud steril pada permukaan  media  TSA  secara  merata  dan dibiarkan  mengering  pada  suhu  ruang  selama dua  jam.  Stok  bakteriofage  diambil  satu  ose dan diinokulasikan pada media TSA tersebut
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
Kemudian  media  TSA  tersebut  diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Terbentuknya plaque atau zona bening diamati.

## Penentuan Densitas Bakteriofage
Penentuan densitas bakteriofage menggunakan  metode  pengenceran  bertingkat menurut  Prescott  (2002)  dengan  sedikit modifikasi.  Stok  bakteriofage  sebanyak  0,1 mL  ditambahkan  ke  dalam  garam  fisiologis 0,85%  sebanyak  0,9  mL  (sampai  pengenceran 10 -6 ). Kemudian dari setiap tahap pengenceran (10 -1 s.d  10 -6 )  bakteriofage  diambil  200  µl untuk ditambahkan ke dalam 4  mL TSA 0,6% yang  mengandung  kultur Salmonella Typhi awal  fase  log  sebanyak  200  µl  dan dihomogensi.  Kemudian  suspensi  dituang  ke dalam  cawan  Petri  berbeda  yang  telah  berisi TSA  dan  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama 24  jam. Plaque yang  terbentuk  pada  cawan petri  yang  memenuhi  syarat  (kisaran  25-250 plaque )  diamati  dan  dihitung  menggunakan rumus  1  dalam  satuan  PFU/mL  ( Plaque Forming Unit /mL). Berikutnya, stok bakteriofage  diencerkan  menggunakan  buffer SM  jika  densitas  yang  diharapkan  lebih sedikit.
(1)
Uji  Aktivitas  Penghambatan  Bakteriofage Litik  terhadap  Pertumbuhan Salmonella Typhi
Uji  aktivitas  bakteriofage  terhadap Sal- monella Typhi menggunakan metode Bacterial Challenge  Test (O’Flynn  et  al,  2004).  Kultur
Salmonella Typhi sebanyak 15 mL diinokulasikan  ke  dalam  150  mL  media  TSB diinkubasi  pada  suhu  37 o C  sampai  mencapai densitas  sel  sebanyak  10 6 sel/mL.  Setelah diinkubasi,  kultur Salmonella Typhi  dalam media  TSB  dibagi  ke  beberapa  Erlenmeyer
(tergantung  jumlah  isolat  bakteriofage  yang diperoleh) dengan volume 50 mL.
Bakteriofage  ditambahkan  dalam  inokulum Salmonella Typhi dengan  volume berdasarkan nilai multiplicity of infection (MOI) sebesar 50. MOI  adalah  perbandingan  antara  jumlah bakteriofage  dan  bakteri  uji  (Stephenson, 2003).  Kultur Salmonella Typhi  yang  telah ditambahkan  bakteriofage  diinkubasi  pada suhu  37 o C  dalam  kondisi  yang  sama  selama 12  jam.  Densitas  sel Salmonella Typhi ditentukan  dengan  mengukur  nilai  kerapatan optik  (λ:  600  nm)  pada  jam  ke-  0,1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11  dan  12.  Kontrol  yang digunakan  pada  uji  aktivitas  ini  adalah  kultur Salmonella Typhi tanpa bakteriofage.

## Analisis Data
Pengaruh  jenis  fage  dan  lama  waktu inkubasi terhadap penurunan jumlah Salmonel- la Typhi dianalisis secara kuantitatif menggunakan  analisis One-Way  Anova yang dilanjutkan  dengan  uji Tukey dan Games Howell pada selang kepercayaan 95%. Analisis statistik  data  tersebut  dilakukan  menggunakan SPSS 22 for Windows .

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Bakteriofage
Enam  isolat  bakteriofage  yang  dapat menginfeksi dan melisiskan Salmonella khususnya Salmonella Typhi  telah  berhasil diisolasi  dari  tempat  pengambilan  sampel (Tabel  1)  ditandai  terbentuknya plaque atau zona  bening. Plaque yang  terbentuk  memiliki karakter  yang  hampir  sama,  antara  lain berbentuk  bulat  kecil  (diameter  ±  0,1  mm), merata  di  seluruh  permukaan  media  namun beberapa  berada  di  bagian  tepi  dari  media (Gambar  1).  Ukuran plaque dengan  diameter besar  bisa  mencapai  3  mm  (Kanjana,  2007). Jumlah dan ukuran plaque yang terbentuk
Total plaque = jumlah plaque faktor pengenceran
dipengaruhi  oleh  beberapa  hal  diantaranya jenis fage, suhu, jumlah bakteri inang, pH, ion- ion,  dan  cahaya  seperti  ultraviolet  (Grabow, 2001).  Isolat-isolat  bakteriofage  kemudian diperbanyak  untuk  stok  dan  selanjutnya  stok
bakteriofage  tersebut  dikonfirmasi  dengan menggunakan  metode spot  test .  Hasil  uji konfirmasi  stok  bakteriofage  menunjukkan terbentuknya plaque pada  biakan Salmonella Typhi di cawan Petri (Tabel 1).
Gambar  1.  Hasil overlay bakteriofage  (isolat  B3-St)
yang mengi feksi Salmonella Typhi
Tabel 1. Isolasi dan konfirmasi stok bakteriofage terhadap Salmonella Typhi No Sumber Kode Isolat Pembentukan Plaque Isolasi Stok 1 Sungai Brantas B2St + + B3St + + 2 Septic Tank S1St + + S2St + + 3 Air Selokan SL1St + + SL3St + + Keterangan. + : terbentuk plaque
Host Range Bakteriofage Uji host range semua  isolat bakteriofage menunjukkan bahwa selain mampu melisiskan Salmonella Typhi,  keenam  isolat  bakteriofage tersebut juga  mampu melisiskan sel Salmonel- la Typhimurium  dan E.  coli yang  ditandai dengan terbentuknya plaque (Tabel 2).
Hal  ini  menunjukkan  bahwa  isolat bakteriofage  yang  diperoleh  memiliki  kisaran inang  yang  luas. Shigella  disentriae dan Salmonella merupakan  anggota  kelompok Enterobactriaceae.  Namun  dalam  uji host range ,  isolat  bakteriofage  yang  didapat  tidak mampu  melisiskan Sh.  disentriae. Hal  ini berkaitan  dengan  perbedaan  molekul  reseptor
inang  dan  berkaitan  dengan  aktivitas  DNA metilase  sehingga Sh.  disentriae lebih  resisten terhadap  virus.  Jenis  reseptor  pada Sh. disentriae yang  dikenali  oleh  bakteriofage adalah  polisakarida-O  (Silva  et  al,  2016). Beberapa faktor yang menyebabkan fage tidak dapat  menginfeksi  strain  bakteri  lain  adalah berkaitan  dengan  variasi  atau  perbedaan molekul  reseptor  sel  inang  ( adsorption blocking ), sistem modifikasi restriksi sel inang, serta  sistem  resisten  terhadap  fage  seperti kegagalan  dalam  menginfeksi  sel  inang (O’Flynn et al, 2004).
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
Tabel 2. Uji host range bakteriofage terhadap beberapa bakteri patogen
Keterangan : (+) :  terbentuk plaque (-) :  tidak terbentuk plaque

## Densitas Bakteriofage
Densitas  isolat  bakteriofage  tertinggi adalah S2-St  (1,20  x 10 10 PFU/mL) sedangkan yang  terendah  adalah  SL1-St  (8,10  x  10 6 PFU/mL)  (Tabel  3).  Densitas  bakteriofage yang berasal dari septic tank (S1-St dan S2-St) lebih  tinggi  dari  sumber  air  selokan  (SL1-St dan  SL3-St)  dan  sungai  Brantas  (B2-St  dan B3-St).  Hal  ini  disebabkan septic  tank mengandung Salmonella dan  bakteri  patogen lainnya  dengan  densitas  yang  lebih  banyak dibandingkan  dengan  sungai  dan  air  selokan. Densitas isolat bakteriofage tersebut digunakan untuk menentukan  volume  bakteriofage dalam uji aktivitas bakteriofage terhadap pertumbuihan Salmonella Typhi  dan  untuk menentukan  isolat  bakteriofage  yang  akan
digunakan untuk uji aktivitas.
Jumlah fage dan bakteri inang merupakan  faktor  terpenting  dalam  replikasi virus.  Jumlah  bakteri  inang  yang  sedikit  akan memengaruhi  jumlah  fage  dan  proses  infeksi. Replikasi  fage  akan  terjadi  apabila  sedikitnya terdapat 10 4 bakteri  inang per  mL. Faktor lain yang  memengaruhi  jumlah  dan  kemampuan fage di perairan adalah adanya  bahan organik, radiasi  ultraviolet,  suhu,  pH,  salinitas,  dan aktivitas metabolisme bakteri non-inang
(Grabow, 2001; Suttle, 2016). Radiasi ultraviolet  merupakan  salah  satu  yang  faktor yang tidak
memengaruhi aktivitas bakateriofage  di septic  tank sehingga  densitas bakteriofage  di  sumber  ini  lebih  banyak dibandingkan sungai dan air selokan.

## Tabel 3. Densitas isolat bakteriofage
No Isolat PFU/mL Isolat Terpilih 1 B2-St 3,20 x 10 8* B2-St B3-St 1,50 x 10 7 2 S1-St 2,53 x 10 7 S2-St S2-St 1,20 x 10 10* 3 SL1-St 8,10 x 10 6 SL3-St SL3-St 3,20 x 10 9*
Keterangan: (*) isolat bakteriofage yang digunakan dalam uji aktivitas
Aktivitas  Isolat  Bakteriofage  terhadap Pertumbuhan Salmonella Typhi
Isolat  bakteriofage  B2-St,  SL3-St,  S2-St merupakan  isolat  terpilih  yang  memiliki densitas  tertinggi  yang  mewakili  dari  ketiga
jenis  asal  sampel  (Tabel  3).  Hal  ini  dilakukan selain  agar  mendapatkan  nilai  MOI  50 diharapkan dengan semakin tinggi densitas sel maka aktivitas penghambatannya akan semakin  baik.  Selama  selang  waktu  12  jam,
No Isolat Host B. cereus St. aureus Sh. disentriae E. coli Salmonella Typhi- murium 1 B2-St (-) (-) (-) (+) (+) B3-St (-) (-) (-) (+) (+) 2 S1-St (-) (-) (-) (+) (+) S2-St (-) (-) (-) (+) (+) 3 SL1-St (-) (-) (-) (+) (+) SL3-St (-) (-) (-) (+) (+)
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
densitas  sel Salmonella Typhi  pada  inokulum perlakuan  (penambahan  isolat  bakteriofage) menunjukkan perbedaan yang signifikan dibandingkan dengan kontrol (tanpa bakteriofage).  Secara  keseluruhan,  jumlah  sel Salmonella Typhi pada inokulum kontrol lebih banyak  (1,3  x  10 8 sel/mL)  dibandingkan perlakuan,  yaitu  S2-St,  SL3-St  dan  B2-St secara berurutan adalah 6,6 x 10 7 sel/mL, 4,1 x 10 7 sel/mL dan 9,5 x 10 6 sel/mL (Gambar 2). Pemberian  bakteriofage  menyebabkan terjadinya  penurunan  jumlah  sel Salmonella Typhi akibat lisis oleh aktivitas litik bakteriofage dalam waktu tertentu.
Bakteriofage  B2-St  merupakan  fage  terbaik karena dapat menurunkan jumlah sel Salmonella Typhi  terendah  dengan  rata-rata 9,5  x  10 6 sel/mL  (Gambar  2).  Penurunan jumlah  sel Salmonella Typhi  menunjukkan nilai  yang  signifikan  pada  jam  ke-2  dengan perlakuan  bakteriofage  B2-St  (9,3  x  10 6 sel/mL),  sedangkan  perlakuan  bakteriofage SL3-St  dan  S2-St  dapat  menurunkan  jumlah sel Salmonella Typhi  signifikan  hanya  pada jam  ke-0  setelah  pemberian  bakteriofage.  Hal ini  dikarenakan  jumlah  sel Salmonella Typhi awal  dari  ketiga  inokulum  berbeda  namun masih berkisar 10 6 sel/mL. Peningkatan jumlah sel Salmonella Typhi terjadi secara bertahap di setiap perlakuan bakteriofage setelah mencapai titik  penurunan  jumlah  sel Salmonella Typhi yang  signifikan,  dan  hal  ini  terjadi  sampai tahap  akhir  pengamatan  (jam  ke-12).  Akan tetapi,  jumlah  sel Salmonella Typhi  pada perlakuan  tersebut  masih  di  bawah  kontrol. Peningkatan  jumlah  sel Salmonella Typhi terjadi diduga karena kecepatan replikasi virus lebih  lambat  daripada  replikasi Salmonella Typhi,  sehingga  jumlah  sel  meningkat  cukup signifikan.  Ada  dua  faktor  yang  memengaruhi aktivitas  bakteriofage.  Pertama,  bakteriofage yang baru saja diisolasi memiliki aktivitas litik terbaik  dibandingkan  isolat  bakteriofage  yang
telah  lama disimpan. Faktor berikutnya adalah jumlah bakteriofage yang lebih  sedikit dibandingkan  jumlah  sel Salmonella sehingga tidak  dapat  melisiskan Salmonella secara optimal (Filho et al, 2007).
Berdasarkan  densitas  fage,  isolat  S2-St memiliki  densitas  tertinggi  (1,20  x  10 10 PFU/mL)  dibandingkan  dengan  kedua  isolat bakteriofage  lainnya  B2-St  (3,20  x  10 8 PFU/mL)  dan  SL3-St  (3,20  x  10 9 PFU/mL). Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  B2-St merupakan  fage  terbaik,  meskipun  memiliki densitas yang lebih sedikit dibandingkan S2-St dan  SL3-St.  Hal  ini  diduga  karena  jenis  virus yang  menginfeksi  berbeda,  sehingga  memiliki kemampuan  menginfeksi,  bereplikasi  dan melisiskan  bakteri  yang  berbeda  (Filho  et  al, 2007).
Prokariotik  memiliki  sistem  perusak DNA  (DNA destruction  systems )  yang  dapat merusak DNA  virus  yang diinjeksikan dengan memanfaatkan  enzim  restriksi  endonuklease. Enzim  tersebut  merupakan bagian  dari mekanisme  sel  inang  untuk  mencegah  invasi asam  nukleat  asing.  Enzim  restriksi  bersifat spesifik  hanya  pada  DNA  virus  bukan  RNA virus.  Beberapa  virus  dapat  mengatasi  adanya hal  tersebut  dengan  memodifikasi  asam nukleatnya.  Modifikasi  secara  kimia  yang dilakukan adalah glukosilasi dan metilasi. Pada bakteriofage  tipe  T  (T2,  T4  dan  T6),  DNA virus  akan  mengalami  glukosilasi  untuk mencegah adanya enzim restriksi endonuklease  dari  sel  inang,  sedangkan metilasi  yaitu  asam  nukleat  virus  dimodifikasi melalui  replikasi  genomik  oleh  protein modifikasi  yang  dikode  virus  (Madigan  et  al, 2010).
Lain  halnya dengan bakteriofage T3 dan T7  yang  mencegah  sistem  restriksi  dengan mengkode  protein  yang  dapat  menghambat sistem  restriksi  inang.  Namun  hal  ini  juga diikuti perlawanan oleh sel inang dengan multi
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
ple  restriction dan  sistem  metilasi  yang  dapat mencegah  infeksi  virus.  Sel  inang  memiliki DNA methylases yang  berperan  sebagai  DNA repair untuk  melindungi  inang  dari  enzim
endonuklease  asing.  Hal  ini  yang  menjadi dasar  evolusi  dan  resistensi  antara  inang  sel prokariotik  dan  virus  yang  menginfeksinya (Madigan et al, 2010).
Gambar 2. Hasil uji aktivitas bakteriofage
Gambar 3. Pengaruh jenis fage terhadap jumlah sel Salmonella Typhi Keterangan: notasi yang berbeda menunjukkan beda nyata dengan p<0,05

## http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati

## Jenis  fage  memengaruhi  jumlah  sel
Salmonella Typhi  secara  signifikan  (p<0,05). Kemampuan  isolat  bakteriofage  B2-St  dalam melisiskan  sel Salmonella Typhi  tampak  lebih tinggi (6,81 ± 0,35 log sel/mL) daripada isolat bakteriofage SL3 (7,39 ± 0,31 log sel/mL) dan S2  (7,60  ±  0,27  log  sel/mL),  secara  berurutan (Gambar  3).  Hal  ini  dapat  disimpulkan  bahwa isolat  bakteriofage  B2-St  merupakan  fage terbaik  dalam  menghambat  pertumbuhan Salmonella Typhi dibandingkan dengan kedua isolat  bakteriofage  lainnya.  Namun  demikian, bakteriofage tersebut tidak bisa menghilangkan/  melisiskan  bakteri  uji  secara keseluruhan.  Menurut  Sulakvelidze  (2013), salah satu permasalahan dalam pengaplikasian bakteriofage  adalah  bakteri  patogen  tidak  bisa secara total dihilangkan atau dilisiskan. Alasan atas fenomena ini belum diketahui jawabannya.  Satu  hal  yang  mungkin  terjadi adalah tidak semua partikel bakteriofage dapat menempel pada semua sel bakteri.
Berdasarkan  uji  Brown-Forsythe  dengan uji  lanjutan  Games-Howell,  diketahui  bahwa isolat  bakteriofage  B2-St  mampu  menurunkan jumlah sel Salmonella Typhi sampai mencapai
nilai  terendah  pada  jam  ke-4  dan  ke-5,  yaitu 6,50  ±  0,03  log  sel/mL  dan  6,53  ±  0,02  log sel/mL,  secara  berurutan  (Gambar  4).  Dengan demikian,  lama  waktu  yang  dibutuhkan  untuk memberikan  efek  penghambatan  yang  terbaik adalah pada jam ke-4. Hasil yang hampir sama ditunjukkan  oleh  aktivitas  isolat  bakteriofage SL3-St.  Aktivitas  penghambatan  optimum terhadap  pertumbuhan Salmonella Typhi terjadi pada jam ke-4 (Gambar 5).
Berbeda dengan kedua isolat sebelumnya,  isolat  bakteriofage  S2-St  tidak menunjukkan  aktivitas  penghambatan  yang cukup  signifikan  (Gambar  6).  Meskipun  hasil analisis  statistik  menunjukkan  pada  jam  ke-0 densitas  sel Salmonella Typhi  adalah  paling rendah,  namun  jumlah  sel  bakteri  cenderung mengalami peningkatan sampai akhir
pengamatan.
Pada setiap perlakuan bakteriofage,  setelah  mencapai  titik  terendah, jumlah  sel Salmonella Typhi  mengalami peningkatan secara bertahap. Hal ini menunjukkan bahwa Salmonella Typhi berusaha  melawan  virus  tersebut  sehingga pertumbuhan sel bakteri tersebut menjadi lebih baik.
Gambar  4.  Pengaruh  isolat  bakteriofage  B2-St  tiap  jam  terhadap  jumlah  sel
Salmonella Typhi
Keterangan: notasi yang berbeda menunjukkan beda nyata dengan p<0,05
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
Gambar 5. Pengaruh isolat bakteriofage SL3-St tiap jam terhadap jumlah sel Salmonella Typhi Keterangan: notasi yang berbeda menunjukkan beda nyata dengan p<0,05
Gambar 6. Pengaruh isolat bakteriofage S2-St tiap jam terhadap jumlah sel Salmonella Typhi Keterangan: notasi yang berbeda menunjukkan beda nyata dengan p<0,05.
Peningkatan  jumlah  sel  inang  diduga disebabkan  beralihnya  siklus  hidup  virus menuju  fase  lisogenik.  Proses  infeksi  virus diawali  dengan  mengenali  protein  reseptor spesifik  pada  dinding  sel  suatu  bakteri  dan dilanjutkan  menginjeksikan  DNA  virus  ke dalam  sel.  Kemudian,  siklus  virus  masuk dalam  fase  litik  ataupun  lisogenik  ditentukan
oleh ekspresi protein cI dan cro. Pada awalnya lisogenik diekspresikan dengan dibantu protein cII  dan  cIII  di  PRE  ( promoter  right  for establishment )  dan  mentranskripsi  gen  cI untuk  menghasilkan  protein  cI.  Protein tersebut akan mencegah transkripsi gen N yang berperan penting dalam  mengekspresikan gen- gen dalam siklus litik. Proses lisogenik  bersai

## http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
ng  dengan  transkripsi  dari  PR  gen  cro  untuk siklus  litik.  Cro  dan  cI  bersaing  dalam mengikat  daerah  promotor  atau  operator  yang kompleks  termasuk  PRM  dan  PR  dimana siklus  litik dan  lisogenik ditentukan (Kutter  & Sulakvelidze, 2005).
Protein  cro  merupakan  suatu  protein repressor yang  dapat  mencegah  terjadinya proses trankripsi  PL  dan  PR  dengan  mengikat OL  ( operator  left )  dan  OR  ( operator  right ). Proses  ini  akan  mengikat  operator  dari site 3, kemudian site 2, site 1  dan  menonaktifkan sintesis  cI,  menjadikan  protein  cII  dan  cIII tidak  dapat  disintesis  untuk  terjadinya  siklus lisogenik (Madigan et al, 2010).
Ada beberapa faktor yang harus dipenuhi supaya  fase  lisogenik  dapat  terjadi  yaitu produksi late protein harus  dicegah  dan  asam nukleat  virus  harus  masuk  ke  dalam  genom bakteri. Late  protein dapat  dicegah  dengan mengekspresikan  gen  cI  untuk  menghasilkan protein lambda  repressor .  Gen  cI  terletak diantara  PL  dan  PR.  Promotor-promotor tersebut  dapat  menghasilkan  mRNA  untuk menghasilkan  PE  ( promotor  establishment ) yang  harus  diaktifkan  agar  protein lambda repressor dapat  disintesis  dan  siklus  lisogenik dapat terjadi. Gen cII menghasilkan protein cII atau  PE activator  protein yang  dapat mengaktifkan  PE.  Namun  protein  cII  bersifat tidak  stabil  dan  dapat  didegradasi  oleh  enzim protease  dari  sel  inang.  Hal  ini  dapat  dicegah dengan  mengekspresikan  gen  cIII  untuk menghasikan  protein  cIII  agar  gen  cII  tetap stabil. Apabila gen cII stabil, selanjutnya akan mengaktifkan PE dan protein lambda repressor (cI)  akan  dihasilkan  (Madigan  et  al, 2010).  Stabilitas  cII  juga  ditentukan  oleh jumlah  energi  dalam  sel.  Suatu  sel  dengan energi  yang  cukup  memiliki cyclic AMP (cAMP)  dalam  jumlah  sedikit,  namun  ketika sel  kekurangan  energi  (misalnya  glukosa dalam  jumlah  sedikit),  jumlah  cAMP  akan
menjadi  tinggi.  Jumlah  cAMP  yang  tinggi menjadikan  cII  stabil  dan  fase  lisogenik  ikut stabil (Kutter & Sulakvelidze, 2005).
Protein lambda  repressor mengikat  OL dan  OR  seperti  halnya  protein  cro,  namun perbedaannya  adalah  mengikat  operator  dari site 1, site 2,  kemudian site 3  dan menonaktifkan  PR  (PL  pada  mekanisme  yang sama).  Ketika  hal  tersebut  terjadi,  semua sintesis protein akan dihentikan dan siklus litik tidak  akan  terjadi.  Tanpa  protein  cII, PE tidak dapat aktif dan protein lambda repressor tidak dapat  dihasilkan.  Oleh  karena  itu,  siklus lisogenik  harus  dapat  dipertahankan  dengan gen  cI  terus  ditranskripsi.  Salah  satu  caranya adalah virus harus mengaktifkan PM ( Promotor  Maintenance )  untuk  mengaktifkan gen  cI  sehingga  protein lambda  repressor dapat  mengikat site 1, site 2  dan site 3.  Oleh karena  itu,  protein lambda  repressor selain berfungsi  sebagai repressor PR  juga  dapat mengaktifkan  PM.  Ketika  PM  aktif,  protein lambda  repressor semakin  banyak  dihasilkan dan  siklus  lisogenik  dapat  dipertahankan (Madigan et al, 2010).
Agen  yang  dapat  menginduksi  siklus lisogenik menjadi siklus litik adalah agen yang dapat merusak DNA yaitu ultraviolet irradiation, X-rays, dan senyawa kimia perusak DNA seperti nitrogen mustard . Ketika kerusakan  DNA  terjadi,  maka  sel  inang  akan melakukan mekanisme pertahanan yang disebut  respon  SOS  ( save  our  souls ).  Bentuk respon  SOS  adalah  suatu  protein  yaitu  RecA yang secara normal termasuk dalam rekombinasi  genetik  yang  dikonversi  menjadi protease.  Protease  merupakan  enzim  yang salah  satu  fungsinya  adalah  menghancurkan protein lambda  repressor .  Ketika  protein lambda  repressor tidak  aktif,  transkripsi  fage akan terjadi (Madigan et al, 2010).
Berdasarkan  hasil  penelitian,  dapat disimpulkan  pada  tahap  uji host  range
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
bakteriofage, semua isolat bakteriofage (B2-St, B3-St,  S1-St,  S2-St,  SL1-St  SL3-St)  mampu melisiskan  sel  bakteri E.  coli dan Salmonella Typhimurium yang menandakan isolat bakteriofage  yang  didapatkan  tidak  spesifik pada Salmonella
Typhi. Pemberian bakteriofage  pada  kultur Salmonella Typhi memengaruhi aktivitas pertumbuhan sel Salmonella Typhi.  Penurunan  densitas  sel inang  terendah  terjadi  pada  jam  ke-4  dan diikuti  peningkatan  jumlah  sel  inang  yang terjadi  secara  bertahap.  Bakteriofage  B2-St merupakan  bakteriofage  terbaik  karena  dapat menurunkan  jumlah  sel Salmonella Typhi terendah  (6,81  ±  0,35  log  sel/mL).  Penelitian lebih  lanjut  diperlukan  untuk  menentukan efikasi  isolat  bakteriofage  tersebut  dalam mencegah  atau  menghambat  pertumbuhan Salmonella Typhi pada produk pangan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  kepada  Nanik  Dwi Rahayu selaku laboran Laboratorium Mikrobi- ologi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengeta- hun Alam, Universitas Brawijaya atas bantuan yang diberikan selama penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Andriani,  D.  &  Kurniawati,  W.  (2007). Pengaruh  Asam  Asetat  dan  Asam  Laktat sebagai  Antibakteri  terhadap  Bakteri Salmonella sp. yang Diisolasi dari  Karkas Ayam. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor.
Bao,  H.,  Zhang,  P.,  Zhang,  H.,  Zhou,  Y., Zhang,  L.  &  Wang,  R.  (2015).  Bio- Control  of Salmonella Enteridis  in  Foods Using  Bacteriophages. Viruses .  7,  4836- 4853.
Clokie,  M.  R.  J  &  Kropinski,  A.  M.  (2009). Bacteriophages:  Methods  and  Protocols. UK: Humana Press.
Eng, S.  K.,  Pusparajah,  P., Ab  Mutalib,  N.  S.,
Ser,  H.  L.,  Chan,  K.  G.  &  Lee,  L.H. (2015). Salmonella : A Review on Pathogenesis, Epidemiology and
Antibiotic  Resistance. Frontiers  in  Life Science , 8(3), 284-293.
Filho,  R.  L.  A.,  Higgins,  J.  P.,  Higgins,  S.  E., Ganoa,  G.,  Wolfenden,  A.  D.,  Tellez,  G. &  Hargis, M. (2007). Ability of  Bacterio- phages Isolated from Different Sources to Reduce Salmonella enterica Serovar Ente- ritidis  In  Vitro  and  In  Vivo. Poultry Science , 86, 1904-1909.
Grabow,  W.  O.  K.  (2001).  Bacteriophages:
Update  on  Application  as  Models  for  Vi- ruses  in  Water. Water  SA  Journal ,  27 , 251-268 Hariyadi, P. (2008). Isu Terkini Terkait dengan Keamanan Pangan. http://seafast.ipb.ac.id/article/isu_terkini_k eamanan_pangan.pdf.
Huff,  W.  E.,  Huff,  G.  R.,  Rath,  N.  C.,  Balog, J.M.  &  Donoghue,  A.M.  (2005).  Alterna- tives to Antibiotics: Utilization of Bacteri- ophage to Treat Colibacillosis and Prevent Foodborne  Pathogens. Poultry  Science Journal , 84, 655–659
Kanjana.  (2007).  Isolation  and  Partial  Charac- terization  of Salmonella Typhi-Specific Bacteriophage. KKU  Science  Journal . 35(3), 162-169
Kocharunchitt,  C.,  Ross,  T.  &  McNeil,  D.  L. (2008).  Use of Bacteriophages as Biocon- trol  Agents  to  Control Salmonella Asso- ciated  with  Seed  Sprouts. International Journal  of  Food Microbiology ,  128,  453– 459.
Kutter, E. & Sulakvelidze, A. (2005). Bacteri- ophages: Biology and Applications . Flori- da. United States : CRC Press.
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
Madigan, M.  T., Martinko, J.  M., Stahl, D. A. &  Clark,  D.  P.  (2010). Brock  Biology  of Microorganims  (13 th edition). USA:  Pear- son Education, Inc.
Mahamuni,  P.  P.,  Patil,  A.  R.  &  Ghosh,  J.  S.
(2017). Proteolytic and lipolytic properties of  endotoxins  (enterotoxins)  produced  by Salmonella  typhi NCIM 5255, Salmonella typhimurium NCIM 2501 and Shigella ex- neri NCIM  5265. Internatonal  Food  Re- search Journal . 24(6), 2685-2688.
O’Flynn,  G.,  Ross,  R.  P.,  Fitzgerald,  G.  F.  & Coffey,  A.  (2004).  Evaluation  of  a  Cock- tail  of  Three  Bacteriophages  for  Biocon- trol of Escherichia coli O157:H7. Applied and  Environmental  Microbiology .  7(6), 3417–3424.
Prescott,  H.  (2002). Laboratory  Exercises  in Microbiology  (Exercise  48:  Isolation  of Escherichia  coli  Bacteriophages  from  Se- wage  and  Determining  Bacteriophage  Ti- ters) .  Fifth  Edition.  USA:  The  McGraw- Hill Companies.
Sillankorva, S.  M.,  Oliviera, H. & Azeredo, J.
(2012).  Bacteriophages  and  Their  Role  in Food Safety. International  Journal  of Mi- crobiology . 1-13.
Silva,  J.  B.,  Storms,  Z.  &  Sauvageau,  D. (2016).  Host  Receptors  for  Bacteriophage Adsorption. FEMS  Microbiology  Letters .
363(4) , 1-11.
Sonderholm,  J.  (2008).  Use  of  Antibiotic  in Food Animals. http://www . Keepan tibioticsworking.com/new/indepth_keyevi d.cfm.
Stephenson,  F.  H.  (2003). Calculations  for Molecular  Biology  and  Biotechnology  (A Guide to  Mathematics in  the Laboratory). United State: Academic Press.
Strauch,  E.,  Hammerl,  J.  A.  &  Hertwig,  S. (2007). Bacteriophages:  New  Tools  for Safer  Food .  Berlin.  Germany:  Bundesins- titut für Risikobewertung
Sulakvelidze, A. (2013). Using Lytic Bacterio- phages  to  Eliminate or  Significantly  Re- duce  Contamination  of  Food  by  Food- borne  Bacterial  Pathogens. Journal  of  the Food and Agriculture . 93, 3137-3146.
Suttle,  C.A.  (2016).  Viral  Diversity  on  the Global  Stage. Nature  Microbiology .  1,  1- 2.
Winarti,  C.  &  Miskiyah.  (2010).  Status Kontaminan  Pada  Sayuran  dan  Upaya Pengendaliannya di Indonesia. Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian. Pengembangan Inovasi Pertanian . 3(3), 227-237.
Wray,  C.  (2003). Salmonella :  Properties  and Occurrence. UK: Elsevier Science Ltd.