BERKALA SAINSTEK 2024 12(2): 57-63 doi: 10.19184/bst.v12i.2.47304 https://jurnal.unej.ac.id/index.php/BST/article/view/47304

## RESEARCH   ARTICLE

## Determination of Reducing Sugar Groups from Hydrolysis of Arthrospira platensis Microalgae using Microwaves
(Penentuan Gugus Gula Reduksi Hasil Hidrolisis Mikroalga Arthrospira platensis dengan Menggunakan Gelombang Mikro)
Sholeh Ma’mun *) , Nur Ariffa Rochmaningsih, Riqqah Nabila, Aisyah Sumalyani Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, Universitas Islam Indonesia,
Jl. Kaliurang Km. 14,5 Yogyakarta 55584, Indonesia

## ABSTRACT
The depletion of fossil fuel sources and increasing carbon dioxide (CO 2 ) emissions have encouraged research into renewable energy sources. Bioethanol is an environmentally friendly energy source with considerable potential for reducing dependence on gasoline. Bioethanol is produced from the fermentation process of monosaccharides. The first and second generations of  bioethanol are derived  from  food  crops,  agricultural  waste,  and  plantation  waste,  whereas  the  third  generation  is  produced  from  microalgae. Arthrospira platensis is a carbohydrate-rich microalgae. This study attempts to determine the content of reducing sugar groups which are monosaccharides formed from a hydrolysis with microwaves. A total of 10 g of microalgae powder was added to 100 mL of 0.3 M H 2 SO 4 solution. The hydrolysis process was carried out in a microwave reactor at a temperature of 100°C for 90 minutes. The hydrolysate obtained was then fermented with Saccharomyces cerevisiae anaerobically in a shaking water bath. The High Performance Liquid  Chromatography  (HPLC)  test  was  performed  to  identify  reducing  sugar  groups  in  the  hydrolysate,  and  the  Gas Chromatography (GC) test was performed to determine the concentration of bioethanol produced during the fermentation process. Meanwhile, the solid content of biochar that remained after hydrolysis was analyzed using Fourier-Transform Infrared Spectoscopy (FTIR). The HPLC test findings showed that the glucose concentrations before and after fermentation were 10.52 and 1.91 g/L, respectively,  indicating  that  81.8%  of  the  glucose  was  converted  to  bioethanol.  Furthermore,  the  distillation  results  from  the fermented hydrolysate were analyzed using GC, yielding a bioethanol content of 3.90 g/L.
Menipisnya sumber bahan bakar fosil dan meningkatnya emisi karbon dioksida (CO 2 ) telah mendorong kegiatan penelitian untuk menemukan sumber-sumber energi terbarukan. Bioetanol merupakan sumber energi yang ramah lingkungan dan memiliki prospek yang  menjanjikan  untuk  mengurangi  ketergantungan  pada  gasolin.  Bioetanol  dihasilkan  dari  proses  fermentasi  monosakarida. Bioetanol generasi pertama dan kedua berasal dari tanaman pangan, limbah pertanian, dan limbah perkebunan, sedangkan generasi ketiga dihasilkan dari mikroalga. Arthrospira platensis merupakan salah satu jenis mikroalga dengan kandungan karbohidrat yang tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kandungan gugus gula  reduksi yang merupakan monosakarida hasil hidrolisis dengan bantuan gelombang mikro. Sebanyak 10 g serbuk mikroalga ditambahkan ke dalam 100 mL larutan 0,3 M H 2 SO 4 . Proses hidrolisis dijalankan dalam sebuah reaktor microwave pada suhu 100°C selama 90 menit. Selanjutnya hidrolisat yang diperoleh difermentasi dengan ragi Saccharomyces cerevisiae secara anaerob di dalam shaking water bath . Uji HPLC dilakukan untuk mengidentifikasi gugus-gugus gula reduksi dalam hidrolisat, sedangkan uji GC dilakukan untuk menentukan konsentrasi bioetanol yang dihasilkan dari proses fermentasi.  Sementara  itu,  kandungan  padatan biochar sisa  hidrolisis  dianalisis  menggunakan  FTIR.  Dari  hasil  pengujian  HPLC diperoleh konsentrasi D-glukosa sebelum fermentasi sebesar 10,52 g/L dan setelah fermentasi sebesar 1,91 g/L atau sebanyak 81,8% D-glukosa terkonversi menjadi bioetanol. Selanjutnya hasil distilasi dari fermentasi hidrolisat diuji dengan GC dan diperoleh kadar bioetanol sebesar 3,90 g/L.
Keywords: Arthrospira platensis , Bioethanol, Microalgae, Microwave, Saccharomyces cerevisiae .

## PENDAHULUAN
Bahan  bakar  fosil  masih  menjadi  sumber  energi utama  di  Indonesia.  Beberapa  dekade  yang  lalu,
Indonesia  merupakan  salah  satu  produsen  minyak bumi terbesar di dunia, tetapi karena konsumsi lebih besar dari pada produksi, maka saat ini Indonesia telah menjadi negara pengimpor minyak bumi [1]. Data dari
*) Corresponding author: Sholeh Ma’mun E-mail: sholeh.mamun@uii.ac.id

## Ma’mun, Determination of Reducing Sugar …
Kontan  [2]  menunjukkan  bahwa  pada  tahun  2017 produksi  minyak  bumi  Indonesia  sebesar  949  ribu barel per hari dan turun menjadi 773 ribu barel per hari pada  tahun  2018.  Sektor  industri  dan  transportasi merupakan  sektor  yang  menggunakan  Bahan  Bakar Minyak (BBM) terbesar, misalnya konsumsi rata-rata BBM oleh PT. Kereta Api Indonesia sebesar 200 juta liter per tahun [2].
Saat  ini  penelitian  untuk  mencari  sumber-sumber energi  alternatif   dan  terbarukan  dilakukan  semakin intensif.  Hal  ini  disebabkan  karena  semakin menipisnya  sumber  bahan  bakar  fosil.  Selain  itu, komitmen untuk menurunkan emisi karbon dioksida (CO 2 )  sebagai  penyebab  terjadinya  perubahan  iklim telah  menjadi driving  force penelitian-penelitian  di bidang Energi Baru dan Terbarukan (EBT). Menurut Dasan et al . [3] bahwa bahan bakar berbasis biomassa, berdasarkan Life Cycle Assessment (LCA), memberikan emisi  CO 2 negatif.  Bioetanol  merupakan  salah  satu jenis  EBT  berbahan  dasar  biomassa  yang  ramah lingkungan  yang  dapat  mensubstitusi  gasolin. Bioetanol  terbuat  dari  konversi  biomassa  melalui proses fermentasi.
Bioetanol  generasi  pertama  diproduksi  dari  hasil fermentasi tanaman pangan seperti tebu, jagung, dan hasil pertanian lainnya, sedangkan bioetanol generasi kedua  berasal  lignoselulosa  seperti  residu  hasil pertanian,  hutan,  dan  bahan  ligniselulostik  lainnya. Berdasarkan  tinjauan  ekonomi  bahwa  bioetanol generasi  pertama  terhitung  lebih  murah,  akan  tetapi dapat  menyebabkan  kompetisi  dengan  sumber pangan. Sementara itu, pembuatan bioetanol generasi kedua  lebih  kompleks  dibandingkan  bahan  baku lainnya  dikarenakan  adanya  lignin  di  dalamnya. Dengan  mempertimbangkan  permasalahan  di  atas, maka  beberapa  peneliti  mulai  aktif   untuk mengembangkan  produksi  bioetanol  generasi  ketiga yang  berasal  dari  dari  mikroalga  [4].  Sebagai  negara maritim,  Indonesia  mempunyai  pesisir  yang  sangat luas,  sehingga  mempunyai  potensi  yang  besar  dalam pembudidayaan mikroalga. Selain itu, jumlahnya yang melimpah  dapat  memberikan  potensi  tinggi  dalam keberlanjutan produksi.
Menurut  Mayers et  al. [5]  bahwa  untuk  saat  ini sintesis  bioetanol  dari  mikroalga  belum  memberikan keuntungan dibandingkan dari sumber lainnya dalam skala besar, karena rute proses dan juga penggunaan energi yang belum optimal. Penelitian-penelitian yang dilakukan  saat  ini  masih  fokus  untuk  mencari  solusi
dari permasalahan di atas dengan mempertimbangkan kondisi  operasi  pembudidayaan  mikroalga  seperti pasokan  cahaya,  nutrisi,  suhu,  dan  derajat  keasaman (pH) media budidaya. Selain itu, studi tentang proses penyiapan  ( pretreatment )  bahan  baku  dan  proses fermentasi  sedang  giat  dilakukan  oleh  beberapa peneliti  untuk  mencari  kondisi  yang  optimum.  Ada beberapa  metode pretreatments yang  digunakan  dalam hidrolisis  mikroalga,  antara  lain  menggunakan  CO 2 superkritis [6], ultrasonikasi [7, 8], hydrothermal [9], dan menggunakan  larutan  asam  maupun  basa  dengan bantuan gelombang mikro [10-13]. Di antara metode pretreatments di  atas,  kombinasi  pemanasan  dengan gelombang  mikro  menggunakan  larutan  asam merupakan metode terbaik karena memerlukan lebih sedikit  energi,  sehingga  menurunkan  biaya keseluruhan  [12].  Namun  konsentrasi  asam  yang digunakan  harus  rendah  untuk  mengurangi  sifat korosif.  Berdasarkan  alasan  ini, pretreatment hidrolisis asam  dengan  bantuan  gelombang  mikro  digunakan dalam penelitian ini.
Bioetanol  diproduksi  dari  hasil  fermentasi  gula monosakarida dengan menggunakan ragi Saccharomyces cerevisiae .  Namun  demikian,  tidak  semua  gugus  gula reduksi  dapat  dikonversi  menjadi  alkohol,  hanya  D- glukosa,  D-galaktosa,  D-mannosa,  dan  L-rhamnosa yang menghasilkan alkohol, sedangkan D-xylosa dan L-arabinosa  tidak  dapat  dikonversi  menjadi  alkohol secara  langsung  [14].  Dengan  demikian,  komposisi gugus gula reduksi sangat penting untuk diketahui agar dapat menentukan berapa banyak gugus gula reduksi yang dapat dikonversi menjadi alkohol. Penelitian ini bertujuan  untuk  menentukan  komposisi  gugus  gula reduksi  hasil  hidrolisis  dengan  bantuan  gelombang mikro  dari  mikroalga Arthrospira  platensis dengan pelarut  asam.  Pemilihan Arthrospira  platensis sebagai bahan  baku  pembuatan  bioetanol  karena  mikroalga jenis ini mengandung karbohidrat yang cukup tinggi berkisar  antara  8-65%  [15-22].  Hasil  hidrolisis kemudian  difermentasi  dan  kandungan  bioetanolnya ditentukan  dengan  cara  distilasi  yang  selanjutnya dianalisis dengan Gas Chromatography (GC).

## METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini antara  lain microwave  chemical  reactor (Electrolux EMM2308X,  China),  labu  Erlenmeyer, shaking  water

## Ma’mun, Determination of Reducing Sugar …
bath (SWB 30, China), pompa vakum (ROCKER 300, Taiwan), glass  vacuum  suction  filter ,  dan  rangkaian  alat distilasi. Sementara itu, bahan - bahan yang digunakan pada  penelitian  ini  antara  lain  mikroalga Arthrospira platensis kering yang diperoleh dari Beautiful Tropical Life of  Bali Ltd. dengan kemurnian 100%, asam sulfat (H 2 SO 4 ) dengan kemurnian 98% (Merck, USA), kultur Saccharomyces cerevisiae , kertas saring Whatman ® No. 42 (Sigma-Aldrich,  USA),  Millipore  0,45  m  (Merck, USA), dan deionized water .
Cara Kerja
a. Hidrolisis dengan Microwave Chemical Reactor Sebanyak  10  g  mikroalga Arthrospira  platensis ditambahkan  ke  dalam  tabung  reaktor  300  mL, kemudian ditambahkan larutan H 2 SO 4 0,3 M sebanyak 100  mL.  Selanjutnya  tabung  reaktor  dimasukkan  ke dalam microwave kemudian diaduk dengan menggunakan  pengaduk  magnetik  dan  dipanaskan sampai suhu 100 ± 1 °C selama 8 menit (kecepatan pemanasan  sebesar  8  °C/menit).  Setelah  mencapai suhu 100 °C, proses hidrolisis dimulai dan berlangsung selama  90  menit  .Hasil  hidrolisis    berupa  campuran padatan dan cairan disajikan pada Gambar 1. Setelah itu,  campuran  padatan  dan  cairan  tersebut  disaring dengan kertas saring biasa, dilanjutkan dengan kertas saring Whatman ® No. 42, dan terakhir disaring dengan Millipore 0,45  m. Padatan yang diperoleh dari hasil penyaringan  kemudian  dikeringkan  untuk  diuji komposisinya  dengan Fourier-Transform  Infrared Spectroscopy (FTIR),  sedangkan  kandungan  gugus monosakarida  di  dalam  hidrolisat  dianalisis  dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
b. Fermentasi Fermentasi  dijalankan  di  dalam  labu  Erlenmeyer 250  mL  yang  berisi  100  mL  hidrolisat  dengan konsentrasi  kultur Saccharomyces  cerevisiae sebesar  5% berat. Fermentasi dijalankan dalam suhu 30 °C pada kondisi anaerob dalam shaking water bath selama 96 jam seperti  terlihat  pada  Gambar  2.  Hasil  fermentasi selanjutnya didistilasi pada suhu antara 96 dan 98 °C untuk  memisahkan  kandungan  bioetanol  dari pelarutnya.  Selanjutnya  konsentrasi  bioetanol  yang diperoleh dianalisis dengan GC.
Gambar  1.  Hasil  hidrolisis  Arthrospira  platensis (H 2 SO 4 0,3  M,  100  °C,  dan  90  menit) dengan bantuan gelombang mikro
Gambar 2. Fermentasi dalam shaking water bath pada suhu 30 °C selama 96 jam

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  hidrolisis  berupa  hidrolisat  dan  padatan. Selanjutnya komposisi padatan sisa hidrolis dianalisis dengan  FTIR  yang  bertujuan  untuk  mengetahui komponen  -  komponen  organik  yang  terkandung  di dalam sampel padatan tersebut. Untuk membandingkan  komponen  organik  sebelum  dan sesudah proses hidrolisis, maka dilakukan pula analisis FTIR  untuk  serbuk  Arthrospira  platensis  murni. Gambar 3 menunjukkan spektra FTIR untuk padatan sisa  hidrolisis  dan  serbuk Arthrospira  platensis murni. Sementara  itu,  komposisi  gugus  gula  reduksi  dalam hidrolisat dianalisis dengan HPLC.

## Ma’mun, Determination of Reducing Sugar …
Gambar  3.  Hasil  analisis  FTIR  untuk  Arthrospira platensis: (a) murni dan (b) biochar
Hasil analisis FTIR pada Gambar 3a menunjukkan bahwa intensitas peak tertinggi pada rentang bilangan gelombang  di  atas  2970  cm –1 terjadi  pada  bilangan gelombang  3278,35  cm –1 dimana  pada  bilangan gelombang  tersebut  menunjukkan  gugus  fungsi hidroksil  -OH  yang  termasuk  dalam  golongan senyawa  alkohol. Peak dengan  rentang  bilangan gelombang 2850 - 2970 cm –1 menunjukkan regangan vibrasi ikatan C-H yang merupakan golongan senyawa alkana dan peak dengan serapan kuat dan tajam pada rentang  bilangan  gelombang  1610  -  1680  cm –1 menunjukkan  regangan  vibrasi  ikatan  C=C  yang merupakan golongan senyawa alkena. Sementara itu, peak dengan rentang bilangan gelombang 1340 - 1470 cm –1 menunjukkan regangan vibrasi ikatan C-H yang merupakan  golongan  senyawa  alkana.  Pada peak di rentang  bilangan  gelombang  1050  -  1300  cm –1 menunjukkan  regangan  vibrasi  ikatan  C-O  dengan golongan  senyawa  alkohol,  eter,  asam  karboksilat, maupun  ester  [23,24].  Sementara  itu,  spektra  pada Gambar 3b menunjukkan kemiripan posisi peak antara sampel  padatan  sisa  hidrolisis  dengan  sampel mikroalga murni, sehingga dapat disimpulkan bahwa padatan  sisa  hidrolisis  mempunyai  komponen  yang identik dengan komponen dalam mikroalga murni.
Tabel 1. Konsentrasi gula reduksi sebelum dan setelah fermentasi
Gula Reduksi Waktu Retensi, menit Konsentrasi (g/L larutan) Konver si, % Sebelum Fermentasi Setelah Fermentasi L- Rhamnosa 5,9 0,75 0,48 36,0 D-Xylosa 8,5 0,60 0,57 5,0 L-Arabinosa 10,0 0,37 0,32 13,5 D-Mannosa 10,2 1,22 0,93 23,8 D-Glukosa 12,9 10,52 1,91 81,8 D-Galaktosa 14,6 2,34 0,32 86,3
Tabel 1 menunjukkan konsentrasi gula reduksi hasil uji  dengan  HPLC  dari  dua  sampel  hidrolisat Arthrospira  platensis masing-masing  sebelum  dan setelah fermentasi. Dari Tabel 1 terlihat bahwa semua konsentrasi gula reduksi mengalami penurunan setelah proses  fermentasi  karena  sebagian  telah  dikonversi menjadi bioetanol. Namun demikian, tidak semua gula reduksi dapat dikonversi menjadi bioetanol, hanya D- glukosa,  D-galaktosa,  D-mannosa,  dan  L-rhamnosa yang  sebagian  besar  terkonversi  menjadi  bioetanol (23,8 - 86,3%), hanya sebagian kecil L-arabinosa dan D-xylosa  yang  terkonversi  menjadi  bioetanol  (5,0  - 13,5%). Hal ini sesuai dengan hasil analisis Bera et al. [14] dimana D-glukosa, D-galaktosa, D-mannosa, dan L-rhamnosa  sebagian  besar  akan  dikonversi  menjadi alkohol  dengan  bantuan Saccharomyces  cerevisiae , sedangkan D-xylosa dan L-arabinosa dapat dikonversi menjadi  alkohol  jika  menggunakan Saccharomyces cerevisiae yang  telah  direkombinasi  dengan  cara rekayasa genetika.
Hidrolisat Arthrospira  platensis yang  telah difermentasi  selanjutnya  didistilasi  pada  suhu  96  - 98 °C. Dari 208,4 g hidrolisat yang didistilasi diperoleh distilat  campuran  bioetanol  dan  air  sebanyak  6,02  g. Selanjutnya  kadar  bioetanol  dalam  distilat  dianalisis dengan  GC  dan  diperoleh  kadar  bioetanol  sebesar 13,38%  atau  sebanyak  0,81  g  dari  total  distilat  yang setara  dengan  kadar  bioetanol  sebesar  3,90  g/L hidrolisat.  Jika  sisa  hidrolisat  pada  suhu  98  °C merupakan  campuran  biner  etanol  -  air  dan  bersifat ideal, maka secara teoritis kadar bioetanol di dalam sisa hidrolisat  pada  kondisi bubble  point 98  °C  tersebut sebanyak  12,84%  atau  seberat  25,98  g.  Perhitungan bubble  point didasarkan  dari  data  tekanan  uap  murni etanol  dan  air  yang  diperoleh  dari  Sinnot  [25].  Dari hasil  perhitungan bubble  point di  atas  terlihat  bahwa konsentrasi  bioetanol  dalam  hidrolisat  jauh  lebih tinggi dari pengukuran konsentrasi bioetanol dengan
(a)
(b)

## Ma’mun, Determination of Reducing Sugar …
GC. Hal ini menunjukkan bahwa hidrolisat terdiri dari campuran multikomponen.
Penelitian serupa telah dilakukan oleh Markou et al. [26]  dimana  proses  hidrolisis  dilakukan  pada  suhu 100°C selama 90 menit dengan menggunakan pelarut H 2 SO 4 0,25 M, sedangkan proses fermentasi dilakukan pada  suhu  30°C  dengan  menggunakan  ragi Saccharomyces  cerevisiae selama  24  jam  dan  diperoleh hasil  bioetanol  sebesar  16,27%  ±  0,97%  (g bioetanol/g biomassa). Sementara itu, hasil bioetanol yang diperoleh pada penelitian ini lebih rendah yaitu sebesar  8,05%  (g  bioetanol/g  biomassa)  meskipun menggunakan  konsentrasi H 2 SO 4 sedikit lebih tinggi (0,3  M).  Hal  ini  kemungkinan  terjadi  karena kandungan  karbohidrat  dalam  biomassa  mikroalga pada penelitian ini lebih rendah daripada kandungan karbohidrat dalam biomassa yang digunakan Markou et al. [26], sehingga bioetanol yang dihasilkan pun akan lebih  rendah.  Pada  penelitian  ini  tidak  dilakukan optimasi untuk mendapatkan kandungan karbohidrat yang  tinggi  karena  mikroalga  yang  digunakan  bukan berasal dari hasil kultivasi melainkan serbuk mikroalga kering yang dijual di pasaran.
Selain itu, jika dibandingkan dengan jenis biomassa yang lain, maka konsentrasi bioetanol yang diperoleh pada  penelitian  ini  hampir  sama  dengan  konsentrasi bioetanol hasil fermentasi dari duckweed ( Lemna minor ) seperti  yang  telah  dilakukan  oleh  Khodijah  dan Abtokhi [27], dimana proses fermentasi hidrolisat dari duckweed dilakukan  selama  5-7  hari  dengan memvariasikan konsentrasi ragi Saccharomyces cerevisiae sebesar 5, 15, dan 25%. Untuk konsentrasi ragi yang sama  dengan  penelitian  ini  (5%),  bioetanol  yang dihasilkan sebesar 5,00 g/L hidrolisat. Terlihat bahwa hasil  bioetanol  dari  fermentasi Arthrospira  platensis sedikit  lebih  rendah  (3,90  g/L  hidrolisat)  daripada duckweed karena durasi fermentasi duckweed lebih lama (6 hari) daripada durasi fermentasi Arthrospira platensis (4  hari).  Semakin  lama  waktu  fermentasi,  semakin banyak bioetanol yang dihasilkan. Selama kandungan gula  reduksi  belum  habis  dikonsumsi  oleh mikroorganisme  sebagai  sumber  makanan,  maka produksi bioetanol masih tetap berlangsung, sehingga konsentrasi  bioetanol  akan  semakin  meningkat  [28]. Namun  demikian,  konsentrasi  maksimum  bioetanol yang masih dapat ditoleransi oleh Saccharomyces cerevisiae sebesar 20% (v/v) [29, 30].

## KESIMPULAN
Konversi mikroalga Arthrospira platensis dilakukan dengan cara hidrolisis menggunakan pelarut asam  sulfat.  Hidrolisat  yang  diperoleh  selanjutnya difermentasi menggunakan Saccharomyces cerevisiae . Dari hasil  analisis  diperoleh  beberapa  gugus  gula  reduksi antara  lain  D-glukosa,  D-galaktosa,  D-mannosa,  L- rhamnosa, D-xylosa, dan L-arabinosa. Namun hanya D-glukosa dan D-galaktosa yang sebagian besar dapat dikonversi  menjadi  bioetanol  dengan  kadar  3,90  g bioetanol/L hidrolisat. Dengan tingginya kandungan D-glukosa  dan  D-galaktosa  di  dalam  hidrolisat diharapkan akan meningkatkan kadar bioetanol yang dihasilkan dari proses fermentasi.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Program  Studi  Teknik  Kimia,  Fakultas  Teknologi Industri,  Universitas  Islam  Indonesia,  Yogyakarta yang  telah  memberikan  dukungan  finansial  melalui Program  Penelitian  Dosen  dan  Mahasiswa  Tahun 2023  dengan  Surat  Perjanjian  Pelaksanaan  Penelitian No. 150/KajurTek.Kimia-S1/70/Prodi Tekim-
S1/VI/2023.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Badan  Pengkajian  dan  Penerapan  Teknologi,
"Indonesia Darurat Energi", https://www.bppt.go.id/teknologi-informasi-energi- dan-material/3296-bppt-indonesia-darurat-energi, diakses tanggal 10 Agustus 2023.
[2]  Kontan.co.id.,  "BPH  Migas  Dorong  Penggunaan LNG  sebagai  Bahan  Bakar  Kereta  Api", https://industri.kontan.co.id/news/bph-migas- dorong-penggunaan-lng-sebagai-bahan-bakar-kereta- api, diakses tanggal 1 Maret 2024.
[3]  Y. K. Dasan, M. K. Lam, S. Yusup, J. W. Lim, and K. T. Lee, “Life cycle evaluation of  microalgae biofuels production:  Effect  of   cultivation  system  on  energy, carbon emission and cost balance analysis,” Sci. Total Environ , vol. 688, pp. 112-128, June 2019.
[4]  E.  Sadatshojaei,  D.  A.  Wood,  and  D.  Mowla,  Third “Generation  of   biofuels  exploiting  microalgae, sustainable  green  chemical processes  and  their  allied application,” Springer , pp. 575-588, 2020.
[5]  J. J. Mayers, S. Vaiciulyte, E. Malmhäll-Bah, J. Alcaide- Sancho,  S.  Ewald,  A.  Godhe,  and  E.  Albers,

## Ma’mun, Determination of Reducing Sugar …
“Identifying  a  marine  microalga  with  high carbohydrate productivities under stress and potential for efficient flocculation,” Algal Res. , vol. 31, pp. 430- 442, March 2018.
[6]  S. Tang, C. Qin, H. Wang, S. Li, and S. Tian, “Study on supercritical  extraction  of   lipids  and  enrichment  of DHA from oil-rich microalgae,” J. Supercrit. Fluids , vol. 57, no.1, pp. 44-49, January 2011.
[7]  J. H. Hwang, A. N. Kabra, M. K. Ji, J. Choi, M. M. El- Dalatony,  and  B.  H.  Jeon,  “Enhancement  of continuous fermentative bioethanol production using combined  treatment  of   mixed  microalgal  biomass,” Algal Res. , vol. 17, pp. 14-20, April 2016.
[8]  A.  Krishnamoorthy,  C.  Rodriguez,  and  A.  Durrant,
“Optimisation  of   ultrasonication  pretreatment  on microalgae  chlorella  vulgaris  &  nannochloropsis oculata  for  lipid  Etraction  in  biodiesel  production,” Energy , vol. 278, p. 128026, June 2023.
[9]  Q. Fu, C. Xiao, Q. Liao, Y. Huang, A. Xia, and X. Zhu, “Kinetics of  hydrolysis of  microalgae biomass during hydrothermal  pretreatment,” Biomass  Bioenergy ,  vol. 149, p. 106074, April 2021.
[10] M.  A.  Kassim  and  S.  Bhattacharya,  “Dilute  alkaline pretreatment  for  reducing  sugar  production  from Tetraselmis suecica and Chlorella sp. Biomass,” Process Biochem , vol. 51, no. 11, pp. 51, 1757-1766, November 2016.
[11] S.  K.  Thangavelu,  T.  Rajkumar,  D.  K.  Pandi,  A.  S. Ahmed,  and  F.  N.  Ani,  “Microwave  assisted  acid hydrolysis  for  bioethanol  fuel  production  from  sago pith waste,” Waste Manage , vol. 86, no. 1,  pp. 80-86, January 2019.
[12] K. L. Yu, W. H. Chen, H. K. Sheen, J. S. Chang, C. S. Lin,  H.  C.  Ong,  and  T.  C.  Ling,  “Bioethanol production  from  acid  pretreated  microalgal hydrolysate  using  microwave-assisted  heating  wet torrefaction,” Fuel ,  vol.  279,  no.  1,  p.  118435,  June 2020.
[13] Y. Zhang, S. Soldatov, I. Papachristou, N. Nazarova, G. Link,  W.  Frey,  and  S.  Silve,  “Pulsed  microwave pretreatment  of   fresh  microalgae  for  enhanced  lipid extraction,” Energy , vol. 248, no. 1, p. 123555, February 2022.
[14] A.  K.  Bera,  M.  Sedlak,  A.  Khan,  and  N.  W.  Y.  Ho, “Establishment  of   L-arabinose  fermentation  in glucose/xylose co-fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae 424A (LNH-ST) by genetic engineering,” Appl. Microbiol. Biotechnol , vol. 87, no. 5, pp. 1803-1811, May 2010.
[15] B.  H.  Um  and  Y.  S.  Kim,  “A  chance  for  Korea  to advance algal-biodiesel technology,” J. Ind. Eng. Chem., vol. 15, no. 1, pp. 1-7, January 2009.
[16] R. Harun, B. Liu,  and M. K. Danquah,  “Analysis of process  configurations  for  bioethanol  production from  microalgal  biomass,  in:  S.  S.  Shaukat  (Ed), progress  in  biomass  and  bioenergy  production,” Intechopen.com , pp. 1-14, July 2011.
[17] U.  Jena,  K.  C.  Das,  and  J.  R.  Kastner,  “Effect  of operating conditions of  thermochemical liquefaction on  biocrude  production  from  Spirulina  platensis,” Bioresour. Technol ., vol. 102, no. 10, pp. 6221-6229, May 2011.
[18] B. M. Chagas, C. Dorado, M. J. Serapiglia, C. A. Mullen, A. A. Boateng, and M. A. Melo, “Catalytic pyrolysis- GC/MS  of   Spirulina:  evaluation  of   a  highly proteinaceous biomass source for production of  fuels and chemicals,” Fuel vol. 179, pp. 123-134, September 2016.
[19] R. D. P. Rodrigues, F. C. de Castro, R. S. de Santiago- Aguiar,  and  M.  V.  P.  Rocha,  “Ultrasound-assisted extraction  of   phycobiliproteins  from  Spirulina (Arthrospira)  platensis  using  protic  ionic  liquids  as solvent,” Algal Res., vol. 31, pp. 454-462, March 2018.
[20] M. Tourang, M. Baghdadi, A. Torang, and S.  Sarkhosh, “Optimization  of   carbohydrate  productivity  of Spirulina microalgae  as  a  potential  feedstock  for bioethanol production,” Int. J. Environ. Sci. Technol., vol. 16, pp. 1303-1318, 2019.
[21] E. B. Werlang, J. Julich, M. V. G. Muller, F. de Farias Neves,  E.  Sierra-Ibarra,  A.  Martinez,  and  R.  C.  S. Schneider,  “Bioethanol  from  hydrolyzed  Spirulina ( Arthrospira  platensis )  biomass  using  ethanologenic bacteria,” Bioresour. Bioprocess, vol. 7, no.1, pp. 1-9, May 2020.
[22] Kusmiyati, A. Heratri, S. Kubikazari, A. Hidayat, and Hadiyanto,  “Hydrolysis  of   microalgae  Spirulina platensis, Chlorella sp., and macroalgae Ulva lactuca for bioethanol production,” Int. Energy J., vol. 20, no. 4, pp.
611-620, December 2020.
[23] D. A. Skoog, F. J. Holler, and S. C. Crouch. Principle of   Instrumental  Analysis,  7th  ed.,  Boston:  Cengage Learning, 2018.
[24] A.  B.  D.  Nandiyanto,  R.  Oktiani,  and  R.  Ragadhita, “How  to  read  and  interpret  FTIR  spectroscope  of organic material,” IjoST , vol. 4, no. 1, pp. 97-118, April 2019.
[25] R.  K.  Sinnot.  Coulson  &  Richardson’s  -  Chemical Engineering  Design,  4 th ed.,  vol.  6.  Oxford,  MA: Elsevier Butterworth-Heinemann, 2005.
[26] G.  Markou,  I.  Angelidaki,  E.  Nerantzis,  and  D. Georgakakis, “Bioethanol production by carbohydrate-enriched  biomass  of   Arthrospira ( Spirulina ) platensis,” Energies, vol. 6, no. 8, pp. 3937- 3950, August 2013.

## Ma’mun, Determination of Reducing Sugar …
[27] S. Khodijah and A. Abtokhi, “Analisis pengaruh variasi persentase ragi ( Saccharomyces cerevisiae ) dan waktu pada proses fermentasi dalam pemanfaatan duckweed ( Lemna minor ) sebagai bioetanol”, Jurnal Neutrino, vol. 7, no 2, pp. 71-76, April 2015.
[28] M.  E.  Legaz,  R.  de  Armas,  E.  Barriguete,  and  C. Vicente,  “Binding  of   soluble  glycoproteins  from sugarcane juice to cells of acetobacter diazotrophicus,” J. Internatl. Microbiol., vol. 3, no. 3, pp. 177-182, September 2000.
[29] P. M. R. Guimarães, J.A. Teixeira, and L. Domingues,
“Fermentation of  lactose to bio-ethanol by yeasts as part  of   integrated  solutions  for  the  valorisation  of cheese whey,” Biotechnol. Adv., vol. 28, no. 3, pp. 375- 384, May-June 2010.
[30] C. Kasavi, I. Finore, L. Lama, B. Nicolaus, S. G. Oliver, O. E. T. Oner, and B. Kirdar, “Evaluation of  industrial Saccharomyces  cerevisiae strains  for  ethanol  production from biomass,” Biomass Bioenergy vol. 45, pp. 230-238, October 2012.