## Pengaruh Bahan Sterilan terhadap Keberhasilan Inisiasi Eksplan
Paulownia ( Paulownia elongata SY Hu) secara In Vitro
The Effect of Sterilant Material on the Success of Initiation Pulownia Explant (Paulownia elongata SY Hu ) by In Vitro

## Arum Sekar Wulandaridan Sabar Sampulan Nasution
Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan IPB

## ABSTRACT
The  availability  of  minimal  seed  requires  alternative  reproduction  system  of  paulownia.  In  vitro  culture  is  used  as one  of  the  solutions  in  the  reproduction  of  paulownia.  In  in  vitro  cultural  contamination  is  the  main  problem  in  the initiation phase. This research studies about the influence of sterilization treatment  to the percentage of contamination, browning,  and  induction  of  paulownia  bud.  Sterilization  techniques  give  the  same  effect  against  the  percentage  of contamination, browning, and induction of paulownia bud. The sterilization technique used in the study consisted of four treatment such as  A (fungicide 0.2 g/L, bactericidal 0.2 g/L, NaOCl 20%, 15%, 10%), B (fungicide 2 g/L, bactericidal 2 g/L, NaOCl 15%, 10%, 5%), C (fungicide 0.2 g/L,  bactericidal 0.2 g/L, detergent 20%, 15%, 10%), dan D (fungicide 2 g/L, bactericidal 2 g/L. Contamination that happened 93.96 % caused by bacteria and 11.5 % by fungi. Eksplan that is free from contamination and browning show the development of the aksilar. There is the development of a callus on some eksplan because the rates of hormone endogenous which is quite high. It strengthened by 100% the formation of callus on the stage multiplication by the addition of regulator substance growing auksin in small quantities.
Keywords: axillary bud, browning, contamination, paulownia,  sterilization

## PENDAHULUAN
Sepanjang  tahun  2011  tercatat  jumlah  lahan kritis  di  Indonesia  sebesar  27.294.842  ha  (Dirjen DAS  dan  Pengelolaan  Sosial).  Dalam  upaya pemulihan  lahan  kristis  diperlukan  pemilihan tanaman  yang  tepat  agar  waktu  yang  dibutuhkan untuk penghijaun kembali relatif lebih singkat dan memberikan  hasil  bagi  masyarakat.  Jenis  tanaman fast  growing  species menjadi  pilihan  dalam pemulihan  kembali  lahan-lahan  yang  kritis,  salah satunya adalah paulownia.
Paulownia  merupakan  tanaman  yang  memiliki pertumbuhan  yang  cepat  dan  mampu  hidup  pada lahan-lahan kritis serta memiliki karakteristik kayu yang  baik  sehingga  sangat  potensial  dalam mendukung pemenuhan kebutuhan industri perkayuan  seperti veneer , playwood ,  furnitur,  dan kertas.  Paulownia  dapat  diperbanyak  secara generatif  dan  vegetatif.  Perbanyakan  paulownia secara  generatif  sulit  diterapkan  karena  sulitnya memperolah  benih  mengingat  paulownia  berasal dari Cina.
Perbanyakan tanaman melalui kultur jaringandapat menghasilkan tanaman dalam jumlah besar yang berasal dari satu tanaman induk. Selain itu  dengan  teknik  tersebut  dapat  dihasilkan tanaman  yang  bebas  dari  penyakit  dan  memiliki sifat  genetik  yang  sama  dengan  induknya.  Oleh karena  itu  penelitian  tentang  Pengaruh  Bahan
Sterilan  Terhadap  Keberhasilan  Inisiasi  Eksplan Paulownia ( Paulownia elongata SY Hu) Secara In Vitro perlu dilakukan.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji pengaruh  teknik  sterilisasi  pada  inisiasi  eksplan paulownia terhadap persentase kontaminasi, browning ,  dan  pertumbuhan  pucuk  eksplan paulownia  melalui  teknik in  vitro .  Penelitian  ini diharapkan  dapat  memberikan  informasi  tentang teknik  sterilisasi  yang  efektif  (konsentrasi  dan lamanya  waktu  perendaman)  pada  paulownia dalam  mengatasi  masalah  kontaminasi  dan browning yang  sering  terjadi  saat  mengisolasi bagian tanaman untuk menghasilkan tanaman yang steril.  Selain  itu  dengan  penelitian  ini  diharapkan dapat memberikan alternatif dalam memilih bahan sterilisasi  yang  tepat  dan  mudah  didapat  dalam melakukan perbanyakan tanaman melalui teknik in vitro .

## BAHAN DAN METODE

## Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian  dilaksanakan  di  laboratorium Silvikultur,  Fakultas  Kehutanan  Institut  Pertanian Bogor  (IPB).  Penelitian  dilaksanakan  selama  ± delapan  bulan  yaitu  dari  bulan  Juni  2012  sampai dengan Januari 2013.

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah bahan tanam (eksplan) dari bibit paulownia, media  tanam  Murashige  dan  Skooge  (MS),  gula, zat  pengatur  tumbuh  NAA  dan  BA,  serta  bahan- bahan  sterilan  berupa  deterjen,    fungisida  (bahan aktif:  mankozeb  80%),  bakterisida  (bahan  aktif: streptomisin sulfat 20%), NaOCl 20%, 15%, 10%, 5%,  deterjen  20%,  15%,  10%,  5%,  alkohol  70%, alkohol  95%,  antiseptik  (bahan aktif:  mundidone), dan air steril.

## Alat
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini antara  lain  botol  kultur,  gelas  piala,  labu enlenmeyer,  labu  ukur,  cawan  petri,  pipet,  pipet bulp,  sendok  takar,  spatula,  gunting,  pinset, skalpel ,  lampu  bunsen,  timer,  sprayer,  kertas lakmus, tissue, plastik, karet gelang, sarung tangan, timbangan  analitik, magnetik  stirer ,  oven,  otoklaf, laminar  air  flow ,  dan  ruang  kultur  serta  alat-alat lainnya  yang  biasa  digunakan  dalam  kegiatan in vitro .

## Prosedur Kerja

## Penyiapan Alat dan Bahan Tanaman
Semua  alat-alat  yang  dibutuhkan  dalam proses kegiatan terlebih dahulu disterilisasi. Bahan tanaman  yang  berasal  dari  bibit  yang  diperbanyak secara  generatif  terlebih  dahulu  dipangkas  untuk mendapatkan  pucuk-pucuk  muda  dalam  jumlah besar  dan  disemprot  dengan  fungisida  dan bakterisida untuk meminimalkan sumber kontaminan yang berasal dari eksplan.

## Sterilisasi Alat
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  kegiatan tersebut  harus  dalam  keadaan  steril.  Alat-alat logam  (pinset,  gagang  scalpel,  gunting,  dll),  gelas (cawan  petri,  botol  kultur,  pipet,  dll)  dibungkus dengan  kertas  kemudian  disterilisasi  dengan otoklaf pada suhu 121 o C selama ± 60 menit. Pada saat  penanaman  alat  yang  digunakan  disterilisasi dengan  mencelupkannya  ke  dalam  alkohol  70% dan membakarnya dengan bunsen. Alat-alat logam dan  kaca  (pipet  dan  cawan  petri)  setelah  di sterilisasi  selanjutnya  disimpan  di  dalam  oven dengan  suhu  50 o C  sampai  alat-alat  tersebut digunakan dan botol kultur disimpan di dalam rak inisiasi.

## Sterilisasi Air
Air yang digunakan berasal dari air kemasan yang  disterilisasi  dengan  otoklaf.  Air  dimasukkan ke  dalam  botol  kultur  sebanyak  1/3  volume  botol. Mulut  botol  ditutup  dengan  plastik  dan  diikat dengan  karet  gelang  agar  air  tidak  menguap.
Sterilisasi air dilakukan selama ±30 menit. Setelah selesai, air steril disimpan di dalam ruang inkubasi sampai digunakan dalam penanaman.

## Pembuatan Media
Media  yang  digunakan  adalah  media  MS (Murashige  dan  Skoog)  lengkap  yang  telah ditambahkan vitamin, asam amino, sumber energi, dan  pemadat  media.  Media  yang  digunakan merupakan  media  kultur  siap  pakai  berupa  bubuk kering.  Media  dimasukkan  ke  dalam  500  mL  air kemudian  diaduk  hingga  rata.  Sumber  energi diperoleh dengan pemberian gula sebanyak 30 g/L yang  dilarutkan  dalam  200  mL  air  kemudian ditambahkan  ke  dalam  larutan  media  dan  pH diukur hingga berkisar 5.5−5.8 sebelum ditambahkan bahan pemadat. Media dipanaskan di atas  pemanas  dengan  magnetik  stirer  kemudian ditambahkan  agar-agar  sebanyak  8  g/L  secara perlahan  sambil  diaduk.  Kemudian  ditambahkan air  sampai  tepat  mencapai  1000  mL.  Pemanasan media dilakukan sampai media mendidih. Selanjutnya  media  dituangkan  ke  dalam  botol kultur  dengan  ketebalan  media  ±  1  cm,  ditutup rapat dengan plastik dan diikat dengan karet gelang serta disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121 o C tekanan 1 atm selama 15 menit.

## Sterilisasi Lingkungan Kerja
Sebelum penanaman permukaan laminar air flow disterilisasi  dengan  menyalakan  lampu ultraviolet  selama  ±  30  menit  untuk  membunuh kontaminan  yang  terdapat  di  permukaan  meja kerja. Meja kerja disemprot terlebih dahulu dengan alkohol  70%,  dibersihkan  dengan  tissue  dan kemudian  blower  dinyalakan  untuk  meniupkan udara  steril  secara  kontinu  melewati  tempat  kerja. Tangan pekerja juga disterilkan dengan menyemprotkan  alkohol  70%  serta  menggunakan jas  laboratorium  dan  masker  untuk  menghindari kontaminan yang berasal dari pekerja.

## Sterilisasi Eksplan
Eksplan yang diambil dari lapangan dimasukkan ke dalam wadah yang berisi air untuk menjaga  kadar  air  eksplan.  Kemudian  dibersihkan di  bawah  air  mengalir  dengan  menyikat  bagian- bagian  tanaman.  Selanjutnya  direndam  dalam  air yang  telah  diberi  deterjen  2  g/100  mL  dan dilanjutkan  dengan  perendaman  eksplan  di  dalam 100  mL  air  yang  telah  ditambahkan  deterjen secukupnya  kemudian  dibilas  dengan  air  mengalir hingga  bersih.  Setelah  itu  ukuran  eksplan diperkecil  lagi  dan  direndam  dalam  larutan fungisida  dan  bakterisida  selam  30  menit  serta dibilas  hingga  bersih  di  bawah  air  mengalir.  Pada tahap akhir, sterilisasi dilakukan di dalam laminar air  flow dengan  perendaman  eksplan  ke  dalam alkohol  70%,  larutan  NaOCl  selama  20,  15,  10,
dan  5  menit),  antiseptik,  dan  pembilasan  dengan air steril.

## Penanaman Eksplan
Eksplan  yang  telah  disterilisasi  diambil dengan menggunakan pinset yang telah dicelupkan ke  dalam  larutan  alkohol  dan  ditanam  pada  media MS 0. Selanjutnya  pada  multiplikasi  ekplan  steril yang  telah  tumbuh  di  dalam  media  MS 0 dipindahkan  ke  dalam  media  MS  yang  telah ditambahkan  zat  pengatur  tumbuh  berupa  NAA dan BA.

## Pemeliharaan
Botol-botol  kultur  yang  telah  berisi  eksplan dimasukkan  ke  dalam  ruang  inkubasi.  Selanjutnya dilakukan  pengamatan  dan  memisahkan  botol- botol yang telah terkontaminasi.

## Analisis Data
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  satu faktor yang terdiri dari empat taraf perlakuan yaitu A  (fungisida  0.2  g/L,  bakterisida  0.2g/L,  NaOCl 20%, 15%, 10%), B (fungisida 2 g/L, bakterisida  2 g/L, NaOCl 15%, 10%, 5%), C (fungisida 0.2 g/L, bakterisida  0.2 g/L, deterjen 20%, 15%, 10%), dan D  (fungisida  2  g/L,  bakterisida  2  g/L,  deterjen 15%,  10%,  5%).  Jumlah  ulangan  setiap  perlakuan adalah empat kali ulangan dan terdiri dari sepuluh unit percobaan berupa botol kultur.

## Persen kontaminasi
Perhitungan  persen  kontaminasi  dihitung dengan cara:
% Kontaminasi = ∑ eksplan yang terkontaminasi/
jumlah seluruh eksplan
Persen Browning Persentasi browning dihitung dengan cara:
% Browning = ∑ eksplan yang terjadi browning / jumlah seluruh eksplan
Persen Pembentukan Tunas Persentasi  pembentukan  tunas  dihitung dengan cara:
% pembentukan tunas = ∑ pembentukan tunas / jumlah seluruh eksplan
Pengolahan  data  hasil  pengamatan  pada penelitian  ini  dibantu  dengan  menggunakan program SPSS 18 for windows .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tingkat Kontaminasi
Gambar 1  Tingkat kontaminasi dan jenis
kontaminan eksplan paulownia
Dari  hasil  analisis  ragam  diperoleh  nilai  F hitung  sebesar  0.626  dan  nilai  Sig.  0.612 menunjukkan bahwa teknik sterilisasi dari keempat perlakuan  tidak  berbeda  nyata  terhadap  tingkat kontaminasi  pada  eksplan  paulownia  karena  nilai P  >  0.05.  Dengan  demikian  penggunaan  keempat bahan  sterilan  memberikan  pengaruh  yang  sama terhadap tingkat kontaminasi eksplan paulownia.
Dalam  kultur in  vitro kontaminasi  merupakan masalah  utama  dalam  tahap  inisiasi  pertama. Kontaminasi  pada  kultur  eksplan  paulownia tersebut  disebabkan  oleh  mikroorganisme  berupa bakteri  dan  fungi.  Kontaminasi  didominasi  oleh bakteri  dengan  nilai  100%  pada  perlakuan  A  dan B,  94.1%  pada  perlakuan  C,  dan  81.8%  pada perlakuan  D,  sedangkan  fungi  memberikan pengaruh  yang  relatif  lebih  kecil  dengan  masing- masing  nilai  8.3%  (A),  4.5%  (B),  5.9%  (C),  dan 27.3%  untuk  perlakuan  D.  Dengan  demikian tingkat  kontaminasi  yang  terjadi  pada  eksplan paulownia,  93.96%  disebabkan  oleh  bakteri  dan 11.5% disebabkan oleh fungi.
Hasil  pengamatan  selama  lima  minggu  setelah inokulasi  menunjukkan  kontaminasi  yang  terjadi berasal  dari  eksplan  dan  media  kultur.  Masing- masing  kontaminan  baik  bakteri  maupun  fungi terdiri  dari  beberapa  jenis,  ada  yang  berwarna putih,  merah,  dan  coklat  kehitaman.  Kontaminasi mulai  terjadi  pada  minggu  pertama  pengamatan dan  meningkat  pada  minggu  kedua,  sedangkan pada minggu berikutnya stabil (Gambar 2).
0 20 40 60 80 100 120 A B C D T ing k a t K o nta m ina si % Sterilisasi Kontaminasi (K)
Bakteri Jamur Fungi
Gambar  2  Laju  tingkat  kontaminasi  eksplan paulownia selama lima minggu
setelah inokulasi
Dari  hasil  analisis  ragam  diperoleh  nilai  F hitung  sebesar  0.430  dan  nilai  Sig.  sebesar  0.735 menunjukkan  teknik  sterilisasi  dari  keempat perlakuan  tidak  berbeda  nyata terhadap  persentase browning pada eksplan paulownia karena nilai P > 0.05.  Penggunaan  bahan  sterilan  memberikan pengaruh yang sama terhadap persentase browning eksplan paulownia.
Gambar  3  menunjukkan  persentase browning pada kultur eksplan paulownia selama lima minggu setelah  inokulasi.  Tingkat browning tertinggi terjadi  pada  perlakuan  C  45%,  kemudian  diikuti oleh perlakuan B, D, dan A dengan masing-masing nilai  sebesar  42.5%,  35%,  dan  32.5%. Browning merupakan proses kemunduran fisiologi dari suatu eksplan  yang  sering  dijumpai  pada  kultur in  vitro . Dalam  kultur in  vitro sering  dijumpai  peristiwa browning yang  pada  akhirnya  menghambat perkembangan  dari  suatu  eksplan.  Masalah browning pada  kultur  eksplan  paulownia  mulai terjadi pada minggu pertama setelah inokulasi dan terus meningkat sampai akhir pengamatan (Gambar 4).

## Tingkat Persentase Browning
Penggunaan  bahan  sterilan  selain  menghambat perkembangan  mikroorganisme  kontaminan  juga dapat  menyebabkan  eksplan  mengalami browning terutama  pada  bahan  tanaman  yang  relatif  muda. Proses browning akan  menghambat  pertumbuhan eksplan  dan  menurunkan  fungsi  fisiologi  dari eksplan  hingga  eksplan  mengalami  kematian (Gambar 5).
Gambar 3  Tingkat browning pada eksplan paulownia  selama  lima  minggu  setelah inokulasi
Gambar 4  Laju  tingkat browning pada  eksplan paulownia selama lima minggu setelah inokulasi
Gambar 5  Eksplan yang tumbuh normal (kiri) dan eksplan  yang  mati  akibat  proses browning (kanan)

## Persentase  Pembentukan  Tunas  dan  Multi- plikasi Eksplan
Teknik  sterilisasi  dari  keempat  perlakuan  juga memberikan  pengaruh  yang  sama  terhadap persentase pembentukan tunas. Dari analisis ragam dihasilkan  nilai  F  hitung  sebesar  0.235  dan  Sig. 0.870  sehingga  nilai  P  >  0.05  yang  menunjukkan pelakuan  yang  diberikan  tidak  berbeda  nyata terhadap persentase pembentukan pucuk.
0 20 40 60 80 1 2 3 4 5 T ingk at K ontam inasi % Pengamatan ke (MSI) 1 A 2 B 3 C 4 D 32.5% 42.5% 45% 35% 0 10 20 30 40 50 A B C D T ingk at B row ni ng % Perlakuan Sterilisasi 0 10 20 30 40 50 1 2 3 4 5 T ingk at B row ni ng % Pengamatan ke (MSI) 1 A 2 B 3 C
4 D
Gambar 6  Persentase  pertumbuhan  tunas  eksplan paulownia  selama  lima  minggu  setelah inokulasi Persentase pembentukan tunas eksplan paulownia  relatif  kecil,  hal  ini  sejalan  dengan tingginya  tingkat  kontaminasi  dan browning pada eksplan  paulownia.  Pola  pertumbuhan  eksplan paulownia  sama  pada  semua  perlakuan  yaitu terbentuknya  pucuk-pucuk  aksilar  pada  eksplan yang  bebas  dari  kontaminasi  dan browning . Namun pada beberapa eksplan terdapat pertumbuhan  tunas  aksilar  yang  diikuti  dengan pembentukan  kalus  pada  bagian  pangkal  eksplan (Gambar 7).
Gambar 7  Pertumbuhan tunas aksilar secara normal  (A),  pertumbuhan  tunas  yang diikuti dengan pertumbuhan kalus pada pangkal eksplan (B dan C)
Terjadinya  pembentukan  kalus  pada  eksplan paulownia  yang  menggunakan  media  MS 0 atau tanpa  penambahan  zat  pengatur  tumbuh  (ZPT) diduga  karena  eksplan  paulownia  memiliki kandungan hormon endogen yang tinggi dan cukup dominan  ke  arah  pembentukan  kalus,  sehingga tanpa  penambahan  zat  pengatur  tumbuh  eksplan mampu  membentuk  kalus.  Eksplan  paulownia telah  membentuk  tunas  pada  minggu  pertama setelah inokulasi. Sekitar 68.75% eksplan paulownia  mulai  membentuk  tunas  pada  minggu pertama  dan  jumlah  eksplan  yang  hidup  menurun pada  minggu  berikutnya  akibat  adanya  konta- minasi dan browning pada eksplan (Gambar 8).
Pada  tahap  multiplikasi  eksplan  paulownia pemberian  zat  pengatur  tumbuh  NAA  dan  BA
mengarahkan ekspresi pertumbuhan eksplan kepada pembentukan kalus (Gambar 9).
Gambar 8  Laju penurunan persentase hidup eksplan paulownia selama lima minggu setelah inokulasi
Gambar 9  Kalus  yang  terbentuk  dari  eksplan potongan batang tanpa nodus (A), kalus yang mulai mengalami pencoklatan (B), kalus yang berpotensi untuk berorganogenisis (C)
Pada  akhir  pengamatan  (4  MSI)  ditemukan 100%  eksplan  membentuk  kalus  dari  semua sumber eksplan baik ujung pucuk, potongan batang satu nodus, dan potongan batang tanpa nodus. Hal ini  menunjukkan  tingginya  hormon  endogen  yang terdapat  pada  eksplan  paulownia  dan  lebih dominan dalam pembelah sel (pembentukan kalus).

## KESIMPULAN
Semua  perlakuan  sterilisasi  yang  diterapkan menunjukkan  pengaruh  yang  sama  terhadap peubah yang diamati yaitu kontaminasi, browning , dan pertumbuhan pucuk aksilar. Kontaminasi yang terjadi  didominasi  oleh  bakteri  sebanyak  93.96% dan  11.5%  disebabkan  oleh  fungi.  Penggunaan bahan  sterilan  selain  menghilangkan  sumber kontaminan  juga  memberikan  dampak  terhadap terjadinya proses browning pada eksplan paulownia.    Tingginya  hormon  endogen  pada eksplan mendorong terbentuknya kalus pada tahap inisiasi pertama dan multiplikasi eksplan paulownia. 7.5% 7.5%
12.5%   12.5% 0 10 20 A B C D P er tumbuhan t un as (% ) Perlakuan Sterilisasi 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 P enurun an pert umbuhan pu cuk % Pengamatan ke (MST) 1 A 2 B 3 C 4 D
A B C A B C

## SARAN
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  awal, sehingga  perlu  dilakukan  penelitian  lanjutan dengan menambahkan asam askorbat dan polivinilpirolidon (PVP)  sebagai  perlakuan  untuk mengatasi  masalah browning .  Dalam  tahap multiplikasi dapat ditambahkan ZPT dari golongan sitokinin tanpa penambahan auksin untuk menghindari terjadinya pembentukan kalus.

## DAFTAR PUSTAKA
El-Showk  S,  El-Showk  N.    2003.    The  paulownia tree  an  alternative  for  sustainable  forestry.  The Farm  [internet].  [diunduh  2012  September  5].
Tersedia pada:
http://www.cropdevelopment.org/docs/Paulown iaBooklet.pdf.
Gunawan  I.    2007.    Perlakuan  sterilisasi  eksplan anggrek  kuping  gajah  ( Bulbophyllum  beccarii Rchb.f)  [skripsi].  Bogor:  Fakultas  Kehutanan. Institut Pertanian Bogor.
Nuhaimi-Haris,  Sumaryono,  Carron  MP.    2009. Pengaruh  bahan  pra-sterilan,  tutup  tabung kultur, dan musim terhadap tingkat kontaminasi eksplan pada kultur microcutting karet. Menara Perkebunan 77(2):89-99.
Nurhaimi-Haris,  NS  Ayuningtias,  IH  Suparto. 2011.    Pengaruh  ventilasi  terhadap  morfologi, stomata,  dan  kadar  klorofil  tunas  karet  yang diperbanyak  melalui microcutting . Menara Perkebunan 79(2):57-63.
Zulkarnain.  2009. Teknik Kultur Jaringan Solusi Perbanyakan  Tanaman  Budidaya .  Jakarta:  PT Bumi Aksara.