## Original Article
The Effect of Methanolic Extract and Ethyl Acetate Fraction of Kepel Fruit (Stelechocarpus burahol) to α-Glutathione S-Transferase Enzyme Concentration of Rat Liver and Blood Induced by CCl 4
Pengaruh  Ekstrak  Metanolik  dan  Fraksi  Etil  Asetat  Buah  Kepel  (Stelechocarpus burahol)  terhadap  Konsentrasi  Enzim  α-Glutation  S-Transferase  Hepar  dan  Darah Tikus yang diinduksi CCl 4
Yusuf Rabbani 1 *, Claude Mona Airin 2 , Sugeng Riyanto 1,3
1 Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, 55281 Indonesia
2 Departemen Anatomi dan Fisiologi Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada, Indonesia
3 Departemen Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, 55281 Indonesia
*Corresponding author: Yusuf Rabbani | Email: yusufrabbani36@gmail.com
Received: 1 July 2020; Revised: 30 August 2020; Accepted: 5 September 2020; Published: 26 October 2020
Abstract: Degenerative diseases are mostly cause by high free radical concentrations in the body. Kepel fruit (Stelechocarpus burahol) is known to contain flavonoid compounds, a class of compounds that has free radical scavenging activity in the body and could affect the activity of antioxidant enzymes. There have been reports that  methanolic  extract  and  ethyl  acetate  fractions  of  Kepel  fruit  have  the  lowest  IC 50 values,  compared  to extracts  or  fractions  which  are  made  using  other  organic  solvents,  on  in  vitro  assays  so  that  flavonoids  are suspected as responsible compounds to the free radical scavenging activity. This study aimed to identify the presence of flavonoid content in methanolic extract and the fraction of ethyl acetate of Kepel fruit and also its effect on rat alpha Glutathione S-Transferase (α-GST) enzyme concentration for the function to prevent hepatic cell  damage  due  to  carbon  tetrachloride  exposure.  The  identification  of  flavonoids  content  used  a  series  of color chemical reaction tests and thin layer chromatography that used silica gel 60F 254 as the solid phase and mixture of ethyl acetate, formic acid, glacial acetic acid, and water (100: 11 : 11: 20 v/v) as the mobile phase. This study used 30 Sprague-Dawley female rats (age 2-3 months) that were grouped into 5 groups as solvent control (CMC-Na) group, negative control (CCl 4 ) group, positive control (vitamin C) group, methanolic extract group, and ethyl acetate fraction group. All groups were induced with carbon tetrachloride (CCl 4 ) compounds except for the CMC-Na solvent control group. Blood sampling at 0 h, 24 h, and 72 h, while liver sampling at 24 h  and  72  h,  with  3  samples  each  group.  The  analysis  of  rat  α-GST  enzyme  concentrations  used  the Enzyme-linked  Immunosorbent  Assay  (ELISA)  method.  Based  on  the  phytochemical  test,  the  methanolic extract and the ethyl acetate fraction of Kepel fruit have been identified contains flavonoids compound. Based on  the  in  vivo  study,  the  positive  control  group's  α-GST  enzyme  concentration  was  decreased,  while  the negative  control  group's  α-GST  enzyme  concentration  was  increased.  Administration  of  methanolic  extract and  ethyl  acetate  fraction  also  decreased  both  liver  and  blood  rat  α-GST  enzyme  concentrations,  although without  significant  correlation,  and  still  could  prevent  the  hepatic  cell  damage  due  to  carbon  tetrachloride exposure.
Keywords: Methanolic extract of Kepel fruit; Ethyl acetate fraction of Kepel fruit; Flavonoid; α-GST enzyme concentration
Abstrak:  Penyakit  degeneratif  banyak  disebabkan  oleh  adanya  radikal  bebas  dengan  konsentrasi  di  atas normal.  Buah  kepel  (Stelechocarpus  burahol)  diketahui  mengandung  senyawa  flavonoid  yang  diketahui memiliki  aktivitas  penangkapan  radikal  bebas  di  dalam  tubuh  dan  mempengaruhi  aktivitas  enzim antioksidan. Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi adanya kandungan flavonoid dalam ekstrak metanolik dan  fraksi  etil  asetat  buah  kepel  serta  mempelajari  pengaruhnya  terhadap  konsentrasi  enzim  α-Glutathione S-Transferase (α-GST)  tikus dalam kaitannya dengan pencegahan kerusakan sel hepar akibat paparan karbon tetraklorida.  Identifikasi  adanya  flavonoid  diuji  menggunakan  uji  reaksi  kimia  warna  dan  uji  kromatografi lapis tipis dengan fase diam silika gel 60F254 dan fase gerak berkomposisi etil asetat, asam format, asam asetat glasial, dan air (100 : 11 : 11 : 20 v/v). Pengujian secara in vivo pada penelitian ini menggunakan tikus galur Sprague-Dawley  betina  (umur  2-3  bulan) sebanyak  30  ekor  yang  dikelompokkan  menjadi  5  kelompok,  yaitu kelompok  kontrol  pelarut  (CMC-Na),  kontrol  negatif  (CCl 4 ),  kontrol  positif  (vitamin  C),  pemberian  ekstrak metanolik  dan  pemberian  fraksi  etil  asetat.  Semua  kelompok  tikus  diinduksi  dengan  senyawa  karbon tetraklorida  (CCl 4 )  kecuali  kelompok  kontrol  pelarut  CMC-Na.  Pengambilan  sampel  darah  pada  waktu  jam ke-0,  ke-24,  dan  ke-72,  sedangkan  pengambilan  sampel  hepar  pada  waktu  jam  ke-24  dan  ke-72,  dengan masing-masing  kelompok  3  sampel.  Analisis  konsentrasi  enzim  α-GST  pada  tikus  menggunakan  metode Enzyme-linked  Immunosorbent  Assay  (ELISA).  Melalui  uji  fitokimia,  teridentifikasi  bahwa  terdapat  kandungan senyawa  flavonoid  dalam  fraksi  ekstrak  metanolik  dan  etil  asetat  buah  kepel.  Penurunan  konsentrasi  enzim α-GST terjadi pada kelompok tikus dengan pemberian vitamin C  dan peningkatan konsentrasi enzim α-GST terjadi pada kelompok tikus dengan pemberian CCl 4 . Pemberian ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat juga menunjukkan  penurunan  konsentrasi  enzim  α-GST  baik  hepar  maupun  darah  tikus  yang  terinduksi  CCl 4 , meskipun tidak ditemukan korelasi yang nyata antara konsentrasi enzim α-GST di hepar dan di darah, serta tetap dapat mencegah kerusakan sel hepar akibat paparan CCl 4 .
Kata kunci: Ekstrak metanolik buah kepel; Fraksi etil asetat buah kepel; Flavonoid; Konsentrasi enzim α-GST

## 1. PENDAHULUAN
Salah  satu  permasalahan  yang  meresahkan  masyarakat  kini  adalah  penyakit-penyakit kronis dan degeneratif seperti kanker, penuaan, hingga penyakit kardiovaskuler yang salah satu penyebabnya karena banyaknya radikal bebas dalam tubuh. Radikal bebas secara alami dibentuk oleh tubuh, dalam konsentrasi rendah berfungsi sebagai imunitas, namun dalam konsentrasi tinggi justru memicu kerusakan seluler [1-2].
Tubuh  manusia  memiliki  mekanisme  untuk  mengatasi  stress  oksidatif  dengan  adanya senyawa  antioksidan.  Antioksidan  berperan  menghambat  oksidasi  dari  molekul  senyawa  lain, dengan  menetralisir  radikal  bebas  berlebih  [3-4].  Antioksidan  dapat  diperoleh  dari  asupan makanan,  antioksidan  sintetik  maupun  antioksidan  alami.  Antioksidan  alami  banyak dikembangkan  karena  kekhawatiran  dari  masyarakat  akan  efek  samping  antioksidan  sintetik. Studi  menunjukkan  bahwa  bahan  alam  yang  mengandung  senyawa  fenolik  seperti  flavonoid memiliki aktivitas  antioksidan  sebagai penangkap radikal bebas, mempengaruhi aktivitas enzim antioksidan, dan dapat digunakan untuk terapi terhadap penyakit yang terkait radikal bebas [5-6].
Penelitian  terkini  menginformasikan  bahwa  buah  tanaman  kepel  (Stelechocarpus burahol) memiliki  kandungan  senyawa  antioksidan.  Bagian  tanaman  kepel  yang  diketahui  memiliki aktivitas  antioksidan  tertinggi  adalah  bunga  dengan  ekstraksi  n-butanol  dan  buah  dengan ekstraksi etil asetat [3]. Telah dilaporkan pula dalam daging buah kepel terdapat senyawa fenolik
yang  bertindak  sebagai  senyawa  antioksidan  [7].  Sejauh  ini  belum  pernah  dilakukan  penelitian untuk menguji aktivitas antioksidan ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat buah kepel secara  in vivo.  Salah  satu  metode  yang  valid  untuk  menentukan  potensi  antioksidan  adalah  dengan mengukur  aktivitas  enzim  glutathione  s-transferase  (GST)  khususnya  tipe  alpha  (α-GST). Kerusakan  sel  akibat  senyawa  radikal  bebas  akan  direspon  tubuh  dengan  membentuk  enzim tersebut  sehingga  konsentrasinya  akan  meningkat.  Perubahan  konsentrasi  konsentrasi  enzim α-GST  dapat  dijadikan  parameter  untuk  mengidentifikasi  aktivitas  antioksidan  dari  suatu senyawa  eksogen  untuk  menetralkan  radikal  bebas.  Maka  dari  itu,  dalam  penelitian  ini  akan diidentifikasi aktivitas penetralan radikal bebas oleh ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat buah kepel secara in vivo pada hewan uji dengan parameter konsentrasi enzim α-GST.

## 2. BAHAN DAN METODE

## 2.1. Bahan
Sampel  buah  kepel  diperoleh  dari  Kecamatan  Seyegan,  Kabupaten  Sleman,  DIY;  metanol (teknis),  etil  asetat,  diklorometan,  dan  natrium  sulfat  anhidrat  (Merck,  untuk  analisis  EMSURE sesuai  ICS,  ISO  atau  Reag.  PhEur.),  petroleum  eter  (Merck,  untuk  analisis  EMSURE   sesuai  ICS, ISO, titik didih 40-60°C), lempeng silika gel 60 F254 (Merck, 20x20 cm), rutin hidrat dan kuersetin dihidrat (Sigma), asam borat, asam asetat glasial, asam format, dan metanol (Merck, untuk analisis EMSURE   sesuai  ICS,  ISO  atau  Reag.  Ph  Eur.),  FeCl3  (Merck,  pro  analys),  asam  oksalat  (Baker Chemical,  Baker  Analyzed  Reagent),  tikus  betina  Strain  Sprague-Dawley  (2-3  bulan)  yang  sehat dengan  bobot  100-160  gram  sebanyak  40  ekor,  senyawa  antioksidan  alami  vitamin  C  (MKR Chemical,  food  grade),  CCl 4 (Merck),  CMC-Na  (Bratachem),  homogenat  hepar  tikus  uji  yang mengandung α-GST, olive oil (Boiges, grade extra virgin olive oil), NaCl 0,9% (Otsu-NS), Fine Test Rat α-GST  (α-Gluthatione  S-Transferases)  ELISA  Kit,  deionized  water  (Onelab  Waterone ),  dan  buffer fosfat salin pH 7,5.

## 2.2. Alat
Alat  yang  digunakan  adalah  sentrifugator  (Microcentrifuge  MPW-55),  neraca  analitik elektrik (Analytical Balances HR-250AZ spesifikasi berat minimal 0,1 mg dan kapasitas maksimal 252 g;  Mettler  Toledo  ME204E  spesifikasi  kepekaan  0,1  mg  dan  kapasitas  maksimal  220  g),  vacuum rotary evaporator (Yamato, tipe RE 310), lampu UV 254 nm dan 366 nm, mikropipet (Socorex volume 100-1000  L;  Gilson  Pipetman  volume  20-200  L),  microplate  reader  (Bio-Rad  680  XR),  disposable  tip, microtube, conical tube, incubator 37°C, microhematocrit non-heparin tube, alat-alat bedah, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan pada laboratorium kimia analisis.

## 2.3. Metode ekstraksi dan fraksinasi buah kepel
Metode  ekstraksi  dan  fraksinasi  buah  kepel  mengacu  pada  Batubara  et  al.  [8].  Buah  kepel segar yang telah dihaluskan dimaserasi dengan metanol (1:2) dengan dilanjutkan 1 kali remaserasi. Maserasi dilakukan selama 3 hari dengan pengadukan setiap hari. Remaserasi dengan total volume metanol  yang  sama  dilakukan  selama  3  hari,  dengan  pengadukan  setiap  hari.  Setelah  maserasi selesai,  dilakukan  penguapan  menggunakan  vaccum  rotary  evaporator  untuk  mendapatkan  ekstrak buah  kepel.  Ekstrak  buah  kepel  kemudian  difraksinasi  secara  bertingkat  menggunakan  pelarut petroleum eter, diklorometan, dan etil asetat.

## 2.4. Uji fitokimia
Uji fitokimia kandungan senyawa fenolik dan flavonoid dilakukan dengan uji reaksi kimia warna maupun uji kromatografi lapis tipis (KLT). Uji reaksi kimia warna menggunakan prosedur
yang  termuat  dalam  buku  Methods  in  Biotechnology  [9].  Identifikasi  senyawa  polifenol menggunakan  reagen  FeCl3  5%  yang  ditandai  dengan  terbentuknya  endapan  warna  cokelat. Identifikasi  senyawa  flavonoid  menggunakan  asam  sulfat  yang  ditandai  dengan  terbentuknya warna  kunig,  merah  kebiruan,  atau  oranye-merah.  Identifikasi  senyawa  glikosida  flavonoid menggunakan  reagen  Taubock  yang  ditandai  dengan  fluoresensi  apabila  diamati  pada  UV 366. Uji kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  didasarkan  pada  Wagner  dan  Bladt  [10]  menggunakan  fase  diam plat  silika  gel  60F 254 dan  dielusi  dengan  eluen  campuran  etil  asetat  :  asam  format  :  asam  asetat glasial  :  air  (100  :  11  :  11  :  20).  Plat  yang  telah  dielusi  diuapi  dengan  ammonia  pekat,  disemprot dengan reagen sitroborat, kemudian diamati dibawah sinar tampak, UV 254 , dan UV 366 .

## 2.5. Perlakuan hewan uji
Perlakuan hewan uji dilakukan sebagaimana dalam Singh et al. [11] dengan penyesuaian. Tikus  betina  muda  (Strain  Sprague-Dawley  dengan  umur  2-3  bulan  dan  berat  100-160  gram) diperoleh  dari  Unit  Pengembangan  Hewan  Percobaan  (UPHP)  Laboratorium  Penelitian  dan Pengujian  Terpadu  (LPPT)  UGM,  dipelihara  dalam  kondisi  yang  dipertahankan  pada  suhu  25 ± 2°C dengan humiditas relatif 70-90% dan siklus gelap/terang selama 12 jam. Tikus uji ditempatkan pada  kandang  ukuran  42  x  21  x  20  cm  (p  x  l  x  t)  dan  diberi  pakan  AD  II  dan  minum  air  RO  ad libitum.  Pengujian  kemampuan  ekstrak/fraksi  buah  kepel  sebagai  antioksidan  dalam  mencegah kerusakan  sel  hepar  yang  bersifat  akut  dilakukan  pada  tikus  dengan  paparan  CCL 4 .  Tikus sebanyak  40 ekor dibagi menjadi 8 kelompok perlakuan dengan masing-masing kelompok berisi 8 ekor. Kelompok I adalah kelompok kontrol pelarut CMCNa 0,1% secara per oral sebanyak 1 mL. Kelompok II sebagai kontrol positif, diberi vitamin C (antioksidan sintesis) dengan dosis sebesar 200 mg/kgBB secara peroral. Kelompok III sebagai kontrol negatif, hanya diinduksi CCl 4 dengan dosis  1,5  mL/kgBB.  Kelompok  IV  diberi  ekstrak  metanolik  buah  kepel,  dan  kelompok  V  diberi fraksi  etil  asetat  buah  kepel.  Pengambilan  darah  pada  plexus  retroorbitalis  dilakukan  pada  jam ke-0, ke-24 dan ke-72 sebanyak 1,5 mL untuk masing-masing waktu pengambilan 3 sampel/tikus tiap  kelompok.  Tikus  uji  pada  jam  ke-24  dan  ke-72  dikorbankan  dan  diambil  organ  heparnya, untuk masing-masing waktu pengambilan 3 sampel/tikus tiap kelompok.
Pengukuran  berat  relatif  organ  hepar  tikus  uji  dilakukan  sebagaimana  Halim  et  al.  [12]. Setiap  hepar  yang  telah  diambil  dibersihkan  dahulu  dari  lemak  yang  tampak  dan  kemudian ditimbang  berat  absolut.  Berat  relatif  organ  (BRO)  dari  tiap  hepar  dihitung  menggunakan persamaan berikut:
𝐵𝑅𝑂 = 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 ℎ𝑒𝑝𝑎𝑟 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠 (𝑔)
𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠 𝑠𝑎𝑎𝑡 𝑑𝑖𝑘𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑘𝑎𝑛 (𝑔) 𝑥 100

## 2.6. Preparasi sampel
Proses  preparasi  serum  darah  dan  hepar  tikus  dilakukan  sebagaimana  protokol  langkah kerja  pada  Fine  Test  Rat  α-GST  (α-Glutathione  S-Transferases)  ELISA  Kit  [13].  Serum  darah diperoleh  dengan  cara  sampel  dibiarkan  selama  2  jam  pada  suhu  ruang  (27°C)  kemudian disentrifugasi  selama  20  menit  dengan  kecepatan  1000xg.  Supernatan  diambil  dan  dimasukkan dalam  microtube,  serta  disimpan  pada  suhu  -80°C.  Untuk  memperoleh  homogenate  hepar  yang mengandung enzim α-GST dari hepar tikus, hepar dicuci terlebih dahulu dengan  Phosphate Buffer Saline  (PBS)  dingin  (0,01  M,  pH  7,4).  Hepar  ditimbang  1  gram  dan  dihancurkan,  kemudian dihomogenkan  dalam  2  mL  PBS.  Homogenat  disentrifugasi  selama  30  menit  dengan  kecepatan
10.000xg  dalam  suhu  4°C.  Supernatan  diambil  dan  dimasukkan  dalam  tube,  serta  disimpan  pada suhu -80°C.

## 2.7. Pengukuran konsentrasi enzim α-GST tikus
Konsentrasi enzim α-GST serum darah dan hepar tikus diukur menggunakan Fine Test Rat α-GST  (α-Glutathione  S-Transferases)  ELISA  Kit.  Prinsip  pengukuran  konsentrasi  enzim  α-GST tikus  ini  sesuai  dengan  metode  sandwich  enzyme-linked  immunosorbent  assay,  dimana  96-well  plate telah  dilapisi  oleh  anti-α-GST  antibodi.  Biotin  terkonjugasi  anti-α-GST  antibodi  digunakan  untuk deteksi.  Larutan  standar,  sampel,  dan  biotin  terkonjugasi  anti-α-GST  ditambahkan  pada  wells setelahnya, dan kemudian dicuci dengan buffer. HRP-Streptavidin ditambahkan, lalu konjugat yang tak berikatan akan hilang bersama pencucian dengan buffer. Substrat TMB ditambahkan pada wells dimana TMB akan dikatalisis oleh HRP untuk menghasilkan produk berwarna biru yang kemudian berubah menjadi kuning setelah diberikan acidic stop solution. Densitas warna kuning proporsional dengan jumlah α-GST dalam  plate. Densitas optik (O.D.) dibaca pada panjang gelombang 450 nm menggunakan  microplate  reader  sehingga  konsentrasi  α-GST  dapat  dikalkulasikan.  Metode  ini memiliki  spesifisitas  yang  tinggi  untuk  enzim  α-GST  tanpa  cross-reactivity  atau  gangguan  yang signifikan dari senyawa analog α-GST [13].

## 2.8. Metode analisis
Data  uji  kualitatif  pada  uji  tabung  berupa  data  reaksi  kimia  warna,  sedangkan  data kualitatif  KLT  berupa  adanya  bercak  yang  diamati  pada  sinar  tampak,  UV 254 ,  dan  UV 366. Bercak berfluoresensi  kuning,  hijau,  atau  biru  di  bawah  UV 366 menunjukkan  adanya  kandungan flavonoid pada ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat. Bila nilai Rf dari sampel dan pembanding (rutin dan kuersetin) sama maka dapat dinyatakan terdapat  kandungan senyawa rutin dan/atau kuersetin pada sampel. Bila nilai Rf sampel dan pembanding tidak sama, maka ada kemungkinan flavonoid jenis lain.
Data penimbangan bobot hepar tikus dalam satuan nilai gram (g) dan berat relatif organ hepar  dihitung  menggunakan  persamaan  yang  telah  tertera.  Data  berat  relatif  organ  disajikan dalam bentuk rata-rata ± simpangan baku (SD). Data konsentrasi enzim α-GST dalam satuan nilai pg/mL.  Perhitungan  nilai  konsentrasi  enzim  α-GST  menggunakan  persamaan  kurva  baku  yang telah memenuhi kriteria validitas.
Uji  signifikansi  antar  data  kuantitatif  satu  kelompok  perlakuan  dengan  kelompok  perlakuan  lain (tiap jenis data) menggunakan aplikasi Statistical Program Service Solution (IBM SPSS Statistics versi 19)  dengan  taraf  kepercayaan  95%.  Uji  normalitas  menggunakan  uji  Shapiro-Wilk  karena  jumlah data tiap kelompok tidak lebih dari 50. Uji signifikansi parametrik antar 2 kelompok menggunakan uji  independent  sample  t-test  dan  bila  non-parametrik  menggunakan  uji  Mann-Whitney.  Uji signifikansi antar >2 kelompok didahului dengan uji homogenitas. Uji signifikansi parametrik (data terdistribusi normal dan homogen) menggunakan uji  One-Way ANOVA yang dilanjutkan uji Post Hoc (membandingkan antar 2 kelompok) dengan metode Tukey dan LSD bila ANOVA menyatakan berbeda  signifikan.  Uji  signifikansi  non-parametrik  menggunakan  Kruskal-Wallis.  Uji  korelasi parametrik antar 2 kelompok data menggunakan uji Pearson dan non-parametrik menggunakan uji Kendall’s tau.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1. Hasil ekstraksi dan fraksinasi
Bagian  tanaman  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  buah  kepel  yang  diperoleh dari  Kecamatan  Seyegan,  Kabupaten  Sleman,  DIY.  Ekstrak  yang  diperoleh  mempunyai  ciri organoleptik  berwarna  cokelat  tua  dengan  bau  khas.  Rendemen  ekstrak  metanol  yang  diperoleh sebanyak 0,81%, sedangkan rendemen fraksi etil asetat didapatkan sebanyak 0,3%. Tahap fraksinasi dilakukan menganut prinsip ekstraksi cair-cair dimana terjadi kontak antar dua pelarut yang tidak saling  bercampur  sehingga  akan  terbentuk  2  fase.  Hal  ini  menyebabkan  terjadinya  perpindahan massa  senyawa  dengan  kelarutan  yang  sesuai  dari  pelarut  asal  ke  pelarut  pengekstraksi  [14]. Fraksinasi  menggunakan  petroleum  eter  dan  diklorometan  akan  menarik  senyawa-senyawa  yang cenderung  non-polar  sehingga  fraksi  etil  asetat  akan  mengandung  senyawa  relatif  lebih  polar. Ekstrak  metanolik  dapat  mengandung  lebih  banyak  senyawa  karena  penyari  alkoholik  dapat menyari senyawa lain selain fenolik, atau dalam hal ini flavonoid. Gula seperti glukosa, fruktosa, dan  sukrosa  kemungkinan  ada  dalam  ekstrak  karena  masih  dapat  terlarut  metanol  baik  dalam bentuk glikosida maupun gula bebas [15].

## 3.2. Uji fitokimia
Uji fitokimia dilakukan dengan uji reaksi kimia terhadap reagen dan  uji kromatografi lapis tipis (KLT) untuk  mengidentifikasi  adanya kandungan  senyawa flavonoid atau fenolik yang terdapat dalam  ekstrak  metanolik  dan  fraksi  etil  asetat  buah  kepel.  Uji  pendahuluan  dilakukan  dengan menggunakan reagen FeCl 3 untuk mendeteksi adanya polifenol. Pengujian menggunakan metode Taubock ditujukan untuk identifikasi adanya glikosida flavonoid sehingga terbentuk larutan yang berfluoresensi  [16].  Senyawa  asam  sulfat  digunakan  untuk  mengidentifikasi  jenis  golongan senyawa flavonoid [17]. Hasil identifikasi senyawa dapat dilihat pada Tabel 1.

## Tabel 1. Hasil identifikasi senyawa berdasarkan uji reaksi kimia
Polifenol Glikosida Flavonoid Flavonoid Ekstrak Metanolik + - +* Fraksi Etil Asetat + + +**
Keterangan: *berwarna cokelat gelap; **berwarna cokelat
Pada penambahan reagen FeCl 3 , ekstrak metanolik berubah warna menjadi cokelat gelap sedangkan fraksi etil asetat berubah menjadi cokelat gelap kehijauan. Pada dasarnya akan terjadi perubahan  warna  menjadi  biru  gelap  atau  biru  gelap  kehijauan  bila  ada  polifenol  [17].  Namun, karena  warna  awal  dari  sampel  adalah  kecokelatan  maka  akan  terbentuk  warna  cenderung cokelat. Kedua sampel dapat dinyatakan mengandung senyawa polifenol, meskipun keberadaan tannin  atau  fenolik  lain  bisa  berpengaruh  sehingga  dapat  terjadi  false  positive.  Pada  pengujian menggunakan  reagen  Taubock,  hanya  pada  fraksi  etil  asetat  yang  terbentuk  fluoresensi  yang berarti terdapat kandungan glikosida flavonoid.
Pengujian  menggunakan  H 2 SO 4 pekat  bertujuan  untuk  mengetahui  jenis/golongan flavonoid.  Sampel  fraksi  etil  asetat  membentuk  cairan  berwarna  cokelat  yang  lebih  terang, perubahan warna ini dapat menunjukkan adanya kandungan flavon dan flavonol dimana warna kuning jika bercampur dengan warna awal cokelat maka hanya akan menambah intensitas warna cokelat.  Sampel  ekstrak  metanolik,  terbentuk  cairan  berwarna  cokelat  gelap  yang  dapat
disebabkan  karena  kandungan  senyawa  flavonoid  golongan  lain  yang  pada  dasarnya  akan memberikan warna merah atau merah kebiruan [17].
Uji  KLT  dilakukan  dengan  menggunakan  pembanding  rutin  dan  kuersetin.  Pereaksi  yang digunakan  pada  uji  KLT  adalah  uap  ammonia  dan  sitroborat.  Profil  kromatogram  ekstrak metanolik  dan  fraksi  etil  asetat  buah  kepel  dapat  dilihat  pada  Gambar  1.  dan  nilai  Rf  hasil pengamatan dapat dilihat pada Tabel 2.
Gambar 1. Profil kromatogram ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat buah kepel. Secara berturut dari kiri pengamatan  di  bawah  sinar  tampak,  di  bawah  UV 254 ,  dan  di  bawah  UV 366 .  Keterangan:  (1)  Rutin,  (2) Kuersetin, (3) Ekstrak metanolik buah kepel, dan (4) Fraksi etil asetat buah kepel.
Tabel 2. Hasil pengamatan bercak pada kromatogram Rf Sinar tampak UV 254 UV 366 Rutin 0,29 Cokelat pudar Abu-abu pudar Biru gelap Kuersetin 0,98 Cokelat Cokelat Biru terang Ekstrak Metanolik 0,96 Cokelat pudar Abu-abu Biru pudar Fraksi Etil Asetat 0,45 0,93 - - - - Biru terang Biru pucat
Rutin tampak pada nilai Rf 0,29 meredam di bawah sinar UV 254 dan sedikit berfluoresensi di  bawah  UV 366 .  Kuersetin  tampak  pada  nilai  Rf  0,98  dimana  di  bawah  UV 254 meredam  dengan kecenderungan berwarna cokelat dan berfluoresensi di bawah UV 366 . Ekstrak metanolik buah kepel tampak meredam di bawah UV 254 dengan nilai Rf 0,96 dan pada nilai Rf yang sama berfluoresensi di bawah UV 366 . Fraksi etil asetat berfluoresensi cukup intens di bawah UV 366 pada Rf 0,45 dan 0,93 meskipun  pada  pengamatan  di  bawah  UV 254 tidak  terdapat  bercak  yang  meredam  fluoresensi. Senyawa  flavonoid  dalam  fraksi  etil  asetat  yang  ditunjukkan  pada  Rf  0,45  dapat  dikatakan memiliki struktur yang berbeda dengan senyawa rutin, dimana  bersifat relatif non-polar terhadap rutin yang mengikat 2 glikosida. Meskipun demikian, sifat kepolarannya juga berbeda cukup jauh (lebih  polar)  dibanding  kuersetin  sehingga  boleh  jadi  merupakan  flavonoid  monoglikosida  atau glikosida  lain  yang  lebih  non-polar  dibanding  rutin.  Hal  ini  diperkuat  dengan  literatur  Pramono [18], dimana pelarut etil asetat dapat melarutkan flavonoid monoglikosida.

## 3.3. Berat relatif hepar
Pemaparan tikus dengan senyawa CCl 4 akan menyebabkan terjadinya hepatotoksik akibat keadaan  steatosis  atau  inflamasi.  Hepar  tikus  baik  jantan  maupun  betina  terinduksi  CCl 4 akan mengalami kenaikan berat absolut maupun berat relatif organ (BRO) hepar [19]. Pada penelitian ini pengukuran berat relatif organ hepar digunakan sebagai gambaran terjadinya kerusakan pada
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0 400 800 1200 1600
2000
2400 O D r el at if Konsentrasi (pg/mL)
hepar  setelah  paparan  CCl 4 .  Berat  relatif  hepar  tikus  uji  dari  tiap  kelompok  perlakuan  dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Nilai BRO hepar rata-rata tiap kelompok tikus pada jam ke-72 Kontrol Pelarut Ekstrak Metanolik Fraksi Etil Asetat Vitamin C CCl 4 BRO 3,82 ± 0,20 3,98 ± 0,15 3,99 ± 0,02 4,06 ± 0,15 4,64 ± 0,12*
Keterangan: nilai BRO ± SD (n=3); *berbeda signifikan (P<0,05) terhadap kelompok lain
Berdasarkan Tabel 3, dapat dinyatakan bahwa pemberian CCl 4 dengan dosis 1,5 mg/kgBB mampu  meningkatkan  berat  relatif  hepar  tikus  secara  signifikan  dan  mungkin  terjadi  kerusakan hepar  tikus.  Di  sisi  lain,  nilai  berat  relatif  hepar  yang  tidak  berubah  signifikan  antara  kelompok kontrol  pelarut,  pemberian  ekstrak  metanolik  buah  kepel  (EM),  pemberian  fraksi  etil  asetat  buah kepel  (EA),  dan  pemberian  vitamin  C  dapat  menjadi  gambaran  bahwa  kandungan  ekstrak metanolik,  fraksi  etil  asetat  buah  kepel,  dan  vitamin  C  memiliki  kemampuan  menghambat kerusakan hepar akibat paparan CCl 4.

## 3.4. Analisis konsentrasi enzim GST
Enzim  α-GST  merupakan  salah  satu  enzim  yang  bertanggungjawab  dalam  proses detoksifikasi seluler. Enzim ini banyak  berada pada hepar, lebih khusus pada  sitosol hepar [20]. Konsentrasi  enzim  tersebut  di  plasma  merepresentasikan  kerusakan  hepar  lebih  baik  dibanding aminotransferase  [21].  Pemaparan  menggunakan  CCl 4 akan  menyebabkan  kerusakan  hepar dengan pembentukan radikal bebas, dimana dengan pemberian ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat  buah  kepel  yang  dicurigai  mengandung  senyawa  antioksidan  akan  menangkal  radikal bebas  dan  menjaga  hepar  dari  kerusakan  sehingga  parameter  konsentrasi  enzim  α-GST  tetap rendah.  Pengukuran  konsentrasi  enzim  α-GST  hepar  dan  plasma  tikus  dilakukan  menggunakan Fine Test Rat α-GST ELISA Kit. Kurva baku ELISA kit tersebut dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Kurva baku standar enzim α-GST tikus
Persamaan  regresi  linier  yang  diperoleh  yaitu 𝑦 = 0,0007𝑥 + 0,0357 ,  dengan  nilai  R  = 0,9896.  Linearitas  dari  kurva  baku  ini  telah  memenuhi  kriteria  linearitas  untuk  sampel  biologis dimana  nilai  R  harus  >  0,97  [22].  Nilai  persen  recovery  dari  tiap  konsentrasi  standar  berturut  dari 2400 pg/mL hingga 37,5 pg/mL adalah 90,91%; 113,96%; 124,12%; 119,19%; 84,38%; 73,52%. Nilai ini telah memenuhi persyaratan nilai persen recovery metode immunoassay untuk rasio analit 10 -9 yaitu antara 70-130% [23].
Peningkatan konsentrasi enzim α-GST sebanding dengan kerusakan yang terjadi pada  sel hepatosit  hepar.  Hasil  pengukuran  konsentrasi  enzim  α-GST  tikus  uji  baik  pada  hepar  maupun darah divisualisasikan pada Gambar 3 dan Gambar 4.

## Gambar 3. Konsentrasi enzim α-GST hepar tikus (tiap kelompok n=3)
Analisis statistik menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan signifikan antar kelompok perlakuan  (P  >  0,05).  Meskipun  demikian,  apabila  dibandingkan  terhadap  kelompok  kontrol pelarut,  maka  kelompok  EM,  kelompok  EA,  dan  kelompok  vitamin  C  cenderung  memiliki konsentrasi  enzim  α-GST  yang  lebih  tinggi.  Kondisi  ini  dapat  disebabkan  oleh  adanya kemungkinan pengaruh dari senyawa eksogen terhadap ekspresi enzim α-GST.
Pada  sel  hepatosit,  terdapat  faktor  transkripsi  Nrf2  yang  berperan  dalam  pembentukan enzim  α-GST.  Ketika  tidak  ada  senyawa  thiol-reactive  elektrofil,  maka  Nrf2  di  sitoplasma  akan terikat pada protein Keap1 dan akan terproteolisis oleh 26S proteasome. Adanya senyawa elektrofil lemah ini, maka Nrf2 dapat bypass dan memasuki nukleus membentuk dimer dengan protein Maf, menempel  pada  antioxidant  response  element  (ARE)  dan  akan  mentranskripsi  cDNA  α-GST sehingga  terbentuk  mRNA  α-GST  dan  pada  akhirnya  akan  terekspresi  enzim  α-GST  [24]. Senyawa  flavonoid  atau  fenolik  yang  ada  dalam  EM  dan  EA  yang  juga  merupakan  senyawa elektrofil  lemah  memungkinkan  untuk  beraktivitas  seperti  itu.  Hal  tersebut  juga  terjadi  dengan adanya  vitamin  C,  dimana  senyawa  vitamin  C  selain  sebagai  penangkap  radikal,  dapat  pula membantu meningkatkan jumlah dari mRNA α-GST [25].
Sejumlah  literatur  menyatakan  bahwa  beberapa  flavonoid  juga  dapat  meningkatkan aktivitas  enzim  GST  [26-27],  seperti  epigallocatechin  gallat,  epigallocatechin,  procyanidin,  glikosida rutin, hesperidin, naringenin, dan kuersetin [28-30]. Aktivitas dari enzim GST berkorelasi dengan konsentrasi  enzim  α-GST  [31].  Peningkatan  jumlah  atau  konsentrasi  enzim  GST  juga  dapat dikatakan  meningkatkan  konsentrasi  enzim  α-GST  karena  persentase  konsentrasi  enzim  α-GST
Gambar 4. Konsentrasi enzim α-GST hepar tikus hasil konversi (tiap
n
2-5% [32] sehingga pemberian ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat diduga dapat meningkatkan konsentrasi enzim α-GST.
Nilai  konsentrasi  enzim  α-GST  kelompok  pemberian  CCl 4 pada  jam  ke-24  lebih  rendah, meskipun  tidak  signifikan  (P>0,05)  dibanding  kelompok  kontrol  pelarut.  Kondisi  ini kemungkinan  diakibatkan  telah  adanya  kematian  sebagian  sel  hepatosit  sehingga  jumlah  enzim α-GST yang diekspresikan lebih rendah. Berdasarkan studi literatur, diketahui bahwa pemaparan CCl 4 akan  berdampak  pada  sel  hepar,  antara  lain  steatosis,  nekrosis,  dan  induksi  apoptosis [33-35].  CCl 4 dapat  menginduksi  terjadinya  apoptosis  melalui  jalur  JNK  dan  mengekspresi  gen pro-apoptosis  seperti  tumor  necrosis  factor-α  (TNF-α)  dan  Bcl2  homologous  antagonist/killer  (Bak) pada liver mencit terinduksi CCl 4 [35].
Konsentrasi enzim α-GST hepar pada jam ke-72 kelompok kontrol pelarut, kelompok EM, dan  kelompok  EA  mengalami  penurunan  dibanding  konsentrasi  enzim  α-GST  pada  jam  ke-24. Hal  ini  sesuai  dengan  literatur  dimana  efek  toksik  CCl 4 akan  berkurang  pada  jam  ke-72  setelah pemejanan karena telah tereliminasi sehingga ekspresi enzim α-GST berkurang [36-37].
Konsentrasi enzim α-GST pada jam ke-72 kelompok CCl 4 dan kelompok vitamin C terjadi kenaikan  meskipun  tidak  signifikan  (P  >  0,05)  terhadap  konsentrasi  enzim  α-GST  jam  ke-24.  Sel hepar  pada  dasarnya  merupakan  sel  dengan  regenerasi  yang  cepat,  dimana  dapat  beregenerasi dalam  kisaran  waktu  48  jam  [38].  Sel  hepar  yang  mengalami  nekrosis  sedang  atau  kerusakan matriks  ekstrasel  akan  tergantikan  dengan  sel  normal  dengan  regenerasi  dari  sel  yang  masih hidup atau dari stem sel [39]. Dengan demikian, maka konsentrasi enzim α-GST akan meningkat seiring dengan terbentuknya sel normal baru dan merespon masih adanya baik senyawa eksogen elektrofil lemah maupun CCl 4 akibat belum tereliminasi karena kematian sebagian sel hepar. Hal ini harus dengan kondisi bahwa puncak ketoksikan dari CCl 4 dosis 1,5 mL/kgBB tidak tepat atau kurang dari jam ke-24.
Selain kadar enzim α-GST, kerusakan hepar tikus pada kelompok CCl 4 dapat juga diamati secara gross patologi dengan berat relatif hepar. Berat relatif hepar tikus kelompok CCl 4 pada jam ke-72  lebih  tinggi  secara  signifikan  (P  <  0,05)  dibanding  kelompok  lainnya.  Hal  ini  diduga  telah terjadi  kerusakan  hepar  dalam  bentuk  steatosis,  inflamasi,  atau  nekrosis  sehingga  berat  hepar
meningkat.  Berat  relatif  hepar  kelompok  vitamin  C  juga  cukup  tinggi  meskipun  tidak  setinggi pada  kelompok  CCl 4 .  Kondisi  tersebut  dapat  pula  menjadi  gambaran  mengapa  terjadi peningkatan konsentrasi enzim α-GST kelompok tersebut pada jam ke-72.
Ketoksikan  CCl 4 dosis  1,5  mL/kgBB  pada  tikus  Sprague-Dawley  betina  ini  juga  dapat dideteksi  menggunakan  konsentrasi  enzim  α-GST  darah.  Konsentrasi  enzim  α-GST  kelompok CCl 4 pada jam ke-0 atau beberapa saat setelah paparan CCl 4 lebih tinggi secara signifikan (P<0,05) dibandingkan pada jam ke-24 dan jam ke-72. Hal tersebut  menunjukkan  bahwa ketoksikan CCl 4 dosis 1,5 mg/kgBB kemungkinan berada pada sebelum jam ke-24. Menurut Janakat dan Al-Merie [37], ketoksikan CCl 4 dapat meningkat secara nyata dalam 2 jam pertama setelah pemaparan CCl 4 dan maksimum terjadi puncak yaitu 24 jam setelah pemaparan.
Gambar 5. Konsentrasi Enzim α-GST darah tikus (tiap kelompok n=3). Keterangan: *) berbeda signifikan terhadap data jam ke-0
Analisis statistik menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan signifikan konsentrasi enzim α-GST  darah  tikus  pada  kelompok  EM,  EA,  dan  Vitamin  C  terhadap  kelompok  kontrol  pelarut (P>0,05).  Pada  Gambar  5  dapat  dilihat  bahwa  kesamaan  profil  penurunan  CCl 4 antara  keempat kelompok  tersebut,  terlihat  pada  jam  ke-24  sampai  jam  ke-72.  Hal  yang  berbeda  terlihat  pada kelompok CCl 4 dimana konsentrasi enzim α-GST mengalami peningkatan dari jam ke-24 sampai jam ke-72.
Profil  penurunan  α-GST  juga  tampak  pada  data  konsentrasi  enzim  α-GST  hepar  tikus. Pemberian CCl 4 justru akan memberikan profil peningkatan konsentrasi enzim α-GST hepar dari jam  ke-24  hingga  jam  ke-72.  Konsentrasi  enzim  α-GST  hepar  kelompok  tikus  EM  dan  EA mengalami  penurunan  sama  dengan  konsentrasi  enzim  α-GST  kelompok  kontrol  pelarut.  Jika peningkatan  konsentrasi  enzim  α-GST  pada  kelompok  kontrol  CCl 4 merupakan  gambaran kerusakan sel hepar, maka dapat dikatakan bahwa ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat mampu menjaga kerusakan sel hepar dengan menurunkan konsentrasi enzim α-GST baik hepar maupun darah tikus. Hasil ini sesuai dengan hipotesis bahwa pemberian ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat buah kepel dapat mencegah kerusakan akibat CCl 4 serupa mekanisme aksi vitamin C.
Tabel 4. Korelasi konsentrasi enzim α-GST hepar dan darah tikus pada jam ke-72 Kelompok Perlakuan Kontrol Pelarut* Ekstrak Metanolik* Fraksi  Etil Asetat** Vitamin C* CCl 4 * Korelasi 0,997 0,855 0,816 -0,890 -0,271 Sig. (2-tailed) 0,051 0,347 0,221 0,301 0,825
Keterangan: *Pearson correlation; **Kendall’s tau correlation
Berdasarkan data konsentrasi enzim α-GST hepar dan darah tikus pada jam ke-72, tidak terdapat  korelasi  secara  secara  signifikan  (P  <  0,05)  antara  konsentrasi  enzim  α-GST  hepar  dan darah (Tabel 4). Meskipun demikian, terdapat korelasi positif cukup kuat pada kelompok kontrol, kelompok EM, dan kelompok EA, hal ini dapat diartikan semakin tinggi konsentrasi enzim α-GST hepar maka semakin tinggi pula enzim α-GST dalam darah. Pada kelompok vitamin C dan CCl 4 , terdapat  korelasi  negatif  namun  tidak  signifikan  yang  berarti  bahwa  konsentrasi  enzim  α-GST hepar berbanding terbalik dengan konsentrasi enzim α-GST darah.

## 4. KESIMPULAN
Ekstrak  metanolik  dan  fraksi  etil  asetat  buah  kepel  terdapat  senyawa  flavonoid.  Ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat berpengaruh menurunkan enzim enzim α-GST di hepar maupun darah tikus serta dapat mencegah kerusakan sel hepar tikus yang terinduksi CCl 4 .
Ucapan  terima  kasih:  Penulis  mengucapkan  terima  kasih  yang  sebesar-besarnya  kepada Kementerian  Riset  dan  Teknologi  serta  Kementerian  Pendidikan  dan  kebudayaan  yang  telah membiayai penelitian ini melalui skema World Class Research 2020.

## Referensi
1. Valko, M.; Rhodes, C. J.; Moncol, J.; Izakovic, M.; Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem Biol Interact. 2006. 160, 1–40.
2. Droge,  W.  Free  radicals  in  the  physiological  control  of  cell  function,  Review.  Physiol  Rev.  2002. 82, 47-95.
3. Tisnadjaja, D.; Edward, S.; Silvia; Partomuan, S. Pengkajian Burahol (Stelechocarpus burahol (Blume) Hook  &  Thomson)  sebagai  Buah  yang  Memiliki  Kandungan  Senyawa  Antioksidan.  Biodiversitas. 2006. 7, 2, 199-202.
4. Pham-Huy,  L.  A.;  He,  H.;  Pham-Huy,  C.  Free  Radicals,  Antioxidants  in  Disease  and  Health,  Int  J Biomed Sci. 2008. 4, 2, 89-96.
5. Gulcin, I.; Uguz, M. T.; Oktay, M.; Beydemir, S.; Kufrevioglu, O. I. Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial Activities of Clary Sage (Salvia sclarea L.). Turk I. Agric. For. 2004. 28, 25-33.
6. Soobrattee, M. A.; Neergheen, V. S.; Luximon-Ramma, A.; Aruoma, O. I.; Bahorun, T. Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: Mechanism and actions. Mutat Res. 2005. 579, 200-213.
7. Sumartini;  Studi  Aktivitas  Antioksidan  Senyawa  Fenolik  dalam  Daging  Buah  Kepel  (Stelechocarpus burahol); Tesis, Airlangga University Library; Surabaya, 2011.
8. Batubara, I.; Darusman, L.K.; Djauhari, E.; Mitsunaga, T. Potency of Kepel (Stelechocarpus burahol) as Cyclooxygenase-2 Inhibitor. The Journal of Indonesian Medicinal Plant. 2010. 3, 2, 110-114.
9. Cannell,  R.  J.  P.,  Methods  in  Biotechnology,  Volume  4:  Natural  Products  Isolation;  Humana  Press  Inc.;
Totowa, 1999.
10. Wagner,  G.  J.;  Hrazdina,  G.  Endoplasmic  Reticulum  as  a  Site  of  Phenylpropanoid  and  Flavonoid Metabolism in Hippeastrum. Plant Physiol. 1984. 74, 4, 901-906.
11. Singh, R. P.; Banerjeea, S.; Kumara, P. V. S.; Raveesha, K. A.; Rao, A. R. Tinospora Cordifolia Induces Enzymes of Carcinogen/Drug Metabolism and Antioxidant System, and Inhibits Lipid Peroxidation in Mice. J Food Chem. 2006. 13, 74–84.
12. Halim,  S.  Z.;  Abdullah,  N.  R.;  Afzan,  A.;  Abdul  Rashid,  B.  A.;  Jantan,  I.;  Ismail,  Z.  Acute  toxicity study of Carica papaya leaf extract in Sprague Dawley rats. J Med Plant Res. 2010. 5, 1867-1872.
13. Fine  Test.  Instruction  Manual:  Rat  α-GST  (α-Gluthatione  S-Transferases)  ELISA  Kit;  Wuhan  Fine Biological Technology Co., Ltd.; Hubei, China, 2017.
14. Mirwan, A.; Ariono, D. Dinamika Tetes Ekstraksi Cair-cair dalam Kolom Isian dan Tanpa Isian; Prosiding Seminar Nasional Teknik Kimia Indonesia; Bandung, 2009.
15. Spigno,  G.;  Tramelli,  L.;  De  Faveri,  D.  M.;  Effects  of  extraction  time,  temperature  and  solvent  on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics. J Food Eng. 2007. 81, 200-208.
16. Taubock,  K.  The  Reduction  Products  of  Flavonols  with  Boric.  Acid  and  Organic  Acids  and  Their Importance for the Fixation of Boron in Plants. Naturwiss. 1942. 30, 439.
17. Jones, W. P.; Kinghorn, A. D.  Extraction of Plant Secondary Metabolites, dalam Sarker, S.D., Latif, Z., Gray, A.I., (Eds), Natural Products Isolation, 2nd Edition, 323-352; Humana Press, New Jersey, 2006.
18. Pramono, S. Bahan Ajar Galenika, 22; Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada; Yogyakarta, 2012.
19. Uemitsu,  N.;  Nakayoshi,  H.  Evaluation  of  Liver  Weight  Changes  following  a  Single  Oral Administration of Carbon Tetrachloride in Rats. Toxicol Appl Pharmacol. 1984. 75, 1-7.
20. Helaly,  G.  F.;  Mahmoud,  M.  M.  Diagnostic  value  of  alphaglutathione  S-transferase  as  a  sensitive marker of increased risk for hepatocellular damage in hepatitis C virus (HCV) infection: relation to HCV viraemia. J Egypt Public Health Assoc. 2003. 78, 3-4, 209-223.
21. Mazur, W.; Gonciarz, M.; Kajdy, M.; Mazurek, U.; Jurzak, M.; Wilczok, T.; Gonciarz, Z. Blood serum glutathione alpha s-transferase (alpha GST) activity during antiviral therapy in patients with chronic hepatitis C. Med Sci Monit. 2003. 9, 3, 44-48.
22. Natarajan,  S.;  Remick,  D.  G.;  The  ELISA  Standard  Save:  Calculation  of  sample  concentrations  in assays with a failed standard curve. J Immunol Methods. 2008. 336, 242-245.
23. Cox,  K.  L.;  Devanarayan,  V.;  Kriauciunas,  A.  Immunoassay  Methods,  dalam  Sittampalam,  G.S., Coussens,  N.  P.,  Brimacombe,  K.,  et  al.,  (eds),  Assay  Guidance  Manual,  Bethesda  (MD):  Eli  Lilly  & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; Bethesda, Maryland, 2014.
24. Higgins,  L.  G.;  Hayes,  J.  D.;  Mechanisms  of  induction  of  cytosolic  and  microsomal  glutathione transferase  (GST)  genes  by  xenobiotics  and  pro-inflammatory  agents.  Drug  Metab  Rev.  2011.  43,  2, 92-137.
25. Elbekai,  R.  H.;  Duke,  J.;  El-Kadi,  A.  O.  S.  Ascorbic  acid  differentially  modulates  the  induction  of heme oxygenase-1, NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 and glutathione S-transferase Ya by As3+, Cd2+, and Cr6+. Cancer Lett. 2007. 246, 54-62.
26. Kumar, S.; Pandey A. K. Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview, Sci World J. 2013. 2013, 1-16.
27. Gopi, S.; Vadde, R.; Setty, O. H. Protective effect of aqueous extract of Phyllanthus fraternus against bromobenzene induced changes on cytosolic glutathione S-transferase isozymes in rat liver. Biochem Biophys Rep. 2017. 10, 208-214.
28. Apati,  P.;  Houghton,  P.  J.;  Kite,  G.;  Steventon,  G.  B.;  Kery,  A.  In-vitro  effect  of  flavonoids  from Solidago canadensis extract on glutathione S-transferase. J Pharm Pharmacol. 2006. 58, 2, 251-256.
29. Ramiro-Puig, E.; Urpí-Sardà, M.; Pérez-Cano, F. J.; Franch, A.; Castellote, C.; Andrés-Lacueva, C.; et al.  Cocoa-enriched  diet  enhances  antioxidant  enzyme  activity  and  modulates  lymphocyte composition in thymus from young rats. J Agric Food Chem. 2007. 55, 6431–6438.
30. Iskender, H.; Yenice, G.; Dokumacioglu, E.; Kaynar, O.; Hayirli, A.; Kaya, A.; The Effects of Dietary Flavonoid Supplementation on the Antioxidant Status of Laying Hens. Braz J Poultry Sci. 2016. 18, 4, 663-668.
31. Innova Biosciences. Guide to Enzyme Unit Definitions and Assay Design ; Innova Biosciences Ltd. Babraham research Campus; Cambridge, 2017 .
32. Haima, P.; Shaw, M. Novel Liver and Kidney Biomarkers for Improved Drug Safety Testing; TECOmedical Clinical & Technical Review, TECOmedical Group; Swiss, 2014.
33. Boll,  M.;  Weber,  L.  W.  D.;  Becker,  E.;  Stampfl,  A.  Mechanism  of  Carbon  Tetrachloride-Induced Hepatotoxicity.Hepatocellular  Damage  by  Reactive  Carbon  Tetrachloride  Metabolites.  Z. Naturforsch. 2001. 56, 649-659.
34. Singh, A.; Bhat, T. K.; Sharma, O. P. Clinical Biochemistry of Hepatotoxicity.  J Clin Toxicol. 2011. 4, 1-19.
35. Ma, J. Q.; Ding, J.; Zhang, L.; Liu, C. Hepatoprotective properties of sesamin against CCl 4 induced oxidative stress-mediated apoptosis in mice via JNK pathway. Food Chem Toxicol. 2013. 64, 41-48.
36. Clarke,  H.;  Egan,  D.  A.;  Heffernan,  M.;  Doyle,  S.;  Byrne,  C.;  Kilty,  C.;  Ryan,  M.  P.  α-gluthatione s-transferase  (α-GST)  release,  an  early  indicator  of  carbon  tetrachloride  hepatotoxicity  in  the  rat. Hum Exp Toxicol. 1997. 16, 154-157.
37. Janakat, S.; Al-Merie, H. Optimization of the dose and route of injection, and characterisation of the time  course  of  carbon  tetrachloride-induced  hepatotoxicity  in  the  rat.  J  Pharmacol  Toxicol  Methods. 2003. 48, 41-44.
38. Fausto, N. Liver Regeneration, J Hepatol. 2000. 32, 19-31.
39. Ramadori, G.; Moriconi, F.; Malik, I.; Dudas, J. Physiology and Pathophysiology of Liver Inflamation, Damage, and Repair. J Physiol Pharmacol. 2008. 59, 1, 107-117.
© 2020 by the authors. Submitted for possible open access publication under the terms and  conditions  of  the  Creative  Commons  Attribution  (CC  BY)  license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).