## Analysis of Titer and Subtypes Antibody in ABO
Incompatibility that Causes HDFN
Analisis Titer dan Subtipe Antibodi pada Inkompatibilitas ABO yang Menyebabkan HDFN Sheila Nurrahmah 1 , Heri Wibowo 2* , Ria Syafitri Evi Gantini 3
1 Program Magister Ilmu Biomedik, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, email: sheila_daras@yahoo.com
*2 Departemen Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, email: bowoheri04@gmail.com
3 Unit Transfusi Darah Pusat Palang Merah Indonesia, Diploma 3 Teknisi Bank Darah Akademi Bakti Kemuliaan PMI, email: ria_prihanto@yahoo.com I N F O  A R T I K E L

## A B S T R A C T

## ARTICLE HISTORY:
Artikel diterima: 30 Desember 2021 Artikel direvisi: 26 Januari 2022 Artikel disetujui: 5 Maret 2022

## KORESPONDEN
Heri Wibowo email bowoheri04@gmail.com, Orcid ID: 0000-0001-7708-5135

## ORIGINAL ARTICLE
DOI: https://doi.org/10.30989/mik.v11i1.675
Penerbit: Universitas Jenderal Achmad Yani Yogyakarta, Indonesia. Artikel terbuka yang berlisensi CC-BY- SA.
Background: Hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN) is a type of  anemia  in  the  fetus  or  newborn.  Clinical  features  of  HDFN  such  as hepatosplenomegaly, liver failure, ascites, at birth die from heart failure to brain damage. One of the most common causes is incompatibility of blood groups  such  as  ABO.  Differences  in  clinical  manifestations  that  occur  in HDFN are caused by differences in antibody titers and IgG subtypes. Objective: The  aim  of  this  study  was  to  determine  the  anti-A  and  anti-B antibody  titers  and  the  types  of  immunoglobulins  that  affect  HDFN  due  to ABO incompatibility.
Methods: The sample used in this study was blood and umbilical cord blood from  30  pairs  of  mother-babies  who  had  different  blood  groups.  Titration examination  by  tube  method  and  IgG  subtype  by  ELISA  method  were performed on maternal samples.
Results: The correlation of total bilirubin levels with maternal Anti-A and Anti- B titers are p= 0.023 and p= 0.001, in addition there are significant increase in OD of Anti-A IgG1 and Anti-B IgG1 againts elevated infant bilirubin levels. Conclusion: IgG titers >8 causing hyperbilirubinemia, but no jaundice and IgG titers >16 causing hyperbilirubinemia to jaundice. The IgG subtype that plays a more role in causing clinical problems is IgG1.
Keywords: ABO  incompatibility,  class  and  subtypes  antibody, hemolytic disease of fetus and newborn, titer antibody.

## A B S T R A K
Latar  Belakang: Hemolytic  disease  of  the  fetus  and  newborn (HDFN) merupakan jenis anemia pada janin dan bayi. Gambaran klinis dari HDFN seperti anemia, hiperbilirubinemia, jaundice , hepatosplenomegali, gagal hati, asites,  pada  saat  lahir  meninggal  karena  gagal  jantung  hingga  kerusakan otak.  salah  satu  penyebab  paling  umum  adalah  inkompatibilitas  golongan darah seperti  ABO.  Perbedaan  manifestasi  klinis  yang  terjadi pada HDFN disebabkan oleh perbedaan titer antibodi dan subtipe IgG.
Tujuan: Mengetahui titer antibodi anti-A dan anti-B dan jenis imunoglobulin yang mempengaruhi HDFN yang disebabkan inkompatibilitas ABO. Metode: Sample yang digunakan adalah darah dan darah tali pusat dari 30 pasang  ibu  dan  bayi  yang  memiliki  golongan  darah  yang  berbeda, Pemeriksaan titrasi dengan metode tabung dan subtipe IgG dengan metode ELISA.
Hasil: Terdapat pengaruh yang signifikan titer IgG anti-A p= 0.023 dan Anti- B p=0.001 terhadap kadar bilirubin total, serta terdapat peningkatan OD IgG1 Anti-A dan IgG1 Anti-B yang signifikan terhadap bilirubin bayi.
Kesimpulan: Ibu  dengan  titer  IgG  >8  menyebabkan  hiperbilirubinemia, tetapi tidak terjadi jaundice dan pada saat titer IgG meningkat menjadi >16 menyebabkan  hiperbilirubin  hingga  jaundice.  Subtipe  IgG  yang  lebih berperan hingga menyebabkan masalah klinis adalah IgG1 dan IgG3.
Kata kunci: hemolytic disease of fetus and newborn , inkompatibilitas abo, kelas dan subtipe antibody, titer antibody .

## PENDAHULUAN

## Hemolytic  disease  of  fetus  and  newborn
(HDFN) merupakan jenis anemia pada janin atau bayi baru lahir. Gambaran klinis dari HDFN seperti hepatosplenomegali,  gagal  hati,  asites,  pada  saat lahir  meninggal  karena  gagal  jantung  hingga kerusakan otak. HDFN secara etiologis disebabkan oleh  non  imun  dan  imun.  Penyebab  non  imun, seperti sel darah merah yang rusak karena infeksi cytomegalovirus ,  toksoplasmosis,  sifilis  dan beberapa  jenis  bakteri  lain,  kelainan  bawaan  sel darah  merah  seperti  kelainan  membran  sel  darah merah  dan  enzim,  hemoglobinopati,  kekurangan
Glucose-6phosphate  dehydrogenase (G6PD)  dan herediter sphereocytosis . Penyebab imun termasuk inkompatibilitas  golongan  darah  (seperi  ABO,
Rhesus, Kidd, Duffy, Kell) dan penyakit autoimun bawaan. 1-3
Inkompatibel
ABO merupakan ketidakcocokkan golongan darah ABO antara ibu dan  bayi.  HDFN  terjadi  karena  ibu  memiliki golongan  darah  O  dengan  janin  yang  memiliki golongan  darah  A/B,  sistem  imun  ibu mengidentifikasi  sel  darah  merah  janin  sebagai benda asing dan membuat antibodi yang spesifik.
Antibodi  tersebut  masuk  ke  tubuh  janin  dan melisiskan sel darah merah sehingga menyebabkan anemia,  penyakit  kuning,  hiperbilirubin,  pada kasus  yang  parah  dalam  menyebabkan  kerusakan otak yang fatal. 4
Terdapat  3  cara  aloimunisasi  pada  ibu hamil yang dapat menyebabkan ibu menghasilnya antibodi  IgG,  yakni  paparan  lingkungan  terhadap zat-zat seperti antigen ABO yang terdapat dialam, pendarahan  feto-maternal  yang  menyebabkan  sel darah  merah  janin  dari  kehamilan  sebelumnya masuk  ke  sirulasi  darah  ibu  dan  sensitisasi  ibu
untuk menghasilkan antibodi IgG anti-ABO, selain itu juga karena transfusi darah yang inkompatibel ABO. 5
HDFN  karena  inkompatibel  ABO  dapat terjadi  pada  kehamilan  pertama,  berbeda  dengan HDFN inkompatibel Rhesus yang biasanya terjadi pada  kehamilan  berikutnya.  Bayi  yang  lahir  dari ibu yang inkompatibel golongan darah ABO tidak semua mengalami abortus, manisfestasi klinis yang umum  terjadi  yakni  hiperbilirubinemia.  Bhat  dan Kumar  menemukan  dari  878  kelahiran,  151 diantaranya bayi yang lahir dari inkompatibel ABO dan  46  bayi  yang  mengalami  hiperbilirubinemia, akan tetapi terdapat 25 bayi yang darahnya terjadi hemolisis  pada  saat  diperiksa  di  laboratorium. 6
Yahya, et al pada tahun 2017 melakukan penelitian di  RS  Dr.  Hasan  Sadikin  Bandung  pada  95  bayi baru  lahir,  terjadi  hiperbilirubinemia  pada  11.6% bayi yang disebabkan oleh inkompatibel ABO. 7
Perbedaan  manifestasi  klinis  yang  terjadi pada  HDFN  disebabkan  oleh  perbedaan  titer antibodi  dan  subtipe  IgG,  akan  tetapi  terdapat perbedaan  pada  setiap  etnik. 8-10 Penelitian  yang dilakukan Bakkeheim, et al tahun 2009 di Norway, menyebutkan bahwa titer IgG antibodi anti-A dan anti-B ibu yang dapat memprediksi terjadi HDFN jika  titernya  ≥512, 11 akan  tetapi  Akanmu  et  al melakukan penelitian di Lagos jika titer antibodi A dan  B  8  sudah  dapat  menyebabkan  HDFN  pada 4.3% kelahiran dari inkompatibel ABO. 12
Antibodi  yang  dapat  melewati  plasenta hanya antibodi kelas IgG, akan tetapi IgG memiliki 4  subtipe  yang  berbeda,  yakni  IgG1,  IgG2,  IgG3 dan IgG4. Subtipe IgG memiliki kemampuan yang berbeda  untuk  menghancurkan  sel  darah  merah, IgG1  dan  IgG3  memiliki  kemampuan  untuk berikatan dengan Fc-reseptor sel fagosit dan dapat
menyebabkan  hemolisis,  akan  tetapi  IgG3 memiliki  kemampuan  yang  lebih  dibandingkan dengan IgG1. 9
Berbagai macam penelitian yang telah dilakukan  tentang  titer  dan  subtipe  antibodi IgG yang telah dilakukan di beberapa Negara asing,  namun  di  Indonesia  belum  diketahui titer  antibodi  dan  subtipe  IgG  yang mempengaruhi  terjadinya  HDFN.  Sehingga
pada penelitian ini akan dilakukan pemeriksaan titer antibodi dan subtipe IgG nya untuk
mengetahui patofisiologinya di
Indonesia.

## BAHAN DAN CARA PENELITIAN
Subjek yang termasuk adalah ibu dan bayi yang  berbeda  golongan  darah  dengan  usia kehamilan 36 sampai dengan 40 minggu.
Penelitian ini telah lulus kaji etik Komite
Etik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Cara Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel darah ibu sebanyak 5 cc  dilakukan,  lalu  dipisah  menjadi  2  tabung (tabung  EDTA  dan  tabung  plain)  serta pengambilan darah talipusat bayi sebanyak 3 cc.
Pemeriksaan Titrasi IgG
Pemeriksaan  titer  IgG  dengan  titrasi metode tabung.
Deteksi Subtipe IgG
Deteksi subtipe IgG menggunakan metode indirect  ELISA.  menggunakan  sistetis  antigen yakni Blood  Type  A dan B  BSA dari Dextra Laboratories serta Mouse anti human IgG1, IgG3
dan IgG4 dari  Invitrogen  (MH1715, MH1732,
MH174).  OD  dibaca  dengan  ELISA  reader  pada panjang gelombang 450 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemeriksaaan  titrasi  antibodi  ini  untuk mengetahui titer anti-A dan anti-B ibu. Hasil dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2.
Gambar 1. Korelasi Titer IgG Anti-B dengan Kadar Bilirubin
Gambar 2. Korelasi Titer IgG Anti-B dengan Kadar Bilirubin
Hasil analisa pada Gambar 1 dan 2 dapat disimpulkan  bahwa  kadar  bilirubin  pada  subjek bayi  yang  lahir  pada  kelompok  dengan  ibu  yang memiliki  titer  Anti-A  dan  anti-B  yang  tinggi menunjukan kadar bilirubin meningkat signifikan dan berlanjut dengan ibu yang memiliki titer anti- A dan anti-B yang lebih rendah tidak mengalami kenaikan  yang  signifikan.  Sehingga  dapat diketahui  terdapat  pengaruh  kadar  bilirubin  total terhadap titer Anti-A dan Anti-B ibu (p= 0.023 dan p=0.001).
Gambar 3. Korelasi OD IgG1 Anti-A, IgG3 Anti-A, IgG1 Anti-B dan IgG3 Anti-B dengan Kadar Bilirubin Hasil  analisa  Gambar  3,  dimana  terdapat peningkatan OD IgG1 anti-A dan IgG1 anti-B yang signifikan  terhadap  kadar  bilirubin  bayi  yang tinggi.
HDFN terjadi karena sel darah merah bayi masuk ke sirkulasi darah ibu, sehingga menginisasi sistem  imun  ibu  untuk  teraktifasi  yang  dimediasi oleh limfosit. Sel T helper ibu berinterasi dengan MHC  kelas  II  yang  diekspresikan  oleh  sel  darah merah  bayi.  Setelah  interaksi  awal,  sel  T  helper menginisiasi limfosit B untuk merangsang respon imun humoral. 10 Antibodi pertama yang diproduksi adalah IgM sebagai respon primer terhadap antigen dan  terbentuk  pada  periode  4  minggu  hingga  3 bulan.  Selama  respon  imun  sekunder  terdapat peralihan kelas IgM menjadi IgG. 13
Antibodi  yang  dapat  melewati  plasenta hanyalah IgG, transfer IgG dimediasi oleh reseptor neonatal  (FcRn). 14 Imunoglobulin  diangkut  oleh
FcRn  dari  sinsitiotrofoblas  yang  juga  melindungi IgG dari katabolisme protein serum normal. Pada trimester  pertama,  transfer  lebih  sedikit,  namun meningkat  secara  eksponensial  pada  trimester kedua dan ketiga. Konsentrasi rata-rata pada janin pada  minggu  ke-24  kehamilan  adalah  1.8  g/dL.
Tingkat  antibodi  IgG  lebih  tinggi  pada  janin  dari pada  ibu  menjelang  aterm.  Meskipun  keempat
subkelas  IgG  dapat  melewati  plasenta,  IgG3  dan IgG1 lebih efisien dalam hemolisis sel darah merah daripada IgG2 dan IgG4. 15
Titer  IgG  ibu  dari  bayi  yang  memiliki hiperbilirubinemia  tetapi  tidak  terjadi jaundice adalah  <32  dan  titer  ibu  dari  bayi  yang  memiliki hiperbilirubinemia  serta  terjadi jaundice adalah ≥32.  Titer IgG anti-A dan anti-B yang dimiliki ibu dari bayi yang memiliki hiperbilirubinemia hingga jaundice dari  penelitian  ini  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  penelitian  yang  dilakukan oleh Dharmayani, et al di Indonesia dan Akmu, et al  di  Lagos  yakni  8  sudah  dapat  menyebabkan HDFN  pada  4.3%  kelahiran  dari  inkompatibel ABO, 12,15 akan tetapi hasil titer dari penelitian ini sejalan  dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh Usha dan Sulochana di India 16 serta Ye et al. 17 Bao et  al  melakukan  penelitian  di  Cina,  jika  ibu memiliki  titer  IgG  Anti-A  dan  Anti-B  ≥32  maka akan beresiko terjadi HDFN. 18 Penelitian lain juga dilakukan  di  Cina  oleh  Li  et  al  di  Cina  dan Bakkeheim  di  Norway  menyimpulkan  jika  titer IgG  ibu  ≥  512  berasosiasi  dengan jaundice pada bayi. 11,19 Hal  tersebut  terjadi  karena  titer  IgG  ibu cenderung  meningkat  pada  trimester  ketiga kehamilan. Oleh karena itu, pemeriksaan antenatal titer  IgG  anti-A  dan  anti-B  ibu  dapat  secara signifikan  memprediksi  terjadinya  HDFN-ABO, meskipun hal itu juga tergantung faktor lain seperti densitas  plasenta,  antigen  permukaan  sel  darah merah dan subtipe IgG. 11
IgG1  ditemukan  lebih  dominan  pada  ibu dengan  bayi  hiperbilirubinemia  yang  disertai dengan jaundice . Hasil penelitian ini mirip dengan penelitian  yang  dilakukan  Zhou  et  al  di  Cina,
Media Ilmu Kesehatan Vol. 0, No. 0, Bulan Tahun
mereka menemukan ibu dengan titer lebih dari 64 dan konsentrasi subtipe IgG1 dan IgG3, khususnya IgG1  secara  signifikan  mempengaruhi  HDN-
ABO. 20 Studi yang berbeda dilakukan oleh Kaplan et  al  di  California  dengan  menggunakan  sampel darah  tali  pusat  bayi,  mereka  menyimpulkan identifikasi subtipe IgG pada darah tali pusat tidak memprediksi terjadinya hemolisis pada inkompatibilitas ABO pada bayi. 21
Konsentrasi subtipe IgG sangat bergantung  pada  usia  janin  dan  transport  aktif melewati  plasenta.  Konsentrasi  IgG1  lebih  dulu naik  daripada  IgG3  pada  usia  kehamilan,  terjadi peningkatan  rasio  IgG1,  IgG3  dan  IgG4  pada trimester ketiga. Konsentrasi IgG2 pada darah tali pusat mengalami defisiensi, karena Fc-reseptor di sel sinsitiotrofoblas di jaringan plasenta berikatan dengan  IgG1  dengan  afinitas  yang  lebih  kuat daripada dengan IgG2. 22-23

## KESIMPULAN
Titer IgG ibu >8 menyebabkan hiperbilirubinemia, tetapi tidak terjadi gejala klinis jaundice .  Titer  IgG  ibu  >16  menyebabkan hiperbilirubinemia dan juga jaundice . Subtipe IgG yang lebih berperan hingga menyebabkan masalah klinis adalah IgG1.

## TERIMA KASIH
1. UKK PPM Laboratorium Terpadu Universitas Indonesia. 2. Unit Transfusi Darah Pusat Palang Merah
Indonesia.
3. Departemen  kebidanan  dan  anak  RSUP Nasional  Dr.  Cipto  Mangunkusumo Jakarta.
4. RS Budi Kemuliaan Jakarta.

## KEPUSTAKAAN
1. Fasano RM. Hemolytic disease of the fetus and newborn  in  the  molecular  era .  Semin  Fetal Neonatal Med 2016; 21(1): 28-34.
2. Watchko  JF. Common  hematologic  problems in the newborn nursery . Pediatr Clin North Am 2015; 62(2): 509-24.
3. De Haas M, Thurik FF, Koelewijn JM, Van der Schoot CE. Haemolytic disease of the fetus and newborn . Vox Sang. 2015; 109: 99-113.
4. Delaney M, Matthews DC. Hemolytic disease of  the  fetus  and  newborn:  managing  the mother, fetus, and newborn . Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2015; 2015: 146- 51.
5. Erhabor  O. Heamolytic  disease  of  the  foetus and  new  born  due  to  ABO  blood  group incompatibility  between  mother  and  their babies  in  specialist  hospital  sokoto ,  Nigeria. SF Obstet Women Health J. 2018; 1(2): 1-6.
6. Bhat  YR,  Kumar  CGP. Morbility  of  ABO haemolytic  disease  in  the  newborn .  2012; 32(2): 93-6.
7. Yahya N, Yuniati T, Lubis L. Characteristics of neonatal hyperbilirubinemia at west java’s top  referral  hospital ,  Indonesia.  AMJ.  2017; 4(2):167-71.
8. Watchko  JF. Common  Hematologic  Problem in The Newborn Nursery . Pediatr N AM. 2015; 62 (2): 509-24.
9. Hunt, Js, Baeck ML, Hardman JT, Tegtmeier GE,  Byer  W. Characterization  of  human erythrocyte  alloantibodies  by  IgG  subclasses and  monocyte  interaction .  In.  Ukita  M,
Takahashi A, Nunotani T, Kihana T, Watanabe S,  Yamada  N. IgG  subclasses  of  anti-A  and anti-B antibodies bound to the cord red cells in ABO  incompatible  pregnancies .  Vox  Sang. 1989; 56: 181-86.
10. Brouwers  HA,  Overbeeke  MA,  van Ertbruggen I, Schaasberg W, Alsbach GP, van der Heiden C, et al. What is The Best Predictor of The Severity of ABO-Haemolytic Disease of
The  newborn? Lancet  Lond  Engl.  1988  Sep 17;2(8612):641–4.
11. Bakkeheim  E,  Bergerud  U,  Schmidt-Melbye AC, Akkök ÇA, Liestøl K, Fugelseth D, et al. Maternal IgG anti-A and anti-B titres predict outcome  in  ABO-incompatibility  in  the neonate . Acta Paediatrica. 2009; 98: 1896-901.
12. Akanmu  AS,  Oyedeji  OA,  Adeyemo  TA, Ogbenna  AA. Estimating  the  risk  of  ABO hemolytic disease of the newborn in Lagos . J Blood Transfus. 2015; 2015: 560738.
13. Klein  GH,  Anstee  D. Mollison's  blood transfusion in clinical medicine . 12th ed. UK: Wiley.
14. Schur  PH. IgG  subclasses.  A  Historical Perspective. Monogr Allergy. 1988;23:1–11
15. Dharmayani  D,  Gatot  D,  Rohsiswatmo  R, Tridjaja B. Serological Profile and Hemolytic Disease  in  Term  Neonates  with  ABO Incompatibility .  Paediatr  Indones.  2009  Aug 31;49(4):219–23.
16. Usha  KK,  Sulochana  PV. Detection  of  High Risk  Pregnancies  with  Relation  to  ABO Haemolytic  Disease  of  Newborn .  Indian  J Pediatr. 1998 Dec;65(6):863–5.
17. Ye HH, Huang HH, Wang XL, Pi YJ. Analysis of Correlation between IgG Titer of Pregnant Women and Neonatal Hemolytic Complications  of  Different  Blood  Groups .
Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2017; 25(5): 1532-1536.
18. Bao R, Wang S, Yang Q. Clinical Study of The Relationship between Prenatal Antibody Titer
and Hemolytic Disease of Newborn . Int J Clin Exp Med 2017;10(1):1637-1642.
19. Li P, Pang LH, Liang HF, Chen HY, Fan XJ. Maternal  IgG  anti-A  and  anti-B  titer  levels screening in predicting ABO hemolytic disease of the newborn: a meta-analysis . Fetal Pediatr Pathol. 2015; 34: 341–50.
20. Chen  JY,  Ling  UP. Prediction  of  the Development of Neonatal Hyperbilirubinemia in ABO Incompatibility . Zhonghua Yi Xue Za Zhi Chin Med J Free China Ed. 1994; 53(1): 13–8.
21. Kaplan  M,  Merlob  P,  Regev  R. Israel Guidelines  for  The  Management  of  Neonatal Hyperbilirubinemia  and  Prevention  of Kernicterus .  J  Perinatol  Off  J  Calif  Perinat Assoc. 2008; 28(6): 389–397.
22. Wu Q, Zhang Y, Liu M, Wang B, Liu S, He C. Correlation  of  Fc(gamma)RIIa  (CD32) Polymorphism and IgG Antibody Subclasses in Hemolytic Disease of Newborn . Neonatology. 2009 ;96(1): 1–5.
23. Leger RM . In Vitro Cellular Assays and Other Approaches  Used  to  Predict  The  Clinical Significance  of  Red  Cell  Alloantibodies :  A Review.  Immunohematology.  2002;  18(3): 65–70.