## AKTIVITAS IMUNOMODULATOR EKSTRAK DAUN Moringa oleifera Lam TERHADAP POPULASI HEMATOPOETIC STEM CELL PADA MENCIT YANG DIINFEKSI Salmonella typhi

## Mohammad Hefni, Muhaimin Rifa’i, dan Widodo
Laboratorium Fisiologi Hewan
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya Email: hefnis2bio@gmail.com

## Abstrak
Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengetahui  aktivitas  imunomodulator  ekstrak  daun  Moringa oleifera Lam terhadap populasi Hematopoetic Stem Cell (HSC) pada mencit yang diinfeksi Salmonella  typhi.Mencit  dikelompokkan  menjadi  2  kelompok.Kelompok  non-infeksi  dan kelompok  infeksi  S.  typhi.Pada  masing-masing  kelompok  diberikan  ekstrak  M.  oleifera secara  oral  selama  20 hari  dengan  dosis  yang berbeda,  diantaranya  kelompok  kontrol  (0 mg/kg  BB),  dosis  1  (14  mg/kg  BB),  dosis  2  (42  mg/kg  BB),  dan  dosis  3  (84  mg/kg BB).Selanjutnya pada kelompok infeksi diinfeksi S. typhi sebanyak 10 8 sel.Jumlah populasi HSC  dapat  diketahui  dengan  mengamati  molekul  permukaan  HSC  (Cluster  of Differentiation 34/ CD34)dengan analisa software BD CellQuest Flowcytometri.Data hasil flowcytometri dianalisis menggunakan Two-Way Anova (P < 0.05), dengan SPSS 16.0 for Windows.  Hasil  penelitian  menunjukkan pemberian  ekstrak  M.  oleifera  dapat beraktivitas sebagai  imunostimulator  terhadap  HSC  (CD34),namun  pemberian  dengan  dosis  rendah (14  dan  42  mg/kg  BB)  lebih  efektif  dibandingkan  dengan  dosis  tinggi  (84  mg/kg  BB). Bahkan,  pemberian  ekstrak  M.  oleiferadengan  dosis  tinggi  (84  mg/kg  BB)  dapat beraktivitas sebagai imunosupresor terhadap HSC
. Kata kunci:Moringa oleifera, Salmonella typhi, Hematopoetic Stem Cell.

## PENDAHULUAN
Agen infeksi maupun non-infeksi banyak  terdapat  di  lingkungan  sekitar  kita, yang  setiap  saat  dapat  menyerang    host  cell maupun  jaringan.  Agen  infeksi  tersebut  dapat berupa  bakteri  patogen  intraseluler,dalam jumlah tertentu dapat menginfeksi dan bermultiplikasi  di  dalam  tubuhyang  akan menyebabkan  penyakit  serius  pada  hewan maupun manusia dalam keadaan immunodeficiency.
Salah  satu  bakteri  patogen  intraseluler diperankan  oleh  kelompok  bakteri  dari  genus Salmonella. Menurut Zang, et al.
(2008)Salmonella  merupakan  agen  penyebab penyakit salmonellosis. Bakteri ini termasuk ke dalam  famili  Enterobacteriaceae,  berbentuk batang,  berflagel  (Pui  et  al.,  2011)  dan termasuk dalam golongan bakteri gram negatif anaerob  fakultatif.  Bakteri  dari  golongan Salmonella  ini  mampu  menyerang  hewan  dan
manusia  dengan  berbagai  level  infeksi  yang bervariasi,mulai infeksi ringan yang mengakibatkan  diare  sampai  pada  infeksi tingkat  tinggi  seperti  demam  tifoid  (Deipen  et al.,  2005).Infeksi  tingkat  tinggi  tersebut diperankan  oleh  spesies  Salmonella  typhi (Deipen  et  al.,  2005).  Gejala  infeksi  S.  typhi dapat  menyebabkan  penyakit  infeksi  sistemik yang parah, serta juga dapat menyerang sel-sel host,  terutama    menyerang  dan  bereplikasi dalam sel makrofag. Salmonellajuga mempunyai faktor virulensi utama yang berupa lipopolisakarida  (LPS)  (Torres  et  al.,  2000). Jika  pertahanan  sel-sel  host  tidak  mencukupi, maka infeksi yang ditimbulkan akan berdampak  pada  organ-organ  vital  termasuk pada  sumsum  tulang  (Bone  marrow),  kelenjar gatah  bening  (limph  node),  dan  limfa  (spleen) (Eckmann et al., 2001).
Pecegahan sedini mungkin perlu dilakukan untuk mengantisipasi adanya infeksi bakteri  patogen  (S.  typhi)  dengan  cara
meningkatkan  sistem  imunitas  baik  humoral maupun seluler. Sel-sel imunitas yang berperan penting dalam sistem imunitas diperankan oleh Hematopoeitic Stem Cell(CD34) yang terdapat pada  bone  marrow.Sel  pluripoten  ini  dapat membelah  menjadi  dua  tipe  stem  cell  yaitu limfoid progenitor dan mieloid progenitor yang berperan  dalam  meregulasi  sistem  imun  baik humoral maupun selular.
Limfoid progenitor berkembang manjadi sel  limfosit  B  dan  T  yang  masing-masing berfungsi sebagai sistem imunitas humoral dan selular  dalam  sistem  imunitas  adaptive. Sedangkan  meiloid  progenitor  berkembang sebagai leukosit, eritrosit, makrofag, dendritik, monosit,  dan  megakariosit  yang  memproduksi platelet  yang  penting  dalam  pembekuan  darah (Hoffbrand, 2005).
Peningkatan imunitas ini dapat dilakukan  dengan  terapi  pemberian  obat- obatan  herbal  untuk  meminimalisir  adanya resistensi  terhadap  bakteri  target.  Obat-obatan herbal  dapat  berasal  dari  buah,  sayur,  maupun tanaman  yang  memiliki  kandungan  sebagai imunomodulator  (memodulasi  fungsi  dan aktivitas sistem imun).Salah satu tanaman yang memiliki  kandungan  imunomodulator  yaitu Moringa  oleifera.M.  oleiferatermasuk  dalam famili Moringaceae, banyak tersebar di negara yang beriklim tropis dan sub-tropis termasuk di Indonesia.Menurut Kasolo et al.(2010) kandungan  fitokimia  daun  M.  oleifera  Lam meliputi  senyawa  gallic  tannin,  steroids, titerpenoid, flavonoid, saponin, antraquinones, catecol  tannin,  alkaloid  dan  reducing  sugar, dan alkaloid..Kandungan fitokimia M.
oleiferaini dapat bermanfaat dalam meningkatkan  titer  antibodi  (Sudha  et  al., 2010),    meningkatkan  konsentrasi  leukosit, eritrosit,  haemoglobin  level  (Hb),  persentase neutrofil, berat organ timus dan spleen (Gupta et al., 2010).
Berdasarkan fenomena tersebut, maka penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  aktivitas  imunomodulator  ekstrak M.  oleifera.terhadap  populasi  Hematopoeitic Stem  Cell  pada  mencit  yang  diinfeksi  S. typhi.Populasi  Hematopoeitic  Stem  Celldapat diketahui  dengan  cara  mengamati  molekul permukaan CD (Cluster of Differentiation) dari HSC berupa CD34. Abbas (2005)
mengungkapkan bahwa, CD34 + merupakan marker  pertama  yang  dapat  digunakan  untuk mengetahui  jumlah  HSC  perimitive  pada sumsum tulang atau darah perifer.

## METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan Juni-November  2012  yang  bertempat  di Laboratorium  Biologi    FMIPA  Universitas Brawijaya  Malang,  meliputi  Laboratorium Fisiologi  Hewan,  Laboratorium  Mikrobiologi, Laboratorium Biologi Molekuler, dan
Laboratorium  Biomedik  Fakultas  Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
Populasi dan Sampel Populasi sampel yang digunakan sebanyak  8  perlakuan  dengan  3  ulangan. Hewan  coba  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah  mencit  (Mus  musculus)pathogen freestrain Deutschland Denken Yonken (DDY)jenis  kelamin  betina  dengan  umur  7 minggu  dengan  rata-rata  berat  badan  26 gram.Sampel  bakteri  yang  digunakan  sebagai agen  infeksi  yaitu  berupa  Salmonella  thyphi yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi  Fakultas  Kedokteran  Universitas
Brawijaya.Daun  Moringa  oleifera  Lam  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  diperoleh  dari desa Karduluk, Kecamatan
Paragaan,
Kabupaten Sumenep.

## Pengelompokan Perlakuan Hewan Coba
Hewan coba berupa mencit sebanyak 32 ekor  dibagi  menjadi  8  kelompok  perlakuan, masing-masing  kelompok  terdiri  dari  4 ekor.Mencit  diaklimasi  selama  1  minggu, selanjutnya  dibagi  menjadi  dua  sub-kelompok (kelompok  infeksi  dan  non-infeksi).Pada masing-masing  kelompok  digunakan  3  variasi dosis yang berbeda Tabel 1.

## Pemberian dan Ekstraksi M. oleifera
Pemberian Ekstrak M. oleifera dilakukan  secara  oral  1  kali  sehari  selama  20 hari  sesuai  dosis  perlakuan  menggunakan sonde.Volume  pemberian  ekstrak  M.  oleifera sebanyak100  µl  dengan  tambahan  pelarut  Na- CMC 0.05%.
Pembuatan  ekstraksi  air  daun  M. oleifera  dilakukan  dengan  cara  mengambil daun M.  oleifera  yang  sudah  dewasa (3-5  dari pangkal atau batang utama), selanjutnya dicuci hingga  bersih.  Daun  M.  oleifera  yang  sudah bersih  dikering  anginkan  dan  diblender,hasil blender  kemudian  diayak  sehingga  didapatkan serbuk (simplisia). 5 gram simplisia dilarutkan dengan 50 ml aquades dan dilakukan maserasi selama  15  menit  sambil  sesekali  diaduk.
Selanjutnya  dipanaskan  pada  suhu    80 o C selama  15  menit.  Kemudian  dilakukan penyaringan  dengan  menggunakan  kain  flanel dan kertas saring, dandidapatkan infusa. Infusa yang  diperoleh  ditambah  aquades  sampai mencapai  50  ml.  Infusa  yang  diperoleh merupakan hasil ekstraksi dengan  konsentrasi 10 kali pengenceran, dan selanjutnya digunakan sesuai dosis perlakuan.

## Injeksi S. thypi
Injeksi  S.  typhi  dilakukan  secara intrapretoneal  pada  hari  ke-21  sebanyak  10 8 sel/ml setelah pemberian esktrak M. oleifera.Injeksi  dilakukan  dengan  mengambil S.  thypi  dari  biakan  murni  dibiakkan  pada  20 ml  mediumLB  (Luria  Broth),  diinkubasi sampai  mencapai  jumlah  10 8 sel/ml  dengan melakukan perhitungan dengan hemacytometer setiap  1  jam.  Setiap  melakukan  perhitungan jumlah  sel/ml  ditambahkan  1-4  tetes  formalin 4% dan dilakukan dengan proses penghitungan bakteri  dengan  menggunakan  hemacytometer, sampaimendapatkan  konsentrasi  sel  bakteri 10 8 sel/ml.Selanjutnya  dilakukan  setrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada  suhu  25 o C.  Pelet  yang  diperoleh disuspensi  dengan  larutan  PBS  for  injection atau  NaCl  fis    sebanyak  100  µl.  Suspensi tersebut  diinjeksikan  pada  hewan  coba  secara intrapretoneal.

## Uji Konfirmasi S. typhi dalam Darah Mencit
Konfirmasi  keberadaan  S.  typhi  di dalam  darah  dilakukan  setelah  24  jam perlakuan  infeksi  S.  typhi  untuk  memastikan keberadaan bakteri setelah infeksi. Uji konfirmasi  ini  dilakukan  dengan  mengambil darah  mencit  melaui  pembuluh  vena  caudalis (ekor).Mula-mula  mencit  dimasukkan  dalam penyungkup  dan  ekornya  dioles  dengan alkohol 70%.Selanjutnya ekor mencit dipotong +  2  mm  dari  ujung  ekor.Tetesan  darah  yang keluar  pertama  kali  diusap  dengan  tissue, selanjutnya  ekor  diurut  dari  pangkal  hingga ujung secara perlahan. Tetesan darah ditampung  dalam  microtube  yang  telah  disisi dengan  antikoagulan  hingga  mencapai  volume 50  µl.  Selanjutnya  ditambah  dengan  larutas NaCl  fis  steril  sebanyak  450    µl.  Darah  hasil isolasi kemudian ditanam pada media  LB dan diinkubasi  dalam  ikubator  shaker  selama  24 jam pada suhu 37 o C, 120 rpm. Hasil isolasi pada media LB kemudian  diinokulasikan  pada  media  selektif
Salmonella  yaitu  media  XLD  (Xylose-Lysine- Deoxycholate).  Pada  medium  ini,  Samonella akan membentuk koloni dan akan menghasilkan warna hitam. Konfirmasi bakteri uji  selanjutnya  dilakukan  dengan  uji  katalase.

## Salmonella akan menunjukkan positif katalase.
Uji  katalase  ini  dilakukan  dengan  mengambil satu ose biakan bakteri dan direaksikan dengan H 2 O 2 yang  sebelumnya  diteteskan  pada  kaca objek. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya gelembung  yang  menunjukkan  H 2 O 2 telah dipecah  oleh  isolat  bakteri  tersebut  menjadi H 2 O dan O 2 dengan reasksi (H 2 O 2 → H 2 O+ O 2 ).

## Pembedahan dan Isolasi Sel
Mencit dilakukan pembedahan pada hari ke-34. Mula-mula mencit dibunuh dengan cara dislokasi  leher,  hal  ini  memungkinkan  mecit tidak  merasakan  sakit  pada  saat  pembedahan. Kemudian  dilakukan  penyayatan  pada  daerah abdomen mencit, selanjutnya dilakukan pengambilan  organ  bone  marrow  untuk diisolasi selnya.
Isolasi  sel  dari  bone  marrow  dilakukan dengan cara mengambil dari tulang femur, dan tibia.    Tulang  femur  dan  tibia  pada  mencit terlebih  dahulu  dibersihkan  dari  sisa  jaringan otot  yang  menempel  kemudian diflush  dengan PBS  menggunakan  jarum  27  G.  Selanjutnya dihomogenkan  dengan  cara  pipeting.  Hasil isolasi  sel  ditambah  sampai  mencapai  volume 6  ml  dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung  falcon untuk selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm, pada suhu 20 o C selama 5 menit.Pellet yang dihasilkan disuspensi dengan 1  ml  PBS  dan  dipipeting  untuk  mendapatkan homogenat.  Sebanyak  200  µl  homogenat dipindahkan  pada  tabung  mikrosentrifus  baru dan  ditambahkan  500  ul  PBS.    Selanjutnya disentrifugasi  dengan  kecepatan  1500  rpm selama  5  menit  pada  suhu  20 o C.  Hasil supernatan dibuang dan pelletnya ditambahkan Antibodi  untuk  selanjutnya  dianalisis  dengan flowcytometri.

## Penghitungan Jumlah Sel
Penghitungan  jumlah  sel  dilakukan untuk  mengetahui  jumlah  absolut  sel  pada masing-masing  organ  yang  diambil  dalam penelitian  ini,  yaitu  bone  marrow  dan spleen.Penghitungan  jumlah  sel  dilakukan dengan menggunakan haemocytometer.
Suspensi  sel  hasil  isolasi  dalam  PBS  diwarnai dengan  pewarnaan  evens  blue.  Sel  yang
dihitung adalah sel hidup yang ditandai dengan tidak terwarnai oleh evens blue.
Suspensi  sel  hasil  isolasi  dihitung dengan  pengenceran  10  kali,  dengan  cara mengambil  10  µl  dan  dimasukkan  ke  dalam microtube,  selanjutnya  ditambahkan  90  µl even  Blue  dan  dihomogenkan.  Penghitungan sel dilakukan terhadap sel hidup yang terdapat pada  5  kotak  sedang  pada  heamocytometer dengan menggunakan rumus:
∑ = = ........x 10 3
Ket : ∑ = Jumlah sel keseluruhan n  = jumlah sel dari 5 bilik hitung FP = Faktor Pengenceran

## Analisis Flowcytometri
Analisis  flowcytometri  dilakukan  untuk mengetahui jumlah populasi HSC(CD34) pada bone  marrow.  Sel  homogenat  yang  diisolasi dari  bone  marrowdiinkubasi  dengan  antibodi rat anti-mouse anti-CD34PE conjugated. Masa inkubasi  dilakukan  +  15  menit  pada  suhu 4 o C.Penambahan sel homogenat dengan antibodi,  digunakan  perbandingan  1:500. Sampel yang telah diinkubasi antibodi ditambah  dengan  3  ml  PBS  selanjutnya ditempatkan pada kuvet flowcytometri. Flowciytometri disetting sesuai dengan prameter yang akan dianalisis.

## Analisis Data Analisis Data Hasil Flowcytometri
Data  hasil  dari  flowcytometri  dianalisa dengan  menggunakan  sofwer  BD  cellquest Pro TM .Program diatur sesuai dengan pewarnaan dan jenis sel yang diidentifikasi.Gated  dilakukan  berdasarakan pola  ekspresi  sel  yang  terlihat  dalam  layar komputer.

## Analisis Statistik
Data hasil  analisa  dengan menggunakan sofwer  BD  cellquest  Pro TM selanjutnya ditabulasi  dan  dianalisis  dengan  menggunakan uji  statistik  two-way  ANOVA  (Analysis  of Variance)  melalui  program  SPSS  16.0.apabila P<0,05 , hal  ini  menunjukkan  perbedaan  yang signifikan    antara  kelompok  perlakuan, sehingga dilanjutkan dengan uji lanjutTukey.

## HASIL
Hasil  rerata  analisis  flowcytometri  pada (Gambar  1)  menunjukkan  bahwa  pada kelompok  perlakuan    pemberian  ekstrak daunM.  oleifera  dengan  model  non-infeksi  S. typhi  dapat  meningkatkan  persentase  CD34 dibandingkan dengan kelompok kontrol. Terbukti  pada  P1(-)  (dosis  14  mg/Kg  BB) diperoleh  persentase  CD34 + sebanyak  3,19%,
P2(-)  (dosis  42  mg/Kg  BB)  4,32%,  dan  P3(-) (dosis  84  mg/Kg  BB)  2,96%,  hal  ini menandakan adanya peingkatan jumlah persentase CD34 apabila dibandingkan dengan kelompok K(-) (dosis 0 mg/Kg BB) 2,60%.
Pada  perlakuan  pemberian  ekstrak  air daun M. oleifera dengan model infeksi S. typhi (Gambar  1)  menunjukkan  hasil  persentase yang  relatif  sama  antar  perlakuan,  yakni  pada K(+)  (dosis  0  mg/Kg  BB)  persentase  CD34 sebanyak  2,07%,  P1(+)  (dosis  14  mg/Kg  BB) sebanyak  2,11%,  P2(+)  (dosis  42  mg/Kg  BB) sebanyak  2,22%,  dan  P3(+)  (dosis  84  mg/Kg BB) sebanyak 2,35%.
Jumlah  persentase  flowcytometri  ini menggambarkan  jumlah  persentase  sel  yang hanya  mengeskpresikan  CD34  dari  jumlah  sel yang terbaca pada alat flowcytometri + 10.000 sel/ sampel. Oleh karena itu, untuk mengetahui jumlah  sel  CD34  di  seluruh  sumsum  tulang/ bone  marrow  dilakukan  perhitungan  secara absolut sel dengan cara menghitung sel/ml dari hasil isolasi sel bone marrowdengan menggunakan hemacytometer.
Berdasarkan  hasil  perhitungan  jumlah absolut  sel  CD34disajikan    pada  (Tabel2) dapat  diketahui  bahwa,  jumlah  absolut  sel CD34 pada perlakuan pemberian ekstrak air M. oleifera  Lam  dengan  model  infeksi  dan  non- infeksi  S.  typhi    terdapat  perbedaan  yang signifikan antar perlakuan (P Value< 0.05).
Hasil  uji  lanjut  menggunakan  Tukey (Gambar 2)menunjukkan bahwa, pada kelompok  perlakuan  pemberian  ekstrak  daun M. oleifera dengan model non-infeksi diketahui  pada  kelompok  P1(-)  (dosis  14 mg/kg  BB)jumlah  populasi  selCD34667329 sel/ml  dan  P2(-)  (dosis  14 mg/Kg  BB)  jumlah sel CD34 + sebanyak 1083753 sel/ml, menunjukkan jumlahlebih tinggi bila dibandingkan  dengan  kelompok  K(-)  (dosis  0 mg/Kg  BB)  591665  sel/ml.  Namun  pada kelompok  P3(-)  (Dosis  84  mg/kg  BB)  jumlah sel  CD34mengalami  penurunan  dibandingkan dengan  K(-),  yaitu  518571  sel/ml.  Fenomena ini mengindikasikan adanya aktivitas
imunostimulator  yang  diperankan  oleh  ekstrak daun M. oleifera pada dosis rendah (14 dan 42 mg/kg BB), sedangkan dosis tinggi (84 mg/kg BB)  pada  penelitian  ini  bertindak  sebagai imunosupresor.
Pada  perlakuan  pemberian  ekstrak  daun M.  oleifera  Lam  dengan  model  infeksi  S. typhijumlah  sel  CD34  meningkat  secara siginifikan(Gambar 2). Jumlah sel CD34 pada masing-masing  kelompok  perlakuan  P1(+) (dosis  14  mg/Kg  BB)sebanyak  510413  sel/ml, P2(+)  (dosis  14  mg/Kg  BB)  sebanyak  366723 sel/ml,  dan  P3(+)  (dosis  84  mg/Kg  BB) sebanyak  478882  sel/ml  menunjukkan  angka yang  lebih  tinggi  bila  dibandingkan  dengan kelompok  yang  hanya  diinfeksi  S.  typhi K(+)186274 sel/ml.

## PEMBAHASAN
Sub-bab  dalam  penelitian  ini  akan membahas jumlah populasi sel induk pluripoten  atau  Hematopoietic  Stem  Cells (HSC)    padabone  marrow  setelah  pemberian ekstrak air daun Moringa oleifera Lam dengan model  non-infeksi  dan  infeksi  Salmonella typhi.  Populasi  HSC  penting  untuk  diketahui karena  termasuk  salah  satu  organ  sentral limfoid yang berperan dalam sistem imunitas.
Penggunaan  M.  oleifera  sebagai  agen imunomodulator
didasarkan pada kemampuaannya  dalam  meregulasi  sistem imunitas.Wiedosari  (2007)  mendefinisikan, imunomodulator  merupakan  substansi  atau obat  yang  dapat    memodulasi  fungsi  dan aktivitas sistem imun.  Imunomodulator dibagi menjadi  3  kelompok:  i)    imunostimulator, berfungsi  untuk  meningkatkan  fungsi    dan aktivitas  sistem  imun,  ii)  imunoregulator, artinya  dapat meregulasi sistem imun, dan iii) imunosupresor    yang  dapat  menghambat  atau menekan aktivitas sistem imun.
Mekanisme  kerja  dari  imunomodulator yaitu dengan caramengembalikan fungsi sistem imun yang terganggu (imunorestorasi), memperbaiki fungsi sistem imun (imunostimulasi),  dan    menekan  respon  imun (imunosupresi).  Imunomodulator  digunakan terutama pada penyakit imunodefisiensi, infeksi kronis dan kanker. Pemberian imunostimulan  atau  imunomodulator  sangat diperlukan  untuk  mencegah  penghancuran  sel T  helper  CD4 + pada  pasien  yang  terinfeksi bakteri dan penderita kanker (Katzung, 1995).
Berdasarkan hasil penelitian inipemberian  ekstrak  M.  oleifera  dapat
bertindak  sebagai  imunomodutor.  Pada  dosis rendah (14 dan 42 mg/kg BB)mampu bertindak sebagai imunostimulator dengan mampu meningkatkan jumlah sel CD34 atau HSC.Sedangkan  pada  dosis  tinggi  (84  mg/kg BB)  dapat  bertindak  sebagai  imunosupresor dengan  mampu  menurunkan  jumlah  sel  CD34 atau HSC.
Peningkatan  jumlah  populasi  sel  CD34 ini  diduga  disebabkan  oleh  kandungan  bahan aktif  dari  ekstrak  air  daun  M.  oleifera  yang berupa  flavonoid,  saponin  dan  Ca.  Middleton et  al.(2000)  mengungkapkan,  flavonoid  dapat memicu  aktivitas  Mitogen  Activated  Protein Kinase  (MAPK).  MAPK  akan  memicu terjadinya posporilasi berbagai protein termasuk  protein  transcription  factor  yang dibutuhkan dalam proses sintesa protein dalam proses  siklus  sel.  Craxton  et  al.(1998) menambahkan  MAPK  dapat  menginduksi terjadinya  aktivasi protein transcription factor dalam  hal  ini  NF- K B  (Nuclear  Factor  Kappa B). Sun (2010) menambahkan, NF- K B merupakan  faktor  transkripsi  yang  dapat bertranslokasi  ke  dalam  nukleus  dan  dapat menginduksi  lebih  dari 200  gen  anti-apoptosis termasuk  protein  Bcl-2  dan  Bcl-XL.  Adanya protein-protein  tersebut  dapat  memungkinkan sel  untuk  tetap  survive  dan  tetap  mampu melakukan  proliferasi  sehingga  jumlah  sel meningkat.
Nuhu  (2010)  menambahkan,  senyawa flavonoid,  saponin,  dan  Ca  dapat  ditemukan pada  ekstrak  air  daun  M.  oleifera.Chen  et  al. (2003)melaporkan senyawa flavonoid, saponin,  dan  Ca  dapat  menginduksi  terjadinya sintesis  proto-oncogene  seperti  halnya  c-fos dan c-myc. proto-oncogene ini merupakan gen regulatorik  normal  yang  terlibat  dalam pengaturan produksi dan proliferasi sel. proto- oncogene tersebut terlibat dalam meningkatkan konsentrasi  cyclin  D2  dan  cyclin  E,  yaitu protein  yang  dapat  mengaktifkan  berbagai cyclin-dependent kinase (CDK) yang dibutuhkan  dalam  siklus  sel.  Peningkatkan konsentrasi  cyclin  D2  dan  cyclin  E  ini  dapat meningkatkan aktivitas proliferasi sel CD34.
Aktivitas imunosupresor diperankan oleh ekstrak daun M. oleifera pada dosis tinggi (84 mg/kg BB) hal ini diduga disebabkan oleh salah  satu  kandungan  bahan  aktif  ekstrak  M. oleifera  Lam  yang  berupa  saponin  dalam konsentrasi tinggi diduga mampu menyebabkan  apoptosis  sel  sehingga  jumlah CD34 berkurang.Statement  ini sejalan dengan
Gao  et.  al.,  (2011)  bahwa,  ektrak  Paris chinensis  yang  mengandung  bahan  aktif saponin  dengan  konsentrasi  tinggi    mampu meningkatkan permeabilitas membran mitokondiria  sehingga  akan  menyebabkan teraktivasinya protein yang dapat mengaktifkan  caspase  9,  yang  didahului dengan  pelepasan  sitokrom  c  dari  membran mitokondria menuju sitosol. Rilisnya sitokrom- c dan teraktivasinya caspase 9 selanjutnya akan memicu  aktivasi  caspase  3  yang  dapat mengaktifkan  ICAD  (Inhibitor  of  Caspase Activated DNAse) diiringi dengan meningkatnya  diterminasi  sel,  sehingga  sel akan  mengalami  apoptosis.  Banyaknya  sel yang  mengalami  apoptosis  dapat  menurunkan jumlah sel CD34 atau HSC.
Menurunnya  jumlah  sel  CD34  juga terjadi  pada  kelompok  perlakuan  dengan model  infeksi,  hal  ini  dapat  dimungkinkan terlibat
dalam
beberapa mekanisme.Mekanisme  apoptosis  sel  akibat adanya  agen  infeksi  dari  bakteri  patogen  atau juga dapat dimungkinkan karena pada perlakuan model infeksi S. typhi dapat memicu berdiferensiasinya  HSC  ke  arah  meiloid maupun  ke  arah  limfoid  dalam  mengatasi antigen  S.  typhi.Weinrauch  &  Zychlinsky (1999) mengungkapkan, bakteri patogen seperi S.  typhi  dapat  memicu  terjadinya  apoptosis pada  host  cell  yang  terinfeksi.  Kemampuan  S. typhi  dalam  menginfeksi  diperankan  oleh endotoksin LPS yang dimilikinya. LPS S. typhi dapat  menekan  ekpresi  protein  anti-apoptosis yang  diperankan  oleh  golongan  protein  Bcl. Hilangnya protein anti-apoptosis akan berdampak pada terganggunya integritas membran  mitokondria,  yang  akan  berdampak pada  terganggunya  influks  Ca,  sehingga  dapat memicu apoptosis sel.
Mekanisme penurunan jumlah sel CD34 yang  lain  akibat  berdiferensiasinya  sel  CD34. Hal  ini  dijelaskan  oleh  Corolin  et  al.  (2008) bahwa HSC akan mengalami proses diferensiasi  dan  akan  kehilangan  molekul CD34,  sehingga  kuantitas  CD34  berkurang. HSC  dengan  salah  satu  fungsinyadapat membelah menjadi stem cell limfoid progenitor  dan  akhirnya  berkembang  menjadi sel  limfosit  B  dan  T.  Hoffbrand  (2005) menambahkan, pada tahap awal perkembangannya  HSC  akan  berkembang menjadi  progenitor  sel  T  yang  kemudian berkembang  menjadi  sel  double  negatif  CD4 - CD8 - ,  selanjutnya  sel  akan  berkembang
menjadi  singgle  positif  (CD4 + atau  CD8 + ) tergantung  pada  reaksi  TCR  dengan  kelas MHC. Jika TCR berikatan dengan MHC kelas I, maka akan memicu diferensiasi ke prekursor sel T sitotoksik (CD8 + ), sedangkan ikatan TCR dengan MHC kelas II akan memicu diferensiasi  ke  prekursor  sel  T  helper  (CD4 + ). Ikatan  TCR  dengan  kelas  MHC  I  atau  II ditentukan  oleh  jenis  antigen  yang  diproses oleh sistem imunitas.

## Kesimpulan
Ekstrak  daun  Moringa  oleifera  Lam dapat bertindak sebagai imustimulator dengan mampu  meningkatkan  populasi  HSC  (CD34) pada  mencit  yang  diinfeksi  Salmonella  typhi, namunpada  pemberian  ekstrak  daun  M. oleifera  Lam  dengan  dosis  rendah  (14  dan  42 mg/kg  BB)lebih  efektif  bila  dibandingkan dengandosis  tinggi  (84  mg/kg  BB).  Bahkan, pada  dosis  tinggi  (84  mg/kg  BB)  dapat berindak sebagai imunosupresor.

## Acknowledgment
Penelitian ini didanai oleh Muhaimin  Rifa’i, Ph.D.,  Med.  Sc.  dalam  hal pengadaan hewan coba dan antibodi.

## Daftar Pustaka
Chen  HL.,  Li  DF.,  Chang  BY.,  Gong,  LM., Piao XS., Yi G.F., and Zhang JX. 2003. Effects of Lentinan on Broiler Splenocyte  Proliferation,  Interlaukin-2 Production,  dan  Signal  Transduction. Journal Poultry Science: 82:760-766 Craxton A., Shu G., Graves J.D., Saklatvala J., Krebs  E.G.,  and  Clark,  EA.  1998.p38 MPAK  is  Required  for  CD40-Induced Gene  Expression  and  Proliferation  in  B Lymphocytes.  Journal  of  Immunology. 161:3225-3236.
Diepen  AV.,  Gevel  JSV.,  Koudijs  MM.,
Ossendrop  F.,  Beekhuizen  H.,  Janssen R.,  and  Dissel  JTV.  2005.  Gamma Irradiation  or  CD4+-T-Cell  Depletion
Causes Reactivation of Latent Salmonella enterica Serovar
Typhimurium  Infection  in  C3H/HeN Mice.  Journal  Infection  and  Immunity. 75(3):2857-2862
Eckmann  L.,  Martin.,  andKagnof  F.  2001. Cytokines  in  Host  Defense  Against Salmonella.  Journal  Mocrobes  and Infection. 3:1191-1200
Gao  L.,  Li  FR.,  Jiao  P.,  Yang  MF.,  Zhou  XJ., Si  YH.,  Jiang  WJ.,  and  Zheng  T.  2011. Paris  chinensis  Dioscin  Induces  G2/M
Cell  Cyle  Arrest  and  Apoptosis  in Human  Gastric  Cancer.Word  Journal Gastroenterology.17(39): 4389-4395.
Gupta  A.,  Gautam  MK.,  Singh  RK.,  Kumar MV., Rao CV., Goel RK., and Anupurba S.  2010.  Immunomodulatory  Effect  of
Moringa  oliefera  Lam.  Extract  on Cyclophophamide  Induced  Toxicity  in Mice.  Journal of Experimental Biology. 48: 1157-1160
Hoffbrand  AV.,  Pettit,  JE.,&  Moss  PA.  2005.
Hematology. Jakarta,: EGC Kedokteran, 285-290.
Kasolo JN., Bimenya GS., Ojok L., Ochieng J., and  Jasper  WO.  2010.  Phytochemicals and  uses  of  Moringa  oleifera  leaves  in Ugandan  rural  communities.  Journal  of
Madicinal  Plant  Reseacrch.  4(9):  753- 757
Katzung  BG.  1995.  Basic  and  Clinical
Pharmacology 6thEd . Prentice, Hall International Inc, 157. Middleton E., Kandaswami C., and Theoharides  TC.  2000.  The  Effects  of Plant  Flavonoids  on  Mammalian  Cells: Implications  for  Inflammation,  Heart Disease,
dan Cancer. Journal Pharmacol.52(4): 673–751. Nuhu  F.  2010.  Effect  of  Moringa  Leaf  Meal (MOLM)  on  Nutrient  Digestibility,
Growth,  Carcass  and  Blood  Indices  of Weaner Rabbits.Thesis.Kwame
Nkrumah  University  of  Science  and
Technology, Kumasi, 87.
Pui  CF.,  Wong  WC.,  Chai  LC.,  Tunung  R., Jeyaletchumi P., Hidayah N., Ubong A., Farinazleen MG., Cheah, YK., and Shon R.  2011.  Salmonella  :  A  Foodborne
Pathogen.  Review  Article  International Food Research Journal. 18: 465-473
Sudha  P.,  Asdaq  SMB.,  Dhamingi  SS.,  and
Chandrakala GK. 2010. Immunomodulatory Activity of Methanolic  Leaf  Extract  Of    Moringa oleifera In Animals. Journal Pharmacol. 54(2): 133-140
Sun  OC.  2010.  Studies  of  The  Anti-Cancer Potential  of  Flavonoids  in  Human
Nasopharyngeal Carcinoma
Cells.
Thesis.Master  of  Science,  National University of Singapore, Singapore, 53.
Torres  AV.,  Carson  JJ.,  Mastroeni  P., Ischiopoulus  H.,and  Fang  FC.  2000. Antimicrobial  action  of  the  NADPH phagocyte  oxidase  and  inducible  nitric oxidase synthase in experimental salmonellosis. Effect on microbial killing by activated peritoneal macrophages in vitro. J Exp Med. 192(2)
: 227-236 Weinrouch  Y  and  Zynchlinsky  A.  1999.The Induction  of  Apoptosis  by  Bacterial Pathogens.Annual Reveiw of Microbiology.53(10): 155-187.
Wiedosari  E.  2007.  Peranan  Imunomodulator Alami  (Aloe  vera)  dalam  Sistem Imunitas  Seluler  dan  Humoral.  Jurnal
Wartazoa. 17(4): 165-171
Zang  LX.,  Jeza,  Vektor  T.,  and  Pan  Q..  2008.
Salmonella  typhi  Human  Pathogen  to  a
Vaccine Vector. Journal Review Cellular    and  Molecular  Immunology. 5(2): 91-97
Tabel 1. Pengelompokan Dosis dan Model Faktor Perlakuan terhadap Hewan Coba
Dosis M. oliefera Model Faktor Perlakuan K (0 mg/kg BB) Non-infeksi S. typhi Infeksi S. typhi P1 (14 mg/kg BB) Non-infeksi S. typhi Infeksi S. typhi P2 (42 mg/kg BB) Non-infeksi S. typhi Infeksi S. typhi P3 (84 mg/kg BB) Non-infeksi S. typhi Infeksi S. typhi
Tabel  2.  Ringkasan  Analisis  SPSS  two-way  ANOVA  (Analysis  of  Variance)  melalui  program SPSS 16.0.
Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model 1.896E12a 7 2,71E+14 56.896  .000 Intercept 9,70E+15 1 9,70E+15 2,04E+06  .000 DOSIS 4,86E+14 3 1,62E+14 34.053  .000 FAKTOR 8,70E+14 1 8,70E+14 182.773  .000 DOSIS * FAKTOR 5,39E+14 3 1,80E+14 37.779  .000 Error 1,14E+14  24 4,76E+12 Total 1,17E+16  32 Corrected Total 2,01E+15  31
Ket: Sig < 0.05 = berbeda antara kelompok perlakuan.
N o n -I n fe k s i In fe k s i Gambar 1. Hasil analisis flowcytometri sel CD34 pada bone marrow.

## k
Gambar 1. Hasil analisis flowcytometri sel CD34 + pada bone marrow.
Gambar 2. Hasil analisis uji lanjut Tukey 0.05 terhadap jumlah sel CD34
Gambar 2. Hasil analisis uji lanjut Tukey 0.05 terhadap jumlah sel CD34
Keterangan:  grafik  yang  diikuti  huruf  yang  tidak  sama  menunjukan  berbeda  nyata pada (P-Value 0.05).
CD34 +