## Deteksi Molekuler Virus Chikungunya
pada Nyamuk Aedes aegypti
menggunakan metode TWO-STEP RT-PCR
Alvira Rifdah Sativa, Endang Srimurni Kusmintarsih, Trisnowati Budi Ambarningrum
Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman Jalan dr Suparno 63 Purwokerto 53122 Email: alvirarifdahsativa@gmail.com
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  :  29/08/2019 Disetujui  :  30/05/2020

## Abstract
The  Chikungunya  fever  is  a  disease  caused  by  an  Alphavirus  of  the  family  Togaviridae  with the  symptoms  of  a  patient's  posture  that  is  bent  over  by  severe  joint  pain  (arthalgia). Chikungunya  disease  can  be  transmitted  to  humans  through Aedes  aegypti as  a  vector.  The outbreak of Chikungunya in Indonesia was first reported in 1973 in Samarinda and then spread to various other regions. Surveillance data show almost every year of the outbreak occurred in various  regions  in  Indonesia.  In  2013  there  was  the  outbreak  of  Chikungunya  in  North Purwokerto, especially in Bancarkembar and Grendeng.Until now, the medicine or vaccine has not been  found to prevent  Chikungunya  disease.  The  purpose  of  this  research  is  to  know  the infection  of  Chikungunya  virus  (CHIKV)  on A.  aegypti. This  research  was  conducted  by survey  methods  employing  purposive  sampling  technique . The  observed  parameter  is  the positivity of CHIKV. Data  were  analyzed descriptively by observing the appearance of DNA bands  on  UV  transilluminator.  The  results  revealed  that  the  amplicon  of  cDNA  CHIKV  was not detected by the use of the two step RT-PCR method.
Key Words : Aedes aegypti , Chikungunya, DNA, Vector

## Abstrak
Demam  Chikungunya  adalah  suatu  penyakit  yang  disebabkan  oleh  virus Alphavirus dari familia Togaviridae dengan gejala postur penderita yang membungkuk akibat nyeri sendi hebat (arthalgia) . Penyakit Chikungunya dapat ditularkan ke manusia melalui nyamuk vektor Aedes aegypti. Kejadian Luar Biasa (KLB) Chikungunya di Indonesia pertama  kali dilaporkan pada tahun  1973  di  Samarinda  dan  kemudian  menyebar  ke  berbagai  wilayah  lainnya.  Data  surveil menunjukkan  hampir  setiap  tahun  terjadi  KLB  di  berbagai  wilayah  di  Indonesia.  Pada  tahun 2013 terjadi KLB Chikungunya   di Purwokerto Utara, khususnya  wilayah Bancarkembar dan Grendeng.  Hingga  saat  ini  belum  ditemukan  obat  ataupun  vaksin  untuk  mencegah  penyakit Chikungunya.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  infeksi  virus  Chikungunya (CHIKV)  pada  nyamuk  dewasa A.  aegypti .  Penelitian  ini  dilakukan  dengan  metode  survei dengan  pengambilan  sampel  menggunakan  teknik purposive  sampling A.  aegypti. Parameter yang  diamati  adalah  positivitas  CHIKV.  Analisis  data  dilakukan  secara  deskriptif  dengan mengamati  kemunculan  pita  DNA  pada  UV Transilluminator .  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa amplikon cDNA CHIKV tidak terdeteksi dengan metode two step RT-PCR. Kata Kunci : Aedes aegypti , Chikungunya, DNA, Vektor.

## PENDAHULUAN
Penyebaran  penyakit  yang  disebabkan  oleh virus  Chikungunya  membutuhkan  interaksi  antara vektor,  inang  dan  lingkungan.    Chikungunya merupakan  salah  satu  penyakit  zoonosis  yang disebarkan oleh nyamuk Aedes aegypti. (Ochieng, et al .,  2013).  Demam  Chikungunya  merupakan  suatu penyakit yang disebabkan oleh virus Alphavirus dari familia  Togaviridae  dengan  gejala  postur  penderita yang  membungkuk  akibat  nyeri  sendi  hebat (arthalgia) (Ekawasti & Martindah, 2016). Virus  Chikungunya  merupakan  salah  satu anggota “group A” arthropode borne viruses dalam genus alphavirus familia Togaviridae .  Virus Chikungunya  ditularkan  melalui  vektor  utama A. aegypti .  Virus  Chikungunya  termasuk  kelompok virus single strand RNA (ssRNA) yang mempunyai selubung  dengan  diameter  60-70  nm  (Caglioti, et
al .,  2013).  Virus  Chikungunya  juga  merupakan re- emerging  diseases yang  sering  menyebabkan Kejadian  Luar  Biasa  (KLB)  di  berbagai  wilayah  di kawasan  Asia  termasuk  Indonesia  (Maha  & Subangkit, 2014).
Kejadian Luar Biasa (KLB) Demam
Chikungunya  di  Indonesia  dilaporkan  pertama  kali di Samarinda pada tahun 1973. Secara epidemiologis, hampir seluruh wilayah di Indonesia berpotensi untuk timbulnya KLB Demam Chikungunya  (Kemenkes  RI,  2012).  Data  Dinas kesehatan  Provinsi  Jawa  Tengah  menyatakan  17 Kabupaten  atau  kota  masuk  dalam  kategori Kejadian  Luar  Biasa  (KLB)  penyakit  Demam Chikungunya,  salah  satunya  adalah  Kabupaten Banyumas. Peningkatan kasus Chikungunya di Jawa Tengah terjadi mulai tahun 2005 yang berjumlah 46 kasus, tahun 2006 menjadi 86 kasus dan pada 2007

## BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed
Volume 2, Nomor 2 (2020): 218 - 221 E-ISSN: 2714-8564
Deteksi Molekuler Virus Chikungunya pada Nyamuk Aedes aegypti; Alvira R. S, Endang S. K, Trisnowati B. A
meningkat  mencapai  2.801  kasus  (Dinkes,  2012). Menurut  DKK  Banyumas  (2016)    pada  tahun  2015 terjadi peningkatan kasus Chikungunya di Banyumas  dari  270  kasus  menjadi  361  kasus.  Kota Purwokerto termasuk daerah endemis dan Kecamatan  Purwokerto  Utara  menempati  urutan pertama  daerah  endemis  Chikungunya.  Daerah endemis  adalah  daerah  yang  dalam  kurun  waktu  3 tahun selalu terdapat kasus Chikungunya.
Nyamuk A.  aegypti berperan  sebagai  vektor utama  dalam  melanjutkan  proses  siklus  hidup  virus dan  memindahkannya  dari  penderita  ke  hospes rentan  tanpa  menyebabkan  penyakit  pada  tubuh nyamuk (Forman et al ., 2008). Penularan ini terjadi karena setiap kali nyamuk  menggigit (menusuk dan menghisap),  sebelum  nyamuk  menghisap  darah akan mengeluarkan air liur melalui probosisnya agar darah yang dihisap tidak membeku. Bersama air liur inilah  virus  dipindahkan  dari  nyamuk  ke  inang  lain (Schneider BS & Higgs, 2008).
Menurut Mahmud et al. (2017) hingga saat ini belum  ada  vaksin  yang  tersedia  untuk  mencegah penyakit  Chikungunya.  Oleh  karena  itu  salah  satu pengendalian  yang  dapat  dilakukan  adalah  dengan mendeteksi  virus  di  dalam  tubuh  nyamuk  sebelum menginfeksi manusia. Pengawasan vektor merupakan  salah  satu  cara  untuk  mendeteksi aktivitas  virus  di  dalam  tubuh  vektor  sehingga potensi kejadian penyakit di masa yang akan datang dapat diketahui (Hall, et al ., 2012). Deteksi ini dapat dilakukan  dengan  berbagai  metode,  salah  satunya Reverse  Transcriptase-Polymerase  Chain  Reaction (RT-PCR) (Macedo, et al. , 2013). Hal ini diperkuat pada  penelitian  sebelumnya  oleh  Herkilini, et  al (2017)  bahwa  teknik reverse  transcriptase PCR (RT-PCR),  terdiri  dari  dua  tahap  yaitu  sintesis cDNA  dari  mRNA  dan  amplifikasi  cDNA  dengan teknik PCR. RT-PCR digunakan untuk mendapatkan  panjang  klon  DNA  secara  utuh  dari jumlah mRNA yang sangat sedikit.
Berdasarkan uraian di atas didapatkan rumusan masalah  sebagai  berikut,  bagaimana  distribusi  virus Chikungunya  pada  vektornya. Tujuan  penelitian  ini untuk  mengetahui  infeksi  virus  Chikungunya  pada nyamuk dewasa A. aegypti . Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai informasi awal untuk prediksi penularan penyakit Chikungunya.

## MATERI DAN METODE

## Pengambilan Sampel
Penelitian dilakukan di Kecamatan Purwokerto Utara,  Kabupaten  Banyumas,  Jawa  Tengah.  Lokasi pengambilan  sampel  pada  3  desa,  yaitu  Desa Grendeng, Desa Bancarkembar dan Desa Purwanegara berdasarkan kejadian terjadinya Chikungunya.  Metode  pengambilan  sampel  yang digunakan  adalah  metode  survei  dengan  teknik purposive sampling.

## Ekstraksi RNA
Menurut  Sari et  al. (2012)  prosedur  ekstraksi RNA diawali dengan membuat larutan sampel, yaitu Nyamuk A. aegypti dimasukkan ke dalam eppendorf dan  ditambahkan  dengan  air  DEPC  sebanyak  200 µI, kemudian digerus dengan menggunakan grinder . Tahapan  selanjutnya  adalah  Preparasi working solution ,  yaitu  dengan  210  µI  Lysis  buffer ditambahkan  5,88  µI  Carrier  RNA  dan  divortex. Selanjutnya  ke  dalam  eppendorf  1.5  ml  steril ditambahkan  200  µI  larutan  sampel  nyamuk,  20  µI Proteinase  K  dan  200  µl working  solution (yang baru  disiapkan  sesaat  sebelumnya)  lalu  divortex selama  15  detik  hingga  homogen,  kemudian diinkubasi  15  menit  pada  suhu  56°  C  dan disentrifugasi  dengan  kecepatan  rendah.  Setelah selesai lalu ditambahkan 250 µl Etanol dan divortex hingga  homogen,  kemudian  diinkubasi  kembali selama  5  menit  pada  suhu  ruang  (25°  C)  dan disentrifugasi  dengan  kecepatan  rendah.  Sampel dipindahkan  ke  dalam viral  spin  column bersama collection tube dan disentrifuse selama 1 menit pada 6800x  g. Collection  tube dilepaskan  dan  kemudian dipasangkan viral spin column pada wash tube baru.
Selanjutnya  ditambahkan  5000  µl  Wash  Buffer  dan disentrifuse  selama  1  menit  pada    6800x  g,  lalu filtrat  dan collection  tube dibuang,  kemudian dipasangkan viral spin column pada wash tube baru. Selanjutnya  ditambahkan  lagi  500  µl  Wash  Buffer dan disentrifuse selama 1 menit pada 6800x g, filtrat dan collection tube dibuang, kemudian dipasangkan viral  spin  column pada wash  tube baru,  filtrat dibuang  dan  disentrifuse  kembali  selama  1  menit pada  kecepatan  maksimum  (13000x  g). Collection tube dibuang  dan viral  spin  column dipasang  ke dalam  eppendorf  1.5  ml  steril  dan  ditambahkan  50 µl RNAse free water lalu diinkubasi selama 1 menit pada  suhu  ruang  (25°  C).  Kemudian  disentrifuse selama 1 menit pada kecepatan maksimum (13000x g). Viral spin column dibuang dan RNA virus  siap digunakan untuk PCR.

## Sintesis cDNA dari sampel nyamuk
Sintesis  cDNA  menggunakan  kit  SuperScript III  First  Strand  Synthesis  System  for  RT-PCR (Invitrogen)  yang  diawali  dengan  mencampurkan  7 µI RNA sampel nyamuk, 1 µI primer oligo (dT), 10 Mm  dNTP  sebanyak  1  µI  kedalam  eppendorf, DEPC  water  1  µI  ,  dan  inkubasi  selama  5  menit pada  suhu  65°C,  lalu chill di  es  selama  2  menit. Selanjutnya  pembuatan  mix  sintesis  cDNA  dengan komponen 10x RT Buffer 2 µI, 25 Mm MgCl 2 4 µI,
0,1 M DTT 2 µI, RNAse out 1 µI, Superscript III 1 µI,  kemudian  masukkan  10  µI  mix  sintesis  cDNA yang baru dibuat ke dalam tube sampel, dilanjutkan dengan  inkubasi  selama  50  menit  pada  suhu  50°C, inkubasi  kembali  selama  5  menit  pada  suhu  85°C, lalu  di chill pada  es  selama  1  menit.  Tambahkan  1 µI  RNAse  H,  inkubasi  kembali  selama  20  menit pada suhu 37°C. Selanjutnya sampel disimpan pada suhu -20°C.
Deteksi  virus  Chikungunya  dengan  metode Two step RT PCR Deteksi RNA
virus
Chikungunya,
menggunakan  metode Two  step menggunakan  My Taq PCR Kit-Bioline dengan primer universal untuk virus  Chikungunya  yaitu  Chick  1  (5’-  ACC  GGC GTC  TAC  CCA  TTC  ATG  T-3’)  dan  Chick  2  (5’- GGG  CGG  GTA  GTC  CAT  GTT  GTA  GA-3’). Kemudian  tabung  PCR  disiapkan  dan  diberi  kode sesuai  dengan  kode  RNA  yang  akan  di-PCR. Selanjutnya  Mix  reagen  disiapkan  sesuai  jumlah sampel yang akan diperiksa. Komponen mix reagent per  reaksi,  yaitu  2  ×  MyTaq  HS  Red  Mix  12,5  µL, primer forward (Chick  1)  1  µL,  primer reverse (Chick  2)  1  µL,  dan  ddH 2 O  9,5  µL,  serta  1  µL template  cDNA.  Selanjutnya  dilakukan spining down sampai  tidak  ada  sampel/reagen  yang tertinggal  menempel  di  dinding  tabung.  Mesin thermocycle disiapkan  untuk  proses  PCR  dan sampel  dimasukan  ke  dalam  mesin.  Proses  PCR dilakukan  dengan setting ,  yaitu  (i)  predenaturasi  1 siklus  (95°  C;  1  menit;  (iii)  amplifikasi  35  siklus yang  terdiri  dari  denaturasi  (95°  C;  15  detik), annealing (60°C; 15 detik), dan ekstensi (72° C; 10 detik);  (iv)  post  ekstensi  1  siklus  (72°  C;  5  menit); dan (v) hold (4° C) . Elektroforesis gel agarosa 1,5% dilakukan  pada  100  volt  selama  50  menit.  Pewarna cDNA  yang  digunakan  adalah  SYBR green fluorescent  dye dan  100  bp  DNA  ladder  digunakan sebagai  marka  untuk  menganalisis  besar  produk PCR. Visualisasi pita cDNA dilakukan menggunakan UV Transilluminator dan hasil positif apabila pita cDNA berukuran 330 bp.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Deteksi  virus  Cikunginya  pada  sampel nyamuk asal wilayah Purwokerto Utara menggunakan metode Two step RT-PCR menunjukkan hasil negatif. Hal ini dapat dilihat dari tidak tampaknya pita pada sampel setelah dielektroforesis  dan  hanya  marka  DNA (ladder) yang terlihat (Gambar 1).
Gambar 1 .  Hasil  Deteksi  CHIKV  pada  Nyamuk A. aegypti dengan  metode Two  Step RT-PCR  pada  gel Agarose 1,5 %.
Keterangan  :  (M)  marka  DNA  (100  pb);  (1)  Sampel nyamuk wilayah Purwokerto Utara.
Deteksi  virus  Chikungunya  dapat  dilakukan dengan  deteksi  antibodi  oleh  serodiagnosis  ataupun deteksi  molekuler  menggunakan  RNA  virus. Amplifikasi tidak dapat dilakukan dengan menggunakan  RNA  sebagai  template  atau  cetakan, sehingga  pada  sampel  RNA  perlu  dilakukan  proses transkripsi  balik (reverse  transcription) atau  RT- PCR.  Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan  Majawati (2014)  bahwa  diagnosis  laboratorium  untuk  infeksi Chikungunya  adalah  isolasi  virus,  deteksi  antibodi oleh  serodiagnosis,  dan  deteksi  molekuler.  Teknik molekuler  berbasis  PCR  digunakan  sebagai  metode pilihan  untuk  diagnosis  infeksi  virus.  PCR  atau rantai  reaksi  polimerase  adalah  suatu  metode  untuk memperbanyak DNA spesifik dengan menggunakan enzim DNA polimerase yang stabil pada suhu tinggi dan  sepasang  primer  yang  melakukan  hibridisasi pada bagian cetakan dari dua arah yang berlawanan.
Reverse  Transcription  Polymerase  Chain Reaction (RT-PCR)  adalah  teknik  yang  paling sensitif  untuk  mendeteksi  virus  RNA  secara molekuler.  Rantai  RNA  terlebih  dahulu  ditranskrip menjadi complementary DNA (cDNA)  (Staples et al .,  2009).  cDNA  adalah  DNA  yang  dibuat berdasarkan  sekuen  mRNA.  Pembuatan  cDNA melalui  pemanfaatan  enzim reverse  transcriptase yang  melakukan  sintesis  DNA  dari  template  RNA (Herkilini et al., 2017). Pemeriksaan dengan RT-PCR digunakan untuk mendeteksi  CHIKV  secara  spesifik  disampel nyamuk  ataupun  klinis.  RT-PCR  dapat  dibedakan menjadi dua metode yaitu one-step dan two-step RT PCR. Pada penelitian  kali ini  menggunakan  metode two-step RT  PCR  dimana  reaksi  RT  dan  reaksi siklus PCR dilakukan secara terpisah (Staples, et al.,
2009) . Sampel  nyamuk  diambil  dari  daerah  endemik
Chikungunya  tetapi  tidak  didapatkan  hasil  yang positif. Hal ini dapat disebabkan oleh nyamuk yang ditangkap  tidak  mengandung  virus  chikungunya ataupun  infeksi  yang  rendah  dalam  tubuh  nyamuk tersebut.  Penelitian  sebelumnya  melaporkan  bahwa dari  50  sampel  yang  diambil  pada  daerah  yang terserang Chikungunya, hanya ditemukan 13 sampel yang positif (Panggabean et al., 2014).
Kemungkinan  hal  ini  disebabkan  karena  nyamuk yang terinfeksi Chikungunya justru tidak tertangkap atau  nyamuk  yang  ditangkap  dari  lapangan merupakan  nyamuk  baru  sehingga  belum  sempat mengisap  darah  dan  kemungkinan  besar  tidak mengandung  virus  (Fadilla et  al., 2015).  Salah  satu faktor  yang  menyebabkan  tidak  terdeteksinya  suatu virus  yang  ditransmisikan  oleh  nyamuk  vektor adalah terjadinya degradasi RNA virus Chikungunya  di  dalam  tubuh  nyamuk  (Sasmono et al. 2012).  Namun,  kemunculan  virus  Chikungunya bukanlah merupakan satu-satunya penyebab terjadinya KLB Chikungunya di suatu daerah karena mobilitas  populasi  yang  tinggi  juga  diduga  menjadi penyebab terjadinya suatu kasus penyakit
M 1
(Agustiningtyas  &  Lusiyana,  2017).  Oleh  sebab  itu dalam penelitian ini kasus Chikungunya masih dapat terjadi meskipun CHIKV negatif.

## SIMPULAN
Berdasarkan  deteksi  molekuler  menggunakan metode two-step RT PCR, Virus Chikungunya tidak terdeteksi  pada  sampel  nyamuk A..aegypti asal wilayah Purwokerto Utara.

## DAFTAR REFERENSI
Agustiningtyas,  I.  &  Lusiyana,  N.  2017.  Ovitrap Survey  and  Serotype  Identification  of Dengue  Virus  on  Aedes  Sp  Mosquito  in Potorono,  Banguntapan,  Bantul,  Indonesia. International  Journal  of  Mosquito  Research , 4(5), pp. 32-37.
Caglioti,  C.,  Lalle,  E.,  Castilleti,  C.,  Carletti,  F., Capobianchi,  M.R.,  &  Bordi,  L.  2013. Chikungunya  Virus  Infection:  an  overview. New Microbiologica , 36, pp. 211-227. Dinkes.  2012. Data  kasus  Chikungunya  di Kabupaten  Gunungkidul. Jawa  Tengah  : Dinas Kesehatan.
DKK  Banyumas.  2016. Profil  kesehatan  banyumas tahun 2015. Purwokerto : DKK Banyumas. Ekawasti,  F.  &  Martindah,  E.  2016.  Pengendalian vektor  pada  penyakit  zoonotik  virus  arbo  di Indonesia. Wartazoa, 26(4), pp. 151-162.
Fadilla,  Z.,  Hadi,  U.  K.,  Setiyaningsih,  S.  2015. Bioekologi Vektor Demam Berdarah Dengue (DBD)  serta  Deteksi  Virus  Dengue  pada Aedes  aegypti (Linnaeus)  dan Ae.  albopictus (Skuse)  (Diptera:  Culicidae)    di  Kelurahan Endemik  DBD  Bantarjati,  Kota  Bogor. Jurnal  Entomologi  Indonesia ,  12(1),  pp.  31- 38.
Forman,  S.,  Hungerford,  N.,  Yamakawa,  M., Yanase,  T.,  Tsai,  H.J.,  Joo,  Y.S.,  Yang,  D. K.,  Nha,  J.  J.  2008.  Climate  change  impacts and  risks  for  animal  health  in  Asia. Revue scientifique et technique , 27(2), pp. 81-97.
Hall, R., Blitvich, B., Cheryl, A. & Stuart, D., 2012. Advances in virus arbo surveillance, detection and diagnosis. Journal of biomedicine and biotechnology, 2012, pp. 1- 2.
Herkilini,  A.,  Hendrati,  P.M.,  Gumilas,  N.S.A., Sulistyo,  H.  2017.  Ekspresi  mRNA  BRLF1 Virus  Epstein-Barr  dari  Biopsi  Jaringan Tumor  Formalin  Fixed  Paraffin  Embedeed Sebagai Petanda  Biologi Molekul  Diagnosis Karsinoma  Nasofaring. Biosfera ,  34(3),  pp. 138-143.
Kemenkes  RI,  2012. Pedoman  Pengendalian Demam Chikungunya. 2 ed. Jakarta:
Kemenkes RI.
Macedo,  G.A.,  de  Araujo,  J.M.G.,  Schatzmayr,  H.
G.,  Costa,  F.A.C.,  de  Filippisa,  A.M.B.,  dos Santosa,  F.B.,  &  Nogueira,  R.M.R.  2013. Virological surveillance for early  warning of dengue  epidemics  in  the  State  of  Rio  de Janeiro,  Brazil. Transactions  of  the  Royal Society  of  Tropical  Medicine  and  Hygiene, 107(3), pp. 141-146.
Maha,  M.S.  &  Subangkit.  2014.  Manifestasi  Klinis Infeksi  Virus  Chikungunya  pada  Kejadian Luar  Biasa  di  Indonesia. Jurnal  Biotek Medisiana Indonesia, 3(1), pp. 11-16.
Mahmud,  S.,  Ahmed,  S.S.,  &  Hussain,  M.  2017. Chikungunya  Fever:  A  Global  Burden Including  Bangladesh. International  Journal of Scientific Research, 6(7), pp. 542-546.
Majawati,  E.S.  2014.  Penggunaan Polymerase Chain  Reaction (PCR)  pada  Diagnosis Filariasis. Jurnal Kedokteran Meditek , 15(39), pp. 1-8.
Ochieng,  C.,  Lutomiah,  J.,  Makio,  A.,  Koka,  H., Chepkorir,  E.,  Yalwala,  S.,  Mutisya,  J., Musila,  L.,  Khamadi,  S.,  &  Richardson,  J. 2013. Mosquito-borne arbovirus  surveillance at  selected  sites  in  diverse  ecological  zones of Kenya. Virology journal , 10, p. 140.
Panggabean,  Y.C.,  Kusumawati,  L.R.,  &  Yulfi,  H. 2014.  Deteksi  virus  chikungunya  pada nyamuk Aedes aegypti di kabupaten Serdang Bedagai. The  journal  of  medical  school,
47(1), pp.14-18.
Sari,  T.F.,  Joharina,  A.S.,  Anggraeni,  Y.M.  2012. Identifikasi  Serotipe  Virus  Dengue  Pada Nyamuk Aedes Aegypti Dan Aedes Albopictus Di Kota Salatiga Dengan Metode RT-PCR. Salatiga: Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Vektor dan Reservoir Penyakit Salatiga.
Sasmono, T., Yohan, B., Setainingsih, T.Y., Aryati,
W.  P.,  &  Rantam,  F.A.  2012.  Identifikasi Genotipe  dan  Karakterisasi  Genome  Virus Dengue  di  Indonesia  untuk  Penentuan Prototipe  Virus  Bahan  Pembuatan  Vaksin Dengue  Berbasis  Strain  Indonesia. Journal Kesehatan Indonesia, 6, pp. 602-609.
Schneider B.S. & Higgs, S. 2008. The enhancement of  arbovirus  transmission  and  disease  by mosquito saliva is associated with modulation  of  the  host  immune  response. Transactions  of  the  royal  society  of  tropical medicine and hygiene, 102, pp. 400-408.
Staples, J.E., Breiman, R.F., & Powers, A.M. 2009. Chikungunya  fever  :  an  epidemiological review  of  a  re-emerging  infectious  disease. Clinical infectious diseases, 49, pp. 942-948.