Pengaruh pemberian seng terhadap indeks fagositosis makrofag dan kadar nitric oxyde mencit balb/c yang terpapar lipopolisakarida e.coli
Nur Fardian 1 , Andrew Johan 2 , RA Kisdjamiatun RMD 3

## ABSTRACT
Background  : Immune  system  responses  to  LPS  by  activating  macrophage  and  producing  NO.  Seng  has  play  it’s  role  as antioxidant and immunomodulator. The aim of this study is to prove the effect of zinc administration to macrophage phagocytosis index and NO level.
Method : The post test only controlled group design was conducted in 4 groups of Balb/C mice. Macrophage phagocytosis index and NO level was analyzed by one way anova, and proceeded with Bonferroni test.
Results  : Means  of  macrophage  phagocytosis  index  were  106,60(±023.31),  428.40(±159.58),  285.70(±90.45)  dan 208.07(±43.85) on control group, 30 ppm, 60 ppm and 120 ppm zinc administration group consecutively. There was a significant difference  of  macrophage  phagocytosis  index  between  control  and  intervention  group  (p  =  0,000).  Mean  of  NO  level  were 0,08(±0,03),  0,12(±0,06),  0,09(±0,03)  and  0,20±0,08  on  control  group,  zinc  dose  group  of  30  ppm,  60  ppm  and  120  ppm consecutively. There was significant difference on NO level between control and intervention group (p= 0,13).
Conclusion : Phagocytosis index of all intervention groups with zinc doses of 30 pp, 60 ppm and 120 ppm were significantly higher compare to control group. NO level in 120 ppm of zinc was significantly higher compare to control. Doses of 30 ppm had the highest phagocytosis index and doses of 120 ppm had the highest NO level.
Keywords : zinc, macrophage, NO, lipopolysaccharide

## ABSTRAK
Latar Belakang : Sistem imun tubuh merespons LPS dengan mengaktifkan makrofag dan memproduksi NO. Seng memiliki sifat sebagai antioksidan dan imunomodulator. Penelitian bertujuan untuk membuktikan pemberian seng berbagai dosis berpengaruh terhadap indeks fagositosis makrofag dan kadar NO.
Metode : The post test only controlled group design pada mencit Balb/C terbagi atas 4 kelompok. Perbedaan indeks fagositosis dan kadar NO dianalisis menggunakan uji one way ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Bonferroni.
Hasil :  Rerata  indeks  fagositosis  makrofag  adalah  106,60(±023,31),  428,40(±159,58),  285,70(±90,45)  dan  208,07(±43,85) berturut turut untuk kelompok kontrol, perlakuan dosis 30 ppm, perlakuan dosis 60 ppm dan perlakuan dosis 120 ppm. Terdapat perbedaan bermakna atas indeks fagositosis makrofag antara kelompok kontrol dan perlakuan (p = 0,000). Rerata kadar NO adalah 0,08(±0,03), 0,12(±0.06), 0,09(±0,03) dan 0,20±0,08 berturut turut untuk kelompok kontrol, perlakuan dosis 30 ppm, perlakuan dosis 60 ppm dan perlakuan dosis 120 ppm. Terdapat perbedaan bermakna atas kadar NO antara kelompok kontrol dan perlakuan (p= 0,013).
Kesimpulan : Indeks fagositosis makrofag seluruh kelompok perlakuan dengan dosis seng bertingkat 30 ppm, 60 ppm dan 120 ppm lebih tinggi secara bermakna dibanding kelompok kontrol. Kadar NO kelompok perlakuan dengan dosis seng 120 ppm lebih tinggi secara bermakna dibanding kelompok kontrol. Sedangkan dosis pemberian seng 30 ppm terbukti memiliki indeks fagositosis tertinggi dan dosis 120 ppm terbukti memiliki kadar NO tertinggi.
Kata kunci : seng, makrofag, NO, lipopolisakarida

## PENDAHULUAN
Seng  sebagai  zat  gizi  mikro  essensial  bagi sistem  imunitas  khususnya  pada  proses  inflamasi  dan sepsis.  Seng  diperlukan  dalam  keadaan  infeksi  lokal atau  sepsis  guna  merespon  kerusakan  agar  dapat mengaktivasi fungsi respon sistem imun bawaan 1 , dan berperan  dalam  pembentukan  NO  oleh  iNOS  sebagai respons  terhadap  LPS  pada  mencit.  LPS  digunakan
dalam  induksi  endotoksemia  eksperimental  pada hewan coba. LPS merupakan aktivator bagi makrofag dan    stimulan  poten  terhadap  respons  imun  bawaan yang mampu membunuh bakteri, dan dapat menyebab kan perubahan patologis yang signifikan pada tubuh host .  Molekul  LPS  dilepaskan  dari  permukaan bakteri  dan  selanjutnya  menstismulasi  makrofag  dan sel  endotel  untuk  memproduksi  sitokin  dan  mediator inflamasi.  Makrofag  bersama  neutrofil  akan  merubah molekul oksigen  mejadi reactive oxygen intermediate (ROI).  Aktivitas  makrofag  sebagai  mekanisme pertahananan tubuh terhadap LPS dapat dinilai melalui kemampuan fagositosis (indeks fagositosis makrofag) dan kadar NO makrofag.
1 Bagian  Ilmu  Gizi  Prodi  Kedokteran  Universitas Malikussaleh,
2 Bagian  Biokimia  Fakultas  Kedokteran  Universitas Diponegoro,
3 Magister Ilmu Biomedik Universitas Diponegoro
Pengaruh seng sebagai zat gizi mikro penting dalam  sistem  imunitas  khususnya  pada  proses inflamasi  dan  sepsis.  Sejumlah  penelitian  telah membuktikan  efek  positif  dari  seng  terhadap  sistem imun termasuk dosis pemberiannya.  Seng diperlukan dalam keadaan infeksi lokal atau sepsis guna merespon kerusakan  agar  dapat  mengaktivasi  fungsi  respon sistem  imun  bawaan.  Penelitian  bertujuan  untuk mengetahui pengaruh seng terhadap indeks fagositosis dan produksi NO pasca pemberian LPS sebagai induksi terjadinya endotoksemia.

## METODE
Penelitian  ini  merupakan  uji  laboratoris  dengan menggunakan  mencit  Balb/c  dan  pendekatan the  post test  only  controlled  group  design .  Dua  puluh  empat ekor mencit yang dipaparkan lipopolisakarida E.coli i.p
dibagi 4 kelompok : kelompok kontrol (K); kelompok perlakuan yang mendapat seng 30 ppm/hari (P2); seng 60  ppm/hari  (P2);  seng  120  ppm/hari  (P3)  selama  11 hari.  Pemberian  LPS  dilakukan  pada  hari  ke  12,  dan seng  dilanjutkan  hingga  hari  ke  14.  Kemudian dilakukan  pemeriksaan  indeks  fagositosis  dan  kadar NO. Indeks fagositosis berdasarkan persentase sel yang memfagosit  partikel latex yang  dihitung  pada 120 sel dikali  rerata  jumlah  partikel  yang  difagosit  pada  sel yang  positif,  sedangkan  kadar  NO  diukur  dari konsentrasi NO yang terdapat dalam supernatan kultur makrofag, diukur dengan metode Griess.
Analisis statistik indeks fagositosis dan kadar NO  menggunakan  ANOVA  dilanjutkan  dengan  uji Bonferroni.

## HASIL
Gambar 1. Box plot indeks fagositosis makrofag
Penelitian  ini  meggunakan  24  ekor  mencit betina  Balb/C  berumur  8-10  minggu  dan  berat  badan 20-30  gram  yang  telah  diadaptasi  selama  7  hari, kemudian  diberikan  seng  sesuai  dosis  masing-masing kelompok selama 11 hari dan hari ke 12 diberikan LPS E.coli sebanyak LPS 0,1 mg/mencit dalam volume 250 µL  larutan  salin  steril.  Pemberian  seng  dilanjutkan hingga  hari  ke-14.  Tidak  ada  tikus  yang  mati  selama penelitian. Setelah itu mencit diterminasi dan diambil cairan  peritonealnya  lalu  dihitung  indeks  fagositosis dan kadar NO pada tiap kelompok. Alur penelitian dan hasil tercantum pada gambar 3.
Terdapat  perbedaan  bermakna  antara  indeks fagositosis  makrofag  kelompok  K  (106,60±23,30) dibandingkan  dengan  masing  masing  kelompok perlakuan  P1  (428,40±159,58),  P2  (285,70±    90,45) dan P3 (208,07± 43,85) dengan nilai p<0,05. Uji post host  antar  kelompok  menunjukkan  :  K-P1(0,000),  K- P2  (0,000),  K-P3  (0,005),  P1-P3  (0,004),  tetapi  tidak didapatkan  perbedaan  yang  bermakna  antara  P1-P2 (0,210)  dan  P2-P3  (0,561).  Oleh  karena  itu  dapat diartikan  bahwa  dibandingkan  kelompok  kontrol, indeks  fagositosis  seluruh  kelompok  perlakuan  lebih tinggi. Rerata indeks fagositosis paling tinggi terdapat pada kelompok P1 senilai 428,40 (Δ = 321,8), diikuti kelompok  P2  dengan  nilai  285,70  (Δ=  179,1),  dan kelompok  P3  dengan  nilai  208,07  (Δ=101,47)  serta paling  rendah  pada  kelompok  kontrol  dengan  nilai 106,60. Rerata indeks fagositosis makrofag mengalami kecenderungan penurunan seiring dengan peningkatan dosis  seng.  Pemberian  seng  menunjukkan  pengaruh terhadap indeks fagositosis.
Terdapat  perbedaan  bermakna  antara  indeks fagositosis  makrofag  kelompok  K  (0,08±0,03) dibandingkan  dengan  kelompok  perlakuan  P3 (0,20±0,08)  dan    P2  (0,09±0,03)  dengan  kelompok perlakuan P3 dengan nilai p<0,05. Uji post host antar kelompok  menunjukkan  :  K-P3  (0,010),  dan  P2-P3 (0,034),  tetapi  tidak  didapatkan  perbedaan  yang bermakna  antara  K-P1(1,000),  K-P2  (1,000),  P1-P2 (1,000) dan P1-P3 (0,228). Rerata kadar NO kelompok perlakuan  lebih  tinggi  dibanding  kelompok  kontrol. Rerata kadar NO paling tinggi terdapat pada kelompok P3 senilai 0,20 (Δ= 0,12), kelompok P1 0,12 (Δ= 0,04), dan  kelompok  P2  0,09  (Δ=0,01)  serta  paling  rendah pada kelompok kontrol. Peningkatan kadar NO terjadi sesuai dengan peningkatan dosis seng. Pemberian seng berpengaruh  terhadap  kadar  NO  mencit  Balb/C  yang terpapar LPS.

## DISKUSI
Sitokin  proinflamasi  berpengaruh  langsung terhadap homeostasis seng. Seng merupakan komponen  penting  bagi  thymulin,  hormon  yang berperan dalam maturasi dan differensiasi sel T. Seng
berperan  menginduksi  aktivasi  sel  T  atau  alterasi produksi  limfokin,  dan  mengaktifkan  makrofag  guna melakukan bacterial clearance . Ekspresi gen IL-2 dan IFN-γ  (sitokin  Th1)  bergantung  pada  seng,  di  mana defisiensi seng menurunkan sitokin sel Th1 IFN-γ dan IL-12 2 . IL-12 di produksi oleh makrofag-monosit yang mengalami stimulasi dan bergantung pada seng. IFN-γ dan  IL-12  bersama  bersama  berperan  dalam membunuh  parasit,  bakteri  dan  virus  oleh  makrofag. Aktvitas sitotoksik sel NK juga menurun pada keadaan defisiensi seng 3,4 . Makrofag yang teraktivasi mengalami  peningkatan  kemampuan  fagositosis  dan produksi  ROI  sehingga  kuman  dapat  lebih  banyak dieliminasi. konsentrasi seng yang tinggi justru bersifat menginhibisi dan berefek negatif bagi sistem imun dan perubahannya  mirip  dengan  keadaan  defisiensi  seng. Konsentrasi seng sebanyak 7-8 kali lipat menghentikan produksi  IFN-γ 5 .  Penurunan  indeks  fagositosis  pada penelitian ini dapat terjadi karena pengaruh pertama : adanya  penurunan  enzim  ATP-ase  pada  membran  sel makrofag.  Konsentrasi  seng  yang  tinggi  dapat mengaktivasi makrofag dengan menghambat membran ATP-ase.  Enzim  ATP-ase  diperlukan  oleh  makrofag untuk  menghidrolisis  ATP  dalam  proses  polimerisasi aktin  sehingga  fagositosis  dapat  terjadi.  Fagositosis akan  menurun  sebagai  akibat  sedikitnya  molekul  G- aktin yang terpolimerisasi saat lateks berikatan dengan reseptor  makrofag.  Hal  ini  terjadi  karena  pemberian diet  tinggi  seng  dapat  menurunkan  enzim  tersebut 6 . Kedua  :  pemberian  seng  dalam  dosis  tinggi  berefek negatif  dan  perubahannya  mirip  dengan  keadaan defisiensi seng. Fungsi sel T dihambat pasca pemberian seng  dosis  tinggi,  sehingga  menyebabkan  penurunan produksi  IFN-γ  yang  tidak  cukup  banyak  untuk mengaktivasi makrofag, sehingga kemampuan fagositosis dan killing makrofag menurun 7 . LPS sering digunakan dalam induksi endotoksemia  eksperimental  pada  hewan  coba  di laboratorium. LPS yang terikat dengan reseptor LPS di membran  sel  akan  mengaktivasi  monosit,  makrofag, neurofil dan sel endotel di paru yang selanjutnya akan menghasilkan NO dalam jumlah besar melalui iNOS. Peningkatan produksi NO melalui iNOS berkontribusi terhadap  respons imun  pada  endotoksemia. Makrofag yang  teraktivasi  LPS  merupakan  sumber  iNOS  yang menghasilkan  NO.  NO  bereaksi  dengan  anion superoksida  untuk  menghasilkan  oksidan  poten peroksinitrit. Peroksinitrit terlibat dalam pembentukan hidroksiradikal  yang  mengakibatkan  induksi  stres nitrosative,  antara  lain  destruksi  protein  dan  enzim pada membran sel pada defisisensi seng. Produksi NO dan  IL-1β  yang  berlebihan  akan  mengakibatkan  efek reactive  oxygen  species (ROS) 8 .  Fagositosis  oleh makrofag  dipengaruhi  oleh  interferon-γ  (IFN-γ)  dan dalam  proses  tersebut  makrofag  akan  mengeluarkan reactive  oxygen  intermediate (ROI)  dan nitric  oxide
(NO)  untuk  proses  destruksi  intraselular.  Ikatan  LPS pada  CD14  memicu  aktivasi  TLR4  dan  meneruskan sinyal  bagi  molekul  lain.  Sinyal  TLR4  mengaktifkan faktor transkripsi seperti nuclear factor–kappa B (NF- κB),  yang merupakan suatu protein faktor transkripsi terdapat pada makrofag, akan teraktivasi akibat toksin dari bakteri seperti LPS. Proses ini akan menyebabkan peningkatan mediator proinflamasi seperti IL-8, TNF- α, intercellular adhesion molecule , serta cyclooxygenase -2.  Antioksidan  seperti  seng    dapat melemahkan  efek  paparan  dari  lipopolisakarida  dan memblok produksi NF-кB 9 . Defisiensi seng merupakan pemicu positif bagi terjadinya translokasi NF-кB yang menyebabkan terjadinya efek proinflamasi. Walaupun
seng berefek anti inflamasi, namun sejumlah aksi dapat bersifat proinflamasi.

## SIMPULAN
Indeks fagositosis makrofag seluruh kelompok perlakuan  dengan  dosis  seng  bertingkat  30  ppm,  60 ppm  dan  120  ppm  lebih  tinggi  secara  bermakna dibanding  kelompok  kontrol.  Kadar  NO  kelompok perlakuan  dengan  dosis  seng  120  ppm  lebih  tinggi secara  bermakna  dibanding  kelompok  kontrol. Sedangkan  dosis  pemberian  seng  30  ppm  terbukti memiliki  indeks  fagositosis  tertinggi  dan  dosis  120 ppm terbukti memiliki kadar NO tertinggi.
Gambar 3. Alur dan ringkasan penelitian

## DAFTAR PUSTAKA
1. Kohler J, Blass A, Williams M, Faldetta K, Kelly E,  editors.  LPS  upregulates  cellular  demand  for Zn2+  in  murine  macrophages.  5th  annual academic  surgical  congress  association  for academic  surgery  and  society  of  university surgeons 2010; Boston, MA.
2. Metz CH, Schroder AK, Overbeck S, Kahmann L, Plumakers  B,  Rink  L.  T-helper  type  1  cytokine
release is enhanced by in vitro zinc supplementation  due  to  increased  NK  cell.  Nutr. 2007;23:157-63.
3. Prasad  AS.  Zinc:  role  in  immunity,  oxidative stress  and  chronic  inflammation.  Curr  Op  Clin Nutr Metab Care 2009;12:646–52.
4. Prasad  AS.  Zinc:  Mechanisms  of  Host  Defense Experimental  Biology  meeting:  Micronutrient Regulation  of    Host-Pathogen  Interactions;  San
Francisco, CA, 2006. 24 ekor mencit  Balb/C ekor Randomisasi Adaptasi 7 hari Kontrol 6 ekor P1 6 ekor P2
6 ekor
P3 6 ekor Seng  30 ppm peroral hari 1-11 Seng 60 ppm peroral hari 1-11 Seng 120 ppm peroral hari 1-11
LPS i.p 0,1 mg/mencit dalam 250 µL larutan salin steril hari 12
Seng 30 ppm hari 12-14 Seng 30 ppm hari 12-14 Seng 30 ppm hari 12-14 Rerata Indeks Fagositosis : 428,40 Rerata Indeks Fagositosis : 106,60 Rerata Indeks Fagositosis : 285,70 Rerata Indeks Fagositosis : 208,07 Kadar NO: 0,08 µM Kadar NO: 0,12 µM Kadar NO: 0,09 µM Kadar NO: 0,20 µM
5. Rink L, Kirchner H. Zinc altered immune function and cytokine production. In: Hambidge M, Cousin R,  Costello  R,  editors.  Zinc  and  health  :  current status and future directions; November 4-5, 1998; Maryland, USA: J Nutr; 1998. p. 1407S-11S.
6. Yuniastuti  A,  Nugrahaningsih  W,  Zunikhah  Z. Efektivitas  seng  (Zn)  sebagai  imunostimulan dalam produksi reactive oxygen intermediate pada mencit  Balb/C  yang  diinfeksi  Salmonella typhimurium. Biosaintifika. 2010;2(1):53-60.
7. Ibs K-H, Rink L. Zinc-Altered Immune Function. J Nutr.  2003;133:1452S-5S.
8. Miyazaki  T,  Takenaka  T,  Inoue  T,  Sato  M, Miyajima Y, Nodera M, et al.
Lipopolysaccharide-induced  Overproduction  of Nitric  Oxide  and  Overexpression  of  iNOS  and Interleukin-1β  Proteins  in  Zinc-deficient  Rats. Biol Trace Elem Res. 2012;145:375–81.
9. Overbeck  S,  Rink  L,  Haase  H.  Modulating  the immune response by oral zinc supplementation : a single  approach  for  multiple  diseases  Arch Immunol Ther Exp. 2008;56:15–30.