Menara Perkebunan , 2002, 70(2), 35-49
Keragaman genetik  klon-klon karet ( Hevea brasiliensis Muell. Arg) yang resisten  dan rentan  terhadap Corynespora casiicola berdasarkan penanda RAPD dan AFLP
Genetic variation  of  rubber ( Hevea brasiliensis Muell. Arg) clones resistance and susceptible to Corynespora cassiicola using RAPD and AFLP markers
Nurita TORUAN-MATHIUS 1) , Z. LALU 2) , SOEDARSONO 3)
& Hajrial  ASWIDINNOOR 3)
1) Unit Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Bogor 16151, Indonesia
2) Fakultas Biologi, Universitas Mataram
3) Institut Pertanian Bogor, Bogor 16151

## Summary
Corynespora leaf fall disease (CFLD) caused by the fungus Corynespora casiicola is one of the most important diseases of Hevea brasiliensis .CFLD was reported to cause serious damage on rubber productivity, and  the disease has became more apparent in the recent  years. The objectives of this study were (i) to analyze genetic similarities among several rubber clones resistance and susceptible to CFLD based on RAPD and  AFLP markers, (ii) to compare the effectiveness of RAPD and AFLP markers.  DNA genomic was extracted from young leaves of RRIM600, GT1, PB260, RRIC100, BPM1 (belongs to resistance group), PPN2058, PPN2444, and PPN2447 (belongs to susceptible group). Data were analyzed with NTSYS-pc program version 2.10, and a dendogram was created by cluster analysis using the unweighted pair group method on the basis of arithmetic averages (UPGMA).  The results show that  marker index AFLP (3.57) is higher than  RAPD (1.02), it means that  AFLP is more effective compared to  RAPD . The average of genetic similarity AFLP (0.63) lower than RAPD (0.67) it means that  AFLP is  more discriminative than RAPD. Dendogram based on  AFLP and RAPD were the best with at 0.65 level of  genetic similarity  cluster divided into two cluster A and B. Cluster  A with a sub  group A1 consisted of RRIC100, PPN2058 and PPN244  are  belongs   to
resistance group),  and  sub group A2 consisted of (RRIM600, GT1, BPM1 and PB 260 are belongs to susceptible group),  while  cluster B only PPN2447 is belong to susceptible group . AFLP analysis show that one AFLP band of   110 bp resulting from PCR amplification using         E-ACA/M-CAG (E-ACA/M-CAG 110 ) primer pairs present  in resistance clones, but absent  in the susceptible clones. Meanwhile, application of    50 random primers decamer in RAPD analysis did not showed the specific band for either one of the group.  It is concluded that AFLP marker analysis using  E- ACA/M-CAG primer pair have a potential to differentiate resistance and the susceptible rubber clones to Corynespora . For the  confirmation of the results  more resistance and susceptible clones are needed  for further test.
[ Key words: Hevea brasiliensis , leaf-fall diseases, Corynespora casiicola , AFLP, RAPD, genetic similarity, UPGMA ]

## Ringkasan
Penyakit gugur daun Corynespora (PDGC) yang disebabkan oleh patogen Corynespora asiicola, merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman karet ( Hevea brasiliensis) . PGDC menyebabkan penurunan yang cukup serius terhadap  produktivitas    tanaman     karet.  Tujuan
Toruan-Mathius et al .
penelitian ini adalah untuk (i) mengidentifikasi kesamaan genetik antar beberapa klon yang tergolong tahan dan rentan dengan marka RAPD dan AFLP, dan (ii) mempelajari efektivitas kedua marka tersebut. DNA genomik diekstraksi dari daun muda klon RRIM600, GT1, PB260, BPM1, RRIC100 (tergolong resisten), PPN2058, PPN2444, dan  PPN2447 (tergolong rentan ). Data dianalisis dengan NTSYS-pc program versi 2.10. Dendogram dibuat dengan analisis pengelompokan menurut metode Unweighted Pair Group berbasis Arithmetic Avarages ( UPGMA). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa marka indeks AFLP (3,57) lebih tinggi daripada RAPD (1,02), sehingga AFLP lebih efektif dibandingkan dengan RAPD. Rata-rata perkiraan kesamaan genetik AFLP (0,63) sedikit lebih rendah dari RAPD (0,67) sehingga AFLP relatif lebih diskriminatif daripada RAPD. Dendogram berdasarkan integrasi AFLP dan RAPD  adalah yang  paling baik, dimana pada rata-rata perkiraan kesamaan genetik (0,65) terbentuk  dua kelompok yaitu A dan B. Kelompok A terdiri atas sub sub kelompok A1 yang beranggotakan  (RRIC100, PPN2058 dan PPN244 yang tergolong resisten), dan   sub  group A2 yang beranggotakan (RRIM600, GT1, BPM1 dan PB 260 yang tergolong rentan) Sedang kelompok B beranggotakan hanya PN2447 yang tergolong rentan.  Analisis AFLP menghasilkan satu pita AFLP dengan menggunakan pasangan primer E- ACA/M-CG (E-ACA/M-CAG 110 ) secara konsisten diperoleh dari klon karet yang resisten, namun tidak ditemukan pada klon yang rentan. Sementara itu, aplikasi 50 primer acak dekamer dalam analisis RAPD tidak menghasilkan pita spesifik untuk kedua kelompok yang diuji. Disimpulkan bahwa analisis AFLP menggunakan pasangan primer   E- ACA/M-CAG berpotensi untuk membedakan klon karet yang resisten dan rentan  terhadap Corynespora .  Untuk mengkorfirmasi hasil yang diperoleh, perlu dilakukan pengujian terhadap klon-klon yang resisten dalam jumlah yang lebih banyak.

## Pendahuluan
Tanaman karet Hevea secara ekonomi dan sosial merupakan komoditas perkebunan
sangat penting bagi Indonesia, Malaysia, Thailand, India, Sri Lanka dan beberapa negara lainnya.  Penyakit gugur daun Corynespora (PGDC) disebabkan oleh patogen Corynespora casiicola, merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman karet  di negara-negara penghasil karet di Asia. Awal penyebaran penyakit ini terjadi sekitar tahun  1980-an baik di Indonesia,   Sri Lanka, Malaysia, India maupun Thailand. Penyakit ini semakin penting, ketika beberapa klon sebelumnya bersifat moderat dilaporkan menjadi rentan dan terserang hebat setelah beberapa tahun kemudian (Jayasinghe & Silva, 1996; Shukor & Hidir, 1996; Sinulinga et al. ,  1996; Rajalaksmy & Kothandaraman, 1996).
Sampai sejauh ini belum ada  fungisida yang direkomendasikan untuk  mengendali-kan penyebaran penyakit ini di lapang. Satu- satunya  cara untuk mengatasi masalah tersebut adalah pekebun harus menggunakan bahan tanam dari klon yang tahan terhadap PGDC. Pemuliaan untuk mendapatkan tanaman yang tahan telah dilakukan, diawali dengan pemilihan klon yang tahan yang kemudian digunakan sebagai tetua dalam program persilangan. Informasi dan pemahaman  mengenai ketahanan tanaman karet terhadap PGDC.  Di samping  itu keragaman genotip plasma nutfah karet merupakan modal dasar untuk keberhasilan program pemuliaan. Keragaman sangat penting untuk memperluas basis genetik dan kemungkinan  mengeksploitasinya melalui penciptaan heterosis.
Beberapa teknik molekuler telah di- kembangkan untuk menetapkan keragaman genetik antar klon karet dan plasma nutfah, diantaranya menggunakan isoenzim (Chevallier, 1988 ; Chaidamsari et al ., 1993; dan Seguin et al ., 1995 dan Yeang et al ., 1998), RAPD Nurhaimi–Haris et al . (1998) dan Venkatachalam et al. (2002), dan RFLP Besse et al . (1994). Teknik  RAPD  tidak
Keragaman genetik  klon-klon karet yang resisten  dan rentan.....
memerlukan pelacak DNA  atau informasi mengenai sekuens DNA yang dilacak. Prosedurnya sederhana, dapat dilakukan secara maksimal untuk contoh dalam jumlah banyak, jumlah DNA yang diperlukan relatif sedikit, dan pengerjaannya tidak meng- gunakan senyawa radioaktif (Karp et al. , 1996).  Kelemahan teknik RAPD  kadang- kadang hasilnya tidak konsisten, disebabkan oleh rendahnya akurasi pengulangan hasil amplifikasi.
Prosedur AFLP lebih  banyak membutuhkan tenaga dan lebih mahal daripada analisis RAPD, namun lebih banyak jumlah lokus yang dapat  diperoleh dari setiap reaksi (Powell et al. , 1996). Teknologi  AFLP telah digunakan dalam studi keragaman intraspesies,  di antaranya adalah  kedelai ( Glycine max ) (Maughan et al. , 1996), teh ( Camelia sinensis L Kunt) (Paul et al. , 1997), tanaman kakao (Perry et al ., 1998) dan kapas (Pillay & Myers, 1999). Yee et al. (1999) membandingkan penggunaan sistem marka RAPD dan AFLP untuk mengevaluasi kesamaan genetik antar tetua Vigna angularis (Azuki). Teknik AFLP juga telah banyak digunakan dalam studi keterpautan dengan sifat tertentu misalnya sifat ketahanan terhadap Cladosporium fulvum pada tomat (Thomas et al. , 1995), sifat ketahanan terhadap Melampsora larici-populina pada Populus (Cervera et al., 1996), dan marka AFLP yang terpaut dengan  gen avirulen alm 1 pada Leptosphaeria maculans (Pongam et al. , 1998).
Tujuan penelitian ini adalah (i) membandingkan struktur keragaman genetik yang diperoleh dari analisis AFLP dan RAPD, (ii) mengevaluasi keragaman genetik klon- klon Hevea yang tahan dan rentan terhadap Corynespora berdasarkan analisis RAPD dan AFLP .

## Bahan dan Metode

## Bahan tanam
Bahan tanam yang digunakan adalah klon yang tergolong resisten terhadap Corynespora yaitu RRIC 100, BPM1, PB 260, RRIM 600, dan GT1, serta klon yang tergolong rentan yaitu PPN2444, PPN 2447 dan PPN 2058.

## Isolasi DNA
DNA genomik tanaman karet diisolasi dari 0,3 g daun muda dari masing-masing klon yang diuji  menurut metode Orozco- Castillo et al .  (1994).  Endapan DNA dicuci sebanyak dua kali dengan  70% etanol, dikeringanginkan dan dilarutkan dalam    500 µL bufer TE  (10mM Tris-HCL, 1mM EDTA, pH 7,5) dan diinkubasi pada suhu  37 o C selama 1  jam dan ditambahkan  20µL RNAse A (10 mg/mL). DNA diendapkan dengan 2 volume 100% etanol dan  0,1 volume  3 M Na-asetat.  Konsentrasi  DNA contoh ditetapkan dengan elektroforesis pada 1,4% agarosa  (Gibco-BRL)  menurut  Sambrook et al . (1989).

## Analisis RAPD
PCR dibuat  dengan volumer  25 µL yang mengandung   50 ng DNA dari setiap klon, 10 pmoles primer DNA (0,4 µM),   100 µM setiap dNTP, 1 U Taq polimerase (Pomega) dan 2,5 µL Taq polimerase 10x bufer Promega (500 mM KCL, 15 mM MgCl 2 , 100 mM Tris-HCl pH 9,0). Primer dekamer dari Operon Technologies (Alameda, CA) atau abi dari Bresatec (Australia) digunakan dalam percobaan ini. Campuran reaksi PCR contoh
Toruan-Mahius et al.
dalam tabung Eppendorf selanjutnya dilapisi dengan   25 µL minyak mineral.
Reaksi amplifikasi DNA dilakukan menggunakan Thermolyne II Thermal Cycler , dengan kondisi  PCR  sebagai berikut : satu siklus 3 menit pada suhu 94 o C, dan diikuti dengan 45 siklus selama  1 min. pada suhu 94 o C (denaturasi), 1 menit pada suhu  37 o C (anealing), 2 menit pada suhu 72 o C (ekstensi). Seluruh produk amplifikasi DNA dilengkapi dengan ekstensi selama      1 menit pada suhu 72 o C. Setelah amplifikasi, produknya kemudian difraksinasi  dengan elektroforesis 1,4  %  gel  agarosa  yang  dijalankan  pada 5 V/cm dengan bufer TAE  (40 mM Tris- asetat, 1 mM EDTA, pH 8.0) selama 3 jam, dan dideteksi menggunakan  etidium bromida. Gel  yang sudah diwarnai dengan etidium bromida divisualisasikan dengan pencaha- yaan UV transiluminator dan didokumentasi dengan alat foto Polaroid tipe 667.
Sebanyak 80 primer dekamer oligo- nukleotida baik dari Operon Technologies (Alameda, CA): Kit A - C  atau  abi  dari Bresatec (Australia) diseleksi menggunakan beberapa klon karet. Primer yang menghasilkan hanya pita monomorfik, pola pita yang lemah tidak digunakan untuk analisis selanjutnya.

## Analisis AFLP
Metode AFLP  yang digunakan menurut metode standar dari  Analysis AFLP TM System I (Cat.No.10544-013) GibcoBRL-Life Technologies. DNA genomik sebanyak 0,5 µg dari masing-masing klon didigesti dengan sepasang enzim restriksi Eco RI/ Mse I pada suhu  37 o C selama  2,5 jam di dalam   1x bufer plus dan 5 µg/mL BSA. Untuk meligasi adapter, sebanyak 10µL campuran ligasi yang terdiri atas  5 pmoL Eco RI, 50 pmol dan Mse I adapter,  1X  T4    bufer ligase (Promega) dan satu Unit  T4 ligase ditambahkan  ke  dalam
campuran  restriksi  dan diinkubasi pada suhu ruang selama  2 jam. Produk ligasi diencerkan 1:5 volume/volume dengan bufer  TE  steril (10 mM EDTA, pH 7,5). Sekuen adapter Eco RI adalah 5' CTCGTA GACTGCG TACC dan CATCTGACGCATGGTTAA 5'. Adapter Mse I 5'GACGATGAGTCCTGAG dan ACTCAGGACTCAT5'.
Ligasi yang sudah diencerkan  selanjut- nya digunakan dalam preamplifikasi PCR. Reaksi preamplification PCR mengandung 1 ng  DNA ligasi, 40 µL reaksi PCR  yang mengandung 5 µL campuran ligasi  1:5 vol/vol, 50 ng Eco RI+1 primer, 50 ng Mse I+ 1 primer, 1x PCR bufer plus, 0,2 mM masing-masing dNTP, dan 1 U Taq polimerase. Sekuen primer + 1 adalah:
5' GACTGCGTACCAATTC-A( Eco RI) dan 5' GATGAGTCCTGAGTAA-C ( Mse I). Campuran reaksi ini kemudian diamplifikasi sebanyak  20  siklus dengan program  94 o C selama  30 menit, 56 o C selama  60 menit dan 72 o C selama 60 menit.  Setelah amplifikasi produknya diencerkan 1:50 volume/volume dalam bufer TE.
Seluruh contoh kemudian diamplifikasi selektif menggunakan  64 kombinasi primer. Primer untuk amplifikasi selektif (SA primer) sekuennya adalah Eco RI: 5'GACT GCGTA CCAATTC-AX (dimana  X  salah satu dari yang berikut ini ACAGCCAC CCGCT GCGG). Mse I: 5'GATGAGTCCT GAGTAA- CY (Y adalah salah satu dari yang berikut ini : AAAACAGATTACT GTT).
Sebanyak 33 pasangan primer selektif diseleksi menggunakan dua klon karet. Sebanyak 13  primer selektif dimasukkan dalam analisis akhir untuk menjaga seandai- nya ada  profil amplifikasi DNA yang sangat lemah untuk penghitungan pita secara akurat, atau hanya pita monomorfik yang dihasilkan. Informasi mengenai 20 pasangan primer yang digunakan dalam analisis ini disajikan dalam Tabel 1. Reaksi PCR mengandung 5 µL larutan pre amplifikasi yang sudah diencer-
Keragaman genetik  klon-klon karet yang resisten  dan rentan.....
kan  1: 25 volume/volume, 5 ng Eco RI SA primer,  1x PCR bufer,        0,2 mM untuk masing-masing dNTP, 1 U Taq polimerase, dan 1,5 mM MgCl 2 . Reaksi diamplifikasi pada: 94 o C selama 30 detik, 65 o C selama  60 detik dan 72 o C selama 60 detik.  Untuk dua siklus yang terdiri atas penurunan suhu anealing 2 o C setiap dua siklus, sebanyak 8 siklus  (63 o C x 2; 61 o C x 2; 59 o C x 2 dan 57 o C x 2). Duapuluh tiga siklus selanjutnya meng- gunakan suhu anealing  56 o C.  Resultante produk PCR didenaturasi pada 7% gel poliakrilamida yang sudah didenaturasi dengan 7 M Urea. Selanjutnya elektroforesis gel dijalankan selama  3,5 sampai  4,0  jam dalam  1X TBE, pada   65 W  secara konstan menggunakan alat elektroforesis mini protean II (Promega) elektroforesis (lempengan kaca 10,0 – 8,5cm). Pemisahan produk AFLP divisualisasikan dengan pewarnaan perak nitrat dari Promega Silver Staining Kit untuk poliakrilamida.

## Analisis Data
Ada atau tidaknya penanda di skor secara manual.  Seluruh klon diskor untuk ada atau tidaknya penanda RAPD dan AFLP yang polimorfik, dan  data  dimasukkan ke dalam matriks biner sebagai peubah yang diskrit  1 untuk ada dan 0 untuk tidak adanya fragmen yang homologus. Data kemudian dianalisis dengan program NTSYS-pc ( Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, Version 2.10).  Penghitungan polymorphic information content (PIC) dilakukan menurut Powell et al . (1996).
Matriks kesamaan dikonstruksi dari data biner dengan Jaccard’s coefficients (JSC). Jarak JCC dari 0 ( untuk semua pita yang berbeda antara klon) dan 1 (untuk semua pita yang sama antar klon)  Dendogram dibentuk dengan Unweighted Pair-Group Method, Arithmatice Average (UPGMA) algoritmik. Jumlah minimum primer yang diperlukan untuk mendiskriminasi semua klon yang diuji
Tabel 1.  Sekuen dari dua puluh pasang primer AFLP dalam analisis keragaman genetik klon  karet.
Table 1.  Sequences of the tweenty pairs of selective AFLP primers used in analysis of  the genetic variation  of  rubber clones.
No Sekuen dari primer selektif  (primer Eco RI-AX & Mse I +CY ) Sequences of selective primers ( Eco R I-AX & Mse I + CY primers )
1.
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.
18. 19. 20
GACTGCGTACCAATTC-ACA & GATGAGTCCTGAGTAA-CAA GACTGCGTACCAATTC-AAC & GATGAGTCCTGAGTAA-CAG GACTGCGTACCAATTC-ACA & GATGAGTCCTGAGTAA-CAC GACTGCGTACCAATTC-ACA & GATGAGTCCTGAGTAA-CTG GACTGCGTACCAATTC-ACA & GATGAGTCCTGAGTAA-CTT GACTGCGTACCAATTC-ACT & GATGAGTCCTGAGTAA-CAA GACTGCGTACCAATTC-ACT & GATGAGTCCTGAGTAA-CTA GACTGCGTACCAATTC-AGG & GATGAGTCCTGAGTAA-CAG GACTGCGTACCAATTC-AGG & GATGAGTCCTGAGTAA-CTA GACTGCGTACCAATTC-ACC & GATGAGTCCTGAGTAA-CAA GACTGCGTACCAATTC-AGC & GATGAGTCCTGAGTAA-CAA GACTGCGTACCAATTC-ACA & GATGAGTCCTGAGTAA-CAG GACTGCGTACCAATTC-ACA & GATGAGTCCTGAGTAA-CTA GACTGCGTACCAATTC-ACT & GATGAGTCCTGAGTAA-CAG GACTGCGTACCAATTC-ACC & GATGAGTCCTGAGTAA-CTA GACTGCGTACCAATTC-AGC & GATGAGTCCTGAGTAA-CTA GACTGCGTACCAATTC-ACT & GATGAGTCCTGAGTAA-CAT GACTGCGTACCAATTC-AGG & GATGAGTCCTGAGTAA-CTT GACTGCGTACCAATTC-AAC & GATGAGTCCTGAGTAA-CAA GACTGCGTACCAATTC-ACT  & GATGAG TCCTGAGTAA-CAC
Toruan- Mathius et al.
diperoleh melalui analisis statistik lanjut terhadap data RAPD atau AFLP  dengan bootsrap menggunakan program  WinBoot sebanyak 2.000 kali pengulangan sebagai uji tingkat goodness of fit kedua matriks yang diperoleh  (Yap & Nelson, 1996). Uji goodness of fit dari  dendogram  dan korelasi antara matriks kesamaan genetik  RAPD dan AFLP diuji dengan uji  Mantel  (Mantel, 1967) dari  NTSYS MXCOMP (Rohlf, 1993). Nilai rata-rata JSC  dibandingkan dengan uji t. Nilai koefisien regresi  (r) yang tinggi menunjukkan tingginya tingkat kesamaan, dan nilai yang rendah menunjukkan tingkat kesamaan yang rendah.

## Hasil dan  Pembahasan

## Analisis RAPD
Dari 80 primer yang diseleksi, 30 primer diantaranya menghasilkan pita yang polimorfik. Ukuran produk amplifikasi ber- kisar antara 250 - 2250 pb (Gambar 1). Tidak
ditemukan adanya pita RAPD yang spesifik untuk setiap klon, namun beberapa klon yang berasal dari tetua yang sama memiliki satu atau dua pita DNA yang unik. Tingkat polimorfisme antar klon yang diuji umumnya rendah (Gambar 2).
RAPD berdasarkan  JSC memberikan konsistensi tingkat kesamaan berkisar antara 0,50 – 1,00 dengan nilai tengah  0,75. Tingkat goodness of fit RAPD berdasarkan dendo- gram UPGMA sangat berbeda nyata   yaitu rRAPD = 0,87 (p < 0,01) dengan   nilai  r integrasi = 0,90   (p < 0,01) (Tabel 2). Pada tingkat fenogram 0,67, diperoleh dua ke- lompok  yaitu A dan B.  A terdiri atas dua sub kelompok yaitu  A1 yang beranggotakan klon RRIC 100, dan A2  terdiri atas dua  sub kelompok, yaitu A1 beranggotakan RRIM 600, GT1, BPM1, PB260, dan  sub kelompok A2 beranggotakan PPN2058, PPN2444 dan PPN 2447. Kelompok B hanya beranggotakan PPN 2447. Menurut Lapitan (1992)  jumlah sekuen yang berulang berkorelasi dengan ukuran genom.
Gambar 1.  Pita RAPD dari 8 klon karet dengan primer OPW-19. Lajur  (1) RRIC100,  (2)  RRIM600,  (3) GT1, (4) PB260, (5) BPM1, (6) PPN2447, (7) PPN2058,  (8) PPN2444;  (M) 1-kb DNA Ladder.
Figure 1.   RAPD bands of 8  rubber clones with OPW-19  primer. Line  (1) RRIC100,  (2)  RRIM600,  (3) GT1, (4) PB260, (5) BPM1, (6) PPN2447, (7) PPN2058,  (8) PPN2444;  (M) 1-kb DNA Ladder.
M          1           2           3        4           5          6         7         8 3000 bp 2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp 500 bp
250 bp
Keragaman genetik  klon-klon karet yang resisten  dan rentan.....
0,50              0,67       0,65               0,75                               1,00
Gambar 2.  Dendogram delapan klon karet dari hasil analisis klaster dengan metode UPGMA berdasarkan RAPD.
Figure 2.  Dendogram of eight rubber clones  from the result of cluster analysis with
UPGMA method based on RAPD.

## Analisis  AFLP
Analisis AFLP menunjukkan bahwa amplifikasi  DNA dengan  22 pasang primer menghasilkan 585 pita dengan ukuran 40-500 pb dan 198 pita yang polimorfik. Indeks penanda AFLP (AFLP-MI) adalah 3,57. Pada umumnya primer EcoR I  dengan dua nukleo- tida selektif dalam pasangan primer dapat menghasilkan lebih banyak pita daripada EcoR I dengan tiga nukleotida selektif, meski- pun tidak selalu  meningkatkan jumlah pita yang  polimorfis.
Secara proporsional dua per tiga dari fragmen yang teramplifikasi adalah mono- morfik untuk seluruh klon yang diuji.
Dari 20 pasang primer selektif yang diuji menunjukkan bahwa pasangan primer L (EACA/MCAG) menghasilkan satu pita DNA dengan ukuran 110 pb yang ditemukan pada klon karet RRIC100, RRIM600, PB260, GT1 dan BPM1 yang tergolong resisten, sedangkan pada klon lainnya yang tergolong rentan  pita
DNA tersebut  tidak ditemukan (Gambar 3).

## Kombinasi analisis  RAPD dan  AFLP
Data RAPD dan AFLP yang dikombi- nasikan menunjukkan bahwa tipe dendogram penggabungan tersebut mengikuti dendogam AFLP (Gambar 5). Nilai goodness of fit sangat nyata (r = 0,74, p < 0,01). Menurut Rohlf (1993) r > 0,5 secara statistik sangat nyata pada  p = 0,01. Matriks koefisien kesamaan genetik antar    8 klon bervariasi dari 0,56 sampai 1,00. Hal ini menunjukkan bahwa polimorfisme antar klon karet yang diuji adalah rendah. Rendahnya polimorfisme pada klon-klon  yang diuji tersebut disebab- kan memiliki basis genetik yang sangat sempit. Tingkat polimorfisme DNA yang rendah antar klon-klon Hevea ,  didominasi oleh pita-pita yang dimiliki secara bersama dalam jumlah banyak, yang menunjukkan bahwa  genom   dari  contoh  yang  dipelajari

## Koefisien  kesamaan genetik
Coefficient of genetic similarity
RRIC100 RRIM600 GT1 BP M1 PB260 PPN2058 PPN2444 PPN2447
41
Keragaman genetik  klon-klon karet yang resisten  dan rentan.....
Gambar 3. Pita  AFLP dari  8  klon  karet. Pita  E-ACA/M-CAG 110 merupakan pita DNA yang hanya  ditemukan pada   klon-klon  RRIC100,  RRIM600,  GT1, PB260,  dan BPM1  yang  tergolong  resisten  terhadap penyakit  gugur    daun Corynespora; Lajur  (1) RRIC100, (2)  RRIM600, (3) GT1, (4)  PB260, (5) BPM1, (6) PPN2447,  (7) PPN2058,  (8) PPN2444;  (M) 30-330 AFLP DNA Ladder.
Figure 3.  AFLP bands of  8 rubber clones. E-ACA/M-CAG 110 a specific DNA  band  which was found only from RRIC100,  RRIM600,  GT1,  PB260,  and  BPM1. These  clones  belong  to  the  group    resistance  to Cor ynespora ; Line  (1)  RRIC100, (2)RRIM600, (3) GT1,   (4) PB260,   (5) BPM1, (6) PPN2447, (7) PPN2058,  (8) PPN2444;  (M) 30-330 AFLP DNA Ladder.
0,50                 0,63                0,75                                        1,00
Gambar 4.  Dendogram  delapan  klon  karet  dari  hasil  analisis  klaster  dengan metode UPGMA berdasarkan AFLP.
Figure 4.   Dendogram of eight rubber clones  from the result of cluster analysis  with UPGMA method based on AFLP .
cenderung  homogenus. Adanya keragaman genetik antar klon pada tanaman karet sangat penting dalam program pemuliaan untuk perakitan genotip baru, khususnya yang tahan terhadap Corynespora.
Berdasarkan analisis UPGMA kombinasi
RAPD dan AFLP menunjukkan bahwa fenogram terbagi menjadi dua kelompok dengan koefisien kesamaan genetik 65%. Kelompok  satu terdiri atas dua sub kelompok
Koefisien kesamaan genetik Coefficient of genetic similarity 1           2           3          4         5           6           7          8         M 200 bp 150 bp 120 bp 100 bp RRIC10 PPN2058 PPN2444 RRIM600 BPM GT PB26 PPN2447 42
Toruan-Mathius et al.
yaitu  RRIC 100, dan  RRIM 600, GT1, PB260 serta  BPM1 yang tergolong resisten, dan sub sub kelompok kedua yang beranggotakan PPN2058, PPN244 yang tergolong rentan. Sedang kelompok dua hanya  beranggotakan PPN 2447 (Gambar 5).
Menurut  Tohme et al. (1996), Maughan et al. (1996)  dan Hill et al. (1996) penggunaan AFLP pada banyak tanaman tidak membutuhkan pengetahuan mengenai sekuen yang ditargetkan, namun mampu mendeteksi  setidaknya  10  kali lebih banyak lokus genetik daripada  analisis RFLP atau RAPD. Oleh sebab itu penggunaan  AFLP memiliki kemampuan untuk mendeteksi ribuan lokus genetik yang independen dalam waktu yang singkat.  AFLP memiliki beberapa keunggulan dibandingkan dengan RAPD,  diantaranya  adalah (i) jumlah  lokus DNA yang dapat manfaatkan  dalam setiap reaksi lebih banyak, (ii) jumlah fragmen DNA yang diperoleh  dari primer yang digunakan lebih  banyak,  dan (iii)  teknik   AFLP dalam
memunculkan beberapa penanda polimorfik lebih baik. Dari hasil studi ini, setiap kelompok klon karet mampu dipisahkan dengan baik.
Pengelompokan menggunakan RAPD atau AFLP  menunjukkan bahwa kedua teknik marka molekuler ini  memberikan hasil yang hampir sama, namun tidak identik dalam informasi filogenetiknya. Pengamatan ini ada hubungannya dengan jumlah pita AFLP yang diperoleh  dalam analisis dibandingkan dengan pita RAPD yang dapat digunakan. Penetapan keragaman genetik sangat dipengaruhi  oleh asesi yang ditetapkan untuk dianalisis dan jumlah penanda yang digunakan.

## Tingkat diskriminasi
Dalam analisis keragaman genetik, rata- rata kesamaan genetik pada delapan klon tanaman karet yang diteliti adalah  0,63 (AFLP),  0,67 (RAPD), dan integrasinya adalah   0,65  (AFLP + RAPD).  Hasil    ini

## Koefisien kesamaan genetik
Coefficient of genetic similarity
0,50                             0,65                        0,75                                1,00
Gambar 5.  Dendogram delapan klon karet dari hasil analisis kelompok  dengan  metode  UPGMA berdasarkan  RAPD dan AFLP.
Figure 5.   Dendogram of eight rubber clones  from the result of cluster analysis  with  UPGMA method based on RAPD and  AFLP .
RRIC100 PPN2058 PPN2444 RRIM600 GT1 BPM1 PB260 PPN2447 43
Keragaman genetik  klon-klon karet yang resisten  dan rentan.....
menunjukkan bahwa tingkat diferensiasi AFLP dengan 20 PPAS relatif lebih tinggi dari RAPD  yang  menggunakan 30 primer (Tabel 2).
Interpretasi perbedaan kemampuan suatu sistem marka terhadap marka yang lain dalam mendeteksi keragaman genetik berdasarkan rataan kesamaan genetiknya telah dilakukan oleh Blair et al . (1999) pada tanaman padi. Dilaporkan bahwa  rataan kesamaan genetik ISSR dan AFLP berturut-turut adalah 0,55 dan 0,73  dan disimpulkan bahwa kemampuan diskriminasi ISSR lebih tinggi dari pada AFLP.

## Pola pengelompokan  dendogram
Analisis korelasi kofenetik menunjuk-kan bahwa   analisis    pengelompokan ber dasarkan data AFLP  mempuyai nilai  r = 0,81 (p < 0,01)  dan nilai r RAPD adalah  0,87 (p < 0,01) dan  nilai r integrasinya  adalah  0,90 (p < 0,01).  Hal ini berarti bahwa  masing- masing fenogram yang dihasilkan  dari metode pengelompokan UPGMA berdasarkan matriks kesamaannya terdapat goodness of fit dalam katagori baik.
Fenogram  dari hasil analisis UPGMA berdasarkan RAPD dan AFLP (Gambar 4   & 5) tampak bahwa pada nilai rata-rata indeks kesamaannya masing-masing marka mem- berikan pengelompokan yang agak berbeda.
Di samping itu rata-rata  perkiraan kesamaan genetik AFLP relatif lebih kecil dari pada RAPD, yang berarti bahwa jarak genetik yang dapat diungkapkan AFLP relatif lebih tinggi dari pada RAPD. Hal ini menunjukkan bahwa AFLP lebih tinggi tingkat diskriminasinya dibandingkan dengan RAPD.
Perbedaan yang paling jelas antara fenogram yang dihasilkan RAPD dan AFLP adalah  berkaitan dengan klon RRIC100. Pada analisis RAPD, RRIC100 merupakan klon yang  terpisah dari kelompok utama yang terdiri dari 6 klon. Klon RRIM 600 dan GT1 memiliki koefisien kesamaan genetik yang paling tinggi disusul oleh koefisien kesamaan antara PPN2058 dan PPN2444. Sedangkan hasil AFLP menunjukkan bahwa RRIC100 membentuk kelompok dengan PPN2058 dan PPN2444. Kelompok ini  mempunyai nilai kofenetik pada kira-kira 0,61 dengan kelompok lain yang terdiri dari RRIM600, BPM1, GT1 dan PB260. PPN2058 dan PPN2444 merupakan  dua klon yang kesama- an genetiknya paling tinggi.
Fenogram yang dihasilkan AFLP dan RAPD juga menunjukkan  bahwa  klon RRIM600, GT1, BPM1 dan PB260     mem- bentuk satu kelompok,  walaupun pasangan antara klon terlihat berbeda. Secara kese- luruhan analisis kelompok berdasarkan data AFLP dan RAPD  tidak  jauh berbeda karena korelasi   kofenetik  antara   keduanya   yang
Tabel 2.  Analisis  indeks  marka  berdasarkan  sidikjari sistem  marka AFLP  dan RAPD.
Table 2. Analysis of marker index based on finggerprinting AFLP and RAPD systems.
Sistem  Marka
Marker system
JUA 1 JP 2 MR 3 β 4 E 5 PIC 6 MI 7 AFLP RAPD 20 30 585 169 29,25 5,63 0,34 0,56 9,92 3,20 0,36 0,32 3,57 1,02 1 Jumlah unit assay; 2 Jumlah pita ; 3 Multipex ratio; 4 Fraksi pita polimorfik. 5 Multiplex  rasio  efektif;
6 Polymorphic information content dan 7 Marka indeks . 1 Number of  unit assay; 2 Band  number ; 3 Multipex  ratio; 4 Fraction   of  Polymorphic band. 5 Multiplex effective ratio; 6 Polymorphic information content dan 7 Marker index.
Toruan-Mathius et al.
nyata (r = 0,74; p<0,01). Rohlf (1993) menyatakan bahwa     r > 0,5 digolongkan nyata secara statistik pada p=0,01.
Berdasarkan fenogram  yang dibentuk melalui  penggabungan  data AFLP dengan RAPD  terlihat bahwa pola pengelompokan yang terbentuk cenderung mengikuti pola pengelompokan  AFLP secara sendiri (Gambar 5). Hasil analisis pengelompokan berdasarkan kombinasi ini merupakan hasil yang paling baik karena merupakan gabungan dari dua  kelompok lokus yang dihasilkan dari RAPD dan AFLP.  Pada umumnya ketepatan perkiraan akan meningkat apabila jumlah lokus yang ter- deteksi dalam analisis meningkat (Lu et al ., 1996). Lebih jauh lagi dengan meng- asumsikan bahwa semakin tinggi jumlah marka akan menurunkan kesalahan   acak pengambilan contoh yang dapat menyebabkan bias pada  perkiraan  kesamaan genetik (Prabhu et al ., 1997), maka perkiraan  dengan AFLP akan lebih baik karena menggunakan 198  lokus dibanding-kan dengan RAPD yang jumlahnya sekitar 50% yaitu 96 lokus. Melchinger (1999) menjelaskan bahwa tingkat ketepatan dalam perkiraan jarak genetik tergantung dari jumlah assay dari suatu marka,  genom yang dapat dicakup dan tingkat polimorfisme dari tanaman yang diuji. Dengan demikian maka AFLP lebih disarankan, dan akan lebih baik lagi jika dikombinasikan dengan RAPD dan mikrosatelit dalam analisis keragaman genetik plasma nutfah karet yang akan bermanfaat sebagai referensi yang baik untuk tujuan tertentu program pemuliaan tanaman karet.
Hasil pengelompokan juga menunjuk-kan bahwa klon yang mempunyai salah satu tetua yang sama tidak berada pada kelompok yang sama, misalnya RRIC100 dan RRIM600. Nurhaimi-Haris et al. (1998) dengan menggunakan 10 primer RAPD menunjukkan hal yang sama, misalnya RRIC100 dan RRIM600 yang salah satu tetuanya adalah
PB86,  pada fenogram kedua klon tersebut terdapat pada  kelompok besar yang berbeda yaitu masing-masing pada kelompok yang terdiri dari 47 klon (RRIC100) dan kelompok lainnya yang terdiri dari 17 klon (RRIM600). Kedua klon ini  memiliki nilai koefisien kesamaan  genetik pada sekitar 0,72. Di samping itu PPN2447 yang merupakan keturunan illegitim dari LCB1320  memiliki nilai kofenetik pada 0,72 dengan tetuanya tersebut. Dalam penelitian ini PPN2447 dan PPN2444 yang sama-sama merupakan keturunan illegitim dari LCB1320 tidak berada dalam kelompok yang sama. Klon PPN2447 bebas dan memiliki nilai kesamaan yang paling rendah terhadap  7 klon lainnya (RRIC100 dengan 6 klon pada kelompok utama), sementara itu PPN2444 membentuk kelompok dengan PPN2058  cenderung memiliki jarak genetik yang lebih tinggi terhadap  klon lainnya (termasuk RRIM600, GT1 dan PB260).  Selanjutnya dijelaskan bahwa terdapat klon karet yang sangat dekat berdasarkan fenogram namun tidak memiliki hubungan  menurut informasi silsilah.
Menurut Varghese et al . (1997) hal ini dapat terjadi karena tanaman karet yang secara umum merupakan tanaman yang menyerbuk silang dimana hibrid F1 difiksasi secara vegetatif,  dan klon-klon tersebut sangat heterozigous. Sebagai akibat dari segregasi dan independent assortment , menyebabkan proporsi dari alel-alel pada hibrid dari setiap  tetuanya  dapat sangat bervariasi. Hal ini dapat menyebabkan tetua dan hibrid mungkin tidak berada dalam satu kelompok secara bersama. Oleh karena itu tanaman karet yang merupakan spesies heterozigos yang saat ini dibudidayakan hanya terbatas dari Wickham gene pool tersebut, maka informasi tetua  mungkin tidak selalu menunjukkan  hubungan genetik yang pasti.
Basis genetik tanaman karet  sempit, paling  tidak  karena   terbatas pada  beberapa
Keragaman genetik  klon-klon karet yang resisten  dan rentan.....
tanaman yang dapat bertahan dari koleksi awal Wickham gene pool yang berasal dari Amazon, Brazil yang diintroduksi oleh Sir Henry Wickman pada tahun 1876. Proses seleksi yang dilakukan secara terus menerus terhadap populasi dasar tersebut semakin mempersempit keragaman genetiknya (Varghese et al., 1997; Benong et al., 1996). Walaupun demikian dalam percobaan ini terlihat bahwa baik RAPD maupun AFLP dapat membedakan setiap klon terhadap yang lainnya, dan rata-rata ESG yang ditunjukkan oleh masing-masing marka berkisar 0,65 (koefisien Dice). Hal ini menunjukkan bahwa pada beberapa klon elit tanaman karet masih terdapat keragaman genetik, walaupun relatif sempit.  Untuk memperlebar basis genetik perlu dilakukan introduksi material genetik baru.
AFLP sebagai  suatu marka  molekuler telah  banyak dimanfaatkan baik dalam studi keragaman genetik misalnya pada tanaman kakao (Perry et al., 1998) dan   kapas (Pillay & Myers, 1999). Teknik ini juga telah banyak digunakan dalam studi keterpautan dengan sifat tertentu misalnya  sifat ketahanan terhadap Cladosporium fulvum pada tomat (Thomas et al., 1995), sifat ketahanan terhadap Melampsora larici-populina pada Populus (Cervera et al., 1996);  identifikasi marka AFLP yang terpaut dengan  gen avirulen alm1 pada Leptosphaeria maculans (Pongam et al., 1998). Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh analisis AFLP dapat digunakan untuk memetakan gen yang terpaut dengan ketahanan tanama karet terhadap PGDC, apabila populasi yang mewakili untuk dianalisis tersedia di lapang.

## Kesimpulan
Analisis keragaman genetik beberapa klon karet menggunakan marka RAPD dan AFLP menunjukkan bahwa :
1. Marka indeks AFLP lebih tinggi daripada RAPD, sehingga AFLP lebih efektif dibandingkan dengan RAPD.
2. Rata-rata perkiraan kesamaan genetik AFLP sedikit lebih rendah dari RAPD sehingga AFLP relatif lebih diskriminatif daripada RAPD.
3. Dendogram berdasarkan integrasi AFLP dan RAPD  paling baik, dimana pada rata- rata perkiraan kesamaan genetik 0,65, terbentuk  dua klaster yaitu kelompok  A (RRIC100, PPN2058 dan PPN244 yang tergolong rentan) dan kelompok  B (RRIM600, GT1, BPM1 dan PB 260 yang tergolong resisten).  Sedangkan PPN2447 yang tergolong rentan tidak termasuk dalam kedua kelompok tersebut.
4. Analisis AFLP menghasilkan pita DNA EACA/MCAG 110 yang berpotensi sebagai kandidat penanda untuk  membedakan kelompok tanaman karet yang resisten dan rentan terhadap  PGDC.

## Daftar Pustaka
Blair, M. W., O. Panaud, S. R. McCouch (1999). Intersimple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice ( Oryza sativa L.). Theor.  Appl.  Genet ., 98 , 780-792.
Benong, M., O. Hashim &  R. Othman (1996).  Evaluation,  utilisation   and conservation of Hevea germplasm. In S. C. Quah et al . (eds.). Underutilised tropical plant genetics resources- conservation and utilization. Kuala lumpur, Universiti Pertanian Malaysia Press.
Besse, P., M. Seguin, P. Lebrun, M. H.  Chevallier,   D. Nicolas     &
Toruan-Mathius et al.
C. Lanaud (1994). Genetic diversity among wild and cultivated populations of Hevea brasiliensis assessed by nuclear RFLP analysis. Plant. Mol. Biol. Rep ., 18 , 235-241.
Cervera, M.T., J. Gusmao, M. Steenackers, J. Peleman, V. Storme, A. Vanden Broeck, M. Van Montagu & W. Boerjan (1996). Identification of AFLP molecular markers for resistance against Melampsora larici-populina in Populus. Theor. Appl. Genet., 93 , 733-737.
Chaidamsari, T. & A. Darussamin (1993).
Polimorfisme beberapa tetua dan hasil persilangan Hevea brasiliensis Muell Arg. Menara Perkebunan, 61 (2), 32-38.
Chevallier, M. H. (1988). Genetic variability of Hevea brasiliensis germplasm using isozymes markers. J. Nat. Rubb. Res ., 3 (1), 42-53.
Hill, M., H. Wiotsenboer, M. Zubeau, P.Vos, R. Kesseli & R. Michelmore (1996). PCR-based fingerprinting using AFLPs as a tool for studying genetic relationships in Lactuca spp. Theor. Appl. Genet ., 93 , 1202-1210.
Jayasinghe, C. K. & W. P. K. Silva (1996). Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka. In Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16-17 December, 1996. p.15-19.
Karp, A., O. Seberg & M. Buiatti (1996). Molecular techniques in the assesment of botanical diversity. Ann. Bot., 78 , 143- 149.
Lapitan, N. L. V. (1992). Organization and evolution of higher plant nuclear genomes. Genome, 35 , 171-181.
Lu,  J.,  M.  R.  Knox,  M.  J.  Ambrose, J. K. Brown & T. H. N. Ellis (1996). Comparative analysis of genetic diversity in pea assessed by RFLP- and PCR based methods. Theor. Appl. Genet., 93 , 1103- 1111
Mantel, N (1967). The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Res ., 27, 209-220.
Maughan, P. J., M. A. S. Maroof, G. R. Buss & G. M. Huestis (1996). Amplified fragment length polymorphism (AFLP) in soybean:  Species diversity, inheritance and near-isogenic line analysis. Theor. Appl. Genet., 76 , 815- 829.
Melchinger, A. E. (1999). Genetic diversity and heterosis. In J.G. Coors & S. Pandey. The genetics and exploitation of heterosis crops. Madison, American Society of Agronomy, Inc.
Nurhaimi-Haris, S. Woelan & A. Darussamin (1998). RAPD analysis of genetic variability in plant rubber ( Hevea brasiliensis Muell Arg.) clones. Menara Perkebunan , 66 (1) 9-19.
Orozco-Castillo, K., J. Chalmers, R. Waugh & W. Powell (1994). Detection of genetic diversity and selective gene introgression in  coffee  using   RAPD markers. Theor. Appl. Gent. , 87 , 934-940.
Paul,  S.,  F.  N.  Wachira,  W.  Powell  & R. Waugh (1997). Diversity and genetic differentiation among  populations  of Indian and Kenyan tea ( Camelia sinensis (L) O Kuntze) revealed by AFLP markers. Theor. Appl. Genet ., 94 , 255- 263.
Keragaman genetik  klon-klon karet yang resisten  dan rentan.....
Perry,  M.  D.,  M.  R.  Davey,  J.  B.  Power, K. C. Lowe & H. F. J. Blig (1998). DNA isolation and AFLP genetic fingerprinting Theobroma cacao (L.). Plant Mol.  Biol. Rep., 16 , 49-59.
Pillay, M. & G. O. Myers (1999). Genetic diversity in cotton assessed by variation in ribosomal DNA genes and AFLP markers. Crop Sci., 39 , 1881-1886.
Pongam, P., T. C. Osborn & P. H. Williams (1998). Genetic analysis and identification of AFLP markers linked to the alm I gene of Leptosphaeria maculans. Phytophatol., 88 , 1068-1072.
Powell, W.,  M. Morgante, C. Andre,         M. Hanafey, J. Vogel, S. Tingey &       A. Rafalski (1996). The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Mol. Breed., 2 , 225-238.
Prabhu, R. R., D. Webb, H. Jenssen, S. Luk, S. Smith & P. M. Gresshoff (1997). Genetic relatedness among soybean genotypes using DNA amplification fingerprinting (DAF), RFLP, and pedigree. Crop Sci ., 37 , 1590-1595.
Rajalaksmy, V.K. & R. Kothandaraman (1996). Current status of Corynespora leaf fall in India. In Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16-17 December, 1996. p.37-43.
Rohlf, F. J. (1993). NTSYS-PC. Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Version 1.8. New York, Exeter Software. p. 10-13.
Sambrook, J., E. F. Fritsch & T. Maniatis (1989). Molecular Cloning: a Laboratory Manual , 2 nd ed. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Seguin,  M.,  P.  Besse,  P.  Lebrun  & M.H. Chevallier (1995). Hevea germplasm characterization using isozymes and RFLP markers. In W.T. Baradat - Adams &  Muller-Starck (eds.)
Population genetics and genetics conservation of forest trees.  p. 129-133.
Shukor, S. K. A., & S. M. Hidir (1996). Current status of Corynespora leaf fall in Malaysia. In Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16-17 December, 1996. p. 21-28.
Sinulingga, W., Suwarto & H. Supena (1996). Current status of Corynespora leaf fall in Indonesia. In Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16-17 December, 1996.
p. 29-36.
Thomas,  C.  M.,  P.  Vos,  M.  Zabeau,
D. A. Jones, K. A. Norcott,   P. Chadwick
& J. D. G. Jones (1995). Identification of amplified restriction fragment polymorphism (AFLP) markers tightly linked to the tomato cf -9 gene for resistance to Cladosporium fulvum. The Plant J., 8 , 785-794.
Tohme, J., D. O. Gonzales, S. Beebe & C. Duque (1996). AFLP analysis of gene pools of a wild bean core collection. Crop Sci., 36, 1375-1384.
Varghese, Y. A., C. Knaak, M. R. Sethuraj &
W. Ecke (1997). Evaluation of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in Hevea brasiliensis . Plant Breeding, 116 , 47-52.
Venkatachalam, P., S. Thomas, P. Priya, I. Thanseem, T. Gireesh, C.K. Saraswathyamma &  A. Thulaseedharan (2002).  Identification   of    DNA poly-
Toruan-Mathius et al.
morphism among clones of Hevea brasiliensis Muell Arg. Using RAPD analysis. Indian J. Nat. Rubb. Res ., 15 (2), 172-181.
Yap. I. V. &  R. J. Nelson (1996). WinBoot. Manila, IRRI Manila. p.22-25.
Yeang, H.Y., E. Sunderasa, R. Wickneswar, D. Napi & A. S. M. Zamri   (1998). Genetics relatedness and identities of cultivated Hevea clones determined by isozymes. J. Rubb. Res ., 1 (1), 35-47.
Yee, E., K. K. Kidwell, G. H. R. Sills & T. A. Lumpkin (1999). Diversity among selected Vigna angularis (Azuki) accessions on the basis of RAPD and AFLP markers. Crop Sci ., 39 , 268-275.
.