KERAGAMAN GEN CYTOCHROME B PADA SIDAT ( Anguila bicolor ) BERDASARKAN RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP)
GENETIC DIVERSITY CYTHOCHROME B OF SIDAT ( Anguila bicolor ) ASSESED BY RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORHISME (RFLP)
Lestari Wilujeng, Gunanti Mahasri dan Mufasirin
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp. 031-5911451

## Abstract
This study aims to analyze the genetic character of Anguilla bicolor based on cytochrome b gene as  the  basis  of  information  in  the  study  of  phylogeny  and  genetic  engineering.  The  research  was conducted  from  May  to  September  2013  in  the  Laboratory  of  Biotechnology  Faculty  of  Science, University of  Brawijaya. This study uses a survey with qualitative descriptive analysis in the laboratory. Samples obtained from direct arrests in Tulungagung Popo Beach , Manado , Medan and Cilacap. Study was initiated by DNA isolation using CTAB method and followed by PCR . Primers used were cytb  - 1 (5' - TGCTAACGATGCCCTAGTGG - 3 ') and b CYT - 2 (5' - CTAGTCAACCTACT - AATGGG - 3 ') . PCR results were cut using restriction enzymes and Msp 1 Hha 1. Data analysis was performed with the aid  of  NTSYS  software  program.  Genetic  character  of  a  sequence  of  nucleotide  bases  making  up  DNA from the cytochrome b gene were obtained on each sample has a degree of similarity around 32 - 100 %.
Keywords : Cytochrome b, Anguila bicolor , RFLP-mtDNA

## Pendahuluan
Satu  diantara  komoditas  perikanan yang memiliki nilai ekonomis tinggi dan saat ini sedang  dikembangkan  adalah ikan  sidat ( Anguila bicolor ).  Permintaan akan sidat cukup tinggi  baik  lokal  maupun  ekspor,  sementara potensi    sidat  di  sebagian      perairan    Indonesia pada tahun 2000 semakin menurun.
Sampai  saat  ini  seluruh  ekspor  sidat  masih merupakan  hasil  tangkapan  dari  alam,  yang dikhawatirkan  akan  mempengaruhi  Populasi  di alam,  karena  pengambilan  sidat  secara  terus menerus dalam jumlah besar dapat menyebabkan  stok  di  alam  berkurang  drastis. Produksi  sidat  pada  tahun  1990  mencapai  41,5 ton  dan  pada  tahun  1996  menurun  hingga  29,1 ton (Haryani, 1999).
Upaya  untuk  memenuhi  permintaan akan  sidat  harus  sudah  mulai  dipenuhi  dengan budidaya  yang  tentu  saja  diawali  dengan penyediaan  benih  yang  berkualitas,  cukup  dan berkesinambungan.
Karakteristik  ikan  sidat  perlu  diteliti  terutama secara  genetiknya,  hal  ini  diperlukan  terutama dalam upaya pembenihan sidat, dengan memahami  dan  mengetahui  inventarisasi  dan evaluasi karakteristik genetik sidat dari beberapa  populasi,  dapat  digunakan  sebagai informasi  awal  atau  bahan  pertimbangan  dalam pelaksanaan breeding  program. Sistem pewarisan  sifat  mtDNA  dilakukan  secara
maternal  tanpa  rekombinasi.    Selain  itu  dalam mtDNA  ini  terjadi  laju  mutasi  yang  tinggi, sehingga  mtDNA  dapat  dimanfaatkan  untuk menentukan  keragaman  genetik  antar  individu dalam  suatu  populasi,  hubungan  evolusi  di antara  populasi  dan  rekontruksi  migrasi  suatu populasi (Toha, 2001).
Keragaman  genetik  dapat  muncul karena  adanya  mutasi,  seleksi  alam,  pengaruh lingkungan  dan  perkawinan  (Warwick  dkk. 1987).   Gen yang digunakan untuk mengetahui keragaman pada sidat adalah gen cythocrome b. Sekuen  gen cyt  b yang  berasal  dari  sidat ( Anguila  bicolor )  mempunyai  panjang  sekuen 15573  pb  (NCBI  2013).    Adapun  tempat  asal atau  habitat  sidat  yang  digunakan  berasal  dari Tulungagung,  Malang,  Medan  dan  Lampung. Pemilihan  empat  lokasi  pengambilan  sidat karena  di  empat  tempat  tersebut  banyak ditemukan  sidat  yang  khusus  spesies Anguila bicolor

## Materi dan Metode
Ikan uji  atau  sampel  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah ikan sidat ( Anguila bicolor) yang  diperoleh  dari  hasil  tangkapan  nelayan  di Perairan  Umum  Manado,  Lampung,    Cilacap dan  Tulungagung.    Jumlah  sampel  di  setiap lokasi  yang  digunakan  untuk  uji  genetik  adalah 3  ekor  dengan  ukuran    panjang  sekitar  7  –  10 cm dan berat 8 – 15 gram.

## Amplifikasi mtDNA dengan PCR
DNA  Mitokondria  diamplifikasikan menggunakan  primer  universal  Cytochrome  b ( Cyt b-1 ) forward : 5’–
TGCTAACGATGCCCTAGTGG-3’ dan Cyt b- 2: 5’–CTAGTCAACCTACT-AATGGG-3’.
(Williams  dan  Benzie,  1997).    Amplifikasi dilakukan  menggunakan  metode Polymerase Chain  Reaction (PCR)  dengan  komposisi  4  µl ddh2O, 2 µl primer F (30 pmol/µl), 2 µl primer R  (30  pmol/µl),  10  µl  go  tag  green  (promega) dan 2 µl DNA dimasukkan ke dalam PCR tube. Amplifikasi dilakukan dengan program predenaturasi  pada  suhu  95°C  selama  5  menit, denaturasi pada  suhu  95°C  selama  45  detik, annealing pada  suhu        62°C    selama  45  detik dan  ekstensi  pada  suhu  72°C  selama  45  detik, sebanyak  35  siklus.  Lalu  ekstensi  akhir  pada suhu 72°C selama 10  menit.  Hasil  PCR  dapat langsung  dianalisis  dengan  elektroforesis  atau disimpan di dalam refrigerator.
Gel agarose dibuat dengan cara memanaskan  di  atas hotplate dan  diaduk  rata. Setelah  gel  larut  dan  berwarna  bening,  larutan tersebut  dibiarkan  sampai  hangat,  kemudian teteskan  etidium  bromida  sebanyak  0,1  ml; kemudian  dituangkan  ke  dalam  cetakan  yang telah  terpasang  sisir  pembuat  lubang  dengan ketebalan  3-5  mm,  selanjutnya  gel  yang  berisi buffer elektroforesis. Hasil PCR divisualisasikan dengan menggunakan  gel  agarosa  1.5%.  sebanyak  0.45 gram  agarosa  dilarutkan  dalam  30  ml  larutan TBE buffer pH ~8.3 (45 mM Tris, 45 mM bric acid,  2  mM  Na 2 EDTA  pH  8.3)  dan  dididihkan. Setelah  mendidih  larutan  agarosa  didinginkan lalu  ditambahkan  0.5  µl  ethidium  bromide  dan dituang  dalam  cetakan  gel  yang  telah  dipasang sisiran.  gel  dan  cetakannya  ditempatkan  dalam chamber elektroforesis yang berisi 300 ml TBE buffer.  Hasil  PCR  serbanyak  5  µl  dimasukkan dalam  sumuran  gel  dan  di  elektroforesis  pada tegangan  100  volt  selama  30  menit.  Kemudian gel  divisualisasi  dengan  menggunakan  UV transiluminator  (Bio-rad)  dan  difoto  dengan DSLR D1100 syngene genetic tool .
Digesti mtDNA dengan enzim restriksi Digesti mtDNA dilakukan menggunakan  enzim  restriksi.    Enzim  retriksi yang  digunakan  adalah Hind III, EcoR I, Hha I dan Msp I.  Tahapannya adalah mencampur 6 µl dH 2 O; 3 µl DNA hasil amplifikasi  PCR, buffer enzim  1  µl,  enzim  restriksi  1  µl  sehingga  total larutan  10  µl  dalam  tabung  PCR  steril    dan dilakukan  on  ice  karena  enzim  sangat  sensitif terhadap  suhu  dan  mudah  rusak  kemudian campuran  dihomogenkan  dan  diinkubasi  pada
suhu  37 o C  selama  1-4  jam,  selanjutnya dilakukan elektroforesis untuk mengetahui hasil digesti enzim dan untuk pengamatan jumlah dan ukuran fragmen  Retriksi.
Siapkan  tabung  propilen  50  ml. Masukkan  4617    µl  akuades,  2833    µl poliakrilamid 30%, 850  µl TBE buffer 10x, 195 µl  APS  dan  5    µl  TEMED  ke  dalam  tabung propilen.  Masukkan  larutan  ke  dalam  plate sampai  penuh  dan  pasang  sisiran  pada  plate. Plate  berisi  gel  dimasukkan  ke  dalam  chamber elektroforesis  dan  masukkan  sebanyak  350  ml TBE buffer 1x ke dalam chamber elektroforesis. Pada  sumur  pertama  sebanyak  2  µl  Marker DNA  ladder.  Sumur  ke  dua  dan  seterusnya dimasukkan  sebanyak  10  µl  sampel  hasil  PCR- RFLP  dicampur  dengan  2    µl  loading  dye. Runing  dilakukan  dengan  tegangan  100  Volt sampai  tracking  dye  berada  0.5  cm  dari  dasar gel.  Gel  dilepaskan  dari  plate  dan  dimasukkan ke  dalam  kotak  plastik.  Gel  diberi  larutan fiksatif (10% ethanol, 0.5% asam asetat glasial) dan  difiksasi  selama  20  menit.  Kemudian  gel diwarnai dengan 0.05 % perak nitrat dan 0.05% formaldehid.  Shaking  selama  20  menit.  Gel kemudian  dicuci  selama  1  menit  dengan akuades.  Gel  diberi  NaOH  2.5  %  dan  0.05% formaldehid lalu shaking sampai muncul pita.
Analisa Data Analisa data dilakukan dengan metode deskriptif  berdasarkan  parameter  keragaman haplotipe  (h)  dan  jarak  genetik  antar  populasi (Nei,  1987,  dab  Kumar  2000).    Hubungan kekerabatan  dan  perbedaan  jarak  genetik  yang nyata  diilustrasikan  dalam  bentuk  dendogram. Persamaan  matematika  keragaman  haplotipe dan  jarak  genetik  secara  berturut  turut  sebagai berikut :
H : keragaman haplotipe N : jumlah sampel X i : frekuensi haplotipe sampel ke-i
P ix : frekuensi alel ke-i dari populasi X P iy : frekuensi alel ke-i dari populasi Y D : jarak genetik
Rekapitulasi  identifikasi  genotype  (tipe restriksi)  mtDNA  teramplifikasi  hasil  digesti dengan  dua  enzim  (Hha1  dan  Msp1)  disajikan dalam Tabel 2.
Hasil  pemotongan  yang  menunjukkan ukuran panjang fragmen berbeda akan memberikan  tipe  pemotongan  (haplotipe)  yang berbeda  pula.    Tipe  pemotongan  yang  berbeda pada  setiap  individu  dalam  suatu  populasi maupun  antara  populasi  dapat  disebabkan  oleh terjadinya pergantian, penambahan atau hilangnya  basa  tertentu  pada  urutan  basa  D- Loop  mtDNAnya.    Sehingga  Enzim  tertentu tidak  memotong pada situs  yang sama.  Hal ini mengakibatkan  terjadinya  pergeseran  situs pemotongan.  Dengan demikian dapat dikatakan bahwa terdapat perbedaan urutan pasangan basa pada individu yang mempunyai tipe pemotongan  basa  yang  berbeda.    Hal  ini mengakibatkan  adanya  keragaman  genetik  di dalam populasi dan antara populasi.
Keragaman Genetik
Hasil pemotongan produk PCR dengan menggunakan  2  enzim  restriksi  menghasilkan lima haplotipe mt  DNA  D-Loop  region.    Tipe composite  haplotipe yang  diperoleh  disajikan dalam  Tabel  3.    Setiap  enzim  memiliki  tipe restriksi (tipe pemotongan) yang berbeda.

## Hasil dan Pembahasan
Hasil Amplifikasi daerah cyt b mtDNA pada  Sidat  ( Anguila  bicolor )  menggunakan primer  Cytochrome  b  ( Cyt  b-1 ) forward :  5’– TGCTACGATGCCCTAGTGG  -  3’  dan Cyt  b- 2: 5’–CTAGTCAACCTACT  –  AATGGG  -  3’ menghasilkan  fragmen  DNA  berukuran  sekitar 1039 bp ( base pairs ) pada semua  sampel lokasi
yaitu Medan, Manado, Cilacap dan Tulungagung. (Gambar.1) Dari  empat  enzyme  yang  digunakan  untuk memotong  templste  mt-DNA  tersebut  ( Hind III, EcoR I, Hha I  dan Msp I),  hanya  2  enzym  yang mempunyai  sisi  pemotongan  yaitu Hha I  dan Msp I.    Pemotongan  fragmen  mt-DNA  dengan menggunakan enzyme Hha I menghasilkan dua jenis  pola  restriksi  sedangkan  enzyme Msp I menghasilkan  tiga  tipe  pola  restriksi.  (Gambar 2)
Panjang  fragmen  mt-DNA  untuk  masing- masing  enzim  restriksi  dapat  dilihat  pada  table 1.    Dari  table  terlihat  bahwa  Digesti  fragmen mtDNA  teramplifikasi  dengan  enzim  restriksi Hha 1 menghasilkan dua tipe yaitu A (523, 516 pb), dan B (147, 892 pb).
Sedangkan      digesti  enzim  restriksi Msp 1 menghasilkan  tiga  tipe  yaitu  A  (203,  325,  511 pb), B (203, 415, 415 pb) dan C (511, 528 pb).
Analisis composite haplotipe
menghasilkan    tiga composite  haplotipe pada seluruh  kelompok  sampel,  nilai  keragaman haplotipe  bervariasi  antara  (0.0)  (Sampel Manado,  Medan  Cilacap)  sampai  0.2  (sampel Tulungagung) ( Tabel 3).  Jumlah terendah yang diamati adalah pada kelompok sampel  Manado, Medan  Cilacap    (  satu composite  haplotipe ). Sedangkan  jumlah  yang  tertinggi  terdapat  pada kelompok sampel Tulungagung ( tiga composite haplotipe )
Jarak  genetik  antar  populasi  (D)  dan dendogram hubungan kekerabatan antar populasi  (filogeni)  pada  empat  populasi  sidat menurut metode UPMGA dengan menggunakan program  software  TFPGA  disajikan  dalam Tabel 4
1        2        3       4        5       6       7        8       9     10       11     12   13
1039 bp 1500 bp 1000 bp 500 bp
Gambar 1.  Fragmen tunggal mtDNA pada Sidat (A. bicolor) yang diamplifikasi dengan primer cyt b Keterangan  :  1  :  Marker  10kb,  2  –  4  :  sampel  Cilacap,  5  –  7  :  sampel    Medan,  8  –  10  :  sampel Manado, 11 – 13 : sampel  Tulungagung, bp : pasangan basa
Gambar 2.  Hasil pemotongan fragmen mr-DNA dengan menggunakan enzyme HhaI dan MspI pada sidat ( Anguila bicolor )
Tabel 1.  Tipe fragmen restriksi mtDNA daerah cyt b dengan dua enzim restriksi H ha 1 dan M sp 1
Tabel 2. Distribusi genotype (tipe restriksi) pada empat populasi sidat
Enzim Type restriksi Medan Manado Cilacap Tulungagung Hha 1 A B 3 - 3 - 3 - 1 2 Msp 1 A B C 3 - - 3 - - 3 - - 1 1 1 Tabel 3.  Distribusi frekuensi dan komposit haplotipe pada empat populasi sidat ( Anguila bicolor) No Composite haplotipe Total Medan Manado Cilacap Tulungagung 1 AA 10 0.3 0.3 0.3 0.1 2 BB 1 - - - 0.1 3 AC 1 - - - 0.1 Jumlah sampel 12 3 3 3 3 Jumlah haplotipe 5 1 1 1 3 Keragaman haplotipe 0.0 0.0 0.0 0.2
Jarak  genetik  antar  populasi  (D)  dan dendogram hubungan kekerabatan antar populasi  (filogeni)  pada  empat  populasi  sidat menurut metode UPMGA dengan menggunakan program  software  TFPGA  disajikan  dalam Tabel 4.
Hasil perhitungan jarak genetik menunjukkan  jarak  terkecil  (terdekat)  antara populasi  Medan,  Manado  dan  Cilacap  yaitu sebesar  0.0000,  sedangkan  jarak  genetik terbesar  (terjauh)  adalah  populasi  Tulungagung yaitu 0.0017.
Berdasarkan  dendogram  kekerabatan  empat populasi  sidat  ( Anguila  bicolor )  menunjukkan bahwa  nilai  similaritas  dari  sampel  sebagai berikut  sidat  cilacap  1,  Medan  2,  Medan  3, Manado  1,  Manado  3,  tulung  agung  1  dan Manado  2  mempunyai  nilai  similaritas  100%. Sidat    cilacap  2,  sidat  cilacap  3  dan  medan  1 mempunyai nilai similaritas 100%.
Antara  kelompok  sidat  Cilacap  1, Medan  2,  Medan  3,  Manado  1,  Manado  3, Tulungagung  1  dan  Manado  2  dan  kelompok Sidat    Cilacap  2,  sidat  Cilacap  3  dan  Medan  1 mempunyai  nilai  similaritas  sebesar  88.9%. Sidat  Tulungagung  3  terhadap  kelompok  sidat Cilacap  1,  Medan  2,  Medan  3,  Manado  1, Manado  3,  Tulungagung  1  dan  Manado  2  dan kelompok  Sidat  Cilacap 2, sidat Cilacap 3 dan Medan  1  mempunyai  nilai  similaritas  sebesar 74.4%.
Sidat  Tulungagung  2  terhadap  Sidat Tulungagung  3,  kelompok  sidat  Cilacap  1, Medan  2,  Medan  3,  Manado  1,  Manado  3, Tulungagung  1  dan  Manado  2  serta  kelompok
Sidat    Cilacap  2,  sidat  Cilacap  3  dan  Medan  1 mempunyai nilai similaritas sebesar 32.2%.
Tinggi rendahnya keragaman haplotipe genetik dapat diindikasikan dari jumlah maupun keragaman  haplotipe  (h)  dan  nukleotida.    Hasil yang  diperoleh  dalam  penelitian  ini  terindikasi tiga tipe composite haplotipe.  Jumlah haplotipe ikan  sidat  yang  dimiliki  oleh  masing  masing sampel  untuk  sampel  dari  Manado,  Medan  dan Cilacap  memiliki  satu  composit  haplotipe  yang sama. Distribusi composite haplotipe menunjukkan  ciri  khas  ikan  sidat  pada  masing- masing  lokasi.    Secara  keseluruhan  keragaman haplotipe  wilayah  Medan,  Manado  dan  Cilacap adalah  seragam  (0.0),  sedangkan  sampel  ikan sidat  dati  Tulungagung  mempunyai  nilai keragaman haplotipe (0.2).
Keragaman  genetik  antar  populasi dapat  dicirikan  dari  jarak  genetik  dalam klasifikasi atau pengelompokan ikan menggambarkan  perbedaan  nilai  suatu  cirri antara  kelompok  ikan  yang  dibandingkan. Semakin kecil nilai jarak genetik, semakin kecil pula  keragamann  antar  populasi  tersebut demikian pula sebaliknya.
Analisis dendogram berdasarkan UPGMA menunjukkan ada strukturisasi genetik sebagai gambaran pemisahan kelompok menjadi dua  unit  populasi,    yaitu  kelompok  pertama yang  terdiri  dari  sampel  sidat  dari  Manado, Medan  dan  Cilacap  dan  kelompok  II  sampel sidat dari Tulungagung.  Jarak genetik dan pola migrasinya diperkirkan mempengaruhi pemisahan  kelompok  sidat.    Secara  berturut
Gambar 3. Jarak genetik antar populasi
turut nilai jarak genetik  kedua populasi tersebut adalah 0.0000 dan 0.0017
Ilustrasi dendogram memberikan informasi  kekerabatan  dari  keempat  lokasi sampel  pengambilan.    Pola  kekerabatan  suatu ikan  terjadi  karena  adanya  penyebaran  dan proses  migrasi  (ruaya).    Adanya  pemisahan populasi  ikan  sidat  pada  keempat  lokasi pengambilan sampel diperkirakan terkait
dengan faktor oseanografi dan geografis.
Sidat  muda  hidup  selama  beberapa  tahun  di sungai-sungai untuk melengkapi siklus reproduksinya.    Ikan  sidat  mampu  mencapai jarak perjalanan ruaya hingga 4000 mil.  Selama melakukan  ruaya  pemijahan,  induk  sidat mengalami  percepatan  pematangan  gonad  dari tekanan  hidrostatik  air  laut.    Proses  pemijahan berlangsung  pada  kedalaman  400  m,  sehingga pengaruh  hidrostatis  permukaan  air  lebih  kecil dibandingkan dengan kondisi hidrostatis perairan lapisan dalam dan pengaruh lebih besar terjadi  pada  fase  disporsal  dan  larva  yang bersifat planktonik.  Letak geografis yang relatif dekat  mengakibatkan  ketiga  sampel  dari  lokasi berada dalam satu kelompok ( D = 0.000). Tingginya nilai keragaman haplotipe di
Tulungagung  ini  disebabkan  oleh  kondisi perairan pantai di Tulungagung yang mempunyai  tingkat  produktifitas  kesuburan yang  tinggi,  sehingga  sidat  dari  Tulungagung secara  genetik  mempunyai  sifat  yang  lebih unggul.    Terkait  dengan  kondisi  lingkungan perairan yang berbeda dari pengambilan sampel diduga  memberi  pengaruh  terhadap  munculnya keragaman genetik populasi sidat.  Seperti pada sidat  dari  Tulungagung  yang  mempunyai  nilai keragaman  haplotipe  yang  tinggi  (0.2)  Hal  ini terkait dengan
kemampuan
individu menyediakan  ragam  genetik  alam  mekanisme evolusi sehingga bertahan hidup dan bereproduksi.    Koen  et  al  (1976)  menyatakan bahwa  perbedaan  genetik  dapat  terjadi  karena letak  geografis,  perbedaan  salinitas  dan  suhu. Perubahan  keragaman  alel  yang  mempengaruhi keragaman  genetik  juga  disebabkan  oleh migrasi,  seleksi  dan genetic  drift (Frankham et al 2002).
Berdasarkan tipe haplotipe sampel dari Medan  dan  Cilacap  AA  juga  ditemukan  pada sampel  dari  Tulungagung,  hal  ini  menunjukkan kedekatan  secara  geografis  dan  pertukaran populasi  sidat  terkait  buidaya  yang  dilakukan. Nilai  keragaman  haplotipe  yang  rendah  dari rata-rata  sidat  di  tiga  lokasi  sesuai  dengan pendapat  Sugama  dan  Hutapea  bahwa  populasi dengan laju migrasi yang sempit atau jarak yang pendek mempunyai heterosigositas yang rendah bila  dibandingkan  dengan  populasi  yang
mempunyai  migrasi  yang  luas  dan  bersifat terbuka.    Terjadinya  pertukaran  gen  dalam melakukan  perkawinan  dapat  mengakibatkan perkawinan  sekerabat  yang  bila  terjadi  secara berulang-ulang dapat mengakibatkan rendahnya variasi genetik / munculnya peluang homosigositas akan lebih tinggi.

## Kesimpulan
Keragaman  haplotipe  (genetik)  dari empat  populasi  sampel  ikan  sidat  bervariasi antara 0.0 – 0.2  Keragaman haplotipe terendah 0.0  terdapat  pada  kelompok  sampel  Manado, Medan  dan  Cilacap  dan  yang  tertinggi  0.2 terdapat pada kelompok sampel Tulungagung.
Jarak  genetik  antar  kelompok  sampel berkisar  antara  0.000  –  0.0017.    Jarak  genetik terdekat  adalah  antara  kelompok  sampel Manado,  Medan  dan  Cilacap  sedangkan  jarak genetik  terjauh  sampel  Tulungagung  dengan nilai jarak genetik 0.0017.
Dendogram  yang  dibentuk  berdasarkan jarak  genetik  menunjukkan  bahwa  kelompok sidat  yang  diamati  dapat  dibagi  menjadi  dua kelompok  populasi  yaitu  kelompok  pertama terdiri  dari  ikan  sidat  yang  berasal  dari kelompok  sampel  Manado,  Medan,  Cilacap sedangkan kelompok kedua berasal dari sampel Tulungagung.

## Daftar Pustaka
Aoyama,  J.,  H.  Sugeha,  dan  K.  Tsukamoto. 2006. Downstream Migration of Tropical Anguillid Silver Eels. Prosiding Seminar Nasional Limnologi 2006 Avis, J.C. Lansman and R.O. Shade. 1979. The use Endonuclease to Mesure Mitochondria DNA Sequense Relatedness  in  Natural  Populayions.  I. Population  Structure  and  Evolution  in Genus  Peromyscus.    Genetic  92:279- 295 Botstein.,  D.R.,  R.L  White,  M.Skolnick,  and R.W.  Davis.  1980.    Construction  of  a Genetic  Linkage  Map  in  man  Using Restriction Fragment Length Polymorphism, Am.J.Hum.Gen. 32:31- 314-331
Brown,  T.  A.  1991.    Pengantar  Kloning  Gen. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica Desjardin,  P.  and  R.  Moris.  1990.    Sequence and  gene  organization  of  chicken mitochondria  genom.    A  novel  gene order in higjer vertebrate.J.Mol. Biol.212.599-624.
Duryadi,  1994.    Peran  DNA  Mitokondria  (mt DNA)  dalam  studi  keragaman  genetic
dan  biologi  populasi  pada  hewan.
Hayati,  Jurnal  Biologi  FMIPA  IPB. 1(1):1-4 Effendie,  M.I.  1997.    Biologi  Perikanan, Yayasan Pustaka Nusatama, Yogyakarta, 163 p Hardys, H., M. Balick, and B. Schiewater, 1992. Application  of  Random  Amplified Polymorphic  DNA  (RAPD)  in  Mol Ecol. 1: 56 – 63. Kocher T.D., Lee W.J., Sobolewska H., Penman D.  &  McAndrew  B.1989.  A  Genetic Linkage  Map  Of  A  Cichlid  Fish,  The Tilapia ( Oreochromis niloticus ).
Genetics 148.
Maniatis,  T.  Sambrook,  J.  and  Fritsch,  E.F. 1989.    Molecular  Cloning  (2th  ed.). Harbor:Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Moria,  S.B.  Haryanti.  Permana,  I.  G.  N  and
Sugama,  K.2001.    Keragaman  dan Kekerabatan  Tiga  Spesies  Kerapu Epinephelus  spp.  Dengan  Metode Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) mtDNA. Teknologi Budidaya Laut dan Pengembangan Sea Farming di Indonesia. Jakarta:Departemen Kelautan dan Perikanan. Hal.285-292 Nelson,  J.S.  1994.    Fishes  of  The  World,  3 rd editions.  John  Wiley  and  Sons,  Inc.,
New York, 600pp Ovendem  J  (2000).    Development  and Restriction  Enzyme  Markers  for  Red Lutjanus malabaricus) Stock Descrimination Using Genetic Variation  in  Mitochondrial  DNA. Molecular Fisheries Laboratory
Southern  Fisheries    Centre.    Produced for CSIRO Marine Laboratories as Part of    The  ACIAR  Indonesia  Snapper Project Perez-Enriquez,  R.,  Takagi,  M.  and  Taniguchi, N.  (2007).  Genetic  Variability  And Pedigree  Tracing  Of  A  Hatchery- Reared  Stock  Of  Redsea  Bream ( Pagrus  Major )  Used  For  Stock Enhancement, Based On Microsatellite DNA  markers.  Aquaculture 173,  413– 423. Primack,  R.  B.  Supriatna,  J.  Indrawan,  M.  & Kramandibrata,P.  1998. Essentials  of
Conservation Biology . Sinauer Asssociate, Sunderland, Massachusetts. Saputra,  D.  2009.  Gambaran (RFLP)  Gen
Sitokrom  b  DNA  Mitokondria  dari Sembilan  Spesies  Ikan  Air  Tawar. Skripsi  Fakultas  Kedokteran  Hewan, Institut  Pertanian  Bogor.Setiawan  I.E, Rovara,  O  dan  M.H  Amarullah.  2007. Mengenal  Sumberdaya  Ikan  Sidat. BPPT-HSF,  Jakarta.  Program  Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor.
Sartika,  Tike,  2000.    Studi  Keragaman  Fenotip dan  Genetik  Ayam  Kampung  pada populasi dasar seleksi. Thesis. Program Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor Teng,  H.Y,  Y.S.  Lin,  dan  T.S.  Tzeng.  2009.  A
New Anguilla Species and a Reanalysis of  the  Phylogeny  of  Freshwater  Eels. Department  of  Life  Science,  National Tsing  Hua  University,  Hsinchu  300, Taiwan.  J. 48(6): 808-822 Tesch,  F.W.  1977.    The  eel  biology  and management  of  anguila  eels.  Chapman and  Hall.    London  434  p.  Snapper (Lutjanus  erythropterus  and  genus anguila.  University  of  Tokyo.    J. coastal marine Sci. 32 (3)
Watanabe,  S,  J.  Aoyama,  K.  Tsukamoto.  2008. The Use of Morphological and molecular  genetic  variation  in  the genus anguila. University of Tokyo.  J.
coastal marine Sci. 32 (3) Warwick,  E.J.,  H.J.Astuti,M.J.  and  W.  Hardjo Subroto,  1987.    Pemuliaan.  Ternak. Gajah Mada University Press. Jogjakarta
Setiawan  I.E,  Rovara,  O  dan  M.H  Amarullah.
2007.    Mengenal  Sumberdaya  Ikan
Sidat.  BPPT-HSF,  Jakarta.  Program Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor