## Efektivitas Ozonated VCO terhadap
Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog

## Tikus Sprague Dawley
1 2 3

## Johan Rinto Even , Hardian , Najatullah
Latar  belakang  : Tatalaksana  luka  memiliki berbagai  tingkatan metode  yang  dapat dilakukan sesuai dengan grading luka itu sendiri. Skin graft saat ini menjadi salah satu terapi  pilihan  pada  proses  penyembuhan  luka  yang  selalu  berkembang.  Proses pembentukan fibroblas dan pembentukan growth factor seperti VEGF memiliki peran penting dalam penyembuhan luka skin graft . Minyak VCO yang telah terozonasi memiliki peran  yang  penting dalam  penyembuhan  luka.  Penelitian  ini  bertujuan  membuktikan efek  VCO  terozonasi  dalam  berbagai  dosis  dalam  meningkatkan  jumlah  proliferasi fibroblas dan ekspresi VEGF pada luka skin graft.
Metode : Penelitan ini adalah studi eksperimental dengan “Randomized parallel study with controlled group design” terhadap 40 ekor tikus Sprague Dawley dilakukan skin graft autolog pada waktu yang bersamaan. Sampel dibagi secara acak menjadi 8 grup (K1 dan K2 = tanpa pemberian kafein), (A1 dan A2 = ozonated VCO 50,4 mg/ml), (B1 dan B2 = ozonated VCO 103,2 mg/ml), (C1 dan C2 = ozonated VCO 204 mg/ml). Penilaian jumlah fibroblast dilakukan dengan pengecatan hematoxylin & eosin pada hari ke 6 dan 12 ,dan ekspresi VEGF dilakukan dengan pengecatan imunohistokimia setelah hari ke 6 dan 12 pasca skin graft . Hasil : Uji statistik perbandingan jumlah fibroblast pada hari ke 6 didapatkan didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok K1 vs A1 ( p = 0,029 ), K1 vs B1 ( p = 0,004 ), K1 vs C1 ( p = 0,000 ), pada hari ke 12 didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok K2  vs  A2  ( p =  0,029  ),  K2  vs  B2  ( p =  0,010),  K2  vs  C2  ( p =  0,001)  .  Analisis  statistik perbandingan  ekspresi  VEGF  pada  hari  ke  6,  didapatkan  perbedaan  yang  bermakna antara kelompok K1 vs A1 ( p = 0,024), K1 vs B1 ( p = 0,005), K1 vs C1 ( p = 0,001), pada hari ke 12 didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok K2 vs A2 ( p = 0,011), K2 vs B2 ( p = 0,036), K2 vs C2 ( p = 0,004 ). Simpulan : Ozonated VCO efektif terhadap peningkatan jumlah fibroblas dan ekspresi VEGF  jaringan  pada  proses  penyembuhan  luka full  thickness  skin  graft  autolog tikus Sprague Dawley.
Kata kunci : Ozonated VCO, full thickness skin graft , fibroblas, VEGF
1 Program Studi Bedah Umum Universitas Diponegoro
2 Bagian Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang
3 Bagian Bedah Plastik RSUP Dr. Kariadi, Semarang
Abstrak
Original Article Med Hosp 2021; vol 8 (1) : 28–38 p-ISSN: 2301-4369 e-ISSN: 2685-7898 https://doi.org/10.36408/mhjcm.v8i1.447
Diajukan: 13 Agustus 2020 Diterima: 12 Oktober 2020

## Afiliasi Penulis:
Program Studi Bedah Umum, Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

## Korespondensi Penulis:
Johan Rinto Even Jl. Dr. Sutomo No.16, Semarang, Jawa Tengah 50244, Indonesia
E-mail: dokterjohan@yahoo.co.id
Background : Now, Skin grafts are one of the therapies of choice in the wound healing process. And this is still developing today. The process of  formation fibroblas  and  the  formation of  vascular  endothelial  growth  factor have an  important role  in  healing  skin  graft wounds. Ozonated virgin coconut oil has an important role in wound healing. Tje objectives of this study was to prove the effect of ozonated virgin coconut oil in various doses in increasing number of fibroblas and expression of vascular endothelial growth factor of skin graft wounds. Methods : This study is an experimental study with "Randomized parallel study with controlled group design" on 40 Sprague Dawley rats which are performed an autologous skin graft at the same time. Samples were divided randomly into 8 groups (K1 and K2 = without ozonated VCO), (A1 and A2 = ozonated VCO 50,4 mg/ml), (B1 and B2 = ozonated VCO   103,2 mg/ml), (C1 and C2   = ozonated VCO 204 mg/ml). Evaluation of the amount of fibroblas was done by staining hematoxylin & eosin after the 6th day and the expression of vascular endothelial growth factor  was done by staining immunohistochemistry after the 12th  day after skin graft.
Results : Statistical analysis of the amount of fibroblas after the 6th  day was found to be significantly different between the K1 vs A1 group ( p = 0.029), K1 vs B1 (p = 0.004), K1 vs C1 ( p = 0.000), on the 12th day was found significantly different the amount of fibroblast between K2 vs A2 ( p = 0,029 ), K2 vs B2 ( p = 0.010 ), K2 vs C2 ( p = 0.001 ). The expression of vascular endothelial growth factor on the 6th day was found a significant difference between the K1 vs A1 group ( p = 0.024), K1 vs B1 ( p = 0.005), K1 vs C1 ( p = 0.001), on the 12th day was found significantly different the expression of vascular endothelial growth factor between K2 vs A2 ( p = 0,011 ), K2 vs B2 ( p = 0,036 ), K2 vs C2 ( p = 0.004 ) . Conclusion : Ozonated VCO can increase the amount of fibroblas and expression of vascular endothelial growth factor  in the wound healing process of autologous skin graft in Sprague Dawley rats.
Keywords : Ozonated VCO, full thickness skin graft, fibroblas, VEGF.

## Abstract

## Effectiveness of ozonated VCO for wound healing in autologous full thickness skin graft in Sprague Dawley Rats

## PENDAHULUAN
Luka  merupakan  hilangnya  atau  terputusnya kontinuitas  jaringan  yang  disebabkan  berbagai  faktor 1 baik internal maupun eksternal.  Berdasarkan insidensi, luka  bakar  merupakan  jenis  luka  yang  paling  banyak
2 membutuhkan penanganan bedah secara serius.  Tahun 2008,  lebih  dari  410.000  kasus  luka  bakar  terjadi  di Amerika  Serikat,  dimana  sekitar  40.000  kasus  butuh
3 perawatan  di  rumah  sakit.   Data  yang  didapatkan  dari RSUPN  Cipto  Mangunkusumo  tahun  2004,  dilaporkan 107  kasus  luka  bakar  yang  dirawat  dengan  angka 4 kematian  37,38%.   Di  Bali  khususnya  pasien  yang dirawat  di  RSUP  Sanglah  Denpasar  pada  tahun  2012 sebanyak 103 orang dirawat dengan luka bakar. Dari 103 orang  yang  dirawat,  sebanyak  48  orang  dilakukan 4 tindakan skin  graft. Dewasa  ini  model  terapi Skin  graft merupakan  salah  satu  pilihan  terapi  yang  sering digunakan, skin  graft merupakan  suatu  langkah  untuk menutup defek yang tidak dapat ditutup secara primer. Tindakan  ini  memindahkan  sebagian  atau  seluruh tebalnya  kulit  dari  satu  tempat  ke  tempat  lainnya sehingga  bisa  hidup  di  tempat  baru  tersebut  dan membutuhkan  suplai  darah  baru  untuk  menjamin
5 kelangsungan  hidupnya.   Berdasarkan  ketebalannya, graft dibagi menjadi split thickness skin graft (STSG) yaitu graft yang mengandung epidermis dan sebagian dermis, dan full  thickness  skin  graft (FTSG)  yaitu graft yang 6 mengandung epidermis dan seluruh ketebalan dermis. Ozon berpotensi sebagai alternatif yang potensial untuk dijadikan agen yang membantu penyembuhan luka pada
kulit. Ozon bereaksi pada setiap organ dan permukaan 7–10 tempat berkontaknya ( misalnya sel endotel).
Sampai  saat  ini  masih  terbatasnya  penelitian terapi  krim  ozon  pada  hewan  coba  dengan  model  full thickness skin graft dan belum adanya penelitian berupa uji  klinis  mengenai  keamanan  penggunaan  krim  ozon untuk terapi full thickness skin graft di Indonesia, sehingga peneliti  bermaksud  untuk  melakukan  penelitian tersebut.  Pemberian ozonated  virgin  coconut  oil diduga d a p a t   m e n i n g k a t k a n   p r o l i f e r a s i   V E G F   d a n meningkatkan jumlah fibroblas pada  pengaplikasian full thickness skin graft pada tikus Sprague Dawley.

## METODE
Dalam  penelitian  ini,  digunakan  hewan  coba  dengan menerapkan animal  ethics ,  yang  diperoleh  dengan  cara pengajuan  persetujuan  kepada  Komisi  Etik  Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro dengan  No.56/EC/H/KEPK/FK-UNDIP/V/2019. Seluruh hewan coba diberi perlakuan dan dirawat sesuai standar  pemeliharaan  binatang.  Semua  tikus diperlakukan  secara  sama  dari  segi  post  operatif,  diet dalam  jumlah  sama  dan  minum ad  libitum ,  masing- masing kelompok dikandangkan secara individual.
Desain  penelitian  merupakan  eksperimental dengan ”Randomized  paralel  study  with  control  group design” . Pembuatan ozonated virgin coconut oil dilakukan di Center Plasma Research Universitas Diponegoro. Proses pembuatan  luka  dan  penerapan full  thickness  skin  graft terhadap  tikus,  serta  proses  pengambilan  jaringan
Efektivitas Ozonated VCO terhadap Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog Tikus Sprague Dawley
dilakukan  di  Laboratorium  Penelitian  dan  Pengujian Terpadu  (LPPT)  Universitas  Brawijaya,  Malang.  Proses pembuatan  preparat,  pewarnaan  HE  serta  pewarnaan imunohistokimia  dilakukan  di  Laboratorium  Patologi Anatomi  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Brawijaya Malang.  Penelitian  dan  pengumpulan  data  dilakukan selama  6  minggu.  Penelitian  ini  dilakukan  selama Februari  2019 –  Mei 2019.
Populasi penelitian melibatkan 2 kelompok besar yang  terdiri  dari  satu  grup  kontrol  dan  tiga  grup intervensi dalam 1 kelompok besar dan setiap kelompok mempunyai  kesamaan  dalam  perlakuan  namun memiliki perbedaan dalam hal lama waktu pengamatan. FTSG  akan  dilakukan  pada  semua  grup.  Semua  subjek akan  diperlakukan  secara  sama  dari  segi  post  operatif dan pemberian ozonated virgin coconut oil topical . Kriteria inklusi  sampel  penelitian  yaitu  tikus Sprague  Dawley jantan,  kondisi  sehat  (bergerak  aktif).  Kriteria  ekslusi pada  penelitian  ini  adalah  tikus  jantan Sprague  Dawley berumur   ±2–3 bulan, berat badan 140±150 gram setelah aklimatisasi,  tidak  ada  abnormalitas  anatomis  yang tampak,  tikus Sprague  Dawley jantan  menunjukkan perubahan  perilaku  (aktivitasnya  tampak  lemah  dan malas).  Perkiraan  total  sampel  pada  penelitian  ini sejumlah  40  tikus  jantan  jenis Sprague  Dawley dewasa dengan  berat  140±150  gram  yang  diberikan  perlakuan luka.
Pembuatan Full Thickness Skin Graft Full thickness skin graft dilakukan dengan cara membuat sayatan dan dibuat luka dengan diameter 2 cm ke badan tikus  yang  telah  dicukur  bulunya.  Kulit  donor  diambil dengan memotong kulit punggung kontra lateral sampai dasar.  Luka  dibersihkan  sampai  dasar  dengan povidone iodine . Bagian ventral dan dorsal jaringan yang diambil dipisahkan secara perlahan dengan forcep kecil. Jaringan bagian dorsal ditaruh ke dalam carian Nacl 0,9% yang di bawahnya  telah  ditaruh  es  batu.  Jaringan  ventral  tidak dipakai. Kulit donor dipindahkan dan dikeringkan dari saline dingin dengan kassa steril. Graft ditempelkan pada
daerah  luka,  lalu  difiksasi  dengan  benang  ukuran  5.0. Sampel dipelihara dalam suhu ruang 28,0±2,0°C dengan pencahayaan  lampu  dari  pukul  09.00  –  21.00  dan diberikan makan secukupnya.
Pembuatan Ozonated Virgin Coconut Oil
Ozonated  virgin  coconut  oil diperoleh  dari  laboratorium Plasma  Research  Universitas  Diponegoro,  yang didapatkan  dari  hasil  generator  ozon.  Ozon  yang dihasilkan dari generator dicampurkan ke dalam Virgin Coconut  Oil  (VCO) .  Alat  yang  digunakan  untuk pembuatan minyak berozon adalah generator ozon dan pengaduk  magnetis (magnetic  stirrer) .  Minyak  yang digunakan adalah minyak VCO sebanyak 40 ml. Variasi dosis konsentrasi ozon adalah 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml. Generator ozon digunakan dengan kapasitas 50 gr/jam. VCO diberikan tekanan Ozon pada kecepatan tetap 1,5 liter per menit dengan konsentrasi ozon 45 mg/L selama 45 menit, 60 menit dan 120 menit.

## Persiapan Hewan Percobaan
Induksi luka pada tikus dilakukan di area dorsum tikus dengan  ukuran  2  cm  x  2  cm  x  5  mm.  Kulit  donor dilakukan  dengan  memotong  kulit  punggung  sampai dasar  dari panniculus  carnosus .  Kulit graft dan bed  graft dibersihkan  dari  jaringan  lemak  dan  jaringan  pengikat secara  lembut.  Kulit graft yang  telah  bersih  dan  kering diletakkan ke bed graft dengan memutar 180° dari posisi awal  sebelum  pengambilan  kulit graft .  Kemudian dilakukan  penjahitan  secara  interuptus  pada  tengah graft, kemudian ke empat sudut graft , diikuti dengan dua jahitan  pada  masing-masing  sisi graft menggunakan benang T-lene 5-0 .
Setelah  dilakukan  FTSG,  luka  pada  tikus dibersihkan dengan normal salin. Tikus diberi perlakuan sesuai  kelompok  perlakuan. Induksi  Full  thickness  skin graft dilakukan  pada  hari  yang  sama,  dan  8  kelompok tersebut akan diberi label K1, A1, B1, C1, K2, A2, B2 dan C2.  Kelompok  K1,  A1,  B1  dan  C1  akan  mendapat perlakuan hingga hari ke 6 lalu diterminasi, sedangkan
Gambar 1. Teknik pembuatan full thickness skin graft autolog .( dokumentasi pribadi)
Medica Hospitalia | Vol. 8, No. 1, Maret 2021
kelompok ke K2, A2, B2 dan C2  diterminasi pada hari ke 12. Kelompok K1 dan K2 merupakan kelompok kontrol dan mendapat perlakuan perawatan luka menggunakan NaCl  0,9%.  Kelompok  A1  dan  A2  sebagai  perlakuan  1 mendapat minyak VCO terozonasi 50,4 mg/ml satu kali per  hari,  kelompok  B1  dan  B2  sebagai  perlakuan  2 mendapatkan minyak VCO terozonasi 103,2 mg/ml satu kali per hari, kelompok C1 dan C2 sebagai perlakuan 3 mendapat minyak VCO terozonasi 204,0 mg/ml satu kali
per hari. Pemberian minyak VCO terozonasi dilakukan pada  hari  pertama  setelah  perlakuan full  thickness  skin graft autolog, kemudian dilakukan observasi selama 12 hari.
Perlakuan proses penyembuhan luka pada tikus yaitu diberikan   kompres NaCl 0,9% dan minyak ozon yang  dibiarkan  terbuka.  Sebelumnya,  telah  dilakukan perlakuan debridement pada  seluruh  kelompok,  baik kelompok  kontrol  dan  perlakuan  sebelum  diberikan
40 ekor tikus Sprague
Aklimatisasi Diet ad Libitum Randomisasi K1 5 ekor
A1 5 ekor B1 5 ekor C1 5 ekor K2 5 Ekor A2 5 ekor B2 5 ekor C2 5 ekor FTSG FTSG FTSG FTSG FTSG FTSG FTSG FTSG NaCl 0,9% Ozonated VCO50,4 mg Ozonated VCO103,2 mg Ozonated VCO 204 mg NaCl 0,9% Ozonated VCO50,4 mg Ozonated VCO103,2 mg Ozonated VCO 204 mg Pengamatan Makroskopis hari ke 1,6 Pengamatan Makroskopis hari ke 12 Terminasi  hari ke 6
Terminasi  hari ke 12
Pemeriksaan  HE untuk  jumlah fibroblas dan IHC untuk
Analisis Data
Gambar 2. Alur penelitian
Efektivitas Ozonated VCO terhadap Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog Tikus Sprague Dawley
terapi. Ozonated virgin coconut oil diaplikasikan pada luka sehari  sekali,  tipis-tipis  menutupi  seluruh  permukaan luka.  Luka  dibiarkan  terbuka,  tidak  ditutup  apapun. Pengaplikasian ozonated  virgin  coconut  oil dilakukan sampai hewan coba mendapatkan perlakuan eksisi.
Pengambilan skin graft
Pada akhir hari ke 12 dilakukan anestesi menggunakan ketamine  10%  (dosis  50–75  mg/KgBB)  intramuskular untuk  pengambilan harvesting jaringan  yang  telah dilakukan full thickness skin graft autolog diikuti dengan proses terminasi melalui dislokasi vertebra cervical pada tikus  yang  telah  terbius. Skin  graft direseksi  sepanjang 0,5– 1 cm dengan jaringan sekitarnya. Fascia (fascia dorsal superfisial) dan otot (m. latissimus dorsi) yang terletak di bawah graft juga direseksi bersamaan dengan skin graft . Sediaan yang direseksi ditransfer ke kotak yang tertutup yang  mengandung  10% neutral  buffered formalin  dan fiksasi  jaringan  18–24  jam.  Agen  fiksasi  dihilangkan dengan  air  selama  1  jam.  Sediaan  dikeringkan  dengan mencelupkan jaringan sesaat dengan etanol (70%, 80%, 90%,  100%),  dan  transfer  jaringan  yang  sudah dikeringkan  menjadi  dua  perubahan  xylol  selama masing-masing  1  jam.  Sediaan  yang  akan  diproses dimasukkan ke lilin parafin panas menyesuaikan lipatan dan  kasetnya.  Blok  parafin  dipotong  dengan  ketebalan 4–5 µm dengan mikrotom dan sediaan diapungkan pada air  mandi  yang  diisi  air  bersuhu  40°C.  Potongan ditransfer ke dalam slide mikroskopik dan dikeringkan
semalaman  pada  suhu  ruangan  sampai  siap  untuk pewarnaan  HE  dan  blok  parafin  dipersiapkan  untuk pengecatan imunohistokimia.

## Analisa data
Analisa  data  dilakukan  denagan  program  SPSS  21.0, meliputi analisis deskriptif dan uji hipotesis. Pada analisa deskriptif  variabel  tergantung  disajikan  dalam  bentuk tabel rerata, SD, median dan grafik box plot . Kemudian dilakukan uji normalitas data dengan uji Saphiro–Wilk . Uji hipotesis  yang  digunakan  adalah  uji One  Way  Anova dengan  alternatif  uji  Non  Parametrik  Kruskal  Wallis, dilanjutkan  dengan Post–Hoc  Test untuk  mengetahui perbedaan  antar  kelompok.  Batas  derajat  kemaknaan adalah apabila p ≤ 0,05 dengan interval kepercayaan 95%.

## HASIL
Pada penelitian ini, selama perlakuan sampai hari ke 12 tidak ada hewan percobaan yang ditemukan mati. Alur penelitian terlihat pada Gambar 2.
Hasil penelitian menunjukkan pemberian ozonated virgin  coconut  oil dengan  berbagai  dosis  terhadap full thickness skin graft menimbulkan efek penyembuhan luka yang  secara  makroskopis  lebih  cepat.  Secara makroskopis,  penyembuhan  tepi  luka full  thickness  skin graft yang  diberikan  perawatan  luka  menggunakan Ozonated virgin coconut oil memiliki kerapatan luka yang lebih    baik  jika  dibandingkan  dengan  kelompok  yang
Gambar 3. Penampakan makroskopis luka full thickness skin graft masing-masing kelompok (dokumentasi pribadi)
Medica Hospitalia | Vol. 8, No. 1, Maret 2021
mendapat perawatan NaCl 0,9% pada full thickness skin graft (Gambar 3).
Jumlah sel fibroblast jaringan melalui pemeriksaan HE  pada  kelompok  K1  dan  K2  (tidak  mendapat perlakuan), A1 dan A2 (50,4 mg/ml), B1 dan B2 (103,2 mg/ml), C1 dan C2 (204,0 mg/ml) melalui pemeriksaan HE terlihat pada Gambar 4.
Rerata  tertinggi  hari  ke-6  didapatkan  pada kelompok C1 diikuti kelompok B1,A1 dan K1. Sedangkan rerata  tertinggi  pada  hari  ke  12  didapatkan  pada kelompok C2 diikuti kelompok B2,A2 dan K2.
Box  plot seperti  yang  terlihat  pada  gambar  5 menunjukkan median jumlah proliferasi fibroblast pada masing-masing  kelompok.  Median  pada  jaringan kelompok  K1  dan  K2  menunjukkan  median  yang terendah dibandingkan kelompok lainnya.
Uji normalitas dan homogenitas data dari masing masing  kelompok  dilakukan  dengan  menggunakan  uji Shapiro–Wilk karena sampel kurang dari 50.
Pada  kelompok  perlakuan  hingga  hari  ke-6 didapatkan distribusi sampel normal ( p > 0,05) sehingga uji  hipotesis  dilakukan  dengan  menggunakan  uji One
Gambar 4. Proliferasi Fibroblast (Pembesaran 1000x/lpk)
H-6 H-12 K-1
K-2
A-1 A-2 B-1 B-2 C-1 C-2
Efektivitas Ozonated VCO terhadap Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog Tikus Sprague Dawley
Way  ANOVA .  Hasil  uji One  Way  ANOVA terhadap jumlah fibroblast pada hari ke 6 didapatkan nilai p = 0,00. Selanjutnya  digunakan  uji Post  Hoc  Bonferroni untuk mengetahui perbedaan antar kelompok.
Hasil uji Post Hoc Bonferroni didapatkan perbedaan yang  bermakna  antara  kelompok  K1  dengan  A1  ( p = 0,029), K1 dengan B1 ( p = 0,004), K1 dengan C1 ( p = 0,000); perbedaan  yang  tidak  bermakna  didapatkan  antara  A1 dengan B1 ( p = 1,00); A1 dengan C1 ( p = 0,268); B1 dengan A1 ( p = 1,00); B1 dengan C1 ( p = 1,00); C1 dengan A1 ( p = 0,268); C1 dengan B1 ( p = 1,00).
Pada  akhir  hari  ke  12  tikus  dilakukan  terminasi dan  diambil  jaringan  lalu  dilakukan  pengecatan  HE untuk  menilai  jumlah fibroblast serta  dilakukan pengecatan  IHC  untuk  menilai  kembali  jumlah
ekspresiVEGF.  Hasil  uji One  Way  ANOVA terhadap jumlah fibroblast pada hari ke 12 didapatkan nilai p = 0,00. Hasil uji P ost Hoc Bonferroni didapatkan perbedaan yang  bermakna  antara  kelompok  K2  dengan  A2  ( p = 0,029), K2 dengan B2 ( p = 0,010), K2 dengan C2 ( p = 0,001). Perbedaan  yang  tidak  bermakna  didapatkan  antara kelompok  A2  dengan  B2  ( p =  1,00),A2  dengan  C2  ( p = 0,655),B2 dengan C2 ( p = 1,00).
Setelah dilakukan pemeriksaan jumlah proliferasi VEGF  pada  kelompok  K1  dan  K2  (tidak  mendapat perlakuan),  A1  dan  A2  (dosis  50,4  mg/ml),  B1  dan  B2 (dosis  103,2  mg/ml),  C1  dan  C2  (dosis  204  mg/ml) dengan  menghitung  jumlah  proliferasi  VEGF  melalui pemeriksaan  imunohistokimia  didapatkan  hasil  pada Gambar 6.
Kelompok

## TABEL 1
Karakteristik Data Jumlah Fibroblas
Umur
Kelas
N
Median (%) TB BMI BB Rerata ± SD (%) 11 12 BMI
5
5 5 5 5 5 5 5 5,80 ± 0,837 11,20 ± 2,490 11,00 ± 1,000
16,80 ± 2,280
16,00 ± 2,828 12,80 ± 3,114
14,80 ± 3,271
18,60 ± 3,050
6,00 12,00
11,00 17,00
17,00 12,00 15,00
18,00
Gambar 5. Grafik box plot data fibroblast
Medica Hospitalia | Vol. 8, No. 1, Maret 2021
Kelompok TABEL 3 Karakteristik Data Ekspresi VEGF K1 A1 N Median (%) Rerata ± SD (%) B1 C1
5 5 5 5 6,60 ± 2,608 12,80 ± 3,114 14,20 ± 3,421 15,60 ± 2,408 K2 A2 B2 C2
5 5
5 5 11,20 ± 1,304 16,40  ± 1,817 15,60 ± 1,817 17,00 ± 3,317 7,00 12,00 15,00 15,00 11,00 17,00 16,00 18,00 Kelompok TABEL 4 Analisis Post Hoc Bonferroni Ekspresi VEGF antar kelompok K2 A2 A2 C2 B2 B2 C2 0,011* –
1,00 1,00 0,036* 1,00 – 1,00 0,004* 1,00 1,00 –
*Diuji dengan Post Hoc Bonferroni ( p < 0,05)
Tabel  3  menunjukkan  rerata  jumlah  proliferasi VEGF  pada  kelompok  kontrol  lebih  rendah  dibanding pada  kelompok  yang  mendapat  perlakuan.  Rerata tertinggi hari ke-6 didapatkan pada kelompok C1 diikuti kelompok B1,A1 dan K1. Sedangkan rerata tertinggi pada hari  ke  12  didapatkan  pada  kelompok  C2  diikuti kelompok  B2,A2  dan  K2. Box  plot seperti  yang  terlihat pada  gambar  7  menunjukkan  median  jumlah  VEGF kelompok K2 lebih rendah dibanding kelompok A2, B2 dan C2.
Uji  Normalitas  Data  Ekspresi  VEGF  dengan Saphiro–Wilk menunjukkan  nilai p >0,05  pada  masing masing kelompok. Hasil uji One Way ANOVA ekspresi VEGF pada hari ke 6 didapatkan nilai p = 0,00. Hasil  uji Post  Hoc  Bonferroni didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok K1 dengan A1 ( p = 0,024), K1 dengan B1 ( p = 0,005), K1 dengan C1 ( p = 0,001);  perbedaan  yang  tidak  bermakna  didapatkan antara A1 dengan B1 ( p = 1,00); A1 dengan C1 ( p = 0,890); B1  dengan  A1  ( p =  1,00);  B1  dengan  C1  ( p =  1,00  );  C1
Kelompok

## TABEL 2
Analisis Post Hoc Bonferroni jumlah fibroblas antar kelompok
K2 A2 A2 C2 B2 B2 C2
0,029* – 1,00 0,655 0,010* 1,00 – 1,00 0,001* 0,655 1,00 – *Diuji dengan Post Hoc Bonferroni ( p < 0,05)
Efektivitas Ozonated VCO terhadap Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog Tikus Sprague Dawley
dengan A1 ( p = 0,890 ); C1 dengan B1 ( p = 1,00 ).
Pada  akhir  hari  ke  12  juga  dilakukan  penilaian terhadap  peningkatan  jumlah  ekspresiVEGF.  Hasil  uji One  Way ANOVA  ekspresi  VEGF  pada  hari  ke  12 didapatkan nilai p = 0,00. Hasil uji Post Hoc Bonferroni didapatkan perbedaan yang bermakna jumlah ekspresi VEGF di akhir hari ke 12 antara kelompok K2 dengan A2 ( p = 0,011), K2 dengan B2 ( p = 0,036 ), serta K2 denganC2  ( p = 0,04). Perbedaan yang tidak bermakna didapatkan antara kelompok A2 dengan
B2 ( p = 1,00 ),A2 dengan C2 ( p = 1,00) dan B2 dengan C2 ( p = 1,00 ).

## DISKUSI
Hasil  penelitian  menunjukkan  adanya  peningkatan bermakna  terhadap  jumlah  proliferasi  fibroblast  pada hari ke 6 ( p =0,000). Selain itu juga terdapat peningkatan bermakna  jumlah  proliferasi  fibroblas  pada  hari  ke  12 ( p =0,001).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  fibroblas  akan
H-6 H-12
K-1
K-2
A-1
A-2
B-1 B-2 C-1
C-2
Gambar 6. Proliferasi VEGF masing-masing kelompok (Pengecatan imunohistokimia dengan pembesaran 1000x/lpk )
muncul  pada  awal  fase  proliferasi  dan  akan  terus meningkat hingga akhir fase proliferasi.
Peningkatan  fibroblast  yang  ditimbulkan  oleh ozon  sesuai  dengan  teori  yang  mendasari  bahwa peningkatan nitric  oxide akan  meningkatkan  proliferasi dari  fibroblas.  Ozon  diketahui  akan  menghasilkan produk H2O2 dan ROS.  ROS yang dihasilkan oleh ozon akan  mengaktivasi  ekspresi  gen Nitric  oxide  synthase sehingga akan meningkatkan pembentukan nitric oxide . Pembentukan  nitric  oxide  akan  merangsang  untuk 11–13 fibroblas berproliferasi.
Hasil  penelitian  ini  tidak  menemukan  adanya perbedaan  bermakna  mengenai  jumlah  proliferasi fibroblas  yang  dihasilkan  pada  berbagai  kelompok perlakuan  ozon  ( p >0,5).  Hal  ini  dapat  didasari  jumlah produk  ROS  dan  NO  yang  dihasilkan  oleh  ozon  pada tingkatan dosis tidak berbeda.
Analisis  perbedaan  ekspresi  VEGF  antar kelompok  menggunakan  uji One  Way ANOVA menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna antara pemberian ozonated  virgin  coconut  oil dengan  kelompok kontrol. Hal ini sesuai dengan penelitian terdahulu yang membuktikan bahwa pemberian ozonated virgin coconut oil akan meningkatkan respon penyembuhan luka yang 14,15 dibuktikan dengan peningkatan ekspresiVEGF.
Hasil penelitian ini menemukan keberhasilan graft dipengaruhi oleh VEGF. Pertumbuhan VEGF baru yang meningkat  akan  meningkatkan  sirkulasi  ke  graft  site sehingga graft dapat  terus  vital.  Proses  pembentukan VEGF terjadi saat fase proliferasi dimulai. Fase proliferasi mulai  timbul  pada  hari  3  hingga  hari  ke  12.  Hal  ini menunjukkan bahwa pada penelitian ini prolifersi VEGF yang  ditimbulkan  sesuai  dengan timeline fase
penyembuhan luka dimana jumlah VEGF semakin lama semakin meningkat.
Penelitian  ini  membuktikan  bahwa  ozon  akan meningkatkan  jumlah  fibroblast,  kolagen  dan  ekspresi VEGF yang merupakan komponen penting dalam proses angiogenesis.  Ozon  akan  berperan  untuk  memanggil sitokin  proinflamasi  seperti  TNF-α,  IL-6,  IL-10  untuk menimbulkan  kaskade  penyembuhan  dengan mendorong  terstimulasinya  VEGF (Vascular  endothelial growth  factor) dan  memastikan  suplai  fibroblas  dapat mencapai tujuan agar bisa menciptakan kolagen untuk 10 perlekatan donor.
Peneliti  juga  menyadari  masih  banyak keterbatasan  penelitian  yang  harus  diperbaiki  untuk melengkapi dan menyempurnakan penelitian ini. Salah satu keterbatasan penelitian ini karena diuji hanya pada beberapa mediator inflamasi. Akan lebih baik penelitian mendatang  dapat  dilakukan  pada  beberapa  mediator inflamasi  lain  seperti  IL-6,  IL-10,  TNF-α, Nitric  oxide . Selain  itu  dipakainya virgin  coconut  oil sebagai  bahan pelarut ozon dapat memberikan bias hasil dikarenakan Virgin coconut oil juga mempunya efek antiinflamasi dan mempercepat wound  healing .  Selain  itu  penelitian  ini dilakukan  hingga  hari  ke-12,  dimana  proses penyembuhan luka masih berlangsung.

## SIMPULAN
Pemberian ozonated virgin coconut oil topikal efektif dalam meningkatkan  proses  penyembuhan  luka  FTSG  pada tikus Sprague  Dawley ditinjau  dari  perubahan makroskopis luka (luka yang menutup rapat, take yang baik pada luka skin graft ), peningkatan jumlah proliferasi
Gambar 7. Grafik box plot data ekspresi VEGF
Efektivitas Ozonated VCO terhadap Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog Tikus Sprague Dawley
fibroblas(di  hari  ke  6  maupun  hari  ke  12  dibanding dengan  kelompok  kontrol),  proses  penyembuhan  luka FTSG ditinjau dari peningkatan ekpresi VEGF(di hari ke 6 maupun  ke  12  dibanding  dengan  kelompok  kontrol). Penelitian selanjutkan diharapkan dapat dilakukan pada beberapa  mediator  inflamasi  lain  seperti  IL    6,  IL    10, TNF-α, nitric  oxide ,  atau  dilakukan  penelitian  ulang dengan  menggunakan  bahan  pelarut  lain  selain  virgin coconut oil untuk menyingkirkan efek perancu terhadap penyembuhan  luka,  dan  diharapkan  penelitian selanjutnya dapat dilakukan hingga akhir penyembuhan luka.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Gosain A, DiPietro L. Aging and wound healing. World J Surg. 2004;28(3):321–6.
2. Geoffrey C, Victor W. Wound Healing: Normal and Abnormal. In: Thorne CH, editor. Grabb and Smith's Plastic Surgery. 7 ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2014; 20–35.
3. Klein  MB.  Thermal,  Chemical,  and  Electrical  Injuries.  In: Thorne  CH,  editor.  Grabb  and  Smith's  Plastic  Surgery.  7  ed. Philadelphia: Lippincott Williams Wilkins; 2014; 602–67.
4. Sjamsuhidajat,  Jong  D.  Buku  Ajar  Ilmu  Bedah.  4  ed.  Jakarta: EGC; 2017;237
5. Valacchi G, Lim Y, Belmonte G. Ozonated sesame oil enhances cutaneous  wound  healing  in  SKH1  mice.  Dipartimento  di Scienze Biomediche,Siena.2011;19(1):107–1
6. Falabella A, Kirsner R. Wound healing: Boca Raton : Talyor & Francis; 2005.
7. Carmeliet  P,  Jain  R.  Molecular  mechanisms  and  clinical applications of angiogenesis. Nature. 2011;473(7347);298–307.
8. Bocci,  Velio  A.  2005. Scientific  and  Medical  Aspects  of  Ozone Therapy. State of the Art . Archives of Medical Research 37 (2006) 425–435 University of Siena : Siena
9. Tepper  O,  Capla  J,  Galiano  R,  Ceradini  D,  Callaghan  M, Kleinman M, et al . Adult vasculogenesis occurs through in situ recruitment, proliferation, and tubulization of circulating bone marrow-derived cells. Blood. 2005; 105(3);1068–7
10. Valls  M,  Cronstein  B,  Montesinos  M.  Adenosine  receptors agonist for promotion of dermal wound healing. Biochemistry Pharmacology. 2009;77:1117–24.
11. Dua  K,  Sheshala  R,  Ling  TY,  Ling  SH,  Gorajana  A.  Anti- Inflammatory, Antibacterial and Analgesic Potential of Cocos Nucifera  Linn.  :  A  Review.  Antiinflamm  Antiallergy  Agents Med Chem. 2013;12(2):158–64
12. Silalahi  J,  Surbakti  C.  Burn  wound  healing  activity  of hydrolyzed virgin coconut oil. Int J PharmTech Res. 2015;8:67-7
13. Anggarwal  B,  Lamba  HS,  Sharma2  P,  Ajeet.  Various Pharmacological  Aspects  of  Cocos  ucifera  –  A  Review.  J Pharmacol Sci. 2017;5:25–30.
14. Johnson K, Wilgus T. Vascular Endothelial Growth Factor and Angiogenesis in the Regulation of Cutaneous Wound Repair. Advances in Wound Care. 2014;3(10);77–86.
15. Eming  SA.  Biology  of  wound  healing.  Surgery.  18:  Elsevier; 2018. P. 2413–24.