## Studi Profil Metabolit Pada Organ Tikus Hasil Uji Toksisitas Sub Kronis Ekstrak Etanol 70% Daun Justicia Gendarussa
Nur Irhamni Sabrina 1 , Luthfiatu Kanina 2 , Bambang Prajogo EW 3 , Retno Widyowati 4* , Suciati 5
1,2 Program Magister Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
3,4,5 Departemen Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia * Koresponden email : rr-retno-w@ff.unair.ac.id Diterima: 16 November 2022 Disetujui: 18 Desember 2022

## Abstract
Justicia gendarussa Burm.f has been traditionally used as male contraceptionin in Indonesia. Gandarusa leaves contain gendarusin A which has potential as an antifertility agent. To prove that gandarusa leaves are safe to use as a male contraceptive, a subchronic toxicity test was carried out on this plant. Acute and subchronic oral toxicity studies of Justicia gendarussa Burm.f in rats were performed in the previous study in order to evaluate its safety. The aim of this study is to identify the metabolite profile of rat organ results of their subchronic toxicity test. Seven organs of rat such as kidney, hepar, testis, limph, instestine, lung, and  heart  were  extracted  using  methanol  and  their  profile  metabolites  were  identified  using  UHPLC Vanquish Tandem Q Exactive Plus Orbitrap HRMS by positive and negatif mode. The results showed that all sampels contain 22 compounds from the positive ionization mode and 35 compounds from the negatif ionization  mode.  Compounds  identified  from  the  positive  mode  were  dominated  by  amino  acid  groups, then compounds identified from the negatif mode were dominated by fatty acids and their derivatives. There were 35 metabolites that identified from the organ samples of the rat resulting subchronic toxicity test using the UHPLC Vanquish Tandem Q Exactive Plus Orbitrap HRMS method.
Keywords: Justicia gendarussa Burm.f , rats, organ, metabolite profile

## Abstrak
Justicia  gendarussa Burm.f  secara  tradisional  telah  digunakan  sebagai  salah  satu  kontrasepsi  pria  di Indonesia.  Daun  gandarusa  mengandung  senyawa  gendarusin  A  yang  memiliki  potensi  sebagai  agen antifertilitas.  Untuk  membuktikan bahwa  daun  gandarusa  aman  digunakan  sebagai  alat  kontrasepsi  pria, maka dilakukan penelitian uji toksisitas subkronis pada tanaman ini. Studi toksisitas oral akut dan subkronis Justicia  gendarussa Burm.f  pada  tikus  telah  dilakukan  pada  penelitian  sebelumnya  untuk  mengevaluasi keamanannya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi profil metabolit organ tikus hasil uji  toksisitas  subkronis.  Tujuh  organ  tikus  seperti  ginjal,  hepar,  testis,  limpa,  usus,  paru,  dan  jantung diekstraksi menggunakan metanol dan diidentifikasi profil metabolitnya menggunakan UHPLC Vanquish Tandem Q Exactive Plus Orbitrap HRMS dengan mode positif dan negatif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa  semua  sampel  mengandung  22  senyawa  dari  mode  ionisasi  positif  dan  35  senyawa  dari  mode ionisasi  negatif.  Senyawa  yang  teridentifikasi  dari  mode  positif  di  dominasi  oleh  gugus  asam  amino, kemudian senyawa yang teridentifikasi dari  mode negatif di dominasi oleh asam lemak dan turunannya. Terdapat 35 metabolit yang teridentifikasi dari sampel organ tikus yang dihasilkan uji toksisitas subkronik dengan menggunakan Metode UHPLC Vanquish Tandem Q Exactive Plus Orbitrap HRMS. Kata Kunci: Justicia gendarussa Burm.f , tikus, organ, profil metabolit

## 1. Pendahuluan
Indonesia  saat  ini  memiliki  laju  pertambahan  penduduk  yang  sangat  tinggi,  sehingga  untuk menanggulangi hal tersebut, pemerintah menggalakkan program Keluarga Berencana (KB). Proyeksi laju angka kelahiran di Indonesia menunjukkan angka yang relatif stabil dengan jumlah kelahiran sebanyak 4,5 juta  jiwa  pertahunnya  [1].  Telah  banyak  metode  kontrasepsi  dengan  berbagai  jenis  kerugiannya.  Peran suami  dalam  KB  juga  masih  kecil  karena  metode  kontrasepsi  yang  terbatas  untuk  suami.  Usaha  dalam meningkatkan peran suami pada program KB, perlu dikembangkan metode kontrasepsi yang efektif dan reversibel,  tidak  ada  penurunan  libido  dan  tidak  toksik  pada  saat  digunakan  dalam  terapi.  Salah  satu tanaman obat di Indonesia yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai obat kontrasepsi adalah gandarusa ( Justicia  gendarussa Burm.  f.).  Berdasarkan  hasil  survei  di  Papua,  daun  gandarusa  dipergunakan  oleh masyarakat setempat sebagai kontrasepsi pria [2].
Penelitian mengenai gandarusa telah dilakukan sejak tahun 1987, dimana penelitian ini berfokus pada uji  aktivitas  antifertilitas  pada  pria  secara  analisis  fitokimia  dan  farmakologis.  Mekanisme  kerja  utama adalah  dengan  menghambat  enzim  hialuronidase  spermatozoa  yang  bersifat  kompetitif  dan  reversibel. Secara in  vitro, uji  antifertilitas  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  60%  dan  fraksi  air  daun  gandarusa dapat menghambat aktivitas enzim hialuronidase pada  testis sapi  [3]. Penelitian lain secara in vitro juga menunjukkan bahwa ekstrak etanol 60% daun gandarusa dengan konsentrasi 15,3 g/mL dapat menghambat 50% aktivitas enzim hialuronidase pada testis manusia [4]. Enzim hialuronidase adalah salah satu enzim yang  berperan  dalam  proses  fertilisasi  untuk  menembus  sel  ovum  [5].  Hialuronidase  berperan  dalam mencerna filamen proteoglikan pada jaringan [6].
Hasil penelitian [4] menunjukkan bahwa gandarusa mengandung alkaloid, flavonoid justicin, tanin, amin  aromatik  iridoid  dan  kumarin.  Selain  itu  hasil  analisis  isolasi  senyawa  golongan  flavonoid  dalam gandarusa  ini  mengandung  flavonol-3-glikosida.  Pada  deteksi  dengan  LC-MS  dari  fraksi  n-butanol menunjukkan 12 senyawa flavonoid yang mempunyai waktu retensi dari 38 hingga 50 menit serta memiliki kesamaan  berat  molekul  (534-535).  Flavonoid  yang  telah  teridentifikasi  dalam  tanaman  ini  adalah gendarusin  A,  gendarusin  B,  gendarusin  C,  gendarusin  D,  dan  gendarusin  E  [7].  Sedangkan  senyawa golongan  alkaloid  yang  telah  teridentifikasi  adalah  2-amino  benzil  alkohol,  2-(2’amino-benzil)-o- metilbenzil-alkohol (justridusamid A), justridusamid B, justridusamid C, dan justridusamid D). Alkaloid tersebut telah diuji dengan software offline toxtree dan diprediksi mempunyai sifat karsinogenik [8]. Pada  tahun  2019  perkembangan  industri  kimia  farmasi  dan  obat  tradisional  menunjukkan  angka peningkatan yaitu sebesar 9,61% dibandingkan tahun sebelumnya yang hanya 8,48% [9]. Dalam rangka pengembangan industri obat tradisional, gandarusa menjadi model penemuan obat yang harus memenuhi persyaratan uji klinik agar dapat dikonsumsi dengan aman oleh manusia. Obat tradisional yang dimaksud harus  memenuhi  persyaratan  mutu  kefarmasian  agar  dapat  menjamin  bahwa  zat  aktif  yang  diinginkan, dalam hal ini gendarusin A telah dapat diabsorpsi dengan baik dan dapat mencapai sirkulasi sistemik agar menimbulkan efek klinik [10].
Pada  penelitian  sebelumnya  telah  dilakukan  uji  toksisitas  subkronis  dari  fraksi  etanol  70%  daun gandarusa  yang  telah  dibebaskan  dari  alkaloidnya  secara  oral  selama  90  hari.  Pemilihan  uji  toksisitas subkronis  tersebut  berdasarkan  hasil  studi  yang  mendeteksi  adanya  senyawa  gendarusin  A  dalam  urine subjek  pada  uji  hari  ke-144.  Pada  uji  toksisitas  subkronis  juga  dilakukan  pemeriksaan  makropatologi, biokimia  klinis,  histopatologi  (organ  hati  dan  ginjal),  pemeriksaan  darah  lengkap  dan  biokimia  klinis (SGOT dan SGPT, ginjal meliputi BUN dan kreatinin darah), dan perubahan metabolit dalam darah [11].
Metabolite  profiling adalah  suatu  analisis  cepat  dari  sejumlah  besar  metabolit-metabolit  berbeda dengan tujuan untuk mengidentifikasi profil metabolit spesifik yang mengkarakterisasi suatu sampel [12]. Dalam metabolite  profiling ,  dilakukan scanning semua  metabolit  yang  terdeteksi  dengan  menggunakan teknik  analisis  terpilih.  Teknik  analisis  yang  dapat  digunakan  adalah  LC-MS,  GC-MS,  CE-MS,  NMR ( Nuclear  Magnetic  Resonance ),  dan  spektroskopi  FT-IR  [12].  Teknik  analisis  saat  ini  yang  memenuhi kualifikasi dan kuantifikasi penuh dari deteksi analit dalam matriks biologi adalah LC-MS/MS. Penggunaan mass  spectrometry untuk  penelitian  sejenis  telah  dilakukan  yaitu  pada  penentuan  jumlah  isoflavon glukoronat dalam urin tikus dengan LC-ESI/MS dan ion-trap LC-MS/MS, penentuan isoflavon glukoronat dan sulfat dari darah manusia, dan deteksi metabolit genistein sulfat dengan menggunakan LC-ESI-MS/MS [12].
Berdasarkan  uraian  tersebut  perlu  dilakukan  penelitian  profil  metabolit  dari    organ  tikus  hasil  uji toksisitas subkronik dari ektsrak etanol 70% daun gandarusa khususnya pada organ hati, ginjal, usus halus, paru, testis, limfa, dan jantung dengan menggunakan UHPLC Vanquish Tandem Q Exactive Plus Orbitrap HRMS.

## 2. Metode Penelitian

## 2.1. Alat dan Bahan
Bahan utama yang digunakan adalah organ tikus hasil uji toksisitas subkronis yang disimpan dalam freezer  dalam  suhu  -28 o C  dan  telah  dipreparasi  metanol,  dan  gas  nitrogen.  Sedangkan  alat-alat  yang digunakan dalam preparasi sampel antara lain mortar-stamper, vial vortex Thermo Scientific M37610-33, ultrasonikator Branson 3510, sentrifus Hettich Zentrifugen EBA 20, neraca analitik Sartorius BL 210S, dan alat gelas. Beberapa instrument untuk profil metabolit adalah UHPLC Vanquish Tandem Q Exactive Plus Orbitrap HRMSion source menggunakan ESI (+) dan ESI (-) dengan energi ionisasi sebesar 18, 35, dan 53eV (ThermoScientific), Accucore phenyl hexyl dimensi 100mm x 2,1 mm, 2,6µm (Thermo Scientific), dan MicroplateReader seri ELx808 (BioTek Instruments,US).
Kondisi LC MS yang digunakan dalam penelitian ini adalah LC-MS : UHPLC Vanquish Tandem Q Exactive Plus Orbitrap HRMS ThermoScientific; Kolom : Accucore C18; 100 x 2,1 mm; 1,5µm (Thermo Scientific);  Laju  Alir  :  0,2  ml/min;  Eluen:  H 2 O  +  0,1%  asam  format  (A)  dan  asetonitril  +  0,1  %  asam format(B);  Gradien  :  0-1  menit  (5%  B),  1-25  menit  (5-95%  B),  25-28  menit  (95%B),  dan  28-35  menit (5%B); Suhu kolom : 30 o C; Volume Injeksi : 5µl; Mass range : 100-1500 m/z; dan Mode ionisasi : Positive dan Negatif.

## 2.2 Preparasi Sampel
Sampel  berupa  berbagai  organ  tikus  hasil  uji  toksisitas  subkronis  dari  ekstrak  etanol  70%  daun gandarusa bebas alkaloid yang disimpan sesuai perlakuan. Sampel ini berasal dari tikus kelompok kontrol yakni kelompok tikus sehat yang tidak diberikan perlakuan ekstrak etanol 70% daun gandarusa. Sampel berkode  perlakuan  atau  P1A/PA  merupakan  sampel  yang  berasal  dari  kelompok  tikus  yang  diberikan ekstrak etanol 70% daun gandarusa secara oral selama 90 hari. Adapun organ tikus yang digunakan yaitu ginjal, hati, paru, limfa, testis, jantung, dan usus.

## 2.3. Ekstraksi Sampel
Organ  ditimbang  kurang  lebih  250  mg  dan  dihaluskan  dengan  bantuan dry  ice sampai  halus, kemudian dilarutkan dalam metanol dan ditampung dalam eppendorf untuk dilakukan sonikasi selama 10 menit.  Setelah  itu  sampel  disentrifus  dengan  kecepatan  3000  rpm  selama  10  menit.  Supernatan  yang diperoleh dikumpulkan dan proses ektraksi ini dilakukan sebanyak 3 kali. Semua supernatan dikumpulkan dan divortex selama 2 menit dan disimpan pada wadah tertutup di dalam lemari pendingin pada suhu -24°C untuk proses analisis selanjutnya. Sampel ini disebut sebagai ekstrak organ.
2.4. Proses Penyimpanan Ekstrak Organ Kering untuk Analisis  dengan UHPLC Vanquish Tandem

## Q Exactive Plus Orbitrap HRMS
Ekstrak organ kering dilarutkan dalam 2 ml metanol dan 0,1% asam format. kemudian divortex selama 15 detik dan diultrasonik selama 10 menit dengan kecepatan 4.000 rpm. Proses ini diulang lagi selama 2 menit (vortex) dan 5 menit (sentrifugasi). Supernatan yang telah terkumpul, diuapkan dengan gas N 2 hingga kering. Sampel ini disebut sebagai ekstrak organ kering [13].
2.5. Proses Analisis pada UHPLC Vanquish Tandem Q Exactive Plus Orbitrap HRMS
Untuk  proses  analisis  pada  instrumen UHPLC  Vanquish  Tandem  Q  Exactive  Plus  Orbitrap HRMS , eksrak organ kering dilarutkan dengan 200,0 μl metanol. Kemudian ekstrak di vortex selama 30 detik dan ultrasonik selama 1 menit sampai terlarut sempurna, disaring dan diinjek sebanyak 1 µL.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Uji toksisitas merupakan suatu uji yang dilakukan untuk mendeteksi efek toksik pada suatu zat dalam sistem biologi dengan memperoleh data respon dari dosis tertentu [14]. Uji toksisitas dapat diamati dari perubahan fungsi atau struktur dari organ vital seperti ginjal sebagai tempat ekskresi senyawa toksin yang masuk ke dalam tubuh [15]. Data yang diperoleh dapat digunakan untuk menggambarkan tingkat bahaya suatu  zat  bila  dipaparkan  kepada  manusia,  sehingga  dapat  ditentukan  dosis  aman  untuk  penggunaannya kepada manusia.
Pada penelitian ini diperoleh beberapa profil  kromatogram dari sampel ekstrak gandarusa, sampel organ kontrol hati, sampel organ kontrol jantung, sampel organ kontrol paru, sampel organ kontrol usus, sampel  organ  kontrol  testis,  sampel  organ  kontrol  ginjal,  sampel  organ  kontrol  limpa,  sampel  organ perlakuan  hati,  sampel  organ  perlakuan  jantung,  sampel  organ  perlakuan  paru,  sampel  organ  perlakuan usus,  sampel  organ  perlakuan  testis,  sampel  organ  perlakuan  ginjal,  dan  sampel  organ  perlakuan  limpa. Masing-masing  kromatogram  menunjukkan  posisi  metabolit  tertentu  dari  hasil  analisa  metode menggunakan UHPLC Vanquish Tandem Q Exactive Plus Orbitrap HRMS dari Thermo Scientific dengan mode ionisasi positif dan negatif. Dilihat dari pola kromatogramnya menunjukkan bahwa profil dari masing masing sampel memberikan pola yang khas dengan menunjukkan BPC ( Base Peak Chromatogram).

## 3.1. Identifikasi Metabolik
Berdasarkan  hasil  identifikasi  kromatogram dari  15 variable  sampel,  maka  diperoleh  sebanyak 22 metabolit yang terdeteksi dengan metode auto MS/MS pada sumber ion positif yang kemudian dinyatakan sebagai  senyawa  positif  dan  35  metabolit  pada  sumber  ion  negtaif  yang  kemudian  dinyatakan  senyawa negatif dengan menggunakan software Compound Discoverer . Keseluruhan metabolit tersebut selanjutnya diidentifikasi dengan berbagai literatur dan database hingga diperoleh data fragmentasi.
Tabel 1. Perbandingan metabolit sampel kontrol dan perlakuan (P1) organ hati
Hati No. Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi positif Kontrol Perlakuan 1. DL-Phenylalanine V V 2. L-(+)-Leucine V V 3. L-(+)-Valine V V 4. L-Proline V V 5. 1,2,3,4-Tetrahydro-Î²-carboline-3-carboxylic acid V V 6. DL-TYROSINE - V 7. L-(-)-Threonine - V 8. DL-Lysine - V No. Senyawa Negatif Kontrol Perlakuan 1. (-)-pinellic acid V V 2. icomucret V V 3. Azelaic acid V V 4. Arachidonic acid V V 5. 8,9-DiHETrE V - 6. Palmitic acid V - 7. Glucose V - 8. Suberic acid - V 9. (-)-Prostaglandin E1 - V Software Compound Discoverer (September, 2021)
Pada data Tabel 1 dengan kategori organ hati menunjukkan bahwa ada perbedaan metabolit yang teridentifikasi  dari  sampel  kontrol  dan  perlakuan.  Perbedaan  tersebut  dapat  dilihat  pada  senyawa DL- TYROSINE,L-(-)-Threonine,DL-Lysine pada  sampel  perlakuan  teridentifikasi  tetapi  pada  sampel  kontrol tidak teridentifikasi pada kategori senyawa positif. Begitu juga pada mode ionisasi negatif dimana senyawa 8,9-DiHETrE,  Palmitic  acid,  Glucose pada  sampel  perlakuan  senyawa  tersebut  tidak  teridentifikasi. Senyawa Suberic acid, Palmitic acid, (-) -Prostaglandin E1 teridentifikasi pada sampel perlakuan tetapi pada sampel kontrol tidak teridentifikasi.
Tabel 2. Perbandingan metabolit sampel kontrol dan perlakuan (P1) organ ginjal Ginjal No. Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi positif Kontrol Perlakuan 1. DL-Phenylalanine V V 2. L-(+)-Leucine V V 3. L-(+)-Valine V V 4. DL-Tryptophan V V 5. L-Proline V V 6. 1,2,3,4-Tetrahydro-Î²-carboline-3-carboxylic acid V V 7. DL-Arginine V V 8. DL-Histidine V V 9. DL-TYROSINE V 10. L-(-)-Threonine V V 11. Dihomo-gamma-linolenic acid - V No. Senyawa Negatif Kontrol Perlakuan 1. (-)-pinellic acid V V 2. icomucret V V 3. (-)-Prostaglandin E1 V V 4. Arachidonic acid V - 5. 8,9-DiHETrE V V 6. DL-Phenylalanine - V 7. 6-Hydroxyhexadecanoic or Juniperic acid V - 8. Leukotriene B4 V V 9. N-Palmitoyl-L-phenylalanine V V 10. Suberic acid V - 11. Ricinoleic acid or 12-Hydroxy-9-octadecenoic acidv V V 12. Palmitic acid V V 13. (9Z,11E)-(13S)-13-Hydroxyoctadeca9,11-dienoic acid or 13(S)-HODE V V 14. gamma-Linolenic acid V - Software Compound Discoverer (September, 2021)
Pada data Tabel 2 dengan kategori organ ginjal menunjukkan bahwa ada perbedaan metabolit yang teridentifikasi dari sampel kontrol dan perlakuan. Perbedaan tersebut dapat dilihat pada senyawa Dihomo- gamma-linolenic acid pada sampel perlakuan teridentifikasi tetapi pada sampel kontrol tidak teridentifikasi pada  kategori  senyawa  positif.  Begitu  juga  pada  mode  ionisasi  negatif  dimana  senyawa  6- Hydroxyhexadecanoic or Juniperic acid, Palmitic acid, Arachidonic acid, Suberic acid, gamma-Linolenic acid pada sampel perlakuan senyawa tersebut tidak teridentifikasi. DL-Phenylalanine teridentifikasi pada sampel perlakuan tetapi pada sampel kontrol tidak teridentifikasi.
Tabel 3. Perbandingan metabolit sampel kontrol dan perlakuan (P1) organ jantung
Jantung No. Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi positif Kontrol Perlakuan 1. DL-Phenylalanine V V 2. L-(+)-Leucine V V 3. L-(+)-Valine V V 4. DL-Tryptophan V V 5. L-Proline V V 6. 1,2,3,4-Tetrahydro-Î²-carboline-3-carboxylic acid V V 7. DL-Arginine V V 8. DL-Histidine V V 9. L-(-)-Threonine V V 10. DL-Lysine V V 11. Leu-Leu V V 12. Leu-Val V - No. Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi negatif Kontrol Perlakuan 1. (-)-pinellic acid V V 2. icomucret V V 3. (-)-Prostaglandin E1 V V 4. Arachidonic acid V V 5. 8,9-DiHETrE V V 6. DL-Phenylalanine V V 7. 6-Hydroxyhexadecanoic or Juniperic acid V V 8. Leukotriene B4 V V 9. 8,9-DiHETrE V - 10. DL-Tryptophan V - 11. Suberic acid V - 12. N-Acetyl-L-phenylalanine V - 13. (9Z,11E)-(13S)-13-Hydroxyoctadeca9,11-dienoic acid or 13(S)-HODE V V 14. Stearic acid V - 15. Azelaic Acid - V 16. Ricinoleic acid or 12-Hydroxy-9-octadecenoic acid - V 17. Palmitic acid - V Software Compound Discoverer (September, 2021)
Pada  data Tabel  3 kategori  organ  jantung  menunjukkan  bahwa  ada  perbedaan  metabolit  yang teridentifikasi dari sampel kontrol dan perlakuan. Perbedaan tersebut dapat dilihat pada senyawa Leu-Val pada sampel kontrol teridentifikasi tetapi pada sampel perlakuan tidak teridentifikasi pada kategori senyawa positif. Begitu juga pada mode ionisasi negatif dimana senyawa 8,9-DiHETrE, DL-Tryptophan, Suberic acid, N-Acetyl-L-phenylalanine, Stearic acid  pada sampel perlakuan senyawa tersebut tidak teridentifikasi. Azelaic Acid, Ricinoleic acid atau 12-Hydroxy-9-octadecenoic acid, dan Palmitic acid teridentifikasi pada sampel perlakuan tetapi pada sampel kontrol tidak teridentifikasi.
Tabel 4. Perbandingan metabolit sampel kontrol dan perlakuan (P1) organ paru
Paru No. Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi positif Kontrol Perlakuan 1. DL-Phenylalanine V V 2. L-(+)-Leucine V V 3. L-(+)-Valine V V 4. L-Proline V V 5. 1,2,3,4-Tetrahydro-Î²-carboline-3-carboxylic acid V - 6. DL-Arginine V V
Paru No. Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi positif Kontrol Perlakuan 7. L-(-)-methionine V V No. Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi negatif Kontrol Perlakuan 1. (-)-pinellic acid V V 2. icomucret V V 3. (-)-Prostaglandin E1 V V 4. Azelaic acid V - 5. Arachidonic acid V V 6. 8,9-DiHETrE V - 7. 6-Hydroxyhexadecanoic or Juniperic acid V - 8. Leukotriene B4 V - 9. 8,9-DiHETrE V - 10. Suberic acid V - 11. Ricinoleic acid or 12-Hydroxy-9-octadecenoic acid V V 12. Palmitic acid V - 13. N-Palmitoyl-L-phenylalanine - V Software Compound Discoverer (September, 2021)
Pada  data Tabel  4 kategori  organ  paru  menunjukkan  bahwa  ada  perbedaan  metabolit  yang teridentifikasi dari sampel kontrol dan perlakuan. Perbedaan tersebut dapat dilihat pada senyawa 1,2,3,4- Tetrahydro-Î²-carboline-3-carboxylic acid pada sampel kontrol teridentifikasi tetapi pada sampel perlakuan tidak teridentifikasi pada kategori senyawa positif. Begitu juga pada mode ionisasi negatif dimana senyawa 8,9-DiHETrE , 6-Hydroxyhexadecanoic atau Juniperic acid , Leukotriene B4 , 8,9-DiHETrE , Suberic acid , Palmitic acid pada sampel perlakuan senyawa tersebut tidak teridentifikasi. N-Palmitoyl-L-phenylalanine teridentifikasi pada sampel perlakuan tetapi pada sampel kontrol tidak teridentifikasi.
Tabel 5. Perbandingan metabolit sampel kontrol dan perlakuan (P1) organ usus
Usus No.   Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi positif Kontrol Perlakuan 1. DL-Phenylalanine V V 2. L-(+)-Leucine V V 3. L-(+)-Valine V V 4. DL-Tryptophan V V 5. L-Proline V V 1,2,3,4-Tetrahydro-Î²-carboline-3-carboxylic acid V V 6. DL-Arginine V V 7. DL-Histidine - V 8. L-(-)-methionine V V 9. L-(-)-Threonine - V 10. DL-Lysine V V 11. Leu-Leu V V 12. DL-Ornithine V V No. Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi negatif Kontrol Perlakuan 1. (-)-pinellic acid V V 2. icomucret V V 3. (-)-Prostaglandin E1 V V 4. Azelaic acid V - 5. Arachidonic acid V V 6. 8,9-DiHETrE V V 7. DL-Phenylalanine V V 8. 6-Hydroxyhexadecanoic or Juniperic acid V V 9. Leukotriene B4 V V 10. 8,9-DiHETrE V V 11. DL-Tryptophan V V 12. N-Palmitoyl-L-phenylalanine V - 13. Suberic acid V V 14. (+)-castanospermine - V 15. Ricinoleic acid or 12-Hydroxy-9-octadecenoic acid - V 16. Palmitic acid - V Software Compound Discoverer (September, 2021)
Pada  data Tabel  5 kategori  organ  usus  menunjukkan  bahwa  ada  perbedaan  metabolit  yang teridentifikasi  dari  sampel  kontrol  dan  perlakuan.  Perbedaan  tersebut  dapat  dilihat  pada  senyawa DL- Histidine pada  sampel  kontrol  teridentifikasi  tetapi  pada  sampel  perlakuan  tidak  teridentifikasi  pada kategori  senyawa  positif.  Begitu  juga  pada  mode  ionisasi  negatif  dimana  senyawa Azelaic  acid , N- Palmitoyl-L-phenylalanine pada sampel perlakuan senyawa tersebut tidak teridentifikasi. Senyawa (+) - castanospermine, Ricinoleic acid atau 12-Hydroxy-9-octadecenoic acid, dan Palmitic acid teridentifikasi pada sampel perlakuan tetapi pada sampel kontrol tidak teridentifikasi.
Tabel 6. Perbandingan metabolit sampel kontrol dan perlakuan (P1) organ testis
Testis No. Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi positif Kontrol Perlakuan 1. DL-Phenylalanine V V 2. L-(+)-Leucine V V 3. L-(+)-Valine V V 4. L-Proline V V 5. 1,2,3,4-Tetrahydro-Î²-carboline-3-carboxylic acid V - 6. DL-Arginine V V 7. L-(-)-Threonine V - No. Senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi negatif Kontrol Perlakuan 1. (-)-pinellic acid V V 2. icomucret V V 3. 8,9-DiHETrE - V 4. (-)-Prostaglandin E1 V - 5. Suberic acid V - 6. Ricinoleic acid or 12-Hydroxy-9-octadecenoic acid V - 7. Palmitic acid V V
Software Compound Discoverer (September, 2021)
Pada  data Tabel  6 kategori  organ  testis  menunjukkan  bahwa  ada  perbedaan  metabolit  yang teridentifikasi dari sampel kontrol dan perlakuan. Perbedaan tersebut dapat dilihat pada senyawa 1,2,3,4- Tetrahydro-Î²-carboline-3-carboxylic  acid,  dan  L-(-)-Threoninepada  sampel  kontrol  teridentifikasi  tetapi pada sampel perlakuan  tidak teridentifikasi pada kategori senyawa positif. Begitu juga pada mode ionisasi negatif  dimana  senyawa  (-)  Prostaglandin  E1,  Suberic  acid,  Ricinoleic  acid  atau  12-Hydroxy-9- octadecenoic  acid  pada  sampel  perlakuan  senyawa  tersebut  tidak  teridentifikasi.  Senyawa  8,9-DiHETrE teridentifikasi pada sampel perlakuan tetapi pada sampel kontrol tidak teridentifikasi.
Hasil dari analisis menggunakan UHPLC Vanquish Tandem Q Exactive Plus Orbitrap HRMS tidak ditemukan  senyawa  gendarusin  A  pada  sampel  yang  berkode  P1  (perlakuan)  dan  terdapat  perbedaan metabolit yang teridentifikasi baik senyawa yang teridentifikasi pada mode ionisasi positif maupun negatif pada  sampel  yang  berkode  kontrol  dan  perlakuan  (P1).  Sampel  yang  berkode  kontrol  merupakan  organ tikus sehat yang tidak diberikan perlakuan ektrak etanol 70% daun gandarussa, sedangkan sampel berkode perlakuan merupakan sampel organ berasal dari tikus yang diberikan dosis 40 mg/kgBB ektrak etanol 70% daun gandarussa selama 90 hari secara oral.
Dari  hasil  penelitian  ini  terdapat  22  metabolit/senyawa  positif  yang  teridentifikasi  dan  35 metabolit/senyawa. Senyawa positif yang teridentifikasi didominasi kelompok asam amino baik aromatis maupun  essensial.  Senyawa  DL-phenylalanine,  L-(+)-leucine,  L-(+)-valine,  dan  L-proline  merupakan senyawa-senyawa  positif  yang  teridentifikasi  dalam  seluruh  organ.  Sedangkan  senyawa  negatif  yang teridentifikasi  di  dominasi  oleh  golongan  asam  lemak  dan  turunannya.  Senyawa  (-)  -pinellic  acid  dan icomucret merupakan senyawa negatif yang teridentifikasi dalam seluruh organ.
Variasi  keberadaan  senyawa  dalam  sampel  dapat  ditentukan  dengan  analisis  PCA.  Sampel dikelompokkan menurut kategori berdasarkan komposisi kimianya, dimana sampel dengan profil metabolit yang mirip akan dikelompokkan bersama sedangkan sampel dengan profil berbeda akan membentuk grup yang  terpisah.  Dua  komponen  utama  yaitu  PC1  dan  PC2,  menjelaskan  sebagian  besar  varian  yang digunakan dalam analisis tersebut. Dalam penelitian ini, persentase kumulatif dari dua PC yang digunakan adalah 87% dari total varian. Jika persentase kumulatif PC1 dan PC2 lebih besar dari 70%, maka plot skor menawarkan visualisasi dua dimensi yang baik [16].
Hasil identifikasi luas simpul area kromatogram dari masing-masing metabolit yang teridentifikasi dari kontrol dan sampel perlakuan menunjukkan perbedaan. Hal ini ditunjukkan dengan adanya trend naik-
turunnya  kromatogram.  Perbedaan  simpul  area  kromatogram  ini  menjadi  dasar  kuantisasi  data.  Data prosentase  simpul area kromatogram hanya digunakan untuk melihat trend naik-turunnya senyawa yang sama  dalam  sampel  yang  berbeda  khususnya  pada  organ  yang  sama.  Apabila  dilakukan  perhitungan konsentrasi suatu senyawa dengan menggunakan data luas area kromatogram dibutuhkan larutan standar. Berdasarkan pemeriksaan, untuk menghitung konsentrasi sampel maka dibutuhkan informasi terkait luas area  peak  pada  setiap  konsentrasi  standar.  Kemudian  dibuat  kurva  linier  antara  hubungan  konsentrasi dengan luas area absorbansi sehingga dapat ditentukan persamaan untuk mencari konsentrasi pada luas area tertentu.  Luas  area  lebih  baik  digunakan  karena  memiliki  nilai  yang  lebih  stabil  dibandingkan  dengan ketinggian peak . Tetapi ketinggian peak juga dapat digunakan untuk menentukan konsentrasinya [16].

## 4. Kesimpulan
Penggunaan  metode  UHPLC Vanquish  Tandem  Q  Exactive  Plus  Orbitrap HRMS  teridentifikasi terdapat  22  senyawa  dari  mode  ionisasi  positif  dan  35  senyawa  dari  mode  ionisasi  negatif  dari  seluruh sampel daun J usticia gendarussa . Senyawa yang teridentifikasi dari mode ionisasi positif didominasi oleh golongan  asam  amino  dan  senyawa  yang  teridentifikasi  dari  mode  ionisasi  negatif  didominasi  oleh golongan asam lemak dan turunannya. Selanjutnya tidak ditemukan senyawa gendarusin A pada seluruh sampel yang digunakan untuk perlakuan.

## 5. Ucapan Terima Kasih
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ketua Program Magister Ilmu Farmasi Fakultas Farmasi Universitas  Airlangga  atas  segala  dukungan  dan  kepada  para  peneliti  yang  telah  meneliti  tanaman Gandarusa.

## 6. Referensi
[1] Jayani, D. hadya, 2019. 2015-2045: Angka Kematian Terus Naik, Angka Kelahiran Relatif Stabil. [online] Databoks. Available at: <https://databoks.katadata.co.id/datapublish/2019/07/18/2015- 2045-angka-kematian-terus-naik-angka-kelahiran-relatif-stabil>.
[2] R. Ummah, B. P. Ew, and R. Widyowati, “Tinjauan Mini : Kajian Pengendalian Mutu Obat Mentah dari Justicia gendarussa Burm . f . Daun sebagai Kontrasepsi Pria,” Media Pharmaceutica Indonesian, vol. 4, no. 1, pp. 94–104, 2022.
[3] Prajogo BEW, Juliaan F, Hinting A, Pramesti MP, Anggraeni M,  Radjaram A  Musta’ina “Laporan Pelaksanaan Uji Klinik Fase III”. Universitas Airlangga dan Badan Koordinasi Keluarga Berencana Nasional. Surabaya, Indonesia, 2011.
[4] B. Prajogo, “Autentik Tanaman Justicia gendarussa Burm.f. sebagai Bahan Baku Obat Kontrasepsi Pria ”. Surabaya: Airlangga University Press, 2014.
[5] Sherwood L. In: Herman OO, Albertus AM, Dian R editors, “Fisiologi Manusia dari Sel ke Sistem,” Jakarta: ECG, p. 730, 2015.
[6] Guyton, A. C., Hall, J. E., “Buku Ajar Fisiologi Kedokteran Edisi 12,” Jakarta : EGC, 1022, 2014.
[7] M. Mnatsakanyan, E. Queiroz, L. Marcourt, B. Prajogo, and J.-L. Wolfender, “Quantitative Evaluation of Various Preparations and Extracts of the Male Contraceptive Justicia gendarussa and Identification of a New Aminobenzyl Derivative,” Planta Medica Int. Open , vol. 5, no. 01, pp. e30–e38, 2018.
[8] A. Ekaputri, “Studi Toksisitas secara in Silico Kandungan Senyawa Flavonoid dan Alkaloid pada Daun Justicia gendarussa Burm. f.,”. Skripsi. Universitas Airlangga, 2015.
[9] Kusnandar, V.B., n.d., “Nilai dan Pertumbuhan PDB Industri Kimia, Farmasi dan Obat Tradisional” (2010-2021). [online] Databoks. Available at:
<https://databoks.katadata.co.id/datapublish/2022/03/29/industri-kimia-farmasi-dan-obat- tradisional-terus-tumbuh-di-masa-pandemi-covid-19>.
[10] L.  Kanina,  M.  Solehah,  H.  Plumeriastuti,  R.  Widyowati,  and  B.  P.  E.  Wardoyo,  “Acute  and Subchronic Toxicity Assessment of 70% Ethanol Extract of Gendarusa Leaves In Vivo,” J. Farm. Dan Ilmu Kefarmasian Indonesia . , vol. 9, no. 1, pp. 39–47, 2022.
[11] M.  Solehah,  “Profil  Toksistas  Oral  Akut  dan  Subkronis  90  Hari  ekstrak  Etanol  70%  Daun Gandarussa ( Justicia gendarussa Burm. f.).,”. Tesis. Universitas Airlangga, 2018.
[12] S. Y. Lee, H. Y. Kim, Sarah Lee, J. M. Lee, M. J. Muthaiya, B. S. Kim, J. Y. Oh, C.K. Song, E. J. Jeon, H. S. Ryu, C. H. Lee . , “Mass spectrometry-based metabolite profiling and bacterial diversity characterization of Korean traditional meju during fermentation,” J. Microbiol. Biotechnol. , vol. 22, no. 11, pp. 1523–1531, 2012.
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
[13] G.  A.  M.  Ratih,  Imawati  MF,  Purwanti  DI,  Nugroho  RR,  Wongso  S,  Prajogo  B,  Indrayanto  G, “Metabolite profiling of justicia gendarussa herbal drug preparations,” Nat. Prod. Commun. , vol. 14, no. 6, pp. 1–5, 2019.
[14] Sharwan  GP,  Jain,  P.,  Pandey,  R.  and  Shukla,  S.S.,  “Toxicity  Profile  of  Traditional  Herbal Medicine,” Journal of Ayurvedic and Herbal Medicine, 1(3): 81-90, 2015.
[15] Abrori, C., Nurfadhila, K. and Sakinah, E.N., “Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Kemangi ( Ocimumsanctum ) diukur dari Nilai LD50 dan Histopatologi Ginjal,” Journal of Agromedicine and Medical Sciences, 5(1), pp.13–19, 2019.
[16] S. S. Mitić, D. A. Kostić, D. C. Nasković-Dokić, and M. N. Mitic, “Rapid and reliable HPLC method for the determination of vitamin C in pharmaceutical samples,” Trop. J. Pharm. Res. , vol. 10, no. 1, pp. 105–111, 2011.