## Evaluasi Keragaman Genetik Mutan Harapan Generasi MV1 Jeruk Keprok SoE ( Citrus reticulata Blanco)

## Berdasarkan Penanda Morfologi dan ISSR
( Evaluation of Genetic Diversity of Putative Mutant MV1 Generation of Mandarine SoE (Citrus reticulata Blanco) Based on Morphology and ISSR Markers )
Indriati Husain 1 , Agus Purwito 2* , Ali Husni 3 , Kikin H. Mutaqin 4 , dan Slamet Susanto 2
Diterima 21 Maret 2016/Disetujui 06 Juli 2016

## ABSTRACT
Mandarin’s SoE is national variety originated from Mount of Mutis, Sub District of SoE, of Timur Tengah Selatan (TTS) District, East Nusa Tenggara (NTT). The genetic diversity of citrus can be  induced  by  gamma  ray  irradiation  on  embryogenic  callus  cells  thus  producing  new  mutants. Genetic  diversity  detection  can  be  based  on  morphological  and  ISSR  markers.  The  aim  of  this research  was  to  obtain  information  on  the  genetic  diversity  on  putative  mutants  mandarin  SoE induced by gamma ray irradiation based on morphology and markers ISSR. ISSR markers used are ISSR  1,  4,  6  and  8.  Analysis  of  morphological  diversity  produced  a  dendrogram  with  the  level  of similarity  between  individuals  each  irradiation  dose  83-95%  with  5-17%  genetic  distance. Dendrogram analysis based on the genetic diversity ISSR  markers showed high levels of 51-100% similarity and genetic distance 0-49%. Individual  sample  obtained from  gamma irradiation,  based both  morphological  and  ISSR  markers,  was  different  from  individual's  genetic  make  up  before irradiation.
Keywords: cluster, gamma ray, genetic distance, genetic diversitys, similarity

## ABSTRAK
Jeruk keprok SoE adalah jeruk varietas unggul nasional yang berasal dari Pegunungan Mutis, Kecamatan  SoE,  Kabupaten  Timur  Tengah  Selatan  (TTS),  Provinsi  Nusa  Tenggara  Timur  (NTT). Keragaman  genetik  jeruk  ini  dapat  diinduksi  dengan  iradiasi  sinar  gamma  pada  sel-sel  kalus embriogenik  untuk  menghasilkan  mutan  yang  solid.  Deteksi  keragaman  genetik  yang  terbentuk dapat  dilakukan  secara  morfologi  maupun  molekuler  dengan  marka  ISSR.  Tujuan  Penelitian  ini adalah untuk mendapatkan informasi mengenai keragaman genetik yang terjadi pada mutan harapan jeruk keprok SoE  hasil iradiasi sinar gamma berdasarkan morfologi dan marka ISSR.  Marka ISSR yang digunakan adalah ISSR 1, 4, 6 dan 8 pada beberapa mutan harapan jeruk keprok SoE. Analisis keragaman  secara  morfologi  menghasilkan  dendrogram  dengan  tingkat  kemiripan  antar  individu masing-masing dosis iradiasi 83-95% dengan jarak genetik 5-17%. Dendrogram analisis keragaman genetik berdasar marka ISSR memperlihatkan tingkat kemiripan 51-100% dan jarak genetik 0-49%. Individu-individu  sampel  yang  diuji  hasil  iradiasi  gamma,  baik  secara  morfologi  dan  marka  ISSR, telah memiliki susunan genetik yang berbeda dari susunan genetik individu sebelum diiradiasi.
Kata kunci: grup, jarak genetik, kemiripan, keragaman, sinar gamma

## PENDAHULUAN
Jeruk  keprok  SoE  adalah  jeruk  unggul nasional yang berasal dari Pegunungan Mutis,
Kecamatan  SoE,  Kabupaten  Timur  Tengah Selatan (TTS), Provinsi Nusa Tenggara Timur (NTT). Jeruk ini telah dilepas sebagai varietas unggul dengan SK Menteri Pertanian
1 Jurusan Agroteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Negeri Gorontalo, Jl. Jend. Sudirman No.6, Kota Gorontalo, Gorontalo, 96128, Indonesia
2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (Bogor Agricultural University) Jl. Meranti, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680, Indonesia. Telp/ Faks. 62-251-8629353
3 Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian, Jl. Tentara Pelajar No.3A, Bogor 16111, Indonesia
4 Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (Bogor Agricultural University) Jl. Kamper, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680, Indonesia email: apurwito@yahoo.com (*penulis korespondensi)
No.863/Kpts/TP.240/11/98. Jeruk ini memiliki rasa  manis  bercampur  rasa  asam  yang  segar, dan  kulitnya  mudah  dikupas.  Ciri  khas  lain dari  jeruk  ini  adalah  kulit  buah  yang  sudah matang berwarna oranye kemerah-merahan.
Jeruk  memiliki  sistem  reproduksi  yang unik,  yaitu  secara  apomiksis  yaitu  suatu bentuk  reproduksi  melalui  biji  yang  mana embrio  terbentuk  bukan  dari  hasil  peleburan sel telur dan sel spermatozoid tapi dapat terjadi karena:  proses  parthenogenesis  dari  sel  telur yang  tidak  dibuahi,  apogami  dari  sel-sel antipoda  dan  sinergid,  ataupun  dari  embrio adventif  seperti  embrio  nuselar  (Kepiro  dan Roose, 2007; Koltunow et al ., 1995). Tanaman jeruk yang diperoleh melalui reproduksi secara apomiksis ini memiliki sifat yang sama dengan induk  tanamannya  ( true-to-type )  (Khan et  al ., 2007; Setiono dan Supriyanto, 2005). (Koltunow et al ., 1995). Perbanyakan tanaman jeruk  melalui  reproduksi  aseksual  ini  dapat dimanfaatkan  untuk  perbanyakan  tanaman jeruk  yang  memiliki  sifat-sifat  unggul  atau sifat  khas  jeruk  dari  suatu  daerah  atau  sentra tanaman jeruk di wilayah-wilayah tertentu. Kegiatan yang dilakukan dengan tujuan mendapatkan  tanaman  jeruk  yang  unggul atau khas  suatu  daerah  dengan  penambahan  sifat- sifat lain seperti tahan terhadap cekaman biotik ataupun  abiotik  dapat  dilakukan  dengan memanfaatkan metode-metode dalam kegiatan pemuliaan  tanaman.  Metode-metode  dalam kegiatan  pemuliaan  tanaman  dimaksudkan mendapatkan  atau  mengembangkan  varietas- varietas  baru  dari  suatu  tanaman  sehingga menjadi  lebih  baik  dan  menguntungkan  bagi kehidupan  manusia.  Ruang  lingkup  kegiatan pemuliaan  tanaman  meliputi  pembentukan keragaman  genetik  dan  seleksi.  Keragaman genetik  yang  terbentuk  dapat  dimanfaatkan sebagai bahan atau populasi dasar untuk proses pemuliaan  tanaman.  Seleksi  adalah  kegiatan dengan melakukan pengujian-pengujian individu-individu  yang  kualitasnya  unggul sebelum  varietas  baru  dilepas  (Pardal,  2014; Sastrosumarjo et al ., 2006). Evaluasi keragaan terhadap  tiga  varietas  jeruk  keprok  dilakukan dengan  melihat  perubahan  warna  kulit  dari kombinasi  perlakuan Degreening dan  suhu penyimpanan (Muthmainnah et al ., 2014). Peningkatan keragaman genetik tanaman  dapat  dilakukan  melalui  beberapa cara,  seperti,  introduksi,  hibridisasi,  seleksi,
bioteknologi  dan mutasi  (IAEA,  1991; Pardal, 2014;  Satrosumarjo et  al .,  2006).  Keragaman genetik  pada tanaman jeruk keprok  SoE dapat ditingkatkan  dengan  cara  mutasi,  mutasi buatan  atau  mutasi  induksi.  Mutasi  adalah perubahan-perubahan yang terjadi pada susunan  gen/genom  tanaman.  Mutagen  yang paling  sering  digunakan  adalah  sinar  gamma. Sinar gamma memiliki daya tembus yang lebih tinggi sehingga peluang terjadinya mutasi akan lebih  besar  pula.  Iradiasi  gamma  dipaparkan pada  kalus  embriogenik  jeruk  keprok  SoE yang  terdiri  atas  individu-individu  sel  yang jumlahnya  sangat  banyak.  Kalus  embriogenik kemudian  diregenerasikan  hingga  membentuk planlet. Individu-individu planlet  yang berasal dari  proses  regenerasi  individu-individu  sel tersebut  merupakan  mutan  yang  solid,  tidak menghasilkan  mutan  kimera,  karena  berasal dari satu sel tunggal (Mba et al ., 2009).
Evaluasi  keragaman  genetik  dari  mutan harapan  hasil  iradiasi  sinar  gamma  jeruk keprok  SoE  diperlukan  untuk  melihat  ada tidaknya  perubahan  genetik  yang  terjadi  pada susunan  gennya.  Deteksi  adanya  perubahan dalam  susunan  gen  menggunakan  marka molekuler  ISSR  yang  berbasis  PCR.  Marka ISSR  lebih  sesuai  digunakan  untuk  tanaman jeruk,  karena  tidak  dipengaruhi  oleh  musim dan lingkungan (Azrai, 2005), tidak diperlukan data  sekuen  awal  (Guo et  al .,  2009),  hanya membutuhkan  5-50  mg template DNA  per reaksi (Sanjay et al ., 2011), tersebar di seluruh genom,  menghasilkan  pita  polimorfik  sampai pada  tingkat  kultivar,  bersifat  dominan (Kumar, 2009), dapat digunakan untuk analisis keragaman  genetik  dan  analisis  kekerabatan (Yulianti et  al .,  2010).  Dengan  demikian, diharapkan  dari  proses  iradiasi  gamma  pada kalus  embriogenik  jeruk  keprok  SoE  bisa diperoleh  individu-individu  tanaman  yang berbeda dalam susunan genetiknya.
Marka  ISSR  telah  digunakan  dalam penelitian untuk mengetahui kekerabatan jeruk siam  dari  beberapa  sentra  produksi  di Indonesia  (Agisimanto et  al .,  2007),  dan variasi genetik jeruk keprok SoE hasil iradiasi sinar  gamma  generasi  kedua  (Yulianti et  al ., 2010).  Tujuan  penelitian adalah untuk mendapatkan  informasi  mengenai  keragaman genetik yang terjadi pada mutan harapan jeruk keprok  SoE  hasil  iradiasi  sinar  gamma berdasarkan  morfologi  dan  marka  ISSR.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan Tanaman
Bahan  tanaman  yang  digunakan  dalam analisis  keragaman  berdasarkan  morfologi adalah  individu-individu  sampel  uji  kontrol (R0)  dan  individu-individu  mutan  harapan generasi  pertama  MV1  (R65,  R75  dan  R85) dari  masing-masing  perlakuan  dosis  sinar gamma 65, 75 dan 85 Gy yang diambil secara acak,  masing-masing  sebanyak  lima  individu sampel  berupa  planlet  berumur  10  bulan. Planlet  jeruk  keprok  SoE  yang  digunakan berasal dari kalus embriogenik hasil regenerasi melalui  proses  embriogenesis  somatik  tidak langsung ( indirect somatic embryogenesis ).
Bahan  tanaman  yang  digunakan  untuk analisis  keragaman  genetik  berdasar  marka ISSR  adalah  daun  dari  lima  belas  individu sampel  uji  yang  terdiri  atas  lima  sampel kontrol  dan  sepuluh  sampel  mutan  harapan generasi  pertama  MV1  yang  diambil  secara acak  dan  mewakili  setiap  dosis  sinar  gamma (65,  75  dan  85  Gy)  berumur  8  bulan  setelah aklimatisasi.
Buffer-buffer isolasi DNA [Cetyl trimethyl  ammonium  bromide  (CTAB)  2%, Kloroform-isoamilalkohol  (CIA),  propan-2-ol (isopropanol), etanol 70%], agarose Invitrogen, TAE  1x,  TAE  2x,  loading  dye,  GelRed,  dan Primer  ISSR  seperti  yang  tercantum  dalam Tabel 1.

## Iradiasi  Sinar  Gamma  terhadap  Kalus Embriogenik Jeruk Keprok SoE
Induksi  mutasi  dengan  sinar  gamma diterapkan  pada  kalus  embriogenik  jeruk keprok SoE dengan dosis 75 Gy dan dua dosis tambahan 65 dan 85 Gy. Dosis 75 Gy dipakai berdasarkan dosis iradiasi gamma LD 50 (75.31 Gray)  dari  hasil  penelitian  Karyanti  (2013); Karyanti et  al. (2015)  sebelumnya.  Kalus
embriogenik kemudian diregenerasikan melalui proses embriogenesis somatik
membentuk  planlet  lengkap  dengan  daun  dan akar.

## Analisis  Keragaman  Genetik  Berdasarkan Morfologi
Pengamatan  sifat  morfologi  dilakukan terhadap  karakter-karakter  kualitatif  seperti bentuk  batang,  warna  batang,  bentuk  daun, warna  daun,  bentuk  tepi  daun,  ketegakan tunas,  dan  bentuk  stomata.  Individu-individu sampel  yang  diamati  diambil  secara  acak berupa  individu-individu  planlet  kontrol  R0 sebanyak  lima  individu  planlet  dan  mutan harapan  generasi  MV1  (hasil  iradiasi  gamma 65,  75  dan  85  Gy)  masing-masing  lima individu planlet.
Skoring  penanda  morfologi  dilakukan terhadap  beberapa  karakter  morfologi  yang pengamatannya  diasumsikan  setara  dengan jenis  primer  pada  penanda  molekuler.  Sub karakter setara dengan lokus pita pada penanda molekuler.  Data  karakter  morfologi  tersebut diubah  menjadi  data  biner  dengan  skoring  1 atau  0.  Apabila  karakter  morfologi  tidak dimiliki  oleh  planlet  maka  diberi  nilai  skor  0, sedangkan  apabila  planlet  memiliki  karakter yang  diamati  maka  diberikan  nilai  skor  1. Analisis stomata menggunakan metode analisis  stomata  sediaan  preparat  segar menurut Mulyono (2011).

## Analisis  Keragaman  Genetik  Berdasarkan Penanda Molekuler
Kegiatan  dalam  analisis  keragaman genetik berdasarkan penanda molekuler dilakukan  berturut-turut  proses  isolasi  DNA, amplifikasi DNA template dengan teknik PCR, pemisahan  pita-pita  DNA  dengan  metode elektroforesis dan visualisasi gel hasil elektroforesis dan dokumentasi.
Tabel 1. Nama primer, sekuen, ukuran sekuen dan suhu penempelan primer untuk jenis primer ISSR.
Nama Primer Sekuen Suhu Annealing ( 0 C) ISSR 1 5’AACACACACACACACA-3’ 53 ISSR 4 5‘TAATCCTCCTCCTCCTCC-3’ 53 ISSR 6 5’CGTTCCTCCTCCTCCTCC-3’ 53 ISSR 8 5’-AGAGAGAGAGAGAGAGTC-3’ 53
Sumber: Karyanti (2013)
Isolasi DNA total tanaman menggunakan Metode CTAB yang dimodifikasi (Ardiana, 2009) dengan penambahan  β-Mercaptoetanol  0.2%.  Daun sampel  tanaman  ditimbang  sebanyak  1.0-10 mg.  Sampel  digerus  sampai  halus  bersama buffer  CTAB  1000  µL  menggunakan  mortar dan  pistil.  Setelah  halus,  suspensi  sampel dimasukkan dalam tabung mikro ukuran 2 mL dan  diinkubasi  dalam  waterbath  dengan  suhu 65 0 C selama 1 jam, bolak-balik tabung mikro setiap 10 menit. Suspensi kemudian diinkubasi pada  suhu  ruang  selama  10  menit  dan ditambahkan  Kloroform-Isoamilalkohol  (CIA) (24:1) sebanyak 800 µL. Suspensi disentrifuse pada  suhu  4 0 C,  kecepatan  12000  rpm  selama 10 menit.  Lapisan epifase (supernatan) bagian atas  campuran  yang  telah  berpisah,  diambil sebanyak  700  µL  dan  dipindahkan  ke  tabung mikro  ukuran  1.5  mL  yang  baru.  Propan-2-ol (isopropanol)  ditambahkan  sebanyak  satu  kali volume epifase yang diambil tadi dan dibolak- balik  perlahan  selama  10  menit.  Suspensi diinkubasi dalam lemari es suhu -20 0 C selama 10-20  menit  dan  disentrifuse  pada  suhu  4 0 C, kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Setelah suspensi  disentrifuse,  buang  supernatan  dan pelet  DNA  berada  pada  dasar  tabung  mikro. Pelet  DNA  dicuci  dengan  menambahkan etanol 70% sebanyak 200 µL, lalu disentrifuse pada suhu 4 0 C, kecepatan 12000 rpm selama 5 menit dan supernatan dibuang. Pelet kemudian dikeringanginkan  selama  1  jam  pada  suhu ruangan dengan memiringkan tabung mikro di atas  lembaran  tisu.  Pelet  yang  telah  kering diresuspensi  dengan  TE  1x  sebanyak  100  µL dan  disimpan  pada  suhu  -20 0 C.  DNA  total yang  telah  diperoleh  dari  proses  ekstraksi  dan isolasi  DNA  dilakukan  pengujian  terhadap kualitas  maupun  kuantitas  DNA  dengan menggunakan Teknik Nanodrop.
Amplifikasi  DNA  menggunakan  mesin
Thermal  Cycler  AB9600.  Campuran  PCR setengah  reaksi  total  12.5  µL  terdiri  dari  6.25 µL  PCR  ready  mix  Kappa  BioSystems,  2.25 µL ddH 2 O, 2 µL primer ISSR dan 2 µL DNA template.  Kondisi  PCR  untuk  sampel-sampel dengan primer ISSR, proses amplifikasi terdiri atas:  satu  siklus  denaturasi  95 0 C  selama  3 menit,  dilanjutkan  dengan  40  siklus  yang terdiri  atas  proses  denaturasi  95 0 C,  15  detik, annealing 53 0 C, 15 detik, dan elongasi 72 0 C, 2 detik, dan satu siklus pemanjangan akhir 72 0 C
selama 10 menit dan pendinginan pada suhu 4 0 C selama 5 menit.
Sampel-sampel hasil PCR hasil amplifikasi  dengan  primer  ISSR,  masing- masing  dilakukan  pemisahan  pita-pita  DNA dengan  Metode  Elektroforesis  pada  gel agarose konsentrasi 1.5% yang telah dicampur dengan GelRed untuk pewarnaan DNA dengan kekuatan arus listrik 75 Volt selama 30 menit. Setelah  itu,  gel  hasil  elektroforesis  diletakkan di  atas  UV  transiluminator  dan  difoto  untuk dokumentasi dengan kamera digital.
Pengamatan  pada  deteksi  molekuler dengan  marka  ISSR  dilakukan  terhadap  pola pita  hasil  elektroforesis.  Skoring  pita  DNA dilakukan  berdasarkan  keberadaan  pita  DNA pada  setiap  sampel  tanaman.  Pita-pita  DNA yang  terbentuk  dari  hasil  analisis  marka molekuler dianggap sebagai satu karakter yang mewakili  satu  lokus  DNA.  Pengamatan ditujukan  pada  pola  pita  dengan  jarak  migrasi yang sama. Pita-pita DNA dengan laju migrasi yang  sama  diasumsikan  sebagai  lokus  yang homolog.  Apabila  pada  jarak  migrasi  yang sama  tidak  terdapat  pita,  maka  diberikan  nilai skor 0. Sebaliknya, apabila pada jarak migrasi tersebut  terdapat  pita,  maka  diberikan  nilai skor 1.

## Analisis  Data  Morfologi  dan  Penanda Molekuler
Analisis  data  morfologi  dan  penanda molekuler ISSR untuk melihat tingkat (koefisien)  kemiripan,  pengelompokkan  dan penyajian dalam bentuk dendrogram digunakan  program  NTSys.  Jarak  genetik dihitung  berdasarkan  rumus  Koefisien  Dice (Bustaman  dan  Mahrup,  2003).  Rumus koefisien  Dice  untuk  menghitung  jarak genetik: D = 1 – S.S: Similarity (kemiripan).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Evaluasi  Keragaman  Genetik  Berdasar Morfologi  pada  Mutan  Harapan  Generasi MV1 Jeruk Keprok SoE
Berdasarkan  dendrogram  (Gambar  2) yang  diolah  dari  hasil  skoring  karakter kualitatif  sifat  morfologi  individu-individu planlet  jeruk  keprok  SoE  kontrol  dan  mutan harapan  MV1  (Tabel  2)  memperlihatkan bahwa karakter kualitatif dari individu kontrol
R0 (tanpa iradiasi gamma) sekelompok dengan individu  mutan  harapan  R65.  Individu  mutan harapan R75 dan R85 masing-masing mengelompok  sendiri.  Koefisien  (tingkat) kemiripan antara individu-individu  kontrol  R0 dan  mutan  harapan  MV1  tersebut  adalah  83- 95%,  dengan  jarak  genetik  0-17%.  Individu- individu R75 telah berbeda susunan genetiknya  dari  individu-individu  kontrol  R0 dan mutan harapan R65, demikian pula dengan individu-individu mutan harapan R85. Penelitian  Karyanti et  al. (2015)  melaporkan bahwa  pada  jeruk  keprok  Garut  menghasilkan keragaman  0-58%  pada  sifat-sifat  kualitatif menggunakan  penanda  morfologi  dengan kisaran dosis iradiasi gamma 0-100 Gray.
Tabel 2 memperlihatkan karakter kualitatif  yang  dapat  diamati  dalam  sifat morfologi  individu  planlet  mutan  harapan jeruk  keprok  SoE  adalah  bentuk  batang  (pada perolehan  pencahayaan  yang  sama),  warna batang,  bentuk  daun,  warna  daun,  bentuk  tepi daun, pertegakkan tunas, dan bentuk stomata.
Bentuk batang individu-individu kontrol R0  dan  mutan  harapan  R65,  R75  dan  R85 yang  dapat  diamati  adalah  lurus  dan melengkung. Bentuk batang yang melengkung bukan  karena  pengaruh  kurang  atau  tidak adanya  cahaya,  karena  kuantitas  cahaya  yang diperoleh  adalah  sama.  Perbedaan  bentuk batang  di  antara  individu-individu  tersebut
adalah  pada  persentase  jumlah  batang  lurus dan  melengkung.  Individu-individu  R0  lebih banyak didapati bentuk batang yang melengkung  sebesar  80%,  individu  mutan harapan R65 lebih banyak bentuk batang lurus (80%).  Individu  mutan  harapan  R75  lebih banyak  bentuk  batang  melengkung  (60%), perbandingan  jumlah  antara  bentuk  batang lurus  dan  melengkung  mendekati  50:50. Individu  mutan  harapan  R85  memiliki  bentuk batang  sama  dengan  individu  mutan  harapan R65,  lebih  banyak  yang  lurus  (80%)  tapi batangnya  pendek-pendek.  Karakter  warna batang, pada umumnya warna batang individu planlet  kontrol  dan  mutan  harapan  R65,  R75 adalah  hijau,  kecuali  warna  batang  dari individu-individu  mutan  harapan  R85,  selain hijau  teramati  juga  hijau  muda.  Karakter bentuk  daun  yang  dominan  teramati  pada individu-individu  kontrol  maupun  mutan harapan MV1 adalah bentuk elliptic , sedangkan  individu  mutan  harapan  R75  dan R85  memiliki  dua  bentuk  daun  lain  yaitu obovate  untuk  individu  R75  dan  obcordate untuk R85. Karakter warna daun pada individu kontrol  R0  dan  mutan  harapan  R65  adalah sama  hijau  tua,  individu  mutan  harapan  R75 warna daun yang teramati adalah hijau tua dan hijau  muda,  sedangkan  warna  daun  individu mutan  harapan  R85  adalah  hijau  dan  hijau muda.
Tabel 2. Karakter kualitatif sifat morfologi planlet calon mutan jeruk keprok SoE hasil iradiasi sinar gamma.
Keterangan: (*) dominan diamati
Individu- individu Planlet
Bentuk Batang (%) Warna Batang Bentuk Daun Warna Daun Tepi Daun Ketegakan Tunas Bentuk Stomata R0 Lurus 20 Hijau Elliptic* Hijau tua Rata Tegak Lonjong Melengkung 80 Tidak rata Tidak tegak R65 Lurus 80 Hijau Elliptic* Hijau tua Rata Tegak Lonjong Melengkung 20 Tidak rata Tidak tegak R75 Lurus 40 Hijau Elliptic* Hijau tua Tidak rata Tegak Lonjong Melengkung 60 Obovate* Hijau muda Tidak tegak R85 Lurus 80 Hijau Eliptic* Hijau Tidak rata Tegak Lonjong Melengkung  20 Hijau muda Obcordate* Hijau muda
Gambar  1.  Dendrogram  analisis  keragaman  genetik  berdasar  morfologi  mutan  harapan  generasi MV1 jeruk keprok SoE.
Gambar 2. Pola pita-pola pita hasil elektroforesis produk PCR 15 individu sampel uji jeruk keprok menggunakan penanda: A) ISSR 1, B) ISSR 4, C) ISSR 6, dan D) ISSR 8. M: 1 kb
Sifat  warna  daun  individu  mutan harapan R75 memiliki  warna daun yang sama pada individu kontrol R0, mutan harapan R65 dan R85 yaitu hijau tua dan hijau muda, warna asli  dan  warna  baru  mutan  harapan.  Karakter bentuk  tepi  daun,  untuk  individu  kontrol  R0
teramati  rata  dan  tidak  rata,  sama  dengan individu  mutan  harapan  R65,  sedangkan individu  mutan  harapan  R75  dan  R85  sama diamati  bentuk  tepi  daun  yang  tidak  rata. Untuk  karakter  ketegakan  tunas,  individu kontrol  R0,  mutan  harapan  R65  dan  R75
adalah sama, diamati ada yang tegak dan tidak tegak.  Individu  mutan  harapan  R85  kondisi batang  semua  tegak.  Untuk  karakter  bentuk stomata,  semua  individu  kontrol  R0  maupun mutan  harapan  R65,  R75,  dan  R85  adalah sama-sama lonjong.

## Evaluasi  Keragaman  Genetik  Berdasar
Marka  ISSR  Putatif  Mutan  Jeruk  Keprok SoE
Pola  pita-pola  pita  yang  diperoleh  dari hasil  elektroforesis  15  sampel  produk  PCR setelah  diskoring  dan  dianalisis  dengan menggunakan  Software  NTSys  menghasilkan pola  pita  yang  beragam  (polimorfik)  (Gambar 2).  Pola  pita-pola  pita  yang  berbeda  tersebut menunjukkan  perbedaan  susunan  genetik  dari setiap  sampel  uji.  Hasil  pengolahan  skoring pola  pita  dengan  Software  NTSys  berupa dendrogram Gambar 3.
Berdasarkan  dendrogram  pada  Gambar 3 koefisien (tingkat) kemiripan sampel-sampel yang  diuji  adalah  52-100%,  dengan  jarak genetik  0-48%.  Pada  tingkat  kemiripan  80% terbentuk  4  kelompok  individu  sampel  uji dengan tingkat kemiripan yang sama. Individu-individu  mutan  harapan  75a,  75c 90%  mirip  dengan  individu-individu  0b,  0p dan  mutan  harapan  75h,  dan  50%  mirip dengan  individu  75k,  sehingga  75k  dapat dikelompokkan  sendiri  karena  memiliki  jarak genetik yang lebih besar. Pada grup 3, individu 0c  90%  mirip  dengan  0d  dan  85a.  Dua  grup
kecil tersebut 87% mirip dengan individu 65.4. Pada  grup  4,  individu  0e  90%  mirip  dengan individu  mutan  harapan  75b,  dan  keduanya mirip  85%  dengan  individu-individu  mutan harapan 75g dan 85b.
Individu-individu sampel kontrol 0b-0p, 0c-0d,  dan  0e  berdasarkan  dendrogram Gambar 3 berada pada grup-grup yang berbeda menunjukkan bahwa
individu-individu tersebut  telah  berbeda  secara  genetik.  Hal tersebut  dapat  terjadi  akibat  pengaruh  dari mutasi  titik  ( point  mutation )  ataupun  mutasi diam  ( silent  mutation ).  Mutasi  titik  ataupun mutasi  diam  hanya  mengubah  satu  pasangan basa nukleotida tanpa menyebabkan perubahan atau  penggantian  jenis  asam  amino  yang dihasilkan  atau  dikodekan  dari  posisi  tiga kodon  (Sastrosumarjo et  al .,  2006).  Kedua jenis  mutasi  tersebut  dapat  dideteksi  secara genetik  tapi  secara  fenotipik  yang  teramati pada  sifat  morfologi  karakter  kualitatif  adalah sama.
Perubahan-perubahan susunan yang terjadi  pada  individu-individu  sampel  kontrol R0  yang  terdeteksi  secara  molekuler  dapat disebabkan  oleh  faktor-faktor  yang  berasal proses kultur in vitro . Faktor-faktor yang dapat menyebabkan terjadinya keragaman somaklonal dalam  proses  kultur in  vitro tersebut,  seperti: penambahan  zat  pengatur  tumbuh  dari golongan  auksin  dan  sitokinin,  frekuensi  sub kultur,  dan  periode  (lama)  kultur  (Yulianti et al ., 2012).
Gambar 3. Dendrogram analisis keragaman genetik dari sampel kontrol (0b, 0c, 0d, 0e, 0p), sampel mutan harapan generasi MV1 jeruk keprok SoE (65a, 65.4, 75a, 75b, 75c, 75g, 75h, 75k, 85a, dan 85b ) berdasar marka ISSR 1, 4, 6 dan 8.

## KESIMPULAN
Keragaman  genetik  yang  terjadi  pada tanaman  jeruk  keprok  SoE  yang  disebabkan oleh  iradiasi  gamma  dapat  dideteksi  baik secara  morfologi  maupun  dengan  marka molekuler  ISSR.  Analisis  keragaman  genetik berdasarkan  morfologi  dan  marka  molekuler ISSR  1,  4,  6  dan  8  memperlihatkan  telah terjadinya  perbedaan  susunan  genetik  antar individu  sampel  R75  dan  R85  mutan  harapan generasi MV1 hasil iradiasi pada dosis iradiasi
75  dan  85  Gray  pada  bahan  awal.  Perbedaan genetik  yang  terjadi  pada  individu  sampel kontrol  R0  dan  mutan  harapan  generasi  MV1 R65 yang terdeteksi secara molekuler berbeda, tapi  secara  morfologi  tidak  berbeda,  diduga karena  terjadinya  proses diplontic  selection ataupun mutasi diam ( silent mutation ).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  penulis  ucapkan  kepada Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi  (Kemenristekdikti)  dan  Lembaga Penelitian  dan  Pengabdian  pada  Masyarakat (LPPM)  Universitas  Negeri  Gorontalo  (UNG) atas  dana  Hibah  Penelitian  Disertasi  Doktor (PDD),  staf  di  Lembaga  Penelitian  (Lemlit) Universitas  Negeri  Gorontalo  (UNG),  Ketua dan Sekretaris Lembaga Penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Agisimanto,  D.,  C.  Martasari,  A.  Supriyanto. 2007.  Perbedaan  primer  RAPD  dan ISSR  dalam  identifikasi  hubungan kekerabatan  genetik  jeruk  Siam  ( Citrus suhuniensis L.  Tan)  Indonesia.  J.  Hort. 17(2): 101-110.
Ardiana,  D.W.  2009.  Teknik  isolasi  DNA genom  tanaman  pepaya  dan  jeruk dengan  mengunakan  modifikasi  bufer CTAB. Bul. Tek Pert. 14(1): 12-16.
Azrai, M. 2005. Pemanfaatan marka molekuler dalam proses seleksi pemuliaan
tanaman. J. AgroBiogen. 1: 26-37. Bustaman,  M.  Mahrup.  2003.  Panduan Pengoperasian Program Numerical
Taxonomy  System  (NTSYS-pc)  Versi 1.8 dan WinBoot untuk Analisis Klaster.
Balai  Penelitian  Bioteknologi  dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Bogor.
Guo, H.B., K.Y. Huang, T.S. Zhou, Q.H. Wu, Y.J.  Zhang,  Z.S.  Lang.  2009.  DNA isolation,  optimization  of  ISSR-PCR system  and  primers  screening  of Scutellaria  baicalensis .  J.  Med.  Plant.
Res. 3: 898-901.
[IAEA]  International  Atomic  Energy  Agency. 1991.  Induced  Mutations  and  In  Vitro Culture Techniques for Improving Crop Plant Resistance  to  Diseases.  Grunbach Germany.
Karyanti.  2013.  Induksi  keragaman  kalus embriogenik  untuk  mendapatkan  mutan putatif  jeruk  Keprok,  Garut  ( Citrus reticulata L.)  melalui  iradiasi  sinar gamma.  [Tesis].  Institut  Pertanian Bogor. Bogor.
Karyanti,  A.  Purwito,  A.  Husni.  2015. Radiosensitivitas  dan  seleksi  mutan putatif  jeruk  keprok  Garut  ( Citrus reticulata L.)  berdasarkan  penanda morfologi.  J.  Agron.  Indonesia.  43(2): 126-132.
Kepiro,  J.L.,  M.L.  Roose.  2007.  Nucellar embryony. In I.A.  Khan  (Ed).  Citrus Genetics,  Breeding  and  Biotechnology. (Ed). London: CAB International.
Khan,  I.A.,  W.J.  Kender.  2007.  Citrus, Genetics,  Breeding  and  Biotechnology. CAB International. London.
Koltunow,  A.M.,  K.  Soltys,  N.  Nito,  S. McClure.  1995.  Anther,  ovule,  seed, and  nucellar  embryo  development  in Citrus  sinensis cv.  Valencia.  Can.  J.
Bot. 73: 1567-1582.
Kumar, P. 2009. Potential of molecular marker in  plant  biotechnology.  Plant  Omics  J.
2: 141-162.
Mba,  C.,  R.  Afza,  J.  Jankowicz-Cieslak,  S. Bado,  M.  Matijevic,  O.  Huynh,  B.J. Till.  2009.  Enhancing  genetic  diversity
through induced mutagenesis in vegetatively  propagated  plants. In Q.Y. Shu  (Ed).  Induced  Plant  Mutations  in Genomics  Era.  Rome:  Food  and
Agriculture  Organization  of  the  United Nations. Mulyono.  2011.  Pengantar  Laboratorium Mikroteknik: Teknik Pembuatan Preparat  Segar  Stomata.  Departemen
Agronomi  dan  Hortikultura,  Institut
Pertanian Bogor. Bogor.
Muthmainnah,  H.,  R.  Poerwanto,  D.  Efendi. 2014.  Perubahan  warna  kulit  buah  tiga varietas  jeruk  keprok  dengan  perlakuan degreening dan  suhu  penyimpanan.  J. Hort. Indonesia. 5(1): 10-20.
Pardal,  S.J.  2014.  Teknik  Mutasi  untuk Pemuliaan Tanaman. In Artikel Litbang Pertanian. Jakarta: BB. Biogen.
Sanjay,  L.S.,  K.N.  Mistry,  S.D.  Shah,  R. Thaker,  P.B.  Vaidya.  2011.  Genetic diversity assessment in nine cultivars of Catharanthus  roseus from  Central Gujarat  (India)  through  RAPD,  ISSR,
and  SSR  markers.  J.  Res.  Biol.  8:  667- 675.
Sastrosumarjo,  S.,  Yudiwanti,  S.I.  Aisyah,  S.
Sujiprihati,  M.  Syukur,  R.  Yunianti. 2006.  Sitogenetika  Tanaman.  Bagian Genetika  dan  Pemuliaan  Tanaman. Departemen Agronomi dan Hortikultura. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Setiono,  A.  Supriyanto.  2005.  Poliembrional dan  seleksi  semaian  vegetatif  pada pembibitan  jeruk.  Citrusindo,  Citrus Indonesia. Vol. 3.05.
Yulianti,  F.,  N.F.  Devy,  S.  Widyaningsih. 2012.  Evaluasi  variasi  somaklonal pada  benih  jeruk  hasil  perbanyakan melalui  embriogenesis  somatik.  J. Hort. 22(3): 210-216.
Yulianti,  F.,  C.  Martasari,  Karsinah,  T. Hartanto.  2010.  Variasi  genetik  jeruk Keprok SoE ( Citrus reticulata
Blanco)  hasil  radiasi  sinar  gamma menggunakan  penanda  ISSR.  Buletin Plasma Nutfah. 16(2): 134-139.