## RESPON PERTUMBUHAN EKSPLAN BIJI LIMAU KUIT DENGAN PENAMBAHAN HORMON IBA DAN BAP SECARA IN VITRO
Respon of Growth Limau Kuit Explant with Arranger IBA and BAP Hormone By Tissue Culture
Heri Kurniawan, Eny Dwi Pujawati, dan Adistina Fitriani Program Studi Kehutanan Fakultas Kehutanan Universitas Lambung Mangkurat
ABSTRACT. This research purposes to determine seed  growth of limau kuit  explant by tissue culture  with  arranger  growth  IBA  and  BAP.  This  research  is  expected  to  give  advantage  for alternative supply limau kuit seeding by tisuue culture and give scientific information for develop best  quality  limau  kuit  seedling.  Data  collection  and  this  research  from  weekly  observations limau  kuit  explant.  The  results  of  the  study S showed  that  the e combination  treatment  of concentration with h the addition  of ZPT  in the form of IBA and  BAP  gave  a visible response to the  concentration  of  treatment  A  with  the  addition  of  IBA  and  BAP  hormones  of  0.5  Ppm  and treatment  of  B  with  the  addition  of  the  hormones  IBA  and  BAP  respectively  1  Ppm  is  more stimulating to the formation of shoots in  limau kuit seeds while in treatment C with the addition of  the  hormones  IBA  and  BAP  respectively  as  much  as  2  Ppm  and  Treatment  D  with  the addition of IBA and BAP hormones as much as 4 Ppm each stimulates root growth. Based on all the experiments from the observed data, there were 15 explants that experienced new organ growth and 2 explants that formed a small callus after being observed for 8 weeks.

## Keywords: explan; growth regulating agent; Limau kuit
ABSTRAK . Penelitian n ini bertujuan untuk mengetahui Respon s pertumbuhan eksplan biji limau kuit  yang  ditumbuhkan  secara  kultur  jaringan  dengan  penambahan  zat  pengatur  tumbuh  IBA dan  BAP . Penelitian a ini  diharapkan  dapat  memberikan , manfaat  sebagai  salah  satu alternatif f penyediaan  bibit  limau  kuit  dengan  cara in  vitro dan  sumber  informasi  ilmiah  dalam rangka  pengembangan  tanaman  limau  kuit  agar  bisa  menghasilkan  bibit  berkualitas. Pengumpulan  data  dalam  penelitian  ini  meliputi  data  hasil  pengamatan  mingguan perkembangan  eksplan  biji  limau  kuit.  Hasil  dari  penelitian  menunjukkan  bahwa  perlakuan kombinasi  konsentrasi  dengan  penambahan  ZPT  berupa  IBA  dan  BAP  memberikan  respon yang terlihat pada konsentrasi perlakuan A dengan penambahan hormon IBA dan BAP masing- masing  sebanyak  0,5  ppm  dan  perlakuan  B  dengan  penambahan  hormon  IBA  dan  BAP masing-masing  sebanyak  1  ppm  lebih  memacu  ke  pembentukan  tunas  pada  eksplan sedangkan  pada  perlakuan  C  dengan  penambahan  hormon  IBA  dan  BAP  masing-masing sebanyak 2 ppm dan perlakuan D dengan  penambahan hormon IBA dan  BAP  masing-masing sebanyak 4 ppm lebih memacu ke pertumbuhan akar. Berdasarkan semua percobaan dari data yang  diamati  diperoleh  15  eksplan  yang  mengalami  pertumbuhan  organ  baru  dan  2  eksplan yang membentuk kalus berukuran kecil setelah 8 minggu penanaman.
Kata kunci : eksplan; Zat pengatur Tumbuh; Limau kuit
Penulis untuk korespondensi :Surel: Heryarsenal68@gmail.com
PENDAHULUAN S
Keanekaragaman vegetasi - yang
tumbuh h dan n berkembang  di  setiap  daerah memiliki perbedaan n vegetasi tertentu yang g dipengaruhi  oleh h tipe  iklim m kawasan, tinggi h tempat dan faktor r lingkungan tumbuhan lainnya.  Lebih h dari 25% jenis buah-buahan s tropis yang tumbuh merupakan    aset  keanekaragamanan  jenis buah-buahan m yang  tumbuh  dan  hidup
diIndonesia,  sehingga  Indonesia  dapat disebut t sebagai pusat
plasma a nutfah (Purnomo, p dkk ., . 2001).
Limau kuit ( Citrus hystrix DC) merupakan jenis  jeruk  khas  Kalimantan  Selatan.  Limau kuit  populer  di  masyarakat  Banjar  di Kalimantan  Selatan  dalam  dunia  kuliner sebagai  penyedap  rasa  dan  bumbu  dapur. Limau  ini  diambil  perasan  buahnya  seperti penggunaan  jeruk  nipis  ( Citrus aurantifolia ) sebagai penyedap rasa khas untuk beberapa  makanan  daerah,  seperti  Soto
Banjar,  Rawon, Tanak  Haruan (masakan santan  ikan  gabus  asin), Paliat (masakan santan  ikan  segar),  dan  lain-lain.  Selain  itu diambil  isi  buahnya  kemudian  di uleg untuk campuran  sambal  terasi  akan  memberikan rasa  unik  limau kuit.  Kajian  pustaka  tentang penelitian  limau  kuit  belum  memberikan informasi  yang  banyak.  Informasi-informasi yang  diperoleh  lebih  mengarah  pada  jenis jeruk purut ( Citrus hystrix DC).
Kultur  jaringan  adalah  teknik i budidaya berbagai  bagian d tanaman,  seperti o organ, jaringan,  sel,  kelompok  sel  dan  protoplas, yang dilakukan s secara in v vitro (Suryowinoto M.  1991).  Budidaya in  vitro merupakan suatu metode perbanyakan vegetatif dengan cara  mengambil  sebagian  kecil  tanaman baik  dari  vegetatif  maupun  generatif  dan menanamnya  pada  medium  buatan  secara aseptis.  Melalui  budidaya  secara in  vitro dapat t diperoleh . tanaman dengan n jumlah
yang banyak dengan umur dan sifatnya . seragam  serta  waktu  yang  singkat. Untuk itulah perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui  respon p pertumbuhan  eksplan biji  limau  kuit  melalui  kultur  jaringan. Penelitian yang dilakukan
adalah
menginduksi  pembentukan  kalus  dengan menanam  eksplan  biji  limau  kuit  dengan medium  pupuk  gandasil  D  dengan  glukosa 30  gr/l  dan  zat t pengatur  tumbuh  IBA dan n BAP.
Kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila  syarat  yang  diperlukan  terpenuhi. Salah satu syarat yang menunjang keberhasilan kultur jaringan adalah penggunaan zat pengatur tumbuh (Koestiati, 1995).  Penambahan  zat  pengatur  tumbuh pada media k kultur r merupakan kunci keberhasilan  baik  pada  tahap  induksi maupun elongasi t tunas (Sukmadjaja dan . Mariska,  2003).  Beberapa  zat  pengatur tumbuh h yang sering g digunakan diantaranya r adalah  sitokinin  dan  auksin. Sitokinin s berperan  dalam  pembelahan  sel dan  inisiasi t tunas  (Kyte  dan  Kleyn,  1996). Menurut p Pratiwi  (2007)  penggunaan  zat pengatur  tumbuh  sebaiknya  pada  selang konsentrasi  rendah,  karena  penggunaan konsentrasi sampai 5 ppm akan berpengaruh  negatif  terhadap  pertumbuhan eksplan biji limau kuit.
Limau  kuit  dapat  tumbuh  baik  di  tanah yang  lembab  sampai  di  pegunungan. Tanaman  ini  mulai  jarang  ditanam  oleh masyarakat sekarang. Berdasarkan informasi  yang  diketahui  tanaman  yang  ada sekarang umumnya merupakan peninggalan
dari orang tua terdahulu, sehingga ketersediaan  tanaman  dan  buah  sangat terbatas. Buah
limau kuit biasa diperdagangkan  secara  musiman  di  pasar- pasar  tradisional.  Buah  limau  kuit  tidak setiap  saat  ada  di  pasaran  karena tanaman ini  hanya  berbuah  lebat  satu  kali  dalam setahun. Di bulan-bulan diantaranya terdapat  buah  sela  namun  jumlahnya  tidak banyak dan ukurannya relatif kecil. Mengingat limau kuit banyak dicari masyarakat  sebagai  bahan  kuliner  maka perlu diusahakan penyediaan bibit limau kuit untuk  dikebunkan  atau  ditanam  ditempat yang cocok untuk tanaman tersebut.
Salah  satu  alternatif  untuk  pengadaan bibit  tanaman  limau  kuit  adalah  melalui kultur  jaringan  untuk  mendapatkan  jumlah yang  banyak , dan  memiliki  sifat  seragam dengan kualitas  yang baik serta waktu yang singkat  untuk  dipanen.  Bibit  tanaman  limau kuit  diharuskan  berasal  dari  tanaman  alam yang  mampu  menghasilkan  buah  yang memiliki kualitas yang baik.

## METODE E PENELITIAN
Tempat , dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium m Kultur  Jaringan / UPT  Balai Benih  Tanaman  Pangan  Dan  Hortikultura Banjarbaru  Kalimantan  Selatan,  dengan waktu  yang  diperlukan  kurang  lebih  ±  4 bulan meliputi persiapan,  pelaksanaan penelitian, pengolahan data dan penyusunan laporan.
Alat t dan Bahan p Penelitian
Peralatan yang j digunakan pada , penelitian  ini  adalah autoklaf digunakan untuk  sterilisasi  alat  dan  media  kultur, LAF digunakan  sebagai  tempat  menanam,  botol kultur  berfungsi  untuk  tempat  pengkulturan eksplan,
erlenmeyer
digunakan sebagai tempat mencampurkan atau menghomogenkan    larutan,  gelas  ukur sebagai  alat  ukur  larutan  pada  saat penambahan  larutan,  cawan  petri  berfungsi untuk  tempat  pemotongan  eksplan  yang akan  ditanam  di  dalam  botol  kultur, pengaduk  sebagai  pengaduk  larutan  pada saat  dipanaskan, pinset digunakan  untuk mengambil atau menjepit eksplan yang akan dipotong, skalpel digunakan  untuk  mengiris
eksplan,  kompor  digunakan  untuk  tempat memanaskan  atau  menyeterilkan  media, timbangan analitik
berfungsi untuk menimbang
bahan-bahan yang g akan dicampurkan
pada media, kamera digunakan sebagai alat dokumentasi, sprayer digunakan sebagai tempat penyimpanan alkohol yang nantinya digunakan  sebagai  penyemprot  proses pensterilan  LAF,  sarung  tangan  karet sebagai penutup tangan agar bisa mengurangi  terjadinya  kontaminasi, hot plate
dan magnetic stirrer untuk menghomogenkan  larutan,  dan  masker berfungsi  sebagai  penutup  wajah  terutama bagian  mulut  untuk  menghindari  pada  saat penanaman  agar  tidak  terjadi  kontaminasi. Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini yaitu , eksplan  biji  limau  kuit,  gandasil  D, glukosa  30  gr/l,  agar  4  gr/l,  aquadest, hormon  BAP  dan  IBA,deterjen,  bayclin,  dan fungisida.

## Rancangan Penelitian
Penelitian  dilakukan - dengan  4  perlakuan yang merupakan n kombinasi
dari hormon n IBA dan BAP dengan konsentrasi 4 kali ulangan. Perlakuannya yaitu dengan zat pengatur  tumbuh  BAP  dan  IBA  masing- masing  sebanyak  0,5  ppm,  zat  pengatur tumbuh  BAP  dan  IBA  masing-masing sebanyak 1  ppm,  zat  pengatur r tumbuh  BAP dan  IBA  masing-masing g sebanyak  2  ppm, zat  pengatur n tumbuh  BAP / dan  IBA  masing- masing  sebanyak  4  ppm.  Masing-masing perlakuan  eksplan  diulang  sebanyak  4  kali ulangan  dengan  pengulangan  penanaman sebanyak 4 kali.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Respon  pada  biji  buah  limau  kuit  diawali dengan  pembentangan  sel  pada  hari  ke-8 sampai  hari  ke-15  setelah  tanam  dapat
dilihat  pada  gambar  1,  eksplan  terlihat sudah  mulai  tumbuh  dengan  munculnya akar, tunas dan daun muda. Dengan adanya pengirisan, yang merupakan bentuk melukai embrio  biji  disertai  akumulasi  hormon  dan ion-ion yang mengakibatkan aktifnya pembelahan  sel.  Pembelahan  sel  yang berulang-ulang  menimbulkan  proliferasi  sel, yang dikenal dengan istilah kalus. Berdasarkan  Roberts  (1993),  pengirisan menyebabkan  banyak  berkas  pengangkut ikut terpotong yang tentunya akan mengganggu pergerakan normal zat pengatur  tumbuh  dan  lepasnya  hormon endogen.
Berdasarkan hasil
pada respon pertumbuhan  beberapa  eksplan  biji  buah limau  kuit  terlihat  pada  minggu  ke-2  hingga dapat  bertahan  sampai  minggu  ke-8. Responnnya  ditandai  dengan  berubahnya warna eksplan dari hijau muda menjadi hijau tua  dikarenakan  eksplan  mampu  menyerap unsur  hara  yang  ada  didalam  media  kultur. Tetapi  sebagian  eksplan  ada  yang  sudah mengalami perkecambahan dengan tumbuhnya  akar,  tunas  dan  daun,  hal tersebut  dapat  dilihat  dari  pengamatan perlakuan  A  pada  ulangan  ke-2  dari kombinasi  hormon  IBA  dan  BAP  sebanyak 0,5 ppm.
Setelah  pengamatan  selama  8  minggu eksplan  biji  buah  limau  kuit  ada  yang mengalami respon lebih cepat dan ada juga yang  mengalami  respon  yang  lebih  lambat bahkan ada juga yang mengalami kontaminasi akibat kurang steril media kultur atau pada saat penanaman.

## Organ yang terbentuk dari eksplan
Berdasarkan  hasil  pengamatan  respon pertumbuhan  biji  buah  limau  kuit  selama  8 minggu,  mengalami  perubahan  dengan terbentuknya  organ  baru  yaitu  kalus,  akar dan  tunas.  Uraian  lebih  lanjut  dapat  dilihat pada gambar-gambar dibawah ini
Hasil  pengamatan  respon  pertumbuhan eksplan  biji  buah  limau  kuit  pada  minggu kedua,  beberapa  eksplan  menunjukkan adanya  pembentukan  organ  tumbuhan seperti  tunas,  akar,  daun  serta  kalus  yang berada di bagian bekas irisan terutama pada bagian embrio biji buah limau kuit. Secara = visual  tampak  bahwa  pertumbuhan dan 4 perkembangan  embrio o dipengaruhi oleh kehadiran zat pengatur tumbuh terutama  sitokinin  dalam  medium  yang berupa  BAP s dan  hormon  auksin  yang berupa IBA dengan rata-rata dapat berkecambah  kurang  dari  2  minggu  (8-10 hari)  dari  saat  penyemaian,  pada  saat  itu ditandai  dengan  munculnya  epikotil.  Hal  ini terjadi  karena  sitokinin  dapat  menstimulasi pertumbuhan embrio dalam kultur in vitro, ” sedangkan auksin memacu pemanjangan sel, p pembelahan s sel, ” dan pembentukan  akar r adventif.  IBA a lebih  lazim
digunakan n untuk
memacu perakaran
dibandingkan dengan n NAA atau
auksin n lainnya. ” IBA  bersifat t aktif,  sekalipun cepat d dimetabolismekan menjadi IBA- aspartat  dan  sekurangnya  menjadi  satu konjugat peptida lainnya. d Diduga, terbentuknya k konjugat tersebut d dapat menyimpan  IBA,  yang  kemudian  secara bertahap  dilepaskan  hal  itu  menjadikan konsentrasi  IBA  bertahan  pada h tingkat yang tepat, ; khususnya p pada tahap pembentukan  akar  (Salisbury  dan  Ross, 1995).    Sedangkan n sitokinin  dari h hasil penelitian n van  Overbeek  (1942)  dalam Weaver (1972) yang mengemukakan bahwa pertumbuhan  embrio  dipengaruhi  oleh  air kelapa, yang salah satunya adalah h mengandung ] hormon sitokinin alami. ”
Berdasarkan  data  pertumbuhan  eksplan biji  limau  kuit  selama  8  minggu  terdapat  20 eksplan  yang  membentuk  organ  tumbuhan.
Gambar  1.  Respon  pertumbuhan  akar,
tunas, dan kalus pada perlakuan  A  (0,5  ppm  IBA  dan 0,5 ppm BAP) minggu ke-6 Gambar  2.  Respon  pertumbuhan  akar, tunas, dan kalus pada perlakuan  B  (1  ppm  IBA  dan  1 ppm BAP) minggu ke-5 Gambar 3. Respon pertumbuhan akar dan calon  tunas  pada  perlakuan  C (2  ppm  IBA  dan  2  ppm  BAP) minggu ke-5 Gambar  4.  Respon  pertumbuhan  akar pada  perlakuan  D  (4  ppm IBA dan 4 ppm BAP) minggu ke-3
Organ  tumbuhan  yang  terbentuk  tersebut dikenal dengan istilah organogenesis,
adapun 2 eksplan lainnya berhasil membentuk  kalus.  Pembentukkan  organ tumbuhan  pada  eksplan  biji  buah  limau  kuit sebagian  besar  berasal  dari  bagian  embrio biji  yang  terluka  akibat  irisan.  Pembentukan organ  tumbuhan  atau  kalus  pada  eksplan biji  limau  kuit  diawali  dengan  respon pembengkakan  eksplan,  perubahan  warna dari  hijau  muda  menjadi  hijau  tua  serta terjadinya pembentangan sel-sel yang merupakan  inisial  kalus  atau  mengalami hipertropi.  Cepat  tidaknya  terbentuknya kalus atau organ tumbuhan tidak
memungkinkan dapat bertahan lama apabila tidak  dilakukan  sub  kultur.  Sebab  apabila cepat terbentuk kalus, organ tumbuhan atau eksplan masih mengalami hipertropi otomatis unsur hara atau nutrisi yang ada di dalam  media  banyak  diperlukan  dalam proses  tersebut  (Mahanani,  2003).  Hal tersebut sesuai dengan pengamatan, dimana dalam waktu 8 minggu banyak yang mengalami perubahan
warna
dan pembengkakan  tetapi  akhirnya  mati  karena terkontaminasi jamur ataupun bakteri.
Respon pembentukan kalus yang berbeda  tidak  hanya  dipengaruhi  oleh  zat pengatur  tumbuh  saja,  tetapi  media  tumbuh berpengaruh  terhadap  ketersediaan  unsur hara  yang  diperlukan  untuk  tumbuh  kalus dan kesterilan pada proses penanaman juga dan berpengaruh untuk keberhasilan persentase  pertumbuhan  kalus.  Roberts (1983),  mengatakan  bahwa  faktor  fisik seperti  cahaya  dan  temperature  juga berperan  dalam  proses  diferensiasi  dengan mempengaruhi  aktivitas  dan  ketersediaan hormon,  sumber  karbon  dan  beberapa  jalur metabolisme  yang  mempengaruhi  proses perkembangan  kalus  atau  organ  tumbuhan yang terbentuk.
induksi  pertumbuhan  biji  limau  kuit diawali  dengan  adanya  perubahan  warna menjadi hijau tua dikarenakan eksplan mulai merespon  dengan  media,  akibat  dari perubahan  warna  menjadi  hijau  tua  yang terjadi dipermukaan eksplan hingga menjadi lebih  menebal  lalu  menonjol  sehingga mengalami  pembengkakan  dan  mengalami hipertropi. Hipertopi merupakan pertumbuhan  abnormal  yang  diakibatkan oleh  pembengkakan  sel  yang  ditandai dengan  bertambahnya  ukuran  sel  tanpa disertai pembelahan yang diakibatkan adanya  auksin  baik  endogen  maupun eksogen.  Pada  penelitian  ini  pertumbuhan
eksplan  dipengaruhi  oleh  kombinasi  dari pemberian  hormon  IBA  dan  BAP  yang digunakan, dimana semakin tinggi konsentrasi  IBA  dan  BAP  yang  digunakan maka pertumbuhan eksplan semakin lambat dan pertumbuhannya lebih memacu keakar. Hal  ini  terlihat  pada  kombinasi  hormon  IBA dan  BAP  dengan  konsentrasi  4  ppm  di ulangan penanaman ke-2 pada perlakuan D pada minggu ke-2.Sehingga dapat disimpulkan bahwa induksi pertumbuhan sel baru  pada  eksplan  biji  buah  limau  kuit dibutuhkan kombinasi IBA  dan BAP dengan konsentrasi yang tinggi.
Namun  tidak  menutup  kemungkinan pembentukan  sel  baru  terbentuk  dengan konsentrasi  yang  tinggi  dan  tidak  semua tanaman  dapat  terjadi  pembentukan  selnya dengan  konsentrasi  yang  rendah.  Karena jika  konsentrasi  Auksin  tinggi  cenderung memacu  perakaran  dan  kalus.  Sedangkan jika  konsentrasi  Sitokinin  tinggi  cenderung memacu  pertunasan.  Kedua  zat  pengatur tumbuh  tersebut  dikombinasikan  untuk  hasil kultur  yang  lebih  baik.  Pembengkakan  ini diduga  sebagai  sebagai  respon  stress karena jaringan tanaman tersebut ditumbuhkan  pada  medium  dengan  nutrisi dan hormon yang tidak seimbang (Dudits, et al ,  1995).  Pembentukan  kalus  yang  lambat kemungkinan  dapat  disebabkan  karena konsentrasi  Zat  Pengatur  Tumbuh  (ZPT) yang  digunakan  masih  belum  sesuai  untuk sel-sel  eksplan  melakukan  dediferensiasi, pembentangan, pembelahan serta proliferasi  sel-sel  sehingga  pembentukan kalus kurang optimal. Mengacu pada Wilkins dan Dodds (1983), kecepatan proliferasi sel- sel  kalus  sangat  bervariasi  tergantung kepada jenis dan varietasnya, selain penambahan ZPT dan bentuk fisik medium.
Respon  pertumbuhan  eksplan  dalam teknik  kultur  jaringan t akan  berhasil  dengan baik l apabila  syarat-syarat t yang  diperlukan terpenuhi.  Syarat-syarat  tersebut  meliputi pemilihan  eksplan  sebagai  bahan  dasar untuk pembentukan k kalus, penggunaan medium m yang  cocok,  keadaan    yang aseptik  dan  pengaturan  udara  yang  baik. Meskipun  pada  prinsipnya a semua  jenis s sel dapat  ditumbuhkan,  tetapi s sebaiknya  dipilih bagian  tanaman  yang  masih m muda  dan mudah h tumbuh  yaitu  bagian  meristem, seperti:  daun  muda,  ujung  akar,  ujung batang,  keping  biji  dan  sebagainya.  Bila menggunakan  embrio  bagian  bji-biji  yang lain sebagai eksplan, yang perlu diperhatikan  adalah  kemasakan  embrio,
waktu  imbibisi,  temperatur  dan  dormansi. Pada  pengambilan  eksplan  biji  limau  kuit juga  harus  diperhatikan  bagus  tidaknya kualitas eksplan yang digunakan hal tersebut sangat mempengaruhi untuk proses  respon  pertumbuhannya.  Eksplan kotiledon lebih responsif g untuk induksi i kalus embriogenesis
somatik d dibandingkan eksplan n yang  berasal  dari  daun,  dan  hal  ini sesuai  hasil  penelitian  Kalimuthu et  al (2007).  Hal  ini  diduga  disebabkan  eksplan kotiledon lebih bersifat meristematik dibanding
organ
tanaman lainnya. Penggunaan e eksplan yang bersifat meristematik memberikan k keberhasilan
pembentukan n embrio = somatik y yang lebih tinggi (Purnamaningsih 2002).
Media a merupakan + faktor r penentu dalam m perbanyakan dengan kultur r jaringan.  Komposisi  media  yang g digunakan tergantung g dengan jenis tanaman s yang akan  diperbanyak. < Media y yang  digunakan biasanya terdiri dari garam m mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan n juga  bahan  tambahan s seperti agar,  gula, d dan  lain-lain.  Zat p pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga g bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya,  tergantung  dengan  tujuan d dari kultur jaringan yang d dilakukan. Media yang s sudah  jadi d ditempatkan  pada  tabung reaksi  atau  botol-botol  kaca.  Media  yang digunakan  juga - harus s disterilkan  dengan cara s memanaskannya teroksidasinya senyawa  fenolik dari irisan eksplan.
Berdasarkan  hasil  penelitian  Anis  dan Oetami  (2010),  penyebab  dari  kontaminasi
(browning) akibat gejala . yang . ditimbulkan . dari 0 adanya  serangan  jamur yang  berupa  tumbuhnya  hifa-hifa  jamur pada a permukaan  media  maupun e eksplan setelah  inokulasi  selama  rata-rata  4-10 i hari setelah h tanam.
Di s samping
itu, mikrooganisme e akan menyerang g eksplan melalui k luka-luka  akibat  pemotongan d dan penanganan w waktu sterilisasi sehingga mengakibatkan n jaringan  eksplan.  Eksplan yang  terkontaminasi  akan  menunjukkan gejala  berwarna  putih,  coklat  atau  krem yang disebabkan jamur dan bakteri. Kontaminasi 0 juga dapat h terjadi
dari eksplan e eksternal maupun n internal, mikroorganisme  yang  masuk k kedalam media,  botol k kultur  atau u alat-alat  tanam yang  kurang  steril,  ruang  kerja  dan  kultur yang  kotor  (mengandung d spora a di  udara ruangan k laboratorium) dan h kecerobohan dalam m pelaksanaan,  Pandiangan  (2003).
Selain itu, masalah
lingkungan inkubator  juga tidak bisa d diabaiakan karena ini  juga s sering  menjadi  masalah.  Suhu ruangan  sangat m menentukan optimasi pertumbuhan   eksplan,  suhu  yang  terlalu rendah  atau u tinggi  dapat m mempengaruhi pertumbuhan  dan  perkembangan  pada eksplan.  Berdasarkan  gambar  pengamatan pada lampiran respon pertumbuhan eksplan biji  buah  limau  kuit  yang  diamati  selama  8 minggu  dengan  4  yaitu  perlakuan  A,  (IBA 0,5  ppm  dan  BAP  0,5  ppm),  perlakuan  B, (IBA  1  ppm  dan  BAP  1  ppm),  perlakuan  C, (IBA  2  ppm  dan  BAP  2  ppm),  perlakuan  D, (IBA 4 ppm dan BAP 4 ppm).
Kendala  lain  berupa a kontaminasi  karena sterilisasi  eksplan, media  serta  peralatan skalpel  yang  kurang  bersih.  Media  tumbuh juga  mudah  ditumbuhi  cendawan  atau bakteri  karena  kurang  steril,  organisme mikro  tersebut t akan  tumbuh  dengan s cepat dan menutupi p permukaan media dan eksplan  yang  ditanam.  Di  samping  itu, organisme  mikro  akan  menyerang  eksplan melalui  luka-luka  akibat  pemotongan  dan penanganan  waktu  sterilisasi  sehingga menyebabkan  kematian  jaringan  eksplan sebelum  terjadi  pembentukan  kalus.  Tidak menutup  kemungkinan  biji  buah  Limau  kuit yang  digunakan  membawa  penyakit  dari indukannya. Kontaminasi yang terjadi kadang  ditemukan s setelah  beberapa k kultur yang  steril h hal  ini  mungkin h disebabkan oleh a agen kontaminan y yang telah h bertahan di dalam h jaringan sampai h kondisi yang m menguntungkan  untuk p pertumbuhan. Kontaminasi pun dapat t terjadi selama proses sub kultur atau dapat p pula masuk m melalui  tutup  botol  kultur  yang kurang rapat (Zulkarnain, 2014).

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Respon  pertumbuhan  eksplan  biji  limau kuit pada medium gandasil dengan kombinasi z zat  pengatur p tumbuh  IBA  0,5 ppm/BAP  0,5  ppm    menunjukkan  respon pembentukan tunas dan akar; Pada kombinasi  zat  pengatur  tumbuh  IBA  1 ppm/BAP 1 1  ppm  menunjukkan  respon pembentukan  tunas;  pada  kombinasi  zat pengatur  tumbuh  IBA  2  ppm/BAP  2  ppm menunjukkan respon pembentukan akar dan pada  kombinasi  IBA  4  ppm/BAP  4  ppm
menunjukkan respon pembentukan akar dan kalus

## Saran
Perlakuan  yang  dapat  mengarahkan eksplan menjadi tumbuhan sempurna (plantlet)  atau  terbentuk  tunas  dan  akar sebaiknya  menggunakan  media  dengan kombinasi IBA 0,5 ppm/ BAP 0,5 ppm.

## DAFTAR PUSTAKA
Anis,  S.,  &  Oetami,  D.  (2010).  Pengaruh Sterilan  Dan  Waktu  Perendaman  Pada
Eksplan Daun Kencur (Kaemferia galanga L) Untuk Meningkatkan
Keberhasilan  Kultur  Kalus.  AGRITECH,
XII(1), 11
Dudits, D.J.G., L. Bogre, and L.  Baho. 1995. Molecular biology
of somatic embryogenesis.  In: Thorpe, T.A. (ed.). In Vitro  Embryogenesis  In  Plants.  Kluwer Acad.  Publ.  Dordrecht.  The  Netherlands. 471-538.
Kalimuthu,  K,  M.  Saravanakumar,  and  R. Senthilkuma.
2007. In
vitro micropropogation  of  Musa  sapientum  L. (Cavendish  Dwarf).  African  Journal  of Biotechnology . 6(9):1106-1109
Koestiati,  D.  1995.  Perkembangan  Embrio Somatik  Bawang  Putih  (Allium  sativum L.)  yang  berasal  dari  Kultur  Bulbus. Skripsi S1  Fakultas Biologi UGM. Yogyakarta.
Kyte, L. dan J. Kleyn. 1996. Plant from Test Tubes An
Introduction
to
Micropropagation.  Timber  Press.  Inc. Portland.
Mahanani,  C.R.L  2003. Pengaruh  Media
Tanam dan Pupuk NPK terhadap Produki
Tanaman  Pak-choi  (Brassica  chinensis)
Varietas Green Pak-choi .Fakultas Pertanian Jurusan Budidaya Pertanian.Institut Pertanian Bogor.
Pratiwi,  R.  E.  2007. Perbanyakan  Cepat Melalui  Teknik  Kultur  Jaringan  bagi Tanaman  Lengkeng  Dataran  Rendah (Dimocarpus  longan  Lour). Skripsi  S1 Fakultas Pertanian UNS. Surakarta
Purnamaningsih, R. 2002. Regenerasi Tanaman Melalui Embriogenesis Somatik  dan Beberapa  Gen  yang Mengendalikannya. Buletin Agrobio       .
5 (2) : 5158 .
Salisbury, F, B. dan C. W. Ross, 1995 . Fisiologi Tumbuhan Diterjemahkan oleh Diah. R. Lukmana. ITB. Bandung.
Sukmadjaja,  D.  dan  I.  Mariska.  2003. Balai Penelitian  Bioteknologi  dan  Sumberdaya Genetik Pertanian. http://www.indobiogen.or.id/ terbitan/pdf/Buku_%20Jati.pdf . Diakses tanggal 27 Juni 2009.
Wilkins, C. P. and Dodds, J. H. 1983. Tissue Culture  Propagation  Of  Temperate  Fruit Trees  dalam  J.  H.  Dodds.  Tissue  culture of tree. Avi pub. Co. Inc. Connecticut. Pp. 65, 69
Zulkarnain. 2014. Kultur Jaringan Tanaman Solusi Perbanyakan Tanaman Budi Daya . PT. Bumi Aksara. Jakarta.