## OPTIMASI DAN VALIDASI METODE ANALISIS SUKROSA UNTUK MENENTUKAN KEASLIAN MADU PERDAGANGAN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Aqnes Budiarti 1* , Ibrahim Arifin 1
1 Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang *Email: aqnesliu@gmail.com

## ABSTRAK
Seiring  dengan  peningkatan  penggunaan  madu,  berkembanglah  pemalsuan  madu  untuk mendapatkan  keuntungan.  Penambahan  larutan  gula  pasir  sering  dilakukan  karena harganya yang relatif murah. Pemalsuan madu dengan cara seperti ini sangat merugikan masyarakat  karena  dapat  memicu  timbulnya  penyakit  diabetes.  Kandungan  sukrosa dalam  madu  menurut  persyaratan  mutu  madu  SNI  01-3545-2004  adalah  maksimal  5%. Apabila  kandungannya  jauh  lebih  tinggi  maka  dapat  dipastikan  bahwa  madu  tersebut tidak asli.
Metode  didasarkan  pada  sifat  glukosa  yang  polar  sehingga  dapat  dianalisis menggunakan  KCKT  dan  struktur  glukosa  yang  mengandung  kromofor  sehingga  dapat dideteksi  menggunakan  detektor  UV.  Analisis  dilakukan  dengan  kolom  C 18 Lichrospher 100  RP-18  (100  mm  x  4.6  mm  ID,  5  μm).  Fase  gerak  terdiri  atas  asetonitril  dan aquabidest  (65:  35,  v/v).  Fase  gerak  dihantarkan  secara  isokratik  dengan  laju  alir  0,8 mL/menit. Detektor UV pada panjang gelombang 191 nm.
Metode  yang  dikembangkan  divalidasi  berdasarkan  parameter  ketelitian,  ketepatan, linieritas,  spesivitas  dan  sensitivitas.  Metode  ini  memenuhi  persyaratan  validasi. Ketelitian  metode  dievaluasi  menggunakan  uji  repeatability  yang  menghasilkan  nilai RSD  0,10  – 1,90%.  Ketepatan  metode  ditentukan  dengan  studi  perolehan  kembali  yang menunjukkan  nilai  perolehan  kembali  adalah  98,72  –  101,22%.  Metode  menghasilkan respon  yang  linier  (r  >  0,99)  pada  kisaran  konsentrasi  30  –  90  µg/mL.  Nilai  LOD  dan LOQ Sukrosa sebesar 2,64 µg/mL dan 8,83 µg/mL
Kata kunci: sukrosa, madu perdagangan, KCKT

## 1. PENDAHULUAN
Rasa  madu  yang  manis  dan  nilai  gizinya  yang  tinggi  semakin  meningkatkan penggunaannya.  Seiring  dengan  hal  ini,  berkembanglah  pemalsuan  madu  untuk mendapatkan  keuntungan.  Penambahan  gula  jenis  sukrosa  berupa  larutan  gula  pasir sering  dilakukan  karena  harganya  yang  relatif  murah.  Kandungan  sukrosa  dalam  madu menurut  syarat  mutu  madu  SNI  01-3545-2004  adalah  maksimal  5%.  Apabila kandungannya  lebih  tinggi  atau  jauh  lebih  tinggi  maka  dapat  dipastikan  bahwa  madu tersebut tidak asli. Pemalsuan madu dengan cara seperti ini sangat merugikan masyarakat terutama  yang  mengkonsumsinya  secara  rutin.  Tingkat  konsumsi  gula  yang  berlebihan setiap hari dapat memicu timbulnya penyakit diabetes mellitus.
Penetapan  kadar  sukrosa  yang  sangat  kecil  kurang  tepat  apabila  menggunakan metode konvensional seperti iodometri. Metode yang diperlukan haruslah bersifat sensitif sehingga dapat menetapkan kadar yang sangat kecil. Metode yang relevan adalah metode analisis menggunakan alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Alat ini memiliki beberapa  keunggulan  dibandingkan  dengan  metode  konvensional  yaitu  lebih  sensitif, cepat, selektif, teliti, dan tepat.
Penelitian  tentang  penetapan  kadar  sukrosa  dalam  madu  randu  dan  madu kelengkeng  telah  dilakukan  oleh  Sumantri  dkk.  (2013).  Penelitian  menggunakan  KCKT tipe  Waters  ec  2695  dengan  fase  diam  C 18 Sunfire  dan  fase  gerak  berupa  campuran asetonitril  dan  aquabides  dengan  perbandingan  75:  25,  v/v.  Hasil  yang  didapat  kurang selektif sehingga penentuan kadar sukrosa terganggu oleh adanya zat lain dalam matriks madu.  Selain  itu  parameter  ketepatan  tidak  ditentukan  sehingga  metode  yang  digunakan tidak dapat menjamin perolehan data yang tepat.
Berdasarkan  latar  belakang  permasalahan  di  atas  maka  peneliti  melakukan pengembangan  metode  analisis  sukrosa  yang  terdiri  dari  optimasi  kondisi  operasional, validasi  metode  dan  aplikasi  metode  pada  sampel  madu  perdagangan.  Optimasi  berupa penentuan  panjang  gelombang  maksimal  untuk  mendeteksi  kadar  sukrosa,  optimasi komposisi  fase  gerak  dan  optimasi  kecepatan  alirnya.  Validasi  meliputi  parameter ketelitian, ketepatan, linieritas, selektifitas dan sensitifitas. Validasi metode analisis untuk menjamin  bahwa  metode  yang  diaplikasikan  dalam  sampel  madu  memiliki  kesesuaian dengan tujuan analisis.

## 2. METODE PENELITIAN

## 2.a. Alat
Seperangkat  KCKT  Jasco  LC-Net  II/ADC  tipe  isokratik  dilengkapi  dengan  detektor UV-2070 Plus, piranti lunak Agilent EZChrom Elit Chromatography Data System dan Rheodyne  Loop  Injector 20  μL.  Kolom  KCKT:  C 18 Lichrospher  100  RP-18  (Merck)
(100 mm x 4,6 mm ID, 5 μm), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1700).
2.b. Bahan
Baku  pembanding  Sukrosa  (Wuhan  Wuyao  Pharmaceutical  Co.,  Ltd.),  asetonitril derajat KCKT (Merck), aquabides (PT. Otsuka) dan metanol derajat KCKT (Merck). 2.c. Tahapan Penelitian
2.c.1. Pengambilan Sampel
Sampel  madu  perdagangan  yang  terdiri  dari  25  merk  diambil  dari  toko-toko pada  5  kota  di  Propinsi  Jawa  Tengah  yang  terkenal  sebagai  penghasil  madu yaitu Kota Semarang, Kota Solo, Batang, Temanggung dan Rembang.
2.c.2. Optimasi Kondisi Operasional
1. Penentuan Panjang Gelombang Maksimal
2. Optimasi  komposisi  fase  gerak  meliputi  campuran  asetonitril  derajat  KCKT  dan aquabides dengan perbandingan 65: 35, v/v; 70: 30, v/v; 75: 25, v/v dan 80: 20, v/v.
3. Optimasi laju alir divariasi 0,8; 1,0; 1,2 dan 1,4 mL/menit.
2.d . Validasi Metode Analisis Sukrosa
a) Ketelitian (Presisi)
Larutan  yang  mengandung  sukrosa  45  μg/mL,  60  μg/mL  dan  75  μg/mL diinjeksikan  sebanyak  20  μL  ke  alat  KCKT  pada  kondisi  optimum  dengan replikasi 6 kali. Ketelitian dinyatakan dengan % RSD.
b) Ketepatan (Akurasi)
Ketepatan  ditentukan  melalui  uji  perolehan  kembali  pada  sampel  yang ditambah  baku  dengan  konsentrasi  mencakup  80;  100 dan  120%  dari  kadar sukrosa dalam madu. Replikasi masing-masing sebanyak 5 kali.
c) Spesivitas
Uji  spesivitas  dilakukan  dengan  mengamati  kromatogram  sampel  madu.
Resolusi dikatakan memenuhi syarat jika nilai R ≥ 2,00 (Snyder dkk.,1997).
d) Linieritas
Larutan  baku  sukrosa  dengan  konsentrasi    30;  45;  60;  75  dan  90  μg/mL diinjeksikan sebanyak 20 μL ke alat KCKT. Metode dikatakan linier apabila
nilai  koefisien  korelasi  (r)  yang  didapat  lebih  besar  dari  0,99  (Miller  dan Miller, 2005).
e) Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi
Batas deteksi dan batas kuantifikasi metode analisis sukrosa dihitung secara statistik menggunakan persamaan garis regresi linier yang diperoleh dari uji linieritas.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.a. Penentuan Panjang Gelombang Untuk Analisis Hasil scanning larutan  sukrosa dalam fase  gerak  asetonitril:  aquabidest (65: 35,  v/v)  menunjukkan  serapan  maksimum  pada  panjang  gelombang  191  nm  yang dapat dilihat pada gambar 1.
Gambar 1. Spektrum Overlay Sukrosa

## 3.b. Optimasi Fase Gerak
Pemilihan  fase  gerak  optimum  berdasarkan  prioritas  yaitu  pertama  adalah parameter  luas  area  puncak  kromatogram,  prioritas  kedua  adalah  resolusi  antara puncak sukrosa dengan puncak zat pengganggu (Rs) dan prioritas ketiga adalah waktu retensi (t R ) dan efisiensi (N).

## 3.b.1.  Optimasi Komposisi Fase Gerak
Optimasi komposisi fase gerak dilakukan untuk mendapatkan pemisahan yang  baik  sehingga  akan  meningkatkan  selektivitas  dan  sensitivitas  metode analisis.  Berdasarkan  gambar  2  terlihat  bahwa  perubahan  komposisi  fase  gerak yang terdiri atas fase air (aquabidest) dan fase organik (asetonitril) menyebabkan perubahan t R sukrosa. Hal ini disebabkan karena adanya perubahan polaritas dan kekuatan  pelarut  yang  sangat  ditentukan  oleh  persentase  (%)  kandungan  fase organik. Pada fase gerak yang mengandung asetonitril relatif banyak (asetonitril: aquabidest dengan perbandingan 75: 25 dan 80: 20, v/v), t R sukrosa paling cepat dan  berdekatan  dengan  puncak  zat  pengganggu  karena  fase  gerak  memiliki kekuatan paling besar untuk mengelusi kedua zat dari kolom. Fase gerak dengan komposisi ini tidak dipilih karena menghasilkan waktu retensi yang terlalu cepat dan  menghasilkan  pemisahan  yang  tidak  baik  (R=  1,34  dan  R=  1,01).  Hasil optimasi ini dapat dilihat pada gambar 2.

## 191 nm
Gambar 2. Kromatogram sukrosa hasil optimasi komposisi fase gerak
(a) asetonitril: aquabidest (65: 35, v/v) (b) asetonitril: aquabidest (70: 30, v/v) (c) asetonitril: aquabidest (75: 25, v/v) (d) asetonitril: aquabidest (80: 20, v/v)
Fase  gerak  dengan  komposisi  asetonitril:  aquabidest    (65:  35,  v/v) menghasilkan area puncak yang paling luas, pemisahan paling bagus dan efisiensi juga  paling  besar.  Fase  gerak  ini  dipilih  sebagai  komposisi  optimum  walaupun waktu retensi paling lama karena selisih waktu antar komposisi sangat kecil.

## 3.b.2.  Optimasi Laju Alir Fase Gerak
Optimasi dilakukan pada laju alir 0,8; 1,0; 1,2 dan 1,4  mL/menit karena standar  laju  alir  untuk  kolom  berdiameter  internal  4,6  mm  seperti  halnya  kolom Lichrospher RP-18 adalah sekitar 1,0 mL/menit (Anonim, 2010). Selain itu, fase diam  dengan  ukuran  partikel  +  5  µm  akan  menghasilkan  efisiensi  pemisahan terbaik  pada  laju  alir  1,0  –  1,5  mL/menit  berdasarkan  persamaan  kurva  Van Deemter (Ornaf, dkk., 2005). Hasil optimasi laju alir fase gerak dapat dilihat pada tabel II dan gambar 3.
Gambar 3. Kromatogram sukrosa hasil optimasi laju alir fase gerak
(a) Laju alir 0,8 mL/menit (b) Laju alir 1,0 mL/menit (c) Laju alir 1,2 mL/menit (d) Laju alir 1,4 mL/menit
Pada  gambar  3  dapat  dilihat  bahwa  area  puncak  kromatogram  sukrosa pada laju alir 0,8 mL/menit paling luas, pemisahannya paling baik dan efisiensinya juga paling besar sehingga digunakan sebagai laju alir optimum.

## 3.c. Validasi Metode Analisis
3.c.1. Ketelitian (Presisi)
Hasil  uji  ketelitian  menunjukkan  bahwa  metode  analisis  yang  divalidasi memiliki ketelitian yang baik karena semua nilai memenuhi persyaratan nilai RSD untuk  rentang  kadar  uji  yang  dapat  diterima  yaitu <  8% (Gonzales,  dkk.,  2010). Dengan  demikian,  metode  dapat  menghasilkan  data  kadar  sukrosa  yang reprodusibel.
3.c.2. Ketepatan (Akurasi)
Akurasi  metode  analisis  pada  penelitian  ini  ditentukan  melalui  uji perolehan  kembali  dengan  metode  penambahan  baku  pada  analit  ( standard addition  method ).  Uji  dilakukan  dengan  cara:  sampel  dianalisis,  kemudian sejumlah bahan baku  (80; 100 dan 120% dari kadar analit target) ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis lagi, masing-masing direplikasi sebanyak 5 kali.  Perolehan  kembali  dihitung  dengan  membandingkan  jumlah  sukrosa  terukur untuk masing-masing penambahan baku terhadap kadar sukrosa yang ditambahkan. Hasil perhitungan perolehan kembali pada 3 tingkat konsentrasi dapat dilihat pada tabel I.
Tabel I. Hasil uji ketepatan ( accuracy ) metode penambahan baku sukrosa (n = 5).
Perbandingan sampel : bahan baku C A (µg/mL) C F (µg/mL) C* A (µg/mL) Perolehan Kembali 100 : 80 49,76 90,00 40 100,62 100 : 100 49,76 99,69 50 99,99 100 : 120 49,76 109,76 60 100,05 Rata-rata 100,29 SD 0,68 RSD 0,67 Keterangan:   C F = kadar  total  yang diperoleh dari pengukuran C A = kadar sebenarnya
C* A = kadar yang ditambahkan
Semua  nilai  perolehan  kembali  yang  dihasilkan  dari  penelitian  memenuhi kriteria rentang nilai yang dapat diterima yaitu 90  – 107% (Gonzales, dkk., 2010). Dengan demikian, metode analisis yang digunakan dapat menghasilkan data kadar sukrosa dalam madu yang dekat dengan kadar sebenarnya.

## 3.c.3. Spesivitas
Kromatogram sukrosa dapat dilihat pada gambar 4.
Gambar 4. Kromatogram sukrosa dalam sampel madu
Pada  gambar  5  dapat  dilihat  bahwa  komponen  lain  dalam  matriks  madu tidak ada yang memiliki t R yang sangat berdekatan dengan puncak Sukrosa. Selain itu  pemisahan  Sukrosa  menghasilkan  nilai  R  =  3,36  yang  memenuhi  persyaratan pemisahan  yang  baik,  R  >  2,00  (Snyder,  dkk.,  1997).  Metode  analisis  memiliki spesivitas  yang  baik  sehingga  mampu  mengukur  sukrosa  secara  cermat  pada  saat berada bersama dengan komponen lain dalam matriks madu.

## 3.c.4. Linieritas
Uji linieritas dilakukan pada lima konsentrasi Sukrosa yaitu 30; 45; 60; 75 dan  90  µg/mL  yang  merupakan  kisaran  konsentrasi  50;  75;  100;  125;  dan  150% dari  konsentrasi  analit  target.  Uji  dilakukan  3  kali  pengulangan.  Uji  linieritas menghasilkan 3 persamaan garis regresi yang terlihat pada tabel II.
Tabel II. Hasil uji linieritas sukrosa (30 - 90 µg/mL)  (n = 3).
No Persamaan regresi linier r 1 59,23 X -177,12 0,99970 2 57,62 X -127,01 0,99974 3 57,56 X -143,54 0,99952
Penetapan  uji  didasarkan  pada  hubungan  linier  antara  konsentrasi  sampel dengan luas puncak kromatogram. Dari tabel IV dapat diketahui bahwa ketiga garis regresi  menunjukkan  korelasi  yang  baik  dengan  koefisien  korelasi  (r)  memenuhi kriteria  nilai  r  yang  dapat  diterima  yaitu  lebih  besar  dari  0,99  (Miller  dan Miller, 2005).  Dengan  demikian,  metode  analisis  mampu  menghasilkan  data  luas  puncak kromatogram Sukrosa  yang secara langsung  proporsional  terhadap  konsentrasinya pada kisaran 30 - 90 µg/mL.
Persamaan  garis  regresi  terbaik  berdasarkan  besarnya  nilai  r  adalah  Y= 57,62  X  -127,01  dengan  nilai  r=0,99974.  Persamaan  garis  ini  selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar Sukrosa dalam sampel madu. Hubungan linier antara  konsentrasi  sukrosa  terhadap  luas  puncak  kromatogramnya  dapat  dilihat pada gambar 5.
Gambar 5.  Kurva linieritas sukrosa (30 – 90 µg/mL)

## 3.c.5. Sensitivitas
Sensitivitas  metode  dinyatakan  dengan  batas  deteksi  (LOD)  dan  batas kuantifikasi  (LOQ).  Uji  validasi  terhadap  metode  analisis  Sukrosa  di  dalam  madu termasuk  uji  kategori  1  sehingga  evaluasi  nilai  LOD  dan  LOQ  sebenarnya  tidak diperlukan  karena  zat  yang  dimaksud  berada  dalam  jumlah  yang  besar  yaitu  di
-5000 0 5000 10000 0 50 100 L u a s P u n c a k M d z x 1 0 0 0 Konsentrasi (µg/mL) Y = 57,62 x - 127,01 r  = 0,99974
dalam  madu.  Namun,  nilai  ini  tetap  ditentukan  untuk  mengetahui  batas  terkecil konsentrasi analit yang masih diijinkan untuk dilakukan analisis.
Pada  penelitian  ini  perhitungan  nilai  LOD  dan  LOQ  ditentukan berdasarkan persamaan garis regresi yang mempunyai koefisien korelasi (r) terbaik yaitu: Y= 57,62 X -127,01. LOD ditentukan sebagai kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blangko, Y B , ditambah 3 simpangan baku blanko, S B . LOQ didasarkan  pada  nilai signal  to  noise (S/N)  =  10  (Miller  dan  Miller,  1988). Berdasarkan  perhitungan,  diperoleh  nilai  LOD  dan  LOQ  Sukrosa  sebesar  2,97 µg/mL dan 9,16 µg/mL.
4. KESIMPULAN
1. Optimasi  kondisi  analisis  menghasilkan  kondisi  optimum  pada  komposisi  fase gerak  berupa  campuran  asetonitril:  metanol  (65:  35,  v/v  dengan  laju  alir  0,8 mL/menit dan deteksi UV pada λ 191 nm.
2. Metode  analisis  sukrosa  yang  dikembangkan  memenuhi  persyaratan  validasi berdasarkan  pada  uji  ketelitian,  ketepatan,  linieritas,  spesivitas  dan  sensitivitas yakni:  nilai  RSD  untuk  parameter  ketelitian  adalah  0,10  –  1,90%,  nilai  perolehan kembali  adalah  98,72  –  101,22%,  metode  menghasilkan  respon  yang  linier  (r  > 0,99)  pada  kisaran  konsentrasi  30  –  90  µg/mL  dan  serta  nilai  LOD  dan  LOQ sukrosa sebesar 2,97 µg/mL dan 9,16 µg/mL.

## 5. UCAPAN TERIMAKASIH
DIKTI yang telah membiayai penelitian ini lewat Skim Dosen Pemula

## 6. DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2004, Standart Nasional Indonesia 01-3545-2004 Madu , Jakarta.
Anonim,  2010,  The  Purest  Reagent  for  Separation  Optimisation  in  HPLC, http://www.romil.com/index.htm , diakses tanggal 12 November 2011. Gonzales, A.G., Herrador, M.A., and Asuero, A.G., 2010, Intra-Laboratory Assesment of Method  Accuracy  (Trueness  and  Precision)  by  Using  Validation  Standards, Talanta , 82 , 1995-1998.
Miller, J.C. and Miller, J.N., 1988, Statistics  for Analytical Chemistry , 2 nd Edition, John Wiley & Sons, New York, 109-120.
Miller, J.C. and Miller, J.N., 2005, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry ,
5 th Edition, Pearson Education Limited, Edinburgh Gate, England, 111. Ornaf, R.M., and Dong, M.W., 2005, Key Concept of HPLC in Pharmaceutical Analysis,
in Handbook  of  Pharmaceutical  Analysis  by  HPLC ,  Edited  by  Ahuja,  S.  and Dong,  M.W., Worldwide  Research  &  Development,  Purdue  Pharma,  New York, 40-66.
Snyder,  R.L.,  Kirkland,  J.J.,  and  Glajch,  J.L.,  1997, Practical    HPLC  Method Development , 2 nd Edition, John Wiley & Son, Inc., New York, 686-697. Sumantri,  Budiarti,  A.,  Parameita,  I.,  2013,  Perbandingan  Kadar  Sukrosa  Dalam  Madu Randu  dan  Madu  Kelengkeng  dari  Peternak  Lebah  dan  Madu  Perdagangan  di Kota Semarang, Jurnal Ilmu Farmasi dan Farmasi Klinik , 10 (1), 1-6.