UJI ANTIMITOSIS EKSTRAK ETANOLIK KLIKA SIRSAK ( Annona muricata L.) TERHADAP SEL TELUR LANDAK LAUT
( Tripneustes gratilla L.) TERFERTILISASI
Niken Pratiwi Liambo 1 , Abd. Malik, dan Aktsar Roskiana Ahmad Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Indonesia niken_weaslay@yahoo.com

## ABSTRACT
Soursop  belongs  to  Annonaceae  family.  In  the  traditional  medicine  has  been  as  anticancer,  antivirus, wound  healing,  lowering  uric  acid  levels.  This  study  aims  to  determine  the  IC 80 value  extract  ethanolic  of  soursop bark  to  sea  urchin  egg  (Tripneustes  gratilla L. )  fertilized.  Dryed  sample  extracted  by  maceration  method  using ethanol solvent. Retrieved rendamen extract as much as 2,525 %. Based on qualitative   test   chemical   components that   extract   ethanolic   of   soursop   bark   contain   tannins, saponins, alkaloids and flavonoids. Antimitotic test conducted  on  extract  ethanolic  of  soursop  bark  (A.muricata)  obtained  by  looking  at  the  sea  urchin  egg  cell inhibition  (Tripneustes  gratilla L. )  to  calculate  IC 80 values  by  probit  analysis  method.  Antimitotic  test  results showed  that  the  extract  ethanolic of soursop bark (A. muricata) as an antimitotic active  with IC 80 values of 1,56 x 10 -3 mg/ml. Although the potential is  lower  than that of vincristine  inhibit 80  % of eggs  fertilized with  Tripneustes gratilla L. IC 80 value is 7,046 x 10 -7 mg/ml.
Keywords: Annona muricata L., antimitotic, Tripneustes gratilla L.

## I. PENDAHULUAN
Secara  lebih  detail,  definisi  jamu  atau  obat tradisional  adalah  bahan  atau  ramuan  bahan  yang berupa  bahan  tumbuhan,  bahan  hewan,  bahan mineral,  sediaan  sarian  (galenik),  atau  campuran  dari bahan  tersebut  yang  secara  turun-temurun  telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman.  Sesuai  dengan  peraturan  perundang- undangan  yang  berlaku,  obat  tradisional  dilarang menggunakan  bahan  kimia  hasil  isolasi  atau  sintetik berkhasiat  obat  yang  sering  disebut  dengan  bahan kimia obat (BKO) (Yuliarti, 2010).
Masyarakat  Indonesia  sudah  mengenal  dan menggunakan tumbuhan berkhasiat obat sebagai salah satu  upaya  penanggulangan  masalah  kesehatan  yang dihadapi.  Hal  ini  telah  dilakukan  jauh  sebelum pelayanan  kesehatan  formal  dengan  obat-obatan modern  menyentuh  masyarakat  pengetahuan  tentang tumbuhan  obat  merupakan  warisan  budaya  bangsa turun temurun.
Bioaktivitas  tanaman  sangat  dipengaruhi oleh  kandungan  senyawa  kimia  yang  terdapat  di dalamnya. Perbedaan kandungan senyawa kimia yang ada dapat menunjukkan perbedaan aktivitas farmakologis  dari  tanaman  yang  bersangkutan (Zuhud, 2011).
Pada  tahun  1995  penelitian  dimulai  oleh Sastrodihardjo  dan  Lauglin  tentang  khasiat  daun sirsak  dalam  mengatasi  sel  kanker  di  Indonesia. Hasil  penelitian  tersebut  menemukan  beberapa senyawa  aktif  yang  termasuk  kedalam annonaceous acetogenins .  Beberapa  senyawa  turunan  asetogenin yang  ditemukan  adalah  asetogenin  murikatosin  A,
murikatosin  B,  annonasin  A,  transisoannonasin, annonasin-10-one, dan murikatosin. Senyawa– senyawa  aktif  tersebut  ditemukan  didalam  daun  dan batang  sirsak  yang  ternyata  mampu  membunuh beragam sel kanker (Zuhud, 2011).
Pengujian  pembelahan  sel  telur  landak  laut dilakukan dengan mengamati penghambatan pembelahan  sel  telur  oleh  suatu  senyawa,  dimana secara  normal  pembelahan  sel  telur  tersebut  terjadi dengan  cepat.  Keuntungan  dari  metode  ini  adalah pengerjaannya  yang  relatif  cepat,  tidak  memerlukan kultur  sel  serta  peralatan  dengan  metode  khusus seperti  sel  kanker,  embrio  landak  laut  juga mempunyai sensitifitas selektif terhadap obat sehingga  pengujian  dengan  cara  ini  menjadi  metode yang  layak  bagi  penentuan  bahan  yang  akan dievaluasi lebih lanjut (Mclaughlin, 1991).
Studi  penghambatan  pada  perkembangan  sel zigot  landak  laut  merupakan  salah  satu  model  yang digunakan  untuk  mendeteksi  aktivitas  sitotoksik, teratogenik, dan antineoplastik dari senyawa baru. Sel zigot  landak  laut  memiliki  sensitivitas  selektif terhadap  obat  dan  mengalami  tahapan  pembelahan seperti halnya sel kanker, sehingga banyak digunakan dalam  penelitian  antikanker.  Misalnya  untuk  melihat pengaruh  suatu  senyawa  dalam  menghambat  laju pembelahan  dan  pertumbuhan  sel  yang  disebut sebagai sifat antimitotik atau sitotoksik.

## II. METODE PENELITIAN
A. Pengabilan dan Pengolahan Sampel
Sampel  Klika  Sirsak  ( Annona muricata L.) dikumpulkan pada pagi hari pukul 10.00 dengan cara
memotong klika dari cabang dan batang utamanya.Sampel  yang  digunakan  diambil  darikota Kendari Provinsi Sulawesi Tenggara.
Klika  Sirsak  ( Annona  muricata L.)  yang telah  diperoleh  dicuci  bersih  dari  kotoran  yang melekat dengan menggunakan air setelah itu   diangin- anginkan.  Setelah  kering  dipotong-potong  kecil kemudian dihaluskan, dan siap untuk diekstraksi.

## B. Metode Ekstraksi
Sampel  klika  sirsak  ( Annona muricata L.) dimasukkan kedalam wadah maserasi, lalu ditambahkan  pelarut  etanol  hingga  simplisia  tersebut terendam,  dibiarkan  selama  3  hari  dalam  bejana tertutup dan terlindungi dari cahaya matahari langsung sambil  diaduk  secara  periodik,  setelah  3  x  24  jam dilakukan  penyaringan  untuk  diperoleh  ekstrak metanolcair. Hasil penyarian yang diperoleh kemudian diuapkan dengan menggunakan rotavapor.

## C. Pembuatan Bahan dan Pengujian Sampel
a. Pembuatan Larutan KCI 10% b/v.
Sebanyak  10 gram KCI  dimasukkan kedalam  labu  tentukur  100  ml  lalu  ditambah  air suling  sedikit  demi  sedikit,  sambil  dikocok  dan dicukupkan volumenya sampai 100 ml.
b. Penyiapan   air   laut   bersih   untuk media
Air  laut  bersih  yang  digunakan  sebagai media  dan  untuk  membersihkan  media  uji  dengan cara  menyaring  dengan  menggunakan  sinter  glass sehingga bebas dari protozoa.
c. Proses penyiapan sel telur dan sperma bulu babi
Penyiapan  sel  telur  dan  sperma  bulu  babi mengacu  pada  cara  Rahman  2005  dan  Militao  et.al. 2007 dengan beberapa modifikasi adapun langkahnya yaitu sebagai berikut:
1. Landak  laut  jantan  dan  betina  yang  dewasa secara  seksual  diinduksi  3,0  ml  dengan penyuntikan KCl 10% .
2. Sperma berwana putih dari landak laut jantan dan sel  telur  berwarna      kuning      dari      landak  laut betina  dikumpulkan  dalam  gelas  kimia  secara terpisah.
3. Fertilisasi  dilakukan  dengan  cara  1  ml  sperma dan  4  ml  sel  telur  difertilkan  dalam  gelas  kimia yang berisi 50 ml air laut bebas protozoa.
4. Embrio–  embrio  tersebut  diinkubasi  2  –  3  jam.
Inkubasi  dilaksanakan  pada  suhu  14 0 atau  15 0 C, disertai  dengan  pengadukan/pergerakan  agar tidak  terjadi  pengendapan,  untuk  meningkatkan adanya  kontak  hambatan  dan  untuk  memastikan
distribusi sampel yang efisien.
5. Perlakuan yang sama dilakukan  terhadap kontrol air laut dan kontrol positif.
6. Sampel  ekstrak  etanol  masing-masing  ditimbang sebanyak  10  mg  kemudian  ditambahkan  dengan air  laut  sebanyak  10  ml  sehingga  diperoleh konsentrasi  1000  µg/ml  sebagai  stok.  Larutan stok  dipipet  sebanyak  10,100,  dan  1000  µl kedalam tabung Eppendrof  yang masing- masing telah  berisi  890  µl  dan  800    µlair    laut    bebas protozoa  lalu  ditambahkan  100µl  larutan  yang berisi  zigot  yang  diperoleh  sebanyak  100µl adalah  10,100,  dan  1000µg/ml.  Selanjutnya disimpan  pada  suhu  15-20ºC  dengan  diselingi pengocokan. Pengamatan yang membelah dilakukan  setelah  3  jam  inkubasi.  Formalin sebanyak 1 tetes ditambahkan.
7. Penghambatan  pembelahan diamati dari populasi acak  di  bawah  mikroskop  cahaya  setelah  waktu inkubasi  2-3  jam.  Jika  80  hingga  100  % penghambatan  pembelahan
8. Hasilnya  dinyatakan  sebagai  persentase  (jumlah sel  membelah  dibagi  dengan  jumlah  total  telur dikali seratus) relatif terhadap kontrol diperlakukan  pelarut.  Pengamatan  dilakukan dengan  menghitung  jumlah  sel  yang  terhambat pembelahannya dan akan dihitung sebagai IC 80 .
d. Pembuatan pembanding
1. Kontrol negatif
Kontrol  negatif  yang  digunakan  yaitu  air laut  bebas  protozoa  sebanyak  900  µl  ditambahkan 100 µl zigot.
2. Kontrol positif
Pembanding  menggunakan  vinkristin  dengan konsentrasi 0,01 µg/ml, 0,1 µg/ml, dan 1 µg/ml. Untuk membuat  konsentrasi  0,01  µg/ml  dipipet  0,1  µl  dari larutan  stoknya  lalu  ditambahkan  100  µl  zigot  dan 899,9  µl  air  laut  bebas  protozoa.  Untuk  membuat konsentrasi 0,1 µg/ml dipipet 1 µl dari larutan stoknya lalu  ditambahkan  100  µl  zigot  dan  899  air  laut  bebas protozoa. Untuk membuat konsentrasi 1 µg/ml dipipet 10  µl  dari  larutan  stoknya  lalu  ditambahkan  100  µl zigot  dan  890  µl  air  laut  bebas  protozoa.  Dilakukan replikasi  3  kali  untuk  tiap  sampel  uji,  kontrol  dan pembanding.    Selanjutnya  disimpan  pada  suhu  15- 20ºC  dengan  diselingi  pengocokan.  Pengamatan  yang membelah dilakukan setelah 2 jam inkubasi.
y = 0.79x + 4.6067 R² = 0.9748 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 P ro bit Log Konsentrasi Ektrak Etanolik Klika Sirsak y Linear (y) y = 0.46x + 7.29 R² = 0.9778 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 P ro bit Log Konsentrasi Vinkristin Series1 Linear (Series1)

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Penelitian Tabel  1 .  Hasil  perhitungan  IC 50 dan  IC 80 menurut  metode  grafik  probit  Log  konsentrasi  dari  ekstrak  etanolik klika sirsak ( Annona muricata L.) dan vinkristin.
Sampel Log Konsentrasi (x) Probit (y) Pers. Garis IC50 (mg/mL) IC80 (mg/mL) Ekstrak etanolik klika sirsak 1 5,47 y = 4,60 + 0,79x 5 x 10 -4 1,56 x 10 -3 2 6,04 3 7,05 Vinkristin -2 6,41 y =7,29 + 0,46x 1,051 x 10 -5 7,046 x 10 -4 -1 6,75 0 7,33
Gambar  1 .  Grafik  hubungan  antara  log  konsentrasi  terhadap  probit  ekstrak  etanol  klika  sirsak ( Annona muricata L.)
Gambar 2. Grafik hubungan antara log konsentrasi terhadap probit kontrol positif (obat vinkristin)

## B. Pembahasan
Penelitian  ini  menggunakan  klika  sirsak ( Annona  muricata L.)  yang  berasal  dari  provinsi Sulawesi  Tenggara  Kota  Kendari.  Tanaman  sirsak ( Annona  muricata L.)  mengandung  flavonoid,
alkaloid,  saponin  dan  tannin  yang  dimanfaatkan sebagai pengobatan  kanker (Rahmadi, 2012). Sampel terlebih  dahulu  dipotong  –  potong  kecil  kemudian dikeringkan  dengan  cara  diangin  –  anginkan  diruang terbuka.  Maksud  dari  pengeringan  yaitu  untuk
mencegah  terjadinya  reaksi  enzimatis,  dimana  reaksi ini  terjadi  jika  simplisia  mengandung  air  lebih  dari 10% (Ditjen POM, 1995).
Pengujian  antimitosis  dengan  menggunakan sel telur landak laut dimana studi penghambatan pada perkembangan  sel  zigot    landak      laut      merupakan salah    satu  model  yang  digunakan  untuk  mendeteksi aktivitas  sitotoksik,  teratogenik,  dan  antineoplastik dari  senyawa  baru.Sel  zigot  landak  laut  memiliki sensitivitas  selektif  terhadap  obat  dan  mengalami tahapan  pembelahan  seperti  halnya  sel  kanker, sehingga banyak digunakan dalam penelitian antikanker.  Misalnya  untuk  melihat  pengaruh  suatu senyawa  dalam  menghambat  laju  pembelahan  dan pertumbuhan sel yang disebut sebagai sifat antimitotik atau sitotoksik (Johannes, 2013).
Alasan  penggunaan  KCl  10  %  yaitu  karena larutan  ini  bersifat  hipotonis  sehingga mampu memecahkan dinding sel dari landak laut tersebut. Hal itulah  yang  mengakibatkan  sel  sperma  dan  sel  telur dapat  keluar.  Air  laut  bebas  protozoa  digunakan karena  jika  dalam  air  laut  terdapat  protozoa,  maka protozoa  tersebut  memakan  sel  sperma  dan  sel  telur dari landak laut. Formalin ditambahkan dengan tujuan untuk  menghambat  pembelahan  sel  dari  landak  laut setelah  diberi  perlakuan  dengan  penambahan  sampel dan  setelah  didiamkan,  hal  ini  dilakukan  agar  tidak mengganggu dalam pengamatan (Nurul, 2012).
Hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan bahwa  ekstrak  etanolik  klika  sirsak          ( Annona muricata L.)  konsentrasi  10  µg/ml,  100  µg/ml  dan 1000  µg/ml  dapat  menghambat  pembelahan  sel  telur Tripneustes gratilla Linn dengan penghambatan  rata- rata  sebesar  68,44%;  85,87%;  dan  98,85%.  Data tersebut  memperlihatkan      bahwa      efek      antimitosis akan menurun pada konsentrasi yang lebih rendah, hal ini  disebabkan  karena  semakin  kecil  konsentrasi ekstrak  yang  digunakan  maka  semakin  kecil  pula kandungan senyawa kimia yangmenghambat pembelahan  sel  telur  landak  laut.  Seperti  halnya dengan vinkristin sebagai pembanding  positif  dengan konsentrasi  0,01  µg/ml;  0,1  µg/ml;  dan  1  µg/ml dengan  penghambatan    rata-rata    sebesar    92,01%, 96,33%  dan  99,23%.  Jadi,  berdasarkan  nilai  persen penghambatan  terhadap  sel  telur  landak  laut  maka diketahui  bahwa  vinkristin  sebagai  kontrol  positif memiliki  nilai  persen  penghambatan  yang  paling besar dibandingkan dengan nilai persen penghambatan dari ekstrak etanol klika sirsak.
Hasil  analisi  probit  menunjukkan  bahwa ekstrak  klika  sirsak  memiliki  nilai  IC80  sebesar 1,56 µg/ml.  Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa  tanaman klika  sirsakdari  ekstrak  etanol  memiliki  aktivitas antimitosis dengan menggunakan metode penghambatan  sel  telur  landak  laut.  Hal  ini berdasarkan  penelitian  sebelumnya  yaitu  suatu  bahan
dinyatakan  aktif  jika  penghambatan  sel  terjadi  (IC 80- 100 )  dicapai  pada  konsentrasi  lebih  rendah  dari  16 mg/ml.  (Rahman et  al ,  2001).  Hasil  yang  diperoleh potensinya  lebih  rendah  jika  dibandingkan  dengan vinkristin  yang  memiliki  nilai  IC 80 sebesar  7,046  x 10 -4 µg/ml.
Berdasarkan  hasil  penelitian  ini  senyawa yang  memiliki  potensi  sebagai  antimitosis  pada ekstrak  klika  sirsak  adalah Annonaceus  acetogenin . Hal  ini  dikaitkan  dengan  penelitian  lain  yang membuktikan  khasiat  kandungan  asetogenin  bahwa pada kulit batang sirsak mengandung satu asetogenin, solamin,  dan  dua  triterpenoid,  stigmasterol  dan sitosteral. Annonaceous  acetogenin telah  ditemukan lebih dari 400 jenis strukturnya dan terus berkembang sampai  sekarang.  Pada  sirsak  khususnya,  telah ditemukan 50 jenis annonaceous acetogenin dari biji, kulit  batang,  daging  buah,  dan  daun  sirsak  (Wijaya, 2012).  Demikian pula  dengan Zuhud,  2011 menyatakan  bahwa  diberbagai  negara  yang  dibiayai oleh  Lembaga  Institut  Kanker  Nasional,  Amerika Serikat  dimana  dari  penelitian    tersebut    didapatkan hasil  sebanyak  20  tes  laboratorium  menemukan bahwa daun dan batang Annona muricata L. memiliki sitotoksisitas terhadap sel kanker.

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan  bahwa  ekstrak  etanol  klika  sirsak ( Annona  muricata L.)  mempunyai  potensi  sebagai antimitosis  dengan  nilai  C80  dari  ekstrak  etanol klika sirsak (Annona muricata L.) sebesar 1,56 x 10 mg/ml.

## DAFTAR PUSTAKA
Adjie,  S.,  2011, Dahsnyatnya  Sirsak  Tumpas Penyakit . Pustaka Bunda: Jakarta. Anderson,  J.  E.,  Goetz,  C.  M,.  1991. A  Blind Comparison Of Simple Benzch Top Bioassay And  Human  Tumor  Cell  Cytotoxicities  As Antitumor  Prescreens,  phytochem  Anal., volume 2.
Arthur C. Guyton dan John E. Hall. 2007. Buku Ajar
Fisiologi Kedokteran. Penerbit Buku Kedokteran EGC: Jakarta
Aslan,  L.M.,  2005. Bulu  babi,  Manfaat  dan pembudidayaanya . UNHALU Press: Kendari
Barnes R.D., 1987. Invertebrate zoology 5 th Ed. Fort Worth ,  TX:  Hacourt  Brace  Jovanovich College Publishers.
Behrman,  Kliegman.  &  Arvin.  2000. Nelson  Ilmu Kesehatan  Anak  Edisi:  15,  vol  2 .  Jakarta: EGC.
Campbell,  Neil  A.,  Jane  B.  Reece,  Lawrence  G. Mitchell.  1999. Biology,  5 th Edition .
Terjemahan  oleh  Rahayu  Lestari.  2002. Elangga. Jakarta Casarett,  L.J.,  dan  Doul  J.  1975. Toxicology,  The Basic  Sceine  of  Poison ,  First  Edition,  Mac Millan Publishing, Co, Inc, Newyork.
Ciulei J.,  1984. Metodologi  for analisa of vegetables      and      Drugs.      Faculty      of Pharmacy, Bucharest Rumania, 11-26 (Online)(http://www.berkalahayati.org/index .p  hp/bph/article/viewFile/484/383)  (diakses 11 september 2013)
Darwis, D.  2000. Teknik dasar Laboratorium dalam Penelitian  Senyawa  Bahan  Alam  Hayati . Workshop Pengembangan Sumberdaya
Manusia  di  dalam  Bidang  Kimia  Organik Bahan  Alam  Hayati.  Padang:  FMIPA Universitas Andalas.
Ditjen  POM.  1986. Sediaan Galenik . Jakarta: Departemen  Kesehatan Republik  Indonesia, Jakarta.
Fadhilla,  R.,  2013. Potensi  Tumbuhan  Lumut Sebagai Sumber Baru Antibakteri . (Online). (http://pustakaku.net/science-
technology-news/potensi-tumbuhan-  lumut- sebagai-sumber-baru-ntibakteri. Diakses tanggal 05 Oktober 2013
Gajalaksmi, Vijayalakshmi, and Rajeswari, D., 2012.
International  Journal  of  Pharmacy  and Pharmaceutical Sciences. Academic Sciences, vol 4, Issue 2. Herbal Secret of the Rainforest, Graviola, www.graviola.org/cgi/gpp.cgi ? ITIS    (Integrated   Taxonomic    Information System. 2013. Hibiscus  sabdariffa (L>)  Skeels
(online).http://www.itis.gov/serulet/singlerpt
) single Rpt?search_topic=TSN&
search_balue=505419.diakses  tanggal  18 September 2013. Johanes.2013. Aktivitas  Antimitotik  B-  Sitosterol Isolat Dari Hydroid Aglaophenia Cupressina Lamoureoux Terhadap Pembelahan  Awal  Sel  Zigot  Bulu  Babi Tripneustes  Gratilla Linn.  Jurusan  Biologi fakultas  MIPA  Universitas  Hasanuddin:
Makassar. Juhaeni,  Radi.  2011.  Budi  Daya  Sirsak  dan Pemanfaatannya. Penerbit Kanisius, Yogyakarta.
Loomis,  T.  A.,  1978. Toksisitas  Dasa r,  edisi  III,
penerjemah  Imono  Argo,  IKIP  Semarang Press.
Naziya.  2006.  Pengaruh  Pemberian  Ekstrak  Tapak Dara (C atharanthus roseus ) Dan Temulawak ( Curcuma xanthorhiza )
Terhadap  Gambaran  Histopatologi  Kelenjar Payudara  Mencit  C3H  Yang  Diinokulasi
Adenocarcinoma Mammae: Semarang Nurhasanah.  2009. Uji  Antimitosis  Ekstrak  Etanol Sangsri  (Celosia  argentea  L. ) dengan Metode  Penghambatan  Pembelahan  Sel Telur Bulu Babi . Fakultas Farmasi Universitas Muslim Indonesia: Makassar. Nurul.  2012.  Uji  Antimitosis  Pada  Sel  Bulu  Babi (Tripenustes gratilla). Universitas Hasanuddin: Makassar
Mc.  Laughlin,  J.L.,  1991. Grown  Gall  Tumours  on Potato Disc and Brine shrimp lethality test : Two  Simple  Bioassay  for  Higher  Plant Screening  and  Fractionation,  Methods  in Plant  Biochemistry,  Assay  for  Bioactivity, Vol.6 , London: AcademicPress Meyer, B. N., Ferrigni, N. R., Putman, J. E., Jacbs en,
L.  B.,  Nicols,.  D.  E.,  and  Mclaughlin,  J.  L. 1982. Brine Shrimp : A Comvenient general Bioassay For Active Plant Constituents. Plant Medica.
Militao,  C.  G.  Gardenia,  Savio.  M.  Pinheiro,  Ivana.
N.  F  Dantas,  Claudia  Pessoa,  Manoel  de Moraes. 2007. Bioassay-guided
fractionation  of  pterocarpans  from  roots  of Harpalyce  brasiliana  Benth,  Fortaleza,
Ceara, Brazil
Mishra,  S.,  Ahmad,  S.,  Kumar,  N  and  Sharma,  B.K, 2013.  Annona  muricata  (The  cancer  killer): A review. The Global Journal of Pharmaceutical Research Vol. 2(1).
Mukono,  H.  J.  2005. Toksikologi  Lingkungan . Airlangga University Press, Surabaya. Nurjanah,  S.,  and  Fathia,  S.  2011 . Antimicrobial Activity  Of  Ginger  Extract  (Zingiber officinale Roscoe) Against Several Pathogen Bacterial. Penerbit  Institut  Pertanian  Bogor; Jawa Barat. Pasaribu,  S.P.  Mei  2008. Uji  Bioaktivitas  Metaboliut Sekunder Dari Daun Tumbuhan Babadotan      (Ageratumconyzoides       L.) . Jurnal       Kimia Mulawarman. Vol. 6, No.2
Pujiati,  I.,  S.  Ningsih,  S.  Palupi  dan  Tri  Windono,
2002. Uji  toksisitas  terhadap  larva  Artemia salina Leach dari fraksi n-heksan, khloroform,  etil  asetat  dan air  ekstrak etanol        rimpang temumangga (Curcuma mangga  VaL). Prosiding  Seminar  Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XXI. Universitas Surabaya, Surabaya.
Pryanto,  2009. Toksikologi  Mekanisme,  Terapi Antidotum  dan  Penelitian  Resiko. Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi
(Leskonfi). Depok.
Rahmadi,  Wijaya.  2012. Potensi  Nanopartikel Magnetik  Ekstrak  Daun  Sirsak  Sebagai Obat Antikanker
Rahman,  A.,  Choudhary  MI,  Thomsen  WJ . 2005. Bioassay Techniques for Drug Development . Amsterdam,  The  Netherlands:  Harwood Academic Rahayu,  et  al.,  2012. Ekstrak  Daun  Sirsak ( Annona muricata. L) sebagai  Antioksidan  pada Penurunan Kadar Asam  Urat Tikus  Wistar . Jurusan  Kimia  Fakultas  MIPA  Universitas Udayana: Bali. Rosenda, E. H.  Anandita  dan Suhardjono. 2009. Uji Toksisitas  Ekstrak  Etanol  Daun  Kemangi (Ocimun  sanctum  Linn).  Terhadap  Larva Artemia salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp  Lethality  Test (BST).  Majalah Faramasi Indonesia, Semarang. Sloane,      Ethel.      2004. Anatomi      Fisiologi  untuk Pemula . EGC: Jakarta Surianto,  2011. Dashatnya  Sirsak  Tumpas Penyakit . Pustaka Bunda: Jakarta. Soemirat,  Juli.  Dkk.  2009. Toksikologi  Lingkungan. Gadja Mada University Press, Yogjakarta. Tobo,  F . 2001 .  Buku  Pengantar  Laboratorium Fitokimia I. Laboratorium Fitokimia Jurusan
Farmasi Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin, Makassar. Wijaya, M., 2012. Ekstraksi Annonaceous acetogenin dari  daun  sirsak,  (Annona  muricata Linn) sebagai senyaa bioaktif antikanker . (Skripsi). Jakarta: Universitas Indonesia. Wilmoth,  J.  H.,  1967. Biology  of  Invertebrate . Prentice-Hall, Inc. New Jersey Zuhud,  E.    A.  2011. Bukti  Kedahsyatan  Sirsak Menumpas  Kanker .  Agromedia  Pustaka: Jakarta