# Korespondensi:  Instalasi  Penelitian  dan  Pengembangan Pengendalian  Penyakit  Ikan,  Depok-Balai  Penelitian  dan Pengembangan  Budidaya  Air  Tawar.  Jl.  Sempur  No.  1,  Bogor 16154.  Tel.:  +  (0251)  8313200
E-mail:    hesta_biotek@yahoo.com
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/ma

## KLONING GEN PUTATIVE CLEAVAGE PROTEIN 1 (PCP-1) PADA UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei) YANG TERSERANG INFECTIOUS MYONECROSIS VIRUS
Hessy  Novita *) ,  Agus  Sunarto **) ,  dan  Septyan  Andriyanto *)
*) Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar
**) CSIRO Health & Biosecurity Flagship, Australian Animal Health Laboratory

## ABSTRAK
Penanggulangan penyakit ikan dapat dilakukan dengan cara meningkatkan kekebalan tubuh ikan melalui program vaksinasi. Namun vaksinasi tidak tepat untuk udang, karena udang tidak mempunyai immunological memory  seperti  ikan.  Oleh  karena  itu,  perlindungan  udang  terhadap  serangan  penyakit  viral  dengan menggunakan  RNA  interference  (RNAi).  Teknologi  RNAi  digunakan  untuk  menghalangi  (interfere)  proses replikasi infectious myonecrosis virus (IMNV) pada udang vaname dengan cara menon-aktifkan gen putative cleavage protein 1 (PCP-1),  yang berfungsi  dalam pembentukan  capsid dan  proses transkripsi  RNA IMNV. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan kloning gen putative cleavage protein 1 dalam rangka perakitan teknologi RNAi untuk pengendalian penyakit IMNV pada udang vaname. Tahapan penelitian meliputi koleksi sampel,  isolasi  RNA,  sintesis  cDNA,  amplifikasi  PCR,  purifikasi  DNA,  transformasi,  isolasi  plasmid, serta sekuensing dan analisis data. Hasil isolasi plasmid cDNA PCP-1 memperlihatkan semua koloni bakteri terseleksi ternyata membawa plasmid hasil insersi DNA gen PCP–1, hasil sekuen dengan nilai homologinya mencapai 100% dan 99% yang dibandingkan dengan sekuen di Genebank. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kloning gen putative cleavage protein 1 (PCP-1) dari udang vaname yang terserang Infectious Myonecrosis Virus berhasil dikloning yang nantinya digunakan untuk perakitan RNAi.
KATA KUNCI: Litopenaeus vannamei; IMNV; gen PCP-1; kloning
ABSTRACT: Putative Cleavage Protein 1 (PCP-1) gene cloning of white shrimp Litopenaeus vannamei infected by infectious myonecrosis virus. By: Hessy Novita, Agus Sunarto, and Septyan Andriyanto
The prevention of fish diseases can be done by increasing of the fish immune through vaccination programs. However, the vaccination can not be done for the shrimp,due to the absence of  immunological memory. Therefore, the protection of shrimp against viral diseases was done by using of RNA interference (RNAi). RNAi technology is used to interfere infectious myonecrosis virus (IMNV) replication process on white shrimp by disabling of putative cleavage protein 1 (PCP-1)gene, which functions in capsid formation and RNA transcription process. The study was conducted to perform putative cleavage protein I gene cloning in the framework of RNAi technologies for IMNV disease control in white shrimp. This study consisted of sample collection, RNA isolation, cDNA synthesis, PCR amplification, DNA purification, transformation, plasmid isolation, sequencing and data analysis.The cDNA PCP-1 plasmid isolation showeds that all selected bacterial colonies appeared lead insertion plasmid DNA PCP-1 gene with100% and 99% sequence homology compared to sequence in Genebank. The results  exhibited that the putative cleavage protein 1 (PCP-1) gene cloning from infectedwhite shrimp of IMNV was completed successfully and used for the framework of RNAi.
KEYWORDS: Litopenaeus vannamei; IMNV; PCP-1 gene; cloning

## PENDAHULUAN
Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan  (KKP) berusaha  untuk  meningkatkan  produksi  perikanan
budidaya melalui industrialisasi. Salah satu program andalannya adalah revitalisasi tambak udang. Namun demikian, banyak kendala yang dihadapi dalam pro- gram  ini,  antara  lain  serangan  penyakit,  terutama penyakit  viral  yang  menyebabkan  kematian  massal pada  udang,  penurunan  produksi,  dan  kerugian ekonomi. Penyakit infectious myonecrosis virus (IMNV) dapat menyebabkan kematian antara 40%-70% (Lightner
Kloning gen putative cleavage protein 1 (PCP-1) pada udang vaname ..... (Hessy Novita)
et  al.,  2004;  Senapin  et  al.,  2007;  OIE,  2013), menyebabkan penurunan produksi udang vaname dari 208.648 ton pada tahun 2008 menjadi 170.699 ton di tahun 2009, dan terus menurun menjadi 157.525 ton pada  tahun  2010,  sehingga  target  produksi  udang vaname sebesar 275.000 ton pada tahun 2010 tidak tercapai. Serangan penyakit IMNV diperkirakan telah menyebabkan  kerugian  sebesar  0,2-1  miliar  US$ (Sunarto, 2011).
Berbagai usaha penanggulangan penyakit udang dan ikan  telah  lama  dilakukan,  antara  lain  melalui penggunaan obat dan antibiotika. Tetapi penggunaan obat dan antibiotika untuk penanggulangan penyakit pada udang dan ikan menimbulkan masalah resistensi bakteri dan residu antibiotika pada udang dan ikan. Banyak produk perikanan asal Indonesia yang ditolak oleh  negara  pengimpor  karena  mengandung  residu antibiotika  dan  logam  berat.  Untuk  menghindari persoalan  tersebut  maka  diterbitkan  Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan No. 26/2002 tentang penggunaan  obat  ikan  dan  larangan  penggunaan antibiotika  tertentu.
Salah  satu  alternatif  penanggulangan  penyakit udang  dan  ikan  yang  ramah  lingkungan  adalah peningkatan sistem kekebalan tubuh (immunity) ikan melalui program vaksinasi sehingga ikan lebih tahan terhadap serangan penyakit tertentu. Vaksinasi pada ikan dilakukan untuk merangsang sistem kekebalan humoral (sel limfosit B) agar memproduksi antibodi yang memberikan perlindungan ikan terhadap penyakit tertentu. Strategi vaksinasi seperti pada ikan ini tidak dapat diterapkan pada udang, karena udang (dan hewan invertebrata lain) mempunyai sistem kekebalan tubuh yang  sangat  primitif  yang  berbeda  dengan  sistem kekebalan tubuh ikan.
Udang  tidak  mempunyai  immunological  memory, seperti sel limfosit B pada ikan dan mamalia, sehingga sistem kekebalan tubuh udang tidak dapat dirangsang dengan pemberian vaksin konvensional seperti pada ikan (Warr, 1997). Oleh karena itu, usaha perlindungan udang terhadap serangan penyakit dilakukan dengan menggunakan  teknologi  RNA  interference  (RNAi) (Bernstein  et  al.,  2001;  Sarathi  et  al.,  2008; Saksmerprome et al., 2009; Flegel, 2009). RNAi adalah teknologi  untuk  mengganggu  (interfere)  proses replikasi  virus  ditingkat  RNA  (Wiznerowicz  et  al., 2006).  Pada  virus  udang,  penon-aktifan  gen  (gene silencing) dilakukan dengan cara mengganggu fungsi gen yang vital untuk proses replikasi virus, misalnya gen viral protein 28 (VP28) pada white spot syndrome virus  (WSSV)  (Sarathi  et  al.,  2008),  gen  RdRp  (RNA- dependent RNA polymerase) pada yellow head virus (YHV) (Saksmerprome et al., 2009), dan gen putative cleavage
protein  1  (PCP-1)  pada  IMNV  (Loy  et  al.,  2012).  Gen PCP-1 adalah gen yang berfungsi dalam pembentukan capsid  dan  proses  transkripsi  RNA  IMNV.  Penelitian ini bertujuan untuk melakukan kloning gen putative cleavage  protein  1  yang  digunakan  dalam  rangka perakitan teknologi RNAi untuk pengendalian penyakit IMNV pada udang vaname.

## BAHAN DAN METODE

## Koleksi  Sampel  Udang  Vaname
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah hemolim udang vaname yang terinfeksi IMNV. Gejala penyakit  IMNV  yang  paling  sering  terlihat  adalah kerusakan (nekrosa) berwarna putih keruh pada otot/ daging,  terutama  pada  otot  perut  bagian  atas (punggung)  dan  ekor  yang  tampak  berwarna  putih opaque  sampai  kemerahan  (Senapin  et  al.,  2007). Sampel  udang  diperoleh  dari  lokasi  pertambakan udang di daerah Kalianda, Lampung.

## Isolasi  RNA  Total
RNA  total  diekstraksi  dari  jaringan  udang  yang terinfeksi IMNV dengan RNAeasy Mini Kit (Qiagen cata- log  kit  /ID  74104).  RNA  yang  telah  diekstraksi  ini digunakan sebagai template dalam reaksi RT-PCR.

## Sintesis  cDNA  dan  Amplifikasi  PCR
RNA hasil ekstraksi selanjutnya ditranskripsi balik menjadi cDNA (complementary DNA) dengan Oligo dT3 dengan menggunakan teknik Reverse Transcription (RT). RNA  udang  vaname  sebanyak  5  µL,  ditambah  H 2 0 sebanyak 25 µL dan diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit. Kemudian dipindahkan ke dalam es selama dua  menit.  Selanjutnya  dipindahkan  semua  larutan (mix. RNA + H 2 0) ke tabung first strand reaction mix bead  (RTG  your  prime  First  Beads).  Selanjutnya ditambahkan primer Oligo DT 3 (5’-gta ata cga ata act ata ggg cag gcg tgg tcg acg gcc cgg gct ggt ttt ttt ttt ttt ttt t-3’, konsentrasi 1 µg /3 µL) sebanyak 3 µL dan diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  satu  menit. Selanjutnya  diinkubasi  pada suhu  37°C  selama  satu jam, lalu ditambahkan 50 µL RNAse free water. Sebelum dilakukan  amplifikasi  dengan  PCR  dilakukan penghitungan konsentrasi dan kemurnian cDNA sampel dengan nanodrop.
Selanjutnya cDNA diamplifikasi dengan PCR dengan volume 100 µL; Master Mix Flexi 20 µL, MgCl 25 mM 10 µL, dNTP 10 mM 2 µL , Platinum Taq Polymerase 1 µL, primer Reverse, dan Forward (10 pmol/µL) masing- masing  2  µL,  Cdna  2  µL  dan  51  µL  ddH 2 O.  Primer Oligonukleotida yang digunakan untuk sintesis cDNA (gen  PCP-1)  didesain  dari  (GenBank  accession  no.
EF061744) yaitu IMNV95F: 5’–
AGA A AGT T TGT T TCGTAGAGCGAGA–3’ dan IMNV474R:  5’–AAAGGTGGCAGGTGTCCATACTGA–3’ (Senapin  et  al.,  2007).  Proses  PCR  dengan pradenaturasi pada suhu 95°C selama empat menit, dilanjutkan 35 siklus dengan denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, annealing pada suhu 55°C selama 30 detik, pemanjangan pada suhu 72°C selama satu menit, dan final extention pada suhu 72°C selama 10 menit (Loy et al., 2012).

## Isolasi Fragmen  DNA dari  Gel dan Purifikasi Produk  PCR
Purifikasi  DNA  dari  gel  menggunakan  QIAquick PCR, purification kit (QIAGEN catalog kit /ID 28104) mengikuti  instruksi  dari  manual.  Selanjutnya  hasil purifikasi  dikonfirmasi  dengan  elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,5%.

## Transformasi,  Seleksi,  dan  Perbanyakan Koloni  Bakteri  Terinsersi  Gen  PCP1
Hasil purifikasi cDNA dari produk PCR kemudian digunakan dalam proses transformasi ke dalam bakteri kompeten  Escherichia  coli  TOP  10  yang  diinsersi  ke plasmid p®2.1 sebagai vektor terlebih dahulu. Reaksi kloning menggunakan TOPO® TA Cloning® Kit For Subcloning With TOP10 E. coli (invitrogen) sesuai dengan inktruksi  manual  (Cat  No  K2000-01).  Hasil  kloning dicampur ke dalam tabung mikro berisi sel kompeten Escherichia coli TOP 10. Transformasi dilakukan dengan cara kejutan panas suhu 42°C selama 30 detik. Setelah diinkubasi on-ice selama 2–3 menit, ke dalam tabung mikro  ditambahkan  250  µL  larutan  SOC  (1,2  g polypeptone; 0,3 g yeast extract; 0,035 g NaCl; 0,011 g KCl; 600 µL MgCl 2 1M; 600 µL MgSO 4 1M dan 60 µL glucose 2M dalam 60 mL SDW). Selanjutnya tabung mikro berisi bakteri hasil transformasi diinkubasi pada suhu 37°C selama satu jam. Kemudian bakteri disebar di atas cawan Luria agar yang mengandung X-gal dan ampisilin, dan inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama semalam. Koloni  putih yang tumbuh di  media Luria agar + ampisilin + X-Gal diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 4  mL  LB  broth  +  ampisilin.  Selanjutnya  diinkubasi selama  24  jam  pada  suhu  37°C  dengan  shaker, dilanjutkan dengan isolasi plasmid.

## Verifikasi  Hasil  Isolasi  Plasmid  dengan  PCR
Isolasi  plasmid  dari  koloni  putih  dilakukan rnenggunakan kit GeneAid High Speed Plasmid Mini Kit dengan  prosedur  sesuai  dengan  manual  (Cat. NoPDL100).  Plasmid  yang  telah  diisolasi,  kemudian di PCR dengan primer IMNV95F: 5’- AGA A AGT T TGT T TCGTAGAGCGAGA-3’ dan
IMNV474R:  5’-AAAGGTGGCAGGTGTCCATACTGA-3’ (Senapin et al., 2007). Proses PCR dilakukan dengan pradenaturasi pada suhu 95°C selama empat menit, dilanjutkan 35 siklus dengan denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, annealing pada suhu 55°C selama 30 detik, pemanjangan pada suhu 72°C selama satu menit, dan final extention pada suhu 72°C selama 10 menit (Loy et al., 2012).

## Sekuensing  dan  Analisis  Data
Plasmid yang telah diisolasi dan di PCR kemudian disekuensing dengan menggunakan mesin pengurut DNA  otomatis  (Automated  DNA  Sequencer  ABI  Prism 310,  Perkin-Elmer).  Analisis  Data  untuk  sekuens Nukleotida dibandingkan dengan database di Bank Gen dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools)  yang disediakan  NCBI  (National  Center  for  Bio- technology information) melalui http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.  Alignment  dan persentase  kesamaan  dianalisis  menggunakan  pro- gram MEGA 5.

## HASIL DAN BAHASAN

## Isolasi  RNA  Total  dan  Sintesis  cDNA
RNA  total  dari  organ target  udang  vaname  yang terinfeksi  IMNV  telah  berhasil  diekstraksi  dan disintesis  menjadi  cDNA  dengan  panjang  fragmen target DNA 379 bp setelah dikonfirmasi dengan PCR. Hasil amplifikasi PCR dan dielektroforesis dengan gel agarosa 1,5% ditunjukkan pada Gambar 1. Pita cDNA dengan panjang sekitar 379 bp yang diberi tanda panah pada gambar merupakan kandidat fragmen gen PCP-1.
Teramplifikasinya cDNA dengan primer IMNV95F dan IMNV474R dengan ukuran 379 bp menunjukkan bahwa sintesis cDNA total melalui proses transkripsi balik telah  menghasilkan pita  tunggal. Sampel  DNA dikatakan spesifik dan berhasil diamplifikasi apabila hasil analisis elektroforesis menunjukkan terdapatnya pita tunggal DNA dengan ukuran sesuai berdasarkan penanda yang telah diketahui sebelumnya (Settanni et al.,  2006).  cDNA  yang  diuji  kemurnian  dan konsentrasinya  hasilnya  dipaparkan  pada  Tabel  1. Berdasarkan hasil pengukurun dengan nanodrop pada masing-masing sampel, cDNA yang berhasil diisolasi memiliki  kemurnian  yang  relatif  tinggi,  dilihat  dari nisbah A260/280 yang mempunyai nilai terendah 1,88 dan kemurnian tertinggi 1,95. Adapun perolehan cDNA tertinggi  adalah  sampel  K1  yaitu  700  ng/µL.  DNA dikatakan  murni  jika  rasio  OD260/OD280  berkisar antara 1,8 sampai 2,0. Kemurnian DNA memengaruhi hasil  PCR  di  mana  jika  pada  ekstrak  DNA  banyak kontaminannya, maka akan mengganggu proses PCR (Sambrook & Russel, 2001).
Transformasi pada Bakteri E. coli TOP  10
cDNA  udang  vaname  yang  telah  diamplifikasi dengan  PCR  dengan  target  379  bp  dan  telah dipurifikasi,  selanjutnya  kemudian  diklon  ke  dalam TOPO TA Cloning. Hasil pengklonan tersebut kemudian dimasukkan  melalui  proses  transformasi  ke  dalam bakteri  E.  coli  TOP  10.  Keberhasilan  transformasi dievaluasi menggunakan metode seleksi koloni biru putih.  Proses  transformasi  telah  berhasil  dilakukan yang  ditunjukkan  dengan  tumbuhnya  transforman koloni putih bakteri E. coli TOP 10 pada media-media seleksi yang  mengandung antibiotik  ampisilin +  X- gal. Hasil seleksi koloni biru-putih pada koloni E. coli TOP  10  yang  berwarna  putih  ditunjukkan  pada Gambar 2.
Koloni  putih  yang  tumbuh  pada  media  seleksi merupakan E. coli TOP 10 yang mengandung insersi atau  yang  membawa  gen  target  PCP-1,  sedangkan koloni yang berwarna biru merupakan E. coli yang tidak mengandung  insersi  (Gambar  2).  Gen  lacZ
menyandikan  (  -galaktosidase)  yang  mengubah substrat  X-gal  menjadi  berwarna  biru.  Ketika  cDNA PCP-1 menyisip pada gen LacZ, maka gen LacZ tidak dapat diekspresikan sehingga koloni E. coli berwarna putih. Bila tidak ada fragmen yang menyisip pada LacZ maka gen X-gal diekspresikan sehingga koloni yang terbentuk berwarna biru.

## Verifikasi  Hasil  Isolasi  Plasmid  dengan  PCR
Isolasi  plasmid  telah  dilakukan  dengan menggunakan kit Gene AidHigh Speed Plasmid Mini Kit dan hasil elektroforesis ditunjukkan pada Gambar 3. Seleksi  melalui  Verifikasi  PCR  koloni  untuk memastikan adanya sisipan gen PCP–1 pada plasmid rekombinan  yang  juga  menunjukkan  proses transformasi ini telah berhasil dilakukan. PCR koloni menggunakan primer IMNV95F dan IMNV474R, dengan hasil  fragmen  DNA  berukuran  379  bp.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  semua  koloni  bakteri  yang berwarna putih dalam master plate membawa plasmid dengan insersi DNA gen PCP–1. Hasil amplifikasi plas-
Gambar 1. Hasil  amplifikasi  cDNA  udang  vaname  Litopenaeus  vannamei menggunakan  primer  IMNV95F  dan  IMNV474R,  no.  1-3  cDNA,  4
(kontrol negatif), dan M (Marker)
Figure 1. Results of cDNA amplification of white shrimp Litopenaeus vannamei using IMNV 95F and IMNV 474R primer, no. 1-3 cDNA, 4 (negative control), and
M  (Marker)
Tabel 1. Hasil penghitungan uji kemurnian dan konsentrasi cDNA Table 1. The testing results of the purity and concentration of cDNA Sampel Sample Kemurnian A (260/280) Purity A (260/280) Konsentrasi cDNA Concentration cDNA (ng/µL) K-1 1.95 700 K-2 1.89 623.23 K-3 1.88 677.35

## 379 Bp
mid rekombinan yang memberikan hasil positif pada tahap  verifikasi  dengan  PCR  menunjukkan terbentuknya pita DNA yang spesifik dengan ukuran 379 bp. Hasil verifikasi kandidat rekombinan melalui PCR  menunjukkan  bahwa  gen  PCP–1  tersisip  dalam plasmid p®2.1.
Hasil penelitian Loy et al. (2012) menyatakan bahwa dengan desain primer IMNV95F dan IMNV474R untuk perakitan RNAi dsRNA95-475, yang mengapit protein pada  ujung  5'  dari  genom  IMNV  yaitu  gen  PCP-1 memberikan perlindungan yang lebih tinggi terhadap penyakit  IMNV  dalam  dosis  dan  durasi  pemberian dsRNA jika dibandingkan dengan dsRNA 3764-4805
yang menargetkan daerah major capsid protein (MCP), yang  hanya  memberikan  perlindungan  intermediate, ketika dsRNA diberikan 48 jam setelah diuji tantang dengan virus IMNV. Daerah dsRNA 95-475 ini meliputi Protein-1  dengan  bagian  terminal  Protein-2  yang berfungsi dalam menekan kekebalan tubuh inang. Pro- tein-1  terdapat  gen  yang  terlibat  dalam  proses patogenesis  virus  pada  inang,  juga  faktor  yang diperlukan  untuk  replikasi  virus,  atau  protein  yang mengubah  respons  inang  terhadap  antivirus  RNAi. Sehingga  dapat  digunakan  sebagai  bagian  yang ditargetkan  untuk  perakitan  RNAi  yang  dapat menghambat RNA dalam replikasi genom virus.
Gambar 2. Koloni  E.  coli  TOP  10  yang  terbentuk  setelah ditransformasikan pada TOPO TA Cloning
Figure  2. E. coli TOP 10 colonies formed after transformed on TOPO TA
Cloning
transforman
koloni putih
Gambar 3. Hasil  amplifikasi  cDNA  plasmid  hasil  isolasi  dari  klon IMNV menggunakan GeneAid High Speed Plasmid Mini Kit. No. 1-9 plasmid yang membawa insert. M: Marker
Figure 3.
Amplification results of cDNA plasmids isolated from IMNV clones by using GeneAid High Speed Plasmid Mini Kit. No. 1-
9 plasmid with insert. M: Marker
M      1      2       3      4       5      6      7        8      9      (-)    M 379 Bp

## Analisis  Hasil  Sekuen  dari  Purifikasi  Plasmid
Hasil  sekuensing  menunjukkan  kesejajaran (alignment) nukleotida dengan program BLAST antara hasil sekuen dari produk plasmid dengan sekuen yang ada di Genebank. Fragmen gen PCP-1 dalam penelitian ini memiliki nilai identitas yang mencapai 100% dan 99% dengan sekuen yang ada di Genebank dalam spesies yang  sama.  Nilai  homologi  sampel  K1  (100%)  yang identik dengan sekuen IMNV dari Brazil, K2 (99%), dan K3 (99%) identik dengan sekuen dari Genebank yang berasal  dari  sekuen  IMNV  Indonesia  sebagaimana disajikan  pada  Tabel  2.  Konfirmasi  identitas  sekuen DNA dilakukan melalui sekuensing fragmen gen PCP- 1 dan penjajarannya dengan sekuen gen yang terdapat pada  Genebank.  Hal  tersebut  bertujuan  untuk memastikan bahwa gen yang teramplifikasi merupakan fragmen gen target sesuai yang diharapkan.
Sekuensing yang dilakukan dua arah menghasilkan sekuen DNA yang berukuran 379 bp. Analisis melalui BLASTn menunjukkan bahwa gen yang tersisip dalam plasmid  p®2.1  merupakan  fragmen  gen  PCP-1. Persentase  tingkat  homologi  sekuen  nukleotida ditunjukkan dengan kemiripan hasil penjajaran sekuen yang  terlihat  dari  nilai  identitas.  Tingkat  homologi juga  dapat  diketahui  dari  nilai  Expect  value  (E-value) yang terdapat pada hitlist BLASTn. Nilai E-value 0 (nol) pada hasil analisis menunjukkan bahwa kedua sekuen tersebut  memiliki  homologi  yang  tinggi.  Menurut Claverie & Notredame (2007), E-value merupakan nilai dugaan  yang  memberikan  ukuran  statistik  yang signifikan terhadap kedua sekuen. Semakin tinggi nilai E-value maka semakin rendah homologi antara kedua sekuen, sebaliknya semakin rendah nilai E-value maka semakin tinggi homologi antara kedua sekuen. Secara
teoritis kisaran skor dengan E-value >e- 04 pada analisis BLAST  menunjukkan  tingkat  kemiripan  yang  tinggi (Claverie & Notredame, 2007).
Peranan  suatu  gen  dalam  pengendalian  suatu penyakit pada ikan dapat dipelajari melalui pendekatan dua  arah,  yaitu  meningkatkan  ekspresi  gen  dengan mengkonstruksi  vektor  over  expression,  serta menghentikan atau menurunkan ekspresi gen antara lain dengan mengkonstruksi RNAi (RNA interference). Teknik RNAi merupakan salah satu cara yang efektif untuk menguji fungsi biologi mRNA target pada ikan. Perkembangan  terkini  mengenai  vektor  RNAi  yang menggunakan  promotor  konstitutif  dan  teknik pengklonan  secara  Gateway®  memudahkan  untuk mengkonstruksi vektor RNAi yang mempunyai sekuen pemicu  dsRNA  dan  memudahkan  pula  untuk menganalisis  fungsi  gen  target.  RNAi  dapat menyebabkan  mRNA  terdegradasi  sehingga  gen menjadi  tidak  berfungsi.  Dengan  mengkonstruksi RNAi dari gen PCP-1 diharapkan hasil yang diperoleh dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai bahan untuk  mempelajari  dan  mengaplikasikan  kandidat antivirus RNAi dalam pengendalian penyakit IMNV.

## KESIMPULAN
Gen putative cleavage protein 1 (PCP-1) dari udang vaname  yang  terserang  Infectious  Myonecrosis  Virus berhasil dikloning, berdasarkan hasil isolasi plasmid cDNA PCP-1 yang menunjukkan semua koloni bakteri terseleksi  membawa  plasmid  hasil  insersi  DNA  gen PCP–1.  Analisis  kesejajaran  urutan  nukleotida menunjukkan  bahwa  cDNA  dari  gen  PCP-1  nilai homologinya mencapai 100% dan 99% dengan sekuen di Genebank yaitu identik dengan sekuen dari Brazil dan Indonesia.
Tabel 2. Hasil analisis sekuen dengan BLASTn
Table 2. Sequence analysis by BLASTn Isolat Isolate Homologi Homology Kemiripan Identity  (%) E-value Nomor akses Accession number K-1 Penaeid shrimp infectious myonecrosis virus strain Brazil complete 100 0.0 KJ556923.1 K-2 Penaeid shrimp infectious myonecrosis virus strain Indonesia, complete genome 99 5.00E-174 KF836757.1 K-3 Penaeid shrimp infectious myonecrosis virus strain Indonesia, complete genome 99 5.00E-174 KF836757.1

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kami  kepada  Johan  Afandi  yang membantu  pelaksanaan  penelitian.  Penelitian  ini merupakan  kegiatan  yang  didanai  oleh  DIPA-APBN Tahun 2013.

## DAFTAR  ACUAN
Bernstein, E., Caudy, A.A., Hammond, S.M., & Hannon, G.J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the  initiation  step  of  RNA  interference.  Nature, 409, 363–366.
Claverie,  J.-M.,  &  Notredame,  C.  (2007). Bioinformatics for  Dummies. 2nd  edition. Wiley Publishing, Inc. Indiana, 417 pp.
Flegel, T.W. (2009). Hypothesis for heritable, anti-vi- ral immunity  in crustaceans  and insects.  Biology Direct, 4, 32.
Lightner, D.V., Pantoja, C.R., Poulos, B.T., Tang, K.T.F., Redman,  R.M.,  Pasos  de  Andrade,  T.,  &  Bonami, J.R. (2004). Infectious myonecrosis: new disease in Pacific white shrimp. Glob. Aquac. Advocate, 7, 85.
Loy, J.D., Mogler, M.A., Loy, D.S., Janke, B., Kamrud, K., Scura, E.D., Harris, D.L.H., & Bartholomay, L.C. (2012). dsRNA provides sequence-dependent pro- tection  against  infectious  myonecrosis  virus  in Litopenaues  vannamei.  Journal  of  General  Virology, 93, 880-888.
OIE.  (2013).  Infectious  myonecrosis  virus. www.oit.int.
Saksmerprome, V., Charoonnart, P., Gangnonngiw, W., & Withyachumnarnkul, B. (2009). A novel inexpen- sive  application  of  RNAi  technology  to  protect shrimp  from  viral  disease.  Journal  of  Virological Methods, 162, 213-217.
Sambrook, J., & Russel, D.W. (2001). Molecular clon- ing: A laboratory manual. 3rd Ed. Cold Spring Har- bor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN:0- 87969-576-3, 1885 pp.
Sarathi,  M.,  Martin,  C., Simon,  C.,  Venkatesan,  A.S., & Hameed, S. (2008). Oral administration of bac- terially expressed VP28dsRNA to Protect Penaeus monodon from White Spot Syndrome Virus. Marine Biotechnology, 10, 242–249.
Senapin, S., Phewsaiya, K., Briggs, M., & Flegel, T.W. (2007).  Outbreaks  of  myonecrosis  virus  (IMNV) in  Indonesia  confirmed  by  genome  sequencing and  use  of  an  alternative  RT-PCR  detection method. Aquaculture, 266, 32-38.
Settanni,  L.,  Valmori,  S.,  Sinderen,  D.W.,  Suzzi,  G., Paparella, A., & Corsetti, A. (2006). Combination of multiplex PCR and PCR denturing gradient gel electrophoresis  for  monitoring  common  sour- dough-associated  Lactobacillus  spesies.  Applied and Environmental Microbiology, 72(5), 3793-3796.
Sunarto,  A.  (2011).  Current  status  of  infectious myonecrosis virus (IMNV) in Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) in Indonesia. Paper presented at One Day Workshop on Prevention and Control of IMNV in Indonesia. Keynote speaker Prof. Donald V. Lightner, University of  Arizona and OIE Refer- ence Laboratory for IMNV. Jakarta, 14 July 2011. 6 pp.
Warr,  G.W.  (1997).  The  adaptive  immune  system  of fish.  In  fish  vaccinology,  edited  by  Gudding,  R., Lillehaug, A., Midtlyng, P.J., & Bown, F. Develop- ment of Biological Standard, 90, 15-21.
Warren, A.A., Meola, D.M., Wang, Y., Guo, X., Zhou, L.,  Xiang,  J.,  Moss,  S.,  Arce,  S.,  Warren,  W.,  Xu, Z.,  &  Bell,  K.  (2006).  Isolation  and  mapping  of telomeric pentanucleotide (TAACC) repeats of the Pacific whiteleg shrimp, Penaeus vannamei, using fluorescence in situ hybridization. Mar. Biotechnol., 8, 467–480.
Wiznerowicz,  M.,  Jolanta,  S.,  &  Trono,  D.  (2006). Tuning  silence:  conditional  systems  for  RNA  in- terference. Nature Methods, 3, 682-688.