## E-ISSN : 2527-712X Vol. 8 (No.1) Juni 2023, 19-26
Jurnal Analis Laboratorium Medik Avalilable Online http://e-journal.sari-mutiara.ac.id/index.php/ALM
DOI: https://doi.org/10.51544/jalm.v8i1.3806
© 2023 Jurnal Analis Laboratorium Medik. This is an open accessarticleunder the CC BY-SA license

## DESAIN PRIMER SECARA IN SILICO UNTUK AMPLIFIKASI GEN tcdA BAKTERI CLOSTRIDIUM DEFFILCILE
I Gusti Agung Ayu Satwikha Dewi 1 , Amellya Octifani 2
1 Prodi DIV Teknologi Laboratorium Medis, Fakultas Ilmu-ilmu Kesehatan, Universitas Bali Internasional
21 Fakultas Ilmu Kesehatan, Prodi D3 Teknologi Laboratorium Medis, Universitas Anwar Medika Email: ayusatwikha@iikmpbali.ac.id

## ABSTRACT
Antibiotics are drugs used to fight infections caused by bacteria. C. difficile bacteria is a bacterium that causes Clostridium difficile infection (ICD). Toxin A of C. difficile bacteria is exotoxin A (tcdA) which is a virulence factor that causes disease. Toxin A can damage the intestinal mucosa and cause bleeding. The cost of examining and treating patients with AAD and PMC is very high, so the dosage must be determined correctly.  Laboratory  tests  function  to  determine  the  presence  or  absence  of  an  ICD.  The  discovery  of specific  biomarkers  is  a  discovery  priority  to  improve  the  quality  of  laboratory  tests.  Specific  primary design  is  an  important  step  in  all  types  of  laboratory  examination  methods,  one  of  which  is  molecular examination  by  PCR.  The  primary  design  must  have  specific  properties  so  as  to  be  efficient  at  target amplification. This study aims to obtain a primer design that can be used to limit the amplification area of the TcdA gene in silico. This study used a literature study from the NCBI genbank to obtain the tcdA gene sequence  of  C.  defficile  bacteria  with  accession  number  DQ902560.1.  The  tcdA  gene  sequence  of  C. difficile  bacteria  was  analyzed  using  Primer3Plus  to  determine  whether  there  is  hairpin  and  dimer formation. Furthermore, identification was carried out using web-based in silico PCR to determine the number of amplicon and visualization on the electrophoretic gel. The level of tcdA gene homology in the species group in the BLAST test. The results showed that the best primer design for in silico detection of the tcdA gene of C. difficile was the forward primer 5'-GCAGATGCCAAGAGACACAC-3' and the reverse primer 3'-GCAGATGCCAAGACACACAC-5'. The primary design is able to amplify the tcdA gene region with a size of 247 amplicons.
Keywords: tcdA; in silico; primer; Clostridium difficile

## PENDAHULUAN
Antibiotik merupakan obat yang bermanfaat bagi manusia yang mana obat ini digunakan  untuk  melawan  infeksi  akibat bakteri  (Debie Rizqoh et al., 2016). Obat ini bekerja dengan cara membunuh bakteri atau mempersulit bakteri untuk berkembang biak dalam tubuh  manusia(Purba  & Manurung2, 2017). Ibarat pedang bermata dua antibiotik akan bermanfaat bagi tubuh manusia apabila digunakan  dengan  bijak,  akan  tetapi  jika
antibiotik  digunakan  secara  tidak  benar maka justru akan menimbulkan infeksi pada tubuh  penggunanya  (Marra  et  al.,  2016). Infeksi Clostridium  difficile (selanjutnya ditulis  ICD)  merupakan  infeksi  akibat kesalahan menggunakan antibitoik. Peristiwa ICD di rumah sakit sudah menjadi ancaman  global  karena  angka  kejadiannya semakin meningkat selama beberapa dekade terakhir (Liwang & Sinto, 2021) . Kasus ICD di
I Gusti Agung Ayu Satwikha Dewi et. all / Desain Primer Secara In Silico Untuk Amplifikasi Gen tcdA Bakteri Clostridium Deffilcile
DOI: https://doi.org/10.51544/jalm.v8i1.3806
© 2023 Jurnal Analis Laboratorium Medik. This is an open accessarticleunder the CC BY-SA license
Jawa  Tengah  cukup  tinggi  beberapa  faktor risiko  yang  mempengaruhi  yaitu  lama perawatan,  pemakaian  antibiotik  dan  lama penggunaan  antibiotik  (San  Millán  et  al., 2013).
Bakteri C.  difficile merupakan  bakteri penyebab ICD tersebut. C. difficile merupakan  bakteri  basil  gram  positif  yang bersifat  anaerob,  berbentuk  spora  serta dapaat  menghasilkan  toksin.  Toksin  yang dihasilkan  oleh  bakteri C.  difficile adalah eksotoksin  A  (tcdA)  dan/atau  toksin  B (tcdB)  yang  berperan  sebagai  faktor virulensi  penyebab  penyakit.  Toksin  A bersifat  enterotoksin  yang  dapat  merusak mukosa  usus  dan  merangsang  pengeluaran cairan, sementara toksin B bersifat sitotoksin yang  dapat  merusak  sel-sel  kolon  (Riley  et al., 2013) Lebih parahnya dapat menyebabkan  erosi  pada  mukosa  usus  dan merangsang  pengeluaran  cairan  dari  usus, selain itu toksin ini juga dapat menyebabkan perdarahan (Putri, 2015).
Biaya pemeriksaan dan pengobatan pada seorang  penderita associated  antibiotic diarrhea (AAD) maupun ( Pseudo Membrane  Colitis ) PMC  sangat  tinggi, sehingga  perlu  memperhatikan  lamanya pemakaian  antibiotika  dan  besarnya  dosis yang  diberikan  kepada  penderita  penyakit infeksi  dengan  tepat  (Kumala,  2004). Sehingga diagnosis yang tepat menjadi kunci dalam pengobatan yang tepat untuk ICD.
Uji  laboratorium  telah  dikembangkan seperti uji mikrobiologi, uji serologi dan uji molekuler  untuk  mendeteksi  bakteri C. difficile. Uji  kultur  jaringan  dianggap sebagai  standar  emas  pemeriksaan C. difficile., namun  memiliki  keterbatasan lamanya  waktu  yang  dibutuhkan  untuk pemeriksaan dan rentan  trejadi kontaminasi (Lagier  et  al.,  2015)  .  Uji  serologi  menjadi salah satu  metode  yang  kerap digunakan di laboratorium  dalam  deteksi C.  difficile (Carroll et al., 2020) , namun belum mampu deteksi cepat toksin TcdA yang dikeluarkan oleh bakteri C. difficile (Lall et al., 2017) . Uji
PCR menjadi salah satu tes amplifikasi asam nukleat yang mampu mendeteksi gen toksin TcdA  dari  bakteri C.  difficile .  Pemeriksaan ini  memliki  tingkat  kepekaan  yang  tinggi (McDonald et al., 2018).
Penemuan  biomarker  menjadi  prioritas utama  peneliti  selama  satu  dekade  terakhir ini.  Biomarker  membantu  peningkatan metode  pemeriksaan  yang  lebih  spesifik  ke target  (Purba  &  Manurung,  2016).  Deteksi bakteri  bakteri C.  difficile dapat  ditemukan dengan  pengembangan  deteksi  terhadap toksin A (TcdA) (Huang et al., 2015). Desain primer  menjadi  langkah  penting  dalam semua jenis metode PCR untuk memastikan amplifikasi  spesifik  dan  efisien  dari  urutan target (Kalendar et al., 2011). Primer spesifik dibuat dari sekuen DNA yang telah diketahui urutannya.  Primer  spesifik  dapat  dirancang untuk  mengamplifikasi  gen  tertentu,  yang memberikan  peluang  lebih  besar  untuk mendapatkan  hasil  PCR  yang  baik  sesuai target  (Ethica  et  al.,  2019).  Sekuen  primer yang spesifik akan mampu memberikan efek besar pada spesifisitas dan sensitivitas reaksi (Ethica et al., 2019) (Ye et al., 2012).
Tujuan  penelitian  ini  yaitu  memperoleh desain  primer  yang  dapat  digunakan  untuk membatasi  daerah  amplifikasi  terhadap  gen TcdA  yang  didesain  secara in  silico. Sehingga  dengan  primer  yang  didesain tersebut,  dapat  digunakan  dalam  proses amplifikasi menggunakan PCR.

## METODE PENELITIAN
Studi literatur digunakan untuk mendapatkan  informasi  mengenai  faktor virulensi  dari  bakteri C.  difficile terutama toksin  spesifik  yang  dihasilkannya.  Toksin spesifik  tersebut  dicari  urutan  gennya  dari genebank
NCBI (Pusat
Informasi Bioteknologi  Nasional)  dengan  nomor aksesi  DQ902560.1  (tcdA)  (Gambar  1). Urutan gen tcdA ini yang digunakan sebagai dasar  primer  beserta  model  3-D-nya (Gambar 2).
I Gusti Agung Ayu Satwikha Dewi et. all / Desain Primer Secara In Silico Untuk Amplifikasi Gen tcdA Bakteri Clostridium Deffilcile
DOI: https://doi.org/10.51544/jalm.v8i1.3806
© 2023 Jurnal Analis Laboratorium Medik. This is an open accessarticleunder the CC BY-SA license
Gambar 1. Urutan gen tcdA (Accesion number DQ902560.1)
Gambar 2. Struktur 3-D protein TcdA Clostridium difficile yang divisualisasikan dengan RCBS PDB
Selanjutnya, dilakukan perancangan
primer  menggunakan  Primer3Plus  dari sekuen  gen  target  (Ethica  et  al.,  2019). Rancangan  primer  kemudian  diidentifikasi dan dipilih untuk menghindari pembentukan hairpin dan dimer (Ethica et  al .,  2017).
Primer  yang  baru  yang  telah  diidentifikasi, digunakan sebagai input untuk PCR in silico berbasis  web  (http://  insilico.ehu.es/  PCR/) menggunakan  semua  genom Clostridium yang  diambil  dari  sumber databased nya
(Bikandi et al., 2004).
Terakhir  dilakukan  analisis  sekuens dengan  mengklik  pita  DNA  yang  muncul sebagai produk PCR keluaran program atau menggunakan  alat  'Amplify  Show  Result'. Langkah  ini  bertujuan  untuk  memperjelas apakah  produk  PCR in  silico (amplikon) spesifik untuk genom C. difficile dan benar- benar  merupakan  bagian  dari  gen  yang ditargetkan.
I Gusti Agung Ayu Satwikha Dewi et. all / Desain Primer Secara In Silico Untuk Amplifikasi Gen tcdA Bakteri Clostridium Deffilcile
DOI: https://doi.org/10.51544/jalm.v8i1.3806
© 2023 Jurnal Analis Laboratorium Medik. This is an open accessarticleunder the CC BY-SA license

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Gen  tcdA  merupakan  penyusun  protein TcdA yang berfungsi sebagai eksotoxin yang akan  menyebabkan  kematian  kolonosit, hilangnya fungsi barier intestinal, dan kolitis neutrofilik  (Putri,  2015).  Urutan  gen  pada gambar  1  digunakan  sebagai  dasar  desain primer. Struktur 3D protein TcdA
ditampilkan  sebagai  uji  validitas  jika sekuens DNA genom yang digunakan untuk merancang  primer  (tcdA)  menghasilkan
protein  terlipat  (fungsional).  Gambar  2 menunjukkan  bahwa  protein  TcdA  terlipat, dan  karenanya  berfungsi.  Hal  ini  membuka kemungkinan  untuk  menggunakan  protein TcdA  sebagai  penanda  protein  bakteri  atau untuk  mengembangkan  vaksin  maupun reagen dengan menggunakan protein tersebut sebagai target. Hasil rancangan desain primer menggunakan Primer3Plus diperoleh sebagai hasil input urutan gen tcdA (Gambar 1 dan 2) yang tercantum dalam Tabel 1.

## Tabel 1. Hasil rancangan desain primer menggunakan Primer3Plus
Urutan  primer  yang  digunakan  untuk amplifikasi PCR dapat memberikan pengaruh  besar  pada  spesifisitas  dan sensitivitas reaksi. Penggunaan Primer3Plus membantu  dalam  memperoleh  data  seperti urutan  primer,  panjang  primer,  titik  leleh, ukuran  produk,  persentase  GC conten serta amplikon.  Data  pada  tabel  1  memudahkan dalam  memilih  desain  primer  yang  tepat dengan kualitas yang baik.
Urutan gen yang diinput ke Primer3Plus  memperoleh  5 pair urutan primer  dengan  karakteristik  yang  berbeda- beda.  Temperatur  titik  leleh/ melting  point antara 57,1 – 60,0  C.
Menurut Biassoni, et al . (2020), panjang primer  yang  ideal  yaitu  18-24  nukleotida. Tabel 1 menunjukkan panjang pasang primer 1-5 yaitu sebanyak 20 buah, sehingga pair 1- 5  memiliki  panjang  primer  yang  ideal. Ukuran  produk primer  yang  diperoleh
memiliki  rentang  antara  150-248  bp. Menurut (Riley et al., 2013) ukuran produk yang  ideal  antara  80-300  basis,  sehingga ukuran  produk  primer  memenuhi  syarat ideal.
Persentase  GC conten memberikan informasi  mengenai  kekuatan  annealing.
Menurut (Raso & Alessandro, 2014) , kandungan primer harus memiliki kandungan  GC  sekitar  50%.  Tabel  1 menunjukkan  persentase  GC conten antara 40-50%, sehingga pasang primer 1-5 masuk dalam rentang yang direkomendasikan.
Urutan  primer  komplementer perlu diperhatikan,  bahwa  desain  primer  tidak boleh  mengandung  homologi  intra-primer lebih  dari  3  pasang  basa.  Jika  primer memiliki  wilayah  homologi  sendiri  karena dapat  menyebabkan  "snap  back".  Bahaya yang  terkait  lainnya  adalah  homologi  yang terjadi  antar-primer:  Homologi  parsial  di
Primer pair No.
Primer sequence Panjang primer Tm (  C) Ukuran produk (bp) GC content Amplifocation Size (bp) 1. F5’-CACAAAGATGGTGCATGGTC-3’ 20 60,0 150 50,0% 150 R3’-TCATTTTGTCCTTCATCACG 20 57,1 150 40,0% 2. F5’-TCACAAAGATGGTGCATGGT-3’ 20 60,0 151 45,0% 151 R3’-TCATTTTGTCCTTCATCACG-5’ 20 57,1 151 40,0% 3. F5’-AGCAGATGCCAAGAGACACA-3’ 20 59,6 248 50,0% 248 R3’-TCATTTTGTCCTTCATCACG-5’ 20 57,1 248 40,0% 4. F5’-TTCACAAAGATGGTGCATGG-3’ 20 60,0 152 45,0% 152 R3’-TCATTTTGTCCTTCATCACG-5’ 20 57,1 152 40,0% 5. F5’-GCAGATGCCAAGAGACACAC-3’ 20 59,4 247 55,0% 247 3’-GCAGATGCCAAGAGACACAC-5’ 20 57,1 247 40,0%
I Gusti Agung Ayu Satwikha Dewi et. all / Desain Primer Secara In Silico Untuk Amplifikasi Gen tcdA Bakteri Clostridium Deffilcile
DOI: https://doi.org/10.51544/jalm.v8i1.3806
© 2023 Jurnal Analis Laboratorium Medik. This is an open accessarticleunder the CC BY-SA license
wilayah  tengah  dua  primer  yang  dapat mengganggu  hibridisasi  atau  annealing  dan memicu pembentukan dimer primer (Ethica et  al.,  2019).  Table  1  menunjukkan  bahwa hanya pasang primer 5 yang tidak memiliki homologi  intra-primer,  sedangkan  yang lainnya  punya.  Sehingga  hanya  pasang primer  5  yang  direkomendasikan  untuk desain primer gen tcdA bakteri C. difficile.
Pasang  primer  yang  sudah  memenuhi kualifikasi  diinput  ke in  silico PCR  pada http://  insilico.ehu.es/  PCR/.  PCR in  silico
disebut  juga  e-PCR  atau  PCR  virtual  yang berfungsi  memberikan  gambaran  awal tentang  sifat  primer,  cara  primer  berikatan, lokasi  pengikatan  primer  dan  produk  yang akan dihasilkannya. Dengan melakukan hal tersebut  efisiensi  dan  sensitivitas  primer hasil desain dapat diprediksi.
Pasang primer 5 selanjutnya dimasukkan ke dalam PCR in silico untuk mengemplifikasi  fragmen  gen  tcdA  dari C. difficile .
Gambar 3. Input desain primer pair 5 ke dalam PCR in silico , untuk mengamplifikasi fragmen gen tcdA dari Clostridium difficile (Ethica dkk., 2018).
Tabel 2 menunjukkan semua strain Clostridium saat ini yang tersimpan dalam databased program PCR in silico (dengan memilih menu APPLY TO ALL Clostridium pada template genomik PCR in silico ).
Tabel 2 Daftar genom spesies Clostridium yang digunakan sebagai template PCR in silico
Daftar lengkap strain Clostridium difficile dalam Databased d in silico PCR 1 - Clostridium acetobutylicum ATCC824 2 - Clostridium acetobutylicum DSM 1731
3 - Clostridium acetobutylicum EA 2018
4 - Clostridium acidurici 9a 5 - Clostridium autoethanogenum DSM 10061
6 - Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 7 - Clostridium botulinum A str. ATCC 19397 8 - Clostridium botulinum A str. ATCC 3502
9 - Clostridium botulinum A str. Hall
30 - Clostridium difficile M12031 - Clostridium difficile M68
32 - Clostridium difficile R20291 33 - Clostridium kluyveri DSM 555 34 - Clostridium kluyveri NBRC 12016 35 - Clostridium lentocellum DSM 5427 36 - Clostridium ljungdahlii ATCC 49587 37 - Clostridium novyi NT
I Gusti Agung Ayu Satwikha Dewi et. all / Desain Primer Secara In Silico Untuk Amplifikasi Gen tcdA Bakteri Clostridium Deffilcile
DOI: https://doi.org/10.51544/jalm.v8i1.3806
© 2023 Jurnal Analis Laboratorium Medik. This is an open accessarticleunder the CC BY-SA license
10 - Clostridium botulinum A2 str. Kyoto 11 - Clostridium botulinum A3 str. Loch Maree 12 - Clostridium botulinum B str. Eklund 17B 13 - Clostridium botulinum B1 str. Okra 14 - Clostridium botulinum BKT015925 15 - Clostridium botulinum Ba4 str. 657 16 - Clostridium botulinum E3 str. Alaska E43 17 - Clostridium botulinum F str. 230613 18 - Clostridium botulinum F str. Langeland 19 - Clostridium botulinum H04402 065 20 - Clostridium cellulolyticum H10 21 - Clostridium cellulovorans 743B 22 - Clostridium cf. saccharolyticum K10 23 - Clostridium clariflavum DSM 19732 24 - Clostridium difficile 2007855 25 - Clostridium difficile 630 26 - Clostridium difficile BI1 27 - Clostridium difficile BI9 28 - Clostridium difficile CD196 29 - Clostridium difficile CF5
38 - Clostridium pasteurianum BC139 - Clostridium perfringens
40 - Clostridium perfringens ATCC 13124
41 - Clostridium perfringens SM101 42 - Clostridium phage phiSM101
43 - Clostridium phytofermentans ISDg 44 - Clostridium saccharobutylicum DSM 13864 45 - Clostridium saccharolyticum WM1
46 - Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-
4(HMT)
47 - Clostridium sp. BNL1100
48 - Clostridium sp. SY8519
49 - Clostridium stercorarium subsp. stercorarium DSM 8532
50 - Clostridium stercorarium subsp. stercorarium DSM 8532
51 - Clostridium sticklandii DSM 519 52 - Clostridium tetani 12124569 53 - Clostridium tetani E88 54 - Clostridium thermocellum ATCC 27405 55 - Clostridium thermocellum DSM 1313
Hasil  sekuens  gen  pasang  primer  5  dimasukkan  dalam in  silico PCR  pada  http:// insilico.ehu.es/PCR/, diperoleh amplikon sebagai berikut (gambar 4).
Gambar 4. Reprensentasi Grafis Amplikon hasil input PCR in silico dari gen tcdA C. difficile
Jumlah amplikon yang muncul dari hasil input PCR in silico berbasis web sebanyak 9 buah.  Program  PCR in  silico berbasis  web menunjukkan panjang dan mobilitas elektroforesis amplikon. Dari jumlah amplikon dan posisi amplikon menunjukkan lokasi  amplikon  yang  sejajar.  Lokasi  yang
sejajar  ini  membantu  dalam  pemilihan pasangan  primer  yang  diinginkan  dan meminimalkan  kemungkinan  produk  yang tidak ditargetkan. Ini tidak hanya meningkatkan spesifisitas tetapi juga meminimalkan  waktu  yang  dibutuhkan terutama  ketika  melakukan  verivikasi  kerja
I Gusti Agung Ayu Satwikha Dewi et. all / Desain Primer Secara In Silico Untuk Amplifikasi Gen tcdA Bakteri Clostridium Deffilcile
DOI: https://doi.org/10.51544/jalm.v8i1.3806
© 2023 Jurnal Analis Laboratorium Medik. This is an open accessarticleunder the CC BY-SA license
secara in  vitro. Oleh karena itu, primer dan probe  yang  dihitung  dari  gen  yang  dipilih akan  berfungsi  sebagai  tanda  tangan  untuk identifikasi bakteri.
Meskipun  tidak  semua  galur  bakteri C. difficile dapat diuji menggunakan databased
http://  insilico.ehu.es  saat  ini,  uji  BLAST menunjukkan  bahwa  di  antara  galur C.
difficile lainnya, gen tcdA sangat terkonservasi,  hal  ini  ditunjukkan  dengan tingkat  homologi  100%  pada  kelompok spesies   (gambar 5).

## Gambar 5. Hasil tingkat homologi amplikon menggunakan BLASTN
Setelah  melakukan  PCR in  silico , dilakukan  pengecekan  produk  amplikon yang  akan  muncul  pada  elektroforesis  gel. Menggunakan  PCR in  silico diperoleh gambar  virtual  hasil  aplikon  pada  gel elektroforesis yang ditunjukkan pada Gambar 4 dengan posisi amplikon sejajar.
Hasil dari penelitian ini  didasarkan pada studi in  silico atau  prediksi  menggunakan PCR in  silico pada  http://  insilico.ehu.es/ PCR. Hasil rancangan desain primer in silico ini  dapat  digunakan  untuk  mendukung keberhasilan amplifikasi DNA
menggunakan  PCR in  vivo sebagai  cara untuk mendeteksi dini dan mengidentifikasi agen  penyebab  infeksi  oportunistik  yang disebabkan oleh bakteri C. difficile.

## SIMPULAN
Desain  primer  yang  diperoleh  secara in silico menghasilkan  primer  terbaik  untuk deteksi  gen  tcdA  bakteri C.  difficile yaitu primer foward 5’-GCAGATGCCAAGAGA CACAC-3’ dan primer reverse 3’-GCAGAT
GCCAAGAGACACAC-5’.  Desain  primer tersebut mampu mengamplifikasi daerah gen tcdA dengan ukuran 247 amplikon.

## DAFTAR PUSTAKA
Bikandi,  J.,  Millán,  R.  S.,  Rementeria,  A.,  & Garaizar,  J.  (2004).  In  silico  analysis  of complete bacterial genomes: PCR, AFLP-PCR and  endonuclease  restriction. Bioinformatics ,
20 (5),
798–799. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btg491
Debie  Rizqoh,  Nita  RatnaSari,  Rina  Nurlia  Wati,
Fery  Santosa,  &  Rianita  Hasanah.  (2016). Aktivitas  Bakteri  Filosfer  Daun  Reundeu ( Staurogyne  longata )  Sebagai  Penghasil Senyawa Antimikrob Potensial. Jurnal Analis Laboratorium Medik , 1 (1), 1–7.
Ethica, S. N., Sulistyaningtyas, A. R., & Darmawati, S.  (2019).  In-silico  specificity  comparison between  GMF-GMR  and  JMF-JMR  primers for  detecting  moaC  genes  of  food  spoilage bacteria  pseudomonas  spp. IOP  Conference Series:  Earth  and  Environmental  Science ,
292 (1). https://doi.org/10.1088/1755- 1315/292/1/012033
I Gusti Agung Ayu Satwikha Dewi et. all / Desain Primer Secara In Silico Untuk Amplifikasi Gen tcdA Bakteri Clostridium Deffilcile
© 2023 Jurnal Analis Laboratorium Medik. This is an open accessarticleunder the CC BY-SA license
Huang, J. H., Shen, Z. Q., Lien, S. P., Hsiao, K. N.,
Leng, C. H., Chen, C. C., Siu, L. K., Chong, P. C.  S.,  &  Vedantam,  G.  (2015).  Biochemical and immunological characterization of truncated  fragments  of  the  receptor-binding domains  of  C.  difficile Toxin  A. PLoS  ONE , 10 (8),
1–27. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0135045
Kalendar,  R.,  Lee,  D.,  &  Schulman,  A.  H.  (2011).
Java  web  tools  for  PCR,  in  silico  PCR,  and oligonucleotide assembly and analysis.
Genomics , 98 (2), 137–144. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2011.04.009
Kumala, W. (2004). Clostridium Difficile: Penyebab Diare dan Kolitis Pseudomembranosa, Akibat Konsumsi Antibiotika yang Irasional. Jurnal Kedokteran Trisakti , 23 (1), 34–38.
Lagier, J. C., Edouard, S., Pagnier, I., Mediannikov, O.,  Drancourt,  M.,  &  Raoult,  D.  (2015). Current and past strategies for bacterial culture in clinical microbiology. Clinical Microbiology  Reviews , 28 (1),  208–236. https://doi.org/10.1128/CMR.00110-14
Lall,  S.,  Nataraj,  G.,  &  Mehta,  P.  (2017).  Use  of culture-  and  ELISA-based  toxin  assay  for detecting  Clostridium  difficile,  a  neglected pathogen: A single-center study from a tertiary care setting. Journal of Laboratory Physicians , 9 (04), 254–259. https://doi.org/10.4103/jlp.jlp_157_16 Liwang, F., & Sinto, R. (2021). Pendekatan Klinis Terkini Infeksi Clostridium difficile Nosokomial. Jurnal Penyakit Dalam Indonesia , 8 (2), 104. https://doi.org/10.7454/jpdi.v8i2.307
Marra, F., George, D., Chong, M., Sutherland, S., &
Patrick,  D.  M.  (2016).  Antibiotic  prescribing by dentists has increased Why? Journal of the American  Dental  Association , 147 (5),  320–
327.
https://doi.org/10.1016/j.adaj.2015.12.014
McDonald,  L.  C.,  Gerding,  D.  N.,  Johnson,  S.,
Bakken,  J.  S.,  Carroll,  K.  C.,  Coffin,  S.  E., Dubberke, E. R., Garey, K. W., Gould, C. V.,
Kelly,  C.,  Loo,  V.,  Shaklee  Sammons,  J., Sandora,  T.  J.,  &  Wilcox,  M.  H.  (2018).
Clinical  Practice  Guidelines  for  Clostridium difficile  Infection  in  Adults  and  Children:
2017  Update  by  the  Infectious  Diseases Society  of  America  (IDSA)  and  Society  for Healthcare Epidemiology of America (SHEA). Clinical  Infectious  Diseases , 66 (7), e1–e48. https://doi.org/10.1093/cid/cix1085 Purba,  D.,  &  Manurung,  D.  B.  S.  (2016).
Perbandingan Pemeriksaan Basil Tahan Asam Metodedirect Smear Dan Metode Imunochromatographi  Test  Pada  Tersangka Penderita Tuberkulosis Paru Di Upt. Kesehatan Paru Masyarakat Dinas Kesehatan Provinsi  Sumatera  Utara. Jurnal  Analis Laboratorium Medik , 1 (1), 32–37.
Purba,  D.,  &  Manurung,  D.  B.  S.  (2017).
Perbandingan Pemeriksaan Basil Tahan Asam Metodedirect Smear Dan Metode Imunochromatographi  Test  Pada  Tersangka Penderita Tuberkulosis Paru Di Upt. Kesehatan Paru Masyarakat Dinas Kesehatan Provinsi  Sumatera  Utara. IEEE  International Conference on Acoustics, Speech, and Signal Processing (ICASSP) 2017 , 41 (2), 84–93.
Putri,  D.  I.  (2015).  Infeksi  Clostridium  Difficile Pada  Diare  yang  Diinduksi  Penggunaan Antibiotika Clostridium Difficile Infection On Antibiotic  Associated  Diarrhea. Majority ,
4 (7), 39–44.
Raso,  R.,  &  Alessandro,  B.  (2014). Quantitative Real-Time  PCR  -  Methods  and  Protocols  | Springer .
Riley, M. C., Aubrey, W., Young, M., & Clare, A.
(2013).  PD5:  A  general  purpose  library  for primer  design  software. PLoS  ONE , 8 (11). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080156
San  Millán,  R.  M.,  Martínez-Ballesteros,  I.,
Rementeria,  A.,  Garaizar,  J.,  &  Bikandi,  J. (2013).  Online  exercise  for  the  design  and simulation of PCR and PCR-RFLP experiments. BMC Research Notes , 6 (1), 2–5. https://doi.org/10.1186/1756-0500-6-513 Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I.,
Rozen,  S.,  &  Madden,  T.  L.  (2012).  Primer- BLAST:  a  tool  to  design  target-specific primers  for  polymerase  chain  reaction. BMC Bioinformatics , 13 , 134. https://doi.org/10.1186/1471-2105-13-134