Menara Perkebunan 2010, 78 (1), 33-42

## Isolasi dan kloning fragmen cDNA dari tanaman karet dengan sifat resisten dan rentan terhadap Corynespora cassiicola
menggunakan metode cDNA-AFLP
Isolation and cloning of cDNA fragments from rubber plant with resistant and susceptible characters to Corynespora cassiicola using cDNA-AFLP method
NURHAIMI-HARIS 1) , Antonius SUWANTO 2) , Maggy T. SUHARTONO 2) & Hajrial ASWIDINNOOR 3)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan,  Jl. Taman Kencana No. 1, Bogor 16151, Indonesia
2 ) Fakultas MIPA, Kampus Darmaga, Institut Pertanian Bogor, Indonesia
3 ) Fakultas Pertanian, Kampus Darmaga, Institut Pertanian Bogor, Indonesia
Terima tgl 30 Januari 2010/Disetujui 3 Mei 2010

## Abstract
Leaf fall disease caused by Corynespora cassiicola fungi is one of the most important diseases in rubber plant.  Rubber clone AVROS 2037 is considered resistant to this pathogen while clone PPN 2444 is susceptible. These two rubber clones were used to identify genes or transcripts differentially expressed during interaction between rubber plants and the fungi, using cDNA-Amplified Fragment Length Poly- morphism (cDNA-AFLP) method. Induced genes/transcripts expression was examined to compare differencies between plants uninfected and infected with C. cassiicola at 24, 36, 48 and 72 hours after inoculation. cDNA-AFLP analysis was performed using restriction enzyme VspI and TaqI so the adapters and primers also have the recognition site of these enzymes. By using 29 specific primers, 35 out of approximately 1450 fragments were differentially expressed between AVROS and PPN 2444 clones.  All of these fragments were cloned and sequenced. The homology-based grouping of these sequences resulted in 19 contigs and nine individual sequences.  Among these, 10 contigs and five sequences have significant sequence homology with known genes in gene bank data base, such as Ran binding protein, protein transporter and transcriptional regulators of some organisms; arginase, GTP-binding protein, heat shock protein (HSP) and aconitase.  Ran binding protein, GTP- binding protein and protein transporter were known as membrane proteins while arginase and HSP usually expressed as a response to wounding or toxin treatment.  The present of arginase is usually related to the availability of nitric oxide (NO) in plant tissue. NO is well known as a signal molecule on plant defense response.
[ Key words: Leaf-fall disease, Hevea brasiliensis , cDNA- AFLP, Corynespora cassiicola]

## Abstrak
Penyakit gugur daun yang disebabkan oleh fungi Corynespora cassiicola merupakan salah satu penyakit penting tanaman karet . Klon karet AVROS 2037 menunjukkan sifat resisten terhadap patogen tersebut sedangkan klon PPN 2444 merupakan klon yang rentan. Kedua   klon    karet    tersebut   digunakan   untuk   meng- identifikasi gen atau transkrip yang diekspresikan secara
diferensial selama terjadi interaksi antara tanaman karet dengan C. cassiicola menggunakan teknik cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism (cDNA-AFLP). Ekspresi gen/transkrip dipelajari untuk membandingkan perbedaan antara tanaman yang tidak diinfeksi dengan yang diinfeksi patogen pada waktu 24, 36, 48 dan 72 jam setelah inokulasi. Analisis cDNA-AFLP dilaksanakan dengan menggunakan pasangan enzim restriksi Vsp I dan Taq I sehingga adapter dan primer memiliki sekuen pengenalan kedua enzim restriksi tersebut. Dengan menggunakan 29 pasang primer spesifik, sebanyak 35 dari sekitar 1450 fragmen memiliki ekspresi berbeda antara klon AVROS 2037 dan PPN 2444.  Semua fragmen yang berbeda tersebut kemudian diklon pada vektor kloning dan disekuen.  Hasil sekuensing dikelompokkan berdasarkan homologi sekuennya dan menghasilkan 19 contigs serta sembilan macam sekuen yang tidak mengelompok.  Sebanyak 10 dari 19 contigs dan lima dari sembilan sekuen tersebut memiliki homologi dengan produk gen yang telah dikenal yang terdapat di pangkalan data GenBank, seperti putative Ran binding protein , protein transporter, regulator transkripsi, arginase, GTP-binding protein , heat shock protein (HSP) dan aconitase.  Beberapa di antaranya seperti putative Ran binding protein , protein transporter dan GTP-binding protein dikenal sebagai protein membran, sedangkan arginase dan HSP merupakan protein atau enzim yang ekspresinya pada tanaman antara lain dipengaruhi oleh adanya pelukaan dan perlakuan toksin. Keberadaan arginase sering berhubungan dengan ketersediaan nitric oxide (NO) pada jaringan tanaman. NO dikenal sebagai salah satu sinyal molekul dalam mekanisme pertahanan tanaman.
[Kata  kunci: Penyakit  gugur-daun, Hevea brasiliensis , cDNA-AFLP, Corynespora cassiicola ]

## Pendahuluan
Corynespora cassiicola merupakan salah satu patogen penting pada tanaman karet yang me- nyebabkan penyakit gugur daun.  Pada tahun 2009, patogen tersebut bersama dengan dua patogen lainnya yaitu Colletotrichum gloesporioides dan Oidium heveae dilaporkan telah menginfeksi seluas 17.966 hektar tanaman karet  di  seluruh Indonesia sehingga sangat merugikan secara ekonomi. Penyakit gugur
Isolasi dan kloning fragmen cDNA dari tanaman karet dengan sifat resisten....... (Nurhaimi-Haris et al .)
daun Corynespora terutama muncul dan berkembang pada klon  karet rentan dan di daerah beriklim basah (Pawirosoemardjo et al ., 2009).  Klon karet dilaporkan memiliki kisaran respons yang sangat luas terhadap serangan C. cassiicola, mulai dari yang sangat tahan sampai sangat rentan.  Klon RRIC 103, KRS 21 dan RRIM 725 yang masuk ke Indonesia melalui pertukaran klon internasional pada tahun 1974 tercatat sebagai klon yang sangat rentan, demikian juga klon seri PPN seperti PPN 2058, PPN 2444, dan PPN 2447 yang merupakan hasil seleksi lokal (Sinulingga et al. , 1996; Suwarto et al ., 1996). Hadi (2003) melaporkan bahwa beberapa klon seperti AVROS 2037, BPM 24, PPN 2058, PPN 2447, PR 300, PR 303, RRIC 110, RRIM 600 dan RRIM 712 memperlihatkan respons yang berbeda terhadap masing-masing isolat virulen. Akan tetapi beberapa klon seperti BPM 1, PB 260, PR 261, RRIC 100 dan RRIM 712 selalu menunjukkan respons ketahanan yang tinggi sedangkan klon PPN 2444 dan RRIC 103 selalu memberikan respon sangat rentan terhadap setiap isolat C. cassiicola yang diuji. Pendekatan yang banyak dilakukan untuk mengen- dalikan penyebaran penyakit C. cassiicola adalah dengan menanam klon-klon karet yang resisten terhadap patogen tersebut. Klon-klon generasi lama yang dilaporkan resisten antara lain AVROS 2037, BPM 1 dan RRIC 100, sedangkan klon-klon baru dari seri IRR antara lain IRR 42, 112 dan 118 serta dari seri PB antara lain PB 260, 330 dan 340 (Pawirosoemardjo et al ., 2009).  Selain itu, pemilihan klon juga dilakukan dengan memperhatikan daerah penanaman karena tidak semua klon resisten sesuai untuk berbagai lingkungan. Berdasarkan tingkat resistensinya, klon karet resisten dibedakan lagi atas yang sangat resisten seperti BPM 1, PB 340, IRR 32, 39, 112 dan 118 serta yang resisten seperti AVROS 2037, RRIC 100 dan IRR 5 (Pawirosoemardjo et al ., 2009).
Resistensi tanaman terhadap suatu patogen ditentukan oleh berbagai faktor, salah satunya adalah sifat genetik tanaman. Sejauh ini, molekul atau gen yang berperan dalam resistensi klon karet terhadap C. cassiicola belum diketahui sehingga dengan mempelajari transkrip/gen yang diekspresikan secara diferensial pada saat terjadinya interaksi inang-patogen akan membuka peluang untuk mengidentifikasi transkrip/gen yang berperan dalam resistensi tanaman. Salah satu teknik yang dapat digunakan untuk identifikasi perbedaan pola ekspresi gen antara tanaman resisten dan rentan adalah cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism (cDNA-AFLP)
(Bachem et al ., 1996).  Kepekaan teknik tersebut telah dibuktikan sebanding dengan analisis Northern sehingga banyak diaplikasikan untuk mengidentifikasi gen yang diekspresikan dalam interaksi inang-patogen, baik gen yang berasal dari tanaman maupun dari patogen (Avrora et al ., 2003; Durrant et al ., 2000; Petters et al ., 2002; Santaella et al ., 2004, Sugui & Deising 2002; Zhang et al. , 2003). Keistimewaan
teknik cDNA-AFLP adalah kemampuannya untuk mengidentifikasi gen yang terinduksi maupun tertekan ekspresinya pada satu percobaan yang sama. Teknik cDNA-AFLP memiliki sensitivitas tinggi, dapat diulang dan didasarkan pada reaksi amplifikasi dengan PCR serta tidak memerlukan pengetahuan tentang sekuen DNA dari genom target (Bachem et al ., 1996). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi transkrip atau gen/bagiannya yang diekspresikan pada saat  terjadi  interaksi  antara  tanaman  karet  dengan C. cassiicola melalui teknik cDNA-AFLP. Hasil penelitian ini diharapkan akan membuka peluang untuk memahami terjadinya resistensi pada klon karet tertentu.

## Bahan dan Metode

## Inokulasi  patogen
Bahan tanam karet yang digunakan adalah klon AVROS 2037 (resisten) dan klon PPN 2444 (rentan) yang ditanam dalam polibeg dan berada pada fase pertumbuhan dua unit daun.  Sebagai patogen adalah isolat C. cassiicola cGT1 SS virulen yang diperoleh dari Balai Penelitian Sembawa. Konidia isolat dihasil- kan berdasarkan metode Situmorang (2002). Daun umur 14 hari diinokulasi dengan suspensi (mengandung 4 x 10 4 konidia/mL) dengan cara me- nyemprotkan secara merata ke permukaan bawah daun, kemudian daun disungkup dengan kantong plastik. Sampel diambil dari daun yang diinokulasi masing- masing 24, 36, 48 dan 72 jam setelah inokulasi serta dari daun yang tidak diinokulasi sebagai kontrol. Daun dimasukkan ke dalam RNAlater ® (Ambion) yaitu reagen yang berfungsi untuk melindungi RNA dari kerusakan.

## Preparasi sampel mRNA
Preparasi mRNA menggunakan mRNA Capture Kit (Roche). Daun dikeringkan dengan alat Lyophilisator selama 48 jam kemudian digerus hingga berbentuk serbuk. Serbuk ditimbang 20 mg di dalam tabung mikro 1,5 mL, ditambahkan 200 μ L lysis buffer , dikocok kuat agar tercampur sempurna dan didiamkan dalam wadah berisi es selama lima menit. Campuran disentrifus dengan kecepatan 11.000 g selama satu menit pada suhu 4 0 C. Semua supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru, endapan disentrifus kembali dengan kondisi sama seperti di atas dan supernatannya digabungkan dengan yang pertama. Selanjutnya oligo(dT) 20 disiapkan dengan cara men- campurkan 2 μ L oligo (dT) 20 yang telah terlabel biotin ( mRNA Capture Kit ) dengan 38 μ L H 2 O ( mRNA Capture Kit ).  Proses hibridisasi mRNA dengan oligo dT tersebut dilakukan sesuai prosedur yang di- rekomendasikan dalam mRNA Capture Kit.
Menara Perkebunan 2010 78 (1), 33-42

## Sintesis cDNA
Ke dalam tabung dimasukkan 50 μ L campuran yang mengandung 10 μ L bufer ligasi lima kali,  0,5 μ L RNase inhibitor, 5 μ L DTT 100 mM, 10 μ L dNTP  10 kali (2,5 mM), 1 μ L Reverse Transcriptase Expand dan 23,5 μ L H 2 O. Campuran diinkubasi pada suhu 42°C selama dua jam. Sebanyak 40 μ L campuran tersebut ditambahkan dengan 120 μ L larutan yang mengandung 16 μ L bufer ligasi, 12 μ L dNTP 10 kali (2,5 mM), 6 μ L DTT 100 mM, 1,5 μ L enzim ligase, 4,3 μ L DNA Polimerase I  ( E. coli ),   1,6 μ L RNase H dan 78,6 μ L H 2 O. Campuran diinkubasi pada suhu 15°C selama 45 menit, kemudian pada suhu 22°C selama  50 menit. Selanjutnya larutan dibuang dan tabung yang me- ngandung cDNA dicuci tiga kali masing-masing menggunakan 200 μ L bufer pencuci.
Pemotongan cDNA dengan enzim restriksi Taq I  dan Vsp I
Untuk memotong cDNA dengan enzim restriksi Taq I, ke dalam tabung yang telah dicuci ditambahkan 50 μ L campuran yang mengandung 5 μ L 1,4 All Buffer 10 kali, 2 μ L enzim restriksi Taq I dan 43 μ L H 2 O, kemudian ditambahkan dua tetes minyak mineral dan diinkubasi pada suhu 65°C selama dua jam.  Setelah larutan dibuang, tabung dicuci tiga kali, masing-masing menggunakan 100 μ L bufer pencuci. Untuk memotong DNA dengan enzim restriksi Vsp I, ke dalam tabung yang telah dicuci ditambahkan 50 μ L campuran yang mengandung 5 μ L 1,4 All Buffer 10 kali, 1 μ L enzim restriksi Vsp I dan 44 μ L H 2 O, kemudian campuran diinkubasi pada suhu  37°C selama dua jam.  Larutan kemudian dipindahkan ke tabung mikro 1,5 mL.

## Ligasi fragmen cDNA dengan sekuen adapter
Sekuen adapter utas atas Vsp I adalah 5’- CTC GTA GAC TGC GTA CC- 3’, utas bawah Vsp I adalah 5’- TAG GTA CGC AGT C – 3’, utas atas Taq I adalah 5’- GAC GAT GAG TCCT GAC – 3’ dan utas bawah Taq I adalah 5’- CGG TCA GGA CTC AT – 3’. Adapter Vsp I disiapkan dengan cara mencampurkan sebanyak 2,6 μ L adapter utas atas Vsp I (1 μ g/ μ L), 2 μ L adapter utas bawah Vsp I  (1 μ g/ μ L), dan 95,4 μ L H 2 O (MilliQ) sehingga konsentrasi akhir adalah 5 μ M. Campuran diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit kemudian didinginkan sampai mencapai suhu ruang. Untuk menyiapkan adapter Taq I, dicampurkan sebanyak 25 μ L adapter utas atas Taq I (1 μ g/ μ L), 22 μ L adapter utas bawah Taq I (1 μ g/ μ L), dan 53 μ L H 2 O  (MilliQ)  sehingga  konsentrasi  akhir  adalah 50 μ M.  Cara inkubasi sama seperti di atas.  Ligasi fragmen cDNA dengan sekuen adapter dilakukan dengan cara menambahkan ke dalam 50 μ L produk restriksi sebanyak 5,5 μ L campuran yang mengandung 1 μ L adapter Vsp I  (5 μ M), 1 μ L adapter Taq I
(50 μ M), 0,5 μ L ATP (10 mM), 0,5 μ L 1,4 All Buffer (10X), dan 2,5 μ L T4 DNA Ligase. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 22 0 C selama dua jam.

## Preamplifikasi
Preamplifikasi menggunakan primer standar Vsp I dan Taq I. Sekuen primer standar untuk Vsp I adalah 5’- CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT – 3’ dan sekuen primer standar untuk Taq I adalah 5’- GAC GAT GAG TCC TGA CCG A – 3’. Setiap campuran preamplifikasi terdiri atas 5 μ L produk ligasi, 1 μ L Vsp I primer (100 ng/ μ L), 1 μ L Taq I primer (100 ng/ μ L), 5 μ L PCR bufer (10 kali), 5 μ L  dNTPs  (10  kali, 2,5 mM), 2 μ L Taq DNA Polimerase, 5 μ L MgCl 2 10 kali, dan ditambahkan H 2 O hingga volume 50 μ L. Ke dalam setiap tabung ditambahkan dua tetes minyak mineral. Reaksi amplifikasi dimulai pada suhu 94°C selama tiga menit kemudian diikuti 25 siklus, masing- masing siklus dilaksanakan pada suhu 94°C (45 detik), 55°C (45 detik), dan 72°C (60 detik). Untuk me- ngetahui hasil preamplifikasi, sebanyak 2 μ L produk PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% dengan tegangan 70 V selama  30 menit. Gel diwarnai dengan etidium bromida (0,5 mg/L) dan produk amplifikasi diamati dengan UV transiluminator.

## Amplifikasi selektif
Produk preamplifikasi diencerkan 10 kali dan primer Vsp I dilabel dengan γ 33 P-dATP. Proses pelabelan dilakukan dengan mencampurkan 5 μ L primer Vsp I (100 ng/ μ L), 10 μ L bufer kinase (bufer A) lima kali, 10 μ L γ 33 P-dATP, 2 μ L T4 kinase dan ditambahkan H 2 O hingga volume 50 μ L. Campuran diinkubasi pada suhu 37°C selama satu jam, kemudian dipanaskan pada suhu 70°C selama 10 menit untuk menginaktifkan enzim. Primer yang telah dilabel disimpan pada suhu 4°C. Untuk amplifikasi selektif digunakan 29 pasang primer (Tabel 1). Preparasi sampel dilakukan dengan men-campurkan 5 μ L produk preamplifikasi yang telah diencerkan, 0,2 μ L Vsp I primer (100 ng/ μ L) yang telah dilabel, 0,6 μ L Taq I primer (100 ng/ μ L),  3,2 μ L dNTPs (10 kali, 2,5 mM), 2 μ L PCR bufer,   2 μ L MgCl 2 10 kali, 1 μ L Taq DNA Polimerase dan H 2 O hingga volume 20 μ L, kemudian ditambahkan satu tetes minyak mineral. Reaksi amplifikasi  dilakukan sebanyak 13 siklus dengan kondisi 94°C (30 detik), 65°C [- 0,7°C/siklus] (30 detik), 72°C (60 detik) dan 23 siklus dengan kondisi 94°C (30 detik), 56°C (30 detik), 72°C (60 detik).

## Visualisasi produk PCR pada poliakrilamid gel
Produk PCR dicampur dengan pewarna formamid dengan volume yang sama, didenaturasi pada suhu 94°C selama tiga menit, dan dielektroforesis pada 5 % gel poliakrilamid. Gel kemudian ditransfer  ke Gel
Isolasi dan kloning fragmen cDNA dari tanaman karet dengan sifat resisten....... (Nurhaimi-Haris et al .)
Tabel 1.   Sekuen primer Vsp I dan Taq I yang digunakan dalam amplifikasi selektif cDNA dari daun karet menggunakan metode cDNA-AFLP.
Table 1. Sequences of VspI and TaqI primer  used in selective  amplification  of cDNA  from rubber leaf by using cDNA-AFLP method.
No. Kombinasi primer Primer combination Sekuen pasangan primer ( Sequence of  primer pair (5’         3’)) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
19. 20. 21. 22.
23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. Vsp 16/ Taq 16
Vsp 16/ Taq 17 Vsp 16/ Taq 19
Vsp 16/ Taq 20
Vsp 16/ Taq 21
Vsp 16/ Taq 22
Vsp 16/ Taq 24
Vsp 16/ Taq 25
Vsp 17/ Taq 16
Vsp 17/ Taq 17
Vsp 17/ Taq 19
Vsp 17/ Taq 20
Vsp 17/ Taq 21
Vsp 17/ Taq 22
Vsp 17/ Taq 24
Vsp 17/ Taq 25
Vsp 20/ Taq 16
Vsp 20/ Taq 17
Vsp 20/ Taq 19
Vsp 20/ Taq 20
Vsp 20/ Taq 21
Vsp 20/ Taq 22
Vsp 20/ Taq 24
Vsp 20/ Taq 25
Vsp 25/ Taq 16
Vsp 25/ Taq 17
Vsp 25/ Taq 19
Vsp 25/ Taq 20
Vsp 25/ Taq 21
GACTGCGTACCTAAT-CC/GATGAGTCCTGACCGA-CC GACTGCGTACCTAAT-CC/GATGAGTCCTGACCGA-CG GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-GA GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-GC GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-GG GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-GT GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-TC GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-TG GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-CC GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-CG GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-GA GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-GC GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-GG GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-GT GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-TC GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-TG GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-CC GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-CG GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-GA GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-GC GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-GG GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-GT GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-TC GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-TG GACTGCGTACCTAAT-TG/ GATGAGTCCTGACCGA-CC GACTGCGTACCTAAT-TG/ GATGAGTCCTGACCGA-CG GACTGCGTACCTAAT-TG/ GATGAGTCCTGACCGA-GA GACTGCGTACCTAAT-TG/ GATGAGTCCTGACCGA-GC GACTGCGTACCTAAT-TG/ GATGAGTCCTGACCGA-GG
Blotting Paper , dikeringkan dengan Gel Dryer dan diekspos dengan film sinar X (Life Ray ™ XDA Plus UTLG) selama tujuh hari.

## Isolasi dan pemurnian fragmen cDNA
Fragmen target ditandai pada film kemudian bagian film sebesar ukuran  fragmen dipotong sehingga terbentuk lubang. Film ditempelkan di atas gel pada posisi yang sesuai, kemudian gel dipotong melalui lubang yang telah dibuat pada film. Setiap potongan gel dimasukkan ke masing-masing tabung PCR 500 μ L dan ditambahkan 100 μ L Tris (10 mM) pH 7,5. Inkubasi dilakukan selama empat jam pada suhu 37°C, larutan dikocok kuat, diinkubasi selama lima menit pada suhu 95°C dan dikocok kuat kembali. Larutan disentrifus sesaat, bagian larutan dipindah ke tabung baru, ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 10 μ L glikogen, 1/10 volume sodium asetat (3M, pH 5,2), dan 2 volume etanol absolut. Campuran diinkubasi semalam pada suhu  – 20°C. Selanjutnya, campuran disentrifus pada kecepatan 12.000g pada suhu 4°C selama 20 menit. Supernatan dibuang, endapan dicuci dengan 1 mL etanol 70 %, disentrifus
12.000 g pada suhu 4 0 C selama 10 menit. Larutan dibuang dan endapan dikeringkan, kemudian endapan dilarutkan dalam  10 μ L Tris 10 mM (pH 8,0). Amplifikasi fragmen cDNA dilakukan pada volume 20 μ L menggunakan primer yang sesuai. Konsentrasi masing-masing komponen sama seperti pada preamplifikasi. Kondisi PCR adalah: 94°C selama tiga menit; kemudian 35 siklus, masing-masing siklus terdiri atas 94°C (45 detik), 56°C  (45 detik), 72°C (60 detik) dan 72°C (7 menit).  Untuk konfirmasi hasil amplifikasi, produk PCR dipisahkan pada 2 % agarose gel melalui elektroforesis  pada voltase  70 V selama sekitar 50 menit. Pemurnian fragmen cDNA dilakukan dengan cara memisahkan produk PCR pada 2 % low melting agarose (Qbiogene), kemudian  fragmen dimurnikan dengan QIAquick Gel Extraction Kit sesuai prosedur yang direkomendasikan di dalam petunjuk teknisnya.

## Kloning fragmen cDNA pada vektor
Kloning fragmen cDNA dilakukan pada vektor pGEM ® -T Easy Vector Systems (Promega).  Proses kloning dimulai dengan meligasikan fragmen cDNA ke vektor   tersebut   menggunakan  enzim   ligase, sesuai
Menara Perkebunan 2010 78 (1), 33-42
rekomendasi. Hasil ligasi diintroduksikan ke sel bakteri E. coli DH5 α kompeten (Sambrook et al., 1989). Sebanyak lima koloni dari setiap cawan dibuat replikanya dan digunakan dalam PCR koloni untuk konfirmasi fragmen cDNA yang diperoleh, maupun untuk digunakan dalam proses sekuensing.

## Sekuensing fragmen cDNA
Sekuensing fragmen cDNA dilakukan oleh perusahaan komersil GATC Biotech, Constance, Germany.  Program Contig Express ( Vector NTI Suite 6 ) digunakan untuk membersihkan sekuen vektor dan adapter dan kemudian mengelompokkan sekuen contigs .   Sekuen yang telah diedit tersebut kemudian dibandingkan dengan yang terdapat di pangkalan data ( data base ) GenBank menggunakan algoritma BLASTX (Altschul et al ., 1997).

## Hasil dan Pembahasan

## Pemurnian mRNA dan sintesis cDNA
Hasil visualisasi cDNA yang diperoleh setelah preamplifikasi terdapat pada Gambar 1.  Kesepuluh cDNA sampel, baik yang berasal dari klon AVROS 2037 maupun PPN 2444, terlihat relatif seragam pada gel agarose.  Prinsip utama dari mRNA Capture Kit yang digunakan dalam penelitian ini untuk memurni- kan mRNA serta mensintesis cDNA adalah adanya lapisan streptavidin pada tabung.  mRNA yang telah dilisis dari sel dan memiliki ujung 3’- poli(A) dihibridisasikan dengan oligo (dT) 20 yang dilabel biotin sehingga sewaktu dimasukkan ke dalam tabung berlapis streptavidin, hanya mRNA yang akan terikat pada tabung sedangkan ribosomal RNA atau transfer RNA dapat dipisahkan langsung dalam proses pencucian. Teknik serupa telah digunakan oleh Feron et al . (2004) untuk mempelajari gen-gen yang diekspresikan secara temporal pada bagian bunga setelah dilakukan persilangan.

## Analisis cDNA-AFLP
Amplifikasi cDNA dengan teknik cDNA-AFLP menggunakan 29 kombinasi primer (Tabel 1) menghasilkan produk amplifikasi berupa fragmen cDNA atau transcript-derived fragment (TDF) dengan berat molekul antara 50 sampai 600 pb.  Rata-rata per kombinasi pasangan primer diperoleh 50 fragmen. Dari sejumlah fragmen tersebut diperoleh 35 fragmen dengan pola ekspresi menarik, baik karena pola ekspresi yang berbeda antara klon AVROS 2037 dengan PPN 2444 (Gambar 2), maupun karena ekspresi yang sangat kuat (Gambar 3). Amplifikasi dengan primer  V16/T16  (Gambar 2)  menghasilkan   fragmen
cDNA dengan ukuran ± 90 pb (fragmen 2 dan 3) yang terekspresi kuat pada klon resisten AVROS 2037 pada waktu 24, 48 dan 72 jam setelah inokulasi patogen, namun pada klon rentan PPN 2444 ekspresi kuat fragmen yang sama hanya terjadi pada waktu 36 jam setelah inokulasi. Fragmen cDNA tersebut diduga merupakan salah satu kandidat transkrip yang ber- hubungan dengan mekanisme resistensi tanaman karet terhadap C. cassiicola. Tidak adanya fragmen yang sama pada klon AVROS 2037 pada waktu 36 jam setelah inokulasi diduga berhubungan dengan pola ekspresi dari fragmen tersebut. Pola ekspresi yang sama juga terdapat pada fragmen 10 dan 11 (Gambar 2). Fragmen cDNA dengan pola ekspresi yang kuat pada kontrol dan kemudian ekspresinya menurun setelah diinokulasi dengan patogen ditemukan pada fragmen 20 dan 24 (AVROS 2037) (Gambar 3). Fragmen 25 dan 26 hanya terekspresi pada klon AVROS 2037 pada periode waktu 48 jam setelah inokulasi, sedangkan fragmen 27 dan 28 terekspresi kuat dan memiliki pola ekspresi yang sama setelah 24 jam dilakukan inokulasi, baik pada klon AVROS 2037 maupun PPN 2444 (Gambar 3).
Fragmen cDNA yang tidak terlihat pada lajur 3 (Gambar 3), baik pada klon AVROS 2037 maupun PPN 2444 dapat disebabkan oleh beberapa kemungkinan, antara lain kesalahan teknis preparasi sampel untuk proses amplifikasi atau kekurang sempurnaan teknis selama proses visualisasi.
Gambar 1. cDNA tanaman karet hasil preamplifikasi menggunakan primer  standar Vsp I dan Taq I. Lajur  1  –  5  adalah  cDNA  dari  daun  klon AVROS 2037, dan lajur 6-10 adalah cDNA dari daun klon PPN 2444, masing-masing pada 0, 24, 36, 48, 72 jam setelah inokulasi  dengan C. cassiicola. M adalah 1 kb DNA ladder (Invitrogen).
Figure 1. cDNA of rubber plant resulted from pre- amplification using standard primer VspI and TaqI . Lanes 1-5 are cDNA from AVROS 2037 clone, and lanes 6-10 are cDNA from PPN 2444 clone, at 0, 24, 36, 48 and 72 hours after inoculation with C.  cassiicola .  M is 1 kb ladder DNA marker (Invitrogen).
bp 500

## M   1    2    3     4    5    6   7    8   9   10  M
220
Isolasi dan kloning fragmen cDNA dari tanaman karet dengan sifat resisten....... (Nurhaimi-Haris et al .)
V16/T16                       V16/T17                     V16/T19                     V16/T20 A               P                    A             P                   A               P                A                P
Gambar 2.  Pola fragmen cDNA dari klon AVROS 2037 (A, resisten terhadap C. cassiicola) dan klon PPN 2444 (P, rentan terhadap C. cassiicola ) berdasarkan analisis cDNA-AFLP dengan empat kombinasi primer (V16/T16, V16/T17, V16/T19, V16/T20).  Setiap lajur adalah templat cDNA dari (1) daun sehat, (2) daun diinokulasi, 24 jam setelah inokulasi (jsi), (3) 36 jsi, (4) 48 jsi, dan (5) 72 jsi. Tanda panah adalah contoh fragmen yang menunjukkan  ekspresi berbeda antara perlakuan. M adalah marker 1 kb DNA ladder.
Figure 2.   Fragment pattern of cDNA from AVROS 2037 clone (A, resistant to C. cassiicola ) and PPN 2444 (P, susceptible to C. cassiicola ) based on cDNA-AFLP analysis by using four combinations of primer (V16/T16, V16/T17, V16/T19, V16/T20). Every line is cDNA template from (1) healthy leaf, (2) inoculated leaf, 24 hour after inoculation (hai), 36 hai, 48 hai, and 72 hai. Arrow is example of fragment showing different expression among treatment. M is 1 kb ladder DNA marker.
Gambar 3.   Fragmen cDNA dari klon AVROS 2037 (A, resisten terhadap C. cassiicola ) dan klon PPN 2444 (P, rentan terhadap C. cassiicola ) berdasarkan analisis cDNA-AFLP dengan primer V16/T21. Setiap lajur adalah templat cDNA dari (1) daun sehat, (2) daun diinokulasi, 24 jam setelah inokulasi (jsi), (3) 36 jsi, (4) 48 jsi, dan (5) 72 jsi. M adalah marker 1 kb DNA ladder. Tanda panah menunjukkan fragmen yang diisolasi dari gel dan angka adalah nomor urut fragmen yang diisolasi.
Figure 3.  cDNA fragments from AVROS 2037 clone (A, resistant to C. cassiicola )  and  PPN  2444  (P,  susceptible  to C. cassiicola ) based on cDNA-AFLP analysis using V16/T21 primer. Every line is cDNA template from (1) healthy leaf, (2) inoculated leaf, 24 hour after inoculation (hai), 36 hai, 48 hai, and 72 hai. M is 1 kb ladder DNA marker. Arrows show the isolated fragments from gel and numbers  show the numbering of fragments.
M 1 2   3  4  5   1  2  3  4 5 1 2  3 4 5  1 2  3 4 5   1 2  3 4 5   1  2 3 4 5   1 2  3 4 5   1 2 3 4 5
2
3 10 11 bp 100 90 80 bp 100 V16/T21 A         P M 1 2 3 4 5   1 2 3 4 5 20 19 18 25 22 21 24 23 26 28 27 29 32 30 31 170 240 330

## Isolasi, kloning dan sekuensing fragmen cDNA
Isolasi fragmen cDNA dilakukan terhadap 35 fragmen yang sudah ditandai pada film.  Dari ke-35 fragmen tersebut, 22 fragmen berasal dari klon resisten AVROS 2037 dan 13 fragmen dari klon rentan PPN 2444.  Selanjutnya reamplifikasi dilakukan terhadap fragmen-fragmen tersebut menggunakan primer yang sesuai dengan tujuan untuk memperbanyak fragmen dan konfirmasi ukuran fragmen.  Hasil reamplifikasi beberapa fragmen terdapat pada Gambar 4. Seluruh fragmen hasil reamplifikasi (35 fragmen) selanjutnya diklon pada vektor pGEM ® -T Easy Vector Systems. Dari hasil kloning setiap fragmen diambil lima klon sehingga total klon adalah 175, dan ukurannya dikonfirmasi melalui elektroforesis pada gel agarose. Hasil PCR koloni sebagian sampel terdapat pada Gambar 5.
Sebagian fragmen yang berasal dari setiap lima klon sesuai dengan perkiraan, yakni memiliki ukuran sama dan konsisten dengan ukuran pada gel akrilamid, namun sebagian lagi ternyata memiliki ukuran berbeda meskipun berasal dari klon yang sama.  Berdasarkan hasil tersebut maka sekuensing dilakukan terhadap seluruh klon sehingga jumlah total fragmen cDNA yang disekuen adalah 175 fragmen.  Dari jumlah tersebut hanya 128 klon yang memiliki sekuen cDNA sisipan, sedangkan 47 klon lain membawa vektor kosong atau vektor dengan beberapa tambahan sekuen basa saja.  Ke-128 sekuen dibersihkan dari kontaminan yang berasal dari sekuen vektor serta dikelompokkan berdasarkan kemiripan sekuen menggunakan program Contig Express ( Vector NTI Suite 6 ). Dari proses tersebut diperoleh sebanyak 20 contigs serta sembilan sekuen yang tidak mengelompok ke salah satu contig . Dari 20 contigs tersebut terdapat satu contig yang hanya mengandung sekuen vektor sehingga tidak diikutkan dalam analisis selanjutnya. Identifikasi homologi fragmen cDNA daun karet dengan produk gen yang telah diketahui fungsinya dilakukan berdasarkan informasi yang terdapat di database GenBank menggunakan BLAST-X (Altschul et al ., 1997). Dari analisis tersebut 10 contigs dan lima sekuen memiliki homologi dengan sekuen gen di database seperti putative Ran binding protein , protein transporter, regulator transkripsi, arginase, GTP- binding protein, heat shock protein (HSP), sugar transferase dan aconitase (Tabel 2).
Fragmen dengan sekuen mirip gen penyandi arginase, aconitase dan heat shock protein (HSP) cukup menarik perhatian.  Regulasi enzim arginase telah banyak dipelajari pada sel mamalia. Induksi ekspresi arginase pada sel mamalia sebagai respons terhadap trauma pelukaan serta infeksi patogen berperan penting dalam mengatur metabolisme L- arginin. Metabolisme arginin terjadi melalui dua jalur utama, yaitu dikatalis oleh enzim arginase dan lainnya oleh nitric-oxide synthase (NOS).  Aktivitas arginase akan mengubah arginin menjadi urea dan ornithin,
sedangkan aktivitas NOS akan mengubah arginin menjadi nitric-oxide (NO). NO berperan dalam pembentukan cGMP ( cyclic guanylate cyclase ) yang diperlukan dalam sinyal transduksi dan pengaturan ion channel (Durner et al ., 1998).  Adanya dua jalur pem- bentukan arginin dapat menimbulkan kompetisi dalam penggunaan arginin. Apabila ekspresi arginase me- ningkat di dalam sel, maka arginin akan lebih banyak digunakan untuk menghasilkan urea dan ornitin sehingga produksi NO berkurang. Pada berbagai mekanisme pertahanan hewan dan tanaman telah banyak dilaporkan bahwa NO merupakan molekul sinyal untuk mengaktifkan mekanisme pertahanan sehingga penurunan level NO dapat mengakibatkan penurunan resistensi inang yang diperantarai NO.
Dari penelitian yang dilakukan oleh Chen et al .
(2004) dilaporkan bahwa pada daun tomat ekspresi gen LeARG2 penyandi arginase meningkat tajam oleh adanya pengaruh pelukaan dan toksin coronatine yang disekresikan oleh bakteri patogen Pseudomonas syringae . Pelukaan maupun toksin tersebut mengaktif- kan sinyal cekaman sehingga terjadi akumulasi asam jasmonat ( jasmonic acid = JA), yang selanjutnya mengaktifkan ekspresi sejumlah gen yang responsif terhadap pelukaan tersebut (Creelman & Mullet, 1997). JA seperti halnya asam salisilat ( salicylic acid = SA) dan etilen merupakan regulator utama dalam respons pertahanan tanaman (Dong, 1998).
Gambar 4. Hasil reamplifikasi fragmen cDNA tanaman karet menggunakan primer yang sesuai untuk masing- masing fragmen.  M adalah 1 kb DNA ladder. (A) Lajur 1 – 9, berturut-turut adalah fragmen no. 12, 13, 14, 18, 19, 21, 22, 23, kontrol negatif. (B)  Lajur 1 – 9 , berturut-turut adalah fragmen no. 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, kontrol negatif.
Figure 4.   cDNA fragment of rubber plant resulted from re- amplification by using suitable primer for each fragment. M is 1 kb ladder DNA marker. (A) Lanes 1-9 are fragment no. 12, 13, 14, 18, 19, 21, 22, 23, negative control. (B) Lanes 1-9 are fragment no.  24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, negative control .
500 220 bp A B 500 M   1  2  3   4  5  6   7  8   9 M 220
Isolasi dan kloning fragmen cDNA dari tanaman karet dengan sifat resisten....... (Nurhaimi-Haris et al .)
Gambar 5.  Hasil PCR koloni sebagian fragmen cDNA dengan primer SP6/T7, lima sampel untuk setiap fragmen. M adalah marker
DNA (1 kb DNA ladder).  (A) Gel atas, berturut-turut setelah M adalah fragmen no. 0,1; 2,3; 0,2; 2,4; 0,3; 2,5; 0,4; 3,1; 0,5; 3,2; 1,1; 3,3; 1,2; 3,4; 1,3; 3,5; 1,4; 4,1; 1,5; 4,2; 2,1; 4,3; 2,2; 4,4; 4,5; 7,2; 5,1; 7,3; 5,2; 7,4; 5,3; 7,5; 5,4; 8,1; 5,5; 8,2; 6,1; 8,3; 6,2; 8,4; M, 17,1; 17,2; 17,3  Gel bawah, berturut-turut setelah M adalah fragmen no. 6,3; 8,5; 6,4; 9,1; 6,5; 9,2; 7,1; 9,3; 9,4; 11,2; 9,5; 11,3; 10,1; 11,4; 10,2; 11,5; 10,3; 12,1; 10,4; 12,2; 10,5; 12,3; 11,1; 12,4; 13,1; 12,5; 13,2; 14,1; 13,3; 14,2; 13,4; 14,3; 13,5; 14,4; 15,1; 14,5; 15,2; 16,1; 15,3; 16,2; 15,4; 16,3; 15,5; 16,4; 16,5. Figure 5. Results of colony PCR of some cDNA fragments with primer SP6/T7, five samples for each fragment. M is 1 kb ladder DNA marker. (A) Upper gel after M is fragment no 0.1; 2.3; 0.2; 2.4; 0.3; 2.5; 0.4; 3.1; 0.5; 3.2; 1.1; 3.3; 1.2; 3.4; 1.3; 3.5; 1.4; 4.1; 1.5; 4.2; 2.1; 4.3; 2.2; 4.4; 4.5; 7.2; 5.1; 7.3; 5.2; 7.4; 5.3; 7.5; 5.4; 8.1; 5.5; 8.2; 6.1; 8.3; 6.2; 8.4; M, 17.1; 17.2; 17.3;  Lower gel after M is fragment no 6.3; 8.5; 6.4; 9.1; 6.5; 9.2; 7.1; 9.3; 9.4; 11.2; 9.5; 11.3; 10.1; 11.4;
10.2; 11.5; 10.3; 12.1; 10.4; 12.2; 10.5; 12.3; 11.1; 12.4; 13.1; 12.5; 13.2; 14.1; 13.3; 14.2; 13.4; 14.3; 13.5; 14.4; 15.1; 14.5; 15.2; 16.1; 15.3; 16.2; 15.4; 16.3; 15.5; 16.4; 16.5.
Tabel 2. Pengelompokan fragmen cDNA yang diperoleh melalui analisis cDNA-AFLP dari daun karet klon AVROS 2037 dan PPN 2444.
Table 2. Grouping of cDNA fragment resulted from cDNA-AFLP analysis from rubber leaf of AVROS 2037 and PPN 2444 clones.
No Kelompok fragmen Fragment group Ukuran Size (bp) Kemiripan sekuen  ( Sequence homology ) Nilai (Value) E 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Contig 1 Contig 2 Contig 5 Contig 8 Contig 12 Contig 13 Contig 14 Contig 15 Contig 18 Contig 19 aflp-14.5 aflp-20.5 aflp-22.3 aflp-26.3 aflp-26.4 108 270 259 153 251 115 145 86 231 251 55 235 236 163 161
putative Ran binding protein 11-like [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] protein transporter [Arabidopsis thaliana] hypothetical protein [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] COG3391: Uncharacterized conserved protein [E. coli F11] Transcriptional Regulator, MarR family [Pseudomonas fluorescens PfO-1] arginase 2 [Lycopersicon esculentum] arginase [Brassica napus] putative arginase [Arabidopsis thaliana] agmatinase/ catalytic [Arabidopsis thaliana] arginase [Glycine max] GTP-binding-like protein [Arabidopsis thaliana] putative GTP-binding protein DRG [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] hypothetical protein PP2606 [Pseudomonas putida KT2440] selenium-binding protein-like [Arabidopsis thaliana] ornithine carbamoyltransferase [Canavalia lineata] putative pyocin S2 (partial) [Yersinia pseudotuberculosis IP 32953] heat shock protein-like protein [Cucumis melo] heat shock protein-like protein [Cucumis melo] nicotinate-nucleotide adenyltransferase [Leifsonia xyli subsp. xyli conserved hypothetical protein [Pseudomonas fluorescens PfO-1] transcriptional regulator, putative [Pseudomonas fluorescens Pf-5] Unknown protein [Arabidopsis thaliana] Sugar transferases involved in lipopolysaccharide synthesis [Pseudomonas aeruginosa C3719] conserved hypothetical protein [Pseudomonas fluorescens Pf-5] Aconitate hydratase-like [Pseudomonas fluorescens PfO-1] putative aconitase [Prunus avium] aconitase [Lycopersicon pennellii] cytosolic aconitase [Nicotiana tabacum]
putative Aconitate hydratase [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]
8e-05 1e-04 0.69 2e-10 8e-18 1e-06 2e-06 5e-06 5e-06 2e-05 5e-14 6e-13 2e-13 4.4 9.7 4e-05 1e-10 3e-08 0.044 3e-16 7e-14 0.70 6e-32 1e-23 1e-24 2e-12 4e-12 4e-12 4e-12
M M M
Di samping arginase, TDF yang lain memiliki homologi tinggi dengan enzim aconitase.  Aconitase diketahui merupakan salah satu enzim yang ekspresinya diregulasi oleh NO, aktivitasnya menyebabkan pening- katan level ion bebas di dalam sel.  Pada tanaman tembakau, peningkatan iron bebas berhubungan dengan fungsi pertahanan setelah terjadi serangan patogen (Klessig et al ., 2000).  Dilaporkan juga bahwa pening- katan level iron bebas melalui pengrusakan kluster iron- sulfur aconitase oleh NO, berimplifikasi terhadap kerusakan DNA (Keyer & Imley, 1996).  Kuat dugaan bahwa NO berkontribusi dalam respons hipersensitif (HR) melalui peningkatan iron bebas dan melalui destabilisasi kluster iron-sulfur (Navarre et al ., 2000).
Dalam penelitian ini dengan teridentifikasinya beberapa enzim yang berhubungan secara langsung ataupun tidak langsung dengan ketersediaan NO di dalam sel, menimbulkan dugaan bahwa kemungkinan mekanisme resistensi pada tanaman karet diperantarai oleh NO. Sejauh ini telah diketahui bahwa NO merupakan molekul sinyal pada respons pertahanan dan diperlukan untuk mengaktivasi sepenuhnya resistensi tanaman terhadap penyakit serta program kematian sel pada tanaman kedelai, Arabidopsis dan tembakau (Delledonne et al ., 1998; Durner et al., 1998).  Beberapa TDF juga memiliki homologi tinggi dengan HSP. Meskipun HSP merupakan kelompok protein yang terakumulasi dalam jumlah tinggi apabila sel terpapar suhu tinggi, namun ekspresi HSP juga dapat dipicu oleh adanya infeksi ataupun toksin. HSP umumnya merupa- kan protein sitoplasma dan berperan penting dalam interaksi protein-protein seperti dalam pelipatan untuk menjaga konformasi serta mencegah agregasi dengan protein yang tidak diinginkan. HSP termasuk dalam kategori protein yang berperan dalam mekanisme pertahanan, dibuktikan melalui identifikasi keberadaan- nya dalam interaksi antara Cassava dengan Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Santaella et al., 2004) dan A. thaliana dengan Peronospora parasitica (Van der Biezen et al., 2000).

## Kesimpulan dan Saran
Melalui kegiatan penelitian ini diketahui bahwa metode  cDNA-AFLP  telah  berhasil  digunakan  untuk mengidentifikasi dan mengisolasi transkrip yang diekspresikan secara diferensial pada daun klon karet resiten AVROS 2037 dan klon rentan PPN 2444 yang diinfeksi dengan cendawan patogen C. cassiicola . Sebanyak 35 fragmen asal transkrip (TDF) telah diisolasi,  diklon,  dan  disekuen.  Pengelompokan ber- dasarkan homologi sekuennya menghasilkan 19 contigs dan sembilan macam sekuen yang tidak mengelompok. Sebanyak 10 contigs dan lima sekuen memiliki homologi dengan produk gen yang telah dikenal yang terdapat di data base gene bank, seperti gen penyandi arginase, heat shock protein (HSP) dan aconitase yang berasal dari beberapa spesies tanaman.
Keterlibatan berbagai TDF tersebut dalam mekanisme resistensi tanaman karet masih memerlukan pembuktian lebih lanjut melalui serangkaian penelitian untuk mengamati pola ekspresinya pada berbagai klon karet resisten dan rentan yang ada. Namun paling tidak informasi di atas diharapkan dapat mengawali penelitian molekuler berikutnya untuk membantu mengungkap transkrip atau bagian gen yang berperan dalam meka- nisme resistensi tanaman karet terhadap C. cassiicola .

## Ucapan Terimakasih
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Dr. Valerie Pujade-Renaud (CIRAD, Montpellier, Perancis) atas pendampingan dan pemberian saran-saran selama proses penelitian ini berlangsung.

## Daftar Pustaka
Altschul SF, TL Madden, AA Schaffer, J Zhang, Z Zhang, W Miller  & DJ Lipman  (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl Acids Res 25, 3389–3402.
Avrova AO, E Venter, PRJ Birch & SC Whisson (2003).
Profiling and quantifying differential gene transcription in Phytophthora infestans prior to and during the early stages of potato infection. Fungal Gen Biol 40, 4-14.
Bachem CWB, RS van der Hoeven, SM de Bruijn D Vreugdenhil, M Zabeau & RGF Visser (1996). Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP : Analysis of gene expression during potato tuber development. Plant J 9, 745-753.
Chen H, BC McCaig, M Melotto, SY He & GA Howe (2004).
Regulation of plant arginase by wounding, jasmonate and the phytotoxin coronatine. J Biol Chem 279(44), 45998- 46007.
Creelman RA & JE Mullet (1997). Oligosaccharins, barassinolides and jasmonates: Nontraditional regulators of plant growth, development and gene expression. Plant Cell 9, 1211-1223.
Delledonne M, Y Xia, RADixon & C Lamb (1998).  Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Nature 394, 585–588.
Dong X  (1998).  SA, JA, ethylene and disease resistance. Curr Opin Plant Biol 1, 316–323.
Durner J, D Wendehenne & DF Klessig (1998).  Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose. Proc Natl Acad Sci USA 95, 10328- 10333.
Durrant WE, O Rowland, P Piedras, KE Hammond-Kosack & JDG Jones  (2000).  cDNA-AFLP reveals a striking overlap in race-specific resistance and wound response gene expression profiles. The Plant Cell 12, 963-977.
Feron R, C Mariani & WH Vriezen (2004). Application of the mRNA capture kit in cDNA-AFLP. Biochemica (3), 23- 24.
Isolasi dan kloning fragmen cDNA dari tanaman karet dengan sifat resisten....... (Nurhaimi-Haris et al .)
Hadi H  (2003).  Analisis genetik sifat ketahanan tanaman karet terhadap penyakit gugur daun Corynespora . Ringkasan Disertasi . Institut Pertanian Bogor.  25 hal.
Pawirosoemardjo S, B Setyawan, H Suryaningtyas, A Situmorang & M Supriadi (2009). Strategy in Controlling Corynespora Leaf Fall Disease in Rubber Plantation. Tanjung Morawa, IRRI-CFC. 24p
Keyer K & JA Imlay (1996).  Superoxide accelerates DNA damage by elevating free-iron levels. In : Proc Natl Acad Sci 93, 13635–13640
Klessig DF, J Durner, R Noad, DA Navarre, D Wendehenne, D Kumar, JIM Zhou, J Shah,  S Zhang, P Kachroo, Y  Trifa, D Pontier, E Lam & Silva H  (2000).  Nitric oxide and salicylic acid signaling in plant defense .  In: Proc Natl Acad Sci USA 97, 8849-8855.
Navarre DA, D Wendehenne, J Durner, R Noad  &  DF Klessig (2000).  Nitric oxide modulate the activity of tobacco aconitase. Plant Physiol 122, 573-582.
Petters J,  C Gobel, D Scheel & S Rosahl  (2002).  A pathogen- responsive cDNA from potato encodes a protein with homology to a phosphate starvation-induced phosphatase. Plant Cell Physiol 43(9), 1049-1053.
Sambrook J, EF Fritsch & T Maniatis  (1989). Molecular Cloning . A laboratory Manual. Second edition.  Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Santaella M, E Suarez, C Lopez, C Gonzalez,  G Mosquera,
S Restrepo, J Tohme, A Badillo & V Verdier (2004). Identification of genes in cassava that are differentially
expressed during infection with Xanthomonas axonopodis pv. manihotis.  Mol Plant Pathol 5(6), 549-558.
Sinulingga W, Suwarto &  H Soepena  (1996).  Current status of Corynespora leaf fall in Indonesia. In: Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16 – 17 Desember.  p: 29 – 36.
Situmorang A  (2002).  Sebaran penyakit gugur daun, virulensi dan genetika Corynespora cassiicola asal sentra perkebunan karet Indonesia. Disertasi . Bogor,  Program Pascasarjana IPB, 115 hal.
Sugui JA & HB Deising  (2002).  Isolation of infection-specific sequence tags expressed during early stages of maize anthracnose disease development. Mol Plant Pathol 3, 197-203.
Suwarto, S Pawirosoemardjo &  W Sinulingga  (1996).
Responses of recommended Hevea rubber clones to Corynespora leaf fall disease in Indonesia. In : Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16 – 17 Desember. p: 149-162.
Van der Biezen EA, J Hedyani, JE Parker &  JDG Jones (2000). cDNA-AFLP display for the isolation of Peronospora parasitica genes expressed during infection in Arabidopsis thaliana . Mol Plant Microbe Interac 13, 895-898.
Zhang L, H Meakin & M Dickinson  (2003).  Isolation of genes expressed during compatible interactions between leaf rust ( Puccinia triticina ) and wheat using cDNA-AFLP. Mol Plant Pathol 4, 469-477.