## PRODUKSI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM KITINASE DARI ISOLAT BAKTERI TERMOFILIK B1211 ASAL AIR PANAS BORA
[Production and Activity Assay of Chitinase Enzyme from B1211 Thermophyl Bacteria Isolates in Bora Hot Springs]
Jaya Hardi 1* , Jusman 1 , Abd. Rahman Razak 1 , Silva 1
1 Jurusan Kimia Fakultas MIPA, Universitas Tadulako Jl. Soekarno Hatta Km.9, Kampus Bumi Tadulako Tondo Palu, Telp. 0451- 422611
Diterima 23 Agustus 2016, Disetujui 23 Oktober 2016

## ABSTRACT
This research aims to production of chitinase from thermophylic bacteria that living in Bora hot spring and  to  determine  of  chitinase  extracts  activity.  The  research  was  began  with  rejuvenated  of  B1211 bacteria  isolates  on  MSM  agar  media.    The  B1211  isolates  was  used  to  production  of  chitinase extracts  on  MSM  broth  media  with  chitin  colloidal  concentration  of  0.25%,  0.5%,  1%,  2%,  4%  and incubation  temperature  of  30 o C  (rt),  37 o C,  50 o C,  and  60 o C  for  3  days.  The  chitinase  activity  were analyzed  based  on  N-acetyl-D-glucosamine  standard.  The  results  was  showed  that  B1211  bacteria isolates  is  potential  isolate  for  production  chitinase.  The  highest  activity  of  chitinase  from  B1211 bacteria isolates of 0.75 U/mL for chitin colloidals concentration of 1% and temperature of 60 o C.
Keywords : Bora, hot spring, bacteria, thermophylic, B1211 isolates, chitinase .

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  memproduksi  enzim  kitinase  dari  bakteri  termofilik  asal  sumber  air panas Bora dan untuk menentukan aktivitas enzim kitinase yang diperoleh. Penelitian diawali dengan peremajaan  isolat  bakteri  B1211  pada  media  MSM  agar.  Isolat  bakteri  B1211  digunakan  untuk produksi  enzim  kitinase  pada  media  MSM  cair  yang  diperkaya  dengan  konsentrasi  koloidal  kitin 0,25%, 0,5%, 1%, dan 4% pada suhu inkubasi 30 o C ( rt ), 37 o C, 50 o C, dan 60 o C selama 3 hari. Aktivitas enzim  kitinase  dianalisis  berdasarkan  standar  N-asetil-D-glukosamin.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  isolat  bakteri  B1211  adalah  isolat  yang  sangat  potensial  digunakan  untuk  produksi  kitinase. Aktivitas  enzim  kitinase  tertinggi  dari  isolat  bakteri  B1211,  yaitu  0,75  U/mL  yang  diperoleh  pada penggunaan konsentrasi koloidal kitin 1% dan suhu 60 o C.
Kata kunci : Bora, sumber air panas, bakteri, termofilik, isolat B1211, kitinase.

## LATAR BELAKANG
Kitin merupakan biopolymer alam yang tersusun  atas  monomer β  -1,4  N-asetil-D- glukosamin (Chen et  al .,  2010).  Pada beberapa dekade terakhir, penelitian tentang  kitin  dan  turunannya,  seperti oligomer  kitin,  N-asetil-D-glukosamin,  dan kitosan  telah  banyak  dikembangkan.  Hal tersebut  tidak  lepas  dari  manfaat  dari produk-produk kitin yang banyak dimanfaatkan pada bidang kosmetik, biomedis,  farmasi,  dan  pertanian  (Purwani et al., 2002).
Pada  produk  hasil  hidrolisis  senyawa kitin  banyak  dimanfaatkan  pada  berbagai bidang, diantaranya bidang farmasi, pertanian  dan  industri  makanan.  Oligokitin dapat  dimanfaatkan  dalam  membantu meningkatkan  sistem  kekebalan  tubuh, memiliki  sifat  anti  bakteri  dan  anti  kapang, serta  meningkatkan  daya  tahan  pada tanaman.  Semnetara  untuk  monomer  N- asetil-D-glukosamin sangat banyak dimanfaatkan sebagai obat untuk mengontrol  kadar  gula  dalam  darah, sebagai  suplemen,  dan  anti  inflamasi.  N- asetil-D-glukosamin  juga  dapat  digunakan di  industri  kosmetik  dalam  mengurangi hilangnya  hiperpigmentasi  (Herdyastuti et al., 2010).
Hidrolisis  atau  degradasi  kitin  dapat dilakukan secara kimiawi maupun enzimatik  (Chen et  al .,  2010).  Degradasi kitin secara enzimatis banyak dikembangkan karena merupakan  memiliki yang  sederhana,  cepat,  dan  proses pemotongan  ikatan  glikosidik  yang  lebih
spesifik  untuk  menghasilkan  senyawa turunan  kitin  atau  kitin  oligosakarida dibandingkan hidrolisis kimiawi. Kitin oligosakarida  dan  N-asetil-D-glukosamin diperoleh  dari  proses  degradasi  secara enzimatik menggunakan enzim yang memiliki aktivitas kitinolitik, yaitu kitinase.
Kitinase (E.C. 3.2.1.14) dapat dihasilkan  dari  beberapa  jenis  organisme, seperti  serangga,  crustacea,  jamur,  dan juga bakteri. Khusus untuk bakteri penghasil  enzim  kitinase,  keberadaan enzim dapat dideteksi dan diisolasi melalui pembentukan  zona  bening  pada  medium selektif  agar  (Herdyastuti et  al., 2010). Salah  satu  bakteri  penghasil  kitinase  yang banyak  mendapatkan  perhatian  adalah bakteri termofil, karena dapat menghasilkan enzim yang bersifat termostabil  juga  yang  tahan  pada  suhu yang  tinggi  dan  memiliki  laju  reaksi  yang lebih  cepat.  Enzim  termostabil  dapat diperoleh dari bakteri yang hidup di daerah bersuhu  tinggi  seperti  sumber  air  panas pada kawah gunung berapi, sumur hidrotermal, dan sebaginya. Bakteri termofil telah  diisolasi  dari  sumur  hidrotermal  di Manado  Sulawesi  Utara  dengan  indeks kitinolitik  2,40  (Purwani et  al., 2002). Selain  indeks  kitinolitik,  aktivitas  kitinase menjadi  parameter  penting  lainnya  dalam pemilihan  isolat  bakteri  termofil  terbaik. Pada  penelitian  sebelumnya  Natsir et  al., ( 2009) berhasil mengisolasi bakteri termofil (isolat  ST-3)  pada  pH  7  dan  suhu  60 o C dengan aktivitas kitinase 0,225 U/mL.
Indonesia yang banyak memiliki gunung  berapi  tentunya  sejalan  dengan melimpahnya  sumber  air  panas,  sehingga potensi  ke  arah  isolasi  bakteri  termofil penghasil  kitinase  sangat  besar.  Salah satunya  adalah  sumber  air  panas  Bora yang  terletak  di  Kabupaten  Sigi  Provinsi Sulawesi  Tengah.  Sumber  air  panas  Bora diasumsikan memiliki potensi besar sebagai  tempat  hidup  dari  bakteri-bakteri termofil  sebagaimana  sumber  air  panas Tompaso  di  Manado  (Chasanah,  2004; Purwani et al. , 2002). Belum adanya kajian yang  menuju  ke  arah  tersebut,  sehingga perlu  dilakukan  isolasi  bakteri  termofilik asal  air  panas  Bora  untuk  memproduksi enzim kitinase dengan aktivitas tinggi yang selanjutnya  memiliki  nilai  ekonomi  yang lebih tinggi.

## METODE PENELITIAN Bahan dan Peralatan
Bahan  utama  penelitian  ini  adalah sampel  isolat  bakteri  B1211,  media  padat MSM  dengan  koloidal  kitin  (komposisi: 0,1%  KH 2 PO 4 ;  0,7%  (NH 4 ) 2 SO 4 ;  0.1%
NaCl;  0.05%  ekstrak  ragi,  1.5%  agar,  dan 2%  koloidal  kitin),  kitin,  MSM  cair  dengan kolidal  kitin  (komposisi:  0,1%  KH 2 PO 4 ; 0,7% (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.1% NaCl; 0,01%; 0.05% ekstrak ragi, dan 0.5% koloidal kitin), bufer fosfat  pH  7,  NaCl  fisiologis,  HCl  pekat, NaOH  12  N, glass  wool ,  NaCl,  dan aquades.  Bahan  lainnya  untuk  analisis meliputi: pewarna Schales,  dan N-asetil-D- glukosamin standar.
Alat yang digunakan meliputi spektrofotometer
UV-Vis, inkubator, laminar air flow , sentrifugasi, penangas air , pipet mikro, vortex, botol sampel,  dan alat- alat  gelas  yang  umum  digunakan  di laboratorium kimia.

## Prosedur Penelitian
Produksi  enzim  kitinase  (Modifikasi Metode Purwani dkk., 2002)
Kultur  awal  bakteri  ( starter )  dibuat dengan  menggunakan  stok  isolat  bakteri termofilik B1211 hasil peremajaan disuspensikan pada 50 mL larutan fisiologis  0,9%  NaCl.  Produksi  enzim kitinase  diawali  dengan  sebanyak  satu  mL inokulum  diambil  dan  dipindahkan  pada media starter yaitu media MSM cair (tanpa koloidal  kitin)  dan  diinkubasi  pada  suhu 37 o C  selama  24  jam.  Langkah  selanjutnya diambil  sebanyak  1  mL  isolat  bakteri  dan dipindahkan  pada  media  produksi  (MSM cair  diperkaya  koloidal  kitin  0,25;  0,5;  1; 2%, dan 4%). Kemudian diinkubasi menggunakan termoshake pada kecepatan 60 rpm selama  tiga hari pada suhu  30 ( rt ), 37, 50, dan 60 o C. Sentrifugasi pada 10.000 rpm  selama  15  menit.  Supernatan  yang diperoleh  adalah  ekstak  enzim  kitinase kasar yang siap diujikan.

## Uji Aktivitas kitinase
Pengujian aktivitas kitinase dilakukan dengan  menggunakan  metode  Ueda  dan Arai  (1992)  dengan  beberapa  modifikasi. Sebanyak 300 μl koloidal kitin (1%), 150 μl bu ffer  fosfat  pH  7  dan  150  μl  enzim  kasar enzim dihomogenisasi dalam tabung reaksi
dan diinkubasi  pada  suhu 55ºC selama 30 menit. Pengujian dilakukan dengan ditambahkan reagen Schales . Hasil perlakuan diukur  absorbansinya  pada  λ= 420  nm.  Pengukuran  konsentrasi  N-asetil- D-glukosamin hasil hidrolisis dihitung berdasarkan  kurva  standar  N-asetil-D- glukosamin.  Satu  unit  aktivitas  enzim kitinase  didefinisikan  sebagai  sejumlah enzim  yang  menghasilkan  satu μmol  N- asetil-D-glukosamin per menit.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas Enzim Kitinase
Produksi enzim kitinase dari mikroorganisme  lebih  baik  dibandingkan kitinase  dari  sumber  yang  lain  karena kemudahannya  berkembang  biak  dalam waktu  yang  relatif  singkat.  Produksi  enzim kitinase  dilakukan  dengan  menumbuhkan isolat bakteri pada media yang mengandung  kitin  sebagai  substrat  dan diinkubasi  pada  waktu,  pH,  dan  suhu tertentu. Isolat bakteri B1211 yang digunakan telah dilaporkan memiliki aktivitas kitinolitk dan dapat digunakan juga untuk produksi kitosanase (Khoridah, 2016). Faktor waktu, pH, dan suhu inkubasi perlu dikontrol untuk mendapatkan produksi enzim yang maksimal (Herdyastuti, 2009).
Deteksi  kinerja  enzim  kitinase  terlihat dari pengukuran aktivitas selama mendegradasi  substrat.  Substrat  yang digunakan untuk mengukur aktivitas kitinase  yaitu  koloidal  kitin.  Aktivitas kitinase  merupakan  ukuran  jumlah  produk
yang  dihasilkan  dari  suatu  pemecahan substrat  kitin.  Aktivitas  kitinase  ditentukan dengan  menggunakan  metode  Schales, yaitu  menggunakan  reagen  berwarna  dan diukur menggunakan spektrofotometer UV- Vis pada panjang gelombang 420 nm.
Gambar 1. Enzim kitinase kasar
Enzim kitinase diperoleh setelah masa inkubasi  selama  tiga  hari  dan  sentrifugasi (Gambar  1).  Berdasarkan  Gambar  2 terlihat  bahwa  pada  suhu  ruang  (±30 0 C) konsentrasi substrat  stabil hingga 1% dan terjadi penurunan pada konsentrasi substrat  2%,  sedangkan  pada  suhu  37 0 C, 50 0 C,  dan  60 0 C  mengalami  kenaikan sampai  pada  konsentrasi  substrat  1%  dan cenderung  konstan  pada    konsentrasi substrat  2%  dan  4%.  Michaelis-Menten menjelaskan  tentang  terjadinya  kompleks enzim  substrat  karena  adanya  kontak antara  bagian  aktif  enzim  dan  substrat. Sehingga  pada  konsentrasi  enzim  yang tetap,  kecepatan  reaksi  akan  meningkat seiring  dengan  penambahan  substrat, karena semakin tinggi konsentrasi substrat maka  semakin  banyak  yang  bereaksi dengan  sisi  aktif  enzim.  Akan  tetapi  pada keadaan  substrat  berlebih,  kerja  enzim
tidak  sampai  menurun  tetapi  konstan dimana enzim menjadi jenuh oleh substratnya,  dan  tidak  dapat  berfungsi lebih  cepat.  Kejenuhan  terjadi  karena seiring  dengan  meningkatnya  konsentrasi substrat,  semakin  banyak  enzim  bebas yang  diubah  menjadi  kompleks  substrat- enzim ES (Lehninger, 1982).
Sementra  pada  penggunaan  beragam suhu inkubasi menunjukkan bahwa kenaikan  suhu  produksi  enzim  kitinase mulai dari suhu ruang (± 30 0 C) hingga suhu
60 0 C  dengan  aktivitas  tertinggi  sebesar
0,75 U/mL (Gambar 2). Kenaikan temperatur  sampai  pada  batas  nilai tertentu, dapat mempercepat proses reaksi kimia,  tetapi  kenaikan  suhu  yang  terlalu tinggi atau setelah melebihi suhu optimumnya akan menyebabkan terjadinya denaturasi  enzim.  Hal  ini  menyebabkan terjadinya  penurunan  kecepatan  reaksi yang  dikatalis  oleh  enzim  tersebut  (Brock dan Brock dalam Dessy, 2008).
Gambar 2 Hubungan antara aktivitas enzim kitinase terhadap konsentrasi koloidal kitin dan suhu.
Natsir  dkk.,  (2012)  melaporkan  bahwa enzim  kitinase  dari B.  licheniformis HSA3- 1a yang diproduksi pada suhu 50 o C selama 72    jam  inkubasi  memiliki  aktivitas  0,45 U/mL,  sedangkan  pembanding  kitinase murni memiliki aktivitas 1,05 U/mL. Aktivitas  enzim  kitinase  yang  diperoleh pada  penelitian  ini  lebih  tinggi  daripada enzim kitinase pada penelitian tersebut dan mendekati aktivitas kitinase murni, sehingga sangat potensial untuk selanjutnya dapat dimurnikan.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang telah  dilakukan,  dapat  disimpulkan  bahwa Enzim  kitinase  yang  dihasilkan  dari  isolat bakteri termofil B1211 menghasilkan aktivitas tertinggi pada penggunaan konsentrasi substrat 1% dan suhu produksi 60 o C, yaitu 0,75 U/mL.
Merujuk  dari  hasil  penelitian  yang diperoleh,  dimana  aktivitas  enzim  kitinase yang  dihasilkan  cukup  tinggi,  maka  perlu dilakukan penelitian lanjutan berupa pemurnian  kitinase  dan  juga  pemanfaatan
0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 2,25 2,5 2,75 3 3,25 3,5 3,75 4 A k tiv it a s ( U /m L ) Konsentrasi  Substrat (%) 30⁰C 37⁰C
50⁰C 60⁰C
pada  produksi  oligomer  kitinase  maupun monomer N-asetilglukosamin.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terimakasih  penulis  haturkan kepada  pihak  DRPM  Kemenristek  Dikti yang telah memberikan hibah penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Chasanah E. 2004. Chitosanase of Bacillus luchenformis MB-2 Isolatd form Manado  Hot  Spring  Water. Disertasi .
Bogor: Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.
Chen  JK,  Shen  CR,  Liu  CL.  2010.  N-
Acetylglucosamine:  Production  and Applications  (Review). Marine  Drugs . 8: 2493-2516.
Dessy,  C.S.  2008.  Isolasi  Bakteri  dan  Uji Aktivitas  Amilase  Termofil  Kasar  dari Sumber  Air  Panas  Penen  Sibirubiru
Sumatera Utara. Tesis . Medan:
Universitas Sumatera Utara.
Herdyastuti  N,  Raharjo  TJ,  Mudasir,
Matsjeh  S.  2009.  Chitinase  and Chitinolytic  Microorganism:  Isolation, Characterization and Potential.
Indonesian  Journal  Chemistry .  9(1): 37-47.
Khoridah,  E.N.  2015.  Produksi  Enzim Kitosanase dari Isolat Bakteri Termofil  Sumber  Air  Panas  Bora.
Skripsi. Palu: Universitas Tadulako.
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia
Jilid  1 ,  (diterjemahkan  oleh  Meggy Thenawijaya). Jakarta: Erlangga.
Natsir  H,  Dali  S,  Astin,  Trisanova.  2009.
Isolasi dan Karakterisasi Enzim
Kitinase  dari  Bakteri  Termofil  Isolat ST-3,2b. Jurnal Ilmiah Biologi
Makassar . 4(1): 51-58.
Natsir  H,  Patong  A.R,  Suhartono  M.T,  dan
Ahmad  A.  2012.  Produksi  dan
Aplikasi  Kitinase  dari B.  licheniformis
HSA3-1a  dalam  Menghidrolisis  Kitin dari  Limbah  Udang  dan  Dinding  Sel
Jamur Ganoderma
sp .
http://repository.unhas.ac.id/handle/1
23456789/1643. Diakses pada tanggal 23 Agustus 2016 ).
Purwani  EY.,Toharisman  A,  Chasanah  E,
Laksmi  JF,  Welan  V,  Suhartono, Purwadaria  T,  Hwang  JK,  Pyun  YR.
2002.  Studi  Pendahuluan  Enzim Kitinase  Extraseluler  yang  Dihasilkan Oleh  Isolat  Bakteri  Asal  Manado.
Jurnal Teknologi dan Industri Pangan . 8(2): 111-117.
Ueda  M,  Arai  M.  1992.  Purification  and Some  Properties  of  Chitinases  from Aeromonas  sp .  No.  1OS-24. Biosci. Biotech  and  Biochem. 56(3):  460-
464.