## VIABILITAS BACILLUS SUBTILIS DI MEDIA PRESERVASI AGAR SUSU SKIM PADA TIGA VARIAN SUHU PENYIMPANAN

## VIABILITY OF BACILLUS SUBTILIS PRESERVED IN SKIM MILK AGAR AT THREE DIFFERENT STORAGE TEMPERATURES
Sheila Febrilia 1 , Enty 2, *
1 Fakultas Kedokteran Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya, Jl. Pluit Raya No. 2, Jakarta, 14440
2 Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya, Jl. Pluit Raya No. 2, Jakarta, 14440
* Korespondensi: enty@atmajaya.ac.id

## ABSTRACT
Introduction:  Bacterial  preservation  is  a  common  practice  in  microbiology  laboratories.  Several  methods considered ideal for long-term bacterial preservation are freeze-drying and cryopreservation. Skim milk agar has  been  used  for  specific  preservation  media.  Bacillus  sp,  like  Bacillus  subtilis,  is  easy  to  grow  on  many growth media. This study aims to determine the viability of Bacillus subtilis preserved in skim milk agar and stored at 3 different temperatures for 150 and 270 days.
Methods:  B.subtilis ATCC 6633 isolates cultivated in skim milk agars were divided into 3 groups  based on temperatures. The viability assessment was carried out twice on days 150 and 270. Colony count has been carried out with  Miles & Misra method. Bacterial growth will be recorded and analysed using general linear model in SPSS.
Results: B.subtilis ATCC 6633 preserved in skim milk agar for 150 and 270 days  were viable. Statistically, skim milk agar and storage temperature showed no significant effect on the growth of B.subtilis ATCC 6633 (p>0,005).
Conclusion: There is no significant effect of preservation media and storage temperature on the growth of B.subtilis ATCC 6633.
Key Words: bacteria viability, B.subtilis ATCC 6633, skim milk agar.

## ABSTRAK
Pendahuluan: Preservasi  bakteri  merupakan  hal  yang  umum  pada  kebanyakan  laboratorium  mikrobiologi. Berbagai  metode  seperti  kering  beku  dan  penyimpanan  suhu  rendah  dianggap  sebagai  metode  preservasi yang ideal, tetapi metode ini membutuhkan alat dan operator khusus. Agar Susu Skim merupakan media yang umum  digunakan  untuk  preservasi  bakteri. B.subtilis merupakan  bakteri  yang  mudah  tumbuh  pada kebanyakan media. Studi ini bertujuan untuk mengidentifikasi viabilitas B.subtilis ATCC 6633 yang disimpan pada 3 suhu berbeda selama 150 dan 270 hari.
Metode: Isolat B.subtilis ATCC 6633 dikultivasi ke dalam tabung berisi agar susu skim, yang kemudian akan dibagi menjadi 3 kelompok penyimpanan berdasarkan suhu yang telah ditentukan. Uji viabilitas akan dilakukan sebanyak 2 kali pada hari ke-150 dan 270 dengan menggunakan metode Miles & Misra. Hasil uji akan dicatat dan dianalisa dengan menggunakan uji General Linear Model pada aplikasi SPSS.
Hasil: Viabilitas bakteri B.subtilis ATCC 6633 pada hari ke-150 dan 270 menunjukkan hasil yang sama yaitu bakteri  tetap  viabel.  Secara  statistik,  tidak  ada  pengaruh  yang  bermakna  oleh  media  preservasi  dan  suhu penyimpanan terhadap pertumbuhan bakteri B.subtilis (p>0,005). Simpulan: Tidak  ada  pengaruh  yang  bermakna  antara  media  preservasi  dan  suhu  penyimpanan  terhadap pertumbuhan bakteri B.subtilis ATCC 6633. Kata Kunci: viabilitas bakteri, B.subtilis ATCC 6633, agar susu skim.

## PENDAHULUAN
Preservasi  bakteri  merupakan  hal  pen- ting pada kebanyakan laboratorium pendidik-
an, pelayanan, dan penelitian. Preservasi bak- teri dapat dilakukan dengan berbagai metode seperti kering beku ( freeze dry dan spray dry ),

## ARTIKEL PENELITIAN
Culti-Loops ®,  kriopreservasi  pada  suhu  ren- dah  (- 150˚C),  penggunaan  gliserol/paraffin pada suhu rendah (- 80˚C) dan media preser- vasi  tertentu.  Metode freeze  dry,  spray  dry, dan  kriopreservasi  ( freezing  and  frozen  sto- rage) merupakan  metode  yang  ideal  diguna- kan dalam preservasi bakteri jangka panjang. Kekurangan  dari  metode  ini  adalah  membu- tuhkan  alat  khusus  yang  harus  dioperasikan oleh  operator  dengan  keahlian  khusus  yang pada  umumnya  tidak  tersedia  pada  keba- nyakan  laboratorium,  selain  itu  energi  yang dibutuhkan pada metode ini juga tidak sedikit serta proses pengerjaan yang kompleks. 1
Metode Culti-Loops® umumnya dihasil- kan  oleh  pabrikan  untuk  tujuan  komersil  dan banyak  digunakan  untuk  tujuan  kendali mutu ( quality contro l). Bakteri yang disimpan dalam bentuk Culti-Loops banyak diminati karena ke- tahanannya  pada  suhu  ruang  atau  4˚C  dan dapat langsung digunakan. 2
Metode  preservasi  dengan  mengguna- kan  minyak  mineral  yang  banyak  dilakukan pada  bakteri  dan  fungi  dapat  dijadikan  salah satu alternatif dalam preservasi dalam jangka waktu 3 tahun. Aktivitas metabolik bakteri ma- sih  tetap  aktif  dengan  metode  ini,  sehingga mutasi  pada  bakteri  masih  dapat  terjadi.  Mi- nyak  mineral  yang  digunakan  adalah  minyak dengan nilai grafitas spesifik (0,865 – 0,890).
Bakteri  perlu  ditanam  dan  diidentifikasi  per- tumbuhannya terlebih dahulu serta dilanjutkan dengan penambahan minyak mineral setinggi 1-2 cm.
Preservasi bakteri juga dapat dilakukan dengan menyimpan bakteri pada suhu freezer - 20˚C. Dengan metode ini, bakteri dapat ber-
tahan selama 1-2 tahun tergantung dari spe- sies yang digunakan. Kekurangan dari meto- de ini adalah pembentukan kristal es selama masa penyimpanan yang dapat merusak din- ding  sel  bakteri  sehingga  kurang  tepat  jika dijadikan  sebagai  metode  preservasi  jangka panjang.
Preservasi  bakteri jangka  pendek  pada umumnya  dilakukan  di  setiap  laboratorium mikrobiologi  untuk  penggunaan  sehari-hari. Metode  ini  dilakukan  dengan  menumbuhkan bakteri di media agar baru dan disimpan pada suhu  4˚C.  Risiko  kontaminasi  dan  kemung- kinan  agar  mengering  tidak  dapat  dicegah, tetapi dapat diminimalisir dengan penggunaan laboratory film , penyimpanan dalam keadaan terbalik  dan  penyimpanan  bakteri  pada  suhu rendah  (5- 8˚C) akan membantu memperlam- bat  proses  metabolik  bakteri  sehingga  dapat memperpanjang waktu penyimpanan. 3
Enriched media merupakan contoh me- dia pertumbuhan yang banyak digunakan dan terdapat  nutrisi  tambahan.  Nutrisi  tambahan dapat berupa darah, serum, kuning telur. Be- berapa  contoh enriched  media adalah  agar darah ( trypticase soy agar yang ditambahkan darah domba 5%), chocolate agar (agar darah yang dipanaskan),  dan Loeffler’s serum slope . Beberapa media perbenihan padat tan- pa nutrisi tambahan banyak dimanfaatkan se- bagai media preservasi. Beberapa contoh me- dia  perbenihan  padat  yang  sering  digunakan adalah MacConkey  Agar yaitu  media  yang memiliki  komponen  seperti  garam  empedu dan violet kristal yang memungkinkan pertum- buhan bakteri gram negatif dan menghambat pertumbuhan  bakteri  gram  positif.  Agar  susu
skim adalah  media  yang  banyak  digunakan untuk  biakan  dan  enumerasi  pada  produk berbahan dasar susu yang direkomendasikan oleh American  Pubic  Health  Association (APHA).  Komposisi  dari  skim  milk  adalah tripton  sebagai  sumber  asam  amino,  ekstrak ragi, dekstrosa, dan bubuk skim milk sehingga media ini dianggap sebagai media yang kaya akan nutrisi.
Sebuah media preservasi yang baik ha- rus memiliki nutrisi yang cukup untuk mendu- kung  kelangsungan  hidup  bakteri,  menurun- kan proses metabolik bakteri dan menurunkan laju pertumbuhannya. Media preservasi yang optimal  belum  dapat  didefiniskan  secara mutlak  dan  bervariasi  tergantung  spesies bakteri yang digunakan.
Sebelum  menjalankan  proses  presser- vasi,  penting  bagi  laboratorium  untuk  meng- identifikasi  ketersediaan  sumber  daya  manu- sia,  alat  dan  bahan,  tujuan  preservasi,  dan daya  tumbuh  bakteri  sebelum  melakukan preservasi. Mengidentifikasi tujuan preservasi akan  membantu  dalam  menentukan  metode preservasi yang akan digunakan.  Contoh jika preservasi  bertujuan  untuk  penyimpanan jangka panjang maka dibutuhkan mesin pen- dingin  ( ultralow  freezer atau liquid  nitrogen ), serta  diiperlukan  mesin  untuk  melakukan proses freeze dry atau spray dry . Jika tujuan preservasi adalah periode waktu jangka pen- dek,  maka  penggunaan  media  perbenihan padat  merupakan  salah  satu  metode  yang dapat digunakan.
Pertumbuhan  bakteri  sangat  dipenga- ruhi  oleh  banyak  hal  selain  media  partum- buhan  yaitu  suhu  pertumbuhan,  nutrisi  yang
dibutuhkan seperti sumber karbon atau mine- ral  (sulfur,  fosfor,  atau  potasium),  dan  pH. 4
Tidak  semua  bakteri  dapat  tumbuh  dengan baik dalam media, suhu, nutrisi dan pH yang sama. Hal ini dikarenakan bakteri memiliki ka- rakteristik pertumbuhan optimum yang berva- riasi agar dapat tumbuh dengan baik.
Penelitian  Sadhu  mendapatkan  bahwa pertumbuhan  bakteri  paling  optimal  adalah pada  suhu  15°C  -  30°C,  sedangkan  penyim- panan bakteri pada suhu di bawah 7°C akan menyebabkan pertumbuhan yang melambat. 5 Selain itu, penelitian Wiebe mendapatkan bah- wa  setiap  penurunan  suhu  akan  menyebab- kan  peningkatan  kebutuhan  substrat  yang memengaruhi pertumbuhan. 6
Bacillus  subtilis merupakan  bakteri Gram  positif,  saprofit,  motil  karena  memiliki flagella, dan dapat ditemukan dengan mudah di  tanah,  udara,  dan  susu  murni.  Bakteri  ini juga  merupakan  mikroorganisme  yang  dapat membentuk  spora  dan  bakteri  non-patogen tetapi  memiliki  kemampuan  untuk  mengon- taminasi  makanan  dan  dianggap  sebagai patogen  oportunistik. 7 B.subtilis  dapat  mela- kukan sporulasi bila berada pada kondisi yang tidak  menguntungkan.  Peran  dari  sporulasi adalah untuk menghasilkan sel dorman yang secara  metabolisme  tidak  aktif  yang  dikenal dengan  sebutan  endospora  yang  memung- kinkan  untuk  mampu  bertahan  hidup  dalam kondisi lingkungan yang buruk karena memi- liki  ketahanan  pada  panas,  pengeringan,  ra- diasi,  pembekuan,  dan  disinfeksi. 8 B.  subtilis memiliki  bentuk  koloni  yang  bulat,  memiliki permukaan yang kasar, opak, berwarna putih
atau  putih  kekuningan  dengan  tepi  yang bergerigi. 9
Penggunaan  media  perbenihan  padat merupakan  kegiatan  yang  umum  dilakukan pada laboratorium mikrobiologi baik dalam bi- dang penelitian maupun akademis. Kegunaan agar  pada  umumnya  adalah  sebagai  media transfer sampel atau isolat bakteri. Agar lebih baik disimpan pada suhu ruang maupun suhu kulkas untuk menghindari rusaknya agar, hal ini  diakibatkan  karena  komposisi  agar  yang kurang tepat jika disimpan pada suhu freezer karena kristal es yang terbentuk dapat meru- sak agar maupun isolat yang ditanam.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mempe- lajari  terkait  metode  preservasi  pada  media pertumbuhan yang umum tersedia pada keba- nyakan  laboratorium  seperti  agar  susu  skim yang  disimpan  pada  suhu  - 20˚C,  2-8˚C,  dan suhu ruang (15- 25˚C).

## METODE
Desain penelitian adalah deskriptif ana- litik yang dilakukan pada bulan Agustus 2020 hingga Mei 2021 di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas  Kedokteran  dan  Ilmu  Kesehatan Unika Atma Jaya Jakarta. Total sampel seba- nyak 27 tabung.
Variabel  dependen  pada  penelitian  ini adalah  viabilitas  bakteri  yang  diuji  dengan menggunakan metode Miles & Misra dan jum-
lah  bakteri  (CFU/ml).  Variabel  independen pada penelitian ini adalah media penyimpan- an yaitu agar susu skim dan suhu penyimpan- an bakteri (- 20˚C, 2-8 ˚C, dan suhu ruang (15- 25 ˚C)).
Analisis  data  dilakukan  secara  multiva- riat  dengan  menggunakan  SPSS  versi  22.0. Analisis  multivariat  dilakukan  menggunakan general linear model .

## HASIL
Bakteri yang telah ditanam pada agar susu skim disimpan pada suhu -20 ˚C, 2-8˚C, dan  suhu  ruang  (15- 25˚C)  selama  150  hari.
Bakteri akan diambil pada hari ke-150 dan ke- 270  untuk  dilanjutkan  dengan  pengamatan viabilitas  pada  kedua  media  uji.  Viabilitas bakteri dinilai berdasarkan ada tidaknya koloni yang  tumbuh  pada  permukaan  agar  setelah proses  pembiakan  ulang  (subkultur)  sesuai dengan  prosedur  mikrobiologi  yang  standar pada suhu 35- 37˚C selama 18-24 jam.
Hasil  viabilitas  seluruh  kelompok  coba menunjukkan  100%  viabel  (9  dari  9  tabung bakteri dengan kondisi yang diujikan) menga- lami pertumbuhan yang ditandai dengan keke- ruhan (Tabel 1). Uji enumerasi dilakukan  pa- da salah satu di antara 9 tabung kelompok uji untuk mendapatkan perhitungan konsentrasi/ jumlah  bakteri  dengan  satuan  CFU/mL  ( Co- lony Forming Unit) (Tabel 2).
Tabel 1. Persentase Viabilitas B.subtilis ATCC 6633 pada Hari ke-150 dan 270
No. Tabung Media Preservasi Suhu Penyimpanan Hasil Pengamatan Pertumbuhan Persentase Viabilitas 150 hari 270 hari 1-9 Agar susu skim - 20 ˚C Tumbuh Tumbuh 100% 1-9 2- 8 ˚C Tumbuh Tumbuh 100% 1-9 Suhu ruang (15- 25˚C) Tumbuh Tumbuh 100%
Secara  umum,  bakteri B.subtilis ATCC 6633 masih  dapat  ditumbuhkan  kembali  de- ngan setelah penyimpanan 270 hari di 3 suhu yang berbeda. Jumlah bakteri tertinggi (1.125 x  10 4 CFU/mL)  bakteri B.subtilis ATCC  6633
tampak pada penyimpanan pada suhu ruang (15-25 ˚C). Jumlah bakteri  terendah (4 x  10 2 ) bakteri B.subtilis ATCC  6633  tampak  pada penyimpanan di suhu -20 ˚C.
Tabel 2. Hasil Pengamatan Viabilitas dan Enumerasi Bakteri B.subtilis ATCC 6633 pada Agar Susu Skim Setelah Penyimpanan pada Suhu - 20˚C, 2-8˚C, dan Suhu Ruang (15-25˚C) Selama 150 dan 270 Hari
Suhu Faktor Dilusi Penyimpanan 150 hari Penyimpanan 270 hari Pertumbuhan bakteri Jumlah Bakteri (CFU/ml) Pertumbuhan bakteri Jumlah Bakteri (CFU/ml) - 20 ˚C 10 0 Tumbuh 4 x 10 2 Tumbuh 1.75 x 10 3 10 -1
Tidak Tumbuh Tumbuh 10 -2 Tidak Tumbuh Tidak Tumbuh 10 -3 Tidak Tumbuh Tidak Tumbuh 10 -4 Tidak Tumbuh Tidak Tumbuh 10 -5 Tidak Tumbuh Tidak Tumbuh 10 -6 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh 10 -7 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh 10 -8 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh 2-8 ˚C 10 0 Tumbuh 3 x 10 3 Tumbuh 5 x 10 2 10 -1
Tumbuh Tumbuh 10 -2 Tidak Tumbuh Tidak Tumbuh 10 -3 Tidak Tumbuh Tidak Tumbuh 10 -4 Tidak Tumbuh Tidak Tumbuh 10 -5 Tidak Tumbuh Tidak Tumbuh 10 -6 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh 10 -7 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh 10 -8 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh Suhu Ruang (15-25 ˚C)
10 0 Tumbuh 1.125 x 10 4 Tumbuh 5 x 10 3 10 -1
Tumbuh Tumbuh 10 -2 Tidak tumbuh Tumbuh 10 -3 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh 10 -4 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh 10 -5 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh 10 -6 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh 10 -7 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh 10 -8 Tidak tumbuh Tidak Tumbuh
Hasil  analisis  data  menggunakan  uji statistik general  linear  model menunjukkan bahwa  media  perbenihan  dan  suhu  penyim- panan tidak memiliki pengaruh yang signifikan terhadap  pertumbuhan  dan  viabilitas  bakteri (p>0,05) (Tabel 3).

## DISKUSI
Perubahan  ekstrim  pada  kondisi  ling- kungan akan menyebabkan bakteri mati, ber- henti bertumbuh, atau berada dalam fase lag yang  memanjang  dan  penurunan  laju  per- tumbuhan. Psikrofil adalah bakteri yang dapat
tumbuh  pada  suhu 0˚C  serta  memiliki  suhu pertumbuhan  optimal  15˚C  dan  suhu  per- tumbuhan  maksimal  20˚C.  Perubahan  pada kondisi  lingkungan  pertumbuhan  yang  terlalu jauh dari kondisi idealnya akan menyebabkan cold  response yang  menyebabkan  bakteri
akan  mementingkan survival dibandingkan dengan  pertumbuhan.  Bakteri  gram  negatif dapat  beradaptasi  lebih  baik  dengan  penu- runan suhu lingkungan dibandingkan dengan bakteri gram positif. 10
Gambar 1. Grafik Pertumbuhan B.subtilis ATCC 6633 pada Agar Susu Skim Selama 270 hari
Tabel 3. Hasil Analisa Data Menggunakan General Linear Model Faktor yang Diteliti Penyimpanan 150 hari  270 hari Media Agar susu skim p > 0,05 Suhu - 20 ˚C
p > 0,05 2- 8 ˚C Suhu Ruang (15- 25˚C)
Suhu  dapat  memengaruhi  respon  bak- teri  secara  langsung  dengan  memengaruhi laju pertumbuhannya, aktifvtas enzim, kompo- sisi  sel,  dan  kebutuhan  akan  nutrisi  atau secara  tidak  langsung  dengan  memengaruhi transpor ion, difusi, tegangan permukaan dan densitas.  Sepanjang  penurunan  suhu,  maka fase lag bakteri  akan  memanjang  menye- babkan penurunan laju pertumbuhan 10 .
Suhu memengaruhi kurva pertumbuhan bakteri.  Hal  ini  didapatkan  pada  penelitian yang  menggunakan  bakteri S.marcescens, E.coli, B.subtilis, P.fluorescens, B.megaterium, dan P.aeruginosa yang  pertumbuhannya diamati  dengan  menggunakan  kurva  Arrhe- nius.  Hasilnya  menunjukkan  bahwa  suhu pertumbuhan  optimum  bakteri  sekitar  38 ˚C serta  menyatakan  bahwa  akan  terjadi  penu-
4 30 112,5 17,5 5 50 0 20 40 60 80 100 120 J um lah B ak teri ( CF U/m l) Suhu Penyimpanan yang diuji Jumlah Bakteri 150 Hari (CFU/ml)
Jumlah Bakteri 270 hari (CFU/ml) - 20˚C 2- 8 ˚C 15- 25 ˚C Jumlah Bakteri 150 hari ( x10 2 CFU/ml) Jumlah Bakteri 270 hari ( x10 2 CFU/ml)
runan  pertumbuhan  bakteri  pada  suhu  yang rendah. 11
Penelitian lain oleh Jordan, et al . adalah dengan  menyimpan  bakteri  pada  suhu  15- 40˚C. Hasilnya adalah suhu 15˚C merupakan kondisi  yang  paling  baik  untuk  pertumbuhan bakteri  pada  percobaannya.  Selain  itu  suhu 35˚C dan 40˚C menyebabkan penurunan laju pertumbuhan bakteri. Suhu yang terlalu tinggi dianggap sebagai suhu kritikal untuk viabilitas bakteri.  Pernyataan  ini  dibuktikan  dengan hasil  penelitian  yang  menunjukkan  jumlah bakteri  yang  viabel  akan  menurun  dimulai pada suhu 30˚C. 12
Penelitian  terkait  efek  media  pertum- buhan,  ukuran  inokulum  dan  waktu  inkubasi pada isolasi bakteri tanah yang dilakukan oleh Kathryn, et  al .  mendapatkan  bahwa  media berperan penting dalam pertumbuhan bakteri. Hal ini dibuktikan dengan hasil penelitian pada medium VL55 memiliki  hasil  pertumbuhan yang kurang baik dibandingkan dengan media lain  yang  digunakan. 13 Penelitian  lain  oleh Ochoa, et  al .  membandingkan  media  dan kondisi pertumbuhan untuk melakukan biakan terhadap Helicobacter sp.,  menemukan  bah- wa  agar Columbia dan Brucella secara  sig- nifikan lebih efektif untuk menumbuhkan spe- sies Enterohepatic  helicobacter .  Hal  ini  dika- renakan  komposisi  di  dalam  agar  Columbia dan  Brucella  lebih  baik  untuk  menumbuhkan spesies  bakteri  tertentu,  dalam  hal  ini Enterohepatic helicobacter . 14
Penelitian yang dilakukan oleh Zeraik, et al .  menyatakan  bahwa  bakteri  dapat  tumbuh dengan baik pada media yang memiliki nutrisi yang tinggi dan pertumbuhannya akan menu-
run  pada  media  dengan  nutrisi  yang  kurang atau sedikit 15 .

## SIMPULAN
Hasil  viabilitas  seluruh  kelompok  coba menunjukkan  100%  viabel  (9  dari  9  tabung bakteri  dengan  kondisi  yang  diujikan)  meng- alami  pertumbuhan  yang  ditandai  dengan kekeruhan.  Terdapat  penurunan  jumlah  bak- teri  pada  sebagian  besar  hasil  pengamatan selama  270  hari  penyimpanan.  Setelah  dila- kukan uji SPSS dengan General Linear Model , maka dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat pengaruh yang signifikan pada media presser- vasi dan suhu penyimpanan terhadap pertum- buhan  bakteri B.subtilis ATCC  6633.  Pene- litian  ini  masih  memiliki  banyak  kekurangan, seperti  jumlah  sampel  yang  terlalu  sedikit, risiko kontaminasi, dan keterbatasan alat dan bahan. Penelitian selanjutnya dapat dilakukan dengan  memilih  metode  enumerasi  yang berbeda  seperti  metode  agar  tuang  dan pengontrolan  suhu  secara  maksimal  yang dilakukan setiap bulannya

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  diberikan  kepada dr.  Lucky  H.  Moehario,  Ph.D.,  Sp.MK  yang telah memberikan pencerahan dalam pembuatan artikel.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Alonso  S.  Novel  preservation  techniques  for microbial  cultures.  In:  Food  Engineering  Series. Springer; 2016. p. 7 –33.
2. Oxoid  -  Product  Detail  [Internet].  [cited  2021  May 17]. Available from: http://www.oxoid.com/UK/blue/ prod_detail/prod_detail.asp?pr=CL1007&cat=&sec
=2&c=UK&lang=EN
3. She  RC,  Petti  CA.  Procedures  for  the  storage  of microorganisms.  In:    Manual  of  Clinical  Microbio- logy  [Internet]. ASM Press; 2015 [cited 2021 May 20]. p. 161 –8.
4. Kaiser  G.  Factors  that  influence  bacterial  growth. In: Microbiology (https://bio.libretexts.org/Book shelves/Microbiology/Microbiology_(Kaiser)/Unit_7 %3A_Microbial_Genetics_and_Microbial_Metaboli sm/17%3A_Bacterial_Growth_and_Energy_Produ ction/17.2%3A_Factors_that_Influence_Bacterial_ Growth)
5. Sadhu SP. Effect of cold chain interruptions on the shelf-life  of  fluid  pasteurised  skim  milk  at  the consumer  stage.  Braz  J  Food  Technol  [Internet]. 2018;21:e2017064.
6. Wiebe  WJ,  Sheldon  WM,  Pomeroy  LR.  Bacterial growth  in  the  cold:  evidence  for  an  enhanced substrate  requirement.  Appl  Environ  Microbiol. 1992 Jan;58(1):359-64.
7. Bacillus subtilis | Microchem Laboratory [Internet]. [cited  2020  Apr  29].  Available  from:  https://microc hemlab.com/microorganisms/bacillus-subtilis
8. Earl AM, Losick R, Kolter R. Ecology and genomics of Bacillus subtilis. Vol. 16, Trends in Microbiology. NIH Public Access; 2008. p. 269 –75.
9. Lu  Z,  Guo  W,  Liu  C.  Isolation,  identification  and characterization of novel bacillus subtilis. J Vet Med
Sci [Internet]. 2018 [cited 2020 Oct 8];80(3):427 –33. 10.  Beales  N.  Adaptation  of  microorganisms  to  cold temperatures,  weak  acid  preservatives,  low  pH, and osmotic stress: A review. Compr Rev Food Sci Food  Saf  [Internet].  2004  Jan  1  [cited  2021  Apr 23];3(1):1 –20.
11.  Mohr PW, Krawiec S. Temperature characteristics and  Arrhenius  plots  for  nominal  psychrophiles, mesophiles  and  thermophiles.  J  Gen  Microbiol. 1980 Dec;121(2):311-7.
12.  Jordan RC, Jacobs SE. The effect of temperature on  the  growth  of  Bacterium  coli  at  pH  7-0  with  a constant  food  supply.  J  Gen  Microbiol  [Internet]. 1947 Jun 1 [cited 2021 Apr 23];1(2):121 –36.
13.  Davis  KER,  Joseph  SJ,  Janssen  PH.  Effects  of growth medium, inoculum size, and incubation time on  culturability  and  isolation  of  soil  bacteria.  Appl Environ  Microbiol  [Internet].  2005  Feb  [cited  2021 Apr 21];71(2):826 –34.
14.  Ochoa  S,  Martínez  OA,  Fernández  H,  Collado  L. Comparison  of  media  and  growth  conditions  for culturing  enterohepatic  Helicobacter  species.  Lett Appl  Microbiol  [Internet].  2019  [cited  2021  Apr 21];69(3):190 –7.
15.  Zeraik AE, Nitschke M. Influence of growth media and  temperature  on  bacterial  adhesion  to polystyrene  surfaces.  Brazilian  Arch  Biol  Technol. 2012;55(4):569 –76.