Abstrak —Kanker  merupakan  kelainan  dengan  karakteristik mutasi  yang  mengganggu  mekanisme  kontrol  normal  dan berpotensi  menghasilkan  sel-sel  yang  berbahaya.  Pengobatan yang diterapkan di Indonesia masih belum mendapatkan hasil yang  memuaskan  serta  menimbulkan  efek  samping.  Senyawa SA  2014  yang  diisolasi  dari  spons  laut  Cinachyrella  anomala dapat  berperan  sebagai  imunomodulator  dan  berpotensi menjadi alternatif pengobatan kanker. Penelitian ini dilakukan untuk  mengetahui  konsentrasi  senyawa  SA  2014  yang  paling optimal dalam meningkatkan aktivitas fagositosis sel makrofag.  Uji  aktivitas  fagositosis  dilakukan  secara  in  vitro dengan  menambahkan  senyawa  SA  2014  dan  doxorubicin sebagai  pembanding  dengan  konsentrasi  10µg/mL,  5µg/mL, 2,5µg/mL,  1,25µg/mL  serta  0µg/mL  (kontrol)  pada  sel makrofag  mencit,  selanjutnya  ditambahkan  latex  beads. Aktivitas    fagositosis  dinyatakan  dalam  kapasitas  fagositosis dan    indeks  fagositosis.  Hasil  penelitian  ini  yakni  senyawa  SA 2014 dapat meningkatkan aktivitas fagostosis pada konsentrasi 2,5 µg/mL dengan kapasitas fagositosis serta indeks fagositosis 2  kali  lebih  besar  dibanding  kontrol,  sedangkan  perlakuan doxorubicin  dapat  meningkatkan  kapasitas  fagositosis  pada konsentrasi  5  µg/mL  1,06  kali  lebih  besar  dibanding  kontrol namun tidak dapat meningkatkan indeks fagositosis.
Kata  kunci —Fagositosis,  Imunomodulator,  Makrofag  dan  SA 2014.

## I. PENDAHULUAN
ANKER  merupakan  kelainan  yang  dikarakterisasikan dengan  mutasi  yang  mengganggu  mekanisme  control normal dan berpotensi menghasilkan sel-sel yang berbahaya [1].  Organisasi  Kesehatan  Dunia  (WHO)  mengestimasikan bahwa 84 juta orang meninggal akibat kanker dalam rentang waktu 2005-2015 [2]. Salah satu karakteristik kanker adalah terjadinya penghambatan proses apoptosis yang berhubungan  dengan  resistensi  sel  kanker  terhadap kemoterapi  maupun  radioterapi.  Kemoterapi  merupakan penggunaan  obat  yang  menghentikan  replikasi  dan pembelahan  sel  dalam  pengobatan  kanker  [3]  sedangkan radioterapi  adalah  pengobatan  kanker  menggunakan  radiasi partikel  atau  gelombang  berenergi  tinggi  seperti  sinar-X, gamma,  elektron  atau  proton  untuk  menghancurkan  atau merusak  sel  kanker  [4].  Selain  kedua        metode      tersebut, pembedahan      merupakan    metode      pengobatan        kanker yang banyak  diterapkan  di  Indonesia.  Prinsip  dasar  metode  ini adalah  pengambilan  sel  kanker  secara  langsung  melalui pembedahan [5].
Beberapa  jenis  terapi  yang  telah  disebutkan  sebelumnya belum mendapatkan hasil yang memuaskan serta menimbulkan efek samping, sehingga perlu dicari alternatif
lain dalam usaha pengobatan penyakit tersebut salah satunya dengan penggunaan bahan-bahan yang bersifat imunomodulator dalam terapi kanker. Senyawa imunomodulator merupakan senyawa yang dapat menginduksi  peningkatan  aktivitas  sistem  imun  di  dalam tubuh.  Senyawa  tersebut  dapat  memicu  proses  apoptosis secara alami [6]. Apoptosis adalah kematian sel terprogram ( programed cell death ) yang bertujuan untuk mempertahankan  kestabilan  populasi  sel.  Peningkatan apoptosis  merupakan  suatu  upaya  yang  dikembangkan sebagai terapi kanker saat ini [7].
Senyawa  SA  2014  merupakan  salah  satu  senyawa  yang bersifat  imunomodulator . Senyawa  ini  diisolasi  dari  spons laut C. anomala dan termasuk dalam kelompok alkaloid [8]. Senyawa  alkaloid  ini  berperan  dalam  menghambat proliferasi  dan  induksi  siklus  sel  pada  fase  sub-G 1 dan  fase G 2 /M  serta  sebagai  inhibitor  CDK2  yang  menghambat progres  siklus  sel  pada  fase  G 1 menuju  ke  fase  S  [9]. Senyawa SA 2014 secara tidak langsung dapat meningkatkan fagositosis makrofag. Fagositosis  merupakan mekanisme pertahanan tubuh terhadap serangan mikroorganisme  yang  juga  berperan  dalam  mengeliminasi sel-sel  yang  telah  rusak  [10]. Sel-sel  yang  telah  mengalami apoptosis  akan  dieliminasi  dalam  proses  fagositosis  oleh makrofag  yang  mengenali  sinyal  spesifik  yang  ditunjukkan oleh  sel  yang  mengalami  apoptosis  [11].  Oleh  karena  itu penelitian  mengenai  efektivitas  senyawa  SA  2014 dalam meningkatkan  aktivitas  fagositosis  harus  dilakukan  untuk mengetahui  potensinya  sebagai  bahan  obat  kanker mengingat pengobatan  yang  yang diterapkan saat ini belum mendapatkan  hasil  yang  memuaskan  serta  menimbulkan efek samping.

## II. METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  dilakukan  pada  Juni  2017-Mei  2018  di Laboraturium Parasitologi, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah  Mada  Yogyakarta.  Selanjutnya  perhitungan  dan analisis  data  dilakukan  di  Laboratorium  Zoologi  dan Rekayasa  Hewan,  Departemen  Biologi  Fakultas  Ilmu  Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember , Surabaya
A. Aklimatisasi Mencit
Mencit  ( Mus  musculus )  jantan  galur Swiss  webster sejumlah  3  ekor  berumur  8-10  minggu  dengan  berat  badan 20-30  g  diaklimatisasi  selama  1  minggu  di  tempat pemeliharaan mencit (animal house). Mencit  diberi  makan pellet  standar dan air ad libitum [12].
Akhlaqul Karimaa
Departemen Biologi, Fakultas Ilmu Alam , Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS)
e-mail: kakhlaqul26@gmail.com

## Uji in Vitro Senyawa Antikanker SA 2014
terhadap Aktivitas Fagositosis Sel Makrofag ( Mus musculus )
K

## B. Preparasi Sampel Uji
Senyawa  SA  2014  didapatkan  dari  hasil  penelitian sebelumnya  berupa  larutan  dengan  konsentrasi  senyawa 200 ppm sebanyak 200 µl [7]. Stok larutan SA 2014 yang didapatkan  selanjutnya  diencerkan  secara  bertingkat dengan  menambahkan  200  µl  SA  2014  ke  dalam  3,8  ml RPMI  dingin,  kemudian  dihomogenkan.  Selanjutnya diambil 2  ml  larutan dari tabung tersebut dan dimasukkan ke  dalam  tabung  reaksi  kedua  yang  berisi  2  ml  RPMI dingin. Langkah ini diulang hingga tabung reaksi keempat sehingga didapatkan suspensi larutan SA 2014 pada tabung reaksi  1-4  dengan  konsentrasi  secara  berturut-turut 10µg/mL; 5µg/mL; 2,5µg/mL; 1,25µg/mL [12].

## C. Isolasi dan Kultur Sel Makrofag
Mencit  yang  telah  diaklimatisasi  dibius  menggunakan kloroform  (bius  hirup).  Mencit  diletakkan  di  papan  bedah dalam  posisi  terlentang.  Kulit  bagian  perut  dibersihkan dengan    alkohol    70%  kemudian  dibuka  menggunakan dissection  set. Selanjutnya  10  ml    RPMI  1640  dingin disuntikkan  ke  rongga  peritoneum  dan  ditunggu  sekitar  3 menit  sambil  rongga  peritoneumnya  ditekan  secara perlahan [12].
Cairan peritoneum selanjutnya diaspirasi  menggunakan jarum  suntik, kemudian  disentrifus  pada  5000  rpm 4˚C selama  3  menit.  Setelah  disentrifus  bagian  supernatan dibuang,      sedangkan  bagian  pelet  disuspensikan  pada media  RPMI  lengkap  (medium  RPMI  yang  ditambah dengan Fetal  Bovine Serum  (FBS)  10%,  amfoterisin  B 0,5%  dan  penisilin/streptomisin  1%)  hingga  15  ml.  Pellet yang  telah  disuspensikan  pada  RPMI  lengkap  divortex dengan  kecepatan  1800  rpm  selama  10  detik.  Suspensi pellet  kemudian  diambil  beberapa  tetes  dan  dihitung jumlah  selnya  dengan  hemositometer.  Setelah  jumlah  sel didapatkan,  suspensi  diencerkan  dengan  RPMI  lengkap hingga didapat kepadatan sel 2,5 x 10 6 /ml [12].
Suspensi yang didapatkan selanjutnya diambil sebanyak 200 µl (5 x 10 5 sel) dan dimasukkan dalam  sumuran  yang telah  dilapisi cover  slips .  Sel-sel  makrofag  tersebut dikulturkan pada inkubator CO 2 5%, suhu 37°C selama 30 menit.  Inkubasi  dilanjutkan  hingga  24  jam  setelah sebelumnya  masing-masing  sumuran  ditambah  RPMI lengkap sebanyak 300 µl [12].

## D. Uji Fagositosis dengan Latex Beads
Uji  kemampuan  fagositosis  non-spesifik  dilakukan secara in  vitro menggunakan latex  beads. Medium  pada sumuran  yang  telah  berisi  kultur  sel  makrofag  dibuang terlebih dahulu kemudian dicuci dengan RPMI sebanyak 2 kali.  Selanjutnya  ditambahkan  200µl  larutan  SA  2014 dengan  konsentrasi  10µl;  5µl;  2,5µl;  1,25µl  serta  0µl dengan  3  kali  pengulangan  pada  masing-masing konsentrasi  senyawa.  Campuran  tersebut  didiamkan selama  4  jam.  Setelah  didiamkan,  suspensi  senyawa dibuang  dan  pada  masing-masing  sumuran  ditambahkan latex beads sebanyak  200  µl.  Sumuran  tersebut selanjutnya diinkubasi selama 60 menit kemudian suspensi latex beads dibuang [12].
Sumuran  selanjutnya  dicuci  dengan Phospat  Buffered Saline (PBS),  difiksasi  dengan  metanol  dan  dikeringkan dengan  cara  diangin-anginkan  pada  suhu  kamar.  Tahapan
selanjutnya  adalah  pewarnaan  dengan  Giemsa  10% kemudian  dicuci  dan  dikeringkan.  Setelah  dicuci  dan dikeringkan, cover  slips diambil  dari  dalam  sumuran  dan diamati  di  bawah  mikroskop  dengan  perbesaran  400  kali. Pada  pengamatan  mikroskop  dihitung  jumlah latex  beads yang difagositosis dan makrofag yang aktif memfagosit tiap 300  sel  makrofag  [12].  Data  yang  didapatkan  digunakan untuk  menghitung  kapasitas  fagositosis  dan  indeks fagositosis dengan persamaan berikut [13]:
Kapasitas fagositosis =  jumlah sel makrofag aktif    x100% jumlah sel makrofag total (300)
Indeks fagositosis  =   jumlah latex beads yang terfagositosis jumlah sel makrofag  aktif
Data yang diperoleh dari kapasitas dan indeks fagositosis makrofag  diuji  dengan  menggunakan One  Way  ANOVA untuk  mengetahui  pengaruh  pemberian  SA  2014  terhadap fagositosis  makrofag  dengan  taraf  kepercayaan  95% kemudian  dilanjutkan  dengan  uji  Tukey  untuk  mengetahui konsentrasi  yang  paling  optimal  dalam  meningkatkan aktivitas fagositosis [12].

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini digunakan sel makrofag sebagai sel uji karena  kemampuan    sel  makrofag    yang  dapat  menempel pada coverslips membedakannya    dengan    sel-sel    lainnya [14]. Sel makrofag yang digunakan diisolasi dari peritoneum mencit.  Rongga    peritoneum    merupakan    tempat  yang mudah  untuk  memanen Resident    Peritoneal    Makrofag (RPM)  yang  merupakan    sel    fagosit    yang    hidup    bebas pada  rongga    peritoneal.  Jutaan  resident    makrofag  dapat diambil dari rongga peritoneum satu mencit. Oleh sebab itu sel  makrofag  dari  rongga  peritoneum  banyak  digunakan dalam  penelitian-penelitian  yang  berhubungan  dengan imunologi [15].
Medium yang digunakan dalam proses isolasi serta kultur sel  makrofag  adalah Roswell  Park  Memorial  Institute 1640 (RPMI  1640).  Medium  RPMI  mengandung  glukosa, vitamin, phenol  red sebagai  indikator  pH  (medium  akan berubah  warna  saat  pH  berubah  atau  terjadi  kontaminasi), garam mineral (NaCl, NaCO 3 , Na 2 PO 4 , CaNO 3 , MgSO 4 dan KCl)  dan  asam  amino  (glutamin,  arginin,  leusin,  lisin  dan serin)  [16].  Medium  tersebut  dapat    meningkatkan    migrasi monosit    ke    dalam  rongga  peritoneum  serta  menjaga makrofag yang dikultur tetap hidup [14].
Makrofag  yang  dikultur  dalam  medium  ditambahkan latex  beads.  Latex  beads merupakan  partikel  asing  yang sangat  direspon  baik  oleh  sistem  imun  mencit  maupun manusia  sehingga  dapat  menstimulus  aktivitas  fagositosis. Karakter latex  beads adalah  tidak  dapat  diwarnai  sehingga pada saat proses pewarnaan dengan Giemsa akan didapatkan makrofag    tampak    berwarna  keunguan  sedangkan  lateks tidak  berwarna.  Hasil  pewarnaan  tesebut  dapat    digunakan untuk  membedakan  antara  lateks  yang terfagositosis  dan yang    tidak  terfagositosis.  Kultur  yang  telah  diwarnai selanjutnya  dicuci  dengan  PBS  untuk    menghilangkan lateks yang  tidak  terfagositosis serta ditambahkan metanol untuk proses fiksasi [14]. Aktivitas fagositosis sel makrofag
dapat diketahui dari pengamatan preparat yang tercetak pada cover slips dengan bantuan mikroskop.
E. Morfologi Sel Makrofag Mencit (M. musculus) dengan Perlakuan Senyawa SA 2014 dan Doxorubicin
Morfologi  sel  makrofag  mencit  ( M.  musculus )  pada kelompok  kontrol  serta  kelompok  perlakuan  senyawa  SA 2014 dan doxorubicin menunjukkan perbedaan pada nukleus dan  sitoplasma  (Gambar  1).  Morfologi  sel  makrofag kelompok  kontrol  maupun  kelompok  perlakuan  SA  2014 menunjukkan  adanya  persamaan,  yakni  karakteristik  sel makrofag yang normal. Sel makrofag normal (Gambar 1.A, B  dan  C)  memiliki  inti  yang  berbentuk  bulat  atau  lonjong serta  berwarna  lebih  gelap  dibanding  sitoplasma  saat  diberi pewarna, dengan ukuran sel 15-80µm [17]. Selain morfologi yang  sama,  sel  makrofag  kelompok  kontrol  dan  kelompok perlakuan  SA  2014  menunjukkan  adanya  pseudopodia (Gambar  1.B).  Pseudopodia  pada  sel  makrofag  merupakan salah  satu  bentuk  perubahan  morfologi  yang  terjadi  akibat adanya  aktivasi  makrofag  oleh  mikroorganisme  patogen atau antigen yang lain Perlakuan SA 2014 tidak memberikan efek  merusak pada sel  makrofag karena  morfologi  sel  yang normal dan adanya pseudopodia [18].
Gambar  1.  Morfologi  Sel  Makrofag  yang  Diberi  Perlakuan  Senyawa  SA 2014 dan Doxorubicin : (A) Kontrol, (B) SA 2014 Konsentrasi 2,5 µg/mL, (C)  SA  2014  Konsentrasi  5  µg/mL,  (D)  Doxorubicin  Konsentrasi  2,5 µg/mL dan  (E) Doxorubicin Konsentrasi 5 µg/mL (Pengamatan Mikroskop Perbesaran 400x)
Keterangan : (m) makrofag, (l) latex beads, (p) peudopodia , (a) ap
Sel makrofag yang diberi perlakuan senyawa doxorubicin (Gambar  1.  D  dan  E)  menunjukkan  adanya  perubahan morfologi  sel  makrofag  yakni  apoptosis  sel.  Sel  makrofag dengan perlakuan doxorubicin dengan konsentrasi 2,5µg/mL (Gambar  1.D)  mengalami  apoptosis  karena  menunjukkan karakteristik apoptosis yakni volume sel berkurang, organel di sitoplasma terkondensasi namun membran sel relatif utuh, sedangkan  sel  makrofag  dengan  perlakuan doxorubicin dengan  konsentrasi  5  µg/mL  (Gambar  1.E)  menunjukkan karakter  apoptosis  yakni  fragmentasi  nukleus  yang  diikuti sitoplasma dan membran sel [19].
Apoptosis  yang  terjadi  pada  sel  makrofag  dengan perlakuan doxorubicin diduga  disebabkan  oleh  sifat sitotoksisitas doxorubicin . Doxorubicin memiliki
kemampuan  untuk  merusak  sel  melalui  menghasilkan radikal  bebas  dan  menginduksi  peroksidasi  lipid.  Selain  itu doxorubicin dapat menghambat enzim-enzim esensial dalam replikasi  seperti  helikase  dan  topoisomerase  II  yang berperan  dalam    melepaskan  untaian  DNA  sehingga  proses replikasi DNA terhambat dan tidak dapat terjadi biosisntesis makromolekul yang menyebabkan kematian sel [20].
F. Kapasitas  Fagositosis  Sel  Makrofag  Mencit  (M. musculus)  dengan  Perlakuan  Senyawa  SA  2014  dan Doxorubicin
Data  yang  didapatkan  melalui  pengamatan  mikroskop digunakan  dalam  perhitungan  kapasitas  fagositosis  untuk mengetahui  nilai  aktivitas  makrofag  (Tabel  1  dan  Gambar 2).  Kapasitas  fagositosis  merupakan  persentase  makrofag yang memfagositosis latex beads dari 300 makrofag [20].
Tabel 1. Nilai Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag ( M.musculus ) dengan Perlakuan Senyawa SA 2014 dan Doxorubicin Konsentrasi (µg/mL) Kapasitas Fagositosis Perlakuan SA 2014 Kapasitas Fagositosis Perlakuan Doxorubicin Kontrol 19,816 ± 0,480 b 19,816 ± 0,479 b 1,25 18,973 ± 0,929 b 15,701 ± 2,002 ab 2,5 40,869 ± 1,903 d 17,868 ± 1,884 ab 5 31,690 ± 1,863 c 21,159 ± 2,676 b 10 9,666 ± 1,217 a 6,533 ± 0,538 a
Keterangan  :  Superskrip  yang  berbeda  pada  kolom  yang  sama menunjukkan perbedaan signifikan (P<0,05)
Uji  ANOVA  nilai  kapasitas  fagositosis  sel  makrofag dengan  perlakuan  SA  2014  maupun  perlakuan doxorubicin menunjukkan  nilai  yang  signifikan  (Lampiran  1  dan  2). Analisis  statistika  dilanjutkan  dengan  uji  Tukey.  Hasil  uji Tukey (Lampiran 3 dan 4) menunjukkan bahwa konsentrasi senyawa  SA  2014  yang  optimal  dalam  meningkatkan kapasitas  fagositosis  sel  makrofag  adalah  2,5  µg/mL, sedangkan konsentrasi doxorubicin yang mampu meningkatkan kapasitas fagositosis adalah 5 µg/mL.
Gambar  2.  Perbandingan  Kapasitas  Fagositosis  Sel  Makrofag  Kontrol, Perlakuan SA 2014 dan Perlakuan Doxorubicin
Data  pada  Tabel  1.  dan  Gambar  2.  menunjukkan  bahwa sel  makrofag dengan perlakuan SA 2014 tidak stabil dalam mempengaruhi nilai kapasitas fagositosis. Terjadi penurunan
nilai  kapasitas    fagositosis  pada  konsentrasi  1,25  µg/mL sebesar  0,834,  namun  pada  konsentrasi  2,5  µg/mL  dan  5 µg/mL mengalami peningkatan secara berturut-turut sebesar 21,053  (2  kali  lebih  besar  dibanding  kontrol)  dan  11,874. Selanjutnya  pada  konsentrasi  10  µg/mL  mengalami penurunan kembali sebesar 10,150. Secara umum, perlakuan senyawa  SA  2014  mampu  meningkatkan  kapasitas fagositosis  karena  2  dari  4  variasi  konsentrasi  yang diberikan  dapat  menghasilkan  nilai  kapasitas  fagositosis yang  lebih  besar  dibanding  perlakuan  kontrol.  Peningkatan kapasitas  fagositosis  yang  terjadi  pada  kelompok  perlakuan senyawa SA 2014 diduga disebabkan oleh adanya pengaruh penambahan senyawa alkaloid SA 2014 ke dalam kultur sel makrofag.  Mekanisme  kerja  senyawa  alkaloid  SA  2014 sebagai imunomostimulant diduga  dengan  meningkatkan produksi  IL-2  (interleukin  2)  dan  proliferasi  limfosit  dalam kultur  [21].  Senyawa  SA  2014  memiliki  massa  molekul yang  besar  yaitu  191.23  g/mol  [8].  Oleh  karena  itu  untuk dapat masuk ke dalam sel limfosit, senyawa SA 2014 harus melalui proses transport aktif sekunder [1].
Senyawa SA 2014 yang telah masuk ke dalam sitoplasma sel  limfosit  menyebabkan  sel  tersebut  teraktivasi.  Sel limfosit  yang  teraktivasi akan  mengaktifkan  sitokin  seperti interleukin-2  (IL-2)  dan  interferon-γ  (IFN-γ).  Sitokin tersebut  akan   mengaktifkan  makrofag  untuk  memberikan respon  terhadap  antigen  yang  ada  dalam  tubuh  [21]. Penambahan senyawa alkaloid SA 2014 akan meningkatkan aktivitas  sel  limfosit  pada  kultur,  secara  tidak  langsung  hal tersebut  menyebabkan  semakin  banyak  sel  makrofag  yang teraktivasi  dan  melakukan  fagositosis latex  beads sehingga didapatkan  nilai  kapasitas  fagositosis  yang  cenderung  lebih besar dibanding kontrol.
Penurunan  nilai  kapasitas  fagositosis  yang  terjadi  pada kelompok  perlakuan  senyawa  SA  2014  diduga  disebabkan oleh sifat senyawa SA 2014 yang sitotoksik. Sifat sitotositas yang dimiliki  senyawa  SA 2014 dapat menekan  kerja imun (imunosupresif).  Senyawa  yang  bersifat  sitotoksik  seperti alkaloid  dapat  menghambat  proliferasi  sel  imun,  produksi limfokin  sel  T  serta  mempengaruhi  sistim  fagosit  melalui penekanan  sistim  myelopoiesis  yang  akan  menurunkan pembentukan oksidan untuk membunuh antigen [22].
Sel makrofag dengan perlakuan doxorubicin memberikan hasil  nilai  kapasitas  fagositosis  yang  lebih  kecil  dibanding kontrol  pada  3  dari  4  variasi  konsentrasi  yang  diberikan (Tabel  1  dan  Gambar  2).  Konsentrasi  yang  paling  optimal adalah  5  µg/mL  dengan  peningkatan  kapasitas  fagositosis sebesar  1,343.  Nilai  kapasitas  fagositosis  yang  rendah tersebut dapat disebabkan oleh doxorubicin yang berpengaruh  pada  sel-sel  yang  mengalami  pembelahan  sel secara  cepat  seperti  sumsum  tulang  [23].  Di  antara  sel sumsum  tulang  belakang,  prekusor  hemopoetik  merupakan sel  yang  paling  sensitif  terhadap  sitotoksisitas  dari doxorubicin [24].  Oleh  karena  itu,  pada  penggunaan doxorubicin banyak  dijumpai leucopenia (jumlah  sel  darah putih yang terlalu rendah) serta penurunan interleukin-2 (IL- 2)  dan  produksi  interferon-γ  (IFN-γ)  yang  merupakan komponen  penting  dalam  sistem  imun.  Hal  ini  dapat menurunkan  jumlah  sel Natural  Killer (NK),  proliferasi limfosit  serta  rasio  limfosit  T  CD4 + /CD8 + yang  juga menurunkan jumlah makrofag aktif dalam sistem imun [25].
G. Indeks  Fagositosis  Sel  Makrofag  Mencit  (M.  musculus) dengan Perlakuan Senyawa SA 2014 dan Doxorubicin
Data  yang  didapatkan  melalui  pengamatan  mikroskop juga  digunakan dalam perhitungan indeks fagositosis untuk mengetahui kemampuan masing-masing sel makrofag dalam memfagosit latex  beads (Tabel  2  dan  Gambar  3).  Indeks fagositosis  adalah  perbandingan  antara  jumlah latex  beads yang  terfagosit  dan  jumlah makrofag yang  aktif memfagositosis [20].
Tabel 2. Nilai Indeks Fagositosis Sel Makrofag ( M. musculus ) dengan Perlakuan Senyawa SA 2014 dan Doxorubicin
Konsentrasi (µg/mL) Indeks Fagositosis Perlakuan SA 2014 Indeks Fagositosis Perlakuan Doxorubicin Kontrol 1,611 ± 0,212 a 1,611 ± 0,212 a 1,25 1,506 ± 0,231 a 1,333 ± 0,059 a 2,5 3,085 ± 0,611 b 1,131 ± 0,051 a 5 2,300 ± 0,290 ab 1,205 ± 0,064 a 10 2,424 ± 0,196 ab 1,194 ± 0,009 a
Keterangan  :  Superskrip  yang  berbeda  pada  kolom  yang  sama menunjukkan perbedaan signifikan (P<0,05 )
Uji ANOVA nilai indeks fagositosis sel makrofag dengan perlakuan  SA  2014  nilai  yang  signifikan,  namun  tidak signifikan  pada  perlakuan doxorubicin (Lampiran  5  dan  6). Analisis  statistika  dilanjutkan  dengan  uji  Tukey.  Hasil  uji Tukey (Lampiran 7 dan 8) menunjukkan bahwa konsentrasi senyawa SA 2014 yang paling optimal dalam meningkatkan indeks  fagositosis  sel  makrofag  adalah  2,5  µg/mL. Sedangkan perlakuan doxorubicin tidak mampu meningkatkan  nilai  indeks  fagositosis  pada  semua konsentrasi.
Gambar 3. Perbandingan Indeks Fagositosis Sel Makrofag Kontrol, Perlakuan SA 2014 dan Perlakuan Doxorubicin
Data  pada  Tabel  2.  dan  Gambar  3.  menunjukkan  bahwa sel makrofag yang diberi perlakuan senyawa SA 2014 pada semua konsentrasi kecuali konsentrasi 1,25 µg/mL memiliki nilai indeks fagositosis yang lebih tinggi dibanding kontrol. Konsentrasi  senyawa  SA  2014  yang  paling  optimal  dalam meningkatkan nilai indeks fagositosis adalah konsentrasi 2,5 µg/mL dengan meningkatkan indeks fagositosis 2 kali lebih besar  dibadingkan  kontrol.  Peningkatan  indeks  fagositosis ini diduga disebabkan oleh semakin banyaknya sitokin yang dihasilkan oleh limfosit akibat perlakuan senyawa SA 2014.
Sitokin-sitokin  tersebut  membuat  makrofag  semakin  aktif dengan  reseptor  yang  sensitif  terhadap  antigen.  Dalam penelitian  ini latex  beads merupakan  substansi  yang berperan  sebagai  antigen. Latex  beads dapat  dianggap sebagai  antigen  karena  dalam  beberapa  kasus  substansi tersebut  dapat  memicu  aktifnya  sistem  imun  tubuh  dengan respon berupa alergi [26].
Latex  beads yang  dianggap  sebagai  antigen  dapat menginduksi  makrofag  untuk  proses  fagositosis.  Proses fagositosis latex  beads oleh  sel  makrofag  diawali  dengan menempelnya substansi tersebut pada reseptor di permukaan sel  makrofag  yang  disebut Toll-like  Receptor (TLR).  TLR merupakan  transmembran  reseptor  yang  dapat  mengenali Pathogen-Associated
Molecular
Patterns (PAMPs) (molekul  spesifik  patogen  seperti  lipoprotein,  asam  nukleat atau polystyrene  beads ).  Pada  TLR  terdapat  banyak  jenis reseptor,  namun  yang  merespon  antigen latex  beads adalah Macrophage Receptor with Collagenouse Structure (MARCO) [27]. Reseptor MARCO berperan berperan untuk mengenali  partikel  yang  non-opsonisasi  seperti  silika,  besi oksida,  karbon  arang  dan polystyrene  beads [28]. Penempelan latex  beads dengan  reseptor  makrofag menginduksi  pseudopodia  untuk  mengelilingi  partikel tersebut,  sehingga  terbentuk  fagosom.  Pada  fagosom terdapat NADPH oxidase yang berperan dalam menghasilkan  oksidan  anion  superoksida  (O 2 - )  hipoklorit (OCl - )  dan  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )  yang  bersifat  toksik [29]. Fagosom menyatu dengan lisosom yang mensekresikan  lisozim  dan  V-ATPase.  Lisozim  berfungsi dalam  proses  hidrolisis  antigen,  sedangkan  V-ATPase berperan dalam menurunkan pH dengan melepaskan ion-ion H + . Akibat serangkaian proses tersebut antigen terfragmentasi  sehingga  terbentuk residual  body [30]. Penurunan  nilai  indeks  fagositosis  sel  makrofag  dengan perlakuan  SA  2014  diduga  disebabkan  oleh  sifat sitotoksisitas  yang  dimiliki  senyawa  tersebut  seperti  yang dijelaskan pada sub-bab kapasitas fagositosis.
Sel  makrofag  dengan  perlakuan doxorubicin pada  semua konsentrasi tidak dapat meningkatkan indeks fagositosis sel makrofag. Hal tersebut dapat dilihat pada Gambar 3. dimana nilai indeks  fagositosis sel  makrofag perlakuan doxorubicin lebih rendah dibanding kontrol pada semua konsentrasi. Hal ini  dapat  terjadi  karena  doxorubicin  memacu  apoptosis melalui  peningkatan    ekspresi  Bax.  Bax  berperan  dalam menginduksi apoptosis melalui mitokondria [31]. Apoptosis yang  terjadi  menyebabkan  kemampuan  fagositosis  sel makrofag.  Salah  satu  karakteristik  proses  apoptosis  yang terjadi  pada  kelompok  perlakuan doxorubicin adalah kondensasi sitoplasma. Hal tersebut menyebabkan metabolisme  sel  makrofag  terganggu  sehingga  tidak  dapat membentuk pseudopodia dan tidak dapat mengenali antigen [19].  Oleh  karena  itu  kemampuan  fagositosis  sel  makrofag kelompok  perlakuan doxorubicin pada  semua  variasi konsentrasi lebih rendah dibanding kontrol.

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa  perlakuan  senyawa  SA  2014  mampu  meningkatkan aktivitas  fagostosis  pada  konsentrasi  2,5  µg/mL  dengan kapasitas  fagositosis  serta  indeks  fagositosis  2  kali  lebih besar  dibanding  kontrol.  Sedangkan  perlakuan doxorubicin
dapat meningkatkan kapasitas fagositosis pada konsentrasi 5 µg/mL 1,06 kali lebih besar dibanding kontrol namun tidak dapat meningkatkan indeks fagositosis.

## LAMPIRAN
Lampiran 1.
Tabel 3. Tabel Hasil Uji ANOVA Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag dengan Perlakuan SA 2014
Lampiran 2.
Tabel 4.
Tabel Hasil Uji ANOVA Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag dengan
Perlakuan Doxorubicin
Lampiran 3.
Tabel 5.
Hasil Uji Tukey Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag dengan Perlakuan
SA 2014
Lampiran 4.
Tabel 6.
Hasil Uji Tukey Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag dengan Perlakuan Doxorubicin
Lampiran 5.
Tabel 7.
Hasil Uji ANOVA Indeks Fagositosis Sel Makrofag dengan Perlakuan SA
2014
Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 1183.482 4 295.870 82.716 .000 Within Groups 17.885 5 3.577 Total 1201.366 9
Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 199.678 4 49.919 9.819 .014 Within Groups 25.419 5 5.084 Total 225.097 9 Konsentrasi N Subset for alpha = 0.05 1 2 10.00 2  9.03250 1.25 2  15.70150  15.70150 2.50 2  17.86750  17.86750 .00 2 19.81600 5.00 2 22.10250 Sig. .055 .160 Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 3.859 4 .965 8.708 .018 Within Groups .554 5 .111 Total 4.413 9 Sum of Squares df Mean Square F Between Groups .332 4 .083 1.292 Within Groups .321 5 .064 Total .653 9
Lampiran 6.
Tabel 8.
Hasil Uji ANOVA Indeks Fagositosis Sel Makrofag dengan Perlakuan
Doxorubicin
Lampiran 7.
Tabel 9. Hasil Uji Tukey Indeks Fagositosis Sel Makrofag dengan Perlakuan
SA 2014
KONSENTRASI  N Subset for alpha = 0.05 1 10.00 2 1.19400 2.50 2 1.23050 1.25 2 1.33350 .00 2 1.61150 5.00 2 1.61400 Sig. .526

## DAFTAR PUSTAKA
[1] E. . Martini, F.H., Nath, J.D. and Bartholomew, Fundamentals of Aanatomy  and  Physiology  Ninth  Edition .  United  States  of America: Pearson Education, Inc, 2012.
[2] L.  Anggorowati,  “Faktor  Risiko  Kanker  Payudara  Wanita,” J. KEMAS , vol. 8, no. 2, pp. 102–108, 2013.
[3] S.  .  Mader, Understanding  Human  Anatomy  and  Physiology . USA: Mc. Graw-Hill, 2004.
[4] Y. Nurhayati, S. dan Lusiyanti, “Apoptosis dan Respon Biologik Sel sebagai Faktor Prognosa Radioterapi Kanker,” J. IPTEK Ilm. Pop. , vol. 7, no. 3, pp. 57–66, 2006.
[5] K. . Stephens, F.O. and Aigner, “Basics of Oncology,” Springer , 2009.
[6] S.  dan  K.  Tyastuti,  E.M.,  “Efek  Imunostimulator  Propolis terhadap  Proliferasi  Limfosit  T  dan  Viabilitas  Sel  Tumor Mammae Mencit secara in Vitro,” J. Bioteknol. , vol. 3, no. 1, pp. 1–7, 2006.
[7] A.  Nugrahaningsih  dan  Yuniastuti,  “Identifikasi  Apoptosis dengan  Metode  Tunel  Pasca  Pemberian  Ekstrak  Sambiloto  dan Pengaruhnya terhadap Volume Tumor,” J. Sain dan Teknol. , vol. 12, no. 2, pp. 139–146, 2014.
[8] S.  Nurhayati,  A.P.D.,  Pratiwi,  S.,  Wahyuono,  S.,  Istriyati., Abdillah, “Isolation and Identification of Alkaloid Compound of Marine Sponge Cinachyrella sp. (Family Tetillidae),” J. Adv. Bot.
Zool. , 2014.
[9] Fatmah,  “Respons  Imunitas  yang  Rendah  pada  Tubuh  Manusia Usia Lanjut,” Makara, Kesehat. , vol. 10, no. 1, pp. 47–53, 2006.
[10] A.  Hartini,  Y.S.,  Wahyuono,  S.,  Widyarini,  S.  dan  Yuswanto,
“Uji  Aktivitas  Fagositosis  Makrofag  Fraksi-fraksi  dari  Ekstrak Metanol  Daun  Sirih  Merah  (Piper  crocatumRuiz  &  Pav.)  secara In Vitro,” J. Ilmu Kefarmasian Indones. , vol. 11, no. 2, pp. 108– 115, 2013.
[11] L. Pecorino, Molecular Biology of Cancer Mechanisms, Targets, and  Therapeutics  Third  Edition .  United  Kingdom:  Oxford University Press, 2012.
[12] A. Puspitasari, “Optimasi Ekstraksi dan Penelusuran Fraksi Aktif Herba  Sambiloto  (Andrographis  paniculata  nees.)  dan  Patikan Kebo  (Euphorbia  hirta  l.) :  Studi  in  vitro  Efek  Fagositosis Makrofag,” Universitas Gadjah Mada.
[13] J.  R.  .  Jensch-Junior,  B.E.,  Pressinotil,  N.,  Borges,  J.C.S.  and Cunha  da  Silva,  “Characterization  of  Macrophage  Phagocytosis of the Tropical Fish Prochilodus scrofa (Steindachner, 1881),” J. Aquac. , vol. 251, pp. 509–515, 2006.
[14] M.  .  Rahayu,  “Aktivitas  Fagositosis  Makrofag  dari  Fraksi  N- Heksan  Herba  Sambiloto  (Andrographis  Paniculata,  (Burm.F) Nees)  terhadap  Mencit  yang  Diinduksi  Vaksin  Hepatitis  B,” J. Pharm. , vol. 11, no. 2, pp. 181–199, 2014.
[15] R.  .  Susanti,  R.,  Yuniastuti,  A.  dan  Iswari,  “Aktivitas  Reactive Oxygen  Species  Makrofag  Akibat  Stimulasi  gel  Lidah  Buaya pada Infeksi Salmonella typhimurium,” J.  MIPA ,  vol.  35,  no.  1, pp. 1–10, 2012.
[16] J.  .  Atlas,  R.M.  and  Snyder, Handbook  of  Media  for  Clinical Microbiology Second Edition . CRC Press, 2006.
[17] E. Widjajanto, “Peranan Makrofag pada Proliferasi, Diferensiasi dan Apoptosis pada Proses Hematopoisis (Penelitian pada Limpa Janin  Tikus  dan  Aspirat  Sumsum  Tulang  Manusia),” J.  Kedokt. Brawijaya , vol. 21, no. 1, pp. 29–36, 2005.
[18] I.  Mustafiah,  S.E.,  Fatmawati,  S.  dan  Yusuf,  “Indeks  Daya Fagosit  Makrofag  Peritoneum  setelah  Pemberian  Propolis  pada Mencit  (Mus musculus),” J.  Sains  Med. ,  vol.  3,  no.  2,  pp.  121– 128, 2011.
[19] J.  J.  A.  Cohen,  “Journal  of  Immunology  Today,”  vol.  14,  pp. 126–130, 1993.
[20] D.  Aldi,  Y.,  Novelin,  F.  dan  Handayani,  “Aktivitas  Beberapa Subfraksi  Herba  Meniran  (Phyllanthusniruri  Linn.)  terhadap Aktivitas dan Kapasitas Fagositosis Makrofag,” J. Sci. , vol. 5, no. 2, pp. 92–96.
[21] H.  .  Sholikhah,  A.R.  dan  Rahayuninsih,  “Pengaruh  Ekstrak Lompong  (Colocasia  esculenta  L.  Schoot)  30 Menit  Pengukusan Terhadap  Aktivitas  Fagositosis  dan  Kadar  NO  (NITRIT OKSIDA)  Mencit  Balb/C  Sebelum  dan  Sesudah  Terinfeksi Listeria  Monocytogenes,” J.  Nutr.  Coll. ,  vol.  4,  no.  2,  pp.  463– 468, 2015.
[22] S.  Andayani,  “Aktivitas  Fagosit  Makrofag  dan  Histopatologi Ginjal  Ikan  Kerapu  Macan  setelah  Diberi  Immunostimulan Alkaloid  Ubur-Ubur  (Bougainvillia  sp)  dan  Diinfeksi  Vibrio harveyi,” J. Berk. Penel. Hayati Ed. Khusus , vol. 6B, pp. 13–17, 2011.
[23] M.  .  Philip,  A.H.,  Garai,  A.S.  and  Valenzuela,  “Reduction  of Doxorubicin (Adriamycin)  Bone  Marrow  Toxixity,” J Pharmaeutical Sci. , vol. 64, no. 9, pp. 1574–1576, 2006.
[24] A.  .  Uspenskaya,  Y.A.,  Mikhutkina,  S.V.,  Taksanova,  E.., Popova,  N.N.,  Olovyannikova, R.Y. and  Salmina,  “Induction  of Apoptosis  in  Bone  Marrow  Cells  in  Mediated  via  Purienic Receptors,” Byulleten “Eskperimental”noi Biol. I Medistiny , vol. 8, no. 138, pp. 135–138, 2004.
[25] T.  Zhang,  X.,  Li,  W.,  Wu,  Y.J.G.  and  Ming,  “Amelioration  of
Doxorubicin-Induced Myocardial Oxydative Stress and Immunosupression by Grape Seed Proanthocyanidins in Tumour- bearing  Mice,” J  Pharm  Pharmacol ,  vol.  57,  no.  8,  pp.  1043– 1051, 2005.
[26] W.  Andriyanti,  W.,  Darsono  and  Faisal,  “Study  of  Natural Rubber Latex Method Free Nitromines and Protein Allergens,” J. ISSN 0216-3128 , pp. 161–169, 2010.
[27] S. M. and J. C. S. Cervantez, J.L., Hawley, K.L., Benjamin, S.J., Winerman,  B.,  Luu,  “Phagosomal  TLR  Signaling  u  on  Borrelia burgdorferi  Infection,” J.  Front.  Cell.  Infect.  Microbiol. ,  vol.  4, no. 55, pp. 1–12, 2014.
[28] S.  Hirano,  S.  and  Kanno,  “Macrophage  Receptor  with Collagenous  Structure  (MARCO)  Is  Processed  by  either Macropinocytosis  or  Endocytosis-Autophagy  Pathway,” J.  Plos
One , vol. 10, pp. 1–16, 2015.
[29] and  C.  A.  Dugenci  SK,  Arda  N,  “Some  Medicinal  Plants  as Immunostimulant for Fish,” J. Ethnopharmacol. , vol. 88, pp. 99– 106, 2003.
[30] S.  Gordon,  “Phagocytosis:  An  Immunobiologic  Process,” J. Immun. , vol. 463–475, 2016.
[31] W.  Yong,  Z.,  Jiang,  L.,  Zong,  L.,  Wen-liang,  W.  and  Zhong,
KONSENTRASI  N Subset for alpha = 0.05 1 2 .00 2  1.41300 1.25 2  1.50600 5.00 2  2.29950 2.29950 10.00 2  2.42450 2.42450 2.50 2 3.08500
Sig. .130 .263
“Bax  Overex-  pression  Enhances  Apoptosis  Induced  by Adriamycin  in  HCC-9204  Cells,” Chinese  J.  Cancer  Res. ,  vol. 16, no. 3, pp. 157–161, 2004.