Menara Perkebunan 2009, 77(1), 47-57.

## Kloning gen penyandi β-1,6-glukanase kapang secara cepat dengan teknik RT-PCR menggunakan primer spesifik
Rapid cloning for gene encoding fungal β-1,6-glucanase by means of RT-PCR using specific primers
Asmini BUDIANI, Riza A. PUTRANTO, Hayati MINARSIH, Niyyah FITRANTI &Djoko SANTOSO *)
Balai Peneltian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151

## Summary
Production  of  bioethanol  from  biomass  of agricultural  waste  has  been  hindered  with  a high  production  cost  because  enzymes  needed for  the  process  has  to  be  imported  with relatively  a  high  price.    Genetic  engineering using  its  encoding  genes  is  able  to  produce those  enzymes    with  lower  cost.  In  this  report we  described  a  research  aimed  to  clone  gene encoding  β-1,6-glucanase from  Trichoderma harzianum with  a  relatively  rapid  and inexpensive  method,  by  means  of  RT-PCR using  gene  specific  primers.  The  primers  were designed  based  on  the  DNA  sequence  of  the target gene from the same species of organism used  in  this  research.  RT-PCR  using  that primers  resulted  in  DNA  fragment  with  sizes corresponding  to  the  predicted  size  of  full length  gene  encoding  β-1,6-glucanase,  about 1300  bp.  After  a  sequential  experiments  of cloning  using  pGEM-T  Easy  vector,  DNA sequencing and BlastN - BlastX analyses of the sequences, it was proven that the isolated DNA was  full  length  gene  of  β-1,6-glucanase.  This was  implied  from  the  percentage  of  Identity and E-value which were 96% and 0.0 (< e-04) respectivety.

## Ringkasan
Produksi bioetanol dari biomassa limbah pertanian,  terkendala  oleh  tingginya  biaya produksi  karena  enzim  yang  diperlukan  untuk proses  tersebut  masih  harus  diimpor  dengan
harga  yang  relatif  mahal.  Melalui  rekayasa genetika  menggunakan  gen-gen  penyandinya, enzim-enzim tersebut dapat diproduksi dengan biaya  yang  lebih  murah.  Penelitian  ini bertujuan untuk mengklon gen penyandi β-1,6- glukanase  dari Trichoderma  harzianum secara cepat  dan  ekonomis,  dengan  RT-PCR menggunakan primer spesifik.  Primer tersebut dirancang  berdasarkan  sekuen  DNA  dari  gen target  asal  spesies  organisme  yang  sama dengan  yang  digunakan  dalam  penelitian.  RT- PCR  dengan  primer  tersebut  menghasilkan fragmen  DNA  yang  ukurannya  sesuai  dengan gen  lengkap  penyandi  β-1,6-glukanase,  yaitu sekitar  1300  bp.  Setelah  secara  berurutan diklon  menggunakan  vektor  pGEM-T  Easy, sekuensing  urutan  DNA  dan  analisis  BlastN maupun  BlastX  dari  sekuen  yang  diperoleh, terbukti  bahwa  fragmen  DNA  tersebut  adalah gen lengkap penyandi β-1,6-glukanase. Hal ini ditunjukkan oleh Nilai Kesamaan ( Identity ) dan E-Value yang  masing-masing  mencapai  96% dan 0.0.
[ Key words : Trichoderma  harzianum, β-1,6- glukanase, bioethanol, RT-PCR, enzyme]

## Pendahuluan
Potensi bioteknologi molekuler dalam  mendukung  industri  pangan  mau- pun energi sangat besar. Melalui rekayasa genetika  organisme  dengan   kemampuan
*) Penulis korespondensi
Budiani et al.
baru   yang  unggul  dapat  dikembangkan dengan  tingkat  presisi  yang  tinggi  dalam waktu  yang  relatif  lebih  singkat  daripada melalui  pendekatan  konvensional.  Lebih dari  itu,  sifat  genetik  organisme  yang dengan  cara  konvensional  tidak  dapat diciptakan,  melalui  rekayasa  genetika yang  telah  berkembang  dengan  pesat,  hal tersebut menjadi mungkin. Meskipun, riset dan  pengembangan  bidang  teknologi  ter- sebut    memerlukan  investasi  yang  sangat besar,  namun    sebagai  salah  satu  bidang iptek  yang  paling  aktif  dikembangkan, banyak  penelitian  telah  dilakukan  di berbagai negara, sehingga kemajuan iptek dasar  bidang  ini  tergolong  sangat  pesat. Teknik-teknik  molekuler  dan  database genetika pendukung bidang ini yang telah menjadi public  domain semakin  banyak dan  lengkap.  Dengan  demikian,  keter- batasan  sumberdaya  riset  dan  pengem- bangan  bidang  ini  di  negara  berkembang dapat  dikompensasi  oleh  ketersediaannya pada domain tersebut.
Dalam  bidang  energi  yang  ramah lingkungan, pengembangan biofuels generasi kedua (G2) dari biomassa limbah pertanian  telah  banyak  dilaporkan  (Gong et  al. ,  1999;  Maas et  al. ,  2008),  dan diyakini  dapat  meminimalkan  konflik dengan  program  ketahanan  pangan. Berbagai  penelitian  rekayasa  genetika yang terkait dengan bioenergi dari limbah pertanian  tersebut  juga  telah  banyak dilaporkan (Howard & White, 1988; Irwin et al ., 2003; Dmytruk et al., 2007). Namun teknologi  pembuatan  etanol  G2  atau etanol  selulosik  semacam  ini  belum ekonomis  karena  enzim  yang  diperlukan dan  merupakan  input  penting,  harus diimpor  dengan  harga   yang   tergolong mahal. Akibatnya biaya keseluruhan untuk
produksi  etanol  G2  masih  jauh  lebih mahal  daripada  biaya  produksi  etanol generasi  pertama  (G1)  yang  bahan bakunya  sama  dengan  bahan  pangan.  Hal tersebut  memacu  perkembangan  rekayasa genetika,  baik  untuk  memproduksi  enzim maupun  untuk  menghasilkan  mikroba unggul, seperti Saccharomyces cerevisiae , yang berkemampuan lebih terutama dalam hal  enzimatiknya  maupun  toleransinya terhadap etanol (Alper et al. , 2006; Carle- Urioste et  al. ,  1996;  Nevoigt,  2008; Stephanopoulos , 2007). Lignoselulosa  merupakan  komponen utama  tanaman  berkayu  maupun  tanaman non  kayu,  dan  terdiri  dari  selulosa,  hemi- selulosa  dan  lignin.    Pada  umumnya kandungan  selulosa  dalam  biomassa lignoselulosa  pertanian  berkisar  antara 40  –  50%  (Howard et  al., 2003)  yang merupakan  bahan  baku  potensial  untuk produksi  etanol.  Konversi  biomassa lignoselulosa  menjadi  etanol  memerlukan beberapa  tahapan,  salah  satunya  adalah hidrolisis  selulosa  menjadi  glukosa  yang dapat  dilakukan  secara  kimiawi  meng- gunakan  asam  atau  secara  biokimiawi menggunakan  enzim  selulase.  Selulase merupakan  kompleks  enzim  yang  ber- dasarkan  aktivitasnya  dapat  dikelompok- kan  menjadi  tiga,  yaitu    endoglukanase, selobiohidrolase  atau  eksoglukanase,  dan β-glukosidase.  Beberapa  mikroorganisme dilaporkan  dapat  menghasilkan  komplek selulase yang berbeda. Pada bakteri misal- nya,  enzim  ini  terdapat  dalam  komplek multi  enzim  yang  disebut  selulosom  dan terdiri  dari  beberapa  subunit.  Sedangkan selulase dari Trichoderma  reesei mengan- dung  dua  eksoglukanase,  paling  sedikit empat  endoglukanase  dan  satu  β- glukosidase (Kumar et al. , 2008).
Kloning gen penyandi β-1,6-glukanase kapang secara cepat ……
Enzim  β-1,6-glukanase  merupakan salah  satu  endoglukanase,  yang  meng- hidrolisis ikatan 1,4-glukosida secara acak pada  beberapa  situs  di bagian  tengah  dari rantai  selulosa,  sehingga  membuka  situs baru  untuk  hidrolisis  berikutnya  oleh eksoglukanase. Eksoglukanase merupakan komponen utama (40-70%) selulosa fungi. Enzim ini memindahkan mono- dan dimer dari bagian tepi rantai glukosa. Sedangkan β-glukosidase menghidrolisis dimer glukosa menjadi glukosa. Proses hidrolisis biomassa  lignoselulosa  untuk  produksi etanol diyakini dapat berjalan lebih efisien apabila  digunakan  campuran    enzim- enzim  tersebut.  Dalam  rangka  produksi enzim-enzim  yang  diperlukan  dalam hidrolisis  biomassa  untuk  mendukung pengembangan etanol selulosik, penelitian ini  bertujuan  untuk  mengklon  gen penyandi β-1,6-glukanase secara cepat dan efisien.

## Bahan dan Metode

## Sebagai  sumber  gen  digunakan
Trichoderma  harzianum isolat  DT38 koleksi  Balai  Penelitian  Bioteknologi Perkebunan  Bogor.  Sedangkan  untuk inang  ( host )  dalam  kloning  produk  RT- PCR  digunakan Escherichia  coli galur DH5α.    Untuk  mencapai  tujuan  dari kegiatan  ini  beberapa  tahapan    dilakukan yaitu  (1)  Isolasi  RNA  total  dari  kapang T.  harzianum ,  (2)  Perancangan  primer spesifik,  (3)  Amplifikasi  fragmen  DNA penyandi  β-1,6-glukanase  menggunakan RT-PCR,  dan  (4)  Kloning full-length gen penyandi β-1,6-glukanase produk RT-PCR dilanjutkan sekuensing dan analisis sekuen DNA.

## Isolasi RNA dari miselium kapang
RNA  total  diisolasi  dari  miselium kapang  menggunakan  metode    Chang et al. (1993) yang dimodifikasi.
T.  Harzianum yang  disimpan  pada medium  PDA  ( Potato  Dextrose  Agar ) diremajakan  kembali  pada  medium  yang sama  selama  tiga  hari,  kemudian  disub- kultur  ke  dalam  medium  PDB  ( Potato Dextrose  Broth )  selama  empat  hari  pada suhu  kamar.    Sebanyak  2,5  gram  serbuk miselium  yang  diperoleh  kemudian digerus  dalam  keadaan  beku  mengguna- kan  nitrogen  cair,  dan  ditambahkan  ke dalam 10 mL bufer ekstraksi (Trizma Base 0,2 M, LiCl 0,3 M,  EDTA 0,01 M, PVP MW  36,000  1%,  Thiourea  5  mM,  Aurin- trikarboksilat  1  mM,  dan  2-Merkapto- etanol  2%).  Campuran  dikocok  kuat kemudian  ditambahkan  1  volume  fenol  : kloroform  :  isoamilalkohol  (25  :  24  :  1), divorteks  3x30  detik,    dan  dilanjutkan dengan  sentrifugasi  pada  15.000  rpm  dan suhu  4°C  selama  15  menit.  Supernatan diekstraksi  sekali  lagi  menggunakan campuran  kloroform  :  isoamilalkohol (24:1)  sebanyak  1  volume  dilanjutkan sentrifugasi  pada  15.000  rpm  dan  suhu 4°C  selama  15  menit.  Supernatan dipindahkan  ke  tabung  sentrifus  baru, kemudian  ditambahkan  1/30  volume  Na asetat  3,3  M  pH  5,2  dan  1/10  volume etanol absolut. Setelah campuran diendapkan  dalam  es  selama  30  menit, RNA  diendapkan  melalui  sentrifugasi pada  15.000  rpm    dan  suhu  4°C  selama 25  menit.  Pelet  yang  terbentuk  dicuci menggunakan etanol 70% dingin dilanjutkan  dengan  sentrifugasi  pada kecepatan  8000  rpm    suhu  4°C  selama lima menit, kemudian   dilarutkan  dalam

## Budiani et al.

## DEPC-dH
2 O.  RNA  dipisahkan  dari  DNA dengan  menambahkan  LiCl  8  M  hingga konsentrasi  akhir  2  M,  didiamkan  selama 4-16  jam  pada  suhu  4°C,  kemudian disentrifus kembali pada 13.000 rpm  suhu 4°C  selama  20  menit.  Setelah pembilasan menggunakan  etanol  dingin  70%  yang dilanjutkan  sentrifugasi  pada  kecepatan 5000 rpm selama lima menit,  pelet RNA dilarutkan  kembali  dalam  50-100  µL DEPC-dH 2 O.  RNA  yang  diperoleh  diuji kualitas dan kuantitasnya dengan elektroforesis  pada  gel  agarose  0,8%  dan dengan  mengukur  absorbansinya  pada panjang gelombang 260, 280, dan 230 nm.

## Perancangan primer spesifik
Primer  spesifik  untuk  mengampli- fikasi  cDNA  daerah  penyandi  lengkap (cds)  β-1,6-glukanase  dirancang berdasar- kan  sekuen  gen  yang  sama  yang  tersedia pada GenBank , dari organisme yang sama dengan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu T.  harzianum. Primer dirancang menggunakan  program  Primer3  yang dapat  diakses  secara online. Penyusunan primer dilakukan dengan mempertimbang- kan panjang nukleotida, melting temperature (Tm)  dan  komplementasi pada  daerah  3’.  Amplifikasi  dengan primer  tersebut  diprediksi  menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 1300 bp, sama  dengan  ukuran  daerah  penyandi lengkap β-1,6-glukanase.

## Amplifikasi fragmen DNA
Untuk  RT-PCR,  sintesis  cDNA  utas tunggal  dilakukan  menggunakan  kit SuperScript TM First-Strand Synthesis
System  for  RT-PCR (Invitrogen)  dengan templat  RNA  total  menggunakan  primer heksamer acak yang tersedia di dalam kit.
Utas  tunggal  cDNA  selanjutnya dijadikan templat  dalam  proses  PCR  menggunakan primer  spesifk  yang  telah  dirancang sebelumnya.  Reaksi  PCR  dilakukan dengan  program  sebagai  berikut:  satu siklus  denaturasi  awal  pada  suhu    94 o C selama  dua  menit,  35  siklus  masing- masing  terdiri  dari  denaturasi  pada  suhu 94 o C selama 15 detik, penempelan primer pada  suhu  48 o C selama  45  detik,  dan ekstensi  pada  suhu  70 o C  selama  dua menit.  Selanjutnya  reaksi  diakhiri  dengan ekstensi  pada  suhu  70 o C  selama  empat menit.  Hasil  RT-PCR  dicek  pada  gel agarosa.

## Kloning  produk  RT-PCR    dan  analisis sekuen DNA
Fragmen  DNA  hasil  RT-PCR diisolasi  dari  gel  menggunakan  kit QIAquick  Gel  Extraction dari  QIAGEN, diligasikan  pada  vektor  kloning  pGEM-T Easy, kemudian dimasukkan ke dalam sel inang E.  coli DH5α  kompeten.  Preparasi E.  coli kompeten  dilakukan  dengan prosedur  kejutan  panas  (Sambrook et  al. , 1989.) . E. coli hasil transformasi diseleksi pada  medium  LB  agar  yang  mengandung ampisilin,  IPTG  dan  X-gal.  Adanya sisipan  DNA  target  dalam  koloni  putih yang  tumbuh  pada  medium  seleksi dianalis  dengan    PCR  koloni  mengguna- kan primer universal SP6 dan T7. Plasmad rekombinan  yang  mengandung  fragmen DNA terklon diisolasi kembali dari koloni yang  teruji  positif  pada  analisis  PCR koloni,  kemudian  dilakukan  sekuensing untuk  menentukan  sekuen  DNA  dari fragmen  terklon.  Sekuen  DNA  yang diperoleh  kemudian  dianalisis  dengan BlastN dan BlastX untuk mengkonfirmasi kebenaran  DNA  terklon  sebagai  fragmen DNA  daerah  penyandi  lengkap  β-1,6- glukanase.
Kloning gen penyandi β-1,6-glukanase kapang secara cepat……

## Hasil dan Pembahasan

## Isolasi RNA dari miselium kapang
Analisis  dengan  elektroforesis  pada gel agarosa dan pengukuran absorbansinya pada  panjang  gelombang  260,  280,  dan 230  menunjukkan  bahwa  RNA  yang tinggi  kualitasnya  berhasil  diisolasi  dari kapang T.  harzianum (Gambar  1  dan Tabel  1).  Selain  tidak  terdegradasi,  RNA yang diperoleh juga menunjukkan kemurnian  yang  tinggi  terhadap  protein (A260/A280)  dan  polisakarida  (A260/ A230).  Konsentrasi  RNA  yang  diperoleh dari  empat  kali  preparasi  berkisar  antara 692 ng/µL hingga 1708 ng/µL (Tabel 1).
Keberhasilan  reaksi  RT-PCR  untuk mengisolasi  suatu  gen,  dipengaruhi  oleh berbagai  faktor,  salah  satunya  adalah kualitas RNA yang digunakan. Selain utuh (tidak  terdegradasi),    RNA  tersebut  juga harus  bebas  dari  kontaminan  DNA  dan senyawa  lain  seperti  protein  dan polisakarida.  Adanya  kontaminan  DNA dapat  menjadi  target  polimerase  untuk amplifikasi  sehingga  hasil  yang  diperoleh menjadi tidak spesifik. Sedangkan kontaminasi protein dan polisakarida akan menghambat  kerja  polimerase  sehingga dapat  berakibat  pada  kegagalan  proses amplifikasi.    Oleh  karena  itu  RNA  yang terdegradasi  oleh RNase atau  terkon- taminasi  oleh  komponen  lain  termasuk DNA  menjadi  salah  satu  indikator ketidakberhasilan  isolasi  RNA.  Kualitas dan  kuantitas  RNA  yang  tinggi  pada penelitian  ini  sebagaimana  ditunjukkan pada  Gambar  1  dan  Tabel  1,    sangat memenuhi  syarat  sebagai  templat  dalam reaksi RT-PCR pada tahap berikutnya.
Primer  spesifik  dan    amplifikasi  gen penyandi  β-1,6-glukanase
Gambar  2  adalah  sekuen  DNA  gen penyandi  β-1,6-glukanase  dari T.  harzi- anum yang  diakses  secara online dari GenBank dengan  no  aksesi  X79197  dan dijadikan  input  pada  perancangan  primer menggunakan  program  primer3.  Pada Gambar  tersebut  dapat  dilihat  posisi primer  yang  digunakan  untuk  amplifikasi DNA  daerah  penyandi  β-1,6-glukanase. Dua primer forward (Cell-F1 dan Cell-F2) dan  satu  primer reverse (Cell-R)  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  beserta susunan nukleotida,  dan  suhu  leleh  (Tm)- nya  disajikan pada Tabel 2.
Hasil  RT-PCR  menggunakan  kedua pasang  primer  (Cell-F1/R  dan  Cell-F2/R) dapat  dilihat  pada  Gambar  3.  Nampak bahwa kedua pasang primer menghasilkan fragmen  DNA  spesifik  dengan  ukuran yang  lebih  kurang  sama  dan  diperkirakan mendekati  ukuran  gen  lengkap  penyandi β-1,6-glukanase.  Sesuai  dengan  posisi masing-masing  primer  yang  ditunjukkan pada  Gambar  1,  maka  pasangan  primer Cell-F1/R  diharapkan  akan  menghasilkan fragmen  DNA  berukuran  1322  bp sedangkan  pasangan  primer  Cell-F2/R akan  mengamplifikasi  fragmen  DNA berukuran 1316 bp.
Gambar  1.  Profil  RNA  hasil  isolasi  dari T. harzianum.
Figure 1. Profile  of  RNA  isolated  from
T. harzianum.
Budiani et al.

## Tabel 1. Konsentrasi dan kemurnian RNA hasil isolasi.
Table 1. Concentration and purity of the isolated RNA.
RNA No. Konsentrasi Concentration ng/uL A 260/A280 A260/A230 RNA-1 692 2,088 1,682 RNA-2 800 2,002 1,560 RNA-3 1324 2,019 1,704 RNA-4 1708 1,909 1,730
Gambar 2. Sekuen DNA gen penyandi β-1,6-glukanase (X79197) dan posisi primer. Tanda panah hitam adalah primer  Cell-F1, tanda  panah  biru  adalah  primer  Cell-F2  dan  tanda  panah  merah adalah primer Cell-R.
Figure 2.  DNA sequence of the gene encoding β-1,6-glucanase ( X79197 ) and the primer position. Black errow is  Cell-F1 primer, blue errow is  is  Cell-F2 primer and red errow is Cell-R primer.
cctacagctaccatca agatgaagtactccatcgt tgctcc g gc ta t tctcgccggcacc gccttt catg gctgccccaagaccgcga cct gaa ggccttcaacca gaccgctcg tttc gagcagcttg gcaa gcgctttgagcctgcacttg cttct ggtatcaccaa g atcc gtggt gtcaact tcggtgg at g gcttatcagtga gccatggat gatgtccaatgagtggaacaac aacatgg gctgcaacaatgctgcctctga gttcg at t gcatgcgcaacaactacatgggc agcaagcgtgcgaccggaaacaccaagttccagaaccactacagg gactggatcaacccc cccaccg t tca g tctg ttcacg atgtcg gcttgaacactatccgtatcccca t tggctac tggtcctacga tgccat tgtcgacacg gctagcgagccatttgccg at ggcaacctccag cttccgtatct t g acgctg tt gttcagaa g gccgct gatctcg gaatctac gtcatcatt gatcttcacggtgcccctg g tg gtcaacaacaggatgccttcaccggccagaaccccaac cctgctg g t t tctacaactcatacgactatg gtcgtgct ga ga g tg gctgtcttggatg acaaaccgca tc cacacca accctgcctactcgac tg ttg gtat gattgaggttctcaac gagcctgtctccagacacg tg ga gg tggtcgctaccctgctcctgggcaggacccaagc atggtccagacctactacccagg tgccctcaa ggccgtgcgtg atgccgaggctgcgctg aacgtcccaagcaacaagaagctgcacgtgcag ttcatg tccagcaag tg ggattctggt gatcctcgcagcaacgccgccg tcaagaacgaccccatg gttg gctttgacgaccacaac tacattg gcttt g cctta gcaacactg gcgacca gtactctctca t gca cagcgcctgc actgactctcgtgtcgtcagcggccag gact tt gctatca ctg gcgagtggagcatgacc tctgg tgccgactg gcatgac g gaaact tcttcaccaagt tcttcacagctcagcagcag ctgtatgagtctcctg gaatggacg gatg ga tctactggacctg gaagaccgagttgaac gacccccg atggacc tactctta tgctaccta cct ca actaca tcccaaccaacgctgct gccctgca gcagcagaacg tt ta ccag gatgtctgctctggatacagg taa atcacgagt gatt g tca acg gtcatcact tat tacatactact tcaaatct g ta t at t t tctcg atgg acat a at t ta tt a gacttgaacactacctag ccaa ct tt aa ttaaca ta aat gtgttc tcagtatctatc
Kloning gen penyandi β-1,6-glukanase kapang secara cepat……

## Tabel 2. Susunan nukleotida primer hasil rancangan beserta suhu leleh (Tm)
Table 2. Nucleotide sequence of the designed primers with melting temperature (Tm)
Primer Primer Susunan nukleotida Sequence of nucleotide Tm Tm ( o C) Cell-F1 5’-ATCAAGATGAAGTACTCCATC 58 Cell-F2 5’-ATGAAGTACTCCATCGTTGCT 58 Cell-R 5’-ACCGTTGAGCAATCACTCGT 60 Selain kemurnian RNA yang
digunakan,  keberhasilan  reaksi  RT-PCR juga  sangat  dipengaruhi  oleh  spesifisitas dan  suhu  penempelan  primer.  Spesifisitas primer  yang  tinggi akan lebih menjamin komplementasi  antara  basa-basa    dari primer dengan basa-basa dari kedua ujung fragmen  DNA  yang  akan  diamplifikasi sehingga peluang keberhasilan amplifikasi fragmen  DNA  target  lebih  tinggi.  Dalam merancang  primer  terdapat  beberapa ketentuan umum untuk primer yang ideal, di antaranya adalah panjang primer antara 18-28  nukleotida,    tersusun    oleh    50  – 60% G+C  dan  kedua primer mempunyai titik  leleh  yang  sebanding  (Innis  & Gelfand,  1990).  Pada  penelitian  ini, meskipun  kedua  primer forward yang digunakan  mempunyai  kandungan  GC lebih  rendah  dari  50%,  ternyata  masih dapat berfungsi dengan baik dalam proses PCR,  dan  menghasilkan  fragmen  DNA yang spesifik.
Kloning  kedua  fragmen  DNA  hasil RT-PCR  secara  terpisah  ke  dalam E.  coli menggunakan vektor pGEM-T Easy juga memberikan  hasil  sebagaimana  diharap- kan.  Hasil  analisis  PCR  terhadap  koloni putih  yang  tumbuh  pada  medium  seleksi menunjukkan  bahwa  lebih  dari  50% koloni  yang  dianalisis  terbukti  positif mengandung  sisipan  DNA  yang  diduga adalah DNA target hasil RT-PCR. Karena primer  yang  digunakan  adalah  primer
universal  T7  dan  SP6,  maka  ukuran fragmen DNA yang dihasilkan lebih besar dari  ukuran  DNA  hasil  RT-PCR,  yaitu sekitar 1450 bp (Gambar 4). Hasil tersebut menunjukkan  bahwa  rangkaian  prosedur percobaan  kloning  yang  terdiri  dari rekombinasi fragmen DNA hasil RT-PCR dengan  vektor  pGEM-T  Easy,  trans- formasi  dengan  kejutan  panas,  dan  kultur pada  medium  seleksi  yang  mengandung antibiotik, secara  kuantitatif  cukup efektif dan  efisien.  Pendekatan  kloning  dengan RT-PCR semacam ini atau dengan primer heterologous  telah  banyak  dilaporkan keefektivannya,  antara  lain  kloning  gen TcAP1 dengan  primer  yang  diisolasi  dari jaringan tanaman kakao (Samanhudi et al. , 2006)  dan  gen  ACCase  dari  tanaman kelapa sawit (Budiani et al. , 2007).
Untuk  lebih  memastikan  keberhasil- an  rekombinasi  dan  keperluan  analisis pada  tahap  eksperimen  berikutnya, selanjutnya  dilakukan  isolasi  plasmid rekombinan dan  pengujian  dengan  digesti menggunkan  enzim  endonuklease Eco RI yang  situs  pemotongannya  mengapit sisipan DNA terklon pada vektor kloning. Profil  elektroforesis  plasmad  rekombinan hasil  isolasi  dan  digestinya  menggunakan Eco RI  mengkonfirmasi  bahwa  rekom- binan antara vektor kloning dengan gen β- 1,6-glukanase  putatif  telah  diperoleh (Gambar  5).  Fragmen  DNA  hasil pemotongan  masing-masing     berukuran
Budiani et al.
sekitar  3  kb  (representasi  ukuran  pGEM- T) dan sekitar 1300 bp yang sesuai dengan ukuran  gen  β-1,6-glukanase  putatif. Karakterisasi  lebih  lanjut  gen  β-1,6- glukanase putatif  1,3  kb  ini  dilalukan dengan  sekuensing  DNA  kedua  fragmen
terklon  yang  dilanjutkan  analisis  Blast untuk  memastikan  identitasnya  sebagai gen  lengkap  penyandi  β-1,6-glukanase. Sekuensing  dilakukan  dengan  primer universal  M13  dan  T7  yang  merupakan bagian    dari   vektor   kloning.   Masing-
Gambar  4.  PCR dari 15 koloni hasil transformasi E.coli dengan  produk RT-PCR (lajur 1-15) dengan pasangan primer  Cell-F1/R (atas) dan Cell-F2/R (bawah). M: 1 kb plus DNA ladder.
Figure  4.    PCR  of  15 colonies   produced  by  transformation of E.coli with RT-PCR  product  (lanes 1-15)  using   primer  pairs of  Cell-F1/R (top) and Cell-F2/R  (bottom). M: I kb  plus DNA ladder.
Gambar 3.  Hasil RT-PCR menggunakan pasangan primer Cell-F1/R (lajur 1), dan Cell-F2/R (lajur  2); M : 1 kb plus DNA ladder.
Figure 3.   Result  of  RT-PCR   with   primer  pairs   of   Cell-F1/R ( lane 1 ) , and  Cell-F2/R ( lane 2 ) ;
M : 1 kb plus DNA ladder. 1650 bp M        1         2 1000 bp 1650 bp 1  2    3   4   5   6   7   8  9   10   11  12  13  14   15    M 1650 bp
55 3000 bp 1300 bp M     1    2 M        1         2
Kloning gen penyandi β-1,6-glukanase kapang secara cepat……
masing sekuensing dapat membaca urutan nukleotida dengan relatif teliti hingga 600- an  basa.  Sekuen  DNA  yang  dihasilkan setelah  dibersihkan  dari  kontaminasi vektornya  kemudian  ditentukan  identitas- nya  melalui  analisis  Blast.  Hasil  analisis secara  ringkas  ditampilkan  pada  Tabel  3 dan Tabel 4.
Dari  Tabel  3  dan  Tabel  4  nampak bahwa  fragmen  DNA  hasil  RT-PCR terklon  mempunyai  homologi  tinggi dengan gen penyandi β-1,6-glukanase dari
T. harzianum dan  dari H. virens .       Selain
BlastN  juga  dilakukan  analisis  BlastX untuk  melihat  homologi  di  tingkat proteinnya.  Hasil  analisis  BlastX  juga memberikan  kecenderungan  yang  sangat mirip (data tidak ditampilkan) dengan data hasil analisis BlastN. Data yang diperoleh dari analisis Blast ini membuktikan bahwa fragmen  DNA  produk  RT-PCR  terklon adalah gen β -1,6-glukanase. Secara teoritis hasil analisis Blast dengan E-value < e-04 mengindikasikan  tingkat  kemiripan  yang tinggi (Claveri et al 2003).
Tabel 3. Hasil BlastN terhadap ujung M13 sekuen gen β-1,6-glukanase putatif.
Table 3. Results of BlastN of the M13 end of  putative β-1,6-glucanase sequence.
No. Aksesi Accesion No. Deskripsi Description E - Value Identitas Identity X79196.1 T.harzianum β  1,6 glucanase gene 0,0 96% AF395757.1 Hypocrea virens β -1,6-glucanase 1e -174 85% FJ589724.1 Hypocrea virens β -1,6-glucanase 7e -167 98%
Gambar 5.  Plasmid   rekombinan  hasil  isolasi  dari  koloni 1 dan 2 (kiri); hasil  digesti  dengan Eco RI (kanan). M : 1 kb plus DNA ladder.
Figure 5.    Recombinant plasmid isolated from colonies 1 and 2 (left); digested with Eco RI (right). M:1 kb plus DNA ladder.

## Budiani et al.
Tabel 4. Hasil BlastN terhadap ujung T7 sekuen gen β-1,6-glukanase putatif.
Table 4. Results of BlastN of the T7 end of  putative β-1,6-glucanase sequence.
No. Aksesi Accession No. Deskripsi Description E - Value Identitas Identity X79196.1 T.harzianum β- 1,6 glucanase gene 0,0 96% FJ589724.1 Hypocrea virens β -1,6-glucanase 0,0 95% AF395757.1 Hypocrea lixii β -1,6-glucanase 0,0 85%

## Kesimpulan
Dengan  pendekatan  eksperimental RT-PCR  menggunakan  primer  spesifik, vektor kloning pGEM-T, dideoxy sequencing dan  analisis  BlasN,  telah berhasil  diklon  dan  dikarakterisasi  secara relatif  mudah  dan  cepat  cDNA  daerah penyandi  lengkap β -1,6-glukanase dari
Trichoderma harzianum .

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini dibiayai oleh Pemerintah Indonesia melalui DIPA 2008
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi  dan  Sumberdaya  Genetik Pertanian, dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan  Penelitian  Nomor  396/PL. 200/I.9/3/08 tanggal 3 Maret 2008.

## Daftar Pustaka
Alper, H., J. Moxley, E. Nevoigt, G.R. Fink & G.  Stephanopoulos  (2006).  Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production. Sci., 314, 1565-1568.
Budiani, A., D. Santoso & A.R. Purba (2007). Keragaman  sekuen  DNA  fragmen  gen
penyandi  ACCase  subunit  BCCP  dari tiga tipe kelapa sawit. Menara
Perkebunan , 75, (1), 1- 11.
Chang,  S.,  J.  Puryear  &  J.  Cairney  (1993).  A simple and efficient method for isolating RNA  from  pine  trees. Plant  Mol.    Biol. Rep., 11, 98-100.
Carle-Urioste, J.C., J.E. Escobar-Vera, S. El-Gogary, F. Henrique-Silva, E.  Torigoi,  O.  Crivellaro,  A.  Herrera-
Estrella & H. El-Dorry (1996). Cellulase
Induction  in Trichoderma  reesei by Cellulose  Requires  Its  Own  Basal Expression. J.  Biologic.  Chem. , 272 , 10169-10174.
Claveri,  J.  M.  &  C.  Notredame    (2003). Bioinformatics  for  Dummies .  2 sd Ed.
New York, Wiley Publishing.
Dmytruk, O.V, A.Y. Voronovsky, C.A. Abbas,
K.V.  Dmytruk,  O.P.  Ishchuk  &
A.A.  Sibirny  (2007).  Overexpression  of bacterial xylose isomerase and yeast host xylulokinase  improves  xylose  alcoholic fermentation  in  the  thermotolerant  yeast Hansenula  polymorpha . FEMS  Yeast Res., 8 , 165 – 173.
Gong,  C.  S.,  N.  J.  Cao,  J.  Du  &  G.T.  Tsao. (1999). Ethanol Production from Renewable  Resources. Adv  in  Biochem Enginee/Biotech., 65, 207-239.
Kloning gen penyandi β-1,6-glukanase kapang secara cepat……
Howard, G.T. & B.A. White (1988). Molecular Cloning  and  Expression  of  Cellulase Genes  from Ruminococcus  albus 8  in Escherichia  coli Bacteriophage  λ. Appl. Environ. Microbiol ., 54, 1752-1755.
Howard,  R.L.,  E.  Abotsi,  E.L.  Jansen  van Rensburg  &  S.  Howard  (2003). Lignocellulose  biotechnology:  isuues  of bioconversion  and  enzyme  production. African J. Biotech., 2, 602-619.
Irwin, D.C., M. Cheng, B. Xiang, J.K.C. Rose
&  D.B.  Wilson  (2003).  Cloning, expression  and  characterization  of  a family-74 xyloglucanase from Thermobifida  fusca . Eur.  J.  Biochem., 270, 3083-3091
Kumar,  R.,  S.  Singh  &  O.V.  Singh  (2008). Bioconversion of lignocellulosic biomass:  biochemical  and  molecular perspective. J. Ind. Microbiol Biotechnol., 35, 377-3791.
Maas,  R.H.W.,  R.R.  Bakker,  A.R.  Boersma, I.  Bisschops,  J.R.  Pels,  E.  de  Jong, R.A. Weusthuis & H. Reith (2008). Pilot- scale  conversion  of  lime-treated  wheat straw into bioethanol: quality assessment of  bioethanol  and  valorization  of  side streams  by  anaerobic  digestion  and combustion. Biotech.  for  Biofuels, 1, 1-
13. Nevoigt,  E.  (2008). Progress  in  metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. & Mol. Biol. Rev.,
72, 379-412.
Samanhudi,  T.  Chaidamsari,  R.A.  de  Maagd, R.  Poerwanto  &  D.  Santoso  (2006). Cloning  and  expression  of  the  cacao APETALA  gene. In: D.  Santoso  (ed). Molecular  and  Genetic  Engineering Studies  Toward  Improvement  of  Cacao Bean  Production .  Bogor,  Indonesian Biotechnology  Research  Institute  for Estate Crops. 133p.
Sambrook,  J.,  E.F.  Fristsch,  &  T.  Maniatis.
(1989). Molecular Cloning: A Laboratory  Manual .  New  York,  Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Santoso,  D.  (2006). Molecular  and  Genetic Engineering Studies Toward Improvement of Cacao Bean Production . Bogor, Indonesian Biotechnology Research Institute for Estate Crops. 133p Stephanopoulos , G.  (2007). Challenges  in engineering  microbes  for  biofuels production . Sci., 315, 801-804
Voet,  D.  &  J.G.  Voet  (1990). Biochemistry . New York , John Wiley &Sons. 1223p.