## OPTIMASI PRODUKSI GAULTHERIN DARI GANDAPURA DENGAN TEKNOLOGI MIXED-DrYING EXTrACTION
PRIYONO KUSUMO 1 , MOHAMAD ENDY YULIANTO 2 , DAN MF SRI MULYANINGSIH 1 1 Jurusan Teknik Kimia UNTAG Semarang Jl. Pawiyatan Luhur Bendan Dhuwur Semarang 50233
2 Jurusan Teknik Kimia Fakultas Teknik UNDIP Jl. Prof Sudarto SH, Pedalangan Tembalang, Semarang 50239
Surel: priyo330@yahoo.com

## AbSTrAK
Tujuan studi ini adalah menentukan optimasi produksi gaultherin dari gandapura melalui teknik inaktivasi enzim gaultherase dengan teknologi mixed-drying extraction. Kegiatan riset meliputi studi produktifitas gaultherin dan optimisasi parameter-parameter proses. Upaya yang dapat meningkatkan produktifitas gaultherin diantaranya pengaruh penambahan drying agent (magnesium sulfat, sodium sulfat, kalsium klorida, dan kalsium sulfat). Optimisasi dilakukan menggunakan faktorial design 2 n . Penentuan variabel berpengaruh dengan menggunakan normal probability plot, setelah dilakukan perhitungan main efek dan perhitungan interaksi. Selama riset, diukur kandungan gaultherin, metil salisilat, asam salisilat menggunakan spektrofotometer maupun HPLC-MS. Hasil riset menunjukkan bahwa meningkatnya konsentrasi drying agent maupun etanol menyebabkan perolehan gaultherin semakin besar, terutama dengan penambahan kalsium klorida. Hasil telaah menyatakan bahwa variabel proses mixed-drying extraction untuk inaktivasi enzim gaultherase yang paling berpengaruh adalah pH dan konsentrasi etanol. Semakin besar pH ekstraksi, akan meningkatkan perolehan senyawa aktif gaultherin. Kondisi optimum mixed-drying extraction untuk inaktivasi enzim tercapai pada pH 8 dengan kadar senyawa aktif gaultherin sebesar 14,46%. Semakin besar konsentrasi pelarut, gaultherin yang terekstrak semakin meningkat. Produksi gaultherin secara maksimum tercapai pada konsentrasi etanol 90% dengan perolehan senyawa aktif sebesar 13,10%.
Kata kunci : drying agent, ekstraksi, gandapura, gaultherin, inaktivasi enzim

## AbSTrACT
This study purposed the optimization of gaultherin production from “gandapura” by inactivating the gaultherase enzyme, including gaultherin productivity and process parameters. This research applied the combination processes of extraction-dryer, simultanously. The productivity of gaultherin was improved by adding the drying agent, such as magnesium sulfate, sodium sulfate, calcium chloride, and calcium sulfate. The optimization was conducted using a factorial design 2n. Dependent variables determined by calculating the main effects and interactions, following by the application of probability plots. During the research, the content of gaultherin, methyl salicylate, salicylic acid were measured by using a spectrophotometer and HPLC-MS. The results shows that the higher concentration of drying agent (especially calcium chloride) and ethanol, increased the content of gaultherin. However, the most influenced factor to this conducted process was pH, regarding to the concentration of ethanol. During extraction, the higher the pH, increased the active compound of gaultherin. The optimum condition of enzyme inactivation was found at pH 8 with the content of gaultherin at 14.46%. The higher the solvent concentration of ethanol, the higher content of gaultherin can be extracted. The maximum process condition regarding to ethanol concentration found at 90% with active compound concentration at 13.10%.
Keywords : drying agent, extraction, gandapura, gaultherin, enzyme inactiavtion

## PENDAHULUAN
Gandapura merupakan salah satu tanaman penghasil minyak atsiri yang masuk dalam daftar Komoditi Binaan Direktorat Jenderal Perkebunan berdasarkan Keputusan Menteri Pertanian nomor 511/kpts/pd.310/9/2006 . Gandapura ( Gaultheria fragantissima )  dapat  tumbuh  pada  dataran tinggi, 1300-3300 meter dpl (Hernani, 2004). Selama  ini  gandapura  belum  dikembangkan secara  ekonomis  dan  tumbuh  liar  didaerah pegunungan  diantaranya  di  Gunung  Lawu, Tawangmangu,  dan  Wonosobo,  Dieng.  Salah satu industri penghasil minyak gandapura yang ada di Wonosobo adalah Kelompok Tani Rukun yang berlokasi di Desa Sikunang, Kecamatan Kejajar, Kabupaten Wonosobo. Minyak gandapura memiliki kandungan metil salisilat antara 93- 98%. Namun demikian, minyak gandapura yang dihasilkan Kelompok Tani di Indonesia hanya memiliki  kandungan  metil  salisilat  82,23% (Mauludi, 2003). Di sisi lain kendala utama yang dihadapi  kelompok-kelompok  tani  penyuling minyak gandapura saat ini, adalah bahwa minyak gandapura  tidak  lagi  kompetitif  di  pasaran mengingat Cina sudah bisa memproduksi minyak gandapura  sintetis  (Manurung,  2002).  Oleh karenanya, perlu pengembangan diversifikasi produk dari tanaman gandapura.
Diversifikasi produk dari gandapura pada dasarnya bisa berupa produksi gaultherin. Produk gaultherin memiliki nilai ekonomis yang jauh lebih tinggi jika dibandingkan dengan minyak gandapura. Karena harga minyak gandapura sebesar 22 dolar tiap 15 ml, sedangkan 10 mg gaultherin seharga 690 dolar. Analisis teoritis menunjukkan bahwa produktivitas gaultherin sekitar 12 kali lebih tinggi dibandingkan produksi
minyak gandapura yang dihasilkan Kelompok Tani di Indonesia. Namun, produksi gaultherin dari tanaman gandapura di Indonesia, sampai saat  ini  belum  dikomersialkan.  Gandapura merupakan spesies tanaman yang mengandung total salisilat dengan konsentrasi sangat tinggi. Konsentrasi salisilat gandapura 20 kali lebih besar dibanding konsentrasi salisilat yang ditemukan pada Filipendula dan 100 kali lebih besar dari konsentrasi  salisilat  pada  Lemon  Thyme. Kandungan total salisilat beberapa tanaman disajikan pada Tabel 1. Sebagian besar salisilat yang terdapat pada tanaman gandapura berada dalam  bentuk  aktif  yang  disebut  gaultherin , yang merupakan konjugasi metil salisilat dengan disakarida. Ketika jaringan tumbuhan tersebut rusak atau terkoyak, gaultherin akan terhidrolisa secara  enzimatis  menjadi  metil  salisilat  dan terlepas. Proses ini diduga merupakan bagian sistem pertahanan dari tumbuhan gandapura.
Gaultherin  memiliki  sifat-sifat  yang menjadikannya sebagai kandidat terbaik natural aspirin,  anti  kanker,  anti  inflamatory,  dan cardiopulmonary (Ribnicky et al ., 2003). Secara empirik  tanaman  dari  keluarga  gaultheria telah  digunakan  dalam  pengobatan  kanker dan leukimia (Hoffman, 2007). Tanaman yang berasal dari gaultheria juga dilaporkan memiliki sifat sebagai senyawa antikarsinogenik. Sebagai natural aspirin, gaultherin memiliki daya sembuh yang  sama  dengan  aspirin  sintetis  namun memiliki efek negatif yang minimal. Saat ini, aspirin ( Acetylsalicylic acid ) merupakan obat yang paling banyak dikonsumsi oleh penduduk dunia karena sifat dan fungsinya sebagai anti piretik, anti inflamatory, dan analgesik (Linjakumpu et  al .,  2002).  Oleh  karenanya,  diperkirakan

## Tabel 1. Konsentrasi Salisilat pada Beberapa Tanaman
Spesies Tanaman Salisilat bebas (ug/mg FW) Salisilat Total (ug/mg FW) Lemon Thyme French Thyme Lavender Rosemary Gandapura 1,55 0,33 0,28 0,58 19,0 42,32 13,26 6,14 3,84 5770
kebutuhan  industri  farmasi  dunia  terhadap gaultherin akan meningkat pada tahun-tahun mendatang. Meskipun demikian, sampai saat ini belum ada metode pengambilan gaultherin yang efektif dari tanaman gandapura. Kesulitan yang dialami dalam proses pengambilan gaultherin adalah selama proses ekstraksi, dengan rusaknya jaringan, maka gaultherin akan dengan segera terhidrolisa  menjadi  komponen-komponen individualnya yaitu metil salisilat dan disakarida. Proses hidrolisa tersebut diyakini dikatalisasi oleh enzim yang terdapat dalam tanaman itu sendiri yaitu gaultherase (U.S. Paten No. 2002/0031562 A1). Untuk mengatasi hal ini, perlu dicari metode guna mengekstraksi gaultherin dari tanaman pada  kondisi  dimana  aktivitas  gaultherase minimal atau inaktif. Dengan demikian reaksi hidrolisa gaultherin menjadi metil salisilat dan disakarida tidak akan terjadi.
Metode  pengambilan  gaultherin  yang terdapat  pada Gaultheria  procumbens hanya  dapat  diekstrak  jika  gaultherin  tidak terhidrolisa oleh enzim gaultherase. Aktivitas gaultherase  terhambat  dengan  penambahan senyawa  polar.  Penambahan  etanol  mampu menghambat aktivitas gaultherase (U.S. Paten No.  2002/0031562  A1,  Kusumo  dkk.,  2013). Beberapa jenis senyawa kimia lain juga mampu menghambat  aktivitas  enzim  gaultherase, antara lain methylen klorida, acetonitril maupun air panas (U.S. Paten No. 7.033.618). Teknik inaktivasi  enzim  gaultherase  dan  ekstraksi gaultherin  secara  simultan  dengan  pelarut etanol perlu dikaji untuk produksi gaultherin dari gandapura. Pelarut etanol akan berfungsi ganda, yaitu inaktivasi enzim sekaligus mengekstrak gaultherin.  Studi  fundamental  perpindahan massa telah dilakukan untuk recovery gaultherin melalui proses ekstraksi (Kusumo dkk., 2013). Hasil kajian menunjukkan, bahwa inaktivasi enzim gaultherase yang berada dalam gandapura menggunakan pelarut etanol sangat potensial dan prospektif, karena mampu meningkatkan perolehan  senyawa  aktif  gaultherin  hingga mencapai 10%. Namun demikian, gaultherin yang terekoveri belum bisa dihasilkan secara maksimal.
Hal ini disebabkan oleh: (i) mekanisme difusi pelarut etanol ke dalam sitoplasma tanaman gandapura sedikit tertahan sel selular, sehingga tidak semua enzim gaultherase mengalami proses unfolding , (ii) reaksi hidrolisa gaultherin menjadi metil salisilat dan disakarida masih tetap terjadi, dan (iii) produk gaultherin berupa serbuk padat relatif kurang stabil.
Pengembangan proses ekstraksi dan drying agent secara simultan merupakan inovasi untuk meningkatkan produksi gaultherin. Keunggulan proses ini adalah mampu meringkas tiga proses sekaligus dalam satu tahapan meliputi proses inaktivasi enzim gaultherase, proses ekstraksi, dan proses dehidrasi osmosis. Modifikasi ekstraktor berfungsi sebagai inaktivasi enzim gaultherase dan perusakan sel selular, agar recovery gaultherin maksimal. Sedangkan drying agent berfungsi sebagai pengering secara osmosis, yaitu proses pengambilan air dari suatu bahan yang dilakukan dengan  menempatkan  bahan  pada  larutan berkonsentrasi tinggi dimana diantara keduanya terdapat membran semipermiabel. Akibatnya kemungkinan  terjadinya  reaksi  hidrolisa gaultherin menjadi metil salisilat relatif rendah. Skema proses ekstraksi dan dehidrasi osmosis simultan  ini  diharapkan  dapat  memberikan sedikitnya  lima  keuntungan,  yaitu  (i)  enzim gaultherase  mengalami unfolding ,  akibatnya akan  mereduksi  reaksi  hidrolisa  gaultherin menjadi metil salisilat yang dikatalisis oleh enzim gaultherase,  (ii) yield gaultherin  meningkat, karena  degradasi  sel  selular  oleh  penetrasi etanol, (iii) kebutuhan energi untuk inaktivasi enzim dan pengambilan gaultherin lebih sedikit, (iv) beban pemurnian produk lebih ringan, dan (v) jumlah limbah sedikit. Semua keuntungan ini akan mereduksi biaya produksi. Meskipun demikian, problem utamanya adalah bagaimana mengkondisikan  supaya  laju  difusi  etanol  ke dalam sitoplasma (enzim gaultherase) seoptimal mungkin, sehingga dapat memperluas penetrasi pelarut ke sisi aktif enzim disamping mereduksi terseretnya fasa diluen ke fasa kontinyu. Untuk itu, fokus penelitian diarahkan guna menentukan optimisasi  paramater-paramater  proses  yang
sangat penting peranannya sebelum diterapkan secara komersial.

## METODE
Penelitian  tentang  inaktivasi  enzim gaultherase  melalui  teknologi mixed-drying extraction untuk produksi gaultherin diinvestigasi secara eksperimen dan pemodelan. Penelitian dilaksanakan selama 10 bulan. Kegiatan yang dilakukan  antara  lain:  studi  produktivitas gaultherin  dan  studi  optimisasi  parameter- parameter proses.

## Studi Produktifitas Gaultherin
Studi  produktifitas  gaultherin  dilakukan selama 2 bulan di Laboratorium Teknik Separasi UNTAG Semarang dan Laboratorium Bioteknologi Teknik Kimia PSD III UNDIP. Usaha-usaha yang dapat meningkatkan produktifitas diantaranya pengaruh penambahan drying agent (sodium sulfat,  kalsium  klorida,  dan  kalsium  sulfat) terhadap proses mixed-drying extraction . Secara umum tingkat produktifitas gaultherin akan lebih baik dengan adanya penambahan drying agent . Penggunaan drying agent bermanfaat mengikat, mengurangi maupun menghilangkan kandungan air dalam larutan maupun dalam campuran air sehingga tidak terjadi reaksi hidrolisa gaultherin oleh  enzim  gaultherase.  Diharapkan  dengan penambahan drying agent , yield yang diperoleh pada produksi gaultherin akan lebih tinggi bila dibandingkan proses produksi tanpa penambahan drying agent .

## Bahan dan Alat Penelitian
Bahan  baku  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah daun dan bunga tanaman gandapura yang diperoleh dari Kelompok Tani Rukun di Desa Sikunang Wonosobo. Bahan baku tersebut dibekukan guna menghambat aktifitas enzim gaultherase. Bahan lain yang diperlukan adalah etanol sebagai pelarut etanol, pH buffer, drying agent (gelatin, kalsium klorida dan sodium sulfat), serta bahan untuk keperluan analisis kadar  gaultherin,  kadar  asam  salisilat  dan
kadar metil salisilat. Penentuan kadar gaultherin dilakukan menggunakan metode analisis HPLC- MS.
Peralatan  utama  yang  dipakai  pada  riset adalah ekstraktor dan dehidrasi osmosis satu tahap yang digunakan untuk inaktivasi enzim, mereduksi  air,  dan  mengekstrak  gaultherin. Mixed-drying extraction memiliki karakteristik multi  fungsi,  yaitu  mampu  meringkas  tiga tahapan proses dalam satu alat, yaitu proses inaktivasi enzim, proses ekstraksi gaultherin, dan  proses  dehidrasi  osmosis. Mixed-drying extraction berupa  tangki  berpengaduk  yang dilengkapi dengan blade /pisau pencacah seperti halnya pada blender . Rangkaian alat ekstraktor dan dehidrasi osmosis satu tahap yang digunakan untuk produksi senyawa aktif gaultherin tersaji pada Gambar 1. Rangkaian alat ini terdiri dari ekstraktor inaktivasi enzimatis yang dilengkapi motor pengaduk, blade pencacah, pengendali suhu, dan pengendali putaran pengaduk. Alat penunjang yang diperlukan meliputi: filtrasi, oven, centrifugasi, dan heater untuk membantu penentuan kadar asam salisilat dan kadar metil salisilat.  Identifikasi  dan  analisis  gaultherin dilakukan  menggunakan  spektrofotometer maupun menggunakan HPLC-MS.
Gambar 1. Mixed-Drying Extraction

## Variabel Percobaan
Rasio  pelarut-umpan  pada  10:1,  suhu pengeringan  produk  80 o C,  pH  larutan  4,8, kecepatan putar pengaduk 75rpm, kecepatan putar pisau pencacah 125rpm, waktu ekstraksi 60menit,  dan  konsentrasi  etanol  80,  85,  90, 95%. Jenis drying agent meliputi: sodium sulfat, kalsium klorida, dan kalsium sulfat. Konsentrasi drying agent pada 10; 15; 20; 25 % (b/b).

## Prosedur Percobaan
Daun  dan  bunga  tanaman  gandapura dibekukan menggunakan es atau nitrogen cair. Ekstraksi dan dehidrasi osmosis dilakukan dalam mixed-drying  extraction. Alat mixed-drying extraction dilengkapi blade atau pisau pencacah di bagian bawah. Rasio pelarut : umpan, 10:1. Etanol yang ditambahkan adalah etanol dengan konsentrasi 90%. pH larutan dijaga pada pH 4,8 menggunakan buffer pH. Kecepatan putar pengaduk dan kecepatan putar pisau pencacah masing masing 75 dan 125rpm. Drying agent ditambahkan sesuai dengan variabel percobaan. Ekstraksi  dilangsungkan  selama  60menit. Padatan  kemudian  dipisahkan  dari  ekstrak menggunakan filter atau sentrifugasi. Ekstrak yang telah terpisah dari padatannya kemudian ditambahkan  dengan  bahan  kimia  atau dipanaskan guna menghilangkan pelarut. Untuk mendapatkan gaultherin dalam bentuk larutan, ekstrak yang telah dipanaskan dapat diresuspensi menggunakan buffer atau air. Hasil ekstraksi kemudian dianalisis kandungan metil salisilat, asam salisilat menggunakan metode analisis dilute isotop stabil dan kandungan gaultherinnya menggunakan HPLC-MS.

## Penentuan Yield
Komposisi gaultherin diukur dengan HPLC- MS. Faktor konversi dihitung berdasar gaultherin yang  terbentuk  terhadap  daun  dan  bunga tanaman  gandapura  yang  digunakan.  Kadar gaultherin  diukur  menggunakan  HPLC-MS. Kadar air diukur dengan penentuan kadar air manual. Berat jenis diukur dengan piknometer, dan indeks bias diukur dengan refraktometer.

## Penentuan Variabel Berpengaruh
Penentuan variabel berpengaruh dilakukan selama  3  bulan  di  Laboratorium  Teknik Separasi Teknik Kimia UNTAG Semarang dan Laboratorium Bioteknologi Teknik Kimia PSD III UNDIP dengan menggunakan experimental design yakni  metode  faktorial  desain  2 n . Parameter-parameter yang diteliti adalah waktu inaktivasi, pengaruh rasio solvent -gandapura, konsentrasi etanol, konsentrasi drying agent , dan kecepatan putar pencacah kecepatan putar pengaduk.  Variabel  pada  penentuan  variabel berpengaruh disajikan pada Tabel 2. Analisis data pada penentuan variabel yang berpengaruh dapat  menggunakan  normal probability  plot , setelah dilakukan perhitungan efek utama dan perhitungan  interaksi  dengan  menggunakan program statistik Matlab ® .

## Variabel Percobaan
Kecepatan putar pengaduk ditetapkan pada putaran  75rpm,  sedangkan  kecepatan  putar pisau pencacah sebesar 125rpm. Jenis drying agent 2  Kas  Kosong  sesuai  data  dari  studi produktifitas dan suhu pengering ditetapkan pada  80 0 C. Penentuan  variabel  berpengaruh Tabel 2. Data Batas Variabel pada Penentuan Variabel Berpengaruh
Variabel Batas Bawah Batas Atas Waktu (A) pH larutan (B) Rasio solvent -daun gandapura (C) Konsentrasi etanol (D)
Konsentrasi drying agent (E) 60 menit 7 10: 1 80% 10% (b/b) 180 menit 9 20: 1 95% 25% (b/b)
meliputi: waktu, pH larutan yang dikendalikan dengan penambahan buffer , rasio pelarut-daun gandapura, konsentrasi etanol, dan konsentrasi drying agent . Variabel berpengaruh ditentukan dengan menggunakan metode faktorial desain, berdasarkan batas bawah dan batas atas. Data batas masing-masing variabel disajikan pada Tabel 2.

## Experimental Design
Analisis data pada penelitian ini menggunakan sistem faktorial desain yang berarti sekumpulan percobaan yang dirancang untuk memperoleh data-data konkret untuk membuktikan suatu hipotesa.  Pada  desain  eksperimental  setiap variabel yang diuji ditentukan pada beberapa harga, biasanya dua harga untuk variabel bebas. Hasil percobaan dengan menggunakan factorial design dua  level,  dilakukan  analisis  regresi terhadap harga efek interaksi dan persentase probabilitas, sehingga variabel berpengaruh pada proses ekstraksi gaultherin dapat ditentukan.

## Optimisasi Parameter Proses
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mencari kondisi optimal untuk produksi gaultherin dari gandapura  melalui  proses  inaktivasi  enzim gaultherase  dengan mixed-drying  extraction . Proses optimasi parameter proses dilaksanakan selama  2  bulan  di  Laboratorium  Teknik Separasi Teknik Kimia UNTAG Semarang dan Laboratorium Bioteknologi Teknik Kimia PSD III UNDIP. Tahap ini adalah melakukan optimasi terhadap variabel berpengaruh . Tetapan pada
optimasi parameter proses adalah tetapan pada penentuan  variabel  berpengaruh  Kecepatan putar pengaduk 75rpm, kecepatan putar pisau pencacah  125rpm,  jenis drying  agent sesuai data dari studi produktifitas, suhu pengeringan 80 o C, dan parameter lain selain variabel paling berpengaruh. Sebagai variabel dalam percobaan, ditentukan dengan membuat interval tertentu pada variabel berpengaruh.

## Telaah Pemodelan Regresi pada Kondisi Optimum
Kegiatan  pemodelan  diawali  dengan menyusun persamaan matematis dengan regresi berdasarkan data dari studi optimisasi parameter proses. Model regresi mewakili variabel proses mixed-drying extraction pada keadaan optimum dan digunakan untuk memprediksikan kondisi serta evaluasi kinerja alat proses.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi tanaman gandapura menggunakan senyawa polar berupa etanol berfungsi ganda, yaitu menginaktifkan enzim gaultherase dan mengekstrak senyawa aktif gaultherin. Difusi etanol  ke  dalam  daun  gandapura  (Gambar 2)  bertujuan  agar  enzim  gaultherase  yang berada dalam sitoplasma berpenetrasi dengan pelarut, sehingga menyebabkan aktivitas enzim terhambat. Pernyataan ini juga diungkapkan oleh Poulev dkk. (2003) bahwa aktivitas gaultherase terhambat dengan penambahan senyawa polar. Mekanisme selanjutnya bahwa pelarut etanol akan menyusup menembus dinding membran
tonoplast dan terjadi kontak fasa dengan senyawa aktif gaultherin. Pelarut polar tersebut akan mendifusi ke luar sel daun dengan membawa gaultherin. Hal ini disebabkan oleh perbedaan kelarutan.
Enzim merupakan suatu molekul raksasa dengan berat molekul yang bervariasi antara 5000  Da-5  juta  Da.  Enzim  termasuk  dalam kelompok  makromolekul  yang  lebih  besar yakni protein dan terdiri dari rangkaian rantai linear asam-asam amino spesifik. Pada kondisi optimumnya  enzim  akan  mengalami  proses folding (Gambar 3). Proses terbentuknya susunan folding pada enzim merupakan proses spontan yang terjadi dalam hitungan detik (Bugg, 2004, Yang et al ., 2004). Oleh karenanya, jika enzim gaultherase berada dalam keadaan folding , dan juga terjadi kerusakan pada membran tonoplast, mengakibatkan enzim tersebut mengkatalisis reaksi hidrolisa senyawa gaultherin menjadi metil salisilat. Hal ini menyebabkan perolehan senyawa aktif gaultherin relatif rendah.
Rangkaian asam amino pada enzim akan membentuk  susunan  tiga  dimensi  tertentu
yang spesifik pada masing-masing jenis enzim (struktur tersier). Bagian dari struktur tersier enzim yang bertanggung jawab terhadap aktivitas katalitik enzim disebut sisi aktif. Jumlah sisi aktif dari suatu enzim mencapai 10-20% dari volume total enzim (Bugg, 2004; Yang et al ., 2004). Sisi aktif suatu enzim biasanya berupa suatu celah hidrofilik yang terdiri dari rangkaian rantai asam amino yang akan mengikat substrat (Gambar 4.a) atau mengikat suatu kofaktor (Gambar 4.b) dan mengkatalisis reaksi.
Proses folding pada enzim merupakan proses yang melibatkan masuknya rantai asam amino yang bersifat hidrofobik ke sisi bagian dalam dari enzim dan proses keluar atau bergesernya rantai asam amino yang bersifat hidrofilik ke bagian luar dari susunan tiga dimensi enzim.

## Identifikasi Senyawa aktif gaultherin
Analisis lanjutan terhadap sampel bertujuan untuk memastikan bahwa yang teridentifikasi adalah gaultherin. Analisis FAB+ memunculkan bahwa pada peak yang muncul pada saat retensi 14 menit adalah senyawa yang memiliki molecular
Gambar 3. Proses Folding
Gambar 4. Sisi Aktif Enzim
ion mass sebesar 469,0945 m/z. Massa tersebut merupakan massa molekul gaultherin (446 m/z) ditambah dengan massa molekul sodium, yang seringkali muncul. Oleh karenanya, berdasarkan grafik hasil analisis FAB+ membuktikan bahwa sampel  yang  dianalisis  benar  mengandung gaultherin  (analisis  pada  waktu  retensi  14 menit).

## Studi Produktivitas Gaultherin
Telaah  produktivitas  senyawa  aktif gaultherin dengan penambahan drying agent berupa  gelatin,  kalsium  klorida,  dan  sodium sulfat.  Gambar  5  dan  6  menyajikan  grafik hubungan antara penambahan drying agent pada berbagai konsentrasi etanol maupun konsentrasi
dehidrasi osmosis terhadap kadar gaultherin. Meningkatnya konsentrasi drying agent maupun etanol  menyebabkan  perolehan  gaultherin semakin besar, terutama dengan penambahan kalsium klorida. Hal ini dapat dijelaskan bahwa drying agent berfungsi sebagai pengering secara osmosis, yaitu proses pengambilan air dari suatu bahan yang dilakukan dengan menempatkan bahan  pada  larutan  berkonsentrasi  tinggi dimana di antara keduanya terdapat membran semipermiabel.  Air  dari  larutan  encer  akan mendifusi  melalui  membran  ke  larutan  yang lebih  tinggi  konsentrasinya  terus-menerus hingga tercapai keadaan setimbang. Mengingat sifat membran semipermiabel yang hanya dapat dilewati air dan senyawa dengan berat molekul
0 2 4 6 8 10 12 14 16 10 15 20 25 Konsentrasi Drying Agent (%) Kadar Gaultherin (%) G E L A T I N K A L S I U M  K L O R I D A S O D I U M  S U L F A T T A N P A  D R Y I N G  A G E N T 0 2 4 6 8 10 12 14 16 80 85 90 95 Konsentrasi Etanol (%) Kadar Gaultherin (%) G E L A T I N K A L S I U M  K L O R I D A S O D I U M  S U L F A T T A N P A  D R Y I N G  A G E N T
Gambar 5. Grafik Hubungan antara Konsentrasi Drying Agent dengan Kadar Gaultherin
kecil maka solut tidak dapat mendifusi melalui membran ke arah sebaliknya. Bilapun ada solut yang mendifusi, perpindahan massa yang terjadi sangat lambat, akibatnya kemungkinan terjadinya reaksi hidrolisa gaultherin menjadi metil salisilat relatif rendah. Perpindahan massa utama yang terjadi pada proses ini adalah perpindahan massa air ke larutan yang konsentrasinya tinggi (Silva et al ., 2011).
Perpindahan massa air melalui membran semipermiabel dapat berlangsung karena adanya beda  potensial  kimia  antara  kedua  larutan tersebut, dimana potensial kimia air di larutan encer lebih tinggi daripada potensial kimia air di larutan dengan konsentrasi tinggi. Fenomena ini dikenal dengan peristiwa osmosis (Cheryan et al. , 1992). Potensial kimia merupakan fungsi konsentrasi,  temperatur  dan  tekanan.  Jika
pada kondisi isothermal, maka potensial kimia hanya dipengaruhi oleh konsentrasi dan tekanan saja.  Meningkatnya  konsentrasi  solut  akan menurunkan potensial kimia solven (Lewicki et al. , 1995, Eren et al. , 2007).

## Penentuan Variabel Proses yang Paling Berpengaruh
Tabel  3  dan  4  menyajikan  perolehan senyawa aktif gaultherin pada berbagai variabel proses ekstraksi. Kajian desain eksperimental ini  digunakan  untuk  menentukan  variabel yang paling berpengaruh. Hasil perhitungan menunjukkan  bahwa  harga  efek  utama  dan interaksi, diketahui bahwa variabel yang paling berpengaruh adalah pH dan konsentrasi etanol (efek BD positif terbesar).
Tabel 3. Harga Efek Utama dan Efek Interaksi pada Penentuan Variabel Berpengaruh Efek Harga Efek Efek Harga Efek Efek Harga Efek Efek Harga Efek a 0.7775 ad 0.8175 ae 1.587 ade 0.06 b -0.275 bd 2.3087 be -0.495 bde 1.73 ab -0.165 abd 0.6675 abe -0.007 abde -0.427 c 1.3475 cd 0.4475 ce -0.19 cde -0.9125 ac -0.925 acd 0.395 ace 0.985 acde 0.8275 bc -1.1125 bcd 0.205 bce 0.6725 bcde -0.6475 abc -0.985 abcd -0.6075 abce 0.6825 abcde -0.08825 d 0.0425 e 1.2487 de 1.1875 Tabel 4. Data Hasil Percobaan pada Penentuan Variabel Berpengaruh Run Ke- Variabel Kadar gaultherin A B C D E 1 10% 80% 5:1 7 30 8,40 2 25% 80% 5:1 7 30 7,62 3 10% 95% 5:1 7 30 11,5 4 25% 95% 5:1 7 30 12,10 5 10% 80% 10:1 7 30 10,75 6 25% 80% 10:1 7 30 10,90 7 10% 95% 10:1 7 30 12,46 8 25% 95% 10:1 7 30 6,22 9 10% 80% 5:1 9 30 7,31 10 25% 80% 5:1 9 30 7,27 11 10% 95% 5:1 9 30 5,20
Optimasi pH pada Mixed-Drying Extraction Proses Inaktivasi Enzim Gaultherase
Gambar  7  menunjukkan  bahwa  semakin besar pH ekstraksi (pengaturan dengan buffer ), akan meningkatkan perolehan senyawa aktif gaultherin. Namun demikian, peningkatan pH lebih lanjut menyebabkan produksi gaultherin menurun.  Kondisi  optimum mixed-drying extraction inaktivasi enzim tercapai pada pH 8 dengan kadar senyawa aktif gaultherin sebesar 14,46% dan persamaan regresi y= -4,8074x 2 + 78,301x – 305,28. Hal ini bisa dijelaskan bahwa gaultherase merupakan jenis enzim hydrolase, yang memiliki aktivitas optimum disekitar pH larutan  asam  lemah.  Oleh  karenanya,  pada kondisi mixed-drying  extraction basa  lemah menyebabkan  enzim  gaultherase  mengalami unfolding ,  akibatnya  akan  mereduksi  reaksi hidrolisa gaultherin menjadi metil salisilat yang dikatalisis oleh enzim gaultherase.
y = -4.8074x 2 + 78.301x - 305.28 R 2 = 0.9209 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 pH ekstraksi Kadar gaultherin (%)
Gambar 7. G r a f i k   H u b u n g a n   a n t a r a pH  Ekstraksi  dengan  Kadar Gaultherin
Run Ke- Variabel Kadar gaultherin A B C D E 12 25% 95% 5:1 9 30 9,82 13 10% 80% 10:1 9 30 12,09 14 25% 80% 10:1 9 30 10,15 15 10% 95% 10:1 9 30 10,90 16 25% 95% 10:1 9 30 8,05 17 10% 80% 5:1 7 60 7,15 18 25% 80% 5:1 7 60 11,75 19 10% 95% 5:1 7 60 5,8 20 25% 95% 5:1 7 60 6,85 21 10% 80% 10:1 7 60 11,47 22 25% 80% 10:1 7 60 11,02 23 10% 95% 10:1 7 60 7,40 24 25% 95% 10:1 7 60 8,50 25 10% 80% 5:1 9 60 8,3 26 25% 80% 5:1 9 60 8,4 27 10% 95% 5:1 9 60 9,08 28 25% 95% 5:1 9 60 12,9 29 10% 80% 10:1 9 60 6,8 30 25% 80% 10:1 9 60 13,05 31 10% 95% 10:1 9 60 9,4 32 25% 95% 10:1
9 60 12,2
Optimasi Pelarut pada Mixed-Drying Extraction Pada Inaktivasi Enzim Gaultherase
Gambar 8 menyajikan grafik hubungan antara konsentrasi etanol terhadap kadar gaultherin. Semakin besar konsentrasi pelarut, gaultherin

## Lanjutan Tabel 4
yang  terekstrak  semakin  meningkat.  Hal  ini terjadi karena memperbesar konsentrasi pelarut berarti memperbesar fasa kontinyu, akibatnya fraksi volum fasa cair yang terdispersi semakin kecil dan diameter partikel juga mengecil. Dengan mengecilnya  diameter  partikel,  maka  akan memperluas kontak antar fasa yang disebabkan semakin meningkatnya solut yang terseret dalam fasa pelarut. Akan tetapi, peningkatan konsentrasi senyawa  polar  lebih  lanjut  menyebabkan perolehan senyawa aktif gaultherin menurun. Hal ini dimungkinkan, pada konsentrasi etanol diatas 90%, menyebabkan sebagian diluen terikut ke fasa kontinyu karena terjadi peningkatan kelarutan. Produksi gaultherin secara optimum tercapai pada konsentrasi etanol 90% dengan perolehan senyawa aktif sebesar 13,10%.

## SIMPULAN
Hasil  riset  menunjukkan  bahwa  variabel proses  inaktivasi  enzim  gaultherase  melalui mixed-drying extraction yang paling berpengaruh adalah pH dan konsentrasi etanol. Semakin besar pH  ekstraksi,  akan  meningkatkan  perolehan senyawa  aktif  gaultherin.  Kondisi  optimum inaktivasi enzim melalui mixed-drying extraction tercapai pada pH 8 dengan kadar senyawa aktif gaultherin  sebesar  14,46%.  Semakin  besar konsentrasi pelarut, gaultherin yang terekstrak semakin  meningkat,  namun  peningkatan
konsentrasi etanol diatas 90%, menyebabkan perolehan senyawa aktif gaultherin menurun. Produksi gaultherin secara maksimum tercapai pada konsentrasi etanol 90% dengan perolehan senyawa aktif sebesar 13,10%.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima  kasih  yang  sebesar-besarnya  kepada DP2M-DIKTI  atas  dukungan  dana  dalam kegiatan Penelitian Hibah Bersaing 2014.

## DAFTAR PUSTAKA
Bugg, T.D.H., 2004. Diverse Catalytic Activities in the Αβ -hydrolase Family of Enzymes: Activation of H 2 O, HCN, H 2 O 2 , and O 2 , Bioorganic Chemistry , 32(5), 367-375.
Cheryan, M. and Nichols, D.J., 1992. Modelling of Membrane Processes : In Mathematical Modelling of Food Processes , edited by S.Thorne, Elsevier, London, UK, 49-98.
Eren,  I.  and  Ertekin,  F.K.,  2007.  Optimization  of Osmotic Dehydration of Potato using Response Surface  Methodolog y, Journal  of  Food Engineering , 79, 344–352.
Hernani, 2004. Gandapura: Pengolahan, Fitokimia, Minyak  Atsiri  dan  Daya  Herbisida. Buletin TRO ,  XV  (2),  Balai  Besar  Penelitian  dan Pengembangan Pascapanen Penelitian. Hoffman,  E.J.,  2007. Cancer  and  the  Search  for Selective Biochemical Inhibitors , Second Ed., CRC Press.
Kusumo, P. K. dan Yulianto, M.E., 2013. Pengaruh Drying Agent pada Ekstraksi dan Inaktivasi Enzim Gaultherase Simultan dari Gandapura ( Gaultheria fragantissima ), Seminar Nasional Teknik Kimia Kejuangan , UPN Yogyakarta.
Lewicki, P. and Lenart, A., 1995. Osmotic Dehidration of Fruits and Vegetables. Handbook of Industrial Drying , (2 nd ed.), New York: Marcel Decker, Inc., 691-713.
Linjakumpu, T., Hartikainen, S., Klaukka, T., Veijola, J., Kivelä, S.L., and Isoaho, R., 2002. Use of Medications and Polypharmacy are Increasing Among  the  Elderly. Journal  of  Clinical Epidemiology , 55 (8), 809-817.
Manurung, R., 2002. Minyak Atsiri, Peluang Bisnis yang Belum Digarap Optimal, Harian Umum Sore Sinar Harapan .
Mauludi,  L.,  2003.  Kelayakan  Usaha  Pengolahan Minyak Gandapura di Kabupaten Wonosobo Jawa  Tengah, Buletin  TRO ,  XIV  (2),  Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat.
y = -0.0157x 2 + 2.897x - 123.94 R 2 = 0.6186 0 2 4 6 8 10 12 14 60 70 80 90 100 Konsentrasi etanol (%) Kadar gaultherin (%)
Gambar 8. Grafik Hubungan antara Konsentrasi Etanol dengan Kadar Gaultherin
Poulev, A.A., O’Neal, J.M., Logendra, S., Pouleva, R.B., Timeva, V., Garvey, A.S., Gleba, D., Jenkins, I.S., Halpern, B.T., Kneer, R., Cragg, G.M., and Raskin, I., 2003. Elicitation, a New Window into Plant Chemodiversity and Phytochemical Drug Discovery, Journal of Medicinal Chemistry , 46, 2542–2547.
Ribnicky, D.M., Poulev, A.A., and Raskin, I., 2002.
Recovery  of  Gaultherin  from  Plants, U.S.
Patents , No. 2002/ 0031562 A1 . Ribnicky, D.M., Poulev A.A., and Raskin, I., 2003. The Determination of Salicylates in Gaultheria Procumbens  for  Use  as  a  Natural  Aspirin Alternative, Journal  of  Nutraceuticals ,
Functional and Medical Food, 4 (1).
Ribnicky, D.M., Poulev A.A., and Raskin, I., 2006. Methods  of  Administering  Gaultherin- Containing  Compositions, U.S.  Patent ,  No.
7.033.618 .
Silva, K.D.S., Caetano, L.C., Garcia, C.C., Romero, J.T., Santos, A.B., and Mauro, M.A., 2011. Osmotic Dehydration  Process  for  Low  Temperature Blanched Pumpkin, Journal of Food Engineering , 105, 56-64.
Yang, X., Wang, M., and Fee, M.C., 2004. Analysis of Protein Folding and Function using Backbone Modified Proteins, Bioorganic Chemistry , 32(5),
438- 449.