Abstrak —  Eksplorasi yeast sebagai  agen biofermentor masih sangat  kurang  padahal  yeast  memiliki  potensi  yang  amat  baik dalam mengubah glukosa menjadi etanol. Yeast tanah merupakan salah  satu  jenis  yeast  yang  berpotensi  tinggi  sebagai  agen biofermentor.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  potensi isolat yeast tanah yang telah diisolasi menggunakan metode SDN (Soil  Drive  Nutrient)  dari  Malang,  Jawa  Timur  dan  untuk mengetahui  konsentrasi  glukosa  terbaik  dalam  memproduksi etanol. Konsentrasi glukosa yang digunakan ialah 10%, 15% dan 20%. Terdapat 5 isolat yeast yang akan digunakan yaitu Candida sp.  1., Candida sp.2., Lindnera , Kloeckera sp  dan Debaryomyces sp.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  isolat  yang berpotensi  dalam  memproduksi  etanol  ialah Kloeckera sp.  dan Debaryomyces sp..  Pada  isolat Kloeckera sp.  optimum  dalam menghasilkan etanol pada konsentrasi glukosa 20% yakni sebesar 30,75%  pada  jam  ke-72.  Sedangkan  isolat Debaryomyces sp. mampu  menghasilkan  etanol  secara  optimum  pada  konsentrasi glukosa 15% yakni sebesar 22,95% pada jam ke 24-48.
Kata Kunci —etanol, fermentasi, glukosa, yeast tanah

## I. PENDAHULUAN
NDONESIA  memiliki  luas  wilayah  yang  mencapai  6.400 km dan terdiri atas 18.108 pulau [1], sehingga biodiversitas flora,  fauna  dan  mikroorganisme  juga  melimpah.  Keberadaan mikroorganisme  di  alam  sangat  melimpah  yang  meliputi wilayah daratan atau tanah, perairan dan udara. Salah satunya ialah yeast yang  dikenal  memiliki  rentang  ekologi  cukup  luas dan  mampu  hidup  pada  daerah  ekstrim  [2]  dan  umumnya ditemukan  pada  lingkungan  organik  tinggi  [3].  Isolasi  dan identifikasi dari total perkiraan keanekaragaman yeast di dunia baru  dilakukan  sekitar 1% [4]. Diantara 89 genera yeast yang pernah  terdaftar  dalam  monograf yeast ,  sebanyak  37  genera atau 42% ditemukan di Indonesia [5].
Penelitian  tentang yeast banyak  dilakukan  dalam  bentuk eksplorasi  dari  berbagai  ekosistem  di  Indonesia.  Hal  ini diyakini  bahwa  jumlah yeast di  alam  jauh  lebih  tinggi dibandingkan yeast yang  telah  diketahui  selama  ini  [6]. Penelitian  mengenai  karagaman yeast tanah  telah  banyak dilakukan  oleh  beberapa  peneliti  sebelumnya  yang  telah mengisolasi yeast dari  berbagai  variasi  tipe  ekosistem  tanah, seperti  daerah  antartika,  gurun  dan  hutan  subtropika.  Akan tetapi,  belum  banyak  peneliti  yang  melaporkan  keragaman yeast yang  hidup  pada  tanah  di  daerah  tropis  [7].  Hal  inilah yang  mendasari  dilakukan  penelitian  mengenai  keragaman
yeast di  daerah  tropis  dan  agar  segera  diketahui  kemampuan yeast sebagai agen biofermentor.
Berdasarkan  penelitian  dan  eksplorasi yeast tanah  pada wilayah  Kota  Malang,  Jawa  Timur  yang  telah  dilakukan  oleh [8] sehingga penelitian ini bertujuan untuk mengerahui potensi isolate yeast tanah  yang  telah  diisolasi  menggunakan  metode SDN  ( Soil  Drive  Nutrient )  dalam  memfermentasi  etanol  serta untuk mengetahui konsentrasi gula terbaik dalam memproduksi etanol.

## II. METODOLOGI

## A. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2016 sampai dengan  Mei  2016  di  Laboratorium  Mikrobiologi  dan Bioteknologi serta Laboratorium Botani, Jurusan Biologi; dan Laboratorium  Mikroorganisme  Jurusan  Kimia,  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam  Institut  Teknologi Sepuluh Nopember (ITS).

## B. Subkultur Isolat Yeast
Isolat yeast yang diujikan dalam penelitian ini adalah isolat yeast koleksi Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian,  Universitas  Brawijaya  Malang.  Medium  YMEA steril  dituangkan  ke  dalam  tabung  reaksi  sebanyak  ±  5  ml. Tabung  reaksi  tersebut  diletakkan  pada  posisi  miring  dan didinginkan  sampai  medium  memadat,  kemudian  disimpan pada  suhu  ruang.  Selanjutnya,  5  isolat yeast diinokulasikan pada  medium  YMEA slant menggunakan  jarum  ose  dan diinkubasi  selama  2-4  hari  pada  suhu  ruang.  Keberhasilan subkultur  ditandai  dengan  tumbuhnya  isolat yeast pada medium YMEA.

## C. Uji Konfirmasi Yeast (Makroskopis dan Mikroskopis)
Pengamatan  karakter  makroskopis  dilihat  berdasarkan kenampakan  koloni  yang  tumbuh  pada  medium  YMEA  yang meliputi; warna koloni, bentuk tepi koloni, elevasi, permukaan koloni dan tekstur koloni [3].
1. Tekstur  koloni: mucoid , fluid atau viscous , butyrous , friable , atau membranous
2. Warna: putih, kuning, oranye, pink dan merah
3. Margin: smooth , entire , undulating , lobed , erosed ,  atau fringed dengan filament
4. Elevasi: flat atau raised

## Uji Potensi Fermentasi Etanol Beberapa Yeast yang Diisolasi dari Daerah Malang, Jawa Timur dengan Metode SDN (Soil Drive Nutrient)
Sabrina Firrar Rahmana, Sri Nurhatika dan Anton Muhibuddin Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
e-mail : nurhatika@bio.its.ac.id
I
5. Permukaan: glistening atau dull , smooth , rough , sectored , folded , ridged , atau hirsute .
Pengamatan  karakter  mikroskopis  dilakukan  dengan menggunakan mikroskop dan pewarnaan laktofenol. Pewarnaan  laktofenol  digunakan  untuk  melihat  karakteristik reproduksi generatif seperti pembentukan askospora, teliospora,  dan  basidiospora.  Selain  itu  juga  untuk  melihat reproduksi  vegetatif  sel yeast yang  meliput  pembentukan budding  dengan  tipe  multipolar,  bipolar,  unipolar  dan  fusi, pembentukan  spora  aseksual  meliputi  arthospora,  blastospora, dan  clamydiospora.  Pengamatan  mikroskopis  lainnya  yaitu meliputi  bentuk  filamen,  bentuk  sel,  ukuran  sel,  ada  tidaknya pembentukan  pseudohifa.  Pengamatan  secara  mikroskopis dilakukan  dengan  cara  membuat  preparat  biakan  di  atas  kaca objek yang telah diwarnai dengan laktofenol, kemudian ditutup dengan  cover  glass  dan  ditetesi  minyak  imersi.  Setelah  itu dilihat  karakter  selnya  pada  mikroskop  dengan  perbesaran 400x  dan  1000x.  Untuk  pengamatan  dengan  perbesaran  400x tidak perlu ditambahkan minyak imersi [3].

## D. Uji Potensi Fermentasi
Uji fermentasi gula dilakukan dengan cara 1 ml isolat yeast dari medium YMB yang telah berumur 24-48 jam diambil lalu diinokulasikan  ke  dalam  media  uji  fermentasi  yang mengandung  glukosa  pada  tabung  yang  berbeda.  Kemudian tabung  dihomogenkan  dan  dilakukan  inkubasi  selama  72  jam pada temperatur 25-28 0 C. Hasil positif jika terdapat perubahan warna  pada  medium  dan  munculnya  gelembung  gas  pada tabung Durham. Warna media berubah yang awalnya berwarna biru  menjadi  kuning  karena  formasi  asam  dan  gas  yang dihasilkan [9].

## 1) Pembuatan kurva pertumbuhan
Diambil 1 ose isolat yeast kemudian disuspensikan kedalam pada  100  mL  air  fisiologis  steril  0,85%  (NaCl  dan  aquades), diukur  nilai  ODnya  menggunakan  spektrofotometer  pada panjang  gelombang  600  nm  hingga  mencapai  nilai  OD  =  0,5 [10].  Selanjutnya  kultur  diambil  20  ml  dan  ditambahkan  ke medium  YMB  sebanyak  180  ml  kemudian  diinkubasi    dalam rotary  shaker dengan  kecepatan  130  rpm  pada  suhu  ruang. Setiap  24  jam  dihitung  OD  kultur  dengan  menggunakan Spektrofotometer  UV-Vis pada  panjang  600nm  selama  8  hari. Data OD yang didapatkan kemudian dibuat kurva pertumbuhannya sehingga umur starter dapat ditemukan [11].

## E. Pembuatan starter yeast
Setelah yeast tumbuh  pada  medium  YMEA,  diambil  1  ose isolat  kemudian  di  inokulasikan  pada  10  ml  air  fisiologis (NaCl  dan  aquades)  diukur  nilai  kepadatan  selnya  ( Optical Density )  nya  hingga  mencapai  0,5  dengan  menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Selanjutnya  isolat  diambil  sebanyak  10%  dan  dimasukkan  ke dalam medium starter lalu diinkubasi selama 2 hari hingga sel yeast mencapai fase eksponensial .

## F. Uji fermentasi substrat glukosa
Media  uji  ini  dibuat  dengan  cara  melarutkan  glukosa  dan dengan  konsentrasi  10%,  15%,  20%, pepton  water 100  ml, Bromthymol blue 0,1 %, dan kloramfenikol 200 mg/l dalam 1
liter  akuades.  Larutan  disterilkan  dengan  autoklaf  121°C,  1,5 atm  selama  15  menit.  Selanjutnya  medium  susbtrat  glukosa dan fruktosa diambil sebanyak 100 ml ke dalam erlenmeyer . Uji fermentasi substrat glukosa dilakukan dengan menginokulasi sebanyak 10% isolat yang telah berumur 48-78 jam  dari  medium  YMB  kedalam  medium  uji.  Sebelum dilakukan  inkubasi,  diuji  dahulu  kadar  gula  reduksi  sebagai data  gula  pereduksi  awal. Fermentasi dilakukan selama 4 hari (96)  jam  dan  diamati  kadar  etanol  dan  gula  reduksi  setiap  24 jam.

## G. Pembuatan kurva standart glukosa
Glukosa  anhidrat  10  mg  dilarutkan  dalam  akuades  hingga volume  10  ml.  Larutan  yang  diperoleh  konsentrasi  akhirnya adalah  1  mg/ml  yang  kemudian  menjadi  larutan  stok  standar glukosa.  Kemudian  satuan  mg/ml  dikonversi  menjadi  µM/ml. Setelah  itu  dilakukan  pengenceran  bertingkat  menggunakan penambahan  akuades  hingga  didapatkan  variasi  knsentrasi glukosa  anhidrat.  Sebanyak  0,2  ml  glukosa  anhidrat  dari masing-masing  konsentrasi  (10%,  15%.  20%)  dimasukkan  ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan reagen DNS sebanyak 2 ml.  Tabung  reaksi  dipanaskan  pada  air  mendidih  selama  2 menit  agar  terjadi  reaksi  antara  glukosa  dengan  DNS. Kemudian  tabung  didinginkan  hingga  mencapai  suhu  ruang dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV- Vis pada panjang gelombang 540 nm [12].

## H. Pengukuran kadar etanol
Pengukuran kadar etanol dilakukan menggunakan piknometer.  Piknometer  adalah  alat  yang  digunkaan  untuk mengukur nilai massa jenis atau densitas dari fluida. Cara kerja menggunakan piknometer pertama-tama yaitu dengan menimbang  massa  piknometer  yang  kosong  dan  kering menggunakan  timbangan  analitik.  Hasilnya  dianggap  sebagai W1.  Setelah  itu  mengisi  piknometer  menggunakan  akuades, lalu  ditutup.  Piknometer  dan  akuades  ditimbang,  berat  yang didapat  adalah  W2.  Berat  akuades  (W)  dihitung  dengan  cara W2-W1.
Piknometer kering diisi dengan hasil fermentasi, permukaan luar  piknometer  dikeringkan  dan  ditimbang.  Hasil  yang didapat  adalah  W3.  Berat  etanol  hasil  fermentasi  adalah  W3- W1=L.  Berat  air  (L)  dihitung  dengan specific  gravity atau spg=  L/W.  Nilai  spg  ditentukan  menggunakan  tabel  AOAC ( Analysis  of  Association  of  Official  Analitical  Chemists )  dan selanjutnya persentase etanol dihitung [13].
I. Pengukuran kadar gula reduksi
Pengukuran kadar gula reduksi dilakukan dengan menggunakan  metode  DNS.  Larutan  Asam  3,5-dinitrosalisilat (DNS) dibuat terlebih dahulu dengan menimbang 1 gr NaOH, dilarutkan  dengan  60  ml  akuades,  ditambah  18,2  gr  Na-K Tartrat,  1  gr  asam  3,5-dinitrosalisilat  (ditambahkan  perlahan lahan  sambil  diaduk  hingga  larut  sempurna),  kemudian ditambah  0,2  gr  fenol  untuk  menstabilkan  warna  dan  0,05  gr Na 2 SO 3 .  Lalu  dipindahkan  kedalam  labu  ukur,  kemudian diencerkan  dengan  akuades  hingga  mencapai  100  mL, kemudian kocok hingga homogen [14].
Pereaksi  DNS  yang  telah  dibuat  ditambahkan  ke  dalam tabung  reaksi  sebanyak  4  mL  yang  berisi  1  mL  supernatan
sampel  hasil  hidrolisis  [15].  Larutan  tersebut  dipanaskan dalam air mendidih selama 2 menit untuk mempercepat reaksi yang  ditandai  dengan  perubahan  warna  larutan  menjadi  lebih pekat,  kemudian  dipindahkan  ke  dalam  air  es  untuk menghentikan  reaksi.  Pengukuran  absorbansi  dilakukan  pada panjang gelombang 540 nm untuk memperoleh nilai OD. Nilai OD  yang  didapat  dimasukkan  ke  dalam  persamaan  regresi yang  dihasilkan  dari  pembuatan  kurva  standar  glukosa  untuk memperoleh  nilai  kadar  gula  reduksi.  Pengukuran  kadar  gula reduksi dilakukan setiap hari selama 4 hari.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat yeast ini dikulturkan pada medium YMEA dan YMB dengan  metode  gores  16  selama  48-72  jam.  Hasil  isolasi tersebut  menunjukkan  bahwa  hanya  terdapat  2  isolat  yang mampu  tumbuh  yaitu Kloeckera sp.  dan Debaryomyces sp., sedangkan isolat Candida sp. 1., Candida sp.2., dan Lindnera tidak  mampu  tumbuh.  Terdapat  beberapa  penyebab  tidak tumbuhnya ketiga isolat yeast antara lain faktor ekstrinsik dan faktor intrinsik. Beberapa faktor ekstrinsik yang mempengaruhi  pertumbuhan yeast tanah  meliputi  pH,  materi organik,  suhu,  kelembaban  dan  nutrisi  tanah  [16].  Kadar nutrisi  dan  hara  di  dalam  tanah  sangatlah  melimpah  sehingga isolat yeast mampu  tumbuh  dengan  baik  di  dalam  tanah. Sehingga bila dibandingkan dengan kadar nutrisi pada medium tumbuh  dengan  kadar  nutrisi  di  dalam  tanah  dimungkinkan berbeda,  terdapat  nurisi-nutrisi  yang  tidak  terpenuhi  seperti nutrisi yang ada di dalam tanah sehingga beberapa isolat tidak mampu  tumbuh.  Selain  itu,  kondisi  tanah  seperti  pH,  materi organik,  suhu,  dan  kelembaban  isolat  yang  berbeda  dengan medium  tumbuh  juga  dapat  menjadi  penyebab  isolat Candida sp.1., Candida sp.2., dan Lindnera sp. mati dan tidak tumbuh. Ketiga  isolat Candida sp.1., Candida sp.2.,  dan Lindnera sp. telah  coba  ditumbuhkan  pada  suhu  yang  berbeda  yaitu  4 0 C, 25 0 C,  37 0 C  dan  40 0 C  namun  dalam  berbagai  macam  suhu tersebut  tetap  tidak  dapat  tumbuh.  Terdapat  faktor  internal yang  juga  turut  mempengaruhi  kemampuan  tumbuh  isolat yeast ,  seperti  genetik  sel  yang  juga  memberikan  pengaruh terhadap  kemampuan  pertumbuhan yeast tanah  yang merupakan  genus  baru.  Faktor  lain  seperti  fisiologis  sel  dan metabolisme sel yang berbeda-beda pada tiap genus juga dapat menjadi  penyebab  kemampuan  tumbuh yeast pada  tiap  genus berbeda-beda.
Faktor lain yang juga mempengaruhi adalah lamanya waktu penyimpanan  kultur  isolat  yang  dapat  menyebabkan  nutrisi  di dalam medium habis terkonsumsi sehingga dapat menyebabkan  isolat  dalam  medium  penyimpanan  mati,  hal inilah  yang  dapat  menyebabkan  isolat  tak  mampu  tumbuh dalam  kultur  baru.  Selain  itu  juga  dapat  disebabkan  karena kurang terpenuhinya kebutuhan nutrisi dalam medium tumbuh.

## A. Hasil Uji Konfirmasi (Makroskopis dan Mkroskopis)
Pengamatan  makroskopis dilakukan setelah subkultur isolat berumur  48  jam.  Berdasarkan  pengamatan  makroskopis, didapatkan  koloni yeast Kloeckera sp.  dengan  ciri  elevasi convex,  entired  margin,  dried  surface  dan  berwarna  putih kekuningan.  Sedangkan  pada  isolat Debaryomyces sp.
memiliki ciri elevasi: raise, margin: undulate, dried surface dan koloni isolat yang berwarna kuning pudar.
Warna koloni yang telah diamati ialah putih kekuningan dan kuning  pudar.  Menurut  [3],  beberapa  koloni yeast memiliki warna  khusus  seperti  kuning,  oranye,  dan  merah.  Namun warna  putih  atau  tidak  berpigmen  sampai  warna  krem  adalah karakteristik  kebanyakan yeast .  Isolat yeast hanya  memiliki dua  bentuk  elevasi  yaitu raised dan flat .  Tepi  koloni yeast beragam  seperti entire , filiform ,  dan undulate .  Sedangkan bentuk  tepi  koloni yeast meliputi smooth , entire , undulating, lobed , erose , atau membentuk filamen memanjang [3]. Pengamatan  mikroskopis  dilakukan  saat  isolat yeast telah berumur  48  jam  lalu  digunakan  pewarna lactofenol  tryphan blue dan diamati menggunakan mikroskop Olympus Binokular CX22  perbesaran  400x.  Metode  pewarnaan  ini  merupakan metode  khusus  untuk  pewarnaan  mikroorganisme  jenis  fungi [17].  Hasilnya  ialah  isolat Kloeckera sp.  yang  teramati memiliki  bentuk  lonjong  menggelondong,  seragam  dan  single cell  dan  beberapa  sel  ditemukan  berpasangan.  Sedangkan isolat Debaryomyces sp. memiliki ciri bentuk membulat, single cell. (Gambar 1).

## B. Hasil Uji Potensi Fermentasi Glukosa
Berdasarkan Gambar 2 diatas, hasilnya seperti terlihat pada kedua tabung isolat, baik Kloeckera sp. dan Debaryomyces sp. muncul gelembung gas dan terjadi perubahan warna dari yang sebelumnya berwarna hijau menjadi kuning bening.
Perubahan warna medium mejadi kuning disebabkan karena terdapatnya indikator bromthymol blue (BTB) dalam medium. Penambahan  indikator  BTB  ke  dalam  medium  yang mengalami  fermentasi  menyebabkan  perubahan  karbohidrat menjadi  asam  dalam  keadaan  aerob,  yang  membuat  pH menurun  dan  indikator  BTB  berubah  warna  menjadi  kuning. Pada  media  glukosa  juga  terbentuk  gelembung  pada  tabung durham yang diletakkan terbalik didalam tabung media artinya hasil  fermentasi  berbentuk  gas.  Indikator  BTB  dalam  larutan asam  berwarna  kuning  dan  dalam  larutan  basa  berwarna  biru [18].

## C. Kurva pertumbuhan Kloeckera sp. dan Debaryomyces sp.
Berdasarkan kedua grafik diatas, dapat diamati bahwa pada kedua isolat yeast sedang berada pada fase log (eksponensial). Hal  ini  terlihat  dari  grafik  yang  dalam posisi garis naik mulai jam 0 hingga jam ke 144 (pada Kloeckera sp.) dan pada jam 0 hingga jam 72 (pada Debaryomyces sp.). Tabel 1.
Hasil presentase kadar etanol dan gula reduksi pada glukosa 10%
Isolat Jam Kadar etanol Gula reduksi awal Gula reduksi akhir Gula terpakai Kloeckera sp. 24 0.8 4.148 3.928 0.22 48 0.7 4.148 3.257 0.891 72 0.7 4.148 3.041 1.107 96 0.7 4.148 2.031 2.117 Debaryomyces sp. 24 0 4.148 4.060 0.088 48 0 4.148 3.900 0.248 72 0 4.148 3.656 0.492 96 0 4.148 2.684 1.464
Tabel 2.
Hasil presentase kadar etanol dan gula reduksi pada glukosa 15%
Isolat Jam Kadar etanol Gula reduksi awal Gula reduksi akhir Gula terpakai Kloeckera sp. 24 0 4.979 1.186 3.793 48 0.7 4.979 0.551 4.428 72 0.7 4.979 0.297 4.682 96 0.7 4.979 0.813 4.166 Debaryomyces sp. 24 22.95 4.979 0.647 4.332 48 22.95 4.979 0.463 4.516 72 22.95 4.979 0.248 4.731 96 22.95 4.979 0.041 4.938 Tabel 3. Hasil presentase kadar etanol dan gula reduksi pada glukosa 20% Isolat Jam Kadar etanol Gula reduksi awal Gula reduksi akhir Gula terpakai Kloeckera sp. 24 0 5.907 4.083 1.824 48 20.85 5.907 2.615 3.292 72 30.75 5.907 1.255 4.652 96 30.75 5.907 1.414 4.493 Debaryomyces sp. 24 0 5.907 2.608 3.299 48 20.1 5.907 0.722 5.185 72 20.1 5.907 0.383 5.624 96 20.2 5.907 0.807 5.100 Kloeckera sp. Debaryomyces sp.
Perbesaran 400 Perbesaran 400
Gambar 1. Hasil pengamatan makroskopis dan mikroskopis
Kloeckera sp. Debaryomyces sp.
Gambar 2. Perubahan warna sebagai hasil fermentasi

## Gambar 3. Kurva Pertumbuhan
Pada  grafik  kurva  pertumuhan,  sel yeast tidak  tampak berada  pada  fase  lag  (adaptasi).  Menurut  [19],  tidak  adanya fase  lag  pada  grafik  kurva  pertumbuhan  dapat  disebabkan karena tidak adanya fase adaptasi yang dilakukan yeast , hal ini dikarenakan  komposisi medium yang sama saat subkultur dan mngukur  OD.  Kemungkinan  lain  adalah  bahwa  isolat yeast telah  melewati  fase  lag  dan  sedang  berada  pada  fase  log  saat pengukuran  OD  sehingga  tidak  muncul  fase  lag  pada  grafik pertumbuhan  kedua  isolat yeast .  Sedangkan  pada  fase  log didapatkan  kurva  yang  relatif  cepat  karena  waktu  fase  log dipengaruhi  oleh  komposisi  medium,  faktor  lingkungan  dan jumlah sel per unit volume [20].
D. Kadar Etanol dan Gula Reduksi Isolat Kloeckera sp dan Debaryomyces sp. pada Konsentrasi 10%
Berdasarkan  tabel  1  diatas  dapat  diketahui  bahwa  pada isolat Kloeckera sp.  dengan  konsentrasi  glukosa  10%  mampu menghasilkan  kadar  etanol  sebesar  0,8%  sedangkan  isolat Debaryomyces sp.  tidak  dapat  menghasilkan  etanol  sama sekali.  Menurut  [21], yeast mampu  membelah  dengan  cepat dan  konstan  mengikuti  kurva  pertumbuhan  logaritmik. Umumnya fase log terjadi saat sel yeast berumur 24 jam. Pada fase  log  jumlah  sel yeast yang  hidup  masih  lebih  banyak daripada  jumlah  sel  yang  mati  [22].  Kadar  gula  reduksi berbanding terbalik dengan kadar etanol, karena apabila yeast mampu  menghasilkan  etanol  maka  kadar  gula  dalam  medium pertumbuhannya semakin sedikit akibat dikonsumsi oleh isolat yeast . Gula dalam medium pertumbuan yeast , selain digunakan pertumbuhan  selnya  juga  digunakan  untuk  menghasilkan metabolit  primer  berupa  etanol  pada  proses  fermentasi. Sedangkan pada isolat Debaryomyces sp. tidak terdapat etanol yang  dihasilkan.  Hal  ini  dapat  dimungkinkan  karena konsentrasi  gula  pada  medium  yang  terlalu  sedikit,  sehingga isolat yeast Debaryomyces sp. hanya dapat memanfaatkan gula
untuk pertumbuhannya saja, tidak mencukupi untuk menghasilkan metabolit primer berupa etanol.
E. Kadar Etanol dan Gula Reduksi Isolat Kloeckera sp dan Debaryomyces sp. pada Konsentrasi 15%
Dapat  diamati  pada  tabel  2  bahwa  isolat  yang  mampu menghasilkan  etanol  paling  besar  dengan  konsentrasi  gula 15% ialah yeast Debaryomyces sp. yaitu sebesar 22,95%. Pada isolat yeast Kloeckera sp. tidak menghasilkan etanol pada jam ke-24,  namun  kemudian  mampu  menghasilkan  etanol  sebesar 0,7%  pada  jam  ke-48.  Idealnya,  semakin  banyak  atau  pekat kadar  gula  yang  terdapat  dalam  medium,  maka  semakin  baik pula yeast dalam  menghasilkan  etanol.  Namun,  isolat Kloeckera sp. tidak mampu menghasilkan etanol pada jam 24, hal  ini  dapat  dimungkinkan  karena  gula  yang  terdapat  dalam medium  pertumbuhan  hanya  dapat  dimanfaatkan yeast untuk memenuhi  kebutuhan  dalam  pertumbuhan  sel  dan  aktivitas intrasel,  namun  tidak  mampu  menghasilkan  metabolit  primer berupa  etanol.  Menurut  [23],  konsentrasi  glukosa  akan menurun  selama  fermentasi,  bertepatan  dengan  peningkatan produksi  sel  dan  etanol.  Hal  ini  disebabkan  sel-sel mengkonsumsi  glukosa  dalam  sistem  untuk  meningkatkan pertumbuhan  sel  dan  produksi  etanol.  Jumlah  konsumsi  gula oleh  juga  berhubungan  dengan  produksi  etanol.  Ketika yeast memproduksi  etanol,  maka  gula  yang  di  konsumsi  akan  lebih tinggi  dari  pada saat tidak memproduksi etanol. Namun, pada jam  ke-48, yeast Kloeckera sp.  mampu  menghasilkan  etanol sebesar  0,7%,  walaupun  hanya  sedikit  bila  dibandingkan dengan  etanol  yang  dihasilkan  oleh Debaryomyces sp..[24] menyatakan  bahwa  tidak  semua  gula  yang  terdapat  pada medium  pertumbuhan yeast dimanfaatkan  untuk  produksi etanol,  akan  tetapi  ada  sebagian  gula  yang  digunakan  untuk metabolisme  intraseluler,  seperti  sintesis  enzim,  DNA  dan lainnya.  Pada  isolat Debaryomyces sp.  mampu  menghasilkan kadar etanol sebesar 22,95% mulai jam ke-24. Selain itu, nilai gula reduksi pada jam ke-24 juga mengalami penurunan yaitu sebesar 4,332%.  Hal tersebut dapat menandakan bahwa isolat yeast Debaryomyces sp. mengkonsumsi gula tidak hanya untuk pertumbuhan  sel  dan  metabolisme  intraselnya,  namun  juga untuk  menghasilkan  metabolit  primer.  Alasan  lain  yang  dapat menyebabkan  hal  tersebut  adalah  kondisi  sel yeast Debaryomyces sp.  yang  diduga  sedang  berada  pada  fase eksponensial,  sehingga  dimungkinkan  kemampuan yeast tersebut  untuk  mengkonsumsi  nutrisi  pada  medium  berada pada tingkat maksimumnya.
F. Kadar Etanol dan Gula Reduksi Isolat Kloeckera sp dan Debaryomyces sp. pada Konsentrasi 20%
Berdasarkan  tabel  3  diatas,  isolat Kloeckera sp.  pada  jam ke-24  tidak  mampu  menghasilkan  etanol,  begitu  pula  dengan isolat Debaryomyces sp.. Pada jam berikutnya, yaitu jam ke-48 isolat Kloeckera sp.  mampu  menghasilkan  etanol  sebesar 20,85%. Dan pada isolat Debaryomyces sp. jam ke-48, mampu menghasilkan  kadar  etanol  sebesar  20,1%.  Namun,  isolat Kloeckera sp. mampu meningkatkan hasil etanolnya pada jam ke-72  hingga  30,75%.  Sedangkan  etanol yang dihasilkan oleh isolat Debaryomyces sp. tidak mengalami pertambahan. Salah satu  hal  yang  dapat  menjadi  penyebab  kedua  isolat  tersebut tidak mampu menghasilkan kadar etanol pada jam ke-24 ialah
kondisi  fisiologis  sel yeast yang  ada  dalam  medium pertumbuhan.  Kondisi  substrat  yang  kaya  akan  gula menyebabkan  kepekatan  dalam  medium  pertumbuhan, sehingga  hal  ini  dapat  menyebabkan  sel yeast mengalami kesulitan  dalam  mengubah  gula  menjadi  metabolit  primer. Kepekatan glukosa dengan konsentrasi 20% dapat menyebabkan  sel  mengalami  inhibisi  antara  substrat  dengan produk  [25].  Selain  itu  juga  dapat  dimungkinkan  karena kondisi  lingkungan  selama  proses  fermentasi berlangsung dan kualitas bahan medium pertumbuhan [26].
Terjadi  kenaikan  jumlah  kadar  etanol  pada  jam ke-72 pada isolat Kloeckera sp., dari 20,85% menjadi 30,75%. Sedangkan pada isolat Debaryomyces sp. produksi etanol pada jam ke-48 sebesar  20,1%  dan  tidak  mengalami  kenaikan.  Kenaikan produksi  etanol  dapat  dimungkinkan  karena  isolat Kloeckera sp.  sedang  mengalami  pertumbuhan  yang  sangat  cepat  yang menyebabkan  pertumbuhan  sel-sel  baru  menjadi  lebih  cepat sehingga mempengaruhi konsumsi gula dan produksi metabolit primernya. Selain itu juga dapat dikarenakan isolat Kloeckera sp.  cenderung  mengkonsumsi  gula  untuk  pertumbuhannya lebih  sedikit  bila  dibandingkan  dengan  isolat Debaryomyces sp.  sehingga  mampu  menghasilkan  etanol  dengan  jumlah besar,  walaupun  kadar  gula  pada  substrat  pertumbuhannya sama.  Berbeda  dengan Debaryomyces sp.  yang  membutuhkan lebih  banyak  isolat  gula  untuk  pertumbuhannya  dibanding untuk memproduksi metabolit primer. Menurut [27], pada fase pertumbuhan  beberapa yeast membutuhkan  energi  yang  lebih banyak daripada fase lainnya.

## V. KESIMPULAN
Isolat  yang  berpotensi  dalam  fermentasi  etanol  ialah  yeast Kloeckera  sp .  dan Debaryomyces  sp. .  Pada  isolat Kloeckera sp .  optimum  dalam  menghasilkan  etanol  pada  konsentrasi glukosa  20%  yakni  sebesar  30,75%  pada  jam  ke-72. Sedangkan  isolat Debaryomyces  sp. mampu  menghasilkan etanol  secara  optimum  pada  konsentrasi  glukosa  15%  yakni sebesar 22,95% pada jam ke 24-48.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  S.F.R  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Allah SWT  yang  telah  memberikan  rahmat  dan  karunia  sehingga naskah tugas akhir ini dapat terselesaikan dengan baik. Kepada dosen pembimbing Ibu Ir. Sri Nurhatika, M.P. dan Bapak Dr. Anton  Muhibuddin,  M.P.,  kepada  dosen  penguji  I  Ibu  Nur Hidayatul  Alami,  S.Si,  M.Si,  dan  dosen  penguji  II  Ibu Kristanti  Indah  Purwani,  S.Si,  M.Si,  serta  kepada  keluarga, teman-teman  dan  semua  pihak  yang  telah  banyak  membantu dalam penyelesaian naskah tugas akhir ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] S.  Singgih.  2007. Statistik  Deskriptif:  Konsep  dan  Aplikasi  dengan Microsoft Exel dan SPSS . Yogyakarta: ANDI.
[2] J.  F.  T.  Spencer, and D.  M.  Spencer.  1997. Yeast  In  Natural  and Artificial Habitats . Berlin: Springer Verlag [3] C.P.  Kurtzman,  and  J.W.  Fell.  1998. The  Yeast  A  Taxonomy  Study. New York: Elsevier.
[4] C.P.  Kurtzman,  and  J.  Piskur.  2006 .  Taxonomy  and  phylogenetic diversity among the yeasts . Berlin: Springer-Verlag
[5] C.P. Kurtzman, and J.W. Fell. 2006. Yeast Systematics and Phylogeny- Implication  of  Molecular  Identification  Methods  For  Studies  In Ecology. Springer-Verlag. Berlin [6] Jumiyati,  H.  S.  Bintari  dan  I.  Mubarok.  2012. Isolasi  dan  Identifikasi Khamir  Secara  Morfologi  di  Tanah  Kebun  Wisata  Pendidikan Universitas Negeri Semarang . Biosantifika. Semarang
[7] A.  Kanti.  2005. Keragaman  Khamir  Tanah  Asal  Taman  Nasional Kalimutu  Dan  Taman  Wisata  Alam  Ruteng  Nusa  Tenggara  Timur . Laporan Teknik bidang Zoologi. Pusat penelitian Biologi LIPI.
[8] A.  Muhibuddin,  dan  I.R.  Sastrahidayat.  2015.  Soil  Drive  Nutrients Creation  through  Alternate  Host  System  Propagation  of  VAM  to Support  Selective  Exploration  of  Microbial  Fermentation. Laporan Akhir  Penelitian  Kerjasama  Luar  Negeri  Publikasi  Internasional. Universitas Brawijaya. Malang
[9] K. Van Rij, M. Kobatake, N.J.W. Placido, M.T.L.C., and N. Van Uden. 1992 .  Isolation  of  Proteolytic  Psychrophilic  Yeasts  from  Raw  Sea Foods . Lett. Appl. Microbiology 14: 37- 42.
[10] V.  Lundblad,  and  K.  Struhl.  2008 . Current  Protocols  in  Molecular Biology . New York: John Wiley and Sons, Inc.
[11] V.  N.  Jisha,  R.B  Smitha,  S.  Pradeep,  Sreedevi,  Unni,  K.N.,  Sajith,  S., Priji P., Josh, M.S., Benjamin. 2013. Versatility of microbial proteases. Creative Common Attribution License. India
[12] B.  D.  A  Kodri,  dan  Y.  Rini.  2013.  Pemanfaatan  Enzim  Selulase  dari Trichoderma Reseei dan Aspergilus niger sebagai Katalisator Hidrolisis
Enzimatik Jerami Padi dengan Pretreatment
[13] Purwanto.  2004. Aktivitas  Fermentasi  Alkoholik  Cairan  Buah .  Jurnal
Universitas Widya Mandala Madiun. No. 1 th. XXXII/ISSN 0854-1981
[14] S. Maturindo. 2014. Hidrolisis Enzimatis Limbah Tongkol Jagung oleh Penicillium  sp.  H9  dengan  Variasi  pH  dan  Suhu .  Skripsi.  Prodi  S1
Biologi Universitas Airlangga.
[15] K.  Sridevi,  and  T.  Janakiram.  2011. Phsyco-chemical  examination  of market wastes-an aerobic composting study . J RJPBCS. 2 (2):121-129
[16] L. M. Manici, F. Caputo, and G. Baruzzi. 2005. Additonal experience to elucidate  the  microbial  component  of  soil  suppressiveness  towards strawberry black root rot complex. Annals of Applied Biology . Research Institute for Industrial Corps. Italy
[17] J.  P.  Harley,  and  L.  M  Prescott.  2002.  Laboratory  Exercises  in Microbiology, Fifth Edition. Mc-Graw Hill Companies. Newyork
[18] Winn  Jr,  Washington  C.,  et  al.  2006. Koneman’s  Color  Atlas  and Textbook  of  Diagnostic  Microbiology ,  6th  Ed,  USA,  Lippincott
Williams & Wilkins, p 251-259.
[19] M.  T.  Madigan  and  J.  M.  MartinkO.  2006. Brock:  Biology  of
Microorganisms, 11th ed . USA: Pearson Prentice Hall, pp: 705
[20] D.  Falahudin.  2014.  Bioassay  antioksidan  ekstrak  daging  nuah  salak bongkok  ( Sallaca  edulis reinw.)  dengan  khamir Candida sp.  Y.  390. Jurnal Oseanografi . Jakarta: LIPI.
[21] Natsir.  2003 . Mikrobiologi  Farmasi  Dasar .  Universitas  Hasanudin:
Makassar
[22] S.  Fardiaz.  1992. Mikrobiologi  Pangan  I .  Gramedia  Pustaka  Utama. Jakarta.
[23] Cheng,  Ngoh  Gek.,  Hasan,  Masitah.,  Kumoro,  Andri  Chahyo.,  Ling, Chew  Fui.,  Tham,  Margaret.,  2009. Production  of  Ethanol  by  Fed- Batch Fermentation . Pertanika J.SCi & Technol 17 (2):399-408
[24] J.C.F  Walker.  1993. Primary  Wood  Pcocessing  Principles  and
Practice. Chapman and Hall. London.
[25] Elevri,  Putra  dan  Surya  Rosa  Putra.  2006. Produksi  Etanol Menggunakan  Saccharomyces  cerevisiae  yang  Diamobilisasi  dengan Agar Batang . Kimia ITS. Akta Kimindo 1(2): 109-110.
[26] A.  M.  Jannah.  2010.  Proses  Fermentasi  Hidrolisat  Jerami  Padi  untuk Menghasilkan Bioetanol. Jurnal Teknik Kimia No. 1 Vol. 17
[27] E.  Purwitasari,  A.  Pangastuti,  dan  R.  Setyaningsih.  2004.  Pengaruh media tumbuh terhadap kadar protein Saccharomyces cerevisiae dalam pembuatan protein sel tunggal. Jurnal Bioteknologi . Vol 1 (2): 37-42.