Gambaran  Histopatologi  Organ  Hati  dan  Ginjal  Mencit Balb/c setelah  Pemberian  Krim  Ekstrak  Teh Hijau (Camellia sinensis L.)

## Nining Sugihartini, M. Alif Fajri
Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta Corresponding author: nining.sugihartini@pharm.uad.ac.id

## Abstract
Background:Development of green tea extract formulation with the addition of enhancers to increase the ability of epigallocatechin gallate to penetrate the skin layers has been done. Objective: The purpose of this study was to determine the effect of green tea extract cream that containing enhancers on the profile of kidney and liver histopathology. Methods: The study used 4 groups which each group was treated with different concentrations of extract (2,0%; 2,5%; 3,0%; 3,5%) and 1 control group. After 24 hours and 14 days of application of the cream, the mice were sacrificed. The liver and kidneys were weighed and made preparations  histopathology. Results: The  results  of the study showed  that  there  similar  (p>0,05)  of  the weight  ratio of  the  liver  and  kidneys  of  Balb/c  mice  after  24  hours  and  14  days.  As  well  the histopathological test indicated that there similar (p>0,05) of the liver and kidneys after 24 hours and 14 days  of  administration  of  green  tea  extract  cream. Conclusions: The levels  concentration  of  green  tea extract  in  cream  (2,0%;  2,5%;  3,0%;  3,5%)  that  contain  enhancers  do  not  affect  the  liver  and  kidney histopathological of Balb/c mice.
Keywords Camellia sinensis L, histopathology, liver, kidney, enhancer

## Abstrak
Latar belakang: Pengembangan formulasi ekstrak teh hijau telah dilakukan dengan penambahan enhancer untuk  meningkatkan  kemampuan  penetrasi  epigalokatekin  galat  menembus  lapisan  kulit.  Tujuan  dari penelitian ini adalah mengetahui pengaruh pemberian krim ekstrak teh hijau yang mengandung enhancer terhadap gambaran histopatologi ginjal dan hati mencit. Metode: Penelitian ini menggunakan 4 kelompok mencit galur Balb/C yang masing-masing diberikan konsentrasi ekstrak yang berbeda (2,0%; 2,5%; 3,0%; 3,5%) dan 1 kelompok kontrol. Setelah 24 jam dan 14 hari pemberian krim,  mencit dikorbankan. Organ hati dan ginjal diambil untuk dibuat preparat histopatologi. Hasil: Hasil uji menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan berat hati dan ginjal mencit setelah pemberian krim selama 24 jam dan 14 hari. Demikian juga dengan gambaran hasil uji histopatologi hati dan ginjal mencit setelah pemberian krim selama 24 jam dan 14  hari.  Kesimpulan:  Konsentrasi  ekstrak  teh  hijau  dalam  krim  (2,0%;  2,5%;  3,0%;  3,5%)  yang mengandung enhancer tidak mempengaruhi gambaran histopatologi hati dan ginjal mencit galur Balb/c. Kata Kunci: Camellia sinensis L, histopatologi, hati, ginjal, enhancer

## P ENDAHULUAN
eh hijau mengandungepigallocatechin gallate (EGCG)  sebesar  51,88%. Epigalokatekin  galat  sebagai kandungan  utama  dalam  ekstrak  teh  hijau tersebut berkhasiat  sebgai  antiinflamasi  (Butt  dan  Sultan, 2009; Nagle  dkk., 2006; Cavet  dkk,  2011; Dona  dkk,  2003). Penghantaran  EGCG dalam  ekstrak  teh  hijau  dalam bentuk  sediaan  topikal  krim  merupakan  saah  satu  pilihan untuk penghantaran sebagai antiinflamasi (Sailendra dkk., 2006  dan  Fang  dkk., 2007). Dalam  memformulasikan krim ekstrak teh hijau diperlukan zat tambahan yang dapat meningkatkan  penetrasi  ke  daerah  inflamasi yang  biasa disebut sebgai enhancer. Pada penelitian tahap sebelumnya  telah  diteliti  komposisi enhancer yang optimal  berupa campuran asam  oleat,  propilen  glikol  dan minyak  atsiri dalam meningkatkan  penetrasi  EGCG menembus lapisan kulit (Sugihartini dkk., 2011).
Mekanisme asam oleat dalam meningkatkan penetrasi absorpsi  perkutan  berdasarkan  kemampuannya  mengubah fluiditas  lipida  dalam  stratum  korneum  yang  dapat meningkatkan  permeabilitas  lapisan  stratum  korneum (Darijanto dkk., 2004 ; Jiang dan Wang, 2005). Selain itu propilenglikol  dilaporkan  dapat  melarutkan  keratin  pada stratum  korneum  (Trommer  dan  Neubert,  2006)  dan minyak  atsiri  temulawak  dengan  kandungan  terpen kamfora  (Sudarsono,  2004)  yang  berdasarkan  penelitian dapat berfungsi sebagai enhancer (Das dkk, 2006) dengan membentuk  jembatan  hidrogen  dengan  ceramid  sehingga dapat memecah ikatan lipid stratum korneum (Lahora dkk, 2011).Oleh  karena  itu  adanya enhancer dalam  formula krim ekstrak teh hijau memungkinkan  senyawa masuk  ke dalam pembuluh darah dan dapat terakumulasi pada organ penting  dalam  tubuh  seperti  organ  hati  dan  ginjal  yang berakibat  pada  keracunan  obat.  Seperti  sudah  diketahui bahwaobat yang masuk ke dalam tubuh akan dimetabolisme  di  hati  dan  setelah  didistribusikan  ke seluruh  tubuh  akan  dikeluarkan  melewati  ginjal.  Hal  ini juga  mengacu  pada  hasil  penelitian  Kapetanovic  dkk. (2009)  yang  menunjukkan  bahwa    pemberian  ekstrak  teh hijau selama 9 bulan pada  hewan  uji anjing dengan dosis 0,200,500,1000 mg/kg/hari menunjukkan adanya hubungan  antara  kematian  dan  gejala  kesakitan  pada hewan  uji  dengan  tingkat  dosis.  Oleh  karena  itu diperlukan penelitian lanjutan untuk mengetahui keamanan krim apabila nanti dipergunakan konsumen.

## B AHAN D AN M ETODE
Bahan
Bahan  yang digunakan antara lain simplisia teh hijau yang  diperoleh  dari  Samigaluh  Kulonprogo,  bahan pembuat  krim  dengan  derajat  farmasetis  (asam  stearat, setil  alkohol,  stearil  alkohol,  trietanolamin,  gliserin,  asam sitrat,  metil  paraben,  asam  oleat,  propilen  glikol,  minyak atsiri  temulawak,  tween  80,  span  80,  vitamin  C) larutan NaCl fisiologis, larutan formalin 10%.
Alat  yang  digunakan antara  lain timbangan,  panci infusa, waterbath (memmerth),  corong  pisah, rotari evaporator (Buchi) dan peralatan bedah.

## Metode Penelitian Pembuatan Ekstrak Teh Hijau
Ekstrak teh hijau diperoleh dengan metode infundasi. Selanjutnya  infusa  yang  telah  diuapkan  difraksinasi dengan etil asetat sebanyak 3 kali dan dikentalkan dengan menggunakan rotari evaporator. Setelah kental kemudian diuapkan  di  atas waterbath sampai  etil  asetatnya  habis sehingga  diperoleh  serbuk  kering  ekstrak  teh  hijau (Sugihartini, 2013).

## Pembuatan Sediaan Krim Ekstrak Teh Hijau
Metode  yang  digunakan  dalam  pembuatan  krim ekstrak  teh  hijau  yaitu  metode  peleburan  dengan komposisi  disajikan  pada  tabel  I.  Cara  pembuatannya yaitu  sebagai  berikut  bahan  yang  bersifat  larut  dalam minyak  yaitu  asam  stearat,  setil  alkohol,  stearil  alkohol, asam  sitrat,  asam  oleat  dan  Span  80  dilelehkan  pada waterbath dengan suhu 75C. Sedangkan untuk bahan yang larut dalam air yaitu trietanolamin, gliserin, metil paraben, propilen glikol, Tween 80 dan Vitamin C juga dileburkan pada  suhu  yang  sama.  Setelah  itu  pencampuran  bahan- bahan  yang  telah  dileburkan  dilakukan  pada  mortir  yang telah  dihangatkan  lalu  kedua  campuran  diaduk  sampai homogen dan terakhir tambahkan minyak atsiri temulawak dan ekstrak teh hijau (Sugihartini, 2013).

## Tabel 1. Formulasi Krim dengan Variasi Konsentrasi
Ekstrak Teh Hijau
Nama bahan Formulasi dalam berbagai tingkat kadar F I F II F III F IV Ekstrak teh hijau 0,06 0,075 0,09 0,105 Asam stearat 5,14 5,14 5,14 5,14 Setil alkohol 2,75 2,75 2,75 2,75 Stearil alkohol 5,14 5,14 5,14 5,14 Trietanolamin 1,28 1,28 1,28 1,28 Gliserin 7,72 7,72 7,72 7,72
Asam sitrat 0,64 0,64 0,64 0,64 Metil paraben 0,25 0,25 0,25 0,25 Asam oleat 6,04 6,04 6,04 6,04 Propilen glikol 7,17 7,17 7,17 7,17 Minyak atsiri temulawak 6,79 6,79 6,79 6,79 Tween 80 10 10 10 10 Span 80 1 1 1 1 Vitamin C 1 1 1 1 Air ad 100 ad 100 ad 100 ad 100 Uji Efek Pemberian Krim Ekstrak Teh Hijau Evaluasi formula krim dilakukan dengan menggunakan mencit Balb/c. Sebelum mendapat perlakuan,  50  ekor  mencit  mengalami  masa adaptasi dengan dikandangkan individual dan diberi pakan standar selama seminggu  secara ad  libitum. Mencit  tersebut  lalu dibagi  menjadi  5  kelompok yang  ditentukan  secara  acak. Setiap  kelompok  terdapat  10  ekor  mencit  dimana lima mencit untuk pengamatan 24 jam dan 5 ekor mencit untuk pengamatan  14  hari  guna  melihat  efek  toksik  yang timbulnya  tertunda.  Kelima  kelompok  tersebut meliputi kelompok  kontrol  (K) (tidak  diolesi  krim),  kelompok perlakuan  1  (P1) (diolesi  krim  kadar  2,0%),  kelompok perlakuan  2  (P2) (diolesi  krim  kadar  2,5%),  kelompok perlakuan  3  (P3) (diolesi  krim  kadar  3,0%),  kelompok perlakuan  4  (P4) (diolesi  krim  kadar  3,5%).  Pada kelompok  mencit perlakuan sehari  sebelumnya dicukur pada  punggung.  Pada  saat  perlakuan krim  dioleskan sebanyak 100 mg per mencit dengan luas 1 cm 2 dari total luas  permukaan.  Pengamatan  dilakukan setelah 24  jam dan 14 hari.

## Pemeriksaaan Hewan Uji
Kelompok mencit yang mendapatkan perlakuan krim, setelah 24  jam dan  14  hari dibunuh  (dekapitasi)  dengan metode cervical  dislocation.  Setelah  itu  dilakukan pembedahan  untuk  pengambilan  hati  dan  ginjal.  Organ hati  dan  ginjal  tersebut dicuci dengan  NaCl  0,9% danditimbang sebagai dasar perhitungan rasio berat organ yang  dihitung  dengan  rumus:  (berat  organ  (gram)/berat badan  hewan  uji  saat  dikorbankan  (gram)x100%. Setelah itu organ  hati  dan  ginjal dimasukkan dalam  wadah  yang berisi larutan pengawet larutan formalin 10% untuk dibuat preparat histopatologinya.

## Pembacaan Preparat Histopatologik
Preparat  hati  dan  ginjal  dibaca  dalam  5  lapangan pandang  yaitu  pada  keempat  sudut  dan  bagian  tengah preparat  dengan  perbesaran  100x  dan  400x  dengan batasan  jumlah  sel  20  sel  tiap  lapang  pandang.  Sasaran yang  dibaca  untuk  organ  hati  adalah  perubahan  struktur sel  normal  atau  inti  sel  karena  inti  sel  merupakan  bagian terpenting dari organ hati. Sedangkan sasaran yang dibaca untuk  organ  ginjal  adalah  perubahan  struktur  histologis tubulus kontortus proksimal ginjal mencit karena sel epitel tubulus  proksimal  peka  terhadap  anoksia  dan  mudah hancur  karena  keracunan  akibat  kontak dengan  bahan- bahan yang diekskresikan melalui ginjal.

## H ASIL D AN P EMBAHASAN

## Perhitungan Rasio Berat Organ
Pengamatan terhadap organ hati dan ginjal dilakukan setelah  24  jam  dan  14  hari  pemberian  krim  ekstrak  teh hijau.  Tujuan  pengamatan  setelah  24  jam  adalah  untuk melihat efek segera dan pengamatan setelah 14 hari adalah melihat efek tertunda. Hasil rasio berat organ hewan uji 24 jam setelah pemberian sediaan uji dapat dilihat pada Tabel 2 dan setelah 14 hari pada Tabel 3.
Tabel 2. Rasio berat organ mencit setelah 24 jam pemberian krim ekstrak teh hijau
No Organ Kontrol positif Kadar 2,0% Kadar 2,5% Kadar 3,0% Kadar 3,5% 1 Hati (%) 4,09±0,37 4,23±0,42 4,26±0,55 4,43±0,64 4,26±1,08 2 Ginjal (%) 1,34±0,06 1,34±0,15 1,37±0,08 1,38±0,16 1,39±0,09
Tabel  3. Rasio  berat  organ  mencit  setelah  14  hari pemberian krim ekstrak teh hijau (Camellia sinensis L)
No Organ Kontrol positif Kadar 2,0% Kadar 2,5% Kadar 3,0% Kadar 3,5% 1 Hati (%) 4,83±1,37 4,62±0,39 4,96±0,44 4,43±0,64 4,79±0,12 2 Ginjal (%) 1,46±0,09 1,41±0,10 1,49±0,28 1,42±0,45 1,40±0,08
Hasil  uji  statistik  pada  kedua  data  menunjukkan bahwa tidak  ada  perubahan  rasio  berat  organ  mencit setelah  pemberian  sediaan  krim  ekstrak  teh  hijau  pada berbagai  kelompok  perlakuan.Ini  dapat  diartikan  dengan adanya komposisi enhancer pada sediaan krim ekstrak teh hijau setelah 24 jam dan 14 hari pemberian  krim tersebut tidak mempengaruhi berat organ hati dan ginjal. Enhancer
membantu penetrasi  EGCG  dalam penghantarannya  ke daerah  inflamasi  sampai  pada  lapisan viable dermis sehingga  ekstrak  yang  masuk  kedalam  pembuluh  darah tidak terlalu banyak. Oleh karena itu tidak mempengaruhi berat organ hati dan ginjal mencit Balb/c.

## Gambaran Histopatologik
Hasil pemeriksaan histopatologi pada organ hati dan ginjal  setelah  24  jam  disajikan  pada  Tabel 4. Hasil pemeriksaan histopastologi pada  organ  hati  dan  ginjal setelah dilakukan 24 jam pemberian krim ekstrak teh hijau menunjukkan  bahwa pada  semua  kelompok  tidak mengalami  perubahan. Ini  dapat  diartikan  dengan  adanya komposisi enhancer pada  sediaan  krim  ekstrak  teh  hijau setelah 24 jam pemberian krim tersebut tidak mempengaruhi  gambaran  histopatologi  organ  hati  dan ginjal.
Kemungkinan hal tersebut
disebabkanenhancermeningkatkan penetrasi senyawa EGCG hanya  mencapai viable dermis,  sehingga  ekstrak yang masuk kedalam pembuluh darah tidak terlalu banyak dan  tidak  mempengaruhi  gambaran  histopatologi  organ hati dan ginjal mencit Balb/c.
Hasil  pemeriksaan  histopatologi  organ  hati setelah pemberian  krim  selama  14  hari  disajikan  pada  tabel  5. Dari Tabel5 dapat dilihat bahwa setelah dilakukan 14 hari pemberian  krim  ekstrak  teh  hijau  organ  hati  yang mengalami  nekrosis  terjadi  pada  kelompok  II  sebanyak  1 ekor  mencit  dan  pada  kelompok IV  terdapat  2  ekor mencit. Infiltrasi sel terjadi pada kelompok III sebanyak 2 ekor  mencitserta  pada  kelompok  V  sebanyak  2  ekor mencit.  Hal  ini  juga  terjadi  pada  kelompok  I  (kontrol) dimana terdapat 1 ekor  mencit  mengalami  nekrosis dan 1 ekor mencit mengalami  infiltrasi  sel.  Gambaran histopatologi  organ  hati  yang  normal  dan  mengalami nekrosis disajikan pada gambar 1 dan 2.
Tabel 4. Hasil pemeriksaan histopatologik organ hati dan ginjal  mencit  setelah  24  jamsebelumnya  diberikan  krim ekstrak teh hijau (Camellia sinensis L).
Kelompok No Hasil Pemeriksaan Histopatologi Hati Ginjal Kelompok I Kontrol 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - - Kelompok II Krim kadar 2,0% 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - - Kelompok III Krim kadar 2,5% 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - - Kelompok IV Krim kadar 3,0% 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - - Kelompok V Krim kadar 3,5% 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - -
Keterangan: (-) menunjukkan tidak adanya perubahan histopatologi pada organ
Tabel 5. Hasil pemeriksaan histopatologi organ mencit 14 hari setelah pemberian krim ekstrak teh hijau (Camellia sinensis L)
Kelompok No Hasil Pemeriksaan Histopatologi Hati Ginjal Kelompok I Kontrol 1 - - 2 N - 3 - - 4 R - 5 - - Kelompok II Krim kadar 2,0% 1 - - 2 N - 3 - - 4 - - 5 - - Kelompok III Krim kadar 2,5% 1 R - 2 R - 3 - - 4 - - 5 - - Kelompok IV Krim kadar 3,0% 1 - - 2 N - 3 - - 4 - - 5 N - Kelompok V Krim kadar 3,5% 1 - - 2 R - 3 R - 4 - - 5 - -
Keterangan: N: Nekrosis R: Infiltrasi sel radang (-)  menunjukkan  tidak  adanya  perubahan  histopatologi pada organ
Gambar 1. Gambaran  histopatologik  organ  hati  normal setelah 14 hari pemberian krim ekstrak teh hijau (Camellia sinensis L)  pada  kelompok  kontrol  dengan  pengecatan hematoxylin-eosin.
Keterangan: VS = Vena sentralis, SN = Inti sel normal,S = Sinusoid
Nekrosis  merupakan  kematian  jaringan,  ditandai dengan  adanya  inti  yang  telah  mati  merupakan  tingkat degenerasi  (Robbins et  al.,  2007).  Terjadinya nekrosis yang  disebabkan  oleh  zat  toksik  dari  spesies  bakteri  ini secara  mikroskopik  tampak  inti-inti  piknotik.  Sesudah beberapa hari sisa-sisa inti menghilang, sitoplasma tampak bebutir,  warna  merah  tua  seperti  terlihat  pada  Gambar  2. Sampai  beberapa  minggu  rangka  sel  masih  dapat  dilihat (Pringgoutomo, 2002). Terdapat pula sel yang  mengalami infiltrasi  seperti  disajikan  pada  gambar  3.  Infiltrasi  yaitu penyusupan  sel  atau  masuknya  sel-sel  radang  dari  luar jaringan  (Darmawan  dan  Himawan,  1994).  Secara mikroskopik,  jaringan  infiltrasi  sel  seluruhnya  ditandai dengan  adanya  sel  radang  berwarna  keunguan.  Adanya perubahan  histopatologi  organ  hati  setelah  pemberian EGCG juga ditunjukkan oleh penelitian Kapetanovic dkk. (2009)  yang  menunjukkan  bahwa  pada  pemberian  kapsul yang  mengandung  katekin  pada  hewan  uji  anjing  yang dipuasakan  menunjukkan  adanya  perubahan  pada  organ hati  yaitu  mengalami hematopoiesis dan pigmented macrophages setelah pemberian dosis 176 mg/kg/hari dan 200  mg/kg/hari.  Pada  penelitian  tersebut  bentuk sediaannya  adalah  kapsul  sehingga  zat  aktif  langsung diserap  dan  mengalami  metabolisme  di  hati.  Sedangkan pada penelitian ini bentuk sediaannya adalah krim di mana
EGCG  masuk  ke  lapisan  kulit  dengan  bantuan enhancer dan  apabila  mencapai  pembuluh  darah pada  jaringan dermis dapat mengalami absoprsi dan kemudian diedarkan ke  seluruh  tubuh.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  adanya absorpsi  EGCG  kemungkinan  menyebabkan  efek  buruk pada  organ  hati.  Penelitian  lebih  lanjut  perlu  dilakukan untuk memperkuat hasil penelitian ini.
Gambar  2. Gambaran  histopatologik  organ  hati  yang mengalami  nekrosis  (N)  setelah  14  hari  pemberian  krim ekstrak  teh  hijau  (Camellia  sinensis L)  pada  kelompok kontrol dengan pengecatan hematoxylin-eosin.
Keterangan: N = Nekrosis, VS = Vena sentralis, SN = Inti sel normal, S = Sinusoid.
Gambar  3. Gambaran  histopatologik  organ  hati  yang mengalami  infiltrasi  sel  radang  (R)  setelah  14  hari pemberian  krim  ekstrak  teh  hijau  (Camellia  sinensis L) pada  kelompok  kontrol  dengan  pengecatan hematoxylin- eosin.
Keterangan: R = infiltrasi sel radang.
Di  sisi  lain  pada  organ  ginjal  di  semua  kelompok tidak  terdapat  perubahan  atau  kerusakan  sel  atau organ.Organ  ginjal  dikatakan  normal  apabila  terdapat
glomelurus,  kapsula  bowman  dan  inti  sel  yang  normal serta  tidak  mengalami  nekrosis  dan  infiltasi  sel seperti terlihat  pada  Gambar 4. Sehingga  dapat  diartikan  bahwa adanya komposisi enhancer pada sediaan krim ekstrak teh hijau  setelah  14  hari  pemberian  krim  tersebut  tidak mempengaruhi gambaran histopatologik organ ginjal. Hal ini  menunjukkan  bahwa enhancer dalam  formulasi  krim meningkatkan  penetrasi  senyawa  aktif  tetapi  tidak mempengaruhi  gambaran  histopatologik  organ  ginjal mencit Balb/c setelah pemberian 24 jam  maupun 14  hari. Penelitian  lainnya  juga  menunjukkan  bahwa  pemberian EGCG ternyata tidak memberikan efek buruk pada organ. Penelitian  Isbrucker  dkk (2006)  menunjukkan  bahwa pemberian  EGCG  dosis  500  mg/kg/hari  pada  hewan  uji tikus yang diberikan selama 13 minggu tidak memberikan efek  samping  pada  hewan  uji.  Hal  ini  sesuai  juga  dengan penelitian  Takami  dkk. (2008)  yang  menunjukkan  bahwa pemberian  katekin  konsentrasi  1,25%  yang  setara  dengan 764  mg/kgBB/hari  untuk  laki-laki  dan  820  mg/kgBB/hari untuk  wanita  tidak  memberikan  efek  buruk  pada  tubuh berdasarkan hasil uji hematologi dan histopatologi.
Gambar  4. Gambaran histopatologik organ ginjal normal dengan pengecatan hematoxylin-eosin.
Keterangan: GR = Glomerulus, CB = Capsula bowman, N = Inti sel normal.

## K ESIMPULAN
Formula  krim  ekstrak  teh  hijau kadar 2,0%;  2,5%; 3,0%; 3,5% tidak mempengaruhi gambaran histopatologik ginjal mencit Balb/c setelah pemberian selama 24 jam dan 14  hari  akan  tetapi  memberikan  efek  pada  organ  hati setelah pemberian selama 14 hari.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terimaksih kepada DIKTI yang telah  memberikan  dana  penelitian  ini  dengan  mekanisme
Hibah Bersaing tahun 2013.
D AFTAR P USTAKA
Butt  MS  and  Sultan  MT.  2009. Green  Tea  :  Nature’s defense  against  malignancies,  critical  reviews  in food science and nutrition.49;463-473.
Cavet  ME,  Harrington  KL.  Vollmer  TR.  Ward  KW. Zhang  JZ.  2011  Anti-inflammatory  and  anti- oxidative  effects  of  the  green  tea  polyphenol epigallocatechin gallate in human corneal epithelial cells.Molecular Vision.17; 533.
Darijanto  ST.  Maria  I.  Heni  S.  2004.  Uji  pengaruh  asam oleat terhadap stabilitas dan difusi prednisolon dari sediaan gel secara in vitro serta uji efek antiradang secara in  vivo.Acta  Pharmaceutica  Indonesia. XXIX; 2 ; 59-71.
Darmawan  S.    dan  Himawan  S.  1994.Patologi.  Fakultas Kedokteran  Bagian  Patologi  Anatomi  Universitas Indonesia. Jakarta
Das  M.  Bhattacharya  A.and  Ghosal  SJ.  2006.  Effect  of different  terpene  containing  essential  oils  on percutaneous absorption of trazodone hydrochloride trough mouse epidermis.Drug
Delivery.13;425 – 431.
Fang  JY.  Tsai  TH.  Lin  YY.  Wong  WW.  Wang  MN. Huang  JF.  2007.  Transdermal  delivery  of  tea cathecins  and  theophylline  enhanced  by  terpenes:a mechanistic  study. Biological  &  Pharmaceutical Bulletin . 30;2;343-349.
Isbrucker  RA.  Edwards  JA.  Wolz  E.  Davidovich A.  and Bausch.  J.  2006  Safety  studies  on  epigallocatechin gallate  (EGCG)  preparations.  Part  2:  dermal,  acute and short-term toxicities studies.Food and

## Chemical Toxicology. 44;636-650
Jiang  J.and  Wang  R.  2005.  How  different  molarities  of oleic  acid  as  enhancer  exert  its  effect  on  optical clearing  on  skin  tissue in  vitro.Journal  of  X-Ray Science and Technology.13;3;149 – 159.
Kapetanovic IM. Crowell J.A. Krishnaraj R. Zakharov A.
Lindeblad M. and Lyubinov A. 2009. Exposure and toxicity of green tea polyphenols in fasted and non- fasted dogs.Toxicology. 260;28-36
Lahora  D.  Chaudary V.  Shah  SK.  Swami  G.  Chaudary  G. and  Saraf  SA.  2011.  Terpenes:  Natural  skin penetration  enhancers  in  transdermal  drug  delivery system.International  Journal  of  Pharma  Research and Development. 2;12; 39-45.
NagleDG. Ferreira D. and Zhoua YD. 2006.
Epigallocatechin-3-gallate  (EGCG):  Chemical  and biomedical perspectives.
Phytochemistry.
67;17;1849-1855.
Pringgoutomo  SS.  Himawan  A.  Tjarta.  2002. Buku  ajar patologi I. Sagung Seto. Jakarta.
Robbins  SL.  Cotran  RS.  dan  Kumar  V.  2007. Buku  ajar Patolog.Ed.7 Vol.1.Buku Kedokteran EGC. Jakarta Sailendra  N.  Nichenametla.  Taruscio  TG.  Barney  DL.
Exon  JH.  2006.  A  review  of  the  Effects  and
mechanisms  of  polyphenolics  in  cancer. Crittical Review in Food Science and  Nutrition. 46;161-183. Sudarsono. 2004. Kamfora, Salah satu komponen  minyak atsiri  rimpang  temulawak  (Curcuma  xanthorrhiza Roxb.)  dari  kebun  tanaman  obat  PT.  Nyonya Meneer,  Karangjati.Majalah  Farmasi  Indonesia. 15;4;194-200
Sugihartini  N.  Fudholi  A.  Pramono  S  dan  Sismindari. 2011.  Optimation  composition  of  oleic  acid, propilenglycol  and  volatile  oil  of Curcuma xanthorriza as enhancer of transport of epigalocatathecin  gallat  in  green  tea  extract  with simplex lattice design methode. Jurnal Bahan Alam Indonesia.7;7;393-395.
Sugihartini  N.  2013.  Optimasi  komposisi  enhancer  dan emulgator  pada  formulasi  krim  fraksi  etil  asetat ekstrak  teh  hijau  (Camelia  sinensis,  L)  sebagai sediaan  topikal  antiinflamasi. Disertasi. Program Pascasarjana Farmasi. Universitas Gadjah Mada.
Takami  S.  Imai T.  Hasumura  M.  Cho YM.  Onose  J. And Hirose M. 2008. Evaluation of toxicity of green tea catechins  with  90-day  dietary administration  to F344 rats.Food and Chemical Toxicology. 46;2224- 2229
Trommer H.and Neubert R. 2006. Overcoming the stratum corneum:  the  modulation  of  skin  penetration  a review.Skin Pharmacology
and Physiology.19;2;106 – 121.