## Ekspresi BMP2 dan TRAF6 pada Jaringan Periodontal setelah Pemberian Ekstrak Kopi Robusta selama Pergerakan Gigi Ortodonti
( Expression of BMP2 and TRAF6 in Periodontal Tissue after Robusta Coffee Extract Administration during

## Orthodontic Tooth Movement )
Herniyati 1 , Happy Harmono 2 , Leliana Sandra Devi Ade Putri 3 , Hestieyonini Hadnyawati 4
1 Bagian Ortodonsia, Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember
2 Bagian Biomedik, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember
3 Bagian Ortodonsia Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember.
4 Bagian Ilmu Kedokteran Gigi Masyarakat, Universitas Jember e-mail: herny_is@yahoo.com

## Abstract
Orthodontic  tooth  movement  occurs  due  to  mechanical  stimulation  followed  by  alveolar  bone  and periodontal ligament remodeling.  Bone remodeling is the process of bone resorption in areas of tension and bone formation in areas of tension. Various techniques and drugs are used to speed up orthodontic treatment.This study aims to analyze the expression of BMP2 and TRAP6 on orthodontic tooth movement after administration of Robusta coffee extract. 24 wistar rats were divided into 4 groups : C1 (2 weeks) and C2 (3 weeks) groups: rats were given orthodontic mechanical force (OMF) and T1 (2 weeks) and T2 (3 weeks) groups  rats were given OMF and Robusta coffee extract. OMF in rats was performed by moving the maxillary right permanent molars mesially with a Niti closed coil spring. Observations were made on the 15th and 22nd day by immunohistochemical examination to determine the expression of BMP2 and TRAP6. Administration of Robusta coffee extract for 2 weeks and 3 weeks increased BMP2 and TRAP6 expression (p <0.05). Administration of Robusta coffee extract increased the expression of BMP2 and TRAP6 in the alveolar bone during orthodontic tooth movement.

## Keywords : BMP2; TRAP6; omf; Robusta Coffee

## Abstrak
Pergerakan  gigi  ortodonti  terjadi  karena  adanya  rangsangan  mekanik  yang  diikuti  dengan  remodeling tulang  alveolar  dan  ligamen  periodontal  Remodeling  tulang  adalah  proses  resorpsi  tulang  di  daerah tekanan dan pembentukan tulang pada daerah tarikan. Berbagai macam teknik dan obat dilakukan untuk mempercepat perawatan ortodonti. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis ekspresi BMP2 dan TRAP6 pada pergerakan gigi ortodonti setelah pemberian ekstrak kopi Robusta. 24 ekor tikus wistar dibagi menjadi 4 kelompok, yaitu kelompok K1 (2 minggu) dan  K2 (3 minggu).: tikus diberikan gaya mekanis ortodonti (GMO) dan kelompok P1(2 minggu) dan P2 (3 minggu): tikus diberikan GMO dan ekstrak kopi Robusta. GMO pada tikus dilakukan dengan menggerakkan gigi molar-1 permanen kanan RA ke mesial dengan Niti closed coil spring. Pengamatan dilakukan pada hari ke 15 dan ke 22 dengan pemeriksaan  imunohistokimia untuk menentukan ekspresi BMP2 dan TRAP6 .  Pemberian ekstrak kopi Robusta selama 2  minggu dan 3 minggu meningkatkan ekspresi BMP2 dan TRAP6 (p <0,05). Ekspresi BMP2 dan TRAP6  pada hari ke 22 lebih besar dibandingkan hari ke 15 (p <0,05) Pemberian ekstrak kopi Robusta efektif meningkatkan ekspresi BMP2 dan TRAP6 pada tulang alveolar  selama pergerakan  gigi ortodonti.
Kata kunci : BMP2, TRAP6 , GMO, Kopi Robusta

## Pendahuluan
Pergerakan  gigi  ortodonti  terjadi  karena adanya rangsangan mekanik yang diikuti dengan remodeling  tulang  alveolar  dan  ligamen periodontal  (PDL).  Remodeling  tulang  adalah proses  resorpsi  tulang  di  daerah  tekanan  dan pembentukan  tulang  pada  daerah  tarikan. Resorpsi  tulang  dilakukan  oleh  osteoklas  di  sisi tekanan  dan  pembentukan  tulang  baru  oleh osteoblas  di  sisi  tarikan.  Pada  pergerakan  gigi ortodonti  gaya  yang  diterapkan  pada  gigi  akan menyebabkan  perubahan  dalam  lingkungan mikro  sekitar  PDL  karena  perubahan  aliran darah,  yang  mengarah  ke  sekresi  mediator inflamasi  seperti  sitokin,  faktor  pertumbuhan, neurotransmiter,  colony-stimulating-faktor  ,  dan metabolit  asam  arakidonat.  Sebagai  hasil  dari sekresi ini, terjadi renovasi tulang [1].
Tumor-necrosis  factor (TNF) factor-related factor  6 (TRAF6)  adalah  satu-satunya  anggota keluarga  TRAF  yang  berpartisipasi  dalam transduksi  sinyal  dari  superfamili  reseptor  TNF (TNFR) dan interleukin-1 receptor (IL-1R) / Toll- like  receptor (TLR)  superfamily  penting  untuk kekebalan  adaptif,  kekebalan  bawaan  dan homeostasis  tulang  [2].  TRAF6  berhubungan dengan cytoplasmic  domain  of  RANK yang merupakan  molekul  adaptor  yang  berperan penting dalam pembentukan osteoklas multinuklear [3,4].
Bhone  Morphogenetic  Proteins (BMPs) termasuk  BMP2  merupakan  famili dari growth factors yang  unik. Growth  factors ini  berperan dalam  diferensiasi  osteoblas  yang  mengatur proses  pembentukan  dan  mineralisasi  tulang. BMPs dikenal menstimulasi pembentukan tulang baru.  BMP2  menstimulasi  diferensiasi  sel mesenkimal  menjadi  osteoblas  dan  kondrosit. BMP2 mengikat reseptornya Ser/Thr kinase yang memfosforilasi dan mengaktivasi molekul sinyaling intraseluler Smad1 dan Smad5, proses ini  mengakibatkan  ekspresi  faktor  transkripsi Cbfa  1  (Runx2),  yang  menghasilkan  ekspresi protein yang penting dalam pembentukan tulang [5].
Keberhasilan perawatan ortodonti dipengaruhi  oleh  sejumlah  faktor,  termasuk kesehatan  periodontal,  kebersihan  mulut,  dan kekuatan ortodonti.  Upaya untuk mempercepat pergerakan gigi ortodonti telah dilakukan, antara lain dengan penggunaan obat-obatan [6].
Kopi  merupakan  salah  satu  minuman populer yang dikonsumsi  kalangan masyarakat. Kopi  antara  lain  mengandung  zat  yang  disebut kafein (1,3,7 trimetilxantin) [7], asam klorogenat
dan  asam  kafeat,  serta  flavonoid  yang mempunyai  efek  sebagai  antioksidan  [8]. Kopi robusta  merupakan  kopi  yang  memiliki  aktivitas antioksidan  tinggi  di  banding  kopi  arabika  dan lainnya  [9].  Flavonoid  merangsang  aktivitas prolidase  yang  mana  mengkatalisasi  langkah terakhir  kolagen  dan  memainkan  peran  penting dalam  biosintesis  kolagen  melalui  pensinyalan yang  dimediasi  integrin  [10].  Hasil  penelitian terdahulu  menunjukkan  bahwa  ekstrak  kopi Robusta selama 2 minggu meningkatkan jumlah fibroblas dan kepadatan kolagen yang disebabkan  karena  kandungan  kopi  yang mempunyai efek antioksidan [11].
Penelitian  ini  dilakukan  untuk  menganalisis peningkatan  ekspresi  BMP2  dan  TRA6  pada jaringan  periodontal  selama  pergerakan  gigi ortodonti  setelah  pemberian  ekstrak  kopi Robusta. Diharapkan, jika penelitian  ini berhasil dapat  dimanfaatkan  sebagai  alternatif  terapi untuk  mencegah  terjadinya  relaps  ortodonti sehingga dapat memperpendek waktu perawatan  ortodonti,  selain  efek  samping minimal,  mudah  didapat  dan  harganya  relatif murah.

## Metode Penelitian
Penelitian  eksperimental  laboratories  ini dilakukan  dengan  menggunakan  24  ekor  tikus wistar jantan dengan rentang usia 3-4 bulan dan berat badan 250-300 gram. Tikus dalam keadaan sehat  dan  dipilih  yang  memiliki  susunan  gigi lengkap,  kondisi  rongga  mulut  dan  jaringan periodontal  yang  sehat.  Tikus  dibagi  secara random ke dalam 4 kelompok: kelompok kontrol (K1  dan  K2):  tikus  diberikan  gaya  mekanis ortodonti  dan  2ml  aquades  untuk  waktu pengamatan  selama  2  dan  3  minggu  dan kelompok perlakuan (P1 dan P2): diberikan gaya mekanis  ortodonti  dan  ekstrak  beku  kering (  freeze  dried  extract)  kopi  Robusta  sebesar 0,050 gram (setara dengan 1 cangkir kopi orang dewasa)  yang  dilarutkan  dalam  2ml  aquades, diberikan dua kali sehari yaitu pagi dan sore hari suntuk  waktu  pengamatan  selama  2  dan  3 minggu.
Gaya  mekanis  ortodonti  pada  tikus dilakukan  dengan  cara  tikus  di  anestesi menggunakan ketamin, Pada gigi molar-1 ( M-1) rahang  atas  (RA)  kanan  dan  pada  kedua  gigi insivus RA diberi kawat ligatur dengan diameter 0,20 mm. Kemudian  M-1 RA kanan digerakkan ke  mesial  menggunakan  Tension  Gauce  untuk menghasilkan  kekuatan3,5  oz  =  10  grF dengan Nickel  Titanium  Orthodontic  closed  coil  spring
panjang  6  mm[12].  Pengamatan  dilakukan dengan  cara  tikus  dikorbankan  pada  hari  ke  15 dan ke 22 , selanjutnya diambil gigi M1-1 dan M- 2  RA  kanan  beserta  jaringan  periodontalnya. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan imunihistokimia  untuk  menentukan  ekspresi BMP2 pada osteoblas daerah tarikan dan TRAP6 padaosteoklas daerah tekanan.
Data  ekspresi  BMP2,  dan  TRAF-6 dianalisis  dengan  menggunakan  independent  t test  dan  Mann  Whitney  test,  dengan  tingkat kepercayaan  95%  (α  =  0,05).  Penelitian  ini disetujui  oleh  komisi  etik  penelitian  Fakultas Kedokteran  Gigi  Universitas  Jember,  Nomor: 984/UN25.8/KEPK/DL/2020.

## Hasil
Hasil  Penghitungan  ekspresi  BMP2 pada osteoblas pada tulang alveolar
Hasil penelitian efek ekstrak kopi Robusta pada ekspresi BMP2 ditunjukkan pada Tabel 1. Hasil  pemeriksaan  imunohistokimia  ekspresi BMP2 ditunjukkan pada Gambar 1
Tabel 1. Rerata ekspresi BMP2 pada hari ke 15 dan 22 dan analisis statistiknya Kelompok N Ekspresi BMP2 (Rerata ± SD) P Hari ke- 15 Hari ke- 22 Kontrol 6  6,967 ± 0,314 8,1500 ± 0,164 0,000 * Perlakuan 6  9,917 ± 0,217 11,917 ± 0,271 0,000 * p 0,000 * 0,000 *
*p < 0.05 = signifikan
Pengujian berdasarkan independent t-test ekspresi  BMP2  antar  kelompok  penelitian  pada hari  ke  15  maupun  hari  ke  22  menunjukkan bahwa ekspresi BMP2 pada kelompok perlakuan lebih besar dibandingkan pada kelompok kontrol dan terdapat perbedaan yang signifikan (p>0,05),
Pengujian berdasarkan berdasarkan independent  t-test pada  kelompok  kontrol  dan pada  kelompok  perlakuan  menunjukkan  bahwa ekspresi  BMP2  pada  kelompok  K  maupun kelompok P pada hari ke 22 lebih besar daripada hari ke 15 secara signifikan (p<0,05), yang berarti terdapat  peningkatan  ekspresi  BMP2  pada  hari ke 22 secara bermakna.
Gambar  histologi  ekspresi  BMP2  pada kelomok  kontrol  dan  kelompok  perlakuan ditunjukkan pada gambar 1.
Gambar  1. Hasil  pemeriksaan  imunohistokimia, diamati  pada  pembesaran  400x. Ekspresi  BMP2  pada  tulang  alveolar pengamatan  hari  ke  15  dan  22 ditunjukkan dengan tanda panah. A. kelompok Kontrol hari ke 15;
B. kelompok Perlakuan hari ke 15; C. kelompok kontrol hari ke 22; D. kelompok Perlakuan hari ke 22.

## Hasil Penghitungan ekspresi TRAF6 pada osteoklas pada tulang alveolar
Hasil penelitian efek ekstrak kopi Robusta pada ekspresi TRAP6 ditunjukkan pada Tabel 2
Tabel 2. Rerata ekspresi TRAP6 pada hari ke 15 dan 22 dan analisis statistiknya
Kelompok n Ekspresi TRAF6 (Rerata ± SD) P Hari ke- 15 Hari ke- 22 Kontrol 6  1,4000 ± 0,155 2,033 ± 0,256 0,004 * Perlakuan  6  2,8000 ± 0,219 3,2500 ± 0,295 0,000 * p 0,002 * 0,000 *
*p < 0.05 = signifikan
Pengujian berdasarkan Uji Mann-Whitney ekspresiTRAF6  antar  kelompok  penelitian  pada hari ke 15 menunjukkan bahwa ekspresi TRAF6 pada kelompok perlakuan lebih besar dibandingkan  pada  kelompok  kontrol  dan terdapat perbedaan yang signifikan (p<0,05).
Pengujian berdasarkan independent t-test ekspresiTRAF6  antar  kelompok  penelitian  pada hari ke 22 menunjukkan bahwa ekspresi TRAF6n pada kelompok perlakuan lebih besar dibandingkan  pada  kelompok  kontrol  secara signifikan (p<0,05).
Pengujian  berdasarkan  berdasarkan  Uji Mann-Whitney  pada  kelompok  kontrol  dan berdasarkan  independent  t-test  pada  kelompok perlakuan menunjukkan bahwa ekspresi TRAF6 pada  kelompok K maupun kelompok P pada hari ke  22  lebih  besar  daripada  hari  ke  15  secara signifikan  (p<0,05),  yang  berarti  terdapat peningkatan  ekspresi  TRAF6  pada  hari  ke  22 secara bermakna.
Gambar  histologi  ekspresi  TRAP  6  pada kelompok  kontrol  dan  kelompok  perlakuan ditunjukkan pada gambar 2.
Gambar 2. Hasil pemeriksaan imunohistokimia, diamati  pada  pembesaran  400x Ekspresi  TRAP6  pada  tulang  alveolar pengamatan  hari  ke  15  dan  22, ditunjukkan dengan tanda panah:
E. kelompok Kontrol hari ke 15;
F. kelompok Perlakuan hari ke 15; G. kelompok Kontrol hari ke 22; H. kelompok Perlakuan hari ke 22.

## Pembahasan

## Ekspresi BMP2
BMP-2  seperti  bone  morphogenetic protein  lainnya,  memainkan  peranan  yang penting  dalam  tumbuh  kembang  tulang  dan tulang  rawan  (kartilago),  meliputi  hedgehog pathway, TGF beta signaling pathway dan pada interaksi  reseptor  sitokin.  BMP-2  merupakan BMP osteoinduktif, telah memperlihatkan potensinya  menginduksi  diferensiasi  osteoblas pada berbagai tipe sel. Disamping itu juga dapat meningkatkan  komponen  selular  dari  ekspresi gen  Id  (inhibitor  of  differentiation)  pada  sel-sel osteoblas  dan  menaikkan  ekspresi  fenotip spesifiknya.  Dalam  penyembuhan  luka,  BMP-2
juga dapat merangsang kemotaksis dari monosit dan  menstimulasi  ekspresi  mRNA  TGFβ-1. Selama penyembuhan fraktur, BMP-2 mempengaruhi  sel-sel  prekursor  untuk  menjadi kondroblas dan mengekspresikan protein-protein yang  dibutuhkan  untuk  memproduksi  anyaman tulang [13].
Remodeling  tulang  adalah  proses  siklus aktifitas seluler tulang, meliputi peristiwa resorpsi dan aposisi secara berurutan. Remodeling tulang terjadi setelah puncak masa pertumbuhan tulang tercapai. Remodeling tulang dimulai dari aktifitas osteoklas,  yang  mengakibatkan  resorpsi  dan selanjutnya  diikuti  aktifitas  osteoblas  untuk aposisi pembentukan tulang baru [14].
Diferensiasi  osteoblas  dicapai  melalui ekspresi bersama dari sejumlah faktor transkripsi kunci,  dan  pembentukan  tulang  oleh  osteoblas dikendalikan baik lokal dan sistemik. Diferensiasi dan  fungsi  osteoblas.diatur  oleh  jalur  sinyal protein  morphogenetic  tulang  (BMP)  [15,16]. Protein Smad heterodimeric mengontrol ekspresi RUNX-2, yang juga dikenal sebagai core binding factor  alpha1  (cbfa1),  adalah  faktor  transkripsi yang  sangat  diperlukan  untuk  diferensiasi osteoblas [17]. Jalur sinyal Kanonik Wnt sangat diperlukan  untuk  diferensiasi  osteoblas  selama skeletogenesis dan terus memiliki peran penting dalam osteoblas dewasa [18].
Peningkatan ekspresi BMP2 pada osteoblast  setelah  pemberian  ekstrak  kopi Robusta  pada  hari  ke  15  maupun  hari  ke  22 disebabkan  karena  flavonoid  yang  terkandung dalam  ekstrak  kopi  robusta  meningkatkan osteogenesisis /pembentukan osteoblas dengan meningkatkan  BMP2  [19].  Flavonoid  telah ditemukan  untuk  menurunkan  ekskresi  kalsium dan  fosfat  dalam  urin,  meningkatkan  aktivitas osteoblas,  menurunkan  aktivitas  osteoklas,  dan melindungi  dari  hilangnya  ketebalan  trabekuler [20-22].  Penelitian  sebelumnya  menunjukkan bahwa  senyawa  flavonoid  turunan  tumbuhan yang  berbeda  dapat  merangsang  fungsi osteoblas,  dan  menghambat  fungsi  osteoklas baik  sendiri  atau  dalam  kombinasi.  Karena kejadian  alami  dan  kurangnya  efek  samping, flavonoid  dianggap  lebih  aman  daripada  terapi penggantian obat konvensional sebagai tindakan pencegahan terhadap berbagai penyakit termasuk osteoporosis [23].
Ekspresi BMP2 pada kelompok perlakuan pada hari ke 22 terjadi peningkatan dibandingkan  hari  ke  15  secara  signifikan (p<0,05).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  semakin lama  pemberian  ekstrak  kopi  Robusta  semakin besar ekspresi BMP2. BMP2 diekspresikan pada

## B

## E F
osteoblas  yang  berperan  dalam  meningkatkan aposisi/pembentukan tulang pada proses remodeling tulang alveolar.

## Ekspresi TRAF6
Diferensiasi  osteoklas  diawali  dengan sinyal  melalui  c-fms,  reseptor  macrophage colony  stimulating  factor  (MCSF),  dalam  sel-sel prekursor mononuklear, yang meregulasi ekspresi  RANK  [24].  Peningkatan  ekspresi TRAF6  pada  osteoklas  setelah  pemberian ekstrak  kopi  Robusta  pada  hari  ke  15  maupun hari  ke  22  disebabkan  karena  kafein  yang terkandung  dalam  ekstrak  kopi  Robusta meningkatkan osteoklastogenesis, [25,26]. Kafein meningkatkan diferensiasi dan pematangan osteoklas melalui aktivasi p38 MAP kinase, sehingga menginduksi ekspresi Mitf dan aktivasi  transkripsi  DC-STAMP,  dan  akhirnya CtsK dan TRAP [27]
Kafein memiliki kemampuan untuk meningkatkan  osteoklastogenesis  termediasi- RANKL  yang  diatur  oleh  COX-2/PGE(2)  [28]. RANKL  yang  diproduksi  oleh  osteoblas selanjutnya  mengikat  Receptor  activator  of Nuclear  Factor-ĸb  (RANK)  pada  permukaan prekursor osteoklas dan merekrut protein adaptor tumour  necrosis  factor  receptor-associated factor6  (TRAF6),  yang  menyebabkan  aktivasi Nuclear factor-kappa
B (NF-Kb) dan mentransmisikan
ke nukleus. NF-Kb meningkatkan  ekspresi  c-Fos,  dan  C-Fos berinteraksi  dengan  NFATc1  untuk  memicu transkripsi gen osteoklastogenik [29].
NFATC1  merupakan  regulator  utama RANKL yang menginduksi diferensiasi osteoklas dan  memainkan  peran  penting  dalam  fusi  dan aktivasi  osteoklas  melalui  peningkatan  regulasi berbagai  gen  yang  bertanggung  jawab  untuk perlekatan  osteoklas,  migrasi,  pengasaman, degradasi anorganik dan  organik matriks tulang [30].
Ekspresi TRAP6 pada kelompok perlakuan  pada  hari  ke  22  terjadi  peningkatan dibandingkan  hari  ke  15  secara  signifikan (p<0,05).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  semakin lama  pemberian  ekstrak  kopi  Robusta  semakin besar  ekspresiTRAP6  .  TRAP6  diekspresikan pada osteoklas yang berperan dalam meningkatkan  resorpsi  tulang  pada  proses remodeling tulang alveolar, sehingga pemberian ekstrak  kopi  Robusta  dapat  dijadikan  bahan alternatif dalam mempercepat perawatan ortodonti.

## Simpulan dan Saran
Pemberian ekstrak kopi Robusta  selama 2 dan  3  minggu  meningkatkan  ekspresi  BMP2 pada  osteoblas  dan  ekspresi  TRAF6  pada osteoklas. Semakin lama pemberian Extrak kopi Robusta semakin meningkatkan ekspresi BMP2 maupun  ekspresi  TRAF6,  sehingga  dapat dijadikan  alternatif  untuk  meningkatkan  proses remodeling tulang.

## Daftar Pustaka
[1]   Nimeri G, Kau CH, Aboe-kheir NS, Corona R,.  Acceleration  of  tooth  movement  during orthodonic  treatment  –  a  frontier  in Orthodontic. Prog Orthod. 2013; (14): 14-42.
[2]   Te H,  Arron JR, Lamothe B, Cirilli M, et al.  2002. Nature. 2002; 418( 6896), 443-447. [3]   Bai S, Kitaura H, Zhao H, Chen J, Muller JM, Schule  R,  Darnay  B,  novac  DV,  FP, Teitelbaum  SL.  FHL2  inhibits  the  activated osteoclast in a TRAF6-dependent manner. J Clin Invest. 2005; 115(10): 2742-2751
[4].  Lamoyhe B, William K, Webster WK, Ambily K , Webster AK, Gopinathan A , Besse A, D Campos A, Bryant G Darnay BG. TRAF6 U biquitin  Ligase  is  Essential  for  RANKL Signaling  and  Osteoclast  Differentiation. Biochemical  and  biophysical  research communications. 2007; 359(4),1044-49,
[5]  Mundy GR, Chen D, and Oyajobi BO. Bone Remodeling,  in  Prime  on  the  Metabolic Diseases and Disorder of Mineral Metabolism.  Favus MJ ed, Washington DC: American  Society  of  Bone  and  Mineral Research, 2003.
[6]  Shenava S, Nayak KUS, Bhaskar V, Nayak A.  Accelerated  Orthodontics-A  Review. IJSRP Journal. 2014; 1(5):  35-39
[7]    Sukendro  S.  Keajaiban  Dalam  Secangkir Kop. Penerbit: Media Pressindo Yogyakarta; 2013.
[8]  Yashin,  A.,  Y.  Yashin,  J.Y.  Wang,  dan  B.S. Nemzer.  Antioxidant  and  Antiradical  Activity of  Coffee.    Antioxidants.  2013;  11(2):  230- 245.
[9]  Richelle MI, Tavazzi, Offord E.l. Comparison of  the  antioxidant  of  commonly  consumed Polyphenole Beverage (Coffee, Cocoa, Tea) Prepared  per  cup  serving.  Journal  of Agricultural  and  Food  Chemistry.  2001; 49(70): 3438-3444
[10]  Galicka  A,  Nazaruk  J.  Stimulation  of Collagen  Biosynthesis  by  Flavonoid Glycosides  in  Skin  Fibroblasts  of Osteogenesis Imperfecta Type 1 and the
Potential Mechanism of their action. IJM Medicine. 2007; ( 20): 889-895.
[11]  Herniyati,    Putri  LSD,  Wijayanti  RPA. Effects  of  Robusta  coffee  extract  on Increasing fibroblast number and Density of  Collagen  Fibers  of  Periodontal
Ligament in Orthodontic Tooth Movement.  Forkinas  2019.  Aston  Hotel 6-7 September 2019.
[12] Akhoundi  MSA, Mehr MS , Keshvad MA, Moghaddam SE , Alaeddini M , Dehpour A , Mirhashemi AH Effect of amitriptyline on orthodontic tooth movement in rats: an experimental study. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects 2020; 14(3): 147-152
[13]  Kim  MK,and    Niyibizi  C.  Interaction  of TGFβ-1  and  rhBMP-2  on  human  bone marrow stromal cells cultured in collagen gel  matrix.  Yonsei  Med  J    2001.:42(3): 338-344.
[14]  Thailander  B,  Rygh  P,  and  Reitan  K. Tissue  Reaction  In  Orthodontics.  In Orthodontics  Current  Principles  And Techniques.  3 rd ed.,  St.  Louis  :  Mosby;
2000.
[15] Cao X and Chen D. The BMP Signalling and  in  Vivo  Bone  Formation.  Gene.  , 2005.: (357): 1-8.
[16]  Day TF, Guo X, Garrett- Beal L and Yang Y.  Wnt/beta  Catenin  Signalling  in Mesenchymal Progenitors Controls Osteoblast and Chondrocyte Differentiation during Vertebrate Skeletogenesis,  Dev.  Cell.  ,  2005:  (8): 739-750.
[17]  Ducy P, Zhang R, Geooffroy V, Ridall AL, and  Karsenty  G..  Osf2/Cbfa1:  a Transcriptional  Activator  of  Osteoblast Differentiation. Cell. 1997: (89):  747-754.
[18]  Crockett  JC,  Rogers  MJ,  Coxon  FP, Hocking  LJ,  and  Helfrich  MH.  Bone emodelling  at  a  Glance,  J  Cell.  2011; (124): 991-998.
[19]  Mamun MA, Islam K, Alam MJ, Khatun A, Alam  MM,  Al-Bari  MA,  Alam  MJ. Flavonoids isolated from Tridax procumbens  (TPF)  inhibit  osteoclasts differentiation  and  bone  resorption.  Biol Res. 2015; (48): 51.
[20]  Mitra  C,  Das  D,  Das  AS,  Preedy  VR. Black  tea  (Camellia  sinensis)  and  bone loss      protection. In: Preedy VR, editor. Tea  in  health  and  disease  prevention. London: Academic Press; 2013.
[21]  Shen  C-L,  Yeh  JK,  Cao  JJ,  Chyu  M-C, Wang  J-S.  Green  tea  and  bone  health:
22.  Mamun  MA,  Islam  K,  Alam  MJ, Khatun  A,  Alam  MM,  Al-Bari  MA,  Alam MJ.  Flavonoids  isolated  from  Tridax procumbens  (TPF)  inhibit  osteoclasts differentiation  and  bone  resorption.  Biol Res. 2015; (48): 51.
[22]  Nash  LA,  Sullivan  PJ,  Peters  SJ,  Ward WE.  Rooibos  flavonoids,  orientin  and luteolin,  stimulate  mineralization  in human  osteoblasts  through  the  Wnt pathway. Mol Nutr Food Res. 2015; (59): 443-53.
[23]  Haq  MJ,  Riaz  M,  Feo  VD,  Jaafar  HZE. Moga  M  .  Rubus  fruticosus  L.: constituents,  biological  activities  and health  related  uses.  Molecules.  2014; 19(8):10998-1029.
[24]  Crockett  JC,  Rogers  MJ,  Coxon  FP, Hocking  LJ,  and  Helfrich  MH.  Bone Remodelling  at  a  Glance,  J  Cell.  2011; (124): 991-998.
[25] Jianru Y, Boxi Y, Meile L, Yu W, Wei Z, Yu L, and Zhihe Z. Caffeine may enhance orthodontic  tooth  movement  through increasing  osteoclastogenesis  induced by  periodontal  ligament  cells  under compression.  Archives  of  Oral  Biology. 2016 ( 64): 51-60.
[26]  Herniyati.  Pengaruh  Kafein  Terhadap Ekspresi  RANKL  dan Jumlah Osteoklas Pada  Pergerakan  Gigi  Ortodonti.  Denta Jurnal Kedokteran Gigi. 2016; 10(1): 62- 70
[27]   Choi  J,  Choi  SY,  Lee  SY,  Lee JY,  Kim HS, Lee SY, Lee NK. Caffeine enhances osteoclast  differentiation  and  maturation through  p38  MAP  kinase/Mitf  and  DC- STAMP/CtsK  and  TRAP  pathway.  Cell Signal. 2013; 25(5): 1222-7.
[28]  Liu  XH  et  al. Interactive  effect  of interleukin-6  and  prostaglandin  E2  on osteoclastogenesis via the
OPG/RANKL/RANK  system.  Ann  N  Y Acad Sci. 2006; (1068): 225-33.
[29]  Boyce,  Brendan  F.MD,  and  Lianping X.MD. Functions  of  RANKL/RANK/OPG in  bone  modeling  and  remodeling.  Arch Biochem Biophys. 2007; 473(2):139-146.
[30]  Zhao  Q,  Wang  Xi,  Liu  Y,  He  Aimin,  Jia Ruokun. NFATc1: Functions in osteoclasts,  iJBCB.  2010;  42(5):  579-
576.