*) Peneliti  pada Balai  Besar  Riset Pengolahan  Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan dan  Perikanan

## PERBANDINGAN BEBERAPA METODE ANALISIS HISTAMIN UNTUK PRODUK PERIKANAN
Hedi Indra Januar *)

## ABSTRAK
Studi  ini    bertujuan    untuk    membandingkan    beberapa    metode  dalam  penentuan  kadar amina    biogenik  histamin.  Diketahui,  kadar  histamin  merupakan  salah  satu  parameter  yang penting    sebagai    standar    kualitas    produk    perikanan.  Metode  yang  dibandingkan  meliputi metode  menggunakan  spektrofluorometri, High  Performance  Liquid  Chromatography (HPLC), Enzyme  Linked  Immunosorbent    Assay (ELISA),  dan Capillary  Electrophoresis/Capillary  Zone Electrophoresis (CE/CZE).  Hasil  perbandingan  menunjukkan  bahwa  baik  dari  sisi  ketidakpastian yang mungkin ditimbulkan  dari metodenya serta  hasil  uji  kelayakan  laboratorium  di  Eropa, metode HPLC  derivatisasi post -kolom  merupakan  metode  yang  optimal  saat  ini  untuk  menentukan  kadar histamin  secara  kuantitatif.  Akan  tetapi,  untuk  pertimbangan  efisiensi  waktu,  maka  studi  ini mengusulkan  bahwa  penggabungan  metode  ELISA  kualitatif  dan  HPLC  kuantitatif  sangat  baik dijadikan  sebagai  standar  metode  penentuan  histamin  di  laboratorium  pengujian  produk perikanan.

## ABSTRACT: The    comparison    of    several    histamine    analysis  methods  for  fisheries products.  By: Hedi Indra Januar
Histamine  content  is one  of  standard  parameters for  the  quality  control  of  fisheries  products. There  are  several  methods    that    have  been  widely    employed    to  determine  the  content  of histamine,  including  spectrofluorometry,  High  Performance  Liquid  Chromatography    (HPLC), Enzyme  Linked  Immunosorbent    Assay  (ELISA),  and  Capillary  Electrophoresis/Capillary  Zone Electrophoresis (CE/CZE)  methods. The  comparison  of  these methods  was performed  based  on their  uncertainty and  proficiency at  several laboratories  in Europe.  The  result   showed   that   the HPLC method  with   post-column  derivatization  is  the most optimized   method.  However, based on  the time efficiency, this  study  suggests  that the combination of both qualitative ELISA method and  quantitative HPLC  method is  preferred for  daily  routine    analysis of histamine.
KEYWORDS: histamine, fluorometry, chromatography, elisa, capillary elektroforesis

## PENDAHULUAN
Produk  perikanan  merupakan  sumber  protein, lemak, dan vitamin. Namun setelah ikan mati, enzim- enzim dari bakteri yang tumbuh di dalamnya dapat dengan  seger a  m engkatalisis  reaksi  y ang menghasilkan amina biogenik, termasuk histamin, yang  bersifat  toksin  (Moreno  &  Torres , 2001). Permasalahan  histamin  ini  termasuk  tiga besar problem kesehatan publik yang  kerap muncul dari makanan  laut  (Kaneko,  2000a).    Ikan  yang  masih segar memiliki kandungan histamin lebih kecil dari 10  ppm.  Kadar  histamin  di  antara  30–50  ppm mengindikasikan penurunan mutu yang signifikan, sedangkan kadar 50 ppm ke atas merupakan bukti bahwa  ikan  mengalami  dekomposisi  yang  tinggi (Rogers  &  Staruszkiewicz,  2000).  Batas-batas konsentrasi histamin tersebut menunjukkan bahwa kadar    senyawa    ini    merupakan  parameter  yang penting dalam kualitas produk perikanan. Walaupun
melalui  pengamatan  secara sensori  oleh panelis yang  berpengalaman  mampu  membedakan  antara ikan    yang    memiliki    kadar    histamin    tinggi  dan rendah, namun metode kontrol histamin yang diakui hanya database ketertelusuran  pascapanen dan random    sampling pengukuran    kuantitatifnya (Kaneko, 2000b). Oleh  karena  itu, berbagai  metode instrum entasi     tel ah    dikem bangk an  untuk menganalisis kadar histamin dari produk perikanan secara  cepat,  akurat,  dan  efisien,  hal  inilah  yang m endasari    penulisan    ini.  Tulisan  ini    akan menguraikan secara umum metode standar dalam melaksanakan    pengukuran    kuantitatif    kadar histamin. Selanjutnya  dipaparkan  hasil  uji  kelayakan beberapa  laboratorium  di Eropa  beberapa waktu lalu    yang  mengaplikasikan  metode  berbeda  dan perbandingan kemungkinan variabel ketidakpastian metodenya. Setelah itu, secara subjektif, diusulkan pengujian yang optimal untuk analisis histamin dari produk perikanan.

## METODE INSTRUMENTASI PENGUKURAN KADAR HISTAMIN
Pada  saat  ini ,  ber bagai   m etode  telah dikembangkan untuk mengukur kadar histamin, mulai dari prosedur yang menggunakan spektrofluorometer, HPLC, derivatisasi pre -kolom,  HPLC  derivatisasi post - kolom ,  (CE/CZE),  hingga  metode  baru  yang menerapkan  kemampuan  reaksi  enzim  terhadap histamin, yaitu ELISA. Secara garis besar, bagan pada Gambar 1 menunjukkan alur kerja metode-metode tersebut.
menggunakan kolom penukar ion karena OPA juga dapat  bereaksi  dengan  amina  biogenik  lain  yang terbentuk bersama dengan histamin.

## High  Performance  Liquid  Chromatography (HPLC)
Metode  ini  memiliki  dua  cara  berdasarkan detektornya. Pertama adalah dengan menggunakan f luorosensi  sedangkan  yang  kedua  dengan menggunakan ultraviolet (Smela et al., 2003). Pada metode  yang  menggunakan  fluorosensi,  senyawa

## Spektrofluorometri
Metode   spektrofluorometri     didasarkan   pada Association  of Official Analytical Chemist (AOAC) Official   Methods 977.13, Histamine  in  Seafood, Fluorometric   Method (Horwit z,  1990),  y ang merupakan  metode  dasar  pengukuran  histamin menggunakan instrumentasi seperti HPLC. Prinsip dari pengukuran ini adalah analisis serapan fluorosensi dari  derivatisasi  histamin  dan o-phthaldialdehyde (OPA)  yang    memberikan  daya  fluorosensi  pada panjang gelombang 330 nm (eksitasi) dan 440 nm (emisi). Selain itu, metode ini juga melibatkan tahapan pemurnian  histamin  dari  amina  biogenik  lainnya
histamin diderivatisasi menggunakan OPA, sedangkan yang menggunakan UV, direaksikan dengan dengan dansyl  clorida (DC).  Perbedaan  kromatogram derivatisasi OPA dan DC dapat dilihat pada Gambar 2.
Berdasarkan  pola  saat  reaksi  derivatisasinya, metode dengan menggunakan HPLC dapat dibagi menjadi dua. Pertama pre -separasi atau pre -kolom (reaksi derivatisasi dilaksanakan sebelum pemisahan histamin dari matrik atau amina biogenik lain pada kolom HPLC) dan kedua adalah post -kolom (reaksi deriv atisasi  dilaksanakan  di  antara  pemisahan histamin pada kolom HPLC dan detektor).
Gambar 1. Bagan  kerja  pengukuran  histamin  menggunakan spektrofluorometri (a), HPLC derivatisasi pre - kolom (b), HPLC derivatisasi post -kolom (c), CE (d), dan ELISA (e).
Ekstraksi sampel
Purifikasi
Kolom
Penukar ion Derivatisasi OPA Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm Ekstraksi sampel Derivatisasi
OPA / DC
Pemisahan Kinerja Tinggi (HPLC) Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm atau Detektor UV 254 nm Ekstraksi sampel Derivatisasi OPA / DC Pemisahan Kinerja Tinggi (HPLC) Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm atau Detektor UV 254 nm Ekstraksi
sampel
Reaksi Imidazole
Pemisahan Berdasar Afinitasi ion
(CE) Detektor UV 210 nm Ekstraksi sampel Derivatisasi Alsilasi Reaksi Antibodi Pencucian ( washing ) Reaksi Enzim Konjugat
Pencucian ( washing ) Reaksi Reagen kromogen Reaksi Reagen Stop Detektor UV 450 nm, Referensi 620-650 nm (a) (b) (c) (d) (e) sampel Purifikasi Kolom Penukar ion Derivatisasi OPA Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm sampel Derivatisasi
OPA / DC
Pemisahan Kinerja Tinggi (HPLC) Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm Detektor UV 254 nm sampel Derivatisasi OPA / DC Pemisahan Kinerja Tinggi (HPLC) Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm Detektor UV 254 nm sampel Reaksi Imidazole Pemisahan Berdasar Afinitasi ion (CE)
Detektor UV 210 nm sampel Derivatisasi Alsilasi Reaksi Antibodi Pencucian ( washing ) Reaksi Enzim Konjugat
Pencucian ( washing ) Reaksi Reagen kromogen Reaksi Reagen Stop Detektor UV 450 nm, Referensi 620-650 nm (a) (b) (c) (d) (e) Ekstraksi sampel
Purifikasi
Kolom
Penukar ion Derivatisasi OPA Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm Ekstraksi sampel Derivatisasi
OPA / DC
Pemisahan Kinerja Tinggi (HPLC) Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm atau Detektor UV 254 nm Ekstraksi sampel Derivatisasi OPA / DC Pemisahan Kinerja Tinggi (HPLC) Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm atau Detektor UV 254 nm Ekstraksi
sampel
Reaksi Imidazole
Pemisahan Berdasar Afinitasi ion
(CE) Detektor UV 210 nm Ekstraksi sampel Derivatisasi Alsilasi Reaksi Antibodi Pencucian ( washing ) Reaksi Enzim Konjugat
Pencucian ( washing ) Reaksi Reagen kromogen Reaksi Reagen Stop Detektor UV 450 nm, Referensi 620-650 nm (a) (b) (c) (d) (e) sampel Purifikasi Kolom Penukar ion Derivatisasi OPA Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm sampel Derivatisasi
OPA / DC
Pemisahan Kinerja Tinggi (HPLC) Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm Detektor UV 254 nm sampel Derivatisasi OPA / DC Pemisahan Kinerja Tinggi (HPLC) Detektor Fluorometer Eksitasi 330 nm Emisi 440 nm Detektor UV 254 nm sampel Reaksi Imidazole Pemisahan Berdasar Afinitasi ion (CE)
Detektor UV 210 nm sampel Derivatisasi Alsilasi Reaksi Antibodi Pencucian ( washing ) Reaksi Enzim Konjugat
Pencucian ( washing ) Reaksi Reagen kromogen Reaksi Reagen Stop Detektor UV 450 nm, Referensi 620-650 nm (a) (b) (c) (d) (e)
Capillary Electrophoresis/Capillary Zone Electrophoresis (CE/CZE)
Pada metode ini, serupa dengan HPLC, histamin tidak perlu dipisahkan dengan amina biogenik lainnya karena histamin akan dipisahkan dari amina biogenik lain  dalam  kolom  kapiler  sebelum  dideteksi  oleh detektor  (Trennery et  al., 2000).  Setelah  proses ekstraksi, aliquot sampel dapat langsung diinjeksikan ke  sistem  kerja.  Pada  sistem  CE,  pemisahan dilakukan berdasarkan mobilitas sampel dalam bentuk ionik di medan listrik (Tissue, 1996).

## Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Metode ini didasarkan pada penggunaan enzim untuk mendeteksi ikatan sampel terhadap antigen (Ag) dan antibodi (Ab). Enzim akan mengubah substrat yang  tidak  berwarna  (kromogen)  menjadi  produk berwarna. Perubahan ini menunjukkan ikatan sampel terhadap  Ag:Ab  (Ma et  al., 2006).  Spektra  warna tersebut  dibaca  absorbansinya  pada  panjang gelombang  tertentu.  Nilai  absorbansi  ini  akan berbanding terbalik dengan konsentrasi histamin yang terkandung di dalamnya  (Anon., 2008).  Walaupun metode ELISA cukup kompleks, namun sistem  ini tidak melibatkan pemisahan serta dapat bekerja dalam skala kecil (mikroliter) dalam 96 well-plate , sehingga
mampu menganalisis banyak sampel pada satu kali pembacaan detektor.

## HASIL UJI KELAYAKAN DI EROPA
Oleh  karena  histamin  merupakan  parameter kualitas  produk  perikanan  yang  penting,  maka pengujiannya secara reguler harus dievaluasi. Selain untuk mengetahui kemampuan laboratorium, secara umum akan dapat diketahui efisiensi metode pada masing-masing laboratorium tersebut. Pada tahun 2006, 30 laboratorium di Eropa telah mengikuti uji kelayakan  yang  dilaksanakan  oleh  lem baga keamanan pangan Belanda (Anon., 2006). Masing- masing  laboratorium  menerapkan  metode  yang berbeda, seperti Tabel  1.
Penilaian hasil pengujian pada Tabel 1 didasarkan hasil  analisis  statistik  nilai Z ,  yang  menerangkan korelasi antara  hasil pengujian yang dilakukan suatu laboratorium,  hasil  rata-rata  yang  didapatkan  dari seluruh laboratorium, dan nilai yang sebenarnya. Jika nilai Z di bawah 1 maka termasuk memuaskan, antara 1  dan  2  adalah  baik,  antara  2  dan  3  meragukan, sedangkan lebih dari 3 menunjukkan hasil pengujian yang tidak memuaskan karena berbeda jauh antara nilai sebenarnya dengan nilai pengujian. Tabel 1 juga menunjukkan  bahwa  metode  CE/CZE,  walaupun
Gambar 2. Kromatogram pemisahan histamin menggunakan derivatisasi OPA dan DC (Smela et al., 2003).
dinyatakan cukup baik, cepat, dan akurat (Trenerry et al., 2000), namun di antara 30 laboratorium yang diuji belum ada yang mengaplikasikannya sebagai metode standar analisis histamin. Hal ini mungkin disebabkan instrumentasi elektroforesis umumnya berada  di  laboratorium  biologi/bioteknologi  untuk penerapan pemisahan bahan-bahan biologis, tidak di laboratorium  kimia  yang  bersifat  umum  sebagai pelaksana uji histamin.
Hasil  uji  kelayakan  pada  Tabel  1  di  atas memberikan  fakta  yang  menarik.  Metode  analisis histamin menggunakan HPLC telah digunakan oleh 22 dari 30 laboratorium  pada  uji  kelayakan  di Eropa. Secara umum, 80% laboratorium yang menggunakan metode HPLC, baik derivatisasi menggunakan DC maupun  OPA,  memperoleh  hasil  kelayakan  yang sangat baik. Uji menggunakan spektrofluorometri juga memperoleh  nilai  yang  cukup  baik,  dengan  80% laboratorium  yang  m enggunakan  metode  ini memberikan hasil yang memuaskan atau baik. Hasil yang tidak memuaskan  terdapat pada uji histamin menggunakan ELISA. Sebagai metode yang baru, metode  ini  hanya  diterapkan  di  dua  laboratorium dengan hasil yang sangat jauh berbeda.
Berdasarkan  hal  di  atas,  maka  tidak  satu  pun m et ode    yang  100%  m endapat kan  k riteria memuaskan  atau  baik  dari  laboratorium  yang menggunakannya. Aspek seperti kapabilitas analis dan kalibrasi  alat pendukung, seringkali menjadi faktor utama penyebab penyimpangan yang besar antara hasil uji dengan nilai sebenarnya. Namun selain itu, kompleksitas metode  analisis histamin  dapat juga
menjadi  sumber  penyimpangan.  Secara  teoritis, v ariabilitas  penyimpangan  dari  m etode  dapat diterangkan melalui variabel ketidakpastian.

## PERBANDINGAN VARIABEL KETIDAKPASTIAN
Secara teoritis, beberapa metode tersebut dapat dibandi ngkan  perk iraan  penyim pangannya berdasarkan besaran ketidakpastian. Artinya, semakin tinggi  ketidakpastian  yang  ada,  maka  bias  hasil analisis akan semakin besar. Oleh karena itu, estimasi ketidakpastian merupakan salah satu faktor penting pada  v alidasi  analisis  laboratorium   menurut pemahaman  ISO/IEC  17025:2005  (Hadi,  2007). Ketidakpastian secara umum muncul dari tahapan kerja,  faktor  intrinsik  yang  berupa  faktor  efisiensi ekstraksi  serta  derivatisasi,  serta  tahapan  kimia- kalibrasi instrumentasi (Romero et al., 2004). Secara umum, Gambar 3 memperlihatkan skema fishbone analisis instrumentasi pada uji histamin.
Nilai penyimpangan  dari parameter ketidakpastian m erupakan  akar  kuadrat  dari  total  kuadratik penambahan masing-masing variabel yang terlibat pada tahapan analisis (persamaan 1 di Gambar 4). Oleh karena itu, untuk membandingkan perbedaan ketidakpastian di antara beberapa metode, variabel- variabel  yang  sama  dapat  dihilangkan  sehingga menyisakan parameter yang berbeda. Selanjutnya secara teoritis, dapat diperkirakan metodologi yang memiliki total ketidakpastian terbesar maupun terkecil.
Jik a  tiap  m etode  anali sis  histam in  y ang dibandingkan  menggunakan  peralatan  pendukung (timbangan, pipet, volumetrik flask) dan ekstraksi yang
Tabel 1. Hasil uji kelayakan histamin 30 laboratorium di Eropa
Memuaskan Baik Meragukan Tidak memuaskan 1 Spektrofluorometri 6 1 4 1 0 2 HPLC-Detektor UV ( Pre -Derivatisasi) 8 4 1 2 1 3 HPLC-Detektor Fluorometer ( Post -Derivatisasi) 13 10 2 1 0 4 HPLC-Detektor Fluorometer ( Pre -Derivatisasi) 2 1 0 1 0 5 ELISA 2 1 0 0 1 6 CE/CZE 0 0 0 0 0
Hasil pengujian Jumlah laboratorium Metode pengujian
No
Sumber:   Anon. (2006)
sama, maka sebagian besar variabel larutan kerja adalah    sebanding    antara  metode  satu  dengan lainnya. Selain itu, faktor kalibrasi kimia akan sangat bervariasi  tergantung  kualitas  instrumentasi  yang digunakan.  Oleh  karena  itu,  variabel  ini  akan disampingkan  agar  perbandingan  ketidakpastian merujuk  langsung  pada metodologi  yang  digunakan. Sehingga,  perbandingan  metodologi  uji  histamin
dilakukan untuk variabel seperti pada persamaan (2) di  Gambar    4.  Lebih  lanjut,  param eter  pada persamaan (3) sampai (7) menunjukan penjabaran parameter  ketidakpastian  yang  dibandingkan  dari masing-masing metode.
Sec ara  t eori tis,  Gam bar   4  di   atas  dapat menjelaskan  penyebab variasi dan penyimpangan hasil uji kelayakan sebelumnya dari sisi metodologi
u Konsentrasi histamin
= (u Larutan kerja) 2 + ( u inherent ) 2
u Banding = (u Larutan derivatisasi) 2 + ( u Efisiensi Reaksi Derivatisasi) 2 + ( u Efisiensi Pemisahan Histamin) 2 (2)
(1) u Fluorometri = (u Larutan OPA) 2 + ( u Efisiensi Derivat OPA) 2 + ( u Efisiensi pemisahan kolom penukar ion) 2
(3) u HPLC Pre-Kolom = (u Larutan OPA/DC) 2 + ( u Efisiensi Derivat OPA/DC) 2 + ( u Efisiensi pemisahan HPLC) 2 (4)
u HPLC
Post -Kolom = (u Larutan OPA/DC) 2 + ( u Efisiensi Pemisahan HPLC) 2 + ( u Efisiensi Derivati OPA/DC) 2 (5) = (u Larutan imidazole) 2 + ( u Efisiensi Derivat imidazole) 2 + ( u Efisiensi pemisahan CE) 2 (6) u CE = (u Larutan asilasi) 2 + ( u larutan antibodi) 2 + ( u larutan enzim konjugat) 2 + ( u larutan kromogen) 2 + (7) u ELISA
(u Larutan stop) 2 + ( u larutan pencuci/ wash ) 2 + ( u Efisiensi asilasi) 2 + ( u efisiensi antibodi) 2 + (u efisiensi enzim konjugat) 2 + ( u Efisiensi kromogen) 2 + ( u Efisiensi stop) 2 + ( u efisiensi washin g) 2
u Konsentrasi histamin = (u Larutan kerja) 2 + ( u inherent ) 2
u Banding = (u Larutan derivatisasi) 2 + ( u Efisiensi Reaksi Derivatisasi) 2 + ( u Efisiensi Pemisahan Histamin) 2 (2)
(1) u Fluorometri = (u Larutan OPA) 2 + ( u Efisiensi Derivat OPA) 2 + ( u Efisiensi pemisahan kolom penukar ion) 2
(3) u HPLC Pre-Kolom = (u Larutan OPA/DC) 2 + ( u Efisiensi Derivat OPA/DC) 2 + ( u Efisiensi pemisahan HPLC) 2 (4)
u HPLC
Post -Kolom = (u Larutan OPA/DC) 2 + ( u Efisiensi Pemisahan HPLC) 2 + ( u Efisiensi Derivati OPA/DC) 2 (5) = (u Larutan imidazole) 2 + ( u Efisiensi Derivat imidazole) 2 + ( u Efisiensi pemisahan CE) 2 (6) u CE = (u Larutan asilasi) 2 + ( u larutan antibodi) 2 + ( u larutan enzim konjugat) 2 + ( u larutan kromogen) 2 + (7) u ELISA
(u Larutan stop) 2 + ( u larutan pencuci/ wash ) 2 + ( u Efisiensi asilasi) 2 + ( u efisiensi antibodi) 2 + (u efisiensi enzim konjugat) 2 + ( u Efisiensi kromogen) 2 + ( u Efisiensi stop) 2 + ( u efisiensi washin g) 2
Gambar 4. Persamaan matematis variabel ketidakpastian analisis histamin yang dibandingkan dari masing- masing metode.
Gambar 3. Skema fishbone analisis instrumentasi pada uji histamin.
Larutan kerja Larutan Stok Standar Preparasi Sampel Larutan derivatisasi LarutanStandar w isotop v w Ekstraksi v v w v Faktor Inherent Kalibrasi Kimia Konsentrasi histamin Transformasi Signal Detektor Reabilitas Intrinsik EfisiensiReaksiDerivatisasi Efisiensi Pemisahan Histamin dari Matrix/biogenik amina lain
Efisiensi Ekstraksi Efisiensi washing (ELISA) Pipet, pengenceran v Larutan Stok Standar Preparasi Larutan derivatisasi LarutanStandar w isotop v w Ekstraksi v v w v Kalibrasi Transformasi Detektor Reabilitas Intrinsik EfisiensiReaksiDerivatisasi Efisiensi Ekstraksi Efisiensi (ELISA) Pipet, pengenceran v Larutan kerja Larutan Stok Standar Preparasi Sampel Larutan derivatisasi LarutanStandar w isotop v w Ekstraksi v v w v Faktor Inherent Kalibrasi Kimia Konsentrasi histamin Transformasi Signal Detektor Reabilitas Intrinsik EfisiensiReaksiDerivatisasi Efisiensi Pemisahan Histamin dari Matrix/biogenik amina lain
Efisiensi Ekstraksi Efisiensi washing (ELISA) Pipet, pengenceran v Larutan Stok Standar Preparasi Larutan derivatisasi LarutanStandar w isotop v w Ekstraksi v v w v Kalibrasi Transformasi Detektor Reabilitas Intrinsik EfisiensiReaksiDerivatisasi Efisiensi Ekstraksi Efisiensi (ELISA) Pipet, pengenceran v
yang digunakan. Metodologi HPLC derivatisasi post - kolom  dapat  diperkirakan  memiliki  variabel  total ketidakpastian terkecil dibandingkan metode lainnya. Walaupun jumlah variabelnya sama dengan metode fluorosensi, HPLC derivatisasi pre -kolom dan CE, akan tetapi jarak waktu antara reaksi derivatisasi sampel dan standar ke detektor relatif  sama sehingga  lebih stabil. Hal ini dapat membuat besaran ketidakpastian efisiensi derivatisasi yang lebih kecil dibandingkan dengan ketiga metode yang lain tersebut. Januar et al. (2008) menunjukan bahwa walaupun reaksi derivat histamin dinyatakan  stabil dalam jangka  waktu 30 menit  (Horwitz, 1990),  namun kenyataannya  daya fluorosensi meluruh seiring waktu. Pada metodologi HPLC derivatisasi pre -kolom OPA dan DC, pemisahan derivat OPA dapat memiliki u lebih besar karena letak puncak histamin di depan sehingga dapat terpengaruh oleh area puncak pelarut (Gambar 2). Metodologi CE, dengan  variabel u -nya  yang  serupa,  diperkirakan memiliki  total  ketidakpastian  yang  hampir  serupa dengan  HPLC  derivatisasi pre -kolom  DC.  Metode fluorometrik dapat memiliki ketidakpastian yang lebih besar  dari  metode  HPLC  dan  CE  karena  faktor u efisiensi pemisahan di resin penukar ion yang lebih besar jika dibandingkan efisiensi pemisahan kinerja tinggi di HPLC serta CE.
Kom pleksitas  uji  ELISA  dapat  terlihat  dari persam aan  ketidakpastiannya.  Pengujian  ini melibatkan beberapa reaksi sehingga secara teoritis memberikan total ketidakpastian dan penyimpangan analisis  kuantitatif  yang  cukup  besar.  Sebagai metodologi yang menerapkan aktivitas enzim terhadap substrat di mikrotiter, metode kolorimetri ELISA sangat sensitif terhadap perubahan. Variabilitas hasil uji dapat terjadi  sebagai  akibat  galat  kecil  dari  v olume mikropipet maupun perbedaan tahap pencucian antara perubahan dari larutan antibodi primer ke sekunder (Park, 2007). Walaupun interferensi dari faktor penguji dapat  diperdebatkan,  namun  Vosikis et  al. (2008) menemukan bahwa pada kadar lebih dari 50 ppm, penyimpangan  yang besar dari metode ELISA dapat terjadi karena keterbatasan enzim yang berada di kit pengujian.

## REKOMENDASI PENGUJIAN ANALISIS HISTAMIN UNTUK PRODUK PERIKANAN
Berdasarkan  analisis  di  atas,  diketahui  bahwa secara umum hasil uji  kelayakan terhadap metode- metode  analisis histamin selaras dengan perkiraan ketidakpastian secara teoritis dari masing-masing uji. Terlepas dari faktor kapabilitas analis dan reliabilitas instrumentasi  yang  digunakan,  maka  jika  akurasi menjadi pertimbangan utama, metodologi HPLC post - kolom derivatisasi adalah pilihan utama. Metode ini
memiliki  ketidakpastian  yang  relatif  lebih  kecil dibanding  metode  lainnya  serta  terbukti  memiliki akurasi  yang  tinggi  pada  uji  kelayakan  di  Eropa. Metode  HPLC pre -kolom  dan  CE  dapat  dijadikan alternatif  kedua  dari  sisi  akurasi  terkait  dengan pertimbangan investasi unit tambahan khusus untuk post -derivat pada metodologi yang pertama. Jika dana investasi  instrumentasi  menjadi  kendala,  metode fluorometrik dapat dijadikan sebagai alternatif lain.
Akan  tetapi,  faktor  kecepatan  pengujian  juga berperan penting. Jika waktu analisis menjadi faktor utama serta bekerja secara rutin untuk jumlah sampel yang besar, alternatif kombinasi antara metode ELISA dan HPLC layak dipertimbangkan. Faktor ELISA yang bekerja dengan skala kecil yaitu mikroliter dan 96 sampel  pada  satu  kali  pembacaan  detektor  akan sangat  m engoptim alkan  penggunaan  waktu. Walaupun penyimpangan  dan ketidakpastian secara teoritis cukup besar, namun berdasarkan Vosikis et al. (2008) yang menyatakan bahwa metodologi ELISA berkorelasi baik dengan HPLC di bawah konsentrasi histamin 50 ppm (di bawah limit legal), maka metode ini baik dijadikan pre-run kualitatif analisis rutin. Jika ditemukan sampel dengan konsentrasi histamin di atas limit, barulah sampel tersebut dianalisis secara kuantitatif menggunakan metode HPLC.

## KESIMPULAN
Hasil perbandingan menunjukkan bahwa baik dari sisi  ketidakpastian-penyimpangan    yang  mungkin ditimbulkan dari metodologinya serta hasil kelayakan laboratorium di Eropa, diusulkan bahwa metode HPLC derivatisasi post -kolom  merupakan  metode yang optimal saat ini untuk menentukan kadar  histamin secara kuantitatif. Akan tetapi, untuk pertimbangan efisiensi waktu, maka penggabungan metode ELISA kualitatif dan HPLC kuantitatif sangat baik dijadikan sebagai standar metodologi penentuan histamin di laboratorium analisis rutin produk perikanan.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonymous.    2006.  Proficiency    study    336-histamine report  No:ND-06-06. Check  Proficiency  Studies- 1380-SI. The  Food  and  Constumer  Product  Safety Authiority-Nedherlands.  p.  4–10.
Anonymous.  2008.  Instructions  for  use  histamine  food ELISA  enzyme  immunoassay  for  the  quantitative  de- termination  of histamine  in  fish  meal, fresh  fish,  milk, cheese,  sausage  and  wine. Biosource  references.
Ref 10-3100.  Biosource  Eropa SA.  p.  3–5. Hadi,  H.  2007. Pemahaman  dan  Penerapan  ISO/IEC 17025:2005:  Pers yaratan  Umum  Kompetens i Laboratorium Pengujian dan Laboratorium Kalibrasi.
Gramedia  Pustaka  Utama.
Horwitz, W. 1990. AOAC- Association of Official Analytical Chemists PO  Box  540,  Benjamin  Franklin  Station Washington, DC 20044., ed 15th ., 531  pp.
Januar, H.I., Wikanta, T., Dwiyitno., Priyatno, N., Siregar, T.H.,  Munifah,  I.,  dan  Iswani,  S.  2008.  Uji  reabilitas analisis histamin pada instrumentasi spektrofluorometri. Laporan  Teknis  Laboratorium Instrumentas i  Ta hun  2008. Balai  Besar  Riset Pengolahan  Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan  dan Perikanan.  Badan  Riset  Kelautan  dan  Perikanan. Jakarta.  p.  8–10.
Kaneko,    J.  2000a.    Development  of  a  HAACP-based strategy for the control of histamine for the fresh tuna industry. NOAA  Fisheres  Grant  Project  Report .  Na- tional  Marine  Fisheries  Services,  USA.  48  pp.
Kaneko,  J.  2000b.    Sensory    Judgments    as    Critical
Control  Points  for  Histamine  Control  in  The  Fresh Tuna Industry. NOAA Fisheres Grant Project Report. National  Marine  Fisheries  Services,  USA.  3  pp.
Ma,  H.,  Shieh,  K-J.,  and  Lee,  S-L.  2006. Application  of ELISA technique. Nature and Science (42),  2006. Moreno,  R.B.  and  Torres,  E.A.  2001.  Histamine  Level  in Fresh  Fish–A  Quality  Index.  Session  42,  Seafood Tech-Safety  Processing. IFT  Annual  Meeting ,  New Orleans,  Lusiana.  p.  4–42.
Park ,  J .  2007.  Beta-Amyloid  (1–40)  and  (1–42)
Colorimetrik  ELISA  kits,  Himan  From  Invitrogen. The Buyer Guide fro Life  Scientist . www.biocompere.com .
Assessed   April  12,  2009.
Rogers, W. F. and Staruszkiewicz. 2000. Journal of Aquatic Food Product Technology , 9 (2) 2000 p. 5–17.
Romero,  R.,  Bagur,  M.G.,  Gazquez,  D.,  Sanchez-Vinas,
M.,  Cuadros-Rodrigues,    L.,  and  Ortega,  M.  2004. Estimation of  the  main source of uncertainty in chro- matographic  analysis:  determination  of  biogenic amines. LCGC  The  Application  Notebook:  Supple- ment To LCGC North America:June 2004, p. 95–103. Smela,  D.,  Pechova,  P.,  Komprada,  T.,  Kledjus,  B.,  and Kuban, V. 2003.  Liquid  chromatograpic  determina- tion  of  biogenic  amines  in  a  meat  product  during fermentation  and Long-term  storage. Chech  J.  Food Sci. Vol 21, (5): p. 167–175.
Tissue,  B.M.  1996.  Electrophoresis.  Online  Educational Hypermedia  –  Encyclopedia  of Analytical  Instrumen- tation. http://www.files.chem.vt.edu/chem-ed/sep/ electrop/  electrop.html .   Assessed   April  12,  2009. Trenerry, V.C., Marshall, P.A., and Windahl, K. 2000. De- termination  of  histamine  in  fish  by  CZE:  Methods Optimation. Algal Project, Research ad Development Report    Series .  Australian  Government  Analytical Laboratories.  p.  163–169.
Vo sikis,  V.,  Papageorgopoulou,  A.,  Economou,  V.,
Frillingos,  S., and Papadopoulou, C. 2008. Survey  of The  histamine  content  in  fish  samples  randomly selected from the Greek retail market. Journal of Food Aditives  and  Contaminant:  part  B 2008:  vol  1:2  p.
122–129.