## PENINGKATAN PERTUMBUHAN MIKROALGA Chaetoceros ceratosporum DAN Nannochloropsis oculata MENGGUNAKAN STRAIN BAKTERI TERSELEKSI PADA KULTUR SKALA TERKONTROL
Nengah Suriadyani # , Luh Yuliani Dewi, Kadek Mas Tantra, I Putu Arta Sudarsana, Kadek Ardika, Wiwin Adiwinata, Husen Husaeni, I Ketut Agus Sudarmayasa, dan Ahmad Muzaki
Kawasan Konservasi Ilmiah Biota Laut, Badan Riset dan Inovasi Nasional Banjar Gondol, Dusun Penyabangan, Kecamatan Gerogak, Kabupaten Buleleng, Bali
(Naskah diterima: 22 Mei 2024; Revisi final: 13 Juni 2024; Disetujui publikasi: 13 Juni 2024)

## ABSTRAK
Sejalan dengan peningkatan produksi budidaya perikanan, maka diperlukan intensifikasi produksi benih ikan atau udang. Di antara permasalahan yang dihadapi pembenih adalah ketersedian pakan alami ( microalgae ) yang memadai dan kontinu baik kualitas maupun kuantitas selama pemeliharaan larva. Upaya meningkatkan produksi mikroalga melalui pendekatan hubungan koeksistensi dan pemacuan pertumbuhan dengan memanfaatkan peran bakteri yang menguntungkan perlu dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan dan mengetahui efektivitas strain bakteri terseleksi yang mempunyai kemampuan menstimulasi pertumbuhan dalam meningkatkan pertumbuhan mikroalga pada kultur skala terkontrol. Pada penelitian ini digunakan mikroalga Chaetoceros ceratosporum dan Nannochloropsis oculata. Bakteri yang berasosiasi dalam kultur tersebut diisolasi, dilakukan screening , uji aktivitas sintesis enzimatik, karakterisasi, identifikasi, kultur, dan re-inokulasi pada kultur mikroalga.  Hasil yang diperoleh ada tujuh isolat bakteri dari C . ceratosporum dan delapan isolat dari N. oculata . Hasil uji aktivitas sintesis enzimatis ternyata hanya ada satu strain (kode CC-22) pada C . ceratosporum dan dua strain pada N. oculata (kode NN-5 dan NN-6) yang potensial menunjukkan peran stimulasi pertumbuhan mikroalga. Dengan pendekatan karakterisasi molekuler menggunakan 16SrRNA maka diperoleh Marinobacter vinifirmus CC22, Alteromonas sp. NN-5, dan Marinobacter hydrocarbonoclastic NN-6. Dari tiga strain bakteri yang terisolasi nampaknya hanya Marinobacter vinifirmus CC22 dan Alteromonas sp. NN-5 yang mempunyai sifat dapat memacu pertumbuhan C.  ceratosporum sebesar 1,76 kali (176 %) dan N. oculata sebesar 1,56 kali (156 %) dibandingkan dengan kontrol. Kedua strain bakteri ini menunjukkan potensi untuk meningkatkan kuantitas dan kualitas mikroalga serta berpeluang sebagai probiotic agent untuk menstimulasi pertumbuhan C. ceratosporum dan N. oculata .
KATA KUNCI: Chaetoceros ceratosporum ; mikroalga; Nannochloropsis oculata ; pertumbuhan; strain bakteri
ABSTRACT: Growth Enhancement of Microalgae Chaetoceros ceratosporum and Nannochloropsis oculata Using Selected Bacterial Strains in Controlled Culture Environments
#Korespondensi: Kawasan Konservasi Ilmiah Biota Laut, Badan Riset dan Inovasi Nasional Banjar Gondol, Dusun Penyabangan, Kecamatan Gerogak, Kabupaten Buleleng, Bali Email: suridimusi@gmail.com
The intensification of  fish and shrimp seed production is necessitated to support the ever growing global aquaculture production. One of the problems faced by most hatcheries is the unavailability of high quality and stable supply of live feed (microalgae) required during larval rearing. Efforts to increase microalgae production through a coexistence relationship approach and promoting growth by utilizing the role of beneficial bacteria need to be carried out. The aims of this study were to obtain and determine the effectiveness of selected bacterial strains that have the ability to stimulate microalgae growth in controlled culture environments. In this study, the microalgae Chaetoceros ceratosporum and Nannochloropsis oculata were used. Bacteria associated in the culture were isolated, screened, tested for enzymatic synthesis activity, characterization, identification, culture, and re-inoculation on microalgal cultures. The results obtained were seven bacterial isolates from C. ceratosporum and eight isolates from N. oculata . The results of the enzymatic synthesis activity test showed that there was only one strain (code CC-22) in C. ceratosporum and two strains in N. oculata (codes NN-5 and NN-6) which potentially showed a role in stimulating microalgae growth. With a molecular characterization approach using 16SrRNA, Marinobacter vinifirmus CC22, Alteromonas sp. NN-5, and Marinobacter hydrocarbonoclastic NN-6. From the three isolated bacterial strains, it appeared that only Marinobacter vinifirmus CC22 and Alteromonas sp. NN-5 had the property of being able to stimulate the growth of C. ceratosporum by 1.76 times (176%) and N. oculata by 1.56 times (156%) compared to the control. These two bacterial strains showed the potential to increase the quantity and quality of microalgae and had the opportunity to act as probiotic agents to stimulate the growth of C. ceratosporum and N. oculata .
KEYWORDS: bacterial strain; Chaetoceros ceratosporum ; growth; microalgae; Nannochloropsis oculata

## PENDAHULUAN
Mikroalga merupakan sumberdaya alam terbesar dan terperbarui untuk penyediaan komponen bernilai tinggi bagi kepentingan budidaya perikanan (akuakultur), peternakan, kesehatan, farmasi, dan minyak-gas. Dewasa ini, akuakultur merupakan salah satu industri yang berkembang pesat di dunia. Sejalan dengan peningkatan produksi budidaya perikanan di Indonesia, maka diperlukan intensifikasi produksi benih ikan atau udang. Permasalahan utama yang dihadapi dalam produksi benih adalah rendahnya sintasan pada saat pemeliharaan larva ikan atau udang. Hal ini sangat berhubungan dengan beberapa faktor, di antaranya kualitas telur, lingkungan pemeliharaan (mutu air dan mutu pakan buatan), infeksi penyakit, dan ketersediaan pakan alami yang memadai dan kontinu baik kualitas maupun kuantitas
selama pemeliharaan larva. Hal ini mengingat bahwa mikroalga merupakan pakan alami awal bagi larva. Pada umumnya mikroalga bersifat uniseluler, fototrof, dan berkembang biak di air tawar atau air laut. Hampir semua mikroorganisme fotosintetik tersebut menunjukkan peran sebagai sumberdaya biologis yang eksklusif dan berperan sangat luas untuk aplikasi akuakultur.
Upaya peningkatan produksi mikroalga melalui pendekatan hubungan koeksistensi dan pemacuan pertumbuhan dengan memanfaatkan peran bakteri yang menguntungkan perlu dilakukan. Peran bakteri dalam media pemeliharaan mikroalga dapat berfungsi sebagai pendekomposisi bahan organik dan memanfaatkan bahan organik terlarut, mengekresi senyawa nutrien esensial yang bermanfaat bagi pertumbuhan mikroalga, memberikan keseimbangan kondisi mikroorganisme dalam media
kultur, memproduksi substansi penghambat pertumbuhan bakteri patogen, dan berperan dalam kompetisi dengan mikroba lain yang merugikan (Cooper & Smith, 2015; Sureshkumar et al ., 2014; Torres-Maravilla, 2024). Di samping itu Saccardo et al. (2022) dan  Ma et al . (2020) menyatakan bahwa mikroalga pada akuakultur memberikan peran sebagai peneduh ( light shading ) pada media kultur larva, sumber pakan alami langsung, mengkondisikan mutu air, mengkondisikan pakan alami lainnya, mensuplai mikronutrien, dan sebagai immunostimulan serta kontrol mikroba.
Berbagai penelitian dan pengembangan produksi mikroalga untuk penyediaan pakan alami dalam produksi benih ikan dan udang telah dilakukan, meliputi teknik kultur dalam berbagai skala produksi, optimasi kondisi lingkungan kultur, optimasi kepadatan awal kultur, dan optimasi nutrien (Sofiyah et al., 2021; Tan et al. , 2020). Selain itu, di antara stimulasi yang pernah dilakukan adalah penyinaran dengan intensitas cahaya tinggi (Farahin et al. , 2021; Metsoviti et al ., 2019; Prasetyo, 2022), penyinaran UV dengan waktu eksposur singkat, penggunaan CO 2 (Cardias, 2023) serta penggunaan NaCl dan Fe 2+ (Polat et al ., 2020).
Namun demikian, kultur mikroalga seringkali masih mengalami kegagalan, di antaranya jumlah kepadatan sel yang rendah, umur kultur yang pendek sehingga dengan cepat mikroalga mengalami kematian, dan kualitas sel yang rendah (kandungan nutrisi, pigmentasi, dinding sel keropos, dan sel mengalami penggumpalan). Studi penggunaan bakteri untuk pemacuan pertumbuhan mikroalga belum banyak dilakukan di Indonesia, sementara biodiversitas bakteri sangat kaya untuk diungkap perannya sebagai bakteri yang menguntungkan dalam kultur mikroalga. Dengan demikian nampaknya penggunaan bakteri dapat dijadikan alternatif dalam memperbaiki teknik kultur mikroalga, terutama dalam meningkatkan pertumbuhan dan produktivitas mikroalga.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan dan mengetahui efektivitas strain bakteri terseleksi yang mempunyai kemampuan menstimulasi pertumbuhan dalam meningkatkan pertumbuhan mikroalga pada kultur skala terkontrol, sehingga diperoleh kualitas dan kuantitas sel dan produktivitas mikroalga yang baik. Ke depan diharapkan penelitian ini dapat menjadi sumber pengetahuan untuk meningkatkan produksi mikroalga melalui penggunaan strain bakteri sebagai agen probiotik.

## BAHAN DAN METODE
Penyediaan Mikroalga Uji melalui Kultur pada Agar Plate
Mikroalga Chaetoceros ceratosporum dan Nannochloropsis oculata yang digunakan sebagai mikroalga uji merupakan biakan hasil kultur murni di Laboratorium Kawasan Konservasi Ilmiah Biota Laut-Gondol, Badan Riset dan Inovasi Nasional. Biakan mikroalga dikultur dalam media agar (Nacalai Tesque, Cat No. 01028-85) dengan konsentrasi 1,5% dan penambahan pupuk seperti tertera pada Tabel 1. Penyiapan media agar dilakukan dengan metoda steaming . Larutan agar dalam flash glass direndamkan dalam air mendidih (dalam panci) dan selalu dikocok hingga larutan agar yang keruh menjadi bening. Hal ini untuk menghindari terdegradasinya unsur hara dalam larutan media tumbuh.  Biakan mikroalga yang tumbuh di media agar, selanjutnya dibiakkan lagi dalam media cair. Pengambilan biakan mikroalga dilakukan dengan jarum ose dan dimasukkan ke dalam test tube berisi media tumbuh cair volume 10 mL. Kultur  selanjutnya diperbesar hingga mencapai volume yang dikehendaki.
Biakan mikroalga selanjutnya diinkubasi atau dikultur dalam ruangan dengan intensitas cahaya berkisar 2.000-2.500 lux, suhu 23- 24°C selama 7 hari. Secara bertingkat biakan mikroalga dari volume 10 mL ( test tube ) diperbesar hingga volume 100 mL. Pada kultur ini tidak dilengkapi dengan aerasi, namun
hanya melalui pengocokan setiap hari (pagi dan sore). Apabila kultur mikroalga sudah tumbuh, maka biakan ini dijadikan inokulan pada kultur volume 1.000 mL. Pada kultur ini dilengkapi aerasi yang telah melalui filtrasi dengan ukuran 0,45 µm. Mikroalga yang digunakan adalah C. ceratosporum (diatom) dan N. oculata (nondiatom). Wadah yang digunakan dalam penelitian ini adalah flash glass volume 1 L masing-masing dengan tiga ulangan.

## Koleksi Isolat Bakteri
Isolat bakteri dikoleksi dari sumber media kultur mikroalga diatom ( C. ceratosporum ), dan nondiatom ( N. oculata ) baik skala kecil atau massal, kemudian ditumbuhkan pada petridish yang berisi marine agar 2216 E (Difco, Cat No . 8079517). Sampel air media kultur disebar pada petridish . Selanjutnya bakteri akan tumbuh setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 25 ° C. Setiap petridish dipilih 3-5 koloni berdasarkan bentuk, warna, dan ukuran, selanjutnya dipurifikasi tiga kali, hingga diperoleh koloni tunggal yang murni. Biakan strain bakteri ini selanjutnya disimpan dalam marine agar miring untuk uji selanjutnya. Di samping itu juga dilakukan pengkulturan dalam media TCBS ( thiosulphate citrate bile salts ) agar bagi semua isolat hasil isolasi. Media TCBS agar merupakan media yang spesifik untuk pertumbuhan strain Vibrio . Dalam penelitian ini strain bakteri dari kelompok Vibrio tidak dipilih sebagai kandidat strain bakteri pemacu pertumbuhan mikroalga.

## Karakterisasi dan Identifikasi Isolat Bakteri
Kandidat probiotik dari isolat bakteri yang mempunyai potensi kemampuan pemacu pertumbuhan mikroalga diuji sifat biologis dan fisiologisnya untuk mengetahui karakteristik dari bakteri tersebut. Langkah awal dalam karakterisasi dan identifikasi dilakukan screening terhadap isolat bakteri hasil purifikasi dengan isolasi DNA, menggunakan Presto
Mini gDNA Bakteria Kit (Genaid, Cat No. GBB100). Ekstraksi DNA mengikuti protokol yang tersedia dari kit tersebut.  Genom DNA hasil ekstraksi selanjutnya diamplifikasi PCR menggunakan metode RAPD ( random amplification polymorphism DNA ) fingerprint untuk mengetahui performansi fragmentasi DNA. Analisis fingerprint menggunakan universal primer 2 AAM2 (5’-CTG CGA CCC AGA GCG G -3’) dalam speedy cycle PCR. Amplikon yang diperoleh difragmentasi dengan agarose gel 1,8 % dalam 1 x TBE. Hasil fragmentasi DNA didokumentasikan dengan gel doc (Vilber- Quantum). Dalam screening ini, isolat bakteri yang mempunyai susunan fragment DNA yang sama hanya dipilih satu strain saja, sehingga hanya isolat bakteri yang mempunyai profil fragmentasi berbeda antarisolat yang akan digunakan untuk uji selanjutnya.
Langkah  selanjutnya  adalah mengamplifikasi genom DNA hasil screening yang terpilih dengan PCR menggunakan pasangan primer 27F (‘5 AGAGTTTGA TCC TGG CTC AG-3’) dan 1492 R (5’-ACG GYT ACC TTG TTA CGA CTT-3’) (Haryanti, 2002). Amplikon DNA yang diperoleh selanjutnya difragmentasi dengan agarose gel 1,5 % dalam 1 x TBE buffer . Hasil fragmentasi DNA didokumentasikan dengan gel doc (Ultraviolet Vilber-Quantum CX5).
Identifikasi pada tingkat molekuler (DNA) dilakukan dengan sequencing susunan nukleotida DNA mengikuti metode Sambrook et al . (1989). Amplikon DNA yang diperoleh selanjutnya diidentifikasi dengan metoda Sanger Sequencing . Sequencing dilakukan dengan menggunakan jasa perusahaan komersial. Hasil sequencing selanjutnya dilakukan BLAST-N dalam NCBI GenBank.
Aktivitas Enzimatik dari Produk Ekstraseluler Strain Bakteri
Uji aktivitas enzimatik meliputi lipase, gelatinase, amilase, urease, casease, lecitinase, dan kitinase dilakukan terhadap isolat bakteri
kandidat probiotik untuk mikroalga yang sudah terseleksi. Isolat bakteri diuji aktivitas enzimatiknya melalui ECP ( extra cellular product ) dengan metode pelat chelofan. Chelofan steril diletakkan di atas permukaan marine 2216E agar dalam petridish dan diinokulasikan biakan bakteri ( spreading ) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 25ºC. ECP yang ada di permukaan selofan dicuci dengan larutan buffer PBS, pH 7,0. Suspensi disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4ºC. Supernatan yang diperoleh disaring secara steril dengan membran filter 0,22 um (Dismic Filter). Aktivitas enzim gelatinase, casease, amilase, lecitinase, lipase, urease, dan kitinase diuji dengan tabung silinder kecil yang diletakkan pada permukaan plate agar . Media agar  2% yang masing-masing mengandung 0.4% gelatin, 0,4% casein, 0,2% starch , 2.5 % egg yolk , 1% Tween 80, 2% urea, dan 2% phenol red disiapkan untuk menguji adanya aktivitas enzimatik tersebut. Pengujian dilakukan dengan meletakkan tabung silinder di atas masing-masing agar, diisi dengan 200 µL filtrat ECP. Dengan indikator adanya gambaran zona
jernih pada sekitar tabung silinder, maka dapat diketahui aktivitas enzimatik produk kandidat probiotiik dari isolat bakteri tersebut. Semakin luas gambaran zona jernih, semakin aktif daya hidrolisis enzim pada substrat agar dengan masing-masing kandungan nutrien.
Kultur Strain Bakteri Terseleksi
Strain bakteri terpilih yang positif menunjukkan kemampuan peran sebagai pemacu pertumbuhan mikroalga, dikultur dengan nutrient marine broth -2216 (Difco, Cat No. 9142906) hingga mencapai kepadatan 10 9-10 CFU mL -1 . Metode pengkulturan bakteri mengikuti metode Nogami & Maeda (1992). Bila bakteri bersifat aerob diperlukan aerasi untuk memacu pertumbuhannya. Media kultur bakteri harus disterilkan dengan sterilisasi basah ( autoclave )  pada suhu 121 ° C selama 15 menit. Kultur bakteri menggunakan wadah flask glass volume 300 mL diulang dua kali. Wadah kultur dilengkapi aerasi dengan Dismic Fiter size pore 0,22 µm untuk mencegah kontaminasi bakteri dari udara. Lama kultur 96
Bahan kimia Chemicals Konsentrasi Concentration Chaetoceros ceratosporum Nannochloropsis oculata NaNO 3 100 g L -1 3 mL Na 2 HPO 4 14 g L -1 1 mL Na 2 SiO 3 5 g L -1 1 mL Clewat-32 100 g L -1 1 mL 3 mL
Vitamin mix (Thiamin: 1 g  L -1 ; Vitamin B12: 0,2 g L -1 ; Vitamin H: 0,2 g L -1 1 mL 1 mL Larutan-A: KNO 3
A-solution: KNO 3
202 g L -1 2 mL
Larutan-B: HCl: Na 2 HPO 4 : 50 g L -1 ; CaCL 2 H 2 O: 33,5 g L -1 B-solution: HCl: Na 2 HPO 4 : 50 g L -1 ; CaCL 2 H 2 O: 33,5 g L -1 14 mL L -1 1 mL
Tabel 1. Komposisi nutrien untuk kultur mikroalga Chaetoceros ceratosporum dan Nannochloropsis oculata pada volume skala terkontrol (1000 mL)
Table 1 . Nutrient composition for Chaetoceros ceratosporum and Nannochloropsis oculata microalgae culture at controlled scale volume (1000 mL)
jam dengan interval waktu pengamatan setiap 24 jam. Penghitungan kerapatan sel bakteri menggunakan spektrofotometer dengan OD ( optical density ) 620 nm.
Penggunaan Strain Bakteri Terpilih untuk Pertumbuhan Mikroalga Skala Terkontrol
Biakan bakteri terpilih yang mempunyai kemampuan untuk memacu pertumbuhan mikroalga digunakan dalam media kultur mikroalga dengan kepadatan 10 4 CFU mL -1 . Selama aplikasi bakteri, air media kultur ditambahkan nutrient makro dan mikro sesuai metode yang ada (Haryanti, 2002). Hal ini untuk memaksimalkan pertumbuhan mikroalga dan kerja stimulasi bakteri. Pengujian dilakukan pada kultur C. ceratosporum dan N. oculata . Inokulasi bakteri diberikan pada awal pengkulturan mikroalga ( lag fase ) dan kepadatan sel mikroalga di amati setiap 2 hari sekali.

## Analisis Data
Data hasil penelitian meliputi kepadatan mikroalga, kepadatan bakteri spesifik, uji aktivitas enzimatis, disajikan dalam bentuk grafik dan dalam bentuk tabel. Adanya perbedaan dibahas secara deskriptif.

## HASIL DAN BAHASAN

## Kultur Mikroalga dalam Media Agar
Hasil pengkulturan C. ceratosporum dan N. oculata dalam media agar (Gambar 1A dan B) menunjukkan pertumbuhan yang baik tanpa ada kontaminasi bakteri pada media kultur. Hal ini dapat dipahami bahwa kandungan agar yang digunakan sebagai media tumbuh terdiri dari sulfat (SO 4 ), Fe, kalsium (Ca) masing- masing sebesar 1,5%, 0,015%, dan 1,0%, tanpa ada kandungan protein, lipid atau karbohidrat dan ditambahkan makro dan mikronutrien sebagai pupuk untuk tumbuhnya mikroalga, sehingga bakteri tidak dapat tumbuh.

## Isolat Bakteri dari Kultur Mikroalga
Isolat bakteri diambil dari media biakan kultur C. ceratosporum dan N. oculata skala kecil (1 m 3 ). Kepadatan sel mikroalga, sel bakteri, dan performa koloni yang diperoleh tertera pada Tabel 1. Sementara itu, pengambilan sampel bakteri pada wadah kultur C. ceratosporum dan N. oculata skala besar (5 m 3 ) tersaji dalam Tabel 2. Dari isolat bakteri yang ada, selanjutnya diseleksi berdasarkan pada ukuran koloni, warna, dan bentuk yang berbeda. Hasil seleksi tersebut diperoleh 23 isolat bakteri yang berasal dari media kultur N. oculata dan 14 isolat bakteri dari media kultur C. ceratosporum.
Gambar 1. Biakan mikroalga. (A) Chaetoceros ceratosporum dan (B) Nannochloropsis oculata pada media agar dalam petri-dish Figure 1.  Microalgae culture. (A) Chaetoceros ceratosporum and (B) Nannochloropsis oculata on agar media in petri-dishes
A B
Secara keseluruhan diperoleh 37 isolat bakteri yang telah dipurifikasi.
Pada Tabel 2 terlihat bahwa kepadatan sel mikroalga, C. ceratosporum dan N. oculata pada wadah 1 m 3 sangat tinggi dan diikuti dengan adanya populasi bakteri dengan ukuran dan performa yang berbeda (koloni besar dan kecil), masing-masing dengan kepadatan antara 61 x 10 2 CFU mL -1 dan 6-84 x 10 4 CFU mL -1 . Hal ini jelas menunjukkan bahwa ada korelasi yang nyata dari koeksistensi bakteri dalam membantu pertumbuhan mikroalga.
Hal yang berbeda dengan kultur massal mikroalga yang terlihat pada Tabel 3. Nampak bahwa kepadatan bakteri pada kultur massal mikroalga ( N. oculata ) sangat rendah (6 x 10 2 hingga 2,7 x 10 3 CFU mL -1 ). Di samping itu pada kultur massal tersebut banyak dijumpai performansi bakteri yang tumbuh melayang dalam marine 2216E agar . Karakter koloni melayang ini banyak mengindikasikan dari kelompok bakteri Vibrio sp. Sementara pada kultur massal C. ceratosporum , populasi bakteri berkisar 9-30 x 10 2 CFU mL -1 , namun tidak diperoleh bakteri melayang dalam populasinya.
Karakterisasi dan Identifikasi Isolat Bakteri Hasil Isolasi dari Media Kultur Mikroalga Isolat bakteri yang telah diisolasi dan dipurifikasi dilakukan screening berikutnya dan diidentifikasi dengan metode molekuler DNA yaitu dengan RAPD fingerprint . Hal ini dimaksudkan untuk menghindari kesamaan
dari jenis strain hasil isolasi dan purifikasi sebelumnya. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa dari 37 isolat bakteri terdapat 22 isolat bakteri adalah Vibrio , sedangkan yang 15 isolat adalah bakteri non- Vibrio .  Performansi fragmentasi DNA masing-masing isolat bakteri hasil RAPD fingerprint terlihat pada Gambar 2. Hasil  pemilihan isolat bakteri berdasarkan pada hasil RAPD fingerprint yang mempunyai karakter susunan fragmen berbeda menunjukkan bahwa bakteri tersebut berpeluang sebagai kandidat bakteri probiotik spesifik. Pada C. ceratosporum ada tujuh strain (kode CP-18, CP-20, CC-21, CC-22, CC-7, CCG, dan CCI),  sedangkan untuk N. oculata terdapat delapan strain bakteri dengan kode: KD-4, KD- 14, KD-15, KD-16, NN-5, NN-6, MS-9, dan MS- 10. Semua strain bakteri tersebut selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas sintesis enzimatik dari ECP.

## Aktivitas Enzimatik Produk Ekstraseluler Bakteri Terseleksi  pada  Kultur Mikroalga
Hasil pengujian terhadap aktivitas enzimatik dari produk ekstraseluler tujuh strain bakteri dari kultur C. ceratosporum dan delapan strain bakteri pada kultur N. oculata , ternyata bahwa bakteri dengan kode CC-22, NN-5, dan NN-6 menunjukkan aktivitas enzimatik dengan nilai yang sama dan mempunyai reaksi positif sintesis daripada yang lain. Hal ini terlihat dari
Jenis mikroalga Species of microalgae
Kepadatan sel mikroalga
(x 10 4 sel mL -1 ) Cells density of microalgae (x 10 4 cells mL -1 )
Kepadatan sel bakteri (x 10 2 CFU mL -1 ) Cells density of bacteria (x 10 2 CFU mL -1 ) Keterangan Remarks Chaetoceros ceratosporum 1330 61 Koloni bening kecil Small clear colony Nannochloropsis oculata 2275 84 Koloni putih kecil White small colony 6 Koloni putih besar White big colony
Tabel 2 . Kepadatan sel mikroalga, bakteri, dan performa koloni pada kultur skala kecil  (1 m 3 ) Chaetoceros ceratosporum dan Nannochloropsis oculata Table 2. The density of microalgae, bacteria, and performance of cells colony on small scale culture (1 m 3 ) of Chaetoceros ceratosporum and Nannochloropsis oculata
Gambar 2. Keragaan fragmentasi amplikon DNA hasil amplifikasi PCR dari isolat bakteri yang telah dipurifikasi. M: marker 100 bp ladder Figure 2.  Performance of DNA amplicon fragmentation of PCR amplification from purified bacterial isolates. M: 100 bp ladder marker
Tabel 3. Kepadatan sel mikroalga, bakteri, dan performa koloni pada media kultur skala besar Chaetoceros ceratosporum dan Nannochloropsis oculata Table 3. Density of microalgae, bacteria, and performance of cells colony on big scale culture of Chaetoceros ceratosporum and Nannochloropsis oculata
Kode bak Tank codes Kepadatan sel mikroalga (x10 4 sel mL -1 ) Cells density of microalgae (x10 4 cells mL -1 ) Kepadatan bakteri (x 10 2 CFU mL -1 ) The cell density of bacteria (x 10 2 CFU mL -1 ) Keterangan Remarks
KD Nannochloropsis oculata 1.025 27
16
Tidak terhitung Uncountable Koloni putih besar
Wide white colony Koloni putih kecil Small white colony
Koloni melayang Swimming colony SH Nannochloropsis oculata 1.400 6 Tidak terhitung Uncountable Koloni putih besar Wide white colony Koloni melayang Swimming colony SP-1 Chaetoceros ceratosporum 810 30 20 Koloni putih besar Wide white colony
Koloni putih kecil Small white colony SP-2 Chaetoceros ceratosporum 10.800 14 9 Koloni putih besar Wide white colony Koloni putih kecil Small white colony
kemampuan bakteri dalam menghidrolisis casein (casease), starch (amilase), Tween-80 (lipase), dan urea (urease) (Tabel 4). Produk enzimatik dari bakteri tersebut diekspresikan dengan adanya gambaran zona jernih di sekitar pipa silinder pada agar. Nampaknya, produk ekstraseluler yang berupa enzim casease, amilase, lipase, dan urease merupakan sumber nutrisi baru bagi mikroalga untuk pertumbuhan dan pembelahan sel. Adanya produk enzimatik yang dihasilkan dari bakteri yang ditambahkan dalam kultur mikroalga berakibat pada peningkatan kepadatan sel dan  metabolisme dalam menjaga fase stasioner yang lebih lama. Proses-proses metabolisme dalam sel mikroalga meliputi biosintesis (anabolisme) dan degradasi (katabolisme) dilakukan secara enzimatis dengan bantuan suatu enzim dan carrier system .
Hasil  identifikasi tiga isolat bakteri terseleksi untuk mikroalga melalui sequencing susunan nucleotida dan dilakukan Blast-N menunjukkan bahwa kemiripan yang tinggi (97,07-99%) antara sampel yang dianalisis dengan sequence DNA pada masing-masing nomor aksesi di GenBank. Nilai similaritas bakteri hasil Blast-N disajikan pada Tabel 5. Hasil sequencing tersebut selanjutnya merupakan nama strain bakteri masing- masing sesuai hasil yang sudah teridentifikasi yaitu Marinobacter vinifirmus strain CC-22, Alteromonas sp. strain NN-5, dan Marinobacter hydrocarbonoclastic strain NN-6.
Kultur Strain Bakteri Terseleksi
Dari hasil uji aktivitas enzimatik menunjukkan ada satu strain bakteri ( Marinobacter vinifirmus strain CC-22) dari
Kode bakteri
Bacteria codes Sintesis enzimatik Enzymatic synthesis Gelatinase Casease Amilase Amylase Lecitinase Lecithinase Lipase Urease Kitinase Chitinase Chaetoceros ceratosporum CP-18 + - - - + - - CP-20 - - + + - - - CC-21 + - - - + - - CC-22 - + + - + + - CC-7 - - + + - - - CCG - - + + - - - CCI + - - - + - - Nannochloropsis oculata KD-4 - + - - + - - KD-14 + - - - + - - KD-15 - + - - + - - KD-16 + - - - + - - NN-5 - + + - + + - KN-6 - + + - + + - MS-9 - - + + - - - MS-10 - + - - + - -
Tabel 4.  Aktivitas enzimatik dari produk ekstra seluler bakteri terseleksi pada kultur Chaetoceros ceratosporum dan Nannochloropsis oculata Table 4. Enzymatic activity of extra cellular product of selected bacteria strains on Chaetoceros ceratosporum and Nannochloropsis oculata culture
Tabel 5. Similaritas sekuen DNA dari strain bakteri terseleksi pada kultur mikroalga dibandingkan dengan total sekuen gen pada GeneBank dengan masing-masing nomor aksesi Table 5. Similarity of DNA sequence isolated from selected bacteria strains in microalgae culture compared of total gene sequence on GenBank from each accession number
Code samples Description strain Percentage similarity (max identity) Accession Forward Reverse CC-22 Marinobacter vinifirmus 98.0 % 97.07 % KT4280429.1 NN-5 Alteromonas sp. 99.0 % 98.0 % JQ309925.1 NN-6 Marinobacter hydrocarbonoclastic 98.0 % 99.0 % JQ799112.1
media kultur C. ceratosporum dan dua strain bakteri  ( Alteromonas sp. strain NN5, Marinobacter hydrocarbonoclastic strain NN- 6) dari N. oculata .  Pengkulturan tiga isolat bakteri tersebut menunjukkan kepadatan sel yang berbeda dalam waktu 96 jam inkubasi (Gambar 3). Kepadatan populasi bakteri pada 48 jam merupakan kepadatan tertinggi. Pada isolat M. vinifirmus strain CC 22 diperoleh kepadatan 14 x 10 8 CFU mL -1 (nilai OD 0,08), sedangkan untuk kepadatan isolat Alteromonas sp. strain NN5 dan M. hydrocarbonoclastic strain NN-6  masing-masing sebesar 78 x 10 10 CFU mL -1 (nilai OD 0,10) dan 25x10 9 CFU mL -1 (nilai OD 0,09). Kepadatan bakteri yang dikultur dalam flask glass (300 mL) masih menunjukkan kepadatan normal, karena pada kultur bakteri tersebut dilengkapi aerasi dengan Dismic Filter size pore 0,22 µm.
Penggunaan Strain Bakteri Terseleksi untuk Pertumbuhan Mikroalga
Hasil pengujian isolat bakteri M. vinifirmus strain CC-22 dengan kepadatan 10 4 CFU mL -1 dalam kultur C. ceratosporum volume 1000 mL menunjukkan hasil seperti tertera pada Gambar 4A. Pada perlakuan kontrol tidak ditambahkan isolat bakteri. Pengamatan terhadap populasi bakteri yang ada dalam media kultur disajikan pada Gambar 4B. Nampak bahwa pemberian bakteri M. vinifirmus strain CC-22 dengan kepadatan 10 4 CFU mL -1 dapat memberikan
performansi pertumbuhan C. ceratosporum yang lebih baik dan kepadatan sel yang lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (tanpa pemberian bakteri). Kepadatan C. ceratosporum dengan pemberian strain bakteri M. vinifirmus strain CC-22 dapat mencapai kepadatan tinggi (14,79 x 10 6 sel mL -1 ). Sementara kepadatan C. ceratosporum pada kontrol relatif rendah 8,38 x 10 6 sel mL -1 . Nampaknya, strain bakteri M. vinifirmus strain CC-22 dapat menjadi kandidat strain bakteri spesifik yang berperan sebagai probiotic agent untuk memacu pertumbuhan mikroalga C. ceratosporum. Hasil pengamatan pertumbuhan strain bakteri di dalam media kultur C. ceratosporum menunjukkan adanya korelasi positif keberadaan bakteri dengan kepadatan mikroalga. Hal yang sama bila dibandingkan dengan kontrol (tanpa bakteri M. vinifirmus strain CC-22) maka populasi sel C. ceratosporum dan bakteri dalam media kultur  juga rendah.
Interaksi antara mikroalga dan bakteri umumnya mencakup berbagai macam simbiosis kemitraan, termasuk mutualisme, hubungan biologis yaitu dua pihak atau lebih berasal dari spesies yang berbeda saling memfasilitasi satu sama lain untuk pertumbuhan dan perkembangan (Cooper & Smith, 2015; Ramanan et al ., 2016). Secara umum, mikroalga melepaskan bahan organik terlarut ( dissolved organic matter ) yang digunakan bakteri sebagai sumber energinya. Bakteri, pada gilirannya, melakukan remineralisasi nutrisi
Gambar 3. Kepadatan sel dari tiga  isolat bakteri terseleksi Marinobacter vinifirmus strain CC-22, Alteromonas sp. strain NN-5, dan Marinobacter hydrocarbonoclastic strain NN-6 yang diukur dengan spektrofotometer pada optical density 620 nm
Figure 3. Cell density from three selected bacteria isolates Marinobacter vinifirmus strain CC-22, Alteromonas sp. strain NN-5, dan Marinobacter hydrocarbonoclastic strain NN-6 measured by spectrophotometer with an optical density of 620 nm
organik menjadi bentuk anorganik, agar mikroalga dapat memanfaatkannya. Dalam kasus mutualisme, suatu bakteri memberikan manfaat senyawa seperti vitamin B12 hingga mikroalga bermitra dengan imbalan karbon yang tetap tersedia (Grossman, 2016; Nef et al ., 2022).
Hasil pengamatan pada kultur C.
ceratosporum , terdapat kecenderungan kesamaan pertumbuhan pada awal kultur antara perlakuan kontrol (tanpa penambahan bakteri M. vinifirmus strain CC-22) dan perlakuan penambahan strain bakteri M. vinifirmus strain CC-22. Hal ini terlihat adanya persamaan pertumbuhan pada fase lag yaitu pada inkubasi selama 2 hari. Pada
Gambar 4. Pola pertumbuhan Chaetoceros ceratosporum yang ditambahkan strain bakteri Marinobacter vinifirmus strain CC-22 (A) dan pola pertumbuhan bakteri Marinobacter vinifirmus strain CC-22 (B) dalam media kultur mikroalga
Figure 4.   Growth pattern of Chaetoceros ceratosporum with supplementation of specific probiotic bacteria Marinobacter vinifirmus strain CC-22 (A) and growth pattern of bacteria Marinobacter vinifirmus strain CC-22 to the culture media
fase eksponensial dan stasioner hingga fase kematian, kedua perlakuan menunjukkan laju pertumbuhan yang berbeda. Jumlah sel terbanyak pada perlakuan pemberian M. vinifirmus strain CC-22 adalah 14,79 x 10 6 sel mL -1 , sedangkan pada kontrol hanya 8,38 x 10 6 sel mL -1 . Persentase peningkatan kepadatan sel pada kultur C. ceratosporum dengan penambahan strain bakteri M. vinifirmus CC-22 sebesar 176% atau ada peningkatan kepadatan sel 1,76 kali dibandingkan dengan kontrol. Pengamatan terhadap performansi sel C. ceratosporum menunjukkan kualitas sel yang sehat (kandungan nutrisi, pigmentasi, dinding sel tidak keropos, dan sel tidak mengalami penggumpalan), kepadatan sel tinggi, umur fase stasioner pada kultur relatif lama (4 hari). Studi penggunaan bakteri untuk pemacuan pertumbuhan C. ceratosporum diharapkan dapat menstimulasi pertumbuhan mikroalga. Biodiversitas bakteri yang sangat kaya untuk diungkap perannya sebagai bakteri yang menguntungkan dalam kultur mikroalga akan dapat memberikan keuntungan. Dengan demikian nampaknya penggunaan bakteri dapat dijadikan alternatif dalam memperbaiki
teknik pengkulturan mikroalga, terutama dalam meningkatkan pertumbuhan dan produktivitas mikroalga.
Hasil pengujian isolat bakteri Alteromonas sp. strain NN-5 dan M. hydrocarbonoclastic strain NN-6  dengan kepadatan 10 4 CFU mL -1 dalam kultur N. oculata volume 1000 mL menunjukkan hasil seperti tertera pada Gambar 5. Pada perlakuan kontrol tidak ditambahkan isolat bakteri.  Nampak bahwa pemberian strain bakteri, menunjukkan perbedaan pertumbuhan yang signifikan. Hal ini mungkin kemampuan isolat bakteri Alteromonas sp. strain NN-5 dan M. hydrocarbonoclastic strain NN-6 berbeda dalam melakukan peran mengurai secara enzimatik terhadap protein, karbohidrat, lipid, dan urea. Walaupun  dengan kepadatan bakteri yang sama, namun M. hydrocarbonoclastic strain NN-6 tidak efektif dalam menstimulasi pertumbuhan mikroalga N. oculata . Pada kontrol, kepadatan mikroalga cenderung lebih rendah tanpa adanya penambahan strain bakteri. Pemberian bakteri Alteromonas sp. strain NN-5 dan M. hydrocarbonoclastic strain NN-6 dengan kepadatan 10 4 CFU mL -1 , nampak ada kecenderungan perbedaan pertumbuhan N. oculata.
Gambar 5. Pola pertumbuhan Nannochloropsis oculata yang ditambahkan isolat bakteri Alteromonas sp. strain NN-5 dan Marinobacter hydrocarbonoclastic strain NN-6 (A) dan pola pertumbuhan bakteri Alteromonas sp. strain NN-5 dan Marinobacter hydrocarbonoclastic strain NN-6 (B) dalam media kultur mikroalga
Figure 5.     Growth  pattern  of Nannochloropsis oculata with supplementation of selected bacteria Alteromonas sp. strain NN-5 and Marinobacter hydrocarbonoclastic strain NN-6 (A) and growth pattern of bacteria Alteromonas sp. strain NN-5 and Marinobacter hydrocarbonoclastic strain NN-6 (B) in the culture media of microalgae
Hingga hari ke-8 kepadatan N. oculata masih stabil tumbuh dengan suplementasi Alteromonas sp. strain NN-5, sedangkan pada M. hydrocarbonoclastic strain NN-6 dan kontrol sudah menunjukkan penurunan. Pada kultur mikroalga N. oculata volume 1000 mL nampak jelas stimulasi bakteri Alteromonas sp. strain NN-5 bagi pertumbuhan, dibandingkan dengan M. hydrocarbonoclastic strain NN-6 dan kontrol. Dengan demikian, ada peluang bahwa isolat bakteri Alteromonas sp. strain NN-5 dapat dijadikan strain bakteri spesifik sebagai probiotic agent dalam pemacuan pertumbuhan N. oculata skala terkontrol.
Hasil pengamatan pada kultur N. oculata , terlihat bahwa pertumbuhan pada fase lag dicapai pada hari kedua untuk tiap perlakuan. Fase eksponensial dan stasioner relatif lebih panjang dengan penambahan Alteromonas sp. strain NN-5  yaitu sejak hari  ke-4 hingga 8. Hal ini dapat terjadi diduga karena sel-sel N. oculata memasuki periode kriptik, yaitu sel-sel yang masih hidup memanfaatkan tambahan nutrisi dari sel-sel mikroalga yang telah lisis dan ketersediaan produk ekstraseluler yang dihasilkan oleh bakteri spesifik Alteromonas sp. strain NN-5 untuk pertumbuhannya. Kepadatan sel tertinggi pada penambahan bakteri Alteromonas sp. strain NN-5 adalah 18,5 x 10 6 sel mL -1 , pada M. hydrocarbonoclastic NN-6 dan kontrol masing-masing sebanyak 13,45 x 10 6 sel mL -1 dan 11,02 x 10 6 sel mL - 1 . Persentase peningkatan kepadatan sel pada kultur N. oculata dengan penambahan bakteri Alteromonas sp. strain NN-5 sebesar 156%, sedangkan dengan penambahan bakteri M. hydrocarbonoclastic NN-6 sebesar  131% dibandingkan dengan kontrol.
Perbedaan kepadatan sel dalam kultur C. ceratosporum atau N. oculata antara lain disebabkan adanya pembelahan sel menjadi individu baru yang muncul per satuan waktu tertentu. Pertumbuhan spesifik pada kultur C. ceratosporum dan N. oculata umumnya akan meningkat hingga mencapai laju pertumbuhan maksimum, kemudian
menurun karena terjadi penurunan kualitas dan kuantitas nutrisi serta berbagai faktor abiotik lainnya. Penelitian oleh Mazli et al . (2024) telah menseleksi dan mengkarakterisasi bakteri pemacu pertumbuhan mikroalga yang cocok untuk meningkatkan produksi mikroalga Cyclotella meneghiniana dengan karakter pelarutan fosfor, produksi asam indol-3-asetat (IAA), dan fiksasi nitrogen. Hubungan antara mikroalga dan bakteri dalam suatu lingkungan mikro mempunyai peran penting dalam meningkatkan kualitas dan kuantitas produksi mikroalga, yang pada gilirannya akan memengaruhi pertumbuhan organisme pemangsa seperti zooplankton dan memperbaiki kualitas nutrisinya, sehingga memilih dan mengkarakterisasi bakteri pemacu pertumbuhan mikroalga yang cocok untuk meningkatkan produksi mikroalga adalah proses penting karena tidak semua bakteri dapat menstimulasi pertumbuhan mikroalga.
Chaetoceros ceratosporum dan N. oculata adalah salah satu species diatom dan nondiatom yang penting dan biasa dimanfaatkan sebagai sumber makanan hidup di budidaya terutama pembenihan ikan atau udang, karena komposisi asam lemak esensial eicosapentaenoic acid (EPA) dan decosahexaenoic acid (DHA) yang tinggi. Hal yang sama juga dilakukan terhadap spesies diatom Cyclotela sp. (Cupo et al ., 2021; Karrar et al. , 2024). Oleh karena itu, banyak upaya untuk meningkatkan produksi beberapa spesies diatom dan nondiatom tersebut dengan berbagai cara (Cupo et al ., 2021; Li et al ., 2017; Pacheco et al ., 2015). Sementara, produk primer yang dihasilkan dari mikroalga mempunyai nilai guna tinggi di antaranya asam lemak, pigmen, dan polisakarida. Metabolit tersebut berperan dalam pertumbuhan dan perkembangbiakan ikan dan udang. Sebagai contoh, mikroalga dari jenis Chaetoceros gracilis mempunyai kandungan nutrisi berupa 25,56% SAFA, 34,77% MUFA, 39,55% PUFA.  Berat kering C. gracillis mengandung 27% air, 25% air, 12,1% lemak, 20,27% protein dan 15.63% karbohidrat. Kandungan komponen aktif pada biomas kering
adalah alkaloids, terpenoids, karbohidrat, gula dengan konsentrasi rendah, dan asam amino, sedangkan calsium merupakan kandungan mineral tertinggi pada C. gracillis (Setyaningsih et al ., 2023).
Dengan demikian, konsorsium mikroalga- bakteri yang sesuai dapat dibentuk untuk meningkatkan pertumbuhan dan kualitas nutrisi mikroalga yang dapat digunakan sebagai pakan alami yang efektif untuk kepentingan komersial produksi benih ikan, crustacea , dan hewan akuatik lainnya.

## KESIMPULAN
Diperoleh dua isolat bakteri terseleksi yaitu bakteri M. vinifirmus strain CC-22 dan Alteromonas sp. strain NN-5 yang berpeluang sebagai probiotic agent untuk menstimulasi pertumbuhan C. ceratosporum dan N. oculata . Penambahan isolat bakteri M. vinifirmus strain CC-22 dan Alteromonas sp. strain NN-5 masing- masing  dapat meningkatkan pertumbuhan mikroalga C. ceratosporum sebesar 1,76 kali (176 %) dan N. oculata sebesar 1,56 kali (156 %) pada fase stasioner.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada peneliti dan teknisi litkayasa Laboratorium Bioteknologi, Laboratorium Pakan dan Nutrisi, KKI Biota Laut BRIN Gondol yang telah berpartisipasi dan membantu pada kegiatan penelitian ini.

## DAFTAR ACUAN
Cardias, B. B., Barcelo-Villalobos, M., Lafarga, T., Aci´en Fernandez, F. G., Morais, M. G., & Costa, J. A. V. (2023). An overall analysis of CO 2 demand and utilization of microalgal cultures in pilot-scale raceway reactors. Algal Research , 74 , 103193 https:// doi.org/10.1016/j.algal.2023.103197
Cooper, M., & Smith, A. (2015). Exploring mutualistic interactions between microalgae and bacteria in the omics age. Current Opinion in Plant Biology ,
26 , 147–153. https://doi.org/10.1016/j. pbi.2015.07.003
Cupo, A., Landi, S., Morra, S., Nuzzo, G., Gallo,
C., Manzo, E., Fontana, A., & d’Ippolito, G. (2021). Autotrophic vs. heterotrophic cultivation of the marine diatom Cyclotella cryptica for EPA production. Marine Drugs , 19 , 355. https://doi.org/10.3390/ md19070355
Farahin A. W., Natrah, I., Nagao, N., Katayama, T., Imaizumi, Y., Mamat, N. Z., Yusoff, F. Md., & Shariff, M. (2021). High intensity of light: A potential stimulus for maximizing biomass by inducing photosynthetic activity in marine microalga, Tetraselmis tetrathele . Algal Research , 60 , 102523. Grossman, A. (2016). Nutrient acquisition: The generation of bioactive vitamin B12 by microalgae. Current Biology , 26 , R319–R337,  http://dx.doi.org/10.1016/j. cub.2016.02.047
Haryanti. (2002). Live food production.  Lectured on training course on grouper hatchery seed production . Balai Besar Riset Budidaya Laut dan Penyuluhan Perikanan Gondol.
Karrar, E., Albakry, Z., Ahmed, I. A. M.,
Zhang, L., Chen. C., Wu, D., & Li, J. (2024). Docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid from microalgae: Extraction, purification, separation, and analytical methods. Algal Research , 77 , 103365. https://doi.org/10.1016/j. algal.2023.103365
Li, X. L., Marella, T. K., Tao, L., Li, R., Tiwari,
A., & Li, G. (2017). Optimization of growth conditions and fatty acid analysis for three freshwater diatom isolates. Phycological Research , 65 , 177–187. https://doi. org/10.1111/pre.12174
Ma, K., Bao, Q., Wu, Y., Chen, S., Zhao, S., Wu, H. and Jianhua Fan, J. (2020). Evaluation of microalgae as immunostimulants
and recombinant vaccines for diseases prevention and control in aquaculture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology ,
8 , 590431. https://doi.org/10.3389/ fbioe.2020.590431
Mazli, N. A. I. N., Yusoff, F. M. D, Nazardin, M. F., Khaw, Y. S., Tan, H. T., & Karim, M. (2024). Enhancing diatom, Cyclotella meneghiniana growth using growth-promoting bacteria isolated from the phycosphere of chlorophytes and chrysophytes. Asian Fisheries Society , 37 (1), 23-36. https://doi. org/10.33997/j.afs.2024.37.1.002
Metsoviti, M. N., Papapolymerou, G., Karapanagiotidis. I. T., & Nikolaos Katsoulas, N. (2019).  Effect of light intensity and quality on growth rate and composition of Chlorella vulgaris , Plants , 9 , 31. https://doi.org/10.3390/plants9010031 Nef, C., Dittami, S., Kaas, R., Briand, E., Noël, C., Mairet, F., & Garnier, M. (2022). Sharing Vitamin B 12 between bacteria and microalgae does not systematically occur: Case study of the haptophyte Tisochrysis lutea . Microorganisms, 10(7), 1337. https://doi. org/10.3390/microorganisms10071337
Nogami, K., & Maeda, M. (1992). Bacteria as biocontrol agents for rearing larvae of the crab Portunus trituberculatus . Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences ,
49 (11), 2373-2376.
Pacheco, M. M., Hoeltz, M., Moraes, M. S. A., & Schneider, R. C. S. (2015) Microalgae: Cultivation techniques and wastewater phycoremediation. Journal of Environmental Science and Health, Part A , 50 , 573–589. https://doi.org/ 10.1080/10934529.2015.994951 Polat, E., Yüksel, E., & Altınbas, M. (2020). Effect of different iron sources on sustainble microalgae-based biodiesel production using Auxenochlorella protothecoides . Renewable Energy , 162 , 1970-1978. https:// doi.org/10.1016/j.renene.2020.09.030 Prasetyo, L. D., Supriyantini, E., & Sedjati, S. (2022). Pertumbuhan mikroalga Chaetoceros calcitrans pada kultivasi dengan intensitas cahaya berbeda. Buletin Oseanografi Marina ,
11 (1), 59–70. https://doi.org/10.14710/ buloma.v11i1.31698
Ramanan, R., Kim, B., Cho, D., Oh, H., & Kim, H. (2016). Algae–bacteria interactions: Evolution, ecology and emerging applications. Biotechnology Advances , 34 , 14–29. https://doi.org/10.1016/j. biotechadv.2015.12.003
Saccardo, A., Bezzo, F., & Eleonora Sforza, E.
(2022).  Microalgae growth in ultra-thin steady-state continuous photobioreactors: assessing self-shading effects. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology , 10 , 977429. https://doi.org.10.3389/ fbioe.2022.977429
Sambrook, J., Ftitsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd edition . Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Setyaningsih, I., Desniar, Ermayanti, E. (2023). Komposisi kimia mikroalga laut Chaetoceros gracilis. http://repository.ipb.ac.id/ handle/123456789/119154
Sofiyah, E. S., Septiariva, I. Y., & Suryawan, I. W.
K. (2021). The opportunity of developing microalgae cultivation techniques in Indonesia. Berita Biologi , 20 (2), 221-233. https://doi.org/10.14203/beritabiologi.
v20i2.4000
Sureshkumar, S., Jasmin, B., Rahiman K. M. M., & Mohammed, A. A. H. (2014). Growth enhancement of micro algae, Chaetoceros calcitrans and Nannochloropsis oculata , using selected bacterial strains International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 3 (4), 352-359. Tan J. S., Lee, S. Y., Chew, K.W., Lam, M. K., Lim, J. W., Ho, S.H., & Showa, P. L. (2020). A review on microalgae cultivation and harvesting, and their biomass extraction processing using ionic liquids. Bioengineered , 11 (1),
116–129. https://doi.org/10.1080/2165597 9.2020.1711626
Torres-Maravilla, E., Parra, M., Maisey, K., Rodrigo, A., Cabezas-Cruz, V. A., Gonzalez, A., Tello, M., & Bermúdez-Humarán, L. G. (2024). Importance of probiotics in fish aquaculture: Towards the identification and design of novel probiotics. Microorganisms , 12 , 626. https://doi. org/10.3390/microorganisms12030626