Kloning cDNA lengkap penyandi ACCase subunit biotin carboxylase dari mesokarp kelapa sawit ( Elaeis guineensis Jacq.)
Cloning of full length cDNA encoding ACCase subunit biotin carboxylase from mesocarp of oil palm (Elaeis guineensis Jacq. )
Asmini BUDIANI 1) , Antonius SUWANTO 2) , Hajrial ASWIDINNOOR 3) , Djoko SANTOSO 1) & Basil J NIKOLAU 4)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana No. 1 Bogor 16128, Indonesia
2 ) Departemen Biologi, Fakultas Matematika & Ilmu Pengetahuan Alam IPB, Kampus IPB Dramaga Bogor 16680, Indonesia
3) Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian IPB, Kampus IPB Dramaga Bogor 16680, Indonesia
4) Departement of Biochemistry, Biophysics & Molecular Biology, Iowa State University, Ames – USA
Diterima tanggal 26 Agustus 2013/disetujui tanggal 12 Nopember 2013

## Abstract
Acetyl-CoA Carboxylase (ACCase) is considered to be one of the key enzymes in palm oil biosynthesis. Availability of  genes  encoding  this  enzyme  would  give  some  advantages in the molecular breeding of oil palm. Over expression of the genes  in  the  oil  palm  mesocarp  might  increase  the  oil production in this tissue. On the other hand, down regulating of ACCase could divert the central metabolite Acetyl-CoA to other  product  such  as  PHB  (Polyhydroxy-butyrate),  one  of the  known  biodegradable  plastic.  This  paper  reported  the work  of  cloning  of  the  full  length  coding  sequence  of  biotin carboxylase (BC), one subunit of the ACCase. Based on the DNA  sequence  of  the  BC  conserved  region  that  had  been cloned  previously,  primers  pairs  were  designed  to  amplify 5’- and 3’- cDNA ends of BC using RACE-PCR. The RACE products of  5’- and 3’- cDNA ends of  BC  were cloned into E.coli , and the DNAs were sequenced and analysed. The full cDNA  of  BC  was  obtained  by  reisolation  of  the  cloned  5’- and  3’-  cDNA  ends  followed  by  digestion  using KpnI, ligation into pGEM-T vector and cloning into E.coli . Colony PCR  was  carried  out  to  confirm  that  the  target  gene  has been cloned. The recombinant plasmid containing full cDNA of  BC  was  then  isolated  for  DNA  sequencing.  The  results showed that the 5’-BC (1367 bp), 3’- BC (1032 bp), and the full  length  cDNA  encoding  BC  (2182  bp)  had  been successfully  cloned,  and  the  DNA  sequence  had  been confirmed  as  gene  encoding  ACCase  subunit  biotin carboxylase.
[Keywords : Heteromeric ACCase,  palm  oil  biosynthesis, fatty acid, RACE-PCR]

## Abstrak
Acetyl-CoA  Carboxylase  (ACCase)  merupakan  salah satu  enzim  kunci  dalam  biosintesis  minyak  sawit.  Keter- sediaan  gen  penyandi  enzim  ini  sangat  berguna  dalam pemuliaan kelapa sawit secara molekuler. Over-ekspresi gen penyandi  ACCase  pada  mesokarp  dapat  meningkatkan  pro- duksi  minyak  pada  jaringan  tersebut.  Sebaliknya,  ekspresi ACCase  dapat  ditekan  melalui  mekanisme down  regulation sehingga  metabolit  central  Acetyl-CoA  dapat  diarahkan untuk  menghasilkan  produk  lain  seperti  PHB  (polyhydro- xybutyrate), salah satu jenis biodegradable plastik yang telah
banyak  dikenal.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengklon cDNA lengkap penyandi ACCase subunit biotin carboxylase (BC) dari mesokarp kelapa sawit. Berdasarkan sekuen DNA daerah  konservatif  BC  yang  telah  diklon  dari  mesokarp kelapa sawit pada penelitian sebelumnya, dua pasang primer dirancang  untuk  mengamplifikasi  daerah  ujung  5’-  dan  3’- cDNA  BC  dengan  RACE-PCR.  Produk  5’-RACE  dan  3’- RACE  diklon  dan  disekuen.  cDNA  lengkap  penyandi  BC diperoleh dengan jalan mengisolasi kembali fragmen 5’- dan 3’- cDNA terklon, dilanjutkan dengan digesti  menggunakan enzim restriksi Kpn I, ligasi kedua fragmen ke vektor kloning pGEM-T, dan introduksi ke dalam E. coli . Setelah dilakukan PCR  koloni  untuk  menguji  keberhasilan  kloning,  plasmid rekombinan  yang  mengandung  cDNA  lengkap  dari  BC diisolasi  untuk  analisis  sekuen  DNA . Dari  penelitian  ini fragmen cDNA 5’-BC (1367 pb) dan 3’- BC (1032 pb), serta cDNA  lengkap  penyandi  BC  berukuran  2182  pb  telah diperoleh  dan  diklon  dalam E.  coli. Analisis  sekuen  DNA mengkonfirmasi  bahwa  cDNA  terklon  adalah  benar  gen penyandi ACCase subunit biotin carboxylase.
[Kata kunci: ACCase heteromerik, biosintesis minyak sawit, asam lemak, RACE-PCR]

## Pendahuluan
Acetyl-CoA  carboxylase  (ACCase)  merupakan salah  satu  enzim  yang  berperan  penting  dalam  bio- sintesis  minyak.  Enzim  ini  mengkatalisis  pemben- tukan  malonyl-CoA  dari  acetyl-CoA,  tahapan  kunci dalam  sintesis  asam  lemak,  senyawa  yang  sangat dibutuhkan  oleh  sel  tanaman  (Ke et  al .,  2000).  Selain sebagai  komponen  penyusun  triasilgliserol  atau minyak,  asam  lemak  juga  digunakan  dalam  pem- bentukan  membran  dan  kutikula  (Kunst  &  Samuels, 2003),  serta  berperan  dalam  biosintesis signaling molecules (Shah,  2005)  seperti jasmonic  acid (Liechti & Farmer, 2002) dan sphingolipid (Sperling & Heinz, 2003;  Worrall et  al .,  2003).  Keterlibatan  asam  lemak dan  enzim-enzim  yang  mengkatalisis  metabolismenya dalam  pertahanan  tanaman  diulas  secara  lengkap  oleh Kachroo & Kachroo (2009).
*) Penulis korespondensi: asminib@yahoo.com
Kloning cDNA lengkap penyandi ACCase subunit biotin …….. (Budiani et al .)
Biosintesis  asam  lemak  pada  tanaman  terjadi  di dalam  plastid  dan  sitosol.  Proses  tersebut  terjadi melalui  penambahan  secara  berulang  dua  unit  karbon yang  diperoleh  dari  malonyl-CoA  ke  acetyl-CoA. Malonyl-CoA  dibentuk  dari  acetyl-CoA  dengan  kata- lisator  ACCase.  Di  dalam  plastid,  acetyl-CoA  me- ngalami  serangkaian  reaksi  menghasilkan  asam  lemak dengan  panjang  rantai  karbon  hingga  18  (Ohlrogge  & Browse,  1995),  sedangkan  dalam  sitosol,  C-18  acyl- CoA mengalami pemanjangan rantai hingga 36 carbon (Leonard et  al. ,  2004).  Dua  jenis  ACCase  yang berbeda  secara  struktural  telah  diidentifikasi  pada tanaman  yaitu  ACCase  multifungsional  atau  ACCase homomerik  (hm-ACCase)  dan  ACCase  multisubunit atau  ACCase heteromerik (ht-ACCase) (Li  &  Cronan, 1992). Kecuali pada famili Graminae, yang hanya me- ngandung  hm-ACCase,  kedua  jenis  ACCase  tersebut pada  tanaman  terdapat  pada  kompartemen  yang berbeda,  ht-ACCase  dalam  plastid  sedangkan  hm- ACCase dalam sitosol (Nikolau et al., 2003).
Pada  sebagian  besar  tanaman,  ACCase  hetero- merik  (ht-ACCase)  terdiri  dari  empat  polipeptida/ subunit  yang  dapat  dipisahkan  yaitu  biotin  carbo- xylase  (BC)  yang  berfungsi  mentransfer  gugus carboxyl  ke  biotin,  biotin-carboxyl  carrier  protein (BCCP)  yaitu  situs  untuk  pengikatan  biotin,  dan carboxyl  transferase  (CT)  dan  ,  yang  mentransfer gugus  carboxyl  dari  biotin  ke  senyawa  lainnya  (Ke et al .,  2000).  Sebagai  protein  tunggal  multifungsi,  hm- ACCase  mengandung  domain  yang  sama  dengan  BC, BCCP dan CT yang tidak dapat terdisosiasi. Beberapa hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  reaksi  yang dikatalisis  oleh  ACCase  merupakan  tahapan  pembatas kecepatan dalam biosintesis asam lemak. Francki et al . (2002)  melaporkan  adanya  korelasi  antara  aktivitas ACCase  dengan  kecepatan  sintesis  asam  lemak maupun dengan akumulasi minyak.
Dalam  bidang  kesehatan  ACCase  merupakan target  yang  menarik  untuk  pengembangan  obat terhadap  obesitas,  diabetes,  kanker  dan  beberapa penyakit akibat infeksi mikroba (Tong & Harwood Jr, 2006; Wright  &  Reynolds,  2007;  Parsons  &  Rock, 2011 ).  Enzim  ini  juga  diketahui  berperan  penting untuk  mempertahankan  daya  hidup  sel-sel  kanker payudara  (Chajes et  al .,  2006).  Zhang et  al. (2004) melaporkan  struktur  kristal  dari  kompleks  antara domain  CT  dengan  CP-640186,  salah  satu  inhibitor ACCase,  dan  mengidentifikasi  tiga  daerah  pengikatan obat  pada  situs  aktif  dari  CT.  Struktur,  kontrol aktivitas  serta  mekanisme  inhibitor  enzim  ini  diulas cukup  lengkap  oleh  Tong  (2005).  Studi  genetik  me- nunjukkan  bahwa  ACCase  terbukti  sangat  diperlukan untuk pertumbuhan in vitro berbagai bakteri (Gerdes et al .,  2003;  Sassetti et  al .,  2003;  Jacobs et  al. ,  2003; Salama et  al. ,  2004;  Payne et  al. ,  2007).  Di  sisi  lain, ACCase  dari  rumput  ( grasses )  adalah  target  dari
herbisida  yang  telah  lama  dikomersilkan  (Tong  & Harwood Jr, 2006).
Perbedaan  pola  ekspresi  ACCase  sitosol  dan plastid  pada  berbagai  bagian  tanaman  gandum  muda yang sedang berkembang dilaporkan oleh Podkowinski et  al. (2003).  Dari  penelitiannya  diidentifikasi  bahwa mRNA  ACCase  sitosol  terdiri  dari  dua  jenis,  dan masing-masing  menunjukkan  pola  ekspresi  yang berbeda,  sehingga  diduga  kedua  mRNA  tersebut dikontrol  oleh  promoter  yang  berbeda.  Sasaki  & Nagano  (2004)  mengulas  secara  ringkas  ACCase  dari tanaman,  mulai  struktur,  biosintesis,  regulasi  hingga manipulasi gen untuk pemuliaan tanaman.
Mesokarp  kelapa  sawit  telah  dikonfirmasi  me- ngandung  kedua  jenis  ACCase,  namun  dalam akumulasi  minyak  pada  jaringan  mesokarp,  peran  ht- ACCase  lebih  besar  dibandingkan  dengan  peran  hm- ACCase.  Di  samping  itu,  juga  dideteksi  adanya  dua isoform  BCCP  pada  mesokarp  kelapa  sawit,  masing- masing  dengan  BM  37  dan  32  kDa  (Budiani,  2005). Aktivitas  ACCase  pada  mesokarp  kelapa  sawit meningkat mulai dari buah berumur 14 minggu hingga umur  20  minggu  setelah  antesis.  Analisis  pola  protein dengan elektroforesis menggunakan gel poli-akrilamid menunjukkan adanya dua protein  yang konsentrasinya meningkat  sejalan  dengan  peningkatan  kandungan minyak.  Analisis  sekuen  asam  amino  dari  protein tersebut  menghasilkan  beberapa  polipeptida  yang mempunyai  homologi  dengan  gen  penyandi  ACCase subunit  BC,  gen  penyandi  Enoyl-ACP  reductase  dan Glyceraldehyde-3P  dehydrogenase  (Budiani et  al. , 2008).  Publikasi  tersebut  juga  melaporkan  bahwa fragmen  gen  penyandi  BC  berukuran  sekitar  500  pb telah  diklon.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengklon cDNA lengkap penyandi ACCase heteromerik subunit BC  dari  mesokarp  kelapa  sawit,  sebagai  bagian  dari upaya  rekayasa  metabolisme  untuk  meningkatkan rendemen minyak pada mesokarp buah kelapa sawit

## Bahan dan Metode
Bahan  yang  digunakan  sebagai  sumber  RNA adalah  mesokarp  buah  kelapa  sawit  Tenera  yang  aktif mensintesis  minyak  (18  –  20  minggu  setelah  antesis) dengan  kandungan  minyak  lebih  kurang  20%  berat basah.  Setelah  buah  dicuci  dan  dikupas  kulit  luarnya, jaringan  mesokarp  diambil  dan  segera  didinginkan dalam  nitrogen  cair  sebelum  digunakan.  Galur  bakteri yang  digunakan  untuk  kloning  DNA  adalah E.  Coli DH5  dan E. coli XL-1-Blue. Sedangkan vektor yang digunakan untuk kloning adalah pGEM-T dan pCR2.1- TOPO.

## Isolasi RNA total mesokarp
RNA  total  diisolasi  dari  jaringan  mesokarp  buah sawit  dengan  metode  Chang et  al .  (1993)  dengan
beberapa  modifikasi.  Mesokarp  buah  sawit  dipotong- potong  kecil  dan  segera  dibekukan  dengan  nitrogen cair.  Setelah  beku,  contoh  dihaluskan  dalam  lumpang porselin  sambil  sekali-sekali  ditambahkan  nitrogen cair.  Jaringan  yang  telah  dihaluskan  tersebut  diho- mogenkan  dengan  bufer  ekstraksi  (1  :  5  w/v)  yang telah  dihangatkan  pada  suhu  65 o C,  dan  divorteks. Komposisi bufer ekstraksi terdiri dari CTAB 2%, Tris- Cl 100 mM pH 8, NaCl 3 M, EDTA 25 mM, PVP 2% (w/v), spermidin 0,5 g/L, ß-mercapto etanol 2%, asam aurin trikarboksilat 1 mM dan DTT 10 mM. Setelah itu dilakukan  dua  kali  ekstraksi  menggunakan  campuran kloroform  :  isoamil  alkohol  (24  :  1)  dengan  volume yang  sebanding  dan  disentrifus  pada  14.000  rpm selama 20 menit.
Supernatan  yang  diperoleh  dipindahkan  ke  dalam tabung sentrifus baru, ditambah ¼ x volume LiCl 10 M dan  disimpan  semalam  pada  suhu  4 o C.  RNA dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm  selama  20  menit.  Pelet  dilarutkan  dalam  bufer SSTE  (NaCl  1,0  M,  SDS  0,5%,  Tris-HCl  10  mM  pH 8,0  dan  EDTA  1  mM)  kemudian  diekstrak  kembali dengan  kloroform:isoamil  alkohol.  Ke  dalam  super- natan  ditambahkan  dua  kali  volume  etanol  dan diendapkan  selama  30  menit  pada  suhu  -70 o C,  di- lanjutkan  dengan  sentrifugasi  selama  20  menit  untuk mengendapkan RNA. Supernatan dibuang dan endapan dibilas  dengan  etanol  dingin  70%.  Setelah  sisa  etanol diuapkan,  endapan  dilarutkan  dalam  0,5  –  1,0  mL aquades steril dalam tabung mikro.
Integritas  RNA  hasil  isolasi  dianalisis  dengan elektroforesis  pada  gel  agarosa  1%.  Visualisasi  RNA dilakukan  dengan  alat  transiluminator  UV.  Kandung- an  dan  kemurnian  RNA  dianalisis  secara  spektrofoto- metri  pada  panjang  gelombang  (  )  260  nm,  280  nm dan  230  nm.  Kuantitas  RNA  dihitung  berdasarkan serapannya  pada  260  nm,  sedangkan  kemurnian RNA  dari  protein  ditunjukkan  oleh  nisbah  A 260 /  A 280 , dan  kemurnian  RNA  dari  polisakarida  ditunjukkan oleh nisbah A 260 / A 230.

## Perancangan primer
Untuk  mengamplifikasi  daerah  ujung  5’  dan  3’ gen penyandi BC, dirancang  primer  spesifik berdasar- kan  sekuen  fragmen  DNA  gen  penyandi  daerah konservatif  BC  berukuran  469  pb  terklon  sebagai- mana  dilaporkan  sebelumnya  (Budiani et  al. ,  2008). Perancangan  primer  dilakukan  menggunakan  program Primer3  yang  dapat  diakses  secara online (http:// www.biotools.umassmed.edu/).
Amplifikasi  dan  kloning  cDNA  daerah  ujung  5’-  and 3’- BC
Amplifikasi daerah ujung 5’ dan 3’ gen penyandi BC  dilakukan  dengan  teknik Rapid  Amplification  of cDNA  Ends  -  Polymerace  Chain  Reaction  (RACE- PCR) menggunakan  kit BD  SMART TM RACE  cDNA Amplification (BD  Biosciences  Clontech).  Sintesis cDNA utas pertama daerah ujung 5’ dan 3’ ( 5’-RACE- READY  cDNA dan  3 ’-RACE-READY  cDNA )  dilaku- kan  dengan  prosedur  sebagaimana  disarankan  dalam User  Manual yang  tersedia  dalam  kit.  Selanjutnya cDNA  daerah  ujung  5’  dan  3’-  BC  diamplifikasi dengan  primer  spesifik  (Tabel  1)  menggunakan templat  utas  pertama  cDNA  daerah  ujung  5’-  dan  3’- BC  yang  telah  disintesis.  Reaksi  amplifikasi  dijalan- kan dengan program thouchdown PCR sebagai berikut: lima  siklus  masing-masing  94 o C  30  detik,  72 o C  3 menit; lima siklus masing-masing 94 o C 30 detik, 70 o C 30  detik  dan  72 o C  3  menit;  dilanjutkan  30  siklus masing-masing 94 o C 30 detik, 68 o C 30 detik dan 72 o C 3 menit. Hasil amplifikasi diverifikasi pada gel agarosa 1,2%.
Fragmen  cDNA  daerah  ujung  5’-  dan  3’-BC dimurnikan  dari  gel  menggunakan  kit QIAquick  Gel Extraction dan  diklon  dalam E.  coli DH5α meng- gunakan  vektor  pCR  2.1-TOPO. E.  coli rekombinan diseleksi  pada  media  LB  padat  yang  mengandung  40 mg/L  X-Gal  dan  50  mg/L  kanamisin.  Adanya  insert cDNA  dalam  koloni  putih  diverifikasi  dengan  PCR koloni  menggunakan  pasangan  primer  NUPM/  RC- BCR  untuk  koloni  yang  diprediksi  mengandung produk  5’-  BC,  dan  menggunakan  pasangan  primer NUPM/RC-BCF  untuk  koloni  yang  diprediksi  me- ngandung  produk  3’-  BC.  Susunan  nukleotida  primer yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 1.
Koloni  yang  dalam  analisis  PCR  teruji  positif mengandung  sisipan  DNA  target  diisolasi  kembali plasmidnya.  Plasmid  yang  diperoleh  didigesti  meng- gunakan  enzim  restriksi Eco RI  dan  dicek  ukurannya pada  gel  agarosa.  Untuk  konfirmasi  bahwa  DNA terklon adalah ujung 5’ dan 3’ dari gen penyandi BC, dilakukan  sekuensing  DNA.  Sekuen  DNA  yang diperoleh  dianalisis  homologinya  dengan  gen  yang sama  dari  tanaman  lain  dengan  BlastN.  Sekuen  DNA dari  fragmen  daerah  ujung  5’-  dan  3’- BC dianalisis peta situs restriksinya menggunakan program BioEdit, untuk  mengidentifikasi  enzim  restriksi  yang  hanya memotong  satu  kali  dan  situs  pemotongannya  terletak pada daerah yang overlap antara kedua fragmen DNA tersebut.  Informasi  mengenai  situs  restriksi  tersebut diperlukan  dalam  menentukan  langkah  berikutnya untuk mendapatkan cDNA lengkap penyandi BC.
Kloning cDNA lengkap penyandi ACCase subunit biotin …….. (Budiani et al .)
Tabel 1. Primer yang digunakan dalam tahap-tahap penelitian untuk mengklon cDNA lengkap penyandi ACCase subunit BC. Table 1. Primers used for the research steps to clone full cDNA encoding ACCase subunit BC.
No. Primer Sekuen DNA ( DNA Sequence) 1 UPM 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ dan 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ 2 NUPM 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ 3 RC-BCF 5 - TTGAAGCACCTTCTCCTGCCTTGACG-3’ 4 RC-BCR 5’-TGTCAGCCTCTCTCCAAGAGCAACTCG-3’ 5 NBCF 5’-CTGAGCTACGGAAAGCTATGGGTGATGC-3’ 6 NBCR 5’-CAGGGTGCTCTACCTGAATCCTGGTGT-3’ 7 3BCSeqF 5’-AAAAAGCGATTGAACGGATG-3’ 8 3BCSeqR 5’-TCCTTCTCATGCTTCGGTATG-3’ 9 5BCSeqF 5’-GAGCATGGAATCAACTTTATTGG-3’ 10 5BCSeqR 5’-ATTTATCACCCATGACTCGAATG-3’ 11 FLBC-F 5’-AGTACGCGGGGATCTCTTCT-3’ 12 FLBC-R 5’-CCCAAATTGTTTCCAAGCAG-3’

## Konstruksi dan kloning cDNA lengkap penyandi BC
Untuk  mengkonstruksi  cDNA  lengkap  penyandi BC, plasmid rekombinan yang mengandung cDNA 5’- BC (pCR2.1-TOPO/5’-BC) dan  yang mengandung 3’- BC  (pCR2.1-TOPO/5’-BC)  diisolasi  kembali  dari koloni rekombinan hasil transformasi produk 5’-RACE dan 3’-RACE yang  telah terbukti mengandung cDNA 5’-BC dan 3’-BC. Isolasi dilakukan dengan High Pure Plasmid  Isolation  Kit (Roche  Diagnostic  GmbH). Plasmid  hasil  isolasi  dicek  ukurannya  dengan elektroforesis pada gel agarosa.
Fragmen  cDNA  5’-BC  kemudian  diisolasi  dari plasmid rekombinan pCR2.1-TOPO/5’-BC dengan dua cara  yaitu,  (1)  digesti  plasmid  rekombinan  dengan Eco RI, dan (2) PCR menggunakan primer NUPM (BD Bioscience)  dan  RC-BCR.  Isolasi  fragmen  cDNA  3’- BC  dari  pCR-TOPO/3’-BC  tidak  dapat  dilakukan dengan cara digesti pCR2.1-TOPO/3’-BC menggunakan Eco RI  karena  fragmen  3’-BC  memiliki situs pemotongan Eco RI. Oleh karena itu isolasi 3’-BC dari  pCR-TOPO/3’-BC  hanya  dilakukan  dengan  PCR menggunakan  pasangan  primer  NUPM  dan  NBC-F dengan templat plasmid rekombinan pCR2.1- TOPO/3’-BC.
Untuk  mendapatkan  cDNA  lengkap  penyandi BC,  fragmen  cDNA  daerah  ujung  5’-  dan  3’- BC hasil PCR didigesti dengan Kpn I, kemudian kedua  fragmen hasil  digesti  langsung  diligasikan  dengan  vektor kloning  pGEM-T.  Hasil  ligasi  kemudian  diklon  ke dalam E.  coli. Proses  digesti  dan  ligasi  DNA  dengan vektor  kloning  pGEM-T,  preparasi E.  coli kompeten dan  transformasinya  dengan  plasmid  rekombinan dilakukan  sesuai  prosedur  standar  (Sambrook et  al. , 1989). Seleksi hasil transformasi dilakukan pada media agar LB padat yang mengandung ampisilin 100 mg/L.
Analisis  koloni  transforman  yang  mengandung DNA  target  dilakukan  dengan  PCR  dari  koloni  putih yang  tumbuh  menggunakan  primer  FLBC-F  dan
FLBC-R.  Plasmid  rekombinan  diisolasi  kembali dengan High  Pure  Plasmid  Isolation  Kit (Roche Diagnostic GmbH) kemudian dicek ukurannya dengan elektroforesis  pada  gel  agarosa  dan  disekuen. Sekuensing  dilakukan  di  Lembaga  Biologi  Molekuler Eijkman  menggunakan  pasangan  primer  M13F/M13R dan  pasangan  primer  FLBC-F/FLBC-R.  Sekuen  DNA yang  diperoleh  dianalisis  menggunakan  BlastN  atau BlastX (http://www.uk.ncbi.nlm.nih.gov) untuk mengkonfirmasi  homologinya  dengan  gen  penyandi BC yang  tersedia  di GenBank. Tabel  1  menyajikan susunan  nukleotida  primer  yang  digunakan  mulai  dari amplifikasi  cDNA  daerah  ujung  5’-BC  dan  3’-BC hingga  amplifikasi  cDNA  lengkap  penyandi  BC, sedangkan  Gambar  1  menunjukkan  posisi  setiap primer terhadap cDNA target.

## Hasil dan Pembahasan

## Amplifikasi  dan  kloning  cDNA  daerah  ujung  5’-  dan 3’- BC
Hasil  amplifikasi  daerah  ujung  5’-BC  meng- gunakan  pasangan  primer Universal  Primer  Mix (UPM) yang tersedia dalam kit dengan primer spesifik RC-BCR  disajikan  pada  Gambar  2A.  Nampak  bahwa berbagai variasi suhu annealing (67, 68 dan 69 ºC) dan konsentrasi  MgCl 2 (1,  1,25  dan  1,5  mM)  yang  dicoba pada  reaksi  PCR  tidak  mampu  meningkatkan spesifisitas  hasil  amplifikasi,  terbukti  dengan  adanya latar  belakang  berupa smear pada  produk  PCR. Meskipun  demikian  hasil  amplifikasi  berupa  fragmen DNA  berukuran  sekitar  1500  pb  sangat  konsisten. Oleh  karena  itu  fragmen  hasil  amplifikasi  tersebut dipotong dan dimurnikan dari gel kemudian diklon ke dalam sel E.coli menggunakan vektor pCR2.1-TOPO. Fragmen  cDNA  daerah  ujung  3’-BC  diperoleh melalui  dua  tahap  amplifikasi  yaitu  pertama  meng-
gunakan  pasangan  primer UPM  dengan  RC-BCF dilanjutkan dengan reamplifikasi menggunakan pasangan  primer  NUPM  dan  NBCF. Pendekatan  ini ditempuh  sebagai  upaya  untuk  mendapatkan  hasil amplifikasi  yang  spesifik.  Dari  Gambar  2B  terlihat bahwa reamplifikasi pada suhu annealing 68ºC dengan
konsentrasi  MgCl 2 1,5  mM menghasilkan  fragmen DNA  yang  intensitasnya  sangat  tinggi  dengan  ukuran sekitar  1000  pb.  Meskipun  tidak  dihasilkan  fragmen DNA  tunggal,  namun  hasil  ini  masih  lebih  baik dibandingkan dengan produk amplifikasi 5’-BC. DNA produk amplifikasi  yang berukuran  kurang lebih 1000
1000 pb 1650 pb
Gambar 2.  (A) Hasil RACE untuk 5’-BC menggunakan primer UPM dan RC-BCR pada suhu annealing 57, 58 dan 59ºC (lajur 1,2 dan 3) dengan konsentrasi MgCl 2 1,5 mM, 2 mM dan 3 mM ( a, b dan c ); (B) Hasil RACE untuk 3’- BC menggunakan primer NUPM dan NBCF pada suhu annealing 68 ºC. Tanda panah menunjukkan produk amplifikasi gen target. M: marker 1 Kb plus DNA ladder.
Figure 2.  (A)  RACE  product  for  5’-BC  using  UPM  and  RC-BCR  primers  at  57,  58  dan  59ºC  (lanes  1,  2  and  3) annealing temperatur with MgCl 2 1,5 mM, 2 mM dan 3 mM (a, b and c); (B) RACE product for 3’-BC using NUPM and NBCF primers at 68ºC annealing temperature. White arrows indicated amplification product of the targeted DNA. M: 1 Kb plus DNA ladder marker.
Gambar  1.  Posisi  primer  spesifik  terhadap  cDNA  target  yang  digunakan  untuk  isolasi  5’-  dan  3’-  BC  dengan RACE-PCR.  (1)  RC-BCF,  (2)  RC-BCR,  (3)  NBCF,  (4)  NBCR,  (5)  3BCSeqF,  (6)  3BCSeqR,  (7) 5BCSeqF dan (8) 5BCSeqR.
Figure 1.   Position of the specific primers on target cDNA used for isolation of 5’- and 3’- BC using RACE-PCR.
(1) RC-BCF, (2) RC-BCR, (3) NBCF, (4) NBCR, (5) 3BCSeqF, (6) 3BCSeqR, (7) 5BCSeqF dan (8) 5BCSeqR.
NNTTTTT-5’
NNAAAA A- 3’

3 3 ’  5’  Bagian yg diamplifikasi dengan 5’-RACE Bagian yang overlap Bagian yg diamplifikasi dengan 3’-RACE 1 4  2 3’-RACE 5’-cDNA end 7 8 6 3’-cDNA end 5’-RACE 5 B b A 1000 pb 1650 pb M             1     2 B M 1     2     3            1    2    3             1     2    3 A c a
Gambar  3.  (A)  PCR  koloni  hasil  transformasi  5’-BC;  (B)  PCR  koloni  hasil  transformasi  3’-BC;  (C)  Hasil  isolasi  plasmid rekombinan  pGEM/5BC  dari  koloni  no  5  (lajur  1=tidak  didigesti;  lajur  2=  didigesti  dengan Eco RI);  (D)  Hasil isolasi  plasmid  rekombinan  pGEM/3BC  dari  koloni  no  1  (lajur  1  =  tidak  didigesti;  lajur  2  =  didigesti  dengan Eco RI). M: Marker 1 Kb plus DNA ladder.
Figure 3.   (A) Colony PCR of transformation product using 5’-BC; (B) Colony PCR of transformation product using 3’-BC; (C) Recombinant plasmid of pGEM/5BC isolated from colony no 5 (lane 1 = undigested; lane 2= digested using EcoRI); (D) Recombinant plasmid of pGEM/3BC isolated from positive colony no 1(lane 1 = undigested; lane 2 = digested using EcoRI). M: 1 Kb plus DNA ladder marker.
pb  inilah  yang  dipilih  untuk  dimurnikan  dari  gel  dan diklon dalam E. coli.
Hasil  PCR  koloni  menunjukkan  bahwa  kedua fragmen  DNA  produk  RACE  tersebut  telah  terklon dalam E.coli ( Gambar  3A  dan  3B).  Isolasi  plasmid rekombinan  dan  digestinya  dengan Eco RI  menun- jukkan bahwa produk terklon mempunyai ukuran yang sesuai  dengan  fragmen  DNA  5’-BC  (Gambar  3C). Sedangkan  elektroforesis  plasmid  rekombinan  dan digestinya  menggunakan Eco RI  dari  koloni  hasil transformasi  menggunakan  produk  3’RACE  meng- hasilkan  fragmen  DNA  yang  berukuran  lebih  rendah (Gambar  3D)  dibandingkan  dengan  hasil  PCR  koloni (Gambar  3B).  Dari  analisis  situs  restriksi  ternyata  hal tersebut  disebabkan  karena  dalam  fragmen  DNA  3’- BC terdapat satu situs enzim restriksi Eco RI, sehingga digesti  plasmid  rekombinan  dengan Eco RI  akan menghasilkan  dua  fragmen  DNA  masing-masing dengan ukuran lebih pendek dari 1000 pb, yaitu sekitar 500-600  pb.  Adanya  satu  fragmen  DNA  berukuran sekitar  500-600  pb  dari  hasil  digesti  plasmid rekombinan  pada  percobaan  ini  diduga  karena  kedua fragmen berukuran hampir sama.
Analisis  sekuen  DNA  menunjukkan  bahwa fragmen  DNA  5’-BC  terklon  berukuran  1367  pb, sedangkan  fragmen  3’-BC  terklon  berukuran  1032  pb dan  mempunyai  homologi  yang  tinggi  dengan  ht- ACCase  subunit  BC  dari Nicotiana  tabacum , Glycine max , Brassica  napus dan Arabidopsis  thaliana (data tidak  ditampilkan) . Konfirmasi  urutan  nukleotida  dari 5’-BC  ini  juga  dilakukan  dengan  jalan  sekuensing kembali menggunakan pasangan primer 5BCSeqF dan
5BCSeqR,  dan  urutan  nukleotida  3’-BC  dilakukan dengan  sekuensing  menggunakan  pasangan  primer 3BCSeqF  dan  3BCSeqR,  sehingga  kesalahan  mem- baca  oleh DNA  Sequencer dapat  dihindari.  Posisi kedua pasang primer terhadap gen BC, 5’-BC dan 3’- BC  dapat  dilihat  pada  Gambar  1,  sedangkan  urutan nukleotidanya disajikan pada Tabel 1.

## Konstruksi dan kloning cDNA lengkap penyandi BC
Hasil  analisis  situs  restriksi  fragmen  5’-BC  dan 3’-BC  menunjukkan  bahwa  enzim Kpn I  hanya memotong  sekali  dan  situs  pemotongannya  terdapat pada  daerah  yang  overlap  antar  kedua  fragmen  DNA, yaitu  pada  nukleotida  ke-1265.  Di  samping  itu informasi penting lain dari hasil analisis  situs restriksi adalah  adanya  situs  restriksi Eco RI  pada  nukleotida ke-1659  yang  berarti  terletak  pada  daerah  ujung  3’. Oleh  karena  itu  isolasi  kembali  fragmen  DNA  daerah ujung  3’-BC  dari  plasmid  rekombinan  tidak  dapat dilakukan dengan digesti menggunakan Eco RI. Dalam hal  ini  isolasi  kedua  fragmen  gen  BC  tersebut dilakukan  dengan  PCR.  Selanjutnya  agar  dapat disambung  dan  menghasilkan  gen  lengkapnya,  kedua fragmen  DNA  didigesti  dengan Kpn I,  enzim  restriksi yang  hanya  memotong  satu  kali  pada  daerah  yang overlap (Gambar  4).  Hasil  isolasi  kembali  plasmid rekombinan  pembawa  fragmen  5’-BC  (pCR2.1- TOPO/5’-BC)  dan  plasmid  rekombinan  yang mengandung  fragmen  3’-BC  (pCR2.1-TOPO/3’-BC) serta  hasil  digestinya  dengan Kpn I  disajikan  pada Gambar 5.
60
2000 pb 1650 pb 1000 pb D B M      1      2     3 C M       1    2    3    4    5    6    7    8    9  10 M      1    2 M    1    2 A
A B
Gambar  6.  Profil  elektroforesis  hasil  PCR  dari  koloni  produk  transformasi  menggunakan  pGEM-T/FLBC.  Lajur  1-8 adalah  hasil  PCR  dengan  primer  M13;  lajur  9-20  adalah  hasil  PCR  dengan  primer  FLBC-F/R;  M  adalah marker 1 Kb plus DNA Ladder.
Figure 6.  Electrophoretic  profile  of  PCR  product  of  colonies  produced  from  transformation  using  pGEM-T/FLBC. Lanes 1-8 are PCR products using M13 primer ; lanes 9-20 are PCR products using FLBC-F/R; M: 1 Kb plus DNA Ladder marker.
Gambar 7.  Profil elektroforesis (A) plasmid rekombinan hasil isolasi kembali dari koloni no. 9 (lajur 1), koloni no. 21 (lajur  2),  koloni  no.  24 (lajur  3),  dan  koloni  no.  29  (lajur  4) ;  (B)  Produk  PCR  menggunakan  pasangan primer  FLBC-F/R  dari  koloni  no.  9  (lajur  1),  koloni  no.  21  (lajur  2),  dan  koloni  no.  29  (lajur  3).  M : Marker 1 Kb plus DNA ladder.
Figure 7.  Electrophoretic profile of (A) recombinant plasmid isolated from colony no. 9 (lane 1), colony no. 21 (lane 2), colony no. 24 (lane 3), and colony no. 29 (lane 4) ; (B) PCR product using primer pair FLBC-F/R from colonies  no.  9  (lane  1),  colony  no.  21  (lane  2),  and  colony  no.29  (lane  3).  M :  1  Kb  plus  DNA  ladder marker.
Gambar 4. Gambaran posisi situs restriksi Kpn I dan Eco RI pada 5’- dan 3’- BC.
Figure 4.  Posisition of restriction sites of Kpn I and Eco RI on 5’- and 3’- BC. 1000 pb 1650 pb Contig BC lengkap 5’- BC-htACCase (1367 bp) 3’- BC-htACCase (1032 bp) Kpn I Eco RI 1     2     3     4     5     6     7       8     M    9     10       11    12   13    14   15     M    16    17   18    19   20 12.000 pb
2.000 pb
1       2        3       4       M
1       2       3       M
Gambar 5.  Fragmen  3’-BC  (1)  dan  fragmen  5’-BC  (2) hasil  isolasi  dengan  PCR  dengan  templat plasmid  rekombinan;  Hasil  digesti  fragmen 3’-BC  (3)  dan  fragmen  5’-BC  (4)  dengan enzim restriksi Kpn 1. M : marker 1 Kb plus DNA ladder.
Figure 5.  3’-BC (1) and 5’-BC(2) isolated using PCR using  DNA  template  of  recombinant plasmid; Digestion product of 3’-BC (3) and 5’BC  (4)  using  restriction  enzyme  of  Kpn I. M : 1 Kb plus DNA ladder marker.
1650 pb 1000 pb
Kloning cDNA lengkap penyandi ACCase subunit biotin …….. (Budiani et al .)
Ligasi  fragmen 5’-BC dan 3’-BC BC  yang  telah didigesti  dengan Kpn I  secara  bersama-sama  pada vektor  pGEM-T  dan  transformasinya  ke  dalam E.coli menghasilkan koloni yang tumbuh pada media seleksi. Elektroforesis  hasil  PCR  terhadap  beberapa  koloni tersebut  disajikan  pada  Gambar  6.  Nampak  bahwa hanya  empat  koloni  yang  memberikan  hasil  PCR dengan  ukuran  sebagaimana  diharapkan  sekitar  2  kb, yaitu  koloni  no.  9,  11,  14,  dan  19.  Keempat  koloni tersebut kemudian diisolasi plasmidnya untuk disekuen.  Hasil  isolasi  plasmid  rekombinan  untuk keempat  koloni  tersebut  dan  hasil  analisis  PCR  untuk memastikan  ukurannya  meng-gunakan  primer  FLBC- F/R  disajikan  pada  Gambar  7A  dan  7B.  Nampak bahwa  keempat  koloni  memiliki  ukuran  plasmid rekombinan  yang  sama.  Ukuran  fragmen  yang diperoleh  dari  analisis  PCR  (sekitar  2  kb)  sesuai dengan  panjang  cDNA  lengkap  penyandi  BC. Meskipun  demikian  untuk  mengkonfirmasi  bahwa fragmen  tersebut  merupakan  cDNA  lengkap  penyandi
BC,  diperlukan  analisis  lebih  lanjut,  yaitu  sekuensing DNA  dan  analisis  sekuennya  yang  harus  dilakukan secara bertahap mengingat ukurannya yang besar.

## Analisis sekuen DNA terklon
Urutan  nukleotida  lengkap  dari  cDNA  penyandi BC  terklon  (2182  bp)  diperoleh  dengan  menggabung- kan  sekuen  nukleotida  hasil  sekuensing  secara bertahap.  Analisis  Blast align  two  sequences (Bl2seq) dari  sekuen  DNA  tersebut  dengan  sekuen  gen  yang sama  dari  kelapa  sawit  yang  dilaporkan  oleh  Omar et al. (2008)  menunjukkan  tingkat  kesamaan  ( identity ) yang  sangat  tinggi  yaitu  99%  (Gambar  8A).  Analisis tersebut  dilakukan  karena  hasil  analisis  Blastn  tidak mengakomodir sekuen DNA yang dilaporkan Omar  et al. (2008) (Gambar 8B dan 8C). Dari Gambar 8B dan 8C nampak bahwa sekuan DNA terklon  menunjukkan 89% identity dengan gen BC dari kelapa sawit Tenera Afrika  ( African  oil  palm  tenera )  sebagaimana  yang
Aksesi
Accession Deskripsi Description Skor Score E- value Kesamaan Identity DQ531848.1 Elaeis guineensis cultivar Tenera acetyl-CoA carboxylase mRNA complete cds 2370 0.0 89% XM.007014490.1 Theobroma cacao biotin carboxylase 1, chloroplastic isoform 2 mRNA, complete cds 1197 0.0 82% AF007100.1 Glycine max Biotin carboxylase precursor (AccC-2) mRNA 1162 0.0 83% XM.002266453.1 PREDICTED Vitis vinifera biotin carboxylase 1 mRNA 1149 0.0 82% FJ768726.1 Arachis hypogeal biotin carboxylase (BC) mRNA, complete cds 1146 0.0 82% XM006372138.1 Populus trichocarpa biotin carboxylase precursor family protein mRNA, complete cds 1140 0.0 82%
Gambar 8. (A). Hasil analisis Blast Align two sequences (bl2seq) antara sekuen BC terklon dengan sekuen BC referen  yang dilaporkan oleh Omar et al. (2008); (B) Hasil analisis BlastN sekuen BC terklon; (C) Enam aksesi yang memiliki skor, E-value dan persen kesamaan tertinggi.
Figure 8. (A). Result of Blast Align two sequences (bl2seq) between the cloned BC DNA sequence and DNA sequence of BC as reported by Omar et al. (2008); (B). Result of BlastN analisis of the cloned BC DNA sequence; (C) Six accession which showed the highest score, E-value and identity percentage.
C B A
E. g. Ref   1 CGACTGGAGCACGGGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAAAATCGATCTCCTCCTCTTCGCTTCTCCTAATTTAACTCTCAACCCCTCCC-CTCGGAA O. full BC  1 ------------------------------------------------------------------------ CAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGG
E. g. Ref   100 CCCATCTCTTCTCCTCCCCTCTAATCCTTCGATACCTCTCCTCCTCATCCCCGACGGCTACCCTTCTTTCCAGATCCGCCCATCTCTCCCACCATTTCGC O. full BC  28 ---ATCTCTTCTCCTCCCCTCTAATCCTTCGATACCTCTCCTCCTCATCCCCGCAGGCTACCCTTCTTTCCAGATCCGCCCATCTCTCCCACCATTTCGC
E. g. Ref   200 GGATTTGATAGCTGGAGTATCTTCTTTCTCTATCCGAACCGAGATCGGTATTAATTTTTTTCGTTCTGTTTGAGGATTTGATCCGAAGATGAACTCCATG O. full BC  126 GGATTTGATAGCTGGAGTATCTTCTTTCTCTATCCGAACCGAGATCGGTATTAATTTTTTTCGTTCTGTTTGAGGATTTGATCCGAAGATGAACTCCATG E. g. Ref   300 ATCACTTGCAAGTCGGCCTGCTCGCCTCTTGGGTTAGTCATCGGACCAGCCAGAGGAATTAGGAGCTCTCAATGTACCTTTATGGTGGGAAATGCTCCAA O. full BC  226 ATCACTTGCAAGTCGGCCTGCTCGCCTCTTGGGTTAGTCATCGGACCAGCCAGAGGAATTAGGAGCTCTCAATGTACCTTTATGGTGGGAAATGCTCCAA E. g. Ref   400 ACTTTCACAAGATAAGCTCTCCGAGGCAAAGAGCTGCTTGTGCAAACCGGAAATCAAAAAGGAGCGGAGGAGCTCTGCATGCAACTTGCCATGATGAGAG O. full BC  326 ACTTTCACAAGATAAGCTTTCCGAGGCAAAGAGCTGGTTGTGCAAACCAGAAATCAAAAAGGAGCGGAGGAGCTCTGCATGCAACTTGCCATGATGAGAG E. g. Ref   500 GATTCTTGTGGCAAATAGAGGGGAAATTGCAGTCAGGGTGATTCGAACTGCACATGAGATGGGGATTCCCTGTGTTGCTGTGCACTCCACAATAGATGAG O. full BC  426 GATTCTTGTGGCAAATAGAGGGGAAATTGCAGTCAGGGTGATTCGAACTGCACATGAGATGGGGATTCCCTGTGTTGCTGTGCACTCCACAATAGATGAG E. g. Ref   600 GATGCTCTTCATGTGCGACTCGCAGATGAGGCAGTGTGCATTGGTGAAGCACCAAGCAGTCAATCGTACTTGTTCATTCCAAATGTTTTATCTGCTGCTG O. full BC  526 GATGCTCTTCATGTGCGACTCGCAGATGAGGCAGTGTGCATTGGTGAAGCACCAAGCAGTCAATCGTACTTGTTCATTCCAAATGTTTTATCTGCTGCTG E. g. Ref   700 TTAGCCGGGGGTGCACTATGTTGCATCCTGGGTATGGTTTCCTAGCTGAGAATGCTGGCTTTGTTGATATATGCAAAGAGCATGGAATCA-CTTTATTGG O. full BC  626 TTAGCCGGGGGTGCACTATGTTGCATCCTGGGTATGGTTTCCTAGCTGAGAATGCTGGCTTTGTTGATATATGCAAAGAGCATGGAATCAACTTAATTGG E. g. Ref   799 GCCAAATCCTGACAGCATTCGAGTCATGGGCGATAAATCTACAGCCAGAGAACCAATGAAGAAAGCAGGCGTCCCGACTGTACCTGGAAGTGATGGATTG O. full BC  726 GCCAAATCCTGACAGCATTCGAGTCATGGGTGATAAATCTACAGCCAGAGAAACAATGAAGAAGGCAGGCGTCCCGACTGTACCTGGAAGTGATGGATTG E. g. Ref   899 TTACAGTCCACTGAAGAGGCTGTCAAGCTTGCACATGAAATTGGTTTCCCAGTGATGATTAAGGCAACTGCTGGTGGTGGAGGGCGTGGAATGCGTCTAG O. full BC  826 TTACAGTCCACTGAAGAGGCTGTCAAGCTTGCACATGAAATTGGTTTCCCAGTGATGATTAAGGCAACTGCTGGTGGTGGAGGGCGTGGAATGCGTCTAG
E. g. Ref   999 CTCATGAACCTGAAGAGTTTGTAAAGTTACTCCAGCAAGCTAAGAGTGAGGCGGCAGCAGCATTTGGAAATGATGGGGTTTACCTGGAGAAATACATCCA O. full BC  926 CTCATGAACCTGAAGAGTTTGTAAAGTTACTCCAGCAAGCTAAGAGTGAGGCGGCAGCAGCATTTGGAAATGATGGGGTTTACCTGGAGAAATACATCCA
E. g. Ref   1099 GAATCCAAGGCACATTGAGTTCCAGGTTCTTGCAGACAAGTATGGTAATGTTGTTCATTTTGGTGAGCGTGATTGCAGTATACAGAGAAGGAATCAGAAG O. full BC  1026 GAATCCAAGGCACATTGAGTTCCAGGTTCTTGCAGACAAGTATGGTAATGTTGTTCATTTTGGTGAGCGTGATTGCAGTATACAGAGAAGGAATCAGAAG E. g. Ref   1199 CTCCTAGAAGAAGCTCCATCCCCTGCATTGACGCCTGAGCTACGGAAAGCTATGGGTGATGCAGCTGTAGCTGCTGCTGCATCTATAGGTTACATTGGTG O. full BC  1126 CTCCTAGAAGAAGCTCCATCCCCTGCATTGACGCCTGAGCTACGGAAAGCTATGGGTGATGCAGCTGTAGCTGCTGCTGCATCTATAGGTTACATTGGTG E. g. Ref   1299 TTGGAACTGTGGAATTTCTCTTGGATGAAAGAGGTACCTTCTACTTCATGGAGATGAACACCAGGATTCAGGTAGAGCACCCTGTCACTGAAATGATTTC O. full BC  1226 TTGGAACTGTGGAATTTCTCTTGGATGAAAGAGGTACCTTCTACTTCATGGAGATGAACACCAGGATTCAGGTAGAGCACCCTGTCACTGAAATGATTTC E. g. Ref   1399 TTCAACCGACTTGATTGAAGAACAAATTCGAGTTGCTCTTGGAGAGAGGCTGACATACAAGCAGGAAGACATTGTTCTGAGAGGACATTCAATTGAATGC O. full BC  1326 TTCAACCGACTTGATTGAAGAACAAATTCGAGTTGCTCTTGGAGAGAGGCTGACATACAAGCAGGAAGACATTGTTCTGAGAGGACATTCAATTGAATGC E. g. Ref   1499 CGGATTAATGCAGAAGATGCCTTCAAAGGATTTCGTCCAGGGCCTGGAAAGATTACATCATACTTGCCATCTGGAGGTCCATTTGTGAGAATGGATAGTC O. full BC  1426 CGGATTAATGCAGAAGATGCCTTCAAAGGATTTCGTCCAGGGCCTGGAAAGATTACATCATACTTGCCATCTGGAGGTCCATTTGTGAGAATGGATAGTC
E. g. Ref   1599 ATGTTTATCCAGGCTATGTGGTTCCCCCAAGCTATGACTCCTTGTTAGGAAAGCTTATTGTGTGGGCACCAACCAGGGAAAAAGCGATTGAACGGATGAA O. full BC  1526 ATGTTTATCCAGGCTATGTGGTTCCCCCAAGCTATGACTCCTTGTTAGGAAAGCTTATTGTGTGGGCACCAACCAGGGAAAAAGCGATTGAACGGATGAA
E. g. Ref   1699 AAGAGCTCTTGATGACACGATAATAACAGGAATTCCTACAACCATTGAATACCATAAGCTAATTCTTGATATCGAGGATTTTAGAAATGGAAAGGTAGAT O. full BC  1626 AAGAGCTCTTGATGACACGATAATAACAGGAATTCCTACAACCATTGAATACCATAAGCTAATTCTTGATATCGAGGATTTTAGAAATGGAAAGGTAGAT E. g. Ref   1799 ACTGCCTTCATACCGAAGCATGAGAAGGATTTGGCTGCACCCCAGAAACTAGTGCTGTTGACATTGGAGAAAGAGCTTGCCGGGTGAAGGGTGATTGAA- O. full BC  1726 ACTGCCTTCATACCGAAGCATGAGAAGGATTTGGCTGCACCCCAGAAACTAGTGCTGTTGACATTGGAGAAAGAGCTTGCCGGG--GTGGGTGCCTAAAC
E. g. Ref   1898 GCCAAGTTGCCAGAGATAAGCCAGGGAATAATTCCTTGTAGCTGCATTTCATGATGCAGGTGGGTAATTGACTTCGAGCCCGTGAAATAAGTGCTATGAT O. full BC  1824 ATTATATTATGTGCTTCAGTTCCTTGCAG---TCCCTATGGC---ATTTCAATCTATACATCATTCATTGCTTACCAGCTGAAGATTTTGACTTGAGAAT
E. g. Ref   1998 TATTAGAAGCATTTCCAGATATTCTCAA-CTCTCTTCTTTTCTTAGATTCAAAATTGTTTTTAGT----CTTTCAGACACATTTGGCATCAATTGTTTGA O. full BC  1918 AACTGTAGCCTAGGCCAATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCACATTTAATTACCTTAAATATTTCTTTCAGTTTGTCTAGGCAGTAAAACATGAC E. g. Ref   2093 CAAACGCTGCC-----------------------------------------------------------------------------------------
O. full BC  2018 TGGAAATTGTATGAATGAGAAGCATAGCTTCTGCTTGGAAACAATTTGGGATGTAGGTATATTTGGGTATGGAGACATATTYTGAACTCAGCTGTTATTG
E. g. Ref   2103 ----------------------------------------------------------------- O. full BC  2118 TTATTTATGGACTTCATGTTCTTTCCAATAGTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Gambar 9.  Hasil penjajaran sekuen DNA BC terklon (O full BC/baris bawah) dengan sekuen BC yang dihasilkan oleh Omar et al. (2008) (E.g. Ref/baris atas). A : hijau; T : merah; G : hitam; C : biru.
Figure 9.  Alignment of the cloned BC sequences (O full BC/bottom row) and BC sequences as reported by Omar et al. (2008)
( E.g. Ref/top row). A : green; T : red; G : black; C : blue.
didepositkan di GenBank dengan  no aksesi ( accession no )  DG531848.1.  Hasil  ini  sedikit  lebih  tinggi  diban- dingkan  dengan  tingkat  kesamaannya  (%  identity) dengan  gen  BC  dari  tanaman  lain  seperti Theobroma cacao (82%) dan Glycine max (83%) (Gambar 8C). Hasil  penjajaran  sekuen  BC  terklon  dengan sekuen  BC  referen  yang  dilaporkan  oleh  Omar et  al. (2008) menggunakan ClustalW program BioEdit dapat dilihat  pada  Gambar  9.  Nampak  bahwa start  codon
(asam  amino  metionin/M)  terletak  pada  nukleotida  ke 224-226  dari  sekuen  BC  terklon  yang  sejajar  dengan basa ke 297-299 dari sekuen BC referensi (Omar et al ., 2008).  Perbedaan  nukleotida  dari start  codon hingga nukleotida ke 1800 antara lain adalah substitusi A pada nukleotida  ke  418  dari  sekuen  referen  oleh  T  pada nukleotida ke 343 dari sekuen BC terklon (C,418/T,343);  (C,  436/G,361);  (G,  448/  A,  373);  (T, 793/A,  720);  (C,  829/  T,  756);  (C,851/  A,  778);  dan
(A,862/  G,786).  Di  samping  itu  juga  dideteksi  adanya insersi  atau  penyisipan  satu  nukleotida  pada  posisi setelah nukleotida ke 751 dari sekuen BC terklon yang sejajar  dengan  nukleotida  ke  789  dari  sekuen  BC referen. Perbedaan sekuen yang cukup tinggi dideteksi setelah  nukleotida  ke  1800  dari  BC  terklon. Keseluruhan  perbedaan  tersebut  menarik  untuk  dikaji lebih  jauh,  apakah  berkaitan  dengan  perbedaan karakter  yang  dimiliki,  seperti  rendemen  minyak, komposisi asam lemak dan lain sebagainya.
Kloning gen ACCase dari berbagai tanaman telah banyak  dilaporkan.  Pada  tanaman  kelapa  sawit, kloning  gen  penyandi  ACCase  subunit  beta  (accD) dilaporkan  oleh  Nugkaew  (2005)  dan  Nakkaew et  al. (2008), sedangkan kloning gen ACCase subunit biotin karboksilase  disampaikan  oleh Nakkaew et  al. (2008) dan  Omar et  al. (2008).  Pendekatan  awal  yang dilakukan  oleh  Omar et  al. (2008)  dalam  mengisolasi gen  BC  sama  dengan  yang  dilakukan  pada  penelitian ini,  yaitu  RACE  PCR  untuk  amplifikasi  fragmen  5’- cDNA  dan  3’-cDNA.  Namun  cara  dalam  mendapat- kan  cDNA  lengkapnya  berbeda,  yaitu  menggunakan teknik end to end PCR. Upaya mengisolasi dan meng- klon  gen  ACCase  merupakan  tahapan  penting  yang diperlukan  untuk  berbagai  tujuan  seperti  rekayasa metabolisme.  Peran  kunci  gen  tersebut  dalam  bio- sintesis asam lemak dan akumulasi kandungan minyak, memberikan  peluang  dilakukannya  rekayasa  genetika untuk  meningkatkan  rendemen  minyak  melalui mekanisme up regulation untuk mengover-ekspresikan gen  tersebut.  Di  sisi  lain,  Omar et  al. (2008) menggunakan gen
ACCase
terklon untuk memproduksi  bioplastik  (PHB  dan  PHBV).  Melalui mekanisme down regulation, aktivitas biosintesis asam lemak  ditekan  dan  asetil  CoA  diarahkan  untuk produksi PHB dan PHBV.

## Kesimpulan
cDNA  lengkap  penyandi  ACCase  subunit  biotin carboxylase telah  diperoleh  dan  diklon  pada E.  coli . Dengan  pendekatan  yang  sama,  gen-gen  penyandi subunit  lainnya  dari  ACCase  juga  dapat  diklon, sehingga  aplikasinya  untuk  peningkatan  rendemen minyak  dapat  lebih  optimal.  Melalui  rekayasa  gene- tika,  cDNA  penyandi  ACCase  subunit  BC  yang berhasil  diklon  dalam  penelitian  ini  diharapkan  dapat dimanfaatkan untuk perbaikan sifat tanaman, terutama peningkatan  rendemen  minyak  atau  lemak,  baik  pada tanaman  kelapa  sawit,  maupun  pada  tanaman  lain seperti kakao, jarak pagar dan jagung.

## Daftar Pustaka
Budiani A (2005). Ekspresi protein spesifik dalam biosintesis minyak  dan  kloning  gen  penyandi  ht-ACCase  subunit biotin  karboksilase  dan  enoil-ACP  reduktase  dari mesokarp kelapa sawit ( Elaeis guineensis Jacq.). Tesis
S3.  Bogor,  Sekolah  Pascasarjana.  Institut  Pertanian Bogor.
Budiani A, D Santoso, H Aswidinnoor & A Suwanto (2008).
Accase  activity  of  oil  palm  mesocarp  and  cloning  of gene  fragment  encoding  biotin  carboxylase  subunit  of ACCase. Ind J Agricul 1(1), 44-50.
Chajes  V,  M  Cambot,  K  Moreau,  GM  Lenoir  &  V  Joulin (2006).  Acetyl-CoA  carboxylase  alpha  is  essential  to breast cancer cell survival. Cancer Res 66, 5287–5294.
Chang  S,  J  Puryear  &  J  Cairney  (1993).  A  simple  and efficient  methode  for  isolating  RNA  from  pine  trees. Plant Mol Biol Rep 11, 98-100.
Francki  MG,  P  Whitaker,  PM  Smith  &  CA  Atkins  (2002).
Differential  expression  of  a  novel  gene  during  seed triacylglycerol  accumulation  in  lupin  species  ( Lupinus angustifolius L.and L.  mutabilis L.). Functional  & Intregative Genomics 26, 292-300.
Gerdes SY, MD Scholle, JW Campbell, G Balazsi, E Ravasz, MD Daugherty, AL Somera, NC Kyrpides, I Anderson, MS  Gelfand,  A  Bhattacharya,  V  Kapatral,  M D'Souza,  MV  Baev,  Y  Grechkin,  F  Mseeh,  MY Fonstein,  R  Overbeek,  AL  Barabasi,  ZN  Oltvai  &  AL Osterman  (2003).  Experimental  determination  and system level analysis of essential genes in Escherichia coli MG1655. J Bacteriol 185, 5673–5684.
Jacobs  MA,  A  Alwood,  I  Thaipisuttikul,  D  Spencer,  E Haugen, S Ernst, O Will, R Kaul, C Raymond, R Levy, L Chun-Rong, D Guenthner, D Bovee, MV Olson & C Manoil  (2003).  Comprehensive  transposon  mutant library  of Pseudomonas  aeruginosa . Proc  Natl  Acad Sci USA 100, 14339–14344.
Kachroo A & P Kachroo (2009). Fatty acid – derived signals in plant defense. Ann Rev Phytopathol 47,153–76.
Ke  J,  T-N  Wen,  BJ  Nikolau  &  ES  Wurtele  (2000). Coordinate  regulation  of  the  nuclear  and  plastidic genes  coding  for  the  subunit  of  heteromeric  Acetyl- Coenzyme  A  Carboxylase. Plant  Physiol 122,  1057- 1071.
Kunst  L  &  AL  Samuels  (2003).  Biosynthesis  and  secretion of plant cuticular wax. Prog Lipid Res 42, 51 – 80.
Leonard,  A.E.,  S.L.  Pereira,  H.  Sprecher  &  Y.S.  Huang (2004).  Elongation  of  long-chain  fatty  acids. Prog Lipid Res 43: 36 – 54.
Li S-J & JE Jr Cronan (1992). The gene encoding the biotin carboxylase  subunit  of Escherichia  coli acetyl-CoA carboxylase. J Biol Chem 267, 855-863.
Liechti R & EE Farmer (2002). The jasmonate pathway. Sci 296, 1649-1650.
Nakkaew A, W Chotigeat, T Eksomtramage & A Phongdara (2008). Cloning  and  expression  of  a  plastid-encoded subunit,  beta-carboxyltransferase  gene  ( accD )  and  a nuclear-encoded  subunit,  biotin  carboxylase  of  acetyl- CoA  carboxylase  from  oil  palm  ( Elaeis  guineensis Jacq.) Plant Sci 175(4), 497 – 504.
Nikolau BJ, JB Ohlrogge & ES Wurtele (2003). Plant biotin- containing  carboxylases. Arch  of  Biochem  &  Biophys 414, 211–222.
Nugkaew  A  (2005).  Cloning  Acetyl-CoA  carboxylase  beta subunuit  (AccD)  from  mesocarp  of  oil  palm  ( E. guineensis ) . Taken  from : http://agris.fao.org/  records  / th2005002332. [2005]
Ohlrogge  J  &  J  Browse  (1995).  Lipid  biosynthesis. Plant Cell 7, 957-970.
Omar  WSW,  LB  Willis,  Chokyun  RHA,  AJ  Sinskey,  US
Ramli, AMM Yunus, GK Parveez & R
Sambanthamurthi  (2008).  Isolation  and  utilization  of Acetyl-CoA  Carboxylase  from  oil  palm  ( Elaeis guineensis ) mesocarp. J Oil palm Res Special Issue on Malaysia- MIT Biotechnology Partnership Programme Vol 2 Oil Palm Metabolic Engineering p. 97 – 107.
Parsons  JB  &  CO  Rock  (2011).  Is  bacterial  fatty  acid synthesis  a  valid  target  for  antibacterial  drug discovery?. Curr Opin Microbiol 14, 544–549.
Payne DJ, MN Gwynn, DJ Holmes & DL Pompliano (2007) Drugs  for  bad  bugs:  Confronting  the  challenges  of antibacterial discovery. Nat Rev Drug Discov 6, 29–40.
Podkowinski  J,  J  Jelenska,  A  Sirikhachornkit,  E  Zuther,  R Haselkorn  &  P  Gornicki  (2003).  Expression  of cytosolic  and  plastid  acetyl-CoA  carboxylase  genes  in young wheat plants. Plant Physiol 131, 763-772.
Salama  NR,  B  Shepherd  &  S  Falkow  (2004).  Global transposon  mutagenesis  and  essential  gene  analysis  of Helicobacter pylori. J Bacteriol 186, 7926–7935.
Sambrook  J,  EF  Fritsch  &  T  Maniatis  (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Book 1 and 2, 2 nd ed.. New York, Cold Spring Habor Laboratory.
Sasaki Y & Y Nagano (2004). Plant acetyl-CoA carboxylase: structure, biosynthesis, regulation, and gene manipulation  for  plant  breeding. Biosci  Biotechnol Biochem 68, 1175-1184.
Sassetti  CM,  DH  Boyd  &  EJ  Rubin  (2003)  Genes  required for  mycobacterial  growth  defined  by  high  density mutagenesis. Mol Microbiol 48, 77–84.
Shah J (2005). Lipids, lipases, and lipid-modifying enzymes in plant diseases resistance. Ann   Rev  Phytopathol 43, 229-260.
Sperling  P  &  E  Heinz  (2003).  Plant  spingolipids:  structural diversity,  biosynthesis,  first  genes  and  functions. Biochim Biophys Acta 1632, 1-15.
Tong  L  (2005).  Acetyl-coenzyme  a  carboxylase:  Crucial metabolic  enzyme  and  attractive  target  for  drug discovery. Cell Mol Life Sci 62, 1784-1802.
Tong  L  &  HJ  Harwood  Jr  (2006) . Acetyl-coenzyme  a carboxylases:  versatile  targets  for  drug  discovery. J Cell Biochem 99, 1476–1488.
Worrall D, CK Ng & AM Hetherington (2003). Spingolipids, new plyers in plant signaling. Trends Plant Sci 8, 317- 320.
Wright  HT  &  KA  Reynolds  (2007).  Antibacterial  targets  in fatty acid biosynthesis. Curr Opin Microbiol 10, 447– 453.
Zhang H, B Tweel, J Li & L Tong  (2004). Crystal structure of  the  carboxyltransferase  domain  of  acetyl-coenzyme a  carboxylase  in  complex  with  CP-640186. Structure 12, 1683–1691.