Jurnal : Jurnal Kesehatan Prima Volume
: 9, No.1, Februari 2015, Halaman : 1457-1469
ISSN Print : 1978 – 1334, ISSN Online : 2460 – 8661

## ___________________________________________________________________________
Maruni  Wiwin  Diarti,  IGAN  Danuyanti,  I  Gede  Billy  Sumantri  :  Jurusan  Analis  Kesehatan  Poltekkes  Kemenkes  Mataram,  Jl.  Prabu Rangkasari Dasan Cermen Sandubaya Mataram

## SENYAWA PENGKUPLING α-NAFTHILAMIN UNTUK VALIDASI METODE
SPEKTROFOTOMETRI PENENTUAN NITRIT ( ) DI DALAM AIR
Maruni Wiwin Diarti, I Gusti Ayu Nyoman Danuyanti, I Gede Billy Sumantri
Abstract :  Validation  of  analytical  methods  need  to  be  conducted  to  determine  the  feasibility  of  the  method when  the  method  is  newly  developed  or  modified.  Determination  of  nitrite  in  water-based  Cupling  diazotized reaction  has  been  developed  in  various  fields.  Many  modifications  have  been  carried  out  primarily  in  the selection of the source of the diazonium salt compound or compounds that can cupling.  The this study was to determine  the  validity  of  the  determination  of  nitrite  in  water  by  spectrophotometric    method    cupling compound  α-nafthilamin.  This  study  is  a  pre-experiments  with  experimental  units  and  large  units  based guidelines experimental validation of analytical methods. The results show the value of 0.995 linearity, limit of detection (LOD) 0.039 ppm, 0.882 sensitivity, precision 1.38%, and 100.37% accuracy rate. The conclusion of this study is the method of spectrophotometric determination of nitrite in water using compound α-nafthilamin cupling  valid for determining the concentration of nitrite in the water with a minimum detection limit of 0.039 ppm.
Kata Kunci : Validation method, Determination of nitrite, α-nafthilamin.

## PENDAHULUAN
Reaksi  diazotasi  adalah  reaksi  antara  nitrit dengan  senyawa  yang  memiliki  amin  aromatik primer  dalam  suasana  asam  akan  membentuk  garam diazonium.  Beberapa  senyawa  yang  memiliki  amin aromatik  primer  yang  umum  digunakan  sebagai sumber  garam  diazonium  adalah  Anilin,  Asam sulfanilat,  atau  ρ-nitro  anilin  (Fesenden,  1991). Garam  diazonium  dapat  bereaksi  dengan  senyawa lain  yang  memiliki  gugus  fenil  terbuka,  disebut sebagai  senyawa  pengkupling,  akan  menghasilkan senyawa  azo.  Kombinasi  garam  diazonium  dengan senyawa pengkupling yang berbeda-beda menghasilkan senyawa azo dengan karakteristik yang berbeda-beda,  misalnya,  senyawa  pengkupling  β- naftol dengan sumber garam diazonium 3-nitroanilin akan  membentuk  senyawa  azo  berwarna  merah, senyawa pengkupling N-(1-naphthyl) ethylene
diamine dihydrochloride dengan sumber garam diazonium asam sulfanilat akan membentuk senyawa azo berwarna merah keunguan, senyawa pengkupling fenol  dengan  sumber  garam  diazonium  anilin  akan membentuk senyawa azo berwarna orange (Fessenden,  1991).    Berbagai  metode  baik  dalam bidang  farmasi,  kimia,  bahkan  bakteriologi  telah dikembangkan  berdasarkan  pada  reaksi  diazotasi- kupling diantaranya mendeteksi nitrit sebagai reduksi nitrat  oleh  bakteri,  penetapan  kadar  Furosamide, penetapan  kadar  nitrit  dalam  air,  dan  lain-lain (Metwally dan Belal,1992; Shah, 2005).  Senyawa α- nafthilamin pertama kali digunakan oleh Peter Griess pada  tahun  1879  sebagai  senyawa  pengkupling dengan  sumber  garam  diazonium  Asam  sulfanilat untuk  mendeteksi  adanya  nitrit  dalam  suatu  larutan atau  campuran.  Senyawa  azo  yang  terbentuk memiliki  karakteristik  berwarna  merah  keunguan.
Saat  ini  α-nafthilamine  umumnya  digunakan  dalam bidang  bakteriologi  untuk  mendeteksi  adanya  nitrit sebagai  reduksi  nitrat  oleh  bakteri.  Di  Indonesia sesuai  ketetapan  Badan  Standarisasi  Nasional penetapan  kadar  nitrit  dalam  air  menggunakan Sulfanilamid  sebagai  sumber  garam  diazonium  dan N-(1-naphthyl) ethylene diamine dihydrochloride sebagai senyawa pengkupling (Badan  Standarisasi  Nasional,  2004;  Buxton,  2012). Berdasarkan  penelitian  pendahuluan  menggunakan α-nafthilaminsebagai  senyawa  pengkupling  dengan sumber  garam  diazonium  Asam  sulfanilat  dapat membentuk senyawa azo dengan karakteristik warna yang  hampir  sama  dengan  senyawa  azo  yang terbentuk  dengan  senyawa  pengkupling N-(1- naphthyl)  ethylene  diamine  dihydrochloride dengan sumber  garam  diazonium  sulfanilamid.  Oleh  karena itu,  dalam  penelitian  ini  peneliti  ingin  mencoba menggunakan senyawa α-nafthilamin  sebagai senyawa pengkupling pada penentuan nitrit dalam air metode spektrofotometri.  Metode yang dimodifikasi tersebut  akan  diuji  validitasnya  dengan  menentukan parameter  validasi  metode  analisis.  Hasil  pengujian tersebut  akan  menentukan  apakah  metode  yang dimodifikasi  tersebut  layak  atau  tidak  digunakan untuk  menentukan  konsentrasi  nitrit  di  dalam  air secara spektrofotometri.

## METODE PENELITIAN
Jenis  penelitian  ini  merupakan  penelitian pre-experiment . Penelitian pre-experiment memenuhi 2  dari  3  syarat true-experiment yaitu  replikasi  dan kontrol  sedangkan  randomisasi  tidak  terpenuhi (Notoatmodjo,  2005).  Unit  eksperimen  dalam
penelitian  ini  menggunakan  larutan  standar  nitrit (NO 2 -N)  dengan  kadar0,1  ppm,  0,2  ppm,  0,3  ppm, 0,4 ppm, dan 0,5 ppm dan sampel dengan konsentrasi nitrit  0,1  ppm,  0,3  ppm,  dan  0,5  ppm.  Standar  dan Sampel  dibuat  dari  natrium  nitrit  (NaNO2)  yang dilarutkan  dengan  akubidest  yang  telah  diuji kemampuan  menghatar  listriknya  hampir  nol  untuk meminimalkan  adanya  pengganggu.  Penentuan linearitas,  batas  deteksi  (LoD),  sensitifitas  dan presisidalam  pedoman  validasi  metode  analisis menggunakan satu seri  larutan  standar  yang berbeda konsentrasinyadan untuk menentukan presisi pembacaan  minimal  direplikasi  sebanyak  6  kali sehinggadalam penelitian ini menggunakan 5 larutan standar  sebagai  unit  eksperimen  dengan  konsentrasi 0,1  ppm;  0,2  ppm;  0,3  ppm;  0,4  ppm;  dan  0,5  ppm masing-masing  direplikasi  sebanyak  6  kali.  Jadi dalam  penentuan  linearitas,  batas  deteksi  (LoD), sensitifitas,  dan  presisi  menggunakan  30  unit eksperimen  (Harmita,  2004).  Penentuan  akurasi menggunakan suatu sampel dengan konsentrasi yang telah  diketahui,  dalam  pedoman  validasi  tidak dijelaskan  berapa  minimal  unit  eksperimen  yang harus digunakan tapi dalam penelitian  ini digunakan konsentrasi  sampel  dengan  konsentrasi  0,1  ppm;  0,3 ppm;  dan  0,5  ppm  dengan  pembacaan  masing- masing  diulang  sebanyak  5  kali.    Instrumentasi penelitian  :  Spektrofotometer,  Neraca  analitik,  Labu Ukur1000 ml, 500 ml, dan 50 ml, Becker glass 1000 ml,  500  ml,dan  200  ml,  Labu  erlenmeyer  100  ml, Pipet volume 1 ml, 2ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, dan 50 ml, Pipet  ukur  1  ml,  Pipet  tetes.  Reagensia  semua reagensia yang digunakan dalam penelitian ini dibuat dari bahan kimia dengan derajat kemurnian pro analis
(pa), Larutan induk nitrit (NO 2 -N) dengan konsentrasi  250  ppm,  Larutan  intermediet  nitrit (NO 2 -N) dengan konsentrasi 50 ppm, Larutan standar nitrit  (NO 2 -N)konsentrasi  0,1  ppm;0,2  ppm;0,3 ppm;0,4  ppm;  dan  0,5  ppm,  Larutan  pereaksi sulfanilamid 1%b/v, Larutan pereaksi α- naphtylamine 0,6 %b/v dalam etanol.
Metoder kerja :
a. Pembuatan  larutan  induk  nitrit  (NO 2 -N)250  ppm sebanyak 1000 ml
1) Dipastikan alat-alat yang akan digunakan telah bersih dan dikalibrasi
2) Dibilas alat-alat gelas yang akan digunakan dengan aquabidest
3) Ditimbang Natrium nitrit 1,232 gram
4) Dimasukkan dalam becker glass
5) Ditambahkan aquabidest sedikit demi sedikit hingga larut
6) Dipindahkan dalam labu ukur 1000ml
7) Ditepatkan sampai tanda dengan pipet tetes
b. Pembuatan  larutan  intermedietnitrit  (NO 2 -N)50 ppm sebanyak 50 ml
1) Dipastikan  alat-alat  yang  akan  digunakan telah bersih dan dikalibrasi
2) Dibilas  alat-alat  gelas  yang  akan  digunakan dengan aquabidest
3) Dipipet  dengan  pipet  volume  10,0  ml  larutan induk nitrit.
4) Dimasukkan dalam labu ukur 50 ml
5) Ditambahkan  aquabidest  sedikit  demi  sedikit sambil dikocok
6) Ditepatkan sampai tanda dengan pipet tetes. (Tujuan  pembuatan  larutan  intermediet  nitrit
(NO 2 -N)  50  ppm  adalah  untuk  memperbesar
nilai  pemipetan  dalam  pembuatan  larutan standar  nitrit  sehingga  mengurangi  faktor kesalahan)
c. Pembuatan  larutan  standar  nitrit  (NO 2 -N)0,1 ppm;  0,2  ppm;  0,3  ppm;  0,4  ppm;  dan  0,5  ppm masing-masing sebanyak 500 ml
1) Dipastikan  alat-alat  yang  akan  digunakan telah bersih dan dikalibrasi
2) Dibilas  alat-alat  gelas  yang  akan  digunakan dengan aquabidest
3) Dipipet dengan pipet volume masing-masing:
a) 1,0  ml  larutan  intermediet  nitrit  (NO 2 - N)untuk  pembuatan  larutan  standard  0,1
ppm
b) 2,0  ml  larutan  intermediet  nitrit(NO 2 -N) untuk  pembuatan  larutan  standard  0,2
ppm
c) 3,0  ml  larutan  intermediet  nitrit(NO 2 -N) untuk  pembuatan  larutan  standard  0,3
ppm
d) 4,0  ml  larutan  intermediet  nitrit(NO 2 -N) untuk  pembuatan  larutan  standard  0,4
ppm
e) 5,0  ml  larutan  intermediet  nitrit(NO 2 -N) untuk  pembuatan  larutan  standard  0.5 ppm
4) Dimasukkan dalam labu ukur 500 ml
5) Ditambahkan  aquabidest  sedikit  demi  sedikit sambil dikocok
6) Ditepatkan sampai tanda dengan pipet tetes.
d. Pembuatan larutan pereaksi sulfanilamid 1%b/v
1) Dipastikan alat-alat gelas yang akan digunakan dalam keadaan bersih
2) Dibilas  alat-alat  gelas  yang  akan  digunakan dengan aquabidest
3) Ditimbang 1 gramSulfanilamid
4) Dimasukkan  dalam becker  glass yang  telah disiapkan
5) Ditambahkan 20 ml aquabidest
6) Ditambahkan 10 ml HCl pekat
7) Diaduk  sampai  sulfanilamid  larut,  bila  sudah larut ditambahkan aquabidest sampai 100 ml.
8) Dipindahkan dalam botol yang telah disiapkan.
e. Pembuatan larutan pereaksi α-nafthilamin
0,6%b/v dalam etanol 95%.
1) Dipastikan alat-alat gelas yang akan digunakan dalam keadaan bersih
2) Dibilas  alat-alat  gelas  yang  akan  digunakan dengan aquabidest
3) Ditimbang 600 mg α-nafthilamin
4) Dimasukkan dalam becker glass
5) Ditambahkan etanol 95% sedikit demi sedikit hingga larut
6) Ditambahkan etanol 95% sampai 100 ml
7) Dipindahkan  dalam  botol  gelap  yang  telah disiapkan.
f. Pengukuranabsorbansi larutan standar nitrit
1) Dipastikan alat-alat gelas yang akan digunakan  telah  bersih  dan  telah  dibilas dengan aquabidest.
2) Dioptimalkan spektrofotometer sesuai petunjuk penggunaan alat.
3) Dipipet  50,0  ml  larutan  standaryang  akan diukur absorbansinya, dimasukkan dalam labu erlenmeyer yang telah disiapkan.
4) Ditambahkan  1  ml  larutan  sulfanilamid, dikocok, dan didiamkan 2-8 menit.
5) Ditambahkan  1  ml  larutan  α-nafthilamin, dikocok  dan  didiamkan  selama  15menit  dan segera lakukan pengukuran absorbansi (pengukuran  tidak  boleh  dilakukan  lebih  dari 1 jam).
6) Diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer  pada  panjang  gelombang 543 nm.
7) Dilakukan replikasi masing-masing 6 kali.
g. Menentukan  konsentrasi  sampel  nitrit  untuk menentukan persen recovery.
1) Dipastikan  alat-alat  gelas  yang  digunakan telah  bersih  dan  telah  dibilas  dengan aquabidest.
2) Dioptimalkan spektrofotometer sesuai petunjuk penggunaan alat.
3) Dipipet  50,0  ml  sampel  yang  akan  diukur konsentrasinya,  dimasukkan  dalam  labu erlenmeyer yang telah disiapkan.
4) Ditambahkan  1  ml  larutan  Sulfanilamid, dikocok, dan didiamkan 2-8 menit.
5) Ditambahkan  1  ml  larutan  α-nafthilamin, dikocok,didiamkan  selama  15  menit,  dan segera lakukan pengukuran absorbansi (pembacaan jangan ditunda lebih dari 1 jam)
6) Ditentukan konsentrasi dengan
spektrofotometer  pada  panjang  gelombang 543 nm.
7) Perlakuan direplikasi 5 kali.
(Penentuan  pembacaan  setelah  15  menit penambahan  α-nafthilamin  dan  penundaan tidak  lebih  1  jam  didasarkan  atas  percobaan
sederhana  pengukuran  absorbansi  dengan interval  waktu dimana dalam  waktu 15  menit sampai  1  jam  tidak  terjadi  perubahan absorbansi)
Data  yang  didapat  dipergunakan  untuk  menentukan nilai parameter validasi sebagai berikut:
a. Penentuan linearitas Linearitas  diperoleh  dari  pembuatan  kurva standar  antara  konsentrasi  terhadap  absorbansi. Dimana  yang digunakan sebagai sumbu  x adalah konsentrasi  larutan  standar  dan  yang  digunakan sebagai  sumbu  y  adalah  absorbansi.  Dari  kurva tersebut  dicari  persamaan  regresinya,  sehingga diperoleh persamaan berikut: y = bx + a Keterangan:
b = Slope
a = Intercept
y = Nilai absorban pada sumbu y
x = Kadar larutan standar pada sumbu x Berdasarkan kurva tersebut didapatkan nilai koefisien korelasi (r).
b. Penentuan batas deteksi (LoD)
Untuk  menentukan  nilai  LoD  pertama-tama  kita harus  menghitung  nilai  absorbansi  hitung  ( ́ ) yang didapat dari subtitusi nilai x pada persamaan regresi garis linear y = bx + a. Selanjutnya dicari nilai (Simpangan  baku  terhadap  blanko) dengan persamaan:
= √
Keterangan:
= Simpangan baku terhadap blanko
́ = nilai  absorbansi  hitung,  yaitu nilai  y  yang  didapat  dengan subtitusi  masing-masing  nilai  x ke  dalam  persamaan  garis  linear y = bx + a
=  nilai  absorban  pengukuran,  yaitu nilai y masing-masing konsentrasi (x). n = jumlah standar nitrit yang digunakan.
Dicari nilai LoD dengan persamaan:
LoD =
Keterangan: LoD = Batas Deteksi b = nilai slope (b) pada persamaan regresi garis lineary = bx + a.
c. Penentuan sensitifitas
Sensitifitas  ditentukan  dari  harga slope (b)  yang berasal  dari  regresi  linier  kurva  standar  y  =  bx  +
a.
d. Penentuan presisi
Berdasarkan data diatas dapat dicari nilai standar deviasi (SD) dengan cara:

## SD = √ ̅
Keterangan:  n = jumlah replikasi Selanjutnya presisi dihitung sebagai simpangan baku relative (RSD) atau koefisien variasi (KV), ditentukan dengan cara:
KV = ̅ X 100%
e. Penentuan Akurasi
Untuk  menentukan  nilai  akurasi  metode  yang dinyatakan  sebagai persen  recovery ditentukan dengan rumus:
% recovery =

## HASIL PENELITIAN
1.  Hasil Pengukuran Absorbansi Larutan Standar Nitrit
Tabel 1.  Hasil Pembacaan Absorbansi Standar Nitrit
No Konst. (ppm) Absorbansi ̅ 1 0,1 0,106 0,103 0,105 0,104 0,107 0,103 0,105 2 0,2 0,176 0,173 0,175 0,179 0,180 0,177 0,177 3 0,3 0,255 0,257 0,259 0,264 0,264 0,260 0,260 4 0,4 0,372 0,372 0,362 0,372 0,375 0,371 0,371 5 0,5 0,444 0,447 0,446 0,445 0,459 0,450 0,449
Hasil pembacaan konsentrasi sampel nitrit  yang digunakan untuk menentukan akurasi dapat dilihat pada tabel 2.

## Tabel 2.  Hasil Pembacaan Konsentrasi Sampel Nitrit
No Sampel (ppm) Konsentrasi (ppm) Rata-rata (ppm) 1 2 3 4 5 1 0,1 0,103 0,101 0,103 0,096 0,102 0,1010 2 0,3 0,300 0,298 0,303 0,298 0,299 0,2996 3 0,5 0,502 0,500 0,499 0,506 0,500 0,5010
Berdasarkan  data  tersebut  dapat  ditentukan  nilai linearitas  metode,  batas  deteksi  metode  (LoD), Sensitifitas metode, presisi dan akurasi metode.

## 1. Penentuan Linearitas Metode
Linearitas  metode  ditentukan  dengan  membaca absorbansi  larutan  standar  dengan  berbagai variasi konsentrasi. Berdasarkan hasil
pembacaan  tersebut  dibuat  kurva  kalibrasi
dengan sumbu x adalah konsentrasi dan sumbu y adalah  absorbansi.  Dari  kurva  tersebut  dapat ditentukan nilai koefisien korelasi yang merupakan acuan linearitas.
Absorbansi rata-rata larutan standar seperti yang ditunjukkan  pada  tabel  4.1.  kemudian  dibuat kurva standar sebagai berikut:
Jurnal : Jurnal Kesehatan Prima Volume
: 9, No.1, Februari 2015, Halaman : 1457-1469
ISSN Print : 1978 – 1334, ISSN Online : 2460 – 8661

## ___________________________________________________________________________
Maruni  Wiwin  Diarti,  IGAN  Danuyanti,  I  Gede  Billy  Sumantri  :  Jurusan  Analis  Kesehatan  Poltekkes  Kemenkes  Mataram,  Jl.  Prabu Rangkasari Dasan Cermen Sandubaya Mataram

## Gambar 1. Kurva Standar
Pada  gambar  1.    dapat  dilihat  nilai  koefisien korelasi (r) yang didapat adalah 0,995.

## 2. Penentuan Batas Deteksi (LoD)
Untuk  menentukan  nilai  batas  deteksi  (LoD) pertama-tama  kita  harus  menghitung  nilai absorbansi hitung ( ́ ) yang didapat dari subtitusi
nilai  x  pada  persamaan  regresi  garis  linear  y  = bx + a. Berdasarkan  kurva standar pada gambar 1 didapat persamaan regresi linear y = 0,882x + 0,0078. Data hasil penghitungan nilai absorbansi hitung ( ́ ) dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3.  Data Hasil Penghitungan Absorbansi Hitung ( ́ )
No Konsentrasi (x) dalam ppm Perhitungan Absorbansi hitung ( ́ ) 1 0,1 0,882 X 0,1 + 0,0078 0,096 2 0,2 0,882 X 0,2 + 0,0078 0,1842 3 0,3 0,882 X 0,3 + 0,0078 0,2724 4 0,4 0,882 X 0,4 + 0,0078 0,3606 5 0,5 0,882 X 0,5 + 0,0078 0,4488
Selanjutnya dicari nilai simpangan baku terhadap  blangko  dengan  rumus = √ , nilai ́ dapat dilihat pada tabel 3 Nilai
merupakan  nilai  absorbansi  pengukuran konsentrasi standar nitrit sesuai tabel 4.
y = 0.882x + 0.0078 R² = 0.995 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 A B SORB A N SI KONSENTRASI KURVA STANDAR
Tabel 4. Data Hasil Perhitungan Nilai ́ No Konsentrasi standar Absorbansi ukur ( ) Absorbansi hitung ( ́ ) ́ 1 0,1 0,105 0,096 0,000081 2 0,2 0,177 0,1842 0,00005184 3 0,3 0,260 0,2724 0,00015376 4 0,4 0,371 0,3606 0,00010816 5 0,5 0,449 0,4488 0,00000004 ́ 0,0003948
Perhitungan  nilai  simpangan  baku  terhadap blangko ( adalah sebagai berikut:
= √ = √ = √
= 0,011471704
Perhitungan  nilai  batas  deteksi  (LoD)  adalah sebagai berikut:
LoD =
LoD =
LoD = 0,039
Berdasarkan  perhitungan  didapatkan  nilai  batas deteksi (LoD) adalah 0,039 ppm.

## 3. Penentuan Nilai Sensitifitas
Sensitifitas  ditentukan  dari  nilai slope (b)  pada persamaan  regresi  garis  linear  y  =  bx  +  a. Berdasarkan  kurva  standar  yang  terlihat  pada gambar  4.1didapatkan  persamaan  regresi  garis linear  adalah  y  =  0,882x  +  0,0078.  Jadi  nilai sensitifitas adalah 0,882.

## 4. Penentuan Presisi
Data  hasil  penentuan  presisi  diperoleh  dari pengukuran  absorbansi  larutan  standar.  Sesuai dengan data yang ditunjukkan pada tabel 5 dapat dihitung nilai standar deviasi (SD) dan koefisien variasi  (KV).  Tabel  hasil  penghitungan  presisi dapat dilihat pada tabel 5.

## Tabel  5. Tabel Penghitungan Presisi
No standar ̅ Standar Deviasi Koefisien Variasi (%) 1 0,1 0,000014 0,00167332 1,59 2 0,2 0,000034 0,002607681 1,47 3 0,3 0,000067 0,003660601 1,41 4 0,4 0,0001 0,004472136 1,20 5 0,5 0,000155 0,005567764 1,24 Rerata 1,38
Berdasarkan  penghitungan  presisi  pada  tabel  6 didapatkan nilai presisi yang dinyatakan sebagai nilai koefisien variasi adalah 1,38 %.
5. Penentuan Akurasi
Untuk menentukan akurasi dilakukan
pengukuran  sampel  dengan  metode  yang divalidasi  dimana  konsentrasi  sampel  yang sebenarnya  telah  diketahui.  Akurasi  dinyatakan sebagai persen  recovery yang  didapat  dengan rumus:
Persen recovery = X 100% Data  hasil  perhitungan persen  recovery dapat dilihat pada tabel 6
Tabel 6. Data Hasil Perhitungan Persen Recovery No Konsentrasi sebenarnya (ppm) Konsentrasi pembacaan (ppm) % recovery 1 0,1 0,1010 101,0 2 0,3 0,2996 99,9 3 0,5 0,5010 100,2 Rerata (%) 100,37
Berdasarkan  penghitungan  nilai  akurasi  pada tabel 6 didapatkan nilai akurasi yang dinyatakan sebagai persen recovery sebesar 100,37%.

## PEMBAHASAN
Validasi metode analisis adalah adalah suatu tindakan penilaian terhadap suatu metode, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk memastikan  atau  mengkonfirmasi  bahwa  metode tersebut  sesuai  untuk  penggunaannya.  Penentuan berbagai  parameter  validasi  metode  analisis  perlu dilakukan  untuk  metode  yang  baru  dikembangkan atau  metode  yang  dimodifikasi  untuk  mengetahui kelayakannya.  Dalam  penelitian  ini  parameter validasi  yang  ditentukan  adalah  linearitas,  batas deteksi, sensitifitas, presisi, dan akurasi.
Berdasarkan  hasil  pengukuran  absorbansi  pada konsentrasi standar nitrit (NO2-N) 0,1 ppm; 0,2 ppm; 0,3  ppm;  0,4  ppm;  dan  0,5  ppm  didapatkan  kurva standar  dengan koefisien  korelasi atau  linearitas 0,995. Nilai ini telah sesuai dengan standar baku SNI 06-6989.9-2004 cara uji nitrit secara spektrofotometri  dalam  air  dan  air  limbah  untuk pengendalian  mutu  dimana  linearitas  tidak  boleh lebih  rendah  dari  0,99.  Tercapainya  nilai  linearitas diatas 0,99 menandakan bahwa walaupun dimodifikasi  menggunakan  senyawa  pengkupling  α-
nafthilamin metode tersebut tetap mampu memberikan  respon  proporsional  terhadap  berbagai perubahan  konsentrasi  nitrit  dalam  sampel.    Batas deteksi  (LoD)  untuk  metode  yang  dimodifikasi menggunakan  senyawa  pengkupling  α-nafthilamin berdasarkan hasil perhitungan didapatkan nilai 0,039 ppm. Nilai ini mengindikasikan bahwa batas minimal nitrit  dalam  sampel  yang  dapat  diperiksa  dengan metode  yang  dimodifikasi  menggunakan  senyawa pengkupling  α-nafthilamin  dan  masih  memberikan respon  signifikan  dan  memenuhi  kriteria  teliti  atau seksama  adalah  0,039  ppm.  Dibandingkan  dengan metode  baku  menurut  SNI  06-6989.9-2004tentang cara  uji  nitrit  secara  spektrofotometri  dalam  air  dan air  limbah,  metode  yang  dimodifikasi  menggunakan senyawa  pengkupling  α-nafthilamin  mengalami penurunan  kemampuan  deteksi  dimana  dalam  SNI tentang  cara  uji  nitrit  secara  spektrofotometri  dalam air  dan  air  limbah  kisaran  konsentrasi  nitrit  minimal yang  diharapkan  dapat  ditentukan  adalah  0,01  ppm. Nilai  sensitifitas  metode  yang  didapatkan  dari metode  yang  dimodifikasi  menggunakan  senyawa pengkupling  α-nafthilamin  adalah  0,882.  Nilai  ini mengindikasikan  bahwa  setiap  peningkatan  1  ppm nitrit  dalam  sampel  terjadi  peningkatan  absorbansi sekitar  0,882.  Semakin  tinggi  nilai  sensitifitas mengindikasikan  semakin  pekanya  suatu  metode.
Dalam  pedoman  baku  SNI  tentang  cara  uji  nitrit secara  spektrofotometri  dalam  air  dan  air  limbah tidak  terdapat  penjelasan  tentang  sensitifitas  metode yang  harus  dipenuhi.    Nilai  presisi  dinyatakan dengan  nilai  Koefisien  variasi.  Nilai  presisi  atau koefisien  variasi  yang  didapatkan  dari  metode  yang dimodifikasi  menggunakan  senyawa  pengkupling  α- nafthilamin  adalah  1,38%.  Presisi  adalah  ukuran yang menunjukkan  besarnya  kesesuaian  atau perbedaan  hasil  pengukuran  sampel  yang  sama  dan dilakukan  berulang-ulang.  Presisi  dapat  dikatakan sebagai  ukuran  ketelitian  suatu  metode.  Dalam  SNI 06-6989.9-2004  tentang  cara  uji  nitrit  secara spektrofotometri  dalam  air  dan  air  limbah  untuk mengendalikan  mutu  pemeriksaan,  perbedaan  hasil analisis  yang  dilakukan  berulang  tidak  boleh  lebih besar  dari  5%.  Berdasarkan  petunjuk  pelaksanaan validasi metode yang dijelaskan oleh Harmita (2004) dikatakan  bahwa  kriteria  seksama  atau  teliti diberikan  jika  metode  memberikan  nilai  koefisien variasi  2%  atau  kurang  akan  tetapi  persyaratan  ini sangat  fleksibel  tergantung  pada  konsentrasi  analit yang  diperiksa,  jumlah  sampel  dan  kondisi laboratorium.  Nilai  maksimal koefisien  variasi atau presisi  untuk  pengukuran  konsentrasi  dalam  satuan satu  per  sejuta  (ppm)  adalah  16%.  Dengan  nilai presisi  atau  koefisien  variasi  1,38%  maka  metode yang dimodifikasi menggunakan senyawa pengkupling  α-nafthilamintelah  memenuhi  standar baik  menurut  SNI  06-6989.9-2004  maupun  menurut pedoman  validasi  metode.    Nilai  akurasi  metode adalah  nilai  yang  menunjukkan  kedekatan  hasil analisis  dengan  konsentrasi  sebenarnya  dari  sampel yang  diperiksa.  Nilai  akurasi  dinyatakan  sebagai
persen  recovery .  Berdasarkan  hasil  pengujian  yang telah dilakukan didapatkan nilai persen recovery dari metode  yang  dimodifikasi  menggunakan  senyawa pengkupling α-nafthilamin adalah 100,37%. Menurut pedoman baku penentuan kadar nitrit dalam SNI 06- 6989.9-2004 tentangcara uji nitrit secara spektrofotometri  dalam  air  dan  air  limbah  sebagai kontrol  akurasi  nilai persen  recovery harus  berada pada kisaran 90% sampai dengan 110% dengan kata lain  100%  ±10%.  Menurut  Harmita  dalam  petunjuk pelaksanaan  validasi  metode  (2004) persen  recovery yang diperbolehkan adalah 100% ±5%. Dengan nilai persen  recovery  100,37%  yang  sama  artinya  dengan 100%  +0,37%  maka  metode  yang  dimodifikasi  ini telah  memenuhi  standar  baik  menurut  SNI  maupun menurut pedoman validasi metode. Berdasarkan nilai berbagai  parameter  validasi  tersebut  metode  yang dimodifikasi  menggunakan  senyawa  pengkupling  α- nafthilamin  telah  memenuhi  ketentuan  dari  Badan Standarisasi  Nasional  sesuai  dengan  SNI  06-6989.9- 2004  tentang  cara  uji  nitrit  secara  spektrofotometri dalam  air  dan  air  limbah  dalam  hal  jaminan  mutu, pengendalian  mutu,  dan  kontrol  ketelitian.  Hal tersebut  membuktikan  metode  penentuan  nitrit  yang dimodifikasi dengan menggunakan senyawa pengkupling  α-nafthilamin  valid  digunakan  untuk menentukan  konsentrasi  nitrit  dalam  air  sepanjang konsentrasi  minimal  nitrit  dalam  sampel  tidak dibawah  0,039  ppm.    Kelemahan  dari  metode  yang dimodifikasi  menggunakan  senyawa  pengkupling  α- nafthilamin  jika  ditinjau  dari  ketentuan  Badan Standarisasi  Nasional  sesuai  SNI  06-6989.9-2004 tentang  cara  uji  nitrit  secara  spektrofotometri  dalam air  dan  air  limbah  adalah  nilai  batas  deteksi  (LoD)
yang  berada  diatas  0,01  ppm.  Hal  ini  dapat disebabkan  oleh  berbagai  hal  yang  memerlukan penelitian  lebih  lanjut  yang  berkaitan  dengan optimalisasi pembacaan absorbansi dan pembentukan warna.    Hal-hal  yang  mungkin  dapat  diteliti  lebih lanjut untuk meningkatkan kemampuan batas deteksi metode  ini  adalah  panjang  gelombang  maksimum, suasana  pH  reaksi,  dan  konsentrasi  optimal  dari  α- nafthilamin.    Panjang  gelombang  maksimum pembacaan  absorbansi  dapat  meningkatkan  nilai absorbansi  yang  didapatkan.  Walaupun  warna  yang terbentuk hampir sama dengan warna yang terbentuk dengan  menggunakan  metode  baku  namun  tetap perlu  dilakukan  pengujian  untuk  menentukan panjang  gelombang  maksimum  sehingga  bisa didapatkan nilai absorbansi pembacaan tertinggi.Peningkatan  nilai  absorbansi  pengukuran dapat  memperkecil  selisih  antara  absorbansi  ukur ( )  dan  absorbansi  hitung  ( ́ .  Nilai  selisih  yang semakin  kecil  akan  menurunkan  hasil  penghitungan penentuan  batas  deteksi  menjadi  lebih  rendah. Suasana  pH  kemungkinan  dapat  mempengaruhi kualitas  garam  diazonium  yang  terbentuk  dalam reaksi  diazotasi,  dimana  kualitas  garam  diazonium ini  akan  mempengaruhi  kualitas  warna  yang terbentuk,ideal  yang  diharapkanadalah  terbentuknya warna  maksimal  dengan  konsentrasi  nitrit  minimal. Kualitas warna yang lebih bagus akan meningkatkan nilai absorbansi yang kemungkinan dapat menurunkan nilai batas deteksi setelah penghitungan. Konsentrasi  optimal  α-nafthilamin  kemungkinan berpengaruh  pada  nilai  blangko,  untuk  mengurangi terbentuknya  warna  yang  tidak  perlu  dan  tidak diinginkan  perlu  diadakan  penelitian  konsentrasi
optimal  senyawa  pengkupling  untuk  meminimalkan terbentuknya  warna  pengganggu  akibat  adanya  sisa senyawa  pengkupling  yang  berlebih.  Pengurangan nilai  blangko  dapat  meningkatkan  nilai  absorbansi pembacaan  yang  kemungkinan  dapat  menurunkan nilai  hasil  penghitungan  batas  deteksi  (LoD).    Hal lain yang penting untuk diteliti adalah pengaruh suhu terhadap  reaksi  diazotasi.  Menurut  beberapa  ahli garam  diazonium  yang  terbentuk  dalam  reaksi diazotasi  tidak  stabil  pada  suhu  diatas  15°C,  tapi menurut  beberapa  jurnal  penelitian  yang  berkaitan dengan penerapan reaksi diazotasi-kupling tergantung  dari  sumber  garam  diazonium  dan senyawa  pengkupling  yang  digunakan,  reaksi diazotasi-kupling  ada  yang  bereaksi  optimal  pada suhu  kamar dan ada juga yang optimal pada suhu di bawah  15°C.  Penelitian  terhadap  pengaruh  suhu  ini kemungkinan  akan  dapat  mempercepat  laju  reaksi sehingga  waktu  penentuan  nitrit  dapat  lebih  cepat (Metwally  dan  Belal,  1992;  Shah,  2005;  Deb,  2007; Khan, 2007; Narayana, 2009; Fessenden, 1991).

## KESIMPULAN
Kesimpulan dari penelitian ini adalah:
1. Nilai linearitas metode spektrofotometri penentuan  nitrit    dalam  air  dengan  senyawa pengkupling  α-nafthilamin  adalah  0,995.  Nilai ini  dapat  memenuhi  standar  dari  Badan Standarisasi  Nasional  yang  mensyaratkan  nilai linearitas minimal 0,99.
2. Batas deteksi metode spektrofotometri penentuan  nitrit    dalam  air  dengan  senyawa pengkupling  α-nafthilamin  adalah  0,039  ppm. Nilai  ini  berada  diluar  batas  deteksi  yang
disarankan  oleh  Badan  Standarisasi  Nasional dalam SNI 06.6989-9.2004 yaitu 0,01 ppm.
3. Nilai sensitifitas metode spektrofotometri penentuan  nitrit    dalam  air  dengan  senyawa pengkupling α-nafthilamin adalah 0,882.
4. Nilai Presisi metode spektrofotometri penentuan nitrit  dalam air dengan senyawa pengkupling α- nafthilaminadalah  1,38%.  Nilai  ini  memenuhi Standar Nasional Indonesia tentang cara uji nitrit secara  spektrofotometri  dalam  air  dan  air limbahyang  mensyaratkan  nilai  presisi  tidak boleh lebih dari 5%.
5. Akurasi  metode  spektrofotometri  penentuan nitrit  dalam air dengan senyawa pengkupling α- nafthilamin  dinyatakan  dengan  nilai persen recovery 100,37%.  Nilai  ini  sesuai  dengan Standar Nasional Indonesia 06.6989-9.2004yang mensyaratkan  nilai persen  recovery harus berkisar antara 90%-110%.
6. Penentuan  kadar  nitrit    dalam  air  metode spektrofotometri  dengan  senyawa  pengkupling α-nafthilamin valid untuk menentukan konsentrasi nitrit dalam air dengan batas deteksi minimal 0,039 ppm.

## Saran
Berdasarkan penelitian ini dapat disarankan:
1. Penggunaan  α-nafthilamin  sebagai  senyawa pengkupling alternatif dalam menentukan konsentrasi nitrit dalam air metode spektrofotometri  dengan  perkiraan  konsentrasi minimal  nitrit  dalam  sampel  tidak  kurang  dari 0,039 ppm.
2. Penelitian  lebih  lanjut  untuk  menentukan panjang  gelombang  maksimum  pembacaan,
suasana  pH  optimal  reaksi,  konsentrasi  optimal α-nafthilamin  yang  dapat  digunakan,  dan  suhu optimal reaksi diazotasi-kupling

## DAFTAR PUSTAKA
Badan  Standarisasi  Nasional,  2004, SNI  06-6989.9- 2004,  Air  dan  Air  Limbah  –  bagian  9  : Cara Uji Nitrit (NO 2 -N) secara
Spektrofotometri , Jakarta.
Basset,  J.,  Denny,  R.  C.,  Jeffrey,    G.  H.,  Mendham,
J.,  1994. Buku  Ajar  VogelKimia  Analisis Kuantitatif  Anorganik Edisi  ke-4.  Jakarta  : EGC
Buxton, R, 2012, Nitrate and Nitrate Reduction Test Protocol , American Society for
Microbiology, http://www.microbelibrary.org
Deb,  M.  K.,  Thakur,  M.,  Khande,  P.,  2007, Determination of Nitrite, Nitrate and Total Nitrogen  Ni  Vegetable  Sampel, Bull. Chem.  Soc.  Ethiop.,  21(3),  445-450, School  of  Studies  Ni  Chemistry,  Pt. Ravisangkar  Shukla  University  Rajpur, India
Fessenden,  R.  J.,  Fessenden  J.  S.,  1991, Kimia Organik,  Edisi  Ketiga,  Jilid  1, Alih Bahasa  Aloysius  Hadyana  Pudjaatmaka PhD, Penerbit Erlangga, Jakarta
Fluke  Analytical,  2010, Nitrate  Reagent  A  (1- Naphthylamine Solution) and B (Sulfanilic Acid  Solution), Sigma-Aldrich  Chemie
GmBH – Industriase, Switzerland
Harmita,  2004,  Petunjuk  Pelaksanaan  validasi Metode dan Cara perhitungannya, Majalah  Ilmu  Kefarmasian,  Vol.  I,  No.  3, Desember  2004,  117-135,  ISSN:1693- 9883, Departemen Farmasi FMIPA-UI
Khan, M. A., Karim, M. M., Wabaidur, S. M., 2007, Spectrophotometric  Methode  for  The Detremination  of  Nimesulide  in  Bulk  and Various  Dosage  Form, Applied  Chemistry Vol.  11  No.  2,  November,  453-456, Department  of  Chemistry,  Kyungpook
National  University,  Taegu,  702-701, Korea.
Khopkar  SM.,  2003, Konsep  Dasar  Kimia  Analitik .
Jakarta: UI Press.
Kurniawan, D., Regresi Linear (Linear Regresssion),
2008, R  Development  Core  Team  (2008). R:  Foundation  for  statistical  Computing, Vienna,  Austria.  ISBN  3-900051-07-0, URL.http://www.R-project.org
Metwally,  ME.,  Belal  F.,  1992,  Primaquine Phosphate as a Promissing Subtitute for N-
(1-Naphtyl)ethylenediamine I. Determination of Nitrite in Natural Waters in  Egypt, Analitycal  Sciences  February
1992,  Vol.  8, Departement  of  Analycal
Chemistry, Faculty of Pharmacy,
University of Mansoura, Mansoura, 35516, Egypt.
Narayana,  B.,  Sunil,  K.,  A  Spectrophptometric Methode  for  Determination  of  Nitrite  and Nitrate,  2009, Eurasian  J.  Anal.  Chem. 4(2):  201-214, Department  of  P.  G. Studies  and  Research  in  Chemistry, Mangalore  University,  Mangalangotri- 574199, India.
Notoatmojo,  S.,  2005, Metodologi  Penelitian Kesehatan, Jakarta: Rineka Cipta.
Rahway  N.  J.,  2010, Chemical  and  Reagent  The Merck  Index ,ed 12th, berlin,  Merck  and Co.
Riyadi,  W.,  2009, Validasi  Metode  Analisis ,  Situs Kimia indonesia, http:/www.chem-is- try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/valida si-metode-analisis.
Shah,  J.,  Jan,  M.  R.,  Khan,  M.  A.,  2005, Determination  of  Furosamide  Bay  Simple
Diazotation  Methode  in  Pharmaceutical Preparation, Journal  of  The  Chinese Chemical Society, 52, 347-352, Department  of  Chemistry,  University  of
Peshawar, N. W. F. P., Pakistan.
Sigma-Aldrich,  2012, Material  Safety  Data  Sheet Version  5.1  Sulfanilamide ,  Sigma-Aldrich Corporation, USA
Suharman,  dan  Mulja,  HM.,  1995, Analisis Instrumental, Surabaya, Airlangga
University Press
Suirta, I W., 2010, Sintesis Senyawa orto-fenilazo-2- naftol  Sebagai  Indikator  Dalam  Titrasi, Jurnal  Kimia  4  (1),  Januari-2010:27-34, ISSN  1907-9850, Jurusan  Kimia  FMIPA Universitas  Udayana,  Bukit  Jimbaran, Denpasar, Bali, Indonesia.
Sunivo, 2012, Material Safety Data Sheet (MSDS) 1-
Naphthylamine ,  Shanghai  Sunivo  Supplay Chain Management Co., Ltd, http://www.sunivo.com/MSDS Tebbutt,  P.,  Sulfanilamide,  1998, Molecule  of  the Mounth: Februari 1998, Cherwell
Scientific Publishing , USA
Wade  Jr,  L.  G.,  2006, organic  Chemistry,Sixth Edition, Person Education, USA