http://jurnal.farmasi.umi.ac.id/index.php/fitofarmakaindo/index
Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Kimia Monoterpen Dari Fraksi Etilasetat Daun Keji Beling ( Strobilanthes crispa (L.) Blume) Yang Mempunyai Daya Sitotoksik
Lilik Sulastri 1* , Ristanti Mega Lestari 1 , Partomuan Simanjuntak 2,3
1 Sekolah Tinggi Teknologi Industri dan Farmasi (STTIF), Bogor
2 Puslit Kimia, Lembaga Ilmu Pengetahua Indonesia (LIPI), Serpong, Tangerang Selatan
3 Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila, Jakarta
Article info Abstract History
Submission : 23-10-2020
Review : 07-12-2020 Accepted : 19-01-2021
* Email: liliksulastri28@gmail.com
DOI: 10.33096/jffi.v8i1.721
Keywords: D-limonene; monoterpene; keji Beling; Strobilanthus crispa ( L .) Blume; cytotoxic
Isolation and identification one of chemical compound mono-terpene from Keji  beling  plant  (local  name)  (Strobilanthes  crispa)  has  been  done. Extraction was carried out by maceration of the keji beling leaf powder with ethanol 96%, then partitioned with water-ethyl acetate. Ethylacetate extract was  isolated  and  purified  by  a  cytotoxic  guide  fractionation  system  with Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) on column chromatography (SiO 2 ; n- hexane  -  ethylacetate  =  20  :  1);  and  preparative  Thin  Layer Chromatography (TLC) (SiO 2 ; n-hexane - ethylaseate = 10 : 1) which gave one  compound  in  oily  form.   Based  on  identification by  infra  red  spectra and  gas  chromatography-mass  spectra  (GC-MS),  the  compound  is  a monoterpene D-limone which has a cytotoxic power of 73,11 ppm.

## I. Pendahuluan
Keji beling dengan nama Latin Strobilanthus  crispa (L).  Blume  atau Sericocalyx crispus (L.)  dapat  tumbuh  di  tanah  yang  memiliki ketinggian  1-1000  m  di  atas  permukaan  laut. (Setyawan et al. , 2016).
Secara  tradisional  tanaman  ini  banyak dimanfaatkan dalam pengobatan berbagai penyakit. Sebuah  survei  obat  herbal  di  melayu  pemukiman Gemencheh  bagian  negri  Sembilan,  Malaysia mengungkapkan  penerapan S.  crispa digunakan untuk  mengobati  batu  ginjal  dengan  cara  daun dipanaskan lalu diletakan di pinggul.  Keji beling ini secara tradisional juga digunakan sebagai antidiabetes, laxative dan agen diuretic (Nurraihana and Norfarizan-Hanoon, 2013).
Berdasarkan beberapa penelitian yang telah dilakukan  bahwa  ekstrak  etanol  daun  keji  beling dapat  meluruhkan  batu  ginjal  karena  memiliki aktivitas sebagai diuretik kuat. Selain itu juga daun keji  beling  juga  memiliki  manfaat  sebagai antidiabetes,  antikanker,  antioksidan,  diuretik  dan laxative (Rahmat et al. , 2006; Dali et al. , 2017; Koh et al. , 2017).
Aktivitas  sitotoksik  dalam  suatu  senyawa dapat  diuji  baik  secara in  vitro maupun in  vivo . Beberapa  di  antara  uji in  vitro untuk  mengetahui aktivitas  sitotoksik  adalah  uji  secara  selular menggunakan  sel  kanker  manusia  yang  diinduksi pada sel hewan. Cara tersebut cukup sulit dilakukan karena membutuhkan tempat dan peralatan tertentu
serta perlu dilakukan oleh orang yang cukup terlatih (Meyer, Ferrigni and Putnam, 1982)(Clarkson et al. ,
2004).  Karena  itu,  diperlukan  uji  awal  yang  lebih mudah  dan  sederhana  yaitu  dengan  uji  toksisitas metode Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT) menggunakan  larva  udang Artemia  salina (R. Hamidi, Jovanova and Kadifkova Panovska, 2014).
Salah  satu  tanaman  yang  berpotensi sebagai antioksidan dan antikanker adalah tanaman keji beling ( Strobilanthes crispa ). Penelitian (Adibi et al. , 2017) melaporkan bahwa ekstrak etanol daun keji  beling  memiliki  aktivitas  antioksidan  dengan nilai  IC 50 sebesar  102,85  ppm.  Sehingga  untuk  itu perlu dilakukan pengujian toksisitas secara in vitro (metode  BSLT)  sebelum  dilakukan  terhadap  sel kanker manusia. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui senyawa kimia dalam ekstrak etilasetat yang  mempunyai  daya  toksisitas  berdasarkan metode brine shrimp lethality test (BSLT).
II. Metode Pendahuluan II.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah Rotary vacuum evaporator (Stuart  RE3022C),  hotplate  ( Thermo Scientific CIMAREC), water  bath (Memmert), thermometer,  ultrasonic  cleaner  (Branson ® 1510), spektrofotometer UV-VIS (Hitachi U-3900H), oven (Elos), desikator, cawan porselin, lempeng silika gel GF 254 ,  bejana  kromatografi,  kromatografi  kolom, statif, lampu TL, aerator, spektrofotometer Fourier Transform Infra Red , GC-MS, dan seperangkat alat gelas.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah  daun  keji  beling  ( Strobilanthes  crispa (L.) Blume)  yang  dikoleksi  dari daerah  Bogor,  etanol 96%,  akuades,  air  laut,  kertas  saring,  HCl  pekat, pereaksi  Wagner,  pereaksi  Mayer,  pereaksi Dragendorff,  metanol  p.a,  etil  asetat  pro  analisis, magnesium,  FeCl 3 ,  metanol, n- heksana,  etil  asetat, serium  sulfat,  larva Artemia  salina , cellite ,  KBr, silika gel 60 (70-230 Mesh ), alumunium foil.

## II.2 Prosedur penelitian II.2.1 Determinasi Sampel
Daun  keji  beling  yang  diteliti  terlebih dahulu  dideterminasi  di  Herbarium  Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi - LIPI Jl. Raya Bogor Km 46,  Cibinong  untuk  memastikan  kebenaran  dan keaslian dari tanaman yang digunakan.

## II.2.2 Pembuatan Simplisia
Sebanyak  ±  4  kg  sampel  disortasi  basah dicuci  dengan  air  mengalir,  ditiriskan,  dan  sampel dirajang  tipis-tipis,  dikeringkan  dengan  cara diangin-anginkan  (tidak  di  bawah  sinar  matahari langsung).  Setelah  kering  sampel  dihaluskan menggunakan  blender  dan  diayak  menggunakan saringan berukuran 40 mesh .
II.2.3 Penentuan Kadar Air (AOAC, 2006) Penentuan  kadar  air  dilakukan  menurut metode Association  of  Official  Analytical  Chemist (Flowers et al. , 2006).

## II.2.4 Ekstraksi
Simplisia  daun  keji  beling  sebanyak  400 gram dimaserasi dengan pelarut etanol 96% selama 24  jam,  terlindung  dari  cahaya  sambil  sesekali diaduk,  dan  dilakukan  6  kali  pengulangan.  Filtrat yang  diperoleh  dipekatkan  menggunakan rotary vacuum  evaporator pada  suhu  50 o C  sampai diperoleh  ekstrak  kental  etanol  dan  dihitung  % rendemennya.

## II.2.5 Partisi Ekstrak Etanol 96%
Ekstrak etanol 96% dilarutkan dengan 100 ml  air  dan  dimasukkan  ke  dalam  corong  pisah kemudian  tambahkan  etil  asetat  sebanyak  100  ml dipartisi,  kocok  dan  diamkan  sampai  terjadi pemisahan antara lapisan etil asetat dan lapisan air, kemudian  lapisan  etil  asetat  ditampung.  Hal  ini dilakukan sampai lapisan etil asetat tidak berwarna (3  kali  pengulangan).  Lapisan  air  yang  terbentuk ditampung  dan  dipekatkan  di  atas  penangas  air hingga  kental  (fraksi  air).  Lapisan  etil  asetat  yang sudah ditampung kemudian diuapkan menggunakan rotary vacuum evaporator hingga kental (fraksi etil asetat).

## II.2.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia untuk golongan senyawa  seperti  alkaloid,  flavonoid,  saponin,
terpenoid,  steroid,  tannin  dan  fenolik  dilakukan berdasarkan metode metode (Buckley, 1966).
II.2.7  Uji  Aktivitas  Sitotoksik  DenganMetode BSLT ( Brine Shrimp Lethality Test ) Uji aktivitas sitotoksik mengunakan menggunakan  larva  udang  ( Artemia  salina ) berdasarkan  metode  (Meyer,  Ferrigni  and  Putnam, 1982) yang telah dimodifikasi.
II.2.8 Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom Faksi etilasetat (10 gr) dimurnikan dengan menggunakan kromatografi Kolom (SiO 2 ; n -heksan- etilasetat  =  20  :  1  ~  1  :  1),  dan  kromatografi  KLT preparative (SiO 2 ; n -heksan-etilasetat = 10 : 1) dan menghasilkan  isolat  murni  yang  berbentuk  cairan minyak.  Skema  kerja  ekstraksi,  isolasi  senyawa kimia  dari  ekstrak  etilasetat  daun  keji  beling  dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Skema kerja ekstraksi, isolasi senyawa monoterpen dari ekstrak etril asetat keji beling ( Strobilanthus crispa )

## III. Hasil dan Pembahasan III.1 Pembuatan Simplisia
Penetapan  kadar  air  dilakukan  untuk mengetahui kandungan air pada simplisia. Kadar air yang  berlebih  pada  simplisia  dapat  menyebabkan pertumbuhan mikroba, jamur, reaksi enzimatis atau proses hidrolisis yang dapat menyebabkan perubahan kandungan kimia yang ada dalam bahan menjadi  produk  lain  yang  mungkin  tidak  lagi memiliki efek farmakologi seperti senyawa aslinya. Prosentasi penyusutan diperoleh 23,58 dan kadar air keji  beling  4  %  (Tabel  1).  Hasil  kadar  air  ini memenuhi yang dipersyaratkan pada simplisia yaitu ≤ 10%.
Tabel 1. Peyusutan dan kadar air keji beling
Sampel Berat Simplisia Basah (Kg) Berat Simplisia Kering (g) Penyusutan (%) Kadar Air (%) Daun Keji Beling 3,9 920 23,58 4

## III.2 Pembuatan Ekstrak
Rendemen  ekstrak  hasil  ekstraksi  dengan etilasetat  keji  beling  diperoleh  1,42  %  (Tabel  2). Ditinjau  dari  segi  waktu  pada  metode  maserasi,
untuk  memperoleh  zat  aktif  yang  lebih  banyak dibutuhkan  waktu  dan  proses  yang  lama  karena ekstraksi  ini  tidak  menggunakan  bantuan  panas (Wijaya, Novitasari and Jubaidah, 2018).
Tabel 2. Rendemen ekstrak etilasetat keji beling
Sampel Berat Ekstrak EtOH 95% (g) Rendemen (%) Berat ekstrak Etilasetat (g) Rendemen (%) Daun Keji Beling 41,27 10,31 5,71 1,42
Keterangan: Dihitung dari 400 gram berat kering simplisia
III.3 Skrining Fitokimia Hasil uji skrining fitokimia untuk ekstrak etilasetat keji beling dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil Uji Skrining Fitokimia No. Pengujian
Perubahan warna Eks. Etilasetat 1. Alkaloid a. Wagner Endapan coklat kemerahan + b. Mayer Endapan putih/kuning + c. Dragendorff Endapan jingga coklat + 2. Flavonoid Endapan merah kuning, jingga + 3. Saponin Busa 1 – 10 cm + 4. Tanin Hijau, hitam, merah ungu + 5. Terpenoid & steroid Cincin kecoklatan +
Skrining fitokimia dilakukan untuk mengetahui  kelompok  senyawa  kimia  dalam tumbuhan yang mungkin dapat diperkirakan sebagai senyawa  bioaktif.  Pendekatan  secara  skrining fitokimia  pada  hakikatnya  adalah  analisis  secara kualitatif  dari  kandungan  kimia  yang  terdapat  d idalam  tumbuhan  atau  bagian  tumbuhan  (akar,
batang, daun, bunga, dan biji) terutama  kandungan metabolit  sekunder  yang  merupakan  senyawa bioaktif  seperti  alkaloid,  antrakuinon,  flavonoid, glokosida  jantung,  kumarin,  saponin,  tanin, polifenol  dan  minyak  atsiri(Ghasemzadeh,  Jaafar and Rahmat, 2015) (Koay et al. , 2013).

## Tabel 4. Hasil Uji Aktivitas Sitotoksik Fraksi Etil Asetat Daun Keji Beling
No Konsentrasi (ppm) Log [C] (ppm) % Mortalitas Probit LC 50 (ppm) 1 0 (kontrol) - - - 2 10 1 22,2 4,23 73,11 3 100 2 37,73 5,61 4 1000 3 66,66 5,41
Pada  pengujian  aktivitas  sitotoksik  untuk fraksi  etil  asetat  daun  keji  beling  diperoleh  LC 50 73,11 ppm (Tabel 4). Hasil ini menunjukkan bahwa fraksi  etil  asetat  daun  keji  beling  mempunyai aktivitas  sitotoksik  yang sangat toksik  karena  hasil tersebut masuk dalam range 0-100 ppm (Clarkson et al. , 2004) .

## III.4 Fraksinasi Kromatografi Kolom
Sebanyak 5,71 gram fraksi etil asetat daun keji beling difraksinasi dengan kromatografi kolom. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 mesh (0,063 mm- 0,200 mm) dengan fase gerak n -heksan – etil asetat  secara gradien mulai dari 20:1 sampai 1:1.  Fraksi  dengan  pola  kromatogram  yang  sama digabung  sehingga  diperoleh  9  fraksi  dan kromatogram KLT dapat dlihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Kromatogram KLT hasil kr.  Kolom (Fr.1 ~ fr. 9) Eluen : n -heksan-etilasetat = 2 : 1; spray : CeSO 4 /H 2 SO 4

## III.5 Uji Aktivitas Sitotoksik Fraksi Hasil Kromatografi Kolom
Hasil uji aktivitas sitotoksik menunjukkan bahwa fraksi-2, 4, 7, dan 8 memiliki nilai LC 50 39,81 ppm, 85,11 ppm, 66,06 ppm, 81,28 ppm
(Gambar 3). Hasil ini menunjukkan bahwa fraksi- fraksi tersebut mempunyai aktivitas sitotoksik yang sangat toksik karena hasil tersebut masuk dalam range 0-100 ppm (Clarkson et al. , 2004) .
Gambar 3. Diagram batang hasil uji aktivitas sitotoksi fraksi etilasetat (fr.1 ~ fr. 9)
Hasil  uji  aktivitas  sitotoksik  yang  dipilih adalah fraksi 7 (66,06 ppm) untuk dilakukan isolasi dan diidentifikasi kandungan senyawa kimia karena, fraksi 7 memiliki pola kromatogram yang baik untuk dilakukan  isolasi,  disamping  fraksi-2  (59,81  ppm) yang jumlahnya sedikt. Pemurnian senyawa fraksi 7 dilakukan dengan KLT preparatif (SiO 2 ; n -heksan- etilasetat = 10 : 1, memberikan isolat murni X yang berbentuk minyak.

## III.6 Identifikasi Senyawa III.6.1 Spektrofotometer FTIR
Hasil  analisis  spektrofotometer  FTIR menunjukkan  bahwa  senyawa  X  memiliki  gugus alkana  (CH)  pada  bilangan  gelombang  2926,  798 cm -1 , gugus alkena (C=C) pada 1641 cm 1 .
III.6.2  Analisis  Gas  Chromatography-Mass Spectra (GC-MS) Pada kromatogram isolat X masih mempunyai  senyawa impurities ,  yang  disebabkan karena  masih  belum  murni  sehingga  pada kromatogram  terdeteksi  beberapa peak (puncak)
senyawa  kimia  dengan  ketinggian  yang  berbeda- beda.  Hasil  analisa  kromatogram  GC-MS  pada Gambar  4  memberikan peak yang  tinggi  dan terdapat  pada  waktu  retensi  (Rt  7,75  menit) mempunyai kuantitas atau  kadar yang paling besar yang diduga merupakan senyawa kimia utama yang terdapat di dalam isolat X dengan persen kemiripan ( Qual )  menurut database  library sebesar  97%
(Gambar  5),  dan  diprediksi  sebagai  senyawa  D- limonen (Gambar 6).
407,38 59,81 158,48 85,11 416,86 109,64 66,06 81,28 144,54 0 100 200 300 400 500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nila i LC 5 0 Fraksi Aktivitas Sitotoksik  Fraksi Hasil Kromatografi Kolom
Gambar 4. Kromatogram kromatografi gas untuk isolat X
Gambar 5. Analisis fragmentasi untuk senyawa D-limonen pada GC-MS
Jadi berdasarkan hasil analisis GC-MS dan data  spektra  IR  bahwa  senyawa  X  yang  memiliki aktivitas sitotoksik dalam fraksi etil asetat daun keji beling adalah minyak atsiri golongan monoterpen D- limonen (Gambar 6).
Gambar 6. Struktur kimia D-limonen

## IV. Kesimpulan
Salah satu senyawa kimia mono-terpen D- limonen  telah  berhasil  diisolasi  dan  diidentifikasi dari  daun  keji  beling  [( Strobilanthus  crispa (L.) Blume] yang mempunyai daya toksik sebesar 73,11 ppm .
Daftar Pustaka Adibi,  S. et  al. (2017)  ‘Induksi  Tunas  Keji  Beling (Strobilanthes crispus L) Dengan Penambahan  Kombinasi  Naphtalen  Acetic Acid  (NAA)  Dan  6-benzyl  Amino  Purin (BAP) Dalam Medium Cair’.
Buckley,  J.  P.  (1966)  ‘Pharmaceutical  sciences (Np)’, Science ,  151(3712),  pp.  874–875. doi: 10.1126/science.151.3712.874. Clarkson,  C. et  al. (2004)  ‘In  vitro  antiplasmodial activity  of  medicinal  plants  native  to  or naturalised  in  South  Africa’, Journal  of Ethnopharmacology ,  92(2–3),  pp.  177–
191. doi: 10.1016/j.jep.2004.02.011.
Dali,  A. et  al. (2017)  ‘Uji  Aktivitas  Antioksidan Ekstrak  Metanol  Daun  Pecah  Beling (Strobilanthes crispus)’, Al-Kimia , 5(2), pp. 145–153.
Flowers,  R. et  al. (2006)  ‘Best  Practices  in Microbiological Methodology.’, Aoac International , 12, p. 201.
Ghasemzadeh, A., Jaafar, H. Z. E. and Rahmat, A.
(2015)  ‘Phytochemical  constituents  and biological activities of different extracts of Strobilanthes  crispus  (L.)  Bremek  leaves grown  in  different  locations  of  Malaysia’, BMC  Complementary  and  Alternative Medicine .  BMC  Complementary  and Alternative Medicine, 15(1), pp. 1–10. doi: 10.1186/s12906-015-0873-3.
Koay, Y. C. et al. (2013) ‘Chemical constituents and biological activities of strobilanthes crispus L’, Records of Natural Products , 7(1), pp. 59–64.
Koh, R. Y. et al. (2017) ‘Anticancer mechanisms of Strobilanthes  crispa  Blume  hexane  extract on  liver  and  breast  cancer  cell  lines’, Oncology  Letters ,  14(4),  pp.  4957–4964. doi: 10.3892/ol.2017.6821.
Meyer,  B.  N.,  Ferrigni,  N.  R.  and  Putnam,  J.  E.
(1982)  ‘Brine  shrimp:  A  convenient general bioassay for active plant constituents’, Planta  Medica ,  45(1),  pp.
31–34. doi: 10.1055/s-2007-971236.
Nurraihana,  H.  and  Norfarizan-Hanoon,  N.  A. (2013)  ‘Phytochemistry,  pharmacology
and  toxicology  properties  of  Strobilanthes crispus’, International  Food  Research Journal , 20(5), pp. 2045–2056. R.  Hamidi,  M.,  Jovanova,  B.  and  Kadifkova Panovska, T. (2014) ‘Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp  (Artemia  salina  L.)  model’, Macedonian Pharmaceutical Bulletin , 60(01), pp.
9–18. doi: 10.33320/maced.pharm.bull.2014.60.01.00 2. Rahmat,  A. et  al. (2006)  ‘Anticarcinogenic Properties of Strobilanthes crispus Extracts and its Compounds in vitro’, pp. 47–49. Setyawan,  B. et  al. (2016)  ‘Pembuktian  Ekstrak Daun  Kejibeling  Dalam  Meningkatkan Sistem  Imun  Info  Artikel  Verification  Of Kejibeling  Leaf  Extract  In  Improving  The Immune  System’, Kesehatan  Masyarakat , 11(2). Wijaya,  H.,  Novitasari  and  Jubaidah,  S.  (2018) ‘Perbandingan Metode Ekstraksi Terhadap Rendemen  Ekstrak  Daun  Rambut  Laut (Sonneratia  caseolaris  L.  Engl)’, Jurnal
Ilmiah Manuntung , 4(1), pp. 79–83.