## PENAPISAN HEMAGGLUTININ DARI ALGA HIJAU GENUS Codium
(Chlorophyceae, Codiaceae)
SCREENING OF HEMAGGLUTININS FROM THE GREEN ALGAL GENUS Codium (Chlorophyceae, Codiaceae)
Danar Praseptiangga 1)
1) Staf Pengajar Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta
email: dpraseptiangga@uns.ac.id

## ABSTRACT
Lectins (hemagglutinins) are widely distributedin nature and also good candidates in such prospecting of  marine  algae.  The  most  important  property  of  a  lectin  is  the  ability  to  bind  to  carbohydrates  and  hence agglutinate  cells.Lectins  are  useful  as  convenient  tools  to  discriminate  differences  in  carbohydrate  structures and  reveal  various  biological  activities  through  binding  and  interacting  to  carbohydrates.  There  is  a considerable  interest  in  discovering  and  isolating  novel  lectins  from  the  perspective  of  their  applications, particularly  in  glycomics  and  in  the  medical  field.  Crude  lectin  fractionsfrom  six  green  algae  of  the  genus Codium were  prepared  and  examined  for  their  hemagglutination  activities  with  trypsin-treated  rabbit erythrocytes.  The  positive  result  of  five  crude  lectin  fractions  of  the  green  algal  genus Codium on hemagglutination  assayindicates  that  lectins  (hemagglutinins)  are  present  in  these  species.  However,  further researches on lectins purificationand characterization of their biochemical propertiesare still needed.
Keywords : lectins (hemagglutinins), thegreen algal genus Codium, hemagglutination activity

## ABSTRAK
Lektin  (hemagglutinin)  tersebar  secara  luas  di  alam  dan  memiliki  potensi  yang  baik  terkait  dengan prospeksinya  dari  alga  laut.  Sifat  terpenting  lektin  adalah  kemampuannya  untuk  mengikat  karbohidrat  dan mengaglutinasi  sel.  Lektin  dapat  berguna  sebagai  alat  yang  mudah  digunakan  untuk  menunjukkan  perbedaan struktur  karbohidrat  dan  mempunyai  berbagai  macam  aktifitas  biologis  terkait  dengan  pengikatan  dan interaksinya dengan karbohidrat, sehingga terdapat ketertarikan yang besar  dalam upaya untuk menemukan dan mengisolasi lektin baru dari perspektif penggunaan lektin, khususnya dalam bidang glycomics dan medis. Fraksi kasar  lektin  dari  enam  spesies  alga  hijau  genus Codium disiapkan  dan  diuji  aktifitas  hemaglutinasinya  dengan menggunakan trypsin-treated rabbit erythrocytes . Hasil positif pada limaspesies alga hijau genus Codium yang diuji  dalam hemagglutination  assay mengindikasikan  keberadaan  lektin  (hemagglutinin)  pada  spesies-spesies tersebut. Namun demikian, masih diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai pemurnian lektin dan karakterisasi sifat biokimianya.
Kata kunci : lektin (hemagglutinin), alga hijau genus Codium, aktifitas hemaglutinasi

## PENDAHULUAN
Lektin (hemagglutinin) atau
carbohydrate-binding proteins tersedia melimpah  di  alam  pada  berbagai  organisme, dari  tanaman,  hewan,  bakteri,  fungi,  virus, sampai  ke  manusia  dan  memegang  peranan penting  sebagai  molekul  pengenal  atau pelacak  dalam  interaksi  antara  sel-sel  atau sel-matriks  (Hori et  al. ,  2000,  Sharon  dan Lis,  2003).Lektin  mengikat  karbohidrat dengan  spesifisitas  yang  tinggi,  namun  tidak memiliki  aktifitas  katalitik  seperti  halnya enzim.  Lektin  berbeda  dengan  antibody  dan bukan  merupakan  produk  dari  respon  imun. Setiap  molekul  lektin  biasanya  mempunyai dua  atau  lebih carbohydrate-binding  sites , oleh  karena  itu  ketika  mereka  bereaksi
dengan  sel,  sebagai  contoh  eritrosit,  mereka tidak  hanya  akan  berinteraksi  dengan  gula yang  ada  pada  pada  permukaan,  melainkan juga  akan  berinteraksi  membentuk  ikatan silang  dengan  molekul-molekul  polisakarida atau glikoprotein dan menginduksi terjadinya presipitasi  dalam  interaksinya  tersebut  yang merupakan  fenomena  yang  disebut  sebagai aglutinasi  (Sharon  dan  Lis,  2003,  Brooks et al. ,  2002.,  Varki et  al. ,  1999).  Aglutinasi eritrosit  oleh  lektin  (hemagglutinin)  adalah sifat  utama  dari  protein  ini  dan  umum digunakan  secara  rutin  untuk  deteksi  dan karakterisasi lektin (hemagglutinin).
Sejumlah kegunaan lektin telah ditemukan dalam riset kimiawi dan biokimiawi,  termasuk  kegunaannya  dalam proses  pemurnian  dan  analisa  glikoprotein
yang  memberikan  kontribusi  signifikan terhadap  bidang glycobiology serta  sebagai alat  untuk  memecahkan  kode  struktur karbohidrat  pada  permukaan  sel  dan  dalam cairan tubuh yang disebabkan oleh keragaman  lektin  yang  terkait  dengan spesifisitas pengikatannya
terhadap karbohidrat  sehingga  sangat  memungkinkan untuk digunakan di bidang kedokteran dalam era glycomics (Brooks et  al. , 2002., Varki et al. , 1999).
Lektin  (hemagglutinin)  dari  alga pertama  kali  dilaporkan  melalui  survei  alga di Puerto Rico (Boyd et al. , 1966).Penelitian selanjutnya  di  beberapa  negara,  antara  lain Inggris  (Blunden et  al. ,  1975,  1978,  Rogers et  al. ,  1980),  Jepang  (Hori et  al. ,  1981,
1986), Spanyol (Fabregas et al. , 1985, 1992),
Amerika  (Chiles  dan  Bird  1989,  Bird et  al. , 1993),  dan  Brasil  (Ainouz  dan  Sampaio 1991,  Ainouz et  al. ,  1992,.  Freitas et  al. , 1997) menunjukkan bahwa
lektin (hemagglutinin)  dapat  ditemukan  pada  lebih dari  dua  ratus  spesies  alga  (Hung et  al. , 2009).
Apabila lektin dari alga dibandingkan dengan  lektin  dari  tanaman  darat  dan  hewan yang telah berhasil dimurnikan dan dikarakterisasi  dengan  baik,  memang  masih ada  keterbatasan  informasi  terkait  dengan karakteristik kimia-biokimia
dan molekulernya. Namun, akhir-akhir ini jumlah lektin dari  alga yang  telah berhasil dimurnikan  dan  dikarakterisasi  mengalami peningkatan.  Selama  dua  dekade  terakhir dilaporkan  bahwa  lektin  telah  berhasil dimurnikan dari lebih dari lima puluh spesies alga  (Sato  dan  Hori,  2009,  Hung et  al. , 2009.).  Penelitian  akhir-akhir  ini  juga mengungkapkan  bahwa  lektin  dari  alga memiliki spesifisitas tinggi terhadap beberapa  struktur  oligosakarida  tertentu  dan dapat dikelompokkan menjadi beberapa jenis berdasarkan  spesifisitas  pengikatan  terhadap oligosakarida  (Sato et  al .,  2007,  Hori et  al ., 2007). Oleh karena itu, alga berpotensi untuk menjadi  sumber  penemuan  lektin  baru  yang dapat  dimanfaatkan  secara  luas  dalam penelitian  dasar  dan  terapan  antara  lain  di bidang  kimia-biokimia,  biologi  molekuler, kesehatan,  dan  juga  ilmu  pangan.  Namun demikian,  terlepas  dari  kemajuan  yang  telah
dicapai  dalam  karakterisasi  kimia-biokimia dan  molekuler  lektin  dari  alga,  informasi tambahan masih diperlukan untuk mendapatkan pemahaman yang lebih komprehensif  tentang  sifat,  struktur,  dan fungsi biologis serta peranan fisiologis lektin dari alga (Hori et al ., 2000, 2007).
Lektin  dari  alga  (khususnya  alga merah) pada umumnya mempunyai karakteristik  seperti  berat  molekul  rendah, tidak  memerlukan  adanya  kation  divalen untuk aktifitas hemaglutinasinya, dan memiliki  afinitas  untuk  glikoprotein  tetapi tidak untuk  monosakarida (Hori et  al ., 1990, 2000,  2007).  Namun  uniknya,  beberapa lektin  yang  telah  berhasil  dimurnikan  dan dikarakterisasi  dari  alga  hijau  genus Codium mempunyai  kemiripan  karakteristikdengan lektin  yang berasal dari tanaman darat,antara lain mempunyai afinitas terhadap monosakarida  dan  berat  molekul  relatif besar,  sehingga  terkadang  dapat  dijumpai dalam  bentuk  polimerik  dan  memiliki struktur  sub  unit.  Kemiripan  karakteristik antara  lektin  dari  alga  hijau  genus Codium dan  tanaman  darat  ini  mungkin  disebabkan oleh  kedekatan  jarak  evolusi  antara  dua kelompok  ini.  Hal  ini  dimungkinkan  oleh karena alga hijau genus Codium berada pada posisi  menengah  di  antara  alga  (alga  coklat, merah,  dan  yang  lainnya)  dan  tanaman  darat dalam  posisi  filogenetiknya  (Verbruggen et al .,  2007).  Selain  itu,  sejauh  ini  hanya beberapa  lektin  dari  genus Codium seperti Codium fragile ssp. tomentosoides , C. fragile ssp. atlanticum , C.  tomentosum , C.  girrafa , dan C.  barbatum (Rogers et  al .,  1986.,
Fabregas et  al .,  1988,  Alvarez-Hernandez et al .,  1999,  Praseptiangga et  al .,  2012)  yang berhasil  dimurnikan  dan  dikarakterisasi secara  parsial,  sehingga  dalam  penelitian iniakan  dilaporkan  hasil  penapisan  lektin (hemagglutinin)  dari  alga  hijau  genus Codium dari  persepektif  bioprospeksi  alga, khususnya  alga  hijau  dari  genus Codium sebagai  kajian  pendahuluan  dalam  upaya penemuan sumber lektin baru.

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan Alat
Beberapa  spesies  alga  hijau  dari genus Codium yaitu, Codiumintricatum , C. spongiosum , C.  subtubulosum , C.  arabicum , C.  latum dan C.  cylindricum yang  diperoleh dari hasil sampling di pantai dan perairan laut pulau Kyushu dan Shikoku, Jepang digunakan  sebagai  bahan  baku  utama  dalam penelitian  ini.  Bahan  pendukung  yang digunakan antara lain larutan buffer phosphate buffered saline (PBS), ammonium sulfat  (NH 4 ) 2 SO 4 ,  sodium  azide  (NaN 3 ), sodium  klorida  (NaCl),  darah  (eritrosit) kelinci, trypsin ,  nitrogen  cair,  air  miliQ,  dan bahan kimia untuk pengujian protein. Semua bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah analytical grade dengan tingkat kemurnian tertinggi.
Alat yang digunakan dapat dibedakan menjadi  dua  macam,  yaitu  alat  yang digunakan  untuk  preparasi  ekstrak  alga  dan presipitat  ammonium  sulfat,  antara  lain blender  (Hamilton  dan  Waring),  gunting, pinset,  spatula,  tabung  nitrogen  cair,  gelas beker,  gelas  ukur,  neraca,  neraca  analitik, magnetic  stirrer , refrigerated  centrifuged (tipe  Sakuma  dan  Sorvall), centrifuge  tubes , hot  plate ,  pH  meter,  pipet, dialysis  tubes , penjepit dialysis tubes , sample tubes dan alat yang digunakan untuk analisa, antara lain 96- well  microtiter  V-plate ,  vortek, micro  mixer , tabung  reaksi,  spektrofotometer  UV-vis, inkubator, dan mikropipet.
Tahapan Penelitian
Preparasi  Ekstrak  Alga  dan  Presipitat Ammonium Sulfat
Sampel  beku  dari  beberapa  spesies alga hijau, Codium intricatum , C.
spongiosum , C.  subtubulosum , C.  arabicum , C.  latum ,  dan C.  Cylindricum dikeluarkan dari  lemari  pendingin  suhu  -30ºC,  dicairkan, dan  kemudian  ditimbang  masing-masing  50 gram.  Pengecilan  ukuran  dilakukan  dengan memotong-motong sampel yang telah dipersiapkan  dan  selanjutnya  digunakan blender  serta  ditambahkan  nitrogen  cair dengan  maksud  agar  sampel  lebih  cepat menjadi bubuk dan homogen.
Proses  ekstraksi  dilakukan  dengan cara menambahkan 20 mM larutan phosphate buffer yang  mengandung  0,85%  NaCl  dan 0,02%  NaN 3 (PBSA,  pH  7.0)  ke  dalam sampel  yang  telah  menjadi  bubuk  dengan rasio  1:2  (b/v). Campuran sampel dan buffer PBSA kemudian diaduk dengan menggunakan  stirer  selama  semalam  pada suhu  4ºC.  Setelah  itu,  campuran  tersebut disentrifugasi  (13,500  g)  pada  suhu  4ºC selama 30 menit dan ammonium sulfat padat yang telah dihaluskan ditambahkan ke dalam supernatan yang diperoleh untuk mendapatkan  konsentrasi  akhir  kejenuhan 75%. Selanjutnya campuran disimpan semalam  pada  suhu  4ºC  dan  disentrifugasi kembali (13,500 g) pada suhu 4ºC selama 30 menit.  Presipitat  yang  diperoleh  kemudian dilarutkan  kembali  dengan  penambahan buffer  sesedikit  mungkin  dan  didialisis dengan menggunakan PBSA. Setelah dialisis, fraksi bagian dalam ( inner fraction ) disentrifugasi  lebih  lanjut  (10,000  g)  pada suhu  4ºC  selama  30  menit  dan  supernatant yang  diperoleh  disebut  sebagai  fraksi  kasar lektin atau sering disebut salting-out fraction . Salting-out  fraction ini  kemudian  disimpan dalam  lemari  pendingin  suhu  -30ºC  setelah digunakan untuk analisa lebih lanjut, yaitu uji aktifitas hemaglutinasi dan kandungan protein. Preparasi Trypsin-treated Rabbit Erythrocytes (TRBC)
Trypsin-treated  Rabbit  Erythrocytes (TRBC)  disiapkan  dari  darah  (eritrosit) kelinci  yang  diperoleh  dari  laboratorium penelitian hewan (Hiroshima, Jepang). Eritrosit  dicuci  tiga  kali  dengan  50  volum saline (0,85  %  NaCl)  dan  disuspensikan  ke dalam saline untuk  memberikan  2%  (v/v) suspensi  dari native eritrosit.  Kemudian  0,5 %  (w/v)  trypsin  dalam saline (1/10  bagian volum)  ditambahkan  ke  dalam  2  %  suspensi dari native eritrosit  dan  campuran  tersebut kemudian diinkubasi  pada suhu 37ºC  selama 60 menit. Setelah itu, campuran dicuci empat kali  dengan saline dan  2  %  suspensi  TRBC dipersiapkan dalam saline .

## Hemagglutination Assay
Pengujian  aktifitas  hemaglutinasi ditentukan  berdasarkan  metode  Hori et  al. (1986).Aktifitas  hemaglutinasi  ini  dilakukan dalam 96-well  microtiter  V-plate dengan menggunakan  TRBC  dan  dilakukan  dengan tiga  kali  ulangan.  Pengenceran  dua  kali  lipat secara  seri  (masing-masing  25  µl)  dilakukan dari  sampel  yang  dianalisa  dan  dipersiapkan di dalam saline terlebih dahulu, kemudian ke dalam  tiap  sumuran  ditambahkan  25  µl TRBC. Microtiter plate kemudian diguncang perlahan  dan  merata  serta  diinkubasi  pada suhu  kamar  selama  1  jam.  Hemaglutinasi diamati  secara  makroskopik  dan  dinilai positif  apabila  lebih  dari  50  %  dari  TRBC dalam sumuran teraglutinasi. Aktifitas hemaglutinasi  ini  dinyatakan  sebagai  titer, yang  berarti  kebalikan  dari  pengenceran  dua kali  lipat  tertinggi  yang  menunjukkan hemaglutinasi positif.

## Penentuan Kandungan Protein
Kandungan protein ditentukan dengan  metode  Lowry et  al .  (1951)  dengan menggunakan bovine  serum  albumin (BSA) sebagai  standar  dan  dilakukan  dengan  dua kali ulangan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktifitas
hemagglutinasi
dan
kandungan  protein  dari  beberapa  alga  hijau genus Codium dapat dilihat pada Tabel 1 .
Hasil pengujian aktifitas
hemaglutinasi  yang dilakukan  pada beberapa fraksi  kasar  lektin  ( salting-out  fraction ) spesies alga hijau genus Codium menunjukkan  bahwa  lima  spesies Codium intricatum , C. spongiosum , C. subtubulosum , C.  arabicum ,  dan C.  latum mampu mengaglutinasi
trypsin-treated rabbit erythrocytes (TRBC). Aktifitas hemaglutinasi  yang  kuat  diperlihatkan  oleh
Codum  latum (2 9 atau  512)  dan Codium spongiosum (2 8 atau  256).  Sedangkan Codiumintricatum,  Codium  subtubulosum, dan Codium arabicum menunjukkan aktifitas hemaglutinasi  yang  relatif  kuat,  akan  tetapi Codiumcylindricum tidak menunjukkan aktifitas  hemaglutinasi  pada  pengujian  ini ( Tabel  1 ).  Dari  hasil  pengamatan  aktifitas
hemaglutinasi  tersebut,  dapat  diindikasikan bahwa Codium  latum dan C.  spongiosum mempunyai potensi yang lebih besar dibandingkan  spesies  alga  hijau  genus Codium yang  diuji  lainnya  untuk  dapat memasuki  tahapan  lanjut  pemurnian  lektin (hemagglutinin). Kandungan protein tertinggi diperlihatkan oleh Codium latum (3.9 mg/ml) ( Tabel 1 ).
Sebagaimana  telah  diketahui  bahwa karakteristik  yang  paling  penting  dari  lektin adalah  kemampuan  mereka  untuk  mengikat karbohidrat dan mengaglutinasi sel.
Aglutinasi  ini  disebabkan  oleh  fakta  bahwa lektin setidaknya memiliki dua sisi pengikatan  sehingga  dapat  berikatan  silang dengan  sel  melalui  interaksinya  dengan karbohidrat  pada  membran  sel  (Sharon  dan Lis,  2003).  Sebagian  besar  peneliti  telah mendeteksi lektin melalui penelitian mengenai  aglutinasi  dengan  menggunakan eritrosit  manusia  dan  hewan  dan  /  atau  sel lainnya.  Oleh  karena  itu,  pengujian  aktifitas hemaglutinasi pada penelitian ini menggunakan  eritrosit  dari  kelinci  dengan perlakuan  enzim  tripsin  ( trypsin-treated rabbit erythrocytes ) berdasarkan pertimbangan  bahwa  lektin  (hemagglutinin) dari  alga  lebih  sensitif  terhadap  eritrosit hewan,  terutama  eritrosit  kelinci  daripada eritrosit  manusia  dan  perlakuan  enzim  yang dalam  hal  ini  digunakan  tripsin  (meskipun enzim lain dapat digunakan, seperti misalnya papain) mengakibatkan sensitifitasnya menjadi  semakin  tinggi  (Hori et  al .,  1988). Hal  ini  didukung  dengan  penelitian  Hori et al. (1990)  yang  mengungkapkan  bahwa ketika ekstrak dari spesies alga diuji aktifitas hemaglutinasinya  terhadap native eritrosit dan  berbagai  perlakuan  enzim  ( enzyme- treated erythrocytes ),  mereka  menunjukkan kecenderungan  untuk  menggumpalkan  lebih kuat  pada  eritrosit,  terutama  eritrosit  kelinci, yang  sebelumnya  telah  dilakukan  perlakuan dengan enzim ( enzyme-treated erythrocytes ), khususnya  tripsin.  Penelitian  yang  dilakukan oleh Blunden et al. (1975) juga menunjukkan bahwa  lektin  (hemagglutinin)  dari  sejumlah besar  spesies  alga  dapat  ditunjukkan  pada saat eritrosit yang digunakan untuk mendeteksi aktifitas hemaglutinasinya telah
Tabel 1 . Aktifitas Hemaglutinasi dan Kandungan Protein Alga Hijau Genus Codium No. Spesies alga Aktifitas Hemaglutinasi (HA) a Kandungan Protein b (mg/ml) 1. 2. 3. 4. 5. 6. Codium intricatum Codium spongiosum Codium subtubulosum Codium arabicum Codium latum Codium cylindricum 32 256 64 32 512 - c 2.6 0.6 2.2 2.6 3.9 1.3
a Aktifitas Hemaglutinasi (HA), dinyatakan sebagai titer, yang berarti kebalikan dari pengenceran dua kali lipat tertinggi yang menunjukkan hemaglutinasi positif
b Kandungan protein ditentukan dengan metode Folin-Lowry (1951)
c Tidak terdeteksi
diberi  perlakuan  dengan  enzim,  seperti papain.
Berdasarkan laporan yang
disampaikan  oleh  Verbruggen et  al .  (2007), alga  hijau  genus Codium telah  digunakan sebagai  sumber  senyawa  bioaktif  yang  di antaranya  berpotensi  sebagai anti-cancer agents dan  antibiotik.  Lebih  lanjut,  terkait dengan kegunaan lektin dari alga hijau genus Codium ,  Wu et  al .  (1997)  mengungkapkan bahwa N -asetil  galaktosamin  spesifik  lektin dari Codium  fragile ssp. tomentosoides menunjukkan  afinitas  khusus  pada forsmann antigen  sugar  chain yang  merupakan penanda  kanker  dan  dapat  dimanfaatkan dalam  bidang  medis.  Selain  itu,  sejauh  ini baru  beberapa  lektin  (hemagglutinin)  yang berhasil  dimurnikan  dari  alga  hijau  genus Codium ,  sehingga  lektin  dari  genus Codium ini  merupakan  target  yang  menarik  untuk dikaji  lebih  lanjut,  khususnya  yang  terkait dengan  aplikasinya  di  bidang  kesehatan dalam era glycomics dan bidang pangan gizi, mengingat  beberapa  spesies  dari  genus  ini dapat  dikonsumsi  sebagai  bahan  pangan, selain  juga  diharapkan  dapat  memberikan wawasan secara menyeluruh dan komprehensif  untuk  mengungkap  hubungan evolusi antara alga dan tanaman darat.

## DAFTAR PUSTAKA
Ainouz, I.L., Sampaio, A.H., 1991. Screening  of  Brazilian  marine  algae  for hemagglutinins. Bot. Mar. 34, 211–214.
Ainouz,  I.L.,  Sampaio,  A.H.,  Benevides, N.M.B.,  Freitas,  A.L.P.,  Costa,  F.H.F., Carvalho,  M.C.,  Pinheiro-Joventino,  F.,
1992. Agglutination  of  enzyme  treated erythrocytes  by  Brazilian  marine  algae . Bot. Mar. 35, 475–479.
Alvarez-Hernandez,  S.,  De  Lara-Isassi,  G.,
Arreguin-Espinoza,  R.,  Arreguin,  B., Hernandez-Santoyo, A., Rodriguez-
Romero,  A.,  1999. Isolation  and  partial characterization  of  giraffine,  a  lectin from  the  Mexican  endemic  alga Codium giraffe Silva . Bot. Mar. 42, 573-580.
Bird,  K.T,  Chiles,  T.C.,  Longley,  R.E., Kendrick, A.F., Kinkema, M.D., 1993. Agglutinins from marine macroalgae  of  the  Southeastern  United States. J. Appl. Phycol. 5, 212–213.
Blunden,  G.,  Rogers,  D.J.,  Farnham,  W.F.,
1975. Survey  of  British  seaweeds  for hemagglutinins. Lloydia. 38, 162-168.
Blunden,  G.,  Rogers,  D.J.,  Farnham,  W.F.,
1978. Hemagglutinins  in  British  marine algae  and  their  possible  taxonomic value. In: Irvine, D.E.G., Price, J.H. (eds), Modern  approaches  to  the  taxonomy  of red  and  brown  algae,  pp  21-45. Academic, London.
Boyd,  W.C.,  Almodovar,  L.R.,  Boyd,  L.G.,
1966. Agglutinins  in  marine  algae  for human  erythrocytes. Transfusion.  6,  82- 83.
Brooks,  S.A.,  Dwek,  M.,  Schumacher,  U., 2002. Functional and molecular glycobiology . Garland Science. UK. Chiles, T.C., Bird, K.T., 1989. A comparative study of the animal erythrocyte agglutinins  from  marine  algae. Comp. Biochem. Physiol. B. 94, 107-111.
Fabregas,  J.,  Llovo,  J.,  Muñoz,  A.,  1985.
Hemagglutinins  in  red  seaweeds. Bot. Mar. 28, 517-520. . Fabregas, J.,  Muñoz,  A., Llovo, J., Carracedo,  A.,  1988. Purification  and partial  characterization  of  tomentine.An N-acetylglucosamine  specific  lectin  from the  green  alga Codium  tomentosum
(Huds.)Stackh. J  Exp.  Mar.  Biol.  Ecol. 124, 21-30.
Freitas,  A.L.P.,  Teixeira,  D.I.A.,  Costa, F.H.F.,  Farias,  W.R.L.,  Lobato,  A.S.C., Sampaio,  A.H.,  Benevides,  N.M.B., 1997. A  new  survey  of  Brazilian  marine algae for  agglutinins. J. Appl. Phycol.  9, 495–501.
Hori,  K.,  Miyazawa,  K.,  Ito,  K.,  1981.
Hemagglutinins  in  marine  algae .  Bull.
Japan. Soc. Sci. Fish. 49, 793-398. Hori,  K.,  Miyazawa,  K.,  Ito,  K.,  1986.
Preliminary characterization of
agglutinins  from  seven  marine  algal species. Bull.  Jpn.  Soc.  Sci.  Fish.  52,
323-331.
Hori,  K.,  Oiwa,  C.,  Miyazawa,  K.,  Ito,  K., 1988. Evidence  for  wide  distribution  of agglutinins in marine algae .Bot. Mar. 31, 133-138.
Hori,  K., Miyazawa, K.,  Ito,  K., 1990. Some common  properties  of  lectins  from marine  algae. Hydrobiologia.  204/205, 561-566.
Hori,  K.,  Matsubara,  K.,  Miyazawa,  K., 2000. Primary structures of two hemagglutinins from the marine red alga, Hypnea japonica.Biochim. Biophys. Acta 1474, 226-236.
Hori,  K.,  Sato,  Y.,  Ito,  K.,  Fujiwara,  Y., Iwamoto, Y., Makino, H., Kawakubo, A., 2007. Strict  specificity  for  high  mannose- type  N-glycans  and  primary  structure  of a red alga
Eucheuma serra
lectin. Glycobiology. 17, 479-491. Hung, L.D., Hori, K., Nang, Q., 2009. Screening and preliminary
characterization  of  hemagglutinins  in Vietnamese  marine  algae .  J.  Appl.
Phycol. 21, 89-97.
Lowry,  O.H.,  Rosebrough,  N.J.,  Farr,  A.L., Randall,  R.J.,  1951. Protein  measurement with  the  folin  phenol  reagent .  J.  Biol. Chem.193, 265-275.
Praseptiangga,  D.,Hirayama,  M.,  Hori,  K.,
2012. Purification,  characterization,  and cDNA  cloning  of  a  novellectin  from  the green  alga,  Codium  barbatum .  Biosci.
Biotechnol.Biochem. 76:805-811.
Rogers,  D.J,  Blunden,  G.,  Topliss,  J.A., Guiry,  M.D.,  1980. A  survey  of  some marine  organisms  for  haemagglutinins .
Bot. Mar. 23:569–577.
Rogers,  D.J.,  Loveless,  E.W.,  Balding,  P.,
1986. Isolation  and  characterization  of the  lectins  from  subspecies  of  Codium fragile. In: Kilpatrick, D.C., Van Driessche,  E.,  Bog  Hansen,  T.C.  (eds.), Lectins:  Biology,  Biochemistry,  Clinical Biochemistry, vol. 5, pp. 155-160. Walter de Gruyter, Berlin, Germany.
Sato, T., Hori, K., 2009. Cloning, expression, and characterization  of  a novel  anti-HIV lectin  from  the  cultured  cyanobacterium,
Oscillatoria  agardhii.Fish.  Sci.  75,  743-
753.
Sato, Y., Okuyama, S., Hori, K., 2007. Primary structure and carbohydrate  binding  specificity  of  a potent  anti-HIV  lectin  isolated  from  the filamentous  cyanobacterium, Oscillatoria agardhii . J.  Biol.  Chem.  282,  11021- 11029.
Sharon,  N.,  Lis,  H.,  2003. Lectins  2 nd ed. Kluwer, The Netherlands.
Varki,  A.,  Cummings,  R.,  Esko,  J.,  Freeze,
H.,  Hart,  G.,  Marth,  J.,  1999. Essentials of  glycobiology .Cold  Spring  Harbor Laboratory Press. New York.
Verbruggen,  H.,  Leliaert,  F.,    Maggs,  C.A.,
Shimada, S., Schils, T., Provan, J., Booth, D.,  Murphy,  S.,  Clerck,  O.,  Littler,  D.S., Littler,  M.M.,  Coppejans,  E..,  2007. Species  boundaries  and  phylogenetic relationships  within  the  green  algal genus  Codium  (Bryopsidales)  based  on plastid DNA sequences. Mol. Phyl. Evol. 44, 240–254.
Wu,  A.M.,  Song,  S.C.,  Chang,  S.C.,  Wu, J.H., Chang, K.S., Kabat, E.A., 1997. Further  characterization  of  the binding  properties  of  a  GalNAc  specific lectin  from Codium  fragile subspecies tomentosoides.Glycobiology  7,  1061- 1066.