IDENTIFIKASI KOI HERPESVIRUS PADA DOSIS YANG BERBEDA DENGAN METODE IMUNOHISTOKIMIA STREPTAVIDIN BIOTIN PADA IKAN NILA ( Oreochromis niloticus )
IDENTIFICATION OF KOI HERPES VIRUS AT DIFFERENT DOSE WITH STREPTAVIDIN BIOTIN METHODS IMMUNOHISTOCHEMISTRY ON TILAPIA ( Oreochromis niloticus )
Faricha Risma Nurani, Hari Suprapto dan Suwarno
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp. 031-5911451

## Abstract
KHV  is  a  viral  disease  in  goldfish  and  Koi  Fish  (Cyprinus  carpio)  is  a  highly  contagious, infecting all ages or sizes of fish and aquaculture systems. This disease results in mortality between 80% - 100%  of  the  total  fish  population,  with  an  incubation  period  of  between  1-7  days.  KHV  infection triggered  by  a  drop  in  ambient  temperature  so  it  is  referred  to  as  a  virus  that  attacks  when  cold  (a  cold virus). The disease attacks the temperature range of 18-28 ° C and can cause death. This virus attacks can occur  at  any  age  of  the  fish  ranging  in  size  from  the  seed  to  the  parent.  The  most  prominent  clinical symptoms due to KHV infection is the sudden death 1-2 days after infection. Other clinical symptoms are necrosis of the gills, sunken eyes, bleeding at the gills, hemorraghe, excess mucus production in the body, and secondary bacterial infections or parasitic infestations.
Streptavidin biotin immunohistochemical method was applied to the study of cells and tissues by staining  imunostaining.  Technique  of  determining  the  existence  of  (location)  antigen  (target  protein)  in tissue  using  antigen-antibody  reaction  that  begins  with  histotenik  procedure  is  the  procedure  of  making tissue  sections  (histology).  This  method  has  high  sensitivity  and  fast  so  that  it  can  be  applied  to  the detection of KHV antigen in tissues of fish Tilapia (Orechromis niloticus).
This  study  aims  to  determine  the  presence  of  KHV  antigen  in  tilapia  gills  after  infection.  The method used in this study is the experimental method. Dose of virus titer used was 1 ID50, ID50 10, 100 ID50, ID50 1000.
The  results  showed  that  the  Streptavidin  Biotin  immunohistochemical  examination imunopatologi  able  to  detect  KHV  virus  Ag  in  the  gill  tissue  of  tilapia  (Oreochromis  niloticus)  were infected with different doses. In all treatments showed on all the gills are KHV antigen is indicated by the presence  of  a  golden  brown  color  on  the  gill  epithelium.  Advised  Streptavidin  biotin immunohistochemistry  test  was  applied  to  the  detection  of  the  presence  or  absence  of  fish-carp  KHV carrier  as  a  routine  control  program  and  control,  including  the  prevention  and  outbreak  of  KHV  in Indonesia, because of KHV were attacked in tilapia was persistent and did not show clinical symptoms
Keywords : KHV, Histopathology, Immunohistochemistry

## Pendahuluan
KHV  merupakan  penyakit  viral  pada Ikan  mas  dan  Ikan  koi  ( Cyprinus  carpio )  yang sangat  menular,  menginfeksi  semua  umur  atau ukuran  ikan  dan  sistem  budidaya.  Penyakit  ini mengakibatkan  mortalitas  antara  80%  -  100% dari  total  populasi  ikan,  dengan  masa  inkubasi antara  1-7  hari.  Infeksi  KHV  dipicu  oleh penurunan  suhu  lingkungan  sehingga  disebut sebagai  virus  yang  menyerang  saat  dingin  ( a cold  virus )  ( Taukhid et  al .  2010).  Penyakit  ini menyerang  pada  kisaran  suhu  18-28°C  dan dapat  menyebabkan  kematian,  paling  sering teramati  luka  pada  insang,  sisik,  ginjal,  limfa, jantung dan  sistem  gastrointestinal (Gilad et al . 2003).  Serangan  virus  ini  dapat  terjadi  pada
berbagai  umur  ikan  mulai  dari  ukuran  benih sampai  induk.  Gejala  klinis  yang  paling menonjol  akibat  infeksi  KHV  adalah  kematian mendadak yaitu 1-2 hari setelah infeksi (Wasito, 2013a).    Gejala  klinis  lainnya  adalah  nekrosis pada  insang,  mata  melesak,  perdarahan  pada insang,  hemorraghe,  produksi  lendir  berlebih pada  bagian  tubuh  dan  infeksi  sekunder  bakteri maupun infestasi parasit (Shapira et al . 2005).
Metode  yang  sudah  sering  dilakukan untuk  mengidentifikasi  KHV  yaitu  dengan metode Polymerase  Chain  Reaction (PCR). Diagnosis  KHV  berdasarkan  isolasi  virus  dan uji  PCR  mempunyai  keterbatasan  dalam  hal sensitivitas  (Bercovier et  al. ,  2005)  sehingga diperlukan  metode  pendekatan  diagnosis  yang
baru untuk peneguhan diagnosis KHV, yaitu uji histopatologi dan uji imunohistokimia streptavidin biotin yang  hasil  diharapkan mampu  mengidentifikasi  KHV  yang  lebih akurat.
Metode  imunohistokimia Streptavidin biotin diaplikasikan  untuk  mempelajari  sel-sel dan  jaringan  dengan  pewarnaan  imunostaining (Brandtzaeg, 1998). Teknik penentuan
keberadaan  (lokasi)  antigen  (protein  target) dalam  jaringan  menggunakan  reaksi  antigen- antibodi yang diawali dengan prosedur histotenik  yaitu  prosedur  pembuatan  irisan jaringan  (histologi)  (Damayanti,  2009).  Metode ini mempunyai sensitifitas yang tinggi dan cepat sehingga  bisa  diaplikasikan  untuk  deteksi antigen KHV pada  jaringan ikan Nila ( Orechromis niloticus ).
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui  keberadaan  antigen  KHV  pada insang ikan nila pasca infeksi.

## Materi dan Metode
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan April-Juni  2014  di  Laboratorium  Pendidikan Fakultas  Perikanan  dan  Kelautan.  Identifikasi virus  KHV  dan  pengujian  histopatologi  dan imunohistokimia  dilakukan  di    Laboratorium Balai  Besar  Karantina  Ikan  Juanda,  isolat  virus dilakukan  di  Laboratorium  Pusat  Kesehatan Veteriner Masyarakat Surabaya.
Materi Penelitian Peralatan Penelitian
Peralatan yang digunakan untuk pemeliharaan  ikan  adalah  24  buah  akuarium berukuran  50cmx30cmx30cm 3 ,  selang  aerasi, batu  aerasi.  Peralatan  untuk  pengambilan  filtrat virus  yaitu  mortar,  tabung  reaksi,  rak  tabung, vortex,  mikropipet  1000  µl,  sentrifuge  dingin ( Refrigerated microcentrifuge ), lemari es, sarung tangan, spidol marker dan kertas label.
Peralatan untuk Imunohistokimia antara  lain  cover  glass,  incubator,  lemari  es, microcentrifuge  tubes,  micropipette  P200, mikroskop  cahaya,  objek  glass,  pippettors, pellet  pastel,  peralatan  elektroforesis,  Polaroid film,  Polaroid  camera,  sarung  tangan,  table  top centrifuge/refrigerated  microcentrifuge,  thermal cycler,  timbangan  analitik,  UV  transiluminator dan vortex.
Bahan Penelitian Bahan  penelitian  yang  digunakan adalah  ikan  Koi,  ikan  Nila  ( Orechromis niloticus ) dengan ukuran panjang rata-rata 5 cm dan pellet ikan.
Bahan untuk Imunohistokimia : xylene , etanol,  aseton,  larutan buffer  saline ,  kit streptavidin  biotin merk  lab  vision  yang  berisi :10% hydrogen  peroxide  black , normal  goat serum Anti-Koi Herpesvirus (KHV) monoclonal antibody, goat anti-mouse IgG biotin conjugate , Streptavidin-horseradish  peroxide , substrat- chromogen  solution , counter  stain  (mayer’s hematoxylin ), entellan  neu untuk  proses mounting, akuades steril.
Rancangan Penelitian Penelitian  ini  menggunakan  metode eksperimental  untuk  mengetahui  perubahan jaringan insang ikan nila ( Orechromis niloticus ) yang  diuji  dengan  metode  imunohistokimia dengan  membandingkan  antara  perlakuan  dan kontrol.
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak  Lengkap  (RAL)  dengan  lima  perlakuan dan  empat  kali  ulangan.  Perlakuan  pada penelitian ini yaitu pemberian dosis titer virus 1 ID 50 , 10 ID 50 , 100 ID 50 , 1000 ID 50 dan kontrol 0
ID 50 .
Pengambilan Sampel Teknik pengambilan sampel menggunakan simple  random  sampling yaitu mengambil  secara  acak  sampel  ikan  dari  tiap perlakuan yang kemudian dilakukan pemeriksaan  imunohistokimia.  Pengambilan sampel  ikan  nila  ( Orechromis  niloticus ) dilakukan setelah 7 hari pemeliharaan.
Variabel Penelitian Variabel  bebas  pada  penelitian  ini adalah  dosis  titer  virus  KHV  (ID50)  yang disuntikan  pada  ikan  nila.  Variabel  tergantung pada penelitian ini adalah perubahan histopatologi  jaringan  insang  ikan  nila  serta keberadaan  antigen  KHV  pada  jaringan  insang ikan  nila.  Variabel  kendali  pada  penelitian  ini adalah pH, suhu, NH 3 (Amoniak), DO (Oksigen terlarut).
Prosedur Penelitian dan Pengumpulan Data
Pengambilan Filtrat Virus Isolasi virus dilakukan dengan
mengambil organ dari ikan yang terinfeksi yang sebelumnya dilakukan uji PCR dengan membaca  pita  DNA  yang  positif  pada  290  bp (Sunarto et  al .,  2005b).  Isolasi  virus  dilakukan dengan  mengambil  bagian  insang,  ginjal,  limpa dan  hati  yang  ditumbuk  menjadi  pasta  halus dalam  mortar  steril  dingin  (Sunarto et.  al ., 2011),  diencerkan  sampai  10%  dengan  PBS ditambah dengan 10x penisilin-streptomisin dan diinkubasi  semalam  pada  suhu  4°C.  Organ
kemudian  dihomogenkan,  disentrifugasi  pada 2500  rpm  pada  suhu  4°C  dan  supernatan disaring  pada  filter  0,45  µm  (Lio-Po et.  al ., 2009).  Hasil  penyaringan  kemudian  diencerkan dengan kelipatan 10-10 -6 .
Penyuntikan pada Ikan Koi Hasil
pengenceran selanjutnya disuntikkan  ke  ikan  sebanyak  200  µl  secara intraperitoneal  (Sunarto et.  al .,  2005b).  Ikan yang  telah  disuntik  dipelihara  selama  14  hari pada  suhu  23-25°C  dan  diamati  setiap  dua  kali sehari  untuk  tanda-tanda  klinis  penyakit  dan mortalitas  Ikan  diberi  makan  sekali  sehari dengan  ransum  komersial  sebanyak  1%  berat badan  setiap  hari  (El-Matbouli and Soliman, 2011).
Penentuan Titer Virus pada Ikan Koi Ikan  yang  telah  disuntik  selanjutnya dihitung  mortalitasnya  dan  dimasukkan  ke dalam  rumus Reed-Muench .  Jarak  proporsional yang diperlukan pada titik akhir kematian 50%, diperoleh sebagai berikut:
Kemudian  dilakukan  penghitungan  untuk mengetahui nilai ID50 yaitu konsentrasi dimana ikan terinfeksi sebanyak 50% dari populasi pada batas waktu tertentu.
PD = 10 4 ID50 = 10 4 x 0,2 ml (dosis penyuntikan)
10 4 x 2.10 -1 2 x 10-5 Titer virus = 1÷ 2x10 -5 = 5 x 10 4 ID50/ml
Injeksi pada Ikan Nila
Ikan  nila  yang  sudah  disiapkan  dalam wadah pemeliharaan, selanjutnya akan
diinfeksikan  dengan  virus  melalui  injeksi  intra peritoneal.  Masing-masing  perlakuan  akan diinjeksikan virus dengan dosis 0 ID50, 1 ID50, 10  ID50,  100  ID50,  1000  ID50    sebanyak  0,2 ml. Ikan yang sudah diinfeksi dipelihara selama 14  hari.  Setelah  itu  sampel  organ  ikan  yang akan dilakukan imunohistokimia diambil setelah pemeliharaan.
Pengujian Imunohistokimia
Pewarnaan  imunohistokimia  berguna untuk  mendeteksi  virus  KHV.  Teknik  ini dilakukan berdasarkan protokol imunohistokimia Aquatic Diagnostic Ltd University  of  Stirling  Scotland.  Pengujian imunohistokimia dilakukan pada sediaan jaringan  insang  yang  direndam  dalam  formalin 10%  selama  24  jam.  Tahapan  imunohistokimia adalah  menyiapkan  preparat  jaringan  yang sudah  dipotong.  Preparat  yang  sudah  disiapkan kemudian  dicelupkan  ke  dalam  xylene  selama 2x5  menit,  100%  etanol  selama  5  menit  dan 70%  etanol  selama  3  menit.  Selanjutnya preparat    dicuci  dengan  akuades  steril  dan diinkubasi  ke  dalam  larutan  aseton  selama  10 menit.  Sampel  ditetesi normal  goat  serum dan diinkubasi  pada  suhu  kamar  selama  30  menit, kemudian sampel ditetesi antibodi primer ( anti- KHV monoclonal antibody ) dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit. Setelah itu sediaan preparat  dicuci  dengan  larutan  PBS Free Calcium selama  10  menit  lalu  titirkan  diatas (% kematian pada pengenceran di atas 50%) – (50%) PD = (% kematian pada pengenceran di atas 50%) – (% kematian pada pengenceran di bawah 50%)
Keterangan: PD : proportionate distance atau selang proporsi
Tabel 1. Data Penghitungan Virus untuk Menentukan ID59
Pengenceran Virus Rasio Mortalitas Mati Hidup Nilai Akumulasi Mati Hidup Mortalitas Rasio Persen 10 -1
10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
5/0 4/5 4/5 3/5 1/5 5 4 4 3 1 0 1 1 2 4 17 12 8 4 1 0 1 2 4 8 17/17 12/13 8/10 4/8 1/9 100 92 80 50 11
Keterangan: ID50 = 10 4 x 0,2 ml = 2x10 5
kertas  tissue.  Selanjutnya  sampel  ditetesi antibodi  sekunder  dan  ditambahi  dengan  cairan biotinylated  secondary  antibody selama  10 menit. Kemudian  sampel dicuci dengan larutan PBS Free Calcium selama 10 menit lalu tiriskan diatas  kertas  tissue.  Selanjutnya  sediaan preparat  diinkubasi  dengan  streptavidin  – peroxidase  conjugate  selama  5  menit.  Setelah itu  sediaan  dicuci  dengan  larutan  PBS Free calcium selama  10  menit  lalu  tiriskan  diatas kertas tissue. Proses selanjutnya adalah menginkubasi  sediaan  dengan  substrat  – chromogen  pada  suhu  ruang  selama  15  menit lalu  cuci  dengan  aquades  selama  10  menit. Tahap  terakhir  adalah  melakukan  pewarnaan dengan counterstain  hematoxylin selama  3 menit dan dicuci dengan aquades dan mounting dengan entellen  neu untuk  pengamatan  di bawah mikroskop cahaya. Hasil preparat positif apabila  dalam  sediaan  yang  telah  dilakukan pewarnaan  menggunakan  streptavidin-biotin terlihat warna coklat keemasan.
Pemeriksaan imunohistokimia dilakukan  berdasarkan  banyak  atau  sedikitnya warna kecoklatan (positif) yang dihasilkan pada slide  jaringan  yaitu  sebagai  hasil  reaksi  antara antigen–antibodi. Selanjutnya preparat dilakukan  proses  skoring.  Skor  histologi dilakukan  lewat  pemeriksaan  imunohistokimia dengan  pewarnaan  metode  streptavidin-biotin pada  jaringan yang dapat dilihat pada
mikroskop cahaya pada pembesaran 400x.
Analisis Data Hasil dari pemeriksaan imunohistokimia streptavidin biotin dan histopatologi jaringan insang ikan nila dilakukan secara
statistika dengan
menggunakan  Kruskal  Wallis  uji  skorring kemudian  dilanjutkan  dengan  uji  Z  (Siregar, 2011).

## Hasil dan Pembahasan
Berdasarkan  hasil  analisis  statistik  dengan uji  Kruskal  Wallis  dapat  dinyatakan  bahwa terdapat  perbedaan  skor  yang  signifikan  antar perlakuan  dengan  p=0,000  (p>0,05).  Setelah dilakukan uji perbandingan berganda dengan uji Z dapat diketahui bahwa pada perlakuan kontrol menunjukkan  perbedaan  yang  sangat  signifikan terhadap  perlakuan  yang  lain.  Perlakuan  1  ID 50 menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap  perlakuan  10  ID 50 dan  berbeda  sangat signifikan  terhadap  perlakuan  100  ID 50 dan 1000  ID 50 .  Perlakuan  10  ID 50 menunjukkan perbedaan  yang  sangat  signifikan  terhadap
perlakuan  100  ID 50 dan  1000  ID 50 .  Perlakuan 100  ID 50 menunjukkan  perbedaan  yang  sangat signifikan terhadap 1000 ID 50 . Hasil
penghitungan  statistik  skor  imunohistokimia jaringan  insang  ikan  nila  dapat  dilihat  pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil  Penghitungan  Nilai  Skoring Imunohistokimia Insang Ikan Nila No Dosis Virus Rerata Nilai Skoring Rerata Ranking 1. Kontrol 0 10,50 a 2. 1 ID50 1 41,00 b 3. 10 ID50 1,25 50,12 c 4. 100 ID50 1,65 66,55 d 5. 1000 ID50 2,35 84,32 e Pemerikasaan imunohistokimia
jaringan  insang  ikan  nila  berdasarkan  banyak sedikitnya  warna  cokelat  (+)  yang  dihasilkan pada  slide  jaringan  yaitu  sebagai  hasil  reaksi antara  Ag-Ab.  Penilaian  dilakukan  berdasarkan rata-rata  hasil  pengamatan  pada  lima  lapang pandang  dengan  menggunakan  pembesaran objektif
20x.
Hasil pengamatan imunohistokimia jaringan insang  ikan  nila pada masing-masing  perlakuan  menunjukkan  skor  0- 3  yang  artinya  mengalami  tingkat  perubahan warna  yang  tinggi,  sedangkan  pada  kontrol tidak  menunjukkan  perubahan  warna.  Gambar hasil  pemerikaan  imunohistokimia  dapat  dilihat pada Gambar 1 . Hasil  pengamatan  imunohistokimia menunjukkan  bahwa  pada  semua  perlakuan terdapat antigen KHV yang ditunjukkan dengan adanya  perubahan  warna  coklat  keemasan  pada jaringan  insang  yang  telah  diwarani  dengan  Ab dan  kromogen.  Penghitungan  bagian  insang yang terjadi perubahan warna dilakukan dengan skoring.  Hasil  uji  statistik  skoring  insang menujukkan bahwa pada masing-masing perlakuan  berbeda  nyata.  Dosis  virus  1-1000 ID50  yang  diinfeksikan  mampu  menginfeksi ikan  nila  sehingga  virion  virus  dapat  terdeteksi setelah  dilakukan  pemeriksaan.  Jumlah  virus yang  masuk  ke  dalam  tubuh  ikan  dan  mampu menginfeksi  ikan  berbeda  sesuai  dosis  yang ditentukan.  Pada  dosis  1000  ID50  yang diinfeksikan,  Nampak  jelas  pada  hampir  semua bagian  jaringan  insang  terdapat  Ag  KHV.  Pada dosis  ini  jumlah  virion  virus  yang  masuk kedalam  tubuh  ikan  lebih  banyak  sehingga  Ag virus yang ada pada jaringan nampak di hampir seluruh bagian jaringan insang yang terwarnai.
Awal  infeksi  dimulai  dari  perlekatan virus  pada  permukaaan  tubuh  maupun  insang. Pada  permukaan  tubuh  diduga  virus  mampu melewati  pertahanan  awal  tubuh  ikan  mas berupa  muskus  dan  epitel  insang.  Nat  (2001) menyatakan bahwa untuk proteksi ikan terhadap invasi  patogen,  permukaan  epitel  (kulit  dan insang)  penting  sebagai  pertahanan  awal.  Virus juga  mampu  melewati  komponen  berbagai substansi  pertahanan  pada  mukus.  Magnadottir (2006) menyatakan bahwa mukus ikan mengandung  parameter  immun  seperti  lectin, pentraxin, lysozym, protein komplemen, peptida antibakterial  dan  IgM.  Virus  yang  menempel dan  masuk  ke  organ  tubuh  bisa  berasal  dari virus  yang  terdapat  pada  feces  ikan  atau perpindahan  virus  akibat  kontak  langsung (kohabitasi) dengan ikan  terinfeksi (Hartman et al. 2004).  Kemudian  virus  akan  masuk  ke jaringan  pada  ruang  antar  sel.  Ligan  pada permukaan  molekul  khusus  virion  mengikat reseptor pada membran plasma sel (Fenner et al . 1995).  Virus  masuk  ke  dalam  sel  melalui  fusi antara  glikoprotein  selubung  virus  dengan reseptorya  yang  terdapat  di  membran  plasma (Daily dan Makes 2002). Proses masuknya virus terjadi  dengan  cara  endositosis  (endositosis diperantarai  sel)  (Fenner  et al. 1995).
Selanjutnya  nukleokapsid  virus  pindah  dari sitoplasma  ke  inti  sel,  setelah  kapsid  genom virus  dilepas  ke  dalam  inti  sel.  Genom  DNA yang  awalnya  linear  segera  berubah  menjadi sirkuler (Daily dan Makes 2002).
Faktor  yang  dapat  mempengaruhi keberhasilan pemeriksaan imunohistokimia diantaranya  adalah  sumber  jaringan  yang digunakan,  adanya  Ag  dalam  jaringan,  afinitas ikatan  antara  Ag  dan  Ab,  tipe  Ab  yang digunakan  dan  metode  yang  digunakan  dalam pemuncula Ag.
KHV  bisa  terdeteksi  pada  jaringan insang  normal  ada  dugaan  bahwa  virus  KHV dari  dalam  muscus  insang  masuk  ke  dalam  air dan bersifat infektif yang secara efisien mampu menginduksi penyakit KHV pada ikan-ikan lain yang  peka.  Hipersensitif  muskus  dianggap sebagai  gejala  kinis  dan  lesi  patologi  awal infeksi KHV (Gilad et al., 2004).
Kulit  pada  bagian  sirip  dan  tubuh  ikan  juga dianggap  sebagai  tempat  masuknya  virus sehingga  ikan  dapat  terinfeksi  KHV  dan selanjutnya  terjadi  Daili  SF  dan.  Makes  WIB. 2002.  Infeksi  virus  herpes.  Jakarta : Balai Penerbit Fakultas  Kedokteran  UI.  penyebaran sistemik  KHV  yang  berasal  dari  insang  dan
Gambar 1. (A) Insang Ikan Nila normal  yang diberi Streptavidin biotin dengan antibodi monoclonal anti  koi  herpesvirus  nampak  berwarna  ungu  (1000x);  (B)  Insang  Ikan  Nila  pemberian  dosis  virus  1 ID 50 berwarna coklat keemasan pada beberapa bagian (C) Insang Ikan Nila pemberian dosis 10 ID 50 (D) Insang Ikan Nila pemberian dosis 100 ID 50 (E) Insang Ikan Nila pemberian dosis 1000 ID 50 .
kulit  ke  organ-organ  internal  didalam  tubuh ikan.  Muskus  yang  dihasilakn  oleh  insang sebagai  sumber  penularan  virus,  ekskresi  virus bersam  urin  dan  tinja  juga  dianggap  berperan penting  dalam  penyebaran  dan  penularan  KHV pada ikan-ikan lain yang peka.
Pada  penelitian  ini  DNA  KHV  pada semua  ikan  nila  yang  nampak  sehat  dan  juga mengkonsumsi  pakan  secara  normal,  setelah dilakukan  uji  imunopatologi  imunohistokimia membuktikan bahwa ikan nila tersebut terinfeksi  KHV  secara  persisten.  Hal  ini menujukkan bahwa ikan nila ini diduga sebagai karier  KHV  yang  dapat  menyebarkan  dan menularkan  virus  pada  ikan-ikan  lain  yang peka.

## Kesimpulan
Pemeriksaan imunohistokimia Streptavidin Biotin  mampu  mendeteksi  Ag  virus  KHV  pada jaringan insang ikan nila (Oreochromis niloticus)  yang  diinfeksi  dengan  dosis  yang berbeda.
Uji  imunopatologi  imunohistokimia streptavidin  biotin  perlu  diaplikasikan  untuk deteksi ada tidaknya ikan-ikan mas carrier KHV sebagai program rutin kontrol dan pengendalian, termasuk  pencegahan  dan  wabah  KHV  di Indonesia,  karena  KHV  yang  menyerang  pada ikan  nila  ini  bersifat  persisten  dan  tidak menampakkan gejala klinis.

## Daftar Pustaka
Bercovier  H,  Fishman  Y,  Nahary  R,  Sinal  S, Ziotkin  A,  Eyngor  M,  Gilad  O,  Eldar A,  Hedrick  RP  2005.  Cloning  of  the koi  herpesvirus  (KHV)  gene  encoding thymidine  kinase  and  its  use  for  a highly  sensitive  PCR  based  diagnosis. BMC Microbiol 5: 13-19.
Brandtzaeg,  P.  1998.  The  Increasing  Power  Of
Immunohistochemistry and
immunocytochemistry. Journal of
Immunology 216; 49-67.
Daili  SF  dan.  Makes  WIB.  2002.  Infeksi  virus herpes.  Jakarta : Balai  Penerbit Fakultas Kedokteran UI. Damayanti, R., Alfinus, I., Rahmadiani., Faizal.
2009.  Deteksi  Antigen  Virus    Rabies Pada  Jaringan  Otak  Dengan  Metode Imunohistokimia.  Seminar  Nasional teknologi  Petrnakan  dan  Veteriner; 707-719.
El-Matbouli,  M. and H.  Soliman.  2011. Transmission  of Cyprinid  herpesvirus- 3 (CyHV-3)  from  goldfish  to  na ȉ ve common carp by cohabitation.
Research  in  Veterinary  Science  90: 536-539.
Fenner  FJ,  Gibbs  EPJ,  Murphy  FA,  Rott  R,
Studdert  MJ  and  White  DO.  1993 . Virologi veteriner. California : Academic Press. Gilad  O.,  Yun  S.,  Zagmutt-Vergara  FJ., Leutenegger CM., Bercovier H., Hendrick  RP.  2004.  Concentrations  of a  koi  herpesvirus  (KHV)  in  tissues  of experimentally infected Cyprinus
carpio  koi as  assessed  by  real-time
TaqMan  PCR. Dis Aqua  Org 60:  179- 187.
Gilad,  O.,  Yun,S.,  adkidson.  M.A.,  Way,  K., Willits,  N.H.,  bercovier,  H.,  and Hedrick, R.P. 2003. Molecular Comparison of Isolate of An Emerging Fish  Pathogen,  Koi  Herpesvirus,  and
The  Effect  of  Water  Temperature  on Mortality  of  Experimentaly  Infected Koi. I Gen Virol, 84 ; 2661-2668. Hartman KH, Yanong RPE, Petty BD, Floyd RF and  Riggs  AC.  2004. Koi  herpes  virus (KHV)  disease.  Publikasi  internet.. http://www.edis.ifasSedu.
Isnansetyo,  A.  dan  Kurniastuti.  1995.  Teknik
Kultur Phytoplankton dan Zooplankton Pakan Alami untuk Pembenihan
Organisme  Laut.  Penerbit  Kanisius.
Yogyakarta. Hal 60- 63. Kusriningrum.  2008.  Perancangan  Percobaan. Airlangga  University  Press.  Surabaya.
hal 21.
Lio-Po,  G., et.  al .  2009.  Surveillance  of Emerging  Fish  Viral  Pathogens  in Some  Southeast  Asian  Countries.  The Israeli
Journal of Aquaculture- Bamidgeh 61(3): 208-214.
Magnadottir  B.  2006.  Innate  immunity  of  fish (overview). Fish and shellfish
Immunology 20 : 137-1 5 1.
Nat  DR.  2001.  Characterization  of  immune system  of  carp  (Cyprinus  carpio  L.)  to the hemoflagellata Trypanoplasma borelly Laveran and Mesnil.
Disertation. Der Universitat Hannover.
Saphira, Y., et al . 2005. Differential Resistance to  KOi  herpesvirus  (KHV)  Carp Interstitial  Nephritis  and  Gill  Necrosis Virus  (CNGV)  Among  Common  Carp ( Cyprinus  carpio )  Strain  and  Croos Breds. Aquaculture 245; 11.
Siregar,  S.  2011.  Statistika  Deskriptif  untuk Penelitian. Dilengkapi Perhitungan
Normal & Aplikasi SPSS versi 17. PT. Raja  Grafindo  Persada.  Jakarta.  hal 324.
Sunarto,  A., et.  al .  2005b.  Field  Investigations on  a  Serious  Disease  Outbreak  among Koi  and  Common  Carp  ( Cyprinus carpio ) in Indonesia. Diseases in Asian Aquaculture V. hal. 125-135.
Sunarto,  A., et  al. 2011.  Isolation  and Characterisation  of  Koi  herpesvirus (KHV) from Indonesia Identification of a New Lineage. Jurnal of Fish Disease.
34; 87-101.
Suprapto,  H.  2011.  Histologi  Ikan.  Fakultas
Perikanan  dan  Kelautan  Universitas Airlangga. Surabaya. hal 6-13. Taukhid,  A.  M.  Lusiastuti,  W.  Andiyani, Rosidah,  dan  Sriati.  2010.  Induksi Kekebalan  Spesifik  pada  Ikan  Mas, Cyprinus carpio Linn. Terhadap Infeksi  Koi  herpevirus  (KHV)  melalui
Teknik  Kohabitasi  Terkontrol.  Balai Riset Budidaya Air Tawar. 257-276. Taukhid,  A.,  Sunarto,  A.,  Koesharyani,  I.,
Supriyadi, H., Gardenia. Strategi Pengendalian Penyakit Koi Herpesvirus  (KHV).  2004.  Balai  Riset Budidaya Air Tawar. Wasito,  R.,  Hastari,  W.,  Bambang,  S.  2013a. Identifikasi KHV Dengan Uji Imunopatologi Imunohistokimia Streptavidin  Biotin  Pada  Ikan  Mas Karier.  Jurnal  Veteriner  14. No.  1: 37-
44.