Seleksi Material Penempelan Biofilm Isolat Bakteri Resisten Tembaga asal PT.

## Freeport Indonesia
Maria Massora 1 )* , Erni Martani 2) , Eko Sugiharto 3) , Roberth Sarwom 4) Tumpal Sinaga 4)
1) Prodi Bioteknologi SPS UGM
2) Fakultas Pertanian  UGM
3) Fakultas MIPA UGM
4) Depart ement Environmental P TFI

## ABSTRAK
Tailing  adalah  lim bah  dari  proses  pemisahan  bijih  mineral  yang  m engandung logam berat yang bersifat sangat toksik pada biota m isalnya m anusia, tanaman, ikan dan mikroba  diantaranya  bakteri.  Bakteri  yang  mampu  tum buh  pada  lingkungan  terc emar logam  berat  cenderung  mem bentuk  biofilm   yang  merupakan  suatu  bentuk  mekanisme pertahanan s el terhadap  kondisi  lingkungan  yang  ekstrim  atau  kurang menguntungkan. Biofilm  terdiri  dari  berbagi  kelompok  bakteri  yang  tum buh  bersama  m ikroba  lain  yang diselubungi  m atriks  polim er  ekstraseluler  (EPS)  dan    melekat  pada  permukaan  m ateri organik  maupun  anorganik.  Biofilm  berpotensi  s ebagai  agensia  remediasi  atau bioremediator  yang  handal.  Empat  is olat  bakteri    yang  digunakan  dalam  penelitian  in adalah  bakteri  resisten  tem baga  yang    diis olasi  dari  tailing  PT  Freeport  Indonesia, Timika,  Papua.  Pada  penelitian  ini  dilakukan  seleksi  materi  penempelan  biofilm  berupa materi  organik m aupun  anorganik  untuk memperoleh  m ateri penempelan yang optim al untuk  pertumbuhan  biofilm.    Masing-  masing  isolat  diinokulasikan  kedalam  medium  LB yang  mengandung  100  mg/L  CuSO 4 .  Material  uji  digantung  pada  tutup  erlenmeyer, diinkubasi  pada  shaker  inkubator  dengan  kecepatan  sedang,  selam a  2  minggu  pada suhu  ruang.  Aktivitas   pembentukan  biofilm  diamati  s etiap  minggu  sekali  berdasarkan penempelan  biofilm  pada  material  yang  diamati  dibawah  mikros kop.  Untuk  mengetahui massa  biofilm  yang  terbentuk,  dapat  dihitung  dengan  cara  menimbang  material penempelan  s ebelum  dan  sesudah    penempelan  biofilm.    Empat  isolat  dapat  tumbuh dengan  baik  pada  batu  kali,  kayu,  plastik  LLDPE  dan  plastik  PET  nam un  penempelan biofilm terlihat lebih stabil pada potongan kayu dan batu kali. Pseudomonas  aeuruginosa strain C53 menunjukkan kemampuan paling tinggi dalam pem bentukan biofilm  kemudian diikuti Bacillus  cereus    strain C38, Lycinibacillus  fusiformis    strain C40  dan Bacillus subtilis strain C43.
Kata Kunci : Bakteri Resisten te mbaga, Biofilm, M aterial Pene mpelan.
Massora, M., et. al., Biowallacea, Vol. 4 (1), Hal : 527-532,  April, 2017
email: ria_massora@yahoo.co.id
asal PT. Freeport Indonesia

## ABSTRACT
Tailings are waste  from the  process of separation of  ore containing heavy metals that  are  very  toxic  to  organisms  such  as  humans,  plants,  fish  and  microbes  suc h  as bacteria. Bacteria capable of growing in a heavy-m etal polluted environment tend to form biofilm  which  is  a  form  of  cell  defens e  mechanism  agains t  extreme  or  less  favorable environm ental  conditions.  Biofilm  consists  of  various  groups  of  bacteria  that  grow together  with  other  m icrobes  that  are  s urrounded  by  the  extrac ellular  polymeric substance  (EPS) and adhere to the surfac e of both organic and in organic matter. Biofilm has  potential  as  a  reliable  rem ediation  agent  or  bioremediator.  Four  bacterial  is olates used in this study were copper-resistant  bacteria isolated  from  PT  Freeport  Indonesia's tailings,  Timika,  Papua.  In  this  research,  selection  of  biofilm  attachment  material  was conducted  in  the  form  of  organic  or  inorganic  material  to  obtain  optim al  attachment material for biofilm  growth. Eac h  isolate was  inoculated into  LB medium  containing  100 mg /  L CuSO 4 .  The  test m aterial was suspended on the  erlenmeyer cover,  incubated in the incubator s haker with medium  speed,  for 2 weeks  at room  temperature. The biofilm forming activity was observed weekly based on the attachm ent of biofilms to the m aterial observed under the microscope. To determine the mass of the biofilm formed, calculation of the attachment m aterial weight was done before and after the biofilm attac hment. Four isolates  could  grow  well  on  stone,  wood,  LLDPE  plastic  and  PET  plastic.  However,  the biofilm attachment  looked m ore stable  on wood and stone fragments. The  highest ability in  the  biofilim  formation  was  perform ed  by Pseudom onas  aeuruginosa  strain C53, followed  by Bacillus  cereus  strain C38, Lycinibacillus fusiformis  strain C40  and Bacillus subtilis strain C43.
Keywords : Copper Resistant Bacteria, Biofilm, Attachment Material

## PENDAHULUAN
Tailing  adalah  lim bah  dari  proses pemisahan bijih mineral yang terkandung  dari  bijih  tam bang.  Tailing mengandung  logam  berat  yang  bersifat sangat  toksik  pada  biota  misalnya manusia,  tanaman,  ikan  dan  mikroba. Logam  tersebut  dapat  terdistribusi  ke bagian  tubuh  m akhluk hidup dan terjadi bioakum ulas i pada rantai makanan.
Bakteri yang mam pu tumbuh pada lingkungan terc emar logam berat cenderung  mem bentuk  biofilm.  Biofilm merupakan  suatu  bentuk  mekanisme pertahanan sel terhadap kondisi lingkungan  yang  ekstrim  atau  kurang menguntungkan. Biofilm  terdiri  dari
berbagi  kelompok  bakteri  yang  tumbuh bersam a  mikroba  lain  yang  diselubungi matriks  polimer  ekstraseluler  (EPS)  dan melekat pada  perm ukaan m ateri  organik maupun anorganik.  EPS dihasilkan oleh mikroba tersebut, s ebagai sumber nutrisi (Klapper,  2006  ;  Anderson,  2009). Matriks EPS pada biofilm memungkinkan  sel  bakteri  bertahan lebih  lama  dibanding  jika  berada  pada kondisi  planktonik  (Flemming,  2000). Penelitian  terdahulu  telah  m embuktikan bahwa sistem biofilm mempunyai potensi  sebagai  agensia  rem ediasi  atau bioremediator  yang handal (Rajbir et  al ., 2006).
Berdasarkan uraian  diatas,  dapat diketahui bahwa biofilm berperan penting dalam pengolahan limbah. Struktur biofilm yang dipengaruhi beberapa  faktor  dapat  dim anfaatkan untuk  mengontrol  pertumbuhan  biofilm, baik  sec ara  fisik  maupun  kimiawi. Faktor-faktor itu diantaranya sifat
permukaan dan ruang
antara,
ketersediaan nutrient, kom posisi kom unitas  m ikroba  dan  hidrodinamika. Pada  penelitian  ini  dilakukan  seleksi materi penempelan biofilm berupa materi  organik  maupun  anorganik  untuk memperoleh    materi  penempelan  yang optimal untuk pertum buhan biofilm.

## METODE, PENELITIAN

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  tailing  PT  Freeport Indonesia,  batu  kali,  potongan  kayu, tutup  botol  air  mineral  yang  berbahan dasar plastik  LLDPE  ( Linear Low
Density   Polyethylene )  dan  botol  air mineral  yang  berbahan  dasar  plastik PET  ( Polyethylene  terephtalate ).  Bahan kimia  lain  yang  digunakan  adalah Medium  Luria-Bertani  (LB)  broth  : tryptone 10 g; yeast extrac t 5 g; NaCl 10 g; glucose 0,1 g; aquadest 1 L.
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian ini meliputi  Mikros kop, laminar air-flow , autoklaf dan inkubator .
Empat  is olat  bakteri    yang digunakan  dalam   penelitian  in  adalah
bakteri  resisten  tembaga  yang  m ampu tumbuh pada medium LB yang mengandung  300-500  CuSO 4 mg/L. Bakteri  diisolasi  dari  tailing  PT  Freeport Indonesia, Timika, Papua (Tabel 1).
Tabel 1. Is olat bakteri resisten tem baga

## Seleksi Material Pene mpelan Biofilm
Pembentukan  biofilm  digunakan material  batu  kali,  potongan  kayu,  tutup botol  air  mineral  yang  berbahan  dasar plastik LLDPE dan botol air m ineral yang berbahan  dasar  plastik  PET  sebagai material  uji.  Mas ing-  masing  isolat diinokulasikan  kedalam   Erlenmeyer   500 mL  yang  berisi  medium  LB  yang mengandung  100  mg/L  CuSO 4 .  Isolat bakteri  yang  dipakai  adalah  Isolat  yang sebelum nya dibandingkan dengan larutan  0,5  McFarland  Standar  yang setara  dengan  10 6 cfu/ml.  Larutan Mc Farland Standar dibuat dengan kom posisi  0,5  ml  BaCl 2 dan  99,5  ml H 2 SO 4. Kekeruhan  larutan  diatur  hingga bernilai 0,08 - 0,10 pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 600nm.
Material  penempelan  digantung pada  tutup  erlenmeyer  m enggunakan tali  nilon.  Kemudian  diinkubasi  ada shaker  inkubator selama 2 minggu  pada
No. Isolat Acession Number 1 Bacillus cereus  strain C38 MF521959 2 Lycinibacillus fusiformis strain C40 MF521962 3 Bacillus subtilis strain C43 MF521960 4 Pseudomonas aeuruginosa strain C53 MF521963
suhu ruang,  dengan  kecepatan sedang.
Aktivitas   pembentukan  biofilm  diam ati setiap minggu sekali berdas arkan penempelan  biofilm  pada  material  yang diam ati dibawah mikroskop. Untuk mengetahui m assa biofilm yang terbentuk,  dapat  dihitung  dengan  cara menim bang material penempelan sebelum  dan  sesudah    menem pelnya biofilm. Berat material penempelan  yang sudah  diselubungi  biofilm  (Berat  Akhir) dikurangi dengan berat material s ebelum penempelan (Berat Awal).

## HASIL DAN DISKUSI
Sebanyak  4  is olat  bakteri  yang diis olas i dari tailing m ampu tumbuh pada medium  yang  mengandung  300-500 mg/L CuSO 4, diuji kem ampuan pembentukan  biofilmnya  pada  berbagai material  penem pelan.  Sem ua  material tampak mendukung  pertumbuhan kultur. Pada  penelitian  ini,  semua  isolat  diduga mampu mem bentuk single-s pecies biofilm karena  dari  has il  pengamatan dengan  mikroskop  menunjukkan  bahwa semua  isolat m ampu membentuk  biofilm pada m aterial uji (Gam bar 1).
Gam bar  1.  Pembentukan  biofilm  oleh
isolat bakteri resisten tembaga pada material penempelan
Ekspresi  gen  dari  setiap  mikroba atau  bakteri  berbeda-beda  sehingga menyebabkan  mekanisme  penempelan dan kemam puan single-cells untuk melekat  ke  s uatu  perm ukaan  berbeda- beda juga (Gordon dkk, 2017).
Aktivitas pertumbuhan merupakan parameter kem ampuan pembentukan  biofilm   oleh  isolat  terpilih. Dari  semua  isolat  uji, Pseudom onas aeuruginosa  strain C53  m enunjukkan kem ampuan paling tinggi dalam pembentukan  biofilm  kemudian  diikuti
Bacillus cereus strain C38, Lycinibacillus  fusiform is    strain C40  dan Bacillus  subtilis  strain C43  (Tabel  2). Pseudomonas  aeruginosa  merupakan salah  satu  jenis  bakteri  pembentuk biofilm yang dapat mensekresikan senyawa EPS  berupa  asam  kolanat dan galaktoglukan (Vu dkk., 2009).
Tabel  2.  Kem ampuan  Pembentukan biofilm oleh isolat
Pembentukan biofilm diawali
dengan  pergerakan  mikroba  menuju  ke
No Isolat Kayu (gr) Batu (gr) Plastik LLDPE (gr) Plasti k PET (gr) 1 Bacillus cereus strain C38 1,44 1,25 0,75 0,56 2 Lycinibacillus fusiformis strain C40 1,32 1,18 0,71 0,49 3 Bacillus subtilis strain C43 1,12 1,05 0,67 0,45 4 Pseudomonas aeuruginosa strain C53 1,52 1,33 0,83 0,67
permukaan material penempelan, kem udian akan m enempel s ecara reversible maupun irreversible.
Penempelan  reversible  dapat  terjadi akibat  ,  interaks i  mikroba dengan permukaan,  gerak  Brown,  dan  aliran konveksi. Penem pelan irreversible terjadi  s aat  sel  mikroba  menghasilkan EPS  yang membentuk  ikatan  dari s el  ke sel,  dan  melekatkan  kumpulan  sel  ke permukaan material penempelan.
Pelekatan irreversible ini memicu kolonisasi  dari  mikroba,  dimana  sel-sel mikroba tum buh membentuk mikrokoloni yang menyusun biofilm (Lindsay dan von Holy, 2006).
Material penempelan yang digunakan  pada  penelitan  ini  adalah batu  kali,  potongan  kayu,  tutup  botol  air mineral  yang  berbahan  dasar  plastik LLDPE  dan  botol  air  mineral  yang berbahan  das ar  plastik  PET.  Material  uji tersebut  m erupakan  bahan  yang  mudah diperoleh,  dan  umum nya  ditem ukan sebagai bahan  buangan,  sehingga bernilai ekonomis.   Aspek-aspek  yang menjadi  pertim bangan  dalam  pemilihan material  penempelan  biofilm  adalah aspek lingkungan, ekonomi dan fungsionalitas  bahan  s elama  proses berlangsung.  As pek  lingkungan  meliputi efek produksi dan pembuangan material, aspek  ekonomi meliputi   biaya awal dan operasional, sedangkan aspek fungsional  m eliputi  biodegrabilitas  dan
tidak  mudah  terkikis  (Anders on  dkk, 2008). Berdasarkan pertimbangan aspek tersebut,  maka  m aterial  penempelan yang  digunakan  dalam  penelitian  ini merupakan  material  terbaik  yang  dapat mendukung pertumbuhan biofilm  bakteri resisten  tembaga  dan  dapat  digunakan dalam  pengolahan  lim bah.  Isolat-isolat terpilih  dapat  tum buh  dengan  baik  pada batu  kali  yang  m emiliki  permukaan kasar,  plastik  LLDPE  dan  plastik  PET yang  memiliki  perm ukaan  yang  halus, serta  kayu  yang  perm ukaanya  berpori dan  kasar,  namun  penempelan  biofilm terlihat  lebih  stabil  pada  potongan  kayu dan batu kali.
Goller dan Romeo (2008) menyatakan bahwa  ada  beberapa faktor yang m empengaruhi pembentukan biofilm  diantaranya  kondisi  permukaan dan  hidrodinamika/aliran  cairan,  nutrisi, suhu,  oksigen  dan  osmolaritas.  Mikroba pada  umumnya  lebih  cepat  menem pel pada  permukaan  yang  kasar  dan membentuk  biofilm  karena  permukaan untuk  penempelan  sel  lebih  luas  dan shear forces lebih rendah (Qureshi  dkk., 2005;  Denkhaus   dkk.,2006).  Plastik HDPE  mem iliki  permukaan  yang  halus sehingga  sulit  untuk  dikolonis asi  oleh bakteri,  namun  jika  bakteri  sudah berhasil  melakukan  penem pelan  awal, maka  akan  diikuti  dengan irreversible attachment dan  maturasi  biofilm  yang cepat (Anders on dkk, 2008).
Pembentukan  biofilm  pada  m ateri  yang porous  juga  lebih  menguntungkan  bagi pembentukan  biofilm   karena  pori-pori memberikan  perlindungan  dari  tekanan lingkungan (Qureshi dkk., 2005).

## KESIMPULAN
1. Empat  is olat  dapat  tum buh  dengan baik  pada  batu  kali,  kayu,  plastik LLDPE  dan  plastik  PET  namun penempelan  biofilm   terlihat  lebih stabil  pada  potongan  kayu  dan  batu kali.
2. Isolat Pseudomonas aeuruginos a strain C53  menunjukkan  kem ampuan paling  tinggi  dalam   pembentukan biofilm kem udian diikuti Bac illus cereus    strain C38, Lycinibac illus fusiformis    strain C40  dan Bac illus subtilis strain C43

## SARAN
Penelitian lanjutan mengenai material-material  lain  yang  berpotensi sebagai tempat penem pelan biofilm.

## UCAP AN TERIM A KASIH
Penulis mengucapkan terim akasih
kepada Direktorat Riset  dan Pengabdian Mas yarakat, Direktorat Jenderal
Penguatan  Riset  dan  Pengem bangan.
Kementerian Riset, Tenologi, dan Pendidikan  Tinggi  atas  bantuan  dana penelitian  m elalui  Program  Penelitian Disertasi Doktor (PDD).

## DAFT AR PUST AKA
Andersson, S., Nilson, M., Dalhammar, G.,
and Rajaro, G. K. 2008, ”Assessment  of  Carrier  Materials for Biofilm Formation and
Denitrification”, Vatten ,  64:  201- 207.
Denkhaus,  E.,  Meisen,  S.,  Telgheder,  U., and Wingender,  J. 2006. Chemical and Physical Methods for Characterization of Biofilms” Microchim. Acta. 158 : 1-27. Flemming,  H.,  Wingender,  J.,  Griebe,  T., and Mayer. 2000. Physico-
chemical  Properties  of  Biofilms, dalam  Biofilms:  Recent  Advances in  their  Study  and  Control,  Editor:
LV.  Evans,  Amsterdam:  Harwood
Academic Publisher. Goller, C.C and Romeo., 2008. Environmental Influences on Biofilm Development, dalam Bacterial Biofilm, diedit oleh Romeo, Tony, Heidelberg: Springer. Gordon,  D.  V.,  Fields,  M.D.,  Kovach,  K., and Rodesney, C.A. 2017. Biofilms and  Mechanics:  a  review  of experimental techniques and findings. J.  Phys.  D.  Appl.  Phys .
50: 1-12. Klapper, I., Biofilm Mechanics .Downloaded fromhttp://www.erc.montana.edu/C BEessential-SW/bf-basis 999/basic01.html on 15/06/2016.
Lindsay  D  dan  A.  Von  Holy.  2006.
Bacterial biofilms within the clinical setting: what health care professionals should know. Journal of  Hospital  Infection. 64 (4):  313- 325
Qureshi,  N.,  Annous,  B.A.,  Ezeji,  T.C., karcher, P., and  Maddox,  I.S.2005. Bofilm  Reactors  for  Industrial
Bioconversion Processes:
Employing  Potential  of  Enhanced
Reaction  Rates.  Microbial  Cell
Factories. 4 (24): 1-21.
Vu B, Chen  M, Crawford RJ,  Ivanasa EP.
2009. Bacterial ekstracellular polysaccharydes involved in biofilm formation. Molecules. 14:  2535 –
2554.