## KOMUNIKASI  RINGKAS

## EKSTRAKSI  DAN  KARAKTERISASI  KOLAGEN
DARI  KULIT  IKAN  NILA  HITAM (Oreochromis  niloticus )
Extraction and Characterization of Collagen from Black Tylapia Skin (Oreochromis niloticus)
A.B. Naro Putra 1* , Latif Sahubawa 1 , dan Nurfitri Ekantari 1
1 Jurusan  Perikanan,  Fakultas  Pertanian  Universitas  Gadjah  Mada. Jl.  Flora  Bulaksumur  DIY  Yogyakarta *  Korespondensi  Penulis:  latifsahubawa2004@yahoo.com
Diterima: 12 Mei 2011, Disetujui: 21 Oktober 2013

## ABSTRAK
Kulit ikan nila hitam (Oreochromis niloticus ) dapat diekstraksi menjadi  kolagen dan turunannya sebagai  salah  alternatif  peningkatan  nilai  tambah  limbah  industri  perikanan.  Ekstraksi  kolagen dari  sampel  kulit  ikan  nila  hitam  menggunakan  asam  asetat  (metode  asam)  dan  dipresipitasi dengan  larutan  garam  dapur  (NaCl)  0,9  M.  Untuk  meningkatkan  optimasi  isolasi  kolagen (berdasarkan  jumlah  rendemen),  kulit  ikan  nila  hitam  diekstraksi  dengan  3  perlakuan  konsentrasi asam asetat, masing-masing: 0,25 M; 0,50 M; dan 0,75  M pada selang waktu 16 dan 48 jam. Dari hasil  pengujian  diketahui  bahwa  perlakuan  interaksi  konsentrasi  asam  asetat  dan  waktu  ekstraksi tidak  berpengaruh  nyata  (p>0,05)  terhadap  pembentukan  rendemen  kolagen  pada  tingkat signifikansi  95%.  Perlakuan  asam  asetat  0,75  M  pada  selang  waktu  16  jam  menghasilkan rendemen terbesar (5,96%), dengan suhu denaturasi kolagen mencapai 35,75 o C; serta  komposisi asam  amino:  glisin  5395,82  ppm  (52,99%),  alanin  2979,15  ppm  (22,08%),  dan  asam  glutamat 1684,42  ppm  (7,45%).  Berdasarkan  analisis  SDS-PAGE,  diketahui  bahwa  kolagen  dari  sampel kulit  ikan  nila  hitam  mengandung  ikatan  rantai-  dan  rantai-  sebagai  kolagen  tipe-I.
KATA KUNCI: asam asetat, kolagen, kulit nila hitam, ekstraksi, karakterisasi

## ABSTRACT
Skin  of  black  tylapia  (Oreochromis  niloticus)  can  be  processed  into  the  collagen  and  its derivatives, as  a alternative  to incrase  value-addition of fisheries industry  wastes.  Skin of  black tylapia  was extracted using acetic acid and precipitated with 0.9 M NaCl. To establish the optimum conditions  for  the  isolation  of  high  yield  collagen  by  acidic  method,  the  skin  was  treated  with various concentrations of the acetic acid, each: 0.25 M, 0.50 M, and 0.75 M at time intervals of 16 and 48 hours. It seemed that the interaction of those treatments did not significantly affect the yield of the collagen (p>0.05), but the skin extracted with 0.75 M acetic acid at 16 hours has the highest yield  of acid soluble collagen (ASC) (5.96%), with denaturation temperature of ASC was  35.75 o C Amino  acid  composition  consisted  of:  glycine  5395.82  ppm  (52.99%),  alanine  2979.15  ppm (22.08%),  and  glutamic  acid 1684.42  ppm  (7.45%).  The  analysis  of SDS-PAGE  showed  that  the collagen  black  tylapia  skin  contained  -chain  and β -chain  bonds  as  a  collagen-type  I.
KEYWORDS: acetic acid, collagen, black tylapia skin, extraction, characterization

## PENDAHULUAN
Penggunaan kolagen dalam industri pangan dan nonpangan pada umumnya bersumber dari jaringan kulit hewan darat (terutama sapi dan babi) sebagai bahan  baku  potensial.  Dalam  pemanfaatannya, kolagen banyak digunakan pada dunia kecantikan dan kesehatan, namun ternyata jenis bahan baku ini dapat
menimbulkan  dampak  buruk  terhadap  kesehatan manusia. Menurut Yamaguchi (2002), lebih-kurang 10% dari total konsumen kolagen di dunia terjangkit penyakit bovine spongiform encephalopathy (BSE) serta penyakit kuku dan mulut setelah menggunakan kolagen yang bersumber dari jaringan kulit sapi dan babi. Permasalahan ini memberikan peluang besar pada pemanfaatan kulit ikan nila hitam khususnya
dan  kulit  ikan  umumnya  sebagai  sumber  kolagen alternatif potensial, yang diharapkan diproduksi secara komersial. Pemanfaatan limbah kulit ikan nila hitam sebagai bahan baku kolagen merupakan salah satu alternatif  peningkatan  nilai  tambah  ( value-added ) limbah  industri  perikanan,  sekaligus  mengurangi dampak negatif (pencemaran) terhadap lingkungan hidup.
Kolagen diketahui mempunyai banyak manfaat di dunia medis dan farmasi. Aplikasi kolagen antara lain: penanganan  penderita  hipertensi,  permasalahan urinari, sakit yang berkaitan dengan osteoarthritis , rekayasa jaringan untuk implantasi pada manusia, dan pengham batan  penyakit angiogenic ,  seperti komplikasi diabetes, obesitas, dan arthritis (Rehn et al ., 2001). Kolagen juga dapat diaplikasikan dalam bidang pangan ( edible casing ), kosmetik (krim kulit, shampo, produk-produk perawatan rambut, cat kuku), dan medis (perbanyakan plasma, plasma pemekar, agen hemostatik, material benang bedah, perbaikan kat up  pr ostensis,  perbaikan  selaput  m ata, hemodialisis,  tulang  buatan,  pebentukan  oksigen membram, dan pemulihan operasi organ-organ yang rusak (esofagus, trakea) (Chvapil, 1979).
Penelitian isolasi rendemen kolagen dari beberapa spesies ikan dan bagian tubuh lainnya telah dilakukan. Ekstraksi kolagen kulit  ikan perch Nil  (usia muda) didapatkan rendemen sebesar 63,1% dan 58,7% pada usia dewasa; pada makarel chub , hiu bullhead , dan kakap Jepang didapatkan rendemen kolagen masing- masing: 49,8% ; 50,1% ; dan 51,4% (Jongjareonak et al ., 2004). Pada ikan cod dan cod Baltic didapatkan kol agen  m asi ng-m asing:  71, 2%  dan  74,4% (Sadowska, et al . 2003). Sedangkan dari kulit sotong, diperoleh Acid Soluble Collagen (ASC) sebesar  2% dan Pepsin  Soluble  Collagen (PSC)  sebesar  35% (Nagai et al ., 2001). Perbedaan spesies, habitat dan perlakuan pada proses ekstraksi sangat berpengaruh pada  rendemen,  karakter,  dan  komposisi  molekul kolagen. Penelitian tentang kolagen dari spesies ikan domestik masih sangat jarang dilakukan, sehingga data terkait belum mencukupi.
Penelitian tentang isolasi kolagen yang berasal dari spesies ikan air tawar yang hidup didaerah tropis jarang dilakukan. Ikan nila hitam merupakan salah satu  spesies  ikan  air  tawar  yang  hidup  didaerah tropis.  Berdasarkan latar belakang diatas dan sebagai upaya untuk memenuhi kebutuhan industri farmasi dari  sumber  kolagen  yang  aman,  berkualitas  dan dapat diterima semua kalangan, maka perlu dilakukan pengkajian  terhadap  potensi  kolagen  kulit  ikan umunya,  dan  kulit  ikan  nila  hitam  khususnya. Penelitian  bertujuan  untuk  mempelejari  pengaruh konsentrasi larutan asam asetat dan lawa ekstraksi terhadap mutu kolagen dari limbah kulit nila hitam,
sekaligus mecoba mengkaji sumber kolagen potensial dan  berkualitas,  serta  am an  dan  halal  untuk konsumen, sebagai alternatif pengganti kolagen dari jaringan babi dan sapi.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan dan Alat
Bahan baku utama penelitian adalah kulit ikan nila hitam  yang telah  dikeringkan,  didapatkan  dari  PT. Aquafarm  Surakarta,  Jawa  Tengah.  Bahan-bahan kimia untuk analisis antara lain: natrium hidoksida (NaOH), aquades, asam asetat (CH 3 COOH), natrium klorida (NaCl), acrylamide, amonium persulfat (APS), coomassie blue R-250, asam etilendiamintetra-asetat, garam dinatrium (Na 2 EDTA.2H 2 O), gliserol (C 3 H 8 O 3 ), glisin,  asam  hidroklorat  (HCl),  â- mercaptoetanol , metanol (CH 3 OH), protein molecular weight standards (e.g. BioRad 161-0318, prestained  SDS-PAGE standards broad range , 209-7 kD), sodium dodecyl sulfate ( SDS, dodecyl sulfate, sodium salt ), N,N,N’,N’- Tetramethylethylenendiamine (TEMED), tris  base , asam borat (H 3 BO 3 ), bromocresol green , etanol (95%), asam hidroklorat pekat (HCl), methyl red , asam sulfat pekat (H 2 SO 4 ), kjeldahl digestion tablets : kalium sulfat (K 2 SO 4 ), cupric  sulfate (CuSO 4 ),  titanium  dioksida (TiO 2 ); tris  hidroksimetil  aminomethane (THAM), petroleum eter , fenol, N 2, air deionisasi, trimetilamin, fenilisotiosianat (PITC), buffer fosfat pH 7,4.
Peralatan  yang  digunakan  terdiri  atas:  pisau stainless steel, talenan, wadah kaca, wadah plastik, neraca analitik, kertas pH,  pH meter, pengaduk, gelas ukur,  alat  sentifugasi,  viscometer,  tabung  dialisis, protein marker , soxhlet extractor , tabung digesti, labu erlenmeyer, kertas timbang, spatula, sistem distilasi dan digesti Kjeldahl, eksikator, oven, cawan, pipet, ember, toples, magnetic stirrer , cold storage , amino acid analyzer , penjepit, kain saring dakron, dan ayakan plastik.

## Metode

## Prosedur Pengolahan Kolagen
Diagram  alir  proses  pengolahan  kolagen  dari sampel kulit ikan nila hitam mengikuti langkah-langkah seperti pada Gambar 1. Secara garis besar, proses pengolahan kolagen terdiri atas 6 (enam) tahap yakni: (1) uji proksimat (kadar air, protein, lemak dan abu) ; (2) Preparasi sampel sebagai tahap awal memulai proses  ekstraksi  ;  (3)  Penghilangan  proten  non kolagen  dengan  larutan  NaOH  0,1M  ;  (4)  Proses ekstraksi  kolagen  ;  (5)  Permurnian  (dialisis)  dan liofilisasi  kolagen;  dan  (6)  Karakterisasi  kolagen.
Gambar 1. Diagram alir pengolahan kolagen dari kulit ikan nila hitam. Figure 1. Flowchart of the collagen processing from black tilapia skin.
Penjelasan  masing-masing  tahap  tersebut  dapat dilihat pada uraian berikut.

## Analisis Proksimat
Sampel kulit nila hitam kering diuji kadar protein, kadar air, kadar abu, dan kadar lemak (Nielson et al , 2003).

## Rendemen dan Isolasi Kolagen
Proses  isolasi  kolagen  kulit  ikan  nila  hitam menggunakan metode Ogawa et al . (2004) dengan
modifikasi. Semua prosedur isolasi kolagen dilakukan pada suhu kamar, kecuali untuk sentrifugasi (4 o C), mengikuti tahap-tahap berikut.
a. Penyiapan  sampel  kulit  ikan  nila  hitam  kering ukuran 1cm  x  1cm.  Penghilangan  protein  non- kolagen dengan cara merendaman sampel dalam larutan  NaOH  0,1  M  selama  24  jam  dengan perbandingan bobot kulit dan volume larutan 1:20.
b. Pencucian sampel dengan aquades hingga pH air cucian mendekati 7 (netral).
c. Proses ekstraksi kolagen menggunakan perlakuan larutan CH 3 COOH konsentrasi 0,25 M; 0,50 M dan

## Sampel Kulit Ikan Nila Kering
Perendaman Sampel dalam Air Leding sampai Kulitnya Lemas (Rehidrasi)
Ditiriskan dan Dipotong Ukuran Kecil-Kecil (1x1cm 2 )
Ditimbang 50 gr
Direndam dalam larutan NaOH 0,1 M (b/v: 1:10) pada Suhu Kamar selama 24 jam
Alkaline-treated Calcified Tissues
Direndam dalam Larutan NaOH 0.1 M (b/v: 1:20) pada Suhu Kamar selama 24 jam
Alkali-insoluble Components
Disaring dengan Kain Saring Dakron di dalam Ayakan Plastik (è 20 cm)
Dicuci dengan Aquades sampai pH Cairan ±7,0 (netral)
Ekstraksi dengan Larutan CH 3 COOH 0,25 ; 0,50 ; 0,75 M (b/v 1:10) pada Suhu Kamar selama 16 jam & 48 jam
Disaring Residu/Supernatan
Salting Out (ditambahkan NaCl murni sampai konsentrasi akhir mencapai 0,9 mol dm -3 )
Disimpan semalam Dalam Chilling Room
Disentrifugasi (kecepatan 3500 rpm), suhu 4 0 C, selama 20 menit
The Resulting Precipitates
Ditimbang
Dilarutkan dalam Larutan CH 3 COOH 0,5 M (b/v: 1:10)
Dialisis dengan Larutan CH 3 COOH  0,1 M dan aquades
Liofilisasi
Karakterisasi
0,75 M (b/v 1:10) dengan lama waktu inkubasi 16 dan  48  jam.  Perlakuan  yang  menghasilkan rendemen kolagen terbesar, akan dipakai untuk analisis lanjutan (karakterisasi).
d. Hasil ekstraksi disaring dengan kain saring dakron dalam ayakan plastik untuk memisahkan residu dan ekstrak (supernatan). Supernatan dipresipitasi dengan  cara  m enambahkan  NaCl  sam pai konsentrasi akhir larutan mencapai 0,9 mol dm ”3 hingga didadapatkan presipitat kolagen ( salting- out ).
e. Presipitat dibiarkan selama 24 jam dalam kondisi dingin, kemudian disentrifus pada kecepatan 3500 rpm dan suhu 4 o C selama 20 menit. Hasil sentrifus didialisis dengan cara melarutkan kolagen di dalam larutan asam asetat 0,5 M (b/v: 1:10), kemudian dimasukkan ke dalam membran selofan.
f. Membran yang  berisi kolagen  direndam dalam larutan asam asetat 0,1 M (diulangi 3 kali dengan larutan asam asetat yang baru). Setelah dua kali dilakukan  penggantian  larutan  asam  asetat, membran yang berisi kolagen direndam di dalam aquades  yang  diganti  setiap  3  jam  sampai  pH aquades  m enj adi  5  atau  lebih.  Kolagen pascadialisis, diliofilisasi ( freeze drying ) selama
12 jam dalam wadah-wadah kecil terpisah yang mudah dikeringkan.

## Pengukuran Viskositas dan Suhu Denaturasi
Viskositas dan suhu denaturasi dianalisis dengan metode Ogawa et al. (2004), dengan menggunakan alat Cannon-Fenske Viscometer , mengikuti persaman 1.
ç sp =  (t – t 0 ) / t 0
Persamaan (1)
Keterangan: ç sp = viskositas spesifik larutan
t = waktu alir larutan kolagen (detik)
t 0 = waktu alir pelarut (detik)
Pengukuran suhu denaturasi kolagen dilakukan dengan cara: (a) mengalirkan larutan kolagen 8 ml, 0,02 g/dl  (20 mg dalam 100 ml larutan asam asetat) melalui kapiler viskometer pada suhu 30 - 42 o C, (b) amati viskositas dengan mengukur waktu alir pada suhu yang sama, (c) kurva denaturasi termal larutan kolagen  dibentuk  dengan  memplotkan  viskositas tereduksi ç sp /c melawan suhu, (d) titik denaturasi ( Td- V ) diekspresikan sebagai suhu pertengahan antara garis terekstrapolasi dari kolagen asal dengan kolagen yang sepenuhnya terdenaturasi pada plot ç sp /c versus suhu.
Analisis Komposisi Asam Amino (Metode Pico.Tag: Bidlingmeyer at al , 1984)
Analisis komposisi asam amino dilakukan dengan terlebih dahulu  memotong rantai  kolagen  menjadi residu  asam  amino,  mengikuti  langkah-langkah berikut.
a. Menyiapkan 5 gram sampel kulit ikan, masukkan ke dalam 20 ml HCl 6 N, dan dihomogenkan.
b. Homogenat dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 110°C dan disimpan selama 12 jam sampai terjadi keseimbangan suhu autoklaf dan ruang.
c. Setelah suhu seimbang, homogenat dinetralkan dengan larutan NaOH 6 N, tambahkan pula 2,5 ml Pb asetat dan 1 ml asam oksalat, dan kemudian disaring dengan rillex 0,45 µm.  Hasil saringan yang terbentuk diinjeksi ke dalam alat HPLC untuk dilihat d. Menyiapkan  alat  HPLC  m erk   Beck m an m enggunakan  metode  Sudarm adji  (1996) mengikuti aturan sebagai berikut.
1). Pengisian kolom ukuran 4,6 x 250 mm dengan bahan  ODS  ( Octa  Dodeyl  Silane atau  C 18 ). Untuk menjaga kondisi bahan, kolom utama disambungkan dengan satu kolom pelindung dengan bahan yang sama namun lebih pendek.
2). Pengisian  kolom  pelindung  4,6  x  45  mm dengan bahan ODS berukuran 5 mikron.
3). Siapkan ultrasphere dengan pendukung silika.
4). Cairan pendorong (eluen) yang digunakan yaitu campuran  metanol  :  larutan  asetat  dengan perbandingan 85:15. Perbandingan asetat dan akuades sebesar 1:100. Kecepatan alir eluen 1  ml/menit,  dengan  panjang  gelombang detektor ultraviolet 267 nm.
Analisis komposisi asam amino hanya mencakup 3 jenis (glisin, alanin, dan asam glutamat) tanpa prolin dan  hidroksiprolin  karena  tidak  tersedia protein molecular weight standards dari ke dua jenis asam amino tersebut.
Analisis Tipe Kolagen (Metode Elektroforesis: Sambrook & Russel, 2001)
Tipe  kolagen  dianalisis  menggunakan sodium dodecyl  sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)  yang  mengacu  pada  buku  panduan Sambrook dan Russel (2001), sebagai berikut.
a. Menyiapkan SDS-PAGE dengan cara preparasi 10 µg sampel bubuk kolagen yang dilarutkan dalam 200 µl aquades, kemudian diaduk dengan magnetic stirrer .  Sampel  bubuk  kolagen  yang  terlarut dicampur pada perbandingan 1:1 (v/v) dengan 10% SDS.
b. Menyiapkan campuran  gel SDS-PAGE  dengan konsentrasi  8%  untuk  dimasukkan  ke  dalam
lempeng  kaca.  Sampel  beserta marker protein yang  telah  disiapkan,  diinjeksikan  ke  dalam sumuran yang tersedia dengan cara memasukan sebanyak 10 µl sampel secara perlahan, diikuti dengan marker sebanyak 1 µl. Marker  rainbow digunakan untuk memperkirakan bobot molekul protein.
c. Elektroforesis dioperasikan pada 10-20 mA selama 30-60 menit sampai membentuk gel, kemudian diwarnai selama 8 jam dengan bahan Coomassie blue R -250 0,05% (b/v) dalam metanol 15% (v/v) dan asam asetat 5% (v/v).
d. Penghilangan warna gel menggunakan metanol 30% (v/v) dan asam asetat 10% (v/v).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Proksimat (%)
Hasil uji proksimat dari sampel kulit ikan nila hitam kering  adalah:  kadar  protein  47,43%;  air  23,74%; lemak 1,68%; dan abu 3,01%. Menurut Sadowska et al . (2003), kandungan kolagen dari sampel kulit ikan adalah sebesar 21,50% (berat basah) dan 71,20% (berat kering). Kadar protein dari sampel kulit ikan nila hitam sebesar 47,43% menunjukan bahwa kulit nila hitam memiliki kualitas yang baik untuk dijadikan sebagai bahan baku kolagen dalam industri sebagai alternatif pengganti jaringan kulit babi dan sapi.

## Rendemen
Hasil analisis sidik ragam  menunjukkan bahwa interaksi  perlakuan  konsentrasi  asam  asetat  dan
waktu  ekstraksi  tidak  berpengaruh  nyata  (p>0,05) terhadap  produksi  rendemen  bubuk  kolagen  pada tingkat  signifikansi  95%.  Berdasarkan  pengujian, dihasilkan rendemen bubuk kolagen dari sampel kulit ikan  nila  hitam  berkisar  antara  2,24%  -  5,96%. Persentase  rendemen  kolagen  yang  diekstraksi dengan  asam  asetat  konsentrasi  0,25M;  0,50M; 0,75M pada selang waktu 16 dan 48 jam diperlihatkan pada  Gambar  2.  Berdasarkan  Gambar  2,  terlihat bahwa proses ekstraski sampel kulit ikan nila hitam yang menggunakan konsentrasi asam asetat 0,75M (tertinggi)  pada  selang  waktu  16  jam  (terpendek) menghasilkan persentase rendemen kolagen yang lebih besar (5,96%) dibandingkan waktu ekstrasi yang lama (48 jam), yakni 2,24%.  Sama halnya dengan penggunaan konsentrasi asam asetat rendah (0,25M dan 0,50M) pada selang waktu 48 jam, artinya  makin tinggi kosentrasi larutan asam asetat yang digunakan, makin banyak kolagen yang dihasilkan.  Sebaliknya makin lama waktu ekstraksi makin sedikit kolagen yang dihasilkan. Hal ini menunjukkan bahwa faktor konsentrasi  larutan  asam  asetat  m emberikan pengaruh signifikan terhadap ekstrasi protein kolagen.
Dibandingkan dengan rendemen kering kolagen dari  sampel  kulit  dan  sisik  ikan  lainnya,  yakni: Cuttlefish  skin  (2.0%),  Sardine  scale  (5.0%), dan Carper scale (7.0%) , serta Baramundi skin (9.0%) ( rendemen basah) yang diekstraksi dengan metode asam (ASC) ternyata kolagen kulit ikan nila hitam yang diekstraksi dengan metode yang sama (asam asetat 0,75M) menghasilkan rendemen kering yang cukup besar (5,96%).  Meskipun demikian, kolagen yang diektrasksi dengan metode enzimatis ( Pepsin Solubilased Collagen , PSC), ternyata menghasilkan
Gambar 2. Rerata nilai rendemen kolagen (%) kulit ikan nila hitam pada perlakuan konsentrasi asam asetat dan waktu ekstraksi yang berbeda.
Figure 2. Avarage value of collagen yield (%) of black tylapia skin with treatment of acetic acid concentration and extraction time that differents.
R en d eme n ke ri n g/ D ry Re n de m en ( % ) Konsentrasi Asam Asetat 16  Jam/16 Hours
48  Jam/48 Hours
rendemen dalam jumlah yang lebih besar (Kimura et al. 1991;  Nomura et  al .  1996;  Nagai et  al .  2001; Sadowska et al . 2003;  Jongjareonak et al . 2004; dan Nagai et al . 2004) (lihat Tabel 1).  Ekstraksi kolagen dengan metode PSC menghasilkan rendemen lebih banyak  dibandingkan  metode  ASC  karena  enzim memiliki aktivitas tinggi dan karakteristik khusus dalam pemotongan atau penguraian secara sempurna asam amino  pembentuk  rantai  peptide  protein  kolagen (Sahubawa, 2008).

## Viskositas
Berdasarkan hasil analisis (Tabel 2), terlihat bahwa makin tinggi suhu, maka waktu alir kolagen makin

## Tabel 1. Perbandingan rendemen kolagen dari berbagai macam sumber
Table 1. Collagen yield comparation of various sources
Keterangan/Note: ASC  = Acid  Solubilised  Collagen
PSC  = Pepsin  Solubilised  Collagen
Sumber Kolagen/ Sources of Colagen Rendemen /Yield Peneliti /Source of Research Cod sk in 20.0% ( dry rendemen PSC ) Sadowska et al . (2003) 2.0% ( dry rendemen ASC ) 35.0% ( dry rendemen PSC ) 9.0% ( web rendemen ASC )
4.7% ( web rendemen PSC ) Sardine scale 50.9% ( dry rendemen PSC ) Nagai et al . (2004) Carper scale 7.0% ( dry rendemen ASC ) Kimura et al. (1991) Sardine scale 5.0% ( dry rendemen ASC ) Nomura et al . (1996) Black  tylapia sk in 6.0% ( dry rendemen ASC ) Hasil Riset Cuttlefish sk in Nagai et al . (2001) Baramundy sk in Jongjareonak et al . (2004)
menurun  karena  besarnya  v iskositas  sampel. Menurunnya  waktu  alir  tersebut  disebabkan berkurangnya  tahanan  dari  cairan  sampel  karena makin pendeknya rantai  senyawa polimer kolagen akibat pengaruh suhu proses. dikatakan Basmal et al . (2007), viskositas adalah tahanan dari suatu cairan untuk  m engalir.  Besarnya  v iskositas  bahan, menandakan makin besarnya tahanan cairan bahan tersebut.  Menurut  Glicksman  (1969),  viskositas adalah  daya-aliran  molekul  dalam  sistem  larutan. Billmeyer (1962) menyatakan bahwa suatu senyawa polimer  dengan  rantai  karbon  yang  lebih  pendek ternyata memiliki viskositas lebih rendah dibandingkan dengan senyawa polimer rantai panjang pada jenis bahan yang sama. Dikatakan Basmal et al . (2005),
Tabel 2. Waktu alir dan viskositas kolagen sampel kulit ikan nila hitam pada suhu berbeda Table 2. The stream time and  viscosity of black tylapia skin collagen at the different temperatures
Larutan Kolagen/ Collagen Solution (t) Pelarut /solven (t 0 ) 30 203.9 192.6 0.0587 2.9335 32 196.9 186.4 0.0563 2.8165 34 186.8 179.1 0.043 2.1496 36 177.3 172.5 0.0278 1.3913 38 169.3 166.2 0.0186 0.9326 40 159.9 160.4 -0.0031 -0.1557 42 154.3 154.6 -0.0019 -0.097 Suhu / Temperature (°C) Viskositas Spesifik/ Specipic Viscosity (ηsp) Viskositas Tereduksi / Reduction Viscosity (ηsp/c)
Waktu Alir (detik)/ Stream Time (second)
terdapat 4 (empat) faktor (suhu, waktu, jenis enzim, serta  jenis  laritan/asam  dan  basa  kuat)  yang mempengaruhi  proses  pemotongan  rantai/polimer protein. Makin besar dan banyak faktor tersebut, makin meningkat jumlah potongan rantai polimer.
Data  Tabel  2  menunjukkan  hasil  perhitungan viskositas kolagen berdasarkan suhu yang berbeda. Makin tinggi suhu, makin menurun viskositas spesifik (ç sp ) maupun viskositas tereduksi (ç sp /c). Viskositas spesifik dan tereduksi tertinggi didapatkan pada suhu 30°C yakni: 0,0587 ç sp dan 2,9335 ç sp /c, sedangkan nilai terendah didapatkan pada suhu 42°C yakni ç sp sebesar  -0, 0019  dan  ç sp /c  sebesar  -0, 0970. Penurunan  viskositas  disebabkan  oleh  penurunan berat molekul kolagen akibat pemutusan rantai polimer. Viskositas spesifik (ç sp ) dihitung dengan persamaan (t-t 0 )/t 0 , yang mengasumsikan bahwa densitas larutan dan pelarut (asam asetat) adalah sama (t= efflux time larutan kolagen dan t 0 = efflux time solven). Viskositas
Gambar 3. Kurva denaturasi termal kolagen kulit ikan nila hitam.
Figure 3. Thermal denaturation curve of black tylapia skin.
Re d uctio n vis cosi ty (dl /g) Suhu/ Temperature (°C)
tereduksi (ç sp /c), dengan c adalah konsentrasi protein (g/dl), diplotkan melawan konsentrasi c.

## Suhu Denaturasi
Denaturasi dapat diartikan sebagai perubahan atau modifikasi struktur sekunder, tersier dan kuartener molekul  protein,  tanpa  diikuti  dengan  pelepasan ikatan kovalen. Suhu denaturasi kolagen dari sampel kulit ikan nila hitam sebesar 35,75 o C, dengan bentuk kurva denaturasi termal kolagen seperti diperlihatkan pada Gambar 3. Suhu denaturasi kolagen kulit ikan nila  hitam  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  suhu denaturasi kolagen dari kulit ikan Cod, Eal, Mackeral, dan Skipjack (Muyonga et  al .  2004) dan    sirip  hiu botol  ( Botle shark ) dan kakap putih ( Baramundy ) serta tulang  kakap  putih  (Nagai et  al .  2001).    Suhu denaturasi kolagen kulit ikan berbeda-beda menurut spesies dan habitatnya, seperti diperlihatkan pada Tabel 3. Kolagen kulit ikan dari spesies yang hidup di

## Tabel 3. Suhu denaturasi kolagen berbagai jenis bahan baku
Table 3. Collagen denaturation temperature from any raw materials
Sumber Kolagen/ Source of Collagen Suhu Denaturasi / Denaturation Temperature Peneliti/Researchers Cod sk in 15.0 °C Eel sk in 29.3 °C Mack eral sk in 26.1 °C Sk ipjack  sk in 29.7 °C Botle shark  fin 25.0 °C Scales of goldfish 32.5 °C Baramundy bond 30.0 °C Baramundy fin 29.1 °C Testis sea urchin 28.0 °C Muyonga et al . 2004 Nagai et al . 2001

## Gambar 4. Kurva hasil analisis asam amino kolagen kulit ikan nila hitam
Figure 4. Curve of collagen amino acid composition from black tylapia skin
d   = Nagai et al. (2001) e   = Nagai et al. (2004) f   = Penelitian  ini td = tidak  diamati
perairan dingin umumnya memiliki suhu denaturasi yang lebih rendah dibandingkan dengan ikan yang hidup di perairan tropis. Kestabilan kolagen terhadap suhu  merupakan  suatu  adaptasi  fisiologis  ikan terhadap perubahan suhu lingkungannya (Ogawa et al . 2004).
Menurut Jongjareonrak et al . (2004), kestabilan kolagen kulit ikan dipengaruhi oleh komposisi 5 (lima) jenis  asam  amino  utama  (glisin,  alanin,  asam glutamate, serta prolin dan hidroksiprolin). Lebih lanjut
dikatakan bahwa makin tinggi kandungan prolin dan hidroksiprolin, makin stabil dan tinggi titik denaturasin struktur heliks kolagen yang dihasilkan. Kolagen yang didapatkan dari bahan baku berbeda, mempunyai titik denaturasi yang berbeda pula.

## Komposisi Asam Amino
Hasil analisis komposisi asam amino kolagen dari sampel  kulit  ikan  nila  hitam  seperti  terlihat  pada Gambar 4. Komposisi asam amino kolagen dari kulit
Keterangan/ Note: a = Morimura  et  al. (2001) b = Ogawa et al. (2004) c = Jongjareonrak et  al. (2004)

## Tabel 4. Perbandingan komposisi asam amino bermacam sumber kolagen
Table 4. Comparation of amino acid composition from various sourcecollagen
Kulit Babi /Pig Skin Sisik Black Drum / Black Dru m Scale (%) b Kulit Kakap Putih /Bara mundy Skin (%) c Kulit Sotong / Cuttlefish Skin (%) d Tulang sheepshead /Sheepshea d bond (%) b Sisik Sardin / Sardine Scale (%) e Sisik Red Sea Bream/ Red Sea Bream Scale (%) e Kulit Nila Hitam /Blac k Tylapia Skin (%) f 1 Glisine 33.8 34.5 25.2 31.8 34.20 34.0 34.0 52.9 2 Alanine 11.3 12.40 14.3 8.3 12.90 11.5 11.6 22.1 3 Glutamate Acid 7.8 6.39 8.1 9.2 6.58 7.1 7.2 7.4 4 Proline 12.6 11.10 13.1 9.8 10.60 11.1 10.9 td 5 Hidroxiproline 7.9 8.79 8.1 9.0 8.85 8.6 8.7 td
No Asam Amino/ Amino Acid
Sumber Kolagen /Source of Collagen (per 1000 amino acid recidu)
Gambar 5. Pola SDS polyacrylamide gel (8%) elektroforesis untuk marker bobot molekul rainbow (sumuran A) dan kolagen kulit nila hitam (sumuran B)
Figure 5. Electroforecis gel SDS polyacrylamide models (8%) for rainbow molecule weight marker (well A) dan black tylapia skin (well B)
ikan nila hitam didominasi oleh asam amino glisin, alanin dan asam glutamat. Hasil analisis menunjukkan bahwa kolagen sampel kulit nila mengandung glisin 5395,82  ppm;  alanin  2979,15  ppm;  dan  asam glutam at   1684,42  ppm .  Berdasark an  hasil penghitungan luas puncak, didapatkan kandungan glisin sebesar 52,9%, alanin 22,1% dan asam glutamat 7,4%. Kandungan asam amino glisin dan alanin dari sampel kulit nilai hitam sangat tinggi, sedangkan asam glutamat  relatif sama dibandingkan dengan sampel kulit, sisik, dan tulang spesies ikan lainnya  (Tabel 4).
Menurut Muyonga et al . (2004), kolagen memiliki kandungan asam amino metionin, tirosin dan histidin yang rendah dan tidak mengandung triptofan atau sistein.  Ogawa et  al .  (2004),  mengatakan  bahwa komposisi asam amino protein kolagen didominasi oleh  prolin,  glisin,  alanin,  asam  glutamat  dan hidroksiprolin.  Protein kolagen yang bermutu tinggi mengandung komposisi asam amino glisin, alanini, prolin, hidroksiprolin, dan asam glutamat dengan sifat amfoter  tinggi,  dimana  jenis  kolagen  ini  dapat membentuk struktur heliks yang paling stabil terhadap perubahan  suhu  dan  pH  (Morimura et  al .,  2002). Dikatakan Junaidianto (2009), bahwa protein kolagen yang  bermutu  memiliki  komposisi  asam  amino minimal 3  dari 5  jenis (prolin,  alanin,  glisin,  asam glutamat,  dan  hidroksiprolin)  karena  memiliki keistimewaan dalam pemanfaatannnya, yakni: mudah diserap dan mengalami degradasi dalam tubuh, tidak toksik dan biokompatibel,  mudah dimodifikasi dan
diformulasikan dalam berbagai bentuk sediaan, mudah dimurnikan, serta tidak bersifat antigen.

## Tipe Kolagen
Pola SDS-PAGE sampel kolagen kulit ikan nila hitam  dapat  dilihat  pada Gambar  5. Pola  tersebut menyerupai  Pola SDS-PAGE sampel kolagen kulit ikan nile  perch (Muyonga et  al .  2004); blackdrum, sheepshead seabream (Ogawa et al . 2004); dan ikan kakap merah (Jongjareonrak et al . 2004). Pola SDS- PAGE hasil pengamatan menunjukan bahwa kolagen kulit ikan nila hitam memiliki rantai  dan  yang tidak dapat  teramati  secara  jelas  karena  masih  tampak berhimpitan. Kondisi ini dapat disebabkan komposisi asam amino rantai  1 dan  2 yang tidak jauh berbeda (bobot  molekul  relatif  sama)  (Wang et  al .  2008). Kolagen sampel kulit ikan nila hitam juga memiliki rantai  , yang menunjukan bahwa dalam kolagen ini terdapat  komponen  terikat-silang  ( cross-linked components ), yaitu terjadinya intra-molecular cross- linking dan/atau inter-molecular cross-linking (Ogawa et al . 2004).

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  analisis  statistik,  perlakuan konsentrasi asam asetat  dan waktu ekstraksi  tidak berpengaruh nyata terhadap pembentukan rendemen
B A ß 225 kDa a 150 kDa 102 kDa 76 kDa 52 kDa 38 kDa
bubuk kolagen dari sampel ikan nila hitam. Perlakuan asam asetat 0,75 M dengan lama waktu ekstraksi 16 jam menghasilkan rendemen bubuk kolagen terbesar (5,96%) dibandingkan lawa waktu ekstraksi 48 jam (2,24%).
Kolagen kulit ikan nila hitam memiliki karakteristik: viskositas larutan kolagen menurun sejalan dengan peningkatan  suhu;  suhu  denaturasi  35,75°C; kandungan asam amino glisin 52,99%, alanin 22,08% dan asam glutamat 7,45%, serta termasuk kolagen tipe-I”.

## Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lanjutan menggunakan konsentrasi  asam  asetat  0,75%  dengan  waktu ekstraksi lebih kecil dari 16 jam.
2. Penting  dilak ukan  riset  lanjutan  tent ang karakteristik kolagen dari kulit dan sisik jenis ikan lainnya dengan metode ekstraksi enzimatis atau basa.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terim akasih  kepada mahasiswa: Tyas Junaidianto, Diah Probo Ningtyas, dan Mastori, atas perhatian dan bantuannya dalam menyiapkan bahan, peralatan, serta rekap data.

## DAFTAR PUSTAKA
Basmal, J., P. Agung, dan Y. Farida. 2007. Pengaruh Suhu Esterifikasi  terhadap  Kualitas  dan  Kuantitas  Kitosan Larut Air yang Dibuat dari Cangkang Rajungan. Jurnal Pasc apanen  dan  Biotek nologi  Kelautan  dan Perikanan. 2  (2): 99-106.
Basmal, J.,  Agung, P.,  dan Fawzya, Y.N. 2005. Pengaruh Konsentrasi  Asam  Monok loroasetat  terhadap Karboksimetil. J urnal  Penelitian  Perikanan Indonesia .  11(8):  47-55.
Billmeyer,  F.W.  1962.  Textbook  of  Polymer  Science. Interscience  Publisher,  New  York.
Chvapil, M. 1979. Industrial  Uses of Collagen. In: D.A.D. Parry  and  L.K.  Creamer  (Eds.)  Fibrous  Protein: Scientific,  Industrial,  and  Medical  Aspects.  Academic Press,  New York.  pp.  247-267.
Glicksman, M. 1969. Gum Technology in Food  Industry .
Academic  Press.  New  York.
Jongjareonrak,  A.,  S.  Benjakul,  W.  Visessanguan,  T.
Nagai,  and  M.  Tanak a.  2004.  Isolation  and Characterisation  of  Acid  and  Pepsin-Solubilised Collagens  from  the  Skin  of  Browns-tripe  Red Snapper  (Lutjanus  vitta). Food  Chemistry.
Junaidianto, T. 2009. Isolasi dan Karakterisasi Kolagen dari Kulit Ikan Kerapu Macan . Skripsi. Program Studi Teknologi  Hasil  Perikanan,  Jurusan  Ilmu  Perikanan,
Fakultas  Pertanian  Universitas  Gadjah  Mada, Yogyakarta. pp.  18-21.
Kimura, S., Miyauchi, Y., dan Uchida, N. 1991. Scale and BoneType  I  Collagens  of  Carp  (Cyprinus  carpio). Comparative Biochemistry and Physiology . 99B: 473- 476.
Morimura,  S.,  Nagata,  H.,  Uemura,  Y.,  Fahmi,  A.,
Shigematsu, T.,  and  Kida,  K.  2002.  Development  of an  Effective  Process  for  Utilization  of  Collagen  from Livestock and Fish Waste. Process Biochemistry. 37: 403-142.
Muyonga,  J.H.,  Cole,  C.G.B.,  and  Duodu,  K.G.  2004. Characterisation of Acid Soluble  Collagen from Skins of Young and adult Nile Perch ( Lates niloticus ). Food Chemistry. 85:  81-89.
Nagai,  T.,    Yamashita,  E.,  Taniguchi,  K.,  Kanamori,  N., and  Suzuki,  N.  2001.  Isolation  and  Characterization of  Collagen  from  The  Outer  Skin  W aste  Material  of Cuttlefish  ( Sepia  lycidas ). Food  Chemistry. 72:  425- 429.
Nagai,  T.,    Izumi,  M.,  and  Ishii,  M.  2004.  Fish  Scale Collagen  Preparation  and  Partial  Characterization. International Journal of Food Science and Technology 39:  239-244.
Nomura,  Y.,  Sakai,  H.,  Ishii,  Y.,    dan  Shirai,  K.  1996. Preparation  and  Some Properties  of  Type  I Collagen from  Fish  Scales. Bioscience,  Biotechnology,  and Biochemistry. 60:  2092-2094.
Ogawa,  M.,    Portier,  R.  J.,    Moody,  M.W.,  Bell,  J., Sc hexnayder,  M.A.,  and  Losso,  J.N.  2004. Biochemical  Properties of Bone and  Scale  Collagens Isolated  from  The  Subtropical  Fish  Blac k  Drum ( Pogonia  c romis )  and  Sheepshead  Seabream ( Archosargus probatocephalus ). Food Chemistry . 88: 495-501.
Rehn,  M.,  Veikkola,  T.,  Kukk-Valdre,  E.,  Nakamura,  H., Ilmonen, M., Pihlajaniemi, T., Alitalo, K., and Vuori, K.. 2001.  Interaction  of  Endostatin  with  Integrins Implicated  in  Angiogenesis. Proceedings   of  the National Academy of Sciences of the USA. 98: 1024- 1029.
Sadowska,  M.,  Kolodziejska,  I.,  and  Niecikowska,  C. 2003.  Isolation  of  Collagen  from  the  Skins  of  Baltic Cod ( Gadus morhua ). Food Chemistry. 81:  257-262. Sahubawa,  L. 2008.    Fungsi  dan Peranan  Enzim  dalam Pengolahan  Produk  Perikanan  dalam Buku  Kimia dan  Biokimia  Hasil  Perikanan ,  Edisi  April  2008. Program  Studi  Teknologi  Hasil  Perikanan,  Jurusan Ilmu  Perikanan  Fakultas  Pertanian  UGM.
Sambrook, J. and Russel, D. W. 2001. Molecular Cloning:
A  Laboratory  Manual. CHSL  Press.  New  York. Sudarmadj i,  S.  1996. Te k nik   Analis a  Biok imiawi .
Penerbit  Liberty,  Yogyakarta.
Wang, L.,  An, X., Yang, F., Xin, Z., Zhao, L., and Hu, Q. 2008.  Isolation  and  Characterisation  of  Collagens from  Skin,  Scale  and  Bone  of  Deep-sea  Redfish ( Sebastes mentella ). Food Chemistry. 108: 616-623. Yamaguchi, K. 2002. Bovine Spongiform Encephalopathy and  People .  Iwanami  Press,  Tokyo.