## Prediksi Farmakokinetik, Toksisitas, dan Aktivitas Enzim Protease HIV-1 Inhibitor dari Daun J. gendarussa

## Agustinus Widodo *

## Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Tadulako Palu
Justicia  gendarussa Burm.f.  (Acanthaceae)  telah  diketahui  memiliki  aktivitas  anti-HIV.  Penelitian  ini  dilakukan untuk mengetahui interaksi flavonoid (gendarusin A, B, C, D, dan E)  dari daun J. gendarussa terhadap reseptor protease  HIV-1.  Diharapkan  penelitian  ini  akan  memberikan  informasi  ilmiah  tentang  pengembangan  daun J. gendarussa sebagai  obat  anti-HIV.  Penelitian  ini  menggunakan  metode  uji in  silico dengan  FAF-Drugs4  untuk memprediksi  ADMET  (absorbsi,  distribusi,  metabolisme,  dan  ekskresi-toksisitas),  dan  Molegro  Virtual  Docker (MVD) untuk memprediksi aktivitas lima senyawa gendarusin terhadap reseptor protease HIV-1 (PDB ID: 4HLA). Prediksi aktivitas ini diamati dari ikatan hidrogen, ikatan sterik, dan rerank score yang ditampilkan pada program MVD.  Senyawa  gendarusin  memiliki  bioavailabilitas  oral  yang  baik  dan  tidak  beracun,  dan  dari  uji docking molekul,  diprediksi  bahwa  gendarusin  daun J.  gendarussa dapat  menghambat  aktivitas  enzim  protease  HIV-1. Gendarusin dari J. gendarussa berpotensi sebagai anti-HIV. Kata kunci: Justicia gendarussa Burm.f., protease HIV-1, in silico

## Prediction of Pharmacokinetics Toxicity and Protease HIV-1

## Inhibitor Activity of J. gendarussa Leaves
Justicia gendarussa Burm.f. (Acanthaceae) has been known to have anti-HIV activity. This study was conducted to determine the interaction of flavonoids (gendarusin A, B, C, D, and E) on the J. gendarussa leaves against HIV-1 protease  receptor.  It  is  expected  that  this  research  will  provide  scientific  information  on  the  development  of J. gendarussa leaves as an anti-HIV drug. This study used in silico testing methods with FAF-Drugs4 to predict the ADMET (absorption, distribution, metabolism, and excretion–toxicity), and Molegro Virtual Docker (MVD) to predict the activity of five gendarusin compounds to the receptor of HIV-1 protease (PDB ID: 4HLA). The activity prediction was reflected by hydrogen bond and steric bond visible in MVD program with amino acid residue of the receptor of HIV-1 protease .  Gendarusin  compounds  had  good  oral  bioavailability  and  were  not  toxic,  and  from  molecular docking  test,  it  was  found  that  gendarusin  of J.  gendarussa leaves  could  inhibit  the  activity  of  HIV protease enzyme. Gendarusin of J. gendarussa has potential as an anti-HIV. Keywords: Justicia gendarussa Burm.f., protease HIV-1, in silico
*Corresponding  author:  Jurusan  Farmasi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam  Universitas Tadulako, Jl. Soekarno Hatta KM.9 Palu, e-mail: aureliasesy1@gmail.com

## PENDAHULUAN
HIV  merupakan  salah  satu  retrovirus  yang menyerang sistem kekebalan tubuh manusia. HIV merusak  sistem  kekebalan  tubuh  dengan menghancurkan jenis sel darah putih yang disebut sel  limfosit  T  yang  pada  permukaannya  terdapat reseptor cluster of differentiation 4 (CD4) . Ketika jumlah sel limfosit T-CD4 rendah maka seseorang lebih rentan terhadap infeksi tertentu (Pattman et al. ,  2005).  Sistem  kekebalan  tubuh  akan  rusak secara  perlahan  seiring  bertambahnya  jumlah virus ( viral load ) dalam tubuh (Naif, 2013). Tahap akhir  dari  infeksi  HIV  adalah  AIDS,  yaitu  ketika CD4  turun  ke  tingkat  yang  sangat  rendah (biasanya  <200  sel/mm 3 ),  sehingga  kemampuan untuk  melawan  infeksi  tertentu  secara  serius terganggu (Pattman et al. , 2005).
Salah satu pendekatan untuk pengembangan  obat  anti-HIV  dapat  dilakukan melalui  program  penelitian  obat  tradisional  baik flora  maupun  fauna.  Penelitian  obat  tradisional diarahkan  untuk  mencari  bukti  ilmiah  tentang obat  tradisional  tersebut.  Saat  ini  salah  satu tanaman yang sedang dikembangkan sebagai anti- HIV  adalah Justicia  gendarussa Burm.f. (Acanthaceae).  Daun J.  gendarussa mengandung amina  aromatis  tersubstitusi  (Chakravarty et  al ., 1982), glikosida flavonoid yaitu gendarusin A dan B  (Prajogo et  al .,  2009),  dan  alkaloid justidrusamida A, B, C dan D (Kiren et al ., 2014). Komponen  utama  dalam  ekstrak  etanol  70% adalah  glikosida  flavonoid  apigenin  yang  disebut Gendarusin  A  (Prajogo et  al .,  2010).  Senyawa flavonoid  diketahui  berperan  sebagai  sumber alami  anti-HIV  untuk  terapi  penderita  (Veljkovic et al., 2007; Ko et al ., 2009).
Hasil  uji  secara in  vitro menggunakan ekstrak  etanol  70%,  ekstrak  etanol  70% terfraksinasi, dan ekstrak air daun J. gendarussa menunjukkan  aktivitas  menghambat  enzim reverse transcriptase HIV (Woradulayapinij et al ., 2005; Prajogo et al ., 2014). Penelitian terbaru uji ekstrak  daun J.  gendarussa pada  kultur  sel MOLT-4 yang terinfeksi HIV, hasilnya menunjukkan  bahwa  daun J.  gendarussa dapat menghambat  replikasi  HIV  melalui  penurunan jumlah  p24  dan  penghambatan  pembentukan syncytia (Widiyanti et al. , 2015).
Pada  penelitian  ini  dilakukan  uji in  silico untuk memprediksi ADMET (absorbsi, distribusi, metabolisme,  ekskresi,  dan  toksisitas)  senyawa gendarusin,  dan  uji in  silico aktivitas  anti- HIVsenyawa  gendarusin  daun J.  gendarussa melalui mekanisme penghambatan enzim protease HIV. Penelitian menggunakan metode in silico dipilih  karena  metode  ini  sering  digunakan dalam  penemuan  dan  pengembangan  suatu  obat, metode ini dapat memberikan penghematan  baik dari  segi  biaya  maupun  waktu  (Markus et  al ., 2003; Yanuar et al ., 2011).

## METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Software: ChemBio Draw Ultra 12.0 untuk menggambar  struktur  2  Dimensi  (2D)  dan  3 Dimensi  (3D)  ligan,  FAF-Drugs4  online  untuk prediksi  ADMET,  dan  Molegro  Virtual  Docker versi  5  untuk  analisis docking Hardware: Komputer Windows 10 Pro, Intel(R) Core(TM) i3- 3110M  CPU  @  2.40GHz,  RAM  2,00  GB,  64-bit Operating  System,  x-64based  procesor.  Struktur 2D dan 3D dari senyawa gendarusin daun Justicia gendarussa Burm.f. Reseptor Protease (PDB ID : 4HLA)  yang  diperoleh  dari  Protein  Data  Bank ( http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId =4hla ).

## Preparasi Struktur Protein
Kristal  protein  dengan  reseptor  protease (PDB  ID  :  4HLA)  ditambahkan  atom  H  dan diperbaiki apabila ada kesalahan/kekurangan dari asam  amino  yang  ada.  Hal  ini  dilakukan  secara otomatis oleh program Molegro Virtual Docker.

## Preparasi Ligan
Menggambar  struktur  2D  dari  struktur gendarusin  A,  gendarusin  B,  gendarusin  C, gendarusin  D  dan  gendarusin  E  pada  program ChemBioDraw Ultra 12.0. Masing-masing struktur  di  atas  kemudian  dijadikan  struktur  3D dengan menggunakan program ChemBio3D Ultra 12.0,  program  ini  dapat  untuk  melihat  bentuk sterokimia  senyawa  dan  mengatur  bentuk  yang paling  stabil  dari  senyawa  dengan  cara meminimalkan energi, kemudian disimpan dalam bentuk  file  SYBYL.mol2,  dan  digunakan  untuk proses docking .

## Prediksi ADMET Ligan
Prediksi  ADMET  senyawa  gendarusin menggunakan  program  FAF-Drugs4 online ( http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin /portal.py?form=FAF-Drugs4#forms::FAF  -Drug s4 ),  program  ini  dapat  memprediksi  absorbsi, distribusi,  metabolisme,  ekskresi,  dan  toksisitas berdasarkan  berat  molekul,  logP,  tPSA,  atau ikatan rotasi.

## Prediksi  Aktivitas  dengan  Docking  dan Analisis Asam Amino
Docking menggunakan  program  Molegro Virtual  Docker,  dan  asam  amino  yang  terlibat pada proses interaksi obat reseptor dibandingkan antara  masing–masing  senyawa,  demikian  pula dengan  nilai docking  score .  Senyawa  dengan energi yang paling rendah menunjukkan interaksi obat-reseptor  yang  paling  stabil,  dan  diprediksi mempunyai  aktivitas  biologis  yang  paling  tinggi diantara  senyawa-senyawa  tersebut  (Siswandono, 2011).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Preparasi Ligan
Hasil  pembuatan  struktur  2D  dengan menggunakan  program  ChemBioDraw  Ultra  12.0 ditunjukkan  pada  Gambar  1.  Struktur  2D
kemudian digunakan untuk membuat struktur 3D dengan menggunakan program ChemBio3D Ultra 12.0.  Struktur  3  D  selanjutnya  digunakan  pada semua tahapan docking .
Gendarusin A Gendarusin B Gendarusin C Gendarusin D

## Gendarusin E
GAMBAR  1. Struktur  2  Dimensi  Senyawa Gendarusin.

## Prediksi ADMET Ligan
Skrining  senyawa  gendarusin  (A,  B,  C,  D, dan  E)  dan  Darunavir  ditentukan  dengan menggunakan program FAF-Drugs4 dan hasilnya ditunjukkan  pada  Tabel  1.  Lima  senyawa gendarusin menunjukkan hasil yang sama, karena pebedaan  posisi  gugus  gula  yang  terikat  pada atom  C6  dan  C8  tidak  mempengaruhi sifat  kimia fisika senyawa secara in silico. Hasil  prediksi  ADME  menunjukkan  lima senyawa gendarusin memiliki bioavailabilitas oral yang baik. Bioavailibilitas oral yang tinggi menjadi pertimbangan  penting  dalam  mengembangkan molekul  bioaktif.  skrining  bioavailibilitas  oral suatu senyawa dilakukan berdasarkan dua aturan yaitu Veber’s rule (Veber et a l., 2002) dan Egan’s rule (Egan et al ., 2000). Berdasarkan Veber’s rule suatu  senyawa  dapat  dikatakan  memiliki bioavailibilias  oral  yang  baik  jika:  ikatan  rotasi  ≤ 10; tPSA (topological polar surface area) ≤ 140 Å; dan donor HB dan akseptor HB ≤ 12. Sedangkan Egan’s  rule  menyatakan,  bahwa  senyawa  yang memiliki  bioavailibilitas  oral  yang  baik  jika:  0  ≥ tPSA ≤ 132 Å dan  Nilai log P ≤ 5.
Profil  keamanan  dari  senyawa  gendarusin ditentukan  dengan  program  FAF-Drugs4  dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar 2. Berdasarkan Pfizer  3/75  Rule  Positioning , senyawa  yang  berada  di  kotak  merah  cenderung menyebabkan  toksisitas,  sedangkan  senyawa gendarusin  berada  pada  kotak  hijau  yang  artinya tidak toksik .
TABEL  1. Hasil  Skrining  Ligan  Menggunakan
FAF-Drugs4. Senyawa Gendarusin Darunavir BM 534.47 547,66 logP -2.12 2.94 tPSA 233.57 148.80 Ikatan rotasi 3 11 Donor HB 9 4 Akseptor HB 13 10 BA Oral Veber Baik Rendah Egan Baik Baik Keterangan : BM: Bobot Molekul; logP: indeks lipofislisitas/hidrofobisitas;  tPSA: topological  polar  surface area ; HB: hydrogen bond ; BA oral : bioavalabilitas oral
GAMBAR  2. Profil  Keamanan  Gendarusin  ( ● ) Berdasarkan Pfizer 3/75 Rule Positioning.

## Prediksi  Aktivitas  dengan  Docking  dan Analisis Asam Amino
Reseptor Protease yang telah di unduh pada situs  Protein  Data  Bank  dengan  kode  4HLA,  dan telah  di import pada  program  Molegro  Virtual Docker ditunjukkan pada Gambar 3.
GAMBAR 3. Reseptor Protease (PDB ID : 4HLA)
Hasil  deteksi  tempat  berinteraksi  antara ligan dan reseptor ( cavity ) pada reseptor Protease (4HLA)  ditunjukkan  dengan  Gambar  4. Cavity yang digunakan adalah pada volume 92.16 dengan luas  permukaan  323.84. Cavity )  ini  digunakan karena  memiliki  area  dimana  ligan  asal berinteraksi dengan enzim protease.
GAMBAR 4. Cavity [Volume=92.16].
Pada  interaksi  antara  ligan  dan  reseptor terdapat  interaksi  ligan  dengan  beberapa  asam amino  residu  dari  reseptor  Protease  (4HLA). Asam-asam  amino  yang  terlibat  pada  proses interaksi  senyawa  gendarusin  dengan  reseptor Protease  (4HLA)  dapat  dilihat  pada  Tabel  2  dan Tabel 3. Interaksi dari residu asam amino reseptor Protease  dengan  senyawa  terjadi  melalui  ikatan hidrogen maupun ikatan sterik, dari tabel tersebut dapat  dilihat  perbedaan  interaksi  antara  masing- masing  senyawa  gendarusin  dengan  reseptor Protease  (4HLA),  hal  tersebut  karena  ada perbedaan  konfigurasi  ruang  dari  struktur senyawa-senyawa gendarusin.
TABEL  2. Interaksi  Ikatan  Hidrogen Reseptor  Protease  HIV-1  (4HLA)  dengan Senyawa Gendarusin.
Asam Amino Da GA  GB  GC  GD  GE Asp29 + + - - + - Asp30 + + + + + + Gly51 - + - + - - Gly27 - - + + - - Thr80 - - + - - - Asp25 - - - + - - Ile50 - - - + - + Gly48 - - - - + + Gly49 - - - - + - Gly52 - - - - + -
Hasil skor doking dari senyawa gendarusin dengan  reseptor  Protease  (4HLA)  (Tabel  4), terlihat  bahwa  urutan  nilai rerank  score dari senyawa  gendarusin  dari  rendah  ke  tinggi  adalah gendarusin  B  >  gendarusin  D  >  gendarusin  C    > gendarusin  E  >  gendarusin  A. Rerank  score merupakan  nilai  yang  mencerminkan  energi ikatan yang dibutuhkan untuk membentuk ikatan antara  ligan  dan  reseptor,  sehingga  dari  nilai tersebut  dapat  diprediksi  aktivitas  dari  suatu
senyawa. Semakin rendah nilai rerank score maka ikatan  antara  ligan  dan  reseptor  juga  akan semakin  stabil  sehingga  aktivitasnya  juga  dapat dikatakan  semakin  tinggi  dibandingkan  dengan senyawa yang mempunyai nilai rerank score lebih tinggi.  Hasil  simulasi  doking  diatas  dapat diprediksi bahwa gendarusin B memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan gendarusin lainnya.
TABEL  3. Interaksi  Ikatan  Sterik  Reseptor Protease  HIV-1  (4HLA)  dengan  Senyawa
Gendarusin Asam Amino Da  GA  GB  GC  GD  GE Asp29 + + + + + - Asp30 + + + + + + Gly51 - + - + - - Gly27 - - + + + + Thr80 + - + - - - Asp25 - + - + - - Ile50 - + - + + +
Gly48 + + + + + +
Gly49 + + - - + + Gly52 - - - - + - Val82 + - - - - - Ile54 + + + - + - Phe53 - + - - + - Ile47 - - + - + + Pro81 - - - + - - Keterangan :
Da  :  Darunavir;  GA  :  Gendarusin  A;  GB : Gendarusin  B;  GC  : Gendarusin C; GD : Gendarusin D; GE : Gendarusin E.
TABEL  4. Nilai rerank  score Darunavir dan Gendarusin
Senyawa Rerank Score Darunavir -86.6954 Gendarusin A -90.4079 Gendarusin B -102.706 Gendarusin C -96.1779 Gendarusin D -96.585 Gendarusin E -96.0895

## KESIMPULAN
Hasil  studi in  silico didapatkan  bahwa gendarusin  A,  B,  C,  D,  dan  E  memiliki  aktivitas sebagai Protease inhibitor HIV-1, dengan aktivitas paling  tinggi  adalah  gendarusin  B.  Senyawa gendarusin  juga  memiliki  bioavailabilitas  oral yang  baik  dan  tidak  toksik,  sehingga  berpotensi dikembangkan sebagai anti-HIV.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  penulis  sampaikan kepada  Prof.  Dr.  Siswandono,  Apt.,MS.  dari Fakultas  Farmasi  Universitas  Airlangga  yang mempunyai lisensi software Molegro.

## DAFTAR PUSTAKA
Chakravarty,  AK.,  Dastiar,  PPG.,  and  Pakrashi,  SC.  1982. Simple  Aromatic  Amines  from  Justicia  gendarussa 13 C  NMR Spectra  of  the  Bases  and  Their  Analogues. Tetrahedron , 18(12): 1797-1802.
Egan W.J, Merz K.M. Jr., and Baldwin J.J. 2000. Prediction of Drug  Absorption  Using  Multivariate  Statistics. J.  Med.  Chem , 43: 3867-3877.
Kiren, Y., Deguchi, J., Hirasawa, Y., Morita, H., and Prajogo, B. 2014.  Justodrusamides  A-D,  new  2-aminobenzyl  Alcohol Derivatives  from Justicia  gendarussa . Journal  of  Natural Medicines .
Ko, Y-J., Oh, H-J., Ahn, H-M., Kang, H-J., Kim, J-H., and Ko, YH.  2009.  Flavonoids  as  Potential  Inhiibitors  of  Retroviral Enzymes. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem , 52(4): 321-326.
Markus  H.J.  Seifert,  Kristina  Wolf,  and  Daniel  Vitt,  2003. Virtual high-throughput in silico screening. Biosilico , 1(4).
Pattman R., Snow M., Handy P., Sankar K. N., and Elawad B., 2005. Oxford Handbook of Genitourinary Medicine, HIV, and Aids , 1st Edition. Oxford University Press, pp. 346-359.
Prajogo,  B.  2014. Autentik  Tanaman  Justicia  gendarussa Burm.  f. Sebagai  Bahan  Baku  Obat  Kontrasepsi  Pria . Surabaya: Airlangga University Press dengan LP3 UNAIR.
Prajogo,  B.,  Guliet,  D.,  Queiroz,  F,  Wolfernder,  J-L.,  Cholies, N.,  Aucky,  H.,  and  Hostettmann,  K.  2009.  Isolation  of  Male Antifertility  Compound  in  n-Butanol  Fraction  of  Justicia
gendarussa  Burm.f.  Leaves. Folia  Medica  Indonesiana ,  45(1): 28-31.
Prajogo,  B.,  Widiyanti,  P.,  and  Riza,  H.  2014.  Effect  of Ethanolic  Extract  of  Justicia  gendarussa  Burm  f.  Against Activity of Reverse Transcriptase HIV Enzyme In Vitro. Jurnal Bahan Alam Indonesia , 8(6): 384-388.
Veljkovic,  V.,  Mouscadet,  J-F.,  Veljkovic,  N.,  Glisic,  S.,  and Debyser,  Z.  2007.  Simple  Criterion  for  Selection  of  Flavonoid Compounds  With  Anti-HIV  Activity. Bioorganic  and Medicinal Chemistry Letters , 17: 1226-1232.
Widiyanti  P.,  Prajogo  B.,  and  Hikmawanti  N.P.E.  2015. Cytotoxicity  of  Justicia  gendarussa  Burm.f.  Leaf  Extracts  on MOLT-4  Cell. Indonesian  Journal  of  Tropical  and  Infectious Disease , 5(7): 188−192.
Siswandono,  2011.  Studi  pemodelan  molekul  interaksi beberapa turunan penisilin dengan reseptor DD- Transpeptidase  dari  streptomyces  R61  (1PWC), Majalah Farmasi Airlangga , 9(2).
Veber D.F., Johnson S.R., Cheng H.Y., Smith B.R., Ward K.W., and  Kopple  K.D.  2002.  Molecular  Properties  That  Influence the Oral Bioavailability of Drug Candidates. J. Med. Chem . 45: 2615-2623.
Yanuar A., Mun’im A.Lagho A.B.A.,  Syahdi R.R., Rahmat M., and Suhartanto H. 2011. Medicinal Plants Database and Three Dimensional  Structure  of  the  Chemical  Compounds  from Medicinal  Plants  in  Indonesia. International  Journal  of Computer Science Issues , 8(5).