Pengaruh Ekstrak Daun Polyscia Obtusa Dan Elephantopin Scaber.L  Terhadap  Sel B220 + Dan TER 119 + Mencit Balb/C Bunting yang Diinfeksi Bakteri Salmonella thypimurium
Ainun Fadhilah 1) , Moh Sasmito Djati M.S 1)
1) Laboratorium Fisiologi Hewan, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Jl. Veteran 65145 Malang.
E-mail: fadhilah.4inun@gmail.com

## ABSTRAK
Percobaan ini bertujuan mengetahui pengaruh  ekstrak  daun  Elephantopus scaber,L dan Polyscias  obtusa    terhadap    sel  B220 + dan  TER  119 + mencit  (Mus  musculus)  bunting.    Mencit (Mus  musculus)  dikelompokkan  menjadi    kontrol  K1  :  mencit  diberikan  injeksi  Salmonella tanpa  diberi  hasil  ekstraksi.  Sedangkan  perlakuan  terbagi  menjadi  2  berdasarkan perbandingan ekstrak daun PI : Polyscias obtusa (PO) : Elephantopus scaber (ES)   0%:100% dan PII : Polyscias obtusa (PO) : Elephantopus scaber (ES) 50%:50%.  Setelah aklimasi selama 7  hari,  mencit  dikawinkan  dengan  metode  monogami,  dan  umur  7  hari  kebuntingan  diinjeksi Salmonella  thyphimurium  secara  intraperitoneal.    Pembedahan  dilakukan  2x  yaitu  hari  ke  14 dan  18.  Mekanisme  pembedahan  didislokasi  leher,  dibedah  dan  diisolasi  organ  bone  marrow untuk  dianalisa  sel  B220  danTER  119.  Selanjutnya  dilakukan  analisa  flowcytometri,  dan analisa  statistika  menggunakan  One  way  ANOVA.  Hasil  percobaan  yang  dilakukan menunjukaan  bahwa    perlakuan  I    dan  Perlakuan  II      terhadap  sel  B220 + bila  dibandingkan dengan kontrol tidak menunjukkan adanya perbedaan yang  nyata, ekspresi Sel B220 + tertinggi terlihat  pada  perlakuan  II  hari  ke  18.  Ekspresi  sel  TER119  untuk  perlakuan  I  dan  II  tidak menunjukkan perbedaan yang nyata bila dibandingkan dengan kontrol, hasil tertinggi dimiliki oleh kontrol hari ke 14.
Kata kunci:  B220 + , Elephantopus scaber  L , Polyscias obtusa , Salmonella ,TER 119 +

## ABSTRACT
This study aims to determine the effect of Polyscias obtusa and Elephantopus scaber L leaf extract for  lymphocyte  development  and  hematopoesis.  Mice  (Mus  musculus)  are  grouped  into    control  and treatment    KI:  mice  given  injection  of  Salmonella  without    extract.  The  treatment  is  divided  into  two there  are  PI  :  Polyscias  obtusa    (PO)  :    Elephantopin  scaber  (ES)  50%:  50%  and  PII  :  Polyscias  obtusa (PO)  :    Elephantopin  scaber  (ES)  0%:  100%.    Mice  has  acclimation  for  7  days,  after  that    mice  ere inbreading  whit  monogamy  metod.  When  pregnancy  has  7  days  has  injected  intraperitoneally  with Salmonella  thyphimurium.  Doing  sugery  2  sesion  after  14    and  18  days.  Sugery  mechanism  whit dislocation  on  neck    and  isolated    bone  marrow  organs  for  analysis  of  cells  B220 + and  TER  119 + . Flowcytometri  analysis,  and  statistic  analysis  using  one  way  ANOVA.  The  results  of  experiments  that treatment I (PI) and Treatment II (PII)  of the cells B220 + when compared with the controls showed  no significant  differences.  Expression  of  cell  B220 + higher  was  seen  in  the  treatment  of  the  second  day  18. Expressions  cells  TER119  for  treatments  I  and  II  did  not  show  significant  differences  when  compared with the control, the highest yield is owned by the control day 14 .
Key words: B220, Elephantopus scaber, L, Polyscias obtusa, Salmonella thyphimurium, TER 119

## PENDAHULUAN
Tanaman  obat  yang  dimiliki  Indonesia    yang memiliki  peran  penting  salah  satunya  tapak  liman (Elephantopus  scaber,  L)  dan  kedondong  laut (Polyscias  obtusa).    Secara  umum    kedua  tanaman tersebut diantaranya mengandung lupeol, stigmasterol  ,flavonoida,  steroida  dan  triterpenoida, saponin  serta  tanin.  Ekstrak  daun  Tapak  liman (Elephantopus scaber, L) telah terbukti meningkatkan  poliferasi  dan  diferensiasi  eritrosit, sehingga ekspresi TER-119  meningkat (Singh et al., 2005).  Sedangkan  ekstrak  daun    Polyscias  obtusa mengandung  senyawa  flavonoida  yang  dipercaya mampu mampu memodulasi sistem imunitas spesifik, dan  meningkatkan    kinerja  IL-2  dan  selanjutnya memodulasi poliferasi limfosit Sel B220 + .
Sebagai    negara  tropis  selain  keberagaman jenis  tanaman  obat,  juga  memiliki  keberagaman mikroorganisme  patogen  salah  satunya    Salmonella thyphimurium.  Salmonella  thyphimurium  merupakan bakteri  pathogen  gram  negatif  yang  memiliki kemampuan  transmisi,  perlekatan  pada  sel  inang, invasi  sel  dan  jaringan  inang,  dan  kemampuan menghindari sistem imun inang (Beswandjarum,2011).
Saat  bunting  hewan  mengalami  perubahan sistem  imun,  karena  terjadi  implantasi  embrio. Kebuntingan  adalah  suatu  keadaan  dimana  janin dikandung  di  dalam  tubuh  betina  diawali  dengan proses  pembuahan  dan  kemudian  akan  diakhiri dengan  proses  persalinan.  Bunting  merupakan  suatu keadaan  fisiologis,  akan  tetapi  pentingnya  diagnosis bunting  tidak  dapat  diabaikan  (Cunningham,  2006). Pentingnya  sistem  ketahanan  tubuh  ketika  kondisi hewan dalam kondisi bunting maka dari itu diberikan ekstrak  tapak  liman  (Elephantopus  scaber,  L)  dan kedondong laut (Polyscias obtusa), untuk mengetahui adanya  pengaruh  pemberian  ekstrak  perlu  diamati pada sel B220 + dan TER 119

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan tempat
Percobaan ini dilaksanakan pada bulan Januari 2014  sampai  Juni  2014  di  Laboratorium  Fisiologi Hewan,  dan  Laboratorium  Mikrobiologi,  Jurusan Biologi  Fakultas  MIPA  Universitas  Brawijaya Malang.
Desain penelitian Kelompok perlakuan dibagi menjadi  4 kelompok  yang  dibedakan  antara  kontrol  dan perlakuan, dengan 2 kali pebedahan didasarkan  lama pemberian  ekstrak  daun  dengan  masing  masing ulangan sebanyak 3 ekor.
Percobaan ini memiliki alur metode sebagai berikut :

## 1. Uji Konfirmasi
Isolat S. typhimurium dikonfirmasi dengan:

## A. Uji media BSA
Isolat  murni  diambil  ose  dan  dilakukan  streak plate  pada  media  BSA,    diinkubasi  pada  suhu  370C selama  24  jam.  Isolat  S.  typhimurium  membentuk koloni berwarna hitam.

## B.   Uji katalase
Isolat  murni  dengan  media  NA  diambil  satu ose secara aseptis ke gelas objek yang telah ditetesi hidrogen peroksida H2O2. Isolat positif akan menghasilkan gelembung gas.

## C.   Uji cat gram
Isolat  diletakkan  pada  gelas  objek,  kemudian ditetesi cat Gram A, B, C, dan D secara berurut turut, masing masing selama 2 menit, 1 menit, 30 detik, dan 30  detik.  Preparat  dicuci  dengan  air  mengalir  setiap akan diberi pewarna yang berbeda untuk menghilangkan  warna  sebelumnya.  Preparat  diamati menggunakan  mikroskop.  S.  typhimurium  berwarna merah karena tergolong bakteri Gram negatif.

## D.   Uji KIA dan LIA
Koloni positif dari uji media BSA diambil satu enten,  ditusukkan  ke  media  KIA  dan  LIA  secara vertikal disepanjang media dan diinkubasi pada suhu 370C  selama  24  jam.  Koloni  S.  typhimurium  akan membentuk garis berwarna hitam.

## E.   Uji patogenitas
Satu  ose  isolat  S.  typhimurium    dilakukan streak plate  pada media blood agar. Diinkubasi pada 37 0 C selama 24 jam. Koloni yang terbentuk berwarna bening menandakan bakteri tersebut dapat menginfeksi organisme lain.

## 2. Pembuatan Kurva Standar
S.  typhimurium  ditumbuhkan  pada  media  NB selama  24  jam.  Biakan  murni  ditambahkan  dengan media  NB  steril  dengan  perbandingan    konsentrasi 0%,  12,5%,  25%,  37,5%,  50%,  62,5%,  75%,  87,5% dan  100%  sebanyak  4  ml.  Masing  masing  suspensi tersebut dihitung absorbansinya berdasarkan
Kelo mpok Perla kuan Bun ting Konsentrasi Ekstrak Infe ksi Pembedah an    hari &jumlah ulangan E. Scabe r P.o btus a Ke -14 Ke- 18 K1 √ − − − 3 3 P1 √ 50 0 √ 3 3 P2 √ 25 25 √ 3 3
spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  600nm. Larutan  blanko  berupa  NB  steril.  Masing  masing suspensi  bakteri  tersebut  dihitung  jumlah  selnya menggunakan haemocytometer.

## 3. Pap smear dan vaginal plug
Mencit yang akan digunakan diamati tampilan morfologi  yaitu vagina berwarna merah dan terbuka. Metode  smear    dilakukan  dengan  cara  cotton  bud dibilas  dengan  aquades  dan  dimasukkan  kedalam vagina  mencit  betina  dengan  sudut  ±45º  dan  diputar sebanyak  2-3  putaran  dan    dibuat  preparat  apusan. Preparat  apusan  dimasukkan  dalam  larutan  alkohol fiksatif  70%  selama  5  menit  kemudian  diangkat  dan dikeringanginkan.  Preparat  diamati  morfologi  sel epitel  dengan  menggunakan  mikroskop  perbesaran 400x.  Mencit  yang  sedang  mengalami  fase  estrus kemudian dikumpulkan dengan pejantan dan dibiarkan  hingga  12  jam.  Pengamatan  vaginal  plug dilakukan  keesokan  paginya  ±05:30  WIB.  Mencit yang  terdapat  vaginal  plug  dihitung  sebagai  hari kebuntingan ke-0.
4.  Pembuatan  dan  pemberian  ekstak  daun  E.

## scaber dan P. obtusa
Masing  masing  daun  E.  scaber  dan  P.  obtusa dicuci  dan  dikering  anginkan  selama  2  hari.  Daun yang  telah  kering  diblender  secara  terpisah  sampai halus.  Masing  masing  daun  ditimbang  500  g  untuk dilarutkan  dalam  etanol  5  L  dalam  wadah  yang berbeda dan didiamkan selama 24 jam untuk diambil supernatan.  Supernatan  ini  selanjutnya  dimasukkan dalam  destilator  pada  suhu  780C  hingga  pelarut etanol  menguap  dan  tersisa  endapan  seperti  pasta. Pemberian ekstrak daun E. scaber dan P. obtusa dilakukan  dengan  cara  disonde  setiap  hari  sejak  hari ke-0 kebuntingan.

## 5. Infeksi S. Typhimurium
Bakteri  S.  typhimurium  dalam  agar  slant dicuplik  dengan  menggunakan  ose  dan  dimasukkan dalam  media  NB  10  ml.  Biakan  selanjutnya dimasukkan  ke  dalam  inkubator  pada  suhu  370C selama  24  jam.  Biakan  aktif  tersebut  dituang  ke dalam  NB  steril  90  ml.  Biakan  yang  diperoleh kemudian diinjeksikan pada mencit dengan konsentrasi  107  sel/ml  sebanyak  0,5  ml  ketika  usia kebuntingan mencit 7 hari.

## 6. Isolasi Sel Limfosit
Bone marrow hasil isolasi di flusing menggunakan  spuit,  kemudian  sel  yg  telah  di dapatkan digerus dengan pangkal spuit dalam cawan berisi PBS dan disaring menggunakan wire. Suspensi sel  tersebut  dipindah  ke  dalam  tabung  propilen  dan disentrifugasi  2500  rpm  selama  5  menit  pada  suhu 4ºC.  Pelet  diresuspensi  dengan  1mL  PBS  untuk diambil 30 µ l kemudian dimasukkan dalam microtube
berisi  1ml  PBS  untuk  disentrifugasi  kembali  pada 1500  rpm  suhu  100C  selama  5  menit.  Pelet selanjutnya ditambah PBS berisi antibodi monoklonal FITC anti-B220 dan PE-anti TER 119  sebanyak 50 µ l dan  diinkubasi  selama  20-30  menit  sebelum dianalisis menggunakan flowcytometri.

## 7. Analisis Flowcytometri
Suspensi  sel  dipindahkan  ke  dalam  cuvet flowcytometer, ditambah 500 µ l PBS dan dihomogenkan.  Selain  itu  dilakukan  koneksi  antara komputer dan flowcytometer yang telah berada pada keadaan aquiring . Setelah semua instrum siap, cuvet dipasang  pada  nozzle  BD  Bioscience  FACS  Calibur TM flowcytometry. Data dari flowcytometer selanjutnya  diolah  dengan  software  BD  CellQuest ProTM dan ditampilkan dalam bentuk histogram.

## 8. Analisis Data
Jumlah  relatif  sel  T  CD8+  dan  CD8+CD62L dianalisis  menggunakan  program  SPSS.  Dilakukan transformasi  data  dikarenakan  data  yang  diperoleh memiliki  nilai  pada  kisaran  angka  0-20%.  Desain penelitian  menggunakan  rancangan  acak  lengkap analisis one way anova dengan  selang  kepercayaan  >95%.  Apabila  terdapat perbedaan nyata pada masing-masing perlakuan,  dilanjutkan  dengan  uji  Turkey  atau Games-Howell

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Profil jumlah relatif sel B220 + dan TER 119 + kelompok K1, P1 dan P2 sebagai berikut : Gambar 1. Profil Jumlah relatif Sel B220 + dan TER 119 + sebagai berikut :
Gambar 1. Ekspresi sel B220 + dan TER 119 +
Presentase  sel  B220 + tertinggi  terlihat  pada perlakuan  II  (PII)  dimana  eksrtrak  yang  digunakan adalah 50% Elephantopus scaber dan 50% Polyscias obtusa.  Presentase  tertinggi  TER  119  dari  hasil analisa  flowcytometri  juga  terdapat  pada  perlakuan
II(PII)  dengan  nilai  24,71%.  Analisa  flowcytometri menggunakan  prinsip  menyebarkan  cahaya,  eksitasi cahaya,  dan  emisi  molekul  flowresence  untuk menghasilkan  data  dengan  parameter  tertentu  dari prtikel  dan  sel  –  sel  dalam  rentang  0.5-4.0µm. Sumber  cahaya  yang  digunakan  adalah  sinar  laser (Ormerod,2000).
1. Ekspresi Sel B220 +
Bone marrow merupakan organ limfoid primer yang merupakan tempat diproduksinya sel imonokompeten,  dan  merupakan  tempat  pematangan sel  B220 + .  Percobaan  yang  telah  dilakukan menunjukkan  adanya  ekspresi  Sel  B220 + yang  di isolasi dari organ Bone marrow , hasil tersebut adalah sebagai berikut :
Gambar 2. Jumlah rata – rata Relatif sel B220 +
(p>0.05) pada masing – masing  kelompok perlakuan
Hasil  analisa  menggunakan  one  way  anova menunjukkan  bahwa  pemberian  bahwa  pemberian ekstrak Elepanthopus scaber L dan Polyscias obtusa memberikan  peningkatan  terhadap  ekspresi  sel B220 + , namun tidak berbeda nyata apabila dibandingkan  dengan  kontrol.  Hal  ini  dimungkinkan karena  perlakuan  formulasi  ekstrak  Elepanthopus scaber  L  dan  Polyscias  obtusa  memiliki  sifat  yang bekerja  secara  antagonis  sehingga  hasil  yang ditunjukkan  kurang  optimal.  Peningkatan  jumlah  sel B220 + dimungkinkan  karena  adanya  flavonoid,  dan injeksi patogen berupa Salmonella thypimurium yang mampu merangsang poloferasi sel limfosit. Flavonoid  merupakan  senyawa  kimia  yang  memiliki kemampuan  untuk  meningkatkan  produksi  IL-2  dan meningkatkan  poliferasi  sel  limfosit.  Poliferasi  sel limfosit  dirangsang  oleh  adanya  antigen,  terutama diatur  oleh  pengaruh  IL-2,  terhadap  reseptor  IL-2 pada permukaan reseptornya. Selain itu poliferasi IL- 2  juga  merangsang  poliferasi  dan  diferensiasi  sel  B dan  NK  (Saifulhaq,  2009).  Flavonoid  memiliki  efek imunostimulan  dengan  memacu  produksi  IL-2  yang meningkatkan poliferasi sel limfosit (Midleton,2000).
Azizah  (2011)  menjelaskan  bahwa  konserntrasi flavonoid  yang  kurang  optimal  tidak  memberikan pengaruh  yang  optimal  pula  bagi  poliferasi  sel limfosit, hal ini yang terjadi pada hasil percobaan
2. Ekspresi Sel TER 119 +
Percobaan  yang  telah  dilakukan  pengaruh ekstrak Elepanthopus scaber L dan Polyscias obtusa terhadap ekspresi sel TER 119 adalah sebagai berikut :
Gambar   4. Ekspresi Sel TER 119 +
Hasil  dari  analisa  menunjukkan  bahwa ekspresi  sel  TER  119 + tertinggi  terlihat  pada perlakuan 2 (P2) dimana perbandingan antara ekstrak P.obtusa dan E.scaber sama. Namun hasil menunjukkan  bahwa  tidak  terdapat  perbedaan  yang signifikan apabila dibandingakn dengan kontrol. TER 119  merupakan  antigen  yang  akan  diekspresikan pada sel eritrosit.  Jangka hidup eritrosit normal pada mencit  adalah  42-56  hari,  dan  eritopoesis  terjadi selama  3  –  4  hari,  namun  beberapa  faktor  seperti anemia,  hipoksia  dan  inflamasi  dapat  mempercepat eritopoesis  dan  meningkatkan  pelepasan  eritrosit pada  perifer  (Roeffler,  dkk,  2008).  Penurunan ekspresi  sel  TER  119  pada  hasil  yang  tertera dimungkinkan  dikarenakan  adanya  injeksi  bakteri Salmonella  thypimurium.  Menurut  Sudoyo  (2006) Salmonella  typhimurium    baik  pada  saluran  cerna maupun  organ  lain,  akan  menyebabkan  reaksi inflamasi.
Injeksi Salmonella thypimurium mampu menyebabkan  efek  inflamasi  yang  berpengaruh terhadap  aktifitas  eritrosit.  Selama  terjadinya  proses oksidasi kerusakan pada eritrosit dapat menyebabkan lepasnya hemoglobin dari sitoplasma,serta terdapatnya  eritrosit  yang  memiliki  abnormalitas akan  segera  dihancurkan  oleh  makrofag  (Martine, 2002).

## KESIMPULAN
Pemberian  ekstrak  Elepanthopus  scaber  L dan  Polyscias  obtusa  dengan  perlakuan  1(P1) maupun  perlakuan  2  (P2)    terhadap    sel  B220 + dan
TER  119  tidak  memberikan    perbedaan  yang signifikan  terhadap  perlakuan  kontrol,  hal  ini dikarenakan  belum  diketahuinya  pemberian  dosis yang tepat antarakedua ekstrak.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Dr.Ir.  Sasmito  Djati  MS,  selaku  pembimbing muhaimin mbak nanik, pak harmaji, Roffico, Nida asfi,  Nurul Faiza  dan  smua  pihak  yang  telah  membantu  dalam penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Azizah N.F. 2011. Efek pemberian Tapak Liman terhadap hematopoesisi Mencit Model Anemia.Thesis.Universitas Brawijaya.Malang
[2]  Beswandjarum.http://www.  Beswandjarum.com/ article_download_pdf/  article_pdf_24.  Pdf. Diakses tanggal 24 Desember 2013.
[3] Bratawidjadja K.G.2010. Imunologi dasar Edisis
9.Balai Penerbit FKUI  Jakarta.
[4] Middleton E. C., Kandaswarni, dan Theoharides. 2000. The Effect of Plant Flavonoid on Mammalian Cells: Implications for Inflamation,
Heart Disease, and Cancer. Journal Pharmacol. 52(4):673-571
[5] Martine J.T. 2002. Heinz Body Anemia In Cats.Vetenary Clinical Pathology Clerkship
program. http://www.vet.uga.edu. Diakses tanggal 5Juli 2014
[6] Rifa’i M. 2011. Imunologi dan Bioregulator. UB press. Malang.
[7] Saifulhaq M. 2009. Pengaruh pemberian Ekstrak Buah Mahkuta Dewa Dosis Bertingkat terhadap polifrasi Limfosit Lien pada Mencit BALB/C.Biomedia (1)2.33
[8] Singh ,S.D.J .2005. Wound  healing    activity  of the   leaf     extracts          and Deoxyelephantopi        Isolate      From
Elephantopus       scaber     Lin Phytochemistry.37:238-242