## ISOLASI DAN IDENTIFIKASI POPULASI BAKTERI ICE NUCLEATION ACTIVE PADA JERUK KEPROK SOE DI DATARAN TINGGI MUTIS PROVINSI NUSA TENGGARA TIMUR
Hildegardis Missa 1) dan Anselmus Boy Baunsele 2)
1. Program Studi Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Katolik Widya Mandira
2. Program Studi Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan,  Universitas Katolik Widya Mandira
1,2 Jl. Ahmad Yani No. 50-52 Merdeka-Kupang kode pos 85225 E-mail: hildegardis.missa@yahoo.co.id 1) anselmusbaunsele@yahoo.co.id 2)

## ABSTRAK
Penelitian  tentang  bakteri  luka  beku  dari  daerah  tropis  belum  banyak  dipublikasikan.  Data-data  bakteri  INA  yang  diteliti pada  Jeruk  Keprok  Soe  di  dataran  tinggi    Mutis  ini  akan  memberikan  informasi  kebaruan  bakteri  INA  di  daerah  tropis. Penelitian  lanjut  mengenai  bakteri  INA  perlu  dilakukan,  mengingat  dampak  buruk  bagi  pertanian  akibat  luka  beku  yang disebabkan  karena  aktivitas ice  nucleation .  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  populasi  bakteri  INA, mengetahui  estimasi  populasi  bakteri  INA,  uji  aktivitas  ice  Nucleation  Active  dan  mengetahui  kelas  protein  INA. Pengambilan  sampel  tanaman  Jeruk  Keprok  Soe  menggunakan  metode purposive  sampling pada  tiga  ketinggian  yaitu 2000, 2100, dan 2200 m dpl. Isolasi bakteri dilakukan dengan metode spread plate pada media Kings’B, aktivitas nukleasi es ditentukan dengan  metode tube nucleation test . Estimasi populasi bakteri INA dilakukan dengan  metode multiple-tube nucleation test formula Thomas seri 3.3.3. Hasil penelitian menunjukan bahwa populasi bakteri INA yang ditemukan pada daun  jeruk  keprok  soe  di  dataran  tinggi  mutis  tergolong  tinggi  yaitu    6  x  10 3 /g  hingga  1,2  x  10 4 /g  daun.  hal  ini menunjukkan bahwa semakin tinggi tempat maka semakin tinggi populasi bakteri INA yang ditemukan. Berdasarkan suhu pembentukan es, terdapat dua isolat bakteri , yaitu 2 sampel mengalami pembekuan pada suhu  -7 o C dengan kelas protein INA B, sedangkan 6 sampel membeku pada suhu -10 o C dengan kelas protein INA C.
Kata Kunci: Isolasi, Identifikasi, Bakteri, Ice Nucleation, Jeruk Keprok
1. PENDAHULUAN
Bakteri merupakan mikroorganisme yang penyebarannya  sangat  luas  dan  bersifat ubiquitos ,  yaitu mampu  hidup  hampir  disemua  tempat  (Missa,  2016). Bakteri Ice  Nucleation  Active (INA)  merupakan  bakteri yang  ditemukan  pada  permukaan  daun  di  dataran  tinggi dengan  suhu  rendah  (Lindo et  al .,  2013).  Bakteri  INA yang  telah  ditemukan  antara  lain  : Pseudomonas syringae, Pseudomonas viridiflava, Pseudomonas
Fluorescens, Erwinia hericola, dan Xantomonas campestris (Edwards et  al .,2014), Pseudomonas  fragi dan Pseudomonas moraviensis yang  ditemukan  pada permukaan daun pistachio (Rostami et al . 2018). Bakteri INA  yang  ditemukan  ini  mampu  mengkatalisis pembekuan  es  pada  suhu  -1,5 o C  sampai  -10 o C,  bahkan pada suhu diatas 5 o C, dan dapat mengekspresikan protein nukleasi  es  dipermukaan  sel  sehingga  suhu  air  menurun dan akhirnya membeku (Stephani dan Waturangi, 2012). Spesies-spesies ini, dapat  menyebabkan luka beku ( forst injury )  di  permukaan  daun  disebakan  karena  terjadinya perubahan air yang terkandung didalam sel daun menjadi es (Gurian et al ., 2013).
Bakteri  INA  memiliki  peran  penting  dalam biopresipitasi,  dan  juga  dapat  dimanfaatkan  untuk membantu  hujan  dan  salju  dengan  cara  penyemaian
bakteri  INA  pada  awan  sebagai  pengganti  penaburan garam  yang  sekarang  telah  banyak  digunakan  untuk membuat hujan buatan (Wahyudi, 2015). Hasil penelitian Lindow et  al. (2012)  menunjukan  bahwa  bakteri  INA ditemukan  pada  daerah  bersuhu  rendah  dengan  suhu optimal  sekitar  18-24 o C.  Dataran  tinggi  gunung  mutis memiliki  ketinggian  2500  m  dpl  dan  merupakan  daerah terbasah  di  Pulau  Timor,  dengan  suhu  berkisar  antara 14 o C–29 o C, namun pada kondisi ektrim suhu dapat turun hingga  9 o C,  sehingga  memungkinkan  peluang  besar untuk  ditemukan  bakteri  INA  sebagai  bakteri  filosfer pembentukan Kristal es.
Jeruk  keprok  Soe merupakan  kelompok tanaman  yang  terdapat  di  dataran  tinggi  mutis  dengan kebutuhan  air  cukup  tinggi  tergantung  pada  curah  hujan dan kelembaban udarah disekitarnya. Melihat kebutuhan air  yang  cukup  tinggi,  dan  suhu  di  dataran  tinggi  mutis yang  rendah  diperkirakan  bakteri  INA  juga  dapat ditemukan  pada  tanaman  jeruk  keprok  Soe  oleh  karena itu  perlu  dilakukan  penelitian  tentang  isolasi  dan identifikasi  populasi  bakteri  INA  dari  tanaman  Jerik keprok  Soe  di  dataran  tinggi  Mutis,  mengingat  peran penting  bakteri  INA  sebagai  biopresipitasi  yang  bisa membentuk awan dan hujan serta masih sedikit informasi tentang bakteri INA didaerah tropis.

## 2. RUANG LINGKUP
Dalam penelitian ini permasalahan mencakup:
1. Estimasi Populasi Bakteri Ice nucleation Active pada daun jeruk keprok soe di dataran tinggi Mutis
2. Uji  aktivitas  bakteri  ice  Nucleation  active  pada  daun jeruk keprok soe di dataran tinggi Mutis
3. Kelas protein Ice Nucleation active bakteri INA pada daun jeruk keprok soe di dataran tinggi Mutis

## 3. BAHAN DAN METODE
Sampel tanaman jeruk keprok soe diambil di dataran tinggi  mutis  dengan  metode purposive  sampling pada tiga  ketinggian  yang  berbeda  yaitu  2000  meter  diatas permukaan  laut  (m  dpl),  2100  m  dpl  dan  2200  m  dpl. Semua  sampel  yang  diambil  diberi  label  berdasarkan ketinggian  kemudian  ditempatkan  dalam  plastik  steril dan  dibawa  ke  laboratorium  menggunakan  kotak pendingin.
Isolasi  bakteri  dilakukan  dengan  mengambil  5  gram sampel  daun  jeruk  keprok  Soe  kemudian  direndam menggunakan  200  mL  larutan  buffer  fosfat  pH  7.0 (Waturangi dan Amelia, 2009), dan dikocok pada rotary shaker selama  2  jam  dengan  kecepatan  150  rpm.
Kemudian  dilakukan  pengenceran  sehingga  10 -3 dengan 9  mL  aquades  steril.  Kemudian  dari  seri  pengenceran, diambil 0,1 mL disebarkan pada media King’s B dengan teknik  cawan  sebar  ( spread  plat )  dan  diinkubasi  pada suhu  37 o C  selama  4  x  24  jam  (Missa,  2016).  Media King’s B dibuat dengan komposisi 20 gr protease pepton, 10  mL  gliserol,  1,5  gr  K2HPO4,  1,5  gr  MgSO4.7H2O dan  15  gr  agar  dimasukkan  ke  dalam  erlenmeyer kemudian  ditambah  1  L  akuades  kemudian  di  sterilkan pada suhu 121 o C selama 15 menit (King, 2014).
Koloni bakteri berbeda yang tumbuh di media King’s B diambil dan digoreskan kembali pada media King’s B agar  Miring,  kemudian  disimpan  4-6  hari  pada  suhu ruang  dan  selanjutnya  disimpan  di feezer pada  suhu  4- 5 o C  (Stephanie  &  Waturangi,  2012),  untuk  selanjtnya dilakukan  pengujian  aktivitas  bakteri  INA  dengan menggunakan  metode tube  freezing yaitu  memasukan 100  l  suspensi  bakteri  berumur  4-6  hari  kedalam supercool  water (Lindow et  al., 2013).  Bakteri  yang telah  dimasukan  kedalam supercool  water didinginkan pada  suhu  -5 o C  hingga  -10 o C  selama  15  menit.  Bakteri INA  dikelompokan  menjadi  tiga  kelas  yaitu  kelas  A membentuk  inti  es  pada  suhu  -2 o C  hingga  -5 o C,  kelas B membentuk inti es pada suhu  -5 o C  hingga  -7 o C,  kelas C  aktif  pada  suhu  -7 o C  hingga  -10 o C  (Rugless et al .,2013).
Estimasi  populasi  bakteri  INA  dilakukan  dengan metodel multiple  tube  nucleation (Cazarlo et  al .,  2015), yaitu dengan cara tabung reaksi yang berisi 9 mL buffer fosfat  steril,  didinginkan  pada  suhu  -10 o C  selama  3 menit, kemudian tabung dikocok dan semua tabung yang mengalami  pembekuan  dipisahkan.  Masing-masing sampel penelitian sebanyak 2 g dihomogenkan dalam 20 mL buffer fosfat,  kemudian  sebanyak  1  mL  suspensi
bakteri  dimasukan  kedalam  tabung  berisi buffer fosfat yang tidak membeku dan sampel yang telah dihomogenkan didinginkan pada suhu -3 o C sampai -9 o C, sedangkan  karakterisasi  isolat  bakteri  dilakukan  dengan pengamatan secara mikroskopis berupa pengamatan jenis gram bakteri dengan menggunakan safranin.

## 4. PEMBAHASAN
Berikut  disajikan  hasil  dan  pembahasan  dari penelitian ini
4.1 Isolat  Bakteri Ice  Nucleation  Active pada  Daun Jeruk Keprok Soe di Dataran Tinggi Mutis
Bakteri  INA  yang  diisolasi  dari  tiga  stasiun ketinggian  diisolasi  menggunakan  media  King;s  B  yang merupakan  media  non-selektif  dan  digunakan  untuk subkultur.  Media  ini  mengandung  antibiotik  seperti cephalexine yang akan membuat media (King’s B) cocok untuk deteksi beberapa pseudomonas seperti Pseudomonas syringae pv , syringae pv dan Pseudomonas  savastonoi hal  ini  yang  menyebabkan koloni Pseudomonas tampak  berfluoresen  di  media King’s B (Arwiyanto et al., 2017), dan juga memberikan jumlah  tertinggi  unit  pembentuk  koloni,  di  beberapa lingkungan (Atlas, 2015).
Koloni  bakteri  yang  didapatkan  dari  cawan kemudian dijadikan  biakan  murni pada  media King’s B. menurut  Kieft  dan  Ruscetti  (2011),  biakan  bakteri  INA yang  mememiliki  aktivitas  pembentukan  inti  es  paling tinggi adalah biakan dengan usia 4-6 hari. Biakan murni yang  terlalu  muda  ataupun  terlalu  tua  tidak  memiliki aktivitas  pembentukan  inti  es  yang  tinggi.  Jumlah  isolat Bakteri  yang  didapat  dari  isolasi  daun  jeruk  keprok  Soe berjumlah 57 isolat, disaijkan pada tabel 1. Semua isolat diuji  aktivitas  nukleasinya  dengan  suhu  -10 o C,  selama  5 menit dan isolat yang positif bakteri INA akan membeku seperti yang terlihat pada gambar 2.

## Tabel 1. Jumlah Isolat bakteri yang didapat dari setiap stasiun pengambilan sampel
Ketinggian Tempat Pengambilan sampel Jumlah Isolat pada Daun Jeruk Keprok Soe Jumlah isolat yang positif INA Kode Isolat 2000 m dpl 21 2 A1H4 A1H6 2100 m dpl 20 2 A2H2 A2H3 2200 m dpl 16 4 A3H2 A3H3 A3H4 A3H6 Keterangan : A : Tempat pengambilan sampel 1
: Stasiun penelitian H : Nama peneliti
4 : Nomor isolat
Tabel  jumlah  isolat  bakteri  diatas,  menunjukkan bahwa  pada  ketinggian  2000  dan  2100  m  dpl  terdapat masing-masing  2  isolat  yang  positif  bakteri  INA  dan pada  ketinggian  2200  m  dpl  diperoleh  4  isolat  positif bakteri  INA.  Berdasarkan  ketinggian  dan  jumlah  isolat yang menunjukan positif bakteri INA pada penelitian ini dikatakan unggul ketika dibandingkan dengan penelitian Latifah,  (2014)  pada  tumbuhan  lumut  yang  diperoleh dari  jalur  pendakian  cemoro  sewu  dengan  ketinggian 2026  m  dpl,  jumlah  isolat  positif  bakteri  INA  adalah  2 isolat,  ketinggian  2331  m  dpl  diperoleh  1  isolat  positif bakteri INA dan pada ketinggian 2509 m dpl diperoleh 4 isolat  positif  bakteri  INA.  Penelitian  Yunigsih,  (2015) Pada tumbuhan paku yang diperoleh dari jalur pendakian cemoro sewu pada ketinggian 2000 m dpl tidak ada isolat bakteri  yang  mempunyai  aktivitas  Nuklesi  es  ditandai dengan  tidak  ada  isolat  bakteri  yang  membeku, kemudian isolat  yang diperoleh pada ketinggian 2100 m dpl  terdapat  2  isolat  positif  bakteri  INA,  dan  pada ketinggian  2200  m  dpl  terdapat  3  isolat  positif  bakteri INA.
Koloni  yang  dikategorikan  sebagai  positif  bakteri INA  adalah  koloni  yang  memiliki  aktivitas  nucleasi  es terlihat  ketika  suspensi  koloni  membeku  setelah dilakukan  uji  aktivitas  pada  suhu  -10 o C  selama  5  menit. Membekunya  suspensi  tersebut  menunjukan  bahwa bakteri  INA  memiliki  protein  tunggal  yang  berperan dalam  proses  pembetukan  inti  es  (Morris et  al., 2009), sebaliknya  suspensi  bakteri  yang  tidak  membeku dikategorikan sebagai negatif bakteri INA.

## Gambar 2. Isolat yang positif bakteri INA pada daun jeruk keprok soe dalam microtobe. kode isolat (a)
A3H2, (b) A3H3, (c) A3H4, (d) A3H6
Isolat  bakteri  INA  yang  positif  paling  banyak ditemukan  pada  stasiun  pengambilan  dengan  ketinggian 2200  m  dpl  ini  disebabkan  karena  sampel  daun  jeruk keprok  soe  yang  diambil  pada  ketinggian  2200  m  dpl merupakan daun yang paling banyak menyerap air hujan, mengingat  bakteri  INA  erat  kaitannya  dengan  air  hujan. Penelitian    Waturangi  dan  Amelia  (2019),  menunjukan bahwa  bakteri  INA  berhasil  diisolasi  dari  tanaman mengkudu  ( Morinda  citrifolia L),  Sirih  ( Peper  betle L),
Pepaya  ( Carica  papaya L)  dan  Strawberry  ( Fragaria  X annanasa ).
Pada  dalam  setiap  stasiun  pengambilan  sampel terdapat  beberapa  bakteri  yang  memiliki  aktivitas  yang berbeda-beda, bahkan dalam 1 stasiun. Pada uji aktivitas nukleasi  es  yang  dilakukan  didapatkan  hasil  yaitu  2 sampel  mengalami  pembekuan  pada  suhu  -7 o C, sedangkan  6  sampel  membeku  pada  suhu  -10 o C.  Kieft dan Ruscetti (2011) menyatakan bahwa uji positif bakteri INA  ditunjukkan  dengan  terbentuknya  inti  es  setelah masa  inkubasi  3  menit.  Dilakukan  pengujian  pada  suhu yang  berbeda  karena  berdasarkan  dari  aktivitasnya, protein INA terbagi atas tiga  kelas utama  yaitu kelas  A, aktif  membentuk  inti  es  pada  suhu  -2 o C  hingga  -5 o C, Kelas B, aktif pada suhu ≥ -5 o C hingga –7 o C dan Kelas C aktif  pada  suhu  ≥  -7 o C  hingga  -10 o C.  Berdasarkan  uji yang  dilakukan  terdapat  aktivitas  nukleasi  es  dari  isolat bakteri,  ditemukan  bahwa  dua  isolat  bakteri  tergolong kedalam  kelas  B  kedua  isolat  ini  terdapat  pada  stasiun pengambilan sampel dengan ketinggian 2000. M dpl dan 2100  mdpl,  sedangkan  enam  isolat  bakteri  lainya merupakan kelas C dengan ketinggian stasiun pengambilan sampel 2000 mdpl, 2100 m dpl dan 2200 m dpl.
4.2 Estimasi Populasi Bakteri Ice Nucleation Active

## Pada Daun Jeruk Keprok Soe Di Dataran Tinggi Mutis
Aktivitas  bakteri  INA  berkaitan  erat  dengan  adanya hujan,  kelembaban  dan  suhu  udarah  yang  rendah,  oleh karena  itu  perlu  dilakuka  uji  estimasi  jumlah  populasi bakteri INA  yang ada di permukaan daun  menggunakan metode multiple  tube  nucleation (Cazorla et  al .,  2015), dan  dilakukan  pada  suhu  -5 o C  selama  10  menit  sesuai dengan  pendapat  Hirano et  al .,  (2015)  dan  Baertlein et al ., (2012) dan juga penelitian dari Cazorla et al ., (2015) yang  menggunakan  suhu  -5 o C  sebagai  suhu  optimum untuk  melakukan  uji  estimasi.  Prinsip  utama  metode  ini adalah  mengencerkan  sampel  sampai  tingkat  tertentu sehingga  didapat  mikroorganisme  yang  sesuai.  Jumlah populasi bakteri INA tersaji pada tabel 2.
Tabel 2. Populasi bakteri INA pada daun jeruk keprok soe menggunakan metode MPN No Ketinggian Tempat Pengambilan sampel Ulangan Nilai MPN 10 -1 10 -2
10 -3
1 2000 m dpl 0 1 1 6 x 10 3 2 2100 m dpl 1 0 1 7 x 10 3 3 2200 m dpl 0 2 2 1,2 x 10 4
Tabel  jumlah  populasi  bakteri  INA  pada  daun  jeruk keprok  soe  menunjukan  bahwa  populasi  bakteri  INA tertinggi  terdapat  pada  daun  jeruk  keprok  soe  yang diperoleh dari ketinggian 2200 m dpl  yaitu sebesar 1,2 x 10 4 /g,  sedangkan  populasi  terendah  yaitu  pada  daun
jeruk keprok soe yang diperoleh dari ketinggian 2000 m dpl  yaitu  sebesar  6  x  10 3 .  Nilai  ini  menunjukan  jumlah bakteri  yang  tinggi  apabila  dibandingkan  dengan penelitian  Karno,  (2014)  yang  mengisolasi  bakteri  INA pada  tumbuhan  berdaun  lebar  dijalur  pendakian  cemoro sewu,  gunung  lawu,  setelah  dilakukan  uji  estimasi populasi,  diperoleh  populasi  bakteri  INA  tertinggi  yaitu 5,4  x  10 -3 /g,  dan  terendah  yaitu  <  3  x  10 -3 /g,  Utami,
(2015) mengisolasi bakteri INA pada tumbuhan berdaun jamur  di  jalur  pendakian  cemoro  sewu,  setelah  diuji estimasi  populasi  bakteri  INA  menunjukan  populasi tertinggi yaitu 3,6 x 10 -3 /g dan populasi terendah yaitu < 3 x 10 -3 /g. Keragaman populasi tersebut dipengaruhi oleh faktor  abiotik  salah  satunya  adalah  sinar  matahari  dan habitat yang berbeda.

## 4.3 Karakterisasi  Mikroskopis  Isolat  Bakteri  INA
Pada Daun Jeruk Keprok Soe
Pengamatan mikroskopis dilakukan dengan mengamati  bentuk  morfologi  sel  dan  pewarnaan  gram untuk melihat jenis gram dari isolat bakteri INA tersebut. Berdasarkan  hasil  pewarnaan  gram  terhada  6  isolat bakteri  positif  nukleasi  es  menunjukan  bahwa  semua isolat  berbentuk  batang  dan  berwarna  merah  sehingga keenam  isolat  tersebut  dikategorikan  kedalam  bakteri gram  negatif,  hal  ini  sesuai  dengan  pendapat  Gurian et al .,  (2013)  yang  menyatakan  bahwa  hamper  semua bakteri pembentuk inti es adalah bakteri gram negatif

## 5. KESIMPULAN
Kesimpulan  dari  penelitian  ini  adalah    populasi bakteri INA pada daun jeruk keprok soe tergolong tinggi pada  ketinggian  2200  m  dpl    yaitu  sebesar  1,2  x  10 4 /g, sedangkan  populasi  terendah  yaitu  pada  daun  jeruk keprok  soe  yang  diperoleh  dari  ketinggian  2000  m  dpl yaitu  sebesar  6  x  10 3 .  Kesimpulan  dari  penelitian  ini adalah  populasi bakteri INA pada daun jeruk keprok soe tergolong  tinggi  pada  ketinggian  2200  m  dpl    yaitu sebesar  1,2  x  10 4 /g,  sedangkan  populasi  terendah  yaitu pada  daun  jeruk  keprok  soe  yang  diperoleh  dari ketinggian  2000  m  dpl  yaitu  sebesar  6  x  10 3 .  Jumlah isolat Bakteri yang didapat dari isolasi daun jeruk keprok Soe  berjumlah  57  isolat  hasil  uji  aktivitas  nukleasinya pada  suhu  -10 o C,  selama  5  menit,    isolat  yang  positif bakteri  INA  adalah  pada  ketinggian  2000  m  dpl diperoleh 2 isolat, 2100 m dpl 2 isolat dan 2200 m dpl 4 isolat.

## 6. SARAN
Saran  dalam  penelitian  ini  adalah  perlu  untuk dilakukan  penelitian  lanjutan  pada  tumbuhan  yang  lain sehingga  mendapat  data  populasi  bakteri  INA  yang lengkap.

## 7. DAFTAR PUSTAKA
Arwiyanto,    T.    2009. Bakteri    Penyebab    Penyakit Tumbuhan    sebagai    Lawan dan  sebagai
Kawan . Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
Atlas,  R. M. 2015. Handbook of  Microbiological Media Fourth Edition . Baertlein,  D.  A.,  Lindow,  S.  E.,  Panapoulos,  N.  J.M., Lee, S. P., Min-drinos, M. N. and Chen, T. H.H. 1992.Expression  of    bacterial  ice  nucleation gene in plants. Plant Physiology 100:1730- 1736 Cazorla,  F.M.,  Olalla  L.,  Tores  J.A.,  Perez-Garcia A.,Codina  J.C.,  and  de  Vicente  A.  2012.  A method for estimation of population densities of ice  nucleation  active Pseudomonas  syringae in buds and leaves of mango. J.Appl . Bacteriol . 79: 341-346.
Edwars.  A.R.,  Ronald,  A.,  Wichman,  H.A.,  and  Orser C.S.  2014.  Unusual  pattern  of  bacterial  ice nucleation  gene  evolution.  Mol.  Biol.  Evol. 11:911-920.
Gurian-Sbennan,      D.,      and      Lindow  S.    E.    2013. Bacterial      Ice      Nucleation:  Significance  and Molecular  Basis. Proc.  Fla.  State.  Hort.  Soc.J. 7:1338-1343.
Hirano,  S.S.,  Baker,  L.T.,  and  Christian,  D.U.  2015. Ice Nucleation  of  individual  leaves  in  relation  to populatioan  sizes  of  ice  nucleation  active bacteria and frost injury. Plant. Physiol. 77:259- 265
Karno.  R.,  Sutarno.,  and  Susilowati,  A.  2014.  Estimasi Populasi  Bakteri  Ice  Nucleation  Active  Pada Tumbuhan  di  Jalur  Pendakian  Cemoro  Sewu Gunung Lawu. El-Vivo. 2:67–72.
Kieft  T.L.  and  Ruscetti  T.  2011.  Characterization  of biological  ice  nuclei  from  a  lichen. J . Bacteriol .172:3519-3523.
King,  E.O.,   Ward   M.K.,  and   Raney  E.D.    2014. Two  simple  media  for  the  demonstration  of pyocyanin and fluorescein. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 44: 301-307. Latifah,  N.  H.  2014. Isolasi  dan  Estimasi  Populasi Bakteri  Ice  Nucleation  Active  Pada  Tumbuan Lumut  di  Jalur  Pendakian  Cemoro  Sewu Gunung  Lawu .  Skripsi.  UNS-FMIPA  Jur. Biologi- M.0409042-2014
Lindow,  S.E.,  Hirano,  S.S.,  Barchet,  W.R.,  Arny,  D.C., and  Upper,  C.D.  2012.  Relationship  beetween ice  nucleation  frequency  of  bacteria  and  frost injury. Plants Physiology 70: 1090-1093.
Lindow,  S.E.,  Arny,  D.C.,  and  Upper,  C.D.  2013. Distribution of ice nucleation active on plants in nature. Appl. Environ. Microbiol. 36:831-838.
Missa,  H.  2016.  Isolasi    Dan  Karakterisasi  Molekuler Gen Penyandi 16s Rrna Bakteri Selulolitik Dari Kotoran  Sapi  Bali  (Bos  Sondaicus)  Di  Timor
Tengah  Selatan.  Tesis.  UNS-Pascasarjan  Prodi.
Biosain- S901408004-2016 Missa, H. (2016). Diversity and phylogenetic relationship  of  cellulolytic  bacteria  from  the feces of Bali Cattle in South Central Timor, East Nusa Tenggara, Indonesia. Biodiversitas, Journal of Biological Diversity , 17 (2), 614–619. https://doi.org/10.13057/biodiv/d170232
Morris,  C.E.,    Sands D.C.,   Bardin   M.,  JaenickeR., VogelB., LeyronasC., Ariya P.A., and
PsennerR. 2009. Microbiology and Atmospheric
Processes:  an  Upcoming  Era  of  Research  on Bio-meteorology. Biogeosciences Discuss 5:191-212.
Rostami, Mahdieh, Nader Hasanzadeh, Pejman Khodaygan,  and  Ali  Riahi-  Madvar.  2018.  “Ice Nucleation  Active  Bacteria  from  Pistachio  in Kerman Province , Iran.” : 51–58.
Ruggles,      J.A.,    Marshall  M.N.,    and    Fall  R.      2013.
Kinetics    of  Appearance  and  Disappearance  of Classes of Bacterial Ice Nucleation Support and Agregation Model for Ice Nucleus Assembly. J. Bacteriol. 175:7216-7221.
Stephanie,  and  Diana  Elizabeth  Waturangi.  2012. “Distribution  of  Ice  Nucleation-Active  (INA)
Bacteria  from  Rain-Water  and  Air.” HAYATI Journal of Biosciences 18(3): 108–12. http://dx.doi.org/10.4308/hjb.18.3.108 .
Utami,    A.  W.  2014.  Isolasi  Dan  Uji  Aktivitas  Bakteri Ice Nucleation Active Pada Tumbuhan Berdaun Jarum  Di  Jalur  Pendakian  Cemoro  Sewu Gunung Lawu. El-Vivo. 3 (1):6-10
Wahyudi, A.T. 2015.  Pembentukan Inti Es oleh Bakteri. Hayati 2:55-59.
Waturangi,    D.E.,    and    Amelia  T.    2009.  Isolation, Characterization    and    Genetic  Diversity  of  Ice Nucleation  Active  Bacteria  on  Various  Plants. Hayati 16 (2):54-58. Yuningsih. 2015. Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri INA (Ice  Nucleastion  Active)  Pada  Tumbuhan  Paku di  Jalur  Pendakian  Cemoro  Sewu  Gunung Lawu .  Skripsi.  UNS-FMIPA  Jur.  Biologi- M0409070-2015.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Disampaikan kepada Kementrian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi Republik Indonesia yang telah mendanai Penelitian ini pada bidang Penelitian Dosen Pemula dengan nomor kontrak 456/WM.H9/SPKP/2019 dan Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM) Universitas Katolik Widya Mandira yang telah mendukung kelancaran penelitian ini.