## OPTIMASI KONDISI DEPOLIMERISASI PULP BIjI KAKAO
GANDA PUTRA, HARIjONO, SUSANTO,

## KUMALANINGSIH DAN AULANNI’AM
Universitas Udayana Denpasar Email: putu_gandraputra@yahoo.com

## ABSTRACT
Pulp breaking on cocoa processing could be conducted with depolymerization of cocoa pulp by enzyme polygalacturonase (PG) endogenous. This research was aimed to determination the optimum condition of depolymerization of cocoa pulp by enzyme polygalacturonase endogenous during incubation. This research was carried out by incubating cocoa pulp for 6 days on various of optimum condition of PG endogenous treatments, that is: temperature were 32.5 o C, 37.5 o C, 42.5 o C, 47.5 o C, 52.5 o C and initial pH of pulp were 4.1; 4.6; 5.1, respectively. Optimum condition of depolymerization of cocoa pulp was determination by effectiveness test. Effectiveness test result, based on the highest effectiveness index, showed that the optimum condition of depolymerization of cocoa pulp was 47.5 o C incubation temperature and 4,6 initial pH of pulp. Those treatment produced 18.29% of pulp liquid wieght total during 5 days incubation with average per day for pectin content, galacturonic acid content, acid total content, and the change of pH were 1.12%, 8.36%, 0.209 meq NaOH/g and 0,19 in cocoa pulp extract was incubated for 6 days, respectively.
Key words: depolymerization, polygalacturonase, cocoa pulp

## PENDAHULUAN
Pengolahan  kakao  adalah  usaha  untuk memproses  buah  kakao  guna  menghasilkan  biji kakao  kering  yang  memenuhi  standar  mutu  dan semaksimal  mungkin  diupayakan  untuk  dapat memunculkan karakteristik khas kakao, yaitu cita rasa.  Tahapan  pengolahan  yang  dianggap  paling dominan mempengaruhi mutu hasil biji kakao kering adalah  fermentasi  (Alamsyah,  1991).  Fermentasi biji  kakao  bertujuan  untuk  menghancurkan  pulp (eksternal)  dan  mengusahakan  kondisi  untuk terjadinya reaksi kimia dan biokimia dalam keping biji (internal). Pulp yang telah hancur akan mudah lepas  dari  biji  sehingga  biji  kakao  menjadi  bersih dan  cepat  kering.  Selanjutnya  reaksi  kimia  dan biokimia  dalam  keping  biji  dimaksudkan  untuk pembentukan  prekursor  cita  rasa  dan  warna coklat.
Penghancuran pulp mungkin dapat dilakukan dengan  depolimerisasi  menggunakan  enzim pektolitik  endojinus.  Pulp  tersusun  diantaranya oleh  pektin,  yang  merupakan  polisakarida struktural yang terdapat pada dinding sel primer dan  ruang  antar  sel.  Depolimerisasi  pektin  dapat berlangsung  karena  adanya  aktivitas  enzim pektolitik  yang  menghidrolisis  substrat  pektin. Depolimerisasi  pektin  yang  merupakan  bahan
perekat  dari  lamela  tengah  sel,  menyebabkan jaringan  pulp  rusak  terdisintegrasi,  membentuk cairan dan menetes keluar tumpukan biji (watery sweatings).  Selama  ini  mekanisme  penghancuran pulp  biji  kakao  didasarkan  atas  pendapat  yang cenderung  menekankan  pada  aktivitas  mikroba semata  (enzim  eksojinus).  Pendapat  ini  didukung oleh  ditemukannya  beberapa  strain  yeast  yang dapat  menghasilkan  enzim  pektolitik,  misalnya Kluyveromyces fragilis (Carr, 1982; Schwan, 1998). Sedangkan  peranan  enzim  pektolitik  endojinus yang terdapat dalam pulp biji kakao belum pernah diungkap.
Menurut  Fox  (1991)  dan  enzim  pektolitik diklasifikasikan  berdasarkan  cara  pemotongan asam  galakturonat  pada  molekul  pektin,  yaitu: (1) pektin metil esterase (PME), (2) poligalakturonase (PG),  (3)  pektat  liase  (PAL)  dan  (4)  pektin  liase (PL).  Blanco  et  al.  (1999),  menambahkan  bahwa enzim  PME  dan  PG  banyak  ditemukan  pada jaringan  tanaman,  tetapi  juga  dapat  diproduksi oleh  beberapa  strain  jamur,  bakteri  dan  yeast. Sedangkan menurut Stephhen (1995), enzim PAL dan PL hanya diproduksi oleh mikroorganisme.
Enzim  PME  atau  pektin  pektilhidrolase  (EC 3.1.1.11) menghidrolisis ikatan metil ester substrat pektin  menjadi  asam  pektat  (poligalakturonat)
dan metanol. Pelepasan metil ester, menyebabkan asam  pektat  memiliki  lebih  banyak  gugus karboksilat bebas. Sedangkan PG atau poli- α -1,4- D-galakturonida glikano-hidrolase (EC 3.2.1.15 dan 3.2.1.67) menghidrolisis ikatan glikosidik antar unit- unit  asam  galakturonat  yang  berdekatan  dengan gugus  karboksilat  bebas.  Hal  ini  menyebabkan pektin  mengalami  depolimerisasi.  PAL  atau poli- α -1,4-D-galakturonida  liase  (EC  4.2.2.2  dan 4.2.2.9)  atau  asam  pektat  liase  juga  memecah ikatan glikosidik asam pekat, tetapi tidak dengan bantuan air, melainkan dengan trans ( b )-eliminasi. PL  atau  poli- α -1,4-D-metoksigalakturonida  liase (EC  4.2.2.10)  yang  hanya  ada  dengan  tipe endo, memecah  ikatan  glikosidik  antar  residu  metoksil galakturonida  dengan  reaksi  trans  ( b )-eliminasi, yang  lebih  menyukai  HM  (high  methoxyl)  pektin (Fox, 1991; Whitaker, 1996).
Enzim  PG  yang  dapat  mendepolimerisasi pektin,  aktivitasnya  akan  maksimum  bila  berada pada  kondisi  optimum.  Hasil  penelitian  Ganda Putra,  dkk.  (2006),  menunjukkan  bahwa  kondisi suhu dan pH optimum aktivitas relatif filtrat enzim PG pada pulp biji kakao adalah suhu 42,5° C dan pH 4,6. Suhu optimum tersebut hampir sama dengan suhu  optimum  enzim  endo-PG  pada  Verticillium albo-atrum  sebesar  46°  C  (Huang  and  Mahoney, 1999) dan PG pada pepaya 45° C Fox (1991). Begitu pula dengan pH optimum enzim PG pada beberapa buah-buahan  yang  berkisar  antara  4,5–5,0  (Fox, 1991). Selanjutnya, berdasarkan kondisi optimum aktivitas enzim PG tersebut akan dapat digunakan sebagai acuan untuk proses depolimerisasi pulp biji kakao.
Adapun  tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengkaji  pengaruh  variasi  kondisi  suhu  dan  pH optimum  aktivitas  enzim  PG  endojinus  terhadap perubahan  karakteristik  ekstrak  pulp  biji  kakao selama  proses  depolimerisasi  dan  menentukan kondisi  optimum  depolimerisasi  pulp  biji  kakao oleh enzim PG endojinus selama inkubasi.

## METODE
Bahan  penelitian  adalah  buah  kakao  jenis lindak  yang  diperoleh  dari  petani  kakao  di  Desa Tumpakrejo,  Kecamatan  Kalipare,  Kabupaten Malang  (±  60  km  dari  Kota  Malang).  Bahan  lain adalah bahan-bahan kimia untuk preparasi sampel
dan  analisis  variabel  pengamatan  pada  ekstrak pulp biji kakao.
Peralatan yang digunakan di antaranya: wadah plastik,  oven  inkubator,  timbangan  elektronik, oven pengering, pH meter, spektrofotometer, kain saring,  kertas  saring  Whatman  1.  Selain  itu  juga digunakan alat-alat gelas untuk analisis.
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan  Acak  Kelompok  (RAK)  pola  faktorial 2  faktor,  dengan  perlakuan  variasi  suhu  dan  pH awal  pulp.  Perlakuan  suhu  inkubasi  (S),  terdiri atas:  32,5° C,  37,5° C,  42,5° C,  47,5° C,  dan  52,5° C,  sedangkan  pH  awal  pulp  (P),  terdiri  dari:  4,1; 4,6; dan 5,1. Masing-masing kombinasi perlakuan diulang  2  kali,  sehingga  diperoleh  30  unit  untuk percobaan.
Data  yang  diperoleh  dianalisis  dengan analisis variansi (Rancangan Acak Kelompok) dan dilanjutkan  dengan  uji  BNT  5%  bila  perlakuan berpengaruh  signifikan  (p  <  0,05).  Penentuan kondisi  optimum  depolimerisasi  pulp  biji  kakao didasarkan  atas  hasil  uji  efektivitas  (De  Garmo et al., 1984).
Pelaksanaan  penelitian  dilakukan  dengan terlebih  dahulu  memilih  buah  kakao  yang  masak optimal  dan  seragam.  Buah  kakao  sebanyak 20  buah  untuk  masing-masing  unit  percobaan dicuci  bersih  dengan  air  (sumber  PAM)  dan dikeringkan  dengan  kain  lap.  Sebelum  dibelah, kulit  buah  kakao  disemprot  dengan  alkohol  90% untuk  sterilisasi  permukaan.  Kemudian  dipecah secara manual dengan pisau stainless steel dan biji kakao  dipisahkan  dari  kulit  dan  plasentanya  lalu ditampung dalam wadah plastik (pisau dan wadah sebelumnya  telah  disemprot  dengan  alkohol  90% untuk sterilisasi). Selanjutnya ditimbang sebanyak 2  kg  sampel  biji  kakao,  ditambahkan  Na-bisulfit 0,1%  (b/b),  dimasukkan  ke  dalam  wadah  plastik berlubang  yang  telah  disterilkan  dengan  alkohol 90%.
Biji  kakao  diinkubasi  pada  oven  inkubator (sterilisasi  dengan  alkohol  90%)  selama  6  hari pada variasi kondisi optimum aktivitas enzim PG (sesuai perlakuan). Pengaturan pH pulp biji kakao dilakukan  dengan  NaOH  2N  dan/atau  HCl  2N, sedangkan  suhu  dengan  mengatur  besaran  suhu pada oven inkubator. Selama inkubasi, setiap hari dilakukan sampling biji kakao sebanyak 200 g.
Putra, dkk: Optimasi Kondisi Depolimerisasi Pulp Biji Kakao
Gambar 1. Grafik perubahan persentase berat cairan pulp biji kakao selama inkubasi pada variasi kondisi enzim PG
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 Waktu inkubasi (hari) Be ra t c ai ra n pu lp (% ) 32,5oC 6.57 2.67 1.40 1.02 0.21 7.06 2.57 1.31 1.25 0.30
6.39 2.58 1.55 0.93 0.35 37,5oC 8.52 2.12 1.05 0.97 0.34 8.85 2.27 1.24 1.03 0.32 8.19 2.31 0.96 0.86 0.29 42,5oC 10.46 1.88 1.03 0.58 0.39 10.65 1.67 1.29 0.66 0.46 10.61 1.59 0.70 0.40 0.35 47,5oC 12.69 3.17 1.20 0.53 0.09 13.47 2.95 1.25 0.52 0.10 12.61 2.76 1.23 0.44 0.07 52,5oC 6.72 1.70 0.92 0.27 0.08 6.79 1.71 1.11 0.34 0.12 6.35 1.52 1.12 0.26 0.11
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 pH 4,1 pH 4,6 pH 5,1
Setelah itu dilakukan ekstraksi pulp biji kakao dengan  cara  diaduk  menggunakan  pengaduk magnetik  selama  10  menit  pada  suhu  50° C,  lalu diperas secara manual dalam kain saring. Ekstrak pulp  biji  kakao  ditampung  untuk  selanjutnya dianalisis.
Pengamatan  pada  ekstrak  pulp  biji  kakao meliputi: persentase berat cairan pulp (%) dengan metode  penimbangan,  kadar  pektin  kasar  (%) dengan  metode  ekstraksi  menggunakan  asam dan  aseton  (Gardjito  dan  Wardana,  2003),  asam galakturonat (%) menurut metode Somogyi-Nelson (Munoz dan Barcelo, 1996; Sudarmadji et al,. 1997), total  asam  (meq  NaOH/g)  dengan  metode  titrasi (James, 1995) dan pH dengan pH meter menurut metode  pengujian  standar  mutu  kakao  (SNI:  01- 2323–1995).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Perubahan  persentase  berat  cairan  pulp  biiji kakao selama inkubasi pada masing-masing variasi kondisi enzim PG disajikan pada Gambar 1.
Berdasarkan  Gambar  1  dapat  dilihat  bahwa persentase  berat  cairan  pulp  biji  kakao  menurun drastis  setelah  1  hari  inkubasi  dan  makin  lama waktu  inkubasi  berat  cairan  pulp  semakin berkurang.  Kondisi  ini  berlangsung  hampir  sama pada  semua  variasi  suhu  dan  pH  awal.  Grafik perubahan persentase berat cairan pulp biji kakao terbesar pada suhu 47,5° C dan terkecil pada suhu 32,5° C  dan  52,5° C  yang  berlaku  hampir  sama untuk  masing-masing  pH  awal.  Hal  ini  terjadi selain karena faktor karakteristik pulp biji kakao yang  mempunyai  kandungan  air  tinggi,  yaitu sekitar  82–87%  air  (Lopez,  1986)  sehingga  pada tahap  awal  inkubasi  air  bebas  yang  terkandung akan  menetes  keluar,  juga  akibat  aktivitas  enzim pektolitik  (PG)  yang  merombak  pektin  dalam pulp.  Depolimerisasi  pektin,  yang  merupakan bahan  perekat  lamela  tengah  sel,  menyebabkan pulp hancur dan membentuk cairan yang menetes keluar  tumpukan  biji  ( watery  sweatings).  Proses depolimerisasi  pulp  oleh  enzim  PG  masih  terus berlangsung, namum aktivitasnya makin berkurang akibat  kondisi  lingkungan,  khususnya  pH  pulp
Tabel 1. Jumlah Persentase Berat Cairan Pulp Biji Kakao (%) pada Variasi Kondisi Enzim PG
Selama Inkubasi Suhu (° C) pH awal pulp Rata-rata*) 4,1 4,6 5,1 32,5 11,85 12,48 11,79 12,04 d 37,5 13,00 13,71 12,61 13,11 c 42,5 14,33 14,71 13,64 14,23 b 47,5 17,67 18,29 17,10 17,68 a 52,5 9,68 10,05 9,35 9,69 e Rata-rata **) 13,31 b 13,85 a 12,90 c
*) Huruf yang sama di samping nilai rata-rata pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata pada uji BNT 5% (= 0,4822)
**) Huruf yang sama disamping nilai rata-rata pada baris yang sama menunjukkan tidak beda nyata pada uji BNT 5% (= 0,3735)
yang  mengalami  perubahan  dan  tidak  lagi  dalam kondisi  optimumnya.  Sebagaimana  diuraikan  di atas  bahwa  kondisi  pH  optimum  aktivitas  enzim PG adalah 4,6.
Hasil  analisis  variansi  (RAK)  menunjukkan bahwa perlakuan suhu dan pH awal berpengaruh sangat  signifikan  (p<0,01),  tetapi  interaksi  suhu dan  pH  awal  tidak  signifikan  (p>0,05)  terhadap jumlah  persentase  berat  cairan  pulp  biji  kakao selama  inkubasi.  Jumlah  persentase  berat  cairan pulp  biji  kakao  pada  variasi  kondisi  enzim  PG selama inkubasi disajikan pada Tabel 1.
Berdasarkan Tabel 1 dan dapat dikemukakan bahwa  jumlah  persentase  berat  cairan  pulp  yang tertampung  selama  5  hari  inkubasi  meningkat secara  signifikan  sejalan  dengan  makin  tingginya suhu  inkubasi  sampai  pada  suhu  47,5° C,  tetapi kemudian  menurun  lagi  dengan  naiknya  suhu inkubasi  menjadi  52,5° C.  Jumlah  prosentase berat  cairan  pulp  biji  kakao  tertinggi  dihasilkan pada  inkubasi  dengan  pH  awal  4,6  yang  berbeda secara  signifikan  dibandingkan  dengan  hasil  dari inkubasi  biji  kakao  pada  pH  awal  4,1  dan  5,1. Hal  demikian  kemungkinan  berkaitan  dengan pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim PG dalam mendepolimerisasi  pulp  biji  kakao.  Laju  aktivitas enzim akan makin meningkat.
Sejalan dengan naiknya suhu sampai mencapai suhu tertentu (optimal), tetapi kemudian menurun setelah suhu dinaikkan lagi. Suhu optimal aktivitas
filtrat enzim PG adalah 42,5° C, namum aktivitas tertinggi  dalam  mendepolimerisasi  pektin  pulp untuk  menghasilkan  cairan  pulp  terjadi  pada suhu 47,5° C, kemungkinan karena enzim tersebut berada dalam pulp sehingga diperlukan tambahan energi (suhu) untuk mengoptimalkan aktivitasnya. Sedangkan  pengaruh  pH  terjadi  karena  proses depolimerisasi  pulp  oleh  enzim  PG  akan berlangsung  optimal  pada  kondisi  pH  optimum untuk  aktivitasnya.  Sebagaimanan  diuraikan  di atas  bahwa  kondisi  pH  optimum  aktivitas  enzim PG adalah 4,6, sedangkan pH 4,1 dan 5,1 kurang optimum.
Perubahan  kadar  pektin  kasar  pada  ekstrak pulp  biiji  kakao  selama  inkubasi  pada  masing- masing  variasi  kondisi  enzim  PG  disajikan  pada Gambar 2.
Berdasarkan  Gambar  2  dapat  dilihat  bahwa kadar  pektin  kasar  ekstrak  pulp  biji  kakao meningkat dengan makin lama waktu inkubasi dan mencapai kadar tertinggi setelah inkubasi 3 hari, tetapi  kemudian  menurun  dengan  bertambahnya waktu  inkubasi.  Kondisi  ini  berlangsung  hampir sama  pada  semua  variasi  suhu  dan  pH  awal. Grafik perubahan kadar pektin kasar ekstrak pulp biji  kakao  terbesar  terjadi  pada  suhu  47,5° C  dan terkecil  suhu  32,5° C  yang  berlaku  hampir  sama untuk  masing-masing  pH  awal.  Hal  ini  terjadi karena  sebelum  (hari  ke-0)  dan  pada  tahap  awal inkubasi  pektin  pulp  belum  atau  hanya  sedikit mengalami  depolimerisasi  sehingga  sel-sel  pulp masih  saling  berikatan  secara  kuat.  Kondisi  ini menyebabkan  efisiensi  ekstraksi  pulp  kurang sempurna,  sehingga  ekstrak  pulp  biji  kakao memiliki  kadar  pektin  lebih  rendah.  Selanjutnya juga terjadi penurunan kadar pektin setelah 3 hari inkubasi karena proses depolimerisasi pektin pulp oleh  enzim  PG  terus  berlangsung  sejalan  dengan makin  lama  waktu  inkubasi.  Winarno  (1992), menerangkan  bahwa  pektin  terdapat  di  dalam dinding  sel  primer  tanaman,  khususnya  di  sela- sela  antara  selulosa  dan  hemiselulosa.  Senyawa pektin  berfungsi  sebagai  perekat  lamela  tengah sel,  keterikatannya  dengan  selulosa  menjadikan senyawa  pektin  tidak  larut  dalam  air,  dikenal dengan  protopektin.  Protopektin  akan  berubah menjadi  pektin  yang  terdispersi  dalam  air  bila dipanaskan dalam air mengandung asam.
Putra, dkk: Optimasi Kondisi Depolimerisasi Pulp Biji Kakao
Tabel 2. Rata-rata kadar Pektin Kasar (%) Ekstrak Pulp Biji Kakao Per Hari Selama Inkubasi pada Variasi Kondisi Enzim PG
Suhu ( o C) pH awal pulp 4,1 4,6 5,1 32,5 0,58 l 0,76 i 0,68 j 37,5 0,63 k 0,79 h 0,76 i 42,5 0,80 h 0,94 e 0,89 f 47,5 0,98 d 1,12 a 1,07 b 52,5 0,82 g 1,03 c 0,90 f
*) Huruf  yang  sama di  samping nilai  rata-rata menunjukkan tidak beda nyata pada uji BNT interaksi 5% (= 0,0189)
Gambar 2. Grafik perubahan kadar pektin kasar ekstrak pulp biji kakao selama 6 hari inkubasi pada variasi kondisi enzim PG 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 Waktu inkubasi (hari) K ad ar p ek tin k as ar (% ) 32,5oC 0.39 0.43 0.73 0.88 0.83 0.49 0.32 0.58 0.69 0.94 1.05 0.92 0.68 0.37
0.62 0.67 0.83 0.96 0.89 0.54 0.25 37,5oC 0.41 0.55 0.76 0.92 0.76 0.58 0.43 0.58 0.79 0.84 1.02 0.91 0.74 0.68 0.62 0.74 0.81 0.99 0.87 0.65 0.61 42,5oC 0.40 0.68 0.79 1.14 0.98 0.88 0.76 0.59 0.81 0.93 1.28 1.14 1.04 0.81 0.64 0.79 0.86 1.19 1.03 0.97 0.78 47,5oC 0.43 0.95 1.11 1.29 1.17 1.02 0.91 0.57 1.10 1.27 1.44 1.26 1.15 1.08 0.61 1.08 1.14 1.36 1.21 1.07 0.99 52,5oC 0.39 0.64 0.85 1.17 0.98 0.91 0.79 0.54 0.91 1.07 1.38 1.23 1.14 0.96 0.59 0.73 0.92 1.23 1.06 0.96 0.82
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 pH 4,1 pH 4,6 pH 5,1
Hasil  analisis  variansi  (RAK)  menunjukkan bahwa  perlakuan  suhu,  pH  awal  serta  interaksi suhu dan pH awal berpengaruh sangat signifikan (p  <  0,01)  terhadap  rata-rata  kadar  pektin  kasar ekstrak  pulp  biji  kakao  per  hari.  Rata-rata  kadar pektin kasar ekstrak pulp biji kakao per hari selama inkubasi pada variasi kondisi enzim PG disajikan pada Tabel 2.
Berdasarkan  Tabel  2  dapat  dikemukakan bahwa  rata-rata  kadar  pektin  kasar  ekstrak pulp  biji  kakao  per  hari  selama  6  hari  inkubasi meningkat secara signifikan sejalan dengan makin bertambahnya suhu dan pH awal sampai pada suhu 47,5° C dan pH awal 4,6, tetapi kemudian menurun dengan makin tingginya suhu dan pH awal.
Rata-rata kadar pektin kasar ekstrak pulp biji kakao  per  hari  selama  inkubasi  tertinggi  dicapai pada  kombinasi  perlakuan  suhu  47,5° C  dan  pH awal 4,6 dan terendah pada kombinasi perlakuan suhu  32,5° C  dan  pH  awal  4,1.  Hal  demikian kemungkinan  berkaitan  dengan  pengaruh  suhu dan  pH  terhadap  aktivitas  enzim  PG  dalam mendepolimerisasi pektin pulp biji kakao.
Laju  aktivitas  enzim  akan  makin  meningkat sejalan  dengan  naiknya  suhu  yang  didukung dengan kondisi pH yang optimal, tetapi kemudian menurun  dengan  makin  tingginya  suhu  dan  pH awal.
Perubahan  kadar  asam  galakturonat  pada ekstrak  pulp  biiji  kakao  selama  inkubasi  pada masing-masing variasi kondisi enzim PG disajikan pada Gambar 3.
Berdasarkan  Gambar  3  dapat  dilihat  bahwa kadar  asam  galakturonat  pada  ekstrak  pulp  biji kakao  meningkat  dengan  makin  lama  waktu inkubasi  dan  mencapai  kadar  tertinggi  setelah inkubasi  2  hari  pada  suhu  32,5° C,  47,5° C,  52,5° C; dan 3 hari pada suhu 37,5° C dan 42,5° C, tetapi kemudian menurun dengan bertambahnya waktu inkubasi  untuk  masing-masing  variasi  pH  awal. Grafik perubahan kadar asam galakturonat ekstrak pulp biji kakao terbesar terjadi pada suhu 47,5° C dan terkecil pada suhu 32,5° C yang berlaku hampir sama untuk masing-masing pH awal. Hal demikian berhubungan  dengan  pengaruh  suhu  terhadap
Gambar 3. Grafik perubahan kadar asam galakturonat ekstrak pulp biji kakao selama 6 hari inkubasi pada variasi kondisi enzim PG 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Waktu inkubasi (hari) K ad ar as am g al ak tu ro na t ( % ) 32,5oC 6.00 6.88 7.04 6.67 6.12 5.75 4.30 4.93 6.24 6.48 6.07 5.64 4.37 4.10
4.77 5.68 5.84 5.39 4.73 3.55 3.38 37,5oC 5.97 7.65 7.90 8.38 7.43 6.86 5.82 5.02 6.54 8.16 9.02 8.18 7.28 6.85 4.71 5.97 7.63 8.15 7.19 6.52 5.67 42,5oC 6.08 7.78 8.32 9.07 8.65 8.24 7.16 5.13 6.85 8.72 10.0 9.78 9.07 7.83 4.61 6.46 7.74 9.48 8.59 8.17 6.96 47,5oC 5.91 7.81 9.72 9.10 8.34 8.29 7.82 4.98 7.64 10.5 10.2 8.69 8.56 7.91 4.62 7.02 9.64 8.92 8.56 8.19 7.53 52,5oC 6.02 8.46 9.43 9.31 7.48 7.29 6.80 5.17 8.36 10.0 9.35 8.84 7.38 6.89 4.82 7.70 9.07 7.87 7.70 7.16 6.59
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 pH 4,1 pH 4,6
pH 5,1
mekanisme reaksi enzimatis oleh enzim PG. Pada suhu yang lebih tinggi (47,5° C dan 52,5° C) proses depolimerisasi pektin pulp berlangsung lebih cepat sehingga  lebih  banyak  asam  galakturonat  yang terkandung dalam ekstrak pulp biji kakao.
Selanjutnya  mengalami  penurunan  walaupun proses  depolimerisasi  pektin  terus  berlangsung, karena  sebagian  asam  galakturonat  yang terbentuk terdispersi dalam cairan pulp yang ikut menetes  keluar.  Fox  (1991)  dan  Whitaker  (1996) mengemukakan  bahwa  enzim  PG  menghidrolisis ikatan glikosidik antar unit-unit asam galakturonat yang berdekatan dengan gugus karboksilat bebas. Hal  ini  menyebabkan  substrat  pektin  mengalami depolimerisasi membentuk unit-unit asam galakturonat.  Aktivitas  enzim  PG  akan  sangat ditentukan oleh suhu dan pH, pada suhu dan pH optimum akan berlangsung reaksi enzimatis yang maksimal.
Hasil  analisis  variansi  (RAK)  menunjukkan bahwa  perlakuan  suhu,  pH  awal  serta  interaksi suhu dan pH awal berpengaruh sangat signifikan (p  <  0,01)  terhadap  rata-rata  kadar  asam galakturonat  ekstrak  pulp  biji  kakao  per  hari. Rata-rata  kadar  asam  galakturonat  ekstrak  pulp
biji  kakao  per  hari  selama  inkubasi  pada  variasi kondisi enzim PG disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3. Rata-rata Kadar Asam Galaturonat (%) Ekstrak Pulp Biji Kakao Per Hari Selama Inkubasi pada Variasi Kondisi Enzim PG
Suhu ( o C) pH awal pulp 4,1 4,6 5,1 32,5 6,11 l 5,40 m 4,76 n 37,5 7,14 j 7,29 i 6,55 k 42,5 7,90 e 8,21 b 7,43 h 47,5 8,14 c 8,36 a 7,78 g 52,5 7,83 f 8,01 d 7,27 i
*) Huruf  yang  sama di  samping nilai  rata-rata menunjukkan tidak beda nyata pada uji BNT interaksi 5% (= 0,0305)
Berdasarkan  Tabel  3  dapat  dikemukakan bahwa rata-rata kadar asam galakturonat ekstrak pulp biji kakao per hari selama inkubasi cenderung meningkat secara signifikan sejalan dengan makin bertambahnya  suhu  dan  pH  awal,  kecuali  pada suhu  inkubasi  32,5° C  sampai  pada  suhu  47,5° C dan pH awal 4,6, tetapi kemudian menurun dengan makin  tinggi  suhu  dan  pH  awal.  Rata-rata  kadar
Putra, dkk: Optimasi Kondisi Depolimerisasi Pulp Biji Kakao
Gambar 4. Grafik perubahan kadar total asam ekstrak pulp biji kakao selama 6 hari inkubasi pada variasi kondisi enzim PG
0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 Waktu inkubasi (hari) K ad ar to ta l a sa m (m eq N aO H /g ) 32,5oC 0.176 0.1880.207 0.165 0.1490.137 0.129 0.1320.156 0.178 0.1490.124 0.119 0.106
0.112 0.136 0.1540.132 0.121 0.1130.102 37,5oC 0.175 0.1840.197 0.201 0.1760.162 0.137 0.1430.168 0.205 0.2130.195 0.174 0.154 0.110 0.146 0.1730.182 0.162 0.1430.125 42,5oC 0.182 0.1970.215 0.236 0.2020.192 0.176 0.1520.178 0.211 0.2440.213 0.199 0.185 0.109 0.156 0.1910.211 0.195 0.1820.160 47,5oC 0.171 0.2010.218 0.245 0.2180.190 0.183 0.1480.193 0.231 0.2560.224 0.215 0.194 0.109 0.162 0.1860.214 0.201 0.1850.172 52,5oC 0.180 0.1970.213 0.202 0.1900.182 0.171 0.1500.182 0.221 0.2100.198 0.184 0.180 0.115 0.154 0.1960.187 0.176 0.1680.163
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
pH 4,1
pH 4,6
pH 5,1
asam  galakturonat  ekstrak  pulp  biji  kakao  per hari  tertinggi  dicapai  pada  kombinasi  perlakuan suhu 47,5° C dan pH awal 4,6 dan terendah pada kombinasi  perlakuan  suhu  32,5° C  dan  pH  awal 5,1. Hal demikian juga berkaitan dengan pengaruh suhu dan pH terhadap aktivitas enzim PG dalam mendepolimerisasi  pektin  pulp  biji  kakao  untuk menghasilkan  asam  galakturonat.  Laju  aktivitas enzim  akan  makin  meningkat  sejalan  dengan naiknya  suhu  yang  didukung  dengan  kondisi  pH yang  optimal,  tetapi  kemudian  menurun  dengan makin tinggi suhu dan pH awal. Penurunan rata- rata  kadar  asam  galakturonat  ekstrak  pulp  biji kakao  per  hari  pada  suhu  lebih  tinggi  (52,5° C) terjadi karena aktivitas enzim PG menurun akibat rusaknya  enzim.  Fox  (1991),  mengemukakan bahwa  lebih  dari  80%  total  aktivitas  enzim  PG pada pepaya hilang dengan perlakuan suhu 85° C selama 10 menit, begitu pula PG pada alpukat akan kehilangan 60% aktivitasnya setelah diperlakukan pada suhu 50° C selama 10 menit.
Perubahan  kadar  total  asam  pada  ekstrak pulp  biji  kakao  selama  inkubasi  pada  masing- masing  variasi  kondisi  enzim  PG  disajikan  pada Gambar 4.
Pada  Gambar  4  dapat  dilihat  bahwa  kadar total asam pada ekstrak pulp biji kakao meningkat
dengan makin lama waktu inkubasi dan mencapai kadar  tertinggi  setelah  inkubasi  2  hari  pada suhu  32,5° C  dan  52,5° C;  dan  3  hari  pada  suhu 37,5°  C,  47,5° C  dan  42,5° C,  tetapi  kemudian menurun  dengan  bertambahnya  waktu  inkubasi untuk  masing-masing  variasi  pH  awal.  Grafik perubahan  kadar  total  asam  ekstrak  pulp  biji kakao  terbesar  terjadi  pada  suhu  47,5° C  dan terkecil  pada  suhu  32,5° C  yang  berlaku  hampir sama untuk masing-masing pH awal. Hal demikian berhubungan  dengan  pengaruh  suhu  terhadap mekanisme reaksi enzimatis oleh enzim PG  pada substrat  pektin  pulp.  Pada  suhu  tinggi  (52,5°  C) proses  depolimerisasi  pektin  pulp  berlangsung lebih cepat sehingga lebih banyak dihasilkan asam galakturonat  yang  akan  memberikan  kontribusi terhadap kadar total asam. Sedangkan pada suhu rendah  (32,5°  C),  peningkatan  kadar  total  asam kemungkinan  selain  disebabkan  oleh  mekanisme disimilasi  gula  pulp  menjadi  asam-asam  organik, juga  oleh  proses  depolimerisasi  pektin  pulp  yang juga berlangsung namun lebih lambat. Selanjutnya mengalami penurunan walaupun proses depolimerisasi  pektin  pulp  terus  berlangsung, karena sebagian asam galakturonat maupun asam organik  lain  yang  terbentuk,  terdispersi  dalam cairan pulp yang ikut menetes keluar. Sulistyowati
3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 Waktu inkubasi (hari) pH 32,5oC 4.14 4.15 4.23 4.25 4.32 4.37 4.43 4.54 4.27 4.33 4.45 4.50 4.54 4.61
5.14 4.80 4.55 4.61 4.73 4.83 4.85 37,5oC 4.12 4.21 4.25 4.32 4.46 4.48 4.50 4.58 4.46 4.38 4.48 4.62 4.70 4.72 5.06 4.92 4.78 4.86 4.95 5.02 5.04 42,5oC 4.06 4.20 4.29 4.31 4.34 4.44 4.52 4.50 4.54 4.60 4.65 4.68 4.72 4.75 5.13 4.98 5.00 5.03 5.06 5.08 5.10 47,5oC 4.11 4.40 4.52 4.60 4.72 4.75 4.78 4.58 4.64 4.69 4.76 4.83 4.90 5.02 5.09 4.88 4.95 5.01 5.03 5.07 5.12 52,5oC 4.16 4.41 4.66 4.71 4.79 4.83 4.94 4.55 4.63 4.85 4.88 4.93 4.97 5.08 5.12 4.98 5.13 5.18 5.20 5.22 5.22
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 pH 4,1 pH 4,6 pH 5,1
Gambar 5. Grafik perubahan pH ekstrak pulp biji kakao selama 6 hari inkubasi pada variasi kondisi enzim PG
(1988), menyebutkan bahwa pada pulp biji kakao yang  difermentasi  terdapat  asam-asam  organik, seperti: asam sitrat, laktat, asetat, tartrat, oksalat, malat, suksinat dan piruvat.
Hasil  analisis  variansi  (RAK)  menunjukkan bahwa  perlakuan  suhu,  pH  awal  serta  interaksi suhu dan pH awal berpengaruh sangat signifikan (p  <  0,01)  terhadap  rata-rata  kadar  total  asam ekstrak  pulp  biji  kakao  per  hari.  Rata-rata  kadar total asam ekstrak pulp biji kakao per hari selama inkubasi pada variasi kondisi enzim PG disajikan pada Tabel 4.
Tabel  4  dapat  dikemukakan  bahwa  rata-rata kadar total asam ekstrak pulp biji kakao per hari selama  inkubasi  cenderung  meningkat  secara signifikan  sejalan  dengan  makin  bertambahnya suhu  dan  pH  awal,  kecuali  pada  suhu  inkubasi 32,5° C,  sampai  pada  suhu  47,5° C  dan  pH  awal 4,6,  tetapi  kemudian  menurun  dengan  makin tinggi  suhu  dan  pH  awal.  Rata-rata  kadar  total asam  ekstrak  pulp  biji  kakao  per  hari  tertinggi dicapai  pada  kombinasi  perlakuan  suhu  47,5° C dan  pH  awal  4,6  dan  terendah  pada  kombinasi perlakuan  suhu  32,5° C  dan  pH  awal  5,1.  Hal demikian  kemungkinan  juga  berkaitan  dengan pengaruh  suhu  dan  pH  terhadap  aktivitas  enzim PG  dalam  mendepolimerisasi  pektin  pulp  biji kakao  untuk  menghasilkan  asam  galakturonat,
yang  berkontribusi  terhadap  kadar  total  asam. Laju  aktivitas  enzim  akan  makin  meningkat sejalan  dengan  naiknya  suhu  yang  didukung dengan kondisi pH yang optimal, tetapi kemudian menurun dengan makin tinggi suhu dan pH awal.
Perubahan pH ekstrak pulp biiji kakao selama inkubasi pada masing-masing variasi kondisi enzim PG disajikan pada Gambar 5.
Berdasarkan Gambar 5 dapat dilihat bahwa pH ekstrak pulp biji kakao meningkat selama inkubasi pada  masing-masing  suhu  dengan  pH  awal  4,1. Pada  pH  awal  4,6,  pH  ekstrak  pulp  biji  kakao cenderung  meningkat  selama  inkubasi,  kecuali
Tabel 4. Rata-rata Kadar Total Asam (meq NaOH/g) Ekstrak Pulp Biji Kakao Per Hari Selama Inkubasi pada Variasi Kondisi Enzim PG
Suhu ( o C) pH awal pulp 4,1 4,6 5,1 32,5 0,164 g 0,138 i 0,124 j 37,5 0,176 e 0,179 e 0,149 h 42,5 0,200 c 0,197 c 0,172 f 47,5 0,204 b 0,209 a 0,176 e 52,5 0,191 d 0,189 d 0,166 g *) Huruf  yang  sama di  samping nilai  rata-rata menunjukkan tidak beda nyata pada uji BNT interaksi 5% (= 0,0031)
Putra, dkk: Optimasi Kondisi Depolimerisasi Pulp Biji Kakao
pada  suhu  32,5° C  dan  37,5° C  yang  cenderung menurun  sampai  dengan  4  hari  inkubasi,  tetapi kemudian naik lagi. Sedangkan pada pH awal 5,1, pH  ekstrak  pulp  biji  kakao  cenderung  menurun selama  inkubasi,  kecuali  pada  52,5° C  terjadi peningkatan  setelah  2  hari  inkubasi.  Grafik peningkatan pH ekstrak pulp biji ka kao terbesar terjadi  pada  suhu  52,5° C  dan  terkecil  pada  suhu 32,5° C yang berlaku hampir sama untuk masing- masing pH awal. Kecenderungan peningkatan pH esktrak pulp biji kakao selama inkubasi dengan pH awal pulp lebih rendah (4,1 dan 4,6) kemungkinan terjadi  lebih  karena  faktor  metabolisme  asam sitrat yang terkandung dalam pulp, sebanyak 1–2% (Lopez, 1986), walaupun telah terjadi pembentukan asam galakturonat namun kontribusinya terhadap pH rendah karena termasuk asam yang lebih lemah daripada  asam  sitrat.  Sedangkan  kecenderungan terjadinya  sedikit  penurunan  pH  ekstrak  pulp yang diinkubasi dengan pH awal pulp lebih tinggi (5,1) karena total asam yang terbentuk lebih kecil dibandingkan  dengan  pH  awal  pulp  4,1  dan  4,6 (Tabel 4).
Hasil  analisis  variansi  (RAK)  menunjukkan bahwa  perlakuan  suhu,  pH  awal  serta  interaksi suhu dan pH awal berpengaruh sangat signifikan (p < 0,01) terhadap rata-rata perubahan pH ekstrak pulp  biji  kakao  per  hari.  Rata-rata  perubahan pH  ekstrak  pulp  biji  kakao  per  hari  hari  selama inkubasi pada variasi kondisi enzim PG disajikan pada Tabel 5.
Berdasarkan Tabel 5 dapat dikemukakan bahwa rata-rata perubahan pH ekstrak pulp biji kakao per
hari  selama  inkubasi  cenderung  menurun  secara signifikan  sejalan  dengan  makin  rendahnya  suhu dan  makin  bertambahnya  pH  awal  pulp,  kecuali pada pH awal pulp 5,1 terjadi peningkatan sejalan dengan  makin  rendahnya  suhu.  Rata-rata  nilai perubahan  pH  ekstrak  pulp  biji  kakao  per  hari tertinggi  dicapai  pada  kombinasi  perlakuan  suhu 52,5° C  dan  pH  awal  pulp  4,1  dan  terendah  pada kombinasi perlakuan suhu 37,5° C dan pH awal pulp 4,6. Hal ini sebagai implikasi dari kecenderungan menurunnya  pH  ekstrak  pulp  selama  inkubasi sejalan dengan makin rendahnya suhu dan makin bertambahnya  pH  awal  pulp,  kecuali  pada  pH awal pulp 5,1 yang cenderung terjadi peningkatan sejalan dengan makin rendahnya suhu.
Kondisi optimum depolimerisasi pulp biji kakao oleh  enzim  PG  ditentukan  dengan  uji  efektivitas terhadap  15  alternatif  perlakuan  variasi  kondisi optimum  enzim  PG.  Masing-masing  variabel pengamatan  ditetapkan  bobot  variabelnya, berturut-turut: 1,00 untuk berat cairan pulp; 0,80 untuk  pektin  kasar  dan  asam  galakturonat;  0,70 untuk total asam; dan 0,5 untuk nilai perubahan pH. Penetapan bobot variabel tersebut didasarkan atas kontribusi masing-masing variabel pada proses depolimeri-sasi  pulp  biji  kakao.  Persentase  berat cairan  pulp  mendapat  bobot  variabel  maksimal didasarkan  atas  tujuan  depolimerisasi  pulp  biji kakao,  yaitu  pulp  menjadi  rusak  terdisintegrasi membentuk  cairan  yang  menetes  keluar.  Hal  ini sangat  dikehendaki  pada  fermentasi  biji  kakao. Selanjutnya  kadar  pektin  dan  asam  galakturonat dengan bobot lebih rendah karena pektin sebagai substrat pada reaksi enzimatis oleh enzim PG, yang akan  menghasilkan  produk  asam  galakturonat. Berikutnya  kadar  total  asam,  mengingat  produk asam  galakturonat  hasil  depolimerisasi  pektin pulp  kemungkinan  akan  berkontribusi  terhadap total asam. Terakhir, perubahan pH karena asam- asam yang terbentuk juga akan mempengaruhi pH ekstrak pulp biji kakao.
Nilai  terbaik  dan  terjelek  adalah  hasil pengamatan tertinggi dan terendah pada masing- masing  variabel  pengamatan.  Nilai  tertinggi merupakan  hasil  maksimal  yang  dicapai  sebagai akibat  depolimerisasi  pulp  biji  kakao  oleh  enzim PG.  Dalam  hal  ini  terdapat  hubungan  yang proporsional  antara  besaran  nilai  masing-masing
Tabel 5. Rata-rata Perubahan Ph Ekstrak Pulp Biji Kakao Per Hari Selama Inkubasi pada Variasi Kondisi Enzim PG
Suhu ( o C) pH awal pulp 4,1 4,6 5,1 32,5 0,13 ef 0,08 f 0,35 bc 37,5 0,21 de 0,02 f 0,11 ef 42,5 0,25 cd 0,13 ef 0,08 f 47,5 0,44 ab 0,19 de 0,06 f 52,5 0,48 a 0,29 cd 0,03 f
*) Huruf  yang  sama disamping nilai  rata-rata menunjukkan tidak beda nyata pada uji BNT interaksi 5% (=0,1110)
variabel  pengamatan  dengan  kesempurnaan mekanisme proses depolimerisasi pulp biji kakao.
Hasil  uji  efektivitas  terhadap  alternatif- alternatif  perlakuan  diperoleh  bahwa  indeks efektivitas  tertinggi  adalah  sebesar  0,92. Berdasarkan  indeks  efektivitas  tersebut  maka alternatif  perlakuan  yang  ditetapkan  sebagai kondisi optimum depolimerisasi pulp biji kakao oleh enzim PG adalah suhu 47,5° C dan pH 4,6. Kondisi suhu optimum depolimerisasi lebih tinggi dari pada kondisi suhu optimum untuk aktivitas filtrat enzim PG  (42,5° C).  Hal  ini  kemungkinan  disebabkan oleh  keberadaan  enzim  PG  yang  terdapat  dalam pulp biji kakao, sehingga memerlukan tamabahan energi  (panas)  untuk  optimalisasi  aktivitasnya. Sedangkan  kondisi  pH  pulp  awal  optimum  sama dengan pH optimum untuk aktivitas enzim PG.

## SIMPULAN
Suhu dan pH awal pulp berpengaruh terhadap perubahan  karakteristik  pulp  biji  kakao  selama inkubasi pada proses depolimerisasi oleh enzim PG endojinus.
Kondisi depolimerisasi pulp biji kakao optimum oleh enzim PG endojinus adalah suhu 47,5° C dan pH awal pulp 4,6.
Perlakuan kondisi optimum tersebut menghasilkan total berat cairan pulp 18,29% selama 5  hari  inkubasi,  serta  rata-rata  per  hari  untuk kadar  pektin  1,12%,  kadar  asam  galakturonat 8,36%, kadar total asam 0,209 (meq NaOH/g), dan perubahan  pH  0,19  pada  ekstrak  pulp  biji  kakao yang diinkubasi selama 6 hari.

## DAFTAR PUSTAKA
Alamsyah,  T.S.,  1991.  Peranan  fermentasi  dalam pengolahan biji kakao kering. Suatu Tinjauan. Berita Perkebunan, 1(2): 97–103.
Carr, J.G. 1982. Cocoa. In A.H. Rose (Ed.). Fermented Foods. New York: Academic Press, Inc.
De Garmo, E.G., W.G. Sullivan dan J.R. Cerook., 1984. Engineering Economy. 7 th . Edition. New York: Macmilland Publ. Co.
Fox, P.F., 1991. Food Enzimology. Vol. 1. London. Elsevier Applied Science Publishers Ltd., p. 636.
Ganda  Putra,  G.P.,  Harijono,  T.  Susanto  dan  S. Kumalaningsih, 2006. Isolasi, karakterisasi dan optimasi enzim pektolitik endojinus pada pulp biji kakao. Prosiding Seminar Nasional Basic Science III di FMIPA-Universitas Brawijaya, Malang tanggal 25 Pebruari 2006.
Gardjito, M. dan Wardana, A.S., 2003. Hortikultura, Teknik Analisis Pasca Panen. Yogyakarta: Transmedia Mitra Printika.
Huang, L.K.dan R.R., Mahoney, 1999. Purification and characterization of an endo-polygalacturonase from Verticillium albo-atrum. J. App. Microb., 86 (1) : 145-156.
James, C.S., 1995. Analytical Chemistry of Foods. , London:
Blackie Academic & Professional.
Lopez, A.S., 1986. Chemical change occurring during the processing of cacao. Proceeding of The Cacao Biotechnology Symposium. Dept. Of Food Science College of Agricultutre, The Pennsylvania State University, Pennsylvania, USA.
Munoz, R. dan A.R. Barcelo, 1996. Enzymes. In L.M.L. Nollet (Ed.). Handbook of Food Analysis. Vol. 1. New York: Marcel Dekker, Inc.
Schwan, R.F. 1998. Cocoa fermentations conducted with a defined microbial cocktail inoculum. Appl. Environ Microbiol., 64(4): 1477–83.
Stephen, A.M. 1995. Food Polysaccharides and Their Applications.  New  York:  Marcel  Dekker,  Inc., p. 654.
Sudarmadji, S.B. Haryono dan Suhardi, 1997. Prosedur analisis untuk bahan makanan dan pertanian. Yogyakarta: Penerbit Liberty.
Sulistyowati, 1988. Keasaman biji kakao dan masalahnya. Pelita Perkebunan, 3(4): 151–8.
SNI 01-2323-1995. Standar Nasional Indonesia Biji Kakao. Dewan Standardisasi Nasional-DSN, Jakarta. Whitaker, J.R., 1996. Enzymes. In O. R. Fennema (Ed.). Food Chemistry. 3 rd Edition. New York: Maecel Dekker, Inc., p. 1067.
Winarno, F.G., 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama.