## PENGARUH 2-iP, BA, 2,4-D, DAN TDZ PADA EMBRIOGENESIS SOMATIK IN VITRO KOPI ROBUSTA UNGGUL LAMPUNG

## EFFECTS OF 2-IP, BA, 2,4-D, AND TDZ ON IN VITRO SOMATIC EMBRYOGENESIS  OF  SUPERIOR  ROBUSTA COFFEE  CLONE OF LAMPUNG
Dwi Hapsoro 1) , Dwi Setiawan 2 , Rahmadyah Hamiranti 3 , Yusnita 1
.
1 Dosen Jurusan Agroteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Lampung
2 Mahasiswa Agroteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Lampung
3 Mahasiswa  Magister Agronomi, Fakultas Pertanian Universitas Lampung Jl. Sumantri Brojonegoro No. 1 Bandar Lampung 35145 Email: dwi.hapsoro@fp.unila.ac.id HP. 081379155175

## ABSTRACT
Effects of 2-iP, BA, 2,4-D, and TDZ on In Vitro Somatic  Embryogenesis of Superior Robusta Coffee Clone of Lampung .  In vitro somatic embryogenesis of Robusta coffee consists of four stages i.e. primary callus induction, embryogenic callus induction, somatic embryo regeneration, and plantlet regeneration. This research aimed to investigate effects of plant growth regulators on primary callus induction in somatic embryogenesis of superior Robusta coffee of Lampung cv. Komari.  Leaf explants were cultured on primary callus induction medium supplemented with (mg/l): BA 1; 2-iP 1; 2-iP 1 + 2,4-D  0,5 ;2-iP 1 + 2,4-D 1 ;TDZ 1 + 2,4-D 0,5; and TDZ 1 + 2,4-D 1 as treatments.  The experiment was arranged in a completely randomized design with three repicates, one culture bottles per replication, five explants per bottle. Results of the experiment showed that after 4 weeks in culture all of the treatments resuted in 100% of primary callus induction, but led to different time of callus initiation and different callus weight.  The earliest callus initiation (14.7 days) was acchieved by treatment with 2-iP 1 mg/l, while  the latest (16.0-16.3 days)  was acchieved by treatment with TDZ + 0.5-1.0 mg/L 2,4- D and BA 1 mg/l.  The highest callus fresh weight was acchieved by treatments with 2-iP + 2,4-D (96-110 mg/ explant) while the lowest was with  2-iP only or BA only (24-18 mg/explant).  Primary calluses developed to become embryogenic when subcultured to embryogenic callus induction medium. Upon subculture to somatic embryo regeneration medium, the embryogenic calluses developed into somatic embryos.
Key Words: Coffea canephora Pierre ex Froe, embriogenic, primary callus, Komari.

## ABSTRAK
Pengaruh 2-iP, BA, 2,4-D, dan TDZ pada Embriogenesis Somatik In Vitro Kopi Robusta Unggul Lampung. Embriogenesis somatik in vitro kopi Robusta terdiri dari empat tahap: induksi kalus primer, induksi kalus embriogenik, regenerasi embrio somatik, dan regenerasi planlet.  Penelitian bertujuan mempelajari pengaruh zat pengatur tumbuh (ZPT) terhadap pembentukan kalus primer kopi Robusta unggul Lampung klon Komari. Eksplan potongan daun ditanam pada media induksi kalus primer dengan  penambahan (mg/l): BA 1; 2-iP 1; 2-iP 1 + 2,4-
D  0,5 ;2-iP 1 + 2,4-D 1 ;TDZ 1 + 2,4-D 0,5; dan TDZ 1 + 2,4-D 1 sebagai perlakuan.  Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap dengan tiga ulangan, 3 botol kultur per ulangan, 5 eksplan per botol.  Hasil percobaan menunjukkan, pada 4 minggu setelah tanam, semua perlakuan dapat menginduksi kalus primer 100%, namun waktu terbentuknya kalus pertama kali dan bobot segar kalus primer berbeda-beda.  Kalus primer paling cepat terbentuk pada perlakuan 2-iP (14,7 hari setelah tanam), sedangkan paling lambat (16,0-16,3) pada perlakuan TDZ + 0,5-1,0 mg/L 2,4-D dan BA 1 mg/l.  Bobot segar kalus primer tertinggi didapat pada perlakuan 2-iP + 2,4-D (96-110 mg/eksplan) dan terkecil pada perlakuan 2-iP atau BA saja (24-18 mg/eksplan).  Kalus primer berkembang menjadi kalus embriogenik waktu dipindah ke media induksi kalus embriogenik.  Subkultur kalus embriogenik ke media regenerasi menghasilkan embrio somatik.
Kata kunci: Coffea canephora Pierre ex Froe, embriogenik, kalus primer, Komari.

## PENDAHULUAN
Indonesia  adalah  negara  penghasil  kopi keempat terbesar di dunia setelah Brazil, Vietnam dan Kolombia (Worldatlas, 2019).  Dalam perdagangan kopi dunia, terdapat dua jenis kopi terpenting yaitu kopi arabika ( Coffea arabica L.) dan kopi robusta ( C. Canephora Pierre ex Froehner).  Pangsa pasar kopi dunia  didominasi  oleh  kopi  arabika.  Walaupun demikian, proporsi dominasi pasar kopi arabika telah menurun yaitu  dari 76,5% pada tahun 1979 menjadi 57,6% pada tahun 2013.  Hal ini berarti peningkatan pangsa pasar kopi robusta telah mengalami kenaikan dari 23,5% pada tahun 1979 menjadi 42,4% pada tahun 2013 (Hartatri et al ., 2016).  Di Indonesia, budidaya kopi didominasi oleh kopi robusta, yaitu mencapai 85% dari produksi kopi nasional, dan hanya 15%-nya  kopi  arabika  (Direktorat  Jenderal Perkebunan, 2015).
Budidaya kopi di Indonesia didominasi oleh perkebunan  rakyat  (95%)  dan  sisanya  adalah perkebunan besar negara (3%) dan perkebunan besar swasta  (2%).  Rata-rata  produktivitas  kopi  di perkebunan  besar  di  Indonesia  pada  tahun  2016
diperkirakan 855  kg /ha untuk  perkebunan besar nasional dan 864 kg/ha untuk perkebunan besar swasta, sedangkan produktivitas rata-rata perkebunan kopi rakyat 722 kg/ha (Direktorat Jenderal Perkebunan, 2015).  Angka ini jauh lebih rendah dibandingkan dengan rata-rata produktivitas kopi robusta di Brazil, yang mencapai 1800 kg/ha (USDA, 2016).
Di antara penyebab rendahnya produktivitas kopi robusta perkebunan rakyat adalah kultur teknis yang kurang intensif, yaitu  masalah ketersediaan bibit berkualitas dari klon-klon kopi unggul, pengaturan tata letak  penanaman  multiklonal  kopi  robusta  yang kompatibel satu sama lain, dan pemeliharaan tanaman yang kurang optimal yang meliputi pemangkasan, pemupukan,  pengairan,  pengendalian  organisme pengganggu tanaman, dan peremajaan tanaman tua yang sudah tidak produktif.  Bahan pertanaman yang digunakan  pada  perkebunan  kopi  rakyat  pada umumnya berasal dari biji.  Sifat kopi robusta yang allogamous atau menyerbuk silang menyebabkan tanaman-tanaman yang berasal dari biji mempunyai sifat beragam, walaupun dari pohon indukan yang sama.
Kopi  robusta  bersifat self-incompatible ,
sehingga pola penanaman multiklonal menggunakan klon-klon unggul yang kompatibel satu sama lain dapat meningkatkan hasil kopi secara signifikan. Oleh karena itu ketersediaan bibit kopi robusta berkualitas dari klon-klon unggul sangat penting untuk menjamin produktivitas tinggi. Perbanyakan klonal kopi secara konvensional umumnya dengan setek batang atau sambung pucuk. Cara-cara tersebut sebenarnya mudah dan murah, namun diperlukan sumber bahan setek dan entress atau batang atas dalam jumlah memadai. Salah satu alternatif perbanyakan klonal secara cepat untuk menghasilkan bibit kopi berkualitas adalah dengan teknik kultur jaringan, yaitu melalui pola regenerasi embriogenesis somatik.  Teknik ini dapat menghasilkan bibit yang true-to-type yang seragam dalam jumlah besar dalam waktu relatif singkat (Hapsoro dan Yusnita, 2018).
Keberhasilan embriogenesis somatik in vitro kopi  arabika  dan  robusta  telah  dilaporkan  oleh beberapa peneliti sebelumnya (Hatanaka et al. , 1991,
Samson et  al .,  2006  dan  Ibrahim et  al .,  2017).
Hatanaka et al . (1991) menyatakan bahwa sitokinin merupakan  faktor  yang  esensial  dalam  proses embriogenesis somatik kopi robusta dari eksplan daun. Sitokinin yang dapat digunakan untuk menginduksi kalus dan embrio somatik (ES) pada eksplan daun kopi adalah benzyladenine (BA), 2-isopentenyladenine (2-iP), dan thidiazuron (TDZ), sedangkan zat pengatur tumbuh (ZPT) golongan auksin yang sering digunakan sebagai campuran  dengan  sitokinin  adalah  2,4– dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Samson et al.
(2006) mendapatkan bahwa 84–100% eksplan yang
dikulturkan pada media yang mengandung sitokinin 2- iP (4,93  M) bersama-sama dengan auksin 2,4-D (2,25 M)  menghasilkan  kalus  embriogenik  dari eksplan daun kopi robusta dan arabika.  Ibrahim et al ., (2007) mendapatkan bahwa pemberian TDZ dan 2,4-D secara bersama-sama terbukti efektif untuk menginduksi kalus embriogenik pada eksplan daun kopi Robusta.
Berbagai bukti telah terdokumentasi bahwa respons regenerasi pada kultur in vitro tanaman sangat dipengaruhi oleh genotipe tanaman dan jenis dan konsentrasi ZPT yang terkandung di media kultur (Hapsoro dan Yusnita, 2018). Respons pembentukan kalus dan ES terhadap ZPT sangat dipengaruhi oleh genotipe tanaman yang dikulturkan. Penelitian ini bertujuan  untuk  mempelajari  pengaruh  jenis  dan konsentrasi ZPT, yang terdiri dari beberapa sitokinin (2-iP,  BA  atau TDZ)  dan  auksin  2,4-D  terhadap pembentukan  kalus  primer  kopi  Robusta  unggul Lampung cv. Komari.

## METODE PENELITIAN Bahan Tanaman
Penelitian dilakukan dari bulan April 2018 - Oktober 2019.  Eksplan berupa potongan daun muda (panjang 7-12 cm) kopi Robusta klon ‘Komari’ dari Lampung, Indonesia.  Eksplan dicuci dengan deterjen cair, dibilas dengan air mengalir,  direndam dalam larutan fungisida mankozeb 2 g/l selama 15 menit, lalu dibilas dengan air mengalir. Eksplan dicelupkan dalam etanol 70% selama 3 detik lalu dibilas dengan air steril sebanyak tiga kali. Selanjutnya eksplan direndam-
kocok  dalam  larutan  pemutih  komersial  (NaOCl 5,25%) dengan konsentrasi 10% selama 7 menit,  lalu dibilas dengan air steril sebanyak tiga kali.

## Media Kultur
Media kultur yang digunakan adalah media induksi  kalus  primer (IKP),  media induksi  kalus embriogenik (IKE), dan media regenerasi embrio somatik (RES) (Samson et al (2006) (Tabel 1), yang merupakan modifikasi dari media dasar Murashige dan Skoog (1962). Ke dalam media  IKP ditambahkan zat pengatur tumbuh (ZPT) sesuai perlakuan. Keasaman
media ditetapkan pada pH 5,8 dengan penambahan KOH  1N atau  HCl  1N.  Sebagai  pemadat  media digunakan 7 g/l agar-agar. Media dipanaskan  hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam botol-botol kultur (ukuran 250 ml), 25 ml/botol. Botol ditutup dengan lembaran plastik tahan panas. Media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan 1,2 kg/cm 2 selama 15 menit.

## Penanaman Eksplan dan Subkultur
Eksplan  berukuran  5  x  5  mm  dengan menyertakan bagian tulang daun samping. Eksplan
Komponen Media Media Induksi Kalus Primer (IKP) (mg/l) Media Induksi Kalus Embriogenik (IKE) (mg/l) Media Regenerasi Embrio Somatik  (RES) (mg/l) NH 4 NO 3 250 825 825 KNO 3 400 950 950 Ca(NO 3 ) 2 .4H 2 O 300 - - MgSO 4 .7H 2 O 90 185 185 KH 2 PO 4 85 85 85 CaCl 2 .2H 2 O 160 220 220 H 3 BO 3 3,1 3,1 3,1 CuSO 4 .5H 2 O 0,0125 0,0125 0,0125 MnSO 4 .H 2 O 90,3 11,2 11,2 Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0,125 0,125 0,125 ZnSO 4 .7H 2 O 4,3 4,3 4,3 CoCl 2 . 6H 2 O - 0,025 0,025 KI - 0,83 0,83 Tiamin-HCl 15 20 10 Asam Nikotinat 1 - 1 Piridoxin 1 - 1 Mio Inositol 130 200 200 Glysin - 20 2 Cystein - 40 - Adenin Sulfat - 60 40 Kasein Hidrolisat - 200 400 FeSO 4 .7H 2 O 27,8 27,8 27,8 Na 2 EDTA 37,3 37,3 37,3 Asam Askorbat 200 200 - Asam Sitrat 150 150 - Sukrosa 30000 30000 35000 BA Sesuai perlakuan 4 - 2,4-D Sesuai perlakuan 1 - TDZ Sesuai perlakuan - - 2-iP Sesuai perlakuan - - Kinetin - - 2
Tabel 1. Komposisi media induksi kalus primer (IKP), induksi kalus embriogenik (IKE) dan regenerasi embrio somatik berdasarkan Samson et al .(2006).
dikulturkan pada media IKP selama 4 minggu, 5 eksplan per botol, dengan permukaan adaksial menempel pada media. Pada akhir minggu ke-4 di media IKP, bobot kalus yang terbentuk dihitung, yang merupakan selisih antara bobot eksplan bersama kalus yang terbentuk dan bobot eksplan sebelum dikulturkan.  Eksplan dengan kalus primer ini lalu dikulturkan pada media IKE selama 4 minggu untuk merangsang pembentukan kalus embriogenik. Banyaknya kalus yang berwarna putih, yang akan menghasilkan kalus embriogenik diukur  dengan  cara  skoring  (Gambar  1).  Kalus disubkultur ke media yang sama untuk merangsang pembentukan dan proliferasi kalus embriogenik.  Kultur diinkubasi dalam gelap dalam ruang kultur pada suhu 24±2 o C.    Kalus-kalus  embriogenik  diseleksi  lalu dikulturkan pada media RES untuk regenerasi embrio somatik pada kondisi terang pada suhu 24±2 o C.

## Rancangan Percobaan
Perlakuan berupa penambahan ZPT ke dalam media IKP, yaitu: (1) BA 1 mg/ L; (2) 2-iP 1 mg/ L; (3) 2-iP 1 mg/ L + 2,4-D  0,5 mg/L; (4) 2-iP 1 mg/ L + 2,4-D 1 mg/ L; (5) TDZ 1 mg/L + 2,4-D 0,5 mg/L; dan (6) TDZ 1 mg/L + 2,4-D 1 mg/L. Percobaan
menggunakan  rancangan  acak  lengkap  dengan  3 ulangan. Masing-masing satuan percobaan terdiri atas 3 botol kultur, 5 eksplan/botol.  Homogenitas data diuji dengan uji Barlett dan dilanjutkan analisis ragam dengan pemisahan nilai tengah menggunakan uji beda nyata terkecil (BNT) pada taraf 5%. Variabel yang diamati yaitu waktu terbentuk kalus primer, persentase eksplan berkalus,  bobot  segar  kalus  primer,  dan  skor pembentukan  kalus  putih.    Penentuan  skor pembentukan kalus putih dilakukan menurut kriteria yang disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1.    Skor jumlah kalus warna putih yang terbentuk ditentukan berdasarkan persentase keliling potongan eksplan yang ditumbuhi kalus putih. (a) skor 1 (0-25%), (b) skor 2 (>25-50%), (c) skor 3 ( >50- 75%), dan (d) skor 4 (>75%)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Semua formulasi media induksi kalus primer (IKP) yang diuji menghasilkan persentase eksplan berkalus 100 %, namun kecepatan pembentukan dan banyaknya kalus berbeda-beda pada tiap perlakuan. Respons mulai terjadi pada saat eksplan berada pada 12 hari setelah tanam (HST) di media IKP, yang ditandai dengan pembengkakan pada bekas sayatan. Pada media perlakuan BA 1 mg/l dan 2-iP 1 mg/l, pembengkakan terjadi hanya pada bekas sayatan pada tulang daun, sedangkan pada media yang mengandung
2,4-D, pembengkakan terjadi pada bekas sayatan pada baik tulang daun maupun bagian daun yang tidak bertulang daun.Pembengkakan lalu diikuti dengan pembentukan kalus. Pembentukan kalus primer pada media yang tidak mengandung 2,4-D utamanya terjadi pada bekas sayatan tulang daun, sedangkan yang mengandung 2,4-D terjadi di seluruh bekas sayatan daun (Gambar 2).
Pembentukan kalus primer tercepat terjadi pada media perlakuan 2-iP 1 mg/l, yaitu 14,67 HST (hari setelah tanam) (Tabel 2).  Kombinasi dengan2,4- D menyebabkan pembentukan kalus primer lebih lambat, yaitu mulai terbentuk pada sekitar 15 HST. Perlakuan lainnya (BA 1 mg/l; TDZ 1 mg/l + 2,4-D 0,5  mg/l;  dan  TDZ    1  mg/l  +  2,4-D  1  mg/l) menyebabkan pembentukan kalus primer yang paling lambat, yaitu sekitar 16 HST (Tabel 2). Bobot kalus terbesar dihasilkan oleh eksplan yang dikulturkan pada media perlakuan 2-iP + 2,4-D 1 mg/l (110,1 mg) dan
Gambar 2.  Pembentukan kalus primer pada eksplan daun kopi Robusta yang dikulturkan in vitro selama 4 minggu di media induksi kalus primer (IKP) dengan berbagai perlakuan jenis dan konsentrasi ZPT (konsentrasi dalam mg/l):  (a) BA 1 ; (b) 2-iP 1; (c) 2-iP 1 + 2,4-D 0,5; (d) 2-iP 1 + 2,4-D 1; (e) TDZ 1 + 2,4-D 0,5 , dan (f) TDZ  1 + 2,4-D 1.
terkecil oleh eksplan yang dikulturkan pada media perlakuan BA 1 mg/l (18,4 mg).  Secara umum, media perlakuan ZPT tunggal menghasilkan bobot kalus primer yang lebih kecil (Tabel 2).
Pada media IKE kalus-kalus yang muncul sebagian berwarna putih, yang dapat berkembang menghasilkan kalus-kalus yang embriogenik. Oleh karena itu berapa banyak kalus putih yang terbentuk pada media IKE menjadi variabel penting. Data pada Tabel 1 menunjukkan bahwa perlakuan media 2-iP 1 mg/l + 2,4-D 1 mg/l menghasilkan jumlah kalus putih terbanyak, sedangkan yang terrendah dihasilkan oleh media perlakuan TDZ 1 mg/l + 2,4-D 1 mg/l. Kalus putih disubultur ke media yang sama, yaitu media IKEuntuk  merangsang  pembentukan  kalus embriogenik. Kalus putih mencoklat lalu muncul kalus embriogenik  (Gambar  3).  Kalus-kalus  ini  jika disubkultur pada media yang samaakan mengalami proliferasi.Kalus embriogenik ini jika disubkultur ke
media  regenerasi  embrio  somatik  (RES)  selama sedikitnya tiga periode pengulturan, masing-masing berdurasi 4 minggu akan menghasilkan embrio somatik (ES). Gambar 4 menunjukkan ES kopi pada berbagai stadia,  yaitu  globular  (G), heart  shaped (H)  dan cotiledonary (C).    Beberapa  SE  pada  fase cotiledonary berwarna hijau dan mulai berkecambah menjadi tanaman.
Embriogenesis somatik in vitro tanaman dapat dibagi menjadi dua fase, yaitu fase induksi dan fase ekspresi (Arnold, 2008).  Pada fase induksi eksplan dirangsang untuk membentuk kalus embriogenik, yaitu kalus  yang  terdiri  atas  sel-sel  yang  mempunyai kemampuan untuk membentuk embrio somatik. Kalus embriogenik dapat membelah-belah diri, terus tumbuh menjadi  semakin  banyak  dengan  tetap mempertahankan sifat embriogeniknya. Pada fase ekspresi kalus embriogenik ini berkembang menjadi embrio yang siap untuk berkecambah. Pada tanaman
Tabel 2. Pengaruh jenis dan konsentrasi ZPT terhadap saat mulai terbentuk kalus, bobot segar kalus, dan jumlah kalus putih pada kultur in vitro tanaman tebu dengan menggunakan potongan daun sebagai eksplan
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata menurut uji- BNT0,05  HST = hari setelah tanam; MST= minggu setelah tanam. Bobot segar kalus merupakan selisih antara bobot segar eksplan berkalus pada 4 MST dan bobot eksplan pada saat tanam pada media induksi kalus primer (IKP). Kalus putih adalah kalus pada media induksi kalus embriogenik (IKE), yang berwarna putih tidak transparan yang kemudian menghasilkan kalus embriogenik pada media yang sama. Jumlah kalus putih dinilai dengan skor pada 8 MST atau 4 MST pada media IKE. Nilai skor didasarkan pada kriteria pada Gambar 1.
No. Perlakuan Saat mulai terbentuk kalus (HST) Bobot segar kalus pada 4 MST (mg) Jumlah kalus putih (Nilai skor) 1. BA 1 mg/l 16,3 c 18,4 d 1,07 c 2. 2-iP 1 mg/l 14,7 a 24,0 d 1,11 c 3. 2-iP 1 mg/l + 2,4-D 0,5 mg/l 15,3 b 95,9 a 2,67 b 4. 2-iP 1 mg/l + 2,4-D 1 mg/l 15,3 b 110,1 a 1,18 c 5. TDZ 1 mg/l + 2,4-D 0,5 mg/l 16,0 c 77,7 b 1,18 c 6. TDZ 1 mg/l + 2,4-D 1 mg/l 16,2 c 56,4 c 0,42 d BNT 0,05 0,3 17,2 0,56
kopi, perbanyakan melalui embriogenesis somatik menggunakan tahap-tahap sebagai berikut: induksi kalus primer, induksi kalus embriogenik, regenerasi atau pembentukan embrio, dan regenerasi tanaman dari embrio (Samson et al. , 2006; Ducos et al. , 2007). Pada  penelitian  ini,  tahapan  utuh  tersebut  belum semuanya dilalui. Pada penelitian ini tahapan yang dilalui adalah baru sampai pada regenerasi embrio pada media regenerasi embrio somatik (RES).  Dalam hal ini semua kalus putih hasil induksi pada media induksi kalus primer (IKP) dapat menghasilkan kalus embriogenik pada waktu disubkultur pada media induksi kalus embriogenik (IKE) (Gambar 3).  Berdasarkan pada penampakan luar, kalus embriogenik dicirikan oleh warnanya yang kuning, friable , dan tersusun dalam dompolan (Campos et al. , 2017)
Seperti yang terjadi pada umumnya tanaman lain, pembentukan kalus diawali dengan pembengkakan pada luka bekas potongan daun. Fenomena ini juga
dilaporkan oleh Ibrahim dan Hartati (2017) pada kultur in vitro tanaman kopi Robusta. Pada percobaan kami, pada perlakuan sitokinin saja (2-iP atau BA saja) dalam media IKP, kalus terbentuk terutama pada luka sayatan pada tulang-tulang daun (Gambar 2ab), sedangkan yang menggunakan campuran sitokinin dan auksin kalus-kalus terbentuk di seluruh luka bekas sayatan, tidak hanya di bekas sayatan pada tulang daun (Gambar 2cdef).  Hal  ini  mungkin  berhubungan  dengan kandungan auksin dan sitokinin pada jaringan luka. Pada umumnya auksin dan sitokinin dibutuhkan untuk pembentukan  kalus.  Kondisi  ini  dipenuhi  pada perlakuan campuran auksin dan sitokinin (2-iP dan 2,4- D  dan  TDZ  dan  2,4-D)  yang  mengakibatkan pembentukan kalus pada seluruh luka bekas sayatan (Gambar 2cdef) . Di lain pihak, penggunaan sitokinin saja tentunya hanya akan mengakibatkan pembentukan kalus pada tempat-tempat yang sudah mengandung auksin dan tempat-tempat tersebut diantaranya adalah tulang-tulang daun (Gambar 2ab), yang adalah jaringan transport, yang merupakan jaringan vaskuler yang terdiri atas xilem dan floem. Jaringan vaskuler sudah diketahui
Gambar 3.   Pembentukan kalus embriogenik pada media induksi kalus embriogenik (IKE). (a) Kalus putih dengan struktur kompak pada 8 MST (minggu setelah tanam) atau 4 MST di media IKE. (b) Pencoklatan kalus putih, (c) kalus embriogenik berwarna kekuningan dengan struktur remah muncul dari kalus berwarna coklat pada 13-16 MST.
merupakan sarana transport jarak jauh fitohormon, termasuk auksin (Lacombe dan Achard, 2016; Kudo et al. , 2010; Bishopp et al. , 2011). Park et al. (2017) menyatakan bahwa salah satu mekanisme transport auksin dalam tanaman adalah dengan jalur-cepat, yaitu berupa transport pasif melalui pembuluh floem dari source ke sink .    Jadi  pembuluh  floem  selalu mengandung auksin, dan pembuluh floem merupakan bagian dari anatomi tulang daun.
Hasil  kajian  oleh  Etienne et  al. (2018) menunjukkan bahwa pemberian auksin dari luar tidak dibutuhkan untuk pembentukan kalus embriogenik dan multiplikasinya pada embriogenesis in vitro pada sebagian besar genotipe tanaman kopi Robusta. Untuk proses itu,  ZPT dari luar yang dibutuhkan hanyalah sitokinin. Penggunaan sitokinin saja (yaitu benziladenin [BA]) sudah dilaporkan Ducos et al (2007) pada scaling  up produksi  bibit  kopi  Robusta  melalui embriogenesis  somatik.Pada  penelitian  kami  ini, sitokinin saja (yaitu 2-iP atau BA) mampu menginduksi pembentukan kalus primer. Penggunaan sitokinin saja yang berupa 2-iP pada embriogenesis tanaman kopi
in vitro juga dilaporkan oleh peneliti lain (Hatanaka et al. , 1991).Namun demikian, dalam penelitian kami, penggunaan auksin bersama-sama dengan sitokinin mampu meningkatkan efektivitas pembentukan kalus primer.  Dalam  hal  ini  media  induksi  kalus  yang mengandung 2-iP 1 mg/l dan 2,4-D 0,5 mg/l atau 1 mg/l adalah paling efektif di antara perlakuan yang dicobakan.  Meskipun  hasil  ini  mengkonfirmasi efektivitas penggunaan campuran ZPT tersebut yang dilaporkan oleh Samson et al. (2006), pada penelitian ini digunakan klon Komari, yang merupakan klon unggul kopi Robusta Lampung yang belum pernah dilaporkan. Di samping itu, perlakuan campuran ZPT tersebut ternyata tidak efektif untuk pembentukan kalus primer pada klon-klon kopi Robusta unggul Lampung lainnya (Hamiranti, 2019). Informasi ini sangat penting untuk pengembangan budidaya tanaman kopi di Lampung.
Pada penelitian kami ini, kalus primer dari
Gambar 4.   Regenerasi embrio somatik kopi Robusta in vitro pada media regenerasi embrio somatik (RES). Tampak banyak embrio somatik pada tahap globular (G), hati (H), torpedo (T), dan kotiledon (C) (berwarna hijau) yangmulai menjadi kecambah (tanda panah).
semua perlakuan dapat berkembang menjadi kalus embriogenik pada waktu dikulturkan pada media IKE. Kalus-kalus embriogenik yang terbentuk dapat melalui perkembangan untuk membentuk embrio somatik pada waktu dikulturkan pada media regenerasi embrio somatik (RES) (Gambar 4).

## KESIMPULAN
Dari hasil percobaan embriogenesis somatik kopi Robusta unggul Lampung cv. Komari, dapat disimpulkan  sebagai  berikut:  (1)  media  yang mengandung masing-masing 2-iP 1 mg/l, BA 1 mg/l, TDZ 1 mg/L + 2,4-D 0,5 mg/L, atau TDZ 1 mg/L + 2,4-D 1 mg/L dapat menginduksi pembentukan kalus primer; (2) penambahan 2,4-D 0,5 atau 1 mg/l pada media yang mengandung 2-iP 1 mg/l  menyebabkan peningkatan secara signifikan bobot basah kalus primer; dan (3) media yang mengandung campuran 2-iP 1 mg/
l  dan  2,4-D  0,5  mg/l  atau  2,4-D  1  mg/l  adalah penginduksi kalus primer paling efektif di antara perlakuan  yang  dicobakan.Kalus  primer  dapat berkembang menjadi kalus embriogenik pada media induksi kalus embriogenik, lalu kalus embriogenik dapat berkembang menjadi embrio somatik pada media regenerasi embrio somatik.

## DAFTAR PUSTAKA
Arnold, S.V. 2008. Somatic embryogenesis. In E.F. George, M.A. Hall, and G.J. DeKLerk (Eds.) Plant Propagation by Tissue Culture. 3rd Edition. Vol 1 . The Background. Springer. AA Dordrecht, The Netherlands.
Bishopp, A., S. Lehesranta, A.Vaten,H. Help, S. El- Showk, B. Scheres,K. Helariutta, A. Pekka Mahonen, H. Sakakibara, and Y. Helariutta. 2011. Phloem-transported cytokinin regulates polar auxin transport and maintains vascular pattern in the root meristem. Current Biology 21: 927–932.
Direktorat  Jenderal  Perkebunan,  2015.  Statistika Perkebunan Indonesia: Kopi.
Ducos, J.P., G. Labbe, C. Lambot, and V. Pétiard. 2007. Pilot scale process for the production of pre-germinated somatic embryos ofselected robusta ( Coffea canephora ) clones. In vitro Cellular and Developmental Biology - Plant, 43(6):652-659.
Etienne, H., D. Breton, J. C.  Breitler, B. Bertrand, E. Déchamp, R. Awada, P. Marraccini,  S. Léran, E. Alpizar, C. Campa, P. Courte, F. Georget, andJ.P.  Ducos.    2018.  Coffee  somatic embryogenesis: how did research, experience
gained  and  innovations  promote  the commercial propagation of rlite clones from the two  cultivated  species?Front.  Plant  Sci. 9:1630.doi: 10.3389/fpls.2018.01630.
Hapsoro, D. dan Yusnita. 2018. Kultur Jaringan: Teori dan Praktik. Andi Publisher. Yogyakarta. 167 hal.
Hamiranti, R. 2019. Embriogenesis Somatik In Vitro Kopi Robusta ( Coffea canephora Pierre ex Froehner)  Klon  Unggul  Lokal  Lampung. Thesis.  Program  Pascasarjana,  Magister Agronomi, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung. 52 hal.
Hartatri, D.F.S., S. Mawardi dan T. Wahyudi. 2016. Ekonomi Kopi, dalam: Kopi: Sejarah, Botani, Proses Produksi, Pengolahan, Produk Hilir dan Sistem  Kemitraan  (Editor:  T.  Wahyudi, Pujiyanto, Misnawi). Pusat Penelitian Kopi dan Kakao  Indonesia.  Gajah  Mada  University Press (hlm 1-18).
Hatanaka, T., O. Arakawa, T. Yasuda, N. Uchida, dan T. Yamaguchi. 1991. Effect of plant growth regulators on somatic embryogenesis in leaf cultures  of Coffea  canephora .  Plant  Cell Reports 10:179-182.
Ibrahim, M. S. D. dan R. S. Hartati. 2017. Peningkatan induksi kalus embriogenik dan konversi embrio somatik kopi robusta klon BP 308. Jurnal Tanaman Industri dan Penyegar 4 (3): 121- 132.
Kudo,  T.,  T.  Kiba,  and  H.  Sakakibara.  2010. Metabolism and long-distancetranslocation of cytokinins. J. Integr. Plant Biol. 52, 53–60.
Lacombe, B. and P. Achard. 2016. Long-distance transport of phytohormones through the plant vascular system.  Current Opinion in Plant Biology 34:1-8.
Murashige T. and F. Skoog.  1962.  A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
Park, J., Y.Lee., E. Martinoia, and M. Geisler. 2017.
Plant hormone transporters: what we know and what we would like to know. BMC Biology (2017)  15:93.DOI  10.1186/s12915-017- 0443-x
Samson, N.P., C. Campa, L. Le Gal, M. Noirot, G. Thomas, T. S. Lokeswari, dan A.de Kochko. 2006.  Effect  of  primary  culture  medium composition  on  high  frequency  somatic embryogenesis in different Coffea species. Plant Cell Tiss Organ Cult 86:37–45.
USDA.  2016. Cofee:  World  Markets  and  Trade .
USDA Foreign Agricultural Service, December
2016 (http://www.fas.usda.gov/data/cofee- world-markets-and-trade)
Worldatlas, 2019. Top Coffee Producing Countries . https://www.worldatlas.com.  Diakses  12 Oktober 2019.