## Efek Penambahan Gula Terhadap Kestabilan Warna Ekstrak Fikosianin Spirulina
sp.
Sri Sedjati * , Ali Ridlo dan Endang Supriyantini
Jurusan Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro. Jl. Prof. Soedarto, SH. Kampus UNDIP Tembalang, Semarang 50275 E-mail : sedjati69@gmail.com

## Abstrak
Mikroalga Spirulina sp. memiliki kandungan fikosianin yang berpotensi untuk digunakan sebagai  pewarna  alami,  namun  fikosianin  tidak  stabil  terhadap  suhu,  cahaya,  pH,  dan oksigen, sehingga perlu ditambahkan pengawet. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh  pengawet  gula  terhadap  kestabilan  fikosianin  yang  diekstraksi  dari Spirulina sp. Spirulina sp  diekstraksi dengan akuades dan larutan buffer  fosfat pH 7.  Efek penambahan gula  diamati  selama  14  hari  penyimpanan  pada  suhu  kamar  (30±3 0 C).  Stabilitas  pigmen diamati berdasar nilai konsentrasi relatifnya (C R ). Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar fikosianin Spirulina sp.  yang  diekstraksi  dengan  aquades  adalah  45,16±1,13  mg/g  dw, sedangkan  untuk  ekstrak  dengan  pelarut  buffer  fosfat  pH  7  adalah  760,51±0,11  mg/g  dw. Penambahan  gula  fruktosa  5%  memberikan  hasil  yang  paling  efektif  selama  14  hari penyimpanan suhu kamar 30±3 0 C, konsentrasi relatif yang tersisa sebesar 19,39 %, sedangkan tanpa  pengawet  konsentrasi  relatif  hanya  10,57  %.  Secara  umum  penambahan  gula (sukrosa,  fruktosa  dan  glukosa  5%  dan  10%  b/v)  mampu  meningkatkan  konsentrasi  relatif menjadi 12,12-19,39%.
Kata kunci : Fikosianin, Spirulina sp,  gula, Aktivitas Antioksidan

## Abstract
Microalga Spirulina sp.  has a high content of phycocyanin. Phycocyanin has potential as  a  natural blue  colorant.  Phycocyanin is  not  stable  against  temperature,  light,  pH  and oxygent.  Preservatives  are  food  additives  commonly  used  to  preserve  unstable  food.  The purpose of this research was to screening sugar preservatives for phycocyanin. The effect of selected sugar preservatives, sucrose, glucose and fructose on the stability of phycocyanin at room temperature (30±3 0 C) was studied in aqueous solution for 14 days.    Pigment stability after  14  days  storages  was  observed  from  concentration  relative  (C R )  value.    The  result showed  that  phycocyanin  content  in  aquadest  extract  was  45,16±1,13  mg/g  dw.  The  C R value remained at approximately 12,12-19,39% after storage for 14 days at room temperature when sugar preservatives (sucrose, glucose and fructose  5% and 10% w/v) was added, while without preservatives C R value decreased to 10,57%. The highest stability of the phycocyanin solution was found in adding fructose 5% (C R value = 19,39%).
Keywords : Phycocyanin, Spirulina sp., Sugar, Antioxidant Activity

## PENDAHULUAN
Kelompok  pigmen  fikosianin  dapat mamancarkan  warna  biru  (Prasanna et al .,2007),  sehingga  berpotensi  untuk dikembangkan  sebagai  pewarna  biru alami.  Pemberitaan  informasi tentang
bahaya/efek  negatif  pewarna  sintetis meningkatkan kesadaran masyarakat untuk  kembali  menggunakan  produk pewarna  alami.  Saat  ini  pewarna  alami pada umumnya berbahan dasar tumbuhan  tingkat  tinggi seperti  daun pandan,  daun  suji,  kunyit  dan  hanya
dimanfaatkan  secara  tradisional.  Secara komersial,  keberadaan  pewarna  alami kalah  bersaing  dengan  pewarna  sintetis yang banyak dijual di pasaran.
Kendala  dalam  proses  eksplorasi pigmen alami adalah rendahnya kestabilan warna baik ketika proses ekstrasi, pemurnian, maupun selama penyimpanan. Fikosianin
akan
pudar warnanya (terdenaturasi)  pada  suhu  di  atas  45 ο C atau pada pH di bawah 4 (stabil pada pH 4-9), namun fikosianin memiliki keunggulan, yaitu  menghasilkan  warna  biru  cerah  dan cemerlang  (Sarada et  al .,  1999;  Jespersen et al ., 2005; Yan et al ., 2011).
Spirulina sp.  merupakan  mikroalga hijau-biru yang kaya pigmen. Pigmen yang terdapat di dalam
Spirulina
sp. dikelompokkan  menjadi  tiga  kelas:  (1) klorofil  a  terdiri  dari  1,7%  dari  berat  sel,  (2) karotenoid dan xantofil yang berkisar  0,5% dari  berat  sel,  (3)  fikobiliprotein/fikobilin yaitu  fikosianin  dan  allofikosianin  yang secara  normal  terdiri  dari  20%  protein seluler  dan  secara  kuantitatif  merupakan pigmen  yang  paling  dominan  pada Spirulina (Richmond, 1988).
Pigmen  fikobilin  merupakan  pigmen yang  berasosiasi  dengan  protein  dan bersifat  polar  serta  larut  air,    dapat diekstrak  dengan  menggunakan  pelarut aquades  atau  buffer  (Masojidek et  al ., 2004).  Berdasarkan  hal  tersebut,  perlu dilakukan  penelitian  tentang  pengaruh penambahan  bahan  pengawet terhadap kestabilan fikosianin yang diekstrak sehingga  bisa  menambah  daya  simpan. Penambahan  gula  dicoba  sebagai alternatif  pengawet  karena  bersifat  alami dan  aman  dikonsumsi  sebagai    bahan pangan.
Fikosianin  harus  melalui  berbagai tahapan  agar  memenuhi  syarat  sebagai pewarna  alami,  yaitu:  pengendapan  dan pemurnian.    Kemurnian  ini  diukur  berdasar rasio  A 620 /A 280 ,  pengukuran    A 620 adalah nilai absorbansi fikosianin  (  = 620 nm) dan A 280 adalah nilai absorbansi protein (  = 280 nm).  Kriteria  kemurnian  fikosianin  untuk pangan  ( food  grade )  minimal  sama dengan  0,7.    Beberapa    penelitian  bisa
menghasilkan kemurnian 0,7  tanpa proses pemurnian.      Proses  pemurnian  secara kromatografi  dilakukan  untuk  memperoleh fikosianin  murni  dengan  tingkat  kemurnian di  atas  4,0  ( analytical  grade )  (Rito- Palomares et.al ., 2001; Hemlata et al ., 2011; Prabuthas et al ., 2011).

## MATERI DAN METODE
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan Juni – November  2014,  di  Laboratorium Marine Station Teluk Awur, Jepara, Fakultas Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,  Universitas Diponegoro.  Bahan  yang  dipakai  dalam penelitian ini adalah mikroalga Spirulina sp . komersial produksi Indonesia dalam  bentuk kering  (bubuk).    Bahan-bahan  kimia  yang dipakai  untuk  ekstraksi  dan  analisis  adalah aquades,  gula  (fruktosa,  glukosa  dan sukrosa p.a) dan kertas saring Whatman no. 42.  Alat-alat  yang  digunakan  meliputi neraca  analitik,  mortar  dan  penggerus, vortex, refrigerator, sentrifuse dan spektrofotometer UV-Vis.
Prosedur  kerja  penelitian  terdiri  dari beberapa  tahap,  yaitu:  ekstraksi  pigmen fikosianin,  penambahan  gula  dan  analisis kadar  pigmen  fikosianin.  Metode  ekstraksi yang digunakan adalah metode coldmaceration dan freezing- thawing .Sampel kering Spirulina sp. digerus dengan  mortar  sampai  halus.  Sampel dimaserasi menggunakan pelarut aquades dengan perbandingan 1:100 (w/v), kemudian  dihomogenasi  dengan  vortex selama  1  menit.  Sampel  dibekukan  dalam freezer selama  12  jam,  setelah  itu  sampel beku  dicairkan  selama  12  jam  pada  suhu kamar  (1  siklus  metode freezing-thawing ) (dilakukan  sebanyak  2  siklus),  lalu  disaring. Filtrat  disentrifugasi dengan  kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Larutan disaring dengan  kertas  saring  sehingga  di  peroleh ekstrak kasar fikosianin Spirulina sp .

## Penentuan  Spektra  Absorbansi  Pigmen
Fikosianin Filtrat diukur absorbansinya menggunakan  spektrofotometer pada kisaran  panjang gelombang 280 – 750 nm. Serapan  maksimum  fikosianin  terletak
pada  panjang  gelombang  610 – 620  nm (Prasanna et al ., 2010; Saleh et.al ., 2011).

## Analisis Kadar Fikosianin
Filtrat fikosianin diukur  absorbansinya menggunakan  Spektrofotometer  UV-VIS pada panjang gelombang 280 nm, 620 nm dan  650  nm.    Kadar    fikosianin  dihitung dengan  metode  Bennet  dan  Bogorad (1973), sebagai berikut :
PC (mg/g)   = PC (mg.mL -1 ) x V p /DW Di mana : PC : Kadar Phycocyanin A 620 : Nilai Absorbansi pada
620 nm A 650 : Nilai Absorbansi pada 650 nm V p : Volume pelarut (ml) DW : Berat kering (g)

## Uji Kestabilan Warna
Stabilitas  larutan  fikosianin  selama masa  penyimpanan  suhu  kamar  dilakukan dengan  menambahkan  bahan  pengawet gula  (sukrosa,  glukosa,  fruktosa,  masing- masing  dengan  konsentrasi  5%  dan  10% (b/v)).  Sebagai  pembanding  adalah pengawet  sintetis  asam  benzoat  (kontrol positif)  dan  tanpa  gula  (kontrol  negatif). Masing-masing  gula  ditambahkan  ke dalam  10  ml  larutan  ekstrak  fikosianin  dan disimpan  pada  suhu  kamar    30  ±  3 o C. Kestabilan  warna  fikosianin  diuji  dengan menghitung  konsentrasi  relatif  pigmen
fikosianin selama masa penyimpanan yang telah ditentukan.
Di mana : C R : konsentrasi relatif Co : konsentrasi awal C : konsentrasi pada waktu penyimpanan

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Fikosianin  yang  diekstrak  dengan pelarut  aquades  menghasilkan  pola spektra dengan puncak serapan 620 nm.
Parameter kemurnian (A 620 /A 280 ) merupakan ukuran relatif berdasarkan rasio absorbansi pada  panjang  gelombang  620 nm dan 280 nm.
Tanpa  proses  pemurnian,  ekstrak kasar  fikosianin  sudah  bisa  mencapai tingkat  kemurnian  lebih  dari  0,7  (Tabel  1). Hasil  ini  sesuai  dengan  penelitiannya sebelumnya, kandungan  fikosianin  pada Spirulina sp.  berkisar 1-10%  berat  kering (Sedjati et  al., 2012) Kandungan  pigmen fikosianin  yang  tinggi  tersebut  menjadi daya  tarik  bagi  pengembangan  dan dianggap  memiliki  pasar  potensial  dalam industri  pangan  dan  kesehatan, karena pigmen fikosianin juga memiliki karakteristik antioksidan (Chrismandha et al., 2006).
Gambar  1 . Spektra Ekstrak Kasar Fikosianin yang Diekstraksi dengan Aquades (sampel:pelarut =1:100 b/v, pengenceran 5x, puncak  λ=620 nm)
Tabel 1. Kadar dan Kemurnian Fikosianin Pelarut [PC] (ppm) [PC] (mg/g sampel DW) Kemurnian (Rasio A620/A280) Aquades 451,65±11,26 45,16 1,61±0,05 Tabel 2 . Konsentrasi  Relatif    Pigmen  Fikosianin  setelah  Penambahan  Gula  selama Penyimpanan Suhu Kamar 30±3 0 C Jenis pengawet Konsentrasi Relatif PC (%) Hari ke- 0 2 5 9 14 PC+Fruktosa 5% 100,00 96,93 65,41 35,32 19,39 10% 100,00 97,46 64,06 22,14 17,15 PC+Glukosa 5% 100,00 93,15 43,92 22,77 13,18 10% 100,00 96,20 64,25 35,54 12,12 PC+Sukrosa 5% 100,00 80,04 73,33 44,33 16,42 10% 100,00 93,75 66,63 37,46 17,53 PC+A. Benzoat 200 ppm 100,00 92,29 70,44 37,84 25,80 Kontrol negatif 100,00 75,57 47,66 22,38 10,57
Kelemahan  fikosianin  adalah  mudah pudar  karena  proses  degradasi  alamiah.
Penambahan  bahan  pengawet  gula diharapkan dapat  memperpanjang  daya simpannya. Penentuan konsentrasi pengawet  asam  benzoat  (200  ppm)  dan gula  pasir  (5%  dan  10%)  berdasarkan peraturan  Badan  Pengawas  Obat  dan Makanan  (BPOM)  no.  36  Tahun  2013 tentang dosis bahan tambahan makanan. Konsentrasi maksimum asam benzoat yang diijinkan  adalah  400  ppm  untuk  minuman berperisa berkarbonase atau tidak berkarbonase.  Peraturan penambahan gula  pasir  pada  bahan  makanan  minimal 3% dari bahan makanan.
Bahan
pengawet gula
yang menghasilkan penurunan konsentrasi relatif terkecil adalah pengawet gula  fruktosa 5% yang
dicoba selama penelitian.
Penambahan  fruktosa  sebanyak  5% mampu  menghasilkan  konsentrasi  relatif dua  kali  lipat  dibanding  kontrol  negatif (tanpa  pengawet).    Kemampuan  5% fruktosa
dalam mempertahankan kestabilan  pigmen  fikosianin  mendekati asam benzoat 200 ppm.
Fikosianin  dalam  pelarut  aquades lebih  stabil  dengan  pengawet  asam
benzoat  (200  ppm)  pada  suhu  30  ±  3 o C  . Konsentrasi  fikosianin  tanpa  penambahan pengawet  menunjukkan  penurunan  yang tinggi  setelah  5 hari,    konsentrasi  fikosianin yang hilang adalah sebanyak 52%. Setelah 14 hari masa penyimpanan, warna pigmen fikosianin hilang sebanyak 90%. Warna biru semakin  pudar  seiring  bertambahnya waktu  penyimpanan.  Hal  tersebut  terjadi karena  nilai  pH  mempengaruhi  kestabilan ikatan  billiprotein  dalam  larutan.    Menurut Duangsee et  al. (2009),    struktur  kimia fikosianin  akan  terbuka  pada  pH ≤  4,5 karena  rusaknya  ikatan  hidrogen  yang ada.   Fikosianin tidak akan larut lagi pada larutan dengan pH kurang dari 3.
Nilai pH dalam larutan fikosianin yang ditambah  gula  berkisar  6-7,  sedangkan yang ditambah asam benzoat berkisar 4-5. Beberapa  pendapat  menguatkan  asumsi ini, pada pH rendah (asam) struktur molekul fikosianin  akan  mengembang,  karena protein  yang  terdenaturasi,  menggumpal dan mengendap
sehingga struktur fikosianin rusak. Hal tersebut menyebabkan intensitas warna dan pembacaan absorbansi dengan spektrofotometer menurun  (Duangsee et  al., 2009).  Semakin banyak  protein  yang  mengendap  maka nilai absorbansi dari fikosianin akan rendah
dan  sebaliknya  (Bhaskar et  al., 2005). Fikosianin dalam bentuk larutan, ditemukan sebagai  gabungan  yang  kompleks  dari monomer,  trimer,  hexamer  dan  oligomer lainnya  (Chaikhlahan et    al .,  2014).
Degradasi  fikosianin  bergantung  pada kesatuan  bagian  dari  protein,  yang dipengaruhi  oleh  beberapa  parameter seperti  cahaya,  suhu,  pH  dan  konsentrasi protein (Jespersen et al ., 2005).

## KESIMPULAN
Penambahan  pengawet  gula    pada ekstrak kasar pigmen fikosianin yang  lebih efektif  adalah  fruktosa  5%.    Konsentrasi relatif  (C R )  selama  14  hari  penyimpanan suhu  kamar  untuk  fruktosa  5%  adalah 19,39%,    bernilai  lebih  tinggi  dibanding tanpa gula (C R =10,57%).

## DAFTAR PUSTAKA
Bhaskar,  S.U.,  Gopalaswamy,  G.  and Raghu,  R.  A.  2005.Simple  method  for efficient extraction and purification of Fikosianin  from  Spirulina  platensis
Geitler.Indian Journal of Experimental
Biology. 43(3): 277-279.
Bennett,  A.  and  L.  Bogorad.    1973. Complementary chromatic adaptation  in  a  filamentous  blue- green alga.  J. Cell. Biol. 58: 419-435. Chaiklahan,  R.,  N.  Chirasuwan,  and  B. Bunnag. 2012. Stability of phycocyanin extracted from Spirulina sp.: Influence of temperature, pH and preservatives. J. Process Biochem. 47:
659-664.
Duangsee, R., Phoopat, N. And Ningsanond
S.  2009.  Phycocyanin  Extraction From Spirulina  platensis and  Extract Stability  Under  Various  pH  and Temperature. As. J. Food Ag-Ind. 2(4): 819-826.
Edwards,  M.R.,  C.  Hauer,  R.F.  Stack,  L.E. Eisele, R. MacColl. 1997. Thermophilic C-phycocyanin: effect of temperature,  monomer stability,  and structure. J. Bioch et Bioph. 1321: 157- 164.
Estrada,  J,E.P.,  P.B.  Bescos,  A.M.  V.  Fresno. 2001.  Anti oxidant activity of different
fractions of Spirulina platensis protean extract. Il Farmaco 56: 497-500. Hamid,  A.A.,  O.O  Aiyelaagbe,  L.A. Usman, O.M.  Ameen,  A.  Lawal.  2010.
Antioxidant  :  its  Medidal  and Pharmacological Applications. African  Journal  of  pure  and  applied chemistry vol.4(8), pp. 142-151
Hemlata,    G.  Pandey,  F.  Bano.T.  Fatma. 2011.    Studies  of Anabaena sp. NCCU-9  with  special reference    to phycocyanin.    J.  Algae  Biomass  Utln. 2(1): 30-51.
Jespersen,  L.,  L.D.  Stremdahl,  K.  Olsen, L.H.Skibsted.    2005.    Heat  and  light stability of three natural blue colorant for  use  in  confectionery  and beverages.    Europ.  Food  Res. Technol. 220(3-4): 261-266.
Masojidek, J., M. Koblizek, G. Torzillo.  2004. Photosynthesis  in  microalgae in :  A. Richmond  (Ed).    Handbook  of Microalgal  Culture:  Biotechnology and  Applied  Phycology.    Blakwell Science Ltd., Iowa. p.20-39.
Prabuthas,  P.,  Majumdar  S.,  Srivastav  P.P., Mishra  H.N.    2011.    Standarization  of rapid  and  economical  method  for nutraceuticals  extraction  from  algae. J.  Stored  Products  and  Post  Harvest Res.  2(25): 93-96.
Prasanna,  R.,  A.  Sood,  A.  Suresh,  S.  Nayak,
B.D.  Kaushik.  2007.  Potential  and aplications  of  algal  pigment  in biology. .Acta Botan. Hungaria 49 (1- 2): 131-156.
Prasanna, R., A. Sood, P. Jaiswal, S. Nayak, V. Gupta, V. Chaudhary, M. Joshi, C. Natarjan. 2010. Rediscovering cyanobacteria as valuable sources of bioaktive compounds. Appl. Biochem.  Microbiol. `46 (2): 119-134.
Rito-Palomoras,  M.,  Nunez  L.,  Amador  D. 2001.    Practical  application  of aqueous  two-phase  systems  for  the development  of  prototype  process for  C-phycocyanin  recovery  from Spirulina  maxima .    J.  Chem.  Techn. Biotechnol. 76: 1273-1280.
Sarada,  R.,  M.G.  Pillai,  G.A.  Ravishankar. 1999.  Phycocyanin from Spirulina sp.: influence of processing of biomass on phycocyanin  yield,  analysis  of efficiency of extraction methods and
stability  studies  on  phycocyanin. J.Proc. Biochem. 34:795-801.
Sedjati, Sri, Ervia Yudiati dan Suryono. 2012.
Profil  Pigmen  Polar  dan  Non  Polar Mikroalga  Laut
Spirulina sp  dan Potensinya  sebagai  Pewarna  Alami. Jurnal Ilmu Kelautan., Vol. 17 (3) 176 –
181.
Yan, S., Zhu LP,  Su HN,  Zhang XY, Chen XL,
Zhou BC, Zhang YZ.  2011. Single-step chromatography  for  simultaneous purification  of  C-phycocyanin  and allophycocyanin with high purity and recovery  from Spirulina ( Arthrospira ) platensis .  J. Appl. Phycol. 23: 1-6.