## PENGUJIAN EFEKTIVITAS EKSTRAK DAUN KELOR DALAM PENGENCER SITRAT- KUNING TELUR TERHADAP KUALITAS SEMEN CAIR BABI LANDRACE

## ( THE EFFECTIVITY OF MORINGA LEAF EXTRACT CONCENTRATION IN CITRATE EGG- YOLK DILUENT ON THE QUALITY OF  LANDRACE LIQUID SEMEN)

## Melianus Fafo, Thomas Mata Hine, Wilmientje Marlene Nalley
Fakultas Peternakan, Universitas Nusa Cendana, Jln Adisucipto Penfui, Kupang 85001 Email : melianusfafo@gmail.com

## ABSTRAK
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  efektivitas  dan  konsentrasi  terbaik  ekstrak  daun  kelor (EDK)  dalam  pengencer  Sitrat-Kuning  telur  (SKT)  terhadap  kualitas  semen  cair  babi  landrace.    Semen dikoleksi  dua  kali  seminggu  menggunakan  metode  masase  dari  tiga  ekor  babi  jantan  landrace  berumur  3 tahun  dengan  kodisi  organ  reproduksi  yang  normal.  Semen  yang  menunjukkan  kualitas  yang  baik    dibagi empat, masing-masing diencerkan dengan SKT (P0), SKT + EDK  5% (P1), SKT + EDK  12,5% (P2), SKT + EKD 22,5% (P3) dan SKT + EDK 35% (P4). Semen yang telah diencerkan disimpan dalam stirofoam pada suhu 18-20 o C dan dievaluasi motilitas, viabilitas, abnormalitas serta keutuhan membran plasma sperma setiap 4  jam.    Rancangan  yang  digunakan  adalah  rancangan  acak  lengkap  yang  terdiri  atas  lima  perlakuan  dan empat  ulangan.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  spermatozoa  yang  disimpan  selama  24  jam  dalam pengencer  SKT  +  EDK  5%  (P1)  memiliki  motilitas  42±7,58%  dan  viabilitas  63,62±13,24%  lebih  tinggi (P<0,05)  daripada  ketiga  pengencer  lainnya,  sedangkan  abnormalitas  dan  keutuhan  membran  plasma spermatozoa dalam keempat pengencer berbeda tidak nyata (P>0,05). Kesimpulan dari penelitian ini adalah EDK  yang  ditambahkan  ke  dalam  pengencer  SKT  efektif  dalam  mempertahankan  kualitas  semen  cair  babi landrace dengan konsentrasi ekstrak daun kelor terbaik adalah 5%. ______________________________________________________________ Kata kunci: Sitrat, kuning telur, ekstrak daun kelor, semen cair, babi landrace.

## ABSTRACT
The aims of the present study were to evaluate the effectiveness and the best concentration of moringa leaf  extracts  (MLE)in  Citrate-egg  yolk  (CEY)  diluent  on  the  quality  of  liquid  semen  of  landrace  boar. The semen samples were collected twice weekly from three landrace boars (2-3 years old) in normal reproductive performance  following  the  massage  method.  The  good  quality  sample  was  divided  into  five  tubes,  each diluted with CEY (P0), CEY + MLE 5% (P1), CEY + MLE 12.5% (P2), CEY + MLE 22.5% (P3) and CEY +  MLE    35%  (P4)following  a  completely  randomized  design  consisting  of  five  treatments  and  four replications. The diluted samples then stored in a styrofoam at a temperature of 18-20˚C and were evaluated for  motility, viability, plasma membrane abnormalities as well as the integrity of every 4 hours. The results showed  that  the  spermatozoa  kept  during  24  hours  in  a  diluent  of  CEY  +  MLE  5%  (P1)  had  higher  (P <0.05)motility  (42  ±  7.58%)  and  viability  (63.62  ±  13.24%)    than  the  other  three  diluents.  However,  there were  no  significant  different  (P>  0.05)  between  treatments  forthe  abnormalities  and  plasma  membrane integrity  of  spermatozoa.  Adding  moringa  leaf  extracts  (MLE)intoCitrate-egg  yolk  (CEY)  is  effectively maintaining the quality of liquid semen of landrace boarat the best concentration of 5%moringa leaf extract (MLE) ______________________________________________________________ Keywords: citrate, egg yolk,  moringa leaf extract, liquid semen,  landrace boar
Fafo et al : Pengujian Efektivitas Ekstrak Daun Kelor Dalam Pengencer Sitrat-Kuning Telur.....

## PENDAHULUAN
Pencapaian  tujuan  program  inseminasi buatan  (IB)  tergantung  pada  beberapa  faktor diantaranya  adalah  kualitas  semen  yang digunakan (Tamoes et al,. 2014) . Semen segar tidak  bertahan  lama  dalam  penyimpanan in vitro yang  diakibatkan  oleh  adanya  kematian sperma  yang  berlangsung  secara  cepat.  Salah satu penyebab kematian sperma adalah adanya serangan  radikal  bebas  sebagai  hasil  dari proses  transpor  elektron  di  mitokondria terhadap membran plasma sperma (Hammerstedt,  1993).  Radikal  bebas  adalah suatu atom atau molekul yang mempunyai satu electron  atau  yang  tidak  berpasangan.  Prinsip kerjanya  adalah  akan  menimbulkan  perubahan kimiawi  dan  merusak  komponen  sel  hidup seperti  protein,  karbohidrat,  lemak  dan nukleotida. Upaya untuk menghambat terbentuknya  peroksida  lemak  dapat  dilakukan dengan  cara  menambahkan  antioksidan  yaitu suatu zat yang dapat mengikat senyawa radikal bebas.
Daun  kelor  ( Moringa  oleifera Lam.) mengandung  46  antioksidan,  antara  lain : vitamin  A,  vitamin  C,  dan  vitamin  E.  Daun
kelor  juga  mengandung  vitamin  K,  vitamin  B, alanin, alfa-karoten, arginin, beta-karoten, beta- sitosterol,  asam     kafeoilkuinat,  kampesterol, karotenoid, klorofil, kromium, delta-5- avenasterol, delta-7-avenasterol, glutation, histidin,  asam asetat   indol,   indoleasetonitril, kaempferal,   leucine,  lutein, metionin, asam miristat,  asam    palmitat,    prolamin,    prolin, kuersetin,  rutin,  selenium,  treonin,  triptofan, xantin,  xantofil,  zeatin,   zeasantin,  zinc (Kurniasih, 2013).
Dalam  penelitian  ini  ekstrak  daun  kelor ditambahkan sebagai suplemen dalam pengencer  sitrat-kuning  telur.  Natrium  sitrat merupakan penyangga yang mampu mempertahankan  kestabilan  pH  pengencer, sedangkan  kuning  telur  bermanfaat  sebagai sumber  energi  dan  lipoprotein  yang  dapat memberikan perlindungan terhadap spermatozoa selama proses preservasi (Aboagla  dan  Terada,  2004,  Nalley et  al., 2011).  Hasil  penelitian  ini  Kombinasi  antara pengencer sitrat-kuning  telur  dan ekstrak  daun kelor  telah  terbukti  mampu  mempertahankan kualitas semen cair babi VDL
.

## METODE PENELITIAN

## Penampungan Semen
Ternak  yang  digunakan  sebagai  sumber semen  dalam  penelitian  ini  adalah  3  ekor  babi pejantan landrace yang  berumur  2-3  tahun, yang  berada  dalam  kondisi  sehat,  tubuh  yang proporsional,  mempunyai  organ  reproduksi normal  dan  telah  terlatih  untuk  ditampung semennya.  Proses  penampungan  semen  pada ternak  babi  menggunakan  metode  massage dimana  pejantan  menaiki  betina  buatan (Dummy).  Alat  yang  digunakan  dalam penampungan  semen  adalah  satu  set  alat penampungan semen.

## Evaluasi Semen
Semen segar hasil ejakulasi yang dievaluasi  secara  makroskopis  yang  meliputi volume,  warna,  bau,  konsistensi,  pH  dan mikroskopis yang meliputi motilitas, viabilitas, konsentrasi, abnormalitas dan MPU. Alat yang
digunakan  untuk  evaluasi  semen  adalah mikroskop,  obyek  glass  dan  cover  glass, heating  table,  kertas  pH, hemacyomete r,  pipet, open  doff ,  tabung  berskala,  centrifuge  untuk menghitung konsentrasi dan conthing chamber lengkap  dengan  pipet  eritrosit.  Semen  segar yang  memiliki  motilitas  ≥70%,  konsentrasi ≥200  x  10 6 sel/ml,  viabilitas  ≥80%  dan abnormalitas  ≤20%  yang  digunakan  dalam penelitian ini.

## Pengencer Semen
. Bahan yang digunakan sebagai pengencer  semen  dalam  penelitian  ini  antara lain:  eosin  2%,  eosin-negrosin,  alkohol  70%, aquabidestilata  steril,  kuning  telur,  tissue, ekstrak  daun  kelor,  sitrat  2,3%  dan  antibiotik (penicilin  dan  streptomicyn).  Pengencer  dasar yang  digunakan  adalah  pengencer  sitrat  dan kuning  telur  (S-KT)  dan  suplementasi  ekstrak
daun  kelor  (EDK).  Dimana  P0  (S-KT),  P1 (S- KT + EDK 5 %), P2 (S-KT + EDK 12,5%), P3 (S-KT  +  EDK  22,5%)  dan  P4  (S-KT+EDK 35%).

## Penyimpanan Semen
Semen  yang  diencerkan  disimpan  dalam Styrofoam dengan  suhu  18-20 o C  dikontrol dengan  thermometer  dan  melakukan  evaluasi setiap  4  jam.  Alat  yang  digunakan  pada penyimpanan semen adalah es batu, styrofoam,
thermometer.
Evaluasi Kualitas Semen Pasca Penyimpanan Parameter  dalam  penelitian  ini  adalah: motilitas, viabilitas, abnormalitas dan membran plasma  utuh.  Pengamatan  dilakukan  setiap  4 jam.  Rancangan  yang  digunakan  adalah rancangan  acak  lengkap  (RAL)  yang  terdiri dari  lima  perlakuan  dan  empat  ulangan.  Data dianalisis dengan sidik ragam dan jika terdapat perbedaan  nyata  dilanjutkan  uji  Duncan, dengan  program  software  SPSS  17.0 for windows.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Motilitas Spermatozoa
Motilitas adalah gerak maju ke depan dari spermatozoa  secara  progresif.  Oleh  karena tujuan  akhir  dari  pengenceran  adalah  untuk kegiatan  inseminasi  buatan  maka  daya  gerak spermatozoa  secara  progresif  (maju  ke  depan) menjadi  patokan  yang  mutlak  diperhitungkan. Kemampuan  spermatozoa  untuk  bergerak progresif    memiliki  korelasi  positif  terhadap
tingkat  fertilitas  spermatozoa,  dan  oleh  karena itu,  penilaian  motilitas  digunakan  sebagai ukuran kesanggupan spermatozoa dalam membuahi sel telur atau ovum. Sifat morfologi dan  pola  metabolisme  khusus  yang  dimiliki oleh  spermatozoa  menyebabkan  spermatozoa mampu  bergerak  maju  ke  depan  pada lingkungan  cair. Mo tilitas  sperma  masing- masing perlakuan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1.   Motilitas spermatozoa (%) dalam pengencer sitrat kuning telur dengan level ekstrak daun kelor yang berbeda
Jam pengamatan Level ekstrak daun kelor (%) P0 (0) P1 (5) P2 (12,5) P3 (22,5) P4 (35) 0 83±2,74 a 84±2,24 a 82±2,74 a 79±5,48 ab 74±8,22 b 4 77±4,48 a 80±0,00 a 68±5,71 a 40±10,25 b 40±16,96 b 8 70±7,08 a 76±2,24 a 51±20,74 b 22±2,74 c 11±2,24 c 12 62±9,09 a 65±10.00 a 32±24,64 b 0±0,00 c 0±0,00 c 16 52±759 a 65±6,13 a 18±25,65 b 0±0,00 c 0±0,00 c 20 39±16,36 a 54±5,48 a 10±22,37 b 0±0,00 b 0±0,00 b 24 24±15,17 b 42±7,58 a 6±13,42 c 0±0,00 c 0±0,00 c
Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Berdasarkan  Tabel  1  terlihat  adanya penurunan motilitas dari masing-masing perlakuan  seiring  dengan  bertambahnya  umur penyimpanan.  Hal  ini  mungkin  disebabkan oleh  semakin  berkurangnya  energi  yang terdapat  dalam  medium  pengencer  sehingga mengakibatkan jumlah spermatozoa yang tidak bergerak progresif semakin bertambah banyak. Secara  umum,  fenomena  penurunan  motilitas
spermatozoa  setelah  penyimpanan  yang    lama lebih  diakibatkan  oleh  menurunnya  zat makanan spermatozoa dan pengaruh zat toksik hasil  sampingan  dari  proses  metabolisme spermatozoa. Rizal et al . (2004) menambahkan bahwa motilitas spermatozoa sangat
bergantung pada suplai energi berupa adenosine    triphosphate (ATP)  hasil  dari prosesmetabolisme  sel.    Penurunan  motilitas
Fafo et al : Pengujian Efektivitas Ekstrak Daun Kelor Dalam Pengencer Sitrat-Kuning Telur.....
juga  dapat  disebabkan  oleh  adanya  kejutan dingin  dan  peningkatan  konsentrasi  asam laktat. Tamoes et al., (2014) menyatakan bahwa pengaruh  utama  dari  kejutan  dingin  terhadap sel  spermatozoa  adalah  penurunan  motilitas dan  daya  hidup,  perubahan  permeabilitas  dan perubahan  komponen  lipid  pada  membran. Suasana asam yang disebabkan oleh penimbunan asam laktat menyebabkan kerusakan organel-organelnya sehingga metabolisme sebagai upaya untuk memperoleh energi  teganggu.  Berkurangnya  metabolisme
mengakibatkan  berkurangnya  energi  yang dihasilkan dan akan menurunkan motilitas.
Penurunan  motilitas  spermatozoa  mulai terjadi  pada  jam  ke-4  penyimpanan  yaitu sebesar  6%  pada  perlakuan  P0,  4%  pada perlakuan  P1,  14%  pada  perlakuan  P2,  39% pada perlakuan P3 dan 34% pada perlakuan P4. Pada  jam  ke-12  penyimpanan,  semua  sperma pada  perlakuan  P3  dan  P4  sudah  mengalami kematian, sedangkan pada perlakuan P1 jumlah sperma yang motil masih mencapai 65%, P0 = 62% dan P2 = 32% (Gambar 1).
Motilitas (%)

## Jam pengamatan
Gambar  1.  Penurunan  persentase  motilitas  spermatozoa  babi  landrace  dalam  pengencer  sitrat- kuning telur yang disuplementasi berbagai level ekstrak daun kelor
Pada  perlakuan  P3  dan  P4  menunjukkan adanya  penurunan  persentase  motilitas  yang sangat  tinggi.  Hal  ini  disebabkan  karena kemungkinan  level  EDK  sebagai  suplementasi dalam pengencer terlalu tinggi. Menurut Fuglie (2001), kandungan vitamin C dalam daun kelor adalah 17,3 mg/100 mg dan vitamin B3 adalah 8,2/100  mg.  Penambahan  vitamin  C  dan vitamin  B3  pada  pengencer  semen  dapat menyebabkan  perubahan  pH  karena  vitamin  C bersifat  asam.  Spermatozoa  sangat  peka terhadap  perubahan  pH  medium  yang  dapat berdampak  pada  penurunan  kualitas  sperma (Rizal  dan  Herdis,  2010).  Selain  itu,  daun kelor  juga  mengandung  zat  anti  nutrisi  seperti saponin  dan  tanin,  zat  ini  bisa  bersifat  toksik pada  spermatozoa  pada  dosis  tinggi.  Dengan demikian, pada dosis yang tinggi, ekstrak daun kelor akan menghasilkan efek negatif terhadap kehidupan sperma selama penyimpanan.
Hasil  analisis  statistik  terhadap  motilitas spermatozoa  pasca  pengenceran  menunjukkan perbedaan  yang  tidak  nyata  (P>0,05)  antara perlakuan  P0,  P1,  P2  dan  P3,  namun  berbeda nyata (P<0,05) dengan perlakuan P4. Pada jam ke-12  penyimpanan,  antara  perlakuan  P1  dan P0  menunjukkan  perbedaan  yang  tidak  nyata (P>0,05),  tetapi  kedua  perlakuan  tersebut berbeda nyata (P<0,05) dengan P2, P3 dan P4. Pada jam ke-24 penyimpanan, motilitas sperma pada  perlakuan  P1  lebih  tinggi  (P<0,05)  dari keempat perlakuan lainya, bahkan sperma pada perlakuan  P3  dan  P4  sudah  tidak  ada  yang motil  progresif  sejak  jam  ke-12  penyimpanan. Hal  ini  memberi  gambaran  bahwa  perlakuan P1 dengan level ekstrak daun kelor sebesar 5% menghasilkan motilitas sperma terbaik dibandingkan dengan perlakuan lainnya.
Pemberian  ekstrak  daun  kelor  yang  tepat memberikan  hasil  yang  maksimal  untuk mencegah  peroksidasi  lipid  pada  membran
0 20 40 60 80 100 0 4 8 12 16 20 24 P0 P1 P2 P3 P4
plasma  spermatozoa  dengan  cara  mencegah atau  memutus  reaksi  rantai  peroksidasi  lipid pada membrane plasma spermatozoa, sehingga mampu  mengurangi  kerusakan  yang  terjadi pada membran plasma spermatozoa. Kurniasih (2013)  menyatakan  bahwa  daun  kelor  kaya akan  nutrisi,  dengan  kandungan    antioksidan daun kelor sebayak 46 jenis.
Selain  digunakan  untuk  bahan  makanan, daun  kelor  telah  dilaporkan  menjadi  sumber yang kaya akan makronutrien maupun mikronutrien  yang  juga  mengandung  β- karoten,  protein,  vitamin C,  kalsium,  dan kalium; dan  juga  bertindak  sebagai  sumber antioksidan alami. Makronutrien dan mikronutrien  tersebut  sangat  bermanfaat  untuk menunjang  motilitas  sperma  (Johnson et  al ., 2000). Antioksidan sebagi senyawa yang dapat menunda, memperlambat dan mencegah proses oksidasi  lipid,  dengan  cara  menunda  atau mencegah terjadinya reaksi outoksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid (Shui et al., 2004).
Dari hasil penelitian motilitas spermatozoa
menunjukkan bahwa spermatozoa  dalam  pengencer  sitrat  kuning telur  dengan  penambahan  ekstrak  daun  kelor level  5%  secara  teknis  layak  dipakai  untuk  IB pada  babi  landrace  dengan    menggunakan semen  cair  sampai  penyimpanan  24  jam, karena  memiliki  persentase  motilitas  progresif di atas 40%.

## Pengaruh Perlakuan terhadap Viabilitas Spermatozoa
Penilaian  viabilitas  dilakukan  secara obyektif  menggunakan  pewarnaan  diferensial.
Pemeriksaan  viabilitas  spermatozoa  penting dilakukan karena berpengaruh terhadap motilitas spermatozoa. Menurut Kostaman dan Sutama  (2006),  persentase  spermatozoa  hidup (viable)  lebih  tinggi  dari  pada  spermatozoa motil  karena  dari  jumlah  spermatozoa  yang hidup  belum  tentu  semua  motil  progresif. Spermatozoa  yang  hidup  memiliki  kepala berwarna  transparan,  sedangkan  yang  mati berwarna  merah  (Gambar  2).  Hal  ini  di sebabkan  karena  membran  plasma  secara  fisik dan  fungsional  masih  utuh.  Eosin  yang berikatan  dengan  natrium  sitrat  akan  masuk kedalam  sel,  tetapi  karena  membrane  plasma sel  masih  berfungsi,  senyawa  Natrium  dan eosin ini akan segara dikeluarkan kembali dari dalam  sel  oleh  mekanisme  kerja  pompa sodium.  Hal  ini  terjadi  pula  karena  secara fisiologik  konsentrasi  Na  di  dalam  sel  lebih rendah  daripada  diluar  sel.  Pada  sperma  mati, membran plasma spermatozoa termasuk pompa sodium sudah rusak, sehingga senyawa natrium dan  eosin  yang  masuk  ke  dalam  sel  tidak  lagi dipompa keluar dan tetap bertahan didalam sel, dan  hal  inilah  yang  mengakibatkan  kepala sperma berwarna merah.  Dalam perbandingan dengan motilitas, viabilitas sperma ditampilkan pada Tabel 2 lebih tinggi dari motilitas. Hal ini sesuai dengan yang dinyatakan oleh Kostaman dan  Sutana  (2006)  bahwa  sperma  yang  hidup selalu  lebih  banyak  daripada  sperma  motil karena  sperma  motil  sudah  pasti  hidup,  tetapi sperma yang hidup belum tentu motil.
Gambar 2. Spermatozoa hidup (H)  danspermatozoa yang mati (M)
Fafo et al : Pengujian Efektivitas Ekstrak Daun Kelor Dalam Pengencer Sitrat-Kuning Telur.....
Tabel. 2.  Viabilitas spermatozoa (%) dalam pengencer sitrat kuning telur dengan level EDK yang berbeda Jam pengamatan Level ekstrak daun kelor (%) P0 (0) P1 (5) P2 (12,5) P3 (22,5) P4 (35) 0 89,41±1,08 a 89,54±0,57 a 88,71±1,23 a 82,73±10,20 a 85,39±7,44 a 4 81,60±4,41 a 83,59±1,72 a 78,81±4,64 a 63,87±17,84 b 57,14±13,08 b 8 80,04±4,26 a 81,26±2,42 a 73,08±8,44 a 39,20±25,89 b 37,38±8,94 b 12 75,34±6,13 a 79,73±2,69 a 52,21±33,05 b 0,00±0,00 c 0,00±0,00 c 16 69,91±4,82 a 76,89±1,73 a 23,42±33,91 b 0,00±0,00 c 0,00±0,00 c 20 58,72±19,24 a 73,78±3,03 a 14,29±31,97 b 0,00±0,00 b 0,00±0,00 b 24 37,79±21,55 b 63,62±13,24 a 9,52±21,28 c 0,00±0,00 c 0,00±0,00 c
Superskrip yang berbeda dalam baris yang sama menunjukkan berbeda nyata (P<0,05)
Dari Tabel 2, terdapat dilihat bahwa setiap perlakuan  mengalami  penurunan  viabilitas spermatozoa pasca pengenceran hingga 24 jam penyimpanan (Gambar 2). Namun sama seperti pada penurunan motilitas, kecepatan penurunan  viabilitas  dari  tiap-tiap  perlakuan berbeda-beda.  Hal  ini  mungkin  disebabkan
oleh  kemampuan  dari  setiap  pengencer  yang berbeda dalam menyumbangkan zat-zat makanan yang dibutuhkan untuk mempertahankan  kehidupan  spermatozoa  dan mampu  memperlambat  penurunan  derajat keasaman  yang  ditimbulkan  karena  adanya aktivitas metabolisme spermatozoa.
Viabilitas (%)

## Jam pengamatan
Gambar 3. Grafik penurunan persentase viabilitas spermatozoa babi landrace dalam pengencer EDK yang disuplementasi ekstrak daun kelor
Secara  umum,  viabilitas  sperma  tertinggi setelah disimpan selama 24 jam dihasilkan oleh perlakuan  P1  yang  mencapai  63,62%  dan terendah  pada  perlakuan  P3  dan  P4  yaitu  0%. Hasil  analisis  statistik  terhadap  viabilitas sperma pada jam ke-0 penyimpanan menunjukkan  perbedaan  yang  tidak  nyata (P>0,05)  antara  perlakuan.  Namun  setelah disimpan  selama  24  jam,  viabilitas  sperma
pada  perlakuan  P1  berbeda  nyata  (P<0,05) dengan  keempat  perlakuan  lainnya,  bahkan pada  perlakuan  P3  dan  P4  semua  spermanya sudah mati sejak 12 jam penyimpanan.
Salah  satu  penyebab  penurunan  viabilitas spermatozoa tersebut adalah terjadinya penurunan  derajat  keasaman  pada  kedua perlakuan  tersebut  hingga  pH-nya  menjadi  6,4 pada  jam  ke-12  sedangkan  perlakuan  lainnya
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 0 4 8 12 16 20 24 P0 P1 P2 P3 P4
masih  berkisar  antara  6,7  dan  7,0.  Derajat keasaman sangat menentukan status kehidupan spermatozoa  di  dalam  semen.  Semakin  rendah atau  semakin  tinggi  pH  semen  dari  normal akan  membuat  spermatozoa  lebih  cepat  mati. Perubahan  pH  kearah  yang  lebih  asam  terjadi karena penimbunan asam laktat yang merupakan  hasil  metabolisme  spermatozoa dalam  kondisi  anaerob  (Daniel et  al .,  2004), dan  hal  ini  diperparah  lagi  oleh  kandungan asam  yang  disumbangkan  oleh  ekstrak  daun kelor  yang  secara  nyata  meningkat  pada konsentrasi yang tinggi (P3 dan P4). Selain itu, rendahnya viabilitas pada perlakuan P3 dan P4 juga  diduga  karena  dosis  suplementasi  ekstrak daun  kelor  yang  sangat  tinggi  sehingga menyebabkan toksik dan akhirnya menimbulkan  tingkat  kematian  yang  paling tinggi.  Pemunahan  radikal  bebas  hanya  dapat dilakukan  apabila  dosis  yang  diberikan  tepat. Hal lainnya yang diduga menjadi penyebab hal tersebut  adalah  pengencer  pada  perlakuan  P3 dan  P4  lebih  kental  sehingga  menyulitkan sperma  untuk  bergerak  dan  mempertahankan hidupnya.  Pada  kondisi  pengencer  yang demikian,  sperma  dapat  menderita  kehilangan cairan  yang  drastic  akibat  adanya  pengeluaran air  dari  dalam  sel  dalam  upaya  untuk  menjaga keseimbangan  air  antara  intra  sel  dan  ekstra sel.
Dari  hasil  studi  fitokimia,  daun  kelor ( Moringa  oleifera )  juga  mengandung  senyawa metabolit sekunder flavonoid, alkaloid, phenols yang  juga  dapat  menghambat  aktivitas  bakteri (Dahot,  1998).  Namun  senyawa  alkaloid merupakan  senyawa  antinutrisi,  sehingga  jika pemberian  dalam  jumlah  yang  banyak  maka fungsinya  bukan  untuk  menghambat  aktivitas bakteri melainkan akan bersifat toksik pada sel sperma.
Hasil  penelitian  ini  mengindikasikan bahwa  perlakuan  P1  dengan  konsentrasi ekstrak  daun  kelor  sebesar  5%  lebih  efektif untuk  mempertahankan  viabilitas  sperma landrace.  Hal  ini  menggambarkan  bahwa dengan konsentrasi yang demikian, kandungan antioksidan  yang  terdapat  di  dalam  ekstrak daun  kelor  sudah  cukup  optimal  untuk menghambat  efek  negatif  dari  radikal  bebas
yang  dapat  menyerang  lipid  pada  membran plasma  sperma.  Prinsip  kerja  dari  antikosidan dalam menghambat oksidasi pada lemak dapat dilihat sebagai berikut: oksigen bebas di udara akan  mengoksidasi  ikatan  rangkap  pada  asam lemak  yang  tidak  jenuh,  kemudian  radikal bebas  yang  terbentuk  akan  beraksi  dengan oksigen sehingga akan menghasilkan peroksida aktif.  Apabila  dalam  suatu  asam  lemak  tidak mengandung antioksidan, maka peroksida aktif akan  bereaksi  dengan  ikatan  rangkap  lemak. Apabila  ditambah  suatu  antioksidan,  maka peroksida aktif akan bereaksi dengan antioksidan  tersebut  sehingga  pembentukan radikal  bebas  dapat  dihentikan  (Alvarez  dan Storey,  1982).Selian  itu,  ekstrak  daun  kelor juga  kaya  akan  senyawa  yang  mengandung gula  sederhana,  rhamnosa, glucosinolates dan isothiocyanates (Bennett et al, 2003).

## Pengaruh Perlakuan terhadap Abnormalitas Spermatozoa
Abnormalitas  spermatozoa  merupakan kelainan  fisik  dari  spermatozoa  (Bonet et  al., 1993)  yang  terjadi  karena  pada  saat  proses pembentukan spermatozoa dalam tubuli seminiferi  maupun  karena  proses  perjalanan spermatozoa  melalui  saluran-saluran  organ kelamin  jantan.  Abnormalitas  spermatozoa terjadi  selain  karena  faktor  heriditer  juga dipengaruhi  oleh  faktor  lain  seperti  penyakit yang apabila menyerang organ reproduksi akan menyebabkan gangguan pada pertumbuhan dan perkembangan organ reproduksi terutama testis yang akan menyebabkan produksi spermatozoa di  dalam  tubuli  seminiferi  tidak  berlangsung secara  sempurna.  Abnormalitas  spermatozoa yang didapatkan pada penelitian ini merupakan abnormalitas  sekunder  (Gambar  4),  seperti ekor  patah  atau  putus  banyak  ditemukan  pada penelitian ini. Abnormalitas sekunder kemungkinan  disebabkan  karena  kesalahan dalam  preparasi  atau  ejakulasi.  Salah  satu abnormalitas  sekunder  yang  terdapat  di penelitian  ini  kebanyakan  terjadi  pada  ekor. Abnormalitas  pada  ekor  bisa  disebabkan karena  ejakulasi  yang  tidak  sempurna  dan shock terhadap suhu.
Fafo et al : Pengujian Efektivitas Ekstrak Daun Kelor Dalam Pengencer Sitrat-Kuning Telur.....
N N N AB
Gambar 4. Bentuk abnormalitas spermatozoa. Bentu normal (N),ekor putus (AB).
Pemeriksaan  abnormalitas  spermatozoa dilakukan  dengan  cara  pewarnaan  diferensial menggunakan  cairan  eosin  dan  diamati
dibawah  mikroskop.  Tabel  3  menampilkan rataan  persentase  abnormalitas  spermatozoa pada berbagai perlakuan.
Tabel  3.  Persentase  abnormalitas  spermatozoa  dalam  pengencer  dalam  sitrat-  kuning  telur  yang disuplementasi berbagai level EDK Waktu pengamatan P0 P1 P2 P3 P4 Awal 8,36±2,57 a 7,40±1,94 a 8,17±303 a 9,81±2,35 a 8,79±2,53 a Akhir 10,73±1,43 a 9,50±2,72 a 13,02±509 ab 14,26±2,91 ab 16,10±4,26 b
Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaaan nyata (P<0,05)
Pada Tabel 3, rataan persentase abnormalitas spermatozoa pada semua perlakuan  mengalami  kenaikan  pada  akhir pengamatan. Abnormalitas spermatozoa terendah  dihasilkan  oleh  perlakuan  P1  dan tertinggi  dihasilkan  oleh  perlakuan  P4.  Hasil analisis  statistik  menunjukkan  bahwa  pada awal  penyimpanan  tidak  ada  perbedaan (P>0,05) abnormalitas sperma antara perlakuan. Namun setelah disimpan selama 24 jam tingkat abnormalitas sperma pada perlakuan  P1  dan  P0  lebih  rendah  (P<0,05) daripada  P4,  tetapi  tidak  ada  perbedaan (P>0,05)  dengan  P2  dan  P3  (Tabel  3).  Hal  ini menggambarkan  bahwa  pada  level  rendah, ekstrak  daun  kelor  tidak  berpengaruh  terhadap abnormalitas sperma. Tingginya tingkat abnormalitas  sperma  pada  perlakuan  P4 mungkin disebabkan karena konsentrasi ekstrak  daun  kelor  yang  terlalu  tinggi  dapat
menyebabkan  pengeluaran  air  yang  berlebihan dari  dalam  sel  sperma  yang  berlanjut  pada pengkerutan sel.
Suyadi  dkk.  (2012)  menyatakan  bahwa peningkatan  angka  abnormalitas  disebabkan tidak  hanya  pada  saat  pembuatan  preparat sebelum  dilakukan  pengamatan  namun  juga disebabkan  oleh  adanya  peroksidasi  lipid. Peroksidasi lipid merupakan kerusakan membran  yang  terjadi  akibat  adanya  reaksi antara  asam  lemak  tak  jenuh  dan  juga  radikal bebas.  Peroksidasi  lipid  dapat  menyebabkan kerusakan  pada  membran  plasma  pada  bagian tengah/midpiece  spermatozoa,  pada  bagian  ini terdapat  mitokondria  yang  terlibat  dalam pembentukan energi, oksidasi asam lemak dan siklus krebs.

## Pengaruh Perlakuan terhadap MPU Spermatozoa
Membran  plasma  utuh    (MPU)  mutlak harus  dimiliki  oleh  spermatozoa  supaya terjamin  kelangsungan  hidupnya  dan  tercapai keberhasilan  saat  proses  fertilisasi.  Selain berfungsi  untuk  melindungi  organel-organel yang  berada  di  dalam  sel,  membran  plasma berfungsi juga untuk mengatur keluar masuknya zat-zat makanan serta keseimbangan elektrolit intra maupun ekstraseluler.
Spermatozoa  yang  memiliki  membran plasma  utuh  (MPU),  setelah  dipapar  dengan
larutan  hipoosmotik  mengunakan  metode hypoosmotik swelling test (HOS-Test) ditandai dengan  ekor  melingkar  atau  menggembung. Hal  ini  dapat  terjadi    karena  medium  yang masuk  ke  dalam  sel  dipertahankan  oleh membran plasma yang utuh tersebut. Sebaliknya  jika  membran  plasma  sudah  tidak utuh  akan  ditandai  dengan  ekor  spermatozoa tetap  lurus  bila  dipaparkan  dalam  larutan hipoosmotik.    Hal  ini  terjadi  karena  membran plasma  yang  sudah  tidak  utuh  lagi  tidak  dapat mempertahankan medium yang telah masuk ke dalam sel (Gambar 5.)
Gambar 5.  Bentuk  membran  plasma  yang  utuh  (U=ekor  sperma  yang  melingkar)  dan  rusak (R=ekor sperma lurus).
Data  hasil  pengamatan  membran  plasma utuh spermatozoa babi landrace yang diencerkan  dengan  sitrat  kuning  telur  dengan penambahan  suplementasi  ekstrak  daun  kelor dalam  konsentrasi  berbeda  disajikan  pada Tabel 4. Tabel  4.  Persentase  MPU  spermatozoa  dalam  pengencer  sitrat-kuning  telur  yang  disuplementasi dengan berbagai level EDK Jam penga matan Perlakaun P0 P1 P2 P3 P4 0 81,42±2,72 a 83,60±1,37 a 83,42±3,23 a 76,56±4,84 b 74,88±3,22 b 4 77,20±3,04 a 80,33±3,58 a 77,61±1,45 a 63,06±10,7 b 50,96±18,9 b 8 74,87±1,98 ab 78,16±3,19 a 66,17±11,7 b 38,29±11,62 c 32,14±4,52 c 12 71,28±0,67 a 75,86±2,93 a 38,48±27,7 b 0,00±0,00 c 0,00±0,00 c 16 62,84±8,20 a 72,74±3,42 a 21,60±31,6 b 0,00±0,00 c 0,00±0,00 c 20 52,16±19,96 a 71,33±2,77 a 13,99±31,2 b 0,00±0,00 b 0,00±0,00 b 24 28,95±28,57 b 48,75±30,58 a 11,85±26,5 b 0,00±0,00 b 0,00±0,00 b
Superskrip yang berbeda dalam baris yang sama menunjukkan berbeda nyata (P<0,05)
Data  pada  Tabel  4  menunjukkan  bahwa secara  empiris  perlakuan  P1  menghasilkan sperma  dengan  persentase  MPU  tertinggi  dan
terendah  pada  perlakuan  P4.  Hasil  analisis statistik  menunjukkan  bahwa  pada  awal penyimpanan  tidak  ada  perbedaan  MPU
Fafo et al : Pengujian Efektivitas Ekstrak Daun Kelor Dalam Pengencer Sitrat-Kuning Telur.....
(P>0,05)  antara  perlakuan  P1,  P0  dan  P2, namun ketiga perlakuan tersebut berbeda nyata (P<0,05)  dengan  P3  dan  P4.  Pada  jam  ke-24 penyimpanan,  perlakuan  P1  berbeda  nyata (P<0,05) dengan perlakuan P1, P2, P3 dan P4. Hal  ini  menggambarkan  bahwa  persentase  5%
ekstrak  daun  kelor  lebih  optimal  dalam melindungi  membran  plasma  sperma  daripada persentase  ekstrak  daun  kelor  yang  lebih tinggi.Penurunan persentase MPU dapat dilihat pada Gambar 6.
MPU (%)

## Jam pengamatan
Gambar 6. Pola penurunan persentase MPU spermatozoa babi
Tingginya  persentase  MPU  spermatozoa pada  perlakuan  penambahan  EDK  5%  dalam pengencer  sitrat  kuning  telur    menunjukkan keefektifannya  dalam  menghambat  terjadinya peroksidasi  lipid  pada  membran  spermatozoa. Kasolo et al. (2010)  menyatakan  bahwa  daun kelor  mengandung  antioksidan  yang  memiliki kekuatan  7  kali  lebih  banyak  dari  vitamin  C. Vitamin C merupakan salah satu vitamin yang bersifat sebagai antioksidan  larut  dalam  lemak yang  mampu  menghambat  aktivitas  senyawa oksigen  reaktif  dan  mencegah    terjadinya reaksi  berantai  antara  senyawa  oksigen  reaktif dengan  asam  lemak  tak  jenuh  majemuk  yang terdapat  pada  membran  plasma  spermatozoa. Vitamin C juga mampu bekerja di dalam dan di luar  dinding  sel  sehingga  dapat  mengurangi atau  mencegah  peroksidasi  lipid  secara  lebih luas (Aitken et al . , 1993).
Keutuhan membran plasma sangat diperlukan oleh spermatozoa, karena kerusakan membran  plasma  akan  berpengaruh  terhadap proses  metabolisme  dan  berhubungan  dengan motilitas  serta  daya  hidup  spermatozoa  yang
dihasilkan.  Metabolisme  sel  akan  berlangsung baik  jika  membran  plasma  sel  berada  dalam keadaan  yang  utuh,  sehingga  mampu  dengan baik mengatur lalu lintas masuk dan keluar dari sel  semua  substrat  dan  elektrolit  yang dibutuhkan dalam proses metabolisme.
Selama  proses  pematangan  spermatozoa di  dalam  epididimis,  juga  terjadi  perubahan susunan komponen senyawa-senyawa penyusun  membran  plasma  sel  spermatozoa. Membran  plasma  sel  spermatozoa  akan kehilangan  sebagian  kolesterol,  sehingga terjadi  peningkatan  nisbah  antara  asam  lemak tak jenuh dan kolesterol. Hal ini menyebabkan membran plasma menjadi lebih rapuh. Kondisi membran  plasma  yang  demikian  ini  secara fisiologis memang dibutuhkan untuk memudahkan  spermatozoa  menjalani  proses kapasitasi di dalam uterus dan pada waktu fusi dengan  membran  plasma  oosit  saat  terjadi fertilisasi,  namun  jika  hal  tersebut  terjadi selama  penyimpanan  sperma  maka  akan berdampak negatif terhadap kemampuan fertilisasi sperma.
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 0 4 8 12 16 20 24 P0 P2 P3 P4

## SIMPULAN
Dari  hasil  penelitian  ini  dapat  diberikan kesimpulan sebagai berikut :
a. Ekstrak  daun  kelor  yang  ditambahkan dalam pengencer sitrat-kuning telur efektif untuk  mempertahankan  motilitas  dan viabilitas, namun tidak berpengaruh
terhadap abnormalitas dan membran plasma  utuh  spermatozoa  babi  landrace yang disimpan pada suhu 18-20 o C.
b. Level  terbaik  ekstrak  daun  kelor  yang digunakan  dalam  pengencer  sitrat-kuning telur, adalah 5%
c. Semen  cair  babi  landrace  yang  diencerkan dengan sitrat-kuning telur dan disuplementasi  dengan  5%  ekstrak  daun kelor dapat bertahan selama 24 jam dalam stirofoam bersuhu 18-20 o C dengan motilitas spermatozoa di atas 40.00%.

## DAFTAR PUSTAKA
Aboagla  EME,  Terada  T.  2004.  Effects  of  the suplementation  of  trehalose  extender conatining  egg  yolk  with  sodium  dodecyl sulphate  on  the  freezability  of  goat spermatozoa. Theriogenology 62:  809-
818.
Aitken R, Harkiss JD, Buckingham DW. 1993. Analysis of lipid peroxidation mechanism in human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev . 35:302-315.
Alvarez  JG,  Storey  BT.·  1982.  Spontaneous lipid  peroxidation  in  rabbit  epididymal· speonatozoa : its effect on sperm motility. BioI. Reprod . 27:110-21108.
Bennett  R,  Mellon  F,  Pratt  J,  Dupont  M, Pernins  L,  Kroon  P  2003.  Profiling glucosinolates and phenolics in vegetative and  reproductive  tissues  of  multi-purpose trees  Moringa  oleifera  L.  (horseradish tree)  and  Moringa  stenopetal  L. J.  Agric.
Food Chem. 51: 3546-5553. Bonet  S,  Briz  M,    Fradera  A.  1993.
Ultrastructural  abnormalities  of  boar spermatozoa. Theriogenology 63:383-396. Dahot  MU.  1998.  Antimicrobial  activity  of
Small  Protein  of  Moringa  oleifera  leaves.
J Islam Acad Sci 11(1): 27-32.
Daniel  LS,  Regina  M,  Botting,  Timothy  H.,
2004.  Cyclooxygenase  isozymes:  the biology  of  prostaglandin  synthesis  and inhibition. Pharmacol Rev . 56: 387-437.
Fuglie L. 2001. The Miracle Tree : The Multipe
Attributes of Moringa, Dakar.
Hammerstedt  RH.  1993.  Maintanence  of bioenergic balance in sperma and prevention of lipid peroxidation: A review
of  the  effects  on  design  and  storage preservation  system. Reprod.  Fert.Div .
5:675-690.
Johnson  LA,  Weitze  KF,  Fiser  P,  Maxwell WMC.  2000.  Storage  of  boar  semen. J Anim Sci 62:143-172.
Kasolo  JN,   Bimeya  GS,  Ojok  L,  Ochieng  J, Okwal-okeng  JW.    2010.  Phytochemicals and  uses  of  moringa  oleifera  leaves   in ugandan    rural  communities. Journal  of Medical Plant Research 4(9):753-757. Kostaman T, Sutama IK. 2006. Studi motilitas dan  daya  hidup  spermatozoa  kambing boer  pada  pengencer  tris  sitrat-fruktosa. J Sain Vet . 24(1): 58-64.
Kurniasih.  2013.  Khasiat  dan  Manfaat  Daun Kelor  Untuk  Penyembuhan  Berbagai Penyakit. Yogyakarta: Pustaka Baru Press.
Nalley  WM,  Arifiantini  I.  2011.  The  Viability of  Local  Ram  Semen  in Tris  Buffer  With Three  Different  Egg  Yolks. Animal Production 13(1): 39-44.
Rizal  M,  Herdis,  Boediono  A.  2004.  Daya hidup  sperma  epididimis  domba  setelah disimpan  pada  suhu  rendah  (5  C). J. Anim. Prod . 6(1):30-36.
Rizal  M,  Herdis.  2010.  Peran  antioksidan dalam meningkatkan kualitas semen beku. Wartazoa 20(3):139-145.
Shui  G,  Wong  SP,  Leong  LP.  2004. Characterization  of  antioxidants  and change  of  antioxidant  levels  during storage  of  Manilkara  zapota  L. Agric Food Chemi . 52:7834-7841.
Suyadi    A,  Rachmawati,    Iswanto  N.  2012. Pengaruh  α-tocopherol  yang  berbeda
Fafo et al : Pengujian Efektivitas Ekstrak Daun Kelor Dalam Pengencer Sitrat-Kuning Telur.....
dalam pengencer dasar tris aminomethane-kuning telur terhadap kualitas  semen  kambing  boer  yang disimpan  pada  suhu  5 O c. Jurnal  Ilmiah
Ilmu-ilmu Peternakan 22(3):1-8.
Tamoes  JA,  Nalley  WM,  Hine  TM.  2014.
Fertilitas  spermatozoa  babi  landrace dalam  pengencer  modifikasi  zorlesco dengan  susu  kacang  kedelai. J  Sains Peternakan 12(1): 20-30.