* Penulis untuk korespondensi. e-mail: bspurwoko@ipb.ac.id ISSN 2085-2916  e-ISSN 2337-3652 Tersedia daring http://jai.ipb.ac.id J. Agron. Indonesia, Desember 2017, 45(3):228-234 DOI: https://dx.doi.org/10.24831/jai.v45i3.12544 Kultur Antera Hasil Persilangan Padi Lokal Beras Hitam dengan Varietas Budidaya (Fatmawati dan Inpari 13)
Anther Culture of Crosses Between Black Rice Landrace and Cultivated Rice Varieties (Fatmawati and Inpari 13)
Yudia Azmi 1 , Bambang Sapta Purwoko 2* , Iswari Saraswati Dewi 3 , Muhamad Syukur 2 , dan Tintin Suhartini 3
1 Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor 2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (Bogor Agricultural University), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia 3 Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Jl. Tentara Pelajar No. 3 A Bogor, Indonesia
Diterima 19 September 2016/Disetujui 19 April 2017

## ABSTRACT
Black rice become popular in recenr years due to health reason. So far, no modern variety has been released. Therefore development of new variety is necessary. The objective of this study was to obtain doubled haploid black rice lines with good agronomic characters through anther culture. Materials used in this experiment were 6 F1 derived from black rice landrace (Melik) and two cultivated varieties (Inpari 13 and Fatmawati): Melik/Inpari13//Inpari13, Melik / Inpari13// Melik, Melik/ Fatmawati //Fatmawati///Fatmawati, Melik/ Fatmawati//Fatmawati// /Fatmawati, Melik/Fatmawati, and Melik/Fatmawati// Melik. The experiment was performed using a completely randomized design consisting of 12 replications. An experimental unit was a petri dish containing ± 150 anthers. Results of the anther culture varied widely between crosses. Crosses Melik/ Inpari13//Melik, Melik/Fatmawati//Melik, and Melik/Inpari13 //Inpari13 showed the best response on callus induction and plant regeneration compared to the other crosses. Melik / Inpari13 // Melik produced  the highest number of acclimatized plants, the highest number and percentage of doubled haploid: 63 plants, 42 plants and 91.3% respectively. The highest number  of  doubled  haploid  having  black  aleuron  layer  were  obtained  by  Melik/Inpari13//Melik  and  Melik/Fatmawati// Melik.
Keywords: anther culture, black rice, doubled haploid, regeneration

## ABSTRAK
Padi beras hitam menjadi populer akhir-akhir ini dikaitkan dengan manfaat untuk kesehatan. Sejauh ini belum ada varietas unggul padi beras hitam. Pengembangan varietas tersebut dipandang perlu. Tujuan penelitian ini ialah untuk mendapatkan galur padi beras hitam dengan warna aleuron berwarna hitam dan umur genjah hasil kultur antera. Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah antera F1 hasil persilangan padi lokal beras hitam (Melik) dengan 2 varietas budidaya (Inpari13 dan Fatmawati), yaitu: Melik/Inpari13//Inpari13, Melik /Inpari13//Melik, Melik/Fatmawati//Fatmawati//Fatmawati, Melik / Fatmawati//Fatmawati, Melik/Fatmawati dan Melik/ Fatmawati //Melik. Percobaan dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap yang terdiri atas 12 ulangan. Satu unit percobaan merupakan satu cawan petri berisi  ± 150 antera.  Hasil kultur antera padi beras hitam antara persilangan sangat bervariasi. Persilangan Melik/Inpari13//Melik, Melik/Fatmawati//Melik, dan Melik / Inpari13 //Inpari13 memiliki respon induksi kalus dan regenerasi tanaman paling baik dibandingkan persilangan lainnya. Selain itu persilangan Melik/Inpari13//Melik menghasilkan genotipe yang dapat diaklimatisasi terbanyak, tanaman dihaploid terbanyak, dan persentase tanaman dihaploid tertinggi dibandingkan persilangan lainnya yakni berturut-turut 63 tanaman, 42 tanaman dan 91.3%. Padi beras hitam yaitu padi dengan lapisan aleuron berwarna hitam terbanyak dihasilkan oleh persilangan Melik/Inpari13//Melik dan Melik/Fatmawati//Melik.
Kata kunci: dihaploid, kultur antera, padi beras hitam, regenerasi

## PENDAHULUAN
Seiring  waktu  padi  beras  hitam  semakin  populer dan  dikonsumsi  karena  mengandung  antosianin  yang kaya  vitamin  dan  mineral  sehingga  sangat  berguna  bagi kesehatan  tubuh  (Kristamtini et  al .,  2012).  Padi  beras hitam ( Oryza sativa L. indica ) memiliki perikarp, aleuron dan  endosperm  yang  berwarna  merah-biru-ungu  pekat, warna tersebut menunjukkan adanya kandungan antosianin (Sa’adah et al ., 2013). Antosianin mempunyai kemampuan antioksidan,  dan  antikanker  (Sutharut  dan  Sudarat,  2012) juga  dapat  memperlambat  penuaan  (Young et  al .,  2008). Pengembangan padi beras hitam saat ini memiliki kendala antara lain berdaya hasil rendah dan berumur dalam (relatif panjang) sehingga petani jarang menanamnya.
Pemuliaan padi beras hitam konvensional memerlukan waktu yang lama dan varietas baru yang dihasilkan masih terbatas. Salah satu teknik untuk percepatan pembentukan varietas  baru  adalah  dengan  menggunakan  kultur  antera, suatu  teknik  kultur in  vitro yang  dapat  mempercepat perolehan galur murni dengan homozigositas tinggi melalui tanaman  dihaploid  (DH)  yang  dihasilkan  langsung  pada generasi pertama dalam waktu kurang dari setahun sehingga meningkatkan  efisiensi  proses  seleksi  pada  pemuliaan tanaman.  Selain  itu  kultur  antera  lebih  hemat  dalam biaya untuk tenaga kerja, sewa lahan, dan waktu pemulia dibandingkan  dengan  program  pemuliaan  konvensional (Dewi  dan  Purwoko,  2012).  Kultur  antera  disebut  juga dengan kultur haploid yang menghasilkan tanaman haploid. Tanaman  haploid  merupakan  tanaman  yang  memiliki jumlah kromosom yang sama dengan kromosom gametnya atau  tanaman  dengan  jumlah  kromosom  setengah  jumlah kromosom somatiknya (Dewi dan Purwoko, 2011). Tanaman hasil kultur antera ini disebut tanaman dihaploid.
Penelitian ini menggunakan beberapa antera F1 hasil persilangan antara Melik, Inpari 13, dan Fatmawati. Melik adalah padi lokal beras hitam asal Bantul (Kristamtini et al ., 2012). Inpari 13 adalah varietas unggul yang memiliki sifat tahan terhadap wereng batang coklat dan berumur genjah (Rozakurniati, 2011), sedangkan Fatmawati adalah varietas padi tipe baru yang berumur genjah (Abdullah et al ., 2008). Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan galur padi beras hitam dengan warna aleuron berwarna hitam dan umur genjah hasil kultur antera.

## BAHAN DAN METODE
Kegiatan  kultur  antera  dilakukan  di  Laboratorium Kultur  Jaringan,  Kelompok  Peneliti  Biologi  Sel  dan Jaringan, BB Biogen, Bogor, pada bulan Juli 2014 sampai Februari 2015.
Bahan  yang  digunakan  pada  percobaan  ini  adalah antera F1 hasil persilangan padi beras hitam lokal (Melik) dengan  2  varietas  budidaya  (Inpari  13  dan  Fatmawati), yaitu: F 1 BC 1 = Melik/Inpari 13//Inpari 13, F 1 BC 1 = Melik/ Inpari13////Melik, F 1 BC 2 = Melik/Fatmawati//Fatmawati/// Fatmawati, F 1 BC 1 = Melik/Fatmawati//Fatmawati, F 1 BC 1 = Melik/Fatmawati//Melik, dan F 1 = Melik/Fatmawati.
Media induksi kalus adalah media N6 yang diberi 2.0 mg L -1 NAA, 0.5 mg L -1 kinetin dan 0.1644 g L -1 putresin, sedangkan  media  regenerasi  dan  perakaran  adalah  media MS  yang  diberi  NAA  dan  Kinetin  (Dewi  dan  Purwoko, 2011). Jenis poliamin yang digunakan adalah Putresin 10 - 3 M  dan  sukrosa  yang  ditambahkan  pada  media  induksi kalus dan media regenerasi. Zat pengatur tumbuh lainnya yaitu IBA. Bahan untuk sterilisasi malai menggunakan 20% pemutih  komersial  dan  air  steril.  Bahan  untuk  sterilisasi alat yaitu alkohol 90%, dan alkohol 70%. Unsur lain yang ditambahkan yaitu phytagel TM 3 g L -1 pada pH 5.8. Percobaan  dilakukan  menggunakan  rancangan  acak lengkap yang terdiri atas 12 ulangan. Satu unit percobaan merupakan satu cawan petri berisi  ± 150 antera (25 buah bulir  bunga  (spikelet)  dari  satu  tanaman  yang  berasal dari  satu  genotipe  F1).  Total  satuan  percobaan  72  satuan percobaan.

## Persiapan Eksplan
Tanaman  sumber  eksplan  (donor)  ditanam  di  rumah kaca. Saat tanaman mencapai fase bunting, malai yang masih dibungkus selubung mulai dikumpulkan. Malai yang masih berada  di  dalam  selubung  setelah  dicuci  bersih  kemudian dibungkus dengan aluminium foil yang telah dilapisi dengan kertas tisu dan disimpan dalam ruang gelap bersuhu 5 o C.

## Sterilisasi Eksplan
Setelah  8-10  hari,  selubung  malai  dibuka  dan  malai yang  berada  di  bagian  tengah  dan  atas  yang  berwarna kuning  kehijauan  diambil.  Malai  dengan  spikelet  yang panjang antera dan filamennya tidak melebihi 1/2 panjang spikelet dipilih untuk mendapatkan antera yang diinginkan yaitu  antera  yang  berwarna  kuning  kehijauan  kemudian disterilkan dengan 10-20% pemutih komersial, yaitu larutan pemutih yang mengandung 5.24% NaOCl selama 20 menit sebelum dicuci dengan air steril 2 x 5 menit di dalam laminar air flow cabinet .

## Inokulasi atau Penanaman Eksplan
Spikelet  yang  sudah  steril  dipotong  1/3  dari pangkalnya  dan  dikumpulkan  pada  cawan  petri  steril. Dengan  menggunakan  pinset,  masing-masing  spikelet kemudian diketukkan pada tepi cawan petri 100 mm x 15 mm yang sudah berisi 25 mL media induksi kalus sampai ke 6 antera keluar sehingga diperkirakan 150 antera per cawan petri (± 25 spikelet). Inokulasi atau penanaman eksplan ini dilakukan dalam laminar air flow cabinet dan diinkubasi di ruang gelap bersuhu 25 ± 2 o C untuk mempercepat keluarnya kalus yang berasal dari butir sari di dalam antera.

## Regenerasi Tanaman dari Kalus
Pada  umur  3-8  minggu  kalus  mulai  terbentuk  dan dipindahkan ke dalam botol kultur yang sudah berisi 25 mL media regenerasi.

## Aklimatisasi
Tanaman  hijau  yang  tumbuh  dari  kalus  pada  media regenerasi dan sudah mencapai tinggi 3-5 cm dipindahkan ke  dalam  tabung  kultur  berisi  15  mL  media  perakaran. Setelah  akar  tumbuh,  tanaman  sudah  siap  diaklimatisasi (Dewi dan Purwoko,  2011).
Pengamatan  dilakukan  terhadap  jumlah  kalus  yang terbentuk,  jumlah  kalus  yang  menghasilkan  tanaman, lamanya  inisiasi  kalus,  jumlah  tanaman  hijau,  jumlah tanaman  albino,  jumlah  antera  yang  ditanam,  dan  jumlah tanaman dihaploid yang dihasilkan. Data primer digunakan untuk  mengetahui  persentase  tanaman  hijau,  persentase tanaman  albino,  persentase  jumlah  kalus  terhadap  jumlah antera (efisiensi pembentukan kalus), dan jumlah tanaman hijau  terhadap  jumlah  antera  (efisiensi  pembentukan tanaman  hijau).  Data  dianalisis  menggunakan  analisis ragam dan dilanjutkan dengan uji DMRT pada taraf 5% bila terdapat pengaruh pada perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan bahwa respon F1 semua hasil persilangan padi lokal beras hitam dengan 2 varietas budidaya terhadap jumlah antera,
inisiasi  kalus,  jumlah  kalus,  jumlah  kalus  menghasilkan tanaman, jumlah kalus menghasilkan tanaman hijau, jumlah kalus menghasilkan tanaman albino, tanaman total, tanaman hijau, dan tanaman albino berbeda nyata (Tabel 1). Dapat disimpulkan  bahwa  terdapat  keragaman  respon  terhadap kultur antera yang sangat tinggi pada F1 hasil persilangan padi beras hitam lokal dengan 2 varietas budidaya. Sejalan dengan  penelitian  Bagheri  and  Jelodar  (2008)  yang mendapatkan  hasil  respon  genotipe  sangat  nyata  pada induksi kalus kultur antera padi lokal Iran dan galur padi komersial serta F1 hasil persilangannya.

## Induksi Pembentukan Kalus dan Regenerasi Tanaman
Pembentukan kalus enam persilangan pada kultur antera padi  lokal  beras  hitam  dengan  varietas  budiaya  memiliki waktu yang berbeda-beda yakni lebih dari 3 minggu (27- 34 hari) (Tabel 2). Kultur antera padi subspesies japonica, kalus terbentuk setelah 3 minggu (Dewi et al., 2004; Dewi dan Purwoko , 2008; Dewi dan Purwoko, 2011). Umur kalus yaitu  lamanya  waktu  (hari)  sejak  kalus  diinduksi  sampai kalus disubkultur ke media regenerasi sangat menentukan frekuensi regenerasi (Dewi dan Purwoko, 2011).  Padi beras hitam menghasilkan jumlah kalus yang berbeda-beda pada masing-masing  persilangan.  Peningkatan  produksi  kalus
Sidik ragam Peubah JA IK JK + JKMT + JKTH + JKTA + TT + TH + TA + Kuadrat tengah 37.1 86.3 51.4 0.7 0.3 0.3 5.0 2.8 1.6 F hitung 2.4* 2.4*     16.8**     3.4**     9.4** 2.2* 3.9**     6.0** 2.3*
Tabel 1. Hasil sidik ragam peubah kultur antera hasil persilangan padi lokal beras hitam dengan varietas budidaya
Keterangan:  JA = jumlah antera; IK= inisiasi kalus; JK = jumlah kalus; JKMT = jumlah kalus yang menghasilkan tanaman (hijau dan albino); JKTH = jumlah kalus yang menghasilkan tanaman  hijau; JKTA =   jumlah kalus yang menghasilkan tanaman albino; TT = tanaman hijau+albino; TH = tanaman hijau; TA = tanaman albino; + = data ditransformasi dengan metode transformasi akar; ** = berbeda sangat nyata pada taraf α = 1%; * = berbeda nyata pada taraf α = 5%
Persilangan JK IK (hari) JKMT JKTH JKTA Persentase KTMT (%) Persentase KTH (%) Persentase KTA (%) Melik/Inpari13//Inpari13 10.0d 34.3a 1.7c 1.4b 0.3b 83.0 14.0 3.0 Melik/Inpari13//Melik 48.2c 29.5ab 4.7a 2.4a 2.3a 90.2 5.0 4.8 Melik/Fatmawati// Fatmawati///Fatmawati 54.8bc   30.7ab 2.1bc 0.2c 1.9a 96.1 0.4 3.5 Melik/Fatmawati// Fatmawati 61.0bc   28.9ab 3.2abc 1.4b 1.8a 94.7 2.3 3.0 Melik/Fatmawati//Melik 87.0a 26.5b 2.8bc 1.3b 1.5ab 96.8 1.5 1.7 Melik/Fatmawati 77.0 ab 27.8b 3.7ab 1.4b 2.3a 95.2 1.8 3.0
Tabel 2. Hasil induksi kalus pada kultur antera enam persilangan padi lokal beras hitam dengan varietas budidaya
Keterangan: JK = jumlah kalus; IK = Inisiasi kalus ; JKMT = jumlah kalus yang menghasilkan tanaman (hijau dan albino); JKTH = jumlah kalus yang menghasilkan tanaman  hijau; JKTA =  jumlah kalus yang menghasilkan tanaman albino; KTMT = persentase kalus  tidak  menghasilkan tanaman hijau dan albino; KTH = persentase  kalus yang menghasilkan tanaman hijau; KTA = persentase kalus menghasilkan tanaman albino. Angka dalam satu kolom yang diikuti oleh huruf yang sama tidak  berbeda nyata pada uji DMRT pada taraf α 5%
sangat penting karena peluang untuk mendapatkan tanaman hijau akan lebih besar (Dewi et al ., 2007).
Rataan jumlah kalus menghasilkan tanaman berbeda- beda pada setiap persilangan kultur antera padi lokal beras hitam  dengan  varietas  budidaya.  Rataan  jumlah  kalus menghasilkan tanaman (hijau dan albino) paling banyak (4.7 butir  kalus)  dihasilkan  pada  persilangan  Melik/Inpari13// Melik. Jumlah kalus yang bervariasi tergantung dari daya tanggap mikrospora dalam antera yang dikulturkan (Dewi et  al., 2009).  Rataan  kalus  yang  beregenerasi  menjadi tanaman  albino  lebih  banyak  dibandingkan  rataan  kalus yang beregenerasi menjadi tanaman hijau. Menurut Safitri et  al. (2010)  yang  menggunakan  formulasi  media  kultur antera  yang  sama  bahwa  kemampuan  membentuk  kalus pada  kultur  antera  persilangan  tidak  diimbangi  dengan kemampuan  meregenerasikan  kalus  menjadi  tanaman, khususnya tanaman hijau.
Berdasarkan persentase kalus menghasilkan tanaman hijau dan tanaman albino, diperoleh persentase kalus tidak menghasilkan  tanaman  masing-masing  persilangan  padi beras hitam dengan varietas budidaya. Persilangan dengan Melik  ( indica )  menghasilkan  daya  kultur  antera  lebih rendah dibandingkan dengan varietas budidaya ( japonica ). Tetua japonica dan indica menghasilkan daya kultur antera lebih tinggi dibandingkan F1 yang hanya melibatkan tetua indica saja (Grewal et al ., 2011: Gunarsih, 2015). Umumnya persilangan dengan Fatmawati menghasilkan tanaman hijau dan tanaman albino lebih banyak dibandingkan persilangan lainnya.  Hal  ini  sejalan  dengan  penelitian  Safitri et  al . (2010) yang menggunakan varietas Fatmawati sebagai tetua persilangan pada kultur antera persilangan Fatmawati/Fulan Telo Gawa dan resiprokalnya.
Persilangan  Melik/Inpari13//Melik  mempunyai  daya kultur antera yang cukup tinggi dibandingkan persilangan lainnya.  Hal ini terlihat dari jumlah tanaman hijau, tanaman albino,  dan  jumlah  tanaman  total  (hijau  dan  albino)  lebih banyak dihasilkan yakni sebesar 8.7 tanaman, 7.8 tanaman, dan 16.5 tanaman dibandingkan persilangan lainnya (Tabel 3). Banyaknya tanaman hijau yang dihasilkan selalu diiringi dengan  banyaknya  tanaman  albino  (Safitri et  al .,  2010). Namun  yang  terpenting  adalah  peningkatan  regenerasi tanaman hijau karena akan mempercepat atau memperbesar kemungkinan  bagi  pemulia  tanaman  untuk  memperoleh
galur yang diinginkan (Herawati et al ., 2008).
Induksi  kalus  dan  regenerasi  tanaman  dipengaruhi terutama oleh kondisi kultur (kondisi suhu di ruang kultur, intensitas  cahaya  dan  kondisi  ruang  gelap)  walaupun keduanya ada di bawah kontrol genetik. Frekuensi induksi kalus  dan  pembentukan  tanaman  hijau  dikendalikan  oleh banyak  gen  (gen  minor/poligenik)  sehingga  gen  tanaman donor  mempunyai  peran  penting  dalam  menentukan frekuensi  produksi  tanaman  dalam  kultur  antera  (Dewi et al .,  2007;  Asakaviciute,  2008)  juga  penyesuaian  kondisi sebelum dan setelah kultur antera (Cha-Um et al ., 2009).

## Efisiensi Pembentukan Kalus dan Tanaman Hijau
Efisiensi  pembentukan  kalus  setiap  persilangan berbeda-beda  (Tabel  4).  Efisiensi  pembentukan  kalus dihitung  berdasarkan  jumlah  kalus  yang  terbentuk  pada jumlah  antera  yang  ditanam.  Menurut  Zhang  (1992), efisiensi kultur antera terkait dengan produksi tanaman hijau yang dinyatakan dalam rasio tanaman hijau terhadap jumlah kalus  menghasilkan  tanaman  dan  efisiensi  tanaman  hijau terhadap  jumlah  antera  yang  ditanam  merupakan  kriteria terpenting  dalam  memperhitungkan  efisiensi  penggunaan kultur  antera.  Persilangan  Melik/Inpari13//Inpari13  dan Melik/Inpari13//Melik memiliki efisiensi kultur antera lebih baik  dibandingkan  persilangan  lainnya  karena  memiliki rasio  atau  perbandingan  tanaman  hijau  terhadap  kalus menghasilkan tanaman dan efisiensi tanaman hijau terhadap jumlah antera tertinggi.

## Aklimatisasi dan Tanaman Dihaploid
Hasil  aklimatisasi  tanaman  menunjukkan  bahwa persilangan  Melik/Inpari13//Melik  menghasilkan  tanaman yang  dapat  diaklimatisasi  terbanyak,  tanaman  dihaploid terbanyak,  dan  persentase  tanaman  dihaploid  tertinggi dibandingkan  persilangan  lainnya  yakni  berturut-turut  63 tanaman, 42 tanaman, dan 91.3%. Sementara jumlah tanaman hidup  terbanyak  pada  persilangan  Melik/Fatmawati// Fatmawati sebanyak 49 tanaman diikuti persilangan  Melik/ Inpari13//Melik  sebanyak  46  tanaman  (Tabel  5).  Hal  ini sejalan  dengan  penelitian  Herawati et  al .  (2008)  bahwa semakin  banyak  tanaman  hijau  yang  dihasilkan  maka Persilangan Tanaman hijau Tanaman albino Tanaman hijau+albino Persentase tanaman hijau (%) Persentase tanaman albino (%) Melik/Inpari13//Inpari13 6.1ab 1.1b 7.2b 84.72 15.28 Melik/Inpari13//Melik 8.7a 7.8a 16.5a 52.73 47.27 Melik/Fatmawati//Fatmawati///Fatmawati 0.4c 4.0ab 4.4c 9.09 90.91 Melik/Fatmawati//Fatmawati 5.8ab 3.5ab 9.3b 62.37 37.63 Melik/Fatmawati//Melik 4.5ab 4.8ab 9.3b 48.39 51.61 Melik/Fatmawati 4.2b 4.8ab 9.0b 46.67 53.33
Tabel 3. Regenerasi tanaman pada kultur antera enam persilangan padi lokal beras hitam dengan varietas budidaya
Keterangan: Angka dalam satu kolom yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji DMRT pada taraf α 5%
semakin banyak kemungkinan mendapatkan galur dihaploid (DH),  galur  dihaploid  yang  mempunyai  homozigositas tinggi akan memudahkan seleksi selanjutnya.
Keberhasilan  kultur  antera  dipengaruhi  antara lain  status  fisiologi  tanaman  donor.  Tanaman  padi  yang ditanam pada musim hujan menyebabkan antera lebih sulit dikulturkan  karena  banyak  yang  menempel  dan  berair, sedangkan  tanaman  padi  yang  ditanam  saat  intensitas hujan  rendah  lebih  mudah  untuk  dikulturkan.  Hal  lain yang perlu diperhatikan ialah kondisi suhu di ruang kultur,
intensitas  cahaya  dan  kondisi  ruang  gelap  untuk  induksi kalus  serta  ruang  terang  untuk  regenerasi  tanaman.  Suhu 27 o C  mempengaruhi  perkembangan  mikrospora  ke  tahap uninukleat dan tahap binukleat dapat berlangsung cepat atau lambat (Dewi dan Purwoko, 2011).
Tanaman  dihaploid  hasil  kultur  antera  padi  beras hitam  menunjukkan  bahwa  padi  beras  hitam  yaitu  padi dengan lapisan aleuron berwarna hitam terbanyak dihasilkan pada  persilangan  Melik/Inpari13//Melik  dan  Melik/ Fatmawati//Melik  (Tabel  6).  Warna  aleuron  F1  ternyata
Persilangan Jumlah tanaman hijau Aklimatisasi Hidup Hidup (%) Dihaploid Dihaploid (%) Melik/Inpari13//Inpari13 37 23 62.2 8 34.8 Melik/Inpari13//Melik 63 46 73.0 42 91.3 Melik/Fatmawati//Fatmawati///Fatmawati 2 2 100.0 1 50.0 Melik/Fatmawati//Fatmawati 50 49 98.0 28 57.1 Melik/Fatmawati//Melik 38 29 76.3 17 58.6 Melik/Fatmawati 39 36 92.3 8 22.2 Tabel 5.  Hasil aklimatisasi dan tanaman dihaploid pada kultur antera hasil persilangan padi lokal beras hitam dengan varietas budidaya
Persilangan Warna aleuron Hitam Putih Melik/Inpari13//Inpari13 6 2 Melik/Inpari13//Melik 28 14 Melik/Fatmawati//Fatmawati///Fatmawati 0 1 Melik/Fatmawati//Fatmawati 4 24 Melik/Fatmawati//Melik 7 10 Melik/Fatmawati 5 3 Tabel 6.  Warna aleuron tanaman dihaploid (DH 0 ) hasil kultur antera hasil persilangan padi lokal beras hitam dengan varietas budidaya Persilangan Jumlah antera (butir) Efisiensi pembentukan kalus (%) Rasio TH:JKMT EPTH (%) Melik/Inpari13//Inpari13 146.4 6.8 3.6 4.2 Melik/Inpari13//Melik 149.7 32.2 1.9 5.8 Melik/Fatmawati//Fatmawati///Fatmawati 146.8 37.3 0.2 0.3 Melik/Fatmawati//Fatmawati 144.6 42.2 1.8 4.0 Melik/Fatmawati//Melik 145.3 59.9 1.6 3.1 Melik/Fatmawati 147.2 52.3 1.1 2.9
Tabel 4.  Efisiensi pembentukan kalus dan tanaman hijau pada kultur antera hasil persilangan padi lokal beras hitam dengan varietas budidaya
Keterangan: JA= jumlah antera; EPK = efisiensi pembentukan kalus; TH:JKMT = rasio tanaman hijau:JKMT; EPTH = efisiensi pembentukan tanaman hijau
sama  dengan  warna  aleuron  tetua  betina  yang  digunakan pada  persilangannya  sehingga  diduga  terdapat  pengaruh maternal  ( maternal  effect )  untuk  karakter  warna  aleuron. Hal ini sejalan dengan penelitian Safitri et al . (2010) yang memperoleh semua persilangan yang menggunakan Fulan Telo Mihat sebagai tetua menghasilkan keturunan F1 yang mempunyai warna merah.
Widyawati et al . (2013) mengemukakan bahwa warna aleuron  merupakan  penentu  kandungan  antosianin.  Padi beras hitam yaitu padi dengan aleuron padi beras berwarna hitam  mempunyai  kandungan  antosianin  paling  tinggi karena  intensitas  warna  aleuron  hitam  dihasilkan  sangat tinggi. Kristamtini et al . (2014) melaporkan bahwa warna aleuron beras hitam dari hitam cerah sampai hitam pekat.

## KESIMPULAN
Persilangan  silang  balik  Melik/Inpari13//Melik, Melik/Fatmawati//Melik,  dan  Melik/Inpari13//Inpari13 memiliki  respon  induksi  kalus  dan  regenerasi  tanaman paling baik dibandingkan persilangan lainnya. Persilangan Melik/Inpari13//Melik  menghasilkan  tanaman  yang  dapat diaklimatisasi  terbanyak,  tanaman  dihaploid  terbanyak, dan  persentase  tanaman  dihaploid  tertinggi  dibandingkan persilangan  lainnya  yakni  berturut-turut  63  tanaman,  42 tanaman  dan  91.3%.  Padi  beras  hitam  yaitu  padi  dengan lapisan aleuron berwarna hitam terbanyak dihasilkan pada persilangan  Melik/Inpari13//Melik  dan  Melik/Fatmawati// Melik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Staf Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengembangan  Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB Biogen) yang telah membantu pelaksanaan penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdullah, B., Dewi, I.S., Sularjo, Safitri, H., Lestari, A.P. 2008. Perakitan padi tipe baru melalui seleksi silang berulang  dan  kultur  antera.  Penelitian  Pertanian Tanaman Pangan. 27:1-8.
Asakaviciute,  R.  2008. Androgenesis  in  anther  culture  of lithuanian  spring  barley  ( Hordeum  vulgare L.)  and potato  ( Solanum  tuberosum L.)  cultivars.  Turk.  J. Biol. 32:155-160.
Bagheri,  N.,  N.B.  Jelodar.  2008.  Combining  ability  and heritability  of  callus  induction  and  green-plant regeneration  in  rice  anther  culture.  Biotechnology 7:287-292.
Cha-Um,  S.,  B.  Srianan,  A.  Pichakum,  C.  Kirdmanee. 2009. An efficient procedure for embryogenic callus induction  and  dihaploid  plant  regeneration  through
anther culture of Thai aromatic rice ( Oryza sativa L. subsp indica). In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 45:171- 179.
Dewi, I.S., B.S. Purwoko, H. Aswidinnoor, I.H. Somantri. 2004.  Kultur  antera  padi  pada  beberapa  formulasi media  yang  mengandung  poliamin.  Bioteknologi Pertanian 9:14-19.
Dewi, I.S., B.S. Purwoko, H. Aswidinnoor, I.H. Somantri. 2007.  Regenerasi  tanaman  pada  kultur  antera  padi: pengaruh  persilangan  dan  aplikasi  putresin. Bul. Agron. 35:68-74.
Dewi,  I.S.,  B.S.  Purwoko.  2008.  Role  of  polyamines  in inhibition of ethylene biosynthesis and their effects on rice anther culture development. IJAS. 9:60-67.
Dewi, I.S., B.S. Purwoko, H. Aswidinnoor, I.H. Somantri,
M.A. Chozin. 2009. Plant regeneration from anther culture of several genotypes of indica rice tolerant to aluminum toxicity. Indonesian J. Agric. 2:1-5.
Dewi,  I.S.,  B.S.  Purwoko.  2011.    Kultur in  vitro untuk pembentukan  tanaman  haploid  androgenik. Dalam G.A.  Wattimena,  N.  Ansori,  N.M.A.  Wiendi,  A. Purwito,  D.  Efendi,  B.S,  Purwoko,  N.  Khumaida. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. IPB Press, Bogor.
Dewi,  I.S.,  B.S.  Purwoko.  2012.  Kultur  antera  untuk percepatan  perakitan  varietas  padi  di  Indonesia. AgroBiogen. 8:78-88.
Grewal,  D.,  C.  Manito,  V.  Bartolome.  2011.  Doubled haploids  generated  through  anther  culture  from crosses  of  elite  indica  and  japonica  cultivars  and/ or  lines  of  rice:  large-scale  production,  agronomic performance,  and  molecular  characterization.  Crop Sci. 51:2544-2553.
Gunarsih, C. 2015. Pembentukan galur-galur dihaploid padi sawah tadah hujan toleran kekeringan melalui kultur antera. Tesis. Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Herawati,  R.,  B.S.  Purwoko,  N.  Khumaida,  I.S.  Dewi, Abdullah.  2008.  Pembentukan  galur  haploid  ganda padi gogo dengan sifat-sifat tipe baru melalui kultur antera. Bul. Agron. 36:181-187.
Kristamtini, Taryono, P. Basunanda, R.H. Murti, Supriyanta, S.  Widyayanti,  Sutarno.  2012.  Morphological  of genetic  relationships  among  black  rice  landraces from Yogyakarta and surrounding  areas.  ARPN J. Agric. Biol. Sci. 7:982-989.
Kristamtini,  Taryono,  P.  Basunanda,  R.H.  Murti.  2014.
Keragaman  genetik  dan  korelasi  parameter  warna beras dan kandungan antosianin total sebelas kultivar padi beras hitam lokal. Ilmu Pertanian. 17:57-70.
Safitri, H., B.S. Purwoko, D. Wirnas, I.S. Dewi, B. Abdullah.
2010. Daya kultur antera beberapa persilangan padi gogo dan padi tipe baru. J. Agron. Indonesia 38:81- 87.
Sa’adah, I.R., Supriyanta, Subejo. 2013. Keragaman warna gabah  dan  warna  beras  varietas  lokal  padi  beras hitam  ( Oryza  sativa L.)  yang  dibudidayakan  oleh petani  Kabupaten  Sleman,  Bantul  dan  Magelang. Vegetalika 2:13-20.
Sutharut,  J.,  J.  Sudarat.  2012.  Total  anthocyanin  content and antioxidant activity of germinated colored rice.
Internat. Food Res. J. 19:215-221.
Widyawati,  P.S.,  T.I.P.  Suseno,  A.M.  Sutedja.  2013. Perbedaan  sifat  fisikokimia,  sensori,  dan  aktifitas antioksidan  beras  organik  lokal. Dalam Seminar Nasional  Insentif  Riset  Sinas  Membangun  Sinergi Riset  Nasional  Untuk  Kemandirian  Teknologi. Jakarta.
Young,  P.S.,  K.S.  Joong,  C.H.  Ihl.  2008.  Isolation  of anthocyani  from  black  rice  and  screening  of its  antioxidant  activities.  Korean  J.  Microbiol. Biotechnol. 36:55-60.
Zhang, Z.H. 1992. Anther culture for rice breeding at SAAS.
p. 38-74. In Zheng, K., T. Murashige ( Eds .). Anther Culture for Rice Breeders. Proceedings of Seminar and Training for Rice Anther Culture at Hangzhou, China.