Majalah Farmasi, Sains, dan Kesehatan ISSN 2442-9791

## Toksisitas  Akut  Senyawa  Metabolit  Sekunder  dari  Spons  Laut
Clathria sp.
Baru Sadarun 1 , Muh. Hajrul Malaka 2 , Wahyuni 2 , Sahidin 2* ,
1 Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Halu Oleo, Kampus Hijau Bumi Tridharma Anduonohu Kendari 93232
2 Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo, Kampus Hijau Bumi Tridharma Anduonohu Kendari 93232

## Abstrak
Isolasi  dan  penentuan  struktur  senyawa  metabolit  sekunder  dari  ekstrak  metanol  spons  laut Clathria  sp serta  uji  toksisitasnya terhadap  larva  udang Artemia  salina Leach  telah  dilakukan.  Tahapan  isolasi  dimulai  dengan  ekstraksi  menggunakan  teknik maserasi dengan pelarut metanol dilanjutkan, selanjutnya dilakukan pemisahan dengan teknik kromatografi, meliputi kromatografi kolom  vakum  (KKV),  dan  kromatografi  radial  (KR).  Struktur  senyawa  hasil  pemurnian  dianalisis  dengan  metode  spektroskopi menggunakan FTIR dan NMR-1D ( 1 H dan 13 C-NMR) serta dibandingkan dengan data sejenis dari literatur. Isolat diperoleh berupa padatan  berwarna  putih 3β-(hydroxymethyl)-A-nor-5α-cholest-l5-ene .  Hasil  uji  toksisitas  akut  isolat  terhadap  larva A.  salina menunjukkan isolat tidak bersifat toksik dengan nilai LC 50 sebesar 497,58 ppm
Kata kunci: Clathria , spons, steroid, toksisitas, A. salina

## 1. Pendahuluan
Indonesia  sebagai  negara  kepulauan  terbesar  di dunia dengan 17.506 pulau dan 81.000 km garis pantai diakui yang terkaya di dunia dalam hal keanekaragaman organisme laut dalam sistem terumbu karang [1]. Fungsi utama  ekosistem  terumbu  karang  yang  penting  adalah menciptakan kesinambungan antara daratan dan lautan, sedangkan  fungsi  kimia  ekosistem  terumbu  karang adalah  bahan  obat-obatan  yang  memiliki  aktivitas farmakologi serta sebagai penyerap karbon di alam [2]. Keanekaragaman  hayati  perairan  laut  Indonesia memberi  peluang  untuk  memanfaatkan  biota  laut  jenis terumbu karang seperti spons untuk pencarian senyawa bioaktif yang baru.
Spons  merupakan  salah  satu  komponen  biota penyusun  terumbu  karang  yang  mempunyai  potensi bioaktif  yang belum banyak  dimanfaatkan. Hewan laut ini  mengandung  senyawa  aktif  yang  persentase keaktifannya lebih besar dibandingkan dengan senyawa- senyawa  yang  dihasilkan  oleh  tumbuhan  darat  [3]. Penelitian  yang  telah  dilakukan  terhadap  spons menghasilkan senyawa baru dengan struktur  yang  unik dan memiliki aktivitas farmakologi [4].
Aktivitas  sebagai  antikanker  dan  antivirus  juga ditunjukkan  oleh  senyawa-senyawa  dalam  spons  [5].
* KBK Farmasi Sains, Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo Email: sahidin02@yahoo.com
Selain  itu  spons  juga  memiliki  aktivitas  sebagai antiinflamasi,  analgetik,  immunomodulator,  alergi, antivirus,  anti-AIDS,  anti-TBC  dan  anti-alzheimer  [8]. Metabolit  sekunder  yang  telah  berhasil  diisolasi  dan diidentifikasi  dari  spons  Indonesia  antara  lain  β- sitosterol; Cholest-5-en-3β-ol; Cholestan-3β-ol; Ergosta-5,22-dien-3β-ol; 9,19-Siklocholest-24-en-3β-ol; dan  Ergost-5-en-3β-ol,  senyawa  tersebut  menunjukkan toksisitas terhadap Artemia salina [4].
Beragamnya jenis metabolit sekunder yang belum diketahui dan mungkin terdapat dalam spons Clathria sp maka  isolasi  dan  identifikasi  kandungan  metabolit sekunder merupakan langkah  awal yang penting dalam penelitian  pencarian  senyawa  bioaktif  baru  dari  spons yang dapat menjadi prekursor bagi sintesis obat baru atau prototipe  obat  beraktivitas tertentu.
2. . Metode

## 2.1 Umum
Ekstraksi  dilakukan  dengan  menggunakan  pelarut metanol  selama  3x24  jam  dengan  penggantian  pelarut. Isolasi  dilakukan  dengan  teknik  kromatografi  vakum cair (KCV), kromatografi radial (KR) menggunakan fase
diam Si-gel 60 GF (Merck), analisis kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase diam silika gel (Merck Kieselgel 60F 254 , 0.25 mm). Pengukuran spektra 1D-NMR ( 1 H and 13 C-NMR) dan 2D-NMR (HMBC, HMQC) menggunakan spektrometer Agilent 500 pada frekuensi 500  MHz  ( 1 H)  dan  125  MHz  ( 13 C)  di  Laboratorium Kimia  Organik  Bahan  Alam,  Institut  Teknologi Bandung, Indonesia.

## 2.2 Sampel Spons
Spons Clathria sp diperoleh di Taman Pendidikan Laut Bintang Samudra,
Kabupaten Konawe. Pengambilan sampel  dilakukan pada daerah tubir karang ( reef  slope )  dengan  kemiringan  70 0 mengikuti  kontur sejajar  garis  pantai.  Spons  diambil  dari  perairan  pada kedalaman  yang  sama  menggunakan  peralatan  selam Self  Contained  Underwater  Breathing  Apparatus (SCUBA)  dari  kedalaman  2-10  meter  dengan  metode koleksi bebas induk. Spons dipotong 70 % dari volume awal untuk memberikan kesempatan beregenerasi.

## 2.3 Isolasi
Sebanyak 2 kg serbuk kering spons P. pulcrhum Bl dimaserasi  dengan  metanol  selama  3x24  jam  di  dalam wadah  yang  tertutup  dengan  penggantian  pelarut. Setelah  dipekatkan  dengan rotary  vacuum  evaporator (Buchi, Switzerland), diperoleh ekstrak kental berwarna kecokelatan  (70  g).  Ekstrak  dipisahkan  dengan kromatografi cair vakum (25 g, diameter kolom Φ 13,5 cm,  fase  diam  Si-gel  150  g)  dengan  fase  gerak  yang ditingkatkan kepolarannya ( n -heksan:etilasetat, metanol),  menghasilkan  20  fraksi  yang  selanjutnya dikelompokkan ke dalam 5 fraksi gabungan berdasarkan profil  KLT.  Fraksi  F5  (15  g)  dipisahkan  lebih  lanjut dengan KCV (diameter kolom Φ 5 cm, fase diam Si-gel 80  g,  dan  fase  gerak  etilasetat: n -heksan  (10-100%, MeOH  100%)  menghasilkan  7  fraksi  gabungan. Pemurnian fraksi F5e menggunakan kromatografi radial (KR),  fase  diam  Si-gel  PF 254 ,  fase  gerak  etilasetat: n - heksan (30:70%) menghasilkan padatan putih sebanyak 15 mg.

## 2.4 Identifikasi
Isolat  diperoleh  sebagai  padatan  putih,  Spektrum IR (KBr) ṽ maks (cm -1 ) 3456 (OH); 2954 (C sp 3 -H); 1466 (C- C); 1327 (C–C); 1075 (C-O). Spektrum ( 1 H-NMR (CDCl 3 , 500 MHz): 3,71 (1H, dd ); 3,41 (1H, t , J =7,7 Hz); 1,11 (1H, d , J =6,5 Hz); 0,85 (1H, d ); 0,7 (1H, s ); 0,6 (1H, s ). Spektrum 13 C-NMR (CDCl 3 , 125 Hz): 39.2, 27.4, 42.7, 67.1, 52.6, 24.6, 32.8, 35.6, 55.5, 44.1, 22.8, 39.9, 43.1, 56.5, 24.6, 28.3, 56.4, 14.7, 12.5, 35.9, 18.9, 36.3, 23.9, 40.9, 28.1, 22.9, 23.3.

## 2.5 Uji  Toksisitas  dengan  metode  Brine  Shrimp Lethality Test (BSLT)
Larutan stok dari masing-masing bahan uji dengan cara melarutkan 15 mg isolat dalam 1.500 µL DMSO 5% masing-masing  pelarut  yang  sesuai  sehingga  diperoleh larutan  stok  dengan  konsentrasi  10.000  ppm.  Pelarut yang  digunakan  disesuaikan  dengan  sifat  kelarutan sampel.  Seri  konsentrasi  sampel  uji  dibuat  dengan pengambilan  volume  tertentu  dari  larutan  stok menggunakan  mikropipet  dan  dimasukkan  ke  dalam vial.  Vial  yang  telah  diisi  sampel  dan  kontrol  diangin- anginkan hingga kering dan tidak berbau pelarut lagi.
Penetasan  telur Artemia  salina Leach  dilakukan dalam  wadah  penetas  telur  atau  akuarium  mini  dengan dua  bagian  ruang  bersekat,  satu  bagian  yang  terisolasi dari  cahaya  dan  bagian  yang  lain  yang  disinari  oleh cahaya lampu. Sekat dibuat berlubang dengan diameter 2  mm.  Air  laut  dimasukkan  ke  dalam  wadah,  serta diaerasi  menggunakan  aerator.  Sejumlah  telur  Artemia salina Leach dimasukkan ke dalam satu ruang, kemudian ruang tersebut ditutup. Sisi yang lain dibiarkan terbuka dan  diberi  lampu  untuk  menarik  Artemia  salina  Leach yang  telah  menetas  melalui  lubang  sekat.  Telur  akan menetas kira-kira setelah 18-24 jam menjadi larva. Larva yang  berumur  48  jam  dapat  digunakan  untuk  uji toksisitas [7].
Pengujiannya  dilakukan  dengan  menggunakan konsentrasi  desimal  dilakukan  dengan  4  variasi konsentrasi yaitu 500  ppm; 250 ppm; 100 ppm; 50 ppm dengan 3 kali ulangan [8].  Pengujian sampel dilakukan dengan  cara  memasukkan  masing-masing  sampel  ke dalam  vial  yang  kemudian  diuapkan  dengan  diangin- anginkan hingga pelarutnya hilang. Selanjutnya vial diisi air  laut  5  mL  dan  ditambahkan  50  µL  DMSO  1%, kemudian  dihomogenkan  dengan  vortex.  Sebanyak  10 ekor A. salina umur 48 jam yang bergerak aktif dipilih secara  acak,  dimasukkan  ke  dalam  vial  yang  berisi sampel  yang  bebas  pelarut  menggunakan  pipet  tetes. Satu tetes suspensi tepung jagung (1 mg/5 mL air laut) ditambahkan  ke  dalamnya  sebagai  makanan A.  salina kemudian  ditambahkan  air  laut  sampai  5  mL.  Vial diletakkan  di  bawah  lampu  penerangan  selama  24  jam dan  dihitung  jumlah  larva  Artemia  salina  Leach  yang mati (tidak bergerak lagi) [7].
% Kematian = . 100%
Jika  terjadi  kematian  pada  kontrol  uji  dapat dikoreksi dengan rumus Abbot, yaitu :
% Kematian = ( ) 100%
Sadarun, dkk : Toksisitas Akut Senyawa Metabolit Sekunder dari Spons Laut Clathria sp.
Analisis  probit  antara  konsentrasi  uji  dan  jumlah kematian larva diuji dengan menggunakan Minitab® ver 17.1.2  sehingga  menunjukkan  nilai  LC50  dari  masing- masing sampel. Berdasarkan suatu  ketentuan, senyawa murni dikatakan aktif apabila nilai LC50 di bawah atau sama dengan 200 ppm dan 500 ppm untuk ekstrak atau fraksi [9, 13].

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1 Isolasi dan Identifikasi
Pengkajian kandungan senyawa metabolit sekunder  spons Clathria sp.  dilakukan  dengan mengisolasi  senyawa  yang  terkandung  dari  spons  dan menguji aktivitas isolat tersebut sebagai antibakteri dan toksisitas  akut.  Secara  keseluruhan  kegiatan  penelitian ini terdiri atas tahapan isolasi, identifikasi dan pengujian aktivitas  isolat.  Spons Clathria sp.  diambil  dalam keadaan  segar  pada  daerah  tubir  karang  ( Reef  Slope ) dengan  kemiringan  70 0 mengikuti  kontur  sejajar  garis pantai  pada  kedalaman  10  meter  dengan  menggunakan peralatan  selam Self  Contained  Underwater  Breathing Apparatus (SCUBA).
Spons  yang  diperoleh  dieksraksi  menggunakan metanol  kemudian  ekstrak  difraksinasi  menggunakan berbagai metode kromatografi sampai diperoleh padatan berwarna putih. Identifikasi dilakukan dengan menggunakan  berbagai  teknik  spektroskopi  (IR  dan NMR).  Hasi  analisis  FTIR  memperlihatkan  Frekuensi serapan  ikatan  C sp 3 -H  ditunjukkan  dengan  pada bilangan gelombang 2954 cm -1 . Keberadaan ikatan C sp 2 (C=C)  ditunjukkan  dengan  adanya  serapan  pada bilangan gelombang 1466 cm -1 dan 1643 cm -1 . Serapan khas  yang  menunjukkan  adanya  vibrasi  uluran  gugus hidroksil  (-OH)  ditunjukkan  pada  bilangan  gelombang 3456 cm -1 dan diperkuat oleh adanya uluran ikatan C-O pada bilangan gelombang 1075 cm -1 . Spektrum 13 C  NMR  memperlihatkan  27  sinyal karbon  alifatik  dan 1 H  NMR  menunjukkan  15  sinyal yang  mengindikasikan  46  proton  alifatik.  Berdasarkan data-data  tersebut,  senyawa  isolat  memiliki  rumus molekul  C 27 H 46 O  dengan  DBE  ( Double  Bond Equivalence )  =  4  yang  berasal  dari  sistem  siklik.  Satu dari 15 sinyal proton menunjukkan geseran kimia di atas 5  ppm  yaitu  5,13  ppm.  Selanjutnya  sinyal  karbon menunjukkan  karbon  yang  mengikat  gugus  hidroksil berada  pada  geseran  kimia  δC  67,1  ppm  (C-OH)  dan sejumlah karbon metil terisolasi pada daerah 0-25 ppm.
Pembuktian  lebih  lanjut  dilakukan  dengan  2D- NMR  menggunakan  teknik  HMBC  dan  HSQC. Keberadaan karbon yang mengikat hidroksil ditetapkan berdasarkan  korelasi  H-pada  δ H 3,52  ppm  dan  δ C 42,7 ppm.  Melalui  penelusuran  literatur  dari  Eggersdorfer
(1982),  hipotesis  struktur  senyawa  isolat  adalah  3β- (hydroxymethyl)-A-nor-5α-cholestane [10,11].
Gambar 1 . 3β-(hydroxymethyl)-A-nor-5α-cholestane

## 3.2 Uji Toksisitas Akut
Suatu ekstrak dikatakan toksik jika  memiliki nilai LC 50 kurang  dari  1000  µg/mL,  sedangkan  senyawa dinyatakan  mempunyai  potensi  toksik  jika  mempunyai nilai LC 50 kurang dari 200 µg/mL (ppm) (Meyer, 1982). Nilai  LC 50 ( Lethal  Concentration 50)  merupakan konsentrasi zat yang menyebabkan terjadinya kematian pada 50% hewan percobaan yaitu larva A. salina Leach. Perlakuan  uji  toksisitas  ini  dilakukan  sebanyak  3  kali pengulangan/replikasi  ( triplo )  untuk  mendapatkan keakuratan  data  dan  data  yang  didapat  baik,  sehingga data yang diperoleh dapat dihitung secara statistik.
Tabel 1. Hasil perhitungan nilai LC 50 Isolat Sampel Konsentrasi (ppm) % Mortalitas LC 50 (ppm) Isolat 0 50 100 250 500 0.00 26,67 26,67 30.00 33,33 713,67
Hasil  uji  menunjukkan  senyawa  hasil  isolasi bersifat  tidak  toksik  dengan  nilai  LC 50 713,67  ppm. Tabel 1 memperlihatkan perbedaan konsentrasi ekstrak maupun senyawa cukup mempengaruhi tingkat kematian hewan  uji  dengan  asumsi  bahwa  semakin  tinggi konsentrasi maka semakin tinggi pula efek toksik yang dapat ditimbulkan.
Fase  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah fase nauplius karena pada saat itu A. salina Leach berada pada  fase  yang  paling  aktif  membelah  secara  mitosis yang  identik  dengan  sel  kanker  yang  juga  membelah secara mitosis. Hal ini menyebabkan uji BSLT ini sering digunakan sebagai penelitian pendahuluan dari aktivitas antikanker. Salah satu mekanisme kerja obat antikanker juga  bersifat  sitotoksik  yaitu  dengan  cara  menghambat pertumbuhan sel yang akhirnya menyebabkan kematian pada sel sedangkan mekanisme aktivitas sitotoksik pada A. salina Leach belum diketahui secara pasti.
Berdasarkan uraian di atas dapat digunakan sebagai dasar  untuk  menentukan  keamanan  bahan  obat  dari bahan  alam  laut  khususnya  dari  spons Clathria sp dengan  cara  uji  toksisitas  akut  secara  invivo  untuk menentukan lethal  dose (LD 50 )  atau  pada  pemberian suatu  bahan  sebagai  dosis  tunggal  yang  dapat menyebabkan  kematian  50%  hewan  uji.  Pendekatan kefarmasian  menekankan  bahwa  keamanan  bahan  obat merupakan salah satu jaminan mutu yang diminta dalam pengembangan  bahan  baku  obat  tradisional  atau konvensional  di  samping  manfaat  (efek  farmakologi) dan kualitas bentuk sediaan yang akan digunakan

## 4. Kesimpulan
Senyawa yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari  ekstrak  metanol  spons  laut Clathria sp.  yaitu  3β- (hydroxymethyl)-A-nor-5α-cholestane  yang  bersifat tidak toksik dengan nilai LC 50 sebesar 750,77 ppm.

## Daftar Pustaka
1. Jaswir  Yunovilsa  M.  2014.  The  Alkaloids  from Indonesian  Marine  Sponges. Oceanography:  Open Access , 02 (02).
2. Sadarun B., Lestari., A., Yusuf A.A, Leri N., Eric Z. 2008. Petunjuk Pelaksanaan Tranplantasi Karang. Departemen Kelautan dan Perikanan. Jakarta.
3. Muniarsih T, dan Rachmaniar R. 1999. Isolasi Substansi Bioaktif  Antimikroba  dari  Spons  Asal  Pulau  Pari Kepulauan  Seribu. Prosidings  Seminar  Bioteknologi Kelautan  Indonesia I  ’98.  Jakarta  14–15  Oktober  1998: 151-158.
4. Astuti P, Apristiani, DWI. 2005. Isolasi Komponen Aktif Antibakteri Ekstrak Kloroform Daun Mimba
(Azadirachta  indica  A.  Juss.)  Dengan  Bioautografi. Biofarmasi , 3 (2).
5. Bhakuni,  D.  S.,  Rawat,  D.  S.  2005. Bioactive  Marine Natural Products . J. of Nat. Pro. Vol. 48.
6. Ichiba, T., Corgiat, J. M., Scheuer, P. J., & Kelly Borges, M.,  1994.  8-Hydroxymanzamine  A,  a  beta  -carboline alkaloid  from  a  sponge, Pachypellina sp. Journal  of Natural Products , 57 (3) , 168–170
7. Anderson,  J.E.,  Goetz,  C.M,  and  McLaughlin,  J.L.1990. A  blind  Comparison  of  Simple  Banch-top  Bioassay  and Human  Tumour  Cell  Cytotoxicities  as  Anti  tumour Prescreen. Phytochemical Analysis. (6): 107-111
8. Dian  H.,  Yohanes  A.,Nicole.  J.D.V.  2012.  Isolasi Senyawa  Sitotoksik  Dari  Spons  Laut  Petrosia  sp. JPB Perikanan . Vol. 7 (1) : 69–76
9. Meyer,  B.N.,  N.R.  Ferrigni,  J.E  Putnan,  L.B.  Jacobsen, D.E.  Nicholas,  J.L.  McLaughlin.  1982.  Brine  Shrimp: A Convenient  General  Bioassay  for  Active  Plant Constituent.    Departement  of  Medical  Chemistry  and Pharmakognocy, School  of  Pharmacy  and  pharmacal science,  and  Cell  Culture  Libratory,  Perdue  Cancer Center. West lavayette. USA
10. Eggersdorfer  W.  C.,  Kokke  M.  C.,  Christopher  W. Crandell,  Jill  E.  Hochlowski  and  Carl  Djerassi.  1982. Sterols  in  Marine Invertebrates.  32.'  Isolation  of3P- (Hydroxymethyl)-A  -nor-5a-cholest-l5-ene,  the  First Naturally OccurringSterol with a 15-16 Double Bond. J. Org. Chem . 5304-5309. California
11. Faulkner, D. J. (2002). Marine natural products. Natural Product Reports , 19 (1) ,  Hal 1–48.
12. McLaughlin,  J.L.  1991.  Crown  Gall  Tumours  on Potato Disc  and  Brine  Shrimp  Lethality:  Two  Simple  Bioassay for Higher Plant Screening and Fractination, Methods in Plants Biochemistry, 6(1): 1-30c