## POTENSI EKSTRAK PROTEIN Candida albicans SEBAGAI BIORESEPTOR PADA IMUNOSENSOR UNTUK DIAGNOSA KANDIDIASIS
Masfufatun 1 , Akhmad Sudibya 2 , Nur Kumala I 1
1 Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya 2 Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya 1 Email : masfufah_habibah@yahoo.com; qulubuna@yahoo.com 2 Email : A_Sudibya@yahoo.com

## Abstrak
Selama  ini  diagnosa    kandidiasis  masih  terbatas  pada  kultur  darah  standar.  Metode konvensioanal  dengan  kultur  mikrobiologi  ini  kurang  sensitif,  beberapa  pasien  kandidiasis mempunyai  kultur  darah  negatif  dan  memerlukan  waktu  yang  lama.  Hal  ini  mendorong beberapa peneliti mencari metode alternatif diagnosa lainnya.
Tujuan penelitian  ini  adalah  untuk  menentukan  potensi  ekstrak  protein Candida  albicans sebagai  bioreseptor  pada  imunosensor  untuk  mendeteksi Candida  albicans dan  biofilmnya dalam darah pasien kandidiasis.
Metode yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  metode  deskriptif  dengan  tahapan sebagai  berikut:  (1)  isolasi  enzim  dari  cairan  pencernaan  bekicot;  (2)  ekstraksi  protein Candida  albicans melalui  metode  enzimatis  dan  mekanik    dan  (3)  analisis  ekstrak  protein sebagai bioreseptor melalui immunodot assay.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim bekicot memiliki  kadar protein 1,35 mg/ml dan aktifitas spesifik 1,96 Unit/mg. Enzim ini mampu menghidrolisis dinding sel C. albicans dan dengan  bantuan  sonikasi  menghasilkan  ekstrak  protein  ekstrasel  planktonik  (PEP)  dan biofilm  (PEB),  ekstrak  protein  intrasel  plantonik  (PIP)  dan  biofilm  (PIB),  dengan  kadar protein  masing-masing  1,44;  1,29;  1,29  dan  1,21  mg/ml.  Ekstrak    protein  PIB  bersifat antigenik  terhadap antibody  anti-Candida (kontrol  positif)  dengan  memberikan  spot berwarna merah pada immunodot assay . Immunodot assay dapat membedakan serum kontrol negatif  (orang  sehat)  dan  kontrol  positif    dengan  menggunakan  antigen  1  ng/nl  dan  50  nl serum.
Kata Kunci : Candida albicans, kandidiasis , biofilm, pemeriksaan immunodot

## THE POTENCY OF Candida albicans PROTEIN EXTRACT AS BIORESEPTOR ON IMMUNOCENCOR TO DIAGNOSE CANDIDIASIS

## Abstract
So  far,  diagnosing  on  candidiasis  has  still  been  limited  in  standard  blood  culture.  The traditional  method  of  this  microbiology  culture  is  less  sensitive,  many  patients  with
candidasis infection have negative blood culture, and need a long time. This case encourage many researchers to use another alternative methode to diagnose.
The purpose of this research is to examine the potency of Candida albicans protein  extract as bioreseptor on immunocencor to  detect  Candida albicans and its biofilm in the blood of candidiasis patients.
The  research  method  which  is  used  is  descriptive  with  the  following  steps  :  (1)  isolating enzim  from  the  liquid of digestive  gland of  snail (Achatina  fulica);  (2)  extraction of protein candida  albicans    through    enzimatis and  mechanic  methods  and  (3)  Analyzing  the  protein extract as bioreseptor through immunodot assay.
The research result shows that the snail enzyme has the protein content 1.35 mg/ml and the specific  activity  1.96  unit/mg.  This  snail  enzyme  can  hydrolyze    the  cell  wall  of  Candidia albicans    and,  with  the  help  oh  sonication,  produce  extract  of  planktonic  extracel  protein (PEP)  and  biofilm  (PEB),  extract  of  planktonic  intracell  protein  (PIP),  and  biofilm  (PIB), with  each  protein  content  1.44;  1.29;  1.29  and  1.21  mg/ml.  The  characeristic  of  biofilm intracell  protein  (PIB)  is  antigenic  on  antibody  anti-candida  (positive  control)  with  giving red  spot  on  immunodot  assay.  Immunodot  assay  can  distinguish  negative  control  serum (health man) and positive Candidiasis control by using antigen 1 ng/nl and 50nl serum.
Keywords: Candida albicans, candidiasis, biofilm, immunodot assay

## PENDAHULUAN
Candida  spp dikenal  sebagai  fungi dimorfik  yang  secara  normal  ada  pada saluran  pencernaan,  saluran  pernafasan bagian  atas  dan    mukosa  genital  pada mamalia 1 .    Populasi Candida  spp yang meningkat ( over growth )
dapat menimbulkan  masalah.  Beberapa  spesies Candida yang dikenal banyak menimbulkan penyakit baik pada manusia maupun hewan adalah Candida    albicans .  Penyakit  yang timbul  akibat  infeksi C.  albicans dikenal dengan istilah kandidiasis.
Kandidiasis diklasifikasikan menjadi kandidiasis superfisial (kandidiasis)  dan  kandidiasis  sistemik
(kandidemia). Kandidiasis superfisial adalah  infeksi Candida pada  permukaan
epidermal  dan  mukosa,  misal  pada  rongga mulut, pharynx,  oesophagus, intestin , urinary  bladder, dan  vagina.  Di  Amerika 75%  wanita  pada  masa  reproduksi  pernah mengalami vulvavaginistis candidiasis. Antara 40-50% dari angka tersebut mengalami  infeksi  berulang  dan  5-8%  nya terkena  infeksi  candida  kronis 2 ,  sedangkan kandidemia  merupakan  kondisi  diseminasi dari  infeksi  oleh Candida .  Kandidemia biasanya  diderita  oleh  penderita  HIV,  atau setelah  menjalani  perawatan  medis  yang menjadi  pasien  rumah  sakit,  terutama  yang menjalani  transplantasi  organ.  Di  London, 40,5% terkena infeksi jamur pasca transplantasi  hati  dan  90%  dari  angka tersebut  disebabkan  oleh  infeksi Candida
spp dan  66%  oleh Candida  albicans 3 .  Di Jerman angka kematian akibat
necrosectomy diikuti  oleh  infeksi  jamur termasuk Candida mencapai 62% 4 .
Infeksi yang disebabkan oleh kandidiasis telah menambah masalah therapeutical di  beberapa  tahun  terakhir. Deteksi  terhadap  kandidiasis  sangat  sulit dilakukan.  Diagnosis  laboratorium  dan pengobatan  terhadap  penyakit  ini  belum memberikan  hasil  yang  memuaskan 5 . Selama  ini  diagnosa  kandidiasis  masih terbatas  pada  kultur  darah  standar.  Metode tradisional  kultur  mikrobiologi  ini  kurang sensitif,  banyak  pasien  dengan  infeksi Candida menunjukkan  hasil  kultur  darah yang  negatif  dan  membutuhkan  waktu beberapa hari (1-3). Hal ini mendorong para peneliti untuk menghasilkan metode alternatif  dalam  mendiagnosis,  seperti diagnosis serologi melalui deteksi antigen/antibodi.
Di  dalam  tubuh,  sebagai  respon terhadap adanya protein antigenik C.  albicans ,  maka  sistem  imun  tubuh  akan memproduksi  antibodi  sebagai  bentuk pertahanan terhadap keberadaan
C. albicans . Keberadaan biofilm C.  albicans tersebut  di  dalam  saluran pencernaan inang akan memicu terbentuknya antibodi yang spesifik terhadap  biofilm  tersebut.  Bentuk  biofilm
dapat  menyebabkan  invasi,  menembus  sel epitel  pada  dinding  usus.  Pada  penderita dengan sistem imun yang normal ( immunocompetent )  sel C.  albicans akan dihadang oleh antibodi sehingga tidak dapat menyebar  ke  dalam  darah.  Antibodi  adalah molekul  protein  yang  dihasilkan  oleh  sel plasma  sebagai  akibat  interaksi  antara limfosit  B  yang  peka  antigen.  Antibodi memiliki  kemampuan  berikatan  secara khusus  dengan  antigen  serta  mempercepat penghancuran  dan  eliminasi  sel  asing. Antibodi dapat membedakan antara berbagai  determinan  antigen  (epitop), walaupun hanya memiliki sedikit perbedaan dalam konfigurasi structural 6 .
Na  dan  Song  (1999)  melaporkan bahwa  respon  antibodi  Sap  ( secreted aspartyl  proteinase )  terhadap C.  albicans mampu  dideteksi  menggunakan  metode ELISA  ( Enzyme-Linked  Immunoabsorbent Assay ).  Metode  ELISA  ini  memiliki sensitivitas  dan  spesifitas  masing-masing 70%  dan  76% 7 .  Selain  antibodi,  diagnosis invasi Candida albicans juga bisa dilakukan  melalui  deteksi  antigen.  Oliveri (2008) melakukan penelitian dengan menggunakan  Platelia  Candida  ELISA untuk mendiagnosis invasi kandidiasis pada pasien  bayi  prematur.  Deteksi  antigen Mannan  Candida (CM) telah  menunjukkan
sensitivitas dan spesifitas lebih tinggi, yakni masing-masing  94,4% dan  94,2% 8 .
Salah  satu  format  pemeriksaan deteksi  antigen/antibodi  yang  baru  adalah dengan imunokromatografi, yang merupakan  sebuah  biosensor 9 .  Biosensor yang  menggunakan  antigen  atau  antibodi sebagai bioreseptor dikenal dengan imunosensor 10 . Gold Immunochromatograaphic Assay (GICA) merupakan teknik imunokromatografi baru yang
menggunakan membran nitroselulosa sebagai pembawa dan  koloid emas  berlabel antigen/antibodi  sebagai  tracer.  Teknologi ini mempunyai banyak keuntungan dibandingkan  dengan Immunoassay yang lain,  yaitu  prosedur  yang  sederhana,  hasil cepat,  harga  murah,  tidak  membutuhkan teknisi  dengan  kemampuan  khusus  atau peralatan mahal dan dapat digunakan untuk mendeteksi  antigen  atau  antibodi.  Metode ini telah banyak  digunakan untuk diagnosis beberapa  penyakit  dan  mendeteksi  molekul bioaktif, hormon, dan haptens 11 .
Di  indonesia  telah  dikembangkan tes  imunokromatografi  untuk  identifikasi berbagai  macam  antigen  atau  antibodi, diantaranya  untuk  identifikasi  antibodi Helicobacter  pylory di  unit  Biomedika Rumah  Sakit  Umum  Daerah  Mataram,
Identifikasi Plasmodium  falciparium  vivax
di Institute  of  Tropical  Disease (ITD) Universitas  Airlangga.  Pada  tahun  2010, Dewi  mengaplikasikan  imunosensor  untuk mendeteksi  IgG  terhadap Toxoplasma gondii dengan metode GICA menggunakan ekstrak  ESA  sebagai  bioreseptor 12 .      Di
Indonesia
belum ada penelitian pengembangan uji imunokromatografi untuk identifikasi C. albicans dan biofilmnya. Metode uji  yang ada selama ini kurang  memuaskan  karena  pelaksanaannya sulit,  karena  membutuhkan  peralatan  yang mahal,  analis  yang  berpengalaman  dan biayanya juga mahal. Oleh karena itu  pada penelitian  ini  perlu  dilakukan  uji  potensi ekstrak  protein  sebagai  bioreseptor  pada imunosensor  melalui immunodot  assay sebagai uji pendahuluan sebelum diaplikasikan  dalam  imunosensor  dengan metode GICA ( Gold Immunochromatographic Assay ).
Tujuan  penelitian  adalah  menguji kemampuan enzim bekicot ( Achatina fulica )  dalam  melisis  dinding  sel Candida albicans untuk menghasilkan estrak protein baik ektrasel maupun intrasel dan membuktikan potensi ekstrak protein Candida  albicans sebagai  bioreseptor  pada imunosensor  untuk  mendeteksi Candida albicans dalam  darah  pasien  kandidiasis.

## BAHAN DAN METODA
Bahan Penelitian Bahan yang akan digunakan dalam penelitian  ini diantaranya  adalah bacto agar (Difco),  dektrosa  (Difco),  pepton  (Oxoid), yeast  extract (Merck),  NaCl  (Merk), NaHCO 3 (Merck), Na 2 HPO 4 .7H 2 O (Merck), NaH 2 PO 4 (Merck), spiritus, aquades,  L-Manitol  (sigma), glukosa, reagen Lowry , reagen DNS.

## Pembuatan Pellet sel Candida albicans
Pembuatan  pellet  sel  planktonik  Candida albicans
Setelah  dikocok  ( shaker )  24  jam,    100 ml inokulum C. albicans dalam media cair YPD  ( Yeast  Peptone  Dextrose )  disentrifus pada 10.000 rpm dan suhu kamar selama 15 menit.  Pellet  yang  diperoleh  dicuci  dengan 0,1  M  buffer  fosfat  salin  (PBS)  steril. Proses  pencucian  ini  dilakukan  dua  kali. Endapan  sel C.  albicans yang  diperoleh disebut sebagai pellet sel planktonik.

## Pembuatan pellet biofilm Candida
albicans
Pembuatan  biofilm  dilakukan  sesuai dengan metode Samaranayake, et al (2005) dan  Merrit, et  al (2005)  yang  telah dimodifikasi 13 .  Biofilm C.  albicans ditumbuhkan  pada  membran  filter  selulosa
nitrat  yang  berdiameter  25  mm  dengan ukuran pori 0,22 µm dengan media spider.
Membran  selulosa  yang  sudah disterilkan  diletakkan  diatas  media  biofilm dengan menggunakan pinset steril. Selanjutnya  50  µl  inokulum C.  albicans dengan Optical  Density (OD) 0,5  pada  λ 469  nm  diteteskan  pada  membran  filter selulosa  nitrat  yang  diletakkan  diatas permukaan media spider dalam cawan petri dan  diinkubasi  pada  37 0 C  selama  1  jam. Cawan  petri  selanjutnya  dibalik  dan inkubasi dilanjutkan selama 24 jam.
Biofilm  yang  terbentuk  dipisahkan dari  membran  untuk  diresuspensi  dengan larutan PBS steril. Suspensi disentrifus pada kecepatan  1000  rpm  selama  15  menit. Residu  hasil  sentrifus  ini  disebut  pelet biofilm sel Candida albicans yang selanjutnya  disimpan  dalam  kulkas  untuk penelitian selanjutnya.

## Isolasi Enzim dari bekicot
(Achatina fulica)
Panen enzim dari Achatina fulica
Bekicot, Achatina  fulica yang  telah dikarantina  selama  lebih  dari  3  hari,  maka akan  siap  untuk  dipanen.  Pengambilan cairan digestive  gland dilakukan  dengan cara  aseptis. Achatina  fulica dipotong bagian  sutura,  dan  cairan  yang  didapat ditampung  dalam beaker  glass yang  telah
direndam  dengan  es  dengan  suhu  2 – 5  ºC. Cairan  yang  didapat  kemudian  disentrifus dengan  kecepatan  4000  rpm  selama  5-10 menit  dengan  suhu  2  –  5  ºC.  Setelah disentrifus  didapat  endapan  dan  supernatan terpisah.  Supernatan  tersebut  merupakan ekstrak kasar enzim yang telah terpisah dari kotoran dan selanjutnya di uji aktivitas 14.

## Penentuan aktivitas enzim Achatina fulica
Aktivitas enzim β -1,3-glukanase  ditentukan dengan  cara  mengukur  banyaknya  gula pereduksi  yang  dihasilkan  dari  hidrolisis substrat laminarin (SIGMA). Sebanyak 750 μ l  substrat  laminarin  1%  ditambah  dengan
75  μ l  enzim  sampel  (3%)  kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 10 menit. Hasil  inkubasi  ditambah  450  μ l  pereaksi DNS  (3,5- dinitrosalisilic  acid )  kemudian dimasukkan  dalam  penangas  air  mendidih dan  dipanaskan  selama  15  menit.  Setelah itu  segera  didinginkan  dalam  air  es  selama 20  menit.  Aktivitas  enzim  diukur  dengan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang 550  nm.  Absorbansi  yang  diperoleh diplotkan pada persamaan regresi linier dari kurva standar larutan glukosa.

## Penentuan kadar protein
Pengukuran  kadar  protein  dari  enzim bekicot  dilakukan  dengan  menggunakan metode Lowry ,  dengan  membuat  4  larutan
yaitu larutan A, B, C dan D terlebih dahulu. Selanjutnya    mencampurkan  0,5  ml  sampel enzim  dan  2,5  ml  larutan  C.  Pencampuran kedua larutan tersebut divortex selama 5-10 menit.  Selanjutnya    ditambah  dengan  0,25 ml  larutan  D,  setelah  itu  diinkubasi  selama 20  menit,  kemudian  diukur  absorbansinya pada panjang gelombang 750nm.
Absorbansi  yang  diperoleh  diplotkan  pada persamaan regresi liner  yang diperoleh dari kurva standar larutan standar protein BSA.

## Ekstraksi Protein planktonik dan biofilm
C. albicans secara enzimatis dan mekanik
Ekstraksi protein plantonik C. albicans Ekstraksi protein dilakukan dengan menggunakan  metode  Casanova,  yang dimodifikasi 15 . Pelet  sel  hasil  sentrifugasi inokulum  C. albicans diresuspensi  dengan KCl  0,6M  dan  disentrifuge  pada  kecepatan 1000  rpm  selama  15  menit.  Pelet  yang dihasilkan  diresuspensi  dengan  buffer posfat  pH  7  dan  ditambah  dengan  enzim Achatina  fulica .  Campuran  diagitasi  pelan pada  suhu  28 o C  selama  beberapa  jam. Selanjutnya  campuran  disentrifuge  dingin pada kecepatan 2600 rpm selama 10 menit. Supernatan  yang  diperoleh  disentrifuge ulang pada kecepatan 20000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak protein ekstrasel
Planktonik  (PEP)    dan  diuji  kadar proteinnya.    Pelet  hasil  sentrifus  I  dan  II digabung    diresuspensi  dengan  buffer posfat,  selanjutnya  disonikasi  selama  10 menit  (10  x    60  detik)  pada  sauhu  dingin. Suspensi  hasil  sonikasi  disentrifus  selama 30  menit  dengan  kecepatan  17.500  rpm. Supernatan  yang  dihasilkan  disebut  ekstrak protein  intrasel plantonik  (PIP)  dan selanjutnya  diuji  kadar  proteinnya.  Baik PEP  maupun  PIP  dipekatkan  melalui liofilisasi dengan freeze dryer dan disimpan pada  suhu  -20 o C  untuk  diuji  sebagai bioreseptor pada immunodot assay .
Ekstrasi protein Biofilm C. albicans Pelet sel  hasil  sentrifugasi  suspensi  biofilm C. albicans diresuspensi dengan 10 ml KCl 0,6M dingin dan disentrifuse pada kecepatan  10.000  rpm  selama  15  menit. Pelet  yang  dihasilkan  diresuspensi  dengan buffer  posfat  pH  7  dan  ditambah  dengan enzim Achatina  fulica .  Campuran  diagitasi pelan pada suhu 28 o C selama beberapa jam. Selanjutnya  campuran  disentrifus  dingin pada kecepatan  2600 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh disentrifus ulang pada  kecepatan  20000  rpm  selama  30 menit. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak protein ekstrasel Biofilm  (PEB)    dan  diuji  kadar  proteinnya. Pelet  hasil  sentrifuse  I  dan  II  digabung
diresuspensi dengan buffer posfat, selanjutnya  disonikasi  selama  10  menit  (10 x    60  detik)  pada  suhu  dingin.  Suspensi hasil  sonikasi  disentrifuge  selama  30  menit dengan  kecepatan  17.500  rpm.  Supernatan yang  dihasilkan  disebut  ekstrak  protein intrasel  Biofilm (PIB) dan  selanjutnya diuji kadar  proteinnya.  Baik  PEB  maupun  PIB dipekatkan  melalui  liofilisasi  dengan freeze dryer dan  disimpan  pada  suhu  -20 o C  untuk uji  selanjutnya  sehingga  dapat  digunakan sebagai bioreseptor pada immunodot assay .

## Persiapan/Preparasi Sampel Serum
Darah Pasien yang Terinfeksi  C.albicans Pasien  yang  menderita  kandidiasis  (pasien Diabetes  Militus,  atau  ODHA)  diambil sampel  darahnya.  Darah  yang  diperoleh dialirkan  ke  lereng  media  miring  SDA secara    aseptis  dan  sisanya  ditampung dalam  tabung Vacutiner .  Darah  yang melapisi permukaan SDA dibiarkan  sampai tumbuh  jamur  dan  selanjutnya  dikultur. Sedangkan darah dalam vacutiner disentrifugasi  dengan  kecepatan  5000  rpm, pada  suhu  4 o C  selama  15  menit  untuk mendapatkan  serum  dan  disimpan  pada suhu -20 o C untuk dilakukan penelitian lebih lanjut  sebagai  antibodi  anticandida  pada dispstik Immunodot. Sebagai kontrol negatif  digunakan  darah    orang  sehat (normal)

## Immunodot Assay

## Optimasi penempelan antigen
Larutan  antigen  diencerkan  menggunakan buffer  carbonat  pH  9,6  sehingga  diperoleh serial    kadar  protein  1,0;  1,5;  2,0  2,5;  dan 3,0  ng/ul.  Sebanyak  3 ul  antigen  diteteskan pada permukaan plastik polystirene menggunakan mikropipet yang akan membentuk  spot  tidak  berwarna.  Setelah dikering anginkan, antigen difiksasi  dengan merendamnya  dalam  methanol  selama  5 menit  dan  dikeringkan  kembali.  Stabilisasi bagian antigen ditutup  dengan cara mencelup  ke  dalam  larutan  10%  sukrosa, dikeringkan  anginkan,  kemudian  disimpan pada 2 o C hingga digunakan.

## Optimasi volume serum
Optimalisasi  volume  serum  menggunakan serum kontrol positif sebanyak 2 sampel
Uji anti-candida dengan distick

## imunodot
Sebanyak  50  ul  serum  dimasukkan  ke dalam  sumuran mikroplate  flat-bottomed yang  telah  terisi  150  ul  Tris-HCl  pH  7,2. Kemudian  dimasukkan  ujung  dipstick  ke dalam  sumuran  dan  diinkubasi  pada  suhu
kamar  selama  30  menit.  Setelah  dicuci  3  x menggunakan buffer Tris-Cl, ujung dipstick dimasukkan  ke  dalam  sumuran  yang  berisi 200  ul  larutan  koloid  emas  yang  diikat Protein  A  dan  diinkubasi  selama  15  menit pada suhu kamar. Dipstick kemudian dicuci 3  kali  dan  diamati  adanya  spot  berwarna merah.  Hasil  dikatakan  positif  bila  timbul spot  warna  merah  penuh.  Hasil  dikatakan negatif  bila  tidak  terbentuk  spot  berwarna merah atau spot yang tidak utuh membentuk lingkaran.

## Teknik Pengumpulan dan Analisis Data
Pengumpulan  data  dalam  penelitian  ini dilakukan  dengan  menggunakan  metode observasi/pengamatan  spot  yang  terbentuk selama  dilakukan  eksperimen  laboratorik melalui  uji distick imunodot .  Pengolahan data  hasil  pengamatan  dilakukan  secara deskriptif dan disajikan dalam bentuk tabel.

## HASIL

## Isolasi Enzim bekicot, Achatina fulica
Dari  15  ekor  bekicot  diperoleh  cairan bening  kebiruan  sebanyak  60  ml  (Gambar 1). Ekstrak  enzim  ini  memiliki  kadar protein sebesar 1,35 mg/ml.
Gambar 1.  Cairan disgestive gland bekicot
Hasil uji aktivitas glukanase menunjukkan  bahwa  ekstrak  enzim  bekicot pada  penelitian  ini  memiliki  aktivitas sebesar  2,649 unit/ml  dan  aktivitas  spesifik sebesar 1,958 unit/mg. Unit aktivitas enzim diartikan Definisi 1U (unit) aktivitas adalah jumlah  enzim β -1,3-glukanase  dalam  1  ml
ekstraks β -1,3-glukanase yang
membebaskan  1 μ mol  gula  pereduksi  yang
dihitung  sebagai  glukosa  permenit  permili pada kondisi percobaan.
Ekstraksi protein C. albicans secara enzimatis dan mekanik
Kadar protein PEP (protein ekstrasel planktonik), PEB (protein  ekstrak Biofilm), PIB  (protein  Intraseluler  biofilm),  PIP (Protein  Intraseluler  Planktonik)  ditentukan dengan menggunakan metode Lowry.
Gambar 2.   Kadar protein hasil lisis matrik biofilm dan dinding  sel C. albicans

## Immunodot Assay
Tabel 1. Hasil optimasi konsentrasi antigen
Jumlah Ag ditempel ng/uL Sampel kontrol C+ (100 uL) Spot warna merah Hasil 2,5 C+ Ada + 2,0 C+ Ada + 1,5 C+ Ada + 1,0 C+ Ada + 0,5 C+ Tidak ada - Tabel 2.  Hasil Optimasi Volume Serum No serum Volume/Pengenceran Serum Kontrol positif Bentuk Spot Hasil P 5 50 100 150 200 Ada Ada Ada Ada + + + + D 1 50 100 150 200 Ada Ada Ada Ada + + + + Blanko (0,8% NaCl) 50 100 150 200 Tidak ada Tidak ada Tidak ada Ada, tidak utuh - - - -
Tabel 3.  Hasil Uji Anti- Candida dengan distick imunodot No. sampel Kode Spot warna merah Hasil Keterangan klinis 1 P1 Ada Pos(+) ODHA 2 P2 Ada Pos(+) ODHA 3 P3 Ada Pos(+) ODHA 4 H1 Ada tapi tidak utuh Neg(-) Sehat 5 H2 Tidak ada Neg (-) Sehat 6 H3 Tidak ada Neg(-) Sehat

## HASIL PEMBAHASAN
Isolasi Enzim bekicot, Achatina fulica
Menurut  Weel,  1961  Enzim  siput mengandung  enzim β -1,3-glukanase, β -
1,4-glukanase, β -1,4-glukanhidrolase, enzim  kitinase,  xilase,  selulase,  lichenase, inulase,  hemiselulase,  amilase,  maltase, dan  sukrase.  Berhubung  komponen  utama dinding  sel Candida  albicans adalah glukan maka pada ekstrak enzim Achatina fulica ini diuji aktivitas  glukanase dengan menggunakan  substrat  laminarin  (1,3-  - glukan).  Uji  aktivitas  enzim  β -1,3- glukanase  diukur  dari  kadar  gula  reduksi hasil  reaksi  antara  enzim  dengan  substrat. Gula  pereduksi  berhubungan  erat  dengan aktivitas  enzim,  semakin  tinggi  aktivitas enzim  maka  semakin  tinggi  pula  gula pereduksi  yang  dihasilkan.  Gula  reduksi merupakan  golongan  gula  (karbohidrat) yang memiliki kemampuan untuk mereduksi  dikarenakan  adanya  gugus aldehid atau keto bebas.
Ekstraksi protein C. albicans secara enzimatis dan mekanik
Ekstrak protein C. albicans diperoleh  melalui  lisis  matrik  biofilm  dan dinding sel C. albicans dengan menggunakan  enzim Achatina  fulica dan disempurnakan  dengan  cara  sonikasi. Proses  lisis  enzimatis  dengan  enzim Achatina  fulica berlangsung  lebih  lama
sekitar 20 jam dibandingkan dengan enzim zymolease ,  yang  hanya  berlangsung  2  jam 15 .  Hal  ini  disebabkan  enzim zymoliase memiliki  aktivitas  jauh  lebih  tinggi dibandingkan  ekstrak  enzim Achatina fulica .
Penelitian  ini  mengasilkan  empat jenis  ekstrak  protein  yaitu  ekstrak  protein PEP  (protein  ekstrasel  planktonik),  PEB (protein  ekstrasel  biofilm),  PIP  (protrein ekstrasel  planktonik),  dan  PIB  (protein ekstrasel  biofilm).  Ekstrak  protein  PEP dan  PEB  memiliki  kadar  protein  lebih tinggi  dari  pada  PIP  maupun  PIB.  Hal  ini disebabkan  pada  proses sentrifugasi, enzim Achatina fulica ikut larut bercampur dengan ekstrak protein ekstrasel.

## Immunodot Assay
Pada  uji  anti- Candida dipstick imunodot  dilakukan  optimasi  pemilihan dan  konsentrasi  antigen  dari  ekstrak protein  yang  diperoleh  dari  penelitian  ini. Pada  optimasi  penempelan  antigen  pada kertas  polistyrena    menunjukkan  bahwa ekstrak  protein  PIP,  PEP  maupun  PEB memberikan spot warna coklat kekuningan pada  kertas  polistyrena  sedangkan  ekstrak protrein  PIB  tidak  memberikan  spot. Munculnya spot warna coklat dikhawatirkan  dapat  menganggu  warna spot  yang  ditimbulkan  oleh signal  reagent pada uji  imunodot  assay . Oleh  karena  itu ekstak protein yang dipilih sebagai antigen
pada  uji  anti- Candida dipstick  imunodot adalah ekstrak protein PIB dan selanjutnya dilakukan optimasi konsentrasi antigen.
Berdasarkan hasil optimasi konsentrasi  antigen,  ekstrak  protein  PIB memberikan  respon  berupa  spot    merah terhadap  serum  pasien  kandidiasis  yang positif kultur sampai pada  konsentrasi 1,0  g/  l.  Pada  konsentrasi  terkecil  0,5  g/  l tidak memberikan respon, dengan demikian    konsentrasi  antigen  yang dipakai  dalam  penelitian  ini  adalah  1,0  g/  l  dengan  volume  serum  50ul  atau pengenceran ¼.
Uji pendahuluan diagnosa
kandidiasis  dengan  menggunakan dipstick imunodot telah  berhasil  dilakukan  dengan menggunakan  beberapa  serum  pasien ODHA  (Orang  dengan  HIV-Aids)  dan orang  sehat.  Pada  penelitian  ini,  antigen direndam  bersama  serum  pasien  dalam sebuah  sumuran    dengan  tujuan  terjadi ikatan  antigen-antibodi  yang  selanjutnya direaksikan dengan signal reagent (protein A  yang  dilabel  dengan  koloid  emas). Protein  A  menyerupai    antibodi  sekunder dengan  mengikat  Fc  antibodi  primer sehingga  pada  uji  diagnosa  dengan immunodot assay ini tidak perlu menggunakan  antibodi  sekunder.  Protein A  berikatan  dengan  IgG  yang  berasal mamalia.    Antigen  berikatan  dengan antibodi anti- Candida yang terdapat dalam
serum  pasien    membentuk  kompleks dengan  protein  A  sehingga    memberikan signal berupa spot merah. Spot merah yang muncul menunjukkan bahwa  serum pasien terinfeksi Candida  albicans .  Ekstrak protein  PIB  bisa  diaplikasikan  sebagai bioreseptor pada imunosensor GICA ( Gold
Imunocromatography
Assay ) pada penelitian  selanjutnya.  Keakuratan  dan sensitivitas uji dipstick imunodot ini belum dilakukan  pada  penelitian  ini,  sehingga perlu  juga  dilakukan  penelitian  lanjutan dengan  membandingkannya  pada    metode serologi lain seperti ELISA.

## KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa 1. Ekstrak  enzim  bekicot, Achatina fulica memiliki  potensi  untuk melisis  matriks  biofilm  maupun dinding sel Candida albicans
2. Ekstrak  protein  intrasel  biofilm (PIB)  memiliki  potensi  sebagai bioreseptor pada imunosensor
3. Pemeriksaan    anti- Candida dengan uji dipstick immunedot  dilakukan pada  konsentrasi  antigen  1,0  g/  L dengan volume serum 50  L

## SARAN
Berdasarkan hasil penelitian ini maka disarankan :
1. Mengaplikasikan ekstrak protein PIB sebagai bioreseptor pada imunosensor GICA ( Gold Immunocromatography  Assay )  pada
penelitian selanjutnya.
2. Menguji  keakuratan  dan  sensitivitas uji dipstick imunodot membandingkannya  dengan    metode serologi lain seperti ELISA.
3. Mengidentifikasi profil protein antigenik  spesifik  biofilm Candida albicans sehingga  bisa  dijadikan sebagai kandidat biomarker
kandidiasis

## UCAPAN TERIMAKASIH
Kami  ucapkan  terimaksih  yang  sebesar- besarnya  kepada  Dijen  DIKTI  yang  telah memberikan  dana  pada  hibah  penelitian pemula ini

## DAFTAR PUSTAKA
1. Brown,  M.R.,  C.A.  Thomson,  and F.M.  Mohamed.  Systemic  candidiasis in  an  apparently  immunocompetent dog. J Vet Diagn Invest. 2005. 17(3) : 272-276.
2. Wilson,  C.  Recurrent  vulvovaginitis candidiasis; an overview of traditional and  alternative  therapies.  Adv  Nurse Pract. 2005. 13(5) : 24-29.
3. Verma,  A.,  J.J.  Wade,  P.  Cheeseman, B. Samaroo, M. Rela, N.D. Heaton, G. Mielivergani,  and  A.  Dhawan. Risk factor  for  fungal  infectionin  pediatric liver  transplant  resipient . Pediatr transplant. 2005. 9(2) : 220-225.
4. Ellepola,  A.N.  and  C.J.  Morrison. Laboratory  diagnosis  of  invasive candidiasis.  J  Microbiol.  2005.  43  : 65-84.
5. Baratawidjaja,  K.G.  Imunologi  Dasar. Balai  Penerbit  Fakultas  Kedokteran Universitas Indonesia. 2014. Edisi 11.
6. Na,  B.K.  and  C.Y.  Song.  Use  of monoclonal  antibody  in  diagnosis  of candidiasis caused by Candida albicans;  detection  of  circulating aspartyl  proteinase  antigen.  Clin.
Diagn.  Lab.  Immunol.  1999.  6  :  924-
929 .
7. Oliver,  S.  L.  Trovato,  P.  Betta,  M.G. Romeo,  G.  Nicoletti.  Experience  with the  platelia  candida  ELISA  for  the diagnosisof  invasive  candidiosis  in neonatal  patiens.  Clin.  Microbiol. Infect. 2008. 14 : 391-393.
8. Sacher  dan  Pherson.  Tinjauan  Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Edisi  11.  Penerbit  Buku  Kedokteran EGC, Jakarta. 2004.
9. Parkison,  G.  and  B.  Pejcic.  Using Biosensors to detect emerging infectious  diseases.  Nanochemistry Research  Institute,  Perth,  Western Australia. 2005.
10. Peng,  D.P.,  S.S.  Hu,  Y.  Hua,  Y.C.
Xiao, Z.L. Li, X.L. Wang and D.R. Bi. Comparation of new gold- immunichromatigraphic  assay  for  the detection  of  antibodies  agains  avian influenza  virus  with  hemagglutination inhibition and agar gel immunodiffusion assays. Veter Immunol Immunop. 2007. 17 : 17-25.
11. Dewi,  L.S.K.  Imunosensor  untuk Mendeteksi  Imunoglobin  G  terhadap
Toxoplasma  gondii  dengan  Metode GICA  menggunakan  Ekstrak  ESA sebagai Bioreseptor. Tesis.departemen
Kimia  Fakultas  Sains  dan  Teknologi
Unair. 2010.
12. Samaranayake,  LP,  W.K.  Leung,  and L. Jin. Oral mucosal fungal infections.
Periodontol 2000. 2009. 49 : L39-59. 13. Kholifah, Ayu. Pemurnian Parsial, Uji Aktivitas dan Stabilitas Enzim
Kitinase  dan  -glukanase. Skripsi . Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Unair. 2013.
14. Casanova,  M. and W. Lajean  Chaffin, Cell  wall  glycoproteins  of Candida albicans as  released  by  different methods. Journal of general Microbiology. 1990. 137 : 1045-1051. 15. Wheel,  B.P.  Van.  The  Comparative Physiologi  of  Digestion  in  Molluscs, AM. Zoologis , Department of Zoology  and  Entomology,  University of Hawaii, USA. 1961. Reviewer
Dr. Dorta Simamora, dra., M.Si