J. Islamic Pharm. Online ISSN: 2527-6123 Volume 8 (1) 2023; p27-33 DOI: 10.18860/jip.v8i1.20840
Putri et al

## Analisis Kualitatif dan Kuantitatif P-Aminophenol dalam Sediaan Sirup Parasetamol dengan Metode HPLC
Astrid Kusuma Putri 1 *, Mochammad Yuwono 2
1 Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Hang Tuah, Surabaya, Indonesia
2 Departemen Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
*Corresponding Author. E-mail: astridputri557@gmail.com, astrid.kusuma@hangtuah.ac.id

## ABSTRAK
Parasetamol  (PA)  atau acetaminophen (N-acetyl-p-aminophenol)  merupakan  obat  yang  secara  luas  digunakan  sebagai antipiretik dan analgesik, berasal dari derivat sintesis nonopioid p-aminofenol (4-APh). PA dimungkinkan lebih mudah terdegradasi menjadi 4-APh pada sediaan sirup PA, 4-APh dapat menunjukkan efek samping seperti nefrotoksisitas dan toksisitas teratogenik dan  dapat  menyebabkan  methemoglobinemia. High-performance  liquid  chromatography (HPLC)  adalah  bentuk  spesifik  dari kromatografi  kolom  yang  umum  digunakan  dalam  biokimia  dan  analisis  untuk  memisahkan,  mengidentifikasi,  dan  mengukur senyawa aktif. Pada penelitian ini akan dilakukan optimasi pemisahan PA dan produk degradasinya, 4-APh dengan menggunakan kolom  LiChrospher®  Reverse  Phase  (RP)  18.  Kemudian  dilakukan  validasi metode  dengan menentukan  presisi,  linieritas,  batas deteksi dan batas kuantifikasi, serta akurasi dari pemisahan PA dan 4-APh. Setelah tingkat validitas terpenuhi, dilakukan analisis kualitatif  dan  kuantitatif  4-APh  dalam  sampel  sediaan  PA  sirup  yang  beredar  di  pasaran.  Analit  dipisahkan  pada  kolom  RP-18 LiChrospher® (250 mm x 4,00 mm id, ukuran partikel 5 μm). Fase gerak MeOH dan buffer fosfat 0,01M pH 4,07 (26:74 v/v) dengan laju alir 1 ml/menit, dengan suhu oven 30°C cocok untuk pemisahan dan penentuan 4-APh dalam simulasi sirup PA. Deteksi UV dilakukan pada 275,8 nm. Parameter kromatografi seperti waktu retensi, faktor kapasitas, faktor tailing, jumlah pelat teoritis, %RSD dari luas puncak dan faktor resolusi ditentukan. Metode yang dikembangkan ternyata linier pada rentang konsentrasi 1,01 – 6,06 μg/ ml untuk 4-APh (r2= 0,9996, Vxo = 1,48%). Batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) untuk 4-APh masing-masing adalah 0,18 μg/ml dan 0,54 μg/ml. Kriteria penerimaan validasi terpenuhi dalam semua prosedur. Kemudian metode yang dikembangkan berhasil diterapkan untuk menentukan 4-APh dalam tiga sirup PA generik di Indonesia, hasil menunjukkan bahwa sirup PA generik merk X, Y dan Z tidak mengandung 4-APh.
Kata Kunci: p-aminophenol, parasetamol, HPLC, validasi metode

## ABSTRACT
Paracetamol (PA) or acetaminophen (N-acetyl-p-aminophenol) is a drug that is widely used as an antipyretic and analgesic, derived from the nonopioid synthetic derivative of p-aminophenol (4-APh). PA may be more easily degraded to (4-APh) in paracetamol syrup preparations, 4-APh can show side effects such as nephrotoxicity and teratogenic toxicity and can cause methemoglobinemia. High-performance liquid chromatography (HPLC) is a specific form of column chromatography commonly used in biochemistry and analysis to separate, identify and quantify active compounds. In this study, optimization of the separation of paracetamol and its degradation product, 4-APh will be carried out using a LiChrospher® Reverse Phase (RP) 18 column. Then the method will be validated by determining the precision, linearity, quantification limit, and accuracy of the separation of paracetamol and 4-APh. After the validity level was met, a qualitative and quantitative analysis of 4-APh was carried out in samples of paracetamol syrup on the market. The analytes were separated on an RP-18 LiChrospher® column (250 mm x 4.00 mm id, 5 μm particle size). MeOH mobile phase and 0.01M phosphate buffer pH 4.07 (26:74 v/v) with a flow rate of 1 ml/min, with an oven temperature of 30°C were suitable for the separation and determination of 4-APh in paracetamol syrup simulations. UV detection was carried out at 275.8 nm. Chromatographic parameters such as retention time, capacity factor, tailings factor, the number of theoretical plates, %RSD of peak area, and resolution factor were determined. The developed method was linear in the concentration range of 1.01 – 6.06 μg/ml for 4-APh (r2= 0.9996, Vxo = 1.48%). The limits of detection (LOD) and quantification limits (LOQ) for 4-APh were 0.18 μg/ml and 0.54 μg/ml, respectively. The validation acceptance criteria were met in all procedures. Then the developed method was successfully applied to determine 4-APh in three generic paracetamol syrups in Indonesia. The results showed that generic paracetamol syrup brands X, Y, and Z did not contain 4-APh.
Keywords: p-aminophenol, paracetamol, HPLC, validation method
Submitted:  April  09 th 2023  |  Accepted:  May  26 st 2023  |  PuPublished:  June  30 st 2023

## RESEARCH ARTICLE

## Pendahuluan
Parasetamol  (PA)  atau acetaminophen ( N-acetyl-p- aminophenol )  merupakan  obat  yang  secara  luas  digunakan sebagai  antipiretik  dan  analgesik,  berasal  dari  derivat  sintesis nonopioid  p-aminofenol  (4-APh)  [1,2,3].  PA  digunakan sebagai  obat  secara  luas,  hal  ini  dikarenakan  PA  memiliki bioavaibilitas  yang  bagus, indeks  terapi  yang  lebar,  eliminasi cepat, harga yang murah, efek samping yang sedikit dan bisa dibeli dengan bebas tanpa resep dokter [2,4].
4-APh  adalah  salah  satu  pengotor  utama  dalam  PA  [5], yang  berasal  dari  sintesis  dan/atau  sebagai  produk  degradasi hidrolitik  primer  dari  kondisi  penyimpanan  dan  sulit  untuk dihilangkan  [6,7].  4-APh  dapat  menunjukkan  efek  samping seperti  nefrotoksisitas  dan  toksisitas  teratogenik  dan  dapat menyebabkan  methemoglobinemia  bahkan  pada  konsentrasi yang  lebih rendah  [8,9].  4-APh terdegradasi  pada  kondisi  pH tertentu,  yang  dapat  menyebabkan  warna  gelap  pada  produk [5].
PA  dimungkinkan  lebih mudah terdegradasi menjadi  4- APh  pada  sediaan  sirup  PA,  yang  mengandung  kadar  air tinggi,  dibanding  sediaan  tablet  yang  memiliki  kadar  air yang  sangat  rendah.  Badan  pengatur  obat  seperti Food  and Drug Administration (FDA) dan European Medicines Agency (EMEA) telah membatasi tingkat pengotor PAP hingga 50 ppm (0,005%  b/b)  dalam  bahan  obat  karena  profil  toksikologinya yang tinggi [5,10].
Metode uji batas 4-APh dalam sediaan mengandung yang parasetamol dapat dilakukan dengan menggunakan metode elusi gradien [11]. Namun elusi gradien memiliki kelemahan, diantaranya  memerlukan  instrumentasi  yang  lebih  kompleks, diperlukan analis yang memiliki kemampuan tinggi dalam pengembangan metode dan transfer metodenya lebih sulit [12].
High-performance  liquid  chromatography (HPLC) adalah  bentuk  spesifik  dari  kromatografi  kolom  yang  umum digunakan  dalam  biokimia  dan  analisis  untuk  memisahkan, mengidentifikasi, dan mengukur senyawa aktif [13,14]. HPLC adalah  metode  pilihan  untuk  memeriksa  kemurnian  puncak entitas kimia baru, memantau perubahan reaksi dalam prosedur sintetik  atau  peningkatan  skala, mengevaluasi  formulasi  baru dan  melakukan  kontrol/penjaminan  mutu  produk  obat  akhir [13,15].
HPLC sekarang menjadi salah satu alat paling kuat dalam kimia analitik. HPLC adalah metode analitik paling akurat yang banyak digunakan untuk analisis kuantitatif maupun kualitatif produk obat dan digunakan untuk menentukan stabilitas produk obat [16]. PA dan produk degradasinya, 4-APh dalam tablet PA untuk kontrol kualitasnya (QC) dapat ditentukan dengan HPLC yang dilengkapi deteksi UV [17].
Pada penelitian ini akan dilakukan optimasi pemisahan PA dan produk degradasinya, 4-APh dengan menggunakan kolom LiChrospher® Reverse  Phase (RP)  18.  Pada  proses  optimasi akan  dicoba  berbagai  komposisi  fase  gerak  dan  kecepatan alir  untuk  menghasilkan  puncak  simetris,  resolusi  yang  baik dan  waktu  pemisahan  yang  singkat.  Kemudian  dilakukan validasi  metode  dengan  menentukan  presisi,  linieritas,  batas kuantifikasi, dan akurasi  dari  pemisahan  PA  dan  4-APh.  Setelah tingkat  validitas  terpenuhi,  dilakukan  analisis  kualitatif  dan kuantitatif 4-APh dalam sampel sediaan PA sirup yang beredar di pasaran.

## Bahan dan Metode

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  meliputi High Performance  Liquid  Chromatography  Agilent :  1100 Series , dengan kolom LiChrospher RP 18 (ukuran partikel 5μm, 250 mm  x  4,6 mm),  dan  DAD  ( Diode  Array  Detektor ), pH  meter Fisher accument model 230 A, neraca analitik Ohaus tipe 2140, filter holder dengan filter Whatman 0,2 μm, dan spuit injeksi. Sedangkan  untuk  bahan  penelitian  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  meliputi  PA  pro  analisis,  4-APh  pro  analisis, metanol  pro  HPLC, Aqua  bidestilata  steril , Aquadestilata , Dikalium fosfat (K2HPO4) pro analisis, Asam fosfat (H3PO4) pro analisis, Filter Whatman 0,2 μm, dan 3 produk PA generik dari apotek yang ada di daerah Surabaya selatan dengan kode X, Y, Z.

## Pembuatan larutan baku induk 4-APh dan PA
Pembuatan  4-APh  dilakukan  dengan  menimbang sejumlah  10  mg,  kemudian  dimasukkan  labu  ukur  10  ml  dan ditambahkan  pelarut  hingga  di  bawah  garis  tanda.  Larutan diultrasonik 5 menit, kemudian ditambah metanol 26% sampai tepat  tanda.  Setelah  divortex  selama  2  menit,  didapat  larutan baku induk 4-APh 1000 ppm.
Pembuatan PA dilakukan dengan menimbang sejumlah 10 mg, kemudian dimasukkan labu ukur 10 ml dan ditambahkan metanol 26% hingga di bawah garis tanda. Larutan diultrasonik 5 menit, kemudian ditambah metanol 26% sampai tepat tanda. Setelah divortex selama 2 menit, didapat larutan baku induk PA 1000 ppm.

## Pembuatan larutan baku induk campuran 4-APh dan PA
PA ditimbang sejumlah 10 mg, kemudian dimasukkan labu  ukur  100  ml,  sehingga  didapatkan  baku  induk  PA  1000 ppm.  Dipipet  1  ml  larutan  baku  induk  4-APh  1000  ppm, kemudian  dimasukkan labu  ukur  100  ml  yang  telah  berisi 10  ml  PA,  dan  ditambah  metanol  26%  sampai  tanda  batas. Setelah diultrasonik larutan ditambahkan metanol 26% hingga tepat  tanda  dan  dikocok  hingga  homogen.  Larutan  disaring menggunakan  membran  filter  0,2  µm.  Didapat  larutan  baku induk campuran 4-APh dan PA (10:100) ppm. Kemudian dibuat larutan baku kerja 4-APh:PA dengan konsentrasi perbandingan (1:10), (2:20), (2,4:24), (3:30), (4:40), (5:50), (6:60).

## Prosedur validasi

## Uji Linieritas
Kolom LiChrospher RP 18 dipasang pada HPLC. HPLC diatur pada komposisi fase gerak dan kecepatan alir fase gerak terpilih.  Disuntikkan  larutan  campuran  4-APh  dan  PA  dan dengan  kadar  (1:10),  (2:20),  (2,4:24),  (3:30),  (4:40),  (5:50), (6:60) ppm pada HPLC. Tiap-tiap luas area kromatogram dari 4-APh dan PA direkam. Luas area dan kadar masing-masing zat dibuat persamaan regresinya dan dicari koefisien korelasinya.

## Penentuan LOD dan LOQ
Dilakukan  penyuntikan  larutan  baku  4-APh  dimulai kadar 6 ppm dan dilanjutkan dengan kadar yang semakin kecil, hingga  terlihat  noise  pada  kromatogram  dan  spektra  tidak dapat dikenali sebagai spektra 4-APh. Didapatkan nilai SD dan persamaan  garis  lurus  (y  =  bx  + a) dari  konsentrasi  terhadap
area pada  berbagai  kadar.  Nilai  LOD  dan  LOQ  dihitung menggunakan rumus yang terdapat pada tinjauan pustaka.
Keterangan:
% recovery = (Cf-Cu)x100/Ca
Penentuan nilai akurasi dan presisi metode dari sirup simulasi

## Pembuatan larutan Cu
1  ml  sirup  simulasi  dan  dimasukkan  secara  kuantitatif ke  dalam  labu  ukur  10  ml.  Ditambahkan  5  ml  metanol  26% dan diultrasonik selama 5 menit. Larutan ditambahkan metanol 26% sampai tepat tanda dan dikocok hingga homogen. Larutan disaring dengan membran filter 0,2 µm dan saringan pertama dibuang.

## Pembuatan larutan Cf
Dibuat  tiga  macam  larutan  dengan  dipipet  larutan  baku induk  campuran  PA  dan  4-APh  dengan  kadar  (10:100)  ppm sebanyak:
Tabel 1. Kadar larutan Cf Larutan (%) Jumlah larutan baku induk Kadar (ppm) 80% 1,8 ml 1,8 100%a 2,4 ml 2,4 120% 3 ml 3
Masing-masing labu ukur 10 ml, ditambahkan 1 ml sirup simulasi dan dimasukkan secara kuantitatif sampai tanda batas. Ditambah 5 ml metanol 26% dan diultrasonik selama 5 menit. Larutan  ditambahkan  metanol  26%  sampai  tanda  batas  dan dikocok  hingga  homogen.  Larutan  disaring  dengan  membran filter  0,2  µm.  Pada  pembuatan  larutan  Cf  ini  masing-masing kadar  direplikasi  sebanyak  3  kali,  sehingga  didapat  9  larutan Cf.
Kemudian semua larutan Cf dan Cu disuntikkan ke dalam HPLC dengan menggunakan kolom LiChrospher®100 RP-18 dengan menggunakan komposisi fase gerak dan kecepatan alir terpilih.  Dihitung % recovery dan rata-rata  (𝑋) dari replikasi % recovery kemudian  dihitung  Standar  Deviasi  (SD)  dan Koefisien variasi (KV).
Penentuan nilai presisi alat dari sirup simulasi dilakukan dengan menginjeksikan larutan standar dengan kadar 4-APh : PA (2,424 : 24,24) ppm pada kolom LiChrospher® 100 RP-18 yang telah dipasang pada HPLC menggunakan komposisi fase gerak dan kecepatan alir fase gerak terpilih sebanyak 10 kali. Dicatat luas area dan waktu retensi dan dihitung % RSD.
Sirup simulasi dibuat menggunakan formula baku sebagai berikut: [18]
Formula Jumlah PA kristal 2,5 g Kollidon 25 atau kollidon 30 30 g Gliserol 6 g Sodium siklamat 4 g Orange flavour < 0,1 g Raspberry flavour 0,2 g Air 57,5 g
Pada  penelitian  ini  dibuat  2  sirup  simulasi  dari formulabaku  yang  sama,  namun  pada  sirup  simulasi  II, pemanis yang digunakan diganti menjadi pemanis Na-sakarin. Mengikuti persamaan:
Cf : konsentrasi sampel yang terukur dengan penambahan analit
Cu : konsentrasi sampel yang terukur tanpa penambahan analit Ca : konsentrasi analit yang ditambahkan pada sampel

## Penentuan kualitatif dan kuantitatif 4-APh dari Sediaan Sirup PA
Diambil  tiga  merk  sirup  PA  generik.  Pada  tiap  merk dilakukan preparasi dengan cara masing-masing sirup PA yang sudah disiapkan, dipipet 1 ml dan dimasukkan secara kuantitatif ke  dalam  labu  ukur  10  ml.  Ditambahkan  5  ml  metanol  26% dan diultrasonik selama 5 menit. Larutan ditambahkan metanol 26% sampai tepat tanda dan dikocok hingga homogen. Larutan disaring dengan membran filter 0,2 µm dan  saringan pertama dibuang. Pembuatan larutan ini direplikasi sebanyak 3 kali.
Kemudian  9  larutan  dari  3  sampel  produk  PA  generik disuntikkan  ke  dalam  HPLC  dengan  menggunakan  kolom LiChrospher®  100  RP-18  dengan  menggunakan  komposisi fase gerak dan kecepatan alir terpilih. Dilakukan analisis secara kualitatif dan kuantitatif kadar 4-APh dalam sediaan sirup PA.

## Hasil dan Pembahasan
Tahap awal penelitian ini dilakukan pemilihan fase gerak dan penetapan panjang gelombang serapan optimal yang akan digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif 4-APh dalam matriks  sirup  simulasi  parsetamol  dengan  metode  HPLC. Setelah didapatkan metode yang telah tervalidasi, maka metode ini diterapkan pada tiga sirup PA generik merk X, Y, dan Z yang ada di daerah Surabaya selatan.
Gambar 1. Spektrum 4-APh
Pemilihan panjang gelombang optimum 4-APh dilakukan dengan Diode Array Detector (DAD) dan spektrofotometri UV- Vis  pada  HPLC  dengan  menggunakan  kolom  LiChrospher® 100  RP-18  (5μm)  pada  rentang  200-400  nm  dalam  eluen campuran  metanol  dan buffer  phosphat 0,01M  pH  5  dengan perbandingan  30  :  70,  sesuai  yang  tertulis  dalam  [17],  untuk pemeriksaan 4-APh dalam matriks tablet. Panjang gelombang optimum  untuk  pengamatan  4-APh  pada  panjang  gelombang 275,8 nm yang mana masih memberikan serapan yang cukup tinggi dan tidak ada gangguan dari matriks.
gelombang 275,8 nm Gambar  2. Serapan  matriks  simulasi  Siklamat  pada panjang
A B
Gambar 3. Serapan matriks simulasi dengan penambahan 4- APh dan PA pada panjang gelombang 275,8 nm, A. simulasi I, B. simulasi II.
Pemilihan  komposisi  fase  gerak  dilakukan  untuk mendapatkan polaritas yang sesuai sehingga dapat memisahkan 4-APh dari PA dengan optimal dan untuk memastikan bahwa puncak  kromatogram 4-APh tidak  terganggu  dengan  zat  lain, seperti eksipien sirup simulasi. Pada analisis PA dan degradasi utamanya yaitu 4-APh dalam sediaan produk tablet PA generik sebelumnya  telah  dilakukan  dengan  menggunakan  fase  gerak metanol: buffer phosphat 0,01 M pH 5 dengan komposisi 30 : 70  [17].  Kondisi  optimum  yang  terpilih  yaitu  komposisi  fase gerak menggunakan metanol : buffer phosphat 0,01M pH 4,07 dengan  perbandingan  26:74,  kecepatan  alir  fase  gerak  1  ml/ menit, panjang gelombang 275,8 nm dan suhu oven 30°C.
Tabel 3. Hasil penentuan kondisi standar 4-APh dengan matriks pada berberapa komposisi fase gerak
Hasil  pengamatan  area  dari  elusi  dengan  fase  gerak terpilih  dan  panjang  gelombang  terpilih  terhadap  standar  4- APh  dengan  kadar  1,01  -  6,01  ppm.  Didapatkan  hubungan antara  kadar  standar  4-APh  dengan  area  seperti  yang  tertera pada Tabel 4 .
Tabel 4. Data Hubungan antara Kadar Standart 4-APh dengan
Area pada Penentuan Linearitas Kadar Standar 4-APh (ppm) Area 4-APh (mAu*s) 1,01 4,68420 2,02 8,11034 2,42 10,13128 3,03 12,28247 4,04 15,99405 5,05 20,12638 6,06 24,20246 r hitung 0,9996 r tabel (n=7, α=0,01) 0,874 Persamaan regresi y = 3,87x + 0,57 Vxo 1,48%
Harga Vxo yang memenuhi syarat yaitu tidak lebih dari 5%,  harga  r  hitung  lebih  besar  dari  r  tabel  tidak  menjamin bahwa  kurva  linear  yang  diperoleh  mempunyai  harga  Vxo yang baik [19]. Berdasarkan data-data hasil perhitungan dapat disimpulkan  bahwa  ada hubungan linier antara konsentrasi 4- APh  dengan  area  pada  konsentrasi  1,01  -  6,06  ppm,  seperti pada Gambar 4 .
Gambar 4. Kurva Hubungan antara Kadar 4-APh dan Area Penentuan  LOQ  dilakukan  dengan  menyuntikkan  kadar terkecil  4-APh  yang  memunculkan  puncak  (peak),  kemudian dilanjutkan  dengan  kadar  yang  lebih  besar  secara  bertahap hingga kadar yang tidak lebih besar dari 10 kali kadar terkecil. Perhitungan  yang  telah  dilakukan  didapat  nilai  LOD  dari  4- APh adalah 0,18 ppm dan LOQ dari 4-APh adalah 0,54 ppm.
Matriks sirup mengandung pemanis Na-sakarin Na-siklamat
Komposisi  (methanol: Buf- fer  phosphate 0,01  M  pH 4,07) 21:79 26:74 30:70 26:74 Waktu retensi (t R ) 2,515 2,425 2,369 2,459 Area 5,3294 5,7620 5,1807 6,7043 Tinggi puncak 0,5455 0,6829 0,7329 0,9420 Symmetry factor 0,47 0,53 0,61 0,62 Lempeng teoritis 1746 2164 2479 2871 Resolusi - 1,88 1,83 1,20 Selektivitas 1,14 1,16 1,14 1,17
Tabel  5. Data  Hubungan  antara  Kadar  Standart  4-APh dengan Area pada Penentuan LOD dan LOQ
Kadar Standar 4-APh (ppm) Area 4-APh (mAu*s) 0,51 1,68946 0,76 2,37572 1,01 3,00680 1,26 3,91083 1,52 4,86183 1,77 5,38189 2,02 6,33632 3,03 9,16233 4,04 12,39108 r hitung 0,9995 r tabel (n=9, α=0,01) 0,798 Persamaan regresi y = 3,03x + 0,09 Vxo 2,26%
Persentase recovery sampel 4-APh dalam sirup simulasi yang  diasumsikan  kadarnya  2,4  ppm  dengan  3  macam konsentrasi  yaitu 80%,  100%,  dan  120%.  Berdasarkan Tabel 6  dan Tabel  7,  diperoleh harga rerata persentase  recovery 4- APh dalam sirup simulasi dengan pemanis Na-siklamat adalah 101,78  %  dengan  koefisien  variasi  1,20  %.  Harga  rerata persentase  recovery 4-APh  dalam  sirup  simulasi  dengan pemanis Na-sakarin adalah 103,44 % dengan koefisien variasi 1,51%.  Harga  yang  diperoleh  tersebut  sesuai  dengan  kriteria persentase  recovery dan  ketelitian  metode  yaitu  ketepatan atau akurasi dikatakan baik apabila harga persentase recovery antara untuk senyawa dengan kadar ≥0,1% adalah (95-105)%, sedangkan harga koefisien variasi tidak lebih dari 3,7% [19].
Tabel 6. Akurasi dan Presisi 4-APh dalam matriks sirup dengan pemanis Na-siklamat
R e p li k a si S ta n d a r y a n g d ita m b a h k a n A r e a (m A U * s) K a d a r 4 -A P h y a n g % r e c o v e r A k u ra si ( 𝑋 ± S D ) P r e si si (K V ) 1 1,82 6,640 1,87 102,75
102,93 ± 0,32 0,31% 2 1,82 6,704 1,88 103,30 3 1,82 6,662 1,87 102,75 1 2,42 8,929 2,48 102,48
102,07 ± 0,72 0,70% 2 2,42 8,929 2,48 102,48 3 2,42 8,809 2,45 101,24 1 3,03 11,013 3,04 100,33
100,33 ± 0,33 0,33% 2 3,03 11,055 3,05 100,66 3 3,03 11,000 3,03 100 101,78 ±1,22 1,20%
Tabel 7. Akurasi dan Presisi 4-APh dalam matriks sirup dengan pemanis Na-sakarin
R e p li k a si S ta n d a r y a n g d ita m b a h k a n A r e a (m A U * s) K a d a r 4 -A P h y a n g d ip e r o le h % r e c o v e r A k u ra si ( 𝑋 ± S D ) P r e si si (K V ) 1 1,82 5,846 1,91 104,95
102,57 ± 2,48 2,42%
2 1,82 5,730 1,87 102,75 3 1,82 5,566 1,82 100 1 2,42 7,725 2,52 104,13 103,58 ± 0,95 0,92%
2 2,42 7,704
2,52 104,13 3 2,42 7,590 2,48 102,48 1 3,03 9,754 3,18 104,95 104,18 ± 0,83 0,80%
2 3,03 9,579
3,13 103,30 3 3,03 9,686 3,16 104,29 103,44 ±1,56 1,51%
Tahapakhirdarivalidasimetodeyaitupresisiatauketelitian dari  suatu  alat  dengan  mengukur  derajat  keterulangannya ( repeatability ),  yaitu  dengan  menyuntikkan  larutan  standar ke dalam HPLC sebanyak 10 kali. Hasilnya didapatkan harga koefisien  variasi  (KV)  4-APh  0,92%,  harga  KV  dari  4-APh sesuai dengan persyaratan nilai standar deviasi respon yaitu ≤ 1%  [20].  Sehingga  dari  hasil  presisi  alat  ( repeatability )  yang diperoleh dari senyawa tersebut dapat disimpulkan bahwa alat yang digunakan memiliki ketelitian yang baik.
Tabel 8. Hasil Penentuan Keterulangan ( Repeatability )
Replikasi Kadar 4-APh (ppm) Area 4-APh (ppm) 1. 2,42 9,36187 2. 2,42 9,11746 3. 2,42 9,17802 4. 2,42 9,08156 5. 2,42 9,14510 6. 2,42 9,15561 7. 2,42 9,28947 8. 2,42 9,24194 9. 2,42 9,24569 10. 2,42 9,23134 𝑋 = 9,2048 SD = 0,0851 KV = 0,92%
Setelah  dilakukan  validasi  metode  pada  sirup  simulasi dengan  pemanis  Na-siklamat  dan  pada  sirup  simulasi  dengan pemanis  Na-sakarin,  dan  didapat  hasil  yang  memenuhi persyaratan  validasi  metode,  maka  metode  ini  digunakan untuk  menentukan  kadar  4-APh  dalam  tiga  sampel  sirup  PA generik yang beredar di pasaran, yaitu merk X, Y, dan Z. Pada masing-masing  sampel  dilakukan  preparasi  dengan  dipipet 1  ml  sampel  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  10 ml,  dan  ditambahkan  pelarut  campuran  metanol  :  air  dengan perbandingan 26 : 74.
formula   berkurang    seiring    dengan    bertambahnya
Gambar  5. Tumpakasuh  Spektra  pada  tR  4-APh dalam  Sirup  Simulasi  PA  yang  telah  diadisi  dengan  Standart p -aminofenol
Tabel 9. Uji Kuantitatif 4-APh dalam Sirup Simulasi PA dengan Perbandingan Waktu Retensi (tR)
Nama zat t R analit di daerah t R 4-APh Standar 4-APh 2,413 Sirup merk X 2,430 Sirup merk Y 2,427 Sirup merk Z 2,422
Dilakukan  replikasi  3  kali  kemudian  disuntikkan  dalam HPLC  dengan  kadar  2400  ppm  PA  sesuai  dengan  kondisi terpilih  yang  telah  divalidasi.  Dilihat  kromatogram  dan dibandingkan waktu retensi serta panjang gelombang zat pada waktu  retensi  yang  sama.  Dari  setiap  puncak  yang  memiliki waktu  retensi  yang  sama  atau  paling  mendekati  dengan waktu  retensi  standar  4-APh  dilihat  spektranya  kemudian ditumpangsuhkan  dengan  spektra  dari  standar  4-APh.  Dari ketiga  replikasi  pada  masing-masing  produk,  didapat  bahwa match  factor antara  spektra  puncak  dalam  sirup  PA  dengan standar 4-APh adalah ≤ 862,0703. Match factor tersebut sangat jauh di  bawah penerimaan threshold untuk analit target  yaitu ≥950. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa ketiga produk sirup PA generik tersebut tidak mengandung 4-APh.
Tabel 10. Match factor Produk Sirup PA Generik dan Sirup Simulasi Na-sakarin dengan Standart 4-APh
S ir u p PA g e n e r ik R e p li k a si
M a tc h fa c - to r d e n g a n S ta n d a r
4 -A p h R e r a ta M a tc h fa ct o r (𝑋 ± S D )
P r e si si (K V ) 1 858,493 862,070 ± 3,10
0,36% Merk X 2 864,029 3 863,688
1 594,401
601,042 ± 24,23 4,03% Merk Y 2 627,898 3 580,828
1 585,112 580,707 ± 8,19 1,41% Merk Y 2 585,756 3 571,252 Sirup simulasi Na- sakarin yang di adisi 4-APh 1 971,422 972,047 ± 1,49 0,15% 2 973,746 3 970,974

## Kesimpulan
Penetapan  kadar  4-APh  dalam  sirup  simulasi  PA menggunakan  HPLC  dengan  kondisi  terpilih  yaitu  fase  gerak metanol:buffer  phosphat  0,01M  pH  4,07  (26  :  74)  dengan kolom  LiChrospher®100  RP-18  (5μm)  dan  kecepatan  alir  1 ml/menit dengan suhu oven 30°C telah memenuhi persyaratan validasi  metode  yang  meliputi  selektivitas,  linieritas,  akurasi serta presisi. Penetapan kadar dalam produk sirup PA generik merk X, Y, dan Z didapatkan bahwa sirup PA generik merk X, Y dan Z tidak mengandung 4-APh.

## Referensi
[1] Sweetman SC. Martindale The Complete Drug Reference 37th edition, Chicago Pharmaceutical Press, USA; 2011.
[2] Hidayati HB, & Kustriyani A. Paracetamol, migraine, and medication  overuse  headache  (MOH).  Journal  of  Pain, Headache and Vertigo. 2020; 1(2), 42-47.
[3] Freo  U,  Ruocco  C,  Valerio  A,  Scagnol  I,  Nisoli  E. Paracetamol:  a  review  of  guideline  recommendations. Journal of clinical medicine. 2021; 10(15), 3420.
[4] Jóźwiak-Bebenista  M,  &  Nowak  JZ.  Paracetamol: mechanism  of  action,  applications  and  safety  concern. Acta poloniae pharmaceutica. 2014; 71(1), 11-23.
[5] Khandavilli  UR,  Keshavarz  L,  Skořepová  E,  Steendam RR, Frawley PJ. Organic Salts of Pharmaceutical Impurity p-Aminophenol. Molecules. 2020; 25(8), 1910.
[6] Suresh K, & Nangia A. Lornoxicam salts: crystal structures, conformations,  and  solubility.  Crystal  growth  &  design. 2014; 14(6), 2945-2953.
[7] Aitipamula S, Wong AB, Chow PS, Tan RB. Novel solid forms  of  oxaprozin:  cocrystals  and  an  extended  release drug–drug salt of salbutamol. RSC advances. 2016; 6(41), 34110-34119.
[8] Li  Y,  Bentzley  CM,  Tarloff  JB.  Comparison  of  para- aminophenol  cytotoxicity  in rat renal  epithelial  cells  and hepatocytes. Toxicology. 2005; 209(1), 69-76.
[9] Fu X, Chen TS, Ray MB, Nagasawa HT, Williams WM. p‐Aminophenol‐induced hepatotoxicity in hamsters: Role of  glutathione.  Journal  of  Biochemical  and  Molecular Toxicology. 2004; 18(3), 154-161.
[10] Snodin  DJ,  &  McCrossen  SD.  Guidelines  and pharmacopoeial  standards  for  pharmaceutical  impurities: overview and critical  assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2012; 63(2), 298-312.
[11] Depkes  RI.  Farmakope  Indonesia  edisi  VI.  Departemen Kesehatan  Republik  Indonesia.  Jakarta:  Kementrian Kesehatan Republik Indonesia; 2020.
[12] Snyder  CR,  Kirkland  JJ,  Glajach  JL.  Practical  HPLC Method  Development,  Second  Edition.  New  York:  John Wiley and Sons, Lnc. 1997.
[13] Basharat R, Kotra V, Loong LY, Mathews A, Kanakal MM, Devi  CBP.  A  mini-review  on  ultra  performance  liquid chromatography. Orient J Chem. 2021; 37(4), 847-57.
[14] Chawla G, & Chaudhary KK. A review of HPLC technique covering  its  pharmaceutical,  environmental,  forensic, clinical  and  other  applications.  Int  J  Pharm  Chem  Anal. 2019; 6(2), 27-39.
[15] Bhardwaj SK,  Dwivedia  K,  Agarwala  DD.  A  review:
HPLC  method  development  and  validation.  International Journal of Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2015; 5(4), 76-81.
[16] Rao BV, Sowjanya GN, Ajitha A, Rao VUM. A review on stability  indicating  HPLC  method  development.  World journal  of  pharmacy  and  pharmaceutical  sciences.  2015;
4(8), 405-423.
[17] Sornchaithawatwong  C,  Vorrarat  S,  Nunthanavanit  P. Simultaneous  determination  of  paracetamol  and  its  main degradation product  in  generic  paracetamol  tablets  using reverse-phase  HPLC.  Journal  of  Health  Research.  2010;
24(3), 103-106.
[18] Bühler  V,  &  Fussnegger  B.  Generic  drug  formulations. Basf-Pharma Ingredients; 2001.
[19] Yuwono M, & Indrayanto G. Validation of chromatographic methods  of  analysis.  Profiles  of  drug substances, excipients and related methodology. 2005; 32, 243-259.
[20] Gandjar IG, & Rohman A. Kimia farmasi analisis. 2007.
Yogyakarta: Pustaka Pelajar, 224, 228.