## DETEKSI DNA SPESIES PADA PRODUK MAKANAN OLAHAN DAGING AYAM MENGGUNAKAN GEN GH (GROWTH HORMONE) SEBAGAI PENANDA MOLEKULER
Detection of Species DNA in Chicken Meat Processed Food Products

## Using GH (Growth Hormone) Genes as Molecular Markers
Alfi Sophian 1* , Sri Utaminingsih 1 , Yenita 1 , Ratna Purwaningsih 2
1 Pusat Pengembangan Pengujian Obat dan Makanan Nasional, Badan POM
2 Direktorat Pengawasan Produksi Pangan Olahan, Badan POM
*e-mail: alfi.sophian@pom.go.id
DOI: 10.33830/fsj.v4i1.6358.2024
Diterima: 5 September 2023, Diperbaiki: 28 Mei 2024, Disetujui: 21 Juni 2024

## ABSTRACT
The species DNA detection test in processed chicken meat food products using genetic growth hormone (GH) gene markers is a novel approach for authenticity test regarding the presence of a particular species in a product. This research aimed to test the ability of the GH genetic marker to detect the presence of chicken species in processed chicken meat food products. The method  used  in  this  research  is  a  molecular  biology  method  using  real-time  PCR  with  the SYBR Green kit. The genetic marker primers used were designed independently from the NCBI website. Based on DNA isolation data, the DNA concentration value is 43.60 ng/µL – 45.20 ng/µL with an average of 44.11. The purity value of isolated DNA is 1.855  – 1.925 with an average  of  1.906.  Chicken  species  DNA  was  detected  in  all  samples  using  real-time  PCR analysis, with a Ct value of 24.50 and a Tm value of 78.10. However, the Ct and Tm values were not detected in the negative control (NTC) and specificity (internal) control samples. In the positive control LOD, the Ct value was detected at 27.20 with a Tm value of 79.40. In the positive  control,  a  Ct  value  of  21.10  and  a  Tm  value  of  78.10  were  detected.  The  results indicate that all samples contained the GH gene, and hence, chicken species DNA was detected in all samples. This suggests that the GH genetic marker can be potentially used for species DNA identification testing.
Keywords : chicken, detection, DNA, testing.

## FOOD SCIENTIA

## Journal of Food Science and Technology
Laman  Resmi: http://jurnal.ut.ac.id/index.php/foodscientia

## ABSTRAK
Uji  deteksi  DNA  spesies  pada  produk  pangan  olahan  daging  ayam  dengan  penanda  gen hormon pertumbuhan (GH) merupakan hal baru untuk uji autentikasi mengenai keberadaan spesies tertentu pada suatu produk. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji kemampuan penanda genetik GH dalam mendeteksi keberadaan spesies ayam pada produk olahan daging ayam.  Metode  yang  digunakan  dalam  penelitian  adalah  metode  biologi  molekuler menggunakan  real-time  PCR  dengan  kit  SYBR  Green.  Primer  penanda  genetik  yang digunakan  didesain  secara  mandiri  dari  situs  NCBI.  Berdasarkan  data  isolasi  DNA,  nilai konsentrasi  DNA  berada  pada  rentang  43,60  ng/µL  –  45,20  ng/µL  dengan  nilai  rata-rata 44,11. Nilai kemurnian DNA hasil isolasi berada pada rentang 1,855 – 1,925 dengan rata- rata  1,906.  Untuk  analisis  PCR  real-time,  seluruh  sampel  terdeteksi  mengandung  DNA spesies ayam pada Ct 24,50 dengan nilai Tm 78,10. Sedangkan pada kontrol negatif, NTC dan kontrol spesifisitas tidak terdeteksi nilai Ct dan Tm. Untuk LOD kontrol positif nilai Ct terdeteksi sebesar 27,20 dan nilai Tm sebesar 79,40. Sedangkan pada kontrol positif terdeteksi nilai Ct sebesar 21,10 dan nilai Tm sebesar 78,10. Berdasarkan hasil penelitian ditemukan bahwa  seluruh  sampel  terdeteksi  gen  GH.  Dapat  disimpulkan  bahwa  seluruh  sampel  yang digunakan  mendeteksi  DNA  spesies  ayam,  sehingga  potensi  penanda  genetik  GH  dapat digunakan dalam pengujian identifikasi DNA spesies.
Kata Kunci : ayam, deteksi, DNA, uji.

## PENDAHULUAN
Deteksi  DNA  spesies  merupakan  salah  satu  jenis  pengujian  yang  umumnya digunakan  sebagai  acuan  dalam  uji  autentikasi.  Perkembangan  dunia  molekuler membuka banyak peluang pengujian yang menggunakan real-time PCR sebagai dasar pengembangan  metode  deteksi  DNA  spesies.  Dalam  melakukan  pengujian  untuk memastikan  keberadaan  suatu  spesies  pada  suatu  produk  olahan  daging  hewan, diperlukan metode yang terukur dan dapat diandalkan. Salah satu poin penting dalam melakukan  deteksi  DNA  spesies  menggunakan  real-time  PCR  adalah  penggunaan penanda genetik yang sesuai.
Pemanfaatan penanda genetik Growth Hormone (GH) dalam penelitian DNA spesies  telah  dilakukan  pada  ayam  lokal  untuk  melihat  korelasinya  dengan  karkas ayam  dan  menganalisis  persilangan  genetik  beberapa  varian  ras  ayam  (Sato et  al ., 2011;  Khaerunnisa,  2017).  Penelitian  DNA  spesies  dengan  menggunakan  penanda genetik  spesies  tipe  liar  menjadi  acuan  uji  autentikasi  pada  tes  DNA  spesies  pada produk pangan berbahan dasar daging hewan (Sophian, 2021a). Dalam melakukan uji autentikasi  diperlukan  banyak  referensi  dan  mencari  sumber  penanda  genetik  yang tepat sehingga dapat menjamin mutu dan mutu hasil uji yang dihasilkan dapat diakui valid.
Penggunaan penanda genetik GH dalam uji autentikasi atau uji deteksi DNA spesies pada produk olahan daging ayam merupakan suatu hal yang baru. Berdasarkan latar  belakang  tersebut,  penelitian  ini  dilakukan  agar  dapat  menjadi  informasi  dan sumber  referensi  bagi  penelitian  serupa,  sehingga  pengembangan  metode  pengujian deteksi  DNA  spesies  dapat  dijadikan  dasar  untuk  menghasilkan  metode  pengujian otentikasi yang valid.

## METODE Persiapan Sampel
Langkah  awal  diawali  dengan  menimbang  sampel  seberat  0,5  g  kemudian dimasukkan ke dalam tabung centrifuge berukuran 2 mL, kemudian ditambahkan 700 μL Food Lysis Buffer [Qiagen] dan 25 μl proteinase K [Qiagen], kemudian diinkubasi dalam waterbath shaker pada suhu 70°C selama 60 menit. . Setelah inkubasi selesai, langkah selanjutnya adalah sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 1400 rpm. Supernatan  yang  diperoleh  dari  centrifuge  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  tabung mikro  sentrifus  baru  berukuran  1,5  mL,  ditambahkan  700  μL  kloroform  setelah  itu dihomogenisasi dengan pusaran selama 30 detik dan disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menit. Pindahkan 350 μl supernatan ke dalam tabung centrifuge 1,5  mL  yang  baru.  Supernatan  siap  diproses  menggunakan  alat  ekstraksi  DNA otomatis (Qiacube) (Sophian, 2021b; Sophian & Abinawanto, 2022).

## Ekstraksi DNA Menggunakan Qiacube
Tahap  awal  dimulai  dengan  melakukan  input  protokol  Qiacube  pada  kit Dneasy  Mericon  Food  Kit  [Germany].  Semua  sistem  dilakukan  secara  otomatis dengan menggunakan sistem robotik sehingga keterlibatan manusia hanya pada tahap lisis  awal.  Protokol  yang  digunakan  adalah  Ekstraksi  DNA  total  dari  bahan  pangan mentah atau olahan dengan metode standar pada kit. Sampel dipipet sebanyak 350 µl ke  dalam  tabung  1,5  mL  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  Qiacube.  Setelah  itu dilanjutkan dengan menyusun kit yang akan digunakan sesuai peta protokol. Setelah semua  hasilnya  sesuai,  barulah  alat  dijalankan  (Sophian,  2021c;  Sophian  & Abinawanto, 2022).

## Analisis DNA Hasil Isolasi
DNA  hasil  isolasi  dianalisis  kemurnian  dan  konsentrasinya  menggunakan nanofotometer pada panjang gelombang A260/A280 (Sophian, 2021).

## Primer
Primer yang digunakan pada penelitian ini adalah gen GH yang dirancang dari situs NCBI dengan urutan primer Forward: 5'- CCC AGG CTG CGT TTT GTT AC - 3', dan urutan primer Reverse:  5'-  CAC GTG GAG ACC CTC  TGT TC  -3' dengan panjang deret primer 131 bp.

## Pengaturan Campuran Utama
Siapkan master mix dengan memipet 10 μL master mix ke dalam tabung PCR lalu tambahkan masing-masing 1 μL primer forward dan reverse serta 1 μL PCR grade H 2 O,  lalu  masukan  5  μL  DNA  cetakan.  Putar  master  mix  dan  DNA  template  yang sudah  tercampur  ke  dalam  tabung  PCR  selama  30  detik.  Setelah  itu  sampel  siap dilanjutkan tahapan PCR.

## Pengaturan Real-Time PCR
Analisis real-time PCR dilakukan dengan metode 2 step cycle yang dilanjutkan dengan analisis Melt Curve dengan pengaturan alat sebagai berikut: Denaturasi 95 o C selama 45 detik dan  Annealing/Ekstensi  60 o C selama 45 detik sebanyak 40 siklus, setelah  itu  pilih  detektor  berwarna  hijau  untuk  diaktifkan,  kemudian  dilanjutkan dengan pengaturan metode kurva leleh tahap pertama 72 o C selama 90 detik dan tahap kedua 95 o C selama 5 detik kemudian mengaktifkan detektor hijau (Sophian, 2021; Sophian & Abinawanto, 2022; Sophian et al ., 2021).

## Uji Spesifisitas
Uji spesifisitas dilakukan dengan menambahkan DNA cetakan spesies lain atau DNA non target yang digunakan sebagai kontrol untuk melihat apakah primer dapat mendeteksi spesies target secara spesifik atau tidak.

## Kontrol positif
Kontrol positif yang digunakan adalah DNA ayam yang diisolasi dari daging ayam.  Control ini berfungsi sebagai pembading dalam menentukan nilai positif dari sampel yang diuji.

## Kontrol LOD
Batas deteksi digunakan sebagai kontrol positif DNA ayam yang diencerkan 100 kali atau 1:100.

## Kontrol Negatif
Kontrol  negatif  dibuat  dengan  menggunakan  air  bebas  nukleotida  yang digunakan  sebagai  templat  selama  pengujian.  Kontrol  negatif  dibuat  untuk  melihat atau memantau rangkaian proses pengujian yang dilakukan dari adanya kontaminasi proses pengujian antar sampel.

## Kontrol NTC
Kontrol  NTC  ( No  Template  Control )  dilakukan  dengan  mencampurkan campuran induk tanpa cetakan DNA. Kontrol NTC dilakukan untuk melihat apakah terjadi  kontaminasi  pada  master  mix  pada  saat  pengujian  (Sophian et  al .,  2021; Sophian, 2021a).

## Analisis data
Analisis  data  dilakukan  dengan  melakukan  uji  rata-rata  nilai  CT  dan  Tm kemudian  membandingkannya  dengan  kontrol  yang  digunakan.  Interpretasi  positif akan disimpulkan jika sampel yang diuji diamplifikasi dan menghasilkan nilai Ct dan Tm,  sedangkan  untuk  interpretasi  negatif  disimpulkan  jika  tidak  terjadi  amplifikasi yang  ditandai  dengan  tidak  terdeteksinya  nilai  Ct  dan  Tm  (Sophian et  al .,  2020;
Sophian et al ., 2021; Sophian & Abinawanto, 2022).

## HASIL PEMBAHASAN Hasil Isolasi DNA
Hasil isolasi DNA diperoleh nilai konsentrasi DNA pada rentang 43,60 – 45,20 dengan  nilai  rata-rata  konsentrasi  44,11.  Nilai  kemurnian  DNA  hasil  isolasi  berada pada rentang 1,855 – 1,925 dengan nilai kemurnian rata-rata 1,906. Data selengkapnya disajikan pada Tabel 1.

## Tabel 1. Hasil Isolasi DNA
Nomor Konsentrasi (ng/ µ L) Kemurnian (A260/A280) 1 44,50 1,925 2 45,20 1,914 3 44,10 1,855 4 44,20 1,912 5 43,30 1,875 6 44,10 1,923 7 43,60 1,922 8 43,90 1,925 Rata-Rata 44,11 1,906
Dalam  proses  isolasi  DNA  yang  dilakukan,  teknik  yang  umumnya  adalah melakukan  lisis  terhadap  sel  dimana  DNA  akan  keluar  setelah  dinding  sel  pecah.
Untuk itu, pemeilihan jenis lisis yang tepat akan mempengaruhi tahapan ini, dimana beberapa  kit  menggunakan  bantuan  proteinase  K  dalam  memecah  dinding  sel, selanjutnya akan masuk dalam proses binding.   Beberapa penelitian yang dilakukan menunjukan bahwa alkohol memiliki peran penting dalam tahapan ini.  Penelitian yang dilakukan  oleh  Wulan  et  al.  (2022);  Sophian  et  al.  (2022),  menunjukkan  bahwa penggantian larutan binding kit komersial menggunakan ethanol dapat meningkatkan nilai konsentrasi DNA hasil isolasi.  Hal ini juga berbanding lurus dengan penelitian yang  dilakukan  oleh  Utamininsih  &  Sophian  (2022)  yang  melakukan  isolasi  DNA pada  sampel  kondroitin,  dimana  modifikasi  yang  serupa  juga  dilakukan  dan menghasilkan nilai konsentrasi DNA hasil isolasi yang lebih baik jika dibandingkan dengan  kit  komersial.    Kedua  penelitian  tersebut  juga  tidak  jauh  berbeda  dengan penelitian  yang  dilakukan  oleh  Utami  et  al.  (2023),  yang  mengisolasi  DNA  pada produk surimi.

## Hasil Analisis Real-Time PCR
Berdasarkan hasil analisis real-time PCR diperoleh data seperti disajikan pada Tabel 2.
Tabel. 2. Hasil Analisis Real-Time PCR Perlakuan Analisis Ct Tm Sample 24,50 78,10 Kontrol Negatif - - NTC - - Kontrol Spesifitas - - Kontrol LOD 27,20 79,40 Kontrol Positif 21,10 78,10
Dari data pada Tabel 2 terlihat bahwa sampel terdeteksi pada Ct 24,50 dengan nilai Tm sebesar 78,10. Sedangkan pada kontrol negatif, NTC dan kontrol spesifisitas tidak terdeteksi nilai Ct dan Tm. Hal ini dapat dijadikan sebagai cara untuk melihat rangkaian  proses  pengujian  yang  baik,  dimana  setiap  pengendalian  yang  digunakan mempunyai maksud dan tujuan tertentu untuk dijalankan. Kontrol negatif digunakan untuk  melihat  kinerja  tester  pada  saat  melakukan  pengujian,  dimana  jika  kontrol negatif  menunjukkan  nilai  Ct  dan  Tm  yang  terdeteksi  maka  dapat  dianggap  dalam melakukan  pengujian  terdapat  kontaminasi  pada  proses  pengolahan  sampel.  NTC digunakan untuk melihat performa dari master mix yang digunakan, dimana nilai yang tidak  terdeteksi  dapat  menandakan  bahwa  master  mix  yang  digunakan  tidak terkontaminasi dengan DNA target dan sebaliknya.
Sedangkan  untuk  kendali  spesifisitas  digunakan  untuk  melihat  keakuratan primer yang digunakan, dimana jika kendali spesifisitas ini menunjukkan nilai Ct dan Tm  yang  terdeteksi  maka  dapat  diasumsikan  bahwa  primer  yang  digunakan  tidak mempunyai  spesifisitas  yang  baik  sehingga  proses  pengujian  gagal  untuk menyimpulkan. Kit yang digunakan dalam penelitian ini adalah kit master mix dengan jenis  SYBR  Green,  dimana  kit  ini  memiliki  keunggulan  dalam  segi  nilai  ekonomis pengujian jika dibandingkan dengan penggunaan kit dengan jenis Taq Man Probe.
Untuk  LOD  kontrol  positif  nilai  Ct  terdeteksi  sebesar  27,20  dan  nilai  Tm sebesar  79,40.  Sedangkan  pada  kontrol  positif  terdeteksi  nilai  Ct  sebesar  21,10  dan nilai Tm sebesar 78,10. Perbedaan nilai ini dapat terjadi karena konsentrasi cetakan DNA  yang  digunakan  juga  berbeda  sehingga  nilai  Ct  juga  akan  dipengaruhi  oleh konsentrasi  cetakan  DNA  yang  digunakan.  Hal  ini  sejalan  dengan  penelitian  yang dilakukan Sophian et al. (2021), Sophian (2021) dan Sophian & Abinawanto (2022),
dimana dalam penelitiannya diketahui bahwa nilai Ct pada sampel dapat dipengaruhi oleh konsentrasi template yang digunakan.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ditemukan bahwa seluruh sampel terdeteksi gen GH.  Dapat  disimpulkan  bahwa  seluruh  sampel  yang  digunakan  mendeteksi  DNA spesies ayam sehingga potensi penanda genetik GH dapat digunakan dalam pengujian identifikasi DNA spesies.

## DAFTAR PUSTAKA
Khaerunnisa,  I.,  Jakaria,  J.,  Arief,  I.  I.,  Budiman,  C.,  &  Sumantri,  C.  (2017).  The Associations of GH and GHR Genes with Carcass Components in Indonesian Kampung  and  Broiler  Chicken  Cross.  Media  Peternakan,  40(2),  78–87. https://doi.org/10.5398/medpet.2017.40.2.78
Qiagen.    (2020).  DNeasy®  Mericon®    Food    Handbook  for    Extraction  of  Total Nucleic      Acidsfrom      a  Range  of  Food      Sample      Types. www.qiagen.com/shop.          Technical          Support          support.qiagen.com. Website. www.qiagen.com Sato,  S.,  Ohtake,  T.,  Uemoto,  Y.,  Okumura,  Y.,  &  Kobayashi,  E.  (2011). Polymorphism of insulin-like growth factor 1 gene is associated with breast muscle  yields  in  chickens.  Animal  Science  Journal,  83(1),  1–6. https://doi.org/10.1111/j.1740-0929.2011.00917.x
Sophian, A. (2021a). Detection of Species DNA in Chicken Meatball Products Using NGF Genes as Molecular Markers. BiosciED: Journal of Biological Science and Education, 2(2), 47–51. doi:10.37304/bed.v2i2.3422
Sophian, A. (2021b). Short Communication: Analysis of purity and concentration of extracted  DNA  on  salted  fish  processed  food  products.  Asian  Journal  of Natural Product Biochemistry, 19(1). doi:10.13057/biofar/f190104.
Sophian, A. (2021c). Species DNA Detection Using PGR Gene Genetic Markers in
Chicken Nuggets. Indonesian Food Science & Technology Journal , 5 (1), 17- 20. Retrieved from https://online-journal.unja.ac.id/ifstj/article/view/14618 Sophian, A., & Abinawanto. (2022). Study of Co1 and BIK BCL2 Gene Analysis in Gorontalo  Local  Chicken.  Journal  of  Hunan  University  Natural  Sciences, 49(1),220–227. doi:10.55463/issn.1674-2974.49.1.28
Sophian, A., Purwaningsih,  R., Lukita, B. L., & Ningsih, E,C.  (2020).  Detection of Salmonella typhimurium ATCC 14028 in supplement health product liquid preparation  using  Real-Time  PCR  (qPCR).  Biofarmasi  Journal  of  Natural Product Biochemistry, 18(2). doi:10.13057/biofar/f180202.
Sophian A, Purwaningsih R, Muindar, Igirisa E,P.J, & Amirullah M,L. (2021). Short Communication:  Analysis  of  purity    and  concentration  of    DNA  extracted from  intron  patho  gene-spin  extraction  on  crab  processed  food  product samples. Asian J Trop Biotechnol 18: 13-27.
Sophian, A., Sri, U., & Sofia, U. D. (2022). DNA isolation in processed chicken meat products  (nugget)  using  modified  DNeasy  Mericon  Food  kit  (Qiagen). HO
CHI  MINH  CITY  OPEN  UNIVERSITY  JOURNAL  OF  SCIENCE- ENGINEERING AND TECHNOLOGY , 12 (2), 15-21.
Utami,  S.  D.,  Utaminingsih,  S.,  &  Sophian,  A.  (2023).  Analisis  DNA  Hasil  Isolasi Pada  Produk  Pangan  Olahan  Ikan  (Surimi  Ikan)  Menggunakan  Nano Photometer. JRST (Jurnal Riset Sains dan Teknologi) , 7 (1), 9-13. Utaminingsih, S., & Sophian, A. (2022). Analysis of Purity and Concentration of DNA Isolation Results on Chondroitin Samples. BiosciED: Journal of Biological Science and Education , 3 (2), 56-61.
Wulan DT, Sutanta M, Sophian A. (2021). Short Communication: Comparison of two commercial DNA extraction kit to obtain high quality porcine DNA. Asian J Trop Biotechnol 18: 69-72.