Induksi  Embriogenesis  Somatik  Menggunakan  2,4- Dichlorophenoxyacetic  Acid
(2,4-D) dan Kinetin pada Eksplan Gulungan Daun Muda Tanaman Tebu
Induction Somatic Embryogenesis Used 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D) and Kinetin in Spindle Leaf Explant Sugarcane
Wardatus Sholeha 1,2 , Bambang Sugiharto 1*),2 , Dwi Setyati 1 , Parawita Dewanti 2,3
1 Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Jember
2 Center for Development of Advanced Science and Technology (CDAST), Universitas Jember
3 Jurusan Agronomi, Fakultas Pertanian, Universitas Jember
*) E-mail: sugiharto.fmipa@unej.ac.id

## ABSTRACT
Induction  of  somatic  embryogenesis  in  sugarcane  requires  the  composition  Plant  Growth  Hormone (PGH)  appropriate.  Utilizing  of  PGH  (2,4-D  and  kinetin)  is  expected  to  induce  sugarcane  somatic embryogenesis.  The  purpose  of  this  study  was  to  obtain  the  concentration  of  2,4-D  and  kinetin  that effective for the multiplication of sugarcane var. NXI 1-3 through somatic embryogenesis. This study consists of four stages: callus induction, callus proliferation, regeneration of shoots and encapsulation. The  plant  material  used  is  a  spindle  leaf  sugarcane  var.  NXI  1-3.  Callus  induction  used  2,4-D  with different concentration (2 ppm, 3 ppm and 4 ppm). Callus proliferation used 2,4-D with concentration 1 ppm and 2 ppm. Regeneration of shoots used kinetin 0,5 ppm. The results are showed that the optimal induction of embryogenic callus on medium MS + sucrose 30 g / L + CH 300 ppm + 300 ppm PVP + 2,4-D 4 ppm as indicated by the high percentage of explants forming embryogenic callus that is equal to 40% and the respective concentration 2 ppm and 3 ppm is 33,3% and 37,5%. In proliferation stage, the development callus optimal on medium MS + sucrose 30 g / L + CH 300pm + PVP 300 ppm + 2,4-D 2 ppm and formulations for regeneration shoot on medium MS + sucrose 30 g / L + kinetin 0.5 ppm. The result of encapsulation can be shaped 100 sythetic seed.
Keywords : Somatic embryogenesis, spindle leaf, kinetin, 2,4-D

## PENDAHULUAN
Perbanyakan  tanaman  secara in  vitro dengan embriogenesis  somatik  banyak  mendapatkan perhatian  karena  jumlah  propagulan  yang dihasilkan  lebih  banyak  dan  diperoleh  dalam waktu
singkat (Purnamingsih, 2002).
Embriogenesis  somatik  adalah  perbanyakan tanaman yang berasal dari sel haploid atau diploid untuk  membentuk  tanaman  baru  tanpa  melalui peleburan sel gamet (Dixon, 1985).
Eksplan  yang  digunakan  untuk  perbanyakan tanaman  melalui  embriogenesis  somatik  adalah gulungan  daun  ( leaf  roll )  muda  tanaman  tebu varietas  NXI  1-3.  Keunggulan  tanaman  tebu varietas  NXI  1-3  antara  lain  mempunyai  daya tahan  kepras,  tahan  terhadap  hama  penyakit tanaman  dan  mampu  beradaptasi  dengan  mudah terhadap lingkungan (Rasullah et al. , 2013). Keberhasilan  embriogenesis  somatik  juga ditentukan oleh beberapa faktor antara lain adalah Zat  Pengatur  Tumbuh  (ZPT)  (Purnamaningsih, 2002).  ZPT  merupakan  senyawa  organik  yang berperan  penting  dalam  pertumbuhan  dan perkembangan  tanaman  (Davies,  1995)  dan (Gaba,  2005).  Jenis  ZPT  yang  banyak  digunakan
pada perbanyakan tanaman melalui embriogenesis somatik adalah dari golongan auksin dan sitokinin (Utami et al. , 2007). Hal ini telah dibuktikan dari beberapa penelitian sebelumnya diantaranya pada tahap  induksi  kalus  embriogenik  tanaman  tebu ( Saccharum  Officinarum L.) in  vitro mampu tumbuh optimal dalam media MS yang dilengkapi dengan 2,4-D (0.5-3,5 mg/l) + 1 mg/l kinetin (Ali &  Iqbal,  2010);  tahap  proliferasi  embriogenesis somatik  dan  regenerasi  padi  ( Oryza  sativa ) in vitro mampu  tumbuh  optimal  pada  media  MS  + 2,4-D (0,4 µ M) + kinetin (2,0 µ M) (Verma et al. , 2011).
Beberapa  penelitian  sebelumnya  penggunaan 2,4-D dan kinetin mampu meningkatkan aktivitas embriogenesis  somatik  pada  tanaman  tebu  dan padi  secara in  vitro serta  regenerasi  tanaman. Tanaman  hasil  embriogenesis  somatik  memiliki tingkat  regenerasi  sangat  tinggi  sehingga dibutuhkan  metode  penyimpanan.  Dewasa  ini penyimpanan  dengan  metode  benih  sintetik (enkapsulasi) semakin berkembang. Penyimpanan tersebut  sangat  diperlukan  agar  benih  mampu bertahan  dalam  jangka  waktu  cukup  lama  tanpa merusak  viabilitas  eksplan.  Penelitian  ini
bertujuan  untuk  mendapatkan  konsentrasi  2,4-D dan  kinetin  yang  efektif  untuk  perbanyakan tanaman tebu var. NXI 1-3 melalui embriogenesis somatik.

## METODE

## Bahan dan Alat
Adapun  bahan  dan  alat  yang  digunakan  pada penelitian  ini  antara  lain  gulungan  daun  ( spindle leaf )  muda  tanaman  tebu  varietas  NXI  1-3, alkohol, kinetin, 2,4- Dichlorophenoxyacetic acid
(2,4-D), media MS0, sukrosa 30 gr/l, mio-inositol
100 ml/l, pyridoxine 0,50 ml/l, thiamine 0,50 ml/l, casein  hidrolisat  300  mg/l,  polivinil  pirolidon (PVP)  300  mg/l,  prolin  560  mg/l,  agar  kuljar  11 gr/l, Na-alginat 3 gr/ 100 ml, dan CaCl 2 100mM, autoclave , Laminar  Air  Flow (LAF),  pipet Pasteur,  neraca  analitis,  dan  mikroskop  stereo Leica EZ4 HD.

## Metode Penelitian
Pengambilan Eksplan Eksplan  yang  digunakan  berasal  dari  gulungan daun  ( spindle  leaf )  muda  tanaman  tebu  varietas NXI  1-3.  Gulungan  daun  muda  disterilisasi menggunakan  larutan  alkohol  70%  selama  5 menit  lalu  dibakar  diatas  api  bunsen  selanjutnya disterilisasi  kembali  menggunakan  alkohol  96% dan  dibakar  diatas  api  bunsen.  Gulungan  daun yang telah steril dipindahkan ke cawan petri steril.
Penanaman
Eksplan dan Induksi Kalus

## Embriogenik
Gulungan  daun  yang  telah  steril  diambil  pada bagian tengah yaitu 4 cm dari bagian pangkal dan dipotong  dengan  panjang  ±  4  mm.  Eksplan tersebut  kemudian  ditanam  dalam  botol  kultur yang  telah  berisi  media  induksi.  Penanaman eksplan bertujuan untuk menginduksi pertumbuhan  kalus  dan  kalus  embriogenik.  Pada media  induksi  menggunakan  2,4-D  dengan konsentrasi  berbeda  yaitu  A1,  A2  dan  A3  (Tabel 1).
Tabel  1.  Formulasi  media  induksi  kalus embriogenik
Media Perlakuan A1 MS  +  2,4-D  2  mg/l  +  kasein hidrolisat 300 mg/l + PVP 300 mg/l + sukrosa 30 g/l + agar kuljar 11 g/l. A2
MS  +  2,4-D  3  mg/l  +  kasein hidrolisat 300 mg/l + PVP 300 mg/l + sukrosa 30 g/l + agar kuljar 11 g/l. A3 MS  +  2,4-D  4  mg/l  +  kasein hidrolisat 300 mg/l + PVP 300 mg/l + sukrosa 30 g/l + agar kuljar 11 g/l.
Kultur  selanjutnya  diinkubasi  dalam  ruang  gelap pada  suhu  22-24 o C  selama  6  minggu.  Setiap  2 hari sekali dilakukan pengamatan terhadap jumlah eksplan  yang  berkalus.  Data  jumlah  eksplan berkalus  digunakan  untuk  menghitung  persentase eksplan  yang  membentuk  kalus  dengan  rumus sebagai berikut:
(Tahir et al. , 2011)
(Tahir et al. , 2011)
Pertumbuhan  eksplan  yang  membentuk  kalus embriogenik  dengan  persentase  tertinggi  dari media induksi terbaik dipindahkan dan ditumbuhkan pada media proliferasi.

## Proliferasi Kalus Embriogenik
Eksplan  berkalus  dari  media  induksi  selanjutnya ditumbuhkan  pada  media  proliferasi  dengan konsentrasi  zat  pengatur  tumbuh  2,4-D  lebih rendah. Komposisi media proliferasi dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel  2.  Formulasi  media  proliferasi  kalus embriogenik Media Perlakuan B1 MS  +  2,4-D  1  mg/l  +  kasein hidrolisat 300 mg/l + PVP 300 mg/l + sukrosa  30  g/l  +  prolin  560  mg/l  + agar kuljar 11 g/l.
B2 MS  +  2,4-D  2  mg/l  +  kasein hidrolisat 300 mg/l + PVP 300 mg/l + sukrosa  30  g/l  +  prolin  560  mg/l  + agar kuljar 11 g/l.
Setiap  media  proliferasi  berisi  satu  eksplan  hal tersebut
bertujuan
untuk memudahkan pengamatan  perkembangan  fase  embriogenesis somatik.
Kultur  selanjutnya  diinkubasi  dalam  ruang gelap  selama  6  minggu  pada  suhu  22-24 o C. Setiap  3  minggu  sekali  dilakukan  pengamatan terhadap perkembangan fase embriogenik menggunakan  mikroskop  stereo  dan  jumlah embrio somatik pada setiap perlakuan. Pertumbuhan  kalus  embriogenesis  somatik  dari media  proliferasi  terbaik  (optimum)  selanjutnya
dipindahkan  dan  ditumbuhkan  pada  media regenerasi.

## Regenerasi Embriogenesis Somatik
Embrio  somatik  yang  telah  diperoleh  dari  media proliferasi  selanjutnya  diperbanyak  dengan  cara ditumbuhkan  ke  dalam  media  perbanyakan (regenerasi).  Satu  botol  kultur  ditanam satu embrio somatik dewasa. Pada tahap ini digunakan formulasi  media  regenerasi  dengan  komposisi seperti yang tercantum dalam Tabel 3.
Pada  media  regenerasi  hanya  digunakan satu  perlakuan  konsentrasi  kinetin  yaitu  0,5  ppm kinetin.  Kultur  diinkubasi  selama  6  minggu  pada kondisi  terang  (Haq  &  Memon,  2012).  Setiap  3 minggu dilakukan pengamatan terhadap perkembangan  embrio  somatik  membentuk plantlet.
Tabel 3. Formulasi media regenerasi kalus embriogenik Media Perlakuan C1 MS  +  kinetin  0,5  mg/l  + sukrosa  30  g/l  +  PVP  300 mg/l + agar kuljar 11 g/l.

## Pembuatan Benih Sintetik (Enkapsulasi)
Proses  enkapsulasi  diawali  dengan  mengisolasi embrio  somatik  yang  telah  memasuki  fase koleoptil  yang  ditandai  dengan  terbentuknya klorofil.  Bagian  koleoptil  yang  didapatkan ditaburkan  pada  permukaan  Na-alginat  3%  yang telah mengandung media tumbuh (MS0 + Sukrosa +  kinetin)  selanjutnya  koleoptil  diambil  secara tunggal.  Na-alginat  yang  telah  mengandung koleoptil diteteskan di atas larutan CaCl 2 100 mM dan  direndam  selama  40  menit.  Kapsul  yang terbentuk dibilas dengan akuades steril selanjutnya  dikeringanginkan  dan  kapsul  siap untuk diinkubasi di dalam media semi solid pada kondisi remang dengan suhu 4 o C.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Induksi Kalus Embriogenik
Induksi kalus embriogenik digunakan tiga macam konsentrasi 2,4-D yaitu 2 ppm, 3 ppm dan 4 ppm. Hasil  penelitian  menunjukkan  2,4-D  pada konsentrasi  4  ppm  lebih  efektif  untuk menginduksi  kalus  dan  kalus  embriogenik (Gambar 1).
Gambar  1.  Pengaruh  konsentrasi  2,4-D  terhadap persentase terbentuknya kalus.
Gambar  1.  menunjukkan  konsentrasi  4  ppm 2,4-D  memiliki  kemampuan  tertinggi  untuk menginduksi  kalus  dibandingkan  dengan  dua konsentrasi  2,4-D  lainnya  yaitu  sebesar  57,14%. Hasil  penelitian  juga  menunjukkan  bahwa semakin tinggi konsentrasi 2,4-D maka persentase kalus  embriogenik  yang  terbentuk  juga  semakin tinggi.  Hal  tersebut  terbukti  pada  konsentrasi  4 ppm  2,4-D  mampu  meningkatkan  pembentukan kalus embriogenik tertinggi yaitu sebesar 40%.
Penambahan 2,4-D merupakan faktor terpenting  untuk  induksi  embriogenesis  somatik hal  ini  disebabkan  2,4-D  merupakan  ZPT sekaligus  herbisida  yang  mampu  mengaktifkan hormon  ABA  dan  etilen.  Peningkatan  hormon ABA  mampu  menginduksi  ekspresi  protein seperti  LEA  ( Leaf  Embryogenesis  Abundant ). LEA merupakan protein yang bertanggung jawab terhadap  perkembangan  embriogenesis  somatik (Grosmann, 2000).
Menurut  Chithra et  al. (2005)  bahwa  tinggi rendahnya persentase kalus embriogenik dipengaruhi  oleh  konsentrasi  hormon  auksin sintetik  yang  berfungsi  untuk  menginduksi  kalus embriogenik.  Kalus  embriogenik  merupakan kumpulan  sel  yang  dicirikan  dengan  struktur bipolar  yaitu  mampu  membentuk  dua  meristem sekaligus  diantaranya  meristem  tunas  dan meristem  akar  (Purnamaningsih,  2002).  Kalus embriogenik  dapat  dibedakan  dengan  kalus  non- embriogenik. Berdasarkan hasil pengamatan kalus embriogenik  dicirikan  dengan  struktur  kalus kering,  berwarna  putih  susu  hingga  bening, berstruktur  remah  serta  mengalami  proses perkembangan membentuk fase-fase embriogenesis  somatik  sedangkan  kalus  non- embriogenik memiliki struktur kalus lunak, berair, berwarna kecoklatan serta tidak mengalami proses perkembangan  fase  embriogenesis  somatik (stagnan).  Hal  ini  didukung  oleh  pendapat Gandanou et al .,  (2005)  yang  menyatakan  bahwa kalus embriogenik dicirikan dengan struktur kalus
kering, berwarna putih hingga krem dan memiliki struktur remah sedangkan kalus non embriogenik dicirikan  dengan  struktur  kalus  kompak,  basah, dan  berwarna  bening  kecoklatan.  Berikut perbedaan  antara  kalus  embriogenik  dan  non- embriogenik secara makroskopis (Gambar 2).
Gambar 2. Kalus  embriogenik  dan  non- embriogenik  pada  tanaman  tebu  Var.  NXI  1-3 secara  makroskopis.  EC  =  kalus  embriogenik; NEC = kalus non-embriogenik.
Proliferasi Kalus Embriogenik Pada  tahapan  proliferasi  kalus  embriogenik, konsentrasi  2,4-D  yang  sesuai  sesuai  adalah  2 ppm.
Gambar 3. Kalus embriogenik pada umur 3 minggu pada konsentrasi 2,4-D yang berbeda: A) Makroskopis  kalus  embriogenik  pada  media proliferasi  2  ppm. B) Makroskopis  kalus embriogenik pada media proliferasi 1 ppm.
Pada  umur  3  minggu  konsentrasi  2,4-D  2  ppm mampu  meningkatkan  perkembangan  kalus embriogenik  dari  fase  globular  membentuk  fase skutelar  (Gambar  3  A)  sedangkan  pada konsentrasi  2,4-D  1  ppm  kondisi  kalus  masih berada pada fase globular (Gambar 3 B).

## Regenerasi Embrio Somatik
Regenerasi  embrio  somatik  ditumbuhkan pada media regenerasi yang mengandung kinetin. Penambahan  ZPT  kinetin  bertujuan  untuk meningkatkan regenerasi melalui mitosis (Wan & Liang, 1988).
Berdasarkan  hasil  pengamatan  pada  Gambar 4 A terlihat bahwa pada umur 3 minggu di dalam media regenerasi embrio somatik telah membentuk  tanaman  tebu   ( plantlet )  akan  tetapi tidak  seragam.  Jumlah plantlet yang  terbentuk dari  satu  eksplan  berjumlah  ±35  sedangkan  yang lain  masih  berada  pada  fase  skutelar  dan
koleoptilar. Pada umur 6 minggu rata-rata jumlah plantlet yang terbentuk mencapai ±82.
Pembentukan  fase  yang  tidak  serempak  dalam satu kalus menyebabkan jumlah plantlet yang ada di dalam media regenerasi berbeda.
Gambar 4. Regenerasi  tanaman  tebu  Var.
NXI  1-3. A) umur  3  minggu. B) umur  6  minggu pada media MS + 0,5 ppm kin + sukrosa 30 g/l + PVP 300 mg/l + agar kuljar 11 g/l.

## Benih Sintetik Tanaman Tebu Var. NXI 1-3
Embrio  somatik  tanaman  tebu  Var.  NXI  1-3 selanjutnya  dikapsulkan  untuk  pembuatan  benih sintetik  (enkapsulasi).  Enkapsulasi  dilakukan dengan  mengisolasi  embrio  somatik  yang  telah membentuk  fase  koleoptil  (Gambar  5  A). Penggunaan  bagian  koleoptil  sebagai  bahan tanaman  yang  dikapsulkan  disebabkan  bagian tersebut  bersifat  meristematik.  Menurut  Yoshida et  al. (1993)  sel  tanaman  yang  bersifat meristematik  lebih  toleran  terhadap  penyimpanan dibandingkan  sel  yang  telah  dewasa.  Bagian koleoptil  selanjutnya  ditaburkan  pada  3%  Na- alginat  yang  telah  mengandung  media  tumbuh. Penggunaan  3%  Na-alginat  didukung  dari  hasil penelitian  Daud et  al. (2008)  dan  Geetha et  al. (2009) yang menyatakan bahwa pembuatan benih sintetik  dengan  3%  Na-alginat  dalam  100  mM CaCl 2 merupakan  konsentrasi  optimal  di  dalam pembuatan  benih  sintetik.  Benih  sintetik  yang dihasilkan  dari  proses  enkapsulai  berjumlah  100 benih.
Proses  selanjutnya  adalah  perendaman  Na- alginat  yang  mengandung  embrio  somatik  pada larutan  100  mM  CaCl 2 .  Menurut  Taha et  al. (2013) larutan CaCl 2 berfungsi untuk memadatkan kapsul.  Proses  perendaman  Na-alginat  di  dalam larutan  CaCl 2 dilakukan  selama  40  menit.  Hal tersebut  berfungsi  untuk  menyempurnakan pembentukan  kapsul  (Ipekci  &  Gozukirmizi, 2003).  Kapsul  yang  telah  terbentuk  kemudian diinkubasi  didalam  media  semi  solid  pada intensitas cahaya ±88 lux dengan suhu 4 o C.
Gambar  5.  Metode  pembuatan  benih  sintetik. A) Bagian  koleoptil  yang  dienkapsulasi  (perbesaran 8X). B) Benih sintetik tanaman Tebu Var. NXI 1- 3  yang  dienkapsulasi  menggunakan  3%  Na- alginat  dan  100  mM  CaCl 2 . C) Inkubasi  kapsul pada media semi solid.
Kapsul tersebut berfungsi sebagai endosperm sintetik  atau  cadangan  makanan  pada  saat  benih disimpan.  Inkubasi  kapsul  didalam  media  semi solid  bertujuan  agar  kapsul  tidak  mudah  rusak akibat  proses  osmosis  sedangkan  penyimpanan pada  suhu  rendah  dapat  mengurangi  aktivitas enzim  terutama  enzim  hidrolisis  sehingga  hal tersebut  dapat  mengurangi  perombakan  cadangan makanan (Syamsu et al. , 2003).

## KESIMPULAN
Konsentrasi  2,4-D  4  ppm  lebih  efektif  untuk menginduksi kalus embriogenik yang ditunjukkan dengan  tingginya  persentase  eksplan  membentuk kalus embriogenik yaitu sebesar 41%. Konsentrasi 2,4-D  2  ppm  adalah  konsentrasi  yang  paling efektif  untuk  tahap  proliferasi  kalus  embriogenik yang  ditandai  dengan  terbentuknya  fase  skutelar pada  umur  3  minggu.  Penggunaan  kinetin  0,5 mg/l  mampu  meningkatkan  pertumbuhan  embrio somatik  dewasa  (koleoptil)  membentuk  tanaman baru ( plantlet ). Benih sintetik yang telah berhasil dibuat  menggunakan  bagian  koleoptil  dengan menggunakan 3 % Na-alginat dan 100 mM CaCl 2 berjumlah 100 benih. Berdasarkan hasil penelitian perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk mendapatkan  prosedur  pembuatan  benih  sintetik yang  mampu  menyimpan  eksplan  dalam  jangka waktu  yang  lebih  lama  tanpa  mengurangi viabilitas dari eksplan.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  berterima  kasih  atas  bantuan  dana penelitian  melalui  dana  proyek  Penelitian Unggulan  Perguruan  Tinggi  tahun  2014  serta
Divisi Penelitian dan Pengembangan Usaha PTPN XI Persero.

## DAFTAR PUSTAKA
Ali,  S.,  &  Iqbal  J.  2010.  Facile  Regeneration Through Adventive or Somatic Embryogenesis  from in  vitro Cultured Immature Leaf Segments of Elite Varieties of
Sugarcane  ( Saccharum  officinarum L.). Biologia (Pakistan). Vol. 56: 55-62. Chithra, M., K.P. Martin, C. Sunandakumari, and P.V. Madhusoodanan. 2005. Somatic Embryogenesis,  Encapsulation,  and  Plant Regeneration  of Rotula  aquatica .,  A  Rare Rhoeophytic  Woody  Medical  Plant. In Vitro Cellular & Developmental Biology . Vol. 41 : 28-31.
Daud  N.,  Taha  R.M.,  and  Hasbullah  N.A.  2008. Artificial Seed Production from Encapsulated Micro Shoots of Saintpaulia ionantha Wendl. (African  violet). J.  Appl.  Sci .  Vol.  8(24): 4662-4667.
Davies,  P.  J.  1995. Plant  Hormone:  Physiology Biochemistry and Molecular Biology .
Netherlands: Kluwer Academic Publishers.
Dixon, R. A. 1985. Plant Cell Culture a Practical Approach .  Washington  DC:  Department  of Biochemistry,  Royal  Holloway  College.  IRL Press Oxford.
Gaba,  V.  P.  2005.  Plant  Growth  Regulator. In R. N.  Trigiano  and  DJ  Gray  ( eds. )  Plant  Tissue Culture and Development. Londn: CRC Press (87-100).
Geetha R., Gopal G.V., and Niranjan M.H. 2009. In vitro Response of Encapsulated Shoot Tips of Spilanthes  acmella . J.  Basic  Appl.  Biol . Vol. 3(1&2): 82-86.
Grossmann,  K.  2000.  Mode  of  Action  of  Auxin Herbicides: A New Ending to A long, Drown Out Story. Trends Plant Sci . Vol. 5: 506-508.
Haq,  I.  &  Memon.  S.  2012.  Efficient  Plant RegeneationThrough Somatic Embryogenesis in  Sugarcane  ( Saccharum  officinarum L.). indian  Journal  of  Biotechnology.  Vol.  11 (15): 3704-3708.
Ipekci,  Z.,  &  Gozukirmizi,  N.  2003.  Direct Somatic  Embryogenesis  and  Synthetic  Seed Production  from Paulownia  elongata . Plant Cell . Vol. 22: 16-23.
Purnamaningsih,  Ragapadmi.  2002.  Regenerasi Tanaman  Melalui  Embriogenesis  Somatik dan  Beberapa  Gen  yang  Mengendalikannya.
Buletin AgroBio . Vol. 5 (2): 51-58.
Rasullah,  F.  F.,  Nurhidayati,  T.,  Nurmalasari. 2013.  Respon  Pertumbuhan  Tunas  Kultur Meristem Apikal Tanaman Tebu ( Saccharum officinarum L.) Varietas NIX 1-3 Pada Media MS  dengan  Penambahan  Arginin  dan Glutamin. Jurnal Sains dan Seni Pomits . Vol. 2 (2): 2337-3520.
Syamsu, W.,Yubiarti, N., Kurniaty, R.., & Abidin, Z.  2003. Teknik penanganan benih orthodok. (buku  1). Bogor:  Badan  Penelitian  dan pengembangan  Kehutanan;  Balai  Penelitian dan pengembangan Teknologi perbenihan.
Taha,  R.  M.,  Mahmad,  N.,  Yaacob  J.  S.,
Abdullah,  N.,  &  Mohajer,  S.  2013.  Sythetic Seeds Production and Regeneration of Oxalis triangularis for  Mass  Propagation  and Conservation. International  Journal  of Environmental  Science  and  Development . Vol. 4 (5): 394.
Tahir,  M.  S.,  Victor,  K.,  &  Abdulkadir,  S.  2011. The Effect 2,4-Dichlorophenoxy Acetic Acid
(2,4-D) Concentration Induction in Sugarcane ( Saccharum  officinarum ). Nigerian  Journal of  Basic  and  Applied  Science .  Vol.  19  (2): 213-217.
Utami, E. S. W., Sumardi, I. Taryono, & Semiarti,
E.  2007.  Pengaruh α -Naphtaleneacetic  acid (NAA)  Terhadap  Embriogenesis  Somatik Anggrek  Bulan Phalaenopsis  Amabilis (L.) BI. Biodiversitas . Vol. 8, No. 4: 295-299.
Wan, Y. S. E. L. & Liang, G. H. 1988. The Effect of  Kinetin  on  Callus  Characters  in  Alfalfa ( Medicago  sativa L.). Euphytica .  Vol.  39:
249.
Verma, D., Joshi, R., & Kumar, P. 2011. Protocol for in  vitro Somatic  Embryogenesis  and Regeneration  of  Rice  ( Oryza  sativa L.). Indian Journal of Experimental Biology . Vol.
49: 958-963.
Yoshida,  S.,  Y.  Hattanda,  and  T.  Suyama.  1993.
Variations in Chilling Sensivity of
Suspension  Cultures  Cell  of  Mung  Bean ( Vigna  radiata (L.)  Wilczek)  during  The Growth  Cycle. Plant  Cell  Physiology .  Vol.
34: 673-679.