## STRES KRONIS MENURUNKAN TEBAL LAPISAN SEL GRANULOSA FOLIKEL ANTRAL RATTUS NORVEGICUS
Alifia Candra Puriastuti 1 , Margarita M. Maramis 2 , Jimmy Januar Annas 3
1 Mahasiswa Ilmu Kesehatan Reproduksi Jenjang Magister, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga Surabaya
2 Departemen Ilmu Kesehatan Jiwa, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, RSUD Dr. Soetomo
3 Departemen Obstetri dan Ginekologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, RSUD Dr. Soetomo e-mail : alifia.can.puriastuti-2016@fk.unair.ac.id

## ABSTRAK
Kondisi reproduksi seorang perempuan dapat dinilai dari keberlangsungan siklus ovarium  dan  siklus  endometrium.  Stres  yang  terjadi  secara  kronis  dapat mempengaruhi    siklus    reproduksi    tersebut.    Folikulogenesis    yang    merupakan bagian dari siklus ovarium dipengaruhi oleh interaksi antara oosit, sel granulosa dan  sel  teka.  Komunikasi  ini  bertujuan  sebagai  pemberi  nutrisi  dan  sinyal pengatur  yang  diperlukan  untuk  maturasi.  Tebal  lapisan  sel  granulosa  terutama pada  fase  folikel  antral  dapat  digunakan  sebagai  marker  homeostasis  sel  dalam mempertahankan  keberlangsungan  folikulogenesis.  Membuktikan  stres  kronis dengan  metode  chronic  unpredictable  mild  stress  (CUMS)  dapat  menurunkan tebal  lapisan  sel  granulosa  pada  Rattus  novergicus.  Unit  sampel  dibagi  menjadi dua  kelompok  yakni  kelompok  kontrol  tanpa  stres  dan  kelompok  perlakuan dengan CUMS 22 hari. Setelah 24 jam dari perlakuan terakhir, tikus dikorbankan dan  dibuat  preparat  ovarium  dengan  pewarnaan  hematoxilin  eosin.  Pengukuran secara  histologi  tebal  lapisan  sel  granulosa  folikel  antral  di  bawah  mikroskop dengan  menggunakan  mikrometer.  Pengujian  hipotesis  dilakukan  dengan  uji Independent  T-Test.  Hasil  uji  dalam  α  =  0.05,  nilai  T hitung =  2.540,  nilai
(            ), dapat disimpulkan menolak H 0 (ada perbedaan signifikan). Maka dapat  diartikan  terdapat  penurunan  signifikan  tebal  sel  granulosa  folikel  antral antara  kelompok  kontrol   dibanding   kelompok   perlakuan.   Stres   kronis  dapat menurunkan tebal lapisan sel granulosa folikel antral.
Kata kunci : stres kronis, tebal lapisan sel granulosa, folikel antral

## ABSTRACT
Woman's reproductive could be determined by the continuity of the ovarian cycle and  the  endometrial  cycle.  Chronic  stress  could  affect  the  reproductive  cycle. Folliculogenesis  which  part  of  the  ovarian  cycle  was  affected  by  the  interaction between  oocytes,  granulosa  cells  and  theca  cells.  These  two-way  communication was  expected  to  provide  the  nutrients  and  regulatory  signals  necessary  for maturation.  The  granulosa  cells  layer  thickness  of  antral  follicle  phase  could  be used  as  a  cells  homeostasis  marker  in  maintaining  the  continuity  of folliculogenesis.  This  study  aimed  to  prove  that  chronic  stress  with  Chronic Unpredictable Mild Stress (CUMS) method could reduce the granulosa cells layer thickness  in  Rattus  novergicus.  The  sample  units  were  divided  into  two  groups  : the stressless control group and the treatment group with 22 days of CUMS. After 24  hours  of  the  last  treatment,  the  mice  were  sacrificed  and  given  an  ovary preparation  with  hematoxylin  eosin  staining.  The  histologically  measurement granulosa  cells  layer  thickness  in  antral  follicle  using  a  micrometer.  Hypothesis analysis  was  tested  by  Independent  T-Test.  The  result  in  α  =  0.05,  T  value  = 2.540, p  value = 0.024 (p <α), it could be concluded  that H 0 was rejected (there was  significant  difference).  Thus,  there  could  be  a  significant  decrease  in  the granulosa  cells  layer  thickness  of  antral  follicle  between  the  control  group  and the treatment group. Chronic stress could decrease the antral follicle’s granulosa cells layer thickness.
Keywords : Chronic stress, granulosa cells layer thickness, antral follicle
© (2017) Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia

## 1.    PENDAHULUAN
Infertilitas  menjadi  masalah  pada 10  –  15%  pasangan  dan  menjadi  hal penting  bagi  para  klinisi  (Fritz,  2011). Data  prevalensi  penyebab  infertilitas pada perempuan menurut WHO, gangguan ovarium menempati prevalensi  tertinggi,  yakni  sebesar  33% dan  gangguan  folikulogenesis  menjadi salah satu bagian penyebabnya (Bedaiwy et   al. ,   2003;   Myrnawati, 2012;    Fitriani,    2016).    Gangguan ovulasi  dan  gangguan  folikulogenesis dapat terjadi akibat paparan stres dalam jangka waktu lama (stres kronis).
Stres  juga  dapat  menyebabkan infertil  sekunder  dan  berdampak  pada kesehatan   reproduksi   perempuan   di saat  mendatang.  Berbagai  penelitian telah  menyatakan  bahwa  stres  terbukti dapat    menyebabkan    infertilitas, terutama  stres  yang  terjadi  secara  terus menerus  atau  stres  kronis  (Whirledge, 2010;  Hendarto,  2015;  Setiyono,  2015; Li, 2017; dan Scarlet,2017).
Folikulogenesis  juga  dipengaruhi oleh  komunikasi  dua  arah  antara  oosit dan  sel  somatik  terutama  sel  granulosa yang  mengelilingi  oosit  (sel  granulosa kumulus) untuk menentukan perkembangan  oosit.  Oosit  bergantung pada  sel  granulosa  untuk  memberikan nutrisi  dan  sinyal  pengatur  yang diperlukan  untuk  maturasi  inti  dan sitoplasma  (Gilchrist et  al. ,  2008; Myrnawati, 2012).
Pada  saat  folikel  mencapai  fase antral,    terbentuk    kompleks    sel granulosa    –    oosit    atau    disebut Kompleks  Oosit  –  Kumulus  (KOK) (Gilchrist et   al. ,   2008;   Myrnawati, 2012).  Tebal  lapisan  tersebut  dapat digunakan  sebagai  acuan  homeostasis sel dalam mempertahankan keberlangsungan folikulogenesis, karena    semakin    sedikit    jumlah prolifersi sel granulosa dapat mempengaruhi  kualitas  oosit  (Gupta et al. , 2008; Myrnawati, 2012).
Oleh  karena  hal  diatas,  penelitian Stres      dan kecemasan      dapat ini   bermaksud   membuktikan   bahwa meningkatkan intensitas       supresi stres  kronis  dapat  mengakibatkan Gonadotrophine   Releasing   Hormone (GnRH)  dan  berhubungan  dengan meningkatnya  disfungsi  ovulasi  (Fritz, 2011). Aktivitas Corticotrophine Releasing Hormone (CRH) yang berlebihan  di  hipotalamus,  sebagai respon terhadap stres menjadi mekanisme untuk supresi GnRH.
Selanjutnya,    sebagai    usaha    tubuh dalam beradaptasi dengan stres menyebabkan diproduksinya suatu hormon  glukokortikoid  yaitu  kortisol oleh     kelenjar    adrenal.     Peningkatan kadar  kortisol  ini  lah  yang  secara  tidak langsung mengakibatkan gangguan pulsasi GnRH (Whirledge, 2010).
Gangguan  pada  aksis  Hipotalamus
–  Pituitari  –  Ovarium  (HPO)  dapat berlanjut  hingga  terjadi  gangguan ovulasi bahkan sampai dengan terjadinya gangguan folikulogenesis.
penurunan  tebal  lapisan  sel  granulosa folikel  antral  pada Rattus  norvegicus model stres kronis.

## 2.    MATERI DAN METODE
Penelitian ini merupakan penelitian  laboratoris  dengan Rattus novergicus sebagai  model  hewan  coba stres  kronis.  Besar  unit  sampel  hingga akhir  penelitian  adalah  16  ekor  yang terbagi  dalam  dua  kelompok,  yakni kelompok kontrol dan perlakuan.
1.  Aklimatisasi
Aklimatisasi      bertujuan      untuk memberikan  kesempatan  adaptasi  bagi tikus    dan    dilakukan    selama    7    hari. Tikus  ditempatkan  di  kandang  dan berkoloni 2  – 3  ekor tikus  dalam ruang penelitian  yang  sunyi  tenang  dan berventilasi.
dengan   wir restrainer (2 e   m jam) esh bising dan keras (85 – 90 dB), (3 jam) 16 6 Berenang dingin 4 o C ( di 3 me air nit) 28 18 Paparan sinar terang 300  –  400  lux  (4 watt)  dilakukan  2x sehari (45 menit) 2.  Sinkronisasi Birahi Sinkronisasi  birahi  dilakuan  pada hari  ke  delapan  dan  kesepuluh  dengan melakukan penyuntikan PGF2α (Lutaprost ® 250, Agrivet, USA) dengan dosis 25 µg/g BB secara intraperitoneal (Rosdianto, 2016). Tujuan dari sinkronisasi birahi yakni untuk penyamarataan   fase  estrus   (Campbel, 2013), hingga saat dilakukan pembedahan. 3.  Pemaparan Stresor Rattus    norvegicus model    stres kronis  adalah  tikus  yang  berada  pada kelompok perlakuan. Sedangkan kelompok  kontrol  digunakan  sebagai pembanding  dan  dicegah  mengalami stres.
Pemberian  stres  kronis  dalam penelitian  ini  menggunakan  metode Chronic  Unpredictable  Mild  Stress (CUMS).  CUMS  adalah  pemberian berbagai    perlakukan    sebagai    stressor dan  menyerupai  stressor  kehidupan sehari  –  hari  yang  tidak  terlalu  berat namun  terus  menerus  dan  dilakukan minimal selama tiga minggu (Maramis,
2015). Lama pemberian perlakuan disesuaikan dengan  siklus  birahi Rattus novergicus , maka metode CUMS
diberikan selama 22 hari agar didapatkan fase proestrus saat pembedahan. Tabel 1 Uraian Stresor yang diberikan Hari ke- Hari perlakuan Stressor (waktu) Hari ke- Hari perlakuan Stressor (waktu) 11 1 Dipadatkan     dalam   23 13 Diikat          ekornya satu  kandang  berisi dengan   benang   (1 5    ekor    tikus    (24 jam) jam) 12 2 Isolasi     di     ruang   24 14 Isolasi     di     ruang sempit    dan    gelap sempit    dan    gelap (24 jam) (24 jam) 13 3 Diikat          ekornya   25 15 Ditusuk       ekornya dengan   benang   (1 dengan            jarum jam) sepanjang  ±  2,5  cm (1 jam) 14 4 Kandang dimiringkan  45 o (5 26 16 Immobilisasi dengan   wire   mesh jam) restrainer (2 jam) 15 5 Immobilisasi 27 17 Pemaparan       suara 17 7                    Tanpa stresor                29        19                  Dipadatkan     dalam satu  kandang  berisi 5    ekor    tikus    (24 jam) 18 8 Dipadatkan     dalam satu  kandang  berisi 5    ekor    tikus    (24 jam) 30 20 Berenang     di     air dingin (3 menit) 19 9 Paparan sinar terang 300   –   400   lux   (4 watt)   dilakukan   2x 31 21 Ditusuk       ekornya dengan            jarum sepanjang  ±  2,5  cm
sehari (45 menit)                                            (1 jam) 20 10                  Pemaparan       suara bising dan keras (85 – 90 dB), (3 jam) 32 22                  Berenang     di     air dingin (3 menit) 21 11                  Tanpa Stresor               33        -                     Visualisasi    vaginal plug dan Terminasi 22        12                  Immobilisasi dengan   wire   mesh restrainer (2 jam) Tikus  dikorbankan  24  jam  setelah perlakuan  terakhir  untuk  menghindari efek stres akut.
4.   Pemeriksaan histologis
Sampel   jaringan   ovarium   kanan dan  kiri  diambil  dengan  pembedahan abdomen. Selanjutnya pembuatan preparat dan teknik pewarnaan hematosiklin eosin.
Cara    mengevaluasi    tebal    lapisan sel granulosa adalah dengan mengamati sel berbentuk kuboid  yang mengelilingi oosit pada  folikel. Pengukuran  secara  histologi  tebal lapisan  sel  granulosa  folikel  antral  di bawah mikroskop dengan menggunakan mikrometer
pada Pembesaran 100x dengan Mikroskop Cahaya
Gambaran    histologi    folikel ovarium  pada  unit  sampel  delapan kelompok  perlakuan  (P8),  yang  tertera pada  gambar  2  menunjukkan  hanya terdapat tiga fase folikel,  yakni : folikel primer  (a),  folikel  sekunder  (b)  dan folikel  atretic  (e).  pada  unit  sampel  ini tidak  ditemukan  fase  folikel  antral  dan preovulatory.
e 3.    HASIL DAN DISKUSI a Gambaran        histologi        folikel b
ovarium     pada     unit     sampel     satu kelompok   kontrol   (K1),   yang   tertera pada  gambar  1  menunjukkan  terdapat seluruh  fase  folikel,  yakni  :  folikel primer  (a),  folikel  sekunder  (b),  folikel antral  (c),  folikel  pre-ovulatory  (d)  dan folikel atretic (e).
c b e
Gambar  2  Gambaran  Histologi  Folikel Ovarium Kelompok Perlakuan (P8)
pada      Pembesaran      100x      dengan Mikroskop Cahaya Pengukuran  secara  histologi  tebal lapisan  sel  granulosa  folikel  antral  di bawah mikroskop dengan menggunakan  mikrometer  dapat  dilihat seperti pada gambar 3. d
a
Gambar  1  Gambaran  Histologi  Folikel Ovarium Kelompok Kontrol (K1)
© (2017) Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
menggunakan uji Shapiro-Wilk . Berdasarkan hasil perhitungan Gambar  3  Pengukuran  Tebal  Lapisan Sel  Granulosa  Folikel  Antral  pada Pembesaran  400x  dengan  Mikroskop Cahaya
Gambar 4 Distribusi Tebal Lapisan Sel Granulosa Folikel Antral
Gambar  4  menunjukkan  bahwa tebal  lapisan  sel  granulosa  kelompok kontrol    mengalami    penurunan dibanding dengan kelompok perlakuan.
Data  deskriptif  tebal  lapisan  sel granulosa  folikel  antral  dapat  dilihat pada tabel 2.
Tabel  2  Data  Deskriptif  Tebal  Lapisan Sel  Granulosa Folikel Antral Kontrol Perlakuan Mean ± SD 76.49 ± 9.74  62.99 ± 11.45 Median 75.39 62.89 Minimal 64.10 43.8 Maksimal 88.30 78.9 Secara deskriptif tampak perbedaan diantara kedua kelompok. Data    hasil    penelitian    terlebih dahulu            diuji            normalitasnya
menunjukkan  bahwa  masing  –  masing data tebal lapisan sel granulosa kelompok kontrol dan kelompok perlakuan  berdistribusi  normal  dengan nilai p berturut – turut :                    dan . Selanjutnya  pengujian  hipotesis dilakukan  dengan  uji  Independent  T- Test.  Hasil  uji  dalam  α  =  0.05,  nilai T hitung =     2.540,     nilai (            ),  dapat  disimpulkan  menolak H 0 (ada  perbedaan  signifikan).  Maka dapat  diartikan  terdapat  penurunan signifikan  tebal  sel  granulosa  folikel antral antara kelompok kontrol dibanding kelompok perlakuan. Hal  ini  membuktikan  bahwa  stres yang  terjadi  secara  kronis  dapat mengakibatkan  penurunan  tebal  lapisan sel  granulosa.  Sel  granulosa  berperan penting  dalam  proses  maturasi  folikel karena  berhubungan  dengan  produksi hormon   steroid,   faktor   pertumbuhan dan   berperan   penting   dalam   proses atresia  folikel  (Gupta et  al. ,  2008; Myrnawati, 2012 dan Qiu et al. , 2013).
Sel  granulosa  ovarium  merupakan sel  somatik  folikel  dimana  asal, perkembangan  dan  fungsi  dari  sel-sel ini    secara    erat    terkait    dengan diferensiasi  gamet  betina,  pembentukan ovarium  dan  kemajuan  normal  dari siklus  reproduksi  wanita  (Baumgarten and  Carlos,  2018).  Perubahan  pada siklus sel granulosa dianggap bertanggungjawab terhadap
terganggunya  pertumbuhan  folikel  dan maturasi  oosit.  (Gupta et  al. ,  2008;
Myrnawati, 2012 dan Qiu et al. , 2013). Bahkan  dalam  penelitiannya,  Qiu et   al. (2013)   membuktikan   bahwa atresia    folikel    dimulai    dengan terjadinya      apoptosis      sel      granulosa. Studi  tentang  jalur  yang  mengatur kematian  sel  dari  ekstra  seluler  masih menjadi  persoalan  yang  rumit,  karena
jalur   yang   sama   sering   digunakan untuk mengirimkan sinyal yang diperlukan  untuk  pertumbuhan  dan diferensiasi    sel.    Sinyal    eksternal, seperti  faktor  trofik  dan  hormon,  dapat mengaktifkan  atau  menekan  program kematian sel (Carou et al. , 2017).
Dalam penelitian ini belum diketahui  apakah  terjadi  peningkatan jumlah  apopotosis  sel  granulosa  pada Rattus norvegicus model stres kronis. Namun  gangguan  homeostasis  sel sehingga proliferasi sel granulosa terganggu    telah    dipastikan    terjadi karena kondisi stres kronis. Gangguan homeostasis sel granulosa    dapat    terjadi    karena lemahnya  stimulus  hormon  (Carou, et al. , 2017), terutama hormon gonadotropin.  Aktivitas  CRH  yang berlebihan  di  hipotalamus,  sebagai respon terhadap stres, menjadi mekanisme untuk supresi GnRH
(Whirledge, 2010).

## 4.    SIMPULAN DAN SARAN
Stres  yang  terjadi  secara  kronis dapat  menyebabkan  penurunan  tebal lapisan  sel  granulosa  folikel  antral.
Akibatnya kualitas folikulogenesis mungkin saja terganggu.
Diperlukan  penelitian  lebih  lanjut terkait  gangguan  folikulogenesis  yang terjadi sebagai akibat stres kronis.
Ucapan Terima kasih 1.   Dr.   Hermanto   Tri   Joewono,   dr., Sp.OG  (K),  selaku  ketua  Program Studi  Magister  Ilmu  Kesehatan Reproduksi FK Unair
2.   Kedua   orang   tua   penulis,   Drs. Djaka    Purwanto,    M.MPd    dan Agung Kridyastuti, S.Pd, M.MPd
3.   Prof.  Dr.  Soetojo,  dr.,  Sp.U  selaku dekan FK Unair Surabaya 4.   Prof.  Dr.  Mohammad  Nasih,  SE., MT.,  Ak.,  CMA.,  selaku  Rektor
Universitas Airlangga Surabaya
5.   Dr.  Bambang  Purwanto,dr.,  M.Kes dan  Dr.  Widjiati,drh.,  M.Si,  selaku staf pengajar     program      studi Magister Ilmu Kesehatan Reproduksi FK Unair 6.   Prof.   Dr.   I   Ketut   Sudiana,   drs., M.Si  dan  Dr.  Agung  Dwi  Wahyu
Widodo,  dr.,  M.Kes  selaku  staf pengajar  program  magister  FK UNAIR.
7.  Staf  sekretariat  pascasarjana  FK Unair
8.   Staf  Departemen  Biologi  Fakultas Sains dan Teknologi UNAIR
9.   Andina  Bella  Rahadi  Putri  selaku tim dalam penelitian
10. Serta   rekan   –   rekan   mahasiswa Magister Ilmu Kesehatan Reproduksi    angkatan   2016   dan 2015 ganjil FK Unair

## DAFTAR PUSTAKA
1.    Fritz,  Marc  A  dan  Leon  Speroff. 2011. Clinical Gynecologic Endocrinology  and  Infertility  8 th
Edition .  Philadelphia  :  Lippincott Williams & Wilkins
2.  Myrnawati,  Mira.   2012. Ekspresi
Growth  Differentiation  Factor-9 (GDF-9)  Kompleks  Oosit-Kumulus Sapi Pada Kultur Zalir Peritoneum Penderita Infertl dengan Endometriosis [Laporan Penelitian]. Surabaya. Program Dokter Spesialis Universitas Airlangga. 73 hal
3.    Whirledge  Shannon  dan  John  A. Cidlowski.  2010.  Glucocorticoids, stress, and fertility. National
Institute of Health. Minerva endocrinol . 35(2):109-25.
4.  Hendarto,    Hendy.    2012. Profil TNF-α,  GDF-9  dan  Hyaluronan pada  Gangguan  Folikulogenesis sebagai Gambaran Penurunan Kualitas  Oosit  Pasien  Infertil dengan  Endometriosis [Disertasi].
Velasco Guimarães Silva, Alessandra Ximenes Santos, Surabaya.   Program   Pascasarjana Universitas Airlangga 5.  Setiyono,  Awik,  Hendy  Hendarto, Budi Prasetyo, Margarita M. Maramis.  2015.  Pengaruh  Tingkat Stres  dan  Kadar  Kortisol  dengan Jumlah  Folikel  Dominan  pada Penderita Infertilitas yag Menjalani Fertilisasi Invitro. Majalah   Obstetri   &   Ginekologi . 23(3): 128 - 131 6.    Li,    Sophie    dan    Bronwyn    M. Graham. 2017.  Why are women so vulnerable  to  anxiety,  trauma- related and stress-related disorders? The potential role of sex hormones. The  Lancet  Psychiatry . 4 (1) : 73 - 82
7.    Scarlet   D.,   N.Ille,   R.   Ertl,   B.G. Alves,  G.D.A.  Gastal,  S.O.  Paiva,
M.O.  Gastal,  E.L.  Gastal,  dan  C. Aurich. 2017. Glucocorticoid Metabolism   in   Equine   Follicles and  Oocytes. Domestic  Animal
Endocrinology . 59 : 11 – 12
8.    Rosdianto,     Aziz     Mardanarian. 2016. Kinerja  Reproduksi  Tikus
Putih    (Rattus    norvegicus    sp.)
Betina  Setelah  Pemberian  Jamu Kesuburan [Tesis]. Bogor. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. 54 hal. 9.    Maramis,  Margarita  Maria.  2015. Mekanisme Gangguan Fungsi Memori Kerja Spasial dan Fleksibilitas Kognitif Melalui HSP70, IL-6,5-HT,BDNF dan pCREB  Pada  Model  Tikus  Putih (Rattus norvegicus)
Depresi [Disertasi]. Surabaya. Program
Pascasarjana Universitas Airlangga. 104 hal. 10.  Qiu,    Mingning,    Fusheng    Quan, Chengquan  Han,  Bin  Wu,  Jun  Liu, Zhongcai  Yang,  Feng  Su,  Yong Zhang.  2013.  Effect  of  Granulosa Cells on Steroidogenesis, Proliferation  and  Apoptosis  of Stromal   Cells   and   Theca   Cells
Derived from The Goat Ovary. The Journal    of    Steroid    Biochemistry and Molecular Biology . 138 : 325
11.  Carou,   M.C.,   P.R.   Cruzans,   A. Maruri,  M.G.  Farina,  C.D.  Fiorito, G.  Olea,  D.M  Lombardo.  2017.
Apoptosis  of  Bovine  Granulosa
Cells  :  Intracellular  Pathways  and Differentiation. Acta Hictochemica . 119 (5) : 462 – 470
12. Da    Costa,    Nathalia    Nogueira, Karynne    Nazaré    Lins    Brito, Priscila  di  Paula  Bessa  Santana, Marcela da Silva Cordeiro, Thiago
Priscilla do Carmo Ramos, Simone do  Socorro  Damasceno  Santos, William  Alan  King,  Moyses  dos Santos  Miranda  dan  Otávio  Mitio Ohashi. 2016. Effect of Cortisol on Bovine  Oocyte  Maturation  and Embryo  Development  In  Vitro. Theriogenology . 85 : 323 - 32
13.  Campbel.    2013. Biologi    Edisi    9 . Wulandari, Damaring Tyas, penerjemah;  Handani,  H.  Wibi,  ed. Jakarta  :  Erlangga.  Terjemahan  dari  : Biology Nine edition
14. Guyton,    Ermita    I.    Ibrahim    Ilyas editorial.  2016. Guyton  dan  Hall  :
Buku  Ajar  Fisiologi  Kedokteran  Edisi Revisi  Berwarna  Ke-12 .  Singapura  : Elsevier Singapore