## CURRENT BIOCHEMISTRY
ISSN: 2355-7877 e-ISSN: 2355-7931 Journal homepage: http://journal.ipb.ac.id/index.php/cbj Journal E-mail: current.biochemistry@gmail.com
Antibacterial Activity of Ethanol Extract of Red Betel Leaves ( Piper crocatum ) and Its Fractions against Escherichia coli pBR322 (Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah ( Piper crocatum ) dan Fraksinya terhadap
Escherichia coli pBR322
Fernanda Chairunisa 1 , Mega Safithri 1,2* , Maria Bintang 1
1 Department of Biochemistry, IPB University, Bogor, 16680, Indonesia 2 Tropical Biopharmaca Research Center, LPPM IPB University, Indonesia
Received: 18 August 2021 ; Accepted: 20 March 2022
*Corresponding author : Mega Safithri, Depatemen Biokimia IPB: e-mail: safithri@apps.ipb.ac.id

## ABSTRACT
Red  betel  leaf  (Piper  crocatum)  is  one  of  the  typical  Indonesian  herbal  plants  that  has  an antibacterial function. This study aimed to test and measure the activity of 70% ethanol extract of red betel leaf and its fractions (n-hexane, ethyl acetate, and water fractions) as antibacterial against specific bacteria Escherichia  coli  pBR322  based  on  activity  and  minimum  inhibitory  concentration.  Extraction  was  carried out  using  the  maceration  method  and  continued  with  fractionation  based  on  the  level  of  solvent  polarity. Antibacterial  activity  was  indicated  by  the  presence  of  inhibition  zones.  The  minimum  inhibitory concentration was indicated by the appearance of the inhibition zone at the minimum concentration. Results showed that extraction process resulted in crude extract yield of 19.49%.   The best antibacterial activity was shown  by  1000  ppm  n-hexane  fraction  with  an  inhibition  zone  of  2.40  mm  ±  0.14.    The  best  minimum inhibitory concentration was 100 ppm n-hexane fraction with an inhibition zone of 0.60 mm ± 0.56.
Keywords: Antibacterial activity, Eschericia  coli pBR322, Minimum inhibition concentration, Red betel leaf

## ABSTRAK
Daun sirih merah (Piper crocatum) merupakan salah satu tanaman herbal khas Indonesia yang memiliki fungsi  sebagai  antibakteri. Penelitian  ini  bertujuan  menguji  serta  mengukur  aktivitas  antibakteri  ekstrak  etanol 70%  daun  sirih  merah  dan  fraksinasinya  (fraksi  n-heksana,  etil  asetat,  dan  air)  terhadap  bakteri  spesifik Escherichia  coli  pBR322  berdasarkan  aktivitas  dan  konsentrasi  hambat  minimum.  Ekstraksi  dilakukan menggunakan  metode  maserasi  dan  dilanjutkan  dengan  fraksinasi  bertingkat  berdasarkan  tingkat  kepolaran pelarut.  Aktivitas  antibakteri  ditunjukkan  dengan  keberadaan  zona  hambat  yang  muncul  pada  beberapa konsentrasi.  Konsentrasi  hambat  minimum  ditunjukkan  dengan  munculnya  zona  hambat  pada  konsentrasi minimum.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  bahwa  proses  ekstraksi  menghasilkan  rendemen  kasar  sebesar 19.49%.    Aktivitas  antibakteri  terbaik  dihasilkan  oleh  fraksi  n-heksana  konsentrasi  1000  ppm  dengan  zona hambat  sebesar  nilai  2.40  mm  ±  0.14.  Konsentrasi  hambat  minimum  terbaik  dihasilkan  oleh  fraksi  n-heksana konsentrasi 100 ppm dengan zona hambat sebesar 0.60 mm ± 0.56.
Kata  kunci :  Aktivitas  antibakteri,  Daun  sirih  merah,  Escherichia  coli  pBR322,  Konsentrasi  hambat minimum.

## 1. PENDAHULUAN
Interaksi  manusia  dengan  lingkungan yang kurang sehat menjadi rutinitas yang tanpa disadari dapat menyebabkan berbagai penyakit infeksi sehingga masalah resistensi meningkat. Tambunan (2018) menyatakan bahwa masalah resistensi  umumnya  terjadi  akibat  adanya “ pressure  selection ”  dari  hasil  penggunaan antibiotik  yang  tidak  terkendali  dan  bijak. Berbagai  macam  mekanisme  biokimiawi  dan fisiologi dari lingkungan mempengaruhi terjadinya  masalah  resistensi.  Pencegahan  dan pengendalian  akan  masalah  resistensi  masih sangat  sedikit.  Antibiotik  telah  digunakan dalam  berbagai  pengobatan  dalam  banyak  hal namun  perkembangan  antibiotik  ini  juga disertai  dengan  berkembangnya  masalah kemunculan  resisten  strain  yang  begitu  cepat (Davies  dan  Davies  2010).  Hal  tersebut menyebabkan kebutuhan akan obat antimikroba  berbahan  dasar  alami  semakin diperhatikan.
Obat-obatan berbahan dasar alami telah dipercaya memiliki manfaat yang besar karena memiliki senyawa alami yang sangat berpengaruh  terhadap  kesehatan  manusia. Lutviandhitarani et  al .  2015  menyatakan bahwa  rebusan  daun  sirih  ( Piper  betle L) memiliki kemampuan sebagai antibiotik berbahan dasar herbal yang memiliki kesamaan efektivitas dengan antibiotik komersil penicillin-dihydrostreptomycin sebagai  alternatif  untuk  pengobatan  mastitis. Manfaat besar yang dimiliki bahan alami telah banyak  diminati  untuk  diidentifikasi  sifatnya dari  efek  biologis  serta  dikembangkannya terapi  baru  dalam  melawan  berbagai  penyakit (Ji et  al .  2019).  Salah  satu  bahan  dasar  alami yang dapat dijadikan obat yakni sirih merah.
Daun  sirih  merah  ( Piper  crocatum ) memiliki  zat-zat  aktif  yakni  alkaloid,  tanin, saponin,  gula  pereduksi,  flavonoid,  glukosida, steroid  glikosida,  eugenol,  dan  minyak  atsiri (Irawan et  al .  2017).  Zat  aktif  tersebut  dapat berfungsi sebagai antibakteri. Menurut
Juliantina  et  al  (2009),  pertumbuhan  bakteri dapat dihambat kerjanya oleh daun sirih merah baik bakteri
Gram positif seperti Staphylococcus  aureus ATCC  25923  maupun Gram  negatif  seperti Escherichia  coli ATCC 35218 yang cenderung stabil dalam menghambat bakteri Gram negatif di konsentrasi  6.25%,  sedangkan  pada  Gram positif cenderung tidak stabil dengan konsentrasi minimum 6.25% dalam menghambat  bakteri.  Menurut  Puspita et  al . (2018),  pertumbuhan  bakteri E.  coli tidak dapat  dihambat  kinerjanya  oleh  ekstrak  etanol 70%  daun  sirih  merah  hasil  ekstraksi menggunakan  metode  maserasi  dan  refluks namun  dapat  menghambat  bakteri B.subtilis dan P.aeruginosa dengan  daya  hambat  yang rendah.
Manfaat  lainnya  dari  daun  sirih  merah yakni sebagai antioksidan. Penelitian Ramadani (2018) menunjukkan bahwa ekstrak dan  fraksi  etanol  70%  memiliki  aktivitas antioksidan  tertinggi  yakni  pada  fraksi  n- heksana  sebesar  31.9  μmol  troloks/g  ekstrak dengan  metode  CUPRAC  dan  mengandung total  tanin  tertinggi  dengan  nilai  9.8  mg/g dengan  metode  kadar  total  tanin.  Penelitian Septiani (2017) menunjukkan daun sirih merah fraksi  etil  asetat  dengan  metode  DPPH memiliki  aktivitas  antioksidan  terbaik  dengan hasil IC 50 sebesar IC 50 13,15 μg/mL. Penelitian Wedasari  (2018)  menunjukkan  bahwa  ekstrak dan  fraksi  etanol  70%  memiliki  aktivitas antioksidan  tertinggi  menggunakan  metode rancimat  dengan  nilai  FP  sebesar  1.38.  Daun sirih  merah  telah  banyak  diujikan  terhadap aktivitas  antioksidan  serta  antibakterinya dengan  berbagai  metode,  namun  pengujian aktivitas  antibakteri  terhadap  bakteri  spesifik Escherichia coli pBR322 menggunakan ekstrak  etanol  70%  dan  fraksinya  yang diperoleh melalui fraksinasi bertingkat dengan n-heksana,  etil  asetat,  dan  air,  belum  pernah dilakukan.
Penelitian  ini  bertujuan  mengukur  dan menguji  aktivitas  antibakteri  ekstrak  etanol 70%  daun  sirih  merah  dan  fraksinasinya (fraksi n-heksana, etil asetat, dan air) terhadap bakteri  spesifik Escherichia  coli pBR322 berdasarkan  aktivitas  dan  konsentrasi  hambat minimum  (KHM).  Hipotesis  penelitian  ini adalah  ekstrak  etanol  70%  daun  sirih  merah dan  dan  fraksinya  mengandung  senyawa  aktif yang  berperan  sebagai  antibakteri.  Penelitian ini diharapkan bermanfaat memberikan informasi ilmiah mengenai senyawa aktif yang terdapat  didalam  ekstrak  etanol  70%  daun merah  ekstrak  dan  fraksinya  yang  berpotensi sebagai sebagai antibakteri.

## 2. METODOLOGI

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian ini  yakni  daun  sirih  merah  yang  telah dikeringkan  dengan  ukuran  60  mesh  yang diperoleh  dari  kebun  Pusat  Studi  Biofarmaka Tropika  IPB.  Bahan  yang  diperlukan  untuk ekstraksi  simplisia  yaitu  pelarut  etanol  70%. Bahan  untuk  metode  fraksinasi  ekstrak  etanol adalah  etanol  CAS-No:  64-17-5  (Merck), pelarut  n-heksana, etil  asetat dan akuades.  Uji aktivitas  antibakteri  menggunakan  bahan tripton OXOID LP0042, yeast ekstrak CRITERION  Cat.no:  C7341,  NaCl,  agar OXOID  LP0011,  antibiotik  ampisilin  Kimia Farma, antibiotik tetrasiklin Bernofarm, antibiotik  kanamisin  Meiji,  H 2 SO 4 ,  BaCl 2 EMSURE CAS-No: 10226-27-9 NaCl
fisiologis,  kanamisin,  DMSO  20%  CAS- No:67-68-5  (EMSURE),  bakteri Escherichia coli pBR322.
Alat  yang  digunakan  pada  preparasi sampel  adalah  oven  NDO-700,  blender, saringan 60 mesh, shaker EYELA, kain saring, cawan porselin, desikator, timbangan, alat-alat gelas, sonikator DECON, micropipet RAINAN  Pipet-lite  XLS,  blue  tip,  yellow  tip, rotary  evaporator R-300  BUCHI,  autoklaf TOMY ES-315, kapas steril, kertas cakram.

## Preparasi Sampel
Daun sirih merah dibersihkan menggunakan air mengalir kemudian ditiriskan.  Daun  sirih  merah  yang  telah  bersih kemudian  di  oven  selama  3  hari  dengan  suhu 50 . setelah kering, daun kemudian diblender dan disaring menggunakan saringan berukuran 60 mesh (Alfarabi et al. 2010).

## Pengukuran Kadar Air
Cawan  porselin  di  oven  dengan  suhu 105   selama  30  menit  lalu  dibiarkan  dingin di  dalam desikator selama 30 menit  kemudian bobot kosongnya ditimbang. Simplisia dimasukkan  kedalam  cawan  kosong  sebanyak 2  gram  kemudian  di  oven  pada  suhu  105 selama 3 jam dan didinginkan dalam desikator Simplisia  yang  telah  didinginkan  ditimbang kembali  hingga  mendapatkan  bobot  konstan. Pengukuran  ini  dilakukan  sebanyak  tiga  kali ulangan.  Kadar  air  simplisia  ditentukan berdasarkan rumus berikut:
adar air a b a 100
Keterangan: a= Bobot sebelum pengeringan (g) b= Bobot setelah pengeringan (g)
(AOAC 2007).

## Ekstraksi Simplisia
Ekstraksi  simplisia  dilakukan  dengan metode  maserasi.  Simplisia  direndam  dalam pelarut dengan perbandingan 1:4. Sebanyak 25 g  simplisia  dilarutkan  dengan  100  mL  etanol 70%.  Maserasi  dilakukan  3  kali  pembilasan lalu ekstrak simplisia diambil filtratnya setelah dilakukan penyaringan dan kemudian dilakukan  pemekatan  menggunakan rotary evaporator pada suhu 50  sehingga diperoleh rendemen kasar. Ekstraksi dilakukan dengan 3 kali  ulangan.  Rendemen  ekstrak  dinyatakan dalam persen yang dihitung dengan rumus:
% 100 air) kadar - (1 x sampel awal Bobot sampel akhir Bobot ekstrak
Rendemen  
(Alfarabi et al. 2010 dengan modifikasi).

## Fraksinasi Ekstrak Etanol
Fraksinasi ekstrak etanol 70% dilakukan  secara  bertingkat  menggunakan pelarut  dengan  kepolaran  yang  berbeda-beda. pelarut  non  polar  menggunakan  n-heksana, semipolar  menggunakan  etil  asetat  dan  polar menggunakan air. Perbandingan yang digunakan  untuk  fraksinasi  yaitu  dengan volume 1:1 untuk masing-masing pelarut.
Fraksinasi dengan n-heksana.
Sebanyak  1  g  ekstrak  etanol  70%  dilarutkan dengan  75  mL  akuades  dan  75  mL  pelarut awal n-heksana yang kemudian dimasukkan ke dalam  corong  pisah  ukuran  500  mL. Campuran  kemudian  dihomogenkan  dengan cara  diputar-putar  secara  horizontal  selama  5 menit.  Keran  corong  sesekali  dibuka  untuk mengeluarkan  udara  yang  terperangkap  dalam corong  dan  menurunkan  tekanan.  Campuran kemudian  didiamkan  sehingga  terbentuk  dua fase  dengan  fase  n-heksana  berada  diatas  dan air  berada  di  bawah  kemudian  masing-masing larutan  dipisahkan  dan  diulang  fraksinasinya sebanyak tiga kali ulangan.
Fraksinasi dengan etil asetat. Fraksi air atau  fraksi  tidak  terlarut  dalam  n-heksana dimasukkan  ke  dalam  corong  kemudian ditambahkan 75 mL etil asetat lalu dihomogenkan  dengan  cara  diputar-putar secara  horizontal  selama  5  menit.  Keran corong  sesekali  dibuka  untuk  mengeluarkan udara  yang  terperangkap  dalam  corong  dan menurunkan  tekanan.  Campuran  kemudian didiamkan  sehingga  terbentuk  dua  fase  yang terpisah  layaknya  hasil  fraksinasi  n-heksana. Fraksinasi  etil  asetat  dilakukan  ulangan sebanyak tiga kali.
Fraksinasi  dengan  air.  Fraksi  air  atau fraksi tidak  terlarut  dalam  etil asetat dihomogenkan  menggunakan  penambahan  75 mL  akuades  selama  5  menit.  Kran  corong sesekali  dibuka  untuk  mengeluarkan  udara yang terperangkap dalam corong dan menurunkan tekanan. Fraksinasi dengan akuades  dilakukan  sebanyak  3  kali  ulangan.
Hasil fraksinasi kemudian dipekatkan menggunakan rotary  evaporator dengan  suhu 50 . Rendemen fraksi yang dinyatakan dalam persen dihitung dengan rumus:
% 100 air) kadar - (1 x sampel awal Bobot sampel awal bobot x total ekstrak awal bobot fraksi bobot (%) fraksi Rendemen  
(Firdausi et al. 2015 dengan modifikasi).
Peremajaan Bakteri Escherichia coli pBR322
Bubuk Luria Bertani Broth (Tripton 2,5 gr,  Yeast  ekstrak  1,25  g,  NaCl  2,5  g) dilarutkan  dengan  250  mL  akuades  dan dipanaskan  diatas  penangas  air  dan  diaduk menggunakan  stirrer  hingga  mendidih.  Media kemudian  disterilisasi  menggunakan  autoklaf selama  15  menit  dengan  suhu  121   dan kemudian  didiamkan  selama  setengah  jam pada  suhu  ruangan  dalam  keadaan  steril. Media  selanjutnya  ditambahkan  antibiotik ampisilin  dan  tetrasiklin  (50  µg/mL  ;  15 µg/mL)  kemudian  dihomogenkan.  Media dituangkan dalam tabung steril dan diinokulasikan isolasi Bakteri Escherichia coli pBR322 kemudian ditutup rapat menggunakan kapas steril dan dilakukan inkubasi pada suhu 37  selama 24 jam lamanya.
Media  Luria  Bertani  Agar  dibuat  dari campuran  tripton  2,5  g, yeast ekstrak  1,25  g, NaCl  2,5  g,  dan  agar  5  g  dalam  250  mL akuades yang dipanaskan dengan penangas air hingga  mendidih.  Campuran  selanjutnya  di autoklaf pada suhu 121 selama 15 menit dan dibiarkan  pada  suhu  ruang  selama  15  menit. Media  yang  masih  dalam  keadaan  hangat selanjutnya  ditambahkan  antibiotik  ampisilin dan  tetrasiklin  (50  µg/mL  ;  15  µg/mL)  dan dituangkan  secara  merata  ke  dalam  cawan petri  steril  secara  aseptik  dan  dibiarkan memadat.  Bakteri Escherichia  coli pBR322 hasil  inkubasi  dari  Luria  Bertani  Broth selanjutnya dipindahkan ke dalam media Luria Bertani  Agar  lalu  diinkubasi  kembali  selama 24  jam  pada  suhu  37  ˚C.  Bakteri Escherichia
coli pBR322 yang tumbuh kemudian diambil 2 sampai 3 koloni kemudian dilakukan penyesuaian  dengan  standar  Mc.  Farland  0,5. (Dima et al. 2016 dengan modifikasi).
Pembuatan Larutan  Standard Mc. Farland 0,5
Larutan  H 2 SO 4 0,36  N  sebanyak  99,5 mL  dicampurkan  dengan  0,5  BaCl 2 1,175%. Larutan  gabungan  kemudian  dikocok  hingga terbentuk  warna  keruh  yang  kemudian digunakan  sebagai  standar  kekeruhan  bakteri dimana  setiap  mL  larutan  setara  dengan konsentrasi  bakteri  1,5x108  CFU/mL  ( Colony Forming Unit ) (Ngajow et al. 2013).

## Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Bakteri Escherichia  coli pBR322  pada media Luria Bertani Agar diambil menggunakan ose. Bakteri yang telah terambil kemudian  dimasukkan  ke  dalam  10  mL  NaCl fisiologis  0,9%.  Suspensi  bakteri  kemudian dihomogenkan  menggunakan  vortex  dan disesuaikan  kekeruhannya  dengan  larutan standar Mc. Farland 0,5 (Ngajow et al. 2013).
Uji  Aktivitas  dan  Konsentrasi  hambat Minimum  (KHM)  Antibakteri  terhadap Escherichia coli pBR322
Sebanyak  10mL  Luria  Bertani  agar yang  telah  mengandung  antibiotik  ampisilin dan  tetrasiklin  (50  µg/mL  ;  15  µg/mL) dimasukkan  ke  dalam  2  cawan  petri  steril  per sampel. Masing-masing cawan petri selanjutnya  diberikan  garis  penanda  yang membagi  cawan  petri  menjadi  5  bagian  yang sama.  Media  didiamkan  hingga  memadat, kemudian  suspensi  bakteri  sesuai  standar Mc.Farland  0,5  dipipet  100  µL  ke  dalam permukaan  media  Luria  Bertani  Agar  dan diratakan menggunakan kaca Spreader . Selanjutnya  kertas  cakram  masing-masing diberikan ekstrak dan fraksi dengan volume 20 µL  pada  konsentrasi  100,  200,  400,  600,  800, 1000,  2000,  4000,  6000,  8000,  10000  ppm.
Kanamisin  dengan  konsentrasi  20  ppm digunakan  sebagai  kontrol  positif  dan  DMSO 20%  sebagai  kontrol  negatif.  Kertas  cakram selanjutnya  ditempatkan  pada  permukaan media kemudian dilakukan inkubasi pada suhu 37   selama  24  jam.  Zona  bening  yang terbentuk  menunjukkan  keberadaan  aktivitas antibakteri.  Daya  hambat  sampel  terhadap bakteri  pada  konsentrasi  minimum  juga ditentukan (Sari et al. 2010).

## 3. HASIL
Kadar  Air,  Rendemen  Ekstrak  dan  Fraksi Daun Sirih Merah
Penentuan  kadar  air  dari  simplisia  daun sirih  merah  dilakukan  berdasarkan  metode gravimetri  dengan  pengulangan  sebanyak  tiga kali.  Hasil  kadar  air  simplisia  didapatkan rerata  sebesar  8.13%  (Tabel  1).  Ekstraksi menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol  70%  sebanyak  3  kali  pembilasan  yang kemudian  hasilnya  dipekatkan  menggunakan rotary evaporator dengan suhu 50 o C menghasilkan rerata rendemen ekstrak sebesar 19.49%  (Tabel  1).  Ekstrak  etanol  70% selanjutnya difraksinasi bertingkat yang kemudian  tiap  hasil  dari  pelarut  dipekatkan sehingga  didapatkan  rendemen  fraksi  dengan hasil terbaik yaitu fraksi air sebesar 3.85%.

## Aktivitas Antibakteri
Aktivitas  antibakteri  daun  sirih  merah ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening. Ekstrak  kasar  etanol  70%  dilarutkan  dalam DMSO  dan  diambil  20  μL  dengan  sampel yang  memiliki  konsentrasi  1000,  2000,  4000, 6000, 8000, 10000 ppm, dengan kontrol positif dan  negatif  yaitu  kanamisin  20  ppm  dan DMSO  20%.  Aktivitas  ekstrak  etanol  70% dapat ditemukan pada konsentrasi 1000, 2000, 4000,  6000,  8000,  dan  10000  ppm.  Aktivitas tertinggi  dari  ekstrak  etanol  70%  terbentuk pada konsentrasi 1000 ppm dan terendah pada konsentrasi 2000, 4000, dan 10000 ppm. Hasil
fraksinasi menghasilkan aktivitas tertinggi dan terendah  yaitu  fraksi  n-heksana  tertinggi  di 1000  ppm  dan  terendah  di  8000  dan  10000 ppm, Fraksi etil asetat dikonsentrasi 6000 ppm dan  pada  4000  ppm,  fraksi  air  tertinggi  pada 1000  ppm  dan  terendah  pada  8000  ppm. Diameter zona hambat dari aktivitas antibakteri  terbaik  ditunjukkan  oleh  fraksi  n- heksana dengan besar 2.40 mm ± 0.14.

## Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)
Penentuan konsentrasi hambat minimum  (KHM)  dilakukan  menggunakan metode difusi pada media agar Luria Bertani. Media  diteteskan  suspensi  bakteri E.coli
pBR322 yang sesuai dengan standar Mc.Farland  pada  absorbansi  660  nm. Pengujian  konsentrasi  hambat  minimum dilakukan  pada  4  sampel  yang  telah dipekatkan  dengan rotary  evaporator yakni ekstrak  etanol  70%,  fraksi  n-heksana,  fraksi etil  asetat,  dan  fraksi  air  dengan  masing konsentrasi  nya  yaitu  100,  200,  400,  600, 800,  1000  ppm.  Kontrol  positif  yang digunakan adalah kanamisin 20 ppm sedangkan  sebagai  kontrol  negatif  adalah DMSO  20%.  Pengujian  dilakukan  dengan dua  kali  ulangan.    Pengamatan  dilakukan pada  jam  ke-  24  dengan  hasil  yang  berbeda- beda.
Tabel 1 Kadar air, rendemen ekstrak dan fraksi daun sirih merah Pengujian Hasil rerata (%) Kadar air simplisia 8.13 Rendemen simplisia (ekstrak etanol 70%) 19.49 Rendemen Fraksi n -heksana 16.03 etil asetat 22.50 Air 47.99 Tabel 2 Aktivitas antibakteri ekstrak dan fraksi etanol 70% daun sirih merah
Keterangan:  Data  aktivitas  diinterpretasikan  oleh  rata-rata  ±  standar  deviasi  dari  2  kali pengulangan  dengan  huruf  yang  sama  pada  data  menunjukkan  hasil  tidak berbeda nyata dengan taraf kenyataan 5% (+) : kontrol kanamisin
(-): kontrol DMSO 20% Konsentrasi Diameter Zona Hambat (mm) setelah inkubasi 24 jam (ppm) Ekstrak etanol n -heksana Etil asetat Air 1000 1.05 ± 1.06 b 2.40± 0.14 a 1.25 ± 0.77 a 1.77 ± 1.17 a 2000 0.00 ± 0.00 a 1.00± 1.41 a 1.50 ± 1.27 a 1.50 ± 1.27 a 4000 0.00 ± 0.00 a 0.95 ± 0.07 a 1.10 ± 0.98 a 1.25 ± 0.71 a 6000 0.20± 0.28 a 0.40± 0.28 a 2.90 ± 0.71 a 0.25 ± 0.21 a 8000 0.05± 0.07 a 0.00 ± 0.00 a 1.35 ± 0.35 a 0.20 ± 0.14 a 10000 0.00 ±0.00 a 0.00± 0.00 a 1.90 ± 0.00 a 1.45 ± 1.06 a + 10.10 ± 0.63 d 12.0 ± 0.14 c 10.65 ± 1.20 c 9.92 ± 0.95 c - 5.10± 0.00 c 5.10 ± 0.00 b 5.10 ± 0.00 b 5.10 ± 0.00 b
A.1 C.1 A.2 C.2 B.1 D.1 B.2 D.2
Gambar 1 Hasil pengamatan akivitas antibakteri ekstrak dan fraksi etanol 70% daun sirih merah
Keterangan: A1 dan A2 merupakan ekstrak etanol 70%, A1(Simplo 1000-10000) dan A2 (Duplo 1000-10000), B1 dan B2 merupakan fraksi n-heksana, B1(Simplo 1000-10000) dan B2 (Duplo 1000-10000), C1 dan C2 merupakan fraksi etil asetat, C1(Simplo 1000-10000) dan C2 (Duplo 1000-10000), D1 dan D2 merupakan fraksi air, D1(Simplo 1000-10000) dan D2 (Duplo 1000-10000).  (+) merupakan kontrol kanamisin, (-): kontrol DMSO 20%, 1: 1000ppm, 2: 2000ppm, 3: 4000ppm, 4: 6000ppm, 5: 8000ppm, 6:10000ppm
Tabel  3  menyajikan  data  konsentrasi hambat  minimum.    Hasil  pengujian  dapat dilihat  pada  Gambar  2.  Ekstrak  etanol  70% menunjukkan  zona  hambat  minimum  pada konsentrasi  1000  ppm.  Fraksinasi  bertingkat diawali  dengan  pelarut  non  polar  yakni  n- heksana  yang  menunjukkan  zona  hambat minimumnya  pada  konsentrasi  100  ppm. Fraksinasi kedua menggunakan pelarut semipolar yaitu etil asetat yang menunjukkan zona  hambat  minimum pada  konsentrasi  100 ppm. Fraksinasi terakhir menggunakan pelarut  polar  yakni  air  yang  menunjukkan zona  hambat  minimumnya  pada  konsentrasi 1000  ppm.  Fraksi  n-heksana  menjadi  fraksi yang  memiliki  zona  hambat  minimum terbesar pada konsentrasi minimum 100 ppm.
Penentuan konsentrasi hambat
minimum (KHM) dilakukan setelah mengetahui  aktivitas  antibakteri  daun  sirih merah terbaik pada konsentrasi tertentu. Nilai KHM  tiap  jenis  pelarut  dan  sampel  berbeda- beda bergantung pada kandungan aktif dalam suatu  sampel  yang  dilarutkan  pada  pelarut tertentu.  DMSO  dijadikan  sebagai  pelarut yang  melarutkan  semua  rendemen  kemudian tiap  rendemen  dengan  konsentrasi  tertinggi dijadikan  sebagai  stok  untuk  diencerkan menjadi  beberapa  konsentrasi  yang  lebih rendah.  Diameter  zona  hambat  kontrol negatif  DMSO  20%  sebesar  5.10  mm merupakan  ukuran  dari paper  disk yang digunakan  untuk  mengurangi  diameter  zona hambat  yang  didapatkan  dari  masing-masing sampel  sehingga  DMSO  tidak  berpengaruh terhadap penghambatan bakteri.
Tabel 3 Konsentrasi hambat minimum Konsentrasi Diameter Zona Hambat (mm) 24 jam (ppm) Ekstrak etanol n -heksana Etil asetat Air 100 0.00± 0.00 a 0.60 ± 0.56 a 0.40 ± 0.56 a 0.00 ± 0.00 a 200 0.00 ± 0.00 a 1.05 ± 0.07 a 0.70 ± 0.14 a 0.00 ± 0.00 a 400 0.00 ± 0.00 a 2.20 ± 0.42 a 0.70 ± 0.14 a 0.00 ± 0.00 a 600 0.00 ± 0.00 a 1.00 ± 0.424 a 0.75 ± 0.07 a 0.00 ± 0.00 a 800 0.00± 0.00 a
0.60 ± 0.56 a 0.25 ± 0.35 a 0.00 ± 0.00 a 1000 1.05± 1.10 a 2.40 ± 0.14 b 1.25 ± 0.77 a 1.77 ± 1.17 b + 10.10 ± 0.63 c 1.20 ± 0.14 d 10.65 ± 1.20 c 9.92 ± 0.95 d - 5.10± 0.00 b 5.10 ± 0.00 c 5.10 ± 0.00 b 5.10 ± 0.00 a
Keterangan:  Data KHM diinterpretasikan oleh rata-rata ± standar deviasi dari 2 kali pengulangan dengan huruf yang sama  pada  data  menunjukkan  hasil  tidak  berbeda  nyata  dengan  taraf  kenyataan  5%.    (+)  merupakan Kanamisin, (-) merupakan DMSO 20%
A.1 C.1 A.2
C.2
B.1 D.1 B.2 D.2

## Gambar 2 Hasil pengamatan konsentrasi hambat minimum
Keterangan: A1 dan A2 merupakan ekstrak etanol 70%, A1(Simplo 1000-10000) dan A2 (Duplo 1000-10000), B1 dan B2 merupakan fraksi n-heksana, B1(Simplo 1000-10000) dan B2 (Duplo 1000-10000), C1 dan C2 merupakan fraksi etil asetat, C1(Simplo 1000-10000) dan C2 (Duplo 1000-10000), D1 dan D2 merupakan fraksi air, D1(Simplo 1000-10000) dan D2 (Duplo 1000-10000).  (+) merupakan kontrol kanamisin, (-): kontrol DMSO 20%, 1: 1000ppm, 2: 2000ppm, 3: 4000ppm, 4: 6000ppm, 5: 8000ppm, 6:10000ppm

## 4. PEMBAHASAN
Kadar  Air,  Rendemen  Ekstrak  dan  Fraksi Daun Sirih Merah
Suatu  sampel  dapat  diketahui  jumlah kandungan  airnya  melalui  metode  penentuan kadar air  yang berpengaruh langsung terhadap masa  simpan  bahan.  Tinggi  rendahnya  kadar air  berpengaruh  terhadap  aktivitas  mikroba yang berbanding lurus dengan cepat lambatnya proses  pembusukan  dan  ketengikan.  Metode lainnya  untuk  pengujian  kadar  air  yaitu pengeringan dengan gelombang mikro ( microwave ), destilasi, titrasi Karl Fischer, dan gravimetri  atau  pengeringan  dengan  oven. Penelitian ini menggunakan metode gravimetri untuk  analisis  kadar  air  dengan  menggunakan alat  berupa  oven  untuk  proses  pengeringan sampel pada suhu 105  selama 3 jam dengan 3  kali  pengulangan  sampai  bobot  konstan. Metode  pengeringan  dapat  menghentikan reaksi  enzimatik  sehingga  simplisia  tidak mudah  rusak.  Selama  bahan  simplisia  masih mengandung  sejumlah  air,  enzim  tertentu dapat  menguraikan  senyawa  aktif  yang terdapat dalam sel suatu bahan bahkan setelah sel mati sekalipun (Atma 2018).
Nilai  kadar  air  simplisia  daun  sirih merah  yang  didapat  pada  penelitian  ini  yakni sebesar  8.13%  (Tabel  1).  Nilai  tersebut  lebih besar jika dibandingkan dengan hasil penelitian  Kusuma  dan  Andriani  (2019) sebesar 6.79% dan lebih kecil jika dibandingkan  dengan  hasil  penelitian  Safithri et  (2012)  sebesar  9.27%.  Nilai  kadar  air simplisia  pada  penelitian  ini  tergolong  baik karena  memiliki  nilai  dibawah  10%  yang menjadi  standar  kadar  air  maksimum  untuk simplisia  dari  tumbuhan  obat  (Depkes  2008). Tinggi rendahnya kadar air bahan dipengaruhi oleh  suhu  dan  durasi  pengeringan.  Maka  dari itu, pengeringan dengan  suhu  dan  durasi  yang sesuai  dilakukan  dengan  tujuan  agar  dalam penyimpanan  jangka  waktu  panjang  sampel tetap  dalam  kondisi  baik.  Kenaikan  suhu
berbanding lurus dengan kelarutan sampel dan koefisien  difusi  untuk  menghasilkan  laju ekstraksi yang tinggi (Perina et al. 2007).
Zat-zat  aktif  dalam  daun  sirih  merah dapat dipisahkan menggunakan metode ekstraksi  yang  memiliki  prinsip  menggunakan pelarut  yang  sesuai  untuk  pemisahan  suatu komponen  dari  suatu  bahan.  Ekstraksi  dapat dilakukan  dengan  beberapa  metode  yakni maserasi,  perkolasi,  dan  sokletasi.  Metode maserasi  yang  digunakan  pada  penelitian  ini berupa ekstraksi padat-cair dan umum dilakukan karena sederhana dan dapat digunakan  untuk  analit  baik  yang  tidak  tahan maupun  tahan  terhadap  proses  pemanasan. Kelemahan  dari  metode  ini  yakni  terlalu banyak  menggunakan  pelarut  (Leba  2017). Proses  maserasi  dilakukan  dengan  merendam sampel  selama  1-5  hari  dengan  pelarut  sesuai untuk melarutkan komponen sampel pada suhu ruang yang sesekali diaduk untuk mempercepat proses pelarutan.
Pemilihan  pelarut  menjadi  salah  satu faktor  terpenting  dalam  ekstraksi  yang  dapat dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor  seperti  daya melarutkan  senyawa,  titik  didih,  sifat  racun, mudah  tidaknya  terbakar,  waktu,  ukuran sampel,  perbandingan  sampel  dan  pelarut, serta  keadaan  penyimpanan  sampel  (Sayuti 2017).  Pelarut  etanol  70%  digunakan  pada penelitian  ini.  Etanol  70%  merupakan  pelarut yang bersifat semipolar karena etanol memiliki sisi  dengan  komposisi  gugus  polar  berupa gugus  -OH  dan  gugus  nonpolar  berupa CH 2 CH 3 sehingga  proses  ekstraksi  dapat dilakukan  secara  optimal.  Pelarut  etanol  70% memiliki  kelebihan  yakni  tidak  merusak komponen  daun  yang  dilihat  dengan  tidak adanya  perubahan  warna,  ekonomis  yang dapat  digunakan  pada  ekstraksi  dari  sampel makanan,  nilai  titik  didih  yang  cukup  rendah dan  cenderung  lebih  aman  untuk  digunakan (Azis et al . 2014).
Rendemen  ekstrak  merupakan  salah satu  parameter  mutu  suatu  ekstrak  yang
dibandingkan  antara  ekstrak  yang  diperoleh dengan  simplisia  awal.  Jumlah  ekstrak  yang didapat berbanding lurus dengan nilai rendemennya  (Wijaya et  al .  2018).  Ekstraksi dalam penelitian ini menggunakan sampel dan pelarut  etanol  70%  dengan  perbandingan  1:4. Ekstraksi  dilakukan  sebanyak  tiga  kali pembilasan.  Bobot  total  simplisia  sebesar  250 yang  menghasilkan  rendemen  kasar  sebesar 19.49%  (Tabel  1)  dalam  bentuk  pasta  hasil pemekatan filtrat menggunakan rotary evaporator .  Hasil  rendemen  tersebut  lebih besar  dibandingkan  dengan  rendemen  ekstrak etanol 70% Weni (2014), Septiani (2017), dan Wedasari  (2018)  dengan  nilai  rendemen berurutan  17.84%  dan  10.10%,  dan  9.21%. Perbedaan  hasil  rendemen  diakibatkan  oleh rasio  antar  sampel  dengan  pelarut,  waktu, suhu,  dan  ukuran  partikel.  Menurut  Nurasiah (2010),  maserasi  tidak  memiliki  bantuan  gaya apapun  yang  hanya  menggunakan  teknik perendaman yang membantu terjadinya proses osmosis pelarut secara statis ke dalam padatan walaupun  telah  dilakukan  pergantian  pelarut. Menurut  Azwanida  (2015),  luas  permukaan antar  sampel  dan  pelarut  yang  semakin  luas berkorelasi  dengan  semakin  kecilnya  ukuran partikel sehingga berpengaruh langsung kepada hasil rendemen. Fraksinasi
merupakan proses
pemisahan senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya  dalam  bentuk  cair-cair  yang sehingga  antara  larutan  asal  dan  pelarut pengekstraknya  dapat  terpisah  (Nurika  dan
Suhartini 2019). Proses fraksinasi menggunakan  3  pelarut  yang  diurutkan berdasarkan  tingkat  kepolarannya  yakni n- heksana bersifat  non  polar,  etil  asetat  bersifat semi  polar,  dan  air  bersifat  polar.  Ekstrak etanol 70% hasil pemekatan diambil 1 g untuk dilakukan  fraksinasi.  Rendemen  fraksi  yang dihasilkan  dari  terbesar  hingga  terkecil  adalah air  sebesar  3.85%,  etil  asetat  2.87%,  dan  n- heksana 1.72%. Nilai rendemen fraksi menunjukkan  seberapa  banyak  metabolit
sekunder  dari  daun  sirih  merah  yang  terlarut dalam  pelarut  sesuai  dengan  kepolarannya (Septiani  2017).  Penelitian  Septiani  (2017) memiliki  hasil  fraksinasi  ekstrak  etanol  70% lebih  kecil  dibandingkan  penelitian  ini  yakni sebesar  n-  heksana  0.42%,  etil  asetat  1.75%, dan  air  7.32%.  Nilai  rendemen  air  lebih  besar dikarenakan  senyawa  metabolit  yang  bersifat polar  pada  daun  sirih  merah  tertarik  pada pelarut yang bersifat polar maupun semipolar.

## Aktivitas Antibakteri
Metode  difusi  cakram  dipilih  pada penelitian  ini  untuk  menentukan  aktivitas antibakteri  dengan  tujuan  untuk  menentukan aktivitas  sampel  dalam  menghambat  bakteri E.coli pBR322.  Aktivitas  antibakteri  dapat ditentukan  dengan  munculnya  zona  hambat yang  semakin  besar  zonanya  maka  semakin baik  aktivitasnya  (Novita  2016).  Aktivitas antibakteri  pada  penelitian  ini  menggunakan sampel  ekstrak  etanol  70%  dan  fraksinya. Penelitian ini mengujikan ekstrak dan fraksinya  pada  beberapa  konsentrasi.  Masing- masing ekstrak dan fraksi diujikan aktivitasnya terhadap  bakteri E.coli pBR322  (resisten ampisilin dan tetrasiklin). Media untuk bakteri E.coli pBR322  diberikan  antibiotik  ampisilin dan  tetrasiklin  untuk  membuktikan  bakteri yang digunakan benar resisten terhadap kedua antibiotik  dan  membantu  dalam  pertumbuhan bakteri agar tidak mudah terkontaminasi.
Aktivitas  antibakteri  (Tabel  2),  hasil pengamatan  ditunjukkan  pada  Gambar  1. Aktivitas  tertinggi  hingga  terendah  secara berurutan  yakni  untuk  fraksi  etil  asetat  pada konsentrasi  6000  ppm  yaitu  2.90  mm  ±  0.71, fraksi  n-heksana  pada  konsentrasi  1000  ppm yaitu  2.40  mm  ±  0.14,  fraksi  air  pada konsentrasi  1000  ppm  yaitu  1.77  mm  ±  1.17, dan  ekstrak  pada  konsentrasi  1000  ppm  yaitu 1.05  mm  ±  1.10.  Aktivitas  fraksi  etil  asetat memiliki aktivitas lebih besar dari pada fraksi n-heksana,  namun  fraksi  etil  asetat  baru menunjukkan  aktivitas  antibakterinya  pada
konsentrasi  6000  ppm  sedangan  n-heksana pada  konsentrasi  1000  ppm.  Penelitian  Mere (2018)  menyatakan  bahwa    daun  jamblang ( Syzygium  cumini (L.)  Skeels)  yang  berasal dari Pulau Timor memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri E.coli pBR322 tertinggi yakni fraksi etil asetat dengan diameter zona hambat 13.61±0.02  mm  pada  konsentrasi  1000  ppm. Fraksi n -heksana  memberikan  hasil  besar dalam konsentrasi minimum dikarenakan daun sirih  merah  mengandung  total  tanin  sebanyak 98.9  mg/g  yang  berfungsi  sebagai  antibakteri dan  bersifat  non  polar  yang  selaras  dengan sifat  dari  pelarut n -heksana  sehingga  dapat melarutkan  beberapa  senyawa  yang  berperan sebagai  antibakteri  di  dalam  daun  sirih  merah (Ramadani 2018).
Diameter  zona  hambat  mengalami peningkatan  dan  penurunan  yang  kurang teratur  tidak  sesuai  dengan  semakin  besarnya konsentrasi maka zona hambat yang dihasilkannya  pun  semakin  besar.  Hasil tersebut  dimungkikan karena adanya beberapa kandungan  penting  yang  terdapat  dalam  daun sirih  merah,  lingkungan,  dan  suhu  dapat mempengaruhi aktivitasya. Menurut Yanti dan Mitika  (2017),  korelasi  antara  diameter  zona hambat  dengan  kenaikan  konsentrasi  tidak selalu  berbanding  lurus  dikarenakan  pada media agar kecepatan difusi senyawa antibakteri berbeda. Selain itu, konsentrasi dan jenis  dari  senyawa  juga  berpengaruh  besar terhadap  pembentukan  diameter  zona  hambat yang  berbeda  dan  berpengaruh  terhadap aktivitasnya.
Ampisilin merupakan antibiotik golongan  penisilin  yang  dapat  menghambat pembentukkan  dinding  dan  permeabilitas membran  sel.  Karakter  golongan  penilisilin yakni  efektif  dalam  melawan  bakteri  Gram positif namun tidak efektif untuk bakteri Gram negatif  yang  disebabkan  oleh  struktur  bakteri. Inner dan outer membran  yang  melapisi peptidoglikan  yang  tipis  membuat  bakteri Gram  negatif  sulit  untuk  ditembus  oleh
antibiotik. Resistensi bakteri terhadap ampisilin disebabkan karena bakteri
membentuk enzim β–lactamase yang mengakibatkan cincin β–laktam pada ampisilin dan  sefalosporin  terbuka  sehingga  dapat merusak aktivitas  ampisilin (May et al . 2009). Tetrasiklin merupakan bakteri spektrum  luas  yang  dapat  membunuh  baik bakteri  positif  maupun  negatif.  Tetrasiklin bekerja  dengan  cara  menghambat  tidak langsung pada tahap translokasi atau penyusunan peptida, namun menghambat pada tahap  terminasi  rantai  peptida  pada  kodon terminasi.  Resistensi  terjadi  dikarenakan meningkatnya  efflux  pump  oleh  transpor  aktif pompa  protein  pada  bakteri  Gram  negatif. Bakteri  menjadi  resisten  terhadap  tetrasiklin dikarenakan efflux pump  dari  bakteri  terus mengeluarkan antibiotik yang berdifusi kedalam bakteri yang terlalu rendah dibandingkan  dengan  pengeluarannya  (Pages dan Amaral 2009).

## Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)
Daun sirih merah mengandung beberapa zat yang berfungsi sebagai antibakteri adalah alkaloid, polivenolad, tanin, dan  minyak  atsiri  (Mardiana  2012).  Senyawa fitokimia  seperti  alkaloid,  polivenolad,  dan tanin  memiliki  sifat  sebagai  antibakteri  yang dapat  mengganggu  integritas  membran  sel bakteri  dengan  cara  membentuk  senyawa kompleks  terhadap  protein  ekstraseluler. Alkaloid  menyebabkan  kerusakan  membran sel.  Polivenolad  pada  membran  sel  bekerja untuk  membuat  membran  sel  lisis  dengan melakukan  proses  denaturasi  pada  ikatan protein membran sehingga dapat menembus ke dalam inti sel (Candrasari et al . 2012).
Ekstrak  etanol  70%  dan  fraksi  daun sirih merah diuji konsentrasi hambat minimum (KHM)  dengan  metode  difusi  yang  memiliki keunggulan  dalam  menentukan  kesensitifan suatu  sampel  dan  estimasi  konsentrasi  hambat minimum  yang  mampu  menghambat  bakteri
secara visual, memiliki fleksibilitas tinggi, dan mudah diterapkan (Agnes 2015). Uji konsentrasi  hambat  minimum  (KHM)  pada penelitian  ini  dilakukan  menggunakan  4 sampel  berupa  ekstrak  etanol  70%,  fraksi  n- heksana,  fraksi  etil  asetat,  dan  fraksi  air dengan konsentrasi yang diujikan sebesar 100, 200,  400,  600,  800,  1000  ppm.  Adanya  zona bening  yang  terbentuk  menunjukkan  daya hambat  sampel  terhadap  bakteri  berdasarkan konsentrasi minimum.
Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) diujikan  sebanyak  dua  kali  ulangan  yang diamati  setelah  24  jam  untuk  tiap  sampel. Hasil  diameter  zona  hambat  minimum  (Tabel 2)  dari  ekstrak  etanol  70%,  fraksi  n-heksana, fraksi  etil  asetat,  dan  fraksi  air  memiliki diameter  kurang  dari  5  mm.  Menurut  Susanto et  al .  2012),  suatu  sampel  dikatakan  memiliki respon  hambat  pertumbuhan  yang  lemah  jika diameter  zona  hambatnya  kurang  dari  5  mm, respon sedang dengan diameter 6-10 mm, dan respon  kuat  dengan  diameter  11-20  mm,  dan respon  sangat  kuat  dengan  diameter  diatas  21 mm.  Fraksi  n-heksana  dan  etil  asetat menghasilkan  diameter  yang  tidak  jauh berbeda dengan konsentrasi minimumnya pada konsentrasi 100 ppm namun diameter keseluruhan n-heksana lebih besar dibandingkan dengan etil asetat. Konsentrasi  hambat  minimum  terbaik
diperoleh oleh pelarut n-heksana yang merupakan  pelarut  non  polar.  Penelitian Ramadani  (2018)  menyatakan  bahwa  daun sirih  merah  memiliki  total  tanin  yang mengandung  senyawa  aktif  yaitu  metil eugenol,  L-(+)-arginin  hidroklorida  dan  asam protokatekuat. Eugenol dapat berfungsi sebagai  antimikroba,  antiseptik,  dan  bahan baku obat lainnya (Nurdjannah 2004). Arginin merupakan  salah  satu  asam  amino  yang memiliki  pengaruh  besar  terhadap  aktivitas peptide  untuk  antibakteri  (Carrillo  dan  Ramos 2018).  Asam  protokatekuat  berfungsi  untuk
aktivitas  antioksidan,  antimikroba,  dan  anti inflamasi (Lin et al . 2007).
Tanin  bersifat  mudah  larut  air,  namun beberapa  jenis  tanin  memiliki  bobot  molekul sekitar sekitar 900-5000 g/mol bersifat kurang larut air atau semakin besar bobot molekulnya maka  semakin  sulit  untuk  terlarut  dalam  air. Tanin  memiliki  sifat  sebagai  antibakteri  yang dapat  merusak  bagian  penting  dari  sel  bakteri yakni membran selnya dengan cara mengganggu  protein  ekstraseluler  dengan pembentukan senyawa kompleks. Protein akan mengendap untuk menghasilkan senyawa tidak larut  dan  menjadikannya  ciut    (Mardiana 2012).
Bakteri E.col i  pBR322  merupakan bagian  dari  golongan  bakteri  Gram  negatif dengan  struktur  dinding  sel  yang  memiliki porin dan lipopolisakarida. Sifat  dari porin itu sendiri  yakni  hidrofilik  menyebabkan molekul molekul  ekstrak  dan  fraksi  etanol  70%  sulit masuk  kedalam  sel  bakteri  Gram  negatif. Kompleksitas  struktur  dan  komponen  yang menyusun  bakteri  Gram  negatif  menjadikan bakteri  ini lebih resisten dibandingkan dengan bakteri  Gram  positif.  Selain  itu,  ekstrak  dan fraksi  etanol  yang  masuk  kedalam  bakteri resisten oleh efflux pump dikeluarkan kembali sehingga bakteri resisten (Darwish dan Aburjai 2010).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  saya  sampaikan kepada  keluarga  dan  Departemen  Biokimia atas kesempatannya bagi saya untuk mempublikasikan hasil penelitian saya dengan harapan  tulisan  ini  bermanfaat  bagi  orang banyak.

## DAFTAR PUSTAKA
[AOAC]  Association  of  Official  Analytical Chemist.  2007. Official  Methods  of Analysis Ed.18.  Washington  DC  (US):
Association of Official Analytical Chemists.
[Depkes] Departemen Kesehatan. 2008. Farmakope  Herbal  Indonesia. Jakarta
(ID): DepKes RI.
Agnes  SH.2015. Mikrobiologi  Kesehatan: Peran  Mikrobiologi  dalam  Bidang Kesehatan .  Yogyakarta(ID):  Penerbit Andi.
Alfarabi  M,  Bintang  M,  Suryani,  Safithri  M. 2010.  The  comparative  ability  of antioxidant activity of piper crocatum in inhibiting  fatty  acid  oxidation  and  free radical  scavenging. Hayati  Journal  of Biosciences . 17(4): 201-204.
Atma  Y.  2018. Prinsip  Analisis  Komponen Pangan: Makro & Mikro
Nutrien .Yogyakarta(ID): Deepublish.
Azis  T,  Febrizky  S,  Mario  AD.  2014. Pengaruh  jenis  pelarut  terhadap  persen yield  alkaloid  dari  daun  salam  india ( Murraya  koenigii ). Tek.  Kim. 2(20):  1-
6.
Azwanida  NN.  2015.  A  review  on  the extraction  methods  use  in  medicinal plants, principle, strength, and limitation [ulasan]. Med  Aromatic  Plants .  4:196. doi:10.4172/2167-0412.100196.
Candrasari  A,  Romas  MA,  Hasbi  M,  Astuti OR.  2012.  Uji  daya  antimikroba  ekstrak etanol daun sirih merah ( Piper Crocatum Ruiz  &  Pav.)    terhadap  pertumbuhan Staphylococcus  aureus ATCC  6538, Escherichia  coli ATCC  11229  dan Candida albicans ATCC 10231 secara in vitro. Biomedika . 4(1):9-16.
Carrillo  W,  Lucio  A,  Gaibor  J,  Morales  D,
Vasquez G. 2018. Isolation of antibacterial  hydrolysates  from  hen  egg white  lysozyme  and  identification  of antibacterial  peptides. Journal  Medical
Food . 21:808-818.
Davies  D,  Davies  J.    2010.    Origins  and Evolution  of  Antibiotic  Resistance. Microbiology  and  Molecular  Biology Reviews . 74(3): 417–433.
Darwish  RM,  Aburjai  TA.  2010.  Effect  of ethnomedicinal  plants  used  in  folklore medicine in Jordan as antibiotic resistant
inhibitors  on Escherichia  coli . BMC
Complementary and Alternative Medicine . 10(9): 1-8.
Dima  LRH,  Fatimawali,  Lolo  WA.  2016.  Uji aktivitas  antibakteri  ekstrak  daun  kelor (moringa  oleifera  L.)  terhadap  bakteri Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus . JIF . 5(2):282-289.
Firdausi  I,  Retnowati  R,  Sutrisno.  2015. Fraksinasi ekstrak metanol daun mangga kasturi  ( Mangifera  casturi Kosterm) dengan  pelarut  n-butanol. J  Kim  Stud . 1(1): 785-790.
Irawan  C,  Foliatinia,  Hanafi.  2017.  GC-MS composition  of  leaf  extract  of Piper  cf. arcuatum blume  and  their  antioxidant activity  and  toxicity  studies. Journal  of Pharmacognosy  and  Phytochemistry . 6(4):461-468.
Ji  HF,  Li  XJ,  Zhang  HY. 2009. Natural products and drug discovery.
Viewpoint. 10(3):194-200.
Juliantina F, Citra DA, Nirwani B, Nurmasitoh T, Bowo ET. 2009. Manfaat sirih merah ( Piper  crocatum )  sebagai  agen  anti bakterial  terhadap  bakteri  Gram  positif dan Gram negatif. JKKI . 1(1): 1-10.
Kurniawati  D,  Rukmi  I,  Lunggani  AT.  2014. Aktivitas antimikroba kombinasi rebusan daun  sirih  hijau  ( Piper  betle )  dan  daun sirih  merah  ( Piper  crocatum )  terhadap Candida albicans . Journal Biology 3(1): 55-61.
Kusuma EW, Andriani  D. 2019. Karakterisasi ekstrak daun sirih merah ( Piper crocatum, Ruiz&Pav)  sebagai  obat antidiabetes menuju obat herbal terstandar. Jurnal  Kesehatan  Husada . 1(1): 71-76.
Leba  MAU.  2017. Ekstraksi  dan  Real Kromatografi . Yogyagkarta(ID): Deepublish Lin  HH,  Chen  JH,  Huang  CC,  Wang  CJ. 2007. Apoptotic effect of 3,4- dihydroxybenzoic acid on human gastric carcinoma  cells  involving  JNK/p38 MAPK signaling activation.
International  Journal  of  Cancer .  120 (11): 2306–2316.
Lutviandhitarani G, Harjanti DW, Wahyono F.
2015.  Green  antibiotic  daun  sirih  ( Piper betle l.)  sebagai  pengganti  antibiotik komersial  untuk  penanganan  mastitis. Agripet. 15(1): 28-32.
Mardiana  L.  2012. Daun  Ajaib  Tumpas Penyakit. Jakarta(ID): Penebar Swadaya.
May  T,  Ito  A,  Okabe  S.  2009.  Induction  of multidrug  resistance  mechanism  in Escherichia  coli biofilms  by  interplay between  tetracycline  and  ampicillin resistance  Genes. Antimicrobial  Agents and Chemotherapy . 53(11): 4628-4639.
Mere  JK.2018.  aktivitas  antibakteri  dari  daun jamblang  ( Syzygium  cumini (L.)  Skeels) asal  pulau  timor  terhadap Escherichia coli pBR322  [skripsi].  Bogor  (ID): Institut Pertanian Bogor.
Ngajow  M,  Abidjulua  M  ,  Kamua  VS.  2013. Pengaruh antibakteri ekstrak kulit batang matoa ( Pometia pinnata ) terhadap bakteri  staphylococcus  aureus  secara  in vitro. Jurnal Mipa Unstrat Online . 2 (2) 128-132.
Novita.  2016.  Uji  aktivitas  antibakteri  fraksi daun  sirih  ( Piper  betle) terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans secara in  vitro.  JMJ. 4(2):140- 155.
Nurasiah  ES.  2010.  Pengoptimuman  ekstraksi andrografolida  dari  sambiloto  dengan rancangan  fraksional  faktorial  [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Nurika  I,  Suhartini  S.  2019. Bioenergi  dan Biorefinery . Malang(ID): UB Press.
Pages  JM,  Amaral  L.  2009.  Mechanisms  of drug  efflux  and  strategies  to  combat them:  challenging  the  efflux  pump  of Gram-negative  bacteria. Biochimica et Biophysica Acta . 1(1): 826-833.
Perina  I,  Satiruaomo,  Soetredjo  FE,  Hindarso H.  2007.  Ekstraksi  pektin  dari  berbagai macam  kulit  jeruk. Widya  Teknik .  6  (1):
1-10.
Puspita  PJ,  Safithri  M,  Sugiharti  NP.  2018. Antibacterial  activities  of  sirih  merah ( Piper  crocatum )  leaf  extracts. Current Biochemistry. 5(3):1-10.
Ramadani F. 2018. Aktivitas antioksidan, total tanin ekstrak dan fraksi daun sirih merah ( Piper crocatum ) dan identifikasi dengan LC-MS  [skripsi].  Bogor(ID):  Institut Pertanian Bogor
Safithri  M,  Fahma  F,  Marlina  PWN.  2012. Analisis  proksimat  dan  toksisitas  akut ekstrak daun sirih merah yang berpotensi sebagai  antidiabetes. Jurnal  Gizi dan Pangan. 7(1): 43-48.
Sari  YD,  Djannah  SN,  Nurani  LH.  2010.  Uji aktivitas  antibakteri  infusa  daun  sirsak ( Annona  muricata  L. )  secara  in  vitro terhadap Staphylococcus  aureus ATCC 25923  dan Escherichia  coli ATCC 35218  serta  profil  kromatografi  lapis tipisnya.
Sayuti  M.  2017.  Pengaruh  perbedaan  metode ekstraksi,  bagian  dan  jenis  pelarut terhadap rendemen dan aktifitas antioksidan  bambu  laut  ( Isis  hippuris ).
Technology  Science  and  Engineering Journal. 1(3): 166-174.
Septiani R. 2017. Ekstrak dan fraksi daun sirih merah  (Piper  crocatum  Ruiz  &  Pav) sebagai  antioksidan  dengan  metode  2,2- difenil-1-pikrilhidrazil  [skripsi].  Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Susanto  D,  Sudrajat,  Ruga.  2012.  Studi kandungan bahan akatif tumbuhan meranti  merah  ( Shorea  leprosula Miq) sebagai  sumber  senyawa  antibakteri. Mulawarmnan  Scientifies .  Vol.  11  (2): 181-190.
Tambunan T.2018. Antibiotic resistance control  (ARCP)  in  Indonesia. Prosiding Simposium  LXXIV  A  to  Z  About Infections Pediatric Antibiotic
Stewardship: How to Prevent of Antibiotic  Resistance? .  Jakarta,  29-30 April 2018
Wedasari  IAI.  2018.  Aktivitas  antioksidan ekstrak  etanol  dan  fraksi  daun  sirih merah  ( Piper  crocatum )  dengan  metode
rancimat dan identifikasi dengan LC-MS [skripsi].  Bogor  (ID):  Institut  Pertanian Bogor.
Weni  M.  2014.  Aktivitas  penghambatan ekstrak  sirih  merah  (Piper  crocatum) terhadap  pembentukan  malondialdehida (MDA)  dan  enzim  tirosinase  [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Wijaya  H,  Novitasari,  Jubaidah  S.  2018. Perbandingan  metode  ekstraksi  terhadap rendemen  ekstrak  daun  rambai  laut ( Sonneratia  caseolaris L.  Engl). Jurnal
Ilmiah Manuntung . 4(1): 79-83.
Yanti  YN,  Mitika  S.  2017.  Uji  efektivitas antibakteri ekstrak etanol daun sambiloto ( Andrographis paniculata
Nees)
terhadap  bakteri Staphylococus  aureus . Jurnal Ilmiah Ibnu Sina .2(1): 158-168.