## ISOLASI MIKROBA TANAH YANG BERPOTENSI MENGHASILKAN ANTIMIKROBA
Submitted : 23 Oktober 2019
Edited : 15 Juni 2020
Accepted : 25 Juni 2020
Ririn Puspadewi*, Rina Anugrah, Afif Abdulbasith, Intan Yunita
Fakultas Farmasi Universitas Jenderal Achmad Yani Cimahi Email : ririn.puspadewi@lecture.unjani.ac.id

## ABSTRACT
The soil is one of the habitats for microorganisms, in one gram soil there are millions of microorganism.  Population  microorganism  per  gram  the  rich  soil  of  covering  bacteria, actinomycetes,  fungi,  algae  and  protozoa.  Garden  having  the  potential  to  do  exploration  of isolation microorganisms. This is because land contains many organic compounds and minerals that  is  one  ecosystem  fertile  to  life  and  growth  microorganisms.  Whenever  a  microorganisms have  proven  produce  substance  antimicrobe  so  organisms  of  its  potential  as  producer antibiotics. Material research the land, taken from the soil Faculty of Pharmacy Plant Garden of  UNJANI,  we  did  dilution and  cultivated  in  a  media  potato  dextrose  broth.  The  isolate  from medium  broth  was  cultivating  in  a  media  potato  dextrose  agar,  to  obtained  isolates  single. Isolates  obtained  seen  features  macroscopic  and  microscopic.  The  results  obtained  isolates isolation  two  of  the  four  isolates  that  can  give  inhibition  to  Escherichia  coli  which  diameter inhibition  were  11,47±0,05  mm  and  inhibition  to  Staphylococcus  aureus  which  diameter inhibition were 23,83±0,46 mm.
Keywords : soil, microbe, isolation, fermentation, diameter inhibition

## PENDAHULUAN
Tanah  yang  terbentuk  merupakan hasil  kombinasi  dari  proses  fisik,  biologi maupun  kimia.  Pada  tanah  baik  didalam maupun  di  permukaan  terdapat  mikroba yang  berkembang  biak  secara  beraneka ragam (1) .  Jenis  mikroba  tanah  antara  lain dapat  berupa  bakteri,  aktomisetes  dan fungi. Adanya mikroba dalam tanah dapat berperan  sebagai  penyubur  tanah  karena menghasilkan  zat-zat  nutrisi dalam  tanah. Selain  itu  mikroba  juga  berperan  untuk menguraikan  bahan-bahan  organik  dan menghasilkan zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba sebagai hasil
metabolismenya (2) .
Banyak  jasad  renik  yang  diisolasi
dari
tanah ditemukan memiliki kemampuan
menghasilkan zat-zat
antibiotik (3) Produksi  antibiotika  yang berasal  dari  hasil  metabolisme  mikroba dilakukan secara fermentasi. Proses fermentasi ini membutuhkan koloni mikroba sebagai stater dan media tertentu sebagai subtrat (sumber nutrisi). Beberapa  penelitian  di  Indonesia  sudah membuktikan  adanya  mikroba  tertentu yang menghasilkan metabolit yang berpotensi sebagai antimikroba (4) .
Mikroorganisme  yang  berada  di permukaan  maupun  dalam  tanah  dapat dijadikan  sebagai  koleksi  untuk  koservasi mikroba  tanah.  Salah  satu  tempat  yang menjadi  habitat  dari  mikroba  adalah kebun.  Tanah  kebun  sangat  berpotensi untuk  diambil  dan  digunakan  sebagai bahan  untuk  mencari  mikroba  yang bermanfaat (5) .

## METODE PENELITIAN
Isolasi mikroba Sebanyak  10  gram  sampel  tanah diambil dari Kebun Tanaman Obat UNJANI.  Masing-masing  5  gram  tanah direndam  dalam  50  mL  NB  dan  5  gram lainnya  direndam  dalam  media  PDB, kemudian dihomogenkan dan diinkubasi (24 jam, 37 o C) untuk tanah dalam media NB dan 3  hari  pada  suhu  25 o C  untuk  tanah  dalam media  PDB.  Mikroba  yang  tumbuh  pada media  NB  dan  PDB  dilakukan  pemisahan dengan kultur berulang pada NA,  diinkubasi (37 o C;  24  jam).  Pada  media  PDA  inkubasi dilakukan  selama  3  hari  pada  suhu  25 o C. Proses  dilakukan  berulang  sampai  diperoleh isolat tunggal (6) .

## Identifikasi mikroba secara fenotip
Pemeriksaan
fenotip meliputi pengamatan  makroskopis  dan  mikroskopis (pergerakan  bakteri,  pewarnaan  Gram,  uji TSIA, dan uji IMVIC) yang selanjutnya data hasil  pengujian  dicocokkan  menggunakan
Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology 7th edition (7) .

## Pengamatan Makroskopis
Pengamatan  makroskopis  dilakukan dengan  mengamati  secara  visual  koloni bakteri  dan  khamir  pada  media  meliputi warna, bentuk, serta permukaan koloni (8) .

## Pengamatan Mikroskopik
Pengamatan  mikroskopis  meliputi pergerakan bakteri, pewarnaan Gram
bakteri,  identifikasi  bakteri  dengan  media TSIA,  uji  IMVIC  (Indole,  Metil  Merah, Voges  Proskauer,  Simmon  sitrat)  dan identifikasi  kapang  dengan  uji  Moist Chamber (7) .

## Fermentasi
Isolat  mikroba  difermentasi  dalam  50 mL NB dan PDB. Isolat mikroba dalam NB diinkubasi (24, 48, dan 72 jam; 37ºC) dalam
shaker inkubator dengan kecepatan 150 rpm. Isolat  mikroba  dalam  PDB  diinkubasi  pada suhu  25ºC  selama  3  hari,  5  hari  dan  7  hari dalam shaker inkubator  dengan  kecepatan 150 rpm.
Hasil  fermentasi  disentrifugasi  ulang (4000  rpm,  30  menit)  untuk  memperoleh supernatan  sebagai  metabolit  dari  bakteri yang akan diuji aktivitas antimikrobanya (4) .
Pengujian Aktivitas Antimikroba. Aktivitas antimikroba diuji menggunakan metode difusi perforasi dengan cara suspensi mikroba uji Escherichia coli sebanyak 1 mL
dimasukkan  kedalam  cawan  Petri  steril kemudian  tambahkan  20  mL  media  NA yang  masih  cair  kemudian  dibiarkan memadat  dan  dibuat  lubang-lubang  dengan menggunakan  perforator.  Perlakuan  yang sama  juga  dilakukan  pada  pengujian  untuk Staphylococcus aureus, yaitu 1 mL suspensi mikroba uji Staphylococcus aur
dimasukkan  ke  dalam  cawan  Petri  steril ditambahkan  20  mL  media  NA  yang  masih cair  kemudian  dibiarkan  memadat  dan dibuat  lubang-lubang  dengan  menggunakan perforator. Untuk Candida albicans sebanyak  1  mL  suspensi  mikroba  uji ditambahkan 20 mL media PDA yang masih cair  dan  diberi  lubang  setelah  memadat. Masing-masing  lubang tersebut diisi dengan sampel  uji  (supernatan  hasil  fermentasi) sebanyak 50 µL. Cawan diinkubasi (24 jam, 37°C)  untuk  media  NA  dan  (72  jam,  25°C) untuk media PDA (9) .
Parameter  terjadinya  daya  hambat dilakukan  terhadap  dengan  melihat  adanya dengan  daerah  bening  yang  muncul  di sekitar lubang.
Diameter hambat pertumbuhan  mikroba  diukur  menggunakan jangka sorong.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Mikroba Tanah
Isolasi  dilakukan  dengan  mengambil koloni  secara  aseptik  dan  digoreskan  ke media  NA  yang  telah  padat,  kemudian diinkubasi  (24  jam,  37°C).  Setiap  koloni  di inokulasikan  kembali  secara  berulang-ulang sampai didapatkan kultur murni (10) .
Dari hasil penelitian diperoleh 4 isolat bakteri  tumbuh  di  media  NA  pada  suhu inkubasi  37°C  lama  inkubasi  ialah  24  jam dan  2  isolat  kapang/khamir  yang  tumbuh  di media  PDA  pada  suhu  inkubasi  25°C. Berikut  ialah  isolat  bakteri,  kapang  dan khamir yang diperoleh dari penelitian ini.
Gambar 1 .  Isolat  bakteri  hasil  isolasi  dari tanah
Gambar 2. Isolat kapang/khamir dari tanah
Setelah  mendapatkan  isolat  bakteri, selanjutnya  dilakukan  identifikasi  bakteri dari isolat yang diperoleh tersebut.
Identifikasi    dilakukan  secara  makroskopis. Untuk  melihat  morfologi  bakteri  dilakukan dengan mengamati cara mengamati
berdasarkan  visual  koloni  bakteri  pada media  pertumbuhan  meliputi  warna,  bentuk serta permukaan koloni (9) .
Secara makroskopis isolat B1 koloninya timbul, berwarna putih kekuningan,  tepi  halus,  sedangkan  isolat  B2 memiliki  ciri  makroskopis  koloni  yang berwarna  kuning,  koloninya  timbul,  tepi halus.  Isolat  B3  memiliki  ciri  makroskopis koloni  berwarna  putih,  licin,  mengkilap, berada diatas media.  Isolat B4 memiliki ciri makroskopis  koloni  berwarna  abu-abu, berada  diatas  media.  Pengamatan  morfologi pada  keempat  koloni  isolat  B1,  B2,  B3  dan B4  tersebut  tumbuh  di  permukaan  Koloni yang  timbul  diatas  media  menandakan bahwa isolat bersifat aerob (11) . Selain identifikasi secara makroskopis dilakukan pula identifikasi secara mikrokopis,  uji  biokimia  IMVIC  dan  uji TSIA.  Berikut  merupakan  tabel  hasil identifikasi bakteri dari isolat yang diperoleh. Berdasarkan  makroskopis  dan  uji identifikasi secara fenotip, dan membandingkan  dengan  berbagai  pustaka, isolat  bakteri  berwarna  putih  (B1)  memiliki kesamaan ciri makroskopis dan mikroskopis dengan  genus Acinetobacter  sp. dengan  ciri koloninya  yang  timbul,  berwarna  putih,  tepi halus. Secara makroskopis bakteri berbentuk bulat,  termasuk  bakteri  Gram  negatif  dan bakteri  aerob,  mampu  tumbuh  dengan memfermentasikan glukosa (uji TSIA positif menghasilkan  gas  H 2 S),  uji  indol,  metil merah,  voges  proskauer  (deteksi  adanya asetoin) negatif, memanfaatkan sitrat sebagai sumber karbon (uji sitrat positif) dan memiliki  kemampuan  menghasilkan  enzim katalase  (uji  katalase  positif).  Bakteri Acinetobacter  sp. Secara  alami  berada  di tanah, air dan kotoran (12) .
Tabel 1. Hasil identifikasi bakteri
Pengujian Isolat Bakteri B1 B2 B3 B4 Pewarnaan Gram (-) (-) (-) (+) Indol (-) (-) (-) (-) Motilitas (-) (-) (+) (-) Metil Merah (-) (-) (-) (+) Simon Sitrat (+) (-) (+) (+) TSIA (+) (-) (+) (+) Gas H 2 S (+) (-) (-) (-) Kesimpulan Acinetobacter sp. Pseudoalteromonas sp. Corynebacterium sp. Bacillus sp Isolat  bakteri  berwarna  kuning  (B2) memiliki  kesamaan  ciri  makroskopis  dan mikroskopis dengan genus Pseudoalteromonas sp. dengan ciri makroskopis  koloni  berwarna  kuning  kasar, bentuk  bundar,  dan  tepi  halus.  Secara mikroskopis  bakteri  berbentuk  batang, (bakteri  Gram  negatif)dan  bakteri  aerob, tidak  memfermentasikan  glukosa  (uji  TSIA negatif  tidak  menghasilkan  gas  H 2 S),  uji indol, metil merah, voges proskauer (deteksi adanya  asetoin)  negatif,  sitrat  negatif  dan memiliki  kemampuan  menghasilkan  enzim katalase  (uji  katalase  positif).  Bakteri Pseudoalteromonas  sp. banyak  ditemukan berasosiasi  dengan  “host    eukariotik”  yang sering diisolasi dari alam (13) .
Hasil  uji  aktivitas  biokimia  isolat  B3 seperti yang tertera pada Tabel 3 menunjukkan  terjadinya  fermentasi  glukosa pada  uji  TSIA.  Jika  berdasarkan Bergey’s Manual  of  Determinative  Bacteriology  7th edition .isolat  B3  termasuk  ke  dalam  genus Corynebacterium sp. Genus Corynebacterium juga sebagai bakteri tanah (14) .
Hasil  pengamatan  isolat  B4  pada secara makroskopik terlihat koloni berbentuk  bulat,  berwarna  abu-abu  kusam.
Secara  mikroskopik  bentuk  sel basil (batang),  bersifat  Gram  positif.  Berdasarkan pengujian  secara  biokimia  pada  Tabel  3 berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology  7th  edition merupakan genus Bacillus  sp.. dengan  ciri- ciri berbentuk batang, terdapat di tanah di air tawar maupun air laut (14) . Isolat khamir (K1) memiliki
kesamaan ciri makroskopis dan mikroskopis dengan  genus Saccharomyces  sp,  yaitu koloninya  berwarna  putih  kekuningan, tepian  halus,  permukaan  licin,  berlendir  dan hasil  pengamatan  dari  uji moist  chamber nampak  selnya  berbentuk  sirkuler,  tepian rata,  elevasi  cembung,  Penelitian  terdahulu pun  berhasil  mengisolasi  khamir  dengan genus Saccharomyces sp . dari alam (7) . Isolat kapang (K2) memiliki berdasarkan  uji moist  chamber mempunyai ciri  yang  sama  secara  makroskopis  dan mikroskopis  dengan  genus Aspergillus  sp. Isolat  K2  berwarna  abu-abu,  tepian  seperti memiliki rambut-rambut halus .

## Fermentasi
Fermentasi  dilakukan  terhadap  semua isolat  mikroba  yang  diperoleh  dari  proses isolasi, untuk diambil metabolit sekundernya
yang  akan  digunakan  untuk  pengujian aktivitas antimikroba. Lama proses fermentasi untuk isolat bakteri yaitu 24 jam, 48  jam  dan  72  jam.  Sedangkan  lama  proses fermentasi  untuk  isolat  kapang/khamir  yaitu 3  hari,  5  hari  dan  7  hari.  Hasil  fermentasi dari  isolat  bakteri  dan  isolat  kapang/khamir disentrifugasi  untuk  kemudian  diambil metabolitnya.
Isolat-isolat  yang  telah  difermentasi disetrifugasi  untuk  mengambil  supernatan yang terdapat metabolit
sekunder
didalamnya,  keberadaan  metabolit  sekunder dalam  supernatan  untuk  uji  aktivitas antimikroba, didukung oleh beberapa penelitian  yang  menggunakan  supernatan untuk uji aktivitas antimikroba (15) .

## Pengujian aktivitas antimikroba
Aktivitas antimikroba diketahui
dengan  melakukan  uji  terhadap  metabolit dari  isolat  bakteri  dilakukan  dengan  metode
difusi  perforasi  terhadap  mikroba  uji Candida  albicans, Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus .  Hasil  pengujian diperoleh metabolit dari isolat yang berpotensi  mempunyai  aktivitas  sebagai antimikroba  ialah  isolat  B1  dan  K1. Supernatan  hasil  fermentasi  isolat  B1 memberikan diameter hambat pada Candida albicans, Escherichia coli dan Staphylococcus  aureus .  Diameter  hambat menunjukkan  kekuatan  daya  antimikroba yang digolongkan
berdasarkan penggolongan  Davis  dan  Stout:  daya antibakteri sangat kuat jika diameter hambat lebih dari 20 mm, kuat jika diameter hambat 10-20  mm,  sedang  jika  diameter  hambat  5- 10  mm,  dan  lemah  jika  diameter  hambat kurang dari 5 mm (16) .
Berikut  merupakan  tabel  pengukuran zona  bening  hasil  pengujian  aktivitas antimikroba.
Tabel 2. Hasil uji aktivitas antimikroba dari isolat bakteri
No. Isolat Mikroba Lama Fermentasi Diameter Hambat pada Mikroba Uji (mm) Candida albicans Escherichia coli Staphylococcus aureus 1 Bakteri berwarna putih kekuningan (B1) 24 jam 14,70±1,65 - 18,96±0,66 2 48 jam 14,50±0,10 12,67±0,30 - 3 72 jam 15,20±1,60 - - 4 Bakteri berwarna kuning (B2) 24 jam - - - 5 48 jam - - - 6 72 jam - - - 7 Bakteri berwarna putih (B3) 24 jam - - - 8 48 jam - - - 9 72 jam - - - 10 Bakteri berwarna abu-abu (B4) 24 jam - - - 11 48 jam - - - 12 72 jam - - -
Supernatan dilakukan pengujian bakteri
Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus memiliki  diameter  hambat  yang  berbeda, Berdasarkan hasil pengukuran terhadap
diameter  hambatan  pada Staphylococcus aureus menghasilkan  diameter  hambat sebesar  18,96±0,66. Staphylococcus  aureus termasuk  Gram  +  dengan  dinding  sel  yang terdiri  dari  peptidoglikan  dan  asam  teikoat sehingga  metabolit  dapat  masuk  kedalam  sel dengan mudah Pada Escherichia coli
mempunyai  dinding  sel  yang  terdiri  dari peptidoglikan lipoprotein, lipopolisakarida dan selaput  luar  yang  membuat  metabolit  susah menembus sel sehingga menghasilkan diameter  hambat  yang  lebih  kecil  dibanding Escherichia coli (10) .
Bakteri  Gram  –  memiliki  susunan dinding  sel  yang  tersusun  lebih  kompleks sehingga  antibakteri  susah  untuk  masuk kedalam  sel.  Jika  diujikan Escherichia  coli dengan isolat B1 yang lama fermentasinya 48 jam,  mampu  memberikan  daya  hambat dibandingkan  dengan  lama  fermentasi  24  dan 72  jam,  diduga  48  jam  merupakan  fase  log, dimana  perbanyakan  jumlah  sel  meningkat. Menurut  Surono  (2004)  dalam  Uun  (2008)  s lama waktu fermentasi, akan membuat bakteri semakin  aktif  dengan  jumlah  yang  semakin banyak, untuk memecah substrat dan menghasilkan  metabolit  yang  berpotensi
sebagai antimikroba. Untuk fermentasi bakteri selama 72 jam sudah memasuki fase kematian sehingga metabolit sekundernya tidak diproduksi  lagi.  Sedangkan  jika  diujikan dengan Staphylococcus  aureus, isolat  dengan lama  fermentasi  24  jam  lah  yang  berpotensi sebagai antibiotik. Beberapa penelitian sebelumnya  pun  mendukung  bahwa  24  jam merupakan fase log menuju fase stasioner dari bakteri dalam perkembangbiakkannya (14) . Supernatan  semua  durasi  fermentasi yang  diujikan  pada  khamir Candida  albicans menunjukkan  adanya  diameter  hambat  pada setiap durasi fermentasi. Hal tersebut menunjukkan  bahwa  metabolit  sekunder  dari isolat  B1  secara  kontinyu  diproduksi  saat fermentasi dan berpotensi sebagai antimikroba. Begitu pula pada uji aktivitas menggunakan  supernatan  isolat  khamir  K1. Hasil pengujian menunjukkan bahwa metabolit  dari  isolat  khamir  K1  memiliki aktivitas antimikroba sedangkan isolat  kapang
K2 tidak memiliki aktivitas sebagai antimikroba. Supernatan hasil fermentasi isolat K1  memberikan  daya  hambat  pada Candida albicans, Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dengan  daya  hambat  yang  berbeda. Berikut  merupakan  tabel  pengukuran  zona bening hasil pengujian aktivitas antimikroba.
Tabel 3. Hasil uji aktivitas antimikroba dari isolat kapang, khamir
No. Isolat Mikroba Lama Fermentasi Diameter Hambat pada Mikroba Uji (mm) Candida albicans Escherichia coli Staphylococcus aureus 1 Khamir berwarna putih kekuningan (K1) 3 hari 16,03±0,63 11,47±0,05 23,83±0,46 2 5 hari 18,30±0,95 - 22,23±0,15 3 7 hari 10,33±0,25 - - 4 Kapang berwarna abu-abu (K2) 3 hari - - - 5 5 hari - - - 6 7 hari - - -
Perbedaan  diameter  hambat  dari ketiga  mikroba  uji,  menunjukkan  bahwa setiap  mikroba  uji  memiliki  kemampuan proteksi  dan  kelemahan  dari  masing-masing sel  mikroba.  Pada  isolat  khamir  K1 menunjukkan  bahwa  fermentasi  selama  3 hari berpotensi sebagai antimikroba terhadap semua mikroba uji, fermentasi selama 5 dan 7  hari  sudah  tidak  mampu  menghambat Escherichia  coli. Jika  diujikan  dengan Staphylococcus  aureus fermentasi  3-5  hari masih  mampu  memberikan  daya  hambat. Jika  diujikan  dengan Candida  albicans memiliki daya hambat yang baik dari semua supernatan hasil fermentasi. Waktu fermentasi mempengaruhi aktivitas antibakteri  dan  mutu  kimia  (total  asam  dan pH) (15) .

## SIMPULAN
Berdasarkan hasil isolasi mikroba dari tanah  di  kebun  tanaman  obat  diperoleh  6 isolat  bakteri  dan  4  isolat  kapang/khamir. Uji  identifikasi,  keempat  isolat  bakteri tersebut  memiliki  kesamaan  ciri  dengan genus Acinetobacter sp., Pseudoalteromonas sp.,  Corynebacterium  sp.,  Bacillus  sp. dan
kedua isolat kapang/khamir memiliki
kesamaan ciri dengan  genus Saccharomyces sp.  dan  Aspergillus  sp. Isolat Acinetobacter sp. yang  diambil  metabolit  sekundernya pada  jam  ke-24  mampu  menghambat pertumbuhan Candida albicans dan
Staphylococcus  aureus dengan  kategori daya  hambat  kuat  dimana  diameter  hambat masing-masing  sebesar  14,70±1,65  mm  dan 18,96±0,66  mm.  Metabolit  sekundernya yang  diambil  pada  jam  ke-24  mampu menghambat pertumbuhan Candida albicans sebesar  14,50±0,10  dan Escherichia  coli sebesar  12,67±0,30  mm.  Dari  kedua  isolat kapang/khamir  yang  diambil  metabolit sekundernya pada hari ke-3, hanya Saccharomyces  sp. mampu  menghambat Candida  albicans,  Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus dengan kategori daya
hambat  kuat  dimana  diameter  hambat masing-masing  sebesar  16,03±0,63  mm, 11,47±0,05 mm dan 23,83±0,46 mm.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  disampaikan kepada  LPPM  UNJANI  dengan  no  : SKEP/133/UNJANI/VII/2017  yang  telah memberikan dana untuk penelitian ini

## DAFTAR PUSTAKA
1. Panangan, Almundari T. (2011): “Isolasi  Mikroba  Penghasil  Antibiotika
Dari  Tanah  Kampus  Unsri  Indralaya Menggunakan  Media  Ekstrak  Tanah.”
Jurnal Penelitian Sains 14(C): 37–40.
2. Nurkanto,  Arif.  (2007):  “Identifikasi Aktinomisetes  Tanah  Hutan  Pasca Kebakaran Bukit Bangkirai Kalimantan Timur Dan Potensinya Sebagai Pendegradasi  Selulosa  Dan  Pelarut Fosfat.” 8: 314–19.
3. Adriani, and Yessica  Febriwanti  Tulak. (2013):  “Isolasi  dan  Karakterisasi Actinomycetes sebagai Penghasil Antibiotik  dari  Sampel  Tanah  Pada Peternakan Sapi di Kecamatan Galesong Kabupaten Takalar.” Biogenesis 1(2): 97–100.
4. Naid,  Tadjuddin,  Syaharuddin  Kasim,
Asnah Marzuki, and Sumarheni. (2013):  “Produksi  Antibiotika  Secara Fermentasi Dari Biakan Mikroorganisme Simbion Rumput Laut Euche.
5. Kanti,  A.  (2005):  Laporan  Penelitian Bidang  Zoologi  Keragaman  Khamir Tanah  Asal  Taman  Nasional  Kalimutu Dan  Taman  Wisata  Alam  Ruteng  Nusa Tenggara Timur. Bogor.
6. Naiola, Elidar, and Nunuk Widhyastuti. (2002):  “Isolasi,  Seleksi  Dan  Optimasi Produksi  Protease  Dari  Beberapa  Isolat Bakteri.” Berita BIologi 6(3): 467–73.
7. Yusra,  Fauzan  Azima,  Novelina,  and Periadnadi.  (2014):  “Isolasi  Dan
Identifikasi Mikroflora.” Agritech
34(3): 316–21.
8. Suryani,  Yani,  Poniah  Andayaningsih, and  Iman  Hernaman.  (2012):  “Isolasi dan  Identifikasi  Jamur  Selulolitik  pada
Limbah Produksi Bioetanol dari Singkong  Yang  Berpotensi  dalam Pengolahan  Limbah  menjadi  Pakan Domba.” VI(1): 1–10. 9. Balouiri,  Mounyr,  Moulay  Sadiki,  and Saad Koraichi Ibnsouda. (2016): “Methods  for  In  Vitro  Evaluating
Antimicrobial  Activity.”  Journal  of Pharmaceutical Analysis: 71–79.
10. Jawetz,  E.Melnick,  and  E.A  Adelberg. (1986):  Mikrobiologi  Untuk  Profesi Kesehatan. 16th ed. ed. Bonang Gerard. Jakarta:  CV.  EGV,  Penerbit  Buku Kedokteran.
11. Bahi,  Muhammad.  (2016):  “Isolasi  dan
Karakterisasi Senyawa Metabolit Sekunder Dari Bakteri Laut Streptomyces Sp.” 1(3): 161–64.
12. Holt,  John  (1994):  Bergey’s  Manual  of
Determinative  Bacteriology.  United States of America: Sanstache.
13. Baehaki,  A,  Rinto,  and  A  Budiman.
(2011):  “Isolasi  dan  Karakterisasi
Protease  dari  Bakteri  Tanah  Rawa Indralaya,  Sumatera  Selatan.” J.
Teknol.  dan  Industri  Pangan  XXII(1): 37–42. 14. Soliev, Azamjon B, Kakushi Hosokawa,  and  Keiichi  Enomoto.
(2011):  “Bioactive  Pigments  from Marine  Bacteria :  Applications  and Physiological Roles.” 2011.
15. Kunaepah,  Uun.  (2008):  “Pengaruh Lama  Fermentasi  dan  Konsentrasi Glukosa Terhadap Aktivitas Antibakteri,  Polifenol  Total  Dan  Mutu Kimia  Kefir  Susu  Kacang  Merah.”
Universitas Diponegoro.
16. Davis,  W.W,  and  T.R.  Stout.  (1971):
Disc Plate Methods of Microbiologycal Antibiotic Assay. 22nd ed. J. Microbiology.