## ANALISIS MORFOLOGI KOLONI DAN KERAGAMAN GENOTIP STREPTOCOCCUS SANGUINIS YANG BERASAL DARI PLAK GIGI DAN SALIVA PENDERITA PENYAKIT JANTUNG KORONER
(ANALYSIS OF COLONY MORPHOLOGY AND GENOTYPE DIVERSITY OF STREPTOCOCCUS SANGUINIS FROM THE DENTAL PLAQUE AND SALIVA OF CORONARY HEART DISEASE PATIENTS)
Yulianti Kemal*, Robert Lesang*, Natalina*, Boy Muchlis Bachtiar**, Lukman Hakim Makmun***
*Departemen Periodonsia **Departemen Biologi Oral
***Departemen Penyakit Dalam RS Ciptomangunkusumo Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Indonesia
Jl. Salemba Raya no 4 Jakarta Pusat 10430 E-mail: yulianti.soewondo@yahoo.com

## Abstract
The  previous  study  showed  that  the  accumulation  of  supragingival  calculus  in  coronary  heart  disease  (CHD)  patients grew faster and higher than that of in non CHD patients. Streptococcus sanguinis is recognized not only for its association with  dental  calculus,  but  also  with  life-threatening  bacterial  endocarditis.  This  preliminary  study  aimed to  identify S. sanguinis collected from dental plaque and saliva of CHD patients. The dental plaque and saliva samples from 17    CHD patients    were  each  dispersed  onto  Mitis  Salivarius  Agar  and  incubated  in  microaerophilic  condition.  A  total  of    50 colonies, 35 from  dental plaque, 15 from  saliva, presumed to be S. sanguinis on the basis of firm, adherent, and star shaped colony morphology, were selected and confirmed by regrowing each bacteria in nutrient blood agar. Furthermore, the  bacterial  chromosomal  DNA    was  extracted  and  confirmed  to  be S.  Sanguinis by  PCR-primers  with  specific amplification of intergenic region (475-bp) and reference strain of S. sanguinis ATCC 10556; the genotype diversity was observed by OPA 2 primers. Four out of 50 isolates (8%), 1 colony from the saliva, and 3 colonies from the dental plaque confirmed to be S. sanguinis . In conclusion,  colony morphology of S. sanguinis is firm, adherent, and star shaped; they are four genotype diversities of S. sanguinis found in  the dental plaque and the saliva of CHD patients.
Key words: Streptococcus sanguinis, colony morphology, coronary heart

## Abstrak
Penelitian  sebelumnya  menunjukkan  akumulasi  kalkulus  supragingiva  pada  pasien  dengan  Penyakit  Jantung  Koroner (PJK) terbentuk lebih cepat dan lebih banyak dibandingkan pasien non PJK. Streptococcus sanguinis dikenal bukan saja dalam hubungannya dengan pembentukan karang gigi, tetapi juga dengan endokarditis bakterial yang dapat menimbulkan kematian. Penelitian awal ini bertujuan untuk mengidentifikasi S.sanguinis yang berasal dari plak gigi dan saliva pasien PJK. Sampel berasal dari plak gigi dan saliva 17 pasien PJK yang disebar pada plat Agar Mitis Salivarius dan diinkubasi dalam suasana mikroaerofilik. Total sampel adalah 50,35 berasal plak gigi, 15 dari saliva, yang diasumsikan sebagai S. sanguinis atas`dasar  morfologi  koloninya  yang  jelas,  lekat,  berbentuk  bintang,  diambil  dan  dikonfirmasi  dengan  cara menumbuhkan setiap koloni kedalam agar darah bernutrisi. Bacterial chromosomal DNA diekstraksi dan dikonformasi sebagai S. sanguinis dengan menggunakan primer PCR amplifikasi spesifik regio intergenik (475-bp) dan strain standard S. sanguinis ATCC 10556. Diversiti genotip diobservasi menggunakan primer OPA2. Didapatkan 4 dari 50 isolat (8%), 1 koloni dari saliva, dan 3 koloni dari plak gigi  dikonformasi sebagai S. sanguinis. Sebagai kesimpulan, morfologi koloni S. sanguinis jelas,  lekat,  berbentuk  bintang,  didapatkan  4  keragaman  genotip S . sanguinis di  dalam  plak  gigi  dan  saliva pasien PJK.
Kata kunci : Streptococcus sanguinis, morfologi koloni, jantung koroner

## PENDAHULUAN
Penyakit  jantung  koroner  (PJK)  adalah  penyakit jantung  yang  disebabkan  oleh  aterosklerosis  atau obstruksi  arteri  koroner  oleh  plak  ateromateus. 1
Infark miokardial sebagai urutan pertama penyebab kematian,  umumnya  disebabkan  oleh  penyakit jantung koroner. 2
Streptococcus  sanguinis adalah  salah  satu  mikro- organisme  yang  umum  ditemukan  dalam  rongga mulut, dan diketahui sebagai komponen utama plak gigi, yaitu deposit lunak pada permukaan gigi yang berasal dari glikoprotein saliva yang telah ditumbuhi berbagai macam mikroorganisme, dan oleh para ahli telah  ditetapkan  sebagai  penyebab  utama  penyakit jaringan penyangga gigi, atau penyakit perodontal. 3,4 Streptococcus sanguinis melalui kolonisasinya pada permukaan  gigi  dianggap  mempunyai  kemampuan agregasi  yang  tinggi  dengan  bakteri  lain,  sehingga mempunyai peranan penting dalam proses maturasi plak  pada  permukaan  gigi,  juga  proses  kalsifikasi plak  menjadi  kalkulus  atau  karang  gigi.  Selain  itu, Streptococcus  sanguinis banyak  dikaitkan  dengan kelainan  jantung. 5,6 Penelitian  Kemal  dan  kawan kawan  pada  penderita  Diabetes  mellitus  tipe  II membuktikan  bahwa  akumulasi  kalkulus  supra- gingiva  pada  daerah  lingual  regio  anterior  bawah pada penderita penyakit jantung koroner (PJK) lebih tinggi  dibandingkan  non  PJK. 7 Sejumlah  peneliti mendapatkan kasus endokarditis pada pasien pasien dengan S.  sanguinis yang  resisten  terhadap  penisi- lin 8 , kelompok peneliti lain mendapatkan S. sangui- nis sering ditemukan pada  isolasi  yang berasal  dari pasien  pasien  endokarditis. 9,10 Pada  beberapa  pe- nelitian  yang  membandingkan  jumlah S.  sanguinis pada penderita PJK dan non PJK, dibuktikan bahwa pada  penderita  PJK  jumlah S.  sanguinis didalam plak  dan  saliva  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan pada  non  PJK. 11,12 Beberapa  penelitian  pada  hewan coba  membuktikan  bahwa S.  sanguinis dapat menyebabkan  agregasi  platelet 13 ,  dan  kalsifikasi aorta. 14
Di Indonesia pada saat ini, penelitian mengenai S. sanguinis tidak  sebanyak  penelitian  mngenai S. mutans. Penelitian  lebih  lanjut  mengenai S.  sangu- inis perlu  dilakukan  karena  besarnya  peranan S.sa- nguinis pada  penyakit  periodontal  maupun  hu- bungannya  dengan  penyakit  sistemik. Sebagai  pe- nelitian  awal , penelitian  ini  bertujuan  untuk  meng- analisis morfologi  koloni dan  keragaman  genotip Streptococcus sanguinis yang berasal dari plak  gigi dan  saliva  penderita  penyakit  jantung  koroner. Penelitian  selanjutnya  akan  diteliti  perbedaan  ge- notip dan karakteristik fenotipnya dengan yang non PJK.  Konformasi S.  sanguinis dilakukan  dengan
tehnik  PCR  berdasarkan  gen  16S  rDNA  dengan menggunakan  probe  SSA-2  yang  mengacu  pada penelitian Yihong Li dkk. terhadap 200 primer PCR yang  membuktikan  bahwa  probe    SSA-2  merupa- kan probe DNA yang specific untuk S. sanguinis. 15

## BAHAN DAN METODE
Subjek  penelitian  adalah  17  penderita  penyakit jantung  koroner  di  Bagian  Jantung  RS  Cipto Mangunkusumo  Jakarta.  Plak  pada  pemukaan  li- ngual  rahang  bawah  dan  saliva  diambil  sebagai sampel. Saliva, dan plak dimasukkan ke dalam cair- an  PBS,  kemudian  masing  masing  diambil  0,5cc dan  disebar  pada  biakan  agar  Mitis  salivarius  yang mengandung sukrose 5%, yaitu kadar sukrose yang sesuai untuk S. sanguinis . Setelah diinkubasi selama 3  hari  dalam  suasana  anaerob,  koloni    yang  sesuai dengan  morfologi  koloni S.  sanguinis yaitu  lekat, berbentuk  bulat  dengan  inti  padat  seperti  bintang 15 , diambil  untuk  dibuat  biakan  murni  pada  Plat  Agar Darah.  Caranya  dengan  mengambil  1  koloni  dari biakan  agar  Mitis  salivarius,  dimasukkan  kedalam 0,2cc NaCl, diaduk dengan apendorf supaya koloni terpisah,  lalu  disebar  dalam  Plat  Agar  Darah  yang dibuat  dari  Standard  Nutrient  Agar  dicampur dengan darah 5%. Didapatkan 50 koloni, 35 koloni dari  plak  gigi,  dan  15  koloni  dari  saliva.  Hasil biakan diekstrak DNA nya dengan Gene Jet Geno- mic DNA Purification Kit #KO721, #KO722 merk Fermentas.  Kemudian  dikonformasi  adanya S.  sa- nguinis dengan  teknik  PCR  berdasarkan  gen  16S rDNA  dengan  menggunakan  probe  SSA-2  dari Yihong  Li  dkk.  yaitu  F2:  GAA  GCC  ATT  TTG CCT AGA TTG ATG G dan R2: CCA TAC CGA TTC CTT ACT CTA AAT TT, dengan amplifikasi spesifik  regio  intergenik  475-bp 15 ,  dan S.  sanguinis standard  ATCC  10556.  Koloni  yang  telah  ter- konformasi  sebagai S.  sanguinis dianalisis  mor- fologinya;  sedangkan  keragaman  genotip  dianalisis dengan  mengacu  pada    profil  AP-PCR  dari  primer OPA-02.

## HASIL
Dari  50  koloni  bakteri,  yaitu  35  berasal  dari  plak gigi dan 15 dari saliva, diduga sebagai S. sanguinis atas dasar morfologi koloninya, setelah dikonfirmasi dengan  probe  SSA-2  dan S.  sanguinis standard ATCC  10556  (Gambar  1),  didapat  4  koloni S.sa- nguinis (8%) , yaitu 1 koloni berasal dari saliva, dan 3 koloni dari plak gigi. Keempat  koloni menunjuk- kan  morfologi  lekat,  berbentuk  bulat  dengan  inti padat  seperti  bintang  (Gambar  3).  Dengan  pem- besaran  100x,  terlihat  tepi  koloni  tidak  teratur,
S. Sanguinis i plak pasien Y S. Sanguinis i plak pasien Y S. Sanguinis i plak pasien Y S. Sanguinis plak pasien R S. Sanguinis i plak pasien M
S. Sanguinis i plak pasien Y S. Sanguinis saliva
pasien R
demikian  juga  intinya  padat  dan  tidak  teratur; dan  keempat  koloni  menunjukkan  gambaran  yang berbeda-beda (Gambar 4-5) . Keragaman  genotip S.  sanguinis dengan  primer OPA-2 didapatkan 4 genotip yang berbeda (Gambar 2.).
Gambar 1. Konfirmasi S. Sanguinis dengan probe SSA-2 pada 475 bp
Gambar 2.  Dengan  OPA-2  didapatkan  4  keragaman genotip S. Sanguinis
Gambaran  morfologi  koloni S.  sanguinis yang  di- temukan dapat dilihat pada Gambar 3,4, dan 5:
Gambar 3. S. sanguinis dari plak gigi dalam biakan agar dengan  pembesaran  10x:  pasien  Y  dan  M dalam agar M. Salivarius, pasien R dalam plat agar darah
Gambar 4. S.  sanguinis dari  plak  gigi  pasien  R  dan  M dalam  biakan  agar  M.  Salivarius  dengan pembesaran 100x
Gambar 5. S. sanguinis dari plak gigi pasien R dan saliva pasien  M  dalam  biakan  agar  M.  Salivarius dengan pembesaran 100x

## PEMBAHASAN
Pada penelitian ini sebagai biakan awal digunakan biakan yang  spesifik  untuk  golongan Streptococcus yaitu biakan agar Mitis salivarius, dengan kandung- an sukrosa 5%. Streptococcus lain umumnya mem- butuhkan  sukrosa dengan  konsentrasi >5%, missal- nya . S. mutan. Namun dengan konsentrasi sukrosa 5% streptococcus lain masih ada yang tumbuh. Dari 50  koloni  yang  diekstrak  dan  dianalisis  dengan probe  SSA-2,  hanya  4  koloni  yang  terbukti S.  sa- nguinis (8%) , yaitu 1 koloni berasal dari saliva, dan 3  koloni  dari  plak  gigi.  Bila  digunakan  perbenihan yang  lebih  spesifik  untuk S.  sanguinis ,  diharapkan akan  didapatkan S.  sanguinis dengan  persentase yang  lebih  besar  sehingga  analisis  mengenai  ke- ragaman  genotip  dan  kharakteristik  fenotip S.  sa- nguinis lebih mudah dilakukan. Perlu dilakukan pe- nelitian  lebih  lanjut  untuk  mendapatkan perbenihan yang lebih spesifik untuk S. sanguinis .
Dengan  pembesaran  10x  keempat  koloni.  S. sa- nguinis menunjukkan morfologi yang hampir sama, yaitu lekat, berbentuk bulat dengan inti padat seperti bintang. Dengan pembesaran 100x, tepi koloni ber- bentuk tidak teatur, demikian juga intinya padat dan tidak  teratur,  dan  keempatnya  menunjukkan  mor- fologi  yang  berbeda  terutama  yang  berasal  dari  sa- liva, bentuk bulatnya tidak sejelas seperti yang ber- asal  dari  plak.  Perbedaan  ini  mungkin  disebabkan karena profil genotipnya berbeda.
Sebagai  kesimpulan , Morfologi  koloni S. Sangui- nis jelas, lekat, berbentuk bulat dengan inti padat se- perti  bintang.  Didapatkan  4  keragaman  genotip S. sanguinis didalam plak gigi dan saliva pasien PJK.
Disarankan untuk dilakukan penelitian lebih lanjut untuk  mendapatkan  perbenihan  yang  lebih  spesifik untuk S.  sanguinis ,  sehingga  analisis  lebih  lanjut mengenai S. sanguinis lebih mudah dilakukan.

## Daftar Pustaka
1. Thomas  G.  Coronary  artery  disease-need  for  better terminology. Br J Cardiol 2009; 16: 192-3.
2. Luthra  K,  Luthra  S,  Aggarwal  N,  Luthra  S.  Gum bugs  hit  heart:  State  of  the  science.  J Oral  Health
and Comm Dent 2011; 5(3): 164-7.
3. Lindhe  J,  Lang  NP,  Karring  T.  Clinical  perio- dontology and implant dentistry. 5 th ed., Munkksgaard: Blackwell, 2008; 185-7.
4. Newman MG, Takei HH, Klokkevold PR, Carranza FA.  Carranza’s  clinical  periodontology.  10 th ed.,  St Louis: Saunders, 2006; 143-7.
5. Mc  Nicol  A,  Agpalza  A,  Jackson  EC,  Hamzeh- Cognasse H, Garraud O, Cognasse F. Streptococcus sanguinis-induced  cytokine  release  from  platelets.  J Thromb Haemost 2011; 9: 2038-49.
6. Mc Nicol A, Zhu R, Pesun R, Pampolina C, Jackson EC,  Bowden  GHW,  et  al.  A  role  for  im- munoglobulin  G  in  donor  specific  Streptococcus sanguis  induced  platelet  aggregation.  J  Thromb Haemost 2006; 95: 288-93.
7. Kemal  Y,  Oemardi  M,  Prasetyo  S.  The  correlation between  periodontal  and  coronary  artery  disease status  in  type  2  diabetes  mellitus  patients.  Asian Pacific Society Periodontol 2000: 96-101.
8. Bavunoglu I, Saahin S, Yilmaz M, Toptas T, Tabak F,  Tunckalle  A.  Nativee  tiple-valve  endocarditis caused b penicillin- resistant Streptococccus sanguis. Nature  Clinical  Practice  Cardiovascular  Medicine 2007; 4: 340-3.
9. Yamaguchi   M,  Terao  Y, Ogawa   T, Takahashi  T, Hamada  S,  Kawabata  S.  Role  of Streptococcus sa-
nguinis sortase  a  in bacterial colonization. Microbes and Infection 2006; 8: 2791-96.
10. Ge X, Kitten T, Chen Z, Lee SP, Munro CL, Xu P. Comprehensive  evaluation  of  Streptococcus  sa- nguinis cell wall-anchored proteins in early infective endocarditis.   Infect    Immun   2009; 77: 4966-75.
11. Deng S,  Chen  H,  Zhang  W. The relativity  between Streptococcus  sanguis  group  and  coronary  heart disease. Zhounghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi 2002; 37: 222-4.
12. Chen  H,  Zhang  WD.  3877  Streptococcus  sanguis group  in  oral  cavities  of  coronary  heart  disease patients  IADR/AADR/CADR 80th  General  session, San Diego, 2002.
13. Kerrigan  SW,  Douglas  I,  Wray    A,  Heath  J,  Byrne MF, Fitzgerald D, et al. A role for glycoprotein Ib in Streptococcus  sanguis-induced  platelet  aggregation. Blood 2002; 100: 509-16.
14. Cohen  DJ,  Malave  D,  Ghidoni  JJ,  Iakovidis  P, Everett MM, You S, et al. Role of oral bacterial  flora in  calcific  aortic  stenosis:  An  Animal  Model.  Ann Thorac Surg 2004; 77: 537-43.
15. Li Y, Pan Y,  Qi F,  Caufield PW.  Identification of Streptococcus  sanguinis  with  a  PCR-generated species-specific DNA probe. J Clin Microbiol 2003; 41: 3481-86.