## AMPLIFIKASI ISOLAT BAKTERI SF1 SIMBION SPONS

## Facaplysynopsis sp. DARI PERAIRAN TONGKEINA, SULAWESI UTARA
(Amplification Of Bacterial Isolate Sf1 Associated With Sponge Facaplysynopsis sp. From Tongkeina, North Sulawesi)
Liviani Rangian 1* , Elvy Like Ginting 1 , Stenly Wullur 1 , Erly Kaligis 1 , Sandra Tilaar 1 , Reiny Tumbol 2.
1 Program Studi Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Sam Ratulangi, Manado.
e-mail : liviaaesther@yahoo.com
2 Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Sam Ratulangi, Manado

## ABSTRACT
This  study  was  conducted  with  the  aim  of  amplifying  the  isolate  of  SF1 symbiont sponge Facaplysynopsis sp . from Tongkeina, North Sulawesi. Samples are obtained and stored in the Lab. Molecular Biology and Marine Pharmacology, FPIK Unsrat. The genomic DNA of the samples was isolated using protocols from the  Innu  PREP  Mini  DNA  Kit.  The  DNA  of  the  SF1  symbionary  bacteria  was amplified  by  PCR  (Polymerase  Chain  Reaction)  using  an  8F  primer  (5'- AGAGTITGATCCTGGCTA-3  ')  and  1492  R  (5'TACCTTACGACTT-3').  DNA bacteria SF1 successfully amplified marked by the appearance of the band of DNA that looks less clear, with a length of 600 bp.
Keywords : Bacterial Isolate, Sponge,  Amplification

## ABSTRAK
Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan  mengamplifikasi  isolat  bakteri  SF1 simbion  spons Facaplysynopsis  sp dari  perairan  Tongkeina,  Sulawesi  Utara. Sampel diperoleh dan tersimpan di Lab. Biologi Molekuler dan Farmasitika Laut, FPIK Unsrat. DNA genom dari sampel diisolasi menggunakan protokol dari Innu PREP  DNA  Mini  Kit.  DNA  bakteri  simbion  SF1  diamplifikasi  dengan  PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan  menggunakan primer 8F  (5’- AGAGTITGATCCTGGCTA- 3’) dan 1492 R (5’TACCTTACGACTT-3’). DNA bakteri SF1  berhasil  diamplifikasi  ditandai  dengan  munculnya  pita  DNA  yang  terlihat kurang jelas, dengan panjang 600 bp.
Kata Kunci : Bakteri Simbion, Spons, Amplifikasi

## PENDAHULUAN
Pesatnya  perkembangan  ilmu pengetahuan  dan  teknologi  dewasa  ini telah merebak ke berbagai cabang ilmu, termasuk  ilmu  biologi  molekuler.  Ilmu biologi  molekuler  dapat  diaplikasikan dalam  berbagai  penelitian,  diantaranya penelitian dengan menggunakan metode  identifikasi  yang  berhubungan dengan DNA. Metode identifikasi bakteri secara molekuler  berhubungan dengan DNA, karena metode ini dianggap lebih tepat dan cepat juga dapat menghasilkan  hasil  yang  sempurna
(Tindi dkk , 2016).
DNA  Barcoding  adalah  sebuah metode identifikasi spesies secara cepat dengan  menggunakan  urutan  pendek DNA sebagai alat pengidentifikasiannya
(Hebert et al ., 2003). Teknik identifikasi molekuler  menggunakan  teknik  PCR (Polymerase  Chain  Reaction), yang dapat  digunakan  salah  satunya  pada bakteri yang bersimbion dengan spons.
Spons  adalah  invertebrata  laut yang  merupakan  salah  satu  sumber potensial  penghasil  komponen  bioaktif dan merupakan tempat hidup organisme yang  bersimbiosis  dengannya.  Bakteri simbion  adalah  bakteri  yang  hidup menetap  pada  suatu  inang,  dan biasanya menghasilkan senyawa bioaktif  yang  sama  seperti  inangnya (Lee et al. , 2011).
Bakteri yang bersimbosis  dengan spons  mampu  menghasilkan  senyawa bioaktif  yang  tidak  hanya  memberikan informasi  mengenai  keragaman  bakteri dalam struktur komunitas mikroba, akan tetapi  juga  dapat  memberikan  suatu tahapan dari solusi masalah penyediaan senyawa-senyawa bioaktif (Ginting dkk.
2010). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk  mengamplifikasi  DNA  bakteri simbion  dengan  spons  dari  Perairan Tongkeina, guna  untuk pengembangan penelitian  lebih  lanjut  secara  analisis molekuler.

## . METODE PENELITIAN Penyiapan Sampel
Sampel  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  merupakan  sampel  yang tersedia  di  Lab.  Biologi  Molekuler  dan Farmasitika  Laut,  FPIK  Unsrat.    Isolat bakteri  simbion  dengan  spons  telah berhasil  dikultur  dan  diisolasi  dari perairan  Tongkeina,  Sulawesi  Utara (Wantania dkk, 2016).  DNA  bakteri simbion  Spons Facaplisynopsis  sp. (SF1) (Gambar  1),  tersedia  dalam bentuk  agar  miring  yang  ditumbukan kembali dalam media nutrient broth dan inkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam.
Gambar. 1 Spons Facaplisynopsis sp. (SF1). (Wantania dkk , 2016)

## Ekstraksi DNA
Pada  serangkaian  prosedur  ini,
DNA  bakteri  simbion  SF1  diisolasi melalui proses pemisahan secara mekanik  dan kimiawi.  Proses  ini  terjadi mulai  dari  lisis  sel,  pemisahan  protein, garam  dan  komponen  penyusun  sel lainnya,
dan terakhir, proses elusi/pengumpulan DNA. Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan
protokol  dari  Kit  Innu  PREP  DNA  Mini
Kit.  Tahapan  proses  ekstraksi  DNA berpedoman  pada  prosedur  pabrikan www.qiagen.com. Sampel  dimasukan ke  dalam  1,5  ml  microcentrifuge  tube dengan  menambahka n  180  μl  Buffer ATL, 20 μl proteinase K, vortex selama 15 detik dan inkubasi sampel pada 55°C selama 3 jam.
Selanjutnya,  tambahkan  200  μl Buffer  AL  pada  sampel, vortex  kembali selama  15  detik  dan  inkubasi  pada  70 °C selama 10 menit. 200 μl etanol (96-
100%) ditambahkan pada sampel dan di vortex  kembali  selama  15  detik. Pindahkan  larutan  pada  DNeasy  Mini Spin  Column  yang  berada  di  atas  2  ml collection tube, sentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
Setelah  itu  buang  cairan  yang berada di bagian bawah dan tambahkan 500 μl Buffer AW1 dan sentrifugasi pada kecepatan  8000  rpm  selama  1  menit. Setelah itu buang cairan yang berada di bagian bawah. Tambahkan 500 µl Buffer AW2.  Sentrifugasi  pada  kecepatan 14000  rpm  selama  3  menit.  Buang cairan  yang  berada  di  bagian  bawah, pindahkan Dneasy Mini Spin Column ke atas Elution Tube dengan
menambahkan  200  µl  Buffer  AE  pada bagian  tengah  Mini  Spin  Column, inkubasi  selama  1  menit  pada  suhu ruangan. DNA telah diisolasi dan berada di dalam Elution Tube.

## Amplifikasi  DNA  dan  Elektroforesis
Gel Proses amplifikasi dengan menggunakan metode PCR (Polymerase  Chain  Reaction). DNA bakteri simbion spons SF1 diamplifikasi dengan  menggunakan  primer 8F  (5’- AGAGTITGATCCTGGCTA- 3’) dan 1492 R (5’TACCTTACGACTT-3’),
dengan pengaturan  suhu sebagai berikut:  predenaturasi  pada  suhu  95ºC selama  2  menit,  denaturasi  pada  95ºC selama 40 detik yang dilakukan sebanyak  37  siklus,  annealing  pada suhu  50ºC  selama  40  detik,  elongasi pada suhu 72ºC selama 40 detik dan 1 siklus  perpanjangan  akhir  pada  suhu 72ºC selama 1 menit.
Masing-masing tahap yaitu isolasi  DNA  dan  amplifikasi  bakteri simbion  spons  SF1    membutuhkan pengujian elektroforesis gel untuk mengetahui  keberhasilan  dari  tahap yang  sudah  dilakukan.  Munculnya keberadaan  pita  DNA  yang merupakan tanda keberhasilan dari isolasi DNA dan amplifikasi  DNA  bakteri  simbion  SF1 yang dilakukan.
Gel  yang  digunakan  adalah  gel berkonsentrasi  1%  yang  ditambahkan dengan maestrosafe prestained
sebanyak 2 μL. Produk amplifikasi DNA sebanyak  4  μL  dan  1  μL  10x  loading buffer dan dimasukkan kedalam masing-masing sumur yang telah disiapkan.  Salah  satu  sumur  dalam gel diisi dengan 2 μL ladder DNA marker (1 kb).  Elektroforesis  menggunakan  1x TBE buffer dan dialiri dengan tegangan listrik  sebesar  80  volts  dengan  waktu kurang lebih 20 menit. Hasil pemeriksaan  gel  elektroforesis  diamati lewat  sinar  UV-transluminator  dan kemudian didokumentasikan
menggunakan kamera

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi  dan  Elektroforesis  DNA Bakteri Simbion Spons SF1
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer 8F (5’AGAGTITGATCCTGGCTA-3’) dan 1492 R (5’TACCTTACGACTT-3’) .
Primer  merupakan  poin  terpenting dalam menentukan keberhasilan dalam proses  amplifikasi.  Primer  berupa untai DNA pendek utas tunggal (oligonukleotida)  yang  berfungsi  untuk menginisiasi  reaksi  proses  polimerisasi DNA  secara  in  vitro,  mengenali  dan menandai fragmen sampel DNA
(template)  yang  akan  di  amplifikasi (Peloa dkk , 2015).
Berdasarkan hasil amplifikasi, dapat dilihat bahwa sampel DNA bakteri simbion SF1 menunjukan pita DNA yang tampak  kurang  jelas  dan  kurang  tebal, bahkan  hampir  tak  terlihat  dan  berada pada panjang basa 600bp (Gambar 2). Dengan kata lain hasil amplifikasi yang dilakukan  dianggap  kurang  sempurna. Beberapa  faktor  yang  menyebabkan hasil  amplifkasi  yang  kurang  baik diantaranya  kondisi  atau  kualitas  dan kuantitas  sampel  DNA  tersebut.  Selain itu,  kurangnya  ketelitian  peneliti  dalam proses  ekstraksi  DNA  dan  amplifikasi juga adanya kemungkinan ketidakcocokan  primer  yang  digunakan menjadi  faktor  yang  mempengaruhi
keberhasilan
proses amplifikasi (Wehantouw dkk , 2016 ).
10.000bp
Gambar 2 . Hasil Elektroforesis produk amplifikasi DNA bakteri SF1 simbion spons
Facaplysynopsis sp . dengan marker dna ladder 1 kb. Oleh karena itu, dalam pelaksanaan proses amplifikasi optimasi PCR penting dilakukan untuk menghasilkan karakter yang diinginkan. Optimasi ini menyangkut suhu denaturasi  dan  annealing  DNA  dalam mesin  PCR.  Suhu  denaturasi  yang rendah  dapat  menyebabkan  belum terbukanya  DNA  utas  ganda  sehingga tidak dimungkinkan terjadinya penempelan primer. Proses  penempelan  primer  pada utas DNA yang sudah terbuka memerlukan suhu optimum, sebab suhu yang  terlalu  tinggi  dapat  menyebabkan amplifikasi  tidak  terjadi  karena  primer
tidak  menempel  atau  sebaliknya  suhu yang  terlalu  rendah  menyebabkan primer menempel  pada  sisi  lain  genom yang bukan sisi homolognya.

## Sekuensing  DNA  Bakteri  Simbion Spons SF1
Sekuensing DNA merupakan suatu  proses  pengurutan  nukleotida pada  suatu  fragmen  DNA.  Hasil sekuensing DNA bakteri simbion dengan  spons  diperoleh  dalam  bentuk format  kromatogram  yang  terdiri  dari primer forward (Gambar  3)  dan  primer reverse (Gambar 4).
Gambar 3. Kromatogram hasil pengurutan DNA Bakteri Simbion Spons SF1 menggunakan primer Forwar d
Gambar 4.  Kromatogram hasil pengurutan DNA Bakteri Simbion Spons SF1 menggunakan primer Reverse
Kromatogram  diperoleh  dalam bentuk  peak  yang  berwarna-warni dengan nukleotida A (Adenin) berwarna hijau,  nukleotida  G  (Guanin)  berwarna hitam,  nukleotida  C  (citosin)  berwana biru  dan  nukleotida  T  (timin)  berwarna
merah.  (Untu dkk ,  2015).    Hasil sekuensing DNA bakteri simbion spons SF1 menghasilkan urutan basa nukleotida  sebanyak  600  bp,  dengan urutan nukeotida sebagai berikut:

## KESIMPULAN
DNA  bakteri  SF1  simbion  spons Facaplysynopsis  sp berhasil  diisolasi menggunakan InnuPREP DNA Mini Kit.
Dan berhasil diamplifikasi menggunakan  pasangan  primer 8F (5’AGAGTITGATCCTGGCTA-3’) dan 1492 R (5’TACCTTACGACTT-3’) , yang ditandai
dengan  munculnya  pita  pada  posisi panjang basa 600 bp.

## DAFTAR PUSTAKA
Ginting,  E.L,.  Warouw,  V,.  Suleman, R.W.  2010.  Aktivitas  Antibakteri Dari  Ekstrak  Kasar  Bakteri  Yang Berasosiasi Dengan Sponge Acanthostrongylophora  sp . Jurnal
Pesisir dan Laut Tropis . 6(3):160-
163. Hebert,  P.D,.  Cywinska,  A.,  Ball,  S.L. 2003.  Biological  identifications through DNA barcodes. Proceedings  of the  Royal  Society of  London.  Series  B  : Biological
Sciences , 270(151):313-321. Lee,  Y.K.,  Jung  H.L,  Hong  K.L.  2001. Microbial  Symbiosis  in  Marine Sponges, TheJournal of Microbiology , 3(9):254-264. Peloa, A,. Wullur, S,. Sinjal, C.A. 2015. Amplifikasi Fen Cytochrome Oxidase  Subunit  I  Dar  Sampel Sirip Ikan Hiu Dengan Menggunakan Beberapa Pasangan.  Primer.Jurnal Pesisir dan Laut Tropis . 1(1):37-42.
Tindi,  M,.  Mamangkey,  G,.  Wullur,  S. 2017.  DNA  barcode  dan  analisis filogenetik  molekuler  beberapa jenis bivalvia asal perairan Sulawesi  Utara  berdasarkan  Gen COI.  Junal Pesisir  dan  Laut Tropis . 1(2):32-38. Untu, P,. Rumengan I., Ginting, E. 2015. Identifikasi Mikroba yang Koeksis dengan ascidia Lissoclinum patella Menggunakan
Sekuens  gen  16S  rRNA.  Jurnal Pesisir  dan  Laut  Tropis .  2(1).  8- 14.
Wantania,  L.,  Ginting,  E.,  Wullur,  S. 2016.  Identifikasi  Sirip  Ikan  Hiu yang  Didapat  dari  Pengumpul  di
Minahasa Tenggara menggunakan DNA  Barcode.  Jurnal LPPM Bidang Sains & Teknologi , Universitas Sam Ratulangi Manado.  3(1):57-65.
Wehantouw,  A.,  Ginting,E.,  Wullur,  S. 2016.  Identifikasi  Sirip  Ikan  Hiu yang  Didapat  dari  Pengumpul  di Minahasa Tenggara menggunakan DNA Barcode. Jurnal Pesisir dan Laut Tropis . 1(1). 62-68.