Abstrak— Penelitian  ini  membahas  tentang  produksi polihidroksialkanoat (PHA) oleh  bakteri  R.picekttii  untuk menghasilkan  bahan  bioplastik  sebagai  biopolimer alternatif.  Bakteri  R. pickettii  merupakan  bakteri  gram negatif, berbentuk batang, dan bakteri patogen yang mampu bertahan  hidup  dalam  kondisi  yang  minimal  nutrisi. Produksi  (PHA)  ini  dilakukan  dengan  metode  fermentasi batch  dengan  media  minimal  nutrisi  (Trace  Element) dengan  fruktosa  sebagai  sumber  kabon.  PHA  yang dihasilkan  menunjukkan  gugus  fungsi  sesuai  dengan spektrum  FT-IR  pada  1022  cm -1 (ikatan  C-O-C  polimer), 1737  cm -1 (ikatan  C=O  ester),  2852  cm -1 dan  2924  cm -1 (ikatan  CH 3 dan  CH 2 )  dan  3448  cm -1 (ikatan  O-H).  Hasil Scanning  Electron  Microscopy  (SEM)  biomassa  dapat dikatakan bahwa PHA telah berhasil dihasilkan oleh bakteri R.picekttii berupa  padatan.  Pada  penelitian  ini  dihasilkan PHA sebanyak 0,0425 g/g sel kering (4,25%).
Kata  Kunci— bioplastik;  PHA;  Ralstonia  Pickettii; fermentasi

## I. PENDAHULUAN
lastik  merupakan  bahan  yang  paling  sering  digunakan oleh manusia karena sifat dan fleksibilitasnya yang tinggi mengakibatkan  penggunaan  yang  berlebih  hingga mencapai jutaan kilogram per tahun. Penggunaan plastik yang terus meningkat menimbulkan kekhawatiran mengenai dampak yang  dihasilkan  terhadap  lingkungan.  Plastik  konvensional yang  digunakan  berasal  dari  minyak  bumi  yaitu  sumberdaya fosil  yang  sebagian  besar  tidak  dapat  didegradasi  sehingga dapat menimbulkan pencemaran terhadap sekitar. Oleh karena itu, perlu  adanya alternatif untuk  menanggulangi keterbatasan tersebut.  Bioplastik  merupakan  salah  satu  sumber  daya terbarukan yang bersifat ramah lingkungan [1].
Bioplastik  dapat  dihasilkan  dari  metabolisme beberapa  bakteri  disaat  terjadi  pembatasan  nutrisi  di lingkungan  dengan  jumlah  sumber  karbon  yang  mencukupi dengan  hasil  samping  berupa  senyawa  poliester,  diantaranya polihidroksialkanoat (PHA). Berbagai mikroorganisme seperti Alcaligenes , Azotobacter , Bacillus , Nocardia , Pseudomonas , Ralstonia , dan Rhizobium mengakumulasi  PHA  sebagai material cadangan energi. Setiap mikroorganisme menghasilkan  komposisi  polimer  PHA  yang  berbeda.  Selain itu,  jenis  sumber  karbon  yang  digunakan  juga  akan menentukan jumlah PHA yang dihasilkan [2].
Bakteri R. picketti merupakan bakteri gram negatif dan salah  satu  jenis  bakteri  oligotropik  yang  mampu  bertahan  di daerah konsentrasi yang sangat rendah nutrisi [3]- [4] . Bakteri R. picketti dapat mengakumulasi PHA sebagai cadangan energi di  dalam  sitoplasma sel,  bentuknya  dapat  berupa  granula dan Kristal.  Pada  penelitian  sebelumnya,  Asranudin  (2014) [5] telah  melakukan  penelitian  terhadap  bakteri R.  pickettii dengan  media Nutrient  Broth (NB)  ditambah  glukosa dengan perolehan  PHA  sebesar  20%,  sedangkan, Martha  dkk  (2010) [6] telah  melakukan  penelitian  tentang  produksi  PHA  dari isolat R. eutropha dengan penggunaan media minimal disertai penambahan  asam  asetat  atau  asam  propionat    dengan perolehan PHA sebesar 8,40%.
Berdasarkan  uraian  diatas,  pada  penelitian  ini  akan digunakan R.  picketti sebagai  bakteri  penghasil  PHA menggunakan  media  minimal  cair  dengan  fruktosa  sebagai media  kultivasi  terhadap  PHA  yang  dihasilkan  dimana penggunaan  media  dan  susbstrat  ini  belum  pernah  dilakukan sebelumnya.

## II. EKSPERIMEN

## A. Pembuatan Trace Element
Trace  element dibuat  dari  Larutan  garam  M9  yang terbuat dari 64 g Na 2 HPO 4 .7H 2 O, 15 g KH 2 PO 4 , 2,5 NaCl, dan 5,0  NH 4 Cl  kemudian  dilarutkan  dalam  air  aquades  hingga volume total sebanyak 1 L. Selanjutnya, diambil 50 mL garam M9 dan ditambahkan dengan 2 mL MgSO 4 1 M, 100 µL CaCl 2 1  M  dan  dilarutkan  dengan  aquades  hingga  volume  total sebanyak 250 mL.

## B. Persiapan Kultur Cair Bakteri
Trace element diambil 50 mL dan ditambahkan dengan 2  mL  MgSO 4 1  M,  100  µL  CaCl 2 1  M  kemudian dilarutkan dengan aquades  hingga  volume  total  sebanyak  250  mL. Selanjutnya,  ditambahkan  dengan  fruktosa  digunakan  sebagai media tumbuh R. picekttii.

## C. Produksi Biomassa PHA
R.  pickettii dalam trace  element (pre-kultur)  25  mL, kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37°C  dengan    kecepatan  120 rpm  selama 24  jam. Selanjutnya,  pre-kultur dimasukkan pada media  minimal  dengan  penambahan  fruktosa  3%  sebanyak 5 mL  sehingga  volume  total  sebesar  250  mL.  Kultivasi dilakukan  selama  68  jam  dengan  kecepatan  150  rpm  ( shaker inkubator )  berdasarkan kurva  pertumbuhan  bakteri  yang memasuki fase pertumbuhan stasioner.

## Produksi Polihidroksialkanoat oleh Bakteri Ralstonia pickettii dengan Fruktosa sebagai Sumber Karbon

## Intan Widya Kustarianingsih dan Refdinal Nawfa
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia e-mail : refnawfa@chem.its.ac.id
P

## D. Proses Pemisahan dan Pemurnian PHA
Biomassa  sel  yang  didapat  dipisahkan  dari  cairan kultivasi  dengan  metode  sentrifugasi  3000  rpm.  Sel  yang diperoleh  kemudian  dicuci  dengan  aquades.  Setelah  proses pencucian, sel yang diperoleh dikeringkan dengan freeze drier . Sel  kering  ditimbang,  kemudian  dilakukan  proses  ekstraksi dengan  kloroform:methanol  dengan  perbandingan  2:1  (Rais dkk,  2007).  Selanjutnya,  dimasukkan  kedalam  labu  bundar untuk  dilakukan  refluks  pada  suhu  50˚C  selama  12  jam. Setelah  proses  refluks,  hasil  disaring  dan  filtrat  diuapkan menggunakan evaporator dengan  suhu  50˚C  untuk mendapatkan  PHA.  Pemurnian  PHA  dilakukan  dengan penambahan n-heksana berkali-kali dan didekantasi .

## E. Karakterisasi PHA
Karakterisasi  plastik  PHA  dilakukan  menggunakan Fourier  Transform-InfraRed (FTIR)  untuk  mengetahui terbentuknya  plastik  PHA  dengan  metode  pendekatan  gugus fungsi.  Selain  itu,  dilakukan  karakterisasi  menggunakan Scanning  Electron  Microscopy (SEM)  untuk  mengetahui morfologi dari R.pickettii yang mengandung PHA.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Kultur Cair Bakteri Ralstonia pickettii
R. pickettii mampu untuk tumbuh pada media minimal. Hal ini  dapat  ditunjukkan  dengan  adanya  perbedaan  kekeruhan yang  terjadi  dimana sebelum bakteri  diinokulasikan  media bening tidak berwarna, sedangkan  setelah bakteri diinokulasikan terjadi perubahan warna menjadi putih keruh.

## B. Produksi Biomassa PHA
Bakteri hasil regenerasi diambil sebanyak satu koloni dan diinokulasikan  ke  dalam  media garam  M9,  MgSO 4 ,  dan CaCl 2 ( trace  element ).  Kultur dilakukan  pre-inkubasi  pada shaker inkubator pada suhu 37ºC selama 24 jam. Selanjutnya, pre-kultur  dipindahkan  pada  media  250  mL  media  minimal dengan Proses inkubasi dilakukan selama 64 jam. Lama waktu inkubasi  berdasarkan  pada  fasa  akhir  eksponensial,  karena pada  fasa  ini  bakteri  menghasilkan  metabolit sekunder paling maksimum  untuk  mempertahankan  diri  karena  kandungan nutrisi media yang ada sudah mulai berkurang (Junairiah dkk., 2014).
Biomassa  hasil  inkubasi  dalam shaker dipisahkan  dari media  biakannya  menggunakan sentrifuge selama  15  menit pada  kecepatan  3000  rpm.  Sentrifugasi  merupakan  teknik pemisahan  berdasarkan  berat  molekul  dengan  kecepatan tertentu  sehingga  partikel  yang  memiliki  berat  moleku  lebih besar terkumpul ke dasar tabung. Hasil yang diperoleh berupa endapan  berwarna  putih  dan  supernatan  bening  (tidak berwarna).  Kemudian  biomassa  dimasukkan  dalam freezer untuk  menonaktifkan  metabolisme  sel. Sel  kering  yang  telah didapat ditimbang massanya dan diperoleh sebesar 0,2817 g/L.

## C. Proses Pemisahan dan Pemurnian PHA
Sel  kering  sebanyak  0,2817  gram  dihaluskan  terlebih dahulu  pada  mortar.  Hal  ini  digunakan  untuk  memperluas permukaan  sel  kering  bakteri.  Selanjutnya,    sel  kering diekstrak  menggunakan  methanol  :  kloroform  (2:1  v/v).
Campuran  pelarut  metanol-kloroform  ini  digunakan  sebagai pelarut  yang  disesuaikan  dengan  sifat  kepolaran  PHA. Campuran pelarut tersebut akan meningkatkan indeks polaritas kloroform  sehingga  sifat  polar  meningkat dimana  sesuai dengan  sifat  PHA  yang  merupakan  rantai  panjang  dengan adanya  gugus  karbonil  di  dalamnya.  Selain  itu,  poliester merupakan  rantai  polimer  yang  cukup  panjang  sehingga mengubah  kepolaran  dari  senyawa  tersebut  untuk  cenderung berubah  pada  sifat  non  polar.  Hal  ini  dijadikan  sebab  untuk mencampurkan  metanol  dengan  pelarut  kloroform  yang bersifat  non  polar  sehingga  campuran yang terbentuk bersifat semi polar.
PHA yang didapat  berupa  padatan berwarna putih. Pada gambar  1(a)  merupakan  hasil  pemisahan  PHA  sebelum dimurnikan,  sehingga  tampak cairan  berwarna kuning dimana merupakan hasil metabolit lain berupa lemak dan asam lemak. Sedangkan  pada  gambar  1(b)  hanya  didapat  PHA  berupa padatan  berwarna  putih.  Pemurnian  menggunakan  n-heksan berfungsi  untuk  memurnikan  PHA  dari pengotor  hasil metabolit  lain  seperti  asam  lemak  dan  lain-lain. PHA  yang didapat pada penelitian ini yaitu sebesar 0,0425 g/g sel kering (4,25%).
Gambar 1 (a) sebelum dimurnikan (b) sesudah dimurnikan

## D. Karakterisasi PHA
Pada penelitian kali ini, dilakukan analisa PHA melalui FT-IR.  Analisa  PHA  dilakukan  sebanyak  dua  kali  yaitu sebelum  dan  setelah  dimurnikan.  Hasil  spektroskopi  FT-IR dari  sampel  PHA  dapat  dilihat  pada  gambar  2.  Pada  hasil spektra  FT-IR  sampel  ketika  sebelum  dimurnikan, menunjukkan  adanya  5  puncak  utama,  yaitu  pada  bilangan gelombang  1084  cm -1 ,  1741  cm -1 ,  2856  cm -1 ,  2926  cm -1 ,  dan 3423  cm -1 .  Puncak  tersebut  hampir  sama  dengan  PHB komersil yaitu pada bilangan gelombang 1054 cm -1 , 1726 cm -1 , 2933 cm -1 , 2984 cm -1 , dan 3440 cm -1 . Pada hasil FT-IR PHA ketika  sebelum  dimurnikan  terdapat  bnyak  puncak  yang tumpang  tindih,  hal  ini  mungkin  dikarenakan  masih  adanya pengotor yang tertinggal dalam sampel.

## Gambar 2. Spektra FT-IR PHA
Setelah  dilakukan  pemurnian  dengan  menggunakan  n- heksan, spektra FT-IR yang didapat juga hampir sama dengan spektra  sebelumnya  yaitu  terbentuknya  5  puncak  utama  pada 1022  cm-1,  1737  cm-1,  2852  cm-1,  2924  cm-1,  3448  cm-1. Hal  yang  nampak  terlihat  jelas  pada  kedua  spektra adalah puncak  OH  yang  sangat  berbeda,  dimana  pada  spektra  PHA sebelum dimurnikan terdapat puncak yang lebih lebar. Hal ini bisa  dimungkinkan  adanya  kontribusi  gugus  OH  dari  lemak ataupun asam lemak.
Berdasarkan  spektra  di  atas,  maka  terlihat  beberapa spektra yang menunjukkan gugus fungsi dari PHA sampel baik sebelum  maupun  sesudah  dimurnikan  dan  dibandingkan dengan PHA komersial dapat ditunjukkan pada tabel 1.
Tabel 1. Tabel Perbandingan Spektra FT-IR
Ikatan (%) Sebelum dimurnikan (cm -1 ) Sesudah dimurnikan (cm -1 ) Standar PHA komersil (cm -1 ) C-O-C 1084 1022 1054 C=O ester 1741 1737 1726 C-H 3 2856 2852 2933 C-H 2 2926 2924 2984 O-H 3423 3448 3440
Pada  spektra  FT-IR  PHA  komersil,  adanya  muncul  pada bilangan gelombang tertentu antara lain 1054 cm -1 merupakan vibrasi  ikatan  C-O,  1726  cm -1 yang  merupakan  vibrasi  khas ikatan C=O pada ester, 2933 cm -1 dan 2984 cm -1 vibrasi ikatan C-H sp2  serta  pada  3440  cm -1 yang merupakan vibrasi ikatan O-H.  Puncak-puncak  spektra  tersebut  dapat  dilihat  bahwa hampir  sama  dengan  spektra  yang  muncul  pada  sampel PHA R. pickettii setelah dimurnikan.
Hasil  analisa  PHA  menggunakan  SEM  dapat  dilihat  pada Gambar 3.

## Gambar 3. Morfologi SEM PHA
Biomassa  sel  PHA  yang  didapat  memiliki  morfologi dengan  kerapatan  yang  rendah.  Hal  ini  dapat  dikarenakan karena  biopoliester  yang  terbuat  dari  mikroorganisme  ini merupakan  biopolimer  yang  sangat  mudah  untuk  didegradasi akibat kerapatan antar molekulnya yang sangat rendah.

## IV. KESIMPULAN
PHA telah  berhasil  diproduksi  dari R.  pickettii berupa padatan berwarna putih. PHA yang dihasilkan sebesar 0,0425 g/g  sel  kering (4,25%).  Biopoliester  PHA    menunjukkan puncak  spektrum  FT-IR  pada  1022  cm -1 (ikatan  C-O-C polimer),  1737  cm -1 (ikatan  C=O  ester),  2852  cm -1 dan  2924 cm -1 (ikatan  CH 3 dan  CH 2 ),  3448  cm -1 (ikatan  O-H). Berdasarkan  hasil  SEM  yang  dilakukan,  sel yang  didapat mengandung  morfologi  granula  PHA  yang  hampir  sama dengan hasil penelitian sebelumnya oleh Aarthi, 2011.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  ucapan  terima  kasih  kepada  dosen pembimbing Drs. Refdinal Nawfa, M.S dan Prof.  Surya Rosa Putra.  Serta  penulis  menyampaikan  ucapan  terima  kasih  atas semua doa, dukungan dan bantuan yang telah diberikan kepada penulis selama proses  pengerjaan  penelitian dan  penyelesaian jurnal ilmiah ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Pilla, S. (2011). Handbook of Bioplastic and Biocomposites Engineerings Applications. Wiley, USA.
[2] Jung, Y. P.  (2002).  Metabolic  Engineering of Alcaligenes Eutrophus through teh Transformation of Cloned phbCAB genes for the investigation of the regulatory mechanism of polyhydroxyalkanoate biosynthesis.
Enzyme
Microbiol.Technol.26 , 201-208.
[3] Adley, C. P. (2007). Ralstonia Pickettii in Environmental Biotechnology  Potential  and  Apllications. Journal  of Applied Microbiology, 103 , 754-764.
[4] Anatia,  D.  (2007).  Pengaruh  suhu,  jenis,  dan perbandingan  pelarut  terhadap  kelarutan  bioplastik  dari PHA  (poly-hidroxyalkanoates)  yang  dihasilkan  Ralstonia Eutropha  pada  substrat  hidrolisat  pati  sagu,  . skripsi, Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor . [5] Asranudin; Surya  Rosa.  (2014). Efek  penambahan  PEG 400  pada  Plastik  PHA  yang  Diproduksi  Dari  Ralstonia pickettii. Prosiding Seminar Nasional Kimia.Jurusan Kimia, Universitas Negeri Surabaya .[6] Martha Aznury, Tjandra Setiadi, dan Adi Pancoro. (2010). Pengaruh  Sumber  Karbon  Terhadap  Produksi  Bioplastik Polihidroksialkanoat  (PHA)  dengan  Ralstonia  eutropha. Jurnal  Teknik  Kimia  Indonesia  Vol.9,  No.1  April  2010, 28-32 [7]  Junairiah, Ni’matuzzahroh, Suwito, H. (2014). Produksi Elisitor untuk Menstimulasi Metabolit Sekunder pada
Kultur Jaringan Tumbuhan . FMIPA Unair. Surabaya.
.