Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology Journal Homepage : http://jurnal.unpad.ac.id/ijpst/ UNPAD
Combination of Propolis Extract (Trigona Sp) and Ginger Rhizome (Zingiber Officinale Roscoe) as Alternative Antibiotics against Escherichia

## Coli In Vitro

## Abdul W. Jamaluddin, Muhammad F. Mursalim, Andi M. S. Apada

## Veterinary Study Program, Faculty of Medicine, Universitas Hasanuddin
Submitted 10 February 2019; Revised 8 May 2019; Accepted 21 August 2019; Published 18 October 2019 *Corresponding author: abdulwahidjamaluddin@unhas.ac.id

## Abstract
Escherichia coli is a gram negative bacterium which is a normal flora in the digestive tract. In birds, this bacterium causes a disease known as colibasillosis. Antibiotics are generally used, but excessive use will cause residues and antibiotic resistance. To avoid resistance or residue, an alternative treatment is needed. The combination of propolis and ginger extract is very promising to develop because both have a synergistic effect as antimicrobials. The research aims to determine the effect of the combination extract on Escherichia coli bacteria in vitro . We used 8 groups which contain combinations of propolis and ginger extract. We used amoxicillin disk as a positive control, 1% Na CMC as a negative control. The results showed a combination of ginger and propolis extract showed good inhibitory activity against Escherichia coli in all groups > 6 mm, and the highest inhibitory activity was K3 (5% propolis combination and 15% ginger extract) with 8.7 mm. The combination of propolis and ginger extract has the potential to be used as an alternative antibiotic to prevent antibiotic resistance from synthetic antibiotics.
Keywords: alternative antibiotics, combination extracts, Escherichia coli , ginger, in vitro , propolis Kombinasi Ekstrak Propolis (Trigona Sp) dan Rimpang Jahe (Zingiber Officinale Roscoe) sebagai Antibiotika Alternatif terhadap Escherichia Coli secara In Vitro
Abstrak Escherichia coli adalah bakteri gram negatif yang merupakan flora normal pada saluran pencernaan. Pada unggas, bakteri ini menyebabkan penyakit yang dikenal dengan sebutan kolibasillosis. Antibiotik umum digunakan, namun penggunaan yang berlebihan akan menyebabkan residu dan resistensi antibiotik. Untuk menghindarinya, dibutuhkan alternatif pengobatan. Kombinasi ekstrak propolis dan jahe sangat menjanjikan untuk dikembangkan karena keduanya memiliki efek sinergis sebagai antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek ekstrak kombinasi terhadap bakteri Escherichia coli secara in vitro . Penelitian ini menggunakan 8 kelompok perlakuan yang mengandung kombinasi propolis dan ekstrak jahe serta memakai disk amoksisilin sebagai kontrol positif, Na CMC 1% sebagai kontrol negatif. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak kombinasi jahe dan propolis memiliki aktivitas penghambatan terhadap Escherichia coli yang cukup baik di semua kelompok perlakuan > 6 mm, dimana konsentrasi tertinggi pada K3 (kombinasi propolis 5% dan ekstrak jahe 15%) memiliki efek yang paling baik, yaitu 8,7 mm. Kombinasi propolis dan ekstrak jahe memiliki potensi untuk digunakan sebagai antibiotika alternatif untuk mencegah resistensi antibiotik dari antibiotika sintetik.
Kata Kunci: antibiotik alternatif, ekstrak kombinasi, Escherichia coli , in vitro , jahe, propolis
1. Pendahuluan Resistensi bakteri terhadap antibiotik dapat mengakibatkan penyakit sulit diobati karena bakteri menjadi kebal, sehingga harus menggunakan antibiotik dengan dosis lebih tinggi, sebagai konsekuensinya harga menjadi lebih tinggi. 1 Disisi lain, beberapa ekstrak dari tumbuhan sudah banyak diteliti menjadi antibiotik alternatif terutama untuk mencegah food borne disease (penyakit yang disebabkan dari mengkomsumsi makanan) akibat infeksi bakteri. 2 Escherichia  coli adalah  penyebab penting foodborne  disease di  banyak negara,  Infeksi  pada manusia  oleh  bakteri Escherichia  coli sering  dihubungkan  dengan konsumsi  daging  sapi  yang  kurang matang dan  dapat  menyebabkan  diare  berdarah, nekrosis  jaringan  usus,  hemorraghic  colitis (HC)  dan  hemolytic uremic syndrome (HUS). 3 Selain itu pada peternakan ayam pedaging penanganan terhadap penyakit unggas yang disebabkan bakteri E.coli masih menggunakan antibiotik sintesis bahkan sering kali berlebihan. Antibiotik yang digunakan secara berlebihan ini rentan mengakibatkan residu pada ternak unggas. Residu antibiotik pada daging hewan dapat menyebabkan resistensi bakteri saat dikonsumsi oleh manusia sehingga sangat berbahaya untuk kesehatan. Oleh karena itu, perlu dicari pengganti antibiotik sintetik tersebut untuk mencegah residunya pada hewan yang akan dikonsumsi oleh manusia sehinggga akan menekan angka resistensi antibiotik. Jahe merupakan tanaman yang sangat  populer  di  Indonesia  yang  banyak digunakan sebagai tanaman obat baik pada hewan dan manusia. Menurut Nursal et al, 4 rimpang jahe-jahean mengandung senyawa antimikroba  golongan  fenol,  flavonoid, terpenoid dan minyak atsiri yang terdapat pada ekstrak jahe merupakan golongan senyawa bioaktif yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Pemanfaatan herbal sebagai bahan antimikroba telah banyak dilakukan secara global seperti yang juga dilakukan menggunakan buah khas india dan Pakistan yaitu Guar Bean ( Cyamopsis tetragonoloba ). 5 Penelitian yang dilakukan
Hanief, 6 bahwa ekstrak tanaman jahe dengan pelarut etanol 96% dapat memberikan efek hambat terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus viridans (p < 0,05).

## 2. Metode
2.1.  Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan adalah toples, kain saring, mangkok, eksikator, silika gel, botol, pisau, blender, timbangan, Erlenmeyer, evaporator/ rotavapor, water bath , herbs dryer, bunsen, korek api, rak tabung, autoclave, swab, label, inkubator, mikroskop, pinset, jangka sorong, cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur, sendok tanduk, objek glass dan ose.
Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri Escherichia coli yang diperoleh dari stock culture milik Laboratorium Mikrobiologi Unhas yang diisolasi pada agar miring, propolis, jahe, Eosin Methylene Blue Agar (EMBA), Muller Hinton Agar (MHA), akuades, paper disk , etanol 95%, alumunium foil, alkohol, disk amoksisilin, crystal violet, lugol, safranin, DMSO 10%, asam sulfat, reagen (wagner, mayer, dragendorf), serbuk magnesium.
2.2.  Prosedur Penelitian 2.2.1. Pembuatan ekstrak propolis dan jahe Propolis yang digunakan diperoleh dari Kabupaten Bulukumba sedangkan  jahe yang kami gunakan diperoleh dari pasar tradisional di Makassar yang homogen sebanyak masing- masing 4 kilogram. Kemudian dilakukan pembuatan ekstrak jahe di Laboratorium Biofarmaka PKP UNHAS. Tahap pertama dilakukan pengeringan pada propolis dan jahe dengan metode herbs dryer. Keduanya selanjutnya dibuat simplisia dengan memprosesnya menggunakan  blender kering untuk menghasilkan simplisia dalam bentuk serbuk. Kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan ditambah dengan pelarut etanol 96% dengan rasio biomassa sel : pelarut adalah 1:4 (b/v). Campuran biomassa dan pelarut tersebut diekstrak dengan gelombang ultrasonik pada frekuensi 50 kHz selama 30 menit. Hasil ekstraksi tersebut disaring dengan kain saring untuk menghilangkan
ampasnya sehingga diperoleh ekstrak dengan pelarut. Untuk mendapatkan ekstrak murni, dihilangkan pelarutnya menggunakan rotary vacuum evaporator suhu 49 o C, kecepatan 20 rpm, dan tekanan 176 mBar sampai tidak ada lagi pelarut yang menetes. Tahap akhir proses ekstraksi menggunakan etanol 96% untuk mengambil konsentrasi bahan-bahan aktif.
2.2.2. Pembuatan stok bakteri Pembuatan stok bakteri ini dilakukan untuk memperbanyak bakteri, dengan cara menginokulasikan 1 ose biakan murni bakteri E.coli dalam media agar darah, kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C di dalam inkubator.
2.2.3. Pembuatan konsentrasi kombinasi ekstrak propolis dan jahe Cairan kombinasi propolis dan jahe dibuat berdasarkan komposisi pada Tabel 1, menggunakan pembawa Na CMC 1%.
Penelitian ini dikerjakan secara triplet. Blank disc dimasukkan ke dalam masing-masing stok variabel konsentrasi selama 10-15 menit sebanyak 20 mikroliter.
2.2.4. Uji daya hambat ekstrak terhadap bakteri
Uji daya hambat ekstrak dengan menggunakan media Muller Hilton Agar yang telah diswab dengan bakteri Escherichia coli yang telah distandarkan dengan 0,5 Mc Farland, dengan pengulangan sebanyak 3 kali (triplo).  Kemudian semua cawan petri diinkubasi selama 18 - 24 jam pada suhu 37 ºC. Setelah diinkubasi, dilakukan pengukuran diameter zona menggunakan jangka sorong.
2.2.5. Analisis Data Analisis data pada penelitian ini dikumpulkan dan dianalisis secara deksriptif.

## 3. Hasil
Hasil uji organoleptik dari ekstrak kombinasi jahe dan propolis terdapat pada Tabel 2. Hasil pewarnaan gram didapatkan hasil yang berwarna merah yang menandakan bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif (Gambar 1a). Uji daya hambat ekstrak terhadap bakteri dapat dilihat pada Gambar 1b.  Hasil uji efek ekstrak kombinasi propolis dan jahe terdapat pada Tabel 3.

## 4. Pembahasan
Proses pembuaan ekstrak pada penelitian ini menggunakan pelarut etanol 70% hal tersebut dikarenakan etanol 70%

## Tabel 1. Kombinasi perbandingan ekstrak jahe dan propolis
Kelompok Perbandingan ekstrak jahe : propolis Kontrol negatif K9 Kontrol positif K10 Jahe 1 mL Propolis 1 mL K1 30% -
Na CMC 1% tanpa ekstrak Disk antibiotik amoksisilin oxoid K2 30% 1%
K3 30% 5% K4 15% - K5 15% 1% K6 15% 5% K7 - 1% K8 - 5%
Tabel 2. Hasil uji organoleptik dari ekstrak
Analisis ekstrak Hasil Bentuk Ekstrak Kental Warna Coklat kehitaman Bau Berbau Khas
masih mengandung air yang cukup banyak (30%) yang membantu proses ekstraksi sehingga sebagian senyawa tersebut ada yang dapat tertarik dalam etanol dan ada pula yang tertarik dalam air. 6
Ekstrak kombinasi ini memiliki efek terhadap bakteri Escherichia coli seperti yang telah ditunjukkan pada Gambar 1b. Kandungan senyawa metabolit sekunder pada tanaman jahe-jahean terutama golongan flavonoid,  fenol,  terpenoid,  dan  minyak atsiri. Flavonoid juga merupakan salah satu kandungan senyawa kimia yang penting pada propolis, dimana mekanisme dari Senyawa  flavonoid  yaitu  dengan  membuat kerusakan permeabilitas dinding sel bakteri. Hal ini akhirnya mengakibatkan sel bakteri mengalami lisis. 8 Zona hambat terhadap beberapa bakteri gram negatif maupun positif sudah banyak ditemukan. 9 Apabila diameter zona hambat yang terbentuk lebih besar atau sama dengan 6 mm, maka ekstrak dikategorikan memiliki aktivitas antibakteri dan bila diameter zona hambat yang terbentuk lebih kecil dari 6 mm atau tidak terbentuk, maka dikategorikan
ekstrak tersebut tidak memiliki aktivitas antibakteri. 10
Hasil pengukuran uji efek pada Tabel 3. Menunjukkan bahwa kombinasi ekstrak propolis dan jahe memilki aktivitas antibakteri pada semua konsentrasi dengan diameter penghambatan mulai dari 6,1 mm. Hal ini menarik karena penelitian ini hanya menggunakan konsentrasi yang relatif kecil. Kelompok dengan aktivitas penghambatan bakteri paling besar adalah kelompok K3 dengan nilai penghambatan 8,7 mm. K3 merupakan kombinasi ekstrak jahe 30% dengan ekstrak propolis 5%.  Berdasarkan hal tersebut, ekstrak kombinasi seluruh kombinasi pada penelitian ini memiliki aktivitas menghambat bakteri Escherichia coli . Kandungan ekstrak propolis terbesar yang digunakan dalam penelitian ini adalah 50 mikrogram/mL sudah memberikan penghambatan mulai dari 6,1 mm yang mana hasil ini lebih baik dari yang dilakukan peneliti sebelumnya menggunakan ekstrak metanol  propolis untuk penghambatan E.coli dengan kandungan 750 mikrogram/mL 6.0 mm. 11
(a)
(b)
Gambar 1. (a) Pewarnaan gram E.coli sebagai gram negatif, (b) hasil uji efek ekstrak
Tabel 3. Hasil uji efek ekstrak kombinasi propolis dan jahe
Pengulangan Kontrol (mm) Diameter zona hambat (mm) K9 K10 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 1 6,6 21 6,5 7 8,5 7,1 7,4 8,3 6,8 7,7 2 6,6 25,4 7,1 6,1 8,9 6,5 8,4 6,2 6,2 7,1 Rata-rata 6,6 23 6,8 6,55 8,7 6,8 7,9 7,25 6,5 7,4
Keterangan: K9 =  Na CMC 1% (kontrol negatif); K10 = disk amoksisilin 30 µg (kontrol positif)
E. coli yang merupakan bakteri zoonosis mampu memindahkan penyakit dari hewan ke manusia, diantaranya bisa menyebabkan enterohemoraghic jika manusia memakan daging yang terkontaminasi E. coli . 12
Semakin tinggi konsentrasi ekstrak masing masing bagian baik ekstrak jahe maupun ekstrak propolis maka semakin besar diameter zona hambat terhadap pertumbuhan bakteri.  Itu  disebabkan  karena  semakin tingginya konsentrasi maka semakin banyak ekstrak yang terkandung sehingga senyawa- senyawa yang dimiliki ekstrak semakin banyak. Konsentrasi ekstrak menurut  Putri et al 13 akan mempengaruhi kecepatan difusi zat aktif, makin besar konsentrasi ekstrak maka makin cepat difusi akibatnya makin besar daya antibakteri dan makin luas diameter zona hambatan yang terbentuk. Untuk itu, kombinasi yang mengandung jenis rimpang ini kemungkinan juga menjanjikan untuk dikembangkan  sebagai zat aktif lain misalnya saja sebagai antioksidan 14 diantaranya gingerol, shogaol dan zingeron 15 ditambah lagi dengan kandungan minyak atsiri dari jahe yang terbukti mampu membunuh bakteri lain seperti Staphylococcus aures . 14

## 5. Simpulan
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak kombinasi jahe dan propolis memiliki efek antibakteri terhadap Escherichia coli pada semua kelompok kombinasi  dimana konsentrasi tertinggi berada pada Kelompok 3  yang merupakan kombinasi ekstrak jahe 30% dengan ekstrak propolis 5%.  Dengan diameter penghambatan 8,7 mm. Kombinasi propolis dan ekrak jahe ini memiliki potensi untuk digunakan sebagai antibiotika alternatif untuk mencegah resistensi antibiotik dari antibiotika sintetik.

## 6. Ucapan Terimakasih
Terimakasih kepada LPPM UNHAS yang telah membiayai penelitian ini.
Pustaka
1.  Warbung, Yanti Y., Vonny N.S. Wowor dan Jimmy Posangi. Daya Hambat Ekstrak Spons Laut Callyspongia sp terhadap
Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus. Jurnal e-Gigi, 2013: Vol 1, No 2.
2.  Jamaluddin AW, Muslimin LW, Djide MN. Ekstrak Daun Jambu Biji ( Psidium guajava L) sebagai inhibitor pertumbuhan bakteri zoonosis Proteus mirabilis yang diisolasi dari daging ayam broiler. Jurnal As-Syifaa. 2018;10(01): 30-36.
3.  Rananda, Rezki Muhammad Aziz Djamal, Juliza. Identifikasi  Bakteri Escherichia coli O157:H7  dalam  Daging Sapi yang Berasal dari Rumah Potong Hewan Lubuk Buaya. Jurnal :kesehatan Andalas,2016 Vol 5(3): 614-618.
4.  Nursal, Wulandari S., dan Juwita W.S. Bioaktivitas Ekstrak Jahe ( Zingiber officinale Roxb.) Dalam Menghambat Pertumbuhan Koloni Bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis . J. Biogenesis 2006:2(2) : 64 66.
5.  Singh, N., Arya, R. S., Sharma, T., Dhuria, R. K., Garg, D. D., 2008. Effect of feeding of clusterbean ( Cyamopsis tetragonoloba ) straw based complete feed in loose and compressed form on rumen and haemato-biochemical parameters in Marwari sheep. Vet. Pract., 2008:9 (2): 110-115
6.  Hanief S, Efektivits jahe ( Zingiber officinale
R) terhadap bakteri Streptococcus viridans (Skripsi), Jakarta: UIN Syarif Hidaytullah;. 2013
7.  Sani,   Robby    Nasrul, Fithri    Choirun Nisa, Ria   Dewi    Andriani,  Jaya Mahar Maligan.  Analisis Rendemen Dan Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Mikroalga Laut Tetraselmis Chuii. Jurnal Pangan Dan Agroindustri 2014:Vol.2 No.2 P.121-126.
8.  Kurniawan, Betta dan Wayan Ferly Aryana. Binahong ( Cassia Alata L) As Inhibitor  Of Escherichia coli Growth. J Majority. 2015:Volume 4 Nomor 4. 100- 104
9.  Ajizah,  Aulia.  2004.  Sensitivitas Salmonella  Typhimurium Terhadap Ekstrak Daun Psidium Guajava L. Bioscientiae Volume 1, Nomor 1, Januari 2004. Hal 31-38
10. Tampedje, Ayu A.D, Josef S.B

## Tuda,  Michael,  A.Leman.  UJI  EFEK
ANTIBAKTERI  EKSTRAK  DAUN JAMBU  BIJI  ( Psidium guajava Linn.) TERHADAP PERTUMBUHAN KOLONI Streptococcus mutans. Jurnal Ilmiah Farmasi. 2016: Vol. 5 No. 3:222- 228
11. Syed A. T. W. Yusop, Mohd R. Asaruddin, Ahmad H. Sukairi, Wan M. A. W. Sabri. Cytotoxicity and Antimicrobial Activity of Propolis from Trigona itama Stingless Bees against Staphylococcus aureus and Escherichia coli .  IJPST  -  SUPP  1(1), 2018; 13-20
12. Lucia Winata Muslimin, Abdul Wahid Jamaluddin, Ressy Dwiyanti, Mochammad Hatta. Antimicrobial inhibition on zoonotic bacterial Escherichia coli O157: H7 as a cause of food borne disease. American Journal of Biomedical and Life Sciences 2014; Vol 2(6): 163-166
13. Putri, Andryana Vera Anindya Astri; Noor  Hafida  Dan  Vera  Megawati. Pengaruh Daya Antibakteri Ekstrak Daun Stevia ( Stevia Rebaudiana Bertoni) Pada Konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40% Dan
80% Terhadap Streptococcus Mutans (In Vitro). Jurnal Ilmu Kedokteran Gigi. 2017;Vol1.No1:9-14
14. Triyono Triyono, Anis Y. Chaerunisaa, Anas Subarnas. Antioxidant Activity of Ethanol Extract of Turmeric Rhizome ( Curcuma domestica Val), Trengguli Bark ( Cassia  fistula L),  and  Its  Combination with DPPH Method. Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 2018; Vol 5.No.2 : 43-48
15. F Firdausni, K Kamsina. Pengaruh pemakaian jahe emprit dan jahe merah terhadap  karakteristik  fisik,  total  fenol, dan kandungan gingerol, shogaol ting- ting jahe ( Zingiber  officinale ). Jurnal Litbang Industri. 2018 Vol 8, No 2: 61 – 66
16. Muhammad Halim Natsir, Eko Widodo dan Muharlien. Penggunaan Kombinasi Tepung Kunyit ( Curcuma domestica ) Dan Jahe ( Zingiber  officinale ) Bentuk Enkapsulasi Dan Tanpa Enkapsulasi Terhadap Karakteristik Usus Dan Mikroflora Usus Ayam Pedaging.Buletin Peternakan. 2016. Vol. 40 (1): 1-10