## Identifikasi Protein Imunogenik Kelenjar Saliva Vektor Malaria
Anopheles vagus Berdasarkan Analisis Mass Spectrometry Identification of Immmunogenic Salivary Proteins of Anopheles vagus based on Mass Spectrometry Analysis
Dwi Esti Febriyantiningsih *) , Kartika Senjarini, Rike Oktarianti Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember (UNEJ) *) E-mail: dwiesti.febriyantiningsih@gmail.com

## ABSTRACT
Malaria has been prevalent for a long time in tropical developing regions causing great morbidity and mortality. Among the malaria vectors, Anopheles vagus has been known as secondary malaria vector in East Java. Salivary glands of mosquitoes perform various functions for survival of the vectors  and  also  conducive  for  blood  feeding, harbouring  of  malaria  parasites,  and  eventual parasite transmission. The salivary gland proteomes of An. vagus have not been carried out yet. The aim of our study was to identify and characterize the immunogenic proteins of salivary glands proteins  of An. vagus . A  proteomic  approach  combining  one-dimensional  electrophoresis  (1DE) followed by western blot analysis using human sera from healthy people living in an endemic area (Kendal); liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS/MS) and bioinformatic analysis was adopted  to  provide  the  first  direct  insight  into  identification  and  characterization  of  salivary proteins  of An.  vagus .  Identification  of  immunogenic  proteins  using  western  blot  analysis  has revealed three immunogenic bands which had molecular weights of 69, 75 and 232 kDa. Among those  proteins  analysed  by  LC-MS/MS,  there  were  alpha,1-4  glucan  phosphorylase,  putative myosin class I heavy chain which have the highest number of total spectrum count peptide. Other proteins like vitellogenin and heat shock protein 82 (Hsp82) were also identified. The majority of proteins  were  scrutinized  marked  for  their  role  in  metabolism,  cytoskeleton  protein  and  stress response.
Keywords: Anopheles vagus , salivary gland, immunogenic, proteomics

## PENDAHULUAN
Malaria  telah  menjadi  prevalensi  sejak  lama yang  menyebabkan  kematian  serta  morbiditas yang tinggi. Menurut laporan yang dikeluarkan oleh  WHO  pada  tahun  2013  diperkirakan sebanyak  3,4  miliar  manusia  beresiko terjangkit  malaria  dan  207  juta  kasus diantaranya telah menjadi kasus global (WHO, 2013).  Diantara  beberapa  vektor  malaria  yang ditemukan  pada  wilayah  Indo-Pakistan, Anopheles  aconitus menjadi  vektor  primer dalam  penyebaran  penyakit  malaria  di  pulau Jawa, diikuti oleh vektor Anopheles maculatus , An.  sundaicus dan Anopheles  vagus
(Kirnowardoyo et al ., 1985; Kirnowardoyo dan
Supalin, 1986).
Saliva  vektor Arthropoda mengandung bahan  yang  bersifat  imunogenik  yang  dapat menghambat hemostatis, vasokonstriksi, menghambat inflamasi serta respon imun inang
(Ribeiro, 1995; Billingsley et al ., 2006; Ribeiro dan  Arca,  2009;  Ribeiro  dan  Francischetti, 2003;  Cornelie et  al .,  2007;  Remoue et  al ., 2006;  Londono-Renteria et  al .,  2010;  Orlandi
et  al .,  2007)  sehingga  dapat  dimanfaatkan sebagai  vaksin  yang  dapat  menghambat transmisi  ( Transmission  Blocking  Vaccine ) (Lavazec et al ., 2007). Karakterisasi  dan  identifikasi  substansi dalam  kelenjar  saliva Arthropoda ,  khususnya Anopheles telah  banyak  dilakukan  baik  secara transcriptomic (Francischetti et al ., 2002; Arca et  al .,  2005), maupun  secara proteomic (Peng et  al .,  1998;  Lawson et  al .,  2007),  namun sebagian  besar  hanya  dilakukan  pada  vektor primer  yang  dianggap  penting  dalam  proses transmisi  parasit  malaria,  misalnya An. gambiae , An.  stephensi , An.  arabiensis , An. funestus , An. albimanus , An. darlingi (Fontaine et al ., 2012), An. barbirostris (Phattanawiboon et  al .,  2014)  dengan  wilayah  penyebaran meliputi  benua  Afrika,  daerah  Timur  Tengah, subkontinen India, Amerika Selatan (VectorBase, 2015). Di wilayah Asia Tenggara seperti  Indonesia,  yang  menjadi  vektor  primer adalah An. aconitus dan An. maculatus , diikuti oleh An.  sundaicus dan An.  vagus sebagai vektor sekunder (Elyazar et al ., 2013).
Sejauh  ini,  penelitian  TBV  ( Transmission Blocking  Vaccine )  oleh  tim  riset  FMIPA-
Universitas Jember  untuk  penyakit  malaria telah  dilakukan  pada  tiga  vektor  yaitu An. aconitus , An.  maculatus ,  dan An.  sundaicus baik secara serologis, bionomik, transkriptomik,  dan  proteomik  (Senjarini, 2013;  Armiyanti,  2015),  sedangkan  untuk dengue ,  penelitian  dilakukan  pada  vektor utama  yaitu Aedes  aegypti (Oktarianti,  2015). Sementara An.  vagus yang  tidak  dianggap sebagai  vektor  penting  pada  penularan  parasit malaria, belum banyak diungkap, padahal pada kondisi  tertentu  nyamuk  ini  diketahui  menjadi salah satu vektor penyebar parasit Plasmodium, bahkan parasit Wuchereria bancrofti penyebab kaki  gajah  pada  manusia  (Manguin et  al ., 2010). Jika  substansi  dalam  kelenjar  saliva nyamuk  yang  bersifat  imunogenik  mampu berperan  sebagai  immunomodulator,  maka isolasi  dan  karakterisasi  komponen  tersebut penting  dilakukan  sebagai  informasi  awal  dan basis  bagi  pengembangan  metode  untuk mengendalikan  atau  bahkan  menghambat transmisi  dan  perkembangan  parasit  yang dibawa  oleh  nyamuk.  Karakterisasi  dilakukan dengan  analisis Liquid  Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS).

## METODE
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan  Januari  sampai Mei  2016  di  Laboratorium  Bioloteknologi  FMIPA UNEJ  dan Core  Facility  Proteomics  University Medical Center, Göttingen-Germany.
Alat dan Bahan Alat-alat  yang  digunakan:  seperangkat  alat  SDS- PAGE,  seperangkat  alat Western  Blot (WB) semi- dry ,  eppendorf,  mikropipet,  mikrotip, magnetic stirrer , jarum serangga, mikroskop stereo, penangas air,  kertas  Whatman  70  mm,  membran  PVDF ( Polyvynilidene difluoride ).
Bahan-bahan yang digunakan: nyamuk Anopheles  vagus ,  NaCl  0,5%,  PMSF  dalam  PBS, akril/bis-akrilamid  30%  (29,2  gr  akrilamid;  0,8  gr bis  akrilamid),  buffer  elektroda  1x  (3  gr  Trisma base; 14,4 gr Glysine; 1 gr SDS), buffer sampel 5x (0,6 ml 1 M Tris-HCl (pH 6,8); 5 ml 50% Glycerol; 2 ml 10% SDS; 0,5 ml 2-merchaptoethanol; 1 ml 1 %  Bromo  Phenol  Blue;  0,9  ml  H 2 O), Staining solution (1  gr  Coommassie  Blue  R-250;  450  ml Methanol; 450 ml H 2 O; 100 ml Glacial Acetic Acid ); Destaining  solution (100  ml  Methanol;  100  ml Glacial  Acetic  Acid ;  800  ml  H 2 0),  APS  10%, TEMED, TBS pH 7,4 (8 gr NaCl; 0,2 gr KCl; 3 gr Trisma base),Transfer Buffer (3,034 gr Trisma base;
1,44  gr  Glycine;  200  ml  methanol),  NBT/BCIP (ScyTek  Laboratories  Inc.),  ladder  protein  prestain (INTRON),  5%  skimmed  milk  dalam  TBS  (w/v), serum darah manusia (sehat endemik malaria).
Prosedur Penelitian Koleksi  nyamuk An.  vagus dan  Isolasi  Kelenjar Saliva Anopheles  vagus yang  digunakan  meupakan  hasil landing  collection dari  Kendal,  Jawa  Tengah. Nyamuk dewasa hasil tangkapan dimasukkan dalam paper cup dengan sumbat kain kassa di bagian atas. Isolasi  kelenjar  saliva  nyamuk  dilakukan berdasarkan  metode  dari  Barber  dan  Rice  (1936). Nyamuk  betina  dewasa  dilemahkan  dengan memasukkannya  pada freezer selama  1  menit, kemudian  diletakkan  di  atas  gelas  benda  yang ditetesi larutan garam fisiologis (NaCl 0,5%) dengan bagian  kepala  berada  di  sisi  kanan  gelas  benda. Selanjutnya  kepala  ditarik  secara  perlahan menggunakan  jarum  diseksi  hingga  terlepas  dari bagian badan dengan posisi jarum diseksi di sebelah kiri menekan bagian thorak nyamuk. Kelenjar saliva yang  melekat  pada  bagian  kepala  nyamuk dipisahkan dan  dimasukkan  dalam  eppendorf  berisi larutan  PBS-PMSF.  Kelenjar  saliva  yang  telah diisolasi  disimpan  dalam suhu -20 o C  hingga diperlukan.
Analisis SDS-PAGE (1 dimensi) dan Western Blot Metode  SDS-PAGE  dilaksanakan  berdasarkan prosedur  dari  Laemmli  (1970)  dengan  sedikit modifikasi.  Sampel  protein  dianalisis  pada  gel akrilamid 12,5%. Elektroforesis dilakukan selama 2 jam  pada  tegangan  konstan  120  V.  Gel  hasil elektroforesis  kemudian  diwarnai  menggunakan larutan Commassie Briliant Blue R-250.
Analisis Western  Blot dilakukan  berdasarkan metode  dari  Harlow  dan  Lane  (1999)  dengan beberapa  modifikasi.  Pita  protein  hasil  SDS-PAGE ditransfer  pada  membran  PVDF  ( Polyvinylidene Difluoride ) selama 1 jam pada temperatur ruang dan tegangan  konstan  100  mA.  Analisis Western  Blott yang  digunakan  adalah semi-dry  method. Selanjutnya  dilakukan  proses  imunobloting  dengan mereaksisilangkan  antigen  pada  membran  dengan antibodi primer yang berasal dari serum orang sehat daerah endemik malaria (1:500). Sementara antibodi sekunder  yang  digunakan  berupa Goat-anti  Human IgG alkaline  phosphatase  conjugate (1:5000). Visualisasi dilakukan dengan menambahkan substrat Nitro  Blue  Tetrazolium- ( 5-Bromo-4-Chloro-3- Indolyl-Phosphatase ) (NBT-BCIP). Reaksi dihentikan  dengan  mencelupkan  membran  dalam akuades dan dikering anginkan.
Identifikasi  Protein  Imunogenik  menggunakan LC-MS/MS a. Preparasi Sampel Preparasi sampel dilakukan berdasarkan metode dari Atanassov  dan  Urlaub  (2013).  Sampel  berupa potongan  gel  SDS-PAGE  yang  diprediksi  sebagai protein  imunomodulator  putatif  direduksi  dengan
dithiothreitol  (DTT),  dialkilasi  dengan  2- iodoacetamide  dan  di- digest dengan  tripsin  selama semalam.  Campuran  peptida  yang  dihasilkan selanjutnya  diekstrak  dan  dikeringkan  pada SpeedVac, lalu dilarutkan pada 2% acetonitrile/0,1% formic  acid  (v/v).  Tiga  kali  injeksi  larutan  peptida masing-masing sebanyak 5µL selanjutnya dianalisis menggunakan nano LC-MS/MS.
b. Analisis Mass Spectrometry dengan LC-MS/MS Sampel  peptida  dimasukkan  pada  pre-kolom  C18 fase  terbalik  (0,15  mm  diameter  internal  x  20  mm, Reprosil-Pur  120  C18-AQ  5  µm,  Ammerbuch- Entringen,  Germany)  dan  dipisahkan  pada  sebuah kolom  C18  fase  terbalik  (0,075  mm  diameter internal x 200 mm Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm, Dr. Maisch) dengan 5-35% acetonitrile/0,1% formic acid  (v/v)  menggunakan  gradien  linear  selama  30 menit  pada  kecepatan  300  nL/menit).  Eluent selanjutnya  dianalisis  pada  sebuah Q  Exactive hybrid  quadrupole/orbitrap mass  spectrometry (ThermoFisher Scientific, Germany) yang dilengkapi  dengan  sumber  nanoSpray  FlexIon  dan dioperasikan menggunakan software Excalibur 2.4. c. Analisis Data Mass Spectrometry Semua  spektra  hasil mass  spectometry diekstrak menggunakan software Raw2MSMS  v1.17  (Max Planck  Institute  for  Biochemistry,  Germany). Identifikasi  protein  dilakukan  menggunakan software MASCOT  2.4  (Matrixscience,  London- UK).  Spektra  MS/MS  selanjutnya  diidentifikasi/ dicocokkan  dengan database protein Anopheles (sebanyak  599919  entri  protein)  pada  UniProtKB v2015.12,  serta  protein-protein  kontaminan  yang sering  ditemukan  pada  laboratorium  tempat mengerjakan MS/MS (sebanyak 51 set kontaminan). Parameter pencarian yang digunakan adalah sebagai berikut: toleransi massa awal di set pada 10 ppm dan toleransi fragmen ion 0,05 Da dengan tripsin sebagai enzim dan iodoacetamide sebagai cysteine blocking agent .  Maksimum  sebanyak  dua  tempat  pemutusan tripsin  dan metionin  oxidation diperbolehkan. Software Scaffold v 4.4.1.1 (Proteome Software Inc, Portland,  OR)  digunakan  untuk  memvalidasi MS/MS peptida dan identifikasi protein. Identifikasi peptida diterima bila dapat mencapai atau  probabilitas  lebih  dari  95%  menggunakan algoritma Protein Prophet (Nesvizhskii et al ., 2003). Identifikasi  protein  dapat  diterima  bila  dapat mencapai  atau  lebih  dari  99%  dengan  setidaknya terdapat  2  peptida  yang  diketahui.  Protein  yang memiliki  susunan  peptida  yang  serupa  dan  tidak dapat  dibedakan  hanya  menggunakan  analisis MS/MS  akan  dikelompokkan  menjadi cluster-
cluster dengan  prinsip  parsimoni  ( Gene  Ontology ) (Ashburner et al ., 2000).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis SDS-PAGE (1 dimensi) dan Western Blot Hasil visualisasi gel SDS-PAGE kelenjar saliva An.  vagus menggunakan  larutan staining diperoleh setidaknya 6 pita protein mayor yang memiliki ukuran berkisar antara 25 kDa hingga lebih dari 245 kDa, serta beberapa pita protein minor,  sementara  hasil western  blotting menunjukkan  adanya  tiga  pita  protein imunogenik  yang  memiliki  kisaran  berat molekul  masing-masing  yaitu  69,  75  dan  232 kDa.  Pengukuran  berat  molekul  dilakukan berdasarkan  metode  dari  Neville  (1971)  yaitu dengan memetakan jarak migrasi protein dalam kurva  persamaan  regresi  linier.  Keberadaan protein  imunogenik  ini  menunjukkan  adanya antigen  dalam  kelenjar  saliva An.  vagus yang dikenali  oleh  antibodi  dari  serum  manusia. Protein  selanjutnya  akan  dikarakterisasi  lebih lanjut menggunakan analisis mass spectrometry untuk  mengetahui  protein-protein  penyusun pita protein imunogenik An. vagus berdasarkan hasil western blotting . Identifikasi  Protein  Imunogenik  dengan Analisis LC-MS/MS Sampel  protein  di- digest secara  enzimatis selama  semalam  menggunakan  enzim  tripsin untuk  memecah  polimer  protein  menjadi peptida  yang  lebih  sederhana  (Kelleher et  al ., 1999; Meng et al ., 2002). Peptida hasil digesti selanjutnya  dianalisis  menggunakan  nano  LC- MS/MS  dan  data  (spektra  MS)  diidentifikasi menggunakan software MASCOT.  Penentuan identitas protein dilakukan dengan membandingkan  ( blast )  hasil  interpretasi MASCOT dengan database protein Anopheles pada  UniProtKB  v.2015.12.  Analisis  peptide untuk  tiap  sampel  gel  terindikasi  imunogenik dilakukan sebanyak tiga kali (RO_1, RO_2 dan RO_3). Berdasarkan Tabel 1, beberapa protein yang ditemukan memiliki nilai total spectrum count peptide yang tinggi ( highlight abu-abu). Hal ini mengindikasikan  protein  tersebut  merupakan protein  yang  paling  banyak  ditemukan  pada pita protein 69 kDa.
Gambar 1. Elektroforegram protein kelenjar saliva An. vagus pada gel akrilamid 12,5% (a); Western blot dengan serum orang sehat endemik malaria (kiri) dan non endemik malaria (kanan) (b).
Tabel 1. Katalog protein kelenjar saliva pita 69kDa
Tabel 2. Katalog protein kelenjar saliva pita 75 kDa
Terdapat pula protein yang termasuk dalam kelompok heat  shock  protein 82 family
(Hsp82)  yang  berperan  utama  dalam menyediakan pertahanan untuk melawan stress eksternal  (Lund et  al .,  2001;  Parsell  and
Lindquist,  1993;  Feder  and  Hofmann,  1999; Rinehart et  al .,  2007).  Berdasarkan  penelitian oleh  Benoit et  al .,  (2011),  diketahui  proses digesti nyamuk yang melakukan blood feeding pada hewan berdarah panas ( endoterm / homoiterm )  menurun  aktivitasnya oleh  adanya  supresi  gen  Hsp. Proses  digesti protein  yang  lambat  akan  menyebabkan penurunan  jumlah  serapan  nutrisi  yang dibutuhkan  oleh  nyamuk,  salah  satunya  untuk pembentukan telur (Denlinger, 2011).
Sementara  pada  pita  protein  75  kDa  dan 232  kDa,  protein  dominan  yang  ditemukan dengan  nilai total  spectrum  count  peptide tertinggi  adalah  protein alpha-1,4  glucan phosphorylase dan putative  myosin  class  I heavy chain . Protein-protein tersebut merupakan  protein  struktural  yang  berperan sebagai protein sitoskeleton dan metabolisme. Protein  myosin  (Tabel  2  dan  Tabel  3) adalah  protein  sitoskeleton  yang  termasuk dalam housekeeping protein yang  berperan penting  pada  kelenjar  saliva Anopheles (Vijay et  al .,  2014).  Menurut  Kappe et  al .  (2004), kompleks  aktin-myosin  berfungsi  membantu pergerakan sporozoite plasmodium dari bagian korteks  membran  plasma  ke  membran  luar IMC ( Inner Membrane Complex ). Myosin  terikat  dengan  bagian  IMC  dan  aktin yang berlawanan dengan membran berinteraksi dengan  sitoplasma  TRAP  ( Thrombospondin- Related Adhesive Protein ) melalui fructose 1,6- bifosfat aldolase (Bosch et al ., 2007). Selain itu juga terdapat protein vitellogenin (Tabel  3).  Gen  vitellogenin  (Vg)  berfungsi sebagai  prekursor  protein  telur  nyamuk  ( egg yolk ) saat perkembangan ovary yang diregulasi oleh  hormon juvenile ,  dan  diketahui  nyamuk mensintesis  vitellogenin  pada  badan  lemak setelah blood  feeding (Hagedorn,  1977). Keberadaan  vitellogenin  menandakan  adanya kontaminasi  badan  lemak  yang  ikut  terbawa saat isolasi kelenjar saliva (Das et al ., 2010).
Tabel 3. Katalog protein kelenjar saliva pita 232 kDa
Berdasarkan  hasil  interpretasi  MASCOT dengan database protein Anopheles pada UniProtKB  v.2015.12  menunjukkan  identitas protein-protein  dominan  tersebut  diatas,  yaitu Cluster  of  AGAP002518-PA,  Cluster  of Aconitate hydratase, mitochondrial (Fragment),  alpha-1,4  glucan  phosphorylase dan putative myosin class I heavy chain bukan termasuk kedalam kelompok protein imunogenik. Nilai total spectrum count peptide yang  tinggi  belum  dapat  menentukan  suatu protein  yang ditemukan  bersifat  imunogenik. Salah  satu  faktor  penting  lain  yang  harus dimiliki  protein  agar  bersifat  imunogenik adalah  adanya signal  peptide ,  yaitu  suatu prekursor  protein  yang  mengandung  residu asam amino (sekitar 15-30 residu) pada bagian N-terminalnya (Petersen et. al ., 2011). Mayoritas  protein  dominan  yang  berhasil teridentifikasi merupakan housekeeping protein yang  berperan  sebagai  protein  protein struktural. Namun  demikian,  beberapa  protein lain  yang  berhasil  diidentifikasi,  terindikasi memiliki potensi  imunogenitas  dengan ditemukannya signal  peptide walaupun  nilai total  spectrum  count  peptide -nya  tidak  terlalu tinggi (data tidak dipublikasikan). Dengan  mengetahui  karakter  protein meliputi fungsi serta kelimpahan sekuens asam amino  penyusun  protein  ( total  spectrum  count peptide ),  diharapkan  mampu  memberikan informasi  awal  untuk  analisis  selanjutnya
mengenai  potensi  protein-protein  tersebut sebagai  kandidat  imunogen  yang  kelak  dapat dipergunakan  untuk  kepentingan  berbagai intervensi  imunologis  sebelum  dilakukan ekspresi protein tersebut.

## KESIMPULAN
Tiga  protein  imunogenik  teridentifikasi  dari kelenjar saliva An. vagus menggunakan analisis western  blotting dengan  serum  orang  sehat endemik  malaria  yang  memiliki berat  molekul ~69,  ~75  dan  ~232  kDa.  Berdasarkan  analisis LC-MS/MS  diketahui  mayoritas  protein imunogenik  tersebut  merupakan  protein struktural  yang  berperan  dalam  metabolisme, protein sitoskeleton dan respon stress.

## DAFTAR PUSTAKA
Arca,  B.,  Lombardo,  F.,  Valenzuela,  J.G., Francischetti,  I.M.,  Marinotti,  O.,  Coluzzi, M.,  Ribeiro,  J.M.  2005.  An  updated catalogue  of  salivary  gland  transcripts  in the  adult  female  mosquito, Anopheles gambiae . Journal of Experimental Biology . 208: 3971-3986.
Armiyanti  Y.,  Nuryady  M.M.,  Arifianto  R.P.,
Nurmariana  E.,  Senjarini  K.,  Fitri  L.E., Sardjono  T.W.  2015.  Detection  of immunogenic  proteins  from Anopheles sundaicus salivary  glands. Revista  da
Sociadade Brasileira de Medicina Tropical . 48(4):410-416. Ashburner,  M.,  Catheine,  A.B.,  Judith,  A.B., David,  B.,  Heather,  B.,  Michael,  C.,  Alan, P.D.,  Kara,  D.,  Selina,  S.D.,  Janan,  T.E., Midori,  A.H.,  David,  P.H.,  Laurie,  I.T., Andrew, K., Sezanne, L., John, C.M., Joel, E.R.,  Martin,  R.,  Gerald,  M.R.,  Gavin,  S. 2000.  Gene  ontology:  tool  for  the unification of biology. The Gene Ontology
Consortium. Nat. Genet . 25: 25-29. Atanassov,  I. & Urlaub,  H.  2013.  Increased proteome  coverage  by  combining  PAGE and peptida isoelectric focusing: comparative  study  of  gel-based  separation approaches. Proteomics . 13: 2947-2955.
Benoit,  J., Lopez-Martinez,  G.,  Patrick,  K., Phillips,  Z.,  Krause,  T., & Denlinger,  D.
2011.  Drinking  a  hot  blood  meal  elicits  a protective  heat  shock  response  in mosquitoes. Proceedings  of  the  National Academy  of  Sciences (PNAS).  108:  8026-
8029.
Billingsley,  P.F.,  Baird,  J.A.,  Mitchell, & Drakeley,  C.  2006.  Immune  interactions between  mosquitoes  and  their  hosts. Parasite Immunology . 28: 143–153. Bosch,  J.,  Buscaglia,  C.A.,  Krumm,  B., Ingason,  B.P.,  Lucas,  R.,  Roach,  C.,
Cardozo, T., Nussenzweig, V., Hol, W.G.J. 2007. Aldolase provides an unusual binding site for thrombospondin-related anonymous protein  in  the  invasion  machinery  of  the malaria parasite. Current Issue . 104: 7015- 7020.
Cornelie,  S.,  Remoue,  F.,  Doucoure,  S., Ndiaye,  T.,  Sauvage,  F.X.,  Boulanger,  D., Simondon,  F.  2007.  An  insight  into immunogenic salivary proteins of
Anopheles gambiae in  African  children.
Malaria Journal . 6:75.
Das,  S.,  Radtke,  A.,  Choi,  Y.J.,  Mendes,  A., Valenzuela, J.G. 2010. Transcriptomic and functional  analysis  of  the Anopheles gambiae salivary gland in relation to blood feeding. BMC Genomics . 11: 566. Denlinger,  D.  2011.  Study  shows  how mosquitoes  handle  the  heat  of  a  hot  blood meal. (on line). http://researchnews.osu.edu/archive/hotbloo d.htm. [tanggal 19 Mei 2016]. Elyazar,  I.R.F.,  Marianne,  E.S.,  Peter,  W.G., Siti,  N.T.,  Asik,  S.,  Rita,  K.,Winarno., J.Kevin, B., Simon, I.H., Bangs, M.J. 2013.
The  Distribution  and  Bionomics  of
Anopheles Malaria  Vector  Mosquitoes  in Indonesia:  Chapter  Three.
Advances  in
Parasitology . 83: 173-266.
Feder, M.E., Hofmann, G.E. 1999. Heat-shock proteins,  molecular  chaperones,  and  the stress response: evolutionary and ecological physiology. Annual  Review  of  Physiology .
61: 243–282. Fontaine, A., Fusai, T., Briolant, S., Buffet, S., Villard,  C.,  Baudelet,  E.,  Pophillat,  M., Granjeaud,  S.,  Rogier,  C.,  Almeras,  L. 2012. Anopheles salivary  gland  proteomes from  major  malaria  vectors.
BMC Genomics . 13: 614. Francischetti,  I.M,,  Valenzuela,  J.G.,  Pham, V.M.,  Garfield,  M.K,  Ribeiro,  J.M.  2002.
Toward  a  catalog  for  the transcripts  and proteins  (sialome)  from  the  salivary  gland of  the  malaria  vector Anopheles  gambiae. Journal  of Experimental Biology .  205:
2429-2451.
Hagedorn, H.H. 1977. Vitellogenin synthesis in the mosquito: the role of juvenile hormone in  the  development  of  responsiveness  to ecdysone.
Physiol Entomol . 2:173–178. Harlow, E & Lane, D. 1999. Using Antibodies:
A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New
York.
Kappe,  S.H.I.,  Buscaqlia,  C.A.,  Berqman, L.W.,  Coppens,  I.,  Nussenzweiq,  V.  2004.
Apicomplexan  gliding  motility  and  host cell invasion: overhauling the motor model. Trends in Parasitology . 20: 13-16. Kelleher,  N.L.,  Lin,  H.Y.,  Valaskovich,  G.A., Aaseruud, D.J., Fridriksson, E.K., McLafferty,  F.W.  1999.  Top  down  versus bottom  up  protein  characterization  by tandem  high resolution  mass  spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 121: 806-812. Kirnowardoyo,  S & Supalin.  1986. Zooprophylaxis as a useful tool for control of Anopheles aconitus transmitted  malaria in Central Java, Indonesia. J. Commun. Dis . 18: 90-94. Kirnowardoyo,  S.,  Situmeang,  R., & Utomo,
W.W.  1985.  Malaria  Transmission  Studies in Jepara and Wonosobo regencies  Central Java,  Indonesia  during  1981-1982. J. Commun. Dis . 17: 230-232.
Laemmli.  1970.  Cleavage  of  Structural Proteins during the assembly of the head of the  Bacteriophage  T4. Nature .  227:  680- 685.
Lavazec,  C.,  Boudin,  C.,  Lacroix,  R.,  Bonnet,
S.,  Diop,  A.,  Thiberge,  S.,  Boisson,  B.,
Tahar,  R.,  Bourgomin,  C.  2007. Carboxypeptidase B of Anopheles gambiae Target  for a Plasmodium  falciparum Transmission-Blocking  Vaccine. Infection and Immunity . 75: 1635-1642. Lawson,  D.,  Arensburger,  P.,  Atkinson,  P., Besansky, N.J., Bruggner, R.V., Butler, R., Campbell,  K.S.,  Christophides,  G.K., Christley,  S.,  Dialynas,  E.,  Emmert, D., Hammond,  M.,  Hill,  C.A.,  Kennedy,  R.C., Lobo, N.F., MacCallum, M.R., Madey, G., Megy,  K.,  Redmond,  S.,  Russo,  S., Severson, D.W., Stinson, E.O., Topalis, P., Zdobnov, E.M., Birney, E., Gelbart, W.M., Kafatos,  F.C.,  Louis,  C.,  Collins,  F.H.
2007. VectorBase: a home  for invertebrate vectors of human pathogens.
Nucleic Acids Res. 35: D503-505. Londono-Renteria, B.L., Eisele, T.P., Keating, J.,  James,  M.A.,  Wesson,  D.M.  2010. Antibody  response  against Anopheles albimanus (Diptera:  Culicidae)  salivary protein  as  a  measure  of  mosquito  bite exposure  in  Haiti. J. Med. Entomol. 47: 1156–1163. Lund, A.A., Rhoads, D.M., Lund, A.L., Cerny, R.L.,  Elthon,  T.E.  2001.  In  Vivo Modifications  of  the  Maize  Mitochondrial Small Heat Stress Protein, HSP22. Journal of  Biological  Chemistry .  276:  29924– 29929. Manguin, S., Bangs, M.J., Pothikasikorn, J. & Chareonviriyaphap,  T.  2010.  Review  on global co-transmission of human
Plasmodium species  and Wuchereria bancrofti by Anopheles mosquitoes.
Infection, Genetics and Evolution . 10: 159-
177.
Meng, F., Cargile, B. J., Patrie, S.M., Johnson, J.R.,  McLoughlin,  S.M.,  Kelleher,  N.L.
2002.  Processing  complex  mixtures  of intact  proteins  for  direct  analysis  by  mass spectrometry. Anal. Chem . 74: 2923-2929. Nesvizhskii,  A.I.,  Keller,  A.,  Kolker.,  E.,
Aebersold, R. 2003. A statistical model for identifying  proteins  by  tandem  mass spectrometry. Anal. Chem . 75: 4646-4658.
Neville,  D.M,  Jr.  1971.  Molecular  Weight
Determination of Protein Dedocyl Sulphate Complexes  by  Gel  Electrophoresis  in  a Discontinous  Buffer  System. The  Journal of Biological Chemistry . 246: 6328-6334.
Oktarianti,  R.,  Senjarini,  K.  Hayano,  T., Fatchiyah.,  Aulanni’am.  2015.  Proteomics analysis  of  immunogenic  proteins  from salivary  glands  Aedes  aegypti. Jounal  of
Infection and Public Health . 428: 1-8.
Orlandi-Pradines,  E.,  Almeras,  L.,  Denis  De
Senneville,  L.,  Barbe,  S.,  Remoue,  F., Villard,  C.,  Cornelie,  S.,  Penhoat,  K., Pascual, A., Bourgouin, C. 2007. Antibody response  against  saliva  antigens  of Anopheles  gambiae and Aedes aegypti in travellers  in  tropical  Africa. Microbes
Infect. 9: 1454–1462.
Parsell,  D.A  and  Lindquist,  S.  1993.  The function  of  heat-shock  proteins  in  stress tolerance:  degradation  and  reactivation  of damaged  proteins. Annual  Review  of
Genetics . 27: 437–496. Peng,  Z.,  Li,  H.,  Simons,  F.E.  1998.
Immunoblot  analysis  of  salivary  allergens in  10  mosquito  species  with  worldwide distribution and the human IgE responses to these  allergens. J. Allergy Clin. Immunol. 101:498-505. Petersen,  T.N.,  Brunak,S.,  VonHeijne,  G., Nielsen, H. 2011. SignalP 4.0: discriminating signal  peptide s  from transmembrane regions. Nature Methods . 8:
785–786.
Phattanawibon, b., Jariyapan, N., Roytrakul, S., Paemanee,  A.,  Sor-suwan,  S.,  Chanmol,
W., Siriyasatien, P., Saeung, A., Choocote, W.  2014.  Morphological  and  protein analysis  of  adult  female  salivary  glands  of
Anopheles barbirostris species A1 (Diptera:
Culicidae). Tropical Biomedicine . 31: 813- 827. Remoue,  F.,  Cisse,  B.,  Ba,  F.,  Sokhna,  C.,
Herve,  J.P.,  Boulanger,  D.,  Simondon,  F.
2006.  Evaluation  of  the  antibody  response to Anopheles salivary  antigens  as  a potential  marker  of  risk  of  malaria. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 100: 363–370. Ribeiro  J.M.C  dan  Francischetti,  I.M.  2003. Role  of  arthropod  saliva  in  blood  feeding: sialome  and  post-sialome  perspectives. Annu Rev Entomol . 48:73–88. Ribeiro,  J.M.C & Arcà,  B.  2009. From sialomes  to  the  sialoverse:  An  insight  into the salivary potion of blood feeding insects. Adv. Insect Physiol. 37: 59–118. Ribeiro, J.M.C. 1995. Blood-feeding arthropods:  live  syringes  or  invertebrate pharmacologists?. Infectious Agents  and Disease . 4: 143–152.
Rinehart,  J.P.,  Li,  A.,  Yocum,  G.D.,  Robich, R.M.,  Hayward,  S.A.L.,  Denlinger,  D.L. 2007. Up-regulation of heat shock proteins is  essential  for  cold  survival  during  insect diapause. Proceeding  of  the  National
Academy  of  Sciences  USA .  104:  11130–
11137.
Senjarini, K. 2013. Potential Use of Mosquito’s Salivary  Components  as  Novel  Target  for the Development of Transmission Blocking Vaccine (TBV). Microbiology Indonesia . 7: 186-191. VectorBase. 2015. Bioinformatic Resource for Invertebrate  Vectors  of  Human  Pathogens. (online).https://www.vectorbase.org/organi sms/. [diakses tanggal 2 April 2016]. Vijay,  S.,  Rawat,  M.,  Sharma,  A.  2014. Mass spectrometry  based  proteomic  analysis  of salivary  glands  of  urban  malaria  vector Anopheles  stephensi . Biomed  Research International . 2014: 1-12. WHO. 2013. World Malaria Report 2013. (on line). https://www.who.int/malaria. [tanggal
3 November 2015].