Volume 8, Nomor 1 Halaman 16-19
Uji Toksisitas Isolat Kristal Protein Bacillus thuringensis (Bt) sebagai Agen Pengendali Hama Terpadu Wereng Hijau ( Nepotettix virescens ) Vektor Penyakit Tungro sebagai Upaya Peningkatan Ketahanan Pangan Nasional

## SUWARNO, MARIDI, DEWI PUSPITA SARI
Program Studi Pendidikan Biologi, FKIP, Universitas Sebelas Maret Surakarta *email: suwarnoswami@yahoo.com
Manuscript received: 09 Desember 2014 Revision accepted: 27 Januari 2015

## ABSTRACT
Bakteri Bacillus thuringensis adalah salah satu jenis mikroba yang telah dikembangkan sebagai salah satu bioinsektisida karena  bersifat  pathogen  terhadap  serangga.  Sifat  dari  Kristal  protein  bakteri Bacillus  thuringensis bersifat  spesisfik terhadap serangga sehingga sangat efektif dan tidak membahayakan organisme non target. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh  bioinsektisida  dari  isolate Bacillus  thuringensis yang  memiliki  konsentrasi  tepat  untuk  mengendalikan serangan hama wereng hijau sebagai agen virus tungro pada tanaman padi. Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi isolasi, pemurnian isolat, pemurnian Kristal protein intaseluler dan aplikasi melalui LD50. Pada penelitian ini digunakan konsentrasi 0,01 ppm, 0,05 ppm, 0,07 ppm, dan 0,1 ppm. Dari hasil penelitian diperoleh hasil konsentrasi LD50 adalah 0,07 ppm.
Keywords: Bacillus thuringensis , Bioinsektisida Bt, Pengendali terpadu, wereng hijau

## LATAR BELAKANG
Sebagai  negara  yang  memiliki  letak  didaerah  katulistiwa, negara  Indonesia  memiliki  kekayaan  flora  fauna  yang sangat  melimpah  .  Selain  kekayan  flora  fauna,  negara Indonesia  juga Mega  diversity organisme  mikro  (  bakteri dan kapang ).
Sebagai  negara  agraris  dan  memiliki  iklim  tropis negara  Indonesia  memiliki  potensi  besar  menjadi  negara yang  berswasembada  pangan.  Untuk  mencapai  tujuan sebagai  negara  berswasembada  pangan  sangat  banyak kendala  yang  harus  dihadapi.  Sebagai  tanaman  pangan utama di Indonesia, padi memiliki banyak hama dari jenis serangga  salah satunya adalah  wereng  hijau ( Nephotettix virescens ) yang menjadi vektor penyakit tungro ( Brar, et al ,   2009  ). Tungro  adalah  salah  satu  jenis  penyakit  yang menyerang  tanaman  padi  yang  disebabkan  oleh  virus. Kerugian yang disebabkan oleh serangan sangat besar dan mampu  mengancam  tercapainya  tujuan  sebagai  negara berswasembada pangan.
Sudah semestinya untuk dicarikan solusi permasalahan tentang  serangan  wereng  hijau  sebagai  agen  penyakit tungro  secara  bijaksana.  Selama  ini  para  petani  hanya menggunakan  jenis  insektisida  kimia  yang  sama  sekali tidak  efektif  karena  selain  dapat  meracuni  lingkungan sehingga  mengganggu  keseimbangan  ekosistem  juga dapat  menyebabkan  resistensi  terhadap  hama  wereng hijau. Bacillus  thuringensis (  Bt  )  diketahui  memiliki Kristal  protein  yang  mampu  mendegradasi  saluran  cerna dari insekta.
Bacillus  thuringiensis ( Bt )  adalah  bakteri  gram  positif yang  berbentuk  batang,  aerobik  dan  membentuk  spora.
Banyak  strain  dari  bakteri  ini  yang  menghasilkan  protein yang  beracun  bagi  serangga.  Sejak  diketahuinya  potensi dari  protein  kristal Bt sebagai  agen  pengendali  serangga, berbagai  isolat Bt dengan  berbagai  jenis  protein  kristal yang  dikandungnya  telah  teridentifikasi.  Sampai  saat  ini telah  diidentifikasi  protein  kristal  yang  beracun  terhadap larva  dari  berbagai  ordo  serangga  yang  menjadi  hama pada  tanaman  pangan  dan  hortikultura.  Kebanyakan  dari protein  kristal  tersebut  lebih  ramah  lingkungan  karena mempunyai target yang spesifik sehingga tidak mematikan  serangga  bukan  sasaran  dan  mudah  terurai sehingga tidak menumpuk dan mencemari lingkungan.
Isolat  Bt  dapat  diisolasi  dari  tanah,  bagian  tumbuhan, kotoran hewan, serangga dan bangkainya dan sumber lain. Salah  satu  cara  isolasi  yang  cukup  efektif  adalah  dengan seleksi asetat. Beberapa gram sumber isolat disuspensikan ke  dalam  media  pertumbuhan  bakteri  (misal LB )  yang mengandung  natrium  asetat  kemudian  dikocok. Media asetat tersebut menghambat pertumbuhan spora Bt menjadi sel  vegetatif.  Setelah  beberapa  jam  media  tersebut  di- panaskan  pada  suhu  80°C  selama  beberapa  menit. Pemanasan  ini  akan  membunuh  sel-sel  bakteri  atau mikroorganisme  yang  sedang  tumbuh  termasuk  spora- spora bakteri lain yang tumbuh. Kemudian sebagian kecil dari suspensi yang telah dipanaskan diratakan pada media padat. Koloni-koloni yang tumbuh kemudian dipindahkan ke  media  sporulasi Bt .  Koloni  yang  tumbuh  pada  media ini  dicek  keberadaan  spora  atau  protein  kristalnya  untuk menentukan apakah koloni tersebut termasuk isolat Bt . Produksi  bioinsektisida  Bt  berkembang  dengan  pesat dari 24 juta dolar Amerika Serikat pada 1980 menjadi 107 juta  dolar  Amerika  Serikat  pada  tahun  1989.  Kenaikan permodalan  diperkirakan  mencapai  11%  per  tahun,  di
mana  pada  tahun  1999  mencapai  300  juta  dolar  Amerika Serikat. Bt yang dikomersialkan dalam bentuk spora yang membentuk  inklusi  bodi.  Inklusi  bodi  ini  mengandung Kristal  protein  yang  dikeluarkan  pada  saat  bakteri  lisis pada  masa phase stationary .  Produk  ini  digunakan sebanyak  10-50  g  per acre atau  1020  molekul  per acre . Potensi  toksisitasnya  berlipat  kali  dibandingkan  dengan pestisida, misalnya 300 kali dibandingkan dengan sintetik pyrethroid  (Feitelson et  al .,  1992).  Penggunaan  Bt  tidak hanya dalam bentuk microbial spray yang berkembang di lapang,  tetapi  juga  dalam  bentuk  tanaman  transgenic  Bt. Sebagai  contoh  luas  penanaman  transgenik  Bt  di  USA meningkat  hampir  3  kali  lipat,  yaitu  dari  4  juta  ha  pada tahun  1997  men-jadi  11,5  ha  pada  tahun  2000 ( James , 2000).
Bt-toksin  telah  digunakan  sebagai  bahan/agen  dalam pengendalian  hama  secara  alami  sejak  tahun  1950-an, yaitu  sebagai  insektisidal  mikrobial.  Namun  demikian, insektisidal mikrobial ini mempunyai beberapa kelemahan,  antara  lain  peka  terhadap  sinar  ultraviolet sehingga  efektifitasnya  terbatas  dalam  waktu  yang pendek.  Selain  itu,  beberapa  hama  tanaman  menyerang pada  lokasi  yang  sulit  dicapai  oleh  insektisidal  mikrobial yang  umumnya  berbentuk  tepung  atau  granular.  Dengan berkembangnya  teknik  rekombinan,  beberapa  gen  yang mengkode Bt-toksin telah berhasil diklon dan diintroduksikan ke dalam tanaman. Dengan terintegrasinya  gen  Bt  di  dalam  sel  tanaman  dapat memperpanjang  peluang  Bt  dalam  mengendalikan  hama dan  meningkatkan  efektifitas  pengendalian.  Sebagian besar  usaha  perakitan  tanaman  transgenik  tahan  hama menggunakan  gen  dari B.  thuringiensis .  Pada  tahun  1995 tanaman  transgenik  pertama  mulai  tersedia  bagi  petani  di Amerika  Serikat  (jagung  hibrida  yang  mengandung cry 1A(b), Maximizer, yang dibuat oleh Novartis, tanaman kapas  Bollgard  mengandung cry 1A(c),  yang  dibuat  oleh Monsanto,  dan  kentang  Newleaf  yang  mengandung cry 3A, yang dibuat oleh Monsanto. Pada tahun 1996 luas area  pertanaman  jagung  transgenic  hanya  400.000 acre , tetapi  tahun  1997  luas  area  meningkat  menjadi  3-4  juta acre dan pada tahun 1998 mencapai 17 juta acre (Matten, 1998).
Berdasarkan dari permasalahan di atas maka penelitian ini  akan  berfokus  pada  uji  toksisitas  isolat  kristal  protein Bt  dan  aplikasinya  terhadap  wereng  hijau  sebagai  agen tungro pada tanaman padi sehingga ditemukan konsentrasi LD50-48  jam  yang  tepat.  Hal  tersebutlah  yang  menjadi kebaruan  dalam  penelitian  ini.  Data  yang  diperoleh  dari penelitian  ini  nantinya  dapat  dijadikan  sebagai  dasar dalam  pengembangan  penelitian  selanjutnya  dan  juga untuk  pengembangan  pemberantasan  hama  tanaman ramah lingkungan.

## Tujuan
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  konsentrasi Kristal  Bt  yang  paling  efektif  sebagai  bioinsektisida wereng hijau pada tanaman padi.

## Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Lab  Biologi  FKIP  UNS, Lab Mikrobiologi UGM dan Lapangan di area persawahan Yogyakarta pada Bulan Juni-Sepetember 2014

## METODE

## Objek Penelitian

## Objek penelitian ini adalah Kristal protein Bt

## Alat
Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah tabung  reaksi,  Erlenmeyer,  petri  disk,  autoclave,  Bunsen, oven,  ose,  shaker,  media  NA,  media  LB,  kapas, aluminium  foil,  korek  api,  spektrofotometer,  gelas  beker, Erlenmeyer, timbangan analitik, perangkat sonikasi, pipet mikro, pipet,oven, freezer,evendoff.

## Metode
Metode  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah dengan  uji  laboratorium  dan  data  LD-50  dihitung  dengan metode Thomson and Weil

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Bacillus  thuringensis adalah  salah  satu  mikroorganisme yang  memiliki  kemampuana  sebagai  agen  pengendali hama  hayati  terpadu  yang  tepat  guna. Bt mengandung Kristal protein yang bersifat toksik terhadap wereng hijau. Keberadaan  Kristal Bt yang  termakan  oleh  wereng  hijau mampu  mendegradasi  saluran  pencernaan  sehingga  dapat menyebabkan kematian.
B.  thuringiensis adalah  bakteri  yang  menghasilkan kristal  protein  yang  bersifat  membunuh  serangga (insektisidal)  sewaktu  mengalami  proses  sporulasinya (Hofte  dan  Whiteley,  1989).  Kristal  protein  yang  bersifat insektisidal ini sering disebut dengan δ-endotoksin. Kristal ini sebenarnya hanya merupakan pro-toksin yang jika larut dalam  usus  serangga  akan  berubah  menjadi  poli-peptida yang  lebih  pendek  (27-149  kd)  serta  mempunyai  sifat insektisi-dal.  Pada  umumnya  kristal  Bt  di  alam  bersifat protoksin,  karena  ada-nya  aktivitas  proteolisis  dalam sistem    pencernaan  serangga  dapat  mengubah  Bt- protoksin  menjadi  polipeptida  yang  lebih  pendek  dan bersifat  toksin.  Toksin  yang  telah  aktif  berinteraksi dengan sel-sel epithelium di midgut serangga. Bukti-bukti telah  menunjukkan  bahwa  toksin  Bt  ini  menyebabkan terbentuknya  pori-pori  (lubang  yang  sangat  kecil)  di  sel membrane  di  saluran  pencernaan  dan  mengganggu keseimbangan  osmotik  dari  sel-sel  tersebut.  Karena keseimbangan  osmotik  terganggu,  sel  menjadi  bengkak dan pecah dan menyebabkan matinya serangga (Hofte dan Whiteley, 1989).
Kristal protein yang termakan oleh serangga akan larut dalam lingkungan basa pada usus serangga. Pada serangga target,  protein  tersebut  akan  teraktifkan  oleh  enzim pencerna  protein  serangga.  Protein  yang  teraktifkan  akan me-nempel  pada  protein  receptor  yang  berada  pada permukaan  sel  epitel  usus.  Penempelan  tersebut
mengakibatkan  terbentuknya  pori  atau  lubang  pada  sel sehingga  sel  mengalami  lysis.  Pada  akhirnya  serangga akan mengalami gangguan pencernaan dan mati.
Umumnya  strain  Bt  diseleksi  berdasarkan  potensinya untuk  menghambat  pertumbuhan  serangga.  Karena  salah satu kelemahan yang sering dijumpai dalam pengaplikasian  Bt  di  lapang  adalah  sensitivitasnya terhadap  sinar  ultra  violet  (UV)  maka  seleksi  juga  harus berdasarkan  tingkat  ketahanannya  terhadap  sinar  UV. Dengan  perkem-bangan  ilmu  pengetahuan,  maka  gen  Bt dapat  diisolasi.  Bahkan  de-ngan  teknik  rekombinan  DNA telah membuka kemungkinan untuk me manipulasi gen Bt sehingga  strain  Bt  menjadi  lebih  baik.  Salah  satu  teknik yang  digunakan  adalah  menempatkan  gen  Bt  di  vektor yang berupa plasmid. Plasmid ini berada di dalam bakteri. Perbaikan  bakteri  dapat  dilakukan  dengan  cara  protoplas transformasi,  transduksi,  dan  konyugasi.  Dengan  teknik tersebut,  tidak  hanya  dapat  dipelajari  cara  kerja  Bt  tapi juga memperbaiki formulasi, host range , dan toksisitasnya.  Di  antara  ketiga  teknik  tersebut,  teknik konyugasi  merupakan  teknik  yang  paling  banyak digunakan  untuk  memperbaiki sifat Bt,  yaitu dengan cara mengawinkan  strain-strain  ( mixture  culture )  untuk pertukaran  plasmid  di  antara  strain  Bt.  Cara  ini  lebih bersifat  alami  untuk  memperbaiki  aktivitas  Bt  dan spektrumnya  daripada  cara  transduksi  dan  transformasi protoplas.  Beberapa  penelitian  telah  dilakukan,  misalnya dengan mentransfer gen kristal lepidoptera-aktif ke dalam strain  koleoptera  aktif  untuk  mendapatkan  strain  Bt  yang aktif terhadap lepidoptera dan koleoptera (Dent, 1993).
Kristal  protein Bt diperoleh  melalui  tahapan  isolasi isolate  kemudia  biakan  yang  sudah  ada  dimurnikan sehingga  diperoleh  biakan  murni.  Setelah  biakan  murni diperoleh  dilakukan  pemisahan  Kristal  protein  dengan cara  isolate  murni  dishaker  selama  7  hari  dengan kecepatan 150 rpp setelah itu disonikasi  dan disentrifuge selama  15  menit  dengan  kecepatan  3.000  rpm.  Tahap selanjutnya  adalah  pengujian  Kristal  protein  yang diperoleh melalui uji LD50 terhadap wereng hijau dengan konsentrasi  yang  digunakan  adalah  0,01  ppm,  0,05  ppm, 0,07 ppm dan 0,1 ppm.
Dari  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan  tahapan isolasi,  pemurnian,  pemisahan  kristal  protein  dan  uji LD50.
Tabel hasil Uji LD50 Dosis (ppm) Jjumlah wereng Mmortalitas Pperiode pengamatan (jam) r 00,01 10 11 448 1 00,05 10 22 448 2 00,07 10 55 448 5 00,1 10 77 448 7
Grafik 1. Uji LD50
Dari  hasil  penghitungan  dengan  metode  Thompson dan Weil diperoleh konsentrasi LD50 adalah 0.07 ppm.
Secara  keseluruhan  Bt  endotok  sin  baik  yang digunakan  secara microbial  spray maupun  yang  beru-pa tanaman transgenic mempunyai pengaruh terhadap musuh alami. Namun demikian, pengaruh Bt endotoksin terhadap musuh  alami  lebih  kecil  dibandingkan  dengan  pestisida buatan. Pengaruh ini sa-ngat spesifik tergantung jenis gen tahan yang diekspresikan tanaman transgenik, jenis hama, dan jenis predator/parasitnya. Penelitian tentang pengaruh Bt-endotoksin terhadap musuh alami telah dilakukan baik di laboratorium maupun di lapang.
Bt-protoksin  yang  digunakan  sebagai  pestisida mikrobial  tidak  toksis  terhadap  parasitoid  meskipun  ada beberapa  kasus  pengecualian  yang  telah  dilaporkan (Schuler et  al .,  1999).  Serangga  parasitoid  mempunyai karakteristik  yang  berbeda  antara  imago  dan  larvanya. Tanaman transgenik akan mempengaruhi parasitoid dalam fase  larva  secara  tidak  langsung  karena  parasitoid  ini terekspos  lebih  banyak  ke  jaringan  tubuh  larva  yang dimakan daripada langsung ke tanaman transgenik.  Larva parasitoid akan terekspos ke  berbagai protein yang ada di tubuh  serangga  yang  dipara-sit  secara  langsung  ketika memakan  jaringan  tubuh  inangnya.  Ada  kemungkinan dosis  sublethal  dari  toksin  yang  ada  di  tubuh  inang  akan meningkatkan daya parasitismenya, yaitu dengan melemahnya  sistem  imun  dari  inangnya.  Penelitian  me- ngenai  pengaruh  Bt-toksin  pada  do-sis  sublethal  terhadap hama  kubis diamond  backmoth ( Plutella  xylostella ), ternyata  ditemukan  bahwa  Bt  dapat  memperpanjang periode  pupa  dari  parasit  braconid Cotesia plutellae . Namun  demikian,  tidak  dijumpai  pengaruhnya  terhadap braconid  lainnya,  yaitu Diadegma  insulare yang  juga memangsa P. xylostella (Schuler et al ., 1999).
Pengaruh  negatif  juga  tidak  dijumpai  pada  parasitoid hama  kubis  lainnya  seperti  hama Helicoverpa  armigera dengan  parasit Microplitis croceipes (Blumberg et  al., 1997).  Percobaan  lapang  dengan  tanaman  transgenik tembakau  yang  mengekspresikan  Bt-toksin  dalam  level rendah menunjukkan adanya sinergistik dengan parasitoid C.  sonorensis dalam  mengendalikan H.  virescens . Perpanjangan periode larva pada H. virescens yang makan tanaman  tembakau  Bt  memperpanjang C. sonorensis sebagai parasit H. virescens (Johnson, 1997).

## KESIMPULAN
1. Bakteri  Bacillus  thuringensis  memiliki  kristal  protein yang  memiliki  kemampuan  mendegradasi  saluran pencernaan  wereng  hijau  sehingga  sangat  tepat  untuk dijadikan PHT.
2. Pada  pengujian  diperoleh  konsentrasi  LD50  adalah 0,07 ppm.

## DAFTAR PUSTAKA
Bahagiawati. Penggunaan Bacillus thuringensis sebagai Bioinsektisida. Buletin AgroBio 5 (1) 21-28.
Blumberg,  D.,  A.  Navon,  S.  Keren,  S.  Goldenberg,  &  S.M. Ferkovich. (1997). Interaction among Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae), its larval endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera: Braconidae), and Bacillus thuringiensis . J. Econ. Entomol. 90:1181- 1186.
Burgess,  H.D.  (1981). Microbial  control  of  pests  and  plant diseases 1970-1980 . Academic press, London.
Dent,  D.R.  (1993). The  use  of  Bacillus  thuringensis  as insecticide.  In  Jones,  D.G  (Ed) .  Exploitation  of Microorganisms. Chapman and Hall, p. 19-44
Dunkle,  R.L.  &  B.S.  Sasha.  (1989).  Response  of  starch- encapsulated Bacillus  thuringiensis containing  ultra  violet screens  to  sunlight.  Environmental  Entomology  18:1035- 1041.
Fieldman,  J.  &  Stone,  T.  (1997).  The  development  of  a comprehensive  resistance  management  plan  for  potatoes expressing  the cry 3A  endotoxin. In Carozzi,  N.  and  M. Koziel  ( Eds .). Advance  in  Insect  Control .  The  Role  of Transgenic Plants. Taylor and Francis. p. 49-61.
Feitelson,  J.S.,  Payne,  J.  &  Kim,  L.  (1992). Bacillus thuringiensis :  Insects  and  beyond.  Bio/Technology  10: 271-275.
Forcada,  C.E.,  Alcacer,  M.D.  Garcera,  &  Martinez,  R.  (1996). Differences  in  the  midgut  proteolytic  activity  of  two Heliothis  virescens strains,  one  is  susceptible  and  one resistance  to Bacillus  thuringiensis toxins.  Arch.  Insect Biochem. Physiol. 3:257-272.
Hilbeck,  A.,  M.  Baumgartner,  P.M.  Fried,  &  Bigler.  F.  (1998). Effects  of  transgenic Bacillus  thuringiensis corn-fed  prey on  mortality  and  development  time  of  immature Chrysoperla carnea (Neuroptera:  Chrysopidae).  Environ. Entomol. 27:480-487.
Huang,  F.,  Buschman,  L.l.  Higgins,  R.A.  &  McGaughey,  W.H. (1999).  Inheritance  of  resistance  to Bacillus  thuringiensis toxin  (Dipel  ES)  in  the  European  corn  borer.  Science 284:965-967.
Hofte,  H.  &  Whiteley,  H.R.  (1989).  Insecticydal  crystal  protein of Bacillus thuringensis . Microbiol. Rev. 53; 42-255.
Madigan, Michael  T.,  Martiko,  John M.,  Dunlap, Paul V.  Clark &  David  P.  Brock :  Biology  of  Micoorganisms .  12 th ed. 2009. San Francisso : Pearson Benjamin Cummings
Sutanto,  R. Penerapan  Pertanian  Organik .  (2002).  Yogyakarta: Kanisus.
Tortora,  Gerard  J.,  Funke,  Berdell  R.,  Case,  Christine  L. Microbiology .  10 th ed.  (2010).  San  Francisso:        Pearson Benjamin Cummings.
Van  Rie,  J.,  McGaughey,  W.H.,  Johnson,  D.E.,  Barnett,  B.  & Mellaert,  H. V. (1990). Mechanism of insect resistance to microbial  insecticide Bacillus  thuringiensis .  Science 247:72-74.