## PRODUKSI ENZIM AMILOLITIK DARI Bacillus megaterium MENGGUNAKAN VARIASI KADAR PATI SAGU ( Metroxylon sp. )

## Sandra Madonna*
Pragram Studi  Teknik Lingkungan, Universitas Bakrie, Jakarta
* Corresponding author : s_ramadonna@yahoo.com

## Abstract
The applicationof enzymes as biocatalysts for  the industries in Indonesia has increased. Among the enzymes  that  are  needed  in  Indonesia,  one  of  which  amylolytic  enzymes.  Amylolytic  enzymes constitute a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of starch into simple sugars consisting of glucose  units.  In  this  study  amylolytic  enzyme  isolated  from  the  bacterium  Bacillus  megaterium. Enzyme production was submerged fermentation method for 14 hours using sagostarch Metroxylon sp.  varies.  Measurement  of  enzyme  activity  was  determined  by  the  method  amylolytik  Somogy- Nelson. Research results showed that2 % (w/v) of sago starchis the optimum consentration in media with  highest  amylolytic  enzyme  activity  that  is  equal  to  0.076  units/ml  and  sugar  medium  formed by181.254ug/ml in the fermentation medium.
Keywords: Amylolytic enzymes, Bacillus megaterium, enzyme activity, fermentation, sago starch

## PENDAHULUAN
Aplikasi enzim amilolitik sebagai biokatalis  mulai  meningkat  sejak  beberapa tahun terakhir. Enzim amilolitik secara umum dikenal sebagai enzim-enzim yang mengkata- lis suatu reaksi hidrolisis pati menjadi dextrin dan gula-gula sederhana yang terdiri dari unit- unit  glukosa  (Mhathre  &  Windish,  1965). Saat  ini  enzim  amilolitik  memegang  banyak peranan  dalam  berbagai  industri,  seperti industri gula, minuman, perekat, textil, farma- si dan detergen (Doi & Martina, 1992). Enzim amilolitik  telah  lama  menggeser  peran  asam dalam industri pengolahan pati sebab dirasakan  lebih  menguntungkan  (Barfoed, 1976;  Underkofler et  al .,  1965 cit. Forgar- ty,1983).
Sampai  saat  ini  kebutuhan  enzim  di Indonesia  masih  99%  tergantung  dari  import (Kemenristek,  2013).  Enzim  yang  banyak dibutuhkan  di  Indonesia  khususnya  enzim penghidrolisa pati, antara lain;  alpha amilase, glukoamilase  dan  glukosa  isomerase  (Prayit- no, et al ., 1994).
Enzim  dapat  diisolasi  dari  hewan, tumbuhan  dan  mikroorganisme  seperti  bakte- ri,  jamur  dan  kapang.  Enzim  mikroba  sangat banyak digunakan dalam industri yaitu sekitar
80%  dari  total  industri  enzim  (Dordick, 1991).  Enzim  mikroba  mempunyai  beberapa kelebihan  diantaranya  yaitu  dapat  diproduksi dalam jumlah besar dan produktifitasnya lebih mudah  ditingkatkan    (Stanbury  &  Whitaker, 1984).
Bakteri  dari  genus Bacillus paling banyak digunakan untuk memproduksi enzim-enzim  hidrolase  dalam  jumlah  besar. Bacillus  megaterium adalah  salah  satu  dari sejumlah  besar Bacillus yang  memegang peran  sangat  baik  bagi  produksi  industri enzim,  dan  bahan  kimia  lain  seperti  amilase, vitamin  B 12 ,  Penicilin  amidase,  dan  glukosa dehidrogenase. B.  megaterium dapat  tumbuh pada  substrat  yang  sederhana  dan  tidak bersifat patogen, menghasilkan enzim  ekstra- selluler  sehingga  berpotensi  untuk  digunakan dalam  produksi  amilase  (Doi  &  Martina, 1992).  Enzim  yang  diproduksi  dalam  skala industri  hampir  sebagian  besar  merupakan enzim  ekstraselluler.  Isolasi  enzim  ekstra- selluler  jauh  lebih  mudah  daripada  enzim intraselluler (Wang et al , 1979).
Subtrat  yang  digunakan  dalam  proses fermentasi berpengaruh terhadap produktifitas enzim.  Adanya  subtrat  tertentu  di  medium fermentasi  dapat  menginduksi  mikroorganis-
me  untuk  mengsekresikan  metabolitnya (Boing, 1982). Pati adalah salah satu induktor (pemacu)  untuk  pembentukan  enzim  amilo- litik, karena keberadaannya di dalam medium diharapkan akan menjadi pemacu peningkatan produksi enzim (Forst dan Moss, 1987; Wang et  al ., 1979). Pemilihan  jenis  dan konsentrasi substrat  akan  menentukan  sintesa  enzim  oleh mikroorganisme.
Sagu merupakan salah satu subtrat yang potensial  digunakan  sebagai  inducer  enzim amilolitik  dari  bakteri.  Potensi  sagu  di  Indo- nesia  merupakan  yang  terbesar  di  ASEAN, namun  demikian  saat  ini  pemanfaatannya khususnya  pati  sagu  masih  rendah.  Peran Bioteknologi  dalam  pemanfaatan  sagu  nam- pak cerah  di masa datang, penggunaan aktiv- itas  Biologi  (enzim)  dapat  mengubah  pati sagu  menjadi  beberapa  macam  dextrin (cyclodextrin dan glukosa (Sa’id, 1993).
Indonesia  kaya  akan  biodiversitas mikroba dan biomasa. Sebagai upaya peman- faatan  mikroba  yang  ada,  maka  telah  dilaku- kan penelitian yang bertujuan untuk mempro- duksi  enzim  amilolitik  dari  bakteri B. megaterium dengan  mengetahui  konsentrasi optimum  dari  pati  sagu  sebagai  substrat, mendapatkan  waktu  fermentasi  dan  kondisi lingkungan yang optimum yang menghasilkan aktifitas  enzim  amilolitik  yang  tertinggi  di dalam media fermentasi.

## MATERIAL DAN METODE
Penelitian dilakukan menggunakan metode  eksperimen  dalam  Rancangan  Acak Lengkap  (RAL)  dengan  7  perlakuan  variasi kosentrasi  pati  sagu  yaitu:    0,5%,  1%,  2%, 3%,  4%,  5%  dan  6%  (b/v)  dengan  4  ulangan pada  masing-masing  perlakuan.  Bahan  yang digunakan adalah; biakan murni B. megaterium koleksi  Laboratorium  Mikro- biologi  Jurusan  Biologi  FMIPA  UNAND, batang  Sagu,  Medium  Czapek  (NaN0 3 , MgSO 4 .  7  H 2 O,  KCl,  FeSO 4 ), Nutrient  Agar (NA), soluble starch , buffer sitrat 0,1 M pH 6, pereaksi  Somogyi-Nelson,  glukosa  monohid- rat, alkohol, spirtus, NaOH, HCl, akuades.
Alat  yang  digunakan  adalah  tabung reaksi,  botol  gelap,  erlenmeyer,  cawan  petri,
beker  glass,  gelas  ukur,  pipet  takar,  mikro pipet,  jarum  ose, coloni    counter ,  autoklaf, neraca analitik, termometer, incubator shaker , sentrifus,  Spectrofotometer  (Spectronik  20), pH meter, mikroskop dan freezer .

## Isolasi Pati Sagu
Empelur sagu sebanyak 300 g dilarutkan dengan 200 ml akuades kemudian dihaluskan menggunakan  blender.  Larutan  yang  jenuh didekantasi,  kemudian  sisanya  ditambahkan dengan  etanol  95  %  lalu  disaring.  Pati  yang didapat dikeringkan  pada  suhu kamar (Arbianto, 1990).
Pembuatan Medium Fermentasi Medium yang digunakan dalam fermentasi  adalah    medium  Czapek  dengan komposisi  3  g  NaNO 3 ,  1  g  K 2 HPO 4 ,  0,5  g MgSO 4 .7  H 2 O,  0,5  g  KCl  dan  0,01  FeSO 4 (Atlas,  1993)  dengan  konsentrasi  pati  sagu bervariasi  sesuai  dengan  perlakuan  yaitu 0,5%,  1%,  2%,  3%,  4%  5%  dan  6%  (b/v) dalam  1  liter  akuades.  Kemudian  medium disterilkan menggunakan autoklaf pada 121  C tekanan 15 lbs selama 15 menit.

## Penyediaan Inokulum
Sebanyak  2  ose Bacillus  megaterium dari biakan murni diinokulasikan ke dalam 50 ml  kultur  media,  kemudian  diinkubasikan pada  inkubator  shaker  dengan  kecepatan  180 rpm selama 14 jam pada suhu kamar.

## Penentuan waktu fermentasi
Waktu  fermentasi  ditentukan  berdasar- kan kurva pertumbuhan Bacillus megaterium. Pembuatan  kurva  pertumbuhan  berdasarkan perhitungan total koloni menggunakan  meto- de plate  count dan  pengukuran Optical Density (OD)  dengan  menggunakan  spektro- fotometer  pada  panjang  gelombang  580  nm. Sampling  dan  pengukuran  dilakukan  setiap  2 jam selama 24 jam. Sementara itu juga setiap 2  jam  dilakukan  pengukuran  aktifitas  enzim amilolitik.

## Fermentasi
Fermentasi  dilakukan  dengan  konsen- trasi  dosis  inokulum  sebesar  3%  (v/v)  dan konsentrasi  pati  sagu  yang  bervariasi  sesuai dengan  pelakuan  yaitu  0,5%,  1%,  2%,  3%, 4%  5%  dan  6%  (b/v),  kemudian  diinku- basikan  pada  inkubator  shaker  dengan  kece-
patan  180  rpm  pada  suhu  kamar,  selama  14 jam  (penetapan  waktu  panen,  berdasarkan kurva  pertumbuhan).  Pada  akhir  fermentasi dilakukan  pengujian  aktifitas  enzim  amilo- litik,  konsentrasi  gula  media,  total  koloni bakteri dan pH media setelah fermentasi.

## Isolasi Enzim
Larutan  crude  enzim  dari  media fermentasi diisolasi secara sentrifugasi dengan  kecepatan  4500  rpm  pada  suhu  4  C selama  15  menit.  Kemudian  supernatan  yang terbentuk  disimpan  pada  botol  vial  di  dalam freezer  untuk  kemudian  diukur  aktivitas enzim amilolitik.

## Pembuatan Kurva Standar Glukosa
Dibuat  larutan  baku  atau  stok  glukosa 1000  µg/ml,  kemudian  dibuat  variasi  kadar glukosa  dengan  metode  pengenceran:  10,  20, 30,  40,  50,  60,  70,  80,  90,  dan  100  µg/ml. Masing-masing  konsentrasi  glukosa  ditentu- kan  absorbansi  gula  pereduksinya  dengan metoda Somogyi-Nelson.

## Penentuan Aktivitas Enzim Amilolitik
Larutan  Pati  1%  (b/v)  sebanyak  1  ml dimasukan  kedalam  tabung  reaksi  dan diinkubasi  (prainkubasi)  pada  suhu  50  C selama  10  menit,  lalu  dimasukan  0,1  ml ekstrak  kasar  enzim  kemudian  diinkubasi pada  suhu    50  C  selama  30  menit,  kemudian dipanaskan  menggunakan  penangas  air  pada suhu  100  C  selama  15  menit.  Selanjutnya campuran  tersebut  ditentukan  kadar  gulanya dengan metoda Somogyi-Nelson, dengan cara 1  ml  campuran  larutan  tersebut  ditambah pereaksi Somogyi 1 ml, kemudian dipanaskan pada  suhu  100  C  selama  15  menit,  lalu didinginkan  dan  ditambahkan  1  ml  reagen Nelson  dan  akuades  sebanyak  6,9  ml  lalu dikocok  dengan vortex .  Setelah  itu  diukur serapan  cahayanya  dengan  Spektrofotometer (Spectronik 20)  pada panjang gelombang 660 nm.  Untuk  blanko  caranya  sama  dengan perlakuan sampel, hanya pada blanko ekstrak kasar  enzim  yang  digunakan  terlebih  dahulu dinonaktifkan  dengan  cara  memanaskannya pada  suhu  100 0 C  selama  10  menit.  Aktivitas enzim  didapat  dengan  cara  mengkonversikan absorban  sampel  dengan  kurva  standar glukosa.  Satu  unit  aktivitas  enzim  meng-
andung pengertian jumlah enzim yang mampu mengkatalis  perubahan  satu  mikromol  sub- strat permenit (Ward, 1983)
Analisis  data  dilakukan  terhadap  aktiv- itas  enzim  amilolitik  pada  masing-masing perlakuan  dengan  perbedaan  kadar  pati  sagu, untuk  mengetahui  kadar  pati  sagu  yang optimum  dalam  produksi  enzim  amilolitik dari B. megaterium, kadar gula media, jumlah populasi B.  megaterium dan  pH  medium setelah fermentasi, apabila terdapat perbedaan yang nyata maka dilanjutkan dengan  uji beda rata-rata menurut DMNRT pada taraf 5%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Waktu Fermentasi
Waktu  fermentasi  yang  terbaik  bagi B. megaterium dalam  memproduksi  enzim amilolitik  adalah  14  jam  berdasarkan  kurva pertumbuhan. Kurva pertumbuhan dan aktivi- tas  enzim  amilolitik  dapat  digambarkan seperti  Gambar  1.  Dari    Gambar  1  diketahui bahwa  pertumbuhan B.  megaterium terdiri atas fase lag atau  fase adaptasi pada 0-2 jam pertama,  selanjutnya  diikuti  oleh  fase  loga- ritmik  antara  2-14  jam.  Pada  fase  logaritmik ini  pertumbuhan B.  Megaterium meningkat dengan  cepat,  lalu  diiukuti  dengan  fase stasioner  setelah  14  jam  fermentasi,  dan  fase kematian terjadi setelah 18 jam fermentasi.
Aktivitas  enzim  amilolitik  tertinggi yaitu  sebesar  0,072  unit/ml  dihasilkan  pada 14 jam waktu fermentasi. Pada 14 jam waktu pertumbuhan  ini B.  megaterium berada  pada akhir fase pertumbuhan logaritmik dan mema- suki  awal  fase  pertumbuhan  stasioner. Pertumbuhan  ini B.  megaterium berada  pada akhir fase pertumbuhan logaritmik dan mema- suki awal  fase pertumbuhan stasioner. Menu- rut Mhatre & Windish (1965) bahwa produksi amilase  maksimum  pada  bakteri  mesofil terjadi setelah populasi bakteri mencapai titik fase  stasioner.  Selanjutnya  waktu  fermentasi yang didapat digunakan untuk tahap penelitian berikutnya guna meng-etahui kadar pati  yang  optimum  terhadap  pro-duksi  enzim amilolitik oleh B. megaterium.
0 0.2 0.4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 O D (5 8 0 n m) & A kt iv it as E n zi m Waktu Fermentasi (jam)
Jumlah Populasi
Aktivitas Enzim
Gambar 1 . Kurva pertumbuhan Bacillus megaterium dan aktivitas enzim amilolitik
Tabel  1 .  Rata-rata  populasi B.  megaterium, aktivitas  enzim  amilolitik,  kadar  gula  media  dan  ph akhir media setelah 14 jam fermentasi
Perlakuan Jumlah Populasi (x 10 6 ) sel/ml Aktivitas Enzim Amilolitik (unit/ml) Kadar Gula Media (µg/ml) pH akhir fermentasi A (0,5% b/v) 122 cd 0,070 a 72,745 e 6,8 a B (1% b/v) 401 a 0,069 a 102,515 c 6,8 a C (2% b/v) 192 b 0,076 a 181,254 a 6,8 a D (3% b/v) 190 b 0,062 bc 117,494 b 6,5 b E (4% b/v) 151 bc 0,056 c 114,097 b 6,8 a F (5% b/v) 134 bc 0,032 d 84,032 d 6,7 a G (6% b/v) 81 d 0,021 e 63,411 f 6,8 a
Keterangan : Angka-angka pada lajur yang diikuti huruf kecil yang sama tidak berbeda nyata pada taraf DNMRT 5%.
Gambar  2 .  Pengaruh  kadar  pati  sagu  terhadap  jumlah  populasi Bacillus  megaterium,  B. megaterium ,  aktivitas enzim dan kadar gula media

## Fermentasi
Hasil  pengamatan  dan  analisis  statistik terhadap  jumlah  populasi B.  megaterium, aktivitas  enzim  amilolitik,  kadar  gula  media dan pH akhir media setelah 14 jam fermentasi dengan  perlakuan  penambahan  kadar  pati sagu  di  dalam  media  fermentasi  tertera  pada Tabel  1.  Dari  Tabel  1.  dapat  dilihat  bahwa kadar pati sagu yang berbeda di dalam media fermentasi memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap jumlah populasi B. megaterium pada  masing-masing  perlakuan. Populasi B. megaterium tertinggi terjadi pada medium  dengan  kadar  pati  1%  (b/v)  dengan jumlah  rata-rata  populasi  401  (x10 6 )  sel/ml.
Tingginya  populasi  pada  medium  dengan kadar  pati  sagu  1%  diduga  karena  pada medium  fermentasi  tersebut  telah  cukup merangsang pertumbuhan B. megaterium. Pati sagu  dalam  medium  fermentasi  berperan sebagai  sumber  karbon  dan  energi  bagi pertumbuhan B. megaterium. Menurut Cooney  (1981)  bahwa  konsentrasi  sumber karbon  sangat  berpengaruh  terhadap  laju pertumbuhan  sel-sel  mikroorgaisme  yang berarti pula turut mempengaruhi laju produksi enzim ekstrasellularnya.
Pada  Gambar  2  terlihat  bahwa  aktivitas enzim amilolitik tertinggi  yaitu sebesar 0,076 (unit/ml)  terdapat  pada  perlakuan  C  yaitu medium  fermentasi  dengan  kadar  pati  sagu 2%  (b/v),  yang  tidak  berbeda  nyata  dengan perlakuan  A  kadar  pati  sagu  0,5%  (b/v)  dan perlakuan  Bkadar  pati  sagu  1%  (b/v). Aktivitas  enzim  amilolitik  semakin  menurun pada kadar pati sagu diatas 2% (b/v) di dalam medium fermentasi. Kadar pati sagu 2% (b/v) di  dalam  medium  fermentasi  telah  mampu menginduksi  sintesa  enzim  amilolitik  yang maksimum  dari B.  megaterium dengan aktivitas enzim yang tertinggi.
Dari  Tabel  1  dapat  dilihat  bahwa pengaruh kadar pati sagu terhadap gula media berbeda sangat nyata. Kadar gula media yang tertinggi  dihasilkan  pada  perlakuan  C  yaitu pada  medium  dengan  kadar  pati  sagu  2% (b/v)  dengan  jumlah  sebesar  181,254  µg/ml, hal  ini  sejalan  dengan  aktivitas  enzim amilolitik  yang  mempunyai  nilai  tertinggi
pada  medium  tersebut.  pH  medium  pada masing-masing perlakuan pada akhir fermentasi  mengalami  penurunan  sekitar  0,2- 0,5 unit, penurunan pH ini disebabkan karena selama proses fermentasi terjadi pembentukan asam-asam  organik  oleh  aktivitas  enzim. Menurut  Suhartono  (1989),  bahwa  aktivitas enzim  dan  pertumbuhan  mikroba  seringkali menghasilkan  produk  yang  dapat  mengubah pH.  Aktivitas  sel  sangat  mempengaruhi  pH medium,  karena  sel  dan  aktivitasnya  akan menghasilkan  asam-asam  organik  selama proses  metabolisme  karbohidrat  dan  sintesa enzim.
Hasil  Penelitian  pH  media  diduga  tidak mempengaruhi  aktivitas  enzim  amilolitik  hal ini  dikarenakan  pH  media  masih  berada dalam batas pH optimum bagi aktivitas enzim amilolitik  dari B.  megaterium, menurut Thomas (1980) cit. Winkelman (1982), bahwa pH  optimum  bagi  aktivitas  enzim  amilolitik dari Bacillus  megaterium berkisar  antara  pH 6,5–7.  Sebagian  besar  enzim  amilolitik  aktif pada kondisi netral dan sedikit asam.

## KESIMPULAN
Kesimpulan  yang  dapat  diambil  dari penelitian  ini  menunjukan  bahwa;  waktu fermentasi  yang  terbaik  untuk  menghasilkan enzim  amilolitik  dari Bacillus  megaterium adalah 14 jam fermentasi dan kadar pati sagu 2%  (b/v)  merupakan  kadar  yang  optimum dalam  memproduksi  enzim  amilolitik  karena dihasilkan aktivitas enzim yang tertinggi yaitu 0,076  unit/ml  dengan  kadar  gula  media  rata- rata yang tertinggi yaitu 181,254 µg/ml.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Melalui  tulisan  ini  Penulis  menghatur- kan  terima  kasih  yang  tak  terhingga  kepada Rachmawati  S,  MS  (alm.)  dan  Dr.  Rer.  nat. Nilla Djuwita Abbas untuk ilmu dan bimbing- an  selama  menuntut  ilmu  dan  penelitian. Semoga menjadi amal ibadah bagi Ibu.

## DAFTAR PUSTAKA
Arbianto.  (1990). Petunjuk  Laboratorium Biokimia  I  Karbohidrat  dan  Lipid .
Bandung:  Pusat  Antar  Universitas Bioteknologi ITB.
Atlas,  R.  M.  (1993). Hand    Book    of Microbiological  Media .  London  and Tokyo:  CRC  Press,  Boca  Raton,  Ann Arbor.
Boing, J. T. P. (1982). Enzyme Production . In
Reed,  G.  (ed.)  1982.  Prescott  and Dunns’s Industrial.
Cooney,  C.  L.  (1981). Growth  of    Micro- organisms . Biotechnology 1. 82-84. Doi, R. H.  &  McGloulin, M.  (1992). Biology of  Bacilli  Application  to  Industry . U.S.A.: Butterworth-Heinemann. Dordick,  J.  S.  (1991). Biocatalysts  for Industry .  New  York  and  London: Plenum Press.
Forgarty,  W.  M.  &  Kelly,  C.  T.  (1983). Microbial  α-Glucosidase . J  Process Biochemistry . 18(3). 6.
Forst,  G.  M.  &  Moss,  D.  A.  (1987).
Production  of    Enzyme  by  Fermen- tation .  In  Rehm,  H.  J.  And  Reed,  G. (eds). Biotechnology vol. 7a. Germany: Weinheim.
Mhathre,  N.  S.  &    Windish,  W.  W.  (1965).
Microbial  Amylases ,  p.  273-304. In Umbreit,  W.  W.  (ed.)  Advances  in
Appllied  Microbiology,  Vol.  7.  New York: Academic Press.
Prayitno,  N. R., Meliawati, R., Wiryasasmita,
&  Sukara,  E.  (1994). Peningkatan
Proses  Produksi  Amiloglukosidase dengan  Mengggunakan  Serbuk  Ino- kulum  Aspergillus  sp.  KT-11  pada
Medium  Singkong  Parut  Segar. Hal.
340. Dalam Prosiding Hasil Penelitian dan Pengembangan Biotek II. Puslitbang LIPI. Bogor.
Sa’id,    E.  G.  (1993). Peluang  Pemanfaatan
Pati  Sagu  dengan  Bioteknologi  dan Kajian  Khusus  Mengenai  Perkaya
Protein Bahan Berpati dengan Kultivasi Media Padat dalam Prosiding  Simpo-sium  Sagu  Nasional 12-13 Oktober 1992. Ambon Stanbury, P. F. and  Whitaker. (1984). Prince of  Fermentation  Technology.  Oxford:
Pergamon Press, Ltd.
Suhartono,  M.  T.  (1989). Enzim  dan Bioteknologi .  Kerjasama  Depdikbud DIKTI  dengan  PAU  Biotek.  Bogor: IPB.
Wang,  D.  I.  C. et  al .  (1979). Fermentation and  Enzyme  Technology .  New  York: Jhon Willey and Sons.
Ward, O. P.  (1983). Proteinase .  In Microbial Enzymes and Biotechnology.  London:
W.M.  Forgaty  (ed).  Applied  Science Publishing. Winkelman, G. (1982). Microbial
Degredation  of    Natural  Products . VCH.  Wein-heim.  New  York:  Basel. Cambridge.
http://www.ristek.go.id/index.php/module/Ne
ws+News/id/13897. Diakses pada tanggal 25 Oktober 2013 Pukul 19.12.