Kandungan Senyawa Bioaktif dan Aktivitas Biologis Ekstrak Daun Rhizophora apiculata Asal Perairan Teluk Awur, Jepara
Mirsa Septiana Mutik 1 , Mada Triandala Sibero 1,2,* , Widianingsih 1 , Subagiyo 1 , Rudhi Pribadi 1 , Dwi Haryanti 1 , Ambariyanto Ambariyanto 2 , Retno Murwani 2
1 Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro 2 Laboratorium Natural Product, UPT Laboratorium Terpadu, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia
Email: madatriandalasibero@lecturer.undip.ac.id

## Abstract

## Evaluation of Bioactive Compounds and Biological Activities of Rhizophora apiculata Leaves from Teluk Awur, Jepara
Rhizophora  apiculata  is  a  type  of  mangrove  that  has  the  ability  to  adapt  to  extreme  environmental  conditions  such  as temperature,  low  oxygen  levels,  and  high  salinity.  This  adaptability  affects  the  production  of  secondary  metabolites. Information about the antibacterial activity of this mangrove against MDR (Multi-Drug Resistant) bacteria is still very limited. The content of secondary metabolites produced by mangrove R. apiculata is also expected to affect antioxidant activity against free radicals. The purposes of this study were to examine the presence of bioactive compounds by phytochemical tests  and  to  evaluate  the  antibacterial  activity  against  MDR  bacteria  such  as  Pseudomonas  aeruginosa,  Escherichia  coli, Bacillus cereus, and Bacillus subtilis; and antioxidants property of R. Apiculata leaves that were collected from Teluk Awur, Jepara. The leaves were extracted using the multilevel maceration method with solvent sequence n-hexane, ethyl acetate and methanol. Metabolite finger printing using TLC method was carried out to detect the presence of alkaloids, flavonoids, saponins,  phenolics,  quinones,  steroids,  and  triterpenoids.  The  antibacterial  test  was  carried  out  using  agar  well  diffusion method while the antioxidant test was carried out using the DPPH method. The results of the phytochemical test showed that there were groups of alkaloids and steroids in the n-hexane solvent; alkaloids, phenolics, and steroids in ethyl acetate solvent; as well as alkaloids, flavonoids, phenolics, and saponins in methanol solvents. The results of this study indicate that R. apiculata from Teluk Awur Coastal Waters, Jepara had no potential as an antibacterial against MDR (Multi-Drug Resistant) bacteria, however  the  methanol  extract  has  the  potential  to  be  used  as  an  antioxidant  with  an  IC 50 value  of  85.999  ppm. The bioautography showed that compounds from the phenol group, flavonoids, triterpenoids and  -carotene pigments acted as antioxidant agents in the leaf extract of R. apiculata.
Keywords : Antioxidant, bioactive, bioautography, mangrove, Rhizophora apiculata

## Abstrak
Rhizophora  apiculata merupakan  salah  satu  jenis  mangrove  yang  memiliki  kemampuan  beradaptasi  terhadap  kondisi lingkungan ekstrem seperti suhu, kadar oksigen rendah dan salinitas tinggi. Kemampuan beradaptasi tersebut mempengaruhi produksi matabolit sekunder. Informasi mengenai kemampuan aktivitas antibakteri mangrove jenis ini melawan bakteri MDR ( Multi Drug Resistent ) masih sangat terbatas. Kandungan metabolit sekunder yang dihasilkan mangrove R. apiculata ini juga diharapkan  dapat  mempengaruhi  aktivitas  antioksidan  melawan  radikal  bebas.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk mengkaji  kandungan  senyawa  bioaktif  serta  aktivitas  biologis  berupa  antibakteri  melawan  bakteri  MDR Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus cereus dan Bacillus subtilis; dan antioksidan dari ekstrak daun mangrove R. apiculata asal perairan Teluk Awur, Jepara. Sampel diekstraksi menggunakan 3 pelarut berbeda (n-heksana, etil asetat dan metanol) dengan  metode  maserasi  bertingkat.  Analisis  metabolit  sidik  jari  dilakukan  menggunakan  plat  KLT  untuk  mengetahui kandungan  senyawa  alkaloid,  flavonoid,  saponin,  fenolik,  kuinon,  steroid  dan  triterpenoid.  Uji  antibakteri  dilakukan menggunakan  metode  sumuran  sedangkan  uji  antioksidan  dilakukan  menggunakan  metode  DPPH.  Hasil  uji  fitokimia menunjukkan terdapat golongan senyawa alkaloid dan steroid pada pelarut n-heksana; alkaloid, fenolik dan steroid pada pelarut etil asetat; serta alkaloid, flavonoid, fenolik dan saponin pada pelarut metanol. Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa R. apiculata asal perairan Teluk Awur, Jepara tidak potensial sebagai antibakteri melawan bakteri MDR ( Multi Drug Resistent ),  akan  tetapi  ekstrak  metanol  potensial  digunakan  sebagai  antioksidan  dengan  nilai  IC 50 85,999  ppm.  Tahapan bioautografi  menunjukkan  bahwa  senyawa  dari  golongan  fenol,  flavonoid,  triterpenoid  dan  pigmen  -karoten  berperan sebagai agen antioksidan pada ekstrak daun R . apiculata .
Kata kunci : Antioksidan, bioautografi, mangrove, Rhizophora apiculata

## Jurnal Kelautan Tropis November 2022 Vol. 25(3):378-390

## PENDAHULUAN
Mangrove  adalah  salah  satu  tumbuhan  pesisir  yang  memiliki  kemampuan  beradaptasi terhadap kondisi lingkungan yang ekstrem seperti suhu yang tidak stabil, kadar oksigen rendah dan salinitas tinggi (Dahibhate et al., 2018). Kemampuan beradaptasi yang unik tersebut mempengaruhi metabolisme  mangrove  dalam  mensintesis  metabolit  sekunder.  Metabolit  ini  berfungsi  untuk beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang fluktuatif serta sebagai respon pertahanan diri (Abdel- Aziz et al., 2016). Tumbuhan mangrove memiliki senyawa bioaktif yang terdapat pada bagian akar, daun, batang dan bunganya (Karim et al., 2020). Lebih lagi, daun mangrove diketahui berperan penting dalam beradaptasi dengan tingkat salinitas tinggi serta beradaptasi dengan paparan suhu maupun  sinar  matahari  (Naskar et  al., 2020).  Tipe  morfologi  daun  mangrove  mempengaruhi kemampuan  dalam  beradaptasi.  Struktur  kutikula  yang  tebal  mampu  melindungi  daun  dalam menerima  radiasi  sinar  matahari  (Lucena et  al., 2011).  Hal  ini  diduga  mempengaruhi  produksi metabolit  sekunder  pada  daun  mangrove.  Potensi  metabolit  sekunder  yang  dihasilkan  oleh mangrove  sangat  berpotensi  dalam  pengembangan  produk  farmaseutika,  kosmeseutika  dan nutraseutika (Vinoth et al ., 2019).
Rhizophora apiculata adalah salah satu jenis mangrove yang keberadaanya umum ditemui di pesisir Indonesia (Ciptaningrum dan Putri, 2019). Lebih lagi mangrove spesies ini juga ditemukan di pesisir Teluk  Awur,  Jepara (Ridlo et al., 2019).  Perairan Teluk  Awur adalah salah satu pantai yang terletak  di  Kabupaten  Jepara,  Jawa  Tengah.  Perairan  ini  merupakan  salah  satu  daerah pengembangan pariwisata di Jawa Tengah (Deviana et al., 2019). Keberadaan flora dan fauna di kawasan  mangrove  Teluk  Awur  membuat  pemerintah  daerah  setempat  menetapkan  kawasan tersebut dijadikan tempat pendidikan dan penelitian. Spesies mangrove yang ada pada perairan Teluk Awur merupakan spesies asli dan hasil pengkayaan jenis dari Mangrove Replant (MR) yang dilakukan oleh organisasi KeSEMaT (Pradana et al., 2013). Keberadaan mangrove R . apiculata pada lokasi ini belum banyak dikaji sebagai sumber metabolit sekunder.
Pemanfaatan mangrove R . apiculata di Indonesia belum optimal meski kandungan metabolit sekunder seperti tannin, saponin dan terpenoid dapat digunakan sebagai sumber antibakteri (Ramli et al., 2020). Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa ekstrak daun R. apiculata memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Gram negatif Pseudomonas aeruginosa (Dewanto et al., 2021). Potensi ekstrak  daun R.  apiculata dalam  menghambat  pertumbuhan  bakteri Eschericia  coli dan Bacillus cereus juga telah dilaporkan pada penelitian sebelumnya (Sormin et al., 2021). Akan tetapi, potensi R. apiculata melawan bakteri strain multidrug resistant (MDR) belum banyak dilaporkan.
Disamping potensinya dalam melawan bakteri patogen, R. apiculata asal perairan Teluk Awur Jepara  juga  diharapkan  dapat  digunakan  sebagai  sumber  antioksidan  melawan  radikal  bebas. Penelitian sebelumnya melaporkan kandungan metabolit sekunder pada mangrove R. apiculata meliputi  fenol,  alkaloid,  flavonoid,  tannin,  saponin,  terpenoid  dan  steroid  (Akasia et  al., 2021). Kandungan senyawa golongan fenolik mengindikasikan kemampuan suatu ekstrak sebagai sumber antioksidan  yang  baik  (Palaniyandi et  al., 2020).  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk mengkarakterisasi  senyawa  bioaktif  serta  aktivitas  potensi  antibakteri  melawan  bakteri  MDR  dan aktivitas antioksidan ekstrak daun R. apiculata yang berasal dari Teluk Awur, Jepara.

## MATERI DAN METODE
Sampel berupa daun mangrove R. apiculata diambil dari perairan Teluk Awur, Jepara, Jawa Tengah.  Identifikasi  sampel  daun R.  apiculata dilakukan  berdasarkan  Noor et  al. (2012),  dengan mengamati  bentuk  morfologi  sampel.  Pengambilan  sampel  dilakukan  pada  daun  yang  memiliki karakteristik berwarna hijau, tidak cacat dan tidak terdapat serangga yang menempel. Selanjutnya sampel diletakkan pada container box kemudian dibawa menuju laboratorium untuk selanjutnya dilakukan preparasi.
Sampel  daun  berjumlah  20  helai  yang  telah  diambil  kemudian  dibersihkan  menggunakan tissue. Selanjutnya sampel dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 40 o C selama 3 x 24 jam. Setelah  dilakukan  pengeringan  kemudian  sampel  dipotong  menjadi  ukuran  kecil  lalu  ditimbang sebanyak 250 gram dan 200 gram kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Ekstraksi dilakukan menggunakan  metode  maserasi  bertingkat  dengan  pelarut  n-heksana,  etil  asetat  dan  metanol masing-masing 200 ml (Ridlo et al ., 2017). Sampel dimaserasi dalam n-heksana 200 mL selama 24 jam pada suhu ruang ±27 o C, lalu disaring. Residu dimaserasi kembali berturut-turut dalam etil asetat dan metanol dengan cara yang sama. Didapatkan 3 filtrat dengan pelarut n-heksana, etil asetat dan metanol. Hasil ekstraksi selanjutnya dievaporasi dengan suhu 31 o C.
Kandungan senyawa bioaktif pada ekstrak kasar daun R. apiculata dilakukan menggunakan metode  fitokimia  (Akasia et  al. 2021;  Sibero et  al. 2019;  Sibero et  al. 2020  dan  Maria et  al. 2018). Masing-masing ekstrak kasar dilarutkan dalam pelarut awal.
Dua mL masing-masing ekstrak  dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 mL asam sulfat (H 2 SO 4 ) 2N, kemudian diaduk hingga larut. Sampel disaring menggunakan kertas saring whatman 0,45  µm.  Pelarut Dragendorff diteteskan  ke  dalam  tabung  lalu  diamati  endapan  yang terbentuk.  Adanya  senyawa  alkaloid  ditandai  dengan  terbentuknya  endapan  kuning  menuju orange ketika ditambahkan Dragendorff.
Sebanyak 0,5 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan  HCl pekat 0,25 mL, kemudian dipanaskan selama 15 menit kemudian diamati perubahan warnanya. Adanya senyawa  flavonoid  ditandai  dengan  warna  orange,  merah  atau  magenta  tergantung  dengan struktur flavonoid yang terkandung dalam sampel tersebut.
Sebanyak 0,5 mL sampel daun yang telah dipekatkan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan  ditambahkan  aquadest  1,25  mL,  kemudian  tabung  tersebut  dipanaskan  hingga  mendidih. Selanjutnya tabung reaksi dikocok secara vertikal hingga terbentuk busa. Diamati selama 30 menit, kemudian  diteteskan  satu  tetes  HCl  2N  ke  tengah  permukaan  larutan.  Adanya  busa  yang  stabil menunjukkan hasil yang positif pada metode ini.
Sebanyak  0,5  mL  sampel  dimasukkan  ke  dalam tabung  reaksi  dan  ditambahkan  tiga  tetes asetat  anhidrida,  kemudian  dipanaskan  hingga  mendidih  dan  didinginkan  pada  suhu  ruangan. Selanjutnya  ditambahkan  satu  tetes  asam  sulfat  H 2 SO 4 melalui  dinding  tabung  reaksi.  Adanya senyawa golongan steroid ditandai dengan munculnya warna hijau pada lapisan atas dan warna merah pekat pada lapisan bawah menandakan adanya senyawa triterpenoid.
Uji  Fenolik  dilakukan  dengan  cara  menambahkan  0,5  mL  ekstrak  daun  mangrove  yang ditambahkan FeCl 3 1%, kemudian diamati perubahan warna yang terjadi. Indikator positif dari uji fenol adalah terbentuknya warna biru kehitaman
Sebanyak  0,5  mL  sampel  daun  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan  ditambahkan aquadest 1,25 mL kemudian ditambahkan 0,25 mL NaOH 2N. Adanya kandungan senyawa kuinon ditandai dengan timbulnya warna pink kemerahan/ungu.
Analisis metabolit sidik jari pada daun R . apiculata dilakukan menggunakan plat KLT silica gel 60 F 254 (merek) sebagai fase diam, sedangkan fase gerak menggunakan kombinasi pelarut organik n-heksana:etil  asetat  (7:3)  (Frederick et  al., 2021).  Kombinasi  pelarut  dilakukan  berdasarkan percobaan trial and error. Hasil uji KLT selanjutnya dilakukan visualisasi menggunakan sinar ultraviolet 366 nm dan perendaman beberapa pereaksi seperti; pereaksi vanillin, FeCl 3 , Dragendorff, DPPH dan AlCl 3 .
Bakteri MDR P. aeruginosa, E. coli, B. cereus dan B. subtilis diremajakan pada media Nutrient Agar selama 24 jam sebelum digunakan dalam uji antibakteri. Tahap ini mengacu pada standar
pengujian oleh CLSI (2016). Ekstrak daun yang telah dipekatkan diencerkan menggunakan DMSO hingga konsentrasinya menjadi 2000 µ/mL, 1000 µ/mL, 500 µ/mL dan 250 µ/mL (Sibero et al., 2019). Tahap  uji  antibakteri  dilakukan  berdasarkan  Nurhayati et  al. (2020).  Bakteri  diencerkan menggunakan  media Mueller  Hilton  Broth hingga  mencapai  kekeruhan  0,5 McFarland. Suspensi bakteri uji diinokulasikan pada media MHA menggunakan cotton swab lalu didiamkan hingga agak kering. Kemudian lubang sumuran ( agar well ) dibuat menggunakan alat pembolong steril kemudian crude extract dimasukkan dengan masing-masing konsentrasi yang telah ditentukan sebanyak 50 µL ke dalam sumuran. Selanjutnya petri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C kemudian diamati zona  bening  yang  terbentuk.    Diameter  zona  hambat  kemudian  diukur  menggunakan  jangka sorong untuk mengetahui efektivitas konsentrasi (Sibero et al., 2018).
Tiga  mL  larutan  ekstrak  dengan  konsentrasi  7.81,  15.6,  31.2,  62.5,  125,  250  dan  500  ppm ditambah  1  mL  DPPH,  kemudian  diinkubasi  selama  30  menit  pada  suhu  ruang  (27 o C)  dan  diukur absorbansinya  pada  panjang  gelombang  517  nm  (Ridlo et  al., 2019).  Penentuan  % radical scavenging activity adalah sebagi berikut:
% 𝑅𝑆𝐴 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 − 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜
×  100%
Aktivitas  antioksidan  dinyatakan  dalam  IC 50 yang  merupakan  konsentrasi  sampel  untuk menghambat 50% radikal bebas. Nilai ini dihitung menggunakan regresi linear (Haerani et al., 2019).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil ekstraksi menggunakan tiga pelarut didapatkan ekstrak kasar dengan pelarut n-heksana sebesar 0,1 gram; pelarut etil asetat sebesar 2,8 gram; sedangkan pelarut metanol sebesar 6,6 gram. Ketiga  ekstrak  kasar  berbentuk  pasta.  Ekstrak  n-heksana  berwarna  coklat  tua;  ekstrak  etil  asetat berwarna coklat kehitaman; sedangkan ekstrak metanol berwarna hijau tua kehitaman. Selanjutnya seluruh ekstrak kasar dilanjutkan untuk  uji fitokimia. Rendemen  ekstrak dipengaruhi oleh jenis dan polaritas  pelarut  serta  karakteristik  alami  sampel  seperti  kandungan  proksimatnya  ().  Jumlah rendemen  yang  diperoleh  dari  pelarut  n-heksan  tercatat  sebagai  yang  paling  rendah  karena pelarut ini umumnya akan menarik senyawa-senyawa non-polar, khususnya asam lemak. Pelarut etil asetat bersifat semi-polar sehingga mampu mengekstrak beberapa senyawa non-polar dan polar. Sedangkan, metanol mampu menarik berbagai senyawa dengan rentang kepolaran yang sangat besar maupun kandungan air yang berasal dari sampel. Hal ini yang diduga mempengaruhi berat rendemen ekstrak yang diperoleh (Sibero et al ., 2019 b ). Selanjutnya, keberadaan senyawa bioaktif pada  seluruh  ekstrak  dideteksi  menggunakan  metode  fitokimia.  Hasil  deteksi  dapat  dilihat  pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil analisis fitokimia ekstrak daun R. apiculata
No Analisis Pelarut n-heksana Etil Asetat Metanol 1 Alkaloid + + + 2 Flavonoid - - + 3 Fenolik - + + 4 Steroid + + - 5 Triterpenoid - - - 6 Kuinon - - - 7 Saponin - - +
Keterangan: (+ : hasil positif, - : hasil negatif)
Berdasarkan  hasil  pengujian  fitokimia  diketahui  bahwa  ekstrak  metanol  daun R.  apiculata mengandung senyawa bioaktif dari golongan alkaloid, flavonoid, fenolik, dan saponin.  Ekstrak R. apiculata dengan pelarut etil asetat terdeteksi memiliki golongan senyawa bioaktif dari golongan alkaloid,  fenolik  dan  steroid.  Sedangkan  ekstrak R.  apiculata dengan  pelarut  n-heksana menunjukkan adanya golongan senyawa bioaktif alkaloid dan steroid. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Akasia et al. (2021), menunjukkan bahwa hasil uji fitokimia terhadap mangrove jenis R. apiculata dengan pelarut metanol mampu mengekstrak senyawa bioaktif dari golongan fenolik, alkaloid, flavonoid, tanin dan saponin . Hasil yang didapatkan menunjukkan bahwa pelarut metanol mampu mengekstrak lebih banyak senyawa bioaktif, di mana hal tersebut terjadi  karena pelarut metanol merupakan pelarut universal, seperti yang dijelaskan dalam Verdiana et al. (2018), bahwa metanol dapat menarik senyawa dengan berbagai tingkat kepolaran.
Analisis  metabolit  sidik  jari  ( metabolite  finger  printing  analysis )  merupakan  suatu  metode karakterisasi perubahan kandungan metabolit suatu sampel akibat perbedaan kondisi lingkungan (Liang et al ., 2015). Namun penelitian yang dilakukan menggunakan metode ini untuk mengetahui perbedaan profil metabolit sampel yang di ekstrak menggunakan pelarut yang berbeda. Analisis ini dilakukan menggunakan plat KLT sebagai fase diam dan eluen n-heksana:etil asetat (7:3) sebagai fase  gerak  (Frederick et  al., 2021).  Metode  yang  paling  sederhana  untuk  melakukan  analisis  ini adalah  menggunakan  plat  KLT.  Kelebihan  metode  ini  dibandingkan  fitokimia  adalah  data  yang didapatkan lebih reliable karena mampu menggambarkan perbedaan metabolit secara presisi dari perbedaan  karakteristik  noda  pada  plat  KLT.  Perbedaan  nilai R f serta  warna  setiap  noda mengindikasikan jenis metabolit yang berbeda pula (Karthika dan Paulsamy, 2015).
Penelitian  ini  melakukan  analisis  metabolit  sidik  jari  melalui  visualisasi  noda  pada  plat  KLT menggunakan iluminasi dengan sinar UV serta penambahan reagent. Hasil visualisasi di bawah sinar UV 366 nm menunjukkan bahwa  perbedaan pelarut ekstraksi menghasilkan noda dengan nilai  R f berbeda. Nilai R f dan warna noda yang sama mengindikasikan adanya senyawa golongan yang sama pada ekstrak.
Gambar 1. Profil ekstrak di bawah sinar tampak dan UV menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (7:3)
X Y Z X Y Z
Hasil  visualisasi  KLT  di  bawah  sinar  tampak  dan  UV  terlihat  bahwa  terdapat  5  noda  yang muncul pada ekstrak n-heksana, 7 noda pada ekstrak etil asetat dan 6 noda pada ekstrak metanol. Terdapat 2 noda dengan nilai R f yang sama pada ekstrak n-heksana dan atil asetat, begitu pula terdapat 2 noda dengan nilai  R f yang sama pada ekstrak etil asetat dan metanol. Bercak noda yang  memiliki  R f yang  sama  diduga  menunjukkan  bahwa  beberapa  senyawa  tersebut  dapat  di ekstrak menggunakan pelarut yang berbeda kepolaran. Lebih lagi, noda berwarna kuning pada plat  KLT  diduga  pigmen  karotenoid  sedangkan  noda  berwarna  hijau  merupakan  pigmen  klorofil yang  terdapat  pada  sampel  daun  (Lumbessy et  al., 2021).  Selanjutnya,  hasil  deteksi  senyawa golongan steroid dan terpenoid ditampilkan pada Gambar 2 dan Tabel 3.
Hasil  visualisasi  vanilin  pada  plat  KLT  (Gambar  2)  menunjukkan  adanya  bercak  noda  ungu pada  ekstrak  n-heksana,  etil  asetat  dan  metanol  dengan  nilai R f yang  berbeda-beda.  Hasil penyemprotan dengan reagen vanilin menunjukkan bahwa ekstrak h-heksan menunjukkan  jumlah
Tabel 2 . Retention factor ( R f ) ekstrak kasar daun R. apiculata
Ekstrak a b c d e f g h i j k l m X 0,26 0,38 0,60 0,79 0,91 Y 0,26 0,35 0,52 0,60  0,76 0,85 0,95 Z 0,11 0,29 0,38 0,57 0,76 0,85
Keterangan : X : ekstrak n-heksana, Y : ekstrak etil asetat, Z : ekstrak metanol
Gambar 2. Profil Ekstrak dengan reagen vanillin dan UV menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (7:3)
Tabel 3. Retention factor ( R f ) ekstrak daun R. apiculata dengan reagen vanillin
Ekstrak
Retention Factor ( R f ) a b c d e f g H X 0,12 0,30 0,51 0,70 0,71 0,82 0,96 Y 0,62 0,71 0.82 0,96 Z 0,71 0,82 0,96
Keterangan: X : ekstrak n-heksana, Y : ekstrak etil asetat, Z : ekstrak metanol
X Z Y a f g b c d e h
noda ungu yang lebih banyak dibandingkan ekstrak dari pelarut lainnya. Warna ungu yang muncul pada plat KLT yang disemprotkan dengan reagen vanillin diduga adalah senyawa terpenoid dan steroid  (Alen et  al .,  2017).  Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  Jiang et  al. (2016)  yang  menyatakan bahwa  n-heksan  merupakan  pelarut  yang  tepat  untuk  mengekstrak  senyawa  dari  golongan terpenoid. Golongan senyawa berikutnya yang dideteksi adalah fenolik. Hasil deteksi ini ditampilkan pada Gambar 3 dan Table 4.
Hasil  visualisasi  FeCl 3 pada  plat  KLT  (Gambar  3)  menunjukkan  adanya  bercak  noda  hitam kebiruan pada ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol dengan nilai R f 0,70 ( a ); 0,78 ( b ); 0,80 ( c ) dan 0.98 ( d ). Warna hitam kebiruan yang muncul pada plat KLT yang disemprotkan dengan reagen FeCl 3 diduga sebagai senyawa dari golongan fenolik (Alen et al ., 2017). Selanjutnya deteksi senyawa dari golongan alkaloid ditampilkan pada Gambar 4.
Hasil visualisasi menggunakan reagen Dragendorf pada plat KLT (Gambar 4) menunjukkan tidak  adanya  bercak  warna  kuning/jingga  pada  ekstrak  n-heksana,  etil  asetat  dan  metanol. Penyemprotan Dragendorf dilakukan untuk mendeteksi senyawa alkaloid pada ekstrak (Alen et al ., 2017). Hal ini diduga akibat konsentrasi alkaloid yang rendah pada ekstrak yang dianalisis sehingga tidak dapat terdeteksi menggunakan metode plat KLT. Selanjutnya deteksi keberadaan senyawa dari golongan flavonoid dilakukan dengan penyemprotan reagen AlCl 3 (Guntarti et al ., 2017). Hasil deteksi ditampilkan pada Gambar 5.
Tabel 4 . Retention factor (R f ) ekstrak daun R. apiculata dengan reagen FeCl 3
Ekstrak
Retention Factor ( R f )
a b c d X 0,74 0,82 0,87 0,96 Y 0,74 0,82 0,87 0,96 Z 0,74 0,82 0,87 0,96
Keterangan: X : ekstrak n-heksana, Y : ekstrak etil asetat, Z : ekstrak metanol
Gambar 3. Profil ekstrak dengan reagen FeCl 3 menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (7:3)
X Y Z b a c d
Gambar 4. Profil ekstrak dengan reagen Dragendorff menggunakan eluen n-heksana: etil asetat (7:3)
Gambar 5. Profil ekstrak dengan Reagen AlCl 3 setelah diiluminasi dengan UV menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (7:3)
Hasil visualisasi AlCl 3 pada plat KLT (Gambar 5) ditemukan adanya perubahan warna noda menjadi kuning berpendar di bawah sinar UV pada R f 0,33 yang dimiliki oleh ekstrak etil asetat dan metanol. Hasil ini sesuai dengan kajian sebelumnya yang menyatakan bahwa flavonoid dapat  di ekstrak  oleh  pelarut  metanol  dan  etil  asetat  (Sibero et  al .,  2019b).  Setelah  mengetahui  profil metabolit  sekunder  pada  setiap  sampel  maka  dilakukan  bioassay  untuk  mengetahui  potensi antibakteri  dan  antioksidan  ekstrak  daun R . apiculata asal  perairan  Teluk  Awur,  Jepara.  Hasil  uji antibakteri melawa patogen MDR dapat dilihat pada Tabel 5.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  seluruh  ekstrak  daun R . apiculata tidak  mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen MDR yang digunakan. Hasil ini bertentangan dengan beberapa  penelitian  sebelumnya  yang  menunjukkan  ekstrak R.  apiculata memiliki  aktivitas antibakteri  terhadap  beberapa  bakteri  pathogen  manusia.  Dewanto et  al .  (2021)  melaporkan bahwa  ekstrak  daun R.  apiculata dengan  pelarut  metanol  dan  dichloromethane  mampu
X Y Z
menghambat  pertumbuhan  bakteri  Gram  negatif Pseudomonas  aeruginosa. Penelitian  yang dilakukan oleh Sormin et al. (2021) menunjukkan bahwa ekstrak daun R. apiculata dengan pelarut n-heksana, etil asetat dan metanol mampu menghambat pertumbuhan dari bakteri Gram positif: Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus maupun Gram negatif: Escherichia coli dan Salmonella typhi. Perbedaan ini dapat dipengaruhi oleh jenis strain patogen yang digunakan. Pada penelitian ini menggunakan bakteri strain clinical multidrug - resistant (MDR). Strain clinical MDR mengindikasikan bahwa bakteri patogen yang digunakan merupakan hasil isolasi langsung dari pasien yang diinfeksi oleh bakteri yang sudah resisten terhadap berbagai jenis antibiotik (Megiorakos et al ., 2012). Bakteri MDR  diketahui  memiliki  berbagai  mekanisme  resistensi  untuk  mencegah  kerusakan  sel  yang diakibatkan  oleh  induksi  berbagai  substansi  yang  bersifat  sebagai  antimikroba.  Hal  ini  dapat diasumsikan sebagai penyebab ketidak mampuan ekstrak daun R. apiculata untuk menghambat pertumbuhan  bakteri  MDR  yang  diujikan.  Dengan  demikian,  ekstrak  daun R.  apiculata tidak disarankan  untuk  digunakan  sebagai  sumber  antibakteri  melawan  bakteri  MDR.  Kajian  bioassay selanjutnya yang dilakukan adalah uji antioksidan. Hasil uji ini ditampilkan oleh Gambar 7.
Aktivitas  antioksidan  dinyatakan  dalam  nilai inhibition  concentration (IC 50 ).  Nilai  ini  berarti konsentrasi  minimal  yang  dibutuhkan  untuk  menghambat  radikal  bebas  sebesar  50%,  sehingga semakin kecil nilai IC 50 maka aktivitasnya akan semakin baik (Sibero et al ., 2022). Hasil uji antioksidan ekstrak daun R. apiculata menunjukkan bahwa ekstrak metanol memberikan kemampuan aktivitas antioksidan tertinggi dengan nilai IC 50 85.999 ± 0,1483 ppm, diikuti dengan etil asetat dengan nilai IC 50 119.69 ± 0,407 ppm dan aktivitas antioksidan paling lemah ditunjukkan pada ekstrak n-heksana dengan nilai IC 50 458.77 ± 0,217 ppm. Muttakin et al. (2019) menyatakan bahwa nilai IC 50 50-100 ppm Tabel 5. Aktivitas antibakteri ekstrak daun R. apiculate
No Bakteri Uji Konsentrasi (mg/mL) 2 1 0,5 0,25 (+) Amoxicillin (-) DMSO 1. Bacillus cereus - - - - ++ - 2. Bacillus subtilis - - - - ++ - 3. Pseudomonas aeruginosa - - - - ++ - 4. Escherichia coli - - - - ++ -
Keterangan: ++ (menghasilkan zona hambat), - (tidak menghasilkan zona hambat)
Gambar 7. Aktivitas Antioksidan (IC 50 ) Ekstrak Daun R. apiculata 0 100 200 300 400 500 600 N-heksana Etil asetat Metanol IC 50 ( p p m) a b c
dikategorikan sebagai antioksidan kuat. Ekstrak metanol memiliki kemampuan antioksidan paling kuat dibanding ekstrak etil asetat dan n-heksana. Hal ini diduga karena pelarut metanol memiliki kepolaran  tinggi  sehingga  mampu  mengekstrak  senyawa-senyawa  bioaktif  polar  dan  non  polar. Aktivitas  antioksidan  dipengaruhi  oleh  keberadaan  metabolit  sekunder  yang  terkandung  pada suatu sampel. Senyawa dari golongan fenolik seperti flavonoid, tannin dan kuinon diketahui sebagai agen antioksidan yang sangat baik. Hal ini diperkuat oleh Palaniyandi et al. (2020), bahwa senyawa fenolik dari tumbuhan merupakan sumber antioksidan alami yang baik. Flavonoid, tannin dan fenolik dikenal sebagai sumber antioksidan yang kuat karena kemampuannya mendonorkan proton untuk menstabilkan radikal bebas. Menurut Ridlo et al. (2017), senyawa fenolik akan memutuskan reaksi berantai ( chain reaction ) radikal dan akan mendonorkan atom hidrogennya sehingga dihasilkan radikal  bebas  yang  lebih  stabil.  Berdasarkan  hasil  yang  didapatkan,  penelitian  ini  menemukan bahwa ekstrak metanol daun R. apiculata berpotensi digunakan sebagai antioksidan.
Penelitian  ini  melakukan  bioautografi  menggunakan  KLT  dengan  penyemprotan  reagen DPPH. Bioautografi merupakan suatu metode yang dilakukan untuk mendeteksi hingga mengisolasi suatu senyawa berdasarkan aktivitas biologis yang ditargetkan menggunakan kromatografi yang sesuai  (Wang et  al .,  2012).  Pada  penelitian  ini,  bioautografi  dilakukan  untuk  menduga  golongan senyawa  bioaktif  dari  ekstrak  daun R . apiculata yang  berfungsi  sebagai  agen  antioksidan. Pendugaan  golongan  senyawa  dilakukan  dengan  mengkombinasikan  pemahaman  dari  analisis metabolit sidik jari dengan hasil penyemprotan reagen DPPH.  Hasil tahapan ini ditampilkan pada Gambar 8.
Hasil visualisasi menggunakan reagent DPPH pada plat KLT (Gambar 8) menunjukkan adanya bercak noda kuning pada ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol dengan nilai R f yang berbeda- beda. Warna putih pudar hingga kuning yang muncul pada plat KLT yang disemprotkan dengan reagen DPPH diduga adalah komponen senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan (Jesionek et al .,  2015).  Berdasarkan  hasil  analisis  metabolit  sidik  jari  menggunakan  observasi  warna  dan pemberian  reagent  maka  dapat  diketahui  bahwa  senyawa  yang  memberikan  efek  antioksidan pada sampel daun R . apiculata merupakan golongan flavonoid (a), terpenoid (d) dan fenolik (e). Sebagai catatan, noda a dan e diduga sebagai kumpulan senyawa yang tidak dapat terpisahkan dengan  sempurna  sehingga  pada  noda  tersebut  juga  terdeteksi  beberapa  golongan  senyawa. Hasil  ini  kembali  menegaskan  bahwa  senyawa  golongan  flavonoid  dan  fenolik  memiliki  potensi sebagai antioksidan (Ridlo et al. , 2017; Palaniyandi et al ., 2020). Berdasarkan hasil visualisasi di bawah sinar tampak (Gambar 1) diduga bahwa noda b dan c merupakan pigmen yang terkandung di
Gambar 8. Profil Ekstrak dengan Reagen DPPH dan UV menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (7:3)
d e e e X Z Y a a b c d e e e b X Z Y a a X Z Y e e e a a X Z Y
dalam duan R . apiculata . Hasil ini sesuai dengan laporan Rumengan et al . (2021) yang menyatakan bahwa daun mangrove Rhizophora mengandung berbagai pigmen alami yang berpotensi sebagai antioksidan  seperti  lutein,  neoxanthin,  violaxanthin,  dan  -karoten.  Lebih  lagi,  pigmen  -karoten sering  ditemukan  pada  noda  terakhir  dengan  nilai R f terbesar  pada  plat  KLT  (Zeb  dan  Murkovic, 2010). Sehingga noda e diduga sebagai pigmen  -karoten.

## KESIMPULAN
Ekstrak daun R. apiculata asal perairan Teluk Awur Jepara mengandaung beberapa senyawa bioaktif seperti: golongan senyawa bioaktif alkaloid, flavonoid, fenolik, dan saponin pada pelarut metanol;  golongan  senyawa  alkaloid,  fenolik  dan  steroid  pada  pelarut  etil  asetat;  sedangkan golongan senyawa alkaloid dan steroid pada pelarut n-heksana. Ekstrak daun R. apiculata pada ketiga pelarut tidak menunjukkan adanya aktivitas antibakteri melawan bakteri MDR ( P. aeruginosa, E. coli, B. cereus dan B. subtilis). Ekstrak metanol menunjukkan potensi antioksidan tertinggi dengan nilai  IC 50 85.999  ±  0,1483  ppm.  Berdasarkan  hasil  analisis  metabolit  sidik  jari  yang  dikombinasikan dengan  bioautografi  diduga  bahwa  senyawa  yang  bersifat  antioksidan  berasal  dari  golongan pigmen  -karoten, flavonoid, fenol dan terpenoid.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Artikel  ini  merupakan  luaran  dari  program  penelitian  yg  didanai  oleh  FPIK  UNDIP  melalui skema penelitian tahun 2022 dengan nomor kontrak 246/UN7.5.10.2/PP/2022 yang diterima oleh Dr. Mada Triandala Sibero.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Aziz, S.M., Mouafi, F.E., Moustafa, Y.A., & Abdelwahed, N.A. (2016). Medicinal Importance of Mangrove Plants. Microbes in Food anh Health. Springer, Cham , pp. 77-96.
Akasia,  A.I.,  Putra,  I.D.N.N.,  &  Putra,  I.N.G.  (2021).  Skrining  Fitokimia  Ekstrak  Daun  Mangrove Rhizophora mucronata dan Rhizophora apiculata yang Dikoleksi dari Kawasan Mangrove Desa Tuban, Bali. Journal of Marine Research and Technology , 4(1), 16 – 22.
Alen,  Y.,  Agresa,  F.L.,  &  Yuliandra,  Y.  (2017).  Test  and  repair  of  non-volatile  commodity  and embedded memories. Jurnal Sains Farmasi & Klinis , 3(2), 146 – 152. doi: 10.1109/TEST.2002.1041926. Ciptaningrum,  I.,  &  Putri,  R.A.  2019.  Efek  Antimikroba  Rhizophora  apiculata  untuk  Menghambat Pertumbuhan Bakteri. Jurnal Farmasetis , 8(2), 75-82.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), (2016) Performance Standards for  Antimicrobial Susceptibility Testing. 26th Edition, Wayne.
Dahibhate,  N.L.,  Saddhe,  A.A.,  &  Kumar,  K.  (2018).  Mangrove  Plants  as  a  Source  of  Bioactive Compounds:  A  Review. The  Natural  Products  Journal, 9(2),  86 – 97.  doi:  10.2174/221031550866 6180910125328.
Deviana, D.A., Purwanti, F., & Rudiyanti, F.  (2019). Analisis Kesesuaian Wisata Pantai Teluk Awur di Kabupaten Jepara Jawa Tengah. Journal of Maquares , 8(2), 93-101.
Dewanto, D.K., Hermawan, R., Muliadin., Riyadi, P.H., Aisiah, S., & Tanod, W.A. (2021). Gc-Ms Profile Of  Rhizophora  Apiculata  Leaf  Extract  From  The  Coast  Of  Tomini  Bay,  Central  Sulawesi  With Antibacterial And Antioxidant Activity, Jurnal Kelautan . 14(1), 30 – 42.  doi: 10.21107/jk.v14i1.8904. Frederick,  E.H.,  Sibero,  M.T.,  Wijaya,  A.P.,  &  Syafitri,  E.  (2021).  Preliminary  Evaluation  of  Anti  Fish Pathogenic Bacteria and Metabolite Profile of Andaliman Fruit (Zanthoxylum acanthopodium DC.)  Ethanol  Extract. The  6th  International  Conference  on  Tropical  and  Coastal  Region  Eco- Development , May, 1 – 6.  doi: 10.1088/1755-1315/750/1/012026.
Guntarti,  A.,  Annisa,  J.,  Mughniy,  M.,  &  Rizqi,  F.  (2017).  Effect  of  Regional  Variation  on  the  Total Flavonoid  Level  of  Ethanol  Extract  of  Mangosteen  ( Garcinia  mangostana )  Peels. Indonesian Journal of Medicine and Health, 8(2), 136-143. doi: 10.20885/JKKI.Vol8.Iss2.art9. Haerani, A., Chaerunisa, A.Y., & Subarnas, A. (2019). Antioxidant Activities of Muntingia calabura , Syzygium cumini, Ocimum basilicum , and Eleutherine bulbosa using DPPH Method. Indonesian
Journal of Pharmaceutics , 1(2), 57 – 61.  doi: 10.24198/idjp.v1i2.21531.
Jesionek, W., Majer-Dziedzic, B., & Choma, I. (2015). Separation, Identification, and Investigation of Antioxidant  Ability  of  Plant  Extract  Components  Using  TLC,  LC-MS,  and  TLC-DPPH. Journal  of Liquid Chromatography & Related Technologies, 38(11), 1147-1153 . doi: 10.1080/10826076.2015. 1028295.
Jiang, Z., Kempinski, C., & Chappell, J. (2016). Extraction and Analysis of Terpenes/Terpenoids. Current Protocols in Plant Biology, 1, 345-358. doi: 10.1002/cppb.20024.
Karim, M.A., Islam, M. A., Islam, M. M., Rahman, M. S., Sultana, S., Biswas, S., Hosen, M. J., Mazumder, K.,  Rahman,  M.M.,  &  Hasan,  M.N.  (2020).  Evaluation  of  antioxidant,  anti-hemolytic,  cytotoxic effects  and  anti-bacterial  activity  of  selected  mangrove  plants  ( Bruguiera  gymnorrhiza and Heritiera littoralis ) in Bangladesh. Clinical Phytoscience , 6(8), 1-12.  doi: 10.1186/s40816-020-0152-9. Karthika, K., & Paulsamy, S. (2015). TLC and HPTLC fingerprints of various secondary metabolites in the stem  of  the  traditional  medicinal  climber, Solena  amplexicaulis . Indian  Journal  of Pharmaceutical Sciences, 77(1), 111-6.  doi: 10.4103/0250-474x.151591. Liang, Q., Wang, C., Li, B., & Zhang, A. (2015). Metabolic fingerprinting to understand therapeutic effects  and  mechanisms  of  silybin  on  acute  liver  damage  in  rat. Pharmacognosy  Magazine , 11(43), 586 – 593. doi: 10.4103/0973-1296.160469
Lucena, I., Maciel, V.E.D.O., Silva, J.B.D., Galvincio, J.D., & Pimentel, R.M.D.M. (2011). Leaf Structure of Mangrove Species to Understand the Spectral Responses. Journal of Hyperspectral Remote Sensing , 02, 19-31.
Lumbessy, S.Y., Junaidi, M., Diniarti, N., Setyowati, D.N., Mukhlis, A, & Tambaru, R. (2021). Identification of  Chlorophyll  Pigment  on Gracilaria  salicornia Seaweed. IOP  Conference.  Series:  Earth  and Environmental Science, 681(1), p. 012017. doi: 10.1088/1755-1315/681/1/012017.
María, R., Shirley, M., Xavier, C., Jaime, S., David, V., Rosa, S., & Jodie, D. (2018). Science Preliminary phytochemical screening , total phenolic content and antibacterial activity of thirteen native species  from  Guayas  province  Ecuador. Journal  of  King  Saud  University .  30,  500 – 505.    doi: 10.1016/j.jksus.2017.03.009.
Magiorakos,  A.P.,  Srinivasan,  A.,  Carey,  R.B.,  Carmeli,  Y.,  Falagas,  M.E.,  Giske,  C.G.,  Harbarth,  S., Hindler, J.F., Kahlmeter, G., Olsson-Liljequist, B., Paterson, D.L., Rice, L.B., Stelling, J., Struelens, M. J.,  Vatapoulos,  A.,  Weber,  J.T.  &  Monnet,  D.L.  (2012).  Multidrug-resistant,  extensively  drug- resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clinical Microbial Infection , 18(3), 268-81.  doi: 10.1111/j.1469- 0691.2011.0 3570.x.
Muttakin., Zulfajri, M., & Mariati. (2019). Antioxidant Activity from SyzygiumCumini (L.) Skeels. Journal of Physics: Conference Series . 1232(1), p. 012009. doi: 10.1088/1742-6596/1232/1/012009. Naskar, S., Mondal, S., & Ankure, S. (2020). Leaf Anatomical Adaptations of Mangroves. Handbook of Halophytes , p.1-15.  doi: 10.1007/978-3-030-17854-3_36-1 Noor,  R., Khazali, M,  & Suryadiputra,  I.N.N.  (1999). Panduan Pengamatan Mangrove di Indonesia. PHKA/WI-IP, Bogor.
Nurhayati, L.S., Yahdiyani, N. & Hidayatulloh, A. (2020). Perbandingan Pengujian Aktivitas Antibakteri Starter Yogurt Dengan Metode Difusi Sumuran Dan Metode Difusi Cakram. Jurnal Teknologi Hasil Peternakan . 1(2), 41-46. doi: 10.24198/jthp.v1i2.27537.
Palaniyandi,  T.,  Sivaji,  A.,  Thirugnanasambandam,  R.,  Durairaj,  P.,  Reddy,  R.K.  &  Vishwanathan,  S. (2020).  Isolation  and  identification  of  Anti-Oxidant  Fraction  from  Active  Extract  of  Rhizophora mucronata Poir Leaves. Pharmaceutical Chemistry Journal , 54(4), 380 – 385. doi: 10.1007/s11094- 020-02208-9.
Pradana, O.Y., Soenardjo, N. & Suryono. (2013). Kajian Bioekologi dan Strategi Pengelolaan Ekosistem Mangrove:  Studi  Kasus  di  Teluk  Awur  Jepara. Journal  of  Marine  Research, 2(1),  54-61.  doi: 10.14710/jmr.v2i1.2056.
Ramli, H. K., Yuniarti, T., Lita, N.P.S.N, & Sipahutar, Y.H. (2020). Uji Fitokimia Secara Kualitatif Pada Buah dan Ekstrak Air Buah Mangrove. Jurnal Penyuluhan Perikanan Dan Kelautan . 14(1), 1 – 12. doi: 10.33378/jppik.v14i1.198.
Ridlo,  A.,  Pramesti,  R.,  Koesoemadji,  Supriyantini,  E,  &  Soenardjo,  N.  (2017).  Aktivitas  Antioksidan Ekstrak Daun Mangrove Rhizopora mucronata. Buletin Oseanografi Marina . 6(2), 110-116.  doi:
10.14710/buloma.v6i2.16555.
Ridlo, A., Supriyantini, E., & Sedjati, S. (2019). Kandungan Total Fenolat pada Ekstrak Rhizophora sp Dari Teluk Awur, Jepara. Jurnal Kelautan Tropis . 22(1), 27-34.  doi: 10.14710/jkt.v22i1.4304. Rumengan, A.P., Mandiangan, E.S., Tanod, W.A., Paransa, D.S.J., Paruntu, C.P., Mantiri, D.M.H. (2021). Identification of pigment profilesand antioxidant activity of Rhizophora mucronata mangrove leaves origin Lembeh, North Sulawesi, Indonesia. Biodiversitas , 22(7), 2805-2816.
Sibero,  M.T.,  Igarashi,  Y.,  Radjasa,  O.K.,  Sabdono,  A.,  Trianto,  A.,  Zilda,  D.S.  &  Wijaya,  Y.J.    (2019). Sponge-associated  fungi  from  a  mangrove  habitat  in  Indonesia:  species  composition, antimicrobial activity, enzyme screening and bioactive profiling. International Aquatic Research . 11(2), 173 – 186.  doi: 10.1007/s40071-019-0227-8.
Sibero,  M.T.,  Sabdaningsih,  A.,  Radjasa,  O.K.,  Sabdono,  A.,  Trianto,  A.,  &  Subagiyo,  S.  (2018). Karakterisasi Senyawa Bioaktif Kapang Laut Trichoderma asperellum MT02 dengan Aktivitas Anti - Extended Spectrum β - Lactamase (ESBL) E.  coli . Jurnal  Kelautan  Tropis 9(22),  9-18  doi: 10.14710/jkt.v22i1.3528
Sibero,  M.T.,  Sabdono,  A.,  Radjasa,  O.K.,  &  Trianto,  A.  (2018).  Antibacterial  Activity  of  Indonesian Sponge  Associated Fungi Against Clinical Pathogenic Multidrug Resistant Bacteria. Journal of Applied Pharmacheutical Science. 8(2), 088-094. doi: 10.7324/JAPS.2018.8214. Sibero, M.T., Siswanto, A. P., Murwani, R., Frederick, E. H., Wijaya, A.P., Syafitri, E., Farabi, K., Saito, S, & Igarashi,  Y.  (2020).  Antibacterial,  cytotoxicity  and  metabolite  profiling  of  crude  methanolic extract from andaliman ( Zanthoxylum acanthopodium ) fruit. Biodiversitas . 21(9), 4147 – 4154.  doi: 10.13057/biodiv/d210928.
Sormin,  R.B.D.,  Nendissa,  D.M.,  Mailoa,  M.N.,  Rieuwpassa,  F.  &  Wenno,  M.R.  (2021).  Antibacterial activity  of  Rhizophora  apiculata  extract  originated  from  Inner  Ambon  Bay  against  selected pathogen  bacteria. IOP  Conference  Series:  Earth  and  Environmental  Science .  797,  1-8.  doi: 10.1088/1755-1315/797/1/012017.
Vinoth, R., Kumaravel, S. & Ranganathan, R. (2019). Therapeutic and traditional uses of mangrove plants. Journal of Drug Delivery and Therapeutics . 9, 849-854. doi: 10.22270/jddt.v9i4-s.3457 Zeb, A. & Murkovic, M. (2010). Thin-layer chromatographic analysis of carotenoids in plant and animal samples. Journal of Planar Chromatography . 23(2), 94-103. doi: 10.1556/jpc.23.2010.2.1