## PENGUJIAN AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN IDENTIFIKASI SECARA MOLEKULER MENGGUNAKAN GEN 16S RRNA BAKTERI SIMBION ENDOFIT YANG DIISOLASI DARI ALGA MERAH ( Galaxaura rugosa)
Muhammad Zulkifli Hamzah 1) , Herny E. I. Simbala 1) , Adithya Yudistira 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Endophytic bacteria are defined as bacteria that colonize healthy plant tissue without causing significant  damage  to  the  host.  Several  studies  have  shown  that  certain  endophytic  bacteria  can produce chemical compounds that have health effects, especially antibacterial-producing compounds. The aim of this study was to obtain endophytic bacteria from red algae Galaxaura rugosa, to test the antibacterial  activity  of  isolated  endophytic  bacterial  against  pathogenic  bacteria  Escherichia  coli and  Staphylococcus  aureus,  and  to identify the  species  of  endophytic  bacteria that  have  the  highest antibacterial  activity  based  on  molecular  analysis  using  encoding  gene  of  16S  rRNA.  Bacterial isolation was performed by dilution method. Three isolates were inoculated based on morphological differences.  Testing  of  antibacterial  activity  was  tested  by  agar  diffusion  method.  Endophytic bacterial  isolate  that  have  the  highest  antibacterial  activity  is  K2  isolate  which  categorized  as intermediate against Staphylococcus aureus and categorized as strong against Escherichia coli. The result  of  molecular  idenfitication  shows  that  K2  isolate  has  99%  similarity  with  Bacillus thuringiensis,  Bacillus  anthracis,  Bacillus  cereus,  and  Bacillus  mycoides.  After  multiple  sequence alignment and phylogenetic analysis, K2 isolate can be identified as Bacillus mycoides.
Keywords: Endophytic  Bacteria,  Galaxaura  rugosa,  Staphylococcus  aureus,  Escherichia  coli,  16S rRNA Gene.

## ABSTRAK
Bakteri  endofit  didefinisikan  sebagai  bakteri  yang  menjajah  jaringan  tanaman  yang  sehat tanpa menimbulkan luka yang nyata pada inang. Beberapa studi menunjukkan bahwa bakteri endofit tertentu  dapat  memproduksi  senyawa  kimia  yang  memiliki  efek  bagi  kesehatan,  terutama  senyawa penghasil  antibakteri.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  memperoleh  bakteri  endofit  dari  alga  merah Galaxaura  rugosa ,  menguji  aktivitas  antibakteri  dari  isolat  bakteri  endofit  tersebut  terhadap  bakteri patogen Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus serta  mengetahui  spesies  bakteri  endofit  yang memiliki  aktivitas  antibakteri  terbesar  berdasarkan  analisis  secara  molekuler  dengan  menggunakan gen  penyandi  16S  rRNA.  Isolasi  bakteri  dilakukan  dengan  metode  pengenceran.  Tiga  (3)  isolat diinokulasi  berdasarkan  perbedaan  morfologi.  Pengujian  aktivitas  antibakteri  diuji  dengan  metode difusi  agar.  Isolat  bakteri  endofit  yang  memiliki  daya  antibakteri  terbesar  yaitu  isolat  K2  yang dikategorikan  sedang  terhadap Staphylococcus  aureus dan  kuat  terhadap Escherichia  coli .  Hasil identifikasi  molekuler  menunjukkan  bahwa  isolat  K2  memiliki  kesamaan  99%  dengan Bacillus thuringiensis , Bacillus anthracis , Bacillus cereus , dan Bacillus mycoides . Setelah dilakukan multiple sequence  alignment dan phylogenetic  analysis ,  isolat  K2  dapat  diidentifikasi  sebagai Bacillus mycoides .
Kata  kunci :  Bakteri endofit, Galaxaura rugosa , Staphylococcus  aureus , Escherichia coli ,  Aktivitas antibakteri, Gen 16S rRNA

## PENDAHULUAN
Makroalga  di  perairan  Indonesia mencapai  782  spesies  yakni  sekitar  8,6% dari  total  biota  di  laut  (Anggadireja et  al . 2009;  Dahuri,  1998).  Rumput  laut  dari kelas  alga  merah  (Rhodophyceae)  adalah yang  terbanyak  yang  tumbuh  di  perairan laut  Indonesia  yaitu  sekitar  452  jenis (Winarno,  1996).  Makroalga  memiliki potensi  diantaranya  mampu  memproduksi sekunder  berupa  senyawa  bioaktif  yang beragam dengan aktivitas yang sangat luas sebagai antibakteri (Zainuddin dan Malina, 2009).  Potensi  yang  dimiliki  oleh  rumput laut  memungkinkan  untuk  dimanfaatkan dalam berbagai bidang, terutama di bidang nutrasetika  dan  pengembangan  senyawa obat (Rahaweman, 2016).
Mikroba yang melekat pada bagian tubuh  tanaman  disebut  sebagai  mikroba endofit.  Mikroba  ini  meliputi  bakteri  dan jamur,  hidup  pada  akar,  batang  maupun daun dari suatu tanaman. Mampu melindungi
inangnya dengan menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang  merupakan  senyawa  bioaktif  yang dapat membunuh bakteri patogen (Prihatiningtyas,  2006).  Senyawa  yang dihasilkan  oleh  mikroba  ini  mirip  dengan inangnya  dan  diduga  sebagai hasil koevolusi  atau  transfer  genetik  dari  inang (Tan dan Zou, 2001).
Identifikasi  berdasarkan  sekuens gen  16S  rRNA  adalah  akurat,  yang  dapat mengidentifikasi  sampai  tingkat  spesies, dan  dapat  secara  rutin  digunakan  untuk identifikasi mikrobakteri serta dapat mengarah  pada  analisis  non  kultur  bakteri patogen (Jill, 2004). Gen 16S rRNA dapat digunakan  sebagai  penanda  molekuler karena  bersifat  ubikuitus  dengan  fungsi yang  identik  pada  seluruh  organisme (Stackebrandt dan Goebel, 1995).
Pentingnya  peran  alga  dan  bakteri yang  berasosiasi  dalam  menghasilkan metabolit  sekunder  memungkinkan  untuk mendapatkan  senyawa  alternatif  sebagai antibakteri.
Berdasarkan hal-hal yang dipaparkan  di  atas,  maka  dilakukan penelitian  isolasi  dan  identifikasi  secara molekuler bakteri yang berasosiasi dengan alga merah Galaxaura rugosa dan menguji potensi  antibakteri  dari  isolat  bakteri  hasil isolasi tersebut.

## METODE PENELITIAN Alat
Masker,  sarung  tangan,  snorkel, fins, cooling box , zipper bag , saringan air, alat-alat  gelas,  rak  tabung  reaksi,  pipet tetes, timbangan analitik (ADAM), lumpang  dan  alu, magnetic  stirrer (Nesco Lab),  jarum  ose,  pinset, rotary  shaker incubator (Infors  HT),  bunsen,  lemari pendingin,  cetakan  sumur  diameter  7  mm, laminar  air  flow (Biotek),  termometer, autoklaf (ALP),  mikropipet  (Ecopipette), L-Glass,  mistar  berskala,  kertas  label, plastik  wrap, aluminium  foil ,  jangka sorong, bacteri  coloni  counter (Health), seperangkat  alat  PCR  ( Biometra  T- Personal )  dan  elektroforesis  ( Biometra  T- Personal ), alat fotografi.

## Bahan
Alga  merah Galaxaura  rugosa. , bakteri uji Escherichia coli (ATCC 25922) dan Staphylococcus aureus (ATCC 25923),  aquades,  etanol  70%,  etanol  95%, NaCl  0.9%,  Natrium  Hipoklorit  (NaOCl) 5,25%,  media  Nutrient  Agar,  media Nutrient  Broth,  antibiotik  amoksisilin  0,1 mg/mL,  kristal  violet,  lugol,  larutan safranin, kit isolasi DNA bakteri (Geneaid),  primer  set  (untuk  bakteri), Master  Mix  untuk  amplifikasi  DNA
(Bioline), ddH2O, gel agarosa, TBE buffer 0.5x,  dan etidium bromida.

## Pengambilan dan Penyiapan Sampel
Sampel  alga Galaxaura  rugosa diambil  dari  perairan  pantai  Malalayang menggunakan  alat  bantu  (masker,  snorkel, dan  fins).  Sampel  difoto  kemudian diambil, selanjutnya dimasukkan ke dalam zipper  bag dan  disimpan  dalam cooling box berisi  es  batu  untuk  dibawa  ke Laboratorium Mikrobiologi Program Studi Farmasi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sam Ratulangi.  Sampel  diidentifikasi  (secara morfologi)  kemudian  dibersihkan  dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang  menempel  dan  dilakukan  sterilisasi permukaan untuk menghilangkan pengotor maupun  mikroorganisme  epifit  lain  yang dapat mengkontaminasi.

## Isolasi dan Purifikasi Bakteri Endofit
Penanaman  bakteri  endofit  yang bersimbiosis dengan alga dilakukan dengaan metode sebaran menurut Madigan (2012).  Satu  (1)  g  sampel  alga  yang  telah disterilisasi  permukaannya  dihancurkan dengan  cara  digerus  dngan  lumpang  dan alu  sampai  halus.  Selanjutnya,  1  g  sampel yang  telah  halus  tersebut  dimasukkan  ke dalam  9  mL  akuades  sehingga  diperoleh pengenceran sampel sebesar 10 -1 .
Pengenceran bertingkat selanjutnya dilakukan  untuk  seri  10 -2 ,  10 -3 ,  dan  10 -4 . Dari masing-masing seri kemudian diambil 100  µL  dan  disebarkan  ke  dalam  cawan petri  steril  yang  berisi  media  NA  dan diinkubasi  dalam  inkubator  (27-29ºC) selama  2  x  24  jam.  Koloni  bakteri  endofit yang  tumbuh  diamati  bentuk,  warna, elevasi,  tepian  dan  ukurannya.  Koloni- koloni  bakteri  (3  koloni)  dipisahkan dengan  jarum  ose  berdasarkan  perbedaan
karakteristik morfologinya pada media NA baru  dalam  cawan  petri  dan  diisolasi selama  24  jam.  Isolat  yang  telah  murni kemudian  dipindahkan  dan  disimpan  pada media NA.

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Bakteri  simbion  endofit  disiapkan dengan  cara  satu ose isolat bakteri  endofit diinokulasikan  ke  dalam  5  mL  media  cair NB  dan  diinkubasi  selama  24  jam  dalam rotary  shaker dengan  suhu  27-29ºC.
Masing-masing  koloni  bakteri  simbion endofit  dalam  media  cair  NB  kemudian dipindahkan  ke  dalam  tabung  sentrifuge dan  disentrifugasi  dengan  kecepatan  3000 rpm  selama  30  menit.  Supernatan  yang terbentuk  kemudian  diambil.  Pengujian aktivitas  antibakteri  dilakukan  dengan menggunakan  metode  difusi  sumuran, yaitu lapisan dasar dibuat dengan menuangkan  masing-masing  10  mL  NA dari  media  dasar  ke  dalam  6  cawan  petri, lalu  dibiarkan  sampai  memadat.  Setelah memadat,  pada  permukaan  lapisan  dasar diletakkan  5  pencadang  baja  yang  diatur sedemikian  rupa  jaraknya  agar  daerah pengamatan tidak saling bertumpuh. Kemudian  suspensi  bakteri  dicampurkan ke  dalam  media  pembenihan  NA.  Setelah itu, dituangkan 20 mL ke dalam tiap cawan petri  yang  diletakkan  pencadang  sebagai lapisan  kedua,  lalu  dibiarkan  sampai memadat.  Selanjutnya  setelah  memadat, pencadang  diangkat  secara  aseptik  dari cawan petri, sehingga akhirnya terbentuklah sumur-sumur yang digunakan dalam  uji  antibakteri.  Kemudian  kultur isolat  bakteri  endofit  diinokulasi  pada sumur  dan  diinkubasi  selama  24  jam. Pengamatan  dilakukan  terhadap  zona bening yang terbentuk disekitar sumur dan diukur menggunakan jangka sorong dengan ketelitian 0,05 mm (Ortez, 2005).
Identifikasi  Bakteri  Endofit  Secara

## Molekuler

## Isolasi DNA Genomik
Isolasi  DNA  Genomik  dari  kultur bakteri  akan  dilakukan  dengan  metode Genomic DNA Mini Kit (Geneaid).
Amplifikasi  gen  16S  rRNA  dengan Teknik PCR
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan  mesin  PCR combi  block ( whatman  biometra  Germany ).  Primer yang  digunakan  untuk  proses  PCR  yaitu pasangan  primer  universal  bact  BKXF  ( forward )  dan  uni  BKXR  ( reverse ).
Cetakan yang digunakan untuk amplifikasi gen  16S  rRNA  yaitu  DNA  genomik bakteri  yang  telah  diisolasi.  Amplifikasi dengan  teknik  PCR  dilakukan  dengan variasi  komposisi  reagen  dan  kondisi reaksi PCR yang telah dimodifikasi.

## Elektroforesis dan Visualisasi
DNA  yang  telah  diamplifikasi  kemudian diseparasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Gel direndam dalam campuran  larutan  TBE buffer dan  etidium bromida.  Visualisasi  dilakukan  dengan sinar  UV  pada UV-transiluminator .  Hasil deteksi didokumentasikan.

## Sekuensing gen 16S rRNA
Sekuensing dilakukan untuk menentukan urutan nukleotida pada fragmen  DNA  yang  terdeteksi  dari  hasil visualisasi DNA yang teramplifikasi dalam proses PCR menggunakan mesin autosequencing . Proses
sekuensing dilakukan  dengan  mengirim  sampel  ke First Base Pte. Malaysia.

## Pengolahan Data Sekuens DNA
Kromatogram DNA hasil sekuensing disunting menggunakan perangkat  lunak  Geneious.  Bagian  awal dan akhir kromatogram DNA dihapus kira- kira  30  bp  dan  untuk  pembacaan nukleotida  yang  kurang  baik  diperbaiki berdasarkan  tingkat  keakuratan  yang terbaca.  Hasil  sekuensing  DNA  kemudian dianalisis  menggunakan  program  BLAST melalui media online NCBI untuk mencari kesamaan  urutan  nukleotida  gen  16S rRNA  dalam  menentukan  spesies  isolat bakteri endofit dari alga Galaxaura rugosa yang memiliki daya antibakteri terbesar.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Bakteri Endofit
Sampel alga yang diperoleh dilakukan  sterilisasi  permukaan  dengan tujuan  agar  bakteri  yang  diperoleh  nanti bebas  dari  kontaminasi  yang  tertempel pada  permukaan  sampel  sehingga  bakteri endofit  yang  ada  di  dalam  sel Galaxaura rugosa didapatkan.  Kemudian  ditimbang lalu  digerus  sampai  halus  yang  kemudian dilakukan  pengenceran  bertingkat  sampai 10 -7 ,  setiap  pengenceran  diinokulasikan sebanyak 100 µL pada media NA.
Hasil isolasi dari sampel Galaxaura rugosa memperlihatkan banyaknya  koloni  bakteri  yang  tumbuh dan  3  koloni  diantaranya  yang  diinokulasi ke  media  NA  yang  baru  berdasarkan perbedaan  karakteristik  morfologi.  Tiga (3) koloni yang terpilih kemudian dimurnikan  dengan  menggunakan  media yang sama.`

## Pengamatan Morfologi
Pengamatan  morfologi  dilakukan dengan
memperhatikan perbedaan morfologi  dari  ketiga  isolat  bakteri
simbion  endofit  seperti  ukuran,  bentuk, elevasi, tepian, dan warna koloni.
Berdasarkan  Tabel  1  diketahui bahwa  bakteri  endofit Galaxaura  rugosa memiliki  ukuran  dan  tepian  yang  sama yaitu  ukuran  yang  kecil  dan  tepian  yang utuh.  Sedangkan  bentuk  koloni Circular dan Irregular ,  Elevasi  juga  ada  yang timbul  dan  rata.  Dan  warna  juga  berbeda-
beda  yaitu  putih  susu,  kuning,  dan  putih bening.
Dikatakan  bakteri  endofit  jika warna  pada  permukaan  koloni  yaitu  putih kekuningan, atau putih kental seperti susu. Selain  itu  bakteri  endofit  dicirikan  dengan bentuk  sel  individu  yang  batang,  serta bentuk  koloni  yang  bulat,  oval  atau  tidak beraturan (Pelczar, 1986).

## Tabel 1. Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Koloni Bakteri Endofit Dari
Galaxaura rugosa
Ciri Morfologi/Makroskopik Koloni Bakteri Endofit
Galaxaura rugosa No. Kode Isolat Ukuran Bentuk Elevasi Tepian Warna 1 K1 Kecil Circular Timbul Utuh Putih Susu 2 K2 Kecil Irregular Timbul Utuh Kuning 3 K3 Kecil Circular Rata Utuh Putih Bening

## Pewarnaan Gram
Pewarnaan  Gram  isolat  bakteri endofit  K1,  K2,  dan  K3  dilakukan  untuk mengidentifikasi  bakteri  yang  diperoleh agar dapat  diklasifikasikan sebagai  bakteri Gram positif atau Gram negatif.
Hasil pewarnaan Gram dari 3 isolat bakteri  endofit  pada  Tabel  2    memiliki bentuk  yang  berbeda  yaitu  Kokus  dan Basil,  dan  terdapat  1  isolat  Gram-negatif yaitu  pada  isolat  dengan  kode  K1  dan  2 isolat Gram-positif yaitu K2 dan K3.
Bakteri Gram positif mampu memepertahankan  zat  warna  utama  dalam pewarnaan  Gram,  yaitu  Gentian  Violet. Sehingga  nampak  warna  ungu  saat pengamatan  dikarenakan  dinding  sel kelompok  bakteri  ini  tersusun  oleh sebagian besar peptidoglikan yang mampu mengikat  zat  warna  dan  tidak  rusak  saat dicuci dengan alkohol.
Bakteri  Gram  negatif  memiliki komponen dinding sel yang sebagian besar tersusun  lapisan  lipid,  sehingga  pada  saat pewarnaan  kurang  dapat  mempertahankan zat warna utama terutama pada saat dicuci dengan  alkohol  (lipid  rusak  pada  saat dicuci dengan alkohol) akibatnya kelompok  bakteri  ini  terlihat  berwarna merah pada hasil pewarnaan Gram.

## Tabel 2 Pengamatan Mikroskopik Sel
Isolat Bakteri Endofit dari Galaxaura
rugosa. No. Kode Isolat Bentuk sel Gram 1 K1 Kokus - 2 K2 Basil + 3 K3 Basil + Uji Daya Antibakteri Bakteri Endofit dari Galaxaura rugosa
Hasil uji aktivitas  antibakteri  isolat bakteri  endofit Galaxaura  rugosa melalui pengamatan  1  x  24  jam  masa  inkubasi dengan  tujuan  pada  waktu  24  jam  bakteri sudah  masuk  fase log dan  sudah menghasilkan metabolit sekunder dengan 3 kali  pengulangan  untuk  masing-masing bakteri  uji,  kepekaan  bakteri  terhadap antibiotik dapat diamati berdasarkan terbentuknya  zona  hambat  (daerah  bening di sekitar pencadang).
Gambar  1.  Diagram  Perbandingan  Rata- rata Diameter Zona Hambat Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri
Berdasarkan  penggolongan  zona hambat  oleh  Davis  dan  Stoud  (1971), maka rata-rata diameter zona hambat hasil pengujian aktivitas antibakteri yang dihasilkan  isolat  bakteri  endofit  dari  alga
Galaxaura
rugosa terhadap Staphylococcus  aureus yaitu:  K1  (8,275 mm) dalam kategori sedang, K2 (9,8 mm) dalam  kategori  sedang,  dan  K3  (1,833 mm)  dalam  kategori  lemah.  Sedangkan rata-rata  diameter  zona  hambat  yang dihasilkan isolate bakteri dari alga Galaxaura  rugosa terhadap Escherichia coli yaitu:  K1  (9,367  mm)  dalam  kategori sedang,  K2  (11,75  mm)  dalam  kategori kuat,  dan  K3  (3,058)  dalam  kategori lemah.
Mekanisme  kerja  antibakteri  dari senyawa  yang  dihasilkan  isolat  bakteri
endofit  K1,  K2,  dan  K3  yang  dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri  uji Staphylococcus  aureus dan Escherichia coli belum  diketahui  dengan  baik,,  namun diduga terlibat dalam penghambatan sintesis dinding sel bakteri.

## Identifikasi  Molekuler  Bakteri  Endofit Galaxaura rugosa
Identifikasi  molekuler  dilakukan pada  isolat  bakteri  endofit Galaxaura rugosa yang  memiliki  daya  antibakteri terbesar pada pertumbuhan bakteri
Staphylococcus  aureus dan Escherichia
coli yaitu  isolat bakteri endofit K2.
Dalam proses identifikasi molekuler  bakteri,  ada  3  proses  utama yang  paling  dasar  yaitu  ekstraksi  DNA,
amplifikasi dengan
PCR dan elektroforesis.
Tahap  pertama  dalam  ekstraksi DNA  adalah  proses  perusakan  atau penghancuran  membran  dan  dinding  sel yang dilakukan menggunakan buffer GP1.
Pemecahan  sel  merupakan  tahapan  awal dari  ekstraksi  DNA  yang  bertujuan  untuk mengeluarkan  isi  sel.  Suhu  pemanasan yaitu 60ºC selama 15 menit dengan tujuan untuk meningkatkan permeabilitas dinding sel  yang  berakibatkan  pada  masuknya cairan  dan  materi  lain  di  sekitar  sel  dan keluarnya  materi-materi  dari  dalam  sel. Buffer-buffer  yang  digunakan  pada  tahap ini  yaitu buffer GP2  yang bertujuan untuk menetralkan,  buffer  GP3  untuk  mengikat DNA.  Kemudian  pencucian  pada  proses ekstraksi  menggunakan  buffer  W1  untuk mencuci protein, buffer Wash Buffer untuk mencuci  buffer-buffer  sebelumnya  dan garam-garam  yang  masih  menempel  pada DNA, dan elution buffer untuk melepaskan DNA dari membran serta untuk penyimpanan.  Setelah  itu  didapati  hasil dari ekstraksi yaitu, DNA murni.
0 10 20 30 40 K1 K2 K3 Kontrol + Kontrol - Rata-rata diameter zona hambat (mm) Escherichia coli Staphylococcus aureus
Hasil ekstrasi kemudian diamplifikasi dengan teknik PCR ( Polymerase Chain Reaction ),
pemanjangan  nukleotida  dilakukan  oleh DNA  polimerase  berdasarkan  cetakan
DNA  yang  diperoleh  dari  proses  ekstraksi
DNA (Bardacki, 1994). Komponen- komponen  yang  diperlukan  pada  proses PCR ada lima yaitu Taq DNA polimerase, MgCl 2 ,  dNTPs,  primer  BKXF  &  BKXR (Kolondam, in  press ),  dan  DNA  template.
Keberhasilan  suatu  proses  PCR  sangat tergantung  dari  primer  yang  digunakan, karena  primer  merupakan  menentukan awal dan akhir daerah yang hendak disalin atau diperbanyak (Becker et al., 1996).
PCR  yang  telah  dilakukan,  akan dilihat  hasilnya  pada  elektroforesis.  Dari hasil elektroforesis ini maka akan diketahui  maksimal  atau  tidak  proses amplifikasi  tersebut.  Dilihat  dari  hasil elektroforesis, tampak adanya perpindahan DNA  dari  kutub  negatif  ke  kutub  positif. Dan  hasil  elektroforesis  dari  isolat  K2 tersebut  diketahui  terdapat  pita  yang teseparasi  dan  sejajar  dengan  marker sekitar  1.200  bp  (Lampiran  11).  Hal  ini mengindikasikan bahwa fragmen gen yang terimplikasi  dengan  ukuran  ±  1.200  bp, sehingga dapat disimpulkan proses amplifikasi isolat K2 berhasil dilakukan.
Gambar 2. Hasil Elektroforesis Kemudian produk PCR DNA isolat K2  dideterminasi  dengan  menggunakan
sekuen  16S  rRNA  dianalisis  secara lengkap  di  First  Base  Malaysia.  Hasil sekuensing  yang  diperoleh  dari  Malaysia dibuka dan disunting dengan menggunakan  perangkat  lunak Geneious , kemudian  dianalisis  pada  Gen  Bank menggunakan  BLAST-N  ( Basic  Local Aligment Search Tool-Nucleotida ). Analisis  tersebut  dilakukan  dengan  tujuan membandingkan  hasil  yang  diperoleh dengan  hasil  sekuen  DNA  dari  seluruh dunia  dari  hasil  yang  didepositkan  pada database Gen Bank sekuen publik. Analisis BLAST-N  dilakukan  secara  online  pada website
NCBI
( http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).
Hasil analisis BLAST-N dari isolat bakteri endofit K2 menunjukkan kemiripan DNA  sekuens  dengan Bacillus  anthracis , Bacillus thuringiensis , Bacillus cereus , dan Bacillus mycoides dengan maximum identity sebesar  99%.  Oleh  karena  itu dilakukan penyetaraan ( alignment )
kembali menggunakan tools situs ExPASy Bioinformatics Resource Portal ( https://www.expasy.org/tools/#translate ) dengan  cara  menerjemahkan  ( translate ) FATSA  sekuens  DNA  dari Bacillus anthracis , Bacillus cereus , Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis dan isolat K2 menjadi sekuens protein, lalu dilakukan  proses alignment  analysis dan phylogenetic analysis supaya bisa diketahui secara jelas jenis spesies Bacillus dari  isolat  bakteri  endofit  K2.  Setelah dilakukan  kedua  analisis  terebut,  didapati hasil  identifikasi  isolat  bakteri  endofit  K2 yaitu Bacillus mycoides

## KESIMPULAN
1. Tiga  isolat  bakteri  endofit  yang diisolasi dari Galaxaura rugosa mampu  menghambat    pertumbuhan
Staphylococcus aureus dengan
kategori rendah-sedang dan
Escherichia  coli dengan  kategori rendah-kuat.
2. Isolat  bakteri  yang  memiliki  indeks penghambatan tertinggi setelah diidentifikasi secara molekuler
menggunakan gen 16S rRNA,
alignment  analysis ,  dan phylogenetic analysis memiliki  kesamaan  dengan Bacillus mycoides .

## SARAN
Sebaiknya  dilakukan  karakterisasi senyawa  antibakteri  dari  isolat  bakteri yang diisolasi sehingga dapat
diprediksikan  mekanisme  penghambatan dari  senyawa  antibakteri  yang  dihasilkan bakteri endofit tersebut terhadap Staphylococcus  aureus dan Escherichia coli .

## DAFTAR PUSTAKA
Anggadireja, J.T., Zatnika A., Purwoto H.,
Istini.  2009. Rumput  Laut .  Penebar Swadaya, Jakarta.
Becker, J. M., Caldwell, G. A., Zuchgo, E. A. 1996.
Biotechnology A Laboratory Course . Academic Press, San Diego.
Dahuri, R. 1998. Coastal zone management  in  Indonesia:  issues and approaches. Journal of Coastal Development . 1(2) :97-112.
Jill, E. C. 2004. Impact of 16S rRNA Gene
Sequence Analysis for Identification  of  Bacteria  on Clinical Microbiology and Infectious Disease. Clinical Microbiology Reviews . 17( 4 ) 840-
862.
Madigan,  J.,  David,  A.  S.,  David,  P.  C. 2012. Biology  of  Microorganimsm
13th Edition . Benjamin Cummings,
USA.
Ortez,  J.  H.  2005. Disk  Diffusion  Testing in Manual of Antimicrobial Susceptibility  Testing .  American Society For Microbiology, USA. Pelczar,  M.  J.  dan  Chan,  E.  S.  C.  1984.
Dasar-Dasar  Mikrobiologi  Edisi  I.
UI-Press, Jakarta.
Prihatiningtyas, W. 2006. Mikroba Endofit, Sumber Penghasil Antibiotik  yang  Potensial .  Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta. Rahaweman, A.C. 2016. Aktivitas Antibakteri dan Isolasi Fraksi Aktif Kapang Endofit Makroalga Chlorophyta dan Phaeophyta [Tesis].  Program  Studi  Teknologi Hasil Perairan, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Stackebrandt,  E.  dan  Goebel,  B.  1995.  A place  for  DNA-DNA  reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the  present  species  definition  in bacteriology. International  Journal of  Systematic  Bacteriology . 44 : 846-849.
Tan,  R.  X.  dan  Zou,  W.  X.  2001.
Endophytes:  A  Rich  Source  of Functional  Metabolites. Natural Product Reports . 18 : 448-459. Winarno, F. G. 1996. Teknologi Pengolahan  Rumput  Laut .  Pustaka Sinar Harapan, Jakarta.
Zainuddin  dan  Malina.  2009. Skrining rumput  laut  asal  Sulawesi  Selatan sebagai antibiotik melawan bakteri patogen pada ikan [Laporan Penelitian].