## Artikel Penelitian
THE EFFECT OF PLATELET RICH PLASMA ON MESENCHYMAL STEM CELLs (MSCs) DIFFERENTIATION INTO CHONDROBLAST
Dwikora Novembri Utomo 1* , I Gde Adi Widiastana 2
1 Senior Consultant of Orthopaedic and Traumatology Department, Faculty of Medicine, Universitas Airlangga, Dr Soetomo General Hospital, Surabaya
2 Resident of Orthopaedic and Traumatology Department, Faculty of Medicine, Universitas Airlangga, Dr Soetomo General Hospital, Surabaya
*Correspondence:  Dwikora  Novembri  Utomo,  Senior  Consultant  of  Orthopaedic  and Traumatology  Department,  Faculty  of  Medicine,  Universitas  Airlangga,  Jl.  Mayjen  Prof.  Dr. Moestopo 6-8, Surabaya E-mail : dwikora_utomo@yahoo.com

## ABSTRAK
Penambahan platelet  rich  plasma ke  kultur mesenchymal stem  cell pada  media pertumbuhan dan media kondrogenik berpengaruh pada proliferasi dan diferensiasi stem cell menjadi kondroblas belum diketahui efeknya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek platelet  rich  plasma pada  diferensiasi mesenchymal stem  cell dan  proliferasi  menjadi kondroblas  pada  media  invitro.  Desain  rancangan  kelompok  kontrol  acak  post  test.  Darah diambil dari vena kelinci untuk diproses menjadi platelet rich plasma (PRP). Mesenchymal stem  cell (MSC)  dipanen  dari  sumsum  tulang  kelinci  untuk  dibudidayakan.  Kultur  MSC dibagi  menjadi tiga  kelompok modifikasi.  Kelompok  pertama  adalah  kombinasi MSC  yang ditambahkan  dengan Complete  Control  Medium (CCM)  dan Chondrogenic  Differentation Medium (CDM) tanpa PRP sebagai kelompok kontrol. Kelompok kedua memiliki kombinasi yang  sama  dengan  kelompok  pertama  dengan  penambahan  PRP  5%.  Kelompok  ketiga memiliki  kombinasi  yang  sama  dengan  kelompok  pertama  dengan  penambahan  PRP  10%. Hasilnya  dievaluasi  dalam  21  hari  sebagai  berikut.  Kelompok  yang  menerima  penambahan PRP  5%  memiliki  peningkatan  kondroblas  yang  signifikan  dibandingkan  kelompok  tanpa penambahan PRP (p = 0,033). Hasil yang sama juga terjadi pada kelompok yang menerima penambahan  PRP  10%  dibandingkan  kelompok  tanpa  penambahan  PRP  (p  =  0,028).  Tidak ada  perbedaan  yang  signifikan  antara  hitung  kedua  dan  kelompok  ketiga  (p  =  0,203).  Ada efek signifikan platelet rich plasma pada diferensiasi mesenchymal stem cell dan proliferasi menjadi kondroblas pada media in vitro .
Kata  kunci  : kondroblas,  medium  kultur  lengkap, mesenchymal  stem  cell,  platelet  rich plasma

## ABSTRACT
The  addition  of  platelet  rich  plasma  to  mesenchymal  stem  cell  culture  on  growth media  and    chondrogenic    media    had    any  effect    on  stem  cell’s  proliferation  and differentiation into chondroblast has not been determined. This research is to find   out   the effect    of    platelet    rich    plasma    on    mesenchymal    stem    cell’s  differentiation  and proliferation  into  chondroblast  on  in  vitro  media.  Randomized  control  group  posttest  only design.  Blood  was  taken  from  the  rabbit’s  vein  to  be  processed  into  platelet  rich  plasma (PRP). Mesenchymal Stem Cell (MSC) was harvested from the bone marrow of the rabbit to be  cultured.  The  MSC’s  culture  were  divided  into  three  groups  of  modification.  The  first group  was  combination  of  MSC  added  with  Complete  Culture  Medium  (CCM)  and Chondrogenic  Diferentation  Medium  (CDM)  without  PRP  as  control  group.  The  second group had the same combination as the first group with extra 5% PRP. The third group had the same combination as the  first group with extra 10% PRP. The results were evaluated in the  following  21  days.  The  group  that  received  extra  5%  PRP  had  significant  increase  of

## Artikel Penelitian
chondroblast  count compared to the group without PRP addition (p=0,033). The same result also  occured  on  the  groups  that  received  extra  10%  PRP  compared  to  the  group  without PRP  addition  (p=0,028).  There  were  no  significant  diferences  between  both the second and the third groupchondroblast count  (p=0,203). There  was  a  significant  effect  of  platelet  rich plasma  on  mesenchymal  stem  cell’s  diferentiation  and  proliferation  into  chondroblast  on invitro media.
Keywords :  chondroblast,  complete  culture  medium,  mesenchymal  stem  cell,  platelet  rich plasma

## PENDAHULUAN
Kartilago  atau  tulang  rawan  adalah sutau  jaringan  yang  kuat,  bersifat  semi transparan,  elastik  dan  fleksibel,  yang terdiri  dari  kondrosit  dan  kondroblas  yang tersebar di antara material lipoprotein, dan diperkuat  oleh  serat-serat  kolagen.  Bagian luar  dari  kartilago  dilapisi  oleh  serabut membran yang tebal dan kuat yang disebut sebagai perikondrium.  Pada kartilago tidak ditemukan  pembuluh  darah  dan  saraf, sehingga    jika  terjadi  kerusakan  maka akan  sulit  terjadi  penyembuhan.  Kartilago sendi  mempunyai      beberapa      fungsi, antara  lain:  sebagai  penutup  permukaan sendi,  mengurangi  gesekan  antar  tulang  di sendi  sehingga  mencegah  kerusakan,  dan juga berperan sebagai penahan goncangan. 1
Degenerasi  dan  cedera  pada  tulang rawan sendi cenderung meningkat disebabkan  oleh  meningkatnya      angka harapan      hidup  dan  meningkatnya  angka kejadian  trauma.      Secara      alami    tulang rawan  sendi  akan  mengalami  degenerasi dan  regenerasi.  Proses  penyembuhan kartilago  diatur  oleh  kondrosit  yang
memproduksi matriks ekstraseluler proteoglikan dan kolagen. Beberapa respon terhadap penyembuhan luka pada kartilago   tidak   akan   diganti dengan tipe kolagen dan preoteoglikan yang sesuai dan akan  menyebabkan  fungsi  yang  abnormal. Terutama  pada  kartilago    artikular,    jika terjadi  cedera  maka      akan      sulit      untuk regenerasi  karena  lambatnya  aktivitas mitotik  dari  kondrosit  dan  jaringan  yang avaskular.  Meskipun  dalam  kondisi  yang ideal,  proses  perbaikan  kerusakan  tulang rawan      sendi              masih      sulit      karena lambatnya proliferasi kondrosit jika dibandingkan dengan jaringan parut. 2
Beberapa  cara  untuk  melakukan penanganan  terhadap  kerusakan  tulang rawan  sendi  antara  lain: Traditional Palliative  (lavage,  chondroplasty) , bone
marrow stimulation techniques (microfractures) , osteochondral
autologous  transplantation,  osteochondral allograft transplantation , cell-based
therapy (Autologous
Chondrocytes Implantation (ACI) , Matrix Induced
Chondrocytes
Implantation ( MACI),

## Artikel Penelitian
Mesenchymal stem cells (MSCs)
implantation) . 3-4
Kemajuan  di  bidang  kedokteran meliputi  kedokteran  molekuler,  biologi molekuler,  rekayasa  jaringan  dan  genetik telah  membuka  cakrawala  baru  dalam penanganan  berbagai macam  kondisi kelainan  sistem  muskuloskeletal.  Sebagai contoh  kemampuan  untuk      mengisolasi dan kultur mesenchymal stem cells (MSCs)
telah  membuka  wacana  baru  dalam pengobatan  defek  tulang  rawan  sendi.
Mesenchymal    stem    cells (MSCs)  adalah sel  multipoten  yang  dapat  berdeferensiasi ke  dalam  beberapa  sel  selama  proses penyembuhan cedera jaringan. MSCs dapat berdiferensiasi menjadi collagen ,
osteoblast pembentuk    tulang,    kondrosit pembentuk tulang rawan sendi dan lainnya.
Sel  itu  secara  bersama-sama  mempunyai kemampuan untuk meregenerasi kerusakan jaringan  yang  disebabkan  oleh  cedera, perubahan degenerasi,  dan  osteoartritis. 1
Diferensiasi MSC menjadi berbagai jaringan  seperti  tulang,  kartilago  dan lemak telah dipelajari oleh banyak laboratorium.  Seperti  telah  dijelaskan sebelumnya,  stimulus  dan  lingkungan yang    tepat    akan  menentukan  diferensiasi MSC menjadi sel yang spesifik. 5
Diferensiasi MSC menjadi kondroblas atau disebut  diferensiasi  kondroblastik  terjadi bila MSC ditumbuhkan pada media dengan
kondisi  yang  memenuhi  syarat  tertentu yaitu  dalam  medium  nutrisi  yang  bebas serum dan mengandung komponen TGF-β. Bila  kondisi  ini  terpenuhi,  MSC  akan kehilangan  morfologi  fibroblastiknya  dan mulai  mengrekspresikan  berbagai  macam komponen    matriks  ekstraseluler.  Proses ini melibatkan biosintesis glikosaminoglikan  dan  diikuti    dengan perubahan    morfologi  sel.  Pada  proses awal  kondrogenesis  terdapat  perubahan progresif dari struktur          kondrotinsulfat yang  dipengaruhi  oleh  TGF-β1,  2,  dan  3. Selama proses diferensiasi, dengan pengaruh    TGF-β,    MSC    akan  mensitesis aggrecan,  link  protein , fibromodulin, decorin dan chondroadherin ,    komponen normal dari matriks kartilago. 6
Pada perkembangan terbaru diketahui  bahwa growth  factor ternyata memegang peranan penting dalam melakukan    regenerasi    jaringan  termasuk tulang  rawan  sendi.  Tetapi,  penjelasan tentang  bekerjanya  senyawa  ini  pada kondrosit  belum  dipaparkan  secara  utuh, namun  nampaknya  hal  ini  berhubungan dengan    tempat    reseptor  sel  permukaan pada sel yang bertanggung jawab.
Beberapa growth  factor yang  sangat berpengaruh  dalam  tulang    rawan    sendi adalah transforming  growth  factor-beta (TGF-  β ), platelet  derived  growth  factor

## Artikel Penelitian
(PDGF) dan insulin  growth  factor  (IGF)
dan lain-lain. 7
Platelet  rich  plasma selama  ini banyak digunakan pada injeksi intraartikular.  Diduga  bahan  ini  dapat memperbaiki  kerusakan    tulang    rawan karena  PRP  mengandung  berbagai  macam growth      factor  (platelet  derived  growth factor (PDGF), transforming growth factor (TGF),  platelet  factor  interleukin  (IL), platelet derived angiogenesis factor
(PDAF),  vascular  endhotelial  growth factor  (VEGF),  epidermal  growth  factor (EGF),  insulin-like  growth  factor  (IGF),
dan fibronektin) yang    sama seperti yang diperlukan oleh MSCs
untuk berdiferensiasi menjadi  kondroblas.    Salah satu growth    factor penting  yang diperlukan adalah TGF-β. 5
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui    pengaruh platelet  rich plasma terhadap mesenchymal  stem  cells
yang  dikultur  dengan  media  pertumbuhan.
Dianalisis  apakah platelet  rich  plasma
dapat  berfungsi seperti media kondrogenik yang menyebabkan diferensiasi dan proliferasi dari MSCs menjadi kondroblas.

## METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian  ini  adalah  eksperimental murni dengan rancangan penelitian
Rancangan Acak Kelompok (RAK) .
Dilakukan    pengukuran  variabel      pada
hewan  coba  hanya  setelah  diberikan perlakuan. 8
Sampel penelitian ini  hewan kelinci putih New Zealand jantan. Diambil  darah vena    dari    kelinci  tersebut  untuk  dibuat platelet  rich  plasma  (PRP), kemudian diukur  konsentrasi  plateletnya.  Kemudian dilakukan    kultur Mesenchymal    Stem Cell    (MSCs) yang    diambil  dari Bone Marrow kelinci,  ditumbuhkan  pada media
Complete Culture Medium (CCM) ditambah dengan Chondrosite
Differentiation  Medium (CDM),  medium selanjutnya    diganti    setiap  3  hari dilakukan  inkubasi  selama  21  hari  dalam suatu inkubator dengan suhu 37 ◦ C dengan CO 2 5%.
Pada  kultur  MSCs  diberikan  tiga perlakuan yaitu perlakuan pertama,
Mesenchymal Stem
Cell (MSCs)
ditambahkan Complete    Culture  Medium
(CCM) ditambah dengan Condrosit
Differentiation  Medium (CDM)      tanpa
PRP  sebagai  kontrol.  Perlakuan  kedua,
Mesenchymal Stem Cell (MSCs)
ditambahkan Complete  Culture  Medium
(CCM) ditambah dengan Condrosit Differentiation Medium (CDM)
ditambahkan  5%  PRP  dan  pada  medium ketiga Mesenchymal  Stem  Cell  (MSCs) ditambahkan Complete  Culture  Medium
(CCM) ditambah dengan Condrosit Differentiation Medium (CDM)
ditambahkan  10%  PRP.  Setelah  dilakukan
kultur  dan  penggantian  media  secara berkala,  maka  dilakukan harvesting pada hari ke-21. Kemudian di lakukan pencucian  pada  masing-masing  media kultur dan diferensiasi kondroblas
diketahui  dengan  melakukan  pemeriksaan
Histopatologis,  yaitu  menghitung  jumlah kondroblas  yang  terbentuk  per-lapang pandang mikroskop.

## Gambar 1. Alur Penelitian

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari hasil pembuatan PRP dengan 5 metode yang berbeda didapatkan peningkatan  konsentrasi  platelet  dalam persen dalam tabel sebagai berikut:
Tabel 1. Hasil Konsentrasi PRP menggunakan 5 metode
PRP Metode 1 (%) Metode 2 (%) Metode 3 (%) Metode 4 (%) Metode 5 (%) Sampel 1 600 517 306 434 153 Sampel 2 617 524 285 417 166 Sampel 3 620 520 320 440 175 Sampel 4 616 533 309 416 163 Sampel 5 606 513 310 416 172 Sampel 6 614 517 307 435 171 Sampel 7 610 500 306 434 174 Sampel 8 600 463 303 373 163 Sampel 9 600 477 309 406 153 Mean 609% 507% 306% 419% 165%
Keterangan :  metode  1  memiliki  prosentase
terbesar (609%)
Dari  hasil  analisa Growth  Factor
PDGF-BB  dan  TGF-β1  pada  PRP,  PPP, plasma, dan serum sebagai kontrol didapatkan  peningkatan  kadar growth factor sebagai berikut:
Tabel 2. Hasil analisa kadar Growth Factor (Platelet, PDGF-BB dan TGF-β1) Sampel Mean (platelet/μl) Mean PDGF-BB (pg/ml) Mean TGF-β1 (pg/ml) PRP metode 1 1.769.200 56.778 96.278 PRP metode 4 1.215.200 37.889 89.000 PPP metode 1 32.800 2.180 6.047 PPP metode 4 36.350 5.541 13.000 Plasma 178.400 4.209 7.111 Serum 289.200 13.222 21.850
Keterangan :  metode  1  memiliki  kadar tertinggi pada kadar PDGF-BB dan TGF-β1
Dari berbagai macam metode pembuatan  PRP  didapatkan  peningkatan konsentrasi  platelet  paling  tinggi  pada metode  1,  yaitu  rata-rata  meningkat  6,09 kali  (609%).  Pada  penilaian  konsentrasi Growth  Factor  PDGF-BB  didapatkan  hasil tertinggi  PRP  dengan  metode  1,  yaitu
56.778  pg/ml  (4,36  kali  atau  436%)  dari kontrol  yaitu 13.222 pg/ml. Pada penilaian konsentrasi growth factor TGF-β1 didapatkan  hasil  tertinggi  PRP  dengan metode 1, yaitu 96.278 pg/ml (4,4  kali atau 440%) dari kontrol yaitu 21.850 pg/ml.

## Artikel Penelitian

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Diantara  lima  metode  pembuatan
Platelet  Rich  Plasma ,  metode  paling optimal  untuk  mendapatkan  konsentrasi tertinggi  platelet  adalah  menggunakan  dua tahap sentrifugasi, pertama dengan kecepatan  3000  rpm  selama  3  menit  dan 45  detik,  kedua  dengan  kecepatan  3000 rpm  selama  10  menit.  Konsentrasi  platelet 6,09  kali  (609%).  Konsentrasi growth factor tertinggi  didapatkan  pada  metode kedua  dengan  peningkatan  konsentrasi TGF-β1  sebesar  4,36    kali    (436%)  dan peningkatan konsentrasi PDGF-BB  sebesar 4,40 kali (440%) dari kontrol.

## REFERENSI
1. Ulrich-Vinther  M,  Maloney  MD, Schwarz  EM,  Rosier  R,  O'Keefe  RJ. Articular  cartilage  biology.  The Journal  of  the  American  Academy  of Orthopaedic  Surgeons.  2003;  11(6): 421-30.
2. Buckwalter JA, Mankin HJ. 1997. An International Course Lecture. J. Bone Joint Surgery. 79-A; 600-11.
3. Gobbi  A.  and  Bathan  L.  2009. Biological  Approach  for  Cartilage Repair. Journal Knee Surgery, 22:36- 44.
4. Getgood  et  al.  2009.  Articular Cartilage Tissue
Engineering:
Today’s research, tomorrow practice?
J  Bone  and  Joint  Surgery, 91(5)  p:
565-576.
5. Gimble  JM,  Guilak  F,  Nuttall  ME, Sathishkumar  S,  Vidal  M,  Bunnell
BA.  In  vitro  Differentiation  Potential of Mesenchymal Stem Cells. Transfusion Medicine and
Hemotherapy. 2008;35(3):228-38.
6. Russell KC, Phinney DG, Lacey MR, Barrilleaux  BL,  Meyertholen  KE, O'Connor  KC.  In  vitro  high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal  stem  cells  reveals  a complex hierarchy of lineage commitment.  Stem  cells  (Dayton,
Ohio). 2010;28(4):788-98.
7. Mankin,  A.  S.  1995.  Selection  for spontaneous and engineered
mutations  in  the  rRNA  genes  in halophilic  archaea.  In Archaea,  A Laboratory  Manual (Robb,  F.  T., Place, A. R., Sowers, K. R., Schreier, H.  J.,  DasDarma,  S.  &  Fleischmann, E. M., eds), pp. 209-216, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
8. A.  Watik  Pratiknya,  2008. Dasar- dasar Metodologi Penelitian Kedokteran  dan  Kesehatan .  Rajawali
Pers.
9. Breinan  HA,  Minas  T,  Hsu  H-P, Nehrer  S,  Sledge  CB,  Spector  M. 1997.  Effect  of  cultured  autologous chondrocytes  on  repair  of  chondral defects  in  a  canine  model. J.  Bone Joint Surg. 1997; 79-A: 1439-1451.
10. Barry F, Boynton RE, Liu B, Murphy JM. 2001. Chondrogenic
differentiation  of  mesenchymal  stem cells from bone marrow:
differentiation-dependent gene expression  of  matrix  component. Experimental Cell Research, 268:189-200.