## Studi Toksisitas Bacillus thuringiensis Isolat Lokal Jawa Timur Berdasarkan Ketinggian Tempat Terhadap Larva Aedes aegypti
Lidwina Faraline Triprisila 1) Suharjono 1) , Zulfaidah Penata Gama 1,2) Nobukazu Nakagoshi 2)
1) Laboratorium Mikrobiologi, Program Studi Biologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang
2) Graduate School for International Development and Cooperation (IDEC), Hiroshima University, Japan
Alamat Korespondensi : Lidwina (lidwinafaraline1991@gmail.com), Suharjono  (calistus@ub.ac.id), Zulfaidah PG (zulfaidahpenatagama@gmail.com)

## ABSTRAK
Demam Berdarah Dengue (DBD) masih menjadi masalah bagi kesehatan masyarakat dan merupakan penyakit endemis  yang  menyebabkan  angka  kematiannya  tinggi  hampir  di  seluruh  provinsi  di  Indonesia.    Pada  kurun empat  tahun  terakhir  Jawa  Timur  memiliki  kasus  DBD  paling  tinggi.  Ketinggian  tempat  merupakan  faktor yang membatasi penyebaran Aedes aegypti sebagai vektor epidemik penyakit demam berdarah. Salah satu cara yang  aman  untuk  memberantas  nyamuk tersebut adalah  dengan Bacillus  thuringiensis.  Tujuan penelitian  ini untuk mendapatkan  isolat  dan  menguji toksisitas Bacillus  thuringiensis yang  efektif  dalam  membunuh  larva Aedes  aegypti dari  beberapa ketinggian  tempat di  Jawa  Timur. Sampel  sedimen  dan  air  diambil  dari  dataran tinggi Blitar dan Bondowoso, dataran sedang di Bangkalan, Ponorogo, Madiun dan Tulungagung serta dataran rendah  di  Lamongan  dan  Surabaya. Bacillus  thuringiensis diisolasi  dengan  media  selektif.  Isolat  yang didapatkan  diamati  karakteristik  fenotip  (Profil  Matching  Method),  kemudian  dilakukan  pengujian  toksisitas pada  larva  nyamuk Aedes  aegypti instar  III.  Persentase  mortalitas  larva  dianalisis  probit (LC50),  ragam (ANOVA) dan uji t (t-test). Dua dari 28 isolat Bacillus thuringiensis yang didapatkan yaitu SK.T dan Mdn I TK2 mampu membunuh larva Aedes aegypti lebih dari 50 %. Isolat Mdn I TK2 pada umur biakan 48 jam dan isolat SK.T  pada  umur  biakan  24  jam  pada waktu pendedahan  72  jam secara  berturut-turut mampu  membunuh larva Aedes  aegypti sebesar  100 % dan 68,3 %. Isolat  Mdn I  TK2 lebih efektif membunuh larva Aedes  aegypti dibandingkan isolat SK.T dengan nilai LC 50-72jam sebesar 2,17×10 7 sel/ml.
Kata Kunci : Aedes aegypti, Bacillus thuringiensis, isolat lokal Jawa Timur, uji toksisitas

## ABSTRACT
Dengue  Hemorrhagic  Fever (DHF)  is  still  a public  health  problem  and  an  endemic  disease  that  causes  high mortality  in  almost  all  provinces  in  Indonesia,  including  East  Java.  In  the  past  four  years,  East  Java  has  the highest  dengue  cases.  Altitude  is  an  important  factor  that  limits  in  the  spread  of Aedes  aegypti as  a  vector  of dengue  fever  epidemic  disease.  The  mosquito Aedes  aegypti can  be  prevented  using Bacillus  thuringiensis.  The purpose  of  this  research  was  to  determine  the  potential  toxicity  of B.  thuringiensis local  isolates  from  several areas in East Java based differences in place that is effective in killing the larvae of Aedes aegypti. Soil samples, sediment  and  water  taken  from  the  high altitude  of Blitar  and  Bondowoso,  middle altitudes  in  Bangkalan, Ponorogo, Madiun and Tulungagung and low altitude Lamongan and Surabaya. Samples was isolated bacteria with  selective  media B.  thuringiensis. Phenotypic  characteristic  as  result  of  selection  was  observed  by  (Simple matching Method) and toxicity assay in the third instar larvae (A. aegypti) were conducted in laboratory. Larvae mortality  (%)  was analyzed  by  using  probit, ANOVA,  and t-test. Two  of  28  isolates of B.  thuringiensis were bacteria with code of SK.T and Mdn I TK2 toxic to the larvae of Aedes aegypti more than 50 %. Isolate Mdn I TK2 at 48 hours of incubation and isolate SK.T at 24 hours of incubation respectively toxic to the larvae of Aedes aegypti were 100 % and 68,3%. Isolate Mdn I TK2 more effectivity to control A. aegypti larvae than isolate SK.T based on LC50 density of viable cell was 2,17 x10 7 cell/ml.
Keyword : Aedes aegypti, B. thuringiensis, indigenous East Java, toxicity

## PENDAHULUAN
Demam  Berdarah  Dengue  (DBD)  masih menjadi  masalah  bagi  kesehatan  masyarakat  dan merupakan  penyakit  endemis  yang  menyebabkan angka  kematiann tinggi  hampir  di  seluruh  provinsi di  Indonesia.    Dalam  kurun  waktu empat tahun terakhir  jumlah  kasus  DBD  terus  meningkat dan
sering  menimbulkan  Kejadian  Luar  Biasa  (KLB) [1].
Berdasarkan  analisis  kasus  DBD  Dinas Kesehatan Jawa Timur periode Triwulan I (Januari- Maret 2012) terdapat kabupaten/kota di Jawa Timur pada dataran tinggi, dataran sedang  maupun dataran rendah yang mengalami KLB DBD yaitu Lamongan, dan Kota Madiun. Selain  itu  juga  terdapat  daerah  yang  mengalami
kasus DBD meningkat namun tidak memasuki KLB yakni  Kabupaten  Ponorogo,  Bangkalan,  Blitar, madiun dan kota Blitar, Tulungagung. Terdapat pula kabupaten/kota  mengalami  peningkatan  jumlah penderita  dan  kabupaten/kota yang  mengalami peningkatan  angka  kematian  (CFR) yaitu  Kota Surabaya,  Lamongan,  Bondowoso,  Kota  Madiun, Kabupaten dan Kota Blitar.
Penyakit DBD ditularkan  oleh  nyamuk Aedes aegypti (Linn.) Ketinggian tempat merupakan faktor penting  yang  membatasi  penyebaran Aedes  aegypti dari  ketinggian  0  hingga  100  meter  di atas permukaan  laut. Pada dataran  rendah  (kurang  dari 500 m) tingkat populasi nyamuk dari sedang hingga tinggi,  sementara  di  daerah  pegunungan  (lebih  dari 500 m) populasinya rendah[14].
Salah  satu pengendalian  vektor  virus  dengue (A.  aegypti)  adalah  dengan penggunaan  insektisida kimiawi, namun penggunaannya dapat menyebabkan  resistensi  vektor  virus  dengue, pencemaran  lingkungan,  serta  terbunuhnya  musuh alami dan organisme lain yang bukan sasaran. Salah satu  cara  yang  aman  untuk  memberantas  nyamuk menggunakan musuh alaminya [2].
Bakteri Bacillus  thuringiensis diketahui  efektif dan  bersifat  sangat  spesifik  yaitu  toksik  terhadap nyamuk A.  aegypti.  Bakteri  ini  juga  aman  bagi manusia  dan  organisme  bukan sasaran (non-target) [3]. Hal ini sangat diperlukan untuk menanggulangi wabah  penyakit  DBD yang  terdapat  di  Jawa  Timur tanpa menimbulkan dampak negatif pada pencemaran lingkungan. Tujuan dalam penelitian ini adalah untuk  mengetahui pengaruh  ketinggian tempat pada  distribusi B. thuringiensis pengendali larva Aedes aegypti dan mengetahui B. thuringiensis isolat  lokal  Jawa  Timur yang  efektif  dalam membunuh  larva Aedes  aegypti serta mengetahui toksisitas (LC 50 ) B.  thuringiensis isolat lokal  Jawa Timur terhadap larva A. aegypti.

## METODE PENELITIAN
Isolasi dan Pemurnian Bakteri Bacillus thuringiensis
Rancangan  penentuan  lokasi  pengambilan sampel  sedimen  dan  air  menggunakan search sampling yaitu dilakukan dengan studi pendahuluan berdasarkan  data  lokasi  kasus DBD  yang  dominan dari  Dinas  Kesehatan  Jawa  Timur  berdasarkan ketinggian tempat yaitu daerah dataran tinggi (Blitar dan  Bondowoso),  dataran  sedang (Bangkalan, Ponorogo,  Madiun  dan  Tulung  Agung) dan dataran rendah (Lamongan dan Surabaya).
Isolasi dan pemurnian Bakteri Bacillus thuringiensis diisolasi  menurut  Chatterje  dkk [4];[5]. Sampel sedimen  tanah ditimbang  sebanyak 25 g dan sampel air sebanyak 25 ml masing-masing
dimasukkan  ke  dalam  225  ml  larutan  garam fisiologis steril (NaCl 0,85 %) dan dipanaskan pada suhu  80 o C  selama  15  menit. Suspensi  sampel kemudian  dibuat  seri  pengenceran  10 -1 -10 -6 . Suspensi  dari  tingkat  pengenceran  10 -2 -10 -6 diambil sebanyak 0,1 ml kemudian diinokulasikan ke dalam cawan  petri  dan  dituang  dengan  komposisi media selektif B. thuringiensis (glukosa 3  g, (NH 4 ) 2 SO4 2
g, yeast  extract 2  g, K 2 HPO 4 .3H 2 O  0,5  g, MgSO 4 .7H 2 O 0,2 g, CaCl 2 .2H 2 O 0,08 g, MnSO 4 .4H 2 O  0,05  g,  Agar  15  g  dalam  1000  ml akuades)  secara pour  plate. Biakan  diinkubasikan selama ± 48-96 jam dalam inkubator pada suhu 30 o C. Koloni  bakteri yang  diisolasi berbentuk bulat, tepian  berkerut,  memiliki diameter  5 – 10  mm, berwarna  putih,  elevasi    timbul (raised) dan permukaan koloni  kasar  [6],  serta sel  gram  Positif, berbentuk batang, dengan ukuran lebar 1,0 - 1,2 µm dan panjang  3 - 5    µm [7] endospora berbentuk oval,  letaknya  subterminal  dan  berukuran  1,0-1,3 µm.
Isolat yang tumbuh dimurnikan dengan metode streak plate secara kuadran. Koloni pada permukaan agar  media  selektif B.  thuringiensis diinkubasikan selama  ±  48-72  jam  pada suhu ruang. Isolat disimpan  dalam  media Nutrient Agar (NA) dan media selektif B. thuringiensis pada suhu 4 o C.

## Klasifikasi  berdasarkan  nilai  similaritas  sifat- sifat fenotip
Isolat  bakteri  diambil untuk  mengkonfirmasi bakteri  gram  positif  seperti Bacillus  thuringiensis [8]. Uji biokimia yang dilakukan yaitu katalase, VP (Voges-Proskauer), hidrolisis pati, dan diuji dengan API  50CHB API  sistem  (bioMerieux,  Marcyle Etoile, France) sesuai dengan petunjuk produsen [9]. Karakteristik  fenotip  seperti ciri-ciri koloni  dan  sel serta biokimiawi  dijadikan  dalam  satu  data. Data diolah  menggunakan  program CLAD97  [10] untuk mengkonstruksikan  dendogram dengan indeks similaritas  antarstrain  menggunakan  algoritma pengklasteran average linkage (UPGMA: Unweight Pair  Group Methode  with  Arithmatic  Average). Nilai  similaritas  ditentukan  dengan  metode Simple matching Method (SSM) menurut rumus 1[11].
Uji  toksisitas B.  thuringiensis terhadap  larva nyamuk A. aegypti
Isolat bakteri dinokulasikan dalam 50  ml medium Nutrient Broth (NB) yang  diinkubasi pada suhu  30 o C  selama 72  jam.  Dalam  inkubasi  tersebut setiap 24 jam, suspensi biakan bakteri sebanyak lima mililiter diinokulasikan pada masing-masing mangkuk plastik yang  berisi air  sumur steril 45  ml. Setiap mangkuk  plastik ditambahkan  larva  nyamuk A. aegypti instar III sebanyak 20 ekor [12] dan diberi
pakan dogfeed,  sedangkan  kontrol  berupa  air  sumur digunakan  20  larva  nyamuk A.aegypti instar  III tanpa  diberi  perlakuan  suspensi B.  thurigiensis. Pengamatan  dilakukan  dengan  menghitung  jumlah kematian  larva  dalam  pendedahan  24,  48,  dan  72 jam [13].
Isolat bakteri terpilih yang berpotensi membunuh larva A. aegypti instar III lebih dari 50 % dilakukan seri dilusi dengan perbandingan air sumur dan  tingkat  konsentrasi  suspensi  sel  bakteri  yang berbeda-beda  yaitu  0:50,  5:45,  10:40,  15:35,  20:30, dan  25:25. Isolat Bt. pada  umur  biakan  24-48  jam diinokulasikan  dalam  50  ml media  NB  (Nutrient Broth) dan diinkubasi pada suhu  30 o C. Kemudian ditambahkan 20  larva  nyamuk  instar  III,  sedangkan k ontrol  digunakan  20  larva  tanpa  diberi  perlakuan suspensi B.  thuringiensis . Larva  yang  mati  dihitung pada pendedahan 24, 48, dan 72 jam [13]. Nilai LC 50 dihitung  berdasarkan  analisis  Probit  SPSS  for Windows release 16.0 pada setiap waktu pengamatan  dan  konsentrasi B.  thuringiensis dilakukan menggunakan  uji Independent  Sample  T Test ( α = 0,05 ).

## ANALISIS DATA
Toksisitas B.  thuringiensis terhadap  larva nyamuk  A.  aegypti  diuji  menurut  Rancangan  Acak Kelompok  (RAK).  Perlakuan  pada  percobaan  ini yaitu  lama  waktu  pendedahan  dan  jenis  isolat  pada masing-masing  uji.  Percobaan  tersebut  dilakukan sebanyak  tiga  kali  dengan  parameter  uji  persentase kematian larva nyamuk A. aegypti

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Jumlah dan Karakteristik Fenotip Isolat Bakteri yang  Mirip dengan B. thuringiensis Pengendali Larva A. aegypti berdasarkan ketinggian tempat
Sebanyak 28 isolat bakteri  dengan karakter fenotip  mirip B. thuringiensis diperoleh dari beberapa daerah di  Jawa  Timur berdasarkan ketinggian  tempat (Tabel  1). Jumlah i solat  yang diperoleh  bervariasi  dari  tiap-tiap  lokasi, di dataran tinggi  (Blitar dan  Bondowoso)  didapatkan enam isolat B. thuringiensis dan  14  isolat Bacillus spp., dataran  sedang  (Ponorogo,  Tulungagung, dan Madiun)  didapatkan  10 isolat B. thuringiensis dan 33  isolat Bacillus spp., sedangkan  dataran  rendah (Lamongan)  didapatkan 10 isolat B. thuringeinsis dan 39 isolat Bacillus spp. Isolat Bangkalan  dan RSBY  didapatkan  dari  koleksi  laboratorium  hasil studi  pendahuluan  yang  memiliki  tingkat toksisitas yang tinggi.
Lokasi-lokasi  dengan  ketinggian  tempat  yang berbeda  di  Jawa  Timur  diperoleh Bt. index  yang berbeda. Nilai Bt index  merupakan  perbandingan
antara  total  isolat Bt. dengan  total  isolat Bacillus spp. [15]. Nilai Bt. index pada dataran tinggi sebesar 0,42,  dataran sedang sebesar 0,30,  dan  dataran rendah sebesar 0,25.  Berdasarkan  nilai Bt. index tersebut dataran tinggi menunjukkan nilai yang lebih tinggi  dibandingkan  dataran  sedang  dan  dataran rendah. Nilai Bt. index  yang  tinggi  menyatakan kelimpahan B. thuringiensis yang tinggi pula, namun secara  keseluruhan Bt. index  yang  diperoleh  dari masing-masing  ketinggian  tempat  masih rendah (<0,5),  sehingga  dapat  dikatakan  kelimpahan B. thuringiensis di Jawa Timur masih rendah.
Tabel 1. Isolat bakteri  yang  mirip  dengan B.

## thuringiensis
Dataran Kota/Kab. Kode Isolat Dataran tinggi Blitar Bltr TI k6 Bltr TII K1b Bltr TII  K1a Bondowoso Bdws T2 K14 Bdws T2 K6 Bdws T2 K3 Dataran Sedang Ponorogo Pono TI K1a Pono TI K2 Pono TII K1a Pono TIIK2 Tulungagung TA.T I  K6b TA.A. K6b Madiun Mdn I TK2 Mdn JT K6b Mdn JT K1a Mdn JT K6b Bangkalan Bgklan.T Dataran Rendah Surabaya RSBY. T Lamongan SK. T Solokuro TK5 Kltgah TK1 Sekaran Ak1 Kltgah TK2 Sekaran TK1 Solokuro TK2 Kedung TK1 Solokuro TK1 Kedung  A 13
Berdasarkan karakter  fenotip  pewarnaan  gram positif,  endospora  subterminal, hasil  uji  katalase, hidrolisis  pati,  dan  VP  (Voges-Proskauer) isolat yang  menunjukkan  reaksi  positif yaitu  sebanyak lima isolat (Bltr TI k6, Mdn I TK2, SK. T, Solokuro TK1,  dan  Sekaran  TK1)  yang identik  dengan B. thuringiensis var. israelensis HD-567. Bentuk pengelompokkan  kelima  isolat  dan  isolat Bti. HD- 567 berdasarkan similaritas karakter fenotip disajikan pada Gambar 1.
Kelima isolat B. thuringiensis lokal Jawa Timur dibagi  menjadi tiga kelompok.  Kelompok  pertama dengan  nilai  similaritas 100  %  terdiri  atas Bti. HD- 567 dan Mdn I TK2, kelompok kedua similaritasnya 89 % terdiri  atas  isolat SK.T,  Solokuro  TK1,  dan Sekaran TK1, sedangkan kelompok ketiga yaitu Bltr TI  K6 memiliki nilai  similaritas terendah  (75  %) dengan  kelima  isolat  lainnya.  Karakter  yang membedakan  antara  kelompok pertama  (Bti. HD- 567 dan Mdn  I  TK2)  dengan  kelompok  kedua (SK.T,  Solokuro  TK1,  dan  Sekaran  TK1) yaitu morfologi  koloni  dengan  tepian round  with  raised margin sedangkan  kelompok  kedua  dengan  tepian round dan  kelompok  ketiga  dengan  tepian  beralun.
Berdasarkan indeks similaritas isolat SK.T, Solokuro TK1, dan Sekaran TK1 dikatakan dalam  satu  genus karena  menunjukkan  nilai  similaritas  89  % sedangkan  isolat  Solokuro  TK1  dengan  Sekaran TK1  menunjukkan  nilai  similaritas  100  %  antara keduanya  sehingga  dapat  dikatakan  satu  strain demikian juga isolat Bti. HD-567 dengan Mdn I TK2 dengan nilai similaritas 100%.
Gambar 1. Dendogram  hubungan  similaritas  antara kelima  isolat bakteri lokal  Jawa  Timur pengendali A. aegypti dengan Bti. HD-567.
Toksisitas Isolat Bakteri  terhadap Larva A. aegypti
Berdasarkan hasil  seleksi,  dua isolat  bakteri Mdn  I  TK2  berasal  dari  Madiun  dab  SK.T  dari Lamongan  menyebabkan mortalitas  larva Aedes aegypti lebih  dari 50 % pada  pendedahan  72  jam Kedua  isolat  tersebut  masing-masing  berasal  dari dataran  sedang  dan  dataran  rendah. Berdasarkan persentase mortalitas larva A. aegypti instar III oleh perlakuan isolat SK.T, Mdn I TK2, dan Bti. HD-567 (Gambar  2) menunjukkan  bahwa ketiganya  memiki potensi  toksisitas yang  berbeda-beda. Hal  ini  dapat terjadi disebabkan oleh perbedaan potensi toksisitas dari  masing-masing  isolat. Potensi  toksisitas  dari kristal  toksin B. thuringiensis tertentu  dipengaruhi oleh  kelarutan,  afinitas  tehadap  reseptor  serta pemecahan proteolitik ke dalam toksin [16].
Potensi  larvasidal Bti tertinggi  pada  perlakuan SK.T terjadi pada umur biakan 24 jam yang masing- masing  pendedahan  24,  48,  dan 72  jam  secara berturut-turut  51,7  %,  65  %,  dan  68,3  %.  pada perlakuan  Mdn  I  TK2  pada  umur  biakan  24  jam waktu  pendedahan  24,  48,  dan  72  jam  secara berturut-turut 61,67 %, 70 %, dan 73 %, sedangkan pada umur biakan 48 jam 95 %, 100 %, dan 100 %. Potensi larvasidal Mdn I TK2 pada umur biakan 48 tertinggi dibandingkan isolat SK.T dan bakteri acuan Bti. HD-567. B. thuringiensis var. israelensis
memiliki daya  bunuh yang sudah  lebih  berkurang dan  kecil  toksisitasnya jika dibandingkan  dengan daya  bunuh Bacillus  thuringiensis isolat lokal  [17]. Larva A. aegypti dapat  mengalami  peningkatan resistensi terhadap B. thuringeinsis hingga mencapai tiga  kali  lipat  dalam  20  generasi B. thuringeinsis yang dimurnikan dalam skala laboratorium [18].
Gambar 2. Persentase  mortalitas  larva A. aegypti Instar III  oleh isolat  SK.T,  Mdn  I  TK2,  dan Bti. HD-567 pada umur  biakan 24,  48,  dan  72 jam. Berdasarkan umur biakan, isolat SK.T menyebabkan mortalitas  larva A.  aegypti instar  III yang  tertinggi  pada  umur  biakan  24  jam sedangkan Mdn  I  TK2  pada  umur  biakan  24  jam  dan  48  jam, hal  ini berhubungan  dengan  produksi  toksin. Mortalitas  larva A. aegypti oleh perlakuan  SK.T pada  umur  biakan  24  jam kemungkinan  besar disebabkan  oleh senyawa β -eksotoksin, sedangkan pada perlakuan Mdn I TK2 kemungkinan disebabkan  oleh  senyawa β -eksotoksin dan δ - endotoksin.
Berdasarkan  toksisitasnya, kedua  isolat  yaitu SK.T  dan  Mdn  I  TK2 mampu  membunuh  larva A. aegypti lebih  dari  50 %. Uji  toksisitas LC 50 dilakukan  untuk  mengetahui  efektivitas  toksin masing-masing  isolat. Berdasarkan analisis  uji  t  (t- test), perbedaan isolat bakteri dan waktu pendedahan berpengaruh signifikan (p<0,05) terhadap LC 50 larva A. aegypti.
Nilai  LC 50 pada perlakuan isolat SK.T pada waktu pendedahan 24, 48, dan 72 jam menunjukkan persentase mortalitas larva A. aegypti tidak berbeda secara signifikan (p>0.05) yaitu antara 2,42 – 2,69 x 10 7 sel/ml.  Nilai  LC 50 perlakuan  isolat  Mdn  I  TK2 lebih  rendah  dibandingkan  isolat  SK.T,  dan pada waktu  pendedahan  24 lebih  tinggi  dibandingkan pada pendedahan  48  dan  72  jam  (p<0.05) tetapi antara  waktu  pendedahan  24,  48  jam dan 72  jam tidak berbeda secara signifikan (p>0,05). Berdasarkan nilai  LC 50 antarisolat, menunjukkan bahwa isolat Mdn I TK2 relatif paling toksik (2,17 x 10 7 sel/ml) kemudian  isolat SK.T dan  yang  paling rendah toksisitasnya terhadap larva A. Aegypti instar III adalah Bti. HD567.
Tabel 2. Nilai  LC 50 isolat  bakteri B. thuringiensis terhadap larva Aedes aegypti instar III
Toksisitas  isolat Mdn  I  TK2  ini  juga lebih  baik jika dibandingkan isolat PWR4 32 yang berasal dari Malang hasil  isolasi Gama dkk (2013) dengan LC50 72jam sebesar 22,79x10 7 sel/ml. Waktu pendedahan  72  jam  lebih  efektif  daripada  24  jam dan 48 jam, hal ini disebabkan adanya penumpukan atau  akumulasi  toksin yang  berdampak negatif dalam saluran pencernaan inang.

## KESIMPULAN
Bacillus  thuringiensis berdasarkan  ketinggian tempat  tidak  terdapat  hubungan  terhadap  mortalitas larva A.  aegypti meskipun  ditemukan  di  dataran tinggi lebih banyak daripada di dataran rendah. Dua isolat yaitu Mdn I TK2 asal madiun dan isolat SK.T asal Lamongan yang  efektif  membunuh larva A. Aegypti. Isolat  Mdn  I  TK2 paling tinggi toksisitasnya  terhadap larva A. Aegypti instar  III dengan LC50 72jam sebesar 2,17×10 7 sel/ml.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  ditujukan  kepada Bapak Dr.  Suharjono  selaku  Dosen  Pembimbing  atas arahan,  kesabaran,  bimbingan,  tambahan  ilmu  serta dukungannya dalam penelitian dan penulisan jurnal. Ibu Zulfaidah  Penata  Gama  selaku  ketua  proyek Bacillus  thuringiensis Jawa  Timur  yang  membiayai penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Depkes  RI.  2007.  Modul  Pelatihan  Bagi  Pengelola Program Pengendalian Penyakit Demam Berdarah di Indonesia. Dirjen P2PL Depkes RI. Jakarta.
[2] Van  Frankenhuyzen,  Schoenmaker,  Astrid;  Cusson, Michel;,  Kees.  2001.  Interactions  between Bacillus thuringiensis and  parasitoids  of  late-instar  larvae  of the spruce budworm (Lepidoptera:
Tortricidae). Can. J. Zool. 79 (9): 1697 – 1703.
[3] Bellows, T. S., Jr. & R. G. Van Driesche. 1999. Life Table Construction  and Alnaysis  for Evaluating Biological Control Agents, Academic  Press.  New York.. hal. 199-223.
[4] Chatterjee,  S.  N.,  T.  Bhattacharya,  T.  K.  Dangar & G. Chandra. 2007. Ecology and diversity of Bacillus
thuringiensis in  soil  Environment. African.  J. Biotechnol. 6 (13): 1587-1591.
[5] Gama,  Z.  P.  &  U.  Marwati.  2005.  Seleksi  Strain Bacillus  thuringiensis Isolat  Sumenep  yang  paling Potensial  sebagai Agen  Pengendali  Larva  Nyamuk A. aegypti. Natural 9 (1): 1-5. 35874
[6] Rampersad,  J.,  A.  K & D.  Ammons.  2002. Usefulness  of  Staining  Parasporal  Bodies  when Screening  for Bacillus  thuringiensis. J.  Invertebr. Pathol. 79:203-4.
[7] Bravo  A.,  S.  Sarabia,  L.  Lopez,  H.  Ontiveros,  C. Abarca,  A.  Ortiz,  M.  Ortiz,  L.  Lina,  F.  Villalobos, G.  Peña,  M.E.  Nuñez-Valdez,  M.  Soberón  &  R. Quintero.  1998.  Characterization  of cry genes  in  a mexican Bacillus thuringiensis strain  collection. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4965-4972.
[8] Garrity,  G.M.,  Julia,  A.B.,  &  Timothy,  G.  L.  2004. Bergey’s  Manual  Of  Systemic.  2 nd Ed.  Bergey’s Manual Trust. New York. USA.
[9] Martin, P.A,  Gundersen,  R.D.E, Blackburn  M.B. 2010.  Distribution  of  phenotypes  among Bacillus thuringiensis strains.  Syst.  Appl.  Microbiol.  33: 204-208.
[10] Rahardi,B.  2002.  Pemrogaman  Aplikasi  Konstruksi Kekerabatan  Taksonomi Dengan  Visual  C++6.0. Jurusan  Biologi  FMIPA  Universitas  Brawijaya Malang. Skripsi.
[11] Sembiring, L. 2002. Petunjuk Praktikum Sistematika Mikroba S-2. Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Biologi. UGM. Yogyakarta.
[12] Walther, C. J., G. A. Couche, M. A. Pfannenstiel, S. E.  Egan,  L.  A.  Bivin & K.  W.  Nickerson.  1986. Analysis  of  mosquito  larvicidal  potential  exhibited by  vegetative  cells  of Bacillus  thuringiensis subsp. israelensis. Appl. Environ. Microbiol. 52:650 – 653.
[13] Gama,  Z.  P.,  Suharjono,  &  G.  Ekowati.  1998.
Potensi Patogenitas Bacillus thuringiensis var.israelensis serotype H-14 dan Bacillus thuringiensis isolat Madura terhadap Larva Nyamuk.  Laporan  Penelitian Jurusan  Biologi FMIPA, Universitas Brawijaya. Malang.
[14] Kristina, dkk. 2004. Demam Berdarah Dengue.http://www.litbang.depkes.go.id/maskes/05 2004/demamberdarah1.htm. Diakses 12 April 2012.
[15] Ammouneh, H.,  M. Harba,  E. Idris, & H. Makee. 2011. Isolation  and  characterization  of  native Bacillus  thuringiensis isolates  from  Syrian  soil  and testing  of  their  insecticidal activities  against  some insect  pests. Department  of  Molecular  Biology  and Biotechnology,  Atomic  Energy  Commission  of Syria. Turk. J. Agric. For 35: 421-431.
[16] Swadener, C. 1994. Insecticide fact sheet (http://www.mindfully.org/GE/Bacillusthuringiensis Bt.htm): Bacillus  thuringiensis (B.t.). J. Pestic. Reform. 14: 3
[17] Gama,  Z.P.  2000.  Usaha  Pengendalian  Secara Biologis  Terhadap  Bahan  Pencemar  Perairan. J.Natural. 4(2):136-141.
[18] Mittal,  P.K,.  2003.  Biolarvicides  in  vector  control  : challenges  and  prospects.  Malaria  Research  Centre. J. Vect. Borne. Dis 40: 20 – 32.
Isolat Densitas Sel (x 10 7 ) sel/ml LC 50 24jam LC 50 48jam LC 50 72jam SK.T 2,49 (a) 2,69 (a) 2,42 (a) Mdn I TK2 2,37 (a) 2,21 (a) 2,17 (a) Bti. HD- 567 47,08 (b) 46,66 (ab) 19,49 (ab)