© 2022 Penulis. Dibawah lisensi CC BY-SA 4.0. Ini adalah artikel Akses Terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Creative Commons Attribution (CC BY), yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan  reproduksi tanpa  batas  dalam media  apa  pun,  selama  penulis  dan  sumber  aslinya  disebutkan.  Tidak  diperlukan  izin  dari penulis atau penerbit.

## Journal of Experimental and Clinical Pharmacy (JECP)
Doi: 10.52365/jecp.v2i2.425 http://jurnal.poltekkesgorontalo.ac.id/index.php/JECP/
2022, 2(2), 115-129

## Research Article
Abstrak: Uji  identifikasi  dan  penetapan  kadar  merupakan  salah  satu persyaratan mutu suplemen kesehatan yang mengandung vitamin B1, B3, B6,  dan  kofein  sehingga  diperlukan  metode  analisis  yang  optimal  untuk mendeteksi  secara  simultan  analit-analit  tersebut  dalam  suatu  campuran matriks. Saat ini telah tersedia metode analisa KCKT sistem gradien untuk pengujian  tersebut.  Namun,  dari  metode  analisa  tersebut diperoleh  profil kromatogram yang belum optimal dengan nilai resolusi 0,844 pada puncak analit vitamin B3 dan B1. Hal ini disebabkan masih berhimpitnya puncak kedua analit dan tidak terpisah dengan baik pada baseline kromatogram. Oleh  karena  itu  dianggap  perlu  untuk  melakukan  optimasi  pada  metode analisa  ini  dengan  melakukan  modifikasi  perbandingan  komposisi  fase gerak  sistem  gradien  pada  menit  terelusinya  vitamin  B3  dan  B1. Metodologi penelitian menggunakan penelitian eksperimental laboratorium dengan parameter yang diamati adalah profil kromatogram pemisahan  puncak  analit  dan  nilai  resolusi  antara  vitamin  B3  dan  B1. Berdasarkan  data  hasil  optimasi  diperoleh  komposisi  fase  gerak ammonium  asetat  :  asetonitril  (25:75)  yang  memberikan  profil kromatogram optimal terhadap pemisahan vitamin B3 dan B1 dengan nilai resolusi 7,230 untuk vitamin B3 dan 3,427 untuk vitamin B1 (syarat resolusi >  2).  Metode  optimasi  kemudian  dilanjutkan  dengan  validasi  metode analisa  dengan  hasil  uji  parameter  selektifitas,  akurasi,  presisi,  linearitas, nilai  LOD,  dan  nilai  LOQ  memenuhi  syarat  keberterimaan  sehingga metode ini dapat digunakan untuk melakukan pengujian identifikasi dan penetapan kadar vitamin B1, B3, B6, dan kofein dalam sediaan suplemen kesehatan.
Kata  kunci: Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi;  validasi  metode  analisa; produk suplemen

## ABSTRAK
Optimasi dan Validasi Metode KCKT untuk Identifikasi dan Penetapan Kadar Vitamin B1, B3, B6, dan Kofein dalam Suplemen Kesehatan
Sabaruddin 1 , Umy Kurniati Rasyid 1 , Whyllies Agung Ajie Buana 1 , Meike Pakaya 1 dan Fitriana Nur Husain 1 *
1 BPOM Gorontalo, Jl. Tengah Toto Selatan Kabila Bone Bolango Gorontalo, Indonesia

## INFO ARTIKEL
Dikirim : 23 Jun. 2022 Direvisi : 15 Agt. 2022 Diterima : 18 Agt. 2022
*Corresponding Author: Fitriana Nur Husain, Balai POM di Gorontalo, Indonesia, Telp: +62-852-5574-9580 Email: fitriana.nur@pom.go.id

## PENDAHULUAN
Suplemen  Kesehatan  adalah  produk  yang  dimaksudkan  untuk melengkapi  kebutuhan  zat  gizi,  memelihara,  meningkatkan  dan/atau memperbaiki  fungsi  kesehatan,  mempunyai  nilai  gizi  dan/atau  efek fisiologis,  mengandung  satu  atau  lebih  bahan  berupa  vitamin,  mineral, asam  amino  dan/atau  bahan  lain  bukan  tumbuhan  yang  dapat dikombinasi  dengan  tumbuhan.  Persyaratan  mutu  Suplemen  Kesehatan harus sesuai dengan ketentuan Farmakope Indonesia dan/atau Farmakope Herbal  Indonesia,  salah  satunya  adalah  parameter  uji  penetapan  kadar bahan  aktif.  Produk  suplemen  kesehatan  mengandung  kombinasi multivitamin  dilakukan  penetapan  kadar  dengan  prioritas  pada  vitamin yang mempunyai laju degradasi paling cepat yaitu vitamin A atau vitamin K  (mewakili  vitamin  larut  lemak)  dan/atau  vitamin  C  atau  Piridoksin (mewakili vitamin larut air) (PerBPOM 2019).
Thiamin  (B1),  Nikotinamid  (B3),  dan  Piridoksin  (B6)  adalah kelompok vitamin larut air. Thiamin dapat mengalami perubahan struktur dalam  kondisi  lingkungan  asam  dan  basa.  Pada  kondisi  asam  (pH≤6), thiamin  terhidrolisis  menjadi  2-methil-4-amino-5  beta  hydroksimetil pirimidin dan 4-methil-5-hydroksietil thiazole. Kondisi larutan asam kuat, thiamin terdegradasi menjadi oxythiamin melalui pelepasan gugus amino primer  dari  cincin  pirimidin,  yang  digantikan  oleh  gugus  hidroksil. Sedangkan  pada  kondisi  basa,  thiamin  dikonversi  menjadi  pseudobasa yang  netral,  kemudian  dikonversi  menjadi  bentuk  thiol,  menjadi komponen-komponen  yang  mengandung  sulfur  dengan  berat  molekul yang  rendah.  Reaksi  konversi  thiamin  dapat  terjadi  pada  pemanasan dan penyimpanan produk. Vitamin B3 atau niasin secara umum terdiri atas dua jenis  yaitu  asam  nikotinat  (C 6 H 5 O 2 N) dan  nikotinamid  (C 6 H 6 ON 2 ).  Niasin merupakan  vitamin  yang  sangat  stabil  terhadap  panas,  cahaya  dan oksigen, sehingga selama pengolahan dan penyimpanan keberadaan niasin dapat  dipertahankan.  Vitamin  B6  terdapat  dalam  tiga  bentuk  yaitu piridoksin,  piridoksal,  dan  piridoksamin.  Bentuk  yang  paling  banyak diproduksi secara komersial adalah piridoksin HCl. Vitamin B6 ada yang bermuatan  positif,  negatif  dan  netral,  tergantung  pada  pH  larutan.  Pada lingkungan  asam,  berada  dalam  bentuk  kation  atau  bermuatan  positif (bertambahnya  jumlah  proton  yang  diberikan  oleh  asam).  Lingkungan netral, tidak bermuatan atau tidak terionisasi. Sedangkan lingkungan basa, berada  dalam  bentuk  anion  atau  negative  (karena  hidrogen  dari  gugus hidroksil  terdisosiasi  dan  atom  hidrogennya  lepas).  Piridoksin  stabil terhadap  panas  namun  kurang  stabil  pada  kondisi  lingkungan  asam  dan basa  terutama  jika  dikombinasikan  dengan  proses  pemanasan.  Piridoksin

## Optimasi dan Validasi Vitamin B dan Kofein dalam Suplemen Kesehatan
yang paling tahan terhadap pengaruh  pengolahan dan penyimpanan (Ina 2015).
Penelitian yang telah dilakukan yaitu perbandingan metode analisis kromatografi  cair  kinerja  tinggi  (KCKT)  eluasi  gradien  dengan  isokratik pada  penentuan  vitamin  B1, B2, dan  B6 pada  sediaan  sirup  multivitamin secara  simultan  (Ariani  2015).  Dari  penelitian  tersebut,  diperoleh  bahwa metode  KCKT  gradien  hasil  pengembangan  dari  metode  isokratik memberikan hasil analisis yang lebih optimal dilihat dari parameter waktu retensi, daya pisah, dan uji presisi (Ariani 2015). Saat ini telah tersedia juga metode analisa untuk identifikasi dan penetapan kadar vitamin B1, B3, B6, dan kofein dalam suplemen kesehatan secara KCKT detektor Photo Diode Array  menggunakan  sistem  gradien  (PPPOMN  2017).  Namun  terdapat kendala  pada  metode  ini  yakni  puncak  analit  vitamin  B3  dan  B1  tidak terpisah  dengan  baik  sehingga  tidak  dapat  ditentukan  baseline  masing- masing  puncak  analit.  Hal  ini  juga  mempengaruhi  nilai  resolusi  yang rendah  antara  analit  vitamin  B3  dan  B1.  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini bertujuan untuk melakukan optimasi komposisi fase gerak sistem gradien sehingga puncak analit vitamin B3 dan B1 dapat terpisah dengan baik pada baseline  masing-masing  serta  menghasilkan  nilai  resolusi  yang  tinggi. Pemisahan  yang  baik  dapat  memudahkan  dalam  perhitungan  penetapan kadar masing-masing analit dan akan berpengaruh terhadap pengambilan kesimpulan  sesuai  persyaratan  mutu  sediaan  suplemen  kesehatan.  Hasil penelitian  ini  diharapkan  dapat  memberikan  informasi  tentang  profil kromatogram vitamin B1, B3, B6, dan kofein yang telah dipotimasi kondisi pemisahannya  serta  dapat  dimanfaatkan  selanjutnya  untuk  melakukan pengujian mutu suplemen kesehatan yang beredar di masyarakat.

## MATERIAL DAN METODE

## Material

## Alat
KCKT Shimadzu SPD-20A dengan Software LC Solution dilengkapi detektor PDA (SPD-M20A), kolom KCKT C18 dimensi 4,6 mm x 250 mm x 5 µm, pH meter Mettler Toledo Seven Multi, timbangan analitik Precisa XB 220A,  timbangan  mikro  Mettler  Toledo  XP6,  Waterbath  Shaker  Memmert SV 1422, penyaring fase gerak Millipore WP6122050.

## Bahan
Baku  pembanding  Tiamin  HCl  BPFI  (Badan  POM  B0318063), Nikotinamid  BPFI  (Badan  POM  B0316228),  Piridoksin  HCl  BPFI  (Badan
POM  B0117537),  Kofein  BPFI  (Badan  POM  413017),  Asam  Folat  BPFI (Badan POM B0314004), Riboflavin BPFI (Badan POM 413029), asam asetat glasial pro analisa (Merck), ammonium asetat pro analisa (Merck), natrium hidroksida  pro  analisa  (Merck),  asam  ortofosfat  pro  analisa  (Merck), asetonitril  HPLC  grade  (Merck),  dan  aqubidestillata  yang  diproduksi  di laboratorium menggunakan Millipore

## Metode
Metodologi  penelitian  yang  digunakan  adalah  penelitian eksperimental  laboratorium  di  laboratorium  Badan  POM  Gorontalo dengan  parameter  yang  diamati  adalah  profil  kromatogram  pemisahan puncak analit dan nilai resolusi antara vitamin B3 dan B1 melalui optimasi variabel perubahan komposisi fase gerak pada menit elusi vitamin B3 dan B1.  Sampel  diperoleh  dari  sampling  secara  purposif  terhadap  tablet multivitamin  suplemen  kesehatan  dengan  kandungan  vitamin  B1,  B3, B6, dan  kofein  yang  beredar  di  provinsi  Gorontalo.  Selanjutnya  dilakukan pengujian  optimasi,  uji kesesuaian  sistem,  dan  validasi  metode  analisa  di laboratorium menggunakan prosedur metode analisa sebagai berikut:

## Pembuatan Pereaksi
- Pelarut asam asetat 1%
- Pelarut natrium hidroksida 1 N
- Larutan  Ammonium  asetat  25  mM  :  Ditimbang  seksama  1,925  gram ammonium asetat, dilarutkan dengan air hingga 1000,0 mL kemudian pH diatur hingga 5,0 dengan penambahan asam ortofosfat 85%.

## Penyiapan Larutan Baku Induk
Baku Vitamin B1, B3, B6, dan Kofein ditimbang saksama lebih kurang 25  mg,  dimasukkan  masing-masing  ke  dalam  labu  tentukur  5  mL, ditambahkan 1 mL larutan asam asetat 1%, diencerkan dengan air  sampai tanda.  Dipipet  50  µL  dalam  labu  tentukur  5  mL,  diencerkan  dengan  air sampai tanda (larutan baku tunggal).

## Larutan Baku Campuran
Masing-masing larutan baku induk dipipet 1 mL ke dalam labu 10 mL,  diencerkan  dengan  air  sampai  tanda.  Dibuat  larutan  seri  sebagai berikut (Larutan A):
- Seri 1 = 200 uL
- Seri 2 = 400 uL
- Seri 3 = 800 uL
- Seri 4 = 1200 uL
- Seri 5 = 1600 uL
- Seri 6 = 2000 uL
Dimasukkan dalam labu 10 mL diencerkan dengan air sampai tanda.

## Larutan Matriks
Sejumlah  10  tablet  dimasukkan  ke  dalam  labu  tentukur  50  mL, ditambahkan 5 mL air, tambahkan 1 mL larutan NaOH 1 N, dimasukkan ke  dalam  shaker  selama  5  menit,  ditambahkan  5  mL  larutan  asam  asetat 1%,  dimasukkan  ke  dalam  shaker  selama  10  menit,  ditambahkan  dengan air  hingga  tanda,  sebelum  dicukupkan  pastikan  pH  dari  larutan  sampel adalah  5,  apabila  larutan  sampel  lebih  dari  5  diasamkan  dengan  asam asetat  1%.  Larutan  sampel  tersebut  disaring  dengan  penyaring  membran. Dipipet  500  µL  filtrat,  dimasukkan  ke  dalam  labu  tentukur  10  mL, diencerkan dengan air sampai tanda, dibuat duplo (Larutan B).

## Larutan Spiked Sample
Dengan cara yang sama seperti larutan uji ditambahkan baku B1, B3, B6, dan Kofein sebanyak kurang lebih 25 mg, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL, ditambahkan 5 mL air, 1 mL NaOH 1 N, dimasukkan ke dalam shaker selama 5 menit, ditambahkan 5 mL larutan asam asetat 1%, dimasukkan  ke  dalam  shaker  selama  10  menit,  ditambahkan  dengan  air hingga  tanda,  sebelum  dicukupkan  pastikan  pH  dari  larutan  sampel adalah  5,  apabila  larutan  sampel  lebih  dari  5  diasamkan  dengan  larutan asam  asetat  1%.  Larutan  sampel  tersebut  disaring  dengan  penyaring membran, Pipet 500 µL filtrat, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, diencerkan dengan air sampai tanda, kemudian dibuat larutan seri, sebagai berikut (Larutan C):
- Seri Spiked 1 = 200 uL
- Seri Spiked 2 = 400 uL
- Seri Spiked 3 = 800 uL
- Seri Spiked 4 = 1200 uL
- Seri Spiked 5 = 1600 uL
- Seri Spiked 6 = 2000 uL Dimasukkan dalam labu 10 mL diencerkan dengan air sampai tanda.

## Cara Penetapan
Larutan  A,  B  dan  C  masing-masing  disuntikkan  secara  berurutan dengan kromatografi cair kinerja tinggi dengan kondisi sebagai berikut : Fase diam   :  Kolom C18 5 µm, 4,6 x 250 mm

## Optimasi dan Validasi Vitamin B dan Kofein dalam Suplemen Kesehatan
Fase gerak  :  Asetonitril dan Amonium asetat 25 mM pH 5,0 dengan sistem gradien pada tabel sebagai berikut: Tabel 1. Sistem gradien sesuai metode Analisa Waktu Ammonium Asetat Asetonitril 0,00 0 100 6,00 0 100 25,00 50 50 25,50 100 0 34,99 100 0 40,00 Stop Volume penyuntikkan  : 20 µL Detektor :  PDA  pada  panjang  gelombang  200-400  nm,  B1, Nikotinamida,  B6  dan  Kofein  diamati  pada panjang gelombang 254 nm Laju alir kolom : 1,0 mL / menit

## Kondisi Optimasi
Optimasi  dilakukan  pada  menit  ke  25,00  dengan  melakukan perubahan  komposisi  fase  gerak  hingga  diperoleh  profil  kromatogram yang terpisah dengan baik antara puncak analit vitamin B3 dan B1. Kondisi optimasi ditunjukkan pada tabel berikut:
Tabel 2. Kondisi optimasi pertama (45:55) Waktu Ammonium Asetat Asetonitril 0,00 0 100 6,00 0 100 25,00 45 55 25,50 100 0 34,99 100 0 40,00 Stop Tabel 3. Kondisi optimasi kedua (25:75) Waktu Ammonium Asetat Asetonitril 0,00 0 100 6,00 0 100 25,00 25 75 25,50 100 0 34,99 100 0 40,00 Stop

## Penetapan Selektifitas
Larutan  baku  tunggal  Vitamin  B1,  Nikotinamid,  B6,  dan  Kofein, larutan  B  dan  larutan  C  (seri spiked 3)  masing-masing  disuntikkan  secara

## Optimasi dan Validasi Vitamin B dan Kofein dalam Suplemen Kesehatan
berurutan  dengan  kondisi  kromatografi  cair  kinerja  tinggi  pada  optimasi kedua.
Hasil uji dinyatakan negatif jika waktu retensi, profil spektrum dan panjang gelombang serapan maksimum dari larutan uji tidak sama dengan larutan baku dan larutan spiked sample.

## Penetapan Presisi dan Akurasi
Digunakan larutan baku induk, larutan baku campuran, dan larutan spiked  sample  seperti  pada  pengujian  Selektifitas.  Untuk  penentuan  nilai akurasi  dan  presisi,  dibuat  3  replikasi  untuk  masing-masing  seri  spiked. Pengukuran  terhadap larutan berikut:
- Seri spiked 1 A, B, C
- Seri spiked 4 A, B, C
- Seri spiked 6 A, B, C
Disuntikkan  secara  berurutan  larutan  baku  seri  1,  2,  3,  4,  5,  dan  6 serta  seri  spiked  1,  4  dan  6  dengan  kondisi  analisis  seperti  pada  cara penetapan pada uji Selektifitas.

## Penetapan Linearitas
Digunakan larutan baku induk, larutan baku campuran, dan larutan spiked  sample  seperti  pada  pengujian  Selektifitas.  Untuk  penentuan  nilai linearitas, dibuat 2 replikasi untuk masing-masing seri spiked. Pengukuran terhadap larutan berikut:
- Seri spiked 1 A, B
- Seri spiked 2 A, B
- Seri spiked 3 A, B
- Seri spiked 4 A, B
- Seri spiked 5 A, B
- Seri spiked 6 A, B
Disuntikkan  secara  berurutan  larutan  seri  spiked  1,  2,  3,  4,  5  dan  6 dengan kondisi analisis seperti pada cara penetapan pada uji Selektifitas.

## Penetapan Batas Deteksi dan Kuantitasi (LOD & LOQ)
Dilakukan  pengujian  seperti  pada  prosedur  akurasi,  dibuat  kurva kalibrasi (konsentrasi sebagai absis dan area sebagai ordinat), dan dihitung nilai Sy/x dan SA, menggunakan rumus:
S y/x = √ ∑( )     2 2 / rata rata i i x y A x x x n x x S S     
yi : respon hasil pengukuran yc: respon hasil perhitungan dari persamaan regresi Kemudian dihitung nilai LOD dan LOQ  menggunakan rumus:
LOD = Nilai LOD metode  (µg/g) = B Fp x LOD LOQ = Nilai LOQ metode  (µg/g) =
B Fp x LOQ
Dimana  S A adalah  simpangan  baku  dari  y-intersep,  b  adalah  slope,  Fp adalah faktor pengenceran, dan B adalah bobot sampel.

## Analisis Data
Analisis data dilakukan menggunakan software Microsoft Excel 2010 .

## HASIL
Hasil pengujian memperlihatkan profil kromatogram yang berbeda antara metode  analisa  awal  dan  metode  optimasi,  terutama  pada  profil  puncak analit vitamin B1 dan B3 yang ditunjukkan pada gambar berikut:
(a) (b) (c)
Gambar 1. Profil kromatogram: (a) Metode awal; (b) Metode optimasi pertama  (45:55); (c) Metode optimasi kedua (25:75)
Pada  gambar  1  menggunakan  perbandingan  amonium  asetat  dan asetonitril (50:50) sesuai dengan metode asli menunjukkan puncak vitamin B1  dan  B3  yang  berhimpit  dan  tidak  terpisah  dengan  baik  sehingga menghasilkan nilai resolusi yang rendah dan penentuan nilai area puncak yang  tidak  berada  pada  baseline  kromatogram.  Puncak  analit  vitamin  B3 belum terelusi sempurna, sebagian lembah analit masih tertahan di dalam fase diam dan puncak analit vitamin B1 sudah mulai terelusi pada waktu

## Optimasi dan Validasi Vitamin B dan Kofein dalam Suplemen Kesehatan
yang  bersamaan.  Hal  ini  menyebabkan  bias  pada  perhitungan  nilai  area dan penarikan kesimpulan hasil uji identifikasi. Oleh karena itu, dilakukan optimasi  dengan  modifikasi  komposisi  amonium  asetat  dan  asetonitril pada  sistem  gradien  metode  tersebut.  Hasil  optimasi  kedua  dengan perbandingan  komposisi  fase  gerak  ammonium  asetat  dan  asetonitril (25:75)  menunjukkan  profil  kromatogram  dengan  pemisahan  optimal sehingga  komposisi  optimasi  kedua  ini  yang  akan  dilanjutkan  dengan validasi metode analisis. Perbandingan parameter kromatogram pada suntikan campuran baku pembanding dapat dilihat pada tabel di bawah:
Tabel 4. Perbandingan hasil optimasi Metode Awal Optimasi I Optimasi II Komposisi Amonium Asetat : Asetonitril 50:50 45:55 25:75 Parameter Vit B3 Vit B1 Vit B3 Vit B1 Vit B3 Vit B1 Waktu retensi 16,040 16,164 15,724 15,980 15,727 16,470 Area 1180932  1505190  1189096 1403861 1110462  1258235 Faktor ikutan 0 0 1,225 1,369 1,171 1,340 Lempeng teoritis 142078 269207 107982 247902 50628 183554 Resolusi 5,871 0,844 7,105 1,605 7,230 3,427
Sebelum  melakukan  validasi  metode,  terlebih  dahulu  dilakukan  uji kesesuaian  sistem  kromatografi  yakni  dengan  menyuntikkan  satu konsentrasi  larutan  baku  ke  dalam  sistem  KCKT  dengan  kondisi  analisis terpilih. Hasil uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada profil kromatogram (Gambar 2) dan tabel nilai parameter hasil uji kesesuaian sistem (Tabel 5) di bawah:
Gambar 2. Profil kromatogram uji kesesuaian sistem metode optimasi kedua (25:75) Tabel 5. Rata-rata nilai parameter uji kesesuaian sistem metode optimasi kedua (25:75) Baku Waktu retensi Area %RSD Area Faktor ikutan Lempeng teoritis Resolusi Vitamin B6 12,857 663859 1,572 1,164 13648 13,287 Vitamin B3 15,510 1090369 1,992 1,157 45146 7,231 Vitamin B1 16,313 1236844 1,585 1,331 179126 3,582 Asam Folat 18,816 657041 0,806 1,252 242763 15,248 Kofein 23,731 1066617 1,674 1,167 253473 28,802 Vitamin B2 25,396 2891844 1,656 1,197 333122 8,180 Syarat < 2,0 < 2,0 > 10000 > 2,0

## Optimasi dan Validasi Vitamin B dan Kofein dalam Suplemen Kesehatan
Dari  data  hasil  uji  kesesuaian  sistem  dibandingkan  dengan  syarat keberterimaan  parameter  uji  kesesuaian  sistem  yakni  pada  %RSD  area, faktor  ikutan,  lempeng  teoritis  dan  resolusi  dari  lima  kali  penyuntikan enam  baku  pembanding  dalam  larutan  baku  campuran  tersebut  sudah memenuhi syarat sesuai Farmakope Indonesia Edisi VI tahun 2020.

## Hasil Uji Selektivitas
Hasil uji selektifitas dapat dilihat pada profil kromatogram gambar 3 berikut ini:
Gambar 3. Profil kromatogram uji selektifitas
Uji  selektifitas  dilakukan  untuk  megetahui  apakah  suatu  metode dapat memisahkan analit dari senyawa pengotor, matriks, atau degradan.

## Hasil Uji Presisi dan Akurasi
Data hasil uji akurasi dari enam senyawa yang diukur menggunakan larutan spiked sample dengan syarat keberterimaan mengikut pada Burges (untuk  presisi)  dan  AOAC  International  (untuk  akurasi  dan  linearitas) dapat dilihat pada tabel di bawah ini:
Tabel 6. Hasil uji presisi dan akurasi Baku Spiked Horrat (%) Syarat Horrat Rekoveri  (%) Syarat (%) Vit B6 1 1,18 ≤ 7,3 96-105 80-110 4 0,49 ≤ 5,3 97-100 90-107 6 1,18 ≤ 3,7 97-103 95-105 Vit B3 1 1,16 ≤ 7,3 90-98 80-110 4 0,48 ≤ 5,3 96-99 90-107 6 1,15 ≤ 3,7 96-102 95-105 Vit B1 1 1,12 ≤ 7,3 95-103 80-110 4 0,93 ≤ 5,3 98-104 90-107 6 1,08 ≤ 3,7 100-105 95-105 Kofein 1 1,04 ≤ 7,3 94-102 80-110 4 0,55 ≤ 5,3 100-101 90-107 6 0,84 ≤ 3,7 100-105 95-105

## Optimasi dan Validasi Vitamin B dan Kofein dalam Suplemen Kesehatan

## Hasil Uji Linearitas
Data hasil uji linearitas berdasarkan nilai koefisien korelasi (r) dapat dilihat pada tabel di bawah ini:
Tabel 7. Hasil uji linearitas Baku Nilai r Syarat r Vitamin B6 0,9999 ≥ 0,999 Vitamin B3 0,9999 ≥ 0,999 Vitamin B1 0,9999 ≥ 0,999 Kofein 0,9999 ≥ 0,999

## Hasil Uji Batas Deteksi dan Kuantitasi (LOD & LOQ)
Hasil  perhitungan  nilai  LOD  dan  LOQ  dari  enam  analit  yang  diuji ditunjukkan pada tabel di bawah ini:
Tabel 8. Hasil perhitungan nilai LOD dan LOQ Baku Nilai LOD (µg/g)  Nilai LOQ (µg/mL) Vitamin B6 10,37 8,18 Vitamin B3 10,56 8,33 Vitamin B1 11,16 8,80 Kofein 9,07 7,16

## PEMBAHASAN
Hasil  optimasi  metode  menunjukkan  bahwa  semakin  rendah komposisi  fase  organik  dari  fase  gerak  maka  dapat  meningkatkan  nilai Relative  Retention  Time (RRT)  pemisahan  analit,  menghasilkan  bentuk puncak  analit  simteris  dan  mendekati  kriteria  keberterimaan  (Chrissanti 2020).  Peningkatan  waktu  retensi  menyebabkan  komponen  analit  keluar dari  kolom  tidak  bersamaan  dan  secara  langsung  akan  meningkatkan resolusi dari puncak yang dihasilkan (Kurnia 2019).
Uji kesesuaian sistem pada penelitian ini mengunakan larutan baku campuran (Larutan A) sebanyak 6 kali penyuntikan berulang pada kondisi optimasi  II.  Parameter  yang  diuji  antara  lain  keterulangan  waktu  retensi, area  puncak  (dinyatakan  dengan  %RSD),  faktor  ikutan,  angka  lempeng teoritis,  dan  resolusi  (Ayuningtyas  2021).  Dari  data  hasil  uji  kesesuaian sistem  dibandingkan  dengan  syarat  keberterimaan  parameter  uji kesesuaian  sistem  yakni  pada  %RSD  area,  faktor  ikutan,  lempeng  teoritis dan  resolusi  dari  lima  kali  penyuntikan  enam  baku  pembanding  dalam larutan baku campuran tersebut sudah memenuhi syarat sesuai Farmakope Indonesia Edisi VI tahun 2020. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa sistem  telah  stabil,  kondisi  operasional  untuk  melakukan  analisis  dengan KCKT  sudah  membentuk  suati  kesatuan  sistem  yang  dapat  memberikan

## Optimasi dan Validasi Vitamin B dan Kofein dalam Suplemen Kesehatan
hasil  uji  dengan  baik,  sehingga  dapat  dilanjutkan  untuk  mengerjakan parameter uji validasi (Aziz 2020).
Uji  selektifitas  dilakukan  untuk  megetahui  apakah  suatu  metode dapat memisahkan analit dari senyawa pengotor, matriks, atau degradan. Puncak  kromatogram  analit  tidak  boleh  diganggu  oleh  puncak-puncak komponen  lain,  dan  memberikan  pemisahan  yang  baik  antara  analit dengan komponen lain (matriks, pengotor, degradan) (Ayuningtyas 2021). Persyaratan suatu metode dapat disebut selektif adalah resolusi lebih besar dari 2,0  (Farmakope  Indonesia 2020).  Hasil  uji  selektifitas  diperoleh  tidak ada puncak pada pelarut dan larutan matriks yang memiliki waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku. Selain itu, larutan baku dan larutan  spiked  sample  memberikan  puncak  dengan  waktu  retensi  yang sama. Hal ini juga ditunjukkan dengan nilai resolusi dari enam baku pada larutan  spiked  sample  tersebut  adalah  vitamin  B6  (14,203),  vitamin  B3 (6,528), vitamin B1 (4,279), asam folat (16,241), kofein (28,068), dan vitamin B2  (9,153)  menunjukkan  metode  selektif  memisahkan  enam  baku  yang digunakan.
Uji akurasi dilakukan untuk mengetahui akurasi dari metode analisis dengan  menghitung  persen  perolehan  kembali  larutan  baku  yang ditambahkan  ke  dalam  sampel.  Uji  akurasi  dilakukan  dengan  standard addition method (Aziz 2020). Akurasi dinyatakan sebagai persen rekoveri dari hasil analisis uji terhadap kadar analit sebenarnya yang ditambahkan dalam  masing-masing  sampel.  Larutan  uji  akurasi  disipakna  dalam  tiga konsentrasi  dengan  replikasi  sebanyak  tida  kali  untuk  setiap  konsentrasi, kemudian dihitung persen rekoverinya (Ayuningtyas 2021).
Uji  presisi  yang  dilakukan  pada  penelitian  ini  adalah  repeatability, yaitu  analisis  dengan  replikasi  tiga  kali  secara  independen  dari  tiga konsentrasi  sampel  seperti  pada  uji  akurasi.  Kriteria  penerimaan  presisi adalah  dengan  menghitung  nilai  relative  standard  deviation  (RSD)  yang dinyatakan dalam nilai RSD Horrat (Ayuningtyas 2021). Berdasarkan tabel di  atas  dapat  dilihat  bahwa  enam  baku  tersebut  memenuhi  syarat keberterimaan  presisi.  Begitu  pula  dengan  rentang  persen  perolehan kembali pada parameter akurasi memenuhi syarat keberterimaan. Hasil ini menunjukkan  bahwa  tidak  ada  perbedaan  nyata  antara  bobot  baku pembanding  yang  ditambahkan  dan  bobot  baku  pembanding  yang diperoleh kembali (Aziz 2020).
Uji  linearitas  dilakukan  dengan  membuat  kurva  baku  antara  area puncak  dengan  konsentrasi  baku,  kemudian  dihitung  harga  koefisien korelasi (r) dan persamaan y=a+bx. Persamaan regresi dianggap linier jika r  ≥  0,999  (Ayuningtyas  2021).  Nilai  koefisien  korelasi  (r)  yang  diperoleh dari  enam  baku  yang  diuji,  semuanya  berada  di  atas  persyaratan  yaitu  ≥ 0,999  dan  mendekati  nilai  1.  Semakin  mendekati  nilai  1  maka  kurva  seri

## Optimasi dan Validasi Vitamin B dan Kofein dalam Suplemen Kesehatan
baku yang dianalisis semakin linear. Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada pengaruh  matriks  terhadap  analit  pada  metode  yang  digunakan  (Aziz 2020).
Batas  deteksi  (LOD)  diuji  untuk  melihat  konsentrasi  terendah  dari suatu  analit  yang  masih  dapat  diuji  menggunakan  metode  analisa  ini. Sedangkan  hasil  uji  kuantitasi  (LOQ)  memberikan  informasi  konsentrasi terendah  analit  dalam  sampel  yang  masih  dapat  ditetapkan  kadarnya secara  akurasi  dan  presisi  sesuai  dengan  syarat  keberterimaan  pada metode analisa ini. Dengan mengetahui nilai LOD dan LOQ dapat menjadi pedoman  berapa  konsentrasi  terendah  dari  enam  analit  tersebut  dalam sediaan  suplemen  kesehatan  yang  dipersiapkan  untuk  melakukan pengujian identifikasi dan penetapan kadar (Aziz 2020).

## KESIMPULAN
Kondisi optimal pengujian identifikasi dan penetapan kadar vitamin B1,  B3,  B6  dan  kofein  dalam  sediaan  suplemen  kesehatan  secara  KCKT dengan  sistem  gradien  adalah  pada  perbandingan  komposisi  fase  gerak ammonium  asetat  dan  asetonitril  (25:75).  Metode  KCKT  gradien  hasil optimasi  pada  penelitian  ini  dapat  digunakan  untuk  analisis  identifikasi dan  penetapan  kadar  secara    simultan  vitamin  B1,    B3,  B6,  dan  kofein dalam  sediaan  suplemen  kesehatan  yang  beredar  di  pasaran  karena memberikan  hasil  analisis  yang  optimal  dilihat  dari  parameter  resolusi pada  kesesuaian  sistem,  selektifitas,  presisi,  akurasi,  linearitas,  nilai LOD, dan nilai LOQ metode analisa.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  pihak-pihak  yang  telah membantu  dalam  penelitian  ini  yakni  Farida  Kurniawati  atas  saran masukan  sebagai  instruktur  pelatihan  dari  PPPOMN  dan  Balai  POM  di Gorontalo atas fasilitas yang diberikan selema penelitian.

## KONFLIK KEPENTINGAN

## Tidak ada

## KONTRIBUSI PENULIS
SBR,  UKR,  WAB,  dan  MPK  melakukan  pengujian  laboratorium,  FNH melakukan  analisis  data  dan  merupakan  kontributor  dalam  penulisan naskah. Semua penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.

## PENDANAAN

## Penelitian ini didanai oleh DIPA Badan POM

## DAFTAR PUSTAKA
Kemeterian  Hukum  dan  Hak  Asasi  Manusia.  2019.  “Peraturan  Badan Pengawas  Obat  dan  Makanan  Nomor  17  Tahun  2019  tentang Persyaratan Mutu Suplemen Kesehatan.”
Ina  PT.  2015.  “Bahan  Ajar  Vitamin  Universitas  Udayana.” Available  from: https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_pendidikan_1_dir/ea3a327 4c98c074a4ae486dd3d6be61f.pdf
Ariani  NLK,  Suaniti  NM,  Sibarani  J.  2015.  “Perbandingan  Analisis Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi  Eluasi  Gradien  dengan  Isokratik pada  Penentuan  Vitamin  B1,  B2,  dan  B6  dalam  Sediaan  Sirup
Multivitamin  Secara  Simultan .  Cakra  Kimia  (Indonesian  E-Journal  of Applied Chemistry) 3(12)
Badan  Pengawas  Obat  dan  Makanan.  2017.  “Metode  Analisa  Pusat Pengembangan Pengujian Obat dan Makanan Nasional.”
Kementerian  Kesehatan  Republik  Indonesia.  2020.  “Farmakope  Indonesia Edisi VI.” ISBN 978-623-301-017-7.
Chrissanti RD, Darmawati A, Yuwono M. 2020. “Optimasi Metode KCKT untuk Penetapan Kadar 4-Isobutilasetofenon dan 2-(4-Isobutirilfenil)
Asam  Propanoat  dalam  Tablet  Ibuprofen.” Jurnal  Farmasi  dan  Ilmu Kefarmasian 7(1)
Kurnia  D,  Pujilestari  ET,  Pamudjo  I.  2019.  “Pengembangan  Metode Penetapan  Kadar  Metil  Prednisolon  dalam  Sediaan  Dry  Injection Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).” Analit : Analytical and Environmental Chemistry . 4(1)
Ayuningtyas  R,  Primaharinastiti  R,  Yuwono  M.  2021.  “Optimasi  dan validasi  metode  KCKT  untuk  identifikasi  dan  penetapan  kadar metabolit  nitofuran  dalam  bakso  udang. Jurnal  Farmasi  dan  Ilmu
Kefarmasian Indonesia 8(2)
Aziz  S,  Nurhidayati  L,  Abdillah  S,  Yuliana  ND,  Simanjuntak  P.  2020. “Optimasi  dan  Validasi  Metode  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi untuk  Menetapkan  Kadar  Asam  Klorogenat  dalam  Ekstrak  Etanol Daun Yakon ( Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson).” Alchemy Jurnal Penelitian Kimia 16 (1). p. 67-66.
Burges C. 2001. “Valid Analytical Method and Procedures.” Royal Society of Chemistry p. 9-14, 57-59.
AOAC  International.  2016.  “Guideline  for  Standard  Method  Performance Requirements.” Appendix f.