p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Enkapsulasi Probiotik Lactobacillus sp. Menggunakan Biopolimer Alginat dan Kitosan dengan Metode Satu Tahap
Tazkia Nur Hidayah 1* , Djaenudin 2 , Novriyanti Lubis 3
1,3 Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Garut, Garut.
2 Loka Penelitian Teknologi Bersih, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia * Koresponden email : tazkianurhidayah2603@gmail.com
Diterima: 27 Februari 2021 Disetujui: 15 Maret 2021

## Abstract
Lactobacillus sp are gram-positive bacteria that cannot survive in acidic conditions, such as stomach acid conditions (pH 1.5- pH 2.5) so that a carrier is needed so that Lactobacillus sp can survive when colonizing the intestine. One way to protect Lactobacillus sp in acidic conditions is by encapsulation. The  core  material  used  for Lactobacillus encapsulation  uses  a  mixture  of  Na-alginate  and  chitosan. The  mixture  formed  then  becomes  microcapsules  using  an  electrospinning  device.  One  of  the components of the electrospinning device is a syringe that provides pressure to form droplets that fall into a solution of CaCl2 and chitosan with a concentration of 1.2%; 1.6% and 2%. Lactobacillus sp. The  encapsulated  viability  was  tested  for  viability  in  simulated  gastric  acid  (0.2%  NaCl  pH  1.2  and pH 3) for 1 minute, 60 minutes, and 120 minutes using the Total Plate Count (TPC) method. After the viability  test  was  carried  out,  it  was  found  that Lactobacillus sp.  encapsulation  results  with  a  2% chitosan matrix with the number of colonies in the simulated gastric acid pH 3 for 1 minute is 4x109 cfu / g, for 60 minutes 3x109 cfu / g and for 120 minutes is 1x9 cfu /g.
Keywords: encapsulation, chitosan, lactobacillus sp., Na-Alginate, electrospinning

## Abstrak
Lactobacillus sp. merupakan  bakteri  gram  positif  yang  tidak  dapat  bertahan  hidup  dalam  kondisi asam,  seperti  kondisi  asam  lambung  (pH  1,5-  pH  2,5)  sehingga  diperlukan  zat  pembawa  agar Lactobacillus sp. dapat  bertahan  hidup  ketika  berkoloni  di  usus.  Salah  satu  cara  untuk  melindungi Lactobacillus sp. dalam  keadaan  asam  dengan  melakukan  enkapsulasi.  Bahan  inti  yang  digunakan untuk  enkapsulasi Lactobacillus menggunakan  bahan  campuran  Na-alginat  dan  kitosan.  Campuran yang  terbentuk  tersebut  selanjutnya  menjadi  mikrokapsul  menggunakan  alat elektrospinning. Salah satu komponen alat elektrospinning yaitu jarum suntik yang memberikan tekanan sebagai pembentuk tetesan  yang  jatuh  ke  dalam  larutan  CaCl 2 dan  kitosan  dengan  konsentrasi  1,2%;  1,6%  dan  2%. Lactobacillus sp. yang telah terenkapsulasi diuji viabilitas dalam simulasi cairan asam lambung (0,2% NaCl  pH  1,2 dan  pH  3)  selama  1  menit,  60 menit,  dan  120  menit  dengan  metode  TPC  ( Total  Plate Count ). Setelah dilakukan uji viabilitas didapatkan Lactobacillus sp. Hasil enkapsulasi dengan matriks kitosan  2%  dengan  jumlah  koloni  pada  simulasi  cairan  asam  lambung  pH  3  selama  1  menit  adalam 4x10 9 cfu/g, selama 60 menit 3x10 9 cfu/g dan selama 120 menit adalah 1x9 cfu/g. Kata kunci: enkapsulasi, kitosan, lactobacillus sp ., Na-Alginat, elektrospinning

## 1. Pendahuluan
Salah  satu  bentuk  pengembangan  makanan  fungsional  berbasis  produk  susu  adalah yogurt probiotik atau sering disebut Bio-yogurt . Menurut FAO/WHO probiotik adalah mikroorganisme non- patogenik  yang  dapat  memberikan  efek  menguntungkan  apabila  dikonsumsi  dalam  jumlah  tertentu, seperti  dapat  menjaga  keseimbangan  mikroba  usus,  dan  dapat  meningkatkan  resisten  terhadap penyakit  infeksi  salah  satunya  diare  [1].  Golongan  mikroba  yang  menguntungkan  adalah  BAL (Bakteri  Asam  Laktat).  BAL  dikelompokan  menjadi  beberapa  genus  diantaranya Streptococcus, Leuconostoc , Pediococcus , dan Lactobacillus [2] .
Lactobacillus sp. merupakan genus dari Lactobacillus yang memiliki manfaat diantaranya dapat menstimulasi sistem imun pada usus, mengurangi keparahaan pada saat diare, dan memiliki sifat anti mikroba  [3]. Lactobacillus sp.  tidak  dapat  bertahan  hidup  dalam  kondisi  asam,  seperti  pada  kondisi asam  di  lambung  (pH  1,5-2,5)  dan  pada  suhu  yang  tinggi  dalam  proses  pengolahan  [4].  Sehingga
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
diperlukan  penambahan  zat  pembawa  agar  probiotik Lactobacillus sp.  dapat  bertahan  hidup  ketika melewati usus dan dapat berkoloni di usus [5].
Namun  penggunaan  probiotik  dalam  bahan  pangan  memiliki  beberapa  permasalahan diantaranya dapat menurunkan viabilitas bakteri  sehingga  jumlahnya tidak mencukupi ketika  sampai di  usus  menurut  FAO/WHO  nilai  minimum  yang  harus  dipenuhi  sekitar  10 6 -10 7 CFU  ( Colony Forming  Units )/gram  bakteri  dalam  sediaan  probiotik  yang  dapat  berkoloni  di  usus  sehingga  dapat memberikan  manfaat [6].  Salah  satu  cara  untuk  mencegah  kerusakan  dan  berkurangnya  viabilitas bakteri  asam  laktat  di  dalam  usus  dengan  memberikan  perlindungan  melalui  proses  enkapsulasi  [7]. Enkapsulasi  adalah  suatu  proses  pembungkusan  ( coating )  bahan  inti  yang  bertujuan  untuk meningkatkan  viabilitas  dan  melindungi  bahan  inti  dari  kondisi  yang  merugikan.  Bahan  inti  yang digunakan  dalam  proses  enkapsulasi  adalah  bakteri  probiotik  dan  polimer  yang  digunakan  dalam proses enkapsulasi adalah Na-Alginat dan Kitosan [8].
Alginat  merupakan  polisakarida  yang  diekstrak  dari  rumput  laut  yang  menjadi  salah  satu  bio- polimer  yang  paling  umum  digunakan  dalam  proses  enkapsulasi  probiotik  [9].  Keuntungan  dari alginat  diantaranya  tidak  toksik  dan  dapat  membentuk  matriks  gel  untuk  menangkap  mikroba  dalam larutan  CaCl 2 [10].  Mikrokapsul  alginat  berbentuk porous ,  sehingga  zat  aktif  didalamnya  dapat mengalami  kebocoran  ( leakage ).  Untuk  mencegah  keluarnya  zat  aktif  dalam  mikrokapsul  alginat maka  dapat  disalut  menggunakan  lapisan  luar  yang  tidak  mengandung  zat  aktif  [11].  Salah  satu polimer  alami  yang  dapat  menjadi  penyalut  dalam  mikrokapsul  alginat  adalah  kitosan.  Kitosan merupakan  jenis polimer  alami  yang dihasilkan dari proses deasetilasi kitin, bersumber dari cangkan hewan vertebrata [12].
Berdasarkan hal tersebut, maka perlu dilakukan pembuatan enkapsulasi probiotik Lactobacillus sp. menggunakan biopolimer Alginat 1% dan matriks Kitosan dengan konsetrasi 1,2%, 1,6%, dan 2% terhadap  waktu  dalam  simulasi  cairan  asam  lambung  dengan  metode  satu  tahap  (pencampuran langsung antara CaCl 2 dan Kitosan). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui viabilitas,  morfologi, bentuk dimensi Lactobacillus sp. yang telah menggunakan campuran biopolimer Alginat dan Kitosan pada simulasi cairan asam lambung dengan menggunakan SEM ( Scanning Electron Microscopy ), dan mengetahui gugus fungsi yang terkandung dalam enkapsulasi menggunakan FTIR.

## 2. Metode Penelitian

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium  Bioproses  dan  Laboratorium  Nanoteknologi  yang bertempat  di  Gedung  Loka  Penelitian  Teknologi  Bersih  (LPTB),  Lembaga  Ilmu  Pengetahuan Indonesia  (LIPI)  pada  tanggal  8  Februari  2020  –  27  Agustus  2020.    Pada  penelitian  ini  terdapat berbagai  rangkaian  proses,  yaitu    proses  enkapsulasi,  proses  peredaman  mikrokapsul  yang mengandung  probiotik  tanpa  simulasi  larutan  asam  lambung  dan  dalam  simulasi  larutan  asam lambung,  dan  proses  pengukuran  viabilitas  probiotik  yang  telah  terenkapsulasi.  Uraian  metode  yang digunakan sebagai berikut:
Prosedur Kerja 1. Preparasi Bakteri Lactobacillus sp.
Peremajaan bakteri Lactobacillus sp. pada media Agar dilakukan dengan cara menggoreskan satu hingga dua bulatan ose yang telah mengandung bakteri Lactobacillus sp. secara zigzag pada media MRS  Agar  miring  di  dalam  tabung  reaksi  steril.  Kemudian  tabung  media  ditutup  menggunakan kapas. Diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam didapatkan kultur stock [13]. 2. Preparasi proses Enkapsulasi
- Pembuatan Suspensi Bakteri Sebanyak  1-2  bulatan  ose  kultur stock Lactobacillus sp.  dimasukkan  ke  dalam  50  mL  MRS Broth,  lalu  diinkubasi  selama  24  jam  pada shaker  incubator dengan  kecepatan  120  rpm dengan suhu 30-37 o C [14].
- Pembuatan Larutan Kitosan
Pembuatan  larutan  kitosan  dibuat  dalam  tiga  konsentrasi,  yaitu  konsentrasi  1,2%, 1,6%, dan 2% dalam 100 mL asam asetat 1% [16].
- Pembuatan Larutan Natrium Alginat
Sebanyak  0,1  gram  natrium  alginat  ditimbang  kemudian  dilarutkan  dengan  aquadest  yang telah dihangatkan pada suhu 60 o C sebanyak 100 mL [14].
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
- Pembuatan Larutan CaCl 2 0,1M
Sebanyak  32  gram  CaCl 2 ditimbang  kemudian  dilarutkan  dengan  aquadest  sebanyak  1  L, setelah larut sempurna kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm selama 15 menit [14].
3. Proses Enkapsulasi
Proses  enkapsulasi  dilakukan  dengan  metode  ekstrusi  menggunakan  diameter  noozel  29,70 mm dengan Q = 1 mL/menit dan V = 0 kV. Diperoleh hasil  enkapsulasi berupa mikrokapsul dan ditampung dengan wadah berisi 125 mL larutan CaCl 2 0,1 M dan larutan kitosan dengan variasi konsentrasi 1,2%, 1,6%, 2% sebanyak 50 mL, kemudian diaduk selama 30 menit, jarak antara ujung eksuder dengan larutan ± 6 cm [14].
4. Perhitungan Lactobacillus sp. yang terenkapsulasi
Diambil  pada  setiap  seri  pengenceran  1000  µL  dan  di  pipet  ke  dalam  cawan  petri  lalu dituangkan MRS Agar ke dalam cawan petri tersebut lalu inkubasi selama 48 jam pada suhu 37 o C [17].
5. Peredaman mikrokapsul mengandung probiotik dalam simulasi larutan asam lambung sebanyak 0,2 gram NaCl dilarutkan di dalam 100 mL aquadest, kemudian diasamkan dengan HCl  0,5  M  hingga  pH  1,5  (20  tetes)  lalu  pipet  9  mL  larutan  dan  disimpan  ke  dalam  tabung ulir.
6. Uji Viabilitas Probiotik Hasil Enkapsulasi Manik  hasil  enkapsulasi  ditimbang  sebanyak  1  gram  dalam Laminar  Air  Flow (LAF)  lalu direndam  dalam  larutan  Na  sitrat  1%  sebanyak  9  mL  dalam  gelas  kimia  30  mL  dan  diaduk menggunakan magnetic  stirrer selama  ±  2  jam  pada  suhu  kamar  [19].  Pada  setiap pengenceran,  diambil  1  mL  larutan  dan  dimasukkan  ke  dalam  cawan  petri,  pada  tahap  ini dilakukan secara triplo. Setelah itu, tuangkan MRS Agar sebanyak 20 mL ke dalam masing- masing  cawan  petri  yang  sudah  berisi  campuran  larutan  mikrokapsul  dan  pepton  0,1%. Selanjutnya,  tahap  inkubasi,  cawan  petri  yang  berisi  media  dan  bakteri  diinkubasi  dalam inkubator dengan suhu 37 o C selama 48 jam. Kemudian dihitung jumlah koloni yang tumbuh dengan prinsip metode TPC [15].
7. Morfologi  mikrokapsul diketahui dengan pengujian Scanning Electron MicroscrophI (SEM) dan gugus fungsi yang terkadung dalam mikrokapsul diketahui dengan pengujian FTIR
3. Hasil dan Pembahasan
Bakteri Lactobacillus sp.  merupakan  genus  terbesar  dalam  bakteri  asam  laktat.  Termasuk  ke dalam  bakteri  gram  positif  yang  tumbuh  pada  pH  4,5-8,5,  katalase  negatif,  anaerobik  fakultatif,  dan heterofermentatif  fakultatif  terdapat  dalam yoghurt ,  keju,  dan  produk  olahan  susu  lainnya.  Memiliki karakteristik  diantaranya,  berbentuk  batang  dengan  panjang  2-4  µm  dengan  lebar  0,7-1,1  µm,  dan tidak berspora. Lactobacillus sp. mengalami pertumbuhan pada suhu 30-37 0 C [20]. Lactobacillus sp. tidak  bersifat  patogen  dalam  tubuh host yang  sehat  dan  dianggap  penting untuk mempertahankan kesehatan saluran cerna. Namun, bakteri ini tidak tahan dalam keadaan asam lambung,  sementara  bakteri  memberikan  manfaat  saat  mencapai  usus  dan  berkoloni  di  usus  dengan mengandung  ± 10 -6 -10 -7 CFU/g.  Maka  dilakukan  teknik  enkapsulasi  agar  bakteri  dapat  melewati lambung sehingga bermanfaat dalam usus [6][7].
Gambar  1 merupakan  hasil  SEM  dari  probiotik Lactobacillus  sp yang  belum  mengalami proses  enkapsulasi  dan  proses  peredaman  dalam  cairan  simulasi  asam  lambung,  menunjukan  bahwa Lactobacillus sp memiliki bentuk batang dengan  ujung persegi cenderung membentuk rantai. Ketika Lactobacillus sp.  dienkapsulasi,  harus  dipastikan  dua  kondisi  agar  enkapsulasi  berjalan  dengan optimal.  Yang  pertama,  lapisan  pelindung  probiotik  dapat  mempertahankan  kelangsungan  hidup bakteri  dalam  simulasi  cairan  asam  lambung,  dan  yang  kedua  probiotik  yang  terbungkus  dapat dilepaskan pada saat  simulasi cairan  usus  [21]. Enkapsulasi bertujuan  untuk menstabilkan  sel,  untuk meningkatkan kelangsungan dan stabilitas zat aktif selama di produksi, penyimpanan dan penanganan [21].  Dalam  enkapsulasi  yang  telah  dilakukan  menggunakan  metode  ekstrusi.  Metode  ini  dipilih karena  menggunakan  alat  yang  sederhana  berupa  jarum  suntik  dan  untuk  menghindari  suhu  ekstrim saat proses enkapsulasi yang dapat menyebabkan berkurangnya jumlah dan viabilitas bakteri probiotik [22].
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Gambar 1. Hasil SEM Lactobacillus sp. dengan perbesaran 10000x Sumber: Data penelitian, 2020
Proses enkapsulasi yang dilakukan terhadap bakteri probiotik kali ini menggunakan biopolimer alginat 1% dan kitosan dengan variasi 1,2%; 1,6%; dan 2% [23]. Alat  yang digunakan dalam proses enkapsulasi  yaitu electrospinning dengan  proses electrohydrodinamic . Electrohydrodinamic merupakan proses dari electrospraying yang mudah, fleksibel. Prinsip dari alat tersebut adalah larutan polimer  disemprotkan  dengan  mengaplikasikan  potensial  listrik  dengan  tegangan  tinggi  untuk memperoleh partikel dengan ukuran mikron, submikron atau rentang nano [24]. Tegangan listrik pada alat electrospinning berfungsi untuk menarik tetesan dari ujung needle menuju larutan CaCl 2 . Voltase yang digunakan pada proses  enkapsulasi  yaitu 0 kV tetesan  yang  keluar memakan  waktu  yang lama sesuai  dengan  settingan  pada  laju  alir  1  mL/  menit  dalam  volume  50  mL  sehingga  waktu  yang dibutuhkan  untuk  proses  pembuatan  mikrokapsul  selama  50  menit  sementara  diameter noozel yang digunakan ± 0,394 mm.
Mikrokapsul  yang  telah  terbentuk dimasukkan ke dalam plastik zipper dan disimpan di dalam lemari  pendingin  dengn  suhu  4 0 C  dengan  alasan  penggunaan  suhu  yang  rendah  dapat  menyebabkan penurunan tingkat reaksi kimia yang merugikan, seperti oksidasi asam lemak [25]. Mikrokapsul yang terbentuk  bulatan  gel  terjadi  karena  peredaman  tetesan  dari  alginat  ke  dalam  larutan  CaCl 2 dan kitosan. Ion kalsium dalam CaCl 2 akan mengikat silang polimer dan menggantikan ion natrium dalam polimer alginat, ion kalsium menempelkan satu sama lain pada banyak titik dalam polimer. Proses ini disebut dengan  tautan  silang dan menghasilkan bentuk  bulat yang tidak  larut  air. Setiap ion kalsium dapat berkaitan dengan dua rantai polimer alginat [26].
Tabel 1. Pemeriksaan organoleptik enkapsulasi Lactobacillus sp. menggunakan variasi konsentrasi matriks kitosan Konsentrasi Kitosan Organoleptis Jumlah mikrokapsul Bentuk Warna Bau 1,2% Bulat sempurna Putih Tidak berbau 37,3 g. 1,6% Bulat sempurna Putih Tidak berbau 33,4 g. 2% Bulat sempurna Putih Tidak berbau 25,8 g. Sumber: Data penelitian, 2020
Gambar 2. (a) Kitosan 1,2%, (b) Kitosan 1,6%, (c) Kitosan 2% Sumber: Data penelitian, 2020.
b a
c
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Gambar  2 menunjukkan  bahwa  organoleptis  dari  enkapsulasi  probiotik Lactobacillus sp yang  dihasilkan  dengan  metode  1  tahap  (larutan  CaCl 2 bersamaan  dengan  larutan  kitosan)  memiliki bentuk  bulat  dengan  permukaan  yang  halus,  berwarna  putih,  dan  tidak  berbau.  Mikrokapsul  yang dihasilkan  dari  setiap  konsentrasi  kitosan  berbeda-beda,  diantaranya  kitosan  1,2%  menghasilkan, mikrokapsul sebanyak 37,3 g, kitosan 1,6% menghasilkan mikrokapsul sebanyak 33,4 g, dan  kitosan 2%  menghasilkan  mikrokapsul  sebanyak  25,8  g.  Konsentrasi  kitosan  yang  semakin  kecil menyebabkan mikrokapsul yang dihasilkan  semakin banyak, hal ini disebabkan karena kitosan 1,2% memiliki  larutan  yang  tidak  terlalu  kental  dibandingkan  kitosan  1,6%  dan  2%.  Karakteristik mikrokapsul  yang dihasilkan ditentukan oleh jenis dan komposisi biopolimer yang digunakan dalam proses  enkapsulasi  dan  akan  mempengaruhi  diameter  serta  bentuk  mikrokapsul  yang  dihasilkan. Komposisi biopolimer juga mempengaruhi viabilitas probiotik yang dienkapsulasi.
Gambar 3. Reaksi pembentukan mikrokapsul
Sumber: Data penelitian, 2020.
Gambar  3 menunjukan  reaksi  pembentukan  mikrokapsul  yang  berbentuk  bulat,  tautan  silang ini menghasilkan padatan gel yang bersifat fleksibel dan lunak. Semakin lama perendaman maka akan menyebabkan  lebih  banyak  ikatan  silang  ion  kalsium  dengan  polimer  alginat  dan  menghasilkan tekstur  semakin  padat.  Kitosan  digunakan  sebagai  penambahan  lapisan  pelindung  pada  permukaan mikrokapsul sehingga meningkatkan kekuatan dan kestabilan mikrokapsul. Peningkatan stabilitas dan perlindungan  yang  efisien  pada  mikrokapsul  disebabkan  adanya  interaksi  ionik  yang  kuat  antara alginat  dengan  kitosan.  Ketika  mikrokapsul  disalut  menggunakan  kitosan  akan  menghasilkan kompleks  elektrolit.  Kompleks  polielektrolit  merupakan  kompleks  asosiasi  yang  terbentuk  antara poliion  dengan  muatan  yang  berlawanan  karena  adanya  interaksi  elektrostatik  antara  poliion bermuatan  tersebut.  Muatan  negatif  gugus  asam  karboksilat  dari  alginat  akan  berikatan  dengan muatan positif gugus amino dari kitosan secara ionik [27].
Pelapisan  mikrokapsul  menggunakan  alginat  dan  kitosan  dapat  mengurangi  porositas  alginat, mengurangi  kebocoran  ketika  mengenkapsulasi  bakteri,  dan  akan  stabil  pada  beberapa  rentang  pH. Pencampuran  kitosan  dengan  CaCl 2 mengakibatkan  mikrokapsul  yang  terbentuk  menjadi  lebih banyak  dibandingkan  dengan  menggunakan  metode  yang  tidak  dimodifikasi  dikarenakan  larutan CaCl 2 langsung  bercampur  dengan  larutan  kitosan.  Untuk  mengetahui  keberhasilan  dari  pembuatan enkapsulasi  probiotik Lactobacillus sp.  menggunakan  metode  1  tahap  (larutan  CaCl 2 dicampurkan dengan  larutan  kitosan)  maka  dilakukan  uji  viabilitas  dengan  metode  TPC  ( Total  Plate  Count ). Metode ini digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada sampel yang akan diuji [28].
Larutan natrium alginat dan lactobacillus sp.
Ion  kalsium  CaCl 2 menggantikan  ion natrium pada alginat
Mikrokapsul yang dilapisi alginat dan kitosan
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Larutan yang digunakan  untuk pengenceran  yaitu larutan  Pepton 0,1% yang berfungsi sebagai sumber  nitrogen  pada  media  pembiakan  mikroorganisme  untuk  tumbuh.  Sedangkan  natrium  sitrat yang  digunakan  untuk  merendam  mikrokapsul  berfungsi  untuk  membuka  penyalutan  bakteri, sehingga  dapat  dijadikan  sebagai  pembuktian  apakah  adanya  penyalutan  dapat  memperlambat  atau dapat  mempertahankan  jumlah  koloni  bakteri  yang  seharusnya  tetap  saat  berada  dalam  kondisi ekstrim.
Tabel 2. Hasil perhitungan Lactobacillus sp. hasil enkapsulasi matrik Kitosan Konsentrasi Kitosan Free cell Lactobacillus sp. (cfu/mL) Lactobacillus sp. hasil enkapsulasi (cfu/g) 1,2% 5x10 10 5,6x10 9 1,6% 5x10 10 3x10 10 2% 5x10 10 7x10 10
Sumber: Data penelitian, 2020.
Gambar 4 menunjukkan  konsentrasi kitosan 1,6% memiliki  nilai persentase yield yang tinggi dibandingkan  dengan  kitosan  (1,2%).  Maka  dapat  dikatakan  bahwa  konsentrasi  kitosan  1,6%  yang paling  optimum  karena  memiliki  % yield yang  tinggi,  semakin  tinggi  % yield maka  semakin  tinggi juga jumlah sel bakteri yang bertahan dan terenkapsulasi.
Gambar 4. Grafik nilai persen yield dari berbagai variasi konsentrasi enkapsulasi Lactobacillus sp. Sumber: Data penelitian, 2020.
Pengujian viabilitas mikrokapsul hasil enkapsulasi dengan matrik kitosan dalam simulasi cairan asam lambung dan usus halus dilakukan variasi terhadap waktu dan konsentrasi cairan asam lambung. Waktu inkubasi mikrokapsul di dalam  simulasi cairan asam lambung berlangsung selama  1, 60, dan 120 menit. Sementara, pH yang digunakan untuk simulasi cairan asam lambung yaitu pH 1,2 dan pH 3. Setelah mikrokapsul melalui proses inkubasi selama 1, 60, dan 120 menit pada larutan simulasi pH 1,2  dan  pH  3,  mikrokapsul  direndam  dalam  larutan  pepton  sebagai  sumber  nitrogen  untuk  bakteri, selanjutnya direndam kembali dalam simulasi larutan garam empedu  sambil di stirrer sampai hancur, dan disuspensikan ke dalam larutan pepton 0,1% dan dilakukan pengenceran bertingkat.
Tabel 3. Jumlah koloni bakteri pada free cell dan koloni bakteri setelah proses enkapsulasi diinkubasi alam simulasi cairan asam lambung
Konsentrasi Kitosan pH 3 pH 1,2 Free cell (cfu/mL) Mikrokapsul (cfu/g) Free cell (cfu/mL) Mikrokapsul (cfu/g) 1’ 60’ 120’ 1’ 60’ 120’ 1’ 60’ 120’ 1’  60’  120’ 1,2% 7x10 9 1x10 6 2x10 5 3,6x10 7 3x10 5 1x10 5 0 0 0 0 0 0 1,6% 7x10 9 1x10 6 2x10 5 2x10 10 2x10 9 1x10 8 0 0 0 0 0 0 2% 7x10 9 1x10 6 2x10 5 4x10 9 3x10 9 1x10 9 0 0 0 0 0 0 Sumber: Data penelitian, 2020. 84% 86% 88% 90% 92% 94% 96% 98% Alginat + kitosan 1,2% Alginat + kitosan 1,6% Alginat + kitosan 2% 91,29% 96,79% 89%
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Gambar  5 menunjukan  bahwa  survivabilitas  dari  variasi  konsentrasi  kitosan  2%  merupakan konsentrasi  yang  paling  optimum  karena  pada  proses  perendaman  enkapsulasi  dalam  simulasi  asam lambung pada waktu 120 menit masih tidak terjadi penurunan yang signifikan dan masih dalam range 90%, hal  tersebut  sesuai  dengan  tujuan  dilakukannya  enkapsulasi  untuk  melindungi  bakteri  dari faktor-faktor lingkungan yang berbahaya bagi bakteri [6].
Gambar 5. Grafik survivabilitas dari  variasi konsentrasi enkapsulasi Lactobacillus sp. Sumber: Data penelitian, 2020.
77,5% 56,2% 51,3% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 1' 60' 120' Survivabilitas  enkapsulasi  Kitosan 1,2% (pH 3) Waktu inkubasi  (menit) S ur v iv abi li ta s (%) 98,3% 88,8% 76,3% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 1' 60' 120' Survivabilitas  enkapsulasi  Kitosan 1,6% (pH 3) Waktu inkubasi  (menit) Su rv iv ab ili tas (%) 96% 94,7% 90% 86% 88% 90% 92% 94% 96% 98% 1' 60' 120' Survivabilitas  enkapsulasi  Kitosan 2% (pH 3) Waktu inkubasi  (menit) S ur v iv abi li ta s (%)
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Setelah  pengujian  didapati  bahwa  mikrokapsul  hanya  tumbuh  dalam  simulasi  cairan  asam lambung pH 3, sedangkan pada pH 1,2 tidak terjadi pertumbuhan bakteri sama sekali. Lamanya waktu inkubasi  yang  dilakukan  dalam  simulasi  cairan  asam  lambung  pH  3  memiliki  hasil  penurunan  yang tidak  signifikan  atau  sangat  kecil.  Namun,  pada  konsentrasi  kitosan  1,2%  dengan  nilai  koloni  pada waktu 120 menit yaitu 1 x 10 5 tidak memenuhi range standar nilai minimum oleh FAO yaitu 10 6 -10 7 cfu ( colony forming units ) hal  ini disebabkan karena konsentrasi  kitosan 1,2% tidak optimum dalam perlindungan enkapsulasi [6].
Pengujian Scanning  Electron  Microscopy (SEM)  dilakukan  untuk  mengetahui  bentuk  dan morfologi dali Lactobacillus sp. hasil enkapsulasi tanpa simulasi cairan asam lambung sebagai kontrol dibandingkan  dengan  hasil  enkapsulasi  yang  telah  direndam  dalam  simulasi  cairan  asam  lambung pada pH 1,2 dan 3 dengan  waktu inkubasi 120 menit. Uji foto SEM dilakukan pada konsentrasi 2% yang merupakan konsentrasi optimum karena penurunan viabilitas yang terjadi sangat sedikit.
Gambar 6. Uji Foto SEM mikrokapsul hasil enkapsulasi pada pembesaran 80x dan 50x Sumber: Penelitian, 2020.
Keterangan: a)Mikrokapsul tanpa diinkubasi dalam simulasi cairan asam lambung, b)Mikrokapsul diinkubasi 120 menit dalam simulasi cairan asam lambung pH 3, dan c)Mikrokapsul diinkubasi 120 menit dalam simulasi cairan asam lambung pH 1,2.
Berdasarkan Gambar  6 dari  hasil  analisa  SEM  diketahui  bahwa  ukuran  mikrokapsul Lactobacillus  sp dengan  kitosan  2%  memiliki  ukuran  yang  berbeda-beda,  untuk  mikrokapsul  tanpa simulasi cairan asam lambung dengan pembesaran 80x memiliki diameter 818,8µm, sementara untuk simulasi  cairan  asam lambung pada pH 3 dengan pembesaran  50x memiliki diameter 297,4 µm, dan untuk simulasi cairan asam lambung pada pH 1,2 dengan pembesaran 50x memiliki diameter 406-550 µm. Hasil SEM pada pH 1,2 menunjukkan mikrokapsul sudah tidak berbentuk, ini disebabkan karena semakin tinggi asam maka mikrokapsul akan semakin larut. Ukuran mikrokapsul yang lebih besar (2- 4 mm) dengan teknik ekstrusi pada penelitian Muthukumarasamy dkk (2006), dapat lebih melindungi bakteri Lactobacillus reuteri dibandingkan dengan ukuran mikrokapsul 20-1000 µm.
Hasil  SEM  pada  diameter  mikrokapsul  tidak  sesuai  dengan  teori,  mungkin  hal  ini  disebabkan adanya  pengaruh  pencampuran  CaCl 2 dengan  kitosan  2%  yang  menyebabkan  diameternya  kecil. Sedangkan  bila  diamati  pada  perbesaran  yang  lebih  besar  yaitu  pada  5000x  yang  terlihat  pada Gambar  7 bahwa  bahan  pengapsul  mengalami  pengerutan  diakibatkan  oleh  simulasi  cairan  asam lambung, sehingga muncul ikatan hidrogen yang lebih kuat dan struktur dari bahan pengapsul menjadi lebih rapat. Pada mikrokapsul tanpa simulasi cairan asam lambung  masih terdapat rongga, sementara pada  simulasi  cairan  asam  lambung  pH  3  mikrokapsul  sudah  mulai  tidak  melindungi  lagi,  dan  pada simulasi  cairan  asam  lambung  pada  pH  1,2  mikrokpasul  sudah  tidak  melindungi  lagi  hal  ini disebabkan  karena  waktu  inkubasi  yang  lama  dan  pH  yang  tinggi  menyebabkan  mikrokapsul  tidak stabil  lagi.    Hal  ini  sesuai  dengan  uji  viabilitas  bakteri  hasil  enkapsulasi  pada  simulasi  cairan  asam lambung  dengan  pH  1,2  bahwa  tidak  didapati  pertumbuhan  koloni  bakteri  pada  media  MRS  Agar karena bakteri sudah dalam keadaan bebas tidak ada lapisan yang melindunginya dari paparan kondisi ekstrim.
a b
c
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Gambar 7. Uji foto SEM mikrokapsul hasil enkapsulasi pada pembesaran 5000x Sumber: Data penelitian, 2020.
Keterangan: a) Mikrokapsul tanpa diinkubasi dalam simulasi cairan asam lambung, b) Mikrokapsul diinkubasi 120 menit dalam simulasi cairan asam lambung pH 3, dan c) Mikrokapsul diinkubasi 120 menit dalam simulasi cairan asam lambung pH 1,2.
Gambar 8. Spektrum EDS enkapsulasi Sumber: Data penelitian, 2020.
Keterangan: a) Mikrokapsul tanpa diinkubasi dalam simulasi cairan asam lambung, b) Mikrokapsul diinkubasi 120 menit dalam simulasi cairan asam lambung pH 3, dan c) Mikrokapsul diinkubasi 120 menit dalam simulasi cairan asam lambung pH 1,2.
Spektrum EDS memberikan informasi mengenai komposisi unsur-unsur yang terkandung pada enkapsulasi  probiotik Lactobacillus sp.  tanpa  menggunakan  simulasi  cairan  asam  lambung  dan dengan  menggunakan  simulasi  cairan  asam  lambung  pada  pH  3  dan  pH  1,2  secara  kualitatif  serta untuk  mengetahui  pola  sebaran  bahan  yang  digunakan  dalam  proses  enkapsulasi. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan secara FTIR untuk melihat gugus fungsi pada enkapsulasi yang menggunakan biopolimer  alginat  dan  kitosan  dengan  konsentrasi  2%.  Rentang  waktu  120  menit  pada  mikrokapsul tanpa  menggunakan  simulasi  cairan  asam  lambung  dengan  menggunakan  simulasi  cairan  asam lambung pada pH 3 dan pH 1,2. Analisis FTIR bertujuan untuk melihat apakah dalam keadaan asam mempengaruhi gugus fungsi.
b a b c a c
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Tabel 4. Presentasi bahan yang terkandung dalam enkapsulasi Element Mikrokapsul tanpa simulasi asam lambung Mikrokaspsul pH 3 Mikrokapsul pH 1,2 Wt% Wt% Sigma Wt% Wt% Sigma Wt% Wt% Sigma C 60,12 0,42 24,69 1,35 26,34 1,36 O 33,35 0,42 13,69 0,42 12,70 0,44 Na - - 25,58 0,50 23,79 0,48 Cl 3,40 0,08 34,98 0,66 37,17 0,72 Ca 3,13 0,09 1,07 0,09 - - Total 100 100 100 Sumber: Data penelitian, 2020.
Gambar 9. Spektrum FTIR Sumber: Data penelitian, 2020.
Keterangan: a) Mikrokapsul tanpa diinkubasi dalam simulasi cairan asam lambung, b) Mikrokapsul diinkubasi 120 menit dalam simulasi cairan asam lambung pH 3, dan c) Mikrokapsul diinkubasi 120 menit dalam simulasi cairan asam lambung pH 1,2.
a
b
c
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Gambar  9 menunjukan  bahwa  kitosan  dan  alginat  mempunyai  kemiripan  spektra  dalam analisis  gugus  fungsional  dari  IR,  karena  kitosan  dan  alginat  memiliki  gugus  fungsi  yang  hampir sama.  Gugus  fungsional  pada  mikrokapsul  tanpa  simulasi  cairan  asam  lambung  menunjukan keberadaan gugus –NH 2 dan –OH dari kitosan ditunjukkan oleh serapan bilangan gelombang 3332,10 cm -1 , sementara serapan pada bilangan gelombang 1633,39 menunjukkan keberadaan gugus C=O dari alginat,  dan  keberadaan  C-O  ester  ditunjukkan  oleh  dibilangan  gelombang  1032,31  cm -1 .Gugus  C-O muncul pada bilangan gelombang 1032,31 cm -1 dengan intensitas yang rendah artinya gugus C-O dari alginat telah banyak yang berikatan dengan Ca 2+ sebagai pengikat silang gugus –COO. Serapan pada bilangan gelombang 1417,36 cm -1 menunjukkan terbentuknya garam karboksilat, artinya ada interaksi gugus –NH 2 kitosan dan –COO alginat yaitu interaksi kompleks polielektrolit [29]. Gugus fungsional pada mikrokapsul dengan pH 3 dan pH 1,2 hasilnya tidak terlalu jauh dengan hasil FTIR mikrokapsul tanpa simulasi cairan asam lambung.

## 4. Kesimpulan
Kitosan dengan konsentrasi 1,2%;1,6% dan 2% dapat digunakan sebagai matriks dalam proses enkapsulasi  bakteri Lactobacillus  sp dengan  nilai  viabilitas  pada  waktu  120  menit  setiap  variasi konsentrasi  mendapatkan  masing-masing  nilai  1x10 5 cfu/g;  1x10 8 cfu/g  dan  1x10 9 cfu/g.  Setelah dilakukan uji viabilitas probiotik terenkapsulasi dalam simulasi cairan asam lambung pada pH 1,2 dan pH 3 dengan waktu inkubasi 1 menit, 60 menit, dan 120 menit, didapatkan konsentrasi penyalut yang dapat  mempertahankan  viabilitas  dalam  enkapsulasi  adalah  kitosan  2%  dengan  viabilitas  berturut- turut 1x10 9 cfu/g; 4x10 9 cfu/g; 3x10 9 cfu/g; dan 1x10 9 cfu/g. Hasil yang diperoleh dari  uji  foto SEM pada mikrokapsul dengan konsentrasi kitosan 2% tanpa diinkubasi dalam larutan simulasi cairan asam lambung dan diinkubasi dalam larutan simulasi cairan asam lambung pada pH 1,2 dan pH 3 diameter yang  diperoleh  297,4  µm  sampai  818,8µm  dengan  pembesaran  50x  sampai  80x.  Semakin  asam kondisi  lingkungan  maka  semakin  terbuka  bahan  pengapsul,  sehingga  mengakibatkan  bakteri  keluar dari mikrokapsul .

## 5. Daftar Pustaka
[1] Food and Agriculture Organisation of the United Nations and World Health Organization, Health and  Nutrition  Properties  of  Probiotics  in  Food  including  Powder  Milk  with  Live  Lactic  Acid Bacteria , Report of a joint FAO/WHO Expert Cpncultation on Evaluation of Health and Nutrion Properties of Probiotics in  Food including Powder Milk  with  Live Lactic  Acid Bacteria.  World Health Organization, 2011.
[2] Simadibrata,  Marcellus.  2011. Probiotik-Peranannya  Dalam  Dunia  Medis .  Jakarta  :  Divisi Gastroenterologi  Departemen  Ilmu  Penyakit  Dalam  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Indonesia RS. Cipto Mangunkusumo Indonesia.
[3] Figueroa-Gonzales, Ivonne, G. Quijano, G. Ramirez, “ Probiotics and Prebiotics-Perspective and Challenges ,” J. Sci Food Agric , Vol. 91: 1341-1348, 2011.
[4] Mandal,  S.,  A.  K.  Puniya.,  K.  Singh,  “Effect  of  alginate  concentration  on  surival  of mivroencapsulated Lactobacillus casei NCDC-298,” Int. Dairy J.,, 16, 1190 – 1195, 2005.
[5] M.D.  Piano,  “Is  microencapsulation  the  future  of  probiotic  preparation?  The  increased  officacy of gastro-protected probiotics,” Gut Microbes . 2:2, 120-123, 2011.
[6] M, Firdaus, Setijawati D, Kartikaningsih, “ The Effect of Lactobacillus Acidophilus Microcapsule Which Encapsulated by Kappa Caragenan  Toward In Vivo Functional Test ,” Research Journal of Life Science , E-ISSN: 2355-9926, Vol. 1 (1), 2014. http://rjls.ub.ac.id
[7] Carranza,  P.  Hernández,  A.  López-Malo,  Maria-Teresa  Jimėnez-Munguia,  “Microencapsulation Quality  and  Efficiency  of  Lactobacillus  casei  by  Spray  Drying  Using  Maltodextrin  and Vegetable Extracts,” J. of Food Research , Vol. 3 (1), ISSN 1972-0887 E-ISSN 1927-0895, 2014.
[8] Wu, Low Melt Encapsulation with High Laurated Canola Oil , US Patent 6,153,326, 2000.
[9] Rokka,  Susanna,  P.  Rantamaki,  “ Protecting  Probiotic  Bacteria  by  Mircoencapsulation: Challenges of Industrial Applications ,” Eur Food Res Technol , Vol. 231:1-12, 2010.
[10] Cook MT, “Layer-by-layer  coating of alginate matrices with  chitosan-alginate for the improved survival  and  targeted  delivery  of  probiotic  bacteria  after  oral  administration,” J.  Mater  Chem , B.1(1):52–60, 2013.
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
[11] Ayuningtyas,  Wildana.  2015. Ketahanan  Bakteri  Probiotik  Bifidobacterium  longum  BF-1  yang dienkapsulasi  Nano  Alginat  terhadap  Cairan  Lambung  dan  Usus  Halus  Simulasi. Bogor: Departemen Gizi Masyarakat Fakultas Ekologi Manusia Institus Pertanian Bogor.
[12] Pradikaningrum,  Henny.  2015. Uji  Viabilitas  Mikroenkapsulasi  Lactobacillus  casei menggunakan  Matrik  Kitosan .  Jakarta:  Program  Studi  Farmasi  Fakultas  Kedokteran  dan  Ilmu Kesehatan Jakarta.
[13] Kholisoh G. 2016. Uji Viabilitas Enkapsulasi Lactobacillus casei Menggunakan Matriks  Kappa Karagenan  Uji  Viabilitas  Enkapsulasi Lactobacillus  casei .  Jakarta:  UIN  Syarif  Hidayatullah;  p. 7–8.
[14] Li,  X,  Y.,  Chen,  X,  G.,  Cha,  D,  S.,  Park,  H,  J.,  Sun,  Z,  W,  “Preparation  of alginate/chitosan/carboxymethyl  chitosan  complex  microcapsules and  application  in Lactobacillus casei ATCC 39,” J. of Carbohydrate Polymers , 83: 1479-1485, 2011.
[15] Woraharn, Sasimar, C. Chaiyasut, B. Sirithunyalug, J. Sirithunyalug, “Survival Enhancement of Probiotic Lactobacillus plantarum CMU-FP002 by Granulation and Encapsulation  Techniques,” African J. of Microbiology Research , Vol. 4(20) pp. 2086-2093, 18 October, 2010. ISSN 1996- 0808 ©2010 Academic Journals. http://www.academicjournals.org/ajmr.
[16] Marzuki,  Ismail.  2012. Pelepasan  Terkendali  Kalium  Klorida  dalam  Mikrosfer  Kitosan  dengan Metode Tautan Silang . Skripsi. Universitas Indonesia.
[17] N.  Benderska,  S.  Chakilam,  M.  Hugle,  J.  Ivanovska,  M.  Gandesiri,  L.J.  Schulze,  “Apoptosis signalling  activated by TNF in  the lower gastrointestinal tract-riview,” Current Pgarmaceutical Biotecnology , 2248-2258, 2012.
[18] O.  Sandoval-Castilla,  C.  Lobato-Calleros,  H.  S.  Garcia-Galindo,  J.  Alvarez-Ramirez,  E.  J. Vernon-Carter,  “Textural  properties  of  alginate-pectin  beads  and  survivability  of  entrapped Lb.casei in Simulated Gastrointestinal Conditions and In Yoghurt,” Food Research International, vol. 43 (1), 111-117, 2010.
[19] Benderska,  N.,  Chakilam,  S.,  Hugle,  M.,  Ivanovska,  J.,  Gandesiri,  M.  dan  Schulze  L.J.  (2012). Apoptosis  signalling  activated  by  TNF  in  the  lower  gastrointestinal  tract-riview. Current Pgarmaceutical Biotecnology . 2248-2258.
[20] Serna-cock L, Vallejo-castillo V. 2013. Probiotic Encapsulation
[21] Gbassi  K,  and  Thierry  Vandamme.  2012. Probiotic  Encapsulation  Technology:  from Microencapsulation to Release into the Gut . ISSN 1999-4923.
www.mdpi.com/journal/pharmaceutics
[22] Heidebach,  T.,  Petra  F.,  Ulrich.  K.  2010.  Influence  of  casein-based  mircroencapsulation  on freeze-drying and strorage of probiotic cells. Journal of Food Engineering. 98, 309-316
[23] I.  Marzuki,  “Pelepasan  Terkendali  Kalium  Klorida  dalam  Mikrosfer  Kitosan  dengan  Metode Tautan Silang,” Skripsi , Universitas Indonesia, 2012
[24] J.A.  Bhushani,  “Electrospinning  and  electrospraying  techniques :  Potential  food  based applications,” Trends Food Sci Technol [Internet], 2016, Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.tifs.`2014.03.004
[25] T.  Heidebach,  F.  Petra,  K.  Ulrich,  “Influence  of  casein-based  mircroencapsulation  on  freeze- drying and strorage of probiotic cells,” J. of Food Engineering , 98, 309-316, 2010.
[26] L.  Serna-cock,  V.  E.  Vallejo-castillo,  “Probiotic  Encapsulation,” African  J.  of  Microbiology Research , 7(40):4743, 2013.
[27] T.  Pawestrisiwi,  “Mikroenkapsulasi  Double  Coating  Menggunakan  Natrium  Alginat  dan Kitosan,” Skripsi ,  Universitas Indonesia, Depok, 2011.
[28] Heidebach,  T.,  Petra  F.,  Ulrich.  K.  2010.  Influence  of  casein-based  mircroencapsulation  on freeze-drying and strorage of probiotic cells. Journal of Food Engineering. 98, 309-316P.F.
[29] Umawiranda,  S.  E.  Cahyaningrum,  “Enkapsulasi  Pirazinamid  Menggunakan  Alginat  Dan Kitosan,” J. of Chemistry , UNESA, Vol. 3 (3), 2014.