## ISOLASI DAN UJI ANTIBAKTERI DARI ISOLAT BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Callyspongia aerizusa

## SERTA IDENTIFIKASI SECARA BIOKIMIA
Angelika Gratia Liempepas 1) , Widya Astuty Lolo 1) , Paulina Yamlean 1)

## 1)Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado

## ABSTRACT
Sponge Callyspongia aerizusa contain potential bioactive compound that can be utilized in the health sector. Extract of sea sponge Callyspongia aerizusa, can hamper the growth of Salmonella typhi bacteria, Streptococcus pyogenes, Shigella and Staphylococcus epidermidis. The aim of this study was to test  the  antibacterial  activity  against  Escherichia  coli  and  Staphylococcus  aureus  bacteria  and  identify the  type  of  symbionic  bacteria  of  Callyspongia  aerizusa  sponge  based  on  their  physiological  and biochemical  characteristics.  The  method  of  testing  the  antibacterial  activity  was  agar  diffusion  method (Kirby and Baurer diffusion disc). There were three bacterial isolates namely T 1 , T 2 , and T 3 isolates. The result showed that T 1 , T 2 , and T 3 bacterial isolates had antibacterial activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus test bacteria. Based on the biochemical test, T 2 bacterial isolates were identified as Bronchothrix bacteria and T 1 and T 3 bacterial identified as Desulfotomaculum.
Keywords: Callyspongia aerizusa, Antibacterial activity, symbiont bacteria, Biochemical Identification

## ABSTRAK
Spons Callyspongia  aerizusa memiliki  kandungan  senyawa  bioaktif  potensial  yang  dapat dimanfaatkan  dibidang  kesehatan.  Ekstrak  spons  laut Callyspongia  aerizusa dapat  menghambat pertumbuhan bakteri Salmonella typhi , Streptococcus pyogenes, Shigella dan Staphylococcus epidermidis . Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menguji  aktivitas  antibakteri  dari  bakteri  simbion  spons Callyspongia aerizusa terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcuc aureus dan mengidentifikasi jenis bakteri simbion  spons Callyspongia  aerizusa berdasarkan  karakteristik  fisiologis  dan  biokimianya.  Metode pengujian  aktivitas  antibakteri  yang  digunakan  yaitu  metode  difusi  agar  ( disc  diffusion  Kirby  and Baurer ). Terdapat tiga isolat bakteri yaitu isolat T 1 , T 2 , dan T 3 . Hasil penelitian menunjukan bahwa isolat bakteri  T 1 ,  T 2 ,  dan  T 3 memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap  bakteri  uji Escherichia  coli dan Staphylococcuc aureus. Berdasarkan uji biokima, isolat bakteri T 2 diduga sebagai bakteri Brochothrix dan isolat bakteri T 1 dan T 3 diduga sebagai bakteri Desulfotomaculum.
Kata kunci: Callyspongia aerizusa , Aktivitas antibakteri, Bakteri simbion, Identifikasi Biokimia

## PENDAHULUAN
Spons merupakan salah satu komponen  biota  penyusun  terumbu  karang yang  mempunyai  potensi  bioaktif  yang belum banyak dimanfaatkan. Hewan laut ini mengandung  senyawa  aktif  yang  presentase keaktifannya  lebih  besar  dibandingkan dengan  senyawa-senyawa  yang  dihasilkan oleh  tumbuhan  darat  (Muniarsih  dan Rachmaniar, 1999).
Komunitas  mikroba  yang  beragam dan  berjumlah  besar  pada  spons  diduga merupakan  sumber  dari  berbagai  senyawa bioaktif  tersebut.  Isolasi  bakteri  yang bersimbiosis dengan spons, dan karakterisasi senyawa  bioaktif  yang  dihasilkan  bakteri tersebut  merupakan  strategi  yang  dapat digunakan  dalam  memproduksi  berbagai senyawa  yang  memiliki  potensi  terapi antibakteri  dalam  jumlah  besar  (Proksch et al ., 2003).
Pengambilan senyawa bioaktif secara  langsung  dari  tanamannya  akan membutuhkan banyak biomassa atau bagian dari tanaman tersebut, maka untuk mengefisienkan  cara  memperoleh  senyawa bioaktif tersebut, digunakan mikroba simbion  spesifik  yang  diperoleh  dari  bagian dalam  tanaman  yang  diharapkan  mampu menghasilkan  sejumlah  senyawa  bioaktif yang  dibutuhkan  tanpa  harus  mengekstrak dari tanamannya (Tan dan Zou, 2001).
Penelitian  yang  dilakukan  oleh Manggalea (2015) menyatakan jamur endosimbion  yang  diisolasi  dari  spons  laut Callyspongia sp . memiliki aktivitas menghambat  pertumbuhan  dari  bakteri Pseudomonas  aeruginosa dan Eschericia coli.
Bakteri simbion yang banyak terdapat pada  tumbuhan  dilakukan  untuk  menambah atau memperkaya koleksi mikroba.
Selanjutnya mikroba tersebut perlu diidentifikasi untuk mengetahui sifat pertumbuhan  dan  jenisnya,  sehingga  lebih lanjut dapat dimanfaatkan di bidang kesehatan (Noverita et al ., 2009).
Penelitian ini bertujuan untuk Menguji aktivitas antibakteri bakteri simbion  yang  diisolasi  dari  spons  terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcuc aureus dan  mengidentifikasi  jenis  bakteri simbion  yang  memiliki  daya  antibakteri berdasarkan  karakteristik  fisiologis  dan biokimianya.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan Oktober 2018 - Maret 2019 di Laboratorium Taksonomi Jurusan Biologi dan Laboratorium Mikrobiologi Farmasi
Program  Studi  Farmasi  Universitas  Sam Ratulangi.

## Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian  ini  yaitu  masker,  sarung  tangan, gunting, zipper bag , wadah, pisau, erlenmeyer (Iwaki  ST  Pyrex), timbangan digital (ADAM) ,  gelas  ukur (Iwaki  ST Pyrex), gelas kimia (Iwaki ST Pyrex) , cawan petri (Iwaki  ST  Pyrex), autoklaf  (ALP), pinset,  lumpang  dan  alu,  pembakar  spritus, pipet  tetes,  batang  pengaduk, laminar  air flow  (Biotek) ,  rak  tabung  reaksi,  tabung reaksi,  lemari  pendingin ,  incubator , rotary shaker incubator (Infors HT) , cakram (paper disc) ,  mikropipet  ( Ecopipette), jarum  ose,
jas lab, aluminium foil , l-glass , plastik wrap , ketas  label,  spidol  permanen,  tissue,  kapas, jangka  sorong,  mikroskop  cahaya,  kaca objek.

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  yaitu spons Callyspongia  aerizusa ,  bakteri  uji Staphylococcus  aureus , Escherichia  coli , aquadest, Nutrient    Agar (NA), Nutrient Broth (NB),  Kristal  violet,  safranin,  lugol, alcohol,  minyak  imersi,  larutan covac , simmon’s  sitrat  agar (SCA), triple  sugar iron  agar (TSIA), lysine  iron  agar (LIA), hydrogen  peroksida ,  NaCl  0,9%,  tablet antibiotik tetrasiklin.

## Isolasi Bakteri Simbion
Penanaman  bakteri  yang  bersimbiosis dengan  spons  dilakukan  dengan  metode sebaran menurut Madigan (2012). Sebanyak 1  g  sampel  spons Callyspongia  aerizusa dicuci, dihancurkan kemudian digerus menggunakan  lumpang  dan  alu  sampai halus.  Selanjutnya,  1  g  sampel  yang  telah halus  dimasukkan  ke  dalam  9  mL  NaCl sehingga  diperoleh  pengenceran  sampel sebesar 10 0 . Pengenceran bertingkat selanjutnya  dilakukan  untuk  seri    10 -1 ,  10 -2 dan  10 -3 .  Masing-masing  seri  kemudian diambil  100  µL  dan  disebarkan  ke  dalam cawan petri steril yang berisi media NA dan diinkubasi  dalam  inkubator  pada  suhu  37- 39ºC  selama  1x24  jam.  Koloni  bakteri simbion  yang  tumbuh  diamati  warna, bentuk,  elevasi,  tepian  dan  ukurannya. Koloni-  koloni  bakteri  dipisahkan  dengan jarum ose berdasarkan perbedaan
karakteristik makroskopik
dan mikroskopiknya pada media NA baru dalam cawan  petri  dan  diinkubasi  pada  suhu  37-
39°C selama 24 jam. Isolat yang telah murni kemudian  dipindahkan  dan  disimpan  pada media  NA  miring  untuk  dijadikan  stok. Seluruh  rangkaian  penelitian  dilakukan secara  aseptik  dengan  dalam laminar  air flow (LAF)  untuk  mencegah  kontaminasi dari mikroorganisme lain.

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Bakteri simbion disiapkan dengan cara satu ose isolat bakteri simbion diinokulasikan  ke  dalam  10  mL  media  cair NB  dan  diinkubasi  selama  24  jam  dalam rotary shaker dengan suhu 37-39ºC. Masing- masing koloni bakteri simbion dalam media cair  NB  kemudian  dipindahkan  ke  dalam tabung  sentrifuge  dan  disentrifugasi  dengan kecepatan  3000  rpm  selama  30  menit. Supernatan yang terbentuk kemudian diambil. Metode yang digunakan dalam penelitian  ini  yaitu  metode  difusi  agar  ( disc diffusion Kirby and Bauer ) dengan menggunakan  aquades  sebagai  kontrol negatif  dan  antibiotik  tetrasiklin  sebagai kontrol  positif  yang  dapat  menghambat sintesis  protein  bakteri  uji.  Pada  pengujian aktivitas antibakteri ini, cakram ( paper disc ) yang  digunakan  berukuran  6  mm  dengan daya serap 50 μL tiap cakram. Sampel yang telah  ditentukan  konsentrasinya  ditotolkan pada masing-masing cakram dengan menggunakan mikropipet. Ambil sebanyak 100
μL staphylococcus  aureus dan  echericia  coli, dipipet dan diletakkan pada media NA yang telah mengeras. Masing-masing cawan petri diberi  label  dan  nomor  sampel  yang  sesuai. Letakkan kertas cakram yang telah ditotolkan  sampel  spons  diletakkan  dengan
pinset  kedalam  cawan  petri  lalu  diinkubasi selama 24 jam
Identifikasi  Bakteri  Secara  Morfologi,

## Fisiologi dan Biokimia
Uji  morfologi  dilakukan  dengan pewarnaan  Gram,  sedangkan  uji  fisiologi dilakukan  dengan  uji  motilitas.  Identifikasi bakteri secara biokimia dilakukan dengan uji H2S,  uji  fermentasi  karbohidrat,  uji  sitrat, uji lisin, uji indol dan uji katalase.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Determinasi Sampel
Determinasi
sampel spons
Callyspongia  aerizusa bertujuan  untuk mengetahui  bahwa  sampel  yang  diambil tepat  dan  mengidentifikasi  bagian  demi bagian  dari  sampel.  Determinasi  sampel merupakan  proses  dalam  menentukan  nama /  jenis  sampel  secara  spesifik.  Determinasi dilakukan di Program Studi Biologi Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam Universitas  Sam  Ratulangi.  Hasil  dari
identifikasi  sampel  menunjukkan  bahwa jenis spons yang hendak diteliti adalah spons Callyspongia aerizusa.

## Uji Aktivitas Antibakteri Spons
Hasil  uji  daya  antibakteri  yang diperoleh  menunjukkan  bahwa  diameter zona  hambat  yang  terbentuk  dari  ketiga isolat  bakteri  simbion  spons Callyspongia aerizusa terhadap  bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia  coli dikategorikan sedang.  Hal  ini  menujukkan  bahwa  isolat bakteri simbion spons Callyspongia aerizusa memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif.
Penelitian  mengenai  daya  hambat  dari ekstrak  spons  laut Callyspongia  sp .  sudah pernah dilakukan sebelumnya pada penelitian Korompis (2017) namun  terhadap bakteri uji yang  berbeda.  Hasil  penelitian  tersebut menunjukkan  bahwa  ekstrak  spons laut Callyspongia sp. dapat menghambat pertumbuhan  bakteri Shigella dan  bakteri Staphylococcus epidermidis.
Tabel 1. Hasil pengukuran rata-rata diameter daya antibakteri dari isolat T1, T2, T3 terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan bakteri Escherichia coli
Rata-rata Diameter (mm) T1 T2 T3 K. positif K. negatif Staphylococcus aureus 9,00 8,00 9,00 14,00 0 Escherichia coli 9,00 8,60 9,00 18,00 0

## Identifikasi Biokimia Isolat Bakteri
Uji  biokimia  bakteri  merupakan suatu  cara  atau  perlakuan  yang  dilakukan untuk  mengidentifikasi  dan  mendeterminasi suatu  biakan  murni  bakteri  hasil  isolasi
melalui sifat-sifat fisiologinya. Hasil identifikasi  biokimia  dapat  dilihat  dalam tabel 3.
Tabel 2. Hasil identifikasi biokimia masing-masing isolat bakteri simbion spons Callyspongia aerizusa .
Isolat  Gram  Bentuk  Katalase  Sitrat  Lisin  Fermentasi
karbohidrat H2S  Indol  Motilitas T1 + Basil - - + - + - - T2 + Basil + + - + - - - T3 + Basil - - - - + - - Pewarnaan  Gram  bertujuan  untuk memperjelas sel bakteri dengan
menempelkan  zat  warna  ke  permukaan  sel bakteri  sehingga  ditentukan  pengelompokan bakteri  berdasarkan  perbedaan  komponen dinding  sel.  Bakteri  gram  positif  adalah bakeri  yang  mempertahankan  zat  warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri  jenis  ini  akan  berwarna  biru  atau ungu di bawah mikroskop sedangkan bakteri gram  negatif  akan  berwarna  merah  atau merah  muda.  Perbedaan  klasifikasi  antara kedua  jenis  bakteri ini terutama  berdasarkan pada perbedaan struktur  dinding  sel  bakteri. Bakteri  gram  negatif  adalah  bakteri  yang tidak  mempertahankan  zat  metal  ungu  pada metode pewarnaan gram,  sementara  bakteri gram-positif akan mempertaahankan warna ungu setelah dicuci dengan alkohol.
Uji  H 2 S  dilakukan  untuk  mengamati kemampuan  bakteri  dalam  mengubah  asam amino alanine dan H 2 S dengan menggunakan  media Triple  Sugar  Iron Agar .  Isolat  bakteri  dengan  hasil  positif
yaitu  dengan  adanya  warna  hitam  atau kehitaman pada media berarti bakteri
tersebut mampu memfermentasi asam amino.  Sedangkan  jika  hasil  negatif  berarti bakteri  tidak  mampu  melakukan  fermentasi asam amino.
Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah kuman mempunyai enzim triptophanase  sehingga  kuman  tersebut mampu mengoksidasi asam amino tryptophan  membentuk  indol.  Hasil  positif dapat  dilihat  dari  terbentuknya  lapisan berwarna  merah  pada  saat  penambahan reagen Kovac’s yang artinya bakteri mampu membentuk  indol.  Pada  uji  ini  semua  hasil yang  diperoleh  negatif  yang  berarti  ketiga isolat bakteri tidak memiliki enzim triptophanase sehingga tidak mampu mengoksidasi asam amino tryptophan (Hemraj, 2013). Uji motilitas bertujuan untuk mengetahui gerak kuman dengan menggunakan  media Nutrient  Agar .  Hasil negatif  apabila  terlihat  adanya  penyebaran yang  berwarna  putih  hanya  pada  bagian
tusukan  inokulasi  sedangkan  hasil  positif apabila  terlihat  adanya  penyabaran  yang berwarna  putih  seperti  akar  disekitar inokulasi.  Pada  uji  memperlihatkan  hasil negatif  pada  semua  isolat  yang  berarti bahwa  ketiga  isolat  bakteri  ini  tidak memiliki  flagel  (Burrows,  2004).  Menurut Waluyo  (2009),  flagella  merupakan  salah satu  struktur  utama  di  luar  sel  bakteri  yang menyebabkan terjadinya pergerakan (motilitas) pada sel bakteri.
Uji  fermentasi  karbohidrat  bertujuan untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam  menghidrolisis  karbohidrat.  Pada  uji ini isolat T2 menunjukkan hasil yang positif yaitu  terjadi  perubahan  warna  menjadi kuning tanpa adanya pembentukan gas yang berarti isolat bakteri T2 memiliki kemampuan dalam menghidrolisis karbohidrat tanpa disertai pembentukan gas.
Pada  uji  lisin,  isolat  bakteri  T1 menunjukkan hasil yang positif. Hasil positif apabila  terjadi  perubahan  warna  dari  ungu menjadi  kuning  dan  kembali  menjadi  ungu. Hal ini menunjukkan isolat bakteri memiliki kemampuan  dalam  memecah  lisin  yang  ada pada media.
Uji katalase berguna dalam mengidentifikasi  kelompok  bakteri  yang dapat  menghasilkan  enzim  katalase.  Hasil positif  apabila  terdapat  gelembung  – gelembung gas setelah ditambahkan
hydrogen  peroksida.  Isolat  bakteri  T2 menunjukkan  hasil  yang  positif.  Hal  ini berarti  isolat  bakteri  T2  memiliki  enzim katalase yang dapat memecah H 2 O 2 menjadi H 2 O  dan  O 2. Menurut  Lubis et  al .  (2014), Hidrogen  peroksida  bersifat  toksik  terhadap sel  karena  menginaktifasikan  enzim  dalam sel.  Katalase  merupakan  enzim  yang digunakan mikroorganisme untuk menguraikan  hidrogen  peroksida  menjadi H2O dan O2.
Uji  sitrat  bertujuan  untuk  mengetahui apakah  kuman  menggunakan  sitrat  sebagai sumber karbon. Jika bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya  maka  akan  menaikan  pH  dan mengubah  warna  medium  biakan  dari  hijau menjadi  biru  (Sunarjo,  1994).    Hasil  positif apabila  terjadi  perubahan  warna  media  dari hijau menjadi biru. Sedangkan hasil negative apabila tidak terjadi perubahan warna media dari  hijau  menjadi  biru.  Isolat  bakteri  T2 menunjukkan hasil  yang positif terhadap uji ini yang berarti isolat bakteri T2 menggunakan  sitrat  sebagai  satu-satunya sumber karbon (Ratna, 2012).
Hasil  uji  H 2 S,  uji  indol,  uji  motilitas, uji karbohidrat, uji lisin, uji katalase, dan uji sitrat isolat bakteri, disesuaikan dengan buku Bergey’s microbiology, maka hasilnya dapat dilihat pada Tabel 3.

## Tabel 3. Hasil identifikasi isolat bakteri berdasarkan identifikasi biokimia
Kode Isolat Hasil Identifikasi Bakteri T1 Desulfotomaculum T2 Brochothrix T3 Desulfotomaculum
Desulfotomaculum merupakan  bakteri pereduksi  sulfat  yang  bermanfaat  untuk bioremediasi.  Bioremediasi  bertujuan  untuk memecah  atau  mendegradasi  zat  pencemar menjadi  bahan  yang  kurang  beracun  atau tidak beracun (karbon dioksida dan air) atau dengan  kata  lain  mengontrol,  mereduksi atau bahkan mereduksi bahan pencemar dari lingkungan.
Brochothrix sering  dijumpai  pada daging yang  merupakan  bakteri  pembusuk, bakteri ini sangat penting karena menyebabkan  pembusukan  secara  luas  pada daging dan produknya dengan cara memproduksi  bau  busuk  yang  membuat daging tidak enak ( Sneath et al , 1986) .

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasilpenelitian  yang dilakukan,  isolat  bakteri  simbion  spons Callyspongia aerizusa memiliki daya antibakteri  terhadap  bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan golongan  daya  antibakteri  dikategorikan sedang  dan  isolat  bakteri  simbion  spons Callyspongia aerizusa diduga sebagai bakteri  Desulfotomaculum  dan  bakteri Brochothrix yang diuji secara biokimia.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut  yaitu  identifikasi  isolat  bakteri  secara molekuler sehingga didapatkan hasil identifikasi  bakteri  yang  lebih  akurat  dan selanjutnya dapat dimanfaatkan.

## DAFTAR PUSTAKA
Burrows,  W.,  J.M.  Moulder,  R.M.  Lewert.
2004. Textbook  of  Microbiology .
W.B. Sauders Company, Philadelphia.
Hemraj,  V.,  2013.  A  review  on  Commonly Used Biochemical Test For Bacteria. India:  Departement  of  Pharmacy,  L R Intitute of Pharmacy, Solan (H.P).
Korompis.,  Christi,  M.,  Edward,  N.  2017. Uji  Daya  Hambat  Ekstrak  Spons Laut  Callyspongia  aerizusa  terhadap Pertumbuhan  Bakteri  Shigella  dan Staphylococcus  epidermidis. Jurnal eBm . 5 (2)
Lubis,  L,  A,  M.  2002. Lele  ikan  berkumis paling populer . Agromedia. Jakarta.
Madigan,  M.,  Stahl,  C.  2012. Biology  of Microorganisms . Pearson Education,
San Francisco.
Manggalea  F.P.,  J.  Posangi.,  M.P.  Wowor.,
Bara  R.  2015.  Uji  Efek  Antibakteri
Jamur  Endosimbion  Spons  Laut terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Escherica  coli . ebm.
3 (1) : 377.
Muniarsih  T.,  Rachmaniar  R.  1999.  Isolasi
Substansi Bioaktif Antimikroba Dari
Spons  Asal  Pulau  Pari  Kepulauan Seribu. Prosiding Seminar Bioteknologi  Kelautan  Indonesia;
Jakarta.
Noverita, D., Fitria.. E. Sinaga. 2009. Isolasi dan  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Jamur Endofit  dari  Daun  dan  Rimpang Zingiber  ottensii . Jurnal  Farmasi Indonesia . 4 (4) : 171-176.
Proksch,  P.,  R.  Ebel.,  R.A.,  Edrada.,  P., Schuup.,  W.H.  Lin.,  Sudarsono.  V. Wray., K. Steube. 2003. Detection of Pharmacologically  Active  Natural Products  using  Ecology  selected Example  from  Indopacific.    Marine Invertebrates  and  Sponge-derived Fungi. Pure and Appl Chem . 75 (3)
Ratna,  S.  2012. Mikrobiologi  Dasar  dalam Praktek:  Teknik  dan  Prosedur  dasar Laboratorium . Gramedia, Jakarta
Sneath  P.H.A.,  Jones  D.  1986.  Genus Brochothrix .  In: Bergey’s  Manual  of Systematic  Bacteriology, Vol.2,  pp. 1249-1253.
Sunarjo,  1994. Penyehatan  Air  dalam Program Penyediaan dan Pengolahan  Air  Bersih .  Direktorat Jenderala  PPM  &  PLP,  Departemen Kesehatan Republik
Indonesia,
Jakarta.
Tan, R. X., Zou, W. X. 2001. Endophytes: A
Rich Source of Functional Metabolites. Natural Product Reports . 18 (4) : 448-459.
Waluyo, L. 2009. Teknik dan Metode Dasar Mikrobiologi . UMM Press, Malang.