1 / Hermawan, L.S., Tugiyono, Rusyani, E., Murwani, S.
Pertumbuhan dan Kandungan Nutrisi Tetraselmis sp. dari Lampung Mangrove Center pada Kultur Skala Laboratorium dengan Pupuk Pro Analis dan Urea yang Berbeda
Growth and Nutritional Content of Tetraselmis sp. Isolated from Lampung Mangrove Center on Laboratory Scale Culture With Pro Analyze Fertilizer And Different Dose of Urea as Fertilizer
Lia Setiani Hermawan 1 , Tugiyono 1 , Emy Rusyani 2 , Sri Murwani 1 ,
1Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung
2 Balai Besar Perikanan Budidaya Laut Lampung Email: setianilia1994@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  dosis  urea  yang  paling  efektif  terhadap  pertumbuhan  dan kandungan nutrisi Tetraselmis sp. dari perairan Lampung Mangrove Center . Penelitian dirancang secara acak  lengkap  (RAL)  dengan  pemberian  kombinasi  pupuk:    A  (Urea  20  ppm,  ZA  30  ppm  dan  TSP  10 ppm), B (Urea 30 ppm, ZA 30 ppm dan TSP 10 ppm), C (Urea 40 ppm, ZA 30 ppm dan  TSP 10 ppm), dan D (Conwy sebagai kontrol).  Parameter  yang diamati kepadatan populasi, laju pertumbuhan,  waktu generasi,  kandungan  protein,  lipid  dan  karbohidrat.    Data  pertumbuhan  dianalisa  varians pada  α  =  5% dan  diuji  lanjut  dengan  uji  Tukey ’s  bila  terdapat  perbedaan.    Data  kandungan  nutrisi  dianalisis  secara deskriptif.    Hasil  analisis  data  menunjukkan  dosis  pupuk  urea  yang  memberikan  kepadatan  populasi maksimum,  laju  perumbuhan  tertinggi,  dan  waktu  generasi  tercepat,  serta  kandungan  nutrisi  terbaik adalah pupuk urea dengan dosis 40 ppm.
Kata kunci : Tetraselmis sp., urea, pertumbuhan,  dan nutrisi

## ABSTRACT
This  research  aimed  to  know  the  most  effective  dosage  from  urea  to  growth  and  nutritional  content  of Tetraselmis sp. in Lampung Mangrove Center. The research is conducted using Completely Randomized Design with treatment A (Urea 20 ppm, ZA 30 ppm and TSP 10 ppm), B (Urea 30  ppm, ZA 30 ppm and TSP 10 ppm), C (Urea 40 ppm, ZA 30 ppm and TSP 10 ppm), and D (Conwy as control). Data for growth obtained  will  be  tested  using  ANOVA  and  post- hoc test with α = 5%  will be conducted if there are any significance differences.  Nutrition information obtained will be analyzed descriptively.  Results of ANOVA showed  significant  differences  between  treatment  on  its  maximum  density,  specific  growth  rate  and doubling time. The most effective dosage of alternative farm fertilizer for Tetraselmis sp. growth is 40 ppm of urea.
Keyword : Tetraselmis sp., urea, growth and nutrition

## PENDAHULUAN
Fitoplankton dapat dimanfaatkan
sebagai  pakan  hidup  dalam  industri  akuakultur. Namun, biaya yang dibutuhkan untuk
mendapatkan  dan  membudidayakan  pakan hidup relatif mahal, sebagai contoh berdasarkan  PP  RI  No.  75  Tahun  2015  harga fitoplankton Nannochloropsis sp.  dalam  bentuk
powder  adalah  Rp.  2.000.000/kg  dan  dalam bentuk  pasta  Rp.  250.000/L.  Selain  itu  harga pupuk  pro  analis  yang  digunakan  dalam  kultur fitoplankton  relatif  mahal  sehingga  diperlukan pupuk  alternatif  dengan  harga  yang  lebih terjangkau, salah satunya adalah pupuk pertanian  (Prabowo,  2009). Menurut  Rusyani (2012)    Nitrogen  sebagai  penyusun  utama
protein  dapat  diberikan  pada  kultur  fitoplankton dalam  bentuk  urea  ((NH 2 ) 2 CO).  Fosfor  sebagai penyusun  asam  nukelat  dapat  diberikan  dalam bentuk Triple  Super  Phosphate (Ca 3 PO 4 ).
Sulfur  sebagai  penyusun  asam  nukleat  dan protein dapat diberikan dalam bentuk ammonium sulfat atau ZA(NH 4 SO 4 ).
Tetraselmis sp . adalah  fitoplankton  sel tunggal  dengan  bentuk  oval  elips  berukuran  7- 12  µm,  memiliki  dua  pasang  flagela  yang berukuran  0,75 –1,2  kali  panjang  tubuhnya.
Dinding  sel Tetraselmis sp.  tersusun  atas selulosa dan pektin. (Butcher, 1959, Redjeki dan Basyarie,  1989). Tetraselmis sp.  merupakan salah  satu  fitoplankton  yang  ditemukan  pada hasil  analisis  lambung  ikan  yang  diambil  dari Lampung  Mangrove  Center (Tugiyono  dkk.,
2013)  dan  telah  banyak  dimanfaatkan  sebagai pakan  hidup  karena  bernilai  nutrisi  tinggi  dan mudah  dibuat  pasta  (Guedes  dan  Malcata, 2012).
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui  pertumbuhan  dan  kandungan nutrisi Tetraselmis sp. dari Lampung Mangrove Center yang  ditumbuhkan  pada  kultur  skala laboratorium  dan  diberi  kombinasi  pupuk pertanian  ZA,  TSP  dan  urea.  Dosis  ZA  dan TSP sama untuk semua perlakuan, sedangkan dosis  urea  dibedakan  tergantung  perlakuan. Sebagai  kontrol,  ke  dalam  media  diberi  pupuk Conwy (pro analis).

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  dilaksanakan  pada  Oktober 2016  sampai  dengan  November  2016  di Laboratorium  Divisi  Pakan  Hidup,  Balai  Besar Perikanan Budidaya Laut, Lampung.
Alat  yang  digunakan  adalah  erlenmeyer (botol  kultur), beaker  glass, tabung  reaksi, stirrer, pipet  tetes, haemocytometer ,  mikroskop, kertas  saring,  timbangan  analitik,  botol  gelap, hand  counter ,  batu  aerasi,  selang  aerasi, aerator,  lampu fluorescens,  cartridge  filter, UV emitter, magnetic stirrer.
Bahan yang digunakan adalah inokulum Tetraselmis sp.  yang  diisolasi  dari Lampung Mangrove  Center yang  terletak  di  Desa Margasari,  Kecamatan  Labuhan  Maringgai, Kabupaten  Lampung  Timur.  Bahan  lainnya adalah pupuk Conwy PA, urea, TSP, ZA, alkohol 70%, air laut steril, aquadest, aquabidest , sabun cuci, tissue.
Penelitian dirancang secara acak lengkap  (RAL)  dengan  4  perlakuan,  yaitu perlakuan A (Urea 20 ppm, ZA 30 ppm dan TSP 10 ppm), B (Urea 30 ppm, ZA 30 ppm dan TSP 10 ppm), C (Urea 40 ppm, ZA 30 ppm dan TSP 10 ppm), dan D (Conwy sebagai kontrol) dimana masing-masing  perlakuan  diulang  sebanyak  5 kali.
Data kepadatan populasi, laju pertumbuhan,  dan  waktu  generasi  dianalisis varians  (ANOVA) pada  α  =  5%,  sedangkan kandungan nutrisi dinalisis secara deskriptif.
Kultur Tetraselmis sp.
Kultur Tetraselmis sp.  diawali  dengan sterilisasi  alat  dan  bahan,  penyediaan  pupuk yang  sesuai  dengan  perlakuan,  adaptasi inokulum  dan  penyediaan  inokulum.  Kepadatan awal  inokulum Tetraselmis sp.  yang  digunakan adalah  5x  10 5 sel/  mL.  Inokulum  dimasukan  ke dalam botol kultur berisi air laut steril dan pupuk sesuai dengan perlakuan. Perhitungan kepadatan  sel  menggunakan haemocytometer di  bawah  mikroskop  dilakukan  setiap  hari selama 7 hari.

## Laju Pertumbuhan
Laju  pertumbuhan  fitoplankton  dihitung dengan rumus:
(Fogg, 1987)
Keterangan:
k = Laju pertumbuhan ( sel/mL /hari) Wt = Jumlah sel setelah waktu t (sel/mL) Wo = Jumlah sel awal (sel/mL) T = Waktu kultur dari Wo ke Wt (hari)

## Waktu generasi
Waktu  generasi  fitoplankton  dihitung dengan rumus:
(Kurniastuty dan Julinasari, 1995) Keterangan: G = Waktu generasi (jam) Wt = Jumlah sel setelah waktu t (sel/mL) Wo = Jumlah sel awal (sel/mL) T = Waktu dari Wo ke Wt (jam)

## Pengamatan Kandungan Nutrisi
Pengamatan kandungan nutrisi dilakukan  dengan  analisa  proksimat  untuk mengetahui jumlah kandungan protein, karbohidrat  dan  lemak  dari Tetraselmis sp.
Kadar protein ditentukan dengan metode Semi mikro  Kjedahl  dengan  prinsip  destruksi, destilasi  dan  titrasi.    Kadar  karbohidrat ditentukan  dengan  metode  by  different  yaitu hasil  pengurangan  100%  sampel  terhadap kadar  air  total,  protein  total,  lemak  total,  dan abu  total  dan  penentuan  kadar  lemak  dengan metode  Soxhlet  (  SII  2453-90).    Hasil  analisa kemudian  dikonversikan  dalam  berat  kering. Analisa  dilakukan  di  Laboratorium  Teknologi Hasil  Pertanian  Politeknik  Negeri  Lampung (THP Polinela).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan  hasil  pengamatan  rerata kepadatan  populasi  puncak  tertinggi  secara berurutan  adalah  pada  perlakuan  D  sebanyak 277,2  x  10 4 sel/ml  pada  hari  ke  5,  kemudian perlakuan  C  sebanyak  251,6  x  10 4 sel/ml  pada hari  ke  4,  perlakuan  B  sebanyak  186,4  x  10 4 sel/ml pada hari ke 4 dan perlakuan A sebanyak 176,8 x 10 4 sel/ml pada hari ke 4 (Gambar 1).
Gambar  1.  Grafik  Rerata  Kepadatan  Populasi Tetraselmis sp. pada Masing- Masing Perlakuan Keterangan:
A =  Perlakuan pupuk  Urea 20 ppm, ZA 30 ppm dan TSP 10 ppm
B =  Perlakuan pupuk  Urea 30 ppm, ZA 30 ppm dan TSP 10 ppm C = Perlakuan pupuk  Urea 40 ppm, ZA 30 ppm dan TSP 10 ppm D = Pupuk Conwy 1 mL/L
Berdasarkan
data pertumbuhan
Tetraselmis sp.  yang  diperoleh  menunjukkan pola  pertumbuhan  yang  tidak  sesuai  dengan pola  pertumbuhan  sigmoid  menurut  Laven  and Sorgeloos (1996). Pada hasil penelitian ini, tidak terdapat  fase  stasioner  setelah  kepadatan puncak  tercapai  (Gambar  1).  Fase  kematian tercepat  dicapai  oleh  perlakuan  C  kemudian diikuti  dengan  perlakuan  A,  B  dan  D.  Pada perlakuan  C,  diduga  pertumbuhan Tetraselmis sp.  sangat  cepat  sehingga  kandungan  nutrisi pada media lebih cepat habis dan menyebabkan kepadatan  populasi  segera  menurun  ketika populasi  puncak  dicapai.  Dari  Gambar  1  juga dapat  dilihat  makin  lambat  kepadatan  puncak dicapai  maka  penurunan  kepadatan  populasi semakin lambat. Selain itu diduga kepadatan sel
yang  tinggi  menyebabkan  hambatan  penetrasi cahaya ke dalam media kultur (Rusyani, 2012).
Kepadatan populasi
maksimum
Tetraselmis sp.  tertinggi  dicapai  oleh  perlakuan D  yaitu  211,200  x  10 4 sel/mL,  sedangkan kepadatan  populasi  maksimum Tetraselmis sp. terendah dicapai oleh perlakuan A yaitu 176,800 x 10 4 sel/mL.
Tabel  1.  Rerata  Kepadatan  Populasi Maksimum  (x  10 4 sel/ml) Tetraselmis sp. Pada setiap perlakuan
Perlakuan Kepadatan  Populasi Maksimum (x 10 4 sel/mL) Tetraselmis sp. (Mean ± SEM) A 176,800 ± 19,678 a B 186,400 ±13,083 a C 251,600 ± 14,871 b D 277,200 ± 6,256 b
Keterangan:  Angka  yang  diikuti  oleh huruf  yang  sama  tidak  berbeda  nyata pada BNT dengan α = 5%.

## Laju Pertumbuhan
Hasil uji ANOVA pada α = 5% (Tabel 2) menunjukkan bahwa dosis pupuk urea memberikan pengaruh terhadap laju
pertumbuhan. Laju pertumbuhan tertinggi dicapai  oleh  perlakuan  C  dengan  dosis  pupuk urea 40 ppm yaitu 0,401 sel/mL / hari.
0 50 100 150 200 250 300 1 2 3 4 5 6 7 K e p a d a ta n s e l (1 0 4 s e l/m L ) A B C D Hari ke -

## 35 / Hermawan, L.S., Tugiyono, Rusyani, E., Murwani, S.
Tabel 2. Nilai Laju Pertumbuhan (hari) Tetraselmis sp. pada saat Pencapaian Populasi  Maksimum  pada  Setiap Perlakuan
Perlakuan Nilai Laju Pertumbuhan Spesifik ( sel/mL / hari )
Tetraselmis sp. (Mean ± SEM) A 0,309 ± 0,026 a B 0,325 ±0,018 a C 0,401 ± 0,014 b
D 0,342 ± 0,004 ab
Keterangan:  Angka  yang  diikuti  oleh huruf  yang  sama  tidak  berbeda  nyata pada BNT dengan α = 5%.
Menurut  Fogg  (1987)  faktor  pembatas laju  pertumbuhan  fitoplankton  adalah  jumlah nutrien  yang  tersedia.  Apabila  fitoplankton kekurangan  nutrisi  essensial  dalam  waktu  yang lama maka pertumbuhan akan menurun demikian  pula  apabila  fitoplankton  kelebihan unsur  hara  mikro,  pertmbuhan  fitoplanktonpun terhambat  karena  kelebihan  unsur  hara  mikro menyebabkan keracunan.
Nilai  laju  pertumbuhan  yang  tinggi menunjukkan  daya  dukung  media  tumbuh  yang baik.  Dengan  demikian  laju  pertumbuhan  dapat digunakan sebagai tolok ukur untuk mengetahui daya  dukung  media  terhadap  pertumbuhan fitoplankton  (Laven  and  Sorgeloos,  1996).
Perlakuan  C  menunjukkan  laju  pertumbuhan tertinggi  diantara  perlakuan  lainnya  sehingga urea dengan dosis 40 ppm pada media TSP dan ZA  merupakan  dosis  yang  direkomendasikan untuk meningkatkan laju pertumbuhan Tetraselmis sp.

## Waktu Generasi
Hasil uji ANOVA pada α = 5% (Tabel 2)
menunjukkan bahwa dosis pupuk urea memberikan pengaruh terhadap waktu generasi. Waktu  generasi  tecepat  dicapai  oleh  perlakuan C dengan dosis pupuk urea 40 ppm yaitu 41,846 jam.
Tabel  3.  Nilai  Waktu  Generasi  (jam) Tetraselmis sp. pada saat Pencapaian Populasi  Maksimum  pada  Setiap Perlakuan Perlakuan Nilai Waktu Generasi (jam) Tetraselmis sp. (Mean ± SEM) A 55,509 ± 4,447 a B 52,086 ± 3,347 ac C 41,846 ± 1,489 bc D 48,949 ± 0,632 ab
Keterangan:  Angka  yang  diikuti  oleh huruf  yang  sama  tidak  berbeda  nyata pada BNT dengan α = 5%.
Menurut Borowitzka (1988) faktor
genetik  dan  faktor lingkungan  merupakan  faktor pembatas pertumbuhan fitoplankton. Urea dengan  dosis 40  ppm  pada  media  TSP  dan ZA sebagai salah satu faktor lingkungan
memberikan nutrisi yang cukup untuk menunjang pertumbuhan dan mampu
meningkatkan waktu generasi Tetraselmis sp.

## Kandungan Nutrisi
Kandungan  protein Tetraselmis sp. secara berurutan dari yang tertinggi adalah pada perlakuan  D  sebesar  70,287%,  perlakuan  C sebesar 67,989%, perlakuan B sebesar 57,017%  dan  perlakuan  A  sebesar  43,581%.
Sedangkan,  kandungan  lipid  dan  karbohidrat Tetraselmis sp.  secara  berurutan  dari  yang tertinggi  adalah  pada  perlakuan  A,  B,  C  dan  D dengan  kandungan  lipid  sebesar  1,365%; 1,068%;  0,775%  dan  0,795%  dan  karbohidrat sebesar 12,273%; 5,822%; 2,703% dan 2,180% (Gambar 2).
Gambar 2. Grafik Kandungan
Nutrisi
Tetraselmis sp. tiap Perlakuan
Kandungan  protein  yang  didapat  dalam penelitian lebih tinggi dibandingkan dengan hasil yang  dicapai  oleh  Arkronrat  (2016)  yaitu kandungan protein sebesar 25,7% pada 120 jam kultur  dan  21,7%  pada  240  jam  kultur.    Namun kandungan  lipid  dan  karbohidrat  yang  didapat dalam  penelitian  ini  lebih  rendah  dibandingkan dengan hasil yang dicapai oleh Arkronrat (2016) yaitu  kandungan  lipid  sebesar  9,4%  pada  120 dan  240  jam  kultur  dan  kandungan  karbohidrat sebesar  16,6%  pada  120  jam  kultur  dan  14,5% pada 240 jam kultur.
Data  kandungan  nutrisi  yang  diperoleh menunjukkan  bahwa  semakin  besar  dosis  urea yang diberikan menghasilkan kandungan protein
yang  semakin  tinggi.    Hal  ini  didukung  oleh pernyataan  bahwa  urea  memiliki  kandungan nitrogen  sebagai  komponen  penyusun  utama protein  yang  cukup  besar  yaitu  sebanyak  46% (Buckman  dan  Brady,  1982).    Menurut  Laven dan  Sorgeloos  (1996)  kandungan  protein tertinggi  didapat  pada  fase  eksponensial. Tingginya kandungan protein pada hasil penelitian  diduga  karena  analisis  proksimat dilakukan  pada  hari  ke  4  yaitu  pada  fase eksponensial dimana kepadatan populasi mencapai puncak.
Beberapa  penelitian  melaporkan  bahwa fitoplankton dapat mengalami perubahan komposisi  biokimia  dalam  kondisi  kultur  yang bervariasi.    Salah  satu  perubahan  biokimia tersebut  adalah  hubungan  antara  rendahnya kandungan  nitrogen  dalam  media  kultur  yang menyebabkan penurunan protein dan peningkatan  kandungan  lipid  dan  karbohidrat yang cukup besar (Chen and Shetty, 1991). Hal ini mendasari hasil penelitian dimana pemberian pupuk  dengan  dosis  urea  paling  rendah dibandingkan  dengan  perlakuan  lainnya  yaitu sebesar  20  ppm  memiliki  kandungan  protein terendah yaitu sebesar 43,581% dan kandungan lipid  dan  karbohidrat  tertinggi  dibandingkan dengan perlakuan lainnya  yaitu  kandungan lipid sebesar  1,365%  dan  karbohidrat  sebesar 12,273%.
Menurut Rusyani (2012) defisiensi nutrisi  dapat  mempengaruhi  kandungan  protein,
0 10 20 30 40 50 60 70 80 A B C D
Protein Lipid Karbohidrat
karbohidrat,  lemak,  pigmen  dan  fotosintesis.
Fogg  (1987)  menyatakkan  nilai  gizi  fitoplankton bervariasi  sesuai  dengan  kondisi  kulturnya, beberapa  fitoplankton  pada  fase  eksponensial memiliki  tingkat  respirasi,  fotosintesis  dan produksi  asam  nukleat  yang  tinggi  dan  dapat memiliki  kandungan  protein  melebihi  70%  berat kering,  tetapi  memliki  kandungan  karbohidrat dan lemak yang sangat rendah.
Meskipun kandungan protein Tetraselmis sp.
yang ditumbuhkan
menggunakan  pupuk  Conwy  (70,287%)  lebih besar  sekitar  3%  dari  kandungan  protein Tetraselmis sp. yang ditumbuhkan
menggunakan  pupuk  pertanian  ZA,  TSP  dan urea  dengan  dosis  40  ppm  (67,989%)  maka berdasarkan  nilai  ekonomis,  dosis  pupuk  urea 40 ppm dapat direkomendasikan sebagai pupuk dalam  kultur Tetraselmis sp.  Dengan  demikian akan  memberikan  keuntungan  yang  besar dalam industri akuakultur.

## KESIMPULAN
Dosis pupuk urea yang direkomendasikan untuk meningkatkan kepadatan
populasi maksimum, laju
perumbuhan  tertinggi,  dan  waktu  generasi tercepat,  serta  kandungan nutrisi  terbaik adalah 40 ppm.

## DAFTAR PUSTAKA
Arkronrat,  W.,  dkk.  2016.  Growth  Performance and Proximate Composition of Mixed Culture of Marine Micoralgae ( Nannochloropsis sp. & Tetraselmis sp.) with monocultures.
Songklanakarin J. of Sci. Technol. Bangkok.
Borowitzka, M.A.  1988. Algal growth Media and Sources  of  Algal  Cultures  in:  Borowitzka, M.A.  &  L.J .    Borowitzka  (Eds)  Microalga Biotechnology.  Cambridge  University  Press. New York.
Buckman,  H.O.  dan  Brady.    1982. Ilmu  Tanah . Bharata Karya Aksara.  Jakarta.
Butcher, R.W. 1959.  An introductory account of the  smaller  algae  of  British  coastal  waters. Part  I:  Introduction  and  Chlorophyceae. Minist. Agric. Fish. Food, Fish. Invest.  Great Britain.
Chen,  J.  and  H.P.C.  Shetty.  1991. Culture  of Marine  Feed  Organisms .  National  Inland Institute Kasetsart University. Bangkok.
Fogg,  G.  E.    1987. Algal  Cultures  and Phytoplankton  Ecology. The  University  of
Wisconsin Press.  London. Guedes,  A.  C.  and    F.  X.  Malcata.    2012 .
Nutritional  Value  and  Uses  of  Microalgae  in Aquaculture. InTech.  Croatia.
Kurniastuty dan Julinasari.  1995.  Pertumbuhan alga  Dunaliela  sp.  pada  media  kultur  yang berbeda  dalam  skala  massal  (semi  outdoor).
Bulletin Budaya Laut Lampung. Laven,  P.  dan  Sorgeloos,  P.    1996.  Manual  on the  production  and  use  of  live  Food  for aquaculture . FAO  Fisheries  Technical
Paper . Rome. Peraturan Pemerintah Republik Indonesia Nomor  75  Tahun  2015  Tentang  Jenis  Dan Tarif  Atas  Jenis  Penerimaan  Negara  Bukan Pajak  Yang  Berlaku  Pada  Kementerian Kelautan Dan Perikanan.
Prabowo,  D.  A.  2009.  Optimasi  pengembangan media untuk pertumbuhan Chlorella sp. Pada skala laboratorium. (Skripsi). IPB. Bogor.
Redjeki,  S.  dan  A.  Basyarie.    1989.    Kultur Jasad  Pakan  untuk  Menunjang  Perikanan Budidaya  Laut.  Staff  Peneliti  Sub  Balai Penelitian  Budidaya  Pantai  Banjarnegara.
Serang.
Rusyani,  E.    2012.    Molase  sebagai  Sumber Mikro Nutrien  pada Budidaya  Phytoplankton Nannochloropsis sp.,  Salah  Satu  Alternatif Pemanfaatan  Jasil    Samping  Pabrik  Gula (Tesis) . Universitas Lampung.  Lampung.
Tugiyono,  S.  Murwani,  S.  Bakri  A.,  dan Erwinsyah.    2013.    Studi  Status  Kualitas Perairan Ekosistem Mangrove Desa Margasari  Kecamatan  Labuhan  Maringgai Kabupaten Lampung Timur. Proseding Seminar  Nasional  Sains  dan  Teknologi  V,
Tahun 2013 ISBN 978-979-8510-71-7.