## EFEK SITOTOKSIK KOMBINASI EKSTRAK METANOL DAUN KENIKIR
( Cosmos caudatus , Kunth) DAN DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D SECARA IN-VITRO DAN IN-SILICO
Fera Elia Fita, Dewi Listianingsih, Yunita Ayu Hapsari, Raka Galih Pradana, Erika Indah S. dan Ibrahim Arifin
Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang
e-mail: veve.difi@yahoo.com

## ABSTRACT
Doxorubicin is chemotherapeutic agents used widely for breast cancer therapy. The use of doxorubicin  may  cause  cardio  toxicity  and  multi-drug  resistance.  In  order  to  overcome  this  side effect,  a  combined  therapy  using  the  methanol  extracts  of  kenikir  leaves  is  developed.  The purposes  of  this  study  are  to  measure  the  cytotoxic  effect  of  methanol  extracts  of  kenikir  leaves and  doxorubicin  combination  treatment  against  T47D  breast  cancer  cell  growth  in-vitro  and  in- silico,  as  well  as  determining  the  optimal  dose  combination  that  produces  the  most  potent cytotoxic  effects.  The  extraction  of  kenikir  leaves  is performed  with  soxhletation  method.  The cytotoxicity assay on the T47D breast cancer cells is carried out using MTT assay. The result of this research shows that the value of IC 50 methanol extracts of kenikir leaves is 778.05µg/mL. The treatment of the methanol extracts of kenikir leaves and doxorubicin combination treatment results in  a  strong  synergy  at  the  concentration  130  µg/mL  (-41  nM);  195  µg/mL  (-41  nM)  and  130 µg/mL (-27.33 nM) with the value of Combination Index 0.2; 0.3 and 0.3 respectively. The result of  in-silico  test  shows  that  the  bond  energies  of  aglycone  flavonoid  and  quercetin  glycoside  on Bcl-2 are -63.3359 and -67.0414.
Key words: Kenikir leaves extract, doxorubicin, T47D cells, molecular docking

## PENDAHULUAN
Kanker  Payudara  telah  dikenal  luas  sebagai  kanker  yang  paling  mematikan  (Arifin  dkk., 2012). Hasil penelitian yang dilakukan oleh American Cancer Society (2013) menunjukkan bahwa pada tahun  2013,  angka kejadian kanker payudara  di  Amerika  Serikat sebanyak  232.340  dimana 39.620  wanita dan 410  pria,  diantaranya  meninggal  dunia.  Data  yang dipublikasikan  oleh  World Health  Organization  (WHO)  menyatakan  bahwa  pada  tahun  2011  kematian  akibat  kanker payudara di Indonesia mencapai 20.052 atau 1,4% dari total kematian (WHO, 2011).
Sampai saat ini, pilihan utama terapi kanker payudara dilakukan dengan menggunakan agen kemoterapi  (Drummond,  2007),  salah  satu  diantaranya  yang  dikenal  paling  luas  adalah doksorubisin (Childs dkk., 2001; Bapsy dan Sahoo, 2004). Penggunaan doksorubisin dosis tinggi berisiko  menimbulkan  kardiotoksisitas  yang  dapat  menyebabkan  kematian  (Singal  dkk.,  2001; Schlatner  dkk.,  2006).  Selain  itu,  penggunaan  doksorubisin  dapat  meningkatkan  terjadinya multi drug resistance (MDR) (Popov, 2005).
Pengatasan  efek  samping  doksorubisin  dilakukan  melalui  melalui  pendekatan  penggunaan kombinasi  kemoterapi  (kokemoterapi).  Salah  satu  bahan  alam  atau  herbal  yang  berpotensi  untuk dikembangkan sebagai agen kokemoterapi adalah ekstrak metanol daun kenikir ( Cosmos caudatus , Kunth.). Penelitian yang dilakukan oleh Pebriana dkk. (2008) melaporkan bahwa ekstrak metanol daun  kenikir  memiliki  aktivitas  memacu  kematian  sel  T47D  melalui  mekanisme  apoptosis, sehingga berpotensi untuk dikembangkan sebagai obat antikanker. Kandungan flavonoid glikosida kuersetin  dalam  ekstrak  metanol  daun  kenikir  dilaporkan  memiliki  efek  sitotoksik  terhadap  sel kanker payudara T47D dengan IC 50 344,91 μg/mL (Pebriana dkk., 2008).
Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengukur efek sitotoksik kombinasi ekstrak metanol daun kenikir dengan doksorubisin terhadap pertumbuhan sel kanker payudara T47D secara in-vitro dan in-silico  dan  menentukan  dosis  kombinasi  yang  menghasilkan  efek  sitotoksik  yang  paling  kuat.
Prosiding Seminar Nasional Peluang Herbal Sebagai Alternatif Medicine Tahun 2015 ISBN: 978-602-19556-2-8 Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim
Sinergisitas  ekstrak  metanol  daun  kenikir  terhadap  doksorubisin  secara in-silico ditunjukkan dengan mengkaji kemampuan senyawa flavonoid glikosida kuersetin dan kuersetin dalam memacu apoptosis  sel  kanker  payudara  T47D  melalui  stimulasi  sitokrom  C  dari  mitokondria  dengan berikatan  pada  protein  Bcl-2  dan  Bcl-XL.  Efek  sinergisitas  secara in-vitro dilihat  dari  nilai Combination  Index (CI)  yang  diperoleh  dari  uji  sitotoksisitas  kombinasi  ekstrak  metanol  daun kenikir dan doksorubisin pada sel kanker payudara T47D.

## METODE PENELITIAN

## Bahan Penelitian
Daun  kenikir  ( Cosmos  caudatus Kunth.),  metanol,  kultur  sel  kanker  payudara  T47D (koleksi  CCRC,  Fakultas  Farmasi  UGM),  media  yang  mengandung  RPMI  1640  (Gibco),  media penumbuh yang mengandung FBS ( Fetal Bovine Serum ) 10% (Gibco) dan penisilin-streptomisin 1%  (Gibco),  DMSO  (Sigma),  ekstrak  metanol  daun  kenikir,  doksorubisin  (Sigma),  aquadest, reagen MTT (Sigma), dan reagen stopper berupa SDS 10% dalam HCl 0,01N (Merck). Senyawa glikosida kuersetin digambar dengan MarvinSketch , struktur kompleks protein Bcl-2 dan Bcl-XL diperoleh dari Protein Data Bank (PDB) didownload dari situs http://www.rscb.org/pdb .

## Alat Penelitian
Seperangkat  alat  gelas,  pemanas,  seperangkat  alat  sokletasi,  corong  pisah,  dan rotary evaporator (Heidolph),  mikroskop  fluoresens  (Axiolab),  mikroskop  cahaya,  ELISA reader (Anthos  2001), treated  tissue  culture  dish diameter  10  cm,  96 well-plate (Nunc),  sentrifus, sentrifuge  tube , object-glass ,  mikropipet, conical  tube , yellow-tip , blue-tip ,  pinset,    vortex,  dan kamera  digital.  PC, software PLANTS  1.1  manual,  Co-Pendrivelinux-KDE,  YASARA  dan MarvinSketch .
Uji In-Silico
Optimasi  geometri  senyawa  glikosida  kuersetin  dibuat  dalam  bentuk  struktur  3D menggunakan  program MarvinSketch .  Protein  dalam  bentuk  aktif  yang  berikatan  dengan native ligand selanjutnya  dipilih  untuk  proses  berikutnya. Native  ligand kemudian  dihilangkan  dengan program  YASARA  untuk  menyediakan  ruang  ( pocket/cavity) .  Ruang  ini  yang  akan  digunakan dalam analisis interaksi ligan dan protein dalam uji in silico . Native ligand selanjutnya dipasangkan kembali pada protein yang sudah dihilangkan native ligand -nya menggunakan program PLANTS. Root Mean Square Distances (RMSD) dari interaksi native  ligand dengan  proteinnya  dianalisis.  Jika  nilai  RMSD  kurang  dari  2,0  angstrom  ( 0 A), protokol diterima dan docking senyawa uji pada protein target dapat dilakukan. Jika nilai RMSD ≥ 2,0 0 A, maka digunakan protein dengan kode (PDB ID) lain.
Aglikon  kuersetin  ditambatkan  pada  protein  Bcl-2  dan  Bcl-XL  yang  sudah  dihilangkan native  ligand -nya  menggunakan  program  PLANTS.  Hasil  analisis  akan  menunjukkan  senyawa dengan  konformasi  yang  memiliki  energi  terendah  untuk  berikatan  dengan  protein  target. Visualisasi  residu  asam  amino  yang  berinteraksi  dengan ligand diolah  dengan  menggunakan program MOE (Purnomo, 2011).

## Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Kenikir
Daun    kenikir  yang  telah  dicuci  bersih  dikeringkan  dalam  oven  pada  suhu  40 o C  hingga memenuhi persyaratan kadar air simplisia secara umum, yaitu <10% (Depkes RI, 1979). Simplisia yang sudah kering kemudian diserbuk hingga halus dan diayak dengan pengayak B 30. Serbuk daun kenikir  diekstraksi  dengan  metode  soxhletasi  menggunakan  pelarut  metanol.  Ekstrak  cair  yang diperoleh kemudian dikentalkan menggunakan rotary evaporator .

## Uji Sitotoksik
Larutan uji ekstrak metanol daun kenikir dilarutkan dengan dimetil sulfoksid (DMSO) dan dibuat  seri  konsentrasi  (1000,  850,  700,  550,  400,  250,  dan  100)  µg/mL,  sedangkan  seri konsentrasi  doksorubisin  dibuat  (250,  200,  150,  100,  50,  25,  12,5  dan  2,5)  nM.  Sel  T47D  yang sebelumnya disimpan dalam tangki nitrogen disubkultur pada media kultur hingga siap digunakan

## Efek Sitotoksik Kombinasi Ekstrak Metanol Daun Kenikir
untuk uji. Sejumlah 1x10 4 sel didistribusikan ke dalam sumuran pada 96 well plate dan diinkubasi dalam  CO 2 5%  dengan  suhu  37 o C  selama  semalam.  Langkah  dalam  pengujian  tunggal  maupun kombinasi  yaitu  larutan  uji  ditambahkan  dalam  sumuran  untuk  selanjutnya  diinkubasi  selama  24 jam.  Media  dibuang,  kemudian  tiap  sumuran  dicuci  dengan  PBS  lalu  ditambahkan  media  kultur sebanyak  100  µL  dan  10  µL  MTT  dengan  konsentrasi  5  mg/mL.  Sel  kembali  diinkubasi  selama 4-6  jam  dalam  inkubator  CO 2 5%  bersuhu  37 o C.  Sel  yang  hidup  akan  bereaksi  dengan  MTT membentuk warna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper berupa SDS 10% dalam HCl  0,01N  (Merck)  lalu  diinkubasi  semalam  pada  suhu  kamar.  Serapan  dibaca  dengan  ELISA reader pada  panjang  gelombang  550  nm  kemudian  dilakukan  pengolahan  data  untuk  mendapat nilai IC 50 (Doyle dan Griffiths, 2000). Nilai IC 50 yang diperoleh dari pengujian tunggal digunakan untuk  menentukan  konsentrasi  kombinasi  antara  ekstrak  metanol  daun  kenikir  dan  doksorubisin dengan perbandingan 1 2 , 1 3 , 1 4 , 1 6 .

## Analisa Data
Data  absorbansi  atau  OD  ( Optical  Dencity )  yang  diperoleh  dari  pembacaan  ELISA  pada masing-masing sumuran kemudian dikonversikan dalam persen viabilitas sel menggunakan rumus sebagai berikut:
𝑷𝒆𝒓𝒔𝒆𝒏 𝑽𝒊𝒂𝒃𝒊𝒍𝒊𝒕𝒂𝒔 𝑺𝒆𝒍  = 𝑂𝐷 𝑠𝑒𝑙 𝑑𝑒𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 − 𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎
𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑠𝑒𝑙 − 𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑥 100 %
Selanjutnya, hasil perhitungan dianalisa secara statistika menggunakan software Microsoft Excell 2007 untuk  mendapatkan  nilai  IC 50 dari  perlakuan  tunggal  ekstrak  metanol  daun  kenikir  dan doksorubisin.  Daya  sitotoksik  sinergistik  ditentukan  dengan  menghitung  nilai  CI (Combination Index) menggunakan rumus sebagai berikut (Reynolds dan Maurer, 2005):
CI = (D) 1 /(D x ) 1 + (D) 2 /(D x ) 2
Konsentrasi  masing-masing  senyawa  uji  yang  digunakan  untuk  uji  kombinasi  dinyatakan dalam D 1 dan D 2 ,  sedangkan  konsentrasi  dari  senyawa  tunggal  yang  diperoleh  dari  interpolasi persen  viabilitas  sel  yang  disebabkan  oleh  perlakuan  kombinasi  (X)  pada  persamaan  regresi tunggal  dinyatakan  dalam Dx 1 dan Dx 2 . Score  docking terendah  menunjukkan  afinitas  reseptor- ligan terkuat karena paling stabil (membutuhkan energi paling kecil untuk berikatan).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Efek  Kombinasi  Ekstrak  Metanol  Daun  Kenikir  dengan  Doksorubisin  terhadap  Viabilitas Sel Kanker Payudara T47D secara In Vitro.
Uji docking  molecular bertujuan  untuk  mengetahui  mekanisme  molekuler  yang memperantarai  efek  apoptosis  aglikon  flavonoid  dan  glikosida  kuersetin  secara in-silico .  Hasil validasi  protein  Bcl-2  (PDB  ID  4LVT)  menunjukkan  bahwa  protokol docking  molecular dapat diterima yaitu dengan nilai RMSD <2 o A (Purnomo, 2011). Hasil docking molecular menunjukkan bahwa  energi  ikatan  antara  aglikon  flavonoid  dan  glikosida  kuersetin  terhadap  Bcl-2  yaitu (-63,3359)  dan  (-67,0414).  Doksorubisin  digunakan  sebagai  pembanding  dalam  pengujian  ini menunjukkan  energi  ikatan  terhadap  Bcl-2  sebesar  -84,9083.  Data  percobaan  yang  diperoleh tersaji pada tabel I.
Tabel I. Analisis Docking Molecular Etil p -metoksisinamat terhadap Protein Target Bcl-2
Keterangan Energi Ikatan (kkal/mol) Aglikon Flavonoid dan Glikosida Kuersetin terhadap Protein Target Bcl-2 (PD ID 4LVT) Aglikon Flavonoid -63,3359 Glikosida Kuersetin -67,0414 Doksorubisin -84,9083 Keterangan = RMSD : 1, 5897 0 A
Semakin rendah energi yang digunakan untuk berikatan menunjukkan bahwa interaksi yang terjadi  semakin  stabil.  Hasil  uji docking  molekular dalam  penelitian  ini  membuktikan  bahwa energi  ikatan  glikosida  kuersetin  dengan  protein  Bcl-2  lebih  kecil  dibandingkan  dengan  aglikon flavonoid,  namun  lebih  besar  dibandingkan  dengan  doksorubisin.  Hal  ini  dapat  diartikan  bahwa afinitas  glikosida  kuersetin  terhadap  protein  Bcl-2  lebih  rendah  dibandingkan  dengan doksorubisin,  sehingga  dapat  diprediksi  bahwa  potensi  glikosida  kuersetin  dalam  memicu apoptosis  sel  kanker  payudara  T47D  akan  rendah  bila  diberikan  secara  tunggal.  Oleh  karena  itu, penelitian  ini  merekomendasikan  berbagai  ekstrak  tanaman  yang  mengandung  senyawa  aktif glikosida kuersetin (termasuk ekstrak metanol daun kenikir) harus diberikan dalam bentuk terapi kombinasi dengan doksorubisin pada terapi kanker payudara. Sementara itu, untuk protein Bcl-XL tidak ditemukan kode PDB yang sesuai dengan ligan berupa glikosida kuersetin.

## Efek  Kombinasi  Ekstrak  Metanol  Daun  Kenikir  dengan  Doksorubisin  terhadap  Viabilitas Sel Kanker Payudara T47D secara In Vitro
Data  yang  dihasilkan  dari  uji  sitotoksik  dalam  penelitian  ini  kombinasi  adalah  persentase jumlah  sel  kanker  T47D  yang  masih  hidup  (%  viabilitas  sel)  setelah  tambahkan  seri  konsentrasi ekstrak  metanol  daun  kenikir,  seri  konsentrasi  doksorubisin  dan  kombinasinya.  Semakin  rendah nilai % viabilitas sel  menandakan bahwa bahan uji semakin potent dalam menginduksi kematian sel  kanker  payudara  T47D  secara  in  vitro.  Morfologi  sel  kanker  T47D  setelah  direndam  dalam ekstrak  metanol  daun  kenikir  selama  24  jam  dapat  dilihat  pada  gambar  1.  Hasil  penelitian membuktikan bahwa ekstrak metanol daun kenikir mampu membunuh sel kanker payudara T47D (gambar 1C). Sel kanker T47D yang masih hidup berbentuk helaian daun (1). Kematian sel kanker T47D  dapat  diamati  dari  perubahan  morfologi  sel.  Morfologi  sel  kanker  T47D  yang  mati berbentuk bulat, tampak keruh dan mengapung (2)

## A                                             B                                              C
Gambar 1.  Morfologi  sel  kanker  payudara  setelah  inkubasi  selama  24  jam. Kontrol  sel T47D  (A);  Doksorubisin  konsentrasi  250  nM  (B);  Ekstrak  Metanol  Daun  Kenikir konsentrasi 1.000 µg/mL (C). Sel Hidup (1) dan Sel Mati (2).
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  kenikir  dan doksorubisin  memiliki  kemampuan  yang  lebih  besar  dalam  menekan  viabilitas  sel  kanker payudara T47D dibandingkan pengujian sitotoksik bahan uji secara tunggal. Persentase viabilitas sel  kanker  payudara  T47D  yang  dihasilkan  dari  pengujian  efek  sitotoksik  kombinasi  ekstrak metanol  daun  kenikir  dan  dosorubisin  dapat  dilihat  pada  gambar  2.  Hasil  analisa  data menunjukkan  bahwa  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  kenikir  dan  doksorubisin  konsentrasi  130 µg/mL-41  nM;  195  µg/mL-41  nM;  dan  130  µg/mL-27,33  nM  menghasilkan  efek  sinergis  kuat dengan nilai indek kombinasi 0,2 ; 0,3 ; dan 0,3 (tabel II).
Aktivitas  sinergisme  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  kenikir  dan  doksorubisin, kemungkinan dihasilkan dari target aksi yang berbeda oleh kedua senyawa tersebut dalam memacu apoptosis  sel  kanker  payudara  T47D.  Mekanisme  aksi  doksorubisin  yaitu  melibatkan  ikatan dengan DNA melalui interkalasi diantara pasangan basa serta menghambat sintesis DNA dan RNA melalui  pengacauan template dan  halangan  sterik.  Mekanisme  aksi  yang  lain  melibatkan  ikatan dengan lipid membran sel, hal ini akan mengubah berbagai fungsi selular dan berinteraksi dengan topoisomerase II membentuk kompleks pemotong DNA (Rock dan DeMichele, 2003). Sedangkan ekstrak  metanol  daun  kenikir  diketahui  mengandung  senyawa  flavonoid  dan  glikosida  kuersetin. Glikosida kuersetin termasuk dalam golongan flavonoid yang mampu mengatur siklus sel kanker
dengan  mengikat  beberapa  target,  misalnya  dengan  pengeblokan  siklus  sel  pada  fase  G2/M  atau pada  transisi  G1/S.  Pengeblokan  pada  siklus  G1/S  melalui up-regulation di  p21,  p27,  dan  p53. Secara  khusus,  p21  menghambat  Cdk2- cyclin akibat  penghambatan  CDK2 dependent fosforilasi pRb  dan  penyerapan  E2F1  sehingga  transkripsi  gen  dan  fase  S  akan  terhambat.  Dalam  kondisi tertentu p27 mampu menghambat kompleks Cdk4- cyclin D dan CDK6- cyclin D. Tumor supresor p53 mampu mengkodekan inhibitor siklus sel dan memacu apoptosis. Selain berperan dalam siklus sel,  kuersetin  mampu  menginduksi  apoptosis  melalui  jalur  mitokondria,  yaitu  kuersetin  mampu mengganggu  MMP  sehingga  memicu  pelepasan  sitokrom  c  dalam  sitoplasma  serta  pengaktifan caspase-3 dan caspase-7 (Gibellini dkk., 2011).
Gambar 2.   Efek  perlakuan  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  kenikir  dengan  doksorubisin terhadap viabilitas sel kanker payudara T47D.
Tabel II.  Nilai Combination  Index (CI)  Ekstrak  Metanol  Daun  Kenikir  dan  Doksorubisin pada Sel Kanker Payudara T47D
Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Kenikir (μg/mL) Nilai CI Konsentrasi Doksorubisin (nM) 41 27,33 20,50 13,67 390 0,6 0,9 1,1 2,2 260 0,4 0,7 0,9 1,2 195 0,3 0,5 0,6 0,8 130 0,2 0,3 0,4 0,5

## KESIMPULAN
Hasil  uji docking  molecular membuktikan  bahwa  energi  ikatan  antara  glikosida  kuersetin dengan protein Bcl-2 lebih kecil dibandingkan aglikon flavonoid, namun lebih besar dibandingkan doksorubisin.  Ekstrak  metanol  daun  kenikir  dan  doksorubisin  mampu  menghasilkan  efek sitotoksik  sinergis  kuat  pada  konsentrasi  130  µg/mL-41  nM  ;  195  µg/mL  -41  nM  ;  dan  130 µg/mL-27,33 nM, dengan nilai indek kombinasi berturut-turut 0,2 ; 0,3 ; dan 0,3.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terimakasih kami sampaikan kepada Ditjen DIKTI melalui program PKM-P tahun 2015.

## DAFTAR PUSTAKA
American Cancer Society, 2013, Cancer Fact and Figure 2013 , American Cancer Society; Atlanta
Fera Elia Fita
Arifin I., Hermawan A., Ikawati M., Haryanti S., Anindyajati and Meiyanto E., 2012, Ursolic Acid Enhances  Doxorubicin  Cytotoxicity  on  MCF-7  Cells  Mediated  by  G2/M  Arrest, Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention , 3 (3), 410-418
Bapsy  P.P.  and  Sahoo  T.P.,  2004,  Recent  Advances  in  the  Management  of  Metastatic  Breast Cancer, Indian Journal Of Medical & Paediatric Oncology , 25 (2), 19-27
Childs  A.C.,  Phaneuf  S.L.,  Dirks  A.J.,  Phillips,  T.  and  Leeuwenburgh,  2002,  Doxorubicin Treatment in Vivo Causes Cytochrome c Release and Cardiomyocyte Apoptosis, as Well as  Increased  Mitochondrial  Efficiency,  Superoxide  Dismutase  Activity,  and  Bcl-2  :  Bax Ratio, Cancer Research , 62, 4592-4598
Depkes RI, 1979, Farmakope Indonesia , Edisi III, 151-152, 673, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
Doyle A. and Griffiths J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research, 402-418, John Wiley and Sons Ltd, New York
Gibellini  L.,  Marcello  P.,  Milena  NJ.P.,  Montagna,  S.D.B.,  Erika  R.,  Linda  B.,  Edwin  L.C.  and Andrea  C.,  2011,  Quercetin  and  Cancer  Chemoprevention, Hindawi  Publishing Corporation , No. 591356
Pebriana R.B., Wardhani B.W.K., Widayanti E., Wijayanti N.L.S., Wijayanti T.R., Riyanto S., dan Meiyanto E., 2008, Pengaruh Ekstrak Metanolik Daun Kenikir ( Cosmos caudatus Kunth.) terhadap Pemacuan Apoptosis Sel Kanker Payudara, Pharmacon , 9 (1), 21-26
Popov I., 2005, Signal Transduction Inhibition, Archive of Oncology, 13 , 48-50
Purnomo  H.,  2011, Kimia  Komputasi:  Molecular  Docking  PLANTS  Penambahan  Molekul PLANTS [Protein-Ligand-Ant-System] (“Ilmu Semut”) , Pustaka Pelajar, Yogyakarta
Reynolds C.P. and Maurer B.J., 2005, Evaluating Response to Antineoplastic Drug Combinations in Tissue Culture Models, Methods in Molecular Medicine , 110, 173-183
Rock  E.  and  DeMichele  A.,  2003,  Nutritional  Approaches  to  Late  Toxicities  of  Adjuvant Chemotherapy in Breast Cancer  Survivors, American Society for Nutritional Sciences, J. Nutr., 133 , 3785-3793
Schlattner  M.T.,  Zaugg  M.,  Zuppinger  C.,  Wallimann  T.,  and  Schlattner  U.,  2006,  New  Insights into Doxorubicin-induced Cardiotoxicity, The Critical Role of Cellular Energetics, Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 41 , 389-405
Singal  P.K.,  Iliskovic  N.,  Li,  T.  and  Kaur  K.,  2001,  Heart  Failure  Due  to  Doxorubicin, Kuwait Medical Journal, 33 (2), 111-115
WHO, 2011, World Health Rangkings, World Health Organization, United Nations