# Korespondensi:  Balai  Riset  Perikanan  Budidaya  Air  Tawar  dan Penyuluhan  Perikanan.
Jl.  Sempur  No.  1,  Bogor  16154,  Indonesia. Tel.  +  62  251  8313200 E-mail:  nunak.nafiqoh@kkp.go.id
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra
STATUS KESEHATAN IKAN  LELE (Clarias gariepinus) YANG  MENERIMA PAKAN BERSUPLEMEN KOMBINASI DAUN SIRIH (Piper betler leaf), JAMBU BIJI (Psidium guajava leaf), DAN KIPAHIT (Tithonia diversifolia leaf)
Nunak  Nafiqoh *)**)# ,  Sukenda **) ,  Muhamad  Zairin  Jr. **) ,  Alimuddin **) , Angela  Mariana  Lusiastuti *) ,  dan  Jean-Christophe  Avarre ***)
*) Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan Jl. Sempur  No. 1, Bogor 16154
**) Institut Pertanian Bogor Jl. Agatis, Kampus  Dramaga,  Bogor, Jawa Barat 16680
***) Institute Research and Development
(Naskah diterima: 8 Maret 2019; Revisi final: 1 April 2019; Disetujui publikasi: 1 April 2019)

## ABSTRAK
Tanaman  obat  telah  banyak  digunakan  sebagai  bahan  pencegah  dan  pengobatan  penyakit  pada  ikan budidaya. Penelitian ini ditujukan untuk mengetahui status kesehatan ikan lele (C. gariepinus) yang menerima pakan dengan suplemen tanaman obat kombinasi dari daun sirih, jambu biji, dan kipahit melalui pengamatan gambaran darah dan histologi ginjal sebagai organ yang memproduksi darah. Kombinasi satu merupakan kombinasi dari ketiga daun tanaman obat masing-masing sebanyak 33%, kombinasi dua juga terdiri dari daun  sirih,  jambu  biji,  dan  kipahit  masing-masing sebanyak  5%:19%:76%,  dan  kontrol  yaitu  pakan  tanpa penambahan  tanaman  obat.  Gambaran  darah  dan  histologi  ginjal  diamati  pada  minggu  ketiga  setelah pemberian pakan. Hasil pengamatan gambaran darah menunjukkan bahwa terdapat peningkatan jumlah sel darah merah pada ikan yang menerima pakan perlakuan dibandingkan dengan kontrol (0,4 ± 0,14). Namun tidak terdapat perbedaan nyata antara jumlah sel darah merah dari kelompok perlakuan kombinasi satu dan dua (1,5 ± 0,17 dan 1,4 ± 0,1). Jumlah sel darah putih pada kelompok perlakuan juga meningkat dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol  (10,5  ±  0,46),  namun  tidak  terdapat  perbedaan  nyata  antara kelompok perlakuan kombinasi satu dan dua (15,1 ± 1,19 dan 17,6 ± 1,14). Hasil pengamatan histologi terlihat jaringan hematopoietik organ ginjal dari kelompok yang menerima perlakuan berproliferasi lebih banyak dibandingkan kelompok kontrol. Namun tidak ada pengaruh pada nilai hemoglobin dan persentase leukosit  diferensiasi  antara  kelompok  perlakuan  dan  kontrol.  Penambahan  daun  tanaman  obat  dalam pakan ikan mampu meningkakan status kesehatan dari ikan lele.
KATA KUNCI: status kesehatan; Clarias gariepinus; pakan suplemen; Piper betle leaf; Psidium guajava leaf; Tithonia diversifolia leaf
ABSTRACT: Improving health quality of catfish (Clarias griepenus) fed with combination of medicinal herb- enriched diet. By: Nunak Nafiqoh, Sukenda, Muhamad Zairin Jr., Alimuddin, Angela Mariana Lusiastuti, and Jean-Christophe Avarre
Medicinal herbs have been traditionally used as prophylactic and therapeutic supplement to treat diseases in aquaculture. This study was aimed to improve the health quality of catfish (C. gariepinus) through feeding on diets enriched with a combination of betel, guava, and tithonia as medicine by analyzing hematology and histology of kidney as blood producing organ. Diet-one was feed enrich with 33% of each plant. Diet-two was feed enriched with betel, guava, and tithonia at a proportion of 5%,19%, and 76%, respectively. Control diet was fed without the plants’ supplementation. Hematology and histology of fish kidney were observed after fish received three-week feed treatments. The results showed that there was an increase of erythrocyte levels in the treated fish groups fed with diet-one and diet-two
compared with  the control (0.4 ±  0.14). However, no significant  differences of erythrocyte level  were observed between fish groups fed with diet -one and die-two (1.5 ± 0.17 and 1.4 ± 0.1). Leucocyte levels also increased in the treated fish group with diet-one and diet-two compared to the control (10.5 ± 0.46). However, there was no significant difference of leucocyte level between the fish group feed with diet-one and diet-two (15.1 ± 1.19 and 17.6 ± 1.14). Histological observations found that there were more hematopoietic tissues in the fish kidney of proliferated treated group than the control group. However, there was no effect on hemoglobin level and leukocyte percentage differentiation between the treatment and control groups. This study concludes that medicinal herbs as enrichment ingredients in fish diet can increase the health quality of fish.
KEYWORDS: health status; Clarias gariepinus; supplemented feed; Piper betler leaf; Psidium guajava leaf;
Tithonia diversifolia leaf
dilakukan untuk menghindari serangan agen penyakit pada ikan dengan meningkatkan status kesehatan pada ikan yang dipelihara. Dalam penelitian ini dilakukan pengamatan pada perubahan gambaran darah sebagai parameter  status  kesehatan  dari  ikan  lele  yang menerima suplementasi kombinasi daun sirih, jambu, dan kipahit dalam pakan,  serta histologi dari organ ginjal sebagai salah satu organ yang terkait dengan sistem  produksi  darah  termasuk  yang  berkaitan dengan  pertahanan  tubuh  bagi  ikan.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  status  kesehatan  ikan lele  (C.  gariepinus)  yang  menerima  pakan  dengan suplemen  tanaman  obat  kombinasi  dari  daun  sirih, jambu biji, dan kipahit melalui pengamatan gambaran darah  dan  histologi  ginjal  sebagai  organ  produsen darah.

## BAHAN DAN METODE

## Serbuk Tanaman Obat
Tanaman obat diperoleh dari kebun yang berlokasi di  Ciampea,  Bogor,  Jawa  Barat.  Pemanenan  daun tanaman  yang  digunakan  sebagai  obat  mengikuti pedoman  pemanenan  untuk  pembuatan  simplisia (Depkes RI, 1985). Daun sirih, jambu biji, dan kipahit yang  dipetik  merupakan  daun  kelima  dari  pucuk, sehingga daun yang diambil merupakan daun yang telah membuka  sempurna.  Daun  kemudian  dipotong, dicuci,  dan  dikeringanginkan  selama  15  menit. Potongan  daun  kemudian  dijemur  di  bawah  sinar matahari selama delapan jam, dan dilanjutkan dengan dikeringanginkan selama lima hari. Setelah itu, daun dimasukkan dalam mesin penggiling untuk dijadikan serbuk dan dikemas dalam wadah bersih dan kering.

## Persiapan  Pakan  Perlakuan
Pakan yang digunakan merupakan pakan komersial (pelet)  dengan  kadar  protein  31%-33%  yang  telah melalui  proses  penepungan.  Dua  kombinasi  dari tanaman obat dipersiapkan, yaitu kombinasi-1 terdiri dari  daun  sirih,  jambu  biji,  dan  kipahit  dalam persentase yang sama (33%:33%:33%) dan kombinasi-2 dengan perbandingan 5%:19%:76%. Sebanyak 80 gram

## PENDAHULUAN
Pembudiaya telah lama memberikan tanaman obat pada ikan peliharaannya untuk pencegahan penyakit sekaligus sebagai pengobatan (Wahjuningrum et al., 2014). Biasanya pembudidaya menggunakan tanaman yang  tumbuh  di  sekitar  kolam  untuk  melakukan tindakan pencegahan ataupun pengobatan. Salah satu tanaman perdu yang banyak tumbuh di sekitar kolam adalah  kipahit  (Tithonia  diversifolia).  Suhaya  (2014) menemukan bahwa kipahit adalah salah satu tanaman yang  mempunyai  potensi  untuk  dikembangkan menjadi salah satu sumber tanaman obat. Sedangkan penggunaan  daun  sirih  (Piper  betle)  dan  jambu  biji (Psidium guajava) telah diteliti oleh Angka (2005), dan melaporkan bahwa daun sirih dan jambu biji mampu mengatasi  penyakit  bakterial  Aeromonas  hydrophila. Tanaman  obat  yang  menarik  perhatian  adalah  daun sirih,  dikarenakan  sirih  merupakan  tanaman  yang diketahui mengandung  antibiotik alami  yang cukup tinggi. Dengan demikian tanaman ini menarik untuk dijadikan  kandidat  potensial  pengganti  antibiotik sintetis,  bahkan  daun  sirih  mempunyai  aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Entero- coccus yang telah resistan terhadap methicilin dan van- comycin (Valle et al., 2016).
Gambaran darah merupakan parameter yang dapat dipercaya sebagai representasi status kesehatan ikan yang diamati. Parameter ini menyajikan data yang cukup akurat  namun  sederhana.  Gambaran  darah  mampu menyajikan status fisiologi ikan, baik dipengaruhi oleh proses di dalam tubuh ikan maupun dari lingkungan hidup ikan yang diamati. Parameter yang penting selain gambaran darah adalah pengamatan organ penghasil darah  di  mana  terdapat  jaringan  hematopoietik  di dalamnya sebagai tempat di mana darah diproduksi, berproliferasi, dan berdiferensiasi (Ivanc et al., 2016).
Penggunaan  daun  sirih,  kipahit,  dan  jambu  biji tersebut  sebagai  bahan  penanggulangan  penyakit bakterial pada ikan telah dipelajari sebelumnya. Namun belum pernah dilakukan studi penggunaan kombinasi dari  ketiga  tanaman  obat  tersebut.  Pengaruh pemberian tanaman obat sebagai pencegahan perlu
campuran daun tanaman obat diaduk bersama 1 kg tepung dari  pakan komesial  (pelet). Pada  campuran ini juga ditambahkan 1% carboxymethylcellulose (CMC) sebagai  pengikat.  Selanjutnya  adonan  ini  dicetak kembali menjadi pelet.

## Pemeliharaan  Ikan  dan  Pengambilan  Sampel
Ikan  ditransportasikan  dari  Kecamatan  Cijeruk Kabupaten Bogor untuk dipelihara di Instalasi Riset Pengendalian Penyakit Ikan, Depok. Ukuran ikan lele yang  dipilih  adalah  7-8  cm  dengan  bobot  3-4  g. Transportasi ikan menggunakan kantong plastik yang telah disuplai dengan oksigen. Ikan diberikan makanan komersial  dengan  kadar  protein  31%-33%  selama proses  adaptasi  pada  lingkungan  laboratorium. Sebanyak  20  ekor  ikan  lele  dipelihara  dalam  air sebanyak  20  liter  menggunakan  wadah  plastik berukuran 53 cm x 45 cm x 25 cm. Pakan perlakuan diberikan selama tiga minggu, sebanyak dua kali dalam sehari.  Bobot  pakan  yang  diberikan  adalah  5%  dari biomassa ikan. Percobaan dilakukan dengan rancangan acak lengkap dalam tiga ulangan pada setiap perlakuan dan kontrol.
Sampel darah diambil pada akhir pemeliharaan dari vena caudal dengan syringe 1 mL. Darah dimasukkan ke  dalam  tube  dengan  3,8%  Na-sitrat  sebagai antikoagulan. Untuk analisis diferensial leukosit, darah diteteskan ke atas kaca objek dan diratakan.

## Hematokrit
Penentuan  nilai  hematokrit  dilakukan menggunakan tabung hematokrit. Darah dimasukkan ke  dalam  tabung  hingga  penuh,  kemudian disentrifugasi  menggunakan  sentrifus  hematokrit selama 20 menit. Persentase sel darah yang memadat (packed  cell  volume)  dari  total  keseluruhan  darah dihitung sebagai nilai hematokrit dan dinyatakan dalam persen (Sirimanapong et al., 2014).

## Hemoglobin
Nilai  hemoglobin  ditentukan  menggunakan metode  sianmethemoglobin  (Misra  et  al.,  2006). Sebanyak  5  mL  larutan  Drapkin  dimasukkan  dalam tabung, kemudian ditambahkan 20 µL darah. Larutan kemudian diinkubasi selama 2-3 menit dan diukur nilai absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Hasil nilai optical density (OD) dikalikan dengan nilai standar HiCN (36,8).

## Sel  Darah  Merah, Sel Darah  Putih,  dan Deferensiasi  Leukosit
Penghitungan jumlah  sel darah merah  dan putih mengikuti  metode  Binaii  et  al.  (2014).  Untuk
menghitung sel darah merah; darah diencerkan dalam larutan Dacie’s (3 g trisodium  citrate (Merck); 1 mL formalin  (Merck);  dan  99  mL  akuades).  Sedangkan untuk menghitung sel darah putih; darah diencerkan dalam larutan Turk’s (1 mL crystal violet 1% (Merck); 0,5 mL asam asetat glasial (Merck); 100 mL akuades). Penghitungan  sel  darah  merah  dan  darah  putih mengikuti rumus:
di mana: N : jumlah SDM dalam lima kotak (bilik R)
P : pengenceran 50 : volume kotak (4.000)/jumlah bujur sangkar (80)
di mana:
N : jumlah SDP dalam empat kotak (bilik W)
P : pengenceran
2,5 : volume kotak (160)/jumlah bujur sangkar (64)
Persentase  diferensial  leukosit  diamati  dengan menghitung 100 sel darah putih dan diamati secara deskriptif untuk masing-masing jumlah dari tiap jenis leukosit (Corrêa et al., 2017).

## Histologi
Pada akhir percobaan, satu ekor ikan dari setiap bak dibedah dan organ ginjalnya diambil dan difiksasi dalam  10%  NBF  (neutral  buffered  formalin).  Jaringan kemudian didehidrasi menggunakan rapid tissue pro- cessor (Milestone) mengikuti petunjuk dari alat yang digunakan. Selengkapnya, jaringan dimasukkan dalam histomodule  dan  difiksasi  menggunakan  formalin selama 30 menit. Jaringan kemudian didehidrasi dalam etanol absolut (Merck) selama 25 menit, dilanjutkan dengan  isopropanol  (Merck)  selama  55  menit  dan terakhir dimasukkan dalam parafin selama satu jam 15 menit. Jaringan yang telah didehidrasi ditambahkan parafin (Merck) dalam proses blocking. Blok yang sudah selesai  diolah,  dipotong  menggunakan  mikrotom dengan ketebalan 4 µm. Potongan jaringan diletakkan pada kaca preparat dan diwarnai menggunakan metode Hematoksilin (Merck) dan Eosin (Merck). Pengamatan jaringan dilakukan menggunakan mikroskop (olympus BX 41) dengan perbesaran 400 kali.

## Analisis  Statistik
Semua data hematologi dianalisis secara ANOVA satu arah menggunakan program statitistik SPSS versi 18. Hasil histologi dianalisis secara deskriptif.
50 x p x N (SDM) merah darah Sel  2,5 x p x N (SDP) putih darah Sel 

## HASIL DAN BAHASAN
Tanaman mengandung beberapa bahan aktif yang mungkin dapat memengaruhi proses biokomia dalam tubuh.  Studi  fitokimia  tanaman  obat  telah  banyak dilakukan. Senyawa yang terkandung dalam tanaman obat di antaranya alkaloid, flavonoid, steroid, terpe- noid,  tannin,  dan  saponin.  Beberapa  tanaman  juga mengandung karbohidrat, asam amino, dan vitamin (Oluwasola & Dairo, 2016). Ketiga tanaman obat yang digunakan pada percobaan ini mempunyai kandungan bahan aktif seperti tertera pada Tabel 1.
Pada  analisis  senyawa  aktif  ditemukan  bahwa senyawa yang terkandung dalam daun sirih di antaranya adalah  chavibetol  dan  eugenol  (Shah  et  al.,  2016). Sedangkan  daun  jambu  dan  kipahit  mempunyai kandungan senyawa aktif yang hampir sama termasuk di  dalamnya  pinene  dan  Germacrene  D  dalam presentase yang berbeda (Thenmozhi & Rajan, 2015).
Gambaran  darah  pada  ikan  dipengaruhi  oleh beragam faktor, antara lain; adanya penyakit, proses inflamasi, stres, fisiologi, asupan nutrisi, serta faktor lingkungan (Clauss et al., 2008). Nutrisi ikan yang telah ditambah  bubuk  daun  tanaman  obat  mengandung bahan aktif diduga mampu memberikan dampak pada perubahan status kesehatan pada ikan.
Hasil  analisis  hematokrit  dan  hemoglobin menunjukkan  tidak  ada  perbedaan  yang  signifikan antara perlakuan dan kontrol. Jumlah sel darah merah pada  perlakuan  penambahan  daun  tanaman  obat menunjukkan perbedaan yang nyata secara statistik dibandingkan dengan kontrol. Jumlah sel darah putih pada  kelompok  kombinasi-2  (17,6  ±  1,14) menunjukkan  perbedaan  signifikan  secara  statistik dibandingkan kontrol (10,5 ± 046), namun perlakuan kombinasi satu (15,1 ± 1,19) menunjukkan perbedaan yang  tidak  signifikan  dibandingkan  pada  kelompok kombinasi-2 dan kontrol (Tabel 2).
Flavonoid yang terkandung pada ketiga tanaman obat yang digunakan  diduga memberikan pengaruh pada status kesehatan ikan yang diamati. Flavonoid merupakan metabolit sekunder yang diproduksi oleh tanaman, dibagi dalam beberapa grup termasuk fla- vonol, flavone, isoflavone, flavanones, flavanols, dan anthocyanidins.  Flavonoid  dapat  bertindak  sebagai anti-inflamasi  dan  antioksidan,  serta  mempunyai peranan  dalam  sistem  imun  (Perez-Cano  &  Castell, 2016).
Tannin merupakan senyawa yang bersifat antinutrisi jika  dikonsumsi  secara  terus-menerus,  terutama mengganggu  penyerapan  besi  dari  asupan  nutrisi. Senyawa ini terdeteksi cukup banyak pada daun sirih
Tabel 1. Kandungan senyawa bahan aktif pada daun sirih (Piper betler leaf), jambu biji (Psidium guajava leaf), dan kipahit (Tithonia diversifolia leaf)
Table 1. Active compound of Piper betler leaf,  Psidium guajava leaf, and Tithonia diversifolia  leafers
Keterangan (Note): - :  tidak terdeteksi (not detected);
+ nd :  terdeteksi namun tidak diamati secara kuantitatif (detected but not quantitively observed)
Senyawa bahan aktif Active compound Daun sirih Piper betle Daun jambu biji Psidium guajava Daun kipahit Tithonia diversifolia Manfaat Benefits Flavonoid Flavonoid 46.08 mg.g -1 6.42 mg.g -1 0.85 mg.g -1 Antioksidan Antioxidants Fenolik Phenolic 47.48 mg.g -1 9.33 mg.g -1 0.06 mg.g -1 Antioksidan Antioxidants Alkaloid Alkaloid - + nd 15.35 mg.g -1 Antioksidan Antioxidants Terpenoid Terpenoid + nd + nd 0.13 mg.g -1 Anti kanker Anti cancer Tannin Tannin 29.33 mg.g -1 4.3 mg.g -1 0.54 mg.g -1 Haemostatik Haemostatic Saponin Saponin + nd 3.67 mg.g -1 0.76 mg.g -1 Antimikrobial Antimicrobial Acuan Reference Periyanayagam et al . (2012) Sundang et al . (2012) Kenneth et al . (2017) Thenmozhi & Rajan (2015) Olayinka et al . (2015)
(Tabel 1). Perlakuan kombinasi satu yang mengandung 33%  daun  sirih  dimungkinkan  memengaruhi  nilai gambaran  darah  pada  ikan  uji.  Sedangkan  pada perlakuan  kombinasi-2,  jumlah  daun  sirih  yang ditambahkan sejumlah 5%. Daun kipahit merupakan tanaman obat dengan persentase tertinggi (76%) pada pelakuan kombinasi-2. Kandungan senyawa tannin pada daun  kipahit  hanya  0,54%;  jauh  lebih  rendah dibandingkan  dengan  kandungan  tannin  pada  daun sirih. Pada studi yang melibatkan tannin pada pakan benih  Laboe  rohita  oleh  Prusty  et  al.  (2007) menyebutkan bahwa penambahan tannin pada pakan hingga  20  g.kg -1 pakan  tidak  memengaruhi pertumbuhan namun berdampak pada gambaran darah dari ikan yang diuji. Sedangkan konsumsi tannin yang masih  terkandung  dalam  daun  teh  memberikan dampak  pada  penurunan  penyerapan  besi  jika dibandingkan hewan uji tikus yang tidak mendapatkan perlakuan (Delimont et al., 2012).  Pada ikan  diduga terjadi juga  respons yang sama saat  ikan menerima pakan yang ditambah daun yang mengandung tannin.
Pada penelitian sebelumnya  penambahan bagian aerial dari tanaman willow pada pakan ikan mas mampu meningkatkan produksi sel darah putih namun  tidak memengaruhi nilai hematokrit dan hemoglobin serta jumlah  sel  darah  merah  pada  kelompok  perlakuan dibandingkan kontrol. Kandungan  flavonoid, tannin dan steroid yang tinggi pada tanaman willow diduga meningkatkan  sifat  antibakteri  tanaman  tersebut (Pakravan et al., 2012), namun diduga pula senyawa tersebut memengaruhi proses biokimia dalam tubuh ikan yang diberikan perlakuan.
Secara  umum  sel  darah  putih  ikan  terdiri  atas monosit,  neutrophil,  dan  limfosit.  Monosit  dan
neutrofil  merupakan  sel  darah  putih  yang  bisa bertindak  sebagai  makrofag.  Sedangkan  sel  darah limfosit akan berdiferensiasi menjadi sel T dan sel B. Pada perlakuan baik kombinasi satu maupun dua tidak terdapat  perbedaan  pada  komposisi  leukosit  yang terhitung jika dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar  1).  Hasil  ini  disebabkan  perubahan persentase  jenis  leukosit  lebih  banyak  dipengaruhi oleh adanya aktivitas serangan patogen atau perubahan kondisi  lingkungan  terhadap  ikan  budidaya,  seperti hasil studi yang telah dilaporkan Irang & Reyes (2017) dengan  menambahkan  ekstrak  acacia,  annatto,  dan indian mango pada media pemeliharaan ikan nila.
Pada teleostei organ utama yang memproduksi sel darah  adalah  ginjal.  Struktur  ginjal  depan  tidak berhubungan dengan fungsi ekskresi. Pada ginjal depan ini  didominasi  oleh  sel  yang  berhubungan  dengan jaringan hematopoietik (Gambar 2). Sel blast sebagai bagian  dari  sel  hemopoietik  berada  dalam  jaringan stroma yang berfungsi sama dengan sumsum tulang belakang  pada  mamalia.  Selain  berfungsi  sebagai produsen  sel  darah,  jaringan  hematopoietic  juga berfungsi sebagai pusat melanomakrofag sebagai sel yang berkaitan dengan sistem pertahanan pada ikan teleostei (Genten et al., 2009). Jaringan hematopietik yang disuplementasi dengan tanaman obat (Gambar 2a; 2b) tampak berproliferasi lebih baik dibandingkan dengan kontrol (Gambar 2c).
Differensiasi sel darah terjadi pula di organ ginjal depan.  Eritrosit  berbentuk  elips  atau  bulat,  limfoid mempunyai nukleus besar dengan sitoplasma tipis di sekitar nukleus. Neutrofil biasanya mempunyai bentuk nukleus yang terdiri atas dua lobus dengan sitoplasma yang  ber-granul,  sedangkan  monosit  mempunyai
Tabel 2. Gambaran  darah  ikan  lele  (Clarias  gariepinus)  setelah  menerima  pakan bersuplemen tanaman obat kombinasi
Table 2. Hematological parameter of Clarias gariepinus after received medicinal plant-enriched diet (mean ± SE)
Keterangan (Note): Perbedaan huruf pada baris yang sama mengindikasikan beda nyata secara statistik (P<0,05); (mean ± SE, n=3)
Different  letter  in  one  row  indicate  a  statistically  significant  different  (P<0.05),  (mean
± SE,  n=3))
Kombinasi-1 Combination-1 Kombinasi-2 Combination-2 Kontrol Control Hematokrit (Hematocrite ) (%) 28.9 ± 1.77 a 28.9 ± 1.61 a 32.5 ± 1.05 a Hemoglobin (Hemoglobin ) (g.dL -1 ) 2.8 ± 0.07 a 4.1 ± 0.25 a 3.0 ± 0.25 a Jumlah sel darah merah (Erythrocyte ) (10 6 .mm -3 ) 1.5 ± 0.17 a 1.4 ± 0.1 a 0.4 ± 0.14 b
Jumlah sel darah putih (Leucocyte ) (10 5 .mm -3 ) 15.1 ± 1.19 ab 17.6 ± 1.14 a 10.5 ± 0.46 b Parameter Parameters Perlakuan (Treatments )
Gambar 1. Leukosit diferensiasi pada ikan lele (Clarias gariepinus) setelah menerima pakan bersuplemen tanaman obat kombinasi (mean ± SE). Perbedaan huruf mengindikasikan beda nyata secara statistik  (P<0,05).
Figure 1. Differential leucocyte of Clarias gariepinus after received medicinal plant-enriched diet (mean ± SE). Diffrent letter indicate a statistically significant different (P<0.05).
* * * 12.33 a 14.75 a
11.25 a
7.25 a
7.33 a 8.6 a 78.6 a 73.8 a 79.4 a
Kombinasi-1 Combination-1 Kombinasi-2 Combination-2 Kombinasi-3 Combination-1 Monosit Neutrofil
Limfosit
Gambar 2. Histologi  organ  ginjal  ikan  lele  (Clarias  gariepinus)  setelah  menerima  pakan bersuplemen tanaman obat kombinasi; (a) kombinasi-1; (b) kombinasi-2; (c) kontrol. Jaringan tubulus (tanda panah), area ekstensif dari jaringan hemopoetic (*).
Figure  2. Kidney histology of Clarias gariepinus after received medicinal plant-enriched diet (a) combination-1; (b) combination-2; (c) control, kidney’s tubules (arrows), extensive area of hematopoietic (*).
A                                                                                    B
C
Kombinas-1
Combination-1 Kombinas-2 Combination-2
Kombinas-3 Combination-3
bentuk  sel  yang  tidak  beraturan  dengan  nukleus berukuran  besar  (Gangopadhyay  &  Homechaudhur, 2011).
Dalam ginjal, pembentukan sel darah diawali dari sel punca hematopoietik (hematopoietic stem cell) yang berasal  dari  sel  punca  multiponent.  Sel  punca  ini berproliferasi dan berdiferensiasi terus-menerus dalam organ.  Sel  punca  hematopoietik  berdiferensiasi menjadi  sel  hematopoietikmyeloid  dan  limphatic. Myeloid  berdiferensiasi  menjadi  sel  eritopoiesis, trombopoiesis, eosinofil, basofil, granulopoiesis, dan monopoiesis.  Sel-sel  tersebut  akan  bermaturasi menjadi  eritrosit,  trombosit,  eosinofil,  basofil, neutrofil,  dan  monosit.  Lymphoid  berdiferensiasi menjadi  sel  NK,  limfopoiesis  T,  dan  limfopoiesis  B yang akan matang menjadi sel NK, limfosit T, dan B (Theml et al., 2004). Sel eritrosit, limfosit, monosit, dan  neutrofil  hasil  maturasi  dari  sel  hematopoietik myeloid disajikan pada Gambar 3.
Pada kelompok perlakuan, peningkatan jumlah sel darah  yang  terhitung  diduga  disebabkan  adanya metabolit  sekunder  bahan  tanaman  yang  berupa senyawa  aktif.  Kedua  kombinasi  proporsi  daun tanaman obat mempunyai kandungan bahan yang sama dengan  persentase  yang  berbeda.  Ketiganya mengandung eugenol dari tanaman  sirih dan terpe-
nes, baik pinene maupun caryophyllene yang berasal dari daun jambu dan kipahit. Pada kombinasi-1, ketiga tanaman obat dikombinasikan dengan perbandingan yang  sama,  sedangkan  pada  kombinasi  dua  jumlah tanaman  obat yang  mengandung terpenes  memiliki persentase lebih banyak. Persentase yang berbeda dari kedua  kombinasi  tersebut  menghasilkan  pengaruh yang tidak berbeda nyata pada parameter-parameter yang diamati.
Seperti  telah  dijelaskan  sebelumnya  bahwa  sel darah  terbentuk  dari  sel  punca  multiponent  yang berdiferensiasi.  Sel  punca  multiponent  ini  mampu memperbaharui  diri  sendiri  dalam  kurun  waktu tertentu.  Perbaruan  sel  punca  ini  dipengaruhi  oleh kondisi  lingkungan  mikro  dalam  jaringan  organ. Penelitian melibatkan penambahan senyawa aktif eu- genol  pada  kondisi  in  vitro  mampu  meningkatkan proliferasi dan migrasi pada sel punca mesenchyma yang  diisolasi  dari  sumsum  tulang  belakang (Sisakhtnezhad et al., 2017). Hasil penelitian ini diduga mempunyai  mekanisme  yang  sama  pada  sel  punca hematopoietic yang berimbas pada naiknya jumlah sel darah merah dan darah putih pada kelompok ikan yang diberi pakan perlakuan.
Proliferasi  dan  diferensiasi  sel  punca  juga dipengaruhi oleh reseptor cannabinoid yakni CB1 dan
Gambar 3. Histologi  organ  ginjal  ikan  lele  (Clarias  gariepinus)  berdasarkan
differensiasi  sel  darah  (1)  eritrosit;  (2)  limfosit;  (3)  monosit;  (4) neutrofil. Figure 3. Kidney histology of Clarias gariepinus based on blood cell differentiation (1) erytrocyte; (2) limphocyte; (3) monocyte; (4) neutrophil.
1 2 3 4
CB2 (Galve-Roperh et al., 2013). Reseptor ini terletak di beberapa bagian tubuh terutama di otak (Mackie, 2008).  Reseptor  canabinoid  bersama  dengan  ligan membentuk sistem endocannabinoid (endocannabinoid system) yang dimodulasi oleh senyawa yang terdapat pada tanaman darat dan air termasuk terpena (terpe- noid) yang terkandung pada tanaman obat kipahit dan jambu biji (Badal et al., 2017).

## KESIMPULAN
Perlakuan penambahan tanaman obat kombinasi satu dan dua pada pakan dapat meningkatkan status kesehatan ikan lele. Hal ini terlihat dari produksi sel darah  merah  yang  meningkat  hingga  3,6  kali  dan produksi sel darah putih yang meningkat hingga 1,55 kali jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Hasil pengamatan histologi menunjukkan bahwa tanaman obat baik kombinasi-1 maupun kombinasi-2 yang telah diberikan  mampu  meningkatkan  proliferasi  organ hematopoietik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih pada Saudara Ahmad Wahyudi, Edi Farid Wadjdi, Setiadi, dan Johan Afandi, serta seluruh staf Instalasi Riset Pengendalian Penyakit  Ikan,  Balai  Riset  Perikanan  Air  Tawar  dan Penyuluhan Perikanan, Bogor atas bantuanya pada saat proses pengerjaan penelitian.

## DAFTAR  ACUAN
Angka, S.L. (2005). Kajian penyakit MAS pada ikan lele dumbo patologi, pencegahan dan pengobatan dengan fitofarmaka. Disertasi. Institut Pertanian Bogor. In- donesia.
Badal, S., Smith, K.N., & Rajnarayanan, R. (2017). Analy- sis of natural product regulation of cannabinoid receptors  in  the  treatment  of  human  disease. Pharmacology & Therapeutics, 180, 24-48.
Binaii, M., Ghiasi, M., Farabi, S.M.V., Pourgholam, R., Fazli,  H.,  Safari,  R.,  Alavi,  S,E.,  Taghavi,  M.J.,  & Bankehsaz,  Z.  (2014).  Biochemical  and  hemato- immunological parameters in juvenile beluga (Huso huso) following the diet supplemented with nettle (Urtica dioica). Fish & Shellfish Immunology, 36, 46- 51.
Clauss,  T.M.,  Dove,  A.D.M.,  &  Arnold,  J.E.  (2008). Hematologic disorders of fish. Veterinary Clinics of North America - Exotic Animal Practice, 11(3), 445- 462.
Corrêa,  S.A.S.,  Abessa,  D.M.S.,  Santos,  L.G.,  Silva, E.B., & Seriani, R. (2017). Differential blood count- ing in fish as a non-destructive biomarker of wa- ter contamination exposure. Toxicological and En- vironmental Chemistry, 99(3), 482-491.
Delimont, N.M., Haub, M.D., & Lindshield, B.L. (2012). The  impact  of  tannin  consumption  on  iron bioavailability and status/ : A narrative review. Cur- rent Developments In Nutrition, p. 1-12.
Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia.  (1985). Cara  pembuatan  simplisia.  Direktorat  Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan
Gangopadhyay, K. & Homechaudhur, S. (2011). Descrip- tive characteristics of haemopoietic cell lineages in a facultative air breathing fish Clarias batrachus (L.). Turkish Journal of Zoology, 35(5), 737-746.
Genten, F., Terwinghe, E., & Danguy, A. (2009). Atlas of  fish  histology.  Second  eds.  New  Hampshire, USA: Science Publishers.
Irang, E.Y.F. & Reyes, A.T. (2017). Assessment of the inhibitory  effect  of  selected  medicinal  plants against Aeromonas Sobria in nile tilapia (Oreochromis niloticus L.). International Journal of Agricultural Tech- nology, 13, 2229-2248.
Ivanc, A., Haskovic, E., Jeremic, S., & Dekic, R. (2016). Hematological evaluation of welfare and health of fish. Praxis Veterinaria, 53(3), 191-202.
Kenneth,  E.,  Paul,  T.,  Istifanus,  N.,  Uba,  U.,  Rejoice, A.,  Victor,  O.,  &  Mohammed,  S.  (2017).  Phy- tochemical  analysis  and  antibacterial  activity  of Psidium guajava L leaf extracts. GSC Biological and Pharmaceutical Sciences, 1(2), 13-19.
Mackie, K. (2008). Cannabinoid receptors: where they are and what they do. Journal of Neuroendocrinol- ogy, 20(s1), 10-14.
Misra, S., Sahu, N.P., Pa, A.K., Xavier, B., Kumar, S., & Mukherjee,  S.C.  (2006).  Pre-  and  post-challenge immuno-haematological changes  in Labeo  rohita juveniles  fed  gelatinised  or  non-gelatinised  car- bohydrate with n-3 PUFA. Fish & Shellfish Immunol- ogy, 21, 346-356.
Olayinka, B.U., Raiyemo, D.A., & Etejere, E.O. (2015). Phytochemical  and  proximate  compostition  of Tithonia diversifoila (Hemsl.) A. Gray. Annals, Food Science and Technology, 16(1), 195-200.
Oluwasola, T.A. & Dairo, F.A.S. (2016). Proximate com- position, amino acid profile and some anti-nutri- ents  of  Tithonia  diversifolia  cut  at  two  different times.  African  Journal  of  Agricultural  Research, 11(38), 3659-3663.
Pakravan, S., Hajimoradloo, A., & Ghorbani, R. (2012). Effect of dietary willow herb, Epilobium hirsutum extract  on  growth  performance,  body  composi- tion,  haematological  parameters  and  Aeromonas hydrophila  challenge  on  common  carp,  Cyprinus carpio. Aquaculture Research, 43(6), 861-869.
Perez-Cano, F.jJ. & Castell, M. (2016). Flavonoids, in- flammation and immune system. Nutrients, 8(659), 8-11.
Periyanayagam,  K.,  Jagadeesan,  M.,  Kavimani,  S.,  & Vetriselvan,  T.  (2012).  Pharmacognostical  and phyto-physicochemical  profile  of  the  leaves  of Piper betle L. var Pachaikodi (Piperaceae) - valuable assessment  of  its  quality.  Asian  Pacific  Journal  of Tropical Biomedicine, 2(2 SUPPL.), 5-9.
Prusty, A.K., Sahu, N.P., Pal, A.K., Reddy, A.K., & Kumar, S. (2007). Effect of dietary tannin on growth and haemato-immunological  parameters  of  Labeo rohita (Hamilton) fingerling. Animal Feed Science and Technology, 136: 96-108.
Shah,  S.K.,  Garg,  G.,  Jhade,  D.,  &  Patel,  N.  (2016). Piper betle: Phytochemical, pharmacological and nutritional value in health management. Interna- tional  Journal of  Pharma Sciences,  Revision and  Re- search, 38(2), 181-189.
Sirimanapong,  W.,  Thompson,  K.D.,  Kledmanee,  K., Thaijongrak,  P.,  Collet,  B.,  Lin,  E.,  &  Adams,  A. (2014). Optimisation and standardisation of func- tional  immune  assays  for  striped  cat  fish (Pangasianodon  hypophthalmus)  to  compare  their immune response to live and heat killed Aeromonas hydrophila as models of infection and vaccination. Fish and Shellfish Immunology, 40(2), 374-383.
Sisakhtnezhad, S.,  Heidari, M.,  & Bidmeshkipour,  A. (2017). Eugenol enhances proliferation and migra- tion  of  mouse  bone  marrow-derived  mesenchy- mal stem cells in vitro. Environmental Toxicology and Pharmacology, 57, 166-174. https://doi.org/10.1016/ j.etap.2017.12.012.
Suhaya, D.D. (2014). efektivitas ekstrak kipahit tithonia diversifolia  dan  kirinyuh  eupatorium  inulaefolium untuk pencegahan dan  pengobatan penyakit akibat infeksi Aeromonas hydrophila pada ikan lele Clarias sp. melalui pakan. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Indonesia
Sundang,  M.,  Nasir,  C.S.,  Sipaut,  S.N.S.,  &  Othman, H. (2012). Antioxidant activity, phenolic, flavonoid and tannin content of Piper betle and Leucosyke capi- tella murni. Malaysian Journal of Fundamental & Ap- plied Sciences, 8(1), 1-6.
Theml,  H.,  Diem,  H.,  &  Haferlach,  T.  (2004).  Color atlas of hematology/ : Practical microscopic and clinical  diagnosis.  (2 nd eds).  Thieme,  Stuttgart. Germany.
Thenmozhi, S. & Rajan, S. (2015). GC-MS analysis of bioactive  compounds  in  Psidium  guajava  leaves. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 3(5), 162-166.
Valle, D.L., Cabrera, E.C., Puzon, J.J.M., & Rivera, W.L. (2016). Antimicrobial activities of methanol, etha- nol  and  supercritical  CO2  extracts  of  Philippine Piper betle L. on clinical isolates of gram positive and gram negative bacteria with transferable mul- tiple drug resistance. PLoS ONE, 11(1), 1-14.
Wahjuningrum, D., Astrini, R., & Setiawati, M. (2014). Pencegahan  infeksi  Aeromonas  hydrophila  pada benih ikan lele Clarias sp. yang berumur 11 hari menggunakan  bawang  putih  Allium  sativum  dan meniran Phyllanthus niruri. Jurnal Akuakultur Indo- nesia, 12(1), 94-104.