Potensi Ekstrak Kakao ( Theobroma cacao ) dalam Menghambat Kerusakan Eritrosit yang Diinduksi Racun Physalia utriculus In Vitro
Cocoa (Theobroma cacao) Extract Potency  in Inhibiting Erythrocyte Damage Induced by Physalia utriculus Venom
Adinningtyas Intansari 1 , Al Munawir 2 , Laksmi Indreswari 3
1 Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran Universitas Jember
2 Laboratorium Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Jember
3 Laboratorium Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Jember email korespondensi: adinningtyasintan@gmail.com

## Abstrak
Physalia utriculus atau ubur-ubur merupakan salah satu biota laut invertebrata yang sering ditemukan di perairan Indonesia . Kakao ( Theobroma cacao L.) terutama bijinya mengandung lemak, karbohidrat, protein, dan senyawa polifenol  yang  berguna  sebagai  antioksidan.  Penelitian  ini  menggunakan  sampel  eritrosit  berjumlah  28  sampel yang  dibagi  menjadi  tujuh  kelompok,  yaitu  kelompok  kontrol  positif,  kontrol  negatif,  dan  perlakuan  dengan pemberian  ekstrak  etanol  kakao  0,2%,  0,1%,  0,04%,  dan  0,02%.  Masing-masing  kelompok  selanjutnya  diinduksi racun Physalia  utriculus. Hasil  penelitian  didapatkan  Rerata  kecepatan  lisis  eritrosit  pada  kelompok  perlakuan dengan  pemberian  ekstrak  etanol  kakao  0,2%,  0,1%,  0,04%,  dan  0,02%  berturut-turut  adalah  858,25 ± 94,44; 1.000,5 ± 159,93; 678,5 ± 19,71; dan 1.006 ± 159,50 (dalam detik). Rerata kecepatan lisis eritrosit pada kelompok kontrol  negatif  sebesar  1.025  ±  164.63  detik  dan  kelompok  kontrol  positif  dengan  pemberian N-Acetylcystein dapat  bertahan  hingga  lebih  dari  satu  jam  setelah  pemberian  racun  (data  tidak  ditampilkan).  Analisis One  Way Annova menujukkan  nilai  signifikansi  p  <  0,05.  Pada  penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  pemberian  ekstrak etanol kakao tidak berpotensi menghambat kerusakan eritrosit yang telah diinduksi racun Physalia utriculus secara in vitro .
Kata kunci: kakao, kerusakan eritrosit, Physalia utriculus

## Abstract
Physalia utriculus or jellyfish is one of the invertebrate marine biota that is often found in Indonesia. Cocoa beans (Theobroma  cacao  L.)  contain  fat,  carbohydrates,  proteins,  and  polyphenol  compounds  that  are  useful  as antioxidants.  The  purpose  of  this  study  was  to  determine  the  potency  of  cacao  (Theobroma  cacao  L.)  ethanol extract in inhibiting the damage of erythrocyte induced by Physalia utriculus in vitro. This study used 28 samples of erythrocytes divided into  seven groups, namely the normal control group, negative controls, and treatment  with cocoa ethanol extract 0.2%, 0.1%, 0.04%, and 0.02%. Each subsequent group induced venom Physalia utriculus. The results showed that the average speed of erythrocyte lysis in the treatment group by giving cocoa ethanol extract 0.2%, 0.1%, 0.04%, and 0.02% respectively (seconds ± standard deviation) was 858,25 ± 94,44; 1.000,5 ± 159,93; 678,5 ± 19,71; and 1.006 ± 159,50. The mean speed of erythrocyte lysis in the negative control group was 1,025 ± 164.63  and  the  positive  control  group  with  the  administration  of  N-Acetylcystein  can  last  up  to  one  hour  after administration  of  venoms.  Test  for  normality  and  homogeneity  shows  that  data  is  normally  distributed  and homogeneous. One Way Annova analysis shows the significance value of p <0.05. In this study it can be concluded that  the  administration  of  cocoa  ethanol  extract  has  no  potential  to  inhibit  erythrocyte  damage  that  has  been venomed by Physalia utriculus in vitro.
Keywords : Physalia utriculus, cacao, erythrocyte damage

## Pendahuluan
Indonesia  merupakan  negara  maritim  dengan  tiga perempat presentasi wilayahnya berupa laut dengan panjang  garis  pantai  95.161  km,  terpanjang  kedua setelah  Kanada.  Salah  satu  biota  laut  yang  sering ditemukan ialah ubur-ubur.
Ubur-ubur  termasuk  ke  dalam  filum Coelenterata yang  dapat  menyebabkan  terjadinya  keracunan pada  manusia.  Spesies  ubur-ubur  yang  sering ditemukan  adalah Physalia  utriculus. Beberapa gejala  keracunan  akibat  sengatan  ubur-ubur menyebabkan  rasa  sakit  dan  gatal  pada  kulit  serta komplikasi  pada  jantung  dan  saraf  sebagai  gejala sistemik akibat racun yang masuk melalui peredaran darah  (Tibbals,  2006).  Di  Indonesia  dilaporkan sebanyak  13  kasus  sengatan  ubur-ubur  pada  tahun 2005-2009  dengan  tiga  orang  meninggal  akibat sengatan ubur-ubur di daerah Jawa, Bali, dan Bangka (Mujiono, 2010).
Racun Physalia  utriculus bersifat  kardiotoksik, hemolitik,  dan  dermotonekrotik  (Alam  dan  Qasim, 1991).  Racun  ubur-ubur  membentuk  ikatan  pada membran  sel  target  diikuti  adanya  oligomerisasi membentuk pori-pori membran. Pembentukan pori- pori membran pada sel eritrosit inilah menyebabkan hemolisis.  Komponen  peptida  litik  menyebabkan peningkatan  permeabilitas  sel  yang  berpengaruh terhadap  transpor  ion,  pembengkakan  sel,  dan terjadinya  lisis  akibat  perbedaan  tekanan  osmotik (Mariottini, 2014 dan Edwards et al. , 2002).
Penelitian berbasis herbal kian dikembangkan, salah satunya  ialah  kakao.  Kakao  ( Theobroma  cacao L.) merupakan salah satu komoditas unggulan Kabupaten  Jember.  Biji  kakao  mengandung  lemak, karbohidrat,  protein,  dan  senyawa  polifenol  yang berguna  sebagai  antioksidan.  Polifenol  yang terkandung  pada  kakao  berupa epicathechin , catechins ,  dan procyanidins berfungsi  untuk menghambat  hemolisis  pada  tikus  percobaan, sehingga senyawa ini dapat memberikan perlindungan  dan  memperkuat  resistensi  terhadap hemolisis  (Weishburger,  2001).  Berdasarkan  latar belakang  tersebut,  maka  peneliti  ingin  melakukan penelitian  untuk  mengetahui  potensi  ekstrak  kakao ( Theobroma cacao L.) dalam menghambat kerusakan  eritrosit  yang  diinduksi  racun Physalia utriculus secara in vitro .

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  desain  penelitian true experimental secara in  vitro dengan rancangan post test  only  control  group  design .  Populasi  yang digunakan ialah whole  blood 3 ml yang diambil dari manusia sehat dengan golongan darah O, berusia 21 tahun, dan tidak memiliki riwayat penyakit koagulan. Pemilihan  sampel  dilakukan  dengan simple  random sampling berupa  28  sampel  eritrosit  yang  telah dipilih  dibagi  menjadi  tujuh  kelompok,  yaitu kelompok  kontrol  normal,  kontrol  positif,  kontrol negatif,  dan  perlakuan  dengan  pemberian  ekstrak etanol kakao 0,2%, 0,1%, 0,04%, dan 0,02%. Masing- masing  kelompok  terdiri  dari  4  sampel  eritrosit. Seluruh  data  dianalisis  dengan  uji Shapiro-Wilk untuk uji normalitas dan dilakukan uji homogenitas. Jika hasil dari uji normalitas berupa data normal dan varian  kelompok  homogen  maka  dapat  dilakukan analisis dengan uji One Way Anova. One Way Anova. Jika  hasil  analisis  data  signifikan  (p  <  0,05)  dapat dilanjutkan  dengan  uji post  hoc untuk  mengetahui perbedaan  secara  signifikan  antar  kelompok perlakuan.

## Hasil Penelitian
Hasil  pengamatan  kecepatan  lisis  dilakukan  dalam satu  waktu  dan  didapatkan  data  rerata  kecepatan lisis  (detik)  ±  standar  deviasi  pada  tiap  kelompok, seperti pada Tabel 1.
Tabel 1. Rerata kecepatan lisis tiap kelompok (detik)
No Kelompok Rerata ± Standar Deviasi 1. Kontrol negatif 1.025 ± 164,63 2. Kelompok P1 858,25 ± 94,44 3. Kelompok P2 1000,5 ± 159,93 4. Kelompok P3 678,5 ± 19,71 5. Kelompok P4 1.006 ± 159,50
Grafik  penghitungan  rerata  kecepatan  lisis  eritrosit dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 4.1 Grafik rerata kecepatan lisis
Kelompok  kontrol  negatif  dengan  pemberian  racun Physalia  utriculus memiliki  rerata  kecepatan  lisis paling lama , diikuti kelompok P4 dengan pemberian ekstrak  etanol  kakao  0,02%,  kelompok  P2  dengan pemberian ekstrak  etanol kakao 0,1%, kelompok P1 dengan  pemberian  ekstrak  etanol  kakao  0,2%,  dan kelompok  P3  dengan  pemberian  ekstrak  etanol kakao 0,04%.
Hasil  uji  normalitas Saphiro-Wilk didapatkan  p  > 0,05. Hasil uji homogenitas Lavene’s Test didapatkan p  <  0,05.  Data  kemudian  ditransformasi  dan diperoleh  nilai  akhir  p  >  0,05.  Hasil  kedua  analisis tersebut menunjukkan bahwa data kelima kelompok terdistribusi  normal  dan  memiliki  varian  yang  sama atau  homogen,  kemudian  dilanjutkan  dengan  uji One  Way  Anova untuk  mengetahui  apakah  ada perbedaan yang signifikan antar kelompok penelitian. Hasil Uji One Way Anova didapatkan p < 0,05  menunjukkan  bahwa  terdapat  perbedaan kecepatan lisis yang bermakna  pada  tiap kelompok, kemudian  dilakukan  uji  analisis post  hoc dengan metode Bonferoni. Hasil analisis post  hoc Bonferoni menunjukkan  perbedaan  signifikan  kecepatan  lisis pada  kelompok  kontrol  negatif  (K-)  terhadap kelompok  P3,  kelompok  P3  terhadap  kelompok  P2 dan  P4.  Namun,  tidak  terdapat  perbedaan kecepatan  lisis  antara  kelompok  kontrol  negatif terhadap P1, P2, dan P4, kelompok P1 terhadap P2, P3, dan P4, serta kelompok P2 terhadap P4.

## Pembahasan
Induksi racun Physalia utriculus dapat menyebabkan blebbing membrane, edema, dan lisis pada eritrosit. Racun Physalia  utriculus mengganggu  permeabilitas ion K + dan Na + pada membran plasma menyebabkan keluarnya  ion  K + yang  berlebih  dari  membran  dan
masuknya  ion  Na+  yang  berlebih.  Peningkatan tekanan osmotik pada eritrosit tersebut mengakibatkan  penurunan  elastisitas  eritrosit sehingga  eritrosit  mudah  lisis.  Komponen  lain  yang dapat menyebabkan lisis adalah hemolisin (Larasati, et al., 2015).
Kelompok  kontrol  negatif  dengan  pemberian  PBS yang diinduksi racun Physalia utriculus tanpa ekstrak etanol  kakao  menunjukkan  kecepatan  lisis  paling lama  sebesar  1.025  ±  164,63  dibandingkan  dengan kelompok  perlakuan.  Hasil  tersebut  menunjukkan bahwa  ekstrak  etanol kakao tidak berpotensi dalam menghambat kecepatan lisis eritrosit secara in vitro. Hal  ini  diduga  dapat  disebabkan  oleh  kandungan kafein  dalam  jumlah  berlebih  yang  dapat mengakibatkan  instabilitas  membran  eritrosit  dan hemolisis (Lecomte dan Boivin 1981).
Bubuk  kakao  terdiri  dari  dua  macam  senyawa bioaktif,  yaitu  polifenol  dan methylxanthines (teobromin dan kafein). Ekstraksi kakao menggunakan senyawa etanol menghasilkan senyawa  antioksidan  berupa  flavonoid,  katekin, epikatekin, antosianidin, dan proantosianidin (Hussain,  2015;  Atikah et  al. ,  2016).  Dalam  hal  ini senyawa  polifenol  berfungsi  sebagai  antioksidan yang  dapat  menghambat  hemolisis,  sedangkan kafein  berperan  sebagai  pro-oksidan.  Kafein merupakan  salah  satu  bagian  dari methylxanthines yang  bersifat  prooksidan  dan  mampu  mengurangi kadar  antioksidan  di  dalam  bubuk  kakao  (Jalil  dan Ismail, 2008). Sifat pro-oksidan dapat menyebabkan stres  oksidatif  pada  membran  sel.  Stres  oksidatif akan mengganggu integritas sel khususnya komponen  fosfolipid  penyusun  membran  sel,  DNA, dan protein sel (Dalle-Donne et al. , 2006).
Faktor-faktor  lain  yang  dapat  mempengaruhi  hasil penelitian  ini  terdiri  dari  beberapa  hal,  yaitu  belum dilakukannya  uji  untuk  analisis  komponen  fitokimia dari  bubuk  kakao  sebelum  dilakukannya  penelitian, metode  yang  dilakukan  merupakan  metode  baru yang  belum  pernah  dilakukan  pada  penelitian- penelitian  sebelumnya  untuk  menguji  hemolisis melalui  kecepatan  lisis  dari  individu  eritrosit,  dan kualitas  eritrosit  yang  berbeda  dalam  satu  lapang pandang  menyebabkan  perbedaan  dari  kecepatan lisisnya  eritrosit.  Eritrosit  yang  berumur  lebih  tua memiliki  potensi  stres  oksidatif  lebih  besar dibandingkan  eritrosit  yang  lebih  muda.  Hal  ini disebabkan  karena  eritrosit  sebagai  pembawa substansi oksigen yang akan terus menerus terpapar dengan  oksigen  menyebabkan  stres  oksidatif.  Stres
oksidatif  menyebabkan  kerusakan  pada  membran sel dan terjadilah hemolisis (Maurya et al. , 2015).

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian,  dapat  disimpulkan bahwa  ekstrak  etanol kakao tidak berpotensi dalam menghambat  kerusakan  eritrosit  yang  diinduksi racun Physalia utriculus secara in vitro .

## Daftar Pustaka
Alam,  J.  M.  dan  Qasim,  R.  1991. Toxicology  of Physalia's  (Portuguese  Man-O'-War)  Venom . Pakistan  Journal  of  Pharmaceutical. 4:  159- 168.
Atikah,  A.  R.,  Hendrik  S.  B.,  dan  Tuti  K.  2016. Antibacterial Effect of 70% Ethanol and Water Extract  of Cacao Beans (Theobroma cacao L.) on Aggrebacter actinomycetemcomitans. Dental Journal. 49 (2): 104-109.
Dalle-Donne, et  al .  2006. Biomarkers  of  Oxidative Damage in Human Disease . Clinical Chemistry. 52: 601-623.
Edward,  L.  dan  Heissinger,  D.  A.  2000. Portuguese Man-of-War (Physalia physalis) Venom
Induces  Calcium  Influx  into  Cells  by Permeabilizing  Plasma  Membranes .  Toxicon . 38(8): 1015-1028.
Hussain,  N.  2015. Effect  of  Different  Solvents  on Phytosterols and Antioxidant Activity of Cocoa
Beans,
International Journal of Food Engineering. 1 (1): 15-20.
Jalil,  A.  M.  M.  dan  Ismail,  A.  2008. Polyphenol  in Cocoa  and  Cocoa  Products:  Is  There  A  Link between  Antioxidant  Properties  and  Health?. Molecules. 13: 2190-2219.
Larasati,  D.  M.,  Al  M.,  dan  Roni,  P.  2015. Pengaruh Induksi  Racun  Ubur-Ubur  (Physalia  utriculus) terhadap  Perubahan  Gambaran  Morfologi Eritrosit  Tikus  Wistar  (In  Vivo)  dan  Eritrosit Manusia (In Vitro). Jurnal Pustaka Kesehatan.
Lecomte, M. C. dan Boivin, P. 1981. Filterability and Pharmacology.  Effects  of  Methylxanthine Derivatives  on  Red  Cell  Phosphorylation . Scand J Clin Lab Invest Suppl. 156:291–295.
Mariottini,  G.  L.  2014. Hemolytic  Venoms  from Marine  Cnidarian  Jellyfish  -  An  Overview. Jurnal of Venom Research. 5: 22-32.
Maurya,  P.  K.,  Prabhanshu  K.,  Pranjal  C.  2015. Biomarkers of Oxidative Stress in Erythrocytes as A Function of Human Age. World Journal of Methodology. 5 (4): 216-222.
Mujiono, N. 2010. Jellyfish Sting: An Indonesian Case Report . Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan.
2: 1.
Tibbals,  J.  2006. Australian  Venomous  Jellyfish, Envenomation Syndromes, Toxins and Therapy. Toxicon . 48: 830-859.
Weisburger, J. H. 2001. Chemo preventive Effects of Cocoa  Polyphenols  on  Chronic  Diseases. Exploraton  Biology  and  Medicine. 10(226): 891-897.