Copyright: ©2022 by the authors. Submitted for possible open-access publication under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International (CC BY-SA) license
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.9 No.1 June 2022 Page 22-26 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048

## Screening and Identification of The 16S rRNA Sequence Phylogeny of Fibrinolytic Bacteria in Shrimp Paste

## Skrining dan Identifikasi Filogeni Urutan 16S rRNA Bakteri Fibrinolitik di Petis Udang
Maharani Puspita Sari 1) , Achmad Toto Poernomo 1) * , Amiruddin Prawita 1)
1 Department of Pharmaceutical Science, Faculty of Pharmacy, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
*Corresponding author E-mail: achma-t-p@ff.unair.ac.id
Article History:
Received: April 12, 2022; Revised: May 22, 2022; Accepted: June 29, 2022; Online: June 30, 2022

## ABSTRACT
Petis was one of the fermentation products made with marine creatures such as fish or shrimp. Fibrinolytic enzymes in some fermentation foods from marine creatures were discovered. Screening of bacteria that produced  fibrinolytic  enzymes  used  six  petis  samples  from  different  home  industries.  The  isolation  of samples was performed using the Skim Milk Agar proteolytic test and fibrin plate test. Identification of the bacteria  was  performed  with  a  gram  staining  test  and  16S  rRNA  sequencing  method.  The  sample  was diluted with NaCl 0.9% up to 10^-7, then inoculated on the SMA media and incubated at 37ºC for 24 hours. All samples showed proteolytic activity, indicated by a clear zone around the colony. Seventeen proteolytic bacterial isolates were tested for fibrinolytic activity with fibrin plates and then incubated at 37ºC for 24 hours. The seventeen isolates showed positive results for fibrinolytic activity, with the highest fibrinolytic index being P3c. The P3c bacterial isolate was identified using 16S rRNA gene sequencing. The result of the identification revealed that the bacteria with strong fibrinolytic activity was Bacillus flexus.
Keywords: Fibrinolytic Enzyme, Petis, Screening, Identification, Bacillus flexus

## ABSTRAK
Petis merupakan salah satu produk fermentasi yang terbuat dari hewan laut seperti ikan atau udang. Enzim fibrinolitik pada makanan fermentasi dari hewan laut sudah banyak ditemukan. Penapisan bakteri penghasil enzim  fibrinolitik  menggunakan  enam  petis  dari  industri  rumah  tangga  yang  berbeda.  Isolasi  sampel diperoleh dari uji proteolitik pada media Skim Milk Agar dan uji fibrinolitik dengan fibrin plate. Identifikasi bakteri ditunjukkan dengan pewarnaan Gram dan metode sekuensing 16S rRNA. Sampel dilarutkan dalam NaCl 0,9% sampai pengenceran 10-7 lalu diinokulasikan pada media SMA dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Seluruh sampel memiliki aktivitas proteolitik yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih  disekitar  koloni  bakteri.  Terdapat  tujuh  belas  isolat  bakteri  proteolitik  yang  digunakan  untuk  uji aktivitas fibrinolitik dengan metode fibrin plate lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Ketujuh belas isolat menunjukkan hasil positif terhadap aktivitas fibrinolitik dengan indeks fibrinolitik terbesar pada bakteri P3c. Isolat bakteri P3c diidentifikasi menggunakan metode sekuensing sekuensing gen 16S rRNA. Hasil dari identifikasi, bakteri yang memiliki aktivitas fibrinolitik terbesar adalah Bacillus flexus .
Kata kunci : Enzim Fibrinolitik, Petis, Penapisan, Identifikasi, Bacillus flexus

## PENDAHULUAN
Enzim  fibrinolitik  merupakan  protease  serin  atau metalloprotease  yang  mengkatalisis  hidrolisis  protein. Fibrin  merupakan  komponen  protein  utama  pada gumpalan  darah  yang  terbentuk  dari  fibrinogen  oleh trombin.  Fibrin  dapat  membentuk  bekuan yang  menjadi faktor  risiko  utama  untuk  stroke  dan  infark  miokard. Enzim  fibrinolitik  berpotensi  menghambat  terjadinya pembentukan  trombus  (gumpalan  darah)  dengan menghidrolisis  fibrin  (Chang  et  al.,  2012).  Penggunaan enzim  fibrinolitik  sebagai  pengobatan  trombosis  yang banyak digunakan adalah urokinase (UK) dan streptokinase (SK), namun pengobatan tersebut harganya
mahal,  hanya  cocok  diberikan  melalui  injeksi  dan memiliki efek samping pendarahan (Yuan et al., 2012).
Telah  ditemukan  beberapa  agen  trombolitik  yang efektif  berasal  dari  mikroorganisme  dapat menghasilkan enzim  fibrinolitik.  Agen  trombolitik  tersebut  diperoleh dari  berbagai  makanan  ataupun  minuman  fermentasi (Mahajan  et  al.,  2012).  Mikroorganisme  pada  makanan fermentasi  yang  dapat  menghasilkan  enzim  fibrinolitik antara  lain  Bacillus  natto  pada  natto  Jepang,  Bacillus amyloliquefaciens pada douchi China, Bacillus sp. KA38 pada jeot-gal Korea (Kotb, 2012), Bacillus weihenstephanensis pada shrimp paste Vietnam (Anh et
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.9 No.1 June 2022 Page 22-26 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
al., 2015). Indonesia memiliki berbagai macam makanan fermentasi,  salah  satunya  adalah  petis.  Petis  merupakan produk  hasil samping  dari  ikan, udang,  ataupun daging. Petis berbentuk kental seperti pasta, berwarna coklat tua sampai hitam, memiliki rasa manis, asin, maupun pedas manis  (Wahdiniati  et  al.,  2016).  Umumnya  petis digunakan  sebagai  bumbu  masakan  atau  penyedap  rasa dan bahan baku pembuatan sambal (Pramono et al., 2008). Petis  memiliki  kesamaan  dengan  jeotgal  Korea  dan shrimp  paste  Vietnam  yaitu  terbuat  dari  ikan  ataupun udang, namun belum ditemukan bakteri penghasil enzim fibrinolitik pada petis.

## METODOLOGI PENELITIAN

## Bahan dan Metode
Bahan  yang  digunakan  petis  dari  pasar  tradisional maupun non tradisional, media NaCl 0,9%, Nutrient Agar (NA),  Skim  Milk  Agar  (SMA),  dan  fibrin.  Alat  yang digunakan  timbangan  analitik  (Sartorius),  inkubator (Memmert),  vortex  (Thermo  Scientific),  mikropipet Socorex®,  mikropipet  Appendorf®,  sengkelit  (Öse), Laminar  Air  Flow  (LAF),  autoklaf  HL  –  340  Series Vertical  Type  Steam  sterilisizer,  lemari  pendingin,  alat gelas, dan jangka sorong.

## Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel petis dilakukan dengan metode purposive sampling. Petis diperoleh dari pasar tradisional maupun non tradisional yang berada di daerah Surabaya Pusat dan Sidoarjo. Sampel yang digunakan yaitu enam petis  dari  industri  rumah  tangga  yang  berbeda.  Sampel diberi kode P1, P2, P3, P4, P5, dan P6.

## Preparasi Sampel
Sampel  ditimbang  sebanyak  10  g  dan  dimasukkan kedalam 50 mL NaCl 0,9% pada labu Erlenmeyer. Lalu dikocok  menggunakan  vortex  dan  diamkan  sampai endapan dan supernatan terpisah. Dilakukan pengenceran terhadap  supernatan  sampai  pengenceran  10-7  dengan menggunakan NaCl 0,9%. Pengenceran dilakukan dengan memipet  1  mL  sampel  menggunakan  mikropipet  lalu ditambahkan  pada  tabung  berisi  9  mL  NaCl  0,9% sehingga diperoleh pengenceran 10-1. Larutan pengenceran  10-1  diambil  1  mL  dan  ditambahkan  pada tabung  berisi  9  mL  NaCl  0,9%  sehingga  diperoleh pengenceran  10-2  dan  diulangi  sampai  diperoleh pengenceran 10-7.

## Uji Aktivitas Proteolitik pada Media SMA
Larutan  pengenceran  10-7  diambil  1  mL  dengan mikropipet  dan  disebarkan  pada  media  lempeng  SMA (susu skim 10% b/v ditambah 1,5% b/v agar). Kemudian diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu  37ºC.  Aktivitas proteolitik ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih disekitar koloni bakteri (modifikasi Sneha et al. 2014).

## Kultur Bakteri Proteolitik pada Media NA
Kultur  dilakukan  dengan  mengambil  1  ose  isolat bakteri  proteolitik,  kemudian  digoreskan  secara  aseptis pada  media  slant  NA.  Lalu  diinkubasi  pada  suhu  37oC selama  24  jam.  Isolat  bakteri  yang  diperoleh  disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4oC .
Uji Aktivitas Fibrinolitik pada Media Fibrin
Isolat bakteri proteolitik ditambahkan dengan 9 mL NaCl 0,9% dan dikocok dengan vortex sehingga terbentuk suspensi  bakteri.  Transmitan  suspensi  bakteri  diukur sebesar 25% menggunakan spektrofotometer visible pada panjang gelombang 580 nm. Kemudian membuat lubang berdiameter  6  mm  dengan  pelubang  steril  pada  media lempeng  fibrin  yang  telah  ditambahkan  methylene  blue (0,3% b/v fibrin dan 1,7% b/v agar dalam larutan dapar fosfat  pH  7,8).  Lalu  ditambahkan  20  µL  isolat  bakteri serta kontrol positif yaitu nattokinase dan kontrol negatif yaitu  NaCl  0,9%  pada  lubang  tersebut.  Setelah  itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Bakteri yang mempunyai  aktivitas  fibrinolitik  akan  memberikan  zona jernih  di  sekitar  koloni.  Aktivitas  fibrinolitik  ditentukan dengan  mengukur  indeks  aktivitas  enzim  yaitu membandingkan  diameter  zona  jernih  dengan  diameter lubang.  Pengukuran  diameter  menggunakan  jangka sorong. Isolat bakteri dengan indeks fibrinolitik terbesar dipilih untuk dilakukan identifikasi (modifikasi Ashipala & He, 2008).
Identifikasi Bakteri secara Mikroskopis dan Makroskopis Identifikasi mikroskopis dilakukan dengan pewarnaan  Gram.  Gelas  objek  dibersihkan  dengan alkohol 70% dan diberi aquadest, dipanaskan diatas nyala api.  Biakan  bakteri  diambil  satu  ose  secara  aseptik, kemudian diratakan di atas objek glass dan difiksasi diatas nyala  api.  Kemudian  diteteskan  larutan  kristal  violet, didiamkan selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan.  Setelah  itu  diteteskan  larutan  lugol, didiamkan selama 1 menit, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Dicuci dengan alkohol selama 30 detik, lalu  dicuci  dengan  air  mengalir  dan  dikeringkan. Selanjutnya diteteskan larutan safranin, diamkan selama 2 menit,  kemudian  dicuci  dengan  air  mengalir  dan dikeringkan. Kemudian diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran kuat. Bakteri Gram positif menghasilkan  warna  ungu  dan  bakteri  Gram  negatif menghasilkan  warna  merah.  Diamati  bentuk  sel  bakteri tersebut bulat (coccus), batang (basil), atau bergelombang (spiral)  (Hastuti  et  al.,  2007).  Identifikasi  secara makroskopis  dilakukan  dengan  menumbuhkan  koloni bakteri  pada  media  NA  dan  diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Kemudian dilihat bentuk, warna, tepian, dan elevasi koloni.

## Amplifikasi Gen 16S rRNA
Amplifikasi 16S rRNA menggunakan metode PCR dengan  primer  universal.  Reaksi  PCR  yaitu  denaturasi pada  suhu  95ºC  selama  1  menit,  tahap  annealing  pada suhu 55ºC selama 1 menit, dan tahap elongasi suhu 72ºC selama 10 menit. Hasil PCR dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% dalam dapar Tris Acetate EDTA (TAE). Volume sampel yang dielektroforesis yaitu 5  µL.  DNA  standard  yang  digunakan  adalah  promega DNA ladder 1kb. Kemudian gel agarosa direndam dalam larutan etidium bromide (EtBr) dan dilihat dibawah sinar UV menggunakan UV transilluminator.

## Identifikasi Bakteri dengan Metode 16S rRNA
DNA  hasil  purifikasi  dikirim  ke  laboratorium Macrogen Korea untuk dilakukan sekuensing 16S rRNA. Hasil sekuensing dianalisis dengan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) yang tersedia pada situs
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.9 No.1 June 2022 Page 22-26 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
NCBI. Kemudian alignment divisualisasi dengan program ClustalW.  Pohon  filogenetik  dibuat  dengan  program MEGA X.

## Analisis Data
Analisis  data  dilakukan  secara  deskriptif  serta ditampilkan  dalam  bentuk  foto  maupun  tabel.  Analisis positif uji aktivitas proteolitik dan fibrinolitik ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih disekitar koloni bakteri. Indeks fibrinolitik diperoleh dari perbandingan diameter zona jernih dengan diameter lubang. Analisis identifikasi bakteri dilakukan secara makroskopis, mikroskopis, dan sekuensing gen 16S rRNA.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Uji Aktivitas Proteolitik
Uji  aktivitas  proteolitik  dilakukan  secara  kualitatif untuk mengetahui adanya aktivitas degradasi protein yang dihasilkan  oleh  bakteri.  Media  yang  digunakan  adalah SMA tinggi kasein. Kasein merupakan protein, sehingga bakteri  yang  menghasilkan  enzim  proteolitik  akan memutus ikatan peptida pada kasein menjadi asam amino dan terbentuk zona jernih disekitar koloni bakteri. Seluruh sampel  petis  memberikan  hasil positif pada uji  aktivitas proteolitik,  kemudian  diambil  tiga  koloni  bakteri
proteolitik  pada  masing-masing  sampel.  Terdapat  tujuh belas koloni bakteri proteolitik untuk dikultur pada media slant NA ( Gambar 1 ).

## Kultur Bakteri Proteolitik
Bakteri  yang  memiliki  aktivitas  proteolitik dibiakkan pada media slant NA dan diinkubasi selama 24 jam. Isolat bakteri yang diperoleh disimpan dalam lemari pendingin sebagai stok dan digunakan untuk uji aktivitas fibrinolitik ( Gambar 2 ).

## Uji Aktivitas Fibrinolitik
Uji  aktivitas  fibrinolitik  dilakukan  pada  media fibrin untuk mengetahui adanya aktivitas fibrinolitik yang dihasilkan oleh bakteri proteolitik ( Gambar 3 ). Aktivitas fibrinolitik ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih disekitar  lubang  sehingga  bakteri  memiliki  kemampuan
untuk mendegradasi fibrin. Penambahan methylene blue pada  media  bertujuan  agar  zona  jernih  yang  terbentuk terlihat  jelas.  Kemudian  dihitung  indeks  fibrinolitik melalui  perbandingan  diameter  zona  jernih  dengan
diameter  lubang.  Isolat  bakteri  P3c  memiliki  indeks fibrinolitik terbesar yaitu 3,91 dapat dilihat pada Tabel 1 dan Gambar 4 yang terpilih untuk diidentifikasi.
Identifikasi  mikroskopis  dengan  pewarnaan  Gram menunjukkan  bakteri  P3c  merupakan  Gram  negatif dengan bentuk basil. Sedangkan identifikasi makroskopis menunjukkan  koloni  berwarna  putih  kusam,  bentuk koloni bulat, tepian tidak rata dan elevasi rata ( Gambar 5 dan Gambar 6 ).
Gambar 1. Hasil Uji Aktivitas Proteolitik Sampel P1, P2, P3,  P4,  P5,  Dan  P6  Pengenceran  10-7 Dengan  Metode  Spread  Plate  Pada  Media Skim Milk Agar
Gambar 2. Kultur Bakteri Proteolitik Sampel P1, P2, P3, P4, P5, Dan P6 Pada Media Slant NA
Gambar  3. Hasil  Uji  Aktivitas  Fibrinolitik  dengan Metode Well Diffusion Pada Media Fibrin
Tabel 1. Hasil Perhitungan Indeks Fibrinolitik
Kode Sampel Rata-rata Indeks Fibrinolitik ± P1 a 3,47±0,05 P1 b 2,43±0,12 P1 c 2,39±0,01 P2 a 2,11±0,11 P2 b 3,21±0,11 P2 c 3,26±0,08 P3 a 2,92±0,62 P3 b 3,49±0,26 P3 c 3,91±0,30 P4 a 2,84±0,06 P4 b 2,44±0,06 P4 c 3,23±0,77 P5 a 1,84±0,60 P5 b 2,99±0,65 P5 c 2,12±0,13 P6 a 2,92±0,10 P6 b 2,44±0,20
Gambar  4. Hasil  Uji  Aktivitas  Fibrinolitik  dengan Metode Well Diffusion Pada Media Fibrin
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.9 No.1 June 2022 Page 22-26 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048

## Amplifikasi Gen 16S Rrna
Proses amplifikasi dilakukan pada DNA yang telah diisolasi  dengan  metode  boiling  lysis.  Amplifikasi  16S rRNA  menggunakan  metode  PCR  dengan  primer universal. Hasil PCR dielektroforesis dan dilihat dibawah sinar  UV.  Hasil  elektroforesis  menunjukkan  pita  DNA bakteri  P3c  berada  pada  panjang  1500  bp  yang  tampak sejajar  dengan  pita  DNA  marker  ( Gambar  7 ).  Sehingga panjang  DNA  bakteri  P3c  sudah  sesuai dengan  panjang komponen 16S rRNA yaitu sekitar 1500-1600 bp.

## Identifikasi Bakteri dengan Metode 16S rRNA
Hasil PCR disekuensing untuk memperoleh sekuen penyandi  16S  rRNA  ( Gambar  8 ).  Sekuen  16S  rRNA bakteri  P3c  dianalisis  menggunakan  program  BLAST pada situs NCBI. Hasil BLAST menunjukkan bakteri P3c memiliki  kecocokan  tertinggi  dengan  Bacillus  flexus sebesar  96%  ( Tabel  2 ).  Kemudian  dianalisis  dengan pohon filogenetik dan terlihat bahwa bakteri P3c memiliki kekerabatan  dengan  Bacillus  flexus  strain  Ha  karena keduanya berada di cabang yang sama ( Gambar 9 ).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa  diperolehnya  tujuh  belas  isolat  bakteri  yang memiliki aktivitas fibrinolitik pada petis dengan aktivitas fibrinolitik  terbesar  yaitu  pada  isolat  bakteri  P3c. Identifikasi  isolat  bakteri  P3c  menggunakan  sekuensing
16S  rRNA  diduga  bahwa  bakteri  P3c  adalah  Bacillus flexus.
Gambar  5. Hasil  Identifikasi  Mikroskopis  Bakteri  P3c Berdasarkan Pewarnaan Gram
Gambar  6. Hasil  Identifikasi  Makroskopis  Bakteri  P3c Pada Media NA
Gambar 7. Hasil PCR Bakteri P3c Setelah Dielektroforesis Keterangan : M = DNA marker 1 = Kontrol negatif 2 = Bakteri P3c
Tabel 2 . Hasil BLAST 16s rRNA Bakteri P3c Kode NCBI Nama Spesies Panjang Sekuen (bp) Persentase Homolog - Isolat P3c 1522 96% KY098767 Bacillus flexus 1404 96% MG725727 Geobacillus stearothermophilus strain GCF12 1420 96% KU570370 Bacillus megaterium strain W-N-5-2-1 1416 96% KR999920 Bacillus licheniformis strain NZ 1443 96% LN874282 Azotobacter chroococcum 1415 96%
Gambar 9. Hasil Identifikasi Mikroskopis Bakteri P3c
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.9 No.1 June 2022 Page 22-26 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048

## DAFTAR PUSTAKA
Anh, D.B.Q. et al. (2015) 'Isolation and optimization of growth condition of Bacillus sp. from fermented shrimp  paste  for  high  fibrinolytic  enzyme production', Biological  Sciences ,  40(1),  pp.  23– 28.
Ashipala,  O.K.  and  He,  Q.  (2008)  'Optimization  of fibrinolytic  enzyme  production  by  Bacillus subtilis DC-2 in aqueous two-phase system (poly- ethylene  glycol  4000  and  sodium  sulfate)', Bioresource Technology , 99, pp. 4112–4119.
Chang,  C.  et  al.  (2012)  'Purification  and  biochemical properties of a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis-fermented  red  bean', Food  Chemistry , 133, pp. 1611–1617.
Hastuti,  U.,  Suarsini,  E.,  Rahayu,  E.  and  Ghofur,  A. (2007) Penuntun  Praktikum  Mikrobiologi  dan Parasitologi . Malang: Universitas Negeri Malang, p. 32.
Kotb,  E.  (2012) Fibrinolytic  Bacterial  Enzymes  with Thrombolytic Activity . London: Springer.
Mahajan,  P.M.,  Nayak,  S.  and  Lele,  S.S.  (2012) 'Fibrinolytic enzyme from newly isolated marine bacterium  Bacillus  subtilis  ICTF-1:  media optimization,  purification  and  characterization',
Journal  of  Bioscience  and  Bioengineering , 113(3), pp. 307–314.
Pramono,  Y.B.,  Rahayu,  E.S.  and  Utami,  T.  (2008) 'Isolasi dan identifikasi  bakteri  asam laktat pada fermentasi petis daging tradisional', Journal of the Indonesian  Tropical  Animal  Agriculture ,  33(4), pp. 319–323.
Sneha, S., Das, M.P. and Rebecca, L.J. (2014) 'Isolation and screening of protease producing bacteria from marine  waste', Journal  of  Chemical  and Pharmaceutical Research , 6, pp. 1157–1159.
Wahdiniati,  L.,  Pantiwati,  Y.  and  Latifa,  R.  (2016) 'Pemeriksaan  kandungan  bakteri  Salmonella  sp. dan  bakteri  Escherichia  coli  pada  petis  ikan  di Pasar  Klampis', Jurnal  Pendidikan  Biologi Indonesia , 2(2), pp. 198–205.
Yuan,  J.  et  al.  (2012)  'Thrombolytic  effects  of  Douchi fibrinolytic  enzyme  from  Bacillus  subtilis  LD- 8547  in  vitro  and  in  vivo', BMC  Biotechnology , 12(36), pp. 1–3.
.
.