44 Elis Nina Herliyana et al.
Analisis Keragaman Genetik Kelompok Pleurotus dengan Teknik

## Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Lenght Polymorphisms (PCR-RFLP)
Analysis of Genetic Variability of Pleurotus group with Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Lenght Polymorphisms (PCR-RFLP) Technique
Elis Nina Herliyana 1 , Reny Meisetyani 1 dan Iskandar Z. Siregar 1
1 Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan IPB

## ABSTRACT
The  research  was  done  in  Forest  Pathology  Laboratory  and  Sylviculture  Laboratory,  Forest  Faculty,  Bogor Agriculture  University.  The  observed  is  too  know  the  genetic  variability  of  Pleurotus  group  and  compare  it  with  the morphological variability also applications of PCR-RFLP in Pleurotus group.
PCR-RFLP  using  the  primers  ITS1  and  ITS4  can  be  applied  to  the  Pleurotus  group.  The  use  of  Alui  restriction enzymes  can  give  results  ribbon  cutting DNA from PCR-RFLP  results.  The  result  of  genetic  variability  by  PCR-RFLP showed differenced compare to genus and morphological variability.

## Keyword: PCR-RFLP, Pleurotus group

## PENDAHULUAN
Salah satu jenis hayati yang berasal dari hutan tropis Indonesia  yang  baru  terungkap  beberapa  potensi  dan manfaatnya  adalah  jamur.  Jamur  banyak  ditemukan tumbuh  liar  baik itu  di  lantai hutan maupun  menempel pada kayu.
Diantara  jamur  yang  tumbuh  di  hutan  tersebut  ada yang dapat dimakan (sebagai  bahan makanan dan obat) maupun  yang  tidak  dapat  dimakan  (beracun).  Menurut Chang  dan  Miles  (1989,  1997)  jamur  telah dikonsumsi sebagai  bahan  makanan  sejak  zaman  dahulu.  Dari sekian  banyaknya  jenis  jamur  yang  dapat  dimakan, salah  satunya  adalah    kelompok Pleurotus atau  yang disebut  dengan  jamur  tiram.  Disebut  tiram  karena bentuk  tudungnya  menyerupai  cangkang  tiram.  Kelom- pok Pleurotus termasuk family Pleurotaceae. Kelompok Pleurotus ini  hanya  mempunyai  dua  genus  yaitu Pleurotus dan Hohenbuehelia (Herliyana et al. 2008).
Perbedaan bentuk  morfologi   dan warna merupakan penciri  dari  masing-masing  spesies.  Bentuk  tudung, diameter  tangkai  dan  panjang  tangkai  tubuh  buah  serta warna  tubuh  buah  merupakan  parameter  untuk pengukuran  morfologinya.  Walaupun  secara  morfologi dapat  diketahui  dan  dibedakan  jenisnya  namun  secara genetik  jenis  jamur  ini  belum  diketahui  tingkat keragamannya.
Penelitian  ini  berusaha  untuk  mengetahui  tingkat keragaman genetik  isolat jamur  tiram dengan melakukan  analisis  DNA  menggunakan  metode Polymerase  Chain  Reaction - Restriction  Fragment Length  Polymorphisms (PCR-RFLP).    Dimana  PCR- RFLP merupakan salah satu teknik penanda DNA yang kini  biasa digunakan selain RAPD dan AFLP.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman  morfologi  dan  genetik  pada  kelompok Pleurotus .  Untuk  membandingkan  antara  keragaman morfologi  dan keragaman genetik serta aplikasi metode PCR-RFLP pada kelompok Pleurotus .

## BAHAN DAN METODE
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah beberapa  isolat  jamur  kelompok Pleurotus yang diperoleh  dari  kultur  koleksi  Laboratorium  Penyakit Hutan,  Fakultas  Kehutanan  IPB.  Isolat-isolat  yang digunakan  adalah  :  12  isolat  yang  terdiri  atas:  Sp  3 ( Hohenbuehelia  petaloides EB4/  warna  abu-abu cokelat), Sp 4 ( H. petaloides EB7/ abu-abu cokelat), Sp 5 ( H. petaloides EB6/ abu-abu cokelat), Sp 6 ( Pleurotus djamor EB9/  merah),  Sp  16  ( Pleurotus  ostreatus JP  / putih), Sp 17 ( P. ostreatus JT/ putih), Sp 18 ( Pleurotus abalonus Abalon/cokelat  abu-abu),  Sp  19  ( P.  ostreatus JB/putih), Sp 21 (hasil mating P. ostreatus MA 35+ MA 36/ abu-abu), Sp 23 ( P. ostreatus MA 35 B monokarion/ abu-abu), Sp 24 ( Pleurotus flabelatus TM/  merah), dan Sp 25 ( Pleurotus cornicopy TC/cokelat).

## Tabel 1.  Bahan-bahan Ekstraksi DNA,PCR-RFLP dan
Restriksi No Bahan-bahan Ekstraksi DNA PCR-RFLP Restriksi 1. Tris-HCL 1 M H 2 O
H 2 O
2. EDTA 0.5 M Hot Star Mix Buffer RE
3. NaCL 5 M Primer ITS 1 DNA 4. CTAB 10% Primer ITS 4 Enzim restriksi
ALU I Hind III 5. Merkap-etanol
DNA
6. PVP 1% 7.
Akuades

## JURNAL SILVIKULTUR TROPIKA
Vol. 03 No. 01 April 2012, Hal. 44 – 48 ISSN: 2086-8227
Sampel tubuh buah jamur
Ekstraksi Elektroforesis Tidak PCR-RFLP Elektroforesis Tidak
Restriksi Foto
Tabel 2.  Alat-alat  ekstraksi  DNA,  PCR-RFLP  dan Restriksi No. Kegiatan Alat yang digunakan 1. Ekstraksi DNA
pestel,  mortal,  vortex,  desikator, freezer , water  bath ,  pH  meter  dan tube 2 ml 2. PCR-RFLP Microtube 0.2 ml dan mesin PCR 3. Restriksi Microtube 0.2 ml dan water bath 4. Umum sarung tangan, pipet, pipet mikro, tips sentrifugasi,  koleksi  tabung,  cetakan gel,  bak  elektoforasis,  microwave, power  supply,  gelas  piala,  gelas ukur,
timbangan analitik, pengaduk magnet, ultraviolet  transimulator dan  kamera digital

## Metode Penelitian
Dalam  penelitian  ini  dilakukan  dalam  dua  tahap yaitu  Tahap  pertama  adalah  kultivasi  jamur  tiram    dan Tahap kedua adalah analisis DNA dengan menggunakan PCR-RFLP dan restriksi pemotongan pita DNA dengan enzim  restriksi ALU I  dan Hind III.  Kegiatan  Tahap pertama penelitian meliputi:
1 .   Pembuatan media tumbuh jamur.
2.   Sterilisasi media tumbuh jamur.
3.   Inokulasi media.
4.   Inkubasi media.
5.   Penumbuhan tubuh buah jamur.
6.   Pemeliharaan.
Pengamatan dilakukan terhadap sifat-sifat morfologi tubuh  buah  yang  tumbuh,  dengan  pengambilan  data terhadap  diameter  tudung,  tinggi  tangkai,  diameter tangkai  dan  warna  tubuh  buah.  Sampel  diambil  dari sebagian  tubuh  buah  jamur  yang  tumbuh.  Kegiatan Tahap kedua meliputi:
Prosedur  penelitian  nalisis  genetik  kelompok Pleurotus dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1.  Bagan prosedur teknik PCR-RFLP

## Analisis Data
Hasil  restriksi  yang  telah  didapat  melalui  foto  dari hasil  elektroforesis  kemudian  dilakukan  skoring  pola pita  yang  muncul.  Skoring  dilakukan  pada  hasil perpotongan  pita  DNA,  jika  terjadi  perpotongan  maka mendapat nilai  1  dan  jika tidak  ada  perpotongan  diberi nilai  0.  Hasil  perhitungan  kemudian  dianalisis  untuk mengetahui  frekuensi  dan  keragaman    dalam  jenis  dan antar  populasi Pleurotus spp . dengan  menggunakan software POPGENE  Versi  1.3.1.  Pengelompokan kekerabatan berdasarkan metode UPGMA ( Unweieghted  Pair  Group  with  Arithmatic  Average) (Nei  1973  dalam  Yunanto  2006)  dengan  software NTSYS Ver 2.0 (Rohlf, 1998).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Keragaman Morfologi  Kelompok Pleurotus
Keragaman  morfologi  kelompok Pleurotus dimulai dengan  pengamatan  terhadap  pertumbuhan  tubuh buahnya  .  Pengamatan  dilakukan  pada  warna  tubuh buah, diameter tudung tubuh buah dan panjang tangkai tubuh  buah.  Pengamatan  ini  dikhususkan  untuk  jamur tiram  yang  pengekstraksian  DNA-nya  dilakukan  di Bogor,  yaitu  pada  subjenis P.  ostreatus JT, Pleurotus ostreatus JP, H. petaloides EB6 dan P. ostreatus JB .
Keempat  jamur  tiram  ini    merupakan  hasil  dari penumbuhan  selama  kurang  lebih  empat  bulan,  dengan waktu inokulasi pada bulan September yang ditumbuhkan  pada  media  campuran  serbuk  gergaji, kapur,  dedak  dan  gips  atau  dinamakan baglog dengan ukuran  0.5  kg.  Pada  waktu  penumbuhan  suhu    dan kelembaban  lingkungan  disesuaikan  dengan  kebutuhan tumbuh jamur tiram.
Pengamatan  morfologi  luar  pada P.  ostreatus JT, Pleurotus ostreatus JP, dan P. ostreatus JB mempunyai tubuh  buah    berwarna  putih.  Ketiga  subjenis  tersebut mempunyai  bentuk  pinggiran  tudung  tubuh  buah  yang bergelombang,  memiliki  tangkai  berkisar  antara  1.6  – 2.5 cm.
Tabel 6.  Pengelompokan Pleurotus berdasarkan warna tubuh buah No. Warna Tubuh buah Kode Isolat Nama Isolat 1.  Putih Pleurotus sp16 Pleurotus ostreatus JP
Pleurotus sp17 P. ostreatus JT
Pleurotus sp19 P. ostreatus JB 2.  Abu Pleurotus sp21  hasil mating P. ostreatus MA 35+ MA
36
Pleurotus sp23 P. ostreatus MA 35 B monokarion 3.  Coklat Pleurotus sp25 Pleurotus cornicopy TC 4.  Merah Pleurotus sp6 Pleurotus djamor EB9
Pleurotus sp24 Pleurotus flabelatus
TM
5  Abu-abu coklat Pleurotus sp 3 H.petaloides EB4 Pleurotus sp 4 H. petaloides EB7 Pleurotus sp 5 H. petaloides EB6
Pleurotus sp 18 Pleurotus abalonus Abalon Interpretasi dan Analisis Data
46 Elis Nina Herliyana et al.

## Analisis Keragaman Genetik Kelompok Pleurotus
Pengamatan  dilakukan  setelah  tubuh  buah  muncul dari  media  tumbuh  atau baglog ,  kemudian  sebagian tubuh  buah  dan  tangkai  diambil  dan  disimpan  dalam kantung  plastik  berisi  silika  gel  dan  disimpan  dalam freezer .  Tubuh  buah  dan  tangkai  tersebutlah  yang digunakan  dalam  ekstraksi  DNA. Kegiatan  yang pertama dilakukan untuk melakukan analisis keanekaragaman  genetik  setelah  pengambilan  sampel adalah  ekstraksi  DNA.  Ekstraksi  DNA  menggunakan metode  CTAB  ( Cetyl  Trimethyl  Ammonium  Bromide ) yang telah dimodifikasi (Murray and Thompson 1980).
Hasil  ekstraksi  diperlukan  untuk  mengetahui kualitas  DNA,  sehingga  dapat  ditentukan  pengenceran yang  diperlukan  untuk  proses  selanjutnya  yaitu  PCR- RFLP.  Pengenceran  DNA  yaitu  hasil  ekstraksi  DNA yang  didapatkan  dicampur  aquabides.  Perbandingan antara  DNA  dan  aquabides    disesuaikan  dengan besarnya pengenceran.
Polymerase Chain Reaction - Restriction
Fragment Length Polymorphisms (PCR-RFLP) Kegiatan  selanjutnya  adalah  PCR-RFLP  dengan menggunakan  pasangan  primer universal untuk  jamur yaitu ITS1 dan ITS4. Wilayah ribosomal DNA (rDNA) Internal  Transcribed Spacer (ITS) mempunyai peranan penting  dalam  investigasi  sistematik  molekular  untuk angiosperma  pada  tingkat  intergenik  dan  interspesifik. ITS  ini  dapat  digunakan  untuk  membedakan  antara tanaman  berbunga,  bryophytes,  dan  beberapa  ordo  dari alga  dan fungi, termasuk fungi yang patogenik dan non patogenik (Jobes dan Thien, 1997).
Gambar 2.  Hasil  elektroforesis  PCR-RFLP  pada  isolat Pleurotus spp.  :  (a) Pleurotus  djamor EB9; (b) P.  ostreatus JT;  (c) Pleurotus  ostreatus JP;  (d) H.petaloides EB4;  (e) H. petaloides EB7  (f) P.  ostreatus JB;(g) Pleurotus abalonus Abalon; (h) H. petaloides EB6.
Pada PCR-RFLP tersebut juga diikutsertakan kontrol negatif,  yaitu  produk  PCR  tanpa  DNA.  Dalam penelitian  lain  yang  dilakukan  Mirhendi et  al. (2006) pasangan universal spesifik fungi (ITS1 dan ITS4) dapat dengan sukses untuk mengamplifikasi daerah ITS untuk semua  ragi yang  diuji,  menghasilkan singel produk PCR-RFLP secara  tepat  pada  510-870  bp.  Hasil amplifikasi  PCR-RFLP  kedelapan  isolat  kelompok Pleurotu s terletak antara  650 bp-800 bp.

## Restriksi
Enzim  restriksi  (atau  endonuklease  restriksi) memotong  DNA  pada  daerah  yang  spesifik  (Brown, 1991). ALU I  dengan  daerah  sekuen  yaitu  5'AGCT  dan 3'TCGA yang memotong pada G dan C. Hind III dengan daerah  sekuen  5'AAGCTT  dan  3'TTCGAA  memotong pada  A  dan  A.  Enzim  endonuklease  restriksi dimanfaatkan  di  dalam  analisis  molekular  struktur khromosom  dan  gen  (pemetaan  DNA),  analisis  proses degenerasi  sel  yang  dikaitkan  dengan  pengubahan  sisi restriksi  khusus  dan  analisa    keterkaitan  filogenetik dengan  pembandingan  sisi  restriksi  khusus  pada  gene- gen  penting  seperti  haemoglobin  (Suhartono,  1989). Hasil  elektroforesis  dengan  enzim  restriksi ALU I menunjukkan  adanya  perpotongan  yaitu  dari  hasil produk PCR sebesar 700 bp menjadi 600 bp.
Gambar 3.  Hasil  elektroforesis  restriksi  Kelompok Pleurotus dengan  enzim  restriksi ALU I.:  1. P. ostreatus JT; 2. Pleurotus ostreatus JP; 3 P.  ostreatus JB;  4. H.  petaloides EB6;  5. Kontrol negatif; 6. hasil mating P. ostreatus MA  35+  MA  36;7. P.  ostreatus MA  35  B monokarion;  8. Pleurotus  flabelatus TM;  9 Pleurotus cornicopy TC;10. Kontrol negatif
H.  petaloides EB6  mempunyai  potongan  pita  DNA pada 90 bp, 100 bp dan 600 bp.  Perpotongan pita 90 bp dan  100  bp  pada H.  petaloides EB6  terlihat  menyatu, tetapi  apabila  lebih  teliti  sebenarnya  ada  dua  pita perpotongan.  Jumlah total perpotongan pada setiap pita DNA,  mempunyai  nilai base  pair yang  sama  dengan hasil PCR-RFLP untuk tiap jenisnya.
100 600 bp 100 600 bp 100 600 bp 100 580 bp 100 100
600 bp
100 150 480 bp 100 650 bp P. ostreatus JB hasil  mating P. ostreatus MA 35+ MA 36
P. ostreatus MA 35 B monokarion
Pleurotus flabelatus TM Pleurotus cornicopy TC H. petaloides EB6 P. ostreatus JT 2642 bp 1000 bp 500 bp M   1    2   3   4    5 2642 bp 1000 bp 500 bp M   6  7   8  9  10 M  (a) (b) (c)(d) (e) (f) (g )(h) (i) 2642 bp 1000 bp 5000 bp 800 bp 650 bp

## Analisis Data
Analisis  data  dilakukan  dengan  menskoring    pola perpotongan  pita  DNA.  Apabila  ada  pita  perpotongan maka  diberi  nilai  1  dan  jika  tidak  ada  diberi  nilai  0. Dalam  tabel  8  merupakan  hasil  skoring  perpotongan pita  DNA  yang  terjadi  pada  ketujuh  sampel.  Dalam Finkeldey (2005), variasi terjadi oleh ada tidaknya situs pengenal  ( recognition  sites )  untuk  enzim  restriksi spesifik.
Tabel 8.  Hasil  skoring  pemotongan  dengan  enzim estriksi Alu I
Lokus Individu Pleurotus sp. 16 sp. 19 sp. 5 sp. 21 sp. 23 sp. 24 sp. 25 L-1 0 0 1 0 0 0 0 L-2 1 1 1 1 1 1 1 L-3 0 0 0 0 0 1 0 L-4 0 0 0 0 0 1 0 L-5 0 1 0 0 0 0 0 L-6 1 0 1 1 1 0 0 L-7 0 0 0 0 0 0 1
Dari  hasil  skoring  maka  terdapat  7  lokus  yang menunjukkan  pola  perpotongan  pita  DNA.  Hasil  ini kemudian  dimasukan  kedalam  progam Software POPGEN  1.3.1  untuk  diolah  lebih  lanjut  guna mengetahui jarak genetik dan dendogram jarak genetik. Dalam tabel 9, menunjukkan angka-angka jarak genetik pada Kelompok Pleurotus .
Tabel 9.  Jarak genetik antar jenis Kelompok Pleurotus
Jenis Pleurotus sp. 16  sp. 19 sp. 5 sp. 21 sp. 23 sp. 24  sp. 25
sp. 16 ****
sp. 19 0.3365  **** sp. 5 0.1542  0.5596 ****
sp. 21 0.0000  0.3365  0.1542  ****
sp. 23 0.0000  0.3365  0.1542  0.0000  **** sp. 24 0.5596  0.5596  0.8473  0.5596  0.5596  ****
sp. 25 0.3365  0.3365  0.5596  0.3365  0.3365  0.5596  ****
Dengan  menggunakan  dendogram  jarak  genetik, pengelompokkan atau klaster antara Kelompok Pleurotus lebih  terlihat  jelas. Hasil  dari  analisis keragaman  morfologi  dan  genetika  ternyata  berbeda. Jika  secara  morfologi  jamur  tersebut  sama  tetapi ternyata secara genetika berbeda.
Teknik  PCR-RFLP  dengan  menggunakan  primer ITS1 dan ITS4 memetakan DNA pada  daerah khuHsus ribosom.    Dalam  Kimball  (1998),  ribosom  merupakan struktur  yang  paling  kecil  yang  tersuspensi  di  dalam sitoplasma. Ribosom merupakan situs dan pada ribosom itulah tempat berlangsungnya sintesis protein.
Gambar 5.  Dendogram Kelompok Pleurotus

## KESIMPULAN
Berdasarkan  dari  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan, memberikan beberapa kesimpulan. Keragaman  morfologi  pada  kelompok Pleurotus dapat dilihat dari warna tubuh buah jamur tiram. Dari 8 isolat yang digunakan secara morfologi  dapat dikelompokkan ke  dalam  jamur tiram  putih  ( P.  ostreatus JT, Pleurotus ostreatus JP  dan P.  ostreatus JB),  berwarna  abu  (hasil mating P.  ostreatus MA  35+  MA  36  dan P.  ostreatus MA  35  B  monokarion),  berwarna  merah  ( Pleurotus flabelatus TM)  dan  berwarna  coklat  ( Pleurotus cornicopy TC) dan berwarna abu-abu coklat ( Hohenbuehelia petaloides EB4, H. petaloides EB7, H. petaloides EB6, dan Pleurotus abalonus Abalon). Jika dibandingkan antara keragaman morfologi  dan genetika  terdapat  perbedaan.  Pengelompokkan  jamur tiram  secara  genetik  berdasarkan  dendogram  mem- berikan hasil  bahwa  hasil mating P.  ostreatus MA  35+ MA  36, P.  ostreatus MA  35  B  monokarion  dan Pleurotus  ostreatus JP    berada  dalam  satu  klaster. Kemudian H.  petaloides EB6  tergabung  dalam  klaster pertama.  Klaster  berikutnya P.  ostreatus JB  dan Pleurotus  flabelatus TM, Pleurotus cornicopy TC  tidak tergabung dalam keduanya.
PCR-RFLP  dengan  menggunakan  primer  ITS1  dan ITS4  dapat  diaplikasikan  pada  jamur  kelompok Pleurotus .  Penggunaan  enzim  restriksi ALU I  dapat memberikan  hasil  pemotongan  pita  DNA  hasil  PCR- RFLP.
48 Elis Nina Herliyana et al.

## DAFTAR PUSTAKA
Bernard  J.  1998. Molecular  Biotechnology,  Principles and Application of Recombinant DNA . University of Waterloo. Waterloo Ontario Canada.
Brown TA. 1991. Pengantar Kloning Gen (Terjemahan oleh  :  Prof.  Soemiati  Ahmad  Muhammad  dan Praseno). Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica.
Chang  ST,  Miles  PG.  1989. Genetics  and  Breeding  of Edible  Mushroom .  Hongkong:  Gordon  and  Breach science Publisher. Unesco.
Chang  ST,  Miles  PG.  1997. Mushroom  Biology . London: World Scientific Publishing.
Finkeldey  R.  2005. Pengantar  Genetika  Hutan  Tropis. E.  Jamhuri,  I.Z.  Siregar,  U.J.  Siregar  dan  A.W. Kertadikara,  penerjemah.  G Ö ttingen  :  Institute  of Forest  Genetics  and  Forest  Tree  Breeding  Georg- August-Univerity-Göttingen.  Terjemahan  dari  : An Introduction to Tropical Forest Genetics.
Ferrer  C, et  al .  2001.  Detection  and  Identification  of Fungal  Pathogens  by  PCR  and  by  ITS2  and  5.8S Ribosomal DNA Typing in Ocular Infections. Spain.
http://jcm.asm.org/cgi/content/full/39/8/2873. [15 Februari 2006].
Jobes  DV,  Thien  LB.  1997.  A  Conserved  Motif  in  the 5.8S  Ribosomal  RNA  (rRNA)  Gene  is  a  Useful Diagnostic  Marker  of  Plant  Internal  Transcribe Spacer  (ITS)  Sequence. Plant  Molecular  Biology Reporter 15:326-334.
Tian  MC,  Shang  YZ,  Zhuang  JY,  Wang  Q,  Kakishima M . 2004. Morphological and molecular phylogenetic analysis  of  Melampsora  species  on  popUlars  in China. Mycoscience 45:56-66.
Mirhendi  H,  Makimura  K,  Khoramizadeh  M, Yamaguchi  H.  2006.  A  One-Enzyme  PCR-RFLP Assay  for  Identification  of  Six  Medically  Important Candida Species. Jpn. J. Med. Mycol . 47:225-229.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi  Rekayasa  Genetik a . Bogor:  Pustaka  Wirausaha  Muda  dan  USESE Foundation.
Suhartono  TM.  1989.  Enzim  Dan  Bioteknologi. Bogor:Departemen  Pendidikan  dan  Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Antar
Universitas Bioteknologi Institut Pertanian Bogor.