ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 16 (1) (2013) : 23 – 26
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi, Identifikasi dan Uji Sitotoksik Senyawa Steroid dari Daun Binahong ( Anredera Cordifilia (Ten.) Stennis)
Yuliana Manik a , Enny Fachriyah a* , Dewi Kusrini a
a Organic Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: enny.fachriyah@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t Keywords: Binahong, steroid, n-hexane extract,
cytotoxic
The Binahong ( Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) is a medicinal plant that potential to cure  a  wide  variety  of  diseases  and  useful  as  antibacterial,  antioxidant  and  antiseptic. Steroid was known to be useful as an antibacterial. In this study, isolation, identification and  a  test  of  cytotoxic  to  n-hexane  extract  of  binahong  leaves  have  been  conducted. Analysis of white crystal isolate with a melting point of 154,9  -155,3°C was done using FTIR spectrophotometer and LC-MS. Analysis of isolate using FT-IR spectrophotometer indicated that the isolate contained groups of -OH, -C-O, C=C, -CH 3 and -CH 2 . The LC- MC chromatogram indicated that the compounds had a molecular weight of 351 g/mol, which indicated the stigmasterol (steroid alcohol). The results of cytotoxic test with BSLT method showed that only fraction A was toxic with value of LC 50 9.931 ppm, extract of n- hexane,  fraction  B,  fraction  C,  and  fraction  D  were  not  toxic  with  value  of  LC 50 were 463.877 ppm, 1664.039 ppm, 1341.507 ppm and 172.213 ppm.

## A b s t r a k
Kata kunci: Binahong, steroid, ektrak n-heksana, sitotoksik
Binahong ( Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) adalah tanaman obat potensial yang dapat mengatasi  berbagai  jenis  penyakit  dan  berguna  sebagai  antibakteri,  antioksidan  dan antiseptik.  Steroid  diketahui  bermanfaat  sebagai  antibakteri.  Pada  penelitian  ini  telah dilakukan  isolasi,  identifikasi  dan  uji  sitotoksik  terhadap  ekstrak  n-heksana.  Analisis isolat  yang  berupa  kristal  putih  dengan  titik  leleh  sebesar  154,9-155,3oC  dilakukan menggunakan  spektrofotometer  FT-IR  dan  LC-MS.  Hasil  analisis  FT-IR  menunjukkan isolat  memiliki  gugus – OH,  -C-O,  C=C, – CH3  dan – CH2.  Sedangkan  hasil  LC-MS menunjukkan bahwa isolat memiliki berat molekul 351 g/mol. Berat molekul ini diduga dimiliki oleh senyawa stigmasterol (steroid alkohol) yang telah mengalami pemutusan ikatan pada rantai cabang. Hasil uji sitotoksik dengan metode BSLT menunjukkan bahwa hanya fraksi A bersifat toksik dengan harga LC 50 sebesar 9,931 ppm sedangkan ekstrak n- heksana, fraksi B, C, dan D tidak bersifat toksik dengan harga LC 50 berturut-turut 463,877 ppm, 1664,039 ppm, 1341,507 ppm dan 172,213 ppm.

## 1. Pendahuluan
Binahong  ( Anredera  cordifolia (Tenore)  Steenis) adalah  tanaman  obat  potensial  yang  dapat  mengatasi berbagai jenis penyakit dan berguna sebagai antibakteri, antioksidan  dan  antiseptik  [1].  Kemampuan  daun binahong untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit berkaitan erat dengan senyawa aktif yang terkandung di dalamnya,  salah  satunya  adalah  steroid.  Kemampuan
steroid dari daun binahong perlu diaplikasikan, terutama dalam  pembuatan  obat.  Penelitian  ini  dilakukan  untuk mengisolasi,  mengidentifikasi  dan  menguji  sitotoksik senyawa steroid ekstrak n -heksana daun binahong.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 16 (1) (2013) : 23 – 26

## 2. Metodologi

## Alat & Bahan
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun binahong yang berasal dari kota Brebes, isolasi dan uji  penapisan  fitokimia  menggunakan  n-heksana, kloroform,  etil  asetat,  benzena,  diklorometana,  aseton, silika gel, pereaksi Lieberman-Burchad (anhidrida asam asetat  p.a, asam  sulfat  pekat  p.a),  pereaksi  Meyer (merkuri (I) klorida p.a, kalium iodida p.a), larutan besi (III) klorida 1 %, asam klorida pekat, serbuk magnesium, amilalkohol p.a, amonia 25% teknis, kloroform p.a, asam klorida 37% p.a , akuades, tween ® 20 dan Artemia salina digunakan untuk uji sitotoksik steroid.
Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah gelas standar penelitian, satu set alat maserator, blender,  kolom  kromatografi,  satu  set  alat rotary evaporator ,  neraca  analitis,  plat  tetes,  pipet  tetes,  pipet mikro,  kaca  pembesar,  botol  vial,  cawan  penguapan, akuarium  penetasan,  satu  set  alat  KLT,  lampu  UV, spektrometer FT-IR dan LC-MS.

## Preparasi sampel
Daun Binahong diiris tipis-tipis, kemudian kering- anginkan (simplisia). Setelah kering, simplisia diblender hingga  menjadi  serbuk  daun  binahong  kemudian dimaserasi dengan n-heksana.

## Penapisan fitokimia
Serbuk  daun  binahong  dan  ektrak  n-heksana  diuji dengan  penapisan  fitokimia  untuk  mengetahui kandungan  golongan  senyawa  kimianya  meliputi  uji saponin,  uji  flavonoid,  uji  fenolik,  uji  alkaloid,  uji triterpenoid dan ujisteroid/triterpenoid.

## Isolasi steroid
Serbuk  daun  binahong  dimaserasi  menggunakan pelarut  n-heksana.  Kemudian  ekstrak  yang  didapatkan dievaporasi  menggunakan  evaporator.  Ekstrak  yang didapat kemudian dilakukan KLT dengan menggunakan campuran  n-heksana,  kloroform,  etil  asetat,  benzena dan  diklorometana  dengan  perbandingan  tertentu. Setelah  didapatkan  komposisi  eluen  yang  sesuai, kemudian dilakukan pemisahan senyawa-senyawa yang terdapat pada ekstrak n-heksana tersebut menggunakan kromatografi  kolom.  Eluen  yang  digunakan  pada kromatografi  kolom  adalah  eluen  terbaik  hasil kromtografi  lapis  tipis.  Fraksi  yang  keluar  ditampung dalam  botol  vial.  Dari  seluruh  fraksi  yang  diperoleh dilakukan  uji  KLT  menggunakan  campuran  n-heksana, kloroform,  etil  asetat,  benzena  dan  diklorometana. Fraksi  yang  menghasilkan  noda  sama  digabungkan menjadi satu. Kemudian dilakukan uji steroid, fraksi yang mengandung steroid kemudian dilakukan KLT preparatif menggunakan  campuran  eluen  n-heksana,  kloroform, etil  asetat,  benzena  dan  diklorometana  dengan perbandingan  tertentu.  Setelah  didapatkan  noda-noda pada  plat  KLT,  kemudian  diuji  steroid  kembali.  Setelah didapatkan  bahwa  ada  senyawa  steroid  pada  noda tersebut, kemudian dikerok dan dimurnikan.

## Uji kemurnian dan pemurnian
Steroid  hasil  isolasi  dilakukan  uji  kemurnian menggunakan  KLT  dengan  berbagai  macam  campuran pelarut yaitu n-heksana, kloroform, etil asetat, benzena, diklorometana dan aseton serta menggunakan KLT dua dimensi.  Apabila  hanya  didapatkan  satu  noda,  maka dapat dikatakan bahwa steroid telah murni.

## Analisis steroid
Analisis  steroid  menggunakan  spektrometer FT-IR untuk mengetahui gugus fungsi steroid dan spektrometer  LC-MS  untuk  mengetahui  berat  molekul steroid.

## Uji sitotoksik dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Uji  sitotoksik  dilakukan  dengan  metode  BSLT. Sampel  yang  diujikan  meliputi  ekstrak  n-heksana  dan fraksi  fraksi  hasil  kromatografi  kolom ( FA, FB, FC  dan FD).
Telur Artemia  salina menetas  dalam  waktu  2  hari untuk menjadi larva. Larva dibiarkan hidup selama 2 hari dan  siap  digunakan.  Masing-masing  10  larva Artemia salina dimasukkan ke dalam vial yang berisi sampel yang dilarutkan dalam air laut dengan konsentrasi 10 ppm,100 ppm,  1000  ppm,  dan  blanko  (sampel)  selama  24  jam. Pembuatan  variasi  konsentrasi  dilakukan  dengan penambahan  Tween ® 20.  Uji  toksisitas  diukur berdasarkan  jumlah  larva A.salina yang  mati. Pengulangan  dilakukan  sebanyak  3  kali.  LC 50 diperoleh berdasarkan analisis probit [2].

## 3. Hasil Dan Pembahasan
Hasil maserasi serbuk daun binahong sebanyak 750g menggunakan pelarut n-heksana menghasilkan ekstrak n-heksana  berbentuk  pasta  berwarna  hijau  kehitaman sebanyak 35,76 g. Serbuk daun binahong dan ekstrak n- heksana  kemudian  dilakukan  uji  penapisan  fitokimia. Hasil  penapisan  fitokimia  menunjukkan  bahwa  serbuk daun binahong mengandung senyawa golongan saponin, flavonoid,  steroid  dan  triterpenoid,  sedangkan  ekstrak n-heksana  daun  binahong  mengandung  senyawa golongan flavonoid dan steroid.
Identifikasi  kandungan  steroid  dilakukan  dengan cara mereaksikan dengan pereaksi Liberman-Buchard (2 tetes  anhidrida  asam  asetat  dan  1  tetes  asam  sulfat pekat).  Keberadaan  steroid  ditunjukkan  dengan  adanya warna ungu [3].
Gambar 1. Hasil uji kemurnian fraksi A dengan KLT berbagai pelarut di bawah lampu uv 365 nm
Isolasi  steroid  dengan  metode  kromatografi  kolom menggunakan  pelarut  benzena  :  kloroform  : diklorometana  (1:1:1)  menghasilkan  4  fraksi  besar  (FA, FB,  FC  dan  FD)  dengan  pola  noda  yang  berbeda-beda. Terhadap  fraksi  besar  A,  B,  C  dan  D  dilakukan  uji kualitatif  terhadap  steroid  dengan  penampak  bercak Lieberman-Burchad. Pada tahap ini fraksi A memberikan uji positif terhadap steroid dengan ditandai terbentuknya warna  ungu  kehijauan  setelah  disemprot  penampak bercak Lieberman-Burchad sehingga fraksi A dilanjutkan ke tahap berikutnya. Fraksi A dilakukan KLT preparatif  dan  diuji  kemurnian  dengan  KLT  berbagai pelarut dan KLT 2 dimensi. Hasil uji kemurnian fraksi A dengan KLT berbagai pelarut ditampilkan pada gambar 1.
Gambar 2. Hasil uji kemurnian fraksi A dengan KLT 2 dimensi
Uji  kemurnian  dilanjutkan  dengan  KLT  2  dimensi dengan  pelarut  benzena  :  kloroform  :  diklorometana (1:1:1) dan benzena : kloroform (1:1). Hasil uji kemurnian dengan KLT 2 dimensi ditampilkan pada gambar 2.
Berdasarkan  hasil  analisis  menggunakan  KLT berbagai pelarut maupun KLT 2 dimensi terhadap noda uji menunjukkan adanya noda tunggal (1 noda) sehingga dapat disimpulkan bahwa isolat (steroid) relatif murni.
Isolasi steroid dari ekstrak n-heksana menghasilkan isolat  berupakristal  berwarna  putih  dengan  rendemen hasil  sebesar  4%  dari  ekstrak  n-heksana  dengan  titik leleh  154,9-155,3 o C.  Titik  leleh  ini mendekati  titik  leleh stigmasterol,  jenis  steroid  alkohol  yang  memiliki  titik leleh 154-155 o C [4].
Analisis  isolat  steroid  dilakukan  menggunakan spektofotometer FT-IR dan LC-MS. Hasil analisis isolat steroid menggunakan FT-IR ditampilkan pada tabel 1.
Tabel 1: Hasil analisis dengan FT-IR isolat steroid [5]
Bilangan Gelombang (cm -1 ) Jenis Vibrasi 3441,01 Vibrasi ulur O-H bebas 2931,80 Vibrasi ulur -C-H alifatik asimetri 2862,36 Vibrasi ulur -C-H alifatik simetri 1627,92 Vibrasi ulur C=C 1573,91 Vibrasi ulur C=C 1103,28 Vibrasi ulur C-O alkohol 802,39 Vibrasi tekuk C-H 2
Analisis  isolat  dilanjutkan  dengan  menggunakan LC-MS.  Data  spektogram  massa  hasil  analisis  isolat steroid menggunakan LC-MS ditampilkan pada gambar 3.
Gambar 3. Spektogram massa isolat steroid daun binahong
Berdasarkan  hasil  analis  isolat  menggunakan spektofotometer FT-IR diketahui bahwa isolat memiliki gugus -OH, C-O alkohol, C=C, -CH 3 dan -CH 2. Jenis Gugus fungsi  yang  dimiliki  isolat  steroid  ini  mengindikasikan jenis  gugus  fungsi  yang  dimiliki  oleh  steroid  yang mengandung gugus -OH. Sedangkan hasil analisis isolat menggunakan  LC-MS  menunjukkan  bahwa  isolat memiliki berat molekul 351 g/mol yang ditandai dengan munculnya  [M+H] + 352,17  g/mol.  Berat  molekul  ini diduga  dimiliki  oleh  senyawa  stigmasterol  yang  telah mengalami  pemutusan  ikatan  pada  rantai  cabang  [4]. Struktur  molekul  senyawa  stigmasterol  ditampilkan pada gambar 4.
145.0 245.6 346.2 446.8 547.4 648.0 Mass (m/z) 0 139.3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % I n t en si t y Mariner Spec /66:67 (T /3.19:3.24) -56:62 (T -3.19:3.24)  ASC=>NR(2.00)[BP = 279.2, 139] 279.21 352.17 301.16 578.73 353.18 280.22 352.65 579.67 302.14 340.22 580.74 383.03 280.67 219.19 163.39
339.16 423.37 494.63 455.71
Gambar 4. Struktur molekul senyawa stigmasterol
Senyawa  stigmasterol  merupakan  jenis  steroid alkohol  yang  biasa  ditemukan  pada  tumbuhan  famili Basellaceae.  Stigmasterol  memiliki  berat  molekul  412 g/mol  dan  dapat  mengalami  pemutusan  ikatan  pada berat molekul 351 g/mol [6].
UJi sitotoksik dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) terhadap ekstrak n-heksana, fraksi A, fraksi B,  fraksi  C  dan  fraksi  D  menunjukkan  bahwa menunjukkan bahwa hanya fraksi A yang bersifat toksik dengan harga LC 50 9,931 ppm (LC 50 < 10 ppm) sedangkan ekstak  n-heksana,  fraksi  B,  fraksi  C  dan  fraksi  D  tidak bersifat toksik dengan harga LC 50 berturut-turut 463,877 ppm; 1664,039 ppm; 1341,507 ppm dan 172,213 ppm (LC 50 > 100 ppm) [7].

## 4. Kesimpulan
Jenis  steroid  dalam  daun  binahong Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) adalah stigmasterol (steroid alkohol)  sedangkan  hasil  uji  sitotoksik  dengan  metode Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT)  terhadap  ekstrak  n- heksana dan fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom (FA, FB, FC dan FD) menunjukkan bahwa hanya fraksi A yang bersifat  toksik  dengan  harga  LC 50 9,931  ppm  (LC 50 <  10 ppm) sedangkan ekstak n-heksana, fraksi B, fraksi C dan fraksi D tidak bersifat toksik dengan harga LC 50 berturut- turut  463,877  ppm;  1664,039  ppm;  1341,507  ppm  dan 172,213 ppm (LC 50 > 100 ppm).

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Yellia Mangan, Solusi Sehat Mencegah & Mengatasi Kanker, AgroMedia, 2009.
[2]  B.  N.  Meyer,  N.  R.  Ferrigni,  J.  E.  Putnam,  L.  B. Jacobsen,  D.  E.  Nichols,  J.  L.  McLaughlin,  Brine Shrimp:  A  Convenient  General  Bioassay  for  Active Plant Constituents, Planta Med , 45, 05, (1982) 31-34 http://dx.doi.org/10.1055/s-2007-971236
[3]  RW Burke, BI Diamondstone, RA Velapoldi, O Menis, Mechanisms  of  the  Liebermann-Burchard  and  Zak color reactions for cholesterol, Clinical chemistry , 20,
7, (1974) 794-801
[4]  M Suzery, Nurhasnawati E Ngadiwiyono, B Cahyono, Senyawa  stigmasterol  dari  Pimpinella  alpina  Molk, Media Medika Indonesiana, Suppl , 29, 1, (2004) 37-39
[5]  Robert  Milton  Silverstein,  G.  Clayton  Bassler, Terence  C.  Morrill,  Spectrometric  Identification  of Organic Compounds, 4 ed., Wiley, 1981.
[6]  Suvi Kemmo, HPLC analysis of plant sterol oxidation products, (2008)
[7]  MJ  Moshi,  E  Innocent,  JJ  Magadula,  DF  Otieno,  A Weisheit,  PK  Mbabazi,  RSO  Nondo,  Brine  shrimp toxicity of some plants used as traditional medicines in Kagera region, north western Tanzania, Tanzania journal  of  health  research ,  12,  1,  (2010)  63-67 http://dx.doi.org/10.4314/thrb.v12i1.56287