Karakterisasi PHA yang dihasilkan oleh Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus  subtilis yang ditumbuhkan dalam media limbah cair pabrik kelapa sawit
Characterization of  PHA  produced by Pseudomonas aeruginosa and  Bacillus subtilis inoculated in palm oil mill effluent (POME) media
Irma KRESNAWATY *) ,  Agustin Sri MULYATNI, Deden Dewantara ERIS & Haryo Tejo PRAKOSO
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia Jl. Taman Kencana No. 1 Bogor 16128 Indonesia
Diterima tanggal 25 Agustus 2014/disetujui tanggal 3 November 2014

## Abstract
The difficulties in processing of petroleum-based plastic waste  had  encouraged  the  development  of  biodegradable plastics polyhydroxyalkanoate (PHA). Researchers isolated the  PHA-producing  microorganisms  from  various  sources to obtain new species with high PHA production capability. In  addition,  the  high  cost  of  PHA  production  might  be overcome by using carbon-rich waste, such as palm oil mill effluent (POME). This research conducted characterization of  produced  PHA  and  optimization  of  PHA  production  in POME.  In  previous  research,  three  potential  isolates  were obtained,  which  are  one Pseudomonas  aeruginosa isolate and  two Bacillus  subtilis isolates.  Analysis  of  Scanning Electron  Microscopy  (SEM)  and  Transmission  Electron Microscopy  (TEM)  showed  the  presence  of  PHA  accumu- lation  within  the  bacterial  cell.  The  results  of  Spectra  of Fourier  Transform  Infra  Red  Spectroscopy  (FT-IR) revealed  differences  in  C-C  and  C-H  alipathic  regions  of PHA  produced  by Pseudomonas  aeruginosa and Bacillus subtilis. Optimum  production  of  PHA  was  obtained  using POME  at  concentration  of  50-25%  during  6  days  of incubation time in an enriched media pretreatment.
[Keywords: Bioplastic, polyhyroxyalkanoate , waste treatment]

## Abstrak
Sulitnya  pengolahan  limbah  plastik  berbasis  minyak bumi mendorong pengembangan plastik biodegradable poli- hidroksialkanoat  (PHA).  Beberapa  peneliti  mengisolasi mikroorganisme  penghasil    PHA  dari  berbagai  sumber karena  diharapkan  akan  diperoleh  spesies  baru  dengan kemampuan  produksi  PHA  yang  tinggi.  Selain  itu  kendala tingginya biaya produksi PHA dapat diatasi dengan peman- faatan  limbah  yang  kaya  akan    karbon,  seperti  limbah  cair pabrik kelapa sawit (LCPKS). Pada penelitian ini dilakukan karakterisasi  PHA  yang  dihasilkan  dan  optimasi  produksi PHA  pada  LCPKS.  Pada  penelitian  sebelumnya  telah diperoleh    tiga  isolat  potensial,  yaitu  :  satu  isolat Pseudo- monas aeruginosa dan dua isolat Bacillus subtilis .  Analisis Scanning  Electron  Microscopy (SEM)  dan Transmission Electon Microscopy (TEM) menunjukkan adanya akumulasi PHA  di  dalam  sel  bakteri.  Dari  hasil  analisis  FT-IR disimpulkan bahwa senyawa PHA  yang dihasilkan Pseudo- monas  aeruginosa berbeda  dengan Bacillus  subtilis yang ditandai   perbedaan   pada  spectra   gugus  C-C  dan   C-H alifatik.  Produksi optimum PHA diperoleh pada konsentrasi
LCPKS  50-25%,  waktu  inkubasi    enam  hari  dan  optima- lisasi pertumbuhan pada media kaya di awal untuk mening- katkan populasi mikroba.
[Kata kunci : Bioplastik, polihidroksi alkanoat, penanganan limbah ]

## Pendahuluan
Saat  ini,  salah  satu    masalah  terbesar  negara berkembang  seperti  Indonesia  adalah  pengelolaan limbah  plastik  berbasis  minyak  bumi.  Sulitnya  pe- ngolahan  limbah plastik  ini  mendorong pengembang- an  plastik  biodegradable  polihidroksialkanoat  (PHA). PHA  merupakan  senyawa  biodegradable  dan  secara alami  diakumulasi  oleh  beberapa  bakteri  seperti Alcaligenes , Pseudomonas , Bacillus , Rhodococcus , Cupriavidus dan beberapa spesies  bakteri fotosintetik dalam kondisi kekurangan nutrisi (Reddy et al ., 2003; Sangkharak  &  Prasertsan,  2007).  PHA    terdiri  dari senyawa    biopoliester  dengan  struktur  yang  sangat beragam.  Beberapa  peneliti  mengisolasi  mikro- organisme  penghasil    PHA  dari  berbagai  sumber karena  diharapkan  akan  memperoleh  spesies  baru dengan  kemampuan  produksi  PHA  yang  tinggi (Singh  &  Parmar,  2011).  Wu et  al .  (2000)  mem- peroleh  data  bahwa  PHA  dapat  disintesis  oleh  lebih dari    30%  bakteri  tanah  lumpur  aktif,  bakteri  dasar laut  dan  bakteri  yang    hidup  di  kondisi  lingkungan ekstrim lainnya.
Pada  penelitian  sebelumnya  telah  dilakukan penapisan    beberapa  isolat  bakteri  yang  berasal  dari tempat  pembuangan  sampah  akhir  (TPA)  dan  limbah cair  kelapa sawit (LCPKS), dan diperoleh  tiga isolat potensial, yaitu: satu  isolat Pseudomonas aeruginosa dan  dua  isolat Bacillus  subtilis .  Identifikasi  spesies mikroba  potensial  penghasil  PHA  merupakan  hal yang  penting  karena  setiap  bakteri  memiliki  jalur biosintesis  yang  spesifik  dan  memerlukan  kondisi optimum  tertentu.  Jika  dibandingkan  jalur  sintesis PHA pada masing-masing spesies ini, pada P. aerugi- nosa, PHA  disintesis  dari  asetil-CoA  melalui  sintesis asam  lemak  (Jalur  II).  (Valentin et  al .,  2000).  Selain itu  juga  diketahui  bahwa P. aeruginosa tidak ber-
*) Penulis Korespondensi: irma.kresnawaty@ yahoo.com
Karakterisasi PHA yang dihasilkan  oleh Pseudomonas aeruginosa ……. (Kresnawaty et al .)
gantung  kepada  kondisi  nutrisi  terbatas  untuk  mem- produksi  PHA  karena  bakteri  jenis  ini  memproduksi PHA  selama  proses  pertumbuhan  sel  (Fernandez et al. , 2005).
Faktor  pembatas  yang    kerap  dijumpai  dalam memproduksi  PHA  dari  bakteri  adalah  ongkos produksi  yang  mahal,  hampir  lima  kali  lipat  ongkos produksi  plastik  secara  konvensional  (Kim,  2000). Mahalnya  ongkos  produksi  terkait  erat  dengan  peng- gunaan  sumber  karbon.  Untuk  itu,  sumber  karbon alternatif  dengan  harga  relatif  murah  mutlak  diperlu- kan  (Cramm,  2009).  Salah  satu  sumber  karbon alternatif  yang  tersedia  banyak  di  Indonesia  adalah limbah cair  pabrik kelapa sawit (LCPKS),  mengingat Indonesia  adalah  produsen  minyak  sawit  nomor  satu di  dunia  (Lubis  2008).  LCPKS  merupakan  limbah yang berasal dari proses ekstraksi minyak tandan buah segar  pada  pabrik  kelapa  sawit.  Limbah  ini  mem- punyai  kadar  BOD  yang  tinggi  (sekitar  20.000  ppm) dan  kadar  nitrogen  yang  rendah    (kurang  dari  200 ppm dalam  bentuk nitrogen amoniak dan kurang dari 500  ppm  dalam  bentuk  total  nitrogen).  Dengan karakteristik  tersebut,  LCPKS  merupakan  substrat yang  tepat  untuk  produksi  PHA.  Penelitian  ini bertujuan  mengkarakterisasi  PHA  yang  dihasilkan oleh  tiga    isolat  terseleksi  dan  melakukan  optimasi produksi  PHA  pada  limbah  cair  pabrik  kelapa  sawit (LCPKS).

## Bahan dan Metode

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah    limbah  cair  kelapa  sawit  (LCPKS),  NaCl, nutrient  agar  (NA),  nutrient  broth  (NB),  glukosa, (NH 4 ) 2 SO4,  KH 2 PO 4 ,  MgSO 4 .7H 2 O,  asam  sitrat, NaOCl, bufer fosfat, dietil eter, dan H 2 SO 4 .
Pengamatan  mikroskopis  PHA  yang  dihasilkan  oleh bakteri
Pengamatan dilakukan menggunakan alat Scanning  Electron Microscope (SEM) di Pusat Pene- litian  Zoologi  LIPI,  Cibinong  dan Transmission electron  microscopy ( TEM) di  Universitas  Gajah Mada, Yogyakarta.
Karakterisasi PHA menggunakan FT-IR
Karakterisasi  dilakukan  untuk  mengetahui  jenis PHA  yang  dihasilkan  menggunakan  Fourier  Trans- form  Infra  Red  (FT-IR)  di  Pusat  Penelitian  Karet, Bogor.
Optimasi  produksi  PHA  menggunakan  variasi konsentrasi  media  LCPKS,  waktu  inkubasi  dan optimalisasi pertumbuhan
Isolat  dipre-kulturkan  terlebih  dahulu  pada 100  mL    NB  yang  kemudian  diinkubasi  pada shaker dengan kecepatan 150 rpm  selama 24  jam. Inokulum bakteri  yang  telah  dipersiapkan,  diambil  sebanyak 5  mL  kemudian  ditumbuhkan  pada  250  mL  variasi
konsentrasi  LCPKS,  yaitu  100;  50  dan  25%  dan diinkubasi  pada shaker dengan  kecepatan  150  rpm selama  72  jam  pada  suhu  30 o C.  Selain  itu  dilakukan variasi  waktu  inkubasi  menjadi  lima  dan  enam  hari dengan konsentrasi 15 dan 25%.
Untuk  mengoptimalkan  produksi  PHA,  sel bakteri  ditumbuhkan  pada  media  kaya  untuk mengoptimalkan  pertumbuhan  sel  selama  3  hari, kemudian  diinkubadi  pada  media  LCPKS  untuk menginduksi produksi PHA.

## Kuantifikasi PHA
Kultur  bakteri  yang  telah  diinkubasi  selama  72 jam,  disentrifugasi  pada  4000  rpm  selama  15  menit, setelah  itu  supernatan  dibuang  dan  pelet  yang terbentuk  disuspensikan  dengan  5  mL  akuades. Suspensi  sel diambil 1  mL untuk analisis kadar PHB dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang  235  nm  dan  1  mL  suspensi  sel  diambil untuk mengukur berat kering massa sel.
Aluminium  foil  dibuat  seperti  botol,  lalu  di- keringkan  pada  suhu  70 o C  selama  24  jam.  Berat kering  aluminium  foil  ditimbang  hingga  berat konstan,  lalu  ditambahkan  1  mL  suspensi  sel. Aluminium  foil  berisi 1  mL  suspensi sel dimasukkan ke  dalam  oven  dengan  suhu  70 o C  selama  24  jam, kemudian  aluminium  foil  berisi  suspensi  sel  yang telah dikeringkan ditimbang hingga berat konstan lalu berat kering massa sel dihitung.
Kemudian  ke  dalam  suspensi  sel  ditambahkan 3 mL  bufer fosfat pH 7,0 dan 1 mL NaOCl 5 %, dan diinkubasi  pada  suhu  25 o C dengan  kecepatan 180  rpm  selama  24  jam.  Sisa  pelet  dikumpulkan dengan sentrifugasi pada  4.000 rpm selama 15 menit. Supernatan kemudian disentrifugasi kembali sebanyak tiga  kali  pada  kecepatan  4.000  rpm  selama  15  menit dengan  pelarut masing-masing, yaitu:  5 mL aquades, 3  mL  aseton  dan  3  mL  eter.  Supernatan  dibuang  dan pelet  dicuci  secara  perlahan  dengan  3  mL  dietil  eter dan  didiamkan  selama  lima  menit,  kemudian  eter dibuang.  Setelah  pelet  kering  ditambahkan  3  mL H 2 SO 4 pekat,  dan  dipanaskan  dalam water  bath dengan  suhu  100 o C  selama  10  menit.  Kadar  PHA dideterminasi  menggunakan  spektrofotometer  UV pada  panjang  gelombang  235  nm  dengan  pelarut H 2 SO 4 pekat.

## Hasil dan Pembahasan
Pengamatan  mikroskopis  PHA  yang  dihasilkan  oleh bakteri
Hasil Scanning  Electron  Microscope (SEM) (Gambar 1) menunjukkan bahwa isolat-isolat perlakuan  yang  ditumbuhkan  pada  media  Ramsay (kaya    C  dan  miskin  N  dan  P)  mengakumulasi  PHA (ditandai  dengan  tanda  panah),  sementara  pada kontrol  tidak  ditemukan  adanya  akumulasi  PHA. Isolat Pseudomonas aeruginosa mengakumulasi PHA lebih  banyak dibandingkan   isolat Bacillus sublitilis . Hal yang sama juga disimpulkan pada penelitian
Gambar  1.  Hasil Scanning  Electron  Microscope (SEM)  dengan  perbesaran  5.000  kali  untuk  masing-masing  perlakuan  :  A1) Kontrol Bacillus  subtilis SO5,  A2)  Produksi  PHA Bacillus  subtilis SO5,  B1)  Kontrol Pseudomonas  aeruginosa DO9,  B2)  Produksi  PHA Pseudomonas  aeruginosa DO9,  C1)  Kontrol Bacillus  subtilis DO2,  dan  C2)  Produksi PHA Bacillus subtilis DO2.
Figure 1.  Scanning Electron Microscope (SEM) result  with  5,000  times magnification respectively : A1) Control of Bacillus subtilis SO5,  A2) Bacillus  subtilis SO5  PHA  production,  B1)  Control  of Pseudomonas  aeruginosa DO9,  B2) Pseudomonas  aeruginosa DO9  PHA  production,  C1)  Control  of Bacillus  subtilis DO2,  and  C2) Bacillus  subtilis DO2 PHA production.
Sangkharak  &  Prasertsan    (2012)  dimana  isolat koleksi Pseudomonas aeruginosa menghasilkan PHA hampir dua kali lipat yang dihasilkan Bacillus subtilis . Pada  hasil  SEM  terlihat  bahwa  PHA  membentuk granul  amorf  bahkan  kadang  granul spherical yang terakumulasi  di  dalam  sel  dan  mendorong  sel  untuk lebih membesar.
Selain  SEM,  dilakukan  pengamatan Trans- mission  electron  microscopy ( TEM)  dengan  tujuan mengamati ukuran PHA yang dihasilkan. Pengamatan TEM    (Gambar  2)  menghasilkan  pengamatan  yang kurang jelas dikarenakan populasi sel yang  tinggi dan karena  ditumbuhkan  pada  media  LCPKS  yang berwarna  hitam.  Selain  itu,  kemungkinan  kondisi  sel bakteri yang tidak lagi sempurna, bahkan diduga telah mengalami  lisis.  Komponen  yang  diduga  PHA  telah dieksresikan  dari  sel  bakteri  yang  mengalami  lisis (Gambar  3).  Dari  hasil  TEM,  isolat Pseudomonas aeruginosa menunjukkan  akumulasi  PHA  yang  lebih tinggi  dibandingkan  yang  lain  dengan  ukuran  PHA diasumsi mencapai 200-1000 nm.
Karakterisasi PHA menggunakan FT-IR
Analisis  FT-IR  dari  PHA  yang  dihasilkan  me- nunjukkan  masing-masing  spesies  ini  memproduksi PHA  yang  berbeda..  Hasil  analisis  FT-IR  PHA Bacillus subtilis menunjukkan adanya pita gugus C-H (daerah  2922  nm)  dan  C-C    (daerah  1380,  1453  dan 1531  nm)  lebih  dominan  dibanding Pseudomonas aeruginosa (Gambar  3,  4  dan  5).  Hasil  penelitian Sangkharak & Prasertsan (2012) menunjukkan bahwa dengan  sumber  karbon  LCPKS, Bacillus  subtilis menghasilkan  kadar  polihidroksi  valerat  lebih  tinggi dibandingkan Pseudomona s  sp.    Diasumsikan  bahwa Pseudomonas  aeruginosa juga  lebih  banyak  meng- hasilkan  polihiroksi  butirat  dibanding  polihidroksi valerat  dan  polihidroksi  heksanoat.  Hal  ini  men- dukung  hasil  penelitian  Thirumala et  al .  (2010)  yang menyatakan  bahwa Bacillus sp.  memiliki  kemam- puan yang besar dalam menghasilkan PHA jenis baru dengan  rentang  komposisi  monomer  yang  besar karena kemampuannya untuk menggabungkan rantai
B1 1 B1 B1 B2 A2 A1 C1 1 C2 B2
Karakterisasi PHA yang dihasilkan  oleh Pseudomonas aeruginosa ……. (Kresnawaty et al .)
Gambar 2.  Hasil Transmission electron microscopy ( TEM) mikroba penghasil PHA. A). Bacillus subtilis D02,
B). Bacillus subtilis SO5 dan C). Pseudomonas aeruginosa TH09.
Figure 2.   Transmission electron microscopy ( TEM) results of PHA producing bacterias. A). Bacillus subtilis D02,
B). Bacillus subtilis SO5, and C). Pseudomonas aeruginosa TH09.
Gambar 3. Hasil analisis FT-IR PHA yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis DO2.
Figure 3.   FT-IR analysis of PHA  produced by Bacillus subtilis DO2 .
Gambar 4.  Hasil analisis FT-IR PHA yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis SO5
Figure 4.   FT-IR analysis of PHA  produced by Bacillus subtilis SO5 .
C A B T ra ns m it ta nc e % Wave numbers (cm-1) C=O C-C 99 98 97 96 95 94 93 92 91 90 89 88 87 86 85 84 83 82 81 4000            3500               3000                 2500                2000                1500                 1000                 500 -OH 3271.82 2922,17 C-H alifatik 1622,07 17 37,41 1531.05 1048.90 1380.33 1453.35 c-c C=O C-O alkohol /karboksilat T ran smi tt an ce % 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 4000             3500                 3000               2500                 2000              1500                 1000                500 Wave numbers (cm-1) 3270,96 1623,37 1062,01 1214,03 1403,26 C-H alifatik -OH C-C C=O C-O alkohol /karboksilat
Menara Perkebunan 2014 82(2), 57-63
pendek  ( short chain length /scl) dan rantai menengah ( medium  chain  length /mcl).  Jika  dibandingkan  pada dua strain Bacillus  subtilis , terlihat bahwa pita gugus O-H  lebih  dominan  pada Bacillus  sublitis SO5 (Gambar 3 dan 4). Hal ini dapat dikarenakan gugus O- H  yang  lebih  banyak  pada  senyawa  PHA  strain Bacillus sublitis SO5, yang secara tidak langsung juga menunjukkan rantai polimer yang lebih panjang.
Optimasi  produksi  PHA  menggunakan  variasi konsentrasi  media  LCPKS,  waktu  inkubasi  dan optimalisasi pertumbuhan
LCPKS  mengandung  banyak  senyawa  organik dan  mineral  an-organik.  Limbah  ini  mengandung karbohidrat dan gula dalam  jumlah tinggi, sedangkan nitrogen  sangat  rendah  sehingga  tepat  sebagai  media mikroba  penghasil  PHA.  Hasil  produksi  PHA  di LCPKS menunjukkan bahwa konsentrasi LCPKS 100 dan  50%  menghasilkan  PHA  dalam  jumlah  yang relatif  sama.  Hasil  tersebut  berkesesuaian  dengan penelitian  Tamboli et  al (2010)  yang  menumbuhkan Sphingobacterium sp  di  media  molasses  dan  pada konsentrasi  tertentu,  kadar  PHA  yang  dihasilkan konstan  walaupun  konsentrasi  molases  ditambah sehingga  diduga  berkaitan  dengan  rasio  jumlah substrat  maksimal  terhadap  enzim.  Penurunan  kadar LCPKS  menjadi  25%  menurunkan  produksi  PHA sebesar  59-76%  (Tabel  1).  Jika  dibandingkan produksi  PHA  pada  LCPKS  dengan  media  Ramsay, media  LCPKS  menyebabkan  penurunan  produksi PHA.  Hal  ini  dapat  disebabkan  kandungan  karbon yang  umumnya  berupa  asam  lemak  pada  LCPKS yang  agak  sulit  untuk  langsung  digunakan  bakteri untuk  menghasilkan  PHA.  Karena  itu  diperlukan perlakuan  anerobik  dimana  akan  terjadi  proses hidrolisis dan acidogenesis untuk  menghasilkan asam lemak  rantai  pendek  volatile   ( volatile  fatty  acid /
VFA), seperti asam asetat, asam butirat, asam  valerat dan  asam  kaproat  yang  lebih  mudah  dikonversi menjadi  PHA  (Bengtsson et  al .,  2009).  Di  samping itu,  produksi  PHA  yang  masih  rendah  ini  dapat dikarenakan kandungan karbon LCPKS yang digunakan saat itu relative  lebih rendah, yaitu 1,09% (sementara  kadar  nitrogen  sama  0,075%)  jika dibandingkan  LCPKS    normal  mengandung  karbon lebih dari 5% (Ahmad et al ., 2003).  Penurunan  kadar karbon ini dapat dikarenakan proses konversi okidatif dan  fermentatif  senyawa  karbon  oleh  bakteri-bakteri indigenous  menjadi  CO 2 dan  CH 4 yang  lepas  ke udara.
Selain  karena  faktor  perlunya  perlakuan  awal limbah  sebelum  digunakan  sebagai  media  produksi PHA,  waktu  inkubasi  juga  memegang  peranan penting  untuk  optimasi  produksi  PHA.  Dengan penambahan waktu inkubasi menjadi 5 hari, produksi PHA  meningkat  menjadi  1,0456%  dan  mencapai 1,5305%  pada  hari  ke-6  (Tabel  2).  Hal  ini  dapat dikarenakan  mikroba  tersebut  memerlukan  waktu adaptasi  dengan  media  LCPKS  yang  memiliki karakteristik  berbeda  dengan  media  Ramsay  yang sebelumnya  digunakan.  Di  samping  waktu  inkubasi, dilakukan  juga  perlakuan  optimasi  pertumbuhan mikroba  sebelum  dikulturkan  dalam  media  LCPKS. Seperti  diketahui,  proses  produksi  PHA  melibatkan berbagai enzim yang umumnya terdiri dari unsur N, P dan  S,  sehingga  defisiensi  unsur  ini  pada  awal pertumbuhan akan mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim-enzim tersebut. Sehingga optimalisasi pertumbuhan  mikroba  pada  media  kaya  ( nutrient broth ) diharapkan akan memaksimalkan pertumbuhan mikroba  dan  produksi  enzim-enzim  yang  terlibat dalam  sintesis  PHA,  sehingga  nantinya  akan memaksimalkan  juga  produksi  PHA  pada  saat dikulturkan  pada  media  miskin  nutrisi  (kecuali karbon).
Gambar 5. Hasil analisis FT-IR PHA yang dihasilkan oleh Pseudomonas aeruginosa DO9.
Figure 5.    FT-IR analysis of PHA  produced by Pseudomonas aeruginosa DO9.
T ra ns m it ta nc e % Wave numbers (cm-1) 97 96 95 94 93 92 91 90 89 88 87 86 4000              3500              3000                  2500              2000                 1500               1000                  500 C-O alkohol /karboksilat C=O -OH 3345,13 1633,99 1058,94
Karakterisasi PHA yang dihasilkan  oleh Pseudomonas aeruginosa ……. (Kresnawaty et al .)
Tabel 1. Jumlah  PHA yang dihasilkan pada variasi konsentrasi LCPKS. Table 1. PHA quantity that produced in variation concentarion of POME.
No Strain Bakteri Bacteria strains Kadar PHA (% PHA / berat kering massa sel) PHA quantity (% PHA/dry weight of cell mass) LCPKS (POME) 100% LCPKS (POME) 50% LCPKS (POME) 25% 1 P. aeruginosa DO9 0,3071 0,3913 0,1282 2 Bacillus subtilis DO2 0,3407 0,6128 0,1565 3 Bacillus subtilis SO5 0,3461 0,3076 0,1934
Tabel 2.  Jumlah  PHA yang dihasilkan oleh Pseudomonas aeruginosa DO9 pada variasi  konsentrasi LCPKS dan waktu inkubasi.
Table 2.  PHA quantity that produced by Pseudomonas aeruginosa DO9 in variation of  concentarion of POME and variation of incubation  time.
No Persentase  LCPKS POME percentage (%) Kadar PHA (% PHA/berat kering massa sel) PHA quantity (% PHA/dry weight of cell mass) 5 hari/days 6 hari/days 1 15 0,5115 1,0327 2 25 1,0456 1,5305
Tabel 3. Jumlah  PHA yang dihasilkan oleh Pseudomonas aeruginosa DO9  pada variasi konsentrasi LCPKS dengan perlakuan awal ditumbuhkan di media kaya ( nutrient broth ) selama tiga hari.
Table 3 . PHA  quantity  that  produced   by Pseudomonas  aeruginosa   DO9 in variation concentarion of POME with pre treatment which was incubated in rich nutrient (nutrient broth) for three days.
Persentase  LCPKS POME percentage (%) Kadar PHA (% PHA / berat kering massa sel) PHA quantity (% PHA/dry weight of cell mass) 20 0,764 30 0,767 40 0,775
Optimalisasi  pertumbuhan  terlebih  dahulu  (Tabel  3) menghasilkan  produksi  PHA  yang  lebih  tinggi dibanding  tanpa  optimalisasi  pertumbuhan  (Tabel  1). Hal  ini  dikarenakan  sel  telah  memiliki  semua kebutuhan  pokoknya  ( building  block  cell )  untuk tumbuh dari media kaya (nutrient broth), dan menjadi dapat  focus  untuk  menghasilkan  PHA  tanpa  harus menyusun  komponen  sel  yang  penting  lainnya. Jumlah  produksi  PHA  yang  tidak  berbeda  jauh dengan variasi konsentrasi LCPKS, dapat dikarenakan kerja  enzim  yang  berperan  dalam  proses  biosintesis PHA  memiliki  batas  maksimal  jumlah  substrat. Sehingga seberapa banyakpun substrat yang ditambahkan,  kadar  PHA  yang  dihasilkan  relatif sama.    Untuk  mendapatkan  produksi  PHA  yang optimum  masih  perlu  dilakukan  lagi  optimasi beberapa parameter di antaranya : pH, perlakuan awal fermentasi  anerobik,  variasi  kondisi  LCPKS,  aerasi dan optimalisasi ekstraksi PHA.

## Kesimpulan dan Saran
Analisis  SEM  dan  TEM  menunjukkan  adanya akumulasi  PHA  di  dalam  sel  bakteri.  Dari  hasil analisis  FT-IR  disimpulkan  bahwa  senyawa  PHA
yang  dihasilkan Pseudomonas  aeruginosa berbeda dengan Bacillus  subtilis yang  ditandai  perbedaan pada  spektra  gugus  C-C  dan  C-H  alifatik.    Produksi optimum  PHA  diperoleh  pada  konsentrasi  50-25%, waktu  inkubasi  6  hari  dan  optimalisasi  pertumbuhan pada  media  kaya  di  awal  untuk  meningkatkan populasi  mikroba.  Untuk  mendapatkan  data  kondisi optimum  produksi  PHA,  masih  perlu  dilakukan beberapa  pengujian  lagi,  di  antaranya  variasi  pH, fermentasi  anerobik,  kondisi  LCPKS,  aerasi  dan kecocokan bakteri  yang digunakan, serta optimalisasi ekstraksi PHA.

## Daftar Pustaka
Ahmad  AL,  S  Ismail  &  S  Bhatia  (2003).  Water  recycling from palm oil  mill  effluent (POME) using  membrane technology. Desalination , 157, 87-95.
Bengtsson  S  (2009).  The  utilization  of  glycogen accumulating  organisms for mixed  culture production of  polyhydroxyalkanoates. Biotechnol  Bioeng 104, 698–708.
Cramm  R  (2009).  Genomic  view  of  energy  metabolism  in Ralstonia  eutropha H16. J  Mol  Microbiol  Biotechnol 16, 38-52.
B C
Fernandez  D,    E  Rodr´ıguez,  M  Bassas,  M  Vi˜nas, AM  Solanas,  J  Llorens,  AM  Marqu´es  &  A  Manresa.
(2005).  Agro-industrial  oily  wastes  as  substrates  for PHA  production  by  the  new  strain Pseudomonas aeruginosa NCIB  40045:  Effect  of  culture  conditions. Biochem Engin J 26, 159–167.
Kim  BS  (2000). Production  of  poly  (3-hydroxybutyrate) from  inexpensive  substrates. Enzyme  Microb  Technol 27, 774-777.
Lubis AU (2008). Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) di Indonesia . Edisi 2. Medan, Pusat Penelitian Perkebunan Marihat.  348p.
Reddy  CSK.,  R  Ghai,  R  Rasmi  &  VC  Kalia    (2003). Polyhydroxyalkanoates: An overview. Bioresour Technol 87, 137- 146.
Sangkharak  K  &  P  Prasertsan  (2007).  Optimization  of polyhydroxybutyrate production from wild type and two mutant  strains  of Rhodobacter  sphaeroides using statistical method. J Biotechnol 132, 331-  340.
Sangkharak  K  &  P  Prasertsan  (2012).  Screening  and identification  of  polyhydroxyalkanoates  producing
bacteria  and  biochemical  characterization  of  their possible application. J Gen Appl Microbiol 58, 173-182.
Tamboli  DP,  MB  Kurade,  TR  Waghmode,  SM  Joshi,    SP Govindwar  &  J  Hazard  Mater  (2010).  Exploring  the ability of Sphingo-bacterium sp. ATM to degrade textile dye  Direct  Blue  GLL,  mixture  of  dyes  and  textile effluent  and  production  of  polyhydroxy-hexadecanoic acid  using  waste  biomass  generated  after  dye degradation. J Harvard Matter 1 82, 169-76.
Thirumala  M,  SV  Reddy    &  K  Mahmood  (2010).
Production and characterization of PHB from two novel strains  of Bacillus spp.  isolated  from  soil  and  activated sludge. J Ind Microbiol Biotechnol 37, 271–278.
Wu  Q,  SQ  Sun,  PHF  Yu,  AXZ  Chen  &  GQ  Chen  (2000). Environmental  dependence  of  microbial  synthesis  of polyhydroxyalkanoates. Acta Polym Sin 6, 751–756
Valentin  HE,  T  A  Mitsy,  DA  Mahadeo,  M  Tran  & KJ Gruys  (2000). Application of a  propionyl  coenzyme a synthetase for poly(3-hydroxypropionate-co-3- hydroxybutyrate) accumulation in recombinant Escherichia coli . Appl Environment Microbiol , 253–258