## ALCHEMY Journal of Chemistry

## Artikel Penelitian
Virtual Screening Peptida Bioaktif Antihipertensi dari Hidrolisat Kasein Susu Kambing Etawa

## Sandra Hermanto
Program Studi Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta, Indonesia
INFO ARTIKEL

## ABSTRAK
Sejarah artikel: Revisi 26 September Diterima 24 Oktober 2016 Tersedia online 31 Oktober 2016
Screening of bioactive peptides from Etawa goat milk casein hydrolyzate as  antihypertensive  drugs  by in  silico method  has  been  conducted.  The protein  used  is  α-S1-casein  precursor  [ Capra  hircus ]  NCBI  Reference Sequence:  NP_001272624.1,  α-S2-casein  precursor  [ C.  hircus ]  NCBI Reference  Sequence:  NP_001272514.1,  β-casein  [ C.  hircus ]  NCBI Reference  Sequence:  AAA30906.1  and  κ-casein  precursor  [ C.  hircus ] NCBI  Reference  Sequence:  NP_001272516.1.  Structural  design  of bioactive  peptides  is  done  through  simulation  of  enzymatic  hydrolysis using  three  proteolytic  enzymes  (trypsin,  chymotrypsin  and  pepsin)  and continued  to  the  preparation  of  the  3D  structure  of  the  ligand.  Virtual screening for peptide fragments is done by determining the value of drug- likeness  and  protease  inhibitors. It was found  that  from the 104  peptide fragments  obtained  10  candidate  bioactive  peptides  for  simulations  of molecular  docking  by  each  of  the  fragments  through  measurement  of ΔG binding and the interaction between the candidates of bioactive peptides with amino acid residue in the active site of ACE (Angiotensin Converting Enzyme). As a positive control used lisinopril which is an ACE commercial inhibitor.  The  results  showed  there  were  six  candidates  of  bioactive peptides  which  had  ΔG binding value  lower  than  the  positive  control (lisinopril). Each peptide is ARPK, QMK, HK, QK, LNP and PYP which are expected to serve as an alternative antihypertensive drug.
Keywords:  bioactive  peptides,  Etawa  goat  milk,  antihypertensive,
molecular docking, drug likeness Penapisan  peptida  bioaktif  dari  hidrolisat  kasein  susu  kambing  Etawa yang berpotensi sebagai obat antihipertensi berdasarkan kajian in silico telah  dilakukan.  Protein  yang  digunakan  adalah  α-S1-kasein  prekursor [ Capra  hircus ]  NCBI Reference  Sequence :  NP_001272624.1,  α-S2- kasein  prekursor  [ C.  hircus ]  NCBI Reference  Sequence : NP_001272514.1,  β-kasein  [ C.  hircus ]  NCBI Reference  Sequence : AAA30906.1  dan  κ-kasein  prekursor  [ C.  hircus ]  NCBI Reference Sequence :  NP_001272516.1.  Perancangan  struktur  peptida  bioaktif dilakukan  melalui  simulasi  hidrolisis  enzimatik  dengan  menggunakan  3 jenis  enzim  proteolitik  (tripsin,  kimotripsin  dan  pepsin)  dan  dilanjutkan dengan  preparasi  struktur  3D  ligan  hasil  pemotongan  secara in  silico . Virtual screening terhadap fragmen peptida dilakukan melalui penentuan nilai drug  likeness dan protease  inhibitor. Dari  104  fragmen  peptida diperoleh 10 kandidat peptida bioaktif yang dilakukan simulasi molecular docking dengan  mengeksplorasi  daya  inhibisi  fragmen  melalui
Penulis korespodensi:
Email: sandra.hermanto@gmail.com
perhitungan nilai (∆ G binding ) dan interaksi antara kandidat peptida bioaktif dengan  residu  asam  amino  pada  sisi  aktif  enzim  ACE  ( Angiotensin Converting  Enzyme) .  Sebagai  kontrol  positif  digunakan  lisinopril  yang merupakan inhibitor ACE komersil. Hasil penelitian menunjukkan dari 10 kandidat  peptida  bioaktif  terdapat  6  peptida  yang  diduga  bersifat antihipertensi dengan nilai ∆ G binding yang lebih rendah dari kontrol positif (lisinopril). Keenam peptida tersebut diharapkan dapat berfungsi sebagai obat alternatif antihipertensi.
Kata  kunci:  Antihipertensi,  Peptida  bioaktif, drug  likeness, molecular docking, Susu kambing Etawa

## 1. Pendahuluan
Angiotensin Converting Enzyme (ACE) adalah enzim  kunci  yang  berperan  penting  dalam mengatur  tekanan  darah  pada  manusia.  ACE mengkatalisis  hidrolisis  dekapeptida  angiotensin inaktif menuju vasokonstriktor angiotensin II, suatu oktapeptida  yang  berperan  dalam  mengatur tekanan  darah.  Selain  itu,  ACE  juga  akan memotong  bradikinin  suatu  vasodilator  menjadi fragmen  tidak  aktif  sehingga  akan  menaikan tekanan  darah.  Inhibisi  terhadap  enzim  ACE mampu  menurunkan  level  angiotensin  II  sehingga akan  menurunkan  tekanan  darah  (Ehlers,  Fox, Strydom,  &  Riordan,  1989).  Beberapa  obat antihipertensi  sintetik  telah  banyak  digunakan sebagai  agen  inhibitor  ACE  dalam  pengobatan hipertensi.  Penggunaan  obat-obat  antihipertensi sintetik ternyata sebagian besar mengandung risiko yang dapat menyebabkan beberapa efek samping antara lain hipotensi, penurunan fungsi ginjal, batuk kering, dan kelainan janin  (Parmley, 1998). Hal ini telah  mendorong  para  peneliti  untuk  mencari alternatif  inhibitor  ACE  alami  yang  dampaknya relatif  kecil  dan  tidak  berisiko  serta  tidak menimbulkan ketergantungan.
Beberapa agen inhibitor ACE alami yang telah banyak  diteliti  diantaranya  bersumber  dari  protein hewani dan protein nabati (Ariyoshi, 1993). Protein susu merupakan salah satu sumber peptida bioaktif yang  dapat  berfungsi  sebagai  antihipertensi. Peptida  ini  dapat  diproduksi  melalui  hidrolisis enzimatik  dengan  enzim  proteolitik  dan  atau melalui  fermentasi  dengan  bakteri  asam  laktat (FitzGerald,  Murray,  &  Walsh,  2004;  Yamamoto, Akino, & Takano, 1994). Beberapa peptida bioaktif susu mampu menghambat aktifitas ACE secara in vitro dan in  vivo (Nakamura,  Yamamoto,  Sakai, Okubo,  Yamazaki,  &  Takano,  1995;    Lopez- Fandino,  Otte,  &  van  Camp,  2006;  Maeno,
Yamamoto,  &  Takano,  1996;  Abubakar,  Saito, Kitazawa,  Kawai,  &  Itoh,  1998;  Pihlanto-Leppala, Koskinen,  Piilola,  Tupasela,  &  Korhonen,  2000; Geerlings et al., 2006; Lee, Kim, Ryu, Shin, & Lim, 2005).  Beberapa  fragmen  peptida  ini  juga  telah ditemukan memiliki sifat antihipertensi pada hewan dan manusia (Nakamura et al., 1995; Korhonen & Pihlanto, 2006).
Penelitian  komputasi  biomolekul  peptida antihipertensi  sebagai  inhibitor  ACE  melalui pendekatan in silico telah dilakukan oleh beberapa peneliti sebelumnya. Wang, Zhang, Wang, Feng, & Shan  (2011)  yang  telah  berhasil  mensintesis peptida bioaktif hasil virtual skrining protein kasein susu sapi dan Li et al. (2014) yang melakukan studi in  vitro , in  vivo dan in  silico peptida  bioaktif  dari hidrolisat  kacang  pistachio  ( Pistacia  vera L.). Peneliti  lainnya  melakukan  pendekatan  kuantitatif in  silico untuk  beberapa  peptida  bioaktif  dari hidrolisis  protein whey yang  memiliki  aktifitas penghambatan  ACE  (Vermeirssen,  van  der  Bent, van  Camp,  van  Amerongen,  &  Verstraete,  2004; Ferranti et al., 2004).
Dalam penelitian ini telah dilakukan eksplorasi peptida bioaktif dari hidrolisat protein susu kambing Etawa  dengan  fokus  kajian  pada  kasein. Pendekatan  secara in  silico dilakukan  melalui virtual  screening terhadap  fragmen-fragmen peptida  hasil  hidrolisis  enzimatik  yang  dilakukan melalui  simulasi  hidrolisis  enzim  protease.  Tiga jenis  enzim  proteolitik  yang  digunakan  untuk menghidrolisis  kasein  yaitu  pepsin,  tripsin  dan kimotripsin.  Dasar  pemilihan  ketiga  jenis  enzim tersebut  karena  pepsin,  tripsin  dan  kimotripsin merupakan  komponen  enzim  proteolitik  yang terdapat  dalam  sistem  pencernaan  manusia sehingga  diharapkan  hasil  hidrolisis  enzimatik tersebut  akan  menghasilkan  peptida  bioaktif  yang tetap  memiliki  aktifitas  fisiologis  khususnya  ketika diaplikasikan secara in vivo.

## 2. Bahan dan metode

## 2.1. Bahan
Bahan  penelitian  terdiri  dari  sekuen  protein  α- S1, α-S2, β dan κ-kasein yang diperoleh dari situs NCBI  ( National  Center  for  Biotechnology Information) ,  http://www.ncbi.nih.gov.  Adapun struktur 3D protein enzim ACE diperoleh dari situs Protein Data Bank (PDB) RCSB, (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)  dengan kode  1O86  yang  merupakan  kompleks  enzim human testicular ACE-lisinopril dengan resolusi 2.0 Å (Natesh, Schwager, Sturrock, & Acharya, 2003).
2.2. Instrumentasi virtual screening
Simulasi virtual  screening dilakukan  dengan menggunakan seperangkat PC ( Personal Computer )  dengan  sistem  operasi  Windows  XP Professional  version  2002 Service  Pack  3 . Perangkat browser yang digunakan adalah Mozilla Firefox  40.0.2.  Penelitian  ini  menggunakan beberapa  perangkat  lunak  ( software )  baik online maupun offline .  Perangkat  lunak  yang  digunakan untuk  simulasi  penambatan  molekul  ( molecular docking )  adalah  MOE  ( Molecular  Operating Environment  / Chemical  Computing  Group  Inc. Montreal,  Canada,  2009)  dan  CAESA  ( Computer Assisted  Estimation  of  Synthetic  Accessibility ). Beberapa  perangkat  lunak offline yang  digunakan diunduh  secara online . Sementara  yang  lainnya, langsung  digunakan  pada web  server tersebut
( online  software ).  Perangkat  lunak yang  dapat diakses secara online tersaji pada Tabel 1.
2.3. Pencarian sekuen protein kasein (α-S1,  α-S2,  dan κ-kasein)
Fragmen  peptida  bioaktif  diperoleh  dari hidrolisis  kasein  dengan  menggunakan  enzim proteolitik  (pepsin,  tripsin  dan  kimotripsin).  Hal yang  pertama  dilakukan  adalah  pencarian  data
sekuen  protein  kasein  susu  kambing  Etawa. Pencarian sekuen ini diprioritaskan pada sekuen α- S1,  α-S2,  dan  κ-kasein  melalui  pendekatan bioinformatika dengan bantuan mesin pencari pada situs  NCBI.  Sekuen-sekuen  tersebut  diunduh  dan disimpan  dengan Notepad dalam  format  FASTA (Li-Chan, 2015).

## 2.4. Preparasi struktur 3D enzim
Sebelum  dilakukan  simulasi docking ,  struktur 3D  enzim  ACE  diunduh  dari  situs  PDB.  Struktur enzim ACE  yang  digunakan  adalah human testicular ACE  dengan  kode  1O8a  ( native )  dan 1O86  (dalam  bentuk  kompleks  dengan  lisinopril) disiapkan  dalam  format  .pdb.  Kemudian,  seluruh data  strukturalnya  dibuka  dengan  perangkat  lunak MOE.  Langkah  selanjutnya  adalah  membuka  data sekuens  (SEQ)  pada  MOE  dan  menghapus beberapa  ligan/inhibitor,  dan  pelarut  (biasanya berupa  molekul  air/H 2 O)  yang  tidak  digunakan dalam simulasi. Setelah itu, penambahan hidrogen polar  dilakukan  menggunakan  menu protonate  3D pada compute .  Kemudian,  muatan  parsial  ( partial charge ) ditambahkan pada menu compute dengan mode forcefield MMFF94  yang  biasa  digunakan untuk  struktur  enzim.  Minimalisasi  energi  pada struktur  enzim  juga  perlu  dilakukan  hingga  ke tingkat  yang  paling  minimum  menggunakan  menu energy  minimize .  Setelah  melalui  berbagai  tahap preparasi  tersebut,  enzim  disimpan  dalam format  .MOE  dan  siap  digunakan  untuk  simulasi molecular docking (Wang et al., 2011).
2.5. Hidrolisis in silico fragmen peptida (α-S1, α-S2,  dan κ-kasein) dan perancangan struktur molekul ligan
Hidrolisis α-S1 , α-S2,  dan κ-kasein secara in silico dilakukan  dengan  menggunakan  perangkat lunak proteolitic  site  enzymatic  prediction yaitu
Tabel 1. Perangkat lunak untuk analisis in silico
Expasy  Peptide  Cutter, http://web.expasy.org/cgi- bin/peptide_cutter/peptidecutter.pl ) (Gasteiger, Hoogland,  Gattiker,  Duvaud,  Wilkins,  Appel,  & Bairoch, 2005). Sekuen asam amino hasil hidrolisis enzimatik  dipetakan  dalam  bentuk  tabel  untuk diolah lebih lanjut dengan menggunakan perangkat lunak ACDLabs  ChemSketch  12.0.  Dengan menggunakan perangkat lunak yang sama, struktur fragmen peptida bioaktif atau disebut juga ligan ini kemudian  diperhalus  dengan  fitur clean  structure dan dilakukan optimisasi dalam bentuk tiga dimensi (3D).  Selanjutnya,  ligan  disimpan  dalam  format MDL  ( Molecular  Design  Limited )  Molfiles.  Ligan dalam format MDL Molfiles ini dikonversi ke dalam format  .mol  menggunakan software OpenBabel 2.2.3  atau  VegaZZ  agar  dapat  digunakan  pada proses docking sebagai  kandidat  ligan  spesifik inhibitor  ACE  (Asoodeh,  Haghighi,  Chamani, Ansari-Ogholbeyk, Mojallal-Tabatabaei, & Lagzian, 2014).
2.6. Preparasi ligan (inhibitor ACE)
Kandidat  inhibitor  ACE  atau  ligan  spesifik dalam  format  .mol  dibuka  dengan software MOE ( Molecular Operating Environment ). Ligan tersebut dibuka  pada database  viewer kemudian  di- wash , ditentukan  mode partial  charge -nya,  dan diminimasi  energinya  pada  menu compute . Algoritma  yang  digunakan  pada  mode partial charge dan energy  minimize pada  ligan  sama dengan  enzim,  yaitu  MMFF94.  Ligan  telah  siap menjalani  proses  simulasi molecular  docking . Untuk  semua  kandidat  ligan  yang  diperoleh  dari hasil  hidrolisis in  silico dilakukan  preparasi  yang sama seperti cara di atas (Asoodeh et al., 2014).
2.7. Simulasi docking dan analisis hasil docking
Simulasi docking dilakukan dengan menggunakan  perangkat  lunak MOE. File enzim ACE  dalam  format  .moe  dibuka  kemudian  diubah mode potential  setup -nya,  yaitu  mode  solvasi menggunakan  fase  gas  ( gas  phase ).  Setelah sistem  molekuler  telah  siap,  struktur  enzim  ACE kembali  diperiksa  dengan  mengulang  rangkaian preparasi  enzim  awal,  yaitu protonate  3D , partial charge, dan energy  minimize .  Menu dock kemudian  dibuka  dan file ligan  dipilih.  Sisi  aktif enzim  terlebih  dahulu  ditentukan  menggunakan sequence  editor .  Mode rescoring adalah  London dG dengan mode refinement forcefield . Banyaknya posisi ligan yang fleksibel adalah 30 posisi dengan 1 nilai interaksi terbaik. Kemudian, simulasi docking
dilakukan.  Hasil docking dengan  MOE  didapat dalam  format file MOE Database .mdb.  Dari  30 model yang dihasilkan diperoleh satu model terbaik berdasarkan  data  energi  bebas  ikatan  (∆ G binding ) untuk  kemudian  dianalisis  interaksinya  (Pierri, Parisi,  &  Porcelli,  2010).  Interaksi  antara  ligan inhibitor  dengan  residu  asam  amino  pada  enzim dapat dilihat menggunakan menu LigX pada  MOE Wang  et  al.,  2011;  Kitchen,  Decornez,  Furr,  & Bajorath, 2004).
2.8. Drug screening dan analisis drug scan Drug  screening dilakukan  untuk  melihat apakah  inhibitor  yang  diusulkan  telah  memenuhi syarat  sebagai  kandidat  obat  berdasarkan Lipinski’s  Rule  of  Five dan  sifat  ADMET ( Absorption,  Distribution,  Metabolism,  Excretion, and  Toxicity )  dari  senyawa  tersebut  (Roy,  Paul, Mitra,  &  Roy,  2009). Drug  scan dilakukan  dengan menggunakan  perangkat  lunak Lipinski  Filters, Molinspiration  dan  Osiris  Property  Explorer. Drug screening dilakukan  untuk  melihat  senyawa kandidat obat dengan nilai parameter yang terbaik diantara  yang  lainnya. Molinspiration dan Lipinski Filters digunakan  untuk  menganalisis  karakter molekuler  seperti  logP,  jumlah  donor  ikatan hidrogen,  jumlah  akseptor  ikatan  hidrogen,  dan massa  molekul  suatu  obat,  sedangkan  Osiris Property  Explorer  digunakan  untuk  mengkalkulasi beragam sifat yang berkaitan dengan obat, seperti toksisitas, druglikeness dan drug  score (Ajmani, Jadhav, & Kulkarni, 2008).

## 3. Hasil dan pembahasan
Pengujian  aktifitas  antihipertensi  peptida bioaktif  susu  kambing  Etawa  dilakukan  melalui pendekatan molecular  docking dengan parameter pencarian (EHiTS  score) yang  diperoleh  dari  hasil penambatan peptida bioaktif dengan enzim human testicular ACE  (1O8a).  Sebelum  dilakukan  uji penambatan  ( molecular  docking )  antara  ligan (kandidat  peptida  bioaktif)  dengan  enzim  ACE disiapkan  terlebih  dahulu  sekuen  protein  kasein dan dilakukan hidrolisis secara in silico .
3.1. Penyiapan sekuen  protein kasein (α-S1, α-S2  dan κ -kasein)
Protein  kasein  yang  digunakan  dalam penelitian ini berasal dari kambing Etawa C. hircus yang  terdiri  dari  α-S1,  α-S2,  β  dan  κ-kasein  yang diperoleh  dari  NCBI.  Hasil  pencarian  sekuen menunjukkan  urutan  sekuen  dari  masing-masing
protein. Berikut urutan protein α-S1, α-S2, β dan κ- kasein  dari  susu  kambing  Etawa  ( C.  hircus ) (Grosclaude,  Mercier,  &  Ribadeau-Dumas,  1970; Lagonigro, Pietrola, D'Andrea, Veltri, & Pilla, 2001).
>gi|311943|emb|CAA51022.1| alpha S1 casein [Capra hircus] MKLLILTCLVAVALARPKHPINHQGLSPEVPNENLLRFVVA PFPEVFRKENINELSKDIGSESTEDQAMEDAKQMKAGSSSS

## SEEIVPNSAEQKYIQKEDVPSERYLGYLEQLLKLKKYNVPQ
LEIVPKSAEEQLHSMKEGNPAHQKQPMIAVNQELAYFYPQL FRQFYQLDAYPSGAWYYLPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSEN SGKAAMPLW
>gi|6179400|emb|CAB59920.1| alpha s2- casein [Capra hircus] MKFFIFTCLLAVALAKHKMEHVSSSEEPINIFQEIYKQEKN MAIHPRKEKLCTTSCEEVVRNANEEEYSIRSSSEESAEVAP EEIKITVDDKHYQKALNEINQFYQKFPQYLQYPYQGPIVLN PWDQVKRNAGPFTPTVNREQLSTSEENSKKTIDMESTEVFT KKTKLTEEEKNRLNFLKIISQYYQKFAWPQYLKTVDQHQKA MKRWTQPKTNAIPYVRYL
>gi|4495057|emb|CAB39200.1| beta-casein [Capra hircus]
MKVLILACLVALALAREQEELNVVGETVESLSSSEESITHI NKKIEKFQSEEQQQTEDELQDKIHPFAQAQSLVYPFTGPIP NSLPQNILPLTQTPVVVPPFLQPEIMGVPKVKETMVPKHKE MPFPKYPVEPFTESQSLTLTDVEKLHLPLPLVQSWMHQPPQ PLSPTVMFPPQSVLSLSQPKVLPVPQKAVPQRDMPIQAFLL YQEPVLGPVRGPFPILV
>gi|550822302|ref|NP_001272516.1| kappa- casein precursor [Capra hircus] MMKSFFLVVTILALTLPFLGAQEQNQEQPICCEKDERFFDD KIAKYIPIQYVLSRYPSYGLNYYQQRPVALINNQFLPYPYY AKPVAVRSPAQTLQWQVLPNTVPAKSCQDQPTTLARHPHPH LSFMAIPPKKDQDKTEVPAINTIASAEPTVHSTPTTEAIVN TVDNPEASSESIASASETNTAQVTSTEV

## 3.2. Preparasi struktur 3D enzim ACE
Pencarian  struktur  3D  enzim  human  ACE diperoleh  dari database RCSB-PDB  ( Research Collaboratory  for  Structural  Bioinformatics–Protein Data
Bank ) yang
diakses dari http://www.rcsb.org/pdb/ dengan kata kunci Human Angiotensin I Converting Enzyme . Hasil pencarian diperoleh struktur kristal enzim ACE dalam keadan native  dengan  kode    DOI: 10.2210/pdb1o8a/pdb dan kompleks enzim human ACE dengan Lisinopril dengan  kode  DOI : 10.2210/pdb1o86/pdb .  Struktur 3D enzim human ACE ditunjukkan pada Gambar 1.
Enzim ACE merupakan
kelas karboksipeptidase  yang  mengkonversi  angiotensin I menjadi angiotensin II dengan melepas dipeptida pada  terminal  C  dan  inaktivasi  bradikinin  menjadi bradikinin  1-7,  sebuah  vasodilator.  Aktifitas katalitiknya  sangat  dipengaruhi  oleh  keberadaan kofaktor  Zn 2+ dan  ion  klorida.  Enzim  ini  memiliki
nilai  K M =6,9  µM  untuk  angiotensin  I,  K M =2  µM untuk  bradikinin  dan  K M =2,51  mM  untuk  Hip-His- Leu serta pH optimum 6,5 dalam larutan NaCl 1M. Rentang  aktifitas  pH  berada  pada  kisaran  6-9. struktur  3D  enzim  menunjukkan  adanya  rongga diisi oleh empat heliks dan satu β-strand. Tiga dari struktur  heliks  berisi  residu  asam  amino  yang bermuatan dan membatasi akses polipeptida yang lebih besar ke arah sisi aktif enzim. Dua ion klorida terikat untuk bagian dalam enzim yang berdekatan dengan  sisi  aktif  enzim  yang  mengandung  ion  Zn (II). Sisi aktif yang mengandung Zn(II) terikat pada HEXXH + E motif (His383, His387 dan Glu411) dan satu  molekul  air  yang  berikatan  koordinasi  pada posisi keempat (Natesh et al., 2003).
Gambar  1 .  Struktur  3D  enzim  ACE  dalam  2  keadaan (a) native dan  (b)  kompleks  enzim  ACE dengan lisinopril (Natesh et al., 2003).
Terdapat  empat binding  subsites (S1,  S2,  S1′ dan S2’) yang berada pada sisi aktif enzim. Pusat aktif  gugus  karbonil  antara  jembatan  thiol  dan terminal residu prolin dilekatkan melalui dua ikatan hidrogen  yang  dimediasi  oleh  (His513,  2,69  Å; His353, 2,54 Å). Ikatan kompleks inhibitor-ACE ini distabilkan  oleh  interaksi  lainnya  melalui  atom oksigen  dari  residu  prolin  karboksilat  dengan
(a)
(b)
Tyr520 (2,66 Å), Gln281 (3,1 Å), dan Lys511 (2,73 Å) (Natesh et al., 2003).
3.3. Hidrolisis proteolitik protein kasein (α-S1, α-S2,  dan κ -kasein)
Simulasi  hidrolisis  enzimatik  dilakukan  secara in silico melalui pendekatan fragmentasi proteolitik dimana  digunakan  3  jenis  enzim  proteolitik  yaitu pepsin,  tripsin  dan  kimotripsin.  Hasil  hidrolisis in silico, nilai drug  likeness dan protease  inhibitor terangkum  dalam  Tabel  2,  3,  4  dan  5  (File tambahan/supplementary file).
Berdasarkan hasil hidrolisis proteolitik (pepsin, tripsin dan kimotripsin) terhadap α-S1, α-S2, β dan κ-kasein  diperoleh  101  fragmen  peptida  yang selanjutnya  dipilih  berdasarkan  nilai drug  likeness dan protease inhibitor terbaik dengan mengunakan software  Lipinski  Filters,  Molinspiration  dan  Osiris Property  Explorer.  Parameter  yang  digunakan sesuai  dengan  aturan  Lapinski  yang  menyatakan bahwa  suatu  kandidat  obat  yang  aktif  secara  oral memiliki kriteria sebagai berikut (Lipinski & Hopkins, 2004):  memiliki  tidak  lebih  dari  5  donor  ikatan hidrogen  (atom  nitrogen  atau  oksigen  yang mengikat satu atau lebih ikatan dengan hidrogen), memiliki  tidak  lebih  dari  10  akseptor  ikatan hidrogen  (atom  nitrogen  atau  oksigen),  massa molekuler  kurang  dari  500  Da  (dalton),  dan memiliki  koefisien  partisi  oktanol-air  (logP)  tidak lebih dari 5.
Berdasarkan  hasil virtual  screening terhadap 101 kandidat peptida diperoleh 10 kandidat peptida bioaktif  dengan  nilai druglikeness terkecil (mendekati  nol)  dan protease  inhibitor tertinggi diantara masing-masing kandidat peptida. Selanjutnya,  terhadap  sepuluh  kandidat  peptida bioaktif  hasil virtual  screening dilakukan  uji penambatan ( molecular docking ) dengan mengamati  daya  inhibisinya  terhadap  sisi  aktif enzim ACE.

## 3.4. Simulasi docking peptida bioaktif
Dalam simulasi docking ini digunakan inhibitor ACE komersil yaitu lisinopril dengan nilai parameter drug-likeness 0,51 dan nilai protease inhibitor 0,91 sebagai  kontrol  positif.  Simulasi docking enzim ACE  dengan  inhibitor  lisinopril  dilakukan  pada algoritma forcefield MMFF94x  dan  mode  solvasi gas  phase , placement , rescoring ,  dan refinement dengan  parameter  yang  dipilih  masing–masing adalah Triangle  Matcher ,  London  dG,  dan Forcefield pada  daerah binding  subsites (S1,  S2, S1′ dan S2’) yang berada pada sisi aktif enzim (El Ashry el et al., 2012; Pierri et al., 2010).
Gambar 2. (a) Pembentukan kompleks 3D lisinopril-ACE hasil simulasi docking dan (b) interaksi 2D lisinopril dengan enzim ACE (MOE 2009).
(a)
(b)
Gambar 3 . Nilai ∆G hasil simulasi enam ligan potensial inhibitor ACE.
Hasil  simulasi docking menunjukkan  lisinopril berikatan  dengan  Zn(II)  pada  pusat  aktif  melalui residu  Tyr523  yang  berinteraksi  dengan  gugus karboksil  dari  lisinopril  dengan  jarak  2,77  Å  dan Glu411  (2,00  Å)  (Gambar  2).  Pusat  aktif  gugus karboksil  lainnya  dari  lisinopril  membentuk jembatan  hidrogen  dengan  Glu384  dan  Ala356 serta  interaksi  ikatan  hidrogen  antara  gugus karbonil  dari prolin lisinopril dengan  residu His353 dengan jarak 3,11 Å dan distabilkan oleh Asp377. Ikatan  kompleks  inhibitor-ACE  ini  distabilkan  oleh interaksi lainnya melalui gugus karboksil dari residu prolin  karboksilat  dengan  Tyr520  (2,56  Å)  dan Lys511 (2,93 Å) (Gambar 2).
Hasil simulasi docking (Gambar
3)
menunjukkan dari sepuluh kandidat peptida bioaktif terdapat  6  kandidat  peptida  bioaktif  yakni  ARPK, QMK, HK, QK, LNP, dan PYP yang menghasilkan ∆G binding relatif  lebih  rendah  dibandingkan  dengan interaksi  ACE-lisinopril  dengan  ∆G binding -14,0092 kkal/mol. Artinya keenam peptida tersebut memiliki aktivitas  penghambatan  ACE  yang  relatif  lebih tinggi  dibandingkan  lisinopril  sedangkan  keempat peptida  lainnya  (PSY,  PLP,  PQY,  dan  PQL) menunjukkan  aktifitas  inhibisi  yang  relatif  lebih rendah.
Berdasarkan  hasil  simulasi docking pada Gambar  3  terlihat  bahwa  interaksi  ligan  ARPK dengan  ACE  menghasilkan  ∆G binding terendah  (- 17,2273  kkal/mol),  dimana  interaksi  molekul  ligan ini  relatif  lebih  stabil  jika  dibandingkan  interaksi lisinopril  (kontrol  positif)  pada  kondisi  parameter docking yang  sama.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa ligan  ARPK  memiliki  kemampuan  inhibisi  yang lebih  baik  terhadap  enzim  ACE  dibandingkan dengan  lisinopril.  Interaksi  kompleks  2D  ligan ARPK  dengan  sisi  aktif  ACE  dapat  dilihat  pada Gambar 4.
Interaksi  yang  terjadi  antara  ligan  dengan reseptor  didominasi  oleh  ikatan  hidrogen  antara residu Thr302 sebagai dengan gugus karboksil dari residu alanil dalam ligan ARPK dan interaksi asam basa  antara  Asp300  (sebagai  donor  hidrogen) dengan  terminal  amina  dari  ligan  serta  Asp453 (akseptor  H)  dan  Asp453  dengan  gugus  samping dari  residu  lisin  dalam  ligan  ARPK.  Interaksi tersebut  memungkinkan  stabilitas  energi  ikatan semakin  tinggi  dan  interaksi  yang  terjadi membentuk  konformasi  yang  lebih  stabil  (Pierri  et al., 2010).
Gambar 4 . Interaksi 2D ligan ARPK dengan enzim ACE (MOE 2009)

## 4. Kesimpulan
Hasil virtual screening secara in silico terhadap peptida bioaktif antihipertensi dari hidrolisat kasein susu  kambing  Etawa  menghasilkan  6  kandidat peptida bioaktif yang memiliki aktivitas antihipertensi lebih tinggi terhadap enzim ACE jika dibandingkan  dengan  ligan  inhibitor  komersil (lisinopril).  Keenam  kandidat  peptida  bioaktif tersebut antara lain ARPK, QMK, HK, QK, LNP dan PYP.  Hasil virtual  screening ini  diharapkan  dapat dijadikan  rujukan  dalam  sintesis  peptida  bioaktif yang  dapat  dimanfaatkan  sebagai  pengganti  obat antihipertensi komersil.

## 5. Daftar pustaka
Abubakar, A., Saito, T., Kitazawa, H., Kawai, Y., & Itoh,  T.  (1998).  Structural  analysis  of  new antihypertensive  peptides  derived  from cheese  whey  protein  by  proteinase  K digestion. Journal of Dairy Science, 81 (2), 3131-3138. doi:10.3168/jds.S0022- 0302(98)75878-3
Ajmani,  S.,  Jadhav,  K.,  &  Kulkarni,  S.A.  (2008). Group-based QSAR (G-QSAR)L mitigating interpretation  challenges  in  QSAR. QSAR &  Combinatorial  Science,  28 ,  36-51. doi:10.1002/qsar.200810063
Ariyoshi, Y. (1993). Angiotensin-converting enzyme inhibitors  derived  from  food  proteins. Trends  in  Food  Science  &  Technology, 4 (5), 139-144. doi:10.1016/0924-
2244(93)90033-7
Asoodeh,  A.,  Haghighi,  L.,  Chamani,  J.,  Ansari- Ogholbeyk,  M.A.,  Mojallal-Tabatabaei,  Z., & Lagzian, M. (2014). Potential angiotensin I  converting  enzyme  inhibitory  peptides from  gluten  hydrolysate:  biochemical characterization  and  molecular  docking study. Journal  of  Cereal  Science,  60 (1), 92-98. doi:10.1016/j.jcs.2014.01.019 Ehlers, M.R., Fox, E.A., Strydom, D.J., & Riordan,
J.F.  (1989).  Molecular  cloning  of  human testicular  angiotensin-converting  enzyme: the  htestis  isozyme  is  identical  to  the  C- terminal  half  of  endothelial  angiotensin- converting  enzyme. Proceedings  of  the National  Academy  of  Sciences,  86 (20), 7741-7745.
El  Ashry  el,  S.H.,  Amer,  M.R.,  Abdalla,  O.M.,  Aly,
A.A., Soomro, S., Jabeen, A., … Ul-Haq, Z. (2012). Synthesis, biological evolution, and molecular  docking  studies  of  benzyl,  alkyl and glycosyl [2-(arylamino)-4,4-dimethyl-6- oxo-cyclohex-1-ene]carbodithioates, as potential immunomodulatory and immunosuppressive  agents. Bioorganic  & Medicinal  Chemistry,  20 (9),  3000-3008. doi:10.1016/j.bmc.2012.03.003
Ferranti,  P.,  Traisci,  M.V.,  Picariello,  G.,  Nasi,  A., Boschi, V., Siervo, M., … Addeo, F. (2004). Casein  proteolysis  in  human  milk:  tracing the  pattern  of  casein  breakdown  and  the formation  of  potential  bioactive  peptides. Journal  of  Dairy  Research,  71 (1),  74-87. doi:10.1017/S0022029903006599
FitzGerald, R.J., Murray, B.A., & Walsh, D.J. (2004). Hypotensive  peptides  from  milk  proteins. The  Journal  of  Nutrition,  134 (4),  980S-
988S.
Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud,
S., Wilkins, M.R., Appel, R.D., & Bairoch, A.
(2005).  Protein  identification  and  analysis tools  on  the  ExPASy  Server.  In The Proteomics  Protocols  Handbook. Humana Press. Retrieved from http://web.expasy.org/tagident/tagident- doc.html
Geerlings, A., Villar, I.C., Zarco, F.H., Sanchez, M., Vera, R., Gomez, A.Z., … Duarte, J. (2006). Identification and characterization of novel angiostensin-converting  enzyme  inhibitors obtained  from  goat  milk. Journal  of  Dairy Science, 89 (9), 3326-2225. doi:10.3168/jds.S0022-0302(06)72369-4
Grosclaude, F., Mercier, J.C., & Ribadeau-Dumas, B.  (1970).  Primary  structure  of  bovine alpha  S1  casein.  Amino  acid  sequence  of the NH 2 -terminal portion. European Journal of Biochemistry, 16 (3), 447-452. Kitchen, D.B., Decornez, H., Furr, J.R., & Bajorath, J.  (2004).  Docking  and  scoring  in  virtual screening for drug discovery: methods and applications. Nature  Reviews  Drug Discovery, 3 (11), 935-949. doi:10.1038/nrd1549
Korhonen,  H.,  &  Pihlanto,  A.  (2006).  Bioactive peptides:  production  and  functionality. International Dairy Journal, 16 (9), 945-960. doi:10.1016/j.idairyj.2005.10.012 Lagonigro, R., Pietrola, E., D'Andrea, M., Veltri, C.,
&  Pilla,  F.  (2001).  Molecular  genetic characterization  of  the  goat  S2-casein  E allele. Animal  Genetics,  32 (6),  391-393. doi:10.1046/j.1365-2052.2001.0781c.x Lee, J.K., Kim, S.B., Ryu, J.S., Shin, H.S., & Lim, J.W. (2005). Separation and purification of angiostensin  converting  enzyme  inhibitory peptides  derived  from  goat's  milk  casein hydrolysates. Asian-Australasian Journal of
Animal Sciences, 18 (5), 741-746.
doi:10.5713/ajas.2005.741
Li, P., Jia, J., Fang, M., Zhang, L., Guo, M., Xie, J.,
… Wei, D. (2014). In vitro and in vivo ACE inhibitory  of  pistachio  hydrolysates  and  in silico  mechanism  of  identified  peptide binding  with  ACE. Process  Biochemistry,
49 (5), 898-904.
doi:10.1016/j.procbio.2014.02.007
Li-Chan,  E.  C.  (2015).  Bioactive  peptides  and protein  hydrolysates:  research  trends  and challenges for application as nutraceuticals and  functional  food  ingredients. Current Opinion  in  Food  Science,  1 ,  28-37. doi:10.1016/j.cofs.2014.09.005
Lipinski,  C.,  &  Hopkins,  A.  (2004).  Navigating chemical  space  for  biology  and  medicine.
Nature, 432 (7019), 855-861. doi:10.1038/nature03193
Lopez-Fandino, R., Otte, J., & van Camp, J. (2006). Physiological,  chemical  and  technological aspects  of  milk-protein-derived  peptides with  anihypertensive  and  ACE-inhibitory activity. International Dairy Journal, 16 (11), 1277-1293. doi:10.1016/j.idairyj.2006.06.004 Maeno,  M.,  Yamamoto,  N.,  &  Takano,  T.  (1996).
Identification  of  an  antihypertensive peptide  from  casein  hydrolysate  produced by  a  proteinase  from Lactobacillus helveticus CP790. Journal of Dairy Science,
79 (8),  1316-1321.  doi:10.3168/jds.S0022- 0302(96)76487-1
Nakamura, Y., Yamamoto, N., Sakai, K., Okubo, A., Yamazaki,  S.,  &  Takano,  T.  (1995). Purification  and  characterization  of angiotensin  I-converting  enzyme  inhibitors from  sour  milk. Journal  of  Dairy  Science,
78 (4),  777-783.  doi:10.3168/jds.S0022- 0302(95)76689-9
Natesh,  R.,  Schwager,  S.L.,  Sturrock,  E.D.,  & Acharya,  K.R.  (2003).  Crystal  structure  of the human angiotensin-converting enzyme lisinopril complex. Nature, 421 (6922), 551- 554. doi:10.1038/nature01370 Parmley,  W.  (1998).  Evolution  of  angiotensin-
converting enzyme inhibition in hypertension,  heart  failure,  and  vascular protection. American  Journal  of  Medicine,
105 (1A), 27S-31S.
Pierri,  C.L.,  Parisi,  G.,  &  Porcelli,  V.  (2010). Computational  approaches  for  protein function  prediction:  a  combined  strategy from  multiple  sequence  alignment  to molecular docking-based virtual screening. Biochimica  et  Biophysica  Acta  (BBA)  - Proteins  and  Proteomics,  1804 (9),  1695- 1712. doi:10.1016/j.bbapap.2010.04.008
Pihlanto-Leppala,  A.,  Koskinen,  P.,  Piilola,  K., Tupasela,  T.,  &  Korhonen,  H.  (2000). Angiotensin  I-coverting  enzyme  inhibitory properties  of  whey  protein  digests: concentration  and  characterization  of active peptides. Journal of Dairy Research,
67 (1), 53-64. Roy, P.P., Paul, S., Mitra, I., & Roy, K. (2009). On two  novel  parameters  for  validation  of predictive QSAR models. Molecules, 14 (5), 1660-1701. doi:10.3390/molecules14051660 Vermeirssen,  V.,  van  der  Bent,  A.,  van  Camp,  J., van  Amerongen,  A.,  &  Verstraete,  W. (2004).  A  quantitative  in  silico  analysis calculates  the  angiotensin  I  converting enzyme (ACE) inhibitory activity in pea and whey  protein  digests. Biochimie,  86 (3), 231-239. doi:10.1016/j.biochi.2004.01.003 Wang, Z.L., Zhang, S.S., Wang, W., Feng, F.Q., & Shan,  W.G.  (2011).  A  novel  angiotensin  I converting  enzyme  enzyme  inhibitory peptide  from  the  milk  casein:  virtual screening and docking studies. Agricultural Sciences  in  China,  10 (3),  463-467. doi:10.1016/S1671-2927(11)60026-6
Yamamoto,  N.,  Akino,  A.,  &  Takano,  T.  (1994). Antihypertensive  effect  of  the  peptides derived  from  casein  by  an  extracellular proteinase  from Lactobacillus  helveticus CP790. Journal of Dairy Science , 917-922. doi:10.3168/jds.S0022-0302(94)77026-0