Khikmah et al.
Uji Antibakteri Rhizopus sp. Asal Inokulum Tempe terhadap Vibrio cholerae
Antibacterial Test of Rhizopus sp. from Tempeh Inoculum Against Vibrio cholerae
Nur Khikmah 1 * dan Apriani Shayoti Haloho 2
1 Akademi Analis Kesehatan Manggala Yogyakarta, Indonesia 2 Rumah Sakit Samarinda Citra Medika, Samarinda, Kalimantan Timur, Indonesia
Abstrak Rhizopus sp . merupakan kapang yang digunakan dalam fermentasi tempe. Kapang Rhizopus pada tempe telah dikaji manfaatnya dalam mengurangi kejadian diare pada Escherichia coli dan Salmonella typhi dibandingkan pada Vibrio cholerae . Diare kolera yang disebabkan oleh Vibrio cholerae pernah menjadi Kejadian Luar Biasa (KLB) di Indonesia, sehingga bakteri kolera sebagai penyebab penyakit pada penderita diare masih ada. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan antibakteri Rhizopus sp asal inokulum tempe terhadap Vibrio cholerae dan mengetahui perbedaan  kemampuan antibakteri Rhizopus sp dari beberapa inokulum tempe terhadap Vibrio cholerae .  Uji antibakteri Rhizopus sp terhadap Vibrio cholerae dilakukan dengan metode difusi kertas. Isolasi dari inokulum tempe komersial memperoleh dua isolat kapang, yang teridentifikasi Rhizopus sp.IP dan Rhizopus sp. IJ. Hasil uji antibakteri menunjukkan bahwa dua isolat Rhizopus sp. tersebut dapat menghambat Vibrio cholerae . dengan kemampuan penghambat kategori sedang dan tidak terdapat perbedaan aktivitas antibakteri Rhizopus sp. IP dan Rhizopus sp. IJ terhadap Vibrio cholerae .
Kata kunci : Rhizopus sp. antibakteri, tempe, Vibrio cholerae
Abstract
Rhizopus sp. is a common mold used in fermenting tempeh. Rhizopus sp in tempeh has been studied for its benefits in reducing the incidence of diarrhea caused by Escherichia coli and Salmonella typhi compared to Vibrio cholerae. Cholera diarrhea caused by Vibrio cholerae was an outbreak in Indonesia and the presence of choleral bacteria as causal agent of  diarrhea is still exists until now. This research aims were to determine the antibacterial activity of Rhizopus sp. from tempeh inocula against Vibrio cholerae and to study the differences of selected Rhizopus sp. inocula antibacterial activity against Vibrio cholerae . Disc diffusion method was employed to test antibacterial activity of Rhizopus sp. on Vibrio cholerae . Isolation of Rhizopus sp. from commercial tempeh inocula obtained two  mold  namely Rhizopus sp. IP and Rhizopus sp. IJ.  The results showed that Rhizopus sp. from commercial tempeh inoculum was able to inhibit Vibrio cholerae. The inhibitory ability was groupped in the medium inhibition category and no difference observed in antibacterial activity of Rhizopus sp. IP and Rhizopus sp. IJ against Vibrio cholerae.
Keywords : Rhizopus sp., antibacterial, tempeh, Vibrio cholerae
* Corresponding author: Nur Khikmah Akademi Analis Kesehatan Manggala Yogyakarta Jl. Bratajaya No. 25, Sokowaten, Banguntapan, Bantul E-mail: khikmahnr@gmail.com
Khikmah et al.
Pendahuluan Rhizopus merupakan kelompok kapang yang digunakan sebagai inokulum dalam pembuatan tempe. Masyarakat umumnya menyebut inokulum tempe dengan nama laru atau ragi tempe. Spesies Rhizopus yang digunakan sebagai inokulum tempe bermacam-macam. Hasil isolasi dan identifikasi kapang dari tempe dan ragi tempe menghasilkan spesies Rhizopus yang berbeda-beda, diantaranya Rhizopus oligosporus , Rhizopus oryzae , Rhizopus cohnii (Purwijantiningsih et al ., 2005), Rhizopus oligosporus (Dewi  &  Aziz,  2011),  dan Rhizopus microsporus (Hartanti et al ., 2015). Pada pembuatan tempe, Rhizopus berperan sebagai pengepak butiran kedelai menjadi bentuk padat dengan anyaman miselium. Rhizopus juga berperan dalam proses enzimatik yang mengubah senyawa kompleks menjadi senyawa sederhana sehingga mudah diserap oleh tubuh. Dengan adanya proses tersebut, maka tempe mengandung semua asam amino esensial, kalsium, asam lemak, vitamin, dan isoflavon (Babu et al ., 2009).
Pada awal tahun 1960, tempe telah dilaporkan mengandung zat antibakteri (Nout & Kiers, 2005). Masyarakat secara empiris telah mengetahui bahwa tempe dapat dijadikan makanan yang membantu proses penyembuhan diare. Saat diare, konsistensi feses menjadi lembek atau cair dan frekuensi buang air besar menjadi lebih sering dalam satu hari. Menurut Brooks et al . (2012), diare dapat disebabkan oleh infeksi bakteri Eschericia coli , Salmonella typhi , Shigella dysenteriae , dan Vibrio cholerae . Babu et al . (2009) melaporkan penelitian yang menyatakan bahwa orang Indonesia yang mengonsumsi tempe secara rutin akan terhindar dari penyakit disentri dan gangguan pencernaan.
Karmini et al . (1987) melaporkan bahwa tempe mempunyai pengaruh dalam mengurangi resiko terhadap diare akibat infeksi bakteri enteropatogenik Escherichia coli 0125K70 (B)H19.  Kiers et al.
(2003), juga membuktikan kacang kedelai yang difermentasi dengan Rhizopus dapat mengurangi keparahan diare pada anak babi yang disebabkan oleh Enterotoxigenic
Escherichia coli (ETEC) K88 dibandingkan dengan kacang kedelai panggang. Senyawa metabolit Rhizopus oligosporus NRRL 2710 menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap patogen yang diuji.  Urutan penghambatan tertinggi pada Eschericia coli dan Salmonella typhi , diikuti Pseudomonas aeruginosa , kemudian
Staphylococcus  aureus , Corynebacteria diphtheriae dan Klebsiella  pneumoniae (Fadahunsi et al ., 2013). Kajian pengaruh tempe ataupun kapang tempe ( Rhizopus ) dalam mengurangi kejadian diare sampai saat ini banyak dilakukan  pada E. coli dan S. typhi sebagai bakteri penyebab dibandingkan pada V. cholerae .  Brooks et al . (2012) menyatakan bahwa diare yang disebabkan oleh V. cholerae dikenal dengan nama penyakit kolera. Gejala khas diare kolera teramati pada bentuk dan warna tinja seperti air cucian beras, mengandung mukus dan sel epitel.  Menurut Puspandari et al . (2009), Kejadian Luar Biasa (KLB) kolera yang pernah dilaporkan di Indonesia tercatat terjadi pada bulan April hingga Agustus 2008 di Kabupaten Paniai dan Kabupaten Nabire, Provinsi Papua. Kejadian ini menelan korban 105 jiwa. Setelah itu, tidak didapatkan laporan terbaru mengenai jumlah kasus kolera di Indonesia hingga saat ini. Sariadji (2019) menuliskan bahwa dalam laporan terakhir periode 2017-2018, WHO melaporkan tidak terdapat kasus kolera di Indonesia.  Data WHO merujuk pada data resmi Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. Namun data kasus kolera di Indonesia tidak terlapor secara kumulatif di pusat data dan informasi kesehatan Kementerian Kesehatan RI.  Data yang tersedia saat ini di Indonesia adalah data diare yang bersifat umum. Diare yang terdata tersebut disebabkan oleh banyak hal dan tidak spesifik, didasarkan pada gejala klinis atau keterangan melalui proses wawancara tanpa penunjang diagnostik laboratorium. Oleh karena kolera pernah terjadi di Indonesia, maka keberadaan bakteri Vibrio cholerae sebagai penyebab diare penderita diare diduga masih ada, akan selalu ada, dan potensial mengancam wilayah di Indonesia ketika faktor risiko kejadian
Khikmah et al.
kolera terpenuhi.  Faktor risiko kolera masih terdapat di Indonesia karena indikator Perilaku Hidup Bersih dan Sehat (PHBS) di Indonesia masih rendah (32,3%). Tingkat indikator PHBS terendah di Indonesia terdapat di Papua dengan nilai 16,4%.
Berdasarkan uraian tersebut, maka dilakukan penelitian tentang antibakteri Rhizopu s sp asal inokulum tempe terhadap Vibrio  cholerae , dengan tujuan untuk mengetahui kemampuan antibakteri Rhizopus sp. asal inokulum tempe dan mengetahui perbedaan kemampuan antibakteri Rhizopus sp. asal inokulum tempe yang berbeda terhadap Vibrio cholerae .
Materi dan Metode Persiapan Sampel Sampel yang digunakan adalah 2 inokulum tempe, yaitu merek Raprima (PT. Aneka Fermentasi Industri, Bandung) dan merek Jago Kate (UD. Jaya Mulya, Kediri). Bakteri Vibrio  cholerae yang digunakan berasal dari Balai Laboratorium Kesehatan (BLK) Yogyakarta.
Isolasi dan Identifikasi Rhizopus dari Inokulum Tempe
Isolasi Rhizopus sp. dilakukan menggunakan metode spread plate .  Sebanyak 1 gram inokulum tempe dilarutkan dalam 9 mL NaCl 0,85 %, dilakukan pengenceran secara serial 10 -1 sampai 10 -3 . Pada dua pengenceran terakhir, suspensi diinokulasi pada medium Potato Dextrose Agar (PDA) secara aseptis untuk kemudian diinkubasi selama 4 hari pada suhu kamar. Setelah inkubasi, dilihat pertumbuhan kapang, kemudian dilakukan pemurnian sampai isolat kapang benar-benar murni (Dewi & Aziz, 2011). Isolat yang telah murni kemudian diidentifikasi berdasarkan pengamatan secara makroskopis dan mikroskopis mengacu pada pustaka Fundamentals of Diagnostic Mycology (Fisher & Cook, 1998) dan Introduction to Food and Airborne Fungi (Samson et al ., 2004).
Produksi Antibakteri dari Rhizopus
Isolat Rhizopus sp yang telah teridentifikasi diinokulasi kembali pada PDA dan diinkubasi selama 4 hari. Isolat tersebut
kemudian digunakan untuk produksi zat antimikroba. Senyawa antibakteri diproduksi dengan cara fermentasi cair. Isolat Rhizopus sp. yang tumbuh diambil sebanyak 4 bulatan dengan perforator berdiameter 5 mm, diinokulasi pada 20 mL Sabouraud Dextrose Broth (SDB), diinkubasi dalam shaker selama 6 hari dengan kecepatan 100 rotary per minute (rpm) pada suhu kamar. Hasil fermentasi disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan atau filtrat yang diperoleh digunakan untuk uji aktivitas antibakteri (Sukron et al ., 2014).
Uji Antibakteri Rhizopus pada Vibrio cholerae Uji antibakteri Rhizopus sp. pada Vibrio cholerae dilakukan menggunakan metode difusi kertas ( disc diffusion ). Blank disc dengan diameter 5 mm direndam dalam supernatan, lalu diletakkan di permukaan Nutrien Agar (NA) yang yang telah diinokulasi dengan V. cholerae .  Kontrol positif  yang digunakan adalah tetrasiklin (30 µg) dan kontrol negatif berupa akuades steril. Media selanjutnya  diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.  Kemampuan antibakteri ekstrak Rhizopus sp. terhadap V. cholerae ditunjukkan oleh keberadaan zona hambat di sekitar disc (Sukron et al ., 2014). Kriteria daya antibakteri berdasarkan diameter zona hambat dikelompokkan menurut Davis & Stout (1971).
Hasil Isolasi dan Identifikasi Rhizopus dari Inokulum Tempe Isolasi kapang dari 2 inokulum tempe mempeoleh 2 isolat (Tabel 1).
Tabel 1.  Hasil isolasi kapang dari inokulum tempe
Merek Inokulum Tempe Jumlah Isolat Kode Isolat Raprima 1 IP Jago Kate 1 IJ Jumlah 2 Pengamatan makroskopis dilakukan dengan mengamati koloni pada medium PDA menunjukkan  bahwa kedua isolat berbentuk filamen, berteksur cottony, berwarna putih keabuan sampai hitam, miselium tumbuh
Khikmah et al.
dengan cepat sehingga memenuhi cawan petri (Gambar 1).
Pengamatan secara mikroskopis isolat menunjukkan hifa hialin, tidak bersepta, dan terdapat hifa horizontal berupa stolon. Pada stolon muncul sporangiofor dan rizoid. Sporangofor tumbuh ke atas menyangga stuktur sporangium yang menghasilkan sporangiospora.  Sporangiospora berbentuk bulat dan bewrana coklat kehitaman.  Rizoid akan tumbuh ke dalam medium (Gambar 2). Identifikasi isolat kapang dilakukan berdasarkan karakterisasi pada pengamatan makroskopis dan mikroskopis dengan mengacu pada Fundamentals of Diagnostic Mycology (Fisher  &  Cook,  1998)  dan Introduction to Food and Airborne Fungi (Samson et al ., 2004). Berdasarkan karakterisasi tersebut, maka isolat kapang IP dan IJ teridentifikasi sebagai anggota Rhizopus dengan ciri adanya rizoid.
Uji Antibakteri Rhizopus . pada Vibrio cholerae Uji antibakteri Rhizopus sp. dari dua merek inokulum tempe menunjukkan bahwa Rhizopus sp. mampu menghambat pertumbuhan Vibrio cholerae . Kemampuan penghambatan ditandai dengan terbentuknya zona hambat berupa zona jernih di sekitar disc (Gambar tidak ditunjukkan).   Klasifikasi kriteria zona hambat dihitung berdasarkan diameternya. Hasil pengukuran diameter zona hambat pada masing-masing kelompok disajikan pada Tabel 1.
Diameter zona hambat dianalisis menggunakan uji-t untuk mengetahui perbedaan daya hambat Rhizopus sp. IP dan Rhizopus sp. IJ terhadap V. cholerae .  Analisis uji-t antara Rhizopus sp. IP dan Rhizopus sp.
IJ menghasilkan nilai signifikansi 0,889 pada taraf kepercayaan 95%  (Tabel 2).
Gambar 1.  Pertumbuhan isolat dari inokulum tempe : Raprima  (IP) dan Jago Kate (IJ) pada medium PDA
Gambar 2. Pengamatan mikroskopis isolat dari inokulum tempe : Raprima  (IP) dan Jago Kate (IJ) Keterangan : sporangium (1), sporangiospora (2), konidiofor (3), dan rizoid (4)
Pengamatan  makroskopis  dilakukan dengan mengamati koloni pada medium PDA menunjukkan    kedua isolat berbentuk filamen, berteksur cottony, berwarna putih keabuan  sampai hitam, miselium  tumbuh  dengan cepat sehingga memenuhi cawan petri (Gambar 1).
Gambar 1.  Pertumbuhan isolat dari inokulum tempe : Raprima  (IP) dan Jago Kate (IJ ) pada medium PDA
Pengamatan secara mikroskopis isolat adalah hifa hialin, tidak bersepta, dan terdapat hifa horizontal berupa stolon.  Pada stolon muncul sporangiofor dan rizoid.  Sporangofor tumbuh ke atas menyangga stuktur sporangium yang menghasilkan sporangiospora.  Sporangiospora berbentuk bulat dan bewrana coklat kehitaman.  Rizoid akan tumbuh ke dalam medium (Gambar 2).
IP IJ
Gambar 2. Pengamatan mikroskopis isolat dari inokulum tempe : Raprima  (IP) dan Jago Kate (IJ)
Keterangan : sporangium (1), sporangiospora (2), konidiofor (3), dan rizoid (4)
Identifikasi isolat kapang dilakukan berdasarkan karakterisasi pada pengamatan makroskopis dan mikroskopis dengan mengacu pada Fundamentals of Diagnostic Mycology (Fisher & Cook, 1998)   dan Introduction to Food and Airborne Fungi (Samson et al ., 2004).   Berdasarkan karakterisasi tersebut, maka isolat kapang IP dan IJ teridentifikasi sebagai anggota Rhizopus dengan ciri adanya rizoid.
Uji Antibakteri Rhizopus . pada Vibrio cholerae Uji antibakteri Rhizopus dari dua merek inokulum menunjukkan bahwa
Rhizopus mampu menghambat pertumbuhan V.  cholerae .  Kemampuan penghambatan ditandai dengan terbentuknya zona hambat berupa zona jernih di sekitar disc (Gambar tidak ditunjukkan). Klasifikasi kriteria zona hambat dihitung berdasarkan diameternya. Hasil pengukuran diameter zona hambat pada masing-masing kelompok disajikan pada Tabel 1.
IP IJ 3 1 2 4 1 2 3 4 IP IJ
Khikmah et al.
Pembahasan
Isolasi dan Identifikasi Rhizopus dari Inokulum Tempe Dua isolat kapang IP dan IJ dari inokulum tempe komersial teridentifikasi sebagai anggota Rhizopus dengan ciri adanya rizoid. Pada penelitian ini identifikasi tidak dilakukan sampai spesies. Menurut Fisher & Cook, (1998) dan Samson et al . (2004), koloni Rhizopus mempunyai ciri mampu tumbuh dengan cepat, hifa tidak bersepta, mempunyai stolon, rizoid dan sporangiofor. Sporangiofor dapat tunggal atau berkelompok, biasanya tidak bercabang. Sporangiofor menyangga sporangium yang banyak mengandung sporagiospora. Sporangium hialin menjadi coklat kehitaman dengan bertambahnya umur kultur.  Kolumela berwarna coklat dan berbentuk globose . Sporangiospora berbentuk ovoid atau elips, berwarna coklat kehitaman.
Rhizopus spp. merupakan mikroorganisme utama dalam fermentasi tempe, yang sekarang umumnya berasal dari salah satu jenis laru komersial yang diproduksi secara pabrikan (Barus et al ., 2019). Rhizopus dapat digunakan sebagai kultur tunggal dalam laru. Beberapa penelitian terdahulu mengidentifikasi kapang dari inokulum tempe komersial Raprima. Purwijantiningsih et al . (2005) yang mengisolasi kapang dari ragi tempe Raprima memperoleh isolat kapang tunggal yang teridentifikasi Rhizopus oligosporus .
Hasil tersebut sesuai dengan penelitian Hartanti et al . (2015), memperoleh 36 Rhizopus yang diisolasi dari tempe yang berasal dari 29 daerah di Indonesia.  Hasil identifikasi
menunjukkan 34 Rhizopus teridentifikasi sebagai Rhizopus microsporus var. oligosporus dan dua Rhizopus teridentifikasi  sebagai R . delemar . Berdasarkan survei yang dilakukan, tempe yang diproduksi di Jawa dan Sumatera  umumnya menggunakan ragi komersial Raprima. Ragi Raprima diproduksi di Bandung menggunakan R. microsporus var. oligosporus (sinonim R . microsporus ) sebagai inokulum. Babu et al .  (2009),  menyatakan R. oligosporus mempunyai peranan utama dalam fermentasi tempe.
Uji Antibakteri Rhizopus pada Vibrio cholerae Kemampuan antibakteri Rhizopus sp. terhadap V. cholerae dikarenakan selama fermentasi Rhizopus mampu menghasilkan senyawa metabolit yang bersifat antibakteri. Aktivitas antibakteri Rhizopus sp. ditandai dengan terbentuknya zona jernih disekitar koloni V. cholerae , yang menunjukkan bahwa senyawa metabolit mampu mematikan pertumbuhan V. cholerae .
McCue et al . (2004) melaporkan bahwa senyawa fenolik yang dihasilkan Rhizopus oligosporus NRRL 2770 pada fermentasi kedelai dapat menghambat pertumbuhan bakteri Helicobacter pylori penyebab infeksi dan kanker lambung.  Kadar fenol tertinggi diperoleh setelah 6 hari fermentasi.  Fadahunsi et al .  (2013) melakukan penelitian fermentasi R. oligosporus NRRL 2770 pada medium Potato Dexrose Broth (PDB). Setelah 8 hari, filtrat bebas sel dari R. oligosporus NRRL 2770 dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif dan positif. Urutan zona penghambatan R. oligosporus NRRL 2770 terhadap patogen uji dalam penelitian Fadahunsi et al (2013) adalah Escherichia coli , Salmonella typhi , Pseudomonas aeruginosa , Bacillus  subtilis (8 mm), Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae , Corynebacteria diphtheriae (7 mm) dan Proteus mirabilis (6,5 mm). Filtrat sebagai antibakteri optimum pada pH 4 dan suhu 37°C.
Hasil penelitian Sukron et al . (2014), menunjukkan bahwa filtrat R. oligosporus Saito dari inokulum tempe dapat menghambat pertumbuhan bakteri E. coli secara in vitro , sedangkan filtrat ekstrak tempe kedelai tidak
Tabel 1. Rata-rata diameter zona hambat Rhizopus pada pertumbuhan Vibrio cholerae Ekstrak Diameter zona hambat (mm) Rhizopus IP 9,25 Rhizopus IJ 9,38 Tetrasiklin 30 µg (kontrol +) 21 Akuades (kontrol -) 0
Tabel 2.  Hasil uji-t antara Rhizopus IP dan Rhizopus IJ Isolat Diameter (mm) P value Rhizopus IP Rhizopus IJ Rhizopus 9,25 9,38 0,889
Khikmah et al.
dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Hasil tersebut membuktikan bahwa senyawa yang bersifat antibakteri terdapat pada R. oligosporus Saito berpengaruh terhadap pertumbuhan E. coli , dengan diameter zona hambat sebesar 5,68 mm. Filtrat yang dihasilkan oleh Rhizopus sp.IP dan Rhizopus sp.IJ pada penelitian ini mempunyai daya antibakteri yang lebih tinggi dibandingkan hasil penelitian McCue et al . (2004) dan Sukron et al . (2014).  Hal ini ditunjukkan dari diameter zona hambat Rhizopus sp.IP dan Rhizopus sp.IJ yang terbentuk (9,25 dan 9,38 mm) lebih tinggi dibandingkan 2 (dua) hasil penelitian terdahulu (5-8 mm). Perbedaan hasil tersebut kemungkinan dikarenakan jenis senyawa antibakteri yang dihasilkan Rhizopus berbeda-beda. Pada penelitian ini senyawa antibakteri belum diidentifikasi. Penggunaan medium fermentasi SDB belum spesifik untuk memproduksi senyawa metabolit tertentu.
Kapang Rhizopu s menghasilkan senyawa metabolit yang berbeda-beda dalam pertumbuhannya. Rhizopus oryzae GY18 menghasilkan etanol, asam laktat, dan asam fumarat dalam jumlah tinggi (Guo et al ., 2010). Rhizopus oryzae 15  yang tumbuhkan  pada Potato Dextrose Broth (PDB), menghasilkan metil euginol yang mempunyai aktivitas antibiotik, benzena dan asam lemak (Peeran et al ., 2018). Metil eugenol dari Rhizopus oryzae 6975 dapat bersifat antijamur, antibakteri dan penarik serangga (hormon seks serangga) (Faisal & Prasad, 2016). Ekstrak etil asetat dari miselium Rhizopus stolonifer mempunyai kemampuan antibakteri terhadap Ervinia carotovora dan Xanthomonas campestris (Iqbal et al ., 2014).  Ekstrak dengan pelarut asetonitril dan n-heksan dari R. stolonifer mempunyai potensi sebagai antibakteri pada P. aeruginosa ,
E. coli , S. aureus , S. aureus ( methicillin resistant ), S. aureus ( vancomycin resistant ).  Ekstrak asetonitril dari R. stolonifer lebih efektif menghambat bakteri dibandingkan ekstrak n-heksan (Sohail et al ., 2014).
Fermentasi kedelai oleh Rhizopus oligosporus efektif meningkatkan kemampuan ekstrak kedelai untuk menghambat
pertumbuhan Heliobacter pylori secara in vitro . Penghambatan dapat terjadi melalui penumpukan fenolik pada membran, mengganggu fungsi atau melalui gangguan transpor elektron rantai respirasi (McCue et al ., 2004). Diameter zona hambat Rhizopus sp.IP dan Rhizopus sp.IJ dalam penelitian ini lebih rendah dibandingkan tetrasiklin 30 µg yang digunakan sebagai kontrol positif (Tabel 1).  Berdasarkan kategori daya antibakteri, daya antibakteri Rhizopus sp.IP dan Rhizopus sp.IJ dikategorikan sedang, tetrasiklin 30 µg dikategorikan sangat kuat. Menurut Davis & Stout (1971),  kategori daya antibakteri dikelompokkan berdasarkan diameter zona hambat menjadi empat kategori yaitu: lemah (<5 mm), sedang (5-10 mm), kuat (10-20 mm), dan sangat kuat (>20 mm). Tetrasiklin (30 µg) digunakan sebagai kontrol positif mampu menghambat Vibrio cholerae dengan diameter zona hambat 21 mm, sedangkan Rhizopus sp.IP dan IJ menghambat dengan diameter zona hambat 9,25 mm dan 9,38 mm.  Berdasarkan diameter zona hambat yang terbentuk tersebut, maka V. cholerae bersifat sensitif terhadap tetrasiklin dan resisten terhadap Rhizopus sp.IP dan Rhizopus sp.IJ.  Menurut CLSI (2002),  interpretasi V. cholerae terhadap tetrasiklin berdasarkan diameter zona hambat dikelompokkan menjadi 3 (tiga) yaitu: susceptible atau sensitif (≥19 mm), intermediate (15-18 mm) dan resistent (≤14 mm). Hasil uji-t nilai signifikansi sebesar 0,899 (P>0,05), menunjukkan bahwa daya antibakteri antara Rhizopus sp.IP dan Rhizopus sp.IJ terhadap pertumbuhan V. cholerae berbeda tidak nyata, sehingga dapat disimpulkan bahwa tidak ada perbedaan daya antibakteri Rhizopus sp.IP dan Rhizopus sp. IJ terhadap pertumbuhan V. cholerae . Uji tersebut menunjukkan bahwa adanya perbedaan spesies Rhizopus yang digunakan dalam pembuatan tempe akan menghasilkan daya antibakteri yang tidak berbeda.
Hasil penelitian uji antibakteri pada penelitian ini menunjukkan bahwa Rhizopus asal inokulum tempe mempunyai potensi menghambat pertumbuhan Vibrio cholerae
Khikmah et al.
dengan kategori penghambatan sedang. Diperlukan identifikasi dan karakterisasi senyawa antibakteri yang dihasilkan Rhizopus sp, sehingga diharapkan dapat meningkatkan daya hambatnya.
Kesimpulan Rhizopus asal inokulum tempe komersial mampu menghambat pertumbuhan Vibrio cholerae . Kemampuan penghambatan yang teramati termasuk dalam kategori sedang. Tidak  ada  perbedaan  daya  antibakteri Rhizopus sp.IP dan Rhizopus sp.IJ terhadap Vibrio cholerae .
Daftar Pustaka Babu, P. D., Bhakyaraj, R., & Vidhyalakshmi,
R. (2009). A Loa Cost Nutritious Food Tempe. World Journal of Diary and Food Sciences , 4 (1), 22–27.
Barus, T., Maya, F., & Hartanti, A. T. (2019). Peran Beberapa Galur Rhizopus microsporus yang Berasal dari “laru tradisional” dalam Menentukan Kualitas Tempe. Jurnal Aplikasi Teknologi Pangan , 8 (1), 17–22. doi.org/10.17728/ jatp.3761 Brooks, G. F., Carroll, K. C., Butel, J. s, Morse, S. A., & Mietzner, T. A. (2012). Jawetz, Melnick, & Adelberg Mikrobiologi Kedokteran (25th ed.; A. Adityaputri, C. Salim, F. Sandra, M. Iskandar, Nalurita,
P. Ayuningtyas, S. Debby, Eds.). Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. CLSI.  Clinical And Laboratory Standarts Institute (2002). Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard — Second Edition. Davis, W. W., & Stout, T. R. (1971). Disc Plate Method of Microbiological Antibiotic Assay. Applied Microbiology , 22 (4), 666– 670. doi.org/10.1128/aem.22.4.666- 670.1971
Dewi, R. S., & Aziz, S. (2011). Isolasi Rhizopus oligosporus pada Beberapa Inokulum Tempe  di  Kabupeten  Banyumas. Molekul , 6 (2), 93–104.
Fadahunsi,  I.  F.,  Ogunbanwo,  S.  T.,  & Ogundana,  D.  T.  (2013).  Heat
Stability And Optimization Of Invitro Antimicrobial Activity Of Metabolites Produced By Rhizopus oligosporus NRRL 2710 Against Some Pathogenic Bacteria. Trakia Journal of Sciences , 11 (2), 110–117. Faisal, M. ., & Prasad, L. (2016). A Potential Source of Methyl-Eugenol From Secondary Metabolite of Rhizopus oryzae 6975. International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology ,
7 (4), 187–192. doi.org/10.21276/ Ijabpt.2016.7.4.22 Fisher, F., & Cook, N. B. (1998). Fundamentals of Diagnostic Mycology. Philadelphia: W.B. saunders.
Guo, Y., Yan, Q., Jiang, Z., Teng, C., & Wang, X. (2010). Efficient Production of Lactic Acid from Sucrose and Corncob Hydrolysate by a Newly Isolated Rhizopus oryzae GY18. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology ,
37 (11), 1137–1143. doi.org/10.1007/ s10295-010-0761-2 Hartanti, A. T., Rahayu, G., & Hidayat, I. (2015). Rhizopus Species from Fresh Tempeh Collected from Several Regions in Indonesia. HAYATI Journal of  Biosciences , 22 (3), 136–142. doi. org/10.1016/j.hjb.2015.10.004 Iqbal, M., Amin, M., Iqbal, Z., Bibi, H., Iqbal, A., Din, Z., M. Suleman., & Shah, H. . (2014). Antimicrobial, Cytotoxic and Phytotoxic Potency of Ethyl Acetate Extract of Rhizopus stolonifer culture. Tropical  Journal  of  Pharmaceutical Research , 13 (1), 87–92. doi.org/10.4314/ tjpr.v13i1.13 Karmini,  M.,  Mahmud,  E.,  Affandi,  & Hermana. (1987). Pengaruh tempe dalam mengurangi risiko terhadap diare akibat infeksi bakteri enteropatogen Escherichia coli . Penelitian Gizi Dan Makanan , 10 , 61–76. Kiers, J. L., Meijer, J. C., Nout, M. J. R., Rombouts, F. M., Nabuurs, M. J. A., & Van Der Meulen, J. (2003). Effect of fermented soya beans on diarrhoea and feed efficiency in weaned piglets. Journal of Applied Microbiology , 95 (3), 545–552. doi.org/10.1046/j.1365- 2672.2003.02011.x
Khikmah et al.
McCue, P., Lin, Y. T., Labbe, R. G., & Shetty, K. (2004). Sprouting and solid-state bioprocessing by Rhizopus oligosporus increase the In Vitro antibacterial activity of aqueous soybean extracts against Helicobacter pylori. Food Biotechnology , 18 (2), 229–249. doi. org/10.1081/FBT-200025669 Nout,  M.  J.  R.,  &  Kiers,  J.  L.  (2005). Tempe  fermentation,  innovation and functionality: Update into the third millenium. Journal of Applied Microbiology , 98 (4), 789–805. doi. org/10.1111/j.1365-2672.2004.02471.x Peeran, M., Prasad, L., & Kamil, D. (2018). Characterization of Secondary Metabolites from Rhizopus oryzae and Its Effect on Plant Pathogens. International Journal  of  Current  Microbiology  and Applied Sciences , 7 (03), 705–710. doi. org/10.20546/ijcmas.2018.703.082
Purwijantiningsih, E., Dewanti-hariyadi, R., Nurwitri, C. C., & Istiana (alm.). (2005). Penghambatan Produksi Aflatoksin dari Aspergillus flavus oleh Kapang dan Khamir yang Diisolasi dari Ragi Tempe.
Biota , X (3), 146–153. Puspandari, N., Sariadji, K., & Wati, M. (2009). Identifikasi Penyebab Kejadian Luar Biasa Kolera Di Papua Terkait Kontak Jenazah dan Sanitasi. Widyariset ,
13 (2), 69–74. Samson, R. A., Hoekstra, E. S., & Frisvad, J. C. (2004). Introduction To Food And AirBorne Fungi (7th ed.). Netherlands: CBS. Sariadji, K. (2019). Benarkah tak ada kasus kolera di Indonesia atau tersamarkan dengan sebutan diare? The Conversation , pp. 2–6. Retrieved from https:// theconversation.com/benarkah- tak-ada-kasus-kolera-di-indonesia- atau-tersamarkan-dengan-sebutan- diare-110576 Sohail, Afzal, M., Iqbal, Z., Sheena, Khan,
S. ., Rahman, U., Khan, W., Asghar, A., Ullah, I., & Numan, M. (2014). Antimicrobial Activity of Mycelial Extracts of Rhizopus stolonifer against Different Fungal and Bacterial Pathogenic Strains. International Journal
of Biosciences (IJB) , 4 (7), 276–282. doi. org/10.12692/ijb/4.7.276-282
Sukron,  M.  A.,  Suarsini,  E.,  &  Witjoro, A. (2014). P engaruh Ekstrak Tempe Kedelai (Glycine max (L) Merr .) d an Ekstrak  Inokulum  Kapang  Tempe Terhadap Penghambat Esherichia coli Secara in Vitro. Universitas Negeri Malang, Malang.