## EFEK PEMBERIAN ALPHA LIPOIC ACID PADA ENDOTEL TIKUS PUTIH YANG DIINDUKSI LIPOPOLISAKARIDA
Olvie Syenni Datu 1) , Fransisco P Sumalong 2)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
2) Instalasi Farmasi, Dinas Kesehatan Provinsi SULUT Manado,

## ABSTRACT
Endothelial  dysfunction  play  a  major  role  in  the  pathogenesis  of  vascular  diseases,  especially atherosclerosis.  Endothelial  dysfunction  causes  endothelial  cells  are  activated  and  resulting homeostasis changes in endothelial cell. Rats were induced by LPS 0.5 mg/kg and treated with ALA at doses  of  30  mg/kg,  60  mg/kg  and  120  mg/kg  BW  for  2  weeks  which  given  1  hour  before  the  LPS administration. This  study  show  that  LPS  causes  morphological  changes  in  rat  aorta  based  on histochemical  staining  show  that  endothelial  cell  are  irregular,  not  homogeneous  and  increase permeability  but  in  group that  received  show  that  ALA  can  improve the  morphological  of  endothelial cell  by  reduces  ROS,  regenerates  of  exogenous  and  endogenous  antioxidants.  Administration  of  ALA and LPS reduce the rats body weight but not significant compared to the control group. Therefore can be concluded that administration of ALA can prevent endothelial dysfunction.
Keywords : Endothel dysfunction, alpha lipoic acid, lipopolysaccharide

## ABSTRAK
Disfungsi  endotel  berperan  penting  pada  pathogenesis  penyakit  vascular,  khususnya  aterosklerosis. Disfungsi  endotel  menyebabkan  sel  endotel  teraktivasi  dan  terjadi  perubahan  homeostatis  pada  sel endotel. Tikus diinduksi dengan LPS 0.5 mg/Kg BB dan selanjutnya di terapi dengan ALA pada dosis  30mg/Kg  BB,  60mg/Kg  BB,  dan  120mg/Kg  BB  selama  2  minggu  1  jam  sebelum pemerian LPS. Penelitian ini menujukan bahwa LPS dapat menyebabkan perubahan morfologi pada sel nedotel berdasakan pada hasil pewarnaan jaringan yang menunjukan sel endotel yang tersusun  tidak  beraturan,  tidak  homogeny  dan  terjadi  peningkatan  permeabilitas  tapi  pada kelompok  perlakuan  yang  mendapatkan  terapi  ALA  menunjukan  ALA  dapat  memperbaiki morfologi  sel  endotel  dengan  mengurangi  ROS,  meningkatkan  antioksidan  eksogen  dan endogen.  Pemberian  ALA  dan  LPS  tidak  menyebabkan  perubahan  berat  badan  tikus  yang signifikan  di  bandingkan  dengan  kelompok  control.  Sehingga  dapat  disimpulkan  pemberian ALA dapat mencegah disfungsi endotel.
Kata Kunci: disfungsi endotel, histokimia, alpha lipoic acid , lipopolisakarida

## PENDAHULUAN
Penyakit  Kardiovaskular  merupakan penyakit yang menyebabkan ± 36% dari total kematian  di  Indonesia.  Berdasarkan  laporan WHO  pada  tahun  2008  ada  tujuh  ratus  lima ribu  orang  yang  meninggal  karena  penyakit kardiovaskular (WHO, 2011).
Penyebab  utama  dari  penyakit  ini adalah  aterosklerosis  (Li et  al ,  2009).
Aterosklerosis  merupakan  penyakit  inflamasi kronis  yang  ditandai  dengan  penurunan ketebalan  arteri  secara  berangsur-angsur, penyempitan  dan  pengurangan  suplai  darah (Xu et al , 2013).
Tahap  awal  pada  patogenesis  penyakit kardiovaskular  adalah  disfungsi  endotel.  Sel endotel  merupakan  barier  yang  memisahkan trombosit  dan  protein-protein  koagulasi,  dari komponen-komponen trombogenik yang terdapat pada jaringan sub endotel (Lee et al , 2012)
Sel Endotel berfungsi sebagai regulator lokal aliran darah  yaitu dengan menghasilkan senyawa-senyawa vasoaktif seperti endothelial derived relaxation factor (EDRF) dan prostaglandin prostacyclin (PGI2) (Caterina dkk, 2007) Aktivasi faktor transkripsi Nuclear Factor Kappa β (NF-  B) dan  overproduksi reactive  oxigen  species (ROS)  berkontribusi  pada  proses  inflamasi pada sel endotel (Caterina et al , 2007., Liu et al , 2012).
Disfungsi  endotel  merupakan  lesi aterosklerotik  dini,  dimana  terjadi  respon inflamasi  yang  merubah  homeostatis  sel endotel, peningkatan permeabilitas sel endotel yang menyebabkan terjadinya migrasi leukosit  pada  intima  dan  adesivitas  terhadap lipoprotein,  leukosit,  platelet  dan  kandungan plasma lain (Ribeiro et al , 2009).
Paparan  LPS  pada  sel  endotel  baik secara in  vivo dan in  vitro menyebabkan aktivasi  pada  sel  endotel.  Penelitian  yang menggunakan model hewan
coba
menunjukan paparan LPS dapat
meningkatkan  lesi  aterosklerosis  ( Li  et  al , 2009).  LPS  akan  berikatan  dengan  reseptor dan  mengaktifkan signaling intraselular termasuk  NF-  B  dan  pembentukan  ROS (Wang et al ,  2000)
Salah satu terapi yang efektif mengatasi  permasalahan  stres  oksidatif adalah penggunaan antioksidan, ada beberapa Antioksidan yang telah uji berpotensi pada pengobatan disfungsi endotel seperti vitamin C dan vitamin E.
Alpha  lipoic  acid (ALA)  atau  1,2- dithiolane-3-pentanoic  acid,  yang  adalah komponen  dithiol  yang  terbentuk  secara alami  melalui  mekanisme  enzimatis  pada mitokondria  dari  asam  oktanoid.  ALA adalah  salh  satu  antioksidan  kuat.  ALA adalah  kofaktor  yang  diperlukan  untuk mitochondrial  α-ketoacid  dehydrogenase / reaksi  bioenergetik  mitokondria  dan  dengan demikian berperan penting pada metabolisme  energi  pada  mitokondria  (Shay et al , 2009).

## METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Peneltian ini dilakukan di laboratorium  Departemen  Farmasi  Klinik, Fakultas  Farmasi  Universitas  Airlangga  dan Laboratorium  Patologi  Anatomi  RSUD  dr. Soetomo , Penelitian ini dilakukan dari Bulan Februari-April 2015.

## Alat dan Bahan a. Alat
Timbangan  tikus,  Preparat  untuk mikroanatomi  :  Disecting  kit,  staining  jar, mikrotom, waterbath, objek glas, dek glas, penjepit kayu, mikroskop, kamera.
b. Bahan
Hewan  percobaan, Alpha-lipoic  acid (ALA)  (Dexa  Medica),  Pakan  hewan  uji
pBR-II  (Comfeed),  NaCl  0,9%  (Widatra), Aquadestilata  (PT.  Brataco),  Eter  (PT. Brataco),  CMC  Na  0,1%  (PT.  Brataco), Lipopolisakarida Escherichia  coli (Sigma- Aldrich), Hematoksilin-Eosin
Pembuatan  model  hewan  coba  terinduksi LPS
LPS dibuat dengan melarutkan 5 mg LPS kedalam  100  mL  NaCl  0,9%  sehingga diperoleh konsentrasi 0,05 mg/mL. LPS 2 mL disuntikan  secara  intraperitoneal  (IP)  pada hewan coba kelompok II-V, sedangkan hewan coba  kelompok  I  sebagai  kelompok  kontrol disuntik  dengan  NaCl  0,9%.  Dosis  LPS  yang disuntikan adalah 0,5 mg/kg BB di suntikan 3 kali  setiap  3  hari  pada  minggu  pertama penelitian (Zhao et al , 2014., Lee et al , 2012).

## Pembuatan  dan  Pemberiaan  sediaan  uji ALA
Dosis yang digunakan pada penelitian ini adalah  30  mg/kg  BB,  60  mg/kg  BB  dan  120 mg/kg  BB.  Sediaan  uji  dengan  dosis  25 mg/kg  BB  dibuat  dengan  mensuspensikan ALA  sejumlah  300  mg  ke  dalam  100  mL NaCMC  0,1%,  untuk  dosis  60  mg/kg  BB dibuat dengan mensuspensikan ALA sejumlah  600  mg  ke  dalam  100  mL  NaCMC 0,1%  dan  untuk  dosis  120  mg/kg  BB  dibuat dengan mensuspensikan  ALA sejumlah 1,2  g ke dalam 100 mL NaCMC 0,1%.
Pemberiaan  sediaan  uji  dilakukan  secara p.o  dengan  menggunakan  sonde,  pemberian disesuaikan  dengan  berat  badan  masing- masing  tikus.  Sediaan  uji  diberikan  1  jam sebelum  induksi LPS  dan  selanjutnya diberikan  setiap  hari  selama  14  hari.  Untuk kontrol  negatif,  diberikan  NaCMC  0,1% sebanyak 2 mL/tikus setiap hari.

## Pembuatan Preparat Slide
Cara pembuatan preparat jaringan aorta
a. Jaringan Aorta diambil, kemudian difiksasi dalam neutral buffered formalin 10%.  Formalin  diserap  cukup  baik  oleh jaringan  dalam  waktu  relatif  lama  yaitu 1-4 jam.
b. Setelah itu jaringan dicuci dengan xylene, direndam dalam parafin dan dipotong.
c. Jaringan  aorta  tikus  yang  telah  diberi parafin  dipotong  dengan  mikrotome setebal  3-5  µm  dan  diletakan  pada  objek glass.
d. Selanjutnya aorta tikus dilakukan pewarnaan dengan menggunakan
pewarna jaringan Hematoksilin-Eosin

## Analisis Data
Data  Berat  badan  di  analisis  dengan menggunakan Indendepent  T  test dan Anova Two Way .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam  Penelitian  ini  digunakan  30  ekor tikus  jantan  strain  wistar  berumur  2-3  bulan dan  dibagi  menajdi  5  kelompok,  masing- masing  kelompok  terdiri  dari  6  ekor  tikus. Empat  (4)  kelompok  tikus  terdiri  dari  tiga kelompok perlakuan yaitu tikus yang diinduksi  dengan  LPS  0,5  mg/kg  BB  dan diterapi  dengan Alpha  lipoic  acid dengan  3 dosis  yang  berbeda  yaitu  (30  mg/kg  BB,  60 mg/kg  BB,  120  mg/kg  BB),  sedangkan  satu kelompok  lainnya  merupakan  kelompok kontrol yang diinjeksi dengan NaCl 0,9% dan selanjutnya diberi larutan Propilenglikol.
Setiap  kelompok  menerima  perlakuan selama 14 hari, Hewan diinduksi dengan LPS pada  hari  ke-1,  hari  ke-3,  hari  ke-7  dan  pada hari ke 15 hewan di korbankan dan dilakukan pengambilan  jaringan  aorta.  Parameter  yang diamati pada penelitian ini adalah berat badan tikus, Histologi jaringan aorta.
a. Berat Badan Tikus
Pemberian  LPS  0,5  mg/kg  BB  pada tikus bertujuan untuk menyebabkan keadaan
disfungsi  endotel.  Selama  14  hari  penelitian berat tikus coba selalu di pantau, perkembangan  berat  badan  tikus  dapat dilihat pada grafik perubahanya dapat dilihat pada Gambar 1
Gambar  I.  Grafik  Perubahan  BB  tikus  normal dan tikus terinduksi LPS
Berdasarkan  uji  statistik independent  t test antara  kelompok  tikus  sehat  dan  tikus disfungsi  endotel  secara  statistik  tidak  ada perbedaan  bermakna  pada  perkembangan berat  badan  tikus  baik  pada  hari  1  sampai pada hari ke 15, dimana nilai P= 0,310 ≥ 0,05.
Hal  ini menunjukan pada pemberian  LPS 0,5 mg/kg  BB  tidak  menyebabkan  perubahan pada berat badan tikus disfungsi endotel.
Pada  kelompok  perlakuan  Berdasarkan uji  statistik Anova  two  way antara  kelompok tikus  perlakuan  I,  perlakuan  II  dan  perlakuan III  secara  statistik  tidak  ada  perbedaan bermakna  pada  perkembangan  berat  badan tikus baik pada hari 1 sampai pada hari ke 15, dimana  nilai  P  ≥  0,05.  Hal  ini  menunjukan pada pemberian LPS 0,5 mg/kg BB dan ALA dosis  30-120  mg/kg  BB  tidak  menyebabkan perubahan  pada  berat  badan  tikus  disfungsi endotel.
b. Histologi Jaringan aorta
Endotel  adalah  selapis  sel  yang  melapisi seluruh pembuluh darah. Sel endotel berperan penting dalam menjaga hemostasis, permeabilitas  pembuluh  darah  dan  respon pembuluh  darah  pada  keadaan  fisiologi  dan patologis.  Pemberian  LPS  pada  tikus  akan
mempengaruhi morfologi dari endotel.
Gambaran  perubahan  morfologi  pada endotel setelah diinjeksi dengan LPS dipreparasi secara histokimia dengan pewarnaan hematoxylin-eosin (HE).
Pada  Gambar  2  dapat  diamati  irisan melintang  Aorta  tikus  sehat  (Gambar  A) terlihat  sel-sel  dengan  bentuk  memanjang, bentuk  dan  ukuran  sel  homogen,  tunika intima  dan  tunika  media  tampak  berbatasan dengan jelas dan rapat sehingga jaringan lebih terlihat dengan jelas (tanda          ).
Sedangkan  pada  aorta  tikus  disfungsi endotel  (gambar  B)  dapat  diamati  setelah diinduksi  dengan  LPS,  sel  endotel  terlihat tidak  beraturan,  tidak  homogen,  terjadi peningkatan  permeabilitas  pada  endotel  dan susunan  pada  tunika  intima  dan  media terlihat  lebih  longgar  dan  tidak  beraturan (tanda         ).
A B
Gambar  2.  Irisan  melintang  jaringan  Aorta tikus  dengan  pewarnaan  HE.
Aorta tikus sehat ditunjukan oleh gambar  A  (perbesaran  400x)  dan Aorta  tikus  disfungsi  endotel ditunjukan pada gambar B
(perbesaran 400x).
Sedangkan  pada  kelompok  Perlakuan I,  II, dan  III setelah pemberian ALA selama 14  hari  menunjukan  sel-sel  yang  tampak homogen  dan  susunan  pada  tunika  intima dan  media  terlihat  lebih  rapat  dan  dan beraturan.
Hal  ini  menunukan  bahwa  ALA  yang bersifat  antioksidan  dapat  menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan  elektron  yang  dimiliki  radikal bebas  dan  menghambat  terjadinya  reaksi berantai  dari  pembentukan  radikal  bebas yang  dapat  menimbulkan  stres  oksidatif (Bourassa dan Tardif, 2006).
ALA  memiliki  kemampuan  untuk menghambat  kerusakan  pada  beberapa jaringan  termasuk  otak,  retina  dan  ginjal. Pada  penelitian  ini  menujukan  bahwa  ALA memiliki efek perlindungan melawan iskemia/  reperfusi  yang  diinduksi  stress oksidatif  (Wang et  al ,  2011).  ALA digunakan  secara  luas  sebagai  obat  untuk pencegahan  berbagai  penyakit  kronis  yang berhubungan  dengan  stres  oksidatif  dan pemberian  setiap  hari  bertujuan  sebagai antiaging, antidiabetes dan penyakit kardiovaskular (Kofuji et al , 2008).

## KESIMPULAN
Pemberian  LPS  dapat  menimbulkan perubahan  pada  morfologi  sel  endotel  dan Pemberian ALA dosis 30mg/Kg BB,
60mg/Kg  BB  dan  120mg/Kg  BB  dapat memberikan efek proteksif pada endotel.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut mengenai  efek  ALA  pada  disfungsi  endotel dengan  menggunakan  parameter  spesifik disfungsi endotel

## DAFTAR PUSTAKA
Bourassa,  G.,  Tardif,  C.  2006. Antioxidants and  Cardiovascular  Disease  Second Edition . Springer. Amerika
Caterina,  R.,  Peter,  L.,  Michael,  G.  2007. Endothelial  Dysfunctions  and  Vascular Disease. Blackwell Publishing, USA.
Kofuji,  K.,  Isobe,  T.,  Yoshifumi,  M.  2009.
Controlled  Release  Of  Alpha-Lipoic
Acid Through Incorporation Into Natural Polysaccharide-Based Gel Beads. Food Chemistry 115 : 483–487.
Lee,  W.,  Ku,  SK.,  Bae,  JS.  2012.  Barrier protective  effects  of  rutin  in  LPS- induced  inflammation  in  vitro  and  in vivo. Food  and  Chemical  Toxicology
50 : 3048–3055.
Li,  S.,  Yuanyuan,  G.,  Ping,  Z.,  Tingshu,  Y. 2013.  Role  of  Ox-LDL/LOX-1/NF-κB signaling  pathway  in  regulation  of atherosclerotic plaque growth by testosterone  in  male  rabbits. Vascular Pharmacology 59 : 131–137.
Shay,  P.,  Régis,  M.,  Eric,  S.,  Anthony,  S., Tory  M.,  Hagen.  2010.  Alpha-lipoic acid as a dietary supplement: Molecular mechanisms  and  therapeutic  potential. Biochimica  et  Biophysica  Acta 1790 : 1149–1160.
Wang, X., Yu, Y., Ji, L., Liang, X., Zhang, T., Hai,  C.  2011.  Alpha-Lipoic  Acid Protects Against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury Via Multiple  Target  Effects. Food  and Chemical Toxicology . 49 : 2750–2757.
WHO.  2011. Noncommunicable  Diseases Country Profiles . WHO Library Cataloguing-in-Publication  Data.  ISBN 978  92  4  150228  3  ©  World  Health Organization 2011.
Xu, Y., Kong, X., Zhoua, H., Zhang, X., Liu, J.,  Yana,  J.,  Xie,  H.,  Xie,  Y.  2013.
oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI complex induced  macrophage  differentiation  to foam  cell  involving  TLR4/NF-kappa  B signal
transduction pathway.
Thrombosis Research 134: 384-392
Zhao,  W.,  Ma,  G.,  Chen,  X.  2014. Lipopolysaccharide  Induced  LOX-1 Expression via TLR4/MyD88/ROS
Activated  p38MAPK-NF-κB  Pathway.
Vascular Pharmacology . 63 : 162-172