Aktivitas Penghambatan Ekstrak Etanol Daun Cassia Spectabilis Terhadap Pertumbuhan Plasmodium falciparum dan Plasmodium berghei
Wiwied Ekasari 1 *, Nindya Tresiana P 1 , Suciati 1 , Tutik Sri Wahyuni 1 , Heny Arwaty 2
1 Pharmacognosy and Phytochemistry Departement, Faculty of Pharmacy, Universitas Airlangga, Surabaya
2 Parasitology Department , Faculty of Medicine, Universitas Airlangga, Surabaya *Corresponding author: wiwiedeka@hotmail.com

## Abstract
Background: Antimalarial screening against nine species of the genus Cassia showed that the methanol extract  of  leaves  Cassia spectabilis  have  the highest activity. Since  it  will  be  used  as  a  traditional medicine,  hence  it  is  needed  further  studies  of  antimalarial  activity  of these  plants  by  choosing  a  safer solvent,  namely  ethanol. Objective: In  vitro anti-malarial activity  against  Plasmodium falciparum was conducted using the method of Trager and Jensen. Methods: The serial solution tested were: 100, 10, 1, 0.1 and 0.01 µg/ mL, while the in vivo test was performed based on Peter’s test (The days suppressive test) that using P. berghei (strain ANKA) infected mice. Results: The results showed that ethanolic extract of C. spectabilis leaves has  inhibitory  activity  against  P.  falciparum with IC 50 value  of  12.52 µg/  mL  and against P. berghei with ED 50 value of 131.5 mg/kg body weight. Conclusions: A further study to see the potential of ethanol extract from C. Spectabilis leaves as anti-malaria is warranted.
Keywords: C. spectabilis, Antimalarial, P. falciparum, P. berghei

## Abstrak
Latar  belakang: Hasil  skrining  antimalaria  terhadap  sembilan  spesies  dari  genus  daun Cassia menunjukkan  bahwa  ekstrak  metanol  daun C.spectabilis memiliki  aktivitas yang terbesar. Karena akan digunakan sebagai obat tradisional, maka dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap aktivitas antimalaria dari  tanaman  ini  memilih pelarut  yang  lebih  aman,  yaitu  etanol. Pengujian aktivitas  penghambatan terhadap P. falciparum secara in  vitro dilakukan  menggunakan metode  Trager  dan  Jensen.    Pengujian secara in  vitro dilakukan  dengan  larutan  uji  seri  100,  10, 1, 0,1  dan  0,01 µg/mL. Sedangkan pengujian antimalaria secara in vivo dilakukan berdasarkan metode Peter yang dilakukan pada  mencit terinfeksi P. berghei (strain ANKA). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun C. spectabilis memiliki aktivitas penghambatan terhadap P. falciparum dengan IC 50 sebesar 12,52 µg/mL dan terhadap P. berghei dengan  ED 50 sebesar 131,5  mg/kg BB. Ekstrak  etanol  daun C.  spectabilis potensial  untuk  diteliti  lebih lanjut dalam rangka mendapatkan zat aktif antimalaria yang terkandung di dalamnya Kata kunci: C. spectabilis, Antimalarial, P. falciparum, P. berghei

## PENDAHULUAN
Malaria merupakan  salah  satu  penyakit  yang penularannya  melalui  gigitan  nyamuk Anopheles betina, dimana  nyamuk  tersebut  telah  terinfeksi  protozoa  dari genus Plasmodium. Pada  2015 dilaporkan,  sekitar  3,2 miliar orang yang berarti hampir setengah dari populasi dunia  berisiko terkena malaria.  Sebagian  besar  kasus malaria  dan  kematian  terjadi  di  sub-Sahara  Afrika. Namun,  Asia,  Amerika  Latin,  dan  pada  tingkat  lebih rendah Timur Tengah dan sebagian Eropa, juga berisiko. Dilaporkan  juga 97 negara  dan  wilayah saat  ini  sedang berlangsung transmisi malaria (WHO, 2015).
Pemberantasan  penyakit  malaria makin  menjadi problem dengan  timbulnya  resistensi  terhadap  obat-obat antimalaria  yang  ada,  sehingga  penemuan  antimalaria baru  baik  dari  bahan  alam  maupun sintesis  masih  terus diupayakan  (Sjafruddin et  al,  2004; Kim and Schneider, 2013)
Berdasar  hasil  uji  pendahuluan  aktivitas  antimalaria ekstrak  metanol  dari  daun  sembilan  tanaman  genus Cassia yaitu C.  moschata, C. javanica,  C.  grandis,  C. spectabilis, C. multijuga, C. tora, C. Alata, C. garettiana, dan C. fistula didapatkan hasil bahwa daun C. spectabilis terbukti  paling  aktif  (Ekasari et  al.,  2015). Untuk dapat digunakan  sebagai obat  tradisional,  ekstrak  yang digunakan  haruslah  berasal  dari  pelarut  yang  tergolong aman.  Untuk  itu  dalam  upaya  pencarian bahan obat tradisional baru  sebagai  antimalaria,  pada  penelitian  ini akan  dilakukan  pengujian  aktivitas  penghambatan  daun C, spectabilis terhadap  pertumbuhan P.  falciparum in vitro dan P. berghei in vivo menggunakan ekstrak etanol.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan Penelitian
Bahan Tanaman: Daun C. Spectabilis yang diperoleh dan  dideterminasi  di  Kebun  Raya  Purwodadi,  Jawa Timur.

## Parasit Uji
In  vitro: P.  falciparum yang  digunakan  adalah biakan P.  falciparum strain 3D7 yang  dibiakkan  dengan metode Trager and Jensen (1976).
In Vivo: Plasmodium  berghei strain  ANKA  yang berasal  dari  Lembaga  Biologi  Molekuler  Eijkman, Jakarta  dan  dikembangbiakkan  di  laboratorium  hewan Fakultas  Farmasi  Universitas  Airlangga,  Surabaya melalui kultivasi pada mencit.

## Hewan Coba
Hewan  coba  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  mencit  jantan  galur  Balb-C  yang  didapat  dari Pusat  Veterinaria  Farma  (Pusvetma)  Surabaya.  Mencit yang  digunakan  adalah mencit  dengan  berat  badan  20- 30g.

## Pembuatan Ekstrak daun:
Serbuk  daun daun Cassia sebanyak 50 gram dimaserasi  dengan etanol  90%. Selanjutnya  filtrat diuapkan  dengan  menggunakan rotary  evaporator (rotavapor)  pada  suhu  50 o C  hingga  diperoleh  ekstrak yang kental
Uji Aktivitas Antimalaria :

## In vitro
Pengujian  aktivitas  antimalaria  dilakukan  menurut modifikasi Budimulja, et  al (1997).  Mulanya  dibuat larutan induk dalam DMSO dan dibuat serial konsentrasi dengan  medium  komplet  (  RPMI  1640  yang  diperkaya dengan  10%  plasma,  25mM  HEPES  dan  25  mM NaHCO 3 )  sampai  konsentrasi  dalam  sumuran  menjadi 100;10;  1;  0,1  dan  0,01 µg/ml.  Kultur  dibuat  dengan hematokrit  5%  dan  parasitemia  sebesar  1%.    Setelah diinkubasi  selama  48  jam, kultur  dipanen  dan  dibuat hapusan tipis  dengan  pewarnaan  larutan  Giemsa. Selanjutnya  dihitung  persen  parasitemia dalam 5000 eritrosit dan dianalisis  menggunakan  analisis  probit sehingga didapatkan harga IC 50 (Fidock et al., 2004).

## In Vivo
Mencit  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  dibagi menjadi 7 kelompok yaitu kelompok kontrol negatif dan kelompok  uji  dengan  suspensi  ekstrak  etanol  90%  daun C.  spectabilis. Untuk  kelompok  kontrol  negatif  diberi CMC Na 0,5% dengan pemberian satu kali sehari secara per  oral.  Untuk  kelompok  suspensi  ekstrak  etanol  90% daun C. spectabilis diberi dosis sebesar 50, 75, 100, 150, 200  dan  250  mg/kg  BB  mencit  dengan  pemberian  satu kali sehari secara per oral.
Penelitian  uji  aktivitas  antimalaria  secara invivo ini menggunakan modifikasi metode Peter (Philipson, 1991), the  4-day supressive test  of  blood  schizontocidal. Pengujian  dilakukan  dengan  pemberian  larutan  uji selama  4  hari  berturut-turut,  pengujian  selama  4  hari merupakan  standard  skrining  obat  antimalaria.  Setiap hari  diambil hapusan darah  dari  ekor  mencit  dan  diberi
pewarnaan  Giemsa  15%.  Setelah  itu  dihitung  dengan mikroskop per 5000 eritrosit.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Uji Aktivitas antimalaria In vitro
Hasil uji aktivitas antimalaria ekstrak etanol daun C. spectabilis dapat dilihat pada tabel berikut ini:
Tabel  1. Persen  pertumbuhan ,  Persen  penghambatan  dan  Harga  IC 50 ekstrak  etanol  daun C.  spectabilis terhadap pertumbuhan P. falciparum setelah diinkubasi 48 jam
Kons (µg/mL) R % Parasitemia % Pertumbuhan rata-rata % Hambatan rata-rata IC 50 (µg/mL) 0 jam Rata-rata 48 jam rata-rata Kontrol neg 1 0,38 0,41 3,78 3,77 3,36 - 12,52 2 0,43 3,76 100 1 0,38 0,41 0,92 0,94 0,53 84,23 2 0,43 0,96 10 1 0,38 0,41 2,60 2,67 2,26 32,74 2 0,43 2,74 1 1 0,38 0,41 2,86 2,89 2,48 16,19 2 0,43 2,92 0,1 1 0,38 0,41 3,12 3,18 2,77 17,56 2 0,43 3.24 0,01 1 0,38 0,41 3,51 3,45 3,04 9,52 2 0,43 3,39

## Hasil Uji Aktivitas antimalaria in vivo
Hasil uji aktivitas antimalaria in vivo terhadap ekstrak etanol 90% daun C. spectabilis dapat dilihat pada tabel 2 dibawah ini:
Tabel 2. Tingkat  parasitemia  rata-rata  mencit  terinfeksi P.  berghei pada  pemberian  suspensi  ekstrak  etanol  90%  daun C. spectabilis per oral
Kelompok dosis uji (mg bahan/kg BB mencit) Tingkat parasitemia rata-rata (%) D 0 D 1 D 2 D 3 D 4 K(-) 1,22 5,24 5,59 16,54 21,77 50 1,57 3,28 6,57 11,15 15,74 75 2,11 3,83 6,02 10,93 15,85 100 1,88 4,35 7,49 10,48 13,47 150 1,30 4,34 5,73 7,11 11,29 200 1,26 3,95 4,69 8,16 9,89 250 0,51 2,51 4,64 5,92 6,90 Keterangan: D 0 -D 4 : Pengamatan persen parasitemia hari ke-0 (sebelum diberi bahan uji sampai hari ke-4
(satu hari setelah bahan uji dihentikan),
K(-) : kelompok yang diberi suspensi CMC-Na 0,5% sebagai kontrol negatif
Tabel 3. Persen pertumbuhan dan penghambatan parasit pada mencit terinfeksi P. berghei yang diberi ekstrak etanol 90% daun C. spectabilis per oral
Kelompok dosis uji (mg bahan/kg BB mencit) Pertumbuhan parasit (%) Penghambatan parasit (%) K (-) 20,55 - 50 14,17 31,05 ± 15,82 75 13,74 33,13 ± 17,26 100 11,59 43,60 ± 29,56 150 10,54 51,38 ± 12,58 200 8,62 58,04 ± 10,59 250 6,39 68,91 ± 8,84
Dari  data  yang  diperoleh  pada  Tabel 3 diperoleh nilai  ED 50 dengan  menggunakan  analisis  probit  sebesar 131,5 mg/kg BB mencit.
Penelitian  mengenai C. spectabilis ini  merupakan lanjutan  dari  hasil penelitian sebelumnya mengenai uji pendahuluan  aktivitas  antimalaria daun  sembilan tanaman genus Cassia yaitu C. moschata, C. javanica, C. grandis,  C.  spectabilis,  C. multijuga,  C.  tora,  C.  Alata, C.  garettiana, dan C.  fistula yang  menggunakan  ekstrak metanol (Ekasari et  al.,  2015).  Diketahui  bersama untuk dapat digunakan  sebagai  obat  tradisional,  ekstrak  yang digunakan  haruslah  berasal  dari  pelarut  yang  tergolong aman.  Untuk  itu pada  penelitian  kali  ini  digunakan ekstrak  etanol  daun C. spectabilis yang  akan  diuji aktivitasnya  dalam  menghambat  pertumbuhan P. falciparum  in  vitro dan P.  berghei  In  vivo dalam  upaya pencarian  aktivitas  antimalaria  tanaman  ini  secara menyeluruh.
Pengujian  aktivitas  antimalaria  dalam  penelitian  ini dilakukan  secara in  vitro terhadap  kultur P.  falciparum strain  3D7  yang  dibiakkan  secara  berkesinambungan dengan metode  Trager  dan  Janssen  (1976). Pengujian dilakukan  dengan  menambahkan  ekstrak  etanol  daun C. spectabilis ke  dalam  sumur  uji  yang  telah berisi  media lengkap. Kemudian dimasukkan suspensi parasit sebanyak  500uL.  Sehingga  didapatkan  konsentrasi larutan  uji  sebesar 100  ug/mL,  10  ug/mL,  1  ug/mL,  0,1 ug/mL,  0,01  ug/mL.  Setelah  diinkubasi  selama  48  jam, mengikuti  siklus  aseksual  parasit,  dilakukan  panen dengan membuat  hapusan  tipis  dan  diwarnai  dengan Giemsa (Fidock et  al.,  2004) Hasil  uji in  vitro etanol daun C. spectabilis terhadap penghambatan pertumbuhan P. falciparum didapatkan  harga IC 50 sebesar  12,52 ug/mL.
Menurut Oliveira et  al. (2009) ekstrak  yang memiliki  nilai  IC 50 ≤ 50  terhadap P.  falciparum dapat dilanjutkan  untuk  dilakukan  isolasi  untuk  mendapatkan senyawa  aktif  antimalaria  dari  tanaman  obat.  Ekstrak yang  menunjukkan  hasil  yang  baik  ini  juga  disarankan untuk dilanjutkan aktivitas antimalarianya secara in vitro. Dengan  demikian  menurut  batasan  tersebut,  ekstrak etanol daun C. spectabilis dengan nilai IC 50 sebesar 12,52 ug/mL memiliki aktivitas yang tinggi sebagai antimalaria.
Selanjutnya  pada  ekstrak  etanol  daun C.  spectabilis ini  dilakukan  uji  aktivitas  penghambatannya secara in vivo pada P. berghei. .Pemilihan dosis berdasarkan pada penelitian  yang  dilakukan  Munoz et  al. (2000)  dimana
peneliti  menggunakan  dosis  hingga  1000  mg/kg  BB mencit.Namun  agar  dapat  memenuhi  syarat  sebagai antimalaria  yang  aktif  dengan  harga  ED 50 dibawah  250 mg/kg, maka dipilih dosis dengan rentang 50-250 mg/kg BB mencit. Dari hasil penelitian terlihat rata-rata persen penghambatan  terhadap P. berghei dari  kelompok kontrol negatif dan kelompok uji, dimana semakin besar dosis  uji  yang  diberikan,  maka  semakin  kecil  persen pertumbuhan P.  berghei.Hal  ini  menunjukkan  bahwa semakin  besar  pula  persen  penghambatan  ekstrak  etanol 90%  daun C.  spectabilis terhadap  pertumbuhan P. berghei.  Dosis  uji  250  mg/kg  memberikan  efek penghambatan  terbesar  (68,91%)  dibandingkan  dengan kelompok  dosis  uji  lainnya.  Sehingga  dapat  dikatakan bahwa  ekstrak  etanol  90%  daun C.  spectabilis memiliki aktivitas  antimalaria  yang  baik  karena  pada  dosis  250 mg/kg/hari  menunjukkan  persen  penghambatan  parasit lebih  besar  dari  50% (Munoz et  al.,  2000). Pustaka lainnya (Bantie et al, 2014), menyebutkan bahwa ekstrak yang  menghasilkan  persentase  penghambatan ≥  50  % dengan uji in vivo pada dosis 500; 250 dan 100 mg/kgbb diklasifikasikan  mempunyai  aktivitas  antiplasmodium sedang,  baik  dan  sangat  baik.  Berdasarkan  klasifikasi Bantie et al. (2014) maka aktivitas ekstrak etanol daun C. spectabilis secara in vivo dapat digolongkan baik  karena pada  dosis  150  mg/kg  bb  sudah  dapat  menghambat pertumbuhan P.  berghei ≥  50  %.  Sedangkan  d engan perhitungan  analisis  probit  didapat  harga  ED 50 dari ekstrak etanol daun C. spectabilis sebesar 131,5 mg/kg.
Hasil keseluruhan diatas menunjukkan  bahwa ekstrak  etanol  90%  daun C.  spectabilis secara in  vitro dan in  vivo mempunyai  aktivitas  yang  baik sebagai antimalaria  yang  dapat  dijadikan  obat  antimalaria alternatif atau sebagai pengkombinasi dengan antimalaria lain.

## KESIMPULAN
Ekstrak  etanol  daun C.  spectabilis potensial  untuk diteliti  lebih  lanjut  dalam  rangka  mendapatkan  zat  aktif antimalaria yang terkandung di dalamnya.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian ini  bagian  dalam  rangkaian proyek penelitian  yang  didanai  oleh Dirjen  Pendidikan  Tinggi Republik Indonesia .

## DAFTAR PUSTAKA
Bantie  L,  Assefa  S,  Teklehaimanot  T,  Engidawork  E, 2014.  In  vivo  antimalarial  activity  of  the  crue  leaf extract and solvent fractions of Croton macrostachyus  Hocsht.  (Euphorbiaceae)  against  P. berghei  in  mice. BMC  Complement  Altern  Med 14:79
Budimulja  AS,  Syaruddin,  Tapchaisri  P,  Wilairat  P,
Marzuki  S.  1997.  The  Sensitivity  of  Plasmodium protein synthesis to prokaryotic ribosomal inhibitors. Mol. Biochem Parasitol 84 (1): 137-41 Ekasari  W,  Wahyuni  TS,  Yuistira  R.A.S.  2015. Potensi antimalaria dan pemeriksaan Mikroskopik- fitokimia  Genus  Cassia. Jurnal  Farmasi  dan  Ilmu Kefarmasian Vol 2.No2. Des .
Fidock DA, Rosenthal PJ, Croft SL, Brun  R,  Nwaka S,
2004. Antimalarial  drug  discovery  :  Efficacy models  for  compound  screening,  Review, Nature 3 (Juni): 509-520.
Kim  Y,  Schneider  KA.  2013.  Evolution  of  drug resistance in malaria parasite population. Nat Educ Knowl 4 (8):6
Munoz  V,  Sauvin  M, Bourdy  G,  Callapa  J,  Rojas  I, Vargas L, Tae A, Deahro E. 2000. The search for
natural bioactive compounds through a multidisciplinary  approach  in  Bolivia.  Part  II. Antimalarial  activity  of  some  plants  used  by Mosetene Indians. J. Ethnopharmacology Vol 69. pp.139-155
Oliveira  AB,  Dolabela  MF,  Braga  CF,  Jacome  R  LRP, Varotti  FP,  Povoa  MM.  2009.  Plant-Derived Antimalarial  Agents:  New  Leads  and  Efficient Phytomedicines. Part I. Alkaloid. An. Acad. Bras. Ciênc. vol.81 no.4 Dec.
Phillipson, J.  David,  1991.  Assays  for  Antimalarial  and Amoebicidal  Activities.  In: Methods  In  Plant Biochemistry, Vol. 6, pp. 135-141
Sjafruddin  D,  Siregar  JE,  Asih  PBS,  2004. Antimalarial drug  resistance  in  Indonesia:  A  molecular analysis.  Symposium  of  malaria  control  in Indonesia,
Proceeding. TDC Airlangga University, Surabaya.
Trager,  W.and  Jensen,  J.B.,  1976,  Human  Malaria parasites in continous culture In: Science, 193, pp.
673-676.
WHO, Malaria, Oktober 2015, www.who.int/ mediacentre/factsheets/fs094/en/ Diakses 21
Desember 2015. Pukul.13.05 WIB