Volume 4(3) 2021 (79-91)

## ISOLASI DAN SKRINING ACTINOMYCETES ENDOFITIK PADA AKAR MANGROVE YANG BERPOTENSI MENGHASILKAN ENZIM HIDROLITIK
( ISOLATION AND SCREENING OF ENDOPHYTIC ACTINOMYCETES
POTENTIALLY PRODUCING HYDROLYTIC ENZYME )
Stormy Vertygo 1)
Program Studi Teknologi Pakan Ternak, Jurusan Peternakan
Politeknik Pertanian Negeri Kupang
Corresponding author : svertygo91@gmail.com

## Abstrak
Actinomycetes termasuk kelompok mikroorganisme prokariotik yang telah lama dimanfaatkan dalam berbagai  bidang  industri  karena  kemampuannya  untuk  menghasilkan  metabolit  primer  dan  sekunder  yang sangat beragam. Di alam, kelompok mikroorganisme ini paling banyak hidup di tanah namun telah berhasil diisolasi  pula  dari  dalam  tubuh  makhluk  hidup  sebagai  organisme  endofitik.  Pada  penelitian  ini,  isolasi Actinomycetes  Endofitik  telah  berhasil  dilakukan  dari  perakaran  Mangrove  yang  hidup  di  perairan  pantai Oesapa, kota Kupang. Proses isolasi menghasilkan 3 isolat Actinomycetes Endofitik, yaitu: isolat A11, A12 dan  A2,  yang  kemudian  dilanjutkan  ke  tahapan  skrining  untuk  melihat  kemampuan  katalitiknya  dalam mendegradasi substrat selulosa, amilum, lipid dan protein. Berdasarkan hasil uji skrining, ketiga isolat memiliki minimal salah satu dari enzim hidrolitik yang diujikan sehingga berpotensi dikembangkan sebagai imbuhan pakan ternak ( feed additive ). Isolat A11 menunjukkan hasil uji positif terhadap enzim Amilase yang tinggi dan juga terhadap enzim Lipase. Isolat A12 menunjukkan hasil uji positif terhadap enzim Amilase yang tinggi dan juga  terhadap  enzim  Lipase  dan  Protease,  sedangkan  isolat  A2  mengandung  semua  enzim  hidrolitik  yang diujikan. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi dan juga kontribusi bagi pengembangan komoditas peternakan di daerah Nusa Tenggara Timur (NTT) sesuai dengan program yang dicanangkan oleh Kementerian Pertanian dan Pemerintah Provinsi NTT misalnya melalui pengembangan produk pakan ternak berkualitas yang memanfaatkan sumber daya lokal.
Kata Kunci: Actinomycetes Endofitik, Enzim Hidrolitik, Imbuhan Pakan Ternak, Perakaran Mangrove.

## ABSTRACT
Actinomycetes are a group of prokaryotic microorganisms that have long been used in various industrial fields because of their ability to produce very diverse primary and secondary metabolites. In nature, this group of  microorganisms  mostly  lives  in  the  soil  but  has  also  been  isolated  from  living  organisms  as  endophytic organisms. In this study, the isolation of Endophytic Actinomycetes has been successfully carried out from the roots of the mangroves that live in the coastal waters of Oesapa, Kupang city. The isolation process resulted in 3 isolates of Endophytic Actinomycetes, namely: isolates A11, A12 and A2, which then proceeded to the screening stage to see their catalytic ability in degrading cellulose, starch, lipid and protein substrates. Based on the results of the screening test, the three isolates had at least one of the tested hydrolytic enzymes and thus could be potentially developed as feed additives. Isolate A11 showed a positive test result to high amylase enzyme and also to lipase enzyme. A12 isolate showed a positive test result for high amylase enzyme and also for lipase and protease enzymes, while isolate A2 contains all the hydrolytic enzymes tested. The results of  this  study  are  expected  to  provide  information  and  also  contribute  to  the  development  of  livestock commodities in the East Nusa Tenggara (NTT) area in accordance with the program launched by the Ministry of Agriculture and the NTT Provincial Government, for example through the development of high quality animal feed products that utilize local resources.
Keywords: Endophytic Actinomycetes, Hydrolytic Enzymes, Animal Feed Additives, Mangrove Roots

## PENDAHULUAN
Actinomyetes merupakan salah satu kelompok mikroorganisme yang telah lama diketahui dan dikembangkan potensinya dalam produksi berbagai metabolit sekunder. Meskipun termasuk ke dalam  kingdom  Monera  yang  bersifat  prokariotik,  bakteri  ini  memiliki  sifat  pertumbuhan  filamen berupa  hifa  dan  memproduksi  spora  sehingga  mirip  dengan  mikroorganisme  eukariotik  dari kelompok  jamur  (fungi)  (Aghamirian  &  Ghiasian,  2009).  Berbagai  metabolit  sekunder  yang  telah berhasil diekstraksi dari kelompok mikroorganisme ini di antaranya: senyawa antibakteri, antivirus, antifungi,  antikarsinogen,  antifibrotik,  antimalaria,  antialga,  neuritogenik  dan  neuroprotektif,  anti- inflamasi  dan  juga  antioksidan  (Aghamirian  &  Ghiasian,  2009;  Berezin et  al. ,  2019).  Selain  itu, metabolit  primer  yang  dihasilkan  berupa  eksoenzim  hidrolitik,  juga  sangat  penting  dimanfaatkan dalam  berbagai  bidang  industri,  misalnya  industri  makanan  dan  minuman,  kosmetik,  deterjen, pakan,  medis,  kertas,  tekstil  dan Biorefinery (Dewi et  al. ,  2017) . Actinomycetes  penghasil  enzim hidrolitik  paling  banyak  berasal  dari  genus Streptomyces dan  juga  beberapa  berasal  dari  genus Microbispora,  Cellulomonas, dan Thermobifida .    Berbagai  enzim  yang  disekresikan  meliputi: selulase, xylanase, amilase, protease, keratinase, kitinase, pektinase, lipase, fitase (Mukhtar et al. , 2017).
Mikrohabitat Actinomycetes tersebar pada berbagai ekosistem dan bahkan di dalam tubuh makhluk  hidup.  Akan  tetapi,  proporsi  paling  banyak  terdapat  di  dalam  ekosistem  darat  (tanah). Bahkan sering dianggap bahwa aroma tanah yang khas khususnya ketika hujan dan juga aroma air berasal dari metabolit sekunder yang dihasilkan oleh Actinomycetes. Saat ini telah banyak kelompok Actinomycetes  yang  berhasil  diisolasi  dari  dalam  tubuh  makhluk  hidup  (endofitik)  dengan  tujuan memperoleh senyawa bioaktif baru yang memiliki fungsi yang lebih efektif (Ravikumar et al. , 2011). Sistem perakaran tumbuhan termasuk salah satu sumber utama dalam penjelajahan Actinomycetes Endofitik  yang  mencakup  lebih  dari  1000  spesies  yang  telah  berhasil  diidentifikasi.  Beberapa spesiesnya  berasal  dari  genus Actinobacteria , Proteobacteria , Verrucomicrobia dan Bacteroides , sedangkan  tumbuhan  yang  menjadi  inang  berasal  dari  spesies Triticum  aestivum , Ophiopogon japonicus ker-Gawler, Sonchus  asper , Helleborus  orientali , Musa  paradisiaca , Camellia  sinensis , dan juga dari kelompok Pteridophyta dan Mangrove (Matsumoto & Takahashi, 2017).
Pada penelitian ini, Actinomycetes Endofitik diisolasi dari perakaran Mangrove yang tumbuh di  daerah  pantai  Oesapa,  Kupang.  Pengisolasian  ini  dilakukan  untuk  memperoleh  kelompok Actinomycetes Endofitik yang memiliki kemampuan menghasilkan enzim hidrolitik. Enzim hidrolitik yang di-skrining mencakup 4 jenis yaitu: Selulase, Amilase, Lipase dan Protease. Manfaat utama dari penelitian ini akan lebih difokuskan aplikasinya dalam dunia peternakan yaitu sebagai bahan informasi dan juga referensi bagi pelaku industri terutama industri peternakan yang bergerak dalam bidang pengolahan pakan. Pengolahan pakan merupakan salah satu aspek yang  sangat penting dalam manajemen pemeliharaan ternak. Suatu pakan yang baik tidak hanya memperhatikan aspek palatabilitas  (‘tingkat  kesukaan’)  namun  juga  aspek  ketersedian  nutrisi  bagi  pertumbuhan  dan perkembangan ternak  yang  optimal.  Seringkali untuk semakin  meningkatkan ketersediaan  nutrisi dalam pakan, zat-zat tambahan dapat diberikan yang di antaranya juga berupa enzim. Kelompok zat  ini  dikenal  dengan  istilah  imbuhan  pakan  ( feed  additives ).  Dengan  demikian,  tujuan  utama penelitian  ini  adalah  untuk  mengisolasi  dan  menskiring  Actinomycetes  Endofitik  pada  akar mangrove  yang  berpotensi  menghasilkan  enzim  hidrolitik  untuk  dikembangkan  sebagai  imbuhan pakan  ternak  ( feed  additive ).  Diharapkan  agar  hasil  penelitian  ini  dapat  mendukung  program Kementerian  Pertanian  dan  juga  Pemerintah  Provinsi  Nusa  Tenggara  Timur  (NTT)  dalam memajukan  komoditas  peternakan  di  daerah  NTT  melalui  pengembangan  pakan  ternak  yang mengutamakan pemanfaatan bahan lokal termasuk dari aspek imbuhan pakan yang digunakan.

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 4(2) 2021

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat Penelitian
Pengambilan  sampel  akar  Mangrove  dilakukan  pada  daerah  pantai  Mangrove  di  daerah Oesapa,  Kota  Kupang,  sedangkan  isolasi  Actinomycetes  Endofitik  sekaligus  skrining  Enzim Hidrolitik dilakukan di Laboratorium Teknologi Pakan Ternak, Politeknik Pertanian Negeri Kupang.

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini di antaranya cawan petri untuk penanaman isolat dalam media, oven inkubator yang digunakan untuk inkubasi isolat, jarum ose untuk pengambilan isolat  secara  aseptik,  pinset  dan  pisau cutter untuk  memotong  bagian  akar  Mangrove,  labu Erlenmayer, pemanas ( hot plate ) dan magnetic stirrer yang digunakan dalam pembuatan media, autoklaf untuk sterilisasi alat dan juga bahan dan Laminair Airflow . Bahan yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  ISP2  Agar,  larutan  NaCl  fisiologis  0,9%,  larutan  iodine,  larutan  natrium hipoklorit  1%,  NaCl  1  M,  tepung  pati,  susu  skim, Carboxymethyl  cellulose (CMC),  pewarna Rhodamine-B, pewarna Congo-Red.

## Metode Dan Teknik Penelitian
Penelitian  ini  bersifat  deskriptif,  di  mana  hasil  penelitian  yang  diperoleh  merupakan  data kualitatif  berupa  isolat  Actinomycetes  Endofitik  murni  serta  hasil  skrining  akan  kemampuannya dalam  menghasilkan  empat jenis  enzim  hidrolitik  yang  diujikan  yaitu:  Selulase,  Amilase,  Lipase dan Protease.
Akar Mangrove yang merupakan sumber pengisolasian Actinomycetes Endofitik di-sampling secara acak di perairan pantai Mangrove, Oesapa, kota Kupang dan ditempatkan dalam wadah steril. Jenis akar yang diambil berasal dari akar lateral yang berukuran kecil sehingga lebih mudah untuk  disayat.  Prosedur  isolasi  akan  mendapatkan  isolat  Actinomycetes  Endofitik  murni  yang kemudian  dilanjutkan  ke  tahapan  skrining  enzim  hidrolitik.  Tahapan  ini  akan  menyeleksi  isolat Actinomycetes Endofitik penghasil minimal salah satu dari keempat enzim hidrolitik yang diujikan. Setelah tahapan skrining, isolat akan diamati karakteristik morfologi koloninya dalam media agar termasuk pewarnaan Gram ( Gram staining ) pula.

## Prosedur Penelitian

## 1)  Pengambilan Sampel
Sampel  cabang  akar  Mangrove  dipotong  secara  aseptis  menggunakan  pisau cutter dan ditempatkan  ke  dalam  wadah  plastik  steril  berisi  larutan  NaCl  fisiologis  0,9%  (Hidayatullah, 2019).
2)  Persiapan Alat dan Bahan
Semua  alat  dan  media  yang  digunakan  selama  pengerjaan  teknis  di  Laboratorium  disteril menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm selama 15 menit (untuk media) dan selama 30 menit (untuk alat) (Tille, 2017).
3)  Tahap Isolasi
a)  Sampel  cabang  akar  Mangrove  disteril  permukaannya  menggunakan  larutan  natrium hipoklorit 1% selama 60 detik (Sauer & Burroughs, 1986).
b)  Sampel akar disayat kemudian permukaan dalamnya ditempatkan pada permukaan media ISP2.
c)  Media yang mengandung sampel kemudian diinkubasi dalam oven inkubator  pada suhu ruang (± 27 o C) selama 3 hari.
4)  Tahap Purifikasi
a)  Mikroorganisme  yang  tumbuh  di  sekitaran  permukaan  dalam  akar  Mangrove  diseleksi terhadap Actinomycetes Endofitiknya, yang ditandai dengan permukaan koloni yang kasar
Indigenous Biologi Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 4(3) 2021 atau  tidak  rata,  dapat  menghasilkan  pigmen,  pertumbuhan  berfilamen  dan  dapat mengeluarkan aroma yang khas (Joseph et al. , 2021; Ortenberg & Telsch, 2003).
b)  Koloni  yang  tumbuh  kemudian  diambil  secara  aseptis  menggunakan  jarum  ose  dan diiokulasikan ke media agar yang baru (media ISP2).
c)  Metode inokulasi dilakukan dengan metode streak kuadran.
d)  Media diinkubasi dalam oven inkubator pada suhu ruang (± 27 o C) selama 3 hari.
e)  Purifikasi  dilakukan  hingga  mendapatkan  koloni  yang  konsisten  karakteristik morfologisnya.
5)  Tahap Skrining
a)  Skrining terhadap enzim Selulase (Gohel et al. , 2014)
1.  Tiap isolat diinokulasikan pada media ISP2 + 1% CMC.
2.  Media diinkubasi dalam oven inkubator pada suhu ruang (± 27 o C) selama 3 hari.
3.  Setelah inkubasi, media digenangi larutan Congo-red 1% selama 15 menit.
4.  Media dibilas sebanyak 3x menggunakan NaCl 1 M.
5.  Isolat  dikatakan  menghasilkan  enzim  selulase  bila  terbentuk  zona  bening  di  sekitar koloni.
b)  Skrining terhadap enzim Amilase (Luang-In et al. , 2019)
1.  Tiap isolat diinokulasikan pada media ISP2 + 1% pati.
2.  Media diinkubasi dalam oven inkubator pada suhu ruang (± 27 o C) selama 3 hari.
3.  Setelah  inkubasi,  media  digenangi  larutan  iodin  1%  yang  menyebabkan  media berwarna biru kehitaman.
4.  Isolat  dikatakan  menghasilkan  enzim  amilase  bila  terbentuk  zona  bening  di  sekitar koloni.
c)  Skrining terhadap enzim Lipase (Pramiadi & Yulianti, 2014)
1.  Tiap isolat diinokulasikan pada media ISP2 + 1% minyak zaitun + 0,01% Rhodamine-B.
2.  Media diinkubasi dalam oven inkubator pada suhu ruang (± 27 o C) selama 3 hari. 3.  Setelah inkubasi, warna koloni isolat diamati.
4.  Isolat  dikatakan  menghasilkan  enzim  lipase  bila  koloni  berwarna  merah  karena menyerap pewarna Rhodamine-B.
d)  Skrining terhadap enzim Protease (Alnahdi, 2012)
1.  Tiap isolat diinokulasikan pada media ISP2 + 1% susu skim.
2.  Media diinkubasi dalam oven inkubator pada suhu ruang (± 27 o C) selama 3 hari. 3.  Setelah inkubasi, koloni isolat diamati.
4.  Isolat  dikatakan  menghasilkan  enzim  protease  bila  terbentuk  zona  bening  di  sekitar koloni.

## Teknik Analisis Data
Analisis  data  dilakukan  secara  deskriptif  kualitatif  dengan  melakukan  karakterisasi morfologi isolat Actinomycetes Endofitik penghasil enzim hidrolitik pada media ISP2 dan termasuk juga dilakukan pewarnaan Gram (Tankeshwar, 2021; Tripathi & Sapra, 2021).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Actinomycetes Endofitik pada Akar Mangrove
Di  antara  semua  mikroorganisme  yang  tumbuh,  3  isolat  berhasil  dideteksi  sebagai Actinomycetes Endofitik yang terdapat dalam akar Mangrove: isolat A11, A12 dan A2. Koloni isolat ditandai dengan struktur yang kasar mirip tepung, pertumbuhan filamentous, dan memiliki aroma yang khas mirip tanah (Joseph et al. , 2021; Ortenberg & Telsch, 2003). Proses isolasi dapat dilihat pada Gambar 1. di bawah.

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 4(2) 2021

## Gambar 1. Sampel akar mangrove yang diinokulasi pada media agar ISP2.
Proses  purifikasi  dilakukan  pada  media  yang  sama  (ISP2  agar)  sebanyak  2  kali  hingga mendapatkan isolat yang benar-benar murni. Metode inokulasi menggunakan teknik streak plate pada permukaan  media  agar  dengan  mempertimbangkan  sifat  fisiologis  Actinomycetes  yang  merupakan mikroorganisme aerobik (Mochon et al. , 2016).

## Skrining Enzim Hidrolitik.
Skrining terhadap enzim Selulase mendapatkan 1 isolat yaitu A2 yang mampu menghasilkan enzim  yang  dimaksud.  Kemampuan katalitik  ini ditunjukkan  oleh  adanya  zona  bening  di sekitar koloni isolat yang ditumbuhkan. Ketika dituangkan dengan larutan Congo-red (CR) 1% pada media agar selama 15 menit, akan terbentuk ikatan hidrogen antara gugus fungsi amino molekul CR dan gugus hidroksil (-OH) dari polisakarida selulosa (Carboxymethyl Cellulose). Ikatan ini kemudian akan memberikan warna merah gelap pada media (Yakupova et al. , 2019). Akan tetapi, apabila substrat  selulosa  terdegradasi  (oleh  enzim  Selulase)  maka  ikatan  ini  tidak  akan  terbentuk, sehingga bila dibilas menggunakan larutan NaCl 1 M, pewarna CR akan larut sehingga terbentuk zona selulolitik yang tampak bening di sekitaran koloni isolat (Gambar 2.).
Gambar 2. Hasil Positif Uji Selulase Terhadap Isolat A2.
Afzal et  al. (2019)  menyebutkan  bahwa  bakteri  endofitik  dalam  suatu  tumbuhan  inang awalnya bersemayam di daerah sekitaran akar (rizosfer) yang kemudian mengkolonisasi bagian dalam  perakaran  secara  pasif  maupun  aktif.  Secara  aktif  akan  dilakukan  melalui  sekresi  enzim selulase dan pektinase yang akan menguraikan komposisi dinding sel tumbuhan. Beberapa strain Actinomycetes  yang  memiliki  kemampuan  katalitik  ini  di  antaranya  berasal  dari  genus Streptomyces dan Nocardiopsis (Putri & Setiawan, 2019; Song et al. , 2020).
Skrining terhadap enzim Amilase memperoleh hasil yang positif untuk ketiga isolat: A11, A12

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 4(3) 2021 dan A2 dengan kedua isolat A11 dan A12 menunjukkan aktivitas yang cukup tinggi, terlihat dari terbentuknya zona bening yang lebih besar. Ketika diberikan larutan iodine, media akan berwarna biru  dalam  keberadaan  amilum.  Hal  ini  disebabkan  oleh  amilum  yang  terdapat  pada  media bertindak sebagai donor muatan ion poliiodida sedangkan larutan iodin sebagai penerima muatan (Madhu et  al. ,  2016).  Reaksi  ini  kemudian  membentuk  Kompleks Charge-Transfer (CT)  yang ketika menyerap panjang gelombang cahaya tertentu akan mengubah warnanya menjadi biru tua yang  khas  (Saenger,  1984).  Namun,  jika  isolat  Actinomycetes  memiliki  enzim  amilase,  maka substrat  amilum  akan  didekomposisi  menjadi  monomer-monomernya  berupa  glukosa.  Glukosa dan poliiodida tidak akan menghasilkan kompleks CT yang mengakibatkan tidak adanya warna (zona  bening)  di  sekitar  koloni  (Goedecke,  2016).  Zona  amilolitik  berupa  zona  bening  tersebut dapat dilihat pada Gambar 3. berikut.
Gambar 3. Hasil Positif Uji Amilase Terhadap Isolat A11 (kiri), A12 (tengah) dan A2 (kiri). Keterangan: A: zona amilolitik, B: koloni isolat.
Seperti yang telah disebutkan di atas, bakteri endofit dapat pula memasuki tumbuhan inang secara pasif yang dilakukan melalui celah atau retakan pada permukaan bulu akar maupun pada bagian lainnya yang telah dilukai atau dicederai oleh organisme-organisme lainnya (Afzal et al. , 2019). Alasan inilah yang mungkin dapat mengkompensasi ketidaan kedua isolat ini akan enzim Selulase  sehingga  tidak  diperlukan  untuk  mendegradasi  selulosa  untuk  penetrasi  secara  aktif. Terkait keberadaan enzim Amilase-nya, substrat amilum dapat diperoleh dari produk fotosintetik tumbuhan inang yang akan didistribusikan ke seluruh bagian termasuk akar (Hastuti et al. , 2015). Actinomycetes  Endofitik  yang  mengandung  enzim  Amilase  kebanyakan  berasal  dari  genus Streptomyces (Ayuningrum et al. , 2021).
Ketiga  isolat  juga  menunjukkan  kemampuan  menghasilkan  enzim  Lipase  yang  ditandai dengan perubahan warna pada koloni menjadi warna karena menyerap pewarna Rhodamine-B. Di bawah aktivitas katalitik lipase, asam lemak yang dilepaskan dari hidrolisis lipid akan mengikat Rhodamin-B (Jette & Ziomek, 1994). Hal ini kemudian akan membuat media menjadi lebih tidak berwarna dan koloni menjadi lebih berwarna kemerahan karena adanya Rhodamin-B yang diserap tersebut  (Pramiadi  &  Yulianti,  2014).  Kebanyakan  genus Streptomyces diketahui  mampu menghasilkan  enzim  Lipase  (Kishore,  2011).  Contoh  salah  satu  isolat  yang  menunjukkan  hasil yang positif ditampilkan pada Gambar 4. berikut.

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 4(2) 2021
Gambar 4. Hasil Positif Uji Lipase Terhadap Isolat A11.
Substrat lipid yang terkandung dalam akar Mangrove terutama berupa senyawa triterpenoid dan fitosterol, di antaranya: lupeol, β-amyrin dan taraxerol untuk triterpenoid, dan β-sitosterol dan stigmasterol  untuk  fitosterol  (Basyuni et  al. ,  2007).  Distribusi  senyawa  lipid  ini  berbeda  secara anatomis  pada  bagian  epidermis,  korteks  dan  stele  di  mana  semakin  ke  arah  luar,  konsentrasi senyawa triterpenoid akan terdapat semakin banyak (S P et al. , 2016).
Terhadap  enzim  Protease,  hanya  isolat  A12  dan  A2  yang  terlihat  menunjukkan  aktivitas Protease. Aktivitas protease dianalisis dengan melihat adanya zona bening yang terbentuk dari reaksi  katalitik  enzim  protease  yang  menguraikan  protein  yang  terkandung  dalam  media  yang mengandung  sumber  susu  skim  (Perwendha et  al. ,  2020).  Substrat  yang  mengandung  protein yang  terdapat  pada  Mangrove  dapat  berasal  dari  senyawa  eksudat  yang  disekresikan  oleh akarnya  (Zhuang et  al. ,  2020).  Kelompok  Actinomycetes  yang  diketahui  dapat  mendegradasi substrat  berprotein  terutama  berasal  dari  Genus Streptomyces (Swarna  &  Gnanadoss,  2020). Contoh salah satu isolat yang menunjukkan hasil yang positif ditampilkan pada Gambar 5 berikut.
Gambar 5. Hasil Positif Uji Lipase Terhadap Isolat A2.
Distribusi produksi enzim hidrolitik pada ketiga isolat dapat dilihat pada tabel 1. di bawah. Dari tabel ini juga terlihat jelas bahwa isolat A2 memiliki keempat enzim hidrolitik yang diujikan. Isolat A11 hanya  mampu  menunjukkan  aktivitas  Amilase  dan  Lipase.  Untuk  isolat  A12,  aktivitas  katalik  hanya ditunjukkan terhadap enzim Amilase, Lipase dan Protease. Meskipun demikian, khusus untuk Amilase, aktivitas tertinggi tampak ditunjukkan oleh isolat A11 dan A12 berupa terbentuknya zona amilolitik (zona bening) yang lebih besar bila dibandingkan dengan isolat A2.

## Tabel 1 Produksi Enzim Hidrolitik Isolat Actinomycetes Endofitik Akar Mangrove
Enzim Hidrolitik Isolat A11 A12 A2 Selulase - - + Amilase ++ ++ + Lipase + + + Protease - + +
Bila  dihubungkan  dengan  aspek  pengolahan  pakan  ternak,  analisis  lanjutan  terhadap efektivitas tiap enzim ini dapat dilakukan dengan menambahkan ekstrak enzim kasar pada pakan ternak  (mungkin  dengan  kisaran  konsentrasi)  dan  memberikannya  langsung  ke  hewan  ternak untuk  mengamati  parameter  pertumbuhan  dan  perkembangannya  ( in  vivo ),  atau  dengan menganalisis  aktivitas  katalitik  masing-masing  eksoenzim  ekstrak  ( in  vitro )  dengan  mengukur jumlah atau konsentrasi monomer yang dihasilkan selama degradasi bahan baku pakan sebagai substratnya.

## Tabel 2 Karakterisasi Morfologis dan Pewarnaan Gram Isolat Actinomycetes Endofitik
Prosedur pewarnaan gram juga dilakukan pada koloni isolat. Karena Actinomycetes adalah Gram-positif,  pewarnaan  akan  memberikan  warna  sel-sel  menjadi  ungu  di  bawah  pengamatan mikroskopis. Berdasarkan prosedur, semua isolat menunjukkan warna ungu. Kelompok bakteri ini akan memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tebal. Bila diwarnai dengan Kristal violet, pewarna primer ini akan  berikatan  dengan  dinding  sel  baik  Gram-negatif  maupun  -positif.  Penambahan  dengan  larutan Iodine  pada  langkah kedua  akan  bertindak sebagai fiksatif  untuk  lebih memperkuat  ikatan kompleks iodium-peptidoglikan. Larutan Etanol 95% pada tahap ketiga akan berfungsi sebagai penghilang warna ( decolorizing agent ) yang melarutkan lipid. Namun, karena Gram-positif memiliki kandungan lipid yang rendah, tahap ini tidak akan memberikan dampak yang signifikan sehingga ketika ditambahkan dengan pewarna  tandingan  ( counter-stain )  pada  tahap  terakhir,  yaitu  Safranin.  Pewarna  ini  kurang  reaktif dengan peptidoglikan, sehingga akan memberikan tapilan dinding sel berwarna ungu dari kristal violet
Karakteristik Morfologis A11 A12 A2 Bentuk Irregular Irregular Irregular Elevasi Crateriform Crateriform Crateriform Margin Undulate Undulate Undulate Tekstur Kasar Kasar Kasar Transparansi Tidak tembus cahaya ( Opaque ) Tidak tembus cahaya ( Opaque ) Tidak tembus cahaya ( Opaque ) Warna dalam Media ISP2 Cokelat muda Cokelat muda Cokelat muda
Tampilan Koloni
Pewarnaan Gram
Gram +
Gram +
Gram +

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 4(2) 2021
yang diberikan pada tahap pertama (Bruckner, 2017). Tampilan pewarnaan gram beserta karakterisasi morfologis  tiap  isolat  Actinomycetes  Endofitik  ditampilkan  pada  Tabel  2.  di  atas.  Akan  tetapi,  untuk mendapatkan  informasi  akurat  terkait  identifikasi  spesies  Actinomycetes  Endofitik  yang  didapatkan, ekstraksi  materi  genetik  sangat  penting  untuk  dilakukan  yang  kemudian  dapat  dilanjutkan  dengan sekuensing genom.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan di atas, dapat disimpulkan beberapa hal berikut:
1.  Actinomycetes Endofitik pada akar Mangrove yang mampu menghasilkan enzim hidrolitik telah berhasil diisolasi yang membuktikan bahwa habitat lokal ekosistem Nusa Tenggara Timur dapat menjadi sumber alternatif penghasil metabolit primer Actinomycetes, terutama enzim hidrolitik.
2.  Enzim hidrolitik yang dihasilkan oleh isolat Actinomycetes Endofitik pada akar Mangrove memiliki prospek untuk diaplikasikan sebagai enzim aditif pakan ternak, khususnya terkait enzim Selulase, Amilase, Lipase dan Protease.
3.  Ketiga  isolat  berpotensi  dikembangkan  sebagai  imbuhan  pakan  ternak  karena mengandung  minimal  salah  1  enzim  hidrolitik  yang  diujikan  dengan  Isolat  A2  memiliki keempat enzim hidrolitik yang diujikan tersebut.

## SARAN
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan di atas, juga dapat disarankan beberapa hal berikut :
1.  Analisis lebih lanjut harus dilakukan pada aktivitas katalitik dari setiap eksoenzim hidrolitik yang dihasilkan oleh masing-masing isolat untuk membandingkan efektivitasnya.
2.  Eksplorasi  lebih  lanjut  terkait  Actinomycetes  Endofitik  ini  dapat  dilakukan  pula  terhadap enzim-enzim  hidrolitik  lainnya  yang  juga  sering  dimanfaatkan  sebagai  imbuhan  pakan ternak seperti enzim Xylanase, Pektinase, Lignase dan Fitase.
3.  Eksplorasi yang sama terhadap Actinomycetes Endofitik penghasil enzim hidrolitik dapat pula dilakukan pada daerah Mangrove pada lokasi habitat yang berbeda di Nusa Tenggara Timur.
4.  Identifikasi  secara  molekuler  terhadap  isolat-isolat  Actinomycetes  Endofitik  yang  telah didapatkan dapat dilakukan untuk memperoleh informasi spesies yang akurat yang dapat dijadikan sebagai referensi bagi penelitian-penelitian lanjutnya.

## DAFTAR PUSTAKA
Afzal, I., Shinwari, Z. K., Sikandar, S., & Shahzad, S. (2019). Plant beneficial endophytic bacteria: Mechanisms, diversity, host range and genetic determinants. Microbiological Research , 221 , 36 –49. https://doi.org/10.1016/j.micres.2019.02.001
Aghamirian, M. R., & Ghiasian, S. A. (2009). Isolation and Characterization of Medically Important Aerobic Actinomycetes in Soil of Iran (2006 —2007). The Open Microbiology Journal , 3 , 53 –57. https://doi.org/10.2174/1874285800903010053
Alnahdi, H. S. (2012). Isolation and screening of extracellular proteases produced by new Isolated Bacillus sp. Journal of Applied Pharmaceutical Science .
Indigenous Biologi Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 4(3) 2021 https://doi.org/10.7324/JAPS.2012.2915
Ayuningrum, D., Sabdaningsih, A., & Jati, O. (2021). Screening of actinobacteria-producing amylolytic enzyme in sediment from Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) ponds in Rembang District, Central Java, Indonesia. Biodiversitas Journal of Biological Diversity , 22 (4), Article 4. https://doi.org/10.13057/biodiv/d220427
Basyuni, M., Oku, H., Baba, S., Takara, K., & Iwasaki, H. (2007). Isoprenoids of Okinawan mangroves as lipid input into estuarine ecosystem. Journal of Oceanography , 63 (4), 601 –608. https://doi.org/10.1007/s10872-007-0053-2
Berezin, V., Abdukhakimova, D., Trenozhnikova, L., Bogoyavlenskiy, A., Turmagambetova, A., Issanov, A., & Azizan, A. (2019). Antiviral activities of extremophilic actinomycetes extracts from Kazakhstan’s unique ecosystems against influenza viruses and paramyxoviruses.
Virology Journal , 16 (1), 150. https://doi.org/10.1186/s12985-019-1254-1
Bruckner, M. Z. (2017). Gram Staining . Microscopy. https://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/microscopy/gramstain.html
Dewi, T. K., Agustiani, D., & Antonius, S. (2017). Secondary Metabolites Production by Actinomycetes and their Antifungal Activity. KnE Life Sciences , 256 –264. https://doi.org/10.18502/kls.v3i4.713
Goedecke, C. (2016). Why Does Iodine Turn Starch Blue? ChemViews . https://doi.org/10.1002/chemv.201600103
Gohel, H. R., Contractor, C. N., Ghosh, S. K., & Braganza, V. J. (2014). A comparative study of various staining techniques for determination of extra cellular cellulase activity on Carboxy Methyl Cellulose (CMC) agar plates . 6.
Hastuti, U. S., Sangur, K., & Khasanah, H. N. (2015). BIODIVERSITY AND ENZYME ACTIVITY OF INDIGENOUS CELLULOLYTIC AND AMYLOLYTIC BACTERIAS IN DECAYED MANGROVE STEM WASTE PRODUCT AT WAAI SEASHORE, AMBON ISLAND. KnE Life Sciences , 433 – 438. https://doi.org/10.18502/kls.v2i1.188
Hidayatullah, A. R. (2019). ISOLASI ACTINOMYCETES DARI SEDIMEN MANGROVE UJUNG PANGKAH DI GRESIK [Skripsi, Universitas Airlangga]. http://lib.unair.ac.id
Jette, J. F., & Ziomek, E. (1994). Determination of lipase activity by a rhodamine-triglyceride-agarose assay. Analytical Biochemistry , 219 (2), 256 –260. https://doi.org/10.1006/abio.1994.1265
Joseph, J., Abirami, B., Manigundan, K., Gopikrishnan, V., & Radhakrishnan, M. (2021). Chapter 9 - Antimicrobial peptides from Actinobacteria: Current status and future prospects. In S. Das & H. R. Dash (Eds.), Microbial and Natural Macromolecules (pp. 205 –231). Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-820084-1.00009-0
Kishore, P. (2011). Isolation, characterization and identification of Actinobacteria of Mangrove ecosystem, Bhitarkanika, Odisha [MSc]. http://ethesis.nitrkl.ac.in/2337/
Luang-In, V., Yotchaisarn, M., Saengha, W., Udomwong, P., Deeseenthum, S., & Maneewan, K. (2019). Isolation and Identification of Amylase-producing Bacteria from Soil in Nasinuan Community Forest, Maha Sarakham, Thailand. Biomedical and Pharmacology Journal , 12 (3),
1061 –1068.

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 4(2) 2021
Madhu, S., Evans, H. A., Doan-Nguyen, V. V. T., Labram, J. G., Wu, G., Chabinyc, M. L., Seshadri,
R., & Wudl, F. (2016). Infinite Polyiodide Chains in the Pyrroloperylene –Iodine Complex: Insights into the Starch –Iodine and Perylene–Iodine Complexes. Angewandte Chemie International Edition , 55 (28), 8032 –8035. https://doi.org/10.1002/anie.201601585
Matsumoto, A., & Takahashi, Y. (2017). Endophytic actinomycetes: Promising source of novel bioactive compounds. The Journal of Antibiotics , 70 (5), 514 –519. https://doi.org/10.1038/ja.2017.20
Mochon, A. B., Sussland, D., & Saubolle, M. A. (2016). Aerobic Actinomycetes of Clinical Significance. Microbiology Spectrum , 4 (4). https://doi.org/10.1128/microbiolspec.DMIH2-0021-2015
Mukhtar, S., Zaheer, A., Aiysha, D., Abdulla Malik, K., & Mehnaz, S. (2017). Actinomycetes: A Source of Industrially Important Enzymes. Journal of Proteomics & Bioinformatics , 10 (12). https://doi.org/10.4172/jpb.1000456
Ortenberg, E., & Telsch, B. (2003). 42 —Taste and odour problems in potable water. In D. Mara & N. Horan (Eds.), Handbook of Water and Wastewater Microbiology (pp. 777 –793). Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-012470100-7/50043-1
Perwendha, R., Oetari, A., & Sjamsuridzal, W. (2020). Skimmed milk-degrading ability of Rhizopus azygosporus UICC 539 at various temperatures . 050006. https://doi.org/10.1063/5.0007872
Pramiadi, D., & Yulianti, E. (2014). Isolasi dan uji aktivitas enzim lipase termostabil dari bakteri termofilik pasca erupsi Merapi . 11.
Putri, A. L., & Setiawan, R. (2019). Isolation and screening of actinomycetes producing cellulase and xylanase from Mamasa soil, West Sulawesi. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science , 308 (1), 012035. https://doi.org/10.1088/1755-1315/308/1/012035
Ravikumar, S., Inbaneson, S., Uthiraselvam, M., Priya, S., Ramu, A., & Banerjee, M. (2011). Diversity of endophytic actinomycetes from Karangkadu mangrove ecosystem and its antibacterial potential against bacterial pathogens. Journal of Pharmacy Research , 4 , 294 –296.
S P, M., Sreeshan, A., & Augustine, A. (2016). Comparative Lipid Isolation Protocols from Rhizophora mucronata L. of Dharmadam Estuary and Lipid Profiling in the Context of a Non Mangrove Mangifera indica. Biochemistry & Analytical Biochemistry , 5 . https://doi.org/10.4172/2161- 1009.1000286
Saenger, W. (1984). The structure of the blue starch-iodine complex | SpringerLink. Naturwissenschaften , 71 , 31 –36.
Sauer, D. B., & Burroughs, R. (1986). Dininfection of Seed Surface with Sodium Hypochlorite. PHYTOPATHOLOGY , 76 (7).
Song, L., Jiang, N., Wei, S., Lan, Z., & Pan, L. (2020). Isolation, Screening, and Identification of Actinomycetes with Antifungal and Enzyme Activity Assays against Colletotrichum dematium of Sarcandra glabra. MICROBIOLOGY , 48 (1), 37 –43.
Swarna, D., & Gnanadoss, J. J. (2020). Screening and Molecular Characterization of Actinomycetes from Mangrove Soil Producing Industrially Important Enzymes. Journal of Scientific Research , 64 (02), 87 –95. https://doi.org/10.37398/JSR.2020.640211
Indigenous Biologi Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 4(3) 2021 Tankeshwar, A. (2021). Colony Morphology of Bacteria • Microbe Online . Microbe Online. https://microbeonline.com/colony-morphology-bacteria-describe-bacterial-colonies/
Tille, P. M. (2017). Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology . Elsevier. https://fk.uii.ac.id/mikrobiologi/materi/sterilisasi/
Tripathi, N., & Sapra, A. (2021). Gram Staining. In StatPearls . StatPearls Publishing. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK562156/
Yakupova, E. I., Bobyleva, L. G., Vikhlyantsev, I. M., & Bobylev, A. G. (2019). Congo Red and amyloids: History and relationship. Bioscience Reports , 39 (1), BSR20181415. https://doi.org/10.1042/BSR20181415
Zhuang, W., Yu, X., Hu, R., Luo, Z., Liu, X., Zheng, X., Xiao, F., Peng, Y., He, Q., Tian, Y., Yang, T., Wang, S., Shu, L., Yan, Q., Wang, C., & He, Z. (2020). Diversity, function and assembly of mangrove root-associated microbial communities at a continuous fine-scale. Npj Biofilms and Microbiomes , 6 (1), 1 –10. https://doi.org/10.1038/s41522-020-00164-6

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 4(2) 2021