## Artikel Penelitian

## Isolasi DNA pada Produk Otak-Otak Ikan Bandeng
Sri Utaminingsih 1 , Sofia Dyah Utami 2 , Alfi Sophian 3
1,2,3 Pusat Pengembangan Pengujian Obat dan Makanan Nasional, Badan Pengawas Obat dan Makanan, Jakarta, Indonesia
* Corresponding author : sri.utami@pom.go.id

## ABSTRACT
Background:  Analysis  of  the  quality  of  isolated  DNA  is  an  analytical  technique  used  to determine the quality of isolated DNA to minimize the failure of the amplification process in molecular analysis. Purposes: The purpose of this study was to see the quality of DNA isolated from processed fish food products in the form of milkfish brains. Methods: The DNA extraction procedure  followed  the  manual  extraction  kit  protocol  used.  Analysis  of  the  quality  of  the isolated DNA was measured using a nanophotometer, where the quality analysis was based on the value of the concentration and purity of the isolated DNA. Data analysis was carried out using the average test of concentration and purity values. Results: Based on the results of the analysis of DNA quality, it was obtained that the concentration of DNA was in the range of 9.6 – 18.5 with the average value of isolated DNA at 13.4 ng/µL, while the purity value read at wavelength A260/A28 was in the range 1.64 – 1.87, with the average value, is at a value of 1.79. Conclusion: The results of the study concluded that the DNA isolated from the processed food product samples of milkfish brains showed the concentration and purity values that were included in the category of good DNA isolation results.

## Keywords: analysis, DNA, extraction, concentration, food

## ABSTRAK
Latar belakang: Analisis mutu DNA hasil isolasi merupakan teknik analisis yang digunakan untuk  mengetahui  kualitas  DNA  hasil  isolasi  sehingga  meminimalkan  kegagalan  proses amplifikasi dalam analisis molekuler. Tujuan: Tujuan dilakukan penelitian ini adalah untuk melihat  mutu  DNA  hasil  isolasi  pada  produk  pangan  olahan  ikan  berupa  otak-otak  ikan bandeng.  Prosedur ekstraksi DNA mengikuti protokol ekstraksi manual kit yang digunakan. Analisis mutu DNA hasil isolasi diukur menggunakan nanophotometer, dimana analisis mutu berdasarkan  nilai  konsentrasi  dan  kemurnian  DNA  hasil  isolasi.  Analisis  data  dilakukan menggunakan uji rata-rata nilai konsentrasi dan kemurnian. Hasil: Berdasarkan hasil analisis mutu DNA diperoleh hasil konsentrasi DNA berada pada kisaran 9.6 – 18.5 dengan nilai rata- rata DNA hasil isolasi berada pada nilai 13.4 ng/µL, sedangkan nilai kemurnian yang dibaca pada  panjang  gelombang  A260/A28  berada  pada  kisaran  1.64  –  1.87,  dengan  nilai  rata-rata berada pada nilai 1.79. Simpulan: Sehingga dapat disimpulkan bahwa DNA hasil isolasi yang dilakukan  pada  sampel  produk  pangan  olahan  otak-otak  ikan  bandeng  menunjukkan  nilai konsentrasi dan kemurnian yang masuk dalam kategori hasil isolasi DNA yang baik.
Kata kunci: analisis, DNA, ekstraksi, konsentrasi, makanan

## PENDAHULUAN
Analisis mutu DNA hasil isolasi merupakan teknik  analisis  yang  digunakan  untuk mengetahui  kualitas  DNA  hasil  isolasi sehingga  meminimalkan  kegagalan  proses amplifikasi  dalam  analisis  molekuler. Beberapa  penyebab  kegagalan  dalam melakukan  analisis  molekuler  adalah adanya  inhibitor  pada  DNA  hasil  isolasi atau  nilai  konsentrasi  DNA  yang  diisolasi sangat  sedikit  sehingga  mempengaruhi kinerja  PCR  dalam  melakukan  proses amplifikasi (1,2).
Pengujian  biologi  molekuler  pada produk  makanan  berbasis  spesies  hewan merupakan  teknik  pengujian  yang  dapat berkembang  dari  penelitian  DNA  spesies pada  bidang  biologi  molekuler  (3).    Oleh sebab  itu,  penelitian  ini  dapat  menjadi  hal baru  yang  dapat  berkembang  untuk pengujian  mutu  produk  dari  ancaman pemalsuan klaim bahan baku.   Diperlukan banyak  informasi  pendahuluan  yang  akan digunakan  sebagai  sumber  acuan  untuk mendukung perkembangan metode pengujian  DNA  spesies  pada  produk pangan  dan  hasil  olahannya.    Penelitian tentang  analisis  mutu  isolasi  DNA  pernah dilakukan  oleh  (4),  dalam  penelitiannya untuk  uji  penelusuran  beberapa  varian produk tomat.
Berdasarkan  latar  belakang  tersebut diatas, maka penelitian ini dilakukan untuk melihat  mutu  DNA  hasil  isolasi  pada produk pangan olahan ikan yaitu otak-otak ikan bandeng, sehingga hasil penelitian ini dapat menyumbang peran dalam perkembangan pengujian bidang molekuler untuk uji identifikasi DNA spesies atau uji autentifikasi  produk  berbasis  uji  biologi molekuler.

## METODE Material
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah  produk  pangan  olahan  ikan  berupa otak-otak  ikan  bandeng,  kit  ekstraksi DNeasy Mericon Food [Qiagen].

## Prosedur Ekstraksi DNA
Timbang  sampel  seberat  200  mg  dalam tabung  mikrosentrifus  2  ml,  kemudian ditambahkan 700 µL lysis buffer dan 30 µL Proteinase  K,  kemudian  diinkubasi  pada suhu  70 o C  selama  30  menit.  Keluarkan sampel  dari  inkubasi  kemudian  lanjutkan dengan  centrifuge  selama  5  menit  dengan kecepatan  putaran  centrifuge  14.000  rpm. Dalam  tabung  sentrifus  akan  terbentuk  2 lapis pelet dan supernatan, ambil supernatan  dengan  cara  dipipet  dan pindahkan  ke  tabung  sentrifus  2  mL kemudian buang pelet dalam tabung. Pada supernatan  dalam  tabung  sentrifus  2  mL ditambahkan  350  µL  kloroform  kemudian disentrifus  selama  10  menit  dengan kecepatan  14.000  rpm,  kemudian  dipipet larutan yang berada di lapisan atas ke dalam tabung  sentrifus  2  mL  yang  baru  dan ditambahkan 750 µL binding buffer PB dan diinkubasi  selama  2  menit  pada  suhu kamar.
Vortex kemudian memasukkan semua cairan ke dalam tabung centrifuge 2 ml secara bertahap sampai habis ke dalam spin column dan centrifuge. Setelah semua cairan habis, masukkan dan centrifuge, lalu tambahkan  500  µL  wash  buffer  AW2  dan centrifuge  lagi  selama  1  menit  dengan kecepatan  putaran  14.000  rpm.  Pindahkan spin column ke dalam tabung sentrifus baru 1,5 mL kemudian tambahkan 70 µL elution buffer  (EB)  kemudian  sentrifus  dengan
kecepatan  putaran  14.000  rpm  selama  1 menit.  Buang  spin  column  dan  sisa  cairan dalam tabung centrifuge 1,5 mL merupakan DNA  hasil  isolasi  yang  akan  diukur kemurnian  dan  konsentrasinya  sebelum digunakan.

## Analisis Mutu DNA
Analisis  mutu  DNA  hasil  isolasi  diukur menggunakan  nanophotometer,  dimana analisis mutu berdasarkan nilai konsentrasi dan  kemurnian  DNA  hasil  isolasi  (1,5,6). Konsentrasi DNA yang menunjukkan hasil isolasi  DNA  yang  baik  jika  nilai konsentrasi  lebih  besar  dari  20  ng/µL, sedangkan  nilai  kemurnian  diukur  pada panjang  gelombang  A260/A280  berada pada rentang nilai 1.7-2.1 (7–9).

## Analisis Data
Analisis  data  dilakukan  menggunakan  uji rata-rata  nilai  konsentrasi  dan  kemurnian, yang didapat dari pengukuran menggunakan nanophotometer (3,5,10,11).

## HASIL
Berdasarkan hasil analisis mutu DNA yang dibaca menggunakan nanophotometer, diperoleh  hasil  konsentrasi  DNA  berada pada  kisaran  9.6  –  18.5  dengan  nilai  rata- rata  DNA  hasil  isolasi  berada  pada  nilai 13.4  ng/µL,  sedangkan  nilai  kemurnian yang  dibaca  pada  panjang  gelombang A260/A28 berada pada kisaran 1.64 – 1.87, dengan  nilai  rata-rata  berada  pada  nilai 1.79.  Data  lengkap,  seperti  disajikan  pada tabel 1 dibawah ini.
Tabel 1. Hasil isolasi DNA No. Konsentrasi (ng/µL) Kemurnian (A260/A280) 1 14.3 1.72 2 13.7 1.84 3 18.5 1.75 4 11.6 1.87 5 11.4 1.87 6 17.7 1.73 7 15.9 1.82 8 13.8 1.80 9 11.3 1.78 10 15.9 1.64 11 11.6 1.77 12 11.3 1.84 13 14.8 1.85 14 10.3 1.77 15 9.6 1.79 Average 13.4 1.79

## PEMBAHASAN
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan  diperoleh  nilai  konsentrasi dengan  rata-rata  13,4  ng/µL  dan  nilai kemurnian  yang  dibaca  pada  panjang gelombang  A260/A80  berada  pada  nilai 1,79.  Hasil  ini  merupakan  hasil  isolasi DNA  yang  masuk  dalam  kategori  hasil isolasi  DNA  yang  baik.    Hal  ini  sejalan dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh (1,12),  yang  menyatakan  bahwa  isolasi DNA yang baik jika konsentrasi DNA hasil isolasi  lebih  besar  dari  10  ng/µL  dan  nilai kemurnian berada pada rentang 1,7-2.
Proses ekstraksi pada sampel produk olahan pangan memiliki poin penting yang harus  diperhatikan  yaitu  pada  sampel produk makanan, kemungkinan DNA yang ada  pada  sampel  akan  terfragmentasi  oleh proses pemanasan, disamping itu pula, pada matrik produk makanan perlu diperhatikan adanya  komposisi  bahan  yang  digunakan. Adanya  inhibitor  dalam  proses  ekstraksi DNA  akan  sangat  berpengaruh  terhadap kualitas mutu DNA yang dihasilkan. Hasil isolasi  DNA  menunjukkan  semua  sampel yang diuji dalam penelitian ini menunjukkan nilai kemurnian dan konsentrasi  DNA  yang  masuk  dalam kategori DNA yang baik.
Menurut Gryson (13), proses pemasakan  pada  sebuah  produk  tidak mempengaruhi  mutu  DNA  hasil  isolasi sebuah  produk.    Oleh  sebab  itu,  pada pengujian DNA spesies yang menggunakan teknik  biologi  molekuler  berbasis Real- Time PCR,  isolasi  DNA  merupakan tahapan  paling  penting.    Keberhasilan sebuah  proses  isolasi  akan  mendukung keberhasilan proses selanjutnya.
Pada  proses  ekstraksi  DNA,  enzim proteinase  K  memiliki  peran  yang  cukup penting,  dimana  enzim  ini  bekerja  dengan cara  menghancurkan  protein  kemudian mencernanya.    Penggunaan  teknik  ini dianggap  lebih  efektif  jika  dibandingkan dengan  metode  yang  menggunakan  bahan kimia, hal ini karena enzim bekerja cukup efektif  langsung  menargetkan  ikatan  asam amino  dalam  melisis  protein.  Enzim proteinase  K  aktif  bekerja  pada  suhu  65- 70 o C,  sehingga  pada  beberapa  penelitian yang  menggunakan  metode  ini  terkadang perlu melakukan optimasi metode sebelum menggunakannya  (14,15).  Tujuan  dari
proses pemanasan ini adalah mengaktivasi enzim proteinase K agar dapat aktif bekerja untuk melakukan lisis (16).
Dalam  melakukan  ekstraksi  DNA dengan  menggunakan  kloroform,  fungsi pelarut  ini  berperan  dalam  meningkatkan densitas fase organik, mencegah fenol dari inverting ke dalam fase air, yang mungkin terjadi  tanpa  menggunakan  kloroform karena kepadatannya yang dekat air.  Oleh karena itu, fungsi kloroform dapat digunakan untuk menjaga DNA dari proses terdegradasi oleh fenol (17).
Sistem  ekstraksi  yang  umumnya menggunakan  Phenol-Chloroform  bekerja dengan  cara  menggunakan  fenol  sebagai pengikat  protein,  lemak  dan  karbohidrat, yang  selanjutkan  akan  dipisahkan  dengan makromolekul lainnya. Pada saat dilakukan sentrifugasi, makromolekul seperti protein dan polisakarida yang diikat oleh  Phenol  dan  Chloroform  Isoamil Alkohol akan mengendap di dasar tabung, sedangkan  DNA  dan  air  berada  di  lapisan atas (18).  Cara yang dapat dilakukan untuk memisahkan  memurnikan  DNA  tersebut adalah  dengan centrifuge  colom, dimana pada akhir setelah proses pencucian dengan menggunakan alkohol sehingga sisa garam dan  fenol  yang  terdapat  pada  sampel  akan keluar  dan  meninggalkan  pelet  DNA. Elusi  untuk  proses  penarikan  pelet  DNA dari  spin  kolom  ini  dapat  menggunakan aquades  steril  atau  nukleotida free  water (19,20).

## SIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa DNA hasil isolasi yang dilakukan  pada  sampel  produk  pangan olahan otak-otak ikan bandeng
menunjukkan nilai konsentrasi dan kemurnian  yang  masuk  dalam  kategori hasil isolasi DNA yang baik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kepala  Pusat  Pengembangan  Pengujian Obat dan Makanan atas dukungan laboratorium  pengujian  yang  digunakan dalam penelitian ini.

## KONFLIK KEPENTINGAN
Penulis menyatakan tidak memiliki konflik kepentingan,  dan  tidak  ada  afiliasi  atau hubungan dengan atau dengan entitas atau organisasi mana pun, yang dapat menimbulkan  pertanyaan  bias  dalam diskusi dan kesimpulan dari naskah.

## REFERENSI
1. Sophian  A.  DNA  Isolation  of Chicken  Feathers  from  the  Base  of the Young Feathers, the Base of the Old  Feathers,  and  the  Tip  of  the Feathers.  Bioeduscience  [Internet]. 2021  Aug  31;5(2):104–8.  Available from: https://journal.uhamka.ac.id/index.p hp/bioeduscience/article/view/6211
2. Sutanta  M,  Wulan  DT,  Nabila  Y, Sophian  A.  Application  of  Double Wash  Technique  for  Species  DNA Isolation  in  Soft  Capsule  Shell Samples:  Application  of  Double Wash  Technique  for  Species  DNA Isolation  in  Soft  Capsule  Shell Samples. Erud  Indones J Food Drug Saf [Internet]. 2022 May 24;2(1 SE- Articles):14–9. Available from:
https://eruditio.pom.go.id/index.php /home/article/view/78
3. Sophian  A.  Detection  of  Species
DNA in Chicken Meatball Products Using  NGF  Genes  as  Molecular Markers. BiosciED J Biol Sci Educ. 2021;2(2):47–51.
4. Turci  M,  Sardaro  MLS,  Visioli  G, Maestri  E,  Marmiroli  M,  Marmiroli N.  Evaluation  of  DNA  extraction procedures for traceability of various tomato  products.  Food  Control [Internet].  2010  Feb;21(2):143–9.
Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retri eve/pii/S0956713509001418
5. Sophian  A.  Short  Communication: Analysis of purity and concentration of  extracted  DNA  on  salted  fish processed food products. Asian J Nat Prod Biochem. 2021;19(1).
6. Piskata  Z,  Servusova  E,  Babak  V, Nesvadbova  M,  Borilova  G.  The Quality  of  DNA  Isolated  from Processed  Food  and  Feed  via Different  Extraction  Procedures. Molecules  [Internet].  2019  Mar 26;24(6):1188. Available from: https://www.mdpi.com/1420- 3049/24/6/1188
7. Piskata Z, Pospisilova E, Borilova G. Comparative study of DNA extraction  methods  from  fresh  and processed  yellowfin  tuna  muscle tissue.  Int  J  Food  Prop  [Internet]. 2017  Dec  18;20(sup1):S430–43. Available
from: https://doi.org/10.1080/10942912.2 017.1297953 8. Aliyu  R.,  Wasiu  AA,  Dangora  D.,
Ademola JO, Adamu A.
Comparative study of genomic DNA extraction protocols in rice species . Int J Adv Res Technol. 2013;2(2):1–
3.
9. Branquinho  MR,  Ferreira  RTB, Cardarelli-Leite  P.  Use  of  real-time PCR to evaluate two DNA extraction methods  from  food.  Food  Sci Technol. 2012;32(1):112–8.
10. Wulan DTRI, Sutanta M, Sophian A. Short Communication : Comparison of  two  commercial  DNA  extraction kit  to  obtain  high  quality  porcine DNA.  Asian  J  Trop  Biotechnol. 2021;18(2):69–72.
11. Sophian A. Species DNA Detection Using PGR Gene Genetic Markers in
Chicken  Nuggets:  Species  DNA Detection Using PGR Gene Genetic Markers in Chicken Nuggets.
Indones  Food  Sci  &amp;  Technol  J
[Internet]. 2021 Dec 31;5(1 SE-):17–
20.  Available  from:  https://online- journal.unja.ac.id/ifstj/article/view/1
4618
12. Sophian  A,  Sri  U,  Sofia  UD.  DNA isolation  in  processed  chicken  meat products  (nugget)  using  modified DNeasy Mericon Food kit (Qiagen). 2022;12(2):15–21.
13. Gryson N. Effect of food processing on plant DNA degradation and PCR- based GMO analysis: a  review. Anal Bioanal Chem. 2010 Mar;396(6):2003–22. 14. Sophian  A,  Syukur  A.  Analysis  of Purity and Concentration of Isolated DNA  in  Making  Raw  DNA  of  Rat Species. Erud  Indones J Food Drug
Saf. 2021;1(2):1–5.
15. Sophian  A.  Short  Communication: Analysis of purity and concentration of  extracted  DNA  on  salted  fish processed food products. Asian J Nat Prod  Biochem  [Internet].  2021  Mar 5;19(1). Available from: https://smujo.id/jnpb/article/view/67 79
16. Renshaw  MA,  Olds  BP,  Jerde  CL, McVeigh  MM,  Lodge  DM.  The room  temperature  preservation  of filtered environmental DNA samples and    assimilation  into  a  phenol- chloroform-isoamyl  alcohol  DNA extraction.  Mol  Ecol  Resour.  2015 Jan;15(1):168–76.
17. Ebeling  W,  Hennrich  N,  Klockow M,  Metz  H,  Orth  HD,  Lang  H. Proteinase  K  from  Tritirachium album Limber. Eur J Biochem. 1974 Aug;47(1):91–7.
18. Kado  CI,  Liu  ST.  Rapid  procedure for  detection  and  isolation  of  large and small plasmids. J Bacteriol. 1981 Mar;145(3):1365–73.
19. Qiagen.  DNeasy®  Mericon®  Food Handbook.  For  extraction  of  total nucleic  acids  from  a  range  of  food sample types.  Vol.  06.  2014.  18–19
p.
20. Matlock B, Scientific TF,
Wilmington  M.  Assessment  of Nucleic Acid Purity. Technical Note 52646. USA; 2015.