## ISOLASI DAN PENENTUAN AKTIVIAS SPESIFIK ENZIM BROMELIN DARI
BUAH NANAS (Ananas comosus L.)

## Wuryanti
Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika Dan Ilmu Penegetahuan Alam UNDIP Jl. Prof. Soedarto, SH Tembalang Semarang 50275

## ABSTRAK
Bromelin merupakan enzim proteolitik yang terdapat pada tanaman nanas (Ananas comosus L).Telah  dilakukan  isolasi  dan  penentuan  aktivitas  spesifik  enzim  bromelin  dari  buah  nanas.Pada penelitian ini bromelin diisolasi dengan metoda ekstraksi, lalu ditentukan aktivitas unit dengan substrat kasein  dan  penentuan  kadar  protein  dengan  metoda  Lowry  menggunakan  spektrofotometer.  Hasil isolasi merupakan ekstrak kasar enzim bromelin dengan aktivitas spesifik 0,521 U/mg.
Kata kunci: enzim, bromelin, aktivitas spesifik.

## ISOLATION AND UNIT ACTIVITY DETERMINATED OF THE BROMELIN ENZYME FROM PINEAPPLE (Ananas comosus L.)

## ABSTRACT
Bromelain is proteolytic enzyme contained in pineapple (Ananas comosus L.) Isolation and unit activity determinated of the bromelain enzyme from fruits had been done.In the research bromelain was isolated from pineapple by extraction method, it was determined the unit activity with casein substrat and protein contain by lowry method with spectrofotometer. Result isolation is crude bromelain enzyme with spesifik activity 0.521 U/mg.
Key words: enzyme, bromelain, specific activity

## PENDAHULUAN
Enzim  merupakan  unit  protein  fungsional  yang berperan  mengkatalisis  reaksi-reaksi  dalam metabolisme  sel  dan  reaksi-reaksi  lain  dalam tubuh.  Spesifikasi  enzim  terhadap  substratnya teramat tinggi dalam mempercepat reaksi kimia tanpa produk samping (Lehninger, 1982).
Enzim  tersusun  dari  protein,  fungsi  katalis dari enzim  ini  ditentukan  oleh  bentuk  strukturnya. Adapun  jenis-jenis  struktur  protein  adalah sebagai berikut:

## 1. Struktur primer
Struktur primer protein tersusun oleh asam- asam  amino  yang  dihubungkan  oleh  ikatan peptida.
2. Struktur sekunde
Struktur sekunder merupakan gabungan dari beberapa  struktur  primer.  Bentuk  dari struktur  sekunder  ini  bisa  berupa  heliks
atau  sheet.  Struktur  sekunder  protein distabilkan  oleh  ikatan  hidrogen  antara gugus  karbonil  dengan  gugus  amida  yang berdekatan.
3. Struktur tersier
Sruktur  tersier  merupakan  gabungan  dari struktur sekunder yang mengalami pelipatan-pelipatan.  Struktur  ini  distabilakn oleh  ikatan  hidrofob  yang  disebabkan kemampatan strukturnya.

## 4. Struktur kwartener
Struktur  kwartener  merupakan  gabungan dari  unit-unit  protein.  Struktur  kwartener dapat  tersusun  oleh  unit-unit  protein  yang sama  ataupun  oleh  unit-unit  protein  yang berbeda ( Conn, et. al., 1967 ).
Jenis-jenis  ikatan  kimia  yang  menstabilkan stuktur  enzim  adalah  ikatan  peptida,  ikatan
hidrogen,  ikatan  hidrofob,  ikatan  elektrostatik dan ikatan disulfida (Conn, et. al, 1967).
Protein  yang  mempunyai  fungsi  sebagai  enzim adalah  bentuk  tersier.  Pada  struktur  tersier mempunyai  sisi  katalitik  yang  merupakan  sisi pengikatan  enzim  dengan  substrat  membentuk komplek.  Tempat  pengikatan  enzim  adalh spesifik  untuk  substrat  tertentu.  Efektivitas katalitik  suatu  enzim  didapat  dari  gabungan pengikatan  yang  khusus  dan  gugus-gugus katalitik.  Gugus-gugus  katalitik  dapat  berupa gugus  karbonil,  gugus  amida,  gugus  hidroksil dan lain sebagainya (Mc Gilvery, et.al ., 1996).
Aktivitas  dari  enzim  dalam  mengkatalis  reaksi dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor,  di  antaranya adalah:
1. Konsentrasi enzim
Pada  suatu  konsentrasi  substrat  tertentu kecepatan reaksi enzimatis bertambah pada saat bertambahnya konsentrasi enzim.

## 2. Konsentrasi substrat
Pada  saat  konsentrasi  enzim  konstan bertambahnya konsentrasi substrat
meningkatkan  kecepatan  reaksi  enzimatis. Pada  konsentrasi  tertentu  tidak  terjadi peningkatan  kecepatan  reaksi  walaupun konsentrasi substrat ditambah.
3. Suhu
Pada suhu rendah reaksi kimia berlangsung lambat, pada suhu tinggi secara umum reaksi kimia  berlangsung  cepat.  Pada  suhu optimum kecepatan reaksi enzimatis adalah maksimum.  Pada  suhu  melewati  suhu optimumnya dapat menyebabkan terjadinya denaturasi  enzim  sehingga  menurunkan kecepatan reaksi.
4. Derajad Keasaman (pH)
Struktur  enzim  dipengaruhi  oleh  pH lingkungannya.  Enzim  dapat  bermuatan positif,  negatif  atau  bermuatan  ganda (zwitter  ion).  Pengaruh  perubahan  pH
lingkungan  berpengaruh  pada  aktivitas  sisi aktif dari enzim.

## 5. Inhibitor
Keberadaan  inhibitor  akan  menurunkan kecepatan  reaksi  enzimatis.  Inhibitor  dapat membentuk  kompleks  dengan  enzim  baik pada  sisi  aktiv  enzim  maupun  bagian  lain dari sisi aktiv enzim. Terbentuknya komplek enzim  inhibitor  akan  menurunkan  aktivitas enzim  terhadap  substratnya  (Poedjiadi, 1994)
Banyak  varietas  nanas  ((Pineapple, Ananas comosus  L) yang  termasuk  dalam  family bromeliaseae  mengandung  enzim  proteolitik yang  disebut  bromelin  (Hui,1992).  Enzim  ini menguraikan protein dengan jalan memutuskan ikatan  peptida  dan  menghasilkan  protein  yang lebih sederhana (Sumarno,1989). Enzim bromelin  terdapat  dalam  semua  jaringan tanaman  nanas.  Sekitar  setengah  dari  protein dalam nanas mengandung protease bromelin. Di antara  berbagai  jenis  buah,  nanas  merupakan sumber  protease  dengan  konsentrasi  tinggi dalam buah yang masak (Donald, 1997).
Bromelin bonggol nanas memiliki sifat karakteristik (Mantell et. al ., 1985; Reed, 1966;
Anonim, 2000) sebagai berikut:
a. Berat molekul: 33 500
b. Titik isoelektrik: pH 9,55
c. Derajad Keasaman (pH) optimum: 6-8
d. Suhu optimum: 50 o C
e. Aktivitas spesifik: 5-10 U/mg protein.
f. Warna:  putih  sampai  kekuning-kuningan dengan bau khas.
Bromelin  merupakan  unsur  pokok  dari  nanas yang penting dan berguna dalam bidang farmasi dan  makanan  (Donald,  1997).  Fungsi  bromelin mirip dengan papain dan fisin, sebagai pemecah protein.  Pada  akhir-akhir  ini  enzim  bromelin lebih  banyak  digunakan  untuk  penjernihan  bir
(“chillpoofing  bir”)  dan  pengempukan  daging (Anonim,  2000).  Selain  itu  enzim  bromelin sering  pula  dimanfaatkan  sebagai  bahan kontrasepsi KB untuk memperjarang kehamilan. Ibu-ibu  yang  sedang  mengandung  tidak dianjurkan makan nanas karena dapat mengakibatkan keguguran (Harianto, 1996).
Kegunaan  lain  dari  bromelin  adalah  untuk memperlancar pencernaan protein, menyembuhkan artritis, sembelit, infeksi saluran pernafasan, luka atletik (pada kaki), angina, dan trauma (Wirakusumah, 1999)
Untuk menentukan cara isolasi enzim, pertama- tama  perlu  mengetahui  lokasi  enzim  di  dalam sumbernya.  Enzim  dari  jasad  hidup  dibagi menjadi  dua  macam  yaitu  enzim  ekstraseluler dan  intraseluler  (Anonim,  2000).  Selanjutnya yang  perlu  diperhatikan  adalah  jenis  enzim serupa  yang  berasal  dari  sumber  yang  berbeda maka berbeda pula jumlah dan aktivitas katalitik enzim  walaupun  katalisasi  reaksinya  sama. Sebagian  besar  waktu  yang  dibutuhkan  dalam isolasi  enzim  adalah  digunakan  dalam  uji aktivitas  dengan  ukuran/porsi  yang  berbeda- beda.  Sangat  dianjurkan  uji  aktivitas  dengan cepat agar lebih akurat (Paul, et. al ., 1985).
Aktivitas enzim tergantung pada kondisi seperti suhu,  pH  dan  konsentrasi.  Jika  perlu  secara khusus  dan  selalu  menggunakan  kondisi  yang sama  dalam  membandingkan  aktivitas  enzim (Paul, et.  al ,1985).  Aktivitas  enzim  sering digunakan  dalam  satuan  unit  (U)  yaitu  jumlah enzim  yang  mengkatalisis  1  mikromol  substrat per  menit  pada  kondisi  tertentu.  Sedangkan kemurnian  enzim  dinyatakan  dalam  aktivitas spesifik yaitu jumlah unit aktivitas per miligram protein (Winarno, 1986).

## METODE PENELITIAN

## 1. Isolasi Enzim
Buah  nanas  dibersihkan,  dipotong-potong kemudian  dihomogenisasi  dengan  bufer  fosfat pH  7,5  dingin  sedikit-sedikit  sebanyak  1:  1. Larutan yang diperoleh disentrifugasi pada 3000
g  selama  kira-kira  15  menit  pada  suhu  15 o C. Selanjutnya supernatan dipisahkan dari endapannya. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim bromelin.

## 2. Penentuan unit aktivitas enzim.
Sebanyak  2,5  mL  substrat  ditambah  dengan larutan  enzim  yang  telah  diencerkan  10  kali. Diinkubasi pada suhu 37 o C kira-kira 10 menit, larutan TCA 1 M ditambahkan sebanyak 3 mL. Campuran  reaksi  diinkubasi  pada  suhu  37 o C kira-kira 40 menit, lalu disentrifugasi 3000 rpm kira-kira  20  menit.  Setelah  disentrifugasi supernatan dibaca serapannya pada lambda 290 nm dengan spektrofotometer UV-Vis simadzu.

## 3. Penentuan Kadar Protein dengan Metoda Lowry
Larutan enzim sebanyak 0,3 mL ditambah 2 mL reagen  Lowry  C  dikocok  pelan  dan  diinkubasi pada  suhu  kamar  selama  10  menit.  Campuran ditambah  reagen  Lowry  D  dengan  cepat kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar dengan sesekali dikocok. Larutan diukur absorbansinya  pada  gelombang  optimum  BSA kemudian  kadar  protein  ditentukan  dengan regresi linier terhadap kurva standar BSA.

## 4. Penentuan spesifik aktivitas enzim.
Spesifik aktivitas ditentukan dengan menentukan unit aktivitas enzim dibagi dengan kadar protein enzim.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi  enzim  dilakukan  dengan  metode ekstraksi.  Tujuan  ekstraksi  adalah  untuk mengeluarkan enzim dari dalam sel-sel jaringan buah  nanas.  Perlu  diperhatikan  bahwa  untuk memperoleh enzim yang berkemampuan/aktivitas  bagus  bahan/sumber harus  dipilih  yang  memenuhi  persyaratan. Selama  proses  berlangsung  diusahakan  suhu dijaga  agar  tidak  melebihi  10 o C  dan  perlu ditambah  larutan  penyangga  dengan  pH  7,5, pada  saat  pemblenderan  yang  merupakan ekstraksi  secara  fisik.  Kemudian  dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan enzim kasar dari
sisa-sisa jaringan nanas. Hasil sentrifugasi akan didapat  endapan  yaitu  sisa-sisa  jaringan  nanas dan  supernatan  merupakan  enzim  kasar bromelin.  Ekstrak  kasar  umumnya  mempunyai aktivitas  yang  rendah  karena  enzim  ini  masih merupakan  campuran  dari  beberapa  enzim  dan kemungkinan  masih  mengandung  senyawa- senyawa yang bukan enzim.
Unit aktivitas enzim bromelin ditentukan dengan menggunakan  substrat  kasein  dan  absorbansi dibaca pada panjang gelombang 290 nm dengan spektrofotometer  UV-Vis  simadzu.  Panjang gelombang  digunakan  290  nm  karena  pada penentuan panjang gelombang maksimum pada tirosin  didapat  bahwa  panjang  gelombang maksimumnya  290  nm.  Unit  aktivitas  untuk ekstrak  kasar  enzim  bromelin  dari  buah  nanas adalah 5,373 U/mL.
Penentuan  kadar  protein  digunakan  metoda Lowry  dengan  menggunakan  larutan  standart protein  kasein.  Metoda  ini  dapat  mengukur kandungan protein sampel yang rendah.  Warna biru  yang  terjadi  oleh  pereaksi  Folin  Ciocalteu disebabkan  reaksi  antara  protein  dengan  ion kupri  (Cu ++ )  dalam  larutan  alkalis  dan  terjadi reduksi garam fosfomolibdat fosfotungstat oleh tirosin  dan  triptopan  yang  ada  pada  protein. Karena  kandungan  kedua  macam  asam  amino tersebut  bervariasi  pada  berbagai  macam protein, maka intensitas warna yang ditimbulkan per  miligram  proteinpun  berbeda  (Sudarmadji, 1984).
Warna biru yang dihasilkan setelah percampuran antara  sampel,  Lowry  C  dan  larutan  folin ciocalteu  terjadi  akibat  adanya  reaksi  antara protein  dengan  ion  cupri  (Cu ++ )  dalam  larutan alkalis,  reduksi  antara  garam  fosfomolibdat fosfotungstat  oleh  tirosin  dan  triptopan  pada protein.
Hasil  serapan  yang  diukur  pada  panjang gelombang 760 nm sebagai panjang gelombang maksimum untuk kasein sebagai larutan standar protein.Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa
kadar  protein  enzim  kasar  bromelin  dari  buah nanas  adalah  10,299  mg/mL.  Kemurnian  suatu enzim  ditentukan  oleh  harga  dari  spesifik aktivitasnya. Terlihat disini bahwa unit aktivitas ekstrak  kasar  yang  didapat  rendah  yaitu  5,373 U/mL dan kandungan proteinnya 10,299 mg/mL protein  sehingga  spesifik  aktivitasnya  adalah 0,521 U/mg.

## KESIMPULAN
Enzim  bromelin  kasar  hasil  isolasi  dari  buah nanas mempunyai:
1. Unit aktivitas 5,373 U/mL,
2. Kadar protein 10,299 mg/mL
3. Aktivitas spesifik 0,521 U/mg.

## UCAPAN TERIMA KASIH:
Penulis  mengucapkan  banyak  terima  kasih kepada  Bapak  Drs.  Damin  Sumardjo,  Sdr. Ratnawati, S.Si dan Bapak Ismiyarto, M.Si yang telah  banyak  membantu  dalam  pelaksanaan penelitian maupun penulisan artikel ini. Semoga budi baik beliau terbalas oleh-Nya.

## DAFTAR PUSTAKA
Lehninger.,  1982., Dasar-Dasar  Biokimia , Erlangga: Jakarta., hlm 248-249.
Conn, E.E., and Stumpf, P.K., 1967, Outlines of Biochemistry ,  second  edition,  John  Willey and  Sons,  inc.,  United  States  of  America, p.87-88.
Poejiadi,  A,  1994, Dasar-dasar  Biokimia ,  UI
Press. Jakarta, hlm.158-166.
Goldstein,  M.C.G.,  1996,  Biokimia  Suatu
Pendekatan Fungsional, Airlangga
University Press.
Hui,  Y.H.,  1992, Encyclopedia  of  food  science and technology , Volume 3 John Wiley and Sons Inc.: New York, p. 1747.
Sumarno, 1989,  Skripsi  S 1 ,  Jurusan  Kimia FMIPA UI, Depok.
Donald,  K.T.,1997, Fruit  and  vegetabel  Juice Processing  Technology ,  2 nd ,  The  AUI publising, p.180.
Mantell, S.H., Matthew, J.A., and McKee, R.A., 1985, Principles of plant Biotechnology: An
introduction  To  Genetic  Engineering  In Plants, Blackweell  Scien  Publication: London, p. 120.
Anonim,  2000, Biochemical  And  Reagents, SIGMA USA, p. 179.
Harianto,  E.,  1996, Nanas Swadaya;  Jakarta, hlm. 85.
Wirakusumah  dan  Emma.  S.,  1999, Buah  dan sayur  untuk  terapi ,  cetakan  V,  Penebar
Semangat, Jakarta. Hlm. 66, 67, 68.
Paul,  N.C.,  Robert,  P.  dan  Ovellette,  1985,
Biotechnology ,  Technomic  Publishing  co.
Inc,Lancater-Basel, p.534, 553.
Winarto, F.G., 1986, Enzim Pangan , Gramedia, Jakarta, hlm.12.
Sudarmadji,  S.,  1984, Prosedure  Analisa  untuk analisa  bahan  pangan  dan pertanian ,  edisi ketiga,  penerbit  Liberty,  Yogyakarta,  hal. 55-58.