Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2016.27.1.10 Hasil Penelitian
IDENTIFIKASI Listeria spp. PADA  PANGAN  JAJANAN

## BERBASIS  IKAN  DI KOTA  BOGOR
[Identification of Listeria spp. in Fish-based Snack in Bogor]
Elia Yuswita 1) , Siti Nurjanah 2,3) , dan Winiati P. Rahayu 2,3) *
1) Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
3) Southeast Asia Food and Agricultural Science and Technology Center, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 28 Maret 2016 / Disetujui 10 Juni 2016

## ABSTRACT
L. monocytogenes contamination in processed food, especially fish-based snack, may results from contaminated raw materials, underprocessed or recontamination. The aims of this study  were to identify the presence of Listeria spp. especially L. monocytogenes b y PCR method and b iochemical methods, as well  as  calculate  the  prevalence  of  Listeria  spp.  in   fish-b ased  snack  food  in  Bogor.  This  study  was conducted of 4 steps: (1) determination of L. monocytogenes’s DNA limit detection, (2) sample preparation,
(3)  identification  of  L.  monocytogenes  with  real-time  PCR,  and  (4)  identification  of  Listeria  spp.  with biochemical methods. The results showed that DNA detection limits of L. monocytogenes in fish meatb all and otak-otak were at 8.3x10 2 and 2.9x10 2 CFU/g,  respectively. The study on 65 samples indicated that contamination of L. monocytogenes was not ob served, b ut other species of Listeria spp., namely L. grayi and L. innocua, were found. The prevalence of L. grayi and L. innocua in siomay was at 5.9%, while the prevalence  of  L.  grayi  in  shrimp  meatb alls,  fish  meat  b alls,  fried  meatballs  was  at  8.3,  9.1,  and  50%, respectively. Furthermore, L. innocua from takoyaki samples with a prevalence of 20% was ob served.
Keywords: fish-b ased snack, Listeria spp., L. monocytogenes

## ABSTRAK
Kontaminasi L. monocytogenes pada pangan olahan khususnya pangan jajanan berbasis ikan dapat terjadi melalui bahan baku yang tercemar, pengolahan yang tidak sempurna atau rekontaminasi setelah pengolahan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  keberadaan Listeria spp . terutama L. m monocytogenes dengan  metode  PCR  dan  metode  biokimiawi,  serta  menghitung  prevalensi Listeria spp.  pada  pangan  jajanan  berbasis  ikan  di  kota  Bogor.  Penelitian  ini  dilakukan  dalam  empat  tahap, meliputi  penentuan  limit  deteksi  DNA L.  monocytogenes, persiapan  sampel,  identifikasi  bakteri L. m monocytogenes dengan real-time PCR, dan identifikasi Listeria spp. dengan metode biokimiawi. Hasil limit deteksi DNA L. monocytogenes pada bakso ikan dan otak-otak masing-masing adalah 8,3x10 2 dan 2,9x10 2 CFU/g. Hasil analisis terhadap 65 sampel pangan jajanan berbasis ikan menunjukkan bahwa tidak ada cemaran L. monocytogenes pada pangan jajanan berbasis ikan, akan tetapi ditemukan L. grayi dan L. n innocua .  Prevalensi L.  grayi dan L.  innocua pada  sampel  siomay  yang  diuji masing-masing  adalah 5,9%.  Pada  sampel  bakso  udang,  sampel  bakso  ikan,  dan  sampel  bakso  goreng  ditemukan L.  grayi dengan  prevalensi  8,3;  9,1;  dan  50%, sedangkan L.  innocua ditemukan  pada  sampel  takoyaki  dengan prevalensi sebesar 20%.
Kata kunci: jajanan berbasis ikan , Listeria spp., L. monocytogenes
PENDAHULUAN 1
Listeria spp.  merupakan  bakteri  Gram  positif, katalase  positif,  berbentuk  batang  pendek,  tidak membentuk  spora,  dan  motil.  Bakteri  ini  motil  pada suhu  28°C  dan  tidak  motil  pada  suhu  37°C,  tumbuh optimum  pada  suhu  30-37°C  (Garrido et  al., 2010).
*Penulis Korespondensi: E-mail:  w ini_a@hotmail.com
Keberadaannya  yang  tersebar  luas  di  alam  patut dicermatimengingat  kemampuannya  untuk  tumbuh pada  berbagai  kondisi  ekstrim,  seperti  pada  media dengan  konsentrasi garam tinggi (10% ) (Campos et al., 2011),  pH  dengan  kisaran  4,3 –9,4 (Nadal et  al., 2007)  dan  mampu  hidup  dalam  waktu  yang  lama pada  suhu  4°C  (Kim dan  Cho,  2010).
Beberapa  spesies  dari  genus Listeria yang  ter- sebar  dialam  adalah L.  monoc ytogenes , L.  innocua , L.  seeligeri , L.  welshimeri , L.  ivanovii ,  dan L.  grayi.
Diant ara  spesies  ini,  yang  bersifat  patogen  terhadap manusia  adalah L.  monocyt ogenes (Janzten et  al., 2006). L.  monocytogenes merupakan  bakteri  pat o- gen  yang  ditemukan  pada  susu  dan  produk  olahan susu,  daging  dan  produk  olahan  daging,  sayuran segar,  ikan  dan  produk  olahan  ikan.  Bakteri  ini mampu  membentuk  biofilm  dan  realtif  tahan  ter- hadap  pemanasan,  pengeringan,  dan  pembekuan (Montero et al., 2015). L. monoc ytogenes mampu menyebabkan penyakit pada hostnya dengan jumlah/dosis minimum  infeksi  100  CFU/g.  Serotipe L.  mono- cytogenes yang menyebabkan kasus listeriosis pada manusia,  diantaranya  adalah  ½  a,  ½  b,  ½ c,  dan  4b (Ragon et  al., 2008).  Sindrom  klinis  yang  ditimbul- kan  oleh  strain  bakteri L.  monocytogenes umumnya bertanggung  jawab  atas  dua  tipe  infeksi  pada manusia,  yaitu  bersifat  invasif  dan  non-invasif. Listeriosis  non-invasif  atau  disebut  juga listerial gastroenteritis (listeriosis  bentuk  saluran  pen- cernaan)  menunjukkan  gejala  penyakit  yang  ringan, seperti  mual,  muntah,  kram  perut,  dan  diare. Listeriosis  invasif  diakui  sebagai foodborne  disease yang  serius  karena  tingkat  keparahan  gejala  dan tingkat  kematian  yang  tinggi  yait u  20 -30%.  Sindrom klinis  yang  ditimbulkan  oleh  listeriosis  bentuk  invasif yaitu septikemia, meningitis, maningoensefalitis, dan dapat  mengakibatkan  keguguran  pada  wanita  hamil, kematian  pada  bayi  yang  baru  lahir  atau  persalinan prematur  (Garrido et al., 2010). Tocmo et  al. (2014)  mengatakan  bahwa  ikan atau  produk  olahannya  dapat  terkont aminasi  oleh polusi  limbah  baik  dari  lingkungan  hidup  ikan tersebut  atau  pada  saat  proses  pengolahan.  Ikan merupakan  salah  satu  bahan  pangan  yang  dapat dengan  mudah  terkontaminasi  bakteri.  Beberapa pangan  olahan  berbasis  ikan  yang  umumnya ditemukan  di  lingkungan  sekolah  adalah  siomay, otak-otak,  bakso  udang,  bakso  ikan,  takoyaki, pempek,  dan  bakso  goreng.  Cemaran  dapat  ber- sumber  dari  ikan  yang  digunakan  ataupun  selama dan  pasca proses  pengolahan.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi keberadaan Listeria spp . terutama L.  monocyt e- genes dengan  metode  PCR  dan  met ode  biokimiawi, serta  menghitung  prevalensi Listeria spp.  pada pangan  jajanan  berbasis  ikan  di  kota  Bogor. Diharapkan  data  mengenai  identitas  dan  prevalensi Listeria spp.  terutama L.  monoc ytogenes dapat digunakan  sebagai  dasar  ilmiah  bagi  pengem- bangan  program  keamanan  pangan.

## BAHAN  DAN METODE

## Bahan
Bahan  utama  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah  sampel  pangan  jajanan  berbasis  ikan
(siomay,  otak-otak,  bakso  udang,  bakso  ikan, takoyaki,  pempek,  dan  bakso  goreng)  yang  di ambil dilingkungan  sekolah.  Pengambilan  sampel  dilak u- kan secara  proporsional sesuai keters ediaan sampel yang dijual pedagang di setiap lokasi sekolah di kota Bogor. Jumlah sampel dan sebaran tempat pengam- bilan  sampel  disajikan  dalam  Tabel  1.  Berdasarkan laporan  Rahayu et  al. (2015),  diketahui  bahwa proporsi  pangan  jajanan  berbasis  ikan  yang  dijual  di lingkungan  sekolah  di  kota  Bogor  didominasi  oleh siomay  yaitu  sebesar  26%.  Selanjutnya  diikuti  oleh otak-otak  (19%),  sate , olahan  (bakso  udang,  bakso ikan,  dan  takoyaki)  (15%),  pempek  (7%),  dan  bakso goreng  (6%).  Sampel  pangan  jajanan  berbasis  ikan yang  dianalisis  adalah  sampel  matang  yang  telah diolah  dengan  cara  dibakar,  direbus/dikukus,  dan digoreng.
Tabel  1.  Jumlah  sampel  dan  sebaran  tempat pengambilan  sampel Kecamatan Tingkat Sekolah Jumlah Pedagang Jumlah Sampel Bogor Selatan PT 4 6 Bogor Timur SLTA PT 4 2 6 3 Bogor Utara SD SLTA 1 1 1 1 Bogor Tengah SD SLTA PT 4 8 2 6 9 1 Bogor Barat SD SLTP SLTA 8 4 7 10 5 8 Tanah Sareal SD SLTP PT 2 1 2 4 2 3 Total 50 65 Keterangan: PT : Perguruan Tinggi SLTA : Sekolah LanjutanTingkat atas
SLTP : Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama
SD
: Sekolah Dasar
Penentuan  limit  deteksi  DNA L.  monocytogenes (Mutsyahidan et al., 2016) Pengujian  limit  deteksi  DNA L.  monocytogenes dilakukan  untuk  mengetahui  sensitivitas  metode yang  digunakan  untuk  mendeteksi  DNA L.  mono- cytogenes yang  di spik e ke  sampel  pangan.  Sampel pangan  digolongkan  dalam  tiga  kategori  yaitu dibakar  (bakso  udang,  bakso  ikan,  dan  takoyaki), direbus/dikukus  (siomay  dan  otak-otak),  dan  di- goreng  (pempek  dan  bakso  goreng).  Limit  deteksi dihitung  untuk  pangan  yang  dibakar  dan  direbus/ dikukus.  Sampel  pangan  yang  diolah  dengan  cara dibakar diwakili oleh bakso ikan, dan sampel pangan yang  diolah  dengan  cara  direbus/dikukus  diwakili oleh  otak-otak.  Limit  deteksi  untuk  pangan  yang digoreng  diwakili  oleh  pempek  dan  telah  dihitung oleh  Mutsyahidan et al. (2016).
Penentuan limit deteksi dia wali dengan menyegarkan  0,1  mL  kultur  bakteri L.  monocyt o- genes strain  ATCC  7644  (A TCC,  USA)  dengan konsentrasi  10 2 CFU/mL  kedalam  8,9  mL Tryptone Soy Broth yeast extract (TSBye) (Oxoid, Inggris ) dan diinkubasi  dalam  inkubator  (Memmert,  German) pada  suhu  37 ° C  selama  18  jam.  Suspensi  bakteri tersebut  (10 8 CFU/mL) ditambahkan k e dalam media Buffered  P eptone  Water (BPW) (Ox oid,  Inggris) steril  dan  dikoc ok  hingga  homogen.  Berikutnya masing-masing  sampel  bakso  ikan  dan  otak-otak sebanyak  25  g  yang  telah  dihancurkan  ditambah dengan  75  mL  suspensi  bakteri  (10 7 CFU/mL)  dan dikocok  hingga  homogen.  Selanjutnya  dari  masing- masing  larutan  sampel  tersebut  sebanyak  1  mL dibuat  seri  pengenceran  hingga  diperoleh  suspensi dengan  konsentrasi  bakteri  10 1 -10 6 CFU/mL,  dan ditumbuhkan  (37 ° C,  48  jam)  pada  media Cromocult ®Listeria  Selective  Agar  Base acc Ottaviani  and Agosti (ALOA)  (Merck,  Jerman).  Selain  itu,  dari masing-masing  larutan  sampel  tersebut  diambil sebanyak  1  mL  dan  dipindahkan  ke  dalam micro- tube (ExtraGene,  Taiwan)  untuk  dilakukan  ekstraksi DNA -nya.  Ekstraksi  DNA  dilakukan  dengan  metode fenol  klorofom  dan  hasil  ekstraksi  diamplifikasi dengan real-time P CR  (rt-P CR)  Swift TM S pectro  48 (ESCO,  Singapura).  Amplifikasi  DNA  secara  otoma- tis  akan  digambark an  dalambentuk  grafik  amplifikasi dan kurva standar menggunakan soft ware IQ-5 (Bio- Rad).
Limit  deteksi  ditentukan  berdas arkan  nilai threshold  cycle (C T )  amplikon.  Nilai  C T adalah  siklus diatas noise ( back ground  fluorescence )  dimana akumulasi  produk  (senilai  2n,  n  ialah  jumlah pengulangan  siklus  amplifikasi)  terbac a  pertama  kali pada  fas e  eksponensial.  Kurva  standar  meng- hasilkan  persamaan  linear  hubungan  ant ara  log konsentrasi  bakteri  dan threshold  cycle (C T ).  Per- samaan  linear  kurva  standar  dapat  digunakan  untuk menghitung  konsentrasi  bakteri  yang  belum  di- ketahui  dalam  sampel  pangan.  Konsentrasi L. monoc ytogenes pada  sampel  pangan  jajanan berbasis  ikan  dihitung  dengan  memasukkan  nilai  C T hasil  amplifikasi  sebagai  nilai  y  pada  persamaan linear  (y  =  ax  +  b),  kemudian  nilai  x  yang  diperoleh diantilogkan.

## Persiapan Sampel (BAM,  2011)
Tahapan  persiapan  sampel  mengacu  pada BAM  (2011)  dengan  modifikasi.  Modifikasi  yang dilakukan  adalah  jumlah  media Listeria  Enrichment Broth  Base yang  digunakan  (dari  225  menjadi  75 mL),  dan  modifikasi  waktu  inkubasi  (dari  24  menjadi 18  jam).  Sampel  pangan  jajanan  berbasis  ikan sebanyak  25  g  dimas ukkan  ke  dalam  kantong  steril secara  aseptis,  dihancurkan,  dan  dit ambah  dengan 75 mL media Listeria Enrichment Broth Base (Oxoid, Inggris),  dikocok  hingga  homogen.  Berikutnya
larutan  sampel  dipindahkan  ke  dalam  botol  bertut up steril  dan  diinkubasi  pada  suhu  30 ° C  selama  4  jam dan  ditambah  1  mL Listeria  Selective  Enrichment Supplement (Oxoid,  Inggris).  Inkubasi  dilanjutkan pada suhu 30 ° C selama 18 jam.  DNA dalam sampel siap diekstrak.
Identifikasi  bakteri L.  monocytogenes dengan real-time PCR  (rt-PCR)  (Mutsyahidan et al., 2016) Sebanyak  1  mL  sampel  disentrifus  dengan kecepatan  12.000  rpm  pada  suhu  25°C  selama  3 menit.  Selanjutnya  dilakukan  resuspensi  dengan 500  L  bufer  tris-ETDA  (TE)  1x  untuk  memisahkan komponen  pangan  dengan  DNA  bakteri  target. Berikutnya  tahapan  pelisisan  sampel  dilak ukan menggunakan  100  L  lisozim  (Bio  Basic,  Canada), 25  L  larutan sodium  dodec yl  sulfate 10%  (Merck, Jerman),  50  l  NaCl  (Merck,  Jerman)  5M,  dan 100 m  L  proteinas e  K  (Peqlab,  Jerman).  Pada tahapan  ini  juga  ditambahkan  500  L  bufer  TE  1x untuk  proteksi  dan  stabilisasi  DNA.  Kemudian ditambahkan  250  L  fenol  (MP  Bio,  US),  250  L kloroform  (J. T.  Baker,  Meksiko)  dan  disentrifugasi pada  kecepat an  12.000  rpm  pada  suhu  4°C  selama 10  menit  untuk  memisahkan  DNA  dari  debris  sel. Setelah  itu  dilakukan  tahapan  presipitasi  DNA dengan  menambahkan  500  L  isopropanol  (Merck, Jerman)  dan  150  L  amonium  asetat  10  M  pH  7,4 (Merck,  Jerman).  Selanjutnya  dilakukan  penc ucian DNA  menggunakan  500  L  etanol  70%  (Merck, Jerman).  Pelet  yang  diperoleh  dikering  udarakan, ditambah  dengan  50  L  bufer  TE  1x,  dan  siap  untuk dilakukan  amplifikasi  DNA.  Amplifikasi  dilakukan dengan  menggunakan  alat  rt-PCR.  Hasil  positif deteksi L.  monocytogenes pada  sampel  ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoidal proses amplifikasi  seperti  dijelaskan  pada  penentuan  limit deteksi.
Identifikasi  bakteri Listeria spp.  dengan  metode biokimiawi (BAM, 2011)
Sebanyak  100  L  dari  kultur  pengayaan ditumbuhkan  pada media ALOA  dan  diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Listeria spp. diisolasi dari koloni  bewarna  hijau-biru  yang  tumbuh  pada  media ALOA.  Isolat  terduga Listeria spp  selanjut nya  diuji dengan  uji  katalase,  pewarnaan  Gram,  uji  motilitas, uji hemolitik, dan  uji fermentasi  karbohidrat.

## HASIL  DAN  PEMBAHASAN
Limit deteksi DNA L. monocytogenes
Limit  deteksi  merupakan  jumlah  terkecil  dalam sampel  yang  dapat  dideteksi,  yang  menunjukkan sensitivit as  dari  suatu  metode.  Limit  deteksi  dari hasil  pengujian  menggunakan  rt-P CR  menunjukkan jumlah  terkecil  DNA  yang  masih  dapat  teramplifikasi
dari  pengenceran  tertinggi.  Berdasarkan  hasil analisis  limit  deteksi  DNA L.  monocytogenes pada bakso  ikan  dan  ot ak-otak  menggunakan  rt-PCR (Tabel  2),  diketahui  bahwa  masing -masing  sampel memiliki limit deteksi sebesar 8,3x10 2 dan 2,9x10 2 n CFU/g.  Limit  deteksi  DNA L.  monocyt e- genes pada  sampel  bakso  ikan  dan  otak-otak  lebih rendah  daripada  limit  deteksi  pempek,  yaitu sebesar 6,3x10 3 CFU/ g  (Mutsyahidan et  al., 2016).  Hal  ini menunjukkan  bahwa  pengujian L.  monoc ytogenes pada  sampel  bakso  ikan  dan  otak-otak  dengan  rt- PCR  memberikan  hasil  yang  lebih  sensitif  daripada sampel  pempek.
Tabel  2.  Hasil  analisis  limit  deteksi  DNA L.  mono- cytogenes pada  bakso  ikan  dan  otak-otak berdasarkan  nilai C T menggunakan  rt-PCR Nama Pangan Jajanan Berbasis Ikan Jumlah Koloni (CFU/g) Rerata Nilai C T ± SD 1 Bakso Ikan 4,9 x 10 6 9,16 ± 0,56 4,0 x 10 5 12,34 ± 1,32 5,8 x 10 4 15,00 ± 0,04 4,1 x 10 3 18,51 ± 0,02 8,3 x 10 2 24,36 ± 0,33 <1,0x10 1 - <1,0x10 1 - Otak-otak 5,4 x 10 7 9,24 ± 0,26 2,3 x 10 6 11,82 ± 0,31 2,0 x 10 5 15,62 ± 0,40 3,0 x 10 4 19,84 ± 0,49 2,9 x 10 3 21,04 ± 0,16 2,9 x 10 2 23,96 ± 0,81 <1,0x10 1 -
Keterangan: 1) n = 2
Perbedaan  ini  terjadi  karena  ekstraksi  pada sampel  pempek  lebih  sulit  dilakukan  dibandingkan ekstraksi  pada  sampel  bakso  ikan  dan  otak -otak. Pempek teksturnya lebih  padat, lengket, dan kenyal. Pempek  yang  dianalisis  dibuat  dari  tepung  sagu sedangkan  bakso  ikan  dan  otak-otak  dibuat  dari tepung  tapioka.  Tepung  sagu  mengandung  amilosa (27% )  yang  lebih  besar  dari pada  amilosa  pada tepung  tapioka  (17% )  (Kusnandar,  2010).  Karak- teristik  amilosa  yang  mampu  membentuk  gel  yang sangat  kuat  diduga  berpengaruh  terhadap  hasil ekstraksi.  Selanjutnya  hasil  ekstraksi  berpengaruh terhadap  hasil  amplifikasi,  karena  semakin  banyak sel L.  monocytogenes yang  t erak umulasi  pada  saat ekstraksi,  menyebabkan  proses  amplifikasi  DNA semakin  cepat  terjadi,  sehingga  nilai threshold  cycle (C T ) yang diperoleh juga semakin kecil. Queero et al. (2014)  melaporkan  bahwa  semakin  tinggi  konsen- trasi  DNA L.  monocytogenes yang  terekstrak,  maka proses  amplifikasi  yang  terjadi  juga  semakin  cepat. Hasil  analisis  (Tabel  2)  digunak an  untuk  membuat kurva  standar.
Gambar  1.  Kurva  standar  hubungan  nilai  C T dan log  konsentrasi L.  monocytogenes pada: A. m Bakso ikan, dan  B. Otak-otak
Kurva  standar  (Gambar  1)  menghasilkan persamaan  C T =  33,75 – 3,79 C untuk sampel bakso ikan, dan  C T =  31,45 – 2,93 Cuntuk sampel otak-otak. C  adalah  nilai  konsentrasi  bakteri  pada  sampel pangan.  Nilai  koefisien  korelasi  dari  persamaan tersebut  adalah  -0,973  dan  -0,987.  Idealnya  nilai koefisien  korelasi  adalah  +/-1.0,  namun  nilai  koe- fisien  korelasi  uji  sudah  menggambarkan  hubungan yang  sangat  kuat  antara  nilai  C T dan  konsentrasi L. monoc ytogenes .  Nilai  korelasi  yang  negatif  menun- jukkan  bahwa  semakin  besar  nilai  pada  sumbu  x (konsent rasi L. monoc ytogenes ) maka semakin kecil nilai pada  sumbu  y (nilai  C T ).
Hasil  identifika si  bakteri L.  monocytogenes dengan real-time PCR  (rt-PCR)
Hasil  identifikasi  menggunakan  rt-PCR  menun- jukkan  bahwa  tidak  ditemui  cemaran L.  monocyt o- genes pada  65  sampel  pangan  jajanan  berbasis ikan.  Kontaminasi L.  monocytogenes pada  produk pangan  siap  saji  dapat  terjadi  melalui  bahan bakunya, komposisi bahan tambahan yang digunakan,  peralatan  pengolahan  yang  tidak  bersih,
Konsentrasi L. monocytogenes (CFU/g) Si kl u s Perpotongan dengan sumbu Y  31,45 Kemiringan  -2,93 Galat 0,052 Koefisien korelasi -0,987 30 25 20 5 10 o 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 10 9 15 10 A B 30 20 10 0 10 o 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 10 9 Konsentrasi L. monocytogenes (CFU/g) Si kl u s Perpotongan dengan sumbu Y  33,75
Kemiringan -3,79 Galat 0,081 Koefisien korelasi -0,973
proses pemasakan yang tidak cukup, dan rekontaminasi  setelah  pengolahan.  Selain  itu, penyimpanan  yang  lama  pada  suhu refrigerat or (suhu  4°C)  juga  berpengaruh  terhadap  keberadaan L.  monocytogenes. Ikan  yang  merupakan  bahan baku  pengolahan  pangan  jajanan  berbasis  ikan mungkin  sudah    terkontaminasi L.  monocytogenes. Jallewar et  al. (2007)  menemukan  prevalensi L. monoc ytogenes pada  ikan  sebesar  13%.  Pada penelitian  ini  tidak  ditemukan L.  monoc ytogenes pada  pangan  jajanan  berbasis  ikan  kemungkinan karena  penggunaan  ikan  sebagai  bahan  baku bermutu  baik,  ataupun  karena  jumlah  ikan  yang digunakan hanya sekitar 10-20%. Kecilnya persentase  ikan  juga  akan  berpengaruh  pada kemungkinan  adanya L.  monocyt ogenes pada sampel.
Bahan tambahan  pangan yang  digunakan pada pengolahan  pangan  jajanan  berbasis  ikan  adalah garam  dan  rempah-rempah.  Garam  hanya  ditam- bahkan  sampai  rasa  asin  sudah  terasa  secara sensori  (2,0-2,5% ),  sedangkan  rempah-rempah yang  ditambahkan  adalah  bawang  putih  (5%). Kecilnya  persentas e  garam  dan  bawang  putih  yang ditambahkan  menyebabkan  tidak  bany ak  pengaruh- nya  pada  ketidakberadaan L.  monocyt ogenes pada produk. L.  monocytogenes mampu  tumbuh  dalam media  dengan    konsentrasi  garam  tinggi  yaitu  10% (Campos et  al., 2011).  Selain  itu,  keberadaan L. monoc ytogenes dalam  pangan  juga  dapat  di- pengaruhi  oleh  proses  pengolahan.  Sampel  pangan jajanan  berbasis  ikan  diolah  dengan  cara  dibakar, direbus/dikukus,  dan  digoreng.  Perlakuan  ini  dapat menghilangkan  dan  membunuh L.  monocytogenes . Proses pemanas an pada suhu 66°C selama  18 detik dapat  membunuh  90%  populasi L.  monoc ytogenes (Shi et  al., 2015).  Sebagian  besar  penjaja  (53%) sudah  memasak  bahan  baku  jauh  sebelum  waktu berjualan  (  4  jam  oleh  85%  penjaja),  dan  penjaja (72% )  meletakkan  pangan  olahan  di  suhu  ruang (30°C).  Tahapan  penyajian  ini  merupakan  titik  kritis karena  lokasi  di  sekitar  tempat  berjualan  kotor (Rahayu et  al., 2015).  Waktu  tunda  antara pengolahan  dan  pengambilan  sampel  berkisar antara 4-6 jam, meskipun  demikian rekontaminasi L. monocytogenes juga  tidak terjadi.
Faktor  lainnya  yang  menjadi  penyebab L. monoc ytogenes tidak  ditemukan  pada  sampel pangan  jajanan  berbasis  ikan  adalah  kompetisi mikroba. Berdasarkan pengujian biokimiawi ditemukan  spesies Listeria spp.  seperti L.  grayi dan L.  innocua. Adanya  kedua  jenis  mikroba  tersebut dapat  menekan  pert umbuhan L.  monoc ytogenes (Zilelidou et  al., 2015). L.innocua telah  diidentifikasi sebagai antagonis yang berpotensi menekan pertumbuhan L.  monoc ytogenes dalam  medium pengayaan  (Besse et al., 2010).
L.  monoc ytogenes telah  ditemukan  pada  ber- bagai  produk  pangan  siap  saji  di  luar  negeri  seperti di  Spanyol. m Berdasarkan  hasil  pengujian  dengan rt-PCR,  ditemukan L.  monocytogenes dengan tingkat cemaran sebesar 1, 4x10 2 dan 4,4x10 5 CFU/g pada  25  sampel summer  s alad dan  28  sampel valencian  salad (Berrada et  al., 2006).  Keberadaan L.  monoc ytogenes juga  ditemukan  pada  berbagai produk  pangan  siap  saji  lainnya,  seperti  produk olahan  ikan  (pie  ikan  dan  ikan  asap),  produk  olahan daging  ( pork   luncheon ,  krok et  ayam,  sosis, ham , turk ey  breast ),  produk  olahan  susu  (keju),  produk dishes dan desserts )  di  Spanyol  dengan  tingkat cemaran  sebesar  10  -  100  CFU/g  (Cabedo et  al., 2008).
Hasil  identifika si  bakteri Listeria spp.  dengan metode biokimiawi
Berdasarkan  hasil  uji  morfologi  dan  biokimia pada sampel pangan jajanan berbasis ikan (Tabel  3), diketahui  prevalensi Listeria spp.  nya  rendah (Tabel n 4). L.  grayi dan L.  innoc ua yang  ditemukan pada  sampel  pangan  berbasis  ikan  merupakan spesies Listeria yang  tidak  berbahaya.  Prevalensi L. grayi dan L.  innocua pada  sampel  siomay  adalah 5,9%.  Berikutnya  ditemukan L.  grayi pada  sampel bakso  udang  dengan  prevalensi  masing-masing  8,3 dan  9,1%  pada  sampel  bakso  ikan. L.  grayi juga ditemukan  pada  sampel  bakso  goreng  dengan prevalensi  50%,  dan L.  innocua pada  sampel takoyaki  dengan  prevalensi  20%.  Ditemukannya L. n grayi dan L.  innocua pada  sampel  siomay mengindikasikan  bahwa  kemungkinan  kontaminasi terjadi  akibat  penanganan  (penyimpanan)  bahan baku  yang  belum  baik  ataupun  karena  terjadi rekontaminasi.  Rahayu et  al. (2015)  melaporkan bahwa pedagang (63,8%) belum melak ukan penyimpanan  bahan  segar  dengan  baik,  dan  belum mempraktikkan  penyimpanan  dingin.  Rekontaminasi juga  dapat  terjadi  setelah  pengolahan  baik  dari peralatan pengolahan yang tidak bersih maupun dari tangan penjamah (pedagang). Rekontaminasi setelah pengolahan juga dilaporkan oleh Holch et al. (2013),  yang  menemukan Listeria spp.  pada makanan  yang sudah  diolah  (ikan asap).
Sampel  bakso  udang,  bakso  ikan  dan  takoyaki merupakan  pangan  jajanan  berbasis  ikan  yang diolah  dengan  cara  dibakar.  Ditemukannya L.  grayi pada  sampel  bakso  udang  dan  bakso  ikan,  serta L. n innocua pada  sampel  takoyaki  disebabkan karena  terjadinya  rekontaminasi  setelah  pengolahan pada  tahap  penyajian  yang  dibiarkan  terbuk a  pada suhu  ruang.  Bakso  udang dan bakso  ikan merupakan  produk  pangan  siap  saji  yang  bias anya jika  tidak  habis  terjual  disimpan  di  dalam  lemari  es untuk dijual  keesokan  harinya.
Tabel  3.   Uji  morfologi  dan  biokimia Listeria spp. sampel  pangan  jajanan  berbasis  ikan Jenis Sampel Sifat Gram dan Bentuk Sel Motilitas Katalase  Manitol Xylosa Rhamnosa Hemolitik Kesimpulan Siomay Gram +, coccobasil + + + - - - L. grayi Gram +, coccobasil + + - - - - L. innocua Bakso udang Gram +, coccobasil + + + - - - L. grayi Bakso ikan Gram +, coccobasil + + + - - - L. grayi Takoyaki Gram +, coccobasil + + - - - - L. innocua Bakso goreng Gram +, coccobasil + + + - - - L. grayi Tabel  4.   Prevalensi Listeria spp. pada  pangan  jajanan  berbasis  ikan
Jenis Sampel Jumlah Sampel Prevalensi Jumlah Sampel Positif (%) L. monocytogenes L. grayi L. innocua Siomay 17 0 5,9 5,9 Otak-otak 15 0 0 0 Bakso Udang 12 0 8,3 0 Bakso Ikan 11 0 9,1 0 Takoyaki 5 0 0 20 Pempek 3 0 0 0 Bakso goreng 2 0 50 0 Total 65
Kedua  jenis Listeria ini  dapat  bertahan  hidup meskipun  bahan  disimpan  dalam  lemari  es,  karena bakteri  ini  mampu  hidup  dalam  waktu  yang  lama pada  suhu  4°C. L.  innocua yang  ditemukan  pada sampel  takoyaki  mengindikasikan  bahwa  proses pengolahan  pangan  tidak  cukup  unt uk  bahan  baku (gurita)  pada  jajanan  ini.  Takoyaki  umumnya  hanya dimasak  setengah  matang  dengan  cara  dibakar. Pada  sampel  bakso  goreng  yang  diolah  hingga matang,  ditemukan L.  grayi kemungkinan  karena rekontaminasi setelah  pengolahan. Lokasi  penjualan dan  tempat  yang  kotor  serta  tangan  pedagang  yang tidak higenis dapat menjadi  penyebab rekontaminasi.
Listeria spp. tidak ditemukan pada sampel ot ak- otak dan  pempek yang dianalisis. Hal ini disebabkan karena  kedua  produk  ini  selalu  dipanaskan  at au disajikan  dalam  kondisi  panas.  Sampel  otak -otak selalu  dikukus  selama  penjualan,  dan  sampel pempek  selalu  digoreng  matang  sesaat  sebelum disajikan.  Takoyaki  diletakkan  terbuka  cukup  lama pada  suhu  ruang  (30°C)  sebelum  dis ajikan  ( Rahayu et al., 2015).

## KESIMPULAN
Pada  penelitian  ini  tidak  ditemukan  cemaran L. monoc ytogenes pada  65  jenis  pangan  jajanan berbasis  ikan  yang  dideteksi  dengan  rt-PCR maupun  yang  diuji  secara  biokimiawi.  Pada  sampel siomay, bakso udang, bakso ikan, dan  bakso goreng ditemukan L.  grayi dengan  prevalensi  5,9-50%, sedangkan  pada  sampel  siomay  dan  takoyaki ditemukan L.  innoc ua dengan  prevalensi  5,9-20%. Penelitian  deteksi L.  monocytogenes pada  pangan perlu  dilakukan  dengan  metode  molek uler  lainnya seperti  teknik Pulsed  Field  Gel  Electrophoresis (PFGE), Amplified  Fragment  Length  Polymorphism (AFLP),  dan Random  Amplified  Polymorphic  DNA (RAPD).

## UCAPAN  TERIMA KASIH
Pada  kesempatan  ini  diuc apkan  terima  kasih kepada  Direktorat  Jenderal  Pendidikan  Tinggi  yang telah  memberikan  dana  penelitian  dengan  skema Hibah  Kompetensi  melalui  Surat  Perintah  Kerja  No.
083/SP2H/PL/Dit.litabmas/II/2015 tertanggal 05 Februari  2015,  atas  nama  Prof. Dr.  Winiati  P.Rahayu.

## DAFTAR PUSTAKA
[BAM] Bacterial Analytical Manual. 2011. Chapter  10 detection and enumeration of Listeria monoc ytogenes in  foods . Food  and  Drug Administration.  www.fda.gov.  [23  November 2014].
Berrada  H,  Soriano  JM,  Pico  Y,  Manes  J . 2006. Quantification  of Listeria  monocytogenes in salads by real time quantitative P CR.  Int J Food Microbiol  107:  202-206.  DOI:  10.1016/j.ijfood micro.2005.07.006.
Besse  NG,  Barre  L,  Buhariwalla  C,  Vignaud  ML, Khamissi  E,  Decours eulles  E,  Nirsimloo  M, Chelly  M,  Kalmok off  M.  2010.  The  overgrowt h of Listeria monocytogenes by other Listeria spp. in food samples undergoing enrichment cultivation  has  a  nutritional  basis.  Int  J  Food Microbiol  136:    345 –351.  DOI:  10.1016/j.ijfood micro.2009.10.025.
Cabedo  L,  Picart  BL,  Teixido  CA.  2008.  Prevalence of Listeria  monoc ytogenes and Salmonella in ready-to-eat  food  in  Catalonia,  Spain.  J  Food Prot 71: 855-9.
Campos CA, Castro MP, Gliemmo MF, Schelegueda LI.  2011.  Use  of  Natural  Antimicrobials  for  The Cont rol  of Listeria  monoc ytogenes in  Foods. 1112-1123.  Mendez-Vilaz  A  Ed.  Formatex. Spanyol.
Garrido  V,  Vitas  AI,  Garcia -Jalon  I.  2010.  The Problem of Listeriosis and Ready-to-Eat Products:  Prevalence  and  Persistence.  1182- 1189.  Mendez-Vilaz  A Ed. Formatex.  Spanyol. Holch  A,  Webb  K,  Lukjancenko  O,  Ussery  D, Rosenthal BM, Gram L. 2013. Genome sequen- cing  identifies  two  nearly  unchanged  strains  of persistent Listeria  monocytogenes isolated  at two  different  fish  processing  plants  sampled  6 years  apart.  Appl  Environ  Microb  79:  2944 – 2951.  DOI:  10.1128/AEM.03715-12.
Jallewar  PK,  Kalorey  DR,  Kurkure  NV,  Pande  VV,
Barbuddhe  SB.  2007.  Genotypic  charac - terization  of Listeria spp.  isolated  from  fresh water  fish.  Int  J  Food  Microbiol  114:  120-130. DOI:  10.1016/j.ijfoodmicro.2006.09.034. Janzten MM, Navas J, Corujo A, Moreno R, Lopez V, Martinez -Suarez  JV.  2006.  Review.  Spesific detection  of Listeria  monocytogenes in  foods using  commercial  methods:  from  chromogenic media  to  real  time  PCR.  Span  J  A gric  Res  4: 235-247.  DOI:  10.5424/sjar/2006043-198. Kim  H,  Cho  J.  2010.  Simple  and  rapid  detection  of Listeria  monocytogenes in  fruit  juice  by  real time  PCR  without  enrichment  culture.  Food Cont rol  21:  1419-1423.  DOI:  10.1016/j.food cont.2010.04.006.
Kusnandar  F.  2010.  Kimia  Pangan  Komponen Makro. 109-112.  Jakarta  (ID):  Dian  Rakyat. Montero  D,  Bodero  M,  Riveros  G,  Lapierre  L,
Gaggero A, Vidal RM, Vidal M.  2015. Molecular epidemiology  and  genetic  diversity  of Listeria monoc ytogenes isolates  from  a  wide  variety  of ready-to-eat  foods  and  their  relationship  to clinical strains from listeriosis outbreaks in Chile. Front  Microbiol  6:  384.  DOI:  10.3389/ fmicb. 2015.00384.
Mutsyahidan  AMA,  Rahayu  WP,  Nurjanah  S.  2016. Detection of Listeria monoc ytogenes in indigenous  Indonesian  snack  using  real  time polymerase chain  reaction. Malaysian J   Microb 12: 177-181.  DOI:  10.21161/mjm.78415.
Nadal  A,  Coll  A,  Cook  N,  Pla  M.  2007.  A  molecular beacon-based  real  time  NASBA  assay  for detection  of Listeria  monocytogenes in  food products:  Role  of  target  mRNA  secondary structure  on  NASBA  design.  J  Microbiol  Met h 68:    623-632.  DOI:  10.1016/j.mimet.2006.11. 011.
Queero GM, Santovito E, Visconti A, Fusco V. 2014. Quantitative  det ection  of Listeria  monocyto- genes in  raw  milk  and  soft  cheeses:  Culture - independent  versus  liquid -  and  solid-based culture-dependent  real  time  PCR  approaches. LWT-Food  Sci  Technol  58:  11-20.  DOI:  10. 1016/j.lwt.2014.03.005.
Ragon  M,  Wirth  T,  Hollandt  F,  Lavenir  R,  Lecuit  M, Monnier  AL,  Brisse  S.  2008.  A  new  perspective on Listeria  monoc ytogenes evolution.  Plos Pathog  4:  e1000146.  DOI:  10.1371/journal. ppat.1000146.
Rahayu  WP,  Nurjanah  S,  Nurwitri  CC.  2015.  Kajian Risiko Listeria  monocytogenes pada  Pangan Jajanan  Anak  Sekolah  Berbasis  Ikan.  Laporan Hibah  Kompetensi  DIKTI.
Shi  Y,  Tang  J,  Yue  T,  Rasco  B,  Wang  S.  2015. Pasteurizing  cold  smoked  salmon  ( Onchoryn- chus  nerk a ):  thermal  inactivation  kinetics  of Listeria  monoc ytogenes and Listeria  innocua. J Aquat  Food  Prod  T  24:  712-722.  DOI:  10.1080/ 10498850.2013.808303.
Tocmo  R,  Krizman  K,  Khoo  W J,  Phua  LK,  Kim  M, Yuk  H.  2014. Listeria  monocyt ogenes in vacuum-packed smoked fish products: occurrence,  routes  of  c ontamination,  and potential  intervention  meas ures.  Compr  Re v Food  Sci  F  13:  172-189.  DOI: 10. 1111/1541- 4337.12052.
Zilelidou  EA,  Rychli  K,  Manthou  E,  Ciolacu  L, Wagner  M,  Skandamis  PN.  2015.  Highly invasive Listeria  monocytogenes strains  have growth  and  invasion  advantages  in  strain competition.  PlosOne  10:  e0141617.  DOI:  10. 1371/journal.pone.0141617.