## SKRINING AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI EKSTRAK ETANOL KERNEL BIJI LIMUS
1 Vera Nurviana
2 Ade Yeni Aprilia
3 Eka Kartika Nuraini
1 Prodi Farmasi Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan bakti Tunas Husada Tasikmalaya (veranurviana@stikes-bth.ac.id)
2 Prodi Farmasi Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan bakti Tunas Husada Tasikmalaya (yeni06aprillia@gmail.com)
3 Prodi Farmasi Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan bakti Tunas Husada Tasikmalaya (ekaaakn@gmail.com)

## ABSTRAK
Antioksidan  merupakan  suatu  senyawa  yang  sangat  penting  dalam  memelihara  kesehatan. Salah satu bahan alam yang berkhasiat sebagai antioksidan adalah biji limus (Mangifera foetida L.) yang merupakan salah satu spesies mangga dari golongan anacardiaceae yang menyebar di wilayah  Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk  mengetahui fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan  yang  paling  baik  pada  kernel  biji  limus  dengan  metode  Bioassay  Guided Fractionation  melalui  reaksi  penangkapan  radikal  bebas  DPPH.  Penyarian  kernel  biji  buah limus  dilakukukan  menggunakan  metode  maserasi  dengan  pelarut  etanol  96%.  Ekstrak selanjutnya  difraksinasi  dengan  pelarut  n-heksana,  etil  asetat,  metanol  dan  air.  Aktivitas antioksidan  masing-masing  fraksi  diukur  menggunakan  spekrofotometer  UV-Visible.  Hasil menunjukan  bahwa  fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  kernel  biji  limus  memberikan  potensi antioksidan yang paling baik yaitu dengan nilai ES 50 sebesar 1,164±0.005 μg/mL (sangat kuat), melebih potensi vitamin C sebagai pembandingnya.
Kata Kunci: Biji limus, Mangifera, Antioksidan, DPPH.

## ABSTRAK
Antioxidants  are  very  important  compounds  in  maintaining  health.  One  of  the  natural ingredients has efficacious as an antioxidant is Limus (Mangifera foetida L.)  seeds which is one  of  the  mango  species  from  the  Anacardiaceae  group  which  spreads  in  the  territory  of Indonesia. This study aims to screen the fraction that has the high antioxidant potential of the Lotus seed kernel used Bioassay-Guided Fractionation method through scavenging reaction of  DPPH  as  free  radical.  The  extraction  of  the  limus  seeds  was  carried  out  using  the maceration method with 96% ethanol. The extract was then fractionated with n-hexane, ethyl acetate, methanol, and water solvents. The antioxidant activity of each fraction was measured
using a UV-Visible spectrophotometer. The results showed that the ethyl acetate fraction of the limus seed ethanol extract provided the high antioxidant potential with an ES50 value of 1.164 ± 0.005 μg / mL (very strong), exceeding the potential of vitamin C as a standard compound.
Keywords : Limus seeds, Mangifera, Antioxidants, DPPH.

## PENDAHULUAN
Antioksidan  merupakan  suatu  senyawa  yang  sangat  penting  dalam  memelihara kesehatan. Berbagai bukti ilmiah menunjukkan bahwa senyawa antioksidan mengurangi risiko terhadap penyakit kronis, seperti kanker dan penyakit jantung koroner (Amrun et al., 2007). Produksi  antioksidan  di  dalam  tubuh  manusia  terjadi  secara  alami  untuk  mengimbangi produksi  radikal  bebas.  Antioksidan  tersebut  kemudian  berfungsi  sebagai  sistem  pertahanan terhadap radikal bebas, namun peningkatan produksi radikal bebas yang terbentuk akibat faktor stress,  radiasi  UV,  polusi  udara  dan  lingkungan  mengakibatkan  sistem  pertahanan  tersebut kurang memadai, sehingga diperlukan tambahan antioksidan dari luar (Muchtadi, 2013).
Antioksidan dari luar tubuh dapat diperoleh dalam bentuk sintesis dan alami (Lie Jinn et al, 2012). Efek samping yang ditimbulkan oleh penggunaan antioksidan sintetik mendorong perkembangan  penelitian  terhadap  antioksidan  alami  yang  lebih  aman  dan  mampu  dalam mengurangi  radikal  bebas  dalam  tubuh.  Antioksidan  alami  dapat  diperoleh  dari  tumbuh- tumbuhan  (Ukieyanna,  2012).    Antioksidan  alami  banyak  terdapat  pada  tumbuh-tumbuhan, sayur-sayuran  dan  buah-buahan  (Winarsi,  2007),  Salah  satu  bahan  alami  yang  memiliki aktivitas  antioksidan  adalah  buah  mangga.  Berdasaran  hasil  penelitian  dilaporkan  bahwa sebagian kerabat mangga ternyata memiliki potensi antioksidan kuat yang bermanfaat untuk kesehatan  (Mirfat  et  al,  2016). Mangifera  foetida Lour  merupakan  salah  satu  spesies  buah mangga dari keluarga Anacardiaceae yang menyebar di wilayah Indonesia. Mangifera foetida L.,  dikenal  sebagai  mangga  bacang,jjjjj  pakel  atau  limus  (sunda).  Kekerabatan  tumbuhan memiliki kemungkinan menghasilkan metabolit sekunder dan efek farmalogis yang serupa.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  fraksi  mana  yang  memiliki  aktivitas antioksidan  paling  kuat  melalui  reaksi  penangkapan  radikal  bebas  DPPH  (2,  2-Difenil-2- Pikrihidrazil). Metode DPPH dipilih karena merupakan metode yang sering digunakan untuk mengevaluasi  aktivitas  antioksidan  dari  senyawa  alami  dan  ekstrak  tanaman.  Tingkat perubahan  warna  menunjukkan  potensi  penangkal  radikal  bebas  dari  senyawa  antioksidan, yang disebabkan oleh kemampuannya menyumbangkan hidrogen (Barreira et al, 2008).

## METODE PENELITIAN

## Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu  maserator,  alat  gelas  kimia,  oven (Memmert®), waterbath sheaker (Memmert®), blender, botol semprot, ball pipet, desikator, mikroskop, lampu sinar UV 254 nm dan 365 nm, kertas saring Whatman, plat silika gel GF254, corong  pisah,  mikropipet,  kuvet,  rotary  evaporator  vacum  (EYELA  OSB-2100),  chamber, statif,  klem  bulat,  krus  porselen,  tang  krus,  loyang,  cawan  porselen,  corong,  neraca  analitik (Mettler Toledo®), spektrofotometer UV-Vis (Genesys 10S UV-Vis).

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu kernel biji buah limus, etanol 96%, aquadest,  kloroform,  asam  klorida,  toluen,  amonia  encer,  pereaksi  Mayer,  pereaksi Dragendorff, serbuk Zn, amil alkohol, eter, pereaksi Liebermann-Burchard, pereaksi besi (III) klorida, gelatin 1%, natrium hidroksida, pereaksi vanilin-asam sulfat, silika gel GF 254 , asam sulfat, n-heksana, etil asetat, DPPH, metanol p.a, asam askorbat (vitamin C) p.a, aseton.

## Cara Kerja

## Determinasi Tanaman
Determinasi kernel biji buah limus dilakukan di Herbarium Jatinangor, Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Departemen Biologi FMIPA, Universitas Padjajaran, Bandung.

## Pengolahan Bahan
Kernel  biji  buah  limus  dikumpulkan  dalam  keadaan  segar,  dicuci  dan  dikeringkan menggunakan oven pada suhu 45˚C. Kemudian dibuat dalam bentuk serbuk halus.

## Ekstraksi
Serbuk  kernel  biji  buah  limus  diekstraksi  dengan  metode  maserasi  menggunakan pelarut etanol 96% hingga  seluruh serbuk kernel biji buah limus terendam.  Proses ekstraksi dilakukan selama 3x24 jam dengan sesekali pengadukan. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator dan waterbath hingga diperoleh ekstrak kental.

## Fraksinasi
Ekstrak  etanol  yang  telah  dipekatkan  difraksinasi  menggunakan  metode  partisi. Siapkan  lima  buah  erlenmeyer,  masukkan  ekstrak  kental  sebanyak  20  g  kedalam  masing- masing  erlenmeyer.  Lakukan  partisi  pertama  dengan  pelarut  n-heksan.  Gojog  dalam erlenmeyer selama 6 jam menggunakan alat sheaker orbital , kemudian diamkan selama 18 jam pada suhu kamar sampai larutan n-heksan tidak keruh (tidak ada yang terlarut). Tampung sari
n-heksan  dan  uapkan  diatas  waterbath,  sisa  partisi  dengan  n-heksan  dipartisi  kembali menggunakan pelarut etil asetat, metanol, dan air secara berturut-turut.

## Penapisan Fitokimia
Penapisan  fitokimia  dilakukan  untuk  mengetahui  kandungan  senyawa  metabolit sekunder  yang  terdapat  pada  tanaman,  meliputi  identifikasi  golongan  alkaloid,  flavonoid, saponin, steroid dan triterpenoid, tanin dan polifenol, kuinon, mono dan seskuiterpenoid.

## Penentuan Kualitatif Aktivitas Antioksidan
Penentuan kualitatif aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode KLT menggunakan fase  gerak  yang  sesuai  untuk  ekstrak  dan  masing-masing  fraksi  dengan  penampang  bercak DPPH  0,2%  dalam  metanol.  Hal  ini  dilakukan  untuk  mengidentifikasi  adanya  senyawa antioksidan  yang  bereaksi  positif  terhadap  pereaksi  DPPH,  ditunjukkan  dengan  timbulnya bercak yang berwarna kuning dengan latar belakang ungu.

## Penentuan Kuantitatif Aktivitas Antioksidan
Penentuan  kuantitatif  aktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan  metode  peredaman radikal bebas DPPH secara spektrofotometri UV-Vis (Molyneux, 2004).

## Pembuatan Larutan DPPH
Sebanyak 78,864 mg serbuk DPPH, larutkan dalam metanol p.a hingga volumenya 100 mL. Pipet 10 mL dan tambahkan metanol p.a hingga volumenya 100 mL, sehingga diperoleh konsentrasi 0,2 mM yang dihitung terhadap BM DPPH sebesar 394,32 g/mol.

## Pembuatan Larutan Uji
Sebanyak  50  mg  ekstrak  dan  masing-masing  fraksi  kernel  biji  limus  dimasukkan kedalam labu takar 50 mL dan tambahkan metanol p.a sampai tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi 1000 ppm (larutan induk). Konsentrasi larutan uji dibuat dengan mempipet larutan induk  untuk  mendapat  seri  konsentrasi,  seri  kadar  masing-masing  sampel  ditentukan berdasarkan hasil uji pendahuluan pengukuran aktivitas antioksidan.

## Pembuatan Larutan Induk Vitamin C
Sebanyak  10  mg  vitamin  C, larutkan  dengan  10  mL  metanol  p.a  sehingga  diperoleh konsentrasi  1  mg/mL  atau  1000  µg/mL  sebagai  larutan  induk.  Kemudian  dibuat  enam  seri konsentrasi.
Penentuan Panjang Gelombang
2 mL larutan DPPH 0,2 mM ditambahkan dengan 1 mL metanol p.a, dikocok sampai homogen. Ukur serapan pada rentang panjang gelombang 400-600 nm.
Penentuan Operating Time
Masing-masing 1 mL larutan sampel dan pembanding vitamin C dikocok dengan 2 mL larutan DPPH 0,2 mM. Pengamatan absorbansinya dilakukan selama 60 menit pada panjang gelombang 517 nm.

## Pengukuran Absorbansi Penangkap Radikal Bebas dengan Metode DPPH
Masing-masing 1 mL ekstrak, fraksi kernel biji buah limus, dan larutan pembanding vitamin  C  dengan  berbagai  konsentrasi  dikocok  kuat  dengan  2  mL  larutan  DPPH  0,2  mM. Campuran  larutan  disimpan  di  tempat  gelap,  absorbansi  sampel  diukur  pada  panjang gelombang serapan maksimal DPPH dengan spektrofotometer UV-Vis. Nilai absorbansi yang diperoleh dihitung persen peredam DPPH oleh sampel dan pembanding.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil Determinasi Tanaman
Determinasi dilakukan di Herbarium Jatinangor, Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Departemen Biologi FMIPA, Universitas Padjajaran, Bandung. Berdasarkan hasil determinasi diperoleh  kepastian  bahwa  nama  spesies  tanaman  yang  digunakan  pada  penelitian  adalah Mangifera foetida Lour.

## Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi Ekstrak Kernel Biji Buah Limus
Ekstraksi  simplisia  kernel  biji  buah  limus  dilakukan  dengan  metode  maserasi menggunakan pelarut etanol 96%, proses ekstraksi menghasilkan rendemen sebanyak 28,78%. Fraksinasi dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan senyawa golongan metabolit sekunder berdasarkan  tingkat  kepolaran.  Persen  rendemen  ekstrak  dan  fraksi-fraksi  ekstrak  yang dihasilkan dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1 Hasil Rendemen Ekstrak dan Fraksi Ekstrak Kernel Biji Limus
Sampel Pelarut Berat Sampel (gram) Berat Ekstrak/Fraksi Kental (gram) (%) Rendemen Ekstrak  Etanol 96% 949,57 273,07 28,7572 Fraksi N-Hexan 100 1,6380 1,638 Etil Asetat 100 37,4033 37,4033 Metanol 100 30,2307 30,2307 Air 100 1,4545 1,4545

## Hasil Penapisan Fitokimia
Penapisan  fitokimia  bertujuan  untuk  mengetahui  golongan  senyawa  kimia  yang terkandung dalam tumbuhan. Proses penapisan fitokimia dilakukan terhadap simplisia, ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, fraksi metanol, dan fraksi air kernel biji buah limus. Hasil dari penapisan fitokimia dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 2. Hasil Penapisan Fitokimia Simplisia, Ekstrak, dan Fraksi Kernel Biji Buah Limus
Senyawa Metabolit Sekunder Hasil Penapisan Fitokimia Simplisia Ekstrak Etanol Fraksi N-Heksana Fraksi Etil Asetat Fraksi Metanol Fraksi Air Alkaloid - - - - - - Flavonoid + + - + + - Saponin - - - - - - Steroid dan Triterpenoid - - - - - - Tanin dan Polifenol + + - + + - Kuinon + + + + + + Mono dan Seskuiterpenoid + + + + + +
Berdasarkan tabel 2, kernel biji limus positif memiliki senyawa-senyawa yang biasanya dikaitkan dengan aktivitas antioksidan diantaranya adalah flavonoid, tanin, polifenol, kuinon, monoterpen dan seskuiterpenoid.

## Hasil Penentuan Kualitatif Aktivitas Antioksidan
Penentuan  kualitatif  aktivitas  antioksidan  menggunakan  metode  kromatografi  lapis tipis (KLT) dengan fase diam plat silika gel GF 254 dan fase geraknya toluen:aseton (3,5: 6). Hasil penyemprotan larutan DPPH 2% dalam metanol terhadap hasil KLT menunjukan bahwa ekstrak  dan  semua  fraksi  ekstrak  memiliki  aktivitas  sebagai  antioksidan  dengan  adanya perubahan  warna  spot  pada  kromatogram  menjadi  kuning  dengan  latar  warna  ungu  yang berasal dari warna DPPH yang disemprotkan.

## Hasil Penentuan Kuantitatif Aktivitas Antioksidan
Penentuan  kuantitatif  aktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan  metode  DPPH menggunakan Spektrofotometer UV-Vis. Pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak biji limus dilakukan menggunakan metode DPPH. Uji DPPH didasarkan pada kemampuan antioksidan untuk  menyumbangkan  radikal  hidrogen  yang  radikal  bebas  stabil  dengan  warna  ungu  tua. Ketika  elektron  ganjil  dipasangkan  dengan  adanya  pemulung  radikal  bebas  dari  zat antioksidan,  radikal  DPPH  diturunkan  menjadi  hidrazin  yang  sesuai,  bentuk  DPPH-H  dan solusinya dihilangkan dari ungu awal menjadi warna kuning muda (Khuma, 2017).
Pengujian aktivitas antioksidan pada ekstrak dan fraksi kernel biji buah limus dilakukan dengan mereaksikan sampel dengan larutan DPPH (1:2). Waktu inkubasi yang dibutuhkan oleh sampel  dan  fraksi  sama,  yaitu  30  menit.  Nilai  ES 50 menunjukkan  konsentrasi  sampel  yang mampu menghambat aktivitas suatu radikal bebas sebesar 50% yang diperoleh dari perhitungan regresi linier antara konsentrasi sampel dengan persen inhibisi. Semakin kecil nilai ES 50 , maka semakin  kuat  aktivitas  antioksidannya  (Budilaksono  et  al.,  2014).  Nilai  ES 50 dan  intensitas aktivitas antioksidan pembanding, ekstrak, dan fraksi kernel biji buah limus dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3 Nilai IC50 dan Intensitas Aktivitas Sampel ES 50 (μg/mL) Intensitas Antioksidan Vitamin C 2.436±0.055 Sangat Kuat Ekstrak Etanol 8.922±0.037 Sangat Kuat Fraksi N-Hexan 10,004±0.004 Sangat Kuat Fraksi Etil Asetat 1,164±0.005 Sangat Kuat Fraksi Metanol 9,289±0.043 Sangat Kuat Fraksi Air 27.900±0.175 Sangat Kuat
Tabel 3 menunjukan bahwa fraksi etil asetat memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kuat  dari  senyawa  pembanding,  ekstrak  dan  fraksi  lainnya  dengan  nilai  ES 50 1,164±0.005 μg/mL. Hail ini menunjukan bahwa hanya dengan konsentrasi tersebut fraksi etil asetat sudah mampu meredam 50 % DPPH sebagai radikal bebasnya. Berdasarkan skrining fitokimia pada tabel  2,  fraksi  etil  asetat  mengandung  golongan  senywa  metabolit  sekunder  diantaranya flavonoid,  polifenol,  tanin,  kuinon,  monoterpen  dan  seskuiterpen.  Golongan  senyawa  kimia tersebut  banyak  dilaporkan  memiliki  khasiat  antioksidan.  Kandungan  fenolik  dan  flavonoid memberikan aktivitas antioksidan (Mayers et al, 2003). Jumlah total dan konfigurasi kelompok hidroksil yang ada pada senyawa dapat meningkatkan efek antioksidan dan antidiabetes dari flavonoid  (Sarian,  dkk  2017).  Selain  itu  monoterpenoid  dan  seskuiterpenoid  merupakan komponen  penyusun  minyak  atsiri.  Tanin  merupakan  senyawa  polifenol  yang  memilki aktivitas antioksidan. Minyak atsiri juga banyak dilaporkan memberikan aktivitas antioksidan yang baik.

## PENUTUP
Ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, fraksi metanol, dan fraksi air kernel biji buah limus yang diuji menggunakan metode DPPH memiliki aktivitas antioksidan  yang sangat kuat. Fraksi etil asetat memiliki aktivitas antioksidan lebih kuat dari vitamin C, sehingga
sangat berpotensi sebagai sumber antioksidan alami. Elusidasi struktur dengan bioassay guided isolation dapat  dilakukan  untuk  memastikan  senyawa  apa  yang  sangat  berpotensi  sebagai antioksidan pada biji limus ini. Adanya pegembangan dalam suantu pruduk sedian farmasi akan menambah  kemanfaatan  dari  biji  limus  ini  terutama  sebagai  antioksidan.  Pengujian  invivo khasiat  antioksidan  biji  limus  disarankan  untuk  dilakukan  sehingga  kajian  efektivitas farmakologinya semakin kuat.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim,  2008,  Farmakope  Herbal  Indonesia,  Edisi  I,  Departemen  Kesehatan  Republik Indonesia, Jakarta.
Amrun,  M.,  Umiyah,  &  Umayah,  E.,  2007,  Uji  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Air  Dan Ekstrak  Metanol  Beberapa  Varian  Buah  Kenitu  (Chrysophyllum  cainito  L.)  dari daerah Jember. Berk. Penel. Hayati 2007; 13:45-50
Barreira JCM., Ferreira ICFR., Oliveira MBPP., Pereira JA., 2008, ‘Antioxidant activities of the extracts from chestnut flower, leaf, skins and fruit’. Food Chem , 107:1106– 1113.
Meyers  KJ,  Watkins  CB,  Pritts  MP,  Liu  RH.,  2003,  ‘Antioxidant  and  antiproliferative activities of strawberries’. J Agric Food Chem , 51: 6887-6892.
Mirfat  AHS,  Salma  I,  Razali  M.,  2016,  Natural  antioxidant  properties  of  selected  wild Mangifera species in Malaysia. J Trop Agric Food Sci.; 44(1):63- 72.
Muchtadi,  Deddy.  (2013). Antioksidan  dan  Kiat  Sehat  di  Usia  Produktif.  Alfabeta. Bandung.
Lie Jin, 2012, Phenolic Compound and Antioxidan Activity of Bulb Extract of Six Lilium Species Native to China , Molecules , hlm. 9362.
Khuma  Sharma  Dhita.,  2017,  ‘Phytochemical  screening  and  antioxidant  activities ofMangifera  indica  leaves  grown  in  temperate  region  of  the  Nepal’. Journal Pharmacognosy and Phytochemstry , 6(3): 205-209
Sarian,  Murni  Nazira.,  Ahmed,  Qamar  Uddin.,  Mat  So’ad,  Siti  Zaiton.,  Alhassan, Muhammad Alhassan., Murugesu, Suganya., Perumal, Vikneswari., Sharifah Nurul Akilah  Syed  Mohamad,  Khatib,  Alfi.,  Latip,  Jalifah.,  2017,  ‘Antioxidant  and Antidiabetic Effects of Flavonoids: A Structure-Activity Relationship Based Study’.
BioMed Research International, Volume 2017, Article ID 8386065: 14 pages