Research Article

## UNPAD

## Analysis of Flavonoids on Fraction from Hydrolysate of Cordia Sebestena L. Leaves Extract
Ni P. E. Hikmawanti 1* , Endang Hanani 1 , dan Rini Mardiyanti 1
1Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi dan Sains, Universitas Muhammadiyah Prof. DR. HAMKA, Jl. Delima II/IV
Klender, Jakarta Timur, DKI Jakarta 13460 , Indonesia
Submitted 25 March 2022; Revised 22 January 2023; Accepted 15 March 2023; Published 01 February 2024 *Corresponding author: ermy0907@uhamka.ac.id
Abstract Cordia sebestena L. contains flavonoids, that play a role in free radical scavenging activity. This study aimed to analyze the flavonoids in the hydrolyzed fraction of the 70% ethanol extract of Cordia leaves. The study was divided into 7 stages: (1) maceration using 70% ethanol, (2) acid hydrolysis of the ethanol extract, (3) fractionation of hydrolysate with ethyl acetate, (4) determination of total flavonoid content, (5) antiradical activity assay against 2,2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), (6) thin layer chromatography (TLC) analysis, and (7) identification of flavonoid using UV-Visible Spectrophotometry and Infrared Spectroscopy. The total flavonoid content of the ethyl acetate fraction was 8.20 mgQE/g with an IC50 value of 296.91 g/mL against DPPH radicals. There is one spot of flavonoids in the ethyl acetate fraction (hRf = 85.5). The UV-Vis spectrum on the spot obtained absorption at 340 nm (band I) and 240 nm (band II). The infrared spectrum shows a signal at 3363 cm -1 (O-H stretching), 1727 cm -1 (C=O), and 1060 cm -1 strong (C-O). The ethyl acetate hydrolysate fraction of Cordia leaf contains flavonoid similar to the chalcone group. Further analysis is needed using 1 H NMR or FTIR data from a known chalcone as a standard to confirm the flavonoid. Keywords: Acid hydrolysis; Boraginaceae; Cordia; Ethyl acetate fraction; Flavonoids

## Analisis Flavonoid pada Fraksi Hasil Hidrolisat Ekstrak Daun
Cordia sebestena L.

## Abstrak
Cordia sebestena L. mengandung flavonoid yang berperan dalam aktivitas peredaman radikal bebas. Penelitian  ini  bertujuan  menganalisis  senyawa  flavonoid  pada  fraksi  hasil  hidrolisat  ekstrak  etanol 70% daun Cordia. Penelitian terbagi menjadi 7 tahapan, yaitu (1) maserasi daun menggunakan etanol 70%,  (2)  hidrolisis  asam  pada  ekstrak,  (3)  fraksinasi  hidrolisat  dengan  etil  asetat,  (4)  penentuan kadar flavonoid total dengan kolorimetri, (5) pengujian aktivitas antiradikal terhadap 2,2′-difenil-1- pikrilhidrazil (DPPH), (6) pemisahan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT), dan (7) identifikasi flavonoid menggunakan spektrofotometri UV-Vis dan infra merah. Kadar flavonoid total fraksi etil asetat  sebesar  8,20  mgQE/g  dengan  nilai  IC50  terhadap  radikal  DPPH  sebesar  296,91  µg/mL. Ada satu bercak flavonoid pada fraksi etil asetat (hRf = 85,5). Hasil spektrum UV-Vis pada bercak tersebut diperoleh serapan pada 340 nm (pita I) dan 240 nm (pita II). Spektrum infra merah menunjukkan adanya sinyal pada 3363 cm -1 (O-H ulur), 1727 cm -1 (C=O), dan 1060 cm -1 kuat (C-O). Fraksi etil asetat hidrolisat ekstrak etanol daun Cordia mengandung senyawa flavonoid yang mirip dengan kelompok kalkon. Namun, diperlukan analisis lebih lanjut untuk memastikan bahwa flavonoid ini merupakan khalkon menggunakan data 1 H NMR atau FTIR dari senyawa khalkon yang telah diketahui. Kata Kunci: Hidrolisis asam; Boraginaceae; Cordia; Fraksi etil asetat; Flavonoid,

## 1.  Pendahuluan
Banyak  tanaman  hias  berbunga merupakan  sumber  alami  senyawa  bioaktif yang  bermanfaat  untuk  kesehatan  manusia, terutama  sebagai  antioksidan.  Meskipun demikian, ketertarikan pemanfaatan tanaman ini sebagai sumber makanan dan obat masih rendah.  Padahal  beberapa  studi  melaporkan bahwa tanaman hias memiliki potensi sebagai sumber  flavonoid  (terutama  antosianin) sebagai  antioksidan  dan  antiinflamasi. 1
Cordia sebestena L.  (Boraginaceae)  atau Cordia  merupakan  suatu  tanaman  hias. Daun  Cordia  mengandung  senyawa  fenolik, flavonoid,  saponin,  alkaloid,  steroid/ triterpenoid,  dan  tannin. 2 Daun  Cordia juga  mengandung  senyawa  volatil  sebesar 0,05%. 3 Daun  cordia  memiliki  beragam aktivitas farmakologi, antara lain antibakteri, 4 analgetik,  antiinflamasi, 5 antioksidan, 6 dan lain  sebagainya.  Studi  mengenai  toksisitas subakut  dari  ekstrak  etil  asetat  daun  Cordia menunjukan  bahwa  ekstrak  tersebut  tidak toksik  terhadap  hati. 4 Sebelumnya,  telah diisolasi kandungan flavonoid hesperetin dari bunga Cordia dengan khasiat antibakteri dan antikanker terhadap kanker serviks in vitro . 7
Namun, studi mengenai flavonoid dari daun Cordia belum banyak dieksplorasi.
Flavonoid merupakan kelompok fenolik  dengan  struktur  inti  C-15  (C6- C3-C6). 8 Flavonoid  merupakan  kelas metabolit sekunder dari bahan alam sebagai nutrasetikal  yang  paling  banyak  digunakan pada  pengobatan,  makanan,  suplemen  dan lainnya. 9 Meskipun  studi  mengenai  isolasi maupun  sintesisnya  telah  banyak,  para peneliti masih tertarik meneliti flavonoid dan turunannya. 10 Umumnya,  flavonoid  dapat diekstraksi  dari  pelarut  air,  etanol,  metanol, n-butanol,  aseton,  etil  asetat,  kloroform  dan lainnya. 11 Pelarut  polar  digunakan  untuk memperoleh  flavonoid  bentuk  glikosida, sedangkan pelarut non-polar untuk ekstraksi bentuk  aglikonnya. 8 Untuk  memperoleh bentuk aglikon flavonoid umumnya dilakukan proses hidrolisis terhadap glikosida flavonoid dengan cara asam, basa, maupun enzimatik. Hidrolisis asam merupakan teknik sederhana, ceapt  dan  ekonomis  untuk  mengubah  suatu
glikosida menjadi aglikon. 12 Teknik ini sering kali dilakukan menggunakan HCl 2 N-metanol atau HCl 2M. 12 Hidrolisis glikosida flavonoid dari  beberapa  sampel  sayuran  dilaporkan baik  dilakukan  dengan  metode  hidrolisis asam  menggunakan  HCl  1,2  M  dalam  50% metanol-air  dengan  penambahan  asam askorbat sebagai pencegah oksidasi pada 80 ºC selama 120 menit. 13
Flavonoid merupakan suatu antioksidan yang  secara  alami  ditemukan  dalam  bahan alam  terutama  tumbuhan. 10 Selain  itu, flavonoid  juga  berperan  sebagai  suatu nutrasetikal  dengan  khasiat  antimikroba, antibakteri,  antifungi,  antivirus,  antiulcer, hepatoprotektif, antiinflamasi, efek kardioprotektif, antineoplasma, dan lainnya. 14 Banyaknya  penemuan  dan  pengembangan obat  baru  dari  flavonoid  yang  berasal  dari tanaman  menjadi  alasan  dilakukannya penelitian  ini.  Penelitian  ini  bertujuan melakukan  analisis  senyawa  flavonoid  pada fraksi etil asetat hasil hidrolisat ekstrak etanol 70%  daun  Cordia  sekaligus  menentukan aktivitas antiradikalnya.

## 2.  Metode
2.1.  Alat Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi toples maserasi, ayakan no. mesh 40,  timbangan  analitik  (Ohaus),  mikropipet (Eppendorf), vacuum rotary evaporator (Eyela N-1100, Cina), oven (Memmert UN- 55),  chamber  (Camag),  kotak  UV  (Camag), ultrasonik (Branson 5510), spektrofotometer UV-Vis (UV-1601 Series, Shimadzu, Japan ), dan  spektrometer  FTIR  (Agilent  Cary  630, USA).
2.2.  Bahan Etanol  70%,  etil  asetat,  metanol, kloroform  pada  tingkat  analitik  (Merck, Jerman)  digunakan  sebagai  pelarut.  Bahan lain  yang  digunakan  antara  lain  plat  KLT GF254  (Merck,  Jerman),  DPPH,  AlCl3  10%, kalium asetat, kuersetin (Sigma-Aldrich Co., USA),  HCl  2N,  Na2SO4,  asam  formiat,  dan aquades.
2.3.  Metode
2.3.1. Ekstraksi Daun Cordia diperoleh dari pekarangan rumah  warga  di  sekitar  Jakarta  Timur. Sebelumnya,  tanaman  telah  dideterminasi di  Lembaga  Ilmu  Pengetahuan  Indonesia ( Indonesian Institute of Sciences ),  Pusat Penelitian  Biologi  ( Research Center for Biology ), Cibinong Sciences Center, Cibinong. Sampel daun segar (2,5 kg) dibuat simplisia menggunakan  oven  pada  50  ºC.  Blender elektrik  digunakan  untuk  menghaluskan simplisia  menjadi  serbuk  untuk  selanjutnya
diayak  dengan  ayakan  no.  mesh  40.  Serbuk kemudian  disimpan  dalam  wadah  kering tertutup rapat. 15
Serbuk  simplisia  (850  g)  diekstraksi menggunakan  metode  maserasi  dengan pelarut  etanol  70%  (dengan  rasio  bahan- pelarut  1:6)  selama  18  jam  sambil  sesekali diaduk.  Ampas  yang  telah  dipisahkan dari  filtrat  kemudian  diremaserasi  sampai pemeriksaan  terhadap  kandungan  flavonoid didalamnya memberikan hasil negatif. Filtrat diuapkan  pelarutnya  menggunakan vacuum
rotary evaporator pada  50  ºC.  Evaporasi dilanjutkan dengan penangas air pada 50 ºC hingga  diperoleh  ekstrak  kental. 15 Ekstrak dihitung persentase rendemen dan dilakukan penapisan  fitokimia  sederhana  mengikuti prosedur  pada  Hanani  (2015). 16 Skema prosedur ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 1.
2.3.2. Hidrolisis Ekstrak Ekstrak  etanol  sebanyak  15,0715  g dicampurkan dengan 240 mL HCl 2N-metanol (dengan  rasio  bahan-pelarut  1:16)  di  dalam labu  alas  bulat.  Campuran  dipanaskan  pada 95 ºC selama 2 jam. Setelah dingin, campuran disaring  dan  dipekatkan  di  atas  penangas air  pada  60  ºC  hingga  diperoleh  hidrolisat kental. 17
2.3.3. Fraksinasi dari hasil hidrolisat Hidrolisat  sebanyak  6,45  g  dilarutkan dalam 20 mL metanol dan 20 mL aquadest, dan  kemudian  dimasukan  ke  dalam  corong pisah.  Selanjutnya,  campuran  difraksinasi menggunakan  etil  asetat  sebanyak  40  mL. Setelah  dikocok  perlahan  dan  didiamkan sesaat,  fase  air  (lapisan  bawah)  dan  fase etil  asetat  (lapisan  atas)  masing-masing dipisahkan  dan  dikumpulkan.  Fraksi  etil asetat disaring menggunakan Na2SO4. Fraksi tersebut  dipekatkan  di  atas  penangas  air dengan suhu 40 ºC. 17
2.3.4. Penetapan kadar flavonoid total fraksi Penetapan kadar flavonoid total dengan metode  kolorimetri. 18 Kuersetin  digunakan untuk  membuat  kurva  kalibrasi.  Kuersetin (1000  μg/mL)  dalam  metanol  kemudian diencerkan  hingga  diperoleh  larutan  seri konsentrasi  26,  44,  62,  80,  dan  98  μg/mL. Fraksi  etil  asetat  disiapkan  dalam  metanol (1000  μg/mL).  Larutan  uji  (0,5  mL)  secara terpisah dicampur dengan metanol (1,5 mL), AlCl3  10%  (0,1  mL),  kalium  asetat  1  M (0,1  mL)  dan  aquades  (2,8  mL),  kemudian dihomogenkan.  Setelah  30  menit  diinkubasi pada  suhu  kamar,  campuran  tersebut  diukur absorbansinya  pada  440  nm  menggunakan Spektrofotometer UV-Vis. Selanjutnya grafik hubungan  absorbansi  terhadap  konsentrasi
standar kuersetin digunakan untuk memperoleh persamaan garis linear (y = bx ±  a).  Persamaan  ini  selanjutnya  digunakan untuk  menetapkan  konsentrasi  flavonoid dalam  larutan  uji.  Selanjutnya,  prosedur mereaksikan  yang  sama  dilakukan  pada larutan uji fraksi etil asetat 6000 μg/mL (0,5 mL) dalam metanol untuk menentukan kadar flavonoid total pada fraksi tersebut. Pengujian dilakukan triplo.
2.3.5. Penentuan  aktivitas  antiradikal  bebas fraksi Penentuan aktivitas antiradikal dilakukan  terhadap  DPPH  dengan  kuersetin sebagai  pembanding  mengikuti  prosedur Batool  et  al.,  (2019) 19 dengan  sedikit modifikasi.  Larutan  DPPH  disiapkan  dalam metanol dengan konsentrasi 0,2 mM. Larutan fraksi  etil  asetat  disiapkan  dengan  seri konsentrasi yaitu 50, 150, 250, 350, dan 450 µg/mL. Sedangkan, seri konsentrasi kuersetin sebagai pembanding adalah 2, 4, 6, 8, dan 10 µg/mL.  Selanjutnya  larutan  uji  sebanyak  1 mL (baik fraksi etil asetat maupun kuersetin) masing-masing  secara  terpisah  dicampurkan dengan  4  mL  DPPH.  Campuran  diinkubasi pada  suhu  ruang  selama  30  menit  dalam kondisi  gelap.  Absorbansi  diukur  pada  515 nm  menggunakan  Spektrofotometer  UV- Vis.  Pengujian  dilakukan  triplo.  Kapasitas antiradikal  dihitung  berdasarkan  persentase inhibisi terhadap radikal DPPH yang dihitung dengan cara: (absorbansi DPPH - absorbansi sampel)  dibagi  dengan  absorbansi  DPPH dikali  100%.  Kemudian  kurva  persentase inhibisi DPPH terhadap konsentrasi masing- masing sampel digunakan untuk memperoleh persamaan garis linear (y = bx ± a). Persamaan tersebut  selanjutnya  digunakan  untuk menghitung konsentrasi sampel yang mampu menghambat  50%  radikal  DPPH  (inhibition concentration  50,  IC50)  yang  dinyatakan dalam µg/mL.
2.3.6. Pemisahan dengan KLT preparatif Sebelumnya,  konfirmasi  keberadaan flavonoid  dalam  fraksi  etil  asetat  dilakukan pada plat KLT GF254. Fase gerak yang digunakan adalah kloroform:etil asetat:metanol (3:2:2,5)
dengan  penambahan  sedikit  asam  formiat. Pereaksi semprot sitroborat digunakan untuk mendeteksi  golongan  senyawa  flavonoid. Pemisahan  flavonoid  pada  fraksi  etil  asetat selanjutnya  dilakukan  pada  plat  KLT preparatif  menggunakan  fase  gerak  yang sama.  Visualisasi  bercak  dipantau  pada sinar  UV  254  dan  366  nm  tanpa  disemprot sitroborat.  Bercak  dihitung  nilai  hRf-nya dengan  cara  membagi  jarak  rambat  bercak (cm) dengan jarak rambat eluen (cm) dikali 100.
2.3.7. Analisis senyawa flavonoid Bercak  yang  diperoleh  dari  hasil  KLT preparatif  dikerok  dan  dilarutkan  dalam metanol  dengan  bantuan  ultrasonik  selama 15  menit.  Filtrat  disaring  dengan  kapas  dan kertas saring. Filtrat kemudian diidentifikasi menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis maupun FTIR.
3.  Hasil
Hasil identifikasi kualitatif menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  70% daun  Cordia  terdeteksi  senyawa  alkaloid, fenolik, flavonoid, tanin, dan saponin. Hasil ekstraksi  dan  fraksinasi  hidrolisat  disajikan pada  Tabel  1.  Kadar  flavonoid  total  fraksi etil  asetat  diperoleh  sebesar  8,20  mgQE/g. Selanjutnya,  pengujian  aktivitas  antiradikal dilakukan  terhadap  DPPH  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis.  Nilai  IC50 kuersetin  adalah  7,028  μg/mL,  sedangkan IC50  fraksi  etil  asetat  adalah  296,91  μg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat memiliki  aktivitas  antiradikal  namun  belum sebanding dengan kuersetin sebagai standar/ pembanding.
Gambar  2  menunjukkan  pola  KLT fraksi etil asetat untuk konfirmasi keberadaan
golongan  senyawa  flavonoid  sebelum dilakukan KLT preparatif. Terdapat 4 bercak yang terdeteksi pada sinar 254 nm (sebelum disemprot  sitroborat),  sedangkan  pada  366 nm  (setelah  disemprot  sitroborat)  hanya ditemukan 1 bercak dominan berwarna kuning yang  disimpulkan  bahwa  bercak  tersebut merupakan  suatu  flavonoid. 16 Gambar  3 menunjukkan  pola  kromatogram  dari  KLT preparatif.  Bercak  yang  tampak  kemudian dianalisis  lebih  lanjut  menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR.
Hasil  spektrum  UV-Vis  pada  bercak 1  (Gambar  4)  diperoleh  serapan  pada 340  nm  (pita  I)  dan  240  nm  (pita  II). Sedangkan spektrum infra merah (Gambar 5) menunjukkan adanya sinyal pada 3363 cm -1 melebar (O‒H ulur), 1727 cm -1 (C=O), 1459 cm -1 tajam dengan intensitas lemah dan 1060 cm -1 kuat (C‒O).
4.  Pembahasan Hasil  identifikasi  kualitatif  ekstrak etanol daun Cordia pada penelitian ini sesuai dengan penelitian Hanani et al., (2019). 2 Etanol memiliki  kemampuan  menarik  senyawa polifenol, flavonoid, tanin, terpenoid, steroid, dan alkaloid. Polaritas etanol berkaitan dengan keberadaan  gugus  OH  pada  strukturnya. 20,21 Kandungan  flavonoid  terdeteksi  lebih  tinggi dalam etanol yang bercampur dengan air pada konsentrasi 70% dibanding etanol absolut. 21,22 Umumnya, flavonoid pada tumbuhan berada pada  bentuk  glikosidanya  dibandingkan bentuk  aglikon.  Dengan  demikian,  prosedur ekstraksi  flavonoid  dapat  dilakukan  dengan menggunakan teknik hidrolisis. 12,16
Hidrolisis dilakukan untuk melepaskan gula pada glikosida dengan cara asam, basa maupun  enzimatik.  Hidrolisis  asam  pada glikosida  flavonoid  dapat  dilakukan  dengan
Sampel Bobot (g) Rendemen (%) Ekstrak etanol 70%* 158,90 18,69 Hidrolisat** 8,8491 58,71 Fraksi etil asetat*** 2,6072 40,37 *Dari 850 g serbuk simplisia
**Dari 15,0715 g ekstrak ***Dari 6,4585 g hidrolisat
Tabel 1. Hasil ekstraksi dan fraksinasi
memanaskan  campuran  bahan  dengan  2 N  HCl-metanol. 12 Beberapa  peneliti  ada yang  menambahkan  asam  askorbat  di dalam  prosedur  tersebut  untuk  mencegah terjadinya  oksidasi.  Proses  hidrolisis  dapat dilakukan selama 2 jam pada suhu 80 ºC atau lebih. 12,16 Bentuk  aglikon  selanjutnya  dapat diekstraksi  dengan  pelarut  semipolar  yaitu etil asetat. 16 Berdasarkan hasil rendemen dari fraksi etil asetat dari hidrolisat pada Tabel 1,
menunjukkan  bahwa  fraksi  ini  mengandung sebagian  besar  senyawa  aglikon  dan  sedikit glikosida.  Kemampuan  ini  didasarkan  pada polaritas etil asetat yang cukup besar karena adanya  elektron  π  dan  elektron  pasangan bebas pada O. 20
Pengujian  spektrofotometri  yang didasarkan  pada  pembentukan  kompleks aluminium  adalah  prosedur  yang  sering digunakan dalam penentuan kadar flavonoid.

## Gambar 2. Pola kromatogram KLT pada fraksi etil asetat
Gambar 3. Pola kromatogram KLT preparatif pada fraksi etil asetat pada sinar UV 254 nm (kiri) dan pada sinar UV 365 nm (kanan)
Sampel  ini  direaksikan  dengan  AlCl3  dan memungkinkan pengukuran flavonoid totalnya  setelah  2-60  menit  dalam  kisaran 404-430  nm. 23 Prinsipnya,  kompleks  stabil dari AlCl3  dengan  gugus  keto  C-4  dan  C-3 atau  C-5  hidroksil  dari  struktur  flavonoid (flavon dan flavonol) dapat terbentuk setelah penambahan  asam.  Selain  itu,  AlCl3  juga membentuk  kompleks  stabil  dengan  gugus ortohidroksil  pada  cincin  A  atau  B  dari flavonoid. 23 Antiradikal  merupakan  kemampuan senyawa  kimia  untuk  bereaksi  dengan radikal bebas. 9 Senyawa bahan alam dengan aktivitas antiradikal umumnya dari kelompok fenolik.  Kelompok  fenolik  (termasuk
flavonoid)  memiliki  struktur  kimia  yang mendukung proses peredaman radikal bebas. 9 Pada  flavonoid,  ada  beberapa  faktor  yang menentukan  kapasitas  antiradikalnya  antara lain:  (1)  adanya  gugus  orto-dihidroksi  pada cincin B mampu menyumbang elektron dan berpartisipasi  dalam  delokalisasi  elektron, (2) adanya ikatan rangkap 2,3 dengan gugus 4-okso pada cincin C bertanggung jawab pada delokalisasi cincin B, (3) adanya gugus 3- dan 5-hidroksil dengan gugus 4-okso pada cincin A  dan  C  ikut  berperan  dalam  menangkal radikal,  (4)  adanya  gugus  3-hidroksil 9,24 Hasil dari studi ini, nilai IC50 fraksi etil asetat masih rendah dibandingkan dengan kuersetin sebagai  pembanding  terhadap  peredaman
Gambar 4. Spektrum UV bercak 1
radikal DPPH. Senyawa antioksidan baik fe- nolik maupun flavonoid memberikan respon aktivitas antioksidan dan antiradikal berbeda (terkait mekanismenya) tergantung dari jenis ujinya. 25 Hal ini berkaitan dengan fakta bah- wa  tiap  uji  memiliki  perbedaan  spesifisitas pelarut,  reagen,  dan  kondisi  pH.  Selain  itu, sifat  hidrofobik/hidrofilik  substansi,  ukuran molekul,  dan  jumlah  (kuantitas)  serta  jenis dari gugus fungsi fenolik dan flavonoid yang diujikan juga ikut berperan pada hasil ujinya. 9
Dengan demikian, diperlukan pengujian den- gan metode selain DPPH pada fraksi etil ase- tat untuk membuktikan hal ini.
Pemisahan dengan KLT masih menjadi metode  yang  paling  banyak  digunakan untuk pemisahan disebabkan karena metode ini  sederhana,  praktis,  dan  ekonomis serta  prosedur  kerja  yang  mudah. 26 Hasil kromatogram  KLT  menunjukan  keberadaan senyawa flavonoid setelah disemprot dengan sitroborat. Sitroborat merupakan reagen yang terdiri atas asam borat dan asam sitrat dalam etanol. Reagen ini bereaksi dengan flavonoid dengan  gugus  ortho-hidroksi 27 dengan  hasil positif berwarna kuning terang pada UV 366 nm. 16 Prosedur pendekatan klarifikasi struktur senyawa  dapat  menggunakan  spektroskopi. Spektroskopi  UV-Visible  dapat  digunakan untuk  menganalisis  kualitatif  kelas  senyawa tertentu.  Spektroskopi  inframerah,  misalnya Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR)  merupakan  metode  dengan  resolusi tinggi yang digunakan untuk mengidentifikasi kandungan  kimia  dengan  cepat  secara  non- destruktif. 21,28 Spektroskopi  serapan  ultraviolet  (UV) dari flavonoid memiliki dua serapan maksimal sekitar  300–350  dan  240–285  nm  masing- masing sesuai dengan pita I dan II dari cincin A dan B. Sebagian besar flavon, isoflavon dan kalkon  terhidroksilasi  memberikan  serapan maksimum pada 3300-3600 cm -1 karena adanya gugus OH. 8 Gugus karbonil (C=O) flavonoid diamati  sekitar  1727  cm -1 .  Serapan  tajam dan  intesitas  tinggi  teramati  pada  1600  dan 1500 cm -1 karena adanya ikatan rangkap pada cincin  aromatik. 8,29 Dengan  demikian,  dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat hidrolisat
ekstrak  etanol  daun  Cordia  mengandung senyawa  flavonoid  mirip  dengan  kelompok kalkon.  Spektrum  UV  kalkon  mengandung dua pita serapan yang ditunjukkan pada Pita I  (340  nm)  dengan  serapan  sebesar  0,785 dan pita II (240 nm) dengan serapan sebesar 0,456.  Pita  I  sering  tampak  pada  340-390 nm,  meskipun  terkadang  sedikit  perubahan atau  puncak  sering  terjadi  pada  300-320 nm.  Pita  II  tampak  pada  220-270  nm 30 . Secara farmakologi, kalkon memiliki khasiat yang  luas  seperti  antidiabetes,  antikanker, antiinflamasi,  antimikroba,  antioksidan, antiparasit, psikoaktif dan neuroprotektif. 31
5.  Kesimpulan Fraksi etil asetat hasil hidrolisat ekstrak etanol  70%  daun  Cordia  mengandung senyawa  flavonoid  yang  memiliki  aktivitas antiradikal DPPH. Flavonoid yang ditemukan memiliki kemiripan dengan kelompok kalkon berdasarkan  analisis  spektrum  UV-sinar tampak  dan  inframerah.  Studi  lebih  lanjut dalam  pemisahan  dan  pemurnian  senyawa ini  masih  perlu  dilakukan  kedepannya dengan  teknik  kromatografi  lain  dan  untuk menentukan struktur molekul senyawa murni perlu  menggunakan  metode  spektroskopi massa  dan  NMR  yang  mendukung  pada penentuan struktur dari flavonoid.

## Referensi
1.  Łysiak  GP.  Ornamental  Flowers Grown  in  Human  Surroundings  as  a Source  of  Anthocyanins  with  High Anti-Inflammatory  Properties.  Foods. 2022;11(948).
2.  Hanani  E,  Soewandi  SHW,  Hayati, Revita  N.  Pharmacognostical  and preliminary  phytochemical  evaluation of  Cordia  sebestena  L.  Pharmacogn  J. 2019;11(5):1100–5.
3.  Adeosun  CB,  Bamigbade  O  l.,  Osho A,  Atolani  O.  Volatile  Composition  of the  Leaf,  Flower  and  Fruit  of  Cordia sebestena  (L.).  J  Essent  Oil-Bearing Plants. 2015;18(4):976–81.
4.  Osho  A,  Otuechere  CA,  Adeosun CB,  Oluwagbemi  T,  Atolani  O.
Phytochemical, sub-acute toxicity, and  antibacterial  evaluation  of  Cordia sebestena  leaf  extracts.  J  Basic  Clin Physiol Pharmacol. 2015;27(2):163–70.
5.  Sunaryo H, Siska S, Hanani E, Anindita RS, Yanti N, Lisa. Evaluation of analgesic and  anti-inflammatory  activities  of ethanolic  extract  of  Cordia  sebestena  L. Eur Pharm J. 2020;66(2):26–31.
6.  Hikmawanti  NPE,  Hanani  E,  Sapitri Y,  Ningrum  W.  Total  Phenolic  Content and  Antioxidant  Activity  of  Different Extracts  of  Cordia  sebestena  L.  Leaves. Pharmacogn J. 2020;12(6):1311–6.
7.  Prakash  S,  Elavarasan  N,  Subashini  K, Kanaga  S,  Dhandapani  R,  Sivanandam M,  et  al.  Isolation  of  hesperetin  -  A flavonoid  from  Cordia  sebestena  flower extract through antioxidant assay guided method  and  its  antibacterial,  anticancer effect on cervical cancer via in vitro and in silico molecular docking studies. J Mol Struct. 2020;1207:127751.
8.  Awouafack  MD,  Tane  P,  Morita  H. Isolation  and  Structure  Characterization of  Flavonoids.  In:  Flavonoids  -  From Biosynthesis  to  Human  Health.  Intech; 2017. p. 45–59.
9.  Huyut  Z,  Beydemir  F.,  Gülçin  E. Antioxidant  and  Antiradical  Properties of  Selected  Flavonoids  and  Phenolic Compounds. Biochem Res Int. 2017;2017:1–10.
10. Arifin B, Ibrahim S. Struktur, Bioaktivitas Dan  Antioksidan  Flavonoid.  J  Zarah. 2018;6(1):21–9.
11. Alara  OR,  Abdurahman  NH,  Ukaegbu CI.  Extraction  of  phenolic  compounds: A  review.  Curr  Res  Food  Sci. 2021;4(March):200–14.
12. Bian Y, Zhang Y, Zhou Y, Li GH, Feng XS.  Progress  in  the  Pretreatment  and Analysis of Flavonoids: An Update since 2013. Sep Purif Rev. 2022;51(1):11–37.
13. Nuutila  AM,  Kammiovirta  K,  Oksman- Caldentey  KM.  Comparison  of  methods for  the  hydrolysis  of  flavonoids  and phenolic  acids  from  onion  and  spinach for  HPLC  analysis.  Food  Chem. 2002;76(4):519–25.
14. Janabi  AHW,  Kamboh  AA,  Saeed M,  Xiaoyu  L,  BiBi  J,  Majeed  F,  et  al. Flavonoid-rich foods (FRF): A promising nutraceutical  approach  against  lifespan- shortening diseases. Iran J Basic Med Sci. 2020;23(2):140–53.
15. Kementerian  Kesehatan  RI.  Farmakope Herbal Indonesia Edisi II. 2nd ed. Jakarta: Kementerian Kesehatan RI; 2017. 51–55 p.
16. Hanani  E.  Analisis  Fitokimia.  Jakarta: Buku Kedokteran EGC; 2015. 34–45 p.
17. Irianti T, Murti YB, Kanistri DN, Pratiwi DR,  Kuswandi,  Kusumaningtyas  RA. DPPH  Radical  Scavenging  Activity  of Aqueous Fraction from Ethanolic Extract of  Talok  Fruit  (Muntingia  calabura  L.). Tradit Med J. 2016;21(1):38–47.
18. Hikmawanti NPE, Fatmawati S, Asri AW. The Effect of Ethanol Concentrations as The  Extraction  Solvent  on  Antioxidant Activity of Katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr.) Leaves Extracts. IOP Conf Ser Earth Environ Sci. 2021;755(1):012060.
19. Batool  R,  Khan  MR,  Sajid  M,  Ali  S, Zahra  Z.  Estimation  of  phytochemical constituents  and  in  vitro  antioxidant potencies  of  Brachychiton  populneus (Schott  &  Endl.)  R.  Br.  BMC  Chem. 2019;13(32):1–15.
20. Houghton  PJ,  Raman  A.  Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extracts.  1st  ed.  Laboratory  Handbook for the Fractionation of Natural Extracts. Springer-Science+Business Media, B.V.; 1998. 14–16, 24–31, 39–52 p.
21. Altemimi  A,  Lakhssassi  N,  Baharlouei A,  Watson  DG,  Lightfoot  DA. Phytochemicals: Extraction, Isolation, and Identification  of  Bioactive  Compounds from Plant Extracts. Plants. 2017;6(42).
22. Zhang Q-W, Lin L-G, Ye W-C. Techniques for  extraction  and  isolation  of  natural products: A comprehensive review. Chin Med. 2018;13(20).
23. Pękal  A,  Pyrzynska  K.  Evaluation  of Aluminium  Complexation  Reaction  for Flavonoid  Content  Assay.  Food  Anal Methods. 2014;7(9):1776–82.
24. Gulcin  İ.  Antioxidants  and  antioxidant
methods:  an  updated  overview.  Arch Toxicol. 2020;94(3):651–715.
25. Gulcin  İ.  Antioxidants  and  antioxidant methods: an updated overview. Arch  Toxicol.  2020;94(3):651–715.
26. Sadeer  NB,  Montesano  D,  Albrizio  S, Zengin  G,  Mahomoodally  MF.  The versatility  of  antioxidant  assays  in food  science  and  safety—chemistry, applications,  strengths,  and  limitations. Antioxidants.
2020;9(8):1–39.
27. Muyumba NW, Mutombo SC, Sheridan  H,  Nachtergael  A,  Duez  P. Quality  control  of  herbal  drugs  and preparations:  The  methods  of  analysis, their  relevance  and  applications. Talanta Open. 2021;4:100070.
28. Sharma  B,  Agrawal  SC,  Gupta KC.  Colour  reactions  of  chalcones and  their  mechanism  (A  review).
Orient  J  Chem.  2008;24(1):289–94.
29. Ingle  KP,  Deshmukh  AG,  Padole  DA, Dudhare MS, Moharil MP, Khelurkar VC. Phytochemicals:  Extraction  methods, identification  and  detection  of  bioactive compounds  from  plant  extracts.  J Pharmacogn Phytochem. 2017;6(1):32–6.
30. Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS, Vyvyan JR. Introduction to Spectroscopy. Fourth Edi. Canada: Brooks/Cole; 2001. 15–104 p.
31. Aksöz  BE,  Ertan  R.  Spectral properties  of  chalcones  II.  Fabad J  Pharm  Sci.  2012;37(4):205–16.
32. Salehi  B,  Quispe  C,  Chamkhi  I, El  Omari  N,  Balahbib  A,  Sharifi- Rad  J,  et  al.  Pharmacological Properties  of  Chalcones:  A  Review of  Preclinical  Including  Molecular Mechanisms  and  Clinical  Evidence. Front  Pharmacol.  2021;11(January).