Vol.18, No.2, Desember 2021, Hal. 85-93 ISSN: 1693-7899     e-ISSN: 2716-3814

## PERBEDAAN KADAR FLAVONOID TOTAL EKSTRAK DAUN
SALAM ( Syzygium polyanthum ) DENGAN METODE REFLUKS DARI BEBERAPA JENIS PELARUT DAN AKTIVITAS ANTIBAKTERI
Yuliana Dewi Hastuti, Dewi Andini Kunti Mulangsri *
Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim, Semarang *Email: andini@unwahas.ac.id

## INTISARI
Daun  salam  mengandung  senyawa  flavonoid  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri Escherichia  coli penyebab  diare.  Metode  ekstraksi  panas  dapat  menyari  lebih  banyak  senyawa dalam  tanaman,  terutama  yang  sifatnya  stabil  terhadap  pemanasan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui perbedaan kadar flavonoid total dan aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dari ekstrak  daun  salam  yang  disari  secara  refluks  dengan  beberapa  jenis  pelarut.  Ekstraksi  dilakukan menggunakan  pelarut  etanol  70%,  etanol  96%,  dan  metanol.  Penetapan  kadar  flavonoid  total dengan  metode  spektrofotometri  menggunakan  pereaksi  AlCl₃  pada  λmax  431,5  nm  dengan operating  time 30  menit.  Uji  aktivitas  antibakteri  dengan  metode  difusi  cakram.  Kloramfenikol sebagai kontrol positif dan dimetil sulfoksida sebagai kontrol negatif. Analisis data kadar flavonoid total  dengan  statistik One  Way  Anova ,  sedangkan  aktivitas  antibakteri  dinyatakan  dengan  nilai diameter  daerah  hambat  (DDH)  dianalisis  dengan Two  Way  Anova dilanjutkan  Tukey.  Kadar flavonoid  total  ekstrak  daun  salam  dengan  variasi  pelarut  (etanol  70%,  etanol  96%,  metanol) berturut-turut  6,089;  5,028;  4,052  mgQE/gram  ekstrak.  Ada  perbedaan  kadar  flavonoid  total ekstrak daun salam antar jenis pelarut dan yang tertinggi diperoleh pada pelarut etanol 70%. Jenis pelarut ekstraksi dan seri konsentrasi ekstrak daun salam menunjukkan adanya perbedaan dan nilai DDH tertinggi pada ekstrak dengan pelarut etanol 96%.
Kata kunci : aktivitas antibakteri, daun salam ( Syzygium polyanthum ), flavonoid total, refluks

## ABSTRACT
Bay leaves that it contains flavonoid compounds can inhibit the growth of Escherichia coli bacteria causes diarrhea. Hot extraction method can extract more compounds in the plants, particularly are heat stable. This study aimed to determine the different of total flavonoid content and antibacterial activity  against  Escherichia  coli  from  bay  leaves  extracts  that  extracted  with  some  solvent  by reflux. The bay leaves extract was extracted with 70% ethanol, 96% ethanol, and methanol solvent. The spectrophotometric method was used to determine of total flavonoid contents at λmax 431,5 nm and  operating  time  30  minutes  with  AlCl₃  reagent.  The  disc  diffusion  method  was  used antibacterial  activity  test  with  chloramphenicol  as  a  positive  control  and  dimethyl  sulfoxide  as negative  control.  Analysis  data  of  total  flavonoid  content  with  One  Way  Anova  statistics, meanwhile  the  zone  of  inhibition  from  antibacterial  activity  test  analysed  by  Two  Way  Anova continued with Tukey. The total flavonoid content of bay leaves extract (ethanol 70%, ethanol 96%, and  methanol)  were  6,089;  5,028;  4,052  mgQE/gram  extract.  There  was significant  difference of total  flavonoid  content  between  variation  solvent  and  the  most  highest  at  70%  ethanol.  Different extraction solvent and concentration serial of bay leaves extract showed significant difference and the most highest zone of inhibition at extract with 96% ethanol solvent.
Keywords : antibacterial activity, bay leaf (Syzygium polyanthum), total flavonoid content, reflux
Nama : Dewi Andini Kunti Mulangsri Institusi : Universitas Wahid Hasyim Alamat institusi  : Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang E-mail
: andini@unwahas.ac.id

## PENDAHULUAN
Diare dan disentri merupakan penyakit pada saluran pencernaan yang dapat disebabkan oleh spesies Escherichia  coli patotipe  tertentu  (Kaper  dkk.,  2004).  Ekstrak  etanol  daun  salam menunjukkan adanya aktivitas antibakteri terhadap bakteri E. coli yang dilakukan  dengan metode difusi  cakram  dengan  nilai  diameter  daerah  hambat  7,6-11,0  mm  dan  nilai  konsentrasi  hambat minimal  dan  konsentrasi  bunuh  minimal  pada  konsnetrasi  200  mg/mL  dan  500  mg/mL (Nurrurahmah, 2011 dan Mursyida dkk., 2021).
Jenis pelarut merupakan faktor yang dapat mempengaruhi kadar dan aktivitas suatu senyawa tanaman.  Penelitian  Islamiyati  dan  Saputri  (2018)  melaporkan  bahwa  ekstrak  daun  salam  yang diekstraksi  secara  maserasi  dengan  pelarut  etanol  70%  dan  etanol  96%,  menghasilkan  kadar flavonoid  total  masing-masing  sebesar  350  ppm  dan  250  ppm.  Penelitian  lainnya  melaporkan bahwa ekstrak metanol daun salam dari hasil maserasi memiliki kadar flavonoid total sebesar 576 mgQE/gram (Ruchiyat, 2013). Hal tersebut menunjukkan bahwa jenis pelarut untuk ekstraksi dapat memberikan perbedaan hasil kadar flavonoid totalnya.
Perbedaan  jenis  pelarut  yang  digunakan  untuk  ekstraksi  suatu  tanaman  juga  dapat berpengaruh  terhadap  aktivitas  farmakologis  ekstrak  tanaman  tersebut.  Hal  ini  ditunjukkan  pada penelitian  dari  dua  peneliti  yang  berbeda  yaitu  Saputri  (2019),  membuktikan  bahwa  ekstrak  daun salam  dengan  pelarut  etanol  96%  yang  diperoleh  seacara  maserasi  pada  konsentrasi  100% menunjukkan  diameter  daerah  hambat  paling  besar  terhadap  bakteri Escherichia  coli yaitu  16,5 mm, sedangkan Trisnawati dkk. (2020), membuktikan ekstrak metanol daun salam yang diperoleh secara maserasi dapat menghambat pertumbuhan bakteri Salmonella typhi dengan nilai konsentrasi hambat minimal sebesar 1-2%. Bakteri E. coli dan S. typhi adalah tipe bakteri Gram negatif. Penggunaan  suatu  metode  ekstraksi  dapat  mempengaruhi  hasil  penyarian  termasuk  jumlah senyawa-senyawa  yang  berhasil  disari.  Sejauh  penelusuran  pustaka  yang  dilakukan,  metode ekstraksi  daun  salam  dilakukan  secara  dingin  diantaranya  maserasi,  kemudian  diuji  aktivitas antibakterinya.  Namun  laporan  mengenai  metode  ekstraksi  daun  salam  dengan  cara  panas  belum ditemukan. Berdasarkan latar belakang tersebut, penelitian ini memilih metode panas yaitu refluks dengan  variasi  pelarut  untuk  melihat  adanya  perbedaan  kadar  flavonoid  total  dan  aktivitas antibakterinya.

## METODE PENELITIAN Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  berupa  daun  salam  ( Syzygium  polyanthum ),  pelarut  etanol  70% teknis,  pelarut  etanol  96%  teknis,  pelarut  metanol  teknis,  kuersetin,  etanol  p.a,  AlCl₃  10%, CH 3 COONa  1  M,  bakteri  murni Escherichia  coli (Laboratorium  Unimus),  antibiotik kloramfenikol 30 µg/disk (Oxoid), media nutrient agar (NA) (Merck), media nutrient broth (NB) (Merck), NaCl 0,9%, larutan 0,5 Mc. Farland , dimetilsulfoksida (DMSO) (Oxoid).
Peralatan  yang  digunakan  terdiri  dari  timbangan  simplisia (Henherr),  timbangan  analitik (Ohaus),  almari  pengering,  alat  penyerbuk, moisture balance (Ohaus),  seperangkat  alat  refluks, penguap  vakum  putar  (Heidolph),  peralatan  gelas  (Iwaki  dan  Pyrex),  mikropipet  (Socorex), spektrofotometer  UV-Vis  (Shimadzu), magnetic  stirer (Silogex), Laminar  Air  Flow (LAF) (Airtech),  inkubator (Binder),  autoklaf  (All  American),  jangka  sorong  (Mitutoyo).

## Jalannya Penelitian Pembuatan serbuk daun salam
Daun  salam  disortasi  dan  hasil  sortasi  ini  harus  dihilangkan  kotorannya  dengan  cara mencucinya  menggunakan  air  mengalir.  Hasil  pencucian  ini  ditiriskan  dengan  teknik  diangin- anginkan.  Proses pengeringan  dengan  alamari  pengering  suhu  50ºC  sampai  kering.  Bahan  yang telah  kering  ditandai  dengan  mudahnya  untuk  diremas  dengan  tangan  sampai  hancur.  Simplisia kering  yang  didapat  kemudian  disortasi.  Simplisia  kering  ditimbang  dan  dibuat  serbuk.  Serbuk simplisia disimpan dalam wadah toples kaca di tempat yang kering dengan penambahan silika gel, dan tidak terkena sinar matahari.

## Pembutaan ekstrak daun salam
Metode  refluks  menggunakan  pelarut  etanol  (70%  dan  96%)  dan  metanol  dengan  bobot serbuk  daun  salam  sebanyak  25  gram.  Labu  alas  bulat  yang  telah  terisi  serbuk  kemudian kemudian  ditambahkan  pelarut  sebanyak  250  ml  dan dipanaskan  pada  suhu  sekitar  78°C  pada etanol  dan  64°C  pada  metanol.  Proses  refluks  dilakukan  selama  dua  jam  dengan  pengulangan  3 kali.  Tiap  proses  penggantian  pelarut  selalu  disaring  dan  filtratnya  ditampung  terlebih  dahulu. Penguap vakum putar yang digunakan untuk memekatkan filtrate yang diperoleh hingga menjadi ekstrak kental. Cara kerja tersebut berlaku untuk masing-masing pelarut.
Penetapan kadar flavonoid total a. Pembuatan larutan induk kuersetin
Serbuk  kuersetin  ditimbang  sebanyak  100  mg,  kemudian  dimasukkan  dalam  labu  takar 100  mL  dan  dilarutkan  dengan  etanol  p.a  sampai  tanda  batas,  dan  dihomogenkan, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 ppm.
b. Pembuatan seri konsentrasi larutan baku kuersetin
Seri  konsentrasi  larutan  baku  kuersetin  dibuat  dari  larutan  induk  hingga  diperoleh  larutan baku dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10, 12 ppm dalam 5 mL etanol p.a.
c. Pembuatan larutan uji
Ekstrak  kental  daun  salam  ditimbang  1gram  dimasukkan  ke  dalam  erlenmeyer  kemudian ditambah etanol p.a sebanyak 25 ml. Larutan ekstrak diaduk selama 1 jam menggunakan magnetic stirrer pada  kecepatan  500  rpm  dan  disaring  hingga  menghasilkan  filtrat.  Hasil  yang  diperoleh ditambah  etanol  p.a  hingga  25  mL.  Cara  kerja  ini  berlaku  untuk  tiga  jenis  pelarut  (etanol  70%, etanol 96%, dan metanol) dan dilakukan replikasi sebanyak tiga kali.
d. Penentuan panjang gelombang maksimal
Seri konsentrasi 6 ppm diambil sebanyak 1000 μL ditambahkan 200 μL AlCl₃ 10%, 200 μL Natrium  asetat  dalam  labu  ukur  5  mL  dan  ditambah  etanol  p.a  hingga  tanda  batas.  Dilakukan scanning pada spektrofotometer Uv-Vis dengan kisaran panjang gelombang 400-500 nm. Panjang gelombang  yang  menghasilkan  serapan  maksimal  ditetapkan  sebagai  panjang  gelombang maksimal kuersetin.
e. Penentuan operating time
Seri konsentrasi 6 ppm diambil sebanyak 1000 μL ditambahkan 200 μL AlCl₃ 10%, 200 μL Natrium  asetat  dalam  labu  ukur  5  mL  dan  ditambah  etanol  p.a  hingga  tanda  batas.  Absorbansi dibaca  pada  spektrofotometer  Uv-Vis  dengan  panjang  gelombang 431,5  nm.  Waktu  pengukuran yang menunjukkan hasil absorbansi tetap stabil ditetapkan sebagai waktu operasi metode analisis kuersetin secara spektrofotometri.
f. Penetapan kurva baku kuersetin
Seri konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10, dan 12 ppm  diambil sebanyak 1000 μL  dimasukkan dalam labu takar  5  mL,  masing-masing  ditambah  200  μL  AlCl₃  10%,  200  μL  Natrium  asetat  dan ditambah  etanol  p.a  hingga  tanda  batas.  Absorbansi  dibaca  menggunakan  spektrofotometer  UV- VIS  dengan  panjang  gelombang  431,5  nm  dan operating  time 30  menit.  Penetapan  kurva  baku dilakukan replikasi tiga kali.

## g. Penetapan kadar flavonoid total
Larutan  ekstrak  daun  salam  konsentrasi  40.000  ppm  diencerkan  sebanyak  5x  hingga konsentrasinya  menjadi  8000  ppm.  Larutan  ekstrak  daun  salam  konsentrasi  8000  ppm  diambil sebanyak  1000  μL  ditambahkan  dengan  pereaksi  AlCl₃  10  %  sebanyak  200  μL,  Natrium  asetat sebanyak  200  μL  dan  etanol  p.a  ad  5  mL.  Kemudian  serapan  diukur  menggunakan  metode spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang  maksimum  431,5  nm  dan operating  time 30 menit.
Uji aktivitas antibakteri
Sterilisasi alat dan bahan dilakukan terlebih dahulu dengan alat autoklaf suhu 121°C selama 15  menit.  Suspensi  bakteri E.coli diencerkan  dengan  NaCl  0,9%  sampai  didapat  kekeruhannya setara dengan 0,5 Mc. Farland . Media uji dibaut dengan mengambil  100 μL suspense bakteri uji dan  dicampur  dengan  25  mL  media  NA  pada  cawan  petri  dan  dihomogenkan  ditunggu  hingga memadat.
Masing-masing  ekstrak  daun  salam  dengan  konsentrasi  larutan  uji  yang  berbeda  (6000; 5500; 5000; 4500; 4000 mg/disk) dan larutan DMSO 10% diambil sebanyak 10 μL dan diteteskan pada  kertas  cakram.  Masing-masing  perlakuan  didiamkan  selama  10  menit  sampai  jenuh, kemudian  diaplikasikan  pada  media  dalam  cawan  petri.  Kertas  cakram  antibiotik  kloramfenikol diaplikasikan langsung pada media. Tahap selanjutnya adalah menginkubasi  semua cawan  petri tersebut pada suhu 37°C selama 24 jam.

## Analisis Data
Kadar  flavonoid  total  ekstrak  daun  salam  dengan  variasi  pelarut  dianalisis  menggunakan One Way Anova pada taraf  kepercayaan 95% dilanjutkan uji Tukey . Zona bening di sekitar kertas cakram  diamati  dan  diukur  diameter  daerah  hambatnya  (DDH)  menggunakan jangka  sorong (Sumiarsih, 2018 dan Oroh dkk, 2015). Analisis data pada uji aktivitas  antibakteri dilakukan uji parametrik Two Way Anova dilanjutkan Tukey (P<0,05) (Santoso, 2012).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Daun salam diperoleh dari beberapa tumbuhan salam yang hidup dalam satu wilayah guna untuk  menghindari  variasi kandungan  senyawa  dalam  tanaman  akibat  kondisi  lingkungan  yang berbeda.  Rendemen  ekstrak  daun  salam  yang  dihasilkan  dari  beberapa  jenis  pelarut  yaitu  etanol 96%, etanol 70%, dan metanol secara berturut-turut yaitu 26%; 59,2%; dan 26,4%.
Perbedaan  rendemen  ekstrak  yang  dihasilkan  dari  metode refluks  diduga  bahwa  jenis  dan jumlah  senyawa  yang  berhasil  tersari  berbeda  tergantung  pada  masing-masing  pelarut  yang digunakan.  Berdasarkan  Lutria  dkk.,  (2017)  melaporkan  bahwa  ekstrak  yang  diperoleh  dari pelarut etanol 70% banyak mengandung senyawa gula (glikosida) sehingga pada saat penguapan menghasilkan   ekstrak lebih  berwarna  coklat  pekat,  hal  ini  ditunjukkan  pada  ekstrak  etanol  70% daun salam sedangkan ekstrak etanol 96% dan metanol daun salam memiliki warna ekstrak hijau kehitaman. Profil warna ekstrak ditunjukkan pada Gambar 1.
A

## B
C
Gambar 1. Tampilan warna ekstrak daun salam dengan pelarut ekstraksi : etanol 70% (A), metanol (B) dan etanol 96% (C)

## Kadar Flavonoid Total
Panjang gelombang maksimum kuersetin yang diperoleh adalah 431,5 nm. Nilai absorbansi yang  stabil terjadi  pada  menit  ke-30,  sehingga  waktu  tersebut  digunakan  sebagai  waktu  operasi. Hasil  reaksi  yang  stabil  antara  kuersetin-AlCl₃  ditunjukkan  dengan  tidak  adanya  penurunan absorbansi. Pada hasil penetapan kurva baku kuersetin nilai r pada replikasi 1 yang dipilih karena paling  mendekati  1  yaitu  0,9945,  sehingga  persamaan  regresi  linier  yang  diperoleh  yaitu  y  = 0,05382x  +  0,12538.    Grafik  hubungan  antara  deret  konsentrasi  baku  kuersetin  dan  absorbansi senyawa komplek Kuersetin-AlCl₃ ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2 . Grafik hubungan antara konsentrasi baku kuersetin dan absorbansi senyaw a komplek Kuersetin-AlCl₃
Penetapan  kadar  flavonoid  total  dilakukan  menggunakan  metode  kolorimetri  dengan pereaksi AlCl₃. Hasil penetapan kadar flavonoid total ekstrak daun dalam dengan berbagai jenis pelarut dapat dilihat pada Tabel I.
Tabel I. Kadar flavonoid total ekstrak daun salam dengan beberapa pelarut
Pelarut Absorbansi Pengenceran (f) Kadar Flavonoid Total (mgQE/gram) Rata-rata±SD Etanol 70% 0,650 25x 6,093 6,089 * ± 0,017 0,648 6,069 0,651 6,104 Etanol 96% 0,558 25x 5,024 5,028  ± 0,018 0,560 5,047 0,557 5,013 Metanol 0,475 25x 4,060 4,052  ± 0,024 0,472 4,025 0,476 4,072
Keterangan: * = kadar flavonoid total ekstrak daun salam berbeda bermakna terhadap kadar flavonoid total ekstrak daun salam dari pelarut lainnya
Hasil  penetapan  kadar  flavonoid  total  dari  berbagai  ekstrak  menunjukkan  bahwa  ekstrak etanol  70%  memiliki  kadar  flavonoid  total  lebih  besar  dibandingkan  dengan ekstrak  etanol  96% dan ekstrak  metanol.  Hasil ekstrak etanol 70% lebih besar  diduga senyawa flavonoid  pada daun salam  memiliki  kepolaran  yang  sama  dengan  pelarut  etanol  70%.  Berdasarkan  hasil  kadar flavonoid total yang telah dilakukan oleh peneliti bahwa ekstrak etanol 70% dan etanol 96% daun salam  mengandung  kadar  flavonoid  total  sebesar  6,089  dan  5,028  mgQE/gram  ekstrak.  Pada penelitian lain oleh Islamiyati dan Saputri (2018), bahwa kadar flavonoid total ekstrak etanol 70%
daun salam yang diperoleh secara maserasi sebesar 0,35 mgQE/gram dan ekstrak etanol 96% daun salam  sebesar  0,25  mgQE/gram.  Hasil  yang  diperoleh  lebih  tinggi  yang  dilakukan  oleh  peneliti. Sehingga untuk mendapatkan kadar flavonoid total yang dianggap sebagai kuersetin lebih tinggi maka digunakan metode refluks pada pelarut etanol 70%.
Hasil  kadar  flavonoid  total  pada  ekstrak  metanol  daun  salam  didapatkan  sebesar  4,052 mgQE/gram. Hasil tersebut kurang optimal jika dibandingkan dengan penelitian sebelumnya oleh Oktavia  (2011),  bahwa  kadar  flavonoid  total  yang  didapat  dari  hasil  maserasi  dengan  metanol sebesar  0,0127  mgQE/mg  ekstrak  yang  setara  dengan  12,7  mgQE/g  ekstrak.  Jenis  pelarut  yang digunakan  pada  metode  refluks  jelas  mempengaruhi  jumlah  flavonoid  yang  akan  tersari.  Hasil uji statistik pada penetapan kadar flavonoid total ekstrak daun salam terdapat perbedaan bermakna antara kadar flavonoid total pada ekstrak etanol 70% terhadap kadar flavonoid total ekstrak daun salam dari pelarut lainnya.

## Aktivitas Antibakteri
Hasil  uji  aktivitas  antibakteri  diperoleh  bahwa  semua  ekstrak  daun  salam menunjukkan adanya  aktivitas  antibakteri  yang  ditunjukkan  dengan  adanya  zona  hambat  di  sekitar  kertas cakram dan merupakan zona radikal.Hasil uji aktivitas antibakteri dapat dilihat pada Tabel II.
Tabel II. Nilai DDH ekstrak daun salam terhadap bakteri E.coli
Perlakuan Konsentrasi DDH (mm) Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Rata-rata ± SD EE 96% a 4000 μg/disk ᵇ 4500 μg/disk ᵇ 5000 μg/disk ᵇ 5500 μg/disk ᵇ 6000 μg/disk ᵇ 8,70 9,30 10,50 11,10 11,35 8,65 9,30 10,60 11,05 11,45 8,75 9,20 10,55 11,05 11,35 8,70 ± 0,05 9,27 ± 0,05 10,55 ± 0,05 11,07 ± 0,03 11,38 ± 0,05 EE 70% 4000 μg/disk ᵇ 4500 μg/disk ᵇ 5000 μg/disk ᵇ 5500 μg/disk ᵇ 6000 μg/disk ᵇ 8,45 9,35 10,25 10,55 11,05 8,35 9,35 10,20 10,50 11,05 8,40 9,30 10,15 10,45 11,00 8,40 ± 0,05 9,33 ± 0,03 10,20 ± 0,05 10,50 ± 0,05 11,03 ± 0,03 EM 4000 μg/disk ᵇ 4500 μg/disk ᵇ 5000 μg/disk ᵇ 5500 μg/disk ᵇ 6000 μg/disk ᵇ 8,20 9,30 10,55 10,65 10,75 8,20 9,25 10,50 10,60 10,75 8,25 9,35 10,55 10,65 10,70 8,22 ± 0,03 9,30 ± 0,05 10,53 ± 0,03 10,63 ± 0,03 10,73± 0,03 Kloramfenikol 30 μg/disk 25,35 25,33 25,35 25,34 ± 0,01 DMSO 0 0 0 0
Keterangan: a = nilai DDH berbeda bermakna (p<0,05) dengan ekstrak dari pelarut lainnya b = nilai DDH berbeda bermakna (p<0,05) antar seri konsentrasi ekstrak
Hasil Two  Way  Anova menunjukkan  bahwa  variasi  pelarut  yang  digunakan  dalam  proses ekstraksi  daun  salam  menghasilkan  DDH  yang  berbeda  (p<0,05)  yang  artinya  variasi  pelarut ekstraksi menghasilkan perbedaan aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli . Hasil uji beda  variasi  pelarut  ekstraksi  terhadap  nilai  DDH  menunjukkan  nilai  tidak  signifikan (p>0,05) yaitu  antara  pelarut  etanol  70%  dan  metanol,  sehingga  dapat  diartikan  bahwa  aktivitas antibakteri antara ekstrak etanol 70% dan ekstrak metanol       setara atau sama.
Pelarut  etanol  96%  pada  metode  refluks  untuk  daun  salam  aktivitas  antibakterinya  lebih poten  dibandingkan  ekstrak  etanol  70%  dan  metanol.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  jenis  pelarut akan memberikan hasil uji aktivitas antibakteri yang berbeda. Artinya walaupun kadar flavonoid total  dari  ekstrak  etanol  96%  lebih  kecil  dibandingkan  ekstrak  etanol  70%  dan  lebih  besar dibandingkan  ekstrak  metanol  ternyata  aktivitas  antibakterinya  lebih  besar.  Hal  tersebut  diduga kadar flavonoid total tidak berperan langsung terhadap aktivitas antibakteri karena masih terdapat senyawa-senyawa  lain  yang tersari  oleh  pelarut  etanol  96%  yang  mungkin  berperan  terhadap aktivitas  antibakteri  dan  belum  dibuktikan  dalam  penelitian  ini.  Senyawa-senyawa  yang  dapat tersari  oleh  etanol  96%  yaitu flavonoid, alkaloid, tanin dan saponin memiliki aktivitas antibakteri (Saputri, 2019).
Pelarut etanol 70% dan metanol memberikan hasil aktivitas antibakteri yang setara dengan kadar  yang  berbeda  untuk  flavonoid  total  sebagai  kuersetin  yang  berbeda.  Walaupun  ada perbedaan kadar flavonoid total, ternyata hal tersebut tidak berperan langsung terhadap aktivitas antibakteri  akan  menjadi  lebih  tinggi  ketika  kadar  flavonoid  total  tinggi.  Hal  tersebut  perlu diketahui bahwa uji aktivitas antibakteri itu berkaitan dengan senyawa aktif. Flavonoid diketahui mempunyai  aktivitas  antibakteri,  namun  ada  senyawa-senyawa  lain  yang  berperan  terhadap aktivitas antibakteri dan tidak ikut tersari oleh pelarut etanol 70% dan metanol. Senyawa-senyawa yang  dapat  tersari  oleh  pelarut  etanol  70%  yaitu  flavonoid  dan  tanin  dengan  menggunakan ekstraksi panas  ultrasonik (Alwie  dkk.,  2021).  Pada  ekstrak  metanol senyawa  yang  dapat tersari yaitu flavonoid dan steroid secara maserasi (Trisnawati dkk., 2020).
Pelczar dan Chan (1988), melaporkan bahwa konsentrasi ekstrak semakin tinggi maka hasil aktivitas  antibakteri  semakin  besar.  Dari  hasil  pengamatan  pada  Tabel  II  dapat lihat  bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak yang digunakan menunjukkan adanya peningkatan nilai DDH, dan  DDH  tersebut  berupa  zona  jernih.  Semakin  tinggi  konsentrasi  ekstrak  maka  konsentrasi senyawa-senyawa  yang  terkandung  dalam  ekstrak  tersebut  akan  menjadi  semakin  tinggi  pula, sehingga  lebih  poten  sebagai  antibakteri.  Secara  signifikan  nilai  DDH  kloramfenikol  30  μg/disk lebih  besar  dibandingkan  dengan  ekstrak  daun  salam.  Kloramfenikol  merupakan  antibiotik murni  yang  sudah  terbukti  memiliki  efek,  sedangkan  ekstrak  daun  salam  masih  berupa ekstrak yang mengandung beberapa senyawa kimia.
Ekstrak  etanol  96%  daun  salam  pada  konsentrasi  50%  memberikan  nilai  DDH  sebesar 10,55  mm.  Dibandingkan  dengan  penelitian  Saputri  (2019),  pada  konsentrasi  50%  nilai  DDH yang  didapat  sebesar 7,5 mm dengan  menggunakan etanol 96%  sebagai pelarut  secara maserasi. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  senyawa  yang  tersari  dalam  ekstrak  etanol  96%  daun  salam  secara refluks lebih banyak dibandingkan dengan metode dingin maserasi.
Penelitian  Haerussana  dkk.,  (2021)  menyebutkan  bahwa  ekstrak  etanol  70%  daun  salam menghasilkan  zona  hambat  pada  bakteri Staphylococcus aureus dan Staphylococcus  epidermis dengan  konsentrasi  75%  dan  100%.  Pada  penelitian  ini  ekstrak  etanol  70%  daun  salam  yang digunakan  untuk  uji  aktivitas  antibakteri  berbeda  konsentrasinya.  Dengan  demikian  perbedaan penelitian  ini  dengan  penelitian  sebelumnya  adalah  pada  seri  konsentrasi  yang  digunakan  selain metode  ekstraksinya  yang  berbeda,  juga  jenis  bakteri  uji  yang  digunakan.  Pada  ekstrak  metanol daun  salam,  hasil  yang  didapat  pada  penelitian  ini  sebesar  8,22  mm.  Dibandingkan  dengan penelitian  Trisnawati  dkk.,  (2020)  pada  konsentrasi  terkecil  yaitu  1%  sudah  memberikan  nilai DDH seberar 6,5 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus . Perbedaan tipe dinding sel bakteri
uji  yang  digunakan  akan  berpengaruh  terhadap  profil  aktivitas  antibakteri.  Bakteri  uji  yang digunakan pada penelitian ini adalah Escherichia coli merupakan tipe bakteri Gram negatif. Hasil Two  Way  Anova menunjukkan  bahwa  seri  konsentrasi  memberikan  perbedaan  yang signifikan terhadap nilai DDH (p<0,05) yang artinya variasi pelarut ekstraksi dan seri konsentrasi menghasilkan perbedaan aktivitas antibakteri terhadap  bakteri Escherichia coli . Analisis statistika uji  beda  seri  konsentrasi  terhadap  nilai  DDH  menunjukkan  perbedaan  bermakna  (p<0,05)  yang artinya bahwa tiap seri konsentrasi memberikan  aktivitas antibakteri yang berbeda.

## KESIMPULAN
Ekstrak  daun  salam  yang  diekstraksi  dengan  pelarut  etanol  70%,  etanol  96%  dan  metanol menghasilkan  kadar  flavonoid  total  berturut-turut  sebesar  6,089;  5,028;  dan  4,052  mgQE/gram ekstrak. Kadar flavonoid total ekstrak daun salam berbeda bermakna diantara variasi jenis pelarut ekstraksi dan kadar yang tertinggi diperoleh pada ekstrak dengan pelarut etanol 70%. Ekstrak daun salam  dengan  semua  jenis  pelarut  ekstraksi  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap E.  coli .  Hasil statistic  menunjukkan  bahwa  nilai  DDH  ekstrak  daun  salam  berbeda  bermakna  terhadap  variasi jenis  pelarut  dan  seri  konsentrasi  ekstrak.  Aktivitas  antibakteri  dengan  nilai  DDH  tertinggi diperoleh pada ekstrak dengan pelarut etanol 96%.

## DAFTAR PUSTAKA
Alwie, R.R., Mumpuni, E., Sulastri, L., dan Simanjuntak, P., 2021, Aktivitas Ekstrak Etanol Daun Salam  ( Syzygium  polyanthum [Wight]  Walp.)  dan  Studi  In  Silico  Senyawa  Kimia Penghambat Enzim α-glukosidase, Jurnal Fitofarmaka Indonesia , 8(2), 36- 42
Fatmawati,  E.,  2011,  Ekstrak  Etanol  Daun  Salam  dan  Fraksinya  sebagai  Inhibitor  Alfa-Amilase,
Skripsi , Fakultas MIPA IPB, Bogor, 11
Haerussana,  A.N.E.M.,  Dwiastuti,  W.P.,  dan  Sukowati,  C.A.,  2021,  Aktivitas  Antibakteri  Daun Salam  (Syzygium  polyanthum)  Ekstrak  Etanol  70%  Terhadap  Bakteri Staphylococcous aureus dan Staphylococcus epidermis , Jurnal Farmasi dan Kimia , 5(4), 375-380 Islamiyati,  R.,  dan  Saputri,  I.N.,  2018,  Uji  Perbedaan  Aktivitas  Antioksidan  dengan  Variasi Konsentrasi  Pelarut  Etanol  70%  dan  96%  pada  Ekstrak  Etanol  Daun  Salam  Menggunakan Metode Peredaman Radikal Bebas DPPH, Cendekia Journal of Pharmacy , 2(2), 140
Kaper J.B, Nataro J.P, dan Mobley H.L., 2004, Pathogenic Escherichia coli , Nature , 2: 123-138 Lutria, D.L., Biswas, L., dan Natarajan, S., 2017, Perbandingan Pelarut Ekstraksi dan Teknik yang Digunakan Uji Isoflavon dari Kedelai, Jurnal Kimia Makanan , 105(1), 325- 333
Mursyida  E.,  Almira  R.,  Widiasari  S.,  dan  Misfa  O.,  2021,  Antibacterial  Activity  of  BayLeaf ( Syzygium  polyanthum )  Ethanol  Extract  on Escherichia  coli Growth, Photon  Jurnal  Sains dan Kesehatan , 12(1): 12.
Nurrurahmah, 2011, Pengaruh Ekstrak Etanol Daun Salam ( Syzygium polyanthum [Wight] Walp.) dalam  Menghambat  Pertumbuhan Escherichia  coli,Skripsi ,  UPT  Perpustakaan  Universitas Syiah Kuala.
Oktavia  J.D.,  2011,  Pengoptimumman  Ekstraksi  Flavonoid  Daun  Salam  ( Syzygium  polyanthum ) dan  Analisis  Sidik  Jari  dengan  Kromatografi  Lapis  Tipis, Skripsi ,  Departemen  Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.
Oroh,  S.B.,  Kandou,  F.E.F.,  Peleulu,  J.,  dan  Pandingan,  D.,  2015,  Uji  Daya  Hambat  Ekstrak Metanol Selaginella  delicatula dan Diplazium  dilatatum terhadap  Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli , Jurnal Ilmiah Sains, 15(1), 54 Pelczar,  M.J.,  dan  Chan,  E.C.S.,  1988, Dasar-dasar  mikrobiologi ,  Universitas  Indonesia  Press, Jakarta, 25-30
Santoso, S., 2012, Panduan Lengkap SPSS Versi 20 , PT Elex Media Komputindo Jakarta, 28-34
Saputri,  A.W.,  2019,  Uji  Antimikroba  Ekstrak  Daun  Salam  ( Syzygium  polyanthum )  Terhadap Pertumbuhan Bakteri Escherichia coli , Jurnal Insan Cendekia , 6(2), 70
Trisnawati,  E.E.,  Astuti,  W.,  Kartika,  R.,  2020,  Kemampuan  Ekstrak  Metanol  Daun  Salam ( Syzygium  polyanthum )  dalam  Menghambat  Pertumbuhan Staphylococcus  aureus dan Salmonella typhi , Jurnal Atomik, 5(1), 53-56