Deteksi Variasi Gen ADAM33 Dengan Metode Sekuensing Sanger

## Detection of ADAM33 Gene Variants Using Sanger Sequencing
Kencono Viyati 1,2 , Kinasih Prayuni 2 , Sri Hastuti Andayani 3 , Yenni Zulhamidah 4 , Achmad Sofwan 4 , Lilah Muflihah 5 , Ronike Yunus 5 , Junaefi 5 , Ijun Judasah 5 1 Department of Histology, Faculty of Medicine, YARSI University, Jakarta 2 Genetic Research Center, YARSI Research Institute, YARSI University, Jakarta 3 Department of Pediatric, Faculty of Medicine, YARSI University, Jakarta 4 Department of Anatomy, Faculty of Medicine, YARSI University, Jakarta 5 Cibitung Regional Public Hospital, Bekasi, Jawa Barat Corresponding author: kencono.viyati@yarsi.ac.id
KATA KUNCI asma, gen ADAM33, polimorfisme nukleotida tunggal ABSTRAK Asma adalah penyakit pernafasan yang ditandai oleh obstruksi saluran napas yang disebabkan oleh peradangan bronkus akut dan kronis.  Gen disintegrin and metalloprotease 33 (ADAM33) merupakan gen terkait kerentanan terhadap asma dan diketahui memiliki lebih dari 300 polimorfisme. Studi meta-analisis melaporkan bahwa rs2280091, rs2787094, rs511898, rs2280089 dan rs2280090 memiliki asosiasi kuat dengan asma pada populasi Asia. Penelitian pendahuluan ini mengumpulkan 10 partisipan dengan penyakit asma dan 10 partisipan sehat untuk mengidentifikasi alel dan genotipe dari masing-masing polimorfisme menggunakan metode amplifikasi dan sekuensing Sanger. Hasil sekuensing menunjukkan bahwa 60% dari sampel yang diuji memiliki genotipe heterozigot untuk rs2280090 dan rs228091 baik pada sampel kasus maupun kontrol. Varian SNP rs2280096 menunjukkan bahwa frekuensi alel homozigot wildtype sebesar 60% baik pada sampel kasus maupun kontrol. Penelitian lanjutan perlu dilakukan untuk mengetahui apakah varian SNP tersebut memiliki aosisasi yang positif dengan penyakit asma.
KEYWORDS asthma, ADAM33 gene, single polymorphism nucleotide ABSTRACT Asthma is a respiratory disease characterized by airway obstruction caused by acute and chronic bronchial inflammation. A disintegrin and metalloprotease 33 (ADAM33) is a gene associated with asthma susceptibility and is known to have more than 300 polymorphisms. Meta-analysis studies reported that rs2280091, rs2787094, rs511898, rs2280089 and rs2280090 have a strong association with asthma in Asian populations. This preliminary study  collected 10 participants with asthma and 10 healthy participants to identify the alleles and genotypes of each polymorphism using PCR  amplification and Sanger  sequencing
methods. Sequencing results showed that 60% of the samples had heterozygous genotypes for rs2280090 and rs228091 in both case and control samples. The SNP variant rs2280096 shows that the homozygous wildtype allele frequency is 60% in both case and control  samples. Further research needs to be done  to find out whether this SNP variant has a positive association with asthma.

## PENDAHULUAN
Asma adalah penyakit pernafasan yang ditandai oleh obstruksi saluran napas yang disebabkan oleh peradangan bronkus akut dan kronis (Howard et al.,, 2003).  Asma masih menjadi masalah kesehatan secara global dan prevalensi di beberapa negara terus meningkat. Data tahun 2016, World Health Organization (WHO) menunjukkan sekitar 339 juta orang menderita asma secara global dengan mortalitas sebesar 417.918 (Backman et al., 2017; Vos et al., 2017).
Berdasarkan data Riskesdas 2018, prevalensi asma di Indonesia sebesar 4.8% dengan tingkat kekambuhan 56.1% untuk laki-laki dan 58.8% untuk perempuan (Badan Penelitian Pengembangan Kesehatan, 2018). Faktor genetik (polimorfisme genetik, riwayat keluarga) dan faktor lingkungan (asap tembakau, polusi udara, alergen) berkontribusi terhadap perkembangan asma (Toskala et al., 2015). Penelitian genetik sebelumnya menunjukkan bahwa kontribusi beberapa gen terlibat dalam kerentanan dan perkembangan asma (Shen et al., 2017). Dengan demikian, penelitian terkait genetik dan asma menjadi menarik untuk mendapatkan data dasar hubungan antara faktor genetik dan asma. Gen disintegrin and metalloprotease 33 (ADAM33)
merupakan gen terkait kerentanan terhadap asma yang pertama kali dilaporkan oleh Van Eeederwegh et al (2002). ADAM33 diasosiakan dengan asma dan hyper-responsif bronkus. Sebagian besar diekspresikan dalam sel otot polos saluran nafas dan sel fibroblast
paru namun tidak diekspresikan pada sel epitel, sel T maupun leukosit terkait inflamasi (Shen et al., 2017; Sun et al., 2017).  Gen ADAM33 terletak pada lengan pendek kromosom 20p13 dan sangat polimorfik. Saat ini diperkirakan lebih dari 300 polimorfisme nukleotida Tunggal (SNP) pada gen ADAM 33 telah diidentifikasi pada berbagai populasi (Xue et al., 2013). Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa terdapat sekitar 14 SNP yang telah diinvestigasi dan memiliki asosiasi terhadap asma pada populasi Asia, Amerika dan Eropa, yaitu rs2280091, rs2787094, rs528557, rs2280090, rs511898, rs44707, rs3918396, rs543749, rs574174, rs597980, rs2853209, rs2280089, rs612709, dan rs3746631. Studi meta- analisis melaporkan bahwa rs2280091, rs2787094, rs511898, rs2280089 memiliki asosiasi kuat dengan asma pada keseluruhan populasi studi. rs2280091 (OR, 2.025; 95% CI, 1.420–2.888), rs2787094 (OR, 1.777; 95% CI, 1.056– 2.989), rs511898 (OR, 1.191; 95% CI = 1.059–1.339), rs2280089 (OR, 3.760; 95% CI, 1.331–10.620)  dan rs2280090 (OR, 1.458; 95% CI, 1.009–2.105) memiliki asosiasi yang kuat pada populasi Asia namun tidak pada populasi Amerika dan Eropa (Liang et al., 2013). Penelitian sebelumnya di Indonesia pada gen ADAM33 menunjukkan tidak terdapat asosiasi kuat antara rs2787094 dan asma (Viyati et al., 2023), namun demikian ditemukan hubungan yang kuat pada populasi China dan India (Shen et al., 2017; Tripathi et al., 2011). Hal ini mungkin terjadi karena
perbedaan etnik dan jumlah sampel yang berbeda. Dalam penelitian ini akan dilaporkan hasil studi pendahuluan untuk rs2280089, rs2280090, dan rs2280091 yang merupakan varian dengan asosiasi kuat pada populasi Asia menggunakan metode amplifikasi dan sekuensing Sanger. Pada penelitian pendahuluan ini diharapkan dapat mengidentifikasi alel dan genotipe yang terdapat pada rs2280089, rs2280090, dan rs2280091 untuk dijadikan rujukan positif pada penelitian lanjutan menggunakan metode amplifikasi PCR.

## METODE PENELITIAN
Pengumpulan sampel Penelitian pendahuluan ini melibatkan 10 orang yang didiagnosis menderita asma dan 10 orang kontrol sehat pada Mahasiswa Fakultas Kedokteran YARSI. Pada penelitian ini kami hanya mengumpulkan sampel pada orang dengan asma herediter dan tidak menilai kapasitas paru-paru mereka. Sampel kontrol normal tidak memiliki gejala asma, alergi, autoimun, atau penyakit inflamasi.  Negatif untuk penyakit parasit. Payung penelitian ini telah disetujui oleh Komite Etik Universitas YARSI (No. 156/KEP- UY/EA.10/VII/2023 ), dan  para peserta telah mendapat penjelasan dan telah menandatangani form persetujuan penelitian.
Ekstrasi DNA dan Identifikasi SNP Darah dari peserta penelitian dikumpulkan sebanyak 3mL dalam tabung anti-koagulan EDTA. DNA
kemudian diekstraksi dari sampel darah menggunakan Kit Isolasi DNA (Quick DNA Kits, Zymo Research, Irvine, CA, USA) sesuai protokol yang dianjurkan oleh produsen kit. DNA yang telah diestraksi dari darah kemudian disimpan dalam lemari es -20 o C. DNA ini kemudian diukur kualitas dan kuantitasnya menggunakan spektrofotometer (Tecan, Männedorf, Switzerland).
Identifikasi SNP menggunakan metode amplifikasi PCR yang dilanjutkan dengan sekuensing. Primer yang digunakan untuk amplifikasi rs2280089, rs2280090, dan rs2280091 dapat dilihat pada Tabel 1. Kami mendesain sendiri primer untuk amplifikasi rs2280089 dan rs2280090, sedangkan untuk amplifikasi rs2280091 berdasarkan artikel ilmiah sebelumnya (Zeinaly et al., 2017). Proses amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR konvensional (T100, BioRad, California, USA). Sebanyak 20 ng DNA dimasukkan dalam larutan mix PCR yang terdiri dari 1x GoTaq Green (Promega, Wisconsin, USA), 0.1  uM primer forward dan reverse (IDT, Singapore) . Profil amplifikasi adalah sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 95 o C selama 3 menit, 35 siklus berulang tahap denaturasi pada suhu 95 o C 30 detik, annealing pada suhu 60 o C selama 30 detik dan polimerisasi pada suhu 72 o C selama 1 menit, diakhiri dengan pilimerisasi akhir pada suhu 72 o C selama 5 menit dan suhu penyimpanan di 4 o C. Hasil amplifikasi kemudian dilakukan direct sekuensing oleh perusahaan jasa sekuensing Macrogen Inc., Singapura.

## Tabel 1. Primer yang digunakan untuk amplifikasi daerah varian gen ADAM33
Nama SNP Sekuen Primer PCR Product (pb) rs2280089  Forward: 5'-TCCAGGTCCCTGCCTACCTTGGGGGTCA-3' 368 Reverse: 5'-ACGTTGCTCAGCCCCAAAGATGGCCCAC-3' rs2280090 Forward: 5'-TCAGGGTCTGGGAGAAATGGTG-3’ 330 Reverse: 5’-GCAGAACTCCCTGGGCTGGACACCATGC- 3’ rs2280091 Forward: 5'-ACTCAAGGTGACTGGGTGCT-3' 400 Reverse: 5'-GAGGGCATGAGGCTCACTTG-3 (Zeinaly et al.,, 2017)
Analisis Data Jumlah alel dan genotipe varian gen ADAM33 pada kelompok kasus dan kelompok kontrol  dikumpulkan dalam spreadsheets excel (Microsoft, Washington, USA). Distribusi alel dan genotipe kemudian dihitung secara langsung menggunakan bantuan tools spreadsheets excel. Dalam penelitian ini tidak dilakukan analisis statistik dikarenakan jumlah sampel yang terlalu kecil. Pencarian varian SNP gen ADAM33 dari hasil sekuensing pada penelitian ini menggunakan perangkat lunak NovoSNP (Weckx et al., 2005). Visualisasi grafik hasil sekuensing menggunakan perangkat lunak BioEdit (Hall, 1999).
HASIL Penelitian pendahuluan ini diikuti oleh 20 orang partisipan yang terdiri dari 10 orang dengan asma dan 10 orang kontrol sehat pada Mahasiswa tingkat 3
FK Universitas YARSI. Proporsi jenis kelamin dari masing-masing kelompok adalah 90% perempuan dan 10% laki- laki. Umur rata-rata dari partisipan pada penelitian ini adalah 22.37 tahun.
Hasil sekuensing menunjukkan genotipe dari masing-masing varian gen ADAM33 pada penelitian ini. Gambar 1- 3. secara jelas menunjukkan perbedaan antar masing-masing alel homozigot wildtype, homozigot mutan dan heterozigot berdasarkan grafik elektroferogram yang terbentuk.
Tabel 2 menunjukkan distribusi alel dan genotipe pada rs2280089, rs2280090, dan rs2280091. Distribusi alel dan genotipe untuk SNP-SNP tersebut konsisten dengan Hardy–Weinberg equilibrium  dengan nilai P>0.05.  Pada sampel yang diuji ditemukan bahwa alel heterozigot pada masing-masing varian SNP menunjukkan frekuensi paling besar dibandingkan dengan alel homozigot wildtype maupun alel homozigot mutan.
Gambar 1. Pola elektroferogram hasil sekuensing sanger pada varian gen ADAM33 rs2280089
Gambar 2. Pola elektroferogram hasil sekuensing sanger pada varian gen ADAM33 rs2280090

## Gambar 3. Pola elektroferogram hasil sekuensing sanger pada varian gen ADAM33
rs2280091
Tabel 2. Distribusi Alel dan Genotipe pada varian gen ADAM33 SNP & Genotipe Perubahan Basa Wildtype Allele Risk allele Alel & Genotipe Kasus Asma (n=10) Kontrol Sehat (n=10) Jumlah  Frekuensi (%)  Jumlah Frekuensi (%) rs2280089 G>A G G 15 75 16 80 A 5 25 4 20 A GG 6 60 6 60 GA 3 30 4 40 AA 1 10 0 0 rs2280090 G>A G G 10 50 12 60 A 10 50 8 40 A GG 2 20 3 30 GA 6 60 6 60 AA 2 20 1 10 rs2280091 A>G A A 11 55 14 70 G 9 45 6 30 G AA 2 20 4 40 AG 7 70 6 60 GG 1 10 0 0 PEMBAHASAN Asma merupakan penyakit multifaktorial yang disebabkan karena faktor genetik dan paparan lingkungan.
Gen ADAM33 diketahui berasosiasi positif dengan penyakit asma. ADAM33 diekspresikan secara terbatas pada fibroblas manusia dan otot polos.
Polimorfisme ADAM33 dapat mempercepat proliferasi pada otot polos dan fibroblas, yang menyebabkan fibrosis sub-epitel dan peningkatan respons bronkus. Gen ADAM33, dengan polimorfisme tertentu meningkatkan peradangan atau respons imun yang dimediasi oleh sel T-helper 2 (Karimi et al., 2014; Van Eerdewegh et al., 2002; Howard et al., 2003). Studi meta-analisis pada varian gen ADAM33 melaporkan bahwa rs2280091, rs2787094, rs511898, rs2280089 dan rs2280090 berkorelasi positif dengan penyakit asma pada populasi di Asia (Siqiao et al., 2013). Studi lain dari Deng et al., (2017) melaporkan bahwa polimorfisme rs2280091 mungkin berpotensi menjadi prediktor asma yang rentan pada anak- anak di populasi Asia. Studi sun et al., (2017) menunjukkan bahwa beberapa polimorfisme ADAM33 rs2280091, rs2280090, rs2787094, rs44707 and rs528557 secara signifikan dikaitkan dengan risiko tinggi asma pada masa kanak-kanak.
Studi meta-analisis Li et al., (2019) menunjukkan bahwa genotipe AA pada SNP rs2280089 meningkatkan resiko asma dibandingkan dengan genotipe GG (AAvsGG: OR=1,55, 95% CI=1,01–2,38, P=0,04). Alel A dan genotipe AA+AG pada rs2280090 meningkatkan resiko asma pada populasi Asia (AvsG:  OR=1.44, 95% CI=1.13–
1.85, P=0.004; AA+AGvsGG: OR=1.45,
95% CI=1.11–1.88, P=0.006) dibandingkan pada populasi Kaukasia. Subgrup analisis juga menunjukkan bahwa alel A dan genotipe AA+AG meningkatkan resiko asma pada anak- anak (AvsG: OR=1.45, 95% CI=1.11– 1.89, P=0.006; AA+AGvsGG: OR=1.43,95% CI=1.07–1.92, P=0.02) dan tidak pada orang dewasa. Namun demikian untuk rs2280091 tidak ditemukan asosiasi signifikan antara alel dan genotipe pada rs tersebut dengan asma  (Li et al.,, 2019). Penelitian lain
menunjukkan bahwa alel G berasosiasi dengan penyakit asma yang parah dibandingkan alel A (P=0.006) (Zand Karimi et al., 2014).  Studi di Indonesia dilakukan oleh Viyati et al (2023) yang melaporkan bahwa tidak terdapat asosiasi signifikan antara rs2787094 dengan penyakit asma. Hal ini mungkin disebabkan karena jumlah sampel yang tidak adekuat untuk menunjukkan signifikansi. Hal ini  bertolak belakang dengan Studi Zheng et al., (2015) yang menunjukkan bahwa polimorfisme ADAM33 rs2787094 dapat digunakan sebagai biomarker untuk diagnosis dini asma.  Penelitian pendahuluan ini menginvestigai varian lainnya pada gen ADAM33 yaitu rs2280091, rs2280089 dan rs2280090 menggunakan metode PCR dan direct sequencing . Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui data dasar alel dan genotipe dari variasi gen tersebut untuk selanjutkan SNP akan dideteksi dengan metode PCR alel spesifik yang lebih sensitive dan lebih murah.
Hasil sekuensing pada penelitian ini menunjukkan bahwa alel homozigot wildtype ,  homozigot mutan, dan heterozigot dapat diidentifikasi secara jelas. Gambar 1-3 menunjukkan elektroferogram grafik sekuensing. Setiap puncak pada elektroferogram mewakili satu nukleotida dalam rangkaian DNA, dan setiap nukleotida memiliki warna berbeda; A berwarna hijau, T berwarna merah, C berwarna biru, dan G berwarna hitam. Sekuensing Sanger merupakan metode gold standart yang digunakan untuk deteksi mutasi pada suatu gen, yang dapat berupa mutasi titik, delesi, insersi maupun duplikasi. Namun demikian metode ini cukup mahal untuk mengurutkan keseluruhan genom.
Sanger sekuensing banyak digunakan untuk deteksi beberapa mutasi pada ukuran panjang basa yang tidak lebih dari 1000 pasang basa (Gomes & Korf, 2018). Hasil penelitian menunjukkan bahwa 60% dari sampel yang diuji memiliki genotipe heterozigot untuk
rs2280090 dan rs228091 baik pada sampel kasus maupun kontrol. Varian SNP rs2280096 menunjukkan bahwa frekuensi alel homozigot wildtype sebesar 60% baik pada sampel kasus maupun kontrol.  Hasil ini menjadi data dasar untuk mengembangkan metode deteksi SNP lain yang lebih terjangkau pada ADAM33 untuk rs2280091, rs2280089 dan rs2280090. Penelitian lanjutan dengan jumlah sampel minimal 30 sampel pada sampel kasus dan kontrol untuk SNP-SNP tersebut perlu dilakukan. Hal ini sejalan dengan Fung & Keenan (2014) bahwa ukuran sampel yang diperlukan untuk setidaknya mendeteksi 95% kemungkinan alel yang muncul pada frekuensi 0,05 adalah 30 individu diploid (Fung & Keenan, 2014).
KESIMPULAN Varian SNP pada gen ADAM33 berhasil dideteksi dengan metode amplifikasi PCR dan direct sanger sequencing . Metode Sekuensing Sanger dapat mengidentifikasi alel homozigot wildtype , homozigot mutan, dan heterozigot pada varian  SNP gen ADAM33 rs2280089, rs2280090, dan rs2280091.
SARAN Penelitian lanjutan dengan jumlah sampel yang lebih besar harus dilakukan untuk mengetahui apakahvarian SNP gen ADAM33 rs2280089, rs2280090, dan rs2280091 memiliki asosiasi yang positif dengan penyakit asma.
Ucapan Terima Kasih Peneliti mengucapkan terimakasih kepada partisipan yang berpartisipasi dalam penelitian ini serta untuk Yayasan dan Universitas YARSI untuk dukungan peralatan laboratorium. Penelitian ini didanai oleh Penelitian Dosen Pemula (PDP), DIKTI (No. Hibah 118/WRII/PN.00/VII/2023).

## DAFTAR PUSTAKA
Backman H, Raisanen P, Hedman L, Stridsman C, Andersson M,
Lindberg A, et al., 2017. Increased prevalence of allergic asthma from 1996 to 2006 and further to 2016- results from three population surveys. Clinical and Experimental
Allergy , 47, 1426–1435. Badan Penelitian Pengembangan Kesehatan 2019. Laporan Nasional RISKESDAS 2018. Available from: https://repository.badankebijakan.k emkes.go.id/id/eprint/3514/1/Lapo ran%20Riskesdas%202018%20Na sional.pdf [Diakses pada 28 Oktober 2023]. Deng R, Zhao F, Zhong X 2017. T1 polymorphism in a disintegrin and metalloproteinase 33 (ADAM33) gene may contribute to the risk of childhood asthma in Asians. Inflamm Res ., 66, 1–12. Fung T & Keenan K 2014. Confidence Intervals for Population Allele Frequencies: The General Case of Sampling from a Finite Diploid Population of Any Size. Plos One , 9(1), e85925. Gomes A & Korf B 2018. Chapter 5 –
Genetic Testing Techniques. Robin NH, Farmer MB, Editors. In Pediatrics Cancer Genetics (pp 47-
64).
Hall T 1999. BioEdit: A User-Friendly Biological Sequence Alignment Editor and Analysis Program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series , 41, 95-98. Howard TD, Postma DS, Jongepier H, Moore WC, Koppelman GH, Zheng SL, Xu J, et  al., 2003.
Association of a disintegrin and metalloprotease 33 (ADAM33) gene with asthma in ethnically diverse populations. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 112(4), 717-722. Li HF, Yan LP, Wang K, Li XT, Liu HX, Tan W 2019. Association between ADAM33 polymorphisms and asthma risk: a systematic review
and meta-analysis. Respiratory Research , 20:38. Shen Bo, Lin R, Wang CC, Rei J, Sun Y,
Yang YL, Lin YY 2017. ADAM33 gene polymorphism identified to be associated with asthma in a Chinese Li Population. Biomedical Reports , 6, 323-328.
Siqiao L, Wei X, Gong C, Jinmei W,
Zhangrong C, Jingmin D 2013. A disintegrin and metalloprotease 33 (ADAM 33) gene polymorphism and the risk of asthma: A meta- analysis. Human Immunology .
74(5), 648-657. Sun FJ, Zou LY, Tong DM, Lu XY, Li J, Deng CB 2017. Association between ADAM metallopeptidase domain 33 gene polymorphism and risk of childhood asthma: a meta- analysis. Brazilian Journal of Medical and Biological Research . 50(10), e6148.
Toskala E & Kennedy DW 2015. Asthma risk factors. Int Forum Allergy
Rhinol , 5, S11–6.
Tripathi P, Awasthi S, Prasad R, Husain
N, Ganesh S 2011. Association of
ADAM33 gene polymorphisms with adult-onset asthma and its severity in an Indian adult population. J Genet , 90, 265–273. Xue W, Han W, Zhou Z 2013. ADAM33 Polymorphisms are associated with asthma and a distinctive palm dermatoglyphic pattern. Molecular
Medicine Reports , 8(6), 1795-1800. Van Eerdewegh P, Little RD, Dupuis J,
Del Mastro RG, Falls K, Simon J, Torrey D, Pandit S, McKenny J, Braunschweiger K, et al., 2002. Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness. Nature , 418:
426‑430. Viyati K, Prayuni K, Zulhamidah Y,
Razari I, Yuliwulandari R 2023.
Association between rs2787094 Genetic Variants in ADAM33
Gene and Asthma in Indonesian Population: Preliminary study.
Makara Journal of Health , 27(2),
149-153. Vos T, Abajobir AA, Abbafati C, Abbas
KM, Abate KH, Abd-Allah F, Abdulle AM, Abebo TA, Abera SF, Aboyans V, et al., 2017. Global, regional, and national  incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-
2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet , 390(10100),
1211–1259. Weckx S, Del-Favero J, Rademakers R,
Claes L, Cruts M, De Jonghe P,
Van Broeckhoven, De Eijk P 2005. novoSNP, a novel computational tool for sequence variation discovery. Genome Research ,
15(3), 436-442. Zand Karimi MR, Faridhosseini R, Abbaszadegan MR, Jabbari azad F, Shirkani A, Riyahi A, Montazar M, Gholamin M 2014. Association of ADAM33 gene single nucleotide polymorphisms with allergic asthma in northeastern Iranian population. Iran J Basic Med Sci , 17:716-721. Zeinaly I, Sadeghi-Shabestari, Razavi
A,Sajay-Asbaghi, Sadigh-Eteghad, Kazemi T  2017. Investigating the Association of ADAM33 Single
Nucleotide Polymorphisms (SNPs) with Susceptibility to Allergic Asthma in Azerbaijan Population of Iran: A Case-control Study. Iran J Allergy Ashma Immunol , 16(05), 378-385.
Zheng W, Wang L, Su X, Hu XF 2015.
Association between V4 polymorphism in the ADAM33 gene and asthma risk: a meta- analysis. Genet Mol Res Gmr ., 14, 989–99.