J. Kartika Kimia , Mei 2020, 3, (1), 1-6 Journal homepage : http://jkk.unjani.ac.id/index.php/jkk P-ISSN: 2655-1322     E-ISSN: 2655-0938

## Identifikasi Mutasi DNA Daerah HV1 dan HV2 D-Loop Mitokondria dari Pasien Diabetes Mellitus Tipe 2 (DMT2)

## Identification of HV1 and HV2 D-Loop Regional Mitochondrial DNA Mutations from Type 2 Diabetes Mellitus Patients (DMT2)
Rina Budi Satiyarti 1 , Nenden Dwi Sajati 2 , dan Rahmaniar Mulyani 2
1 Universitas Islam Negeri Raden Intan Lampung
2 Universitas Jenderal Achmad Yani *E-mail: rinabudisatiyarti@radenintan.ac.id
DOI : https://doi.org/10.26874/jkk.v3i1.41
Received: 6 Dec 2019, Revised: 31 May 2020, Accepted: 31 May 2020, Online: 31 May 2020

## Abstrak
Diabetes mellitus tipe 2 (DMT2) adalah penyakit yang disebabkan oleh penurunan jumlan insulin oleh sel beta pankreas atau kerja insulin yang tidak efektif. Penyakit ini terakumulasi dari gaya hidup tidak sehat  atau  karena  keturunan.  Penyebab  DMT2  dapat  dikaitkan  dengan  disfungsi  DNA  mitokondria (mtDNA) yang disebabkan oleh penumpukkan mutasi. Daerah D-loop merupakan bagian dari mtDNA yang  memiliki  dua  daerah  yaitu  HV1  dan  HV2  dengan  laju  mutasi  paling  tinggi.  Maka,  dilakukan penelitian untuk mengidentifikasi mutasi d-loop daerah HV1 dan HV2 untuk mencari mutasi baru yang berkaitan dengan DMT2. Tahapan yang dilakukan meliputi isolasi mtDNA, amplifikasi fragmen HV1 dan HV2 dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR), visualisasi hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa, penentuan urutan nukleotida daerah HV1 dan HV2 mtDNA, dan analisis hasil sekuensing. Berdasarkan  hasil  analisis  dari  perbandingan  antara  urutan  nukleotida  sampel  dengan revised Cambridge Reference Sequence (rCRS), ditemukan mutasi 16189T>C pada sampel DM02; DM03, dan mutasi 16223C>T pada sampel DM02; DM03; DM04 daerah HV1 D-loop mtDNA, juga mutasi 73A>G pada  sampel  DM02;  DM03;  DM04  daerah  HV2  D-loop  mtDNA.  Hasil  analisis  pada  MITOMAP menunjukkan  bahwa  mutasi  16189T>C  tercatat  sebagai  mutasi  yang  terdapat  pada  diabetes,  mutasi 16223C>T tidak terkait dengan penyakit apapun, dan mutasi 73A>G terdapat pada penuaan sel otak.
Kata Kunci : Diabetes mellitus tipe 2 (T2DM), mitokondria DNA, D-loop, mutasi, MITOMAP.

## Abstract
Type 2 diabetic mellitus (T2DM) is a disease which is caused by insufficient insulin amount or ineffective insulin action to breakdown glucose. This disease is an accumulation from unhealthy lifestyle and for some people, they inherit T2DM from their parents. T2DM is related to mitochondria DNA (mtDNA) dysfunction due to DNA mutation. D-loop area is a control region in mtDNA, which is has a highest rate of DNA mutation. It divided into two areas, HV1 and HV2. Therefore, it need a lot of information to  study  T2DM  genetically.  There  three stages  in  this  research,  D-loop  DNA fragment amplification from four blood samples, namely DM01, DM02, DM03, and DM04. Sequence determination of D-loop fragment,  and  mutation  analysis.  D-loop  fragment  amplification  given  0,9  kilobase  (kb)  in  size. Sequence  DNA  determination  showed  only  three  samples  were  successful  to  be  sequenced  (DM02, DM03,  and  DM04).  Alignment  analysis  of  D-loop  fragment  and  reference  (rRCS)  show  three substitution mutations, there are 16189T>C occur in DM02 and DM03, 16233C>T occur in DM02, DM03, DM04. Both mutation located in HV1 area. While 73A>G which located in HV2 occur in DM02, DM03, and DM04. 16189T>C in MITOMAP was related to diabetic, while 16233C>T was not related to any disease, while 73A>G was related to brain death cell.
Keywords:  Type 2 diabetic mellitus (T2DM), DNA mitochondria, D-loop, mutation, MITOMAP

## 1 Pendahuluan
Diabetes  melitus  (DM)  dapat  didefinisikan sebagai  suatu  penyakit  gangguan  metabolisme yang  ditandai  dengan  peningkatan  kadar  gula darah  yang  dapat  diakibatkan  oleh  kerja  hormon insulin  yang  tidak  optimal  (insufisiensi  insulin). Insufisiensi fungsi  insulin dapat  disebabkan  oleh gangguan  produksi  insulin  oleh  sel-sel  beta Langerhans  kelenjar  pankreas,  atau  disebabkan oleh  kurang  responsifnya  sel-sel  tubuh  terhadap insulin [1]. Diabetes mellitus dibagi menjadi dua jenis yaitu diabetes mellitus tipe 1 dan 2, diabetes khusus lainnya, dan diabetes kehamilan [2].
Diabetes melitus Tipe-2 (DMT2) disebabkan oleh  faktor  pola  gaya  hidup  dan  faktor  genetik. Beberapa  faktor  pola  gaya  hidup  diketahui berpengaruh  besar  pada  pembentukan  DMT2. Diantaranya adalah fisik yang tidak aktif bergerak, merokok dan konsumsi alkohol yang berlebih [3]. Penyakit  diabetes  melitus  tipe-2  (DMT2)  ada hubungannya  dengan  mitokondria.  Mitokondria berpengaruh  dalam  sekresi  insulin  dari  sel β pankreas.  Sekresi  insulin  oleh  sel β pankreas sangat bergantung pada sintesis adenosin trifosfat (ATP)  melalui  fosforilasi  oksidatif  mitokondria [4].  Beberapa  penelitian  telah  menjelaskan hubungan mutasi DNA pada mitokondria dengan penyakit  DMT2  ini,  yaitu  pada  daerah  gen tRNA leu , gen ATP6 dan ATP8 [5-7]. Daerah pada mtDNA yang mengalami laju mutasi paling tinggi dan  menjadi  fokus  studi  dalam  pemeriksaan keterkaitan  mutasi  genetik  dan  berbagai  jenis penyakit adalah daeah D-loop [8].
Daerah  D-loop  merupakan  bagian  dari mtDNA  yang  memiliki  dua  daerah  dengan  laju mutasi  dan  tingkat  polimorfisme  paling  tinggi, yaitu  daerah  Hipervariabel  I  (HVI)  dan Hipervariabel II (HVII) [9]. Tingginya laju mutasi mtDNA  disebabkan  karena DNA  polymerase γ yang  digunakan  pada  proses  replikasi  mtDNA tidak memiliki proffreading yang dapat mengoreksi  kesalahan-kesalahan  selama  proses replikasi.  Laju  mutasi  mtDNA  5-10  kali  lebih tinggi  dibanding  laju  mutasi  DNA  inti  (nDNA) [8].
Penelitian mengenai daerah D-loop mtDNA pada penderita  diabetes  juga  telah  dilakukan  oleh Puspitaningrum dkk, (2014) pada daerah HVI D- loop  mtDNA  dari  16  pasien  penderita  DMT2. Sebanyak  30  daerah  mutasi  ditemukan  dalam 442pb (16.024-16.365). Daerah dengan frekuensi mutasi  tertinggi  ditemukan  pada  T16296C (66,6%),  C16126T  (61,1%),  C16223T  (55,5%), T16294C  (55,5%).  Penelitian  lain  mengenai
mutasi  penyebab  DMT2  pada  daerah  selain  D- loop  yaitu  daerah  Gen  tRNA leu mtDNA  telah dilakukan  oleh  Maksum et  al .  (2010)  pada  101 pasien  penderita  DMT2  isolat  Bandung  yaitu  di RS Ciumbuleuit, RS Pindad, Laboratorium Klinik Prodia, dan Laboratorium Klinik Pramita [6].
Urutan  nukleotida  pada  daerah  D-loop mtDNA  pada  setiap  manusia  sangat  bervariasi, sehingga  perlu  dilakukan  penelitian  mengenai mutasi  pada  daerah  D-loop  mtDNA  untuk mengetahui  mutasi  selain  dari  mutasi  yang  telah ditemukan pada penelitian sebelumnya. Sehingga, perlu dilakukan penelitian mengenai variasi basa nukleotida  pada  daerah  HVI  dan  HVII  D-loop mtDNA  pada  penderita  DMT2  di  wilayah  Jawa Barat.

## 2 Metode Penelitian

## 2.1 Bahan
Sampel darah diperoleh dari empat penderita Diabetes Melitus Tipe-2 dilakukan di RS Dustira Cimahi.  Rentang  usia  penderita  adalah  60-80 tahun,  dan  terdiri  dari  tiga  wanita  dan  satu  pria. Buffer  lisis  10x  (50  mM  Tris-HCl  pH  8,  1  mM EDTA  pH  8,  dan  0,5%  Tween-20),  enzim proteinase K 200 µg/mL dan ddH 2 O steril. primer M1  (5’-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’)  20 pmol/µL,
primer HV2R (5’- CTGTTAAAAGTGCATACCGCC-3’) 20
pmol/µL, DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) ( DreamTaq DNA polimerase, 2X buffer DreamTaq  Green ,  0,4  mM  dNTP,  dan  4  mM MgCl 2 ),  dan  NFW  ( Nuclease-Free  Water ), agarosa,  TAE  1x  (40  mM  Tris-asetat  dan  1  mM EDTA pH 8,0); loading buffer (sukrosa 50% dan 0,1% bromfenol biru pH 8,0); NFW; dan gel red . Penanda  ( marker ) GeneRuler TM 1  kb  DNA Ladder .

## 2.1 Tahapan Penelitian
Sampel  darah  dicuci  sebanyak  tiga  kali menggunakan  buffer  TE  1x,  hingga  sel  darah terpisahkan  dari  plasma  darah.  DNA  template diperoleh dari hasil lisis sel darah. Sel darah dilisis menggunakan buffer lisis (Bufer Tris-Cl, EDTA, Tween  80,  Proteinase  K).  Campuran  kemudian dipanaskan selama 60 menit pada suhu 50 o C, dan dipisahkan  melalui  sentrifugasi  12000  rpm. Kondisi PCR yang dilakukan terdiri dari 30 siklus, terdiri  dari  94 o C (60  detik),  50 o C  (60  detik),  dan 72 o C  (90  detik).  Primer  yang  digunakan  adalah

## M1  5’-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’  dan
HV2R  5’-CTGTTAAAAGTGCATACCGCC-3’. Sekuensing  dilakukan  oleh Macrogen  Inc . Analisis  variasi  DNA  mitokondria  dilakukan menggunakan perangkat lunak DNA STAR.

## 3 Hasil dan Diskusi
Fragmen  DNA  mitokondria  yang  mengapit daerah  HV1  dan  HVII  D-loop  mitokondria  dari
empat  sampel  berhasil  diamplifikasi  dengan ukuran  0,9  kb-1  kb  (Gambar  1).  Fragmen  ini didapatkan  dari  hasil  optimasi  suhu  penempelan primer, yaitu 49,7 o C. Adapun Kontrol positif dari keempat  sampel  adalah  templat  DNA  dari manusia yang tidak terdiagnosa DMT tipe II.
Gambar 1. (a) hasil amplifikasi fragmen DNA sampel DM2, (b) hasil amplifikasi  fragmen DNA sampel DM1, DM3, dan DM4.
Amplikon  yang  di  urutkan  nukleotidanya sebesar  6-12  µg/L.  Amplikon  ini  ternyata menghasilkan uraian nukleotida sepanjang kurang lebih  800  pasang  basa.  Urutan  nukleotida  ini  di analisa  variasi  basa  nukleotidanya,  dengan membandingkan urutan sampel dan urutan kontrol positif.
Hasil analisa urutan nukleotida menunjukkan bahwa hanya tiga sampel dari empat sampel yang dapat  di  urutkan,  yaitu  DM2,  DM3,  dan  DM4. Ketiga  sampel  tersebut  disejajarkan  urutannya dengan urutan basa daerah HVI dan HV2 D-loop mitokondria reverse Cambridge reference sequence (rCRS).  Hasil  dari  ketiga  pensejajaran tersebut  memperlihatkan  mutasi  titik  yag merupakan  mutasi  substitusi  basa  nukelotida 16189T>C,  16223C>T  pada  daerah  HVI,  dan 73A>G pada daerah HVII (Gambar 2). Diketahui
bahwa mutasi 16189T>C merupakan mutasi pada daerah  HVI  yang  terjadi  ketika  seseorang mengalami Diabetes [10]. Mutasi tersebut terdapat pada sampel DM2 dan DM3. Sedangkan, mutasi 16223C>T  terjadi  di  semua  sampel.  Mutasi  ini terdapat  juga  pada  daerah  HVI  dari  beberapa sampel mtDNA penderita DMT2 [11].
Hasil  analisis  MITOMAP  menunjukkan bahwa mutasi 16189T>C memang terkait dengan diabetes.  Sedangkan  mutasi  16223C>T  tidak terkait  dengan  penyakit  apapun.  Analisis  mutasi 73A>G  menunjukkan  keterkaitan  mutasi  ini dengan  penuaan  sel  otak.  Hal  ini  sejalan  dengan usia  manusia  yang  diambil  darahnya  sebagai sampel pada penelitian ini, yaitu rentang usia 60- 80 tahun. Dari MITOMAP juga diketahui bahwa 16189T>C,  16223C>T,  dan  73A>G  merupakan haplogrup (Tabel 1).
(a)
(b)
(c)
Gambar.2. (a) Mutasi 16189T>C pada sampel DM2 dan DM3; (b) Mutasi 16223C>T pada sampel DM2, DM3 dan DM4; (c) Mutasi 73A>G pada sampel DM2, DM3, dan DM4
Tabel. 1 Hasil analisa mutasi pada MITOMAP No Mutasi Keterangan dari MITOMAP 1. 16189T>C Terdapat pada diabetes 2. 16223C>T - 3. 73A>G Terdapat pada penuaan sel otak 4. 16189T>C, 16223C>T, 73A>G Haplogrup

## 4 Kesimpulan
Dari  empat  sampel  yang  dianalisa  ternyata ditemukan  mutasi  yang  telah  diketahui  pada bebereapa  oang  menjadi  ciri  khas  penderita diabetes.  Namun,  dengan  penelitian  ini  dapat dinyatakan  bahwa  mutasi  16189T>C  terkait dengan diabetes mellitus tipe II.

## Daftar Pustaka
[1]   Alberti  KGMM,  Zimmet  PZ.  Definition, diagnosis  and  classification  of  diabetes mellitus  and  its  complications.  Part  1: diagnosis  and  classification  of  diabetes mellitus.  Provisional  report  of  a  WHO Consultation. Diabet Med . 1998. 15(7):539– 53. http://dx.doi.org/10.1002/(sici)1096- 9136(199807)15:7%3C539::aid- dia668%3E3.0.co
[2]   Wulandari, Retno D, Sugiri, Yani J. Diabetes Melitus  dan  Permasalahannya  pada  Infeksi Tuberkulosis. J Respir Indo . 2013. 33(2).
[3]   Olokoba  AB,  Obateru  OA,  Olokoba  LB. Type 2 diabetes mellitus: a review of current trends. Oman  Med  J .  2012.  27(4):269–73. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23071876
[4]   Chinnery  PF,  Mowbray  C,  Patel  SK,  Elson JL,  Sampson  M,  Hitman  GA,  et  al. Mitochondrial DNA haplogroups and type 2 diabetes:  a  study  of  897  cases  and  1010 controls. J Med Genet . 2007. 44(6):e80–e80. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17551080
[5]   Sriwidodo  O,  Subroto  T,  Maksum  P.  Study Mutasi  Titik  A3243G  DNA  Mitokondria Penyebab Maternally Inherited Diabetes and Deafness. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2008.
:121–9.
[6]   Maksum  IP,  Sriwidodo,  Suprijana  O, Natadisastra  G,  Nuswantara  S,  Noer  AS. Identifikasi  Mutasi  Heteroplasmi  A3243G DNA  Mitokondria  dan  Studi  Pewarisan Maternal pada Pasien Diabetes Melitus Tipe 2. Bionatura-Jurnal  Ilmu-ilmu  Hayati  dan Fis . 2010. 12(2):78–85.
[7]   Maksum  IP,  Silaen  M.,  Suprijana  O, Natadisastra  G,  Nuswantara  S.  Mutasi  Baru G9053A  DNA  Mitokondria  pada  Pasien Diabetes  Tipe  2  Maternal  dan  Katarak  dan Pengaruh  Mutasi  terhadap  Struktur  Subunit ATP6. In: I-MHERE. 2011.
[8]   Palit  EIY,  Ngili  Y.  Kuantifikasi  dan Filogenetika  Mutasi  DNA.  Yogyakarta: Innosain; 2016.
[9]   Anderson  S,  Bankier  AT,  Barrell  BG,  de Bruijn  MHL,  Coulson  AR,  Drouin  J,  et  al. Sequence  and  organization  of  the  human mitochondrial genome. Nature . 1981.
290(5806):457–65. http://dx.doi.org/10.1038/290457a0
[10]  Poulton J, Brown MS, Cooper A, Marchington DR, Phillips DIW. A common mitochondrial  DNA  variant  is  associated with  insulin  resistance  in  adult  life.
Diabetologia . 1998. 41(1):54–8. http://dx.doi.org/10.1007/s001250050866
[11]  Puspitaningrum  R,  Maududi  A,  Ferania  M, Adiyanto  C,  Fitri  AL,  Evriyani  D,  et  al. Analysis  of  Hypervariable  Region  1D-Loop mtDNA Mutation in Diabetes Mellitus Type 2 Patients. Adv Sci Eng Med . 2014. 6(1):114– 8. http://dx.doi.org/10.1166/asem.2014.1450