DOI: 10.6066/jtip.2015.26.2.179 Hasil Penelitian

## AKTIVITAS  ANTIBAKTERI  DAN ANTIOKSIDAN  HIDROLISAT  HASIL  HIDROLISIS PROTEIN SUSU KAMBING  DENGAN EKSTRAK KASAR  BROMELIN
[Antibacterial and Antioxidant Activity of Hydrolysate from Goat Milk Protein Hydrolized by Crude Bromelain Extract]
Eni Kusumaningtyas 1,2) ,  Raphaella Widiastuti 1) , Harsi Dewantari Kusumaningrum 2) , dan Maggy Thenawidjaja Suhartono 2) *
1) Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl RE Martadinata 30 Bogor, Bogor
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor,  Bogor
Diterima 03 Agustus  2015 / Disetujui 02 November 2015

## ABSTRACT
Goat  milk  is  highly  nutritious  foodstuffs  that  b eneficial  for  improving  health.  The  milk  contains b ioactive  peptides  which  produced  b y  hydrolysis  process.  The  aim  of  this  study  was  to  evaluate antib acterial and antioxidant activities of hydrolisate produced from hydrolysis of goat milk protein b y crude b romelain extract. Hydrolysis of goat milk protein was conducted using crude b romelain (0.1 U/mL) at pH 6, 50°C for 60 min. Hydrolysate was fractionated b y using memb rane molecular weight cut off 10 kD a. hydrolysate b efore and after fractionation were assayed for antib acterial and antioxidant activities. Toxicity of the Hydrolysate was determined b y hemolysis assay. The result showed that the  hydrolysate b efore and after  fractionation  inhib ited  growth of E. coli, S. Typhimurium and L. monocytogenes. Hydrolysate after fractionation has higher antib acterial activity indicated that fractionation was ab le to improve antib acterial activities  of  the  hydrolysate  fraction.  The  hydrolysate  showed  scavenging  activity  to  ABTS  and  DPPH radicals.  Fraction  <10  kDa  has  the  highest antioxidant activity against b oth ABTS and DPPH radicals. Hemolysis assay showed that hydrolysate b efore and after fractionation did not cause lysis of red b lood cells,  indicating  safe  for  application.  Both  fraction  <10  kDa and >10 kDa not only showed ab sence of hemolysis  b ut  also  they  were  ab le  to  reduce  autolysis  of  red  b lood  cells.  The  result  showed  that hydrolysate from goat milk hydrolyzed b y b romelain were ab le to b e antib acterial and antioxidant.
Keywords: antib acterial, antioxidant, b romelain, goat milk , hydrolysate

## ABSTRAK
Susu  kambing  merupakan  bahan pangan bernutrisi tinggi yang bermanfaat untuk meningkatkan kesehatan. Susu mengandung peptida bioaktif yang dapat dihasilkan melalui proses hidrolisis. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi aktivitas antibakteri dan antioksidan hidrolisat yang dihasilkan dari  hidrolisis  protein  susu  kambing  dengan  bromelin.  H idrolisis  protein  susu  kambing  dilakukan menggunakan ekstrak kasar bromelin (0,1 U/mL) pada pH 6, 50 ° C selama 60 menit. Hidrolisat difraksinasi menggunakan membran molecular weight cut off 10 kDa. Hidrolisat sebelum dan sesudah fraksinasi diuji kemampuan  antibakteri  dan  antioksidannya.  Toksisitas  hidrolisat  dan  hasil  fraksinasinya  ditentukan dengan uji hemolisis. Hasil menunjukkan bahwa hidrolisat sebelum dan sesudah fraksinasi dapat meng- hambat  pertumbuhan E.  coli,  S. Typhimurium   dan L.  monocytogenes. Hidrolisat  setelah  fraksinasi mempunyai aktivitas antibakteri lebih tinggi yang mengindikasikan bahwa fraksinasi dapat meningkatkan aktivitas  antibakteri.  Fraksi  hidrolisat  juga  menunjukkan  aktivitas  netralisasi  radikal ABTS dan DPPH. Fraksi <10 kDa mempunyai aktivitas antioksidan yang paling tinggi terhadap radikal ABTS dan DPPH. Uji hemolisis menunjukkan bahwa hidrolisat sebelum dan sesudah fraksinasi tidak menimbulkan lisis pada sel darah merah menandakan  aman untuk diaplikasikan.  Kedua fraksi <10 kDa dan >10 kDa tidak hanya menunjukkan ketidakberadaan hemolisis tetapi juga dapat menurunkan autol isis pada sel darah merah. Hasil tersebut menunjukkan bahwa susu kambing yang dihidrolisis dengan bromelin dapat berfungsi sebagai antibakteri dan antioksidan.
Kata kunci: antibakteri, antioksidan, bromelin, hidrolisat, susu kambing
PENDAHULUAN 1
Susu  merupakan  bahan  pangan  bernutrisi tinggi  yang  ditandai  dengan  keseimbangan  asam
*Penulis Korespondensi: E-mail:  mthenaw idjaja@yahoo.com
aminonya  dan  dapat  meningkatkan  kesehatan.  Susu juga  dapat  menjadi  sumber  peptida  bioaktif  dengan fungsi  biologis  yang  luas (Szwajkowska et al., 2011).
Peptida  bioaktif  yang  berasal  dari  protein  susu sapi  telah  banyak  dilaporkan,  diantaranya  adalah peptida  yang  dapat  berfungsi  sebagai  antihipertensi (Mos-lehishad et  al., 2013),  antibakteri  (Atanasova dan  Ivanova  2010)  antitrombotik,  opioid,  opioid  anta- gonis, immunomodulator, antifungi, mencegah amnesia,  dan  optimalisasi  kontrol  kontraksi  dan relaksasi  otot  polos  (Szwajkowska et  al., 2011) misalnya pada  kandung  kemih (Uckert et al . , 2002). Susu kambing telah lama dimanfaatkan sebagai  pengganti  susu  sapi  terutama  yang  mem- punyai  risiko  alergi  terhadap  protein  susu  sapi. Meskipun  demikian,  laporan  mengenai  pemanfaatan susu  kambing  sebagai  penghasil  peptida  bioaktif belum  banyak  dilaporkan.  Beberapa  peptida  bioaktif hasil  hidrolisis  enzimatik  susu  kambing  yang  telah teridentifikasi  adalah  peptida  antibakteri  (Almaas et al., 2011),  antioksidan  (Li et  al., 2013)  dan  peng- hambat Angiotensin converting  enzyme (ACE) (Nandhini et  al., 2012).  Peptida-peptida  tersebut biasanya  masih  terikat  dalam  protein  alamiahnya dan  dapat  diisolasi  melalui  proses  hidrolisis.    Bebe- rapa  enzim  yang  dapat  digunakan  untuk  meng- hidrolisis  protein  adalah  enzim  dari  pencernaan hewan  seperti  tripsin,  kimotripsin  dan  pepsin,  dari tanaman  seperti  bromelin  dan  papain  atau  enzim yang  dihasilkan  oleh  bakteri  misalnya  alkalase  dari Bacillus  licheniformis (Li et  al . , 2016).  Keberhasilan untuk  mendapatkan  potongan  peptida  yang  bersifat bioaktif  sangat  ditentukan  oleh  sumber  protein  dan spesifitas  enzim,  sehingga  pemilihan  enzim  merupa- kan  tahap  penting  untuk  mendapatkan  peptida bioaktif  dan  akan  menentukan  bioaktivitas  peptida yang  dihasilkan  (Kumar et  al . , 2013).  Bromelin dihasilkan  dari  buah  nanas  yang  banyak  tersedia  di Indonesia.  Kelebihan  bromelin  dibandingkan  dengan protease  tanaman  yang  lain  adalah  bromelin  mudah diperoleh  dan  tersedia  dari  awal  perkembangan buah  sampai  buah  matang  meskipun  ada  fluktuasi pada  aktivitas  proteolitiknya  (Maurer,  2001).  Pro- tease  dari  buah  lain  seperti  tin  dan  papaya,  ficin  dan papain  hanya  ditemukan  ketika  buah  masih  hijau dan  protease  menghilang  setelah  buah  masak (Bartholomew et  al., 2003).  Selain  itu,  bromelin  juga aktif  baik  dalam  bentuk  enzim  murni  maupun  masih dalam bentuk jus buah  nanas.  Pemanfaatan bromelin  untuk  menghasilkan  peptida  bioaktif  dari susu kambing  belum  pernah  dilaporkan.
Bromelin  termasuk  dalam  sistein  protease  yang dapat  diisolasi  dari  buah  nanas.  Bromelin  juga merupakan  endoprotease  yang  memecah  protein menjadi  peptida  (Arshad et  al . , 2014).  Bromelin memecah  protein  pada  ujung  karbonil  asam  amino lisin,  alanine,  tirosin  dan  glisin  (Godfrey  dan  Reichel, 1983).  Bromelin  dapat  digunakan  untuk  mem- produksi  peptida  bioaktif  seperti  peptida  antimikroba dari  protein  ikan Meuschenia  sp. yang  dapat  meng- hambat Staphylococcus  aureus dan Bacillus  cereus
(Salampess y  et  al . , 2010)  Hidrolisis  protein  oleh protease  seperti  bromelin  menghasilkan  hidrolisat yang  mengandung  campuran  peptida  yang  bersifat bioaktif  maupun  yang  tidak  mempunyai  aktivitas. Oleh  karena  itu,  diperlukan  fraksinasi  pemekatan dan  pemurnian  peptida  bioaktif.  Beberapa  metode dapat  digunakan  untuk  mengisolasi  peptida  bioaktif yang  diinginkan  dan  memisahkan  dari  protein  yang tidak  terhidrolisis  atau  kontaminan  lainnya.  Salah satunya  adalah  pemisahan  menggunakan  membran molecular  weight  cut  off (MWCO).  Filtrasi  tersebut mampu  memekatkan  peptida  yang  diinginkan  ber- dasarkan  berat  molekul  tertentu  (Vandanjon et  al . , 2007).  Metode  filtrasi  tersebut  dinilai  mudah  untuk digunakan  dalam  skala  besar  dengan  biaya  yang lebih  murah  dibandingkan  dengan  metode  kromato- grafi  cair (Muro et al., 2013).
Pada  penelitian  ini  bromelin  digunakan  untuk menghidrolisis  protein  susu  kambing  dan  selanjut- nya  hidrolisat  yang  dihasilkan  diuji  aktivitas  anti- bakteri  dan  antioksidannya.  Pada  uji  antioksidan digunakan  dua  metode  yaitu  pengujian  mengguna- kan  [2,  2’- azino-bis (3- ethylbenzthiazoline -6- sulpho- nic  acid )]  (ABTS)  dan  2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)  untuk  membandingkan  dan  mendapatkan metode  yang  sesuai  untuk  sampel  hidrolisat  susu kambing.  Hidrolisat  tersebut  mengandung  peptida- peptida  yang  dapat  berfungsi  sebagai  antibakteri sekaligus  antioksidan  dan  akan  membuka  peluang untuk  pemanfaatan  peptida  bioaktif  dari  susu kambing  sebagai  ingredien  pangan  fungsional  di masa depan.

## BAHAN  DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah  susu  kambing  peranakan  Ettawa  (PE)  di- peroleh  dari  peternakan  kambing,  Fakultas  Peterna- kan  Institut  Pertanian  Bogor.  Buah  nanas  bogor mengkal  diperoleh  dari  pasar  di  kota  Bogor  dan mikroorganisme  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah Escherichia  coli (ATCC  25922), Salmonella enterica sub  spesies  enterica  serovar Salmonella Typhimurium  (ATCC  13311)  dan Listeria  mono- cytogenes (ATCC  15313).

## Persiapan susu  kambing
Lemak  yang  terkandung  pada  susu  segar dipisahkan  dengan  sentrifugasi  6000×g  (Hybrid refrigerated centrifuge, CAX-371, Tomy Seiko, Japan)  pada  suhu  4°C  selama  15  menit.  Susu bebas  lemak  selanjutnya  dihidrolisis  atau  disimpan pada  -20°C  sampai  digunakan.

## Penentuan kadar protein
Pengukuran  kadar  protein  dilakukan  meng- gunakan  larutan  Bradford  (Quick  start TM Bradford
protein  assay,  Bio-Rad  Inc,  Philadelphia,  USA). Kurva  standa r  dibuat  dengan  mereaksikan  5  μL larutan standar  Bovine  serum  albumin  (BSA) dengan  b erbagai  konsentrasi  dengan  95  μL  larutan Bradford.  Perlakuan  yang  sama  dilakukan  pada sampel  protein  dan  aquades  sebagai  blanko. Larutan  didiamkan  selama  5  menit  dan  diukur  absor- bansinya  pada λ=  600  nm  (Labsystems,  original Multiscan Ex, Champaign,  USA).

## Ekstraksi  dan penentuan aktivitas enzim
Bromelin diekstrak  dengan  menghancurkan buah  nanas  muda  tanpa  kulit  menggunakan food processor .  Jus  yang  diperoleh  selanjutnya  disaring menggunakan  kertas  saring  Whatman  No.  41 (Sigma-  Aldrich,  USA),  ditambahkan  aseton  (Sigma- Aldrich,  USA)  dengan  perbandingan  1:1  (v/v)  dan disimpan  pada  suhu  4°C  semalam.  Larutan  disen- trifugasi  (micro  ultracentrifuge  CS  150  NX,  Hitachi, Japan)  pada  suhu  4°C  6000  ×g  selama  15  menit. Endapan  kemudian  dicampur  dengan phosphate buffer  saline (PBS)  pH  7,4  dengan  perbandingan  1:1 (w/v)  (Rowan et  al., 1990).  Penentuan  aktivitas enzim  dilakukan  menggunakan  metode  Bergmeyer dan  Grassel  (1983)  dengan  mereaksikan  250 μL kasein  (Oxoid,  UK)  dengan  konsentrasi  2%  (w/v) dengan 50  μL  enzim  dan  250  μL PBS 0,05 M pH 7. Campuran  reaksi  diinkubasi  pada  suhu  37°C selama 10  menit  kemudian  ditambahkan  500  μL  TCA (Sigma-Aldrich,  USA)  0,2  M.  Larutan  diinkubasi kembali  pada  suhu  37°C  selama  10  menit,  disen- trifugasi  2000×g  (centrifuge  MRX-152,  Tomy  Seiko, Japan) selama  10  menit.  Supernatan  375  μL  dicam- purkan  dengan  125 0  μL  Na 2 CO 3 0,4  M  dan  ditam- bahkan  250  μL  pereaksi Folin  ciolcateau (Merck, Damstardt,  Germany)  dengan  pengenceran  1:2  (v/v) dan  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  20  menit. Absorbansi  diukur  dengan  spektrofotometer  (LKB- Novaspec  II,  Pharmacia-Biotech)  pada λ  578  nm. Aquades  digunakan  sebagai  blanko  dan  sebagai standar  digunakan  larutan  tirosin  (Sigma-Aldrich, USA)  5  mM.  Satu  unit  aktivitas  didefinisikan  sebagai jumlah  enzim  yang  dapat  menghasilkan  satu  μmol tirosin permenit  pada  kondisi  pengujian.

## Hidrolisis  protein susu  kambing
Hidrolisis  dilakukan  pada  suhu  50°C,  pH  6 selama  60  menit  dengan  aktivitas  bromelin  0,1 unit/mL  dengan  perbandingan  enzim:substrat  1:4 (v/v).  Hidrolisat  yang  diperoleh  sebagian  digunakan langsung  untuk  uji  antibakteri  dan  antioksidan, sebagian  lagi  difraksinasi  menggunakan  membran cut  off 10  kDa  (AMICON  Ultra  centrifugal  units, Merck  Millipore  Ltd.,  Darmstadt,  Germany).  Masing- masing  fraksi  peptida  yang  diperoleh  yaitu  <10  kDa dan  >10  kDa  diuji  aktivitas  antimikroba  dan  anti- oksidannya.
Sodium dodecyl sulphate-polyacrilamide  gel electrophoresis (SDS-PAGE)
Penentuan  berat  molekul  peptida  dilakukan menggunakan  SDS-PAGE  (Laemmli,  1970)  dengan komposisi  gel  penahan  4%  dan  gel  pemisah  10% untuk  protein  dan  18%  untuk  peptida  (Anderson et al., 1983).  Elektroforesis  dilakukan  pada  tegangan 100  Volt.  Pewarnaan  dilakukan  menggunakan  com- masie  blue  (Sigma-Aldrich,  USA)  untuk  protein  susu kambing  dan silver  staining kit  (Sigma-Aldrich,  USA) untuk peptida.
Karakterisasi peptida dengan reverse-phase high  performance  liquid  chromatography (RP- HPLC)
Karakterisasi  peptida  dalam  hidrolisat  dilaku- kan  menggunakan  HPLC  (Waters,  Massachuset, USA)  berdasarkan  metode  McCann et  al. (2006). Sampel  hidrolisat  dimasukkan  ke  dalam  kolom HPLC  C- 18  (5  μm,  4.6  x  250  mm,  Xterra,  Waters, Massachuset,  USA).  Elusi  hidrolisat  dilakukan dengan  menggunakan  gradient  acetonitril  (ACN) (Sigma-Aldrich,  USA)  dan  trifuoroacetic  acid  (TFA) (Sigma-Aldrich,  USA)  yang  terdiri  dari  larutan  A 0,1%  TFA  (v/v)  dalam  ACN  dan  larutan  B  0,1%  (v/v) TFA  dalam  air  tanpa  ion  ( deionized  water ).  Sistem HPLC  diseimbangkan  dengan  95%  larutan  B  selama 5  menit,  diikuti  gradien  linier  5-45%  (v/v)  larutan  A selama  20  menit  untuk  mengelusi  peptida  dan kemudian  diseimbangkan  kembali  dengan  95%  (v/v) larutan  B  selama  5  menit.  Absorbansi  diukur  pada panjang  gelombang  215  nm  yang  merupakan panjang  gelombang  spesifik  untuk  peptida  (Driver dan  Raynie,  2007).

## Uji antibakteri
Pengujian  antibakteri  dilakukan  berdasarkan metode  Lopez-Exposito et  al .  (2007)  dengan  men- campurkan  100  μL  bakteri  uji  10 6 CFU/mL  dengan 100  μL  peptida  dengan  konsentrasi  1 mg protein/mL dalam  mikroplate  kemudian  diinkubasi  pada  suhu 37°C  selama  2  jam.  Setelah  2  jam,  campuran  di- encerkan dan masing-masing  pengenceran  di- tumbuhkan  pada  media Mueller  Hinton  Agar (Oxoid, UK)  dan  diinkubasi  kembali  pada  suhu  37°C  selama 24  jam.  Jumlah  koloni  yang  tumbuh  dihitung. Pengujian  dilakukan  dengan  3 kali ulangan.

## Pengujian antioksidan
Pengujian  antioksidan  dilakukan  berdasarkan metode  Thaipong et  al. (2006) menggunakan  [2,  2’- azino-bis (3- ethylbenzthiazoline -6- sulphonic  acid )] (ABTS)  (Sigma-Aldrich,  USA)  dan  2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, USA) . Larutan  stok  ABTS  dibuat  dengan  melarutkan  ABTS dalam deionized  water sehingga  diperoleh  konsen- trasi  7,4  mM.  Larutan  stok  potassium  persulfat (Sigma-Aldrich,  USA)  dibuat  dengan  konsentrasi  2,6
mM.  Untuk  larutan  yang  akan  direaksikan  dibuat dengan  mencampurkan  larutan  stok  ABTS  dengan larutan  stok  potassium  persulfat  dengan  per- bandingan  1:1  (v/v).  Reaksi  oksidasi  dilakukan dalam  kondisi  gelap  selama  16-18  jam.  Selanjutnya larutan diencerkan dengan deionized water sehingga  diperoleh  absorbansi  1,1±0,02  unit  pada panjang  g elombang  405  nm.  Sebanyak  100  μL peptida  sebelum  atau  setelah  fraksinasi  dengan konsentrasi  0,1  mg  protein/mL  dicampurkan  dengan 200  μL  radikal  ABTS  dalam  mikroplate  dan  diletak- kan  pada  suhu  ruangan  selama  10  menit.  Pengukur- an  absorbansi  dilakukan  pada λ  405  nm  (Lab- systems,  original  Multiscan  Ex,  Champaign,  USA). Untuk  standar  antioksidan  digunakan  vitamin  C  p.a. pada  berbagai  konsentrasi.  Pengujian  mengguna- kan DPPH dilakukan berdasarkan kombinasi metode  Thaipong et  al. (2006)  dan  Clarke et  al. (2013)  dengan  menambahkan  etanol  96%  pada DPPH  sehingga  diperoleh  absorbansi  1,1±0,05  pada λ=540  nm.  Sebanyak  100  μL  hidrolisat  dan  fraksi peptida  dengan  konsentrasi  0,1  mg  protein/mL ditambahkan  dengan  200 μL  DPPH,  dibiarkan selama  30  menit  dan  absorbansi  campuran  diukur pada  λ  540  nm  (Labsystems,  original  Multiscan  Ex, Champaign, USA). Untuk standar antioksidan digunakan  vitamin  C  p.a  pada  berbagai  konsentrasi. Aktivitas  antioksidan  pada  uji  ABTS  dan  DPPH dihitung  berdasarkan  persamaan:
Aktivitas antioksidan ( ) = A blangko A sample A blangko 100 Keterangan: A blangko  : absorbansi hasil reaksi larutan
ABTS/DPPH  dan deionized  water A sampel  :  selisih  absorbansi  antara  sampel  (hasil reaksi  peptida  dan  ABTS/DPPH)  dan kontrol  peptida

## Uji hemolisis
Uji  hemolisis  dilakukan  berdasarkan  metode Lorenzon et  al. (2012)  dan  Nguyen et  al .  (2011).  Sel darah  merah  ayam  dicuci  dengan  0,01  M  Tris-HCl (pH  7,4)  yang  mengandung  0,15  M  NaCl  (Tris-salin) kemudian  disentrifugasi  pada  1000×g  (Microspin  12, Biosan,  EU)  supernatan  dibuang  dan  pelet  dicuci lagi  sebanyak  2  kali.  Suspensi  0,1%  sel  darah merah  dibuat  dengan  melarutkan  kembali  sel  darah merah  dengan  larutan  Tris- salin.  Sebanyak  100  μL peptida  ditambahkan dengan  100  μL  sel  darah merah  0,1%,  diinkubasi  selama  2  jam  pada  suhu 37°C, kemudian disentrifugasi pada 2000×g (Microspin  12,  Biosan,  EU)  selama  5  menit.  Super- nat an  dipisahkan  dan  diambil  100  μL,  dimasukkan ke  dalam  mikroplate.  Absorbansi  diukur  pada panjang  gelombang  540  nm  (Labsystems,  original Multiscan  Ex,  Champaign,  USA).  Triton  X-100
(Sigma-Aldrich,  USA)  digunakan  sebagai  kontrol positif  untuk  lisis  100%  dan  Trissalin  sebagai  kontrol negatif.  Pengujian  dilakukan  dengan  3 kali ulangan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Profil  susu  kambing  dan  peptida  dengan  SDS- PAGE
Hasil  analisis  SDS-PAGE  susu  kambing  seperti terlihat  pada  Gambar  1,  jalur  1.  Apabila  dibanding- kan  dengan  SDS-PAGE  susu  kambing  oleh  Munoz et  al .  (2004)  pita  protein  pada  penelitian  terlihat  lebih banyak, kemungkinan disebabkan konsentrasi sampel  dan  pewarnaan  yang  menyebabkan  pita protein  pada  Munoz et  al .  (2004)  sangat  tipis  dan kurang  jelas.  Menurut  Munoz et  al .  (2004)  pita antara  20-35  kDa  teridentifikasi  sebagai  casein  dan tiga  pita  lainnya  merupakan  α-lactalbumin,  β- lactoglobulin  dan  serum  albumin  (Gambar  1,  jalur G).
Gambar  1.  SDS-PAGE  susu  kambing,  M:  marker,
G:  susu  kambing  (Munoz et  al., 2004).
1.  Susu  kambing  sebelum  dihidrolisis,
2.  Susu  kambing  setelah  dihidrolisis dengan  enzim  bromelin  selama  60 menit,  konsentrasi  gel  10%,  pewarnaan dengan coomassie  blue .  3.  Marker,  4. Peptida  hasil  hidrolisis  susu  kambing menggunakan  enzim  bromelin  selama 60  menit,  konsentrasi  gel  18%,  pewar- naan  dengan  pewarna silver
Hidrolisis  protein  susu  kambing  dengan  bro- melin  menghasilkan  peptida-peptida  dengan  berat molekul  rendah  (Gambar  1).  Berdasarkan  kandung- an  proteinnya,  protein  susu  telah  terhidrolisis  90% (dari  kadar  protein  susu  kambing  50  mg/mL  menjadi 5  mg/mL  pada  hidrolisat).  Hasil  tersebut  menanda- kan  bahwa  hampir  semua  protein  susu  telah  terhi- drolisis.  Peptida-peptida  yang  dihasilkan  mempunyai berat  molekul  antara  12-35  kDa  (Gambar  1, jalur  4).
M G 1 2 97,4 66,2 45,0
31,0 21,5 14,4 kDa 3 4
42 26 17 10 4,6 kDa

## Karakterisasi  peptida dengan RP-HPLC
Karakterisasi dilakukan menggunakan RP- HPLC  dengan  panjang  gelombang  215  nm  yang spesifik  untuk  peptida.  Kromatogram  menunjukkan adanya  4  puncak  peptida  (Gambar  2).  Berdasarkan waktu  retensinya  yaitu  antara  1.9 –2.6  menit  menun- jukkan  peptida  tersebut  terdeteksi  pada  waktu  fase gerak  dalam  kondisi  hidrofilik,  menandakan  bahwa peptida-peptida  tersebut  bersifat  hidrofilik.  Per- mukaan  sisi  hidrofobik  bertanggungjawab  pada pembentukan  dan  pertahanan  struktur  spasial, interaksi  peptida,  termasuk  ikatan  dengan  membran sel,  pengenalan  antar  peptida  atau  protein  dan  pem- bentukan  komplek  dengan  suatu  senyawa  (Mundi dan  Aluko,  2014).  Pada  peptida  antimikroba, informasi  tentang  karakter  hidrofobisitas  akan  mem- berikan  pemahaman  lebih  jauh  tentang  mekanisme kerja  dan  berpengaruh  pada  bioaktivitasnya  (Zhao et  al., 2013).  Semakin  besar  hidrofobisitas  dan muatan  positif  suatu  peptida  maka  semakin  besar pula  kemampuan  antimikrobanya  (Yin et  al., 2012). Hidrofobisitas  juga  menentukan  spesifisitas  peptida antibakteri  sehingga  hanya  bakteri  patogen  yang menjadi  target  sedangkan  flora  normal  tidak  ter- pengaruh.  Menurut  Huang et  al .  (2014),  peptida antibakteri  dapat  didesain  untuk  meningkatkan  spe- sifitas  dan  aktivitasnya  melalui  penggantian  asam amino  hidrofobik  atau hidrofilik.
Pada  penelitian  ini  protein  dan  peptida-peptida pada hidrolisat bersifat hidrofilik. Meskipun demikian,  hidrolisat  dan  hasil  fraksinasinya  masih menunjukkan  aktivitas  antimikroba.  Menurut  Yin et al .  (2012)  aktivitas  antimikroba  suatu  peptida ditentukan  oleh  keseimbangan  antara  hidrofobisitas dan  distribusi  muatan.  Hidrofobisitas  yang  tinggi justru  dapat  meningkatkan self-association yang dapat mengurangi kemampuan antimikrobanya. Distribusi  muatan  positif  yang  seimbang  pada  ujung terminal  peptida  dapat  mengembalikan  kemampuan antimikroba tersebut. Hidrolisat  hasil  hidrolisis protein susu kambing  dengan  bromelin  pada
penelitian  ini  belum  dipisahkan  dan  disekuens ing sehingga  masih  sulit  untuk  menentukan  pengaruh hidrofilisitas  terhadap  aktivitas  antimikrobanya.

## Aktivitas  antibakteri
Hasil  pengujian  antibakteri  menunjukkan  bahwa peptida  sebelum  dan  sesudah  fraksinasi  dapat menghambat  pertumbuhan E.  coli,  S. Typhimurium dan  L.  monocytogenes (Gambar  3).  Pada E.  coli , fraksi  >10  kDa  menunjukkan  penghambatan  yang lebih  baik  dibandingkan  dengan  peptida  sebelum fraksinasi  maupun  fraksi  <10  kDa.  Untuk S. Typhimurium  dan L.  monocytogenes ,  fraksinasi dapat  meningkatkan  aktivitas  antibakterinya.
Hasil  pengujian  antibakteri  juga  menandakan bahwa  peptida  yang  berukuran  besar  maupun  kecil mempunyai  aktivitas  antibakteri.  Aktivitas  antibakteri peptida  tersebut  berbeda  dengan  hasil  hidrolisis kasein  susu  sapi  dengan  protease Lactobacillus acidophilus DPC6026  yang  menunjukkan  bahwa peptida  dengan  ukuran  >10  kDa  tidak  mempunyai aktivitas  antibakteri  (Hayes et  al., 2006).  Perbedaan sumber  protein  dan  spesifitas  enzim  menyebabkan perbedaan  ukuran  dan  aktivitas  peptida  yang dihasilkan.  Berdasarkan  aktivitas  antibakteri,  peng- hambatan  tertinggi  terjadi  pada L.  monocytogenes fraksi  <10  kDa.  Pada L.  monocytogenes ,  aktivitas hidrolisat  lebih  tinggi  daripada  fraksi  >10  kDa  dan aktivitas  tertinggi  pada  fraksi  <10  kDa.  Berdasarkan hasil  tersebut  kemungkinan  peptida  yang  aktif sebagai  antimikroba  banyak  terkandung  pada  fraksi <10  kDa,  sehingga  ketika  dipisahkan  maka  aktivitas fraksi  >10  kDa  lebih  rendah  dibandingkan  dengan hidrolisat  yang  merupakan  campuran  fraksi  <10  kDa dan  >10  kDa.  Menurut  Lopez-Solanilla et  al. (2003) kerentanan L.  monocytogenes terhadap  peptida antimikroba  juga  tergantung  pada  suhu. L.  mono- cytogenes menjadi  sangat  rentan  terhadap  peptida antimikroba  pada  suhu  37°C  dan  menjadi  resisten pada  suhu  20°C.
Gambar  2.  Kromatogram Reverse-Phase  High  Performance  Liquid  Chromatography (RP-HPLC)  dari peptida hasil hidrolisis susu kambing dengan  enzim bromelin  selama 60 menit pada  λ=215 nm
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 Waktu (Menit)
1,946 2,251 2,403 2,522 AU 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6
0,4
0,2 0,0
1,272
0,788 0,752 0,588 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Kontrol Hidrolisat <10 kDa >10 kDa 1 0 6 C F U /m L E. co li Perlakuan 0,718 0,581 0,324 0,413 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Kontrol Hidrolisat <10 kDa >10 kDa 1 0 6 C F U /m L S. T yp h im u ri u m Perlakuan 1,315 0,84 0,387 1,139 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Kontrol Hidrolisat <10 kDa >10 kDa 1 0 6 C F U /m L L . m o n o cy to g e n e s

## Perlakuan
Gambar  3.  Hasil  uji  antibakteri  terhadap  peptida hasil  hidrolisis  susu  kambing  sebelum fraksinasi  (hidrolisat)  dan  setelah  frak- sinasi  menggunakan  membran cut  off 10  kDa.  Pengujian  dilakukan  terhadap E.  coli (A), S. Typhimurium  (B)  dan L. monocytogenes (C)
Pada  penelitian  ini  inkubasi  dilakukan  pada suhu  37°C  yang  mungkin  membuat  aktivitas  peptida hasil  hidrolisis  susu  kambing  dengan  bromelin  fraksi <10  kDa  terhadap L.  monocytogenes lebih  tinggi dibandingkan  aktivitasnya  terhadap E.  coli dan S. Typhimurium. L.  monocytogenes merupakan  bakteri psikrofilik  yang  mampu  tumbuh  dan  berkembang biak  pada  suhu  rendah  (Saha et  al., 2015). L.  mono- cytogenes mengembangkan resistensi terhadap
peptida  antimikroba  pada  suhu  yang  lebih  rendah dengan  mengubah  komposisi  membran  sitoplasma dan  meningkatkan  ketebalan  dinding  sel  (Mendoza et  al., 1999).  Lebih  lanjut,  Dare et  al. (2014)  menya- takan  bahwa  proporsi  lipida  seperti  lisillcardiolipin dan  lisilfosfatidilgliserol  berubah  dengan  turunnya suhu  lingkungan  dan  meningkatkan  kemampuan bertahan L.  monocytogenes dari  peptida  anti- mikroba.
Pada  Gambar  3.  terlihat  bahwa  fraksi  >10  kDa efektif  pada S.  aureus ,  sedangkan  fraksi  <10  kDa lebih  efektif  pada S. Typhimurium dan L.  mono- cytogenes .  Dari  hasil  tersebut  terlihat  bahwa  fraksi peptida  tertentu  spesifik  terhadap  bakteri  tertentu pula.  Menurut  Mondhe et  al .  (2014)  peptida  anti- bakteri  secara  alamiah  atau  hasil  modifikasi  bersifat spesifik  spesies,  yaitu  peptida  tersebut  hanya  efektif terhadap  bakteri  tertentu  sehingga  peptida  dapat membunuh  bakteri  patogen  tanpa  harus  mematikan flora  normal.  Peptida  antibakteri  berinteraksi  dengan membran  sel  bakteri  melalui  interaksi  muatan  positif peptida  dengan  muatan  negatif  pada  permukaan  sel bakteri.  Mekanisme  selanjutnya  tergantung  pada tipe  peptida.  Secara  umum  dapat  dipisahkan  peptida yang  bekerja  dengan  mempengaruhi  permeabilitas membran  dan  peptida  yang  bekerja  di  dalam  sito- plasma.  Peptida  yang  bekerja  dengan  mempenga- ruhi  permeabilitas  membran  dapat  terjadi  dengan cara  membuat  pori  atau  dengan  cara  melarutkannya (bekerja  seperti  halnya  deterjen)  (Mihajlovic  dan Lazaridis,  2010).  Mekanisme  lain  adalah  peptida antibakteri  masuk  ke  dalam  sitoplasma  dan  meng- hambat  fungsi  intraseluler  seperti  menghambat sintesis  DNA,  RNA  dan  reaksi  enzimatis   tanpa mengganggu  stabilitas  membran  (Jenssen et  al., 2006).

## Aktivitas  antioksidan
Aktivitas  antioksidan  peptida  sebelum  dan sesudah  fraksinasi  diuji  dengan  mengukur  kemam- puannya  untuk  menetralisasi  radikal  ABTS  dan DPPH.  Warna  pada  radikal  ABTS  dan  DPPH  akan berkurang  dengan  kehadiran  antioksidan  yang  men- donorkan  ion  hidrogen  atau  yang  dapat  memecah rantai  senyawa  radikal  (Correa et  al., 2011).  Hasil pengujian  antioksidan  seperti  terlihat  pada  Gambar 4.  Pada  pengujian  dengan  ABTS,  aktivitas  anti- oksidan  sebelum  fraksinasi  dan  fraksi  <10  kDa hampir  sama  yaitu  99%  dan  100%.  Untuk  fraksi  >10 kDa  lebih  rendah  yaitu  97%.  Jadi  fraksi  yang  paling aktif adalah  fraksi  peptida  <10 kDa.
Pada  pengujian  antioksidan  dengan  DPPH menunjukkan  bahwa  fraksi  <10  kDa  mempunyai aktivitas  antioksidan  yang  lebih  tinggi  daripada sebelum  fraksinasi  dan  fraksi  >10  kDa.  Apabila dibandingkan  dengan  hasil  hidrolisis  kacang  merah menunjukkan  bahwa  peptida  hasil  hidrolisis  susu kambing  dengan  enzim  bromelin  <10  kDa  mem-
A
B
C
13 14 4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hidrolisat <10 kDa >10kDa A kt iv it a s A n ti o ks id a n (% )
(D PP H ) Perlakuan 99 100 97 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hidrolisat <10 kDa >10kDa A kt iv it a s A n ti o ks id a n (% ) (A BT S) Perlakuan
punyai  aktivitas  antioksidan  terhadap  radikal  DPPH yang  lebih  tinggi.  Pada  peptida  dari  kacang  merah dengan  konsentrasi  1  mg  protein/mL  mempunyai aktivitas  antioksidan  15%  (Mundi  dan  Aluko,  2014), sedangkan  aktivitas  peptida  dari  susu  kambing fraksi  <10  kDa  14%  pada  konsentrasi  0,1  mg protein/mL.
Gambar  4.  Aktivitas  antioksidan  peptida  terhadap radikal  ABTS  dan  DPPH  sebelum  frak- sinasi  (hidrolisat)  dan  sesudah  frak- sinasi  menggunakan  membran cut  off 10  kDa
Pada  pengujian  ABTS  maupun  DPPH,  fraksi >10  kDa  mempunyai  aktivitas  antioksidan  yang  lebih kecil  daripada  peptida  sebelum  fraksinasi  maupun fraksi  <10  kDa,  sedangkan  aktivitas  antioksidan tertinggi  pada  fraksi  <10  kDa.  Berdasarkan  hasil tersebut  kemungkinan  peptida  yang  aktif  lebih banyak  pada  fraksi  <10  kDa.  Fraksinasi  akan  me- nurunkan  rasio  peptida  aktif  pada  fraksi  >10  kDa sehingga  aktivitasnya  menjadi  lebih  rendah  sedang- kan  untuk  fraksi  <10  kDa  fraksinasi  justru  lebih mengkonsentrasikan peptida bioaktifnya. Ultra- filtrasi  menggunakan  membran molecular  weight  cut off (MWCO)  memungkinkan  untuk  memekatkan peptida  dengan  berat  molekul  tertentu  dengan menghilangkan  konsentrasi  garam  dan  kontaminan (Vandanjon et  al., 2007),  sehingga  aktivitasnya meningkat.  Menurut  Picot et  al .  (2010),  fraksinasi peptida  menggunakan  membran  MWCO  merupakan
cara  yang  efektif  untuk  memekatkan  peptida  anti- oksidan,  tetapi  dalam  prosesnya  masih  memerlukan optimasi.  Selektivitas  membran  yang  digunakan bukan  hanya  memisahkan  peptida  berdasarkan ukuran  tetapi  juga  berdasarkan  gugus  aromatik (Picot et  al., 2010)  dan  muatan  (Doyen et  al., 2011) yang  berpengaruh  pada  bioaktivitasnya.  Menurut Udenigwe  dan  Aluko  (2011)  asam  amino  yang  me- ngandung  sulfur,  asam  dan  hidrofobik  mempunyai aktivitas  antioksidan  yang  kuat  terhadap  radikal DPPH  dan  H 2 O 2 .  Berlett  dan  Levine  (2014)  menam- bahkan  bahwa  asam  amino  metionin,  sistein  dan aromatik  seperti  tirosin,  histidin,  fenilalanin  dan triptofan  menunjukkan  aktivitas  antioksidan  jauh lebih  tinggi  dibandingkan  asam  amino  yang  lain. Untuk  aktivitas  antioksidan  terhadap  radikal  super- oksida  hanya  lisin  dan  leusin  yang  menunjuk kan aktivitas  tinggi.  Sebaliknya,  asam  amino  bermuatan positif  dalam  hidrolisat  justru  menurunkan  aktivitas antioksidan  pada  uji  Fe reducing  power, DPPH  dan H 2 O 2 (Udenigwe  dan  Aluko,  2011).  Keberadaan asam  amino  yang  bertanggungjawab  terhadap  anti- oksidan  terutama  fenilalanin  dan  histidin  pada  susu kambing  cukup  tinggi  (Sabahelkheir et  al., 2012) menandakan  kemungkinan  keberadaaan  peptida yang  bersifat  antioksidan  juga  cukup  tinggi.
Aktivitas  antioksidan  pada  pengujian  dengan ABTS  menghasilkan  nilai  yang  lebih  besar  di- bandingkan  dengan  hasil  uji  DPPH.  Radikal  DPPH lebih  stabil  dibandingkan  dengan  radikal  ABTS  yang menyebabkan  DPPH  lebih  sulit  dinetralisasi.  Selain itu  beberapa  antioksidan  bereaksi  lebih  cepat  ketika diuji  menggunakan  metode  lain  dan  bereaksi  lebih lambat  pada  DPPH  serta  menghasilkan  kisaran reaksi  yang  lebih  kecil  (Prior et  al., 2005).  DPPH larut  dalam  pelarut  organik  yang  lebih  sesuai  untuk senyawa  lipofilik  atau  senyawa  yang  mempunyai kandungan  lipid  tinggi,  sedangkan  ABTS  kompatibel dengan senyawa hidrofilik maupun hidrofobik (Damgaard et  al., 2014).  Karakterisasi  hidrolisat menggunakan  HPLC  menunjukkan  bahwa  hidrolisat didominasi  oleh  peptida  hidrofilik  sehingga  memberi- kan  hasil  uji  DPPH  yang  lebih  kecil  daripada  hasil uji ABTS.  Berdasarkan  hasil  tersebut  pengujian  anti- oksidan  menggunakan  DPPH  kurang  sesui  untuk digunakan  pada  hidrolisat  bromelin  susu kambing.
Hidrofobisitas  menjadi  faktor  penting  yang berperan  dalam  aktivitas  antioksidan  suatu  peptida (Mundi  dan  Aluko,  2014).  Seperti  telah  dilaporkan oleh  Pownall et  al. (2010)  aktivitas  antioksidan  lebih berhubungan  dengan  kandungan  total  asam  amino hidrofobik  daripada  ukuran  peptida.  Pendapat  yang sama  dilaporkan  oleh  Ajibola et  al. (2011)  yang menyatakan  bahwa  aktivitas  yang  tinggi  pada  fraksi peptida  <1  kDa  dari  biji  bengkuang  disebabkan  oleh jumlah  total  asam  amino  hidrofobik  dan  aromatik . Pada  penelitian  ini  peptida  yang  terkandung  pada hidrolisat  bersifat  hidrofilik.  Selain  hidrofobisitas,
100 3,33 -2,55 -2,75 -20 0 20 40 60 80 100 120 Triton X- 100 hidrolisat H e m o ly s is (% ) Perlakuan
<10 kDa     >10 kDa
muatan  dan  komposisi  asam  amino  aromatik  juga menjadi  penentu  aktivitas  antioksidan  (Udenigwe dan  Aluko,  2011).  Meskipun  peptida  dalam  hidrolisat bersifat  hidrofilik,  kandungan  asam  amino  aromatik pada  susu  kambing  cukup  tinggi  yaitu  (dalam  mg asam  amino/g  total  asam  amino)  tirosin  (38,2), histidine  (31,1),  dan  fenilalanin  (62)  (Sabahelkheir et al., 2012).  Keberadaan  asam  amino  dengan  akti- vitas  antioksidan  tinggi  seperti  metionin  (5,5),  sistein (20,5),  lisin  (26,3)  dan  leusin  (146,2)  (Sabahelkheir et  al., 2012)  juga  ikut  berperan  dalam  peningkatan aktivitas  antioksidan  peptida  dalam  hidrolisat.

## Aktivitas  hemolisis
Uji  hemolisis  biasa  dilakukan  untuk  me- ngetahui  toksisitas  peptida  antimikroba  karena  sen- sitivitasnya  untuk  mengevaluasi  kerusakan  mem- bran  sel  eukariot  (sel  inang)  (Lorenzon et  al., 2012). Seperti  terlihat  pada  Gambar  5,  peptida  hasil hidrolisis  protein  susu  kambing  sebelum  fraksinasi hanya  sedikit  menimbulkan  hemolisis.  Peptida setelah  fraksinasi  bahkan  bernilai  negatif  yang  me- nandakan  bahwa  nilai  hemolisis  lebih  kecil  daripada kontrol  sel  darah  merah.  Kontrol  sel  darah  merah seperti  diketahui  juga  mengandung  enzim  tertentu yang  menyebabkan  autolisis  sel  darah  merah.  Nilai negatif  menandakan  bahwa  keberadaan  peptida dapat  membantu  mengurangi  autolisis  pada  sel darah  merah.  Hasil  tersebut  mengindikasikan  bahwa peptida  hasil  hidrolisis  protein  susu  kambing  dengan bromelin  aman  untuk diaplikasikan.
Gambar  5.  Hasil  uji  hemolisis  terhadap  peptida sebelum fraksinasi (hidrolisat) dan sesudah  fraksinasi  dengan  membran cut  off 10  kDa.  Nilai  hemolisis  negatif disebabkan  oleh  pengurangan  terhadap kontrol  negatif  sel  darah  merah  yang mempresentasikan  hemolisis  0%.  Tri- ton  X-100  sebagai  kontrol  positif  hemo- lysis 100%

## KESIMPULAN
Peptida  hasil  hidrolisis  susu  kambing  dengan enzim  bromelin  dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri E.  coli,  S. Typhimurium dan L.  mono- cytogenes. Peptida  tersebut  juga  dapat  berfungsi sebagai  antioksidan  yang  ditandai  dengan  kemam- puan  untuk  menetralisasi  radikal  ABTS  dan  DPPH. Fraksinasi  menggunakan  membran cut  off 10  kDa dapat  meningkatkan  aktivitas  antimikroba  maupun antioksidan.  Hasil  uji  hemolisis  menunjukkan  bahwa peptida  tersebut  tidak  menyebabkan  hemolisis bahkan  dapat  mengurangi  autolisis  pada  sel  darah merah .

## UCAPAN  TERIMA KASIH
Penelitian  ini  terlaksana  atas  biaya  penelitian Badan  Penelitian  dan  Pengembangan  Pertanian, Kementrian  Pertanian  APBN  2013  No  18023D  dan Direktorat  Jendral  Pendidikan  Tinggi,  BOPTN  2013 No  2013.089.521219.

## DAFTAR PUSTAKA
Almaas  H,  Eriksen  E,  Sekse  C, Comi I, Flengsrud R, Holm  H,  Jensen  E,  Jacobsen  M,  Langsrud  T, Vegarud  GE.  2011.  Antibacterial  peptides derived from caprine whey proteins, by digestion  with  human  gastrointestinal  juice.  Brit J  Nutr  106:  896-905.  DOI:  10.1017/S000711 4511001085.
Anderson  BL,  Berry  RW,  Telser  A.  1983.  A  sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro- phoresis  system  that  separates  peptides  and proteins  in  the  molecular  weight  range  of  2500 to  90,000.  Anal  Biochem  132:  365-375.  DOI: 10.1016/0003-2697(83)90022-2.
Ajibola  CF,  Fashakin  JB,  Fagbemi  TN,  Aluko  RE. 2011.  Effect  of  peptida  size  on  antioxidant properties  of  African  yam  bean  seed  ( Sphe- nostylis  stenocarpa )  protein  hydrolysate  frac- tions.  Int  J  Mol  Sci  12:  6685-6702.  DOI:  10.33 90/ijms12106685.
Arshad  ZIM,  Amid  A,  Yusof  F,  Jaswir  I,  Ahmad  K, Loke  SP.  2014.  Bromelain:  an  overview  of  in- dustrial  application  and  purification  strategies. Appl  Microbiol  Biotechnol  98:  7283-7297.  DOI: 10.1007/s00253-014-5889-y.
Bartholomew  DP,  Paull  RE,  Rohrbach  KG.  2003.
The  Pineapple:  Botany,  Production  and  Uses. 1-301.  1 st Ed.  Wallingford-UK:  CABI  Publish- ing.
Bergmeyer  HU,  Bergmeyer  J,  Grassel  M.  1983.  Met- hods  of  Enzymatic  Analysis . 2 nd Ed.  118-126.
Weinheim:  Verlag  Chemie,  USA.
Berlett  BS,  Levine  RL.  2014.  Designing  antioxidant peptides.  Redox  Rep  19:  80-86.  DOI:   10.1179/ 1351000213Y.0000000078.
Clarke  G,  Ting  KN,  Wiart  C,  Fry  J.  2013.  High correlation  of  2,2 –dipheenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)  radical  scavenging,  ferric  reducing activity  potential  and  total  phenolics  content indicated  redundancy  in  use  of  all  three  assay in  use  of  all  three  assay  to  screen  for antioxidant  activity  of  extracts  of  plants  from  the Malaysian  reinforest.  Antioxidants  2:  1-10.  DOI: 10.3390/antiox2010001.
Correa  AP,  Daroit  DJ,  Coelho  J,  Meira  SM,  Lopes FC,  Segalin  J,  Risso  PH,  Brandelli  A.  2011. Antioxidant,  antihypertensive  and  antimicro-bial properties  of  ovine  caseinate  hydrolyzed  with microbial  protease.  J  Sci  Food  Agr  91:  2247-
Damgaard  TD,  Otte  JAH,  Meinert  L,  Jensen  K,
Lametsch  R.  2014.  Antioxidant  capacity  of hydrolyzed  porcine  tissues.  Food  Sci  Nutr  2:
Doyen  A,  Beaulieu  L,  Saucier  L,  Pouliot  Y,  Bazinet L.  2011.  Impact  of  ultrafiltration  membrane material  on  peptida  separation  from  a  snow crab  byproduct  hydrolysate  by  electrodialysis with  ultrafiltration  membranes.  J  Agric  Food Chem  59:  1784-1792.  DOI:  10.1021/jf103739 m.
Dare  K,  Shepherd  J,  Roy  H,  Seveu  S,  Ibba  M.  2014. LysPGS  formation  in Listeria  monocytogenes has  broad  roles  in  maintaining  membrane  inte- grity  beyond  antimicrobial  peptide  resistance. Virulance  5: 534-546.  DOI:  10.4161/viru.28359.
Driver  JL,  Raynie  DE.  2007.  Method  Development for  Biomolecules in HPLC  Method  Develop- ment  for  Pharmaceutical.  430-435.  Ahuja  SA, Rasmussen  (Eds)  Elsevier  Inc. Italy.
Godfrey  T,  Reichel  J.  1983.  Industrial  Enzymology.
Macmillan  Publishers  Ltd., 1-4 Surrey  ,UK.
Hayes  M,  Ross  RP,  Fitzgerald FG, Hill C, Stanton C. 2006.  Casein-derived  antibacterial  peptidas  ge- nerated  by Lactobacillus  acidophilus DPC6026.
Appl  Env  Microb  72:  2260 –2264.  DOI:  10.1128/ AEM.72.3.2260-2264.2006.
Huang  Y,  He  L,  Li  G,  Zhai  N,  Jiang H, Chen Y. 2014. Role  of  helicity  of  α-helical  antimicrobial  pep- tidas  to  improve  specificity.  Protein  Cell  5:  631- 642.  DOI:  10.1007/s13238-014-0061-0.
Jenssen  H,  Hamill  P,  Hancock  REW.  2006.  Peptide antimicrobial  agent.  Clin  Microbiol  Rev  19:  91- 511.  DOI:  10.1128/CMR.00056-05.
Kumar  S,  Chouhan  S,  Sanghi  A,  Teotia  UVS.  2013.
Antioxidative  effect  of  yak  milk  caseinate  hydro- lyzed  with  three  different  proteases.  Vet  World 6:  799-802.  DOI:  10.14202/vetworld.  2013.799- 802.
Laemmli  UK.  1970.  Cleavage  of  structural  protein during  the  assembly  of  the  head  of  bacterio- phage  T4.  Nature  227:  680-685.  DOI:  10.1038/ 227680a0.
Li  Z,  Jiang  A,  Yue  T,  Wang  Y,  Su  J.  2013. Purification  and  identification  of  five  novel antioxidant  peptidas  from  goat  milk  casein hydrolysates.  J  Dairy  Sci  96:  4242-4251.  DOI: 10.3168/jds.2012-6511.
Li  Y,  Yu  J,  Goktepe  I,  Ahmedna  M.  2016.  The potential  of  papain  and  alcalase  enzyme  and process  optimizations  to  reduce  allergenic gliadins  in  wheat  flour.  Food  Chem  196:  13388- 1345.  DOI:  10.1016/j.foodchem.2015.10.089.
Lopez-Solanilla  E,  Gonzalez-Zorn  B,  Novella  S, Vazquez-Boland  JA,  Rodriguez-Palenzuela  P. 2003.  Susceptibility  of Listeria  monocyte-genes to  antimicrobial  peptidas.  FEMS  Microbiol  Letter 226:  101-105.
Lopez-Exposito  I,  Quiros  A,  Amigo  L,  Recio  I.  2007. Casein  hydrolysate  as  a  source  of  anti-micro- bial,  antioxidant  and  antihypertensive  peptides. Le  Lait 87: 241-249.  DOI:  10.1051/lait:2007019.
Lorenzon  EN,  Cespedes  GF,  Vicente  EF,  Nogueira LG,  Bauab  TM,  Castro  MS,  Cilli  EM.  2012. Effect  of  dimerization  on  the  structure  and  bio- logical  activity  of  antibacterial  peptida  Ctx-Ha. Antimicrob  Agents  Ch  56:  3004-3010.  DOI: 10.1128/AAC.06262-11.
Maurer  HR.  2001.  Bromelain:  biochemistry,  phar- macology  and  medical  use.  Cell  Mol Life Sci 58: 1234-1245.
McCann  KB,  Shiell  BJ, Michalski WP, Lee A, Wan J, Roginski  H,  Conventry  MJ.  2006.  Isolation  and characterisation of antibacterial peptidas derived  from  the  f  (164 –207)  region  of  bovine α S2 -casein.  Int  Dairy  J  16:  316 –323.  DOI:  10.
1016/j.idairyj.2005.05.005.
Mendoza  F,  Maqueda  M,  Galvez  A,  Martinez-Bueno M,  Valdivia  E.  1999.  Antilisterial  activity  of peptide  AS-48  and  study  of  changes  induced  in the  cell  envelope  properties  of  an  AS-48 adapted  strain  of Listeria  monocytogenes .  Appl Environ  Microbiol  65: 618-625.
Mihajlovic  M,  Lazaridis  T.  2010.  Antimicrobial  pep- tides  in  toroidal  and  cylindrical  pores.  Biochim Biophys  Acta  1798:  1485-1493.  DOI:  10.1016/j. bbamem.2010.02.023.
Mondhe  M,  Chessher  A,  Goh  S,  Good  l,  Stach JEM. 2014.  Species-selective  killing  of  bacteria  by
2254.  DOI:  10.1002/ jsfa.4446.
282-288.  DOI:  10.1002/fsn3.106.
antimicrobial  peptida-PNAs.  PLoS  ONE  9: e89082.  DOI:  10.1371/journal.pone. 0089082.
Moslehishad  M,  Ehsani  MR,  Salami M, Mirdamadi S, Ezzatpanah,  Naslaji  AN,  Moosavi-Movahedi AK.  2013.  The  comparative  assessment  of ACE-inhibitory and antioxidant of peptida fraction  obtained  from  fermented  camel  and bovine  milk  by Lactobacillus  rhamnosus PTCC 1637.  Int  Dairy  J  29:  82-87.  DOI:  10.1016/j. idairyj.2012.10.015.
Mundi  S,  Aluko  RE.  2014.  Inhibitory  properties  of kidney bean protein  hydrolysate  and  its membrane  fraction  against  renin,  angiotensin converting  enzyme,  and  free  radicals.  Austin  J Nutr  Food  Sci 2: 1008.
Munoz  MT,  Caballer  DB,  Lizana  MF,G  Mendiola  R, Montano  PP,  Cano  MS.  2004.  Selective  allergy to  sheep’s  and  goat’s  milk  proteins.  Allergol Immunopat  32:  39-42.  DOI:  10.1016/S0301- 0546(04)79222-8.
Muro  C,  Riera  F,  Fernandez  A.  2013.  Advance  in  the fractionation  of  milk  biopeptides  by  means  of membrane  processes . Intech  241-266.  DOI: 10.5772/53674.
Nandhini  B,  Angayarkanni  J,  Palaniswamy  M.  2012. Angiotensin  converting  enzyme  inhibitor  activity and antioxidant properties of goat milk hydrolysates.  Int  J  Pharm  Pharm  Sci  4:  367- 370.
Nguyen    LT,    de  Boer  L,  Zaat  SAJ,  Vogel  HJ.  2011. Investigating  the  cationic  side  chains  of  the antimicrobial peptide tritrpticin: hydrogen bonding properties govern its membrane- disruptive  activities.  BBA-Biomembranes  1808: 2297-2303. DOI: 10.1016/j.bbamem.2011.05. 015.
Picot  L,  Ravallec  R,  Fouchereau-Peron  M,  Van- danjon  L,  Jaouen  P,  Chaplain-Derouiniot  M, Guerard  F,  Chabeaud  A,  LeGal  Y,  Alvarez  OM, Berge  J,  Batista  I,  Pires  C,  Thorkelsson  G,  De- lannoy  C,  Jakobsen  G,  Johansson  I,  Bourseau P.  2010.  Impact  of  ultrafiltration  and  nano- filtration  of  an  industrial  fish  protein  hydrolysate on  its  bioactive  properties.  J  Sci  Food  Agr  90:
Pownall  TL,  Udenigwe  CC,  Aluko  RE.  2010.  Amino acid  composition  and  antioxidant  properties  of pea  seed  ( Pisum  sativum L.)  enzymatic  protein hydrolysate  fractions.  J  Agr  Food  Chem  58: 4712-4718.  DOI:  10.1021/jf904456r.
Prior  RL,  Wu  X,  Schaich  K.  2005.  Standardized methods for determination of antioxidant capacity  and  phenolics  in  foods  and  dietary supplements.  J  Agr  Food  Chem  53:  4290-4302. DOI:  10.1021/jf0502698.
Rowan  AD,  Buttle  DJ,  Barrett  AJ.  1990.  The  cys - teine  proteinases  of  the  pineapple  plant. Biochem  J 266:  869-875.
Sabahelkheir  MK,  Fat  en  MM,  Hassan  AA.  2012. Amino  acid  composition  of  human  and animal’s milk  (camel,  cow,  sheep  and  goat).  ARPN  J  Sci Technol  2: 32-34.
Saha  M,  Debnath  C,  Pramanik  AK.  2015. Listeria monocytogenes : An emerging food borne pathogen.  Int  J Curr  Microbiol  App Sci 4: 52-72.
Salampessy  J,  Phillips  M,  Seneweera  S,  Kaila- sapathy  K.  2010.  Release  of  antimicrobial  pep- tides  through  bromelain  hydrolysis  of  leather- jacket  ( Meuchenia  sp. )  insoluble  proteins.  Food Chem  120:  556-560.  DOI:  10.1016/j.foodchem. 2009.10.054.
Szwajkowska  M,  Wolanciuk  A,  Barlowska  J,  Krol  J, Zygmunt  L.  2011.  Bovine  milk  proteins  as  the source  of  bioactive  peptidas  influencing  the consumers  immune  system.  Anim  Sci  Pap  Rep 29: 269-280.
Thaipong  K,  Boonprakob  U,  Crosby  K,  Cisneros - Zevallos  L,  Byrne  DH.  2006.  Comparison  of ABTS,  DPPH,  FRAP,  and  ORAC  assays  for estimation  antioxidant  activity  from  guava  fruit extracts.  J  Food  Compos  Anal  19:  669-676. DOI:  10.1016/j.jfca.2006.01.003.
Uckert  S,  Stief  CG,  Lietz  B,  Burmester  M,  Jonas  U, Machtens  SA.  2002.  Possible  role  of  bioactive peptides  in  the  regulation  of  human  detrusor smooth  muscle-functional  effects  in  vitro  and immunohistochemical  presence.  World  J  Urol 20: 244-249.
Udenigwe  CC,  Aluko  RE.  2011.  Chemometric analysis  of  the  amino  acid  requirement  of antioxidant  food  protein  hydrolysates.  Int  J  Mol Sci  12:  3148-3161.  DOI:   10.3390/ijms12053 148.
Vandanjon  L,  Johannsson  R,  Derouiniot  M,  Bour- seae,  Jaouen  P.  2007.  Concentration  and  puri- fication  of  blue  whiting  peptida  hydrolysate  by membrane  processes.  J  Food  Eng 83:  581-589.
Yin  LM,  Edward  MA,  Li  J,  Yip  CM,  Deber  CM.  2012. Roles  of  hydrophobicity  and  charge  distri-bution of  cationic  antimicrobial  peptides  in  peptides- membrane  interaction.  J  Biol  Chem  287:  7738-
Zhao  LJ,  Huang  YB,  Gao  S,  Cui  Y,  He  D,  Wang  L,
Chen  YX.  2013.  Comparison  on  effect  of hydrophobicity on the antibacterial and antifungal  act ivities  of  α-helical  antimicrobial peptides.  Sci  China  Chem  56:  1307-1314.  DOI: 10.1007/s11426-013-4884-y.
7745.  DOI:  10.1074/jbc.M111. 303602.
DOI:  10.1016/j.jfoodeng.2007.03. 040.
1819-1826.  DOI:  10.1002/jsfa. 4020.