Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B

## ANALISIS KEKERABATAN KURA-KURA BATOK (Cuora Amboinensis) WILAYAH INDONESIA TIMUR (AMBON, LUWU, DAN GORONTALO) BERBASIS SEKUEN GEN CYTOCHROME B
Candra Hermawan 1
1 Program Studi Pendidikan Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas 17 Agustus 1945 Banyuwangi email: candrahermawan87@gmail.com

## Abstrak
Tujuan dari penelitian ini untuk melihat hubungan kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora amboinensis )  wilayah  Indonesia  Timur  (Ambon,  Luwu,  dan  Gorontalo)  berdasarkan  hasil analisis  konstruksi  pohon  filogeni,  jarak  genetik,  dan  similaritas  berdasarkan  variasi  sekuens gen Cytochrome  b. Penelitian  ini  masuk  ke  dalam  penelitian  deskriptif  eksploratif  yang dilakukan di dalam laboratorium. Tahapan dalam penelitian ini meliputi isolasi DNA jaringan, purifikasi  DNA, Poly  Chain  Reaction (PCR),  elektroforesis  horizontal,  sekuensing  gen,  dan analisis  filogeni  menggunakan software  MEGA  6 .  Sampel  dalam  penelitian  ini  merupakan  8 spesies yang berasal dari  Ambon, Gorontalo, dan Luwu. Hasil analisis filogeni menunjukkan nilai  jarak genetik  sebesar  0,003-0,349  dan nilai  similaritas  genetik  sebesar  65,13%-99,70%. Cuora  amboinensis dari  daerah  yang  sama  memiliki  hubungan  kekerabatan  lebih  tinggi dibanding  dari  daerah  yang  berbeda.  Terdapat  anomali  pada  sampel  Gorontalo  10  yang berkerabat  dekat  dengan  wilayah  Ambon  padahal  kedua  sampel  tersebut  terletak  pada  pulau yang  berbeda.  Kondisi  ini  dapat  karena  terjadi  perdagangan  lintas  wilayah  pada C. amboinensis sehingga menyebabkan variasi  genetik  rendah  serta  tingkat  simialiaritas  genetik tinggi pada spesies yang terletak pada pulau berbeda.
Kata Kunci: Cuora amboinensis; filogeni; neighbor joining; jarak genetik; similaritas genetik

## Abstract
The purpose of this study was to look at the kinship relationship between the shell turtles (Cuora  amboinensis)  in  Eastern  Indonesia  (Ambon,  Luwu,  and  Gorontalo)  based  on  the analysis  of  phylogenetic  tree  construction,  genetic  distance,  and  similarities  based  on variations  in  the  Cytochrome b  gene  sequence.  This  research  is  included  in  the  exploratory descriptive  research  conducted  in  the  laboratory.  The  stages  in  this  study  included  tissue DNA  isolation,  DNA  purification,  Poly  Chain  Reaction  (PCR),  horizontal  electrophoresis, gene  sequencing,  and  phylogeny  analysis  using  the  MEGA  6  software.  The  samples  in  this study  were  8  species  originating  from  Ambon,  Gorontalo  and  Luwu.  The  results  of  the phylogenetic  analysis  showed  a  genetic  distance  value  of  0.003-0.349  and  a  genetic similarity  value  of  65.13%-99.70%.  Cuora  amboinensis  from  the  same  area  has  a  higher kinship  relationship  than  from  a  different  area.  There  is  an  anomaly  in  the  Gorontalo  10 sample which is closely related to the Ambon region even though the two samples are located on  different  islands.  This  condition  could  be due  to  cross-regional  trade  in  C. amboinensis, causing low genetic variation and high levels of genetic similarity among species located on different islands.
Keywords: Cuora amboinensis; phylogeny; neighbor joining; genetic distance; genetic similarity
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B

## 1. PENDAHULUAN
Kura-kura  adalah  hewan  berkaki  empat  bersisik  yang  termasuk  dalam  kelas reptil.  Hewan  yang  termasuk  dalam  suku Testudinata atau Chelonians ini  mudah dikenali  dengan  adanya  tempurung  luar  yang  keras  atau  cangkang  bertulang  (bony shell).  Tempurung  kura-kura  terdiri  dari  dua  bagian,  dimana  bagian  atas  menutupi punggung yang disebut karapas dan bagian bawah berisi perut yang disebut plastron. Setiap bagian terdiri dari dua lapisan, yaitu lapisan luar umumnya bersisik besar dan keras  yang  tersusun  seperti  genting,  sedangkan  lapisan  dalam  berupa  lempeng- lempeng tulang yang tersusun rapat seperti tempurung  (Iskandar, 2000).
C.  amboinensis di  Indonesia  tersebar  di  beberapa  wilayah  meliputi  pulau Sumatera, Kalimantan, dan Sulawesi (Ernst & Barbour, 1989). Hal ini dimungkinkan karena kemampuan adaptasi yang dimiliki oleh spesies ini sangat tinggi. Hewan ini dapat hidup di kolam, rawa air payau, rawa air tawar, sungai dan persawahan, bahkan secara umum  hewan ini dapat hidup  di  darat  maupun  di air  sehingga  sering  disebut hewan semi akuatik (Lim & Indraneil Das, 1999).
Keberadaan C.  amboinensis yang  tersebar  di  Indonesia  tidak  menjamin  bahwa spesies ini berada pada status konservasi yang aman. Mulai tahun 2010 banyak reptil yang  dimanfaatkan  dalam  perdagangan  meliputi  tokek  tanah,  kadal  duri,  maupun kura-kura.  Kura-kura  batok  yang  dalam  bahasa  ilmiah  disebut C.  amboinensis merupakan kura-kura endemik daerah Indonesia Timur yang banyak diperdagangkan hingga  keluar  negeri.  Hal  tersebut  mengakibatkan  terjadinya  penurunan  drastis populasi C.  amboinensis (Guntoro et  al., 2020).  Keberadaan C.  amboinensis di Indonesia  saat ini  sedang  dalam  kondisi  terancam  punah (Nasution  &  Fatah,  2021). Menurut data International Union for Conservation of  Nature and Nature Resources (IUCN)  diketahui  jenis  kura-kura  ini  memiliki  resiko  tinggi  dan  berpotensi mengalami kepunahan. Walaupun statusnya belum kritis namun  dalam kurun waktu 10  tahun  terakhir  telah  terjadi  penurunan  jumlah  sebanyak  20%  (Schoppe,  2008). Kondisi  ini  jika  dibiarkan  tentu  akan  mengancam  keberadaan C.  amboinensis di
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Indonesia.  Penurunan  jumlah  kura-kura  ini  disebabkan  oleh  adanya  eksploitasi terhadap hewan ini khususnya untuk kebutuhan ekonomi. Kura-kura Indonesia pada tahun 2000 banyak ditemukan diekspor ke China untuk dimanfaatkan dalam produk makanan  dan  produk  obat-obatan  (Schoppe,  2008).  Kondisi  ini  harus  segera ditindaklanjuti  agar  tidak  terus  terjadi  penurunan  jumlah  populasi  dari C. amboinensis di Indonesia.
Tindakan  konservasi  diperlukan  untuk  mencegah  penurunan  populasi C. amboinensis .  Upaya  konservasi  dapat  dilakukan  melalui  perkawinan  silang  antar kura-kura  yang  berkerabat  jauh  dan  menghindari  perkawinan  sedarah,  sehingga mampu memunculkan sifat yang unggul pada kura-kura tersebut (Hermawan, 2016). Perkawinan  silang  bertujuan  untuk  menghasilkan  spesies  dengan  tingkat  variasi genetik  yang  tinggi.  Hewan  yang  terancam  punah  dicirikan  oleh  tingkat  variasi genetik yang rendah, terutama jika dibandingkan dengan spesies yang tidak terancam punah  (Spielman et  al .,  2004).    Untuk  mengetahui  tingkat  variasi  genetik  dapat dilihat melalui pohon filogenetik. Ternyata pohon filogenetik dapat digunakan untuk menunjukkan  hubungan  evolusi  antar  organisme  selain  untuk  menentukan kekerabatan (Schmidt, 2003).
Guna  mengetahui  kepastian  tentang  kekerabatan  dan  variasi  genetik C.amboinensis di wilayah Indonesia timur perlu dilakukan sebuah penelitian berbasis molekuler. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melihat hubungan kekerabatan C. amboinensis wilayah  Indonesia  timur  (Ambon,  Gorontalo,  dan  Luwu)    berdasarkan hasil analisis konstruksi pohon filogeni, jarak genetik, dan similaritas genetik.

## 2. METODE PENELITIAN
Jenis penelitian  ini  adalah  deskriptif  eksploratif  dimana  bertujuan  untuk menggambarkan  keadaan  suatu  fenomena  (Arikunto,  2006).  Penelitian  ini menggunakan  pendekatan  observasi  laboratorium,  dengan  teknik  analisis  biologi molekuler.  Rangkaian  kegiatan  pada  penelitian  ini  meliputi:  Isolasi DNA  jaringan,
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Purifikasi  DNA, Polymerase  Chain  Reaction (PCR),  Elektroforesis  horizontal,  dan Sekuensing  gen.  Hasil  sekuen  gen  dianalisis  secara  deskriptif  eksploratif menggunakan software  MEGA  6 untuk  mengetahui  hasil  analisis  filogeni,  jarak genetik, dan similaritas genetik.
Objek  penelitian  pertama  adalah  koleksi  jaringan  ekor C.  amboinensis di Laboratorium Biologi Molekuler Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Malang. Jaringan  ekor C.  amboinensis berukuran  1  –  3  cm  yang  disimpan  pada  tabung Eppendorf  1,5  ml  berisi  etanol  70%.  Sampel  jaringan  ekor C.  amboinensis yang digunakan berasal dari daerah Ambon sejumlah 3 sampel, Luwu sejumlah 2 sampel, dan Gorontalo sejumlah 3 sampel.
Waktu  isolasi  DNA,  purifikasi,  PCR,  dan  elektroforesis  horizontal  dilakukan pada bulan Februari 2017 di laboratorium Biologi Molekuler Jurusan Biologi FMIPA Universitas  Negeri  Malang.  Sekuensing  gen  dilakukan  di  PT.  Genetika  Science, Jakarta pada bulan Maret 2017.
Daftar  alat  dan  bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  pada  setiap  tahapnya dapat dilihat pada tabel di bawah ini.
Tabel 2.1 Alat dan Bahan Isolasi DNA Alat Bahan • Centrifuge • Eppendorf 2 ml
• Mikropipet 1 – 10 µl, 10 – 100 µl, 100 – 1000 µl
• Tip (biru, kuning, putih)
• Rak eppendorf
• Freezer • Vortex • Mortar
• Pistil
• Gunting
• Pinset • Water Bath incubator • 0,03 gr jaringan ekor
• Buffer STE
• Proteinase – K (Pro – K)
• SDS 10%
• NaCl 5M
• Phenol
• Chloroform Isoamil
• Etanol absolute
• Etanol 70%
• TE
• RNAse
• Aquades
• Aqua Bidestilasi
• Chloroform
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Tabel 2.2 Alat dan Bahan Purifikasi DNA
Alat Bahan • Satu set alat elektroforesis horizontal • Mikropipet 1 – 10 µl
• Tip warna putih
• Gel document
• Rak tube
• Microwave oven • Vortex • Mortar • Pistil
• Gunting
• Pinset
• Waterbath incubator
• Agarose
• Glove • TBE 1x • Tissue
• Loading dye
• Ethidium Bromine (EtBr)
• Sampel DNA
• Aquades steril
Tabel 2.3 Alat dan Bahan Polymerase Chain Reaction (PCR) Alat Bahan • Tube PCR • Mikropipet 1 – 10 µl
• Tip warna putih
• Rak tube
• Ice box •
Centrifuge
• Satu set mesin PCR
• 5 µl primer Cytochrome b
• 25 µl PCR mix (dNTP, Taq polimerase, buffer)
• 10 µl dH2O
• µl sampel DNA Tabel 2.4 Alat dan Bahan Elektroforesis Horizontal Alat Bahan • Satu set alat elektroforesis horizontal
• Mikrowave oven
• Timbangan analitik
• Mikropipet 1 – 10 µl, 10 – 100 µl
• Tip (putih dan kuning)
• Tabung Erlenmeyer • Agarose
• Glove • TBE 1x
• Tissue
• Parafilm
• Loading dye
• EtBr
• Sampel DNA
• Aquades steril
Data diperoleh dari hasil sekuen gen dari sampel Ambon A, Ambon C, Ambon F, Gorontalo 5, Gorontalo 10, Gorontalo 13, Luwu 3, dan Luwu 6 menggunakan primer Cytochrome b . Data akhir yang diperoleh dari hasil sekuensing adalah komposisi basa
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
nitrogen dari masing-masing sampel kura-kura.
Analisis  filogenetik  menggunakan  analisis  model Neighbor  Joining (NJ)  dari software MEGA  6 ,  ditunjang  dengan  data  similaritas  dan  variasi  genetik.  Sekuens sampel C.  amboinensis dibandingkan  dengan  sekuens Cytochrome  b spesies C. trifasciata yang  sudah  dipublikasikan  di Gene  Bank (Bank  Data).  Tujuan perbandingan ini untuk mengetahui posisi kekerabatan tiap sampel C. amboinensis .

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil Penelitian

## 3.1.1 Konstruksi Pohon Filogeni
Analisis  kekerabatan  atau  filogeni C.  Amboinensis wilayah  Ambon,  Luwu,  dan Gorontalo  didukung  dengan  data  variasi  sekuen  gen Cytochrome  b DNA mitokondria.  Sebelummnya  dilakukan  amplifikasi  pada  gen Cytochrome  b untuk menentukan posisi gen target yang sesuai melalui proses Polymerase Chain Reaction (PCR) yaitu ±340 bp (Gambar 3.1).
Gambar 3.1 Hasil Amplifikasi Gen Cytochrome b pada proses PCR . M (Marker), AA (Ambon A), AC (Ambon) C, AF (Ambon F), L3 (Luwu 3), L6 (Luwu 6), G5 (Gorontalo 5), G13 (Gorontalo 13), G 10 (Gorontalo 10).
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Hasil  dari  amplifikasi  Gen Cytochrome  b pada  proses PCR digunakan  sebagai rujukan  dalam  melakukan  sekuensing.  Hal  ini  dikarenakan  pada  proses  sekuensing diperlukan jumlah gen target yang cukup banyak agar susunan basa nukleotida DNA dapat dimunculkan. Hasil sekuensing dari C. amboinensis dapat dilihat menggunakan software Finch TV (Gambar 3.2).
Gambar 3.2 Hasil Sekuensing Basa Nukleotida DNA ( software Finch TV )
Hasil  sekuensing  yang  diperoleh  selanjutnya  dianalisis  menggunakan software BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool) untuk mengetahui persentase kecocokan hasil sekuensing basa nukleotida DNA (Hidayatun et al ., 2011), yang telah diperoleh dengan  data  urutan  basa  nukleotida  DNA C.  amboinensis yang  terdapat  pada Genbank (Gambar 3.3).
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Gambar  3.3  Hasil  Analisis  Menggunakan BLAST untuk  Mengetahui  Persentase Kecocokan dengan Sekuen DNA yang Terdapat pada Genbank Berdasarkan  analisis  menggunakan BLAST diperoleh  bahwa  hasil  sekuen  yang diperoleh menunjukkan tingkat homologi sekuen ≥300 bp dengan kesamaan sebesar 98%.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  sekuen Cytochrome  b yang  diperoleh  dari penelitian merupakan sekuen gen Cytochrome b dari C. amboinensis .
Analisis  filogeni  dilakukan  dengan  melibatkan  keseluruhan  sampel  yang digunakan yaitu sebanyak 8 sampel yang berasal dari Ambon, Luwu, dan Gorontalo. Sebagai  pembanding  digunakan  sekuen  gen Cytochrome  b Kura-kura  Emas (Cuora trifasciata) yang  berasal  dari  wilayah  perairan  Cina.  Sekuen  gen Cytochrome  b  C. trifasciata diperoleh  dari Genbank (http://ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)  dengan    nomer aksesi  JN710010.1.  Sekuen  gen Cytochrome  b yang  diperoleh  selanjutnya disejajarkan (alignment) menggunakan  program Clustal  X .  Fungsi Clustal  X untuk pensejajaran sekuen DNA (Rohimah et al ., 2018). Hasil alignment dapat dilihat pada Gambar 3.4.
Analisis  filogenetik  dapat  dilakukan  dengan  melakukan  rekonstruksi  pohon filogenetik dari 9 sampel. Software MEGA 6 digunakan untuk merekonstruksi pohon filogenetik  melalui metode Neighbor Joining (NJ) (Tindi et al ., 2017). Luaran hasil rekonstruksi pohon filogenetik ditampilkan melalui Gambar 3.5.
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Gambar  3.4  Hasil Alignment 9  Sampel  Sekuen  Gen Cytochrome  b Kura-kura Lokal Indonesia (C. amboinensis) dengan Sekuen Acuan Kura-kura Emas Cina (C. trifasciata)
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Kura-kura_Gorontalo_5 Kura-kura_Gorontalo_13 Kura-kura_Luwu_6 Kura-kura_Luwu_3 Kura-kura_Gorontalo_10
Kura-kura_Ambon_C Kura-kura_Ambon_A
Kura-kura_Ambon_F
Kura-kura_Emas_Cina
Gambar 3.5 Pohon Filogeni C. amboinensis melalui Metode Neighbor Joining Berdasarkan  hasil  konstruksi  pohon  filogeni  dengan Neighbor  Joining terlihat percabangan  dua  kelompok  besar  pada  Kura-kura  Batok ( C.  amboinensis ) wilayah Indonesia Timur (Ambon, Gorontalo, dan Luwu).  Terlihat pada kelompok A maupun kelompok B terdapat spesies kura-kura yang berkumpul dan berasal dari daerah yang berbeda. Pada kelompok A ditempati jura-kura Gorontalo 5, Gorontalo 13, Luwu 6, dan Luwu 3, sedangkan pada kelompok B ditempati kura-kura Gorontalo 10, Ambon A,  Ambon  F,  dan  Ambon  C.  Kura-kura  yang  digunakan  sebagai  pembanding  yakni kura-kura Emas Cina ( C. trifasciata ) terlihat memiliki cabang sendiri dan keluar dari dua kelompok besar (A dan B).

## 3.1.2 Jarak Genetik
Jarak  genetik  digunakan  untuk  menunjukkan  kekerabatan  antara  sampel. Semakin  kecil  jarak  genetik  antar  sampel,  maka  kesamaan  basa  nukleotida  DNA semakin  besar  (Brahmantiyo et  al .,  2016).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  hubungan kekerabatan  antar  sampel  semakin  dekat.  Nilai  jarak  genetik  antar  sampel C. amboinensis dapat dilihat pada Gambar 3.6.
A
B
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Gambar  3.6  Nilai  Jarak  Genetik (Genetic  Distance) antar  Sampel C.  amboinensis dengan Spesies Acuan C. trifasciata
3.1.3 Nilai Similaritas dan Varian Sekuen
Analisis  similaritas  dan  varian  sekuen  gen  dilakukan  untuk  mengetahui persentase  kemiripan  sekuens gen dari  beberapa  sampel  yang  dibandingkan  (Munir et  al .,  2012).  Sekuen  gen Cytochrome  b  C.  amboinensis dari  wilayah  Ambon, Gorontalo,  dan  Luwu  akan  dibandingkan  dengan  sekuen  gen Cytochrome  b  C. trifasciata sebagai outgroup . Nilai similaritas dan varian sekuen gen Cytochrome b C. amboinensis dapat dilihat pada Tabel 3.1.
Melalui  Tabel  3.1  diketahui  bahwa  nilai  similaritas C.  trifasciata sangat  kecil ketika  dibandingkan  dengan  semua  sampel C.  amboinensis, yakni  berkisar  pada angka  3-6%.  Kondisi  itu  membuktikan  bahwa  sekuen C.  trifasciata dengan C. amboinensis memiliki  kemiripan  yang  sangat  rendah.  Dapat  dilihat  pada perbandingan  semua  sampel  antara C.  amboinensis (Ambon,  Gorontalo,  dan  Luwu) memiliki  nilai  similaritas  yang  tinggi  (berkisar  66%-99%)  dimana  hal  itu menunjukkan  bahwa  ketiga  sampel C.  amboinensis dari  ketiga  wilayah  tersebut memiliki kemiripan sekuens yang tinggi antara satu dengan yang lain.
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Tabel  3.1  Nilai  Similaritas  dan  Varian  Sekuen  Gen Cytochrome  b  Cuora amboinensis
Spesies 1 Spesies 2 Jarak Genetik Std. Err  Similaritas Varians Gorontalo 5 Luwu 3 0,024 0,008 97,59 % 2,41 % Gorontalo 5 Gorontalo 13 0,006 0,004 99,41 % 0,59 % Luwu 3 Gorontalo 13 0,024 0,008 97,59 % 2,41 % Gorontalo 5 Luwu 6 0,015 0,006 98,50 % 1,50 % Luwu 3 Luwu 6 0,015 0,006 98,51 % 1,49 % Gorontalo 13 Luwu 6 0,015 0,006 98,51 % 1,49 % Gorontalo 5 Ambon A 0,339 0,038 66,15 % 33,85 % Luwu 3 Ambon A 0,349 0,039 65,13 % 34,87 % Gorontalo 13 Ambon A 0,338 0,038 66,18 % 33,82 % Luwu 6 Ambon A 0,329 0,037 67,11 % 32,89 % Gorontalo 5 Ambon F 0,334 0,037 66,60 % 33,40 % Luwu 3 Ambon F 0,334 0,037 66,56 % 33,44 % Gorontalo 13 Ambon F 0,334 0,037 66,63 % 33,37 % Luwu 6 Ambon F 0,334 0,037 66,60 % 33,40 % Ambon A Ambon F 0,009 0,005 99,11 % 0,89 % Gorontalo 5 Gorontalo 10 0,329 0,037 67,11 % 32,89 % Luwu 3 Gorontalo 10 0,329 0,037 67,08 % 32,92 % Gorontalo 13 Gorontalo 10 0,329 0,037 67,13 % 32,87 % Luwu 6 Gorontalo 10 0,329 0,037 67,11 % 32,89 % Ambon A Gorontalo 10 0,024 0,008 97,60 % 2,40 % Ambon F Gorontalo 10 0,015 0,006 98,51 % 1,49 % Gorontalo 5 Ambon C 0,334 0,037 66,63 % 33,37 % Luwu 3 Ambon C 0,334 0,037 66,60 % 33,40 % Gorontalo 13 Ambon C 0,333 0,037 66,66 % 33,34 %
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Luwu 6 Ambon C 0,334 0,037 66,63 % 33,37 % Ambon A Ambon C 0,012 0,006 98,81 % 1,19 % Ambon F Ambon C 0,003 0,003 99,70 % 0,30 % Gorontalo 10 Ambon C 0,012 0,006 98,81 % 1,19 % Gorontalo 5 Emas Cina 0,967 0,099 3,28 % 96,72 % Luwu 3 Emas Cina 0,937 0,095 6,34 % 93,66 % Gorontalo 13 Emas Cina 0,958 0,099 4,16 % 95,84 % Luwu 6 Emas Cina 0,947 0,098 5,26 % 94,74 % Ambon A Emas Cina 0,956 0,098 4,37 % 95,63 % Ambon F Emas Cina 0,947 0,098 5,26 % 94,74 % Gorontalo 10 Emas Cina 0,946 0,098 5,36 % 94,64 % Ambon C Emas Cina 0,946 0,097 5,36 % 94,64 % Keterangan: Nilai similaritas antar sampel C. amboinensis
Nilai similaritas antara C. amboinensis dengan C. trifasciata Nilai varians antar sampel C. amboinensis
Nilai varians antara C. amboinensis dengan C. trifasciata
3.2 Pembahasan
3..2.1 Pola Substitusi Sekuen Gen Cytochrome b
Analisis  filogenetik  Kura-kura C.  amboinensis dilakukan  berdasarkan  variasi sekuen  gen Cytochrome  b DNA  mitokondria.  Gen Cytochrome  b pada  sampel diamplifikasi  dengan  metode Polymerase  Chain  Reaction  (PCR) dengan  panjang sekuen  gen  ±340  bp.  Dilihat  dari  panjang  sekuen  gen  terbukti  bahwa  gen  tersebut adalah Cytochrome  b, (Koh et  al .,  2009) menyatakan  bahwa  panjang  sekuen  parsial gen Cytochrome b pada beberapa spesies kura-kura sebesar 340 bp.
Sequence  alignment dilakukan  dari  sekuen  gen Cytochrome  b antar  sampel  dan spesies acuan terlihat adanya substitusi basa nukleotida (Toha et al ., 2016). Substitusi yang  terjadi  meliputi  substitusi  transisi  dan  transversi.  Substitusi transisi merupakan pergantian  antara  basa  purin  (A  dan  G)  atau  antara  basa  pirimidin  (C  dan  T),
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
sedangkan  substitusi  transversi  adalah  pergantian  antara  basa  purin  dan  pirimidin (Karmana, 2009).

## 3.2.2 Analisis Filogeni
Analisis  filogeni  dilakukan  dengan  cara  merekonstruksi  pohon  filogeni menggunakan software  MEGA  6 .  Program  yang  digunakan  untuk  merekonstruksi pohon filogeni meliputi Neighbor Joining (NJ) . Neighbor Joining termasuk ke dalam metode  jarak  ( distance  method ),  yaitu  cara  untuk  merekonstruksi  pohon  filogeni berdasarkan jarak evolusi, yairu jumlah perbedaan basa nukleotida antara dua sekuen DNA atau lebih (Saleky et al ., 2020).
Hasil rekonstruksi pohon filogeni C. amboinensis daerah Ambon, Gorontalo, dan Luwu  dengan  spesies  acuan  menggunakan  metode neighbor  joining (Gambar  5), menunjukkan adanya pengelompokan individu kura-kura berdasarkan daerah masing- masing.    Hai  ini  dapat  diamati  dari  gambar  konstruksi  pohon  filogeni  seperti  kura- kura Ambon yang masuk ke dalam rumpun kura-kura Ambon dengan nilai bootstrap 83 dan 61. Hal serupa juga terjadi pada individu-individu C. amboinensis dari daerah lain  seperti  Gorontalo  dan  Luwu.  Pengelompokan  berdasarkan  daerah  ini  diduga karena  masing-masing  individu  kura-kura  mengalami  perkawinan  antara  kura-kura pada  daerahnya  masing-masing  ( inbreeding ),  sehingga  memunculkan  kekerabatan dekat antara individu yang berasal dari daerah yang sama jika  dibandingkan dengan individu  dari  daerah  yang  berbeda.  (Muharam et  al .,  2012) menegaskan  bahwa perkawinan  secara inbreeding mengakibatkan  invidivu  memiliki  kekerabatan  yang dekat.  Hal  ini  didukung  dengan  nilai  jarak  genetik  (Gambar  6)  dan  nilai  similaritas (Tabel  5)  pada  masing-masing  individu  kura-kura  antar  tiap  daerah.  Semakin  besar jarak  genetik  antar  sampel  menunjukkan  kesamaan  basa  nukleotida  yang  semakin kecil, sehingga hubungan kekerabatan semakin jauh. Dilihat dari similaritas, semakin besar nilai similaritas antar sampel menunjukkan kemiripan basa nukleotida semakin besar sehingga hubungan kekerabatan semakin dekat (Sujaya et al ., 2016).
Pohon  filogeni  pada  Gambar  3.5  menunjukkan  pengelompokan C.  amboinensis
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
yang  diteliti  menjadi  dua  kelompok  besar  yaitu  kelompok  A  yang  terdiri  dari C. amboinensis Gorontalo  dan  Luwu,  dan  kelompok  B  terdiri  dari  Ambon  dan Gorontalo.  Pengelompokan  dua  kelompok  besar  ini  menunjukkan  bahwa  daerah berpengaruh  terhadap  kekerabatan C.  amboinensis .  Pada  kelompok A  yang  terdiri dari  kura-kura  Gorontalo  dan  Luwu  menunjukkan  bahwa  kura-kura  Luwu  6  satu cabang dengan kura-kura Gorontalo 5 dan Gorontalo 1, hal ini menunjukkan bahwa kekerabatan yang dekat antara kura-kura Gorontalo dan Luwu.
Tingginya  tingkat  kekerabatan  antara  kura-kura  Gorontalo  dan  Luwu  pada kelompok A  diduga  karena  terjadi  perkawinan  antar  populasi  kura-kura  pada kelompok  A.  Hal  ini  didasari  dengan  gambar  peta  persebaran C.  amboinensis (Gambar  7)  yang  menunjukkan  bahwa  posisi  Gorontalo  dan  Luwu  berdekatan  dan hanya dipisahkan oleh laut sempit. Peta persebaran C. amboinensis ditunjukkan oleh oleh (Schoppe, 2008) juga menunjukkan daerah persebaran C. amboinensis meliputi Sulawesi, Kepulauan Halmahera, dan Filipina,  sehingga sangat dimungkinkan terjadi perkawinan  antar  populasi  kura-kura  dalam  kelompok A  yang  berakibat  pada kedekatan kekerabatannya.
Gambar 3.7 Peta Persebaran Cuora amboinensis (Schoppe, 2008)
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
C. amboinensis pada kelompok B yang terdiri dari daerah Ambon dan Gorontalo menunjukkan  hasil  yang  berbeda  dengan  kelompok A  (Gambar  5).  Pohon  filogeni pada  kelompok B  menunjukkan  bahwa  kura-kura  Gorontalo  10  satu  kelompok dengan  kura-kura  Ambon  (Gambar  3.5).  Hal  ini  menunjukkan  adanya  kedekatan kekerabatan  pada  individu-individu  yang  masuk  dalam  kelompok  tersebut.  Secara geografis  letak  pulau  Sulawesi  dan  Ambon  terpisah  oleh  lautan , namun  dari  peta persebaran C.  amboinensis (Gambar  3.7)  menunjukkan  bahwa C.  amboinensis memang  tersebar  meliputi  Sulawesi  dan  Ambon,  sehingga  sangat  dimungkinkan adanya  percampuran  genetik  antara  kura-kura  Gorontalo  dan  Ambon  sehingga menunjukkan adanya hubungan genetik yang dekat (Van Dijk et al. , 2014).
Gambar 3.8 Peta Persebaran Cuora trifasciata (Van Dijk et al ., 2014)
Pohon  filogeni  menunjukkan  bahwa  kura-kura  yang  digunakan  sebagai outgroup yakni kura-kura Emas Cina ( Cuora trifasciata ) memiliki kekerabatan yang jauh dengan C. amboinensis dari berbagai daerah yang telah dijadikan sampel, hal itu dapat dilihat dengan terpisahnya cabang pohon filogeni C. trifasciata pada Gambar 5.
Kenyataan  itu  menunjukkan  bahwa  daerah  memang  mempengaruhi  kedekatan kekerabatan,  terbukti  dimana C.  trifasciata yang  tersebar  di  daerah  Cina  Selatan (Gambar  3.8)  dan C.  amboinensis yang  tersebar  di  daerah  Sulawesi,  Kepulauan
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Halmahera, dan Filipina (Gambar 7) (Van Dijk et al ., 2014).  Dapat dikatakan bahwa bahwa  Kura-kura  Batok  ( C. amboinensis)  dari  wilayah  yang  sama  memiliki  nilai kekerabatan yang lebih tinggi dibandingkan dengan C. amboinensis dari wilayah lain.

## 3.2.3 Nilai Jarak Genetik dan Similaritas
Jarak genetik individu dari daerah yang sama memiliki nilai yang lebih rendah jika dibandingkan dengan nilai jarak genetik antar individu dari daerah yang berbeda (Hadiati,  2003). Fenomena  ini  dapat  dijumpai  pada  hampir  seluruh  sampel C. amboinensis. Jarak  genetik C.  amboinensis sampel  berkisar  antara  0,003-0,349 (Gambar 3.6). Hal ini menunjukkan bahwa hubungan kekerabatan antar individu dari satu daerah lebih dekat jika dibandingkan dengan individu dari daerah lain. Contoh itu dapat diamati pada nilai jarak genetik seperti pada individu kura-kura Ambon C dengan  kura-kura  Ambon  F  yang  memiliki  nilai  jarak  genetik  sebesar  0,003.  Nilai jarak genetik akan lebih besar ketika dibandingkan dengan individu dari daerah lain, seperti pada kura-kura Ambon F dengan kura-kura Luwu 3 yang memiliki nilai jarak genetik  sebesar  0,334  (Gambar  3.6).  Nilai  similaritas  genetik  juga  mendukung hubungan  kekerabatan  spesies  (Murtiyaningsih,  2017).  Nilai  similaritas  diperoleh antara 65,13%-99,70% (Tabel 3.1). Nilai similaritas terkecil ditunjukkan antara kura- kura  Luwu  3  dengan  kura-kura  Ambon  A  sebesar  65,13%,  sedangkan  nilai similaritas terbesar ditunjukkan antara kura-kura Ambon F dengan kura-kura Ambon C  sebesar  99,70%.  Semakin  besar  nilai  similaritas  menunjukkan  semakin  dekat hubungan  kekrabatan  antara  dua  individu.  Berdasarkan  nilai  similaritas  diketahui bahwa  hubungan  kekerabatan  antar  individu  dalam  satu  daerah  lebih  besar  jika dibandingkan  dengan  nilai  similaritas  individu  dari  daerah  yang  berbeda.  Spesies pada wilayah yang sama akan memiliki jarak genetik yang kecil dan memiliki nilai similaritas genetik yang tinggi (Gusmiaty et al ., 2017). Namun terdapat satu individu yang memiliki nilai similaritas kecil dalam satu daerah yaitu kura-kura Gorontalo 10, dimana  menunjukkan  fenomena  nilai  similaritas  lebih  besar  dengan  kura-kura
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Ambon. Hal itu mengindikasikan bahwa sampel kura-kura Gorontalo 10 berasal dari daerah  atau  populasi  yang  berbeda  dengan  sampel  kura-kura  Gorontalo  5  dan  13. Penyebab  yang  memungkinkan  hal  ini  terjadi  adalah  adanya  perdagangan C. amboinensis antar pulau, bahkan sampai ke luar negeri. C. amboinensis merupakan kura-kura  endemik  Indonesia  timur  yang  sering  diperdagangkan,  selain  di  dalam negeri juga sampai ke luar negeri untuk dijadikan produk makanan dan produk obat- obatan (Schoppe, 2008).

## 4. KESIMPULAN DAN SARAN

## 4.1 Kesimpulan
Hasil analisis kekerabatan C. Amboinensis wilayah Ambon, Gorontalo, dan Luwu menunjukkan  nilai  jarak  genetik  sebesar  0,003-0,349  dan  nilai  similaritas  genetik sebesar  65,13%-99,70%.  Diketahui  bahwa C.  amboinensis pada  satu  daerah  akan memiliki nilai jarak genetik semakin kecil dan memiliki nilai similaritas yang semakin besar. Sedangkan C. amboinensis pada daerah yang berbeda akan memiliki nilai jarak genetik  yang  besar  dan  akan  memiliki  nilai  similaritas  yang  kecil.  Terdapat  anomali pada  sampel  Gorontalo  10  yang  berkerabat  dekat  dengan  wilayah  Ambon  padahal kedua  sampel  tersebut  terletak  pada  pulau  yang  berbeda.  Penyebab  yang memungkinkan hal ini terjadi adalah adanya perdagangan C. amboinensis antar pulau yang mengakibatkan kura-kura berpindah dari daerah asalnya.

## 4.2 Saran
Penelitian  sejenis  perlu  menambah  jumlah  sampel  dari  setiap  wilayah  sehingga representasi  data  yang  diperoleh  akan  semakin  baik.  Selain  itu  perlu  dilakukan penelitian  menggunakan  pendekatan  molekuler  yang  lain  seperti  menggunakan  gen Cytochrome  C  Oxidase  Subunit  I (COI)  atau  D-Loop  DNA  mitokondria  untuk dibandingkan hasilnya dengan penelitian ini.
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B

## 5. REFERENSI
Arikunto, S. (2006). Prosedur Penelitian Suatu Pendekatan Praktik . Jakarta: Rineka Cipta.
Brahmantiyo,  B.,  Priyono,  P.,  &  Rosartio,  R.  (2016).  Pendugaan  Jarak  Genetik Kelinci  (Hyla,  Hycole,  Hycolex  NZW,  Rex,  dan  Satin)  Melalui  Analisis Morfometrik  (ESTIMATION  OF  RABBIT  GENETIC  DISTANCE  (HYLA, HYCOLE,  HYCOLEXNZW,  NZW,  REX  AND  SATIN)  THROUGH MORPHOMETRIC  ANALYSIS). Jurnal  Veteriner , 17 (2),  226–234. https://doi.org/10.19087/jveteriner.2016.17.2.226
Ernst,  C.  H.,  &  Barbour,  R.  W.  (1989). Turtles  of  the  world .  Washington: Smithsonian Institution Press.
Guntoro,  J.,  Wirdateti,  &  Riyanto,  A.  (2020).  The  very  low  genetic  variability  on aceh tamiang’s (Indonesia) population of painted terrapin (batagur borneoensis) inferred  by  cytochrome  oxidase  I  (CO  I)  and  D-loop  (control  region). Biodiversitas , 21 (6), 2514–2520. https://doi.org/10.13057/biodiv/d210624
Gusmiaty,  G.,  Restu,  M.,  Asrianny,  A.,  &  Larekeng,  S.  H.  (2017).  Polimorfisme Penanda  RAPD  untuk  Analisis  Keragaman  Genetik  Pinusmerkusii  di  Hutan
PendidikanUnhas. Jurnal Natur Indonesia , 16 (2), 47. https://doi.org/10.31258/jnat.16.2.47-53
Hadiati,  S.  (2003).  Pendugaan  Jarak  Genetik  dan  Hubungan  Kekerabatan  Nanas
Berdasarkan Analisis Isozim. Jurnal Hortikultura , 13 (2), 87–94. http://ejurnal.litbang.pertanian.go.id/index.php/jhort/article/view/1156
Hermawan,  C.  (2016).  Rendahnya  Diversitas  Tingkat  Gen  Pada  Kura-Kura  (Cuora Amboinensis)  Dilihat  Dari  Hasil  Analisis  Kekerabatan. Jurnal  Ilmiah PROGRESSIF , 13 (37), 1.
Hidayatun,  N.,  Susilowati,  D.  N.,  &  Mulya,  K.  (2011).  Identifikasi26  Isolat  Bakteri Endofitik Dan Filosfer Padi Dengan Analisis Sekuen16s Rdna 1 [ Identification of 26 Endophytic and Phyllosphere Bacteria Isolated from Rice by 16S rDNA Sequence Analyses ]. Berita Biologi , 10 (April), 455–461.
Iskandar. (2000). Kura-kura dan Buaya Indonesia dan Papua Nugini . Palmedia Citra: Bandung.
Karmana,  I.  W.  (2009).  Kajian  Evolusi  Berbasis  Urutan  Nukleotida. GaneÇ  Swara ,
3 (3), 75–81.
Koh, H. S., Lee, B. K., Wang, J., Heo, S. W., & Jang, K. H. (2009). Two sympatric
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
phylogroups  of  the  chinese  water  deer  (Hydropotes  inermis)  identified  by mitochondrial dna control region and cytochrome b gene analyses. Biochemical Genetics , 47 (11–12), 860–867. https://doi.org/10.1007/s10528-009-9285-8 Lim,  B.  L.,  &  Indraneil  Das.  (1999). Turtles  of  Borneo  and  Peninsular  Malaysia . Kinabalu: Natural History Publications (Borneo).
Muharam,  E.  G.,  Buwono,  I.  D.,  &  Yuniar  Mulyani.  (2012).  Analisis  Kekerabatan Ikan  Mas  Koi  (Cyprinuscarpio  koi)  Dan  Ikan  Mas  Majalaya  (Cyprinuscarpio Carpio) Menggunakan Metode Rapd. Perikanan Dan Kelautan , 3 (3), 15–23.
Munir,  M.,  Suryaningtyas,  H.,  &  Kuswanhadi,  K.  (2012).  Analisis  Keragaman Genetik  Isolat  Corynespora  Cassiicola  (Berk  &  Curt)  Wei.  Di  Indonesia Menggunakan  Marker  Issr  (Inter  Simple  Sequence  Repeat). Jurnal  Penelitian Karet , 30 (2), 86–99. https://doi.org/10.22302/ppk.jpk.v30i2.125
Murtiyaningsih, H. (2017). Isolasi DNA genom dan identifikasi kekerabatan genetik nanas menggunakan RAPD. Journal Agritop , 15 (1), 84–93.
Nasution,  E.  D.,  &  Fatah,  H.  (2021).  Rapid  Survei  Keanekaragaman  Hayati  Status Konservasi  Permen  LHK  (P.106/2018)  dan  IUCN  di  areal  Nilai  Konservasi
Tinggi Perkebunan Kelapa Sawit. Agrifor , 20 (1), 161. https://doi.org/10.31293/agrifor.v20i1.5211
Rohimah, S., Mukarramah, L., Sindiya, V., S., V. Y., K., G. A., & Su’udi, M. (2018).
Eksplorasi  Jenis  dan  Potensi  DNA  BARCODE  ANGGREK  Thrixspermum Secara In Silico. Jurnal Biodjati , 3 (2), 50–58. https://doi.org/10.15575/biodjati.v3i2.3409 Saleky,  D.,  Supriyatin,  F.  E.,  &  Dailami,  M.  (2020).  Pola  Pertumbuhan  dan Identifikasi  Genetik  Turbo  setosus  Gmelin,  1791  [Turbinidae,  Gastropoda]. Jurnal Kelautan Tropis , 23 (3), 305–315.
https://doi.org/10.14710/jkt.v23i3.7514
Schmidt,  H.  a.  (2003).  Phylogenetic  trees  from  large  datasets. Unpublished  PhD Thesis .
http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.87.1104&rep=rep1&t ype=pdf%5Cnpapers://0bf253c3-7396-4811-afa5-28e5fa189e15/Paper/p22437
Schoppe,  S.  (2008).  Science  in  CITES:  the  biology  and  ecology  of  theSoutheast Asian  box  turtle  and  its  uses  and  trade  inMalaysia.  In Science  in  CITES:  the biology  and  ecology  of  theSoutheast  Asian  box  turtle  and  its  uses  and  trade inMalaysia. www.traffic.org/species-reports/traffic_species_reptiles18.pdf
Analisis Kekerabatan Kura-Kura Batok ( Cuora Amboinensis ) Wilayah Indonesia Timur (Ambon, Luwu, dan Gorontalo) Berbasis Sekuen Gen Cytochrome B
Spielman, D., Brook, B. W., & Frankham, R. (2004). Most species are not driven to extinction  before  genetic  factors  impact  them. Proceedings  of  the  National Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America , 101 (42),  15261–15264. https://doi.org/10.1073/pnas.0403809101
Sujaya, I., Nocianitri, K., Aryantini, N., Nursini, W., Ramona, Y., Orikasa, Y., Kenji, F.,  Urashima,  T.,  &  Oda,  Y.  (2016).  Identifikasi  dan  Karakterisasi  Bakteri Asam  Laktat  Isolat  Susu  Segar  Sapi  Bali  (Identification  And  Characterization Of  Lactic  Acid  Bacteria  Isolated  From  Bali  Cattle’s  Raw  Milk). Jurnal Veteriner , 17 (2), 155–167. https://doi.org/10.19087/jveteriner.2016.17.2.155
Tindi,  M.,  Mamangkey,  N.  G.  F.,  &  Wullur,  S.  (2017).  The  DNA  Barcode  and molecular  phylogenetic  analysis  several  Bivalve  species  from  North  Sulawesi Waters based on COI gene. Jurnal Pesisir Dan Laut Tropis , 1 (2), 32–38. Toha,  A.,  Hakim,  L.,  &  Sumitro,  S.  (2016). Panduan  Dasar  Analisis  Data  Genetik Untuk  Publikasi (Vol.  3,  Issue  July).  Proyek  Marine  Biodiversity  of  Raja Ampat Islands. Kerjasama Universitas Papua-Universitas Brawijaya.
Van Dijk, P. P., Iverson, J., Rhodin, A., Shaffer, B., & Bour, R. (2014). Turtles of the World, 7th Edition: Annotated Checklist of Taxonomy, Synonymy, Distribution with Maps, and Conservation Status.
https://doi.org/10.3854/crm.5.000.checklist.v7.2014.