## Penggunaan Agar-agar Komersial sebagai Media Gel Elektroforesis Pada Zat Warna Remazol: Pengaruh Komposisi Buffer, pH Buffer dan Konsentrasi Media
Atik Rohmana Maftuhatul Fuad, Ita Ulfin, Fredy Kurniawan Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS)
Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
e-mail : itau@chem.its.ac.id
Abstrak —Elektroforesis gel menggunakan media agar- agar  komersial  untuk  zat  warna  remazol  telah  dilakukan. Agar-agar  komersial  digunakan  sebagai  alternatif  media elektroforesis  gel  untuk  zat  warna  remazo Brilliant  Blue  R , Red RB , Yellow FG , Turquoise Blue G dan Violet 5R dengan beberapa  variabel  optimasi  elektroforesis  gel  antara  lain  : pengaruh  komposisi  buffer,  pH  buffer,  dan  konsentrasi media  yang  dilakukan  pada  tegangan  150  volt  selama  15 menit.  Kemudian  diperoleh  kondisi  optimal  menggunakan buffer  dengan  komposisi  NaH 2 PO 4 .H 2 O  +  Na 2 HPO 4 .  Pada pH  buffer  9  didapatkan  jarak  migrasi  terjauh  untuk masing-masing  zat  warna  RBBR,  RYFG,  RRRB,  RTBG dan RV5R secara  berturut-turut adalah :  29,11 mm;  35,40 mm; 33,40 mm; 32,07 mm; dan 31,07 mm. Pada konsentrasi 2%  didapatkan  jarak  migrasi  untuk  kelima  zat  warna remazol paling jauh, yaitu : RBBR 29,13 mm; RYFG 34,14 mm;  RRRB  31,16  mm;  RTBG  30,25  mm  dan  RV5R  29,20 mm.
Kata Kunci —elektroforesis gel; zat warna remazol; agar- agar komersial.

## I. PENDAHULUAN
lektroforesis  merupakan  suatu  cara  analisis  kimiawi yang  didasarkan  pada  pergerakan  molekul-molekul bermuatan  di  dalam  medan  listrik  (titik  isoelektrik). Pergerakan  molekul  dalam  dalam  medan  listrik dipengaruhi  oleh  bentuk,  ukuran,  dan  besar  muatan  dari molekul[1].Metode  pemisahan Gel  Electrophoresis System adalah salah satu metode yang murah dan mudah dikembangkan.  Metode  ini  biasanya  digunakan  untuk pemisahan  DNA  dan  protein.  Pergerakan  molekul tergantung  pada  beberapa  faktor,  yaitu  :  massa,  bentuk molekul dan suhu, porositas dan viskositas media [2].
Larutan  elektrolit  sangat  diperlukan  dalam  metode elektroforesis  gel,  berfungsi  sebagai  penghantar  arus listrik dalam elektroforesis. Larutan elektrolit yang biasa digunakan  adalah  buffer.  Pada  penelitian  ini  digunakan larutan  buffer  fosfat  yang  sudah  sering  digunakan  dan pertama kali digunakan oleh Jorgenson dan Luckas pada tahun 1981 [3]. Salah satu kelebihan buffer fosfat adalah area kerja buffer fosfat yang lebar yaitu dari asam sampai basa. Hal ini karena asam fosfat merupakan asam trivalen dengan  nilai  pKa  2,12;  7,47;  dan  12,36  yang  mampu mempertahan kan pH [4].
Elektroforesis  melalui  gel  agarosa  atau  akrilamid merupakan  teknik  pemisahan  yang  sederhana,  cepat  dan tepat  memisahkan  molekul  yang  diinginkan[5].  Jenis
elektroforesis  gel  yang  lain  adalah  Elektroforesis  Gel Poliakrilamid-SDS (SDS-PAGE) yang merupakan sebuah  metode  elektroforesis  untuk  pemisahan  protein berdasarkan  berat  molekul.  Teknik  ini  dilakukan  dalam gel  poliakrilamid  yang  mengandung sodiumdodecyl sulphate (SDS).  SDS  adalah  sebuah  detergen  anionik untuk menyelubungi molekul protein. [5].
Secara umum elektroforesis gel diakui sebagai metode analitik  untuk  pemurnian  protein,  dengan  meletakkan sampel protein pada gel yang telah diberi pewarna seperti :  amido  black  fast  green  atau  yang  lebih  sensitif coomassie  blue.  Namun,  metode  ini  memerlukan  waktu hingga beberapa jam untuk proses pemisahannya. Sebuah metode  untuk  pewarnaan  protein  pada  pemisahan menggunakan elektroforesis gel  poliakrilamid  dijelaskan oleh  Hartman  dan  Udenfriend  pada  tahun  1969.  Tetapi pada  metode  ini  penggunaan    gel  dengan  SDS  terbatas untuk background berfluorescence[6].
Pada tahun 1972 Griffith memperkenalkan penggunaan reactive dye anionic pertama kali menggunakan remazol sebagai  pewarna  dalam  pemisahan  protein  pada Poliakrilamid Gel Elektroforesis (PAGE). Pada penelitian tersebut menjelaskan prosedur untuk mereaksikan material biologi dengan zat warna Remazol Brilliant Blue R (RBBR) dan hasil yang diperoleh adalah pemisahan  protein  dengan  prosedur  tersebut  dapat divisualisasikan secara langsung. Sehingga pada penelitian  ini  dipilih  sampel  zat  warna  remazol  yang mempunyai banyak varian dan mudah didapatkan dengan harga  terjangkau  untuk  mengetahui  kondisi  optimum pada  metode Gel  Electrophoresis  System sebelum diterapkan untuk pewarnaan makromolekul yang lain[7].
Remazol  merupakan  perarna  reaktif  kelompok ethilsulfonil  yang  memiliki  muatan  negatif.  Jenis-jenis remazol beragam, setiap jenis memiliki struktur, muatan, dan  warna  yang  berbeda.  Lima  jenis  remazol  (Remazol Brilliant Blue R , Remazol Yellow FG , Remazol Red RB , Remazol Turquoise  Blue  G ,  dan  Remazol Violet  5R ) yang  berbeda  digunakan  dalam  penilian  ini  untu mempelajari  karakteristik  migrasi  dari  remazol  dengan elektroforesis gel.
Secara  umum  sampel  makromolekul  dielektroforesis melalui  beberapa  jenis  media.  Media  bertindak  sebagai saringan  molekuler  untuk  membantu  dalam  pemisahan molekul  berdasarkan  ukuran.  Jenis  media  pendukung yang digunakan tergantung pada jenis molekul yang akan dipisahkan  dan  pemisahan  berdasarkan  muatan,  berat
E
molekul atau keduanya [8]. Bahan yang biasa digunakan untuk pemisahan asam nukleat dan protein yaitu agarosa dan akrilamida. Barril dan Nates (2012) membandingkan sensitivitas  deteksi  antara  agarosa  dan  poliakrilamida sebagai  media  dalam Gel  Electrophoresis  System [9]. Media  gel  yang  digunakan  pada  metode  ini  merupakan gel  transparan  dalam  sinar  UV  (Reddy  and  Raju,  2012). Agarosa  dan  poliakrilamid  sulit  didapatkan,  oleh  karena itu  pada  penelitian  ini  digunakan  agar-agar  batangan komersial  sebagai  pengganti  atau  alternatif  media  gel dalam Gel Electrophoresis System .Penelitian ini dilakukan  untuk  mengetahui  pengaruh  komposisi  buffer fosfat, pH buffer fosfat, dan konsentrasi media agar pada elektroforesis gel untuk zat warna remazol.

## II. URAIAN PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  antara  lain: zat  warna  remazol,  agar-agar  batangan  komersial,  dan buffer  fosfat . Remazol  yang  digunakan  yaitu  :  Remazol Brilliant Blue R , Red  RB , Yellow  FG , Turquoise Blue G dan Violet  5R dengan  konsentrasi  0,01%  (w/v).  Buffer fosfat  yang  digunkan  mempunyai  berbagai  komposisi  , yaitu  :  NaOH  +  H 3 PO 4 ;  KOH  +  H 3 PO 4 ;  dan NaH 2 PO 4 . H 2 O  +  Na 2 HPO 4 .  Alat  yang  digunakan  pada penelitian ini antara lain : serangkaian alat elektroforesis gel, power  suply ,  pH  meter,  termometer,  jangka  sorong, ddan AVOmeter.

## Elektroforesis Zat Warna Remazol
Media  agar-agar  batangan  komersial  konsentrasi  2%; 2,5%;  3%;  3,5%;  dan  4%  dibuat  menggunakan  pelarut buffer  fosfat  dengan  pH  buffer  3  –  9.  Kemudian dipanaskan  dan  diaduk  menggunakan magnetic  stirrer dengan  kecepatan  pengadukan  600  rpm  sampai homogen, dan didiamkan sampai mengeras pada cetakan berbentuk  segi  empat  dengan  ukuran  15  cm  X  7,5  cm [10].
Sampel  zat  warna  remazol  0,01%  (w/v)  disuntikkan pada  media  agar  menggunakan  mikro  pipet  20  µL  dan didiamkan  selama  ±  5  menit.  Media  agar  yang  telah berisi  larutan  sampel  dimasukkan  ke  dalam  chamber elektroforesis berisi larutan buffer fosfat. Serangkain alat elektroforesis dihubungkan  pada power  suply ,  kemudian dilakukan  proses  elektroforesis  untuk  kelima  zat  warna remazol  dengan  tegangan  150  volt  selama  15  menit. Setelah  selesai, power  supply dimatikan  dan  dilakukan pengambilan  data  berupa  suhu  buffer  menggunakan,  pH buffer, jarak migrasi, dan arus.
Metode elektroforesis dilakukan untuk pemisahan lima jenis  larutan  zat  warna  remazol  yang  dicampur  dengan perbandingan  1:1,  kondisi  optimum  dan  dilakukan selama 15 menit dan 30 menit. Selain itu juga diterapkan pada  pemisahan  limbah  tekstil.  Proses  elektroforesis dilakukan dengan kondisi optimum selama 15 menit dan 30 menit.

## III. HASIL DAN DISKUSI

## Pengaruh Komposisi Buffer
Larutan  buffer  sebagai  elektrolit  dalam  elektroforesis gel  sangat  mempengaruhi  hasil  migrasi  molekul  pada sampel.  Larutan  elektrolit  yang  digunakan  adalah  buffer fosfat,  komposisi  buffer  fosfat  yang  digunakan  antara
lain : NaOH + H 3 PO 4 ; KOH + H 3 PO 4 ; dan NaH 2 PO 4 . H 2 O +  Na 2 HPO 4 .  Ketika  komposisi  buffer  terdapat  basa  kuat yaitu : NaOH + H 3 PO 4 ; KOH + H 3 PO 4 , suhu pada sistem sangat  tinggi,  sehingga  menyebabkan  media  agar  pada elektroforesis gel rusak. Berdasarkan beberapa komposisi tersebut  diperoleh  kondisi  paling  optimal  untuk elektroforesis  gel  dengan  menggunakan  buffer  fosfat yang  komposisinya  terdapat  garam  dari  asam  fosfat seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1. Hasil elektroforesis gel dengan komposisi buffer: (a) NaOH + H 3 PO 4 (b) KOH + H 3 PO 4 (c) NaH 2 PO 4 . H 2 O + Na 2 HPO 4 Penggunaan buffer dengan komposisi NaOH  + H 3 PO 4 dan KOH + H 3 PO 4 sukar untuk menetukan jarak migrasi dari  pita  yang  dihasilkan  dan  hasil  media  yang  baik didapatkan  dari  komposisi  buffer  NaH 2 PO 4 .H 2 O  + Na 2 HPO 4 .

## Pengaruh pH Buffer
Larutan  buffer  sebagai  elektrolit  pada  elektroforesis gel  mempengaruhi  migrasi  molekul  zat  warna  remazol. Pada  pH  9  zat  warna  remazol  mempunyai  jarak  migrasi terjauh  kecuali  remazol yellow FG.  Adapun  panjang jarak  migrasi  RBBR,  RYFG,  RRRB,  RTBG  dan  RV5R secara  berturut-turut  adalah  :  29,11  mm;  35,40  mm; 33,40  mm;  32,07  mm;  dan  31,07  mm.  Pada  pH  9  rata- rata zat warna remazol mempunyai jarak migrasi terjauh, hal  ini  karena  zat  warna  remazol  mempunyai  muatan negatif dan larutan elektrolit mempunyai pH basa dengan ion OH - lebih banyak daripada ion H + , sehingga menarik lebih  cepat  molekul  bermuatan  negatif  menuju  kutub positif. Larutan bufer berperan sebagai media pendukung yang  dapat  mempengaruhi  kecepatan  gerak  senyawa karena  ion  pembawanya  bermuatan.  Kekuatan  ion  yang tinggi  dalam  bufer  akan  meningkatkan  panas  sehingga aliran  listrik  menjadi  maksimal,  dan  dapat  mempercepat gerakan molekul pada sampel [11].
Konduktivitas  larutan  buffer  sangat  mempengaruhi hasil  elektroforesis.  Konduktivitas  larutan  merupakan kemampuan  suatu  larutan  dalam  menghantarkan  arus listrik.  Pada  larutan  kemampuan  ini  dilakukan  oleh kation dan anion  [12].  Konduktivitas larutan  bergantung pada  jumlah  ion  yang  ada  di  dalam  larutan  tersebut, didefinisikan seperti pada persamaan 1. :
𝛬𝑚 = κ c (1)
Dari  persamaan  2.2  konsentrasi  elektrolit  dinyatakan dalam  notasi  c,  dan  satuan  untuk  konduktivitas  molar adalah  (S.m 2 .mol -1 )[13]. 𝛬°𝑚 dapat  dinyatakan  sebagai penjumlahan ion yang terdapat dalam larutan, dengan λ + sebagai notasi konduktivitas molar kation dan λ −. sebagai notasi  konduktivitas  molar  anion.  Maka  didapatkan persamaan 2. :
𝛬° 𝑚 = 𝑣 + 𝜆 + + 𝑣 − 𝜆 − (2)
Gambar 2 . Pengaruh pH larutan buffer terhadap jarak migrasi

## Pengaruh Konsentrasi Media
Pengaruh konsentrasi media terhadap jarak migrasi zat warna  ditunjukkan  pada  Gambar  4.5,  meningkatnya konsentrasi  media  agar-agar  akan  menaikkan  tingkat kekerasan,  ukuran  pori-pori  dan  keefektifan  agar-agar. Semakin  tinggi konsentrasi  agar-agar  maka  ukuran  pori- pori  akan  semakin  rapat.  Variasi  konsentrasi  agar-agar batangan  komersial  yang  digunakan  adalah  1%;  2%; 2,5%;  3%;  3,5%  dan  4%.  Pada  konsentrasi  1%  media rusak, sehingga jarak migrasi tidak dapat diukur. Kondisi media  agar  dengan  berbagai  konsentrasi  setelah dilakukan  proses  elektroforesis  ditunjukkan  pada lampiran G. Hasil yang didapatkan bahwa semakin besar konsentrasi  agar-agar  maka  jarak  migrasi  zat  warna semakin  rendah  atau  kecepatan  migrasi  zat  warna semakin kecil.
Berdasarkan  Gambar  3.  menunjukkan  pengaruh konsentrasi  media  terhadap  jarak  migrasi,  dimulai  dari konsentari  2%.  Pemilihan  konsentrasi  2%  pada  media sebagai  kondisi  optimal  karena  pada  konsentrasi  media tersebut  didapatkan  jarak  migrasi  terjauh  dan  kondisi media  yang  paling  baik  setelah  dilakukan  proses elektroforesis.  Pada  konsentrasi  2%  hasil  jarak  migrasi untuk  kelima  zat  warna  remazol  paling  jauh,  yaitu  : RBBR  29,13  mm;  RYFG  34,14  mm;  RRRB  31,16  mm; RTBG 30,25 mm dan RV5R 29,20 mm.
Gambar 3. Pengaruh konsentrasi media terhadap jarak migrasi

## Elektroforesis gel campuran zat warna remazol
Lima jenis larutan zat warna remazol dicampur dengan perbandingan 1:1. Kemudian dilakukan proses elektroforesis  untuk  campuran  lima  zat  warna  remazol tersebut  dengan  kondisi  optimum  dan  dilakukan  selama 15  menit  dan  30  menit.  Hasil  dari  elektroforesis campuran  kelima  zat  warna  remazol  ditunjukkan  pada Gambar 4. Berdasarkan hasil elektroforesis gel campuran
zat  warna  remazol,  pada  waktu  15  menit  campuran  zat warna  remazol  belum  terpisah  dengan  baik.  Sedangkan pada  waktu  30  menit  campuran  zat  warna  remazol terpisah dengan baik.
Gambar 4 . Hasil elektroforesis campuran lima zat warna Remazol (a) 15 menit (b) 30 menit

## Elektroforesis gel limbah tekstil
Limbah  tekstil  yang  diperoleh  dari  limbah  industry pewarnaan  batik  tulis  di  Desa  Sendang  agung,  Paciran, Lamongan  dicoba  untuk  dipisahkan  menggunakan elektroforesis  gel  dengan  media  agar-agar  batangan komersial  seperti  prosedur  yang  dilakukan  pada elektroforesis  gel  campuran  zat  warna  remazol.  Dari elektroforesis  gel  limbah  tekstil  diperoleh  hasil  seperti pada Gambar 5., yang menunjukkan bahwa limbah tekstil dapat terpisah dengan metode elektroforesis gel.

## Gambar 5. Hasil elektroforesis limbah tekstil
Ukuran  dan  bentuk  masing  –  masing  remazol diperkirakan  menggunakan  software Chemdraw dan disajikan dalam  Gambar 6. Ukuran  remazol yang paling besar berdasarkan perhitungan panjang ikatan antar atom adalahremazol  brilliant  blue  R  yang  berukuran  2,8911 nm 3 ,  sedangkan  yang  berukuran  paling  kecil  adalah remazol red RB yang berukuran 1,7774 nm 3 .

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan, diperoleh  bahwa  agar-agar  batangan  komersial  dapat digunakan  sebagai  alternatif  media  elektroforesis  gel untuk  zat  warna  remazol,  dengan  beberapa  variabel optimasi  elektroforesis  gel  antara  lain  :  pengaruh komposisi buffer, pH buffer, dan konsentrasi media yang dilakukan pada tegangan 150 volt selama 15 menit. Dari beberapa  variabel  tersebut  diperoleh  kondisi  optimal yaitu menggunakan buffer dengan komposisi NaH 2 PO 4 . H 2 O + Na 2 HPO 4 . Pada pH buffer 9 didapatkan jarak  migrasi  terjauh  untuk  masing-masing  zat  warna RBBR,  RYFG,  RRRB,  RTBG  dan  RV5R  secara berturut-turut adalah : 29,11 mm; 35,40 mm; 33,40 mm; 32,07  mm;  dan  31,07  mm.  Pada  konsentrasi  2% didapatkan jarak migrasi untuk kelima zat warna remazol paling jauh, yaitu : RBBR 29,13 mm; RYFG 34,14 mm; RRRB  31,16  mm;  RTBG  30,25  mm  dan  RV5R  29,20 mm.
Pada  waktu  30  menit  dan  kondisi  optimal elektroforesis  didapatkan  hasil  yang  baik  untuk pemisahan  campuran  kelima  zat  warna  remazol  dan limbah tekstil.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  terimakasih  kepada  Dra.  Ita Ulfin, M.Si selaku dosen pembimbing I, Dr.rer.nat. Fredy Kurniawan,  M.Si  selaku  dosen  pembimbing  II,  Dr. Hendro  Juwono,  M.Si  atas  bimbingannya,  Kalab Mikrobiologi  ITS  atas  bantuan  alat  elektroforesis,  dan semua pihak yang telah membantu dalam penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Titrawani,  Biodiversiti  Kodok  Genus  Rana  Ditinjau  dari Morfologi,  Kariotip  dan  Pola  Protein  di  Kodya  Sawahlunto, Bogor: Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor, 1996.
[2] P.  R.  Reddy  and  N.  Raju,  "Gel-Electrophoresis  and  Its Applications  -  Department  of  Chemistry,  Osmania  University, Hyderabad," InTech, India, 2012.
[3] J.  ..  Jorgenson  and  K.  D.  Luckas,  "High-Resolution  Separations based  on  Elektrophoresis  and  Electroosmosis," Journal  of Chromatography, vol. 4, pp. 209-216, 1981.
[4] P. Gebauer, Capillary Zone Electrophoresis in Phosphate Buffer - known  or  unknown,  Czech  Republic:  Institute  of  Analytical Chemistry Academy of Sciences of the Czech Republic, 2000.
[5] G.  W.  David,  Pharmaceutical  Chemistry,  Glasgow:  Elsevier, 2011.
[6] I.  P.  Griffith,  Thesis,  Australian  National  Univercsity,  Canberra: A.C.T, 1970.
[7] I.  P.  Griffith,  "Immediate  Visualization  of  Proteins  in  Dedocyl Sulfate-Polyacrylamide Gels by Prestaining with Remazol Dyes," Analytical Biochemistry, pp. 402-4012, 1972.
[8] V.  Dolnik,  "Capillary  Zone  Electrophoresis  of  Proteins," Electrophoresis, pp. 2353-2361, 1997.
[9] P.  Barril  and  S.  Nates,  "Introduction  to  Agarose  and Polyacrylamide  Gel  Electrophoresis  Matrices  with  Respect  to Their Detection Sensitivities," Gel Electrophoresis Principles and Basics, pp. 1-14, 2012.
[10] A. Brian, Sanderson, N. Araki, J. L, Lilley, G. Guerrero and L. K. Lewis,  "Modification  of  Gel  Archiecture  and  TBE/TAE  buffer Composition  to  Minimize  Heating  during  Agarose  Gel Electrophoresis," Analytical  Biochemistry, vol.  454,  pp.  44-52, 2014.
[11] S.  Soedarmadji,  Teknik  Analisa  Biokimiawi.  Edisi  Pertama, Yogyakarta: Liberty, 1996.
[12] Sukardjo, Kimia Fisika, Jakarta: Rineka Cipta, 2002.
[13] P. Atkins and J. d. Paula, Physical Chemistry, Ninth Edition ed., Great Britain: Oxford University Press, 2010.