## SINTESIS ESTER-C SEBAGAI SENYAWA ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN BIOKATALIS ENZIM LIPASE/ZEOLIT ALAM
Nanik Wijayati 1* , Siti Anisa Rohmah 1 , Supartono Supartono 1
1 Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Semarang
* email: nanikanang@gmail.com

## Abstrak
Imobilisasi enzim lipase merupakan metode yang digunakan untuk meningkatan daya tahan enzim  terhadap  perubahan  lingkungan  dan  penggunaan  secara  berulang.  Penelitian mengenai  imobilisasi  enzim  lipase  dari  jamur  tiram  putih  ( Pleurotus  ostreatus )  telah dilakukan dengan metode entrapment (penjebakan, penjeratan) menggunakan zeolit alam teraktivasi  dan  larutan  gel  NaF.  Waktu  pengadukan  optimum  yang  diperoleh  dalam imobilisasi enzim lipase ialah selama 3 jam dengan nilai aktivitas lipase sebesar 4,24 U/mL dan  enzim loading sebesar  63,07%.  Enzim  lipase  terimobilisasi  yang  diperoleh diaplikasikan  dalam  uji  stabilitas  berulang  pada  sintesis  ester-C.  Hasil  sintesis  dianalisis menggunakan instrument FT-IR dan HPLC.
Kata kunci: enzim, lipase, imobilisasi, ester-C

## Abstract
Immobilized  lipase  enzyme  is  the  method  used  to  improve  the  durability  of  enzymes  to changes  in  the  environment  and  use  repeatedly.  Research  on  the  lipase  enzyme immobilization  of  white  oyster  mushroom  ( Pleurotus  ostreatus )  has  been  done  by  the entrapment  method  using  activated  natural  zeolites  and  NaF  gel  solution.  The  optimum stirring time obtained in immobilized lipase is for 3 hours with a value of lipase activity of 4.24  U/mL  and  enzyme  loading  of  63.07%.  Immobilized  lipase  enzyme  obtained  in  the stability tests repeatedly applied to the synthesis of ester-C. Synthesis results were analyzed using FT-IR instrument and HPLC.
Keywords: enzymes, lipase, immobilization, ester-C

## Pendahuluan
Antioksidan  merupakan  suatu  aditif yang  penting  dalam  bahan  makanan, kosmetik,  dan  obat-obatan.  Aditif  ini berfungsi sebagai pengawet dan mencegah kerusakan  produk  akibat  pembentukan radikal  bebas.  Vitamin  C  ( L-asam askorbat )  bekerja  sebagai  antioksidan alami  dengan  kelarutan  tinggi  dalam  air, namun  adanya  sifat  hidrofilik  mampu mengurangi efektivitas dalam menstabilkan lemak dan minyak (Song and Wei, 2002). Masalah  stabilitas  tersebut  dapat  diatasi
dengan mensintesis senyawa ester-C (ester askorbil  asam  lemak)  yang  merupakan turunan  dari  vitamin  C  (Costa et  al ., 2014).Ester-C  memiliki  sifat  yang  mirip dengan  vitamin  C  sebagai  antioksidan (Spiclin et  al .,  2001),  serta  memiliki kelarutan  yang  tinggi  dalam  lemak  dan minyak  (Eitenmiller and Landen,  2010). Sintesis  ester  C  melalui  reaksi  enzimatik mempunyai  banyak  keuntungan  bagi produsen  maupun  konsumen  (Treichel et al ., 2010).
Penggunaan  enzim  lipase  sebagai biokatalisator dalam sintesis ester-C karena spesifitas,
regioselektivitas
dan
efektivitasnya  yang  tinggi  pada  kondisi ringan  sehingga  dapat  mencegah  oksidasi vitamin  C  dan  esternya  selama  reaksi (Kidwai et al ., 2009). Meskipun demikian, Nisha et  al .  (2012)  menyatakan  bahwa lipase  mempunyai  berbagai  keterbatasan, diantaranya  ialah  ketidakstabilan  enzim, sensitivitas yang tinggi terhadap perubahan lingkungan  dan  biaya  penggunaan  enzim yang  mahal.  Kelemahan  enzim  dapat diatasi  menggunakan  metode  imobilisasi yang  mampu  memperbaiki  kestabilan enzim dan kemampuan dalam penggunaan kembali pada proses selanjutnya, sehingga dapat  mengurangi  biaya  penggunaannya. Oleh  karena  itu,  pada  penggunaan  enzim lipase  sebagai  biokatalis  dalam  sintesis ester-C  perlu  dilakukan  imobilisasi  enzim untuk  meningkatkan  daya  tahan  terhadap perubahan  lingkungan  dan  menjaga kestabilan pada reaksi berulang.

## Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini ialah sentrifuge (G.P. Series), Pengaduk magnet  multi,  spektrofotometri  UV-Vis (Shimadzu  VU  mini  1240), shaking incubator (VS-8480), tube furnace (79400), Infra-red  spectrometer (FT-IR Shimadzu-8201 PC), High Pressure Liquid Chromatography (Shimadzu LC-20AD).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini  ialah  jamur  tiram  putih  ( Pleurotus ostreatus ),  buffer  phosphate  pH  8,  zeolit alam ( Chemmix Pratama), Sodium Florida, minyak  VCO,  Sodium  Hidroksida,  n- heksana,  Etanol  (97%),  indikator  pp, Bovine  Serum  Albumine (BSA),  reagen biuret,  kloroform,  Asam  Klorida  (37%), Sitopharm  Asam  Askorbat,  dan  kertas saring.

## Prosedur Penelitian Imobilisasi enzim lipase
Jamur  tiram  putih  diblender  dengan menambahkan buffer  phosphate pH  8
sampai  terbentuk  bubur  jamur  tiram. Supernatan  diperoleh  dari  hasil  sentrifus pada 350 rpm selama 20 menit. Pada proses imobilisasi  enzim,  30  mL  larutan  enzim lipase dicampurkan ke dalam 3 mL larutan gel  NaF  dan  9  g  zeolit  alam  teraktivasi. Campuran  diaduk  menggunakan stirrer pada  temperatur  10 ⁰ C  dengan  variasi waktu pengadukan selama 1, 2, 3, 4, dan 5 jam.

## Uji aktivitas enzim lipase
Aktivitas  enzim  lipase  terimobil dianalisis  menggunakan  metode  volumetri dengan  menambahkan  enzim  lipase terimobilisasi  ke  dalam  campuran  minyak VCO dalam n-heksana. Campuran diinkubasi  pada  temperatur  50 ⁰ C  dengan kecepatan  150  rpm  selama  30  menit. Campuran  dititrasi  menggunakan  larutan NaOH.Satu  unit  (U)  aktivitas  lipase didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  lipase untuk  membebaskan  1 𝜇𝑚𝑜𝑙 asam  lemak per menit (Karkhane et al ., 2012).

## Penentuan enzim loading
Penentuan  enzim loading dilakukan dengan cara mengetahui konsentrasi enzim lipase  sebelum  diimobilisasi  dan  sesudah diimobilisasi. Konsentrasi enzim diperoleh dengan  memplotkan  absorbansi  sampel pada persamaan regresi dari kurva kalibrasi standar albumin.Absorbansi diukur menggunakan  UV-Vis  pada  panjang gelombang 540 nm.
Sintesis ester-C dan uji stabilitas berulang Sintesis
dilakukan dengan menambahkan  serbuk  enzim  lipase terimobil, asam askorbat dan minyak VCO dengan  pelarut  kloroform.  Campuran diaduk  pada  temperatur  50 ⁰ C  dengan kecepatan  150  rpm  selama  6  jam.  Residu dicuci  menggunakan  larutan  NaCl  dan pelarut  untuk  digunakan  kembali  sebagai biokatalis dalam sintesis ester-C selanjutnya.  Hasil  sintesis  yang  diperoleh dikarakterisasi  menggunakan  FT-IR  dan HPLC.

## Hasil dan Pembahasan
Aktivitas Enzim Lipase Uji aktivitas enzim lipase terimobilisasi dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui dan membandingkan aktivitas enzim lipase bebas  dan  enzim  lipase  terimobilisasi secara entrapment menggunakan  zeolit alam  teraktivasi.  Hasil  aktivitas  katalitik pada  reaksi  hidrolisis  minyak  VCO  yang dihasilkan disajikan pada Tabel 1.

## Tabel 1. Nilai aktivitas enzim lipase
No. Nama enzim NaOH 0,05 M (mL) Aktivitas (U/mL) Sampel  blanko 1. EB 1,75 0,90 1,39 2. EI1 1,60 0,40 1,96 3. EI2 2,35 0,30 3,34 4. EI3 2,95 0,35 4,24 5. EI4 0,75 0,30 0,73 6. EI5 0,65 0,30 0,57
Keterangan: EB = enzim bebas, EI1 = enzim imobil selama 1 jam, EI2 = enzim imobil selama 2 jam, dst.
Aktivitas enzim pada enzim lipase bebas sebesar  1,39  U/  mL.  Waktu  pengadukan pada proses imobilisasi enzim yang paling optimum  ialah  selama  3  jam  dengan menghasilkan  aktivitas  katalitik  sebesar 4,24  U/  mL.  Adanya  perbedaan  hasil aktivitas  pada  enzim  lipase  sebelum  dan sesudah diimobilisasi diduga dari perbedaan daya tahan terhadap temperatur yang  digunakan  pada  saat  pengujian.Pada temperatur yang terlalu tinggi, enzim lipase bebas  akan mengalami denaturasi protein yang dapat mengubah konformasi struktur molekul dan mengganggu bagian sisi aktif enzim,  sehingga  enzim  kehilangan  sifat katalitiknya  (Amalia et  al .,  2013).
Sedangkan pada enzim lipase terimobilisasi,  kerusakan  yang  terjadi akibat perubahan lingkungan akan mengalami  keterlambatan  karena  adanya perlindungan dari matriks zeolit.

## Persentase Enzim Loading
Penentuan  enzim loading dilakukan untuk  mengetahui  besarnya  enzim  lipase yang  berhasil  terimobilisasi  menggunakan
metode entrapment dalam support zeolit (Parthu,  2012).  Enzim  lipase  yang  terjerat dalam  pori-pori  zeolit  akan  berinteraksi membentuk ikatan hidrogen akibat adanya kontak  antara  atom  oksigen  pada  zeolit alam (Si-O-Al) dengan atom H pada residu asam  amino  (-COOH)  (Sari et  al .,  2014). Hasil penentuan persentase enzim loading ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1. Hasil penentuan enzim loading pada variasi waktu pengadukan
Jumlah enzim lipase yang terjerat dalam matriks  zeolit  semakin  meningkat  dengan bertambahnya  waktu  pengadukan  sampai pada  waktu  optimum  yaitu  3  jam  dengan persentase enzim loading sebesar 63,07 %. Peningkatan  persentase  enzim loading dapat  dikaitkan  dengan  interaksi  antara enzim  lipase  dengan  matrik  yang digunakan  semakin  lama  akan  semakin kuat ikatannya (Sari et al ., 2014), sehingga pada  waktu  pengadukan  optimum  enzim lipase diperkirakan terjerat sempurna dalam matrik  tersebut.  Namun  demikian,  pada pengadukan  lebih  dari  waktu  optimum terjadi penurunan enzim loading . Kemungkinan  yang  terjadi  ialah  enzim lipase  mengalami  tingkat  kejenuan  pada waktu pengadukan selama 4 jam dan 5 jam, dimana laju adsorpsi yang dihasilkan akan sama dengan laju desorpsi sehingga enzim lipase akan terlepas kembali dari pori-pori zeolit.

## Sintesis Ester-C secara Berulang
Sintesis ester-C dilakukan melalui reaksi transesterifikasi  antara  asam  askorbat (vitamin C) yang bertindak sebagai alkohol
38.527 46.563 63.068 41.9 32.634 0 10 20 30 40 50 60 70 0 2 4 6 Enzim Lo a d in g (% ) Waktu (jam)
dan  suatu  ester  yang  berasal  dari  minyak VCO. Reaksi yang terjadi ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar  2. Reaksi  transesterifikasi  dalam sintesis ester-C
Reaksi  transesterifikasi  yang  terjadi pada  sintesis  ester-C.  Laju  asilasi  yang terjadi  bergantung  pada  halangan  sterik dalam suatu alkohol yang digunakan.Asam askorbat  mempunyai  empat  gugus  –OH, dimana  salah  satunya  merupakan  alkohol primer.  Secara  umum,  Karmee  (2011) menyatakan  bahwa  laju  esterifikasi- transesterifikasi paling cepat pada penggunaan  alkohol  primer,  karena mempunyai  reaktivitas  yang  paling  tinggi pada  reaksi  esterifikasi-transesterifikasi, sehingga  alkohol  primer  tersebut  yang menyerang karbon positif dari suatu ester. Selanjutnya  pada  reaksi  tersebut  akan mengalami  eliminasi  ROH  dan  akan membentuk  suatu  ester  baru  yang  dituju, yaitu  ester-C  ( ascorbyl  ester ).Hubungan antara  uji  stabilitas  enzim  secara  berulang dengan  persentase  konsentrasi  ester-C disajikan pada Gambar 3.
Enzim  lipase  terimobilisasi  dapat digunakan  secara  berulang-ulang  dalam reaksi  transesterifikasi  pada  sintesis  ester- C.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  enzim lipase terimobilisasi mampu mempertahankan  aktivitas  katalitiknya pada  penggunaan  sebanyak  tiga  kali pengulangan.  Meskipun  demikian,  ester-C yang  diperoleh  menunjukkan  adanya penurunan  persentase  area.Kemungkinan yang  terjadi  ialah  adanya  kontaminasi substrat yang mengakibatkan enzim lipase mengalami kerusakan, dapat pula disebabkan karena konsentrasi enzim yang bereaksi  pada  penggunaan  selanjutnya sudah  berkurang.  Selain  itu,  Hasanah and Putra  (2009)  menyatakan  bahwa  proses penyimpanan  enzim  lipase  terimobilisasi
dapat mempengaruhi aktivitas katalitik. Hal ini  disebabkan  oleh  adanya  pelepasan enzim selama masa penyimpanan berkaitan dengan temperatur maupun pH yang tidak konstan dan perbedaan waktu penyimpanan.
Gambar 3. Hubungan antara uji stabilitas enzim  secara  berulang  dengan  persentase konsentrasi ester-C.

## Analisis FT-IR
Analisa FT-IR dilakukan untuk mengetahui  adanya  gugus  fungsi  yang terdapat pada senyawa hasil sintesis ester- C.  Hasil  spektra  IR  pada  asam  askorbat sebagai bahan awal dan hasil sintesis ester- C ditampilkan pada Gambar 4.
Gambar  4. Spektra  IR  dari  (A)  asam askorbat dan (B) hasil sintesis ester-C
Karakterisasi  gugus  fungsi  pada  asam askorbat  ditunjukkan  dengan  adanya serapan puncak yang menunjukkan alkohol primer dan puncak regangan C-O alkohol. Menurut  Panicker et al.  (2005),  pada spektrum IR asam askorbat terdapat puncak gugus O-H yang membentang dikarenakan
41.07 36.09 25.39 20 25 30 35 40 45 1 2 3 K o n se n tr as i ( % ) Pengulangan ke-
adanya  kelembaban  dalam  sampel  yang digunakan.  Serapan  puncak  C=O  yang muncul dimungkinkan adanya  gugus ester dalam senyawa tersebut. Hal ini ditunjukkan  adanya  perbedaan  antara spektrum  IR  asam  askorbat  (vitami  C) dengan hasil sintesis.
Berdasarkan interpretasi data spektra IR pada hasil sintesis ester-C diduga terdapat perbedaan dengan spektrum IR pada asam askorbat.  Spektrum  hasil  sintesis  ester-C menunjukkan  adanya  regangan  C-H  sp 3 , yang  diperkuat  dengan  adanya  puncak regangan C-H. Sedangakan pada spektrum asam  askorbat  tidak  menunjukkan  adanya puncak  yang  sama.Hal  ini  dikarenakan terjadi  peningkatan  jumlah  streching  C-H sp 3 pada  ester  C  dibandingkan  asam askorbat.
Puncak  khas  gugus  alkohol  pada  hasil sintesis ester-C dapat dilihat menunjukkan adanya perbedaan. Pada hasil sintesis ester- C menunjukkan puncak regangan gugus O- H  dan  puncak  regangan  C-O  yang  terikat pada  alkohol  terdapat  pada  bilangan gelombang  1111  cm -1 yang  menunjukkan adanya  alkohol  sekunder.  Hasil  spektrum IR  ester-C  tidak  menunjukkan  adanya gugus  C-O  yang  terikat  pada  alkohol primer,  yaitu  pada  bilangan  gelombang 1075-1000cm -1 .  Hal  ini  dikarenakan  pada reaksi  transesterifikasi,  gugus  alkohol primer  pada senyawa asam askorbat akan berikatan  dengan  suatu  ester  dari  minyak VCO  menjadi  senyawa  ester-C,  sehingga pada  senyawa  ester-C  tidak  mengandung alkohol primer. Berdasarkan hasil perbandingan  interpretasi  spektra  IR disimpulkan bahwa pada reaksi
transesterifikasi  menghasilkan  senyawa ester-C.

## Analisis HPLC
Standar yang digunakan pada penelitian ini  ialah  larutan  standar  Asam  Askorbat (Vitamin  C)  dan Ester-C  holisticare yang telah diekstrak. Hasil kromatogram larutan standar  ditunjukkan  pada  Gambar  5. Menurut  Erviana et  al .  (2013),  puncak ester-C akan muncul lebih lama
dibandingkan  dengan  puncak  asam askorbat,  hal  ini  berkaitan  dengan perbedaan  titik  didih  kedua  senyawa tersebut. Puncak identifikasi asam askorbat muncul  pada  waktu  retensi  2,41  menit Sedangkan hasil kromatogram dari holisticare  Ester-C yang  telah  diekstraksi menunjukkan  puncak  pada  waktu  retensi 2,66  menit,  dimana  puncak  tersebut merupakan  puncak  identifikasi  dari  asam askorbat.  Puncak  pelarut  kloroform diketahui  muncul  pada  waktu  retensi  3,41 menit dan puncak yang diduga merupakan ester-C  muncul  pada  waktu  retensi  6,37 menit.  Adapun  hasil  kromatogram  pada sintesis ester-C disajikan pada Gambar 6.
Gambar 5. Hasil kromatogram standar (A) Asam askorbat dan (B) Ester-C holisticare
Hasil  kromatogram  pada  Gambar  6 menunjukkan  puncak  pada  waktu  retensi 2,46  menit  yang  diketahui  merupakan puncak  senyawa  asam  askorbat.  Puncak senyawa  ester-C  dari  hasil  sintesis  diduga muncul  pada  waktu  retensi  6,63  menit. Sintesis  ester-C  pada  penelitian  ini dimungkinkan menghasilkan suatu senyawa yang mirip dengan senyawa yang terkandung  dalam holisticare  Ester-C , dibuktikan  dengan  terbentuknya  puncak
B
B A
yang  muncul  pada  waktu  retensi  sekitar menit ke-6.
Gambar 6. Hasil kromatogram pada hasil sintesis Ester-C

## Kesimpulan
Imobilisasi enzim lipase secara entrapment menggunakan zeolit alam dapat digunakan sebagai biokatalis dalam sintesis ester-C pada penggunaan berulang sebanyak tiga kali. Pada waktu pengadukan imobilisasi  enzim  lipase  selama  3  jam menunjukkan waktu yang paling optimum dengan nilai aktivitas lipase sebesar 4,24 U/ mL  dan  persentase  enzim loading sebesar 63,07 %.

## Daftar Pustaka
Amalia, R., Rumondang B. dan Firman S. (2013).  Penetuan  pH  dan  Suhu Optimum  untuk  Aktivitas  Ekstrak Kasar  Enzim  Lipase  dari  Kecambah Biji  Karet  ( Hevea  brasiliensis) terhadap Hidrolisis PKO ( Palm Kernel Oil ), Jurnal Saintia Kimia, 1(2).
Costa, I. C. R., Sutili, F. K., Da Silva, G. V. V,  Leite,  S.  G.  F.,  Miranda,  L.  S.  M. and  De  Souza,  R.  O.  M.  A.  (2014). Lipase  catalyzed  ascorbyl  palmitate synthesis under microwave irradiation, Journal  of  Molecular  Catalysis  B: Enzymatic , 102, 127–131.
Eitenmiller, Ronald, R. and Landen, W. O. (2010). Vitamin  Analysis  for  the Health  and  Food  Sciences, London: CRC Press.
Erviana,  W.,  E.  Kusumo  dan  Supartono. (2014).  Sintesis  Ester-C  melalui Reaksi Transesterifikasi dengan Katalis  Enzim  Lipase, Indonesian Journal of Chemical Science, 3, 203 – 206.
Hasanah, Elok N.I. dan Putra, S. R. (2009).
Karakterisasi  Ekstrak  Kasar  Enzim Invertase  yang  Diamobilisasi  dengan Na-Alginat, Prosiding Skripsi, SK-08.
Surabaya:  FMIPA,  Institut  Teknologi 10 Nopember.
Karkhane, A. A., Yakhchali, B. Jazli, F. R.,
Hemmat, J., Shariati, P.,
Khodabandeh, M. and Zomorodipoor, A.  (2012).  Periplasmic  Expression  of Bacillus  thermocatenulatus Lipase  in Escherichia  coli in  Presence  of Different  Signal  Sequences, Iranian Journal of Biotechnology, 10(4) 255 – 262.
Karmee,  S.  K.  (2011).  The  Synthesis,
Properties,  and  Applications  of Ascorbyl Ester, Lipid Technology , 23, 227 – 229.
Kidwai, M., Mothsra, P., Gupta, N., Kumar, S.  S.  and  Gupta,  R.  (2009).  Green Enzymatic  Synthesis  of  L-Ascorbyl Fatty  Acid  Ester:  An  Antioxidant. Synthetic Communications, 39 , 1143 – 1151.
Nisha,  Arun  K.    and  Gobi  N.  (2012).  A Review  on  Methods,  Application  and Properties  of  Immobilized  Enzyme, Chemical Science Review and Letters , 1, 148 –155.
Panicker, C.Y., Varghese, H.T. and Philip, D.  (2005).  FT-IR,  FT-Raman  and SERS  Spectra  of  Vitamin  C. Spectrochimica Acta Part A, 65 , 802 – 804.
Parthu,  R.  D.  (2012).  Sintesis  Biodiesel Rute Non Alkohol dari Minyak Goreng dengan Biokatalis Terimobilisasi
Entrapment  pada  Reaktor  Batch  dan Reaktor Packed Bed , Skrips i, Fakultas Teknik, Universitas Indonesia.
Sari, I.P., Sutrisno and Sasangka P. (2014). Optimasi  Amobilisasi  Xilanase  dari ITrichoderma  viride  dengan  Matriks Zeolit, Kimia Student Journal, 2, 421 – 427. Song, Q. X. and Wei, D. Z. (2002). Study of  Vitamin  C  Ester  Synthesis  by Immobilized Lipase from Candida sp., Journal  of  Molecular  Catalysis  B: Enzymatic , 18, 261 – 266.
Spiclin,  P.,  Gasperlin  M.  and  Kmetec,  V. (2001). Stability of Ascorbyl Palmitate in  Tropical  Microemulsions. Inter- national  Journal  of  Pharmaceutic,
222, 271 – 279.
Treichel, H., Oliveira, D., Mazutti, M. A., Luccio,  M.  D.  and  Oliveira,  J.  V. (2010).  A  Review  on  Microbial
Lipases Production, Food and Bioprocess Technology, 3,182 – 196.