ANALISIS SEKUENS DAN FILOGENETIK BEBERAPA TUMBUHAN Syzygium (MYRTACEAE) DI SULAWESI UTARA BERDASARKAN GEN mat K
Presticilla D. Irawan 1) Trina E. Tallei 1) Beivy J. Kolondam 1)
1) Program Studi Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Sam Ratulangi Jl. Kampus UNSRAT FMIPA, Manado 95115
e-mail: presticilla@ymail.com ; trina_tallei@unsrat.ac.id; beivy.kolondam@unsrat.ac.id

## ABSTRAK
Syzygium (Myrtaceae)  merupakan  tumbuhan  yang  memiliki  banyak  manfaat  di  bidang  ekonomi dan  kesehatan.  Informasi  dan  publikasi  mengenai  klasifikasi  tumbuhan Syzygium masih  sedikit. Pengelompokkan  beberapa  jenis  tumbuhan  dalam  genus  ini  masih  ditemui  masalah,  antara  lain tumpang  tindihnya  nama Syzygium dengan Eugenia dan  beberapa  tumbuhan  belum  diketahui posisinya dalam klasifikasi. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis variasi sekuens gen mat K dan  mengkonstruksi  pohon  filogenetik  pada  beberapa  tumbuhan Syzygium di  Sulawesi  Utara, yaitu pakoba, jamblang dan bombongan. Analisis variasi sekuens menunjukkan adanya perbedaan satu  nukleotida  antara  tumbuhan  pakoba  dan  jamblang,  serta  perbedaan  5-6  nukleotida  antara bombongan  dengan  jamblang  dan  pakoba.  Selain  itu,  variasi  juga  ditunjukan  antara  sekuens sampel tumbuhan Syzygium dengan sekuens kerabat yang diperoleh dari basis data GenBank yaitu adanya  perbedaan  2-3  nukleotida  dengan  spesies  kerabat  terdekat  dan  perbedaan  5-6  nukleotida dengan  spesies  kerabat  terjauh.  Hasil  perhitungan  jarak  genetik  menggunakan  Kimura-2- parameter menunjukkan nilai jarak interspesies kecil, yaitu 0.000-0.011.
Kata Kunci: Variasi Genetik, Gen mat K, Syzygium , Sulawesi Utara .
SEQUENCES AND PHYLOGENETIC ANALYSIS OF Syzygium (MYRTACEAE) PLANTS IN NORTH SULAWESI BASED ON mat K GENE

## ABSTRACT
Syzygium (family:  Myrtaceae)  is  a  genus  of  plants  with  many  benefits  in  economics  and  health. Information and publications on the classification of Syzygium are still few in number. Grouping several  plant  species  in  this  genus  is  still  problematic,  among  other  there  is  overlapping  of Syzygium and Eugenia and the position in the classification of some plants are yet unknown. This study  was  conducted  to  analyze  the  sequences  variations  of mat K  genes  and  and  to  construct phylogenetic  tree  of  some Syzygium plants  found    in  North  Sulawesi,  namely  pakoba,  jamblang and bombongan. There are one nucleotide nucleotide difference between pakoba and jamblang, as well as 5-6 nucleotide differences between bombongan with jamblang and pakoba. In addition, 2- 3  sequence  variations  also  occur  between  our Syzygium samples  and  their  closest  allied  species and 5-6 nucleotides differences  with their farthest  allied species, all of which are retrieved from GenBank. Genetic distance calculated using Kimura-2-parameter shows a very low (0.000-0.011) interspesific distance.
Keywords: Genetic Variation, mat K Gene, Syzygium , Sulawesi Utara.

## PENDAHULUAN
Syzygium salah  satu  genus  dari  suku Myrtaceae  (jambu-jambuan),  memiliki  lebih dari  1000  spesies,  dan  merupakan  tumbuhan utama  flora  hutan  hujan  tropis  di  daerah Malesia  (Asif et  al. ,  2013).  Di  Indonesia, jumlah  tumbuhan Syzygium mencapai  300 jenis,  dan  di  Jawa  terdapat  sekitar  60  jenis
(Sunarti,  2015). Banyak  anggota  dari  genus ini  memiliki  nilai  ekonomis  dan  telah digunakan  sebagai  obat-obatan,  makanan, bahan bangunan, dan tanaman hias. Syzygium merupakan genus yang sulit untuk diklasifikasikan karena  hanya memiliki sedikit  karakter  morfologi  yang  secara konsisten  menghubungkan  suatu  spesies  ke dalam kelompok spesies tertentu. Hal ini juga
didukung  dengan  tumpang  tindihnya  nama Syzygium dengan Eugenia .  Hingga  saat  ini hanya  relatif  sedikit  publikasi  mengenai klasifikasi Syzygium (Craven  dan  Biffin, 2010).
Identifikasi  spesies  secara  akurat menggunakan metode tradisional bisa memakan  waktu  yang  lama  disebabkan kurangnya  pengetahuan  mengenai  tumbuhan dan/atau  kurangnya  karakter  bunga  dan  buah yang  dibutuhkan  untuk  identifikasi  (Colpaert et  al .,  2005).  Identifikasi  spesies  berbasis sekuens  DNA  merupakan  metode  yang dianggap cepat,
dapat dipertanggungjawabkan, dan konsisten, sehingga  penting  dalam  penelitian  biologi konservasi  dan  keanekaragaman  (Waugh, 2007).  Identifikasi  dengan  sekuens  DNA dilakukan  menggunakan  penanda  molekuler. Salah  satu  penanda  molekuler  yang  saat  ini digunakan  dalam  mengungkapkan  taksonomi yaitu  kode  batang  DNA  ( DNA  barcoding ) yang merupakan urutan  sekuen pendek DNA yang  dapat  menunjukkan  variasi  genetik dalam  suatu  spesies  (Chippindale et  al ., 1999).  Dalam  proses DNA  Barcoding ,  gen tertentu  dapat  digunakan  sebagai marker
dalam  pembagian  genetik  spesies  dan rekonstruksi filogenetik. Salah satu gen yang digunakan  yaitu mat K  ( Maturase  K ),  yang merupakan  gen  kloroplas  berukuran  sekitar 1500  pasang  basa  (bp)  yang  berlokasi  di intron trn K  (Selvaraj et  al. ,  2008;  Jethra et al. , 2014 ).  Saat ini gen mat K telah digunakan sebagai  alat  yang  penting  untuk  memeriksa keanekaragaman  genetik  intraspesies  dan interspesies  karena  memiliki  laju  substitusi yang  tinggi  (Hollingsworth et  al .,  2011). Penelitian  ini dilakukan  dengan  tujuan menganalisis  variasi  sekuens  gen mat K  dan membangun pohon filogenetik beberapa jenis Syzygium yang  ada  di  Sulawesi  Utara,  yaitu pakoba, jamblang, dan bombongan.

## METODE PENELITIAN
Ekstraksi DNA Ekstraksi
DNA menggunakan
Axyprep Multisource Genomic DNA miniprep kit (Axygen).  Modifikasi  dilakukan  untuk memaksimalkan  lisis  dengan  waktu  inkubasi 1  jam  dalam  suhu  60°C  (Kolondam et  al. ,
2013). Bagian sampel  yang digunakan dalam ekstraksi yaitu potongan kecil lembaran daun muda.
Amplifikasi  Gen mat K  dengan  metode PCR dan Sekuensing
Primer  gen mat K  yang  digunakan yaitu mat K-3F-R  (5’-CGT  ACA  GTA  CTT TTG  TGT  TTA  CGA  G-3’)  dan mat K-1R-F (5’ACC  CAG  TCC  ATC  TGG  AAA  TCT TGG TTC-3’) yang dirancang oleh Ki-Joong Kim (Kuzmina et al. , 2012). Amplifikasi gen mat K  dilakukan  di  dalam  40  µL  reaksi  PCR menggunakan  2x  KapaTaq  PCR  MasterMix. Komponen  yang  dicampur  yaitu  20  µL  2X KapaTaq,  1,5µL  primer  forward,  1,5µL primer reverse, 2 µL templat DNA, dan 15µL ddH 2 O  (air  terdeionisasi)  untuk  satu  kali reaksi.  Pengaturan  suhu  untuk  mesin  PCR TPersonal (Bimetra) dimulai dengan denaturasi  awal  ( initial  denaturation )  pada 95˚C  selama  2  menit,  35  siklus  yang  terdiri atas  tahap  denaturasi,  penempelan  primer pada  cetakan,  dan  ekstensi  DNA.  Suhu  dan waktu  berturut-turut  yaitu  95˚C  selama  30 detik, 50˚C selama 30 detik, dan 72˚C selama 50  detik  (Tallei et  al .,  2016).  Sekuensing dilakukan  oleh  penyedia  jasa  sekuensing 1 st BASE Malaysia .

## Analisis Data
Data  sekuens  dirakit  dan  diedit menggunakan  Genious  v  5.6  mengikuti prosedur Tallei dan Kolondam (2015). Proses pairwise  alignment dilakukan  untuk  hasil sekuensing  menggunakan  primer  reverse (matK-1R-f),  kemudian  dipadukan  dengan hasil sekuensing primer forward (matK-3F-r) menggunakan Global Alignment yang terintegrasi  dalam  Geneious.  Kedua  ujung sekuens  dipotong  pada  saat  penjajaran  untuk menghindari  salah  pembacaan  sehingga semua  sekuens  dipotong  hingga  menyisakan 648  nukleotida.  Sekuens mat K  dari  sampel digunakan  untuk  mencari  sekuens  serupa  di Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Sekuens-sekuens mat K  kemudian  dijajarkan menggunakan Multalin v.5.4.1 (multalin.toulouse.inra.fr/multalin/). Pohon filogenetik
dikonstruksi menggunakan metode  UPGMA  dan  jarak  genetik  dihitung menggunakan  metode  Kimura’s  2-parameter yang  terintegrasi  di  dalam  piranti  lunak MEGA6 yang dikembangkan oleh  Tamura et al . (2013).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penjajaran  awal  dilakukan  antara sekuens  pakoba,  jamblang,  dan  bombongan.
Hasil pada Gambar 1 menunjukkan perbedaan  hanya  satu  nukleotida  antara pakoba  dan  jamblang,  yaitu  pada  posisi  ke- 523. Perbedaan nukleotida antara bombongan dengan  pakoba  yaitu  sebanyak  6  nukleotida, yaitu pada posisi ke- 131, 432, 474, 523, 645, dan  666.  Perbedaan  nukleotida  bombongan dengan  jamblang  yaitu  5  nukleotida,  yaitu pada posisi ke- 131, 432, 474, 645, dan 666.
Masing-masing  sekuens  sampel  yang telah diedit menggunakan Geneious digunakan  dalam  pencarian  sekuens  kerabat terdekatnya  di  GenBank  (Gambar  2).  Dilihat dari  perbedaan  jumlah  variasi  nukleotida, spesies  yang  mendekati  kelima  sampel tersebut  yaitu Syzygium  ngoyense dan Syzygium sandwicense . Perbedaan dua nukleotida terdapat antara Syzygium ngoyense dengan  jamblang  (posisi  77,  612),  serta berbeda  tiga  nukleotida  dengan  pakoba (posisi  77,  469,  612)  dan  bombongan  (posisi 378,  420,  591). Syzygium  sandwicense berbeda  dua  nukleotida  dengan  sekuens jamblang  (posisi  77,  612),  serta  berbeda  tiga nukleotida dengan sekuens pakoba (posisi 77, 469,  612)  dan  bombongan  (posisi  378,  420, 591).  Spesies  kerabat  terjauh  dengan  ketiga sampel  yaitu Syzygium  glenum ,  di  mana perbedaan  sekuens  dengan  jamblang  5 nukleotida  (posisi  77,  387,  416,  612,  613), serta  dengan  pakoba  (posisi  77,  387,  416, 469,  612,  613)  dan  bombongan  (posisi  378, 387,  416,  420,  591,  613)  yaitu  6  nukleotida. Hasil  penjajaran  sekuens  jamblang  dengan beberapa  sekuens Syzygium  cumini di GenBank (DQ088575, JX495762, GU134997, AB924857, AB924961, AB925017, AB925174, AB925241, AB925007,  AB  925038,  GU135062,  JN 114772) menunjukkan perbedaan 4-10 nukleotida (Gambar 3).
Hasil  sekuens  dibuat  dalam  format FASTA  untuk  konstruksi  pohon  filogenetik menggunakan  MEGA6.  Pohon  dikonstruksi dengan  model  UPGMA  dan  jarak  genetik Kimura-2-Parameter.  Pada  proses  pembuatan pohon tersebut, sekuens tumbuhan Myrtaceae lain  yaitu Psidium  guajava (AB354958)
digunakan  sebagai outgroup .  Selain  itu sekuens Eugenia ,  yaitu Eugenia  capensis
(KF147400),
Eugenia salamensis (JQ588488), dan Eugenia nesiotica (GQ981989) digunakan  untuk  memperjelas hubungan dengan Syzygium karena penamaan dengan  keduanya  yang  tumpang  tindih (Craven  dan  Biffin,  2010).  Pohon  tersebut menunjukkan  posisi  sampel dengan  spesies kerabatnya  (Gambar  4).  Posisi  jamblang dengan  pakoba  dalam  pohon  filogenetik terletak pada satu klaster, sehingga menunjukkan  bahwa  keduanya  berkerabat dekat.  Akan  tetapi,  posisi Syzygium  cumini (DQ088575)  berada  pada  klaster  yang berbeda,  sehingga  jamblang  tampaknya memiliki  kekerabatan  yang  jauh  dari S. Cumini tersebut . Pohon filogenetik mengindikasikan  hubungan  yang  jauh  antara Eugenia dengan Syzygium .
Jarak genetik antara sampel tumbuhan dengan kerabat
Syzygium dihitung menggunakan  metode  Kimura-2-Parameter pada MEGA6 (Kimura, 1980). Hasil menunjukkan jarak genetik antara pakoba dan jamblang  yaitu  0.002.  Menurut  Tallei et  al. (2016),  semakin  sedikit  nilai  jarak  genetik antara  dua  organisme,  semakin  dekat  pula hubungan kekerabatan keduanya. Hasil tersebut  menandakan  bahwa  kemungkinan besar  tumbuhan  pakoba  dan  jamblang berkerabat  dekat,  dan  bahkan  cenderung sebagai  spesies  yang  sama  atau  merupakan subspesies.  Jarak  genetik  antara  jamblang dengan Syzygium  cumini yaitu  0.010.  Nilai ini jauh lebih besar dibandingkan nilai antara pakoba  dan  jamblang.  Nilai  jarak  genetik antara  bombongan  dengan Syzygium lainnya yang  diperoleh  dari  GenBank  berkisar  antara 0.005-0.010. Nilai jarak interspesies di antara genus Syzygium yaitu  0.000-0.011.  Kisaran tersebut  sangat  kecil  dibandingkan  dengan hasil jarak genetik interspesies 0.0023-0.0291 untuk  tumbuhan Acacia (Newmaster  dan Ragupathy,  2009),  rata-rata  jarak  genetik interspesies  0.042±0.0030  untuk  tumbuhan dari  famili  Myristicaceae  (Newmaster et  al., 2008), serta rata-rata jarak genetik interspesies  0.0093±0.0081  untuk  tumbuhan Rosaceae  (Pang et  al. ,  2010).  Berdasarkan hasil  tersebut,  kemampuan  gen mat K  untuk memisahkan  tumbuhan Syzygium dalam  hal ini rendah.
Gambar  1.  Penjajaran  sekuens  gen mat K  tumbuhan Syzygium di  Sulawesi  Utara,  yaitu  pakoba, jamblang, dan bombongan menggunakan software Multalin v5.4.1.
Gambar  2.  Penjajaran  sekuens  gen mat K  tumbuhan Syzygium di  Sulawesi  Utara  dengan  kerabat terdekat dari genus Syzygium yang diperoleh dari GenBank
Gambar  3.  Penjajaran  sekuens  gen mat K  tumbuhan  jamblang dengan  sekuens Syzygium  cumini yang diperoleh dari GenBank
Gambar 4. Pohon Filogenetik Syzygium yang dikonstruksi menggunakan metode UPGMA dalam software MEGA6

## KESIMPULAN
Perbandingan  variasi  genetik mat K sampel  menunjukkan  perbedaan  hanya  1 nukleotida antara jamblang dan pakoba, serta perbedaan  5-6  nukleotida  antara  keduanya dengan  bombongan.  Perbedaan  nukleotida sekuens  sampel  dengan  kerabatnya  di GenBank  yaitu  2-6  nukleotida.  Nilai  jarak genetik  interspesies Syzygium termasuk rendah, yaitu 0.000-0.011.

## DAFTAR PUSTAKA
Asif,  H.,  Khan,  A.,  Iqbal,  A.,  Khan,  I.A., Heinze,  B.  2013.  The  chloroplast genome sequence of Syzygium cumini (L.)  and  its  relationship  with other  angiosperms. Tree  Genetics  & Genomes 9(3): 867-877.
Chippindale,  P.T.,  Dave,  V.K.,  Whitmore,
D.H., Robinson, J.V. 1999 Phylogenetic  relationships  of  North American  damselflies  of  the  genus Ischnura (Odonata: Zygoptera: Coenagrionidae)  based  on  sequences of three mitochondrial genes.
Molecular Phylogenetics and Evolution 11(1): 110-121.
Colpaert,  N.,  Cavers,  S.,  Bandou,  E.,  Caron, H.,  Gheysen,  G.,  Lowe,  A.J.  2005. Sampling  Tissue  for  DNA  Analysis of  Trees:  Trunk  Cambium  as  an Alternative to Canopy Leaves. Silvae Genetica 54(6): 265–269.
Craven, L.A., Biffin, E. 2010. An infrageneric classification of Syzygium (Myrtaceae). Blumea 55(1): 94–99.
Hollingsworth,  P.M.,  Graham,  S.W.,  Little, D.P.  2011.  Choosing  and  Using  a Plant  DNA  Barcode. PLoS  ONE 6(5): e19254.
Kolondam, B. J. 2015.  Applying mat K  Gene For  Identification  of  Liliopsida  Plant
Species From North Sulawesi Through Bold Systems. International Journal  of  Applied  Biology  and Pharmaceutical  Technology 6(2): 242-245.
Kolondam,  B.J.,  Lengkong,  E.,  Polii- Mandang, J., Runtunuwu, S., Pinaria, A.  2013. Barcode DNA  Anthurium Gelombang Cinta ( Anthurium plowmanii )  berdasarkan  gen  rbcL dan matK. BIOSLOGOS 3(1): 17-25.
Kuzmina, M.L., Johnson, K.L., Barron, H.R., Herbert,  P.D.N.,  2012.  Identification of  vascular  plants  of  Churchill, Manitoba,  using  a  DNA  barcode library. BMC  Ecology 12  (1):1-11. DOI:10.1186/1472-6785-12-25
Pang,  X.,  Song,  J.,  Zhu,  Y.,  Xu,  H.,  Huang, L.,  Chen,  S.  2010.  Applying  plant DNA  barcodes  for  Rosaceae  species identification. Cladistics 27(2):  165- 170.
Newmaster,  S.G.,  Fazekas,  A.J.,  Steeves,
A.D.,  Janovec,  J.  2008.  Testing candidate  plant  barcodes  regions  in the Myristicaceae. Molecular Ecology Resources 8(3): 480-490.
Newmaster,  S.G.,  Ragupathy,  S.  2009. Testing  plant  barcoding  in  a  sister species complex of pantropical Acacia (Mimosoideae,  Fabaceae). Molecular  Ecology  Resources 9 Suppl s1: 172-180.
Sunarti,  S.  2015.  Persebaran Syzygium endemik  Jawa. Prosiding  Seminar Nasional  Masyarakat  Biodiversitas
Indonesia 1(5): 1093-1098.
Tallei,  T.E.,  Kolondam,  B.J.  2015.  DNA
Barcoding of Sangihe Nutmeg
( Myristica  fragrans )  using  matK Gene. HAYATI Journal of Biosciences 22(1): 41-47.
Tallei,  T.E.,  Rembet,  R.E.,  Pelealu,  J.J.,
Kolondam,  B.J.  2016.  Sequence Variation  and  Phylogenetic  Analysis of Sansevieria trifasciata
(Asparagaceae). Bioscience Research
13(1): 01-07.
Tamura,  K.,  Stecher,  G.,  Peterson,  D., Filipski,  A.,  Kumar,  S.  2013.
MEGA6:  Molecular  Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Molecular  Biologi  and  Evolution 30(12): 2725-2729.
Waugh,  J.  2007.  DNA  barcoding  in  animal species:  progress,  potential  and pitfalls. Bioessays 29(2): 188–197.