## ANALISIS  FILOGENETIK  GEN  gyrA  DAN  gyrB  DARI  GENUS
Mesorhizobium, Rhizobium DAN Ensifer
PHYLOGENETICS  ANALYSIS  OF  gyrA  AND  gyrB  GENES  FROM  GENUS Mesorhizobium, Rhizobium AND Ensifer
Edwin Thomas Apituley * 1 , Efraim Samson 2 , Amos Killay 3
1 Program Studi Bioteknologi, Fakultas MIPA Universitas Pattimura, Ambon - Indonesia
2 Program Studi Biologi, Fakultas MIPA Universitas Pattimura, Ambon – Indonesia
3 Program Studi Sains Biomedis, Fakultas MIPA Universitas Pattimura, Ambon - Indonesia * Corresponding Author e-mail : edwin.apituley.mail@gmail.com

## ABSTRACT
Keywords: DNA gyrase; filogeni ; rhizobium; ensifer;
mesorhizobium
GyrA and gyrB genes encoding subunit A and B of gyrase enzyme have often been used as molecular chronometer in phylogenetics analysis including nitrogen fixing microorganisms such  as  genus  of  Rhizobium,  Ensifer  dan  Mesorhizobium.  Nucleotide  variation  and  gene copy  number  usually  limit  interpretation  of  phylogenetics  analysis  using  gen  sequence  as molecular chronometer. In this  study, gyrA  and  gyrB sequences from genus of Rhizobium, Ensifer  and  Mesorhizobium  were  analyzed  to  determine  evolutionary  relationship  among them.  Maximum  Likelihood    and  Kimura  2  parameter  methods  were  used  to  construct phylogenetic  tree  and  measure  genetic  distance.  Phylogenetic  tree  based  on  nucleotide sequence of gyrA gene was compared to phylogenetic tree based on nucleotide sequence of gyrB  gene.  Comparison  of  identity  percentage  among  nucleotide  sequence  of  gyrA  gene from  genus  Rhizobium,  Ensifer  and  Mesorhizobium  show  similarity,  where  each  of  them have narrow range of identity percentage, however nucleotide sequence of gyrB gene from genus  Rhizobium  and  Ensifer  show  wider  identity  percentage  range  than  genus Mesorhizobium.  Several member of genus Rhizobium and Ensifer have double copy of gyrB gene with identity percentage less than 50 percent between them. Topology of phylogenetic tree  based  on  nucleotide  sequence  of  gyrA  gene  have  similar  topology  to  topology  of phylogenetic tree based on nucleotide sequence of gyrB gene, except for additional branch formed by one of additional copy of gyrB sequences.

## Article History:
Dikirim: 07 November 2023 Diterima: 26 November 2023 Disetujui: 30 November 2023 © 2023 Jurusan Biologi FMIPA Universitas Pattimura
Copyright © 2023 Biofaal Journal Homepage: https://ojs3.unpatti.ac.id/index.php/biofaal/index E-mail: biofaaljournal@gmail.com
This  article  is  an  open  access  article  distributed a  Creative  Commons  Attribution-NonCommercial-ShareAlike  4.0 International License
How to cite: Apituley ET, Samson E, and Killay A. 2023. Analisis Filogenetik Gen gyr A dan gyr B Dari Genus Mesorhizobium , Rhizobium Dan Ensifer . Biofaal Journal. 4(2): 118-127.

## BIOFAAL Journal
Desember 2023   Volume 4 Nomor 2   Halaman 118-127 E-ISSN: 2723-4959
https://doi.org/10.30598/biofaal.v4i2pp118-127

## A. PENDAHULUAN
Nitrogen  adalah  salah  satu  komponen  yang  sangat  penting  di  dalam  ekosistem  dan merupakan  komponen  penting penyusun protein maupun asam nukleat pada mahluk hidup. Kemampuan  bakteri  yang  hidup  pada  perakaran  tanaman  untuk  menambat  nitrogen  dan digunakan tanaman untuk membentuk protein maupun senyawa organik   yang   lain   sangat berpengaruh    terhadap      kesejahteraan    manusia,    seperti  ketersediaan  pangan  khususnya pangan  sebagai  sumber  protein.  Beberapa  spesies  prokariot  memiliki  kemampuan  untuk melakukan penambatan  nitrogen, misalnya  beberapa spesies  bakteri seperti Rhizobium yang hidup  bersimbiosis pada  bintil  akar  tanaman  legume  maupun  sejumlah  jenis tanaman yang lain. Rhizobium merupakan  genus  anggota  subdivisi  Alphaproteobacteria  dari  ordo Rhizobiales ,  bersama  dengan  beberapa  genus  yang  lain,  seperti Bradyrhizobium , Ensifer , Mesorhizobium (Chen  et  al.,  1988;  Jarvis  et  al.,  1997)  disebut  rhizobia.  Anggota  ordo Rhizobiales hidup bersimbiosis dengan tanaman inang, misalnya Bradyrhizobium japonicum yang  hidup  bersimbiosis  dengan Glycine  max , Ensifer  meliloti dengan Medicago  sativa , Mesorhizobium  amorphae dengan Amorpha    fruticosa dan Rhizoium    trifolii dengan Trifolium  sp. ).
Secara  tradisional,  hubungan  kekerabatan  antar  organisme  direpresentasikan  sebagai pohon  filogenetik,  diagram  yang  merunut  hubungan  evolusioner.  Sekuens  asam  amino pada  protein  disintesis  berdasarkan  sekuens  nukleotida  RNA  yang  ditranskripsi  dengan menggunakan DNA sebagai cetakan, sehingga kemiripan nukleotida dapat  digunakan  untuk memperkirakan  kedekatan  hubungan  secara  filogenetik  antara satu spesies dengan spesies yang  lain.  Sekuens  gen,  seperti  gen  16S  rRNA  dapat  digunakan  untuk  mempelajari hubungan  filogenetik      dan  identifikasi    suatu  organisme  (Woese,  1987;  Zuckerkandl  & Pauling,  1965).  Analisis  sekuens  gen  penanda  evolusi  yang  stabil,  seperti  gen  16S  rRNA digunakan    untuk    identifikasi,    klasifikasi    prokariot    secara    genotip    (Weisburg  et  al., 1991).  Diferensiasi  bakteri  pada  tingkat  genus  dan  klasifikasi  pada  tingkat  spesies  dan subspesies    dapat  dilakukan  dengan  membandingkan  sekuens  gen  16SrRNA,  meskipun demikian  terdapat  kelemahan  dalam  penggunaan  sekuen  gen  tersebut,  seperti  lebih  dari satu salinan gen pada kebanyakan  bakteri (Conville & Witebsky, 2005). Beberapa alternatif penggunaan  sekuens  molekul  lain,  seperti  hsp70  (Hu  et  al.,  2018),  subunit  B  dari  RNA polymerase  (Klenk & Zillig, 1994),  Elongation  factor  Tu  or  EF-Tu  (Creti et al., 1994),  gen recA  dan  glnA  (Gutacker et al., 2002).  Gen gyr A  dan gyr B  merupakan  gen- gen  yang  juga digunakan  sebagai  kronometer molekuler   (Liu et al., 2022; Ménard et al., 2016; Peeters & Willems,  2011).  Gen gyr A    dan gyr B    merupakan    gen    yang    menyandikan    komponen penyusun  enzim  DNA  gyrase  atau  topoisomerase  II,  suatu  enzim  yang  berperan  dalam mengkatalisis  proses  pembentukan  DNA  supercoiling,      yang  dibutuhkan  dalam  proses replikasi,  transkripsi  dan  rekombinasi  DNA  pada  bakteri  (Gellert et al., 1976; Wang, 1985). Enzim    DNA  gyrase  pada E.coli terdiri  dari  dua  subunit  A  (97-kDa)    dan  dua  subunit  B (90-kDa) yang merupakan produk dari gen gyr A dan gyr B. Kedua subunit tersebut memiliki fungsi  yang  berbeda  dalam  mekanisme  kerja  enzim  DNA  gyrase  mengkatalisis  perubahan topologi  pada  DNA.  Subunit  GyrA  memutuskan  dan  menyambungkan  DNA,  sedangkan GyrB  memiliki  aktivitas  ATPase.  Gen  gyrA  dan gyrB  telah  digunakan  dalam  mempelajari hubungan  kekerabatan  pada  rhizobia  (Mauchline  et  al.,  2014).  Penelitian  ini  bertujuan
untuk  menganalisis  sekuen  dan  filogeni  gen gyr A dan gyr B,   dari   beberapa   strain   bakteri dari    genus Rhizobium , Ensifer dan Mesorhizobium . Rhizobium dan Ensifer merupakan anggota  famili  dari  Rhizobiaceae,  sedangkan Mesorhizobium merupakan  anggota  famili Phyllobacteriaceae  (Ferraz  Helene  et  al.,  2022).  Ketiga  genus  tersebut  sebelumnya dikelompokan sebagai fast-growing rhizobia (Peter et al., 1996).

## B. METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus hingga Oktober 2022 di Laboratorium pada Jurusan Biologi, Fakultas MIPA Universitas Pattimura, Ambon.

## Alat dan Bahan
Alat      yang      digunakan      dalam      penelitian      ini    adalah      perangkat      komputer yang  dilengkapi    dengan    program    yang  dibutuhkan    untuk    melakukan    analisis.    Bahan yang  digunakan  adalah  data  sekuens  nukleotida  gen gyr A  dan gyr B  yang  diperoleh  dari National Center for Biotechnology Information (NCBI) Data Bank, United States (Sayers et al.,  2021).  Sekuens  nukleotida  gen gyr A  dan gyr B  berasal  dari  33  spesies  bakteri,  yaitu; Rhizobium  leguminosarum bw. trifolii WSM2304, Rhizobium  leguminosarum bw. trifolii WSM1689, Rhizobium  anhuiense bv.  trifolii  strain  T24, Rhizobium  leguminosarum bv. viciae 3841, Rhizobium gallicum bv. gallicum R602, Rhizobium  leguminosarum bv. trifolii CB782, Rhizobium  tropici  CIAT  899 , Rhizobium  etli CFN42, R hi z obi um  gr a ha mi i st rai n  BG7, Rhizobium  phaseoli strain  N261, Rhizobium  zullae strain  WSM  1592, Rhizobium  rosettiformans strain  MAE2-X, Rhizobium  sp .  007, Ensifer  fredii NGR234, Shinorhizobium  americanum CCGM7, Shinorhizobium      medicae WSM419, Ensifer kummerowiae strain  CCBAU  71714 ,  Ensifer  meliloti strain  BIM  B-442D ,  Ensifer  meliloti strain  USDA1157, Ensifer  mexicanum strain  ITTG  R7, Ensifer  terangae strain  CB3126 , Mesorhizobium  amorphae CCNWGS0123, Mesorhizobium  australicum WSM2073 , Mesorhizobium  ciceri biovar biserrulae strain  WSM1284, Mesorhizobium  ciceri biovar biserrulae WSM1271, Mesorhizobium  erdmanii strain  NZP2014, Mesorhizobium  huakuii strain  583 ,  Mesorhizobium  japonicum R7A, Mesorhizobium  jarvisii strain  ATCC  33669, Mesorhizobium  loti NZP2037, Mesorhizobium  loti strain  SU343, Mesorhizobium mediterraneum strain  R31, Mesorhizobium  opportunistum WSM2075 . Spesies  –  spesies tersebut dipilih berdasarkan keterwakilan spesies anggota untuk tiap genus, dan berdasarkan ketersediaan data sekuens gen gyr A dan gyr B dari tiap spesies.

## Analisis Data
Analisis    filogenetik    data  penelitian  ini  dilakukan    dengan    menggunakan perangkat  lunak  MEGA  X (Kumar et al., 2018)  dengan  menggunakan  metode  Maximum Likelihood  (Felsenstein,  1981)  untuk  konstruksi  pohon  filogenetik,  dan  model  Kimura-2 Parameter  (Kimura,  1980)  untuk  memperkirakan jarak genetik.      Penjajaran      multisekuens dilakukan      dengan      menggunakan      perangkat  lunak  Clustal-W  (Thompson  et  al.,  1994). Analisis    bootstrap    dilakukan    dengan    1000   uji    untuk mengevaluasi  topologi  pohon filogenetik.  Persentase  keidentikan  antar  sekuen  dihitung  sebagai  persentase  jumlah
nukleotida  atau  asam  amino  yang  identik  pada  suatu  sekuen  relatif  terhadap  jumlah  total nukleotida atau asam amino.

## C. HASIL DAN PEMBAHASAN
Tiga  belas  strain  dari  genus Rhizobium ,  delapan  strain  dari  genus Ensifer dan  dua belas  strain  dari  genus Mesorhizobium telah  dianalisis  pada  penelitian  ini.  Semua  strain dalam penelitian ini adalah strain yang memiliki gen gyr A yang menyandikan subunit A dan gen gyr B  yang  menyandikan  subunit  B  dari  enzim  gyrase    atau  topoisomerase  II,  dan sekens-sekuens tersebut dapat diakses pada basis data NCBI.
Beberapa  strain  anggota  dari  genus Rhizobium dan Ensifer ,  yaitu Ensifer  fredii NGR234, Ensifer  americanum CCGM7, Rhizobium phaseoli strain  N261,  dan Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841    memiliki  lebih  dari  satu  sekuen  gen gyr B  (Gambar  5). Rentang    persentase      kemiripan      sekuens      yang  berasal  dari    strain      bakteri  genus Rhizobium dalam  penelitian  ini  adalah  78,9  hingga  96  persen dengan rata-rata 85,65  persen untuk  gen gyr A,    dan  43,6  hingga  98,3  persen  untuk  gen gyr B  dengan  rata-rata  75,21 persen.  Persentase  kemiripan  sekuen  diantara  strain  bakteri  dari  genus Ensifer dalam penelitian  ini  memiliki  rentang  dari  86,2  hingga  99,9    persen    dengan  rata-rata  89,63 persen untuk  gen gyr A,  dan  44,9  hingga  100  persen  untuk  gen gyr B dengan rata-rata 73,98  persen.  Strain  bakteri    dari  genus Mesorhizobium memiliki  rentang  persentase kemiripan  gen gyr A    89,3 hingga  100  persen, dengan rata-rata 92 persen,  dan  88.7  hingga 100  persen  untuk  persentase  kemiripan  di  antara  gen gyr B  dengan  rata-rata  73,98  persen. Rentang  presentase  keidentikan  sekuens  gen gyr A  dan gyr B  pada Rhisobium , Ensifer ,  dan Mesorhizobium dapat dilihat pada Gambar 1 dan Gambar 2. Ensifer  fredii NGR234, Ensifer americanum CCGM7, Rhizobium  phaseoli strain  N261,  dan Rhizobium  leguminosarum bv. viciae 3841,  memiliki  2  salinan  gen gyr B  dengan  persentase  keidentikan  antar  2  gen gyr B  yang  terdapat  pada  spesies  yang  sama  kurang  dari  50,  atau  berada  pada  rentang  44,6 hingga  46,3  persen  (Gambar  3).  Kisaran  persentase  keidentikan  gen gyr A  untuk  genus Rhizobium relatif  lebih  luas  dibandingkan  pada  genus Ensifer dan Mesorhizobium .  Kisaran persentase  keidentikan  menunjukkan  kedekatan  hubungan  diantara  sekuen-sekuen  gen tersebut.
Gambar 1. Rentang presentase keidentikan sekuens gen gyr A pada Rhisobium, Ensifer dan Mesorhizobium .
Gambar 2. Rentang presentase keidentikan sekuens gen gyr B pada Rhisobium , Ensifer dan Mesorhizobium .
Gambar 3. Persentase keidentikan antar 2 gen gyr B yang terdapat pada spesies yang sama
44,6 45,2 46 46,3 0 20 40 60 Rhizobium leguminosarum bv. viciae strain 3841 Rhizobium phaseoli N261 Ensifer americanum CCGM7 Ensifer fredii NGR234 Presentase keidentikan
0 20 40 60 80 100 Mesorhizobium Rhizobium Ensifer P er se n ta se k ei d en ti k an Spesies 0 20 40 60 80 100 Mesorhizobium Rhizobium Sinorhizobium Spesies P er se n ta se k ei d en ti k an
Rentang  persentase  keidentikan  sekuen  gen gyr A  dan gyr B  yang  berasal  dari  genus Mesorhizobium relatif  tidak  lebar,  dan  tidak  banyak  berbeda  antara  gen gyr A  dan gyr B. Rentang  persentase  keidentikan  pada  gen gyr B  dari  genus Mesorhizobium lebih  sempit dibandingkan  gen gyr A  pada  genus Rhizobium dan Ensifer ,  yang  dipengaruhi  keberadaan jumlah salinan rangkap gen gyr B dengan persentase keidentikan yang rendah pada beberapa anggota  genus Rhizobium dan Ensifer ,  gen-gen  tersebut  mungkin  diperoleh  melalui meknisme  transfer  gen  secara  horizontal.  Transfer  gen  secara  horizontal pada bakteri,  dapat terjadi  melalui  penyebaran  elemen  genetik  yang  mobil,  plasmid  dan  elemen  konjugasi integratif  (Iranzo  et  al.,  2016;  Koonin,  2016),  dan  diketahui  elemen-elemen  ini  dimobilisasi didalam  populasi  bakteri  rhizobial  (Wardell  et  al.,  2022).  Hasil  analisis  pohon  filogenetik berdasarkan  sekuens  gen gyr A  (menunjukkan  bahwa  kedua  pohon  memiliki  kemiripan topologi  dengan  jarak  genetik  pada    pohon    filogenetik    berdasarkan    sekuens    gen gyr A adalah    0.05    dan    jarak  genetik  pada  pohon  filogenetik  berdasarkan  sekuens  gen gyr B adalah sebesar 0.1 (Gambar 4  dan  Gambar 5).
Gambar 4. Pohon  filogenetik  berdasarkan  analisis  sekuens  gen gyr A  yang  berasal  dari  strain  bakteri  genus Rhizobium , Ensifer dan Mesorhizobium .  Jarak genetik diindikasikan dengan skala.
Gambar 5. Pohon  filogenetik  berdasarkan  analisis  sekuens  gen gyr B  yang  berasal  dari  strain  bakteri  genus Rhizobium , Ensifer dan Mesorhizobium .  Angka  di  dalam  tanda  kurung  menunujukkan  nomor salinan dari gen gyr B. Jarak genetik diindikasikan dengan skala.
Pohon  filogenetik  berdasarkan  analisis  sekuens  gen gyr A  yang  berasal  dari  strain bakteri  genus Ensifer dan Mesorhizobium menunjukkan  bahwa  sekuens gyr A  dari  spesies- spesies  anggota   p a d a   tiap  genus  membentuk  kelompok  percabangan  yang  terpisah  pada pohon  filogenetik  (Gambar  4).  Gen gyr A  dari Rhizobium  tropicii CIAT  899  membentuk percabangan terpisah dari kelompok sekuens gyrA genus Rhizobium pada pohon filogenetik .Pohon  filogenetik  berdasarkan  analisis  sekuens  gen gyr B  yang  berasal  dari  bakteri  genus Rhizobium,  Ensifer dan Mesorhizobium juga menunjukkan  bahwa  masing-masing  genus membentuk percabangan tersendiri pada  pohon filogenetik (Gambar 5), meskipun demikian terdapat percabangan terpisah yang dibentuk oleh  salinan kedua dari sekuen gen gyr B yang berasal  dari Ensifer  fredii NGR234, Ensifer  americanum CCGM7, Rhizobium  phaseoli strain  N261,  dan Rhizobium  leguminosarum bv. viciae 3841.  Gen gyr A  merupakan  gen housekeeping yang  diketahui  memberikan  hasil  resolusi  filogenetik  yang  lebih  tinggi dibandingkan    gen  16S  rRNA  untuk  beberapa  isolat  dari  bakteri  genus Bacillus (Chun  & Bae, 2000), dan pohon filogenetik  yang  stabil  pada  resampling  dengan  metode  bootsrap dengan    pemisahan  yang  baik  pada  taxa  Helicobacter  (Ménard  et  al.,  2016).  Sekuens nukleotida gen gyr B memiliki laju evolusi yang lebih tinggi dibandingkan sekuen gen 16S rRNA  (Yamamoto  &  Harayama,  1995)  dan  digunakan  sebagai  penanda  filogenetik  pada berbagai  penelitian  hubungan  filogenetik  dan  taksonomi,  seperti  pada  kelompok Bacillus (Wang et.al .,  2007), kelompok Pseudomonas (Yamamoto & Harayama, 1995), Salmonella , Shigella dan Escherichia  coli (Fukushima  et  al.,  2002),  dan Flavobacterium (Peeters  & Willems, 2011).

## D. KESIMPULAN
Jarak  genetik  pada  pohon  filogenetik  berdasarkan    gen gyr B  lebih  besar dibandingkan   jarak  genetik pada pohon   filogenetik   berdasarkan   gen gyr A.   Rentang persentase  kemiripan  sekuens  nukleotida  gen gyr B  pada  genus Rhizobium and Ensifer lebih  lebar  dibandingkan Mesorhizobium, dipengaruhi  oleh  adanya  sejumlah  anggota  genus Rhizobium dan Ensifer yang  memiliki  dua  salinan  gen gyr B  dengan  persentase  kemiripan antar  salinan  gen  yang  rendah,  salinan  kedua  dari  masing-masing  tersebut  membentuk percabangan tersendiri pada pohon filogenetik, sehingga duplikasi gen gyr B dapat membatasi penggunaanya sebagai kronometer molekuler pada genus Rhizobium dan Ensifer .

## E. DAFTAR PUSTAKA
Chen, W. X., Yan, G. H., & Li, J. L. (1988). Numerical taxonomic study of fast-growing soybean rhizobia and a proposal  that  Rhizobium  fredii  be  assigned  to  Sinorhizobium  gen.  nov. International  Journal  of Systematic and Evolutionary Microbiology , 38 (4), 392–397. Chun, J., & Bae, K. S. (2000). Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences. Antonie Van Leeuwenhoek , 78 , 123–127. Conville, P. S., & Witebsky, F. G. (2005). Multiple copies of the 16S rRNA gene in Nocardia nova isolates and implications for sequence-based identification procedures. Journal of Clinical Microbiology , 43 (6), 2881– 2885.
Creti, R., Ceccarelli, E., Bocchetta, M., Sanangelantoni, A. M., Tiboni, O., Palm, P., & Cammarano, P. (1994). Evolution of translational elongation factor (EF) sequences: reliability of global phylogenies inferred from EF-1 alpha (Tu) and EF-2 (G) proteins. Proceedings  of the National Academy of  Sciences , 91 (8), 3255– 3259.
Felsenstein,  J.  (1981).  Evolutionary  trees  from  DNA  sequences:  a  maximum  likelihood  approach. Journal  of
Molecular Evolution , 17 , 368–376.
Ferraz  Helene,  L.  C.,  Klepa, M.  S.,  &  Hungria,  M.  (2022).  New  insights  into  the  taxonomy  of  bacteria  in  the genomic era and a case study with rhizobia. International Journal of Microbiology , 2022 . Fukushima,  M.,  Kakinuma,  K.,  &  Kawaguchi,  R.  (2002).  Phylogenetic  analysis  of  Salmonella,  Shigella,  and Escherichia coli strains on the basis of the gyrB gene sequence. Journal of Clinical Microbiology , 40 (8), 2779–2785.
Gellert,  M.,  Mizuuchi,  K.,  O’Dea,  M.  H.,  &  Nash,  H.  A.  (1976).  DNA  gyrase:  an  enzyme  that  introduces superhelical turns into DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences , 73 (11), 3872–3876.
Gutacker,  M.,  Valsangiacomo,  C.,  Bernasconi,  M.  V,  &  Piffaretti,  J.-C.  (2002).  recA  and  glnA  sequences separate  the  Bacteroides  fragilis  population  into  two  genetic  divisions  associated  with  the  antibiotic resistance genotypes cepA and cfiA. Journal of Medical Microbiology , 51 (2), 123–130. Hu, Y., Sun, F., & Liu, W. (2018). The heat shock protein 70 gene as a new alternative molecular marker for the taxonomic identification of Streptomyces strains. AMB Express , 8 , 1–8.
Iranzo, J., Puigbò, P., Lobkovsky, A. E., Wolf, Y. I., & Koonin, E. V. (2016). Inevitability of genetic parasites. Genome Biology and Evolution , 8 (9), 2856–2869.
Jarvis, B. D. W., Van Berkum, P., Chen, W. X., Nour, S. M., Fernandez, M. P., Cleyet-Marel, J. C., & Gillis, M.
(1997). Transfer of Rhizobium loti, Rhizobium huakuii, Rhizobium ciceri, Rhizobium mediterraneum, and Rhizobium  tianshanense  to  Mesorhizobium  gen.  nov. International  Journal  of  Systematic  Bacteriology , 47 (3), 895–898.
Kimura,  M.  (1980).  A  simple  method  for  estimating  evolutionary  rates  of  base  substitutions  through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution , 16 , 111–120.
Klenk,  H.-P.,  &  Zillig,  W.  (1994).  DNA-dependent  RNA  polymerase  subunit  B  as  a  tool  for  phylogenetic reconstructions:  branching  topology  of  the  archaeal  domain. Journal  of  Molecular  Evolution , 38 ,  420– 432.
Koonin,  E.  V.  (2016).  Horizontal  gene  transfer:  essentiality  and  evolvability  in  prokaryotes,  and  roles  in evolutionary transitions. F1000Research , 5 .
Kumar,  S.,  Stecher,  G.,  Li,  M.,  Knyaz,  C.,  &  Tamura,  K.  (2018).  MEGA  X:  molecular  evolutionary  genetics analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution , 35 (6), 1547. Liu, Y., Štefanič, P., Miao, Y., Xue, Y., Xun, W., Zhang, N., Shen, Q., Zhang, R., Xu, Z., & Mandic-Mulec, I. (2022). Housekeeping gene gyrA, a potential molecular marker for Bacillus ecology study. AMB Express , 12 (1), 133.
Mauchline,  T.  H.,  Hayat,  R.,  Roberts,  R.,  Powers,  S.  J.,  &  Hirsch,  P.  R.  (2014).  Assessment  of  core  and accessory genetic variation in Rhizobium leguminosarum symbiovar trifolii strains from diverse locations and host plants using PCR‐based methods. Letters in Applied Microbiology , 59 (2), 238–246. Ménard, A., Buissonnière, A., Prouzet-Mauléon, V., Sifré, E., & Mégraud, F. (2016). The GyrA encoded gene: a pertinent  marker  for  the  phylogenetic  revision  of  Helicobacter  genus. Systematic  and  Applied Microbiology , 39 (2), 77–87.
Peeters, K., & Willems, A. (2011). The gyrB gene is a useful phylogenetic marker for exploring the diversity of Flavobacterium  strains  isolated  from  terrestrial  and  aquatic  habitats  in  Antarctica. FEMS  Microbiology Letters , 321 (2), 130–140.
Peter, J.,  Young, W., &  Haukka, K.  E.  (1996). Diversity and phylogeny of rhizobia. New  Phytologist , 133 (1), 87–94.
Sayers, E. W., Beck, J., Bolton, E. E., Bourexis, D., Brister, J. R., Canese, K., Comeau, D. C., Funk, K., Kim, S.,  &  Klimke,  W.  (2021).  Database  resources  of  the  national  center  for  biotechnology  information. Nucleic Acids Research , 49 (D1), D10.
Thompson,  J.  D.,  Higgins,  D.  G.,  &  Gibson,  T.  J.  (1994).  CLUSTAL  W:  improving  the  sensitivity  of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research , 22 (22), 4673–4680.
Wang, J. C. (1985). DNA topoisomerases. Annual Review of Biochemistry , 54 (1), 665–697. Wardell, G. E., Hynes, M. F., Young, P. J., & Harrison, E. (2022). Why are rhizobial symbiosis genes mobile? Philosophical Transactions of the Royal Society B , 377 (1842), 20200471.
Weisburg,  W.  G.,  Barns,  S.  M.,  Pelletier,  D.  A.,  &  Lane, D.  J.  (1991).  16S  ribosomal DNA  amplification  for phylogenetic study. Journal of Bacteriology , 173 (2), 697–703.
Woese, C. R. (1987). Bacterial evolution. Microbiological Reviews , 51 (2), 221–271.
Yamamoto, S., & Harayama, S. (1995). PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers  and  their  application  to  the  detection  and  taxonomic  analysis  of  Pseudomonas  putida  strains. Applied and Environmental Microbiology , 61 (3), 1104–1109. Zuckerkandl, E., & Pauling, L. (1965). Molecules as documents of evolutionary history. Journal of Theoretical Biology , 8 (2), 357–366.