## UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN BIOTRANSFORMASI EKSTRAK ETANOL DAN HEKSANA DAUN KELAPA SAWIT UNTUK SUPLEMEN KESEHATAN

## ANTIOXIDANT ACTIVITY TEST AND BIOTRANSFORMATION OF PALM LEAF ETHANOL AND HEXANE EXTRACTS FOR HEALTH SUPPLEMENTS
Irma Kresnawaty 1)* , Galuh Wening Permatasari 1) , Widodo 2) ,  Djoko Santoso 1)
1) Pusat Penelitian Kelapa Sawit Unit Bogor Jl. Taman Kencana No.1 Bogor, Jawa Barat, Indonesia 16128 Email : irmakresnawati83@gmail.com
2) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang, Jawa Timur, Indonesia
Makalah: Diterima 25 Mei 2023; Diperbaiki 6 September 2023; Disetujui 1 November 2023

## ABSTRACT
Oil palm fronds and leaves are wastes of oil palm plantations which are abundantly available in Indonesia and contain polyphenolic compounds which have high economic potential and health value. However, the potential for polyphenols from oil palm leaf extract (OPLE), which has antioxidant activity, has not been utilized optimally until now. In this research, an antioxidant food supplement from OPLE which is rich in polyphenolic compounds was developed. OPLE  was prepared using ethanol as a solvent and concentrated by vacuum evaporation, then separated by liquid-liquid column chromatography and identified by LC-MS. The total phenolic yield of the ethanol extract of palm leaves contained was higher phenolic content than the hexane extract, while the phenolic content and  antioxidant  content  of  the  oldest  leaf  were  higher  than  the  17th  leaf.  Separation  of  the  active  antioxidant ingredients was carried out by liquid-liquid column chromatography with chloroform eluent: methanol = 4: 1 v/v which  is expected  to  separate the  active compounds.  The content  of  flavonoids  contained  in this fraction  is  6- Methoxy-2-[2-(3'-methoxyphenyl)  ethyl]  chromone.  Biotransformation  using  tannase  enzyme  produced  the increase of flavonoid content and antioxidant of oil palm extracts.
Keywords : antioxidant, biotransformation, immunomodulator, OPLE, supplement

## ABSTRAK
Pelepah  dan  daun  kelapa  sawit  merupakan  limbah  perkebunan  kelapa  sawit  yang  tersedia  melimpah  di Indonesia dan mengandung senyawa polifenol  yang memiliki potensi ekonomi dan nilai kesehatan yang tinggi. Namun demikian, potensi polifenol dari oil palm leaf extract (OPLE) yang memiliki aktivitas antioksidan tersebut hingga  saat  ini  belum  termanfaatkan  secara  optimal.  Dalam  penelitian  ini  dikembangkan  suplemen  pangan antioksidan dari OPLE yang kaya senyawa polifenol. OPLE dibuat menggunakan pelarut etanol dan dipekatkan dengan evaporasi vakum, kemudian dipisahkan dengan kromatografi kolom cair-cair dan dilakukan identifikasi senyawa tersebut dengan LC-MS. Hasil total fenolik ekstrak etanol daun sawit mengandung kadar fenolik yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak heksana, sementara kadar fenolik dan kadar antioksidan daun tertua lebih tinggi dibandingkan dengan daun ke-17.  Pemisahan bahan aktif antioksidan dilakukan dengan kromatografi kolom cair- cair dengan eluen kloforom : metanol = 4: 1 v/v diharapkan dapat memisahkan senyawa-senyawa aktif. Kandungan flavonoid  yang  terkandung  di  fraksi  tersebut  adalah  6-Methoxy-2-[2-(3'-methoxyphenyl) ethyl] chromone. Biotransformasi menggunakan enzim tannase menghasilkan peningkatan kadar flavonoid dan antioksidan ekstrak daun sawit.
Kata kunci: antioksidan, biotransformasi, imunomodulator, OPLE, suplemen

## PENDAHULUAN
Berdasarkan  data  Dirjen  Perkebunan  2020, luas  perkebunan  sawit  terus  meningkat  dan diperkirakan mencapai 14.996.010 hektar (Direktorat Jenderal Perkebunan, 2020). Perluasan areal sawit di Indonesia tentu berdampak pada peningkatan limbah daun dan pelepah sawit per tahun. Di areal PTPN VII, pelepah sawit yang dipotong dan dibuang dari setiap pohon  mencapai  20.739  BK/ha/tahun  (Fakhri et  al., 2014).  Terdapat  beberapa  data  terkait  dengan  daun dan  pelepah  sawit  yang  paling  melimpah  adalah bahan  kering  sebesar  48,78%,  bahan  ekstrak  tanpa
nitrogen  (BETN)  sebesar  51,87%,  serat  kasar 31,09%, lignin 16,9%, dan lain-lain termasuk protein kasar 5,3% dan silika 0,6% (Imsya, 2008).
Hal  yang  menarik  dari  hasil  analisis  HPLC ekstrak  daun  kelapa  sawit  atau Oil  Palm  Leaves Extract (OPLE)  adalah  kandungan  utama  flavonoid yang mirip dengan kandungan teh, yakni epigallocathecin  sebanyak  800  mg/kg,  cathecin  3 g/kg, epicathecin 100 mg/kg, epigallocathecin gallate 2.8 g/kg, epicathecin gallate 500 mg/kg dan glukosida (Jaffri et al., 2011). Penelitian lain juga melaporkan bahwa  OPLE  memiliki  senyawa  yang  bersifat antioksidan dan fitoestrogenik lain seperti vitamin E,
Jurnal Teknologi Industri Pertanian 33 (3): 207-215, Desember 2023 DOI: https://doi.org/10.24961/j.tek.ind.pert.2023.33.3.207 ISSN: 0216-3160    EISSN: 2252-3901
Terakreditasi Peringkat 2 SK Dirjen Pendidikan Tinggi, Riset, dan Teknologi No. 158/E/KPT/2021 Tersedia online http://journal.ipb.ac.id/index.php/jurnaltin
*Penulis Korespondensi
asam ferulic, asam klorogenik, dan senyawa biofenol lain  seperti  asam  galat  dan  asam  protokatekuik (Namvar et  al., 2012).  Fitokimia  dalam  OPLE memiliki  nilai  lebih  sebagai  bahan  baku  farmasi maupun kosmetik (Tow et al., 2021). Secara In vitro , flavonoid  dan  turunannya  menghambat  berbagai faktor  transkripsi,  yang  memodulasi  diferensiasi, proliferasi,  aktivasi  sel  imun  dan  meningkatkan pembentukan  sel  T  regulator.  Beberapa  flavonoid memberikan efek anti-inflamasi melalui inhibisi NF- κB dan NLRP3, penghambatan produksi sitokin pro- inflamasi,  IL-1β,  IL-2,  IL-6,  TNF-α,  IL-17A, down regulasi kemokin,  dan  pengurangan  ROS  dan nitrogen reaktif. Namun demikian, beberapa laporan telah  menunjukkan  bahwa  beberapa  flavonoid meningkatkan  respons  imun  dengan  meningkatkan radikal  oksigen  dan  nitrogen,  produksi  antibodi, aktivitas sitotoksik melawan tumor dengan meningkatkan  reseptor  aktivator  dan  menurunkan regulasi reseptor inhibition (Ciz et al., 2012; Ribeiro et al., 2015; Ribeiro et al., 2015; Bukhari et al., 2014; Bukhari et al., 2015)
Dengan  memanfaatkan  kandungan  flavonoid yang  melimpah  pada  OPLE,  salah  satunya  melalui upaya  biotransformasi  dapat  menjadi  salah  satu sumber antioksidan yang menjanjikan.
Biotransformasi  dapat  dilakukan  melalui  modifikasi beberapa  reaksi  enzimatik,  seperti  hidroksilase, glikotransferase,  dan  metiltransferase  sehingga menghasilkan flavonoid dalam jumlah besar, dengan struktur  dan  properti  molekul  yang  bervariasi (Bukhari et al., 2014). Walaupun riset terkait dengan efisiensi  OPLE  sebagai  sumber  antioksidan  sudah cukup  banyak  dilakukan,  namun  hingga  saat  ini belum  banyak  ditemukan  suplemen  kesehatan flavonoid  berbahan  dasar  OPLE  yang  beredar  di pasaran,  maka  tujuan  dari  penelitian  ini  untuk memanfaatkan  kandungan  antioksidan  pada  OPLE dan  mengolahnya  menjadi  suplemen  kesehatan. Diharapkan riset ini dapat meningkatkan manfaat atau added  value limbah  daun  dan  pelepah  sawit  secara ekonomi,  menjadikan  alternatif  sumber  antioksidan yang potensial dan terjangkau bagi masyarakat luas, serta  membantu  pemerintah  dalam  mencapai kebutuhan  suplemen  kesehatan.  Penelitian  ini bertujuan untuk menganalisa kadar flavonoid, fenolik dan aktivitas antioksidan ekstrak etanol dan heksana daun  sawit  yang  nantinya  akan  digunakan  sebagai suplemen Kesehatan kaya antioksidan.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan adalah Daun sawit dari kebun percobaan Pusat Penelitian Kelapa Sawit Unit Bogor (PPKS-UB) dengan varietas DxP tahun tanam 2008,  etanol,  aseton,  kertas  saring  Whatman,  silica gel,  metanol,  kloroform,  AlCl 3 ,  quercetin,  Folin- Ciocalteu, asam galat, Na 2 CO3, 2-difenil-1- pikrilhidrazil (DPPH), asam askorbat, enzim tannase, buffer fosfat dan alat gelas umum laboratorium.

## Pembuatan Preparat Daun Kering Kelapa Sawit
Sampel  daun  diambil  dari  pelepah  kelapa sawit di kebun percobaan Ciomas, PPKS-UB, dengan karakteristik  masih  segar  dan  tandan  buahnya  telah dipanen.  Setelah dipisahkan  dari lidinya, helai  daun dicuci bersih dengan air lalu dipotong dengan ukuran panjang  5  cm  dan  segera  dikeringkan  dengan  suhu diatur  pada  30-50 o C  hingga  kering.  Setelah  itu, dihaluskan  hingga  menjadi  bubuk  menggunakan blender .

## Ekstraksi OPLE Dari Daun Kelapa Sawit
Senyawa  polifenol  diekstraksi  dari  sampel bubuk  daun  kering  sawit  dengan  pelarut  etanol  dan heksana dengan sedikit modifikasi metode Ahmad et al . (2018). Alat sokletasi dipasang, kemudian serbuk daun sawit 5 g dibungkus dengan kertas saring, diikat dengan benang, dimasukkan kedalam labu alas bulat pada  soklet.  Sokletasi  dilakukan  pada  suhu  70oC sampai tetesan siklus tidak berwarna lagi. Ekstrak cair yang  diperoleh  kemudian  dipekatkan  dengan menggunakan  rotary  evaporator  pada  suhu  40 o C sampai  diperoleh  ekstrak  kental  etanol.  Maserat disaring  menggunakan filter Whatman dan dipekatkan  menggunakan  evaporator  vakum  atau rotary  evaporator. Kandungan  fitokimia  (total fenolik,  dan  total  flavonoid)  dianalisis.  Ekstrak kemudian difraksinasi menggunakan kolom kromatografi silika gel dengan variasi pelarut. Fraksi disampling  setiap  5  mL  dengan  kecepatan  alir  1 mL/menit. Kemudian setiap fraksi diukur kandungan total  fenolik,  flavonoid  dan  diuji  komposisinya dengan  kromatografi  lapis  tipis.  Beberapa  ekstrak dengan  komposisi  total  fenolik  tertinggi  diuji aktivitas antioksidannya.

## Uji Kandungan Total Flavonoid
Sebanyak  2%  AlCl 3 dilarutkan  dalam  etanol kemudian dicampurkan dengan ekstrak sawit dengan rasio 1:1. Setelah dinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar,  absorbansi  campuran  diukur  pada  panjang gelombang  420  nm  dengan  senyawa  standar quercetin (50–500  mg/mL).  Konsentrasi  flavonoid yang  diperoleh  dalam  mg  ekuivalen quercetin per gram berat kering sample (mg QE/g d.w.), sementara kandungan  total  flavonoid  dihitung  menggunakan rumus :
TFC = (c x V) / m
Dimana  c  =  kosentrasi  sample  dari  kurva  kalibrasi (mg/  mL),  V  =  volume  pelarut  etanol  (mL),  dan  m berat kering sampel (g) (Suryati et al., 2016).

## Uji Kandungan Total Fenolik
Sebanyak  100  mL  ekstrak  ditambahkan  0,2 mL larutan Folin-Ciocalteu dan diinkubasi selama 5 menit  di  ruang  gelap  pada  suhu  kamar.  Kemudian ditambahkan 0,6 mL Na 2 CO 3 dengan konsentrasi 0.2 mM  dan  diinkubasi  selama  120  menit.  Absorbansi campuran diukur pada menggunakan spekrofotometer  pada  765  nm  dengan  senyawa
standar  asam  gallat  (50–500  mg/mL).  Konsentrasi fenolik  yang  diperoleh  dalam  mg  equivalent  asam gallat per gram berat sample kering (mg GAE/g d.w.) (Meda et al., 2005).

## Purifikasi Flavonoid Ester
Reaksi  dihentikan  dengan  memindahkan biokatalis dan molecular sieves melalui sentrifugasi. Ekstrak  flavonoid  yang  terpurifikasi  diperoleh dengan  menggunakan  kromatografi  kolom  silica  gel 60A  (Merck;  Art.  9385),  menggunakan  pelarut campuran  kloroform–metanol  dengan  peningkatan kepolaran  eluen  (7:3);  (5:5)  dan  (3:7)  v/v.    Eluat ditampung  sebanyak  10  fraksi  ke  dalam  botol  vial. Masing-masing fraksi dianalisa kandungan flavonoid dan  antioksidannya  menggunakan  spektrofotometer. Struktur kimia flavonoid ester ditentukan dengan LC- MS  (Oliveira et al., 2009 ) .

## Pengukuran Aktivitas Antioksidan dari OPLE
Aktivitas  antioksidan  diperiksa  berdasarkan penangkapan radikal bebas menggunakan 2,2-difenil- 1-pikrilhidrazil  (DPPH).  Larutan  DPPH  0,01  M dibuat dengan melarutkan 39,5 mg DPPH dalam 100 ml metanol. Kemudian dibuat larutan kontrol DPPH dengan  cara  dipipet  0,1  mL  larutan  DPPH  0,01  M diencerkan dengan metanol p.a sampai 5 mL. Sampel dilarutkan  sesuai  dengan  pelarutnya  sehingga diperoleh  konsentrasi  0,  20,  40,  60,  80,  100,  200 ppm.  Sebagai  baku  pembanding,  dibuat  larutan vitamin C dengan konsentrasi 0,1; 2,5; 5,0; 7,5; dan 10  ppm.  Uji  aktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan dengan  menambahkan  0,1  mL  DPPH  0,01  M  ke dalam deret sampel dan baku pembanding vitamin C, lalu  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  30  menit. Absorban  larutan  diperiksa  dengan  menggunakan spektrofotometer  UV-VIS  pada  panjang  gelombang 515  nm.  Warna  DPPH  akan  berubah  dari  ungu menjadi    kuning      apabila      ekstrak      mengandung antioksidan. Aktivitas antioksidan dihitung berdasarkan persentase inhibisi ( inhibition concentration ) yang diwakili oleh nilai IC 50 .
Analisis LC-MS Pengukuran senyawa hasil ekstraksi menggunakan  LC-MS  dengan  detector  ESI  dengan rasio  pemisahan postcolumn 2:1.  Spektrum  massa diperoleh  menggunakan  instrumen  ion  trap ESI
source.  Nitrogen  digunakan  sebagai  auxiliary  gas, sementara helium sebagai collision gas. Spektra ESI MS  diperoleh  dalam  bentuk  positif  dan  negatif  ion, dengan  kondisi  pengujian  : spray  voltage ,  4.0  kV; capillary  temperature 350◦C;  capillary  voltage  −10 V;  tube  lens  offset  −30  V.  Analisis  full  scan  MS analysis dalam rentang m/z 50–1000.

## Biotransformasi Enzimatis
Ekstrak  yang  diperoleh  dari  daun  sawit digunakan sebagai subtract untuk hidrolisis enzimatis menggunakan  tannase  dari  Paecilomyces  variotii. Ekstrak kering sebanyak (5 mg)  dilarutkan dalam 1 mL  buffer  fosfat  (pH  7,4;  75  mM)  dan  diinkubasi dengan  5  mg  tannase  pada  40 o C  selama  30  menit. Proses  hidrolisis  dihentikan  dengan  menempatkan reaksi di dalam penangas es selama 15 menit. Hasil biotransformsi  dilanjutkan  untuk  uji  antioksidan dengan DPPH (Macedo et al., 2011).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Produksi OPLE dari Daun Kelapa Sawit
Proses  ekstraksi  senyawa  aktif  antioksidan menggunakan  dua  pelarut  etanol  dan  heksana. Sample  dihancurkan  untuk  memecahkan  membran sel  sehingga  lebih  memungkinkan  pelarut  kontak dengan senyawa bahan aktif sehingga meningkatkan yield . Teknik ekstraksi  menggunakan teknik soxhletasi  (Gambar  1)  dengan  tujuan  untuk  dapat menghasilkan  ekstrak  yang  lebih  banyak,  pelarut yang digunakan lebih sedikit (efisiensi bahan), waktu yang  digunakan  lebih  cepat,  dan  sampel  diekstraksi secara  sempurna  karena  dilakukan  berulang-ulang, tetapi tidak mengurangi aktivitas biologis (Heinrich, 2004).  Setelah  proses  ekstraksi  dan  pemekatan menggunakan rotary  evaporator sampel  dianalisa kandungan  total  fenolik  dan  kadar  antioksidan (Gambar 2-5). Hasil total fenolik ekstrak etanol daun sawit  mengandung  kadar  fenolik  yang  lebih  tinggi dibandingkan ekstrak heksana.
Kadar  fenolik  daun  tertua  lebih  tinggi dibandingkan dengan daun ke-17, dimana daun ke-17 mengandung  963,75  ppm  (pada  pokok  1)  dan 1175,417  ppm  (pada  pokok  2),  sementara  daun  tua mengandung total fenolik 1724,538 ppm ( pokok 1) dan  1720,417 ppm (pokok 2) (Gambar 2).
Gambar 1. Tahapan ekstraksi senyawa antioksidan dengan pelarut etanol dan pemekatan dengan rotary evaporator
Gambar 2. Kadar fenolik ekstrak etanol daun sawit
Daun  tua  menghasilkan  akumulasi  total fenolik  yang  lebih  tinggi  dibandingkan  daun  ke-17. Usia ternyata mempengaruhi jumlah senyawa fenolik yang  terkandung  di  dalamnya.  Senyawa  fenolik sebagai  metabolit  sekunder  makin  terakumulasi seiring dengan bertambahnya usia tanaman . Namun, peran penting dan luas dari metabolit sekunder telah dipahami dan terakumulasi sebagai respons terhadap tekanan  lingkungan  termasuk  serangan  patogen, radiasi  UV,  cahaya  tinggi,  defisiensi  nutrisi,  dll. Menurut Bryant et al . (1983) konversi karbon untuk pembentukan  metabolit  sekunder  merupakan  proses perlindungan  tanaman  dalam  menanggapi  stres, misalnya,  pembentukan  fenil  amida  dan  akumulasi antosianin  dan  poliamina  sebagai  respons  terhadap stres lingkungan (Akula et al., 2011). Hasil ekstraksi dengan  pelarut  heksana  menghasilkan  kadar  total fenolik  yang  lebih  rendah  dari  pelarut  etanol.  Nilai total fenolik ekstrak heksana untuk daun ke-17 yaitu 978,75 ppm (pokok 1 ) dan 1024,583 ppm (pokok 2), sementara  daun  tertua  1274,583  ppm  dan  1145,417 ppm  (pokok  2)  (Gambar  3).  Hal  ini  diduga  karena polaritas  senyawa-senyawa  fenolik  relatif  polar dengan adanya gugus –OH pada cincin aromatic.
Gambar 3. Kadar fenolik ekstrak heksana daun sawit
Kadar  antioksidan ekstrak  etanol  untuk  daun ke-17 yaitu 523,199 ppm (pokok 1) dan 504,109 ppm (pokok  2),  sementara  daun  tertua  863,168  ppm  dan 878,621  ppm  (pokok  2)  (Gambar  4).  Sebanding dengan  kadar  total  fenolik  yang  lebih  rendah, aktivitas  antioksidan  ekstrak  heksana  juga  lebih rendah  dibandingkan  ekstrak  etanol  dengan  nilai sebagai  berikut  :  daun  ke-17  yaitu  296,855  ppm (pokok  1)  dan  5244,133  ppm  (pokok  2),  sementara daun tertua 582,584 ppm dan 649,551 ppm (pokok 2) (Gambar 5). Kadar antioksidan untuk ekstrak etanol dan  heksana  ditentukan  oleh  gugus  –OH  yang berperan dalam aktivitas antioksidan.
Gambar 4. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun sawit
Gambar 5. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun sawit
Gugus-gugus  -OH    pada    struktur    senyawa fenolik  menyumbangkan    atom    H    sebagai    donor radikal    bebas    sehingga   umumnya   menjadikan senyawa    fenolik    memiliki    berbagai    manfaat di antaranya: antioksidan, antiinflamasi, antidiabetik, imunoregulasi, antikanker, antimikrobia,  melindungi dari    penyakit    jantung  dan    sebagainya.  Struktur molekul    dari    senyawa    ini    dapat  memberi elektronnya    pada  molekul  radikal  bebas  tanpa mengganggu  fungsinya  dan  dapat  memutus  reaksi berantai        dari        radikal    bebas.  Dalam kemampuannya  menangkal  radikal  bebas,  senyawa
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Daun ke 17 (1) Daun ke 17
(2) Daun Tertua T1 Daun Tertua T2 K ad ar fe n o lik (p p m )/ Phe no lic c on te nt (p p m ) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Daun ke 17 (1) Daun ke
17 (2) Daun Tertua T1 Daun Tertua T2 K ada r fe n o lik (p p m )/ P h en o lic c o n te n t (ppm ) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Daun ke 17 (1) Daun ke 17
(2) Daun Tertua T1 Daun Tertua T2 A kti vi ta s an ti o ksi d an (p p m )/
A nti iox idan t ac ti vi ty (p p m ) 0 100 200 300 400 500 600 700 Daun ke 17 (1)
Daun ke 17 (2) Daun Tertua T1 Daun Tertua T2
Ak ti vi ta s ant iok si da n (ppm )/ An ti io xi da n t a cti vi ty (ppm )
fenolik  termasuk      antioksidan      primer  yang berfungsi    mencegah  pembentukan    radikal  bebas selanjutnya    dengan    melepas    hidrogen sehingga disebut    donor    hidrogen    atau  s cavenger radikal bebas (Guinda et al., 2015), namun  ada  juga  yang termasuk antioksidan  sekunder  dengan  menangkap radikal  bebas      kemudian    mengubahnya      menjadi lebih stabil,   umumnya   dengan   mengkhelat   ion atau meredam pembentukan oksigen single. Kemampuan  antioksidan  senyawa  fenolik  terbentuk karena    adanya    hubungan    aktifitas    atau structure activity  relationship (SAR), jumlah  dan posisi gugus hidroksil, adanya ikatan rangkap dan glikosilasi (Yin et al., 2018).
Pemisahan bahan aktif antioksidan dilakukan dengan kromatografi kolom cair-cair untuk memperoleh  yang  lebih  murni  dengan  aktivitas antioksidan  yang  tinggi  dengan  eluen  kloroform  : metanol  =  4:  1  v/v  diharapkan  dapat  memisahkan senyawa-senyawa  aktif  (Gambar  6).    Dari  10  fraksi yang  dihasilkan  kadar  flavonoid  tertinggi  diperoleh pada  fraksi  ke-9,  6  dan  10.  Sedangkan  aktivitas antioksidan pada fraksi ke-2 dan ke-3 (Gambar 7).
Kandungan  flavonoid  yang  terkandung  di fraksi yaitu 6-Methoxy-2-[2-(3'-
methoxyphenyl) ethyl] chromone.  Senyawa  ini  telah dilaporkan  memiliki  beberapa  aktivitas  biologis, seperti  inhibitor  acetylcholinesterase,  sitotoksik, antibakteri, dan aktivitas neuroprotektif.
Gambar 6. Proses kromatografi kolom sample ekstrak etanol sampel daun sawit
Gambar  7.  Kadar  flavonoid  dan  antioksidan hasil  fraksinasi  kromatografi  kolom  sample  ekstrak  etanol  sampel daun sawit 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 160.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Fraksinasi Hasil kromatografi kolom cair/ Coloumn Chromatography Result
Kadar flavonoid (ppm) Kadar antioksidan (ppm) K ad ar (/ C o n te n t p p m )
Tabel 1. Kandungan senyawa terpenoid, flavonoid dan polifenol hasil pemisahakan ekstrak daun sawit dengan kromatografi kolom cair
Kandungan senyawa Ulangan 2 Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 4 Fraksi 5 Fraksi 6 Fraksi 7 Terpenoid 5,6,7,7α-Tetrahydro- 4,4,7α-trimethyl-2(4H)- benzofuranone 3-Tert-butyl-4- methoxyphenol_1 1,1,6-Trimethyl-1,2- dihydronaphthalene 5,6,7,7α-Tetrahydro- 4,4,7α-trimethyl-2(4H)- benzofuranone Ginsenoside F3 1,1,6-Trimethyl-1,2- dihydronaphthalene Arteannuin A Arteannuin A 6,17-Epoxylathyrol- 5,15-diacetate-3- phenylacetate 1,4-Diethyl-1,4- dimethyl-2,5- cyclohexadiene Curculigo saponin A Platycodigenin_1 4-Methoxypropiophenone Blumenol C glucoside Curculigo saponin A Digiprolactone Cuminic aldehyde Digiprolactone α-Ionone 5,6,7,7α-Tetrahydro-4,4,7α- trimethyl-2(4H)-benzofuranone Digiprolactone Ginsenoside F3 Dihydroactinidiolide Dictamnol Erythrocentaurin - Curculigo saponin A α-Ionone α-Ionone Ginsenoside F5 Digiprolactone Genipin - Dictamnol - - α-Ionone Dihydroactinidiolide Ginsenoside F3 - Digiprolactone - Erythrocentaurin Pseudoionone_2 Erythrocentaurin Perillylaldehyde_1 Trifoside B Ginsenoside F5 Trifoside B Vomifoliol_1 Olibanumols I Trifoside C α-Ionone Platycodigenin_1 Trifoside C Vomifoliol_1 α-Ionone
Brucein E
Flavonoid - - Naringenin-4′,7- dimethyl ether 6-Methoxy-2-[2-(3'- methoxyphenyl) ethyl] ch romone 6-Methoxy-2-[2- (3'- methoxyphenyl) et hyl] chromone 6-Methoxy-2-[2-(3'- methoxyphenyl) ethyl] chromo ne - Rhamnazin Naringenin-4′,7- dimethyl ether Naringenin-4′,7-dimethyl ether Polifenol - - - - - - -
Biotranformasi dilakukan menggunakan enzim  tannase.  Tannase,  atau  dikenal  juga  tannin acyl-hydrolase  (TAH)  (E.C  3.1.1.20)  merupakan enzim  hidrolitik  ekstraseluler  yang  mengkatalisis hidrolisis  dan  sintesis  ikatan  tannin  yang  mudah terhidrolisis (substrat asam tannin) dan memfasilitasi pelepasan asam galat dan glukosa (Gambar 7) (Shao et al., 2020). Tannase merupakan enzim yang penting dalam  memodifikasi  struktur  catechin  teh  sehingga dapat meningkatkan kualitas dan bioaktivitasnya. Teh yang  ditambahkan  tannase  menunjukkan  aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan teh hitam biasa  karena  inbibisi  yang  efektif  dari  nitrosamine yang bersifat karsinogenik dan mutagenik. Selain itu juga  meningkatkan  ketahanan  warna  dan  sifat organoleptik,  serta  meningatkan uptake seluler  dari catechin  teh  (Govindarajan et  al., 2016).  Tannase menghidrolisis  Epicatechin  gallate  (ECG)  dan Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) menjadi Epigallocatechin (EGC), Epicatechin (EC) (Gutha et al., 2010). Senyawa ini memiliki aktivitas antioksidan melalui mekanisme scavenging radikal bebas. Secara umum,  radical  scavenging  activity  sample  hasil biotransformasi  meningkat  dengan  peningkatan metabolit sekunder yang larut air seperti ECG dan GA (Ong dan Mohamad Annuar, 2017).
Gambar  8.  Reaksi  enzim  tannase  pada  senyawa flavonoid
Biotransformasi dengan enzim tannase menunjukkan adanya peningkatan kadar antioksidan dan fenolik (Tabel 2 dan 3). Hal ini menunjukkan ada indikasi positif bahwa biotransformasi berhasil tetapi perlu  ditingkatkan  dengan  penambahan  waktu inkubasi atau jumlah enzim yang digunakan.
Tabel 2. Hasil analisa antioksidan hasil biotransformasi ekstrak daun sawit menggunakan enzim tannase
Kode sampel Ulangan Konsentrasi antioksidan (ppm) Rata-rata ((ppm) Ektrak Heksana 1 159,34 157,97 2 156,61 3 157,97 Ekstrak Etanol 1 250,69 262,96 2 276,60 3 261,60 Ektrak Heksana + Tannase 1 376,13 371,14 2 369,32 3 367,95 Ekstrak Etanol + Tannase 1 286,14 290,23 2 291,60 3 292,96
Tabel 3. Hasil analisa flavonoid hasil biotransformasi ekstrak daun sawit menggunakan enzim tannase
Kode Sampel Ulangan [Flavonoid] (%) Rata-rata Ektrak Heksana 1 0,10 0,09 2 0,09 3 0,08 Ekstrak Etanol 1 0,13 0,13 2 0,14 3 0,13 Ektrak Heksana + Tannase 1 0,10 0,09 2 0,09 3 0,09 Ekstrak Etanol + Tannase 1
0,14
0,15 2 0,15 3 0,15 2 0,16 3 0,15

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Hasil  total  fenolik  ekstrak  etanol  daun sawit mengandung kadar fenolik yang lebih tinggi dibandingkan  ekstrak  heksana,  sementara  kadar fenolik  dan  kadar  antioksidan  daun  tertua  lebih tinggi dibandingkan dengan daun ke-17. Pemisahan  bahan  aktif  antioksidan  dilakukan dengan kromatografi kolom cair-cair dengan eluen kloforom  :  metanol  =  4:  1  v/v  diharapkan  dapat memisahkan  senyawa-senyawa  aktif.  Kandungan flavonoid yang terkandung di fraksi tersebut adalah 6-Methoxy-2-[2-(3' methoxyphenyl) ethyl] chromone.  biotransformasi menggunakan enzim tannase menghasilkan peningkatan  kadar  flavonoid  dan  antioksidan ekstrak daun sawit.

## Saran
Pengujian  masih  perlu  dilanjutkan  dengan menggunakan  enzim  tannase  untuk  menghasilkan flavonoid  dengan  aktivitas  antioksidan  yang  lebih tinggi.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad  N,  Hasan  ZAA,  Muhamad  H,  Bilal  SH, Yusof  NZ,  Idris  Z.  2018.  Determination  of total phenol,  flavonoid,  antioxidant  activity of  oil  palm  leaves  extracts  and  their application in transparent soap. Journal Oil Palm Research. 30(2) : 315–325.
Akula  R  dan  Ravishankar  GA.  2011.  Influence  of abiotic stress signals on secondary metabolites in plants. Plant Signal Behaviour 6(11): 1720-31.
Bryant,  JP,  Chapin  FSI,  Klein  DR.  1983. Carbon/nutrient balance of boreal plants in relation  to vertebrate  herbivory .  Oikos. 40: 357-68.
Bukhari  SN,  Tajuddin  Y,  Benedict  VJ,  Lam  KW, Jantan I, Jalil J, Jasamai, M. 2014. Synthesis and  evaluation  of  chalcone  derivatives  as inhibitors of neutrophils' chemotaxis, phagocytosis  and  production  of  reactive oxygen  species. Chemical  Biology  &  Drug Design . 83(2): 198-206. Ciz,  MP,  Denev  M,  Kratchanova  O,  Vasicek  G, Ambrozova,    Lojek  A.  2012  Flavonoids inhibit the respiratory burst of neutrophils in mammals. Oxidative Medicine and Cellular Longevity . Volume 2012. Article ID 181295 De  Oliveira  EB,  Humeau  C,  Chebil,  L,  Maia  ER, Dehez F, Maigret B, Engasser JM. 2009. A molecular modelling study to rationalize the regioselectivity  in  acylation  of  flavonoid glycosides catalyzed by Candida antarctica
lipase  B. Journal  Molecular  Catalysis  B: Enzymatic . 59(1-3): 96-105. Direktorat  Jenderal  Perkebunan.  2020. Palm  Oil Area by Province in Indonesia , 2013-2020. Kementerian Pertanian RI.
Elisabeth  J  dan  Ginting,  SP.  2003.  Pemanfaatan hasil samping industri kelapa sawit sebagai bahan pakan ternak sapi potong, Prosiding.
Lokakarya Nasional Sistem Integrasi
Kelapa Sawit. 110–119.
Fakhri  S,  Budiansyah  A,  dan  Kaswari,  T.  2014. Pengenalan  ransum  komplit  pellet. Jurnal.
Pengabdian Masyarakat. 29(4): 11–16. Govindarajan RK, Khanongnuch C, Mathivanan K, Shyu  DJ,  Sharma  KP,  De-Mandal  S.  2021. In-vitro  biotransformation  of  tea  using tannase produced by Enterobacter cloacae. Journal Food Science and
Technology . 58 : 3235-3242.
Guinda  A,  Castellano  M,  Santos-Lozano  JM, Delgado-Hervás  T,    Gutiérrez-Adánez  T, Rada  M.  2015.  Determination    of  major bioactive      compounds      from      olive  leaf. Food  Science Technology. 64(1), 431-438. Gutha LR, Casassa LF, Harbertson JF, Naidu RA. 2010. Modulation of flavonoid biosynthetic pathway  genes  and  anthocyanins  due  to virus  infection  in  grapevine  (Vitis  vinifera L.) leaves. BMC Plant Biology . 10: 1-18. Hassan OA dan Ishida M. 1992. Status of utilization of selected fibrous crop residues and animal performance  with  special  emphasis  on processing  of  oil  palm  frond  (OPF)  for ruminant  feed  in  Malaysia. Tropical Agriculture Research Series. 24 :135–143. Imsya A. 2008. Konsentrasi N-amonia, Kecernaan bahan  kering  dan  kecernaan  bahan  organik pelepah sawit hasil amoniasi secara in vitro.
Prodising.  Seminar.  Nasional  Teknol. Peternak dan Vet. 111–115. 13-14 Agustus
2008
Jaffri  JM,  Mohamed  S,  Rohimi  N,  Ahmad  IN,
Noordin MM, Manap YA. 2011.
Antihypertensive and cardiovascular effects of catechin-rich oil palm ( Elaeis guineensis ) leaf  extract  in  nitric  oxide-deficient  rats. Journal Medicinal Food . 14(7/8): 775–78. Jin  Y,  Li  P,  dan  Wang  F.  2018.  β-glucans    as potential  immunoadjuvants:  A  review  on the adjuvanticity, structure-activity relationship and receptor recognition properties. Vaccine. 36(35):  5235-5244.
Meda  A,  Lamien  CE,  Romito  M,  Millogo  J, Nacoulma  OG.  2005.  Determination  of  the total  phenolic,  flavonoid  and  proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their  radical  scavenging  activity. Food Chemistry. 91(3): 571–577.
Namvar  F,  Mohamed  S,  Fard  SG,  Behravan,  J,
Mustapha NM, Alitheen, NBM,  Othman F. 2012.  Polyphenol-rich  seaweed  ( Eucheuma cottonii )  extract  suppresses  breast  tumour via  hormone  modulation  and  apoptosis induction. Food chemistry . 130(2): 376-382. Ong  CB  dan  Annuar  MS.  2017.  Polyphenolic composition  and  in  vitro  antioxidant activities of native‐and tannase‐treated green tea  extracts. International  Journal  of  Food Science & Technology . 52(3): 748-756. Ribeiro  D,  Mreitas  JL,  Lima  FC,  Fernandes  E. 2015.  Proinflammatory  Pathways:  The Modulation  by  Flavonoids. Medical Research Review . 35(5): 877–936.
Ribeiro D, Freitas M, Tomé SM., Silva AM, Laufer S, Lima JL, Fernandes E. 2015. Flavonoids inhibit  COX-1  and  COX-2  enzymes  and cytokine/chemokine  production  in  human whole blood. Inflammation . 38 :858-870. Saroni Arwa P, Zeraik ML, Farias-Ximenes V, Da- Fonseca LM,  Da-Silva Bolzani V, Siqueira- Silva, DH. 2015. Redox-active biflavonoids from Garcinia  brasiliensis as  inhibitors  of neutrophil  oxidative  burst  and  human
erythrocyte  membrane  damage. Journal. Ethnopharmacol. 174 :410–418.
Shao Y, Zhang YH, Zhang F, Yang QM, Weng HF, Xia  Q,  Xiao  AF.  2020.  Thermostable tannase  from Aspergillus  niger and  its application  in  the  enzymatic  extraction  of green tea. Molecules . 25(4) :952.
Suryati  S,  Dillasamola  D,  dan  Rahadiant  F. 2016. The  effect  of  ethanolic  extract  of Vernonia amygdalina ,  del  leaves  on  serum  creatinin level  of  male  white  mice. Jurnal  Sains Farmakologi Klinik. 3(1): 79–83. Tow  WK,  Goh  APT,  Sundralingam UD, Palanisamy  UD,  Sivasothy  Y.  2021. Flavonoid composition and pharmacological properties  of Elaeis  guineensis jacq.  leaf extracts: A systematic review. Pharmaceuticals . 14(10): 1–20.
.