Isolasi Bakteri Asam Laktat Pada Perendaman Biji Gude ( Cajanus cajan (L) Millsp.)
Yuni Sine a Gergonius Fallo b
a Fakultas Sains dan Teknologi, Program Studi Biologi Universitas Timor, Kefamenanu, TTU- NTT, 85613, Indonesia email:yuni_sine@yahoo.com
b Fakultas Ilmu Pendidikan, Program Studi Pendidikan Biologi Universitas Timor, Kefamenanu, TTU-NTT, 85613, Indonesia
Article Info Abstrak Article history: Received 27 Agustus 2015 Received in revised form 12Desember 2015 Accepted 11Januari 2016
Bakteri  asam  laktat  merupakan  mikroorganisme  yang  berperan  sangat  penting  dalam  proses  fermentasi  tempe,  terutama  pada  proses perendaman substrat untuk fermentasi, dan bakteri asam laktat berperan dalam penurunan pH dan menjadi inhibitor bagi mikroorganisme yang  menyebabkan  kontaminan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  bakteri  asam  laktat  yang  terdapat  dalam  air  rendaman  biji gude  ( Cajanus cajan (L)  Millsp.)  yang  digunakan  sebagai  substrat  fermentasi  tempe.    Bakteri  asam  laktat  diisolasi  dengan  metoda pengenceran  secara pour  plate ,  dan  diinokulasikan  ke  dalam  medium  deMann  Rogosa  Sharpe  Agar  (MRSA).  Kemudian  karakter morfologi  koloni  dianalisis  secara  kualitatif.  Berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  didapatkan  dua  isolate  bakteri  yaitu bakteri dengan kode  BAR1 dan BAR2,  BAR1 yang diisolasi adalah berbentuk bulat,  memiliki elevasi cembung, tepian licin, berwarna putih  susu,  bentuk  sel  basil  pendek,  gram  positif,  spora  negatif,  katalase  negatif,  non  motil,  menghasilkan  gas,  reduksi  nitrat  negatif, mirip dengan Lactobacillus sp. Sedangkan isolat  BAR2 berbentuk  bulat,   memiliki elevasi cembung, tepian  licin, berwarna putih susu, bentuk sel coccus, gram positif, spora negatif, katalase negatif, non motil, tidak  menghasilkan gas, reduksi nitrat negatif,  mirip dengan Pediococcus sp.
Keywords: Bakteri Asam laktat Fermentasi Biji gude ( Cajanus cajan (L) Millsp.)

## 1. Pendahuluan
Bakteri  asam  laktat    (BAL)  adalah bakteri  yang  memiliki  kontribusi  yang besar dalam dunia pangan  terutama sebagai  pengawet alami dari suatu produk pangan fermentasi.  Penggunaan BAL  dikarenakan bakteri asam laktat disebut sebagai  food  grade  microorganisms  yang  merupakan    mikroba  yang  tidak berisiko terhadap  kesehatan karena tidak menghasilkan  racun berbahaya pada pangan melainkan mempunyai fungsi sebaliknya yang baik bagi kesehatan.  Hal ini karena bakteri asam laktat dapat menghambat secara alami mikroba patogen.
Metabolit  aktif    yang  dihasilkan  oleh  bakteri  asam  laktat    yaitu  etanol, hidroperoksida,  bakteriosin,  dan  asam  laktat.    Metabolit  yang  dihasilkan merupakan  agen  yang  dapat  digunakan    dalam  membunuh  bakteri.  Salah  satu yang  digunakan  sebagai  antimikroba  yaitu  bakteriosin.  Dilaporkan  bahwa bakteriosin  memegang  peranan  paling  penting  dalam  menanggulangi  infeksi akibat  mikroorganisme.  Selain  itu  asam  laktat    yang  diproduksi  oleh  BAL dapat  menurunkan  pH  lingkungan.  pH  yang  rendah  dapat  menghambat kontaminasi bakteri pembusuk dan juga membunuh mikroba patogen terutama yang ada di dalam tubuh.
Penelitian  tentang  isolasi    BAL  telah  banyak    dilakukan  terutama    pada produk-produk fermentasi  (tape, tempe), namun belum ada yang diisolasi dari rendaman  biji  gude  atau  kacang  turis.    Di  Nusa  Tenggara  Timur    (NTT)  biji gude  atau  kacang  turis    ( Cajanus  cajan L.)  banyak  tumbuh  dan  cukup melimpah. Biji gude pada umumnya toleran terhadap kekeringan, polong tidak mudah  pecah  dan  sesuai  untuk  berbagai  jenis  tanah,  sehingga  tanaman  gude telah  dikembangkan  di  daerah-daerah  kering  dan  tandus.  Biji  gude  juga  bisa digunakan  sebagai  substrat  fermentasi  tempe.  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini bertujuan  untuk  mengisolasi  bakteri  asam  laktat  yang  terdapat  dalam  air rendaman  biji  gude  ( Cajanus cajan (L)  Millsp.)  yang  digunakan  sebagai substrat fermentasi tempe.
2. Metode
2.1 Alat dan Bahan Bahan yang digunakan untuk membuat tempe adalah: Biji  gude  ( Cajanus cajan L.)  yang  berasal  dari  Desa  Binaus  Kabupaten  Timor  Tengah  Selatan- Nusa  tenggara  Timur.  Media  pertumbuhan  bakteri:  Media de  Man  Rogosa Sharpe Agar (MRSA), Media Uji pertumbuhan Bakteri: media yang digunakan untuk  menguji  pertumbuhan  bakteri  adalah Triple  Sugar  Iron  Agar (TSIA), dengan komposisi Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Nutrient agar (NA), de Man Rogosa Sharpe Broth (MRSB), Peptone . Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah: Laminary  air  flow (Memmert), timbangan analitik (ANDGR-200),  Sentrifuge (Heraeus Sepatect- Biofuge  13),  spektrofotometer  (Genesis  20  Thermo  Spectronic),  Penangas (Memmert),  pipet  mikro  1000  µl  ( Eppendorf), mikroskop  cahaya  (Boeco, Germany), seperangkat alat gelas ( glassware ) untuk mengkukturkan bakteri. 2.2 Pengamatan Keberadaan Isolasi BAL Pengamatan  keberadaan  BAL  dilakukan  terutama  pada  proses  penyiapan biji  gude  sebagai  substrat  fermentrasi.  BAL  diisolasi  dari  air  rendaman  biji gude melalui pengenceranserimenggunakan akuades steril (seri pengenceran 10 - 1 ,  10 -2 ,  10 -3 ,  dan  10 -4 )  dan  ditanam  secara  taburan.  Masing-masing  suspensi pengenceransampel  yang  dimulai  dari10 -3 dan  10 -4 ,  dipipet  0,1  ml  dan diinokulasikan  ke  dalam  cawan  petri  sterilyang  kemudian  dituangi  medium MRSA  yang  sedang  mencair  (55 o C),  diratakan,  diinkubasi  pada  suhu  30°C selama24–48  jam.  Koloni  yang  tumbuh  terpisah  dan  berbeda  diambil  secara aseptik dan dipindahkan ke medium agar miring untuk pengamatanlebih lanjut (makroskopik atau mikroskopik).
2.3 Karakterisasi BAL Karakterisasi  bakteri  asam  laktat  dilakukan  menurut  standar  identifikasi bakteri  ( Bergeys  Manual  Determinative )  yang  meliputi  karakteri  morfologis koloni  dan  selular,  serta  sifat  fisiologis.  Karakter    morfologi  koloni (bentuk,warna,tepian,  elevasi,  ukuran  koloni)  dan  morfologi  sel  secara mikroskopis  dengan  pewarnaan  Gram,  spora  dan  motilitas  bakteri,  sedangkan
karakter    fisiologis  BAL  dilakukan  dengan  uji  katalase,  kemampuan  tumbuh BAL pada berbagai konsentrasi garam ( 0%, 4% dan  6% ) dan suhu (5, 15, 37, dan 45 o C). a. Pewarnaan Gram (Soetarto, et al ., 2009)
Secara aseptis dibuat lapisan tipis dari suspensi bakteri di atas gelas objek dan  dilakukan  fiksasi  pada  udara  terbuka.    Pada  lapisan  tipis  ini  ditetesi  zat warna  gram  A  dan  dibiarkan  selama  1  menit,  kemudian  dibilas  dengan  air dengan cara memegang gelas objek pada posisi miring.  Sisa air yang tertinggal pada gelas objek dibuang dan ditetesi dengan Gram B serta dibiarkan selama 1 menit.    Setelah  dicuci  kembali  dengan  air,  kemudian  Gram  C  dan  dibiarkan selama  10-20  detik.    Setelah  dicuci  sebentar  dengan  air,  kemudian  diwarnai dengan  safranin  (gram  D)  dan  dibiarkan  selama  10-20  detik.  Kaca  objek selanjutnya  dibilas  dengan  air  dan  dikeringkan  dengan  kertas  serap  (tisu). Preparat  ini  diamati  dibawah  mikroskop  dengan  mengunakan  lensa  objektif yang  telah  diolesi  minyak  immersi.    Dengan  pengamatan  secara  mikroskopik, dapat ditentukan bentuk sel bakteri serta reaksi Gramnya.  Bakteri Gram positif akan  ditunjukkan  dengan  warna  ungu,  sedangkan  bakteri  Gram  negatif  akan ditandai dengan warna merah atau merah muda.
b. Pewarnaan Spora (Soetarto, et al ., 2009)
Secara aseptis dibuat lapisan tipis dari suspensi bakteri di atas gelas objek dan difiksasi.  Pada lapisan tipis ini ditetesi pewarna hijau malasit dan dibiarkan selama  20  menit  tanpa  pemanasan.    Selanjutnya,  preparat  dibilas  dengan  air dengan cara memegang gelas objek pada posisi miring dan dikeringkan dengan kertas serap ( tissue ).  Setelah kering, kemudian ditambahkan beberapa tetes zat warna  safranin  dan  dibiarkan  selama  30  detik  dan  dicuci  dengan  air  mengalir serta  dikeringkan.    Preparat  ini  diamati  di  bawah  mikroskop  dengan menggunakan  lensa  objektif  yang  telah diolesi  minyak  immersi.    Dengan cara ini endospora yang masih terdapat dalam sel vegetatif maupun spora bebas akan berwarna  hijaubiru,  sedangkan  sel  vegetatif  akan  berwarna  merah  sampai merah muda.
c. Uji Motilitas (Fardiaz 1989)
Pengujian  motilitas  bakteri  dilakukan  dengan  cara  sebagai  berikut:  secara aseptis  dengan  menggunakan  jarum  ose  yang  lurus  bagian  ujungnya,  isolat bakteri ditusukkan ke dalam nutrient broth yang mengandung agar 0,5 % (agar lunak).  Inkubasi  dilakukan  pada  suhu  35 o C  selama  2  hari.  Bila  pertumbuhan menyebar,  maka  bakteri  tersebut  bersifat  motil  dan  bila  pertumbuhan  bakteri tidak  menyebar,  hanya  berupa  garis  saja,  maka  bakteri  tersebut  bersifat  non motil.
d. Uji Katalase (Soetarto, et al ., 2009)
Secara  aseptis  diambil  1  loop  isolat  bakteri  dan  dipindahkan  pada  gelas objek.  Preparat  tersebut  ditetesi  dengan  larutan  3  %  H 2 O 2 .  Uji  positif  ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung oksigen yang menunjukkan bahwa organisme  yang  bersangkutan  menghasilkan  enzim  katalase  yang  mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen (Hadioetomo, 1993). e. Uji Kemampuan tumbuh pada Berbagai Suhu (Pisol, et al ., 2013)
Kemampuan tumbuh isolat pada berbagai suhu diuji dengan menggunakan medium cair (MRSB), diinkubasi pada suhu 5ºC, 15ºC dan 45ºC selama selama 24- 48jam. Pertumbuhan bakteri dipantau berdasarkan kekeruhan diukur secara spektrofotometri (A 600nm ). f. Uji Kemampuan  tumbuh pada Berbagai Konsentrasi Garam (Pisol, et al ., 2013)
Kemampuan  tumbuh  isolat  pada  berbagaikonsentrasi  garam  diuji  dengan menggunakan    MRSB  yang    ditambahkan  NaCl  0%,  4%  dan  6,5%, diinkubasikan  pada  suhu  37ºC  selama  24-  48jam.  Pertumbuhan  yang  terjadi pada  bakteri  dipantau  berdasarkan  kekeruhan  diukur  secara  spektrofotometri (A 600nm ). g. Uji Reduksi Nitrat (Hadioetomo, 1985)
Kemampuan  isolat  bakteri  dalam  mereduksi  nitratdilakukan  dengan menggunakan, nitrate broth .    Setelah  inkubasi pada  suhu 37 o C  selama 48 jam pada  kultur  cair,  kemampuan  mereduksi  nitrat  bagi  masing-masing  isolat
bakteri  dideteksi  dengan  membubuhkan  tiga  tetes  larutan  asam  sulfanilat  dan tiga  tetes  larutan  dimetil alpa-naphtylamin ke  dalam  kultur  cair  tersebut. Reduksi  nitrat  menjadi  nitrit,  ditandai  dengan  terbentuk  warna  merah  (reduksi nitrat positif).
h. Kemampuan  Fermentasi  Gula  dan  Pembentukan  Gas  isolat  bakteri (Soetarto, et al ., 2009) Uji  kemampuan  fermentasi  dilakukan  menggunakan  medium triple  sugar iron  agar (TSIA)  yang  diberi  glukosa,  sukrosa  atau  laktosa.  Fermentasi  gula tersebut ditunjukkan dengan adanya  perubahan pH  medium dengan perubahan warna,pembentukan gas darigula sederhana (glukosa) dan produksi H 2 S.  Isolat bakteri diinokulasi pada agar miring TSIA dengan cara menusukannya sampai bagian  bawah  agar  kemudian  ditarik  ke  permukaan  agar,  diinkubasikan  pada suhu 37 o C selama 48 jam.
Reaksi-reaksi  yang  terjadi  pada  medium  TSIA  adalah  jika  bagian  bawah agar agar berwarna merah bagian atas agar berwarna oranye maka tidak terjadi fermentasi glukosa, jika bagian bawah agar berwaran kuning, bagian atas agar berwarna  merah  maka  terjadi  fermentasi  glukosa,  jika  bagian  bawah  tabung kuning  bagian  atas  tabung  kuning  terjadi  fermentasi  laktosa  dan  sukrosa.  Jika agar terangkat atau pecah maka ada produksi gas.

## 3. Hasil dan Pembahasan
3.1 Bakteri Asam Laktat Saat Perendaman
Bakteri  yang  berasal  dari  sampel  air  rendaman  biji  gude  ditumbuhkan  ke dalam  media  MRSA.    Media  tersebut  merupakan  medium  selektif  bagi pertumbuhan bakteri asam laktat.  Untuk mengurangi jumlah populasi mikroba yang  terdapat  dalam  media,  terlebih  dahulu  dilakukan  pengenceran.    Larutan pengencer  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  aquades  steril.    Hasil isolasi bakteri  asam  laktat  yang  diperoleh  dimurnikan,  kemudian  diidentifikasi dengan  berpedoman  Bergey’s  Manual  of  Determinative  Bacteriology  (Holt et al .,  1994).  Pengamatan  pada  morfologi  koloni  meliputi bentuk, tepian,  elevasi dan  warna  koloni  (Hadioetomo,  1993).  Pengamatan  morfologi  sel  yang meliputi  uji  pewarnaan  Gram,  bentuk  sel  dan  uji  motilitas,  serta  uji  sifat fisiologis  yaitu  uji  katalase,  dilakukan  uji  pertumbuhan  pada  suhu  dan konsentrasi garam (NaCl) berbeda.
Gambar 1. Koloni Bakteri Asam Laktat. Ket:  Strain  BAR1= bakteri air rendaman koloni 1
Koloni  bakteri  strain  BAR1  (gambar  15)  menunjukkan  koloni  bakteri berwarna  putih  susu,  berbentuk  bulat,  memiliki  tepian  yang  licin  serta permukaan yang cembung, karakter yang sama juga terlihat pada koloni bakteri strain BAR2 (Gambar 16) akan tetapi ukuran koloni keduanya berbeda.
Gambar 2. Koloni Bakteri Asam Laktat. Ket: StrainBAR2= bakteri air rendaman koloni 2
Sumber=Bergey’s manual of determinative bacteriology (Holt et al ., 1994)*.
Untuk memastikan ada bakteri asam laktat pada air rendaman keping gude, dilakukan  pengecatan  spora,  berdasarkan  hasil  pengecatan  spora  diketahui bahwa  isolate  bakteri  yang  diperoleh  merupakan  bakteri    yang  tidak  memiliki spora  (spora  negatif),  yang  merupakan  karakter  dari  bakteri  asam  laktat, selanjutnya  dilakuakn  pengectan  gram    untuk  menentukan  sifat  gram  isolate bakteri.  Hasil  yang  diperoleh  adalah  bakteri  dengan  kode  strain  BAR1  dan BAR2  merupakan  bakteri  gram  positif,  yaitu  kedua  isolat  bakteri  berwarna ungu  kebiruan,  bentuk  bakteri  terlihat    BAR1  memiliki  bentuk  basil  pendek sedangkan BAR2 memiliki bentuk coccus.
Gambar 3. Morfologi sel bakteri asam laktat  dari air rendaman  keping gude ( Strain  BAR1=Gram+,  Strain  BAR2=); Bar= 1000µm, pembesaran 10x100.
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan  uji  katalase,  didapatkan  hasil negatif  terhadap  isolat  bakteri  uji.  Hal  ini  ditunjukkan  dengan  tidak  adanya gelembung udara yang terbentuk pada saat isolat bakteri dicampurkan kedalam tetesan  H 2 O 2 .  Pada  hasil  positif,  akan  terbentuk  gelembung  udara  saat  isolat dicampurkan  ke  dalam  zat  H 2 O 2 .  Hal  ini  merupakan  indikasi  terjadinya pemecahan H 2 O 2 menjadi molekul air dan oksigen yang diperantarai oleh enzim katalase. Berikut adalah reaksi pemecahan H 2 O 2 yang terjadi :
2 H 2 O 2
2 H 2 O + O 2 Enzim Katalase
Sifat  katalase  negatif  yang  ditunjukkan  oleh  isolat  bakteri  uji  merupakan salah  satu  karakter  kunci  bakteri  asam  laktat.  Karakter  katalase  negatif  yang dimiliki  oleh bakteri  asam laktat  disebabkan  oleh  sifat  kelompok  bakteri  asam laktat yang merupakan jenis bakteri mikroaerofilik .
BAR1 BAR2
Lahtinen et  al. (2012)  menyatakan bahwa  bakteri  asam  laktat  mempunyai karakter morfologis, metabolis, dan fisiologis tertentu. Bakteri asam laktat tidak melakukan  respirasi  namun  bersifat aerotoleran ,  selnya  menghasilkan  asam laktat  sebagai  salah  satu  produk  utama  fermentasi  karbohidrat.Bakteri  yang dikelompokkan  ke  dalam  bakteri  asam  laktat  merupakan  bakteri  yang  bersifat non-motil. Isolat  bakteri ditumbuhkan pada medium MRS semi padat atau agar lunak tegak dengan konsentrasi agar sebesar 0,8%. Isolat ditumbuhkan dengan cara tusukan. Dari hasil penelitiaan isolat bakteri yang diuji merupakan bakteri non-motil.  Hal  tersebut terlihat dari pertumbuhan koloni  yang  hanya  ada pada area sekitar tusukan dan tidak menyebar ke bagian medium yang lain.
Bakteri  asam  laktat  dapat  tumbuh  pada  konsentrasi  NaCl  4%  tetapi  tidak dapat  tumbuh  pada  konsentrasi  6,5  %.    Bakteri  ini  dapat  tumbuh  pada  suhu 15°C,  dan  tumbuh  dengan  baik  pada  suhu  37°C  namun  pada  suhu  45°C  tidak selalu  dapat  tumbuh  dengan  baik,  hal  ini  karena  kondisi  lingkungan  sangat berpengaruh  terhadap  pertumbuhan  mikrobia,  jika  suhu  terlalu  dingin,  panas atau  pun  dengan  kadar  garam  yang  tinggi  akan  menciptakan  kondisi  yang ekstrim pada lingkungan pertumbuhan dari mikrobia (Guerra et al ., 2007).
Morfologi  koloni  terpilih  dari  BAL  isolat  BAR1  yang  diisolasi  adalah berbentuk bulat,  memiliki elevasi cembung, tepian licin, berwarna putih susu, bentuk sel basil pendek, gram positif, spora negatif, katalase negatif, non motil, menghasilkan  gas,  reduksi  nitrat  negatif,  mirip  dengan Lactobacillus sp. Sedangkan  isolat  BAR2  berbentuk  bulat,    memiliki  elevasi  cembung,  tepian licin,  berwarna  putih  susu,  bentuk  sel  coccus,  gram  positif,  spora  negatif, katalase  negatif,  non  motil,  tidak  menghasilkan  gas,  reduksi  nitrat  negatif, mirip  dengan Pediococcus sp.  Menurut  Ashenafi  (1991)  bakteri  asam  laktat memberikan  kontribusi  dalam    proses  fermentasi  tempe.  Bakteri  asam  laktat juga  dapat  menghilangkan  pertumbuhan  jamur  seperti Aspergillus , Fusarium dan Penicillium (Magnusson et al ., 2003 ). Pada saat perendaman bakteri asam laktat  akan  berperan  sebagai  inhibitor  sehingga  mikrobia  yang  lain  tidak tumbuh. Dari hasil penelitian ini, diketahui bahwa pada air rendaman biji gude terdapat bakteri asam laktat yang tumbuh, hal ini sesuai dengan Mulyowidarso et  al (1991)  yang  melaporkan  bahwa  BAL  memiliki  peranan  yang  sangat penting pada saat perendaman, dengan menurunkan pH dan karena itu mampu menekan  pertumbuhan  bakteri  pathogen.Penurunan  pH  biji  gude  memberi kesempatan jamur tempe tumbuh lebih lama dan menjamin kualitas tempe yang baik.  Karena  BAL  menjadikan  pH  biji  gude  turun  sehingga  memberikan kondisi  yang  baik  bagi  pertumbuhan  jamur.  Menurut  Hermana  dan  Karmini (1996)  keuntungan  lain  dari  kondisi  asam  yang  disebabkan  oleh  BAL  dalam biji  adalah  menghambat    kenaikan  pH  sampai  di  atas  7,0  karena  adanya aktivitas  proteolitik  jamur  dapat  membebaskan  amonia  sehingga  dapat meningkatkan  pH  dalam  biji.  Pada  pH  di  atas  7,0  dapat  menyebabkan penghambatan pertumbuhan atau kematian jamur tempe.

## 4 Simpulan
Bakteri  asam  laktat  yang  berhasil  diisolasi  adalah  isolat  BAR1  mirip dengan Lactobacillus sp. Sedangkan isolat BAR2 mirip dengan Pediococcus sp Bakteri  asam  laktat  berperan  penting  dalam  fermentasi  tempe,  terutama  pada saat  perendaman  biji  gude,  yang  menyebabkan  penurunan  pH,  yang  menjadi inhibitor bagi mikrobia kontaminan.

## Pustaka
Adam. 2009. Tempe dan Proses Pembuatannya . http://www.ad4msan.com//Diakses pada tanggal 21 april 2015. Ashenafi,  M.,  1991.  Growth  of  Listeria  monocytogenes  in  fermenting  tempeh made of various beans and its inhibition by Lactobacillus plantarum. Food Microbiology, vol 8 hal. 303-310.
Ashenafi, M dan Busse, M.  1991.  The  Microflora  of  Soaking  During  Tempeh Production from Various Beans. J of Food Science and Technology .  Hal. 501-506. Buckle,  KA.,Edwards,RA,Fleet,GH,  Wootton,M.  1985. Ilmu  Pangan. Penerjemah: Purnomo, H. dan Adiono). Jakarta: UI Press Desmazeaud,  M.1996.  Lactic  Acid Bacteria in  Food:  Use  and  Safety, Cahiers Agricultures , vol 5, no 5.hal. 331-342. Downes,  DF,    Ito,  K.  2001. Compendium  of  Metods  for  The  Microbiological Examination  of  Foods .  Fourth  Editition.  American  Public  Health Association Washington DC.p.656.
Feng, XM, Eriksson, Anders R.B.,  and Schnurer Johan. 2005. Growth of lactic acid bacteria and Rhizopus oligosporus during barley tempeh fermentation. J of Food Microbiology vol 104, hal.249-256.
Guerra, P.N., Bern rde       M nde         achaldora       astrana       astrana L.  2007. Production of Four Potentially Probiotic Lactic Acid Bacteria and their  Evaluation  as  Feed  Additives  for  Weaned  Piglets. Animal  Feed Science and Technology vol. 134 hal. 89-107.
Hermana,  M.  Karmini,  Karyadi,D.  1996.  Health  significance  of  tempe  for human nutrition. Proceedings of the Second International SoybeanProcessing and Utilization Conference. Funny Publishing Limited Partnership. Bangkok Thailand. 391-394.
Holt,  John.  G.,  Noel,  RK.,  Peter,  HAS.,  James,  TS.,  Stanley,    TW.  1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9 th Edition .  United  States of America: A Waverly Company.
Hui, YH., Meunier-Goddik,L. Hansen,AS., Josephsen,J., Nip,W., Stanfield,PS., Torldra,F.,2004. Handbook  of  Food  and  Beverage  Fermentation Technology . Marcel Dekker Inc. New York John K. 2002. Cajanus cajan (L.) Millsp. ( PigeonPea ). www.fs.fed.us/global/iitf/pdf/shrubs/Cajanus%20cajan.pdf.
Lahtinen, SP., Guimonde, M., Ouwihend, AC., Reinikainen,JP., Salminen, SJ., 2005. Comparison of Four Methods to Enumerate Probiotic Bifidobacteria in  FermentedFood  Product .  Department  of  Food  Chemistry  and Biochemistry. University ofTurku. Turku
Magnusson, J., Strom , K., Roos, S., Sjogren, J., Schnurer, J., 2003. Broad and complex  antifungal  activity  among  environmental  isolats  of  lactic  acid bacteria. FEMS Microbiology. vol 219, hal. 129 – 135.
Mulyowidarso,  RK,    Fleet  GH,  Buckle,  KA.  1989.    The  microbial  ecology  of soybean soaking for tempe production. Int J Food Microbiol . Vol 8, no 1, hal. 35–46.
Pisol , B., Nuraida, L., Abdullah, Suliantari, N., Khalil, KA.2013. Isolation and Characterization of Lactic Acid Bacteria from Indonesian Soybean Tempe. 4th  International  Conference  on  Biology, Environment  and  Chemistry IPCBEE vol.58 (2013). IACSIT Press, Singapore. DOI: 10.7763/IPCBEE. 2013. V58. 7.
Ryan,  J.  G . 1998. Pigeonpea  Improvement .  ACIAR  Projects  8201  and  8567. Trendsetting.  Canberra.
Singh,  F  and    Diwakar,  B.  1993. Nutritive  Value  and  Uses  of  Pigeonpea  and Groundnut .  International  Crops  Research  Institute  for  the  Semi-Arid Tropics. India. http://www.icrisat.org/Training/sds.14.pdf. Diakses 4 maret 2015 .
Soetarto,  ES.,    Nastiti,SJ.,    Suharni,T.,    Sembiring,  L.,  2009. Petunjuk Praktikum  Mikrobiologi .  Laboratorium  Mikrobiologi,  Fakultas  Biologi UGM, Yogyakarta.
Steinkraus,  KH.,  Hand,  DB.,  Van  Buren,  JP.,  Heckler,  LR.  1961. Pilot  Plant Studies On Tempeh .  Proc. Conf.  Soybean  Products  for  Proteins  in  Human Food. USDA, Peoria. Hal. 71-22.
Sujaya, I. N., Nocianitri, K. A. and Asano, K. 2010. Diversity of bacterial flora of Indonesian ragi tape and their dynamics during the tape fermentation as determined by PCR-DGGE . J researc food. Vol 17, hal. 239-245.
Tadasse, G., Ephraim, E., Ashenafi, M. 2005. Assessment of the  antimicrobial activity  of  lactic acid bacteria  isolatd  from Borde  and  Shamita,  traditional Ethiopian  fermented  beverages,  on  some  food-borne  pathogens  and  effect of growth medium on the inhibitory activity. Journal of Food Safety.
Tamang,  JP.,  Shin,  DH.,  Jung,  SJ.,  Chae,  SW.  2016.  Functional  Properties  of Microorganismsin  Fermented  Foods.  Front. Microbiol. 7:578.doi: 10.3389/fmicb.2016.00578 Taylor,  L.  2005. Tropical  Plant  Database:  GUANDU ( Cajanus  cajan ). www.raintree.com/guandu.htm. Diakses pada Senin, 14 april 2015. Van  der  maesen,  LJG.  1980. Taxonomy  of  Cajanus .  Proceedings  of  the international  workshop on pigeonpeas. Icrisat center. India. Vol 2. hal 9-14. Wang, HL., Ruttle, DI., Hesseltine, CW.1969. Antibacterial Compound from a Soybean  Product  Fermented  by  Rhizopus  oligosporus. Proc.  Soc.  Exptl. Biol. Med. vol 131, hal. 579-583.