EISSN: 2407-7690 https://ejournal3.undip.ac.id/index.php/jmr

## Kandungan Lutein Mikroalga Chlorella vulgaris dengan Salinitas Berbeda pada Media Kultur

## Theresia Claudia Lasmarito*, Widianingsih, Hadi Endrawati
Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof.H.Soedarto S.H, Tembalang,Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia *Corresponding author, e-mail: therclaudiaa@gmail.com
ABSTRAK: Chlorella vulgaris merupakan mikroalga yang tergolong dalam alga hijau ( chlorophyta ). C . vulgaris mengandung pigmen karotenoid yang hampir sebagian besar terdiri dari lutein. Hal ini membuat C . vulgaris memiliki keunggulan dibandingkan dengan jenis mikroalga lain. Lutein memiliki manfaat  sebagai  antioksidan  untuk  melawan  radikal  bebas  pada  mata.  Salah  satu  parameter lingkungan yang mempengaruhi jumlah kandungan lutein adalah salinitas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui salinitas terbaik guna mengoptimalkan pertumbuhan dan produksi pigmen lutein pada C . vulgaris . Metode yang digunakan adalah eksperimen laboratorium dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap. Mikroalga C . vulgaris di kultivasi dengan tiga taraf perlakuan salinitas yang berbeda yaitu 20, 25, 35 dan 30 ppt (kontrol) dengan tiga ulangan. Pertumbuhan C . vulgaris diamati  selama  8  x  24  jam  kemudian  dipanen  untuk  perhitungan  biomassanya.  Biomassa  basah hasil  kultivasi  diekstraksi  menggunakan  pelarut  aseton  PA.  Ekstrak  aseton C . vulgaris kemudian dianalisis  kandungan  pigmen  luteinnya  secara  spektrofotometri.  Kandungan  pigmen  lutein C . vulgaris tertinggi diproduksi pada salinitas 35 ppt yakni 0.011363 µg/g. Berdasarkan hasil penelitian dapat  disimpulkan  bahwa  perlakuan  salinitas  berpengaruh  secara signifikan terhadap  kandungan pigmen lutein C . vulgaris .
Kata kunci: Salinitas; Lutein; Mikroalga; Chlorella vulgaris
Lutein Content of Chlorella vulgaris Microalgae with Different Salinity in Culture Media
ABSTRACT: Chlorella vulgaris is a microalga belonging to the green algae (chlorophyta). C. vulgaris contains carotenoid pigments which consist mostly of lutein. This makes C. vulgaris has advantages compared to other types of microalgae. Lutein has benefits as an antioxidant to fight free radicals in the eyes. One of the environmental parameters that affect the amount of lutein content is salinity. This study aims to determine the best salinity to optimize the growth and production of lutein pigment in C. vulgaris. The method used is a laboratory experiment using a completely randomized design. Microalgae C. vulgaris was cultivated with three different levels of salinity treatment, namely 20, 25, 35 and 30 ppt (control) with three replications. The growth of C. vulgaris was observed for 8 x 24 hours and then harvested for the calculation of its biomass. The wet biomass from the cultivation was extracted using acetone PA as a solvent. The acetone extract of C. vulgaris was then analyzed for its lutein pigment content by spectrophotometry. The highest content of lutein pigment C. vulgaris was produced at a salinity of 35 ppt, namely 0.011363 g/g. Based on the results of the study, it can be concluded that the salinity treatment had a significant effect on the lutein pigment content of C. vulgaris.
Keywords: Salinity ; Lutein ; Microalgae ; Chlorella vulgaris

## PENDAHULUAN
Age - related Macular Degeneration (AMD) merupakan penyebab kebutaan pada orang dewasa karena  adanya  perubahan  pada  pusat  retina  dan  makula,  yang  mendorong  menurunnya
kemampuan melihat (Abidin dan Karwur, 2009). Penyakit AMD bisa dicegah dengan suplemen atau asupan makanan yang kaya akan lutein. Lutein dikenal sebagai pigmen makula ( macular pigment ) yang  berfungsi  untuk  menutrisi  mata  karena  keberadaanya  terletak  pada  jaringan  penting  dalam penglihatan yaitu makula (Kurniawan et al ., 2020). Pigmen lutein juga berfungsi sebagai antioksidan yang  dapat  mencegah  perkembangan  penyakit  degeneratif  yang  berkaitan  dengan  pertambahan usia (Kusmiati, 2012). Mikroalga merupakan salah satu  alternatif  sumber potensial pigmen lutein. Mikroalga umumnya dapat hidup di perairan tawar dan laut, beberapa jenis mikroalga yang banyak dijumpai pada wilayah perairan serta dibudidayakan untuk dikembangkan potensinya antara lain C . vulgaris . Mikroalga C . vulgaris mempunyai kandungan yang penting dalam  kehidupan antara lain karbohidrat, protein, lipid, klorofil, serta mempunyai pigmen karotenoid. Karotenoid dari C . vulgaris hampir  seluruhnya  terdiri  dari  lutein,  hal  ini  yang  membuat C . vulgaris memiliki  keunggulan dibandingkan dengan jenis mikroalga lain (Fretes et al ., 2012).
Beberapa faktor  yang  dapat  mempengaruhi  kandungan  lutein  pada mikroalga  adalah suhu, penyinaran cahaya, pH, sumber nitrogen dan salinitas (Guedes et al ., 2011). Faktor stress abiotik yang  paling  berpengaruh  terhadap  produktivitas  lutein  pada  mikroalga,  yaitu  sumber  nitrogen, pencahayaan dan salinitas (Fu et al ., 2014). Salinitas yang tinggi mengakibatkan adanya tekanan osmosis melalui pertukaran ion yang dapat memicu perubahan protein menjadi asam piruvat yang digunakan sebagai bahan dasar pembentukan lutein (Imron et al ., 2016). Beberapa penelitian telah dilakukan  untuk  mengetahui  kandungan  pigmen  lutein  pada  mikroalga.  Penelitian  Kimberly et  al . (2019),  tentang  kandungan  pigmen  lutein  pada Dunaliella  salina dengan  kadar  salinitas  yang berbeda,  menunjukkan  bahwa  kandungan  pigmen  lutein  tertinggi  diperoleh  pada  salinitas  25  ppt sebesar 0,0039 µg/g. Penelitian tentang kandungan pigmen lutein juga dilakukan oleh Imron et al . (2016), pada mikroalga Botryococcus braunii dengan kondisi salinitas yang berbeda menghasilkan kandungan pigmen lutein tertinggi pada salinitas 20 ppt sebesar 0,0035 µg/g. Pigmen lutein sudah banyak banyak diekstraksi dari tumbuhan darat seperti bunga kenikir dan marigold, namun masih sedikit lutein yang diekstraksi dari mikroalga, sehingga perlu adanya penelitian lebih lanjut mengenai produksi pigmen lutein pada mikroalga.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh salinitas terhadap kandungan lutein pada kultur mikroalga Chlorella vulgaris , serta untuk menentukan salinitas terbaik untuk pertumbuhan sel dan produksi pigmen lutein.

## MATERI DAN METODE
Penelitian  dilakukan  pada  bulan  Oktober  -  November  2021.  Materi  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  kultur  murni  mikroalga Chlorella  vulgaris yang  diperoleh  dari  Balai  Besar Pengembangan Budidaya Air Payau (BBPBAP), Jepara. Metode penelitian yang digunakan adalah eksperimen  laboratorium,  yaitu  suatu  metode  penelitian  yang  melihat  hubungan  sebab  akibat melalui perbandingan kelompok yang diberikan perlakuan dengan kelompok yang tidak diberikan perlakuan  (Setyanto,  2013).  Rancangan  percobaan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor (Perbedaan Salinitas) dengan 3 taraf perlakuan, yaitu 20 ppt, 25 ppt dan 35 ppt dengan 3 ulangan dan 1 kontrol (30 ppt).
Sterilisasi bertujuan untuk menghilangkan mikroorganisme atau zat pengganggu yang tidak diharapkan keberadaannya pada alat dan media kultivasi yang akan digunakan selama penelitian (Hartanto et al ., 2013). Alat dan bahan yang perlu disterilisasikan seperti toples kaca,  pipet tetes, selang aerasi, dan air laut sebagai media kultivasi. Peralatan yang telah dibersihkan dan dikeringkan kemudian  disemprot  menggunakan  alkohol  70%,  fungsi  penggunaan  alkohol  ini  adalah  untuk menghambat  pertumbuhan  kuman  dengan  cara  denaturasi  protein  pada  kuman  (Wahyuni et  al ., 2017).  Setelah  itu  peralatan  dilapisi  dengan  plastik  wrap  agar  tidak  terkena  debu  menempel (Wulandari et  al .,  2019).  Pada  tahap  terakhir  sterilisasi  alat  dilakukan  penyinaran  UV  untuk memastikan kembali bahwa peralatan ini terbebas dari bakteri, penyinaran UV dilakukan selama 2 jam (Sulatri et al ., 2017).
Sterilisasi  air  laut  sebagai  media  kultur  dilakukan  dengan  merebus  dan  menyaring  air  laut hingga mendidih selama kurang lebih 2 jam, kemudian didinginkan sampai suhu air laut mencapai temperatur ruang (Hartanto et al ., 2013). Selanjutnya, media kultur dilakukan penyinaran UV selama
Journal of Marine Research Vol 11, No.2 Mei 2022, pp. 320-326
2 jam untuk memastikan tidak ada bakteri yang tertinggal (Sulatri et al ., 2017). Stok air laut steril dengan salinitas 40 ppt diencerkan menjadi empat salinitas perlakuan yang berbeda, yaitu 20, 25, 30, dan 35 ppt.
Kultivasi  dilakukan  menurut  Zainuddin et  al .  (2017),  yang  menyatakan  bahwa  kultivasi dilakukan dengan perbandingan 1:2 ( C . vulgaris : air laut steril) pada stoples dengan volume 3000 ml.  Pupuk  Walne  diberikan  sebanyak  3  mL  ke  dalam  kultivasi C . vulgaris (dosis  1  mL/L). Pengamatan  kepadatan  sel C . vulgaris dilakukan  setiap  24  jam.  Perhitungan  kepadatan  sel dilakukan dengan cara mengambil sampel mikroalga sebanyak 1 mL dan dimasukan ke dalam botol sampel.  Selanjutnya  dilakukan  perhitungan  menggunakan haemocytometer .  di  bawah  mikroskop dengan perbesaran 100x. Kepadatan sel C . vulgaris dihitung dengan menggunakan rumus menurut Ariany dan Syamsunarno, (2021).
Pemanenan biomassa C . vulgaris dilakukan pada fase stasioner (H-8). Pemanenan dilakukan dengan  metode  sentrifugasi  pada  kecepatan  3000  rpm  selama  10  menit  (Imron et  al .,  2016). biomassa berupa pasta kemudian di timbang menggunakan timbangan analitik untuk mengetahui berat basahnya.
Ekstraksi pigmen lutein dilakukan dengan melakukan maserasi biomassa basah C . vulgaris , metode maserasi ini menggunakan pelarut yang akan berdifusi masuk kedalam sel dan selanjutnya senyawa aktif akan keluar akibat adanya tekanan osmosis (Maleta et al ., 2018). Maserasi biomassa basah C . vulgaris dilakukan dengan pelarut aseton PA selama 12 jam dengan perbandingan 1:10 (gram  biomassa  basah:mililiter  pelarut  aseton)  (Imron et  al .,  2016).  Pembacaan  absorbansi dilakukan  dengan  menggunakan  spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  446  nm  yang merupakan spektrum serapan puncak (Koushan et al ., 2013). Perhitungan kadungan lutein dihitung dengan menggunakan rumus menurut Hajare et al . (2013).
Data pertumbuhan dan kandungan pigmen lutein diolah menggunakan aplikasi SPSS 22 dan Microsoft  Excel.  Analisis  statistik  SPSS  22  menggunakan  Uji  ANOVA  satu  arah,  sebelumnya dilakukan uji normalitas serta uji homogenitas terlebih dahulu. Apabila dalam hasil pengujian Anova terlihat  berbeda  nyata,  maka  dilakukan  uji  lanjutan  dengan  Uji  Tukey.  Uji  ini  bertujuan  untuk mengetahui perbedaan signifikan antara masing-masing perlakuan ( Persulessy et al ., 2016).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kepadatan awal sel C . vulgaris pada penelitian ini adalah 50 x10 5 sel/ml. Hasil pengamatan terhadap  kepadatan  sel C . vulgaris menunjukkan  bahwa  terjadi  pertambahan  dan  pengurangan kepadatan sel dari hari ke-0 (H-0) hingga hari ke-8 (H-8) selama masa kultur seperti yang disajikan pada Gambar 1. Lama masa kultur pada pengamatan C . vulgaris ini juga sesuai dengan penelitian Rosahdi et al . (2015), yang menyatakan bahwa pemanenan C . vulgaris dilakukan saat kepadatan sel sudah cukup tinggi yaitu terdapat pada hari ke-7 (H-7) dan ke-8 (H-8). Pertumbuhan C . vulgaris dapat  diamati  dengan  kurva  pertumbuhan  fase  awal  (lag),  pada  fase  ini  terdapat  penambahan kepadatan sel yang sedikit yaitu terjadi pada hari pertama hingga hari ke-2 (H-2). Setelah itu dilanjut dengan fase eksponensial yang ditandai dengan penambahan kepadatan sel yang cukup tinggi yaitu di hari ke-3 (H-3) hingga hari ke-6 (H-6) kultur. Pada hari ke-7 (H-7) hingga ke-8 (H-8) merupakan fase stasioner yang ditandai dengan kepadatan sel yang mulai stabil (Setyati et al ., 2015). Kepadatan  sel  pada  hari  ke-7 (H-7)  hingga  hari ke-8  (H-8)  menunjukkan  peningkatan  yang relatif kecil. Hal ini sesuai dengan penelitian Setyati et al . (2015), yang menyatakan bahwa saat fase stasioner kepadatan sel cenderung tetap karena jumlah sel yang membelah sama dengan jumlah sel  yang  mati.  Faktor  lain  yang  juga  berpengaruh  terhadap  penurunan  kepadatan  sel  adalah kandungan unsur hara yang terdapat dalam media kultur (Zainuddin et al ., 2017). Kandungan nutrien yang tinggi pada fase awal kultur digunakan oleh masing-masing sel untuk melakukan pertumbuhan hingga  pada  fase  eksponensial.  Namun  tidak  adanya  penambahan  nutrien  setelah  fase eksponensial  dapat  menyebabkan  kepadatan  sel  mulai  menurun  dikarenakan  terjadi  persaingan dalam memperebutkan nutrien yang ada (Kurniawan et al ., 2017). Kepadatan sel di hari ke-8 (H-8) pada  salinitas  20  ppt,  25  ppt,  30  ppt  dan  35  ppt  secara  berturut-turut,  yaitu  111,25  x  10 5 sel/ml, 131,98  x  10 5 sel/ml,  141,20  x  10 5 sel/ml  dan  152,63  x  10 5 sel/ml.  Kepadatan  sel  tertinggi,  yaitu 152,63 x 10 5 sel/ml pada salinitas 35 ppt. Hal ini diduga karena salinitas 35 ppt merupakan salinitas awal bibit dari stok kultur BBPBAP Jepara. Pernyataan ini juga didukung oleh Djunaedi et al . (2017), yang  menyatakan  bahwa  mikroalga C . vulgaris dapat  tumbuh  pada  salinitas  10 – 35 ppt, namun salinitas 35 ppt diduga merupakan salinitas optimal untuk pertumbuhan C . vulgaris .
Gambar 1. Pertumbuhan C . vulgaris pada Perlakuan Salinitas yang Berbeda
Berdasarkan  Uji  ANOVA  satu  arah  perbedaan  salinitas  pada  media  kultivasi  memberikan pengaruh  nyata  (p    0,05)  terhadap  pertumbuhan C . vulgaris .  Hal  ini  diduga  karena  salinitas memberikan  pengaruh  terhadap  tekanan  osmotik  sel.  Tekanan  osmotik  dapat  mempengaruhi Kecepatan sel dalam menyerap nutrien (Zainuddin et al ., 2017). Konsentrasi garam yang tinggi pada media kultivasi dapat menyebabkan air dalam sel banyak keluar (Imron et al ., 2016).
Salinitas merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kandungan lutein pada mikroalga. Kondisi  stress  pada C . vulgaris akan  memproduksi  pigmen  karotenoid  yang  berperan  dalam melindungi kloroplas dari kerusakan oksidatif sehingga menghasilkan pigmen karotenoid yang tinggi (Kojo,  2004).  Pigmen  karotenoid  tidak  digunakan  dalam  proses  pertumbuhan  melainkan  sebagai bentuk pertahanan diri pada saat mikroalga mengalami kondisi stress (Kimberly et al ., 2019). Pada salinitas  tinggi  sel  mampu  bertahan  hidup  karena  adanya  bantuan  gliserol  yang  berfungsi  untuk menyeimbangkan proses osmolaritas pada sel bagian luar. Produksi karotenoid berbanding lurus dengan tahap kematian sel. Pigmen yang meningkat pada fase stasioner disebabkan karena pigmen tersebut  dihasilkan  sebagai  upaya  untuk  bertahan  hidup  karena  nutrisi  yang  ada  pada  medium semakin menipis (Kusumaningrum dan Zainuri, 2013).
Kandungan lutein pada salinitas 20 ppt merupakan kandungan lutein terendah yakni 0,011212 µg/g  berat  basah.  Pada  salinitas  20  ppt  diduga C . vulgaris tidak  mengalami  gangguan  tekanan osmotik  sehingga  kurang  optimum  dalam  produksi  pigmen  lutein.  Sedangkan  kandungan  lutein tertinggi terdapat pada perlakuan dengan salinitas 35 ppt yaitu sebesar 0,011363 µg/g berat basah (Gambar 2). Hal ini diduga karena pada salinitas 35 ppt memiliki kepadatan yang tinggi, sehingga kandungan  karotenoidnya  juga  tinggi.  Hal  ini  juga  didukung  oleh  penelitian  Agustini (2014),  yang menyatakan  bahwa  jumlah  karotenoid  berbanding  lurus  dengan  kepadatan  biomassa.  Semakin tinggi  kepadatan  biomassa  pada  mikroalga,  maka  semakin  tinggi  kadar  karotenoidnya.  Semakin tinggi kadar karotenoid, maka kandungan lutein juga semakin tinggi.
Kondisi stress pada C . vulgaris akan memproduksi pigmen karotenoid yang berperan dalam melindungi kloroplas dari kerusakan oksidatif sehingga menghasilkan pigmen karotenoid yang tinggi (Kojo, 2004). Pigmen adalah suatu zat kimia yang memiliki warna dan merupakan bagian dari sistem fotosintesis  mikroalga.  Pigmen  dibedakan  menjadi  tiga  kelas  yaitu  karotenoid,  klorofil  dan phycobiliprotein (Barra et al ., 2014). Salinitas akan menyebabkan adanya tekanan osmolaritas yang berakibat  pada  perubahan  tatanan  lipid  membran  plasma.  Perubahan  ini  mengaktivasi  protein kinase  yang  akan  dipecah  menjadi  asam  piruvat.  Asam  piruvat  digunakan  sebagai  dasar pembentukan senyawa karotenoid. Asam piruvat pada mikroalga hijau akan digunakan bersamaan dengan Gliseraldehida-3-Fosfat untuk proses pembentukan isopentenil pirofosfat (IPP).
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 160.00 180.00 H-0 H-1 H-2
H-3 H-4 H-5 H-6 H-7 H-8 K ep ad atan S el ( 10 5 sel /m l) Hari ke- 20 ppt 25 ppt
35 ppt 30 ppt (Kontrol)
Journal of Marine Research Vol 11, No.2 Mei 2022, pp. 320-326
Gambar 2. Kandungan Lutein C . vulgaris pada Perlakuan Salinitas yang Berbeda
Molekul isopentenil  pirofosfat (IPP)  bergabung  dengan dimetilalil  pirofosfat (DMAPP)  untuk menghasilkan geranylgeranyl difosfat (GGPP). Senyawa GGPP inilah yang merupakan prekursor dari semua karotenoid (Ramos et al ., 2011). Pigmen lutein merupakan hasil dari metabolit sekunder yang akan meningkat jumlahnya apabila mengalami suatu tekanan. Tekanan yang ditimbulkan akan mengakibatkan kondisi keseimbangan sel terganggu dan terciptanya radikal bebas yang berlebih. Pigmen lutein diproduksi sebagai bentuk pertahanan diri dari kondisi keseimbangan yang terganggu (Kimberly et al ., 2019). Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbedaan salinitas memiliki pengaruh nyata (p  0,05) terhadap kandungan lutein pada mikroalga C . vulgaris . Hal ini diduga disebabkan oleh adanya peningkatan konsentrasi garam pada media kultur. Konsentrasi garam didominasi oleh ion  Na + dan  Cl - yang  dapat  mengganggu  keseimbangan  osmotik  antara  sel  dengan  lingkungan luarnya,  hal  ini  kemudian  menyebabkan  air  dalam  sel  banyak  keluar  (Erdmann  dan  Hagemann, 2001).  Proses  hilangnya  air  dan  ion  dalam  sel mengharuskan  sel  melakukan  proses  aklimatisasi atau penyesuaian diri untuk mempertahankan hidup. Salah satunya adalah dengan mengeluarkan metabolit  sekunder  guna  mendukung  aklimatisasi  terhadap  peningkatan  salinitas  (Erdmann  dan Hagemann, 2001).

## KESIMPULAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  mikroalga C.  vulgaris dapat  tumbuh  pada  salinitas  yang diberikan  (20  ppt,  25  ppt,  35  ppt  dan  30  ppt).  Perbedaan  kadar  salinitas  pada  media  kultivasi memberikan  pengaruh  nyata  (p0,05)  terhadap  pertumbuhan  dan  kandungan  pigmen  lutein. Perlakuan  dengan  salinitas  35  ppt  merupakan  salinitas  optimal  untuk  pertumbuhan  dan pembentukan pigmen lutein pada mikroalga C . vulgaris . Semakin tinggi kepadatan C . vulgaris yang didapatkan maka semakin tinggi kandungan luteinnya.

## DAFTAR PUSTAKA
Abidin, D.  Karwur, F. 2009. Zeasantin dari Mikroalga: Biosintesis dan Pemanfaatannya. Squalen Bulletin of Marine and Fisheries Postharvest and Biotechnology , 4(3):112-118. Agustini, N.W.S. 2014. Kandungan Pigmen Astaxanthin dari Mikroalga Botryococcus braunnii pada Berbagai Penambahan Nitrogen dan Phosphor. Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI . 9 hal. Ariany, N.  Syamsunarno, M.B. 2021. The Application of Duckweed Liquid Organic Fertilizer to Cell Populations in the Culture of Nannochloropsis oculata . Torani Journal of Fisheries and Marine Science , 4(2):58-71. DOI: 10.35911/torani.v4i2.13707
0.010000 0.010500 0.011000 0.011500 0.012000 0.012500 Lu tei n (µg /g ) Perlakuan Salinitas
20 ppt 25 ppt 35 ppt 30 ppt (Kontrol)
Barra,  L.R.,  Chandrasekaran.,  Corato,  F.    Brunet,  C.  2014.  The  challenge  of  ecophysiological biodiversity for biotechnological applications of marine microalgae. Marine Drugs , 12(3): 1641- 1675.
Djunaedi, A.S., Sunaryo., Suryono, C.A.  Santosa, A., 2017. Kandungan Pigmen Fikobi liprotein dan  Biomassa  Mikroalga Chlorella  vulgaris pada  media  dengan  Salinitas  Berbeda. Jurnal Kelautan Tropis , 20(2):112-116.
Erdmann, N.  Hagemann, M. 2001. Salt Acclimation of Algae and Cyanobacteria: A Comparison. In: L.C Rai and J.P Gaur. Algal Adaptation to Environmental Stres. Physiological, Biochemical and Molecular Mechanism. Springer Verlag Berlin Heidelberg . German. pp. 324-350.
Fretes,  H.,  Susanto,  A.B.,  Budhy,  P.    Leenawanty,  L.  2012.  Karotenoid  dari  Makroalga  dan Mikroalga: Potensi Kesehatan Aplikasi dan Bioteknologi. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan , 23(2):221-228.
Fu,  W.,  Paglia,  G.,  Magnúsdóttir,  M.,  Steinarsdóttir,  E.A.,  Gudmundsson,  S.,  Palsson,  B.Ø. Brynjólfsson, S. 2014. Effects of abiotic stressors on lutein production in the green microalga Dunaliella salina . Microbial cell factories , 13(1):1-9 Guedes, A.C., H. Amaro, H.M.  Malcata, F.X. 2011. Microalgae as sources of carotenoids. Marine drugs , 9(4):625-644.
Hajare, R., Ray, A., Shreya, T.C., Avadhani, M.N.  Selvaraj, I.C. 2013. Extraction and quantification of  antioxidant  lutein  from  various  plant  sources. International  Journal  of  Pharmaceutical Sciences Review and Research , 22(1):152-157.
Hartanto, H.S.B., Hariyati, R.  Soeprobowati, T.R. 2013. Pertumbuhan Populasi Chlorella Vulgaris Beijerinck  Dengan  Perlakuan  Penambahan  Logam  Berat  Tembaga  (Cu)  Pada  Skala Laboratorium. Jurnal Akademika Biologi , 2(1):19-27.
Imron, M.A., Sudarno  Mastihah, E.D. 2016. Pengaruh Salinitas Terhadap Kandungan Lutein pada Mikroalga Botryococcus braunii . Journal Marine and Coastal Science , 5(1): 36-48. Kimberly, F.D., Supriyantini, E.  Sedjati, S. 2019. Pertumbuhan dan Kandungan Lutein Dunaliella salina pada Salinitas yang Berbeda. Buletin Oseanografi Marina , 8(1):44-48.
Kojo,  S.,  2004.  Vitamin  C:  Basic  Metabolism  and  Its  Function  as  an  Index  of  Oxidative  Stress.
Current Medicinal Chemistry , 11:1041-1064.
Koushan, K., Rusovici, R., Li, W., Ferguson, L.R.  Chalam, K.V. 2013. The role of lutein in eye- related disease. Nutrients , 5(5):1823-1839.
Kurniawan, J.M., Yusuf, M.M., Heriyanto, H.  Brotosudarmo, T.H.P. 2020. Telaah Literatur Potensi Lutein  dari  Bunga  Marigold  Lokal  sebagai  Suplemen  Kesehatan. Media  Penelitian  dan Pengembangan Kesehatan , 30(2):147-162.
Kusmiati,  K.  2012.  Kemampuan  Senyawa  Lutein  Dari  Daun  Bayam  ( Amaranthus SP)  Untuk Menetralisir  Oksidan  T-bhp  Dalam  Sel  Darah. Proceeding  Biology  Education  Conference: Biology, Science, Enviromental, and Learning , 9(1):691-697
Kusumaningrum, H.P.  Zainuri, M. 2013. Aplikasi pakan alami kaya karotenoid untuk post larvae Penaeus monodon Fab. Ilmu Kelautan : Indonesian Journal of Marine Sciences ,18(3):143-149. Maleta, H.S., Indrawati, R., Limantara, L.  Brotosudarmo, T.H.P. 2018. Ragam metode ekstraksi karotenoid dari sumber tumbuhan dalam dekade terakhir (telaah literatur). Jurnal Rekayasa Kimia dan Lingkungan , 13(1):40-50.
Persulessy,  E.R.,  Lembang,  F.K.    Djidin,  H.  2016.  Penilaian  Cara  Mengajar  Menggunakan Rancangan Acak Lengkap. Jurnal Ilmu Matematika dan Terapan , 10(1):9-16.
Ramos, A.A., Polle, J., Tran, D., Cushman, J.C., Jin, E.S.  Varela, J.C. 2011.The unicellular green alga Dunaliella salina Teod.as a model for abiotic stress tolerance: genetic advances and future perspectives. Algae , 26(1):3-20.
Rosahdi, T.D., Susanti, Y.  Suhendar, D. 2015. Uji aktivitas daya antioksidan biopigmen pada fraksi aseton dari mikroalga chlorella vulgaris . Jurnal Istek , 9(1):1-16
Setyati,  W.A.,  Martani,  E.,    Zainuddin,  M.,  2015.  Kinetika  Pertumbuhan  dan  Aktivitas  Protease Isolat 36k dari Sedimen Ekosistem Mangrove, Karimunjawa, Jepara. Ilmu Kelautan : Indonesian Journal of Marine Sciences , 20(3):163-169
Sulatri, N.L., Yogeswara, I.B.  Nursini, N.W. 2017. Efektivitas Sinar Ultraviolet terhadap Cemaran Bakteri Patogen pada Makanan Cair Sonde untuk Pasien Immune-Compremissed . Jurnal Gizi Indonesia , 5(2):112-117.
Wahyuni,  D.,  Herliawati,  H.    Purnamasari,  N.  2017.  Penggunaan  Alkohol  Sebagai  Desinfektan Pada Terapi Komplementer Bekam. Proceeding Seminar Nasional Keperawatan . 3(1):251-253. Wulandari, R., Dharma, A.  Syafrianti. 2019. Pengaruh Pemberian Variasi pH terhadap Produksi Trigliserida  Total  dan  Komposisi  Asam  Lemak  dari Chlorella  vulgaris Air  Tawar. Jurnal  Riset Kimia, 10(2):66 –74.
Zainuddin,  M.,  Hamid,  N.,  Mudiarti,  L.,  Kursistyanto,  N.    Aryono,  B.  2017.  Pengaruh  Media Hiposalin  dan  Hipersalin  terhadap  Respon  Pertumbuhan  dan  Biopigmen Dunaliella  salina . Jurnal Enggano , 2(1):46-57.