## Fraksi Aktif Antibakteri dari Ekstrak Etanolik Daun Johar (Cassia siamea Lam.) terhadap Staphylococcus epidermidis dan
Bioautografinya
Active Antibacterial Fraction from Ethanolic Extract of Johar Leaves (Cassia siamea Lam.) against Staphylococcus epidermidis and Its Bioautography
Rima Munawaroh 1* , Khoirunnisa 1
1 Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Sukoharjo, Indonesia *E-mail: rima.munawaroh@ums.ac.id
Received: 17 Desember 2023; Accepted: 26 Desember 2023; Published: 30 Desember 2023

## Abstrak
Daun Johar ( Cassia siamea Lam.) telah digunakan secara tradisional untuk mengobati gatal karena memiliki aktivitas antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi fraksi aktif dari ekstrak etanolik daun Johar terhadap Staphylococcus epidermidis serta golongan senyawa aktif yang berperan. Proses ekstraksi menggunakan metode maserasi dengan etanol 96%. Metode ekstraksi cair-cair digunakan untuk memisahkan fraksi  n-heksana,  etil  asetat,  dan  air.  Ekstrak  dan  fraksi  yang  dihasilkan  dinilai  aktivitas  antibakterinya dengan menggunakan metode difusi sumur. Sampel sebanyak 4 mg, 2 mg, dan 1 mg per sumur digunakan, dengan  DMSO  sebagai  kontrol  negatif  dan  kloramfenikol  6  mg  sebagai  kontrol  positif.  Hasil  pengujian menunjukkan  bahwa  fraksi  etil  asetat  lebih  efektif  daripada  ekstrak.  Secara  spesifik,  fraksi  tersebut menghasilkan  zona  hambat  sebesar  13,5  ±  0,5  mm  pada loading  dose 4  mg/sumuran,  sedangkan  ekstrak hanya menghasilkan zona hambat sebesar 9,3 ± 1,2 mm pada loading dose yang sama. Selain itu, terdapat perbedaan yang signifikan pada diameter zona hambat antar kelompok perlakuan pada p < 0,05. Hasil KLT menunjukkan  bahwa  fraksi  etil  asetat  daun  johar  mengandung  senyawa  alkaloid,  fenolik,  flavonoid,  dan steroid dengan fase diam silika gel 60 F 254 dan fase gerak kloroform:etil asetat:etanol (7:2:1 v/v/v). Hasil bioautografi menunjukkan bahwa senyawa fenolik dan alkaloid pada Rf 0,22 serta senyawa fenolik pada Rf 0,42 bertanggung jawab terhadap antibakteri.
Kata Kunci : antibakteri, Cassia siamea , fraksinasi, bioautografi, Staphylococcus epidermidis

## Abstract
Johar leaves (Cassia siamea Lam.) have been traditionally used to treat pruritus due to their antibacterial properties.  This  study  aims  to  identify  the  active  fraction  of  an  ethanolic  extract  of  Johar  leaves  against Staphylococcus  epidermidis,  as  well  as  the  active  chemical  class.  The  extraction  process  involved maceration with 96% ethanol. The liquid-liquid extraction method was used to separate the n-hexane, ethyl acetate, and water fractions. The resulting extract and fraction were assessed for antibacterial activity using the well diffusion method. Sample loadings of 4 mg, 2 mg and 1 mg per well were used, with DMSO as a negative  control  and  6  mg  chloramphenicol  as  a  positive  control.  The  test  results  indicate  that  the  ethyl acetate fraction is more effective than the extract. Specifically, the fraction produced an inhibition zone of 13.5 ± 0.5 mm at a loading of 4 mg/well, while the extract only produced an inhibition zone of 9.3 ± 1.2 mm at the same loading. Additionally, there was a significant difference in the diameter of the inhibitory zone between treatment groups at p < 0.05. The TLC results indicate that the ethyl acetate fraction of Johar leaves contains alkaloid, phenolic, flavonoid, and steroid compounds when using silica gel 60 F 254 stationary phase and  chloroform:ethyl  acetate:ethanol  (7:2:1  v/v/v)  mobile  phase.  Bioautography  results  showed  that  the phenolic  and  alkaloid  compounds  at  Rf  0.22  and  phenolic  compound  at  Rf  0.42  are  responsible  for  the antibacterial activity against Staphylococcus epidermidis.
Keywords: antibacterial, Cassia siamea, fractionation, bioautography, Staphylococcus epidermidis

## PENDAHULUAN
Bahan  alam  terus  dikembangkan  untuk memenuhi kebutuhan biologis termasuk untuk mekanisme pertahanan endogen dan interaksi dengan  organisme  lain  sehingga  memegang peran penting dalam penemuan obat terutama pada  kanker  dan  penyakit  infeksi.  Wawasan tentang  efikasi  dan  keamanan  bahan  alam dapat  diamati  pada  penggunaannya  dalam pengobatan  tradisional  (Atanasov et  al ., 2021).  Bahan  alam  yang  digunakan  dalam pengobatan salah satu sumbernya berasal dari tumbuhan  (Saifudin,  2014).  Aktivitas  yang dihasilkan  oleh  tumbuhan  berasal  dari metabolit  primer  dan  metabolit  sekunder. Skrining fitokimia dari tumbuhan menunjukkan adanya metabolit sekunder yang meliputi  tannin,  alkaloid,  glikosida,  saponin, dan  flavonoid.  Metabolit  sekunder  tersebut digunakan  untuk  mekanisme  pertahanan terhadap  mikroorganisme,  serangga,  dan herbivora (Compean & Ynalves, 2014). Johar ( Cassia  siamea Lam.)  adalah  salah  satu tumbuhan  yang  mengandung  metabolit sekunder dengan aktivitas antimikroba.
Johar  sering  ditanam  sebagai  pohon peneduh  karena  berupa  tumbuhan  berkayu besar. (Laksmi & Hidayati, 2014). Masyarakat telah  menggunakan  daun  johar  secara tradisional  sebagai  obat penyakit  kulit. Daun johar  untuk  mengobati  rasa  gatal  dilakukan dengan mengambil bagian daunnya kemudian direbus  sampai  mendidih.  Air  hasil  rebusan didiamkan sampai dingin kemudian digunakan untuk mandi (Indriyani  & Wulandari,  2015).  Bakteri Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes,
Staphylococcus epidermidis ,
dan Staphylococcus  aureus dapat  menyebabkan infeksi pada kulit (Sari, 2019). Ekstrak etanol daun johar memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas  aeruginosa sebesar  10,14  mm pada  konsentrasi  210  ppm/disk  (Andayani et al. ,  2021), Staphylococcus  aureus sebesar 14,9 mm pada konsentrasi 100%, Micrococcus  luteus sebesar  12  mm  pada konsentrasi 100% (Fitriah et al ., 2017).
Fraksinasi  cair-cair  atau  partisi  perlu dilakukan  pada  ekstrak  yang  memiliki aktivitas  biologis  karena  ekstrak  kasar kandungannya masih sangat kompleks. Hasil semua  fraksi  kemudian  dipantau  potensinya dengan  melakukan  uji  aktivitas  (Saifudin, 2014).  Hasil  fraksi  teraktif  dapat  dilakukan evaluasi menggunakan teknik KLT- bioautografi.  KLT-bioautografi  merupakan gabungan  antara  teknik  pemisahan  KLT dengan penentuan aktivitas biologis (Wang et al., 2021). Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan fraksinasi ekstrak etanol daun johar dan  melakukan  KLT-bioautografi  fraksi teraktif untuk mengetahui komponen metabolit  sekunder  yang  berperan  dalam penghambatan bakteri Staphylococcus epidermidis .

## METODE PENELITIAN Alat
Alat yang dipakai terdiri dari serangkaian alat maserasi, neraca analitik (Ohaus), mikroskop (Olympus), waterbath (Memmert),  rotary evaporator  (Heidolph),  autoklaf  (Hirayama), oven  (Memmert), shaker  incubator (New Brunswick  Scientific), Laminar  Air  Flow (CV. Srikandi Laboratory), vortex (Thermolyne  Corporation), cork  borer , inkubator  bakteri  (Memmert),  mikropipet (Socorex), chamber¸ lampu UV 254 nm, dan lampu UV 366 nm.

## Bahan
Bahan  yang  dipakai  terdiri  dari  daun  johar ( Cassia  siamea Lam.)  dari  Sawahan, Ngemplak,  Boyolali,  Jawa  Tengah;  biakan bakteri Staphylococcus  epidermidis dari Laboratorium Biologi Farmasi UMS; pelarut teknis  etanol  96%,  n-heksana,  etil  asetat, akuades,  metanol;  reagen  kristal  violet, reagen  mordant,  reagen decolorizing  agent , reagen counterstain ,  minyak  imersi;  media MSA  ( Mannitol  Salt  Agar ),  media  MHA
( Mueller  Hinton  Agar ),  media  BHI  ( Brain Heart  Infusion ),  standar  McFarland,  larutan salin,  DMSO  (dimetil  sulfoksida);  silika  gel 60 F 254 , tips , reagen FeCl 3 , reagen
Dragendorff,  reagen  Liebermann  Burchard, dan reagen Sitroborat.
Determinasi Tanaman
Tanaman Johar dideterminasi di Laboratorium Herbarium B2P2TOOT (Badan Penelitian  dan  Pengembangan  Kesehatan Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengembangan Tanaman  Obat  dan  Obat  Tradisional) Tawangmangu, Karanganyar.

## Ekstraksi
Daun Johar disortasi basah dan dicuci dengan air mengalir selanjutnya dikeringkan di dalam lemari pengering. Sebanyak 500 gram serbuk daun johar direndam dengan 5 L etanol 96% selama 5 hari dan diaduk sesekali. Selanjutnya disaring dan didapatkan maserat I. Ampas kemudian dimaserasi selama 5 hari dengan 2,5 L etanol 96% dan sesekali diaduk. Hasil  remaserasi  disaring  dan  didapatkan maserat II. Kedua maserat dicampur kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada  temperatur  50 o C  dan  dipekatkan menggunakan waterbath temperatur  50 o C sehingga didapatkan ekstrak kental  (Daeli & Ridho, 2023).

## Fraksinasi
Metode  ekstraksi  cair-cair  dilakukan  dengan mengambil  5  gram  ekstrak  kental  dan dilarutkan dalam 50 mL metanol:air (9:1 v/v) kemudian  dimasukkan  dalam  corong  pisah. N-heksana ditambahkan sebanyak 50 mL dan digojog  beberapa  kali  kemudian  didiamkan hingga  terbentuk  dua  lapisan.  Lapisan  atas diambil dan disebut fraksi n-heksana. Lapisan bawah diuapkan untuk menghilangkan metanolnya  selanjutnya  dilarutkan  dalam  50 mL air dan dimasukkan dalam corong pisah. Etil asetat ditambahkan sebanyak 50 mL dan digojog  beberapa  kali  kemudian  didiamkan hingga  terbentuk  dua  lapisan.  Lapisan  atas diambil  dan  disebut  fraksi  etil  asetat sedangkan  lapisan  bawah  disebut  fraksi  air. Setiap penambahan pelarut dilakukan pengulangan  sebanyak  3  kali.  Fraksi  yang diperoleh diuapkan dengan rotary evaporator pada  temperatur  50 o C  dan  dipekatkan menggunakan waterbath temperatur  50 o C
sehingga didapatkan fraksi kental (Munawaroh et al ., 2018).

## Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat  dari  kaca  dibungkus  kertas  dan dimasukkan  oven  selama  1  jam  pada temperatur 170 o C. Alat dari logam disterilkan dengan  melewatkannya  di  atas  api  menyala tidak  kurang  dari  20  detik.  Media,  akuades, larutan  NaCl,  dan  tips  dimasukkan  autoklaf pada  temperatur  121 o C  selama  15  menit (Ningtyas, 2023).

## Identifikasi Bakteri

## Pewarnaan Gram
Satu  ose  bakteri  diratakan  setipis  mungkin pada  gelas  objek  selanjutnya  preparat dikeringkan di atas nyala api spiritus. Selama 1  menit  preparat  digenangi  reagen  kristal violet  kemudian  dibiarkan  catnya  mengalir tanpa  dicuci  dengan  air.  Selama  1  menit preparat  digenangi  reagen  mordant  (Iodine Gram’s)  kemudian  cat  dibilas  dengan  air. Preparat  ditetesi decolorizing  agent (etanol) sampai warna cat tepat luntur. Selama 1 menit digenangi counterstain (Safranin) selanjutnya dibilas  dengan  air  mengalir  dan  dibiarkan kering  (Smith  &  Hussey,  2005).  Preparat yang telah kering dilakukan observasi dengan bantuan  minyak  imersi  dan  mikroskop perbesaran 1000 kali.

## Uji Manitol
Uji  manitol  dilakukan  menggunakan  media selektif  MSA.  Plates  media  diinokulasikan bakteri di permukaannya dan diinkubasi pada temperatur  35  ±  2 o C  selama  24-48  jam (Liofilchem, 2005).
Pembuatan Suspensi Bakteri Secara streak  plate satu  ose Staphylococcus epidermidis digoreskan pada media MSA dan diinkubasi  24  jam  pada  temperatur  37 o C. Selanjutnya  diambil  3-5  koloni  bakteri kemudian  dimasukkan  dalam  media  BHI  5 mL  dan  diletakkan  pada shaker  incubator selama  2-6  jam,  selanjutnya  dibandingkan standar McFarland 1,5x10 8 CFU/mL. Apabila suspensi bakteri terlalu keruh dapat ditambahkan larutan saline sedangkan apabila suspensi bakteri kurang keruh dapat
ditambahkan inokulasi bakteri atau penambahan waktu inkubasi (Leber, 2016). Pembuatan  Kontrol  dan  Seri  Konsentrasi ekstrak/fraksi
DMSO digunakan sebagai kontrol negatif dan kloramfenikol 30%b/v (300 mg kloramfenikol  dalam  1  mL  etanol  96%) digunakan  sebagai  kontrol  positif,  masing- masing  sebanyak  20  µL/sumuran.  Bakteri Staphylococcus epidermidis sensitif terhadap antibiotik kloramfenikol (Fahmi et al ., 2014). Masing-masing  ekstrak  dan  fraksi  dibuat konsentrasi  20%, 10%, dan 5%. Konsentrasi 20%  dibuat  dengan  mengambil  200  mg ekstrak  atau  fraksi  kemudian  dilarutkan DMSO hingga 1 mL, selanjutnya konsentrasi 10%  dibuat  dengan  mengambil  500  µL campuran  tersebut  dan  ditambahkan  DMSO hingga 1 mL. Konsentrasi 5% dibuat dengan mengambil  500  µL  konsentrasi  10%  dan ditambahkan  DMSO  hingga  1  mL. Loading volume sampel tiap sumuran sebanyak 20 µL sehingga diperoleh loading ekstrak atau fraksi tiap sumuran 4 mg, 2 mg, dan 1 mg. Loading kloramfenikol  (kontrol  positif)  sebanyak  6 mg/sumuran.

## Uji Aktivitas Antibakteri
Metode difusi sumuran dipilih sebagai metode uji  aktivitas  antibakteri.  Suspensi  bakteri sebanyak  200  µL  diinokulasi  pada  media MHA  yang  telah  memadat  dan  diratakan menggunakan spreader glass . Hasil inokulasi didiamkan  selama  10  menit.  Selanjutnya dibuat  5  sumuran  berdiameter  6  mm  dengan cork  borer .  Ekstrak  atau  fraksi  konsentrasi 20%,  10%,  5%,  dan  kontrol  dimasukkan sebanyak 20 µL ke dalam sumuran kemudian diinkubasi  pada  temperatur  37 o C  selama  24 jam  (Balouiri et  al. ,  2016).  Pengujian dilakukan  dengan  replikasi  sebanyak  3  kali. Adanya  zona  jernih  di  sekeliling  sumuran menandakan adanya zona hambat. Pengukuran menggunakan penggaris diameter zona  hambat  sebanyak  2  kali  dari  sisi  yang berbeda  kemudian  dihitung  rata-ratanya (Bagul & Sivakumar, 2016).
Uji Kromatografi Lapis Tipis
Fase gerak kloroform:etil  asetat:etanol (7:2:1 v/v/v)  dan  fase  diam  silika  gel  60  F 254 digunakan pada pemisahan fraksi teraktif daun johar menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).  Fase  diam  silika  diaktifkan  dengan dimasukkan  oven  pada  temperatur  120 o C selama 30 menit. Sampel fraksi dalam etanol 96% ditotolkan pada lempeng KLT kemudian dielusi  dengan  fase  gerak.  Hasil  elusi dilakukan  pengamatan  menggunakan  sinar UV  254  nm,  sinar  UV  366  nm,  dan  reagen semprot  serta  dihitung  Rf  tiap  bercak (Rubiyanto, 2017).

## Uji Bioautografi
Metode bioautografi kontak digunakan dalam uji  bioautografi.  Sebanyak  200  µL  kultur bakteri diratakan pada media MHA menggunakan spreader glass dan didiamkan selama  10  menit.  Lempeng  KLT  hasil  elusi fraksi  teraktif  dan  lempeng  KLT  hasil  elusi fase  gerak  saja  (kontrol  negatif)  diletakkan selama  30  menit  di  atas  media  kemudian diambil.  Selanjutnya  media  diinkubasi  pada temperatur 37 o C selama 24 jam. Adanya zona hambat  yang  timbul  dilakukan  pengamatan nilai Rf-nya (Wang et al. , 2021).

## Analisis Data
Analisis  SPSS  25  metode  Kruskal-Wallis yang dilanjutkan dengan Mann-Whitney pada taraf  kepercayaan  0,05  digunakan  untuk menganalisis  data  diameter  zona  hambat. Fraksi  dengan  hasil  diameter  zona  hambat terbesar disebut fraksi teraktif. Fraksi teraktif dilakukan KLT dan bioautografi, selanjutnya diamati kesesuaian nilai Rf antara hasil KLT dan bioautografi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi dilakukan dengan menetapkan  kesesuaian  tanaman  secara makroskopis  dari  bagian  akar,  batang,  daun, bunga, dan polong untuk memastikan tanaman yang  digunakan  adalah Cassia  siamea Lam. Berdasarkan surat keterangan hasil determinasi  No.  KM.04.02/2/1903/2022  oleh B2P2TOOT  Karanganyar,  sampel  tanaman yang  diserahkan  merupakan  tanaman  johar
dengan  spesies Senna  siamea Lam.  dengan sinonim Cassia siamea Lam.
Ekstraksi  dilakukan  untuk  memisahkan bagian  aktif  dari  jaringan  tumbuhan.  Etanol 96%  merupakan  pelarut  pilihan  untuk  tujuan skrining  dan  mampu  mengekstraksi  senyawa yang  belum  diketahui  strukturnya  (Saifudin, 2014). Hasil ekstraksi didapatkan 127,77 gram ekstrak  kental  dari  500  gram  simplisia, sehingga diperoleh rendemen sebesar 25,55%.
Fraksinasi  merupakan  proses  pemisahan campuran menjadi komponennya berdasarkan perbedaan  sifat  dan  karakteristik  komponen individu (Ibrahim, 2018). Fraksinasi dilakukan setelah mendapatkan ekstrak aktif. Pada penelitian ini, metode ekstraksi cair-cair digunakan  pada  proses  fraksinasi  dengan menggunakan pelarut yang berbeda polaritasnya sehingga zat yang yang berada di dalam ekstrak akan terlarut dan terdistribusi ke pelarut sesuai prinsip “ like dissolve like ”. Pada Tabel  1 dapat  dilihat  rendemen  tertinggi diperoleh pada fraksi air sedangkan rendemen terendah  diperoleh  pada  fraksi  n-heksana. Berdasarkan  hasil  tersebut,  kemungkinan kandungan senyawa pada ekstrak etanol daun johar  didominasi  oleh  senyawa  yang  bersifat polar.
Pemastian bakteri Staphylococcus epidermidis yang digunakan dilakukan dengan  identifikasi  bakteri.  Hasil  pewarnaan Gram  ( Gambar  1A )  menunjukkan  bakteri memiliki koloni berbentuk bulat dan berwarna ungu, hasil tersebut sesuai dengan karakteristik dari Staphylococcus epidermidis yang berupa bakteri Gram-positif (Zhou & Li, 2015). Bakteri Gram-Positif memiliki dinding sel  yang  dapat  mengikat  kompleks  kristal violet-iodine  di  dalam  sel  bersama  dengan dehidrasi  akibat  penambahan  etanol  karena memiliki  lapisan  peptidoglikan  yang  tebal sehingga  akan  tetap  berwarna  ungu  setelah penambahan  safranin  (Smith  &  Hussey, 2005).  Hasil  uji  manitol  ( Gambar  1B ) menunjukkan  koloni  yang  berwarna  merah dengan  media yang tidak  mengalami perubahan  sesuai  dengan  karakteristik  dari Staphylococcus epidermidis yang tidak memfermentasi manitol (Liofilchem, 2005).
Ekstrak  kental  dan  fraksi  kental  yang diperoleh  dilakukan  uji  aktivitas  antibakteri. Metode  difusi  sumuran  digunakan  karena konsentrasi  sampel  pada  metode  difusi sumuran  lebih  tinggi  dibandingkan  metode difusi disc sehingga terjadi proses osmolaritas secara  keseluruhan  dan  didapatkan  tingkat Tabel 1. Hasil Fraksinasi Ekstrak Etanol Daun Johar (Cassia Siamea Lam.) No Pelarut Berat Awal Ekstrak (gram) Berat Fraksi (gram) Rendemen (%) 1 N-heksana 25,38 g 2,03 8,0 2 Etil asetat 3,68 14,5
3 Air 12,03 47,4
(A)
(B)
Gambar 1. Hasil identifikasi bakteri Staphylococcus epidermidis melalui pewarnaan Gram diamati menggunakan mikroskop perbesaran 1000x (A) dan uji manitol diamati pada media MSA (B)
homogenitas  yang  tinggi.  Selain  itu,  metode difusi sumuran terjadi kontak langsung antara sampel dengan media yang telah diinokulasikan bakteri. Adanya zona jernih di sekeliling sumuran menandakan adanya zona hambat (Zada & Febriawan, 2021).
Pada  penelitian  ini  pembuatan  seri konsentrasi  ekstrak  etanol  dan  fraksi  n- heksana menggunakan pelarut DMSO 100%, sedangkan  seri  konsentrasi  fraksi  etil  asetat dan  fraksi  air  menggunakan  pelarut  DMSO 20%.  DMSO dapat  melarutkan  senyawa  dari berbagai tingkat kepolaran dan tidak menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri sehingga dapat digunakan sebagai kontrol negatif (de Brito et al .,  2017).  Kontrol  positif  menggunakan
kloramfenikol sebagai antibakteri yang bekerja  dengan  mengikat  subunit  50S ribosom,  yang  menghambat  enzim  peptidil transferase sehingga mencegah sintesis ikatan peptide akibatnya menghambat pembentukan protein bakteri (Mardiastuti et al. , 2021). Penggunaan kloramfenikol sebagai kontrol  positif  memperlihatkan  adanya  zona hambat  sedangkan  DMSO  sebagai  kontrol negatif  tidak  memperlihatkan  adanya  zona hambat ( Tabel 2 ). Penggunaan kontrol positif untuk  membandingkan  potensi  dan  validasi metode,  sedangkan  kontrol  negatif  untuk memastikan  penggunaan  pelarut  pada  seri konsentrasi tidak berkontribusi pada munculnya zona jernih.
Hasil  analisis  statistik  menggunakan metode  Kruskal-Wallis  menunjukkan  nilai  p
signifikan (0,000 < 0,005) sehingga menunjukkan  adanya  perbedaan  bermakna antara  rata-rata  antar  kelompok  perlakuan terhadap diameter zona hambat yang dihasilkan. Kelompok perlakuan yang berbeda bermakna  dapat  diketahui  melalui  pengujian Mann-Whitney  ( Tabel  2 ).  Hasil  pengujian menunjukkan ekstrak etanol dapat menghambat bakteri
Staphylococcus epidermidis pada loading ekstrak  terbesar yaitu  4  mg/sumuran;  fraksi  n-heksan  dan fraksi  air  tidak  dapat  menghambat  bakteri pada  semua loading ekstrak  1,  2,  4 mg/sumuran;  sedangkan  fraksi  etil  asetat dapat  menghambat  bakteri  pada  semua loading ekstrak 1, 2, 4 mg/sumuran, diameter zona  hambatnya  semakin  besar  dengan
meningkatnya loading ekstrak/sumuran.
Hasil  penelitian  ini  sejalan  dengan  hasil penelitian Fitriah et al . (2017), ekstrak etanol daun johar pada konsentrasi 100% menunjukkan diameter zona hambat terhadap Staphylococcus aureus sebesar  14,9  mm  dan penelitian  Oyebade et  al .  (2021)  yang menunjukkan kemampuan antibakteri ekstrak etanol  daun  johar  terhadap Staphylococcus aureus pada  konsentrasi  50%  menghasilkan diameter zona hambat sebesar 10,0 mm.
Fraksi  etil  asetat  adalah  fraksi  yang memiliki  zona  hambat  diantara  ketiga  fraksi dari  ekstrak  etanol  daun  johar,  juga  pada loading dose 4  mg/sumuran  diameter  zona hambat  fraksi  etil  asetat lebih  besar  daripada ekstrak  etanolnya  ( Tabel  2 ).  Fraksi  teraktif daun  johar  yang  didapatkan  ialah  fraksi  etil

## Tabel 2. Hasil uji aktivitas antibakteri daun Johar terhadap Staphylococcus epidermidis
No Loading sampel Diameter zona hambat* (rerata ± SD mm, n=3) Ekstrak etanol Fraksi n-heksan Fraksi etil asetat Fraksi air 1 4 mg/sumuran 9,3 ± 1,2** ab 6,0 ± 0,0 13,5 ± 0,5** c 6,0 ± 0,0 2 2 mg/sumuran 6,5 ± 0,5 6,0 ± 0,0 11,2 ± 1,0** b 6,0 ± 0,0 3 1 mg/sumuran 6,0 ± 0,0 6,0 ± 0,0 8,5 ± 0,9** a 6,0 ± 0,0 K+ Kloramfenikol 6 mg/sumuran 19,8 ± 1,0** d 20,6 ± 0,5** d 19,8 ± 0,8** d 19,5 ± 0,5** d K˗ DMSO 100%, 20 µL DMSO 20%, 20 µL 6,0 ± 0,0 - 6,0 ± 0,0 - - 6,0 ± 0,0 - 6,0 ± 0,0 *Diameter zona hambat termasuk diameter sumuran 6 mm **Berbeda bermakna terhadap kontrol negatif
a,b,c,d: Tanda huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna - : tidak dilakukan
asetat  dan  lebih  poten  dibandingkan  ekstrak etanol.  Oleh  karena  itu,  fraksi  etil  asetat selanjutnya dilakukan pengujian KLT- Bioautografi.
KLT-Bioautografi  merupakan  gabungan antara  pemisahan  KLT  dengan  penentuan aktivitas biologis. KLT-Bioautografi digunakan  untuk  menemukan,  mengisolasi, dan  mengevaluasi  bagian  aktif  dari  bahan alam.  Hasil  elusi  KLT  dapat  menunjukkan pemisahan  senyawa  sedangkan  hasil  elusi KLT  yang  dilanjutkan  bioautografi  dapat menunjukkan  aktivitas  antibakteri  melalui penampakan zona hambat (Wang et al ., 2021). Fraksi  etil  asetat  daun  johar  terlebih dahulu dipisahkan menggunakan KLT dengan fase  diam  silika  gel  60  F 254 dan  fase  gerak kloroform:etil  asetat:etanol  (7:2:1  v/v/v). Hasil  elusi  KLT  dan  bioautografi  dilakukan perhitungan  Rf  untuk  mengamati  senyawa yang  berkontribusi  pada  penghambatan pertumbuhan bakteri. Faktor retardasi ( Retardation  factor atau  Rf)  merupakan perbandingan  jarak  migrasi  analit  dengan jarak  migrasi  eluen  yang  menunjukkan parameter  migrasi  senyawa  dalam  KLT (Rubiyanto, 2017).
Hasil kromatogram fraksi etil asetat daun johar  ( Tabel  3 )  memperlihatkan  bercak- bercak yang pemadaman fluoresensi pada UV 254  nm  disebabkan  adanya  senyawa  dengan ikatan  rangkap  yang  terkonjugasi.  Pada  UV 366  nm  muncul  bercak  berfluoresensi,
fluoresensi dapat terjadi karena senyawa dapat menyerap  cahaya  dan  bereksitasi  dari  energi rendah  menuju  energi  yang  lebih  tinggi (Spangenberg et al. , 2011).
Alkaloid  dideteksi  menggunakan  reagen Dragendorff  dengan  ditandai  munculnya warna cokelat atau oranye pada sinar tampak. Hasil  KLT  menunjukkan  adanya  warna cokelat  pada  Rf  0,22  dan  0,64  serta  oranye pada  Rf  0,74.  Munculnya  warna  tersebut karena  nitrogen  pada  alkaloid  berikatan dengan ion logam K+ (Marliana et al., 2005). Triterpenoid atau steroid dideteksi menggunakan  reagen  Liebermann-Burchard (LB) dengan triterpenoid ditandai munculnya fluoresensi  ungu,  violet,  atau  merah  muda pada  UV  366 nm  sedangkan steroid ditandai dengan  fluoresensi  hijau  atau  biru  pada  UV 366 nm. Hasil KLT memperlihatkan fluoresensi hijau pada Rf  0,36 dan biru pada Rf  0,54.  Munculnya  warna  tersebut  karena reaksi antara asetat anhidrida dari pereaksi LB dengan  gugus  hidroksil dari steroid  sehingga menyebabkan perpanjangan konjugasi (Siadi, 2012).
Fenolik  dideteksi  menggunakan  reagen Besi-III-Klorida  (FeCl 3 )  dengan  ditandai
munculnya  warna  hijau,  biru,  cokelat,  atau kehitaman  pada  sinar  tampak.  Hasil  KLT menunjukkan  adanya  warna  hitam  pada  Rf 0,22  dan  0,64  serta  warna  cokelat  pada  Rf 0,42.  Munculnya  warna  tersebut  karena kandungan  fenolik bereaksi dengan Fe 3+ dari
Tabel 3. Hasil KLT fraksi etil asetat daun johar menggunakan fase diam silika gel 60 F 254 dan fase gerak kloroform:etil asetat:etanol (7:2:1 v/v/v) No Rf UV 254 UV 366 Dragendorff vis LB
UV 366 FeCl 3 vis Sitroborat UV 366 Interpretasi 1 0,22 P Biru Coklat - Hitam - Alkaloid, Fenolik 2 0,36 P Biru tua - Hijau - - Steroid 3 0,42 P Cokelat - - Cokelat - Fenolik 4 0,54 P - - Biru - - Steroid 5 0,58 P Kuning - Biru - - Steroid 6 0,64 P Ungu Coklat Biru Hitam - Alkaloid, Steroid, Fenolik 7 0,74 P Oranye Oranye - - Kuning Alkaloid, Flavonoid 8 0,86 P Merah - - - - Klorofil Keterangan: P = Pemadaman fluoresensi
UV 366 = fluoresensi Vis = sinar tampak
FeCl 3 sehingga membentuk kompleks trisianoferitrikalium  ferri  (III)  (Ergina  & Pursitasari, 2014).
Flavonoid dideteksi menggunakan reagen sitroborat  dengan  ditandai  pada  UV  366  nm muncul  fluoresensi  kuning.  Hasil  KLT memperlihatkan  adanya  fluoresensi  kuning pada  Rf  0,74.  Munculnya  warna  tersebut dengan  mekanisme  yang  belum  jelas, kemungkinan dengan terbentuknya kompleks dari  boron  dan  orto  hidroksil  dari  flavonoid (Suhendi et al. , 2018)
Kandungan  metabolit  sekunder  dalam fraksi  etil  asetat  daun  johar  meliputi  fenolik, alkaloid,  steroid,  dan  flavonoid  ( Tabel  3 ). Hasil ini sesuai dengan penelitian Fitriah et al. (2017)  yang  menyatakan  ekstrak  etil  asetat daun  Johar  yang  diperoleh  secara  ekstraksi bertingkat daun Johar menggunakan n-heksan, etil  asetat,  etanol;  ekstrak  etil  asetatnya mengandung  alkaloid,  tanin/fenolik,  dan steroid.    Juga  sesuai  dengan  penelitian
Oyebade et  al. (2021)  yang  menyatakan ekstrak  etil  asetat  daun  johar  hasil  maserasi bertingkat  dengan  cara  yang  sama  seperti  di atas, mengandung flavonoid.
Hasil  bioautografi  menunjukkan  adanya zona hambat pada Rf 0,22 dan 0,42 ( Gambar 2 ).  Nilai  Rf  tersebut  sama  dengan  Rf  hasil KLT  yang  menunjukkan  adanya  senyawa fenolik dan alkaloid pada Rf 0,22 dan fenolik pada Rf 0,42. Oleh karena itu, senyawa dalam fraksi etil asetat yang diduga berperan dalam penghambatan pertumbuhan bakteri Staphylococcus  epidermidis adalah  fenolik dan  alkaloid.  Kamagate et  al .  (2014)  juga menyatakan bahwa senyawa alkaloid, fenolik, dan sterol berperan pada aktivitas antibakteri ekstrak daun johar.  Phlobatannins merupakan fenolik  yang  terkandung  dalam  daun  johar sedangkan alkaloid yang terkandung didalamnya  yaitu  cassiarin  A  dan  B; siaminine  A  dan  B  (Kumar et  al .,  2017). Mekanisme  fenolik-tanin  sebagai  antibakteri meliputi menghambat enzim bakteri ekstraseluler,  menghilangkan  substrat  yang berperan  dalam  pertumbuhan  bakteri,  dan mempengaruhi  metabolisme  bakteri  melalui penghambatan  fosforilasi  oksidatif  (Scalbert, 1991).  Alkaloid  berperan  sebagai  antibakteri dengan  menghambat  DNA  topoisomerase (Yan et al ., 2021).

## KESIMPULAN
Fraksi aktif dari ekstrak etanol daun johar ( Cassia  siamea Lam.)  yang  mempunyai aktivitas  antibakteri  terhadap Staphylococcus epidermidis adalah fraksi etil asetat. Metabolit sekunder yang berperan di dalam fraksi aktif berdasarkan hasil KLT-bioautografinya adalah fenolik dan alkaloid.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  dibiayai  oleh  Universitas Muhammadiyah  Surakarta  melalui  Hibah Integrasi Tridharma (HIT) tahun 2022.

## Daftar Pustaka
Andayani, S., Suprastyani, H., &  Leyana, M. (2021). Uji Daya Hambat Ekstrak Kasar Daun Johar  (Cassia  siamea  L.)  terhadap  Bakteri  Pseudomonas  aeruginosa  secara  In  Vitro. Journal of Fisheries and
Marine
Research, 5(1), 8–14. https://doi.org/10.21776/ub.jfmr.2021.005.01.2
Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M., & Supuran, C. T. (2021). Natural Products in
Gambar 2.  Hasil uji bioautografi fraksi etil asetat (A) dan kontrol negatif (B)
Drug  Discovery:  Advances  and  Opportunities.  Springer  Nature  Limited  2021. https://doi.org/10.1038/s41573-020-00114-z
Bagul,  U.  S.,  &  Sivakumar,  S.  M.  (2016).  Antibiotic  Susceptibility  Testing:  a  Review  on Current Practices.
International
Journal of Pharmacy, 6(3), 11–17. http://www.pharmascholars.com
Balouiri,  M.,  Sadiki,  M.,  &  Ibnsouda,  S.  K.  (2016).  Methods  for  In  Vitro  Evaluating Antimicrobial  Activity :  A  Review.  Journal  of  Pharmaceutical  Analysis,  6(2),  71–79. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2015.11.005
Compean,  K.  L.,  &  Ynalves,  R.  A.  (2014).  Antimicrobial  Activity  of  Plant  Secondary Metabolites: A Review. Academic Journals Inc, 8(5), 2014–2213. https://doi.org/10.3923/rjmp.2014.2014.213
Daeli, I.O., & Ridho, R. (2023). Formulasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Krim Ekstrak Daun Johar  (Cassia  siamea  L.)  terhadap  Staphylococcus  aureus.  Jurnal  Farmasi  dan Farmakoinformatika, 1(2), 88-103. http://dx.doi.org/10.35760/jff.2023.v1i2.8967
de  Brito,  R.  C.,  da  Silva,  G.  N.,  Farias,  T.  C.,  Ferreira,  P.  B.,  &  Ferreira,  S.  B.  (2017). Standardization of the Safety Level of the Use of DMSO in Viability Assays in Bacterial Cells. MOL2NET, 1–6. https://doi.org/10.3390/mol2net-03-04980
Ergina, S. N., & Pursitasari, I. D. (2014). Uji Kualitatif Senyawa Metabolit Sekunder pada Daun Palado  (Agave  angustifolia)  yang  Diekstraksi  dengan  Pelarut  Air  dan  Etanol.  Jurnal Akademika
Kimia, 3(3), 165–172.
http://jurnal.untad.ac.id/jurnal/index.php/JAK/article/view/7797
Fahmi,  I.,  Nurrokhman,  &  Mustafa,  M.  (2014).  Pola  Kepekaan  Staphylococcus  Epidermidis terhadap Beberapa Golongan Antibiotik di RSUP Dr. Soeradji Tirtonegoro Klaten Tahun 2012-2013. Skripsi, Universitas Gadjah Mada.
Fitriah, Mappiratu, & Prismawiryanti. (2017). Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Tanaman Johar  (Cassia  siamea  Lamk.)  dari  Berbagai  Tingkat  Kepolaran  Pelarut.  Kovalen,  3(3), 242–251. http://jurnal.untad.ac.id/jurnal/index.php/kovalen/article/view/9333
Ibrahim,  H.  A.-H.  (2018).  Introductory  Chapter :  Fractionation.  Intech  Open,  1–12. https://doi.org/10.5772/intechopen.78050
Indriyani, T., & Wulandari, Y. (2015). IbM Pengolahan Daun Johar. Seminar Nasional Sains Dan Teknologi Terapan III 2015, 361–368. http://jurnal.itats.ac.id/wp- content/uploads/2015/10/11.-TUTUK2_IbM_edited.pdf
Kamagate,  M.,  Koffi,  C.,  Kouame,  N.M.,  Akoubet,  A.,  Yao,  N.A.R.,  &  Die-Kakou,  H.M. (2014). Ethnobotany, Phytochemistry, Pharmacology and Toxicology  Profiles of Cassia siamea Lam. The Journal of Phytopharmacology, 3(1), 57-76. https://phytopharmajournal.com/articles/details/436
Kumar, D., Jain, A., & Verma, A. (2017). Phytochemical and Pharmacological Investigation of Cassia  Siamea  Lamk :  An  Insight.  The  Natural  Products  Journal,  7(1),  1–11. https://doi.org/10.2174/2210315507666170509125800
Laksmi,  R.,  &  Hidayati.  (2014).  Budidaya  Johar  (Cassia  seamea)  Untuk  Antisipasi  Kondisi Kering. IPB Press, Bandung.
Leber, A. L. (2016). Clinical Microbiology Procedures Handbook, Volume 1‐3, 4th Edition. In Clinical  Microbiology  Procedures  Handbook.  American  Society  for  Microbiology.
https://doi.org/10.1128/9781555818814.ch5.20.1
Liofilchem. (2005). Mannitol Salt Agar ( MSA-D ). Culture, 1–3.
Mardiastuti,  Sjatha,  F.,  Kusumaningrum,  A.,  &  Rozaliyani,  A.  (2021).  MIMS  Mikrobiologi Medis. Edisi ke-6. Elsevier, Singapore.
Marliana, S. D., Suryanti, V., & Suyono. (2005). Skrining Fitokimia dan Analisis Kromatografi Lapis  Tipis  Komponen  Kimia  Buah  Labu  Siam  (Sechium  edule  Jacq.  Swartz.)  dalam Ekstrak Etanol. Biofarmasi, 3(1), 26–31. https://doi.org/10.13057/biofar/f030106
Munawaroh, R., Siswadi, Setyowati, E.P., Murwanti, R. & Hertiani, T. (2018). Korelasi Antara Kadar  Flavonoid  Total  dan  Aktivitas  Fagositosis  Makrofag  Fraksi-Fraksi  dari  Ekstrak Etanol  Kulit Batang Faloak (Sterculia quadrifida R. Br.) secara In Vitro.  Trad. Med. J., 23(1), 47-55. https://doi.org/10.22146/mot.30882
Ningtyas,  R.  (2023).  Teknik  Dasar  dalam  Mikrobiologi.  dalam  Fadhila,  F.  Pengantar Mikrobiologi. Sada Kurnia Pustaka, Banten.
Oyebade,  K.  F.,  Daspan,  A.  J.,  Denkok,  Y.,  Alemika,  T.  E.,  &  Ojerinde,  O.  S.  (2021). Antimicrobial,  Antioxidant,  and  Antiproliferative  Properties  of  the  Leaves  of  Senna siamea.  Journal  of  Complementary  and  Alternative  Medical  Research,  14(1),  22–29. https://doi.org/10.9734/JOCAMR/2021/v14i130235
Rubiyanto,  D.  (2017).  Metode  Kromatografi:  Prinsip  Dasar,  Praktikum,  dan  Pendekatan Pembelajaran Kromatografi. Deepublish, Yogyakarta.
Saifudin, A. (2014). Senyawa Alam Metabolit Sekunder. Deepublish, Yogyakarta.
Sari, M., (2019). Gambaran Umum Infeksi Bakteri di Kulit, dalam Hidayati, A.N., Damayanti, Sari,  M.,  Alinda,  M.D.,  Reza,  N.R.,  Anggraeni,  S.,  &  Widia,  Y.  Seri  Dermatologi  dan Venerologi: Infeksi Bakteri di Kulit. Airlangga University Press, Surabaya.
Scalbert, A. (1991). Antimicrobial Properties of Tannins. Phytochemistry, 30(12), 3875–3883. https://doi.org/10.1016/0031-9422(91)83426-L
Siadi, K. (2012). Ekstrak Bungkil Biji Jarak Pagar (Jatropha curcas) sebagai Biopestisida yang Efektif  dengan  Penambahan  Larutan  NaCl.  Jurnal  MIPA  Unnes,  35(1),  77–83. https://doi.org/10.15294/ijmns.v35i1.2099
Smith,  A.  C.,  &  Hussey,  M.  A.  (2005).  Gram  Stain  Protocols.  American  Society  for Microbiology,  1(September  2005),  14.  https://asm.org/getattachment/5c95a063-326b- 4b2f-98ce-001de9a5ece3/gram-stain-protocol-2886.pdf
Spangenberg, B., Poole, C. F., & Weins, C. (2011). Quantitative Thin-layer Chromatography. In Quantitative Thin-Layer Chromatography (pp. 277–288). https://doi.org/10.1007/978- 3-642-10729-0
Suhendi, A., Hanwar, D., Santoso, B., Wicaksono, A.N., & Widiana, L. (2018). Antioxidant Activity of Non polar and Semipolar Fractions of Ethanol Extract of Zingiber zerumbet Smith  Leaves  by  Spectrophotometer  and  ELISA  Reader.  Journal  of  Pharmaceutical Sciences and Research, 10(3), 439-441.
Wang,  M.,  Zhang,  Y.,  Wang,  R.,  Wang,  Z.,  Yang,  B.,  &  Kuang,  H.  (2021).  An  Evolving Technology  That  Integrates  Classical  Methods  Chromatography  Bioautography. Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 26, 1–21.
https://doi.org/10.3390/molecules26154647
Yan, Y., Li, X., Zhang, C., Lv, L., Gao, B., & Li, M. (2021). Research Progress on Antibacterial Activities and Mechanisms of Natural Alkaloids: A Review. Antibiotics, 10(318), 1–30. https://doi.org/10.3390/antibiotics10030318
Zada,  A.A.S., & Febriawan, R. (2021). Perbedaan Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Metode Well Diffusion dan Kirby bauer Terhadap Pertumbuhan Bakteri. Jurnal Medika Hutama, 2(04), 1156–1161. https://jurnalmedikahutama.com/index.php/JMH/article/view/241
Zhou,  X.,  &  Li,  Y.  (2015).  Supragingival  Microbes.  Atlas  of  Oral  Microbiology,  41–65. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-802234-4.00003-3