p-ISSN 2550-1232
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.4.176 e - ISSN 2550-0929

## Histopatologi dan Ekspresi TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α) Terhadap Kerusakan Hati akibat Invasi Parasit pada Ikan Kembung (Rastrelliger brachysoma)
Histopathology and TNF-α ( Tumor Necrosis Factor-α ) Expression Against Liver Damage due to Parasite Invasion in Mackerel ( Rastrelliger brachysoma )
Allyes Amarens P. Lekatompessy 1 *, Shelly M. Pattipeiluhu 2 , Bethsy J. Pattiasina 2
1 Mahasiswa Program Studi Magister Ilmu Kelautan, Pascasarjana Universitas Pattimura , Maluku Ambon, 97114, Indonesia
2 Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Pattimura Ambon, 97233, Indonesia
*Korespondensi: lekatompessyallyes45@gmail.com

## ABSTRAK
Ikan  kembung ( Rastrelliger  brachysoma ) merupakan salah  satu jenis ikan  pelagis kecil yang hidup di pesisir dan lepas pantai yang sering terinfeksi parasit. Penelitian ini bertujuan  untuk  mengidentifikasi  endoparasit  pada  ikan  dan  pengaruh  invasi  pada jaringan hati ikan melalui teknik imunohistokimia. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat parasit yang menyerang hati ikan, antara  lain Contracaecum sp dan Henneguya sp. Gambaran histopatologi jaringan hati menunjukkan beberapa infiltrasi sel, degenerasi sel dan nekrosis. Ekspresi TNF-α yang positif hampir semua jaringan hati ikan terinfeksi dan menyebabkan kerusakan pada ikan secara spesifik.
Kata kunci : endoparasit; histopatologi; ekspresi TNF-α;  imunohistokimia; hati

## ABSTRACT
Mackerel  ( Rastrelliger brachysoma )  is  a  type  of  small  pelagic  fish  lives  on  the coast  and  offshore  that  common  infected  by  parasites.  This  study  aims  to  identify endoparasits  in  fish  and  the  effect  of  the  invasion  on  fish  liver  tissue  through immunohistochemistry  technique.  The  results  indicate  that  there  were  parasitic  agents attack fish livers, including Contracaecum sp and Henneguya sp. The histopathology of liver  tissue  shows  some  cells  infiltration,  cells  degeneration  and  necrosis.  The  TNF-α expression were positive that was almost all tissue of fish liver infected and cause damage to fish specifically.
Keywords :  endoparasit, histopathology, TNF-α expression, immunohistochemistry, liver

## PENDAHULUAN
Ikan  kembung  adalah  salah  satu jenis  ikan  pelagis  kecil  yang  dapat ditemukan di pesisir pantai maupun lepas pantai  dengan  kedalaman  10-50  meter. Ikan  ini  dapat  ukuran  panjang  mencapai 100 cm dan penyebarannya sangat luas di bagian  tengah  Indo-Pasifik  (Peristiwady,
2006). Ikan kembung mudah didapat dan banyak  dikonsumsikan  oleh  masyarakat karena memiliki kandungan protein yang tinggi  dan  rendah  lemak  (Yulvizar, 2013). Setiap perairan memiliki karakteristik fisik kimiawi yang berbeda- beda  sehingga  dapat  mempengaruhi respon  sumber  daya  perairan  terhadap
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.4.176
kondisi  penyebaran  ikan.  Salah  satunya yang  menjadi  indikator  aspek  biologi terhadap  ikan  yaitu  parasit  (Williams dkk,  1992).  Parasit  adalah  organisme yang  hidup  pada  organisme  lain  dan memperoleh  keuntungan  dengan  cara melakukan  simbiosis  serta  membawa dampak  negatif  baik  secara  langsung maupun  tidak  langsung  terhadap  inang. Parasit  banyak  terdapat  pada  ikan  dan beberapa  diantaranya  bersifat  patogen bagi  manusia.  Diba  dan  Rahman  (2018) menjelaskan  bahwa  ikan  yang  terinfeksi parasit  tidak  menyebabkan  kematian tetapi pertumbuhannya terhambat, fekunditas inang menurun dan menyebabkan  kerusakan  pada  jaringan organ tubuh inang. Rastrelliger brachysoma merupakan  salah  satu  ikan  yang  telah dilaporkan terkena parasit seperti Nematoda,  Capilarrid,  Branchiura  dan Nerocila  (Diba  dan  Rahman,  2018). Pemeriksaan  inang  secara  histopatologi dan  menggunakan  metode  imunohisto- kimia  merupakan  salah  satu  cara  untuk mendukung  diagnosis  secara  spesifik terhadap  suatu  penyakit.  Infeksi  parasit tidak  menunjukan  adanya  gejala  klinis sehingga  harus  dilakukan  pembedahan dan  pengamatan  terhadap  organ  yang ditargetkan.
Selain itu menurut Andriyanto, dkk., (2009) metode
imunohistokimia  memiliki  sensitifitas yang  tinggi  dan  cepat  sehingga  mampu mendeteksi  antigen  pada  jaringan  yang diperiksa  dengan  menggunakan  antibodi yang  spesifik  sehingga  terjadi  ikatan antara  antigen-antibodi  kemudian  dapat diamati menggunakan mikroskop.
Baratawidjaja  (2014)  menjelaskan bahwa  TNF-α  adalah  protein  yang dihasilkan oleh leukosit dalam merangsang  dang  mengaktifkan  system imun  terhadap  respon  inflamasi,  yang patogen  dalam  keadaan  normal  akan memicu  reaksi  system  imun  secara spesifik maupun nonspesifik.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  kerusakan  jaringan  hati  ikan Rastrelliger  brachysoma yang  terinvansi endoparasit dan ekspresi TNF-α terhadap kerusakan jaringan.

## METODE PENELITIAN

## Bahan
Bahan-bahan yang digunakan
dalam  penelitian  ini  antara  lain:    sampel ikan  kembung  sebanyak  24  ekor,  larutan NaCl, formalin, xylol, alkohol bertingkat (75%,  85%  dan  absolut),  hematoxilin euosin  dan  diaminobenzidine  untuk pewarnaan imunohistokimia.

## Alat
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  antara  lain:  pisau  bedah, gunting,  mikroskop  elektron,  timbangan digital analitik, cawan petri, kertas, label, slade kosong, cover glass dan tissue, dan zymed invitrogen kit Cat 95-9643.

## Metode Histopatologi dan Imunohisto- kimia
Organ hati diambil dan dibersihkan dari  darah  yang  menempel,  kemudian difiksasi dengan formalin 10% selama 24 jam.  Proses  dehidrasi  menggunakan alkohol bertingkat (70%, 80%, 90%) dan alkohol absolut yang bertujuan menghilangkan kadar air dalam jaringan. Semua  organ  yang  sudah  difiksasi kemudian  diproses  untuk  pembuatan histopatologi dengan menggunakan prosedur  pewarnaan  imunohistokimia. Proses  pengerjaan  pewarnaan  imuno- histokimia  diantaranya  deparafinisasi, digesti  proteolitik,  staining  protocol, countertain  dan  mounting.  Total  ikan  24 ekor  diambil  3  slide  untuk  pewarnaan hematoxilin  euosin  dan  3  slide  untuk pewarnaan imunohistokimia dengan menggunakan antibodi.
Preparasi  slide  menggunakan  cara Andriyanto (2009), untuk uji imunohisto- kimia  mulai  dari  deparafinisasi  sampai redehidrasi.  Jaringan  organ  preparat histologi  direaksikan  dengan  antibodi primer  selama  30-60  menit.  Apabila reaksi  positif  maka  akan  ditunjukan dengan  warna  coklat  pada  jaringan dengan  sistem  komplek  imunohistokimia yang  berasal  dari Kit  Zymed  Invitrogen .
p-ISSN 2550-1232
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.4.176 e - ISSN 2550-0929
Semua  prosedur  dari  imunohistokimia dilakukan sesuai dengan petunjuk dari kit zymed  invitrogen yang  dipergunakan. Preparat  yang  telah  diwarnai  dengan hematoxilin  eosin  dijadikan counter stain .  Setelah  preparat  sudah  melalui proses  dehidrasi  hingga  penjernihan maka  preparat  siap  diamati  dibawah mikroskop.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebagian  besar  parasit    memerlukan inang sebagai habitat sekaligus melengkapi siklus hidupnya. Ikan menjadi  salah  satu  habitat  dari  berbagai jenis parasit, yang menyebabkan gangguan  kesehatan  dan  kematian    ikan. Banyak jenis parasit yang tidak menyebabkan  kematian  terhadap  ikan namun  tampilan  ikan  jelas  terlihat  ada perubahan (Hilal, 2016). Dalam penelitian  ini  ditemukan  dua  jenis endoparasit C ontracaecum sp dan Henneguya sp  yang hidup organ usus.

## Contracaecum sp
Parasit  ini  (Gambar  1)  termasuk dalam  salah  satu  anisakiasis  yang menginfeksi  ikan.  Larva  parasit  ini biasanya  terdapat  dalam  rongga  tubuh dan  metasenterium.  Terjadi  pengikisan pada  mukosa  dan  tingkat  keparahannya tergantung  dari  jumlah  cacing  yang menyerang  organ  pada  inang.  Cacing akan  membuat  lubang  pada  mukosa  di dalam  organ  inang.  Nurcahyo  (2014) menjelaskan bahwa Contracaecum spiculigerum adalah  salah  satu  parasit yang  juga  ditemukan  pada  bebek,  angsa dan  jenis  burung  lain  yang  hidup disekitar perairan. Cacing jantan
berukuran  32-45  mm  dan  cacing  betina berukuran  24-64  mm.  Biasanya  dalam siklus  hidup  cacing  ini,  telur  akan dilepaskan  ke  perairan  melalui  kotoran burung  dan  akan  berkembang  menjdai larva  kemudian  menginfeksi Copepoda cyclopoid, dimakan oleh ikan maka larva yang  ada  di  dalamnya  berkembang  biak dan  kemungkinan  akan  menempel  pada organ inang. Inang yang terinfeksi cacing
tersebut  akan  menjadi  habitat bagi cacing  tersebut  dan  siklus  hidupnya lengkap.
Gambar 1. Contracaecum sp

## Henneguya sp
Henneguya sp (Gambar 2) merupakan parasit yang bentuknya langsing,  fusiform,  anterior  sporanya berbentuk  tumpul  dan  akan  membesar pada  bagian  posterior.  Ukuran  panjang parasit  ini  berkisaran  dari  10,6-12,6  μm, lebar  parasit  2,8-3,9  μm  dan  ketebalan mencapai  3,4  μm.  Siklus  hidup  dari parasit  ini  diduga  secara  aseksual  dan seksual.  Stadium  infeksi  dari  parasit  ini berupa  spora yang berfungsi sebagai alat untuk menyebarkan parasit. Setelah inang mati maka parasit akan keluar dari tubuh inang dan menginfeksi ikan yang lainnya. Spora  akan  menulari  inang  lainnya dengan menggunakan mekanisme
transmisi.  Spora  akan  tumbuh  menjadi kista  dan  menghasilkan  ribuan  spora  di dalam  tubuh  inang.  Menurut  Nurcahyo
(2014), p arasit ini merupakan organisme  dari  bivalvulida  jenis protozoa  yang  tergolong  dalam: Filum:  myxozoa,  Kelas:  myxosporea,
Ordo: bivalvulida, Sub Ordo: Platysporina,  Family:  Mxyobolidae, Genus: Henneguya
Pada  dasarnya  infeksi  parasit terhadap organ ikan menimbulkan kerugian.  Scholz  (1999)  menjelaskan bahwa  infeksi  menjadi  salah  satu  faktor predisposisi  terhadap  infeksi  yang  lebih berbahaya dari patogen. Menurut Hartono. dkk (2021), ikan yang mengalami serangan penyakit disebabkan karena  adanya  interaksi  antara  inang, patogen dan lingkungan.
40x10 0,5 mm
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.4.176

## Gambar 2. Henneguya sp
Degenerasi  sel  ditandai  dengan adanya  inti  sel  yang  mulai  mengecil, warnanya lebih pekat dan pada sitoplasma  terdapat  vakuola  yang  di dalamnya berisi  lemak. Degenerasi terjadi  akibat  adanya  lemak  yang  tidak dikeluarkan  dari  sel.  Penumpukan  lemak terjadi  karena  sel  mengalami  defisiensi oksigen  dan  zat  makanan  sehingga mengganggu  proses  terbentuknya  energi dan sel tidak mampu membentuk protein. Menurut  Sari,  dkk  (2016)  degenerasi  sel dapat  dilihat  secara  mikroskopis,  ada vakuola  yang  berisi  lemak  di  dalam sitoplasma  hati,  sesuai  dengan  hasil penelitian ini (Gambar 3).
Gambar 3. Degenerasi sel (A), Nekrosis (B)
Nekrosis merupakan tahap lanjutan dari  degenerasi  sel  yang  ditandai  dengan adanya struktur jaringan yang hilang dan daerah  nekrosisnya  mengalami  bintik pendarahan.  Dengan  adanya  nekrosis maka  terjadi  peradangan  pada  jaringan yang  masih  hidup.  Peradangan  ditandai
dengan  jendolan-jendolan  darah  dan jaringan yang berwarna merah disebabkan  karena  eritrosit  keluar  dari pembuluh darah. Tujuan dari peradangan ini  untuk  memulihkan  jaringan  dan menekan  agen  penyebab  nekrosis.  Sel yang  mengalami  nekrosis  tidak  mampu diasorbsi oleh sel fagosit sehingga unsur- unsur  dalam  sel  mudah  terlarut  dan mengeluarkan enzim litik. Setyowati, dkk (2011)  menjelaskan  bahwa  histopatologi hati  ikan  berbeda  dengan  mamalia disebabkan karena sinusoid yang menyebar  berjumlah  sedikit  dan  dibatasi oleh sel endotelial sehingga penyebarannya tidak terjadi secara merata.
Dasar  dari  uji  imunohistokimia adalah  menunjukan  adanya  antigen dalam  suatu  jaringan  oleh  antibodi  yang spesifik.  Ketika  antibodi  dan  antigen mengalami  pengikatan  maka  terjadi sebuah  reaksi  warna  dari  histokimia. Metode  imunohistokimia  menambahkan Diaminobenzidine
(DAB) untuk memperlihatkan  adanya  ikatan  tersebut. Jika  reaksi  TNF-α (Tumor  Necrosis Factor-α) positif  dapat  ditandai  dengan adanya  warna  coklat  pada  jaringan histopatologi. Hasil pengamatan mikroskop terhadap jaringan histopatologi  yang  mengalami  ekspresi TNF-α dapat dilihat pada Gambar 4. Deteksi antigen parasit pada organ hati  terlihat  pada  sel-sel  makrofag. Gambaran  mikroskopik  hasil  penelitian menunjukan  bahwa  reaksi  yang  spesifik terjadi  dalam  sel  antara  antibodi  yang digunakan  dengan  antigen  parasit.  Dari penelitian ini membuktikan bahwa ekspresi  TNF-α  dengan  menggunakan teknik  imunohistokimia  pada  jaringan histopatologi hati hasilnya adalah positif,
sehingga hampir semua jaringan hati ikan mengalami  infeksi.  Jadi  semakin  banyak warna  coklat  pada  jaringan  histopatologi hati berarti semakin meningkatnya infeksi parasit terhadap jaringan tersebut. 40x10 0,5 mm
A B
p-ISSN 2550-1232
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.4.176 e - ISSN 2550-0929
Gambar 4.  Hati mengalami tiga kerusakan  yaitu  infiltrasi  sel radang  (A),  vakuolisasi  dan melanomakrofag  (B).  Perbe- saran 40x10. Organ Target Histopato- logi Reaksi Imunohisto- kimia Hati Infiltrasi sel            Positif (+) Degenerasi             Positif (+) Nekrosis                 Positif (+) Dalam penelitian ini terlihat bahwa keadaan jaringan yang mengalami histopatologi dan dipengaruhi oleh ekspresi  TNF-α  adalah  jaringan  yang banyak  mengalami  beberapa  gangguan misalnya infiltrasi sel  radang,  degenerasi sel  dan  nekrosis.  Akibat  gangguan kerusakan itu maka ekspresi TNF-α dapat berpengaruh  terhadap  jaringan  yang rusak.  Pewarnaan  hematoxilin  dan  eosin juga  berfokus  pada  sel  yang  mengalami peradangan berupa nekrosis sel-sel hepatosit  yang  ditandai  dengan  warna merah  pekat.  Sedangkan  pewarnaan imunohistokimia  berfokus  pada  reaksi antara  antigen  dan  antibodi  sehingga  sel mengalami  peradangan  yang  ditandai dengan  warna  coklat.  Nasution  dkk,
(2015) juga menjelaskan bahwa tidak ada perubahan patognomik secara histopatologi dengan penggunangan pewarnaan  HE  maka  perlu  dilakukan  uji yang  benar-benar  menunjukan  adanya agen  parasit  pada  organ  target  dengan menggunakan  teknik  imunohistokimia. Dalam  penelitian  ini  tidak  dilakukan kuantifikasi kerusakan hati, baik pewarnaan  HE  dan  IHK.  Hal  ini  dapat dilakukan  pada  penelitian  selanjutnya tingkat  kerusakan  hati  akibat  invasi parasit.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  maka dapat  disimpulkan  bahwa  kehadiran parasit dapat dideteksi dengan menggunakan metode histopatologi dengan menggunakan teknik imunohistokimia  yang  dapat  digunakan untuk  mengetahui  kerusakan  jaringan hati  ikan Rastrelliger  brachysoma yang terinvasi endoparasit dan ekspresi TNF-α terhadap kerusakan jaringan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada April Molle (Mahasiswa Magister Biologi, Universitas  Brawijaya)  dalam  proses analisa sampel di laboratorium.

## DAFTAR PUSTAKA
Andriyanto,  S.,  Haririah.,  Yulianti, Y., Purnomo, S.H.I., Astuti, S. T.,  Nurlaila.,  Samudro,  T.,
Priosoeryanto,  B.P.  (2009). Deteksi  Edwardsiella  tarda Secara  Imunohistokimia  Pada Ikan Patin (Pangasius pangasius).Fakultas Kedokteran.  Institut  Pertanin Bogor. Jawa Barat. Baratawidjaja , K. G. (2014). Imunologi Dasar: Sitokin. Balai Penerbit FK-UI. Jakarta. Diba,  D.  W.  dan    Rahman,  W.  E. (2018). Gambaran Histopatologi  Hati,  Lambung Dan  Usus  Ikan  (Katsuwonus A B
40x10 40x10
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.4.176
pelamis) Yang Terinfeksi Cacing Endoparasit. Universitas  Indonesia  Timur  , Makassar. Hartono,  P.,  Dewi,  J.,Tusihadi,  T. 2021. Penyakit Pada Budidaya Ikan  Kerapu.  Balai  Budidaya Laut Lampung. Bandar Lampung. Hilal.  (2016).  Parasitologi  Ikan: Biologi, Identifikasi dan Pengendaliannya. Yogyakarta. Nasution, S.  S.,  Setiyono,  A., Handharyani, E. (2015). Deteksi Imunohistokimia Antigen Coxiella burneti Sebagai  Penyebab  Q  Fever Pada  Sapi.  Institut  Pertanian Bogor. Bogor.
Nurcahyo,  W.  (2014).  Parasit  Pada Ikan. Universitas Gajah Mada. Yogyakarta.
Palm, H. W., Theisen, S,. Pikalov, E. Kleinertz.,S. (2018). Manipulation of Fish Phenotype  by  Parasits.  Jurnal Elsevier. University of Rostock. Germany. Peristiwady,  T.  (2006).  Ikan-ikan Laut  Ekonomis  Penting  di Indonesia. Petunjuk Identifikasi. LIPI Press Jakarta. Sari,  A.  H.  W.  dan  Perwira,  I.  M. (2019). Biomarker Histopatologi Hati Ikan Belanak  (Mungil  cephalus) Sebagai Peringatan Dini Toksisitas  Kromium  (Cr)  Di Muara Tukad, Bali. Universitas Udayana. Bali. Scholz, T. 1999. Parasites in Cultured and  Feral  Fish.  Veterinary Parasitology 84, 317-335.
Setyowati,  A.,  Hidayati,  D.,  Awik.,
Abdulgani,  N.  (2011).  Studi Histopatologi Hati Ikan Belanak  (Mugil  cephalus)  Di
Muara  Sungai  Aloo  Siduarjo. Fakultas MIPA. Institut Teknologi Sepuluh November. Surabaya. Williams,  H.H.,  MacKenzie,  K., McCarthy, A.M. (1992). Prasites As Biological Indicators  Of  The  Popilation Biology,  Migrations,  Diet, And  Phylogenetics  Of  Fish. Rev. Fish. Biol. 2, 144-176 Yulvizar. (2013). Isolasi dan Identifikasi  Probiotik  Pada Rastrelliger  sp.  Universitas
Syiah Kuala. Indonesia.