## Motif Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Gen Phytoene Synthase (PSY) Penyandi Karotenoid Ubi Kayu Berumbi Kuning
The Polymorphic Gene of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of Phytoene Synthase (PSY) to Characterize Carotenoids Yellow Root Cassava
Siti Kurniawati *) , N.Sri Hartati, Hartati, Enny Sudarmonowati Pusat Penelitian Bioteknologi – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor Indonesia
* E-mail: kurniawatie@gmail.com

## ABSTRACT
Cassava  (Manihot  esculenta Crantz.)  is  a  carbohydrate  sources containing  a  limited  amount  of micronutrients, but some genotypes contain β -carotene as the precursor of vitamin A in the storage roots  and  leaves.  Improvement  of  β -caroteneand  minerals such  as  Fe  /  Zn  content  of  cassava’s nutrition is mostly through by biofortification program. The storage root of β -carotene recognized by  a  yellow  or  yellowish  color  while  the  apical  shoots  with  red  to  purplish.  β -carotenein carotenoid  biosynthetic  pathway  is  an  expression  of  the  phytoene  synthase  (PSY)  gene.  The MePSY2 gene, one of the three MePSY family is the key gene to characterize carotenoids related gene in cassava. In this  study, sequencing of the two cassava fulllenght PSY  genomic DNA  was carried out  in  conserved  areas  in  the  PSY  gene  region  (PSY1  and  PSY2)  from  the  DNA  of  the cassava leaves. Adira1, Carvita25 and Ubi Kuning are yellow root storage genotypes (K1, K2 and K3)  while  Adira4 and Menti  are  white root storage genotypes (P1 and P2). Carvita25 is induced somaclonal  variant  of  the  Adira4  genotype.  Contiq  and  consensus  of  nucleotide  base  sequences from  the  five  cassava  genotypes  and  CM3306-4  cultivars  (acc  GU111715.1)  as  references  were analysed using the lasergene DNASTAR sequence analysis program. The results of the alignment of the base sequence constituent of the MePSY2 gene showed that the PSY2 gene with amplified genome length was 2,380 base pairs (bp) consisting of 1,140 bp exon region and 1,240 bp intron region. In the conserved coding region, there was a difference of one nucleotide base, that is, base C in two white tuber cassava genotypes replaced with A in three yellow tuber cassava genotypes in the 1.485 base (C 1.485 A). The SNP converts the amino acid (aa) alanine (A) to aspartic acid (D) at the  191th  (A 191 D).  Single  Nucleotide  polymorphism  in  conserved  coding  region  can  be  used further as carotenoid marker for plant breeding of  yellow root cassava.
Keywords: β carotene, PSY gene, polymorphic gene SNP, yellow root cassava .

## PENDAHULUAN
Karotenoid  merupakan  pigmen  warna  yang sangat  penting  peranannya  pada  tanaman  dan hewan  termasuk  manusia  (Eldahshan  & Singab,  2013).  Karotenoid  diproduksi  oleh sebagian besar organisme berfotosintesis (Wong et  al.,  2004),  yang  berperan  dalam photoreception dan  fotoproteksi  (Giuliano, 2014).  Pada  tanaman,  karotenoid  berfungsi sebagai prekursor dua fitohormon penting yaitu asam  absisat  (ABA)  dan strigolactone yang merupakan
regulator
utama pada perkembangan  dan  respon  terhadap  cekaman (Yuan et  al.,  2015),  pewarna,  prekursor molekul  volatile  pada  tanaman  isoprenoid, antioksidan dan prekursor vitamin A (Giuliono, 2014).  Beberapa  tahun  terakhir,  karotenoid banyak  dimanfaatkan  untuk  kesehatan  karena aktivitas  antioksidan  yang  tinggi,  dan  secara intensif  digunakan  dalam  dunia  industri makanan, farmasi dan nutraceutical
(Sankari et  al.,  2018).  Karotenoid  bermanfaat bagi  kesehatan  manusia  diantaranya  mencegah degenerasi  makula,  beberapa  jenis  kanker tertentu  dan  berbagai  gangguan  terkait  usia (Fraser &  Bramley 2004;  Singh &  Goyal 2008).
Phytoene synthase (PSY) merupakan enzim utama  yang  mengatur  pada  awal  jalur biosintesis  karotenoid  sehingga  signifikan mempengaruhi jumlah karotenoid yang dihasilkan (Sugiyama et al., 2017), dikode oleh tiga  gen,  dua  diantaranya  (PSY1  dan  PSY2) menunjukkan  ekspresi  di  banyak  jaringan sedangkan  PSY3  sangat  rendah  dan  terbatas hanya pada akar (Giuliano, 2014). Flowerika et al.  (2016)  melaporkan  tiga  gen PSY pada tanaman  gandum  (Triticum  aestivum L.) yaitu berdasarkan  analisis  urutan  protein  terdapat conserved  motif terkait  aktivitas  enzim  pada TaPSY1 dan TaPSY3.  Sankari et  al.  (2018) mengulas  aplikasi  rekayasa  genetik  pada  jalur
biosintesis karotenoid dalam upaya peningkatan  kandungannya  sehingga  produksi metabolit  sekunder  dari  pigmen  karotenoid dapat  relevan  secara  industri.  Gen PSY pada ubi  kayu  telah  dipelajari  oleh  Arango et  al., (2010), dan berdasarkan hasil analisis kuantitatif  diperoleh  hasil  bahwa MePSY1 dan MePSY2 terekspresi pada saat induksi cekaman salinitas  dan  kekeringan  selama  12  hari  dan tidak  pada  gen MePSY3,  dimana MePSY2 terekspresi  10  kali  lebih  tinggi  dibandingkan MePSY1 pada umbi.
Single  nucleotide  polymorphism (SNP) adalah  perubahan  dalam  basa  tunggal  pada posisi  tertentu  dalam  genom,  dalam  banyak kasus dengan dua alel atau perbedaan satu basa nukleotida pada gen PSY ubi kayu diekspresikan  bersegrasi  dengan  warna  dan akumulasi  kandungan  beta  karoten  umbi.  SNP tersebut  menyebabkan  perubahan  asam  amino pada  daerah conserve protein  dan  ketika  diuji dalam E.coli menghasilkan peningkatan aktivitas  katalitik  (Welsch et  al.,  2010). Perbandingan  aktivitas  enzim  PSY  terlihat sangat  signifikan  dengan  akumulasi  beta karoten  yang  lebih  efisien  pada  endosperm golden  rice  dan  jagung  (Giuliano,  2014). β - carotene  hydroxylase  (CHY)  dan  lycopene  ε - cyclase  (LCY-e)  juga  merupakan  regulator penting  pada  akumulasi  beta  karoten  dan carotenoid  total. Mutasi  pada  lokus LCY-
emengarahkan
flux menuju
β -branch menyebabkan  peningkatan  kandungan  beta karoten (Harjes et al., 2008).
Ubi kayu (M. esculenta) memiliki kandungan  beta  karoten  pada  beberapa genotipnya yang ditandai dengan warna kuning pada  umbi,  namun  jumlahnya  lebih  sedikit dibandingkan  ubi  kayu  berumbi  putih.  Hasil penelitian Luo et al. (2018), sedikitnya terdapat 84  SNP  dan  694  gen  terdeteksi  berasosiasi dengan  kandungan  karotenoid  pada  ubi  kayu menggunakan genome wide association studies (GWAS), dimana Manes.04G164700 (XanDH) dan  Manes.11G105300  (AAO)  diduga  terkait dalam  jalur  metabolisme  karotenoid  dan  enam genotip yang diuji coba terekspresi. Sedangkan Welsch et  al.  (2010)  menyatakan  bahwa  gen PSY2 antara  ubi  kayu  berumbi  kuning  dan berumbi putih ternyata terdapat perbedaan basa nukleotida (polimorfisme alel) yang berpengaruh  pada  peningkatan  fluks  karbon jalur biosintesis karotenoid sehingga mengarah pada  akumulasi  warna  karotenoid  umbi. Carvita  25  adalah  ubi  kayu  berumbi  kuning
yang  merupakan  varietas  hasil  pemuliaan rekayasa in vitro (friable embryogenic callus/FEC)  berasal  dari  varietas  Adira4  yang berumbi  putih.  Perubahan  warna  umbi  dari putih  menjadi  kuning  diduga  berkaitan  dengan terjadinya  mutasi  pada  runutan  basa  gen penyandi sifat karotenoid yaitu PSY. Berdasarkan  penelitian  Welsch et  al.  (2010), satu  dari  tiga  gen PSY ubi  kayu,  hanya  gen PSY2 yang  memiliki polimorfisme alel dengan perbedaan  pada  dua  basa  nukleotida  sehingga menentukan warna kuning umbi ubi kayu pada silsilah persilangan.
Untuk melihat perubahan pola runutan basa nukloetida  gen PSY, penyandi sifat  karotenoid pada  umbi  Carvita  25  yang  diduga  berkorelasi terhadap  akumulasi  kandungan  beta  karoten umbi,  maka  dilakukan  penyandingan  runutan basa nukleotida gen PSY1 dan gen PSY2 antara Carvita25 dengan  Adira4 sebagai  genotip asal. Genotip Adira1 dan Ubi Kuning yang berumbi kuning serta genotip Menti yang berumbi putih juga  disertakan  sebagai  kontrol  runutan  basa gen PSY untuk ubi kayu jenis lainnya.

## METODE

## Waktu dan Tempat
Penelitian  dilakukan  pada  bulan  Maret  hingga November 2019 di Laboratorium Genetika Molekuler dan Modifikasi Jalur Biosintesa Tanaman,  Pusat  Penelitian  Bioteknologi,  Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Cibinong-Bogor.

## Material Tanaman
Daun ubi kayu diambil dari tanaman ubi kayu  yang tumbuh di kebun koleksi Pusat Penelitian Bioteknologi  LIPI  yaitu  genotip  Adira4  (P1)  dan Menti  (P2)  merupakan  varietas  nasional  dan  lokal berumbi  putih,  serta  Adira1  (K1),  Carvita25  (K2) dan  Ubi  Kuning  (K3)  yang  merupakan  varietas nasional, varian somaklonal dari Adira4 dan genotip lokal (Gambar 1).

## Isolasi Genom DNA Ubi Kayu
DNA  genom  daun  lima  genotip  ubi  kayu  di  isolasi menggunakan  metode  CTAB  (Cetyl  Trimethyl Ammonium  Bromida)  yang  dimodifikasi.  Sebanyak ±  200  mg  sampel daun  ubi  kayu  diekstraksi menggunakan  nitrogen  cair  hingga  menjadi  seperti tepung  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  tabung berisi 1 ml Buffer CTAB + 0.2% β -mercaptoethanol dan  dikocok  hingga  homogen  lalu  diinkubasi  pada suhu  65°C  selama  60  menit.  Campuran  yang dihasilkan  disentrifugasi  dengan  kecepatan  12.000 rpm  selama  10  menit  pada  suhu  4°C.  Supernatan dipindahkan ke dalam tube baru dengan penambahan 600 µl Chloroform Isoamyl Alcohol/CIA  (24:1) yang  dibuat fresh lalu disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10
menit suhu 4°C. Proses ini diulangi sebanyak 3 kali dengan  modifikasi  penambahan  100µl air  bebas nuclease  (nuclease  free  water).  Ethanol  absolut dimasukkan ke dalam supernatan dengan perbandingan  1:1  kemudian  diinkubasi  selama  60 menit  pada  suhu -20°C, kemudian  disentrifugasi dengan  kecepatan  penuh  pada  suhu  4°C  selama  5 menit,  pellet  dibilas  menggunakan  400  µl  Et-OH
80%  dan  disentrifugasi  dengan  kecepatan  penuh selama  8  menit  pada  suhu  4°C.  Pembilasan  diulang dua  kali.  Pellet  yang  dihasilkan  dikeringanginkan pada  suhu  ruang  hingga  kering.  Sebanyak  30-40 µlRNAse free water digunakan sebagai larutan dilusi kemudian  disimpan  pada  suhu -20°C.  gDNA  siap digunakan  setelah  dilakukan  pengujian  secara kualitatif dan kuantitatif.
Adira1 (K1) Adira 4 (P1) Carvita25 (K2) Menti (P2) Ubi Kuning (K3)
Gambar 1. Variasi Fenotipik Warna Umbi Lima Genotip Ubi Kayu Koleksi Puslit Bioteknologi LIPI

## Isolasi Genom DNA Ubi Kayu
DNA  genom  daun  lima  genotip ubi  kayu  di  isolasi menggunakan  metode  CTAB  (Cetyl  Trimethyl Ammonium  Bromida)  yang  dimodifikasi.  Sebanyak ±  200  mg  sampel  daun  ubi  kayu  diekstraksi menggunakan  nitrogen  cair  hingga  menjadi  seperti tepung  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  tabung berisi 1 ml Buf fer CTAB + 0.2% β -mercaptoethanol dan  dikocok  hingga  homogen  lalu  diinkubasi  pada suhu  65°C  selama  60  menit.  Campuran  yang dihasilkan  disentrifugasi  dengan  kecepatan  12.000 rpm  selama  10  menit  pada  suhu  4°C.  Supernatan dipindahkan ke dalam tube baru dengan penambahan 600 µl Chloroform Isoamyl
Alcohol/CIA  (24:1) yang  dibuat fresh lalu disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit suhu 4°C. Proses ini diulangi sebanyak 3 kali dengan  modifikasi  penambahan  100µl air  bebas nuclease  (nuclease  free  water).  Ethanol  absolut dimasukkan ke dalam supernatan dengan perbandingan  1:1  kemudian  diinkubasi  selama  60 menit  pada  suhu -20°C, kemudian  disentrifugasi dengan  kecepatan  penuh  pada  suhu  4°C  selama  5 menit,  pellet  dibilas  menggunakan  400  µl  Et-OH 80%  dan  disentrifugasi  dengan  kecepatan  penuh selama  8  menit  pada  suhu  4°C.  Pembilasan  diulang dua  kali.  Pellet  yang  dihasilkan  dikeringanginkan pada  suhu  ruang  hingga  kering.  Sebanyak  30-40  µl RNAse  free  water digunakan  sebagai  larutan  dilusi kemudian  disimpan  pada suhu -20°C.  gDNA  siap digunakan  setelah  dilakukan  pengujian  secara kualitatif dan kuantitatif.

## Amplifikasi Gen Phytoene Synthase (MePSY)
Amplifikasi  gen  MePSY1 dan  MePSY2 dari  DNA daun  ubi kayu  genotip  Adira1,  Adira4,  Carvita25, Menti  dan  Ubi  Kuning  dilakukan  menggunakan PCR  dengan  masing-masing  sepasang  primer spesifik MePSY1 dan MePSY2 berdasarkan penelitian  Arango et  al.  (2010).  Proses  reaksi  PCR dilakukan  dengan  tahapan  kondisi  yaitu  fase
denaturasi  pada  suhu  95 ° C  selama  1  menit,  diikuti 35  siklus  yang  terdiri  dari  fase  denaturasi  95 ° C selama  15  detik,  penempelan  primer  (annealing) 60 ° C  selama  15  detik,  perpanjangan  (elongation) 72 ° C  selama  3  menit  dan  siklus  terakhir fase elongasi  72 ° C selama  10  menit.  Perunutan  basa nukleotida  penyusun  gen MePSY1 dan MePSY2 dilakukan di 1stBASE Company, Malaysia menggunakan primer forward dan reverse.

## Analisis Runutan Basa Nukleotida/Bioinformatik
Data  hasil  sekuensing  (pembacaan forward dan reverse) dianalisa  tingkat  kemiripannya  (similarity) dengan  data  GenBank  pada  program online BLASTn  (Basic  Local  Alignment  Search  Tools Nucleotide) diakses  melalui NCBI (National Center for  Biotechnology  Information).  Runutan  basa nukloetida  kemudian  diedit  menggunakan BioEdit software (Hall,  1999).  Pasangan  runutan  basa  dari kelima  genotip  ubi  kayu  disejajarakan  beserta runutan  basa  nukleotida  cultivar  CM3306-4  dengan nomor  aksesi  GU111715.1  sebagai  referensi berdasarkan  pengelompokan contiq menggunakan program  analisis  sekuen  DNASTAR  laser  gene  dan dilakukan analisis perbedaan basa nukleotida (SNP). Variabel parameter SNP berupa sites nukleotida dan asam amino serta komposisi basa nukleotida.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kuantifikasi dan Kualifikasi DNA
Kualitas DNA hasil isolasi dilihat menggunakan  elektroforesis  gel  agarose  1% dan diukur kuantitasnya menggunakan spektrofotometer
Nanodrop. Hasil
elektroforegram  menunjukkan  pendaran  pita DNA  yang  baik  yaitu  tajam  dan  utuh sedangkan  konsentrasi  DNA  kelima genotip lebih  dari  1000  ng/μl  dengan  nilai  kemurnian berdasarkan  rasio  absorbansi  pada  panjang
gelombang A260/A280 berada pada kisaran 1.9 (Tabel 1).
Amplifikasi  MePSY  dari  DNA  genom  lima genotip ubi kayu Struktur genom gen target MePSY1 (Manes.02G081700.1.  kromosom  2:  posisi 6091016-6093529) dan MePSY2 (Manes.01G124200.1.  kromosom  1:  posisi 24153420-24156720)  berdasarkan  database
Phytozome (http://www.phytozome.net/cassava.php).  Gen MePSY1 terdiri  dari  1.296  pasang  basa  (pb) pada  6  daerah  ekson,  713  pb  pada  5  daerah intron serta daerah 5’UTR dan 3’UTR masing -
masing  389  pb  dan  116  pb.  Sedangkan  gen MePSY2terdiri  dari  1290  pb  pada  6  daerah ekson  dan  1369  pb  pada  5  daerah  intron  serta daerah  5UTR  dan  3’UTR  masing -masing  489 pb dan 153 pb (Gambar 2).
Ukuran  pita  putative  gen MePSY1 dan MePSY2 yang berhasil teramplifikasi dari DNA genom  menggunakan  primer  spesifik  berturut- turut sekitar 2300 pb dan 2500 pb (Gambar 3).
Ukuran  tersebut  lebih  kecil  dari  struktur genom  gen  target  PSY1  dan  PSY2  yaitu  2514 dan  3301,  hal  tersebut  karena  amplifikasi dimulai  dari open  reading  frame (ORF)  pada daerah coding sequence (cds).
Tabel 1. Hasil pengukuran kuantitas DNA lima genotip ubi kayu
No. Genotip Konsentrasi (ng/μl) Kemurnian (A260/A280) 1. 2. 3. 4. 5. Adira1 Adira4 Carvita25 Menti Ubi Kuning 1141 1189 1932 1214 1039 1.967 1.976 1.995 1.961 1.945
Gambar  2.  Skema  struktur  gen  target MePSY1 (a)  dan MePSY2 (b)  teramplifikasi  menggunakan spesifik primer Fw dan Rv (http://www.phytozome.net/cassava.php)
Gambar 3. Elektroforegram gen MePSY1 (a) dan gen MePSY2(b) pada lima genotip ubi kayu yaitu Adira1 (1); Adira4 (2); Carvita25 (3); Menti (4); dan Ubi Kuning (5)

## Analisis Variasi Basa Nukleotida
Hasil  perunutan  basa  nukleotida  dari  lima genotip  ubi  kayu  menggunakan  primer  F (forward)  dan  R  (reverse)  kemudian  masing- masing  diidentifikasi  menggunakan  program
online BLASTn  NCBI.  Hasil  BLAST  sekuen MePSY1 dan MePSY2 dengan  dua  arah pembacaan dapat dilihat pada Tabel 2. MePSY1 dari  kelima  genotip  ubi  kayu  memiliki  tingkat kemiripan  antara  93-99%  dengan MePSY1 ubi
kayu  yang  telah  terdeposit  pada  database genebank, namun dengan tingkat E-value yang rendah  terutama  genotip  Adira1,  Adira4,  dan Ubi  Kuning.  Sedangkan  MePSY2  kelima genotip  ubi  kayu  memiliki  tingkat  kemiripan antara 94-99% dengan E-value 0.0.

## Variasi  Satu  Basa  Nukleotida  pada  Gen MePSY2
Hasil  penyejajaran full-length sekuen  gen MePSY2 dari  DNA  lima  genotip  ubi  kayu terdiri  dari  ubi  kayu  berumbi  putih  dan berumbi  kuning  menunjukkan  terdapatnya polimorfisme  basa  nukleotida  tunggal  (SNP) pada  beberapa  titik  daerah coding dan non- coding genom.  Terdapat  tujuh  titik  SNP  pada non-coding region (ncSNP)  (Gambar  4)  yang diduga  tidak  berdampak  pada  fenotipik  kelima ubi kayu dan lima titik SNP pada coding region (cSNP)  (Gambar  5)  yang  dapat  menyebabkan
perubahan asam amino dan mengubah transkrip protein. Carvita25 (K2) yang merupakan varian somaklonal dari Adira4 (P1) menunjukkan terjadinya mutasi atau perbedaan satu basa pada basa ke-1.485 (cSNP3) dan basa ke-2.050  (ncSNP7).  Perbedaan  satu  basa  pada coding  region (cSNP3)  ini  terlihat  jelas  antara genotip berumbi putih dan kuning yaitu basa C menjadi A yang mengubah asam amino ke-191 dari Alanin (A) menjadi asam aspartate (D).
Pada  basa  ke-640,  Adira4  dan  Carvita25 memiliki  basa  G  sedangkan  genotip  lain dengan basa A sama dengan cultivar CM3306- 4 sebagai referensi (ncSNP2). Terdapat variasi perbedaan  satu  basa  nukleotida  dari  kelima genotip ubi kayu berumbi putih, kuning beserta kultivar  referensi.  Perbedaan  tampak  pada daerah pengkodean atau daerah bukan pengkodean (Tabel 3).
Tabel 2. Persentase kemiripan (similarity) runutan basa nukleotida penyusun MePSY lima genotip ubi  kayu  dengan  MePSY1 dan  MePSY2 cultivar  CM3306-4  (acc  GU111715.1  dan GU111715.1) pada database NCBI
Genotip Prediksi Alignment ORF Query cover (%) E value Similarity (%) Adira1 Adira4 Carvita25 Menti Ubi Kuning Adira1 Adira4 Carvita25 Menti Ubi Kuning Adira1 Adira4 Carvita25 Menti Ubi Kuning Adira1 Adira4 Carvita25 Menti Ubi Kuning MePSY1, complete cds MePSY1, complete cds
MePSY1, complete cds MePSY1, complete cds MePSY1, complete cds MePSY1, complete cds MePSY1, complete cds MePSY1, complete cds MePSY1, complete cds MePSY1, complete cds
MePSY2, complete cds MePSY2, complete cds MePSY2, complete cds MePSY2, complete cds MePSY2, complete cds MePSY2, complete cds MePSY2, complete cds MePSY2, complete cds MePSY2, complete cds
MePSY2, complete cds Fw Fw Fw Fw Fw Rv Rv Rv Rv Rv Fw Fw Fw Fw Fw Rv Rv Rv Rv Rv - 91 98 98 - 69 91 97 97 6 96 98 84 88 97 98 96 97 96 96 - 2e-48 0.0 0.0 - 2e-108 2e-48 0.0 0.0 1e-08 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - 95 95 99 - 93 95 98 99 96 96 96 99 97 94 97 98 96 97 96
Ket: ( - ) = tidak terdapat kemiripan atau terkontaminasi
Tabel  3.  Variasi  perbedaan  basa  nukleotida  (SNP)  lima  genotip  ubi  kayu  dengan  umbi  berwarna kuning dan putih.
Jenis / Genotip Warna umbi Posisi SNP Coding region cSNP1 1.435 cSNP2 1.462 cSNP3 1.485 cSNP4 1.821 cSNP5 1.857 Adira 1 Kuning A T A G A Carvita 25 Kuning G C A G A Ubi Kuning Kuning G T A G A Adira 4 Putih G T C G A Menti Putih G T C A A CM3306-4 (accGU111715.1) Putih G T C G T Non coding region ncSNP 1 579 ncSNP2 640 ncSNP3 889 ncSNP4 921 ncSNP5 1.696 ncSNP6 1.752 ncSNP7 2.050 Adira 1 Kuning C A T G G T C Carvita 25 Kuning C G T G G T T Ubi Kuning Kuning C A T A G T C Adira 4 Putih C G C G G A C Menti Putih C A T G C T C CM3306-4 (accGU111715.1) Putih G A T G C T C
Gambar 4. Penyejajaran runutan basa nukleotida kelima genotip ubi kayu beserta referensi diluar daerah  pengkodean  (non-coding  region)  menunjukkan  tujuh  titik single  nucleotide polymorphism (SNP).
Gambar  5.  Penyejajaran  runutan  basa  nukleotida  kelima  genotip  ubi  kayu  beserta  referensi  pada daerah  pengkodean  (coding  region)  menunjukkan  lima  titik single  nucleotide polymorphism (SNP).
DNA  genomik  mengandung  berbagai polimorfisme,  seperti  substitusi  nukleotida tunggal,  penyisipan/penghapusan,  dan  motif pengulangan nukleotida. Menurut Wondji et al. (2007),  SNP  dapat  terletak  pada  daerah  non- coding  genom  dan synonymous SNP  (sSNP) pada daerah pengkodean yang tidak berdampak pada  fenotipik  namun  dapat  memberikan penanda sehingga berguna untuk studi genetika populasi,  sedangkan non-synonymous SNP (nsSNP)  mengubah  struktur  dan  urutan  asam amino yang dapat merubah fungsi protein yang disandi  sehingga  dapat  digunakan  sebagai penanda dalam studi asosiasi untuk mendeteksi variasi genetik terkait dengan sifat fenotipik.
SNP  berguna  sebagai  penanda  dalam genetika populasi dan studi evolusi. Tergantung  di  mana  SNP  terjadi,  berpotensi memiliki perbedaan ditingkat fenotipik. SNP di daerah  pengatur  gen  kemungkinan  akan mempengaruhi  risiko  penyakit  umum.  SNP  di wilayah  3 ′ -UTR  dapat  mengubah  stabilitas mRNA dengan mengubah situs pengikatan atau struktur  sekunder,  sehingga  lebih  atau  kurang diduga dapat membuatnya terdegradasi. SNP di wilayah  5  memungkinkan  dapat  mengubah situs  pengikat  dan  dapat  memodifikasi  afinitas faktor  transkripsi.  nsSNP  dapat  menyebabkan terjadinya  kodon  stop  di  awal  sehingga polipeptida  terpotong,  dan  mengakibatkan hilangnya fungsi (Jehan & Lakhanpaul, 2006).

## KESIMPULAN
Hasil  analisa  perunutan  basa  nukleotida penyusun  gen PSY2 lima  genotip  ubi  kayu,
yaitu  tiga  jenis  berumbi  kuning  dan  dua  jenis berumbi  putih,  menunjukan  terdapat  tujuh site SNP  pada  daerah non-coding dan  lima site SNP  pada  daerah  pengkodean  (empat sites ynonymous SNP  (sSNP)  dan  satu site  non- synonymous SNP  (nsSNP).  Satu  nsSNP  pada daerah  pengkodean  memiliki  motif  yang  sama pada  ubi  kayu  berumbi  kuning  yaitu  basa  A sedangkan  ubi  kayu  berumbi  putih  memiliki basa  C  pada  pasa  ke-1.485  sehingga  merubah asam  amino  ke-191  dari  Alanin  (A)  menjadi asam aspartate (D). Carvita25 yang merupakan varian somaklonal, memiliki motif A pada titik nsSNP  yang  berbeda  dari  Adira4  yang memiliki  motif  C  pada  titik  nsSNP.Perbedaan motif nukleotida pada titik nsSNP pada Carvita 25  diduga  berkaitan  dengan  perubah  fenotipik umbi  menjadi  kuning  dari  Adira4  yang berumbi putih.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Dr. Rikno  Harmoko  untuk  diskusi  ilmiahnya,  Dr. Ima  M.  Zainuddin  serta  Muhammad  Usen untuk bantuan teknis di laboratorium. Kegiatan penelitian  ini  merupakan  bagian  dari  kegiatan Insinas Ristek Program Flagship LPNK WBS 1 tahun anggaran 2018.

## DAFTAR PUSTAKA
Arango,  J.,  Wüst,  F.,  Beyer,  P.,  Welsch,  R.
2010. Characterization of Phytoene Synthases From Cassava and Their Involvement  in Abiotic Stress-mediated
Responses. Planta 232: 1251-1262.
Eldahshan,  O.  A,  Singab,  A.  N.  B.  2013.
Carotenoids. Journal  of  Pharmacognosy and Phytochemistry 2 (1): 225-234. Flowerika.,  Alok,  A.,  Kumar,  J.,  Thakur,  N., Pandey,  A.,  Pandey,  A.  K.,  Upadhyay,  S.
K,  Tiwari,  S.  2016.  Characterization  and Expression Analysis  of Phytoene Synthase From Bread Wheat  (Triticum  aestivum L.). PloS ONE 11(10):e0162443. doi:10.1371/journal.pone.0162443. Fraser,  P.  D.,  Bramley,  P.  M.  2004.  The Biosynthesis  and Nutritional Uses  of Carotenoids. Progress  in  Lipid  Research 43: 228-265. doi: 10.1016/j.plipres.2003.10.002 PMID:
15003396.
Giuliano, G. 2014. Plant Carotenoids: Genomics Meets Multi-gene Engineering. Current  Opinion  in  Plant  Biology  19:  111- 117. doi: org/10.1016/j.pbi.2014.05.006.
Hall,  T.  A.  1999.  BioEdit;  a  User-friendly Biological  Sequence  Alignment  Editor  and Analysis  Program  for  Windows  95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41:95-98..
Harjes,  C.  E.,  Rocheford,  T.  R.,  Bai,  L., Brutnell, T. P., Kandianis, C. B., Sowinski, S.  G.,  Stapleton,  A.  E.,  Vallabhaneni,  R.,
Williams,  M.,  Wurtzel,  E.T.,  et  al.  2008. Natural Genetic Variation  in Lycopene Epsilon Cyclase Tapped For Maize
Biofortification. Science. 319:330-333. Jehan,  T.,  Lakhanpaul,  S.  2006.  Single Nucleotide Polymorphism  (SNP)-Methods and Applications  in Plant Genetics:  A review. Indian  Journal  of  Biotechnology. 5(4): 435-459.
Luo,  X.,  Tomlins,  K.  I.,  Carvalho,  L.  J. C.  B., Li,  K.,  Chen,  S.  2018.  The Analysis  of
Candidate Genes  and Loci Involved With Carotenoid Metabolism in Cassava (Manihot  esculenta Crantz.) Using  SLAF-
seq. Acta  Physiologiae  Plantarum 40:  66. doi.org/10.1007/s11738-018-2634-7. Sankari,  M.,  Rao,  P.  R.,  Hemachandran,  H., Pullela, P. K., Doss, C. G. P., Tayubi, I. A., Subramanian, B., Gothandam, K. M, Singh, P.,  Ramamoorth,  S.  2018.  Prospects  and
Progress  in The Production  of Valuable Carotenoids:  Insights From Metabolic Engineering, Synthetic Biology, and Computational Approaches. Journal  of Biotechnology. 266: 89-101. Singh,  P.,  Goyal,  G.  K.  2008.  Dietary Lycopene: Its Properties and Anticarcinogenic Effects. Compr Rev Food Sci Food Saf. 7: 255-270. doi: 10.1111/j.1541-4337.2008.00044.x.
Sugiyama,  A.,  Ikoma,  Y.,  Fujii,  H.,  Endo,  T.,
Nesumi,  H.,  Shimada,  T.,  Omura,  T.  2017. Allelic Diversity  of Phytoene Synthase Gene Influences  the Transcription Level  in Citrus Fruit Among A Citrus  F 1 Hybrid Population. Breeding Sciences 67: 382-392.
Welsch, R., Arango, J., Bär, C., Salazar, B., Al- Babili,  S.,  Beltrán,  J.,  Chavarriaga,  P., Ceballos,  H.,  Tohme,  J.,  Beyer,  P.  2010. Provitamin  A Accumulation  in Cassava (Manihot  esculenta) Roots Driven  by A Single Nucleotide Polymorphism  in A Phytoene Synthase Gene. The  Plant  Cell. 22: 3348-3356.
Wong,  J.  C.,  Lambert,  R.  J.,  Wurtzel,  E.  T., Rocheford, T. R. 2004. QTL and Candidate
Genes Phytoene S ynthase  and  ζ -carotene Desaturase Associated With The
Accumulation  of Carotenoids  in Maize.
Theor. Appl. Genet. 108: 349 – 359.
Yuan,  H.,  Zhang,  J.,  Nageswaran,  D.,  Li,  L.
2015. Carotenoid Metabolism and Regulation in Horticultural Crops. Horticulture Research 2: 15036. doi:10.1038/hortres.2015.36.