## UPAYA MENINGKATKAN PATOGENISITAS
Lecanicillium lecanii TERHADAP HAMA PENGISAP POLONG KEDELAI Riptortus linearis melalui REGULASI KITINASE DAN UJI KOMPATIBILITAS PESTISIDA
( Efforts to Increase The Pathogenicity of Lecanicillium lecanii Against Soybean Sucking Pest Riptortus Linearis Through Chitinase Regulation and Pesticide Compatibility Tests )
Mulyati, Y.
Prodi Pendidikan IPA, FMIPA, Universitas Negeri Malang Email: yayuk.mulyati.fmipa@um.ac.id Diterima :  12/07/2021
Disetujui : 18/08/2021

## ABSTRACT
The aim of this study was to increase the killing power of Lecanicillium lecanii through (1) regulation of  chitinase  synthesis  and  (2)  finding  compatible  pesticides  to  be  applied  together  with L.  lecanii . Analysis  of  the  role  of  chitinase  on  the  pathogenicity  of L.  lecanii was  carried  out  through  the selection of basal media composition, optimization of culture conditions (media pH, temperature and incubation period), and bioassay against soybean pod sucking pest Riptortus linearis . Meanwhile, the compatibility  test  of  fungi  with  pesticides  was  carried  out  by  growing  the  fungus  on  PDA  media added with fungicides with the active ingredients of carbendazine, triadimefon, methyl thiophanate, kaptan, iprodion, and mankozeb. The results showed that L. lecanii grown on I basal media, pH 5, temperature 30 o C, and an incubation period of 5 or 6 days was able to optimally increase chitinase activity. Bioassays on R. linearis showed a mortality of up to 80% at 3 days after application. The pathogenicity of L lecanii in this study is much more significant than in previous research reports. In the second study, the compatibility test with pesticides showed that L. lecanii was compatible with pesticides with the active ingredients of mancozeb. Pesticides with the active ingredients of kaptan, iprodione, carbendazine, triadimefon, and methyl thiophanate are toxic (strongly inhibit) the growth of L. lecanii colonies. The two findings of this study indicate that L. lecanii has good prospects as a bioinsecticide in terms of increasing its pathogenicity and compatibility with pesticides.
Keyword : chitinase, pesticide compatibility, Lecanicillium lecanii , pathogenicity, Riptortus linearis

## ABSTRAK
Penelitian  ditujukan  untuk  meningkatkan  daya  bunuh Lecanicillium  lecanii melalui  (1)  regulasi sintesis  kitinase  dan  (2)  menemukan  pestisida  kompatibel  untuk  diaplikasikan  bersama  dengan L. lecanii . Tujuan tersebut dicapai melalui dua kegiatan penelitian yang berbeda. Analisis peran kitinase terhadap  patogenisitas L.  lecanii dilakukan  melalui  tahapan  seleksi  komposisi  media  basal, optimalisasi  kondisi  kultur  (pH  media,  suhu  dan  periode  inkubasi),  dan bioassay terhadap  hama pengisap  polong  kedelai R.  linearis .  Sementara  itu,  uji  kompatibilitas  cendawan  dengan  pestisida dilakukan  dengan  menumbuhkan  cendawan  pada  media  PDA  yang  ditambahkan  dengan  fungisida berbahan  aktif  karbendazin,  triadimefon,  tiofanat  metil,  kaptan,  iprodion,  dan  mankozeb.  Hasil penelitian menunjukkan bahwa L. lecanii yang ditumbuhkan pada media basal I, pH 5, suhu 30 o C, dan periode inkubasi 5 atau 6 hari mampu meningkatkan aktivitas kitinase secara optimal. Bioassay terhadap R.  linearis menunjukkan  mortalitas  mencapai  80%  pada  3  hari  setelah  aplikasi  (HSA). Patogenisitas L lecanii pada penelitian ini jauh lebih signifikan dibandingkan pada laporan penelitian sebelumnya.  Pada  penelitian  kedua,  uji  kompatibilitas  dengan  fungisida  menunjukkan  bahwa L. lecanii kompatibel dengan pestisida berbahan aktif mankozeb. Pestisida dengan bahan aktif kaptan, iprodione,  karbendazin,  triadimefon,  dan  tiofanat  metil  bersifat  toksik  (menghambat  kuat)  terhadap pertumbuhan  koloni L.  lecanii .  Dua  hasil  temuan  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa L.  lecanii memiliki prospek yang baik sebagai bioinsektisida terkait dengan peningkatan daya patogenisitas dan kompatibilitasnya dengan pestisida.
Kata Kunci : kitinase, kompatibilitas pestisida, Lecanicillium lecanii , patogensitas, Riptortus linearis

## PENDAHULUAN
Hama  pengisap  polong  kedelai  antara lain  adalah Nezara  viridula , Piezodorus hybneri ,  dan Riptortus  linearis (Indiati et  al ., 2017). R.  linearis (L.)  (Hemiptera:  Alydidae) merupakan  salah  satu  jenis  hama  pengisap polong  kedelai  yang  sangat  penting  di  antara tiga  jenis  hama  pengisap  polong  yang  disebut di  atas.  Hama  tersebut  tersebar  hampir  di seluruh propinsi di Indonesia dan menyebabkan kerugian  panen,  baik  itu  dari  segi  kualitas maupun  kuantitas  (Krisnawati et  al .,  2016). Kerugian  hasil  panen  akibat  hama  pengisap polong kedelai hingga mencapai 80% (Prayogo, 2011).
Upaya pengendalian R. linearis dengan menggunakan  agens  hayati  telah  banyak diteliti. Lecanicillium lecanii (Zimm.) (Viegas) Zare & Gams (Deuteromycotina: Hyphomycetes) merupakan salah satu cendawan  agens  hayati  yang  sudah  diketahui potensinya untuk mengendalikan berbagai jenis hama,  termasuk  didalamnya R.  linearis (Prayogo,  2011).  Cendawan  ini  memiliki kisaran  inang  yang  luas,  meliputi  Ordo
Orthoptera,
Hemiptera, Lepidoptera, Thysanoptera,  dan  Coleoptera  (Khoiroh et  al ., 2014). Meskipun  sudah  diketahui  potensinya dalam  mengendalikan  hama,  akan  tetapi cendawan L. lecanii kurang memenuhi harapan sebagai agen pengendali biologis terkait dengan daya  bunuh  yang  relatif  lebih  lambat dibandingkan  pestisida  kimia  (Fang et  al ., 2009). Pada umumnya,
cendawan entomopatogen membutuhkan waktu lebih dari
7  hari  untuk  mematikan  serangga  inang  (Faria dan  Wraight,  2001).  Empat  isolat L.  lecanii yang  terseleksi  sebagai  isolat  yang  paling berpotensi  dalam  mengendalikan  telur R. linearis dibandingkan  33  isolat  lainnya, membutuhkan  waktu  6  hari  untuk  menekan 72%  perkembangan  telur R.  linearis (Prayogo, 2011). Tiga isolat L. lecanii , yaitu L. lecanii 2, L. lecanii 3, dan L. lecanii 5 yang diujicobakan terhadap  green  peach  aphid Myzus  persicae hanya  mampu  menyebabkan  mortalitas  secara berturut-turut  sebesar  47.19%,  24.56%,  dan 26.17%  pada  3  HSA.  Pada  6  HSA,  mortalitas M.  persicae akibat  aplikasi  3  isolat  tersebut secara  berturut-turut  sebesar  67.42%,  80.70%, dan  68.22%  (Khan et  al .,  2012).  Pada pengamatan  5  hari  setelah  aplikasi  (HSA), L. lecanii menyebabkan  mortalitas T.  tabaci
Lindeman  sebesar  49-54%  (Moctezuma et  al ., 2014).  Hasil  penelitian  Putra et  al .  (2013)
menunjukkan  bahwa L.  lecanii menyebabkan mortalitas Bemisia tabaci sebesar 68.5% pada 7 HSA.
Salah  satu  faktor  yang  menentukan keberhasilan pengendalian hama menggunakan cendawan entomopatogen yaitu virulensi isolat (Khan et  al .,  2012).  Virulensi  isolat  salah satunya  ditentukan  oleh  kemampuannya memproduksi  enzim  degradatif  (Hasan et  al ., 2013).  Enzim  degradatif  tersebut  berfungsi untuk  mendegradasi  kutikula  serangga  yang bertindak sebagai penghalang pertama melawan infeksi cendawan (Xie et al ., 2010). Zhu et al . (2008)  menyatakan  bahwa  kitinase  merupakan enzim  degradatif  yang  utama  pada L.  lecanii .
Khan et al . (2012) melaporkan bahwa L. lecanii 3  yang  memproduksi  kitinase  tertinggi menunjukkan  daya  patogenisitas  tertinggi  pula terhadap green  peach  aphid  Myzus  persicae , dibandingkan  2  strain  uji  lainnya.  Temuan  ini menjadi  informasi  yang  sangat  penting  terkait pengendalian  hama  menggunakan  cendawan entomopatogen  mengingat  pada  umumnya komponen  utama  eksoskeleton  serangga merupakan  senyawa  kitin  (Muthukhishnan et al ., 2020). Upaya peningkatan virulensi cendawan dapat  dicapai  optimalisasi  media  serta  kondisi kultur  (Jholapara et  al .,  2013).  Produksi kitinase diyakini dapat meningkat tajam apabila cendawan  ditumbuhkan  pada  media  dengan komposisi yang optimal (Rebecca et al ., 2013). pH,  suhu,  dan  periode  inkubasi  merupakan kondisi  kultur  yang  mempengaruhi  produksi enzim.  Hal  tersebut  dikarenakan  enzim  hanya dapat  diproduksi  secara  optimal  pada  pH  dan suhu  spesifik  serta  periode  inkubasi  tertentu (Vitolo, 2020). Selain  kitinase  sebagai  faktor  internal, daya  patogenisitas  agens  hayati  juga dipengaruhi  oleh  faktor  eksternal  saat  aplikasi di  lapang.  Salah  satu  faktor  yang  dapat mempengaruhi  kinerja  jamur  tersebut  dalam mengendalikan  hama  di  lapangan  adalah senyawa  kimia,  yaitu  pestisida.  Tkaczuk et  al . (2015) menyatakan bahwa informasi mengenai pengaruh  pestisida  kimia  terhadap  cendawan entomopatogen  sekaligus  penentuan  mengenai kemungkinan  cendawan  untuk  diaplikasikan bersama  dengan  pestisida  merupakan  hal  yang penting dalam pengendalian hama terpadu.
Di  Indonesia,  uji  kompatibilitas  yang telah  dilaporkan  sampai  saat  ini  adalah
kompatibilitas L.  lecanii dengan  pestisida nabati (Indriati et al ., 2015 dan Prayogo, 2011). Belum  pernah  ada  laporan  mengenai  uji kompatibiltas L. lecanii dengan pestisida kimia. Penelitian  ini  penting  dilakukan  mengingat tingginya  penggunaan  pestisida  kimia  untuk mengendalikan R. linearis. Informasi mengenai kompatibilitas L. lecanii dengan pestisida kimia menentukan
keberhasilan penggunaan cendawan ini sebagai bioinsektisida. Berdasarkan  paparan  di  atas,  penelitian ini  ditujukan  untuk  (1)  menemukan  komposisi media  serta  kondisi  kultur  yang  dapat mengoptimalkan  produksi  kitinase L  lecanii serta  (2)  menemukan  pestisida  kimia  yang kompatibel  untuk  diaplikasikan  bersama L. lecanii. Upaya  tersebut  ditujukan  untuk meningkatkan patogenisitas L. lecanii terhadap R.  linearis yang  selama  ini  kurang  memenuhi harapan  sebagai  agens  hayati  terkait  daya bunuhnya yang relatif lambat..

## BAHAN DAN METODE
Tempat, waktu, alat, dan bahan Seluruh  kegiatan  penelitian  dilakukan di Laboratorium Jurusan Biologi, FMIPA, UB. Penelitian  tahap  I  (regulasi  kitinase  dan bioassay-nya  terhadap R. linearis)  dilakukan mulai  Februari  sampai  dengan  April  2015). Penelitian tahap II (uji kompatibilitas cendawan dengan  pesisida)  dilakukan  pada  Mei-Juni 2021.
Bahan-bahan  yang  digunakan  yaitu isolat L. lecanii, serangga uji R. linearis , Potato Dextrose Agar (PDA); cling wrap ; alumunium foil;  akuades;  kertas  saring;  kitin  bubuk;  kitin koloid; N-asetil D-glukosamin; Na 2 HPO 4 .2H 2 O;  KH 2 PO 4 ;  NaCl;  NH 4 Cl; MgSO 4 .7H 2 O;  CaCl 2 ;  pereaksi  Schales,  buffer asetat,  buffer  fosfat,  dan  buffer  Tris  HCl,  dan pestisida  dengan  bahan  aktif  karbendazin, tradimefon,  tiofanat  metil,  kaptan,  iprodion, dan mankozeb.
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu:  cawan  petri; laminar  air flow ;  tabung  reaksi;  jarum  inokulum  lurus; erlenmeyer  250  ml;  bor  gabus; hand  sprayer ;
kuas
halus; Tween 80; vortex; thermohygrograph ; mikropipet; blue tip ; yellow tip ; microfuge  tube ; sentrifuge ; microwave ; waterpass ;  auctoclave; shaking  water  bath ; timbangan  digital;  sangkar  untuk rearing  R. linearis dengan  diameter  30  cm  dan  tinggi  40
cm;  penggaris,  milar  plastik,  oven  kering;  dan magnetik stirer.
Penentuan  media  basal  optimal  untuk analisis  kitinase  berdasarkan  tiga  karakter virulensi:  pertumbuhan  koloni,  jumlah  dan ukuran konidia
Terdapat  tiga  komposisi  media  basal yang  diuji,  yaitu  Media  basal  I,  II,  dan  III. Media basal yang telah di auctoclave pada suhu 121 o C  selama  15  menit  kemudian  dituang kedalam petri dish sebanyak 15 ml. Pada media yang  telah  memadat  kemudian  dibuat  lubang difusi dengan diameter 7 mm. Suspensi konidia sebanyak  65 µ L  diinokulasikan  pada  lubang difusi  dan  diinkubasi  pada  suhu  ruang. Rancangan  penelitian  yang  digunakan  adalah rancangan  acak  kelompok  dengan  4  ulangan pada  parameter  pertumbuhan  koloni,  40 ulangan pada parameter jumlah konidia, dan 20 ulangan  pada  parameter  ukuran  konidia. Parameter-parameter yang diamati diukur pada 7  HSA.  Pertumbuhan  koloni  diukur  dengan mengukur  dua  sisi  diameter  koloni.  Jumlah konidia dihitung dengan menggunakan haemocytometer .  Ukuran  konidia  diukur dengan  menggunakan  mikrometer  meja  dan okuler.
Pengaruh  kondisi  kultur  terhadap  aktivitas kitinase Kondisi  kultur  yang  diuji  antara  lain pH, suhu, dan periode inkubasi. pH media yang diuji yaitu 4, 4.5, 5, 5.5, 6, dan kontrol masing- masing  4  ulangan.    Variasi  suhu  yang  diuji yaitu  25 o C,  30 o C,  35 o C,  dan  kontrol  (suhu ruang)  dengan  6  ulangan.  Aktivitas  kitinase pada  perlakuan  pH  dan  suhu  inkubasi ditentukan  secara  kuantitatif  pada  5  HSA. Perlakuan  periode  inkubasi  dilakukan  selama 10  hari  pada  guhu  ruang  dan  pengukuran aktivitas  kitinase  secara  kuantitatif  dilakukan setiap  24  jam  selama  10  hari.  Data  yang diperoleh  dianalisis  dengan  anova  satu  arah. Apabila  nilai  F hitung signifikan,  uji  lanjut dilakukan dengan LSD.
Analisis kuantitatif aktivitas kitinase Erlenmeyer  flask  100  ml  yang mengandung 35 ml media diauctoclave selama 15  menit  pada  suhu  121 o C.  Suspensi  konidia sebanyak  1  ml  1  x  10 6 diinokulasikan  pada media  steril.  Cendawan  diinkubasi  selama  5 hari  pada rotary  shaker .  Pengukuran  aktivitas kitinase  adalah  dengan  menggunakan  metode
Scales dengan  merujuk  pada  Spindler  (1997) dengan  modifikasi.  Satu  unit  aktivitas  kitinase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat membebaskan glucosamine sebesar 1 µmol per menit. Desain penelitian adalah rancangan acak kelompok  dengan  4  ulangan.  Data  yang diperoleh  dianalisis  dengan  anova  satu  arah. Apabila  nilai  F hitung signifikan,  uji  lanjut dilakukan dengan LSD.
Rumus penentuan aktivitas kitinase:
Keterangan  A  :  Aktivitas  Kitinase  (Unit  ml -1 ), [GlcNAc]:  Konsentrasi  N-asetil-D-glukosami- na  hasil  reaksi  enzimatis,  ditetapkan  dengan menggunakan  persamaan  kurva  standar,  t: waktu  inkubasi,  Vtr:  Volume  total  reaksi enzimatis  (ml),  Ve:  Volume  enzimatis  yang digunakan  (ml),  Va:  Volume  filtrat  yang dianalisa.
Uji  Patogenisitas  Inokulum terhadap  Nimfa I R. linearis Aplikasi inokulum terhadap nimfa I R. linearis dilakukan  dengan  cara  disemprotkan pada  seluruh  tubuh  nimfa  yang  telah dimasukkan dalam milar plastik. Jumlah nimfa yang  diuji  adalah  20  nimfa.  Volume  suspensi konidia  larutan  kitinase  untuk  setiap  unit percobaan adalah 3 ml. Pada perlakuan kontrol, nimfa  disemprot  dengan  akuades  steril  dalam jumlah yang sama (Indriyati, 2009).
Penghitungan Mortalitas Nimfa R. linearis Jumlah  nimfa R.  linearis yang  mati terinfeksi L.  lecanii dari  masing-masing perlakuan  dihitung  pada  3,  6,  dan  10  HSA. Rumus  yang  digunakan  untuk  menentukan keefektifan L.  lecanii dalam  menyebabkan mortalitas  nimfa R.  linearis adalah  sebagai berikut:
% 100 x perlakuan serangga total mati yang serangga Mortalitas ∑ ∑ =
Data  persentase  hasil  perhitungan  mortalitas imago R.  linearis ditransformasikan  ke  arc  sin x sebelum  dilakukan  perhitungan  dengan menggunakan sidik ragam.
Uji kompatibilitas cendawan dengan fungisida
Platting dilakukan  di  dalam laminar  air flow dengan  mengambil  1  ml  pestisida  dari masing-masing perlakuan kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri berdiameter 9 cm. Konsentrasi pestisida yang ditambahkan adalah sesuai dengan rekomendasi penggunaannya.  Pada  cawan  petri  tersebut ditambahkan  PDA  sebanyak      10  ml.  Tiap perlakuan  diulang  tiga  kali. V.  lecanii dari biakan  murni  diambil  dengan  menggunakan bor  gabus  berdiameter  1  cm,  kemudian diinokulasikan  ke  dalam  cawan  petri  yang telah  diisi  dengan  fungisida  dan  PDA  sesuai dengan  perlakuan.  Selanjutnya  cawan  petri disimpan  di  dalam  ruangan  pada  temperatur 27-31 o C. Pengamatan dilakukan setiap 12 jam sekali selama 7 hari. Data pertumbuhan koloni V.  lecanii dianalisis  dengan  analisis  variansi tunggal.  Bila  ada  pengaruh  jenis  fungisida terhadap  pertumbuhan  jamur  tersebut,  maka dilakukan uji lanjut beda nyata terkecil (LSD).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil dan pembahasan penelitian tahap I Media  basal  optimal  untuk  analisis  kitinase berdasarkan tiga karakter virulensi:
pertumbuhan  koloni,  jumlah  dan  ukuran konidia
Parameter-parameter  yang  digunakan untuk  menentukan  media  basal  optimal  untuk analisis  kitinase  yaitu  pertumbuhan  koloni, jumlah konidia, dan ukuran konidia. Hasil sidik ragam menunjukkan bahwa macam media basal berpengaruh  terhadap  pertumbuhan  koloni  dan jumlah  konidia.  Pada  parameter  ukuran konidia, hasil anova menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan secara signifikan ukuran konidia L. lecanii yang ditumbuhkan pada media basal I,  II,  dan  III  (Tabel  1).  Namun  demikian, konidia  cendawan  yang  ditumbuhkan  pada media  basal  I  menunjukkan  ukuran  yang  lebih besar  dibandingkan  media  basal  II  dan  III. Rata-rata ukuran konidia L. lecanii pada media basal  I,  II,  dan  III  secara  berturut-turut  yaitu 4.625 µm x 11.875 µm, 3.875 µm x 10.375 µm, dan 3.75 µm  x 11.75 µm.
Tabel 1.  Pertumbuhan  koloni,  jumlah  dan ukuran  konidia L.  lecanii pada  7 HSA, pada media basal I, II, dan III Media basal Parameter yang diamati Rata-rata pertumbuhan koloni (mm) Rata-rata jumlah konida Rata-rata ukuran konidia (µm) I 78.25 b 45 b 4.63 a II 53.75 a 9.9 a 3.88 a III 86 b 10.4 a 3.75 a
Keterangan: Hari  Setelah  Aplikasi;  angka dalam  satu  lajur  yang  diikuti dengan  huruf  yang  sama  tidak berbeda  nyata  pada  taraf  5%  dan 1% menurut uji LSD
Atas  dasar  paparan  data,  dapat disimpulkan  bahwa  media  basal  I  memiliki potensi lebih baik dibandingkan media basal II dan  III  terkait  tiga  parameter  yang  dipakai sebagai  acuan  penentuan  media  basal  yang akan dipakai pada analisis kitinase. Komposisi utama yang membedakan antara media basal I, II,  dan  III  adalah  sumber  nitrogen penyusunnya.  Media  basal  I  memiliki  sumber nitrogen organik berupa urea dan yeast extract , sedangkan  media  basal  II  dan  III  memiliki sumber  karbon  berupa  pepton.  Pada  dasarnya, yeast  extract maupun  pepton  memiliki  unsur penyusun  yang  sama. Yeast  extract sebagai faktor  pertumbuhan  tersusun  atas  nitrogen, asam  amino,  vitamin  terlarut  dalam  air,  dan karbohidrat.  Pepton  mengandung  senyawa
nitrogen, faktor pertumbuhan, dan oligomer N- acetyl-glucosamine  (Jholapara et  al .,  2013). Karbohidrat  pada yeast  extract dan  N-acetyl- glucosamine  pada  pepton  sama-sama  berperan sebagai sumber karbon. Berdasarkan kesamaan tersebut,  dapat  dikatakan  bahwa L.  lecanii memang lebih sesuai tumbuh pada media basal I dan kurang cocok pada media basal II maupun III.
Pengaruh Kondisi Kultur terhadap Aktivitas Kitinase L. lecamii pada 7 HSA Hasil analisis menunjukkan bahwa pH, suhu,  dan  periode  inkubasi  merupakan  kondisi kultur yang mempengaruhi aktivitas kitinase L. lecanii .  Kitinase L.  lecanii diproduksi  secara optimal pada pH 5, suhu 30 o C dengan periode inkubasi selama 3 hari (Tabel 2).
pH Sifat  ionik    gugus  karboksil  dan  gugus  amino suatu  senyawa  dipengaruhi  oleh  pH.    Menurut Vitolo  (2020),  produksi  kitinase  dipengaruhi pH.Hal tersebut dapat mengakibatkan perubahan  daerah  katalitik  dan  konformasi enzim. L. lecanii mampu menghasilkan kitinase pada  pH  4 hingga  pH  6;  akan  tetapi  mencapai maksimum  pada  pH  5.  Hasil  penelitian  ini sesuai  dengan  pernyataan  Sinkar  dan  Kasav
(2009) bahwa endokitinase mengalami peningkatan pada saat pH rendah. Tabel 2. Aktivitas kitinase pada berbagai perlakuan kondisi kultur pH Aktivitas kitinase (U ml -1 ) Suhu Aktivitas kitinase (U ml -1 ) Periode Inkubasi (jam) Aktivitas kitinase (U ml -1 ) 4 23.306 ab 25 23.477 a 24 49.167 ab 4.5 23.688 bc 27 (kontrol) 24.162 bc 48 50.056 cdef 5 24.042 c 30 24.352 c 72 50.611 f 5.5 23.819 bc 35 23.523 ab 96 50.667 f 6 23.750 bc 120 50.667 f Kontrol (7.95) 23.038 a 144 50.472 ef 168 49.861 bcde 192 49.694 abcd 216 49.667 abcd 240 49.472 abc
Keterangan: Angka dalam satu lajur yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 1% menurut uji LSD
Gambar 1.   Aktivitas kitinase L. lecanii pada kondisi kultur (a) pH, (b) suhu inkubasi
Vitolo et al . (2020) menjelaskan bahwa enzim dapat berperilaku asam, basa, atau netral sesuai  dengan  konstitusi  asam  amino  yang dapat  mempengaruhi  sisi  aktif  enzim. Berdasarkan  pernyataan  tersebut,  diketahui bahwa  sisi  aktif  enzim  kitinase L.  lecanii dipengaruhi  oleh  kondisi  asam.  Pada  kisaran pH  yang  diuji,  pH  5  dapat  mempengaruhi secara  optimal  sisi  aktif  kitinase  sehingga mampu  berikatan  dengan  substrat  yang  pada gilirannya  dapat  menghasilkan  aktivitas kitinase secara optimal pula. Pada pH dibawah 5  atau  diatas  5,  sisi  aktif  enzim  tidak  dapat bekerja optimal. Kondisi tersebut menyebabkan menurunnya  kemampuan  berikatan  dengan substrat  sehingga  aktivitas  kitinase  yang dihasilkan juga tidak optimal. Aktivitas kitinase L.  lecanii pada  kondisi  asam  hingga  basa ditunjukkan pada Gambar 1a.
Suhu Selain  pH,  reaksi-reaksi  kimia  yang dikatalisis enzim juga peka terhadap suhu. Hal tersebut dikarenakan enzim merupakan struktur protein  yang  akan  mengalami  denaturasi  pada suhu yang tidak tepat. Denaturasi menyebabkan kerja  enzim  mengalami  penurunan  (Vitolo, 2020).
Pada empat suhu yang diuji, pada suhu 25 o C,  kitinase  diproduksi  pada  jumlah  yang rendah.  Produksi  kitinase  meningkat  seiring dengan  peningkatan  suhu  dan  mencapai optimal  pada  suhu  30 o C;  akan  tetapi  tidak berbeda  signifikan  pada  suhu  27 o C  (rata-rata suhu  ruang).  Produksi  kitinase  mengalami penurunan pada suhu 35 o C. Hasil penelitian ini sesuai  dengan  pernyataan  Vitolo  (2020)  yang menjelaskan  bahwa  aktivitas  kitinase  akan
semakin  meningkat  seiring  dengan  kenaikan suhu  sampai  ke  tingkat  optimal.  Peningkatan suhu  menyebabkan  energi  kinetik  enzim semakin tinggi. Kondisi tersebut menyebabkan peningkatan  gerakan  vibrasi,  translasi,  dan rotasi  antara  enzim  dengan  substrat  sehingga peluang  substrat  –  enzim  bereaksi  semakin besar  (Rochima,  2006).    Pada saat  suhu  kultur terus dinaikkan melebihi suhu optimal aktivitas enzim,  maka  akan  mengakibatkan  penurunan aktivitas  enzim.  Penurunan  aktivitas  kitinase tersebut  diduga  karena  enzim  mengalami denaturasi  sehingga  kehilangan  sebagian aktivitasnya  (Vitolo,  2020).  Aktivitas  kitinase L. lecanii pada suhu inkubasi 25 o C, 27 o C, 30 o C, dan 35 o C ditunjukkan pada Gambar 1b.

## Periode Inkubasi
Secara  umum,  aktivitas  kitinase L. lecanii dimulai  pada  24  jam  setelah  inkubasi dan mengalami peningkatan pada 2 hari setelah inkubasi  (HSI)  hingga  6  HSI.  Hasil  tersebut didukung  pernyataan  Sinkar  dan Kasav  (2009) yang  menyatakan  bahwa  aktivitas  kitinase cendawan  berfilamen,  salah  satunya  yaitu L. lecanii , mengalami peningkatan seiring dengan periode  inkubasi.  Pada  periode  inkubasi  yang lebih  lama  (melebihi  periode  waktu  inkubasi optimal), aktivitas kitinase mengalami penurunan. Penurunan aktivitas kitinase diduga berkaitan  dengan  dihasilkannya  protease  yang mampu mendegradasi kitinase.
Produksi kitinase pada kultur cendawan pada  umumnya  diketahui  maksimum  pada waktu  inkubasi  3  dan  4  HSI.  Periode  inkubasi optimal aktivitas kitinase bergantung pada jenis substrat  pada  medium.  Pada  penelitian  ini, aktivitas  kitinase  optimal  dicapai  pada  hari
(a) (b)
kedua  inkubasi  pada  media  dengan  sumber karbon  N-acetyl-D-glucosamine.  Aktivitas optimal  tersebut  bertahan  hingga  hari  keenam inkubasi. Hasil penelitian sebelumnya melaporkan  produksi  optimal  kitinase B.
bassiana terjadi pada 3 HSI pada media wheat bran-based (Suresh  dan  Chandrasekharan, 1999).  Nampoothiri et  al .  (2004)  melaporkan periode  inkubasi  4  HSI  sebagai  periode aktivitas  kitinase  optimal  pada T.  Harzianum TUBF 781.
Pada  paparan  sebelumnya,  telah dijelaskan  bahwa  aktivitas  kitinase  tertinggi dijumpai  pada  media  dengan  sumber  karbon kitin  dan  produk  hidrolisisnya  N-acetyl-D- glucosamine.  Kesesuaian  substrat  diduga mempengaruhi  sisi  aktif  enzim  untuk  dapat bereaksi lebih cepat sehingga aktivitas kitinase mencapai optimal pada waktu yang lebih cepat. Aktivitas  kitinase  selama  10  hari  inkubasi ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 3.  Aktivitas Kitinase L. lecanii pada 10 hari periode inkubasi
Uji  Patogenisitas L.  lecanii terhadap  Hama Pengisap Polong Kedelai Riptortus linearis Bioinsektisida berbahan aktif L. lecanii diaplikasikan dalam bentuk suspensi. Preparasi inokulum  dilakukan  pada  kondisi  kultur optimal  sesuai  rekomendasi  tahap  penelitian sebelumnya.  Aplikasi  inokulum  menggunakan tiga  konsentrasi  yang  berbeda.    Hasil  anova faktorial menunjukkan bahwa interaksi konsentrasi  inokulum  dan  hari  pengamatan berpengaruh  signifikan  terhadap  patogenisitas L. Lecanii (Tabel 3).
Berdasarkan  Tabel  3,  diketahui  bahwa konsentrasi inokulum 10 8 merupakan konsentrasi
inokulum paling efektif dibandingkan  dua  konsentrasi  perlakuan
lainnya.  Efektifitas  tersebut  dicapai  pada  3 HSA.
Tabel 3.  Mortalitas R. linearis pada pengamatan 3, 6, dan 10 HSA Perlakuan Total (individu) Rata-rata (individu)  Notasi [In Hari pengamatan 10 6 H3 18 4,5 a H6 32 8 ab H10 43 10,75 bc 10 7 H3 15 3,75 a H6 41 10,25 bc H10 60 15 a 10 8 H3 64 16 a H6 67 16,75 a H10 67 16,75 a Keterangan: Angka  dalam  satu  lajur  yang diikuti  dengan  huruf  yang  sama tidak berbeda nyata pada taraf 1% menurut uji LSD Hasil-hasil penelitian sebelumnya mengindikasikan  bahwa L.  lecanii merupakan cendawan entomopatogen yang kurang memenuhi  harapan  sebagai  agen  pengendali biologis.  Moctezuma et  al .  (2014)  melaporkan bahwa  pada  kerapatan  10 9 , L.  lecanii mampu menyebabkan mortalitas Thrips tabaci
Lindeman  sebesar  49-54%  pada  5  HSA.
Penelitian  yang  dilakukan  Suhairiyah et  al .
(2013) dengan menggunakan kerapatan konidia 10 8 dan  10 9 ,  pengamatan  pada  7  HSA menunjukkan  tingkat  mortalitas Spodoptera litura secara  berturut-turut  sebesar  80%  dan 83%.  Putra et  al .  (2013)  melaporkan  bahwa pada  pengamatan  7  HSA, L.  lecanii mampu menyebabkan mortalitas Bemisia tabaci sebesar 68,5%.  Hasil  penelitian  Khan et  al .  (2012) menunjukkan  bahwa  pada  kerapatan  konidia 10 8 , tiga isolat L. lecanii ( L. lecanii 2, L. lecanii 3, dan L. lecanii 5) yang diujicobakan terhadap green  peach  aphid  Myzus  persicae hanya mampu  menyebabkan  mortalitas  secara berturut-turut  sebesar  47.19%,  24,56%,  dan 26,17%  pada  3  HSA.  Pada  6  HSA,  mortalitas M.  persicae akibat  aplikasi  3  isolat  tersebut secara  berturut-turut  sebesar  67,42%,  80,70%, dan 68,22%. Berdasarkan  beberapa  laporan  hasil penelitian  tersebut,  dapat  dinyatakan  bahwa hasil  penelitian  ini  memberikan  harapan  yang lebih  baik  terkait  pemanfaatan L.  lecanii sebagai agen pengendali biologis. Patogenisitas L. lecanii yang tinggi diduga berkaitan dengan
pengaruh preparasi inokulum sebelum diaplikasikan.  Pinnamaneni et  al .  (2010)  dan Fang et  al .  (2010)  menyatakan  bahwa optimalisasi  kondisi  kultur  pada  saat  preparasi inokulum  diperlukan  untuk  keberhasilan pengendalian biologis. Hal tersebut dikarenakan  media  dan  kondisi  kultur  tidak hanya  mempengaruhi  pertumbuhan  dan sporulasi  cendawan,  tetapi  juga  viabilitas  dan virulensi konidia.
Pada  hasil  penelitian  sebelumnya, diperoleh media basal yang mampu mendukung produksi kitinase serta produksi konidia dalam jumlah  yang  optimal.  Selain  media  basal  yang optimal, pada penelitian tahap I juga diperoleh kondisi  kultur  yang  meliputi  pH  media,  suhu inkubasi,  serta  periode  inkubasi  yang  optimal pula  untuk  mendukung  produksi  kitinase  serta jumlah konidia. Pada tahap preparasi inokulum, hal  yang  membedakan  penelitian  ini  dengan penelitian-penelitian  yang  telah  disebutkan yaitu terkait media yang digunakan, pH media, serta umur inokulum (periode inkubasi).
Pada  beberapa  penelitian  yang  telah disebutkan, media kultur yang digunakan yaitu beras jagung, Adamek liquid media (glukosa 20 g L -1 , corn step liquor 15 g L -1 , yeast extract 20 g  L -1 ,  dan  tween  80  4  g  L -1 ).  Informasi  lain yang  diperoleh  dari  laporan  penelitian tersebut yaitu  periode  inkubasi  (umur  inokulum),  yaitu berkisar  20-21  HSI.  Adanya  perbedaan
komposisi  media  serta  periode  inkubasi tersebut dimungkinkan mempengaruhi produksi kitinase L. lecanii . Akan tetapi, penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mendapat jawaban yang pasti terkait hal-hal tersebut.

## Hasil dan Pembahasan Penelitian Tahap II
Kompatibilitas  Bioinsektisida  Berbahan Aktif L. lecanii dengan Pestisida Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa  jenis  pestisida  berpengaruh  terhadap pertumbuhan  cendawan L.  lecanii (Tabel  4). Pertumbuhan  koloni L.  lecanii tertinggi  terjadi pada  medium  yang  diberi  perlakuan  fungisida dengan  bahan  aktif  mankozeb.  Hal  ini  berarti bahwa  mankozeb  merupakan  jenis  fungisida yang  paling  kompatibel  (dapat  diaplikasikan bersama)  dengan L.  lecanii dibandingkan dengan  fungisida  lainnya.  Hasil  ini  sesuai dengan  pernyataan  Koppert  (2002)  bahwa fungisida  dengan  bahan  aktif  mankozeb  dapat dikombinasikan  penggunaannya  dengan L. lecanii .  Selain  diameter  pertumbuhan,  aplikasi bersamaan  dengan  fungisida  juga  dapat mempengaruhi  perubahan  warna  koloni.  Pada berbagai jenis perlakuan fungisida, hanya pada media  yang  ditambahkan  fungisida  berbahan aktif  mankozeb  yang  tidak  menimbulkan perubahan warna koloni (Gambar 4).
Tabel 4. Pengaruh jenis pestisida terhadap pertumbuhan dan warna koloni L. lecanii Jenis Fungisida Rata-rata diameter pertumbuhan koloni L. lecanii pada hari ke-7 Warna koloni Karbendazin Triadimefon Tiofanat metil Kaptan Iprodion Mankozeb Kontrol 14 a 14 a
14 a 21,03 b 27,13 c 46,07 d Coklat kehitaman Coklat kehitaman Coklat kehitaman Putih kecoklatan Putih kecoklatan Putih kekuningan Putih kekuningan LSD 1% 2,81
Keterangan: Angka dalam kolom  yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf
1% uji LSD)
Gambar 4.   Pertumbuhan dan warna koloni L. lecanii pada media PDA+fungisida: a. karbendazin; b. triadimefon; c. tiofanat metil; d. kaptan; e. iprodione; f. mankozeb; g. PDA saja (kontrol)
(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g)
Pestisida  dengan  bahan  aktif  kaptan dan iprodion bersifat
menghambat pertumbuhan  koloni,  akan  tetapi  tidak  bersifat toksik  (menghambat  kuat).  Hasil  penelitian ini sesuai  dengan  Alves et  al .  (1998),  yaitu  dari dua  jenis  iprodion  yang  diberikan,  iprodion  2 bersifat  menghambat  pertumbuhan L.  lecanii , akan  tetapi  tidak  bersifat  toksik.  Meskipun demikian,  fungisida  berbagan  aktif  kaptan  dan iprodion  tetap  tidak  dapat  diaplikasikan bersamaan  dengan L.  lecanii terkait  dengan kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan  cendawan.  Tkaczuk  (2015) menyatakan  bahwa  fungisida  tertentu  dapat membahayakan kehidupan cendawan entomopatogen dan hendaknya tidak diterapkan serempak  dengan  agen  hayati.  Selang  waktu penggunaan fungisida berbahan aktif mankozeb dengan bioinsektisida berbahan aktif L. lecanii lebih  pendek  penerapannya  dibandingkan dengan kaptan dan iprodion yang membutuhkan  selang  waktu  yang  lebih  lama untuk  aplikasinya  bersama  dengan L.  lecanii . Akan  tetapi,  berapa  lama  selang  waktu  yang pasti  untuk  kombinasi  penggunaan  fungisida dengan cendawan masih memerlukan penelitian lebih lanjut.
Temuan dua kegiatan penelitian di atas memberikan  prospek  positif  penggunaan bioinsektisda  berbahan  aktif L.  lecanii .  Pada penelitian  tahap  1,  temuan  media  basal  dan kondisi  kultur  optimal  untuk  preparasi inokulum L. lecanii yang mampu menunjukkan daya  bunuh  yang  lebih  cepat  dibandingkan temuan  penelitian  sebelumnya  memberikan harapan  baru  terkait  penggunaan  cendawan entomopatogen  untuk  pengendalian  hama. Temuan  penelitian  tahap  II  memberikan informasi  bahwasannya  aplikasi  bioinsektisida berbahan  aktif L.  lecanii di  lapang  bersamaan dengan  pestisida  tertentu  tidak  mempengaruhi daya bunuhnya terhadap hama sasaran.

## KESIMPULAN
1. Penelitian  tahap  I.  Preparasi  inokulum L. lecanii pada  media  basal  I  dengan  kondisi kultur  pH  5,  suhu  30 o C,  dan  periode inkubasi selama 5 hari mampu mengoptimalkan  produksi  kitinase L. lecanii .  Peningkatan  produksi  kitinase  ini mampu meningkatkan  daya  bunuh/ patogenisitas L.  lecanii terhadap R.
linearis .
2. Penelitian tahap II. Bioinsektisida berbahan aktif L. lecanii dapat diaplikasikan bersama dengan pestisida berbahan aktif mankozeb.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada  Direktorat  Jenderal  Pendidikan  Tinggi Kementerian  Pendidikan  dan  Kebudayaan Indonesia yang telah mendanai penelitian tahap I  dan  kepada  Fakultas  MIPA,  Universitas Negeri Malang yang telah mendanai penelitian tahap II..

## DAFTAR PUSTAKA
Alves.  1998.  Biologycal  Control  Efeito  de
Produtos  Fitossanitarios  Quimicos Utilizados  em  Alface  e  Crisantemo  So bre Furgos Entomopathogenicos. http://www.Neotrop.Entomol.V.31n2 Iondrina.abr./jun.2002 [8-02-2021].
Fang.  W.,  Feng,  J.,  Fan,  Y.,  Zhang,  Y., Bidochka,  M.J.,  St.  Leger,  R.,  Pei,  Y. 2009. Expressing a fusion protein with protease  and  chitinase  activities increases  the  virulence  of  the  insect pathogen Beauveria  bassiana . Journal of  Invertebrate  Pathology .  102:155– 159.
Faria,  M.  dan  Wraight,  S.P.  2001.  Biological Control  of Bemisia  tabaci with  fungi. Crop  Protection  (Elsevier) .  20:767- 778.
Hasan S, Anis A, Abinav P, Nausheen K, Rishi K,  Garima  G,  2013.  Production  of Extracellular Enzymes in the Entomopathogenic Fungus Verticillium lecanii. Bioinformation 9(5): 238-242. Indiati, S.W., Bejo, Rahayu, M. 2017. Diversity of  Mung  Bean  Insect  Pest  and  Their Natural  Enemies  in  Farmer’s  Fields  in East  Java,  Indonesia. Biodiversitas , 18(4): 1300-1307. Indriati,  G.,  Samsudin,  Amaria,  W.  2015. Potensi Lecanicillium  lecanii untuk pengendalian Helopeltis  antonii pada Tanaman Teh. J. TIDP ¸2(2): 99-106. Jholapara R.J., Mehta R.S., Bhagwat A.M. and Sawant  C.S.  (2013).  Exploring  and Optimizing  the  Potential  of  Chitinase Production  by  Isolated Bacillus  Spp. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences , 5: 412-418.
Khan, S., Guo, L., Shi, H., Mijit., Qiu, D. 2012. Bioassay and enzymatic comparison of six  entomopathogenic  fungal  isolates for  virulence  or  toxicity  against  green peach  aphids Myzus  persicae . African Journal of Biotechnology . 11 (77):14193-14203. ISSN 1684-5315. Khoiroh,  F.,  Isnawati,  Faizah,  U.  2014. Patogenitas  Cendawan  Entomopatogen ( Lecanicillium lecanii ) seagai Bioinsektisida  untuk  Pengendalian Hama  Wereng  Coklat  secara  In  Vitro.
LenteraBio , 3(2): 115-121. Koppert, B.V.2002. General Information . Netherlands: Berkel en Rodenrijs Moctezuma,  H.E.F.,  Gutierrez,  C.L-G.,  Ayala,
C. 2014. Effectiveness of Lecanicillium lecanii for  Control  of Thrips tabaci Lindeman  on  Onion  Crop.  Journal  of Chemical,  Biological  and  Physical Sciences, 4 No. 5, 95
Muthukhishnan,  S.,  Mun,  S.,  Noh,  M.Y., Geisbrecht,  Arakane,  Y.  2020.  Insect Cuticular  Chitin  Contributes  to  Form and Function. Curr Pharm Des , 26(29): 3530-3545.
Nampoothiri,  K.M.,  Abdulhameed,  S.,  Szkacs,
G.,  Pandey,  A.  2004.  Process optimization  for  antifungal  chitinase production  by Trichoderma  harzanum . Process Biochemistry , 39(2004): 1583- 1590.
Krisnawati,  A.,  Bayu,  M.S.Y.I.,  Adie,  M.M. 2016.  Identification  of  Soybean Resistance  to  Pod  Sucking  Bug ( Riptortus linearis ) by No-Choice Test.
Biosaintifika , 8(3): 406-413.
Pinnamaneni,  R.,  Kalidas,  P.,  Rao,  K.R.S.S.
2010.  Cloning  and  Expression  of Bbchit1 gene  of Beauveria  bassiana . The  Open  Entomology  Journal .  4:  30-
35.
Prayogo,  Y.  2011.  Isolat  Virulen  Cendawan Entomopatogen Lecanicillium  lecanii sebagai Bioinsektisida Untuk Pengendalian  Telur  Kepik  Coklat Riptortus  linearis (F.)  Pada  Kedelai.
Buletin Palawija, No. 21: 39-54. Putra,  G.M.,  Hadiastono,  T.,  Afandhi,  A., Prayogo, Y. 2013. Patogenisitas Jamur
Entomopatogen Lecanicillium  lecanii
(Deuteromycotina: Hyphomycetes) terhadap Bemisia  Tabaci  (G.)  sebagai
Vektor Cowpea  Mild  Mottle  Virus
(CMMV)  pada  Tanaman  Kedelai. Jurnal HPT , 1 : 27-39.
Rebecca  L.J.,  Susithra  G.,  Sharmila  S.  and Singh  A.  2013.  Optimization  of Physical  Parameters  for  Chitinase Production  from Serratia  marcescens . Research  Journal  of  Pharmaceutical, Biological  and  Chemical  Sciences ,  4: 1676-1682.
Rochima, E. 2006. Pemurnian dan karakterisasi
Kitin  Deasetilase  Termostabil  dari Bacillus  papandayan  Asal  Kawah Kamojang  Jawa  Barat.  Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas  Padjadjaran,  Jatinagor. Bandung 8, 193-209.
Sinkar,  T.  A  dan  Kasav,  A.R.  2009. Isolation and Screening of Bacterial and Fungal Isolates Based on Chitinolytic Enzymes For  The  Control  Of  Insect  Pests  in Agriculture .  Unpublished  Dissertation:
University of Pune.
Spindler K.-D. 1997. Chitinase and Chitosanase Assays.  In:  Chitin  Handbook  (eds.:
R.A.A.  Muzzarelli  and  M.G.  Peter), 229-235. Suresh  PV  and  Chandrasekaran  M.  1999. Impact  of  Processes  Parameters  on Chitinase Production By An Alkalophilic Marine Beauveria Bassiana in  Solid  State  Fermentation.
Process Biochem , 34:257– 267 Tkaczuk,  C.,  Harasimluk,  M.,  Krol,  A.,  Beres, P.K.  2015.  The  Effect  of  Selected Pesticides on the Growth of Entomopathogenic  Fungi Hirsutella nodulosa and Beauveria  bassiana . Journal  of  Ecological  Engineering . 16(3):177-183. Vitolo,  M.  2020.  Brief  Review  on  Enzyme Activity. World Journal of Pharmaceutical Research , 9(2): 60-76. Xie, Y., Liu, W., Xue, J., Peng, Z., Han, Zhang, Y.  2010.  Integument  of  soft  scale insects  and  the  invasion  of  the pathogenic fungus Lecanicillium lecanii . Entomologia Hellenica . 19: 66-
75
Zhu,  Y.,  Pan,  J.,  Qiu,  J.,  Guan,  X.  2008. Isolation  and  Characterization  of  a Chitinase Gene From Entomopathogenic Fungus Verticillium  lecanii . Brazillian Journal of Microbiology . 39: 314-320