Copyright © 2022 by Authors, published by Journal of Food Technology and Industry This is an open-access article distributed under the CC BY-SA 4.0 License https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

## Optimasi Formula Tepung Komposit Tinggi Protein dan Seng dengan Response Surface Methodology

## [Optimization of High Protein and Zinc Composite Flour Formulation with Response
Surface Methodology]

## Christina Mumpuni Erawati* dan Ardhia Deasy Rosita Dewi
Program Studi Biologi, Fakultas Teknobiologi, Universitas Surabaya, Surabaya, Indonesia
Diterima 13 Desember 2021 / Disetujui 18 Juli 2022

## ABSTRACT
Covid- 19  pandemic  had  limited  people’s  movement  despite  the  demand  to  remain  productive  and maintain good health. Therefore, it was necessary to provide foods which are easy to distribute, durable, nutritious, and easily transformable to increase immunity. This research aims to develop a composite flour (TK) formula with optimal proportion of wheat flour (TT), snakehead fish flour (TIG), pumpkin flour (TBuL), and pumpkin seed flour (TBiL) which then enriched with zinc. The resulting TK is expected to be used as an ingredient for nutritious snacks containing high protein and zinc. The research was conducted in four stages, namely the making of each constituent flour, determining the best formulation with the Response Surface Methodology using Central Composite Design model, characterizing the physicochemical properties of TK and  making  meatballs,  biscuits,  and  unting-unting  from  the  TK.  The  three  products  were  tested  on experimental animals for their metabolic responses. The optimization of the formula resulted in three optimal formulations, namely formula A, B, and C with the proportion of TT:TIG:TBuL:TBiL respectively as follows 55:20:15:10;  56.65:20:13.35:10;  57.98:20:12.02:10.  The  most  optimal  formula  of  composite  flour  was formula A with the highest protein (26.12%) and zinc (18.06 mg/kg) content among other formulas. Then, zinc was added into Formula A using microencapsulation, and TK with protein content of 26.74% and zinc of 56.8 mg/kg were obtained. The histopatology observation on experimental animals showed that the three products made from TK did not cause necrosis of the liver or cell infiltration in the kidneys .
Keyword: composite flour, covid 19, protein, zinc

## ABSTRAK
1
Pandemi  Covid 19 menyebabkan  ruang gerak  terbatas,  aktivitas  harus tetap  produktif  dan  imunitas harus tetap terjaga. Oleh karena itu, diperlukan suatu bentuk bahan pangan yang mudah didistribusikan, tahan  lama,  banyak  aplikasi  produk  yang  dapat  dibuat  dan  mampu  mencukupi  kebutuhan  gizi  untuk meningkatkan imunitas. Penelitian ini dilakukan untuk membuat suatu formula tepung komposit (TK) dengan proporsi bahan yang optimal dari tepung terigu (TT), tepung ikan gabus (TIG), tepung buah labu (TBuL) dan tepung  biji  labu  (TBiL)  kemudian  diperkaya  dengan  mineral  seng  secara  mikroenkapsulasi.  TK  ini diharapkan dapat digunakan sebagai bahan baku pembuatan makanan selingan yang memenuhi kebutuhan gizi  tinggi  energi  tinggi  protein  terutama  kebutuhan  mineral  seng  para  tenaga  kesehatan  dalam  tim penanganan  Covid-19  serta  masyarakat  pada  umumnya.  Penelitian  dilakukan  dalam  empat  tahap  yaitu pembuatan  masing-masing  tepung  penyusun,  menentukan  formulasi  terbaik  dengan  metode  Response Surface  Methodology  (RSM)  dengan  model Central  Composite  Design ,  karakterisasi  fisikokimia  TK  dan pembuatan produk makanan selingan bakso, biskuit, dan unting-unting. Produk kemudian diberikan pada hewan coba dan  diamati respon metabolismenya. Hasil optimasi formula menampilkan tiga formula optimal yaitu  formula  A,  B  dan  C  dengan  proporsi  TT:TIG:TBuL:TBiL  berturut-turut  adalah  55:20:15:10; 56,65:20:13,35:10; 57,98:20:12,02:10. Tepung komposit formula A memiliki kadar protein dan seng paling tinggi dengan kadar protein (26,12%) dan seng (18,06 mg/kg). Formula A ini kemudian ditambah mineral seng  secara  mikroenkapsulasi  dan  diperoleh  TK  dengan  kadar  protein  26,74%  dan  seng  sebesar  56,8 mg/kg. TK diaplikasikan pada pembuatan produk bakso, biskuit, dan unting-unting lalu uji respon metabolis- me  pada  hewan  coba.  Pengamatan  histopatologi  pada  hewan  coba  menunjukkan  bahwa  produk  bakso, biskuit, dan unting-unting. berbahan baku TK tidak menyebabkan nekrosis pada organ hati atau infiltrasi sel pada ginjal.
Kata kunci: covid 19, protein, seng, tepung komposit

## PENDAHULUAN
Pandemi  covid-19  membuat  ruang  gerak masyarakat  terbatas.  Di  lain  pihak,  imunitas  tubuh mesti terjaga. Salah satu alternatif menghadapi pan- demi maupun kondisi-kondisi darurat adalah dengan membuat tepung komposit sebagai bahan baku ber- bagai produk aplikasi terutama untuk makanan seli- ngan.  Mineral  seng  saat  ini  sudah  digunakan  oleh berbagai  pihak  untuk  menghadapi  virus  corona (covid-19)  baik  sebagai  anti  inflamasi,  antioksidan, produksi  metallothionein, complement  activity ,  akti- vasi NK cell , phagocytosis maupun sebagai antivirus yang mampu menghambat replikasi virus dalam pro- ses  translasi  dan  transkripsi.  Mekanisme  kerja mineral seng ini cukup kompleks namun sudah teruji dalam studi in vitro maupun uji klinik (Pal et al., 2020). UNICEF dan WHO juga telah menyarankan penam- bahan  garam  seng  untuk  menangani  kasus  diare pada penderita covid-19 karena diketahui bahwa pe- nambahan  garam  seng  dapat  meningkatkan  penye- rapan  air  (Murugaia et  al., 2020).  Namun  demikian, pemberian  tambahan  seng  pada  bahan  makanan perlu  memperhatikan  aturan  pemakaian  maupun formulasi bahan yang terlibat karena ada bahan yang memperkuat  maupun  melemahkan  bioavailabilitas seng. Bahan yang memperkuat bioavailabilitas seng diantaranya  protein  dan  yang  melemahkan  adalah tannin dalam teh maupun asam fitat (Yohanes, 2013).
Ikan  gabus  sering  digunakan  sebagai  sumber protein  dalam  berbagai  penelitian  karena  memiliki kandungan  protein  yang  lebih  tinggi  dibandingkan ikan  air  tawar  lainnya  (Prastari et  al., 2017).  Ikan gabus  memiliki  kadar  protein  sekitar  25,5%  dan albumin  6,22%  (Susetyowati et  al., 2020).  Tepung labu kuning memiliki kadar provitamin A dan mineral kalsium,  fosfor  dan  zat  besi  (Susetyowati et  al., 2020).  Labu  adalah  sumber  yang  baik  dari  karoten, serat  makanan,  vitamin,  mineral  dan  rendah  lemak. Oleh karena itu, labu biasa digunakan sebagai bahan makanan  berbagai  kasus  kesehatan  seperti  maka- nan  anak  gizi  kurang,  pangan  untuk  penderita  dia- betes,  pangan  tinggi  antioksidan,  antikarsinogenik maupun  antiinflamasi.  Biji  labu  memiliki  beberapa kandungan  mineral,  salah  satunya  adalah  seng (Sharma et  al., 2019).  Optimasi  formula  TK  diperlu- kan  supaya  berbagai  bahan  baku  tepung  itu  saling mendukung hingga  diperoleh manfaatnya sampai di tubuh  manusia.  Harapan  lebih  lanjut,  TK  ini  dapat diproduksi untuk kebutuhan masyarakat pada umum- nya  sebagai  bahan  baku  makanan  selingan  tinggi protein  dan  seng  yang  diperlukan  untuk  menjaga imunitas  dan  meningkatkan  kemampuan  melawan infeksi  di  masa  pandemi.  Setelah  mendapatkan  for- mulasi  yang  tepat  untuk  produk  tepung  komposit tinggi protein dan seng penelitian dilanjutkan dengan fortifikasi  tepung  komposit  tepilih  dengan  mikroen- kapsulasi  seng  untuk  mencapai  kecukupan  kadar
seng dalam TK yang hilang sebagian karena proses pengolahan.
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  mengetahui formulasi optimum TK yang diharapkan dapat meme- nuhi kebutuhan gizi tenaga kesehatan dan masyara- kat pada umumnya terutama pemenuhan kebutuhan protein  dan  seng.  Tepung  komposit  (TK)  dirancang tinggi protein dan mineral seng menggunakan bahan lokal yaitu tepung ikan gabus (TIG), tepung buah labu (TBuL),  serta  tepung  biji  labu  (TBiL).  Campuran tepung-tepung  tersebut  kemudian  ditambah  tepung terigu (TT) dan mineral seng dengan metode mikro- enkapsulasi. Selain itu, rancangan TK ini diharapkan dapat  memenuhi  kebutuhan  gizi  tenaga  kesehatan yang berhadapan langsung dengan penderita covid- 19  dan  masyarakat  pada  umumnya  berdasarkan AKG  penyesuaian  dalam  Panduan  Praktis  Penata- laksanaan Nutrisi covid-19 (Taslim et al., 2020) pada porsi makanan selingan.
Karakterisasi  produk  TK  dilakukan  secara  fisik, kimia,  mikrobiologi  dan  aspek  keamanan  pangan. Dalam penelitian ini, uji keamanan pangan dilakukan karena produk TK diperkaya mineral seng. Pengujian dilakukan dengan uji respon metabolisme dari organ hati dan ginjal hewan coba setelah TK menggantikan proporsi tepung terigu pada beberapa makanan seli- ngan  yang  biasa  dikonsumsi  masyarakat.  Makanan selingan ini adalah biskuit (mewakili pengolahan de- ngan pemanggangan) dengan proporsi tepung terigu sekitar 42,8% dari resep totalnya, unting-unting (me- wakili  pengolahan  dengan  penggorengan)  dengan proporsi  tepung  terigu  sekitar  62,1%  dari  resep totalnya  dan  bakso  (mewakili  pengolahan  dengan perebusan)  dengan  proporsi  tepung  terigu  sekitar 29,6% dari resep totalnya. Ketiga makanan selingan tersebut  dibuat  dengan  penambahan  telur  untuk memberi kontribusi vitamin D (Valentina et al., 2014).

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini ada- lah buah labu kuning dan ikan gabus yang dibeli dari pasar  tradisional  di  Kecamatan  Rungkut  Surabaya serta  tepung  terigu  protein  sedang,  C 4 H 4 Na 2 O 5 (Merck,  Jerman),  CaCl 2 (Sigma-Aldrich  Ireland  Ltd), NaNO 3 (Merck,  Jerman),  C 2 H 3 NaO 2 ,  ethanol  99% (Sigma-Aldrich Ireland Ltd), HCl bufer (pH 1,5), KOH (Sigma-Aldrich Ireland Ltd), Sodium Acetate (Sigma- Aldrich Ireland Ltd).

## Proses pembuatan TBuL dan TBiL
Proses  pembuatan  TBuL  dan  TBiL  mengacu pada metode Diska (2018) dengan modifikasi. Buah labu  kuning  dikupas  dan  dipisahkan  antara  bagian daging buah dan bagian biji labu. Bagian daging buah dipotong  dalam  bentuk  irisan  ( slice) dengan  kete-
balan  ±2mm  lalu  dikeringkan  menggunakan  penge- ring  kabinet  (Omron  E5CSL/E5EWL,  Jepang)  pada suhu 50 ° C selama 15 jam sambil dibolak balik setiap 2 jam hingga kering merata. Setelah itu, dihancurkan dengan  blender  hingga  halus  dan  diayak  dengan ayakan 100 mesh. Biji labu kuning disortir dan diber- sihkan lalu dikeringkan menggunakan sinar matahari selama  3-4  jam,  kulit  biji  labu  dikupas,  dihancurkan dengan  blender  hingga  halus  dan  diayak  dengan ayakan 100 mesh.

## Proses pembuatan TIG
Proses pembuatan TIG mengacu pada metode Sari et  al. (2014)  dengan  modifikasi.  Ikan  gabus dibersihkan  dan  bagian  kepala,  ekor,  isi  perut,  sisik dan sirip dibuang lalu dibelah pada bagian punggung, dicuci  dan  dikukus  selama  15  menit  pada  suhu sekitar 90°C. Daging ikan dikeringkan menggunakan cabinet dryer (Omron E5CSL/E5EWL, Jepang) pada suhu 60°C selama 72 jam sambil dibolak balik hingga kering merata. Daging ikan yang telah kering, dihan- curkan lalu diayak dengan ukuran 60-80 mesh.

## Formulasi tepung komposit
Metode penelitian untuk mendapatkan formulasi tepung komposit ini termasuk penelitian eksperimen- tal. Penelitian ini menggunakan metode central com- posite design (CCD) untuk mencocokkan permukaan respon  dalam Response  Surface  Methodology (RSM). CCD dalam proses optimasi dilakukan untuk mengetahui  perkiraan  arah  optimal  karena  dalam RSM  optimasi  dan  lokasi  optimal  tidak  diketahui. Penemuan titik optimum dilihat dari desirability yang dihasilkan.  Titik  optimum  yang  baik  memiliki desi- rability yang tinggi  atau mendekati  1 (Hidayat et al., 2021).  Tahapan  pertama  yang  dilakukan  adalah perancangan  dengan  faktor  berupa  proporsi  bahan penyusun  tepung  komposit  berdasarkan  penelitian sebelumnya yaitu TT (komponen A) pada kisaran 55- 70%,  TIG  (komponen  B)  15-25%,  TBuL  (komponen C)  sekitar  0-15%,  dan  TBiL  (komponen  D)  0-10% (Erawati dan Khasanah, 2021) hingga menghasilkan 20  formula.  Pada  tahapan  ini  juga  ditentukan  batas atas  dan  batas  bawah  tiap  komponen  penyusun tepung  komposit.  Tahapan  selanjutnya  adalah ana- lyzing menggunakan respon protein (%) dan respon kandungan mineral seng (mg/kg) untuk melihat signi- fikansi  dan  optimasi  formula  dengan  kadar  protein dan mineral seng tertinggi pada responnya.

## Proses mikroenkapsulasi Seng (Zn)
Proses  mikroenkapsulasi  seng  (Zn)  mengacu pada metode Kustiyah et al . (2011) dan Santoso et. al .  (2016)  dengan  modifikasi.  Seng  yang  dicampur- kan adalah Seng-asetat (Zn-asetat) (Merck, Jerman) yang  bioavailabilitasnya  lebih  baik  dibandingkan ZnSO 4 . Bahan penyalut pada mikroenkapsulasi ada- lah  gum  arab  (Merck,  Jerman)  dan  maltodekstrin
(Merck, Jerman) dengan perbandingan 80:20 dengan intinya  adalah  Zn-asetat  dan  pengeringan  menggu- nakan metode spray drying (Buchi B290). Fortifikasi Zn  dilakukan  pada  tepung  komposit  terpilih  dengan didasarkan pada AKG tenaga kesehatan dan masya- rakat umum dalam tiga jenis makanan selingan yaitu biskuit,  unting-unting  dan  bakso.  Selanjutnya  ketiga produk olahan tersebut diuji respon metabolismenya pada hewan coba dan sifat fisikokimianya.

## Analisis produk
Tepung  komposit  terpilih  dengan  RSM  dan ditambahkan  hasil  mikroenkapsulasi  seng  sesuai AKG  merupakan  produk  akhir  penelitian  ini  yang disebut  sebagai  TK.  Karakterisasi  yang  dilakukan pada  TK  adalah  uji  parameter  fisik  berupa  densitas kamba  (Indriyani et  al., 2013)  dan  warna  produk (Kaemba et  al .,  2017),  pengujian  parameter  kimia dengan basis basah meliputi kadar air metode oven (AOAC, 2005), kadar abu (AOAC, 2005), kadar lemak metode Soxhlet (AOAC, 2005), kadar protein metode Kjeldahl  (AOAC,  2005),  karbohidrat  metode  Luff Schrool, analisis seng dilakukan dengan alat Atomic Absorption  Spectroscopy (AAS)  dan  pengujian  res- pon metabolisme seng pada hewan coba (Sugihartini dan  Fajri,  2016;  Prasetyo,  2020).  Pengujian  mikro- biologi, khususnya angka lempeng total dan Bacilus cereus (SNI  2973-2011).  Prinsip  pengujian  angka lempeng  total  adalah  pertumbuhan  bakteri  mesofil aerob  setelah  contoh  diinkubasi  dalam  pembenihan yang  sesuai  selama  28  jam  pada  suhu  35±1°C. Sementara  itu,  prinsip  pertumbuhan Bacilus  cereus adalah  ditandai  dengan  terbentuknya  koloni  eosin merah  muda  penghasil  lechitinase  yang  diikuti dengan uji konfirmasi pada berbagai media.

## Uji respon metabolik pada hewan coba
Uji respon metabolik TK yang diaplikasikan pada resep makanan selingan  yang umum dibuat masya- rakat dilakukan secara in vivo dengan post-test only control  group  design mengacu  pada  metode Sugihartini dan Fajri (2016) dan Prasetyo (2020). Uji respon  metabolik  ini  menggunakan  mencit  galur BALB/c  jantan  yang  diperoleh  dari  pasar  hewan  di Singosari  Malang,  umur  8  minggu  bobot  20  g  yang diaklimatisasi selama 1 minggu dengan diberi pakan standar  dan  minum  akuades  secara ad  libitum . Mencit tersebut lalu dibagi menjadi 5 kelompok yang ditentukan secara acak. Pembedahan mencit dilaku- kan pada hari ke-21 melalui bius lokal menggunakan kloroform  (Sigma-Aldrich  Ireland  Ltd)  dan  secara euthanasia  lalu  diambil  organ  hati  dan  ginjal. Pemeriksaan organ mencit hingga membuat preparat histopatologinya.

## Analisis data
Penetapan  formula  diperoleh  dengan  metode central  composite  design (CCD)  menggunakan  20
J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 33(2): 119-128 Th. 2022
formula percobaan. Respon formula optimasi tepung komposit yang diperoleh selanjutnya dianalisis meng- gunakan  RSM  program Design  Expert 12.0.  Data parametrik dan non parametrik yang diperoleh pada uji fisikokimia dan uji respon metabolism pada hewan coba  dianalisis  menggunakan  ANOVA two-way dan dilanjutkan  dengan  Turkey  test  jika  signifikan ( p <0,05).  Data  non  parametrik  diuji  menggunakan Kruskall  Wallis  menggunakan  SPSS  rev  2019 (Hidayat et al., 2020)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  karakterisasi  warna  bahan-bahan  tepung penyusun tepung komposit
TK  terdiri  dari  TT,  TBuL,  TBiL  dan  TIG  yang selanjutnya  diuji  parameter  warna  menggunakan color  reader (Konica  Minolta  CR-10,  Jepang). Semakin  besar  nilai  L*  ( Lightness )  semakin  terang, semakin kecil nilai L* semakin gelap mendekati hitam (Tabel 1). Pengamatan parameter warna L* menun- jukkan bahwa TK ini memiliki warna relatif lebih gelap dibanding TT yang umum digunakan masyarakat dan TBuL yang memiliki nilai L* paling rendah atau paling gelap. Karakter warna gelap pada TBuL karena kan- dungan  pigmen  karotenoid  dari  bahan  buah  labu (Sharma et  al., 2019).  TBuL  inilah  yang  menyebab- kan  warna  gelap  menyerupai  warna  cokelat  pada produk aplikasinya.
Tabel 1.  Hasil  pengamatan  warna  tepung  bahan baku
Table 1.  The results of observing the color of the raw material flour
Tepung ( Flour ) L* a* b* TK 73.83 a 5.58 21.24 TT 90.83 a 1.00 9.40 TBuL 51.58 b 11.45 21.15 TBiL 52.40 b 2.15 15.23 TIG 81.85 a 2.08 15.45
Parameter  warna  a*  menunjukkan  kecenderu- ngan  warna  merah.  Pengamatan  parameter  warna hue  a*  menunjukkan  bahwa  TBuL  memiliki  angka tertinggi dibanding tepung lainnya. Parameter warna b*  menunjukkan  kecenderungan  warna  kuning.  Pe- ngamatan  parameter  warna  b*,  perbedaannya  tidak signifikan, hanya TBuL tetap memiliki angka tertinggi dibanding tepung lainnya.

## Hasil formulasi tepung komposit
Optimasi formula tepung komposit dari berbagai variasi  proporsi  tepung  menghasilkan  20  formula yang  digunakan  pada  CCD  (Tabel  2).  Penentuan
batas atas dan batas bawah variasi tepung komposit diperoleh  dari  penelitian  pendahuluan  yaitu  TT  55- 70%,  TIG  10-20%,  TBuL  0-15%,  dan  TBiL  0-10%. Selanjutnya, 20 formula tersebut masing-masing diuji kadar protein dan seng sebagai respon untuk menen- tukan  formula  yang  optimum.  Hasil  pengujian  pada Tabel  2  menunjukkan  kisaran  kadar  protein  pada tepung  komposit  antara  18,47-26,74%  dan  seng pada tepung komposit berkisar 11,3-31,7 mg/kg. Hal ini  menunjukkan  semakin  tinggi  penambahan  TIG pada  formula  optimum  yaitu  20%  memberikan  hasil kadar protein tertinggi (formula nomor 7). Hal ini juga memperkuat  hasil  penelitian  Nurilmala et  al. (2020) bahwa  kadar  protein  ikan  gabus  murni  adalah  ter- tinggi dibandingkan jenis ikan lain yaitu 105,23 mg/g, sementara  Dewantara et  al. (2019)  menguji  kadar protein pada tepung ikan gabus sebesar 84,77%.
Kandungan seng pada  tepung komposit teruta- ma dipengaruhi oleh penambahan TT dan TIG. TBuL juga  menyumbang  kandungan  seng  pada  tepung komposit.  Menurut  Cahyaningtyas et  al. (2014),  se- makin tinggi penambahan tepung labu kuning, sema- kin besar kandungan seng pada tepung. Jayadi dan Rahman (2018) menerangkan tepung ikan mengan- dung  seng  sebesar  0,6-4,7  mg/100  g  tepung  ikan. Hasil pengujian ANOVA pada Tabel 3 menunjukkan bahwa  formulasi  berbagai  variasi  proporsi  tepung berpengaruh nyata ( p <0,05) untuk parameter protein, tetapi tidak berpengaruh nyata pada parameter seng ( p >0,05).
Pada Gambar 1 terlihat bahwa model linier signi- fikan  ( p <0,05)  terhadap  kandungan  protein  tepung komposit. Lack of fit value (ketidaktepatan terhadap model) sebesar 0,37 yang menunjukkan tidak signifi- kan terhadap pure error (kesalahan/variasi data) Sig- nifikansi ini menunjukkan adanya kesesuaian antara data  respon  kandungan  protein  tepung  komposit terhadap  model  linier  pada  RSM.  Nilai predicted  R- squared dan adjusted  R-squared untuk  respon berturut-turut  sebesar  0,86  dan  0,89  menunjukkan bahwa data yang diprediksikan dan data aktual untuk respon protein tercakup ke dalam model sebesar 86 dan  89%. Adequate  precision (tanda  untuk  variasi data)  juga  mengindikasikan  sinyal  yang  memadai sehingga model ini dapat dijadikan pedoman prediksi formula yang baik.
Kandungan  seng  tepung  komposit  percobaan berkisar  antara  11,3-31,7%  (Gambar  2).  Pada Gambar 2 terlihat bahwa model linier tidak signifikan ( p >0,05) terhadap kandungan seng tepung komposit. Lack  of  fit  value sebesar  0,86  yang  menunjukkan tidak  signifikan  terhadap pure  error .  Signifikansi  ini menunjukkan adanya kesesuaian antara data respon kandungan  seng  tepung  komposit  terhadap  model linier pada RSM.
A: Terigu (%) A: Wheat Flour (%) B: t.Ikan (%) B: t.Fish (%) C: t.Labu (%) C: t.Pumpkin (%) Seng (mg/kg) Zinc (mg/kg) 83 28 55 38 10 0 A: Terigu (%) A: Wheat Flour (%) B: t.Ikan (%) B: t.Fish (%) C: t.Labu (%) C: t.Pumpkin (%) Protein (%) 83 28 55 38 10 0

## Tabel 2. Hasil uji protein dan seng dari 20 proporsi tepung
Table 2. Protein and zinc test results from 20 proportions of flou r Run TT (%) TIG (%) TBuL (%) TBiL(%) Protein (%) Seng (mg/kg) Zinc (mg/kg) 1 65.40 14.93 15.00 4.67 22.49 19.9 2 70.00 20.00 0.00 10.00 26.35 20.8 3 70.00 10.00 10.00 10.00 19.91 19.9 4 61.58 19.61 14.68 4.12 24.95 14.7 5 59.44 18.12 12.44 10.00 25.73 18.4 6 62.78 19.39 8.41 9.42 24.29 11.3 7 55.00 20.00 15.00 10.00 26.74 12.00 8 70.00 15.26 8.59 6.14 22.66 16.6 9 65.48 14.35 10.17 10.00 22.20 11.3 10 67.39 17.57 5.03 10.00 22.52 15.6 11 62.78 19.39 8.41 9.42 24.97 18.1 12 66.58 10.00 14.23 9.19 19.16 16.3 13 70.00 15.26 8.59 6.14 22.82 20.4 14 70.00 20.00 8.82 1.18 24.76 23.4 15 62.10 13.74 15.00 9.16 21.36 24.9 16 70.00 10.00 15.00 5.00 18.47 15.7 17 70.00 15.26 8.59 6.14 21.09 31.7 18 70.00 20.00 8.82 1.18 24.73 15.6 19 69.35 15.65 15.00 0.00 21.45 14.0 20 61.58 19.61 14.68 4.12 24.54 20.6

## Tabel 3. Hasil pengujian ANOVA untuk model linier RSM
Table 3. ANOVA test results for the RSM linear model
Variabel ( Variable ) F P R 2 Adj. R 2 Signifikansi ( Significant ) Protein (%) 56.92 <0.0001 0.9143 0.8983 Signifikan ( Significant ) Seng (mg/kg) Zinc (mg/kg) 0.50 0.858 0.00 0.00 Tidak signifikan ( Not significant )
Gambar 1.  Respon  kandungan  protein  tepung  kom- posit (TK) pada berbagai variasi tepung Figure 1.   Response  of  zinc  content  of  composite flour protein in various flour variations
Gambar 2.  Respon kandungan seng TK pada berba- gai variasi tepung
Figure 2.   Response  of  zinc  content  of  composite flour on various flour variations
Nilai predicted  R-squared dan adjusted  R- squared serta adequate  precision untuk  respon berturut-turut menunjukkan nilai 0 yang berarti model yang digunakan belum mampu memprediksikan for- mula yang baik untuk kandungan seng pada tepung komposit.  Metode  RSM  dilakukan  untuk  mencari formulasi terbaik dari 20 formulasi yang ada dengan kadar protein dan mineral seng sebagai masukannya menghasilkan 3 formula terbaiknya di Tabel 4.
Hasil RSM (Tabel 4) diperoleh hasil terbaik ada- lah formula optimasi A (formula nomor 7 CCD) yaitu TT  (55%),  TIG  (20%),  TBuL  (15%)  dan  TBiL  (10%) dengan  perkiraan  kadar  protein  26,12%  dan  kadar seng 18,06 mg/kg (nilai perkiraan kadar protein dan seng software RSM, sementara hasil uji laboratorium formula  nomor  7  CCD  pada  Tabel  2  adalah  kadar protein  26,74%,  seng  12  mg/kg.  Hasil  pengukuran kadar seng dibawah kadar seng hasil prediksi meng- gunakan software RSM.

## Hasil formulasi mikroenkapsulasi mineral seng
Mikroenkapsulasi dilakukan menggunakan gum arab dan maltodekstrin 80:20 (w/w) sebagai penyalut yang dilarutkan dalam aquades 193,5 mL hingga total larutan 213,5 g kemudian dikeringkan dengan spray dry pada suhu 110 ° C. Metode ini sama dengan meto- de yang dikerjakan Sari et al. (2014) dan menghasil- kan  serbuk  enkapsulasi  seng  dengan  kadar  seng 29,8 mg/kg. Sementara itu, formula tepung campuran TT, TIG, TBuL dan TBiL yang terpilih dari hasil RSM memiliki kadar seng 12 mg/kg (Tabel 4).
Nilai kecukupan gizi tenaga kesehatan yang ber- hadapan langsung dengan penderita covid-19 adalah 20  mg/kg/hari  (Taslim et  al., 2020),  sehingga  perlu tambahan mineral seng sebesar 8 mg/kg. TK (dibuat dengan mencampur TT, TIG, TBuL dan TBiL dengan proporsi  terpilih/formula  7)  sebanyak  1  kg  ditambah bubuk mikroenkapsulasi hasil pengeringan spray dry sebanyak 270 mg, demikian pula kelipatannya.

## Hasil  karakterisasi  fisikokimia  tepung  komposit (TK)
Karakterisasi  fisikokimia  TK  terdiri  dari  analisis kadar air; kadar abu; kadar lemak; kadar protein dan kadar  seng  berturut-turut  adalah  6,54;  2,48;  1,00; 26,74%  dan  56,8  mg/kg.  Kadar  seng  TK  ini  lebih
tinggi daripada kadar seng TT yaitu 26,2 mg/kg. Hal ini memperlihatkan hasil formulasi TK yang diperkaya dengan  mikroenkapsulasi  mineral  seng  menghasil- kan kadar  seng  sekitar  2  kali  lipat  kadar  seng  pada TT  yang  biasa  digunakan  masyarakat  dalam  pem- buatan  makanan  selingan.  Demikian  pula,  kadar protein  TK  sebesar  26,74%  jauh  lebih  tinggi  dari tepung terigu yang biasanya berkisar 7-12% protein.
Dampak dari pencampuran tepung juga  terlihat dari pengamatan fisik yaitu daya serap air dari cam- puran  tepung  (TK)  dibanding  salah  satu  tepung  pe- nyusunnya  (TT).  Perubahan  daya  serap  air  menye- babkan  kebutuhan  air  untuk  membentuk  adonan produk  olahan  juga  berbeda  (Rauf  dan  Sarbini, 2015).  TK  memiliki  daya  serap  lebih  tinggi  (42,9%) daripada  TT  (33,1%)  karena  selain  berbeda  jenis tepung juga ada perbedaan umur produksi. TT yang dibeli di pasar retail tentunya sudah menjalani lama- nya  penyimpanan  selama  transportasi  maupun  di pajangan,  sehingga  sudah  cukup  menyerap  air (relatif  lebih  jenuh)  karena  sifat  kering  tepung  yang higroskopis.  TK  diproduksi  baru  dalam  kisaran  1-2 bulan  sehingga  lebih  kering  dan  daya  serap  airnya lebih tinggi.  Selain itu, perbedaan daya serap air ini bisa  terjadi  karena  distribusi  ukuran  partikel  yang cukup  besar  yaitu  75-400  mikron  (Gambar  3). Semakin  kecil  ukuran  partikel  semakin  besar  luas permukaan  dan  akan  lebih  mudah  menyerap  air. Molekul dengan bobot massa kecil menyebabkan po- sisi agak renggang sehingga lebih mudah menyerap air  (Aini et  al., 2016).  Makin  tinggi  daya  serap  air campuran tepung, semakin banyak volume air  yang dibutuhkan  untuk  membentuk  adonan  yang  baik (Rauf dan Sarbini, 2015) pada pembuatan roti.
Pengukuran  sudut  curah  sangat  dipengaruhi oleh  ukuran,  bentuk,  karakteristik  permukaan  parti- kel, kadar air dan kerapatan tumpukan. Tepung gan- dum  dengan  kadar  air  13%  memiliki  sudut  curah 33,60 ° (Khan dan Saini, 2016). Tepung kunyit dengan kadar air 15,86-17,32% memiliki ukuran partikel (150- 425 µ m) dan kisaran sudut curah 27-41° (Priastuti et al., 2016). Sudut curah TK terukur 35° dan TT terukur 38°. Ukuran partikel TK berkisar 75-400 µ m (Gambar
3).

## Tabel 4. Hasil optimasi formula tepung komposit menggunakan metode RSM
Table 4. Optimization results of composite flour formula using the RSM method
Formula TT(%) TIG (%) TBuL (%) TBiL (%) Protein (%) Seng (mg/kg) Zinc (mg/kg) A 55.00 20 15.00 10 26.12 18.06 B 56.65 20 13.35 10 26.04 18.06 C 57.98 20 12.02 10 25.98 18.06
Keterangan:  A=  Perbandingan  tepung  terigu:tepung  labu  (55:15);  B=  Perbandingan  tepung  terigu:tepung  labu (56,65:13,35); C= Perbandingan tepung terigu:tepung labu (57,98:12,02)
Note: A= Comparison of wheat flour:pumpkin flour (55:15); B= Comparison of wheat flour:pumpkin flour (56.65:13.35); C= Comparison of wheat flour:pumpkin flour (57.98:12.02)
B

## A
Hasil ini menunjukkan bahwa ukuran partikel TK tidak  terlalu  homogen,  karena  masih  menggunakan peralatan sederhana di laboratorium namun memiliki kisaran sudut curah yang relatif sama dengan tepung lain maupun tepung komersial (TT).
Gambar 3.  Ukuran  partikel  tepung  komposit  (perbe- saran 400x (A)  dan 100x (B))
Figure 3.   Particle size of composite flour (400x (A) and 100x magnification (B))
Ukuran partikel tepung labu berkisar 74-841 µ m dengan  densitas  kamba  berkisar  0,5-0,7  g/cm 3 (Ahmed et al., 2014). Densitas kamba TK (0,63 g/mL) dan  TT  (0,71  g/mL).  Densitas  kamba  tepung  beras
merah  adalah  0,70  g/mL  (Rachma et  al., 2018), sementara  densitas  kamba  pangan  bubuk  pada umumnya berkisar 0,3-0,8 g/cm 3 (Ardhianditto et al., 2013).  Semakin  besar  densitas  kamba,  semakin efektif dan efisien dalam aspek penyimpanan bahan, karena  dengan  volume  (ruang)  penyimpanan  yang sama jumlah bobot bahan yang ditampung akan lebih banyak  (Ramdhiana et  al., 2020).  Beberapa  penga- matan fisik ini dapat menunjukkan bahwa keperluan alat/mesin untuk tepung dengan karakteristik TK tidak banyak berbeda dengan keperluan alat/mesin untuk tepung  yang telah  produksi secara komersial hanya perlu perbaikan dalam proses milling sehingga distri- busi ukuran partikel bisa diperkecil.
Hasil  karakterisasi  kimia  dan  mikrobiologi  serta uji  respon  metabolisme  TK  dalam  produk  seli- ngan
Kebutuhan  gizi  untuk  para  tenaga  kesehatan dalam penelitian ini lebih difokusksn untuk terpenuhi- nya  kebutuhan  protein  dan  seng  pada  TK  sebagai bahan  baku  pembuatan  makanan  selingan.  TK  ini diujikan  pada  beberapa  produk  yang  biasa  dibuat masyarakat umum yaitu biskuit (produk dipanggang), bakso  (produk  direbus)  dan  unting-unting  (produk digoreng). Tabel 5 menunjukkan kadar seng tertinggi ada  pada  produk  biskuit  (37,0  mg/kg)  dan  terendah ada  pada  produk  bakso  (16,6  mg/kg).  Data  karak- teristik  kimia  TK  memiliki  kadar  seng  sebesar  56,8 mg/kg  maka  pengolahan  dengan  pemanggangan cukup dapat mempertahankan mineral seng dari TK dibanding perebusan maupun penggorengan. Hal ini kemungkinan  karena  mineral  seng  terlarut  dan mengendap pada air rebusan maupun minyak peng- goreng.  Mineral  seng  termasuk  logam  berat  yang pada dasarnya bersifat mengendap (Triantoro et al., 2017).
Kebutuhan mineral seng per hari dapat ditentu- kan  dari  umur,  jenis  kelamin,  dan  aktivitas  fisik. Taslim et al. (2020) telah mengatur AKG penyesuaian untuk tenaga kesehatan yang berhadapan langsung dengan  penderita  covid-19.  Berdasarkan  Pedoman Gizi Seimbang (PGS) untuk 1 kali makanan selingan yaitu 10%  dari  kebutuhan  AKG  (dalam  1  hari  ada  2 kali makanan selingan).

## Tabel 5. Hasil analisis gizi dan mikrobiologis pada produk aplikasi
Table 5. Results of nutritional and microbiological analysis on application products
Parameter Bakso ( Meatball ) Unting-Unting Biskuit ( Biscuit ) Metode ( Method ) Seng (mg/kg) ( Zinc mg/kg ) 16.6 29.3 37.0 AAS Karbohidrat (%) ( Carbohydrate (%) ) 16.4 31.5 38.8 Luff Schrool Protein (%) 13.8 8.3 6.3 Kjeldahl Lemak (%) ( Fat (%) ) 3.9 21 19.7 Ekstraksi B.cereus 0 0 0 Koloni/g
AKG  mineral  seng  untuk  tenaga  kesehatan adalah 2 mg/kg untuk sekali periode makan makanan selingan  per  hari  sehingga  didapatkan  banyaknya makanan selingan untuk memenuhi kebutuhan mine- ral seng yaitu 12 butir bakso (@10 g bakso/ butir), 9 biji unting (@8 g unting/biji), atau 11 keping biskuit (@ 5 g biskuit/keping). AKG protein 1 kali periode makan makanan selingan tenaga kesehatan covid-19 adalah 1,5%  sehingga  jika  dikonversikan  pada  banyaknya makanan  selingan  didapatkan  1  butir  bakso,  3  biji unting atau 5 keping biskuit.
Kadar  seng  pada  bakso,  unting-unting,  biskuit berturut-turut sebesar 16,6; 29,3; dan  37 mg/kg, ter- nyata tidak membuat histopatologi organ hati mencit mengalami  nekrosis  dan  organ  ginjal  juga  tidak mengalami  infiltrasi  sel.  Kedua  organ  masih  dalam keadaan  normal,  hal  ini  dikarenakan  penurunan kadar seng plasma posprandial pada mencit sehing- ga absorpsi seng terhambat juga efikasi seng makin menurun  dengan  meningkatnya  dosis  seng  yang diberikan seperti 40% efikasi pada 15 mg pemberian seng  (Santosa et  al., 2016).  Toksisitas  seng  terjadi pada penyerapan 300 mg/hari (Santosa et al., 2016).

## KESIMPULAN
Hasil optimasi formula menampilkan tiga formu- lasi optimal yaitu formula A, B dan C dengan proporsi TT:TIG:TBuL:TBiL  masing-masing  formula  adalah 55:20:15:10;  56,65:20:13,35:10;  57,98:20:12,02:10. Kadar protein dan seng tertinggi dari formula optimal tepung komposit hasil RSM adalah formula A dengan kadar protein (26,12%) dan seng (18,06 mg/kg). Hasil optimasi  formula  lalu  diperkaya  mineral  seng  dan dihasilkan TK dengan kadar protein 26,74% dan seng 56,8  mg/kg.  Hasil  uji  respon  metabolisme  hewan coba  terhadap  produk  aplikasi  TK  (dalam  bentuk biskuit, bakso, unting unting) menunjukkan hasil bah- wa  ketiga  produk  aplikasi  tersebut  tidak  membuat histopatologi  organ  hati  hewan  coba  mengalami nekrosis  dan  organ  ginjal  hewan  coba  juga  tidak mengalami  infiltrasi  sel  (Gambar  4  dan  Tabel  6). Produk TK ini berpotensi menjadi bahan baku maka- nan  selingan  dalam  upaya  menjaga  imunitas  tubuh dan  meningkatkan  kemampuan  tubuh  melawan infeksi covid-19.
Keterangan: A= Kontrol, B= Tepung Komposit, C= Bakso, D= Biskuit, E= Unting-unting Note: A=Control, B= Composite Flour, C=Meatball, D=Biscuit, E= Unting-unting
Gambar 4.  Gambaran histopatologi organ hati mencit setelah 14 hari diberikan perlakuan dibanding kontrol Figure 4.   Histopathological picture of the liver of mice after 14 days of treatment compared to control
A B C D E

## Tabel 6. Hasil histopatologi mencit setelah 14 hari diberikan makanan selingan
Table 6. Histopathological results of mice after 14 days of being given a snack
Kelompok ( Group ) Hasil Histopatologi Organ ( Organ Histopathology Results ) Hati ( Heart ) Ginjal ( Kidney ) Kontrol ( Control ) - - Perlakuan 1 (TK) ( Treatment 1 (Composite flour) ) - - Perlakuan 2 (Bakso) ( Treatment 2 (Meatball) ) - - Perlakuan 3 (Unting-unting) ( Treatment 3 (Unting-unting) ) - - Perlakuan 4 (Biskuit) ( Treatment 4 (Biscuit) ) - -
Keterangan: (-) menunjukkan tidak ada perubahan histopatologi organ Note: (-) indicate no histopathological changes in organs

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmed J, Al-foudari M, Al-Salman F, Almusallam AS. 2014. Effect of particle size and temperature on rheological, thermal, and structural properties of pumpkin  flour  dispersion.  J  Food  Eng  124:  43- 53. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2013.09.0 30
Aini N, Wijonarko G, Sustriawan B. 2016.  Sifat fisik, kimia dan fungsional tepung jagung yang dipro- ses  melalui  fermentasi.  Agritech  36:  160-169. https://doi.org/10.22146/agritech.12860
[AOAC]  Association  of  Official  Analytical  Chemists. 2005.  Official  Methods  of  Analysis.  Arlington. AOAC International.
Ardhianditto  D,  Affandi  DR,  Riyadi  NH,  Anandito RBK.  2013.  Kajian  karakteristik  bubur  bayi  ins- tan berbahan dasar tepung millet kuning ( Pani- cum sp .) dan tepung beras merah ( Oryza nivara ) dengan  flavor  alami  pisang  ambon  ( Musa  X paradisiaca  L .)  sebagai  makanan  pendamping ASI (MP-ASI). J Teknosains Pangan 2: 88-96.
Cahyaningtyas FI, Basito, Anam C. 2014. Kajian fisi- kokimia dan sensori tepung labu kuning ( Cucur- bita maschuta Durch ) sebagai substitusi tepung terigu  pada  pembuatan  eggroll.  J  Teknosains Pangan 3: 13-19.
Diska  AS.  2018.  Pengembangan Cookies dari  Te- pung Labu Kuning, Tepung Biji Labu Kuning, Te- pung Beras, dan Tepung Oncom Hitam yang Me- ngandung  Omega-3.  [Skripsi].  Bogor:  Fakultas Ekologi Manusia, Institut Pertanian Bogor.
Dewantara EC, Wijayanti I, Anggo AD. 2019. Karak- teristik  fisiko  kimia  dan  sensori  pasta  makaroni dengan  penambahan  tepung  ikan  gabus ( Channa striata ) . J Ilmu Teknol Perikanan 1: 22- 29.
Erawati  CM,  Khasanah  TA.  2021.  Pengaruh  formu- lasi  tepung  ikan  haruan,  tepung  buah  dan  biji labu  kuning  pada  biskuit  terhadap  kandungan gizi  dan  daya  terima.  J  Nutr  College  10:  1-9. https://doi.org/10.14710/jnc.v10i1.28486
Hidayat  B,  Hasanudin  U,  Nurdjanah  S,  Yuliana  N,
Akmal  S,  Muslihudin  M.  2020.  Optimasi  karak- teristik tepung komposit berbasis tepung onggok fermentasi  menggunakan  metode  Response Surface  Methodology  (RSM).  J  Aplikasi  Teknol Pangan  9:  126-132. https://doi.org/10.17728/ja tp.6005
Indriyani F, Nurhidajah, Suyanto A. 2013. Karakteris- tik  fisik,  kimia,  dan  sifat  organoleptik  tepung beras merah berdasarkan variasi lama pengeri- ngan. J Pangan Gizi 04: 27-34.
Jayadi YI, Rahman A. 2018.  Analisis kandungan gizi makro  pada  ikan  duo  (penja)  hitam  dan  putih sebagai pangan lokal Kota Palu. Ghidza: J Gizi Kesehatan  2:  31-38. https://doi.org/10.22487/ ghidza.v2i1.10421
Kaemba  A,  Suryanto  E,  Mamuaja  CF.  2017.  Karak- teristik  fisiko-kimia  dan  aktivitas  antioksidan beras  analog  dari  sagu  baruk  ( Arenga  micro- carpha )  dan  ubi  jalar  ungu (Ipomea  batatas  L. Poiret) . J Ilmu Teknol Pangan 5: 1-8.
Khan A, Saini CS. 2016. Effect of roasting on physico- chemical  and  functional  properties  of  flexseed flour, Cogent Eng 3: 1145566. https://doi.org/10. 1080/23311916.2016.1145566
Kustiyah  L,  Anwar  F,  Dewi  M. 2011.  Mikroenkapsu- lasi  mineral  besi  dan  seng  dalam  pembuatan makanan  tambahan  untuk  balita  gizi  kurang.  J Ilmu Pertanian Indonesia 13: 156-163.
Murugaiah  C,  Constance  LSL,  Al-Talib  H,  Nisha  M, Robin  T,  Chilek  TZT,  Baig  AA,  Guad  RM,  Soe MZ, Hossain AT, Salih FAM, al Shagga M. 2020. Zinc supplementation for  respiratory  illness and acute  gastroenteritis  as  complement  treatment for  covid-19.  Int  J  Med  Biomed  Stud  4:  79-81. https://doi.org/10.32553/ijmbs.v4i6.1203
Nurilmala M, Safithri M, Pradita FT, Pertiwi RM. 2020. Profil protein ikan gabus ( Channa striata ), toman ( Channa  micropeltes ),  betutu  ( Oxyeleotris  mar- morata ). J Pengolahan Hasil Perikanan Indone- sia  23:  548-557. https://doi.org/10.17844/jphpi. v23i3.33924
Pal A, Squitti R, Picozza M, Pawar A, Rongioletti M, Dutta  AK,  Sahoo  S,  Goswami  K,  Sharma  P, Prasat  R.  2021.  Zinc  and  COVID-19:  Basis  of current clinical trials.  Biol Trace Elem Res 199: 2882-2892. https://doi.org/10.1007/s12011-020-
02437-9
Prastari C, Yasni S, Nurilmala M. 2017. Karakteristik protein ikan gabus yang berpotensi sebagai anti- hiperglikemik.  J  Pengolahan  Hasil  Perikanan Indonesia  20:  413-423. DOI: https://doi.org/10. 17844/jphpi.v20i2.18109
Prasetyo DYB, Darmanto YS, Swastawati F, Agustini TW,  Wibisono  G,  Setyastuti  AI.  2020.  Analisa keamanan pangan secara in vivo ikan bandeng cabut duri dengan asap cair. PENA Aquatika 19: 11-20. https://doi.org/10.31941/penaakuatika.v 19i2.1162
Priastuti  RC,  Tamrin,  Suhandy  D.  2016,  Pengaruh arah  dan  ketebalan  irisan  kunyit  terhadap  sifat fisik  tepung  kunyit  yang  dihasilkan.  J  Teknik Pertanian Lampung 5: 101-108.
Rachma  YA,  Anggraeni  DY,  Surja  LL,  Susanti  S, Pratama  Y.  2018.  Karakteristik  fisik  dan  kimia tepung malt gabah beras merah dan malt beras merah  dengan  perlakuan  malting  pada  lama germinasi  yang  berbeda.  J  Aplikasi  Teknol Pangan  7:  104-110. https://doi.org/10.17728/ja tp.2707
Rauf  R,  Sarbini  D.  2015.  Daya  serap  air  sebagai acuan  untuk  menentukan  volume  air  dalam pembuatan  adonan  roti  dari  campuran  tepung terigu  dan  tepung  singkong.  Agritech  35:  324- 330. https://doi.org/10.22146/agritech.9344
Ramdhiana  RF,  Jannah  A, Wibaningwati  DB.  2020. Pengaruh  perlakuan  perendaman  terhadap  ka- rakteristik  tepung  talas  Bogor  ( Colocasia  escu- lenta L.Schott ) pada klon yang berbeda. J Agri- business  Agrotechnol  1:  58-68. https://doi.org/ 10.31938/agrisintech.v1i2.286
Santosa  H,  Handayani  NA,  Cahyono  H,  Arum  W, Purbasari  A,  Kusumayanti  H,  Ariyanti  D.  2016. Fortifikasi  seng  (Zn)  pada  beras  analog  berba- han dasar tepung dan pati ubi ungu. Reaktor 16: 183-188. https://doi.org/10.14710/reaktor.16.4.1 83-188
Sari  DK,  Marliyanti  SA,  Kustiyah  L,  Khomsan  A, Gantohe TM. 2014. Bioavailabilitas fortifikan, da- ya  cerna  protein,  serta  kontribusi  gizi  biskuit yang  ditambah  tepung  ikan  gabus  ( Ophioce- phalus  striatus )  dan  difortifikasi  seng  dan  besi. Agritech  34:  359-364. https://doi.org/10.22146/ agritech.9429
Sharma P, Kaur G, Kehinde BA, Chhikara N, Panghal A, Kaur H. 2019. Pharmacological and biomedi- cal uses of extracts of pumpkin and its relatives and  applications  in  the  food  industry:  a  review. Int  J  Vegetable  Sci  26:  79-95. https://doi.org/ 10.1080/19315260.2019.1606130
Sugihartini  N,  Fajri  MA.  2016.  Gambaran  histopato- logi organ hati  dan ginjal  mencit BALB/ setelah pemberian  krim  ekstrak  teh  hijau  ( Camellia sinensis L.).  J  Farmasi  Ilmu  Kefarmasian Indonesia 3: 32-38. https://doi.org/10.20473/jfiki.
v3i12016.32-38
Susetyowati,  Lestari  LA,  Astuti  H,  Setyopranoto  I, Probosuseno. 2020. Analisis mikroba dan orga- noleptik  makanan  cair  instan  berbasis  pangan lokal untuk perbaikan status gizi pasien. Amerta Nutr  4:  225-230. https://doi.org/10.20473/amnt. v4i3.2020.225-230
Taslim  NA,  Primana  DA,  Wijayanto,  Rani  NA, Marniar,  Bamahry  A,  FAradillah  A,  VIrani  D. 2020. Panduan Praktis Penatalaksanaan Nutrisi Covid  19,  (Versi  1),  Perhimpunan  Dokter Spesialis Gizi Klinik Indonesia. Jakarta.
Triantoro DD, Suprapto D, Rudiyanti S. 2017. Kadar logam berat besi (Fe), seng (Zn) pada sedimen dan jaringan lunak kerang hijau ( Perna viridis ) di Perairan  Tambak  Lorok  Semarang.  Manag Aquatic Resour J 6: 173-180. https://doi.org/10. 14710/marj.v6i3.20573
Valentina V, Palupi NS, Andarwulan N. 2014. Asupan kalsium dan vitamin D pada anak Indonesia usia 2-12 tahun. J Teknol Industri Pangan 26: 83-89. https://doi.org/10.6066/jtip.2014.25.1.83
Yohanes.  2013.  Bioavailabilitas  Besi  dan  Seng  Pro- duk Pangan Olahan Berbasis Terigu yang Ditam- bahkan  Na2EDTA  dengan  Kombinasi  Berbagai Minuman. [Skripsi]. Bogor:  Fakultas Ekologi Ma- nusia, Institut Pertanian Bogor.