PENINGKATAN KAPASITAS PRODUKSI GAS HIDROGEN (H 2 ) DENGAN SUBSTRAT  LIMBAH BIODIESEL OLEH   MUTAN GANDA
Enterobacter aerogenes AD-H43  DI BATCH STIRRED TANK REACTOR (BSTR)
Iwan Hidayat 1) , Mahyudin AR 2) Srikandi 3)* ,
1) Program Studi Kimia, Fakultas MIPA, UNB Bogor
2 ) BPPT PUSPIPTEK Serpong
3) Progam Studi Biologi, Fakultas MIPA, UNB Bogor Jl. K.H. Sholeh Iskandar Km. 4 Cimanggu, Tanah Sareal, Bogor 16166 Telp. 0251-8340217, 7535605 *e-mail: sriuus@yahoo.co.id

## ABSTRACT
Enhancement of Hydrogen Gas Production Capacity (H2) With Substrate of Biodiesel Waste By Double Multiles Enterobacter aerogenes Ad-H43 In Batch Stirred Tank Reactor (Bstr)
Hydrogen is the simplest element consisting of only one proton and one electron. Almost all components inside  the  cell  contain  hydrogen  atoms.  Hydrogen  gas  (H 2 )  consists  of  two  binding  hydrogen  atoms.  H 2 can  be producted by chemical / physics method and biological method. The production of H 2 by chemical / physics method is done  thermochemically  and  electrolyzed  water,  while  biologically  done  by  microorganisms  through  direct  and indirect biofotolysis  as  well  as light  and dark  fermentation.  The results  showed  that  H 2 production using  a double Enterobacter aerogenes AD-H43 mutant on the BSTR fermentor scale occurred an increase in H 2 capacity followed by  decreased  production  of  lactic  acid  due  to  mutation  with  Ethyl  Methane  Sulfonate  (EMS).  On  the  glycerol substrate E. aerogenes AD-H43 produces H 2 of 3.14 mol / mol glycerol while E. aerogenes AY-2 produces only H 2 of 2.65 mol / mol glycerol, or an increase of 18% compared to E. aerogenes AY-2 whereas for production lactic acid decreased 33% while in biodiesel waste E. aerogenes AD-H43 yield H 2 0.98 mol / mol glycerol and E. aerogenes AY- 2 only 0.85 mol / mol glycerol or about 15% increase and in purified biodiesel waste resulting in a higher yield of H 2 from biodiesel waste of 0.89 mol / mol glycerol at E. aerogenes AY-2 and 0.98 mol / mol glycerol in E. aerogenes AD-H43.
Keywords: Hydrogen, Enterobacter aerogenes, BSTR fermentor

## ABSTRAK
Hidrogen  adalah  unsur  paling  sederhana  yang  hanya  terdiri  dari  satu  proton  dan  satu  elektron.    Hampir semua komponen di dalam sel mengandung atom hidrogen.  Gas hidrogen (H 2 ) terdiri atas dua atom hidrogen yang berikatan.    Pembuatan  H 2 dapat  dilakukan  dengan  metode  kimia/fisika  dan  metode  biologis.    Produksi  H 2 dengan metode  kimia/fisika  dilakukan  secara  termokimia  dan  elektrolisis  air,  sedangkan  secara  biologis  dilakukan  oleh mikroorganisme melalui biofotolisis langsung dan tidak langsung serta fermentasi terang dan gelap. Hasil penelitian menunjukkan bahwa produksi H 2 menggunakan mutan ganda Enterobacter aerogenes AD-H43 pada skala fermentor BSTR  terjadi  peningkatan  kapasitas  H 2 dengan  diikuti  penurunan  produksi  asam  laktat  akibat  mutasi  dengan Ethyl Methane  Sulfonate (EMS).  Pada  substrat  gliserol E.  aerogenes AD-H43  memproduksi  H 2 sebesar  3.14  mol/mol gliserol  sedangkan E.  aerogenes AY-2  hanya    memproduksi  H 2 sebesar  2.65  mol/mol  gliserol,atau  mengalami kenaikan sebesar 18 % dibandingkan E. aerogenes AY-2 sedangkan untuk produksi asam laktatnya terjadi penurunan 33% sedangkan pada limbah biodiesel E. aerogenes AD- H43 menghasilkan yield H 2 0.98 mol/mol gliserol dan E. aerogenes AY-2 hanya 0.85 mol/mol gliserol atau terjadi kenaikan sekitar 15 % dan pada limbah biodiesel  yang di purifikasi  menghasilkan  yield  H 2 yang  lebih  tinggi  dari  limbah  biodiesel  yaitu  0.89  mol/mol  gliserol  pada E. aerogenes AY-2 dan 0.98 mol/mol gliserol  pada E. aerogenes AD-H43.
Kata Kunci: Hidrogen, Enterobacter aerogenes , fermentor BSTR

## PENDAHULUAN
Menurunnya cadangan minyak bumi mendorong  dilakukan  usaha  penghematan energi  dan  pencarian  sumber  energi  baru sebagai  alternatif.  Gas  hidrogen  (H 2 ) merupakan  bahan  bakar  yang  menjanjikan sebagai  bahan  bakar  alternatif  yang  ramah lingkungan  karena  dapat  diperbaharui, efisien,  dan  juga  karena  tidak  memiliki ikatan  dengan  karbon  sehingga  tidak menghasilkan  emisi  gas  buang  yang  dapat mencemari  lingkungan.  (Sardjoko,  1991, Ngundiwaluyo dan Amos, 1996)
Gas  H 2 dapat  dihasilkan  dengan bantuan  mikroorganisme  yang  dikenal sebagai  biohidrogen  (Said,  2007).  Gas  H 2 dapat  dihasilkan  oleh  beberapa  bakteri misalnya Enterobacter
aerogenes,
Clostridium  butyricum, dan Klebsiella  sp (Sang-Eun  Oh et.al ,  2003).  Pada  penelitian ini  yang  digunakan  adalah Enterobacter aerogenes  (E.  aerogenes )  Bakteri  tersebut dapat  menghasilkan  H 2 melalui  fermentasi gelap,  sehingga  tidak  tergantung  pada cahaya  matahari. E.  aerogenes juga  dapat menghasilkan H 2 lebih cepat dari mikroorganisme  fotosintetik  dan  dapat bertahan  hidup  pada  konsentrasi  H 2 yang tinggi    (Rachman,  1997). E.  aerogenes mampu  memanfaatkan  berbagai  macam substrat,  misalnya  gliserol,  substrat  tersebut dapat diperoleh dari limbah biodiesel karena merupakan  salah  satu  komponen  utama penyusun  limbah  tersebut    (Ngan et  al. , 2004).
Limbah biodiesel merupakan limbah organik  yang  dapat  digunakan  sebagai substrat  karena  kaya  akan  bahan-bahan organik.  Limbah biodiesel  yang merupakan sisa  hasil  pengolahan  minyak  kelapa  sawit menjadi  bahan  bakar  biodiesel  dapat dimanfaatkan sebagai substrat oleh beberapa mikroorganisme.  Substrat organik  di dalam limbah tersebut bermacam-macam, di antaranya  karbohidrat,  protein,  lipid,  dan asam  nukleat  (Ngan et.al ,  2004).  Indonesia merupakan  salah  satu  negara  penghasil kelapa  sawit  terbesar,  sehingga  penggunaan limbah tersebut untuk  produksi biohidrogen bersifat ekonomis dan menguntungkan.
Produksi  H 2 secara  teoritis  pada fermentasi  asetat  menghasilkan  4  mol
H 2 /mol glukosa, sedangkan produksi H 2 oleh E. aerogenes menggunakan  substrat  gliserol hanya  mencapai  0.669  mol  H 2 /mol  gliserol
(Nishio dan Nakashimada, 2004). Pengembangan  galur E.  aerogenes untuk mendapatkan  produktivitas  H 2 lebih  tinggi juga  telah  dilakukan  dengan  melakukan mutasi  pada E.  aerogenes HU-101  dengan senyawa kimia N-methyl-N’-nitro-N-
nitrosoguanidine (NTG), kemudian diseleksi dengan alil  alkohol dan proton  suicide menghasilkan  suatu  mutan E.  aerogenes AY-2.  Produksi  H 2 oleh    mutan E. aerogenes AY-2  menghasilkan  1,17  mol H 2 /mol glukosa atau 1,5 kali lebih tinggi dari E.aerogenes HU-101  (Rachman  dkk,  1997), sedangkan  secara  teoritis  (stoikiometri) adalah  1  mol  H 2 /mol  gliserol  (Ngan et.al , 2004).  Produktivitas  H 2 oleh  mutan E. aerogenes AY-2  masih  dapat  ditingkatkan melalui perubahan metabolisme yaitu dengan menghambat pembentukan metabolit berupa alkohol dan asam organik . Perubahan metabolisme pada mikroorganisme  dapat  dilakukan  dengan mutagenesis  menggunakan  suatu  mutagen, antara  lain  mutagen  kimia Ethyl  Methane Sulfonate (EMS). Dari penelitian sebelumnya  diperoleh  informasi  bahwa EMS  memberikan  efek  mutasi  sehingga terjadi  perubahan  jalur  metabolisme  pada mutan E. aerogenes
AY-2 dengan memproduksi  asam  laktat  lebih  rendah  dari sebelumnya, sehingga mengakibatkan Mutan  ganda E.  aerogenes AD-H43.  Mutan ganda E.  aerogenes AD-H43  memiliki produktifitas  H 2 lebih  tinggi  yaitu  sebesar 20% dari nilai produksi mutan E. aerogenes AY-2    pada  skala  vial  botol  (50  ml)    (Said, 2007).

## BAHAN DAN METODE

## Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah mutan  ganda E.  aerogenes AD-H43  dan mutan E.  aerogenes AY-2,    ekstrak  khamir (Scharlau 07-079), Tripton (Oxoid), KH 2 PO 4 (Univar),  K 2 HPO 4 (Univar),  MgSO 4 . 7H 2 O (Merck),  gliserol,  Na 2 CO 3 ,  NaOH  (Merck), HCl  (Merck),  akuades,  akuabides,  limbah biodiesel, (NH 4 ) 2 SO 4 , CaCl 2 . 2H 2 O, Co(NO 3 ) 2 . 6H 2 O, Fe(NH 4 ) 2 SO 4 . 6H 2 O,
MnCl 2 . 4H 2 O,  H 3 BO 3 ,  AlK(SO 4 ) 2 . 12  H 2 O, CuCl 2 . 2H 2 O, nicotinic acid, Na 2 EDTA . 2H 2 O,  H 2 PO 4 ,  Ca(OH) 2 ,  H 3 PO 4 , NaCl.
Peralatan  yang  digunakan  adalah autoklaf  (Iwaki,  jepang), high  performance liquid  chromatograph (Hitachi  L  5025, jepang), high performance liquid chromatograph (Waters),  respirometer, batch  stirred  tank  reactor (LKB  bromma), pH  meter  (Knics),  alat  sentrifugasi,  oven (Memmert), vorteks (Sargen Welch), neraca teknis  (Sartorius),  mikroskop  compound (Nikkon),  kamar  hitung  improve  Neubauer (Assistant),
inkubator statis, spektrofotometer,  penangas  air,  termometer, cool  chamber , water  bath,  laminar  air  flow cabinet , alat hitung, tabung mikrosentrifugasi, mikrofilter 0,2 µm, pengaduk  bermagnet,  tabung  sentrifugasi, pipet  mikro,  erlenmeyer  dan  peralatan  yang biasa digunakan dalam laboratorium.
Metode 1. Pembuatan medium a. Pembuatan Media Pertumbuhan Kompleks
Sebanyak  0,25  g  ekstrak  khamir, 0,25  g  tripton,  0,5  ml  unsur  makro {(NH 4 ) 2 SO 4 ,  MgSO 4 . 7H 2 O,  CaCl 2 . 2H 2 O, Co(NO 3 ) 2 . 6H 2 O,  Fe(NH 4 ) 2 SO 4 . 6H 2 O},  dan 0,5  ml  unsur  mikro  {Na 2 Se0 3 , NiCI 2 , MnCl 2 . 4H 2 O,  H 3 BO 3 ,  AlK(SO 4 ) 2 . 12  H 2 O, CuCl 2 . 2H 2 O,  Na 2 EDTA . 2H 2 O  dan nicotinic acid },  dimasukkan  dalam  erlenmeyer  50  ml dan dilarutkan menggunakan akuades hingga  volume  40  ml,  dihomogenkan dengan  pengaduk  bermagnet  dan  pH ditepatkan menjadi pH 6,8 dengan penambahan  NaOH  0.1N.    Sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada suhu 121 °C selama  15  menit.    Media  yang  sudah  steril dan dingin ditambahkan gliserol 5 ml  dan 5 ml buffer fosfat yang juga sudah disterilisasi.

## b. Pembuatan Media  Pertumbuhan Agar
Semi Solid
Sebanyak  0,575  g  ekstrak  khamir agar,  0,175  g  ekstrak  khamir    0,375  g tripton, dan 0.25 g NaCl , dimasukkan dalam erlenmeyer 125 ml dan dilarutkan menggunakan  akuades  hingga  volume  50 ml, dihomogenkan dengan pengaduk
bermagnet  dan  pH  ditepatkan  menjadi  pH
6,8 dengan penambahan NaOH 1N.
Sterilisasi  dilakukan  dengan  autoklaf  pada suhu 121 °C selama 15 menit.

## c. Pembuatan Media Fermentasi Limbah Biodiesel pada BSTR
Medium produksi H 2 dibuat berdasarkan  metode  Hungate  (Miller et.al, 1974)  yang  dimodifikasi.  Sebanyak  17.5  g ektrak  khamir,  17.5  g  tripton,  35  ml makroelemen  dan  35  ml  mikroelemen dilarutkan dalam 2555 ml aquades  ditambah 175 ml limbah biodiesel yang sudah disaring sehingga  volumnya  2800  ml  dihomogenkan dengan  pengaduk  bermagnet  dan  pH ditepatkan menjadi pH 6,8 dengan penambahan  NaOH  1  N.    Erlenmeyer  yang berisi medium tersebut ditutup dengan kertas alumunium  dan  dipanaskan  dalam water bath pada  suhu  100 o C  selama  20  menit. Medium  kemudian  didinginkan  dengan  es pada  suhu  –5 o C.    Setelah  dingin,  medium kemudian  dipindahkan  ke  fermentor  dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 100 o C, tekanan  1  bar,  selama  15  menit.    Medium yang  sudah  steril  dan  dingin  ditambahkan 350 ml buffer fosfat yang sudah disterilisasi

## d. Pembuatan  Media Fermentasi  Limbah Biodiesel purifikasi pada BSTR
Pembuatan  media  fermentasi  limbah Biodiesel  yang  dipurifikasi  prinsipnya  sama dengan pembuatan media fermentasi  limbah biodiesel tanpa purifikasi, Purifikasi dilakukan  dengan  cara  memanaskan  limbah biodiesel  sambil  dihomogenkan  dengan pengaduk  bermagnet  hingga  mencapai  suhu  40 0 C kemudian ditambahkan H 2 SO 4 pekat dengan menggunakan pipet, dengan konsentrasi  2.5%  v/v.    Sehingga  dari  hasil purifikasi  ini  diperoleh  gliserol  dan  garam pospat reaksinya sebagai berikut:
Limbah  Biodiesel  +  H 2 SO 4 →  Na 2 SO 4 + Gliserol
2.   Pembuatan Kultur Stok E.  aerogenes
AY-2 dan E.  aerogenes AD-H43 Kultur stok yang disimpan pada –80
0 C    diambil  sebanyak  1  ml  kemudian dimasukkan  ke  dalam  erlenmeyer  125  ml yang  berisi  50  ml  medium  pertumbuhan kompleks kemudian diinkubasi dalam
inkubator  statis  selama  8-12  jam  pada  suhu 37  °C.  Kultur  kemudian  disimpan  dalam cool  chamber dan  diremajakan  setiap  dua minggu sekali.

## 3. Pembuatan Kultur Kerja
Kultur  stok  yang  disimpan  di cool chamber diambil
sebanyak  1  ose dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi yang  berisi  50  ml  media  agar semi  solid dengan  cara  ditusukan.  Kultur  tersebut diinkubasi  dalam  inkubator  statis  pada  suhu 37 0 C  selama  8  jam.  Kultur  kemudian disimpan dalam cool chamber dan diremajakan setiap dua minggu sekali.
4 . Pembuatan Kultur Awal ( Pre Culture ) Sebanyak 35 ml media
pertumbuhan  kompleks  dimasukkan  dalam erlenmeyer  50  ml  pH  ditetapkan  6.8. Sterilisasi  dilakukan  dengan  autoklaf  pada suhu  121  °C  selama  15  menit.    Media  yang sudah steril dan dingin ditambahkan gliserol 3.5  ml    dan  3.5  ml buffer fosfat  yang  juga sudah  disterilisasi,  kemudian  dilakukan inokulasi  1  ose  bakteri  mutan  dari  media agar  semi  solid.  Setelah  diinokulasi  simpan dalam  inkubator  pada  suhu  37 0 C  selama  8 jam
5.  Pembuatan kurva pertumbuhan Kurva  pertumbuhan  dibuat  dengan mengambil kultur mutan E. aerogenes AY-2 dan  mutan  ganda E.  aerogenes AD-H43 sebanyak  1  ml  kemudian  dimasukkan  ke dalam botol serum 125 ml yang berisi media pertumbuhan  .  Kultur  tersebut  kemudian diinkubasi  dalam  inkubator  statis  pada  suhu 37 0 C.  Penghitungan Optical  Dencity (OD) dilakukan pada jam ke 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, dengan cara diukur menggunakan
spektrofotometer  pada  panjang  gelombang (  ) = 680 nm
6.  Pembuatan  Media  starter  ( Main culture )
Sebanyak  1.75  g  ekstrak  khamir, 1.75 g trypton , 3.5 ml unsur mikro, 3.5  ml unsur  makro  dilarutkan  dengan  238  ml aquades sampai volum 280 ml dihomogenkan  dengan pengaduk bermagnet dan  pH  ditepatkan  menjadi  pH  6,8  dengan
penambahan  NaOH  1  N.  Erlenmeyer  yang berisi media ditutup dengan sumbat kemudian  disterilisasi  pada  suhu  121 0 C selama  15  menit.setelah  medium  dingin ditambahkan  larutan buffer pospat  35  ml yang  sudah  disteril  terpisah  kemudian dilakukan  inokulasi Pre  culture kedalam media  starter    di Laminar  Air  flow. Kemudian    disimpan  dalam  inkubator  pada suhu 37 0 C selama 8 jam .
7.    Produksi  H 2 oleh Enterobacter aerogenes AD-H43  dalam  fermentor BSTR
Sebanyak 35 ml media pertumbuhan yang berisi kultur mutan ganda      AD-H43 diinokulasi  kedalam  350  ml  media  starter steril,  selanjutnya  media  starter  steril dinokulasi  kedalam    media  fermentasi didalam sebuah fermentor 6L.  Suhu selama produksi  dijaga  pada  37  C,    pH  6,8  dan agitasi  40  rpm.  Volume  gas  H 2 yang dihasilkan  selama  20  jam  dicatat,  dan pengukuran  jumlah  sel  dilakukan  pada  jam ke  0,  4,  8,  12,  16,  20.  Selain  melakukan pengukuran  dan  penghitungan  sel  juga dilakukan.  Pengukuran  asam  laktat  diukur pada jam ke 20.

## 8.  Pengukuran hasil fermentasi
a. Pengukuran H 2 Pengukuran jumlah hidrogen dilakukan menggunakan respirometer.
Selang  respirometer  dihubungkan  dengan lubang pada bagian atas fermentor.  Gas CO 2 dan  H 2 yang  terbentuk  akan  mengalir melalui  selang  tersebut  ke  erlenmeyer  yang berisi  larutan  Ca(OH) 2 .  Gas  CO 2 akan bereaksi  dengan  Ca(OH) 2 membentuk CaCO 3 , sedangkan H 2 akan masuk ke dalam tabung respirometer yang berisi NaCl jenuh. Reaksinya sebagai berikut : CO 2(g) +  Ca(OH) 2(l0 CaCO 3 + H 2(g) Volume  NaCl  yang  dipindahkan  pada respirometer  diukur  sebagai  volume  gas  H 2 yang  dihasilkan.  Jumlah  H 2 diperoleh melalui perhitungan (Rachman dkk, 1997). Yield H 2 =
mol H 2 mol substrat b.  Pengukuran konsentrasi asam laktat Pengukuran  jumlah  asam  laktat dilakukan  menggunakan  analisis  HPLC.
Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung  mikrosentrifus  steril  dan  kemudian disentrifugasi  pada  5.000  rpm  selama  15 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dipindahkan  ke  tabung  mikrosentrifus  yang lain  dan  kemudian  disaring  menggunakan mikrofilter  0,2  m.  Larutan  standar  asam laktat  100  mM  diinjeksi  ke  HPLC  dan setelah  injeksi  tersebut  supernatan  hasil sentrifugasi diinjeksikan ke HPLC. Konsentrasi sampel diketahui dengan rumus perhitungan: Kons. sampel= area sampel x  kons std area standar Produksi asam laktat = mol asam laktat mol substrat

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kurva  Pertumbuhan  mutan Enterobacter aerogenes AY-2  dan  mutan  ganda E.aerogenes AD-H43 Menurut Harley (2005) kurva pertumbuhan  dapat  memperlihatkan  empat tahapan  pertumbuhan,  yaitu  fase  lag,  fase log  (fase  logaritmik/eksponensial),  fase stasioner,  dan  fase  kematian  ( death  phase ). Fase lag dan fase log pada Gambar 1 terjadi pada  jam  ke-0  sampai  jam  ke-8.  Fase stasioner  dimulai  setelah  jam  ke-8  dan  pada jam  ke-48  dianggap  sel  telah  mengalami
fase  kematian    Fase  kematian  tidak  dapat diamati,      karena  pengamatan  kurva pertumbuhan  dilakukan  dengan  metode spektrofotometer.    Menurut  McKanne  dan
Kandel (1996), kelemahan metode spektrofotometer adalah tidak dapat mengamati jumlah sel yang hidup dan mati
Pengukuran  OD E.  aerogenes AD- H43    dilakukan  pada  =  680  nm.  Hal tersebut  berdasarkan  Rachman  (2001)  yang telah  melakukan  pengukuran  OD  pada E. aerogenes AY-2 . Nakashimada et al (2002) juga  menggunakan  =  680  nm  untuk mengukur  OD E.  aerogenes HU-101. Gambar 1 menunjukkan bahwa Enterobacter  aerogenes AD-H43  dan E. aerogenes AY-2 membutuhkan waktu 8 dan 12 jam untuk mencapai akhir fase log. Akhir fase  log  adalah  kondisi  pada  kurva pertumbuhan  saat  bakteri  mencapai  jumlah maksimal dan aktif melakukan metabolisme. Penentuan  kecepatan  tumbuh  dan  waktu bakteri  melakukan  proses  metabolisme  juga dapat  diketahui  dengan  melihat  nilai  dari spesifik  rods (µ).  Rumus  dari    µ  =  tan  α  = nilai OD akhir fase log dibagi dengan waktu pada saat akhir fase log. Sehingga diperoleh nilai µ dari E. aerogenes AD-H43 = 0.09 j -1 , Berdasarkan data tersebut diketahui bahwa fase  log E.  aerogenes AY-2  lebih  lama  dari E.  aerogenes AD-H43.  Hal  tersebut  yang menjadi pertimbangan dalam penentuan saat inokulasi.
Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Bakteri Mutan Ganda E. aerogenes AD-H43 dan E.  aerogenes AY-2
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 4 8 12
16 20 24
O p ti k a l D e n si ti ( O D ) Waktu (Jam)
E. aerogenes AY-2
E. aerogenes AD-H43
E. aerogenes AY-2
Nilai  µ  yang  semakin  besar  dari E. aerogenes AD-H43  berarti  bahwa  mutasi menggunakan  EMS pada E. aerogenes AY- 2    memberikan  efek  terjadi  perubahan  pada bentuk koloni maupun fisik bakteri selain itu juga memungkinkan terjadi perubahan DNA yang  lebih  tinggi  dari  gen  pengkode  laktat dehidrogenase akibat alkilasi yang diakibatkan  oleh  gugus  etil  pada  EMS. Menurut  Meuth  &  Arrand  (1982),  mutasi menggunakan  EMS  dapat  menyebabkan kesalahan  pemasangan  basa  ( mispairing ), sehingga  terjadi  transisi  basa  GT  menjadi AT pada replikasi DNA.
Enterobacter  aerogenes termasuk  ke dalam kelompok yang sama dengan Escherichia  coli ( E.  coli )  dalam penggolongan  beberapa  genus  bakteri, sehingga dapat dianggap mewakili beberapa karakter E.  aerogenes. Beberapa  bakteri, seperti E.  coli memiliki  enzim  O 6 - alkilguanin-DNA alkiltransferase (AGT atau MGMT) yang dapat memperbaiki kerusakan akibat  alkilasi  EMS  (Margison et.  al ,  2003, Mishina, 2005). Enzim alkiltranferase
merupakan suicide  enzyme dan  bersifat
irreversible . Enzim tersebut, setelah memperbaiki satu basa guanin yang teralkilasi  tidak  dapat  digunakan  lagi  dan akan  dihancurkan  oleh  sel  (Twyman,  1998, Faibanks  dan  Andersens,  1999).  Apabila kerusakan  DNA  akibat  alkilasi  oleh  EMS terjadi  pada  banyak  basa  guanin  gen tersebut,  maka  mekanisme  perbaikan  hanya dapat memperbaiki sebagian kecil basa yang telah teralkilasi. Hal tersebut dapat menyebabkan kemungkinan bakteri termutasi pada gen pengkode laktat dehidrogenase akan semakin besar.

## Fermentasi dengan substrat gliserol murni dalam fermentor BSTR
Fermentasi  dengan  substrat  gliserol murni  dilakukan  untuk  mengetahui  kerja E. aerogenes AD-H43  dalam  substrat  gliserol murni  dalam  memproduksi  H 2 serta  untuk mengetahui  kenaikan  produktivitas  dari E. aerogenes AD-H43    pada  skala  lebih  besar. Kecepatan  produksi  H 2 pada  kedua  bakteri dengan  substrat  gliserol  mencapai  optimum pada jam ke 8, tetapi kecepatan produksi H 2 mutan  ganda  AD-H43  lebih  tinggi  dari wild
type nya. Hal tersebut terjadi karena efek dari mutasi  yang  berakibat  pada  kecepatan pertumbuhan  bakteri  untuk  mencapai  fase log.  Dimana  fase  tersebut  kondisi  bakteri mencapai  jumlah  maksimal  dan  aktif melakukan  metabolisme.  Ito et.al (2005) menyatakan  bahwa  sumber  karbon  gliserol murni  dapat  digunakan  untuk  produksi  H 2 . Produksi H 2 dan metabolit  lain  seperti  asam laktat  oleh  mutan  ganda E.  aerogenes AD- H43  berbeda  dengan  mutan E.  aerogenes AY-2  dimana  mutan  ganda E.  aerogenes AD-H43  memproduksi  H 2 lebih  tinggi dibandingkan  mutan E.  aerogenes AY-2 tetapi produksi asam laktat rendah. Perlakuan mutasi diduga berpengaruh pada mutan ganda E. aerogenes AD-H43  sehingga  menyebabkan  bakteri tersebut melakukan perubahan yang berdampak  pada  perubahan  pada    produksi H 2 dan  asam  laktat  yang  dihasilkan.  Salah satu  perubahan  yang  diduga  dilakukan mutan  ganda E.  aerogenes AD-H43  adalah cenderung  melakukan  metabolisme  piruvat menjadi H 2 dan asam laktat.
Dari  Gambar  2  dapat  disimpulkan bahwa  OD  mutan  ganda E.  aerogenes AD- H43    tertinggi  pada  jam  ke-8  dan  pada mutan E.  aerogenes AY-2  pada  jam  ke-12 hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  pada  jam ke-8  mutan  ganda E.  aerogenes AD-H43 mencapai  pertumbuhan  yang  maksimal sehingga melakukan proses produksi metabolit  seperti  H 2 mencapai  jumlah terbanyak  pada  jam  tersebut.  Pada  saat  OD tinggi  maka  diikuti  dengan  penurunan  pH sehingga  terjadi  produktivitas  H 2 yang cukup  tinggi  juga.  Penurunan  pH  yaitu  dari pH  6.8  menjadi  6.14  terjadi  karena  pada waktu  produksi  H 2 juga  diikuti  dengan produksi asam-asam organik sehingga reaksi menjadi  asam.  Singleton  dan  Sainsbury (1981) mengatakan bahwa dalam setiap jalur fermentasi,  akan  terjadi  keseimbangan pembentukan  produk  yaitu  apabila  suatu produk dibentuk berlebih maka akan disertai dengan penurunan produk lain.
Gambar 2. Kurva Hubungan Optical Density (OD) terhadap pH dan Waktu
E. aerogenes AD-H43 dan E. aerogenes AY-2 dengan Substrat Gliserol
Gambar 3. Kurva Hubungan Produktivitas H 2 dengan Waktu pada Fermentasi dengan Substrat Gliserol dalam Fermentor
BSTR
Pada Gambar 3 terlihat bahwa produktivitas  H 2 tertinggi  terletak  pada  jam ke-4  sampai  ke-8,  pada  mutan  ganda  AD- H43  pada  jam  ke-4  sudah  menghasilkan  H 2 yang  cukup  tinggi  sehingga  diperkirakan mutan  ganda  AD-H43  menghasilkan    H 2 pada jam ke-2 sama seperti pada AY-2 tetapi berbeda dalam kecepatannya. Pada penelitian ini mutan ganda AD-H43 menghasilkan  kecepatan  pembentukan  8.53
mmol/L.jam sedangkan AY-2 7.16 mmol/L.jam Pembentukan  metabolit  seperti asam laktat yang berkurang diduga menyebabkan  NADH 2 dalam  sel  bertambah karena  NADH 2 tersebut  tidak  mengalami oksidasi  menjadi  NAD.  NADH 2 tersebut diduga  digunakan  oleh  enzim  hidrogenase untuk diubah menjadi H 2 . Menurut Nakashimada et.al (2002), H 2 dapat diproduksi dari kelebihan NADH 2 . Produksi
5.6 6 6.4 6.8 7.2 0 0.25 0.5 0.75 1 0 4 8 12 16 20 pH Op tik al D en si ti ( OD ) Waktu (Jam) AY-2 AD-H43 pH  AY-2 pH AD-H43 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 4 8 12 16 20 P ro d u k ti v it a s H 2 (m o l/ m o l g li s e ro l)
Waktu (Jam)
Prod. AY-2
Prod. AD-H43
H 2 oleh  hidrogenase  melalui  oksidasi NADH 2 tersebut  diduga  menguntungkan bagi E.  aerogenes karena  memperlancar reaksi  reduksi-oksidasi  dalam  sel.  Mutan ganda E.  aerogenes AD-H43 memproduksi  H 2 sebesar  3.14  mol/mol gliserol sedangkan mutan E. aerogenes AY- 2  hanya    memproduksi  H 2 sebesar  2.65 mol/mol  gliserol,atau  mengalami  kenaikan sebesar  18  %  dibandingkan E.  aerogenes
AY-2  sedangkan  untuk  produksi  asam laktatnya terjadi penurunan 33%. Berdasarkan hasil tersebut dapat diasumsikan bahwa mutan ganda E. aerogenes AD-H43  mengalami  defisiensi laktat dehidrogenase. Menurut Nakashimada et.al (2002)  pembentukan  asam  laktat, etanol,  dan  2,3  Butandiol  melibatkan oksidasi  NADH  berperan  dalam  produksi H 2 .  Senyawa  NADH  yang  tidak  digunakan sebagai  koenzim  dalam  pembentukan  asam laktat  akan  berinteraksi  dengan  enzim hidrogenase  dan  feredoksin  yang  tereduksi sehingga menghasilkan H 2 (2NADH→FdH 2 → H 2 )
Dari  hasil  penelitian  diperoleh bahwa  kenaikan  H 2 pada  skala  lebih  besar tidak  mengalami  kenaikan  sebesar  20% seperti  pada  penelitian  sebelumnya  yang dilakukan  oleh    Said  (2007)  pada  skala  vial botol,  selain  kenaikan  produksi  H 2 juga terjadi  penurunan  produksi  asam  laktat.  Hal tersebut  juga  memberikan  informasi  bahwa perlakuan mutasi menggunakan EMS memberikan  efek  mutasi  sehingga  terjadi perubahan  jalur  metabolisme  pada E. aerogenes AY-2  dengan  memproduksi asam  laktat  lebih  rendah  dari  sebelumnya. perubahan  produksi  tersebut  diduga  karena adanya  perubahan  basa  pada  gen  pengkode laktat
dehidrogenase,
sehingga
menyebabkan  penurunan  aktivitas  enzim laktat  dehidrogenase.  Mutan  ganda E. aerogenes AD-H43 merupakan bakteri yang potensial  dalam  pengembangan  bioenergi masa depan.
Fermentasi  dengan  substrat  Limbah Biodiesel dalam fermentor BSTR Produksi  H 2 dalam  fermentor menggunakan  substrat  limbah  biodiesel
dilakukan  untuk  mengetahui  perbandigan kecepatan  produksi  H 2 dan  produktivitas antara E. aerogenes AY-2 dan E. aerogenes AD-H43.  Selain  itu  juga  sebagai  awal peningkatan skala produksi H 2 menggunakan E. aerogenes AD-H43 setelah produksi pada skala botol. Produksi tersebut dilakukan untuk mengetahui berapa kenaikan yield H 2 yang  dihasilkan  mutan ganda E. aerogenes AD-H43. Hasil penelitian (Gambar 4) menunjukkan  bahwa  kecepatan  produksi  H 2 terus  mengalami    kenaikan  hingga  jam  ke-4 kemudian mulai turun pada jam ke-8 sampai jam ke-20 hingga gas yang dihasilkan habis. Pada  kedua  bakteri  kecepatan  pembentukan tertinggi  pada  jam  4  tetapi  berbeda  mutan ganda  AD-H43  lebih  tinggi  dari  AY-2. Kenaikan  produksi  H 2 diikuti  dengan penurunan  pH  hal  ini  disebabkan  adanya reaksi  yang  bersuasana  asam  pada  waktu fermentasi  mencapai  waktu  yang  optimum untuk bakteri menghasilkan metabolit seperti H 2 dan asam-asam organik.
Hasil  fermentasi  selama  20  jam (Gambar  4)  mengindikasikan  bahwa E. aerogenes mampu  memanfaatkan  lebih  dari satu sumber karbon untuk memproduksi H 2 . Pemanfaatan tersebut terlihat dari  kecepatan produksi yang mencapai maksimal pada jam ke-4  dan  kemudian  menurun  pada  jam  ke-8 hingga  akhir  jam  ke-16.  Penurunan  tersebut kemungkinan mutan ganda AD-H43 memproduksi  H 2 secara  optimum  hanya sampai  jam  ke-8  setelah  itu  mutan  ganda AD-H43  memproduksi  metabolit  lain  selain H 2 .  Menurut  Nishio  dan  Nakashimada (2004), E. aerogenes mampu memanfaatkan beberapa  sumber  karbon    seperti  gliserol, glukosa,  fruktosa,  sukrosa,  manitol,  dan sorbitol untuk
memproduksi H 2 . Enterobacter  aerogenes diduga  mampu memanfaatkan lebih dari satu sumber karbon dalam  limbah  biodiesel  untuk  produksi  H 2 karena limbah biodiesel  adalah limbah  yang kaya akan bahan organik seperti karbohidrat, protein, lipid, dan asam nukleat.
Gambar 4.   Kurva Hubungan Kecepatan Produksi H 2 dengan pH dan waktu Fermentasi dengan Substrat Limbah Biodiesel dalam Fermentor BSTR
Enterobacter aerogenes diduga memanfaatkan  gliserol  lebih  dahulu  dan kemudian  memanfaatkan  sumber  karbon lain yang lebih kompleks untuk memproduksi  H 2 .  Judoamidjojo et.  al. (1990)  menyatakan  bahwa  dalam  substrat yang  kompleks,  bakteri  dapat  memanfatkan lebih  dari  satu  substrat  untuk  pertumbuhan dengan terlebih dahulu memanfaatkan substrat yang paling sederhana.
Pengukuran  terhadap  produk  lain juga  dilakukan  tetapi  hanya  pada  pengaruh asam laktat terhadap produksi H 2 . Dari hasil penelitian didapat bahwa dengan bertambahnya  atau  semakin  tinggi  produksi H 2 mutan  ganda  AD-H43  berpengaruh  pada produksi  asam  laktat,  hal  ini  disebabkan pengaruh  mutagen  EMS  pada E.  aerogenes AY-2    sehingga  menyebabkan  mutasi  acak pada
basa-basa
DNA, sehingga mempengaruhi aktivitas enzim serta
metabolit yang dihasilkan pada setiap mutan guna  menjaga  reaksi  oksidasi  dalam metabolisme. Hasil penelitian memberikan informasi  bahwa yield H 2 0.98  mol/mol gliserol  dan E.  aerogenes AY-2  hanya  0.85 mol/mol  gliserol  atau  terjadi  kenaikan sekitar 15 %.
Fermentasi dengan substrat limbah biodiesel yang dipurifikasi
Fermentasi  dengan  substrat  limbah biodiesel  yang  dipurifikasi  dilakukan  untuk mengetahui produktivitas H 2 yang dihasilkan oleh mutan ganda E. aerogenes AD-H43 dan mutan E.  aerogenes AY-2,  kemudian membandingkan  dengan  produktivitas  H 2 yang  dihasilkan  oleh  kedua  bakteri  pada substrat  limbah  biodiesel  tanpa  purifikasi. Seperti  diketahui  produksi  H 2 dengan substrat  limbah  biodiesel  tanpa  purifikasi diduga  masih  kurang  optimum  karena kandungan  gliserol  dalam  limbah  biodiesel tersebut  masih  terikat  dengan  katalis  sisa proses  pembuatan  biodiesel.  Salah  satu perlakuan  terhadap  limbah  biodiesel  yang dapat  mengikat  katalis  yang  masih  ada dalam  limbah  biodiesel  sehingga  didapat gliserol    lebih  murni  yaitu  dengan  cara purifikasi.
Hasil penelitian
menggunakan limbah  biodiesel  yang  dipurifikasi  (Gambar
5)  telihat  produktivitas  H 2 yang  dihasilkan mutan  ganda  AD-H43  lebih  tinggi  dari mutan  AY-2  yaitu  0.89  mol/mol  gliserol pada E.  aerogenes AY-2  dan  0.98  mol/mol gliserol    pada E.  aerogenes AD-H43.
Sedangkan  kalau  dibandingkan  dengan substrat  limbah  biodiesel  tanpa  purifikasi nilai produktivitasnya lebih tinggi  walaupun pola  grafiknya  sama yaitu  mencapai optimum pada jam ke-4 sampai jam ke-8.
6.2 6.4 6.6 6.8 7 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 4 8 12 16 20 pH Ke c e p a ta n P ro d u k s i (m o l/ L .J a m ) Waktu (Jam) AY-2 AD-H43
pH  AY-2 pH  AD-H43
Pada fermentasi menggunakan substrat  limbah  biodiesel  yang  dipurifikasi (Gambar 5) terlihat bahwa dengan menurunnya produksi H 2 pada kedua bakteri terjadi  kenaikan  pH  dengan  dipurifikasi kandungan  gliserol  dalam  limbah  biodiesel semakin  murni  sehingga  dihasilkan  H 2 dengan yield yang tinggi.
Pada  fermentasi  dengan  substrat  ini juga  dilakukan  juga  pengukuran  asam organik  selain  asam  laktat.  Dari  hasil
pengukuran  dengan  menggunakan  GCMS didapatkan  asam  organikyang  ada  dalam jalur metabolisme dari data tersebut disimpulkan bahwa asam-asam organik yang dihasilkan  mutan  ganda  AD-H43  seperti Etanol,  1,3  propandiol,  meningkat  hal  ini disebabkan  oleh  efek  dari  EMS  yang memblok  jalur  pembentukan  asam  laktat sehingga H + hasil oksidasi NADH membentuk  alkohol  grup  yang  penting  bagi oksidasi E. aerogenes.
Gambar  5.   Kurva Hubungan Waktu, pH dan Produktivitas H 2 pada Fermentasi Dengan Substrat  Limbah Biodiesel Purifikasi
Tabel 1. Perbandingan Produksi H 2 Mutan E. aerogenes AY-2 dan Mutan Ganda E. aerogenes AD-H43 Substrat Produksi H 2 dengan mikroorganisme E. aerogenes AY-2 (mol/mol gliserol) E. aerogenes AD-H43 (mol/mol substrat) Gliserol 2.65 3.14 Limbah Biodiesel 0.85 0.98 Limbah Biodiesel Purifikasi 0.89
0.98 6.2 6.4 6.6 6.8 7 0.000 0.040 0.080 0.120 0.160 0.200 0 4 8 12 16 20 pH P ro d u k tiv it a s H 2 ( m o l/ m o l g li s e ro l) Waktu (Jam) AY-2 AD-H43
pH  AY-2 pH AD-H43
Dari  Tabel  1  terlihat  produksi  H 2 dengan  substrat  Gliserol  murni  lebih  tinggi dibandingkan  limbah  biodiesel  dan  limbah biodiesel  purifikasi.  Menurut  Ito et.al (2004)  produksi  menggunakan  limbah biodiesel  lebih  rendah  dari  menggunakan gliserol murni pada konsentrasi yang sama. Produksi H 2 yang lebih tinggi pada gliserol disebabkan  gliserol  merupakan  substrat tunggal  sehingga E.  aerogenes dapat memanfaatkan  substrat  tersebut  dengan optimum untuk menghasilkan H 2 , sedangkan  pada  limbah  biodiesel  lebih rendah karena dalam limbah tersebut masih terdapat  substrat  kompleks.  Judoamidjojo et.  al (1990)  menyatakan  bahwa  dalam substrat  yang  kompleks,  bakteri  dapat memanfatkan  lebih  dari  satu  substrat  untuk pertumbuhan dengan terlebih dahulu memanfaatkan substrat yang paling sederhana. Oleh sebab limbah biodiesel merupakan  substrat  kompleks  maka  pada waktu fermentasi mutan ganda E. aerogenes AD-H43  sebelum  menggunakan substrat  tersebut  secara  maksimal  untuk produksi H 2 , bakteri tersebut telah mencapai  fase  kematian.  Sedangkan  pada limbah  biodiesel  yang  dipurifikasi  masih lebih  rendah  dari  gliserol  murni  karena substrat  tersebut  masih  belum  murni  benar sehingga kemungkinan masih ada kandungan  selain  gliserol  yang  dapat menghambat  produksi  H 2 .  Pada  tabel tersebut  juga  terlihat  produksi  H 2 oleh mutan  ganda E.  aerogenes AD-H43  lebih tinggi  karena  terjadi  perubahan  jalur metabolisme  akibat  mutasi  dengan  EMS sehingga  memproduksi  asam  laktat  lebih rendah. Penurunan produksi tersebut diduga karena  adanya  perubahan  basa  pada  gen pengkode  laktat  dehidrogenase,  sehingga menyebabkan  penurunan  aktivitas  enzim laktat dehidrogenase (Said, 2007).

## KESIMPULAN
Enterobacter  aerogenes AD-H43 memiliki spesifik rods yang besar dari wild type nya hal ini mengakibatkan waktu untuk melakukan  proses  metabolisme  lebih  cepat dari Enterobacter aerogenes AY-2. Produksi H 2 dalam substrat limbah biodiesel  tidak  dipurifikasi  dan  limbah
biodiesel  yang  dipurifikasi  menggunakan mutan  ganda Enterobacter  aerogenes AD- H43  pada  skala  fermentor  BSTR  terjadi peningkatan  kapasitas  H 2 dengan  diikuti penurunan produksi asam laktat.

## DAFTAR PUSTAKA
Fairbank,  D.J  &  W.R  Andersen.  1999. Genetic;  the  continuity  of  life . Wadsworth Publishing Company, London.
Harley,  J.  P.  2005. Laboratory  exercise  in microbiology .  6th  ed.  McGraw Hill  Companies,  Inc.  ,    New York.
Judoamidjojo,  M.,  A.A.  Darwis  &  E.G. Sa,id.  1990. Teknologi  fermentasi .
Rajawali Pers, Jakarta.
Meuth,  M  &  J.E.  Arrand.  1982.  Alteration of  gene  structure  in  Ethyl  Methane Sulfonate-  induced  mutants  of mammalian  cells .  Mol.  Cell.  Biol .
2: 1459-1462
Mishina,  Y.,  E.M.  Duguid  &  Chuan  He. 2006. Direct  reversal  of  alkylation damage. Januari: 18 hlm
http://he- group.uchicago.edu/chem%20Revi ew.pdf, 25 juli 2006
McKanne, I. & J. Kandel. 1996. Microbiology: Essentials & application .  2 nd ed.  McGraw  Hill Companies, Inc. ,  New York.
Miller,  T.L.  &  M.J.  Wolin.  1974. A  serum bottle  modification  of  the  hungate technique  for  cultivating  obligate anaerobes. Applied  Microbiology
27 (5): 985--987.
Nakashimada,  Y.,  M.A.  Rachman,  T.
Kakizono  &  N.  Nishio.  2002. Hydrogen production of Enterobacter  aerogenesaltered  by extracellular and intracellular redox state. Int.  J.  Energy .  27  :  1399- 1405.
Ngan,  M.  A.,  S.  Tanisho,  M.  Marimoto  &
S.  Yoshino.  2004. Development  of conversion  technology  of  biomass into bioenergy. Maret 2004. http://www.nedo.go.jp/english/arch ives/170117/pdf/H-02Y_E.pdf.  20 Mei 2005. Ngundiwaluyo,  S.  dan  Amos  .  1996. Hidrogen sebagai alternative energi. Majalah  BPPT .65  (5):  134-
138. Nishio,  N.  &  Y.  Nakashimada.  2004.  High rate production of hydrogen/methane  from  various substrat and waste. Advanced Biochemical Engineering Biotecnology. 90: 63--87. Rachman, M.A. 2001. Hubungan antara pH kultur  dan  aktivitas  hidrogenase pada produksi H 2 mutan Enterobacter aerogenes . Jurnal Hayati 8(1): 15-17. Rachman M.A., Y. Furutani, Y Nakashimada,  T. Kakizono, and N. Nishio.  1997.  Enhanced  hydrogen production  in  altered  mixed  acid fermentation of glucose by Enterobacter aerogenes. J. of Ferm.
And Bioeng. 83: 358-363.
Said,  A.,  2007. Perlakuan  Ethyl  Methane Sulfonate(EMS)  pada  Enterobacter aerogenes untuk Peningkatan Produksi Gas Hidrogen (H 2 ). Skripsi.  Departemen  Biologi FMIPA UI, Depok.
Sang-Eun Oh, S. Van Ginkel &B.E. Logan. 2003. Relativeness  of  pH  control and  heat  treatment  for  enhancing biohydrogen  gas  production . Enviromental Science & Tecnology Singleton,  P.  &  D.  Sainsbury  .1981.
Introduction  to  bacteria .  John Wiley & sons, Chichester. Sardjoko. 1991. Bioteknologi: latar belakang dan beberapa penerapannya . PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Twyman, R.M. 1998. Advanced molecular biology: A concise reference . Bioscientific Publisher, New York.