## Karakterisasi Fenotip dan Indeks Similaritas Isolat Actinomycetes yang Memiliki Kemampuan Antibakteri terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
Wahyu Nur Sulistyanto 1)* , Guntur Trimulyono 1)
1) Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Surabaya,
Jl. Ketintang Surabaya, Jawa Timur
*) Alamat korespondensi: wahyunut@gmail.com

## ABSTRAK
Eksplorasi kandidat mikrobia penghasil antibiotik semakin meningkat sebagai solusi banyaknya bakteri resisten  terhadap  antibiotik  yang  telah  ada.  Pada  penelitian  sebelumnya  telah  didapatkan  empat  isolat Actinomycetes yaitu ACB34a, ACB44c, ACB54c dan ACB55c yang memiliki kemampuan antibakteri, sehingga diperlukan identifikasi jenis isolate sampai tingkat Genus. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi jenis isolat  yang  terpilih  (ACB34a,  ACB44c,  ACB54c  dan  ACB55c)  berdasarkan  karakteristik  fenotip,  dan menentukan  indeks  similaritas  antarisolatnya.  Identifikasi  isolat  dilakukan  menggunakan  karakter  fenotip yang  meliputi  morfologi,  fisiologi,  biokimia  dan  dilanjutkan  pengolahan  numerik.  Analisis  data  secara deskriptif  dan  numerik  menggunakan  Clad97.  Hasil  penelitian  menunjukkan  dua  isolat  Actinomycetes (ACB34a dan ACB55c) memiliki kemiripan dengan Genus Actinomadura. Sedangkan dua isolate berikutnya, yaitu  ACB44c  dan  ACB54c  masing-masing  mirip  dengan  Genus  Nocardia  dan  Streptomyces.  Nilai  indeks similaritas antara isolat ACB34a dan ACB55c adalah 0,856, selanjutnya isolat ACB54c dan ACB44c memiliki kesamaan 0,788, dan isolat ACB55c dan ACB34a memiliki kesamaan sebesar 0,7788.
Kata kunci: Actinomycetes, antibakteri, indeks similaritas, karakteristik fenotip
Phenotypic Characterization and Similarity Indices of Actinomycetes Isolates with Antibacterial Ability against Escherichia coli and Staphylococcus aureus
Wahyu Nur Sulistyanto 1)* , Guntur Trimulyono 1)
1) Biology Study Program, Faculty of mathematics and Natural Sciences, Universitas Negeri Surabaya, Ketintang Street,
Surabaya, East Java
*) Email: wahyunut@gmail.com

## ABSTRACT
Exploration of antibiotic-producing microbes is getting increase as a solution to the increasing number of  resistant  bacteria  to  existing  antibiotics.  Previous  studies  have  shown  that  four  isolates  of  Actinomycetes namely ACB34a, ACB44c, ACB54c and ACB55c have antibacterial activities therefore further identification is required. The purpose of this study was to identify the Actinomycetes isolates (ACB34a, ACB44c, ACB54c and ACB55c) based on phenotypic characteristics, and to determine the similarity index among isolates. Isolates identification  was  performed  using  phenotypic  characters  including  morphology,  physiology,  biochemistry, and then followed by numerical processing. Analysis of data was conducted descriptively and numerically using Clad97.  The  results  showed  that  the  four  Actinomycetes  isolates  (ACB34a,  ACB44c,  ACB54c  dan  ACB55c) have  similarities  to  the  character  of  different  genus,  which  were  Actinomadura,  Nocardia,  Streptomyces  and Actinomadura,  respectively.  The  similarity  index  between  isolate  ACB34a  and  ACB55c  was  0.856,  isolate ACB54c with ACB44c had similarity index of 0.788, while between isolate ACB55c and ACB34a was 0.7788.

## Keywords: Actinomycetes, antibacteria, phenotypic characteristics, similarity index

## PENDAHULUAN
Actinomycetes  diketahui  telah  banyak menyumbang  sebagai  sumber  antibiotik  yang ada  saat  ini.  Eksplorasi  sumber-sumber
antibiotik  semakin  ditingkatkan  sebagai  solusi semakin  banyaknya  bakteri  resisten  terhadap antibiotik yang telah ada. Actinomycetes diketahui menjadi penghasil senyawa bioaktif yang berpengaruh terhadap dunia industri [1].
Kemampuan  dalam  menghasilkan  banyak senyawa  bioaktif  yang  berhasil  diisolasi  dan dimanfaatkan  peneliti  antara  lain  antibiotik, antikanker,  antitumor,  dan  immunosupresan dengan  dugaan  jenis  senyawa  bakteri  yang ditemukan Erythromycin, Tetracycline, Rifampicin,  Polymyxin  dan  Chloramphenicol [2].  Berbagai  senyawa  bioaktif  tersebut memiliki  potensi  antibakteri  yaitu  dengan merusak  dinding  sel  atau  merusak  sintesis dinding  sel,  dan  merusak  asam  nukleat  yang menyebabkan  peningkatan  tekanan  osmotik yang  mengakibatkan  sel  lisis.  Senyawa antimikroba  yang  ideal  adalah  senyawa  yang memiliki toksisitas selektif.
Keragaman mikroba pada rhizosfer merupakan  hasil  interaksi  dan  adaptasi  yang dapat  dimungkinkan  adaptif  atau  resisten terhadap  toksin  yang  dihasilkan  tanaman. Kemampuan  tersebut  memungkinkan  mikroba menghasilkan metabolit sekunder yang spesifik seperti  antibiotik.  Tanah  di  sekitar  akar  atau rhizosfer  mengandung  banyak  bahan  organik yang  dapat  mendukung  peningkatan  mikroba aktif daripada tanah biasa atau tanah curah  [3-
4].
Pada  penelitian  sebelumnya  telah  berhasil mengisolasi  bakteri  Actinomycetes  isolat ACB34a  dan  ACB55c  yang  diduga  anggota Genus Actinomadura ,  isolat  ACB44c  diduga anggota  Genus Necordia serta  isolat  ACB54c diduga  anggota  Genus Streptomyces [5].
Karakterisasi  lanjutan  perlu  dilakukan  untuk melengkapi  hasil  penelitian  sebelumnya  dan mendapatkan nilai indeks similaritas menggunakan CLAD97. Pengolahan data untuk menentukan indeks similaritas banyak tersedia seperti MVSP dan lainnya. Penggunaan MVSP memiliki  kelemahan  yaitu  membutuhkan  byte perangkat PC yang khusus dalam penginstalannya.  Di  sisi  lain,  penggunaan Clad97  lebih  mudah  jika  dilihat  dari  langkah, prosedur  preparasi  dan  pengerjaannya.  Oleh karena  itu,  pada  penelitian  ini  Clad97 digunakan untuk menentukan tingkat kesamaan antarisolat.  Nilai  output  similaritas  dalam rentang skala 0,00 – 1,00 [6].
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi jenis isolat yang terpilih (ACB34a, ACB44c,  ACB54c  dan  ACB55c)  sampai  tingkat Genus  berdasarkan  karakteristik  fenotip,  dan menentukan indeks similaritas antar isolatnya.

## METODE PENELITIAN
Waktu dan tempat penelitian . Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari sampai Maret 2019. Isolat  Actinomycetes  didapatkan  dari  penelitian sebelumnya  yang  diisolasi dari  rhizosfer tanaman tebu  dari  kebun  tebu  daerah  Kamal,  Bangkalan. Isolat-isolat  tersebut  ( ACB34a,  ACB44c,  ACB54c dan  ACB55c ) memiliki  kemampuan  antibakteri terhadap E.  coli dan S.  aureus [5].  Penelitian dilakukan  di  Laboratorium  Mikrobiologi  Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (KIPM) Kelas I Surabaya.
Persiapan  media. Media  pertumbuhan  yang digunakan antara lain Starch Casein Agar (SCA), Nutrient  Broth (NB),  dan Nutrient  Agar (NA),. Media SCA dibuat dengan cara mencampurkan 10 g soluble  starch ,  2  g  K 2 HPO 4 ,  2  g  KNO 3 ,  0,3  g kasein, 0,05 g MgSO4.7H 2 O, 15 g agar dalam 1 L aquades [7]. Media NB dibuat dengan mencampurkan 8 g NB dalam 1 L aquades. Media NA dibuat dengan mencampurkan NB menggunakan  agar  1,5%.  Masing-masing  media disterilisasi  menggunakan  autoklaf  pada  suhu 121°C dengan tekanan 1 atm [8].
Kultur isolat Actinomycetes terpilih . Tahapan  kultur  dilakukan  dengan streak isolat terpilih pada media SCA miring diinkubasi selama tujuh  hari  untuk  mendapatkan  koloni  dengan ukuran besar [9].
Karakterisasi  fenotip  isolat  Actinomycetes. Karakterisasi  fenotip  ini  meliputi karakter morfologi,  fisiologi,  dan  biokimia.  Karakterisasi morfologi sel dilakukan melalui pewarnaan Gram. Tahapan  pewarnaan  Gram  dilakukan  dengan mempersiapkan  crystal  violet,  iodine,  alkohol 96%,  dan  safranin.  Hasil  pewarnaan  Gram menunjukkan Gram positif jika berwarna biru/ungu, dan Gram negatif jika berwarna merah [8].
Karakterisasi  fisiologi  meliputi  uji  oksidase, uji  katalase,  ketahanan  pada  suhu  berbeda,  dan ketahanan pada berbagai kadar garam. Uji oksidase dilakukan  menggunakan oxydase  strips .  Uji katalase  dilakukan  dengan  menggunakan  reagen H 2 O 2 3%  yang  diteteskan  (1-2  tetes)  pada  kultur. Pengujian ketahanan  suhu diawali bakteri disuspensikan pada media NB. Kemudian suspensi tersebut  diinkubasi  dengan  suhu  yang  berbeda antara lain 25 ℃ , 37 ℃, 40 ℃ dan 45 ℃ dengan lama inkubasi 24 jam. Pertumbuhan suatu bakteri dapat diketahui dengan mengamati tingkat kekeruhannya [10]. Ketahanan NaCl dilakukan dengan pembuatan  NB  dengan  kadar  NaCl  5%  dan  10%. Kemudian  biakan  diinokulasikan  dan  diinkubasi
selama  24  jam.  Pertumbuhan  bakteri  dapat diketahui dengan kekeruhan pada tabung [10].
Karakterisasi  biokimia meliputi  beberapa jenis uji seperti MIO, TSIA, reduksi gula, urea, arginin,  sitrat,  oksidatif/  fermentasi,  aesculin, lysin dan MRVP. Uji MIO merupakan uji untuk mengetahui  motilitas,  indole  dan  ornithin menggunakan media MIO. Isolat diinokulasikan dengan cara kultur ditusukan ke dalam  2/3  bagian  media  MIO  [11].  Uji  TSIA merupakan  uji  untuk  mengetahui  inokulan dapat  menghasilkan  acid/alkali  serta  H 2 S menggunakan  media  TSIA.  Kultur  diinokulasi dengan cara ditusuk hingga dasar tabung media TSIA  [12].  Uji  reduksi  gula  dengan  cara menumbuhkan  isolat  pada  media  yang mengandung  berbagai  jenis  gula  seperti glukosa,  laktosa,  sukrosa,  arabinosa,  manitol, inositol,  maltosa,  dulcitol,  xylose,  salicin, sorbitol, trehalosa.
Uji  urea merupakan  pengujian  untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam mereduksi  urea.  Pengujian  dilakukan  dengan streak pada media urea miring. Indikasi positif jika  media  berwarna  merah  muda  [13].  Uji arginin adalah  salah  satu  uji  bakteri  yang digunakan untuk mengetahui kemampuan suatu bakteri dalam mendegradasi argnin [14]. Uji ini dilakukan  dengan  menginokulasikan  isolat pada  media  argnin broth .  Hasil  positif  jika media  menjadi  keruh,  sedangkan  negatif apabila media tetap jernih [12].
Uji  sitrat  menggunakan  media simmon’s citrate dengan teknik streak pada media miring simmon’s  citrate .  Hasil  positif  ditunjukkan dengan  warna  biru  pada  bagian  dalam  atau permukaan  dari  medium  [1].  Uji  oksidatif/ fermentatif  (O/F)  merupakan  salah  satu  uji untuk mengetahui sifat oksidasi atau fermentasi suatu bakteri pada glukosa. Uji ini menggunkaan  dua  tabung,  satu  media  diberi parafin  cair  sedangkan  yang  lain  tidak.  Jika kedua  tabung  berwarna  kuning  membuktikan bakteri  bersifat  fermentatif  (F),  apabila  yang tidak  diberi  parafin  memiliki  warna  hijau diketahui  bahwa  bakteri  bersifat  oksidatif  (O) dan  jika  kedua  tabung  berwarna  hijau menunjukkan no  reaction (NR).  Tujuan pemberian parafin cair pada media O/F adalah sebagai  pembanding  untuk  membuktikan apakah  bakteri  tersebut  mampu  melakukan respirasi  tanpa  menggunakan  oksigen  bebas (respirasi anaerob) [13, 15].
Uji
MRVP dilakukan dengan menumbuhkan  isolat  pada  media  MRVP
kemudian  diinkubasi  selama  24  jam.  Biakan bakteri pada media uji MRVP dibagi menjadi dua. Tabung  reaksi  pertama  ditetesi  dengan  reagen Methyl  Red (MR)  hingga  setengah  dari  banyak media  di  tabung.  Kemudian  tabung  reaksi  kedua ditetesi dengan reagen VP1 (α -naphthol) sebanyak ¼ total media MRVP di tabung reaksi dan reagen VP 2 (KOH 40%) sebanyak ¼ total media MRVP di tabung reaksi. Kemudian dikocok dan ditunggu hingga 15 menit. Uji MR dikatakan positif apabila terjadi perubahan warna menjadi merah dan negatif jika berwarna kuning. Sedangkan uji VP dikatakan positif jika berubah menjadi merah dan dikatakan negatif saat tidak terjadi perubahan atau berwarna kuning [12].
Uji aesculin dilakukan dengan menginokulasikan biakan pada media aesculin dan dihomogenasi,  kemudian  diinkubasi  selama  24 jam. Hasil reaksi positif jika warna media berubah menjadi hitam. Uji lysin menggunakan media LIA dengan  pembacaan  positif  diketahui  jika  warna media  berubah  menjadi  ungu  pada  goresan  dan kuning pada tusukan berarti dikatakan negatif [12].
Analisis  deskriptif  dan  numerik. Hasil karakterisasi  fenotip  yang  telah  didapatkan, kemudian dianalisis menggunakan Profile Matching untuk  mengetahui  dugaan  Genus  isolat terpilih  dan  analisis  numerik  menggunakan software Clad97 untuk menghasilkan hasil indeks similaritas  atau  indeks  kesamaan  antarisolat terpilih.  Indeks  similaritas  ditentukan  pada  hasil karakteristik fenotip dengan penulisan (+) sebagai hasil  positif  dan  (-)  sebagai  hasil  negatif.  Hasil tersebut dipreparasi menggunakan aplikasi Programmers File Editor (PFE). Data dengan hasil (+)  diganti  dengan  1  dan  (-)  dengan  angka  0. Pengubahan  tersebut  dilakukan  pada  aplikasi CLAD97  untuk  dihasilkan  cladogram  yang mencerminkan
klasifikasi Operational Taxonomical Unit (OTU) [16].

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Empat  isolat Actinomycetes yaitu  ACB34a, ACB44c, ACB54c dan ACB55c dengan kemampuan  antibakteri  [5],  kemudian  dilakukan karakterisasi lanjutan berdasarkan karakter fenotip. Karakter  keseluruhan  isolat  kemudian  dianalisis menggunakan Profile  Matching. Hasil  dugaan isolat terpilih antara lain Actinomadura, Necordia dan Sterptomyces. Actinomycetes  merupakan golongan  bakteri  yang  menghasilkan  metabolit sekunder.  Actinomycetes  menghambat  sintesis dinding sel dari bakteri uji yang menyebabkan
Tabel 1. Karakter fenotip isolat Actinomycetes
Karakteristik ACB34a ACB44c ACB54c ACB55c Tumbuh di SCA + + + + Warna koloni Putih Putih Krim Putih Bentuk koloni Circular Circular Circular Circular Tepi Entire Entire Entire Entire Elevasi Convex Convex Convex Convex Permukaan Kasar Kasar Kasar Kasar Optik Opaque Opaque Opaque Opaque Tumbuh di Oatmeal + + + + Miselium subtrat Merah muda Merah muda Abu-abu Putih Miselium aeral Merah muda Putih Abu-abu Abu-abu kemerahan Pigmentasi miselium - - Kuning emas - Morfologi Branching rod Branching rod Branching rod Branching rod Gram + + + + Antibakteri E. coli - + (3,5 mm) + (0,7 mm) - Golongan - Lemah Lemah - Antibakteri S. aureus + (3,2mm) + (5,9 mm) + (5,8 mm) + (3,2 mm) Golongan lemah sedang sedang sedang Uji Fisiologi-biokimia Oksidase + + + + Katalase + - + + O/F NR NR NR NR TSIA, Gas, H2S Ak Ak Ak Ak LIA - - - - Motilitas - - - - Gelatin + + + + Indol - + - - Ornithin - - - - Arginin - - + - Simmon’s Citrat - - + + Urease + + - - MR - + - - VP - - - - Tb - - - - Aesculin - - - - Reduksi Gula Glukosa + + + + Laktosa + + + + Sukrosa + + + + Arabinosa + + + + Manitol + + + + Inositol + + + + Maltosa + + + + Dulcitol + + + + Xylose + + + + Salicin + + + + Sorbitol + + + + Trehalosa + + + + Pertumbuhan Bakteri Pertumbuhan Obligat Aerob Obligat Aerob Obligat Aerob Obligat Aerob Kemampuan Hidup Suhu 24°C + + + + Suhu 28°C + + + + Suhu 32°C + + + + Suhu 36°C + + + + NaCl 5 % + + + + NaCl 10 % - - - - Hasil Identifikasi Actinomadura Nocardia Streptomyces Actinomadura
peningkatan  tekanan  osmotik  sel  sehingga bakteri uji menjadi terhambat [23].
Berdasarkan keseluruhan
hasil karakterisasi  awal  dan  lanjutan,  semua  isolat kebanyakan  memiliki  karakter  yang  sama namun beberapa karakter menunjukkan perbedaan  antarisolatnya  (Tabel  1).  Karakter yang  berbeda  antara  lain  katalase  isolat
ACB44c  negatif  lainnya  positif,  indol  isolat ACB44c  positif  lainnya  negatif,  Ornitin  isolat ACB34a  positif  lainnya  negatif,  Arginin  isolat ACB54c positif lainnya negatif, Simmon’s citrate isolat  ACB54c  dan  ACB55c  positif  sedangkan lainnya negatif, urease isolat ACB34a dan ACB44c positif  sedangkan  lainnya  negatif,  karakter  MR isolat ACB44c positif lainnya negatif.
Tabel 2. Generic assignment ( profile matching ) isolat Actinomycetes terpilih yang diduga anggota Genus
Streptomyces
Karakteristik ACB34a Streptomyces* Morfologi Koloni di media SCA Tumbuh di media SCA + + Permukaan Kasar Kasar, lekat pada media Morfologi Koloni di media Oatmeal Miselium subtrat Abu-abu Abu-abu, kuning, merah Miselium aeral Abu-abu Abu-abu, krim, merah keabuan Pigmentasi miselium Kuning emas Kuning Uji Fisiologi-biokimia Gram + + Morfologi sel Filamen Filamen Uji Fisiologi-biokimia Ornithin - - MR - - Reduksi Gula Glukosa + + Manitol + + Fruktosa + + Kemampuan Antibakteri E. coli + + S. aureus + + Keterangan:
(+) Dapat menghasilkan/ mereduksi/ dapat tumbuh/ tahan terhadap/ menggunakan
(-) Tidak dapat menghasilkan/ mereduksi/ dapat tumbuh/ tahan terhadap/ menggunakan
(NR) No reaction ; ( Ak) Alkaline *Sumber: [5, 11]; Metode: Penyocokan Generic Assignment ( Profile Matching )
Tabel 3. Generic assignment ( profile matching ) isolat Actinomycetes terpilih yang diduga anggota Genus Necordia
Karakteristik ACB34a Necordia* Morfologi Koloni di media SCA Tumbuh di media SCA + + Morfologi Koloni di media Oatmeal Miselium subtrat Merah muda Merah muda, putih, abu-abu, kuning, coklat Miselium aeral Putih Putih, coklat, kuning Pigmentasi miselium - - Uji Fisiologi-biokimia Gram + + Morfologi sel Filamen Filamen Motil - - Gelatin + + Indol + + Reduksi Gula Glukosa + + Pertumbuhan Obligat Aerob Obligat Aerob NaCl 5 % + +
Keterangan:
(+) Dapat menghasilkan/ mereduksi/ dapat tumbuh/ tahan terhadap/ menggunakan
(-) Tidak dapat menghasilkan/ mereduksi/ dapat tumbuh/ tahan terhadap/ menggunakan
(NR) No reaction ; ( Ak) Alkaline *Sumber: [4, 11, 21]; Metode: Penyocokan Generic Assignment ( Profile Matching )
Tabel  4.  Generic  assignment ( profile  matching )  isolat  Actinomycetes  terpilih  yang  diduga  anggota
Genus Actinomadura Karakteristik ACB34a ACB55c Actinomadura* Morfologi Koloni di media SCA Tumbuh di media SCA + + + Morfologi Koloni di media Oatmeal Tumbuh di media Oatmeal + + + Miselium subtrat Merah muda Putih Merah, coklat, putih, krim Uji Fisiologi-biokimia Gram + + + Morfologi sel Filamen Filamen Filamen Gelatin + + + Reduksi Gula Maltosa + + + Sukrosa + + + Arabinosa + + + Fruktosa + + + NaCl 5 % + + +
Keterangan:
(+) Dapat menghasilkan/ mereduksi/ dapat tumbuh/ tahan terhadap/ menggunakan
(-) Tidak dapat menghasilkan/ mereduksi/ dapat tumbuh/ tahan terhadap/ menggunakan
(NR) No reaction ; ( Ak) Alkaline *Sumber: [18-22]; Metode: Penyocokan Generic Assignment ( Profile Matching )
Hasil  karakterisasi  fenotip  yang  diperoleh dicocokkan karakter kunci dengan sumber utama Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology , kemudian  dibuat  tabel Generic  Assignment ( Profile Matching ). Data tabel berupa penyandingan hasil karakterisasi dengan karakterisasi  kunci  genus  yang  diduga. Genus- genus  yang  diduga  tersebut  antara  lain Actinomadura, Necordia dan Streptomyces.
Gambar  1. Similaritas  isolat Actinomycetes terpilih . HTU ( Hypothetical
Taxonomy  Unit ):  Nodus  internal dalam analisis fenetik/filogenetik
Hasil karakter penelitian sebelumnya [5] dan penelitian  ini  digabungkan  untuk  pengerjaan klasifikasi numerik (indeks similaritas).
Karakterisasi  saat  skrining  awal,  skrining
lanjutan  dan  uji  kemampuan  antibakteri  pada penelitian  sebelumnya  juga  diinput  bersama dengan  karakterisasi  lainnya.  Semua  karakter kemudian dilakukan penyocokan dengan panduan  buku  Bergey’s  Manual  serta  literatur penelitian yang lainnya, serta dilakukan pengecekan key  identification .  Terdapat  52  uji pendukung  karakterisasi  bakteri  Actinomycetes terpilih.  Uji-uji  tersebut  juga  dilakukan  pada penelitian sebelumnya [17-22].
Berdasarkan hasil identifikasi isolat ACB54c merupakan Genus Streptomyces (Tabel 2). Rincian kesamaan hasil karakterisasi dengan beberapa  literatur  antara  lain  warna  miselium subtrat  abu-abu,  memiliki  warna  miselium pigmen  kuning,  memiliki  miselium  aeral  abu- abu, suhu inkubasi optimal 20-37 °C, ketahanan terhadap  NaCl  3%,  arginin  positif  [21].  Uji gelatin  positif  dan  memiliki  kemampuan antibakteri terhadap E. coli dan S. aureus . Non- motil,  indol  negatif,  ornithin  negatif,  tergolong aerob,  katalase  positif,  dapat  mereduksi  sitrat, alkaline  pada  uji  TSIA  [20].  Koloni  berwarna krim  [19].  Permukaan  kasar  dan  melekat  pada media. Dapat memfermentasi arabinosa, fruktosa,  manitol,  inositol,  Gram  positif,  MR menunjukkan  hasil  negatif,  oksidase  positif, tanpa gas dan H 2 S pada media TSIA [22].
Pada identifikasi isolat ACB44c
menunjukkan  masuk  ke  dalam  anggota  Genus Nocardia (Tabel  3).  Rincian  hasil  kesamaan karakter kunci dari beberapa literatur antara lain menampakkan miselium subtrat berwarna merah muda  [19],  tidak  menghasilkan  pigmen  pada
ACB54c ACB44c ACB55c ACB34a
subtrat, Gram positif, tidak menghasilkan enzim katalase, hasil uji O/F menunjukkan no reaction , hasil  uji  TSIA  menunjukkan  hasil  K/K  atau alkaline ,  non-motil,  menghasilkan  gelatinase, indol  positif,  hasil  uji simmon’s  citrate negatif, uji  urease  menunjukkan  hasil  positif,  dapat memfermentasi  glukosa,  sukrosa  dan  maltosa, dan bersifat aerob [20, 24].
Hasil  identifikasi  isolat  ACB34a  dan ACB55c menunjukkan kemiripan dengan Genus Actinomadura (Tabel  4).  Hasil  penyocokan dengan  beberapa  karakter  kunci  antara  lain memiliki  warna  miselium  subtrat  berwarna merah,  coklat,  putih  hingga  krim,  koloni berbentuk convex dengan  tepi entire ,  uji  gelatin positif,  dapat  memfermentasi  gula  arabinosa, glukosa,  laktosa,  maltosa  dan  sukrosa  serta optimum  pada  suhu  20-30°C  [17].  Kemudian memiliki  hasil  negatif  pada  uji  aesculin,  uji simmon’s  citrate negatif  dan  dapat  tahan  pada NaCl 3% namun di bawah 10% [17-18].
Perbedaan utama karakter fenotip Actinomycetes  asal  rhizosfer  tanaman  tebu  ada pada karakter morfologi koloni pada media SCA dan Oatmeal, katalase, indol, ornithin, kemampuan antibakteri, urease, simmon’s citrate serta reduksi gula. Pada penelitian ini menggunakan pesenjajaran karakter dengan tetap menggunakan  hasil double  negative atau  dapat disebut metode simple matching [25].
Koefisien  similaritas simple  matching umum  digunakan  pada  ilmu  bakteriologi  dalam mengukur  proporsi  karakter  yang  sesuai,  dapat memperbanyak input data sehingga karakter yang digunakan  sebagai  dasar  semakin  banyak (mendekati  standar  minimum  70  karakter). Penggunaan Clad97 pada penelitian ini dikarenakan  prosedur  preparasi  dan  pengolahan aplikasi  ini  mudah.  Tidak  memerlukan  byte perangkat PC khusus seperti halnya MVSP, nilai output indeks similaritas berupa skala 0,00-1,00 serta  dalam  penginputan  data  tergolong  banyak yaitu maksimal 50 taksa dengan 200 karakter [6, 26].
Berdasarkan hasil similaritas  tersebut dicocokkan dengan konsep taksospesies bakteri. Strain  mikroba  dapat  dikelompokkan  menjadi satu  sepsies  jika  mempunyai  indeks  similaritas ≥70%.  Nilai  koefisien  korelasi  fenetik  ≥70% diasumsikan  semakin  dapat  mewakili  matrik similaritas  serta  dapat  menjadi  dasar  kontruksi. Setiap bagan menunjukkan kesamaan spesies dan bagan  diatasnya  berarti  berbeda  spesies  namun dalam satu genus [25, 27]. Hasil antara ACB34a lebih mirip dengan ACB55c, kemudian ACB44c memiliki  indeks  similaritas  yang  lebih  dekat
dengan ACB54c (Gambar 1). Namun penentuan satu  spesies  yang  sama  dalam  suatu  strain  atau berbeda  dalam  suatu  strain  tertentu  harus dilakukan  uji  lanjutan.  Uji  lanjutan  bisa  berupa penambahan  karakterisasi  sejumlah  70  karakter sebagai  syarat  ditentukannya  spesies  [28]  atau dilakukan  uji  lanjutan  juga  berupa  karakterisasi molekuler  16S  rRNA.  Karakterisasi  gen  16S rRNA  sering  dilakukan  karena  memang  daerah tersebut adalah daerah konservasi [29].

## KESIMPULAN
Karakter  fenotip  pembeda  keempat  isolat Actinomycetes  terpilih  berdasarkan  morfologi antara  lain  miselium  aeral,  miselium  subtrat putih,  dan  pigmentasi.  Perbedaan  karakter fisiologi  dan  biokimia  keempat  karakter  isolat adalah  katalase,  indol,  ornithin,  kemampuan antibakteri,  urease, simmon’s  citrate ,  reduksi gula. Hubungan isolat ACB34a dengan ACB55c memiliki  kesamaan  0,856,  kemudian  isolat ACB54c  dengan  ACB44c  memiliki  kesamaan 0,788  serta  tiap-tiap  kedua  isolat  memiliki kesamaan senilai 0,7788. Saran untuk penelitian lanjutan  yaitu  berupa  uji  lanjutan  uji  biokimia, fisiologi  hingga  identifikasi  spesies  berdasarkan sekuen gen 16S rRNA.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  disampaikan  kepada  tim Mikrobiologi  2015,  keluarga,  semua  dosen Jurusan  Biologi  FMIPA  Universitas  Negeri Surabaya.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Aditi FY, Rahman SS, Hossain, MM (2017) A  study  on  the  microbiological  status  of mineral drinking water. The Open Microbiology Journal 11: 31-44.
[2] Khanna M, Renu S, Rup L (2011) Selective isolation  of  rare actinomycet es  producing novel antimicrobial compounds. International Journal of Advanced Biotechnology and Research 2(2): 357-375.
[3] Geetanjali,  Pranay  J  (2016)  Antibiotic production by rhizospheric soil microflora - A review. International Journal of Pharmaceutical  Sciences  and  Research
7(11): 4304-4314.
[4] Krismawati H, Langkah Sembiring,
Subagus W (2015) Streptomycetes penghasil antibiotik yang berasosiasi dengan rhizosfer
beberapa  spesies  Mangrove.  Plasma  1(2): 59-70.
[5] Sulistyanto  WN,  Trimulyono  G  (2019) Isolation  and  antibacterial  activities  of Actinomycetes from  rhizosphere  plant  cane
( Saccharum  officinarum )  on Escherichia coli and Staphylococcus aureus . Bioedukasi 17(1): 17-24.
[6] Julisaniah  NI,  Liliek  S,  Arifin  NS  (2008) Analisis  kekerabatan  Mentimun  ( Curcumis sativus L)  menggunakan  metode  RAPD- PCR  dan  isozim. Biodiversitas  9  (2):  99- 102.
[7] Mohseni M, Norouzi H, Hamedi J, Roohi A (2013) Screening of antibacterial producing Actinomycetes from sediment of the Caspian Sea. International Journal of Molecular and
Cellular Medicine 2(2): 64-71.
[8] Prasetya IAW (2016) Isolasi dan karakterisasi bakteri kitinolitik endofit pada tanaman Bawang Merah ( Allium ascalonicum ) dan potensinya dalam menghambat pertumbuhan Fusarium oxysporum .  Skripsi.  Surabaya:  Universitas Negeri Surabaya.
[9] Sateesh  V,  Naikpatil  JL,  Rathod  (2011) Selective isolation and antimicrobial activity of  rare Actinomycetes from  Mangrove sediment of Karwar. Journal of Ecobiotechnology 2 (10): 48-53.
[10] Akond MA, Jahan MN, Nigar S, Farhana R, (2016) Effect of temperature, pH and NaCl on the isolates of Actinomycetes from straw and  compost  samples  from  Savar,  Dhaka, Bangladesh. American Journal of Microbiology and Immunology 1(2): 10-15.
[11] Hemraj  V,  Diksha  S,  Avneet  G  (2013)  A review on commonly used biochemical test for  bacteria.  Innovare  Journal  of  Life Science 1(1): 1-7.
[12] Balai  KIPM  Kelas  I  Surabaya  (2016) Protokol  Instruksi  Kerja.  Sidoarjo:  BKIPM Kelas 1 Surabaya.
[13] Barrow  GI,  Feltham  RKA  (1993)  Cowan and Steel’s  manual for the identification of medical  bacteria  (Third  Edition).  UK: Cambridge University Press.
[14] Usman  WS  (2015)  Bakteri  asosiasi  karang yang terinfeksi penyakit Brown Band (BRB) di  perairan  Pulau  Barranglompo  Kota Makassar.  Skripsi. Makasar:  Universitas Hasanuddin.
[15] Tantu  W,  Reiny  AT,  Sammy  NJL  (2013) Deteksi  keberadaan  bakteri Aeromonas sp. pada  Ikan  Nila  yang  dibudidayakan  di
karamba  jaring  apung  Danau  Tondano. Jurnal Budidaya Perairan 1(3): 74-80.
[16] Rohmanita  SA,  Ardyati  T,  Gama  ZP, Nakagoshi N (2013) Identifikasi dan analisis Bacillus  thuringiensis isolat  lokal  Jawa Timur  yang  berpotensi  mengendalikan pertumbuhan larva Aedes aegypti .
Biotropika:  Journal  of  Tropical  Biology 1(5): 226-230.
[17] Athalye M, M Goodfellow, Lacey J, White RP  (1985)  Numerical  classification  of Actinomadura and Nocardiopsis . Journal of Systematic Bacteriology 35 (1): 86-98.
[18] Holt JG, Sneath, PH, Krieg, Noel R (1994)
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology: Ninth Ed. USA: William and Walkins Baltimore.
[19] Pujiati,  (2014)  Isolasi Actinomycetes dari tanah  kebun  sebagai  bahan  petunjuk praktikum  mikrobiologi.  Jurnal  Flore  1(2): 42-46.
[20] Armaida  E,  Siti  K  (2016)  Karakterisasi Actinomycetes yang  berasosiasi  dengan Porifera ( Axinella spp.)  dari  perairan  Pulau
Lemukutan Kalimantan Barat. Jurnal
Protobiont 5 (1): 68-73.
[21] Nurkanto  A,  Andria  A  (2015)  Identifikasi molekular dan karakterisasi morfo-fisiologi Actinomycetes penghasil senyawa antimikroba.  Jurnal  Biologi  Indonesia  11 (2): 195-203.
[22] Al-Alsaadi A, Noora MH, Eman MJ (2013) Isolation and identification of Streptomyces from  different  sample  of  soils.  Journal  of Biology and Medical Science 1: 31-36.
[23] Jawetz  M,  Adelberg  (2007)  Mikrobiologi Kedokteran. EGC: Jakarta. 165-174.
[24] Valenzuela-cova  JF,  Cudberro  CP,  Hector SH,  Lorena  CG,  Carlos  AVC,  Hiram  OD (2005)  Biochemical  identification  and molecular  characterization  (PCR-RFLP)  of Nocardia Isolates from sputum. Archives of Medicine Research 36: 356-361.
[25] Nursulistyarini  F,  Erny  QA  (2014)  Isolasi dan  identifikasi  bakteri  endofit  penghasil antibakteri  dari  daun  tanaman  Binahong ( Anredera cordifolia (Ten.) Steenis). Seminar  Nasional  XI  Pendidikan  Biologi
FKIP UNS. Surakarta: UNS. [26] Rahardi  B,  Arumingtyas  EL,  Firdaus  W (2012) Constructing phenetic and phylogenetic  relationship  using  Clad97. Journal of Tropical Life Science 2(1): 15-20.
[27] Cohan  FM  (2002)  What  are  bacterial species?  Annual  Review  of  Microbiology 56: 457-487.
[28] Kelley  RW,  Kellogg  ST  (1978)  Computer- assisted identification of anaerobic bacteria. Applied  and  Environmental  Microbiology
35(3): 507-511.
[29] Zulaika E, Rositawati DN (2016) Keanekaragaman bakteri pelarut fosfat dari kawasan  Mangrove  Wonorejo  dengan pendekatan  taksonomi  numerik  fenetik. Seminar Nasional
Biodiversitas VI, Surabaya 3 September 2016.