## KATA PENGANTAR
Dengan  penuh  rasa  syukur  kehadirat  Allah  SWT,  Media  Farmasi  Vol.  11 No.2 Tahun 2014 telah terbit.
Pada  edisi  ini,  Jurnal  Media  Farmasi  menyajikan  artikel  yang  semuanya merupakan  hasil  penelitian.  Sembilan  artikel  dari  luar  Fakultas  Farmasi  UAD membahas,  (1)  Studi  pengguna  spektrofometri  inframerah  dan  kemometrika  (2) Optimasi  formula matrik patch mukoadhesif ekstrak daun sirih  ( Piper batle L .)
(3) Pengembangan basic cold cream ekstrak kulit manggis ( Garcinia mangostana L. ) (4) Aktivitas antioksidan ekstrak etanolik berbagai jenis sayuran (5) Layanan pesan  singkat  pengingat  (6)  Pola  peresepan  antiemetik  pada  penderita  dispepsia pasien dewasa dan lanzia (7) Evaluasi kepatuhan pasien diabetes melitus tipe 2 (8) Pengaruh  pengetahuan  dan  sikap  orang  tua  terhadap  swamedikasi  obat  demam pada  anak.  Tiga  artikel  dari  penelitian  Fakultas  Farmasi  UAD  yang  membahas tentang  :    (1)  Penggunaan  antibotik  pada  pasien  leukemia  akut  dewasa  (2) Formula granul kombinasi ekstrak terpurifikasi herba pegagan ( Centella asiatica (L)  Urban )  dan  herba  sambiloto  ( Andrographis  paniculata)  (Burm.f.)Ness )  (3) efek ekstrak etanol kelopak rosela ( Hibiscus sabdariffa L ).
Harapan  kami,  jurnal  ini  dapat  bermanfaat  bagi  pembaca  atau  menjadi referensi  peneliti  lain.  Kritik  dan  saran  membangun,  senantiasa  kami  terima dengan tangan terbuka.
Efek Ekstrak Etanol Kelopak Rosella
Nurkhasanah, dkk 155

## EFEK EKSTRAK ETANOL KELOPAK ROSELLA
( Hibiscus sabdariffa L.) TERHADAP SEKRESI NITRIT OXIDA (NO) MAKROFAG PERITONEUM TIKUS YANGDIINDUKSI

## 7,12-dimethylbenz(α)antracene (DMBA)
THE EFFECT OF ROSELLE ( Hibiscus sabdariffa L.) CALYX
ETHANOLIC EXTRACT ON THE SECRETION OF NITRIT OXIDE (NO) OF PERITONEAL MACROPHAGE OF 7,12- dimethylbenz(α)antracene (DMBA) INDUCED RATS

## Nurkhasanah, Lovrina Rahmi Zulkarmen
Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan Jl. Prof. Dr. Soepomo, Janturan, Yogyakarta, Telp. (0274) 379418 Email: nurkhas@gmail.com

## ABSTRAK
Sistem  imun  merupakan  sistem  perlindungan  tubuh  terhadap  penyakit.  Senyawa DMBA  dilaporkan  memiliki  efek  imunosupresif.  Tujuan  penelitian  ini  untuk mengetahui  efek  ekstrak  etanol  kelopak  rosella  terhadap  sekresi  Nitrit  Oxide makrofag  tikus  SD  yang  diinduksi  DMBA.  Tikus  jantan  galur  SD  sebanyak  25 ekor  dibagi  menjadi  5  kelompok,  masing-masing  kelompok  terdiri  dari  5  ekor tikus, kelompok I (normal) yang hanya diberi makan dan minum saja, kelompok II  diberi  DMBA  15  mg/tikus  dan  kelompok  III,  IV,  V  sebagai  kelompok perlakuan  yaitu diberi ekstrak etanol kelopak rosella dengan dosis 10 mg/kgBB, 50 mg/kgBB dan 100 mg/kgBB per oral. Setelah diberikan perlakuan, 5 ekor tikus pada masing-masing kelompok dibedah dan uji sekresi NO makrofag. Sekresi NO dilakukan dengan metode Griess assay . Data yang diperoleh dianalisis dengan uji Kolmogorof Smirnov, kemudian dilanjutkan dengan uji ANOVA dan uji post hoc LSD  untuk  melihat  kelompok  mana  saja  yang  menunjukkan  perbedaan  yang bermakna.  Dari  penelitian  yang  dilakukan  diperoleh  hasil  bahwa  terjadi  pada kelompok DMBA terjadi penurunan sekresi NO dibandingkan normal. Perlakuan ekstrak rosella meningkatkan sekresi NO setelah perlakuan DMBA. Dosis ekstrak etanol  kelopak  rosella  yang  paling  efektif  dalam  meningkatkan  sekresi  NO makrofag yaitu pada dosis 50 mg/kgBB.
Kata kunci : DMBA, sistem imun, Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.), Nitrit oksida (NO).
Media Farmasi, Vol. 11 No.2 September 2014 : 155-166

## ABSTRACT
The  immune  system  is  the  body's  protection  against  disease.  DMBA  compounds reported to have immunosuppressive effects. The purpose of this research was to determine  the  effects  of  roselle  calyx  ethanol  extract  of  the  secretion  of  Nitric Oxide DMBA-induced rat  macrophages. SD strain  male rats by 25 tails divided into 5 groups, each group consisted of 5 rats, group I (normal) were only given food  and  drink  alone,  the  second  (II)  group  was  given  15  mg  DMBA/rat  and group III, IV, V as a treatment group that was given roselle calyx ethanol extract at a dose of 10 mg/kgBB, 50 mg/kgBB and 100 mg/kgBB orally. After being given the treatment, 5 rats in each group dissected and macrophage NO secretion test. NO  secretion  was  conducted  by  Griess  assay.  Data  were  analyzed  with Kolmogorof Smirnov test, followed by ANOVA and post hoc LSD test to see which groups  showed  no  significant  differences.The  research  found  that  DMBA treatment decrease the NO secretion compare to normal group. Treatment rosella extract  increase  the  NO  secretion.  The  dose  50mg/kg  BW  was  found  to  be  the most effectife dose on increasing the secretion of NO.
Keywords: DMBA, immune system, Rosella (Hibiscus sabdariffa L.), Nitric oxide (NO)

## PENDAHULUAN
Sistem  imun  adalah  sistem yang  digunakan  tubuh  sebagai perlindungan  diri  terhadap  bahaya yang  ditimbulkan  oleh  lingkungan hidup  (Baratawidjaja,  2006).  Sistem imun  terbagi  menjadi  sistem  imun spesifik dan sistem imun non spesifik (Kresno,  2001).  Pada  sistem  imun non  spesifik  terdapat  sel-sel  yang berperan  salah  satunya  adalah makrofag.  Makrofag  sebagai  efektor pada sistem imun, berperan memusnahkan  kuman  atau  patogen yang akan merusak tubuh (Harijanto, 2000),  baik  melalui  mekanisme fagositosis  intraseluler  langsung maupun  melalui  mekanisme  tak langsung  dengan  melepaskan Nitrit oxide (NO), Reactive  Oxygen Intermediate (ROI)  dan  sitokin (Wijayanti, 2000).
Nitrit  oksida  (NO)  merupakan suatu  radikal  bebas  yang  disintesa oleh  enzim Nitric  Oxide  Synthase (NOS) melalui reaksi yang komplek. Nitric  Oxide mempunyai  banyak manfaat  bagi  tubuh,  salah  satu  yang terpenting  adalah  peranannya  dalam sistem imun tubuh (Idhayu, 2006). Senyawa yang dapat meningkatkan  sistem  imun  disebut dengan  imuno  stimulansia.  Imuno stimulansia  dapat  diperoleh  dari tanaman,  salah  satu  jenis  tanaman yang dimanfaatkan untuk meningkatkan  sistem  imun  adalah Rosella  ( Hibiscus  sabdarifa  L. ). Ekstrak  etanol  kelopak  rosella sebagai  upaya  pengobatan  telah dibuktikan dapat meningkatkan aktivitas fagositosis makrofag,
Efek Ekstrak Etanol Kelopak Rosella Nurkhasanah, dkk 157 jumlah sekresi NO, sekresi ROI, dan ekspresi  IL-12  makrofag  peritoneum tikus  SD  yang  diinduksi  DMBA (Akuba, 2013) pada tikus immunedepresi  akibat  radikal  bebas. Penelitian  ini  akan  melihat  efek protektif  dari  pemberian  rosella, sehingga  rosella  diberikan  terlebih dahulu kemudian tikus diberiperlakuan DMBA. Senyawa  DMBA  merupakan zat  kimia  yang  termasuk  dalam polycyclic  aromatic  hydrocarbon (PAH)  (Budi  dan  Widyarini,  2010). Pembetukan metabolit DMBA melibatkan  enzim  sitokrom  P450 1A1 (CYP1A1) dan enzim mikrosomal hidrolase pada metabolisme  fase  I  merubah  DMBA menjadi  DMBA-DE  yang  bersifat imunosupresif (Hamid dkk, 2009).
Induksi  DMBA  pada  tikus dapat  menurunkan  jumlah  makrofag peritoneal.  Jika  jumlah  makrofag peritonealnya menurun, maka sekresi NO  akan  mengalami  penurunan sehingga  dapat  menurunkan  sistem imun.  Torroella-Kouri  dkk.  (2009) telah  melaporkan  bahwa  induksi DMBA menghambat  ekspresi  iNOS, menghambat sekresi  NO dan sekresi IL-12 oleh makrofag, maka penelitian  ini  dirancang  untuk mengetahui lebih dalam efek ekstrak kelopak  rosella  sebagai  terapi pencegahan  (preventif)  terhadap sekresi Nitrit  Oksida (NO) makrofag peritoneum  tikus  yang  diinduksi DMBA.

## METODE PENELITIAN
Penelitian yang akan dilakukan adalah penelitian eksperimental dengan  rancangan post-test  only control group design .
Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  ekstrak  etanol rosella ( Hibiscus sabdariffa L. ) yang diperoleh dari Jawa Timur.
Hewan  uji  yang  digunakan adalah  tikus  jantan  galur Sprague
Dawley yang  berumur  kurang  lebih 1,5  bulan  yang  diperoleh  dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada (LPPT UGM) Yogyakarta.
Pembuatan  Ekstrak  Etanol  Rosella ( Hibiscus sabdariffa L. )
Sebanyak  1500  gram  serbuk kelopak  bunga  rosella  diekstraksi dengan  pelarut  etanol  60%  7500  ml (1:4) menggunakan metode maserasi dengan  pengadukan  selama  kurang lebih  3  jam,  kemudian  didiamkan sampai  24  jam.  Maserat  diuapkan dengan  vacum  rotary  evaporator dengan suhu 60 0 C dan dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-70 0 C hingga  diperoleh  ekstrak  kental.
Ektrak  etanol  kelopak  bunga  rosella ditimbang dan dihitung rendemennya. Perlakuan Hewan Uji Tikus  SD  sebanyak  25  ekor dibagi menjadi 5 kelompok, masing- masing  kelompok  terdiri  dari  5ekor
158 Media Farmasi, Vol. 11 No.2 September 2014 : 155-166 tikus. Seluruh hewan uji diadaptasikan selama 1 minggu. Kelompok  I  adalah  kelompok base  line atau  normal  yaitu  tikus hanya diberi makan dan minum saja. Kelompok  II  adalah  kelompok dengan  pemberian  DMBA  dalam minyak  jagung  dengan  dosis  15 mg/ekor secara single dose .
Kelompok III, IV dan V adalah kelompok dengan pemberian  ekstrak etanol kelopak rosella dengan variasi dosis yaitu masing-masing 10mg/kgBB,  50mg/kgBB,  dan  100 mg/kgBB per oral dan DMBA dalam minyak  jagung  dengan  dosis  15
mg/ekor  secara single  dose .  Pada kelompok  perlakuan  ini  terlebih dahulu  masing-masing  kelompok hewan  uji  diberikan  ekstrak  etanol kelopak  rosella  sesuai  dengan  dosis masing-masing  kelompok  selama  3 minggu  dan  diinduksi  DMBA  pada hari ke-22.
Setelah  induksi,  tikus  pada setiap  kelompok  dibiarkan  hidup selama  1  minggu  dengan  pemberian makan  dan  minum  saja.  Tikus ditimbang  seminggu  sekali  untuk mengetahui  perkembangan  berat badan.  Pada  hari  ke  30,  lima  ekor tikus  pada  masing-masing  kelompok dibedah  dan  dilakukan  uji  sekresi NO makrofag.
Isolasi dan kultur makrofag Semua  kelompok  hewan  uji dibunuh dengan narkose menggunakan kloroform. Tikus diletakkan  pada  posisi  telentang,
kulit  bagian  perut  dibuka  dan dibersihkan  selubung  peritoneumnya dengan  alkohol  70%,  kemudian disuntikkan  10  ml  medium  RPMI dingin  ke  dalam  rongga  peritoneum, ditunggu  selama  3  menit  sambil digoyang-goyang  perlahan.  Cairan peritoneum  dikeluarkan  dari  rongga peritoneum  dengan  cara  menekan rongga  dengan  2  jari,  cairan diaspirasi  dengan  spuit  injeksi, dipilih  pada  bagian  yang  tidak berlemak dan jauh dari usus. Aspirat yang  terkumpul  dalam  spuit  injeksi dikumpulkan dan dimasukkan dalam wadah  sesuai  dengan  kelompok (tanpa  induksi  DMBA  dan  induksi DMBA). Jumlah sel dihitung dengan haemocytometer dan ditentukan viabilitasnya,  ditambahkan  medium komplit sehingga didapatkan suspensi  sel  dengan  kepadatan  2,5  x 10 6 ml/Suspensi  sel  ditumbuhkan dalam mikrokultur 24  sumuran. Setiap  sumuran  diisi  200  µl  (5x10 5
sel).  Sel  diinkubasi  dalam  inkubator
CO 2 5% selama 30 menit, ditambahkan  medium  komplit  tiap sumuran  dan  diinkubasi  sampai  24 jam. (Wijayanti, 2000). Diambil  100 µl tiap sumuran, untuk dilakukan uji NO.

## Determinasi NO
Pembuatan kurva baku nitrit oksida Larutan  Griess  A    dibuat dengan  melarutkan  0,1  gram  N-(1- naphthyl) ethylene diamin ehydrochloride (SigmaN, 5889) dalam  100  ml  aquadest.  Disimpan
Efek Ekstrak Etanol Kelopak Rosella Nurkhasanah, dkk 159
pada  suhu  0-4 0 C,  terlindung  dari cahaya.  Larutan  Griess  B  dibuat dengan melarutkan 1 gram sulfanilamide (Sigma N 5589) dalam 100  mL  5%  (v/v)  orthophosphoric acid.  Simpan  pada  suhu  0-4 0 C, terlindung dari cahaya.
Nitrit  standard  dibuat  dengan melarutkan  69,0  mg  sodium  nitrate dalam  100  ml  aquadest.  Disimpan pada  suhu  0-4 0 C,  terlindung  dari cahaya,  buat  larutan  standar  dari stock  ini  antara  0-50  uM  nitrit. Sebanyak  100  uL  sampel  dan  nitrit standard  dimasukkan  dalam 96-well mikrotitter  plate, jika  kurang  dari 100 uL sampel yang digunakan maka volume  dinaikkan  hingga  100  uL dengan air atau medium. Ditambahkan  100  uL  larutan  griess dan  inkubasi  pada  temperatur  kamar selama  15  menit  hingga  terjadi perubahan  warna.  Setelah  semua sampel  dan  standar  dimasukkan dalam microtiter  plate ,  diukur absorbansinya  dengan  menggunakan alat ELISA reader. Ukuran absorbansi untuk sampel dan standar
adalah 540 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis Kadar Fenolik Kualitatif Hasil uji polifenol menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol bunga  rosella  yang  digunakan  pada penelitian positif mengandung senyawa polifenol. Hasil uji
polifenol  dapat  dilihat  pada  gambar 1.
Uji  polifenol  dimaksudkan untuk  memastikan  adanya  senyawa polifenol  dalam  ekstra  ketanol kelopak  rosella.  Penetapan  kadar polifenol dilakukan dengan menggunakan pereaksi Folin- Ciocalteau. Reagen  Folin  Ciocalteau digunakan  karena  senyawa  fenolik dapat bereaksi dengan Folin membentuk  larutan  berwarna  yang dapat  diukur  absorbansinya.  Setelah dilakukan pengujian didapatkan operating  time  57–77  menit,  dan panjang  gelombang  maksimal  780. Pada  penentuan  kadar  fenolik  total, larutan  standar  yang  digunakan adalah  asam  galat asam  3,4,5- trihidroksi benzoat (C 6 H 2 (OH) 3 CO 2 H) dengan  variasi konsentrasi yaitu  100, 125, 150, 175, dan  200  μg/ml. Asam  galat digunakan  sebagai  larutan  standar karena  merupakan  salah  satu  jenis senyawa  fenolik.  Hasil  pengukuran dapat dilihat pada tabel I.
.
Gambar  1 .  Hasil  Uji  Kualitatif  dengan  Penambahan  FeCl 3; a)  Filtrat  EEKR  sebelum  ditambah FeCl 3; b) Filtrat EEKR setelah ditambah FeCl Kuantitatif
Tabel I. Kurva baku larutan standar asam galat Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi 100 0,363 125 0,460 150 0,527 175 0,637 200 0,710
Gambar  3. Kurva baku penetapan kandungan fenolik total menggunakan standar asam galat
Berdasarkan  data  diatas  dibuat kurva  hubungan  antara  konsentrasi larutan  standar  asam  galat  dengan absorbansi  dan  dicari  persamaan regresi  linier.  Persamaan  regresi linier  yang  diperoleh,  y  =  0,003x  + 0,016  dan  R  =  0,997,  dimana  x  =
konsentrasi  (µg/ml)  dan  y  = absorbansi,  R  tabel  dengan  N  =  5 yaitu  0,878.  Dikatakan  persamaan yang linear, jika R hitung lebih besar dari  R  tabel,  dari  data  diperoleh
A B
Efek Ekstrak Etanol Kelopak Rosella Nurkhasanah, dkk 161 Rhitung  >Rtabel  yaitu  0,997>0,087, sehingga  persamaan  linear.  Hasil pengukuran  kandungan  fenolik  total ekstrak etanol kelopak bunga rosella dapat dilihat pada Tabel II.
Kandungan fenolik total rata- rata  EEKR  diperoleh  kadar  sebesar 2,3399  gram  GAE/100g  ekstrak. Kadar  yang  didapat  berbeda  dengan penelitian  yang  telah  dilakukan Apsari  (2011)  memperoleh  kadar fenolik total ekstrak metanol kelopak rosella  merah  adalah  1,568+0,031 gram  GAE/100g  ekstrak.  Perbedaan perolehan  kadar  ini  dapat  terjadi karena  perbedaan  tempat  tumbuh, kondisi  iklim  bunga  rosela  yang digunakan dalam penelitian sehingga kandungan  zat  aktif  yang  diperoleh berbeda.
Uji  Sekresi NO Uji  sekresi  NO  dilakukan untuk untuk mengetahui efek prefentif  pemberian  ekstrak  rosella terhadap  sekresi  NO  makrofag peritoneum tikus untuk menanggulangi immunosupresi akibat  radikal  bebas.  Sekresi  NO diuji  dengan griess  reaction  assay yang  menghasilkan  warna  merah muda yang kemudian diukur absorbansinya dengan Elisa Reader
Hewan  uji  yang  digunakan adalah tikus galur SD yang memiliki sensitifitas  sangat  tinggi  terhadap karsinogen  DMBA.  Tikus  yang digunakan berumur 1,5 bulan karena merupakan  periode  yang  paling sensitive untuk karsinogenesis (Kubatka, 2002). Kemampuan makrofag peritoneum tikus SD dalam mensekresi  NO  diuji  dengan griess reaction  assay yang  menghasilkan warna  merah  muda  yang  kemudian diukur  absorbansinya  dengan ELISA Reader .  Pada  metode  ini  nitrit direaksikan  dengan  reagen  diazotasi yaitu  sulfanilamide  dalam  suasana asam  membentuk  garam  diazonium. Garam  diazonium  ini  kemudian bereaksi dengan reagen kopling yaitu N-napthylethylendiamine menjadi bentuk  azo  yang  stabil. Griess Reaction  Assay akan  menghasilkan warna  merah  muda  yang  intensif. Absorbansi  nitrit  ini  dibaca  pada panjang  gelombang  550  nm  (Sun et al ., 2003; Stevenson et al. , 2005).
Sekresi  NO  oleh  makrofag dihitung  dengan  membandingkan dengan kurva baku NO pada tabel III
Tabel II . Hasil penetapan kandungan fenolik total ekstrak etanol kelopak bunga  rosella. Replikasisa mpel Absorbansi X (µg/mL) Kadar fenolik total (g GAE/100 g ekstrak) X ± SD 1 2 0,412 0,409 116,23 115,35 2,3236 2,3056 2,3399 ±0,0316 3 0,417 117,70 2,3538 4 0,421 118,88 2,3769
Media Farmasi, Vol. 11 No.2 September 2014 : 155-166 Tabel III. Kurva baku larutan standar nitrit Konsentrasi Nitrit Standar (µM) Absorbansi 50 2,684 25 1,485 12,5 0,787 6,25 0,426 3,125 0,224
Tabel  IV. Kadar  sekresi  NO  makrofag  peritoneum  tikus  SD  yang  diinduksi  DMBA  dan  diberi
perlakuan ekstrak etanol kelopak rosella (EEKR )
Dari  hasil  kurva  baku  pada tabel III dihitung regresi linear antara absorbansi  versus  konsentrasi  nitrit standar,  diperoleh  persamaan  regresi linear  sebagai  berikut  Y  =  19,09x  – 2,04,  dengan  nilai  R  =  0,998.  Dari persamaan  regresi  linear  tersebut akan  didapatkan  kadar  sekresi  NO makrofag  peritoneum  tikus  SD  pada setiap  kelompok  perlakuan..  Data aktivitas  sekresi  NO  dapat  dilihat pada tabel IV.
Hasil  penelitian  pada  uji Kolmogorof-Smirnof menunjukkan data  terdistribusi  normal  (p>0,05) yaitu 0,955 dan pada uji homogenitas varian dengan uji Levene menunjukkan data terdistribusi homogen  (p>0,05)  yaitu  sebesar 0,146. Analisis dilanjukan dengan uji ANOVA  dan  uji  LSD  untuk mengetahui  ada  atau  tidaknya perbedaan  antar  kelompok.  Hasil
menunjukkan  terdapat  perbedaan bermakna  antara  kelompok  DMBA dengan  kelompok  normal  dan kelompok variasi dosis.
Jika  dilihat  gambar  4,  dapat terlihat  bahwa  semua  kelompok variasi  dosis  dan  kelompok  normal memiliki  rata-rata  sekresi  NO  yang berbeda signifikan dengan kelompok DMBA (p<0,05). Pemberian DMBA menimbulkan  efek  immunosupresi secara  signifikan,  kadar  NO  pada kelompok  DMBA  lebih  rendah secara signifikan dibandingkan dengan  kadar  NO  pada  kelompok normal. Selain itu, perlakuan ekstrak rosella  pada  semua  dosis  perlakuan meningkatkan  kadar  NO  secara signifikan  dibandingkan  kelompok DMBA. Hal ini membuktikan bahwa ekstrak  rosella  dapat  meningkatkan sekresi NO pada kondisi immunosupresi Kelompok Replikasi Rata-rata SD Normal 0,118 0,122 0,119 0,119 0,0020 DMBA 0,112 0,113 0,111 0,112 0,0010 EEKR 10mg 0,122 0,119 0,125 0,122 0,0030 EEKR 50mg 0,132 0,135 0,134 0,133 0,0015 EEKR 100mg 0,127 0,123 0,134 0,128 0,0055
Ket : *berbeda signifikan dengan kelompok DMBA (p<0,05)
Gambar 4. Grafik rata-rata sekresi NO makrofag peritoneum tikus SD yang diinduksi DMBA dan diberi perlakuan ekstrak etanol kelopak rosella
Untuk mengetahui dosis EEKR yang mampu mengembalikan sekresi NO menjadi normal, maka kelompok variasi  dosis  dibandingkan  dengan kelompok  normal.  Secara  umum, diperoleh  rata-rata  dari  kelompok variasi dosis lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok normal,  walaupun  pada  dosis  10 mg/kgBB  setelah  dilakukan  uji statistik didapatkan signifikansi yang tidak  berbeda  signifikan  dengan kelompok  normal  yaitu  p  = 0,376>0,05,  ini  dapat  disimpulkan bahwa  EEKR  dengan  dosis  10 mg/kgBB dapat menormalkan sekresi NO makrofag. Pada  dosis  50  mg/kgBB  dan dosis 100 mg/kgBB setelah dilakukan  uji  statistik  didapatkan signifikansi  yang  berbeda  signifikan dengan  kelompok  normal  yaitu masing-masing p=0,000
dan p=0,008<0,005.  Dari  data  tersebut maka    pada  dosis  50  mg/kgBB  dan 100 mg/kgBB mampu meningkatkan sekresi NO melebihi normal.
Gambar  4  juga  menunjukkan bahwa  pada  perlakuan  pada  rentang dosis  yang  diberikan  10-100  mg/kg BB, diketahui perlakuan dengandosis 100mg/kgBB memberikan efek peningkatan lebih kecil dibandingkan dengan  dosis  50  mg/kg  BB.Maka dapat  disimpulkan  bahwa  dosis  50 mg/kgBB  merupakan  dosis  yang paling  efektif  untuk  meningkatkan sekresi NO.
Juliyanti  Akuba  (2013)  dalam penelitiannya juga melaporkan bahwa  pemberian  ekstrak  etanol kelopak  rosella  dosis  10  mg/kgBB,
50  mg/kgBB  dan  100  mg/kgBB sebagai  upaya  pengobatan  dapat
164 Media Farmasi, Vol. 11 No.2 September 2014 : 155-166 meningkatkan  sistem  imun  yang ditandai dengan meningkatnya aktifitas  fagositosis,  sekresi  NO, sekresi ROI dan ekspresi IL- 12 pada makrofag  tikus  SD  yang  telah diinduksi DMBA. Sedangkan kelompok  yang  diinduksi  DMBA dapat menurunkan aktifitas fagositosis,  sekresi  NO,  sekresi  ROI dan  ekspresi  IL-  12  pada  makrofag sehingga  dapat  menurunkan  sistem imun. Pemberian ekstrak etanol kelopak  rosella  dapat  meningkatkan aktivitas fagositosis makrofag, menunjukkan bahwa terjadi peningkatan  aktivitas  fagositosis makrofag  dengan  pemberian  ekstrak etanol  kelopak  rosella  dan  terjadi penurunan  pada  kelompok  induksi DMBA.  Ekstrak  etanol  kelopak rosella  juga  dapat  meningkatkan sekresi  ROI,  bahwa  pada  pemberian ekstrak etanol kelopak rosella terjadi peningkatan  persentase  sekresi  ROI dan  penurunan  persentase  sekresi ROI pada kelompok induksi DMBA, pada  uji  sekresi  ROI  ini  diperoleh dosis  yang  paling  efektif  yaitu  dosis 10 mg/kgBB.
Nitrit  Oxida (NO)  mempunyai banyak  manfaat  bagi  tubuh,  salah satu yang terpenting adalah peranannya  dalam  sistem  imun tubuh. Nitrit  Oxide ikut  membantu melindungi  tubuh  dari  bakteri  yang masuk  melalui  saluran  pencernaan (Idhayu,  2006)  dan  merupakan efektor  anti  bakterial  yang  efektif dalam sistem imunitas tubuh.
Senyawa  NO  bersifat  toksik  dan berumur pendek, berupa molekul gas yang  diproduksi  oleh  iNOS  (Oca dkk,  2005).  Adanya  variasi  dosis dalam penelitian ini dilakukan untuk melihat  dosis  mana  yang  paling efektif  untuk  meningkatkan  sekresi NO  makrofag  pada  tikus  yang diinduksi DMBA.
Secara biokimia aktivitas imunostimulator  yang  ditimbulkan oleh  ekstrak  etanol  kelopak  rosella mungkin  disebabkan  oleh  kompleks fenol  dengan  protein  atau  masing- masing  komponen  tersebut  yang berperan sebagai imunogen. Kompleks fenol dan protein ini akan berikatan dengan reseptor permukaan sel  makrofag  (TLR).  Hal  ini  dapat memacu aktivitas makrofag sehingga dapat  meningkatkan  sekresi Nitrit Oxide dan Reactive Oxygen Intermediate yang merupakan komponen  sistem  imun  nonspesifik.
Kompleks fenol  dengan  protein juga dapat  meningkatkan  sistem  imun spesifik  dengan  perantara  NO  yang dilepaskan  oleh  makrofag.  NO  yang dilepaskan  oleh  makrofag,  dapat berdifusi masuk kedalam sel limfosit T  dan  meningkatkan  proliferasi limfosit  T  (Betteli  dkk.,  2005).
Secara  umum  dapat  disimpulkan hasil penelitian ini telah menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol kelopak  rosella  sebagai  terapi pencegahan telah mampu meningkatkan  sekresi  NO  makrofag peritoneum  tikus  SD  yang  diinduksi DMBA.
Efek Ekstrak Etanol Kelopak Rosella Nurkhasanah, dkk 165

## KESIMPULAN
Ekstrak  etanol  kelopak  rosella dapat  meningkatkan  sekresi  NO makrofag  peritoneum  tikus  SD  yang diinduksi  DMBA,  dengan  dosis 50mg/kg  BB  adalah  dosis  efektif untuk peningkatan sekresi NO.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapakan  terimakasih kepada  Lembaga  Penelitian  dan Pengembangan    UAD,  atas  bantuan biaya penelitian yang diberikan .

## DAFTAR PUSTAKA
Akuba, J., 2013, Efek Ekstrak Etanol
Rosella  ( Hibiscus  sabdariffa Linn)  Terhadap  Aktifitas Fagositosis, Sekresi NO, Sekresi ROI dan Ekspresi IL- 12  Makrofag  Tikus  Sprague Dawley  yang  di  induksi DMBA, Tesis , Program Pasca Sarjana  Unuversitas  Ahmad
Dahlan, Yogyakarta.
Apsari,  P.D.,  2011,  Perbandingan
kadar  fenolik  total  ekstrak metanol  kelopak  merah  dan ungu  bunga  rosela  ( Hibiscus sabdariffa Linn.) secara spektrofotometri, Skripsi , Fakultas  Farmasi  Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta. Baratawidjaja, K.G., 2006, Imunologi  Dasar ,  Edisi  7, Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Umum Universitas Indonesia, Jakarta. Bettelli,  E.,  Dastrange,  M.,  Oukka, M.,  2005,  Foxp 3 interacts with nuclear factor of activated  T  cells  and  NF- kappa  B  to  repress  cytokine gene  expression  and  effector functions  of  T  helper  cells, Proc  Natl  Acad  Sci. 102(14):
5138-43 Budi,  R,  T  dan  Widyarini,  S.,  2010, Dampak Induksi Karsinogenesis Glandula Mammae  dengan  7,  12- dimetilbenz(α)antrasen terhadap Gambaran Histopatologis Lambung Tikus Sprague Dawley , J Vet
Vol. 11 No. 1: 17-23.
Hamid,  S.,  Iwan.,  Sugiyanto., Meiyanto,  E.,  Widyarini.,
2009,  Ekspresi  CYP1A1  dan
GSTµ  hepatosit  terinduksi 7,12-dimetilbenz(a)antrasena dan pengaruh  pemberian ekstrak etanolik Gynura procumbens, MFI ,  20(4), 198-206. Harijanto,  P.N.,  2000, Malaria Epidemiologi, Patogenesis, Manifestasi Klinis dan Penanganannya, EGC, Jakarta. Idhayu, A., 2006, Pengaruh Pemberian  polifenol  Teh Hijau  Terhadap  sekresi Nitrit
Oksida (NO)  Sel  Fagosit, Karya  Tulis  Ilmiah ,  Fakultas Kedokteran UNDIP, Semarang. Kresno,  S,  B.,  2001, Imunologi , Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.
166 Media Farmasi, Vol. 11 No.2 September 2014 : 155-166
Kubatka, P., Ahlersova E., Ahlers, I.,
Bojkova,  B.,  Kalicka,  K., Adamekova,  E.,  Markova, M.,  Chamilova,  M.,  and Cermakova, M., 2002, Variability of Mammary Carsinogenesis  Induction  in Female Sparague-Dawley and  Wistar:  Han  Rats:  the effect  of  Season  and  Age, Physiol . Res. 51: 633-40
Oca,  MM.,  Torres,  SH.,  Santics,  D., Mata,  A.,  Hernandez,  N., Talano  C.,  2005,  Sceletal muscel  inflamation  and  nitric oxide in patients with COPD,
Eur  Respir  J .  Vol.26  no.  3. 390-397. Steveson, L.M., Mathias, A.,
Banbury,  L.,  Penman,  K.G., Bone,  K.M.,  Leach,  D., Leachman, R.P., 2005, Modulation  of  Macrophage Immune respons by Echinacea, Molecule, 10, 1279-1285.
Sun,  J.,  Zhang,  X.,  Broderick,  M.,
Fein,  H.,  2003,  Measurement of Nitirc Oxide Production in Biological  System  by  Using Griess Reaction Assay, Sensors , 3, 276-284.
Torroella-Kouri,  M.,  Silvera,  R., Rodriguez,  D.,  Caso,  R.,
Shantry,  A.,  Opiela,  S., Ilkovitch,  D.,  Schwendener,
RA.,  Iragavarapu-Charyulu,
V.,  Cardentey,  Y.,  Strbo,  N., Lopez, DM., 2009, Identification of a subpopulation of macrophages  in  mammary tumor-bearing  mice  that  are the  neither  M1  nor  M2  and are less differentiated, Cancer Res . 69(11): 4800-9. Wijayanti,  M.W.,  2000,  Sekresi Reactive Oxygen Intermediates  oleh  Makrofag Peritoneum Mencit yang Diimunisasi  Selama  Infeksi Plasmodium  berghe i, BIK ,
32, 77-