## PENGARUH  EKSTRAK PROPOLIS TERHADAP PENINGKATAN EKSPRESI p21, EKSPRESI PROTEIN Bax DAN INDUKSI APOPTOSIS PADA KULTUR SEL KANKER KOLON ( CELL LINE WiDr )

## THE EFFECT OF PROPOLIS EXTRACT ON THE IMPROVEMENT OF EXPRESSION OF p21, Bax PROTEIN EXPRESSION AND INDUCED APOPTOSIS IN CULTURE
CANCER CELLS KOLON (CELL LINE WiDr)
Didik Prasetyo, Suradi Maryono, Bambang Purwanto Sub Bagian Hemato Onkologi Medik, Bagian Ilmu Penyakit Dalam FK UNS / RSUD Dr. Moewardi Surakarta Korespondensi: Didik Prasetyo: prasetyobama@gmail.com
ABSTRAK
Kanker kolorektal merupakan kanker ketiga terbanyak dengan lebih dari 1 juta kasus setiap tahunnya dan salah satu kanker dengan mortalitas tertinggi di seluruh dunia. Radioterapi dan kemoterapi pada kanker relatif terbatas karena toksisitasnya yang tinggi dan efek samping yang bersifat merusak. Pengembangan propolis merupakan  strategi  baru  untuk  terapi  adjuvan  yang  diharapkan  meminimalkan  efek  samping  terapi  standar yang ada. Peran propolis pada keganasan terkait kemampuannya dalam menginduksi apoptosis dan aktivitas antiproliferasi.  Penelitian  in  vitro,  menunjukkan  propolis  memiliki  aktivitas  proapoptosis  pada  berbagai  jenis sel  kanker,  meliputi  :  kanker  laring,  kanker  paru,  kanker  pankreas,  kanker  tiroid,  kanker  payudara,  kanker prostat dan glioma. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian propolis yang berasal dari Kerjo, Karanganyar, Indonesia terhadap aktivitas antiproliferasi, terkait peningkatan ekspresi p21 dan induksi apoptosis terkait peningkatan ekspresi protein bax pada kultur sel kanker kolon (cell line WiDr). Jenis penelitian ini, eksperimental laboratorik dengan post test with control group design. Penelitian menggunakan kultur sel WiDr (sel kanker kolon) dengan pemberian ekstrak etanol propolis (EEP). Pengamatan ekspresi p21 dan protein Bax dengan metode imunositokimia, sedangkan pengamatan induksi apoptosis dengan flowcytometry. Analisis statistik  menggunakan uji Kruskall Wallis dilanjutkan Mann WhutneyU test. EEP cenderung menekan viabilitas sel WiDr dengan IC 50 sebesar 140 µg/mL. EEP konsentrasi 70,140, 280 µg/mL mampu meningkatkan ekspresi p21 yang sebanding dengan peningkatan konsentrasi yang diberikan. EEP konsentrasi 70 µg/mL (1/2 IC 50 ) paling efektif dalam menginduksi apoptosis dan meningkatkan ekspresi Bax pada sel WiDr. Peningkatan konsentrasi EEP mengakibatkan kematian sel WiDr ke arah nekrosis. Penelitian ini menunjukkan EEP mampu menekan viabilitas sel WiDr. Aktivitas ini kemungkinan terkait dengan kemampuannya dalam meningkatkan ekspresi p21 sebanding dengan peningkatan konsentrasi yang diberikan. EEP pada konsentrasi 70µg/mL mampu menginduksi apoptosis pada sel WiDr terkait dengan peningkatan ekspresi Bax. Peningkatan konsentrasi EEP konsentrasi 140 dan 280 µg/Ml mengakibatkan nekrosis sel WiDr.
Kata kunci: EEP, p21, protein bax, cell line WiDr

## ABSTRACT
Colorectal cancer is the third most cancers with more than 1 million cases each year and one of the cancers with the highest mortality worldwide. Radiotherapy and chemotherapy in cancer is relatively limited because of its high toxicity and side effects of a destructive nature. Propolis is a new development strategy for adjuvant therapy which is expected to minimize the side effects of standard therapy available. The role of propolis in malignancy related to its ability to induce apoptosis and anti-proliferation activities. In vitro studies showed propolis has proapoptosis activity on various types of cancer cells, including: laryngeal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, breast cancer, prostate cancer and glioma. This study is aimed to determine the effect of propolis originating from Kerjo, Karanganyar, Indonesia against anti-proliferation activities, related to increased expression of p21 and induction of apoptosis related to the increased expression of Bax protein in cultured colon cancer cells (cell line WiDr). This study is a laboratory experimental with post test with control group design. Research using
cell culture WiDr (colon cancer cells) with ethanol extract of propolis (EEP). Observations expression of p21 and Bax protein by immunocytochemistry method, whereas the induction of apoptosis by flowcytometry observations. Statistical  analysis  using  Kruskal  Wallis  test  followed  Mann  WhitneyU  test.  EEP  tend  to  suppress  WiDr  cell viability with IC50 of 140 mg / mL. EEP concentration of 70.140, 280 mg / mL can improve p21 expression that is comparable to the increasement in concentration given. EEP concentration of 70 ug / mL (1/2 IC50) is most effective in inducing apoptosis and increasing the expression of Bax in WiDr cells. Increasing concentrations of EEP can cause WiDr cell death toward necrosis. This study shows EEP able to suppress WiDr cell viability. This activity is probably related to its ability to improve p21 expression is proportional to the increasement in concentration given. EEP concentration of 70μg / mL was able to induce apoptosis in cells WiDr associated with increased expression of Bax. EEP concentrations of 140 and 280 mg / mL cause WiDr cell necrosis.
Keywords: EEP, p21, Bax protein, cell line WiDr.
PENDAHULUAN Kanker merupakan penyebab kematian utama, baik di negara maju maupun negara berkembang. Berdasarkan Globocan, pada tahun 2012 di seluruh dunia terdapat sekitar 14,1 juta kasus baru dan 8,2 juta kematian akibat kanker (Torre et al ., 2015). Di Indonesia, kanker menempati urutan kelima sebagai penyebab kematian dan angka kematian akibat kanker meningkat dari tahun ke tahun. Pada tahun 1992, angka kematian akibat kanker sebesar 4,8%, meningkat menjadi 5% pada tahun 1995, dan semakin meningkat menjadi 6% pada tahun 2001 sehingga kanker menjadi masalah kesehatan di masyarakat dengan prevalensi 4,3 per 1000 penduduk (SKRT, 2002; Depkes RI, 2009).
Kanker kolorektal merupakan kanker ketiga terbanyak di seluruh dunia, dengan lebih dari 1 juta kasus setiap tahunnya. Kanker ini mengakibatkan 0,7 juta kematian pada tahun 2012 dan merupakan salah satu kanker dengan angka kematian tertinggi di seluruh dunia (Globocan., 2013 ; Siegel et al .,  2014).  Di  Indonesia,  kanker  kolorektal merupakan jenis keganasan saluran cerna yang menempati urutan kedua terbanyak setelah kanker hepatoseluler. Berdasarkan data dari Indonesian Cancer , pada tahun2002 ditemukan sebanyak 3.572 kasus baru kanker kolorektal di Indonesia (Kurniawati dan Tenggara., 2011).
Mortalitas yang tinggi pada pasien kanker kolorektal dipengaruhi oleh kemampuan kanker tersebut metastasis ke organ yang jauh (Ottaiano et al .,  2006).  Sekitar  20%  dari  kasus  kanker kolorektal yang telah metastasis ini pada umumnya inoperable dan relatif tidak dapat disembuhkan dengan 5-year survival rate sebesar 12% (Wang dan  Zhang.,  2014).  Aplikasi  terapi  dengan menggunakan radioterapi dan kemoterapi relatif terbatas karena toksisitasnya yang tinggi dan efek
samping yang bersifat merusak. Pendekatan yang menarik untuk dikembangkan adalah penggunaan kombinasi kemoterapi atau sering disebut sebagai ko-kemoterapi. Ko-kemoterapi merupakan strategi terapi kanker dengan mengkombinasikan suatu senyawa kemopreventif yang bersifat tidak toksik dengan agen kemoterapi. Hal ini dapat meningkatkan  efikasi  agen  kemoterapi  karena adanya kombinasi yang sinergis dan memperkecil kemungkinan efek samping karena mengurangi dosis  agen  kemoterapi  (Alison,  2004).  Aplikasi ko-kemoterapi ini diharapkan dapat menurunkan toksisitas terhadap jaringan normal. Oleh karena itu, pengembangan terapi alternatif merupakan strategi yang mungkin dapat menurunkan efek samping dari terapi kanker kolorektal (Naithani et al ., 2008). Salah satu bahan alam yang potensial dikembangkan sebagai agen ko-kemoterapi adalah propolis. Propolis merupakan suplemen nutrisi yang dihasilkan oleh lebah dan telah digunakan sebagai pengobatan tradisional di dunia. Selain itu, propolis juga telah digunakan secara aman oleh dokter di Brazil, Jepang dan beberapa negara lain sebagai nutrisi suportif yang menyertai terapi standar untuk kanker (Paulino et al .,  2009). Propolis terdiri dari campuran resin, serbuk sari dan lilin tanaman yang dikumpulkan lebah dari berbagai jenis tanaman dan digunakan untuk proteksi sarang lebah dari mikroba (Ananda et al .,
2013 ; Watanabe et al ., 2011). Propolis mengandung berbagai senyawa kimiawi, seperti polyphenol (flavanoids,  asam fenolat dan esternya, aldehid fenolat, alkohol dan  keton),  terpenoid,  steroid,  asam  amino  dan berbagai komponen in organik (Kartal et al . 2003). Komposisi senyawa kimiawi dan aktivitas biologi propolis  bervariasi  tergantung  lokasi  geografi, asal tanaman, musim dan spesies lebah (Paulino et
al ., 2009). Propolis telah dibuktikan mempunyai berbagai aktivitas biologis seperti antibakteri, antijamur, antivirus, anestetik lokal, antiinflamasi, antioksidan,hepatoprotektor, imunostimulator, antikanker (antiproliferatif dan proapoptosis) serta berperan pada proses penyembuhan luka (Paulino et al ., 2009 ; Vatansever et al ., 2010 ; Kubina et al ., 2015). Hal yang relatif menjanjikan dari propolis, yaitu terkait dengan aktivitas antikanker yang dimilikinya. Sejak tahun 2003, berbagai penelitian memfokuskan pada pengaruh propolis terhadap sinyal tranduksi intraseluler yang menunjukkan bahwa beberapa target penting pada sel kanker dapat dimodulasi melalui pemberian propolis. Propolis mempengaruhi protein proapoptosis ( Bax, Bak, caspase 3, cytochrome C ), protein regulator diferensiasi sel (p38, p56, p21, cyclin dependent kinase )  dan  target  yang  berperan  pada  inflamasi yang terkait dengan kanker, seperti NFκB maupun cyclooxigenase two (Paulino et al ., 2009). Pada berbagai penelitian in vitro , propolis menunjukkan aktivitas proapoptosis pada berbagai jenis sel kanker, meliputi : kanker laring, kanker paru, kanker pankreas, kanker tiroid, kanker kolorektal, kanker payudara, kanker prostat dan glioma (Kubina et al ., 2015). Aktivitas antikanker propolis ini dipengaruhi oleh geografis dan tumbuhan sebagai asal pengumpulan resin oleh lebah untuk membentuk propolis. Dua faktor tersebut mempengaruhi komposisi dari propolis (Syamsudin et al ., 2009).
Berdasarkan fakta-fakta yang diuraikan di atas, mendorong peneliti untuk mengetahui pengaruh pemberian propolis yang berasal dari Kerjo, Karanganyar, Indonesia terhadap peningkatan ekspresi p21 dan induksi apoptosis, terutama terkait dengan peningkatan ekspresi protein Bax pada kultur sel WiDr ( cell line kanker  kolon).  Penelitian  ini  sebagai  upaya penemuan dan pengembangan strategi baru dalam melawan kanker, khususnya kanker kolon dengan memanfaatkan kekayaan sumber daya hayati lokal.

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan menggunakan post test with control  group  design . Penelitian dilakukan
pada kultur sel WiDr (sel  kanker  kolon)  dengan pemberian propolis. Pengamatan ekspresi p21 dan ekspresi protein Bax dilakukan dengan metode imunositokimia, sedangkan pengamatan induksi apoptosis dilakukan dengan flowcytometry menggunakan pewarnaan annexin V dan propidium iodida (PI).
HASIL DAN PEMBAHASAN 1.    Uji sitotoksisitas dengan MTTassay untuk menetapkan nilai IC 50 ekstrak etanol propolis dan 5-Fluorouracil.
Sel WiDr ditumbuhkan pada media komplit, selanjutnya diberikan perlakuan dengan ekstrak etanol propolis. Sel WiDr yang hidup memiliki morfologi berbentuk poligonal dan menempel pada dasar sumuran, sedangkan sel WiDr yang mati bentuknya menjadi bulat dan lebih kecil dari sel hidup, tersebar dan tidak menempel pada dasar sumuran. Morfologi sel WiDr ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1. Morfologi Sel WiDr , sel hidup ditunjukkan panah warna hijau  dan sel mati ditunjukkan panah warna merah. Sel diamati dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 100 kali
Data yang didapatkan dari uji sitotoksisitas dengan MTT  assay berupa absorbansi dari tiap sumuran yang merupakan hasil pembacaan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Untuk mendapatkan persentase viabilitas sel, data tersebut kemudian diolah lebih lanjut dengan cara membandingkan nilai absorbansi antara sel yang diberi perlakuan dan kontrol (sel tanpa perlakuan) setelah masing-masing dikurangi dengan kontrol media ( blank ).  Data  tersebut digunakan untuk menetapkan nilai IC 50 bahan uji dengan menggunakan analisis regresi linear antara
dosis bahan uji dan persentase viabilitas sel WiDr . Nilai rata-rata persentase viabilitas sel WiDr dan IC 50 dari bahan uji ditunjukkan pada Tabel 1
Tabel 1. Nilai rata-rata persentase viabilitas sel WiDr dan nilai IC 50 bahan uji dengan metode MTT assay. Bahan Uji Konsentrasi (µg/mL) Rata-rata viabilitas sel WiDr (% ± SD) IC 50 ± SD (µg/ mL) Ekstrak Etanol Propolis (EEP)
12,5
126,60 ± 7,92 139,61±49,48
25 103,93 ± 7,23 50 67,78 ± 1,63 100 34,48 ± 2,10 200 15,31 ± 1,75 5-Fluorouracil (5-FU)
12,5
118,57  ± 5,57 502,33±60,52
25 114,17 ± 3,83 50 112,61 ± 6,86 100 105,37 ± 3,09 200 91,27 ± 4,86
Tabel 1. Menunjukkan bahwa secara umum peningkatan konsentrasi EEP mengakibatkan penurunan persentase viabilitas sel WiDr . Pada konsentrasi  EEP  yang  tertinggi  (200  µg/mL), diperoleh persentase viabilitas sel WiDr yang terendah (15,31%). Pada pemberian 5-FU secara umum tidak seefektif pemberian EEP, karena pada konsentrasi yang tertinggi (200 µg/uL)  persentase viabilitas sel WiDr masih mencapai 91,27%. Dari analisis regresi linear diperoleh IC 50 EEP sebesar 139,61 µg/mL. Nilai IC 50 EEP ini digunakan sebagai dasar penentuan konsentrasi EEP yang digunakan pada penelitian selanjutnya, yaitu sebesar 70, 140, dan 280 µg/mL (1/2 IC 50, IC 50, dan 2 IC 50 ). Nilai IC 50 5-FU yaitu sebesar 502,33 µg/mL akan digunakan sebagai pembanding (kontrol positif).

## 2. Pengamatan ekspresi p21
P21 adalah protein yang memiliki fungsi utama dalam regulasi progresivitas siklus sel
dengan menghalangi ikatan antara CDK dan cyclin (Abukahader  &  Park,  2005).  Untuk  mengetahui apakah penghambatan proliferasi sel WiDr setelah pemberian EEP selama 24 jam terkait peningkatan ekspresi p21, maka dilakukan pengamatan ekspresi p21 pada sel WiDr dengan pengecatan imunositokimia. Pengecatan imunositokimia untuk ekspresi p21 dilakukan pada 5 kelompok perlakuan (kontrol, EEP ½ IC50, EEP IC50, EEP  2IC50  dan  5FU  IC50)  dan  masing-masing kelompok perlakuan tersebut dibuat triplicate .
Data yang diperoleh berupa persentase sel yang mengekspresikan p21 (tampak sebagai warna  coklat  pada  inti  sel  maupun  sitoplasma) dari keseluruhan sel pada 5 lapangan pandang (Gambar 2). Penilaiannya dilakukan pada 3 slide dari tiap-tiap kelompok perlakuan.
Gambar 2. Hasil pengecatan imunositokimia perbesaran 400 kali untuk ekspresi p21 pada sel WiDr setelah perlakuan dan inkubasi selama 24 jam pada kelompok dengan EEP konsentrasi ½ IC50 (a), IC 50 (b), 2IC 50 (c), kelompok dengan 5-FU (d) dan kelompok kontrol (e). Sel yang mengekspresikan p21 ditunjukkan dengan panah warna merah.
Gambar 3. Hubungan antara konsentrasi bahan uji dengan rata-rata persentase ekspresi p21 pada sel WiDr setelah inkubasi 24 jam.
Dari grafik di atas, terlihat bahwa pemberian EEP selama 24 jam meningkatkan ekspresi p21. Peningkatan ekspresi p21 sebanding dengan peningkatan konsentrasi EEP yang diberikan. Hasil uji statistik menunjukkan adanya perbedaan ekspresi p21 yang bermakna diantara semua kelompok perlakuan yang mendapatkan EEP konsentrasi 70, 140 dan 280 µg/mL dibandingkan dengan kelompok kontrol positif (5- FU) maupun kelompok kontrol tanpa perlakuan.
3.    Uji induksi apoptosis EEP pada sel WiDr dengan flowcytometry Uji induksi apoptosis dilakukan untuk mengetahui kemampuan EEP dalam menginduksi apoptosis sel WiDr . Uji ini dilakukan pada lima kelompok perlakuan, yaitu kelompok dengan EEP konsentrasi 70, 140,280 µg/mL (1/2 IC 50, IC 50, dan 2 IC 50 ), kelompok dengan 5-FU  konsentrasi 500 µg/mL (IC 50 ),  dan  kelompok  kontrol  tanpa perlakuan. Morfologi sel WiDr pada kelima kelompok perlakuan setelah inkubasi selama 24 jam ditunjukkan pada Gambar 4.
Gambar 4. Gambar sel WiDr dengan perbesaran 100 kali, untuk uji apoptosis setelah inkubasi 24 jam pada kelompok kontrol (a), kelompok dengan pemberian EEP konsentrasi 70 µg/mL (b), 140 µg/mL(c), 280 µg/mL (d), serta kelompok dengan pemberian 5-FU 500 µg/mL (e). Sel hidup ditunjukkan dengan panah warna hijau,sedangkan sel mati dengan panah warna merah.
Setelah inkubasi selama 24 jam, dilakukan uji apoptosis dengan metode flowcytometry dan tiap-tiap kelompok perlakuan dibuat duplo . Data hasil flowcytometry yang diperoleh berupa persentase sel WiDr yang hidup, mengalami apoptosis, maupun nekrosis pada kelima kelompok perlakuan (Gambar 5).
Gambar 5. Hasil flowcytometry sel WiDr setelah perlakuan dan inkubasi selama 24 jam pada kelompok kontrol (a), kelompok dengan pemberian EEP konsentrasi ½ IC 50 (b), IC 50 (c) dan 2 IC 50 (d) serta kelompok dengan pemberian
5-FU konsentrasi IC 50 (e)
Keterangan untuk tiap-tiap kuadran :
a. Kiri  Bawah  (Anexin  negatif,  PI  negatif): Sel Hidup
b. Kanan Bawah (Anexin positif, PI negatif): Sel Apotosis
c. Kanan Atas (Anexin positif, PI positif): Sel Nekrosis
Tabel 2. Rata-rata persentase sel WiDr yang mengalami apoptosis setelah inkubasi selama 24 jam dengan bahan uji
(EEP dan 5-FU) maupun pada kelompok kontrol.
Perlakuan Konsentrasi (µg/mL) Rata-rata Apoptosis Sel WiDr (%) ± SD Kontrol Sel 0 1,55 ± 0,05 EEP 70   (1/2 IC 50 ) 35,37 ± 1,2 140 (IC 50 ) 21,88 ± 0,67 280 (2IC 50 ) 3,11 ± 0,13 5-FU 500 (IC 50 ) 43,16 ± 0,45
Data pada tabel 2 menunjukkan bahwa rata-rata persentase apoptosis pada sel WiDr yang diberikan EEP lebih kecil dibandingkan dengan kelompok kontrol positif yang diberikan 5-FU. EEP pada konsentrasi ½IC 50 mampu menginduksi apoptosis sel WiDr yang paling tinggi dibandingkan dengan konsentrasi EEP yang lain (IC 50 dan 2IC 50 ). Hal ini menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi EEP yang diberikan akan menginduksi terjadinya nekrosis pada sel WiDr . Hasil statistik menunjukkan terdapat perbedaan rata-rata persentase apoptosis sel WiDr yang bermakna secara statistik pada semua kelompok. Perbedaan yang tidak bermakna secara statistik terdapat diantara kelompok kontrol sel dengan kelompok perlakuan yang mendapatkan EEP  konsentrasi 280 µg/mL (2IC 50 )
4.    Pengamatan ekspresi protein bax
Protein bax adalah protein yang diidentifikasi  sebagai  protein  proapoptosis. Peningkatan protein ini mengakibatkan sel lebih sensitif  terhadap  apoptosis  (Dash,  2003).  Oleh karena itu, untuk mengetahui apakah peningkatan apoptosis sel WiDr setelah pemberian EEP selama 24 jam terkait peningkatan ekspresi protein bax , maka dilakukan pengamatan peningkatan ekspresi protein bax pada sel WiDr dengan pengecatan imunositokimia. Pengecatan imunositokimia dilakukan pada 5 kelompok (kontrol, ½ IC50, IC50,  2IC50  dan  5FU)  dan  masing-masing kelompok tersebut dibuat triplicate . Data yang diperoleh berupa persentase sel yang mengekspresikan protein bax (tampak sebagai warna coklat pada inti sel maupun sitoplasma) dari keseluruhan sel pada 5 lapangan pandang dan penilaiannya dilakukan pada 3 slide dari tiap-tiap kelompok perlakuan (Gambar 6) .
Gambar 6. Hasil pengecatan imunositokimia perbesaran 400 kali untuk ekspresi protein bax pada sel WiDr setelah perlakuan dan inkubasi selama 24 jam pada kelompok dengan EEP konsentrasi ½ IC50 (a), IC 50 (b), 2IC 50 (c), 5-FU (d) dan kontrol (e). Sel yang mengekspresikan protein bax ditunjukkan dengan panah warna merah.
Gambar 7. Hubungan antara konsentrasi bahan uji dengan rata-rata persentase ekspresi protein bax pada sel WiDr setelah inkubasi 24 jam.
Dari grafik di atas, terlihat bahwa pemberian EEP selama 24 jam meningkatkan ekspresi protein bax . Peningkatan ekspresi protein bax yang paling tinggi terdapat pada kelompok dengan pemberian EEP konsentrasi 70 (1/2IC 50 ).  Hasil  uji  statistik menunjukkan adanya perbedaan ekspresi protein bax yang bermakna diantara semua kelompok perlakuan yang mendapatkan EEP konsentrasi 70, 140 dan 280 µg/mL dibandingkan dengan kelompok  kontrol  positif  (5-FU)  maupun kelompok kontrol tanpa perlakuan.
Penelitian ini diawali dengan uji sitotoksisitas senyawa  ekstrak  etanol  propolis  (EEP)  pada  sel
WiDr menggunakan metode MTT  assay . Uji sitotoksisitas ini dilakukan untuk menetapkan nilai IC 50 senyawa EEP yang selanjutnya akan digunakan sebagai dasar penetapan konsentrasi EEP untuk pengamatan ekspresi p21, protein bax maupun uji induksi apoptosis pada sel WiDr . Selain itu, uji sitotoksisitas ini juga digunakan untuk menetapkan IC 50 5-fluorouracil (5-FU) pada sel WiDr sebagai kontrol positif pada uji induksi apoptosis. Pada uji sitotoksisitas ini secara umum didapatkan persentase viabilitas sel WiDr semakin menurun sebanding dengan peningkatan konsentrasi EEP yang diberikan (Tabel 5). Hal ini menunjukkan bahwa pemberian EEP konsentrasi 70-280 ug/mL selama 24 jam mampu menghambat proliferasi sel WiDr .
Hasil ini sejalan dengan beberapa penelitian eksperimen in vitro yang menyatakan bahwa EEP mampu menghambat pertumbuhan berbagai sel tumor dikarenakan mempunyai efek sitotoksik, antiproliferatif dan induksi apoptosis (Kubina et al ,  2015).  Szliszka et al .  (2012)  melaporkan bahwa pemberian EEP dengan konsentrasi 5, 25,
50 ug/mL selama 48 jam mampu menghambat proliferasi cell line HeLa yang merupakan turunan kanker servik. Selanjutnya aktivitas sitotoksisitas EEP pada sel WiDr setelah inkubasi 24 jam dinyatakan dengan nilai IC 50 yang diperoleh melalui analisis regresi linear. Pada analisis tersebut diperoleh IC 50 EEP pada sel WiDr di penelitian ini sebesar 139,32 ug/mL. Sz liszka et al . (2011) melaporkan bahwa konsentrasi EEP 50 ug/mL dari Negara Polandia bagian selatan mempunyai efek sitotoksisitas 25% pada cell line kanker prostat. Vatansever et al . (2010) menunjukkan bahwa EEP konsentrasi 125 ug/mL mempunyai efek sitotoksik pada sel MCF- 7 ( cell line kanker  payudara).  Vatansever et al . (2010) juga melaporkan bahwa terdapat perbedaan efek sitotoksik dari tujuh sampel EEP yang berbeda yang dikumpulkan dari lokasi yang sama. Penelitian ini mengindikasikan bahwa komposisi kimia dan farmakokinetik EEP berbeda-beda. Hal  ini  selain  dipengaruhi  oleh  geografis  juga dipengaruhi jenis tanaman, asal propolis tersebut diperoleh.
Pada uji sitotoksisitas ini secara umum didapatkan persentase viabilitas sel WiDr semakin menurun sebanding dengan peningkatan
konsentrasi  EEP  yang  diberikan  (Tabel.1).  Hal ini menunjukkan bahwa pemberian EEP pada penelitian ini selama 24 jam mampu menghambat proliferasi dan menurunkan viabilitas sel WiDr . Hal ini sesuai dengan penelitian Ishihara et al .(2009),  mengenai  efek  anti  proliferasi  dari ekstrak etanol propolis yang berasal dari Cina dan Brazil pada cell line kanker kolorektal.
Motomura et al . (2008) melaporkan bahwa ekstrak methanol propolis konsentrasi 100-1000 µg/mL mampu menghambat pertumbuhan cell line U-937 (sel kanker leukemia) yang sebanding dengan peningkatan konsentrasi yang diberikan. Lie et  al. (2007)  menunjukkan  bahwa  propolis dari Mexico mampu menghambat proliferasi sel epitelial paru cell line A-549 manusia dengan IC 50 6,2 µM (lebih rendah dari IC 50 5-FU). Hambatan proliferasi sel WiDr oleh EEP pada penelitian ini kemungkinan terkait dengan kemampuan EEP dalam meningkatkan ekpresi p21 pada sel WiDr. P21 adalah suatu tumor suppresor protein dengan berat 21 KDa memiliki fungsi utama dalam regulasi terhadap progresi siklus sel. Hasil ini terutama dicapai dengan menghalangi ikatan CDK dengan cyclin . Lie et al . (2007) melaporkan hal yang sama, bahwa ekstrak etanol propolis yang berasal dari brasil memiliki efek antiproliferatif melalui peningkatan ekspresi p21 pada sel kanker prostat.
Selain memiliki efek antiproliferasi, pada penelitian ini juga ditunjukkan bahwa propolis dengan konsentrasi ½ IC 50 (70  µg/mL)  mampu menginduksi apoptosis sel WiDr sebesar 35,37%. Beberapa penelitian sebelumnya mendukung hasil tersebut. Syamsudin et al .  (2010)  melaporkan ekstrak ethyl acetate propolis pada konsentrasi 47,45 µg/mL mengakibatkan peningkatan apoptosis pada cell line MCF-7 yang merupakan turunan kanker payudara sebesar 13,21%. Pengamatan yang menarik juga dilakukan oleh Lee et al .  (2003)  yang  melaporkan  bahwa phenylethyl ester of caffeic acid (CAPE) salah satu komponen dari propolis berpengaruh terhadap aktivitas protein p53 dan protein p38 pada sel glioblastoma. Penelitian tersebut menunjukkan propolis memiliki aktivitas sitotoksik dan induksi pengeluaran cytochrome c dari mitokondria ke sitosol dan mengaktifkan caspase  3 . Ekspresi dari protein p53 , Bax dan Bak meningkat setelah inkubasi 3 jam dan juga menurunkan  ekspresi
protein antiapoptosis Bcl2 setelah inkubasi 36 jam. Mootomura et al. (2008) melaporkan propolis mampu meningkatkan apoptosis cell line U-937 (sel kanker leukemia) melalui aktivasi caspase-3 dan penekanan Bcl-2 . Sejalan dengan penelitian di atas, Eom et al .  (2010)  melaporkan  bahwa propolis menginduksi apoptosis melalui pelepasan cytochrome C dari mitokondria ke dalam sitosol dan melalui aktivasi caspase-3 pada cell line HL- 60 (sel kanker leukemia). Namun, pada penelitian ini menunjukkan bahwa dengan peningkatan konsentrasi EEP yang diberikan akan menyebabkan kematian sel ke arah nekrosis. Nekrosis merupakan proses kematian sel patologis yang terjadi secara pasif, katabolik dan umumnya merupakan respon terhadap faktor-faktor  toksik  eksternal,  seperti  inflamasi, iskemia maupun toxic  injury . Nekrosis ditandai dengan adanya pembengkakan mitokondria, ruptur membran plasma, pemisahan kromatin dan destruksi struktur sel yang semula utuh (Wu et al ., 2001). Menurut Kumar et al . (2005), pada proses nekrosis terjadi pelepasan komponen sitoplasma sehingga mencetuskan respon inflamasi.
Mekanisme molekuler terkait induksi apoptosis pada penelitian ini juga diamati melalui ekspresi protein bax . Peningkatan ekspresi protein bax pada penelitian ini didapatkan hasil tertinggi pada konsentrasi EEP ½ IC 50 (70  µg/mL)  yaitu sebesar 83,84%. Pada konsentrasi EEP yang semakin meningkat, yaitu konsentrasi IC 50 (140 µg/mL  )  dan  2  IC 50 (280  µg/mL),  ekspresi bax mengalami penurunan, yaitu sebesar 80,97% dan 69,45%. Penurunan ekspresi protein bax pada konsentrasi IC 50 (140 µg/mL)  dan 2 IC 50 (280 µg/ mL)  menunjukkan  bahwa,  kematian  sel WiDr dengan pemberian dua konsentrasi EEP tersebut terjadi secara nekrosis dan nekrosis tidak terkait dengan jalur sinyal apoptosis. Berdasarkan hasil ini, konsentrasi optimal EEP untuk menekan viabilitas sel WiDr melalui mekanisme induksi apoptosis yang terkait dengan peningkatan ekspresi protein bax yaitu sebesar 70 µg/mL.

## SIMPULAN
1. Ada pengaruh pemberian ekstrak propolis terhadap peningkatan ekspresi protein p21 pada kultur sel WiDr .
2. Ada pengaruh pemberian ekstrak propolis konsentrasi ½ IC 50 (70  µg/mL)    terhadap
peningkatan ekspresi protein bax pada kultur sel WiDr. 3. Ada pengaruh pemberian ekstrak propolis terhadap induksi apoptosis pada kultur sel
WiDr.

## DAFTAR PUSTAKA
Alison, M.R. 2001. Cancer. In : Encyclopedia of Life Seciences. Nature Publishing Group. London. United Kingdom.
Ananda, S.K., Tragoolpua, K., Chantawannakul, P., Tragoolpua, Y. 2013. Antioxidant and anticancer cell proliferation of propolis extracts from two extraction methods. Asian Pac J Cancer Prev. 14(11): 6991-6995.
Departemen Kesehatan RI (Depkes RI). 2009. Profil Kesehatan Indonesia 2008. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.
Eom, H.S., Lee, S.J., Yoon, B.S., Yoo, B.S. 2010. Propolis inhibit the proliferation of human leukemia HL-60 cells by inducing apoptosis through the mitochondrial pathway. Nat Prod Res. 24:375- 386.
Globocan. 2013. Cancer Fact Sheets for Colorectal Cancer.2013. Available from: URL: http://globocan. iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx
Ishiara M, Naoi K, Hashita M, Itoh Y, Suzui M. 2009. Growth inhibitory activity of ethanol extracts of Chinese and Brazilian propolis in four human colon carcinoma cell lines. Oncol Rep. 22: 349–354.
Kartal, M.,Yildiz, S.,Kaya, S.,Kurucu, S.,Topcu, G. 2003. Anti-microbial activity of propolis samples from two different regions of Anatolia. J Ethnopharmacol. 86:69–73.
Kurniawati, A dan Tenggara, R. 2011. Pengaruh Asam Asetil Salisilat terhadap Penurunan Prevalensi Kanker Kolorektal. CDK. 186: 38(5): 350-352.
Kubina, R., Dzik, A.K., Dziedzic, A., Bielec, B., Wojtczka, R.D., Buldok, R.J., Wysznynska, M., et al. 2015. The ethanol extract of polish propolis exhibits anti-proliferative and/or pro-apoptotic effect on HCT 116 colon cancer and Me45 malignant melanoma cell in vitro conditions. Adv Clin Exp Med. 24(2): 203-212.
Kumar, V., Cotran, R.S., Collins, T. 2005. Neoplasia In Robins Pathologic Basis of Disease, 7th ed. Philadelphia : W.B. Saunders, p.269-342.
Lee YJ, Kuo HC, Chu CY, Wang CJ, Lin WC, Tseng TH. 2003. Involvement of tumor suppressor protein p53 and p38 MAPK in caffeic acid phenethyl ester-induced apoptosis of C6 glioma cells. Biochem Pharmacol. 66: 2281–2289.
Lie, H., Kapur, A., Yang, J.X., Srivastava, S., McLeod, D.G., Paredes-Guzman, J.F et al. 2007. Antiproliferation of human prostat cancer cell by ethanolic extracts of Brasilian propolis and its botanical origin. Int J Oncol; 31:601-06
Motomura, M., Kwon, K.M., Suh, S.J. 2008. Propolis induces cell cycle arrest and apoptosis in human leukemic U937 cells through Bcl-2/Bax regulation. Environ Toxicol Pharmacol. 26:61-67.
Naithani, R., Huma, L.C., Moriarty, R.M., McCormick, D.L., Mehta, R.G. 2008. Comprehensive review of cancer chemopreventive agentsevaluated in experimental carcinogenesis models and clinical trials.Curr Med Chem. 15: 1044-1071.
Ottaiano, A., Franco, R., Aiello, T.A., Liguori, G., Tatangelo, F., Delrio, P., Nasti, G., et al. 2006. Overexpression of bothCXC chemokine receptor 4 and vascular endothelial growth factorproteins predicts early distant relapse in stage II-III colorectalcancer patients. Clin Cancer Res. 12: 2795-2803.
Paulino, N., Abreu, S.R.L., Machodo, G., Silveira, E. 2009. Scientific evidences to pharmacological anticancer action of Baccharis dracunculifolia Brazilian propolis. Rev Pesq Inov Farm. 1(1):

## 15-26.
Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. 2014. Cancer statistics.CACancer J Clin.64: 9-29.
Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT). 2002. Laporan studi mortalitas 2001:pola penyakit penyebab kematian di Indonesia. Badan Litbang Departemen Kesehatan. Jakarta.
Syamsudin Simanjuntak P, Djamil R, Heffe WL. 2010. Apoptosis of human Breast Cancer Cells induced by Ethylacetate Extracts of Propolis. Am J Biochem Biotechnol. 16: 84–88.
Syamsudin, Wiryowidagdo, S., Simanjuntak, P., Heffen, W.L. 2009. Chemical composition of propolis from different region in java and their cytotoxic activity. AJBB. 5(4): 180-183.
Szliszka E, czuba ZP, Domino M, Mazur B, Zydowicz G, Krol W. 2009. Ethanolic extract of propolis (EEP) enhances the apoptosis-inducing potential of TRAIL in cancer cells. Molecules. 14: 738–754.
Torre, L.A., Bay, F., Siegel, R.L., Ferlay, J., Tieulent, J.L., Jemal, A. 2015. Global Cancer Statistic. Ca Cancer J Clin. 65: 87-108.
Vatansever, H.S., Sorkun, K. Gurhan, S.I.D., Ozdal-Kurt, F., Turkoz, E., Gencay, O., Salih, B. 2010. Propolis from Turkey induces apoptosis through activating caspases in human breast carsinoma cell lines. Acta Histochem. 112: 546-556.
Wang, X dan Zhang, Y. 2014. Targeting mTOR network in colorectal cancer therapy. World J Gastroenterol. 20(15): 4178-4188.
Watanabe, M.A.E., Amarante, M.K., Conti, B.J., Sforcin, J.M. 2011. Cytotoxic constituents of propolis inducing anticancer effect: a review. JPP. 63: 1378-1386.
Wu, M., Ding, H.F., Fisher, D.E. 2001. Apoptosis: Molecular Mechanisms. In : Encyclopedia of Life Seciences. Nature Publishing Group. London. United Kingdom.