Optimasi Purifikasi Protein Rekombinan CIDRα-PfEMP1 Plasmodium falciparum dengan Kromatografi Afinitas
Optimized Purification of CIDRα-PfEMP1 Plasmodium falciparum Recombinant Protein with Affinity Chromatography
Eqiel Navadz Akthar Alami 1 , Erma Sulistyaningsih 1,2*) , Irawan Fajar Kusuma 1 , Sheilla Rachmania 1
1 Fakultas Kedokteran, Universitas Jember
2 Center for Excellence of Agromedicine (CEAMED), Universitas Jember
* E-mail: sulistyaningsih.fk@unej.ac.id

## ABSTRACT
Interaction  of  Cysteine-rich  Interdomain  Region  (CIDR)α- Plasmodium  falciparum Erythrocyte Membrane Protein (PfEMP1) and Endothelial Cell Receptors especially CD36 on host cells is main malaria pathogenesis, makes this domain as a malaria vaccine candidate. Recently, the development of the malaria vaccine is conducted by recombinant technology, and the purification of the CIDRα- PfEMP1 recombinant protein is a pivotal step. This study aimed to determine an optimal condition to purify the CIDRα-PfEMP1 recombinant protein by affinity chromatography through imidazole and NaCl concentration. The purified recombinant protein was visualized using SDS-PAGE and its concentration was measured using Image J software and Bradford Assay. The data were analyzed using SPSS 26 software, and the Paired T-Test analysis was conducted to compare the concentration of purified recombinant protein from two different methods. The result showed that thetarget band of  purified  recombinant  protein  was  27  kDa.  The  thickest  target  protein  band  was  observed  in purified recombinant protein using 140 mM imidazole and 300 mM NaCl. The recombinant protein concentration using Image J software was 0.025 µg/µL, while the Bradford Assay was 0.56 µg/µL. The  Paired  T-Test  analysis  has  a  significance  value  of  0.010  (p<0.05),  meaning  there  was  a significant difference between the concentration measurement using Image J software and Bradford Assay. In conclusion, the optimized condition to purify the CIDRα-PfEMP1 recombinant protein by affinity chromatography was using 140 mM imidazole and 300 mM NaCl. It is suggested to measure the purified CIDRα-PfEMP1 recombinant protein concentration using the Bradford Assay method due to its convenience and sensitivity.
Keywords: Purification, affinity chromatography, CIDR1α, PfEMP1.

## PENDAHULUAN
Malaria  merupakan  sebuah  penyakit  endemis dengan  prevalensi  cukup  tinggi.  Total  kasus malaria pada tahun 2018 adalah 228 juta kasus, dengan  kematian  sejumlah  405  ribu  jiwa  yang tersebar  di  seluruh  dunia  (World  Health Organization,  2019).  Prevalensi  malaria  di Indonesia berdasarkan diagnosis positif malaria melalui  pemeriksaan  darah  mencapai  total 1.017.290  kasus  pada  tahun  yang  sama (Riskesdas,  2018).  Pengembangan  vaksin malaria  merupakan  salah  satu  strategi  untuk memberantas  penyakit  malaria.  Pendekatan biomolekular dilakukan untuk mengidentifikasi protein-protein imunogenik yang dapat dijadikan kandidat
vaksin malaria (Sulistyaningsih et  al. ,  2013,  Zhang et  al. , 2019).  Protein  imunogenik  merupakan  protein yang  dapat  menginduksi  antibodi  pada  tubuh (Dewi et al. , 2018).
Salah  satu  protein  imunogenik  kandidat vaksin  malaria  adalah Plasmodium  falciparum Erythrocyte  Membrane  Protein  1 (PfEMP1). Protein  ini  merupakan  mediator  yang  dapat berikatan  dengan  berbagai  reseptor  sel  hospes, terutama Endothelial  Cell  Receptors (ECRs) dan  mengakibatkan  sitoaderens,  penyebab utama  patogenesis  malaria  (Lubiana et  al. , 2020).  Domain  utama  dari  PfEMP1  adalah Duffy  Binding-Like (DBL),  terdiri  dari  empat tipe  utama  (α,  β,  γ,  dan  δ)  dan Cysteine-rich Interdomain  Region (CIDR),  terdiri  atas  tiga tipe utama (α, β, dan γ). Eritrosit yang terinfeksi oleh P.  falciparum dapat  mengikat  reseptor CD36 sel hospes, ketika domain PfEMP1 yang terlibat  dalam  pengikatannya  adalah  domain CIDRα (Smith, 2014).
Domain CIDRα
dari
PfEMP1
memperantarai  pengikatan  beberapa  reseptor hospes, antara lain Cluster of Differentiation 36 (CD36),  CD31,  dan Chondroitin  sulfate  A
(CSA) yang berperan dalam proses sitoaderens. Penelitian  sebelumnya  melaporkan  protein CIDRα  terdiri  atas  174  asam  amino  dan berukuran  sebesar  27  kDa.  CIDRα-PfEMP1 menjadi  salah  satu  protein  kandidat  vaksin malaria  karena  diduga  memiliki  kemampuan penginduksi antibodi dan epitop sel B (Dewi et al ., 2018; Sulistyaningsih et al ., 2021).
Pendekatan  teknologi  rekombinan  banyak digunakan untuk mendapatkan protein imunogenik.  Tahapan  penting  yang  harus dilakukan  antara  lain  produksi  dan  purifikasi protein rekombinan untuk mendapatkan protein rekombinan  berkualitas  tinggi.  Kromatografi afinitas  adalah  metode  yang  paling  banyak digunakan,  karena  menawarkan  selektivitas tinggi, resolusi tinggi, dan menghasilkan protein kapasitas  tinggi.  Metode  ini  menggunakan beberapa buffer untuk  membantu  proses pemurniannya, seperti NaCl dan imidazol. NaCl berfungsi sebagai dapar pengikat protein untuk menghindarkan protein dari kontaminan, sedangkan  imidazol  sebagai  dapar  pemisah antara ikatan ligan dan protein, sehingga protein dapat  dihasilkan  sesuai  dengan  harapan  (IBA Lifesciences,  2012;  Puspitaningrum et  al. , 2018).
Penelitian  sebelumnya  telah  membahas peran  imidazol  dan  NaCl  dalam  proses purifikasi  protein  (Oliveira  &  Domingues, 2018;  Putri et  al. ,  2015;  Simaremare et  al. , 2015).  Penelitian  terkait  optimasi buffer
purifikasi maupun metode pengukuran konsentrasi protein rekombinan CIDR  - PfEMP1  belum  pernah  dilakukan,  sehingga penelitian  ini  bertujuan  untuk  mencari  kondisi optimum konsentrasi NaCl dan imidazol dalam proses  purifkasi  protein  rekombinan  CIDR  - PfEMP1  dengan  metode  kromatografi  afinitas, serta mengukur konsentrasi protein rekombinan CIDR  -PfEMP1 menggunakan
metode Bradford  Assay dan  software  Image  J  untuk membandingkan  keduanya.  Metode Bradford Assay dipilih karena memiliki tingkat sensitivitas  yang  tinggi  untuk  menugukur protein  secara  kuantitatif,  sedangkan  software Image  J digunakan  karena  merupakan domain public yang mudah digunakan, memungkinkan memproses  gambar  dari  berbagai  media,  dan dapat  menganalisis  penghitungan  gambar, segmentasi,  pengukuran  fitur  spasial  dari elemen  biologis  dan  penelitian  biomolekuler yang  sangat  penting  untuk  penelitian.  Kedua metode  ini  juga  relatif  mudah  digunakan
dibanding  metode  lainnya  (Ernst  &  Zor  2010; Ferreira & Rasband 2012; Reinking 2007).

## METODE

## Ethical Clereance
Penelitian   ini telah   mendapat  ijin  kelayakan  etik oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas Jember dengan No 1.467/H25.1.11/KE/2021.
Purifikasi  Protein  Rekombinan  CIDR α- PfEMP1
dengan Kromatografi Afinitas
Purifikasi  dengan  kromatografi  afinitas  dilakukan sesuai  metode  dari kit resin  Ni-NTA  QIAGEN expressionist (Qiagen, 2003). Penelitian ini menggunakan  variasi  konsentrasi buffer purifikasi, yaitu  NaCl  dan  imidazole.  Konsentrasi  NaCl  yang digunakan  mengacu  pada  penelitian  sebelumnya adalah 300 mM, 600 mM, 900 mM, dan 1000 mM. Konsentrasi imidazol yang digunakan sebagai buffer lysis adalah 5 mM, sedangkan sebagai buffer washing adalah 10 mM, 20 mM, dan 40 mM. Imidazol yang digunakan  sebagai elution  buffer adalah 60  mM,  80 mM, 100 mM, 120 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 180  mM,  serta  200  mM  (Dewi et  al .,  2018).  Lisat protein rekombinan yang digunakan sebanyak 4 mL, untuk kemudian dicampurkan dengan resin. Campuran ini kemudian dimasukan ke orbital shaker dan  diinkubasi  selama  satu  jam.  Pencucian  kolom purifikasi berisi campuran dilakukan setelah inkubasi satu jam dan dilakukan secara bertingkat (Rachmania et al ., 2021).
Visualisasi hasil purifikasi dengan metode Sodium Dodecyl Sulphate- Polyacrylamie Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) Protein hasil purifikasi dianalisis menggunakan SDS PAGE. Protein didenaturasi melalui proses pemanasan  menggunakan dry  heat  block .  Sebanyak 50  µL  sampel  protein  ditambahkan buffer sampel dengan  volume  50  µL.  Sampel  protein  yang  telah tercampur, dipanaskan menggunakan dry heat block selama  5  menit.  Konsentrasi gel yang  digunakan untuk upper  gel adalah  4,5%,  sedangkan lower  gel adalah  15%.  Sebanyak  10µL  dimasukkan  ke  dalam kolom gel . Running buffer dituang ke chamber . Gel dijalankan dengan voltase 50 V selama 1 jam untuk upper  gel dan  80  V  selama  3  jam  untuk lower  gel . Pewarnaan  menggunakan Commasie  Brilliant  Blue (CBB)  diberikan  pada gel untuk  memudahkan visualisasi (Sawitri et al. , 2016).

## Analisis Software Image J
Analisis  menggunakan  metode  Software  Image  J didahului dengan membuat kurva standar. Kurva ini didapat dari analisis densitometri dari running protein Bovine  Serum  Albumin (BSA).  Analisis  semi kuanitatif ini dilakukan dengan menilai densitas dari protein  sampel,  untuk  kemudian  dimasukan  dalam kurva  standar  BSA.  Konsentrasi  protein  target didapat dari nilai akhir rumus persamaan linear.

## Analisis Bradford Assay
Kurva standar terlebih dahulu dibuat dengan menilai
absorbansi  campuran  BSA  dan  reagen Bradford
Assay . Sampel protein hasil purifikasi diambil 5 µL untuk  dicampurkan  dengan  larutan  reagen Bradford Assay sebanyak  995  µL  ke  dalam microtube .
Campuran  ini  diinkubasi  selama  10  menit.  Analisis absorbansi dari larutan menggunakan
spektrofotometer  dengan  panjang  gelombang  595 nm.

## Analisis Statistik
Data  dianalisis  menggunanakan  uji Paired  T-Test dengan SPSS untuk menguji perbedaan hasil analisis konsentrasi protein antara dua metode.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil Analisis SDS PAGE
Analisis  SDS  PAGE  pada  penelitian  ini menunjukkan band protein  target  cukup  tebal pada posisi 27 kDa. Band paling tebal dan bersih ditemukan  pada  protein  hasil  purifikasi menggunakan  300  mM  NaCl  serta140  mM imidazole atau elusi kelima tahap dua (Gambar 1). Band yang  tervisualisasi  sesuai  dengan ukuran  target  protein  rekombinan  CIDR α - PfEMP1  yaitu  sebesar  27  kDa  (Dewi et  al ., 2018; Sulistyaningsih et al. , 2021). Hasil  ini  relevan  dengan  referensi  lain tentang konsentrasi imidazole yang direkomendasikan  untuk  purifikasi  berkisar antara  10-20  mM  sebagai  buffer  lysis  dengan pengurangan  1-5  mM  untuk  hasil  optimal,  10- 50  mM  sebagai  buffer  purifikasi  untuk  proses washing,  sedangkan  untuk  proses  elusi  untuk mendapatkan protein target sesuai harapan bisa diberikan  konsentrasi  lebih  tinggi  yaitu  >100 mM.  Untuk  konsentrasi  NaCl  yang  digunakan juga  sesuai  dengan  referensi  dimana  minimal penggunaan NaCl adalah sebanyak 300 mM dan dapat  ditingkatkan  sebanyak  2  M  (Qiagen, 2003).
Analisis protein hasil purifikasi yang murni dapat ditunjukkan dengan menggunakan metode kuantifikasi seperti Bradford Assay dan software Image J. Sementara itu, kegunaan dari elektroforesis  SDS  PAGE  adalah  dapat memberikan  gambaran  atau  visualisasi  tentang ukuran  protein  target,  kemungkinan  terdapat protein  pengotor  lainnya.  Semakin  banyak protein  pengotor,  maka  visualisasi  tersebut menunjukkan  kualitas  purifikasi  yang  kurang baik.  Sementara  itu,  kualitas  hasil  purifikasi yang  baik  ditunjukkan  dengan  visualisasi  pita protein tunggal atau single band yang tebal dan minim  kontaminan.  Pada  penelitian  ini  protein rekombinan  yang  terpurifikasi  berukuran  27 kDa  tampak  sebagai band dengan  tingkat ketebalan  paling  menonjol  diantara band-band
yang  lain. Band protein  kontaminan  atau pengotor tampak lebih tipis daripada band target sebesar  27  kDa.  Protein  kontaminan  ini  dapat muncul  dikarenakan  beberapa  kemungkinan, diantaranya ko-purifikasi protein dari bakteri E. coli yang  mengandung his-tagged protein rekombinan.  Problem  ini  umum  terjadi  pada protein  purifikasi,  terutama  apabila  tingkat ekspresi protein
rekombinan rendah. Kontaminan  ini  mengandung  banyak  residu histidin  dan  molekul  pendamping  yang  dapat mengikat resin atau protein rekombinan  secara langsung. Resin juga memiliki kapasitas afinitas yang terbatas, sehingga memungkinkan berikatan  dengan  kontaminan  (Gräslund et  al ., 2008).
Gambar  1.  Visualisasi  protein  rekombinan terpurifikasi  pada  SDS-PAGE. Gambaran penebalan sebuah band berukuran  27  kDa  pada beberapa  konsentrasi  imidazole. E1: elusi tahap 1, E2: elusi tahap 2.
Analisis  Konsentrasi  Protein  Rekombinan CIDR α -PfEMP1 menggunakan Metode

## Software Image J
Hasil  analisis  konsentrasi  protein  rekombinan menggunakan  metode  software  Image  J menunjukkan  nilai  variatif.  Nilai  ini  diperoleh dari  analisis  konsentrasi  sampel  protein  yang telah dipilih berdasarkan kualitas band terbaik. Terdapat empat  sampel  yang  dianalisis. Empat sampel ini mewakili dari empat jenis purifikasi yang  dilakukan.  Sampel  protein  yang  dipilih adalah sampel dengan perlakuan 300 mM NaCl dan 140 mM imidazol, 600 mM NaCl dan 140 mM  imidazol,  900  mM  NaCl  dan  140  mM imidazol,  dan  1000  mM  NaCl  dan  140  mM imidazol.
Nilai  konsentrasi  protein  tertinggi  didapat dari sampel protein dengan perlakuan 300 mM
NaCl dan 140 mM imidazol, dengan konsentrasi 0,025  µg  /µL  (Tabel  1).  Nilai  konsentrasi protein  ini  didapatkan  dari  profil band target yang  direpresentasikan  menjadi  rata-rata  nilai skala  abu-abu  atau  densitas  optik.  Perhitungan dari  kepadatan  optik  ini  menggunakan  salinan 8-bit  dari  16-bit  gambar  asli.  Densitas  optik dikalibrasi  menggunakan  standar protein  BSA. Densitas optik digunakan juga sebagai korelasi antara  protein  sampel  yang  dianalisis  dan protein standar, sehingga ditemukan nilai mean dari  keduanya.  Nilai mean inilah  yang dimasukkan  ke  dalam  rumus  persamaan  linear untuk  mendapatkan  nilai  konsentrasi  protein sampel. Hasil  konsentrasi protein pada  metode ini  akan  sangat  bergantung  dari  kondisi gambaran gel SDS  PAGE,  terutama  gambaran protein standar dan kualitas latar belakang dari gel hasil SDS PAGE yang akan mempengaruhi kualitas  densitas  optik.  Penelitian  lainnya menyebutkan  keuntungan  metode  ini  adalah dapat  menggunakan marker protein  untuk kuantifikasi protein dalam gel SDS PAGE tanpa protein standar. Hal ini dikarenakan sifat marker yang dapat berperan sebagai protein standar jika melakukan  analisis  protein  menggunakan software Image J (María et al. , 2020).
Tabel  1.  Hasil  analisis  konsentrasi  protein rekombinan  menggunakan  Software
Image J
Analisis  Konsentrasi  Protein  Rekombinan CIDR- α PfEMP1 menggunakan Metode Bradford Assay
Analisis Bradford  Assay juga  dilakukan  pada empat sampel terbaik. Nilai konsentrasi protein tertinggi  didapat  dari  sampel  protein  dengan perlakuan 300 mM NaCl dan 140 mM imidazol, dengan  konsentrasi  0,56  µg  /µL  (Tabel  2). Analisis  ini  menggunakan  prinsip  absorbansi cahaya  dari  perubahan  cahaya  berwarna kebiruan  yang  mengindikasikan  protein  telah berikatan  dengan dye  Coomassie  Blue  G250 pada kondisi asam.
Metode ini sangat mudah digunakan dengan sensitivitas  cukup  tinggi.  Semakin  warna larutan  menjadi  biru,  nilai  absorbansi  larutan semakin  tinggi,  yang  menandakan  tingkat
konsentrasi  protein  yang  tinggi  pula.  Prinsip analisis ini sangat berkaitan dengan keterikatan protein, seperti residu arginine dan lysine yang mengakibatkan  adanya  ikatan  ionik.  Adanya pola ikatan arginine dan lysine yang jauh lebih mudah  dengan dye  Coomassie  Blue  G250 ini sebenarnya  menjadi  salah  satu  kerugian  pada analisis  konsentrasi  protein  menggunakan metode Bradford Assay , dikarenakan preferensi ikatan  dye  dengan  asam  amino  lainya  dapat menimbulkan  respon  variatif  dari  proses pengujian  pada  protein  yang  berbeda  (Walker, 2002).  Pada  referensi  lain  diebutkan  bahwa permukaan  molekul  terbuka  seperti  domain PfEMP1 bermuatan positif dikarenakan berlimpahnya  residu  arginine  dan  lysine  pada sekuennya  (Flick et  al. ,  2004).  Komposisi sampel  sangat  penting  hubungannya  dengan pemilihan uji protein. Protein dengan kandungan  residu  arginin  yang  banyak  akan menghasilkan hasil yang baik atau tinggi secara artifisial jika menggunakan Uji Bradford Assay . Uji  protein  lainnya  juga  demikian,  akan memiliki  keuntungan  lainnya  jika  digunakan pada  sampel  yang  sesuai,  misalnya  uji  Lowry atau BCA Assay akan lebih baik jika digunakan pada  sampel  dengan  campuran  kompleks protein (Olson & Markwell, 2007).
Tabel  2.  Hasil  analisis  konsentrasi  protein rekombinan  menggunakan Bradford
Assay No. Konsentrasi Imidazol (mM) Konsentrasi NaCl (mM) Konsentrasi Protein (µg /µL) 1 140 300 0,56 2 140 600 0,54 3 140 900 0,48 4 140 1000 0,225 Hasil pengukuran konsentrasi protein menggunakan  dua  metode  pengukuran,  yaitu Software  Image  J  dan Bradford  Assay pada penelitian ini menunjukkan hasil yang berbeda. Hal  ini  terjadi  karena  fungsi  dan  cara pengukuran  kedua  metode  analisis  berbeda. Software  Image  J  menganalisis  band  protein target  secara  spesifik,  sedangkan Bradford Assay menganalisis  kandungan  utuh  protein rekombinan  hasil  elusi.  Kondisi  ini  membuat adanya perbedaan signifikan pada hasil analisis keduanya,  hasil  pengukuran  Software  Image  J akan  mempunyai  nilai  yang  lebih  kecil dibandingakan dengan hasil pengukuran Bradford Assay, sesuai dengan  hasil penelitian ini.  Perbedaan  ini  dapat  diminimalkan  bila
No.  Konsentrasi Imidazol (mM) Konsentrasi NaCl (mM) Konsentrasi Protein (µg /µL) 1 140 300 0,025 2 140 600 0,022 3 140 900 0,018 4 140 1000 0,007
metode  purifikasi  yang  dipilih  sangat  spesifik untuk dapat  memisahkan semaksimal  mungkin protein kontaminan dari protein target, sehingga saat  diukur  menggunakan  metode Bradford Assay hanya akan mengukur protein target saja. Perbedaan  ini  juga  membuat  kedua  metode analisis ini tidak dapat disejajarkan.
Hasil Uji Paired T-Test Uji Paired T-Test antara konsentrasi protein dari metode  software  Image  J  dan Bradford  Assay menunjukkan  nilai  p  =  0,01  (p<0,05),  yang berarti  terdapat  perbedaan  rerata  dari  nilai konsentrasi protein
hasil pengukuran menggunakan  software  Image  J  dan  metode Bradford  Assay (Dahlan,  2014).  Perbedaan  ini disebabkan  oleh  beberapa  hal,  diantaranya adalah  perbedaan  prinsip  metode  analisis  dari keduanya.  Software  Image  J  menggunakan prinsip  densitometri  dengan  menganalisis kerapatan  gambaran  8-bit  ( binary )  dari protein terget dalam gel hasil SDS PAGE. Hasil analisis konsentrasi  protein  sangat  tergantung  kondisi gel SDS  PAGE,  terutama  gambaran band protein  dan  kualitas  latar  bekakang gel yang mempengaruhi kualitas densitas optik. Kondisi ini  membuat  uji  software  Image  J  memiliki subyektivitas  tinggi  (María et  al. ,  2020).  Uji Bradford Assay mempunyai  prinsip absorbansi cahaya.  Perubahan  cahaya  berwarna  kebiruan mengindikasikan sampel protein telah berikatan dengan dye  Coomassie  Blue  G250 dalam kondisi  asam.  Prinsip  ini  memungkinkan sensitivitas  metode  ini  cukup  tinggi  (Walker, 2002).

## Implikasi Penelitian
Hasil  penelitian  ini  dapat  menjadi  rujukan kondisi  optimum  konsentrasi  NaCl  dan imidazole  untuk  purifikasi  protein  rekombinan CIDRα-PfEMP1. Selanjutnya protein rekombinan terpurifikasi dapat digunakan untuk tahapan  lanjut  pengujian  protein  imunogenik kandidat vaksin malaria, misalnya uji imunogenitas,  uji  toksisitas  maupun  penentuan respon dosis terbaik pada hewan coba, sehingga mendukung  tujuan  pengembangan  vaksin malaria.

## KESIMPULAN
Protein  rekombinan  CIDRα-PfEMP1  berhasil dipurifikasi dengan ditunjukkan dari hasil SDS PAGE  terbentuk  pita  tebal  dengan  berat molekul  27  kDa.  Kondisi  optimum  untuk purifikasi protein rekombinan CIDRα-PfEMP1 adalah  konsentrasi  imidazol  140  mM  dengan
konsentrasi  NaCl  sebesar  300  mM.Terdapat perbedaan  yang  signifikan  antara  rerata konsentrasi protein rekombinan CIDR-α PfEMP1 yang diukur dengan software Image J dan Bradford Assay dimana metode yang lebih direkomendasikan untuk mengukur konsentrasi hasil  purifikasi  protein  rekombinan  CIDR-α PfEMP1 adalah metode Bradford Assay karena aspek kemudahan dan sensitivitas.

## DAFTAR PUSTAKA
Dahlan  SM.  2014. Statistik  untuk  Kedokteran dan  kesehatan:  Deskriptif,  Bivaruat,  dan Multivariat. (W.  Kurniawan  (ed.).  6 th ed.,
Issue 1). Salemba Medika.
Dewi  R,  Ratnadewi  AAI,  Sawitri  WD,
Rachmania  S  &  Sulistyaningsih  E.  2018.
Cloning, Sequence Analysis, and
Expression  of  CIDR1α-pfEMP1  from Indonesian Plasmodium  falciparum isolate. Current  Topics  in  Peptide  and  Protein Research . 19 :95-104.
Ernst  O  &  Zor  T.  2010.  Linearization  of  the Bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. 38 :1-6.
Ferreira  T  &  Rasband  W.  2012.  Image  J  User Guide  User  Guide  ImageJ. Image  J  User Guide , 1.46r .
Flick  K,  Ahuja  S,  Chene  A,  Bejarano  MT  & Chen  Q.  2004.  Optimized  Expression  of
Plasmodium falciparum Erythrocyte Membrane Protein 1 Domains in Escherichia coli. Malaria Journal . 3 (50):1-8.
Gräslund  S,  Nordlund  P  &  Weigelt  J.  2008.
Protein Production and Purification. Nature Methods . 5 (2):135-146.
IBA  Lifesciences.  2012.  Expression  and
Purification of Proteins Using 6x Histidine - tag  A  Comprehensive  Manual.  In IBA Solutions For Life Sciences (Issue October). IBA Headquarters. Lubiana P, Bouws P, Roth LK, Dörpinghaus M, Rehn T, Brehmer J, Wichers JS, Bachmann A., Höhn K, Roeder T, Thye T, Gutsmann T, Burmester T, Bruchhaus I & Metwally NG. 2020.  Adhesion  Between P.  falciparum Infected Erythrocytes and Human
Endothelial  Receptors  Follows  Alternative Binding  Dynamics  under  Flow  and  Febrile Conditions. Scientific Reports . 10 (1):1-14. Oliveira  C  & Domingues   L. 2018. Guidelines to Reach High-quality Purified Recombinant Proteins. Applied
Microbiology and Biotechnology . 102 (1): 81-92.
Olson  BJSC  &  Markwell  J.  2007.  Assays  for Determination  of  Protein  Concentration.  in Current Protocols in Protein Science (pp. 1- 29). John Wiley & Sons Inc.
Puspitaningrum  R,  Adhiyanti  C  &  Solihin. 2018. Genetika  Molekuler  dan  Aplikasinya (S. Attas (ed.)). Deepublish. Putri  M,  Munadziroh  E  &  Soebagio.  2015. Purifikasi  Secretory  Leukocyte  Protease Inhibitor  Membran  Amnion  Rekombinan sebagai Kandidat Biomaterial Menggunakan Kromatografi Afinitas. Jurnal PDGI . 64 (1): 11-16.
Qiagen.  2003.  The  QIA  Expressionist  -  Fifth Edition.  In Qiagen  GmbH,  Düsseldorf. Germany (Issue June). Reinking L. 2007. ImageJ Basics. Word Journal of The International Linguistic Association . 1-22.
Riskesdas  K.  2018.  Hasil  Utama  Riset Kesehatan Dasar (RISKESDAS). Journal of Physics  A:  Mathematical  and  Theoretical . 44 (8):1-200. Sawitri  WD,  Narita  H,  Ishizaka-Ikeda  E, Sugiharto B, Hase T & Nakagawa A. 2016. Purification and Characterization of
Recombinant Sugarcane Sucrose Phosphate
Synthase Expressed in E. Coli and Insect Sf9 cells:  An  Importance  of  the  N-Terminal Domain  for  An  Allosteric  Regulatory property. Journal  of  Biochemistry . 159 (6): 599-607.
Simaremare APR, Bela B, Yasmon A & Ibrahim F.  2015.  Optimizations  of  Expression  and Purification of Recombinant HIV-1
CRF01_AE p24 Protein in Escherichia coli for  Development  of  Immunodiagnostic Assay. Medical  Journal  of  Indonesia .
24 (1):14-18.
Smith JD. 2014. The Role of PfEMP1 Adhesion
Domain  Classification  in Plasmodium falciparum Pathogenesis  Research. Mol Biochem Parasitol . 195 (2): 82-87.
Sulistyaningsih  E,  Armiyanti  Y  &  Dewi  R.
2021.  The  Cidr1α-Pfemp1  Sequence  From Indonesian Plasmodium  falciparum and  Its
Potential  Association  with  The  Cerebral Outcome. MNJ (Malang Neurology
Journal) . 7 (1):34-39. Sulistyaningsih  E,  Fitri  LE,  Löscher  T  & Berens-Riha N. 2013. Diversity of The Var Gene  Family  of  Indonesian Plasmodium falciparum Isolates. Malaria  Journal . 12 (1): 1-13.
Walker  JM.  2002. The  Protein  Protocols Handbook-Second  Edition .  Humana  Press Inc.
World  Health  Organization.  2019.  World malaria  report  2019.  In WHO  Regional
Office for Africa . World Health Organization. Zhang CL, Zhou HN, Liu Q & Yang YM. 2019. Genetic Polymorphism of Merozoite
Surface  Proteins  1  And  2  of Plasmodium Falciparum in The China-Myanmar Border Region. Malaria Journal. 18 (1):1-10.