TEKNIK, 43 (1), 2022,  17 - 24
doi: 10.14710/teknik.v43i1.41985                   Copyright © 2022, TEKNIK, p-ISSN: 0852-1697, e-ISSN: 240-9919
Analisis Penambahan Ion Na dan Ca pada Hidrolisis Pati Singkong ( Manihot esculanta ) untuk Meningkatkan Aktivitas Enzim: Studi Kinetika Hidrolisis
Hargono Hargono * , Bakti Jos, Hantoro Satriadi, Muhammad Fahmi Zakaria
Departemen Teknik Kimia Fakultas Teknik, Universitas Diponegoro, Jl. Prof. Soedarto, SH, Kampus UNDIPTembalang, Semarang, Indonesia 50275

## Abstrak
Singkong manis (Manihot esculanta) merupakan ubi-ubian dengan kandungan pati yang tinggi  sehingga dapat diolah untuk menghasilkan gula reduksi melalui proses hidrolisis. Salah satu jenis proses hidrolisis adalah  hidrolisis  enzimatis.  Penambahan  ion  logam  pada  hidrolisis  enzimatis  dapat  meningkatkan aktivitas  enzim  sehingga  berpengaruh  pada  peningkatan  konsentrasi  gula  reduksi.  Tujuan  penelitian  ini adalah  menganalisis  penambahan  ion  Na  dan  ion  Ca  terhadap  konsentrasi  gula  reduksi  sekaligus mempelajari kinetika hidrolisis. Percobaan dilakukan pada berbagai konsentrasi substrat pati (100, 200, dan 300 g/L), konsentrasi enzim (1 dan 1,5% (b/b)), penambahan ion Na dan Ca masing-masing 60 ppm. Metode hidrolisis yang digunakan pada suhu rendah yaitu 30°C dengan enzim StargenTM 002 pada pH 4, selama  24  jam.  Hasil  penelitian  menunjukkan  konsentrasi  pati  100-200  g/L  mampu  meningkatkan produksi  gula  reduksi  secara  signifikan  pada  konsentrasi  enzim  1,5%  (b/b).  Penambahan  ion  Ca meningkatkan  konsentrasi  gula  reduksi  64%  sedangkan  penambahan  ion  Na  meningkatkan  konsentrasi gula reduksi 18,9%. Konsentrasi gula reduksi terbaik (68,79 g/L) diperoleh pada kondisi konsentrasi pati 200  g/L  dan  konsentrasi  enzim  1,5%  (b/b)  dengan  penambahan  ion  Ca.  Studi  kinetika  menunjukkan fenomena  hidrolisis  ini  mengikuti  persamaan  Michaelis-Menten  dengan  nilai  Km  99,183  g/L  dan  nilai Vmaks  berturut-turut  6,053;  8,881;  15,106  g/L.jam  sehingga  penambahan  ion  Na  dan  Ca  mampu meningkatkan aktivitas enzim.
Kata kunci : singkong; hidrolisis enzimatis; penambahan ion Na; penambahan ion Ca; studi kinetika

## Abstract
[Title:  The  Analysis  of  Na  and  Ca  Ions  Addition  on  Cassava  Hydrolysis  on  Reducing  Sugar Concentration  to  Increase  Enzyme  Activity:  Hydrolysis  Kinetics  Study] Sweet  cassava  is  tuber  that contains  large amount  of  starch  so  that  it  can produce  reducing  sugars.  The  addition  of  metal  ions  can increase  enzyme  activity.  The  purpose  was  to  study  the  addition  of  Na  and  Ca  ions  on  reducing  sugars concentration and to study the hydrolysis kinetics. Experiments were carried out at various concentrations of substrates (100, 200, and 300 g/L), enzyme concentrations (1 and 1.5% (w/w)), addition of Na and Ca ions of 60 ppm. The hydrolysis method was conducted at temperature of 30°C with the enzyme Stargen TM 002  at  pH  4,  for  24  hours.  The  results  showed  that  starch  concentrations  of  100-200  g/L  were  able  to significantly increase the reducing sugars at enzyme concentration of 1.5% (w/w). The addition of Ca ions increased  the  concentration  of  reducing  sugar  by  64%  while  the  addition  of  Na  ions  increased  it  by 18.9%.  The  best  reducing  sugar  concentration  (68.79  g/L)  was  obtained  at  starch  concentration  of  200 g/L and enzyme concentration of 1.5% (w/w) with the of Ca ions. Kinetic studies show that phenomenon follows  Michaelis-Menten  equation  with  V max valued  of  6.053;  8,881;  15.106  g/L.hour,  respectively.  So that, addition of Na and Ca ion can increase the enzyme activity.
Keywords : cassava; enzymatic hydrolysis; addition of Na ions; addition of Ca ions; kinetic studies
------------------------------------------------------------------
*) Penulis Korespondensi. E-mail: hargono@che.undip.ac.id

## TEKNIK, 43 (1), 2022, 18

## 1. Pendahuluan
Hidrolisis  pati  dapat  dilakukan  menggunakan metode  hidrolisis  asam  ataupun  hidrolisis  enzimatis. Hidrolisis  enzimatis  menunjukkan  bahwa  produk  lebih spesifik  dan  tidak  memerlukan  proses  lanjutan  seperti netralisasi  (Bednarska,  2015).  Saat  ini  industri  pati menggunakan hidrolisis enzimatis secara konvensional yaitu menggunakan  α-amilase  dan  glukoamilase  untuk memperoleh  hasil  glukosa  95%  lebih  banyak  daripada hidrolisis  asam  (Hua  &  Yang,  2016).  Hidrolisis  secara konvensional  memerlukan  suhu  yang  lebih  tinggi  pada proses  likuifikasi  (90-125°C)  dan  pada  proses  sakarifikasi (55-65°C)  (Hargono dkk. ,  2015).Hal  ini  mengakibatkan industri  harus  menambah  biaya  untuk  energi  pada  proses hidrolisis.
Hidrolisis  enzimatis  pada  suhu  rendah  dinilai mampu  menekan  biaya  energi  pada  proses  hidrolisis. Proses  ini  dilakukan  menggunakan granular  starch hidrolyzing enzyme (GSHE) yang tidak memerlukan proses pemanasan  (Bialas dkk. ,  2010).  Beberapa  peneliti  telah melakukan  hidrolisis  pati  menggunakan granular  starch hidrolyzing  enzyme (GSHE)  (Szymanowska dkk. ,  2014). Metode  ini  menawarkan  beberapa  keuntungan  bila dibandingkan  dengan  metode  konvensional.  Pertama GSHE dapat mengkatalisis dan menghidrolisis polimer pati pada suhu sub-gelatinasi dan tidak membutuhkan aktivator apapun  seperti  yang  biasanya  digunakan  pada  hidrolisis enzim  konvensional  (Szymanowska dkk. ,  2014).  GSHE menyederhanakan  proses  produksi  gula  reduksi  dan menghemat  konsumsi  energi  hingga  10-20%  (Robertson dkk. ,  2016).  Kedua,  metode  ini  dapat  mencegah peningkatan  viskositas slurry karena  proses  terjadi  pada suhu sub-gelatinasi sehingga kontak antar molekul pati dan air  dapat  terjadi  dengan  lebih  baik  (Robertson dkk. ,  2016; Uthumporn dkk. , 2010; Foerster, 2010; Szymanowska dkk. , 2014). Pada proses hidrolisis enzimatis perlu adanya proses pre-treatment untuk  memaksimalkan  aktivitas  enzim, aktivitas inhibitor, maupun kinetika hidrolisis.
Metode pre-treatment pada  hidrolisis  enzimatis telah  dikembangkan  oleh  beberapa  peneliti  terdahulu. Anggraini dkk. (2020)  melakukan  penelitian  parameter kinetika  hidrolisis  dengan  penambahan  ion  Mg 2+ pada aktivitas  enzim  pektinase.  Pada  konsentrasi  enzim  2  -  4 mm,  penambahan  ion  Mg 2+ bertindak  sebagai  aktivator . Wang dkk. (2018)  melakukan  penelitian  penambahan  ion logam Na, Fe 2+ , Fe 3+ , Mg 2+ , dan Co 2+ pada hidrolisis jerami gandum.  Penambahan  ion  Fe 3+ memberikan  hasil  produk terbaik  dalam  hidrolisis  tersebut.  MgSO 4 ,  FeSO 4 ,  dan bahan ion lain dapat meningkatkan konsentrasi gula reduksi pada hidrolisis enzimatis jerami padi (Ren dkk. , 2012). Fe 2+ dan  Cu 2+ mampu  mendegradasi  jerami  padi,  sedangkan Mg 2+ dan  Fe 3+ menginhibisi  hidrolisis  enzimatis  pada substrat  yang  sama  (Li dkk. ,  2015).  Presecki dkk. (2013) melakukan  hidrolisis  pati  menggunakan  campuran  eznim amilase  dan  glukoamilase  dengan  penambahan  ion  Ca.
Konversi  gula  reduksi  yang  diperoleh  sebesar  100%. Penambahan  ion  Ca  secara  signifikan  meningkatkan produksi  gula  reduksi  dan  menjaga  stabilitas  dari  enzim. Gula  reduksi  dapat  diperoleh  dari  tanaman  yang mengandung pati.
Singkong merupakan salah satu jenis tanaman yang berpotensi di daerah tropis (Ikeh dkk. , 2012). Secara global, tanaman singkong menempati urutan keenam dan menjadi makanan pokok selama lebih dari 800 juta orang di dunia, terutama di negara tropis (Ladeira dkk. , 2013) sedangkan di Indonesia,  singkong  menempati  urutan  ketiga  makanan pokok  terpenting  setelah  beras  dan  jagung  (Ristono  & Amarullah,  2011).  Salah  satu  jenis  singkong  yang berpotensi  di  Indonesia  adalah  singkong  manis  ( Manihot esculanta ). Singkong manis memiliki kandungan pati yang cukup  tinggi  yaitu  sebesar  78,7  %  (b/b)  (Hargono dkk. ,
2017a).  Pati  singkong  manis  dapat  diolah  menjadi  gula reduksi melalui proses hidrolisis.
Hargono dkk. (2017b)  melakukan  penelitian hidrolisis  pati  menggunakan  Enzim  Stargen TM 002  pada pati singkong manis, pati singkong pahit, dan pati gadung. Berdasarkan  penelitian  tersebut,  konsentrasi  gula  reduksi tertinggi  dan  aktivitas  enzim  terbaik  diperoleh  dari  pati singkong  manis.  Pada  penelitian  ini  akan  mengkaji  lebih lanjut  mengenai  penambahan  ion  Na  dan  ion  Ca  untuk mampu  meningkatkan  aktivitas  enzim  sehingga  produksi gula reduksi meningkat.
Penelitian  ini  bertujuan  mempelajari  pengaruh konsentrasi substrat pati singkong manis, konsentrasi enzim Stargen TM 002,  dan  penambahan  ion  Na  dan  Ca  terhadap konsentrasi  gula  reduksi  serta  dipelajari  pula  kinetika hidrolisis  enzimatis  pati  singkong  tanpa  penambahan  dan dengan penambahan ion Na dan Ca.

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1 Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah singkong  manis  ( Manihot  esculanta )  berumur  10  bulan, yang  berasal  Desa  Pung  Wetan,  kecamatan  Jatipuro, Kabupaten  Karanganyar,  Surakarta.  Adapun  reagen  kimia yang  digunakan  adalah:  (1)  potasium  sodium  tartrat tetrahidrat,  (2)  DNS  (3.5-dinitrosalicylic  acid),  (3)  sodium hidroksida (Merck, 98%), (4) sodium sulfit (Merck, 98.5%), (5)  asam  sulfat  (Merck,  98.5%),  (6)  larutan  buffer  0,01  M sodium  fosfat  asam  sitrat,  (7)  glukosa  (Merck,  99,5%). Semua  reagen  dibeli  dari  Sigma-Aldrich  Indonesia.  Enzim yang  digunakan  adalah  koktail  Stargen TM 002.  Enzim  ini merupakan    enzim  campuran  dari  α-amilase  yang  berasal dari Aspergillus  kawachi dalam Trichoderma  reseei dan glukoamilase  dalam Trichoderma  reseei ,  dikenal  dengan sebutan granular  starch  hydrolyzing  enzyme (GSHE).
GSHE  merupakan  enzim  generasi  kedua  yang  diproduksi oleh Genencor Internasional, BV (Genencor Internasional di Palo  Alto,  CA,  USA).  Aktivitas  endo  α-amilase  dan  ekso gluko-amilase  secara  lengkap  menghidrolisis  granula  pati
doi: 10.14710/teknik.v43i1.41985                   Copyright © 2022, TEKNIK, p-ISSN: 0852-1697, e-ISSN: 240-9919
Gambar 1. Penentuan kecepatan reaksi awal, Vo dengan menggambar  garis  lurus  dan  bersinggungan  pada  kurva hidrolisis (Lehninger, 1982).
dan bekerja secara sinergi untuk menghidrolisis substrat pati menjadi glukosa.
2.2 Metode
2.2.1 Pembuatan Pati Singkong
Pembuatan  pati  singkong  dilakukan  secara konvensional, diawali dengan pengupasan kulit pada ubi singkong,  dilanjutkan  pencucian  dan  pemarutan.  Hasil parutan  ditambah  air,  selanjutnya  dilakukan  pemerasan agar  pati  bisa  terekstrak  dan  terpisah  dari  ampasnya. Campuran  air  dan  pati  dipisahkan  menggunakan centrifuge Hettich  EBA200  agar  diperoleh  pati  dengan kandungan  air  yang  rendah,  selanjutnya  pati  tersebut dikeringkan  dengan  sinar  matahari  selama  3  hari berturut-turut  sampai  kandungan  air  minimal  (Hargono dkk. , 2017a).
2.2.2  Pengaruh  Konsentrasi  Pati  Singkong  terhadap Konsentrasi Gula Reduksi
Pati  singkong  yang  telah  dibuat  kemudian digunakan  sebagai  substrat  pada  hidrolisis  dengan konsentrasi  100,  200  dan  300  g/L.  Penambahan  Na + (NaCl) dan Ca 2+ (CaCl 2 ) pada masing-masing konsentrasi slurry pati  kemudian  dilakukan  inkubasi dalam shaker pada kecepatan 100 rpm, selama 10 menit pada  pH  4.  Untuk  menjaga  pH, slurry dikontrol menggunakan  larutan buffer 0,01  M sodium  phosphate asam  sitrat.  Selanjutnya  untuk  proses  hidrolisis, slurry pati  singkong  manis  dipindahkan  ke  dalam  jar  tes, ditambahkan  Stargen TM 002  sesuai  variabel  1  dan  1,5% (b/b)  pada  suhu  30°C,  pH  4,    selama  24  jam.  Setiap periode  waktu  3,  6,  9,  12,  15  dan  18  jam,  sampel diambil,  dilakukan  sentrifugasi  selama  4  menit  pada putaran  100  Hz.  Sampel  hasil  centrifugasi  yang  telah terpisah  filtratnya  disaring  menggunakan  kertas  saring Whatman  CAT  40  No.1440-125  mm,  agar  diperoleh filtrat  yang  telah  bebas  dari  padatan.  Filtrat  kemudian dianalisis untuk menentukan konsentrasi gula reduksi.

## 2.2.3 Metode Analisis Gula Reduksi
Filtrat  hasil  hidrolisis  kemudian  dianalisis konsentrasi  gula  reduksinya  menggunakan  metode dinitrosalicylic  acid (DNS)  (Miller,  1959).  Reagen terdiri  dari  larutan  1%  3,5-dinitrosalicylic  acid,  0,05% sodium  sulfit,  20%  sodium-potasium  tartrat  dan  1% sodium  hidroksid  ditambahkan  pada  rasio  3:1  ke  dalam sampel  dalam  tabung  reaksi.  Larutan  ini  dikocok  dan diinkubasi  menggunakan  air  mendidih  selama  8  menit. Sampel  kemudian  didinginkan  menggunakan  air  es selama 5  menit, sebelumnya  mengukur absorbansi pada 570 nm pada spektrophotometer UV/visible (UV-160A, SHIMADZU,  Kyoto,  Japan).  Glukosa  murni  0  sampai 10 g/L digunakan sebagai larutan standar. Oleh sebab itu pengukuran  konsentrasi  gula  reduksi  ditulis  dalam satuan g/L.
2.2.4 Penentuan Kecepatan Awal Reaksi, Vo
Kecepatan  awal,  Vo  dari  hidrolisis  pati  singkong manis ditentukan dari slope /kemiringan kurva hubungan
antara  konsentrasi  gula  reduksi  dengan  waktu  hidrolisis pada awal reaksi. Cara menentukan kecepatan awal, Vo, seperti ditunjukkan dalam Gambar 1.

## 2.2.5 Penentuan Parameter Kinetika
Karakteristik  konstanta  V maks dan  K m dapat ditentukan berdasarkan data eksperimen dengan menginkubasi  enzim  pada  berbagai  konsentrasi  substrat awal [So].  Selanjutnya data-data yang diperoleh dibuat grafik  hubungan  antara  Vo  dengan  [So].  Linierisasi kurva  (garis  lurus)  dilakukan  dengan  membuat  grafik hubungan antara 1/Vo vs 1/[So]. Nilai slope merupakan K m /V maks ,  intersep  sumbu  y  adalah  1/V maks dan  titik potong  kurvadengan  sumbu  x  negatif  adalah  –1/K m (Fange dkk. ,  2011).  Persamaan  Michaelis-Menten, seperti  yang  ditunjukkan  pada  Persamaan  1,  adalah persamaan  kecepatan  bagi  suatu  reaksi  enzimatik  satu substrat.  Persamaan  ini  adalah  suatu  pernyataan mengenai  hubungan  kuantitatif  di  antara  kecepatan reaksi  awal  Vo,  kecepatan  maksimum  V maks ,  dan konsentrasi  substrat,  semua  dihubungkan  melalui tetapan Michaelis-Menten, K m .
    m maks 0 K S S V V  = (1)
Vo adalah kecepatan reaksi awal, (g/Ljam), V maks adalah kecepatan maksimum, (g/Ljam), [S0] adalah konsentrasi substrat,  g/L,  K m adalah  tetapan  Michaelis  Menten. Selanjutnya Persamaan 1 dibuat invers oleh Lineweaver Burk menjadi Persamaan 2.
      max max m max m V 1 S 1 V K S V S K V 1    = (2)

## 2.2.6  Penentuan  Prosentase  Kenaikan  Konsentrasi Gula Reduksi
Penambahan  ion  Na  dan  Ca  diharapkan  akan menghasilkan  kenaikan  konsentrasi  gula  reduksi terhadap  hasil  hidrolisis  tanpa  penambahan  ion  Na  dan
(a) (b) (c )
Gambar 2. Pengaruh penambahan ion Na dan ion Ca pada konsentrasi pati: a) 100 g/L, b) 200 g/L,c) 300 g/L terhadap konsentrasi gula reduksi pada hidrolisis menggunakan Stargen TM 002, konsentrasi 1% (b/b), suhu 30°C
Ca. Prosentase kenaikan dihitung menggunakan Persamaan 3.
100% C C C %Kenaikan 0 0   i = (3)
C i dan  C 0 secara  berturut-turut  adalah  konsentrasi  gula reduksi dengan penambahan ion Na maupun ion Ca dan konsentrasi  gula  reduksi  tanpa  penambahan  ion  Na maupun ion Ca.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1  Pengaruh  Penambahan  Ion  Na  dan  Ca  pada Berbagai  Konsentrasi  Pati  dan  Konsentrasi  Enzim terhadap Konsentrasi Gula Reduksi
Hidrolisis  enzimatis  singkong  manis  ( Manihot esculanta ) dilakukan menggunakan berbagai konsentrasi pati singkong yaitu 100, 200, dan 300 g/L dan berbagai konsentrasi enzim yaitu 1 dan 1,5% (b/b). Pada masing- masing  konsentrasi  pati  dan  konsentrasi  enzim
dilakukan  tanpa pre-treatment dan  dengan pre- treatment penambahan  ion  Na  dan  Ca.  Pengaruh konsentrasi  pati  dan  penambahan  ion  Na  dan  Ca  pada konsentrasi enzim 1% (b/b) ditunjukan pada Gambar 2.
Gambar  2  (a,b  dan  c)    menunjukkan  fenomena yang  sama  dari  masing-masing  variabel.  Konsentrasi gula  reduksi  meningkat  dengan  bertambahnya  waktu hidrolisis  hingga  12  jam  kemudian  cenderung  konstan. Hal  ini  disebabkan  salah  satunya  karena  telah  tercapai titik  saturasi  sehingga  enzim  sudah  tidak  mampu  lagi mengkonversi  pati  menjadi  gula  reduksi  (Daniel  & Danson, 2013).
Konsentrasi gula reduksi tertinggi yang diperoleh pada  konsentrasi  pati  100  g/L  untuk  tanpa  penambahan logam,  dengan  penambahan  ion  Na + ,  dan  penambahan ion  Ca 2+ secara  berturut-turut  18,84;  21,87;  25,92  g/L. Konsentrasi  gula  reduksi  tertinggi  yang  diperoleh  pada konsentrasi  pati  200  g/L  untuk  tanpa  penambahan logam,  dengan  penambahan  ion  Na + ,  dan  penambahan ion  Ca 2+ secara  berturut-turut  24,85;  28,30;  32,82  g/L. Berdasarkan  data  tersebut,  kenaikan  konsentrasi  gula
doi: 10.14710/teknik.v43i1.41985                   Copyright © 2022, TEKNIK, p-ISSN: 0852-1697, e-ISSN: 240-9919
Tabel  1. Pengaruh  penambahan  ion  Na  dan  ion  Ca  pada  konsentrasi  pati  100  g/L,  200  g/L,  dan  300  g/L  terhadap konsentrasi gula reduksi menggunakan Stargen TM 002, konsentrasi 1,5% (b/b), suhu 30°C.
Waktu (jam) Konsentrasi Gula Reduksi (g/L) Konsentrasi Pati 100 g/L Konsentrasi Pati 200 g/L Konsentrasi Pati 300 g/L Tanpa +Na +Ca Tanpa +Na +Ca Tanpa +Na +Ca 3 16,34 20,54 30,52 19,45 28,45 39,90 18,12 30,12 36,12 6 24,16 29,08 35,88 34,22 38,24 48,92 35,65 39,24 42,45 9 28,24 34,64 48,65 40,12 42,56 59,07 41,34 43,56 52,84 12 30,12 40,23 52,44 41,33 49,78 68,32 42,65 50,34 55,60 15 30,34 40,45 52,56 41,89 49,82 68,76 42,70 50,36 55,70 18 30,56 40,54 52,58 41,94 49,86 68,79 42,72 50,40 55,78
Tabel 2. Prosen kenaikan konsentrasi gula reduksi terhadap penambahan ion Na dan ion Ca pada berbagai konsentrasi pati terhadap konsentrasi gula reduksi pada hidrolisis menggunakan Stargen TM 002, konsentrasi 1,5% (b/b), suhu 30°C.
Waktu (jam) Kenaikan konsentrasi gula reduksi (%) Konsentrasi Pati 100 g/L Konsentrasi Pati 200 g/L Konsentrasi Pati 300 g/L +Na +Ca +Na +Ca +Na +Ca 3 25,7 86,8 46,3 105,1 66,2 99,3 6 20,4 48,5 11,7 43,0 10,1 19,1 9 22,7 72,3 6,1 47,2 5,4 27,8 12 33,6 74,1 20,4 65,3 18,0 30,4 15 33,3 73,2 18,9 64,1 17,9 30,4 18 32,7 72,1 18,9 64,0 18,0 30,6
reduksi  dari  konsentrasi  pati  100  g/L  ke  200  g/L  cukup signifikan.  Hal  ini  disebabkan  semakin  banyak konsentrasi  pati  maka  semakin  banyak  substrat  yang dikonversi  menjadi  gula  reduksi.  Hal  ini  menandakan bahwa  situs  aktif  enzim  masih  mampu  mengkonversi jumlah substrat yang lebih banyak (Mezule dkk. , 2019). Konsentrasi gula reduksi tertinggi diperoleh pada konsentrasi  pati  300  g/L  untuk  tanpa  penambahan logam,  dengan  penambahan  ion  Na + ,  dan  penambahan ion  Ca 2+ secara  berturut-turut  25,92;  28,82;  33,20  g/L. Berdasarkan  data  tersebut,  kenaikan  konsentrasi  gula reduksi  dari  konsentrasi  200  g/L  ke  300  g/L  tidak menunjukkan  perbedaan  signifikan.  Hal  ini  disebabkan oleh  peningkatan  viskositas  yang  menghambat  proses difusi.  Selain  itu,  terdapat  kemungkinan  terjadi  inhibisi akibat  konsentrasi  substrat  yang  tinggi  (Ruiz dkk. , 2011).
Mezule dkk. (2019) melakukan hidrolisis dengan konsentrasi  substrat  1-10%  (b/v).  Peningkatan  pada konsentrasi substrat hingga 5% (b/v) dapat meningkatkan  produk  gula  reduksi.  Pada  konsentrasi substrat  diatas  5%  (b/v)  tidak  mampu  meningkatkan konsentrasi gula reduksi atau cenderung konstan. Hal ini serupa dengan penelitian yang dilakukan.
Penelitian  yang  sama  juga  dilakukan  dengan menggunakan  konsentrasi pati 100-300 g/L untuk tanpa
penambahan  logam  dan  dengan  penambahan  ion  Na + dan  Ca 2+ menggunakan  konsentrasi  enzim  Stargen TM 002 sebesar 1,5% (b/b) seperti disajikan pada Tabel 1.
Berdasarkan fenomena yang disajikan pada Tabel 1,  pengaruh  gula  reduksi  terhadap  waktu  hidrolisis  dan konsentrasi  pati  memiliki  kecenderungan  yang  sama pada penelitian menggunakan konsentrasi enzim sebesar 1%  (b/b).  Namun  demikian,  konsentrasi  enzim  sebesar 1,5%  (b/b)  menghasilkan  peningkatan  konsentrasi  gula reduksi  yang  signifikan  untuk  masing-masing  variabel dibandingkan dengan konsentrasi enzim 1% (b/b).
Krajang dkk. (2021)  melakukan  hidrolisis enzimatis  pada  pati  singkong  menggunakan  enzim Stargen TM 002  dengan  variasi  konsentrasi  0,1  hingga 0,4% (w/v). Hasil produk gula reduksi meningkat seiring bertambahnya  konsentrasi  enzim  yang  digunakan  yaitu mencapai 78,70 g/L pada konsentrasi enzim 0,4%(w/v). Hal  ini  disebabkanoleh  semakin  banyaknya  situs  aktif yang bekerja (Krajang dkk. , 2021).
Konsentrasi  gula  reduksi  setelah  diberikan penambahan  ion  Na + dan  ion  Ca 2+ mengalami peningkatan  dibandingkan  tanpa  pemberian  ion  logam. Prosentase  kenaikan  konsentrasi  gula  reduksi  terhadap penambahan ion Na + dan ion Ca 2+ untuk masing-masing variabel disajikan pada Tabel 2.
Penambahan  ion  logam  menunjukkan  kenaikan
doi: 10.14710/teknik.v43i1.41985                   Copyright © 2022, TEKNIK, p-ISSN: 0852-1697, e-ISSN: 240-9919
Gambar  4. Hubungan  1/So  terhadap  1/Vo  pada penambahan ion Na dan ion Ca.
Gambar 3. Hubungan konsentrasi substrat awal (So) terhadap kecepatan reaksi awal (Vo) pada penambahan ion Na dan ion Ca.
konsentrasi  gula  reduksi  yang  cukup  tinggi  seperti ditunjukkan  pada  Tabel  2.  Penambahan  ion  Ca 2+ menghasilkan  kenaikan  konsentrasi  gula  reduksi  yang lebih  tinggi  dibandingkan  penambahan  ion  Na + untuk masing-masing variabel Na + yang mampu meningkatkan konsentrasi  gula  reduksi  dan  mengaktivasi  enzim dengan  mengikat  air  dan  residu  protein  yang  sesuai (David dkk. ,  2016).  Zohra dkk. (2016)  telah  melakukan penelitian  hidrolisisenzimatis  dengan  penambahan  ion logam  monovalen,  divalen,  dan  trivalen.  Penambahan ion Ca 2+ menghasilkan aktivitas enzim tertinggi diantara ion logam lain. Hal ini disebabkan secara umum amilase dikenal sebagai metaloenzim dan mengandung setidaknya  satu  ion  Ca 2+ sebagai  komponen  integral untuk  meningkatkan  aktivitas  enzim.  Selain  itu,  untuk menjagakestabilan  dan  memperpanjang  waktu  paruh enzim,  Ca 2+ adalah  kation  yang  disukai.  -amilase termostabil  menggambarkan  stabilitas  termo  yang  lebih dengan adanya Ca 2+ (Zohra dkk. , 2016).
Penelitian serupa juga dilakukan oleh Wang dkk. (2018).  Ia  melakukan  hidrolisis  jerami  gandum  dengan penambahan  ion  logam.  Hasil  yang  diperoleh  bahwa semakin  tinggi  muatan  ion  pada  logam  tersebut  maka semakin  tinggi  pula  aktivitas  enzim  yang  dihasilkan. Namun  tidak  semua  jenis  logam  dengan  muatan  yang lebih  tinggi  dapat  bertindak  sebagai  aktivator  (Wang dkk. ,  2018).  Salah  satu  contohnya  adalah  ion  logam Mg 2+ .  Pada  konsentrasi  6-10  mM,  ion  Mg 2+ dapat menurunkan  aktivitas  enzim  karena  mampu  mengikat sisi aktif enzim (Anggraini dkk. , 2020). Ezugwu dkk. (2016)  melakukan  studi  aktivitas enzim  glukoamilase  menggunakan  beberapa  ion  logam divalen  yaitu  Ca 2+ ,  Zn 2+ ,  dan  Fe 2+ .  Penggunaan  ion logam  ini  mampu  menahan  substrat  untuk  melakukan interaksi  dengan  enzim  menggunakan  bantuan  ion hidroksida  nukleofilik  yang  dihasilkan  oleh  ion  logam
tersebut.  Peningkatan  aktivitas  enzim  denganion  Ca 2+ , Zn 2+ ,  dan  Fe 2+ dapat  didasarkan  pada  kemampuan berinteraksi  dengan  asam  amino  bermuatan  negatif, seperti  asam  aspartat  dengan  menstabilkan  muatan negatif  yang  terbentuk  di  situs  aktif  (Carvalho dkk. , 2014).

## 3.2  Parameter  Kinetika  Hidrolisis  Pati  Singkong terhadap Penambahan Ion Na dan Ca
Salah  satu  faktor  yang  berpengaruh  terhadap aktivitas  enzim  adalah  konsentrasi  substrat  pati singkong.  Pada  penelitian  ini  digunakan  variasi konsentrasi  substrat  sebesar  100,  150,  200,  250,  300, 350,  400,  dan  450  g/L.  Kecepatan  reaksi  awal  (Vo) ditentukan  menggunakan  tangen  dari  persamaan  garis polynomial  hubungan  waktu  terhadap  produksi  gula reduksi  seperti  ditunjukkan  pada  Gambar  1.  Kecepatan reaksi awal (Vo) kemudian diplotkan pada  grafik  untuk mengetahui  hubungan  antara  konsentrasi  substrat  (So) terhadap  kecepatan  reaksi  awal  (Vo)  seperti  disajikan pada Gambar 3.
Penambahan  konsentrasi  substrat  meningkatkan kecepatan  reaksi  awal  kemudian  pada  konsentrasi substrat  setelah  300  g/L  menghasilkan  kecepatan  reaksi awal  yang  cenderung  konstan.  Hal  ini  sesuai  dengan konsep  Michaelis-Menten  bahwa  konsentrasi  substrat awal  berpengaruh  terhadap  kecepatan  reaksi.  Pada kenaikan  konsentrasi  substrat  akan  meningkatkan kecepatan  reaksi  sampai  titik  tertentu  kemudian  tidak akan  meningkat  meskipun  ditambahkan  substrat  yang lebih  banyak.  Hal  ini  disebabkanenzim  sudah  mencapai titik  jenuh  terhadap  substrat  dan  mencapai  kecepatan reaksi maksimum (V maks ) sehingga aktivitas enzim tidak dipengaruhi konsentrasi substrat (Vitolo, 2020).
Parameter  kinetika  hidrolisis  singkong  dapat ditentukan  menggunakan  bantuan  persamaan  hasil

## TEKNIK, 43 (1), 2022, 23
doi: 10.14710/teknik.v43i1.41985                   Copyright © 2022, TEKNIK, p-ISSN: 0852-1697, e-ISSN: 240-9919
Tabel  3. Parameter  kinetika  hidrolisis  pati  singkong terhadap penambahan ion Na dan ion Ca.
Persamaan Garis V maks (g/L.jam) K m (g/L) Tanpa Y = 16,26 X + 0,1652 6,053  98,426 + Na Y = 11,17 X + 0,1126 8,881  99,183 + Ca Y = 6,572 X + 0,0662 15,106  99,269
linearisasi  dari  persemaan  Michaelis-Menten  yaitu menggunakan kurva Lineweaver-Burk seperti ditunjukkan  pada  Gambar  4.  Hubungan  antara  1/So  vs 1/Vo  akan  menghasilkan  persamaan  garis  yang  mana slope merupakan K m /V maks dan intercept adalah 1/V maks . Data  kinetika  disajikan  pada  Tabel  3  dan  kurva hubungan 1/So vs 1/Vo disajikan pada Gambar 4.
Hasil  perhitungan  dari  kurva  Lineweaver-Burk menunjukkan  bahwa  penambahan  ion  Na  dan  ion  Ca meningkatkan  nilai  V maks .  Penambahan  ion  Ca meningkatkan V maks dengan signifikan  mencapai 15,106 g/L.jam  sedangkan  penambahan  ion  Na  meningkatkan nilai V maks hingga 8,881 g/L.jam. Berdasarkan fenomena tersebut keberadaan ion Ca dan ion Na bertindak sebagai aktivator karena mampu meningkatkan nilai V maks. Pada persamaan  Michaelis-Menten,  penambahan  inhibitor dapat  menurunkan  nilai  V maks dan  meningkatkan  nilai K m sedangkan penambahan aktivator dapat menurunkan nilai  K m dan  meningkatkan  nilai  V maks (Silverstein, 2019).
Berdasarkan  Gambar  4,  masing-masing  kurva garis lurus berpotongan di satu titik pada sumbu x yang menunjukkan  nilai  -1/K m yang  berhimpitan.  Hal  ini menunjukkan pada fenomena ini memiliki nilai K m yang sama.  Fenomena  tersebut  sesuai  dengan  persamaan Michaelis-Menten  yaitu  termasuk  dalam  jenis  non kompetitif.  Anggraini dkk. (2020)  melakukan  studi kinetika menggunakan penambahan ion Mg 2+ memperoleh  nilai  K m yang  sama  di  satu  titik.  Hal  ini menunjukkan  penambahan  ion  logam  mengikuti  model Michaelis-Menten jenis non kompetitif.

## 4. Kesimpulan
Analisa  penambahan  ion  Na  dan  Ca  terhadap hidrolisis pati singkong pada berbagai variasi konsentrasi  pati  dan  konsentrasi  enzim  telah  dilakukan. Penambahan ion Ca menghasilkan peningkatan konsentrasi  gula  reduksi  yang  lebih  besar  dibandingkan penambahan  ion  Na.  Prosen  peningkatan  konsentrasi gula reduksi tertinggi diperoleh pada kondisi konsentrasi pati 200 g/L dengan konsentrasi enzim 1,5% (b/b) pada penambahan  ion  Ca  60  ppm  dengan  hasil  konsentrasi gula  reduksi  sebesar  68,79  g/L.  Studi  kinetika menunjukkan fenomena hidrolisis ini mengikuti persamaan  Michaelis-Menten  dengan  nilai  K m 99,183
g/L  dan  nilai  V maks berturut-turut  6,053;  8,881;  15,106 g/L.jam  sehingga  penambahan  ion  Na  dan  Ca  mampu meningkatkan aktivitas enzim.

## Ucapan Terima Kasih
Terima  kasih  disampaikan  kepada  Departemen  Teknik Kimia,  Fakultas  Teknik  Universitas  Diponegoro  yang telah  memfasilitasi  penelitian  ini  di  Laboratorium Pengolahan Limbah hingga penelitian ini dapat berjalan dan selesai dengan baik.

## Daftar Pustaka
Anggraini, D.P., Sulistiana, D., Agustina, D.K., Ulimaz, A.  (2020).  Determination  of  Kinetic  Parameters and  The  Effect  of  Ion  Mg 2+ Inhibition  Into Pectinase Activities. Jurnal Penelitian dan Pengkajian Ilmu Pendidikan , 4(2), 112-118. Bednarska, K.A. (2015). Kinetic modelling of enzymaticstarch hydrolysis . Wageningen:Wageningen University Press.
Bialas,  W.,  Daria,  S.,  Włodzimierz,  G.  (2010).  Fuel ethanol  production  from  granular  corn  starch using  Saccharomyces  cerevisiae  in  a  long  term repeated SSF process with full stillage recycling. Bioresources Techno logy, 101, 3126–3131. Carvalho,  C.C.,  Ziotti,  L.S.,  Pereira,  G.M.,  Furquim  da Cruz,  A.,  Jorge,  J.A.,  Polizeli,  M.T.M.  (2014). Production and Functional Properties of Free and
Immobilized Glucoamylases of Penicilliumcitrinum. Jacobs Journal
ofBiotechnology and Bioengineer , 1(2), 1-10. David,  W.,  Gohara,  Cera,  E.D.  (2016).  Molecular Mechanisms ofEnzyme Activation byMonovalent Cations. Journal  of  Biological  Chemistry , 291(40), 20840-20848.
Daniel, R.M., Danson, M.J. (2013). Temperature and the catalytic activity of enzymes: A
freshunderstanding. FEBS  Letters ,  587,  2738- 2743.
Ezugwu,  A.L.,  Ottah,  V.E.,  Eze,  S.O.O.,  Chilaka,  F.C. (2016).  Effect  of  pH,  various  divalent  metal  ion and different substrates on glucoamylase activity obtained from Aspergillus niger using amylopectin  from  tiger  nut  starch  as  carbon source. African Journal of Biotechnology , 15(21), 980-988.
Foerster, H. (2010).  Granular starch  hydrolysis (GSHE) for  conversion  of  grains  to  ethanol. Near-term Opportunities  for  Biorefineries  Symposium . Champaign, IL: Genencor- A Danisco Division.
Hargono, H., Jos, B., Kumoro, A.C. (2017a). Production of  Bioethanol  from  Sweet  andBitter  Cassava Starches  by  SimultaneousSaccharification  and
FermentationUsing  Saccharomyces  cerevisiae. Advanced Science Letters , 23, 2427–2431.
Hargono, H., Jos, B., Kumoro, A.C. (2017b). Kinetics of the Enzymatic Hydrolysis of Sweet CassavaStarch,  Bitter  Cassava,  and  Gadung ( Dioscorea  hispida  Dennst )  Flours  at  Low Temperature. Bulletin  of  Chemical  Reaction Engineering & Catalysis , 12(2), 256-262.
Hargono,  Kumoro,  A.C.,  Jos,  B.  (2015).  Comparative study  on  the  conventional  and  non-thermal simultaneous  saccharification  and  fermentation of Manihot glaziovii root starch. AIP Conference Proceedings . (1699) 030013.
Hua, X., Yang, R. (2016). Enzymes in starch processing. In  Chandrasekaran,  M.  (Ed.) Enzymes  in  Food and Beverage Processing , Boca Raton: CRCPress.
Ikeh,  A.O.,  Udaeyo,  N.U.,  Udoh,  E.I.,  Iboko,  .K.O., Udounang,  P.I.  (2012).  Growth  and  yieldof Cassava (Manihot esculenta Crants) asinfluenced by  the  number  of  shoots  retainedper  stand  on  as Ultisol. Nature and Science , 10(8), 17-20.
Ladeira, T., Souza, H. Pena, R. (2013). Characterization of  the  roots  and  starches  ofthree  cassava cultivars. International  Journal  ofAgricultural. Science Research , 2(1), 12-20.
Li,  D.Y.,  Tian,  Y.H.,  Gong,  D.C.  (2015).  Effects  of Metal  Ion  on  the  Hydrolysis  of  Steam-Exploded Straw by Cellulase. Hubei Agricultural Sciences , 54(3), 546-549.
Mezule,  L.,  Berzina,  I.,  Strods,  M.  (2019).  The  Impact of  Substrate–Enzyme  Proportion  for  Efficient Hydrolysis of Hay. Energies , 12(3526), 1-8. Presecki,  A.V.,  Blazevic,  Z.F.,  Vasic-Racki,  D.  (2013). Complete  starch  hydrolysis  by  the  synergistic action  of  amylaseand  glucoamylase:  impact  of calcium ions. Bioprocess Biosystem Engineering , 36, 1555-1562.
Ren,  T.B.,  Yin,  S.Y.,  Ma,  X.Q.,  Zhang,  L.L.,  Su,  Y., Song,  A.D.  (2012).  The  Effect  of  Chemical Inducers on Enzymatic Hydrolysis of Rice Straw.
Journal  of  Agro-Environment  Science ,  31(1), 206-211.
Ristono,  Amarullah.  (2011). Singkong  Gajah  Berjuang Balikpapan: Petrogas Press.
Robertson, G.H., Wong, D.W., Lee, C.C., Wagschal, K., Smith,  M.R.,  Orts,  W.J.  (2016).  Native  orraw starch  digestion:  a  key  step  in  energy  efficient biorefining  of  grain. Journal  of  Agricultural  and Food Chemistry , 54, 353-365.
Ruiz,  M.I.,  Sanchez,  C.I.,  Torrres,  R.G.,  Molina,  D.R. (2011).  Enzymatic  hydrolysis  of  cassava  starch for  production  of  bioethanol  with  a  colombian wild  yeast  strain. Journal  of  the  Brazilian Chemical Society , 22(12), 2337-2343.
Silverstein,  T.P.  (2019).  When  both  Km  and  Vmax  are altered,  Is  the  enzyme  inhibited  or  activated? Biochemistry  and  Molecular  Biology  Education , 47(4), 446-449.
Szymanowska,  D.P.,  Lewandowicz,  G.,  Kubiak,  P., Błaszczak,  W.  (2014).  Stability  ofthe  process  of simultaneous  saccharification  and  fermentation of corn flour. The effect of structural changes of starch by stillage recycling and scaling  up of the process. Fuel , 119, 328-334.
Uthumporn,  U.,  Zaidul,  I.S.,  Karim,  A.  (2010). Hydrolysis of granular starch at subgelatinization suhue  using  a  mixture  of  amylolytic  enzymes. Food Bioprod Process , 88, 47-54.
Vitolo,  M.  (2020).  Brief  Review  on  Enzyme  Activity. World Journal of Pharmaceutical Research , 9(2), 60-76.
Wang,  S.,  Lv,  M.,  Yang,  J.,  Zhou,  Y.,  Xu,  B.  (2018). Effects  and  Mechanism  of  Metal  Ions  on Enzymativ  Hydrolysis  of  Wheat  Straw  after Pretreatment. BioResources , 13(2), 2617-2631. Zohra,  R.R.,  Qader,  S.A.U.,  Pervez,  S.,  Aman,  A. (2016).  Influence  of  different  metals  on  the activation  and  inhibition  of  α-amylase  from thermophilic  Bacillus  firmus  KIBGE-IB28. Pakistan  Journal  of  Pharmaceutical  Sciences , 29(4), 1275-1278.