ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 17 (3) (2014) : 75 – 79
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi dan Identifikasi Senyawa Aktif dari Ekstrak Aseton Rimpang Bangle ( Zingiber cassumunar Roxb. ) sebagai Antioksidan
Ika Rissanti a , Enny Fachriyah a* , Dewi Kusrini a
a Organic Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: dewi.kusrini@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords: Bangle ( Zingiber cassumunar Roxb. ),
Isolation, Identification,
antioxidants, DPPH
An active compound was isolated and identified from acetone extracts of bangle rhizome ( Zingiber cassumunar Roxb. ) as an antioxidant. Isolation of active compounds was done by soxhlet and chromatography method while antioxidant assay by DPPH method. The active isolate  was  analyzed  using  UV-Vis  spectrophotometer  by  the  addition  of  some  shift reagent and FTIR. Based on the analysis results, the active isolate was suspected as auron from flavonoid class that has absorbance at wavelength 260.5 nm (band II) and 421.5 nm (band I), it has hydroxylation pattern on 6,7,3',4', and contains a functional group of OH, CO phenols, CO ether, C=O ketone, C=C alkene, C=C and =CH aromatics, and substituted benzene,  that  was  suspected  as  6,7,3',4'tetrahidroksiauron  (Maritimetin)  compound. Antioxidant assay of the acetone extracts showed IC 50 at 91.513 ppm thus classified as a strong antioxidant.

## A b s t r a k
Kata Kunci: Bangle ( Zingiber cassumunar Roxb. ),
Isolasi, Identifikasi, Antioksidan, DPPH
Telah  dilakukan  isolasi  dan  identifikasi  senyawa  aktif  ekstrak  aseton  rimpang  bangle ( Zingiber cassumunar Roxb. ) sebagai antioksidan. Isolasi senyawa aktif dilakukan dengan ekstraksi soklet dan kromatografi sedangkan uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH. Isolat aktif dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan pereaksi geser  serta  FTIR.  Berdasarkan  hasil  analisis  tersebut  diduga  bahwa  isolat  aktif  adalah senyawa flavonoid golongan auron yang memiliki serapan pada panjang gelombang 260,5 nm  (pita  II)  dan  421,5  nm  (pita  I) ,  memiliki  pola  hidroksilasi  pada  6,7,3’,4’,  da n mengandung gugus fungsi OH, CO fenol, CO eter, C=O keton, C=C alkena, C=C dan =CH aromatik,  serta  benzena  tersubstitusi  sehingga  diduga  sebagai  senyawa 6,7,3’,4’tetrahidroksiauron  (Maritimetin). Uji  aktivitas  antioksidan  terhadap  ekstrak aseton  menunjukkan  harga  IC 50 sebesar  91,513  ppm  sehingga  tergolong  sebagai antioksidan kuat.

## 1. Pendahuluan
Salah  satu  dari  penyakit  degeneratif  yang  banyak terjadi  pada  beberapa  dekade  ini  adalah  kanker  yang disebabkan  karena  antioksidan  dalam  tubuh  tidak mampu  menetralisir  peningkatan  konsentrasi  radikal bebas. Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menghambat  atau  mencegah  proses  oksidasi  senyawa lain yang diakibatkan oleh adanya suatu radikal bebas [1]. Radikal  bebas  adalah  atom  atau  molekul  yang
mempunyai  satu  atau  lebih  elektron  yang  tidak berpasangan sehingga bersifat sangat reaktif [2].
Bangle  ( Zingiber  cassumunar  Roxb. )  merupakan tanaman  dalam  famili  Zingiberaceae  dan  mengandung beberapa  senyawa  kimia  meliputi  Phlobatanin, flavonoid, alkaloid, saponin, tannin, terpenoid, steroid, dan glikosida [3] sehingga dapat digunakan sebagai obat untuk  mencegah  peradangan  (sebagai  antiinflamasi), mengobati  asma,  memiliki  efek  karminatif  [4],
antibakteri  [5],  antiobesitas  [6],  antialergi  [7],  dan bersifat sebagai antioksidan [8].
Beberapa  penelitian  tentang  rimpang  bangle  telah dilakukan  diantaranya  adalah  ditemukannya  senyawa jenis phenilbutenoid seperti [(E)-4- (3’,4’ -
dimethoxyphenyl)but-3-en-1-ol], [(E)-4- (2’,4’,5’ -
trimethoxyphenyl)-  but-3-en-1-ol]  dan [(E)-4-
(3’,4’,1 -trimethoxy- phenyl)but-3-en-1-ol]  dalam ekstrak etil asetat rimpang bangle sebagai imunostimulan  [9],  identifikasi  senyawa  kaemferol-3- o-metileter  pada  ekstrak  metanol  rimpang  bangle sebagai  antioksidan,  serta  uji  aktivitas  ekstrak diklorometan dan ekstrak metanol dari rimpang bangle sebagai antioksidan [8].
Sumber  antioksidan  yang  potensial  telah  banyak ditemukan berasal dari tumbuhan dan perlu dieksplorasi lebih  lanjut  untuk  mendapatkan  alternatif  senyawa penangkap  radikal  yang  aman  beraktivitas  besar.  Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa aktif ekstrak aseton rimpang bangle yang memiliki ativitas sebagai antioksidan.

## 2. Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Alat  gelas  standar  penelitian,  timbangan  digital, satu  set  alat  soklet, water  bath ,  maserator, rotary evaporator , satu set KLT dan kromatografi kolom, lampu UV, Spektrofotometer UV-Vis dan FTIR. Rimpang bangle, n-heksana, aseton, kloroform aquades, aseton, metanol, etanol, butanol, benzena, diklorometana, etil asetat, dan asam  asetat,  silika  gel,  serbuk  Mg,  amil  alkohol,  HCl pekat, FeCl 3 , NaOH, ammonia, pereaksi Dragendroff (Bi 3+ dan  HI),  pereaksi  Mayer  (Hg 2+ dan  KI),  eter,  anhidrida asam  asetat,  H 2 SO 4 ,  AlCl 3 ,  NaOAc,  H 3 BO 3 ,  DPPH, kuersetin.

## Isolasi Senyawa Aktif
Serbuk  rimpang  bangle  diekstraksi  dengan  cara soklet menggunakan n-heksana pada suhu 70 0 C. Residu n-heksana  diangin-anginkan  dan  disoklet  kembali dengan  aseton  sehingga  diperoleh  ekstrak  aseton. Ekstrak  aseton  diuji  fitokimia  (alkaloid,  flavonoid, steroid,  terpenoid,  tannin,  dan  saponin)  dan  aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH.
Ekstrak  aseton  yang  mengandung  senyawa  aktif dilakukan  KLT  dan  dipisahkan  dengan  kromatografi kolom sehingga diperoleh 5 fraksi besar. Masing-masing fraksi  hasil  kromatografi  kolom  diuji  aktivitas antioksidannya. Fraksi yang memilik aktivitas antioksidan  terkuat  dipisahkan  dengan  KLT  preparatif sehingga  diperoleh  isolat  aktif.  Isolat  aktif  diuji kemurniannya dengan KLT berbagai eluen dan KLT dua dimensi.

## Uji aktivitas antioksidan
Uji  aktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan  metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)

## Uji Kualitatif antioksidan
Plat KLT  yang  telah  digunakan  untuk memisahkan senyawa  disemprot  dengan  larutan  DPPH  0,1  mM  yang dibuat dengan melarutkan 1 mg serbuk DPPH ke dalam 25 mL  metanol.  Aktivitas  antioksidan  ditunjukkan  dengan warna kuning berlatar belakang ungu pada plat KLT.

## Uji Kuantitatif antioksidan
Sebanyak  0,002  g  ekstrak  aseton  rimpang  bangle dilarutkan  dalam  10  mL  metanol  sehingga  diperoleh larutan  ekstrak  dengan  konsentrasi  200  ppm  sebagai larutan  induk.  Larutan  ekstrak  200  ppm  diencerkan menjadi  berbagai  konsentrasi  (0,  20,  40,  60,  80,  100 ppm)  dan  masing-masing  direaksikan  dengan  larutan DPPH 0,1 mM selama 30 menit. Pengukuran absorbansi dilakukan  pada  panjang  gelombang  517  nm  dengan kuersetin  sebagai  pembanding.  Perhitungan  aktivitas antioksidan  ditentukan  menggunakan  persamaan berikut:
% inhibisi = 𝐴 blanko –𝐴 sampel 𝐴 blanko × 100%
Keterangan:
A blanko = absorbansi DPPH dalam etanol
A sampel = absorbansi DPPH dalam sampel
Nilai IC 50 dihitung menggunakan rumus persamaan regresi.

## Identifikasi Senyawa Aktif
Isolat aktif dianalisis dan diidentifikasi strukturnya menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  dan  pereaksi geser serta FTIR.

## 3. Hasil Dan Pembahasan

## Isolasi senyawa aktif
Sebanyak 1070 g serbuk rimpang bangle diekstraksi dengan  cara  soklet  menggunakan  pelarut  n-heksana pada suhu 70°C untuk menghilangkan senyawa-senyawa yang  bersifat  non  polar  seperti  lemak,  steroid,  dan triterpenoid. Proses ekstraksi dengan cara soklet dipilih karena  penyarian  terjadi  berulang-ulang  sehingga  zat yang  tersari  di  dalam  pelarut  lebih  banyak  dengan penggunaan pelarut yang sedikit. Residu yang diperoleh disoklet  kembali  dengan  aseton  sehingga  diperoleh ekstrak aseton yang selanjutnya dilakukan uji fitokimia sehingga  diketahui  kandungan  senyawa  kimia  di dalamnya.
Ekstrak  aseton  diuji  aktivitas  antioksidannya dengan  metode  DPPH  (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) secara  kualitatif  dan  kuantitatif.  Pengujian  antioksidan secara  kualitatif  dilakukan  menggunakan  KLT  dengan eluen  kloroform:aseton  (10:1)  dan  memberikan  hasil positif  dengan  terbentuknya  warna  kuning  berlatar belakang  ungu  pada  plat  KLT.  Perubahan  warna  terjadi karena  reaksi  antara  radikal  DPPH  (1,1-difenil-2- pikrilhidrazil)  dengan  senyawa  antioksidan  yang terdapat  pada  ekstrak  aseton  membentuk  senyawa  1,1- difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning.
Gambar 1. (a) Hasil uji antioksidan kualitatif ekstrak aseton dan (b) grafik hasil pengukuran antioksidan ekstrak aseton dan kuersetin
Hasil  pengukuran  aktivitas  antioksidan  ekstrak aseton  secara  kuantitatif  dilakukan  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  dengan  pembanding  senyawa kuersetin  yang  telah  diketahui  sebagai  antioksidan. Aktivitas  antioksidan  secara  kuantitatif  dinyatakan dengan  nilai  IC 50 yang  ditentukan  melalui  persamaan regresi  pada  grafik  hubungan  antara  daya  antioksidan (%)  serapan  radikal  DPPH  dengan  konsentrasi  larutan ekstrak  aseton.  Grafik  hasil  pengukuran  hubungan antara % inhibisi dan konsentrasi larutan uji ditunjukkan pada gambar 1.
Berdasarkan  persamaan  regresi  linear  pada  grafik tersebut dapat diketahui harga IC 50 ekstrak aseton adalah 91,513 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak aseton memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  kuat  karena memiliki  harga  IC 50 kurang  dari  200  ppm  [10].  Apabila dibandingkan  dengan  kuersetin  maka  aktivitas antioksidan ekstrak aseton 11,210 kali lebih rendah dari kuersetin  yang  memiliki  harga  IC 50 sebesar  8,163  ppm. Hal ini dikarenakan senyawa dalam ekstrak aseton yang berperan  sebagai  antioksidan  belum  murni  sehingga memiliki  aktivitas antioksidan  yang  rendah dibanding- kan dengan senyawa kuersetin.
Ekstrak  aseton  yang  telah  diketahui  aktivitas antioksidannya  dianalisis  mengguna-  kan  KLT  dengan eluen  kloroform:aseton  (10:1)  yang  ditunjukkan  pada gambar 2.
Gambar 2. Hasil KLT ekstrak aseton
Pola  noda  yang  terlihat  menunjukkan  pemisahan yang cukup baik sehingga eluen kloroform:aseton (10:1) dapat  digunakan  untuk  pemisahan  skala  besar menggunakan  kromatografi  kolom.  Diperoleh  5  fraksi besar hasil pemisahan dengan kromatografi kolom yaitu fraksi A,B,C,D, dan E.
Gambar 3. Hasil pengujian antioksidan masing-masing fraksi secara kualitatif (a) pada sinar tampak dan (b) pada sinar UV λ 365 nm
Hasil  pengujian  antioksidan  secara  kualitatif  pada masing-masing fraksi menunjukkan bahwa pada fraksi D memiliki  aktivitas  antioksidan  terkuat.  Selanjutnya fraksi  D  dipisahkan  menggunakan  KLT  preparatif sehingga  diperoleh  isolat  murni  yang  kemudian  diuji kemurniannya dengan KLT berbagai eluen dan KLT dua dimensi.  Hasil  uji  kemurnian  menggunakan  KLT berbagai  eluen  dan  KLT  dua  dimensi  terhadap  isolat ditunjukkan pada gambar 4.
Gambar 4. (a) Hasil uji kemurnian isolat dengan KLT berbagai eluen dan (b) KLT dua dimensi pada UV λ 365 nm
Hasil  uji  kemurnian  menggunakan  KLT  berbagai eluen  dan  KLT  dua  dimensi  terhadap  isolat  masing- masing menghasilkan satu noda pada setiap pengujian. Hal ini menunjukkan bahwa isolat diduga telah murni.

## Identifikasi Senyawa Aktif
Hasil  analisis  spektrofotometri  UV-Vis  terhadap isolat  aktif  menunjukkan  adanya  dua  serapan  panjang gelombang  yaitu  pada  421,5  nm  (pita  I)  dan  260,5  nm (pita II) yang menunjukkan senyawa flavonoid golongan auron.  Spektrum  UV-Vis  isolat  (dalam  metanol) ditunjukkan pada gambar 5.
Gambar 5. Spektrum UV-Vis isolat (dalam metanol)
Struktur senyawa flavonoid dan pola oksigenasinya dapat  ditentukan  dengan  menambahkan  pereaksi  geser pada  isolat.  Hal  ini  dikarenakan  pereaksi  geser  dapat bereaksi dengan gugus hidroksil pada flavonoid sehingga dapat  digunakan  untuk  meramalkan  posisi  gugus hidroksil pada struktur flavonoid berdasarkan pergeseran panjang gelombang yang terjadi [11]. Pereaksi geser  yang  digunakan  meliputi  natrium  hidroksida (NaOH), alumunium klorida (AlCl 3 ), asam klorida (HCl), natrium  asetat  (NaOAc),  dan  asam  borat  (H 3 BO 3 ).  Hasil pengukuran  spektra  UV-Vis  terhadap  isolat  dengan penambahan  pereaksi  geser  tersebut  ditunjukkan  pada gambar 6.
Gambar 6. Spektrum UV-Vis isolat (dalam metanol) dengan penambahan pereaksi geser
Pergeseran  panjang  gelombang  isolat  dengan penambahan  pereaksi  geser  NaOH,  AlCl 3 ,  HCl,  NaOAc, dan H 3 BO 3 ditunjukkan pada tabel 1.
Tabel 1: Hasil pengukuran spektra UV-Vis isolat
Pereaksi Pita I (nm) Pita II (nm) Pergeseran Pita I (nm) Keterangan Metanol 421,5 260,5 − Flavonoid golongan Auron NaOH 468,0 257,5 46,5 6-OH dengan oksigenasi pada 4’ NaOH 5 menit 469,0 257,0 47,5 6-OH dengan oksigenasi pada 4’ NaOAc 441,0 260,0 19,5 Gugus hidroksi pada 4’ dan 6-OH pada cincin A NaOAc +H 3 BO 3 422,5 −
1 Ortodihidroksi pada cincin A (C 6 dan C 7 ) AlCl 3 471 − 49,5 Orthodihidroksi pada cincin B AlCl 3 + HCl 448 232 42 Orthodihidroksi pada cincin B
Berdasarkan  data  dan  analisis  di  atas  maka  dapat diduga bahwa isolat aktif adalah senyawa jenis 6,7,3’,4’ -
tetrahidroksiauron  (maritimetin).  Struktur  senyawa maritimetin ditunjukkan pada gambar 7.
Gambar 7. Struktur senyawa 6,7,3’4’ -tetra- hidroksiauron (maritimetin)
Identifikasi  senyawa  maritimetin  selanjutnya dilakukan  dengan  spektrofoto-  meter  FTIR  untuk memperkuat dugaan hasil identifikasi dengan spektrofotometer  UV-Vis.  Hasil  analisis  FTIR  senyawa maritimetin ditunjukkan pada gambar 8.
Gambar 8. Spektrum FTIR isolat
Serapan  bilangan  gelombang  hasil  analisis  FTIR terhadap senyawa maritimetin ditunjukkan pada tabel 2.
Tabel 2: Pita serapan FTIR isolat
Bilangan Gelombang (cm -1 ) Gugus Fungsi 3431,43 O–H ulur yang dapat membentuk ikatan hidrogen 3001,00 =C–H ulur aromatik 2925,64 C–H ulur (asimetri) 2854,93 C–H ulur (simetri) 1731,00 C=O ulur keton 1628,76 C=C ulur (alkena konjugasi) 1513,36; 1541,58 C=C ulur (aromatik) 1462,06 C–H tekuk 1383,38 O–H tekuk bidang 1275,30 C–O eter (jembatan O) 1120,21 C–O ulur fenol 873,92; 794,43; 742,08 Benzena tersubstitusi meta, para dan ortho
Hasil  analisis  dengan  spektrofotometer  FTIR menunjukkan adanya gugus OH, CO fenol, CO eter, C=O keton, C=C alkena, C=C dan =CH aromatik, serta benzena tersubstitusi.  Gugus  fungsi  hasil  analisis  FTIR  sesuai
dengan  gugus  fungsi  pada  senyawa  6,7,3’,4’ -
tetrahidroksiauron (maritimetin) hasil analisis menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  dan  pereaksi geser.  Dengan  demikian  dapat  disimpulkan  bahwa senyawa  maritimetin  merupakan  salah  satu  senyawa yang  terkandung dalam  ekstrak  aseton  rimpang  bangle dan  memiliki  aktivitas antioksidan. Harga  IC 50 senyawa maritimetin diduga lebih rendah dari IC 50 ekstrak aseton rimpang  bangle  (91,513  ppm).  Hal  ini  dikarenakan maritimetin  merupakan  senyawa  murni  sehingga memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  lebih  kuat. Mekanisme  reaksi  antara  DPPH  dengan  senyawa maritimetin  hasil  isolasi  dari  ekstrak  aseton  rimpang bangle  ( Zingiber  cassumunar  Roxb. )  ditunjukkan  pada gambar 9.
Gambar 9. Reaksi antara DPPH senyawa maritimetin hasil isolasi dari ekstrak aseton rimpang bangle ( Zingiber cassumunar Roxb. )

## 4. Kesimpulan
Ekstrak  aseton  rimpang  bangle  memiliki  aktivitas antioksidan yang kuat dengan harga IC 50 sebesar 91,513 ppm.  Senyawa  aktif  dalam  ekstrak  aseton  rimpang bangle  yang  memiliki  aktivitas  sebagai  antioksidan adalah  senyawa  flavonoid  berupa  padatan  berwarna kuning. Hasil identifikasi isolat menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  dengan  pereaksi  geser  dan FTIR menunjukkan bahwa isolat tersebut diduga sebagai senyawa 6,7,3’,4’ -tetrahidroksiauron (maritimetin).

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Titik  Sunarni,  Suwidjiyo  Pramono,  Ratna  Asmah, Flavonoid antioksidan penangkap radikal dari daun kepel  (Stelechocarpus  burahol  (Bl.)  Hook  f.  &  Th.), Majalah Farmasi Indonesia , 18, 3, (2007) 111-116
[2]  RJ  Fessenden,  JS  Fessenden,  Kimia  Organik,  3rd edition ed., A. Pudjaatmaka, 1989.
[3]  S  Majaw,  J  Moirangthem,  Qualitative  and quantitative
Analysis of Clerodendron colebrookianum walp. leaves and Zingiber cassumunar Roxb. Rhizomes, Ethnobotanical Leaflets ,
2009, 5, (2009) 3
[4]  Mohammad  Nazrul  Islam  Bhuiyan,  Jasim  Uddin Chowdhury,  Jaripa  Begum,  Volatile  constituents  of essential  oils  isolated  from  leaf  and  rhizome  of Zingiber  cassumunar  Roxb, Bangladesh  Journal  of
Pharmacology , 3, 2, (2008) 69-73 http://dx.doi.org/10.3329/bjp.v3i2.844
[5]  Tg  Siti  Amirah  Tg  Kamazeri,  Othman  Abd  Samah, Muhammad Taher, Deny Susanti, Haitham Qaralleh, Antimicrobial activity and essential oils of Curcuma aeruginosa,  Curcuma  mangga,  and  Zingiber cassumunar  from  Malaysia, Asian  Pacific  Journal  of Tropical Medicine , 5, 3, (2012) 202-209
http://dx.doi.org/10.1016/S1995-7645(12)60025-X
[6]  Dyah  Iswantini,  Rhoito  Froista  Silitonga,  Elizabeth Martatilofa,  Latifah  Kosim  Darusman,  Zingiber
cassumunar,  Guazuma  ulmifolia,  and  Murraya paniculata  Extracts  as  Antiobesity:  In  Vitro Inhibitory  Effect  on  Pancreatic  Lipase  Activity, HAYATI  Journal  of  Biosciences ,  18,  1,  (2011)  6-10 http://dx.doi.org/10.4308/hjb.18.1.6
[7]  Supinya  Tewtrakul,  Sanan  Subhadhirasakul,  Anti- allergic  activity  of  some  selected  plants  in  the Zingiberaceae family, Journal of Ethnopharmacology , 109, 3, (2007) 535-538 http://dx.doi.org/10.1016/j.jep.2006.08.010
[8]  M. Habsah, M. Amran, M. M. Mackeen, N. H. Lajis, H. Kikuzaki,  N.  Nakatani,  A.  A.  Rahman,  Ghafar,  A.  M. Ali,  Screening  of  Zingiberaceae  extracts  for antimicrobial  and  antioxidant  activities, Journal  of Ethnopharmacology , 72, 3, (2000) 403-410
http://dx.doi.org/10.1016/S0378-8741(00)00223-3
[9]  Sofnie Marusin Chairul, Phagocytosis effectivity test of phenylbutenoid compounds isolated from Bangle (Zingiber cassumunar Roxb.) Rhizome, Biodiversitas , 10, 1, (2009) 40-43
[10] Marsden S. Blois, Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical, Nature , 181, (1958) 1199 http://dx.doi.org/10.1038/1811199a0
[11]  KR Markham, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, ITB, Bandung, 1988.
N N NO 2 O 2 N NO 2 NH N NO 2 O 2 N NO 2 + 4 4 O OH HO OH OH O O O O O O O +