## The Indonesian Journal of Health Promotion

## ISSN 2597– 6052

## MPPKI Media Publikasi Promosi Kesehatan Indonesia

## Artikel Penelitian

## Open Access

## Identifikasi Gen ICSA pada Feses Anak Penderita Diare dengan Metode Polymerase
Chain Reaction

## Identification of ICSA Gene From Stool Children with Diarrhea Using Polymerase
Chain Reaction Methode
Rusdianto 1* , Akbar Asfar 2 , Hairil Akbar 3
1 Program Studi Pendidikan IPA Universitas Jember
2 Program Studi Ilmu Keperawatan Universitas Muslim Indonesia
3 Program Studi Kesehatan Masyarakat STIKES Graha Medika *Korespondensi Penulis : rusdian@unej.ac.id

## Abstrak
Gen IcsA merupakan salah satu gen yang berperan dalam virulensi pada bakteri Shigella sp yang dapat menyebabkan diare pada  manusia.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mendeteksi gen  IcsA pada  feses  anak  penderita  diare  dengan  metode  PCR. Sebanyak  50  sampel  klinis  yang      diperoleh  dari  4  puskesmas  di  Kota  Makassar,  yaitu  Barabaraya,  Pampang,  Antang Perumnas dan Tamangapa dari bulan Mei 2016 - Juli  2016. Pengambilan sampel dilakukan dengan teknik rektal swab dan dilanjutkan pemeriksaan dengan  PCR menggunakan primer icsA . Hasil penelitian menunjukkan dari 50 sampel yang diuji diperoleh 6 sampel (24%) positif mengandung gen IcsA. Kesimpulan penelitian ini yaitu gen icsA efektif digunakan sebagai target gen (primer) untuk mendeteksi bakteri Shigella sp dengan metode PCR.
Kata Kunci : Diare, IcsA , PCR

## Abstract
IcsA gen is one of Gens that have a part of virulenting on Shigella sp that causes diarhea of human. This research aim to detect IcsA gen of diarhea in the stool of children with diarrhea using PCR method. There are 50 clinical sample that tooks from 4 medical center at Makassar city which are Barabaraya, Pampang, Perumnas Antang and Tamangapa from may 2016 - july 2016. Sampling was held by rectal swab technique and continued by PCR using icsA primarry. The research result shows that from 50 sample have been tested, there are 6 samples (24%) confirmed postive  witj  icsA gen. This research conclude that Shigella sp causees diarhrea to 6 positive icsA gen samples.
Keywords : Diarrhea, IcsA, PCR

## MPPKI (September, 2020) Vol. 3. No. 3

## PENDAHULUAN
Pada  tahun  2015,  infeksi  diare  di  dunia mencapai sekitar 688 juta kasus, dan sebanyak 499.000 kasus  pada  anak  yang  berusia  di  bawah  59  bulan meninggal  dunia  [1].  Menurut WHO dan UNICEF , terdapat  2  miliar  kasus  diare  di  dunia  setiap  tahun, dengan angka kematian sebanyak 1,9 juta  balita , dan kasus terbanyak ditemukan di negara berkembang. Ini berjumlah 18% dari semua kematian balita dan artinya lebih dari 5000 anak meninggal setiap hari akibat diare [2].
Di  negara  berkembang,  sebagian  besar morbiditas  dan  mortalitas  yang  terjadi  pada  anak disebabkan  oleh  5  penyakit  yaitu  infeksi  saluran pernapasan  akut,  diare,  campak,  malaria,  dan kekurangan  gizi  [3].  Diare  adalah  penyakit  endemis yang  yang  bepeluang  untuk  menjadi  kasus  KLB  dan disertai dengan kematian. Pada tahun 2012, kasus diare pada  semua  golongan  usia  sebesar  214  per  1.000 penduduk  dan  pada  balita  sebesar  900  per  1.000 penduduk  [4].  Berdasarkan  Survei  Kesehatan  Rumah Tangga (SKRT),Studi Mortalitas dan Riset Kesehatan Dasar dari tahun ke tahun diketahui bahwa diare masih menjadi penyebab utama kematian balita di Indonesia [5]
Secara  etiologi  diare  dapat  disebabkan  oleh adanya    infeksi    (bakteri,  virus  atau  parasit), malabsorbsi,  alergi,  keracunan  bahan  kimia  atau makanan,  dan  imunodefisiensi  [6].  Infeksi    rotavirus merupakan penyebab diare yang paling umum  sekitar 60%-70%,   sekitar  10%-20%  disebabkan  oleh  bakteri dan < 10% oleh parasit. Shigella sp adalah bakteri  yang dapat  menyebabkan  diare  mulai  dari  diare  ringan sampai  diare  berat.  Menurut  Tjaniadi et  al (2003), Shigella  sp merupakan    sebagai  patogen  nomer  dua yang paling tinggi frekuensinya sebagai penyebab diare dengan  infeksi  terbesar  ke  2  setelah Vibrio  cholera (37,1%)    sekitar  27,3%  [7].  Bakteri  ini  memiliki kemampuan untuk bertahan hidup di lingkungan yang asam  termasuk  di  lambung  dan  juga  dapat menyebabkan  infeksi  dalam  jumlah    inokulum  yang rendah  sehingga  mudah  ditularkan  ke  orang  lain. Hanya  dengan  10-100  sel  dalam  tubuh,  bakteri  ini sudah mampu melakukan infeksi pada manusia [8].
Strain  Shigella  merupakan  diferensiasi  dari bakteri Escherchia coli sehingga  antara seluruh strain Shigella  dan E.  coli memiliki  keterkaitan  DNA  yang sangat erat [9]. Hal ini tentunya menimbulkan polemik di  laboratorium    mikrobiologi  diagnostik  khususnya terkait  hasil  pemeriksaan.  Sebagian  besar  penelitian untuk  deteksi Shigella  sp dengan  metode  PCR menggunakan  gen  traget  plasmid  invasif ipaH yang memberikan  hasil  yang  bias.  Hal  ini  disebabkan  oleh gen    plasmid  invasif ipaH ini,  juga  terdapat  pada bakteri Escherchia coli khususnya jenis Enteroinvasif Escherhicia  coli (EIEC)  [10].  Oleh  sebab  itu
diperlukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan    gen  target  yang  lebih  khusus  untuk mendeteksi Shigella  sp mengingat  bakteri  ini  mampu menginfeksi dalam jumlah yang sangat rendah.

## METODE
Penelitian  dilaksanakan    di  2  tempat    yanag berbeda  yaitu  tempat  pengambilan  sampel  klinis  dan tempat pemeriksaan sampel dari bulan Maret samapai Juli 2016. Pengambilan sampel klinis dilakukan pada 4 puskesmas  yaitu  Puskesmas  Barabaraya,  Puskesmas Pampang, Puskesmas Antang Perumnas dan Puskesmas  Tamangapa.  Deteksi  gen  IcsA  dengan metode PCR dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi RSPTN    Universitas  Hasanuddin.  Penelitian  ini merupakan    penelitian  deskriptif    dengan cross sectional design .
Populasi  adalah  seluruh  pasien  diare    di
Puskesmas Barabaraya, Puskesmas Pampang, Puskesmas Antang Perumnas dan Puskesmas Tamangapa.  Sampel  sebanyak  50  orang  yang  dipilih berdasarkan kriteria inklusi yaitu anak penderita diare, usia 0-59 bulan (< 5 tahun), belum mendapatkan terapi antibiotik,  dan  bersedia  menandatangani informed concent.
Pengumpulan  sampel  feses    dengan  teknik rektal  swab.  Pasien  dibaringkan  dengan  posisi menyamping ke kiri. Lubang anus dibuka menggunakan  tangan,  kemudian  dimasukkan  kapas swab  ke  dalam  anus  dengan  cara  diputar  360 o yang sebelumnya  direndam  dalam  larutan  NaCl.  Tip  swab kemudian dimasukkan ke dalam medium transpor yaitu Cair-Bair .  Setelah  tiba  di  laboratorium  sampel  rektal swab  diinokulasi pada medium pemupuk yaitu BHIB dan  diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  24  jam. Kemudian dilakukan ekstraksi DNA dengan menggunakan  Presto TM DNA  Kit  Protocol  dan dilakukan  uji  PCR  dengan  menggunakan  primer IcsA ( F: 5´- ATG CAG GCA TTC TAA AAA TGG 3´ ; R: 5´-ACA  GTG  CCC  TGT  TTC  AGG  CG  -3’). Pembuatan PCR mix dengan cara mencampurkan 12,5 µl  master  mix  green  (dNTP,  DNA  tag  polymerase, MgCl 2 ), primer forward 0,5 μl, primer reverse 0,5 μl, nuclease  free  water  6,5  μl,  DNA  produk  5,0  μl,  dan dimasukkan  ke  dalam  tabung  eppendorf.  Tabung dimasukkan ke dalam mesin PCR. Program amplifikasi dilakukan  dalam  beberapa  siklus.  Siklus  pertama dilakukan denaturasi pada suhu 94ºC selama  3 menit. Selanjutnya sebanyak 35  siklus berikutnya dilakukan denaturasi  pada  suhu  94ºC  selama  1  menit,  annealing pada  suhu 56°C  selama  45  detik  dan  elongating  pada suhu 72°C selama 1 menit dan siklus ketiga dilakukan final extention pada suhu 72°C selama 5 menit. Hasil PCR divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis gel agarose 2%.

## MPPKI (September, 2020) Vol. 3. No. 3

## HASIL
Pemeriksan  feses  adalah  tes  yang  dilakukan pada  sampel  feses  atau  tinja  untuk  mendiagnosis sejumlah penyakit pada sistem pencernaan. Pemeriksaan ini dapat mendeteksi adanya infeksi yang berasal  dari  bakteri,  virus,  atau  parasit,  dan  berbagai penyakit, mulai dari penyerapan gizi yang kurang baik hingga kanker
Dari 50 sampel yang diuji dengan metode PCR dan  dilakukan  visualisasi  di  bawah  sinar  ultra  violet dengan  menggunakan  elektoforesis  gel  agarosa  2% (Gambar 1-3).
Gambar  1.  Hasil  elektroforesis  dari  DNA  produk PCR sampel feses anak diare pada gel agarose 2% sampel 1 - 17
Gambar 2. Hasil elektroforesis dari DNA produk PCR sampel feses anak diare pada gel agarose 2% sampel 18 - 34
Gambar 3. Hasil elektroforesis dari DNA produk PCR sampel feses anak diare pada gel agarose 2% sampel 35 - 50
Hasil  yang  menunjukkan  positif  terdapat  gen  icsA  di dalam  sampel  dapat  dilihat  dengan  adanya  terbentuk band target yang berukuran 526 bp. Berdasarkan hasil PCR, ada 6 sampel dari 50 sampel klinis  yang positif terdeteksi  gen  icsA,  sementara  44  sampel  tidak menunjukkan  band  target.  Terbentuknya  band  target pada 6 sampel tersebut menunjukkan bahwa penyebab diare pada 6 sampel tersebut adalah bakteri Shigella sp yang  ditandai  dengan  adanya  band  target  yang terbentuk. Dimana band target tersebut merupakan gen IcsA  yang  merupakan  salah  satu  gen  virulensi  yang terdapat pada Shigella sp . Sedangkan tidak terbentuknya band target dalam 44 sampel menunjukkan  bahwa  penyebab  diare  pada  anak tersebut  bukan  berasal  dari  spesies Shigella  sp ,  tetapi disebabkan oleh bakteri lain atau faktor lain.

## PEMBAHASAN
Diare  merupakan  penyakit  dengan  tingkat morbiditas dan mortalitas terjadi pada balita dan sekitar 18%  kasus  kematian  bayi  di  dunia  setiap  tahun disebabkan oleh diare [11]. Gejala klinis dari penyakit ini    ditandai  dengan  meningkatnya  frekuensi  BAB lebih dari biasanya (> 3  kali/24 jam)  dan   konsistensi tinja  menjadi  cair  dengan  atau  tanpa  darah  dan  lendir [12]. Faktor yang menyebabkan terjadinya diare yaitu kondisi  lingkungan,  kontaminasi  makanan  dan minuman,  suplai  air  bersih  yang  kurang,  kemiskinan dan taraf pendidikan yang rendah.
Shigella  sp merupakan  golongan  bakteri  dari famili enterobacteriae. Berdasarkan sifat biokimia dan antigen nya, dibedakan atas S. dysenteriae, S. flexneri, S.  boydii ,  dan S.  sonnei [13].  Semua  jenis  Shigella mampu menginfeksi manusia dan menyebabkan diare, mulai diare ringan sampai diare berat [14].
Infeksi  bakteri  Shigella  sp, biasanya  diawali dengan demam dan malaise , diikuti oleh diare cair dan nyeri kram pada perut. Pada hari ke 2, feses biasanya mengandung  darah  dan  mukus,  serta tenesmus [15]. Namun,  adanya  darah  dalam  feses  tidak  selamanya merupakan  infeksi oleh Shigella sp . Bakteri penyebab diare yang disertai dengan darah yaitu Shigella dan E. coli  invasif , Salmonella , Campylobacter  jejuni dan Balantidium coli [16]. Namun pada penelitian ini pada sampel  yang  digunakan  tidak  menunjukkan  adanya darah    pada  feses  (diare  ringan)  tetapi  mampu mendeteksi  keberada  gen  IcsA  yang  merupakan  gen virulensi pada bakteri Shigella sp .
Sifat virulensi dasar yang dimiliki oleh semua bakteri Shigella sp adalah kemampuannya menginvasi sel epitel kolon. Sifat ini dikodekan pada plasmid besar (120-140  MD)  yang  menyebabkan  sintesis  kelompok polipeptida    yang  terlibat  dalam  invasi  dan pembunuhan sel. Plasmid ini  terdiri dari invasi antigen plasmid (IPA), gen yang mengkode 4 polipeptida yang sangat  imunogenik  (IpaA,  IpaB,  IPAC,  dan  iPad).
Invasi  juga  diperantarai  oleh  gen  virF  yang  terletak pada plasmid virulensi, dan gen virR yang terletak pada kromosom.  Gen  virF  mengkodekan  protein  30  kDa yang positif mengatur ekspresi gen-gen IPA dan IcsA . Selain  sifat  virulensi  utama  yang  dikode  plasmid, kromosom  juga  diperlukan  untuk  virulensi  penuh. Beberapa  sifat  dari  kromosom  penting  untuk  semua Shigella seperti sintesis lipopolisakarida [17]
Virulensi dari Shigella berhubungan dengan 3 hal, yaitu (1) plasmid, karena plasmid berperan dalam mengenali  sel  epitel.  Shigella  yang  tidak  mempunyai plasmid  menjadi  tidak  virulen,  (2)  aktin  yang  jika terjadi  mutasi  aktin  intraselular (IcsA)  akan menurunkan virulensi bakteri karena terjadi penurunan kemampuan bakteri untuk berpindah dan berkembang dalam  intraselular,  (3)  kemampuan  menempati  epitel sehingga  mampu  melindungi  diri  dari  kontak  dengan lingkungan  ekstraselular  dan  tidak  pernah  menembus mukosa menjadi suatu infeksi sistemik [18].
Seluruh  spesies  dari  bakteri  ini memiliki plasmid  virulensi  yang  mengkodekan  gen  yang berperan dalam proses invasi. Gen icsA, ipaJ dan ipgD merupakan  gen  yang  berperan  dalam  virulensi.  Gen icsA  merupakan  gen  yang  menyandikan  protein  iscA yang  terletak  bagian  luar  membran  protein  berperan dalam  mengontrol  invasif  secara  intraseluler  dan interseluler (May and Morona, 2008). Gen icsA dibagi atas  3  bagian  yaitu  bagian  N-terminal  yang  tersusun atas 52 asam amino, α-domain yang tersusun atas  706 asam  amino  dan  C-terminal  β-core  terdiiri  atas  344 asam amino [19].
Hasil  deteksi gen  IcsA dengan    metode  PCR didapatkan  sebanyak  6  sampel  (24%)  yang  positif, yaitu pada kode sampel F. 19, F. 22, F. 27, F. 31, F. 28, dan  F.  45  ditandai  dengan  pita  band  yang  terbentuk sesuai  dengan  ukuran  pita  band  marker  dan  kontrol positif  sebesar  526  bp.  Hasil  penelitian  ini menunjukkan  bahwa  gen  icsA  efektif  dalam mendeteksi  bakteri Shigella  sp pada  feses  anak penderita diare sehingga dapat dipilih sebagai alternatif primer  yang  digunakan  dalam  metode  PCR  dan selanjutnya  dapat  digunakan  untuk  mengidentifikasi pasien asimptomatik, yang berfungsi sebagai reservoir potensial  Shigella  dalam    mentransmisikan  penyakit dalam komunitas.
Hasil penelitian ini juga mendukung penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Alipour et  al (2012) untuk  mengetahui  kemampuan  set  primer  spesifik  ini dalam  mengkonfirmasi  keberadaan  gen  icsA  dengan menggunakan beberapa jenis bakteri yakni S.dysentriae, S. Flexeneri, S. sonnei, S. boydii,  E. coli ( ATCC 43889) O157, Klebsiella pneumonia, Proteus spp, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, dan Clostridium perferingenes  yang  menunjukkan  gen  icsA  hanya ditemukan pada spesies bakteri Shigella sp.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa gen  icsA efektif  digunakan  sebagai  primer  dalam mendeteksi Shigella sp dengan metode PCR pada feses anak penderita diare. Berdasarkan penelitian ini maka dapat  disarankan  bahwa  diperlukan  penelitian  lebih lanjut  dengan  jumlah  sampel  yang  lebih  banyak  dan pada populasi yang berbeda Kota Makassar.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  kami  ucapkan  kepada pihak  Puskesmas  Barabaraya,  Puskesmas  Pampang, Puskesmas Antang Perumnas dan Puskesmas Tamangapa  yang  telah  mengizinkan  kami  untuk mengambil  sampel  di  instansi  mereka  serta  pihak laboratorium  Mikrobiologi  Rumah  Sakit  Pendidikan Tinggi  Negeri  UNHAS  yang  telah  membantu  kami dalam  melakukan  penelitian  ini  dan  para  anggota peneliti.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Walker, C.L.F., et al., Global burden of childhood pneumonia  and  diarrhoea. The  Lancet,  2013.
381(9875): p. 1405-1416.
2. Organisation,  W.G., World  Gastroenterology Organisation global guidelines: acute diarrhea in adults  and  children:  a  global  perspective .  2012, World  Gastroenterology  Organisation  (WGO) Milwaukee, WI.
3. Farthing, M., et al., Acute diarrhea in adults and children: a global perspective. Journal of clinical gastroenterology, 2013. 47(1): p. 12-20.
4. Kemenkes    RI., Data  dan  informasi  tahun  2014 (profil  kesehatan  Indonesia). Kemenkes  RI, Jakarta, 2015.
5. Kemenkes  RI., Situasi diare di Indonesia. Buletin Jendela Data dan Informasi Kesehatan, 2011. 2(2): p. 1-6.
6. Sukut,  S.S.,  Y.  Arif,  and  N.  Qur’aniati, Faktor kejadian  diare  pada  balita  dengan  pendekatan teori Nola J. Pender di IGD RSUD Ruteng. Jurnal Pediomaternal, 2015. 3(2): p. 230-249.
7. Tjaniadi,  P.,  et  al., Antimicrobial  resistance  of bacterial  pathogens  associated  with  diarrheal patients  in  Indonesia. The  American  journal  of tropical  medicine  and  hygiene,  2003.  68(6):  p. 666-670.
8. Nascimento,  A.M.  and  S.T.  Van  Der  Sand, Detection of the virulence plasmid pINV, using inv E gene in shigella sp. in sewage samples by PCR assay. Biociências (On-line), 2008. 16(1).
9. van der Ploeg, C.A., et al., Laboratory Protocol: Serotyping of Shigella spp. Geneva: WHO Global Foodborne Infections Network, 2010.
10.  Binet,  R.,  D.M.  Deer,  and  S.J.  Uhlfelder, Rapid detection of Shigella and enteroinvasive
Escherichia  coli  in  produce  enrichments  by  a conventional multiplex PCR assay. Food microbiology, 2014. 40: p. 48-54. 11.  Bryce,  J.,  et  al., WHO  estimates  of  the  causes  of death in children. The Lancet, 2005. 365(9465): p. 1147-1152.
12.  Sudaryat,  S., Gastroenterologi  Anak. Lab/SMF Ilmu  Kesehatan  Anak  Fakultas  Kedokteran.
Universitas Udayana, 2010.
13.  Brooks, G.F., J.S. Butel, and S.A. Morse, Jawetz, Melnick,  &  Adelberg  Mikrobiologi  Kedokteran, Edisi  23. Alih  bahasa:  Huriawati  Hartanto  et  al. Editor edisi bahasa Indonesia: Retna Neary Elferia et  al.  Jakarta:  Penerbit  Buku  Kedokteran  EGC, 2008. 14.  Levine,  M.M.,  et  al., Clinical  trials  of  Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nature Reviews Microbiology,
2007. 5(7): p. 540-553.
15.  Wyllie,  R.,  J.S.  Hyams,  and  M.  Kay, Pediatric gastrointestinal and liver disease . 2015: Elsevier Health Sciences.
16.  Bhutta,  Z.A., Acute  gastroenteritis  in  children.
Nelson textbook of pediatrics, 2007. 19: p. 1323- 39.
17.  Marcdante,  K.J.,  et  al., Nelson  ilmu  kesehatan anak esensial . 2014: Elsevier. 18.  Nafianti,  S.  and  A.B.  Sinuhaji, Resisten Trimetoprim–Sulfametoksazol Terhadap Shigellosis. Sari Pediatri, 2005. 1(1): p. 39-44. 19.  May,  K.L.  and  R.  Morona, Mutagenesis  of  the Shigella  flexneri  autotransporter  IcsA  reveals novel  functional  regions  involved  in  IcsA biogenesis and recruitment of host neural Wiscott- Aldrich syndrome protein. Journal of bacteriology, 2008. 190(13): p. 4666-4676.