## 156 ODONTO Dental Journal. Volume 8. Nomor 2. Desember 2021

## ROLE OF COMBINATION CASEIN AND  LACTOFERRIN BOVINE’S COLLOSTRUM AS A  PULP CAPPING ON MACROPHAGE EXPRESSION IN MALE WISTAR RATS
Endah Aryati Eko Ningtyas* , **, Oedijani Santoso***, Udadi Sadhana****, Siti Sunarintyas*****

## ABSTRACT
Background: Inflammatory and/or non-inflammatory processes play a role in stimulating pulp repair and the formation of hard tissue, namely reparative dentin.  Macrophages  play  a  role  in  the  pathogenesis  and  chronic inflammatory  disorders.  The  combination  casein    lactoferrin  of  bovine colostrum  as  an  immunomodulator  has  therapeutic  potential.  This  study aims to determine the therapeutic effect and duration of application of the combination of casein lactoferrin of  bovine colostrum,  on the expression of macrophages as pulp capping.
Method:  This  study  was  a  true  experimental  laboratories  post  test  only control group design, consisting of three groups of 60 male wistar rats with 4 observation times,  namely day to day 7, 14, 21 and 28  each  of 5 mice. The  maxillary  1 st molars  were  prepared  until  the  roof  of  the  pulp  was exposed.  Three  groups,  namely  the  combination  of casein  and  lactoferrin bovine colostrum (CKL) and calcium hydroxide (K1) and the untreated group (K0). Each group was filled with glassionomer as a permanent restoration. The  tissue  was  made  histological  preparations  with  hematoxylin-eosin staining and the number of macrophages were counted, then analyzed by two way ANOVA and post hoc LSD tests.

## Result:
The results showed that the therapeutic effect and duration of application of the  combination  of  casein  and    lactoferrin  bovine  colostrum  on  the expression of macrophages as pulp capping
Conclusion:  The combination of casein and lactoferrin of bovine  colostrum as capping material can increase the number of macrophages in the healing process of dental pulp.

## PENDAHULUAN
Penyembuhan  luka  merupakan  proses kompleks  yang  melibatkan  sel  inflamasi  dan faktor  pertumbuhan  yang  saling  berpengaruh pada  setiap  tahap  penyembuhan.  Proses
penyembuhan luka dimulai pada tahap inflamasi dan memerlukan waktu selama beberapa menit hingga  jam  yang  dikenal  dengan  peradangan akut.
Tahap  inflamasi  didominasi  oleh  neutrophil yang    berlangsung  hingga  beberapa  hari kemudian  digantikan  oleh  makrofag  sebagai bagian  dari  inflamasi  akhir,  di  mana  sitokin
yang  dihasilkan  oleh  sel  T  menginduksi inflamasi 1 .  Inflamasi  akhir  yang    terjadi merupakan    awal  dari  proses  penyembuhan. Makrofag  terlihat  pada  48-72  jam  setelah
*Doctoral Program of Medical and Health Science, Faculty of Medicine Diponegoro University ** Poltekkes Kemenkes of  Semarang
***Dentistry Study Program, Medical Faculty, Diponegoro University
****Anatomy Pathology Department, Medical Faculty, Diponegoro University *****Dental Biomaterial Department, Dentistry Faculty, Gadjah Mada University
Correspondence : endahaeyatu@gmail.com
Keywords : macrophages,
combination of casein and lactoferrin bovine colostrum,
capping pulp
cedera dan berperan pada proses fagositosis. Selanjutnya diikuti oleh fase proliferasi sel dan pembentukan  pembuluh  darah  baru  yang dikenal  sebagai  jaringan  granulasi.    Proses sintesis,  remodeling,   dan  infiltrasi  struktural dari  molekul  matriks  ekstra  selular  sangat ditentukan  pada  tahap  awal  dan  lanjut   dari penyembuhan luka 2 . Studi terbaru menunjukkan  bahwa makrofag dapat dijumpai pada  beberapa   tahap  penyembuhan  luka yang  berbeda  dan   berpengaruh  secara bervariasi terhadap setiap tahap  perbaikan di mana    makrofag  dapat  pula  menyebabkan peradangan yang  berlebihan. Kondisi jaringan granulasi    yang    diremodeling  oleh  sel-sel radang  seperti  neutrofil  dan  makrofag dalam jangka waktu cukup lama menyebabkan   pembentukan  jaringan  ikat akan  terhambat.  Disfungsi  makrofag  atau jumlah  makrofag   yang  rendah  dalam  proses perbaikan jaringan menyebabkan penyembuhan luka tidak optimal serta     terhambatnya  proliferasi  fibroblas  dan angiogenesis 3 .
Makrofag  memiliki  dua  fungsi   utama, yaitu menghancurkan antigen dan melepaskan  berbagai  enzim  serta  isi  granula ke luar sel bersamaan dengan  sitokin seperti Tumor  Necrosis  Factor (TNF)  hingga  mampu membunuh organisme  patogen. Fungsi kedua yaitu  sebagai Antigen  Presenting  Cell (APC) yang  memberikan  antigen  kepada  limfosit 4 . Selain  itu  makrofag  memiliki  kemampuan sebagai  pengatur  tingkat  peradangan  dan perekrutan  neutrofil 5 .  Lipopolisakarida  (LPS) merupakan  komponen  utama  dari  endotoksin akan menginduksi aktivasi makrofag, selanjutnya berpengaruh terhadap peningkatan    ekspresi Inducible  Nitric  Oxide
Synthase (iNOS)    sehingga  menghasilkan produksi oksida nitrat (NO) yang berlebihan 6 . NO memainkan peran penting dalam respons imun  inflamasi dan  pertahanan host terhadap berbagai  patogen  seperti  bakteri  dan  virus 7 .   Namun,  NO  dalam  jumlah  tinggi  memiliki sitotoksisitas  dan  menginduksi  kerusakan jaringan  yang  berhubungan  dengan  inflamasi akut dan kronis.
Dalam  situasi  di  mana  ada  kerusakan pada struktur gigi yang menyebabkan terbukanya pulpa gigi, beberapa jenis sel imun berperan dalam melindungi pulpa gigi terhadap  benda  asing  yang  berpotensi menyebabkan  infeksi 8 .  Diketahui  bahwa makrofag terdapat dalam pulpa gigi dan peran mereka  dalam  pembentukan  dentin  reparatif sampai saai ini belum sepenuhnya dipahami 9 .
Makrofag memengaruhi Wnt yang
berhubungan dengan diferensiasi sel induk hal ini menunjukkan kemungkinan terdapat interaksi  langsung  antara  makrofag  dan  sel induk 10 .  Memahami  proses  inflamasi  yang terjadi di pulpa gigi sebagai respons terhadap kerusakan  dentin  dan  efek  terhadap  aktivasi sel  induk  penting  untuk  merencanakan  terapi yang  berpengaruh  bagi  pembentukan  dentin tersier.  Proses  inflamasi  dan  atau  non inflamasi berperan  untuk menghasilkan dentin reparatif  tergantung  pada  induksi  terhadap reaksi  pulpa  yang    dipengaruhi  oleh  bentuk karies dan tingkat keparahan proses inflamasi dan  non-inflamasi  juga  bahan  kaping  yang yang digunakan.
Kaping  pulpa  adalah  perawatan  yang diindikasikan  untuk  pulpa  yang  disebabkan adanya  faktor  trauma  atau  karena  faktor iatrogenik,  di  mana  proses  penyembuhan diawali  dengan  fase  inflamasi  akut.  Selama  ini

## ROLE OF COMBINATION CASEIN AND  LACTOFERRIN BOVINE’S COLLOSTRUM AS A  PULP CAPPING ON MACROPHAGE EXPRESSION IN MALE WISTAR RATS
standar bahan kaping yang digunakan di Bagian Konservasi adalah  kalsium hidroksida (CaOH) . CaOH dapat memicu pertumbuhan dentin tersier karena    memiliki  pH  tinggi  12,5y  yang  dapat menyebabkan terjadinya pelepasan ion OH- dan mengakibatkan peningkatan respon inflamasi 11 .
Kalsium hidroksida juga memiliki kerugian yaitu menyebabkan nekrosis permukaan pulpa setelah  aplikasi  bahan  kaping,  kelarutan  tinggi, pembentukan jembatan dentin yang buruk, dan resistensi mekanik rendah.
Saat ini dikembangkan pemakaian sumber alam yang digunakan sebagai alternatif  sebagai obat atau bahan perawatan di bidang kesehatan untuk  mengurangi  efek  samping    pemakaian bahan  berdasar  bahan  kimia  yang  tersedia. Salah satu bahan yang dapat digunakan adalah pemakaian  bahan  kombinasi  kasein  dan laktoferin  kolostrum susu sapi. Kolostrum susu sapi  merupakan  salah  satu  sumber  alam  yang memiliki  kandungan  kasein  dan  laktoferin  yang tinggi.  Diketahui  bahwa  fungsi  dari  masing- masing  bahan  memiliki  fungsi  bagi  kesehatan yaitu laktoferin adalah glikoprotein pengikat besi multifungsi  ~80  kDa  dari  keluarga  transferrin. Laktoferin  adalah  activator  yang  poten  bagi makrofag 11 .  Kasein  bersifat    imunomodulator yang memengaruhi makrofag. Kasein mengurangi  fungsi  fagositosis  makrofag  dan menekan produksi spesies oksigen dan nitrogen reaktif  sebagai  respons  terhadap  rangsangan inflamasi. kappa-kasein secara signifikan mengurangi TNF- α dan IL-10 12 .
Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  dilakukan untuk mengetahui pengaruh penggunaan bahan imunomodulator protein bioaktif berbasis kasein laktoferin kolostrum susu terhadap sel makrofag pada peradangan pulpa gigi  untuk memajukan
pemahaman  kita  tentang  dampaknya  terhadap sel-sel  imunitas,  yang  berpotensi  mengarah pada  penemuan  alternatif  baru  yang  layak sebagai bahan kaping pulpa.

## METODE
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan design post test  control  group  design .  Penelitian  ini menggunakan 60 tikus Wistar jantan umur 12-16 minggu  dengan  berat  300-350  gram.  Hewan coba  dibagi  menjadi  3  kelompok  (masing- masing  dengan  20  ekor)  yaitu  kelompok preparasi  dan  tanpa  bahan  perawatan  kaping (K0); kelompok bahan kaping dengan kombinasi kasein  laktoferin  kolostrum  susu  sapi  (CKL); kelompok  bahan  kaping  memakai  CaOH  (K1). Preparasi  dilakukan  pada  molar    pertama rahang  atas  hewan  coba  dan  kavitas  dibuat perforasi di kamar pulpa dengan anestesi lokal. Pengamatan  dilakukan  pada  Hari ke  7,  14,  21, dan  28  di  mana    masing  masing  hari pengamatan  butuh  5  hewan  coba.  Sesuai dengan  hari  pengamatan,  kemudian  hewan coba  diinkubasi selama 7 hari sebelum akhirnya didekapitasi  dan  pembuatan  preparat  jaringan sebagai  berikut  difiksasi  selama  4  hari  dengan formalin  10%  kemudian  didekalsifikasi  dengan EDTA 15% selama 60 hari. Proses selanjutnya deparafinisasi, parafin diblokir, direndam dalam PBS,  diteteskan  dengan  tripsin  0,025%,  dicuci dengan PBS 3x, diteteskan dengan H 2 O 2 dicuci dengan PBS 3x, dipotong dengan mikrotom dan pewarnaan  HE.  Sel-sel  inflamasi    yaitu makrofag  diamati  di  bawah  mikroskop  cahaya dengan pembesaran 400x bidang pandang  dan data dianalisis menggunakan two way  ANOVA kemudian diikuti uji post hoc LSD.

## HASIL
Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah rata-rata ekspresi sel makrofag  tertinggi pada kelompok tanpa perawatan (K0), kemudian kelompok kombinasi kasein laktoferin (CKL) dan
terendah  pada  kelompok  kelompok  kalsium hidroksida  (K1).  Penelitian  ini  menganalisis jumlah  ekspresi  makrofag  pada  pulpa  perforasi tikus  Wistar  pada  hari  ke-7,  14,  21,  dan  28 (Tabel 1).
Tabel 1. Rerata dan simpangan baku ekspresi makrofag pada kelompok kombinasi kasein laktoferin,
CaOH, dan tanpa perlakuan dalam berbagai lama perlakuan Lama perlakuan Jenis Perlakuan Kontrol (K0) CaOH (K1) CKL 7 hari 20,00 ± 3,81 1,00 ± 1,00 8,00 ± 2,91 14 hari 25,00 ± 2,92 5,00 ± 1,00 3,00 ± 1,22 21 hari 18,00 ± 1,23 10,00 ± 2,55 13,00 ± 2,24 28 hari 21,00 ± 3,54 6,00 ± 1,58 2,00 ± 1,58
Pada  Tabel  1  menunjukkan  bahwa  ekspresi tertinggi  terlihat jumlah sel makrofag pada hari ke 7, 14, 21, dan 28  pada kelompok kontrol (K0) ,diikuti  oleh  kelompok  Kombinasi  kasein  dan
laktoferin (CKL)  dan terendah dalam kelompok kalsium  Hidroksida  (K1).  Jumlah  rata-rata  sel makrofag kecenderungan lebih tinggi  pada ke- 21 untuk kelompok CKL dan K0.
Deskripsi jumlah makrofag menurut jenis dan lama perlakuan
Gambar 1. Deskripsi jumlah makrofag menurut jenis dan lama perlakuan
Dari  gambar  1  menunjukkan  jumlah makrofag pada semua kelompok  meningkat hari ke  7  sejak  pembukaan  atap  jaringan  pulpa. Kelompok CKL, jumlah sel makrofag pada lama
perlakuan  7  hari  menuju  ke  hari  21  terjadi kenaikan kemudian menurun menuju hari ke 28. Jumlah sel makrofag kelompok
K1
kecenderungan meningkat dari hari ke 7 menuju
0 5 10 15 20 25 30 7 14 21 28 Jum lah m akr of ag ( se l) Lama perlakuan (hari) Grafik Gabungan NT CaOH CKL Kontrol (K0) CaOH (K1) CKL

## ROLE OF COMBINATION CASEIN AND  LACTOFERRIN BOVINE’S COLLOSTRUM AS A  PULP CAPPING ON MACROPHAGE EXPRESSION IN MALE WISTAR RATS
pada  hari  ke  21  kemudian  menurun  dengan jumlah  ekspresi  makrofag    masih  tinggi dibanding hari ke 14.
Hasil  analisis  normalitas  sebaran  data dengan  uji Kolmogorov  Smirnov pada  data residual standardized diperoleh sebaran normal
(p>0,05).  Hasil  uji  homogenitas  varian  dengan uji Levene juga  didapat  varian  data  yang homogen (p>0,05). Perbedaan jumlah makrofag menurut jenis dan lama perlakuan dilakukan uji two way ANOVA dengan hasil yang ditunjukkan pada Tabel 2 sebagai berikut
:
Tabel 2. Perbedaan rerata jumlah makrofag pada kelompok kombinasi kasein laktoferin, CaOH, dan
tanpa perlakuan dalam berbagai lama perlakuan F hitung p-value Jenis perlakuan 311,379 0,000 Lama perlakuan 11,034 0,000 Jenis x lama perlakuan 19,310 0,000
Berdasarkan Tabel 2 diketahui bahwa jenis perlakuan, lama perlakuan, dan interaksi antara jenis dan lama perlakuan berpengaruh signifikan terhadap  jumlah  makrofag,  yang  ditunjukkan dengan  perolehan  nilai  p  masing-masing sebesar 0,000 (p < 0,05).
Perbedaan jumlah makrofag menurut jenis dan  lama  perlakuan,  berikutnya  dianalisis  lebih lanjut  dengan  uji post  hoc LSD  yang  hasilnya diketahui  bahwa  perbedaan  jumlah  makrofag antara  bahan  CKL  dalam  berbagai  lama perlakuan berbeda signifikan dengan di kelompok kontrol  juga dengan kelompok K1  (p ≤  0,05),  kecuali  perbedaan  jumlah  makrofag antara  bahan  CKL  dengan  K1    pada  lama perlakuan 14 hari (p>0,05).

## PEMBAHASAN
Makrofag  membantu  pertahanan  imunitas, pengaturan  imun  dan  perbaikan  jaringan. Berdasarkan  produksi  sitokin  dan  aktivasinya, makrofag diklasifikasikan menjadi dua populasi: M1  pro-inflamasi  (makrofag  teraktivasi  klasik) dan  M2  anti-inflamasi  (makrofag  teraktivasi)  di
arah  lain).  Calprotectin  dapat  menginduksi sitokin  pro-inflamasi  dalam  monosit  dan makrofag melalui jalur NF-kB dan p38 MAPK 13 . Makrofag  adalah  sel  yang  berkontribusi  pada pembentukan reparative  dentin melalui  aktivasi sel  pulpa 14 ,  ketika  jumlah  makrofag  berkurang selama  perbaikan,  maka  berpengaruh  pada pembentukan dentin reparative nya. Pengaktifan sel pulpa tersebut akan menginduksi  respons  antiinflamasi  makrofag melalui  Pensinyalan Wnt / catenin 15 . Meskipun, inflamasi merupakan prasyarat untuk penyembuhan  dan  regenerasi  bila  peradangan dalam  jangka  lama  maka  menyebabkan kerusakan  pulpa  yang  lebih  parah,  yang  dapat menghambat proses regeneratif. Inflamasi yang berlanjut dan meluas dapat terjadi pada jaringan pulpa  karena  karakteristik  morfologis  jaringan pulpa  yaitu  jaringan  lunak  yang  dikelilingi jaringan  keras  sehingga  tidak  terdapat  area pembengkaan 9 .
Berdasarkan  hasil  penelitian  juga  hasil  uji analisis Anava 2 jalur diketahui bahwa jenis dan lama aplikasi bahan kaping baik pada  CKL dan
K1    berpengaruh  terhadap  jumlah  ekspresi makrofag.  Hal  ini  mungkin  disebabkan  sifat karakteristik  biologi  dari  bahan  kaping  yang dapat  mengindukasi  respons  jaringan  pulpa  di bawahnya.  Kemampuan  kompatibilitas  dan sitotoksitas  dari  bahan  kaping  memengaruhi kemampuan biologis bahan untuk menghindari atau membatasi iritasi atau degenerasi jaringan pulpa 16 , di mana masing-masing bahan kaping memiliki  pengaruh  terhadap  proses  inflamasi dan  regenerasi  jaringan  pulpa      yang  terdapat kerusakan 17 . Pada tabel 1 menunjukkan bahwa jumlah  ekspresi  makrofag  pada  aplikasi  bahan kombinasi kasein dan laktoferin kolostrum susu sapi lebih banyak daripada kalsium hidroksida, hal ini dimungkinkan karena kemampuan bahan aktif  dari  kasein  dan  laktoferin  sebagai  bahan imunodulator yang menimbulkan reaksi biomolekuler    bagi  sel  pulpa.  Diketahui  pulpa gigi memiliki kemampuan pertahanan terhadap kerusakan    yang  mendekati  pulpa  dengan reaksi  inflamasi  dan  melakukan  regenerasi pulpa  dentin.  Kemampuan  tersebut  meliputi interaksi  sel  endothelial  dengan  sel  inflamasi, interaksi stem cell di jaringan pulpa dengan sel fibroblast  pulpa  serta  proliferasi  ,  migrasi  dan diferensiasi  sel pulpa 18 . Sedangkan dari tabel 1  menunjukkan  pula  pada  kelompok    kontrol (K0) yaitu kelompok yang tidak diberikan bahan perawatan    kaping  pulpa  setelah  preparasi kavitas, menunjukkan  proses inflamasi dengan jumlah  ekpresi    makrofagnya  paling  banyak sejak  hari  ke  7  sampai  hari  ke  28  dibanding pemakaian  bahan  kaping  CKL  dan  K1.  Hal  ini dimungkinkan karena kerusakan sel odontoblas di bawah pembukaan pulpa menimbulkan iritasi yang berat sehingga  stimulus tersebut  melebihi kapasitas penyembuhan pulpa sehingga memengaruhi  proses  inflamasi  pada  kompleks
dentin-pulpa termasuk proses regenerasi jaringan pulpanya 19 .
Pada  gambar  1  menunjukkan  mekanisme keberlangsungan proses inflamsi yang berkaitan dengan proses regenerasi jaringan pulpa. Grafik tersebut  menunjukkan  bahwa  pada    hari  ke  7 semua  perlakuan  terlihat  keberadaan    ekspresi sel  makrofag,  hal  ini    berarti    preparasi  yang mendekati    pembukaan  atap  pulpa  pada penelitian  ini  menimbulkan  reaksi  dari  jaringan odontoblas  di  bawahnya  sebagai pertahanan pertama dengan memulai proses inflamasi yaitu memproduksi  sitokin  pro  inflamasi 20 .  Hal  ini sejalan  penelitian  lainnya  yang  menyatakan bahwa  sel  odontoblas  akan  mengaktifkan  jalur NF-kB  sebagai  respon  inflamasi  bila  terjadi kerusakan mendekati jaringan pulpa 21 .
Pada  gambar  1  juga  menunjukkan  bahwa ada  kecenderungan  kenaikan  jumlah  makrofag pada  pemakaian  kombinasi  kasein  laktoferin  ( CKL)  di  hari  ke  7  menuju  hari  ke  14.  Hal  ini, menunjukkan  bahwa  pemakaian  bersama  2 macam  protein  yang  dicampur  menjadi  satu yaitu    CKL  berfungsi  sebagai  imunomodulator. Hal  ini  kemungkinan  dikarenakan    adanya peningkatan kemampuan dari adanya gabungan protein dari kasein dan laktoferin yang memicu  ekspresi  makrofag.    Pengamatan  hari ke 7 adalah saat berlangsungnya fase inflamasi di  mana  terjadi  peningkatan  jumlah  makrofag atas  terbukanya  atap  pulpa,  sebagai respons awal host terhadap  infeksi.  Jumlah  Makrofag sebagai respons awal terhadap infeksi mengalami  perubahan  sehubungan    fungsinya yaitu    mengenali  rangsangan  inflamasi,  inisiasi respon  inflamasi  berupa    produksi  sitokin proinflamasi,  dan    pembersihan  pathogen 22 . Pada  pengamatan  hari  ke  7  dari  penggunaan gabungan  bahan  kasein  dan  laktoferin  pada

## ROLE OF COMBINATION CASEIN AND  LACTOFERRIN BOVINE’S COLLOSTRUM AS A  PULP CAPPING ON MACROPHAGE EXPRESSION IN MALE WISTAR RATS
pulpa terbuka, jumlah ekspresi sel makrofagnya sudah  tinggi  hal  ini  dikarenakan  karena  sifat masing  masing  protein  yang  mendukung terjadinya proliferasi dan peningkatan terjadinya sinyal biologi 23 , dan yang paling menonjol pada kelompok pengamatan hari ke 21. Hal ini berarti pada waktu pengamatan tersebut adalah jumlah makrofag    mencapai  puncaknya,  hal  ini dimungkinkan bahwa pada pengamatan hari ke 14  menuju  ke  21  fungsi  makrofag  mencapai puncaknya yaitu selain produksi sitokin proinflamasi saat  inflamasi  juga  melakukan fungsi  untuk  regenerasi  jaringan.  Diketahui bahwa peningkatan Wnt memengaruhi polarisasi makrofag selama perbaikan dentin di mana polarisasi makrofag M1 ke M2 merupakan faktor penting untuk meningkatkan TGF- β1 pada perbaikan jaringan 24 .
Ekspresi makrofag pada pemakaian bahan CKL  di  grafik  1  cenderung  lebih  tinggi  dari CaOH, hal ini dimungkinkan karena kasein dan laktoferin yang memiliki pengaruh  menstimulasi makrofag. Diketahui laktoferin yang mengandung Ig memicu aktivasi produksi sitokin proinflamasi langsung oleh makrofag.  Laktoferin memicu  polarisasi  M2  melalui  jalur    CD14/toll- like  receptor  (TLR)  4  da n  FcγRIIa  (CD32a) 25 . Toll-like  receptor  (TLR)  adalah    kelompok glikoprotein  yang  berfungsi  sebagai  reseptor permukaan  transmembran  dan  terlibat  dalam respons imun alami terhadap infeksi.
Selanjutnya  TLR  memulai  jalur  yang  memberi sinyal untuk mengaktifkan sitokin dan  kemokin. Fc  adalah  reseptor  untuk  bagian  Fc  dari imunoglobulin  (Ig). FcγRIIa adalah  reseptor permukaan  sel  untuk  Ig  yang  interaksinya memicu respons sistem kekebalan atau fisiologi antibodi kekebalan 26 . Demikian pula dengan k- casein, β -casein  (b-CN),  protein β -CN  (193 –
209)  yang  merupakan immunomodulatory peptides. Peningkatan variable sel imun protein b-CN meningkatkan ekspresi molekul makrofag 2 24 ,  serta kappa-kasein  merupakan  imuno- modulator  yang  kuat  bagi  makrofag 12 . Aplikasi bahan  kaping  dengan  kombinasi  kasein  dan laktoferin  menunjukkan  bahwa pada  hari  ke  21 jumlah  ekspresi  makrofag  menurun,  hal  ini kemungkinan  disebabkan  karena  keadaan signaling  mulai mereda, di  mana jumlah sitokin mulai  menurun,  proses  inflamasi   telah  banyak berkurang,  dan  luka  akan  diisi  oleh   proliferasi jaringan
Jumlah ekspresi makrofag pada pemakaian CaOH  (K1)  lebih  sedikit  dari  pada  pemakaian CKL,  hal  ini  kemungkinan  karena  sifat  alkali bahan  K1  yang  tinggi  dan  menimbulkan  area nekrosis  pada  jaringan  pulpa  di  bawah  dan sekitar  aplikasi  bahan  .  Dari  grafik  1 menunjukkan  pula  kecenderungan  jumlah ekspresi CaOH yang melambat peningkatannya hal  ini  dimungkinkan  adanya  penundaan  yang lebih  lama  dalam  proses  perbaikan,  dengan area  nekrotik  yang  luas  menyebar  ke  jaringan pulpa.  Pada  kelompok  CaOH  menunjukkan beberapa sel inflamasi, peningkatan terjadi saat menuju  hari  ke  21,  menghasilkan  nekrosis jaringan  yang  besar.  Ph  yang  tinggi  pada kalsium  hidroksida  menyebabkan  nekrosis koagulasi 27 . Pada  kondisi  nekrosis  koagulasi aktivitas enzim  dihambat sehingga bentuk area nekrotik  akan  bertahan  beberapa  minggu  dan selanjutnya  akan  menurunkan  vakuolisasi  dan lebih  banyak  jaringan  nekrotik  terjadi  pada CaOH 28 .  Hal  ini,  dapat  menjelaskan  mengapa pada penggunaan bahan kaping dengan CaOH terjadi multiple  tunnel  defect  yang  berakibat pembentukan jembatan dentin tidak maksimal .

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulakn bahwa:
1. Kombinasi  kasein  laktoferin  kolostrum  susu sapi sebagai bahan perawatan kaping pulpa berpengaruh terhadap ekspresi makrofag
2. Lama  aplikasi kombinasi  kasein  laktoferin kolostrum susu sapi sebagai bahan perawatan kaping pulpa berpengaruh
terhadap ekspresi  makrofag selama 7,14,21 dan 28 hari
3. Kombinasi  kasein  dan  kolostrum  laktoferin susu  sapi  sebagai  bahan  kaping  dapat meningkatkan jumlah makrofag dalam proses penyembuhan pulpa gigi

## REFERENSI
1.   Nicholson LB. The immune system. Essays Biochem. 2016;60(3):275 –301.
2.   Brancato SK, Albina JE. Wound macrophages  as  key  regulators  of  repair: Origin,  phenotype,  and  function.  Am  J Pathol. 2011;178(1):19 –25.
3.   Koh  T  and  DLA.  Inflammation  and  wound healing: The role of the macrophage. Expert Rev Mol Med. 2013;13(e23):1 –14.
4.   Duque  GA,  Descoteaux  A.  Macrophage cytokines:  Involvement  in  immunity  and infectious diseases. Front Immunol. 2014;5(OCT):1 –12.
5.   Ginhoux  F,  Jung  S.  Monocytes  and macrophages:  Developmental  pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 2014;14(6):392 –404.
6.   Soufli I, Toumi R, Rafa H, Touil-Boukoffa C. Overview  of  cytokines  and  nitric  oxide involvement  in  immuno-pathogenesis  of inflammatory  bowel  diseases.  World  J Gastrointest
Pharmacol
Ther.
2016;7(3):353.
7.   Bogdan  C,  Röllinghoff  M,  Diefenbach  A. The  role  of  nitric  oxide  in  innate  immunity. Immunol Rev. 2000;173(1):17 –26.
8.   Bjørndal L, Demant S, Dabelsteen S. Depth and activity of carious lesions as indicators for the regenerative potential of dental pulp after  intervention.  J  Endod.  2014;40(4 SUPPL.):S76 –81.
9.   Cooper PR, Chicca IJ, Holder MJ, Milward MR. Inflammation and Regeneration in the
Dentin-pulp  Complex:  Net  Gain  or  Net Loss? J Endod. 2017;43(9):S87 –94.
10.   Sehgal A, Donaldson DS, Pridans C, Sauter KA,  Hume  DA,  Mabbott  NA.  The  role  of CSF1R-dependent macrophages in control of  the  intestinal  stem-cell  niche.  Nat Commun. 2018;9(1):1 –17.
11.   Siqueira  JF,  Lopes  HP.  Mechanisms  of antimicrobial  activity  of  calcium  hydroxide: A critical review. Int Endod J. 1999;32(5):361 –9.
12. Lalor R, O’Neill S. Bovine κ-casein fragment induces hypo-responsive m2-like macrophage
phenotype. Nutrients.
2019;11(7).
13.   Chen X, Chen W, He Y, Zhang Y, Chen C, Zhu  Z,  et  al.  The  p38  MAPK  and  NF- κB pathways are involved in cyclic compressive force-induced IL-6 secretion in MLO-Y4 cells. Brazilian Arch Biol Technol. 2018;61.
14.   Neves  VCM,  Yianni  V,  Sharpe  PT. Macrophage modulation of dental pulp stem cell  activity  during  tertiary  dentinogenesis. Sci Rep. 2020;10(1):1 –9.
15.   Neves  VCM,  Babb  R,  Chandrasekaran  D, Sharpe  PT.  Promotion  of  natural  tooth repair by small molecule GSK3 antagonists. Sci Rep. 2017;7(November 2016):1 –7.
16.   Modena  KC  da  S,  Casas-Apayco  LC,  Atta MT, Costa CA de S, Hebling J, Sipert CR, et  al.  Cytotoxicity  and  biocompatibility  of direct and indirect pulp capping materials. J Appl Oral Sci. 2009;17(6):544 –54.
17.   Giraud  T,  Jeanneau  C,  Rombouts  C, Bakhtiar  H,  Laurent  P,  About  I.  Pulp capping  materials  modulate  the  balance between  inflammation  and  regeneration. Dent Mater. 2019;35(1):24 –35.
18.   Rombouts  C,  Jeanneau  C,  Bakopoulou  A, About I. Dental Pulp Stem Cell Recruitment Signals  within  Injured  Dental  Pulp  Tissue. Dent J. 2016;4(2):8.
19.   Zaky  SH,  Shehabeldin  M,  Ray  H,  Sfeir  C. The  role  of  inflammation  modulation  in dental  pulp  regeneration.  Eur  Cells  Mater. 2021;41:184 –93.
20.   Ley  K,  Laudanna  C,  Cybulsky  MI, Nourshargh  S.  Getting  to  the  site  of inflammation:  The  leukocyte  adhesion cascade  updated.  Nat  Rev  Immunol. 2007;7(9):678 –89.
21.   Lawrence T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2009;1(6):1 –11.
22.   Elsalhy  M,  Azizieh  F,  Raghupathy  R. Cytokines  as  diagnostic  markers  of  pulpal inflammation. Int Endod J. 2013;46(6):573 –

## ROLE OF COMBINATION CASEIN AND  LACTOFERRIN BOVINE’S COLLOSTRUM AS A  PULP CAPPING ON MACROPHAGE EXPRESSION IN MALE WISTAR RATS
80.
23.   Farges J-C, Alliot-Licht B, Renard E, Ducret M,  Gaudin  A,  Smith  A.,  et  al.  Dental  Pulp Defence and Repair Mechanisms in Dental Caries.  Mediators  Inflamm.  2015;2015:1 – 16.
24.   Sandre  C,  Chilmonczyk  S.  Nutritional Immunology A Peptide Derived from Bovine ␤ -Casein Modulates Functional Properties of  Bone  Marrow-Derived  Macrophages from Germfree and Human Flora- Associated Mice 1. 2018;(August
2001):2936 –42.
25.   Gao  CH,  Dong  HL,  Tai  L,  Gao  XM. Lactoferrin-containing  immunocomplexes drive the conversion of human macrophages from M2-into M1-like
phenotype. Front Immunol. 2018;9(JAN):1 – 11.
26.   Anania  JC,  Chenoweth  AM,  Wines  BD, MarkHogarth P. The human FcγRII (CD32) family  of  leukocyte  FCR  in  health  and disease. Front Immunol. 2019;10(MAR):1 –
17.
27.   Kunarti  S.  Pulp  tissue  vacuolization  and necrosis  after  direct  pulp  capping  with calcium hydroxide and transforming growth factor- β1.  Dent  J  (Majalah  Kedokt  Gigi).
2008;41(1):35.
28.   Pallotta  RC,  Machado  ME  de  L,  Reis  NS dos, Martins GHR, Nabeshima CK. Tissue inflammatory  response  to  implantation  of calcium hydroxide and iodoform in the back of rats. Rev Odonto Ciência. 2010;25(1):59 –64.