Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2015.26.1.100 Hasil Penelitian

## KONSENTRASI MINIMUM SISTEM LAKTOPEROKSIDASE UNTUK MENEKAN PERTUMBUHAN Escherichia coli PADA SUSU SAPI SEGAR
[Minimum Inhibitory Concentration of Lactoperoxidase System Against Escherichia coli in Fresh Bovine Milk]
Bagus Fitriansyah 1) , Ahmad Ni ’matullah Al-Baarri 2) *, dan Anang Mohamad Legowo 2)
1) Jurusan Peternakan, Fakultas Peternakan dan Pertanian Universitas Diponegoro Semarang, Semarang
2) Jurusan Pertanian, Fakultas Peternakan dan Pertanian Universitas Diponegoro Semarang, Semarang
Diterima 04 Maret 2015 / Disetujui 29 Juni 2015

## ABSTRACT
Fresh milk production in Central Java has increased every year resulting in the requirement of the rapid and  good  process  for  fresh  milk  handling  to  keep  the  quality  against  bacteria.  Lactoperoxidase  system (LPOS) was well documented as a strategy to extend the shelf life of fresh milk but i t hasn’t been known yet for the minimum level of lactoperoxidase (LPO) utilization to activate LPOS in the milk. The purpose of this  study  was  to  analyze  minimum  concentration  of  LPO  and  its  components  by  calculating  minimum inhibitory concentration (MIC) against Escherichia coli and total bacteria in fresh milk. LPO was obtained from  bovine  whey  and  its  purity  was  analyzed  using  SDS-PAGE.  To  activate  the  LPO  performance,  two substates namely H 2 O 2 and KSCN were used with various concentrations. The MIC was analyzed 3 times using 3M™ Petrifilm™ Aerobic Count Plates. The result showed that  3.11 unit/mL LPO, 0.03 mM subs- trates  have  been  found  as  MIC  of  LPOS  against  bacteria  and  Escherichia  coli  in  milk.  This  result  might provide benefit to the utilization of minimal LPOS in fresh milk to safe the amount of LPO.
Keywords: Escherichia coli, fresh milk, lactoperoxidase, minimum inhibitory concentration

## ABSTRAK
Produksi  susu  segar  di  Jawa  Tengah  mengalami  peningkatan  setiap  tahunnya  yang  mengakibatkan penanganan  susu  segar  harus  dirancang  dengan  tepat  untuk  memperpanjang  umur  simpan.  Metode sistem  laktoperoksidase  (LPOS)  telah  dipelajari  dapat  memperpanjang  umur  simpan  susu  dengan menekan  pertumbuhan  bakteri  dalam  susu  segar.  Namun  hingga  saat  ini  belum  diketahui  penggunaan LPO  minimal  dan  komponen  substratnya  dalam  upaya  untuk  menghambat  pertumbuhan  bakteri  dalam susu.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  menganalisis Minimum  Inhibitory  Concentration (MIC)  LPO dan  komponen-komponennya  dalam  upaya  menekan  pertumbuhan Escherichia  coli dan  bakteri  dalam susu  segar.  LPO  diperoleh  dari whey susu  sapi  dan  tingkat  kemurniannya  dianalisis  dengan  meng- gunakan SDS-PAGE. Guna mengaktifkan kerja  LPOS, digunakan dua substrat: H 2 O 2 dan KSCN dengan konsentrasi  yang  berbeda.  MIC  dianalisis  3  kali  dengan  menggunakan 3M™  Petrifilm™  Aerobic  Count Plates . Hasil penelitian menunjukkan bahwa MIC dalam menekan Escherichia coli dan total bakteri dalam susu adalah sebanyak 3,11 unit/mL LPO dan 0,03 mM substrat. Hasil ini dapat memberikan manfaat bagi upaya  pemanfaatan  LPOS  dalam  susu  segar  secara  hemat  dengan  menggunakan  jumlah  LPO  yang minimal.
Kata kunci: Escherichia coli , laktoperoksidase, minimum inhibitory concentration, susu segar

## PENDAHULUAN
1
Produksi  susu  segar  di  Jawa  Tengah  me- ngalami  peningkatan  setiap  tahunnya.  Produksi susu  yang  tinggi  ini  harus  diimbangi  dengan  pe- nanganan  pascapanen  yang  tepat  agar  susu  tetap
*Penulis Korespondensi: E-mail: albari@undip.ac.id
berkualitas  baik  dan  tidak  mudah  rusak  serta  untuk menanggulangi  masalah  yang  berakibat  pada  ter- tolaknya  susu  dari  peternak  oleh  industri  pe- ngolahan  susu  (IPS)  dan  tidak  termanfaatkannya susu  sebagai  akibat  penanganan  pascapanen  yang kurang baik.
Penanganan susu yang sering dilakukan yaitu pendinginan.  Namun  penanganan  ini  memiliki  ke- lemahan diantaranya masih berbiaya tinggi dan sulit dilakukan  di  tingkat  pedesaan,  padahal  peternakan sapi  perah  pada  umumnya  berlokasi  di  daerah  pe- desaan.  Oleh  karena  itu  perlu  ditemukan  pena- nganan  pascapanen  yang  murah  dan  aman  di- antaranya dengan menerapkan prinsip sistem lakto- perokidase  (LPOS).  LPOS  terdiri  tiga  komponen, yaitu  enzim  laktoperoksidase,  hidrogen  peroksida dan ion thiosianat dan ketiganya secara alami sudah tersedia  di  dalam  susu.  Namun  jumlah  ketiga  kom- ponen ini, sangat terbatas dan tidak  bertahan lama. Sebagai  contoh,  aktivitas  enzim  LPO  akan  hilang pada  jam  ke  3  penyimpanan  pada  suhu  kamar  dari jumlah  mula-mula  dalam  susu  sekitar  10-30  ppm (Fitriansyah,  2012;  Seifu et  al., 2005).  Sistem laktoperoksidase  merupakan  sistem  antibakterial yang  terdapat  di  dalam  susu  dan  digunakan  untuk mengawetkan  susu  terutama  pada  kondisi  tanpa pendinginan  (Asaah et  al., 2007;  Defabachew, 2003).  Enzim  laktoperoksidase  murni  dan whey mampu  berperan  bersama  dalam  mencegah  per- tumbuhan Salmonella  enterica sehingga whey mampu  dijadikan  sebagai  bahan  antimikroba  (Al- Baarri et  al., 2011).  Pengaktifan  LPO  digunakan untuk  mengontrol  pertumbuhan  Pseudomonas  di dalam  susu  (Saad,  2008).  LPOS  memberikan  efek bakterisidal  yang  kuat  terhadap  mikroba  patogen. Sistem  LPO  mampu  menghambat  pertumbuhan bakteri Salmonella  enterica dan Escherichia  coli O157:H7 (Min et al., 2005). Sistem laktoperoksidase mempunyai  aktivitas  antimikroba  terhadap  mikro- organisme  patogen.  Pengaktifan  LPOS  efektif dilakukan pada susu segar. LPOS tidak mendukung pertumbuhan mikroorganisme patogen. LPOS digunakan  untuk  menjaga  kualitas  susu  karena  ter- bukti  memiliki  efek  bakteriostatik  dari  tahap  pe- ngumpulan  susu  hingga  tahap  proses  akhir.  LPOS sebagai  tindakan  alternatif  yang  efisien  untuk  pe- ngawetan  susu  tidak  menghambat  dan  tidak  ber- dampak  negatif  pada  proses  pengolahan  selanjut- nya  (FAO,  2005).  Pengaktifan  LPOS  di  dalam  susu sapi dan susu kambing tidak memberikan efek pada uji  organoleptik  keju  putih.  Semua  produk  keju dengan aktivasi LPOS dapat diterima oleh konsumen (Suleiman et al., 2009).
Aktivitas  LPO  akan  meningkat ketika  tersedia H 2 O 2 dan  SCN - .  Ketersediaan  senyawa  lain  juga mempengaruhi  efisiensi  sistem  LPO  (Fonteh et  al., 2005).  Aktivitas  laktoperoksidase  dipengaruhi  oleh banyak  faktor,  antara  lain  faktor  ternak,  pakan  dan tahap-tahap  laktasi.  Oleh  karena  itu,  tiosianat  dan hydrogen  peroksida  yang  dibutuhkan  untuk  meng- aktifkan  sistem  laktoperoksidase  untuk  mengawet- kan susu segar bervariasi jumlahnya tergantung dari faktor-faktor tersebut  (Fonteh et  al., 2002).
Laktoperoksidase  dalam  susu  dapat  diaktifkan dengan  menggunakan  sodium  thiosianat  dan sodium  percarbonate  masing-masing  sebanyak  14 mg/liter  dan  30  mg/liter  pada  0-2  jam  setelah pemerahan (FAO, 2005; Saad, 2008).
Senyawa H 2 O 2 dan SCN - juga sudah tersedia di  dalam  susu  masing-masing  sebanyak  3-5  ppm dan  1-2  ppm.  Enzim  LPO  bersama  dengan  oksigen mengubah  SCN - menjadi  OSCN - yang  nantinya berfungsi  sebagai  antimikroba  (Dwiyanti,  2009).  Al- Baarri  dan  Legowo  (2012)  menyatakan  bahwa  LPO di  dalam  susu  dapat  menjadi  sebuah  katalisator untuk  membentuk  senyawa  hipotiosianit  (OSCN - ) yaitu produk anti mikroba  yang dapat menekan per- tumbuhan  bakteri  dalam  susu.  Penelitian  mengenai konsentrasi  minimum  OSCN - sangat  diperlukan untuk membuat formula  yang tepat agar pemakaian komponen dalam LPOS ini sesuai dengan kebutuhan.  Kontrol  konsentrasi  minimum  ini  dapat dilakukan  dengan  mengkontrol  konsentrasi  LPO. Laktoperoksidase  dapat  secara  khusus  diambil  dari whey tanpa  mengurangi  kandungan  gizi  yang terdapat  dalam whey seperti  mengobati  kanker, penyakit  jantung,  dan  sebagai  agen  antimikroba (Marshall,  2004). Minimum  Inhibitory  Concentration (MIC)  lazimnya  digunakan  untuk  menentukan  kon- sentrasi  minimal  terhadap  suatu  zat  dalam  me- lakukan upaya aktif sesuai dengan tujuan dibuatnya senyawa  tersebut.  Walaupun  LPOS  telah  banyak dipelajari,  namun  MIC  konsentrasi  LPO,  belum dipelajari.  Hal  ini  sangat  penting  untuk  mengguna- kan  konsentrasi  LPO  secara  minimal  agar  kerja LPOS  tetap  dapat  berfungsi  dengan  baik.  Hal  ini penting  sekali  untuk  dipelajari  karena  penggunaan LPOS  masih  dinilai  mahal,  sehingga  konsentrasi minimal  LPO  perlu  untuk  diketahui.  Dalam  rangka menghemat  penggunaan  substrat,  maka  dua komponen  substrat:  H 2 O 2 dan  SCN - juga  perlu dianalisis.  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan untuk  menguji  jumlah  atau  konsentrasi  minimum LPO  dan  komponen  substratnya:  H 2 O 2 dan  SCN - dalam  upaya  menekan  pertumbuhan  bakteri  pada susu dan Escherichia coli . Penelitian ini sangat ber- manfaat  dalam  upaya  melakukan  penghematan penggunaan enzim LPO dan komponen pendukung- nya  dalam  upaya  menekan  pertumbuhan  mikroba susu dan Escherichia coli .

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  adalah  susu  segar yang  diperoleh  dari  peternakan  sapi  perah  di Fakultas  Peternakan  dan  Pertanian  Universitas Diponegoro  Semarang  pada  pemerahan  pagi  hari jam  4  pagi.  Sapi  yang  diperah  berumur  sekitar  3-4
tahun  dengan  masa  laktasi  3-5  bulan  berjumlah  5 ekor.  Hal  ini  bertujuan  untuk  mempertahankan kualitas  enzim  LPO  yang  akan  diimobilisasi.  Lokasi kandang  tidak  jauh  dari  laboratorium.  Setelah  pe- merahan  susu  dimasukkan  ke  dalam  kotak  pen- dingin  lalu  dibawa  ke  Laboratorium  dan  disimpan  di dalam freezer .
Pengambilan LPO dari whey Prosedur  pengambilan  LPO  dari whey susu sapi  ( whey didapat  dari  reaksi  enzimatik  dengan menggunakan  renet)  (Formase  50,  Holand)  yang bercampur dengan Lactic Acid (Purac, Indonesia Lot number  1107002157)  yang  dipanaskan  mengguna- kan waterbath (W,  Germany)  dengan  suhu  35°C. Terdapat  2  bagian  setelah  proses  ini  yaitu  cairan dan padatan, dan yang diambil adalah cairan ( whey ) dengan  memisahkan  menggunakan  kain  nilon.  Ber- dasarkan  pada  metode  peneliti  sebelumnya  (Al- Baarri et  al., 2011)  Sepharose  Fast  Flow  (SP-FF) (GE  Healthcare  Bio-Science  AB,  Sweeden,  Lot number 10081054)  digunakan  sebagai  agen  untuk mengimobilisasi LPO dari whey . Kolom kaca dengan ukuran  0,5  x  10  cm  dibersihkan  setelah  itu  diberi tutup  di  bawahnya  dengan  lubang  kecil  di  tengah. Diantara  tutup  dan  kolom  kaca  terdapat  kain  nilon sebagai  penyaring  agar  SP-FF  tidak  ikut  hanyut  ke bawah.  Aquades  dialirkan  untuk  mencoba  apakah bocor  apa  tidak  di  dalam  tutup,  setelah  dirasa  baik maka whey dialirkan  secara  perlahan  ke  dalam kolom kaca yang didalamnya telah diisi dengan SP- FF  dan  telah  dicuci  dengan  menggunakan  1,0  dan 10,0 mL Phosphate Buffer (PB) yaitu penggabungan antara NaH 2 PO 4 .H 2 O dan NaHPO 4 (HIMEDIA, India) 10  mM  (pH  7,0)  secara  berturut-turut. Whey disirkulasikan melalui kolom dengan bantuan pompa peristaltik  yang  diatur  dengan  kecepatan  1  mL  per menit.  Setelah  itu,  SP-FF  dialiri  dengan  0,1  M  NaCl (Merck,  Germany)  dalam  10  mM  PB  sebanyak  100 mL yang bertujuan untuk menghilangkan protein non LPO yang terikat ke dalam SP-FF. Selanjutnya, SP- FF  dialiri  dengan  100  mL  0,25  mM  NaCl  dalam  10 mM PB dan hasil yang keluar dari aliran terakhir ini, ditampung  dalam ultracentrifuge  tube (Biologix, China)  berukuran  15  mL  (sebanyak  10  ml  per tabung). LPO tersebut dipakai untuk proses selanjut- nya dan disimpan di dalam freezer .

## Analisis profil protein
Analisis  protein  menggunakan  elektroporesis (GE  Healthcare  Bio-Science  AB,  Sweeden).  Profil protein  masing-masing  tabung  yang  diperoleh  dari hasil  pengambilan  LPO,  kemudian  dianalisis  kon- sentrasi  dan  kemurniannya  masing-masing  dengan menggunakan  metode  Lowry  dan  10%  SDS-PAGE (Hames,  1998).  Sampel  sebanyak  30  µL  kemudian ditambahkan  30  µL  gel loading buffer.  Terakhir,
ditambahkan  6  µL  mercaptoetanol  (BioChemica, Inggris)  menggunakan  pipet  (Eppendorf,  Germany) dan  tip  (Axygen, USA)  lalu  sampel  didihkan  selama 2  menit.  Volume  injeksi  adalah  15  µL  pada  setiap lane .  Gel  ditempatkan  dalam  unit  elektoporesis dengan  tegangan  sebesar  30  V  dan  diproses selama  7  jam.  Tabung  dengan lane tunggal  yang berwarna  biru  kemudian  dipilih  untuk  digunakan sebagai sumber LPO pada penelitian ini.

## Pengukuran  aktivitas  LPO  spektro  mini  UV shimatzu
Pengukuran  aktivitas  LPO  dilakukan  ber- dasarkan  pada  penelitian  Al-Baarri et  al. (2011) menggunakan  spektrofotomeer  (UV  Mini  Shimadzu, China).  Aktivitas  LPO  diukur  dengan  cara  men- campurkan 50 µL LPO dan 450 µL  1mM 2.2'-azino- bis ( 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid ) (ABTS) (BioChemica,  Inggris  Lot  1Y00616)  dalam  10  mM acetat  buffer  (Himedia,  India)  (pH  4,4).  Reaksi enzimatis  selama  20  detik  menggunakan  stopwatch (Agnesis, Indonesia)  dimulai dengan menambahkan 450  µL  0,55  mM  H 2 O 2 (Merck,  Germany).  Nilai absorbansi  dimonitor  pada  412  nm.  Satu  unit aktivitas  enzimatis  LPO  dalam  susu  dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk meng- oksidasi  1  µmol  ABTS  per  menit.  Koefisien  molar ABTS  pada  412  nm  adalah  32400  per  molar  per sentimeter.
Penentuan residu substrat H 2 O 2 Konsentrasi  H 2 O 2 dalam  LPOS  pasca  reaksi, diukur  melaui  prosedur  sebagaimana  dinyatakan oleh Hanna Instrumen dengan menggunakan tes kit HI3844  (Hanna  Instrumen,  Indonesia)  dengan  se- dikit modifikasi. Konsentrasi H 2 O 2 (Merck, Germany) dihitung  berdasarkan  kurva  standar  H 2 O 2 dengan konsentrasi  berkisar  0,1  sampai  dengan  0,5  mM. Perubahan  warna  yang  ada  pada  tes  kit  menunjuk- kan adanya H 2 O 2 . Deteksi konsentrasi H 2 O 2 diguna- kan  spektrofotometer  (UV  Mini  Shimadzu,  China) dengan panjang gelombang 350 nm.

## Pengujian total bakteri
Pengujian total bakteri Escherichia coli dilaku- kan  pada  laminar  (Airtech,  China).  Sampel  yang berupa Escherichia  coli murni  didilusikan  dengan larutan 10 mM PB steril dan kemudian 1 mL sampel diteteskan  pada  permukaan  petrifilm  (3M,  USA) bagian  dalam,  setelah  itu  petrifilm  ditutup  kembali lalu  ditekan  dengan  menggunakan  penekan  plastik berbentuk  bulat  guna  meratakan  sampel.  Petrifilm diinkubasi  pada  inkubator  (Heraeus,  Germany)  se- lama 2 hari pada suhu 30°C untuk mengetahui total bakteri  dalam  sampel.  Penggunaan  LPOS,  maka LPO,  H 2 O 2 ,  dan  KSCN  dengan  berbagai  unit  dan konsentrasi yang di saring dengan syringe filter (3M,
USA) diinkubasi dalam suhu kamar dan tabung steril selama  1  jam.  Larutan  LPOS  ini  kemudian  diguna- kan  untuk  mengetahui  sifat  antibakteri  yang  di campurkan dengan Escherichia coli .

## Aplikasi LPOS dalam susu segar
Guna  mengaktifkan  LPOS,  maka  LPO,  H 2 O 2 , dan  KSCN  masing-masing  sebanyak  3,11  U/mL, 0,03  dan  0,03  mM  yang  di  saring  dengan syringe filter diinkubasi dalam suhu kamar dan tabung steril selama  1  jam.  Larutan  LPOS  ini  kemudian  diguna- kan untuk mengetahui sifat antibakteri di dalam susu segar.  Penambahan  LPOS  dalam  susu  segar  di- tetapkan sebesar 5% (v/v). Susu segar yang didapat dari peternak (±1 jam pasca pemerahan) dituangkan ke  dalam  tabung  steril  tertutup  di  dalam  laminar (Airtech,  China)  kemudian  1  mL  sampel  diteteskan pada  permukaan  petrifilm  (3M,  USA)  bagian  dalam, setelah  itu  petrifilm  ditutup  kembali  lalu  ditekan dengan  menggunakan  penekan  plastik  berbentuk bulat  guna  meratakan  sampel  lalu  ditempatkan  di dalam  inkubator  (Heraeus,  Germany)  dengan  suhu 30°C.  Penambahan  larutan  LPOS  ini  dilakukan  di- lakukan  bervariasi  mulai  dari  jam  ke-2  hingga  jam ke-6  inkubasi.  Uji  total  bakteri  semua  sampel  susu tanpa  dan  dengan  perlakuan  LPO  dilakukan  pada jam ke-6 inkubasi.

## Analisis data
Penelitian ini dilakukan dengan replikasi 3 kali dan  kemudian  untuk  seluruh  data  yang  diperoleh, yaitu  hasil  aktivitas  LPO,  konsentrasi  H 2 O 2 ,  total mikroba, dan profil protein dianalisis dengan metode analisis  deskriptif  berupa  analisis  dari  rata-rata  dan range  data  yang  telah  diperoleh  dihitung  secara deskriptif.  Analisis  ini  menggambarkan  atau  men- jelaskan  fenomena  spesifik  pada  suatu  penelitian yang  dapat  mewakili  gambaran  objektif  dari  sampel yang  diteliti.  Gambaran  umum  ini  dapat  menjadi acuan untuk melihat karakteristik dari data (Fahardian et  al .,  2012).  Menurut  Dwiloka  dan Srigandono  (2006)  deskriptif  adalah  gambaran mengenai  sifat  suatu  populasi  tertentu  sehingga diperlukan  data  yang  mewakili  populasi  sehingga gambaran populasi menjadi objektif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil proses purifikasi LPO dari whey Penelitian  ini  menggunakan  bantuan  SP-FF untuk  mengimobilisasi  LPO  dari whey agar  enzim dapat  digunakan  secara  berulang  atau  tidak  larut dalam  pelarutnya.  Dalam  penggunaannya,  imobili- sasi  ini  berguna  untuk  menangkap  enzim  dari media,  mengukur  stabilitas  enzim  dan  mengguna- kan  enzim  berulang  kali  (Sebayang,  2006).
Laktoperoksidase  merupakan  enzim  yang  paling banyak di dalam susu sapi dibanding dengan enzim lain  dan  bersifat  stabil  dalam  kondisi  relatif  panas serta  aktivitasnya  tetap  bertahan  meskipun  setelah mengalami pasteurisasi  pada suhu  63°C selama 30 menit. Pemanasan whey atau susu pada suhu 80°C selama  2,5  detik  dapat  merusak  LPO  (Suleiman et al., 2009).  Purifikasi  LPO  pada  penelitian  ini  meng- gunakan whey dari  susu  sapi  yang  dilakukan  se- banyak  dua  kali  guna  memenuhi  kebutuhan  volume yang digunakan dalam penelitian, yaitu sebanyak 20 mL LPO dengan konsentrasi rata-rata sebesar 89,79 unit  per  mL.  Hasil  pengukuran  aktivitas  LPO  pada purifikasi ke-1 dan 2 dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1.  Hasil  pengukuran  absorban  (412  nm)  dan unit aktivitas laktoperoksidase
Purifikasi ke- Absorban Selisih Absorban Aktivitas LPO (U/mL) Awal Akhir 1 0,618± 0,037 1,120± 0,017 0,502± ,153 93,53± 3,74 2 0,693± 0,038 1,153± 0,016 0,460± 0,195 86,05± 3,74 Rerata 0,655± 0,053 1,137± 0,023 0,655± 0,030 89,79± 5,29
Keterangan:  Purifikasi  LPO  1  menghasilkan  93,53  ±  3,74 unit dan LPO 2 menghasilkan 86,05 ± 3,74 unit
Aktivitas  enzim  LPO  ditentukan  dengan menggunakan  substrat  ABTS  dan  diukur  dengan spektrofotometer  dengan  panjang  gelombang  412 nm.  Secara  visual  aktivitas  LPO  yang  tinggi  dapat dilihat  dengan  warna  hijau  pada  sampel  setelah terjadinya reaksi antara LPO, ABTS, dan H 2 O 2 . Hasil pengukuran  yang  terdapat  pada  Tabel  1  meng- indikasikan  adanya  kemampuan  SP-FF  dalam mengimobilisasi  LPO  dari whey .  Hasil  sampel  dari purifikasi  ke-1  dan  2  memiliki  selisih  nilai  absorban masing-masing sebesar 0,50±0,15 dan 0,46±0,19.
Sepharose  Fast  Flow  memiliki  keunggulan dalam  menangkap  LPO  dengan  mudah  dan  kuat. Hal  ini  dapat  terlihat  dari  tingginya  aktivitas  LPO yang  didapat,  yaitu  sebesar  93,53±3,74  U  dan 86,05±3,74  U.  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Al- Baarri et  al. (2010)  menunjukkan  bahwa  1  gram SPFF  efektif untuk menahan 750  unit/mL LPO. Jika penelitian  ini  dibandingkan  dengan  penelitian  ter- sebut  maka,  sebenarnya  SPFF  yg  dipakai  masih mencukupi untuk menahan lebih banyak LPO.
Pengukuran  perkiraan  protein  dari  sampel purifikasi  LPO  dapat  dilakukan  dengan  mengguna- kan  spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  280 nm (Al-Baarri et al., 2010). Berdasarkan perhitungan tersebut,  didapat  hasil  bahwa  sampel  mempunyai protein  yang  diperkirakan  sebasar  59,26%  (pada purifikasi  ke-1)  dan  61,06%  (pada  purifikasi  ke-2). Jika  dibandingkan  dengan  hasil  purifikasi  penelitian
yang  lain  maka  hasil  yang  didapat  pada  penelitian ini  lebih  rendah.  Hal  ini  disebabkan  karena  proses purifikasi  dari whey ,  berbeda  dengan  penelitian  Al- Baarri et  al. (2011)  yang  menyatakan  bahwa  hasil purifikasi  LPO  bekisar  90%  yang  proses  purifikasi tersebut  dari  LPO  murni.  Uji  Lowry  yang  dilakukan terhadap campuran hasil purifikasi ke-1 dan 2 meng- hasilkan  konsentrasi  protein  sebesar  58,50%  (data tidak  ditampilkan).  Oleh  karena  itu,  dapat  disimpul- kan bahwa angka perkiraan jumlah protein dan hasil uji Lowry, mempunyai selisih yang tidak terlalu besar namun  jika  kedua  angka  ini  dibandingkan  dengan hasil  peneliti  terdahulu,  maka  hasilnya  jauh  lebih kecil.  Perbedaan  ini  diduga  karena  perbedaan konsentrasi awal LPO pada whey yang digunakan.

## Profil protein hasil purifikasi
Hasil  pengujian  profil  protein  dengan  meng- gunakan  SDS-Page  menunjukkan  bahwa  standar albumin  komersial  dan  LPO  masing-masing  berada pada band 67 dan 78 kDa lane 1 (Gambar 1).
Gambar 1.  Hasil  analisis  profil  protein  dengan menggunakan  SDS-PAGE. Lane 1 adalah  standar  protein  berupa  albumin (67 kDa) dan laktoperoksidase (78 kDa). Lane 2 –6  adalah  sampel  yang  diambil dari  pengumpulan hasil elusi dari kolom SP-FF.  Nampak  hanya lane 6  yang menunjukkan single band
Laktoperoksidase dikatakan murni jika terbukti dengan  munculnya  1 band saja  pada  masing- masing lane , yaitu terdapat pada lane 6, sedangkan pada lane yang  lain,  muncul  dua band atau  lebih. Profil  protein  dari  purifikasi  kedua,  didapatkan  hasil yang  tidak  berbeda  jauh  dengan  purifikasi  pertama sehingga  dari  hasil  purifikasi  ke-2,  yang  diambil sebagai  LPO  hanyalah  sampel lane 6.  Kemurnian
suatu  protein  dapat  diperoleh  informasinya  ber- dasarkan  profil  protein  dengan  menggunakan  SDS PAGE  (Sisecioglu et  al., 2010).  Oleh  karena  itu, dalam  penelitian  ini,  untuk  mendeteksi  kemurnian LPO,  dilakukan  analisis  SDS  PAGE.  Intensitas ketebalan pita sebagaimana tampak dalam  Gambar 1,  disebabkan  kuantitas  protein  dalam  sampel  dan kuatnya  interaksi  elektrostatik  (Maheswari et  al., 2007;  Kukic  dan  Nielsen,  2010;  Tay  dan  Gam, 2011).  Walaupun lane 6  terlihat  lebih  tipis  dari lane lainnya,  namun  karena  hanya  muncul  satu  band, maka  dipilihlah  sampel lane 6  ini  sebagai  sumber LPO.  SDS  PAGE  dipilih  sebagai  penentuan  profil protein dikarenakan poliakrilamid merupakan polimer  sintesis  yang  larut  dalam  air  dan  mampu memisahkan  protein  dengan  kisaran  0,5 –250  kDa (Widyastuti dan Nucholis, 2012).
Selanjutnya, sampel lane 6 hasil purifikasi ke- 1 dicampur dengan hasil purifikasi ke-2 serta dilaku- kan  sterilisasi  dengan  menggunakan syringe filter 0,22  µm.  Sampel  LPO  ini  disimpan  di  dalam  dalam microtube  (200  µL  per  tube)  didalam freezer untuk digunakan dalam penelitian.
Residu H 2 O 2 dalam LPOS
Tabel 2 menunjukkan kandungan residu H 2 O 2 pada  LPOS  setelah  satu  jam  pasca  reaksi.  Peng- gunaan  H 2 O 2 dengan  konsentrasi  sebesar  0,4  mM atau lebih, dapat menghasilkan residu H 2 O 2 sebesar lebih  dari  0,1  mM.  Walaupun  jauh  dari  ambang batas  maksimal  sesuai  dengan  standar  dari  Envi- ronmental  Protection  Agency  (EPA),  yaitu  sebesar 3,52  mM  (Venkitanarayanan et  al., 2002),  namun adanya residu ini dapat berakibat pada melemahnya aktivitas LPO (Al-Baarri et al., 2010).
Tabel 2.  Hasil  Pengukuran  residu  H 2 O 2 dalam larutan  LPOS  yang  dibuat  dengan  meng- gunakan berbagai konsentrasi H 2 O 2 Konsentrasi Penggunaan H 2 O 2 (mM)
Residu H 2 O 2 dalam LPOS (mM) 0,55 0,173±0,107 0,50 0,122±0,056 0,45 0,139±0,073 0,40 0,110±0,044 0,35 0,086±0,020 0,30 0,021±0,045 0,25 0,031±0,035 0,20 0,027±0,039 0,15 0,016±0,050 0,10 0±0,059 0,05 0±0,059
Keterangan:  Residu  (mM)  H 2 O 2 dari  penggunaan  H 2 O 2 pada larutan LPOS mulai konsentrasi 0,05-0,55 mM
Pada  pembentukkan  OSCN - ,  sesuai  dengan proses  reaksi  yang  ada  dalam  LPOS,  yaitu  satu
molekul  H 2 O 2 akan  bereaksi  dengan  satu  molekul ion  SCN  yang  akan  menghasilkan  satu  melokul OSCN - .  Namun  proses  reaksi  ini  dibatasi  oleh kemampuan  enzimatik  LPO  sehingga  jika  jumlah substrat  dan  aktivitas  LPO  tidak  seimbang,  akan berakibat  pada  munculnya  residu  substrat,  baik  itu H 2 O 2 , maupun ion SCN. Penggunaan 0,10 mM H 2 O 2 dalam  LPOS  terlihat  tidak  menyisakan  residu  H 2 O 2 , sehingga  dalam  penelitian  selanjutnya,  digunakan konsentrasi H 2 O 2 sebesar maksimal 0,1 mM.
Minimum  inhibitory  concentration  konsentrasi LPO terhadap bakteri Escherichia coli Menurut  Al-Baarri et  al. (2011),  kemampuan LPOS  dalam  menekan  atau  membunuh  bakteri adalah  tergantung  kepada  jumlah hyphothiocyanite . Semakin  besar  substrat  yang  digunakan  akan  ber- potensi  untuk  menghasilkan  daya  antibakteri  yang besar,  namun  karena LPO  akan  dihambat  aktivitas- nya oleh substrat KSCN dan H 2 O 2, maka pengguna- an  substrat  dengan  jumlah  yang  banyak,  tidak menjamin  dihasilkannya  aktivitas  antibakteri  yang tinggi.  Disamping  itu,  penggunaan  substrat  yang berlebih,  diperlukan  LPO  yang  banyak  pula.  Oleh karena  aplikasi  LPOS  dalam  produk  pangan  masih dikatakan  relatif  mahal,  maka  dalam  penggunaan- nya  perlu  disesuaikan  dengan  tujuan  untuk  mem- bunuh  bakteri  atau  untuk  menekan  pertumbuhan bakteri.  Penelitian  ini  fokus  pada  upaya  menekan jumlah  bakteri  patogen  di  dalam  susu  sehingga pada jam ke-6 penyimpanan pada suhu kamar, tidak lebih  dari  10 6 CFU/mL  sebagaimana  yang  telah ditentukan  dalam  BSN  susu  segar.  Sebelum  di- aplikasikan ke dalam susu segar, maka LPOS perlu terlebih  dahulu  dicobakan  pada single  bacteria dan dipilihlah  bakteri Escherichia  coli untuk  mengetahui konsentrasi LPO minimal untuk menghambat bakteri ini.
Tabel 3.  Aktivitas antibakteri LPOS terhadap Escherichia  coli dengan  menggunakan berbagai konsentrasi LPO
Laktoperoksidase (Unit) Total Bakteri Escherichia coli (CFU/mL) 3,11 1,5±0,5x10 4 4,67 1,5±0,5x10 4 5,61 3,5±0,5x10 4 6,23 2±1x10 5 6,67 1,5±0,5x10 4 Kontrol 2,5±2,5x10 5
Keterangan:  Data  total  bakteri  adalah  rerata  dari  tiga  kali percobaan.  Sedangkan  untuk  mengaktifkan  LPOS, digunakan  KSCN  dan  H 2 O 2 dengan  total  konsentrasi masing-masing sebesar 0,03 mM
Tabel  3  menunjukkan  penggunaan  LPO dengan  konsentrasi  3,11 –6,67  U/mL.  Pemilihan kisaran  konsentrasi  LPO  ini  adalah  berdasarkan
kemudahan  aplikasi  dan  berdasarkan  hasil  pene- litian  dari  peneliti  lain  yang  menggunakan  LPO dengan konsentrasi sebesar 4,0 –4,5 U/mL. Konsen- trasi  KSCN  dan  H 2 O 2 yang  digunakan  untuk  meng- aktifkan  LPOS  yaitu  sebesar  0,03  mM.  Hasil  pe- ngujian  menunjukkan  bahwa  LPO  3,11  U/mL  dapat menekan  jumlah Escherichia  coli sebesar  1  Log CFU/mL, yaitu dari 2,5±2,5x10 5 menjadi 1,5±0,5x10 4 CFU/mL. Sifat antibakteri ini sebesar 1 Log CFU/mL ini  juga  masih  nampak  saat  penggunaan Es- cherichia  coli sebesar  1x10 6 dan  1x10 7 (data  tidak ditampilkan).  Sifat  antibakteri  LPOS  ini  sejalan dengan  banyak  peneliti  yang  mampu  menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli dengan meng- gunakan  LPOS  (Min et  al., 2005;  Assah et  al., 2007).  Hasil  penelitian  dengan  menggunakan  LPO sebesar lebih kecil dari 3,11 U/mL (yaitu 1,87 U/mL) tidak  menunjukkan  adanya  antibakteri  dari  LPOS yang  diaktifkan  dengan  menggunakan  konsentrasi substrat sebesar 0,03 mM, sehingga MIC konsentrasi  LPO  untuk  membunuh  bakteri Escheri- chia coli adalah 3,11 U/mL.
Minimum  inhibitory concentration LPOS  ber- dasarkan konsentrasi substrat
Setelah  mendapatkan  MIC  konsentrasi  LPO sebesar  3,11  U/mL  dengan  konsentrasi  substrat masing-masing  sebesar  0,03  mM,  maka  perlu analisis lebih lanjut atas terjadinya ketidakmampuan LPOS  dalam  menghambat Escherichia  coli jika menggunakan  LPO  sebesar  1,87  U/mL.  Sebagai- mana diketahui bahwa konsentrasi hyphothiocyanite adalah  tergantung  dari  substrat  LPO,  maka  pene- litian  lanjutan  adalah  menggunakan  LPOS  untuk membunuh Escherichia  coli dengan  menggunakan substrat yang lebih besar, yaitu 0,18 mM (Tabel 4).
Tabel 4.  Aktivitas antibakteri LPOS terhadap Escherichia  coli dengan  berbagai  konsen- trasi komponen LPOS Laktoperoksidase (U/mL) KSCN (mM) H 2 O 2 (mM) Total Bakteri Escherichia coli 1,87 0,18 0,18 1,5±0,5x10 5 3,11 0,03 0,03 1,5±0,5x10 5 4,67 0,03 0,03 2,5±2,5x10 5 Kontrol 4±1x10 6
Keterangan:  LPO,  KSCN  dan  H 2 O 2 dengan  berbagai  unit dan total konsentrasi
Berdasarkan  Tabel  4,  maka  didapat  hasil bahwa  walaupun  konsentrasi  LPO  ditingkatkan, tidak  dapat  meningkatkan  daya  antibakteri  LPOS, namun  ketika  diturunkan  konsentrasinya,  tidak nampak adanya sifat antibakteri dari LPOS. Setelah konsentrasi  substrat  ditingkatkan  menjadi  0,18  mM, maka  terlihat  adanya  daya  antibakteri  sekitar  1  Log CFU/mL  (terdapat  pengurangan  jumlah  bakteri  dari
4±1x10 6 manjadi 1,5±0,5x10 5 CFU/mL). Oleh karena itu,  dapat  disimpulkan  bahwa  konsentrasi  substrat sebesar  0,18  mM  merupakan  konsentrasi  minimal agar  LPOS  dapat  mempunyai  sifat  antibakteri. Namun  oleh  karena  jumlah  substrat  sebesar  0,18 mM,  berdasarkan  hasil  penelitian  sebagaimana tampil  dalam  Tabel  2,  dapat  meninggalkan  residu H 2 O 2 , maka untuk langkah aplikasi pada susu segar, digunakan  formula  yang  tidak  meninggalkan  residu H 2 O 2 ,  yaitu  3,11  U/mL  LPO,  0,03  mM  H 2 O 2 ,  dan 0,03 mM KSCN.
Aplikasi  LPOS  di  dalam  susu  segar  dinilai kompleks  mengingat  banyaknya  faktor  yang  dapat menurunkan aktivitas LPO. Namun kecilnya substrat yang  digunakan  dapat  diatasi  dengan  adanya fenomena  bahwa  di  dalam  susu  segar  terkandung H 2 O 2 dan ion  SCN  yang  dapat  mengaktifkan sistem laktoperoksidase.  Susu  sapi  secara  alami  mengan- dung  thiosianat  namun  dalam  level  yang  rendah sehingga  perlu  ditambah  konsentrasinya  untuk mengaktifkan  sistem  LPO  (Firmansyah et  al., 2002, Legowo et al., 2009).
Minimum  inhibitory concentration LPOS  pada susu segar
Data aplikasi LPOS pada susu segar terdapat pada Tabel 5. Aplikasi LPOS ini dengan mengguna- kan  formula  yaitu  3,11  U/mL  LPO,  0,03  mM  H 2 O 2 , dan  0,03  mM  KSCN.  Ketiga  komponen  LPOS  ini dibiarkan  bereaksi  selama  satu  jam  sebelum  diapli- kasikan  ke  dalam  susu  segar.  Selain  itu,  sebagai pembanding,  maka  dilakukan  juga  aplikasi  LPOS dengan  menggunakan  konsentrasi  substrat  yang lebih  besar,  yaitu:  0,3  mM H 2 O 2 dan  0,3  mM  KSCN (dengan  konsentrasi  LPO  tetap).  Aplikasi  LPO dilakukan  secara  bervariasi  mulai  dari  aplikasi  jam ke-2, 3, 4, 5, dan 6 pasca susu segar disimpan pada suhu  30°C  dan  data  yang  tampak  pada  Tabel  5  ini adalah data populasi bakteri dalam susu segar pada jam  ke-6  penyimpanan  pada  suhu  30°C.  Berdasar- kan  pada  Tabel  5.  LPOS  terbukti  dapat  menekan populasi  total  bakteri  pada  susu  segar  hingga  ±2 Log  CFU/mL  (terdeteksi  sebesar  4±1x10 3 dari
kontrol  sebesar  2±1x10 5 CFU/mL),  yaitu  pada pengunaan  LPOS  dengan  substrat  0,3  mM  pada jam  ke-2.  Ketika  konsentrasi  substrat  diturunkan, LPOS  masih  menunjukkan  adanya  sifat  antibakteri sebesar  ±1  Log  CFU/mL  (terdeteksi  sebesar 5,5±0,5x10 4 dari  kontrol  sebesar  2±1x10 5 CFU/mL). Oleh  karena  itu,  dapat  disimpulkan  bahwa  kedua macam konsentrasi substrat terbukti dapat menekan bakteri  pada  susu  segar.  Penggunaan  LPOS  pada jam  ke-3  dan  jam  ke-4  pasca  penyimpanan,  masih nampak adanya sifat antibakteri LPOS namun ketika penggunaan LPOS diterapkan pada jam ke-5 dan 6 pasca  penyimpanan,  tidak  nampak  adanya  sifat antibakteri dari LPOS dalam susu segar. Ketidakmampuan  LPOS  untuk  menekan  populasi bakteri  tersebut  diduga  karena load bakteri  yang tidak  seimbang  dengan  jumlah hyphothiocyanite yang  diproduksi  oleh  LPOS.  Selain  itu  kandungan lain  di  dalam  susu  seperti  laktosa  dan casein dapat melemahkan  aktivitas  LPO.  Gula  termasuk  laktosa telah  digolongkan  dalam non  competitive  inhibitor . Komponen  lain  seperti casein dan  asam amino tyrosine juga  dapat  menghambat  aktivitas  LPO  (Al- Barrri et al., 2011; Fonteh et al., 2005). Menurut  Legowo et  al. (2009)  susu  segar yang  berkualitas  baik  mengandung  1-2  juta  sel bakteri  per  mL  susu.  Penelitian  Balia et  al .  (2008) menunjukkan bahwa jumlah bakteri pada susu segar asal  peternakan  rakyat  dapat  mencapai  3,70x10 6 CFU/mL  jika  disimpan  tanpa  penyimpanan  yang memadai. Jumlah bakteri telah ditentukan sebanyak maksimal  1x10 6 CFU/mL  (BSN,  2000),  sehingga penggunaan  LPO  dengan  konsentrasi  substrat sebesar  0,03  mM  telah  mampu  untuk  menekan populasi  bakteri  secara  minimal  pada  susu  segar. Oleh  karena  itu,  LPOS  dengan  LPO  3,11  unit  dan substrat  sebanyak  0,03  mM  merupakan  MIC substrat  LPOS  untuk  dapat  menekan  pertumbuhan bakteri  dalam  susu  segar  yang  dapat  di  aplikasikan kepada  peternak  secara  langsung  sesaat  setelah pemerahan  atau  maksimal  1  jam,  agar  dapat  mem- perpanjang masa simpan susu segar.
Tabel 5. Aktivitas antibakteri LPOS pada susu segar dengan konsentrasi substrat berbeda
Konsentrasi Substrat (mM) Populasi Bakteri (CFU/mL) Jam Pengaktifan LPOS ke- 2 3 4 5 6 0,03 5,5±0,5x10 4 4,5±1,5x10 5 1,5±0,5x10 4 1,5±0,5x10 5 2,5±3,5x10 5 0,3 4±1x10 3 5±1x10 4 1,5±0,5x10 4 2,5±2,5x10 5 4,5±0,5x10 5 Kontrol 2±1x10 5 2±1x10 5 7,5±1,5x10 4 1,5±0,5x10 5 3±0x10 5
Keterangan: Konsentrasi substrat rendah yaitu 0,03 mM; konsentrasi substrat tinggi 0,30 mM

## KESIMPULAN
Minimum Inhibitory Concentration (MIC) LPOS LPO adalah sebesar 3,11 U/mL agar Escheri- chia  coli dapat  ditekan  populasinya.  Konsentrasi substrat  LPO,  yaitu  H 2 O 2 dan  KSCN  agar  LPOS menunjukkan  sifat  antibakteri,  keduanya  harus mempunyai  konsentrasi  minimal  sebesar  0,03  mM. Konsentrasi  sebesar  ini  terbukti  tidak  meninggalkan residu  H 2 O 2 dalam  LPOS  dan  mampu  menekan populasi Escherichia  coli sebesar  ±1  Log  CFU/mL sehingga  dapat  disimpulan  bahwa  MIC  LPOS adalah 3,11 U/mL, dan konsentrasi H 2 O 2 dan KSCN masing-masing  sebesar  0,03  mM. Aplikasi  LPOS  di dalam susu segar dengan menggunakan formula ini terbukti  dapat  menekan  pertumbuhan  bakteri  dalam susu  segar  sebesar  ±1  Log  CFU/mL  sehingga formula  ini  juga  dapat  sebagai  formula  MIC  LPOS pada susu segar.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  penghargaan  dan ucapan terima kasih kepada Kemenristek Dikti yang telah  memberikan  dukungan  finansial  untuk  melak- sanakan  penelitian  ini  melalui  skema  Hibah Kompetisi  Nasional  sehingga  penelitian  ini  dapat berjalan dengan baik.

## DAFTAR PUSTAKA
Al-Baarri  AN,  Legowo  AM.  2012.  Aplikasi  Teknologi Lactoperoksidase-Sepharose-Membrane sebagai  Metode  Pengawetan  Susu  Segar yang  Murah  dan  Aman.  Prosiding  InSiNas Hal:103-109. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Al-Baarri  AN,  Ogawa  M,  Hayakawa  S.  2010.  Scale- up studies on immobilization of lactoperoxidase using milk whey for producing antimicrobial  agent.  J  Indonesian  Tropical Anim Agr 35: 185-191.
Al-Baarri  AN,  Ogawa  M,  Hayakawa  S.  2011. Application  of  lactoperoxidase  system  using bovine whey and  the  effect  of  storage condition  on  lactoperoxidase  activity.  Int  J Dairy  Sci  6:  72-78.  DOI: 10.3923/ijds.2011. 72.78.
Asaah  NO,  Fonteh  F,  Kamga  P,  Mendi  S,  Imele  H. 2007.  Activation  of  the  lactoperoxidase system as a method of preserving raw milk in areas without cooling facilities. Afr J Food Agr Nutr Dev 7: 1-15.
Balia  RL,  Harlia  E,  Suryanto  D.  2008.  Jumlah Bakteri  Total  dan  Koliform  pada  Susu  Segar Peternakan  Sapi  Perah  Rakyat  dan  Susu Pasteurisasi  Tanpa  Kemasan  di  Pedagang Kaki  Lima.  Prosiding  Prospek  Industri  Sapi Perah  Menuju  Perdangangan  Bebas  2020, Hal.  322-325.  Pusat  Penelitian  dan  Pe- ngembangan Peternakan Bogor.
[BSN]  Badan  Standarisasi  Nasional.  2000.  SNI  01- 6366-2000  tentang  Batas  Maksimum  Ce- maran  Mikroba  dan  Batas  Maksimum  Residu dalam Bahan Makanan Asal Hewa, Jakarta.
Seifu  E.  2003.  Application  of  the  Lactoperoxidase System  to  Improve  the  Quality  and  Safety  of Goat  Milk  and  Goat  Milk  Cheese.  [Disertasi]. Faculty  of  Natural  and  Agricultural  Sciences. University of Pretoria. Pretoria.
Dwiloka  B,  Srigandono  B.  2006.  Metodologi Penelitian.  Badan  Penerbit  Universitas  Dipo- negoro, Semarang.
Dwiyanti  G.  2009.  Pengaruh  penambahan  aktivator laktoperoksidase  terhadap  ketahanan  susu sapi segar. J Pengajaran MIPA 13: 1-10.
Fahardian  A,  Jinap  S,  Faridah  A,  Zaidul  ISM.  2012.
Effects  of  marinating  on  the  formation  of polycyclic  aromatic  hydrocarbons  (benzoal- [a]pvrene,  benzo[b]]fluorathene  and  fluoran- thene)  in  grilled  beef  meat.  Food  Cont  28: 420-425.  DOI:  10.1016/j.foodcont.2012.04. 034.
[FAO]  Food  and  Organization.  2005.  Benefit  and Potential  Risks  of  the  Lactoperoxidase System  of  Raw  Milk  Preservation.  Animal Production  Service.  FAO  Animal  Poduction and Health Division. Rome.
Firmansyah  H,  Maheswari  RRA,  Bakrie  B.  2002.
Perbandingan Kinerja Aktivator Sistem Laktoperoksidase  (Lactoperoxidase  System) dalam  Pengawetan  Susu  dengan  Volume yang  Berbeda.  [Seminar  Nasional].  Teknologi Peternakan dan Veteriner 2002. Hal. 55-60.
Fonteh  F,  Grandison  A,  Lewis  MJ.  2002.  Variations of  lactoperoxidase  activity  and  thiocyanate content  in  cow’s  and  goat’s  milk  throughout lactation. J Dairy Res 69: 401-409.
Fonteh FA, Grandison AS, Lewis MJ. 2005. Factors affecting  lactoperoxidase  activity.  Int  J  Dairy Tech  58:  233-236. DOI:  10.1111/j.1471-0307. 2005.00227.x.
Kukic P, Nielsen JE. 2010. Electrostatics in proteins and  protein –ligand  complexes.  Future  Med Chem 2: 647-666. DOI: 10.4155/fmc.10.6.
Legowo  AM, Kusrahayu,  Mulyani  S.  2009.  Ilmu  dan Teknologi  Susu.  Badan  Penerbit  Universitas Diponegoro, Semarang.
Maheswari  RAA,  Setiawan  J,  Mulyanto  S,  Batubara
I,  Sumantri  C,  Farajallah  A.  2007.  Identifikasi laktoferin pada susu kambing kacang dengan metode imunodifusi radial tunggal dan natrium deodesil  sulfat  poliakrilamida  elektroforensis gel. J Ilmu Pertanian Indonesia 12: 163-172.
Marshall  K.  2004.  Therapeutic  applications  of  whey protein: review. Alt Med Rev 9: 136-156.
Min  S,  Harris  LJ,  Krochta  JM.  2005.  Antimicrobial effects  of  lactoferrin,  lysozyme,  and  the lactoperoxidase  system  and  edible whey protein films incorporating the lactoperoxidase system  against Salmonella  enterica and Escherichia coli O157:H7. J Food Sci 70: 332- 338. DOI: 10.1111/j.1365-2621.2005.tb11476. x.
Saad  AH.  2008.  Activation  of  milk  lactoperoxidase system  for  controlling  ps eudomonas  in  cow’s milk. Int J Dairy Sci 3: 131-136. DOI: 10.3923/ ijds.2008.131.136.
Seifu E, Buys EM, Donkin EF. 2005. Significance of the  lactoperoxidase  system  in  the  dairy
industry  and  its  potential  apllications:  a review. Trends Food Sci & Tech 16: 137-154. DOI: 10.1016/j.tifs.2004.11.002.
Sisecioglu  M,  Klreccl  E,  Cankaya  M,  Ozdemlr  H,
Gulcin  I,  Atasever  A.  2010.  The  prohibitive effect  of  lactoperoxidase  system  (LPS)  on some  pathogen  fungi  and  bacteria.  Afr  J Pharm Pharmacol 4: 671-677.
Suleiman  AME,  Zubier  SE,  Hardallou  SBE.  2009. Activation of lactoperoxidase milk in manufacture  of  jibna-beida  (white  cheese).  J Sci Technol 10: 1-12.
Tay  EP,  Gam  LH.  2011.  Proteomics  of  human  and the  domestic  bovine  and  caprine  milk.  Aspac J Mol Biol Biotechnol 19: 45-43.
Venkitanarayanan KS, Lin CM, Balley H, Doyle MP. 2002. Inactivation of Esherichia coli O 157;H7, Salmonella  enteritidis ,  and Listeria  monocylo- geneses on apples, oranges, and tomatoes by lactic  acid  with  hydrogen  peroxide.  J  Food Protect 65: 100-105.
Widyastuti  E,  Nucholis  M.  2012.  Electrophoresis Food  Analysis  and  Biochemistry-Practice. Ilmu  Teknologi  Pangan,  Universitas  Bra- wijaya, Malang.