PENGARUH MACAM EKSPLAN DAN KONSENTRASI 2,4 D TERHADAP INDUKSI KALUS KLUWEK (Pangium edule Reinw.) SECARA IN VITRO
The Effect of Kind of Explant and 2,4-D Concentration of Callus Induction at Football Fruit  (Pangium edule Reinw.)  In
Vitro
Hendy Dwi Prabakti 1 )* , Didik Pudji Restanto 1) , Sholeh Avivi 1) 1) Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian,Universitas Jember
DOI: 10.21111/agrotech. v3i2. 930 Terima 18  Juni  2017               Revisi 09  September  2017                        Terbit 30 December  2017
Abstrak: Kluwek adalah tanaman asli Indonesia memiliki fungsi ekologi dalam perbaikan lingkungan dan potensial untuk dibudidayakan. Tanaman ini memiliki nilai konservasi dan ekonomi atau disebut jenis tanaman Multi Purpose Tree Species ( MPTS ) atau tanaman multi guna. Tanaman MPTS adalah tanaman serbaguna yang dapat diambil buah, bunga, kulit, dan daunnya. Kebanyakan pemakaian Pangium edule didasarkan pada adanya asam sianida. Perbanyakan bibit lewat biji sangat terbatas karena keberhasilan perkecambahan hanya 10 %. Karena itu perlu pengadaan bibit kluwek siap tanam yang mencukupi diperoleh melalui perbanyakan vegetatif kultur jaringan. Tujuan penelitian untuk mengetahui respon eksplan dan pengaruh konsentrasi pemberian 2,4 D Induksi Kalus Pangium edule Reinw. melalui  kultur in vitro , serta interaksi macam eksplan dengan 2,4 D. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Jurusan Agronomi Fakultas Pertanian Universitas Jember. Percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang tersusun secara faktorial dengan dua faktor perlakuan. Faktor pertama yaitu Macam eksplan terdiri dari 2 taraf: E1 = Daun; dan E2 = Endosperm . Faktor kedua yaitu taraf konsentrasi 2,4 D yang diberikan: D0 = 0,0 ppm; D1 = 0,2; D2 = 0,4 ppm; D3 = 0,6 ppm; D4 = 0,8 ppm; D5 = 1 ppm. Data dianalisis dengan anova dan apabila terdapat perbedaan nyata diantara perlakuan maka dilanjutkan dengan menggunakan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) dengan taraf kepercayaan 95 %. Hasil penelitian menunjukkan bahwa, terdapat interaksi yang sangat nyata antara macam
* Korespondensi email: heroosoul@rocketmail.com Alamat : Jalan Kalimantan 37, KampusTegalBoto,Jember 68121
eksplan dan 2,4 D. Hasil terbaik, berturut-turut parameter kedinian kalus, pembentukan kalus, dan penambahan biomassa, ditunjukkan dengan penambahan 2,4 D 0,8 ppm, 1 ppm, dan 0,4 ppm pada 14 hari, 86,67% dan 66 mg. Parameter warna kalus pada 2,4 D 1 ppm dengan skor 4,2 skor dan tekstur kalus pada 0,8 ppm 2,4-D dengan skor 4.
Kata Kunci : Kluwek ( Pangium edule Reinw.), MPTS, Asam Sianida
Abstract: Football Fruit is a native Indonesia tree with typical ecological function in improving the environment and it is a potencial plant for cultivating. This plant has a conservation and economic value or Multi Purpose Tree Species (MPTS) or multi-use plant. MPTS plant is a versatile crop, the fruits, flowers, bark, and leaves of which can  be taken. Most of the uses of Pangium edule are based on the presence of cyanide. The plant propagation   through seed have low germination around 10% of germination. Therefore, it is deemed important to provide sufficient ready-to-plant seedlings of football fruit, which can be obtained from the vegetative explant for callus induction. The aim of the research is studying the response of kind of explants and the concentration effect of 2,4-D at Pangium edule Reinw for callus induction. The research was conducted at the Laboratory of Tissue Culture of the Department of Agronomy, the Faculty of Agriculture, at Jember University. The experiments applied complete randomized design  (CRD), which was factorially arranged with two factors. The first factor was kind of explants, which consisted of 2 levels: E1 = Leaf; and E2 = endosperm. The second factor was concentration levels of 2.4 D such as: D0 = 0.0 ppm; D1 = 0.2; D2 = 0.4 ppm; D3 = 0.6 ppm; D4 = 0.8 ppm; D5 = 1 ppm. The obtained data were analyzed using ANOVA and if there were significant differences between the treatments, then data analysis would be continued by using Test of the Least Significant Difference with 95% confidence  level. The results showed that there was a very significant interaction between kind of explant and 2.4-D concentration. Based on the observation parameters, the best explant, as indicated by beginning of callus induction, callus formation, biomass addition, callus color, and callus texture, was the one taken from leaf. The best result, at theparameters beginning callus induction, callus formation, and biomass addition, was shown in the addition of 2.4-D with a concentration of 0.8 ppm, 1 ppm and 0,4 ppm were 14 days, 86,67% and 66 mg, respectively. The parameters of callus color at 2,4-D 1 ppm with 4,2 score and the callus texture at 0.8 ppm of 2.4-D with 4 score.
Keywords : Football Fruit ( Pangium edule Reinw.), MPTS, Cyanide

## 1. Pendahuluan
Kluwek adalah pohon asli Indonesia yang memiliki fungsi ekologi dalam perbaikan lingkungan dan patut untuk dibudidayakan. Pangium edule Reinw. berdasarkan status konservasi menurut Red List International Union for Conservation of Nature IUCN merupakan plasma nutfah hutan yang dikategorikan tumbuhan asli nusantara dan sedikit dibudidayakan (Gunawan dan Sugiarti, 2015). Prinsip pokok yang sama-sama harus dipahami Kluwek bukan sebagai tanaman pokok ekonomi, melainkan tanaman pendukung peningkatan ekonomi alternatif. Jenis ini memiliki nilai konservasi dan ekonomi atau disebut jenis tanaman Multi Purpose Tree Species ( MPTS ) atau tanaman multi guna. Tanaman MPTS adalah tanaman serbaguna yang dapat diambil buah, bunga, kulit, dan daunnya. Kebanyakan pemakaian Pangium edule didasarkan pada adanya asam sianida pada semua bagian tanaman mulai dari biji, buah, daun, kulit kayu atau akar. Daun segar, getah daun, tumbukan daun, dan tumbukan biji digunakan sebagai antiseptik dan disinfektan untuk membersihkan luka dari luar (Yohar, 2012). Bagi petani sekitar kawasan Taman Nasional Meru Betiri, pohon Kluwek selain sebagai bumbu dapur (daging biji yang sudah tua) banyak dimanfaatkan pula pucuk daun untuk pembuatan pestisida nabati berupa racun serangga (insektisida).
Kluwek memiliki beragam manfaat, namun nilai ekonominya masih diukur dari pasar lokal, belum ada upaya pengembangan untuk nasional apalagi internasional (Yohar, 2012). Pengembangan untuk nasional ataupun internasional perlu didukung dengan penyediaan bibit siap tanam yang mencukupi. Kebutuhan bibit tanaman tidak akan tercukupi bila hanya mengandalkan perbanyakan tanaman secara generatif karena terbatas adanya, musim berbuah, beragamnya sifat keturunan, membutuhkan tempat perbanyakan yang luas, dan bibit yang dihasilkan jumlahnya terbatas. Sehingga untuk itu diperlukan adanya alternatif perbanyakan tanaman. Pengadaan bibit lewat biji sangat terbatas karena keberhasilan perkecambahan hanya 10 %. Karena itu perlu pengadaan bibit kluwek siap tanam yang mencukupi diperoleh melalui perbanyakan vegetatif kulur jaringan. Kultur jaringan diharapkan menjadi salah satu alternatif perbanyakan kluwek yang dikembangkan dari eksplan tanaman dengan media khusus tanaman kayu Woody Plant Medium (WPM), dan perlakuan konsentrasi 2,4-dichlorophenoxyacetic
(2,4-D). 2,4-D ZPT dari golongan auksin.

## 2. Bahan dan Metode
Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-November 2016 di Laboratorium Kultur Jaringan, Jurusan Agronomi, Fakultas Pertanian,
Universitas Jember.
Bahan-bahan yang digunakan adalah daun muda tanaman kluwek ( Pangium edule Reinw.), media Woody Plant Medium (WPM), Zat Pengatur Tumbuh 2,4-D, aquades, tween, natrium hipoklorit, iodin, sukrosa, alkohol 70%.
Alat-alat yang digunakan diantaranya timbangan analitik, pengaduk magnetik, pH meter, autoclave , Laminair Air Flow (LAF), nutcracker,
gelas ukur, botol kultur, cawan petri, pinset, gunting, skalpel.
Rancangan acak lengkap (RAL) yang tersusun secara faktorial. Percobaan yang dilaksanakan menggunakan 2 faktor perlakuan yaitu; Faktor Pertama: Macam Eksplan yang terdiri dari Daun = E1 dan Endosperm = E2. Faktor Kedua Konsentrasi 2,4 D yang terdiri dari 6 taraf: D0 = Kontrol; D1 = 0,2 ppm; D2 = 0,4 ppm; D3 = 0,6 ppm; D4 = 0,8 ppm; D5 = 1 ppm. Setiap kombinasi tersebut diulang 5 kali, sehingga dihasilkan 60 kombinasi perlakuan. Data yang diperoleh akan dianalisis menggunakan analisis ragam ANOVA untuk mengetahui apakah ada pengaruh perlakuan terhadap parameter pengamatan. Apabila didapatkan hasil perbedaan yang nyata diantara perlakuan- perlakuan tersebut, maka analisis akan dilakukan uji lanjutan dengan uji Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) dengan taraf 5%.
Pembuatan Media. Media WPM yang telah ditambahkan sukrosa dan ZPT 2,4-D sesuai perlakuan, diukur derajat keasaman medianya hingga larutan menunjukkan angka 5,8. Media ditambah agar dan dipanaskan, kemudian dimasukkan dalam botol kultur dan dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 1210C, tekanan 17,5 psi
selama 45 menit.
Sterilisasi Eksplan dan Penanaman Eksplan. Sterilisasi daun, d aun yang digunakan usia 3-4 hari dibilas dengan air mengalir pada seluruh permukaan daun 5 menit. Eksplan dikeringkan dengan tisu, eksplan yang kering kemudian diisolasi dengan tisu yang sudah disemprot dengan alkohol 70 %, kemudian eksplan dimasukkan kedalam botol steril dan ditutup dengan tisu kering. Selanjutnya eksplan dibawa ke Laminar Air Flow . Berikutnya gojok eksplan dengan alkohol 70 % selama 30 detik, dilanjutkan dengan melarutkan natrium hipoklorit 20 mL dan air steril 80 mL dalam 100 mL larutan. Eksplan selanjutnya digojog dengan 50 mL larutan ditambah tween selama 3 menit dan membilasnya sebanyak dua kali selama 3 menit. Sisa larutan 50 ml  digunakan untuk tahap kedua selama 3 menit, kemudian dilanjutkan dengan pembilasan dengan aquadest steril sebanyak 3 kali selama 3 menit. Berikutnya eksplan dipotong dengan ukuran ± 0,5 cm di dalam larutan iodine dan air steril, dilanjutkan penirisan. Potongan eksplan daun yang telah ditiriskan ditanam pada media yang telah disiapkan.
Sterilisasi endosperm berasal dari biji kluwek masak fisiologis.
Sterilisasi terbagi menjadi dua macam bagian. Pertama sterilisasi kulit tebal, biji dicuci dengan air sabun dan sikat sampai permukaan biji terasa kesat. Selanjutnya sterilisasi dengan natium hipoklorit dengan konsentrasi 20 mL sampai penampakan cangkang biji berwarna putih, kemudian dicelupkan dalam alkohol 96 % dan dibakar di atas bunsen.
Kedua memecahkan cangkang dengan nutcracker di dalam Laminar Air Flow (LAF). Cangkang yang telah dipecah diambil Endosperm - nya, eksplan disterilisasi dalam aquadest steril dan betadine. Selanjutnya membilas dengan aquadest steril sebanyak 2 kali selama 3 menit. Eksplan diangkat, ditiriskan, dan dibelah menjadi beberapa bagian kemudian menanamnya pada media.
Pemeliharaan. Eksplan disubkultur setiap 1 bulan sekali. Botol kultur disemprot dengan menggunakan alkohol 70% setiap hari untuk menghindari terjadinya kontaminasi lingkungan.
Variabel Pengamatan. Variabel pengamatan diantaranya kedinian munculnya kalus, persentase eksplan yang membentuk kalus, berat kalus, warna kalus, dan tekstur kalus.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui interaksi macam eksplan dengan berbagai macam konsentrasi 2,4 D terhadap induksi kalus Kluwek ( Pangium edul e Reinw.) secara in vitro sebagai alternatif dalam upaya konservasi dan pengembangan kluwek di masa yang akan datang. Penggunaan macam eksplan dan penggunaan konsentrasi 2,4 D dirangkum dari tabel hasil anova seluruh variabel pengamatan yaitu, kedinian munculnya kalus, jumlah eksplan yang membentuk kalus, berat kalus, warna, dan tekstur kalus yang disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1.  Rangkuman F-hitung Semua Variabel Pengamatan
No Pengamatan Nilai F-hitung Eksplan 2,4 D Interaksi 1 Kedinian kalus 0 8,52** 8,31** 10,52** 2 Persentase kalus 0 6,53* 6,89** 0 9,16** 3 Berat kalus 56,42** 7,79** 0 8,24** 4 Warna kalus 28,74** 4,67** 0 6,32** 5 Tekstur Kalus 25,91** 4,21** 0 5,64**
Keterangan: **= berpengaruh sangat nyata, *= berpengaruh nyata, tn= tidak berpengaruh nyata
Hasil analisis ragam (Tabel 1) menunjukkan variabel seluruh pengamatan pengaruh sangat nyata pada macam eksplan, konsentrasi pemberian 2,4 D, dan interaksi macam eksplan dengan konsentrasi 2,4 D terdapat pada setiap variabel pengamatan. Sedangkan, pada nilai F- hitung macam eksplan dengan variabel pengamatan persentase terbentuknya kalus menunjukkan bahwa, F-hitung pada variabel tersebut berbeda nyata dan pada pemberian konsentrasi 2,4 D serta interaksi antara eksplan dengan 2,4 D menunjukkan pengaruh yang sangat nyata. Interaksi yang menunjukkan pengaruh berbeda sangat nyata di analisis dengan menggunakan uji BNT (Beda Nyata Terkecil) untuk mengetahui interaksi kedua faktor tersebut.
Pengamatan pada kedinian terbentuknya kalus terhadap macam eksplan dan penambahan berbagai konsentrasi 2,4 D dimulai setelah eksplan ditanam pada media perlakuan. Pertumbuhan kedinian kalus mulai tampak pada 14 HST. Pengaruh macam eksplan dan konsentrasi
2,4 D memiliki hubungan interaksi yang berpengaruh sangat nyata (Tabel 1) pada variabel kedinian terbentuknya kalus. Kemudian dari hasil tersebut dilakukan uji lanjut BNT.
Tabel 2. interaksi antara macam eksplan dan konsentrasi 2,4 D antara E1D4 dan E1D5 memiliki nilai yang tidak berbeda nyata,
Tabel 2.  Hasil Uji Lanjut BNT 5% interaksi antara macam eksplan dan
konsentrasi 2,4 D terhadap kedinian kalus Eksplan D0 D1 D2 D3 D4 D5 E1 90,00 aA 90,00 aA 44,40 bA 45,40 bA 14,00 cB 14,20 cB E2 90,00 aA 62,20 abA 21,20 cA 48,20 bcA 90,00 aA 90,00 aA
Keterangan:  angka yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji BNT pada taraf kepercayaan 95% huruf kecil dibaca arah horizontal dan huruf kapital dibaca vertikal
dan bila dibandingkan dengan nilai E2D2 nilai yang ditunjukkan berbeda nyata. Sedangkan, nilai interaksi pada E1D4 dan E1D5 bila dibandingkan dengan interaksi yang lain menunjukkan perbedaan nilai berbeda sangat nyata. Sehingga hasil secara keseluruhan bila dibandingkan, nilai persentase eksplan terbaik dalam kedinian kalus adalah eksplan daun dengan pemberian konsentrasi 2,4 D sebesar 0,8 ppm.
Pengamatan persentase eksplan yang membentuk  kalus pada Tabel 3. interaksi E1D5 dengan E1D4 memiliki pengaruh yang berbeda nyata.  Sedangkan bila dibandingkan  dengan nilai
interaksi yang lain pengaruh yang ditunjukkan akan sangat berpengaruh nyata.
Tabel 3. Hasil Uji Lanjut BNT 5% interaksi antara macam eksplan dan konsentrasi 2,4 D terhadap persentase terbentuknya kalus
Eksplan D0 D1 D2 D3 D4 D5 E1 00,00 aA 00,00 aA 33,33 bA 40,00 bA 53,33 bcB 86,67 cB E2 00,00 aA 20,00 aA 73,33 bA 20,00 aA 00,00 aA 00,00 aA
Keterangan:angka yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji BNT pada taraf kepercayaan 95% huruf kecil dibaca arah horizontal dan huruf kapital dibaca vertikal
Interaksi terbaik ditunjukkan pada perlakuan E1D5 dengan nilai 86,67 cB. Sehingga hasil secara keseluruhan bila dibandingkan, nilai persentase eksplan terbaik dalam membentuk kalus adalah eksplan daun dengan pemberian konsentrasi 2,4 D sebesar 1 ppm.
Tabel 4.  Hasil Uji Lanjut BNT 5% interaksi antara macam eksplan dan
konsentrasi 2,4 D terhadap berat kalus Eksplan D0 D1 D2 D3 D4 D5 E1 00,00 aA 38,00 bA 66,00 cA 24,00 aA 38,00 bB 58,00 cB E2 00,00 aA 06,00 aA 6,00 aA 32,00 bA 00,00 aA 00,00 aA Keterangan: angka yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda
nyata berdasarkan uji BNT pada taraf kepercayaan 95% huruf kecil dibaca arah horizontal dan huruf kapital dibaca vertikal
Pengamatan berat kalus pada Tabel 4. interaksi E1D2 memiliki nilai 66,00 cA yang berbeda nyata dengan E1D5 dengan nilai 58,00 cB, sedangkan interaksi yang lain bila dibandingkan menunjukkan perbandingan yang sangat berbeda nyata. Interaksi terbaik ditunjukkan pada perlakuan E1D2. Sehingga hasil secara keseluruhan bila dibandingkan, nilai pertambahan biomassa (berat kalus) eksplan terbaik adalah eksplan daun dengan pemberian konsentrasi 2,4 D sebesar 0,4 ppm diikuti pemberian konsentrasi 2,4 D 1 ppm.
Tabel 5.  Hasil Uji Lanjut BNT 5% interaksi antara macam eksplan dan
konsentrasi 2,4 D terhadap warna kalus Eksplan D0 D1 D2 D3 D4 D5 E1 00,00 aA 00,00 aA 02,40 bA 02,40 bA 04,00 bcB 04,20 cB E2 00,00 aA 00,80 aA 00,80 aA 00,80 aA 00,00 aA 00,00 aA
Keterangan:  angka yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji BNT pada taraf kepercayaan 95% huruf kecil dibaca arah horizontal dan huruf kapital dibaca vertikal
Pengamatan warna kalus pada Tabel 5. interaksi terbaik ditunjukkan pada perlakuan E1D5 dengan nilai 4,20 cB, dan berbeda nyata bila dibandingkan dengan nilai interaksi E1D4 yang memiliki nilai 4,00 bcB, sedangkan interaksi secara keseluruhan bila dibandingkan dengan interaksi E1D5 akan menunjukkan perbandingan yang berbeda sangat nyata. Sehingga hasil secara keseluruhan bila dibandingkan, eksplan terbaik dalam warna kalus
adalah eksplan daun dengan pemberian konsentrasi 2,4 D sebesar 1 ppm.
Warna kalus berdasarkan Munsell Color Chart dikelompokkan menjadi tiga kategori hue, value, dan chroma. Tabel 6 warna kalus pada eksplan daun dan warna kalus pada  eksplan Endosperm ditunjukkan dengan nilai, D1  (2,4 D 0,2 ppm), pada eksplan Endosperm yang memiliki kategori warna 2,5Y 8/8 (kuning, value
Tabel 6.  Warna kalus terbaik berdasarkan Munsell Color Chart Perlakuan Visual Munsell Skor 2,4 D Macam Eksplan Warna Color Chart 0 ppm Daun - - 0 Endosperm - - 0 0,2 ppm Daun - - 0 Endosperm 2,5 Y 8/8 4 0,4 ppm Daun 5 Y 8/8 4 Endosperm 5 Y 8/6 4 0,6 ppm Daun 5 Y 7/4 4 Endosperm 5 Y 7/10 4 0,8 ppm Daun 5 Y 8/6 4 Endosperm - - 0 1 Daun 2,5 GY 7/8 6 ppm  Endosperm - - 0
8 dan chroma 8). D2 (2,4 D 0,4 ppm) eksplan daun memiliki kategori warna 5Y 8/8 (kuning, value 8 dan chroma 8) dan
Endosperm memiliki kategori warna 5Y 8/6 (kuning, value 8 dan chroma 6). Berikut pada D3 (2,4 D 0,6 ppm) eksplan daun memiliki kategori warna 5Y 7/4 (kuning, value 7 dan chroma 4) dan eksplan Endosperm memiliki kategori warna 5Y 7/10 (kuning,
value 7 dan chroma 10). Selanjutnya pada D4 (2,4 D 0,8 ppm) eksplan daun memiliki kategori warna 5Y 8/6 (kuning, value 8 dan chroma 6) dan D5 (2,4 D 1 ppm) eksplan daun memiliki kategori warna 2,5Y 7/8 (kuning, value 7 dan chroma 8). Sisanya, beberapa eksplan tidak memiliki kategori warna, karena kalus tidak muncul.
Pengamatan tekstur kalus pada Tabel 6. interaksi terbaik ditunjukkan pada perlakuan E1D4 dengan nilai 4,00 bB. Sehingga hasil secara keseluruhan bila dibandingkan, eksplan terbaik dalam membentuk kalus adalah eksplan daun dengan pemberian konsentrasi 2,4 D sebesar 0,8 ppm.
Persemaian yang dilaksanakan dalam proses persemaian biji kluwek rata-rata memerlukan waktu semai sampai berkecambah ± 2 bulan. Bji kluwek sangat mudah kehilangan kadar air dan mengalami penyusutan pada daging biji, sehingga pada akhirnya warna daging biji berubah menjadi hitam. Pengamatan tersebut membuktikan bahwa, daya hidup dan daya tumbu benih biji kluwek sangatlah rendah. Yohar (2012) menyatakan, kluwek juga merupakan benih semi rekalsitran yang viabilitas benihnya sangat rendah. Benih rekalsitran yaitu benih yang tidak dapat disimpan dalam waktu lama, tidak tahan atau mati jika disimpan pada suhu dingin, dan tidak tahan disimpan bila kadar airnya diturunkan sampai di bawah kadar air kritis. (Hasanah, 2006).
Tabel 7.  Hasil Uji Lanjut BNT 5% interaksi antara macam eksplan dan
konsentrasi 2,4 D terhadap tekstur kalus Eksplan D0 D1 D2 D3 D4 D5 E1 00,00 aA 00,00 aA 02,40 bA 02,40 bA 04,00 bB 03,60 bB E2 00,00 aA 00,80 aA 00,80 aA 00,80 aA 00,00 aA 00,00 aA
Keterangan: angka yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji BNT pada taraf kepercayaan 95% huruf kecil dibaca arah horizontal dan huruf kapital dibaca vertikal
(a)                             (b)                             (c)
(d)                      (e)
Gambar 1. (a) Ekplan daun mati/tidak terbentuk kalus, skor = 0; (b) Eksplan Endosperm mati/tidak terbentuk kalus, skor = 0; (c) Eksplan daun dengan kalus friabel type 2, kalus yang teksturnya mudah pecah, skor = 4; (d)  Eksplan Endosperm dengan kalus friabel type 2, kalus yang teksturnya mudah pecah, skor = 4; (e) Eksplan daun dengan kalus kompak, skor = 2
Kultur in vitro daun dan Endosperm kluwek menghasilkan beberapa kalus. Pembentukan kalus terbentuk secara acak dan beberapa diantaranya tidak merata. Pembentukan kalus terjadi melalui beberapa tahapan yaitu, induksi, pembelahan sel, dan diferensiasi sel (Zulkarnain, 2011). Kalus merupakan jaringan yang mengalami proses diferensiasi, dimana kalus banyak muncul bila dilakukan perluasan permukaan melalui irisan pada eksplan, sehingga nantinya kalus yang terbentuk akan semakin banyak (Wattimena, 1992). Kalus yang terbentuk selain karena irisan dan pengaruh media WPM, dipengaruhi pula oleh zat pengatur tumbuh.
Kedinian terbentuknya kalus, interaksi terbaik ditunjukkan pada eksplan daun dengan konsentrasi 2,4 D 0,8 ppm dan persentase terbentuknya kalus interaksi terbaik ditunjukkan pada eksplan daun dan pemberian 2,4 D 1 ppm. Perbedaan kedinian terbentuknya kalus dipengaruhi adanya beberapa perlakuan yang tidak membentuk kalus. Menurut Indah dan Ermavitalini (2013), kalus yang tidak muncul ini dimungkinkan karena kombinasi ZPT pada media belum mampu menginduksi kalus dan terhambatnya pembentukan kalus dikarenakan hormon endogen dan eksogen yang terdapat pada eksplan tidak dapat merangsang pertumbuhan kalus dengan cepat.
Konsentrasi 2,4 D 0 ppm dan konsentrasi 0,2 ppm tidak mampu untuk memunculkan kalus, hanya pada beberapa eksplan
endosperm konsentrasi 0,2 ppm dapat memacu kemunculan kalus.
Hal ini diduga karena tidak adanya zat pengatur tumbuh dan rendahnya zat pengatur tumbuh untuk memacu kemunculan kalus pada eksplan. Menurut Malik (2003), penggunaan 2,4 D pada konsentrasi tinggi akan menghambat poliferasi tunas dan pada konsentrasi rendah akan merangsang terjadinya morfogenesis, sehingga pada konsentrasi 0 ppm kalus tidak terbentuk, sedangkan pada konsentrasi 0,2 ppm 2,4 D beberapa eksplan yang membentuk kalus dan beberapa tidak muncul kalus namun eksplan memiliki nilai pertambahan biomassa yang mengindikasikan eksplan hidup dan mengalami proses pertumbuhan.
Berat kalus terbaik ditunjukkan oleh eksplan daun dengan konsentrasi pemberian 2,4 D 0,4 ppm berdasarkan nilai kuantitas, sedangkan berdasarkan interaksi yang memiliki hubungan terbaik terdapat pada interaksi pengaruh macam eksplan dan konsentrasi eksplan daun dengan pemberian zat pengatur tumbuh 2,4 D sebesar 1 ppm. Peningkatan berat kalus dan pertambahan massa sel merupakan bagian dari bukti adanya pertumbuhan pada eksplan.
Interaksi eksplan dengan konsentrasi 2,4 D secara visual menunjukkan hasil warna berbeda. Warna kalus disebabkan adanya perubahan pigmen kalus karena pengaruh cahaya yang sangat baik sehingga klorofil yang terdapat pada media perlakuan
dan hormon yang diberikan di media perlakuan membuat pertumbuhan kalus dengan cepat (Nofanda dkk., 2016).
Kalus dibedakan menjadi beberapa tipe, tipe kompak, intermediet, dan juga tipe remah. Kalus tipe terbaik memiliki tipe remah, karena mudah untuk berkembang untuk menjadi sel-sel baru. Sel-sel tersebut dalam prosesnya terus tumbuh dan berkembang sampai membentuk jaringan baru yang pada akhirnya membentuk sebuah kalus dengan bentuk yang tidak beraturan. Bentuk-bentuk tersebut digolongkan menjadi beberapa tipe dan ditentukan nilainya. Thomy, 2012 dalam Gultom, dkk. (2015), membagi tekstur kalus dalam beberpa bentuk nilai diantaranya, Nilai 0 untuk eksplan mati dan tidak terbentuk kalus. Nilai 1 untuk terbentuk kalus friabel type 1 yaitu kalus yang teksturnya seperti kapas. Nilai 2 untuk terbentuk kalus kompak kalus kompak. Nilai 3 untuk terbentuk kalus kompak bernodul. Nilai 4 untuk terbentuk kalus friabel type 2 yaitu kalus yang teksturnya mudah pecah. Nilai 5 untuk terbentuk kalus friabel type 2 dan diikuti dengan pembentukan nodul. Nilai skoring terbaik tekstur kalus ada pada skor 4, yang menandakan bahwa nilai skor 4 adalah tipe tekstur kalus yang pertumbuhannya terbaik. Menurut Kartika dkk. (2014), perbedaan laju pertumbuhan juga dipengaruhi oleh kemampuan jaringan untuk menyerap zat-zat hara yang tersedia, hal ini banyak dipengaruhi oleh aerasi dan tekstur kalus. Kalus yang terlalu padat
dan kompak mempunyai kemampuan menyerap zat hara lebih rendah daripada tekstur kalus yang tidak terlalu padat.

## 4. Kesimpulan
Interaksi antara eksplan dengan 2,4 D berpengaruh sangat nyata terhadap semua pengamatan. Hasil terbaik, berturut-turut pada parameter kedinian kalus, pembentukan kalus, dan penambahan biomassa, ditunjukkan dengan penambahan 2,4 D 0,8 ppm, 1 ppm, dan 0,4 ppm yang terbentuk pada 14 hari, 86,67%, dan 66 mg. Parameter warna kalus pada pemberian 2,4 D konsentrasi 1 ppm dengan skor 4,2 dan tekstur kalus pada 0,8 ppm 2,4 D dengan skor 4.

## 5. Referensi
Gultom, M.S., Anna, N., dan Siregar, E.B.M. 2012. Respon Eksplan Biji Gaharu ( Aquilaria malaccensis Lamk.)
terhadap Pemberian IAA secara In Vitro . Peronema Forestry Science Journal , 1 (1): 1-6.
Gunawan, H., dan Sugiarti. 2015. Pelestarian Keanekaragaman Ex Situ Melalui Pembangunan Taman Kehati oleh Sektor Swasta: Lesson learned dari Group Aqua Danone Indonesia.
Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon, 1(3): 565-573.
Hasanah, M., dan Rusmin, D. 2006. Teknologi Pengelolaan Benih Beberapa Tanaman Obat di Indonesia. Jurnal Litbang
Pertanian , 25 (2): 68-73.
Indah, P.N., dan Ermavitalini, D. 2013. Induksi Kalus Daun Nyamplung ( Calophyllum inophyllum Linn.) pada Beberapa Kombinasi Konsentrasi 6-Benzylaminopurine (BAP) dan
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D). Jurnal Sains dan Seni Pomits , 2 (1): 1-6.
Kartika, L., Atmodjo, P.K., dan Purwijantiningsuh, L.M.E. 2014.
Kecepatan Induksi Kalus dan Kandungan Eugenol Sirih Merah ( Piper crocatum Ruiz and Pav.) yang diperlakukan Menggunakan Variasi Jenis dan Konsentrasi Auksin. e-
journal uajy , 1 (1): 1-15.
Malik, S. I., Rashih, T., Yasmin, dan N. M. Minhas. 2003. Effect of 2,4 Dichlorophexyacetic acid on Callus Induction from
Mature Wheat ( Triticum aestivum L.) Seeds. Ints. Agri. Bid,
6 (1).
Nofanda, H., Rahayu, T., dan Hayati, A. 2016. Peranan Penambahan BAP dan NAA pada Pertumbuhan Kalus
Kedelai ( Glycine max ) Menggunakan Media B5. e-Jurnal Ilmmiah Biosaintropis (BIOSCIENCE-TROPIC) ,  2 (1): 35-
45.
Wattimena, GA. 1992. Bioteknologi Tanaman . Departemen P dan
K. Dirjen Pendidikan Tinggi. PAU Bioteknologi Bogor.
Yohar, Supintri. 2012. Kepayang Tanaman Konservasi Bernilai
Ekonomi . Yayasan Genesis, Mukomuko.
Zulkarnain, dan Lizawati. 2011. Proliferasi Kalus dari Eksplan Hipokotil dan Kotiledon Tanaman Jarak Pagar ( Jathropa
curcas L.) pada Pemberian 2,4 D. Jurnal Natur Indonesia,
14 (1): 19-25. ISSN 1410-9.