## ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN PRODUKSI ETANOL KHAMIR INDIGENOUS
NIRA SIWALAN ( Borassus flabellifer L.) DARI TUBAN, JAWA TIMUR, INDONESIA
Ekwan Nofa Wiratno 1)* , Novi Soleman Rupilu 1)
1 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya
*) Alamat korespondensi: ekwanwiratno@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  dan  mengidentifikasi  isolat  khamir  dari  nira  siwalan ( Borassus  flabellifer L.)  serta  mengetahui  potensinya  dalam  produksi  etanol.  Tahapan  penelitian  ini  meliputi isolasi,  enumerasi,  karakterisasi,  identifikasi  dan  produksi  etanol  serta  pengukuran  konsentrasi  etanol  dan keasaman  media  selama  proses  fermentasi.  Total  khamir yang  berhasil  diisolasi dari  nira  siwalan  ( Borassus flabellifer L.)  adalah 5,06  x  10 5 CFU/mL  dan  diperoleh  satu  isolat  (U2)  yang  teridentifikasi  secara  fenotipik sebagai Candida  tropicalis (%  ID  95,7%  dan  T  =  1).  Selama  proses  fermentasi  etanol  terjadi  penurunan keasaman media. Khamir isolat U2 mampu memproduksi etanol sebesar 140,1 g/L menggunakan glukosa 50 g/L dan  tidak  berbeda  secara  signifikan  dibandingkan  hasil  produksi  etanol  dari Saccharomyces  cerevisiae (148,6 g/L).
Kata kunci : Borassus flabellifer L. , Candida tropicalis , etanol, khamir

## ISOLATION, IDENTIFICATION AND ETHANOL PRODUCTION OF INDIGENOUS
YEAST OF TODDY PALM ( BORASSUS FLABELLIFER L.) JUICE FROM TUBAN,

## EAST JAVA, INDONESIA
Ekwan Nofa Wiratno 1)* , Novi Soleman Rupilu 1)
1 Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Brawijaya
*) Email: ekwanwiratno@gmail.com

## ABSTRACT
This study aimed to obtain and identify the indigenous yeasts isolated from Borassus flabellifer L. juice and  its  potency  in  ethanol  production.  Steps  of  this  study  included  isolation,  enumeration,  characterization, identification  and  ethanol  production  and  measurement  of  ethanol  concentrations  and  medium  acidity  during fermentation. The yeast total isolated from Borassus flabellifer L. juice was 5.06 x 10 5 CFU/mL and the isolate U2  was  phenotypically  identified  as Candida  tropicalis (95.7%  ID  and  T  =  1).  The  pH  level  of  medium decreased during the ethanol fermentation. Yeast isolate U2 was able to produce ethanol by 140.1 g/L using 50 g/L of glucose and it was not significantly different with ethanol yield fermented by Saccharomyces cerevisiae (148.6 g/L).
Keywords: Borassus flabellifer L. , Candida tropicalis , ethanol, yeast

## PENDAHULUAN
Isu  sentral  berkaitan  dengan  lingkungan dan  energi  dalam  dekade  terakhir  ini  adalah pemanasan  global  dan  penurunan  produksi bahan  bakar  fosil.  Penggunaan  bahan  bakar fosil  mengakibatkan  polusi  karbondioksida (CO 2 ) yang membahayakan kehidupan manusia  [1].  Penurunan  produksi  bahan  bakar
fosil  juga  terjadi  di  Indonesia.  Tahun  2011, produksi  bahan  bakar  fosil  Indonesia  menurun sebesar  36,36  %  dibandingkan  dengan  tahun  2000 [2].
Hal tersebut mendorong perkembangan eksplorasi  bahan  bakar  alternatif  yang  tidak mengakibatkan  polusi  dan  bersifat  terbarukan. Salah satu bahan bakar alternatif yang aman adalah etanol. Etanol berfungsi sebagai penambah volume
Bahan Bakar Minyak (BBM), peningkat angka oktan  dan  sebagai  sumber  oksigen  untuk pembakaran yang lebih bersih [3].
Salah satu metode pembuatan etanol yang umum  dilakukan  adalah  fermentasi.  Bahan baku proses fermentasi berupa mono/disakarida  (gula  tebu,  tetes  tebu),  bahan berpati  (padi,  jagung  atau  umbi)  dan  bahan berselulosa (kayu dan limbah pertanian) [4].
Selama  ini  nira  siwalan  ( Borassus flabellifer L.) hanya  dimanfaatkan  sebagai minuman  dan  tidak  dimanfaatkan  secara  luas dalam  pemenuhan  kebutuhan  energi  alternatif. Nira siwalan ( Borassus flabellifer L.) memiliki kadar gula sebesar 10-20 % dan produktivitasnya  mencapai  20  ton  per  hektar per tahun [5].
Produksi etanol secara umum
menggunakan  khamir  dan  bakteri.  Khamir yang  paling  umum  dimanfaatkan  dalam produksi etanol adalah Saccharomyces cerevisiae .  Eksplorasi  khamir indigenous dari nira  siwalan  ( Borassus  flabellifer L.)  perlu dilakukan  untuk  mendapatkan  khamir  yang lebih adaptif dalam proses produksi etanol.

## METODE PENELITIAN
Isolasi  Khamir. Nira  siwalan  ( Borassus flabellifer  L. )  asal  Kota  Tuban,  Jawa  Timur sebanyak  25  mL  dimasukkan  ke  dalam akuades steril sebanyak 225 mL secara aseptis (pengenceran  10 -1 ).  Suspensi  tersebut  dibuat pengenceran  bertingkat  dalam  akuades  steril hingga  10 -6 .  Suspensi  nira  sebanyak  0,1  mL pada  tiap  pengenceran  diinokulasikan  secara pour plate pada media Yeast Malt Agar ( 3 g/L yeast extract , 3 g/L malt extract , 5 g/L pepton, 50 g/L glukosa dan 20 g/L agar) [6]. Enumerasi  dan  Karakterisasi  Khamir.
Khamir  yang  tumbuh  setelah  inkubasi  selama 48  jam  dihitung  jumlahnya  menggunakan metode  TPC  dan  dikarakterisasi  berdasarkan karakter  morfologi  koloni  (warna,  bentuk, pinggiran,  tekstur,  elevasi)  dan  sel  (bentuk, diameter, pseudohifa, askospora).
Identifikasi Khamir. Khamir murni hasil isolasi diidentifikasi secara fenotipik menggunakan API 20C AUX.
Produksi  Etanol. Etanol  diproduksi menggunakan media fermentasi etanol (50 g/L glukosa,  1  g/L yeast  extract ,  5  g/L KH 2 PO 4, 2 g/L (NH 4 ) 2 SO 4, 0,4 g/L MgSO 4 .7H 2 O, pH 5,0) [7]. Fermentasi  dilakukan selama 72 jam pada suhu  30  °C,  120  rpm  dalam  kondisi  anaerob.
Produksi  etanol  khamir  hasil  isolasi  dibandingkan dengan  isolat  kontrol  yaitu Saccharomyces cerevisiae .
Pengukuran Etanol.
Etanol diukur menggunakan metode asam dikromat [8] pada awal fermentasi  dan  akhir  fermentasi.  Perubahan  pH awal  fermentasi  dan  akhir  fermentasi  ditentukan menggunakan pH meter.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Enumerasi  dan  Karakterisasi  Khamir
Berdasarkan penghitungan diketahui bahwa khamir yang  tumbuh  dari  nira  berjumlah  5,06  x  10 5 CFU/mL. Hasil karakterisasi morfologi  koloni  dan sel  khamir  didapatkan  satu  isolat  dengan  karakter yang sama seperti pada Tabel 1 dan diberikan kode isolat U2.
Identifikasi Khamir. Hasil identifikasi secara  fenotipik  isolat  U2  menggunakan  API  20C AUX menunjukkan bahwa isolat tersebut memiliki kesamaan dengan Candida tropicalis dengan % ID 95,7%  dan  T  sebesar  1.  Hasil  identifikasi  tersebut tergolong valid karena % ID lebih dari 95 % dan T antara 0,5-1.
Candida  tropicalis ditemukan  juga  pada  nira Borassus  flabellifer L. dari  Thailand  bersama dengan Kloeckera  apiculata , Kloeckera  japonica, Candida  krusei, dan Candida  valida [9].  Nira Borassus  akeassii dari  Burkina  Faso,  Afrika  Barat juga  terdapat  khamir Candida  tropicalis bersama dengan beberapa khamir lain seperti
Saccharomyces cerevisiae dan Candida pararugosa [10].
Produksi  Etanol.  Khamir isolat  U2  mampu memproduksi etanol sebesar 140,1 g/L menggunakan  glukosa  50  g/L. Hasil tersebut  tidak berbeda  signifikan  dengan konsentrasi etanol  hasil produksi Saccharomyces  cerevisiae (148,6  g/l) ( α =0,05). Produksi etanol menggunakan bahan pati ketela  pohon  oleh Candida  tropicalis BCC7755 sebesar  143  g/L  [12]  sedangkan  menggunakan glukosa  100  g/L  oleh C.  tropicalis TERI  SH  110 menghasilkan etanol dengan konsentrasi 214,2 g/L [13].
Tabel 1 . Karakter morfologi koloni dan sel khamir isolat U2 Karakter Khamir Koloni Warna Putih Bentuk Circular Elevasi Convex Tepi Entire Tekstur Smooth Sel Bentuk Oval Diameter 5 μm Pseudohypha Ada Ascospore Tidak ada Gambar 1 . Sel khamir isolat U2 dari Borassus flabellifer L.
Gambar 2 .  Konsentrasi etanol dan keasaman media selama proses  fermentasi  oleh  isolat U2  ( C.  tropicalis ) dan S.
cerevisiae
Selama  proses  fermentasi  etanol  terjadi proses penurunan keasaman media. Perubahan keasaman  media  kedua  isolat  tersebut  tidak berbeda  signifikan  ( α =0,05).  Setelah  72  jam fermentasi, keasaman media isolat U2
( Candida  tropicalis )  sebesar  4,33  sedangkan
keasaman media Saccharomyces cerevisiae sebesar 4,32.  Penurunan  keasaman  medium  tersebut mengindikasikan terjadinya proses fermentasi yang menghasilkan  CO 2 ,  asam  asetat  dan  asam  formiat. Penurunan keasaman medium berhubungan dengan konsumsi nitrogen dan pelepasan ion H + [11].

## KESIMPULAN
Khamir  isolat  U2  dari  nira  siwalan  ( Borassus flabellifer L.) berjumlah  5,06  x  10 5 CFU/mL  dan teridentifikasi  sebagai Candida  tropicalis (%  ID 95,7  %  dan  T=1).  Khamir  isolat  U2  ( Candida tropicalis )  mampu  memproduksi  etanol  sebesar 140,1 g/L menggunakan glukosa 50 g/L yang tidak berbeda  secara  signifikan  dengan  hasil  produksi Saccharomyces cerevisiae (148,6 g/L). Oleh karena itu,  isolat  U2  ( Candida  tropicalis ) berpotensi sebagai agen fermentasi untuk produksi etanol dari nira siwalan ( Borassus flabellifer L.).

## DAFTAR PUSTAKA
[1] De Oliveira, M.E.D., B.E. Vaughan, & E.J. Rykiel. 2005. Ethanol as fuel: Energy, carbon dioxide balances, and ecological footprint. BioScience. 55(7): 593-602.
[2] Pusdatin ESDM. 2012. Handbook of energy and economic statistics of Indonesia 2012. Kementerian Energi dan Sumber Daya
Mineral. Jakarta. [3] Goksungur, Y. & N.  Zorlu. 2001. Production of ethanol from beet molasses by Ca-alginate immobilized yeast cells in a packed-bed bioreactor. Turkey Journal of Biology. 25: 265-275.
[4] Bailey, J.E. & D.F. Ollis. 1986. Biochemical engineering fundamentals, 2 nd edition. McGraw-Hill Book Co. Singapore. [5] Naknean, P., Meenune, M. & Roudaut, G. 2010. Characterization of palm sap harvested in Songkhla Province, Southern Thailand. International Food Research Journal. 17: 977-986.
[6] Aung, W., Y. Watanabe & F. Hashinaga. 2012. Isolation and phylogenetic analysis of two thermotolerant, fermentative yeast strains from liquid tapé ketan (Indonesian rice wine). Food Science and Technology Research.
18(2): 143-148.
[7] Cheng, N.G., M. Hasan, A. C. Kumoro, C.F. Ling & M. Tham. 2009. Production of ethanol by fed-batch fermentation. Pertanika
Journal of Science & Technology. 17(2):
399-408.
[8] Caputi, A Jr, M. Ueda & T. Brown. 1968. Spectrophotometric determination of ethanol in wine .  American Journal
Enologi and Viticulture. 3(19): 160-165.
[9] Tuntiwongwanich, S. & B. Leenanon. 2009. Morphology and identification of yeasts isolated from toddy palm in Thailand. Journal of Microscopy Society of Thailand. 23(1): 34-37.
[10] Ouoba, L. I., C. Kando, C. Parkouda, H. Sawadogo-Lingani, B. Diawara & J. P. Sutherland. 2012. The Microbiology of bandji, palm wine of Borassus Akeassii from Burkina Faso: Identification and genotypic diversity of yeasts, lactic acid and acetic acid bacteria. Journal of Applied Microbiology. 113(6): 1428-
1441.
[11] Wiratno, E.N., T. Ardyati & A.K. Wardani. 2014. Effect of reducing sugar and total nitrogen to ethanol production from molasses by Saccharomyces cerevisiae . Journal of Experimental Life Science. 4(2): 50-55.
[12] Rattanachomsri, U., S. Tanapongpipat, L. Eurwilaichitr & V. Champreda. 2009.
Simultaneous non-thermal saccharification of cassava pulp by multi-enzyme activity and ethanol fermentation by Candida tropicalis . Journal of Bioscience and Bioengineering. 107(5): 488–493.
[13] Patlea, S. & B. Lalb. 2008. Investigation of the potential of agro-industrial material as lowcost substrate for ethanol production by using Candida tropicalis and Zymomonas mobilis . Biomass and Bioenergy. 32: 596 – 602.