## Identifikasi Keragaman Gen Leptin pada sapi Bali dan kambing Kacang (Polymorphism of Leptin Gene in Bali Cattle and Kacang Goat)
Nining Syarifulaya 1) , Made Sriasih 2) , Maskur 3)
1). Mahasiswa Pascasarjana Program Studi Sumberdaya Peternakan Program Pascasarjana
Universitas Mataram
2). Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi;
3). Laboratorium Genetika dan Pemuliaan Ternak Fakultas Peternakan Universitas Mataram, Jalan
Majapahit No. 62 Mataram 83125
e-mail: nining_syarifulaya@yahoo.com
Diterima : 7 Maret 2015/ Disetujui:  27   Mei 2015

## ABSTRACT
The purpose of this research was to identify polymorphism of leptin gene in Bali cattle and Kacang goat by PCR-RFLP technique. Material used was blood samples collected from 50 head of Bali cattle and 50 head of Kacang goat. Identification procedure was consisted of three stages namely extraction of DNA genom, PCR amplication of leptin gene (552bp on intron 2-exon 3) and RFLP method using enzyme    restriction  ( BsaA1 ).  Primer  sequences  used  were forward primer:  5'GTCTGGAGGCA AAGGGCAGAGT-3'and reverse primer: 5'CCACCACCTCTGTGGAGTAG-3'. Data analyzed were frequency of allele, genotype frequency, heterozygosity value, and value of Polymorphic Informative Content (PIC). The results of this study indicate that three genotypes (AA, AG and GG) were found on  Bali  cattle  whilst  only  two  genotypes  (AA  andAG)  were  on  Kacang  goat.  The  values  of heterozygosity  observation  (Ho)  and  expectation  heterozygosity  (He)  on  Bali  cattle  were  0.08  and 0.48  respectively.  Kacang  goat  showed  the  value  of  0,14  (Ho)  and  0.14  (He).  The  PIC  value  of Leptin- BsaA1 gene on  Bali cattle  was 0.43 (moderate high), and on  Kacang  goat considered as low (0.13).  These  results  showed  than  Leptin- BsaA1 in  Bali  cattle  and  Kacang  goat  may  be  used  as  a genetic marker for selection.
Key words: genetic polymorphism, leptin gene, Bali cattle, Kacang goat

## PENDAHULUAN
Sapi  Bali  dan  kambing  Kacang  merupakan sumber  daya  genetik  yang  perlu  dikembang biakkan.  Ke-ragaman  performa  tubuh  baik pada  sapi  Bali  dan  kambing  Kacang dipengaruhi oleh variasi genetik yang ada pada ternak  tersebut,  maka  untuk  meningkatkan performa tubuh sapi Bali dan kambing Kacang perlu  dilakukan  identifikasi  keragaman  gen dengan  memanfaatkan  teknologi  molekuler yang  sudah  mulai  berkembang  saat  ini. Pengukuran  potensi  ternak  dapat  diamati melalui  sifat  pertumbuhan  yang  banyak dikendalikan oleh gen. Salah satu gen penting yang  mempengaruhi  pertumbuhan  sapi  Bali dan  kambing  Kacang  adalah  gen Leptin (LEP).Leptin  merupakan  kandidat  utama
sebagai  marker  genetik  untuk  sifat  produksi (Maskur et al. , 2008).
Keanekaragaman gen mengakibatkan varia- si  antar  individu  sejenis.  Keragaman  genetik terdapat  dalam  suatu  individu  bilamana  dua alel untuk gen yang sama merupakan perbeda- an  konfigurasi  DNA  yang  menduduki  lokus yang sama pada suatu kromosom (Indrawan et al., 2007).
Strategi  kandidat  gen  merupakan  teknik biologi  molekuler  untuk  mengidentifikasi lokus sifat kuan-titatif secara langsung, dengan asumsi  bahwa  variasi  genetik  pada  kandidat gen  ini  berpengaruh  terhadap  proses  metabo- lisme  sehingga  mengakibatkan  variasi  sifat kuan-titatif.  Gen Growth  hormone (GH) , Leptin dan Gen  Pituitary  Specific  Positive
Transcription Factor1 ( Pit1 / Hinf1 ) merupakan kandidat  utama  sebagai  marker  genetik  untuk sifat  produksi  (Maskur et  al .,  2008). Leptin memiliki  massa  sekitar  16  kDa  yang disekresikan  oleh  jaringan  adipose  yang mempengaruhi pertumbuhan dan metabolisme serta  memiliki  peran  penting  dalam  regulasi konsumsi pakan, kese-imbangan energi, kesuburan, pro-duksi susu dan fungsi kekebal- an tubuh (Singh et al ., 2012).
Gen  Leptin  sapi  terletak  pada  kromosom ke  4,  dengan  panjang  16,735  kb,  meliputi  3 ekson  dan  kode  protein  dari  167  asam  amino yang  mencakup  21  urutan  asam  amino (Taniguchi et al., 2002).
Polimorfisme  gen  leptin  dapat  mempe- ngaruhi  pengaturan  gen  dan  mempengaruhi pertambahan  berat  badan.  Beberapa  mutasi gen  leptin  pada  sapi  FH  berassosiasi  dengan produksi  susu,  konsumsi  pakan  dan  konsen- trasi plasma leptin selama kehamilan (Liefers, et  al ,  2005).  Pada  domba,  polimor-fisme  gen Leptin  dapat  mempengaruhi  per-tumbuhan otot,  lemak  dan  kualitas  karkas  (Boucher et al .,  2006).  Menurut  Shojaei et  al .(2010)  poli- morfisme  gen  leptin  pada  domba  kermani dapat  mempengaruhi  sifat  pertumbuhan  dan dapat digunakan sebagai  pengembangan seleksisecara  genetik  untuk  meningkatkan berat badan.
Leptin  berperan  dalam  perkem-bangan folikel  dan  pematangan  oosit  pada  ovarium kambing  (Batista et  al .,  2013).  Menurut
Maskur et  al. (2008),  pengembangan  marker se-leksi  dari  beberapa  kandidat  gen  yang berasosiasi  dengan  sifat  produksi  sapi  Bali menunjukkan  bahwa  polimorfisme  gen Pit 1- Hinfl dan  gen Leptin-BsaA1 pada  sapi  Bali memiliki  pengaruh  yang  signifikan  terhadap berat lahir dan pertambahan berat badan harian ternak.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidenti- fikasi  keragaman  gen Leptin pada  sapi  Bali dan  kambing  Kacang  dengan  menggunakan me-tode  PCR-RFLP.  Hasil  penelitian  ini diharapkan  dapat  memberikan  infor-masi genetik  dari  sapi  Bali  dan  kambing  Kacang, sehingga  gen Leptin dapat  digunakan  sebagai penciri  genetik  dalam  pelaksanaan  seleksi untuk  sifat  pertumbuhan  sapi  Bali  dan kambing Kacang.

## MATERI DAN METODE Hewan percobaan
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium Imunobiologi  FMIPA  Universitas  Mataram menggunakan  sampel  darah  50  ekor  sapi  Bali dan  50  ekor  kambing  Kacang.  Identi-fikasi keragaman gen Leptin - BsaA1 dilakukan menggunakan teknik PCR-RFLP.

## Desain primer gen Leptin
Desain  primer  gen Leptin - BsaA1 yang digunakan  pada  penelitian  ini  disajikan  pada Tabel 1. Tabel 1. Sekuen primer dan enzim restriksi gen Leptin Jenis primer Sekuen DNA Enzim restriksi Target leptin Leptin F:5’GTCTGGAGGCAAAGGGCAGAGT -3’ R : 5’ CCACCACCTCTGTGGAGTAG -3’ BsaA1 522 bp
Sumber : Choudhary et al. , 2005

## Ekstraksi DNA genom
Materi  utama  penelitian  ini  adalah  DNA genom yang diperoleh dari darah sapi Bali dan kambing  Kacang  masing-masing  sebanyak  50 ekor.  DNA  diisolasi  dan  dimurnikan  meng- gunakan  metode  ekstraksi  phenol  chloroform untuk  mende-gradasi  protein  dan  lemak  yang dipresipitasi  menggunakan  etanol  absolut (Sambrook et al., 1989).

## Amplifikasi DNA
Untuk  menghasilkan  fragmen  DNA  dari gen Leptin dilakukan  amplifikasi  dengan menggunakan  primer  yang  diadopsi  dari Choudhary et  al., 2005  (Tabel  1).  Fragmen gen Leptin yang  diampli-fikasi  dengan  primer tersebut berukuran 522 bp.
Amplifikasi  dilakukan  dengan  mesin  PCR ( Polymerase  Chain  Reaction ).  Kondisi  mesin
PCR  dimulai  dengan  denaturasi  awal  pada
suhu 94 o C x 5 menit, diikuti dengan 35 siklus berikutnya  masing-masing  denaturasi  94 o C selama  5  detik,  dengan  suhu annealing :  64 o C selama 30 detik, yang dilanjutkan dengan satu siklus ekstensi awal pada 72 o C selama 1 menit dan  ekstensi  akhir  pada  suhu  72 o C  selama  5 menit dengan menggunakan mesin PCR.
Produk  PCR  kemudian  di  elektro-foresis pada  gel  agarose  1,5%  yang  diwarnai  dengan Ethidium  Bromide  (EtBr).  Kemudian  divisu- alisasi den-gan proses elektroforesis dan pem- bacaan  pita  DNA    dengan  meng-gunakan gel documentation system .
Polymerase chain reactionrestric-tion fragment  length  polymer-phism  (PCR- RFLP)
Produk  PCR  yang  diperoleh  dari  masing- masing  gen  target  kemudian  dianalisis menggunakan  RFLP  me-lalui  pemotongan menggunakan  en-zim  restriksi  yang  memiliki situs  pemotongan  pada  gen Leptin-BsaA1 . Sebanyak  10  µL  produk  PCR;  1,5  µL NEBuffer  (10x);  ditambahkan  0,5  µL  (0,25 unit) enzim restriksi BsaA1 ; ddH 2 0 sebanyak 3 µl  selanjutnya  dilakukan  inkubasi  selama  16 jam  pada  suhu  37 o C.  Kemudian  divisuali- sasikan  dengan  elektro-foresis  menggunakan gel  agarose  2%    pewarnaan  dengan  EtBr  dan pembacaan  pita  DNA    dengan  meng-gunakan gel documentation system .

## Analisa data
Nilai  frekuensi  alel,  frekuensi  genotip, Heterozigositas  pengamatan  (Ho)  dan  Hetero- zigositas  harapan  (He)  dihitung  berdasarkan rumus  Nei  (1987).  Nilai  Keseimbangan Hardy-Weinberg dihitung dengan rumus Hartl dan  Clark  (1997)  dan  Nilai Polymorphic Informative  Content (PIC)  dihitung  berdasar- kan rumus Bostein et al. (1980).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi  gen  Leptin  pada  sapi  Bali  dan kambing Kacang
Gen  Leptin    pada  sapi  Bali  dan  kambing Kacang  berhasil  di  amplifikasi  dengan  teknik PCR ( Polymerase Chain Reaction ).
Panjang  fragmen  yang  dihasilkan  adalah 522  bp.  Hasil  amplifikasi  gen  Leptin  yang dapat  divisualisasikan  pada  gel agarose 1,5% dapat dilihat pada Gambar 1.
Genotip  gen  Leptin  pada  sapi  Bali  dan kambing Kacang
Gen  Leptin  terletak  pada Exon 3  dengan produk  PCR  berukuran  522  bp,  yang selanjutnya  dipotong  dengan  menggunakan enzim  restriksi BsaA1 ,  pada  situs  ke  2793 dengan posisi titik potong AC|GT (Gambar 2).
Pemotongan  enzim BsaA1 meng-hasilkan  alel A  dan  alel  G.  Alel  A  berukuran  522  bp  dan alel  G  berukuran  81  bp.  Pada  sapi  Bali diperoleh  3  genotip  yaitu  AA  dengan  satu fragmen  (522  bp),  GG  dengan  dua  fragmen (441  bp  dan  81  bp)  dan  genotip  AG  dengan
menghasilkan  tiga  fragmen  (522  bp,  441  bp dan 81 bp) (Gambar 3).
Genotip  kambing  Kacang  yang  dihasilkan pada penelitian ini adalah AA dengan fragmen 522  bp  dan  genotip  AG  dengan  fragmen  522 bp,  441  bp  dan  81  bp  sedangkan  genotip  GG tidak ditemukan (Gambar 4).
Pemotongan  pada  lokus BsaAI terjadi karena  mutasi  yang  men-yebabkan  enzim BsaA1 mengenali daerah tersebut sebagai situs potong.  Sebagai  akibatnya,  terdapat  satu  titik pemotongan enzim BsaA1 yang menghasilkan 2 fragmen. Mutasi pada lokus ini diperkirakan adalah  mutasi  transisi  yang    menyebabkan terjadinya  perubahan  basa  dari  Guanin  (G) menjadi Adenin (A) substitusi.
4

## Frekuensi alel dan frekuensi genotip
Frekuensi  alel  adalah  frekuensi  relatif  dari suatu  alel  dalam  populasi  atau  jumlah  suatu alel  terhadap  total  alel  yang  terdapat  dalam suatu  populasi  (Nei  dan  Kumar.,  2000).  Nilai frekuensi alel dan frekuensi genotip gen Leptin
pada  sapi  Bali  dan  kambing  Kacang  disajikan pada Tabel 2.
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilaku- kan  diperoleh  hasil  yaitu  frekuensi  alel  untuk alel  A  pada  sapi  Bali  (0,76)  dan  kambing Kacang  (0,93),  sedangkan  frekuensi  alel  G pada  sapi  Bali  (0,24)  dan  kambing  Kacang (0,07). Dilihat dari data, frekuensi alel A lebih tinggi  dari  alel  G  baik  pada  sapi  Bali  dan kambing  Kacang.  Data  ini  menunjukkan bahwa  populasi  yang  diamati  be-ragam.  Hal ini  sesuai  dengan  pendapat  Nei  dan  Kumar (2000)  bahwa  gen  dikatakan  polimorfik (beragam)  apabila  salah  satu  alel  kurang  dari 99%.  Keragaman  dapat  ditunjukkan  dengan adanya dua alel atau lebih dalam satu populasi.
Tabel 2. Nilai frekuensi alel dan frekuensi genotip gen Leptin pada sapi Bali dan kambing Kacang
Populasi Jumlah sampel Frekuensi Alel Frekuensi genotip ᵡ 2 (HWE) ᵡ 2 (0,05) A G AA AG GG Bali cattle 50 0.76 0.240 0.72 0.2 0.08 30.43 * 5,991 Kacang goat 50 0.93 0.070 0.86 0.14 0.00 0.28 ns 3,841
Keterangan : * = χ 2 hitung > χ 2 tabel 0,05 (tidak seimbang) ns = χ 2 hitung < χ 2 tabel 0,05 (seimbang)
Hasil  penelitian  ini  sesuai  dengan  pendapat Azari et  al. (2012)  pada  sapi Mazandarani menunjukkan  frekuensi  alel  A  (0,56)  lebih tinggi  diban-dingkan  alel  B  (0,44).Sedangkan menurut  Choudhary et  al. (2005)  pada Bos indicus dan Bos Taurus frekuensi alel G lebih tinggi diban-dingkan dengan alel A.
Frekuensi genotip AA pada sapi Bali  lebih tinggi  dibandingkan  de-ngan  genotip  GG  dan AG. Hasil yang berbeda dilaporkan oleh Azari et al. (2012) pada populasi sapi perah Holstein dan  kerbau Mazandarani yang  menunjukkan frekuensi  genotip  AB  lebih  tinggi  diban- dingkan  dengan  genotip  AA  dan  BB. Sedangkan  menurut  Choudhary et  al. (2005) pada Bos  indicus dan Bos  Taurus ,  frekuensi genotip AA lebih rendah dibandingkan dengan genotip GG dan AG.
Frekuensi genotip AA (0,86) pada kambing Kacang  lebih  tinggi  di-bandingkan  dengan genotip  AG  (0,14).  Sedangkan  genotip  GG tidak  ditemukan  pada  kambing  Kacang.  Hal ini  disebabkan  oleh  peng-gabungan  alel  pada gen  leptin  terjadi  secara  acak,  sehingga  ge-
notip  GG  tidak  ditemukan  pada  kambing Kacang.

## Keseimbangan Hardy-Weinberg
Pengujian  keseimbangan  Hukum  Hardy- Weinberg  pada  populasi  sapi  Bali  dan kambing  Kacang  dilakukan  dengan  meng- gunakan  uji chi-square untuk  mengetahui apakah  data  pengamatan  diperoleh  menyim- pang  atau  tidak  menyimpang  dari  yang diharapkan.
Pada  penelitian  ini  (Tabel  2)  nilai chi square pada  sapi  Bali  (30,47)  tersebut menunjukkan  bahwa  pada  sapi  Bali  tidak berada dalam kese-imbangan Hardy- Weinberg, Ketidak-seimbangan genetik dalam populasi  sapi  Bali  diduga  disebabkan  oleh adanya  kegiatan  seleksi  yang  dilakukan  oleh peternak. Pendugaan ini diperkuat oleh sampel darah  sapi  Bali  yang  digunakan  pada  peneli- tian  ini  merupakan  peternakan  sapi  Bali  yang dipelihara secara intensif serta proses perkawinan dalam populasi tidak terjadi secara acak.  Nilai chi  square yang  dihasilkan  pada
kambing Kacang (0,28).  Hal ini menunjukkan bahwa populasi kam-bing Kacang yang diteliti berada  dalam  keseimbangan  Hardy-Wein- berg.  Keseimbangan  genetik  dalam  populasi kambing  Kacang  diduga  disebabkan  oleh karena  belum  adanya  kegiatan  seleksi  yang dilakukan  oleh  peternak.Pendugaan  ini  diper- kuat  bahwa  populasi  kambing  Kacang  masih dipelihara  secara  tradisional,  tidak  pernah dilakukan  seleksi  dan  kemungkinan  terjadi perkawinan  secara  acak  pada  populasi kambing Kacang.
Suatu  populasi  dikatakan  dalam  keseim- bangan  Hardy-Weinberg  yaitu  jika  frekuensi genotip  dan  frekuensi  alel  selalu  konstan  dari generasi  ke  generasi  berikutnya  akibat  peng- gabungan  gamet  yang  terjadi  secara  acak dalam  populasi  besar  (Vas-concellos et  al ., 2003).
Keseimbangan  genotip  dalam  populasi yang cukup besar terjadi jika tidak ada seleksi, mutasi, migrasi dan genetic drift . Genetic drift adalah  perubahan  frekuensi  genotip  yang
diakibatkan  oleh  fluktuasi  acak  akibat  adanya peluang  dalam  pola  perkawinan,  kesalahan pengambilan  sampel  dan  perubahan  frekuensi mendadak  akibat  adanya  faktor  lingkungan (misalnya  bencana  alam).  Sebaliknya  jika terjadi akumulasi genotip, populasi yang terba- gi,  mutasi,  seleksi  migrasi  dan  per-kawinan dalam kelompok yang sama (endogami), dapat menyebabkan  terjadinya  ketidakseimbangan genotip.
Nilai heterozigositas dan polymorphic informative content (PIC)
Menurut Nei dan Kumar (2000) keragaman genetik dapat diukur berdasarkan nilai hetero- zigositas.  Nilai  heterozigositas  meru-pakan rataan persentase lokus heterozigot tiap indivi- du  atau  rataan  persentase  individu  heterozigot dalam populasi.
Hasil  analisis  pendugaan  nilai  heterozi- gositas  dan  PIC  gen Leptin disajikan  pada Tabel 3.
Tabel 3. Nilai Heterozigositas dan PICgen Leptin pada sapi Bali dan kambing kacang
Populasi Jumlah sampel Nilai heterozigositas PIC Ho He Sapi Bali 50 0,08 0,48 0,43 Kambing  Kacang 50 0,14 0,14 0,13 Keterangan: Ho=heterozigositas pengamatan; He=heteozigositas harapan; PIC= olymorphic Informative Content
Pada  sapi  Bali,  nilai  Ho  dan  He  yang dihasilkan  masing-masing  sebesar  0,08  dan 0,48,  dimana  nilai  He  lebih  tinggi  dari  Ho. Pada kambing Kacang  nilai Ho (0,14) dan He (0,14)  tidak  menunjukkan  perbedaan  yang signifikan. Kondisi ini mengindikasikan bahwa  frekuensi  genotip  dari  populasi kambing  Kacang  dalam  keadaan  keseim- bangan.  Tambasco et  al .  (2003)  menyatakan bahwa jika terjadi perbedaan yang besar antara nilai  heterozigositas  pengamatan  (Ho)  dan nilai heterozigositas harapan (He), maka dapat dijadikan  indikator  adanya  ketidak  seimbang- an  genotip  pada  populasi  yang  dianalisis. Machado et al . (2003) menyatakan bahwa jika nilai  heterozigositas  pengamatan  (Ho)  lebih rendah  nilai  heterozigositas  harapan  (He) dapat mengindikasikan adanya derajat
endogami  (perkawinan  kelompok)  sebagai akibat dari adanya proses seleksi yang intensif. Secara  umum  nilai  heterozigositas  harapan merupakan indicator yang baik sebagai penciri genetik  yang  dapat  men-jelaskan  kera-gaman genetik  pada  suatu  populasi  ternak  domestik. Nilai Polymorphic  Informative  Content (PIC) merupakan  salah  satu  parameter  yang  menun- jukkan  tingkat  informatif  suatu  penciri/ marker. Hasil pendugaan nilai PIC gen leptin- BsaA1 pada  sapi  Bali  dan  kambing  Kacang masing-masing  sebesar  0,43  dan  0,13. Menurut  Botstein et  al .  (1980)  menyatakan bahwa kriteria PIC termasuk dalam kelompok rendah  jika  nilai  PIC  <  0,25,  nilai  PIC termasuk  katagori  sedang  adalah  antara  0,25- 0,5 dan termasuk kategori tinggi bila nilai PIC > 0,5.
Berdasarkan  pernyataan  tersebut  maka  nilai PIC gen leptin- BsaA1 pada sapi Bali termasuk kategori  sedang  dan    nilai  PIC  pada  kambing kacang  termasuk  kategori  rendah.  Dengan demikian  gen  leptin- BsaA1 pada  sapi  Bali pada  penelitian  ini  mempunyai  tingkat informasi  genetik  yang  lebih  tinggi  dari  pada
kambing  Kacang.  Sapi  Bali  memiliki  potensi lebih tinggi sebagai penciri genetik gen Leptin dibandingkan dengan kambing Kacang. Semakin  besar  nilai  PICsuatu  primer  maka primer  tersebut  semakin  baik  untuk  diguna- kan sebagai penanda molekuler.

## SIMPULAN DAN SARAN

## Simpulan
Gen  leptin  pada  sapi  Bali  dan  Kambing Kacang  bersifat  polimorfik.  Gen  leptin menunjukkan  bahwa  terdapat  keseimbangan populasi  genotip  pada  kambing  Kacang  dan pada  sapi  Bali  tidak  terjadi  keseimbangan populasi  genotip.  Nilai  infor-masi  genetik pada  kambing  Kacang  dan  sapi  Bali dikategorikan rendah sampai sedang. Berdasarkan  hasil  tersebut  gen  Leptin- BsaA1 pada  sapi  Bali  dan  kambing  kacang  dapat digunakan sebagai penciri/marker untuk kegiatan seleksi.

## Saran
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut untuk  mengetahui  pengaruh  gen  leptin terhadap kandidat gen yang berasosiasi dengan sifat  produksi    pada  sapi  Bali  dan  kambing Kacang.

## DAFTAR PUSTAKA
Azari  M.  Hasani  S.  Heidari  M.  Yousefi  S. 2012.  Genetict  Polimorphism  of  Leptin Gene  Using  PCR-RFLP  Method  in  Three Different Populations.Gorgan University of
Agricultural Sciences and Natural
Resources. Iran. ISSN 1337-9984.
Batista  AM,  Silva  DM,  Rêgo  MJ,  Silva  FL,
Silva  EC,  Beltrão  EI,  Gomes  Filho  MA, Wischral  A,  Guerra  MM.  2013.  The expression and localization of leptin and its receptor  in  goat  ovarian  follicles.  Anim Reprod.  Sci.  doi:  10.1016/j.anireprosci. 2013.08.007. Epub 2013 Aug 22.
Botstein D, White RL, Skolnick M, and Davis RW,  1980.  Construction  of  a  genetic linkage  map  in  man  using  restriction fragment  length  polymorphisms.  Am  J Hum Genet 32:314–331.
Boucher D, Palin MF, Castonguay F, Gariepy C,  Pothier  F.  2006.  Detection  of  poly- morphisms  in  the  ovine  leptine  ( LEP ) gene:  association  of  a  single    nucleotide polymorphism  with  muscle  growth  and meat  quality  traits.  Canadian  Journal  of Animal Science. 86, 31-35.
Choudhary V.,  Kumar P., Bhattacharya T. K., Bhushan  B.  and  Sharma  A.  (2005)  DNA polymorphism of leptin gene in Bos indicus and  Bos  taurus  cattle.  Genetics  and Molecular Biology 28: 740-742.
Hartl  Dl  dan  Clark  AG.  1997.  Principles  of Population  Genetics  3 rd ed.  Sinauer Associates. Inc. Publishers.Sunderland. Massachusetts.
Indrawan,  M.,  R.B.  Primack  dan J.  Supriatna. 2007.  Biologi  Konservasi.  Yayasan  Obor Indonesia. Jakarta.
Liefers, S.C., R.F. Veerkamp, M.F.W. Te Pas, C. Delavaud, Y. Chilliard, M. Platje, T. van der Lende. 2005. Leptin promoter mutations affect leptin levels and performance  traits  in  dairy  cows.  Animal Genetics.36 : 111 – 118.
Machado  MA,  Schuster  I,  Martinez  ML.
Compus  AL.  2003.  Genetic  diversity  of four  breed  using  microsatellite  marker. Rev. Bras De Zoo 32. 93-98.
Maskur, C. M. Kertanegara. N. Hilmiati. 2008.
Pengembangan Marker Seleksi Dari
Beberapa  Kandidat  Gen  yang  Berasosiasi dengan  Sifat  Produksi  Sapi  Bali.  Badan Pengkajian  Teknologi  Pertanian  (BPTP) NTB.
Nei  M.  and  Kumar  S.  2000.  Molecular Evolution  and  Phylogenetics.  New  York: Oxford University, Press.
Sambrook  J.,  E.  F.  Fritsch  &  T.  Maniatis.
1989.  Moleculer  Cloning  a  Laboratory Manual. CSH laboratory Press. USA.
Shojaei  M,  M.  Reza,  M.  Abadi,  M.  Asadi  F., Omid D, Amin K. and Masoumeh A. 2010. Association of growth trait and Leptin gene polymorphism  in  Kermani  sheep.  Depar- tment  of  Animal  Science,  Faculty  of Agriculture,  Shahid  Bahonar  University  of Kerman.Journal  of  Cell  and  Molecular Research (2010) 2 (1), 67-73
Singh  Umesh,  Kumar  S,  Deb  R.  2012.
Monograph  on  bovine  leptin  gene:  A Biomarker  Associated  with  Dairy  Milk Production. ISBN: 978-3-659-13582-8,
Lambert  Academic  Publishing,  Germany (In press).
Taniguchi  Y,  Itoh  T,  Yamada  T,  Sasaki  Y. 2002.  Genomic  structure  and  promoter analysis  of  the  bovine  leptin  gene.IUBMB Life . ;53:131–5 Vasconcellos LPMK, Talhari DT, Pareira AP, Coutinho  LL,  Regitano  LCA.  2003. Genetic  characterization  of  aberden  angus cattle  using  moleculer  markers.  Genet  Mol Biol 26 : 133-137