## ALCHEMY : JOURNAL OF CHEMISTRY

## Artikel Penelitian
Sintesis Senyawa Vanilil Metil Keton dan Uji Aktivitas Antiinflamasi terhadap Enzim COX-1 dan COX-2 melalui Analisis In Silico
Khoirotul Ummah 1* , Robby Gus Mahardika 2 , Ana Mardliyah 3
1 Jurusan Pendidikan Ilmu Pengetahuan Alam, Fakultas Tarbiyah dan Keguruan, Universitas Islam Negeri Sunan Ampel Surabaya, Indonesia, 60237
2 Jurusan Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Bangka Belitung, Bangka Kepulauan Bangka Belitung, Indonesia, 33126
3 Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Walisongo, Semarang, Indonesia, 50185
INFO ARTIKEL ABSTRAK Riwayat Artikel Diterima 7 Oktober 2020
Direvisi 30 Oktober 2020
Tersedia online 23 November 2020 * Email penulis korespondensi: khoirotul.ummah @uinsby.ac.id
This study carries out the synthesis of vanillyl methyl ketone from eugenol through Wacker  oxidation  and  anti-inflammatory  activity  test  toward  COX-1  and  COX-2 through in silico analysis. Wacker oxidation proses were catalyzed by PdCl 2 and CuCl 2 using DMF solvent under the aerobic condition at room temperature for 48 hours.  The  synthesis  product  was  purified  by  column  chromatography  and  was characterized  by  NMR,  IR  and  MS  spectroscopy.  By  spectroscopic  methods, characterization  showed  that  vanillyl  methyl  ketone  was  formed  with  a  yield  of 45%,  and  vanillin  (3%)  was  produced  as  a  by-product.  The  anti-inflammatory activity  of  vanillyl  methyl  ketone  was  carried  out  by  molecular  docking  toward COX-1  and  COX-2  obtained  from  PDB.  The  analysis  showed  that  the  anti- inflammatory activity and selectivity toward COX-2 of vanillyl methyl ketone was higher than eugenol. This was shown by the low binding energy affinity and the number  of  hydrogen  bonds  formed  between  the  vanillyl  methyl  ketone  and  the enzyme’s active site.
Keywords:  Eugenol,  Wacker  oxidation,  vanillyl  methyl  ketone,  anti-inflammatory,

## in silico
Pada  penelitian  ini  dilakukan  sintesis  senyawa  vanilil  metil  keton  dari  eugenol melalui oksidasi Wacker serta dilakukan uji aktivitas antiinflamasi terhadap enzim COX-1  dan  COX-2  melalui  analisis in  silico .  Proses  oksidasi  Wacker  dikatalisis oleh PdCl 2 dan CuCl 2 menggunakan pelarut DMF dalam kondisi aerob pada suhu ruang  selama  48  jam.  Senyawa  hasil  sintesis  dipisahkan  menggunakan  kolom kromatografi  dan  dikarakterisasi  menggunakan  spektroskopi  NMR,  IR  dan  MS. Hasil  karakterisasi  menunjukkan  bahwa  senyawa  vanilil  metil  keton  telah terbentuk dengan randemen sebanyak 45% dan juga dihasilkan senyawa vanillin (3%) sebagai produk samping. Aktivitas antiinflamasi senyawa vanilil metil keton dilakukan  dengan docking molekuler  terhadap  enzim  COX-1  dan  COX-2  yang diperoleh dari PDB. Hasil analisis menunjukkan bahwa aktivitas antiinflamasi dan selektivitas  terhadap  COX-2  pada  senyawa  vanilil  metil  keton  lebih  tinggi dibandingkan  eugenol.  Hal  ini  ditunjukkan  melalui  rendahnya  afinitas  energi pengikatan  dan  banyaknya  ikatan  hidrogen  yang  terbentuk  antara  vanilil  metil keton dengan sisi aktif enzim.
Kata kunci: Eugenol, oksidasi Wacker, vanilil metil keton, antiinflamasi, in silico

## 1. Pendahuluan
Obat  antiinflamasi  nonsteroid  (NSAID)  dikenal  sebagai  senyawa  aktif  farmakologis  yang  digunakan  dalam mengatasi peradangan, nyeri, dan demam [1]. NSAID bekerja menghambat aktivitas enzim siklooksigenase (COX-1 dan COX-2) dalam mengkatalisis pembentukan prostaglandin (mediator inflamasi)  [1, 2, 3]. Enzim COX-1 secara konstitutif terdapat pada sebagian besar jaringan dan organ untuk mengkatalisis sintesis prostaglandin dalam regulasi fisiologis dan aktivitas seluler, sedangkan COX-2 distimulasi oleh sitokin, mitogen, dan endotoksin yang terinduksi pada sel inflamasi [4].  Berdasarkan  mekanisme  tersebut,  efek  antipiretik  yang  dihasilkan  lebih  efektif  apabila  dilakukan  penghambatan terhadap  enzim  COX-2,  sedangkan  kemungkinan  efek  samping  yang  ditimbulkan  akan  lebih  banyak  terjadi  pada penghambatan  enzim  COX-1  [5].  Secara  umum  obat-obat  NSAID  bekerja  aktif  dalam  penghambatan  aktivitas  enzim COX-1  dan  COX-2  [5,  6].  Penggunaan  obat-obatan  NSAID  dalam  jangka  panjang  juga  menyebabkan  efek  samping seperti peradangan lambung, peningkatan resiko jantung dan hepatotoksik [7]. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang obat antiinflamasi yang aman dan selektif terhadap penghambatan enzim COX-2.
Penelitian antiinflamasi berbasis bahan alam telah banyak dilakukan untuk menemukan obat antiinflamasi dengan efek  samping  yang  lebih  kecil  [8,  9].  Senyawa  bahan  alam  yang  berpotensi  sebagai  antiinflamasi  diantaranya  yaitu eugenol  [10,  11].  Eugenol  merupakan  senyawa  utama  dalam  minyak  cengkeh  (80-90%)  dan  tersedia  melimpah  di Indonesia  [12].  Selain  berpotensi  sebagai  antiinflamasi,  eugenol  juga  memiliki  sifat  farmakologi  sebagai  antibakteri, antioksidan,  dan  analgesik  [13,  15].  Struktur  senyawa  eugenol  berupa  fenil  propana  dengan  gugus  fungsi  hidroksi, metoksi,  dan  olefin.  Beberapa  penelitian  telah  dilakukan untuk mentransformasi  eugenol menjadi senyawa  turunannya yang bernilai lebih tinggi seperti flavonoid, hidroksitirosol, metileugenol, dan bahan dasar polimer terbarukan [16, 17, 18, 19].
Kajian in  silico terhadap  senyawa-senyawa  antiinflamasi  menunjukkan  bahwa  adanya  cincin  aromatik  pada senyawa ligan dapat meningkatkan interaksinya dengan sisi aktif enzim [20]. Selain meningkatkan aktivitas antiinflamasi, adanya gugus karbonil seperti mono keton atau diketon pada senyawa ligan dapat meningkatkan selektivitas inhibisinya terhadap  COX-2  [21].  Dengan  mentransformasi  gugus  olefin  pada  eugenol  menjadi  gugus  keton  diharapkan  dapat meningkatkan aktivitasnya sebagai antiinflamasi. Gugus olefin dapat ditransformasi menjadi gugus keton melalui oksidasi Wacker  menggunakan  katalis  paladium,  air  dan  ko-oksidan  [22].  Dalam  reaksi  oksidasi  Wacker,  katalis  Pd(II)  akan mengalami reduksi menjadi Pd(0) yang kemudian dapat dioksidasi kembali oleh ko-oksidan seperti CuCl 2 [23]. Oksidasi Wacker banyak digunakan dalam berbagai sintesis senyawa organik karena dianggap sebagai reaksi yang paling efisien dan  spesifik  dalam  mengubah  olefin  terminal  menjadi  metil  keton  [24].  Konversi  gugus  keton  yang  dibentuk  dapat dipengaruhi oleh struktur ligan, substrat dan senyawa lain yang ikut dalam reaksi [25]. Pelarut yang digunakan selama proses  oksidasi  juga  berperan  penting  dalam  terbentuknya  produk  yang  dihasilkan.  Pelarut  yang  berpotensi  sebagai nukleofil  seperti  metanol  dan  etanol  dapat  menggantikan  molekul  H 2 O  dalam  proses  oksidasi  Wacker  sehingga menghasilkan  produk  yang  bervariatif  [26].  Berdasarkan  latar  belakang  tersebut,  maka  dalam  penelitian  ini  dilakukan transformasi  gugus  olefin  pada  eugenol  menjadi senyawa  vanilil  metil  keton  dan  analisis  aktivitas antiinflamasi melalui docking molekuler.

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1. Bahan
Eugenol  diperoleh  dari  PT.  Indesso  Utama  Kencana.  Bahan  kimia  yang  digunakan  adalah  PdCl 2 99%  (Sigma Aldrich),  CuCl 2 99%  (Sigma  Aldrich),  dan  gas  oksigen  (O 2 )  95%  (Oxycan).  Pelarut  yang  digunakan  yaitu  dimetil formamida  (DMF)  p.a  (Merck),  diklorometana  (DCM)  p.a  (Merck)  dan  n-heksana  p.a  (Merck).  Kromatografi  lapis  tipis dilakukan  menggunakan  plat  gel  silika  pra-dilapisi  60  F254  (ketebalan  0,25  mm)  (Merck).  Kromatografi  kolom  flash dilakukan menggunakan  silika  gel  60 (70-230  mesh)  (Merck)  dengan  pelarut  n-heksana  dan  diklorometana  yang  baru didestilasi.
Pada analisis in silico ,  molekul  enzim  COX-1  dan  COX-2  pada  manusia  diperoleh  dari Protein Data  Bank  (PDB) https://www.rcsb.org  dengan  kode  COX-1  (ID:  5GMM)  dan  COX-2  (ID:  5GMN).  Ligan  diperoleh  dari  bank  data https://www.pubchem.com  dengan  kode  vanilil  metil  keton  (CID:  17262)  dan  eugenol  (CID:  3314).  Simulasi docking molekuler  dilakukan  dengan  menggunakan  Microsoft  Surface  Laptop  2 core i5  dengan Windows  10  Home .  Beberapa software yang digunakan adalah Discovery Studio Client 4.1, Autodock 4.2, Autodock Vina, PyMOL dan LigPlot.

## 2.2. Sintesis Senyawa Vanilil Metil Keton
Sebanyak 1,02 g (6 mmol) senyawa eugenol  dilarutkan dalam 120 mL dimetil formamida (DMF) dan dimasukkan dalam labu alas bulat 250 mL. Selanjutnya, ditambahkan 12 mL H 2 O; 0,098 g (0,55 mmol) PdCl 2 dan 0,82 g (6 mmol) CuCl 2 kemudian bagian atas labu ditutup dengan balon yang berisi oksigen. Campuran tersebut diaduk menggunakan
pengaduk magnetik pada temperatur 25 ° C selama 48 jam dan proses reaksi dipantau menggunakan KLT dengan eluen n-heksana:diklorometana (3:7). Setelah reaktan habis, reaksi dihentikan dan diperoleh campuran produk berwarna coklat. Hasil reaksi diekstraksi menggunakan pelarut diklorometana (DCM) dan air dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya fasa organik  (DCM)  diekstraksi  kembali  dengan  akuades  (1:10)  untuk  menghilangkan sisa  DMF  dari  reaksi  tersebut.  Fasa organik dipisahkan dan dilakukan evaporasi sehingga diperoleh campuran dua senyawa hasil reaksi. Campuran tersebut dipisahkan menggunakan kolom kromatografi dengan eluen n-heksana:diklorometana (3:7).

## 2.3. Karakterisasi Senyawa Hasil Sintesis
Karakterisasi senyawa hasil sintesis dilakukan menggunakan spektroskopi NMR, IR dan MS. Spektroskopi 1 H-NMR dan 13 C-NMR diukur pada Agilent DD2 dan JEOL ECA 500 MHz dengan pelarut cloroform-d (CDCl 3 ). Spektroskopi IR menggunakan  spektrometer  Alpha  Bruker  FTIR  dan  spektroskopi  masa  (MS)  menggunakan  (HRESIMS)  Waters  LCT Premiere XE.
Senyawa vanilil metil keton , padatan berwarna kuning, 493 mg (45%), 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ H 6,88 (d, J =7,8
Hz, 1H), 6,72 (s, 1H), 6,70 (s, 1H), 5,63 (s, br, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,62 (s, 2H), 2,15 (s, 3H);
13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ C 206,99, 146,67, 144,77, 126,01, 122,28, 114,57, 111,63, 55,91, 50,68, 29,04 ppm; IR (KBr): v maks 3435, 3002, 2934, 2838,
1708, 1601, 1518, 1431, 1271, 769 cm -1 ; HRESIMS (C 10 H 12 O 3 ) dengan nilai (M-H) - data pengukuran m/z : 179,0707 dan data perhitungan m/z : 179,0708.
Senyawa vanilin, padatan berwarna kuning pucat, 30 mg (3%), 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ H 9,83 (s, 1H ), 7,44 (dd, J 1 = 5 Hz, J 2 = 1,7 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,25 (s, br, 1H), 3,98 (s, 3H); 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ): δ C 190,92, 151,71,  147,17, 129,93, 127,57, 114,41, 108,8, 56,16 ppm; IR (KBr) : v maks 3182, 2941, 2842, 1671, 1587, 1514, 1467, 1428, 1271, 1207, 1153, 1027, 860, 731; HRESIMS (C 8 H 8 O 3 ) dengan nilai (M-H) + data pengukuran m/z: 153,0551 dan data perhitungan m/z: 153,0552.
2.4. Analisis in Silico

## 2.4.1. Persiapan Ligan dari Protein
Molekul  enzim  COX-1  dan  COX-2  pada  manusia  diperoleh  dari Protein  Data  Bank  (PDB) https://www.rcsb.org dengan  kode  COX-1  (ID:  5GMM)  dan  COX-2  (ID:  5GMN).  Ligan  diperoleh  dari  bank  data  https://www.pubchem.com dengan  kode  vanilil  metil  keton  (CID:  17262)  dan  eugenol  (CID:  3314)  yang  ditunjukkan  pada Gambar  1 .  Preparasi molekul  enzim  dan  ligan  dilakukan menggunakan perangkat  lunak  Discovery  Studio  Client  4.1 . untuk  mengganti  ligan menjadi  bentuk  format  PDB  dan  menghilangkan  molekul  air  yang  melekat  pada  enzim  COX-1  dan  COX-2.  Preparasi selanjutnya dilakukan dengan Autodock 4.2 untuk menambahkan hidrogen polar, muatan dan menyimpan enzim serta ligan dalam format PDBQT. Selain itu, dengan Autodock 4.2 juga dilakukan analisis ukuran grid box yang akan digunakan dalam proses docking.
(A) (B) (C)
Gambar 1. Struktur 3D ligan: ( A ) Ligan natif pada enzim COX-1 dan COX-2, ( B ) Vanilil metil keton, dan ( C ) Eugenol

## 2.4.2. Validasi Metode Docking Molekuler
Untuk  mengetahui  ketepatan  posisi  ligan  dan grid  box yang  dipakai  dalam  proses molecular  docking ,  maka dilakukan  validasi  dengan  melakukan redocking antara  ligan  natif  dengan  enzim  menggunakan  Autodock  Vina.  Hasil redocking kemudian dianalisis menggunakan PyMOL untuk mengetahui nilai root mean square deviation (RMSD) antara ligan  natif  asal  dari  PDB  dengan  ligan  natif  hasil redocking.  Metode molecular docking yang  dilakukan dikatakan  valid apabila nilai RMSD ≤ 2,0 Å [27].

## 2.4.3. Molecular Docking
Docking molekuler  antara  ligan  dan  enzim  dilakukan  menggunakan  Autodock  Vina.  Hasil docking dianalisis menggunakan PyMOL untuk melihat posisi ligan dalam pocket sisi aktif enzim. Selanjutnya interaksi antara ligan dengan enzim dianalisis menggunakan LigPlot .

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1. Sintesis Senyawa Vanilil Metil Keton
Oksidasi  eugenol  menjadi  vanilil  metil  keton  dilakukan  dengan  pereaksi  Wacker  menggunakan  katalis  paladium klorida 10% mol ( Gambar 2 ). Selama proses reaksi, Pd(II) akan mengalami reduksi menjadi Pd(0) sehingga digunakan ko-oksidan  CuCl 2 untuk  mengoksidasi  kembali  Pd(0)  menjadi  Pd(II).  Mekanisme  reaksi  oksidasi  Wacker  ( Gambar  3 ) diawali dengan pengikatan ion Cl - oleh senyawa PdCl 2 membentuk PdCl 4 , kemudian dilanjutkan dengan pergantian atom Cl  dengan  senyawa  eugenol  sehingga  menjadi kompleks  PdCl 3 -eugenol.  Dengan  adanya  molekul H 2 O,  maka  atom  Cl yang terikat pada paladium dapat digantikan oleh H 2 O dan selanjutnya akan mengalami reaksi adisi oleh gugus hidroksi dari air [28]. Sesuai dengan aturan Markovnikov, regioselektifitas reaksi adisi dengan air cenderung akan masuk pada karbon yang lebih tersubstitusi yaitu karbon sekunder. Hal ini disebabkan oleh adanya efek hiperkonjugasi yang dapat menstabilkan karbokation. Mekanisme reaksi Wacker diakhiri dengan adanya penataan ulang ikatan membentuk gugus keton [29].
H 3 CO
HO
H 3 CO HO O PdCl 2 (10%mol), CuCl 2 (1 eq)
DMF/H 2 O (10:1), O 2 atm.
25 o C, 48 jam
H 3 CO HO O H + ( 45% ) ( 3% )
Eugenol 1 1a
Gambar 2. Oksidasi Wacker pada senyawa eugenol, ( 1 ) vanilil metil keton, dan ( 1a ) vanilin.
Senyawa  hasil  sintesis  berupa  campuran  dua  senyawa  yang  selanjutnya  dipisahkan  menggunakan  kolom kromatografi  dengan  eluen  diklorometana:n-heksana  (7:3).  Hasil  pemisahan  diperoleh  senyawa 1 (vanilil  metil  keton) sebanyak  493  mg  dengan  rendemen  sebesar  45%.  Uji  kemurnian  dilakukan  dengan  kromatografi  lapis  tipis  (KLT) menggunakan tiga sistem eluen yang berbeda yaitu diklorometana dengan R f 0,43, n-heksana:etil asetat (7:3) dengan R f 0,40 dan n-heksana:diklorometana (1:9) dengan R f 0,35.

## 3.2. Identifikasi Senyawa Hasil Sintesis
Analisis struktur senyawa 1 menggunakan spektroskopi NMR menunjukkan adanya 10 sinyal karbon pada spektrum 13 C-NMR  yaitu  satu  sinyal  karbonil  (C=O),  enam  sinyal  aromatik  dan  tiga  sinyal  alifatik.  Adanya  sinyal  karbonil  pada pergeseran 206,9 ppm menunjukkan bahwa sinyal tersebut adalah sinyal dari gugus keton yang tidak terkonjugasi [30]. Hal ini membuktikan bahwa terjadi reaksi oksidasi dari olefin menjadi keton. Data tersebut juga diperkuat dengan adanya sinyal metil  (CH 3 )  dan metilen  (CH 2 )  pada spektrum 1 H-NMR yang  muncul  pada  pergeseran  2,15 ppm  dan  3,62  ppm, dimana metil dan metilen tersebut merupakan alkil yang berikatan dengan gugus karbonil (keton). Pada 1 H-NMR masih terdapat  tiga  proton  aromatik  pada  pergeseran  6,70–6,88  ppm  serta  sinyal  metoksi  yang  merupakan  substituen  pada cincin  aromatik  muncul  sebagai  sinyal  singlet  pada  pergeseran  3,88  ppm.  Berdasarkan  analisis  tersebut,  maka  dapat diasumsikan bahwa senyawa 1 telah berhasil disintesis dari eugenol melalui reaksi oksidasi Wacker. Untuk memperkuat analisis gugus fungsi yang terdapat pada senyawa 1 , maka dilakukan pengukuran spektroskopi IR ( Gambar 4 ) .
Pada spektrum IR, senyawa 1 memiliki pita serapan pada bilangan gelombang 3435 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur  dari  gugus  hidroksi  (OH)  pada  fenol.  Adanya  gugus  keton  (C=O)  hasil  oksidasi  Wacker  dibuktikan  dengan  pita serapan  yang  muncul  secara  kuat  pada  bilangan  gelombang  1708  cm -1 .  Serapan  keton  tersebut  berbeda  dengan serapan  gugus  alkena monosubstitusi  pada  eugenol  yang  akan muncul  secara  lemah  pada  bilangan gelombang  1648 cm -1 [31]. Serapan (C=C) aromatik muncul pada bilangan gelombang 1601, 1518, dan 1431 cm -1 sedangkan gugus aril alkil eter (C-O-CH 3 ) muncul pada bilangan gelombang 1271 cm -1 . Pita serapan C-H sp 2 aromatik muncul pada bilangan gelombang 3002 cm -1 dan C-H sp 3 muncul pada bilangan gelombang 2934–2838 cm -1 .
Senyawa hasil samping oksidasi Wacker dari senyawa eugenol dihasilkan senyawa 1a sebanyak 3%. Hasil analisis senyawa 1a dengan spektroskopi NMR diperoleh delapan sinyal karbon pada 13 C-NMR yaitu satu sinyal karbonil, enam sinyal  aromatik  dan  satu  sinyal  alifatik.  Berdasarkan  jumlah  atom  karbonnya,  dapat  diidentifikasi  bahwa  terdapat pemutusan  dua  atom  karbon  pada  eugenol  menjadi  senyawa 1a .  Sinyal  karbonil  pada  senyawa 1a muncul  pada pergeseran  190,92  ppm,  dimana  sinyal  tersebut  merupakan  sinyal  dari  gugus  aldehid  yang  diperkuat  dengan  adanya sinyal proton aldehid yang muncul pada pergeseran 9,83 ppm. Tiga sinyal proton aromatik dan satu sinyal dari substituen metoksi  masih  muncul  pada  spektrum 1 H-NMR  seperti  pada  senyawa 1 .  Akan  tetapi,  sinyal  proton  aromatik  pada senyawa 1a memiliki  pergeseran  sinyal  yang  lebih deshielding dibandingkan  dengan  senyawa 1 .  Hal  ini  disebabkan karena adanya pengaruh dari gugus aldehid yang merupakan gugus penarik elektron sehingga proton pada posisi orto
dan para terhadap gugus aldehid tersebut memiliki kerapatan elektron yang lebih kecil [32]. Berdasarkan analisis tersebut, maka dapat disimpulkan bahwa senyawa 1a adalah senyawa vanilin.
PdCl 2 2 Cl Pd Cl Cl Cl Cl 2 Pd Cl Cl Cl + Cl H 2 O Cl OCH 3 Pd OH Cl Cl H 2 O H OH OCH 3 OH Pd H 2 O Cl Cl OCH 3 OH OCH 3 OH OH Pd OH Cl OCH 3 OH CH 2 HO H Pd H 2 O Cl OH OCH 3 OH Cl Pd H 2 O Cl OCH 3 OH C O CH 3 H OCH 3 OH O H 2 O + HCl Pd (0) H 2 O 2 C u (I I) C l 2 2 C u (I ) C l 0 ,5 O 2 + 2 H C l Cl i ii iii iv v vi 1 Gambar 3. Mekanisme reaksi oksidasi Wacker pada senyawa eugenol.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 20 40 60 80 100 Bilangan gelombang (cm -1 ) 3435 3002 1708 1518 1271 1033 1601 1359 1431 1152 2934 2838 %T senyawa 1 769
Gambar 4. Spektrum IR senyawa 1 . Bilangan Gelombang (cm -1 ) % Tra nsm ita n
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 -20 0 20 40 60 80 100 Senyawa 1a 731 1207 1467 Bilangan gelombang (cm -1 ) %T 3182 1514 1587 1671 1428 1153 1027 1271 860 2842
Gambar 5. Spektrum IR senyawa 1a .
Untuk  memperkuat  hasil  analisis  NMR  senyawa 1a ,  dilakukan  pula  identifikasi  gugus  fungsi  menggunakan spektroksopi  IR  ( Gambar  5 ).  Beberapa  pita  serapan  gugus  fungsi  yang  muncul  pada  senyawa 1a identik  dengan senyawa 1 yaitu terdapat gugus fenol yang muncul pada bilangan gelombang 3182 cm -1 , (C=C) aromatik pada bilangan gelombang 1587, 1514, dan 1467 cm -1 serta gugus eter pada substituen metoksi (C-O-CH 3 ) yang muncul pada bilangan gelombang 1271 cm -1 . Terdapat pita serapan gugus karbonil yang muncul secara kuat pada bilangan gelombang 1671 cm -1 , dimana nilai bilangan gelombang tersebut lebih rendah dari pada gugus keton pada senyawa 1 . Serapan karbonil pada  senyawa 1a tersebut  diidentifikasi  sebagai gugus  aldehid  (HC=O)  yang  terkonjugasi  dengan  aromatik [31]. Hasil analisis  IR  tersebut  memperkuat  analisis  spektroskopi  NMR  bahwa  senyawa 1a merupakan  senyawa  vanilin. Terbentuknya senyawa vanilin pada oksidasi Wacker disebabkan karena terjadi isomerisasi alil benzena pada eugenol menjadi  propenilbenzena  yang  diikuti  dengan  pemutusan  secara  oksidatif  pada  ikatan  olefiniknya.  Reaksi  pemutusan ikatan olefin tersebut kemungkinan terjadi melalui proses mekanisme auto-oksidasi radikal [33].

## 3.3. Analisis in Silico

## 3.3.1. Validasi Metode Docking
Validasi metode docking dilakukan untuk mengetahui ketepatan posisi ligan dan grid box yang akan dipakai dalam proses docking molekuler [5] . Sebelum proses validasi, dilakukan preparasi dengan memisahkan struktur enzim COX-1 dan COX-2 dengan ligan natif menggunakan Autodock 4.2. Sruktur enzim yang digunakan adalah rantai A dengan ligan natif  inhibitornya  adalah 4-[3-(3-fluorophenyl)-5,5-dimethyl-4-oxidanylidene-furan-2-yl]benzenesulfonamide. Pada  proses preparasi  dilakukan  pula  analisis  terhadap  kompleks  enzim  dan  ligan  natif  menggunakan  LigPlot  untuk  menentukan residu  aktif  yang  terlibat  pada  interaksi  kompleks  enzim-ligan.  Residu  aktif  tersebut  digunakan  sebagai  pertimbangan dalam penentuan ukuran grid box , dimana ukuran grid box yang digunakan harus meliputi semua residu aktif yang terlibat dalam interaksi 45 pada sisi aktif enzim [34]. Hasil pengukuran grid box menggunakan Autodock 4.2 pada enzim COX-1 adalah  sebesar  16x20x18  dan  enzim  COX-2  adalah  16x22x20.  Validasi  metode docking dilakukan  dengan redocking antara ligan natif dengan enzim menggunakan Autodock Vina. Metode docking yang digunakan dikatakan valid apabila nilai RMSD ≤ 2,0 Å [27]. Hasil validasi redocking pada enzim COX-1 dan COX-2 ( Gambar  6 ) terlihat bahwa ligan natif hasil redocking telah  berhimpit  dengah  ligan  natif  dari  PDB  dengan  nilai  RMSD  sebesar  1,589  Å  pada  COX-1  dan sebesar  0,923  Å  pada COX-2. Hal  ini  menunjukkan bahwa  ukuran grid  box yang  digunakan pada  validasi docking ini telah benar dan dapat digunakan untuk proses docking senyawa hasil sintesis [27].

## 3.3.2. Docking Molekuler
Docking molekuler senyawa  hasil  sintesis  (vanilil  metil  keton)  dilakukan  menggunakan  Autodock  Vina  kemudian dianalisis menggunakan PyMOL dan LigPlot. Potensial aktivitas antiinflamasi yang diperoleh melalui docking molekuler dapat  dilihat  dari  nilai  afinitas  energi  pengikatan dan  jumlah  interaksi yang  terjadi  antara  ligan  dengan  sisi  aktif  enzim ( Gambar 7 ). Afinitas energi ikatan enzim-ligan merupakan energi yang dibutuhkan untuk membentuk ikatan antara ligan dengan enzim. Semakin kecil energi yang dibutuhkan maka semakin stabil kompleks enzim-ligan tersebut [34]. Jumlah interaksi  yang  terjadi  antara  ligan  dengan  sisi  aktif  enzim  seperti  ikatan  hidrogen  dan  interaksi  hidrofobik  juga mempengaruhi  aktivitasnya.  Banyaknya  ikatan  hidrogen  yang  terbentuk  pada  interaksi  protein-ligan  memberikan
Bilangan Gelombang (cm -1 ) % Tra nsm ita n
kontribusi  terhadap  kestabilan  struktur  kompleks,  dengan  kata  lain  semakin  banyak  jumlah  ikatan  hidrogen  yang terbentuk  maka  akan  semakin  kompleks  strukturnya  [27].  Dalam  interaksi  protein-ligan,  ikatan  hidrogen  dan  ikatan hidrofobik  juga  mempengaruhi  stabilitas  ikatan  antara  ligan  dan  targetnya.  Bila  ikatan  hidrogen  yang  cukup  banyak disertai  dengan  interaksi  hidrofobik, maka  dapat dikatakan bahwa  interaksi  antara  kedua  molekul tersebut merupakan interaksi yang cukup kuat [35].
(A) (B)
Gambar  6. Hasil validasi ligan natif pada enzim COX-1 ( A ) dan COX-2 ( B ). Ligan dari PDB ditunjukkan dengan warna hijau, sedangkan ligan hasil redocking ditunjukkan warna ungu.
(A) (B)
Gambar 7. Posisi senyawa vanilil metil keton pada sisi aktif enzim: ( A ) COX-1 dan ( B ) COX-2.
Hasil simulasi docking molekuler ( Gambar 8 ) menunjukkan bahwa senyawa 1 (vanilil metil keton) dapat berinteraksi dengan  sisi  aktif  enzim COX-1  melalui  4  ikatan hidrogen  yaitu  antara  gugus  keton pada  senyawa 1 dengan  hidrogen pada  Gln92 dengan  jarak  ikatan sebesar  2,90 Ǻ dan  oksigen  pada  gugus metoksi  berikatan  hidrogen  dengan  Thr199 (2,99 Ǻ). Gugus hidroksi (OH) pada senyawa 1 dapat berikatan hidrogen dengan dua residu asam amino pada sisi aktif enzim.  Atom  oksigen  pada  gugus  hidroksi  berikatan  hidrogen  dengan  His119  (3,04  Ǻ)  sedangkan  atom  hidrogennya berikatan  dengan  atom  oksigen  pada  gugus  hidroksi  Thr  199  (2,77  Ǻ).  Kompleks  tersebut  juga  distabilkan  dengan adanya interaksi hidrofobik antara senyawa 1 dengan residu Val43, Phe91, His94, Ala121, His200 dan Trp209 pada sisi aktif enzim COX-1. Kestabilan kompleks enzim-ligan diperkuat dengan nilai afinitas energi pengikatan yang rendah yaitu sebesar  -5,9  kkal/mol  ( Tabel.1 ).  Berdasarkan  jumlah  interaksi  antara  senyawa  1  dengan  enzim  COX-1,  maka  dapat dikatakan bahwa senyawa 1 memiliki aktivitas inhibisi yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan eugenol, dimana pada senyawa eugenol hanya gugus hidroksi yang dapat berikatan hidrogen dengan sisi aktif enzim ( Gambar 8 ). Atom oksigen pada  gugus  hidroksi  eugenol  berikatan  hidrogen  dengan  2  asam  amino  yaitu  His96  (3,06  Ǻ)  dan  His119  (3,34  Ǻ), sedangkan  atom  hidrogennya  berikatan  dengan  atom  oksigen  pada  gugus  hidroksi  asam  amino  Thr199  (2,82  Ǻ). Berdasarkan data tersebut juga terlihat bahwa adanya gugus keton pada senyawa 1 berkontribusi dalam interaksi enzim- ligan  melalui  ikatan  hidrogen.  Dengan  kata  lain,  keberadaan  gugus  keton  pada  senyawa 1 dapat  meningkatkan kestabilan kompleks enzim-ligan sehingga dapat meningkatkan aktivitas inhibisi terhadap enzim COX-1 [21] .
Gugus keton pada senyawa 1 (vanilil metil keton) juga berperan penting dalam interaksinya dengan sisi aktif enzim COX-2. Pada Gambar  8 terlihat bahwa gugus keton pada senyawa 1 dapat berikatan hidrogen dengan 3 asam amino yaitu His94 (3,10 Ǻ), His96 (3,18 Ǻ), dan His119 (3,01 Ǻ). Selain gugus keton, gugus metoksi pada senyawa 1 juga dapat berikatan hidrogen dengan 2 residu asam amino, Asn67 (3,01 Ǻ) dan Gln92 (2,98 Ǻ), serta diperkuat dengan beberapa interaksi hidrofobik dengan asam amino His64, Ala65, Thr198, Thr199 dan Trp208 ( Tabel 1 ). Seperti halnya pada inhibisi enzim  COX-1,  aktivitas  inhibisi  senyawa 1 terhadap  COX-2  juga  lebih  tinggi  dibandingkan  eugenol  yang  dibuktikan dengan  jumlah  ikatan  hidrogen  pada  senyawa 1 lebih  banyak  dari  pada  eugenol.  Eugenol  hanya  memiliki  dua  ikatan
hidrogen melalui atom oksigen pada gugus hidroksi (OH) dengan atom hidrogen pada residu asam amino His96 (3,23 Ǻ) dan His119 (3,11 Ǻ). Dalam hal ini, adanya gugus keton pada senyawa 1 berkontribusi dalam peningkatan kompleksitas enzim-ligan, begitu pula dengan aktivitas inhibisi terhadap enzim COX-2. Tingginya potensial inhibisi senyawa 1 terhadap COX-2  juga  didukung  dengan  nilai  afinitas  energi  pengikatan  yang  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  eugenol  yaitu sebesar -6,2 kkal/mol ( Tabel 1 ).
(a) Interaksi senyawa 1 dengan enzim COX-1
(b) Interaksi senyawa 1 dengan enzim COX-2
(c) Interaksi eugenol dengan enzim COX-1
(d) Interaksi eugenol dengan enzim COX-2
Gambar 8. Interaksi senyawa ligan dengan enzim COX-1 dan COX-2.
Secara  keseluruhan hasil docking molekuler senyawa 1 terhadap  enzim  COX-1  dan COX-2 menunjukkan  bahwa keberadaan gugus keton pada senyawa 1 dapat meningkatkan aktivitas inhibitornya melalui ikatan hidrogen dengan sisi aktif  enzim.  Oleh  karena  itu,  potensial  inhibisi  senyawa 1 terhadap  kedua  enzim  tersebut  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  eugenol,  begitu  pula  aktivitas  antiinflamasinya.  Berdasarkan  perbandingan  hasil  inhibisi  senyawa 1 terhadap COX-1  dan  COX-2,  terlihat  bahwa  senyawa  vanilil  metil  keton  juga  memiliki  selektivitas  inhibitor  yang  lebih  tinggi terhadap  enzim  COX-2  dibandingkan  COX-1.  Selektivitas  tersebut  dibuktikan  dengan  nilai  afinitas  energi  pengikatan pada  enzim  COX-2  yang  lebih  rendah  dari  pada  COX-1.  Hal  tersebut  juga  diperkuat  dengan  jumlah  ikatan  hidrogen antara senyawa 1 dengan sisi aktif enzim COX-2 lebih banyak dibandingkan COX-1 ( Gambar 5 ). Dengan demikian dapat disimpulkan  bahwa  transformasi  gugus  olefin  pada  senyawa  eugenol  menjadi  gugus  keton  (vanilil  metil  keton)  dapat meningkatkan aktivitasnya sebagai antiinflamasi serta selektivitas inhibisinya terhadap enzim COX-2.
Tabel 1. Hasil Docking Senyawa Eugenol dan Vanilil Metil Keton Enzim COX-1 COX-2 Senyawa Eugenol Vanilil metil keton Eugenol Vanilil metil keton Energi (kkal/mol) -5,9 -5,9 -5,7 -6,2 Ikatan hidrogen His96 (3,06 Ǻ), His119 (3,34 Ǻ), Thr199 (2,82 Ǻ) Gln92 (2,90 Ǻ), His119 (3,04 Ǻ), Thr199 (2,77 Ǻ), Thr199 (2,99 Ǻ) His96 (3,23 Ǻ), His119 (3,11 Ǻ) Asn67 (3,01 Ǻ), Gln92 (2,98 Ǻ), His94 (3,10 Ǻ), His96 (3,18 Ǻ), His119 (3,01 Ǻ) Interaksi hidrofobik Leu41, Val43, His67, Phe91, Gln92, His94, Leu198, His200, Trp209 Val43, Phe91, His94, Ala121, His200, Trp209 Val42, His94, Val121, Leu140, Leu197, Thr198, Thr199 His64, Ala65, Thr198, Thr199, Trp208

## 4. Kesimpulan
Oksidasi  Wacker  pada  senyawa  eugenol  menghasilkan  senyawa  vanilil  metil  keton  dengan  randemen  45%  dan produk samping berupa vanillin sebanyak 3%. Berdasarkan analisis in silico , senyawa vanilil metil keton memiliki aktivitas antiinflamasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan eugenol dan memiliki selektivitas yang lebih tinggi terhadap enzim COX-2  dibandingkan  COX-1.  Hal  ini  ditunjukkan  melalui  rendahnya  afinitas  energi  pengikatan  dan  banyaknya  ikatan hidrogen yang terbentuk antara vanilil metil keton dengan sisi aktif enzim. Analisis lebih lanjut melalui uji in vitro dan in vivo sangat dibutuhkan untuk validasi hasil analisis in silico .

## Daftar Pustaka
[1] P.  G. Conaghan,  “A Turbulent  Decade for NSAIDs:  Update  on  Current Concepts  of  Classification, Epidemiology, Comparative Efficacy, and Toxicity”, Rheumatology International , vol. 32, no. 6, pp. 1491–502, 2012.
[2] J.  A.  Mitchell,  S.  Larkin,  &  T.  J.  Williams,  “Cyclooxygenase-2:  Regulation  and  Relevance  in  Inflammation”, Biochemical Pharmacology , vol. 50, no. 10, pp. 1535-1542, 1995.
[3] A. A. M. Abdel-Aziz, A. Angeli, A. S. El-Azab, M. E. A. Hammouda, M. A. El-Sherbeny, & C. T. Supuran, “Synthesis and  Anti-inflammatory  Activity  of  Sulfonamides  and  Carboxylates  Incorporating  Trimellitimides:  Dual Cyclooxygenase/Carbonic Anhydrase Inhibitory Actions”, Bioorganic Chemistry , vol. 84, pp. 260–268, 2019.
[4] P. P. Kapupara, S. P. Dholakia, V. P. Patel, & B. N. Suhagia, “Design, Synthesis and Pharmacological Screening of 4-Amino-5-pyrimidinecarbonitriles as Potential Anti-inflammatory Agents”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research , vol. 2, no. 3, pp. 287-294, 2010.
[5] R. D. Kamble, R. J. Meshram, S. V. Hese, R. A. More, S. S. Kamble, R. N. Gacche, & B. S. Dawane, “Synthesis and In Silico Investigation of Thiazoles Bearing Pyrazoles Derivatives as Anti-Inflammatory Agents” Computational Biology and Chemistry, vol. 61, pp. 86-96, 2016.
[6] R. Ottana, R. Maccari, M. L. Barreca, G. Bruno, A. Rotondo, A. Rossi, G. Chiricosta, R. Di Paola, L. Sautebin, S. Cuzzocread,  &  M.  G.  Vigorita,  “5-Arylidene-2-imino-4-thiazolidinones:  Design  and  Synthesis  of  Novel  Anti- inflammatory Agents”, Bioorganic and Medical Chem istry, vol. 13, no. 13, pp. 4243-4252, 2005.
[7] S.  Bindu,  S.  Mazumder,  &  U.  Bandyopadhyay,  “Non-steroidal  Anti-inflammatory  Drugs  (NSAIDs)  and  Organ Damage: A Current Perspective”, Biochemical Pharmacology, vol.180, no. 114147, 2020.
[8] P.  Apridamayanti,  F.  Sanera,  &  Robiyanto,  “Aktivitas  Antiinflamasi  Ekstrak  Etanol  Daun  Karas  ( Aquilaria malaccensis Lamk.)”, Pharmaceutical Sciences and Research , vol. 5, no. 3, pp. 152-158, 2018.
[9] O.  K.  Nwosu,  M.  Keskin, H.  Lohani, C.  Egbuna, &  S.  Z.  Haider,  “Bioactive  Lead  Compounds  and  Molecular  the Development of Antiinflammatory Drugs”, Phytochemicals as Lead Compounds for New Drug Discovery , pp. 317- 331, 2020 .
[10] J.-H Lee, H.-H. Lee, K.-N. Kim, & K.-M. Kim, “Cytotoxicity and Anti-inflammatory Effects of Zinc Ions and Eugenol during Setting of ZOE in Immortalized Human Oral Keratinocytes Grown as Three-dimensional Spheroids”, Dental Materials , vol. 32, no. 5, pp. e93-e104, 2016.
[11] X.  Huang,  Y.  Liu,  Y.  Lu,  &  C.  Ma,  “Anti-inflammatory  Effects  of  Eugenol  on  Lipopolysaccharide-induced Inflammatory  Reaction  in  Acute  Lung  Injury  via  Regulating  Inflammation  and  Redox  Status”, International Immunopharmacology , vol. 26, no. 1, pp. 265–271, 2015.
[12] H.  Prianto,  R.  Retnowati,  &  U.  P.  Juswono,  “Isolasi  dan  Karakterisasi  dari  Minyak  Bunga  Cengkeh  ( Syzigium aromaticum ) Kering Hasil Distilasi Uap”, Jurnal Ilmu Kimia Universitas Brawijaya, vol. 1, no. 2 , pp. 269–275, 2013.
[13] T. S. Kaufman, “The Multiple Faces of Eugenol. A Versatile Starting Material and Building Block for Organic and Bio-organic  Synthesis  and  a  Convenient  Precursor  toward  Bio-based  Fine  Chemicals”, Journal  of  the  Brazilian Chemical Soc iety, vol. 26, no. 6, pp. 1055-1085, 2015.
[14] W.  Qian,  Z.  Sun,  T.  Wang,  M.  Yang,  M.  Liu,  M.,  J.  Zhang,  &  Y.  Li  “Antimicrobial  Activity  of  Eugenol  against Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae and Its Effect on Biofilms”, Microbial Pathogenesis , vol. 139, 2020.
[15] J. Bonilla, T. Poloni, R. V. Lourenço, & P. J. A. Sobral, “Antioxidant Potential of Eugenol and Ginger Essential Oils with Gelatin/Chitosan Films, Food Bioscience , vol. 23, pp. 107-114, 2018.
[16] J.  Towaha,  “The  Benefits  of  Cloves  Eugenol  in  Various  Industries  in  Indonesia”, Majalah  Perspektif  Review Penelitian Tanaman Industri, vol. 11, no. 2, pp. 79–90, 2012.
[17] W. Wibowo, W. P. Suwarso, T. Utari, & H. Purwaningsih, “Aplikasi Reaksi Katalisis Heterogen untuk Pembuatan Vanilin  Sintetik  (3-hidroksi-2-metoksibenzaldehid)  dari  Eugenol  (4-alil-2-metoksifenol)  Minyak  Cengkeh”, Makara Sains, vol. 6, no. 3, pp. 142-148, 2002.
[18] D. Deffieux, P. Gossart, & S. Quideau, “Facile and Sustainable Synthesis of the Natural Antioxidant Hydroxytyrosol”, Tetrahedron Letters, vol. 55, no. 15, pp. 2455–2458, 2014.
[19] B. G. Harvey, A. J. Guenthner, G. R. Yandek, L. R. Cambrea, H. A. Meylemans,  L. C. Baldwin, & J. T. Reams, “Synthesis  and  Characterization  of  a  Renewable  Cyanate  Ester/Polycarbonate  Network  Derived  from  Eugenol”, Polymer, vol. 55, no.20, pp. 5073–5079, 2014.
[20] R. Heiran, S. Sepehri, A. Jarrahpour, C. Digiorgio, H. Douafer, J. M. Brunel, A. Gholami, E. Riazimontazer, & E. Turos,  “Synthesis,  Docking  and  Evaluation  of in  Vitro Anti-inflammatory  Activity  of  Novel  Morpholine  Capped  β- Lactam Derivatives”, Bioorganic Chemistry, vol. 102, 2020.
[21] L. Arshad, M. A. Haque, S. N. A. Bukhari, & I. Jantan, “An Overview of Structure–activity Relationship Studies of Curcumin Analogs as Antioxidant and Anti-inflammatory agents, Future Medicinal Chemistry , vol. 9, no. 6. 605-626, 2017.
[22] J. R. McCombs, B. W. Michel, & M. S. Sigman, “Catalyst-controlled Wacker-type Oxidation of Homoallylic Alcohols in the Absence of Protecting Groups”, Journal of Organic Chemistry , vol. 76, no. 9, pp. 3609–3613, 2011.
[23] J.  M.  Takacs,  &  X.  Jiang,  "The  Wacker  Reaction  and  Related  Alkene  Oxidation  Reactions”, Current  Organic Chemistry , vol. 7, no. 4, pp. 369-396, 2003.
[24] T.  Mitsudome,  T.  Umetani,  K.  Mori,  T.  Mizugaki,  K.  Ebitani,  &  K.  Kaneda,  “Highly  Efficient  Wacker  Oxidation Catalyzed by Heterogeneous Pd Montmorillonite under Acid-free Conditions”, Tetrahedron Letters , vol. 47, no. 9, pp. 1425–1428, 2006.
[25] H.  R.  Darabi,  M.  Mirzakhani,  K.  Aghapoor,  K.  Jadidi,  L.  Faraji,  &  N.  Sakhaee,  “A  Structure-activity  Relationship Study on the Wacker Oxidation of Stilbenes at Ambient Condition”, Journal of Organometallic Chemistry, vol. 740, pp. 131-134, 2013.
[26] M.  Cox  &  G.  Klass,  “Synthesis  By-products  from  the  Wacker  Oxidation  of  Safrole  in  Methanol  using ρ - Benzoquinone and Palladium Chloride”, Forensic Science International , vol. 164, no.2-3, pp. 138-147, 2006.
[27] W. F. de Azevedo Jr., Docking Screens for Drug Discovery . New York: Humana Press, 2019.
[28] H.  Eshtiagh-Hosseini,  S.  A.    Beyramabadi,  A.  Morsali,  &  M.  R.  Housaindokht,  “O-H  Bond Cleavage  Step  of  the Wacker Process: A DFT study”, Journal of Molecular Structure THEOCHEM , vol. 941, no. 1, pp. 138–143, 2010.
[29] T.  V.  Baiju,  E.  Gravel,  E.  Doris,  &  I.  N.  N.  Namboothiri,  “Recent  Developments  in  Tsuji-Wacker  Oxidation”, Tetrahedron Letters , vol. 57, no. 36, pp. 3993-4000, 2016.
[30] P. Y. Bruice, Organic Chemistry , 4 th Ed. New York: Prentice Hall, 2003.
[31] R. M. Silverstein, F. X. Webster, & D. J. Kiemle, Spectrometric Identification of Organic Compounds , 7 th Ed. New York: John Wiley and Sons, Inc., 2005.
[32] D.  L.  Pavia,  G.  M.  Lampman,  G.  S.  Kriz,  &  J.  R.  Vyvyan, Introduction  to  Spectroscopy ,  4 th Ed.  California: Brooks/Cole, 2009.
[33] L.  A.  Parreira,  L.  Menini,  J.  C.  da  Cruz  Santos,  &  E.  V.  Gusevskaya,  “Palladium-catalyzed  Aerobic  Oxidation  of Naturally Occurring Allylbenzenes as a Route to Valuable Fragrance and Pharmaceutical Compounds”, Advanced Synthesis and Catalysis , vol. 352, no.9, pp. 1533-1538, 2010.
[34] T. Joshi, P. Sharma, T. Joshi & S. Chandra, “ In Silico Screening of Anti-inflammatory Compounds from Lichen by Targeting  Cyclooxygenase-2”, Journal  of  Biomolecular  Structure  and  Dynamics ,  vol.  38,  no.  12,  pp.  3544-3562, 2019.
[35] R.  Patil,  S.  Das,  A.  Stanley,  L.  Yadav,  A.  Sudhakar,  &  A.  K.  Varma,  “Optimized  Hydrophobic  Interactions  and Hydrogen Bonding at the Target-Ligand Interface Leads the Pathways of Drug-Designing”, Plos One, vol. 5, no. 8, pp. e12029, 2010.