Indonesia has abundant stock of Tamarindus indica seeds, but it is not yet utilized maximally, especially in medical field. Tamarindus indica seeds have high content of polyphenols compound. No reseacrh is supported by in silico data on  polyphenol  compound  in  Tamarindus  indica  seeds  extract.    Polyphenols  compound  can  be  utilized  as  a neuroprotective  agent.  This  research  aims  to  measure  polyphenols  concentration  in  methanol  Tamarindus  indica seeds  extract  and  determine  the  anti  inflammation  and  antioxidant  potential  of  each  polyphenol  compound  in methanol Tamarindus indica seeds extract by in silico method. The extraction of Tamarindus seeds used maceration method  and  methanol  as  solvent.  Identification  and  measurement  of  polyphenols  compound  applied  HLPC-MS. PyMol and Pyrx tools were used for in silico analysis. Extract recidu was obtained from methanol Tamarindus indica seeds as much as 12%w/v. HPLC-MS anaysis mentioned that levels of procyanidin B2, myricentin and caffeic acid were respectively 38.850 mg/kg, 5.845 mg/kg and 260 mg/kg. The highest anti inflammatory potential was owned by myricentin than caffeic acid, while the lowest potential in procyanidin B2. Furthermore, the highest antioxidant potential    was  sequentially  in  myricentin,  procyanidin  B2  and  caffeic  acid.  It  is  very  possible  to  utilize  methanol Tamarindus  indica  seeds  extract  for  preventing  neurodegenerative  diseases  since  its  pathogenesis  involves inflammatory and stress oxidative process.
Keywords: Tamarindus indica, myricetin, procyanidin B2, caffeic acid, anti inflammatory, antioxidant
Ketersediaan biji Tamarindus indica di Indonesia cukup banyak dan melimpah, tetapi belum dimanfaatkan secara maksimal khususnya dalam bidang kesehatan. Biji Tamarindus indica memiliki kandungan senyawa polifenol cukup tinggi. Belum ada penelitian yang didukung data in silico tentang senyawa polifenol dalam ekstrak biji Tamarindus indica .  Senyawa  polifenol  dapat  dimanfaatkan  sebagai  bahan  neuroprotektif.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengukur  kadar  senyawa  polifenol  dalam  ekstrak  metanol  biji Tamarindus  indica dan  mengetahui  potensi  anti inflamasi dan antioksidan masing-masing senyawa polifenol secara in silico. Ektraksi biji Tamarindus indica dengan metode maserasi dan pelarut metanol. Identifikasi dan pengukuran  kadar senyawa polifenol menggunakan HPLC- MS, analisis in silico menggunkan tool Pymol dan Pyrx. Didapatkan residu ekstrak metanol biji Tamarindus indica sebanyak  12  %w/v.  Analisis  HPLC-MS  menyebutkan  kadar  procyanidin  B2,  myricetin  dan  caffeic  acid  secara berurutan adalah 38.850 mg/kg, 5.845 mg/kg dan 260 mg/kg. Secara in silico potensi anti inflamasi tertinggi dimiliki oleh myricetin kemudian caffeic acid dan terendah procyanidin B2, sedangkan potensi antioksidan tertinggi dimiliki myricetin  kemudian  procyanidin  B2  dan  terendah  pada  caffeic  acid.  Sangat  dimungkinkan  ekstrak  metanol  biji Tamarindus indica dimanfaatkan untuk pencegahan penyakit neurodegeneratif karena pathogenesis penyakitnya melibatkan proses inflamasi dan stres oksidatif.
Kata kunci : Tamarindus indica, myricetin, procyanidin B2, caffeic acid, anti infamasi, antioksidan
Identifikasi dan Uji In Silico Potensi Anti Inflamasi Dan Antioksidan Senyawa Polifenol Ekstrak Metanol Biji Tamarindus indica
Identification and In Silico Analysis of Anti Inflammation and Anti Oxidant Potentials of Polyphenol Compounds in Methanol Extract of Tamarindus indica Seeds
Muhammad Ihwan Narwanto 1 , Masruroh Rahayu 2 , Setyawati Soeharto 3 , Nurdiana 3 , Moch. Aris Widodo 3 1 Program Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Laboratorium Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Jember
2 Departemen Neurologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya
3 Departemen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya e-mail korespondensi: muhammadnarwanto@unej.ac.id
Abstrak
Abstract

## Pendahuluan
Pada  pengobatan  tradisional,  bagian  tanaman Tamarindus  indica antara  lain  daun,  bunga,  buah, kulit dan akar telah banyak digunakan sebagai terapi pada  berbagai  penyakit  diantaranya  peradangan, tumor,  gigitan  ular,  penyembuhan  luka,  fraktur  dan demam (Kuru 2014; Meher et al. , 2014). Tamarindus indica merupakan tanaman endemis di daerah tropis (El-Siddig et al. , 2006). Ketersediaan biji Tamarindus indica di  Indonesia  cukup  banyak  dan  melimpah, tetapi  belum  dimanfaatkan  secara  maksimal khususnya dalam bidang kesehatan (Balittri, 2017).
Penelitian Chunglok et al. , 2014, menunjukkan bahwa biji Tamarindus indica memiliki kandungan senyawa polifenol lebih tinggi dibanding biji tanaman lainnya. Penelitian  Razali et  al. ,  2015,  menyebutkan kandungan  senyawa  polifenol  dalam  ekstrak  biji Tamarindus indica antara lain procyanidin B2, caffeic acid dan myricetin. Kandungan bahan aktif senyawa polifenol  pada  tanaman  diyakini  dapat  memberikan manfaat  neuroprotektif,  diantaranya  melalui  efek anti  inflamasi  dan  antioksidan  (Rossi et  al. 2008, Spencer  2009).  Inflamasi  dan  stres  oksidatif  terlibat penting dalam pathogenesis penyakit neurodegeneratif  antara  lain  parkinson,  alzheimer dan hutington disease  (Amor et al. , 2014; Liu et  al. , 2017).
Belum  ada  penelitian  identifikasi  senyawa  polifenol dalam ekstrak biji Tamarindus indica yang didukung data  in  silico  tentang  potensi  anti  inflamasi  dan antioksidan.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengukur  kadar  senyawa  polifenol  dalam  ekstrak metanol  biji Tamarindus  indica dan  mengetahui potensi anti inflamasi dan antioksidan masing-masing senyawa polifenol secara in silico.

## Metode Penelitian
Biji Tamarindus indica
Biji Tamarindus  indica didapatkan  langsung  dari pohon  di  wilayah  Jember  pada  periode  Juni  2017. Identifikasi  spesies  dilakukan  di  LIPI  UPT  Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Purwodadi dengan no identifikasi 0876/IPH.06/HM/VII/2017.
Bahan kimia. Standar procyanidin B2 dan caffeic acid (ChemFaces PRC), myrecitin (Sigma USA). Mobile fase acetic acid 2%, double distilat water dan acetonitril.
Persiapan  sampel.  Biji  dipisahkan  dari  daging  buah, selanjutnya  dicuci  dengan  aquades.  Pengeringan pada suhu ruang selama 7 hari, kemudian dilakukan penggilingan.
Pembuatan  ekstrak.  Serbuk  biji Tamarindus  indica (100gr)  dilarutkan  dalam  methanol  (500ml)  selama 72  jam  pada  suhu  kamar.  Setelah  itu  disaring  dan larutan  dievaporasi  dengan  water  bath  untuk mendapatkan  residu  ekstrak.  Simpan  pada  suhu  - 200C (Bandawane et al. , 2013).
Analisis  HPLC-MS.  Alat  HPLC-MS  (shimadzu  LC-MS 2020) dengan colom SunFire C18 (5µm, 4.6x150mm) diatur  sesuai  dengan  keadaan  yang  diinginkan (proses  pemisahan  13  menit,  kecepatan  alir  1 ml/menit), kemudian sampel ditempatkan pada auto sample SIL 20AC (Shimadzu). Mobile fase, larutan A acetic  acid  2%  dalam  air  double  distillat,  larutan  B acetonitril dengan gradien 5% hingga 100% dalam 10 menit,  kemudian  dipertahankan  100%  selama  3 menit  sampai  dengan  selesai.  Setelah  proses pemisahan  selesai  akan  dihasilkan  grafik  yang menunjukkan  senyawa-senyawa  yang  mengalami pemisahan  sesuai  dengan  waktu  retensinya  dan berat molekul, bandingkan hasil dengan standar.
Analisis insilico. Analisis aktifitas biologi berdasarkan nilai  Probability  activity  (Pa)  dengan  rentang  nilai  0 sampai  dengan  1.  Menggunakan  tool  :  PyMol  dan PyRx.

## Hasil Penelitian

## Ekstraksi
Didapatkan  residu  ekstrak  metanol  biji Tamarindus indica sebanyak 12 %w/v.

## HPLC-MS
Hasil  analisis  HPLC-MS  kadar  procyanidin  B2, myricetin  dan  caffeic  acid  secara  berurutan  adalah 38.850 mg/kg (3,89%), 5.845 (0,58%) mg/kg dan 260 mg/kg (0,03%). Gambar kurva kadar masing-masing senyawa dapat dilihat pada Gambar 1.
A.

## B.

## C.
Gambar 1. Chromatogram standar dan sampel ekstrak biji Tamarindus indica . A. Chromatogram standar procyanidin B2 dan sampel. B. Chromatogram standar myricetin dan sampel. C. Chromatogram standar caffeic acid dan sampel.

## In silico
Hasil  uji  in  silico  potensi  anti  inflamasi  dan antioksidan  dari  ketiga  senyawa  procyanidin  B2, myricetin dan caffeic acid dapat dilihat pada gambar
2. Potensi antioksidan tertinggi dimiliki oleh myricetin kemudian  procyanidin  B2  dan  terendah  dimiliki caffeic  acid.  Potensi  anti  inflamasi  tertinggi  pada myricetin kemudian caffeic acid dan terendah dimiliki procyanidin B2.
Gambar 2. Potensi anti inflamasi dan antioksidan senyawa polifenol dalam  ekstrak biji Tamarindus indica .

## Pembahasan
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  analisis  dengan HPLC-MS kadar senyawa dalam ekstraks metanol biji Tamarindus indica yaitu procyanidin B2 paling banyak (kadar procyanidin B2 cukup besar hampir mencapai 4  %)  dibandingkan  myricetin  dan  terkecil  adalah caffeic acid. Hal ini berbeda dengan penelitian Razali, et al. , 2015, dengan lama perendaman selama 24 jam dan  menggunakan  UHPLC  menghasillkan  senyawa terbesar  adalah  procyanidin  B2  sebesar  (0,06%) kemudian  caffeic  acid  dan  myricetin  paling  kecil diantara  ketiganya.  Hal  ini  dimungkinkan  karena perbedaan  asal  daerah  sampel  dan  lama  waktu perendaman biji Tamarindus indica. Waktu ekstraksi yang  lebih  lama  akan  menghasilkan  residu  ekstrak yang lebih  banyak dan  potensi aktifitas biologi yang lebih tinggi  (Baldosano et al. , 2015; Sulaiman et  al. , 2017).
Berdasarkan nilai probability actifity uji in silico, jika nilai  Pa>  0,7  maka  perkiraan  secara  laboratorium akan  sesuai  dengan  uji  komputasi.  Hal  tersebut menunjukkan  myricetin  memiliki  potensi  anti inflamasi  dan  antioksidan  tertinggi  dibanding  ketiga senyawa  lainnya,  procyanidin  B2  cukup  tinggi  pada potensi  antioksidannya  tetapi  rendah  pada  potensi anti  inflamasi,  sedangkan  caffeic  acid  memiliki potensi  anti  inflamasi  dan  antioksidan  yang sebanding  tetapi  dengan  nilai  Pa<  0,7.  Hasil komputasi  tersebut  sejalan  dengan  beberapa  hasil penelitian  yang  ada.  Penelitian  Zhao et  al. ,  2013 menunjukan  adanya  potensi  anti  inflamasi  dan antioksidan dari senyawa myricetin ditandai dengan adanya  penurunan  MDA,  penurunan  IL1β  dan  IL6
pada  tikus  model  kolitis  ulceratif.  Potensi  anti inflamasi  dan  antioksidan  dimiliki  oleh  procyanidin B2,  ditunjukkan  adanya  penurunan  kadar  IL6  dan PGE2  pada  kultur  dipapar  LPS.  Peningkatan  enzym prooksidan  dan  penurunan  MDA  pada  hepar  tikus dipapar CCl4 (Martinez et al, 2012; Yang et al, 2015). Caffeic  acid  memiliki  potensi  anti  inflamasi  dan antioksidan ditunjukkan adanya penurunan malondialdehide  (MDA)  dan  nitric  oxide  (NO)  pada jaringan otak tikus (Kim et al. , 2015). Penurunan IL1β dan TNFα pada tikus model DM (Chao et al, 2009) Pathogenesis  penyakit  neurodegeneratif  terjadi karena adanya inflamasi dan stres oksidatif (Rasool et al. , 2014). Sehingga bahan yang memiliki potensi anti inflamasi  dan  antioksidatif  sangat  bermanfaat sebagai  neuroprotektif,  untuk  pencegahan  penyakit neurodegeneratif  (Fratiglioni  &  Qiu  2009,  Singh 2015).  Sehingga  sangat  dimungkinkan  pemanfaatan ekstrak  biji  Tamaridus  indica  sebagai  sumber pencegahan untuk penyakit neurodegeneratif antara lain  alzheimer  dan  parkinson.  Dapat  disimpulkan, terdapat  senyawa  procyanidin  B2,  myricetin  dan caffeic  acid  dalam  ekstrak  metanol  biji Tamarindus indica , dan ketiganya memiliki potensi anti infamasi dan antioksidan yang bersifat neuroprotektif.

## Daftar Pustaka
Amor,  S., et  al. (2014).  Inflammation  in neurodegenerative diseases – an update.
Immunology 142(2): 151-166.
Baldosano, H. Y., et al. (2015). Effect of particle size, solvent and extraction time on tannin extract from Spondias purpurea bark through soxhlet extraction. Proceedings of the DLSU Research
Congress. Balittri., (2017). Retrieved from http://balittri.litbang.pertanian.go.id/index.p hp?option=com_content&task=view&id=75&
Itemid=1&lang=ba
Bandawane,  D., et  al. (2013).  Evaluation  Of  Anti- Inflammatory  And  Analgesic  Activity  Of Tamarind  ( Tamarindus  indica L.)  Seeds.  Int  J Pharm Pharm Sci, 5, 623-629.
Chao,  P., et  al. (2009).  Anti-inflammatory  and  anti- coagulatory  activities  of  caffeic  acid  and ellagic acid in cardiac tissue of diabetic mice. Nutrition & metabolism, 6(1), 1.
Chunglok,  W., et  al. (2014).  Antioxidant  and Antiproliferative Activities of Non-Edible Parts
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 anti inflamasi antioksidan
of  Selected  Tropical  Fruits.  Sains  Malaysiana, 43(5), 689-696.
El-Siddig,  K.  (2006).  Tamarind: Tamarindus  indica L (Vol. 1): Crops for the Future.
Fratiglioni,  L.  and  C.  Qiu  (2009).    Prevention  of common  neurodegenerative  disorders  in  the elderly.  Experimental  gerontology  44(1):  46- 50.
Kim, J. H., et al. (2015). Protective role of caffeic acid in  an  Aβ25 -35-induced  Alzheimer's  disease model.  Nutrition  research  and  practice,  9(5), 480-488.
Kuru,  P.  (2014). Tamarindus  indica and  its  health related  effects.  Asian  Pacific  Journal  of Tropical Biomedicine, 4(9), 676-681.
Liu,  Z., et  al. (2017).  Oxidative  stress  in neurodegenerative  diseases:  from  molecular mechanisms to clinical applications. Oxidative medicine and cellular longevity 2017.
Martinez-Micaelo,  N., et  al. (2012).  Omega-3 docosahexaenoic acid and procyanidins inhibit cyclo-oxygenase activity and attenuate NF- κB activation  through  a  p105/p50  regulatory mechanism  in  macrophage  inflammation. Biochemical Journal, 441(2), 653-663.
Meher, B., et al. (2014). A review on: Phytochemistry,
pharmacology  and  traditional  uses  of Tamarindus  indica L.  World  J  Pharm Pharmaceut Sci, 3, 229-240.
Rasool,  M., et  al. (2014).  Recent  Updates  in  the Treatment  of  Neurodegenerative  Disorders
Using  Natural  Compounds.  Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,
Razali, N., et al. (2015). Polyphenols from the extract and  fraction  of  T.  indica  seeds  protected HepG2  cells  against  oxidative  stress.  BMC complementary  and  alternative  medicine, 15(1), 1.
Rossi,  L., et  al. (2008).  Benefits  from  dietary polyphenols  for  brain  aging  and  Alzheimer’s disease.  Neurochemical  research,  33(12), 2390-2400.
Singh,  S.  (2015).  Antioxidants  as  a  preventive therapeutic option for age related neurodegenerative  diseases.  Therapeutic Targets for Neurological Diseases 2.
Spencer,  J.  P.  (2009).  Flavonoids  and  brain  health: multiple  effects  underpinned  by  common mechanisms.  Genes  &  nutrition,  4(4),  243- 250.
Sulaiman, I. S. C., et al. (2017). Effects of temperature, time,  and  solvent  ratio  on  the  extraction  of phenolic  compounds  and  the  anti-radical activity of Clinacanthus  nutans Lindau  leaves by response surface methodology. Chemistry Central Journal 11(1): 54.
Yang,  B.-Y., et  al. (2015).  Protective  effect  of procyanidin  B2  against  CCl4-induced  acute liver  injury in mice. Molecules,  20(7),  12250- 12265.
Zhao, J., et al. (2013). Protective effect of myricetin in dextran  sulphate  sodium-induced  murine ulcerative colitis. Molecular medicine reports, 7(2), 565-570.