ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (1) (2017) : 48 – 52
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi, Fabrikasi dan Penentuan Ukuran Nanopartikel Steroid (StrNPs) Ekstrak Lengkuas Merah ( Alpinia purpurata K. Schum) dengan Metoda Dynamic Light Scattering
Shelly Wiarsih a , Dewi Kusrini a , Pratama Jujur Wibawa a,*
a Organic Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: pratamajw@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords: red ginger, Alpinia purpurata , steroids, steroid
nanoparticles.
Research  on  steroid  of  red  ginger  ( Alpinia  purpurata K.  Schum)  and  the  fabrication  of steroid  nanoparticles  (StrNPs)  has  been  done.  The  aim  of  this  research  is  to  isolate steroids  from  red  ginger  ( Alpinia  purpurata K.  Schum)  tissue  and  then  fabricate  the isolated  steroid  to  become  StrNPs.  The  associated  steroid  was  isolated  as n -hexane fraction  through  the  subsequently  works  such  as  maceration,  extraction,  and  column chromatography. While the StrNPs were fabricated by colloidal method under ultrasonic agitation  of  40  kHz,  2×50  watt  for  10  minute.  The  molecular  structure  of  the  isolated steroid was elucidated based on the molecular structure data base similarity index that generated by gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS).The size of the fabricated StrNPs  was  determined  by dynamic  light  scattering (DLS)  method  using  particle  size analyser  (PSA) machine.  The results  show  that  the  isolated steroid  can be  classified as progesterone group and the particle size of the fabricated StrNPs are about 95,0 ± 12,2 nm for the first group and 670,2 ± 141,1 nm for StrNPs of the second group.

## A b s t r a k
Kata kunci: lengkuas merah, Alpinia purpurata , steroid, nanopartikel steroid.
Telah  dilakukan  penelitian  mengenai  steroid  dari  rimpang  lengkuas  merah ( Alpinia purpurata K.  Schum)  dan  pabrikasi  nanopartikelnya.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah untuk  m emperoleh  isolat  steroid  dari  rimpang  lengkuas  merah  ( Alpinia  purpurata  K. Schum ) dan memperoleh nanopartikel steroid dari hasil isolasi. Senyawa steroid diisolasi dari fraksi n-heksana dengan maserasi, ekstraksi, dan kromatografi kolom. Nanopartikel steroid difabrikasi dengan ultrasonikasi. Struktur molekul steroid diidentifikasi dengan gas  chromatography-mass  spectrometer (GC-MS).  Ukuran  nanopartikel  steroid dikarakterisasi dengan metoda dynamic light scattering (DLS) menggunakan alat particle size  analyzer (PSA).  Hasil  menunjukkan  bahwa  isolat  steroid  mengandung  senyawa golongan progesteron. Ukuran rata-rata nanopartikel steroid secara statistik adalah 95,0 ± 12,2 nm untuk nanopartikel steroid (StrNPs) kelompok I dan 670,2 ± 141,1 nm untuk StrNPs kelompok II.

## 1. Pendahuluan
Rimpang  lengkuas  merah  ( Alpinia  purpurata K. Schum)  merupakan  keluarga  tanaman Zingiberaceae yang secara tradisional luas digunakan untuk mengobati berbagai  penyakit  seperti  sakit  kepala,  rematik,  sakit
tenggorokan,  dan  penyakit  ginjal  [1,  2].  Selain  itu, beberapa  penelitian  melaporkan  bahwa  rimpang lengkuas  merah  juga  menunjukkan  bioaktifitas  sebagai antimikroba  [3],  antioksidan,  antikanker  [4]  dan antibakteri  terutama  bakteri Mycobacterium  tuberculosis penyebab penyakit tuberkolosis (TBC) [5]. Fenomena ini
menarik  perhatian  para  peneliti  untuk  melakukan penelitian yang lebih mendalam untuk menemukan jenis senyawa  kimia,  terutama  metabolit  sekunder  yang terdapat  di  dalam  rimpang  lengkuas  merah.  Salah  satu penelitian  ini  melaporkan  bahwa  rimpang  lengkuas merah  diketahui  mengandung  steroid,  flavonoid, alkaloid,  fenol,  tanin,  karbohidrat,  protein,  glikosida, resin,  tiol,  saponin,  dan  gula  pereduksi  [6].  Namun demikian,  penelitian-penelitian  yang  khusus dan  fokus untuk  mengeskplorasi  steroid  saja  dalam  lengkuas merah,  dalam  pengertian  tidak  hanya  isolasi  dan karakterisasi tetapi juga pembentukan nanopartikelnya, masih  sangat  sedikit  yang  melakukan.  Hal  ini ditunjukkan  dengan  publikasi  tentang  steroid  rimpang lengkuas merah yang masih sangat sulit ditemukan, baik yang berupa jurnal, proceeding seminar, maupun buku.
Di  pihak  lain,  penelitian-penelitian  mengenai nanopartikel  berkembang  begitu  pesat  dan  merambah keberbagai  disiplin  ilmu  pengetahuan.  Hal  ini  terkait dengan  salah  satu  sifat  unggul  nanopartikel  yang  tidak dimiliki  oleh  jenis  material  yang  lain,  yaitu  rasio  luas permukaan  terhadap  volumenya  yang  jauh  lebih  besar dibanding  material-material  lain  pada  keadaan normalnya.  Situasi  ini  mengakibatkan  sifat-sifat nanopartkel  menjadi  lebih  ditentukan  oleh  sifat-sifat permukaan  dibanding  oleh  komposisinya.  Sifat-sifat permukaan  ini  memainkan  peran  yang  sangat  penting bagi perjalanan suatu obat menuju reseptor atau massa target  di  dalam  sel  [7].  Permukaan  yang  luas  akan meningkatan gaya-gaya adhesi yang dapat mempercepat pelarutan  dan  mempermudah  masuknya  sebuah nanopartikel  ke  dalam  membran  sel  disamping memberikan efek titik kuantum ( quantum dot effect) yang baik [7, 8]. Fenomena ini dibuktikan oleh Basniwal dkk. [9]  yang  mencatat  bahwa  sifat  antibakteri  kurkumin terhadap B. subtilis meningkat sekitar 33% setelah dalam bentuk  nanopartikelnya  (KurNPs)  [9].  Fakta  ini menginspirasi  untuk  tidak  saja  mengisolasi  dan mengkarakterisasi  steroid  lengkuas  merah  tetapi  juga membuat  nanopartikel  steroid  (StrNPs).  Selanjutnya, paper ini melaporkan cara isolasi, karakterisasi dan cara membuat  nanopartikel  steroid  (StrNPs)  rimpang lengkuas merah.

## 2. Metode Penelitian

## Bahan
Rimpang  lengkuas  merah  lokal  Semarang,  Jawa Tengah, etanol 96% teknis, akuades, metanol teknis, n - heksana teknis, kloroform teknis, pereaksi Liebermann- Burchard, kloroform p.a., n -heksana p.a., etil asetat p.a., silika gel 60 G, plat KLT, plat KLT preparatif, aqua bides dan virgin  coconut  oil (VCO)  komersial  lokal.  Bahan- bahan  kimia  ini  diproduksi  oleh  Merck,  Jerman  dan digunakan sesuai aslinya tanpa perlakuan lebih lanjut.

## Alat
Alat gelas standar penelitian, lampu UV 254 nm dan 365  nm,  satu  set  alat  maserasi  dan rotary  evaporator Buchii ,  neraca  analitik,  botol  vial,  kolom  kromatografi, chamber KLT, melting point , pipa kapiler, GCMS-QP2010S
Shimadzu,  KRISBOW Ultrasonic  Cleaner, dan  HORIBA Scientific particle size analyzer .

## Persiapan Bahan dan Skrining Fitokimia
Sampel  rimpang  lengkuas  merah  sebanyak  20  kg dibersihkan  dengan  air,  dikeringkan  pada  temperatur kamar,  dan  dihaluskan  hingga  menjadi  serbuk.  Setelah itu  dilakukan  skrining  fitokimia  yang  meliputi  uji steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, alkaloid, tanin, dan  kuinon  berdasarkan  metoda  yang  dilaporkan  oleh Subramanian [6].

## Isolasi steroid dan elusidasi struktur
Serbuk  lengkuas  merah  sebanyak  2  kg  dimaserasi dengan  etanol  96%  selama  24  jam  kemudian  diuapkan hingga  diperoleh  ekstrak  kental.  Selanjutnya  ekstrak kental  dilarutkan  kedalam  metanol  dan  difraksinasi menggunakan  eluen n -heksana.  Ekstrak  ini  kemudian diuapkan  dengan rotary  evaporator hingga  didapatkan ekstrak  kental n -heksana.  Terhadap  ekstrak n -heksana ini  dilakukan  uji  steroid,  Sementara  itu untuk mendapatkan steroid  murni  dilakukan  kromatografi kolom  gravitasi  terhadap  ekstrak  kental n -heksana. Fraksi-fraksi yang didapatkan dari proses kromatografi ini kemudian dilakukan KLT dan fraksi dengan pola noda yang sama digabungkan menjadi satu fraksi. Fraksi yang mengandung steroid dipisahkan dengan KLT preparatif, noda yang terlihat dominan dikerok, dilarutkan dengan kloroform, dan diuapkan hingga diperoleh isolat steroid. Isolat steroid diuji kemurnian dengan KLT dua dimensi menggunakan  berbagai  eluen  dan  ditentukan  titik lelehnya menggunakan melting point tester .
Selanjutnya  elusidasi  struktur  steroid  dilakukan menggunakan  GCMS-QP2010S  Shimadzu  (kolom AGILENT HP 1MS, panjang 30 m, internal diameter 0,25 mm,  gas  pembawa  helium).  GC-MS  dioperasikan  pada kondisi  temperatur  injektor  310°C,  tekanan  13,7  kPa, aliran  total  gas  pembawa  12,9  mL/menit,  temperatur kolom  terprogram  200°C  selama  5  menit  kemudian dinaikkan temperaturnya dengan laju 5°C /menit hingga 300°C.  Puncak-puncak  kromatogram  yang  dihasilkan dengan  intesitas  puncak  yang  relatif  tinggi  dilakukan analisis fragmentasi massa dan fragmen-fragmen massa yang  dihasilkan  dengan  kelimpahan  lebih  dari  25% diambil  sebagai  dasar  penentuan  struktur  molekul steroid  melalui  pendekatan  basis  data  indek  kemiripan struktur (molecular  structure  similarity  index) lebih  dari 85%.

## Fabrikasi dan karakterisasi nanopartikel steroid (StrNPs)
Fabrikasi  StrNPs  dapat  dilakukan  sebagai  berikut, kristal  isolat  steroid  sebanyak  10  mg  dicampurkan kedalam  10  mL  larutan  aquabides/VCO  perbandingan volum  9:1  kemudian  diultrasonikasi  menggunakan KRISBOW Ultrasonic  Cleaner (frekwensi  gelombang ultrasonik  40  kHz,  daya  2×50  watt)  selama  10  menit. Ukuran partikel StrNPs ditentukan berdasarkan metoda dynamic  light  scattering (DLS)  menggunakan  Horiba Scientific particle size analyzer buatan USA.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (1) (2017) : 48 – 52

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Sekrining fitokimia dan isolasi steroid
Hasil sekrining fitokimia terhadap serbuk lengkuas merah  memastikan  bahwa  beberapa  jenis  senyawa metabolit  sekunder  berikut  ini  positif  terdapat  didalam lengkuas merah, steroid/triterpenoid, saponin, flavonoid, alkaloid, tanin, dan kuinon. Selanjutnya hasil isolasi  steroid  dari  sejumlah  rimpang  lengkuas  merah tersebut di atas diperoleh ekstrak kental etanol sebanyak 78,98 gram  dengan  rendemen  sebesar  3,95  %.  Setelah dilakukan  proses  fraksinasi  terhadap  ekstrak  etanol  ini dengan n -heksana  dihasilkan  ekstrak  kental  sebanyak 9,88 gram yang positif mengandung senyawa steroid.
Proses  pemurnian  steroid  yang  dilakukan  dengan KLT  memberikan  hasil  terbaik  ketika  menggunakan eluen n -heksana/kloroform (4:6) yang diterapkan pada kromatografi  kolom  gravitasi.  Pemisahan  ekstrak n - heksana  menghasilkan  220  fraksi  yang  dikelompokkan ke dalam 8 fraksi besar (A, B, C, D, E, F, G, dan H). Fraksi besar  E,  F,  G,  dan  H  positif  terhadap  steroid  dan digabungkan  sebagai  fraksi  S.  Selanjutnya  fraksi  S dipisahkan  dengan  KLT  preparatif  menggunakan  eluen n-heksana/kloroform  (4:6)  Dari  pemisahan  ini dihasilkan tiga pita dominan, yaitu pita S 1 dengan Rf 0,42 (pada λ 365 nm), pita S 2 dengan Rf 0,50, dan S 3 dengan Rf 0,62  (pada λ 254  nm).  Pita  S 2 Kemudian  dipisahkan dengan eluen n-heksana/kloroform (3:7) dan dihasilkan pita S 2a dengan Rf 0,37 dan pita S 2b dengan Rf 0,42 pada λ 254  nm.  Pita  S 2a kemudian  dipisahkan  dengan  eluen n - heksana/kloroform (4:6) kembali dan dihasilkan pita S 2a1 dengan Rf 0,43 dan pita S 2a2 dengan Rf 0,53 yang dapat dilihat pada gambar 1.
Proses  KLT  lebih  lanjut  yang  meliputi  KLT  dua demensi  terhadap  pita  S 2a1 ini  menghasilkan  noda tunggal, dan steroid yang diperoleh memiliki titik leleh sebesar 218-220°C.
Gambar 1: Pita noda pemisahan steroid (a) fraksi S 2a2 , (b) fraksi S 2a1

## Elusidasi struktur steroid
Kromatogram  hasil  analisis  isolat  steroid  pita  S 2a1 yang dilakukan  dengan GC ditampilkan  pada gambar  2. Gambar  ini  memperlihatkan  13  puncak  yang merepresentasikan  terdapat  13  jenis  senyawa  di  dalam isolat S 2a1 .
Gambar  2  menunjukkan  bahwa  isolat  steroid  S 2a1 sesungguhnya belum merupakan senyawa murni untuk tingkat kualitas analisis GC meskipun sudah merupakan senyawa tunggal untuk tingkat kualitas analisis KLT dua demensi.  Dari  13  senyawa  ini  selanjutnya  dipilih  satu senyawa yang memberikan intensitas puncak tertinggi, yaitu puncak ke-12 untuk difragmentasi lebih lanjut guna mengetahui struktur molekul senyawa yang memberikan puncak  ke-12  ini.  Hasil  fragmentasi  massa  senyawa puncak ke-12 ini ditampilkan pada gambar 3.
Gambar 2: Kromatogram GC isolat steroid S 2a1
Gambar 3: Fragmentogram massa molekul puncak ke-12 kromatogram isolat S 2a1
(a) (b)
Gambar 4: Spektogram pola fragmentasi massa senyawa/molekul basis data yang paling mendekati pola fragmentasi massa senyawa puncak ke-12 isolat S 2a1 yang ditampilkan pada gambar 3 dengan indek kemiripan 87%.
Terlihat  pada  gambar  3  bahwa  senyawa/molekul yang  memberikan  puncak  ke-12  itu  memiliki  berat molekul  (BM)  sekitar  412  gram/mol  sebagaimana  yang direpresentasikan oleh rasio massa/muatan (m/e) = 412. Disamping  itu,  molekul  ini  juga  memberikan  fragmen massa yang paling stabil yang merupakan puncak dasar (base peak) dengan m/e=43. Berdasarkan BM dan puncak dasar ini selanjutnya struktur molekul senyawa tersebut ditentukan melalui matching basis data indek kemiripan molekul > 85%, yang hasilnya ditampilkan pada gambar 4.
Terlihat  pada  gambar  4  bahwa  senyawa  yang terdapat didalam isolate S 2a1 dan memberikan puncak ke- 12 pada analisis GC adalah mirip dengan senyawa pregn- 4-ena-3,20-dion yang memiliki struktur molekul seperti yang  terlihat  pada  gambar  4  itu  (direproduksi  kembali dan  ditampilkan  pada  gambar  5),  yang  termasuk golongan steroid khususnya progesteron.
Gambar 5: Struktur molekul steroid yang paling mendekati steroid yang terdapat di dalam isolate S 2a1 dan memberikan puncak ke-12 pada analisis GC

## Fabrikasi dan karakterisasi nanopartikel steroid (StrNPs)
Hasil fabrikasi StrNPs adalah berupa koloid steroid di dalam media air/VCO berwarna putih susu seperti yang ditampilkan  pada  gambar  6a.  Sedangkan  grafik  hasil penentuan  ukuran  partikel  StrNPs  menggunakan  alat particle size analyzer (PSA) ditampilkan pada gambar 6b dan  analisis  statistik  ukuran  rata-rata  partikel ditampilkan  pada  tabel  gambar  6c.  Gambar  6b menunjukkan  bahwa  koloid  StrNPs  tersusun  oleh  dua kelompok partikel steroid yang berukuran diameter rata- rata  kurang  dari  100  nm  dan  satunya  lagi  kurang  dari 1000  nm  (1  µm).  Perhitungan  secara  statistik menggunakan Horiba scientific PSA software menemukan bahwa  ukuran  diameter  rata-rata  kelompok  partikel StrNPs  yang  pertama  adalah  95,0  nm  dengan  standar deviasi (SD) sebesar 12,2 nm. Ini berarti ukuran partikel StrNPs dalam kelompok I berkisar dari 82,8 nm hingga
107,2  nm  (95,0  ±  12,2  nm)  sebagaimana  yang ditunjukkan pada tabel 1.
Gambar 6: Hasil fabrikasi StrNPs (a) berupa koloid steroid di dalam media air/VCO yang berwarna putih susu, (b) grafik hasil penentuan ukuran StrNPs menggunakan PSA
Tabel 1. Tabel hasil perhitungan ukuran rata-rata
statistik partikel StrNPs Peak No. S.P Area Ratio Mean S.D Mode 1 0,36 95,0 nm 12,2 nm 96,5 nm 2 0,64 670,2 nm 141,1 nm 622,6 nm
Lebih  lanjut  kurva  integrasi  pada  gambar  6b menunjukkan  bahwa  sekitar  40%  dari  jumlah  partikel StrNPs  yang  terdapat  pada  kelompok  I  berukuran dibawah rata-rata ( mean ) keseluruhan partikel 95,0 nm. Sementara  tabel  gambar  6c  (kolom mode )  lebih  lanjut menunjukkan  bahwa  partikel  StrNPs  yang  berukuran 96,5  nm  adalah  partikel  yang  paling  sering  terdekteksi oleh detektor PSA. Hal yang sangat kontras diperlihatkan oleh  partikel-partikel  StrNPs  yang  tergabung  kedalam kelompok  II  (lihat  gambar  6b  dan  tabel  gambar  6c) dimana  rata-rata  diameternya  berukuran  670,2  nm dengan  SD  sebesar  141,1  nm.  Ini  sebuah  ukuran  yang cukup  besar  untuk  skala  nanopartikel.  Kisaran  ukuran partikel StrNPs dalam kelompok II ini adalah dari 529,1 nm hingga 811,3 nm (670,2 ± 141,1 nm). Kurva integrasi pada  gambar  6b  untuk  partikel-partikel  kelompok  II menunjukkan  bahwa  sekitar  80  %  jumlah  partikel tersebut berukuran lebih kecil dari 670,2 nm. Dapat pula
ditambahkan bahwa partikel-partikel dalam kelompok II yang  berukuran  622,6  nm  merupakan  partikel  yang paling  sering  terdeteksi  oleh  detektor  PSA  (lihat  tabel gambar 6c kolom mode ).
Fakta-fakta  ini  menunjukkan  bahwa  nanopartikel steroid (StrNPs) terbukti dapat terbentuk melalui sistem dispersi  koloidal  menggunakan  media  air/VCO  (rasio volum 9:1) dibawah pengaruh gelombang ultrasonik.

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  uraian  tersebut  di  atas,  dapat disimpulkan  bahwa  steroid  yang  diisolasi  dari  rimpang lengkuas  merah  dapat  dibuat  menjadi  nanopartikel steroid  (StrNPs)  berukuran  95,0  ±  12,2  nm  untuk kelompok  I  dan  670,2  ±  141,1  nm  untuk  kelompok  II. Lebih lanjut dapat disimpulkan bahwa tujuan penelitian ini secara keseluruhan berhasil dicapai dengan baik.

## 5. Ucapan Terima Kasih
Terima  kasih  disampaikan  kepada  Bapak  Hari, teknisi  alat particle  size  analyzer (PSA)  Laboratorium Fisika  Farmasi  Universitas  Islam  Indonesia  (UII) Yogyakarta  yang  telah  mengerjakan  analisis  sampel StrNPs.

## 6. Daftar Pustaka
[1]  Nurliani  Bermawie,  Susi  Purwiyanti,  Melati  Melati, Nurlaila  Wahyuni  Meilawati,  Karakter  morfologi, hasil,  dan  mutu  enam  genotip  lengkuas  pada  tiga agroekologi,  Buletin  Penelitian  Tanaman  Rempah dan
Obat, 23, 2, (2016) 125-135
http://dx.doi.org/10.21082/bullittro.v23n2.2012.%25 p
[2]  Narayan  Das  Prajapathi,  S.  S.  Purohit,  Arun  K. Sharma,  Tarun  Kumar,  A  handbook  of  medicinal plants:  A  complete  source  book,  Agrobios,  India, 2003.
[3]  KP  Kochuthressia,  S  John  Britto,  MO  Jaseentha,  L Joelri  Michael  Raj,  SR  Senthilkumar,  Antimicrobial efficacy of extracts from Alpinia purpurata (Vieill.) K.
Schum.  against  human  pathogenic  bacteria  and fungi,  Agriculture  and  Biology  Journal  of  North
America, 1, 6, (2010) 1249-1252 http://dx.doi.org/10.5251/abjna.2010.1.6.1249.1252
[4]  Chinthamony  Arul  Raj, Paramasivam  Ragavendran, Dominic Sophia, Muthaiyan Ahalliya Rathi, Velliyur Kanniappan  Gopalakrishnan,  Evaluation  of  in  vitro antioxidant  and  anticancer  activity  of Alpinia purpurata , Chinese Journal of Natural Medicines, 10,
4,  (2012)  263-268 http://dx.doi.org/10.1016/S1875- 5364(12)60053-3
[5]  Oliver  Villaflores,  Allan  Patrick  Macabeo,  Dietmar Gehle,  Karsten  Krohn,  Scott  Franzblau,  Alicia Aguinaldo, Phytoconstituents from Alpinia purpurata and  their  in  vitro  inhibitory  activity  against
Mycobacterium tuberculosis, Pharmacognosy Magazine, 6, 24, (2010) 339-344
http://dx.doi.org/10.4103/0973-1296.71785
[6]  Vadivel  Subramanian,  Evaluation  of  antioxidant activity  of Alpinia  purpurata rhizome  (Vieill),
International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, 2, 4, (2016) 601-607
[7]  Rainer H. Müller, Sven Gohla, Cornelia M. Keck, State of  the  art  of  nanocrystals – Special  features, production, nanotoxicology aspects and intracellular delivery,  European  Journal  of  Pharmaceutics  and Biopharmaceutics, 78, 1, (2011) 1-9 http://dx.doi.org/10.1016/j.ejpb.2011.01.007
[8]  Matthew N. Rhyner, Andrew M. Smith, Xiaohu Gao, Hui Mao, Lily Yang, Shuming Nie Nie, Quantum dots and  multifunctional  nanoparticles:  new  contrast agents  for  tumor  imaging,  Nanomedicine,  1,  2,
(2006) 209-217 http://dx.doi.org/10.2217/17435889.1.2.209 [9]  Rupesh Kumar Basniwal, Harpreet Singh Buttar, V. K. Jain, Nidhi Jain, Curcumin Nanoparticles: Preparation,  Characterization,  and  Antimicrobial Study,  Journal  of  Agricultural  and  Food  Chemistry, 59, 5, (2011) 2056-2061 http://dx.doi.org/10.1021/jf104402t