UJI AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL 96% BIJI SRIKAYA ( Annona squamosa L.) SEBAGAI ANTIDIARE YANG DISEBABKAN OLEH BAKTERI S higella dysenteriae DENGAN METODE DIFUSI CAKRAM
Submitted : 28 Nov 2015
Edited : 15 Des 2015
Accepted : 21 Des 2015
Leonov Rianto, Indri Astuti Handayani, Annisa Septiyani

## Akademi Farmasi IKIFA
Email : leonovrianto@gmail.com

## ABSTRACT
This research aims to find out how to extract ethanol 96% seed custard apples as Antidiarrhoeal that is caused by bacteria Shigella dysenteriae with different concentrations and compare with chloramphenicol. In addition, also to find out whether their respective inhibitory power of concentration of ethanol 96% seed extract custard apples have a difference in meaning. Research done by experimental methods, was carried out in the laboratory of pharmaceutical Academy IKIFA. Testing was done using the diffusion disc method. The concentration of ethanol 96% seed extract custard apples are used i.e. 15%, 30%, 45%, 60%, and 75%. As  positive  controls  used  chloramphenicol  30  µg/ml  and  NaCl  0.9%  as  the  negative  control.  Each  test  is carried out as many as eight repetitions. The results showed an average diameter drag power which formed on the test solution with a concentration of 15%, 30%, 45%, 60% and 75% respectively of 6,887 mm, 11,49 mm, 8,144 mm, 7,694 mm, 7,150 mm, whereas for chloramphenicol for 40,31 mm. Based on the results of the statistical  tests  there  are  meaningful  differences  between  concentrations  showed  a  meaningful  difference between the concentration of 15% and 30%, 15% and 60% and 15% and 75%. Conclusion of this research is at  a  concentration  of  15%,  96%  ethanol  extract  of  seeds  of  custard  apples  have  been  able  to  inhibit  the growth of bacteria, Shigella dysenteriae.
Keywords  : Custard  apples seed ( Annona  squamosa L), antidiare , Shigella  dysenteriae , disc  diffusion method

## PENDAHULUAN
Kesehatan merupakan hal yang sangat penting bagi kehidupan manusia. Kondisi lingkungan yang kurang  baik  dapat  mengganggu  kesehatan. Berbagai  macam  bakteri,  kuman,  virus  dapat tumbuh  dan  berkembang  biak  dengan  cepat  yang akan  mengganggu  kehidupan  manusia.  Diare, DBD,  muntaber,  pilek,  batuk  merupakan  contoh dari penyakit yang ditimbulkan.
Salah  satu  penyakit  yang  sering  terjadi  di Indonesia  adalah  diare  akibat Shigella  dysenteriae dan berjangkit sebagai endemi. Distribusi musiman yang  dilaporkan,  dengan  puncak-puncaknya  pada musim dingin (1) .
Salah  satu  penyebab  diare  karena  bakteri Shigella  dysenteriae .  Shigelosis  atau  disentri basiler adalah suatu reaksi peradangan akut saluran
pencernaan  yang  disebabkan  oleh  bakteri  yang tergolong genus shigella. Penyakit ini berbeda dari disentri  yang  disebabkan  oleh  amoeba  dan  oleh virus (1) .
Shigella  dysenteriae adalah  bakteri  gram negatif  yang  telah  lama  dikenal  sebagai  agen penyebab  penyakit  disentri  basiler.  Berbentuk batang,  ukuran  0,5-0,7  µm  x  2-3  µm  dan  tidak berflagel (2) .
Teknologi  di  bidang  kedokteran  khususnya bidang  antibiotik  banyak  memberikan  kemudahan bagi  kehidupan  manusia.  Namun,  dampak  negatif yang  tidak  dapat  dicegah  seringkali  timbul sehingga  terjadi  peningkatan  angka  kesakitan  dan angka kematian. Oleh karena itu, perlu dikembangkan  alternatif  pengobatan  baru  yang efektif, efisien, dan tidak  melupakan  standar  mutu
pelayanan  medis.  Dalam  hal  ini,  pengobatan dengan  memanfaatkan  bahan-bahan  alam  dapat dijadikan pilihan.
Keistimewaan  tanaman  Srikaya  ( Annona squamosa L) khususnya pada bidang Mikrobiologi ialah  terletak  pada  biji.  Walaupun  belum  terdapat penelitian  mendalam  tentang  biji  Srikaya    sebagai antidiare,  tetapi  bagian  lain  dari  tanaman  srikaya mengandung  zat  yang  berguna  sebagai  antidiare. Karena  manfaat  itu  peneliti  ingin  mengetahui apakah  biji  srikaya  memiliki  aktivitas  antidiare yang disebabkan oleh Shigella dysenteria.

## BAHAN
Bahan-bahan  yang  digunakan  yaitu  biji Srikaya  ( Annona  squamosa L.)  yang  didapat  di Pasar  Induk  Kramat  Jati  Jl.  Raya  Bogor  Km  17 Kramat  Jati  Jakarta  Timur,  bakteri Shigella disenteriae yang  di  dapat  dari  Laboratorium Mikrobiologi Universitas Indonesia. Media: Nutrient Agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA), Nutrient Broth , Natrium Klorida (NaCl).

## METODE PENLITIAN Pembuatan Ekstrak Secara Maserasi
Pembuatan  ekstrak  biji  Srikaya  ( Annona squamosa L.)  dengan  cara maserasi  menggunakan pelarut  etanol  96%.  Serbuk  simplisia  biji  Srikaya sebanyak  25  g  masukkan  ke  dalam  wadah maserasi,  lalu  tambahkan  250  ml  etanol  96% direndam  selama  6  jam  sambil  sesekali  diaduk, kemudian  didiamkan  sampai  24  jam.  Maserat dipisahkan dan proses diulangi 2 kali dengan jenis dan  jumlah  pelarut  yang  sama.  Semua  maserat dikumpulkan  dan  diuapkan  diatas  waterbath dengan  suhu  70  °C  sampai  terbentuk  ekstrak kental.  Rendemen  biji  Srikaya  yang  diperoleh ditimbang dan dicatat.

## Identifikasi senyawa fitokimia dalam ekstrak
1. Uji Alkaloid
Timbang 500 mg ekstrak, tambahkan 1 ml HCl  2  N  dan  9  ml  air,  kemudian  panaskan selama 2 menit. Setelah dingin disaring, 3 tetes filtrat diambil, kemudian ditaruh pada 2 tabung reaksi.  Pada  tabung  reaksi  pertama,  sampel ditambahkan  2  tetes  Meyer  LP,  jika  terdapat endapan  putih  kuning  maka  positif  alkaloid. Endapan  putih  kuning  tersebut  larut  dalam metanol.  Pada  tabung  reaksi  kedua,  sampel
ditambahkan  2  tetes  Bouchard  LP,  maka  akan terbentuk endapan coklat sampai hitam (3) .
2. Uji Flavonoid
Timbang  1  g  ekstrak,  tambahkan  5  ml etanol  95%,  kemudian  panaskan.  Setelah  itu masukkan  serbuk  Magnesium  sebanyak  0,1  g dan  10  tetes  HCl  pekat,  maka  akan  terbentuk merah jingga sampai dengan merah ungu (3) .

## Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi  alat  dan  bahan  dilakukan  dengan cara  yang  sesuai.  Corong,  cawan  petri  disterilisasi dalam  oven  dengan  suhu  160  °C  selama  1  jam. Spatula,  ose  dan  pinset  disterilisasi  dengan pemijaran.  Tabung  reaksi,  pipet  kaca,  erlenmeyer, tip mikropipet, kapas, media NA dan media MHA disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu 121 °C selama 15 menit dengan mengatur tekanan sebesar 15  dyne/cm 3 (1  atm).  Sebelumnya  semua  alat dicuci  bersih,  dikeringkan  dan  dibungkus  dengan kertas (4) .

## Pembuatan Nutrient Agar
Larutkan  2,3  g  serbuk  NA  dengan  100  ml  air suling  dalam  erlenmeyer,  lalu  dipanaskan  sambil sesekali diaduk sampai serbuk NA larut. Kemudian larutan  NA  dituang  ke  dalam  tabung  reaksi  yang sudah dikalibrasi sampai 7 ml. Setelah dimasukkan,  tutup  tabung  reaksi  dengan  kapas, sterilkan  di  dalam  autoklaf  dengan  suhu  121  °C selama  15  menit  pada  tekanan  1  atm.  Miringkan dan didinginkan sehingga terbentuk agar miring (4) .

## Pembuatan Mueller Hinton Agar (MHA)
Dilarutkan  6,8  g  bubuk  MHA  dengan  200  ml air  suling  dalam  erlenmeyer  lalu  panaskan  sambil sesekali  diaduk  sampai  serbuk  MHA  larut.  Lalu sterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 °C selama 15  menit  pada  tekanan  1  atm.  Media  agar didinginkan  kemudian  dituang  ke  dalam  cawan petri yang telah steril dengan kedalaman 5 mm dan biarkan memadat pada suhu kamar (4) .

## Pembuatan Nutrient Broth
Sebanyak  3,65  g  bahan  dilarutkan  dalam  100 ml  air  suling,  kemudian  dipanaskan  hingga  larut sempurna.  Selanjutnya  disterilkan  dalam  autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit (5) .

## Pembiakan Bakteri
Diambil  satu  sengkelit  bakteri  dari  biakan murni Shigella  disentriae dengan  menggunakan ujung ose steril. Lalu goreskan secara zig-zag pada seluruh media nutrient agar miring, oleskan secara merata.  Kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37  °C selama 18-24 jam (4) .

## Pembuatan Suspensi Bakteri
Diambil  beberapa  sengkelit  bakteri  hasil persiapan  bakteri  uji.  Masukkan  ke  dalam  tabung yang  berisi  larutan  NB,  kemudian  dikocok  secara berhati-hati hingga terbentuk suspensi bakteri (4) .

## Pembuatan Larutan Uji Sampel
Pembuatan  larutan  induk  ekstrak  etanol  96% biji  Srikaya  yaitu  dengan  menimbang  7  g  ekstrak kental  biji  srikaya  kemudian  dilarutkan  dengan NaCl  fisiologis  hingga  100  ml  kocok  sampai homogen.  Kemudian  buat  larutan  uji  sampel dengan konsentrasi 15%, 30%, 45%, 60% dan 75% dengan cara :
a. Ukur dengan gelas ukur dan mikropipet larutan induk  sebanyak  6,5  ml,  kemudian  encerkan dengan  NaCl  fisiologis  hingga  10  ml.  Kocok sampai  homogen.  Diperoleh  ekstrak  dengan konsentrasi 75%.
b. Ukur dengan gelas ukur dan mikropipet larutan konsentrasi  75%  sebanyak  5,6  ml,  kemudian encerkan dengan NaCl fisiologis hingga 10 ml. Kocok  sampai  homogen.  Diperoleh  ekstrak dengan konsentrasi 60%.
c. Ukur dengan gelas ukur dan mikropipet larutan konsentrasi  60%  sebanyak  5,25  ml,  kemudian encerkan dengan NaCl fisiologis hingga 10 ml. Kocok  sampai  homogen.  Diperoleh  ekstrak dengan konsentrasi 45%.
d. Ukur dengan gelas ukur dan mikropipet larutan konsentrasi  45%  sebanyak  4,7  ml,  kemudian encerkan dengan NaCl fisiologis hingga 10 ml. Kocok  sampai  homogen.  Diperoleh  ekstrak dengan konsentrasi 30%.
e. Ukur dengan gelas ukur dan mikropipet larutan konsentrasi  30%  sebanyak  3,5  ml,  kemudian encerkan dengan NaCl fisiologis hingga 10 ml. Kocok  sampai  homogen.  Diperoleh  ekstrak dengan konsentrasi 15%.
Larutan uji ekstrak biji srikaya siap diteteskan pada cakram.
Uji Aktivitas Antibakteri
Pada  setiap  cawan  petri  yang  berisi  media MHA dioleskan suspensi bakteri Shigella disenteriae secara  merata,  lalu  ratakan  dengan kapas.  Letakkan  kertas  cakram  pada  permukaan MHA  tersebut  dengan  menggunakan  pinset. Teteskan  ekstrak  etanol  96%  biji  srikaya  ( Annona squamosa L.)  pada  kertas  cakram  yang  berada  di cawan petri yang telah ditumbuhi  media. Lakukan delapan kali pengulangan sesuai dengan konsentrasi.  Sebagai  kontrol  media  digunakan cawan  petri  yang  telah  ditumbuhi  media  dan bakteri Shigella  disentriae saja.  Sebagai  kontrol positif  digunakan  cakram  antibiotik  kloramfenikol dengan  kandungan  30  µg/disc  yang  diletakkan pada  media  agar.  Kemudian  semua  perlakuan dimasukkan  ke  inkubator  pada  suhu  37°  selama 18-24 jam (4) .
Pengamatan dan Pengukuran Diameter Hambat Bakteri
Efek antibakteri dinyatakan positif jika terlihat zona  hambat  di  sekitar  kertas  cakram.  Dilakukan pengukuran  zona  hambat  yang  berada  di  sekitar kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong (dalam mm).
Rumus  pengukuran  zona  hambat  sebagai berikut:
Keterangan : X= rata-rata daya hambat (mm) Z= diameter hambat (mm) n= jumlah perlakuan

## Analisa Data
Data  yang  diperoleh  dari  penelitian  yang sudah  dilakukan  dengan  larutan  uji  yaitu  ekstrak etanol  96%  biji  srikaya  ( Annona  squamosa L.), kontrol  positif  yaitu  antibiotik  kloramfenikol  dan kontrol negatif NaCl fisiologis. Untuk menganalisis  data  penelitian  ini,  dilakukan pengamatan  visual  dan  pengukuran  rata-rata  zona hambat disekitar cakram yang telah ditetesi larutan uji terhadap bakteri Shigella disentriae .
Data  yang  diperoleh  merupakan  data  primer dari hasil pengamatan laboratorium yang kemudian dianalisis  dengan  cara  mengamati,  mencatat,  dan menganalisis.  Data  tersebut  kemudian  akan  diuji statistik normalitas Kolmogorov-Smirnov a
dilanjutkan dengan uji homogenitas Levene dan uji T.

## HASIL
Hasil  organoleptik  meliputi  warna,  bau  dan rasa  yaitu  serbuk  biji  srikaya  ( Annona  squamosa L.)  berwarna  hitam,  bau  khas,  rasa  pahit.  Hasil maserasi  ekstrak  biji  srikaya  beserta  rendemennya dapat dilihat pada tabel 1.

## Identifikasi senyawa fitokimia dalam ekstrak
Identifikasi senyawa fitokimia dalam ekstrak etanol  96%  biji  srikaya  ( Annona  squamosa L.) meliputi  uji  alkaloid,  dan  uji  flavonoid.  Hasil identifikasi senyawa fitokimia dalam ekstrak dapat dilihat pada tabel 2.

## Uji aktivitas antibakteri
Uji aktivitas antibakteri menggunakan larutan uji  ekstrak  etanol  96%  biji  srikaya  ( Annona squamosa L.)  konsentrasi  15%,  30%,  45%  60%,
75%  dan  kontrol  positif  yang  digunakan  adalah kloramfenikol.  Besarnya  rata-rata  diameter  zona hambat  pada  konsentrasi  15%  sebesar  11,49  mm, pada  konsentrasi  30%  sebesar  6,887  mm,  pada konsentrasi  45%  sebesar  8,144  mm,  pada konsentrasi  60%  sebesar  7,694  mm,  pada konsentrasi 75% sebesar 7,150 mm.

## Analisis Data
Analisis  data  dilakukan  setelah  mendapatkan diameter  zona  hambat.  Analisis  data  dimulai dengan  uji  normalitas  menggunakan Kolmogorov- Smirnov a .  Hasil  dari  uji Kolmogorov-Smirnov a adalah p-value 0,00 < 0,05 yang berarti data tidak normal.  Selanjutnya  uji  homogenitas  dengan Levene  test ,  hasilnya  adalah p-value 0,515  >  0,05 yang  berarti  sebaran  data  homogen.  Kemudian dilanjutkan  uji Kruskall-Wallis , p-value 0,00  < 0.05  artinya  ada  perbedaan  yang  signifikan  antar kelompok perlakuan.

## Tabel 1. Hasil pembuatan ekstrak secara maserasi
No Maserasi Maserat Hasil (mL) Warna Berat Ekstrak Kental (g) Rendemen 1. Biji srikaya I II III 222 249 248 Coklat Coklat Coklat 8,36 33,4%
Tabel 2. Hasil identifikasi senyawa fitokimia dalam ekstrak.
No. Uji kandungan Kimia Ekstrak Ekstrak Biji Srikaya (Annona squamosa L.) 1. Flavonoid (+) 2. Alkaloid (+) a) Mayer LP (+) b) Bouchardat LP (+)
Keterangan :   + : menyatakan positif -  : menyatakan negatif

## Tabel 3. Hasil uji aktivitas antibakteri
Perlakuan Ekstrak Etanol 96% Biji Srikaya ( Annona squamosa L.) Diameter Zona Hambat (mm) 15% 30% 45% 60% 75% Kontrol Positif 1 9,80 10,00 6,10 8,20 9,50 42,70 2 11,40 10,60 10,00 8,80 7,40 40,15 3 9,00 9,300 7,45 8,70 10,0 44,10 4 8,40 9,40 0,00 7,45 10,00 43,65 5 19,0 9,30 9,30 8,30 11,50 40,60 6 11,67 0,00 9,00 11,40 8,80 37,60 7 11,67 6,50 11,40 8,70 0,00 40,30 8 11,00 0,00 11,90 0,00 0,00 33,40 Rata-rata 11,49 6,88 8,14 7,69 7,15 40,31

## PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol 96% biji srikaya ( Annona  squamosa L.)  terhadap  bakteri Shigella dysenteriae .  Metode  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  metode  difusi  cakram.  Metode ini  digunakan  untuk  mengetahui  besar  diameter zona hambat yang terbentuk di sekitar cakram pada media  agar  yang  telah  ditanami  bakteri  gram negatif  yaitu  bakteri Shigella  dysenteriae .  Metode difusi  cakram  digunakan  karena  merupakan  salah satu  metode  termudah  untuk  menentukan  potensi antibiotik  suatu  zat.  Penentuan  potensi  antibiotik maserasi biji srikaya ini dilihat dari besarnya zona hambat masing-masing konsentrasi larutan uji.
Metode  ekstraksi  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  maserasi,  karena  metode  ini mudah dalam pengerjaannya dan tidak menggunakan peralatan khusus.
Pada  kontrol  positif  digunakan  cakram kloramfenikol 30 µg/ disc . Kloramfenikol digunakan  untuk  melihat  bakteri  yang  akan diujikan  masih  sensitif  atau  sudah  resisten  yang ditandai  dengan  besarnya  zona  hambat.  Bakteri yang  masih  sensitif  mempunyai  zona  hambat sebesar 18 mm atau lebih, sedangkan bakteri yang sudah  resisten  mempunyai  diameter  zona  hambat sebesar 12 mm atau kurang (6) . Pada kontrol negatif digunakan NaCl 0,9%.
Bakteri  yang  digunakan  sebagai  bakteri  uji adalah  bakteri Shigella  dysenteriae . Shigella dysenteriae adalah bakteri gram negatif yang telah lama  dikenal  sebagai  agen  penyebab  penyakit disentri  basiler (2) .  Sebelum  digunakan  dalam
penelitian  uji  aktivitas  antibakteri,  terlebih  dahulu dilakukan  peremajaan  bakteri  selama  18-24  jam karena diperlukan bakteri dalam keadaan aktif dan sedang  mengalami  masa  pertumbuhan  yang optimal.
Tumbuhan  srikaya  mengandung  alkaloid  tipe asporfin  (anonain),  bisbenziltetrahidroisokinolin (retikulin),  sianogen,  sitrulin,  asam  aminobutirat, ornitin,  arginin,  serta  arsitogenin  (skuamostatin  C dan  D),  anonasin  A,  anonin,  skuarnostatin  A, bulatasin, bulatasinon dan flavonoid (7) . Terhambatnya pertumbuhan Shigella dysenteriae dapat  terjadi  karena  adanya  aktivitas dari  flavonoid  yang  menyebabkan  terjadinya kerusakan  permeabilitas  dinding  sel  bakteri, mikrosom,  dan  lisosom  sebagai  hasil  interaksi antara  flavonoid  dan  DNA  bakteri.  Selain  itu, flavonoid memiliki sifat lipofilik sehingga memungkinkan  untuk  merusak  membran  sel bakteri (6) . Kemudian, senyawa alkaloid mempunyai kemampuan dalam menghambat kerja enzim untuk mensintesis  protein  bakteri.  Penghambatan  kerja enzim  ini  dapat  mengakibatkan  metabolisme bakteri  terganggu.  Alkaloid  juga  dapat  merusak komponen  penyusun  peptidoglikan  pada  sel bakteri, sehinga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan bakteri mati (8) .
Hasil  uji  aktivitas  antibakteri  dapat  dilihat pada  tabel  3.  Dengan  adanya  peningkatan konsentrasi diharapkan adanya peningkatan aktivitas  antibakteri  dari  ekstrak  biji  srikaya. Namun,  terjadi  penurunan  pada  konsentrasi  30%, 60%  dan  75%  dan  saat  konsentrasi  45%  terjadi kenaikan kembali. Hal ini terjadi karena data yang
didapat  kurang  merata  yang  disebabkan  oleh  cara pengolesan  bakteri  yang  kurang  merata  dan penggunaan  media  yang  kurang  tepat  untuk pertumbuhan  dari  bakteri Shigella  dysenteriae sehingga  menghasilkan  daya  hambat  yang  kurang maksimal dan diameter zona hambat yang berbeda pada tiap konsentrasi.
Hasil  diameter  rata-rata  zona  hambat  bakteri Shigella dysenteria pada cakram  kloramfenikol 30 µg/ disc sebesar 44,10 mm. Sedangkan, untuk hasil diameter  rata-rata  zona  hambat  maserasi  biji srikaya yang paling optimal yaitu pada konsentrasi 15%.  Dari  hasil  tersebut,  kloramfenikol  memiliki daya hambat yang jauh lebih optimal dibandingkan dengan maserasi biji srikaya. Hal ini wajar, karena kloramfenikol  adalah  antibiotik  dengan  spektrum kerja  luas,  yang  efektif  terhadap  hampir  semua gram  positif  dan  sejumlah  kuman  gram  negatif. Bakteri  gram  positif  dihambat  oleh  kloramfenikol pada  konsentrasi  antara  1-10  µg/ml  dan  bakteri gram  negatif  yang  dihambat  pada  konsentrasi antara  2-5  µg/ml.  Sekitar  95%  galur  bakteri  gram negatif dihambat secara invitro oleh 8,0 µg/ml atau kurang (9) .  Namun,  dari  hasil  ini  cukup  untuk membuktikan bahwa maserasi biji srikaya memiliki aktivitas antibakteri. Pada kontrol negatif yaitu  NaCl  0,9%,  tidak  terbentuk  adanya  zona hambat disekitar cakram.

## SIMPULAN
Dari  penelitian  ini  Ekstrak  etanol  96%  biji srikaya  ( Annona  squamosa L.)  memiliki  khasiat antibakteri  terhadap  bakteri Shigella  dysenteriae pada  konsentrasi  15%,  30%,  45%,  60%  dan  75%. Besarnya  diameter  zona  hambat  pada  konsentrasi 15%  sebesar  11,49  mm,  pada  konsentrasi  30% sebesar  6,887  mm,  pada  konsentrasi  45%  sebesar
8,144  mm,  pada  konsentrasi  60%  sebesar  7,694 mm, pada konsentrasi 75% sebesar 7,150 mm.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Sari,  Diane  tantia,  2010,  Efek  Antibakteri Ekstrak  Etanol  Rimpang  Kunyit (Curcumae domesticae) Terhadap  Pertumbuhan Shigella dysenteriae  ISOLAT  2312-F Secara In  Vitro , Skripsi, Malang.
2. Staf  pengajar  FKUI,  2012,  Buku  Ajar Mikrobiologi Kedokteran edisi Revisi, Binarupa Aksara, Jakarta. 3. Departemen Kesehatan, 1979, Materia
Medika  Indonesia,  Edisi  III,  112-115, Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia, Jakarta.
4. Tim  Penyusun  Buku  Pedoman  Praktikum Mikrobiologi  Jurusan  Farmasi,    2010,  Buku Pedoman Praktikum Mikrobiologi,
Polikteknik Kesehatan Kementrian Kesehatan Jakarta II, Jakarta.
5. Priyandari,  Susanti,  2003,  Isolasi  Derivatisasi Uji  Aktivitas  Antibakteri  Andrografolid  dari Herba Sambiloto, Skripsi, Jakarta.
6. Nurfianita,  Rahma,  2013,  Uji  Aktivitas Antibakteri  Infus  Daun  Salam  ( Syzygium polyanthum ( Wight ) Walp .)  terhadap  Bakteri Staphyloccus  eureus  dengan  Metode  Difusi Cakram, Laporan Penelitian, Politeknik Kesehatan  Kementrian  Kesehatan  Jakarta  II, Jakarta.
7. Anonim,  2008,  Buku  Pintar  Tanaman  Obat: 431  jenis  tanaman  penggempur  aneka penyakit, AgroMedia, Jakarta.
8. Dwitasari, Indar Lylan, 2003, Daya Antibakteri  antara  Ekstrak  Teh  Hijau  dan Ekstrak  Teh  Hitam  terhadap  Bakteri  dari Saliva Anak, Skripsi, Universitas Airlangga.
9. Katzung, B. G. 1998. Farmakologi Dasar dan Klinik  edisi  VI.  Alih  bahasa  oleh  Staf  Dosen Farmakologi Fakultas Kedokteran-Universitas Sriwiyaja. EGC, Jakarta.