## EFEKTIVITAS ASAM RETINOIK PADA PENYEMBUHAN LUKA PERFORASI BARU MEMBRAN TIMPANI HEWAN COBA MARMOT

## EFFECTS OF RETINOIC ACID IN WOUND CLOSURE OF ACUTE TYMPANIC MEMBRANE PERFORATION IN GUINEA PIGS

## Daniel Widjaja
Departemen Telinga Hidung Tenggorok – Kepala Leher, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya, Jl. Pluit Raya no. 2, Jakarta Utara 14440 Korespondensi: daniel.widjaja@atmajaya.ac.id

## ABSTRACT
Introduction: Tympanic membrane (TM) perforation is common in our practice. It may be due to infection or trauma. Retinoic acid (RA) has been studied for its effect on wound healing. It can stimulate angiogenesis and increase  the  rate  of  re-epithelialization  in  wounded  skin.  The  purpose  of  this  study  is  to  determine  the effectiveness and the rate of healing of RA in wound closure of acute TM perforations in Guinea pigs Methods: This is a randomized control trial animal experimental study, twenty Guinea pigs (40 TM) were used. Randomization was done using the toss coin method to determine the intervention and control group. A small perforation using spinal needle G 20 was done. RA was introduced in the intervention group, while TM was allowed to heal spontaneously in the control group. All TM were examined on day 3, 7, 10 and 14. Recording of perforation was done with the videoendoscopic system. Measurement of the TM and the perforation was done by using a graphic program (AutoCAD R14).
Results: TM healed completely on day 14 in the intervention group and the control group was 52.9 % and 47.1%  respectively  with p  =0.492.  The  rate  of  healing  on  day  3,7  and  10  in  the  intervention  group  and  the control group was 0.15 & 0.08; 0.38 & 0.69; 0.29 & 0.58 respectively with p= 0.01; 0.003 and 0.001. Conclusion: Tympanic membrane with RA treated group showed a significant healing rate on day 3,7, and 10. However, RA has no significant effect on the closure of acute traumatic perforations after day 14.
Keywords: perforation, retinoic acid, tympanic membrane, wound closure

## ABSTRAK
Pendahuluan: Perforasi  membran  timpani  (MT)  merupakan  masalah  yang  umum  dijumpai  dalam  praktek sehari-hari, Infeksi atau trauma merupakan salah satu penyebab terjadinya perforasi MT. Asam retinoik (AR) telah  lama  diketahui  mempunyai  efek  pada  penyembuhan  luka.  AR  dikatakan  dapat  menstimulasi  proses angiogenesis dan meningkatkan kecepatan re-epitelisasi pada luka di kulit. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh  efektifitas AR dan kecepatan penyembuhan luka perforasi baru pada MT marmot. Metode: Penelitian  ini  adalah  studi  eksperimental  acak  terkendali  pada  hewan  percobaan,  Penelitian  ini melibatkan dua puluh marmot (40 MT). Pemilihan acak untuk menentukan kelompok intervensi dan kelompok kontrol dilakukan melalui metode lempar koin. Perforasi kecil pada MTdilakukan dengan menggunakan jarum spinal ukuran 20G. Pemberian AR dilakukan sekali saja pada kelompok intervensi, sedangkan pada kelompok kontrol  dibiarkan  sembuh  spontan.  Semua  MT  diperiksa  pada  hari  ke-3,7,10  dan  14.  Perekaman  gambar perforasi dilakukan dengan menggunakan sistem videoendoskopi. Pengukuran luas area MT dan luas  area perforasi dengan menggunakan program grafis (AutoCAD R14).
Hasil: MT yang menutup sempurna pada hari ke 14 pada kelompok intervensi dan kontrol adalah 52,9% dan 47,1% dengan p=0,492, Tingkat penutupan perforasi (TPP) pada hari ke 3, 7 dan 10 pada kelompok intervensi dibandingkan dengan kelompok kontrol adalah 0,15 & 0,08; 0,38 & 0,69; 0,29 & 0,58 dengan p= 0,01; 0,003 dan 0,001.
Simpulan: Pemberian  AR  pada  kelompok  intervensi  memberikan  hasil  penyembuhan  luka  perforasi  yang lebih  cepat  secara  signifikan  pada  hari  ke-3,  7  dan  10,  tetapi  pemberian  AR  tidak  memberikan  efek penyembuhan luka perforasi setelah hari ke-14.
Kata kunci: asam retinoik, membran timpani, penutupan luka, perforasi

## ARTIKEL PENELITIAN

## PENDAHULUAN
Perforasi  MT  merupakan  salah  satu gejala  yang  sering  dijumpai  dalam  praktek dokter  THT  sehari-hari.  Perforasi  dapat disebabkan oleh proses trauma, infeksi seperti otitis media akut, otitis media supuratif kronis ataupun  akibat  perforasi  yang  terjadi  karena paska  pemasangan  pipa  ventilasi.  Walaupun hampir 90 % perforasi MT akibat trauma dapat sembuh  secara  spontan,    sisanya  akan berakhir  menjadi  perforasi  yang  kronik  dan memerlukan  penanganan  yang  lebih  lanjut. 1
Pasien  dengan  perforasi  MT  yang  persisten dapat  mengalami  proses  infeksi  menjadi otorea, tinnitus dan pembentukan kolesteatoma. Komplikasi seperti ini meningkatkan resiko penyakit yang berkelanjutan  dan  membutuhkan  biaya  serta kemungkinan  tindakan  operasi  di  kemudian hari.
MT  terdiri  dari  2  bagian,  yaitu  pars flaksida  dan  pars  tensa.  Pars  flaksida  terdiri dari  2  lapis  yaitu  lapisan  epitel  dan  lapisan mukosa endotel, sedangkan pars tensa terdiri dari  3  lapis,  yaitu  lapisan  epitel  pada  bagian eksternal, lapisan fibrosa pada bagian tengah, dan  lapisan  mukosa  endotel  pada  bagian dalam. 2 MT  mempunyai  karakter  yang  unik pada  proses  penyembuhan  luka  perforasi. Penelitian  oleh  Johnson,  Wang  dan  Araújo pada  binatang  percobaan  menunjukkan bahwa  penyembuhan  perforasi  MT  adalah melalui  mekanisme  proses  migrasi  epitel. 3-5
Pusat  pembentukan  epitel  ada  di  bagian annulus  dan  di  bagian  manubrium  malleus. Lapisan  epidermis  merupakan  lapisan  yang pertama yang akan menutupi lubang
perforasi,  dan  arah  dari  penutupan  tersebut sesuai  dengan  arah  dari  migrasi  epitel. Penutupan  oleh  lapisan  fibrosa  akan  terjadi sesudahnya karena pengaruh aliran vaskularisasi  pembuluh  darah  pada  MT, sedangkan  lapisan  mukosa  endotel  kurang berperan dalam proses penyembuhan lubang perforasi.
Penanganan perforasi MT karena trauma  atau  infeksi  karena  otitis  media  akut akan  dimulai  dengan  cara  yang  konservatif seperti  menjaga  telinga  tetap  kering  dan bersih  serta  pemberian    antibiotik  bila  terjadi infeksi. Penanganan berupa tindakan operasi seperti timpanoplasti diperlukan bila perforasi tidak  menutup  lagi  dan  telah  berlangsung selama  lebih  dari  tiga  bulan.  Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mempercepat proses  penutupan  perforasi  tersebut  seperti pemberian platelet rich fibrin , fibroblast growth factor ,  aplikasi sea  buckthorn  oil  patch dan pemberian ofloxacin gelatin patch . 6,7.8,9 Semua penelitian  tersebut  menunjukkan  hasil  yang baik dan menjanjikan.
Vitamin A atau asam retinoik telah lama diketahui  mempunyai  efek  penyembuhan pada luka di kulit dengan cara  menstimulasi proses  angiogenesis  dan  melawan  efek glukokortikoid  yang  menghambat  penyem- buhan luka. Asam retinoik (AR) dapat merang- sang  pergantian  lapisan  epidermis  dan  me- ningkatkan  proses  re-epitelisasi  pada  luka  di kulit. 10 Pengaruh AR tidak hanya pada lapisan kulit  saja,  tetapi  juga  pada  lapisan  epitel mukosa traktus respiratorius.  Pada penelitian yang  dilakukan  oleh  Hwang,  AR  diketahui sebagai  faktor  yang  penting  dalam  proses
pembentukan  silia  dan  proses  penyembuhan luka setelah tindakan operasi sinus maksilaris pada  hewan  percobaan  kelinci. 11 Pemakaian AR secara topikal pada kulit akan meningkatkan proses fibroplasia, kolagenosis dan  angiogenesis. 12 Asam  retinoik  akan mengikat  secara  spesifik  pada  reseptor  di sitoplasma  dan  nukleus  yang  akan  berperan pada  proses  pembelahan,  diferensiasi  sel, sintesa  protein,  dan  stabilisasi  membran  sel. Asam  retinoik    juga  menghambat  aktivitas leukosit,  mengeluarkan  sitokin  pro  inflamasi dan  beberapa  mediator  inflamasi  lainnya, serta  berperan  sebagai toll  receptor pada proses imunomodulasi. 13 Asam retinoik akan mengurangi penebalan stratum korneum dan mengembalikan  proses  deskuamasi  yang abnormal.  Efek  farmakologi  seperti  ini  telah lama  digunakan  sebagai  salah  satu  cara dalam  pengobatan  jerawat  selama  beberapa dekade. 14
Peran  AR  dalam  penyembuhan  luka baru  pada  perforasi  MT  belum  pernah dieksplorasi sebelumnya. Tujuan penelitian ini adalah  untuk  mengetahui  efektivitas  AR  dan kecepatan  penyembuhan  luka  perforasi  baru pada MT .

## METODE
Desain  penelitian  ini  adalah  uji  acak terkendali  pada  hewan  percobaan  marmot. Kelompok  kasus  atau  kelompok  intervensi adalah  marmot  yang  akan  diberikan  AR, sedangkan  kelompok  kontrol  adalah  yang tidak  diberikan  apapun  juga.  Penelitian  ini melibatkan  dua  puluh  (20)  marmot  (40  MT) dengan  kisaran  berat  antara  250-400  Gram.
Hewan ini dipelihara dan disimpan di skills lab Departemen  THT-KL  University  of  Santo Tomas  Hospital,  Manila.  Marmot  dianestesi dengan injeksi secara intramuskuler menggu- nakan  ketamin  hidroklorida  25  mg  pada  ba- gian  paha.  Pemilihan  hewan  coba  untuk kelompok intervensi (AR) dan kelompok kon- trol  adalah  secara  acak dengan  metode toss coin . Marmot akan diberi nomor dan ditempat- kan  dalam  kandang  yang  berbeda  untuk kelompok intervensi dan kelompok kontrol.
Perforasi dilakukan menggunakan jarum spinal  ukuran  20  G  pada  kuadran  anterior superior MT dengan menggunakan mikroskop. AR  kemudian  diaplikasikan  pada  kelompok intervensi  dengan  menggunakan gelfoam pada  luka  perforasi  MT, gelfoam kemudian diambil  kembali  secepatnya  setelah  aplikasi dilakukan.  Alasan gelfoam diambil  kembali secepatnya  adalah gelfoam sendiri  memiliki potensi efek penyangga dalam proses migrasi epitel yang berfungsi dalam proses penyembuhan. 15 Pada  kelompok  kontrol,  MT dibiarkan  sembuh  sendiri  tanpa  diberikan apapun juga.
Semua  MT  dilakukan  perekaman  dan pengukuran  pada  hari  ke  3,  7,  10,  dan  14. Perekaman  lubang  peforasi  dengan  meng- gunakan  teleskop  0°,  diameter  4mm  (Storz), yang  dihubungkan  dengan  sistem  video  ka- mera (Mega). Gambar yang didapatkan kemu- dian ditransfer ke komputer. Pengukuran luas MT dan luas area  perforasi dianalisa dengan menggunakan program grafis (AutoCAD R14) (Gambar  1).  Hasil  dari  pengukuran  adalah persentase  luas  area  perforasi  (PLAP)  yang didapatkan dengan cara membagi luas lubang
perforasi  dengan  luas  MT  dan  dikalikan  100 (Gambar 2a dan 2b). Tingkat Penutupan (TP) MT didapatkan dengan cara selisih dari PLAP hari  ke-0  dengan  hari  ke-3,  7,  10,  dan  14
dibagi  dengan  PLAP  hari  ke-0.  Semua  data yang  didapatkan  kemudian  dikumpulkan  dan dianalisa  menggunakan  program  statistik SPSS V26.
Gambar 1. Kalkulasi luas area membran timpani dengan program grafis AutoCAD R14

## HASIL
Pada  awal  penelitian  terdapat  20  ekor hewan  marmot,  lalu  hanya  17  marmot  yang dapat  diikuti  sampai  akhir  penelitian.  Satu marmot  pada  kelompok  intervensi  dan  dan satu  marmot  dari  kelompok  kontrol  mati selama  proses  penelitian.  Satu  marmot  dari kelompok intervensi dikeluarkan dari penelitian  karena  marmot  tersebut  hamil
selama  penelitian.  Akhirnya  hanya  34  MT yang  dievaluasi  yaitu  16  dari  kelompok intervensi dan 18 dari kelompok kontrol.
Persentase  luas  area  perforasi  (PLAP) hari  ke-0  pada  kelompok  intervensi  adalah 34,19±3,33, sedangkan pada kelompok kontrol  adalah  33,61±2,38.  Kedua  PLAP tersebut  secara  statistik  tidak  berbeda bermakna (p=0,562) (Tabel 1).
Tabel 1. Persentase luas area perforasi pada hari ke-0 Kelompok PLAP±SD p Intervensi 34,19±3,33 0,562 Kontrol 33,61±2,38 T test dengan alpha=0,05 Tabel 2. Proporsi penutupan MT antara kelompok intervensi dan kelompok control Kondisi Intervensi Kontrol N Perforasi 7(41,2) 10 (58,8) 17 Sembuh 9 (52,9) 8 (47,1) 17 Total 16 18 34
Pearson Chi-Suare p=0,492 dengan alpha=0,05
Proporsi  penutupan  sempurna  dari  MT (100%)  pada  kelompok  intervensi  dan kelompok  kontrol  pada  hari  ke-14  adalah 52,9%  pada  kelompok  intervensi  dan  pada kelompok  kontrol  adalah  47,1%.  Uji  Chi- Square memperlihatkan bahwa ternyata tidak ada  perbedaan  bermakna  antara  proporsi kesembuhan  antara  MT  pada  kelompok intervensi dengan kelompok kontrol (p=0,492) (Tabel 2).
Gambar  2  (a  dan  b)  memperlihatkan gambaran  perkembangan  penutupan  lubang perforasi membran timpani marmot pada hari ke-0 dan hari ke-14. Perbandingan persentase  luas  area  perforasi  (PLAP)  pada hari  ke-0, 3, 7, 10 dan 14  diperlihatkan pada Gambar  3.  Perbandingan  PLAP  antara kelompok intervensi dengan kelompok kontrol
memperlihatkan  perforasi  MT  yang  lebih besar  pada  kelompok  kontrol  pada  hari  ke-7 dan  10,  yaitu  sebesar  23,9  %  dan  13,9  %, sedangkan  pada  kelompok  intervensi  adalah 21,2%  dan  10,7%  dengan  uji  statistik  yang bermakna (p=0,023 dan p=0,004). Kemudian bila  dibandingkan  PLAP  kelompok  kontrol dengan  kelompok  intervensi  pada  hari  ke-3 dan  ke-14  ternyata  tidak  ada  perbedaan bermakna dalam PLAP yaitu 31% dan 3,39 % vs  29%  dan  2,1%  dengan  p=0,086  dan p=0,375.
Bila  dilihat  dari  tingkat  penutupan perforasi  (TPP)  MT,  ternyata  ada  perbedaan bermakna pada kelompok intervensi pada hari ke-3,  7,  dan  10  dibandingkan  dengan kelompok kontrol, tetapi tidak ada perbedaan bermakna pada hari ke-14 (Tabel 3).
Gambar 2. Perkembangan penutupan lubang perforasi membran timpani marmot a. pada hari ke-0; b. pada hari ke-14
Tabel 3 .  Tingkat penutupan perforasi MT Kelompok Hari ke-3 Hari ke-7 Hari ke-10 Hari ke-14 Intervensi 0,15 0,38 0,69 0,94 Kontrol 0,08 0,29 0,58 0,9 p 0,010 0,003 0,001 0,417 P= level of significance (T test) Tingkat penutupan perforasi: Selisih antara PLAP hari ke-0 dengan PLAP hari ke-3, 7, 10, dan 14 dibagi dengan PLAP hari ke-0
a
b
Gambar 3 . Persentase luas area perforasi (PLAP) pada hari ke-0, 3, 7, 10, dan 14

## DISKUSI
Tidak seperti pada jaringan lain di tubuh manusia, MT memiliki mekanisme penyembuhan  luka  yang  berbeda.  MT  tidak memiliki jaringan lain di bawahnya yang dapat menyediakan  nutrisi  untuk  memperbaiki  sel yang  rusak,  tetapi  MT  mempunyai  kapasitas untuk  memperbaiki  dirinya  sendiri.  Beberapa penelitian memperlihatkan kemampuan perforasi  MT  untuk  menutup  secara  spontan hampir 90-100% dalam waktu tujuh sampai 21 hari, tergantung dari luas dan area perforasi. 5,16 Hasil penelitian ini menunjukkan 52,9%  (9/16)  dari  pada  kelompok  intervensi dan 47,1% (8/18) dari kelompok kontrol yang menutup  sempurna  pada  hari  ke-14.  Ini menunjukkan  hasil  yang  komparatif  dengan penelitian yang lain bila dihubungkan dengan lamanya waktu observasi.
Pada penelitian ini, hasil rata-rata PLAP antara  kelompok  intervensi  dan  kelompok kontrol  adalah  kurang  lebih  sama  sejak  hari ke-0. Ini menunjukkan PLAP antara kelompok
intervensi  dan  kelompok  kontrol  memiliki lubang perforasi yang kurang lebih sama sejak awal  penelitian,  hal  ini  tentunya  dapat menghindari  bias  terhadap  ukuran  perforasi yang dapat mempengaruhi hasil TPP.
Lapisan epitel MT pada dasarnya akan mengalami pergerakan secara terus menerus. Penelitian oleh Johnson, menunjukkan lapisan epitel akan bergerak dengan kecepatan  0.5-1mm  per  hari. 17 AR  mungkin berperan  dalam  proses  penutupan  perforasi melalui percepatan migrasi epitel dengan cara akselerasi turn-over  rate dari  lapisan  epithel tersebut.
Kelompok  AR  menunjukkan  TPP  yang signifikan  pada  hari  ke-3,7  dan  10.  Tetapi pada  hari  ke-14  efek  AR  menjadi  tidak signifkan.  Ini  berarti  pengaruh  AR  pada penutupan  luka  perforasi  baru  MT  tidak berpengaruh setelah hari ke-14. Hal ini sesuai dengan hasil beberapa peneliti yang menunjukkan  penutupan  yang  terjadi  secara spontan dengan berjalannya waktu
Saat  ini,  belum  ada  penelitian  yang menggunakan  AR  sebagai  media  untuk mempercepat  penutupan  perforasi  MT.  AR mungkin  dapat  menjadi  salah  satu  pilihan yang  dapat  dipertimbangkan  karena  AR sangat  murah,  tersedia  dan  gampang diaplikasikan  dalam  praktek  poli  rawat  jalan oleh dokter THT.

## SIMPULAN
Pemberian  AR  menunjukkan  hasil  TPP yang lebih baik pada hari ke-3,7dan 10, tetapi tidak  mempunyai  efek  setelah  hari  ke-14, karena  baik  kelompok  intervensi  dan  kelom- pok kontrol memiliki kemungkinan yang sama untuk menutup secara spontan.
Kekurangan  penelitian  ini  adalah  tidak adanya pemeriksaan histopatologi yang dapat menilai  efek  dari  AR  pada  MT  dalam  hal ketebalan epitel, reaksi fibroblas dan neovas- kularisasi.  Keterbatasan  lainnya  adalah  pe- nelitian  ini  dilakukan  pada  kondisi  perforasi baru.  Tentunya  ini menjadi  suatu  pertanyaan mengenai  manfaat  AR  bila  diberikan  pada perforasi  yang  subakut  ataupun  kronis. Limitasi  yang  lain  adalah  penelitian  ini dilakukan  oleh  peneliti  tunggal,  sehingga sangat  mungkin  terjadi  bias  pada  saat pencatatan dan analisa PLAP untuk kelompok intervensi  dan  kelompok  kontrol.  Penelitian lanjutan  mungkin  diperlukan  untuk  menilai efek AR terhadap pembentukan kolesteatoma pada  kavum  timpani  dan  efek  ototoksisitas pada telinga bagian dalam.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Griffin  WL.  A  retrospective  study  of  traumatic tympanic  membrane  perforations  in  a  clinical
practice.  Laryngoscope. 1979; 89:261 –82.
2. Valentine P, Wright T. Anatomy and embryology of the  external  and  middle  ear.  In:  Watkinson  JC,
Clarke RW,
editors. Scott- Brown’s
Otorhinolaryngology  Head  and  Neck  Surgery.  8th ed. Taylor & Francis Group, LLC; 2018. P. 525 –43. 3. Johnson  AP,  Smallman  LA,  Kent  SE.  The mechanism  of  healing  of  tympanic  membrane perforations. Acta Otolaryngol. 1990;109(5 –
6):406 –15.
4. Wang  WQ,  Wang  ZM,  Chi  FL.  Spontaneous healing of various tympanic membrane perforations in the rat. Acta Otolaryngol. 2004;124(10):1141 –4.
5. De Araújo MM, Murashima AAB, Alves VM, Jamur MC,  Hyppolito  MA.  Spontaneous  healing  of  the tympanic  membrane  after  traumatic  perforation  in rats. Braz J Otorhinolaryngol [Internet]. 2014;80(4):330 –8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2014.05.014
6. Gür ÖE, Ensari N, Öztürk MT, Boztepe OF, Gün T, Selçuk  ÖT,  et  al.  Use  of  a  platelet-rich  fibrin membrane to repair traumatic tympanic membrane perforations: a comparative study. Acta Otolaryngol. 2016;136(10):1017 –23.
7. Lou  ZC,  Lou  ZH,  Xiao  J.  Regeneration  of  the tympanic membrane using fibroblast growth factor- 2. J Laryngol Otol. 2018;132(6):470 –8.
8. Gao  T,  Li  X,  Hu  J,  Ma  W,  Li  J,  Shao  N,  et  al. Management  of  traumatic  tympanic  membrane perforation:  A  comparative  study.  Ther  Clin  Risk Manag. 2017;13:927 –31.
9. Li X, Zhang H, Zhang Y. Repair of large traumatic tympanic  membrane  perforation  using  ofloxacin otic solution and gelatin sponge. Braz J Otorhino- laryngol  [Internet].  2022;88(1):9 –14.  Available from: https://doi.org/10.1016/j.bjorl.2020. 03.007
10.  Polcz ME, Barbul A. The role of vitamin A in wound healing. Nutr Clin Pract. 2019;34(5):695 –700.
11.  Hwang  PH,  Chan  JM.  Retinoic  acid  improves ciliogenesis  after surgery  of  the  maxillary  sinus in rabbits. Laryngoscope. 2006;116(7):1080 –5.
12.  Elson ML. The role of retinoids in wound healing. J Am Acad Dermatol. 1998;39(2 III):79 –81.
13.  Zinder R, Cooley R, Vlad LG, Molnar JA. Vitamin A and wound healing. Nutr Clin Pract. 2019;34(6):839 –49.
14.  Leyden  J,  Stein-Gold  L,  Weiss  J.  Why  topical retinoids  are  mainstay  of  therapy  for  acne.
Dermatol Ther (Heidelb). 2017;7(3):293 –304.
15.  Lee  DH.  Re:  A  randomised  controlled  trial comparing spontaneous healing, gelfoam patching, and  edge-approximation  plus  gelfoam  patching  in traumatic  tympanic  membrane  perforation  with inverted or everted edges. Clin Otolaryngol. 2011;
36(4):399 –400.
16.  Amadasun  JEO.  An  observational  study  of  the management  of  traumatic  tympanic  membrane perforations. J Laryngol Otol. 2002;116(3):181 –4.
17.  Johnson  A,  Hawke  M.  The  function  of  migratory epidermis  in  the  healing  of  tympanic  membrane perforations  in  guinea-pig:  a  photographic  study. Acta Otolaryngol. 1987;103(1 –2):81–6.