EISSN: 2407-7690 https://ejournal3.undip.ac.id/index.php/jmr
Optimasi Kondisi Inkubasi Kultur (Suhu dan Agitasi) Terhadap Pertumbuhan dan Aktivitas Protease Ektraseluler Bakteri Bacillus firmus Asosiasi Sponge (Porifera:
Demospongiae) dari Nusa Lembongan Bali Indonesia
Muhammad Zainuddin 1,2 *, Delianis Pringgenies 3 , Ocky Karna Radjasa 4 , Haeruddin 5 , Aninditia Sabdaningsih 6 , dan Vivi Endar Herawati 7
1 Mahasiswa Program Doktor Manajemen Sumber Daya Pantai, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro
Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia
2 Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Sains dan Teknologi Unisnu Jepara Jl. Taman Siswa No.9, Tahunan, Jepara, Jawa Tengah, Indonesia
3 Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia
4 Badan Riset dan Inovasi Nasional, Indonesia Jl. M.H. Thamrin No. 8, Jakarta Pusat 10340 Indonesia
5 Departemen Manajemen Sumber Daya Pantai, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro
6 Program Doktor Manajemen Sumber Daya Pantai, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro
7) Departemen Budidaya Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia *Corresponding author e-mail: zainudin@unisnu.ac.id
ABSTRAK : Perkembangan budidaya udang secara intensif, diikuti pula oleh permasalahan limbah organik sisa pakan. Salah satu cara untuk mengatasi permasalahan limbah organik adalah dengan bioremediasi  menggunakan  probiotik.  Komponen  utama  limbah  organik  pakan  ini  adalah  protein. Oleh  sebab  itu,  konsorsium  probiotik  merupakan  bakteri  proteolitik.  Bakteri Bacillus  firmus yang bersimbiosis dengan sponge Chalinula pseudomolitba merupakan bakteri yang menghasilkan enzim protease ektraseluler yang dapat menghidrolisis protein menjadi senyawa yang sederhana. Bakteri Bacillus firmus memiliki potensi untuk dijadikan probiotik. Diperlukan informasi tentang kondisi suhu dan agitasi inkubasi yang optimal untuk mendapatkan biomassa sel bakteri Bacillus firmus dalam pembentukan probiotik. Tujuan penelitian ini adalah melakukan uji optimasi suhu dan agitasi dalam inkubasi kultur terhadap pertumbuahn dan aktivitas protease ekstraseluler bakteri Bacillus firmus . Penelitian  menggunakan  metode  eksperimen  laboratoris.  Penelitian  telah  berhasil  melakukan  uji optimasi  suhu  dan  agitasi  inkubasi  kultur.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  bakteri Bacillus firmus memiliki  laju  pertumbuah  dan  aktivitas  protease  terbaik  pada  kondisi  kultur  dengan  suhu inkubasi  30 o C  dengan  nilai  sebesar  0,194  c  dan  34,660  d  IU/ml.  Selain  itu  juga  memiliki  laju pertumbuah  dan  aktivitas  protease  terbaik  pada  kondisi  agitasi  inkubasi  150  rpm  dengan  nilai sebesar 0,124 b dan 40,039 b IU/ml.
Kata Kunci : bakteri; simbion; sponge; pertumbuhan; protease
Optimization of Culture Incubation Conditions (Temperature and Agitation) on the Growth and Activity of Extracellular Protease Bacteria Bacillus Firmus Association Sponge (Porifera: Demospongiae) From Nusa Lembongan Bali – Indonesia.
ABSTRACT  :  The  development  of  intensive  shrimp  farming  is  also  followed  by  the  problem  of organic  waste  from  feed  residues.  One  way  to  overcome  the  problem  of  organic  waste  is bioremediation  using  probiotics.  The  main  component  of  this  feed  organic  waste  is  protein. Therefore, the  probiotic  consortium  is  a  proteolytic  bacteria.  Bacillus  firmus  bacteria  in  symbiosis with Chalinula pseudomolitba sponge is a bacterium that produces extracellular protease enzymes that can hydrolyze proteins into simple compounds. Bacillus firmus bacteria have the potential to be used  as  probiotics.  Information  about  optimal  temperature  conditions  and  incubation  agitation  is needed to obtain cell biomass of Bacillus firmus bacteria in the formation of probiotics. The purpose of this study was to test the optimization of temperature and agitation in culture incubation on the

## Journal of Marine Research
Vol 11, No.3 Agustus 2022, pp. 547-556
growth and activity of extracellular proteases of Bacillus firmus bacteria. The study used a laboratory experimental  method.  Research  has  successfully  carried  out  the  optimization  test  of  culture incubation temperature and agitation. The results showed that Bacillus firmus had the best growth rate and protease activity in culture conditions with an incubation temperature of 30 oC with values of 0.194 c and 34.660 d IU/ml. In addition, it also has the best growth rate and protease activity at 150 rpm agitated incubation conditions with values of 0.124 b and 40.039 b IU/ml.

## Keywords: bacteria; symbionts; sponges; growth; proteases

## PENDAHULUAN
Pemberian  pakan  buatan  ke  dalam  sistem  budidaya  intensif  secara  berlebihan  telah menimbulkan terbentuknya limbah organik pada media air dan pengendapan pada dasar tambak. Limbah organik tersebut dapat menimbulkan kerusakan media tambak seperti meningkatnya kadar amoniak,  terbentuknya  senyawa  H 2 S  dan  munculnya  penyakit.  Kerusakan  kualitas  lingkungan seperti  ini  menyebabkan  udang  rentan  terhadap  penyakit,  sehingga  menurunkan  produktivitas tambak (El-Saadony et al. , 2021). Umumnya pengusaha tambak bergantung kepada pergantian air yang  relatif  tinggi  untuk  menjaga  kualitas  air  pada  sistim  produksi,  akibatnya  terjadi  pengeluaran material limbah pakan dan berbagai metabolit langsung ke lingkungan sekitar terdekat. Pencemaran lingkungan tambak dapat mengakibatkan kerusakan lingkungan dan ekologi.
Saat  ini  telah  berkembang  teknologi  untuk  mengatasi  permasalahan  pencemaran  bahan organik tambak yaitu dengan cara pemanfaatan mikroba. Mikroba dengan aktivitas penghasil enzim ekstraseluler  untuk  mendegradasi  limbah  organik  menjadi  struktur  sederhana  (Bioremediasi). Sehingga lingkungan tambak menjadi terjaga kualitas dan kesehatannya (Holt et al. , 2021). Limbah organik  sisa  pakan  memiliki  komponen  terbesar  berupa  protein.  Oleh  kerena  itu,  di  dalam konsorsium bakteri probiotik terdapat bakteri proteolitik. Salah satu bakteri proteolitik adalah bakteri Bacillus  firmus yang  bersimbiosis  dengan  sponge Chalinula  pseudomolitba .  Bakteri  ini menghasilkan enzim protease ektraseluler yang dapat menghidrolisis protein menjadi senyawa yang sederhana.
Bakteri Bacillus  firmus memiliki  potensi  untuk  dikembangkan  menjadi  konsorsium  probiotik. Diperlukan teknologi kultur yang optimal guna mendapatkan biomassa sel Bacillus firmus yang tinggi untuk  pembentukan  probiotik.  Optimasi  kondisi  inkubasi  pada  kultur  yaitu  parameter  suhu  dan agitasi  merupakan  hal  yang  penting  untuk  di  ketahui.  Optimasi  kondisi  kultur  merupakan  faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan dan biomassa sel bakteri  (Zárate-Chaves et al. , 2013; Oh et  al. ,  2007).  Agitasi  dalam  inkubasi  kultur  mempengaruhi  pertumbuhan  sel, sedangkan  suhu inkubasi kultur mempengaruhi produksi enzim (Rashmi and Gayathri, 2017). Penelitian ini memiliki tujuan mendapatkan kondisi suhu dan agitasi optimal dalam inkubasi kultur bakteri Bacillus firmus untuk produksi biomassa bakteri.

## MATERI DAN METODE
Penelitian  menggunakan  materi  isolat  bakteri Bacillus  firmus simbion  sponge Chalinula pseudomolitba yang didapatkan dari perairan pantai dengan adanya ekosistem lamun di perairan Nusa  Lembongan  Bali –  Indonesaia.  Bakteri Bacillus  firmus memiliki  morfologi  berbentuk  bulat sedang,  permukaan  kasar  dan  kering,  sudut  elevasi  datar,  tepian  tidak  rata  dan  berwarna  putih pucat.

## Peremajaan dan Preparasi Inokulum
Peremajaan bakteri menggunakan media Nutrient Agar (NA). Dilakukan pengambilan isolat bakteri Bacillus  firmus sebanyak  satu  ose  dan  di  inokulasi  dengan  metode  gores  kuadran  pada media NA. Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C (Pringgenies et al. , 2021; Wijaya et al ., 2021). Bakteri yang tumbuh siap untuk digunakan.
Preparasi Inokulum dilakukan dengan mengambil satu ose koloni diinokulasikan ke medium zobell  221E  cair  volume  20  ml  dan  diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu  30 o C.  Hasil  inkubasi dilakukan scale up ke 200 ml medium zobell 221E cair dan diinkubasi selama 24 jam pada agitasi 150 rpm, suhu 30 o C (Ayuningtyas et al. , 2021; Girsang et al. , 2020).

## Optimasi Suhu
Medium zobell  2216E cair ditambah substrat susu skim dan ko-substrat dengan konsentrasi optimum, ditambahkan starter bakteri hingga memberikan OD 0,01 pada panjang gelombang 600 nm. pH dan salinitas media diatur pada pH 8 dan salinitas 30 ppt. Kultur diinkubasi pada variasi suhu 20 o C,  25 o C,  30 o C,  35 o C.  Selama  inkubasi  dilakukan  pengamatan  terhadap  petumbuhan  bakteri, aktivitas protease ekstraseluler dan kadar protein (Sriyapai et al. , 2022).

## Optimasi Agitasi
Medium zobell 2216E cair ditambah substrat susu skim, ko-substrat glukosa 0,5 %, Amonium nitrat 0,01 %, pH 8 dan salinitas 30 ppt. Media tersebut ditambahkan bakteri Bacillus firmus hingga memberikan OD 0,01 pada A 600 . Kutur diletakkan dalam inkubator seker dengan suhu optimum dan pemberian perlakuan perbedaan agitasi 100 rpm dan 150 rpm. Selanjutnya pada inkubasi jam ke- 0,  2,  4,  6,  12,  18,  24,  30,  36,  42,  dan  48  dilakukan  pengamatan  terhadap  petumbuhan,  aktivitas protease dan kadar protein (Prajapati et al ., 2022).

## Pengukuran Pertumbuhan Bakteri
Pertumbuhan bakteri diukur dengan cara sebanyak 10 ml sampel disentrifugasi selama 10 menit  dengan  kecepatan  3000  rpm.  Supernatan  di  buang  dan  natan  yang  didapatkan  dilarutkan dengan  10  ml  PBS.  Selanjutnya  diamati  nilai  OD-nya  dengan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang 600 nm (Setyati et al. , 2014). Data hasil pengukuran OD pada A 600 kemudian di konversi dengan persamaan standart Mc Farland menjadi satuan sel/ml. Nilai sel/ml tersebut digunakan untuk menghitung jumlah generasi (g), waktu generasi (Tg) dan laju pertumbuhan (µ) bakteri.

## Pengukuran Aktivitas Enzim Protease
Substrat yang digunakan adalah kasein 1%  di dalam buffer fosfat (50 mM,  pH  8). Sampel di tambahkan ke dalam substrat dengan perbandingan 1 : 1 (v/v) dan inkubasi 10 menit. Sebanyak 2  ml  campuran  di  tambahkan  1  ml  trichloroacetic  acid  (TCA)  10%  lalu  inkubasi  selama  10  menit pada  suhu  37 o C.  Selanjutnya  disentrifugasi  10.000  rpm  selama  20  menit.  Supernatan  yang terbentuk  di  ambil  1  ml  dan  ditambahkan  Na 2 CO 3 0,5  M  sebanyak  2,5  ml  dan  folin  ciocalteus sebanyak 0,5 ml, campuran diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Setelah inkubasi dilakukan spektrofotometri pada λ 660 nm (Setyati et al. , 2015). Persamaan standar tirosin digunakan untuk konversi data OD menjadi mM. Selanjutnya mM untuk menentukan AP (aktivitas protease) dan T.AP (total protease).
(a). (b). (c)
Gambar 1. (a). Peta lokasi sampling, (b) Perairan lokasi sampling dan (c) Isolat Bacillus firmus

## Pengukuran Kadar Protein
Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford (1976). Sebanyak 1 ml sampel ditambah reagen Bradford 4 ml dan inkubasi 10 menit. Setelah inkubasi dilakukan penentuan niai OD dengan spektrofotometer  λ  595  nm.  Data  OD  dengan  persamaan  standart  BSA  digunakan  untuk menentukan  nilai  KP  (kadar  protein)  dan  TP  (total  protein).  Berdasarkan  data  aktivitas  protease (U/ml) dan kadar protein (gram/ml) tersebut berikutnya dilakukan penghitungan AS (IU/mg).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Optimasi suhu
Optimasi suhu dilakukan terhadap perbedaan level yaitu 20, 25, 30 dan 35 °C. Berdasarkan hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  perlakuan  optimasi  suhu  berpengaruh  signifikan  (α  <  0,05) terhadap pertumbuhan bakteri Bacillus firmus .
Pengaruh perlakuan perbedaan suhu terhadap respon pola polynomial pertumbuhan bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah 20, 25, 35 dan 30 °C dengan nilai kepadatan bakteri pada  puncak  polynomial  sebesar  2,388; 5,024;  6,442  dan  47,572  x  10 8 sel/ml.  Perlakuan suhu  30 o C  adalah  yang  terbaik  terhadap  pertumbuhan  dengan  pola  polynomial  y  =  -0,0603x 2 + 3,3349x - 8,7572; R 2 = 0,8346; R = 0,914.
a b c d
Gambar 2. Optimasi suhu terhadap Polynomial (a) pertumbuhan, (b) aktivitas protease, (c) kadar protein dan (d) aktivitas spesifik protease bakteri Bacillus firmus
a
b c
d
Gambar 3 . Pengaruh perbedaan suhu terhadap (a) pertumbuhan mutlak, (b) laju pertumbuhan, (c) jumlah generasi dan (d) waktu generasi bakteri Bacillus firmus.
Perlakuan  perbedaan  suhu  berpengaruh  signifikan  terhadap  pertumbuhan  mutlak,  laju pertumbuhan, jumlah generasi dan waktu generasi bakteri. Nilai pertumbuhan mutlak bakteri secara berurutan  dari  terendah ke tertinggi  adalah  20  °C,  25 °C,  35  °C  dan  30 °C  dengan  nilai  2,214  a, 4,870  b,  6,287  b  dan  47,398  c  x  10 8 sel/ml.  Nilai  laju  pertumbuhan  bakteri  secara  berurutan  dari terendah ke tertinggi adalah 20 °C, 25 °C, 35 °C dan 30 °C dengan nilai 0,091 a, 0,124 b, 0,131 b dan 0,194 c jam -1 . Nilai jumlah generasi secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah 20 °C, 25 °C, 35 °C dan 30 °C dengan nilai 3,689 a, 5,041 b, 5,302 b dan 7,850 c. Nilai waktu generasi secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah 20 °C, 25 °C, 35 °C dan 30 °C dengan nilai 7,695 a, 5,566 b, 5,315 b dan 3,611 c jam.
Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan perbedaan suhu berpengaruh signifikan (α < 0,05) terhadap aktivitas protease, kadar protein dan aktivitas spesifik protease bakteri Bacillus  firmus.  pengaruh  perbedaan  suhu  terhadap  respon  pola  polynomial  aktivitas  protease bakteri  dari  yang  terendah  ke  tertinggi  secara  berurutan  adalah  20  °C,  25  °C,  35  °C  dan  30  °C dengan nilai aktivitas protease pada puncak polynomial sebesar 23,421 a, 26,591 b, 30,385 c dan 34,660 d IU/ml. Perlakuan suhu 30 o C adalah yang terbaik terhadap aktivitas protease dengan pola polynomial  y = -0,0441x 2 + 2,5013x - 5,7357; R 2 = 0,9491; R = 0,974.
Pengaruh perbedaan suhu terhadap respon pola polynomial kadar protein bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah 25 °C, 20 °C, 35 °C dan 30 °C dengan nilai kadar protein pada inkubasi jam ke- 30 sebesar 8,098 a, 8,607 ab, 8,710 ab dan 8,718 b mg/ml. Perlakuan suhu  30 o C  adalah  yang  terbaik  terhadap  kadar  protein  dengan  pola  polynomial  y  =  0,0040x 2 - 0,3777x  +  16,613;  R 2 =  0,9755;  R  =  0,988.  Pengaruh  perbedaan  suhu  terhadap  respon  pola polynomial aktivitas spesifik protease bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah
20  °C,  25  °C,  35  °C  dan  30  °C  dengan  nilai  aktivitas  spesifik  protease  pada  puncak  polynomial sebesar 2,723 a, 3,286 b, 3,492 b dan 3,978 c IU/mg. perlakuan suhu 30 o C adalah yang terbaik terhadap aktivitas spesifik protease dengan pola polynomial y = -0,0043x 2 + 0,2639x - 0,8324; R 2 = 0,9040;  R  =  0,951.  Berdasarkan  penelitian  perbedaan  suhu  maka  dapat  disimpulkan  bahwa perlakuan suhu 30 o C adalah yang terbaik dalam kultur bakteri Bacillus firmus .
Paparan hasil optimasi suhu diatas menunjukkan bahwa masing-masing isolat memiliki laju pertumbuhan  yang  berbeda.  Laju  pertumbuhan  bakteri  tergantung  dengan  kondisi  suhu.  Apabila kondisi suhu sesuai, maka laju pertumbuhannya akan meningkat, sebaliknya apabila kondisi suhu tidak  sesuai  maka  laju  pertumbuhannya  akan  lambat.  Pertumbuhan  bakteri  dapat  diukur  dengan pertambahan berat sel. Karena berat sel relatif sama dengan siklus sel, maka pertumbuhan dapat didefinisikan sebagai pertambahan jumlah sel (Zheng et al. , 2020).

## Optimasi Agitasi
Optimasi agitasi dilakukan terhadap perbedaan level yaitu 100 dan 150 rpm. Hasil penelitian optimasi agitasi berpengaruh signifikan (α < 0,05) terhadap pertumbuhan Bacillus firmus . Pengaruh perlakuan  perbedaan  agitasi  terhadap  respon  pola  polynomial  pertumbuhan  bakteri  dari  yang terendah  ke  tertinggi  secara  berurutan  adalah  agitasi  100  dan  150  rpm  dengan  nilai  kepadatan bakteri pada puncak polynomial sebesar 5,012 dan 101,016 x 10 8 sel/ml. Perlakuan agitasi 150 rpm adalah  yang  terbaik  terhadap  pertumbuhan  dengan  pola  polynomial  y  =  -0,1182x 2 +  7,3073x  - 25,593; R 2 = 0,9507; R = 0,975.
Perlakuan  perbedaan  agitasi  berpengaruh  signifikan  terhadap  pertumbuhan  mutlak,  laju pertumbuhan, jumlah generasi dan waktu generasi bakteri. Nilai pertumbuhan mutlak bakteri secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah agitasi 100 dan 150 rpm dengan nilai 2,214 a dan 4,870 b x 10 8 sel/ml. Nilai laju pertumbuhan bakteri secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah
a b c d
Gambar 4. Pengaruh perbedaan suhu terhadap (a) aktivitas protease, (b) kadar protein, (c) aktivitas spesifik dan (d) total aktivitas protease bakteri Bacillus firmus

## Journal of Marine Research
Vol 11, No.3 Agustus 2022, pp. 547-556
agitasi 100 dan 150 rpm dengan nilai 0,091 a dan 0,124 b. Nilai jumlah generasi secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah agitasi 100 dan 150 rpm dengan nilai 3,689 a dan 5,041 b. Nilai waktu generasi secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah agitasi 100 dan 150 rpm dengan nilai 7,695 a dan 5,566 b.
Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan perbedaan agitasi berpengaruh signifikan  (α  <  0,05)  terhadap  aktivitas  protease  dan  aktivitas  spesifik  protease  bakteri Bacillus firmus . Pengaruh perbedaan agitasi terhadap respon pola polynomial aktivitas protease bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah agitasi 100 dan 150 rpm dengan nilai aktivitas protease pada puncak polynomial sebesar 34,350 a dan 40,039 b IU/ml. Perlakuan agitasi 150 rpm adalah yang terbaik terhadap aktivitas protease dengan pola polynomial   y = -0,0485x 2 + 2,6818x - 5,7228; R 2 = 0,9106; R = 0,954.
Pengaruh perbedaan agitasi terhadap respon pola polynomial kadar protein bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah agitasi 100 dan 150 rpm dengan nilai kadar protein pada inkubasi jam ke- 30 sebesar 9,274 a dan 9,457 a mg/ml. Perlakuan agitasi 150 rpm adalah yang terbaik terhadap kadar protein dengan pola polynomial y = 0,0044x 2 - 0,375x + 16,767; R 2 = 0,9952; R = 0,998.
Pengaruh  perbedaan  agitasi  terhadap  respon  pola  polynomial  aktivitas  spesifik  protease bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah agitasi 100 dan 150 rpm dengan nilai  aktivitas  spesifik  protease  pada  puncak  polynomial  sebesar  3,705  a  dan  4,237  b  IU/mg. Perlakuan  agitasi  150  rpm  adalah  yang  terbaik  terhadap  aktivitas  spesifik  protease  dengan  pola polynomial  y  =  -0,0047x 2 +  0,2711x  -  0,7954;  R 2 =  0,8745;  R  =  0,935.  Berdasarkan  penelitian perbedaan agitasi maka dapat disimpulkan bahwa perlakuan agitasi 150 rpm adalah yang terbaik
a b c d
Gambar 5 . Optimasi agitasi terhadap Polynomial (a) pertumbuhan, (b) aktivitas protease, (c) kadar protein dan (d) aktivitas spesifik protease bakteri Bacillus firmus.
a
b c
d
Gambar 6. Pengaruh perbedaan agitasi terhadap (a) pertumbuhan mutlak, (b) laju pertumbuhan, (c) jumlah generasi dan (d) waktu generasi bakteri Bacillus firmus
a b c d
Gambar 4 . Pengaruh perbedaan pH terhadap (a) aktivitas protease, (b) kadar protein, (c) aktivitas spesifik dan (d) total aktivitas protease bakteri Bacillus firmus
Journal of Marine Research Vol 11, No.3 Agustus 2022, pp. 547-556
dalam kultur bakteri Bacillus firmus . Protease adalah enzim yang mengkatalisasi pemecahan ikatan peptida  dalam  peptide,  polipeptida  dan  protein  dengan  menggunakan  reaksi  hidrolisis  menjadi molekul-molekul  yang  lebih  sederhana  seperti  peptida  rantai  pendek  dan  asam  amino.  Aktivitas protease tiap isolat bakteri berbeda diduga karena dipengaruhi oleh jenis bakteri, lingkungan dan media. Pertumbuhan bakteri sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan baik factor fisik, kimia dan biologi.  Faktor  fisika-kimia  diantaranya  suhu,  pH,  aerasi,  agitasi  dan  komposisi  media  tumbuh. Sedangkan factor biologi adalah kompetisi dan kontaminasi (Rocchetti et al. , 2020)

## KESIMPULAN
Penelitian  telah  berhasil  melakukan  uji  optimasi  pertumbuhan  dan  aktivitas  enzim  protease ektraseluler bakteri Bacillus firmus simbion sponge Chalinula pseudomolitba . Bakteri Bacillus firmus memiliki laju pertumbuah dan aktivitas protease terbaik pada kondisi suhu inkubasi 30 o C sebesar 0,194 c dan 34,660 d IU/ml. serta pada agitasi inkubasi 150 rpm dengan nilai 0,124 b dan 40,039 b IU/ml.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti mengucapkan terima kasih kepada DIKTI yang telah memberikan beasiswa program doktor BPPDN dan dana penelitian sekema PDD. Peneliti mengucapkan terima kasih atas dukungan fasilitas penelitian dari Laboratorium Prodi Budidaya Perairan UNISNU Jepara, Laboratorium MSTP Undip Jepara, BBPBAP Jepara.

## DAFTAR PUSTAKA
Ayuningtyas, E.P., Sibero, M.T., Hutapea, N.B., Frederick, E.H., Murwani, R., Zilda, D.S., Wijayanti, D.P., Sabdono, A., Pringgenies, D. & Radjasa, O.K. 2021. Screening of Extracellular Enzyme from  Phaeophyceae-Associated  Fungi IOP  Conference  Series:  Earth  and  Environmental Science , 750(012005):1 –10. DOI: 10.1088/1755-1315/750/1/012005.
El-Saadony, M.T., Alagawany, M., Patra, A.K., Kar, I., Tiwari, R., Dawood, M.A., Dhama, K. & Abdel- Latif, H.M. 2021. The functionality of probiotics in aquaculture: An overview, Fish and Shellfish Immunology , 117:36 –52. DOI: 10.1016/j.fsi.2021.07.007.
Pringgenies,  D.,  Girsang,  P.H.,  Yudiati,  E.  &  Santosa,  G.W.  2020.  Exploration  of  Sea  Cucumber Intestinal Symbiont Microbe As Probiotic Microbe Candidate in Healthcare Products. Journal of Fisheries and Marine Research , 4(1):27 –34. DOI: 10.21776/ub.jfmr.2020.004.01.4.
Holt,  C.C.,  Bass,  D.,  Stentiford,  G.D.  &  van  der  Giezen,  M.,  2021.  Understanding  the  role  of  the shrimp gut microbiome in health and disease, Journal of Invertebrate Pathology , 186(107387): 1 –14. DOI: 10.1016/j.jip.2020.107387.
Oh,  Y.J.,  Jo,  W.,  Yang,  Y.  &  Park,  S.  2007.  Influence  of  culture  conditions  on  Escherichia  coli O157:H7  biofilm  formation  by  atomic  force  microscopy. Ultramicroscopy ,  107:869 –874.  DOI: 10.1016/j.ultramic.2007. 01.021.
Prajapati, D., Bhatt, A. & Gupte, A. 2022. Production, optimization, partial-purification and pyrolysis kinetic studies of exopolysaccharide from a native brown-rot fungi Fomitopsis meliae AGDP-2. Bioresource Technology Reports , 17:p.100948. DOI: 10.1016/j.biteb.2022.100948.
Pringgenies,  D.,  Setyati,  W.A.,  Djunaedi,  A.,  Pramesti,  R.,  Rudiyanti,  S.  &  Ariyanto,  D.  2021.
Exploration of antimicrobial potency of mangrove symbiont against multi-drug resistant bacteria. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan , 13(2):222 –232. DOI: 10.20473/jipk.v13i2.26199. Rashmi,  B.  &  Gayathri, D.  2017.  Evaluation  and  Optimization  of  Extracellular  Digestive  Enzymes from  Bacillus  spp.  Isolated  from  Curds. Maternal  and  Pediatric  Nutrition ,  03(118):1-6  DOI: 10.4172/2472-1182.1000118.
Rocchetti, G., Alcántara, C., Bäuerl, C., García-Pérez, J.V., Lorenzo, J.M., Lucini, L., Collado, M.C. & Barba, F.J. 2020. Bacterial growth and biological properties of Cymbopogon schoenanthus and Ziziphus lotus are modulated by extraction conditions. Food Research International , 136:
1 –10. DOI: 10.1016/j.foodres.2020.109534.
Setyati,  W.A.,  Martani,  E.,  Triyanto,  Subagiyo,  Zainuddin,  M.  2014.  Consortium  of  Mangrove Ecosystems  as  Bioremediation  and  Biocontrol  in  Shrimp  Ponds. Jurnal  Pengolahan  Hasil Perikanan Indonesia , 17(3):243 –253.
Setyati, W.A., Martani, E. & Zainuddin, M. 2015. Kinetika Pertumbuhan dan Aktivitas Protease Isolat 36k  dari  Sedimen  Ekosistem  Mangrove,  Karimunjawa,  Jepara, Ilmu  Kelautan:  Indonesian Journal of Marine Sciences , 20(3):163 –169.
Sriyapai,  T.,  Chuarung,  T.,  Kimbara,  K.,  Samosorn,  S.  &  Sriyapai,  P.  2022.  Production  and optimization  of  polyhydroxyalkanoates  (PHAs)  from  Paraburkholderia  sp.  PFN  29  under submerged fermentation, Electronic Journal of Biotechnology , 56:1 –11. DOI: 10.1016/j.ejbt.2021.12.003.
Wijaya,  P.A.,  Pringgenies,  D.  &  Yudiati,  E.  2021.  Antibacteria  Activity  of  Gastropod  Association Bacteria  From  Mangrove  Ecosystem  Against  Bacillus  Cereus  and  Escherichia  Coli  and  It’S Potency  of  Application  for  Belanak  Fish  (Mugil  Subviridis). Journal  of  Fisheries  and  Marine Research , 5(1):15 –21. DOI: 10.21776/ub.jfmr.2021.005.01.3.
Zárate-Chaves,  C.A.,  Romero-Rodríguez,  M.C.,  Niño-Arias,  F.C.,  Robles-Camargo,  J.,  Linares- Linares,  M.,  Rodríguez-Bocanegra,  M.X.  &  Gutiérrez-Rojas,  I.  2013.  Optimizing  a  culture medium for biomass and phenolic compounds production using Ganoderma lucidum. Brazilian Journal of Microbiology , 44(1):215 –223. DOI: 10.1590/S1517-83822013005000032. Zheng,  L.,  Yu,  X.,  Wei,  C.,  Qiu,  L.,  Yu,  C.,  Xing,  Q.,  Fan,  Y.  &  Deng,  Z.  2020.  Production  and characterization of a novel alkaline protease from a newly isolated Neurospora crassa through solid-state fermentation. Lwt , 122:p. 108990. DOI: 10.1016/j.lwt.2019.108990.