PEMANTAUAN VIRUS DENGAN METODE PCR ( POLYMERASE CHAIN REACTION ) DI PANTAI UTARA JAWA TIMUR
MONITORING VIRUS BY PCR METHOD ( POLYMERASE CHAIN REACTION ) IN NORTH COAST, EAST JAVA
Hari Suprapto dan Yulia Kartika
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp. 031-5911451

## Abstract
The disease most dangerous for the cultivation activity is virus. Viruses are organisms subseluler that contain only nucleic acid (RNA or DNA) as genetic material. Koi Herpes Virus is one type of virus that  causes  mortality  in  cultured  Cyprinids. KHV  disease  in  Indonesia  started  in  Blitar,  East  Java  on March 2002 because the entry of imported koi fish that carry the virus KHV, while mortality prosentase could  reach  80%  -  85%,  which  causes  loss  of  about  5  billion  rupiah. In    addition  of  KHV,  there  are several types of viral diseases in shrimp is White Spot Syndrome Virus (WSSV), Taura Syndrome Virus (TSV),  dan  Yellow  Head  Virus  (YHV).  Disease  can  cause  losses  in  farming  activities,  such  as  WSSV. WSSV  is  an  endemic  disease  since  1995.  disease  WSSV  is  exotic  viral  disease  that  attacks  the  shrimp monodon  in  1998/1999  has  resulted  in  decreased  production  of  very  large,  so  the  Indonesian  shrimp exports  down  33,000  tons.  Treatment  of  viral  diseases  is  difficult  because  the  virus  resistant  to  certain antibiotics and chemical compounds. Therefore, prevention needs to be done, one through the monitoring activities conducted on the northern coast of East Java.
The  method  implemented  is  monitoring  in  location  and  identification  of  viruses  by  PCR (Polymerase Chain Reaction). Monitoring in location includes water quality measurements and sampling. Identification  of  virus  carried  by  IQ  2000TM.  The  identification  procedure  includes  extraction, amplification and electrophoresis.
Regional  monitoring conducted on the northern coast of East Java  includes Gresik, Lamongan, Tuban,  Bangkalan,  Sampang,  Pamekasan,  and  Sumenep.  Water  quality  at  locations  quite  well.  Results activities of monitoring on the northern coast of East Java is disease White Spot Syndrome Virus (WSSV) was  found positive  in several  locations:  Gresik, Lamongan and Tuban, while the  virus Taura Syndrome Virus (TSV) and Yellow Head Virus (YHV) was not found at all locations . In tilapia, disease Koi Herpes Virus (KHV) was found positive in Tuban.
Keywords : Monitoring virus, East Java, PCR

## Pendahuluan
Virus  berbahaya  karena  penularan virus  yang  sangat  cepat  sehingga  dapat mengakibatkan  kematian  massal  bagi  ikan dalam jumlah yang besar dengan waktu singkat. Salah satu contoh virus yang mewabah dan sulit untuk  dikendalikan  yaitu Koi  Herpes  Virus (KHV).  KHV  pertama  kali  dilaporkan  pada tahun  1998  di  Israel  dan  Amerika  Serikat  yang menyebabkan  kematian  masal  ikan  Mas  dan Koi.  Di  Indonesia  serangan  KHV  pertama  kali dilaporkan  pada  awal  tahun  2002  dan  selama periode  tersebut  telah  menyebar  ke  seluruh pulau  Jawa  dan  Bali  serta  Sumatera  bagian Selatan (Sugianti, 2005).
Penyakit  KHV di  Indonesia dimulai di Blitar  Jawa  Timur  pada  bulan  Maret  2002 akibat masuknya ikan koi impor yang membawa virus  KHV,  adapun  tingkat  kematiannya  bisa
mencapai  80%  –  85%  yang  menyebabkan kerugian  sekitar  5  milyar  rupiah.  Penyakit  ini menyerang populasi ikan koi dan ikan mas dari berbagai umur dan ukuran  baik  yang dipelihara di  kolam,  danau  maupun  karamba  jaring  apung (Setyorini,  2008).  Virus  ini  merupakan  famili Herpesviridae yang mempunyai virion beramplop  berdiameter  sekitar  150  nm,  dengan nukleokapsid  ikosahedral  dengan  diameter  100 nm.  Genomnya  merupakan  molekul  dsDNA linier tunggal (Fenner, 1993).
KHV  memiliki  ukuran  diameter  170- 230  nm,  sedangkan  inti  virus  berukuran  100- 110  nm  dengan  bentuk  icohedral  (Hutoran,  et al.,  2005).  Hasil  pemotongan  tipis  pellet  virus yang  telah  dimurnikan  menunjukkan  adanya partikel yang terbungkus dengan struktur seperti benang  pada  permukaan  inti  (Hutoran,  et  al., 2005).
Antara
pembungkus dengan
nucleocapsid  dipisahkan  oleh  celah  electron- lucen  sekitar  10  nm  (Handoyo,  2010).  KHV juga berisi daerah padat-elektron asimetrik yang relatif  kecil  di  dalam inti viral yang kemungkinan  merupakan  DNA  genomik  dan kompleks  nucleoprotein (Hutoran, et al., 2005). Virus  ini  memiliki  kepadatan  bouyant  sebesar 1.16 g/ml (Ilouze, et al., 2006). White  Spot  Syndrome  Virus (WSSV) merupakan  salah  satu  jenis  virus  yang menyerang  pada  udang.  Virus  ini  termasuk genus  Whispovirus  dari  famili  Nimaviridae dengan  amplop  trilaminar.  WSSV  merupakan virus jenis double-stranded DNA (dsDNA) yang memiliki  virion  yang  besar  (80-120  x  250-380 nm)dan berbentuk batang/elips (Lightner,
2004).  Tahun  1993  merupakan  tahun  pertama kali White  Spot  Syndrome  Virus (WSSV) menyerang budidaya udang. Hal itu dikarenakan sanitasi  yang  tidak  memadai  sehingga  dengan cepat virus dapat menyebar (Rosenberry, 2000). Vektor  WSSV  yaitu  rotifer  (Yan et  al ,  2004), moluska,  cacing  polychaete  (Vijayan et  al , 2005),  crustacean  termasuk Artemia  salina (Chang et  al ,  2002),  copepods,  isopods,  dan larva  Euphydradae.  Semua  spesies  tersebut daapat  berakumulasi  dengan  konsentrasi  tinggi WSSV, meskipun tidak terbukti terjadi replikasi virus (Lo et al , 1998).
Di  Indonesia,  penyakit White  Spot Syndrome  Virus (WSSV)  mewabah sejak tahun 1995.  WSSV  menyerang  udang  pada  semua stadia  baik  benur  maupun  udang  dewasa. WSSV  dapat  menyebabkan  kematian  pada udang  hingga  100%  selama  3-  10  hari  sejak gejala  klinis  muncul  (Aryani,  2008).  Wabah penyakit  udang  yang  disebabkan  oleh  WSSV, yang  merupakan  penyakit  virus  eksotik  yang menyerang udang monodon pada tahun 1998/1999  telah  mengakibatkan  penurunan produksi  yang  sangat  besar,  sehingga  ekspor udang Indonesia turun 33.000 ton (senilai US $ 330 juta, saat itu Rp 10.000,- – 15.000,-/US $), sebagai akibat penutupan 70 % usaha tambak di Jawa dan luar jawa. Sejak saat itu selalu terjadi wabah,  akibatnya  usaha  budidaya  udang monodon  di  Indonesia  kolap  sampai  sekarang belum dapat dipulihkan meskipun telah melakukan berbagai upaya. Taura Syndrome Virus (TSV)
merupakan  spesies  dari  famili  Dicistroviridae yang  terdiri  dari  ssRNA.  Umumnya  virus  ini menyerang  udang  terutama  pada  fase Post Larva (PL) dan  mengakibatkan  mortalitas  yang tinggi  karena  memiliki  tingkat  mutasi  spontan yang  tinggi.  Virus ini memiliki virion berdiameter  32  nm  dan  dapat  bereplikasi  di sitoplasma  sel  inang.  Inang  utama  TSV  yaitu
L.vannamei (Lightner et  al ,  1995).  Penyakit pada  udang  lainnya  yaitu Yellow  Head  Virus (YHV)  yang  menyerang  pertama  kali  di Thailand  pada  tahun  1991  dan  kemudian menyebar  ke  negara-negara  Asia  (Limuswan, 1991).  Virus  ini  memiliki  nukleokapsid  sekitar 15  nm  x  130-800  nm  yang  terakumulasi  dalam sitoplasma.  Virus  ini  termasuk  ssRNA  yang merupakan  famili  Roniviridae  (Tang  and Lightner, 1999).

## Materi dan Metode
Pengukuran Kualitas Air
Pemantauan  yang  dilakukan  langsung di  lokasi  salah  satunya  yaitu  pengukuran kualitas  air.  Beberapa  parameter  yang  diukur meliputi  suhu,  warna  air,  salinitas,  pH,  DO, ammonium, ammonia, nitrat dan nitrit.
Pengambilan Sampel Ikan  yang  diambil  meliputi  ikan nila  ( Oreochromis  niloticus )  yaitu  untuk identifikasi  KHV.  Organ  yang  diambil  untuk dijadikan  specimen  identifikasi  KHV  yaitu insang.  Sedangkan  organ  yang  diambil  pada udang vannamei ( Litopenaeus vannamei ) untuk identifikasi  WSSV,  TSV,  dan  YHV  yaitu pleopoda  (kaki  renang),  ekor,  dan  insang. Spesimen  difiksasi  dengan  menggunakan alkohol  70%,  disimpan  dalam  botol  dan dimasukkan  dalam  cool  box.  Pergantian alkohol untuk pengawetan lebih lama dilakukan  setiap  7  hari  dengan  alkohol  70% dengan suhu dibawah 4 o C.
Identifikasi Virus dengan PCR IQ 2000 TM
Identifikasi  virus  dilaksanakan  di laboratorium  biologi  molekuler  dengan  metode PCR  dengan  IQ  2000 TM .  Prosedur  identifikasi virus dengan PCR meliputi ekstraksi, amplifikasi, elektroforesis.
Ekstraksi Virus Pada  virus  DNA,  sampel  sejumlah  20 mg ke dalam mikrotube 1,5 ml dan ditambahkan 500 µl Lysis buffer kemudian sampel dihaluskan menggunakan  pestle.  Sampel  diinkubasi  pada suhu  95 o C  selama  10  menit  kemudian disentifuse  pada  12.000  rpm  selama  10  menit. Sebanyak  200  µl  supernatan  ditambahkan  400 µl  etanol  95%,  sentrifuse  dengan  kecepatan 12.000  rpm  selama  5  menit.  Pellet  dikeringkan dan  dilarutkan  dengan  DEPC.ddH 2 O  atau TE Buffer .
Pada  virus  RNA,  sampel  20-25  mg sampel  ke  dalam  mikrotube  1,5  ml  dan ditambahkan 100 µl CHCl 3 , kemudian disentrifugasi  12.000  rpm  selama  15  menit.
Supernatan  sebanyak  200  µl  ditambahkan  200 µl  isopropanol,  sentrifuse  dengan  kecepatan 12.000  rpm  selama  10  menit  dan  buang isopropanol.  Pellet  ditambahkan  alkohol  75%, sentrifuse dengan kecepatan 9000 rpm selama 5 menit dan larutkan pellet dengan DEPC.ddH 2 O.
Amplifikasi PCR IQ 2000 TM Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan Thermal  cycler . Reagen  First PCR Kit IQ 2000 disiapkan dan dimasukkan ke dalam mikrotube 1,5 µl dengan komposisi yang berbeda.  Pada  KHV  dan  WSSV  reagen  yang ditambahkan yaitu 7,5 µl First PCR Premix, 0,5 µl IQzyme, 2 µl DNA template (sampel, kontrol +, kontrol  -  ). Sedangkan untuk TSV dan YHV komposisi  reagen  yaitu  7  µl  First  PCR  Premix,
0,5 µl IQzyme, RT Enzyme Mix 0,5 µl, dan 2 µl RNA  template  (sampel,  kontrol  +,  kontrol  -  ). Proses  amplifikasi  dimulai  pada  tahap  1  ( First PCR) dengan suhu 94 o C, 62 o C, 72 o C, dan 20 o C. Setelah  First  PCR,  ditambahkan Nested PCR yaitu sebanyak 14 µl Nested PCR Premix dan 1 µl  IQzyme.  Amplifikasi  tahap  2  (PCR Nested ) pada suhu : 94 o C, 62 o C, 72 o C, dan 20 o C.
Elektroforesis
Sampel/standart hasil amplifikasi
sebanyak  8  µl  ditambahkan  dengan  2  µl  6x Loading  dye ,  kemudian  dielektroforesis  dengan menggunakan  gel  agarose  2%  yang  direndam dengan TAE buffer dengan kekuatan listrik 110- 125 V selama 35-45 menit. Setelah elektroforesis,  agarose  direndam  dalam  larutan Ethidium  Bromide (10  µl  EtBr  dilarutkan  ke dalam  100  ml aquadest )  selama  10  menit, kemudian  agarose  direndam  dengan aquadest selama 10 menit (pencucian berulang). Agarose hasil pencucian diamati pada
UV tansilluminator dan dilakukan analisis.

## Hasil dan Pembahasan
Pemantauan  virus  dilaksanakan  di pantai  utara  Jawa  Timur  meliputi  :  Gresik,
Lamongan, Tuban, Bangkalan, Sampang,
Pamekasan,  dan  Sumenep.  Kualitas  air  pada umumnya  relatif  baik  di  seluruh  daerah pemantauan.  Namun,  pada  beberapa  daerah kadar  DO  sangat  rendah  seperti  di  Bangkalan (2,36  mg/L)  dan  Sampang  (1,06mg/L).  Hal  itu dikarenakan  sistem  sirkulasi  air  masih  buruk dan  pada  beberapa  kolam  tidak  dilakukan pergantian  air,  sehingga  tidak  terjadi  difusi oksigen udara ke dalam air. Pada tambak udang, kualitas  air  relatif  baik  dan  terkendali.  Hal  itu dapat  dilihat  dari  suhu  (25,55-34,72 o C),  DO (6,74-7,14 mg/L), salinitas (5-13 ppt), warna air
(cokelat-kehijauan), pH (8,2-8,5), ammoniak (0-
0,5 mg/L). Namun kandungan nitrat dan nitrit di atas  batas  wajar  yaitu  nitrat  (10-50  mg/L),  dan nitrit  (0-1  mg/L).  Hal  itu  dapat  dikarenakan pada pembesaran udang diberikan pakan dalam jumlah  besar  sehingga  kandungan  nitrat  dan nitrit tinggi.
Koi Herpes Virus (KHV) KHV merupakan penyakit yang diakibatkan  oleh  virus  golongan  DNA  dari famili Herpesviridae. Virus ini merupakan virus yang  mempunyai  virion beramplop  berdiameter sekitar 150 nm, dengan nukleokapsid ikosahedra dengan diameter 100 nm. Genomnya merupakan  molekul  dsDNA  linier  tunggal (Fenner,  1993).  Ciri-ciri  ikan  yang  tetrinfeksi KHV  yaitu  terdapat  bintik  putih  pada  insang, pendarahan  pada  insang,  mata  cekung,  dan warna tubuh pucat. Kematian akan terjadi dalam waktu  24-48  jam  setelah  terdapat  tanda-tanda klinis  (Hartman,  2008).  Menurut  Sugianti (2005), kematian terjadi antara 1 – 5 hari setelah gejala  awal.  Kematian  mencapai  100  %  dalam waktu singkat.
Koi Herpesvirus (KHV) adalah
penyakit  yang  disebabkan  oleh  virus  yang menyerang  ikan  Koi  ( Cyprinus  carpio  koi )  dan ikan Mas ( Cyprinus carpio ). Saat ini KHV tidak hanya  menyerang  ikan  Koi  dan  ikan  Mas  saja, tapi sudah mulai ditemukan pada ikan air tawar lainnya  seperti  ikan  nila,  ikan  gurami  dan  ikan mujaer  sehingga  dalam  kegiatan  pemantauan dilakukan uji PCR KHV untuk komoditas ikan- ikan tersebut. Organ yang menjadi target infeksi KHV adalah organ  insang, ginjal, otak dan hati karena organ tersebut diduga memiliki
prevalensi (populasi virus) lebih tinggi dibandingkan  dengan  jenis  organ  lainnya (Taukhid et. al. , 2005 dalam Setyorini, 2008). Pada pemantauan tahun 2010 ditemukan  adanya  penyakit Koi  Herpees  Virus (KHV)  pada  komoditas  ikan  nila  hitam ( Oreochromis  niloticus )  di  Tuban,  sedangkan untuk  daerah  lainnya  tidak  ditemukan  KHV. Pada  sampel  ikan  dari  daerah  Pamekasan, Lamongan  dan  Tuban  menunjukkan  sampel negatif  KHV  yaitu  munculnya  band  pada  665 bp.  Pada  sampel  ikan  dari  daerah  Tuban menunjukkan  sampel  positif  KHV  yang diindikasikan dengan munculnya band pada 440 bp dan 665 bp.
Hasil  pemantauan  yang  menunjukkan bahwa  ikan  nila  di  Tuban  positif  KHV.  Secara eksternal,  ikan nila positif  KHV  di Tuban tidak menunjukkan gejala klinis seperti  ikan koi atau ikan  mas  yang  terserang  KHV,  namun  dalam pemeriksaan laboratorium ditemukan band pada 440  bp  dan  665  bp  yang  menunjukkan  bahwa
ikan  tersebut  positif  KHV.  Ikan  nila  positif KHV  karena  mudahnya  virus  untuk  bermutasi.
Mutasi adalah perubahan yang terjadi pada bahan genetik (DNA atau RNA), baik pada taraf  urutan gen  (disebut mutasi  titik)  maupun pada  taraf  kromosom.  Virus merupakan mikroorganisme  yang  mudah  bermutasi  karena virus  memiliki  struktur  yang  sangat  sederhana dan  hanya  terdiri  dari  satu  asam  nukleat  saja (Agustian, 2009).
White Spot Syndrome Virus (WSSV) WSSV  merupakan  virus  penyebab penyakit White  Spot  Disease (WSD)  pada udang. Virus DNA dari  famili Nimaviridea dan genus  Whispovirus  ini  dapat  hidup  di  kolam selama 3-4 hari. WSSV menyebabkan perubahan  histopatologis,  kerusakan  hampir semua  jaringan,  hypertrophy,  dan  ditemukan badan  inklusi  berwarna esinofilik atau basofilik yang  dikenal  dengan Cowdry  Type-A  inclusion body (Lightner,  1996).  Pemantauan  ditemukan
Gambar 1. Hasil Elektroforesis KHV dengan metode IQ 2000
Gambar 2. Hasil Elektroforesis WSSV dengan metode IQ 2000
adanya  WSSV  pada  komoditas  udang  di beberapa  lokasi.  Berikut  pembacaan  hasil elektroforesis WSSV.
Sampel  udang  mati  yang  beraasal  dari Gresik  dan  Lamongan  positif  terinfeksi  WSSV stadium  berat.  Hal  itu  terlihat  dari  keluarnya band  296  bp,  550  bp  dan  diatas  848  bp  pada lane  2  dan  4.  Pada  sampel  udang  hidup  dari Lamongan  dan  Tuban  juga  terinfeksi  WSSV stadium sangat ringan yaitu dengan adanya band 296  bp  dan  diatas  848  bp  pada  lane  1  dan  3. Sedangkan  sampel  udang  hidup  dari  Gresik terdeteksi negatif terhadap WSSV (lane 5 dan 6 tidak ditemukan band).
Pada hasil pemantauan diketahui bahwa  dua  sampel  udang  mati  (Gresik  dan Lamongan)  terinfeksi  berat  dengan  kodisi  fisik sampel insang geripis dan warna udang menjadi orange  karena  terkena  panas  matahari.  Empat sampel  udang  hidup  lainnya,  dua  diantaranya (Lamongan dan Tuban) terinfeksi sangat ringan. Perbedaan stadium infeksi dari virus menandakan  tahapan  replikasi  virus  di  dalam tubuh  ikan.  Infeksi  stadium  berat  berarti  virus sedang/telah  melakukan  replikasi  di  dalam  sel, sedangkan  untuk  infeksi  ringan  berarti  virus dalam kondisi masuk atau akan masuk ke dalam sel  (penetrasi)  dan  infeksi  ringan  berarti  virus berada  di  sekitar  sel  atau  menempel  di permukaan  sel  (adsorbsi).  Kondisi  sampel belum  menunjukkan  gejala  klinis  dan  berarti udang  tersebut  bersifat carrier .  Pada  umumnya ikan  muda  yang  sembuh  dapat  tahan  terhadap penyakit  tetapi  dapat  menjadi carrier seumur hidup,  sehingga  kemungkinan  besar  dapat menularkan  WSSV  ke  udang  lainnya  baik
secara  horizontal  maupun  vertikal  (Sugianti, 2005).
Yellow Head Virus (YHV) Yellow Head Disease (YHD) merupakan penyakit viral yang dapat menyebabkan  kematian  massal  pada  udang yang  diakibatkan  oleh  YHV  ( Yellow  Head Virus ). Gejala klinis yang khas dari penyakit  ini yaitu cephalothorax berwarna kekuning- kuningan.  Pada  pemantauan  ini  ini  tidak ditemukan  YHV.    Positif  YHV  diindikasi dengan keluarnya  band 277  bp dan 777  bp dan negatif YHV bila tidak terdapat band atau band keluar  pada  680  bp.  Berikut  merupakan  hasil pembacaan elektroforesis untuk YHV.
Taura Syndrome Virus (TSV) Taura Syndrome Virus adalah penyakit udang  yang  disebabkan  virus  RNA  dari  famili Dicistroviridae.  TSV  dapat  menginfeksi  udang vannamei  dan  rostris  ( L.  stylirostris )  yang keduanya  telah  diintroduksi  di  Indonesia. Serangan  TSV  pada  umumnya  terjadi  pada umur  14-40  hari  setelah  penebaran  di  tambak, dengan  tingkat  kematian  dapat  mencapai  95%. Apabila  penyakit  terjadi  pada  umur  30  hari pertama,  berarti  infeksi  berasal  dari  induk (vertikal),  jika  lebih  dari  60  hari  berarti  infeksi berasal  dari  lingkungan  (horisontal).  Berikut merupakan  hasil  pembacaan  elektroforesis untuk TSV.
Taura  Syndrome  Virus (TSV)  tidak ditemukan  menginfeksi  udang  di  semua  lokasi pemantauan. Hal tersebut terlihat dari keluarnya band  pada  sekitar  680  bp  yang  terdapat  diatas
Gambar 3. Hasil Elektroforesis YHV dengan metode IQ 2000
band  positif  (476  bp).  Positif  TSV  terjadi apabila  terdapat  band  284  bp  dan  476  bp, namun  apabila  tidak  keluar  band  atau  terdapat band  sekitar  680  bp  menunjukkan  bahwa sampel negatif TSV.
Pemantauan  virus  di  pantai  utara  Jawa Timur mendapatkan hasil bahwa Hama Penyakit Ikan Karantina (HPIK) golongan virus yang  ditemukan  yaitu White  Spot  Syndrome Virus (WSSV)  pada  udang  vannamei  di beberapa  lokasi  yaitu  Gresik,  Lamongan  dan Tuban. Koi Herpes Virus (KHV) pada ikan  nila ditemukan positif di kabupaten Tuban. Sedangkan  jenis  virus Taura  Syndrome  Virus (TSV)  dan Yellow  Head  Virus (YHV)  tidak ditemukan di semua lokasi.

## Daftar Pustaka
Agustian,  D.  2009.  Materi  Kelas  X  :  Maret 2009. http://educorolla2.blogspot.com/2009_
03_01_archive.html.  24/11/2010.  25 hal. Aryani,  D.,  G.  N.  Susanto,  Sumardi,  Iswadi. 2008.  Pengaruh  Perubahan  Salinitas Terhadap Virulensi White Spot Syndrome  Virus (WSSV)  Pada  Udang
Putih. Universitas Lampung. Lampung. 9 hal.
Chang Y.S., C.F. Lo, S.E. Peng, K.F. Liu, C.H. Wang,  G.H.  Kou  (2002).  White  spot syndrome  virus  (WSSV)  PCR-positive Artemia cysts  yield  PCR-negative nauplii  that  fail  to  transmit  WSSV
when  fed  to  shrimp  postlarvae. Dis. Aquat. Org., 49, 1–10. Fenner,  F.  J.,  E.  P.  J.  Gibbs,  F.  A.  Murphy, R.Rott,  M.  J.Studdert,  D.  O.  White. 1993. Veterinary Virology. Terjemahan : Putra, H. IKIP Semarang Press. Semarang. 699 hal.
Handoyo,  B.  2010.  Present  Status  KHV  ( Koi Herpes Virus ) atau CNGV atau CyHV- 3.  http://boyunaquaculturist.blogspot. com. 27/11/2010.
Hutoran,  M.,  A.  Ronen,  A.  Perelberg,  M. Illouze,  A.  Dishon,  I.  Bejerano,  N. Chen,  M.  Kotler.  2005.  Description  of an  as  Yet  Unclassified  DNA  Virus from Diseased Cyprinus carpio Species.  Journal  of  Virology  Vol.  79, No. 4. Illouze,  M.,  A.  Dishon,  M.  Kotler.  2006.
Characterization  of  a  Novel  Virus Causing  a  Lethal  Disease  in  Carp  and
Koi.  Microbiology  And  Molecular
Biology Reviews.  147–156 p. Lightner,  D.V.,  R.  M.  Redman,  K.  W.  Hasson, and  C.  R.  Pantoja. 1995.  Taura Syndrome in Penaeus vannamei (Crustacea: Decapoda) :
gross signs, histopathology and ultrastructure. Dis Aquat Org 21. 53-59
p.
Lightner  D.V.  1996.  A  Handbook  of  Shrimp
Pathology  and  Diagnostic  Procedures for  Diseases  of  Cultured  Penaeid, Shrimp  World  Aquaculture  Society, Baton Rouge, Louisiana, USA. 304 p.
Gambar 4. Hasil Elektroforesis TSV dengan metode IQ 2000
Lightner, D. V. 2004. The Penaeid Shrimp Viral Pandemics  due  to  IHHNV,  WSSV, TSV,  YHV  :  History  in  the  Americas and  Current  Status.  University  of Arizona, Tuscon. USA. 20 p.
Limuswan, C . 1991. Handbook for Cultivation of  Black  Tiger  Prawns.  Tansetakit,
Bangkok, Thailand.
Lo  C.F.,  G.H.  Kou.  1998.  Virus-associated white  spot  syndrome  of  shrimp  in Taiwan:  a  review. Fish  Pathol., 33,
365–371.
Mbwana J, et al . 2006. Molecular characterization of Haemophilus ducreyi isolates from different geographical locations. J Clin Microbiol 44(1):132-137 Pharmawati,  M.  2008.  Optimalisasi  Ekstraksi DNA  dan  PCR-RAPD  Pada  Grevillea spp. (Proteaceae). Universitas Udayana. 4 hal.
Rosenberry,  B.  2000.  World  Shrimp  Farming
2000,  Shrimp  News  International
(2000). 324 p.
Setyorini, N., A. Khusnah, L. Widajatiningrum.
2008.  Kelangsungan  Hidup  Ikan  Koi ( Cyprinus  carpio  koi )  Yang  Terinfeksi
KHV  ( Koi  Herpes  Virus ).  Balai
Pengembangan  Budidaya  Air  Payau Bangil. 9 hal. Sugianti, B. 2005. Pemanfaatan Tumbuhan Obat Tradisional Dalam Pengendalian Penyakit Ikan. Jurnal Makalah Falsafah Sains. Institut Pertanian Bogor. Bogor. 37 hal. Tang,  K.  F.  J.,  and  D.  V.  Lightner. 1999.  A Yellow-Head virus gene probe: application to in situ hybridization and determination of its nucleotide
sequence. 173 p. Vijayan K.K., V. Stalin, C.P. Balasubramanian,
S.V.  Alavandi,  V.  Thillai,  T.C.
Santiago.  2005.  Polychaete  worms  –  a vector  for  white  spot  syndrome  virus (WSSV). Dis.  Aquat.  Org., 63,  107– 111.
Westermeier. 2004. Electrophoresis in Practice: A  Guide  to  Theory  and  Practice .  New Jersey: John Wiley & Sons inc.
Williams  JG, et  al . 1990. DNA polymorphisms amplified  by  arbitrary  primers  are useful  as  genetic  markers. Nucleic Acids Res 18(22):6531-5. Yan D.C., S.L. Dong, J. Huang, X.M. Yu, M.Y. Feng,  X.Y.  Liu.  2004.  White  spot syndrome  virus  (WSSV)  detected  by PCR in rotifers and rotifer resting eggs from  shrimp  pond  sediments. Dis. Aquat. Org., 59, 69–73.