POTENSI CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T CELL (CAR-T CELL) DENGAN TARGET PROSTATE- SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN (PSMA) TERMODIFIKASI CRISPR/CAS9 SEBAGAI TERAPI KANKER PROSTAT
Ali Habibi 1 , Siti Zulaikha Risqiyani 1 , Dwi Ari Santi Putri 2
1 Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember, Jember

## ABSTRAK
Pendahuluan: Kanker  prostat  merupakan  keganasan  sel-sel  prostat yang  menjadi  salah  satu  keganasan  tersering  pada  pria  dengan prevalensi  137,9  kasus  baru  per  100.000  pria tiap tahunnya. Salah satu pekerjaan  yang  memiliki  risiko  tinggi  terhadap  kejadian  kanker  prostat adalah  petani  karena  diakibatkan  pajanan  pestisida  dan  zat  berbahaya lainnya.  Saat  ini, Androgen  Deprivation  Therapy (ADT)  masih  menjadi terapi  yang  banyak  digunakan.  Namun,  ADT  dapat  menurunkan  libido, impotensi, hot  flashes ,  dan  peningkatan  risiko  patah  tulang.  Karena beberapa kelemahan dari terapi ADT, maka diperlukan inovasi terapi untuk kanker prostat.
Metode: Proses  pencarian  literatur  yang  relevan  kami  lakukan menggunakan  metode  PRISMA  dengan  kata  kunci  yang  telah  ditetapkan sebelumnya.  Dari  94  jurnal  yang  telah  ditelaah,  64  jurnal  diantaranya dianggap sesuai dengan topik bahasan dan digunakan sebagai referensi. Hasil  dan  Pembahasan:  CAR-T  Cell termodifikasi  CRISPR/Cas9 terbukti efisien dan efektif meningkatkan fungsi CAR-T Cell pada uji in vitro dan in  vivo. Mekanisme  imunosupresif  yang  diakibatkan  oleh  ikatan programmed  cell  death  protein 1  (PD-1) dengan Programmed Death- Ligand 1  (PD-L1)  dapat  dituntaskan  dengan  menggunakan  metode CRISPR/Cas9- mediated anti  PD-1  sehingga  dapat  mempertahankan aktivasi CAR-T  Cell .  Hal ini dibuktikan  dengan  peningkatan  degranulasi CAR-T  Cell dan clearance tumor pada uji in vivo . Simpulan:  Chimeric  Antigen  Receptor  T  Cell ( CAR-T  Cell )  dengan target Prostate-  Specific  Membrane  Antigen (PSMA)  termodifikasi CRISPR/Cas9 berpotensi sebagai inovasi terapi yang efektif pada kanker prostat.
Kata  Kunci:  Chimeric  Antigen  Receptor  T  Cell ( CAR-T  Cell ), CRISPR/Cas9, Prostate Cancer , dan Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)
Korespondensi:
Ali Habibi
Email author: alisegaf21@gmail.com

## Riwayat Artikel
Diterima: 12 Maret 2021 Selesai revisi: 5 Juni 2021
DOI :
10.53366/jimki.v9i1.321

## JIMKI : JURNAL ILMIAH MAHASISWA KEDOKTERAN
INDONESIA e-ISSN : 2721-1924 ISSN : 2302-6391

## THE POTENTIAL OF CHIMERIC ANTIGEN
RECEPTOR T CELL (CART-T CELL) TARGETTING PROSTATE-SPECIFIC MEMRANE ANTIGEN (PSMA) MODIFIED BY CRISPR/CAS9 AS PROSTATE CANCER THERAPY

## ABSTRACT
Introduction: Prostate cancer is a malignancy of prostate cells which is one of the most common malignancies in  men  with  a  prevalence of  137.9  new  cases per  100,000 men each year. One of the jobs that have a high risk of prostate cancer is farmers because it is  caused  by  exposure  to  pesticides  and  other  hazardous  substances.  Currently, Androgen Deprivation Therapy (ADT) is  still  a  widely used therapy. However, ADT  can decrease libido, impotence, hot flashes, and an increased risk of fractures. Due to several disadvantages of ADT therapy, therapeutic innovations for prostate cancer are needed. Method:  We  searched  relevant  literature  using  the  PRISMA  method  with  predefined keywords.  Of  the 94 journals  that have  been  reviewed,  64 of them  are considered according to the topic of discussion and are used as references.
Results and Discussion: CAR-T Cell modified CRISPR/Cas9 proved to be efficient and effective  in  increasing  the  function  of  CAR-T  Cell  on  in  vitro  and  in  vivo  tests.  The immunosuppressive  mechanism  caused  by  PD-1  binding  with  PD-L1  can  be  resolved using the CRISPR / Cas9 - mediated anti PD-1 method so that it can maintain CAR-T Cell activation.  This  is  evidenced  by  the  increase  in  CAR-T  cell  degranulation  and  tumor clearance in the in vivo test.
Conclusion:  Chimeric  Antigen  Receptor  T  Cell  (CAR-T  Cell)  with  a  CRISPR/Cas9 modified Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA) target has the potential to  be  an effective therapeutic innovation for prostate cancer.
Keywords:  Chimeric  Antigen  Receptor  T  Cell (CAR-T  Cell),  CRISPR/Cas9, Prostate Cancer , and Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)

## 1. PENDAHULUAN
Kanker prostat merupakan keganasan  pada  sel-sel  prostat  yang ditandai  dengan  peningkatan  serum prostate  specific  antigen (PSA)  dan keabnormalan colok dubur yang
dipastikan  dengan  pemeriksaan  biopsi prostat, transrectal ultrasonography (TRUS), prostate  cancer  gene 3 (PCA3), dan magnetic resonance imaging (MRI). [1,2,3] Kanker  prostat menyumbang 16% kematian di
Indonesia. [4] Kanker  prostat  adalah salah  satu  keganasan  tersering  pada pria  dengan  137,9  kasus  baru  per
100.000 pria tiap tahunnya. [5,6,7]
Prevalensi  kanker  prostat  di  seluruh dunia  pada  tahun  2018  mencapai 1.276.106  kasus  dengan  kematian sebanyak  358.989. [6,8,9] Sampai  tahun
2040, diperkirakan akan ada kasus baru sebanyak  2.293.818  kasus. [9,10] Di Indonesia,  jumlah  penderita  kanker prostat  di  tiga  rumah  sakit  pusat pendidikan (Jakarta, Bandung, Surabaya) selama 8 tahun terakhir yaitu 1.102 pasien dengan bentuk terseringnya adalah adenokarsinoma. [11,12] Beberapa  mekanisme telah diajukan untuk menjelaskan perkembangan kanker  akibat  pestisida.
Kebanyakan  pestisida  tidak  bersifat mutagenik.  Namun,  pestisida  mungkin mengandung endocrine disruptors yang bisa  memblokir  ataupun  merangsang reseptor  hormonal  dan  menyebabkan peningkatan  testosteron.  Namun,  bukti dari  studi  epidemiologi,  tidak  dapat membuktikan  dengan  pasti  bahwa paparan endocrine  disruptors atau
kadar androgen endogen yang
bersirkulasi berhubungan dengan peningkatan  risiko  kanker prostat. Selain  itu,  penelitian  pada  hewan  dan jaringan  telah  menunjukkan  bahwa
salah satu jenis pestisida yaitu karbamat, dapat menyebabkan kerusakan kromosom. Selain itu,
pestisida juga dapat menyebabkan stres oksidatif yang dapat merusak sel. [13]
Pekerjaan petani memiliki risiko tinggi  terhadap  beberapa  paparan berbahaya,  seperti  debu  organik  dan anorganik,  pestisida,  jamur,  mikroba, virus,  bensin,  knalpot  diesel,  asap pengelasan,  dan  sinar  ultraviolet [13] yang dapat dikaitkan dengan beberapa jenis kanker, termasuk kanker prostat. [14] Sejak tahun 1970-an, banyak penelitian  melaporkan  risiko  kanker prostat  yang  signifikan  pada  petani dibandingkan dengan pekerjaan lain. [13]
Laporan  terbaru  dari  Studi  Kesehatan Pertanian  (AHS),  sebuah  kelompok besar pengguna pestisida dan
pasangan mereka, terkonfirmasi bahwa pestisida  tertentu menjadi faktor  utama risiko  kanker  yang  diamati  pada populasi pertanian. [15]
Penderita  kanker  prostat  perlu dikelompokkan  menjadi  3  kelompok, yaitu  kelompok  dengan  risiko  rendah, risiko  menengah,  dan  risiko  tinggi. Pengelompokan  risiko  dilakukan  untuk menentukan  jenis  pengobatan  kanker. Pengobatan  kanker  yang  dimaksud terdiri  dari  observasi,  operasi,  radiasi, atau pengobatan paliatif dengan
memberikan obat antihidrogen. [16] Selama dekade terakhir ini, pengobatan kanker prostat telah berubah dengan terapi baru, pencitraan fungsional tingkat lanjut dan pembaruan  dari  terapi  yang  ada  pada tahap awal. [17] Terdapat beberapa faktor yang memengaruhi keberhasilan terapi, yaitu stadium, komorbiditas, dan grading .  Faktor-faktor  risiko  ini  perlu dikenali  dan  dikelola  dengan  baik  dan benar  untuk  memilih  opsi  perawatan yang  tepat  dan  meminimalkan  efek samping dan perbaikan kualitas hidup. [18]
Terdapat  banyak  pengobatan baru  untuk  kanker  prostat  dengan imunoterapi, salah satunya yaitu sipuleucel-T (sip-T). Penggunaan imunoterapi berpotensi untuk
meningkatkan kelangsungan hidup bagi
pasien kanker prostat metastatik
dengan  melibatkan  sistem  kekebalan untuk menyerang sel-sel tumor. [19] Akan tetapi,  terapi  ini  menimbulkan  efek samping,  seperti  flu  dan  demam sebagai  efek  samping  yang  paling umum. Efek  samping  yang  lebih  serius jarang  terjadi.  Kadang-  kadang  sistem kekebalan  tubuh  mulai  menyerang bagian  lain  dari  tubuh  yang  dapat menyebabkan  masalah  serius  di  paru- paru,  usus,  hati,  kelenjar  pembuat hormon, ginjal, atau organ lain. [20] Dari studi sebelumnya menyatakan selain
imunoterapi,
Androgen  Deprivation  Therapy (ADT) masih  menjadi  strategi  terapi  yang banyak  digunakan  dalam  praktik  klinis yang bekerja  dengan cara menghalangi efek androgen dan dapat memperlambat  pertumbuhan  kanker prostat. [17] Androgen Deprivation Therapy sejauh  ini  menjadi  standar terapi  dan  biasanya  berlanjut  seumur hidup  untuk  pasien  dengan  kanker prostat metastatik. Perkembangan Androgen  Deprivation  Therapy (ADT) untuk metastatic  castration-resistant
prostate cancer (mCRPC) diobati dengan penambahan manipulasi hormonal sekunder, termasuk antiandrogen  seperti  bicalutamide  dan nilutamide, ketoconazole, atau kortikosteroid. [17] Namun,  ADT  dapat menurunan libido, impotensi, hot flashes, osteopenia dengan peningkatan  risiko  patah  tulang. [21]
Karena beberapa kelemahan dari terapi ADT,  maka  diperlukan  inovasi  terapi untuk  kanker  prostat,  salah  satunya dengan Chimeric  Antigen  Receptor  T cell (CAR-T)  dengan  target  Prostate-
Specific  Membrane  Antigen  (PSMA) termodifikasi CRISPR/Cas9. Terapi Chimeric Antigen Receptor T cell (CAR-T) telah mendapatkan  perhatian  besar  karena keunggulan  CAR-T dalam pengobatan tumor  ganas  pada  sistem  peredaran
darah.  Teknologi  CAR-T  memberikan cara  baru  untuk  terapi  tumor  ganas, termasuk kanker prostat. [22] CAR adalah protein  transmembran  yang  disintesis, yang  dapat  mengenali  antigen  target yang  diekspresikan  dalam  sel  tumor melalui  pemrograman  ulang  genetik. Teknologi  transfer  gen  ini  dapat memperkenalkan  gen  yang  mengkode CARs  ke  dalam  sel  imun  secara efisien. [23] CAR-T membutuhkan receptor  transmembran  spesifik  untuk dikenali,  salah  satunya  adalah  PSMA ( Prostate- specific membrane antigen ). [22] PSMA ( Prostate-specific membrane antigen )  adalah glikoprotein transmembran tipe II yang
diekspresikan pada membran sel  epitel prostat. Prostate-Specific  Membrane Antigen (PSMA)  juga  diekspresikan pada  membran  ovarium  dan  sel payudara dalam kadar yang rendah dan hampir tidak ada di usus, hati, membran sel  ginjal,  tetapi  tinggi  dalam  jaringan prostat  dan  pembuluh  darah  tumor. Dengan  demikian,  PSMA  memiliki spesifisitas  jaringan  prostat  yang  baik. Selain  itu,  PSMA  dapat  berfungsi sebagai  reseptor  untuk  melakukan pensinyalan untuk meningkatkan
migrasi  sel  dan  mengatur  stabilitas kromosom.  Oleh  karena  itu,  PSMA merupakan target antigen yang
menjanjikan untuk terapi kanker prostat. [22]
Salah satu  mekanisme dimana kanker  dapat  menghambat  fungsi  dari sel T yaitu melalui mekanisme imunosupresif dengan mengekspresikan inhibitory ligand seperti  PD-L1  pada  sel  kanker  dan jaringan di sekitarnya (misalnya stroma atau  tumor  pembuluh  darah)  ekspresi protein  PD  -1  pada  sel  T  dan  protein PD-  L1  pada  sel  kanker  berkorelasi dengan  prognosis  yang  buruk  pada beberapa  kanker.  Penelitian  terbaru menunjukkan bahwa metode Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic  Repeats  Associated  with Cas9  protein (CRISPR/Cas9)  dapat digunakan untuk menghilangkan
mekanisme  munosupresif  yang  dapat meningkatkan  prospek  terapi  CAR-T melalui modifikasi gen. [24] CRISPR/Cas9 merupakan metode genome  editing yang  memiliki  tingkat kespesifikan yang tinggi, tidak
melibatkan  integrasi  antar-DNA,  dan dapat  menargetkan  lebih  dari  satu genom target. [25] Oleh karena itu, untuk meningkatkan  potensi  dari CAR-T  Cell pada  terapi  kanker  prostat,  kami mengajukan  metode  CRISPR/Cas9 untuk  menghambat  protein  PD-1  pada CAR-T  Cell ,  sehingga  tidak  bisa berikatan  dengan  protein  PD-L1  pada sel  tumor.  Hal  ini  berefek  pada CAR-T Cell menjadi tidak bisa dinonaktifkan. [24,26]

## 2. METODE
Penulisan karya  ilmiah  tinjauan pustaka  ini menggunakan  metode PRISMA ( Preferred Reporting Items for
Systemic Reviews and Meta-Analyses ).
PRISMA merupakan suatu studi pustaka  yang  didasarkan  atas  fakta- fakta  serta  pengambilan  data  secara random. Struktur yang digunakan dalam karya  ilmiah  ini  mengaplikasikan:  latar belakang, sasaran, sumber data, kriteria kelayakan  jurnal,  dan  intervensi, study appraisal dan synthesis methods, hasil, batasan masalah, kesimpulan  dan kata kunci,  serta  daftar  pustaka.  Penulis menggunakan search  engine PubMed,
ScienceDirect,
GoogleSchoolar,
Elsevier ,  Nature  dengan  kata  kunci: “ Prostate  Cancer , Chimeric  Antigen Receptor T Cell ( CAR-T Cell ), Prostate- Specific  Membrane  Antigen (PSMA), CRISPR/ Cas9, dan Agriculture ”. Jurnal ilmiah  yang  telah  berhasil  melewati kriteria  inklusi  dan  eksklusi  akan menjalani  proses  pemindaian  kembali untuk  mengetahui  adanya  publikasi tambahan  mengenai  kata  kunci  yang ditentukan. Jurnal ilmiah akan menjalani proses eksklusi jika tahun publikasi atau terbit  jurnal  telah  melebihi  10  tahun, tidak  relevan,  dan  bukan  merupakan artikel full- text . Terdapat 94 artikel atau jurnal  ilmiah  yang  sesuai  dengan  topik yang  dibahas,  tetapi  hanya  65  jurnal yang  memenuhi  kriteria  inklusi  yang telah ditetapkan penulis.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Patogenesis Kanker Prostat
Patogenesis  yang  berperan dalam  kanker  prostat  diakibatkan  oleh faktor androgen, hereditas, lingkungan, dan  mutasi  somatik. [27] Androgen, terutama testosteron dan dihidrotestosteron,  merupakan  hormon penting  untuk  pertumbuhan  dan  fungsi prostat,  namun  juga  berperan  dalam progresivitas dan metastasis kanker. [28,29] Pajanan terhadap pestisida meningkatkan  risiko  kanker  prostat melalui efek biologisnya dalam perubahan  kadar  dan  fungsi  hormon serta sebagai promotor tumor. [30] Salah satu  respon  dari  androgen  dalam  sel kanker  prostat  adalah  meningkatkan regulasi  dari Transmembrane  Serine Protease 2 ( androgen-responsive TMPRSS2)  yang  diekspresikan  pada sisi  luminal  epitel  prostat. [31] Gen TMPRSS2  ( Transmembrane  Serine Protease 2 ) berfusi dengan ERG ( ETS- related  gene )  atau  ETV1  ( Variant
Transcription Factor 1) yang merupakan faktor transkripsi ETS (E26 Transformation-Specific ) family dan bersifat karsinogenik. [32,33,34,35]
Riwayat  keluarga  dan  latar belakang  etnis  sering  diasosiasikan dengan  peningkatan  insiden  kanker prostat  sebagai  predisposisi  genetik dan  herediter. [36] Pada  orang  Amerika berkulit putih,  terjadinya kanker  prostat dikaitkan  dengan  suatu  lokus  pada kromosom  1q24-q25,  sedangkan  pada laki-laki keturunan Afrika, varian onkogen  MYC  pada  kromosom  8q24 diduga  sebagai  penyebab  peningkatan insidens kanker prostat. [1] Mutasi sering mengakibatkan aktivasi PI3K/AKT signaling pathway yang bersifat onkogenik,  di  antaranya  ialah  mutasi yang  rnenginaktifkan  gen  supresor tumor  PTEN  ( Phosphatase and  Tensin Homolog deleted on  Chromosome 10 ), yang  bertindak  sebagai  penghambat pada  aktivitas  PI3K. [1,37] Perubahan struktural
lainnya yang telah
dikemukakan  dalam  kanker  prostat yaitu fusi  gen  ESRP1- RAF1 ( epithelial splicing regulatory protein-1-v-raf-1
murine leukemia viral oncogene
homolog-1 ),  ETS family, dan  RAF kinase. [27,38] Respon  imun  anti  tumor, terutama  sel  T  sitotoksik  atau  sel  T CD8 + memediasi eliminasi sel kanker
sehingga  sel  kanker  tidak  dapat berkembang dan bermetastasis. [39] Pada  kanker  prostat tingkat lanjut, PD- 1 pathway dan  ligannya  yaitu  PD-L1 muncul  sebagai  mekanisme  toleransi imun  yang  menyebabkan  sel  tumor dapat  menekan antitumor  dengan cara menghambat fungsi efektor dan mengurangi  efektivitas  sel  T(Lihat gambar  1). [40,41] ositif  PD-L1  sering dikaitkan  dengan  peningkatan  risiko metastasis dan rekurensi. [42,43]
Gambar 1. Blokade PD-1 / PD-L1 meningkatkan regresi dan rejeksi tumor dengan mengaktifkan sel T. (Kiri) Ketika jalur PD-1/PD-L1 aktif, maka akan meningkatkan progresivitas sel kanker melalui sinyal antiapoptotik yang dimediasi PD-L1 dan menghambat jalur pensinyalan yang mengaktivasi sel T (sel yang mengenali antigen tumor). Peristiwa ini menyebabkan rusaknya efektor T dan sel-sel memori serta diferensiasi sel TEX dan TReg, yang menyebabkan  toleransi terhadap sel kanker.
(Kanan) Berbeda dengan gangguan pensinyalan T- cell receptor ( TCR ) yang disebabkan oleh PD-1, blokade PD-1 / PD-L1 meningkatkan kapasitas sel T dengan cara mengaktivasi jalur PI3K/Akt atau Ras/MAPK, menyebabkan diferensiasi sel T efektor dan memori serta supresi dari diferensiasi TEX dan Treg [44]
3.2 Chimeric Antigen Receptor  T Cell (CAR-T Cell) Terapi Chimeric antigen receptor (CAR-T)  telah  mendapatkan perhatian  besar  karena  keunggulan sel-sel  CAR-T dalam pengobatan tumor dan  telah  mendapat  pengakuan  besar atas hasil terapinya. [22] Chimeric antigen receptor (CAR-T)  merupakan  metode transfer  sel  T  yang  direkayasa  secara genetika dengan mengekspresikan Chimeric  Antigen  Receptor (CAR). [45]
Sel  T  yang  telah  direkayasa  secara  ex vivo  nantinya  akan diarahkan terhadap antigen spesifik pada sel tumor. [46] CAR sebagai reseptor sintetis menggunakan single-chain  variable  fragment  (scFv) dalam  penargetan  antigen  permukaan sel. [47] Fragmen  scFv  sendiri  berperan sebagai tumor-associated antigens
receptor (TAAs)  atau  reseptor  antigen yang  diekspresikan  oleh  sel-sel  tumor.
Selain fragmen scFv, terdapat beberapa komponen lain  yang menjadi bagian reseptor CAR dalam sel T, yaitu domain transmembran dan immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs) yang merupakan  bagian  intraseluler. [48,49]
Zona  transmembran  terdiri  dari  CD3, CD8,  CD28,  atau  Fc εRI  dan  dapat memperbaiki scFv pada permukaan sel T  dan  mentransduksi  sinyal  ke  dalam sel.  Zona  transduksi  sinyal  intraseluler terdiri dari CD8, CD28, atau CD137 dan CD3 ζ,  yang  berisi immunoreceptor tyrosine-based activation
motifs (ITAMs). [22]
3.3 Peran Prostate-specific membrane
antigen (PSMA) sebagai Target CAR-T Cell Dalam pengembangan terapi
CAR-T  cell dibutuhkan  pengenalan tentang  reseptor  antigen  tumor  atau tumor-  associated  antigens  receptor (TAAs).  Antigen  yang  terkait  dengan kanker prostat dapat berupa protein yang ada pada  sel  prostat. Contohnya adalah prostate-specific antigen (PSA), prostate- specific membrane antigen (PSMA),  dan prostate  stem  cell  antigen (PSCA). [50]
Antigen  terkait  tumor  yang  paling  umum digunakan  untuk  kanker  prostat  terapi CAR-T cell adalah PSMA. [22] Pada dua uji klinis  fase  1,    terapi CAR-T  cell dengan target PSMA dinilai aman. [51,52]
Prostate-Specific Membrane
Antigen (PSMA) memiliki berbagai nama lain, seperti glutamat  karboksipeptidase II (GCP II), N-asetil-L-aspartil-L-glutamat peptidase  I  (NAALA  Dase  I),  atau  folat hidrolase,  yaitu  100-kD  glikoprotein transmembran  tipe  II  golongan  M28 peptidase. Protein PSMA memiliki glutamat carboxypeptidase aktif berperan untuk mengkatalisis neuropeptida N-asetil-L-aspartil-L- glutamat (NAAG) menjadi N- asetillaspartat (NAA) dan glutamate. [53] Beberapa  molekul  protein  dan glikoprotein diekspresikan pada jaringan kanker prostat, yang berfungsi sebagai  target  untuk CAR-T  Cell telah dijelaskan sebelumnya, seperti prostate-specific antigen (PSA),
prostate-specific  membrane  antigen (PSMA), dan prostate stem cell antigen (PSCA).  Reseptor  CAR-  T  Cell  dapat membaca  frame  protein,  transient receptor potential-p8, dan enam transmembrane epithelial  antigen pada sel prostat. [54] Prostate-specific membrane
antigen (PSMA)  merupakan salah  satu protein  transmembran  yang  dapat dikenali  oleh CAR-T  Cell .  Ekspresi PSMA rendah pada sel ovarium dan sel payudara,  tetapi  tinggi  dalam  jaringan prostat. [22,55] Antigen  ini  diekspresikan pada  permukaan  sel  pada  jaringan prostat  normal  dan diekspresikan berlebih  pada  kanker  prostat.  Ekspresi PSMA akan semakin meningkat sebanding  dengan  tingkat  keparahan tumor. Prostate-Specific  Membrane Antigen (PSMA)  diakui  sebagai  target pada  kanker  prostat  sekitar  3  dekade lalu  ketika  antibodi  pertama  pada domain intraseluler dikembangkan. [56]

## 3.4  Mekanisme  terapi  CAR-T  Cell sebagai antitumor
Sel-sel  CAR-T  dapat  secara khusus mengenali antigen tumor dengan cara MHC-independen. Setelah CAR  secara  spesifik  berikatan  dengan TAA,  sel  T  akan  diaktifkan  melalui fosforilasi immune receptor  tyrosine- based  activation  motifs (ITAM)  diikuti oleh peningkatan sitokin (termasuk IL-2, IL-4,  IFN- γ,  IL-12,  dan  TNF)  sekresi, proliferasi sel T, dan sitotoksisitas. IL-12 dapat  memperkuat  fungsi  sel  imun bawaan  seperti  sel  NK  dan  makrofag. Sel T dan CAR-T yang teraktivasi
melakukan  sitotoksisitas,  terdapat  2 jalur, yaitu sekresi granula perforin dan granzyme,  serta  melalui  jalur  aktivasi reseptor  sinyal  yang  menginduksi kematian  sel  melalui  Fas/Fas-L  (Lihat gambar 2). [47] Sel T  yang termodifikasi CD40L mampu memberikan efek dengan meningkatkan  proliferasi  dan  sekresi sitokin  Th1  proinflamasi,  termasuk  IL-2, IFN- γ,  IL-12,  dan  TNF.  IL-12  berperan dalam  peningkatan  aktivasi  sel  T sitotoksik. [57] IFN- γ  yang  disekresikan oleh sel  CAR-T  juga  berkontribusi pada penghancuran  sel  tumor. [55] Selain  itu,
CD28  dijadikan  sebagai  co-stimulator dalam terapi CAR-T anti-PSMA generasi kedua  yang  diuji  pada  tikus,  memiliki peran  sangat  penting  untuk  sekresi sitokin spesifik antigen dan proliferasi sel T.  Sel-  sel  CAR-T  generasi  kedua menunjukkan  efek  merusak  sel  target yang  lebih  baik  daripada  generasi sebelumnya  dan  mewakili  pendekatan target  imun  baru  untuk  mPCa. [22,55] Efeknya, volume tumor menurun secara signifikan  (berkurang  setelah  3  minggu) pada  tikus  yang  diinokulasi  dengan  sel CAR-T anti-PSMA . [55,58]
Gambar 2, Mekanisme CAR-T Cell sebagai anti-tumor [50]
3.5 Prinsip dan Mekanisme Kerja CRISPR/Cas9 Rekayasa genetik adalah teknologi yang sangat dibutuhkan dalam penelitian  biologi  dan  aplikasi  biomedis. Rekayasa  genetik  memungkinkan  kita untuK  mengubah sekuens  genetik sesuka  hati  untuk  mengatur  informasi genetik fundamental dalam sel.
Rekayasa  ini  telah  diimplementasikan untuk  studi  fungsi  gen  atau  genetika penyakit  pada  manusia,  dan  juga  telah digunakan  dalam  terapi  gen  untuk memperbaiki  perubahan  genetik  yang merugikan dan dapat memberi manfaat. [59]
Prinsip  dasar  untuk  proses  ini dapat  dibagi  menjadi  dua  langkah. Langkah  pertama  adalah  pengenalan DNA cleavage yang  ditargetkan,  dalam
bentuk double strand breaks (DSBs) atau single  strand  nicks (SSNs),  melalui aktivitas nucleases atau nickases . Langkah  kedua  melibatkan  proses  DNA repair yang diaktifkan oleh cleavage yang ditargetkan,  yang dilakukan  secara normal  oleh endogenous  DNA  damage repair machinery di dalam sel. [59]
Metode rekayasa genetik terbaru yang  digunakan  sebagai  terapi  gen adalah Clustered  regularly  interspaced short palindromic repeats (CRISPR) dan CRISPR- assosiated  protein  9 (Cas9), yang  merupakan  sistem  pertahanan pada bakteri S. pyogen dan telah terbukti bisa  diterapkan  pada  sel  manusia. [60] CRISPR  mengacu  pada sequences dalam genom bakteri. Sedangkan CRISPR-assosiated  protein  9 (Cas9) adalah  endonuklease  yang  memotong
kedua  untai  DNA . Cas9  diarahkan menuju  target  pada  DNA  oleh  bagian RNA.  RNA  ini  dapat  disintesis  sebagai untai  tunggal  yang  disebut synthetic single guide RNA  (sgRNA); bagian RNA yang  berikatan  dengan  DNA  genomik yang  tersusun  dari  18-20  nukleotida. Untuk  memotong,  urutan  DNA  spesifik harus terletak pada ujung 3' dari sgRNA, ini  disebut protospacer  adjacent  motif (PAM). [61] Proses perbaikan setelah
pemotongan  DNA  dapat  terjadi  melalui dua  jalur,  yaitu non-homologous  end joining (NHEJ),  biasanya  mengarah  ke penyisipan/penghapusan  bagian  DNA, dan  yang  kedua  adalah homology directed repair (HDR), di mana sepotong DNA homolog digunakan sebagai template perbaikan. [61] Kelebihan mekanisme  perbaikan  DNA  endogen seluler NHEJ dibanding dengan mekanisme  endogen  seluler  lainnya seperti Homology dorected repair (HDR) yang  memperlukan template rantai  DNA untuk  melakukan perbaikan DNA adalah NHEJ  bisa  memperbaiki  DNA  melalui mutasi  ketika  sel  sedang  dalam  fase membelah ataupun ketika sel dalam fase tidak membelah serta efektivitasnya yang lebih  tinggi.  Sedangkan  HDR  hanya mampu memperbaiki DNA yang
terpotong  ketika  sel  sedang  dalam  fase pembelahan G2 atau S. [62]
3.6  Potensi  CAR-T  Cell  Termodifikasi CRISPR/Cas9
Sistem  imun  memainkan  peran penting  dalam  perkembangan  kanker.
Dalam keadaan normal, sistem kekebalan tubuh dapat mengenali, mengontrol,  dan  bahkan  menghilangkan tumor.  Sel  CD8+ adalah sel imun utama yang bertanggung jawab untuk membunuh  sel  tumor.  Salah  satu mekanisme  yang  digunakan  oleh  tumor adalah meningkatkan regulasi dari Programmed  Death-Ligand 1  (PD-L1), yang telah diidentifikasi sebagai indikator prognosis  buruk  pada  beberapa  jenis tumor. [64]
Sel CD8+ mengekspresikan programmed  cell  death  protein 1  (PD- 1) pada  permukaannya, sedangkan  PD- L1  diekspresikan  oleh  sebagian  besar jenis sel, termasuk juga sel tumor. Ikatan PD-1  dengan  PD-L1  memainkan  peran penting  dalam  sistem  kekebalan  untuk menjaga  toleransi  imun  dan  respons
imun fisiologis yang seimbang. sel tumor dapat  memanfaatkan  jalur  PD-1/PD-L1 untuk  melemahkan  aktivitas  sel  CD8+. PD-1  ketika  berikatan  dengan  pada ligannya  PD-L1,  menghasilkan inhibitory signals untuk  menekan  aktivitas  Sel CD8+. [64] Begitu pula dengan CAR-T cell yang  menunjukkan  penurunan  fungsi untuk terapi tumor sebagian karena efek supresif  diakibatkan  oleh  ekspresi  PD-1 mereka  sendiri.  Penurunan  fungsi  ini termasuk penurunan kemampuan sitotoksik  dan  sekresi  sitokin CAR-T Cell. [63] Untungnya,  downregulasi  yang diinduksi oleh tumor untuk fungsi CAR-T Cell dapat dituntaskan dengan menggunakan blokade PD-1 yang dapat mempertahankan  aktivasi CAR-T  Cell sebagai terapi tumor. [65] Oleh karena itu, kombinasi CAR-T Cell dan PD-1 inhibitor dapat  meningkatkan  kontrol  tumor  dan kelangsungan hidup. [64] Salah  satu metode  yang  digunakan  untuk  blokade PD-1  adalah  dengan  metode  lentivirus CRISPR/Cas9. Gambar 3 menjelaskan protokol  skematik  produksi  lentivirus CRISPR/Cas9. Untuk produksi lentivirus  CRISPR/Cas9, non-targeting guide  RNA  sequence dan  tiga PD-1
guide RNA sequences dirancang menggunakan program online http://crispr.mit.edu. PD-1  guide  RNA sequence PD-1sg-1: aggcgccctggccagtcgtc, PD-1sg-2: cgtctgggcggtgctacaac, PD-1sg-3: ctacaactgggctggcggcc dan non-
targeting control RNA sequence : atcgtttccgctcg.  Lentivirus  diproduksi menggunakan co- transfecting sel 293T dengan  kemasan  vektor  ps-PAX2, envelope  vektor pCL-  VSVG  dan masing-masing  vektor  LentiCrispr  V2. 24  jam  setelah  transfeksi, media  kultur diubah  menjadi  RPMI  disuplementasi dengan  10%  FBS.  Lentivirus  dalam supernatant dikumpulkan 72 jam setelah  transfeksi  dan  disaring  melalui 0,45 μm syringe filter. [64]
Gambar 3. Protokol skematik untuk modifikasi kombinasi gen CRISPR dan transduksi lentiviral pada sel CD8+ manusia. [24] Hasil dari CAR-T Cell termodifikasi CRISPR/Cas9 untuk blokade  PD-1  menunjukkan  hasil  yang baik pada uji in vitro maupun uji in vivo . CAR-T Cell termodifikasi CRISPR/Cas9
menunjukkan  peningkatan  degranulasi CAR-T Cell pada uji in vitro
dibandingkan dengan CAR-T  Cell tanpa modifikasi (Lihat gambar 4). Pada uji in  vivo,  CAR-T  Cell termodifikasi CRISPR/Cas9  meningkatkan clearance tumor  dengan  signifikan  (Lihat  gambar 5). [24]
Gambar 4. Blokade PD-1 pada CD8+ anti-CD19 CAR-T Cell ( ΔPD-1) menunjukkan degranulasi yang lebih besar dibandingkan dengan kontrol CD8+ CAR-T Cell. [24]
Gambar 5. CAR-T Cell termodifikasi CRISPR/Cas9 -mediated anti PD-1 meningkatkan fungsi sel anti-CD19 CAR-T Cell dan meningkatkan clearance tumor in vivo. [24]
4. SIMPULAN Banyak peneliti telah melakukan  uji  coba  pada  metode  dan mekanisme terapi kanker prostat. Salah satu  metode  yang  paling  mutakhir adalah terapi CAR-T Cell dengan target PSMA termodifikasi CRISPR/Cas9 yang dapat secara langsung menargetkan sel kanker  prostat.  Disrupsi  PD-1  pada CAR-T  Cell menggunakan  metode CRISPR/Cas9  menunjukkan  efek  yang signifikan terhadap peningkatan degranulasi CAR-T  Cell dan clearance tumor. Oleh karena itu, metode terapi ini berpotensi  sebagai  inovasi  terapi  yang efektif,  efisien,  dan  dapat  menjadi modalitas terapi pada kanker prostat.

## 5. SARAN
Untuk  penelitian  selanjutnya, diperlukan  penelitian mengenai  jumlah dosis CAR-T Cell termodifikasi CRISPR/Cas9- mediated anti PD-1 yang harus diinjeksi, efek sampingnya,
efektivitas pada manusia, serta penggunaan  terapi  ini  pada  penyakit lainnya.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Kumar  V,  Abbas  AK,  Aster  JC. Robbins  Basic  Pathology.  Ninth Edit.  Philadelphia,  Pennsylvania: Elsevier; 1390. 668 p.
2. Mottet  N,  Bellmunt  J,  Briers  E, Bergh  RCN  van  den,  Bolla  M, Casteren  NJ van, et al. Guidelines on  Prostate  Cancer  [Internet].
European Association  of  Urology. 2015.  31-45  p.  Available  from: http://www.uroweb.org/fileadmin/tx _eauguidelines/2005/Pocket/Prost ate_ Cancer.pdf
3. Castillejos-molina  RA,  Gabilondo-
navarro  FB.  Prostate  Cancer. Salud Publica Mex. 2016;58(2):279 –84.
4.   Baade  PD,  Youlden  DR,  Cramb SM,  Dunn J, Gardiner RA. Epidemiology of prostate cancer in the Asia-Pacific region. Prostate Int [Internet]. 2013;1(2):47 –58. Available from: http://dx.doi.org/10.12954/PI.1201 4 5.   Crawford  ED,  Petrylak  D,  Sartor O.Navigating the evolving therapeutic landscape in advanced prostate cancer. Urol Oncol Semin Orig Investig [Internet]. 2017;35(01):1 –10.  Available  from: http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc. 2017.01.020 6.   Lawrenti  H. Perkembangan  Terapi Kanker Prostat. CKD. 2019;46(8):521 –8. 7. Ferlay J, Colombet M, Soerjomataram  I,  Mathers  C, Parkin  DM,  Piñeros  M,  et  al. Estimating the global cancer incidence  and  mortality  in  2018: GLOBOCAN sources and
methods.  Int  J  Cancer  [Internet].
2019;144(8):1941 –53.    Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubm ed/30350310
8. The  Global  Cancer  Observatory G.  Prostate  2018.  World  Health Organization. 2019.
9.  Rawla P. Descriptive Epidemiology of Prostate Cancer. World J Oncol. 2019;10(2):63 –89.
10.   International  Agency  for  Research on Cancer. Cancer Tomorrow.
World Health Organization (WHO). 2019. 11.  Kementerian  Kesehatan  Republik Indonesia. Panduan Penatalaksanaan  Kanker  Prostat. Komite  Penanggulangan  Kanker Nasional. 2015. 47 p. 12.  Kementerian  Kesehatan  Republik Indonesia. Keputusan Menteri Kesehatan RI Nomor Hk.01.07/Menkes/291/2018 Tentang Pedoman Nasional Pelayanan Kedokteran Tata Laksana  Kanker  Prostat  [Internet]. Komite  Penanggulangan  Kanker Nasional.  Jakarta;  2018.  9-42  p. Available from: http://kanker.kemkes.go.id/guidelin es/PNPKProstat.pdf 13.  Krstev S, Knutsson A. Occupational Risk Factors for Prostate Cancer: A Meta-analysis. J  Cancer  Prev . 2019;24(2):91 ‐ 111. doi:10.15430/JCP.2019.24.2.91 14.   Silva JF, Mattos IE, Luz LL, Carmo CN,  Aydos  RD.  Exposure  to pesticides  and  prostate  cancer: systematic  review  of  the  literature. Rev Environ Health . 2016;31(3):311 ‐ 327. doi:10.1515/reveh-2016-0001 15.   Kachuri L, Harris MA, MacLeod JS, Tjepkema  M,  Peters  PA,  Demers
PA.  Cancer  risks  in  a  population- based  study  of  70,570  agricultural workers: results from the Canadian census  health  and  Environment cohort  (CanCHEC). BMC  Cancer . 2017;17(1):343.  Published  2017 May  19.  doi:10.1186/s12885-017- 3346-x
16.   Miller KD, Nogueira L, Mariotto AB, Rowland  JH,  Yabroff  KR,  Alfano CM,  et  al.  Cancer  treatment  and survivorship statistics, 2019. CA: A Cancer  Journal  for  Clinicians. 2019Nov;69(5):363 –85.
17.  Teo  MY,  Rathkopf  DE,  Kantoff  P.
Treatment  of  Advanced  Prostate Cancer. Annu Rev Med . 2019;70:479 ‐ 499. doi:10.1146/annurev-med-051517- 011947 18.   Perdana  NR,  Mochtar  CA,  Umbas HR, Hamid ARAH. The Risk Factors of Prostate Cancer and Its Prevention. Acta medica Indonesiana. 2016 Jul 1;48(3):228-238. 19.  Gamat  M,  McNeel  DG.  Androgen deprivation and immunotherapy for the  treatment  of  prostate  cancer. Endocr Relat Cancer . 2017;24(12):T297 ‐ T310. doi:10.1530/ERC-17-0145 20.  Bilusic  M,  Madan  RA,  Gulley  JL. Immunotherapy of Prostate Cancer:  Facts  and  Hopes. Clin Cancer  Res .  2017;23(22):6764 ‐ 6770. doi:10.1158/1078- 0432.CCR-17-001921. Sountoulides P, Rountos T. Adverse effects of androgen deprivation  therapy  for  prostate cancer: prevention and management. ISRN Urol . 2013;2013:240108. Published 2013 Jul 25. doi:10.1155/2013/240108 22.   Yu H, Pan J, Guo Z, Yang C, Mao
L.  CART  cell  therapy  for  prostate cancer:  status  and  promise. Onco Targets  Ther .  2019;12:391 ‐ 395. Published 2019 Jan 3. doi:10.2147/OTT.S185556 23.   Sha HH, Wang DD, Yan DL, et al. Chimaeric  antigen  receptor  T-cell therapy for tumour immunotherapy. Biosci Rep . 2017;37(1):BSR20160332. Published 2017 Jan 27. doi:10.1042/BSR20160332
24.   Rupp LJ, Schumann K, Roybal KT, et  al.  CRISPR/Cas9-mediated PD- 1  disruption  enhances  anti-tumor efficacy of human chimeric antigen receptor T cells. Sci Rep . 2017;7(1):737.  Published 2017 Apr  7.  doi:10.1038/s41598-017-
00462-8
25.   Chen H,  Choi J,  Bailey S.  Cut  site selection  by  the  two  nuclease domains  of  the  Cas9  RNA-guided endonuclease. J Biol Chem . 2014;289(19):13284 ‐ 13294. doi:10.1074/jbc.M113.539726
26.   Fay  AP,  Antonarakis ES.  Blocking the  PD-1/PD-L1  axis  in  advanced prostate cancer: are  we  moving in the  right  direction?. Ann  Transl Med . 2019;7(Suppl 1):S7. doi:10.21037/atm.2019.01.37 27.  Wallis  CJD,  Nam  RK.  Prostate Cancer Genetics: A  Review. Ejifcc Int  Fed  Clin  Chem  Lab  Med [Internet]. 2015;26(2):79 –91. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubm ed/27683484%0Ahttp://www.pubm edcentral.nih.gov/articlerender.fcgi
?a rtid=PMC4975354.
28.   Ricke  EA,  Williams  K,  Lee  YF, Couto S, Wang Y, Hayward SW, et al.  Androgen  Hormone  Action  in Prostatic  Carcinogenesis:  Stromal Androgen Receptors Mediate Prostate Cancer Progression, Malignant Transformation and Metastasis. Carcinogenesis. 2012;33(7):1391 –8.
29.   Simoes GF, Sakuramoto P, Santos
CB dos, Furlan NKC, Augusto TM. An Overview on Prostate Pathophysiology: New Insights into Prostate Cancer Clinical Diagnosis.  In:  Pathophysiology- Altered Physiological States. Brazil:  IntechOpen;  2018.  p.  183 –
202. 30.   Ragin C,  Davis-Reyes B, Tadesse
H, Daniels D, Bunker CH, Jackson M,  et  al.  Farming,  Reported
Pesticide Use, and Prostate Cancer.  Am  J  Mens  Health. 2013;7(2):102 –9. 31.   Stopsack KH, Mucci LA, Antonarakis ES, Nelson PS, Kantoff PW. TMPRSS2 and COVID-19: Serendipity or opportunity for intervention?
Cancer  Discov  Am  Assoc  Cancer Res. 2020;10(1):1 –4.
32.   Baena  E,  Shao  Z,  Linn  DE,  Glass K,  Hamblen  MJ,  Fujiwara  Y,  et  al. ETV1 Directs Androgen Metabolism and Confers Aggressive  Prostate  Cancer  in Targeted Mice and Patients. Genes Dev. 2013;27(6):683 –98.
33.   Linn DE, Bronson RT, Li Z. Genetic Interaction Between Tmprss2-ERG Gene Fusion and Nkx3.1-loss does not Enhance Prostate Tumorigenesis  in  Mouse  Models. PLoS One. 2015;10(3):1 –12.
34.   St. John J, Powell K, Katie Conley- LaComb M, Chinni SR. TMPRSS2- ERG  Fusion  Gene  Expression  in Prostate  Tumor  Cells  and  Its Clinical and Biological Significance in  Prostate  Cancer  Progression.  J Cancer  Sci  Ther.  2012;4(4):94 – 101.
35.   Liu CY, Yu T, Huang Y, Cui L, Hong
W.  ETS  (E26  transformation- specific)  Up-regulation  of the
Transcriptional  co-Activator  TAZ Promotes Cell Migration and
Metastasis  in  Prostate  Cancer.  J Biol Chem. 2017;292(22):9420 –30. 36.   Mottet N, Bergh van den, Briers E, Cornford  P,  Grummet J,  Santis,  et al. EAU - EANM - ESTRO - ESUR -  SIOG  Guidelines  on  Prostate Cancer  2019  [Internet].  European Association  of Urology Guidelines 2019.  European  Association  of Urology;  2019.  1-161  p. Available from: https://uroweb.org/guideline/prosta t e-cancer 37.   Chen CY, Chen J, He L, Stiles BL.
PTEN:  Tumor  Suppressor  and Metabolic Regulator. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9(338):1 –12. 38.  Rubin  MA,  Maher  CA,  Chinnaiyan AM. Common Gene Rearrangements in Prostate Cancer. J Clin Oncol. 2011;29(27):3659 –68. 39.   Ness N, Andersen S, Khanehkenari MR,  Nordbakken  C
V.,  Valkov  A,  Paulsen  EE,  et  al. The  Prognostic  Role  of  Immune Checkpoint  Markers  Programmed Cell  Death  Protein  1  (PD-1)  and Programmed Death  Ligand 1  (PD- L1) in a Large, Multicenter Prostate
Cancer Cohort. Oncotarget.
2017;8(16):26789 –801.
40.   Tumeh  PC,  Harview  CL,  Yearley JH, Shintaku IP, Emma J, Taylor M,
et  al.  PD-1  Blockade  Induces Responses  by  Inhibiting  Adaptive Immune Resistance. Nature. 2015;515(7528):568 –71.
41.   Fay  AP,  Antonarakis ES.  Blocking the  PD-1/PD-L1  Axis  in  Advanced Prostate  Cancer.  Ann  Transl  Med. 2019;7:1 –4.
42.   Gevensleben H, Dietrich D, Golletz C, Steiner S, Jung M, Thiesler T, et al. The Immune Checkpoint Regulator PD-L1 is Highly
Expressed  in  Aggressive  Primary Prostate Cancer. Clin Cancer Res. 2016;22(8):1969 –77.
43.   Sharma  M,  Yang  Z,  Miyamoto  H, Lucarelli  G.  Immunohistochemistry of  Immune  Checkpoint  Markers PD-1  and  PD-L1  in  Prostate Cancer.  Med    (United    States).
2019;98(38):1 –6. 44.  Bardhan K, Anagnostou T, Boussiotis  VA.  The  PD1:  PD-L1/2 Pathway from Discovery to Clinical Implementation.  Front  Immunol.
2016;7(550):1 –17.
45.  Yeku  O,  Slovin  SF.  Immune Therapy  for  Prostate  Cancer. Cancer J . 2016;22(5):334 ‐ 341. doi:10.1097/PPO.0000000000000
223
46.   Sadelain M, Brentjens R, Rivière I.
The  basic  principles  of  chimeric antigen  receptor  design. Cancer Discov . 2013;3(4):388 ‐ 398. doi:10.1158/2159-8290.CD-12-
0548
47.   Benmebarek  MR,  Karches  CH,
Cadilha  BL,  Lesch  S,  Endres  S, Kobold  S.  Killing  Mechanisms  of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Int J Mol Sci . 2019;20(6):1283.  Published  2019 Mar 14. doi:10.3390/ijms20061283
48.   Magee MS, Snook AE. Challenges to chimeric antigen receptor (CAR)- T  cell  therapy  for  cancer. Discov Med . 2014;18(100):265 ‐ 271.
49.  Yu  S,  Li  A,  Liu  Q,  et  al.  Chimeric antigen  receptor  T  cells:  a  novel therapy for solid tumors. J Hematol Oncol .  2017;10(1):78.  Published 2017  Mar  29. doi:10.1186/s13045-
017-0444-9
50.   Westdorp  H,  Sköld  AE,  Snijer  BA, et  al.  Immunotherapy  for  prostate cancer:  lessons  from  responses to tumor-associated  antigens. Front Immunol .  2014;5:191.  Published 2014 May 6. doi:10.3389/fimmu.2014.00191 51.   Junghans RP, Ma Q, Rathore R, et al.  Phase  I  Trial  of  Anti-PSMA Designer  CAR-T  Cells  in  Prostate Cancer: Possible Role for Interacting  Interleukin  2-T  Cell Pharmacodynamics as a Determinant  of  Clinical  Response. Prostate.  2016;76(14):1257-1270.
doi:10.1002/pros.23214 52.   Slovin  SF,  Wang  X,  Hullings  M, Arauz  G,  Bartido  S,  Lewis  JS, Schöder H, Zanzonico P, Scher HI, Sadelain M, et al. Chimeric antigen receptor  (CAR+)  modified  T  cells targeting prostate-specific membrane  antigen  (PSMA)  in patients (pts) with castrate metastatic prostate cancer (CMPC).  J.  Clin.  Oncol.  2013;31. doi: 10.1200/jco.2013.31.6_suppl.72 53.   Diao W, Cai H, Chen L, Jin X, Liao
X,  Jia  Z.  Recent  Advances  in
Prostate-Specific Membrane Antigen-Based Radiopharmaceuticals. Curr  Top Med Chem . 2019;19(1):33 ‐ 56. doi:10.2174/15680266196661902
01100739 54.   Ullah K, Addai Peprah F, Yu F, Shi
H.  The  application  of  prostate specific  membrane  antigen  in CART-cell therapy for treatment of prostate carcinoma (Review). Oncol Rep . 2018;40(6):3136 ‐ 3143. doi:10.3892/or.2018.6758 55.   Schepisi, G., Cursano, M.C., Casadei,  C. et  al. CAR-T  cell therapy:  a  potential  new  strategy against prostate cancer. j. immunotherapy  cancer  7, 258 (2019).
https://doi.org/10.1186/s40425- 019-0741-7 56.  Hofman  MS,  Hicks  RJ,  Maurer  T, Eiber M. Prostate-specific Membrane  Antigen  PET:  Clinical Utility  in Prostate  Cancer,  Normal Patterns,  Pearls,  and  Pitfalls. Radiographics . 2018;38(1):200 ‐ 217. doi:10.1148/rg.2018170108
57.   Textor  A,  Listopad  JJ,  Wuhrmann LL,  Perez  C,  Kruschinski  A,
Chmielewski  M,  et  al.  Efficacy  of CAR T-cell therapy in large tumors relies  upon  stromal  targeting  by IFNgamma. Cancer Res.
2014;74(23):6796 –805
58.   Zhang Q, Helfand BT, Carneiro BA, et  al.  Efficacy  Against  Human Prostate  Cancer  by  Prostate- specific Membrane Antigen- specific, Transforming Growth
Factor- β  Insensitive  Genetically Targeted  CD8 + T-cells  Derived from  Patients  with Metastatic
Castrate-  resistant  Disease. Eur Urol . 2018;73(5):648 ‐ 652. doi:10.1016/j.eururo.2017.12.008 59.  Cong  L,  Zhang  F.  Genome engineering  using  CRISPR-Cas9 system. Methods Mol Biol .
2015;1239:197 ‐ 217. doi:10.1007/978-1-4939-1862- 1_10 60.  Rodríguez-Rodríguez DR, Ramírez-Solís  R,  Garza-Elizondo MA, Garza-Rodríguez ML, Barrera-
Saldaña  HA.  Genome  editing:  A perspective  on  the  application  of CRISPR/Cas9  to  study  human diseases  (Review). Int  J  Mol  Med . 2019;43(4):1559 ‐ 1574.
doi:10.3892/ijmm.2019.4112
61.   Redman M, King A, Watson C, King
D.  What  is  CRISPR/Cas9?. Arch Dis Child Educ Pract Ed . 2016;101(4):213 ‐ 215. doi:10.1136/archdischild-2016-
310459
62.   Ryu SM, Hur JW, Kim K. Evolution of CRISPR  towards  accurate  and efficient mammal genome engineering. BMB Rep . 2019;52(8):475 ‐ 481. doi:10.5483/BMBRep.2019.52.8.1 49 63.   Hu  W,  Zi  Z,  Jin  Y,  et  al. CRISPR/Cas9-mediated PD-1 disruption enhances human
mesothelin-targeted  CAR  T  cell effector functions. Cancer Immunol Immunother .  2019;68(3):365 ‐ 377. doi:10.1007/s00262-018-2281-2 64.  Zhao  Z,  Shi  L,  Zhang  W,  et  al. CRISPR knock out of programmed cell death protein 1 enhances anti- tumor  activity  of  cytotoxic  T
lymphocytes. Oncotarget . 2017;9(4):5208 ‐ 5215. Published
2017 Dec 27. doi:10.18632/oncotarget.23730 65.  Guo  X,  Jiang  H,  Shi  B,  et  al.
Disruption  of  PD-1  Enhanced  the Anti-tumor  Activity  of  Chimeric Antigen  Receptor  T  Cells  Against Hepatocellular  Carcinoma. Front Pharmacol . 2018;9:1118. Published 2018 Oct 1.
doi:10.3389/fphar.2018.01118