## Penapisan dan Identifikasi Bakteri Penghasil Enzim Xilanase pada Peuyeum Singkong dengan Metode Penanda Gen 16S rRNA

## Screening and Identification of Xylanase Enzyme-Producing Bacteria in Peuyeum Cassava with 16S rRNA Gene Marker method
Fenti Fatmawati * , Muhammad Nur Abdillah, Astri Fatmasari, dan Yuni Dwi Mulyaningsih Departemen Farmasi, Sekolah Tinggi Farmasi Bandung, Indonesia Telp / fax : +6222- 7830760 *E-mail: fenti.fatmawati@stfb.ac.id
DOI: https://doi.org/10.26874/jkk.v2i1.22
Received : 24 April 2019, Revised : 22 May 2019, Accepted : 23 May 2019, O nline : 31 May 2019

## Abstrak
Peuyeum merupakan sumber karbohidrat dan merupakan komoditas pertanian yang banyak ditanam di Indonesia.  Jenis-jenis  polisakarida  yang  menyusun  singkong  adalah  pati,  selulosa  dan  hemiselulosa dalam bentuk xilan. Xilanase adalah enzim xilanolitik yang dapat menghidrolisis xilan. Bakteri yang memproduksi  enzim  xilanase  telah  diisolasi  dari  peuyeum  yang  diduga  mempengaruhi  proses fermentasi.  Peuyeum  mengandung  amilum  sehingga  merupakan  salah  satu  sumber  enzim  amilase. Namun belum pernah dilakukan penelitian mengenai skrining enzim xilanase dari peuyeum ini. Tujuan dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mengisolasi  bakteri  penghasil  xilanase  pada  peuyeum  dan mengidentifikasi spesies bakteri ini dengan menganalisis gen 16S rRNA sehingga dapat menjadi sumber baru dalam pencarian enzim. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap yaitu isolasi bakteri, penapisan enzim  xilanase,  pengujian  morfologi,  isolasi  DNA  bakteri,  sekuensing,  identifikasi  bakteri  dengan metode  pohon  filogenetik.  Bakteri  penghasil  enzim  xilanase  di  peuyeum  telah  berhasil  diisolasi. Berdasarkan hasil analisis pohon filogenetik ditemukan bahwa bakteri XF1 memiliki homologi terdekat dengan Bacillus cereus dengan kemiripan 99,84%.
Kata kunci: Bacillus cereus , Filogenetik, Peuyeum, PCR, Xilanase.

## Abstract
Peuyeum comes from cassava which is an agricultural commodity that is widely grown in Indonesia as a food which is source of carbohydrates. The types of polysaccharides that compose cassava are starch, cellulose and hemicellulose in the form of xylan. Xylanase is a xylanolytic enzyme that can hydrolyze xylan. The bacteria producing xylanase enzyme has been isolated from peuyeum which is thought to affect the fermentation process. Peuyeum contains starch so that it is one of the sources of the amylase enzyme. But there has never been a study of peuyeum's xylanase enzyme screening. The purpose of this study was to isolate xylanase-producing bacteria on peuyeum and identify these bacterial species by analyzing the 16S rRNA gene so that it could become a new source in the search for enzymes. This study consisted  of  several  stages,  namely  bacterial  isolation,  xylanase  enzyme  screening,  morphological testing, bacterial DNA isolation, sequencing, bacterial identifikation with the phylogenetic tree method. Xylanase enzyme producing bacteria in peuyeum has been successfully isolated. Based on the results of phylogenetic tree analysis it was found that XF1 bacteria had the closest homology to Bacillus cereus with 99% similarity.
Keywords: Bacillus cereus, Phylogenetic, Peuyeum, PCR, Xilanase
1 Pendahuluan
Singkong  adalah  komoditas  pertanian  yang banyak  ditanam  di  Indonesia  sebagai  sumber karbohidrat.  Jenis-jenis  polisakarida  penyusun singkong diantaranya pati, selulosa dan hemiselulosa  dalam  bentuk  xilan.  Salah  satu makanan  olahan  dari  singkong  yang  berasal  dari Jawa  Barat  adalah  Peuyeum.  Peuyeum  adalah makanan  yang  difermentasi  dari  konsorsium mikroba. Konsorsium mikroba di peuyeum terdiri dari jamur amilolitik, ragi dan bakteri [1].
Peuyeum  memiliki  aroma,  rasa  dan  tekstur lembut yang khas. Salah satu yang mempengaruhi kualitas  peuyeum  adalah  mikroorganisme  pada starter  yang  digunakan  dalam  proses  fermentasi [2]. Selama proses fermentasi peuyeum, mikroorganisme  yang  ada  akan  memetabolisme senyawa  nutrisi  dalam  singkong.  Secara  umum, jamur  akan  menghidrolisis  pati  menjadi  gula sederhana  yang  kemudian  akan  difermentasi menjadi alkohol dan komponen rasa lainnya oleh ragi  [3].  Peuyeum  mengandung  3%  alkohol, 40,2%  karbohidrat  dan  pH  sekitar  4,38  -  4,75. Ragi  yang  biasa  ditemukan  dalam  konsorsium adalah Sacharomyces  cereviceae sedangkan bakteri  yang  biasanya  ditemukan  di  peuyeum adalah jenis bakteri asam laktat.
Peuyeum  yang  terbuat  dari  singkong mengandung  pati  dan  juga  xilan.  Sampai sekarang,  ada  banyak  penelitian  tentang  enzim amilase  karena  peuyeum  mengandung  pati. Amilase  dalam  peuyeum  berperan  dalam memecah  pati  yang  ditemukan  dalam  singkong menjadi gula sederhana oleh karena itu peuyeum memiliki rasa yang manis. Sampai saat ini belum ada penelitian mengenai penapisan enzim xilanase dari peuyeum singkong. Xilanase sangat bermanfaat  dan  banyak  diaplikasikan  dalam industri.    Dalam  industri  kertas  xilanase digunakan  sebagai agen pemutih karena enzim ini berguna  dalam  menghilangkan  hemiselulosa dalam  proses  pemutihan.  Enzim  ini  adalah pengganti  metode  kimia  sehingga  polusi  racun limbah  kimia  akan  dihindari  dan  lebih  murah. Xilanase  juga  berperan  dalam  meningkatkan kandungan nutrisi pakan ternak dimana seringkali ditambahkan  sebagai  campuran  pakan  untuk meningkatkan  pertambahan  bobot  ayam  broiler dan  efisiensi  konversi  pakan.  Selain  itu  xilanase dalam  industri  makanan,  banyak  digunakan sebagai pemurni jus, untuk meningkatkan volume roti.  Xilanase  juga  dapat  digunakan  untuk menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi gula xilosa.  Gula  xilosa  banyak  digunakan  untuk konsumsi penderita diabetes [4].
Adapun  tujuan  dari  penelitian  ini  adalah untuk mengisolasi bakteri penghasil xilanase dari peuyeum singkong dan kemudian mengidentifikasi  bakteri  penghasil  xilanase tersebut. Hal ini sangat penting untuk memberikan informasi  dalam  mencari  sumber  alternatif  baru enzim yang banyak digunakan dalam industri.

## 2 Metode Penelitian

## 2.1. Bahan dan Alat
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah gelas kimia, gelas ukur, labu Erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, mikrotube, pipet mikro Eppendorf,  tip  pipet  mikro  berbagai  ukuran, autoklav, waterbath ( Memmert WNB45) , inkubator  (Memmert  UNB400), microcentrifuge (BOECO  M24A),  alat  PCR  (c-100  Thermal Cycler BIORAD), alat elektroforesis.  Bahan yang digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  peuyeum, Luria  Bertani,  Xilan,  kongo  merah,  NaOCl, NaOH,  Aquades,  HCl,  TRIsure,  96%  Etanol, Sodium  sitrat,  Alkohol  70%,  NaOH,  EDTA, primer
BactF
(5’- AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3’) dan
Uni  B1  (5’-GGTTAC(G/C)TTGTTACGACTT- 3’),  Gel  agarosa,  TAE  Buffer, loading  dye ,  KI, kristal ungu, Fuschin.

## 2.2. Isolasi Bakteri
Sampel peuyeum diambil dari peuyeum yang matang  dan  siap  dikonsumsi.  Isolasi  bakteri dilakukan dengan teknik E.R Sanders [5]. Bakteri ditumbuhkan  pada  suhu  37 o C  selama  16  jam dalam media Luria bertani.

## 2.3. Penapisan Xilanase
Koloni  tunggal  yang  diperoleh  dari  hasil isolasi bakteri pada peuyeum ditanam kembali ke media  LB  baru.  Sebuah  koloni  tunggal  yang diperoleh  dari  media  baru  kemudian  ditanam kembali  di  media  spesifik  (Luria  Bertani  dan xilan) lalu diinkubasi pada suhu 37 °C selama 16 jam.  Tahap ini  dilakukan  untuk  mengidentifikasi bakteri  penghasil  xilanase.  Bakteri  xilanolitik dapat  diidentifikasi  dengan  melihat  zona  bening setelah penambahan kongo merah [6].

## 2.4. Penentuan Morfologi Bakteri
Bakteri yang teridentifikasi memiliki aktivitas  xilanolitik  lalu  dianalisis  morfologinya dengan  teknik  pewarnaan  Gram  menggunakan mikroskop Olympus pembesaran 100 kali [7].

## 2.5. Isolasi DNA bakteri
Bakteri  yang  memiliki  aktivitas  xilanolitik disolasi  DNA  kromosomnya.  Tahap  awal  yang dilakukan  adalah  menambahkan  reagen  TRIsure pada  koloni  bakteri.  Setelah  didiamkan  selama  5 menit lalu ditambahkan kloroform dan diinkubasi selama  3  menit.  Tahap  selanjutnya  adalah sentrifugasi  pada  12.000  rpm  selama  15  menit pada  4ºC.  Etanol  ditambahkan  pada  pellet kemudian dihomogenisasi  dan diinkubasi selama 3  menit.  Sentrifugasi  dilakukan  kembali  pada 2000  rpm  selama  5  menit  pada  4ºC.    Pellet ditambahkan  dengan  200  μg  natrium  sitrat  lalu ditambahkan  etanol  dan  disentrifugasi  kembali. Pellet  diambil  dan  dikeringan  selama  15  menit. Lalu  NaOH  ditambahkan  dan  disentrifugasi. Supernatan  diambil  dan  500  μg  ditambahkan EDTA.

## 2.6. Amplifikasi DNA
Proses amplifikasi DNA dilakukan menggunakan  PCR.  Amplifikasi  menggunakan primer BactF, Uni B1 primer dan mastermix PCR (promega).  Kondisi  ini  dilakukan  sebanyak  30 siklus.  Suhu  dan  kondisi  yang  digunakan  pada tahap  denaturasi  awal  95  ºC  selama  3  menit; Annealing  53ºC  selama  30  menit;  ekstensi  72ºC selama 5 menit. Metode ini dijelaskan oleh Feris et al [8].

## 2.7. Sekuensing
Proses sekuensing untuk menentukan urutan nukleotida  dilakukan  di  1 st Base  Malaysia menggunakan metode Sanger.
2.8. Identifikasi Bakteri
dengan Pohon Filogenetik Urutan nukleotida dari  gen  16S  rRNA  yang diperoleh  kemudian  dianalisis  dengan  program BLAST dari NCBI. Kemudian dilakukan analisis filogenetik menggunakan situs web EBI ( European Bioinformatics Institute )
http://www.ebi.ac.uk.

## 3 Hasil dan Diskusi
Fermentasi dapat didefinisikan sebagai reaksi substrat  organik  karena  aktivitas  enzim  yang dihasilkan  oleh  mikroorganisme  [9].  Peuyeum adalah salah satu makanan traf. disional singkong yang  difermentasi  yang  banyak  dikonsumsi  oleh masyarakat  Indonesia.  Fermentasi  peuyeum dipengaruhi oleh mikroorganisme yang ditemukan
pada  starter  yang  ditambahkan  ke  singkong. Starter  berisi  konsorsium  mikroba  seperti  jamur, ragi,  dan  bakteri  [10].  Penelitian  ini  dibatasi dengan hanya mengisolasi bakteri dalam peuyeum. Sampel singkong peuyeum dapat dilihat pada Gambar 1.

## Gambar 1. Peuyeum singkong

## 3.1. Isolasi Bakteri
Bakteri  dari  sampel  peuyeum  yang  diisolasi dapat tumbuh setelah inkubasi selama 16 jam pada suhu  37  ºC  dimana  sebelumnya  dilakukan pengenceran bertingkat dengan 4 seri konsentrasi. Serangkaian konsentrasi pengenceran yang dipilih 1000  kali  dan  10.000  kali  karena  jumlah  bakteri yang  representatif  (Gambar  2).  Pengenceran dilakukan agar bakteri yang tumbuh tidak terlalu terkonsentrasi  sehingga  memudahkan  proses perhitungan. Pengenceran bertingkat ini meminimalkan  jumlah  mikroba  yang  tersuspensi dalam  cairan.  Penentuan  jumlah  atau  jumlah pengenceran  tergantung  pada  taksiran  jumlah mikroba dalam sampel. Pengenceran ini menggunakan  NaCl  fisiologis  yang  berfungsi sebagai  larutan  isotonik  untuk  menyesuaikan kondisi tubuh bakteri. Teknik isolasi bakteri yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  prosedur lempeng  menyebar.  Jumlah  total  bakteri  yang diperoleh adalah 4,47 x 104 CFU / mL.
Gambar  2.  Pertumbuhan  bakteri  dari  pengenceran 1000 dan 10000 kali

## 3.2. Penapisan Xilanase
Bakteri  yang  representatif  dari  pengenceran 1000  kali  dan  10.000  kali  pada  tahap  isolasi
kemudian  ditumbuhkan  kembali  ke  media  LB baru. Sebanyak 162 koloni tunggal diperoleh dari media  baru  dan  kemudian  ditumbuhkan  kembali dalam  medium  spesifik  (Luria  bertani  dan  xilan) lalu  diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  16  jam. Hasil kultivasi dengan medium spesifik menunjukkan  adanya  2  bakteri  yang  memiliki aktivitas  xilanolitik  dari  jumlah  keseluruhan koloni yaitu 162. Hal ini ditandai dengan adanya zona bening yang diproduksi oleh bakteri setelah penambahan  kongo  merah.  Bakteri  ini  diperoleh dari koloni nomor 61 dan 62 yang kemudian kedua bakteri  tersebut  dinamakan  XF1  dan  XF2 (Gambar 3).
Gambar 3. Penapisan xilanase XF1 dan XF2

## 3.3. Penentuan Morfologi Bakteri
Hanya  koloni  XF1  yang  diuji  lebih  lanjut karena XF1 dianggap memiliki zona bening yang lebih  jelas.  XF1  dianalisis  morfologinya  dengan teknik pewarnaan Gram Hasil pengujian menunjukkan bahwa koloni XF1 adalah kelompok bakteri  Gram  positif  dengan  bentuk  batang.  Ini ditunjukkan  oleh  hasil  pewarnaan  Gram  yang berwarna ungu jika dilihat dari mikroskop. Bakteri Gram positif masih akan mengikat pewarna kristal ungu  sehingga  warna  berubah  menjadi  ungu. Sedangkan bakteri Gram negatif akan kehilangan kompleks kristal ungu karena lapisan peptidoglikan  pada  bakteri  Gram  negatif  lebih tipis sehingga warna akhirnya merah (Gambar 4).
Gambar 4. Hasil pewarnaan gram pada koloni XF1

## 3.4. Isolasi DNA Bakteri
Isolasi  DNA  kromosom  dilakukan  pada koloni  XF1.  DNA  yang  diisolasi  kemudian dielektroforesis  menggunakan  gel  agarosa.  Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa DNA memiliki ukuran diatas 10.000 bp (Gambar 5).
Gambar  5.    Elektroforegram  hasil  PCR  DNA kromosom total koloni XF1

## 3.5. Amplifikasi DNA
Proses  amplifikasi  DNA  dilakukan  dengan menggunakan alat PCR.
Amplifikasi menggunakan 2 buah primer yaitu BactF dan Uni B1  serta  reagen  PCR  (promega).  Amplifikasi DNA kromosom dilakukan dengan menggunakan teknik PCR dan hasilnya dielektroforesis dengan agarosa  gel.  DNA  kromosom  yang  terisolasi digunakan  sebagai  templat  dalam  proses  PCR. PCR  dengan  menggunakan  penanda  genetik  16S rRNA dilakukan dengan tujuan untuk memperkuat gen 16S rRNA. Amplifikasi gen 16S rRNA  dilakukan  dengan  menggunakan  primer universal.  Urutan  gen  16S  rRNA  telah  banyak digunakan untuk menentukan filogeni bakteri dan taksonomi  sebagai  penanda  genetik  yang  paling umum  digunakan  karena  kehadiran  mereka terdapat hampir di semua jenis bakteri. Selain itu, fungsi gen 16S rRNA tidak berubah dari waktu ke waktu  [11].  Keberhasilan  amplifikasi  gen  16S rRNA  dapat  dilihat  dari  ukuran  DNA  yang diperoleh.  Dari  hasil  penelitian  ini  diperoleh ukuran DNA setelah amplifikasi adalah ± 1500 pb (Gambar 6).
Ini  menunjukkan  bahwa  proses  amplifikasi telah  berhasil  dilakukan.  Ini  karena  gen  yang diamplifikasi  adalah  gen  16S  yang  memiliki ukuran sekitar 1500 pb [12].
Gambar 6. Elektroforegram hasil PCR fragmen 1.5 kb dari koloni XF1

## 3.6. Sekuensing
Proses sekuensing untuk menentukan urutan nukleotida  dilakukan  di  1 st Base  dengan  metode Sanger.  Untuk  mendapatkan  urutan  nukleotida, hasil PCR perlu diurutkan menggunakan beberapa primer.  Yang  utama  digunakan  adalah  Bact  F untuk  primer  maju  dan  Uni  B  untuk  primer mundur.  Diharapkan  dari  primer  dapat  dibaca dengan baik urutan nukleotida dari bakteri target. Berdasarkan hasil dari sekuensing gen 16S rRNA, data  pada  urutan  nukleotida  dari  primer digunakan.  Setiap  primer  memberikan  data tentang urutan nukleotida dalam bentuk elektroforegram dari puncak puncak basa. Puncak dipilih  dari  puncak  tinggi  dan  tidak  menumpuk. Urutan  nukleotida  yang  diperoleh  kemudian dianalisis menggunakan program BLAST (www.blast.nbi.nlm.nih.gov/).  Program  BLAST membandingkan urutan nukleotida yang diproduksi dengan urutan nukleotida di GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank).
3.7. Identifikasi Bakteri dengan Pohon Filogenik Berdasarkan analisis homologi yang diperoleh  dari  BLAST,  dapat  dilihat  persentase kesamaan  bakteri  target  dengan  bakteri  lain. Urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  dianalisis dengan menggunakan program BLAST dari NCBI dan  diperoleh  beberapa  spesies  bakteri  yang memiliki kedekatan dengan bakteri XF1 (Gambar 7).  Analisis  filogenetik  ini  dinyatakan  dalam pohon filogenetik. Pohon filogenetik dibuat untuk menentukan  hubungan  evolusi  antara  berbagai spesies. Pohon filogenetik dalam bentuk diagram bercabang dapat dibangun berdasarkan persamaan atau  perbedaan  sifat  fisik  atau  genetik  seperti sekuens DNA, sekuens asam amino (protein), pola pemotongan  enzim  restriksi  dan  lainnya.  Pohon filogenetik  dapat  dibangun  menggunakan  situs web  EBI  ( European  Bioinformatics  Institute )  di http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/.
Berdasarkan hasil analisis pohon filogenetik ditemukan bahwa bakteri XF1 memiliki homologi terdekat dengan Bacillus cereus dengan kemiripan 99,84%  (Gambar  8). Bacillus  cereus adalah bakteri  gram  positif.  Bakteri  ini  umumnya ditemukan di tanah dan makanan. Beberapa strain bakteri  ini  dapat  bermanfaat  sebagai  probiotik untuk  hewan.  Dalam  penelitian  ini,  bakteri  yang dapat  menghasilkan  enzim  xilanase  dari  sampel singkong  peuyeum  berhasil  diisolasi.  Bakteri  ini adalah Bacillus  cereus .  Bakteri  yang  biasanya ditemukan  di  peuyeum  singkong  menurut  Barus dan Wijaya adalah Bacillus subtilis , Lactobacillus plantarum , dan Pseudomonas fragi dengan jumlah 107 cfu / g [13]. Hasil penjajaran sejumlah bakteri yang  diperoleh  dari  BLAST  dapat  dilihat  pada Gambar 6. Pohon filogenetik dapat dilihat Gambar 7.
Gambar 7. Hasil pensejajaran sejumlah bakteri

## Gambar 8. Pohon filogenetik XF1 (Koloni XF1 pada kotak merah menandakan Xilanase)
4 Kesimpulan
Bakteri penghasil enzim xilanase di peuyeum telah berhasil diisolasi. Berdasarkan hasil analisis pohon  filogenetik  ditemukan  bahwa  bakteri XF1 memiliki  homologi  terdekat  dengan Bacillus cereus dengan kemiripan 99,8%.

## Daftar Pustaka
[1]   Finalika  E,  Widjanarko  SB.  Penetuan  nilai maksimum  respon  rendemen  dan  gula reduksi  brem  padat  tape  ubi  kayu  ( Manihot esculenta ). J  Pangan  dan  Agro  Ind .  2015. 3(2):670–80.
[2]   Barus  T,  Natalia  Wijaya  L.  Mikrobiota Dominan  dan  Perannya  dalam  Cita  Rasa Tape  Singkong. J  Biota .  2011.  16(2). http://dx.doi.org/10.24002/biota.v16i2.119
[3]   Djien  K.  Tape  fermentation. Appl  Environ Microbiol . 1972. 23:976–8.
[4]   Richana  N,  Irawadi  TT,  Nur  A,  Syamsu  K. Isolasi Identifikasi Bakteri Penghasil
Xilanase  serta  Karakterisasi  Enzimnya. J AgroBiogen . 2016. 4(1):24. http://dx.doi.org/10.21082/jbio.v4n1.2008.p 24-34
[5]   Sanders ER. Aseptic Laboratory Techniques:
Plating  Methods. J  Vis  Exp .  2012.  (63). http://dx.doi.org/10.3791/3064
[6]   Samanta AK, Kolte AP, Senani S, Sridhar M, Jayapal  N.  A  simple  and  efficient  diffusion technique  for  assay  of  endo  β-1,4-xylanase activity. Brazilian  J  Microbiol .  2011. 42(4):1349–53. http://dx.doi.org/10.1590/s1517- 83822011000400016
[7]   Wilson  C,  Lukowicz  R,  Merchant  S,  Flynn, Caballero  J.  Quantitative  and  Qualitative Assessment Methods for Biofilm Growth: A Mini-review. Res  Rev J  Eng  Technol .  2017. 6(4).
[8]   Ferris MJ, Muyzer G, Ward DM. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Profiles of 16S rRNA-Defined Populations Inhabiting a Hot Spring  Microbial  Mat  Community. Appl Environ Microbiol . 1996. 62(2):340–6.
[9]   Suprihatin.  Teknologi  Fermentasi.  Unesa Press; 2010.
[10]  Gultom  GM.  Komposisi  Mikroorganisme dan  Kimia  Tape  Singkong  dan  Tape  Ketan yang  Diproduksi  di  daerah  Bogor.  Institut Pertanian Bogor; 2017.
[11]  Janda  JM,  Abbott  SL.  16S  rRNA  Gene Sequencing for Bacterial Identification in the Diagnostic  Laboratory:  Pluses,  Perils,  and Pitfalls. J Clin Microbiol . 2007. 45(9):2761– 4. http://dx.doi.org/10.1128/jcm.01228-07
[12]  Clarridge  JE.  Impact  of  16S  rRNA  Gene Sequence  Analysis  for  Identification  of Bacteria  on  Clinical  Microbiology  and Infectious  Diseases. Clin  Microbiol  Rev .
2004. 17(4):840–62. http://dx.doi.org/10.1128/cmr.17.4.840- 862.2004
[13]  Barus T, Kristiani T, Yulandi A. Diversity of Amylase-Producing Bacillus  spp .  from “Tape”  (Fermented  Cassava). HAYATI  J Biosci . 2013. 20(2):94–8. http://dx.doi.org/10.4308/hjb.20.2.94