Pengujian  Anti  Protein  Produksi  Blastosis  (Anti-PAG) melalui Metode Dot Blot (Evaluatin  Of  Anti  PAG  From  Blastosis  through Dot  Blot Method)
Tita Damayanti Lestari Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran

## Abstrak
Penelitian    pengujian    reaksi  antiprotein  dan  protein  produksi  blastosis  dilakukan  dengan tujuan mengetahui apakah  terjadi saling mengenali antara anti-PAG dan protein PAG yang terdapat dalam serum sapi bunting. Pengujian dilakukan dengan menggunakan metode Dot Blot. Uji  dilakukan  terhadap  serum  sapi  bunting umur 15,  20,  25  dan  30  hari, masing- masing  dari  empat  ekor  dengan  dosis  pengenceran  anti-PAG  adalah  1/100,  1/200  dan 1/400. Hasil reaksi berupa warna ungu dikonversikan kedalam angka menggunakan metode NIH  Image  Version  1.62.  Data  dianalisis  menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap  Pola Tersarang,  dilanjutkan  dengan  uji  jarak  berganda  Duncan  untuk  mengetahui  pengaruh serum  dalam  dosis. Uji  statistik  pada  hasil  reaksi  Dot  Blot  menunjukkan  perbedaan  yang signifikan  antara  serum  sapi  dara  bunting  15,20,25  dan  30  hari  dalam  dosis  pengenceran 1/100, 1/200  dan  1/400.  PAG  pada  serum  sapi  dara  bunting  15  hari  mampu  dikenali  oleh anti-PAG  pada  pengenceran  1/400.  Serum  sapi  dara  bunting  umur  30  hari  memiliki  nilai paling  sensitif  pada  semua  dosis  pengenceran,  disusul  kemudian  dengan  serum  sapi  umur kebuntingan 25, 20 dan 15 hari.
Kata Kunci : Anti-PAG, PAG, Dot Blot, serum sapi bunting

## Abstract
Research  on reaction  test  between  anti  protein  and  protein  produced  by  blastocyst  was conducted  to  find  out the  recognition  between  anti-PAG  and  PAG  derived  from  pregnant cow  serum.  Spesificity  test  was  done  qualitatively  by  Dot  Blot  method. Test  were administered on pregnant cow serum of 15, 20, 25 and 30 day of pregnancy, from four head each.  Dilution  doses of  anti  PAG  were 1/100,  1/200  and1/400. Datas  collected  were visualisation  with blue purple color derifed from specific reaction between antigen (PAG) and  antibody  (anti-PAG).  Expression  of  color  were  conversed  to  numbers  by  NIH  Image Version  1.62.  Average  of  numbers  represent  result  of  Dot  Blot  reaction.  Datas  collected were analysed statistically by Nested Completely Random Design, and continued further by Duncan test. Result shows Anti-PAG can recognise antigen PAG in pregnant cow serum. PAG of 15 day cow pregnancy serum is   recognized by anti PAG from 1/400 dilution. The most sensitive recognition is  showed in 30 day of pregnant cow serum from all anti PAG dilution, followed by 25, 20 and 15 day.
Keywords :  Anti-PAG, PAG, Dot Blot, pregnant cow serum

## Pendahuluan
Metode  deteksi  kebuntingan pada  sapi perah  selama  ini  dilakukan secara  klinik yaitu dengan dengan pemeriksaan eksplorasi rektal dan ultrasonografi  (USG).  Metode  eksplorasi  rektal, membutuhkan  petugas  pemeriksa  kebuntingan (PKB)  yang  trampil  dan  berpengalaman  guna mendapatkan  diagnosa  umur  kebuntingan  yang tepat  dengan  tidak  melukai  baik  fetus  maupun induknya.  Dengan  metode  ini  kebuntingan  baru dapat  dideteksi  pada  usia  di  atas  40  hari  (Arthur, et  al,  1989  dan  Ball  and  Peters,  2004),  sehingga hewan  tersebut  baru  diketahui  bunting  atau  tidak bunting  sesudah  lewat  satu  siklus  berahi. Pemeriksaan  dini  dengan  eksplorasi  rektal  ini didasarkan  pada  terjadinya  perubahan  dan
pembesaran  bentuk  cornua  uteri  yang  belum menjamin adanya konseptus di dalamnya (Arthur, et  al,  1989  dan  Ball  and  Peters,  2004).  Dengan alat  USG,  walaupun  dapat  dilakukan  lebih  dini yaitu  pada  22  hari  setelah  inseminasi,  namun harga  alat  ini  masih  cukup  mahal  bagi  peternak- peternak  rakyat.  Selain  itu  ada  resiko  traumatik, yakni apabila probe dimasukkan ke dalam rectum dapat menyebabkan shock yang berakibat kematian  embrio  serta  dibutuhkan  pula  operator terlatih  yang  trampil,  yang  berpengalaman  dalam menginterpretasikan  gambar  yang  muncul  pada layar  monitor  (Jainudeen  dan  Hafez,  2000). Gambar  yang  muncul  di  layar  monitor  adalah adanya  pembesaran  lumen  uterus    yang    belum
merupakan jaminan adanya konseptus didalamnya.
Deteksi  kebuntingan  dini  pada  sapi  secara imunologik juga sudah dilakukan, yaitu berdasarkan  pengukuran  konsentrasi  hormon pregesteron,  antara  lain  dengan  teknik Radio Immuno Assay (RIA) dan Enzym Linked Immuno Absorbend  Assay (ELISA).  Namun  metode  ini tergolong  tidak  ekonomis,  mengingat  harga  satu kit    masih  mahal  dan  ada  masalah waste radioaktif,  sehingga  teknik  ini  tidak  digunakan secara  luas  dan  komersial.  Pemeriksaan  kadar progesteron      dapat  dilakukan  pada  hari  ke  24 tetapi  sering  terjadi false  positive ,  hal  ini disebabkan  hormon  progesteron  diproduksi  oleh induk  yang  bisa  saja  tinggi  kadarnya  pada  induk yang  tidak  bunting  apabila  mengalami corpus luteum persistent (CLP). Sementara kadar hormon estron sulfat dapat dideteksi pada hari ke 72 (Ball and  Peters,  2004)  sedangkan  kadar  eCG  dapat dideteksi pada hari ke 40 umur kebuntingan pada kuda, artinya, kedua teknik ini tidak lebih unggul dibandingkan  teknik eksplorasi rektal.
Dari  berbagai  metode  deteksi  kebuntingan secara  klinis  dan  imunologis,  sebagaimana  yang dilaporkan  Jainudeen  and  Hafez  (2000),  maka metode deteksi secara imunologis yang melibatkan  kehadiran  protein-protein  spesifik yang  diproduksi  blastosis  pada  awal  terjadinya implantasi    dapat  digunakan  sebagai  dasar mendeteksi kebuntingan dini. Dengan terdeteksinya  protein  spesifik  dalam  serum  darah sapi  betina  setelah  terjadi  perkawinan  maka kehadiran  protein  tersebut  dapat  dipakai  sebagai indikator  bahwa    sapi    betina  tersebut  bunting pada  taraf  implantasi  embrio  (Hafez  and  Hafez, 2000 ; Balls and Peters, 2004 dan Bearden, et al, 2004).
Beberapa      protein  yang  dihasilkan  oleh blastosis  menjelang  implantasi pada  sapi  antara lain  adalah bovine  pregnancy  specific  protein B (bPSPB), bovine  Trophoblastic  Protein-1  (bTP- 1), pregnancy  specific  protein 60  (PSP60), Early Pregnancy Factor (EPF) dan Pregnancy- Associated  Glycoprotein (PAG).    Teknik  RIA dapat  mendeteksi kehadiran  bPSPB  pada  hari  ke 24  setelah  inseminasi,  sedangkan  PSP60    dapat terdeteksi pada hari ke 28. Sementara EPF adalah produk  ovum  maternal  sebagai  respon  saat penetrasi  sperma  (Morton, et  al,    1992),  dan bukan  merupakan  produk  blastosis,  sehingga belum  dapat  dijadikan  acuan  berlangsungnya suatu kebuntingan.
Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG), sebagai  protein  produksi  blastosis  sebagaimana disebut  di  atas,  adalah  substansi  yang  berupa molekul  glikoprotein.    PAG  diproduksi  oleh  sel- sel  trophoblast blastosis  pada  awal  terjadinya implantasi  setelah  konsepsi    (Xie, et  al,  1994). Apabila  PAG  terdeteksi  dalam  sistem  darah maternal,  maka  hal  ini  dapat  dijadikan  sebagai indikator  berlangsungnya  kebuntingan.  Dengan teknik  RIA,  kehadiran  PAG  mulai    terdeteksi pada  hari  ke  22  setelah  inseminasi  (  Zoli, et  al, 1991 dan Karen, et al, 2002), sedangkan   protein blastosis yang lain baru dapat terdeteksi lebih dari hari ke 22.
Secara in  vitro, apabila  serum  darah  sapi bunting  yang  mengandung  protein  blastosis  yang dikenali oleh anti-protein tersebut pada konsentrasi  yang  sangat  kecil,  maka  artinya  sapi betina  tersebut  bunting.  Hal  ini    karena  adanya reaksi  antigen - antibodi  yang  sangat  spesifik, sehingga  apabila  terjadi  reaksi    antara  PAG  dari serum sapi yang diduga bunting dengan anti-PAG maka artinya sapi betina tersebut positif bunting.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menguji adanya  reaksi  antara  anti-PAG  sebagai  anti  dari protein  produksi    blastosis  PAG  dengan  antigen PAG  sendiri.  Pengujian  dilakukan  menggunakan metode Dot Blot. Apabila terjadi reaksi yang akan dimanifestasikan  dengan  warna  biru  keunguan artinya  anti-PAG  dapat  mengenali  PAG.  Lebih jauh  anti  PAG  dapat  digukana  sebagai  penciri pada terjadinya kebuntingan pada sapi secara dini.

## Metode
Penelitian ini  adalah  uji  reaksi antara  anti protein  produksi  blastosis yaitu  PAG  (anti-PAG) dengan antigen standar (bovine PAG  MDBiomed Cat. 101-7963-13-3 ) dan serum sapi dara bunting umur  15,  20,  25  dan  30  hari  kebuntingan  yang sudah dikonfirmasi terlebih dulu kebuntingannya. Metode  pengujian  yang  dilakukan  adalah  metode Dot  Blot. Metode  ini  menggunakan  alat  Dot blotter  (BioRad)  untuk  mendeteksi  reaksi  antara anti-PAG  dengan  PAG  standar  yang  diteteskan pada membran nitroselulose selanjutnya ditambahkan Anti Rabbit IgG Alkaline Phosphatase  (AP) Conjugated serta  substrat Western  blue.  Hasilnya  divisualisasikan  dengan adanya noda biru keunguan. Protein yang akan  diuji  langsung  ditotolkan  pada  membran. Analisis keberadaan PAG secara semi kuantitatif, dinilai melalaui  pengukuran  intensitas warna  dengan  program  NIH  Image  Version  1.62. Sampel  yang  diukur  adalah    serum  sapi dara
bunting  mulai  umur  kebuntingan  15,  20,  25  dan 30  hari  setelah  inseminasi  buatan  (IB),  masing- masing dari empat ekor sapi..
Uji  dot  blot  diawali  dengan  merangkai membran  pada  alat  Dot  Blotter  (BioRad) selanjutnya  membran  ditetesi  dengan  sampel dengan konsentrasi @ 50 µl. .setelah  inkubasi 30 menit,  dilakukan  bloking dengan PBS Skim 1% selama  1  jam  dan  dicuci  dengan  PBS  Tween selama  3x3  menit.  Setelah itu direaksikan  selama 2  jam  dengan  antibodi  primer dengan pengenceran    (1/100;  1/200  dan  1/400),      sambil digoyang.  Kemudian  membran  dicuci  dengan PBS  Tween  3x3  menit  dan  diinkubasi  dengan antibodi  sekunder Anti  Rabbit  IgG  Alkaline Phospatase dengan pengenceran 1:2500 selama 1 jam.  Membran  dicuci  dengan  PBS  Tween-20 0,05%  selama  3x3  menit  lalu  diinkubasi  dengan substrat  Western  Blue  Substrat  Solution  selama 30  menit.  Dilakukan  stop  reaksi  dengan  aquades, lalu  membran  dikeringkan  dan  dilihat  ada tidaknya noda berwarna .
Metode penelitian ini adalah eksperimental dengan rancangan percobaan  yang digunakan yaitu Pola  Tersarang  dengan  dasar Rancangan Acak Lengkap (RAL). Perlakuan yang dicobakan adalah dosis atau konsentrasi anti-PAG sebanyak tiga dosis yaitu D1 : 1/100 ; D2 : 1/200 dan  D3  :  1/400.  Hari  pengamatan  adalah  umur kebuntingan  sapi    dara    yaitu  15,  20,  25  dan  30 hari setelah IB yang telah dikonfirmasi kebuntingannya.  Sampel  adalah  serum  sapi  dara bunting dengan umur kebuntingan yang disebutkan  di  atas,  masing-masing  dari  empat ekor  sapi.  Setiap  ekor  sapi  diambil  serum sebanyak  enam  sampel  dan  berfungsi  sebagai ulangan.

## Hasil dan Pembahasan
Penelitian ini bertujuan untuk
membuktikan bahwa anti-PAG mampu mengenali  PAG  dari  serum  sapi  dara  berbagai umur  kebuntingan  dini melalui metode  Dot  Blot. Apabila  anti-PAG  dapat  mengenali  antigen  PAG yang  berasal  dari  serum  sapi  bunting dini,  maka anti-PAG  tersebut  dapat  dijadikan  indikator  atau deteksi  kebuntingan  pada  sapi  mulai  umur kebuningan  yang  dini. Data  yang  dihasilkan berupa visualisasi terjadinya reaksi spesifik antara antigen  (PAG)  dengan  antibodi  (Anti-PAG)  yang terlihat sebagai noda biru keunguan.
Ekspresi warna keunguan hasil uji Dot Blot kemudian di  konversi  ke  dalam  angka  melalui program  NIH  Image  version  1.62. Hasil analisis
serum  dalam  dosis  secara  simultan  menunjukkan perbedaan  yang  signifikan.  Untuk  mengetahui lebih  lanjut  secara  parsial,  maka  dilakukan  uji ganda menurut metode Duncan. Hasil uji Duncan pengaruh  serum  pada  dosis  D  1  adalah sebagaimana tertera pada Tabel 1.
Tabel 3. Hasil Uji Duncan pada D1 Perlakuan Rataan Signifikansi S1 33,28 a S2 44,68 b S3 87,77 c S4 152,48 d
Ket.:    Huruf  yang  tidak  sama  ke  arah  kolom menunjukkan perbedaan yang nyata
Hasil  uji  ganda  dengan  metode  Duncan menunjukkan  antara    S1  (serum  dari  15  hari) dibandingkan  dengan  S2  (20  hari),  S3  (25  hari) dan  S4  (30  hari)  berbeda  nyata  satu  sama  lain pada  dosis  D1(dosis  pengenceran  1/100). Hasil uji Duncan pengaruh serum pada dosis D 2 adalah pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Uji Duncan pada  D2 Perlakuan Rataan Signifikansi S1 25,32 a S2 37,98 b S3 58,66 c S4 120,29 d
Ket.:    Huruf  yang  tidak  sama  ke  arah  kolom menunjukkan perbedaan yang nyata
Hasil  uji ganda  dengan  metode  Duncan menunjukkan antara  S1 dibandingkan dengan S2, S3 dan S4 berbeda nyata satu sama lain pada dosis D2  (dosis  pengenceran  1/200). Hasil  uji  Duncan pengaruh  serum  pada  dosis  D  3  adalah  sebagai berikut  pada Tabel 3 . Tabel 3. Hasil Uji Duncan pada D3 Perlakuan Rataan Signifikansi S1 21,38 a S2 31,09 b S3 50,19 c S4 116,77 d
Ket.:    Huruf  yang  tidak  sama  ke  arah  kolom menunjukkan perbedaan yang nyata
Hasil  uji  ganda  dengan  metode  Duncan menunjukkan  antara S1  dibandingkan  dengan S2, S3 dan S4 berbeda nyata satu sama lain pada dosis D3 (dosis pengenceran 1/400).
Untuk  membuktikan bahwa anti-PAG hasil isolasi dari  penelitian  terdahulu  yang  diproduksi pada hewan  coba  kelinci  dapat  mengenali  PAG
dalam  serum  sapi  bunting  maka  dilakukan pengujian  spesifisitas  secara  kualitatif    dengan metode Dot Blot. Pengujian spesifisitas anti-PAG dengan  PAG  standar  melalui    metode  dot  blot menunjukkan  homologi  nukelotida  dan  asam amino  yang  tinggi  karena  terjadi  ikatan  kovalen diantara keduanya (Tizard, 2004).
Metode  dot  blot  juga  dilakukan  untuk pengujian  secara  kualitatif  antara  anti-PAG  hasil isolasi  hewan  coba  kelinci  dengan  PAG  yang terkandung  dalam  serum  sapi  dara  bunting  umur 15, 20, 25 dan 30 hari.   Hasil reaksi uji Dot Blot terhadap  serum  sapi  dara  bunting  menggunakan anti-PAG  hasil  isolasi  dari  kelinci,  ternyata menghasilkan warna, hal ini membuktikan bahwa terjadi  reaksi  pada  semua  sample.    Artinya, sample  serum  sapi  dara  mulai  umur  kebuntingan 15  hari  mengandung antigen PAG  yang  berhasil dikenali oleh anti-PAG. Warna ungu yang timbul sebagai  hasil  reaksi      uji  dot  blot    selanjutnya dikonversikan  ke  dalam  angka  menggunakan metode NIH Image Version sehingga muncul nilai yang dapat di analisis.
Dikenalinya  PAG  pada  kebuntingan  umur 15  hari  dapat  dijelaskan  karena setelah fertilisasi, menjelang  hari  ke  tujuh,  zona  pellucida  di sekeliling blastosis mulai tanggal, sehingga sel-sel trophoblas  berkontak  langsung  dengan  epihel uterus.  Sel-sel  trophoblas  berkembang  dengan pesat dan membentuk pelipatan dinding trophoblas (Arthur, et al, 1989). Implantasi terjadi bila  embryo  telah  bertaut  pada  endometrium. Proses  embryo  mamalia  menempel  pada  uterus melibatkan  proliferasi,  diferensiasi  dan  migrasi dari  sel  embryo  maupun  uterus  (Gordon,  2004). Masih menurut Gordon, 2004, menjelang penempelan  pada  endometrium,  embryo  ruminan dan babi melayang-layang bebas selama beberapa hari  dalam  lumen  uterus  bersamaan  dengan tropectoderm  yang  tumbuh  membesar.  Pada  babi pertautan  berlangsung  pada  hari  ke  12  sampai  24 sesudah  fertilisasi,  sedang  pada  sapi  pada  hari  ke 11  sampai  40      (Gordon,  2004).  Sementara menurut Arthur, et al, 1989,  penempelan embryo sapi pada uterus terjadi pada hari ke 12.
Pada  uterus  ruminansia  dimana  allanto- chorion    melakukan  kontak  dengan  karunkula uterus, vili-vili yang mengandung kapiler, tumbuh keluar  dari  allanto-chorion  menjulur  memasuki kripta-kripta karunkula induk yang juga dikelilingi oleh plexus kapiler. Hal ini membentuk karakteristik kotiledon ruminansia atau placentom,  tempat  terjadi  pertukaran  nutrisi  dan gas  antara  induk  dan  fetus  (Arthur, et  al,  1989).
Pertautan  pada  endometrium  ini  dilaporkan secepat-cepatnya  pada  hari  ke  10,  walaupun sampai  hari  ke  17  ternyata  masih  bisa  didapat dengan  cara  membilas  uterus.  Trophoblas berkembang  terus  sehingga  memenuhi  seluruh ruang  uterus.  Sel-sel  trophoblas  masuk  ke  dalam celah  vili  yang  terdapat  pada  karunkula,  dan terjadilah  pertautan  yang  erat  karena  terjadi peleburan  sel  vili.  Seluruh  lumen  uterus  terisi pertautan    trophoblas  dengan    karunkula    dan proses plasentasipun telah dimulai (Senger, 2003).
Pada penelitian terkini, dengan menggunakan analisis cDNA microarray, Ushizawa,  dkk,  2004  dapat  menunjukan  bahwa beberapa  molekul  PAG  diekspresi  tujuh  hari sampai  14  hari  setelah  konsepsi  dan  bahkan sebelum  tujuh  hari  (Ushizawa, et  al,  2004). Namun  demikian  karena  sebagian  besar  protein ini  belum  dapat  dipurifikasi,  maka  tidak  dapat dilakukan pengukuran konsentrasinya menggunakan teknik RIA dan ELISA.
Dari  referensi  di  atas  dapat  dikatakan bahwa  pada  hari  ke  15  umur  kebuntingan  telah terjadi  kontak  antara  embryo  dan  uterus  induk, sehingga  PAG  yang  dihasilkan  oleh  sel-sel binukleat trophoblas sudah dapat  terdeteksi pada sirkulasi darah maternal. Walaupun konsentrasinya  mungkin  sangat  kecil,  namun PAG  sudah  terekspresi  kehadirannya.  Kehadiran PAG  inilah  yang  dikenali  oleh  Anti-PAG sehingga  menimbulkan  warna  ungu    pada  hasil reaksi.  Warna  yang  dihasilkan  dari    reaksi  pada umur  kebuntingan  15  hari  berbeda  dengan  warna yang  dihasilkan  pada  umur  kebuntingan  yang lebih lama.
Pada  umur  kebuntingan  20  hari,  embryo sudah  menetap  di  lumen  cornua  uteri,  implantasi sudah dimulai. Sedang pada umur kebuntingan 25 hari  embryo  sudah  stabil  pada  satu  lokasi  dalam salah  satu  cornua  uteri  (Bearden,  et  al,  2004) maka  interaksi  antara  embryo  dan  endometrium induk  menjadi  lebih  intens.  Pada  sapi,  embryo tidak  seperti  pada  domba  yang  sering  mengalami perpindahan dari satu cornua ke cornua uteri yang lain  (Bearden, et  al,  2004).  Pada  umur kebuntingan  30  hari  proses  plasentasi  mendekati lengkap. Sel-sel binukleat dalam plasenta ruminansia  merupakan  diferensiasi  dari  sel-sel trophoblas  mononukleat  fetus  dan  diketahui mensekresi  glikoprotein.  Selagi  penempelan terjadi,  sel-sel  binukleat  trophoblas  bermigrasi dari  trophoblas  untuk  fusi  dengan  sel-sel  epithel endometrial  maternal.  Pada  tahap  ini  granula- granula  yang  terkandung  dalam    sel-sel  binukleat
disekresikan langsung ke dalam jaringan maternal,  dan  diantara  produk  sekresi  ini, terbanyak adalah pregnancy-associated glycoprotein atau PAG (Gordon, 2004).
Pada umur kebuntingan 20, 25 dan 30 hari sesuai  pendapat  Zoli, et  al,  1992  dimana konsentrasi  PAG  mulai  dapat  dideteksi  dalam sirkulasi  darah  maternal  pada  hari  ke  22  yaitu 0,38ng/ml,  dan  meningkat secara  gradual  sesuai dengan  bertambahnya  umur  kebuntingan,  maka hal  inilah  yang  menyebabkan  warna  yang  timbul pada  reaksi  uji  dot  blot  lebih  jelas  dibandingkan dengan pada 15 hari.
Hasil  reaksi    uji  dot  blot    menunjukkan bahwa  pada  pengenceran  1/400  masih  mampu mengenali antigen PAG dalam serum sapi bunting bahkan  pada  umur  kebuntingan  15  hari,  artinya reaksi  berjalan  sangat  spesifik.  Dengan  demikian maka  hasil  reaksi  dari  serum  sapi  umur kebuntingan  20,  25  dan  30  hari  akan  lebih  jelas pada semua pengenceran. Hal ini dimanifestasikan oleh nilai yang tertera pada hasil konversi dengan metode NIH Image Version 1.62.
Dikenalinya antigen PAG dalam serum sapi bunting  umur  15  hari  pada  pengenceran  terkecil 1/400  selain  karena  reaksi  berjalan  sangat spesifik, juga  disebabkan  oleh  terjadinya  kontak antara  uterus  ruminansia  melalui  allanto-chorion dan  karunkula  uterus  serta    vili-vili  yang mengandung  kapiler,  tumbuh  keluar        menjulur memasuki kripta-kripta karunkula induk kemudian  membentuk  karakteristik  kotiledon ruminansia  atau  placentom  (Athur, et  al,  1989). Pertautan  pada  endometrium  ini  dilaporkan secepat-cepatnya  pada  hari  ke  10.  Trophoblas berkembang  terus  sehingga  memenuhi  seluruh ruang  uterus.  Sel-sel  trophoblas  blastosis  masuk ke dalam celah vili yang terdapat pada karunkula, dan  terjadilah  pertautan  yang  erat  karena  terjadi peleburan  sel  vili.  Seluruh  lumen  uterus  terisi pertautan    trophoblas  dengan    karunkula    dan proses plasentasipun telah dimulai (Senger, 2003 ; Bearden, et al, 2004 dan Gordon, 2004).

## Kesimpulan
Anti-PAG  mampu  mengenali  antigen  PAG yang merupakan protein produksi blastosis. Anti- PAG dalam  pengenceran  1/400 masih mampu mengenali  PAG  dalam  serum sapi  dara  bunting
umur  15  hari.  Kemampuan  Anti-PAG  mengenali PAG dalam serum sapi dara bunting umur 30 hari dengan  pengenceran 100 kali adalah paling baik.

## Daftar Pustaka
Abbas,  K.A.;  A.H.  Liccthman  and  J.S. Pober.  2000. Antibodies  and  Antigen.  Cellular and Molecular Immunology. 4 th Ed. Philadelphia. WB Saunders Co.p. 41-62. Abbas, K.A.and  A.H.  Liccthman.  2005.
Cellular  and  Molecular  Immunology.  Fifth Edition.  Elsevier  Saunders.  The  Curtis  Center. Philadelphia.
Arthur,  G.  F.;  D.E.  Noakes  and  H. Pearson.  1989. Veterinary  Reproduction  and Obstetrics.  Sixth  Edition.  ELBS.  Bailliere Tindall. London. p : 60 – 86. Aulanni’Am.  2003. Prinsip  dan  Teknik Analisis  Biomolekul.  Edisi  1.  FPUB  Press bekerja sama dengan Usaha Nasional Surabaya.
Aulanni’Am . 2004. Dasar-dasar Biomolekul.  Edisi  1.  FPUB  Press  bekerja  sama dengan Usaha  Nasional Surabaya.
Aulanni’Am . 2005. Protein & Analisisnya. Penerbit  Citra  Mentari  Grup.
Malang.
Ball,  P.J.H.  and  A.R.  Peters.  2004. Reproduction in Cattle. Third Edition. Blackwell Publishing Ltd. Oxford. UK. Bearden,  H.  J.  and  J.W.  Fuquay.  2000. Applied  Animal  Reproduction,  Fifth  Edition Prentice Hall-Upper Saddle River. New Jersey.
Bearden,  H.J.  ;  J.W.  Fuquay  and  S.T. Willard.  2004. Applied  Animal  Reproduction, Sixth  Edition.  Prentice  Hall-Upper  Saddle River. New Jersey.
Gordon, I. 2004. Reproductive Technologies in Farm Animals. CABI Publishing. Cambridge. USA
Hafez,  E.S.E  and  B.  Hafez.  2000. Reproduction  in  Farm  Animals.  7 ed. .  Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia.
Jainudeen,  M.R.  and  E.S.E.  Hafez. 2000. Pregnancy  Diagnosis,  dalam  Hafez, E.S.E and  B.  Hafez. 2000. Reproduction  in Farm  Animals.  7 ed. .  Lippincott  Williams  & Wilkins. Philadelphia.
Kresno, S.B. 2004.  Imunologi : Diagnosis dan Prosedur laboratorium. Edisi Keempat. Balai Penerbit Fakultas Kedokteran. Universitas Indonesia. Jakarta.
Rantam, F.A. 2003. Metode Imunologi. Edisi 1. Airlangga University Press.Surabaya