## ALCHEMY : JOURNAL OF CHEMISTRY

## Artikel Penelitian

## Variasi Komposisi Eluen pada Isolasi Steroid dan Triterpenoid Alga Merah Eucheuma cottonii dengan Kromatografi Kolom Basah
Armeida Dwi Ridhowati Madjid *, Dwi Anik Rahmawati , Ahmad Ghanaim Fasya
Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, Indonesia, 65144
INFO ARTIKEL ABSTRAK Riwayat Artikel Direvisi 6 Juni 2019 Diterima 23 Juni 2020 Tersedia online 27 Juli 2020 * Email penulis korespondensi: armeida@uin-malang.ac.id
Steroid  and  triterpenoid  compounds  in  petroleum  ether  fractions  of  red  algae Eucheuma cottonii were isolated by slurry column chromatography. Isolation was started with maceration extraction using methanol solvent. The methanol extract was hydrolyzed with HCl 2 N and partitioned using petroleum ether solvent. The presence of steroid and triterpenoid was determined by phytochemical test using Lieberman  Burchard reagent.  Petroleum  ether  fraction  was  separated  by  slurry column chromatography with the variation of eluent composition n-hexane: ethyl acetate  16:4;  17:3;  18:2.  The  isolates  were  monitored  by  analytical  thin-layer chromatography (TLC) and the best result was identified using FTIR. Percent yields of  methanol  extract  and  petroleum  ether  fraction  were  11.866%  and  8.03%, respectively.  The  optimum  eluent  composition  in  column  chromatography  for separation was n-hexane : ethyl acetate (18:2) obtained 2 steroid and 3 triterpenoid fractions. FTIR analysis gives information about functional groups of –OH, C=C, C- O,  CH 2 ,  -C(CH 3 ) 2 for steroids  and  functional  groups  of  –OH,  C=O,  C=C,  CH 2, - C(CH 3 ) 2 for triterpenoid.
Keywords: Eucheuma  cottonii, column  chromatography,  steroid,  triterpenoid , variation of eluent composition
Senyawa  steroid  dan  triterpenoid  dalam  fraksi  petroleum  eter  alga  merah Eucheuma cottonii telah diisolasi menggunakan kromatografi kolom basah. Isolasi dilakukan dengan cara ekstraksi maserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak pekat  metanol  dihidrolisis  dengan  HCl  2  N  dan  dipartisi  menggunakan  pelarut petroleum  eter.  Senyawa  steroid  dan  triterpenoid  diuji  fitokimia  menggunakan reagen Lieberman  Burchard .  Fraksi  petroleum  eter  dipisahkan  menggunakan kromatografi kolom basah  variasi komposisi eluen n-heksana:etil asetat dengan perbandingan  16:4;  17:3;  dan  18:2.  Hasil  isolasi  dimonitoring  menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) analitik. Hasil monitoring yang terbaik diidentifikasi gugus  fungsinya  menggunakan  FTIR.  Hasil  penelitian  menunjukkan  rendemen ekstrak metanol dan fraksi petroleum eter masing-masing sebesar 11,866% dan 8,03%.  Pemisahan  kolom  dengan  variasi  komposisi  eluen  n-heksana:etil  asetat terbaik adalah 18:2 dengan diperoleh 2 kelompok fraksi steroid dan 3 kelompok fraksi  triterpenoid.  Hasil  analisis  FTIR  pada  isolat  steroid  memberikan  informasi gugus –OH, C=C, C-O, CH 2 , -C(CH 3 ) 2, sedangkan isolat triterpenoid memberikan informasi gugus  –OH, C=O,  C=C, CH 2 , -C(CH 3 ) 2 . Gugus gem dimetil (-C(CH 3 ) 2 ) merupakan ciri khas rantai samping steroid ataupun triterpenoid.
Kata  kunci: Eucheuma  cottonii ,  kromatografi  kolom,  steroid,  triterpenoid,  variasi komposisi eluen

## 1. Pendahuluan
Kekayaan alam di Indonesia untuk golongan alga tersebar luas di seluruh daerah. Salah satu daerah yang memiliki kekayaan tersebut adalah Wongsorejo Banyuwangi. Kekayaan alam biota laut pada daerah ini cukup melimpah dengan beberapa  jenis  serta  variasi  warna.  Rumput  laut  memiliki  toksisitas  [1,  2]  sehingga  berpotensi  sebagai  antivirus  [3], antibakteri [4, 5] dan antioksidan [2, 6, 7]. Salah satu kekayaan biota laut yang dimanfaatkan dan dibudidayakan manusia adalah  alga  merah Eucheuma  cottonii. Hal  ini  dikarenakan  banyak  kandungan  zat-zat  yang  bermanfaat  di  dalamnya. Senyawa metabolit sekunder yang terkandung E. cottonii adalah steroid dan triterpenoid [8]. Senyawa steroid tersebut memiliki  toksisitas  terhadap Artemia  salina [9]  dan  berpotensi  sebagai  antioksidan  [2]  serta  antimikroba  [5].  Adapun senyawa triterpenoid memiliki kemampuan sebagai zat yang mampu meningkatkan aktivitas rifampisin (antibiotik) dalam menghambat pertumbuhan bakteri Mycobacterium tuberculosis [10].
Isolasi senyawa aktif diawali dengan ekstraksi maserasi menggunakan pelarut metanol dan rendemen yang diperoleh sebesar  16,97%  [1].  Ekstrak  metanol E.  cottonii dihidrolisis  dengan  HCl  2  N  untuk  memecah  ikatan  glikosida  yang menghubungkan antara komponen gula (glikon) dan metabolit sekunder (aglikon) [7]. Ekstrak hasil hidrolisis dengan HCl 2 N memiliki nilai LC 50 lebih rendah sebesar 70,32 ppm dibandingkan dengan sebelum dilakukan hidrolisis sebesar 194,40 ppm [1].
Senyawa steroid lebih murni dapat diisolasi menggunakan kromatografi kolom [8]. Fase gerak (eluen) merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi hasil isolasi pada kromatografi kolom [11]. Isolasi senyawa steroid dan triterpenoid menggunakan kromatografi kolom dapat dilakukan dengan memvariasikan komposisi eluen n-heksana:etil asetat dengan perbandingan  16:4;  17:3;  dan  18:2.  Hasil  isolat  murni  yang  diperoleh  dapat  dimonitoring  dengan  menggunakan kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  analitik  dengan  eluen  terbaik  4,25:0,75  [12].  Adanya  steroid  ditunjukkan  dengan  noda berwarna hijau kebiruan [13] dan triterpenoid ditunjukkan dengan noda berwarna merah ungu (violet) [14].
Isolasi steroid dan triterpenoid dengan menggunakan kromatografi kolom basah diperoleh 9 kelompok fraksi dengan 5 kelompok fraksi steroid dan 4 kelompok fraksi triterpneoid [13]. Gugus fungsi dari hasil isolat yang positif terdapat steroid dan triterpenoid dapat diidentifikasi gugus fungsinya dengan FTIR (Fourier-Transform Infrared), dimana terdapat gugus gem dimetil yang merupakan ciri khas rantai samping senyawa steroid ataupun triterpenoid. Berdasarkan latar belakang di atas, untuk mengetahui keefektifan kromatografi kolom dengan variasi kompisisi eluen dalam memisahkan senyawa steroid dan triterpenoid dalam sampel E. cottonii menjadi tujuan atas penelitian ini.

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1. Bahan
Sampel pada penelitian ini adalah alga merah Eucheuma cottonii dari Wongsorejo, Banyuwangi. Bahan kimia yang digunakan adalah metanol p.a (Merck), HCl 2 N p.a. (Merck), petroleum eter p.a. (Merck), n-heksana p.a. (Merck), etil asetat p.a. (Merck), asam asetat anhidrat (Merck), H 2 SO 4 p.a. (Merck), kloroform p.a. (Merck), NaHCO 3 (Merck), plat silika gel GF 254 (Merck) , dan silika gel G60 (Merck).

## 2.2. Preparasi Sampel
Alga merah sebanyak 75 kg dicuci bersih dengan air dan diiris kecil-kecil. Kemudian, sampel dikeringanginkan dan dioven pada suhu 38°C selama 24 jam. Sampel yang sudah kering dihaluskan hingga didapatkan serbuk alga merah.

## 2.3. Penentuan Kadar Air
Sampel sebanyak 1 g dimasukkan dalam cawan porselen yang sudah diketahui berat konstannya, kemudian dioven pada suhu 100-105°C dan didinginkan dalam desikator. Perlakuan ini diulangi sampai berat konstan. Kadar air dalam alga merah dapat dihitung menggunakan Persamaan 1 [15].
Kadar air = (b - c) (b- a) x 100%
Dimana, a adalah bobot cawan kosong, b adalah bobot sampel ditambah cawan sebelum dikeringkan, dan c adalah bobot cawan ditambah sampel setelah dikeringkan.

## 2.4. Ekstraksi Maserasi Alga Merah
Sampel alga merah sebanyak 100 g diekstraksi secara maserasi menggunakan 500 mL pelarut metanol selama 24 jam disertai dengan pengocokan, dan disaring menggunakan ayakan 60 mesh. Ampas yang telah diperoleh selanjutnya dimaserasi kembali dengan pelarut metanol sebanyak tiga kali pengulangan hingga filtrat yang dihasilkan bening. Ketiga
(1)
filtrat yang diperoleh hasil penyaringan digabung dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator . Ekstrak pekat yang diperoleh dihitung nilai rendemennya dengan Persamaan 2 [6].
Rendemen (%) = berat ekstrak berat sampel x 100%

## 2.5. Hidrolisis Ekstrak Pekat Metanol
Ekstrak pekat metanol alga merah sebanyak 5 g ditambahkan 10 mL larutan HCl 2 N dan diaduk menggunakan magnetic stirer pada suhu ruang selama 1 jam. Selanjutnya, hidrolisat yang diperoleh ditambahkan NaHCO 3 sampai pH- nya netral (pH 7) [16].

## 2.5. Partisi Ekstrak dengan Petroleum Eter
Hidrolisat dengan pH 7 kemudian dipartisi dengan 50 mL petroleum eter dan 50 mL metanol. Dari hasil partisi akan diperoleh dua lapisan yaitu lapisan organik dan lapisan air. Partisi dilakukan tiga kali pengulangan dengan pelarut yang sama untuk memperoleh senyawa aktif yang lebih maksimal. Ekstrak hasil partisi kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat yang kemudian ditimbang beratnya dan ditentukan rendemennya [16].

## 2.6. Uji Steroid dan Triterpenoid dengan Reagen Lieberman Burchard
Satu miligram ekstrak petroleum eter alga merah dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dan dilarutkan dalam 0,5 mL kloroform. Selanjutnya, ekstrak ditambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrida dan 1-2 mL larutan H 2 SO 4 pekat melalui dinding tabung reaksi. Golongan senyawa steroid akan menunjukkan warna biru kehijauan [17] dan senyawa triterpenoid akan menunjukkan cincin kecoklatan atau violet pada pembatas dua pelarut [16].

## 2.7. Isolasi Steroid dan Triterpenoid dengan Kromatografi Kolom Basah Variasi Komposisi Eluen
Ekstrak alga merah yang menunjukkan positif steroid dan triterpenoid diisolasi menggunakan kromatografi kolom basah dengan fase diam silika gel G60. Bubur silika dibuat dengan ditambahkan pelarut n-heksana:etil asetat (16:4; 17:3; 18:2) sampai silika terendam dan diaduk dengan magnetic stirer pada suhu ruang sampai terbentuk suspensi. Suspensi tersebut kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan didiamkan selama 24 jam. Setelah itu, sampel sebanyak 0,1 g yang sudah dilarutkan dalam 1 mL eluen n-heksana:etil asetat (16:4) dimasukkan dalam kolom kromatogafi [13]. Perlakuan yang sama diulangi dengan untuk eluen dengan komposisi 17:3 dan 18:2. Kecepatan alir diatur 2 mL/menit dan eluat ditampung pada botol vial. Proses elusi dihentikan setelah semua senyawa steroid dan triterpenoid diperkirakan telah keluar dari kolom.

## 2.8. Monitoring Hasil Kromatografi Kolom Basah dengan Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Analitik
Identifikasi  fraksi  hasil isolasi  kromatografi kolom  dilakukan  dengan  KLT analitik. Identifikasi  dengan  KLT  analitik menggunakan  fase  diam  plat  silika  gel  GF 254 dan  eluen  berupa  pelarut  campuran  n-heksana  dan  etil  asetat  dengan perbandingan 17:3. Sebelum digunakan, eluen dijenuhkan selama 1 jam, sedangkan plat silika gel diaktivasi dengan dioven pada  suhu  110°C.  Kemudian,  fraksi  ditotolkan  pada  silika  gel  yang  telah  diaktivasi,  dimasukkan  ke  dalam  bejana pengembang yang berisi eluen jenuh, dan dielusi sampai tanda batas atas. Noda hasil pemisahan kemudian diamati di bawah sinar UV pada panjang gelombang 366 nm dan dihitung faktor retensi (Rf) noda [18].

## 2.9. Identifikasi Gugus Fungsi dengan Spektrofotometer FTIR
Senyawa  hasil  isolasi  kemudian  dilakukan  identifikasi  dengan  menggunakan  spektrofotometer  FTIR.  Isolat  yang diperoleh dijadikan pelet KBr dengan cara digerus bersamaan dengan KBr mengguanakan mortar agate kemudian ditekan dengan tekanan 80 Torr. Selanjutnya, sampel yang sudah berupa pelet dimasukkan ke dalam spektrofotometer FTIR untuk dianalisis gugus fungsi.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1. Identifikasi Sampel
Kadar  air  yang  tinggi  dapat  menurunkan  konsentrasi  pelarut  yang  digunakan  pada  ekstraksi  maserasi.  Kadar  air maksimal  untuk  memenuhi  syarat  maserasi  yaitu  <11%  [19].  Kandungan  kadar  air  pada  alga  merah  sebesar  4,56%. Ekstraksi maserasi dengan pelarut metanol akan menyebabkan proses difusi dari steroid dan triterpenoid yang terkandung dalam sampel ke pelarut. Steroid dan triterpenoid bersifat non polar tetapi karena senyawa tersebut terikat dengan ikatan glikosida yang bersifat polar, maka untuk mengekstraknya dibutuhkan pelarut polar yaitu metanol. Dari 100 g sampel yang dimaserasi dengan 1,5 L metanol diperoleh rendemen sebesar 11,866%. Selanjutnya, ikatan glikosida tersebut diputus melalui hidrolisis dengan penambahan HCl. Pengambilan steroid dan triterpenoid dalam bentuk aglikon dilakukan dengan
(2)
menggunakan  petroleum  eter.  Fase  organik  diambil  dan  dipisahkan  dari  pelarutnya  menggunakan rotary  evaporator vacuum dan rendemen yang diperoleh pada tahapan partisi sebesar 8,03% dari berat ekstrak awal 5,0004 g.

## 3.2. Isolasi Steroid dan Triterpenoid dengan Kromatografi Kolom Basah Variasi Komposisi Eluen
Fraksi pekat petroleum eter yang dilarutkan dengan reagen Lieberman Burchard menghasilkan warna hijau yang menunjukkan senyawa steroid dan cincin coklat menunjukkan senyawa triterpenoid. Fase diam yang berupa bubur silika mengalami penurunan ketinggian dari 8 cm menjadi 7,5 cm, hal ini menunjukkan fase diam sudah termampatkan dan dapat memisahkan senyawa dengan maksimal. Hasil isolat ditampung setiap 2 mL dalam vial. Hasil monitoring variasi komposisi eluen 16:4 diperoleh dua kelompok fraksi yaitu 1 fraksi steroid dan 1 fraksi triterpenoid ( Tabel 1 ).
Tabel 1. Hasil Monitoring Variasi Eluen n-Heksana : Etil Asetat (16:4)
Fraksi Warna (UV 366 nm) Js* (cm) Je* (cm) Rf Senyawa 1-8 - - - - - 9-10 Hijau 4,9 8 0,6125 Steroid 11-12 Hijau 4,85 8 0,606 Campuran Hijau 2,8 8 0,35 13 Hijau 2,8 8 0,933 Campuran Ungu 2,3 8 0,288 14-19 Hijau 2,75 8 0,344 Campuran Ungu 2,35 8 0,294 Merah 1,5 8 0,188 20 Hijau 2,9 8 0,363 Campuran Ungu 2,5 8 0,313 Merah 1,1 8 0,138 21-25 Merah 1,1 8 0,138 Campuran Merah 1,05 8 0,131 46-200 - - - - - *Js = jarak senyawa, Je = jarak elusi
Hasil  monitoring  variasi  komposisi  eluen  17:3  diperoleh  tiga  kelompok  fraksi  yaitu  1  fraksi  steroid  dan  2  fraksi triterpenoid ( Tabel 2 ). Hasil monitoring variasi komposisi eluen 18:2 diperoleh lima kelompok fraksi yaitu 2 kelompok fraksi steroid dan 3 kelompok fraksi triterpenoid ( Tabel 3 ). Jadi, dapat disimpulkan bahwa variasi komposisi eluen terbaik untuk isolasi steroid dan triterpenoid adalah 18:2 karena diperoleh hasil fraksi tunggal yang lebih banyak.
Tabel 2. Hasil Monitoring Variasi Eluen n-Heksana : Etil Asetat (17:3) Fraksi Warna (UV 366 nm) Js* (cm) Je* (cm) Rf Senyawa 1-8 - - - - - 9-10 Hijau 5,25 8 0,6563 Steroid 11-12 Hijau 5,2 8 0,65 Campuran Merah 3,75 8 0,4688 13-16 Merah 3,8 8 0,475 Triterpenoid 17-19 Merah 3,85 8 0,4813 Campuran Hijau 3,15 8 0,3938 Ungu 2,7 8 0,3375 20-29 Hijau 3,1 8 0,3875 Campuran Ungu 2,7 8 0,3375 30-37 Hijau 3,2 8 0,4 Campuran Merah 1,8 8 0,225 38-39 - - - - - 40-67 Merah 1,8 8 0,225 Campuran Merah 1,15 8 0,1438 68-90 Merah 1,2 8 0,15 Triterpenoid 91-200 - - - - - *Js = jarak senyawa, Je = jarak elusi
Tabel 3. Hasil Monitoring Variasi Eluen n-Heksana : Etil Asetat (18:2)
Fraksi Warna (UV 366 nm) Js* (cm) Je* (cm) Rf Senyawa 1-11 - - - - - 12-19 Hijau 4,75 8 0,594 Steroid 20-21 - - - - - 22-29 Merah 3,5 8 0,438 Triterpenoid 30-34 Merah 3,6 8 0,45 Campuran Hijau 3,1 8 0,388 Ungu 2,6 8 0,325 35-49 Hijau 2,9 8 0,3625 Campuran Ungu 2,5 8 0,3125 50-65 Hijau 2,8 8 0,35 Steroid 66-70 - - - - - 71-119 Merah 1,85 8 0,231 Triterpenoid 120-122 Merah 1,85 8 0,231 Campuran Merah 1,2 8 0,15 123-199 Merah 1,2 8 0,15 Triterpenoid 200 - - - - *Js = jarak senyawa, Je = jarak elusi

## 3.3. Identifikasi Senyawa dengan Spektrofotometer FTIR
Hasil identifikasi menggunakan spektrofotometer FTIR ditunjukkan pada Gambar 1 . Kelima isolat memiliki serapan O-H  pada  bilangan  gelombang  3550-3200  cm -1 ,  serapan  Csp 3 -H  pada  3000-2800 cm -1 , C=C  pada  1690-1620  cm -1 ,  – C(CH 3 ) 2 pada 1396-1365 cm -1 dan C-O alkohol pada 1205-1030 cm -1 . Adapun perbedaan dari kelima hasil serapan FTIR tersebut adalah pada triterpenoid 3 tidak memiliki serapan C=C-H siklik pada 995-650 cm -1 , steroid 1 terdapat serapan C=O keton pada 1745-1715 cm -1 , steroid 2 terdapat serapan C=C general pada 1750-1735 cm -1 , triterpenoid 1 terdapat serapan C=O ester pada 1745-1735 cm -1 , triterpenoid 2 terdapat C=O asam karboksilat pada 1725-1700 cm -1 , sedangkan triterpenoid 3 terdapat serapan C=O keton pada 1745-1715 cm -1 .
Gambar 1 . Spektra FTIR fraksi tunggal variasi eluen n-heksana : etil asetat (18:2).

## 4. Kesimpulan
Fraksi pekat petroleum eter hasil hidrolisis ektrak metanol alga merah mengandung steroid dan terpenoid. Variasi komposisi eluen terbaik pada pemisahan senyawa steroid dan triterpenoid fraksi petroleum eter menggunakan kromatografi kolom basah adalah 18:2. Identifikasi gugus fungsi menggunakan FTIR pada steroid dan triterpenoid dengan eluen terbaik
% Tr an smi tan si Bilangan Gelombang (cm -1 )
diperoleh  5  kelompok  fraksi,  yaitu  2  kelompok  fraksi  steroid  dan  3  kelompok  fraksi  triterpenoid.  Hasil  identifikasi  dari senyawa  steroid  menghasilkan  serapan  O-H,  C-H  sp 3 ,  C=C,  -C(CH 3 ) 2 ,  sedangakan  pada  senyawa  triterpenoid menghasilkan serapan O-H, C-H sp 3 , C=O, C=C, C-O, -C(CH 3 ) 2 . Adanya gugus gem dimetil merupakan ciri khas rantai samping senyawa steroid dan triterpenoid.

## Daftar Pustaka
[1] S. Afif, A. G. Fasya, & R. Ningsih, “Ekstraksi, Uji Toksisitas dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif Alga Merah Eucheuma cottonii dari Perairan Sumenep Madura,” ALCHEMY: Journal of Chemistry, vol. 4, no. 2, pp. 101-106, 2015.
[2] A. G. Fasya, S. Amalia, D. S. Megawati, F. Salima, V. A. Kusuma, & B. Purwantoro, "Isolation, Identification, and Bioactivity of Steroids Isolates from Hydrilla verticillata Petroleum Ether Fraction," in IOP Conference Series: Earth and Environmental Science on the 10 th International Conference on Green Technology, vol. 456, no. 012009, 2020.
[3] A. Manilal, S. Sugathan, J. Selvin, S. Kiran, & C. Shakir, “In Vivo Antiviral Activity of Polysaccharide from the Indian Green Alga, Acrosiphonia orientalis (J. Agardh): Potential Implication in Shrimp Disease Management,” World Journal of Fish and Marine Sciences , vol. 1, no. 4, pp. 278-282, 2009.
[4] K. Zandi, S. Tajbakhsh, I. Nabipour, Z. Rastian, F. Yousefi, S. Sharafian, & K. Sartavi, “In Vitro Antitumor Activity of Gracilaria  corticata (a  Red  Alga)  against  Jurkat  and  Molt-4  Human  Cancer  Cell  Lines,” African Journal  of Biotechnology, vol. 9, no. 40, pp. 6787-6790, 2010.
[5] Z. Andriani, A. G. Fasya, & A. Hanapi, ”Aktivitas Antibakteri Ekstrak Alga Merah Eucheuma cottonii dari Pantai Tanjung, Sumenep,” ALCHEMY: Journal of Chemistry , vol. 4, no. 2, pp. 93-100, 2015.
[6] A. Hanapi, A. G. Fasya, U. Mardiyah, & Miftahurrahmah, “Uji Aktivitas Antioksidan dan Antibakteri Ekstrak Metanol Alga Merah Eucheuma spinosum dari Perairan Wongsorejo Banyuwangi,” ALCHEMY: Journal of Chemistry, vol. 2, no. 2, pp. 126-137, 2013.
[7] U. Mardiyah, A. G. Fasya, B. Fauziyah, & S. Amalia, “Ekstraksi, Uji Aktivitas Antioksidan dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif Alga Merah Eucheuma spinosum dari Perairan Banyuwangi,” ALCHEMY: Journal of Chemistry, vol. 3, no. 1, pp. 39-46, 2014.
[8] A. G. Fasya, A. P. Tyas, F. A. Mubarokah, R. Ningsih, & A. D. R. Madjid, “Variasi Diameter Kolom dan Rasio Sampel- Silika  pada  Isolasi  Steroid  dan  Triterpenoid  Alga  Merah Eucheuma  cottonii dengan  Kromatografi  Kolom  Basah,” ALCHEMY: Journal of Chemistry , vol. 6, no. 2, pp. 57-64, 2018.
[9] A. G. Fasya, A. Baderos, A. D. R. Madjid, S. Amalia, & D. S. Megawati, "Isolation, Identification, and Bioactivity of Steroids Compounds from Red Algae Eucheuma cottonii Petroleum Ether Fraction," in AIP Conference Proceedings, vol. 2120, no.1, 2019 .
[10] E. Pridawati, A. Ahmad, & U. Hanapi, “Isolation and Identification of Secondary Metabolites of Chloroform Fraction of Macroalgae Padina australis as Anti Tuberculosis,” Indonesia Chimica Acta, vol. 7, no.1, pp. 1-8, 2014.
[11] I.  Sundari,  “Identifikasi  Senyawa  dalam  Ekstrak  Etanol  Biji  Buah  Merah  ( Pandanus  conoideus Lamk.),”  Skripsi, Universitas Sebelas Maret, Surakarta, 2010.
[12] M. I. Setiyawan, R. Ningsih, U.  Syarifah, & T. K. Adi, “Isolasi Senyawa Triterpenoid Fraksi Petroleum Eter Alga Merah ( Eucheuma spinosum ) Hasil Hidrolisis Ekstrak Metanol dan Identifikasinya Menggunakan FTIR,” Skripsi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2015.
[13] A. N. L. Sholikah, “Isolasi Senyawa Steroid dari Fraksi Petroleum Eter Hasil Hidrolisis Ekstrak Metanol Alga Merah ( Eucheuma spinosum ) Menggunakan Metode Kromatografi Kolom,” Skripsi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2016.
[14] E. S. Simaremare, “Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Gatal ( Laportea decumana (Roxb.) Wedd),” Pharmacy , vol. 11, no.1, pp. 98-107, 2014.
[15] AOAC, Official Methods of Analysis . Washington: Association of Official Analytical Chemists, 1995.
[16] S.  Khoiriyah,  A.  Hanapi,  &  A.  G.  Fasya,  “Uji  Fitokimia  dan  Aktivitas  Antibakteri  Fraksi  Etil  Asetat,  Kloroform  dan Petroleum Eter Ekstrak Metanol Alga Coklat Sargassum vulgare dari Pantai Kapong Pamekasan Madura,” ALCHEMY, vol. 3, no.2, pp. 133-144, 2014.
[17] L.  Indrayani,  H.  Soetjipto,  &  L.  Sihasale,  “Skrining  Fitokimia  dan  Uji  Toksisitas  Ekstrak  Daun  Pecut  Kuda ( Stachytarpheta jamaicensis L. Vahl) terhadap Larva Udang Artemia salina Leach,” Berkala Penelitian Hayati , vol. 12 no. 1, pp. 57-61, 2006.
[18] A. N. Kristanti, N. S. Aminah, M. Tanjung, & B. Kurniadi, Buku Ajar Fitokimia . Surabaya: Airlangga University Press. 2008.
[19] A. Sulistijowati & D. Gunawan, “Efek Ekstrak Daun Kembang Bulan ( Tithonia diversifolia A. Gray) terhadap Candica albicans serta Profil Kromatografinya,” Media Penelitian dan Pengembangan Kesehatan , vol. 8, no. 3-4, pp. 32-37, 1998.
[20] G. Socrates, Infrared Characteristic Group Frequencies 2 nd Edition . New Jersey: John Wiley and Sons, 1994 .