## OPTIMASI PRODUKSI SENYAWA ANTIMIKROBIA PADA CELL FREE EXTRACT  HASIL FERMENTASI BAKTERI TERMOFILIK PASCA ERUPSI MERAPI

## OPTIMATION OF ANTIMICROBIAL SUBSTANCE PRODUCTION IN CELL FREE EXTRACT FROM THERMOPHYLIC BACTERIA FERMENTATION AFTER MERAPI ERRUPTION
Evy Yulianti*, Anna Rakhmawati, dan Kartika Ratna Pertiwi
Jurusan Pendidikan Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Yogyakarta
*email: evy_yulianti@yahoo.com
diterima 1 September 2015, disetujui 10 September 2015

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh variasi medium dengan pH (6,7,9),  kadar garam (0,5; 1; 2 %), dan  waktu  fermentasi  (24  dan  48  jam)  terhadap  aktivitas  cell  free  extract  yang  mengandung  senyawa  antimikrobia terhadap    tiga  mikrobia  uji  yaitu  Eschericia  coli,  Staphylococcus  aureus,  dan  Candida  albican.  Penelitian  meliputi tahapan produksi senyawa antimikrobia dengan medium yang berbeda pH, kadar garam, dan waktu fermentasi kemudian dilanjutkan  dengan  uji  senyawa  antimikrobia  terhadap  bakteri  dan  fungi  patogen  yaitu  Eschericia  coli,  Staphylococcus aureus,  dan  Candida  albican  menggunakan  metode  Kirby  Bauer  menggunakan  paper  disk.  Kadar  garam,  pH  dan  lama fermentasi  yang  berbeda  mempengaruhi  kemampuan  antimikrobia  cell  free  extract  yang  dihasilkan.  Perlakuan  yang menghasilkan CFE dengan aktivitas antimikrobia terbaik adalah perlakuan dengan waktu fermentasi 24 jam, dengan pH 7 dan  kadar  garam  2%  pada  S  aureus  dan  pH  6  kadar  garam  1%  pada  E  coli.  Cell  free  extract  yang  dihasilkan  tidak berpotensi  sebagai  antifungi  terhadap  Candida  albicans  kecuali  CFE  yang  dihasilkan  dari  proses  fermentasi  bakteri termofilik pada pH 7 dan kadar garam 1% selama 1 hari dengan indeks zona hambat sebesar 1,17.
Kata kunci: cell free extract, antimikrobia, pH, kadar garam, lama fermentasi

## Abstract
The aims of this study was to investigate the effect of medium with different pH (6,7,9), salt concentration (0,5; 1; 2 %)  and  fermentation  periode  (24  and  48  hr)  to  the  antimicrobial  activity  of  cell  free  extract  to  three  pathogens, Eschericia coli, Staphylococcus aureus, and Candida albican. This study consists of antimicrobial compounds production with  different  medium  and  continued  by  antimicrobial  tested  to  fungi  and  bacterial  pathogens  Eschericia  coli, Staphylococcus aureus, and Candida albican by Kirby Bauer  method with paper disk. Different salt concentration, pH and fermentation periode affected the  antimicrobial activity potency of cell free extract yielded by thermophylic bacteria. Treatment which yielded CFE with the best antimicrobial activity was treatment with 24 hr fermentation, pH 7 and salt concentration 2% to S aureus and pH 6 salt concentration 1% to E coli. Cell free extract had no potency as antifungi to Candida albicans except CFE yielded by thermophylic bacteria fermented in medium with pH 7 and salt concentration 1% in 24 hr with inhibition zone index 1,17.
Keywords: cell free extract, antimicrobial, pH, salt concentration, fermentation period

## Pendahuluan
Resistensi  sel,  bakteri  patogen  dan  virus mengalami  peningkatan  dan  beberapa  obat  terapi yang  sudah  ada  tidak  lagi  efektif  untuk mengatasinya.  Produk  alami  memiliki  potensi sebagai  dasar  agen  terapi  untuk  permasalahan tersebut  [1,2].  Mikroorganisme  menggunakan berbagai  macam  cara  untuk  meningkatkan resistensinya terhadap obat.  Bisa melalui transfer gen horisontal (plasmid, transposon and
bacteriophages),  rekombinasi  dengan  DNA  asing pada  kromosom  bakteri  dan  mutasi  pada  lokus kromosom yang berbeda [3].
Bakteri merupakan sumber senyawa kimiawi yang  tidak  habis-habisnya,  yang  menghasilkan berbagai macam metabolit sekunder aktif. Bakteri yang  berasal  dari  laut  biasanya  merupakan  target untuk  bioteknologi  industri  karena  memiliki sejumlah  besar  senyawa  bioaktif.  Produksi
senyawa  bioaktif  ini  disebabkan  karena  tekanan lingkungan di mana tumbuhnya, seperti kompetisi,  perlawanan  terhadap  predator  dan reproduksi  [4].  Setelah  penemuan  penicillin, mikrobia telah banyak digunakan sebagai sumber agen bioaktif. Aplikasi terapi dari metabolit yang dihasilkan  mikrobia  telah  memberikan  peluang untuk  penemuan  antibiotik  lain  seperti  penicillin, erythromycin,  streptomycin,  amphotericin  and polyketides [5].
Antibiotika  merupakan  metabolit  sekunder yang  dihasilkan  oleh  organisme  tertentu,  yang dalam  jumlah  kecil  mampu  membunuh  atau menghambat pertumbuhan organisme lain. Antibiotika dapat diklasifikasikan menjadi antibakteri, anti jamur, anti amoeba dan lain lain. Beberapa  antibiotik  diperoleh  dari  berbagai mikroorganisme  yang  tumbuh  dalam  lingkungan yang  ekstrim,  seperti  daerah  suhu  tinggi,  suhu rendah,  laut  bagian  dalam,  padang  pasir,  lapisan es, sumber air panas dan minyak [6].
Bakteri  memproduksi  antibiotika  pada  fase stasioner dalam siklus kehidupannya, karena pada fase  ini  mulai  terjadi  persaingan  mendapatkan nutrisi.  Untuk  memenangkan  persaingan,  bakteri memproduksi  antibiotik  untuk  menghambat/ membunuh pertumbuhan mikroorganisme lainnya.  Isolasi  antibiotika,  umumnya  bakteri penghasil  antibiotika  ditanam  (difermentasi) dalam  medium  cair  tertentu  sampai  fase stasionernya.  Proses  fermentasi  bakteri  harus berlangsung  pada  kondisi  optimal,  baik  kondisi nutrisi maupun kondisi lingkungannya. Supernatan dari cairan fermentasi dipisahkan dari sel  bakteri  melalui  berbagai  metode,  seperti sentrifugasi, filtrasi atau melalui pengendapan [8]. Semakin  diperlukannya  senyawa  antimikrobia baru  yang  lebih  poten  menyebabkan  semakin banyak penelitian mengenai senyawa antimikrobia  ini,  seperti  eksplorasi  organisme penghasil  antimikrobia,  identifikasi  senyawa antimikrobia  yang  dihasilkan  sampai  optimasi produksi  senyawa  antimikrobia.  Penelitian  ini akan  difokuskan  pada  optimasi  kondisi  medium fermentasi  yang  dapat  menghasilkan  senyawa antimikrobia  yang  memiliki  potensi  paling  besar dalam  menghambat  pertumbuhan  3  mikroba  uji, yaitu Eschericia coli, Staphylococcus aureus, dan Candida albican.

## Metode Penelitian
Bahan  yang  digunakan  antara  lain  adalah isolat  bakteri  termofilik  yang  diperoleh  dari  Kali
Gendol  pasca  erupsi  Merapi,  Medium  Nutrient Broth  (NB  Oxoid),  Nutrient  Agar  (NA  Oxoid), Potato  Dextrose  Agar  (PDA  Oxoid),  paper  disk microbial  test  blank  (Oxoid),  NaCl  (Merck), NaOH  (Merck),  HCl  (Merck),  kertas  saring, tissue, tabung flakon, tabung 1,5 mL (Eppendorf)
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini antara  lain  adalah  tabung  reaksi  (Pyrex), Timbangan  analitik  (AND HF-300),  Laminar  Air Flow (LAF Shimadzu type SCB-1000A), petridish  (Pyrex),  erlenmeyer  (Pyrex),  ose, mikropipet (Sibata), autokalf (ALP-KT23), lemari es,  sentrifuge  (Kokusan  type  H-103),  inkubator (Eyela  type  SLI-600N),  jangka  sorong,  water bath, shaker, vortex (Sibata), hot plate (Eyela type BI-63).
Persiapan  inoculum.  Bakteri  termofilik ditumbuhkan  pada  nutrient  agar  miring  dan diinkubasi  pada  suhu  55°C  selama  24  jam. Reisolasi  dilakukan  untuk  membuat  kultur  baru dengan  menggunakan  ose  steril  dan  inkubasi dilakukan  lagi  pada  55°C  selama  24  jam. Inokulum  disiapkan  pada  medium  Nutrien  Broth 100  ml.    Media  disiapkan  dalam  erlenmeyer 250ml  dan  diautoklaf  pada  suhu  121°C  dan tekanan 15 psi selama 15 menit. Dari NA diambil 1 ose dan dipindahkan ke medium NB.
Batch  fermentation.  Medium  NB  dibuat dengan  pH  yang  berbeda  (5,7,9)  dan  ditambah NaCl  dengan  konsentrasi  0,5%,  1%  dan  2% dalam  1,5  liter  akuades  dan  digunakan  sebagai medium produksi. Medium yang sudah disterilisasi (200ml) dimasukkan dalam Erlenmeyer  250ml.  Inokulum  (10%)  dimasukkan dalam erlenmeyer. Dan diinkubasi lagi pada suhu 55°C  selama  24  dan  48jam.  Setelah  waktu inkubasi  selesai,  sampel  dimasukkan  tabung konikel  15  mL,    disentrifugasi  selama  30  menit dengan  kecepatan  3.000  rpm  untuk  memperoleh supernatant yang tidak mengandung sel.
Uji  antimikroba.  Uji  antimikroba  dilakukan dalam dua langkah :
1. Uji antijamur.
Cell free extract dari masing-masing perlakuan  diambil  10  µl  lalu  diteteskan  pada paper disk dengan diameter 5 mm. PDA steril (20  ml)  dibiarkan  mengeras  kemudian diinokulasi  dengan  100  µl  bibit  jamur Candida  albicans  dan  didiamkan  selama  30- 60  menit.  Setelah  itu  dimasukkan  keping paper  disk  yang  telah  diberi  CFE.  Diameter penghambatan  di  sekitar  keping  paper  disk diukur setelah 24 jam pada suhu 37 o C.
2. Uji antibakteri
Cell free extract dari masing-masing perlakuan  diambil  sekitar  10  µl  lalu diteteskan pada paper disk dengan diameter 5 mm.  NA  steril  (20  ml)  dibiarkan  mengeras kemudian  diinokulasi  dengan  100  µl  bibit bakteri E coli dan Staphylococcus aureus dan didiamkan  selama  30-60  menit.  Setelah  itu dimasukkan  keping  paper  disk  yang  telah diberi  CFE.  Diameter  penghambatan  di sekitar  keping  paper  disk  diukur  setelah  24 jam pada suhu 37 o C.

## Hasil dan Pembahasan
Hasil penelitian menunjukkan bahwa masing-masing  cell  free  extract  yang  dihasilkan dari inkubasi  dengan  medium  yang  berbeda-beda mempunyai aktivitas yang berbeda-beda terhadap 3  patogen  yang  diujikan.  Hasil  uji  antimikrobia dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil Uji antimikrobia CFE hasil fermentasi dengan medium yang berbeda
Hari pH Kadar garam (%) Rata-rata indeks zona hambat SA EC CA
1 6 0,5  1,64  0,49
1  1,47  0,98 2  0,73  0,83 7 0,5  1,09  0,61 1  1,22  0,63  1,17
2  2,01  0,51
9 0,5  1,13  0,69 1  0,95  0,74 2  0,39  0,58 kontrol 1,33  0,51 2 6 0,5  1,08  0,23 1  0,62  0,35 2  1,06  0,68 7 0,5  1,36  0,97 1  1,46  0,33 2  1,63  0,39 9 0,5  2,00  0,56 1  1,16  0,81 2  1,36  0,34 kontrol 1,23  0,80
Ket  :  SA  =  Staphylococcus  aureus,  EC  =  Eschericia  coli,  dan CA = Candida albicans
Berdasarkan  Tabel  1,  tampak  bahwa  semua cell  free  extract  yang  dihasilkan  tidak  berpotensi sebagai  antifungi  terhadap  Candida  albicans kecuali  CFE  yang  dihasilkan  dari  proses
fermentasi bakteri termofilik pada pH 7 dan kadar garam  1%  selama  1  hari  dengan  indeks  zona hambat sebesar 1,17. Hasil uji aktivitas CFE hasil fermentasi  dapat  dilihat  pada  Gambar  1  dan Gambar 2.
Gambar 1. Indeks zona hambat pada S aureus
Dari  Gambar  1  tampak  bahwa  perlakuan terbaik  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri S aureus  pada pH media 7 dengan  kadar garam  2%  dan  waktu  fermentasi  24  jam, sedangkan perlakuan yang menghasilkan kemampuan  antimikrobia  terhadap  bakteri  ini yang  paling  rendah  perlakuan  pH  9  dan  kadar garam 2% dengan lama fermentasi 24 jam.

## Gambar 2. Indeks zona hambat pada E coli
Gambar  2  menunjukkan  bahwa  perlakuan terbaik  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri  E  coli    pada  media  pH  6  dengan  kadar garam  1%  dan  waktu  fermentasi  24  jam, sedangkan perlakuan yang menghasilkan kemampuan  antimikrobia  terhadap  bakteri  ini yang  paling  rendah  adalah  perlakuan  media dengan pH 6 dan kadar garam 0,5% dengan lama fermentasi 48 jam.
Secara umum aktivitas CFE dengan berbagai perlakuan  menghasilkan  aktivitas  antimikrobia yang lebih tinggi pada S aureus bila dibandingkan dengan E coli seperti yang terlihat pada Gambar 1
dan  2.  Perlakuan  yang  memberikan  CFE  dengan sifat  antibakteri  terbaik  pada  kedua  bakteri  uji adalah  perlakuan  dengan  waktu  fermentasi  24 jam,  dengan  pH  7  dan  kadar  garam  2%  pada  S aureus dan pH 6 kadar garam 1% pada E coli.
Faktor  lingkungan  yang  mempengaruhi pertumbuhan  mikrobia  antara  lain  nutrien, kelembaban,  suhu,  pH,  tekanan  osmotik,  tekanan barometrik,  dan  komposisi  atmosfer.  Produk alami  dari  mikrobia  merupakan  sumber  yang sangat  menjajikan  untuk  penemuan  antibiotik. Penelitian  antibiotika  baru  atau  pencarian  strain baru  yang  dapat  menghasilkan  antimikrobia merupakan  program  penelitian  utama  di  seluruh dunia  karena  adanya  peningkatan  resistensi patogen  dan  terjadinya  adanya  toksisitas  pada beberapa  antibiotik  kimia  yang  sudah  ada.  Telah diketahui  sebelumnya  bahwa  desain  medium fermentasi  yang  cocok  adalah  hal  yang  sangat penting  dalam  produksi  senyawa  metabolit sekunder.  Adanya  pengetahuan  dan  pengalaman dalam  mengembangkan  medium  dasar  sangat penting  untuk  optimasi  medium.  Produksi metabolit  sekunder  melalui  prosess  fermentasi melibatkan  berbagai  faktor  lingkungan,  termasuk nutrien  (sumber  nitrogen,  fosfat  dan  karbon), kecepatan pertumbuhan, kontrol feedback, inaktivasi  nezim  dan  bermacam  kondisi  (suplai oksigen, suhu, cahaya dan pH).
Agen antimikrobia bekerja dengan menggunakan  lima  macam  mekanisme  umum, antara  lain  dengan  menghambat  sintesis  dinding sel,  merusak  membran  sel,  menghambat  sintesis asam  nukleat  (sintesis  DNA  atau  RNA), menghambat sintesis protein, menghambat aktivitas  enzim.  Senyawa  antimikrobia  dapat membunuh  bakteri  patogen  dengan  baik  karena memiliki  struktur  seluler  dan  jalur  metabolisme yang  berbeda,  sehingga  bakteri  patogen  dapat mati tanpa merusak sel inangnya yang berupa sel eukariotik.  Ada  dua  macam  senyawa  antibakteri, yaitu  bakterisidal  yang  dapat  membunuh  bakteri dan bakteriostatik yang menghambat pertumbuhan bakteri.
Antibiotik  merupakan  metabolit  sekunder yang  dihasilkan  oleh  mikroorganisme  pada  fase stasioner  siklus  pertumbuhan  mikrobia,  memiliki bermacam  struktur  kimia  yang  berbeda  beda  dan memiliki  aktivias  biologis  yang  berbeda  juga. Salah satu jenis antibiotik yang ditemukan dalam cell  free  extract  hasil  fermentasi  adalah  berupa Antimicrobial Peptide (AMP).
Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa AMP,  baik  yang  sintetik  maupun  alami  bisa
meningkatkan sistem imun dan berpotensi sebagai antibiotik yang potensial. Adanya ikatan elektrostatik  antara  komponen  bakteri  yang bermuatan  negatif  dan  AMP  yang  bermuatan positif  dipercaya  berperanan  penting  untuk membuat  ikatan  yang  kuat  dan  selektif  di  dalam merusak  membran  sel  bakteri.  Sebagian  besar AMP  dapat  membunuh  bakteri  baik  yang  gram positif  maupun  gram  negatif.  Peptida  yang ditemukan  memiliki  memiliki  kemampuan  dalam menetralkan lipopolisakarida (LPS) dan kemampuan  untuk  meningkatkan  respon  imun adaptif    (Hoskin,    D.  W.  and  Ramamoorthy,  A., 2008).
AMP secara umum bersifat kationik (memiliki  muatan  pada  pH  netral  antara  +2 sampai  +9)  dan  bersifat  amfipatik,  yang memungkinkan  peptida  ini  berinteraksi  dengan membran  dan  merusak  lipid  membran.  Sebagian besar AMP memiliki struktur yang pendek, hanya terdiri  dari  5  sampai  40  residu  asam  amino,  dan sedikit jumlahnya  yang  memiliki  panjang  sampai lebih  dari  40  residu.  Residu  yang  mempunyai muatan  positif  seperti  Lys  dan  Arg  dan  sebagian mempunyai  residu  yang  bersifat  hidrofobik (~30%  atau  lebih)    biasanya  ditemukan  pada peptida ini. Sifat penting yang dimiliki oleh AMP, seperti  tritrpticin,  lactoferricins  dan  indolicidin, mereka  kaya  akan  residu  Trp  dan  Arg  residues. Studi telah menunjukkan bahwa semua analog D- amino-acid memiliki aktivitas yang identik, tetapi memiliki  khiralitas  yang  berkebalikan  dengan semua  L-peptida;  sifat  ini  digunakan  untuk mendesain  AMP  yang    tahan  terhadap  degradasi proteolitik. Tidak seperti antibiotik yang konvensional  yang  biasanya  berinteraksi  hanya dengan  target  khusus,  sebagian  besar  kationik AMP memliki target membran sel dari mikroorganisme yang menyerang, dan menyebabkan  sel  lisis  dan  mati  (Hoskin,    D.  W. and Ramamoorthy, A., 2008).
Dalam  penelitian  ini,  pengaruh  kadar  garam dan  pH  dalam  produksi  antimikrobia  adalah dengan mempengaruhi stabilitas protein antimikrobia yang
dihasilkan. Dalam memproduksi suatu senyawa antimikrobia, melibatkan  bermacam  enzim  yang  bekerjanya sangat  dipengaruhi  oleh  pH.  pH  medium  akan mempengaruhi  kestabilan  senyawa  antimikrobia yang  dihasilkan  dan  disekresikan  keluar  sel  oleh bakteri  termofilik.  Karena  dengan  pH  dapat merubah  muatan  yang  ada  pada  asam  amino penyusun  senyawa  antimikrobia.  Sehingga  dapat menyebabkan  aktivitasnya  berubah.  Untuk  itu
setiap  senyawa  antimikrobia  membutuhkan  pH yang  sesuai  untuk  menjaga  kestabilan  struktur aktifnya.  Pengaruh  kadar  garam  dalam  penelitian ini  adalah  mempengaruhi  tekanan  osmotik  sel bakteri  termofilik.  Setiap  bakteri  memiliki kemampuan  untuk  bertahan  hidup  pada  kadar garam  yang  berbeda.  Pada  tingkat  salinitas tertentu bakteri dapat bertahan hidup

## Simpulan
Kadar  garam,  pH  medium  dan  lama fermentasi mempengaruhi kemampuan antimikrobia  cell  free  extract  yang  dihasilkan. Perlakuan  yang  menghasilkan  CFE  dengan aktivitas  antimikrobia  terbaik  adalah  perlakuan dengan  waktu  fermentasi  24  jam,  dengan  pH  7 dan  kadar  garam  2%  pada  S  aureus  dan  pH  6 kadar  garam  1%  pada  E  coli.  Cell  free  extract yang dihasilkan tidak berpotensi sebagai antifungi terhadap  Candida  albicans  kecuali  CFE  yang dihasilkan dari proses fermentasi bakteri termofilik pada pH 7 dan kadar garam 1% selama 1 hari dengan indeks zona hambat sebesar 1,17.

## Ucapan Terima Kasih
Terimakasih peneliti ucapkan kepada Fakultas  MIPA  yang  telah  memberikan  dana untuk pelaksanaan penelitian ini.

## Pustaka
[1] Fawzy  G  A,  Al-Taweel  A  M  and  Melake  N A.  (2011)  In  Vitro  Antimicrobial  and  Anti- Tumor.    Activities  of  Intracellular  and Extracellular  extracts  of  Aspergillus  niger and  Aspergillus  flavus  var.  columinarisJ.
Pharm. Sci. & Res. 3(1), 980-987.
[2] Strobel G And Daisy B. (2003) Bioprospecting  For  Microbial  Endophytes
And  Their  Natural  Products.  Microbiology And Molecular Biology Reviews  P. 491–502 [3] Alam M. J. Awal M. R, Sharifuzzaman M. A, Fatema  K  and  Sultana  M.  S.  (2013) Antibiogram and plasmid profiling of E. coli isolates  and  assessment  of  antibacterial activity  of  their  extracellular  synthesized silver  nanoparticles.  Current  Research  in Microbiology  and  Biotechnology  1,  5  :245- 250
[4] Gómez  V  L  J.,  Soria-I  E.,  Rivas  G  G-  and Sánchez  A  N  E.  (2010)    Antibacterial  and anticancer  activity  of  seaweeds  and  bacteria associated  with  their  surface,  Revista  de Biología  Marina  y  Oceanografía  45  (2), 267-275
[5] Phonnok S., Tanechpongtamb W U
Wongsatayanon  B  T.  (2010)  Anticancer  and apoptosis-inducing  activities  of  microbial metabolites. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458 DOI: 10.2225/vol13-5
[6] Sulistiyaningsih.  (2008)  Identifikasi  Isolat Bakteri  Penghasil  Zat  Antibakteri  Dari
Cairan  Kantung  Tanaman  Kantong  Semar (Nepenthes  ampullaria,  Jack).  Laporan Penelitian Mandiri. Fakultas Farmasi
Uiversitas Padjadjaran. Bandung [7] Hoskin,  D. W. and Ramamoorthy, A. (2008) Studies on Anticancer Activities of Antimicrobial  Peptides.  Biochim  Biophys
Acta. 2008 February ; 1778(2): 357–375