## IDENTIFIKASI JENIS LEBAH MADU ASAL KEPULAUAN SULA MENGGUNAKAN APLIKASI DNA BARCODE LCO GEN
Abdu Mas’ud 1 *, Said Hasan 1 , Sundari 2 1 Program Studi Magister Pendidikan Biologi, Universitas Khairun, Jl Jusuf Abdulrahman Kel. Gambesi, Kota Ternate Selatan, Maluku Utara
2 Program Studi Pendidikan Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Khairun, Jl Bandara Babulah, Kel. Akehuda, Kota Ternate Utara, Maluku Utara *Corresponding author, e-mail: abdumasud@unkhair.ac.id

## A B S T R A C T
Sanana  Honey  is  a  local  brand,  a  type  of honey  produced  by forest  bees which  is well known in the Sula Islands, North Maluku. The forest bees of the Sula Islands have  the  potential  to  be  developed  as  a  producer  of  quality  honey.  At  this  time there  has  been  no  scientific  report  regarding  the  types  and  characteristics  of  the forest  bee  species  from  the  Sula  Islands.  This  study  aims  to  identify  the  types  of honey-producing forest bees by applying the LCO gene DNA barcode. The methods used  in  this  study  used:  1)  DNA  extraction  from  bee  body  tissues  using  the  DNA Miniprep  Kit  procedure  (Zymo  Research,  D6016);  2).  DNA  amplification  by  PCR amplification  procedure  with  TOYOBO  KOD  FX  Neo  (KFX-201);  3)  bidirectional DNA sequencing process (Bi-directional sequencing). The results showed that the specimen was successfully amplified with an amplicon size of 677 bp. Furthermore, the results of BLASTN analysis revealed that the sequence has a 97.78% similarity with the Apis cerana mitochondria complete genome gene country of Russia, but is phylogenetically different between the two .
Keywords : Apis cerana , Bee, DNA Barcode, LCO, Spesies

## PENDAHULAN
Maluku  Utara  merupakan  wilayah  Indonesia  yang  beriklim  tropis  dan memiliki  keanekaragaman  jenis  flora  dan  fauna  yang  tinggi.  Salah  satu keanekaragaman fauna yang dimiliki adalah lebah madu. Kepulauan Sula merupakan salah satu sentra penghasil madu yang dikenal dengan nama madu Sanana. Pada saat ini belum ada informasi ilmiah terkait  identifikasi dan posisi takson dari jenis lebah madu  yang  terdapat  di  kepulauan  Sula.  Potensi  lebah  penghasil  madu  ini  perlu mendapatkan  perhatian,  sehingga  perlu  adanya  identifikasi  jenis  lebah  madu  di kepulauan  Sula.  Beberapa  macam  spesies  lebah  madu  yang  terdapat  di  Indonesia, yaitu Apis  cerana , A.  mellifera,  A.  Koschevnikovi,  A.  dorsata , A.  nigrocincta , A. andreniformis (Nuraini & Purwanto, 2021).
Keanekaragaman genetik dari lebah madu akan memberikan informasi terkait korelasi keanekaragaman dengan potensi pengembangan atau  pendayagunaan  dari spesies  lebah  di  suatu  wilayah  (Nuraini  &  Purwanto,  2021).  Informasi  terkait keanekaragaman genetik yang tinggi akan menguntungkan  bagi pembudidaya lebah, hal ini dikarenakan adanya profil genetic dari obyek kajian lebah. Selanjutnya profil genetic akan memberikan kontribusi dalam penentuan teknik persilangan antar lebah untuk  menghasilkan  jenis  lebah  unggul.  Setiap  jenis  lebah  madu  memiliki
kemampuan beradaptasi pada perubahan lingkungan yang berbeda sehingga mampu bertahan  hidup  disuatu  wilayah  yang  berbeda  pula.  Keanekaragaman  genetik  lebah madu dapat termanifestasi pada variasi ciri-ciri morfologi lebah. Karakter morfologi lebah dapat memberikan informasi  penting untuk menentukan pertumbuhan spesies lebah.  Selanjutnya  database  karakter  morfologi  juga  dapat  berkontribusi  dengan teknik  pengumpulan  polen,  karena  polen  bernutrisi  tinggi  sangat  penting  bagi pertumbuhan larva dan perkembangan fisiologis lebah pekerja (Keller et al , 2005). Beberapa  hasil  penelitian  tentang  keanekaragaman karakter  morfologi  lebah madu  di  Palawan  Filipina  (Tilde, et  al ,  2000),  di  Bengkulu  Indonesia  (Novita  & Sutriyono,  2013),  di  Sulawesi  Tengah  (Nuraini  dan  Purwanto,  2021)  dan    Erwan (2003) melaporkan  bahwa secara morfologi kapasitas kantung madu tergantung dari ukuran tubuh pada  lebah pekerja. Penelitian terkait karakter morfologi lebah madu di  kepulauan  Sula  sejauh  ini  belum  dilakukan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengidentifikasi  jenis  lebah  hutan  penghasil  madu  dari  kepulauan  Sula  dengan aplikasi  DNA  barcode  LCO  gen.  Hasil  penelitian  ini  dapat  memberikan  informasi ilmiah  sebagai  database  fauna  berpotensi  untuk  budidaya  madu  di  kepulauan  Sula berbasis data molekuler.
Aplikasi  DNA  barcode  sebagai  teknik  molekuler  untuk  identifikasi  spesies umumnya  menggunakan  DNA  mitokondria  (mtDNA)  untuk  identifikasi  hewan, sedangkan  DNA  kloroplas  (cpDNA)  untuk  identifikasi  tumbuhan.  Beberapa keunggulan  DNA  mitokondria  diantaranya  sangat  efisien  dengan  93%  mewakili wilayah  pengkodean  (Chinnery  &  Hudson,  2013),  pewarisan  secara  maternal (Sharma & Sampath, 2019), tingkat mutasi tinggi (Susanti et al, 2018), dan replikasi yang  berlangsung  terus  menerus  (Muthiadin et  al ,  2018).  Pada  saat  ini  DNA mitokondria digunakan secara luas pada studi genetika populasi, identifikasi spesies, identifikasi  penyakit,  filogeni  kedokteran  hewan,  dan  sebagainya  (Wibowo et  al , 2013).
Selanjutnya  untuk  mengidentifikasi  spesies  hewan  salah  satu  gen  pada  DNA mitokondria  yang  paling  populer  digunakan    adalah  gen Cytochrome  c  oxidase 1 (CO1).  Gen  CO1  telah  terbukti  mengungkap  identitas  spesies,  pola  filogeni  dan keanekaragaman genetik spesies air (Tan et al , 2019). Keberhasilan gen CO1 dalam identifikasi spesies  hewan  telah  ditunjukkan  dalam  beberapa  penelitian  identifikasi ikan pari di Australia Barat (Cerutti-Pereyra et al, 2012) dan Puckridge et al (2013) di Indonesia pasifik bagian barat dan Madduppa et al (2016) di Palabuhan Ratu, Muara Saban,  dan  Lampung.  Pada  penelitian  ini  digunakan  aplikasi  DNA  mitokondria  LCO untuk identifikasi sampel lebah madu asal Kepulauan Sula Maluku Utara.

## METODE
Sampel lebah madu berasal dari kabupaten Sanana di kepulauan Sula  Maluku Utara. Lebah disimpan dan diawetkan dalam etanol absolut.  Ektraksi DNA lebah yang digunakan  adalah  bagian  toraks  lebah  pekerja.    Selanjutnya  tahap  ekstraksi  DNA lebah menggunakan prosedur  Genomic DNA extraction with ZR Tissue & Insect DNA Miniprep Kit (Zymo Research, D6016). Tahap amplifikasi DNA menggunakan teknik PCR amplification with TOYOBO KOD FX Neo (KFX-201) dengan meggunakan primer LCO  forward  dan  reverse  spesifik  untuk  lebah  dan  kupu-kupu.  Tahap  sekuensing secara Bi-directional sequencing dan menggunakan jasa 1 st Base Malaysia. Data yang diperoleh dianalis dengan bantuan program komputer, antara lain: analisis    Alligment  DNA  dengan  program  MEGA  5,  BLASTn  sekuen  DNA  sampel dengan  urutan  DNA  yang  ada  di GenBank ,  pengambilan  urutan  DNA  dari GenBank ,
dan  konstruksi  pohon  filogenetik  Neighbour  Joining  (NJ)  menggunakan  program MEGA 5.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Data hasil ekstraksi DNA dari sampel lebah madu asal kepulauan Sula seperti pada  tabel  1,  merupakan  produk  tahap  awal  untuk  melakukan  proses  amplifikasi dengan menggunakan PCR.  Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh ( Tabel 1).
Tabel 1. Hasil ekstraksi  DNA  lebah madu asal kepulauan Sula
No  Sample Name Conc (ng/ml) A260/280 A260/230 Volume (microlit) 1 L1 10,9 2,00 0,14 30
Hasil  analisis  kuantitatif  diketahui  bahwa  dari  sampel  lebah  madu  asal kepulauan Sula memiliki konsentrasi DNA yang cukup bagus dengan kemurnian 2,00 mendekati  1,8.  Selanjutnya  dilakukan  amplifikasi  DNA  dengan  menggunakan  gen LCO.  Hasil  amplifikasi  gen  LCO  dan  elektroforesis  dari    sampel  lebah  madu  asal kepulauan Sula dideskripsikan  pada Gambar 1.

## Gambar 1. Elektrogram Hasil amplifikasi gen LCO Sampel Lebah Madu asal kepulauan Sula
Hasil  amplifikasi  gen  LCO  menunjukkan  pita  DNA  dengan  ukuran  ±  700  bp. Selanjutnya dilakukan analisi penelusuran BLASTn (NCBI genebank) diketahui bahwa sampel  lebah  madu  asal  kepulauan  Sula  memiliki  nilai  identik  dengan Apis  cerana mitochondria complete genom country Rusia dengan nilai identik 97,78%. Data hasil analisis kemiripan (BLASTn) dari  sampel  lebah madu Sanana seperti pada gambar 2. Selanjutnya untuk mengetahui posisi takson dan nama spesies dari sampel lebah madu  asal  kepulauan  Sula  maka  selanjutnya  dilakukan  analisis  filogenetik  dengan program  MEGA  5  dari  sampel  dan  dibandingkan  dengan  data  dari  genebank  hasil penelusuran  BLASTn  di  NCBI.  Dari  analisis  filogenetik  ini  dapat  diketahui  posisi takson dari sampel lebah madu asal kepulauan Sula. Data hasil analisis kekerabatan (filogenetik) dari sampel lebah madu asal kepulauan Sula  seperti pada gambar 3.
Gambar 2. Hasil BLASTn Sampel Lebah Madu asal kepulauan Sula dibandingkan dengan 10 Spesies terdata di NCBI

## Gambar 3. Filogenetik analisis Lebah madu asal kepulauan Sula
Hasil  analisis  filogenetik  dengan  metode  Neighbour  Joining  (NJ)  dari  sampel lebah madu asal kepulauan Sula diketahui memiliki posisi takson satu cluster dengan Apis  cerana dan  berbeda  sub  kluster  dengan  spesies Apis  cerana mitochondria complete  genom  country  Rusia,  namun  hasil  analisis  BLASTn  menunjukkan  nilai identik tertinggi yaitu sebesar   97,78%. Hal ini dapat dikatakan bahwa  lebah madu asal  kepulauan  Sula  satu  spesies  dengan Apis  cerana ,  namun  untuk  karakteristik khusus  karakter  morfologi  dan  molekuler  masih  perlu  dikonfirmasi  lebih  lanjut. Berdasarkan  hasil  penelitian  ini  diketahui  bahwa  aplikasi  DNA  barcode  gen  LCO untuk identifikasi spesies lebah madu  dapat memberikan informasi terkait prediksi nama  spesies  berdasarkan  nilai  kemiripan  ( identically )  sampel  dibandingkan  data base di NCBI.
Berdasarkan  uraian  di  atas  diketahui  bahwa  hasil  Analisis  BLASTn berdasarkan  urutan  nukleotida  dari  gen  LCO  sampel  lebah  madu  Sanana  memiliki kemiripan 97,78% dengan Apis cerana dengan posisi takson yang tidak satu node. Hal ini  dapat  diprediksi  bahwa  Sampel  lebah  madu  Sanana  memiliki  kemiripan  dengan Apis cerana namun dapat diprediksi bahwa sampel tersebut bukan Apis cerana .
Hasil analisis filogenetik dengan program MEGA 5 dan menggunakan metode Neighbour  Joining  (NJ)  dapat  menggambarkan  kejelasan  identifikasi  suatu  spesies, pada  umumnya  perbedaannya  dibatasi  oleh  suatu node dan  kluster.  Sampel    lebah madu  sanana  tidak  terletak  pada  satu  node  dengan Apis  cerana NCBI.  Pada  pohon filogenetik  suatu  spesies  dari  daerah  yang  berbeda  dapat  secara  bersama-sama berada pada kluster yang sama (Che et al . 2012).
Berdasarkan  hasil  analisis  di  atas  diketahui  bahwa  analisis  BLASTn  dan Filogenetik  menghasilkan  identifikasi  yang  sama  pada  level  genus  Apis  sp.  Analisis kekerabatan  dalam  penelitian  ini  menggunakan  gen  mitokondria  LCO.  Hal  ini dilakukan  karena  gen  mitokondria  memiliki  beberapa  keunggulan  dibandingkan dengan gen lain dalam proses analisisnya, terutama pada ordo Hymenoptera. Hal ini didukung oleh pernyataan Whitfield dan Cameron dalam Nuraini & Purwanto (2021) bahwa  gen  mitokondria  merupakan  gen  yang  paling  informatif  untuk  analisis filogenetik antara spesies atau populasi yang berkerabat dekat, antar suku, subfamili dan famili.
Penggunaan  gen  LCO  juga  dapat  memberikan  solusi  terhadap  permasalahan morfologi yang muncul seperti cryptic species dan sibling species . Selain itu, pemilihan gen  mitokondria  16S  rRNA  dan  CO1  pada  penelitian  ini  didasarkan  pada  jumlah database lebah Apis yang tersedia di website NCBI (https: //www.ncbi.nlm.nih.gov). Pada  data  NCBI  sekuens  spesies  lebah  Apis sebagian  besar  menggunakan  gen  16S rRNA  dan  CO1  dibandingkan  dengan  gen  lain,  sehingga  dapat  digunakan  sebagai sumber data untuk analisis atau perbandingan sekuens pada penelitian ini
SIMPULAN
Aplikasi  DNA  barcode  gen  mitokondria  LCO  untuk  identifikasi  spesies  lebah madu  asal  kepulauan  Sula  pada  penelitian  ini  memberikan  informasi  bahwa  lebah madu  asal  kepulauan  Sula  memiliki  kemiripan  dengan Apis  cerana ,  namun  posisi takson  dalam  analisis  filogenetik  menunjukkan  bahwa  spesies  lebah  madu  asal kepuauan Sula  berbeda  sub kluster  dengan Apis cerana . Efektifitas gen mitokondria LCO  untuk  identifikasi  spesies  lebah  pada  level  genus  yaitu  Apis  sp.  Saran  dan rekomendasi  perlu  konfirmasi  penggunaan  primer  16S  rRNA  untuk  memastikan identifikasi pada tingkat spesies.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terimakasih  kepada  LPPM  Universitas  Khairun  Ternate  yang  telah memberikan Dana Hibah penelitian Pasca Sarjana tahun anggaran 2021.

## REFERENSI
Cerutti-Pereyra, F., Meekan, M. G., Wei, N. W. V., O'Shea, O., Bradshaw, C. J., & Austin, C. M. (2012). Identification of rays through DNA barcoding: an application for ecologists. PLoS One , 7 (6), e36479. Chinnery, P. F., & Hudson, G. (2013). Mitochondrial Genetics. British Medical Bulletin , 106 (1), 135-159.
Che, J, Chen HM, Yang JX, Jin JQ, Jiang K,Yuan ZY, Murphy RW, dan Zhang YP. (2012). Universal  COI  primers  for  DNA  barcoding  amphibians. Mol  Ecol  Res , 12, 247-258. DOI: 10.1111/j.1755-0998.2011.03090.x.
Erwan.  (2003).  Pemanfaatan  Nira  Aren  dan  Nira  Kelapa  serta  Polen  Aren  sebagai Pakan  Lebah  untuk  Meningkatkan  Produksi  Madu Apis  cerana .  [Tesis]. Program Pascasarjana. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Keller, I., P. Fluri., and A. Imdorf. (2005). Pollen nutrition andcolony development in honey bees-part II. Bee Word , 86 (2), 27- 34. https://doi.org/10.1080/0005772X.2005.11099650.
Madduppa,  H.,  Ayuningtyas,  R.  U.,  Subhan,  B.,  &  Arafat,  D.  (2016).  Exploited  but unevaluated:  DNA  barcoding  reveals  skates  and  stingrays  (Chordata, Chondrichthyes) species landed in the Indonesian fish market. Indon J Mar Sci , 21 (2), 77-84.
Muthiadin, C., Aziz, I. R., & Darojat, A. Z. (2018). DNA Mitokondria Untuk Identifikasi Ikan yang Kaya Spesies. In Prosiding Seminar Biologi .
Novita,  R.  S.  &  Sutriyono.  (2013).  Analisis  morfometrik  lebah  madu  pekerja Apis cerana budidaya  pada  dua  ketinggian  tempat  yang  berbeda. Jurnal  Sains Peternakan  Indonesia 8:  41-  56.  https://doi.org/10.31186/jspi.id.8.1.41- 56
Nuraini  &  Purwanto,  H.  (2021).    Morphology,  morphometrics,  and  molecular characteristics of Apis cerana and Apis nigrocincta from Central Sulawesi, Indonesia
Jurnal Biologi Tropis, 21(2), 368 – 382. DOI: http://dx.doi.org/10.29303/jbt.v21i2.2614
Puckridge,  M.,  P.R.  Last,  W.T.  White  &  N.  Andreakis.  (2013).  Phylogeography  of  the Indo-West Pacific maskrays (Dasyatidae, Neotrygon): A complex example of chondrichthyan radiation in the Cenozoic. Jurnal Ecology ,  3, 21 – 32.
Sharma,  P.,  &  Sampath,  H.  (2019).  Mitochondrial  DNA  integrity:  role  in  health  and disease. Cells , 8 (2), 100.
Tilde, A.C., S. Fuchs., N. Koeniger., and C. R. Cervancia. (2000). Morphometric diversity of Apis cerana Fabr. within the Philippines. Apidologie , 31, 249 – 264. Wibowo,  S.  E.,  Djaelani,  M.  A.,  &  Kusumaningrum,  H.  P.  (2013).  Pelacakan  Gen Sitokrom  Oksidase  Sub  Unit  I  (COI)  DNA  Mitokondria  Itik  Tegal  (Anas domesticus)  Menggunakan  Primer  Universal. Bioma:  Berkala  Ilmiah Biologi , 15 (1), 20-26.
Susanti,  R.,  Iswari,  R.  S.,  Fibriana,  F.,  &  Indriawati,  I.  (2018).  The  duck  cytochrome oxidase  I  (CO1)  gene:  Sequence  and  patterns  analysis  for  potential barcoding  tool. Biodiversitas  Journal  of  Biological  Diversity , 19 (3),  997- 1003.
Tan, M. P., Amornsakun, T., Siti Azizah, M. N., Habib, A., Sung, Y. Y., & Danish-Daniel, M. (2019).  Hidden  genetic  diversity  in  snakeskin  gourami,  Trichopodus pectoralis  (Perciformes,  Osphronemidae),  inferred  from  the  mitoch.
Mitochondrial DNA Part B, 4(2), 2966 – 2969. https://doi.org/10.1080/23802359.2019.1662741