## Isolasi dan uji aktivitas enzim lipase termostabil dari bakteri termofilik pasca
erupsi Merapi
(Isolation and activity test of thermo stable Lipase Enzyme from thermophilic bacteria post Merapi erruption)

## Drajat Pramiadi, Evy Yulianti, dan Anna Rakhmawati
Jurusan Pendidikan Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Yogyakarta (UNY), Kampus Karangmalang, Sleman, DI Yogyakarta 55281 tel. 08122753549, faks. (0274) 548203 dan e-mail:
diterima 2 Desember 2013, disetujui 3 Februari 2014

## Abstrak
Pemanfaatan  enzim  yang  berasal  dari  mikroorganisme  lebih  menguntungkan  karena  lebih  mudah berkembang biak dalam waktu yang relatif singkat dan tidak memerlukan tempat yang luas, termasuk enzim lipase, yang  banyak  digunakan  untuk  industri.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  enzim  lipase  termostabil  dari bakteri  termofilik  dan  mengetahui  aktivitas  spesifiknya.  Isolasi  bakteri  termofilik  dilakukan  dengan  metode  pour plate,  seleksi  bakteri  penghasil  lipase  ditunjukkan  dengan  adanya  zona  bening  di  sekitar  koloni  pada  medium minyak  zaitun  dengan  0,1%  Rhodamine-B.  Dua  isolat  penghasil  zona  bening  terbesar  dilanjutkan  dengan  isolasi enzim lipase dan uji aktivitasnya. Dari 253 isolat, 43 isolat dapat tumbuh pada medium yang mengandung olive oil dan  2  isolat  menunjukkan  zona  jernih  di  sekeliling  isolat,  yaitu  isolat  361  dan  isolat  213.  Hasil  pengukuran  kurva pertumbuhan  selama  24  jam  menunjukkan  waktu  eksponensial  dicapai  pada  jam  ke-10  untuk  kedua  isolat.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  variasi  temperatur,  pH  dan  jenis  isolat  mempengaruhi  aktivitas  enzim.  Hasil pengujian aktivitas enzim menunjukkan bahwa pada isolat 361, aktivitas enzim yang paling baik adalah pada suhu inkubasi  50 ⁰ C  dengan  pH  7,  sedangkan  pada  isolat  213,  aktivitas  enzim  terbaik  ditunjukkan  pada  suhu  inkubasi 70 ⁰ C dengan pH 6.
Kata kunci: lipase, olive oil, bakteri termofilik, enzim termostabil, aktivitas enzim

## Abstract
The usage of enzyme which comes from microorganism is more advantageous because it is easier to be multiplied in a relatively short time and does not need a large space, including lipase enzyme, which is often used in industries. The objective of this research is to isolate thermo stable lipase enzyme from thermophilic bacteria and to  understand  specific  ativities.  The  thermophilic  bacteria  isolation  is  done  using  pour  plate  method.  Selection  of the bacteria producing lipase is shown from the presence of the biggest translucent zone around the colony on the olive oil medium with 0.1% Rhodamine-B. Two isolate produced by the biggest translucent zone are then continued by  lipase  enzyme  isolation  and  activity  tests.  From  253  isolate,  43  isolate  can  grow  on  the  medium  that  contains olive  oil  and  2  isolate  shows  translucent  zone  around  the  isolate,  that  is  isolate  361  and  isolate  213.  The  growth curve measurement for 24 hours shows that the exponential time is reached at the 10 th hour for both isolates. The result of this research shows that temperature, pH, and enzyme isolate variation effects the enzyme activities. The enzyme activity tests show that on isolate 361, the best enzyme activities is obtained from incubation temperature of 50 ⁰ C with pH 7, whereas for isolate 213, the best enzyme activities is reached when incubation temperature is 70 ⁰ C with pH 6.
Key words: lipase, olive oil, thermophilic bacteria, thermo stable enzyme, enzyme activities

## Pendahuluan
Semenjak ditemukannya organisme yang  dapat  hidup  pada  lingkungan  yang mempunyai  suhu  ekstrim,  pH  ekstrim,  tekanan tinggi  dan  salinitas  yang  tinggi,  hal  ini  sangat menarik  perhatian  pada  bidang  bioteknologi khususnya tentang potensi enzim yang dihasilkan  oleh  organisme  tersebut  [1].  Enzim memegang  peranan  penting  dalam  dunia industri  seperti  industri  tekstil,  detergen,  bahan pangan,  dan  minuman,  bahan  kimia,  obat- obatan dan industri kulit [2].
Organisme  hipertermofil  dapat  tumbuh secara  optimal  pada  temperatur  antara  80  dan 110°C.  Enzim  dari  organisme  ini  berkembang dan  memiliki  struktur  dan  fungsi  yang  unik dengan  kemampuan  termostabilitas  yang  tinggi dan  memiliki  aktivitas  optimal  pada  temperatur di  atas  70°C.  Beberapa  dari  enzim  ini  bahkan dapat  aktif  pada  temperatur  di  atas  110°C. Organisme  termofilik  dapat  tumbuh  secara optimal  pada  suhu  antara  50  dan  80°C.  Enzim termofilik ini dapat aktif pada suhu antara 60 dan 80°C [3].
Lipase  atau  disebut  juga  triasilgliserol hidrolase, merupakan enzim yang penting dalam bidang  bioteknologi,  dan  memiliki  banyak aplikasi  di  bidang  industry  makanan,  susu, detergen dan farmasi. Lipase banyak dihasilkan olek  mikrobia  terutama  lipase  yang  dihasilkan oleh  bakteri  berperanan  penting  dari  segi komersial.  Beberapa  genus  bakteri  penghasil lipase antara lain adalah Bacillus, Pseudomonas dan  Burkholderia.  Lipase  biasanya  dihasilkan pada  medium  yang  mengandung  karbon  lipid, seperti  minyak,  asam  lemak,  gliserol,  tween dengan adanya sumber nitrohen organik. Enzim lipase  yang  dihasilkan  bakteri  biasanya  bersifat ekstraseluler dan dihasilkan fermentasi [4].
Tujuan yang hendak dicapai dlam penelitian ini adalah 1) mengetahui isolat terbaik yang  berpotensi  dalam  menghasilkan  enzim lipase  termostabil,  2)  mengetahui  pengaruh variasi  temperatur  pada  aktivitas  enzim  lipase, 3)  mengetahui  pengaruh  variasi  pH  terhadap aktivitas  enzim  lipase,  4)  mengetahui  pengaruh variasi  jenis  isolat  terhadap  aktivitas  enzim lipase,  dan  4)  mengetahui  temperatur  dan  pH optimum untuk aktivitas enzim lipase.

## bakteri termofilik
Mikroorganisme termofilik biasa ditemukan  pada  daerah  yang  memiliki  aktivitas geothermal, seperti daerah pegunungan gunung berapi,  sumber  air  panas,  dan  juga  tempat cadangan  minyak  bumi  atau  batu  bara. Mikroorganisme  ini  sangat  menarik  untuk  dikaji dari sudut pandang ilmu dasar maupun terapan. Bidang penelitian dasar yang berhubungan yaitu biologi  molekuler,  genetika,  biokimia,  evolusi, taksonomi,  ekologi  dan  asal  usul  kehidupan. Dari  sudut  pandang  terapan  dan  bioteknologi, termofil  merupakan  sumber  enzim-enzim  yang unik  dengan  sifat  luar  biasa,  khususnya  yang tahan suhu tinggi [5].

## enzim lipase
Sebagian  besar  lipase  dapat  aktif  pada rentang  pH  dan  temperature  yang  luas, biasanya  lipase  dari  bakteri  banyak  yang  aktif pada  pH  basa.  Lipase  termasuk  serin  hidrolase dan  memiliki  stabilitas  yang  tinggi  pada  pelarut organik.  Beberapa  jenis  lipase  menunjukkan aktivitas    chemo-,  regio-  dan  enantioselectivity. Lipase  termasuk  enzim  hidrolase  yang  bekerja pada  lingkungan  air  pada  ikatan  ester  karboksil yang terdapat pada triasilgliserol untuk memisahkan  asam  lemak  dan  gliserol.  Substrat alami  untuk  lipase  adalah  triasilgliserol  rantai panjang yang memiliki kelarutan yang rendah di dalam air, dan reaksi ini dikatalisis pada daerah yang berhubungan antara lipid dan air. Di bawak keadaan  yang  sedikit  air,  lipase  memiliki kemampuan  unik,  yaitu  melakukan  reaksi  yang sebaliknya, menyebabkan terjadinya esterifikasi, alkoholisis  dan  asidolisis.  Selain  lipolisis,  lipase juga  memiliki  aktivitas  esterolitik  sehingga mempunyai substrat yang banyak [4].
Katalitik  triad  yang  menyusun  sisi  aktif lipase  tersusun  atas  Ser-Asp/Glu-His  dan biasanya  sekuen  yang  tetap  (Glyx-Ser-x-Gly) ditemukan  di  sekitar  sisi  aktif  serine.  Struktur tiga  dimensi  lipase  menunjukkan  sifat α / β - hydrolase  fold.  Lipase  banyak  ditemukan  di alam  dan  merupakan  produk  alami  tanaman, hewan  maupun  mikroorganisme.  Lipase  yang dihasilkan  oleh  mikrobia,  terutama  bakteri  dan fungi,  merupakan  enzim  yang  paling  banyak digunakan  di  dalam  aplikasi  bioteknologi  dan kimia organik. Beberapa jenis mikrobia penghasil  lipase  antara  lain  Achromobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus,
Burkholderia, Chromobacterium dan
Pseudomonas.  Lipase  yang  dihasilkan  oleh bakteri  Pseudomonas  paling  banyak  digunakan untuk aplikasi bioteknologi [4].

## Metode Penelitian

## a)  desain penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian ekperimental dengan perlakuan variasi suhu (50ºC, 60ºC, 70ºC), pH (6, 7, 8), dan 2 jenis isolat.

## b)  objek penelitian
Objek  dari  penelitian  ini  adalah  bakteri termofilik  yang  diisolasi  dari  pasir  dan  air sungai merapi.

## c)  waktu dan tempat penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  selama  7  bulan. Sampel  diambil  dari  pasir  dan  air  sungai merapi,  isolasi  enzim  lipase  dilakukan  di laboratorium  mikrobiologi  FMIPA  UNY  dan uji aktivitas enzim dilakukan di  laboratorium biokimia FMIPA UNY.

## d)  alat dan bahan
Media NA, NB, minyak zaitun, Rhodamine-B,  aquades,  aseton  :  ethanol (1:1), 0,05M
NaOH, buffer fosfat, phenolphtalien  1%,  aluminium  foil,  kasa, kapas steril.
Alat  yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol sampel steril, thermometer, pH meter,  forteks,  water  bath,  Bunsen,  pipet ukur,  jarum  ose,  petridish,  tabung  reaksi, autoklaf,  incubator,  gelas  objek,  erlemeyer, hot  plate,  magnetic  stirrer,  oven,  test  tube, mikroskop,  kamera  foto,  spektrofotometer, sentrifus, jangka sorong.
e)  langkah penelitian

## isolasi bakteri
Isolasi  bakteri  dilakukan  dengan  metode cawan  tuang  (pour  plate  method)  pada media  agar  (NA)  yang  mengandung  10%
minyak  zaitun  dan  0,1  %  Rhodamine-B. Selanjutnya  kultur  dituangkan  pada  cawan petri steril dengan penambahan media agar yang mengandung Rhodamine-B, kemudian diinkubasi pada suhu 55º C sampai tumbuh koloni  bakteri.  Aktifitas  lipolitik  diidentifikasi dengan  terbentuknya  warna  orange  yang berpendar  pada  permukaan  koloni  bakteri dan  dari  pengukuran  lebar  diameter  koloni. Selesai  diinkubasi  dan  didapatkan  bakteri lipolitik, koloni yang tumbuh diamati dengan melihat  morfologinya  meliputi  tipe,  bentuk, warna  dan  diameter  koloni.  Berdasarkan diameter  koloni  bakteri  yang  terbentuk, maka  dipilih  dua  isolat  bakteri  yang mempunyai aktivitas lipolitik tertinggi sebagai sumber untuk produksi enzim.

## pembuatan kurva pertumbuhan isolat
Isolat  sebanyak  10  mL  ditumbuhkan  dalam 90 mL medium NB yang mengandung 10% olive  oil.  Pengamatan  dilakukan  selama  48 jam dan pengambilan sampel dilakukan tiap 3  jam.  Ulangan  dilakukan  sebanyak  3  kali. Sampel diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

## produksi enzim lipase
Enzim lipase diperoleh dengan cara mengambil  1  ml  strain  dari  penyimpanan dan  diinokulasikan  ke  dalam  Erlenmeyer yang  berisi  99  ml  media  NB  yang mengandung 10% minyak zaitun, kemudian diinkubasi pada suhu 55ºC sampai mencapai  fase  eksponensial.  Enzim  lipase kasar pada Erlenmeyer dipanen dari biakan dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan 5.000  rpm  selama  15  menit.  Setelah  itu supernatan  yang  terbentuk  diambil  dan dipindahkan  ke  Erlenmeyer  lain,  untuk selanjutnya dilakukan uji aktivitas enzim.

## uji aktivitas lipase
Pengujian aktivitas lipase dilakukan dengan mencampur  2  mL  minyak  zaitun,  4  ml larutan  buffer  phosphate  (pH  (5,7,9),  1  ml larutan enzim kasar (supernatan). Campuran  dikultivasi  pada  suhu  60  ºC,  70 ºC,  80  ºC  selama  30  menit.  Setelah  waktu kultivasi  habis,    campuran  substrat  enzim diinaktifkan  dengan  penambahan  larutan
aseton  :  ethanol  (1:1)  sebanyak  10  ml,  lalu dilakukan  titrasi  dengan  NaOH  0,05  M dengan menambah 2-3 tetes phenolphtalien 1%  sebagai  indikatornya.  Titrasi  dihentikan jika  sudah  terbentuk  warna  merah  jambu. Aktivitas enzim ditunjukkan dengan perubahan warna menjadi merah jambu. Ini adalah  perlakuan  yang  diberikan  pada sampel perlakuan, sedangkan untuk sampel kontrol,  enzim  kasar  (supernatan)  diberikan setelah  kultivasi  selama  30  menit.  Aktivitas lipolitik  dalam  1  unit  didefinisikan  sebagai banyaknya  enzim  yang  dibutuhkan  untuk menghidrolisis minyak menghasilkan 1 µ mol produk  selama  1  jam.  Aktivitas  spesifik adalah  jumlah  unit  aktivitas  enzim/mg protein. Banyaknya konsentrasi asam lemak bebas  atau  FFA  (CFFA)  yang  terkandung dalam  2  ml  substrat  minyak  dihitung dengan:  Mol  FFA  =  mol  NaOH  =  0.05M  x volume NaOH titrasi,
Tiap  2  ml  sampel  minyak  zaitun  memiliki berat  1.7  gram  =  1700  mg  trioleogliserol (trigliserida  dari  minyak  zaitun)  dengan rumus  molekul  (C17  H34  COO)3  C3H5 memiliki  berat  molekul  884  g/mol,  berarti dalam  2  ml  sampel  minyak  zaitun  terdapat mol  trigliserida  sebanyak  1.923  mmol.  Mol FFA  yang  maksimal  terbentuk  secara
teoritis  dalam  2  ml  sampel  minyak  zaitun adalah  3  x  mol  trigliserida,  yaitu  sebesar 5.769 mmol

## f)  identifikasi variabel penelitian
1.  variabel tergantung
• suhu (50 ºC, 60 ºC, 70 ºC)
• pH (6,7,8)
• jenis isolat (2 isolat terpilih yang menghasilkan zona jernih terbesar)
2.  variabel bebas
• aktivitas enzim

## Hasil dan Diskusi

## isolasi dan seleksi bakteri lipolitik
Dari  253 isolat yang dapat ditumbuhkan pada  suhu  55ºC,  terdapat  43  isolat  yang  dapat tumbuh  pada  medium  yang  mengandung  olive oil.  Jumlah  isolat  yang  menunjukkan  aktivitas lipolitik  ada  2  isolat,  yaitu  isolat  361  dan  isolat 213.  Isolat  tersebut  diseleksi  pada  media  NA yang  mengandung  10%  olive  oil  dan  dan  0,1% Rhodamine-B.  Hasil  positif  ditunjukkan  dengan adanya  zona  jernih  di  sekeliling  isolat.  Berikut adalah  isolat-isolat  yang  dapat  tumbuh  pada medium yang mengandung olive oil.
Tabel 1. Morfologi koloni isolat yang dapat tumbuh pada medium NA dengan 10% olive oil.
No Isolat Zona jernih Suhu inkubasi 70 ⁰ C
Suhu inkubasi 55 ⁰ C Morfologi  Koloni Warna Bentuk Ukuran Tepi Elevasi 1. 5 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 2. 6 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 3. 9 - √ Putih susu Irreguler Kecil Entire Rata 4. 15 - √ Putih susu Irreguler Kecil Entire Rata 5. 24 - √ Putih susu Irreguler Kecil Entire Rata 6. 26 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 7. 38 - √ √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 8. 50 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 9. 52 - √ Putih susu Sirkuler Sedang Entire Rata 10. 53 - √ √ Merah Sirkuler Kecil Entire Rata 11. 68 - √ Putih susu Irreguler Kecil undula te Rata 12. 93 - √ Putih susu Irreguler Kecil undula te Rata
13. 101 - √ √ Putih susu Irreguler Kecil undula te Rata 14. 106 - √ Putih susu Irreguler Kecil undula te Rata 15. 114 - √ Putih susu Irreguler Besar undula te Rata 16. 131 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 17. 132 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 18. 137 - √ Putih susu Irreguler Besar undula te Rata 19. 140 - √ Putih susu Sirkuler Besar Entire Rata 20. 142 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 21. 151 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 22. 153 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 23. 159 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 24. 163 - √ Merah Irreguler Sedang undula te Rata 25. 172 - √ Merah Irreguler Sedang lobate Rata 26. 174 - √ Putih susu Sirkuler Kecil Entire Rata 27. 185 - √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 28. 186 - √ Putih susu Irreguler Sedang undula te Rata 29. 187 - √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 30. 191 - √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 31. 194 - √ Kuning Sirkuler Kecil Entire Rata 32. 197 - √ Kuning Irreguler Sedang undula te Rata 33. 199 - √ √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 34. 204 - √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 35. 207 - √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 36. 208 - √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 37. 209 - √ √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 38. 213 √ √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 39. 214 - √ Putih susu Irreguler  Pinpoint Entire Rata 40. 217 - √ Putih susu Irreguler Kecil undula te Rata 41. 221 - √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 42. 361 √ √ Putih susu Sirkuler Pinpoint Entire Rata 43. 380 - √ Putih susu Sirkuler Sedang Entire Rata
Dari  hasil  tersebut,  tampak  bahwa  isolat
213 dan 361 merupakan isolat yang mempunyai kemampuan lipolitik.
Berikut  adalah  gambar  zona  jernih  yang dihasilkan oleh dua isolat tersebut.
Gambar 1. Uji lipolitik isolat 213 (kiri) dan 361 (kanan).
Tabel 2. Diameter nisbah zona jernih yang dihasilkan isolat lipolitik.
Isolat Diameter koloni (mm) Diameter zona jernih (mm) Nisbah zona jernih 213 1,15 2,6 2,26 361 2,6 6,57 2,53
Secara  umum,  mikroorganisme  dibagi dalam 4 kelompok berdasarkan suhu lingkungan di  mana  dia  hidup,  yaitu  psikrofil,  mesofil, termofil  dan  hipertermofil.  Kelompok  bakteri termofil termasuk dalam kelompok Archaebacteria  yang  secara  umum  struktur selnya  memiliki  beberapa  kelebihan  dibanding kelompok bakteri lainnya. Kelompok ini umumnya  memiliki  daya  adaptasi  yang  tinggi terhadap  kondisi  lingkungan  yang  bersifat ekstrim,  seperti  temperatur,  kadar  garam,  pH, tekanan  dan  oksigen  dimana  mikroorganisma lain  tidak  dapat  mempertahankan  aktivitas hidupnya. Mikroorganisme termofil dapat bertahan  hidup  pada  lingkungan  yang  ekstrim disebabkan karena struktur selnya yang mendukung kehidupan mikroorganisme tersebut di lingkungan yang ekstrim. Beberapa komponen struktur sel yang mendukung tersebut  adalah  membran  sel.  Membran  sel setiap  mahluk  hidup  tersusun  atas  senyawa lipid,  protein  dan  karbohidrat.  Bagian  lipid terbesar  yang  menyusun  membran  sel  adalah fosfolipid.  Bagian  lipid  sel  pada  umumnya dihubungkan oleh ikatan ester, sedangkan pada organisme  termofil  senyawa  lipid  yang  terdapat pada  membran  selnya  memiliki  ikatan  eter. Ikatan  ini  terbentuk  melalui  proses  kondensasi gliserol  atau  senyawa  poliol  kompleks  lainnya dengan  alkohol  isoprenoid  yang  mengandung 20,  25  atau  40  atom  karbon.  Senyawa  eter gliserol  pada  Archaebacteria  mengandung  2,3 О -sn-gliserol yang menyebabkan struktur lipoprotein  dari  membran  sel  termofil  tersebut
lebih  stabil.  Selain  struktur  membrannya  yang berbeda,  sel  pada  organisme  termofil  memiliki sejumlah  protein  khusus.  Dalam  sel  organisme termofil terdapat protein chaperonin, yaitu suatu protein  yang  berperan  dalam  mempertahankan kembali  struktur  tiga  dimensi  protein  fungsional sel  dari  denaturasi  akibat  meningkatnya  suhu lingkungan  yang  bersifat  ekstrim.  Protein  ini memiliki  struktur  yang  tetap  stabil,  tahan terhadap  denaturasi  dan  proteolisis  Protein  ini dapat membantu organisma termofil mengembalikan  fungsi  aktifitas  enzimnya  bila terdenaturasi oleh suhu yang tinggi. Chaperonin tersusun  oleh  molekul  yang  disebut  chaperone, yang  membentuk  struktur  chaperonin  seperti tumpukan  kue  donat  pada  sebuah  drum.  Tiap cincin  donat  ini  terdiri  atas  7,  8  atau  9  subunit chaperone  tergantung  jenis  organismanya. Dalam  aktivitasnya  mempertahankan  struktur protein  fungsional  agar  tetap  stabil,  chaperonin membutuhkan  molekul  ATP.  Selain  itu,  pada organisme  termofilik  juga  mengandung  DNA gyrase  yang  merupakan  salah  satu  anggota kelompok  enzim  topoisomerase  yang  berperan dalam  mengontrol  topologi  DNA  suatu  sel  dan memegang peran penting dalam proses replikasi  dan  transkripsi  DNA.  Semua  jenis topoisomerase  dapat  merelaksasikan  DNA tetapi hanya DNA gyrase yang dapat mempertahankan  struktur  DNA  tetap  berbentuk supercoil.  DNA  girase  disusun  oleh  90-150 pasangan  basa-N  DNA.  DNA  girase  ini  juga selalu  dijumpai  pada  organisme  yang  hidup  di lingkungan di atas 70 o C dan juga dapat dijumpai
pada  organisme  yang  hidup  pada  suhu  sekitar 60 o C.  DNA  girase  ini  merupakan  salah  satu kelengkapan sel dari organisme termofil.
Enzim  diproduksi  oleh  bakteri  pada  fase eksponensial. Untuk mengetahui kapan
berlangsungnya  fase  tersebut,  maka  dibuat grafik  kurva  pertumbuhan  untuk  dua  isolat terpilih  yang  ditumbuhkan  pada  medium  NB yang mengandung 10% olive oil.
Gambar 2. Kurva pertumbuhan isolat 213 pada medium NB dengan 10% olive oil.
Gambar di atas adalah kurva pertumbuhan  isolat  213  ditumbuhkan  pada medium  NB  dengan  10%  olive  oil.  Dari  gambar
tersebut  tampak  bahwa  isolat  213  mencapai puncak  fase  eksponensial  pada  jam  ke-10.

## Gambar 3. Kurva pertumbuhan isolat 361 pada medium NB dengan 10% olive oil.
Dari  kurva  pertumbuhan  di  atas,  tampak bahwa  isolat  361  memasuki  puncak  fase eksponensial dalam waktu yang sama, yaitu jam ke-10.
pengaruh  suhu  dan  pH  terhadap  kadar  asam lemak bebas dan aktivitas enzim lipase
Dari  hasil  pengujian  kadar  asam  lemak bebas  menggunakan  metode  titrasi  dengan NaOH  0,05M,  diperoleh  data  besar  konsentrasi asam  lemak  bebas  hasil  hidrolisis  olive  oil seperti pada Tabel 3.
N il a i a b so rb a n si Jam ke- N il a i a b so rb a si Jam ke-
Tabel 3. Pengaruh suhu dan pH terhadap konsentrasi asam lemak bebas (mmol), persentase hidrolisis dan aktivitas enzim.
Isolat pH Suhu ( ⁰ C) Asam lemak bebas (mmol) % hidrolisis Aktivitas enzim (unit/jam)* 361 6 50 1,04 18,03 2,08 60 1,21 20,97 2,42 70 1,18 20,51 2,37 7 50 1,35 23,31 2,69 60 1,16 20,17 2,33 70 1,15 19,99 2,31 8 50 1,11 19,27 2,22 60 1,11 19,30 2,23 70 1,17 20,32 2,35 213 6 50 0,81 13,95 1,61 60 0,91 15,69 1,81 70 1,28 22,22 2,56 7 50 0,69 11,96 1,38 60 0,96 16,64 1,92 70 0,77 13,29 1,53 8 50 0,82 14,13 1,63 60 1,04 18,09 2,09 70 0,87 15,11 1,74
*Aktivitas  lipolitik  dalam  1  unit  didefinisikan  sebagai  banyaknya  enzim  yang  dibutuhkan  untuk menghidrolisis minyak menghasilkan 1 mmol produk selama 1 jam
Dari  Tabel  3  tampak bahwa  kadar asam lemak  bebas  tertinggi  yang  dihasilkan  dari hidrolisis  olive  oil  oleh  enzim  yang  berasal  dari isolat 361 adalah 1,35 mmol, yang diperoleh dari perlakuan  inkubasi  pada  suhu  50 ⁰ C  dengan  pH 7, sedangkan pada isolat 213, konsentrasi asam lemak  bebas  tertinggi  yang  dihasilkan  adalah 1,28  mmol,  yang  diperoleh  dari  perlakuan  suhu inkubasi 70 ⁰ C dengan pH 6. Adapun persentase
hidrolisis  tertinggi  pada  isolat  361  adalah 23,31%,  sedangkan  pada  isolat  213  sebesar 22,22%.  Aktivitas  enzim  tertinggi  yang  diisolasi dari  isolat  361  yang  tertinggi  adalah  2,69 unit/jam, sedangkan dari isolat 213 sebesar 2,56 unit/jam.  Perbedaan  aktivitas  enzim  dari  dua isolat bakteri ditunjukkan pada gambar di bawah ini.
Gambar 4. Konsentrasi asam lemak bebas yang diperoleh dari hasil hidrolisis enzim lipase.
Dari  gambar  tersebut  tampak  bahwa kadar asam lemak naik seiring dengan kenaikan suhu,  namun  turun  lagi  pada  perlakuan  dengan suhu  70ºC.  Kadar  asam  lemak  juga  bervariasi dengan adanya perubahan pH.
Enzim lipase termostabil atau asilgliserol hidrolase  (E.C  3.1.1.3)  merupakan  enzim  yang dapat  menghidrolisis rantai panjang trigliserida. Enzim  ini  memiliki  potensi  untuk  digunakan memproduksi  asam  lemak,  yang  merupakan prekursor  berbagai  industri  kimia.  Enzim  ini
digunakan  untuk  memecah  lemak  menjadi komponen  asam  lemak,  yang  amat  dibutuhkan dalam metabolisme mikroorganisme yang bersangkutan.  Enzim  ini  bersifat  konstitutif artinya terus-menerus diekspresi tanpa membutuhkah  induser.  Ekspresi  enzim  lipase meningkat  saat mikroorganisme  memasuki  fase kematian  karena  jumlah  produk  lemak  dari  sel- sel  yang  mati  meningkat.  Reaksi  hidrolisis trigliserida spesifik adalah sebagai berikut:
Gambar 5. Reaksi pemecahan triasilgliserol oleh lipase.
Gambar 6. Skema reaksi hidrolisis enzimatis spesifik pada olive oil.
K o n se n tr a si a sa m l e m a k b e b a s (m m o l)
Perlakuan jenis isolat, pH dan suhu
Kemampuan  enzim  dalam  mendegradasi  olive oil  dilihat  dari  %  hidrolisis  untuk  melihat seberapa  banyak  pembentukan  FFA  per  waktu.
Berikut  ini  adalah  hasil  %  hidrolisis  dari  isolat 361  dan  213  yang  diberi  perlakuan  suhu,  pH, dan jenis isolat yang disajikan pada Gambar 8.

## Gambar 7. Persentase hidrolisis yang dilakukan oleh enzim selama 30 menit.
Dari  gambar  tersebut  nampak  bahwa  % hidrolisis  enzim  tertinggi  dicapai  oleh  isolat  361 yang  diinkubasi  pada  suhu  50ºC  dan  pH  7.
Kemampuan  enzim  dalam  menghidrolisis  olive oil  dapat  dilihat  dari  aktivitas  enzim  yang  akan ditunjukkan pada gambar berikut ini.
Gambar 8. aktivitas enzim
Dari  Gambar  8  tersebut  tampak  bahwa  isolat 361  mempunyai  aktivitas  tertinggi  pada  suhu 50ºC  dan  pH  7.  Semakin  meningkat  suhu, aktivitas  enzim  tampak  meningkat,  namun aktivitas  enzim   menjadi  turun  pada  suhu  80ºC. Hasil  yang  berbeda  juga  ditunjukkan  pada perlakuan dengan pH yang berbeda..
Peningkatan  suhu  dapat  meningkatan kecepatan  reaksi,  baik  itu  yang  dikatalisis  oleh enzim maupun yang tidak dikatalisis oleh enzim dengan  meningkatkan  energi  kinetic  dan frekuensi  terjadinya  tumbukan  antara  molekul- molekul  yang  bereaksi.  Energi  panas  dapat meningkatkan  energi  kinetik  enzim  dan  dapat
% h id ro li si s (% ) Perlakuan jenis isolat, pH dan suhu A k ti v it a s e n zi m ( u n it /j a m )
Perlakuan jenis isolat, pH dan suhu
pula  melampaui  barier  energi  sehingga  dapat merusak  interaksi  non  kovalen  yang  menjaga struktur  tiga  dimensi  enzim.  Rantai  polipeptida enzim mulai terurai, atau mengalami denaturasi, yang diikuti dengan hilangnya aktivitas katalitik.
Kecepatan  reaksi  yang  dikatalisis  enzim menunjukkan  ketergantungan  yang  signifikan terhadap  konsentrasi  ion  hidrogen.  Hubungan aktivitas enzim terhadap konsentrasi ion hidrogen  menunjukkan  keseimbangan  antara terjadinya  denaturasi  enzim  pada  pH  yang terlalu rendah atau terlalu tinggi dan pengaruhnya  pada  perubahan  status  muatan pada  enzim,  substrat  atau  keduanya.  Pada enzim  yang  mekanisme  kerjanya  melibatkan katalisis  asam  basa,  residu  yang  terlibat  harus berada  pada  status  protonasi  yang  tepat  untuk dapat berlangsungnya suatu reaksi.
Konsep  tentang  termostabilitas  yang dimiliki oleh enzim yang berasal dari mikroorganisme  termofil  ini  dilandaskan  pada dua  konsep  yaitu  pertama  struktur  molekular pada  selnya  yang  memang  tersusun  oleh molekul protein yang termostabil, kedua termostabilitas  itu  berkaitan  dengan  adanya asosiasi senyawa protein enzim dengan molekul lainnya  seperti  lipid,  polisakarida  maupun protein lainnya yang menyebabkan terbentuknya suatu  senyawa  yang  memiliki  mekanisme  yang memungkinkannya tetap stabil saat menghadapi kondisi yang dapat menginaktivasinya.
Adapun  faktor-faktor  yang  dianggap berhubungan  dengan  termostabilitas  enzim- enzim  dari  mikroorganisme  termofil  bervariasi pada berbagai spesies termofil, namun beberapa hal  umum yang ditemukan antara lain terjadinya  peningkatan  ikatan  hidrogen  dan  salt bridge  pada  protein  dari  enzim  termofik.  Selain itu  ditemukan juga  adanya  perbedaan  jenis  dan komposisi  asam  amino  penyusun  protein  enzim termofil bila dibandingkan dengan protein enzim yang  mesofilik.  Pada  enzim  temofilik  terjadi penurunan  jumlah  sistein  dan  serin  secara nyata,  sedangkan  jumlah  arginin  dan  tirosin meningkat  secara  nyata.  Asam  amino  prolin juga  lebih  sedikit  ditemukan  pada  struktur α - heliks pada protein termofilik.

## Kesimpulan
1.  Isolat terbaik yang berpotensi dalam menghasilkan enzim lipase termostabil
adalag isolat 361 dan 213.
2.  Temperatur  mempengaruhi  aktivitas  enzim lipase.
3.  pH mempengaruhi aktivitas enzim lipase.
4.  Setiap  jenis  isolat  memiliki  aktivitas  enzim lipase yang berbeda.
5.  Temperatur  dan  pH  optimum  untuk  aktivitas enzim  lipase  pada  isolat  361  adalah  pada suhu  50 ⁰ C  dengan  pH  7,  sedangkan  pada isolat 213 pada suhu 70 ⁰ C dengan pH 6.

## Pustaka
[1] M. W. W. Adam and R. M. Kelly, Chem. Eng. News (1995) pp. 32-42.
[2] Muchtadi, S. Nurleni, dan Made, Enzim dalam Industri Pangan, Institut Pertanian Bogor, 1992. [3] C.  and  G.  J.  Zeikus,  Microbiology  And Molecular  Biology  Reviews,  1092- 2172/01/$04.0010 Vol. 65, No. 1 (2001) pp. 1–43.
[4] R.  Gupta,  N.  Gupta,  P.  Rathi,  Appl Microbiol  Biotechnol,  64  (2004)  pp. 763–781.
[5] T.  D.  Brock,  and  K.  M.  Brock, Thermophilic  microorganism  and  life  at high temperature, Springer Verlag, New York, 1978.