## BIOAKTIVITAS  EKSTRAK  METANOL  DAUN  NAMNAM  SERTA KOMBINASINYA  DENGAN  MADU  TRIGONA

## [Bioactivity of Methanol Extract of Namnam Leaves in Combination with Trigona Honey]
La Ode Sumarlin 1,2) *, Agik Suprayogi 1) ,  Min Rahminiwati 1) , Achmad  Tjachja 3) , dan Dede Sukandar 2)
1) Program Doktor Ilmu-Ilmu Faal dan Khasiat Obat, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Program Studi Kimia, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta, Tangerang
3) Program Studi Agribisnis, Universitas Islam Negeri  Syarif Hidayatullah Jakarta, Tangerang
Diterima 28 Mei 2015 / Disetujui 15 September 2015

## ABSTRACT
Namnam  (Cynometra  cauliflora L )  and  trigona  honey  are  two  potential  natural  ingredients  to  b e developed in Indonesia. However, scientific evidence of their active compounds and b ioactivity is still rarely found, particularly the combination of these two materials. Therefore , this research aimed to explore the active ingredients of the combination of the two materials, i.e. total phenolic, flavonoids, vitamin C and β- carotene and its b ioactive capabilities such as antioxidant activity and antibacterial activity. The analysis showed  the methanol  extract  of  Nam nam leaves  (EMDN)  and  trigona  honey  either  in  their  sole  form or combined form has antioxidant and antib acterial activity. The EMDN   was more active to Staphylococcus aureus (23.7±3.3 mm) than to Escherichia coli, while the Trigona honey (MT) more active to Escherichia coli (32.6 ± 4.4 mm) than Staphylococcus aureus (16.6±4.1 mm). Similarly, the combination  of EMDN and MT showed higher activity to  Escherichia coli (23±1.9 mm) than Staphylococcus aureus (17.6±2.6 mm). Analysis of  the  antioxidant  activity  also  showed  that  EMDN  provided  the  highest  activity  with  an IC 50 of 0.0048±0.000 mg/mL), while a comb ined EMDN and MT had an IC 50 of 0.0085±0.000 mg/mL) and MT with an IC 50 of 3.736±0.112 mg/mL. Moreover, this analysis also showed that sole samples of MT and EMDN have total phenolic content, flavonoids,  and vitamin C that were higher than the comb ination of MT and EMDN.  However,  the  content  of  β-carotene  in  the  combined  form  of  MT  and  EMDN  was  higher.  Thus trigona  honey,  methanol  extract  of  leaves  Nam nam  (Cynometra  cauliflora L )  in  a  single  form  or  in  a combination are potential to b e utilized  and developed as a source of antioxidants and antibacterial in the form of functional food.
Keywords: antib acterial, antioxidant, Cynometra cauliflora L , honey trigona, namnam

## ABSTRAK
Tanaman  namnam  ( Cynometra  cauliflora L)  dan  madu  trigona  merupakan  dua  bahan  alam  yang sangat  potensial  untuk  dikembangkan  di  Indonesia.  Namun  informasi  ilmiah mengenai  bahan  aktif  dan bioaktivitasnya masih belum banyak diteliti khususnya kombinasi dari kedua bahan tersebut. Oleh karena itu, penelitian ini ditujukan untuk mengeksplorasi bahan aktif kombinasi kedua bahan tersebut seperti total fenolik, flavonoid, vitamin C dan β-karoten serta kemampuan aktivitas antioksidan dan antibakteri. Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun namnam ( Cynometra cauliflora L) dan madu trigona dalam  bentuk  tunggal  maupun  bentuk  kombinasinya  memiliki  aktivitas  antioksidan  dan  antibakteri. Akti vitas antibakteri ekstrak metanol daun namnam (EMDN) lebih  tinggi terhadap Staphylococcus aureus (23,7±3,3 mm)  dibandingkan Escherichia  coli ,  sedangkan  aktivitas  antibakteri  madu  trigona  (MT)  lebih tinggi  terhadap Escherichia  coli (32,6±4,4  mm)  dibandingkan  bakteri Staphylococcus  aureus (16,6±4,1 mm). Demikian pula, kombinasi EMDN dan MT lebih kuat terhadap Escherichia coli (23±1,9 mm) daripada Staphylococcus aureus (17,6±2,6 mm). Analisis terhadap aktivitas antioksidan juga menunjukkan bahwa EMDN  memberikan  aktivitas  tertinggi  (IC 50 0,0048±0,000  mg/mL),  kombinasi  EMDN  dan  MT  (IC 50 0,0085±0,000 mg/mL) dan MT (IC 50 3,736±0,112 mg/mL). Selain itu, analisis ini menunjukkan pula sampel MT  dan  EMDN  tunggal memiliki  kandungan  total  fenolik,  flavonoid,  vitamin  C  lebih  tinggi  dibandingkan kombinasi  MT  dan  E MDN.  Namun  pada  kandungan  β-karoten  kombinasi  MT  dan  EMDN  lebih  tinggi. Dengan  demikian, madu  trigona,  ekstrak metanol  daun  namnam   ( Cynometra  cauliflora L) dalam  bentuk tunggal  maupun  kombinasinya  sangat  potensial  dimanfaatkan  dan  dikembangkan  sebagai  sumber antioksidan dan antibakteri dalam suatu bentuk pangan fungsional.
Kata kunci: antibakteri, antioksidan, Cynometra cauliflora L, madu trigona, tanaman namnam
*Penulis Korespondensi: E-mail:  sumarlin@uinjkt.ac.id

## PENDAHULUAN
Tanaman  namnam  ( Cynometra  cauliflora L) dan  madutrigona  merupakan  dua  bahan  alam  yang sangat  potensial  untuk  dikembangkan  di  Indonesia. Namun  informasi  ilmiah  tentang  aktivitas  bioaktifnya masih  belum  banyak  diteliti,  khususnya  kombinasi dari  kedua  bahan  tersebut.  Komponen  bioaktif  yang dimaksud  adalah  k omponen  secara  alamiah  ter- dapat  dalam  bahan  pangan  dan  dapat  memberik an manfaat  bagi  kesehatan  (Biesalski et al., 2009). Hasil  penelitian  Owayss et  al. (2004)  dan Ferreira et  al .  (2009)  menunjukkan  bahwa  pada madu  terdapat  klorofil,  β-k aroten,  likopen,  karote- noid,  dan  flavonoid.  Bahkan,  Ferreira et  al. (2009) menyatakan  bahwa  k andungan  β-k aroten  dan likopen  madu  masing-masing  sebesar  9,49  mg/kg dan  6,12  mg/kg.  Selain  itu,  Zainol et  al . , 2013  juga menyatakan  bahwa  madu  kelulut  memiliki  potensi sebagai  antibakteri.  Madu  dari  lebah stinglessbee bahkan  memiliki  rasa,  aroma  dan  kekentalan  ber- beda  yang  berguna  unt uk  medis  dan  terapi  (Biluca et al., 2014). Madu Trigona spp memiliki total  fenolik sekitar  784,3 mg  GAE/kg  dibandingkan  dengan madu Apis spp. sekitar 590,5 mg GAE/kg (Kek et al . , 2014).  Keberadaan  senyawa-senyawa  tersebut  me- nunjukkan  bahwa  madu  lokal  juga  memiliki  potensi sebagai anti kanker  dan antioksidan (S umarlin et  al., 2014).
Seperti  halnya  madu,  daun  tanaman  namnam ( Cynometra  cauliflora L)  yang  merupak an  pohon berbuah  dari  suku  polong -polongan, Leguminos ae atau Fabaceae juga  telah  diteliti  oleh  Aziz  dan  Iqbal (2013), terkandung adanya tanin, saponin,  flavonoid, terpenoid,  dan  glikosida  yang  bermanfaat  sebagai antioksidan.  Aktivitas  antioksidan  dalam  tanaman Cynometra  cauliflora L.  ditemukan  dalam  urut an sebagai  berikut:  daun  muda  >  daun  tua  >  batang  > kulit.  Hasil  penelitian  Ado et  al. (2014),  juga  me- nunjukkan  bahwa  ekstrak  metanol  daun  namnam memiliki  kadar  total  fenolik  sebesar  214,370  mg GAE/g  dan  aktivit as  antioksidan  dengan  nilai  IC 50 sebesar  0,048  mg/mL.  Penelitian  lain  dari  suku golongan Fabaceae sebagai  antibakteri  diant aranya ekstrak Senna  italica yang  memiliki  daya  hambat terhadap  bakteri Pseudomonas  aeruginosa , E ntero- coccus  faecalis , Escherichia  coli dan Staphylo- coccus  aureus (Masoko et  al., 2009),  ekstrak  etil asetat  daun  jengkol  ( Pithecolobium  lobatum Bent h) memiliki  aktivitas  dalam  menghambat  pertumbuhan bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli (Salni et al., 2011).
Semua  publikasi  tanaman  namnam  dan  madu trigona  tersebut  dalam  bentuk  tunggal.  Beberapa publikasi  kombinasi  madu  seperti  kombinasi  madu dan Nigella  sativa (Maslem et  al., 2012),  kombinasi madu  dan Garcinia  Kola (Akinnibosun  dan  It edjere, 2013),  kombinasi  madu  alam  dan  benih Peganum harmala (Ahmed et al., 2013), serta kombinasi madu dan  tepung  kentang  (Ahmed et  al., 2012)  yang  telah menghasilkan  efek  sinergis  dan  meningkat  aktivitas- nya.  Oleh  karena  itu,  dalam  penelitian  ini  ditujuk an untuk  mengeksplorasi  bahan  aktif  pada  kombinasi bahan  ekstrak  metanol  daun  namnam  dan  madu trigona  seperti  total  fenolik,  flavonoid,  vitamin  C  dan β-karoten  serta  kemampuannya  sebagai  bahan antioksidan  dan  antibakteri.  Hal  ini  penting  untuk mengetahui  efek  sinergi  kedua  bahan  pot ensial tersebut  secara  ilmiah.  Untuk  mendapatkan  hasil yang  maksimal,  digunakan  metode  maserasi  cara dingin  untuk  mencegah  terurainya  metabolit  yang tidak  tahan  pemanasan.  Penggunaan pelarut metanol   berfungsi  melunakkan  sel  simplisia  sehing- ga  seny awa  metabolit  sekunder  yang  masih  terik at, tertarik ke luar sel dan dilarutkan. Penelitian S uryan- to  dan  Wehantouw  (2009)  menunjukkan  bahwa metanol  mampu  menarik  lebih  bany ak  jumlah metabolit  sekunder  yaitu  senyawa  fenolik,  flavonoid, dan tanin dalam daun Artocarpus altilis F. dibanding- kan  dengan  et anol.  Hasil  penelitian  Rabeta  dan Farazina  (2013)  pada  ekstraksi  daun  dan  buah Garcinia  atrovirdis sert a  buah Cynometra  cauliflora dengan  menggunakan  pelarut  metanol  memberik an aktivit as  antioksidan  yang  lebih  kuat  daripada  eks - traksi dengan pelarut air. P ada akhirnya, diharapk an penelitian  ini  dapat  digunakan  sebagai  basis  data untuk formulasi antioksidan dan antibakteri kombina- si  tanaman  namnam  dan  madu  trigona  dalam  ber- bagai  aplikasi.

## BAHAN  DAN METODE

## Bahan
Bahan  utama  adalah  sampel  madu  trigona yang  diperoleh  dari  peternak  lebah  di  daerah  Luwuk Sulawesi  Tengah,  daun  namnam  diperoleh  dari daerah  Pangandaran,  Jawa  Barat  dan  diidentifikasi di  Herbarium  Bogoriense  Bidang  B otani,  Pusat Penelitian  Biologi  LIP I,  Bogor,  DPPH  (2,2-difenil-1- pikril-hidrazil)  (Sigma-Aldrich,  USA), Escherichia  coli ATCC  25922 dan Staphylococcus  aureus  ATCC 25923 serta  bahan-bahan  kimia  pro  analitik  lainnya yang  diperlukan  untuk analisis.

## Ekstraksi  daun namnam
Daun  namnam  ( Cynometra  cauliflora L.)  dicuci, disortasi  lalu  dikeringkan  dengan  sinar  matahari selama  30  jam  sampai  kadar  air  9-10%.  Kemudian digiling  dengan blender (A rte,  Indonesia),  sehingga diperoleh  serbuk  halus.  Serbuk  daun  namnam sebanyak  100  gram  direndam  dengan  100  mL methanol  (JT  Baker,  USA)  dan  dimaserasi  selama 24  jam.  Setelah  itu  hasil  rendaman  disaring  dengan kertas  saring  Whatman  No.  4  (Merk  milipore, Germany),  sehingga  diperoleh  filtrat  yang  pertama. Residu  daun  namnam  dimaserasi  kembali  dengan pelarut  methanol    selama  9  jam,  sehingga  diperoleh filtrat  yang  kedua.  Filtrat  diuapkan  dengan rotary evaporator (Laborat a  4000  Heidolph,  USA )  pada suhu  49°C  sehingga  diperoleh  ekstrak  kental. Proses ekstraksi dilakukan sebanyak lima kali. Pem- buatan  formulasi  kombinasi  madu  dan  ekstrak metanol  daun  namnam  dilakuk an  dengan  cara  me- nimbang  madu  dan  ekstrak  metanol  daun  namnam dengan  menggunakan  perbandingan  1:1 (b/b).

## Uji alkaloid (uji dragendroff dan bourchardat)
Sampel  sebanyak  0,5  gram  ditambah  10  mL kloroform-amoniak (Merk Milipore, Germany), kemudian  disaring.  Filtrat  ditambahkan  dengan  3-5 tetes  H 2 SO 4 2  M  (Merk  Milipore,  Germany)  dan dikocok  sehingga  terbentuk  dua  lapisan.  Lapis an asam (terdapat  pada bagian  atas) dipipet  dalam dua tabung  reaksi  lain,  lalu  ditambahkan  beberapa  tetes pereaksi  Dragendroff  (kombinasi  Bi(NO 3 ) 2 .5H 2 O (Merk  Milipore,  Germany)  dalam  HNO 3 (Merk Milipore,  Germany)  dan  larutan  KI  (Merk  Milipore, Germany)  pada  tabung  A  dan  pereaksi  Bourc hardat (4  gram  KI  (Merk  Milipore,  Germany)  dilarutkan dalam  20  mL  akuades,  ditambah  2  gram  I 2 (Merk Milipore,  Germany)  ditera  hingga  100  mL)  pada tabung  B.  Adanya  alkaloid  ditunjukkan  dengan  ter- bentukny a  endapan  jingga  sampai  merah  coklat (Harborne,  1996).
Uji  steroid  dan  triterpenoid  (uji  salkowski) (Harborne, 1996  dengan modifikasi)
Sampel  sebanyak  0,5  gram  ditambah  dengan 20  mL  n-heksana  (JT  Baker,  USA)  dan  didiamk an selama  2  jam.  Kemudian  disaring  dan  ditambahk an H 2 SO 4 pekat  sebanyak  2  tetes  (Metode  Harborn, 1996 menggunakan kloroform  dan  asetat anhidrida). Steroid  memberik an  warna  biru  atau  hijau,  sedang- kan  untuk  tritepenoid  memberikan  warna  merah atau  ungu.

## Uji flavonoid (Harborne, 1996  dengan modifikasi)
Sampel  sebanyak  0,5  gram  ditambah  dengan 10  mL  air  panas  (metode  Harborne,  1996  meng- gunakan  alkohol),  dan  didihkan  selama  5  menit, kemudian  disaring  kertas  Whatman  No.  4.  Filtrat sebanyak  5  mL  ditambahkan  HCl  pek at  (Merk Milipore,  Germany)  dan  0,05  mg  serbuk  Mg  (Merk Milipore,  Germany),  kemudian  dikocok  kuat-kuat.  Uji positif  ditunjukkan  dengan  terbent uknya  warna merah,  kuning,  atau  jingga.

## Uji saponin  (uji forth)
Sampel  sebanyak  0,5  gram  ditambah  air  panas sebanyak  5  mL  dalam  tabung  reaksi  dan  dikocok. Sampel  dinyatakan  positif  mengandung  saponin apabila  terdapat  busa.  Terbentuknya  busa  yang stabil  dalam  t abung  reaksi  menunjukkan  adanya senyawa  golongan  saponin,  bila  ditambahkan  1 tetes  asam  klorida  1%  (encer)  busa  tetap  stabil (Djamil  dan  Anelia,  2009).

## Uji tanin atau fenolik
Sampel  sebanyak  0,5  gram  ditambah  10  tetes FeCl 3 1%  (Merk  Milipore,  Germany).  Sampel  positif mengandung  tannin  at au  fenol  apabila  menghasil- kan  warna  hijau,  merah,  ungu,  biru  atau  hitam  pekat (Djamil  dan  Anelia,  2009).

## Uji kuinon
Sampel  sebanyak  0,5  gram  ditambah  etanol 95%  (Merk  Milipore,  Germany)  sebanyak  2  mL,  lalu ditambahkan  NaOH  10%  (Merk  Milipore,  Germany). Jika  terjadi  warna  kuning,  jingga,  coklat,  atau  merah menunjukkan  adanya  fenolhidrokuinon  (Harborne, 1996).
Penentuan  aktivitas  antioksidan  dengan  metode DPPH  (Singh et  al., 2013  dimodifikasi)
Sebanyak  2  mL  sampel  masing -masing  di - masukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahk an ke  dalamnya  2  mL  DPPH  0,002%  (Sigma-Aldrich, USA) (Singh et al., 2013) menggunakan  4 mL  DPPH 0,004%  yang  dilarutkan  dalam  metanol).  Kemudian sampel  dihomogenk an  dan  diinkubasi  selama  30 menit  dalam  ruang  gelap.  Serapan  diukur  pada panjang  gelombang  517  nm  dengan  spektrof- otometer UV -VIS (P erkin Elmer Lambda 25). Pengu- kuran  dilak ukan  pengulangan  sebanyak  3  kali. Sebagai  standar  digunakan  asam  askorbat  (Merk Milipore, Germany)  pada konsentrasi 0,5; 1; 2; 4 dan 8 ppm dengan  perlakuan yang sama dengan sampel uji.  Nilai  absorbansi  yang  didapat  digunakan  untuk menentukan  nilai  penghambatan  sampel  melalui perhitungan  sebagai  berikut:
% inhibisi = lanko-   ampel lanko x 100%
Keterangan:
A blanko   = Absorbansi  tidak mengandung  sampel A sampel  = Absorbansi  sampel
Selanjutnya  hasil  perhitungan  dimasukkan  ke dalam  persamaan  regresi  sehingga  diperoleh  nilai IC 50 didapat  dari  perhitungan  pada  saat  pers en inhibisi sebesar  50%.
Uji total fenolik (Socha et  al., 2009)
Madu  t rigona,  ekstrak  metanol  daun  namnam, dan kombinasi madu-ekstrak metanol  daun namnam (1:1)  masing-masing  sebanyak  100  mg  dilarutkan dalam  10  mL  akuades.  Kemudian  dipipet  sampel sebanyak  0,5  m L  dan  ditambahk an  0,3  m L  reagen Folin-Cioucalteu  (Merk  Milipore,  Germany),  2  mL Na 2 CO 3 15%  (Merk  Milipore,  Germany)  dan  ditepat- kan dengan  akuades hingga  volume larutan menjadi 5  mL.  Selanjutnya  sampel  divortex  dan  diinkubasi selama  2  jam.  Sampel  diukur  serapannya  meng- gunakan  spektrofotomet er  UV -VIS  (Perkin  Elmer Lambda  25)  pada  panjang  gelombang  750  nm. Kurva  standar  asam  galat  (Sigma-Aldrich,  USA) dibuat  pada  deret  konsentrasi  10,  20,  40,  60,  80, 100  ppm.  Kandungan  total  fenolik  dinyatak an sebagai  jumlah  ekuivalen  mg  asam  galat  (GAE)  per 1 gram  sampel.
Uji total flavonoid (Meda et al., 2005) Madu  t rigona,  ekstrak  metanol  daun  namnam, dan  kombinasi  (1:1)  masing-masing  sebany ak  100 mg  dilarutkan  dalam  10  m L  metanol.  Kemudian sampel  disaring  dan  diambil  sebanyak  5  mL  dan ditambahkan  5  m L  AlCl 3 2%  (b/ v)  (Merk  Milipore, Germany).  Kemudian  sampel  dihomogenkan  dan diinkubasi selama  10 menit. Sampel diukur serapan- nya  menggunak an  spektrofotomet er  UV-VIS  pada panjang  gelombang  454,63  nm.  Kuersetin  sebagai standar  dengan  deret  konsentrasi  10,  20,  30,  40,  50 ppm. Kandungan  flavonoid  dianggap sebagai jumlah ekuivalen  mg  kuersetin  (QE)  (Sigma-Aldrich,  USA) per  1 gram  sampel.
Uji kadar vitamin C  (Ferreira et al., 2009) Madu  t rigona,  ekstrak  metanol  daun  namnam, dan  kombinasi  (1:1)  ditimbang  sebanyak  100  mg dan  diekstraksi  dengan  10  mL  H 3 P O 4 1%  (Merk Milipore,  Germany).  Setelah  itu  sampel  diinkubasi 45  menit  pada  suhu  ruang  dan  dilanjutkan  dengan penyaringan  menggunakan  kertas  Whatman  No.  4. Diambil  1  mL  filtrat  dan  ditambahkan  9  mL  DCP IP
0,005%  (Merk  Milipore,  Germany).  Sampel  kemu- dian  dihomogenkan  dan  diinkubasi  selama  30  menit pada  suhu  ruang.  Serapan  diukur  menggunak an spektrofotometer  UV-V IS  pada  panjang  gelombang 519  nm.  Sebagai  standar  digunakan  asam  askorbat standar  dengan  deret  kons entrasi  10,  20,  40,  80, 100  mg/L  dan  menggunak an  persamaan  regresi. Kandungan  vitamin  C  dinyatakan  sebagai  jumlah ekuivalen  mg asam  askorbat  (AA) per  1 g sampel.
Uji  total  kandungan  karotenoid  (Alvarez-Suarez et  al., 2010)
Uji  kandungan  total  karotenoid  dilakukan  pada madu  trigona  dan  ekstrak  dari  daun  namnam. Sampel  madu  sebanyak  1  gram  dilarutkan  dengan pelarut  n-heksana-metanol  (1:1)  (JT  Baker,  USA) dishaker  (Heidolph  Unimax  1010,  USA)  selama  1 jam  dan  didiamkan  selama  10  menit  pada  suhu ruang.  Kemudian  dis aring  dengan  menggunak an kertas  saring  Whatman  No.  4.  Filtrat  diuk ur  absor- bansinya  dengan  spektrofotometer  UV-Vis  pada panjang  gelombang  450  nm.  Sebagai  standar  di- gunakan  β-k aroten  (Sigma-Aldrich,  USA)  dengan kurva  standar  pada  konsent rasi  (0,015 –0,6  µg/mL). Total  kandungan  karot enoid  dinyatakan  dalam  mg etara  dengan  β-karoten  (mg  βCE/g).  Diulang dengan  menggunak an  ekstrak  madu  dan  daun namnam  dan  hasil  partisi  n-heksana,  etil  asetat  dan butanol.
Pengujian  antibakteri  dengan  metode  zona bening (Lestari et  al., 2013)
Sebanyak 1 mL inokulum  bakteri uji  fase midlog diambil  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  100  mL media  MHA  (Merk  Milipore,  Germany)  dan  di- homogenkan.  Selanjutnya  media  yang  berisi  ino- kulum  tersebut  dituang  ke  dalam  cawan  petri  dan dibiarkan  memadat.  Sebanyak  0,1  mL  baik  sampel maupun  kontrol  yang  telah  dipersiapkan  di  dalam syringe dit uangkan  pada  agar  yang  telah  dilubangi dengan  sedotan  steril.  Kemudian  pet ri  ditutup kembali  segera,  setelah  itu  diinkubasi  selama  18-24 jam  pada  s uhu  37°C.  Diukur  zona  hambat  dari masing-masing  sampel  kemudian  dibandingk an dengan  kontrol  positif.  Untuk  setiap  perlakuan dilakukan  tiga kali pengulangan  ( triplo ).

## Analisis  data
Analisis  data  dilakukan  sebanyak  triplo  dan data  yang  ditampilkan  berupa  mean  ±  standar deviasi.  Hasil  uji  fitokimia  dianalisis  secara  deskriptif sedangkan  aktivitas  antioksidan,  kadar  total  fenolik, total  flavonoid,  dan  vit amin  C  dianalisis  secara statistik  menggunakan  Analisis  Variansi  (ANOVA)
satu  arah  ( One  Way )  dengan  batas  kepercayaan 95 %   α  0,05)  menggunakan Statistical  Pack age  for the Social Sciences (SPSS)  versi 20  (Latuconsina et al., 2014).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil  uji fitokimia
Rendemen  ekstrak  yang  diperoleh  dalam penelitian  ini  bervariasi  sebesar  6,16%  hingga 9,41% (Tabel  1). Nilai rendemen ini  dapat digunak an untuk  mengetahui  nilai  ekonomis  suatu  produk  at au bahan.  Rendemen  ekstrak  dalam  penelitian  ini  ber- variasi  disebabkan  oleh  ketidakseragaman  ukuran partikel  pada  satuan  mesh  tert entu  setelah  digiling dan  pengayak an  goyang.  Hasil  ini  akan  digunak an untuk uji-uji  selanjutnya  termasuk  uji fitokimia.
Tabel  1.   Rendemen  ekstrak  metanol  daun  namnam
dalam  beberapa  pengulangan Maserasi* Berat Sampel Serbuk (g) Berat Ekstrak (g) Rendemen (%) I 100 7,55 7,55 II 100 6,19 6,19 III 100 6,16 6,16 IV 100 6,30 6,30 V 100 6,85 6,85 VI 100 9,41 9,41 Keterangan:  *I,  II,  III,  IV,  V  dan  VI  adalah  pengulangan untuk  mendapatkan sampel  yang  akan  diuji  selanjut- nya
Analisis  fitokimia  dilakukan  untuk  memberikan gambaran tentang golongan senyawa yang terkandung  dalam  Madu  Trigona  (MT)  dan  Ekstrak Metanol  Daun  Namnam  (EMDN)  secara  tunggal maupun  kombinasi  (EMDN  :  MT).  Hasil  pengujian memperlihatkan  bahwa  semua  jenis  sampel  baik tunggal  maupun  kombinasi  positif  mengandung senyawa  fenolik  dan  flavonoid  (Tabel  2).  Hasil  uji
fitokimia  terhadap  ekstrak  metanol  daun  namnam Positif  mengandung  fenolik,  flavonoid,  steroid/ triterpenoid,  saponin,  dan  kuinon  (Tabel  2).  Hasil  ini sesuai  dengan  penelitian  Aziz  dan  Iqbal  (2013), penentuan  kandungan  awal  senyawa  fitokimia  me- nunjukkan  bahwa  adanya  tanin,  saponin,  flavonoid, terpenoid,  dan  glikosida  yang  bermanfaat  sebagai antioksidan pada daun namnam ( Cynomet ra cauliflora ). Pada awalnya MT tidak mengandung steroid/triterpenoid,  saponin,  dan  kuinon,  namun setelah  kombinasi  dengan  EMDN  menunjukkan hasil  fitokimia  yang  positif  (Tabel  2).  Hal  ini  meng- indikasikan  bahwa  kandungan  golongan  senyawa saponin,  kuinon,  terpenoid  dan  steroid  berasal  dari ekstrak  daun  namnam.  Artinya  bahwa  kombinasi dua  bahan  ini  saling  melengkapi  yang  dapat  me- nambah  nilai aktivitas  dari  bahan  kombinasi.

## Aktivitas  antioksidan
Hasil  analisis  memperlihatkan  bahwa  semua sampel  yang  dianalisis  memiliki  kemampuan  me- lakukan  penghambatan  terhadap  radikal  DPPH. Aktivitas  antioksidan  t ertinggi  terdapat  pada  sampel EMDN  dengan  nilai  IC 50 sebesar  0,0048  mg/mL (Tabel  3).  Keberadaan  senyawa-senyawa  seperti fenolik,  flavonoid,  dan  vitamin  C  pada  madu  dan namnam  berperan  penting  untuk  aktivitas  anti- oksidan.  Hal  ini  ditunjukkan  oleh  pola  hubungan kandungan  senyawa  ters ebut  dengan  aktivitas antioksidan  (Tabel  4).  Hubungan  ini  memper- lihatkan  bahwa  tingginya  kadar  fenolik,  flavonoid dan  vitamin  C  pada  sampel  menyebabkan  tingginya aktivit as  antioksidan  (Tabel  4).  Hal  ini  dipertegas oleh  hasil  penelitian  Ado et  al. (2014),  yang melaporkan  kandungan  total  fenolik  dari  ekstrak metanol  daun  tanaman  namnam  sebesar  214,370 mg  GAE/g  ekstrak  dan  aktivitas  antioksidan  dengan nilai IC 50 sebesar  0,048  mg/mL.
Tabel  2.   Hasil  uji  fitokimia  sampel  ekstrak  metanol  daun  namnam  sebelum  dan  sesudah  di kombinasikan dengan  madu  trigona Sampel Fenolik Flavonoid Alkaloid Steroid/Triterpenoid Saponin Kuinon EMDN + + - + + + MT + + - - - - EMDN : MT  (1:1) + + - + + +
Keterangan: (+): Terdeteksi; (-): Tidak Terdeteksi; EMDN : Ekstrak Metanol Daun Namnam; MT  :  Madu Trigona;  MT : EMDN (1:1): Kombinasi Madu Trigona : Ekstrak Metanol Daun Namnam (1:1)
Tabel  3.  Aktivitas antioksidan sampel ekstrak metanol  daun  namnam  dan  madu  t rigona sebelum  dan  setelah  kombinasi Sampel IC 50 (mg/mL) Standar vitamin C 0,0036 ± 0,000 a MT 3,736 ± 0,112 b EMDN 0,0048 ± 0,000 a MT  : EMDN (1:1) 0,0085 ± 0,000 a
Keterangan: Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada tabel  menunjukkan  nilai  tidak  berbeda  nyata  (uji Duncan α  =  5% ;  MT:  Madu  Trigona;  EMDN:  Ek trak Metanol Daun Namnam; MT : EMDN (1:1): Kombinasi Madu Trigona : Ekstrak Metanol Daun Namnam (1:1)
Ado et  al .  (2014)  juga  menyatakan  bahwa terdapat  18  senyawa  yang  telah  diidentifikasi  dari fraksi  aktif  etil  asetat  dan  butanol  daun Cynomet ra cauliflora L  yang  merupakan  bagian  dari  senyawa fenolik  dan  flavonoid.  Ketika  sampel  MT  dan  EMDN dikombinasikan menunjukkan perubahan yang signifikan  terhadap  aktivitas  antioksidan  meskipun tidak  sebesar  EMDN  sebelum  dikombinasikan.  Hasil ini  diperkuat  oleh  hasil  analisis  statistika  yang menunjukkan  bahwa  aktivitas  antioksidan  sebelum dan  sesudah  kombinasi  berbeda  nyata.  Aktivitas antioksidan  pada  sampel  setelah  kombinasi  diduga diakibatkan  oleh  keberadaan  senyawa  aktif  yang terdet eksi  pada  uji  fitokimia  (Tabel  2)  maupun  uji kuantitatif  (Tabel  4).
Tabel  4.  Kandungan  tot al  fenolik,  flavonoid,  dan vitamin  C  madu  trigona  dan  ekstrak metanol  daun  namnam  sebelum  dan setelah  kombinasi Sampel Kadar Total Fenolik Kadar Total Flavonoid Kadar Vitamin C (mg GAE/g Sampel ± SD) (mg QE/g Sampel ± SD) (mg AA/g Sampel ± SD) MT 1,0096 ± 0,1170 a 0,0962 ± 0,00490 a 49,7352 ± 1,43334 b EMDN 267,6897 ± 7,27079 c 12,5850 ± 0,17950 c 201,6848± 14,86620 e MT  : EMDN (1:1) 131,7105 ± 4,66267 b 6,9388 ± 0,35035 b 61,9637 ± 1,42908 c,d
Keterangan: Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada tabel  menunjukkan  nilai  tidak  berbeda  nyata  (uji Duncan α  =  5% ;  MT:  Madu  Trigona;  EMDN:  Ek trak Metanol Daun Namnam; MT : EMDN (1:1): Kombinasi Madu Trigona : Ekstrak Metanol Daun Namnam (1:1)
Hal  ini  terlihat  dari  keberadaan  total  fenolik, flavonoid  dan  vitamin  C  yang  mempengaruhi mekanisme  radikal  DPPH scavenging .  Selain  itu,
flavonoid  juga  telah  dilaporkan  berpengaruh  pada sifat  antioksidan  melalui  aktivitas scavenging dan kelating.
Hasil  analisis  sifat  antioksidan  (LC 50 )  (Tabel  3) pada  kombinasi  MT  dan  EMDN  tidak  menunjukkan nilai  yang  paling  tinggi.  Hal  ini  sejalan  dengan fluktuasi  total  fenolik,  flavonoid  dan  vitamin  C. Kondisi  ini  memperk uat  alasan  bahwa  kemampuan antioksidan  kombinasi  MT  dan  EMDN  dipengaruhi oleh  keberadaan  total  fenolik,  flavonoid  dan  vitamin C.  Pengaruh  senyawa  ini  telah  disimpulkan  oleh Singh et  al., 2010  melalui  kombinasi  Triphala dengan Terminalia chebula, Terminalia Bellerica dan Emblica  officinalis .  Penelitian  tersebut  menyatak an bahwa  fraksi  yang  kaya  polifenol  relatif  berpengaruh terhadap  sifat  antioksidan  dibandingkan  yang  lebih rendah  kadar  fenoliknya.  Dugaan  lain  yang  mem- pengaruhi  aktivitas  antioksidan  bahan  kombinasi tersebut  adalah  komposisi  bahan.  Liu et  al., 2014 melakukan  penelitian  kombinasi  ekstrak  ubi  jalar manis  dengan  polifenol  tanaman  Teh  dan  flavonoid Pueraria yang  menyatakan  bahwa  komposisi  bahan yang  optimum  berperan  penting  pada  kondisi oksidatif  sistim  biologi.  Kondisi  ini  juga  memunc ul- kan  dugaan  bahwa  telah  terjadi  interaksi  senyawa yang  terdapat  dalam  bahan  yang  dikombinasikan. Meskipun  demikian,  mekanisme  peranan  fitokon- stituen  yang  berbeda  pada  bahan  campuran  dan mempengaruhi  aktivitas  antioksidan  perlu  diteliti lebih  lanjut.
Perbedaan sifat antioksidan tidak hany a berkorelasi  dengan  jumlah  total  antioksidan,  tetapi berkenaan  juga  dengan  komponen-k omponen  yang terpilih.  Secara  rinci  dikatakan  bahwa  perbedaan kemampuan sebagai antiradikal (antioksidan) diakibatkan  karena  (i)  perbedaan  komponen  dan komposisi bioaktif, (ii) k eragaman karakteristik struk- tural  fenolik  yang  berpotensi  sebagai  antioksidan, (iii)  sinergisme  komponen  bioaktif  yang  ada  dalam setiap  kombinasi  dan  (iv)  perbedaan  sifat  kinetik antioksidan  potensial  (Ramadan,  2008).
Semua  sampel  yang  ada  baik  dalam  bentuk tunggal  maupun  campuran  menunjukkan  nilai  IC 50 kurang  dari  50  ppm.  Menurut  Jun et  al. (2003), aktivit as  antioksidan  digolongkan  sangat  aktif  jika nilai  IC 50 kurang  dari  50  ppm,  digolongkan  aktif  bila nilai  IC 50 antara  50-100  ppm,  digolongkan  sedang bila  nilai  IC 50 101-250  ppm,  dan  digolongkan  lemah bila  nilai  IC 50 250-500  ppm,  serta  digolongkan  tidak aktif bila nilai IC 50 lebih besar dari  500  ppm. Semakin kecil  nilai  IC 50 berarti  semakin  tinggi  aktivitas antioksidan.  Oleh  karena  itu,  nilai  IC 50 sampel  yang dianalisis  menunjukkan  kemampuan  antioksidan sangat  aktif.
Uji fitokimia dan id entifikasi β-karoten
Hasil  uji  fitokimia  (Tabel  5)  menunjukkan adanya  kandungan  senyawa  golongan  triterpenoid dan  karotenoid.  Senyawa  golongan  triterpenoid ditandai  dengan  timbulnya  warna  merah  sedangk an senyawa  golongan  steroid  ditandai  dengan  ter- bentukny a  warna  hijau.  Selain  itu,  uji  kualitatif karotenoid  dengan  menggunakan  pereaksi Carr Price (SbCl 3 dalam  kloroform).  Terbentukny a  warna merah jingga  atau coklat setelah penambahan S bCl 3 menunjukkan  dalam  ekstrak  terdapat  karotenoid. Terbentukny a  warna  merah  disebabkan  karotenoid membentuk  komplek  dengan  ion  logam  Sb.
Tabel  5.  Hasil  uji  kualitatif  ( Scan  λ Maks )  keberadaan senyawa  karotenoid  dan  steroid/triter- penoid  pada  sampel  madu  trigona  dan ekstrak metanol  daun  namnam
Sampel Golongan Senyawa λ maks (nm) Steroid/Triterpenoid Karotenoid MT + + 442,83 EMDN + + 328,37; 382,20; 418,81; 443,68; 472,30 Keterangan: + (Terdeteksi), dan – (Tidak terdeteksi) Madu Trigona (MT),  Ekstrak Metanol Daun Namnam  (EMDN)
Hasil scan λ maks (Tabel  5)  sampel  MT  dan EMDN  menunjukkan  serapan  maksimum  pada panjang  gelombang  tertentu  (Tabel  5).  Hasil  ini diperkuat oleh Britton et al. (2004) yang menyatak an ahwa   erapan  mak imum  β-karoten  pada  panjang gelombang  425,  450,  dan  477  nm.  Hal  ini  men g- gambarkan  bahwa  sampel  MT  dan  EMDN  memiliki kandungan  β-k aroten,  selisih  jarak  panjang  gelom- bang  yang  berdekatan.  Pada  sampel  ekstrak  daun namnam  terdapat  banyak  serapan  maksimum, karena  adanya  senyawa  lain  yang  terdapat  pada ampel.  nali i  ini menggunakan  tandar β-k aroten murni  sebagai  standar  pengukuran.  Hasil  merujuk pada  penelitian  Alvarez-Suarez et  al. (2010)  dan Biswas et  al. (2011)  dengan  menggunak an  spektro- fotometer  UV-Vis.
Kandungan β-k aroten  pada  ekstrak  daun namnam  1, 013  mg  βCE/gr  le ih   e ar  jika  di- bandingk an  dengan  sampel  madu  trigona  (Tabel  6). Hasil  ini  diakibatkan  oleh  pengaruh  klorofil  terutama pada  bagian  permukaan  atas  daun  dan  keberadaan senyawa  polifenol.  Lisiewska et  al .  (2006)  menyat a- kan  bahwa  tanaman  memiliki  kandungan  karotenoid dan  β-karoten  lebih  tinggi  pada  tanaman  yang memiliki kandungan klorofil  dan  polifenol yang tinggi.
K andungan  β-karoten  tersebut  akan  mengalami peningkatan  (Tabel  6)  ketika  MT  dan  EMDN dikombinasikan.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pe- manfaat an  kombinasi  kedua  bahan  tersebut  sangat potensial  untuk  mendapatkan  fungsi  yang  terkan- dung dalam β-karoten.
Tabel  6.  Kadar β-karoten  pada  sampel  madu trigona dan  ekstrak metanol daun  namnam sebelum  dan  setelah  dikombinasikan  serta ekstraksi partisi  pada  beberapa  pelarut
Sampel Kadar β-karoten mg βCE/gr MT 0,014 ± 0,100 EMDN 1,013 ± 0,020 MT:  EMDN (1:1) 3,15 ± 0,500 Fraksi n-heksana 18,83 ± 0,030 Fraksi etil asetat 0,022 ± 0,120 Fraksi butanol - Fraksi air -
Keterangan:  MT:Madu  Trigona,  EMDN:Ekstrak  Daun Namnam,  MT:EMDN  (Kombinasi  Madu  Trigona  & Ekstrak  Daun  Namnam).  Data  partisi  pada  beberapa pelarut untuk sampel setelah kombinasi (MT : EMDN)
Hasil  ini  akan  mengalami  peningkatan  lagi ketika  sampel  kombinasi  diekstraksi  partisi  dengan fraksi  n-heksana  yang  menyebabkan  peningkat an kadar  β-karoten  hingga  mencapai  6  (enam)  kali dibandingkan  sebelum  kombinasi.  Penyebab  pe- ningkatan  kadar  β-karoten  ini  ditinjau  dari  struktur dan   ifat  β-karoten,  termasuk  golongan  karetonoid yang  bersifat  non-polar,  sehingga  mudah  larut dalam  pelarut  non-polar  sesuai  dengan  prinsip lik e disolves  lik e .  Sementara  itu,  pada  fraksi  etil  asetat relatif  edikit β-karoten yang terdeteksi pada pelarut ini,  karena  etil  asetat  merupakan  pelarut  semi  polar. Akibatnya, β-karoten yang terekstrak pada fraksi etil asetat relatif  lebih  sedikit.

## Aktivitas  antibakteri
Hasil  analisis  terhadap  aktivitas  antibakteri pada  semua  sampel  menunjukkan  adanya  pem- bentukkan  zona  bening,  namun  dengan  intensitas yang  berbeda-beda.  EMDN  menunjukkan  zona bening  yang  paling  tinggi  pada Staphyloc occus aureus ,  tapi  sampel  MT  paling  tinggi  pada Escherichia  coli (Tabel  8).
Perbedaan  respon  bakteri  dapat  disebabkan oleh  faktor-faktor  yang  ada  dalam  sampel  tersebut. Misalnya  perbedaan  zona  hambat  sampel  MT terhadap  kedua  bakteri  t ersebut  disebabkan  karena perbedaan  dinding  sel E.  coli yang  memiliki  dinding sel  yang  lebih  tipis  dibanding S.  aureus .  Peranan dinding  sel  ini  oleh  Fadhilla et  al. (2012)  dinyatak an
dalam  penelitian  ekstrak  etanol  lumut  hati  bahwa sensitivit as S. aureus A TCC  5923  yang  tinggi disebabkan  karena  struktur  dinding  selnya.  Bakteri Gram  positif  seperti S. aureus tidak  memiliki  mem- bran  luar  seperti  yang  dimiliki  kebanyakan  bakteri Gram  negatif.  Disamping  itu S.  aureus memiliki dinding  sel  yang  bersifat  hidrofobik  pada  bagian luarnya,  sehingga  konsentrasi  rendah  dari  ekstrak lumut  (<1  mg/mL)  akan  dapat  membunuh  seluruh bakteri S. aureus (Madigan et al., 2009) .
Senyawa  fenolik  akan  merusak  sel  bakteri dengan  cara  mengubah  permeabilitas  membran sitoplasma  karena  larut  lemak.  Sementara  dalam konsentrasi  yang  lebih  rendah,  fenol  menginaktifk an sistem enzim penting dalam s el bakteri (Oliver et  al., 2001).  Madu  kelulut  dari Trigona spp  memiliki kandungan  fenolik  dan  intensitas  warna  yang  lebih tinggi  dari  madu  Apis  spp  (Kek et  al., 2014). Aktivitas  antibakteri  pada  madu  dapat  disebabk an konsentrasi  gula  yang  tinggi,  keasaman,  total flavonoid, total  fenol, konsent rasi hidrogen  peroksida atau  komponen  yang  belum  teridentifikasi  lainnya yang  terdapat  di  dalam  madu  (B ogdanov,  201 5). Keberadaan  senyawa  fenolik  dan  flavonoid  pada sampel  MT  dan  EMDN  yang  diuji  telah  mendukung beberapa  pernyataan  sebelumnya  (Tabel  4).
Pengujian  antibakteri  ekstrak  metanol  daun namnam (EMDN) menunjukkan  bahwa zona  hambat S. aureus sebesar  23,7 mm, sedangkan E. coli tidak membentuk  zona  hambat  (Tabel  7).  Senyawa  aktif yang  berperan  sebagai  antibakteri  pada  daun  nam- nam  hampir  sama  dengan  senyawa  aktif  yang terkandung di  dalam MT, hanya saja kadar senyawa aktif  tersebut  yang  berbeda,  sehingga  memberik an pengaruh  y ang  berbeda  pula  pada  kedua  bakteri. Total  fenolik  dan  flavonoid  pada  ekstrak  metanol daun  namnam  cukup  tinggi  dibandingkan  dengan madu,  namun  senyawa  aktif  ekstrak  metanol  daun namnam  hanya  mampu  menghambat  pertumbuhan S.  aureus yang  disebabkan  dinding  selnya  bersifat polar,  sehingga  senyawa  aktif  ekstrak  metanol  daun namnam  yang  bersifat  polar  juga  lebih  mudah menembus  dinding  sel S. aureus tersebut.
Sampel EMDN dapat menghambat per- tumbuhan S.  aureus karena  bakteri  tersebut  tidak memiliki  membran  luar  seperti E.  coli . S.aureus hanya  memiliki  dinding  sel  yang  terdiri  dari  lapis an peptidoglikan  tanpa  adanya  tiga  polimer  pem- bungkus  di  luar  sehingga  selnya  akan  mudah  ter- denaturasi  oleh  senyawa  aktif  di  dalam  ekstrak metanol  daun  namnam.  Sebaliknya, E.  coli memiliki tiga  lapisan  dinding  sel  yang  menyebabkan  bakteri tersebut  lebih  tahan  terhadap  ekstrak  met anol  daun namnam.  Senyawa  fenolik  yang  memiliki  substansi
cincin  aromatik  dengan  satu  atau  lebih  gugus hidroksil  sehingga  dapat  menembus  peptidoglikan. Akibatnya,  dinding  dan  membran  sel  mengalami kerusakan  dan  mengganggu  sistem  transpor  aktif bakteri  (B achir  dan  Benali,  2012).  Menurut  Ruiz et al .  (2012)  senyawa  fenolik  selain  merus ak  struktur dinding  sel  dan  mengganggu  kerja  transpor  aktif, juga  mengganggu  kekuatan  proton  di  dalam  mem- bran  sitoplasma  bakteri.  Kemampuan  antibakteri tanaman dari jenis cynometra yang lebih besar  pada S. aureus dibandingkan E.  coli ini  dipertegas  oleh beberapa  penelitian  seperti  pada  ekstrak  etanol daun Cynometra  travancorica (John et  al., 2012) dan ekstrak met hanol kulit kayu Cynometra  ramiflora Linn  (Afjalus et al., 2013).
Tabel  7.   Pengaruh  ekstrak  tunggal  dan  kombinasi MT  dan  EMDN  terhadap  penghambatan pertumbuhan Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli Sampel Staphylococcus aureus (mm ± SD) Escherichia coli (mm ± SD) EMDN 23,7 ± 3,3 d 0,00 ± 0,00 a MT 16,6 ± 4,1 c,d 32,6 ± 4,4 d,e,f,g MT:EMDN  (1:1) 17,6 ± 2,6 d 23 ± 1,9 c Kloramfenikol 22,2 ± 3,8 d 27,9 ± 0,5 c,d,e Povidone iodine 10,3 ± 1,0 b,c 23,5 ± 8,9 c Metanol 0,00 ± 0,00 a 10,8 ± 3,8 b Aquades 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a
Keterangan:  Angka-angka  yang  didampingi  oleh  huruf yang  sama  dalam  satu  kolom  menunjukkan  tidak berbeda  nyata  pada  taraf  uji  lanjut  Duncan  5%  taraf signifikan  95%  ( P <0,05).  Data  pada  perlakuan  telah dikonversi terhadap zona hambat oleh metanol
Hasil  pengujian  antibakteri  selanjutnya  melalui kombinasi  MT  dan  EMDN  menunjukkan  bahwa  baik pada E.  coli maupun S.  aureus menunjukkan  ada- nya  zona  hambat  (Tabel  7).  Hasil  ini  menunjukkan adanya  penurunan  dibandingkan  pada  saat  sampel tunggal.  Selanjutnya  pem bentukan  zona  hambat pada E.  coli sampel  kombinasi  yang  sebelumnya tidak  nampak  pada  EMDN  menunjukkan  kont ribusi hambatan  berasal  dari  sampel  MT.
Zona  hambat  pada  kombinasi  lebih  kecil dibandingkan  dengan  sampel  tunggal.  Maslem et  al. (2012) menyatakan bahwa kombinasi  dua atau lebih substansi  akan  memberik an  nilai  medis  yang  lebih baik  jika  komponen-komponen  di  dalamnya  tidak terjadi  reaksi  yang  dapat  merugikan  kesehatan. Selain  itu,  kecilnya  daya  hambat  ini  menunjukkan bahwa  komposisi  MT  dan  EMDN  (1:1)  bukanlah komposisi  yang  optimal  untuk  mendapatkan  efek antibakteri  yang  maksimal.  Hal  ini  telah  dibuktikan
melalui  penelitian  kombinasi  madu  dan Nigella sativa (Maslem et  al., 2012),  kombinasi  madu  dan Garcinia  k ola (Akinnibosun  dan  Itedjere,  2013),  dan kombinasi  madu  alam  dan  benih Peganum  harmala (Ahmed et  al., 2013),  madu  dan  tepung  kentang (Ahmed et  al., 2012).  Hasilnya  menunjukkan  bahwa jika  komposisi  bahan  yang  dicampurkan  dengan madu  berbeda  maka  zona  hambat  yang  dihasilkan cenderung  berbeda t erhadap masing-masing bakteri uji  dan  menunjukkan  efek  sinergi.  Bahkan  pada beberapa  kondisi  makin  tinggi  komposisi  yang  di- campurk an  dengan  madu  maka  zona  hambat  makin tinggi  (Maslem et  al., 2012;  Akinnibosun  dan Itedjere,  2013).
Hasil  analisis  ini  menunjukkan  pula  bahwa peningkatan  komposisi  komponen  EMDN  me- nyebabkan  peningk atan  zona  hambat.  Mekanisme aktivit as  antibakteri  madu  yang  kompleks  ini  diduga berkaitan  dengan  aktivitas  sinergis  antara  berbagai bahan  bioaktif  seperti  polifenol  dan  flavonoid (Escuredo et  al .,  2012;  Lee et  al., 2008)  yang  juga terdapat  pada  MT  dan  EMDN.  Selain  itu,  kombinasi MT  dan  EMDN  dalam  penelitian  ini  masih  meng- hasilkan  zona  hambat  yang  lebih  tinggi  dibanding- kan  dengan  antibakteri  komersil  ( Povidine  Iodine ) (Tabel  7),  sehingga  masih  sangat  potensial  untuk tetap  dikembangkan  sebagai  s alah  s atu  alternatif antibakteri  pada  berbagai  bahan  pangan.
Analisis  ini  menunjukkan  bahwa  sampel  MT dan EMDN tunggal memiliki kandungan tot al fenolik, flavonoid,  vit amin  C  lebih  tinggi  diban dingk an kombinasi  MT  dan  EMDN.  Namun, kandungan  β- karoten  kombinasi  MT  dan  EMDN  menunjukkan hasil  yang  lebih  tinggi.  Analisis  terhadap  aktivitas antioksidan  menunjukkan  bahwa  EMDN  mem- berikan aktivitas tertinggi (IC 50 0,0048±0,000 mg/mL), kombinasi  EMDN  dan  MT  (IC 50 0,0085±0,000 mg/mL)  dan  MT  (IC 50 3,736±0, 112  mg/mL).  Analisis bioaktivitas  sebagai  antibakteri  juga  menunjukkan bahwa  EMDN  lebih  peka  terhadap S.  aureus
(23,7±3,3  mm)  dibandingkan  pada E.  coli ,  sedang- kan  MT  lebih  peka  terhadap E.  coli (32,6±4, 4  mm) dibandingkan  bakteri S.  aureus (16,6±4,1  mm). Demikian  pula,  kombinasi  EMDN  dan  MT  lebih  peka terhadap E.  coli (23±1,9  mm)  daripada S.  aureus (17,6±2,6  mm).  Dengan  demikian  madu  trigona, ekstrak metanol daun namnam ( Cynomet ra cauliflora L)  dalam  bentuk  tunggal  maupun  kombi- nasinya  sangat  potensial  dimanfaatkan  sebagai sumber  antioksidan  dan  antibakteri  dalam  suatu
bentuk  pangan  fungsional.  Namun  demikian,  perlu dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  dengan  perbanding- an  yang berbeda-beda.

## UCAPAN  TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  semua  pihak  yang  telah membantu riset ini dan khususnya kepada almarhumah  Dr.  Nastiti  Kusumorini  yang  telah melakukan  pembimbingan  hingga  penelitian  tahap ini  dapat  terlaksana  dengan  baik.  Ucapan  terima kasih  juga  saya  sampaikan  kepada  Hilyatuzzahrah yang  telah  membantu  melakukan  pengeditan  ter- hadap  beberapa  bagian  dari  tulisan ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmed  M,  Khiati  B,  Djebli  N,  Aissat  S,  Maslem  A,
Bacha  S.  2013.  Potent  synergism  of  the combination  of  nat ural  honey  and Peganum harmala seeds  against Candida  albicans ATCC 10231.  Open  Access  Scientific  Reports  2:  736. DOI:  10.4172/scientificreports736.
Ahmed  M,  DjebliN,  Aissat  S,  Bacha  S,  Meslem  A,
Khiati  B.  2012.  Synergistic  inhibition  of  natural honey  and  potato  starc h  and  their  correlation with diastase number and sugar content against Klebsiella  pneumoniae ATCC  27736.  Nat  Prod
1000102.
Afjalus SM, Malik S, Emrul H, S anjana S, Farjana Y. 2013.  E valuation  of  neuropharmacological, antibacterial  and  antinociceptive  activity  of methanolic  extract  of  the  bark  of Cynometra ramiflora linn.  (Leguminosae).  Int  J  Res Ayurveda  P harm  4:  192-197.  DOI:  10. 7897/ 2277-4343.04220.
Akinnibosun,  Itedjere.  2013.  E valuation  of  the antibacterial  properties  and  synergistic  effect  of Garcinia  k ola heckel  (Family:  Guttiferae)  seed extract  and  honey  on  some  bacteria.  Afr J Microbiol  Res 7: 174-180.
Ado  MA,  Abas  F,  Ismail  IS,  Ghazali  HM,  Shaari  K.
2014. Chemical profil and antiacetyl- cholinesterase,  antityrosinase,  antioxidant  and α-glucosidase  inhibitory  activity  of Cynometra cauliflora L.  leaves.  J  Sci  Food  Agric  95:  635- 642. DOI:  10.1002/jsfa.6832.
Alvarez-Suarez  JM,  Tulipani  S,  Romandini  S,  Vidal A,  Battino  M.  2010.  Methodologic al  aspects about  determination  of  phenolic  compounds and  in  vitro  evaluation  of  antioxidant  capacity  in
KESIMPULAN
Chem  Res  1:  102.  DOI:  10.4172/ 2329-6836.
the  honey:  a  review.  Curr  Anal  Chem  5:  292 –
Aziz  AFA,  Iqbal  M.  2013.  Antioxidant  activity  and phytochemical composition of Cynometra cauliflora .  J  Exp  Int egr  Med  3:  337-341.  DOI: 10.5455/jeim.250813.or.086.
Bachir  GR,  Benali  M.  2012.  Antibacterial  activity  of the  essential  oils  from  the  leaves  of  Eucalyptus globulus against Escherichia  coli and Staphy- lococcus  aureus .  Asian  Pac  J  Trop  Biomed  2: 739-742.  DOI:  10.1016/S2  221-1691(12)60220- 2.
Bogdanov S. 2015. Honey as nutrient  and  functional food.  Bee  product  sci.  A  Review,  1-28.  http:// www.bee- hexagon.net/ﬁle /ﬁle/ﬁleE/HealthHo ney/8HoneyNutrientFunctionalReview.pdf [15 Mei 2015].
Biesalski  HK,  Dragsted  LO,  Elmadfa  I,  Grossklaus R,  Müller  M,  Schrenk  D,  Walter  P,  Weber  P.
2009.  Bioactive  compounds:  definition  and assessment  of  activity.  Nutr  25:  1202 –1205. DOI:  10.1016/j.nut.2009.04.023.
Biluca  FC,  Betta  FD,  Oliveira  GPD,  Pereira  LM, Gonzaga  LV,  Costa  ACO,  Fett  R.  2014.  5-HMF and  carbohydrates  content  in  stingless  bee honey  by  CE  before  and  after  thermal treatment.  Food  Chem  159:  244-249.  DOI: 10.1016/j.foodchem.2014.03.016.
Biswas AK, Sahoo  J, Chatli MK. 2011. A simple  UV- Vis  spectrophot ometric  met hod  for  determina - tion  of  β-carotene  content  in  raw  carrot,  sweet potato and supplemented chicken meta nuggets.  LWT-J  Food  Sci  Tech 44:  1809-1813.
Britton  G,  Jensen  SL,  Pfender  H.  2004.  Handbook Caretonoids.  15-538.  Birkhauser  Verlag.  Berlin. ISBN:  978-3-7643-6180-8  (book )  ISBN:  978-3- 0348-7836-4  (eBook ).  DOI:  10.1007/978-3- 0348-7836-4.
Djamil  R,  Anelia  T.  2009.  Penapisan  fitokimia,  uji BSLT,  dan  uji  antioksidan  ekstrak  metanol beberapa spesies papilionaceae. J Ilmu Kefarmasian  Indonesia  7: 65-71.
Escuredo  O,  Silva  LR,  Valent ão  P,  Seijoa  MC, Andrade  PB.  2012.  Assessing Rubus honey value:  Pollen  and  phenolic  compounds  content and  antibacterial  capacity.  Food  Chem  130: 671 –678.  DOI:  10.1016/j.foodchem.2011.07. 107.
Fadhilla  R,  Iskandar  EA,  Kusumaningrum  HD.  2012. Aktivitas  antibakteri  ekstrak  tumbuhan  lumut hati  ( Marchantia  paleacea )  terhadap  bakteri patogen  dan  perusak  pangan.  J  Teknol  Industri Pangan  23:  126-131.  2012.  DOI:  10.6066/jtip. 2012.23.2.126.
Ferreira ICFR, Aires E, Barreira  JCM, Estevinho LM.
samples:  Different  contributions  of  the  entire honey  and  phenolic  extract.  Food  Chem 114: 1438-1443. DOI: 10.1016/j. foodchem. 2008. 11.028.
Harborne  JB.  1996.  Metode  Fitokimia  Penunt un Cara  Modern  Menganalisis  Tumbuhan.  Edisi Kedua.  97-240.  ITB,  Bandung.
Jun  M,  Fu  HY,  Hong  J,  Wan  X,  Yang  CS,  Ho  CT. 2003.  Comparison  of  antioxidant  activities  of isoflavones  from  kudzu  root  ( Pueraria  labata Ohwl).  J  Food  Sci  68:  2117 –2122.  DOI:
John  J,  Ragi  RP,  Sujana  KA,  Kumar  A N.  2012. Analysis of phytochemical contents and antibacterial  activity  of  an  endangered  tre e ( Cynometra  travancorica Bedd.)  of  Western Ghats, India.  Adv  Biol Res 6: 1-5.
Kek  SP,  Chin  NL,  Yusof  YA,  Tan  SW,  Chua  LS. 2014.  Total  phenolic  contents  and  colour intensity  of  Malaysian  honeys  from  the Apis spp.  and Trigona spp.  bees.  Agric  Agric  Sci Proced  2:  150 –155.  DOI:  10.1016/j.aaspro. 2014.11.022.
Latuconsina  NH,  Fatimawali,  Citraningtyas  G.  2014 Uji  efektivitas  diuretik  ekstrak  etanol  biji  salak ( Salacca  Zalacca varietas Zalacca (Gaert.) Voss)  pada  tikus  putih  jantan  galur  wistar ( Rattus  norvegicus )  PHARMA CON  J  Ilmiah Farmasi  3: 177-181.
Lee  H,  Churey  JJ,  Worobo  RW.  2008.  Antimicrobial activity  of  bacterial  isolates from  different  floral sources  of  honey.  Int  J  Food  Microbiol  126: 240-244.  DOI:  10.1016/j.ijfoodmicro.2008.04. 030.
Lestari  A,  Jamhari  M,  Kundera  IN.  2013.  Daya hambat  ekstrak  daun  tembelek  ( Lantana camara
L.)  terhadap  pertumbuhan  bakteri
Escherichia  coli . E-Jip  Biol 1: 42-49.
Lisiewska  Z,  Kmiecik  W,  Korus  A.  2006.  Content  of vitamin C, carotenoids, chlorophylls and polyphenols  in  green  parts  of  dill  ( Anethum graveolens L.)  depending  on  plant  height.  J Food Compos  Anal  19:  134 –140.  DOI: 10.1016/j.jfca.2005.04.009.
Liu  X,  He  F,  Zhao  L,  Zhou  A,  Liu  X.  2014. Synergistic  antioxidant  activity  of  sweet  potat o extracts  in  combination  with  tea  polyphenols and  pueraria  flavonoid  in  vitro.  Adv  J  of  Food Sci Technol  6: 215-220.
Madigan  MT,  Martinko  JM,  Dunlap  VP,  Clark  PD. 2009.  Brock:  Biology  of  Microorganisms.  12th Edition.  p  794-807.  Pearson  Benjamin-Cum - mings, San Francisco.
DOI:  10.1016/j.lwt.2011.03. 017. 10.1111/j.1365-2621. 2003.tb07029.x.
302.  DOI:  10.2174/157341109789077 768.
2009.  Antioxidant  activity  of  Portuguase  honey
Maslem  A,  Ahmed  M,  Djebli  N,  Aissat  S.  2012. Antibacterial  activity  of  honey  alone  and  in combination  with Nigella  sativa seeds  against Pseudomonas  aeruginosa infection.  Asian  Pac J Trop  Dis 2: S428-S430.
Masoko  P,  Gololo  SS,  Mokgotho  MP,  Eloff  JN, Howard  RL,  Mampuru  LJ.  2009.  E valuation  of the  antioxidant,  antibacterial,  and  antiprolifera - tive  activities  of  the  acetone  extract  of  the  roots of Senna  italica ( Fabaceae ).  Afr  J  Trad  CAM  7: 138 –148.
Meda A, Lamien  CE, Romito M, Millogo J,  Nacoulma OG.  2005.  Determination  of  the  total  phenolic, ﬂavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey,  as  well  as  their  radical  scavenging activity.  Food  Chem  91:  571 –577.  DOI:  10.10 16/j.foodchem.2004.10.006.
Oliver  SP,  Gillespie  BE,  Lewis  MJ,  Ivey  SJ,  Almeida RA,  Luther  DA,  Johnson  DL,  Lamar  KC, Moorehead  HD, Dowlen HH. 2001. Efficacy of  a new  premilking  t eat  disinfectant  containing  a phenolic  combination  for  the  prevention  of mastitis.  J  Dairy  Sci 84: 1545-1549. DOI: 10.31 68/jds.S0022-0302(01)70189-0.
Owayss  AA,  Rady  MM,  Gadallah  FM.  2004.  Pig- mentation  of  some  honeybee, Apis  Mellifera L., products . Fayoum  J  Agric  Res  Dev  18:  121- 132.
Rabeta  MS,  Farazina  R.  2013.  Tot al  phenolic  con- tent and  ferric reducing  antioxidant power of the leaves  and  fruits  of Garcinia  atrovirdis and Cynometra  cauliflora .  Int  Food  Res  J 20:  1691-
1696.
Ramadan  MF.  2008.  Total  antioxidant  potential  of juices,  beverages  and  hot  drinks  consumed  in Egypt screened by DPPH in  vitro  assay. Grasas Y  Aceites  59:  254-259.  DOI:  10.3989/gya. 2008. v59.i3.516.
Ruiz  AG,  Cueva  C,  Rompinelli  EMG,  Yuste  M, Torres  M,  Álvarez  PJM,  Bart olomé  B,  Arribas MVM.  2012.  Antimicrobial  phenolic  extracts able  to  inhibit  lactic  acid  bacteria  growth  and wine  malolactic  fermentation.  Food  Cont 28:
Salni,  Marisa  H,  Mukti  WR.  2011.  Isolasi  senyawa antibakteri  dari  daun  jengkol  ( Pithecolobium lobatum benth) dan  penentuan  nilai KHM -nya.  J Penelitian  Sains 14:  1410938-1410941.
Singh  R,  Singh  B,  Kumarb  N,  Arora  S.  2010.
Antioxidant  activity  of  triphala  a  combination  of Terminalia  c hebula,  Terminalia  bellerica and Emblica  officinalis .  J  Food  Biochem  34:  222 –
Singh  P,  Singh  S,  Kapoor  IPS,  Singh  G,  Isidorov  V,
Szczepaniak  L.  2013.  Chemical  composition and  antioxidant  activities  of  essential  oil  and oleoresins  from Curc uma  zedoaria rhizomes, part-74.  Food  Biosci  3:  42-48.  DOI:  10.1016/j. fbio.2013.06.002.
Socha  R,  Juszczak  L,  Pietrzyk  S,  Fortuna  T.  2009.
Antioxidant  activity  and  phenolic  composition  of herbhoneys.  Food  Chem 113:  568-574.  DOI: 10.1016/j.foodchem.2008.08.029.
Sumarlin  L,  Anna  M,  Prita  W,  Masitoh.  2014.
Aktivitas  antikank er  dan  antioksidan  madu  di pasaran  lokal  Indonesia.  J  Ilmu  Pertanian  Indo- nesia  19: 136-144.
Suryanto  E,  Wehantouw  F.  2009.  Aktivitas  penang- kapan  radikal  bebas  dari  ekstrak  fenolik  daun sukun ( Artocarpus  altilis F.). Chem  Prog  2: 1-7.
Zainol  MI,  Yusoff  KM,  Yusof  MYM.  2013.  Anti- bacterial  activity  of  selected  Malaysian  honey. BMC Complemen Altern 13: 129. DOI: 10. 1186/ 1472-6882-13-129.
212-219.  DOI:  10.1016/j.foodcont.2012.05. 002.
232.  DOI:  10.1111/j.1745-4514.2009.00 326.x.