Uji Aktivitas Analgesik Asam 2-(3-(Klorometil)Benzoiloksi) Benzoat dan Asam 2-(4-(Klorometil) Benzoiloksi)Benzoat pada Tikus Wistar Jantan dengan Metode Plantar Test
Analgesic Activity Test 2- (3- (chloromethyl) Benzoiloksi) Benzoate And 2- (4- (chloromethyl) Benzoiloksi) Benzoate On Male Wistar rats with Plantar Test Method
Wahyu Dewi Tamayanti* ) , Ratna Megawati Widharna, Catherine Caroline, Bambang Soekarjo Jurusan Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala, Surabaya
*) Email: dewffua@gmail.com

## ABSTRACT
The new compounds of salicylic acid derivatives, 2- (3- (chloromethyl) benzoiloksi) benzoic acid and 2-(4- (chloromethyl) benzoiloksi) benzoate was synthesized to produce a greater analgesic activity and lower stomach irritation from salicylic acid. 2-(4-(chloromethyl) benzoiloksi) benzoic acid and 2-(3-(chloromethyl) benzoiloksi) benzoate was synthesized by Schotten-Baumann acylation reaction. In this study, the analgesic test activity with plantar test method. The compound was given to test animals in doses of 12.5; 25; 50; 100; and 200 mg.kg -1 . Analgesic  activity  was  determined  by  the  response  time  of  mice  to  pain  infra-red  heat.  The  percentage  is calculated by the mean pain barrier time response to pain. The results showed percentation of pain barrier: 74.28%; 105.58%; 110.58%; 115.29%; and 175.87% after administration of the compound 2-(4-(chloromethyl) benzoiloksi) benzoate at doses of 12.5; 25; 50; 100; and 200 mg.kg -1 , respectively. The results of calculations percent pain barrier 2-(3-(chloromethyl) benzoiloksi) benzoate, obtained 85.30%; 92.48%; 124.96%; 180.36%; and 208.01% consecutive for the doses compound of 12.5; 25; 50; 100; and 200 mg.kg -1 . Five doses of acetyl salicylic  acid  ranging  from  12.5 mg. kg -1 to  200  mg.kg -1 resulted  in  percent  pain barrier  as  follows:  26%; 34.34%; 45.68%; 60.38% and 114.12%. This study indicates that 2-(3-(chloromethyl) benzoiloksi) benzoic acid and 2-(4-(chloromethyl)benzoiloksi) benzoate are capable of producing higher analgesic activity than acetyl salicylic acid.Keywords: Aktivitas analgesik, plantar test, 2-(3-(klorometil) benzoiloksi) benzoate,asam 2-(4- (klorometil) benzoiloksi) benzoate.
Keywords : analgesic, benzoate, plantar test method

## PENDAHULUAN
Asam  asetil salisilat bekerja sebagai  analgesik antipiretik  dengan menghambat  prostaglandin yang  dibentuk  dari  metabolisme  asam arakidonat dengan katalisator enzim siklooksigenase  (Furst  dan  Munster, 2002). Asam  asetil salisilat  memiliki  efek  samping, diantaranya  terhadap  pernafasan  dan  saluran cerna  yang  dapat menyebabkan  perdarahan lambung  berat  (Gunawan,  2009). Alternatif untuk meningkatkan  aktivitas  analgesik- antipiretik asam  asetil salisilat serta menurunkan  efek  samping terus  diupayakan. Modifikasi struktur dari senyawa turunan asam salisilat  dilakukan  dengan  mengubah  gugus karboksil  melalui  pembentukan  garam,  ester, atau  amida;  modifikasi  pada  gugus  karboksil dan  hidroksil;  substitusi  pada  gugus  hidroksil; memasukkan  gugus  hidroksil  atau  gugus  yang
lain  pada  cincin  aromatik  atau  dengan mengubah  gugus  fungsional  (Purwanto & Susilowati, 2000). Pratiwi  (2009)  telah  melakukan  modifikasi struktur  dengan  penambahan  gugus  3- klorometil benzoil  klorida,  menghasilkan senyawa  asam  3-klorometil benzoil  salisilat atau  disebut  juga  asam  2-(3-(klorometil) benzoiloksi)  benzoat    yang aktivitas analgesiknya telah diujikan pada mencit. Hasil uji  aktivitas analgesik asam  2-(3-(klorometil) benzoiloksi)  benzoat  menunjukkan  harga
Effective  Dose 50 (ED) 50 sebesar  14,05 mg/kgBB  dimana  hasil  tersebut  lebih  kecil dibandingkan  dengan  ED 50 dari  asam  asetil salisilat  yaitu  sebesar 20,83 mg/kgBB. Hal ini menunjukkan  bahwa  senyawa  asam  2-(3- (klorometil) benzoiloksi) benzoat  lebih  aktif dan  potensial  sebagai  analgesik  dibandingkan asam asetil salisilat.
Modifikasi  lain  dilakukan  pada asam salisilat dengan  mereaksikan  dengan  asam  4- klorometil benzoil klorida melalui reaksi asilasi Schotten-Baumann menghasilkan  asam  2-(4- (klorometil) benzoiloksi) benzoate.  Penelitian mengenai  karakter  senyawa  tersebut  telah dilakukan,  antara  lain:  asam  2-(4-(klorometil) benzoiloksi) benzoat memiliki log  P sebesar 3,73, lebih tinggi dari log P asam asetil salisilat yaitu 1,2. Hal ini mengindikasikan bahwa asam 2-(4-(klorometil) benzoiloksi) benzoat mempunyai  sifat  lipofilik lebih besar dibandingkan  asam  asetil salisilat (Martak dkk,2009).Raniya  dkk  (2009)  melakukan  uji aktivitas  analgesik  asam  2-(4-(klorometil) benzoiloksi) benzoat  terhadap  mencit dan menunjukkan  bahwa  nilai  ED 50 asam  2-(4- (klorometil) benzoiloksi) benzoat sebesar 11,31 mg/kg BB.
Natalia et  al. , 2013 memodelkan  beberapa turunan  senyawa  asam  asetilsalisilat  yang berinteraksi dengan reseptor  siklooksigenase-2 menggunakan program Glide (lisensi Schrodinger) .  Dari  hasil  penelitian  tersebut menunjukkan  nilai Glide  Score  (GScore) senyawa asam 2-(3- (klorometil)benzoiloksi)benzoat  sebesar -9,48 dan asam  2-(4-(klorometil) benzoiloksi)
benzoat sebesar -7,39.  Nilai  tersebut  lebih rendah  dibandingkan  dengan  senyawa analgesik paten lain yang sudah beredar seperti asam  asetilsalisilat  ( GScore -5,88)  dan celecoxib  ( GScore -9,47). Nilai GScore merupakan  sistem  penilaian  empiris  yang mendekati  energi  bebas  pengikatan  ligan  dan digunakan  untuk  menentukan  peringkat  pose ligan yang berbeda. Semakin kecil nilai GScore maka  semakin  stabil  ikatan  obat  dan  reseptor yang  terbentuk  (Natalia  dkk,  2013).  Stabilnya obat dengan reseptor tersebut akan menghasilkan  efek  farmakologi  yang  lebih baik. Tingkat keamanan asam 2-(3- (klorometil)benzoiloksi)  benzoatedan 2-(4- (klorometil) benzoiloksi) benzoate diteliti dengan  dilakukannya uji  toksisitas  akut untuk mengetahui efek samping penggunaan senyawa asam  2-(3-(klorometil) benzoiloksi) benzoat pada  mencit.  Dari uji  toksisitas  akut,  kedua senyawa menunjukkan  nilai Lethal  Dose 50 (LD 50 )  sebesar  2000  mg/kg  BB. Penelitian mengenai  aktivitas  analgesik  kedua  senyawa sintetis  masih  terus  dilakukan  sebagai  upaya untuk  melengkapi  data  aktivitas  dan keamanannya.  Pada  penelitian  ini  dilakukan
penelitian  uji  aktivitas  analgesik  pada  tikus Wistar jantan untuk membuktikan reprodusibilitas  aktivitas  senyawa  pada rodensia.

## METODE

## Hewan Coba
Pada  penelitian  ini tikus  Wistar jantan  sehat  dan belum pernah digunakan untuk percobaan lain, tidak ada  kelainan  pada  bagian  tubuh,  dengan  usia 2 - 3 bulan,  bobot  150 - 250  g.  Sebelumnya  tikus diaklimatisasi selama tujuh hari. Sebelum digunakan untuk  penelitian  hewan  coba  dipuasakan 18  jam tetapi tetap diberi minum.

## Sintesis Senyawa Turunan Asam Salisilat
Asam  salisilat dilarutkan  pada aseton  dan ditambahkan  piridin. Senyawa  3-klorometil benzoil klorida dilarutkan dalam aseton. Larutan  asam salisilat dicampurkan  larutan 3-klorometil benzoil klorida tetes demi  tetes lalu direfluks  pada ±56 o C. Dilakukan  uji  KLT  asam  salisilat  dan  3-klorometil benzoil  klorida  sebagai  pembanding  tiap  1  jam sampai  noda  senyawa ersebut hilang. Campuran didinginkan dan air  suling  ditambahkan  perlahan- lahan  sampai  terbentuk  endapan.  Asam  salisilat dilarutkan dalam aseton dan ditambah piridin. Senyawa  4-klorometilbenzoil  klorida  dilarutkan ke  dalam  aseton dan  direfluks  selama  ±4  jam  pada 60°C. Setelah refluks, cairan dituang ke gelas beker lalu ditambah  akuadeshingga  terbentuk  endapan. Endapan disaring dan direkristalisasi dengan alkohol 60% kemudian dikeringkan.

## Karakterisasi Senyawa Turunan
Senyawa turunan diuji  kualitatif  organoleptis (bentuk, bau, dan warna), uji kemurnian struktur (uji titik leleh dan uji KLT), dan uji identifikasi struktur dengan spektrofotometer
inframerah. Pada pemeriksaan  titik  leleh  dilakukan  dengan  tiga  kali replikasi  dengan  menggunakan Electrothermal Melting  Point  Apparatus, Pada  pemeriksaan kromatografi  lapis  tipis  dilakukan  dengan menggunakan tiga macam fase gerak dengan tingkat kepolaran  yang  berbeda  yaitu  etil  asetat  :  etanol (1:2),  aseton  :  etanol  (8:2)  dan  n-heksan  :  etanol (2:8).
Uji Aktivitas Analgesik Senyawa Turunan Aktivitas analgesik diuji dengan metode plantar test, dengan  menggunakan  alat basile  plantar  test yang dapat  menghantarkan  panas pada kisaran  55-56ºC. Uji  aktivitas  analgesik dilakukan secara  oral pada dosis  12,5;  25;  50;100;  200mg/kgBB.  Aktivitas analgesik ditentukan dengan cara mengamati waktu respon  yang  ditunjukkan  oleh  tikus  berupa mengangkat  atau  menjilat  kaki  terhadap  adanya stimulus  panas  yang  diberikan  sebagai  penyebab nyeri(Mishra  dkk,  2011).  Stimulus  panas  diberikan pada  interval  waktu  setiap  10  menit  selama  1  jam
dengan  menggunakan  radiasi  inframerah  sebagai sumber  panas.  Waktu  dicatat  sebelum  dan  sesudah pemberian  analgesik  (Vogel,  2008).Hasil  kumulatif dari  waktu  respon  tikus  terhadap  panas  tersebut kemudian  dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol dan selanjutnya dianalisis dengan one way ANOVA. Rerata  waktu  bertahan terhadap nyeri dicatat  dan dihitung  persentase  hambatan  nyeri,  menggunakan persamaan berikut:
keterangan:
f T = waktu rata-rata kemampuan untuk menahan nyeri pada kelompok uji atau kelompok pembanding
f K = waktu rata-rata kemampuan untuk menahan nyeri pada kelompok kontrol

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tabel 1a . Kromatografi  Lapis  Tipis  Senyawa Hasil Sintesisdan Harga Rf asam 2- (3-(klorometil) benzoiloksi) benzoate Fase Gerak
Harga Rf Asam Salisilat 3-klorometil benzoil klorida Asam 2-(3- (klorometil) benzoiloksi) benzoat Etilasetat : etanol (1:1,v/v) 0,74 0,79 0,82 n-heksana : Etanol (2:8, v/v) 0,70 0,78 0,88 Aseton : Etanol (8:2, v/v) 0,71 0,76 0,78 Tabel 1b. Kromatografi  Lapis  Tipis  Senyawa Hasil Sintesisdan Harga Rf Asam 2- (4-(klorometil) benzoiloksi) benzoate Fase Gerak
Harga Rf Asam Salisila t 4-klorometil benzoil klorida Asam 2-(4- (klorometil) benzoiloksi ) benzoat n-heksana : Etanol (1:2) 0,45 0,56 0,75 Aseton : Etanol (9:1) 0,56 0,70 0,92 Etilasetat : Etanol (1:5) 0,65 0,68 0,90
Gambar 1 Spektrum inframerah asam salisilat Tabel 2a. Karakteristik  spektrum  inframerah asam salisilat Gugus Fungsi Bilangan Gelombang (cm -1 ) Asam Salisilat Pustaka* O-H alkohol 3441,70 3400-3650 O-H Fenol 3237,96 3200-3550 C=O asam 1665,44 1600-1850 C=C aromatis 1446,61 1300-1600 C-O asam 1297,59 1100-1300 *  (Robert  and  David,  2005;  Mcmurry  and Simanek, 2007) Gambar 2. Spektrum  inframerah  senyawa asam 2-(3- (klorometil) benzoiloksi) benzoat Tabel 2b. Karakteristik  spektrum  inframerah senyawa asam 2-(3- (klorometil)benzoiloksi) benzoate Gugus Fungsi Bilangan Gelombang (cm -1 ) 2-(3- (klorometil) benzoiloksi) Hasil Sintesis terdahu- lu Pustaka* O-H alkohol 3447,75 3444,2 3400- 3650 C=O ester 1695,94 1694,7 1680- 1760 C=C aromatis 1486,47- 1605,59 1488,2- 1605,6 1475- 1600 C-O ester 1279,24 1280,3 1210- 1320 *  (Robert  and  David,  2005;  McMurry  and Simanek, 2007)
Gambar 3. Spektrum Inframerah (IR) dari asam 2-(4-(klorometil) benzoiloksi) benzoate Tabel 2c. Karakteristik  Spektrum  Inframerah Asam  2-(4-(klorometil) benzoiloksi) benzoate Ikatan Kimia Bilangan Gelombang (cm -1 ) 2-(4-(klorometil) benzoiloksi) Pustaka (Fessenden, 1997) O-H 3444,13 3100-3650 C=O ester 1739,39 1730-1750 C=O asam 1679 1650-1800 C=C aromatis 1488 1475-1600 C=O ester 1018 1000-1300 Tabel 3a. Hasil Perhitungan Persentase Hambatan Nyeri pada Kelompok Asam 2-(3-(klorometil) benzoiloksi) benzoat Dosis Mg/kgBB Rata-rata waktu respon nyeri % Hambatan nyeri Asam 2-(3- (klorometil) benzoiloksi)- benzoat Asam asetilsalisilat Asam 2-(3- (klorometil) benzoiloksi)- benzoat Asam asetilsalisilat 12,5 44,62 30,34 85,30 26,00 25 46,35 32,35 92,48 34,34 50 54,17 35,08 124,96 45,68 100 67,51 38,62 180,36 60,38 200 74,17 51,56 208,01 114,12 Kontrol negatif 24,08
Tabel 3b. Hasil Perhitungan Persentase Hambatan Nyeri pada Kelompok Asam 2-(4-(Klorometil) Benzoiloksi) Benzoat
Dosis Mg/kgBB Rata-rata waktu respon nyeri % Hambatan nyeri Asam 2-(4- (klorometil) benzoiloksi)- benzoat Asam asetilsalisilat Asam 2-(4- (klorometil) benzoiloksi)- benzoat Asam asetilsalisilat 12,5 41,9625 30,34 74,28 26,00 25 49,5 32,35 105,58 34,34 50 50,65 35,075 110,36 45,66 100 51,8375 38,62 115,29 60,39 200 66,425 51,56 175,87 114,13 Kontrol negatif 24,08 0
Pada  uji kromatografi  lapis  tipis diperoleh
harga Rf asam2-(3-(klorometil) benzoiloksi) benzoat dan asam 2-(4-(klorometil) benzoiloksi) benzoat berbeda dengan  harga Rf asam salisilat, 3-klorometilbenzoil klorida, dan 4-klorometilbenzoil klorida. Hal ini mengindikasikan  bahwa  kedua  senyawa turunan  tidak  mengalami  peruraian selama proses penyimpanan (Tabel 1a dan 1b). Spektrum  inframerah  senyawa  asam salisilat  ditunjukkan  pada  gambar  1 menggambarkan karakteristik  spektrum  asam salisilat  pada  Tabel 2a. Spektrum  inframerah dari senyawa asam 2-(3-(klorometil) benzoiloksi) benzoat pada Gambar2, karakteristik  spektrum  inframerah  pada  tabel 2b, dan spektrum inframerah serta karakteristik asam  2-(4-(klorometil) benzoiloksi) benzoate pada gambar 3 dan tabel 2c. Hasil identifikasi struktur  pada  beberapa  daerah  bilangan gelombang  (cm -1 )  menunjukkan  adanya perbedaan  karakteristik  dari  gugus-gugus fungsi  asam  2-(3-(klorometil)benzoiloksi) benzoat  dan  asam  salisilat. Pada asam  2-(3- (klorometi)benzoiloksi)benzoat terlihat gugus O-H  fenolat  pada  panjang  gelombang  sekitar 3200  cm -1 telah hilang  jika  dibandingkan dengan  asam  salisilat.  Hal  ini  dapat  diperkuat dengan adanya gugus C=O ester pada panjang gelombang 1695.94 cm -1 . Pada spektrum asam 2-(4-(klorometil benzoiloksi) benzoat  tidak terlihat  spektrum  OH  fenolat  pada  panjang gelombang sekitar 3200 cm -1 . Hal ini diperkuat dengan adanya gugus C=O ester pada panjang gelombang  1297,59cm -1 .  Sedangkan  pada senyawa asam salisilat terdapat spektrum gugus C=O  asam,  berdasarkan  hal  tersebut  dapat diduga  bahwa  senyawa  baru  yang  dihasilkan adalah  suatu  ester  yang  masih  mempunyai gugus asam dan telah berbeda dengan senyawa asalnya.
Pada Tabel 3a  dan 3b  tersaji  hasil  uji aktivitas  analgesik  yang  menampilkan  rerata waktu  respon  nyeri  kedua  senyawa  dan persentase  hambatan  nyeri  yang  dihasilkan. Kedua  senyawa  menunjukkan  aktivitas analgesik  yang  lebih  baik  dari asam asetilsalisilat.  Hal  ini  sejalan  dengan  hasil penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan  pada mencit  (Pratiwi,  2009).  Tingginya  aktivitas analgesik dibanding asam asetilsalisilat diduga karena  sifat  lipofil  pada  kedua    senyawa turunan  lebih  tinggi,  sehingga  penembusan membran semakin optimal, dan berujung pada pertemuan  peningkatan  jumlah  senyawa dengan reseptornya.

## KESIMPULAN
Penelitian  ini  melaporkan  bahwa  asam  2-(3- (klorometil)  benzoiloksi) benzoat  dan  asam  2- (4-(klorometil) benzoiloksi) benzoat menghasilkan  aktivitas  analgesik  lebih  tinggi dibandingkan asam asetil salisilat.

## Ucapan Terima Kasih
Terima  kasih  ditujukan  kepada  pemerintah Indonesia  yang  telah  mendanai  penelitian  ini melalui  program  Hibah  Bersaing.  Pula  kepada Umi Hanik Sekarwati dan Hanna Yosefa Lolo yang mendukung proses penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Furst, D.E., dan Munster, T. (2000). Obat-obat Antiinflamasi Nonsteroid, Obat-obat Antireumatik Pemodifikasi-penyakit, Analgesik Nonopioid dan Obat-obat Untuk Pirai, In : Katzung B.G. (Ed.), Farmakologi Dasar  dan  Klinik:  Basic  dan  Clinical Pharmacologi,  8th  ed.  Jakarta:  Salemba Medika,  pp. 455, 459-461.
Gunawan,  S.G.  (2009).  Farmakologi  dan Terapi,  Edisi  5,  Jakarta:  Bagian  Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia,  pp. 231-
233, 235.
Martak R., Soekardjo, B., Surdijat, S., Caroline and  Setybudi,  I.  (2009).  Synthesis  of  4- Chloromethylbenzoyl Salicylic Acid and Its Analgesic  Activity  on  Mice  ( Mus musculus ),  Poster  Presentation  in  Bandung International  Conference  on  Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Bandung.
McMurry,  J.,  and  Simanek,  E.  (2007).
Fondementals  of  Organic  Chemistry  6th ed.,  Examview  and  Examview  pro  are Registered Trademarks of FsCreations, Inc., America, p.413-417.
Mishra  (2011).  Analgesic  and  Inflammatory
Activity of Methanol Extract of Scindapsus officinalis  Root  in  Experimental  Animals, India: Odisha.
Natalia,  O.  (2013).  Pemodelan  Interaksi
Turunan  Potensial  Asam  Benzoil  Salisilat dengan Reseptor Enzim Siklooksigenase-2, Skripsi  Sarjana  Farmasi,  Universitas Katolik Widya Mandala, Surabaya.
Pratiwi,  D.V.  (2009).  Sintesis  Asam  3- klorometilbenzoil Salisilat dan Uji Aktivitas Analgesik  pada  Mencit  ( Mus  musculus ), Skripsi  Sarjana  Farmasi,.  Universitas Widya Mandala Surabaya.
Purwanto dan Susilowati, R. (2000). Hubungan struktur-aktivitas  obat  analgetika,  In: Siswandono  dan  Soekardjo,  B.,  (Eds.),
Kimia  Medisinal  2,  Airlangga  University Press, Surabaya, pp. 283, 291-292, 295. Robert,  M.S.,  Francis,  X.W.,  and  David,  J.K. (2005).  Spectrofotometric  Identification  of Organic  Compounds  7th ed.,  John  Wiley and Sond, Inc., America, pp. 72-101. Vogel,  H.G.  (2008).  Drugh  Discovery  and Evaluation Pharmacological Assay, 3rd ed.,
Springer-verlag,  Berlin, pp.  1010-1014.