## Analisa Jembatan Garam untuk Meningkatkan Kestabilan Termal Enzim Xilanase Aspergillus niger
Nya Daniaty malau *1 , Manogari Sianturi 2
1,2 Program Studi Pendidikan Fisika, Universitas Kristen Indonesia Jln. Mayjend Sutoyo, No.2, Cawang, Jakarta Timur, 13630
*e-mail: malaunyadaniaty@gmail.com

## Abstract
Enzymes are  the  same  biomolecules  such  as  proteins,  has  only  a functional  difference.  Enzymes  are biocatalyst  that  recently  applied  to  many  industrial  fields.  To  be  applied  in  the  field  of  industrial enzymes  should  be  enhanced  stability  against  temperature.  Analysis  of  the  salt  bridge  is  able  to demonstrate  the  potential  of  residues  mutated  to  improve  thermal  stability.  Molecular  dynamics simulations performed by observing the unfolding process. Variations in temperature used is 400 K, 450 K and 500 K, respectively performed for 2.5 ns. Then analyzed the pair a salt bridge is formed. There are 25 pairs of salt bridges at a temperature of 400 K, 24 pairs of salt bridges at a temperature of 450 K, and there are 30 pairs of the salt bridge is formed at a temperature of 500 K. To determine the salt bridge partner is a key enzyme kesstabilan we then plotted salt bridge between distances (Å ) with time (ns) only at a temperature of 500 K, for allegedly at these temperatures has been a process of  unfolding.  Of  the  30  pairs  of  the  salt  bridge  that  had  plotted  the  distance  with  time,  the  pair obtained  a  salt  bridge  that  pattern  similar  to  the  pattern  chart  graph  analysis  Root-mean-square deviation (RMSD). There are three curves salt bridge that pattern is similar to the pattern of RMSD curve  and  SASA,  namely  the  salt  bridge  Glu84-Arg134,  Asp104-Arg134  and  Asp113-Arg115.  The sharp  rise  in  the  value  of  RMSD  and  the  resulting  rupture  SASA  three  pairs  of  the  salt  bridges.  So when carried mutations in-silico candidate mutants that will be transferred is the amino acid residues are thought to play a role in electrostatic interactions and replace it with another amino acid residue on the basis of structural similarities.
Keywords : Salt bridge, Electrostatic bond, Mutation, Unfolding

## PENDAHULUAN
Protein  merupakan  penyusun  kunci dari sel-sel  hidup  dan terlibat  dalam semua proses  dalam  kehidupan.  Protein  disusun dari monomer nya yang disebut asam amino. Terdapat 20 jenis  asam amino di alam yang merupakan  penyusun  semua  jenis  protein. Asam  amino – asam  amino  tersebut dirangkai  dalam  ikatan  peptida.  Komposisi asam  amino  dalam  ikatan  peptida  akan menentukan  sifat  dari  struktur  protein.
Struktur  protein  dibagi  atas  4  bagian  yaitu struktur  primer, struktur sekunder, struktur tertier  dan  kuartener  (Triwibowo  Yuwono, 2005).
Beragamnya  fungsi  protein  terletak tidak  saja  dari  keragaman  susunan  asam aminonya  tetapi  karena  keragaman  struktur tiga  dimensi  (struktur  sesungguhnya)  yang membentuk  protein  itu  sendiri.    Fungsi protein  hanya  dapat  ditafsirkan  dari
strukturnya  (Szila´gyi  et  al,  2007  ).  Untuk memperoleh bentuk aktifnya secara biologi, protein  dengan  struktur  sekunder  akan mengalam  pelipatan (folding )  untuk  dapat mencapai struktur aslinya. Pelipatan protein di  dalam  sel  merupakan  proses  kompleks yang  membutuhkan  bantuan  molekul  lain dan  energi.  Kegagalan  suatu  protein  dalam proses folding protein ( misfolding ) ini dapat menyebabkan  malfungsi  berbagai  sistem biologis  yang  dapat  menimbulkan  berbagai penyakit,  seperti Alzheimer,  parkinson , katarak dan kanker.
Untuk  menentukan  struktur  tiga dimensi  protein  dapat  dilakukan  dengan teknik  X-ray  cristallography  untuk  melihat struktur  protein  dalam  bentuk  padat/kristal dan  teknik Nuclear  Magnetic  Resonance (NMR) Spectroscopy untuk melihat struktur protein dalam cairan serta dapat memberikan  informasi  struktural  pada keadaan unfoalded yang  penting  dalam karakterisasi  proses  pelipatan  protein. Tetapi  teknik  ini  membutuhkan  biaya  yang besar  dan  waktu  yang  cukup  lama  jika digunakan untuk mengamati proses pelipatan protein. Karena tidak efisien maka ditemukan  teknik  baru  yaitu  dengan Simulasi dinamika molekuler.
Dinamika  molekul  (MD)  simulasi adalah  salah  satu  alat  utama  dalam  studi teoritis molekul biologis. Berdasarkan
persamaan  gerak  Newton,  metode  simulasi ini  merepresentasikan    interaksi    molekul  - molekul    atom    dalam    jangka    waktu tertentu.  Simulasi  MD  telah  memberikan informasi  rinci  tentang  fluktuasi  dan perubahan  konformasi  protein.  Metode  ini sekarang  secara  rutin  digunakan  untuk menyelidiki struktur, dinamika dan termodinamika protein dan interaksi mereka dengan substrat, ligan, dan inhibitor (Katrin Bidmon ).
Beberapa  penelitian  telah  dilakukan untuk  menyelidiki  proses folding dari sebuah  molekul  protein  kecil  seperti  yang dilakukan Ryan Day (2002)
mensimulasikan  proses unfolding protein kecil  Trp-cage  miniprotein  menggunakan Amberff99SB  dengan  40  jenis  variasi temperatur  mulai  dari  280  K  hingga  539,7 K  dengan  waktu  total  100  mikro  detik  dan didapat  hasil  protein unfolding pada  suhu dengan  nilai  tinggi  yaitu  450  K.  Jinhyuk Lee et al (2003) menyelidiki unfolded pada protein  kecil  1GB1,  3AIT  dan  1A2P menggunakan  CHARMM  dengan  variasi temperatur  mulai  dari  300K,  400K,  500K, 600K dan 700K dengan waktu 2ns.
Penelitian  ini  akan  mengamati  proses unfolding pada  enzim Xilanase  Aspergillus niger .  Enzim  merupakan  biomolekul  sama seperti  protein,  hanya  memiliki  perbedaan fungsi saja. Enzim merupakan
biokatalisator  yang  belakangan  ini  banyak diaplikasikan  pada  bidang  industri.  Enzim merupakan katalisator pilihan yang diharapkan  dapat  mengurangi  dampak pencemaran  dan  pemborosan  energi  karena reaksinya tidak membutuhkan energi tinggi, bersifat spesifik, dan tidak toksik (Aunstrup,  1979).  Salah  satu  jenis  enzim yang  mempunyai  peran  penting  dalam bidang  industri  adalah  enzim  xilanase (Marisa, 2013).
Karakteristik  xilanase    komersial yang    ada    saat    ini  memiliki    suhu optimum  kurang  dari  50°C (Dhillon  dkk., 2000a)    sehingga    kurang    sesuai    dengan kondisi    proses    pra-pemutihan pulp , sehingga  dilakukan  berbagai  teknik  untuk meningkatkan stabilitas termal enzim tersebut.  Salah  satu  cara  yang  dapat dilakukan untuk meningkatkan termostabilitas  suatu  enzim  adalah  dengan teknik rekayasa protein.
Sifat protein yang mendapat perhatian dari  sekian  banyak  sifat  protein,  dalam teknik  rekayasa  protein  adalah  stabilitas, khususnya  stabilitas  terhadap  suhu.  Ini disebabkan  karena  sejak  proses  produksi, penyimpanan  sampai  kepada  penggunaan, semuanya  dipengaruhi  oleh  panas.  Struktur protein  (konformasi)  akan  mempengaruhi fungsinya.    Interaksi  hidrofobik,  jembatan garam  dan  interaksi  antara  asam  amino
yang memiliki  muatan seperti lisin, arginin, asam  aspartat,  asam  glutamat  serta    asam amino dari   ikatan peptida adalah beberapa force penting yang menjaga struktur protein. Secara  umum,  menguatkan force tersebut, misalnya  dengan  merubah  asam  amino hydrophilic dalam lingkungan yang hydrophobic ,  akan  menaikkan  stabilitas protein bersangkutan.
Dalam penelitian ini dilakukan
Analisa
Jembatan Garam untuk Meningkatkan  Kestabilan  Termal  Enzim Xilanase
Aspergillus  niger Wild  Type (ANX) .

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium  Fisika  Teori  dan  Komputasi,
Program Studi
Pendidikan Fisika Universitas Kristen Indonesia.

## Peralatan
Penelitian ini menggunakan peralatan berupa alat tulis, komputer dengan spesifikasi  3,40  GHz,  12  GB  RAM menggunakan sistem operasi Linux Ubuntu 12.10.  Program  pendukung  VMD  1.9.1 pada  tahap  preparasi  protein,  NAMD  2.9 sebagai  simulator,  CatDCD  4.0,  Gnuplot 4.6.4,  dan  Ms.  Excel  2013  sebagai  analisa hasil simulasi.

## Metode Penelitian
Preparasi Sistem Simulasi
Struktur kristal enzim xilanase Aspergillus  niger (kode  PDB:  1UKR) (Krengel dan Dijkstra, 1996) yang digunakan  pada  simulasi  didapat  dari  bank data Protein Data Bank (PDB)
( http://www.pdb.org/pdb/home/home.do ).
Penentuan  struktur  kristal  1UKR  dilakukan dengan  metode  difraksi  sinar-X  dan memiliki  resolusi  2.4  Å.  Residu  asam amino penyusun Xilanase adalah 181 residu. File PSF (Protein Structure File) adalah file berisikan informasi molekul secara spesifik yang  dibutuhkan  untuk  menerapkan  medan gaya  tertentu  ke  dalam  sistem  molekul. Untuk membuat file ini NAMD menyediakan program psfgen.
Untuk lebih menyerupai lingkungan selular, protein dilarutkan dan dimasukkan kedalam air.  Protein  itu  dilarutkan  dalam  bentuk kotak dengan ukuran 100 Å x 100 Å x 100 Å yang berisi molekul air. Molekul air yang dipilih  sebagai  pelarut  eksplisit  (solvasi) pada sistem simulasi adalah model molekul air TIP3P dengan metode periodic boundary  condition  (PBC).  Sistem  ini dinetralkan  dengan  menambahkan  ion (NaCl) pada konsentrasi fisiologis menggunakan VMD solvate dan autoionize plugin. Dalam  simulasi  ini
dibutuhkan  file  parameter  medan  gaya. Sebuah  medan  gaya  adalah  ekspresi matematis dari gaya  potensial yang diperoleh  dalam  sistem.  Sebuah  file parameter  medan  gaya  CHARMM  berisi konstanta  numerik  yang  diperlukan  untuk mengevaluasi  gaya  dan  energi,  mengingat PSF  sebuah  file  struktur  dan  atom coordinates.  Parameter  CHARMM  dapat di-download dari website: http : //www.charmm.org/. Untuk  menjalankan simulasi  dinamika  molekuler  dibutuhkan script. Script simulasi adalah program untuk menjalankan  simulasi  NAMD  seperti  yang diinginkan. NAMD menjalankan file konfigurasi dengan menggunakan bahasa scripting Tcl.

## Simulasi Dinamika Molekul
Simulasi  ini  dilakukan  dengan  empat tahapan  menggunakan  program  NAMD dengan  masukan    awal    file    konfigurasi. File  ini  sebagai  pengontrol  sistem  yang berisi  parameter    dalam    menjalankan simulasi.    File    topologi    yang    digunakan adalah  par_all27_prot_na_lipid.inp.    Tahap pertama    adalah    minimisasi.    Minimisasi bertujuan untuk meminimalkan energi pada molekul. Masukan awal adalah file struktur dan  file psf  hasil  dari  preparasi  molekul. Kedua,  pemanasan,  masukan  awal  adalah hasil  dari  minimisasi.  Pada  awal  simulasi
sistem  bersuhu  0  K,  suhu  akhir  akan divariasikan  menjadi  400  K  ,  450  dan  500 K.  Ketiga,  ekuilibrasi,  suhu  sistem  dijaga konstan  dengan  protokol    Langevin. Kemudian tahap terakhir adalah  production run.  Pada  tahap  inilah  simulasi  dinamika molekul  dijalankan.  Molekul  dibiarkan bebas  bergerak    dengan    cara  suhu  sistem tidak  dikontrol  lagi.  Tahap  ini  dilakukan selama  2.5  ns  untuk  suhu  400K,  450K  dan 500 K.
Keluaran  dari  tahap  akhir  simulasi dinamika    molekul    adalah    file    dcd.    File ini    divisualisasikan  pada    program    VMD. Data yang diperoleh tersebut menghasilkan    grafik    yang    dibutuhkan untuk    analisis  jembatan  garam  dalam meningkatkan  kestabilan  termal  enzim xilanase Aspergillus niger.

## Prosedur Analisa Data
Analisa  simulasi  dinamika  molekul pada  enzim  xilanase Aspergillus  niger dilakukan  untuk  mengetahui  fleksibilitas enzim  dan  perubahan  struktur  yang  terjadi. Parameter yang dianalisis antara lain adalah Jembatan Garam/ Interaksi elektrostatik.
Interaksi    elektrostatik    yang    sering disebut    sebagai    interaksi    pasangan    ion (ion  pairs    interaction) (Vieille    dan Zeikus  2001)  atau  jembatan  garam (salt bridge) merupakan    interaksi    antara residu-residu    asam  amino  bermuatan. Penelitian  mengenai  pentingnya  interaksi elektrostatik  pertama  kali  dilaporkan  oleh Perutz  (1978)  yang  menyatakan  bahwa interaksi ini memiliki kontribusi  signifikan untuk  menstabilkan  protein.

## HASIL  DAN PEMBAHASAN
Xilanase Aspergillus niger berhasil di kristalisasi  oleh  Krengel  dan  Dijkstra pertama  kali  pada  tahun  1996  dengan resolusi  struktur  kristal  2,4  Angstrom. Struktur  ANX  ini  diambil  dari  protein  data bank  (PDB)  dengan  kode  1UKR  dengan berat  molekul  13,5  -  14  kDa  (Beg  dkk., 2001),  suhu  22 o C  sedangkan  asam  amino penyusun adalah 181 asam amino.
Representasi    struktur    sekunder secara new  cartoon menggunakan  program VMD (Humprey et al. 1996),  dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 . Representasi struktur sekunder enzim Xilanase Aspergillus niger
Interaksi    elektrostatik    yang    sering disebut    jembatan    garam  merupakan interaksi  antara  residu-residu  asam amino bermuatan. Terdapat 25  pasangan jembatan garam  pada  temperatur  400  K,  24  pasang
jembatan garam pada temperatur 450 K dan ada  30  pasang  jembatan  garam  yang terbentuk  pada  temperatur  500  K,  masing- masing selama 2.5 ns. Perhatikan pada tabel 1.
Tabel 1. Pasangan jembatan garam yang muncul selama simulasi 2.5 ns pada suhu 400 K
Suhu 400 K Suhu 450 K Suhu 500 K Glu 84 Segname P4 – Arg134 Segname P4 Glu 84 Segname P4 – Arg134 Segname P4 GLU84 segname P4-ARG134 segname P4 Glu 118 Segname P2 – Arg115 Segname P2 Glu 79 Segname P1 – Arg115 Segname P1 GLU79 segname P1-ARG115 segname P1 Asp 113 Segname P2 – Arg115 Segname P2 Glu 118 Segname P2 – Arg115 Segname P2 GLU118 segname P3-ARG115 segname P3 Glu 118 Segname P3 – Arg115 Segname P3 Asp 104 Segname P1 - Arg138 Segname P1 ASP113 segname P2-ARG115 segname P2 Glu 79 Segname P2 – Arg115 Segname P2 ASP113 segname P2- ARG115 segnameP2 ASP104 segname P1-ARG138 segname P1 Glu 84 Segname P1 – Arg134 Segname P1 GLU118 segname P3 -ARG115 segname P3 ASP113 segname P3-ARG115 segname P3 Asp 104 Segname P3 - Arg134 Segname P3 GLU84  segname P1-ARG134 segname P1 GLU118 segname P2-ARG115 segname P2 Glu 79 Segname P1 – Arg115 Segname P1 ASP104 segname P3-ARG134 segname P3 GLU79 segname P2-ARG115 segname P2
Asp 104 Segname P2 – Arg134 Segname P2 ASP104 segname P2-ARG134 segname P2 GLU84 segname P1-ARG134 segname P1 Asp 37 Segname P4 – Arg155 Segname P4 ASP104 segname P4-ARG138 segname P4 ASP104 segname P3-ARG134 segname P3 Asp 104 Segname P4 – Arg138 Segname P4 GLU118 segname P1-ARG115 segname P1 GLU84 segname P3-ARG138 segname P3 Asp 113 Segname P1 – Arg115 Segname P1 ASP113 segname P3-ARG115 segname P3 ASP104 segname P4-ARG138 segname P4 Glu 118 Segname P1 – Arg115 Segname P1 ASP104 segname P1-ARG134 segname P1 ASP104 segname P2-ARG134 segname P2 Glu 84 Segname P2 – Arg138 Segname P2 GLU84 segname P3-ARG138 segname P3 ASP113 segname P1-ARG115 segname P1 Asp 113 Segname P3 – Arg115 Segname P3 GLU79 segname P4-ARG115 segname P4 ASP104 segname P1-ARG134 segname P1 Glu 84 Segname P3 – Arg138 Segname P3 GLU84 segname P2-ARG138 segname P2 GLU118 segname P1-ARG115 segname P1 Glu 79 Segname P3 – Arg115 Segname P1 GLU84 segname P4-ARG138 segname P4 GLU84 segname P2-ARG138 segname P2 Glu 84 Segname P3 – Arg134 Segname P3 GLU84 segname P3-ARG134 segname P3 GLU79 segname P4-ARG115 segname P4 Asp 104 Segname P4 – Arg134 Segname P4 ASP104 segname P4-ARG134 segname P4 GLU84 segname P4-ARG138 segname P4 Glu 118 Segname P4 – Arg115 Segname P4 ASP104 segname P2-ARG138 segname P2 ASP104 segname P4-ARG134 segname P4 Glu 84 Segname P2 – Arg134 Segname P2 GLU118 segname P4-ARG115 segname P4 GLU84 segname P3-ARG134 segname P3 Asp 104 Segname P3 – Arg138 Segname P3 GLU84 segname P2-ARG134 segname P2 ASP104 segnameP2-ARG138 segnameP2 Glu 84 Segname P2 – Arg138 Segname P1 ASP104 segname P3-ARG138 segname P3 GLU118 segnameP4-ARG115 segnameP4 Glu 84 Segname P4 – Arg138 Segname P4 GLU84 segname P1-ARG138 segname P1 GLU84 segnameP2-ARG134 segnameP2 Asp 104 Segname P2 – Arg138 Segname P2 ASP113 segnameP4-ARG115 segname P4
GLU135 segname P1-ARG138 segname P1
ASP104 segname P3-ARG138 segnameP3
GLU84 segnameP1-ARG138 segnameP1
ASP37 segnameP2-ARG115 segnameP2
ASP37 segnameP1-ARG115
segnameP1
Untuk  menentukan  pasangan  jembatan garam  yang  menjadi  kunci  kesstabilan enzim  maka  selanjutnya  jembatan  garam diplot  antara  jarak  (Å)  dengan  waktu  (ns) hanya yang pada suhu 500 K, karena diduga pada  suhu  tersebut  telah  terjadi  proses unfolding .
Dari 30 pasang jembatan garam  yang telah  diplot  antara  jarak  dengan  waktu, maka  diperoleh  pasangan  jembatan  garam yang  pola  grafiknya  sama  dengan  pola grafik  analisa Root-mean-square  deviation (RMSD).
Selanjutnya  jembatan  garam  diplot antara  jarak  (Å)  dengan  waktu  (ns).  Ada tiga  kurva  jembatan  garam  yang  polanya sama dengan pola kurva RMSD dan SASA yang  mana  jarak  jembatan  garamnya meningkat  mulai  pada  selang  waktu  0.5  ns hingga 1.5 ns, yaitu jembatan garam Glu84- Arg134,  Asp104-Arg134  dan  Asp113-
Arg115.  Perhatikan  gambar  2.  Kenaikan tajam  nilai  RMSD  dan  SASA  tersebut disebabkan putusnya ketiga pasang jembatan  garam  tersebut.  Sehingga  ketika dilakukan  mutasi  secara in-silico calon mutan  yang  akan  dimutasi  adalah  residu- residu  asam  amino  yang  diduga berperan dalam    interaksi    elektrostatik    dan menggantinya  dengan  residu  asam amino yang lain atas dasar kemiripan struktur. Selain  itu,  jika  diamati  dari  energi elektrostatiknya  ketiga  pasang  jembatan garam ini akan kehilangan energinya  mulai pada  selang  waktu  0.5  ns  hingga  1.5  ns, waktu ini sama dengan waktu unfolding nya.
Ini  menandakan  bahwa  kedua  pasang jembatan  garam  ini  merupakan  pengunci kestabilan termal enzim Xilanase Aspergillus niger.
(a)
(b)
(c)
Gambar 2 . Jarak jembatan garam  antara (a) Glu84-Arg134 (b) Asp104-Arg134 (c) Asp113-Arg115

## KESIMPULAN
Enzim  lipase  Xilanase Aspergillus  niger mengalami unfolding pada  temperatur  500 K  saat  2.5  ns.  Residu-residu  yang bertanggung  jawab  terhadap  kestabilan termal  enzim  Xilanase Aspergillus  niger berdasarkan  analisa  pasangan  jembatan garam  atau    interaksi  elektrostatik  yaitu pasangan asam amino Glutamat pada residu 84  dan Arginin pada residu  134 ,  pasangan asam amino Asam Aspartat pada residu 104 dan Arginin pada residu 134 serta pasangan asam amino Asam Aspartat pada residu 113 dan  Arginin  pada  residu  115.  Sehingga berdasarkan Interaksi
Elektrostatik/
jembatan  garam  ketiga  pasang  jembatan garam ini memiliki potensi untuk meningkatkan kestabilan termal jika dilakukan  mutasi  pada  ketiga  pasang jembatan garam tersebut.

## DAFTAR PUSTAKA
Aunstrup,  K.O.,  Andressen,  Falch,  and Nielsen. 1979. Production of
Microbial Enzymes. Microbial Technology . Vol. 1. Academic Press Inc. New  York Beg, Q. K., M. Kapoor, L. Mahajan, and G.S.
Hoondal. 2001. Microbial xylanases and  their  industrial    applications:    a
review. Applied  Microbiology  and Biotechnology . 56: 326-338
David  B.  Kony,  Philippe  H.  Hu¨nenberger,
Wilfred  F.  Van  Gunsteren.  2007. Molecular  dynamics  simulations  of the native and partially folded states of  ubiquitin:  Influence.  of  methanol cosolvent,  pH,  and  temperature  on the  protein  structure  and  dynamics. Protein Science . 16 : 1101-1118
Dhillon,  A.,  J.  K.  Gupta,  and S.  Khanna.
2000a. Enhanced production, purification    and  characterization  of a novel  cellulase-poor thermostable, alkalitolerant xylanase from Bacillus circulans    AB    16. Process Biochemistry .  35:849- 856
Humphrey W,  Dalke A,  Schulten K. 1996.
VMD:   visual  molecular dynamics.
J. Mol. Graph, 14(1) : 27 – 38.
Jinhyuk  Lee,  Soonmin  Jang,  Youngshang Pak,  and  Seokmin  Shin.  2003. Folding  Dynamics  of  β -Hairpins: Molecular  Dynamics  Simulations. Korean Chem. 24 (6) : 787-791
Katrin  Bidmon  dan  Guido  Reina.  Time- Based  Haptic  Analysis  of  Protein Dynamics. Visualization and Interactive  Systems  Group  (VIS).
University of Stuttgart, Germany
Krengel,  U.  and  B.W.  Dijkstra.  1996.
Three-dimensional structure of
Endo-1,4-beta-xylanase I from
Aspergillus  niger:  molecular  basis for its low pH optimum . J.Mol.Biol.
263: 70-78
Marisa  A .  Lima.  2013.  Aspergillus  nigerβ - Glucosidase  Has  a  Cellulase-like Tadpole  Molecular  Shape. The Journal  of  Biological  Chemistry. 288 : 32991-33005
Perutz  M.  1978.  Electrostatic    effects    in proteins.    Science.    201(4362)  : 1187-1191.
Rico,  Manuel  .  Protein  structure,  dynamics and  function  by  NMR.  Instituto  de

## Química Física “Rocasolano”. Spain
Ryan  Day,  Dietmar  Paschek,  and  Angel  E.
Garcia.
2002. Microsecond
simulations  of  the  folding/unfolding thermodynamics  of  the  Trp-cage
mini  protein. Proteins. 78  :  1889-
1899
Stumpe, Martin. 2007. De natura denaturantium-On  the  molecular basis  of  urea-indunced  protein denaturation  [disertasi].  Der  Georg- August-Universitat  zu  Gottingen  : der  Matematish-Naturwissen  schaft lichen Fakultaten
Szila´gyi.  A,  Kardos  J.  Osva´th.  S.    Barna L. Za´vodszky. P. Protein Folding.
Vieille C, Zeikus GJ. 2001. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, dan molecular mechanisms for thermostability.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65(1) : 1- 43.
Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekuler .  Jakarta  :  Erlangga.  Hlm
23-25