Available online at https://jurnal.stikesmus.ac.id/index.php/avicenna Avicenna : Journal of Health Research, Vol 5  No 2. Oktober 2022 (9 - 17)

## PEMANFAATAN LARUTAN KAYU SECANG (Caesalpinia sappan L.) SEBAGAI COUNTERSTAIN PADA PENGECATAN GRAM Escherichia coli ATCC 25922
The    Application     Of      Sappan     Wood     Solution (Caesalpinia Sappan L.)  As  Counterstain  In Gram Staining Of  Escherichia Coli  ATCC  25922
Francisko Angelo Eko Sujono 1, , Anggraeni Sih Prabandari 2* , Fredericus Pramonodjati 3 1,2,3 Program Studi D-IV Teknologi Laboratorium Medis Politeknik Santo Paulus
Surakarta
1 anggraenisihp@gmail.com

## ABSTRAK
Latar  Belakang :  Pengecatan  Gram  merupakan  metode  identifikasi  bakteri berdasarkan  komponen  dinding  sel.  Kayu  secang  ( Caesalpinia  sappan L.) mengandung senyawa brazilin yang teroksidasi menjadi brazilein, suatu kromofor berwarna  merah.  Brazilein  mengandung  atom  O  gugus  fungsional  yang  dapat berikatan dengan peptidoglikan sehingga berpotensi sebagai pewarna sel bakteri.
Tujuan Penelitian : Menguji efektivitas larutan secang sebagai counterstain pada pengecatan Gram Escherichia coli ATCC 25922.
Metode  : Jenis  penelitian merupakan  eksperimental.  Brazilein  diperoleh melalui maserasi  serbuk  kayu  secang  dalam  pelarut  akuades  dan  etanol  96%  selama  1 minggu. Larutan secang digunakan sebagai counterstain dengan metode pewarnaan langsung,  pra-mordan,  dan  mordan  berkelanjutan.  Hasil  pewarnaan  dinilai  oleh peneliti berdasarkan standar penilaian parameter uji, yaitu: intensitas, artifak, dan keseragaman  warna.  Data  dianalisis  dengan  uji One  Way  ANOVA dan Duncan. Hasil  : Hasil  analisis  menunjukkan  adanya  perbedaan  signifikan  antara  tiap perlakuan. Larutan etanol 96%-secang metode pra-mordan memberikan intensitas warna  tertinggi  sedangkan  larutan  akuades-secang  metode  pewarnaan  langsung menghasilkan jumlah artifak terendah.
Kesimpulan: Larutan  kayu  secang  dapat  digunakan  sebagai counterstain pada pengecatan Gram Escherichia coli ATCC 25922.
Kata kunci : pengecatan Gram, larutan secang, brazilein, mordan, Escherichia coli

## ABSTRACT
Background: Gram  staining  differentiates  bacteria  by  their  chemical  and  physical properties of their cell walls. Brazilein, a cromophore is oxidizing form of brazilin, the main chemical component of sappan wood (Caesalpinia sappan L.). Its O functional group  can  bind  to  peptidoglycan,  a  component  of  bacteria  cell  wall  and  stain  them. Research purpose : We conduct this research to evaluate the efficacy of sappan wood solution as counterstain in Gram staining of Escherichia coli ATCC 25922.
Avicenna : Journal of Health Research, Vol 5  No 2. Oktober 2022 (9 - 17) 10 Francisko Angelo Eko Sujono et.al ( Pemanfaatan Larutan Kayu Secang ( Caesalpinia Sappan L.) Sebagai Counterstain Pada Pengecatan Gram Escherichia Coli ATCC 25922)
Methods  :  This  study  was  an  experimental  laboratory  design . We  obtained  brazilein extract by macerated the sappan wood powder in aquadest and ethanol 96% solvent for a  week.  They  were  applied  as  counterstain  by  direct  dyeing,  pre-mordanting,  and simultaneous mordanting methods. The staining result is evaluated based on density, artifact,  and  color  consistency.  The  data  were  analyzed  with  One  Way  ANOVA  and Duncan test.
Results:  The  result  shows  there  were  significantly  difference  among  the  treatments. Ethanol 96%-sappan wood solution by pre-mordanting method has the highest color intensity,  whereas  aquadest-sappan  wood  solution  by  direct  dyeing  has  the  lowest number of artifact.
Conclusion:  Sappan  wood  solution  can be  used  as  counterstain in  Gram  staining  of Escherichia coli ATCC 25922
Keywords: Gram staining, sappan wood solution, brazilein, mordant, Escherichia coli

## PENDAHULUAN
Pengecatan Gram merupakan metode identifikasi bakteri yang penting dalam proses diagnosis penyakit infeksi. Pengecatan Gram menggunakan reagen kristal violet  (pewarna primer), iodin, etanol 95%, dan safranin ( counterstain ). Safranin mewarnai  bakteri  Gram  negatif  menjadi  merah.  Mekanisme  pewarnaan  terjadi melalui ikatan ionik antara pewarna basa dengan komponen dinding peptidoglikan karboksil  dan  amino  yang  bermuatan  negatif  (Natarajan,  2018).  Limbah  reagen pengecatan Gram apabila tidak diolah dengan benar dapat mencemari lingkungan. Hal ini karena bahan kimia sintetis sulit didegradasi dan pada konsentrasi tertentu dapat  mengintervensi  aktivitas  biologis  makhluk  hidup.  Selain  itu,  reagen  Gram khususnya safranin dapat menyebabkan kerusakan mata serius yang berbahaya bagi petugas laboratorium (Global Safety Management, 2014). Berdasarkan hal tersebut, maka  peneliti  ingin  mengembangkan counterstain alternatif  dengan  kualitas pewarnaan yang sama, tetapi lebih aman dan ecofriendly.
Kayu  secang  ( Caesalpinia  sappan L.)  mengandung  senyawa  brazilin  yang teroksidasi  oleh  udara  dan  cahaya  matahari  menjadi  brazilein,  suatu  kromofor berwarna  merah  (Rondao et  al. ,  2013).  Brazilein  umumnya  diolah  menjadi brazalum, suatu larutan pewarna histologi. Brazalum serupa dengan hemalum yang secara  selektif  mewarnai  nukleus  (Dapson  dan  Bain,  2015).  Selain  itu,  larutan brazilein  pada  pH  5  diketahui  memberikan  kualitas  pewarnaan  yang  baik  pada pewarnaan  sel  spermatozoa  (Husein  dan  Abdurrahman,  2018).  Pemanfaatan brazilein  sebagai  pewarna  sediaan  hanya  terbatas  pada  sel/jaringan  manusia  dan binatang.  Dalam  bidang  bakteriologi,  brazilein  kemungkinan  dapat mewarnai  sel bakteri pada pewarnaan Gram melalui pembentukan kompleks mordan.  Brazilein memiliki  gugus  hidroksil  yang  berpotensi  membentuk  ikatan  hidrogen  dengan peptidoglikan  yang  merupakan  lapisan  terluar  bakteri  meskipun  sangat  minimal. Selain  itu,  berdasarkan  karakteristik  warnanya  maka  kemungkinan  dapat  pula diaplikasikan sebagai counterstain pengecatan Gram (Dapson dan Bain, 2015).
Avicenna : Journal of Health Research, Vol 5  No 2. Oktober 2022 (9 - 17) 11 Francisko Angelo Eko Sujono et.al ( Pemanfaatan Larutan Kayu Secang ( Caesalpinia Sappan L.) Sebagai Counterstain Pada Pengecatan Gram Escherichia Coli ATCC 25922)
Mordan  secara  tradisional  digunakan  dalam  pewarnaan  tekstil  untuk mengikat zat warna alami pada serat kain. Setiap jenis mordan memberikan reaksi pewarnaan  yang  berbeda.  Alumunium  asetat  merupakan  mordan  yang  baik digunakan pada serat selulosa. Peptidoglikan yang merupakan lapisan dinding sel bakteri  memiliki  struktur  yang  serupa  dengan  selulosa  karena  tersusun  atas monomer  gula  dan  memiliki  gugus  hidroksil  sehingga  dalam  pewarnaan  Gram digunakan  mordan  alumunium.  Selain  itu,  ion  alumunium  dapat  membentuk kompleks koordinasi dengan brazilein (StainsFile, 2019).
Brazilein  diperoleh  dari  kayu  secang  melalui  ekstraksi  maserasi.  Maserasi merupakan  metode  ekstraksi  dengan  merendam  simplisia  dalam  pelarut  tertentu. Brazilein  merupakan  homoisoflavonoid  yang  larut  dalam  pelarut  polar  seperti akuades dan etanol (Dapson dan Bain, 2015). Lamanya proses ekstraksi yaitu 3 – 7 hari tergantung dari ukuran sampel, jenis dan volume pelarut. Hasil dari ekstraksi maserasi adalah larutan yang mengandung senyawa fitokimia.

## METODE
Jenis penelitian yang digunakan ialah eksperimen murni kuantitatif dengan desain  penelitian Posttest-Only  Group  Design. Subjek  penelitian  adalah  larutan pewarna kayu secang, sedangkan objek penelitian adalah Escherichia coli ATCC 25922.  Larutan  pewarna  kayu  secang  meliputi:  larutan  akuades-secang  metode pewarnaan  langsung  (K1),  larutan  akuades-secang  metode  pra-mordan  (K2), larutan  akuades-secang  metode  mordan  berkelanjutan  (K3),  larutan  etanol  96%- secang metode pewarnaan langsung (K4), larutan etanol 96%-secang metode pra- mordan (K5), dan larutan etanol 96%-secang metode mordan berkelanjutan (K6). Setiap jenis larutan secang diujicobakan sebanyak 4 kali.
Ekstraksi dilakukan dengan merendam 10 gram serbuk kayu secang masing- masing  dalam  100  ml  akuades  mendidih  dan  etanol  96%.  Rendaman  didiamkan selama  1  minggu  dengan  penggojokan  berkala  setiap  12  jam.  Setelah  1  minggu, larutan  dipisahkan  dari  residu  dan  disimpan  dalam  botol  kaca  hingga  siap digunakan.  Larutan  kayu  secang  tersebut  digunakan  sebagai counterstain pada pengecatan  Gram  dengan  metode  pewarnaan  langsung,  pra-mordan,  dan  mordan berkelanjutan.
Mordan  alumunium  asetat  dibuat  dengan  mencampur  0,7  gram KAI(SO 4 ) 2. 12H 2 O dan 0,8 gram NaCH 3 COO.3H 2 O dalam 100 ml akuades. Larutan mordan  tersebut  ditambahkan  pada  larutan  secang  dengan  perbandingan  volume 1:2  untuk  membuat  larutan  secang-mordan.  Larutan  mordan  tersebut  juga digunakan pada metode pra-mordan.
Prosedur  pewarnaan  mengikuti  standar  prosedur  operasional  pengecatan Gram  dengan  rincian  waktu  setiap  reagen  sebagai  berikut:  kristal  violet  2%  60 detik, iodin 60 detik, etanol 95% 10 – 30 detik, dan safranin 0,25% 30 detik (Remel, 2008). Pada metode pewarnaan langsung, pra-mordan, dan mordan berkelanjutan, safranin digantikan oleh: larutan secang 5 menit, larutan mordan 3 menit kemudian larutan secang 2 menit, dan larutan secang-mordan 4 menit. Setelah penambahan larutan mordan dan larutan secang, preparat tidak dicuci, tetapi ditiriskan hingga kering sempurna.
Avicenna : Journal of Health Research, Vol 5  No 2. Oktober 2022 (9 - 17) 12 Francisko Angelo Eko Sujono et.al ( Pemanfaatan Larutan Kayu Secang ( Caesalpinia Sappan L.) Sebagai Counterstain Pada Pengecatan Gram Escherichia Coli ATCC 25922)
Preparat  diamati  secara  mikroskopis  dengan  perbesaran  kuat  1000x  dan diperiksa  20  lapang  pandang.  Hasil  pewarnaan  dinilai  berdasarkan  parameter: intensitas warna (Tabel 1), keberadaan artifak, dan keseragaman warna. Intensitas warna dinilai berdasarkan warna standar bakteri Gram negatif yaitu merah muda sampai  merah  (sebagai gold  standard )  yang  ditentukan  mengacu  pada  Hardy Diagnostics (2014). Intensitas warna ini diukur dengan tabel warna sederhana yang dibuat oleh peneliti dan disesuaikan berdasarkan warna kontrol dan latar belakang lapang  pandang.  Semakin  pudar  warna  semakin  rendah  nilai  intensitas  yang diberikan.
Tabel 1. Diagram Gradasi Warna Pengecatan Gram
Artifak adalah sisa atau gumpalan cat yang dapat mengganggu pengamatan. Penilaian (N) dilakukan secara kuantitatif dengan konversi jumlah lapang pandang yang tidak terdapat artifak (LP) sebagai berikut:
20 x N = 10 x LP
N = 10 x LP
Keterangan: N   : nilai (1-10) LP : jumlah lapang pandang
Uji  statistik  yang  digunakan  ialah  uji One  Way  ANOVA dengan  taraf kepercayaan 95% dilanjutkan uji Duncan. Uji One Way ANOVA digunakan untuk menganalisis perbedaan perlakuan terhadap hasil, sedangkan uji Duncan digunakan untuk menganalisis pengaruh antar perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil
Hasil  pewarnaan  sel  bakteri  K0  (kontrol  positif/safranin),  K1  (larutan akuades-secang metode pewarnaan langsung), K2 (larutan akuades-secang metode pra-mordan),  K3  (larutan  akuades-secang  metode  mordan  berkelanjutan),  K4 (larutan etanol 96%-secang metode pewarnaan langsung), K5 (larutan etanol 96%- secang metode pra-mordan), dan K6 (larutan etanol 96%-secang metode mordan berkelanjutan) terlihat pada gambar di bawah ini.
20
Avicenna : Journal of Health Research, Vol 5  No 2. Oktober 2022 (9 - 17) 13 Francisko Angelo Eko Sujono et.al ( Pemanfaatan Larutan Kayu Secang ( Caesalpinia Sappan L.) Sebagai Counterstain Pada Pengecatan Gram Escherichia Coli ATCC 25922)
Gambar 1. Hasil Pewarnaan Bakteri pada Masing-masing Kelompok Perlakuan
Rerata penilaian terhadap intensitas warna yang terbentuk, keseragaman warna dan keberadaan artifak diberikan pada diagram pada Gambar 2 di bawah ini.
Gambar 2. Grafik Rerata Nilai Kualitas Pewarnaan Gram Escherichia coli
Tabel 2. Output One Way ANOVA
Parameter Nilai Signifikansi Intensitas Warna 0,00* Artifak * p<0,05 ada beda signifikan
Hasil penilaian dianalisis secara statistik dengan uji One Way ANOVA. Tabel 2 menunjukkan nilai signifikansi sebesar 0,00 < 0,05 sehingga terdapat perbedaan intensitas warna antar perlakuan. Selanjutnya dilakukan uji Duncan untuk melihat
0 2 4 6 8 10 K0 K1 K2 K3 K4 K5 K6 9.25 2.75 6.75 4 0 9.25 3 8.75 9.5 6.25 1 0 4.5 1 10 10 10 10 0 10 10 Intensitas Arifak Keseragaman
Avicenna : Journal of Health Research, Vol 5  No 2. Oktober 2022 (9 - 17) 14 Francisko Angelo Eko Sujono et.al ( Pemanfaatan Larutan Kayu Secang ( Caesalpinia Sappan L.) Sebagai Counterstain Pada Pengecatan Gram Escherichia Coli ATCC 25922)
besarnya pengaruh dari setiap perlakuan terhadap intensitas warna. Semakin besar pengaruh  maka  semakin  baik  intensitas  warnanya  sehingga  dapat  diurutkan perlakuan dari kualitas terbaik ke terburuk, sebagai berikut: K0 dan K5, K2, K3, K6 dan K1, dan K4. Demikian pula pada parameter artifak warna dengan urutannya sebagai berikut: K0 dan K1, K2, K5, dan K6, K3, dan K4. Uji One Way ANOVA parameter  keseragaman  warna  tidak  dilakukan  karena  nilai  yang  diperoleh  tiap perlakuan adalah sama dan merupakan nilai maksimum kecuali K4.

## Pembahasan
Larutan  kayu  secang  mengandung  brazilein,  suatu  senyawa  kromofor berwarna  merah  yang  berpotensi  sebagai counterstain pada  pengecatan  Gram. Brazilein memiliki 2 struktur predominan yang berbeda tergantung pH. Pada pH netral,  brazilein  mengalami  perubahan  gugus  10-hidroksil  menjadi  atom  O - , demikian pula pada pH basa dengan penambahan perubahan yang sama pada gugus 3-hidroksil (Ngamonglumlert, 2020).
Berdasarkan  hasil  pewarnaan  bakteri  pada  Gambar  1  terlihat  bahwa  hasil pewarnaan sel bakteri K0 (kontrol positif/safranin) dan K5 yaitu merah muda cerah dan merah muda violet dengan intensitas warna tinggi sehingga morfologi sel jelas. Hasil pewarnaan K2, K3, dan K6 masing-masing: merah muda violet, merah tua, dan  merah  dengan  intensitas  sedang  sehingga  morfologi  sel  kurang  jelas. Selanjutnya,  K1  dengan  hasil  pewarnaan  merah  muda  violet,  tetapi  intensitas warnanya  rendah  sehingga  morfologi  sel  tidak  jelas.  Sebaliknya  dengan  K4,  sel bakteri sama sekali tidak terwarnai sehingga morfologi tidak dapat diamati.
Preparat  dengan  jumlah  artifak  terbanyak  yaitu  K3  dan  K6.  K2  dan  K5 memiliki cukup banyak artifak, tetapi dengan ukuran yang lebih kecil daripada K3 dan K6 sehingga sel bakteri tidak tertutupi dan masih dapat diamati dengan jelas. Pada  K1  dan  K2  ditemukan  sangat  sedikit  artifak.  Secara  keseluruhan  setiap perlakuan  menghasilkan  sebaran  warna  yang  merata  kecuali  K4.  Hal  ini  karena pada  sel  yang  tidak  terwarnai  tingkat  absorpsi  sel  terhadap  bahan  pewarna  tidak dapat dinilai.
Berdasarkan  Gambar  2,  diketahui  bahwa  metode  dengan  intensitas  warna tertinggi  ke  terendah ialah  metode  pra-mordan,  kemudian  mordan  berkelanjutan, dan  terakhir  pewarnaan  langsung.  Pada  metode  pra-mordan,  K5  memberikan intensitas warna yang lebih baik daripada K2. Hal ini karena etanol 96% memiliki tingkat  kepolaran  yang  sama  dengan  brazilein.  Adapun  reaksi  pewarnaan  yang terjadi yaitu ikatan koordinasi antara alumunium dan gugus hidroksil peptidoglikan (tahap mordanting )  dan  kompleks  koordinasi  antara  alumunium  dan  brazilein
(tahap pewarnaan) (Zaman et al., 2018; StansFile, 2019).
Pada  metode  mordan  berkelanjutan,  K3  memberikan  intensitas  pewarnaan yang lebih baik daripada K6. Hal ini karena tingkat kelarutan dan disosiasi mordan terjadi  optimum  dalam  pelarut  air  bukan  etanol  96%.  Tingkat  disosiasi mempengaruhi interaksi elektron kompleks alumunium-brazilein yang
Avicenna : Journal of Health Research, Vol 5  No 2. Oktober 2022 (9 - 17) 15 Francisko Angelo Eko Sujono et.al ( Pemanfaatan Larutan Kayu Secang ( Caesalpinia Sappan L.) Sebagai Counterstain Pada Pengecatan Gram Escherichia Coli ATCC 25922)
menyebabkan pergeseran batokromik. Adapun jenis reaksi pewarnaan yang terjadi yaitu  kompleks  koordinasi  antara  brazilein  dan  alumunium  (tahap  pembuatan larutan secang-mordan) dan ikatan koordinasi antara gugus hidroksil peptidoglikan dengan kompleks alumunium-brazilein (tahap pewarnaan) (Zaman et al., 2018).
Gambar 3. Kompleks  Al-Brazilein yang terjadi pada perlakuan K3 dan K5 (Rattanaphani & Bremmer, 2008; Ngamonglumlert, 2020)
Pada  metode  pewarnaan  langsung,  K1  memberikan  intensitas  pewarnaan yang lebih baik daripada K4. Hal ini karena pada pH basa (pH larutan-secang K4 = 8,8),  brazilein  bermuatan  negatif,  demikian  pula  dinding  sel  sehingga  terjadi penolakan zat warna oleh peptidoglikan yang menyebabkan zat warna tidak dapat berdifusi ke dalam sel. pH larutan secang K1 yaitu 6,8, di mana brazilein bersifat nonionik dan lifofilik sehingga brazilein dapat masuk ke dalam dinding sel, tetapi tidak dapat berikatan dengan komponen dinding sel. Hal ini mengakibatkan hanya sedikit zat warna yang tertahan di dalam sel akibat gaya van der Waals (Dapson dan Bain, 2015).
Gambar 4.  Kompleks  Al-Brazilein  yang terjadi pada perlakuan K2 dan K4
(Rattanaphani & Bremmer, 2008; Ngamonglumlert, 2020)
Metode pra-mordan lebih baik daripada metode mordan berkelanjutan karena pada  metode  mordan  berkelanjutan  dihasilkan  kompleks  alumunium-brazilein (pigmen) yang ukuran molekulnya lebih besar (> 1nm) daripada pori dinding sel Escherichia coli (± 2nm) sehingga zat warna lebih sulit berdifusi ke dalam dinding sel.  Hal  ini  berbeda  pada  metode  pra-mordan,  di  mana  proses  pewarnaan  terjadi secara bertahap, yaitu mordanting kemudian pewarnaan sehingga tidak terbentuk pigmen lebih dahulu.
Al Ikatan koordinasi - Al Ikatan koordinasi Ikatan kovalen +
Avicenna : Journal of Health Research, Vol 5  No 2. Oktober 2022 (9 - 17) 16 Francisko Angelo Eko Sujono et.al ( Pemanfaatan Larutan Kayu Secang ( Caesalpinia Sappan L.) Sebagai Counterstain Pada Pengecatan Gram Escherichia Coli ATCC 25922)
Metode  mordan  berkelanjutan  menghasilkan  jumlah  artifak  terbanyak daripada  metode  pra-mordan.  Hal  ini  karena  pada  mordan  berkelanjutan,  larutan yang  digunakan  adalah  asam  lemah  (pH  =  4,2)  sehingga  memperantarai terbentuknya  flok  oleh  Al 3+ (Mbaeze et  al. ,  2017).  Selain  itu,  artifak  juga disebabkan  oleh  akumulasi  brazilein  dan  presipitat  Al(OH) 3 .  Pada  metode  pra- mordan,  artifak  berasal  dari  pembentukan  pigmen  brazilein  dengan  sisa  mordan yang menempel pada preparat. Metode pewarnaan langsung menghasilkan jumlah artifak  paling  sedikit  karena  akumulasi  brazilein  beradhesi  lemah  dengan permukaan kaca benda (tidak ada tahap mordanting ) sehingga zat warna terbuang saat preparat ditiriskan.
Seluruh kelompok memberikan hasil keseragaman warna yang baik kecuali kelompok  K4.  Hal  ini  menandakan  bahwa  metode  yang  digunakan  mampu memberikan  sebaran  zat  warna  yang  merata  pada smear. Brazilein  merupakan senyawa yang larut dalam air dan ethanol melalui ikatan hidroksil sehingga setiap molekul pelarut mengandung molekul brazilein.

## SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Larutan kayu secang dapat digunakan sebagai counterstain pada pengecatan Gram Escherichia  coli ATCC  25922.  Perlakuan  K5  (larutan  etanol  96%-secang metode  pra-mordan)  menghasilkan  intensitas  warna  dan  keseragaman  warna terbaik,  sedangkan  perlakuan  K1  (larutan  akuades-secang  metode  pewarnaan langsung) menghasilkan jumlah artifak terkecil dan keseragaman warna terbaik.

## Saran
Untuk penelitian selanjutnya, dapat dilakukan pengujian penggunaan ekstrak murni  brazilein  dan  fiksatif  untuk  meningkatkan  kualitas  pewarnaan.  Selain  itu, dapat pula dilakukan pemanfaatan ekstrak brazilein kayu secang sebagai pewarna pada jenis pengecatan bakteri lainnya dan jaringan.

## DAFTAR PUSTAKA
Dapson,  R.  dan  C.  Bain.  2015.  Brazilwood,  Sappanwood,  Brazilin  and  The  Red Dye Brazilein: Form Textile and Folk Medicine to Biological Staining and Musical Instruments. Biotechnic & Histochemistry 90(6): 401-423
Global Safety Management. 2014. Safety Data Sheet: Safranin Staining Solution 1%. http://www.beta-static.fischerchi.com . Tanggal akses 21 Februari 2022 Hardy Diagnostics. 2014. Q-Slide TM Gram. https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/content/hugo/Q-
SlideGram.htm. 17 November 2021.
Husein,  L.  O.  I  dan  S.  Aburrahman.  2018.  Pengaruh  Variasi  pH  Ekstrak  Kayu Secang  ( Caesalpinia  sappan Linn)  terhadap  Pewarnaan  Sel  Spermatozoa pada Sampel Suspek Infertilitas. Jurnal MediLab Mandala Waluya Kendari 2(2): 29-33.
Avicenna : Journal of Health Research, Vol 5  No 2. Oktober 2022 (9 - 17) 17 Francisko Angelo Eko Sujono et.al ( Pemanfaatan Larutan Kayu Secang ( Caesalpinia Sappan L.) Sebagai Counterstain Pada Pengecatan Gram Escherichia Coli ATCC 25922)
Mbaeze, M. C., V. E. Agbazue, dan N. M. Orjioke. 2017. Comparative Assessment of  Performance  of  Alumunium  Sulphate  (Alum)  and  Ferrous  Sulphate  as Coagulant in Water Treatment. Mod Chem Appl 5(4): 1-14 Natarajan,  K.  A.  2018. Biotechnology  of  Metals:  Principles,  Recovery  Methods, and Environmental Concern. Elsiever. London. Ngamwonglumlert, L., S. Devahastin, N. Chiewchan, dan G. S. V. Raghavan. Color and Molecular Structure Alterations of Brazilein Extracted from Caesalpinia sappan L. Under Different pH and Heating Conditions. SCIENTIFIC Reports 10(12386): 1-10.
Rattanaphani, V. dan J. Bremmer. 2008. Study of an Al (III) Complex with the Plant Dye  Brazilein  from Caesalpinia  sappan Linn. Suranaree  J.  Sci.  Technol
15(2): 159-165.
Remel. 2008. Gram Decolorizer (95% Ethyl Alcohol).
https://assets.thermofisher.com/TFSAssets/MBD/Instructions/IFU40168.pdf. 18 Juli 2022.
Rondao R., J. S. S. de Melo, J. Pina, M. J. Melo, T. Vitorino, dan A. J. Parola. 2013. Brazilwood  Reds:  The  (Photo)Chemistry  of  Brazilin  and  Brazilein. The Journal of Physical Chemistry 117: 10650-10660. StainsFile. 2019. Formulating Alum Hematoxylin. https://stainsfile.info/stain/hematoxylin/mordant_hemalum.htm. 12  Januari
2022.
Zaman, N. U., M. L. R. Liman, A. Kader, M. A. Al Mamun, B. Sarker, R. Islam, dan  I.  Parveen.  2018.  An  Eco-friendly  Approach  of  Cotton  Fabric  Dyeing with Natural Dye Extracted from Bixa orellana Seeds Employing Different Metallic Mordants. Chemical and Materials Engineering 6(1): 1-8.