## PENDAHULUAN
Eritropoetin  merupakan  hormon  yang  diketahui memiliki  peranan  penting  untuk  produksi  sel  darah merah  dan  memiliki fungsi  fisiologis  yang  kompleks. Saat hormon ini berkurang atau tidak diproduksi dalam tubuh tentunya tubuh akan mengalami anemia. Adanya
stimulasi  pemberian  hormon eritropoetin  dari  luar biasanya  untuk penderita kasus gagal ginjal kronis dan kanker (Falck, 2017).
Eritropoetin  yang  dikenal  pula dengan  nama  lain hematopoietin,  adalah  senyawa  glikoprotein  yang mengendalikan proses eritropoiesis (produksi sel darah

## Optimasi Purifikasi Darbepoetin Alfa Berdasarkan Metode Kromatografi Penukaran ION dengan Dua Variasi Resin

## Optimization of Purification of Darbepoetin Alfa Based on ION Exchange
Chromatography Method with Two Variations of Resin
Indah Shaliha 1*
Marlia Singgih Wibowo 2
Neny Nurainit 3
*1 Program Studi Farmasi, STIKES Khas Kempek,
2 Program Studi Sains dan Teknologi Farmasi, Institut Teknologi Bandung, Bandung, Jawa Barat, Indonesia
3 Penelitian dan Pengembangan,
PT Biofarma
*email: shalihaindah@gmail.com

## Abstrak
Kasus  gagal  ginjal  merupakan  kasus  yang  setiap  tahunnya  mengalami  peningkatan. Kasus ini tak bisa dianggap sepele karena bisa mengancam nyawa seseorang. Memang penyakit gagal ginjal tidak menular seperti penyakit lainnya dan disebabkan oleh pola hidup  yang  buruk.  Kasusnya  di  Indonesia  sendiri  mengalami  angka  kenaikan  yang cukup tajam. Sebagai contoh di Kepulauan Riau angka pasien cuci darah mengalami lonjakan  tajam  dari  85 orang  menjadi 700 orang  dan  kenaikannya mencapai  10  kali lipat. Darbepoetin  (merupakan EPO  yang  memiliki  gula  lebih banyak)  yang  dikenal pula  dengan  nama  lain  hematopoietin  adalah  senyawa  glikoprotein  yang mengendalikan  proses  eritropoiesis  (produksi  sel  darah  merah).  Hormon  ini dihasilkan di ginjal, juga ada yang dihasilkan di hati. Tujuan dari penelitian ini adalah memurnikan darbepoetin itu sendiri dan menghilangkan beberapa protein lain atau zat pengotor  yang  mengganggu  agar  darbepoetin  ini  sendiri  siap  diproduksi  dan membantu banyak orang yang mengalami gagal ginjal. Metode yang digunakan adalah kromatografi  penukar  ion  dengan  resin  Toyopearl  DEAE  650  M.  Selanjutnya dilakukan optimasi  dengan  berbagai  variasi  khususnya  variasi  resin  yang  digunakan adalah resin Toyopearl DEAE 650 M dan GE- DEAE. Berdasarkan hasil, DPO bisa dimurnikan dengan resin Toyopearl. Setelah itu dilakukan optimasi pemurnian dan didapat jika resin TOSOH-DEAE memang merupakan resin yang lebih baik daripada GE-DEAE.

## Kata Kunci:
EPO Kromatografi Penukaran ION Pemurnian
Keywords : EPO ION Exchange Chromatography Purification

## Abstract
Kidney  failure  cases  are  cases  that  increase  every  year.  This  case  cannot  be  considered trivial because it can threaten someone's life. Indeed, kidney failure is not contagious like other diseases and is caused by a bad lifestyle. The number of cases in Indonesia itself has increased quite sharply. For example, in the Riau Islands the number of dialysis patients experienced a sharp jump from 85 people to 700 people and the increase reached 10 times.  Darbepoetin  (which  is  EPO  which  has  more  sugar)  which  is  also  known  as hematopoietic, is a glycoprotein compound that controls the process of erythropoiesis (red blood cell production). This hormone is produced in the kidneys, and some is also produced in the liver. The aim of this research is to purify darbepoetin itself and remove several other proteins or interfering impurities so that darbepoetin itself is ready to be produced and help many  people  who  experience  kidney  failure.  The  method  used  was  ion  exchange chromatography with Toyopearl DEAE 650 M resin. Optimization was then carried out with various variations, especially the resin variations used were Toyopearl DEAE 650 M and GE-DEAE resins. Based on the results, DPO can be purified with Toyopearl resin. After that, purification optimization was carried out and it was found that TOSOH-DEAE resin was indeed a better resin than GE-DEAE.
© 2023 The Authors. Published by Institute for Research and Community Services Universitas Muhammadiyah Palangkaraya. This  is  Open  Access  article  under  the  CC-BY-SA  License  (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/).  DOI: https://doi.org/10.33084/jsm.v9i2.5685
merah).  Hormon  ini  dihasilkan  di  ginjal,  juga ada  yang dihasilkan  di  hati.  Produksi  eritropoetin  di  hati umumnya  terjadi  pada  janin,  sedangkan  produksi eritropoetin  di  ginjal  terjadi  pada  masa  dewasa. Eritropoietin  digunakan  pada  kondisi  anemia  akibat penyakit  gagal  ginjal  kronik,  serta  anemia  akibat kemoterapi kanker (Farmakoterapi, 2017).
Dalam  skala  industri,  Indonesia  memperoleh  produk EPO  dari  beberapa  produsen  di  negara-negara  Eropa dan  Amerika.  Kebutuhan  EPO  Indonesia  untuk tahun 2012 mencapai 850.000 IU per tahun yang berupa obat dalam  bentuk  2000  IU,  4000  IU,  dan  10.000  IU.  IU adalah satuan internasional unit untuk EPO (LIPI, 2015). Berkat  adanya  eritropoietin  sel-sel  darah  merah  bisa dikendalikan dan diproduksi karena umumnya sel darah merah menua dan harus diganti dalam waktu  3 bulan sekali.  Jika  ginjal  tidak  dapat  melaksanakan  fungsinya sebagai penghasil hormon eritropoetin maka diperlukan asupan eritropoetin dari luar.
Meski  eritropoetin  ditemukan  sangat  efektif  untuk mengatasi  pasien  anemia  namun  pendeknya  waktu paruh  membuat  injeksi  hormon  ini  harus  berlangsung berkali-kali  dalam  satu  minggu  dan  kondisi  ini  tentu kurang efektif. Oleh karena itu para pakar menemukan cara  dengan  mensintesis darbepoetin  yang  merupakan turunan eritropoetin (Macdougall, 2003),
Darbepoetin alfa merupakan glikoprotein yang memiliki 2  ikatan  ekstra situs  N-glikosilasi.  Oleh  karenanya darbepoetin alfa mempunyai 5 ikatan  N rantai karbon dibandingkan dengan rHuEpo biasa yang hanya memiliki 3 ikatan saja. Adanya ikatan tambahan membuat waktu paruh DPO lebih lama daripada EPO biasa yaitu 3 kali lebih lama (Macdougall, 2003).
Produksi  dari  darbepoetin  tersebut  tentunya merupakan hasil dari rekayasa genetika. Dalam proses sintesisnya  diperlukan  pemurnian  dari  eritropoetin tersebut  karena  jika  belum  dalam  keadaan  murni tentunya  tubuh  akan  menolak  karena  adanya  partikel asing yang masuk ke dalam tubuh.
Oleh  sebab  itu  diperlukan  suatu  metode  pemurnian darbepoetin alfa agar kasus penolakan dalam tubuh bisa dicegah sebisa mungkin. Karena darbepoetin yang belum murni tentunya bisa membahayakan tubuh.
Metode penelitian yang digunakan dalam kasus ini yaitu menggunakan  kromatografi  penukar  ion  dengan memanfaatkan muatan yang terkandung di dalam DPO tersebut dalam keadaan basa. Dengan begitu tentunya proses  pemurnian  DPO  pun  akan  akan  lebih  mudah dalam bentuk anionnya.
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  memurnikan eritropoetin  itu  sendiri  dan  menghilangkan  beberapa protein  lain  atau  zat pengotor  yang  mengganggu  agar eritropoetin ini sendiri siap diproduksi dan membantu banyak orang yang mengalami gagal ginjal.

## METODOLOGI

## Alat
Alat hitung sel  (Cedex hires (roche),  Alat sentrifugasi (Hich  Zentrifugen  Rotanta  460R),  Alat  BSC (biological science  culture), Tabung  ukuran  25  mL  dan  50  mL (Falcon), Tabung kecil ukuran 5 mL (Eppendorf), Filter ukuran  0,42  µm (Millipore),  Syringe  (Thermo  Syringe), strip glucose dan lactate (Roche), pH meter (Thermo), Mikro pipet berukuran 2µL-1000µL, Pipet steril ukuran 5  mL-50  mL,  Labu  erlenmeyer  ukuran  1L  (Corning), Alat  IEF  (Serva),  Alat  SDS  Page  (BR Biochem  Life Sciences Private), Alat BCA Assay (Thermo Fisher), Kit BCA  Assay  (Thermo)  dan  Alat  IEC (Ion  Exchange Chromatography).

## Bahan
Sel  CHO  ( Chinese  Hamster  Ovary), feed,  galaktosa, NAMA, glukosa, Larutan rehidrasi (Serva), Servalit, Gel IEF,  Cooling  fluid  (serva),  Sampel  standar  (Aranesp), Buffer tris pH 8, pH meter, TBS-BSA 2%, Antibodi 1 2% BSA-TBS,  TBST-T,  Antibodi 2%,  Substrate  BCIP-NBT, DIWF ( deionization water), Membran ukuran 100 KDA, Larutan  NaOH  0,5  M,  antibodi  primer,  antibodi sekunder, PBS, PBS-Tween, Ladder , Running  Buffer SDS
Page,  Buffer  Fosfat  (Merck),  Larutan  NaCl  (Merck), Larutan Histidin (Merck).

## Proses Resusitasi sel CHO
Lampu  BSC  UV  dinyalakan  selama 30  menit  untuk menghilangkan kontaminan dan bakteri patogen lainnya. Setelah  itu  alat  hitung  sel  dinyalakan  dan  dimasukan DIWF  sebagai  standar.  Alat-alat  lain  yang dibutuhkan seperti alat sentrifugasi juga dinyalakan. Semua alat-alat dan  bahan  yang  dibutuhkan  disiapkan  terlebih  dahulu dan  kaca  BSC  dibuka  sampai  batas.  Terlebih  dulu desinfektan disemprotkan untuk menghilangkan  bakteri  kontaminan.  Lalu  pada  tabung sebesar 50 mL ditambahkan glutamin dengan kadar 4% serta opti CHO sesuai perhitungan. L-glutamin dikocok keras dan  dimasukkan  sebanyak  1,4  mL  saja. Sedangkan untuk  opti  CHO  ditambahkan  dalam  tabung  sebesar 33,6  mL,  dihomogenisasi  menggunakan  filter  steril dengan ukuran 10 mL.
Selanjutnya diambilah 5 mL menggunakan filter steril lalu dimasukkan  ke dalam  tabung.  Sel  CHO  diambil  dari nitrogen  cair  dan  dimasukkan  ke  sebuah  wadah isopropanol es. Sel CHO lalu dicairkan dan dipindahkan ke  tabung  15  mL  yang  berisi media  untuk  membuang DMSO. Setelah itu disentrifugasi selama 5 menit  pada 2000  rcf,  supernatannya  diambil  lalu  dibuang. Selanjutnya  diambil  5  mL  media  lalu  dimasukkan  ke dalam  tabung  15  mL  yang mengandung  pelet  hasil  dari sentrifugasi. Media dan pelet dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer  dan  direkatkan  dengan  menggunakan parafilm.  Selanjutnya  selama 18 hari sel diberi glukosa dan feed dan dipanen.

## Proses Isoelectric Focusing (IEF)
Seluruh  bahan  yaitu  larutan  rehidrasi  dan  servalit dicampurkan  ke  dalam  tabung  ukuran  50  mL.  Lalu dilakukan homogenisasi dan dimasukkan ke suatu wadah plastik. Gel tersebut direndam dan disimpan  ke  dalam inkubator  pada  suhu 25 0 C  selama  1  malam.  Wadah yang berisi gel IEF yang telah diinkubasi selama 1 malam disimpan  di  atas  alat  IEF.  Sebelumnya  dasar  dari  gel tersebut diberi cooling fluid untuk menghindari  panas.
Pada  katoda  diberi  buffer  asam  fosfat  sedangkan  pada anoda diberi buffer EPO. Gel disimpan di atas alat IEF, sampel  dimasukkan  ke  dalam  sumur  dan  alat  ini dinyalakan selama kurang lebih 4 jam.

## Proses western blot
Gel  yang  didapatkan  dari  proses  IEF, direndam  dalam buffer tris pH 8 dan ditiriskan. Nitroselulosa dan paper block direndam dalam buffer tris pH 8 dan ditiriskan. Gel diletakkan  dibawah membran nitroselulosa. Paper block diletakkan diatas membran nitroselulosa. Beberapa tisu disimpan  di  atas paper  block .  Perendaman  gel berlangsung  selama  semalam.  Setelahnya  membran diblok oleh BSA 2% dalam larutan TBSA selama 3-4 jam. Setelah  itu  gel  tersebut  dicuci  dengan  larutan  TBST dengan konsentrasi 0,05% selama 3 kali selang 2 menit. Selanjutnya  antibodi  pertama  dimasukkan  selama kurang  lebih  2  jam  dan  selanjutnya  dicuci  kembali dengan  menggunakan  TBST  sebanyak  3  kali.  Antibodi kedua selanjutnya dimasukkan pula ke dalam gel selama 1 jam saja dan selanjutnya dicuci kembali dengan TBST. Langkah  selanjutnya  ditambahkan  substrat  BCIP/NBT sampai gel memiliki pita warna biru. Substrat tersebut dibuang  kemudian  langkah  terakhir  cuci  gel  tersebut sampai kering.

## Purifikasi  protein  DPO  dengan  kromatografi pertukaran ion
Resin  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah toyopearl  DEAE  650M.  Sistem  TFF  diatur  dahulu dengan  menggunakan  membran  100  KDA  dan  luas permukaan  0,005  m².  Sistem  TFF  disanitasi  terlebih dahulu dengan larutan NaCl 0,5M selama 1 jam. Sistem TFF diekuilibrasi  dengan buffer elusi fosfat dan filtrat port  serta  retentat  port  dibuka  dan  diatur  lajunya. Terdapat dua buffer dalam sistem yaitu buffer fosfat dan buffer  fosfat  yang  mengandung  NaCl.  Sebelumnya sampel  dimasukkan  ke  dalam  sistem.  IEC  pool disirkulasikan  menggunakan  pompa  peristaltik  dengan kecepatan  30  mL/min  hingga  mencapai  10-20mL selanjutnya  residu  dibilas  dari  sistem  TFF  dengan menutup  filtrat  port  dan  buffer  dialirkan  selama
beberapa menit dengan  kecepatan 50 mL/min sebanyak 20-30  mL  dengan  menggunakan  buffer  elusi  fosfat. Filtrat port dibuka dan diatur serta disirkulasikan bilasan hingga  mencapai  10-20  mL  dicampur  konsentratnya serta  dicuci. Konsentrat  IEC  di  sampling  sebanyak  500 µL.

## Prosedur SDS Page
Sebelum  proses  SDS  Page  dilakukan  alat-alat disambungkan terlebih dahulu, termasuk gel SDS untuk mengetahui  seberapa  besar  kemurnian  sampel  yang telah dipisahkan. Karena sampel yang digunakan cukup banyak maka proses running pun dilakukan dengan 2 gel sekaligus.  Setelah  itu  suatu  larutan running  buffer dimasukkan  sampai  penuh  untuk  mencegah  gel mengering  dan  membantu  proses  protein bergerak sesuai  dengan  berat  molekulnya.  Kemudian  sampel dengan  pemberat  dan ladder dimasukkan  ke  sumur- sumur yang telah dibuat dan dilakukan proses running selama  kurang  lebih  2  jam  untuk mendapatkan  proses pemisahan protein yang lebih efisien.

## Proses kontak sampel dengan dua variasi resin
Sampel  dimasukkan  ke  dalam  microplate  sebanyak  32 percobaan.  Tiap  sampel  mendapatkan  perlakuan  yang berbeda sesuai  desain  eksperimen  yang  telah  dibuat. Supaya  sampel  dapat  melakukan  kontak  secara maksimal  dengan  resin  serta  buffer,  dilakukan  proses sentrifugasi selama kurang lebih 4 jam dengan kecepatan 300 rpm. Setelah itu sampel dalam mikroplate diambil kembali dengan tabung kecil eppendorf.

## Menentukan  konsentrasi  protein  dengan BCA

## Assay
Hal pertama yang dilakukan adalah preparasi standar dan reagen sesuai dengan prosedur yang berlaku. Albumin (BSA) disiapkan dengan berbagai  variasi konsentrasi dari mulai  konsentrasi  paling  tinggi  sampai  konsentrasi albumin  yang  paling  rendah  (  dari  konsentrasi  2000 ug/mL  sampai  25  ug/mL).  Selanjutnya  disiapkan  BCA reagent dengan menyiapkan 50 bagian reagent A dan 50 bagian reagen B. Standar dan reagen dimasukkan dalam microplate sebesar 25 uL. Selain itu sampel dan reagen
pun dimasukkan dan perlakuannya sama dengan standar dan  reagen.  Setelah  itu  microplate  dimasukkan  dalam suatu instrumen  hingga  konsentrasi  total  dari  sampel yang diinginkan pun akhirnya bisa diketahui.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## PEMBAHASAN

## Hasil IEF DPO yang belum dipurifikasi
Berdasarkan  titik  isoelektriknya ternyata  ada  protein DPO  yang  memiliki  nilai  bervariasi.  Untuk  lebih meyakinkannya  ada  pita  standar  yang  muatan isoelektriknya  sebanding  dengan  eritropoetin,  pita standar ini disebut dengan Nersp. Karena ini merupakan hasil iso electrofocusing tanpa proses purifikasi, tentunya terdapat  pita-pita  protein  lain  yang  muatannya  lebih rendah dan bukan protein yang diharapkan.
Gambar 1. Hasil  isoelectric  focusing  DPO yang belum dipurifikasi. Sampel (A) dan (B) merupakan  sampel  DPO  yang  belum dipurifikasi sedangkan (S)  merupakan standar Aranesp yang digunakan dalam percobaan.
Dengan  kata  lain  protein-protein tersebut  merupakan zat  pengotor  atau  protein yang  tidak  diharapkan  yang nantinya  akan dilakukan  proses  pemurnian.  Proses isoelectric  focusing merupakan  hal  yang lumrah  untuk mendeteksi adanya protein  berdasarkan titik isoelektriknya.  Teknik  IEF  merupakan  pemisahan komponen amfolit karena molekul bisa berlaku seperti asam  lemah  maupun  basa  tergantung  dari  titik isoelektriknya  (Pergande,  2017).  Titik  isoelektrik merupakan muatan yang sama antara muatan positif dan negatif  sehingga total  muatan  dalam  protein  tersebut biasanya bernilai nol (Rozycki, 2018).
Standar yang digunakan  untuk metode isoelektrik poin ini  adalah ARANESP yang merupakan  darbepoetin alfa. Biasanya  titik  isoelektriknya  ada  pada  rentang  3,7-4,7 karena rentangnya lumayan besar maka terdapat 4 pita utama  saat  metode IEF  ini  dilakukan.  Oleh  sebab  itu sampel  yang  pitanya  sejajar  dengan  standar  maka  hal tersebut menunjukkan adanya DPO yang diinginkan. Proses  IEF  memang  tidak  menghasilkan  1  pita  spesifik karena beberapa DPO rekombinan biasanya memiliki 4 pita bahkan ada yang lebih. Hal ini disebabkan muatan isoelektrik  DPO  yang  lumayan  besar  sehingga rentangnya  pun  lumayan  besar.  DPO  memang  pada umumnya memiliki pita banyak karena sifatnya sebagai molekul besar dan memiliki gugus fungsi  yang banyak (Kang.  dkk.,  2010).  Pada  dasarnya  titik  isoelektrik protein terkadang  bersifat  lebih  asam  dan  terkadang bersifat  lebih  basa.  Saat  titik  isoelektrik tinggi  itu menandakan  bahwa  protein  lebih  bersifat  basa  atau muatannya  lebih  negatif  sedangkan  jika  pita  titik isoelektrik  rendah itu menandakan jika protein tersebut bersifat lebih asam (Breidbach et al., 2003). Pada gambar bisa  terlihat  bahwa  titik  isoelektrik  EPO  cenderung tinggi  itu  artinya  EPO  bersifat  asam  dan  anionnya bersifat sangat  basa.
Hal ini terjadi karena adanya penambahan  situs  N- glycosylation menyebabkan  DPO  menjadi  lebih  asam (sekitar  3,7-4).  Dengan  penambahan  dua  N-
Glycosylation  kestabilan  DPO  menjadi  meningkat (Delanghe, 2008).
Pada dasarnya pita IEF menghasilkan banyak variasi yaitu ada yang pitanya tinggi maupun rendah. Hal ini karena struktur DPO  yang  kompleks  seperti  adanya  terminal asam  sialat  (sialic  acid)  yang  berikatan  dengan  rantai glikan  pada  posisi α 2-3,  oligomer  N-asetilglukosamin dan residu α manosa (Schmidt et al., 2003).
Namun proses isoelektrofocusing memerlukan tahap lain yaitu  proses  western  blot  karena  gel  agarosa  tidak mampu  membaca  pita  yang  dihasilkan  dari  proses isoelektrofocucsing tersebut.  Dengan  begitu diperlukan transfer membran ke western blot.
Transfer  membran  nitroselulosa  dengan  western  blot memerlukan  waktu  semalam  penuh  dengan  cara  yang manual dan memerlukan waktu hanya 5  menit dengan menggunakan  instrumen.  Sebenarnya  western  blot sendiri  merupakan  suatu  proses  pemindahan  protein dari gel hasil elektroforesis ke membran agar hasilnya mudah terbaca. Karena  seperti  yang diketahui jika gel hasil  elektroforesis  tidak memberikan  hasil  dan  pita apapun  sehingga  membutuhkan  metode  western  blot didalamnya.
Pita sampel sebelah kiri terlihat lebih tebal daripada pita sampel  di  sebelah  kanan.  Hal  ini  karena  pita  sampel sebelah  kanan  mengandung  kadar  DPO  yang  lebih sedikit sehingga saat proses IEF pita yang dihasilkan pun cenderung  tipis  bahkan  dengan  beberapa  kali pemekatan.  Namun  seperti  yang  terlihat  di  atas  jika DPO yang kita harapkan masih bisa dipakai karena pita yang  dihasilkan  masih  sebanding  dengan  standar  yang telah ditetapkan.
Karena pita sampel sejajar dengan standar maka sampel ini bisa dimurnikan dengan perlakukan lebih lanjut dan membuktikan jika ada darbapoetin dalam sampel.

## Purifikasi  sampel  dengan  kromatografi penukar ion
Metode  yang  selanjutnya  dilakukan  adalah  pemurnian sampel  pertama  atau  A  dengan  kromatografi  penukar ion.  Resin yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah
resin toyopearl DEAE ukuran 650 kda. Karena protein yang  ingin  dipisahkan  adalah  anionnya  (negatif)  maka resin yang digunakan adalah resin penukar anion. Dari kromatogram dapat terlihat bahwa ada beberapa puncak yang mengindikasikan  adanya DPO. Fase gerak yang  digunakan  dalam  proses  pemisahan  ini  adalah larutan NaCl. Karena protein sering memiliki pH yang berubah-ubah,  maka  dalam  proses  pemisahan  ini diperlukan  sebuah  buffer  untuk  menstabilkan  pH  agar tidak  berubah-ubah.  Buffer  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah buffer fosfat pH 7.
Tingginya  puncak menandakan bahwa intensitas DPO dalam larutan tersebut besar. Hanya saja dalam  proses  pemisahan  ini  DPO  belum  benar-benar murni  dan  masih terdapat  beberapa  protein  pengotor yang menempel di dalam sampel. DPO memiliki muatan atau charge yang cenderung lebih negatif dibandingkan protein  lainnya  dalam  bentuk  anion  (Jelkman,  2013) sehingga diperlukan suatu senyawa yang bisa ditukarkan saat  berikatan  dengan  resin  penukar  anion.  Biasanya spesi yang ditukarkan adalah anion yang keelektronegatifannya  tinggi  seperti  ion  klorin  -  ). Karena  ion  ini  jauh  lebih  bermuatan  negatif  daripada DPO  sehingga  cenderung  bisa  ditukarkan  untuk berikatan  dengan  resin  sehingga  fraksi  DPO  pun  bisa dipisahkan (Garcia, 2013).
Molekul  DPO  merupakan  molekul  yang  besar  dan bermuatan  cenderung  negatif  sehingga  tidak  bisa langsung  murni  dengan  satu  kali  tahap  pemisahan. Diperlukan  pemisahan  berkelanjutan  sampai  DPO tersebut murni sehingga diperlukan sampel yang banyak agar tahap pemurnian bisa lebih efisien.
Gambar II. Hasil kromatogram dari sampel (terdapat 8  puncak  kromatogram)  yaitu  pada sampel 1A3 dan 1A4 dengan konsentrasi 0%,  buffer  B  1B3  dan  1C4  dengan konsentrasi  buffer  5  %,  2A4  dengan konsentrasi  10%  buffer  B,  2B5  dengan konsentrasi  20%  buffer  B,  1A2’ dengan konsentrasi  30%  buffer  B,  1B2’  dengan konsentrasi  100%  buffer  B  dimana buffer B merupakan buffer fosfat 10 mM dan 1 M natrium klorida pH 7.
Proses  pemisahan  DPO  harusnya  berjalan  dengan maksimal  melalui  proses  kromatografi  penukar  ion namun tentunya semua itu tergantung dari penggunaan resinnya (Hernandez et al., 2015).
Pemilihan resin biasanya  didasari oleh sifat pengikatan resin  terhadap  sampel  atau  protein  yang  ingin dipisahkan.  Selain  itu resin  tersebut  harus  bersifat selektif dimana hanya protein yang diinginkan saja yang dapat  bertukar  secara  kation  atau  anion dengan  resin tersebut.  Ketika  selektivitas  resin  tersebut  tinggi tentunya  proses  pemurnian  EPO  atau  DPO  pun semakin baik ( Ostrihonova et al., 2019).
Resin Toyopearl biasanya dapat memurnikan DPO dari protein  lain  dengan kadar  kemurnian  sebesar  90%. Namun  resin  ini  juga  seringkali  dimodifikasi  entah dengan rantai lurus maupun siklik dengan harapan proses pemurnian  DPO  berjalan  dengan  lebih  maksimal (Stanley, 2016).

## Hasil SDS page dari sampel 1 DPO
Setelah  sampel  A  dipurifikasi  dengan  menggunakan metode  kromatografi  ion  exchange  maka  langkah selanjutnya  adalah SDS  page.  Metode  ini  merupakan pemisahan  protein  berdasarkan  berat  molekulnya. Biasanya  protein  yang  berat  molekulnya sangat  kecil akan berada paling bawah begitu pula jika berat molekul suatu protein besar maka akan berada paling atas.
Gambar III. SDS Page dari DPO, dari kiri ke kanan (S)  merupakan  standar  yang  biasa digunakan untuk SDS Page, nomor  1 sampai  10  merupakan  sampel  yang telah  dipurifikasi  dan  terdapat  puncak kromatogram saat proses
kromatografi penukar ion.
Molekul  protein  yang  diinginkan  dalam  penelitian  ini adalah darbepoetin yang memiliki berat molekul 55 Kda. Bisa  terlihat  pada  gambar  jika  molekul  DPO  mulai nampak pada berat molekul sekitar 55 Kda. Beberapa fraksi sampel tersebut ada yang masih memiliki banyak zat  pengotor  dan  ada  yang  mulai  sedikit  zat pengotornya.  Fraksi yang  sudah  memiliki  zat  pengotor sedikit adalah fraksi no 3 dan fraksi no 6.
Sampel  yang  mengalami  proses  SDS  page  merupakan sampel  yang  diketahui  memiliki  puncak  kromatogram saat melalui purifikasi dengan kromatografi penukar ion sehingga hanya ada 10 sampel saja yang melalui proses SDS page.
Pemisahan  dengan  kromatografi  penukar  ternyata berhasil  dengan  indikasi  pada  fraksi  no  3  dan  6  yang sudah  sedikit  pengotornya.  Namun  karena  SDS  page memisahkan  protein  berdasarkan  berat  molekulnya, sampel  yang  nampak  pada  gambar  tentu  saja  bukan hanya  DPO.  Selain  itu  meskipun  berat  molekul  DPO
adalah 55 Kda tapi kita tetap harus  mengkonfirmasi jika ini benar-benar DPO dengan metode isoelectric focusing kembali.
Sebenarnya  sampel  ini  harus  melalui  metode kromatografi penukar ion kembali untuk mendapatkan sampel  yang  benar-benar murni.  Hanya  saja  sampel sangatlah terbatas dan tidak mencukupi sehingga sampel tidak  dapat  dimurnikan  kembali  dengan  metode kromatografi.
Namun  menurut  beberapa  penelitian ada  juga  proses kromatografi  penukar  ion  hanya  dengan  sekali  proses running karena  resin  toyopearl  biasanya  dapat memurnikan  sampel  sampai  87%  (Stanley,  2016). Sedangkan menurut sumber lain jika proses pemurnian atau  purifikasi  dengan  kromatografi  penukar  ion menghasilkan sampel  yang  murni  minimal  58%  dalam sekali running (Falck, 2017).
Hal  ini  karena  resin  Toyopearl  memiliki  muatan  yang positif dan dapat menarik muatan negatif dengan  baik sehingga resin ini kapasitas kerjanya lebih baik daripada resin lain (Hong, 2017).
DPO memiliki berat molekul yang bervariasi dari yang berat molekulnya rendah hingga tinggi. Namun biasanya molekul  EPO yang  diharapkan  memiliki  berat  molekul kurang lebih 50 Kda (Kang. dkk, 2010).
Sehingga tentunya diperlukan sampel dalam jumlah yang besar  ketika  ingin  memurnikan  DPO  lewat  metode kromatografi penukar ion. Namun proses mendapatkan DPO memang  diperlukan waktu yang lumayan lama dan faktor-faktor  pendukung  lainnya.  Saat  menginginkan DPO dalam  jumlah  yang  banyak  diperlukan  suatu fermentor  saat  pembiakan  sel  CHO.  Sehingga semakin  banyak  sel  CHO  yang  dikembangkan  maka diharapkan DPO yang dihasilkan pun semakin banyak. Hasil  IEF  dari  sampel  EPO  yang  sudah  di kromatografi
Berdasarkan hasil yang tertera pita sampel menunjukkan setara dengan pita standar. Pita standar selalu memiliki 4  pita  utama  karena  titik  isoelektrik  DPO  yang bervariasi. Molekul darbepoetin yang besar dan memiliki
banyak gugus fungsi membuat pita yang dihasilkan harus banyak yaitu memiliki 4 pita.
Gambar IV. Hasil  IEF  setelah  di  kromatografi,  (S) merupakan standar yang biasa digunakan dalam  IEF,  nomer  (1)  sampai  (23) merupakan  fraksi-fraksi  sampel  yang
sudah mendapatkan perlakuan kromatografi  penukar  ion,  pita  sampel yang  sejajar  dengan  standar merupakan indikasi  adanya  DPO  dan muatan  atau charge sampel sama dengan standar.
Berdasarkan  hasil  yang  tertera  pita  sampel menunjukkan setara dengan pita standar. Pita standar selalu  memiliki  4  pita  utama  karena  titik  isoelektrik DPO yang bervariasi. Molekul darbapoetin yang besar dan memiliki banyak gugus fungsi membuat pita yang dihasilkan harus banyak yaitu memiliki 4 pita.
Proses  IEF  menggunakan  semua sampel  yang  telah dipurifikasi  oleh  KPI,  baik yang  terdapat  puncak kromatogram  ataupun  tidak.  Berbeda  dengan  SDS karena SDS hanyalah sampel yang mengandung sinyal dalam kromatogram bukan semuanya.
Seperti  yang  terlihat  pada  gambar  setelah  melalui metode  kromatografi  ion exchange  sampel  sudah memiliki  banyak  fraksi-fraksi  yang  terpisah  yang memiliki titik isoelektrik bervariasi dari muatan rendah sampai yang bermuatan tinggi.
Gambar V. Hasil  IEF  lanjutan  sampel  nomer  (24) sampai  (37)  tidak  terdapat  pita yang sejajar  dengan  standar  sehingga  bisa disimpulkan  jika  sampel  ini  tidak terdapat DPO yang diinginkan.
Oleh  sebab  itu  meskipun  sudah  mencapai  dan  sejajar dengan pita standar tetap  saja  ada  beberapa  pita  yang belum  benar-benar  melampaui  standar  seperti  yang diharapkan. Meski begitu setidaknya muatan atau charge sampel yang diharapkan sudah tinggi dan sejajar dengan standar.
Meskipun  muatannya  bervariasi, sampel  ini  tetaplah eritropoetin  namun  memang  yang  muatannya  atau charge tinggi lebih diharapkan daripada yang muatannya rendah.  Meskipun  dari  hasil  SDS  page  sudah  terdapat pita  dengan  berat  molekul  kurang lebih  55  KDA  tetap saja  untuk  memastikan  apakah  sampel  ini  DPO  atau bukan harus dengan metode isoelectric focusing.
Karena titik isoelektrik DPO bersifat spesifik tentunya metode isoelectric  focusing cenderung  efektif  untuk memastikan apakah dalam sampel terdapat eritropoetin atau tidak.

## Desain eksperimen untuk pemurnian DPO
Saat ini    untuk    memurnikan   DPO memang masih menggunakan  metode kromatografi  pertukaran  ion. Hal  ini  karena   umumnya  metode  kromatografi penukar  ion sudah efektif  memisahkan DPO dari protein-protein  pengotor  lainnya.  Sebenarnya  ada metode  lainyang  sangat  selektif  memurnikan  DPO yaitu kromatografi afinitas dengan  resin  yang  digunakan yaitu  resin Ni-NTA  (Singh,  2015).  Namun  diperlukan sampel  yang  sangat  banyak  saat  memisahkan dengan resin  Ni-NTA  karena  selektivitasnya yang  tinggi  dan hanya  menghasilkan sample murni yang relatif sedikit. Untuk  menentukan  metode  mana  yang  paling  efektif dalam  pemisahan  tentunya  diperlukan  metode  DOE dan  sampel yang  digunakan  adalah  sampel  no  B  untuk pencarian  mana  perlakuan  paling  maksimum  dalam proses  percobaan  yang  mana  nantinya  hasil  screening sampel menggunakan  DOE ini digunakan untuk proses purifikasi sampel lain.
Metode  DOE  merupakan  hal  yang lumrah  dilakukan dalam  memprediksi  suatu percobaan atau eksperimen. Biasanya  ada  dua  variabel  yang  berlaku  dalam  DOE yaitu variabel input (X) dan variabel respon (Y). Dengan menggunakan metode ini biasanya suatu penelitian akan mendapatkan  hasil yang  berkembang  dan  terdapat kemajuan  yang  signifikan  sehingga  DOE  sering digunakan di beberapa industri seperti industri farmasi, makanan,  kimia  hingga  pemasaran  atau  marketing (Durakovic, 2017).
Desain  eksperimen  diketahui  merupakan  metode statistika  yang  digunakan  oleh  ilmuwan  untuk memahami fenomena yang kompleks. Ini  menggunakan pendekatan  sistematis  dan  penyelesaian  masalah sehingga nantinya didapat gabungan data dan kesimpulan yang valid (Kaselvoya, 2014).
Biasanya  desain  eksperimen digunakan  sebagai  metode optimasi kondisi suatu percobaan sehingga didapat data yang optimal dan valid dengan menggunakan beberapa parameter yang saling mempengaruhi (Dennison, 2015). Desain eksperimen ini melibatkan  beberapa faktor yang mempengaruhi  pada  proses  pemisahan.  Faktor  yang digunakan  adalah  jenis  resin,  variasi  pH  buffer,  jenis buffer, jenis larutan blocking, variasi konsentrasi larutan blocking serta  variasi konsentrasi  dari  buffer  yang digunakan.
Dengan  adanya  variasi  faktor  untuk proses  pemisahan tersebut  diharapkan  dapat  tercapainya  optimasi  dan pemurnian  DPO  tersebut.  Selanjutnya  untuk  desain eksperimen diperlukan suatu software untuk membuat desain  optimasi  seperti  yang diharapkan  selama  ini. Software  yang  digunakan  untuk  proses  ini  adalah software Minitab 19. Berikut desain eksperimen untuk optimasi pemurnian dari sampel DPO:
Tabel 1. Desain  eksperimen  untuk  purifikasi  EPO.
Percobaan  dilakukan  sebanyak  32  kali dengan  perbedaan  perlakuan  untuk mendapatkan pemisahan yang maksimal
Dari  beberapa  faktor  yang  mempengaruhi  proses pemisahan  terdapat  32  percobaan  berbeda  untuk menentukan optimasi pemurnian sampel. Faktornya pun beragam seperti misalnya menggunakan 2 variasi resin. Resin yang digunakan dalam desain percobaan ini  salah satunya adalah resin GE-DEAE yang sifatnya gel. Meski begitu resin ini tetap memiliki  prinsip penukar ion sama seperti  resin  TOSOH  atau  resin  Toyopearl  DEAE. Resin  GE-DEAE  disini  bersifat  penukar  anion  sama
seperti resin TOSOH. Karena sifatnya yang reaktif sama maka  kedua  resin  ini  dibandingkan  agar  proses pemisahan pun menjadi lebih baik.
Sedangkan  seperti  yang  kita  tahu  jika  toyopearl merupakan  resin  penukar  anion  dalam  proses kromatografi dan sudah sering dijadikan sebagai metode pemisahan protein yang lumayan efektif.
Ada faktor lainnya yang tak kalah penting adalah variasi buffer.  Seringkali buffer  fosfat  selalu  dijadikan  larutan penyangga  agar  pH  larutan  tidak  berubah-ubah  saat proses kromatografi. Namun tentunya diperlukan variasi buffer lainnya pula untuk mengetahui apakah buffer fosfat memang  larutan  penyangga  terbaik  atau  tidak  dalam proses pemisahan ini. Tak kalah penting pula besarnya konsentrasi  antar buffer  tersebut.  Konsentrasi  yang dipilih sebesar 5 dan 15mM karena sejauh ini konsentrasi 10  mM  adalah  yang  dipakai  untuk  proses  pemisahan DPO.
Selanjutnya  faktor  yang  juga dimasukkan  dalam  desain eksperimen  adalah  blocking  buffer.  Terdapat  2  variasi blocking  buffer  yaitu  histidin  dan  NaCl.  Diharapkan dengan  adanya  variasi blocking  buffer maka  proses pemurnian  pun  berjalan  dengan  maksimal  dan  sesuai yang kita harapkan. Fungsi blocking buffer sendiri adalah agar spesi-spesi  lain  yang  tidak  diinginkan  tidak  ikut dalam  proses  pemisahan  sehingga  akhirnya  pemisahan hanya terfokus  pada spesi yang diinginkan. Tidak hanya berfungsi sebagai blocking buffer, histidin maupun NaCl pun  berfungsi  sebagai  penukar  anion.  Saat  DPO berikatan  dengan  resin  tentunya harus  ada  spesi  yang mampu ditukarkan
Dengan  adanya  desain  eksperimen  yang  telah disebutkan di atas  maka pemurnian protein pun sudah teroptimasi  sehingga  kedepannya  kita  tinggal  memilih mana metode terbaik yang bisa dipilih untuk kemajuan penelitian di masa mendatang.
Tabel II. Desain eksperimen  lanjutan untuk purifikasi EPO.  Percobaan dilakukan  sebanyak  32  kali dengan  perbedaan perlakuan untuk mendapatkan pemisahan yang maksimal Meski  metode  DOE  sering  digunakan dalam  suatu percobaan  namun  keberhasilan  metode  tersebut tentunya  tergantung  dari  peneliti  dan  variabel-variabel yang  mempengaruhinya.  Sehingga  tentunya  hasil  yang didapat  tidak  selalu  sempurna  seperti  yang  kita harapkan.
Desain optimasi pemurnian  protein ini menggunakan 2 variasi  resin  yaitu  Toyopearl  dan  GE-DEAE  yang diharapkan diantara kedua resin ini mampu memberikan hasil terbaik dalam pemisahan EPO.
Penggunaan  resin  GE  DEAE  tak  lepas  karena kemampuannya  memisahkan protein  EPO.  Resin  ini mampu  mengadsorpsi protein  selama  200  detik  dan menukarnya dengan ion yang bermuatan lebih besar dari protein EPO tersebut (Emanuelsson et al., 2008).
Desain eksperimen ini  menggunakan factorial functional dan      hanya      bertujuan  mencari  metode terbaik agar nantinya proses pemurnian DPO berjalan dengan baik serta selektif.

## Penentuan  kadar  protein  berdasarkan metode BCA Assay
Penentuan kadar protein pada sampel setelah optimasi pemurnian  dengan  beberapa  variasi  bahan  bertujuan untuk  mengetahui  seberapa  besar  proses  pemisahan terjadi. Dengan  menggunakan  metode  ini  tentunya kita bisa mengetahui kadar protein keseluruhan dari sampel yang sudah dimurnikan.
Meski begitu metode ini memang tidak bisa menentukan kadar protein  dari EPO saja melainkan semua protein yang ada dalam  sampel  sehingga  tentunya  diperlukan tahap  lain  agar  kita  yakin  jika  protein  yang  sudah terpisah ini merupakan EPO. Namun seperti yang kita tahu jika sampel sudah mendapatkan variasi perlakuan sesuai dengan desain eksperimen yang sudah ditetapkan. Dengan  begitu  tentunya  bisa  disimpulkan  semakin sedikit kadar protein dengan metode BCA Assay maka itu  artinya  sampel  sudah  dapat  dipisahkan  secara optimum.
Gambar VI. Hasil  penentuan  konsentrasi  protein dengan  BCA  Assay.  Sampel  nomor  1 sampai 32 merupakan sampel yang telah mendapatkan  perlakuan  berbeda-beda berdasarkan  DOE  untuk  mendapatkan hasil  purifikasi  sampel  yang  maksimal, sampel yang memiliki nilai paling sedikit yaitu  nomor  8  dan  11  merupakan perlakuan paling optimal.
Karena  tentunya  saat  kontak  dengan  resin  pasti  ada protein  yang  terjerap  dalam  resin  tersebut  sehingga kadar  protein  dalam  sampel  tersebut  turun.  Terlebih resin yang digunakan merupakan resin penukar ion dan resin  GE-DEAE.  Meski  kedua  resin  ini  cara  kerjanya sama  dan  keduanya  sama-sama mampu  menangkap
protein yang tidak  diperlukan  dan meloloskan protein yang diinginkan.
Pada BCA Assay konsentrasi absorbansi dengan standar kurva  absorbansi  dari  variasi  serum  bovin  albumin sebanding  dengan  konsentrasi  protein  dalam  larutan. Sehingga nilai ini bisa digunakan untuk menentukan kadar protein dari sampel yang diinginkan (Huang, 2010). Meski  begitu  pengukuran  protein  dengan  cara  ini  bisa mengalami  bias sehingga  bisa  saja  kadar  protein  yang diukur kurang akurat. Hal ini karena asam amino seperti cysteine,  tirosin  dan  tryptophan  berpartisipasi mereduksi  ion  cu 2+ menjadi  cu + .  Sehingga  protein tersebut malah membuat residu tersebut makin reaktif. Akhirnya  komposisi  protein  dan  standar  bisa  saja mengalami  perbedaan  yang  signifikan  hingga  hasil pengukurannya menjadi tidak akurat (Brady, 2015). Biasanya  pengukuran  menggunakan  BCA  Assay  di daerah  panjang  gelombang  562  nm  dan  ini  berlaku untuk  semua  protein  (Hussain,  2019).  Semua pengukuran  kadar  protein  pada  BCA  merupakan pengukuran  secara  kuantitatif  sekaligus  kualitatif. Kuantitatif  berdasarkan  pengukuran  absorbansi  dan kualitatif  berdasarkan  perubahan  warna  dari  hijau menjadi biru (Biru artinya sampel tersebut mengandung protein).
Resin  TOSOH  mampu  menangkap  protein  yang muatannya  lebih  negatif.  Resin  ini  pada  akhirnya  akan mengikat DPO dan spesi DPO ditukarkan dengan spesi lain  yang lebih  negatif  seperti  ion  Cl - misalnya.  Sama halnya  dengan  resin  GE  DEAE  yang  juga merupakan penukar  ion  hanya  saja  bentuknya gel.  Namun  prinsip keduanya  sama  yaitu  sama-sama  resin  penukar  anion yang sifatnya  spesifik.
Resin  GE-DEAE  Sepharose  akan  memisahkan  suatu sampel  terhadap  pengotor  dengan  baik  namun tergantung  dari  derajat keasaman  atau  pH  sampel tersebut.  Biasanya  pH  7-7,5  merupakan  pH  optimum dan proses pemisahan akan berjalan  dengan baik  pada pH tersebut (Hong, 2017).
Jadi  fungsi  BCA  Assay  disini  adalah  mengukur konsentrasi  total  protein  dalam  sampel  tersebut. Semakin sedikit kadar protein yang diukur menandakan resin  tersebut  sudah  maksimal  dan  selektif  dalam memisahkan protein yang  diharapkan. Namun jika total konsentrasi  protein  tersebut  masih  tinggi  itu  artinya proses  pemisahan pun tidak berjalan dengan maksimal (Ostrihonova et al., 2019).
Hasil BCA Assay menunjukkan jika sampel no 8 dan 11 memiliki  kadar  protein  total  paling  sedikit.  Itu menunjukkan  jika  sampel  yang  diinginkan  sudah berikatan dengan  sempurna  dengan  resin  sehingga  saat ditukarkan  dengan  spesi  lain  yang  lebih negatif  maka protein yang lolos tersebut adalah DPO.
Sampel no 8 menggunakan buffer PB pada pH 7,5 dan histidin  sebagai  blocking buffer-nya.  Sedangkan  resin yang  digunakan  adalah  TOSOH-DEAE  atau  toyopearl 650 M. Sampel no 11 menggunakan buffer Tris-HCL pada pH  7,5  serta  NaCl  sebagai  blocking  buffer  sedangkan resin  yang  digunakan  adalah  TOSOH-DEAE.  Sehingga dapat dikatakan  jika  resin  TOSOH  DEAE  merupakan resin  yang  lebih  baik  daripada  GE-DEAE  dalam memurnikan protein DPO.
Diharapkan  dari  dua  perbandingan  ini  kita  bisa mengetahui  mana  resin,  buffer  serta  blocking  buffer terbaik  untuk  mendapatkan  EPO  yang  murni.  Ketika sudah mengetahui mana perlakuan terbaik maka proses pemurnian pun akan berjalan lebih mudah.

## Hasil SDS Page
Berkurangnya kadar protein pada sampel setelah proses optimasi memang menunjukkan jika proses pemisahan sampel  berjalan  dengan  baik.  Namun  kita  tetap  harus melihat hasil SDS page dari sampel yang telah dioptimasi pemisahannya tersebut. Dari hasil SDS Page ditemukan bahwa  eritropoetin  pada  sampel  memang  terdapat kemiripan antara satu dan yang lainnya dan belum begitu spesifik. Hal ini wajar karena proses optimasi tersebut hanya  melalui screening saja  bukan  melalui  alat kromatografi  penukar  ion  maupun kromatografi  filtrasi gel.
Sebelum mendapatkan pita, proses SDS Page memang melewati  serangkaian  destaining  solution  terlebih dahulu.  Destaining  bertujuan  untuk  menghasilkan pita yang lebih jelas dan bersih supaya hasil SDS Page dapat terbaca (Jan, 2016). Namun dari hasil bisa terlihat bahwa hasil SDS page sangat tipis karena memang proteinnya tidak  mengalami  pemekatan  dahulu  karena  bertujuan hanya untuk proses screening.
Namun setidaknya lewat proses screening ini kita akan mendapatkan  perlakuan  mana  yang  memberikan  hasil terbaik  sehingga  kedepannya  proses pemisahan  DPO berjalan dengan lebih baik.
Gambar VII. Hasil SDS page sumur pertama, (S) merupakan  standar  yang  biasanya  dipakai  untuk  SDS Page  sedangkan  (1)  sampai  dengan  (14)  merupakan sampel  yang telah  mendapatkan  perlakuan  sesuai DOE

## KESIMPULAN

## UCAPAN TERIMA KASIH
Gambar VIII .   Hasil  SDS  page  sumur  kedua,  (S)
merupakan standar yang biasa dipakai untuk  SDS  Page  sedangkan  nomer (15) sampai (28) merupakan SDS Page lanjutan sampel yang telah mendapatkan  serangkaian  percobaan sesuai DOE.
Pada sumur pertama bisa dilihat bahwa hasil SDS Page terlihat  sangatlah  tipis namun  tetap  memberikan  pita yang menunjukkan  adanya  protein  DPO.  Tipisnya  pita dalam  hasil  SDS  page  di  atas  ini  karena  hasil  optimasi pemurnian  sampel  dengan berbagai  variabel  tersebut tidak  menjalani  proses  pemekatan  dahulu.  Idealnya sampel  sebelum dipisahkan dengan metode kromatografi,  sampel  tersebut  harus  dipekatkan terlebih  dahulu  agar  protein  yang  akan  dipisahkan terkumpul  dan  nantinya   hasil  SDS  page  pun  akan terlihat  sangat  jelas. Namun  karena  ini  merupakan proses  screening  saja  untuk  menentukan  mana  hasil terbaik dari desain eksperimen yang telah dipilih maka proses pemekatan pun tidak perlu dilakukan.
Tentunya pita SDS page DPO ada yang memang tebal dan  tipis  tergantung  tipe  DPO  itu  sendiri.  Karena seperti yang kita tahu ada DPO alfa, DPO beta bahkan EPO beta dan ketiga jenis EPO tersebut memiliki jenis perbedaan pita satu sama lain  (Reichel, 2008).
Pada  sumur  pertama  pita  sampel  tidak sejajar  dengan pita  standar  meski  begitu  berat molekul  antara  sampel dan pita standar tidak terlalu berbeda secara signifikan dan masih berada dalam rentangnya. Hal ini bisa terjadi karena proses running pemisahan protein berdasarkan berat  molekulnya  dengan  SDS page  tidak  berjalan dengan lama  karena waktu yang dipakai hanya selama 90 menit.
Proses  running  harusnya  bisa  dimulai  dengan voltase yang rendah dulu yaitu sekitar 30 V baru setelah itu bisa dinaikan  tegangannya sesuai  kebutuhan.  Selain  itu  arus yang  dipakai  ada  baiknya  dimulai  80  mA  sebagai
pemanasan supaya proses SDS page berlangsung dengan baik (Schagger, 2006).
Pada sumur kedua hasil pita sampel dan pita standar ada yang sejajar  dan  ada yang tidak.  Perbedaan kondisi ini pun bisa terjadi karena waktu running sampel yang tidak terlalu lama yaitu hanya selama 90 menit seperti sumur sebelumnya.  Alhasil protein  EPO  pun  munculnya  tidak sejajar dengan pita standar.
Baik  pada  sumur  pertama  maupun  sumur  kedua  bisa terlihat  jika  DPO  masih belum  murni.  Hal  ini  karena protein  DPO tersebut  hanya  melalui  proses  screening saja  dengan  prosedur  yang  menggunakan  desain eksperimen.  Meski  begitu  dengan  adanya  hasil  SDS page  sudah  menunjukkan  jika dalam pita tersebut ada DPO sehingga proses perhitungan kadar protein dengan BCA assay tersebut merupakan hal yang valid.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  maka  didapat  kesimpulan bahwa :
a. Protein  EPO  dapat  dipisahkan  dari  matriks pengotor  dengan  metode  kromatografi  penukar ion.
b. Menurut  percobaan  ini  resin  TOSOH  atau toyopearl  650  DEAE  lebih  efektif  dalam  proses pemisahan daripada resin GE-DEAE.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada PT. Biofarma  karena  telah  banyak  membantu  dalam penelitian ini

## REFERENSI
Brady, Pamlea  N  dan  Megan  A.  Macnaughtan. (2015). Evaluation  of  Colorimetric Assaysfor Analyzing Reductively Methylated Proteins:  Biases and Mechanistic  Insights. Anal Biochem.  2015
December  15;  491:  43–51. Breidbach
Andreas,  Don  H.  Catlin, Gary  A.  Green, Inna Tregub. 2003.
Delanghe,  Joris  R.  Mathieu  Bollen  and  Monique Beullens.  (2008). Testing  for recombinant erythropoietin. Wiley-Liss, Inc.
Dennison,  Thomas  J,  Julian  Smith,  Michael  P. Hofmann,  Charlotte  E.  Bland,  Raj  K. Badhan,  Ali  Al-Khattawi,  Afzal  R. Mohammed . ( 2016). Design of Experiments  to  Study  the  Impact  of Process Parameters on Droplet  Size and Development  of  Non-Invasive  Imaging Techniques in Tablet Coating. PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0157267 Detik com. (2016). Kasus Gagal Ginjal . https://health.detik.com/berita-detikhea  lth/d- 3129326/kasus-gagal-ginjal-naik-  4-kali-lipat- dalam-5-tahun
Durakovic,  Benjamin.  (2017).  Design  of  Experiments Application,  Concepts,  Examples:  State of the  Art. Periodicals  of  Engineering  and Natural Scinces Vol 5, No 3, December 2017, pp. 421 ‒ 439
Emanuelsson,  Ida.  Anna  Karin  Janson.  Katarina  Riso. (2008). Characterising  of  Chromatography Gels  for  Purification  of  Erythropoetin . Hogskolan I Boras.
Falck, David, Markus Haberger, Rosina Plomp, Michaela
Hook,  Patrick  Bulau,  Manfred  Wuhrer  & Dietmar Reusch. (2017). Affinity purification  of  erythropoietin  from  cell culture  supernatant  combinated  with MALDITOF- MS analysis of erythropoietin N -glycosylation. Scientific Reports | 7: 532.
Farmakoterapi.  (2017). Eritropoietin,  Hormon  Penghasil Sel Darah Merah. http://www.farmakoterapi.com/eritropo ietin-hormon-penghasil-sel-darah-mera h/
Farooqahmed  S.  Kittura,  Elena  Arthura,  Maikhanh Nguyena,1,  Chiu-Yueh  Hunga,  David  C. Saneb,  and  Jiahua  Xiea.  (2015).  Two-step purification  procedure  for  recombinant human asialoerythropoietin  expressed  in transgenic plants . Int J Biol Macromol. 2015 January ; 72: 1111–1116.
Garcia,  Osnel,  Elias  Nelson  and  Leonardo Gordinez. (2013).  Improvement  in  an  Ion Exchange Chromatography  Proceure  to  Increase Recovery and Biological Activity of EPO in Preperation for Paharmaceutical Use. Latin
America Journal  of  Pharmacy.  32(6):  852-9 (2013). Hernandez, Lourdes. Diobel  Stewart, Lourdes Zumalacárregui,  Daniel  Amaro.  (2015). Comparison Among Three Anion Exchange Chromatographic  Supports  to  Capture Erythropoietin From Cell Culture Supernatant .  2015 Jun;33(6):642-6
Homkhao Sakullapat Homkhao, Pongsatorn Poopisut & Dyah  Wulandari.  ( 2017). SDS  Page .
Suranaree University of Technology.
Hong, Zhi-Wei Hong,Yu-Chi Yang, Timothy Pan,, Huey- Fen  Tzeng,  Hua-Wen  Fu.  (2017). Differential effects of DEAE negative mode chromatography and gel-filtration chromatography  on  the  charge  status  of Helicobacter  pylori neutrophil-activating protein. Plos One https://doi.org/10.1371/journal.pone.01 73632 Huang,  Tao,  Mian  Long  and  Bo  Huo.  (2010). Competitive  Binding  to  Cuprous Ions  of Protein and BCA in the Bicinchoninic Acid Protein  Assay. The  Open  Biomedical Engineering Journal, 2010, 4, 271-278
Hussain,  Maryam  T,  Neil  Forbes  and  Yvonne Perrie. (2019).  Comparative  Analysis  of  Protein Quantification  Methods  for  the  Rapid Determination  of  Protein  Loading  in Liposomal  Formulations. Pharmaceutics
2019, 11, 39
Jan, Sohail, Zabta Khan Shinwari, Malik Ashiq Rabbani,
Sabir  Hussain  Shah,  Muhamad  Ishaq Ibrahim, Muhammad  Ilyas. (2016).
Optimization  of  an  efficient  SDS-PAGE protocol  for  rapid  protein  analysis  of Brassica  rapa .  Journal  of  Biodiversity  and
Environmental Sciences (JBES) Vol. 9, No. 2, p. 17-24, 2016 Jawapos. (2017). Kasus Gagal Ginjal di Kepulauan Riau Melonjak Tajam. https://www.jawapos.com/jpg-today/1 0/07/2018/kasus-gagal-ginjal-di-kepula  uan- riau-melonjak-tajam/ Jelkman Wolfgang. (2013). Physiology and Pharmacology of Erytropoetin. Transfusion Medicine  and Hemotherapy.  2013;40:302-
309
Kang Min-Jung, Sang Mi Shin, Hey Hyun Yoo, Oh-Seung Kwon  and  Changbae  Jin.  (2010). Characteristics  of  IEF Patterns  and  SDS- PAGE Results of Korean EPO Biosimilars. Bull. Korean Chem. Soc. 2010, Vol. 31, No. 9
Kaselvoya  Bibiana  &  Michal  Tkac.  (2014).  Design  of Experiments  in  Truck  Company. KVALITA INOVÁCIA PROSPERITA 19/1 – 2015
Khoury,  Graziella  El  Khoury,  Basmah  Khogeer,  Chen Chen,  Kheng  T  Ng,  Shaleem  I  Jacob  & Christopher  R Lowe1.  (2015).  Bespoke affinity ligands for the Kittur.
LIPI. (2015). Eritropoetin. www.biotek.lipi.go.id/publication/berit a/biotek-dalam-berita/1552-erythropoie tin-epo-dari-ragi-dan-barley Muller, Egbert. (2005). Properties and Characterization of High Capacity Resin for Biochromatographyc. Chem. Eng. 2005. 28, 11. Ostrihonova,  Marta,  Jana  Adamíková,  Tomáš  Molnár, Monika  Antošová,  Milan Polakovič.  (2019). Recombinant human erythropoietin separation using a cation-exchange multimodal  adsorbent . Acta  Chimica  Slovaca,
Vol.  12,  No. 1, 2019, pp. 103—107
Pergande, Melissa R. and Stephanie M. Cologna. (2017). Isoelectric  Point  Separations  of  Peptides  and Proteins. Proteomes 2017,  5,
4;
doi:10.3390/proteomes5010004.
Reichel.  C,  R.  Kulovics,  V.  Jordan,  M.  Watzinger,  T.
Geisendorfer. (2008). SDS-PAGE of recombinant  and endogenous  erythropoietins: benefits and  limitations  of  the  method  for application in doping control. Sport und Buch
Strauß - Köln 2008.
Republika. (2018). Kasus  Gagal  Ginjal  Meningkat
Tajam. https://www.republika.co.id/berita/gaya- hidup/info-sehat/18/05/06/p8ap02399-jumlah- pasien-penyakit-ginjal-kronis-t erus-meningkat.
Rozycki Mirosław, Ewa Chmurzyńska, Ewa Bilska-Zając, Jacek  Karamon,  Tomasz  Cencek.  (2018) . Isoelectric  focusing  of  proteins  in  the  pH gradient as a tool for identification of species origin of raw meat. J Vet Res 62, 151-159, 2018
Rubiyana,  Yana,  Adi  Santoso,  and  Irmanida  Batubara. (2015).  Comparison  of  Immobilized  Metal Affinity Chromatography  Ni-NTA  and  Co- TALON  for  the  Purification  of  Recombinant Human  Erythropoietin. Makara  Journal  of Science 19/4 (2015) 137-142
Sartika, I Nyoman. Wayan Retayasa, Made Kardana, Ida Bagus Mudita. (2008).  Peran Eritropoetin pada Anemia Prematuritas. Sari Pediatri, Vol. 9, No. 6, April 2008
Schagger,  Hermann.  (2006). Tricine–SDS-PAGE .  Nature Publishing  Group.
Schmidt Cleber A., Cristiane F. CODEVILLA,  Marcio
FRONZA, Renata Girardi CASALI & Sérgio L. DALMORA. (2003). Physico-Chemical Characterization  and  Biological Evaluation  of Recombinant  Human  Erythropoietin  in Pharmaceutical Products. Lat. Am. J. Pharm. 22 (4): 343-50 (2003)
Smejkal Gary B and Darren J. Bauer . ( 2012). High Speed Isoelectric  Focusing  of  Proteins  Enabling Rapid Two-Dimensional  Gel  Electrophoresis.
University of New Hampshire
Stanley,William. (2016). Peptide Afinity Adsorbents for Purification  of  High  Value  Biotherapics. Disertation. North California State .