( JPP) Jurnal Kesehatan Poltekkes Palembang Vol. 17, No. 2, Desember 2022, e ISSN 2654-3427 DOI: https://doi.org/ 10.36086/jpp.v17i2

## ANALISIS KEMURNIAN EKSTRAKSI ASAM RIBONUKLEAT PADA SAMPEL DARAH MENSTRUASI

## ANALYSIS OF RIBONUCLEIC ACID EXTRACTION PURITY IN MENSTRUAL BLOOD SAMPLES
Ocktariyana 1 , Dian Lestari 2 , Asmarinah 3 1,2 Politeknik Kesehatan Kemenkes Palembang.
3 Universitas Indonesia. Jakarta (e-mail korespodensi penulis: ocktariyana@poltekkespalembang.ac.id)

## ABSTRAK
Latar  Belakang: Asam  nukleat  mengandung  materi  genetik  dan  berfungsi  untuk  mengatur perkembangan  biologis  seluruh  bentuk  kehidupan  secara  seluler.    Asam  nukleat  yang  paling  umum adalah Asam deoksiribonukleat (ADN) dan Asam ribonukleat (ARN). Untuk mengeluarkan ARN dari dalam intisel maka diperlukan suatu teknik isolasi. Suatu ekstraksi asam nukleat dikatakan baik jika dari  prosedur  yang  dilakukan  bisa  didapatkan  asam  nukleat  yang  murni  dan  utuh.    Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  bagaimana  tingkat  kemurnian  ekstrak  asam  nukleat  dari  sampel  darah menstruasi menggunakan teknik isolasi asam nukleat.
Metode: Sampel  darah  menstruasi  dikumpulkan  dengan  cara  ditampung  pada  kertas  saring  yang  di desain  khusus.  Sampel  akan  diekstraksi  menggunakan  Quick-ARN  Miniprep  Plus  Kit  R1058  Zymo Research  untuk  isolasi  ARN,  selanjutnya  diukur  tingkat  kemurnian  dengan  menggunakan  alat nanodrop  berdasarkan  prinsip  spektrofotometri.  Data  diolah  secara  statistic  dengan  menggunakan analisis deskripsi dalam disajikan dalam bentu distribusi frekuensi dan nilai rerata.
Hasil: pada  penelitian  ini  diperoleh  bahwa  rerata  tangka  kemurnian  ARN  sampel  darah  menstruasi yang ditampung pada kertas saring pada Panjang gelombang A260 / A280 adalah 2,07, dan Panjang gelombang A260 / A230 adalah 2,1.
Kesimpulan: Isolasi ARN pada sampel darah menstruasi yang ditampung di kertas saring  memiliki tingkat kemurnian yang optimal.
Kata Kunci: Asam ribonukleat, isolasi ARN, menstuasi.

## ABSTRACT
Background: Nucleic acids contain genetic material and regulate the entire development of cellular life  forms.  Deoxyribonucleic  acid  (DNA)  and  ribonucleic  acid  (RNA)  are  the  most  common  nucleic acids. An isolation technique is needed to remove RNA from the nucleus. This study aims to determine the purity level of nucleic acid extracts from menstrual blood samples using modification nucleic acid isolation techniques.
Methods: Menstrual blood samples were collected on specially designed filter paper. The sample will be extracted using Zymo Research's Quick-ARN Miniprep Plus Kit R1058 to isolate RNA; The purity level was measured using a nanodrop device based on spectrophotometric principles. The data were statistically processed using descriptive analysis using frequency distribution and an average value.
Results: In this study, the average RNA purity of menstrual blood samples collected on filter paper at A260/A280 wavelength was 2.07, and A260/A230 wavelength was 2.1.
Conclusion:  The  RNA  isolation  in  menstrual  blood  samples  in  the  filter  paper  of  this  study  was optimal purity.
Keywords : Nucleic acids; RNA extraction; Menstrual.
Info artikel      Diterima: 19 Agustus 2022      Direvisi: 30 November 2022       Disetujui: 28 Desember 2022
( JPP) Jurnal Kesehatan Poltekkes Palembang Vol. 17, No. 2, Desember 2022, e ISSN 2654-3427 DOI: https://doi.org/ 10.36086/jpp.v17i2

## PENDAHULUAN
Menstruasi  adalah  perdarahan  vagina secara  berkala  akibat  terlepasnya  lapisan endometrium uterus. Fungsi menstruasi normal  merupakan  hasil  interaksi  antara hipotalamus,  hipofisis,  dan  ovarium  dengan perubahan-perubahan  terkait  pada  jaringan sasaran  pada  saluran  reproduksi  normal, ovarium  memainkan  peranan  penting  dalam proses  ini,  karena  tampaknya  bertanggung jawab dalam pengaturan perubahan-perubahan siklik maupun lama siklus menstruasi. (1)
Darah menstruasi merupakan cairan tubuh kompleks  yang  terdiri  atas  sel  endometrium, sel  imun  tubuh,  cairan  vagina,  dan  darah. Cetakan epigenetik dapat diperoleh dari tumor, biopsi, darah, dan komponen biologis lainnya. (2)  Sebelumnya,  Suatu  penelitian  telah menggunakan darah menstruasi sebagai sampel  untuk  menganalisis  keberadaan  jenis sel  T  pada  endometrium.  (3)  Pengeluaran darah menstruasi terdiri dari fragmen-fragmen kelupasan  endrometrium  yang  bercampur dengan  darah  yang  banyaknya  tidak  tentu. Biasanya  darahnya  cair.  Rata-rata  banyaknya darah  yang  hilang  selama  satu  periode menstruasi  sekitar  25-60ml.  Darah  menstruasi juga  digunakan  untuk  mengidentifikasi  dan mengevaluasi biomarker melalui teknik analisis  spektrometri  (4)  Selain  itu  terdapat banyak protein yang juga diekspresikan dalam peluruhan  sel  endometrium  selama  proses menstruasi. (5)
Protein  dalam  darah  menstruasi  memiliki potensi  untuk  menjadi  biomarker  noninvasif yang  selanjutnya  dapat  dimanfaatkan  untuk diagnosis  dini.  Namun  belum  diketahui bagaimana  sampel  darah  menstruasi  dapat menjadi  salah  metoda  diagnostik  berdasarkan aspek molekuler.
Sel  mamalia  mengandung  ARN  sebesar 10-5 µg, 80-85% dari total ARN adalah rARN dan sisanya 15-20% terdiri dari berbagai ARN dengan  berat  molekul  yang  rendah  sperti tARN  dan  snARN.  Isolasi  ARN  digunakan untuk memisahkan RNA dari zat lain sehingga menghasilkan  RNA  murni  dari  zat-zat  dan molekul  lainnya  seperti  DNA,  lipid,  protein, dan karbohidrat. (6)
Oleh  karena  itu  penelitian  ini  bertujuan untuk  menganalisis  tingkat  kemurnian  isolate RNA sampel darah menstruasi yang ditampung pada kertas saring.

## METODE
Subjek  penelitian  berjumlah  16  orang Wanita  dalam  keadaan  menstruasi  hari  kedua, darah  menstruasi  akan  ditampung  dengan terlebih dahulu membersihkan daerah ginetalia sampai  benar  bersih  dan  kering,  kemudia darah  menstruasi  subjek  penelitian  ditampung pada  pembalut  yang  sudah  di  desain  khusus, cara  pemakaiannya  sama  seperti  penggunaan pembalut pada umumnya. Pembalut dipasangkan pada celana dalam selama sekitar 30  menit,  setelah  darah  tertampung  dalam diameter  10  cm  maka  pembalut  dikeringkan sampai  benar-benar  kering,  lalu  ditempatkan pada kantong yang telah disediakan.
Isolasi  ARN  mengikuti  prosedur  yang telah  dipatenkan  oleh  Ocktariyana  dan Asmarinah dengan nomor registrasi:
500201910022.
Pengukuran  konsentrasi  dan  kemurnian ARN dilakukan dengan menggunakan NanoDrop.  Alat  nano  drop  yang  digunakan dikoneksikan pada perangkat koputer. Sebelum  meletakan  1  µl  sampel  ARN  pada NanoDrop, terlebih dahulu teteskan 1 µl ARN Elution  Buffer  sebagai  banko.  Prinsip  teknik spetrophotometri diterapkan dalam alat
NanoDrop.
Tingkat  kemurnian  asam  nukleat  dapat diestimasi melalui penentuan nisbah λ260 terhadap λ280.
ARN murni mempunyai nisbah λ260 / λ280 sekitar 2,0.
Analisis data pada penelitian ini dilakukan dengan membedakan data berdasarkan sebaran data  yang  diperoleh.  Jika  diperoleh  sebaran data  normal,  maka  untuk  menganalisis perbedaan  antara  tingkat  kemurnian  isolat asam  nukleat  antara  Subjek  dismenoreadan tanpa endometriosis, digunakan analisis statistik  uji  T-Independent.  Namun,  jika diperoleh  sebaran  data  tidak  normal,  maka untuk menganalisis perbedaanya digunakan uji Mann-Whitney.

## HASIL
Pada penelitian ini diperoleh hasil kemurnian  asam  ARN  dari  16  sampel  darah menstruasi.  Penelitian  dilakukan  isolasi  ARN dari  sampel  darah  menstruasi  menggunakan Teknik lisis bertingkat dan beberapa modifikasi  pada  volume  buffer  dan  prinsip sentrifugasi.  Sampel  yang  telah  diisolasi
( JPP) Jurnal Kesehatan Poltekkes Palembang Vol. 17, No. 2, Desember 2022, e ISSN 2654-3427 DOI: https://doi.org/ 10.36086/jpp.v17i2
memiliki  konsentrasi  dan  tingkat  kemurnian
yang bervariasi sebagaimana tabel berikut ini:
Berdasarkan  diatas  diketahui  bahwa  nilai rerata kemurnian ARN pada Panjang gelombang  260/280  sebesar  2,07  dan  pada Panjang  gelombang  260/230  sebesar  2,10. Selain  itu  tingkat  konsentrasi  yang  diperoleh pada  sampel  darah  menstruasi  terkecil  adalah 57,9 ng/µl dan yang terbesar 186,6 ng/µl.

## PEMBAHASAN
Penelitian-penelitian sebelumnya yang menjelaskan  bahwa  darah  menstruasi  dapat dianalisis dalam melekuler. Harapannya dalam darah  menstruasi  mengandung  endometrium. Suatu  penyakit  yang  berhubungan  dengan gangguan endometrium adalah penyakit endometriosis.(7),(8),(9),(10)
Patogenesis utama  dari  diagnosis  kasus  endometriosis adalah  ditemukannya  serabut  saraf  pada lapisan fungsional endometrium melalui laparoskopi  dan  biopsi,  dimana  serabut  saraf tersebut  tidak  ditemukan  pada  wanita  tanpa endometriosis. Selain itu, wanita endometriosis
cenderung mengalami
peningkatan  kepadatan  serabut  saraf  pada lapisan  basal  endometrium,  miometrium,  dan peritoneum. (11),(12),(13)
Diketahuinya patogenesis  endometriosis  melalui  mekanisme epigenetik metilasi DNA, memudahkan
penentuan diagnosis dini dan prediksi pengobatan jangka panjang. Mekanisme metilasi DNA juga diharapkan dapat membantu pengembangan biomarker epigenetik.  Sebab,  sejauh  ini,  prosedur diagnosis secara non-invasif seperti biomarker serum  belum  dapat  ditemukan,  sehingga diagnosis  dari  kasus  endometriosis  hanya dapat  dilakukan  dengan  visualisasi  langsung melalui  laparoskopi  dan  biopsi.(14)  Bagi wanita yang  belum  menikah, prosedur diagnosis tersebut tentunya tidak
memungkinkan  untuk  diterapkan,  sehingga menampung darah menstruasi yang mengandung  endometrium  dianggap  rasional untuk.mendapatkan materi genetic ARN sebagai identifikasi beberapa biomarker penyebab penyakit endometriosis.
Pada  penelitian  ini  hasil  kemurnian  isolate ARN  darah  mentruasi  memiliki  tingkat
Sampel Konsentrasi Kemurnian ARN (ng/µl) 260/280 260/230 1 65,7 2,08 2,00 2 173,4 2,03 2,07 3 138,5 2,2 2,11 4 59,9 2,00 2,15 5 57,9 2,27 2,06 6 86,5 2,00 2,15 7 166,3 2,02 2,04 8 63,8 2,04 2,11 9 62,8 2,01 2,13 10 112,3 2,01 2,18 11 178,9 2,14 2,06 12 86,5 2,00 2,01 13 150,6 2,1 2,13 14 186,6 2,09 2,23 15 100,6 2,10 2,11 16 186,6 2,09 2,00 Rerata 2,07 2,10
( JPP) Jurnal Kesehatan Poltekkes Palembang Vol. 17, No. 2, Desember 2022, e ISSN 2654-3427 DOI: https://doi.org/ 10.36086/jpp.v17i2
kemurnian yang optimal. Keberhasilan Teknik isolasi asam nukleat ini sangat ditentukan oleh beberapa  hal  antara  lain  isolasi  sel,  lisis dinding membran, ekstraksi larutan, purifikasi, dan presipitasi.(15) Selain itu prinsip sentrifugasi juga menentukan tingkat kemurnian isolasi ARN pada penelitian ini. Nilai  rasio  λ260/λ230  dapat  digunakan untuk  membantu  mengevaluasi  keberadaan senyawa  garam,  protein,  guanidin  HCL, EDTA,  lipid,  dan  fenol.  Semakin  rendah nilainya,  semakin  tinggi  jumlah  kontaminan (16)  Namun,  nilai  konsentrasi  tinggi  belum tentu  nilai  kemurniaannya  tinggi.  Jika  nilai λ260 yang merupakan nilai untuk ARN tinggi maka  nilai  konsentrasi  akan  tinggi.  Nilai kontaminan untuk kemurnian ARN dipengaruhi  oleh  nilai  λ280  sehingga meskipun  nilai  konsentrasi  ARN  tinggi  bukan berarti nilai kemurnian akan tinggi juga.(17) ARN  memiliki  struktur  beruntai  tunggal yang tersusun atas monomer-monomer nukleotida dengan gula ribose. ARN merupakan
polimer yang disebut
polinukleotida. Setiap nukleotida tersusun atas tiga  bagian,  yaitu  basa  nitrogen,  gula  pentose, dan  gugus  asam  fosfat.  Basa  nitrogen  pada ARN  terdiri  dari  atas  adenin  (A)  dan  guanin (G)  yang  memiliki  struktur  cincin-ganda, sedangkan  basa  pirimidin  terdiri  atas  sitosin (C) dan Urasil (U). Urutan basa nitrogen dapat tersebut  dapat  mengkode  informasi  genetik.
(18)

## KESIMPULAN DAN SARAN
Isolasi ARN pada sampel darah menstruasi yang ditampung di kertas saring dengan teknik lisis  bertingkat  memiliki  tingkat  kemurnian yang optimal.
Saran  dalam  penelitian  ini  adalah  perlu dilakukan  pemeriksaan  dengan  jumlah  sampel yang lebih banyak.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Saya  mengucapkan  terima  kasih  kepada Direktur  Poltekkes  Kemenkes  Palembang  dan jajarannya,
Ketua Jurusan
Kebidanan Poltekkes  Kemenkes  Palembang  dan  tim peneliti.

## DAFTAR PUSTAKA
1.   Sukarmi, Margareta. Kehamilan, Persalinan, dan Nifas. Yogyakarta: Nuha Medika; 2013.
2.   Moylan C, Murphy S. DNA methylation: basic principles. In: Tollefsbol T, editor. Medical epigenetics. London: Academic Press Elsevier; 2016. p. 11–31.
3.   Al-Sabbagh M1, Lam EW BJ.
Mechanisms of endometrial progesterone resistance. Mol Cell Endocrinol
[Internet]. 2012;352(2):208–15. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22 085558
4.   Hawthorn A, Kleidon T, Larsen E, Marsh N, Marshall A, Ray-Barruel G, et al. Peripheral Intravenous Catheter
Protection : Br J Nurs [Internet]. 2018 [cited 2020 Apr 9];30(February):28. Available from: https://www.health.qld.gov.au/__data/ass ets/pdf_file/0025/444490/icare-pivc- guideline.pdf 5.   Yang H, Zhou Y, Edelshain B, Schatz F,
Lockwood CJ, Taylor HS. FKBP4 is regulated by HOXA10 during decidualization and in endometriosis. Reproduction. 2012;
6.   Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning Vol1, 2 , 3. New York, USA: Springs Harbor Lab Press: Long Island; 2001.
7.   Zahrah A, Muharam R, Luky Satria Marwali M, Ocktariyana, Deraya IE, Asmarinah. MRNA expression and DNA methylation level of the MMP-2 gene in peritoneal endometriosis. J Pak Med
Assoc. 2021;71(2):S112–5.
8.   Zahrah A, Muharam R, Marwali MLS, Sururi A, Harzif AK, Pratama G, et al. Analysis of DNA methylation and its correlation with mRNA expression of epidermal growth factor receptor encoding for cytoskeleton regulating protein in peritoneal endometriosis tissue. IOP Conf Ser Earth Environ Sci. 2020;457(1).
9.   Ocktariyana, Hikmawati N, Hestiantoro A, Muharam R, Luky Marwali M, Surur A, et al. Analysis of DNA methylation level and mRNA expression of Transient
Receptor Ankyrin Member 1 (TRPA1) in
( JPP) Jurnal Kesehatan Poltekkes Palembang Vol. 17, No. 2, Desember 2022, e ISSN 2654-3427 DOI: https://doi.org/ 10.36086/jpp.v17i2
endometriosis-associated pain. AsPac J Mol Biol Biotechnol. 2021;29(3):1–10.
10.   Deraya IE, Hestiantoro A, Muharam R, Marwali ML, As’adi AS, Darmawi, et al. Analysis of mrna expression and dna
methylation level of rac1 gene encoding focal adhesion molecule in endometrial and peritoneal endometriosis. Asia- Pacific J Mol Biol Biotechnol. 2020;28(2):43–9. 11.   Ocktariyana, Hestiantoro A, Rahmala R,
Asmarinah. DNA methylation of P2X3 receptor gene encoded pain marker protein in endometriosis. J Phys Conf Ser.
2019;1246(1).
12.   Al-Jefout M, Dezarnaulds G, Cooper M, Tokushige N, Luscombe GM, Markham R, et al. Diagnosis of endometriosis by detection of nerve fibres in an endometrial biopsy: A double blind study.
Hum Reprod. 2009;24(12):3019–24.
13.   Ocktariyana. Nyeri pada endometriosis dalam perspektif molekuler. 1st ed.
Kediri, Indonesia: Chakra Brahmanda Lentera; 2020. 1–64 p.
14.   Guo S-W. The Epigenetics of Endometriosis. In: Epigenetics in Human
Disease [Internet]. Elsevier; 2012. p. 443– 69. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pi i/B9780123884152000226 15.   Dale J., Schantz MV. From genes to genomes. Canada: John Wiley & Sons, Ltd; 2002. xi + 360.
16.   JT M, EN O. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 2012;148(6):1172–87.
17.   Lucena-Aguilar G, Sánchez-López AM, Barberán-Aceituno C, Carrillo-Ávila JA,
López-Guerrero JA, Aguilar-Quesada R. DNA Source Selection for Downstream Applications Based on DNA Quality Indicators Analysis. Biopreserv Biobank [Internet]. 2016 Aug 1 [cited 2022 Oct 10];14(4):264–70. Available from: https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/ bio.2015.0064 18.   Chambell NA. Biologi Jilid 2. Jakarta: Erlangga. 2002;