Pemurnian Parsial dan Kritalisasi Papain dari Getah Carica papaya
Dwi Putri Mashfufatur Rohmah, Sofijan Hadi, Afaf Baktir *
Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga *email: afaf-b@fst.unair.ac.id
Received 29 November 2019 Accepted 31 December 2019

## Abstract
This research has done partial purification by fractionation and optimization crystallization of  papain  from  Carica  papaya  latex  with  the  addition  of  ammonium  sulphate.  The enhancement of purification factor was determined by its specific activity. The fractionation results  show  that  papain  fraction  of  Carica  papaya  can  be  obtained  by  adding  40-80% saturated ammonium sulphate, with the highest specific activity, i.e. 2,0819 U/µg and the factor purification increase of 6,27 fold than papain extract. Meanwhile, the highest total activity, i.e. 10,7780 U of papain crystals can be obtained by presipitant agent addition of ammonium sulphate in the level / concentration 80% saturated at 15 °C. Microscopycally papain crystals profile in this condition have cube and tetragonal shape.
Keywords : Crystallization, fractionation, ammonium sulphate, papain

## Pendahuluan
Dewasa ini, enzim memiliki peran besar  dalam  pengaplikasiannya  di  bidang agrikultural  maupun  bidang  industri. Enzim digunakan sebagai  alternatif untuk menggantikan  berbagai  proses  kimia dalam bidang industri. Hal ini dikarenakan sifatnya yang efisien, selektif, predictable , dan  ramah  lingkungan.  Bahkan  dalam beberapa  aplikasinya,  enzim  dinyatakan lebih ekonomis dibandingkan katalis kimia karena  dapat  digunakan  secara  berulang selama  aktivitasnya  masih  ada  (Sutandi, 2003;  Zusfahair  dkk.,  2014).  Salah  satu enzim  yang  mendominasi  pasar  dunia sebesar  60%  adalah  protease.  Enzim  ini biasanya  ditemukan  dalam  buah-buahan tropis  maupun  subtropis,  seperti  papaya, kiwi,  dan  nanas  (Malek  dkk.,  2016; Zusfahair dkk., 2014).
Indonesia  merupakan  salah  satu negara  beriklim  tropis  dengan  sebaran pertumbuhan  papaya  hampir  di  seluruh wilayah.  Produksi  papaya  di  Indonesia mencapai  840,112  ton  menurut  pantauan terakhir  oleh  Kementerian  Pertanian
Indonesia  pada  tahun  2014.  Hal  tersebut menunjukkan  adanya  potensi  yang  besar untuk produksi enzim protease di Indonesia  dengan  sumber  daya  yang mendukung.
Protease  dibedakan  sesuai  jenis gugus  fungsi  pada  sisi  aktifnya,  salah satunya  yaitu  gugus  tiol-sistein.  Protease dengan  jenis  gugus  fungsi  tersebut termasuk protease sistein. Protease sistein ini juga dikenal sebagai protease tiol yang memiliki  peran  utama  (primer)  dalam degradasi dan pemecahan  protein. pepaya (Latin: Carica  papaya )  telah  diketahui menjadi sumber utama protease sistein dari penelitian yang dilakukan oleh Malek dkk. (2016).
Getah  pada  daging  buah  papaya muda, daun, dan kulitnya kaya akan enzim yang dikenal sebagai papain. Getah Carica papaya terdiri dari campuran endopeptidase  sistein  seperti  papain, endopeptidase  III  papaya,  endopeptidase IV papaya, caricain, kemopapain A dan B, serta proteinase IV papaya yang menyusun lebih  dari  80%  fraksi  enzim  yang
dipertimbangkan  menjadi  bahan  komersil dengan nilai tertinggi, mengingat kegunaannya  dalam  berbagai  aplikasi  di industri.  Di  antara  enzim  tersebut,  papain menjadi  sumber  utama  data  empiris  dari super-famili  protease  sistein  dengan karakterisasi  paling  luas  terkait  data kinetiknya  dan  struktur  enzimnya  (Malek dkk., 2016).
Papain merupakan protein globular  dengan  rantai  tunggal  dan  3 jembatan  disulfida  serta  gugus  sulfhidril pada  sisi  aktifnya  (Patel,  2016).  Papain memiliki  berat  molekul  23.406  Da  dan terdiri  dari  212  asam  amino  (Gunde  dan Amnerkar,  2016).  Sifat  yang  sangat menarik  dari  papain  adalah  kestabilannya ketika  terpapar  suhu  yang  tinggi,  pelarut organik,  dan  reagen-reagen  yang  dapat menyebabkan  denaturasi  pada  enzim  lain (Llerena-Suster dkk., 2012).
Pemurnian  papain  telah  berhasil dicapai  secara  konvensional  dengan metode  presipitasi.  Presipitasi  dapat dilakukan dengan salting out menggunakan  garam  ammonium  sulfat. Salting  out merupakan  penggaraman protein  sehingga  terjadi  agregasi  karena efek hidrofobik yang kuat dan terstabilkan. Molekul  air  disekitar  residu  hidrofobik protein  akan  dipindahkan  ke  permukaan, sehingga  residu-residu  hidrofobik  dapat berinteraksi  satu  sama  lain  membentuk agregat (Scopes, 2013).
Enzim  dalam  bentuk  kristal memiliki  ketahanan  yang  jauh  lebih  baik terhadap  pengaruh  lingkungan  (suhu,  pH, pengaruh oksidasi, dan lain-lain) sehingga perlakuan dan penyimpanannya akan lebih mudah serta bertahan lebih lama.
Kristalisasi setiap molekul maupun campuran  senyawa  kimia,  termasuk protein terdiri dari dua tahap yang berbeda namun  tidak  dapat  dipisahkan,  yaitu nukleasi  dan  pertumbuhan.  Nukleasi merupakan proses pembentukan inti kristal dimana  keadaan  molekul  yang  semula tidak  teratur  menjadi  tertata.  Adapun, pertumbuhan kristal terjadi setelah nukleasi  dengan  pembentukan  agregat-
agregat tertata menjadi molekul yang lebih besar (McPherson dan Gavira, 2014).
Nukleasi dan pertumbuhan kristal  sangat  tergantung  dengan  keadaan supersaturasi larutan induk ( mother liquor )
pembentuk kristal.
Supersaturasi
merupakan  keadaan tidak  seimbang dimana beberapa jumlah molekul/ protein melebihi  batas  kelarutan,  namun  masih dalam  fasa  cair.  Keseimbangan  dapat dicapai kembali dengan pembentukan dan pertumbuhan  fasa  solid  (padat)  sebagai kristal,  karena  batas  kejenuhan  tercapai (McPherson dan Gavira, 2014).
Metode pemurnian dan kristalisasi protein pada umumnya dilakukan secara bertahap (tidak sinambung). Adapun kristal yang dihasilkan  memiliki  tingkat  kemurnian yang tinggi serta didapatkan dalam jumlah sangat  kecil.  Sedangkan,  enzim  yang dibutuhkan  industri  adalah  kristal  dalam jumlah  besar  dengan  tingkat  kemurnian parsial.
Suatu metode
kristalisasi dikembangkan untuk meningkatkan kemurnian  dan  kestabilan  suatu  enzim.
Crystallizer Sinambung  didesain  khusus untuk  kristalisasi  dan  pemurnian  parsial protein  enzim  dan  protein  lain  secara sinambung  dengan  sistem  filtrasi.  Proses kristalisasi sinambung menggunakan Crystallizer Sinambung ini dapat diaplikasikan untuk pemurnian parsial dan kristalisasi sediaan enzim atau protein lain, dengan  penambahan  ammonium  sulfat atau agen presipitan lain yang sesuai dalam kadar  hasil  percobaan  optimasi  (Paten, unpublished ).

## Metode Penelitian

## Alat dan bahan
Getah Carica  papaya dari  buah papaya muda (berumur 2,5–3 bulan) yang tumbuh  di  wilayah  Mulyorejo,  Surabaya, yang  dilarutkan  dalam  akuades  dingin dengan rasio 1:1 dan diaduk selama 1 jam. Larutan  getah  ini  disentrifuga  selama  20 menit  dengan  kecepatan  9.000  rpm  dan
suhu  4°C  sehingga  didapat  supernatan yang  merupakan  ekstrak  papain  (Malle dkk., 2015; Malek dkk., 2016).

## Fraksinasi ammonium sulfat
Ekstrak papain ditambahkan ammonium  sulfat  secara  bertahap  sesuai dengan  tingkat  kejenuhan  dan  diikuti dengan inkubasi dalam es selama minimal 2  jam,  kemudian  disentrifuga  dengan kecepatan  10.000  rpm  pada  suhu  4  °C selama  15  menit.  Presipitat  yang  didapat dari setiap sentrifugasi tersebut dilarutkan kembali  dalam  buffer  yang  mengandung 0,2  M  fosfat,  pH  6  hingga  tepat  larut. Langkah-langkah tersebut dilakukan untuk ammonium  sulfat  dengan  kejenuhan  40% dan 40- 80%. Adapun presipitat yang telah dilarutkan tersebut didialisis dengan buffer fosfat  0,05  M  pH  6  sehingga  dapat dilakukan  uji  selanjutnya  (Purwanto, 2016).

## Penentuan kadar protein
Kadar  protein  dalam  sampel selama pemurnian
ditentukan menggunakan  metode  Bradford  dengan kurva  standar  larutan  BSA  1  mg/mL (Purwanto, 2016). Sampel enzim sebanyak 20  µL  ditambahkan  akuades  hingga  600 µL  dan    larutan  Bradford  500µL,  lalu didiamkan  selama  5  menit,    pada  suhu ruang.  Absorbansi  sampel  diukur  pada panjang  gelombang  595  nm  (Rosenberg, 2005).

## Penentuan aktivitas protease
Penentuan aktivitas protease dilakukan  menggunakan  kurva  standar dari  larutan  induk  tirosin  100  µg/  mL dalam HCl 0,2 N. Suatu campuran reaksi uji terdiri dari substrat kasein 1% sebanyak 400 µL dan ektrak enzim sebanyak 20 µL, lalu ditambahkan buffer fosfat 0,05 M  pH 6  hingga  volume  900  µL.  Campuran tersebut  diinkubasi  pada  suhu  65  °C selama 5 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 3 mL TCA 5%. Campuran
disentrifuga  dan  diukur  absorbansinya pada  panjang  gelombang  275  nm. Pengukuran  ini  juga  dilakukan  terhadap blanko  tanpa  adanya  ekstrak  enzim. Aktivitas  protease  diukur  berdasarkan kadar  tirosin  yang  terbaca  (Purwanto, 2016).

## Optimasi kristalisasi fraksi papain
Fraksi  dengan  aktivitas  spesifik terbaik, dikristalisasi dengan penambahan ammonium sulfat. Kadar ammonium sulfat untuk  kristalisasi  dioptimasi  berdasarkan data  kadar  ammonium  sulfat  pada  saat fraksinasi  papain,  yaitu  dengan  tingkat kejenuhan  20%,  30%,  40%,  50%,  55%, 60%,  70%,  dan  80%.  Kristalisasi  ini dilakukan  dengan  inkubasi  pada  suhu  5, 15, 25, dan 30 °C hingga terbentuk kristal papain  secara  perlahan.  Kristal  papain yang terbentuk dipisahkan dengan supernatannya,  kemudian  diamati  secara makroskopis  dan  mikroskopis  serta  diuji aktivitas proteasenya.

## SDS-PAGE
SDS-PAGE  pada  penelitian  ini  bertujuan untuk  membandingkan  papain  sebelum dan  sesudah  dimurnikan  secara  parsial melalui  pita  papain  pada  gel.  Pita  papain ditentukan  berat  molekulnya  berdasarkan pembanding marker. SDS-PAGE dilakukan  menggunakan akrilamida 12% (Purwanto,  2016).  Sampel  disiapkan dalam loading  buffer tris/  gliserol/  β- merkaptoetanol, kemudian diletakkan dalam  air  mendidih  selama  10  menit  dan dielektroforesis  dengan  100  V  selama  60 menit.  Pewarnaan  gel  menggunakan Coomasie-Blue R-250.

## Hasil dan Pembahasan

## Preparasi  ekstrak  papain  dari  getah

## Carica papaya
Getah Carica  papaya diperoleh dari  penyayatan  kulit  buah  papaya  muda yang  berumur  2,5-3  bulan.  Menurut penelitian  Malek  dkk.  (2016),  semakin hijau (muda) buah papaya, akan diperoleh papain  yang  semakin  banyak  karena jumlah  pati  dan  gula  pada  buah    masih rendah    pada  11  minggu  (2,5-3bulan) pertama. Penyayatan dilakukan pada pagi hari untuk menghindari reaksi fotosintesis dan  polusi  udara  yang  mungkin  terjadi. Empat buah pepaya muda dari pohon yang sama menghasilkan getah sebanyak 25,6916  g.  Getah  dikumpulkan  dalam sebuah  wadah  plastik  bertutup  dan disimpan dalam freezer sampai digunakan untuk  menghindari  reaksi  yang  dapat menurunkan aktivitas enzim.
Papain merupakan protein globular  sehingga  dapat  dilarutkan  dalam air  dengan  mudah.  Digunakan  akuades dingin  sebagai  pelarut  untuk  menjaga kualitas  papain  selama  proses  ekstraksi. Larutan  getah  ini  disentrifuga  selama  20 menit dengan kecepatan 9.000 rpm dengan suhu 4 °C. Presipitat merupakan komponen yang tidak digunakan, sedangkan  supernatan  merupakan  ekstrak papain. Diperoleh ekstrak papain sebanyak 31 mL.

## Fraksinasi  papain  dari  getah Carica papaya
Fraksinasi  bertujuan  memisahkan sebagian  besar  senyawa  pengotor,  baik protein maupun bukan protein dari protein target. Fraksi papain diperoleh dari ekstrak papain sebanyak 31 mL dengan penambahan  ammonium  sulfat  secara bertahap  dengan  tingkat  kejenuhan  40% dan 40-80%.
Berdasarkan  hasil  uji  aktivitas spesifik protease sebagaimana pada Tabel 3.1,  dapat  disimpulkan  bahwa  aktivitas
spesifik  paling tinggi  terdapat  pada fraksi papain  40-80%  dengan  faktor  kemurnian meningkat 6,86 kali dari ekstrak papain.
Fraksi 0-40% menunjukkan aktivitas  protease  yang  jauh  lebih  rendah dibanding fraksi 40-80%. Namun aktivitas spesifik  fraksi  0-40%  sangat  rendah.  Hal ini  menunjukkan  pada  fraksi  0-40% mengandung  banyak  protein  pengotor. Adapun aktivitas spesifik pada supernatan hampir  mendekati  nol.  Sehingga,  dapat ditarik kesimpulan bahwa papain terdapat pada fraksi 40-80%.

## Optimasi Kristalisasi Fraksi Papain
Pengamatan  secara  makroskopis dilakukan melalui pengamatan pembentukan  presipitat  pada  masing- masing  tabung.  Data  hasil  pengamatan disajikan pada Tabel 3.2.
Pengamatan  secara  mikroskopis pada  keseluruhan  tabung  yang  memiliki presipitat  menunjukkan  kristal  kubus  dan tetragonal.  Selain  dilakukan  terhadap sampel, pengamatan ini dilakukan terhadap blanko yang mengandung ammonium  sulfat  sebagai  perbandingan bentuk kristal. Adapun kristal ammonium sulfat pada  kondisi kristalisasi ini cenderung berbentuk bulat (Gambar 3.1).
Aktivitas protease masing- masing  kristal  yang  diperoleh  dengan menggunakan presipitan ammonium sulfat 55-70%  cukup  rendah,  dan  aktivitas protease  yang  tertinggal  di  supernatan cukup tinggi. Hal ini berhubungan dengan ketidaksempurnaan kristalisasi yang menggunakan presipitan ammonium sulfat 55-70%.  Adapun  presipitan  ammonium sulfat 80% pada suhu 15 °C menghasilkan kristal  dengan  aktivitas  protease  paling tinggi.  Presipitan    ammonium  sulfat  80% pada  suhu  30  °C    menghasilkan  kristal maupun  supernatan  dengan  aktivitas protease  lebih  rendah,  diduga  berkaitan dengan  kestabilan  enzim  terhadap  suhu (Tabel 3.3).

## SDS-PAGE
Sampel yang diuji menggunakan SDS-PAGE meliputi ekstrak papain, fraksi papain  (fraksi  40-80%)  dengan  berbagai pengenceran  dan  volume,  serta  kristal papain  yang  dihasilkan  dari  presipitan ammonium  sulfat  80%  pada  suhu  15  °C. Adapun  gel  yang  digunakan  dalam  SDS- PAGE  ini  adalah  12%  akrilamida,  yang dapat  memisahkan  protein  dengan  berat molekul ~15 kDa hingga ~120 kDa.
SDS-PAGE  pada  percobaan  ini menunjukkan  adanya  pemurnian  ekstrak papain secara parsial
melalui berkuranganya pita-pita yang tampak pada gel  dari  Gambar  3.2  (b)  menjadi  Gambar 3.2  (c).  Adapun  pita  pada  kristal  papain (Gambar 3.2 (a)) tampak tebal dibandingkan  dengan  pita  fraksi  papain (fraksi  40-80%).  Hal  ini  dikarenakan kristal  papain  yang  lebih  pekat  serta volume yang dimasukkan ke dalam sumur gel  lebih  banyak  dari  pada  fraksi  papain (fraksi 40-80%).
Gambar 3.2 (a) Kristal Papain (b) Ekstrak Papain (c) Fraksi Papain dengan berbagai Pengenceran  dan  Volume  (d)  Marker Protein
Pita  papain  ditentukan  berat molekulnya berdasarkan pembanding marker  dan  perhitungan  R f melalui  kurva standart. R f merupakan perbandingan jarak migrasi pita dengan jarak migrasi loading buffer .  Berdasarkan  penentuan  berat molekulnya, diketahui bahwa sampel yang digunakan  pada  penelitian  ini  memiliki kandungan  papain  dengan  berat  molekul ~23 kDa.
Tabel 3.1 Data Hasil Fraksinasi Papain dari Getah Carica papaya Sampel Aktivitas Protease (U/mL) Volume (mL) Aktivitas Total (U) Kadar Protein Total (µg) Aktivitas Spesifik (U/µg) Faktor Ke- murnian Ekstrak papain 237,1351 31 7.351,1881 22.151,9321 0,3318 1,00 Fraksi 0-40% 2,7123 1,2 3,2547 5,9375 0,5482 1,65 Fraksi 40-80%  382,7962 31,9 12.246,4175 5.882,3690 2,0819 6,27 Supernatan 0,0584 113,1 6,5983 139,0788 0,0475 0,14
Tabel 3.2 Hasil Pengamatan Makroskopis Pembentukan Presipitat Fraksi Papain
Kondisi Hasil Pengamatan pada Hari ke-
Suhu (°C) Ammonium Sulfat (%) 1-3 4-6 5-8 9-12 13-15 16-18 5 20 - - - - - - 30 - - - - - - 40 - - - - - - 50 - - - - - - 55 - - ++ ++ ++ ++ 60 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 70 +++++  +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ 15 20
- - - - - - 30 - - - - - - 40 - - - - - - 50 - - - - +++ - 55 - - ++++ ++++ ++++ ++++ 60 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 70 +++++  +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ 80 +++++  +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ 25 20
- - - - - - 30 - - - - - - 40 - - - - - - 50 - - - - - - Kondisi Hasil Pengamatan pada Hari ke- Suhu (°C) Ammonium Sulfat (%) 1-3 4-6 5-8 9-12 13-15 16-18 25 55 - - - - - - 60 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 70 +++++  +++++ +++++ +++++ +++++ +++++
30 80 +++++  +++++ +++++ +++++ +++++ +++++
Keterangan:  +  : terbentuk larutan koloidal atau suspense atau presipitat
- : larutan bening (a) (b) (c) (d)
Gambar 4.2  (a) Kristal Papain Perbesaran 400x (b) Kristal Papain Perbesaran 1.000x (c) Kristal Ammonium Sulfat Perbesaran 400x (d) Kristal
Ammonium Sulfat Perbesaran 1.000x Tabel 3.3 Hasil Optimasi Kristalisasi Fraksi Papain Kondisi Sampel Aktivitas Protease (U/mL) Volume** (mL) Aktivitas Total (U)
Suhu
(°C)
Ammonium Sulfat (%) 5 55
Kristal 3,3988 0,13 0,4418 Supernatan 4,3132 0,32 1,3802 60 Kristal 2,1412 0,20 0,4282 Supernatan 3,2074 0,85 2,7263 70 Kristal 4,3429 0,30 1,3802 Supernatan 4,5145 0,80 3,6116 15 55 Kristal 4,7060 0,27 1,2706
Supernatan 3,8379 0,30 1,1514 60 Kristal 4,2868 0,20 0,8574 Supernatan -* -* -* 70 Kristal 4,1680 0,23 0,9586 Supernatan -* -* -* 80 Kristal 71,8535 0,15 10,7780 Supernatan 0,5139 0,12 0,0642 25 60 Kristal -* -* -* Supernatan 4,5079 0,13 0,5860 70 Kristal 2,8047 0,30 0,8414 Supernatan -* -* -* 30 80 Kristal 51,0580 0,15 7,6587 Supernatan 0,0518 0,12 0,0064
*Beberapa data tidak didapatkan karena keterbatasan sampel
** Volume larutan enzim hasil pelarutan kristal

## Kesimpulan
Dari  penelitian  ini,  dapat  ditarik kesimpulan  bahwa  fraksi  papain  pada proses  fraksinasi  getah Carica  papaya adalah  fraksi  40-80%  ammonium  sulfat dengan peningkatan faktor kemurnian 6,27 kali  lebih  besar  daripada  ekstrak  papain. Selain  itu,  kristalisasi  papain  dapat dihasilkan secara optimum dengan penambahan  presipitan  ammonium  sulfat 80%  jenuh  pada  suhu  15  °C.  Adapun kristal  papain  dari  fraksi  40-80%  yang diperoleh berbentuk kubus dan tetragonal.
Metode fraksinasi untuk mendapatkan kristal papain dengan tingkat kemurnian  parsial  dari  getah Carica papaya dapat diaplikasikan dalam Crystallizer Sinambung  dengan  kadar ammonium  sulfat  sesuai  hasil  percobaan optimasi  pada  penelitian  ini.  Selanjutnya, penelitian  ini  dapat    dikembangkan  dan diterapkan  untuk  enzim-enzim  lain  yang potensial  sebagai  alternatif  pemenuhan kebutuhan enzim di Indonesia.

## Daftar Pustaka
Baktir, A., 2018, Prototipe dan Penggunaan  Kristaliser  Protein untuk  Kristalisasi  dan  Pemurnian Parsial  Protein/  Enzim  secara Sinambung ,  Paten,  Unpublished, Indonesia Gunde, M.C., dan Amnerkar, N.D., 2016, Nutritional, Medicinal and
Pharmacological Properties of Papaya  ( Carica  papaya linn.):  A Review, JIPBS , 3 , 162-169
Kementerian  Pertanian,  2015, Statistik
Produksi Hortikultura Tahun
2014 , Direktorat Jenderal Hortikultura, Kementerian Pertanian, Indonesia
Llerena-Suster,  C.R.,  Jose,  C.,  Collins, S.E.,  Briand,  L.E.,  dan  Morcelle,
S.R.,  2012,  Investigation  of  the
Structure  and  Proteolytic  Activity of Papain Miscible Organic Media,
Process Biochemistry , 47 , 47-56
Malek,  K.,  Norazan,  M.,  Ramaness,  P., Othman, N.Z., Malek, R., Aziz, R., Aladdin,  dan  A.,  El-Enshasy,  H., 2016,  Cysteine  Protease  from Carica  papaya :  An  important enzyme  group  of  many  industrial applications, IOSR-JPBS , 11 ,  11-
16
McPherson,  A.,  dan  Gavira,  J.  A.,  2014, Introduction to Protein Crystallization, Acta  Cryst. , F70 , 2-20Sutandi,  C.,  2003, Analisis
Potensi  Enzim  Protease  Lokal ,
Skripsi, IPB, Indonesia
Patel,  T.,  2016,  Papain  Enzyme:  A Digestive  Aid, Int.  J.  Clin.  and
Biomed.  Res ., 2 ,  52-53Zusfahair, Ningsih, D.R., dan Habibah, F.N.,
2014,  Karakterisasi  Papain  dari
Daun  Pepaya  ( Carica  papaya l.), Molekul , 9 , 44-55
Purwanto,  M.G.M.,  2016,  The  Role  and Efficiency of Ammonium Sulphate Precipitation  in  Purification  of Papain  Ekstrak  papain  Extract, Procedia Chemistry , 18 , 127-131
Scopes, R. K., 2013, Protein Purification: Principles and Practice , 2 nd Edition, Springer Science &
Business Media, USA
Sutandi, C., 2003, Analisis Potensi Enzim Protease  Lokal ,  Skripsi,  IPB,
Indonesia
Zusfahair,  Ningsih,  D.R.,  dan  Habibah,
F.N.,  2014,  Karakterisasi  Papain
dari Daun Pepaya ( Carica papaya l.), Molekul , 9 , 44-55