ISSN: 1410-8917 e-ISSN: 2597-9914
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 22 (2) (2019): 58 – 66

## Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Review: Potensi mikrobial selulase, xilanase, dan protease dalam fermentasi kopi luwak ( Paradoxurus hermaphroditus ) secara in vitro
Warsono El Kiyat a,1 , Dessy Mentari b,2 , Natalia Santoso b,3
a Department of Food Technology, Faculty of Engineering, Bina Nusantara University, Jakarta, Indonesia
b Department of Nutrition & Food Technology, Faculty of Life Sciences, Surya University, Banten 15117, Indonesia
Author email: 1 warsono.el.kiyat@gmail.com; 2 desdessymentari@gmail.com ; 3 natalia.santoso14@student.surya.ac.id https://doi.org/10.14710/jksa.22.2.58-66
A r t i c l e   I n fo

## A b s t r a c t
Article history: Received: 6 December 2018 Revised: 21 March 2019 Accepted: 22 March 2019 Online: 31 March 2019
Keywords: cellulase; civet coffee; in vitro fermentation; protease; xylanase Title: Review: Potential of Microbial cellulase, xylanase, and protease on in vitro fermentation of civet ( Paradoxurus hermaphroditus ) coffee
Civet coffee is a highly priced coffee with distinctive aromas and flavours that produced from partially fermented coffee beans in the digestive system of the civet ( Paradoxurus hermaprodithus ). The high demand of this coffee and its unique natural production have implications for the animal welfare and controversy of halal status of the product. In vitro fermentation using cellulase, xylanase, and protease that isolated from civet faeces seems to be an alternative process s to resolved  animal-abuse  issue,  halal  status  of  the  product  as  well  as  to  ensure sustainability of civet coffee production. This paper was aimed to summarize and synthesize the roles of these three enzymes (cellulase, xylanase, and protease) in in  vitro fermentation  of  civet coffee  and  their  effects on  chemical  and  sensory characteristics based on the most recent research studies. Results showed that in vitro fermentation using cellulase, xylanase and protease of coffee beans resulted in  similar  chemical  and  sensory  characteristics  as  those  produced  through natural process that involved civet animals.

## A b s t r a k
Kata Kunci: fermentasi in vitro ; kopi luwak; protease; selulase; xilanase Kopi  luwak  adalah  kopi  bernilai  tinggi  dengan  aroma  dan  rasa  khas,  yang dihasilkan  dari  biji  kopi  yang  telah  difermentasi  sebagian  dalam  sistem pencernaan luwak ( Paradoxurus hermaprodithus ). Tingginya permintaan kopi ini dan  produksi  alami  yang  unik  berimplikasi  pada  praktek  pemaksaan  dan penyiksaan  hewan  luwak,  serta  adanya  kontroversi  status  kehalalan  produk. Fermentasi in vitro menggunakan selulase, xilanase, dan protease yang diisolasi dari  kotoran  luwak  tampaknya  dapat  menjadi  alternatif  proses  untuk menghindari  masalah  pelecehan  hewan,  menjamin  kehalalan  produk  serta memastikan  keberlanjutan  produksi  kopi  luwak.  Kajian  ini  bertujuan  untuk meringkas  dan  mensintesis  peran  tiga  enzim  ini  (selulase,  xilanase,  dan protease)  dalam  fermentasi in  vitro kopi  luwak  dan  pengaruhnya  pada karakteristik kimia dan sensori berdasarkan hasil-hasil penelitian terbaru. Hasil kajian menunjukkan bahwa fermentasi in vitro menggunakan selulase, xilanase, dan protease. biji kopi menghasilkan karakteristik kimia dan sensorik yang sama dengan yang dihasilkan melalui proses alami yang melibatkan hewan luwak.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 22 (2) (2019): 58 – 66 59

## 1. Pendahuluan
Kopi  luwak  adalah  kopi  yang  diproses  melalui fermentasi  singkat  yang  terjadi  di  dalam  saluran pencernaan luwak ( Paradoxurus hermaphroditus ) [1, 2, 3]. Enzim-enzim  pada  saluran  pencernaan  tersebut berperan dalam menghasilkan kopi dengan cita rasa dan aroma khas  [4]. Kopi luwak merupakan salah satu jenis kopi yang paling banyak diminati di dunia [5]. Adanya ciri khas unik yang dimiliki oleh kopi luwak ini menjadikan kopi  luwak  memiliki  harga  yang  cukup  tinggi  [6]  dan salah  satu  yang  paling  mahal  di  dunia  dengan  harga sekitar $1.300/kilogram [2].
Saat  ini,  kebutuhan  kopi  luwak  100%  masih tergantung secara alami [7], yaitu hanya berasal dari hasil fermentasi  oleh  luwak.  Penggunaan  hewan  pada  proses produksi  kopi  luwak  memiliki  beberapa  permasalahan, seperti:  penyalahgunaan  hewan  yang  berpotensi  pada animal  abuse [8],  produktivitas  hewan  yang  sangat terbatas  karena  tidak  mudah  untuk  dikembangbiakkan [8]  dapat  memicu  kerusakan  ekosistem  hewan  yang berimplikasi  pada  kelangkaan  dan  kepunahan  luwak  di kemudian  hari  [9].  Selain  itu,  karena  prosesnya  yang melibatkan saluran pencernaan hewan, status kehalalan dari  kopi  luwak  juga  masih  diperdebatkan  [10,  11], meskipun  Majelis  Ulama  Indonesia  (MUI)  telah memberikan  fatwa  halal,  dengan  syarat  biji  kopi  luwak disucikan  sebelum  dikonsumsi  [12].  Begitu  juga  dengan keotentikannya,  masih  banyak  terjadi  pemalsuan  kopi luwak  yang  dicampur  dengan  jenis  kopi  lain  yang  lebih murah  [13],  meskipun  beberapa  penelitian  telah menemukan  metode  terkini  untuk  mendeteksi  keaslian kopi luwak [14, 15, 16, 17].
Untuk  mengurangi  penggunaan  hewan  luwak  pada pembuatan  kopi  luwak,  dapat  dilakukan  melalui  proses fermentasi  secara in  vitro ,  baik  menggunakan mikroorganisme  [7,  13,  18,  19]  maupun  enzim  [18,  20]. Mikroorganisme dan enzim diyakini dapat menghasilkan kopi  yang  terfermentasi menjadi  lebih  unik dengan  cita rasa  dan  aroma  yang  khas  [1].  Penggunaan mikroorganisme  dan  enzim  ini  diharapkan  dapat mengatasi permasalahan yang terjadi dalam penggunaan hewan  luwak,  seperti  biaya  produksi  yang  mahal  [21], kemungkinan  kontaminasi  yang  tinggi  dari E.  coli dan Salmonella [22],  dan  produksinya  yang  terbatas  [13]. Mikroorganisme yang digunakan dalam fermentasi kopi luwak  secara in  vitro pada  umumnya  merupakan kelompok  bakteri  yang  berasosiasi  dengan  saluran pencernaan  luwak  [23].  Bakteri-bakteri  tersebut  antara lain diisolasi dari sampel feses  [19, 24] atau dari bagian gastrointestinal  luwak  [28].  Beberapa  bakteri  yang ditemukan  pada  usus  luwak,  di  antaranya: Enterobacter cloacae , Lactobacillus  brevis , Enterobacter , Bacillus dan beberapa  bakteri  lain  dalam  jumlah  yang  lebih  sedikit [25].  Sementara  itu,  beberapa  bakteri  yang  berhasil diisolasi  dari  feses  luwak  yaitu:  bakteri  selulolitik, xilanolitik,  dan  proteolitik  yang  terdapat  dalam  jumlah yang besar [26]. Bagaimanapun juga, yang bekerja dalam fermentasi  kopi  luwak  adalah  enzim,  karena  melalui aktivitas enzimnya, mikroorganisme dapat menghidrolisis substrat kopi luwak tersebut.
Bakteri  selulolitik,  xilanolitik,  dan  proteolitik memiliki karakteristik yang berbeda, karena enzim yang dihasilkan  untuk  menguraikan  substrat  juga  berbeda. Bakteri  selulolitik  dapat  menghasilkan  selulase  untuk mendegradasi selulosa, bakteri xilanolitik memproduksi enzim  xilanase  untuk  mendegradasi  xilan,  sementara bakteri  proteolitik  dapat  mensekresi  protease  untuk mendegradasi  protein  [26].  Ketiga  enzim  ini  berperan dalam proses fermentasi kopi di dalam tubuh luwak [27]
dan berpotensi untuk digunakan sebagai agen enzimatis dalam fermentasi kopi luwak secara in vitro . Seperti yang telah  dilakukan  Hadipernata  dan  Nugraha  yang menggunakan  protease  menggunakan  bioreactor  [13]. Hal ini juga dilakukan oleh Zahiroh [28] dan Rohman [29] yang  menggunakan  selulase,  xilanase,  dan  protease dengan  memanfaatkan  bakteri  yang  telah  diisolasi. Xilanase  merupakan  enzim  yang  dapat  menghidrolisis hemiselulosa  (xilan  atau  polimer  dari  xilosa)  dan  xilo- oligosakarida  [30].  Protease  merupakan  enzim  yang mampu  mengkatalisis  reaksi  hidrolisis  ikatan  peptida pada  [31]  yang  terdapat  pada  protein  di  dalam  kopi, sementara  selulase  merupakan  enzim  yang  mampu memutus  ikatan β -1,4  pada  substrat  selulosa, selodekstrin, selobiosa dan turunan selulosa lainnya [32].
Adapun  tujuan  dari  kajian  ini  yaitu  untuk menganalisis  bagaimana  kerja  mikrobial  selulase, xilanase, dan protease dalam memfermentasi kopi secara in  vitro .  Selain  itu,  dari  kajian  dapat  dianalisis  peran fermentasi  secara in  vitro dalam  memberikan karakteristik kimia dan sensori dari kopi luwak. Melalui kajian  ini,  diharapkan  dapat  diketahui  bagaimana fermentasi  kopi  luwak  secara in  vitro dapat  digunakan sebagai  alternatif  fermentasi  tradisional  biji  kopi  pada saluran  pencernaan  luwak  yang  memiliki  banyak keterbatasan.

## 2. Kopi Luwak
Kopi  luwak  adalah  salah  satu  produk  kopi  khas Indonesia  yang  dihasilkan  dari  feses  hewan  luwak (Paradoxurus  hermaphroditus) ,  setelah  hewan  tersebut mengkonsumsi  buah  kopi  matang  [18].  Kopi  yang dimakan  oleh  luwak  kemudian  keluar  bersama kotorannya berupa biji kopi dengan syarat biji kopi masih utuh  terbungkus  kulit  tanduk  dan  dapat  tumbuh  jika ditanam kembali [33]. Protease yang dihasilkan di dalam saluran  pencernaan  luwak  memecah  protein  pada  biji kopi,  sehingga  menyebabkan  kandungan  peptida  dan asam amino bebas meningkat dan menghasilkan rasa dan aroma  yang  unik.  Selain  itu,  selama  fermentasi berlangsung, kadar lemak kopi meningkat dan membuat rasa  kopi  semakin  enak  dan  berperan  dalam pembentukan body kopi  [6].  Adanya  kandungan  lemak yang tinggi merupakan salah satu penyebab peningkatan kualitas cita rasa kopi luwak dibandingkan kopi biasa [1, 34]. Senyawa lemak dan turunannya, yaitu: trigeliserida, asam  lemak  bebas,  ester  diterpen,  diterpen  bebas, triterpen,  sterol,  tokoferol,  dan  fosfatida,  berperan terhadap  cita  rasa  kopi  yang  dihasilkan  [4].  Pada  saat fermentasi,  bakteri  mengaktifkan  beberapa  enzim, seperti  lipase  [35]  yang  mengkatalis  proses  konversi lemak dan asam lemak bebas menjadi asam butirat [36]. Tingginya  asam  butirat  yang  dihasilkan  mempengaruhi kualitas  sensori  kopi  yang  dihasilkan  [29].  Rasa  dan aroma  yang  khas  ini  membuat  kopi  menjadi  banyak diminati. Diketahui bahwa harga kopi luwak cukup mahal [1], yaitu 20 kali lebih mahal dibandingkan kopi biasa [13]. Adapun  perbandingkan  harga  kopi  luwak  dengan  kopi lain disajikan pada Tabel 1. Berdasarkan Tabel 1 tersebut, kopi luwak menempati posisi ke-4 dari kopi 10 termahal di dunia.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 22 (2) (2019): 58 – 66 60 Tabel 1. Perbandingan 10 harga kopi termahal di dunia Jeni Kopi Harga per pound* (dalam dolar) Daerah Asal Black Ivory Lebih dari 500 Thailand Finca El Injerto 500 Guatemala Hacienda La Esmeralda Lebih dari 500 Panama Kopi Luwak 160 Asia Saint Helena 79 Pulau St. Helena Jamaican Blue Mountain Lebih dari 50 Jamaika Fazenda Santa Ines 50 Brasilia Starcbucks Quadriginoctuple 47,30/cangkir Philadeplhia, USA Los Planes 40 El Slvador Hawaiiaan Kona 34 Hawai, USA *Keterangan:  hanya  untuk  jenis  kopi  selain Starcbucks Quadriginoctuple
Standar mutu kopi luwak sendiri di Indonesia sampai saat ini masih mengacu pada Standar Nasional Indonesia (SNI)  untuk  Kopi,  yaitu  SNI  01-2907-2008  [33,  37]. Perbedaan  kopi  luwak  dengan  kopi  biasa  tidak  hanya terletak  pada  prosesnya  saja,  komposisi  kimia  dari keduanya pun cukup berbeda (Tabel 2).
Tabel 2. Perbandingan kandungan kimia pada kopi luwak dan kopi biasa Kandungan Kimia Konsentrasi (g/100g) Kopi biasa Kopi luwak Kafein 1,1 – 2,5* 0,358 – 0,363** Asam klorogenat 1,9 – 3,8*  0,0544 – 0,0571** Protein 6,5 – 10* 1,09 – 1,11** Polisakarida 31 – 37* 69,16 ± 69,72*** Lemak 17,37 19,76**** Sumber: *[38], **[13], ***[2], ****[34]
Pada Tabel 2, terlihat bahwa kadar kafein pada kopi luwak  lebih  rendah  dibandingkan  kopi  biasa.  Hal  ini disebabkan  oleh  adanya  penurunan  kandungan  kafein yang  terjadi  selama  fermentasi  kopi  di  dalam  saluran pencernaan luwak [39]. Semakin lama proses fermentasi terjadi,  maka  kandungan  kafein  pada  kopi  semakin sedikit,  karena  kafein  terdegradasi menjadi uric  acid,  7- methilxanthine, dan xanthine [40].  Selain  itu,  kafein berubah  menjadi  kafeol  yang  berimplikasi  pada  aroma dan  flavor  kopi.  Senyawa  kafein  ini  juga  berkontribusi terhadap  rasa  pahit  pada  kopi.  Penurunan  kadar  kafein juga  dipengaruhi  oleh  penguraian  protein  selama fermentasi.  Adanya  aktivitas  protease  yang  tinggi  dari bakteri  proteolitik  yang  terdapat  pada  saluran pencernaan  luwak,  menyebabkan  berkurangnya  kadar kafein  pada  kopi  serta  akan  meningkatkan  asam  amino bebas  [1].  Semakin  panjang  proses  fermentasi berlangsung,  maka  kadar  kafein  dalam  biji  kopi  akan semakin  menurun  [41].  Begitu  juga  kadar  protein  pada
kopi  luwak,  yang  cenderung  lebih  rendah  dibandingkan kopi biasa (Tabel 2).
Asam  klorogenat  yang  terkandung  di  dalam  kopi luwak  lebih  sedikit  dibandingkan  kopi  biasa.  Asam klorogenat  adalah  turunan  dari  senyawa  fenol  dan merupakan  faktor  penentu  kualitas  kopi  khususnya aroma  kopi  [42].  Senyawa  ini  juga  menentukan karakteristik  pahit  pada  kopi  [43].  Hal  ini  yang menyebabkan  rasa  kopi  biasa  lebih  pahit  dibandingkan kopi  luwak  [17].  Selama  fermentasi  berlangsung,  asam klorogenat dihidrolisi oleh klorogenat hidrolase menjadi asam  kafeat  dan  asam  ferulik  yang  menyebabkan  rasa pahit pada kopi menurun [44].

## 3. Peran Selulase pada Fermentasi Kopi Luwak
Selulosa merupakan serat utama pada dinding sel biji kopi  [45].  Selulosa  bersama  polisakarida  lain  seperti arabinogalaktan  dan  galaktomanan  sebagai  fraksi karbohidrat  dalam  biji  kopi,  berkontribusi  hampir  50% dari berat kering biji kopi [46]. Selulosa ditemukan pada dinding  sel  tanaman,  khususnya  dari  substrat lignoselulosa  [47].  Struktur  kimia  selulosa  terdiri  dari polimer tunggal yang tersusun oleh monomer-monomer glukosa  yang  dihubungkan  dengan  ikatan  glikosidik β - 1,4 [48, 49, 50], yang memiliki area kristalin yang sangat teratur dan beberapa area amorphous pada interval yang tidak teratur [51]. Keteraturan struktur kristalin tersebut menyebabkan  dinding  sel  biji    kopi  menjadi  resisten terhadap serangan mikroba.
Enzim  yang  dapat  mendegradasi  selulosa  yaitu selulase.  Selulase  merupakan  enzim  ekstraseluler  yang terdiri dari 3 grup enzim [52], yaitu: kompleks endo- β - 1,4-glukanase  (EC  3.2.1.4),  kompleks  ekso- β -1,4- glukanase  (EC  3.2.1.91),  dan β -1,4-glukosidase  atau selobiose (EC 3.2.1.21) [53]. Adapun mekanisme hidrolisis selulosa oleh selulase dapat dilihat pada Gambar 1. Selain itu,  ikatan  glikosidik β -1,4  pada  selulosa  dapat  diputus oleh selulase menjadi monomer yang sederhana [28, 29, 54].
Gambar 1. Mekanisme hidrolisis selulosa oleh selulase [55]
Seperti  yang ditunjukkan  pada  Gambar 1,  hidrolisis substrat  lignoselulosa  terbagi  menjadi  dua,  hidrolisis primer  dan  sekunder  [56].  Secara  umum,  hidrolisis primer  yang  terdiri  dari  kerja  endoglukanase  dan eksoglukanase,  terjadi  pada  permukaan  substrat, mengubah  rantai-rantai  selulosa  menjadi  gula  yang terlarut  dengan  derajat  polimerisasi  kurang  dari  enam sehingga gula yang dihasilkan umumnya berbentuk cair. Endoglukanase  menghidrolisis  rantai-rantai  selulosa membentuk  ujung-ujung  rantai  baru  yang  kemudian akan  dipecah  lagi  menjadi  selobiosa  maupun  selo-
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 22 (2) (2019): 58 – 66
oligosakarida  oleh  eksoglukanase  [50,  57].  Selanjutnya, hidrolisis  sekunder, β -glukosidase  memecah  selobiosa menjadi glukosa. Glukosa yang dihasilkan dari fermentasi enzimatis  secara in  vitro ini  berkontribusi  dalam memberikan  aroma,  flavor,  rasa  yang  lebih  disukai daripada  kopi  pada  umumnya,  khususnya  bagi  orang yang  memiliki  intensitas  rendah  dalam  meminum  kopi [13]. Pada saat fermentasi, selulosa dan karbohdirat lain diubah  menjadi  polisakarida  larut  air,  oligosakarida, monomer, melanoidin, senyawa karamel, dan komponen volatil.  Karbohidrat  berkontribusi  dalam  pembentukan warna  cokelat  pada  kopi,  pembentukan  senyawa  volatil serta meningkatkan body kopi.
Rohman  [29]  mengkombinasikan  aktivitas  selulase dengan  xilanase  untuk  mengukur  kemampuan  enzim menguraikan  selulosa  dan  hemiselulosa  dalam  substrat biji  kopi  luwak  secara in  vitro menjadi  produk  berupa glukosa  dan  xilosa.  Aktivitas  enzim  diukur  pada  cairan hasil  fermentasi  yang  menggunakan  kombinasi  isolat FLs1 ( Proteus penneri ) dan FLx3 ( Stenotrophomonas sp. MH 34).  Berdasarkan  penelitian  tersebut,  lama  inkubasi optimum  dalam  menghasilkan  kombinasi  selulase  dan xilanase dari substrat biji kopi luwak secara in vitro adalah pada hari ke-3.
Isolat bakteri FLs1 dan FLx3 termasuk dalam bakteri mesofilik yang tumbuh optimal pada suhu 30°C, sehingga enzim  yang  dihasilkan  juga  semakin  banyak  [29]. Kemampuan  bakteri  selulolitik  dalam  mendegradasi selulosa  dan  hemiselulosa  pada  kopi  mempengaruhi kandungan asam  organik  dalam biji  kopi  [1]. Pada  suhu 37°C  (di  atas  suhu  optimum)  aktivitas  enzim  lebih rendah, karena pertumbuhan bakteri menjadi terhambat dan enzim yang dihasilkan lebih sedikit [54]. Bakteri yang ditumbuhkan pada kondisi lingkungan yang tidak sesuai, sulit  beradaptasi  dan  menyebabkan  pertumbuhan  tidak optimal sehingga produksi enzim juga terhambat bahkan inaktif.

## 4. Peran Xilanase pada Fermentasi Kopi Luwak
Xilan merupakan polisakarida kedua yang melimpah di alam setelah selulosa dan terhitung hampir berjumlah sebanyak  sepertiga  dari  sumber  karbon  organik terbarukan di bumi [58]. Struktur xilan yang bervariasi di antara spesies tanaman yang berbeda dan rantai backbone homopolimernya  dapat  diganti  dengan  gugus-gugus rantai samping berbeda pada posisi yang bervariasi pula [58]. Adapun enzim yang dapat mendegradasi xilan yaitu xilanase.  Pada  proses  produksi  kopi  luwak  melalui fermentasi  secara in  vitro ,  mikroorganisme  seperti Stenotropomonas sp.  dapat  digunakan  sebagai  sumber xilanase  [28,  29,  54].  Xilanase  merupakan  kompleks enzim  yang  terdiri  dari  endoxilanase  (E.C.3.2.1.8), β - xilosidase  (E.C.3.2.1.37), α -glucuronidase  (E.C.3.2.1.139), α -arabinofuranosidase  (E.C.3.2.1.55),  dan  acetilxilan esterase (E.C.3.1.1.72). Adapun mekanisme kerja xilanase dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2 . Mekanisme hidrolisis xilan oleh xilanase [58]
Xilanase  mendegradasi  polimer  xilan  sebagai komponen  utama  dari  hemiselulosa,  menjadi  xilosa. Xilan  merupakan  heteropolimer  yang  terutama  terdiri atas gula pentosa xilosa dan arabinosa di mana backbone utama  dari  xilan  memiliki  ikatan β -(1 → 4)  yang menghubungkan residu-residu xilosa. Xilosa diklasifikasikan
sebagai monosakarida yang mengandung  lima  atom  karbon  dan  termasuk  gugus fungsi  aldehid.  Adanya  gugus  aldehid  bebas  tersebut, maka  xilosa  tergolong  gula  pereduksi.  Seperti kebanyakan  gula  lainnya,  xilosa  dapat  mengadopsi berbagai  struktur  bergantung  kondisi,  seperti:  struktur cincin furanosa (5-member) atau piranosa (6-member) [59].  Karakteristik  tersebut  membantu  proses  ekstraksi biji kopi, khususnya dikenal sebagai coffee bean mucilage liquefraction di mana mucilage (pulp atau mesokarp) yang melapisi  biji  kopi  (endosperma)  menjadi  lebih  mudah terekstraksi. Dengan kata lain, biji kopi yang dihasilkan memiliki  kualitas  fisik  yang  baik,  karena  sudah dipisahkan dengan mucilage . Hal ini dapat memudahkan proses fermentasi kopi karena xilanase akan lebih mudah untuk mendegradasi xilan yang terdapat pada kopi [60]. Dengan hidrolisis xilan, xilosa yang dihasilkan memiliki nol  kalori  sehingga  bisa  menjadi  kopi  alternatif  rendah kalori bagi pecinta kopi [60].
Aktivitas  xilanase  yang  tinggi  menyebabkan terjadinya  degradasi  selulosa,  hemiselulosa,  dan  xilan semakin  meningkat,  sehingga  menghasilkan  produk- produk  turunan  seperti  gula  sederhana  [7].  Hal  ini mengakibatkan  kandungan  asam  organik  pada  biji  kopi semakin meningkat dan berperan dalam kualitas sensori dari kopi. Hasil dari proses pemecahan gula adalah asam laktat dan asam-asam lain yaitu etanol, asam butirat, dan propionat [13].
Xilanase  berperan  penting  dalam  fermentasi  kopi luwak  secara in  vitro. Dengan  aktivitasnya  dalam mengkatalis  konversi  xilan  menjadi  gula  pereduksi seperti  xilosa  [30],  xilanase  berkontribusi  dalam pembentukan  reaksi  Maillard.  Reaksi  ini  terjadi  antara gugus aldehid yang terdapat pada gula pereduksi dengan gugus  amina  yang  ada  pada  peptida  sederhana,  yang menghasilkan  warna  coklat  pada  biji  kopi  serta komponen  volatil  yang  berimplikasi  pada  terbentuknya aroma dan flavor khas kopi [13].

## 5. Peran Protease pada Fermentasi Kopi Luwak
Protease  atau  biasa  disebut  proteinase,  peptidase, enzim  proteolitik,  hidrolase  protein  merupakan  enzim yang  mampu  melakukan  proteolisis  atau  katabolisme protein  melalui  hidrolisis  ikatan  peptida.  Enzim  ini merupakan  salah  satu  enzim  yang  berperan  penting dalam  industri,  di  mana  penggunaannya  mampu mencapai sekitar 60% dari total pemanfaatan enzim [61].
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 22 (2) (2019): 58 – 66
Adapun mekanisme hidrolisis protein oleh protease dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 . Mekanisme hidrolisis protein oleh protease [62]
Sama  seperti  dalam  pencernaan  perut  luwak,  biji kopi  diuraikan  oleh  salah  satu  enzim  yaitu  protease, contohnya  yaitu  enzim  yang  berasal  dari Bacillus aerophillus dan Stenotropomonas sp.  [28,  29,  54]. Penelitian  sebelumnya menemukan  bahwa  hasil  sekresi endogen oleh enzim proteolitik pada sistem pencernaan luwak  dapat  meresap  ke  dalam  biji  kopi  yang  melewati saluran  pencernaan  luwak  tersebut.  Enzim  proteolitik memecah  kandungan  protein  dari  biji  kopi  sehingga asam-asam organik maupun amina seperti asam amino bebas pun meningkat dan menghasilkan aroma, rasa, dan flavor yang unik [1]. Selain itu, pada penelitian lain, yang mengisolasi  bakteri  asam  laktat  (BAL),  menunjukkan bahwa dari 3 isolat yang digunakan, hanya isolat 1 (ICF 1) dan  isolat  3  (ICF  3)  yang  memperlihatkan  aktivitas protease [63]. Proses penguraian protein ini menyebabkan  rasa  pahit  kopi  luwak  berkurang berbanding kopi biasa dan kopi luwak memberikan aroma tersendiri  [11].  Protease  secara  umum  digunakan  untuk memecah oligopeptida menjadi asam amino [64].
Proses roasting semakin memperkuat aroma, warna, rasa  dari  biji  kopi  yang  selanjutnya  mengalami  reaksi Mailard oleh karena biji kopi mengandung protein, asam amino,  trigonelin  (produk  metabolisme  niasin  yang diekskresi  dari  urine  luwak),  serotonin,  karbohidrat, asam  karboksilat,  fenol,  dan  sebagian  komponen mikro lainnya.  Asam-asam  lemak  dan  turunannya  yang terdapat dalam biji kopi, diantaranya: trigeliserida, ester diterpen,  diterpen  bebas,  triterpen,  sterol,  tokoferol, fosfatida  dan  turunannya  juga  berperan  memberikan karakteristik sensori yang lebih enak serta pembentukan konsistensi viskositas kopi setelah diseduh [4].
Masing-masing dari penelitian Rohman [29], Susilo [54],  dan  Zahiroh  [28],  meneliti  aktivitas  enzim  dari Bacillus aerophilus sebagai isolat FLp1 dan Stenotropomonas sp MH3 sebagai isolat FLp2 yang berasal dari  biji  kopi  yang  ada  pada  feses  luwak  segar  yang diperoleh  dari  perkebunan  kopi.  Isolat  FLp1  dan  FLp2 yang ditumbuhkan pada media susu skim dan didapatkan waktu  optimum  yang  berbeda  dalam  memproduksi protease.  Selain  itu,  pada  penelitian  yang  dilakukan Hadipernata dan Nugraha  yang  membandingkan antara buah  kopi  segar,  biji  kopi  segar  dan  biji  kopi  luwak menunjukkan  bahwa  enzim  proteolitik  hanya  terdapat pada biji kopi luwak. Hal ini disebabkan oleh fermentasi yang terjadi pada biji luwak [65].
6. Karakteristik  Kimia  dan  Sensori  Kopi  Luwak Hasil Fermentasi Secara In vitro Melalui  fermentasi  secara in  vitro, kopi  luwak (artifisial)  yang  diproses  menggunakan  bioreaktor memiliki  karakteristik  kimia  yang  tidak  jauh  berbeda dengan  kopi  luwak  yang  difermentasi  secara konvensional  atau  asli  [13].  Hal  ini  ditunjukkan  pada
kadar  air,  abu,  lemak,  dan  karbohidrat  dari  kedua  kopi luwak  tersebut,  yang  disajikan  pada  Tabel  3  [13]. Berdasarkan Tabel 3 tersebut, hanya kandungan protein dari  kopi  luwak  artifisial  yang  lebih  tinggi  secara signifikan  dari  kopi  luwak  asli.  Tingginya  kandungan protein  disebabkan  oleh  aktivitas  bakteri  asam  laktat (BAL) dan enzim proteolitik yang ditambahkan ke dalam bioreakor  sebelum  fermentasi  artifisial  dilakukan  [13]. Menurut  Radha dkk. [66],  protease  merupakan  enzim kompleks  yang  mengkatalisis  proses  hidrolisis  molekul protein.  Pada  proses  fermentasi  kopi  luwak  asli,  enzim protease  ini  yang  menyebabkan  kandungan  protein menurun [4]. Dengan adanya penambahan protease pada fermentasi kopi luwak artifisial, proses degradasi protein menjadi peptida yang lebih sederhana tetap terjadi tanpa menurunkan kandungan protein secara keseluruhan jika dibandingkan dengan kopi luwak asli.
Tabel 3. Perbandingan kandungan proksimat kopi luwak artifisial dan kopi luwak asli [13]
Kandungan Kimia Konsentrasi (g/100g) Kopi luwak artifisial Kopi luwak asli Air 2,05 ± 0,11 2,00 ± 0,15 Abu 5,38 ± 0,22 5,34 ± 0,17 Lemak 12,21± 0,19 12,13 ± 0,22 Protein 13,11± 0,23 11,08 ± 0,31* Karbohidrat 67,25± 0,33 69,44 ± 0,28 Kafein merupakan senyawa alkaloid yang terkandung  secara  alami  pada  lebih  dari  60  jenis tanaman,  terutama  kopi.  Berdasarkan  penelitian  yang dilakukan  oleh  Usman dkk. [7] yang  melakukan fermentasi secara in vitro kopi luwak selama 12 dan 24 jam dengan  penambahan  mikroorganisme,  menghasilkan kopi dengan kadar kafein yang tidak jauh berbeda dengan dengan  kopi  luwak  asli.  Kandungan  kafein  pada  kopi luwak yaitu 0,7%. Hal in berbeda dengan penelitian lain yang  melakukan  fermentasi  kopi  luwak  menggunakan bioreaktor,  di  mana  kadar  kafein  yang  dihasilkan  lebih rendah dibandingkan kopi luwak asli [13].
Mikroorganisme  dan  enzim  juga  diharapkan  dapat menghasilkan  kopi  yang  terfermentasi  menjadi  lebih unik  dengan  cita  rasa  dan  aroma  yang  khas  [1].  Oleh karena  itu,  karakteristik  sensori  yang  juga  berperan penting  dalam  menentukan  kualitas  kopi  perlu dipertimbangkan  untuk  mengukur  kualitas  kopi  luwak artifisial.  Hasil  penelitian  sebelumnya  menunjukkan bahwa  fermentasi  biji  kopi  secara  basah  dengan mikroorgansime  probiotik  yang  diisolasi  dari  organ pencernaan  luwak  menghasilkan  produk  kopi  yang memiliki cita rasa dan aroma yang mendekati kopi luwak asli.  Berdasarkan  cita  rasa  dan  kenikmatannya,  kopi luwak  probiotik  memiliki  tekstur  yang  lebih  lembut dengan cita rasa kopi yang lebih kuat daripada kopi luwak asli [21]. Produksi kopi luwak secara fermentasi dengan mikroba  probiotik  yang  berhasil,  setidaknya  dapat menghasilkan  keuntungan,  di  antaranya  (1)  produksi lebih mudah diprogramkan serta tidak terbatas, (2) biaya menjadi  lebih  murah,  (3)  bebas  dari  aroma  tanah,  (4) lebih  higienis,  dan  (5)  dapat  menghilangkan  perasaan jijik bagi konsumen tertentu.
Pada  penelitian  lain  [16],  yang  membandingkan kualitas sensori antara kopi luwak asli dengan kopi luwak artifisial menggunakan cupping test analysis menunjukkan  hasil  sensori  yang  bervariasi  dari  setiap atributnya  (Tabel  4),  meskipun  secara  keseluruhan
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 22 (2) (2019): 58 – 66
memiliki skor yang tidak jauh berbeda. Dilihat dari atribut aroma ( fragrance ), kopi luwak artifisial memperoleh skor yang lebih rendah dibandingkan kopi luwak asli. Hal ini disebabkan oleh kandungan protein kopi luwak artifisial yang lebih tinggi seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3. Protein  akan  terdegradasi  menjadi  asam  amino  bebas yang  merupakan  salah  satu  senyawa  kimia  yang berkontribusi pada aroma kopi [67]. Akan tetapi, atribut after taste kopi luwak artifisal lebih rendah dibandingkan dengan  kopi  luwak  asli.  Selama  proses  penyangraian, terjadi  reaksi  Maillard  antara  gugus  karbonil  dari  gula pereduksi dengan asam amino, peptida, dan protein pada kopi [68]. Reaksi ini menghasilkan senyawa melanoidin yang menyebabkan warna kopi menjadi cokelat [69] dan memberikan flavor pada kopi [70]. Jika dilihat dari atribut body kopi,  skor  yang  dimiliki  kopi  luwak  artifisial  tidak jauh  berbeda  dengan  kopi  luwak  asli.  Hal  ini  diduga disebabkan  oleh  kandungan  lemak  yang  dimiliki  dari kedua  kopi  tersebut.  Kandungan  lemak  yang  tinggi menghasilkan body kopi yang kuat [4].
Tabel 4. Perbandingan karakteristik sensori kopi luwak artifisial dengan kopi luwak asli [13] Atribut sensori Kopi luwak artifisial Kopi luwak asli Aroma 7,75 8,00 Flavor 7,75 7,75 After taste 7,75 7,90 Keasaman 7,63 7,75 Body 7,75 7,50 Keseragaman 10,0 10,0 Balance 7,88 8,00 Keseluruhan 7,88 8,00

## 7. Kesimpulan
Selulase, xilanase, dan protease dapat dimanfaatkan dalam  proses  fermentasi  kopi  luwak  secara in  vitro . Selulase  mengubah  selulosa  menjadi  glukosa  sehingga berkontribusi  pada  aroma,  flavor,  rasa  kopi  luwak. Kemudian, xilanase mengubah xilan menjadi xilosa yang berperan  dalam  produk  akhir  yang  dihasilkan  bersifat rendah  kalori.  Selanjutnya,  protease  mampu  mengubah protein menjadi asam-asam organik dan amina yang juga meningkatkan  karakteristik  dari  kopi  serta  konsistensi viskositas  kopi  setelah  diseduh.  Fermentasi  kopi  luwak secara in  vitro memberikan  karakteristik  kimia  dan sensori kopi yang tidak jauh berbeda dengan kopi luwak asli.  Teknologi  fermentasi  tersebut  dapat  digunakan sebagai  alternatif  untuk  menghasilkan  kopi  luwak dengan  kualitas  yang  sama  dengan  kopi  luwak  yang difermentasi secara konvensional.

## Ucapan Terima Kasih
Penulis berterima-kasih kepada Lembaga Penelitian dan  Pengabdian  Masyarakat  (LPPM)  Universitas  Surya atas  kesediannya  untuk  memberikan  konsultasi  dan bimbingan.

## Daftar Pustaka
[1]  Massimo F. Marcone, Composition and properties of Indonesian  palm  civet  coffee  (Kopi  Luwak)  and Ethiopian  civet  coffee, Food  Research  International , 37, 9, (2004) 901-912 https://doi.org/10.1016/j.foodres.2004.05.008
[2]  Yoshikazu  Nishiguchi,  Michiko  Goromaru-shinkai, Jun  Kuroda,  Sachiko  Kiuchi,  Hiroshi    Ihara, Estimation of protein, total polyphenol, chlorogenic acid,  caffeine,  and  caffeic  acid  contents  in Indonesian  palm  civet  coffee  (Kopi  Luwak), International  Journal  of  Analytical  Bio-Science ,  5,  4, (2017) 53-56
[3]  Dany  Ardiansyah,  Helen  Tjota,  Warsono  El  Kiyat, Review : Peran Enzim dalam Meningkatkan Kualitas Kopi, Jurnal  Agri-Tek  :  Jurnal  Penelitian  Ilmu-Ilmu Eksakta , 19, 2, (2018) 86-91
[4]  E.  Panggabean,  Buku  Pintar  Kopi,  Agromedia Pustaka, Jakarta, 2011.
[5]  Murna  Muzaifa,  Anshar  Patria,  Amhar  Abubakar, Febriani,  Faidha  Rahmi,  Dian  Hasni,  Ismail Sulaiman,  Kopi  Luwak:  Produksi,  Mutu  dan Permasalahannya,  Syiah  Kuala  University  Press, Banda Aceh, 2016.
[6]  E  Panggabean,  Mengeruk  Untung  dari  Bisnis  Kopi Luwak, Agromedia Pustaka, Jakarta, 2011.
[7]  Doni Usman, Agung Suprihadi, Endang Kusdiyantini, Fermentasi  Kopi  Robusta  (Coffea  canephora) Menggunakan Isolat Bakteri Asam Laktat Dari Feces Luwak  Dengan  Perlakuan  Lama  Waktu  Inkubasi, Jurnal Biologi , 4, 3, (2015) 31-40
[8]  Udi  Jumhawan,  Sastia  Prama  Putri,  Yusianto, Takeshi Bamba, Eiichiro Fukusaki, Quantification of coffee blends for authentication of Asian palm civet coffee  (Kopi Luwak)  via  metabolomics:  A  proof  of concept, Journal of Bioscience and Bioengineering , 122, 1, (2016) 79-84 https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2015.12.008 [9]  Miyabi Nakabayashi, Yoshihiro Nakashima, Andrew J.  Hearn,  Joanna  Ross,  Raymond  Alfred,  Hiromitsu Samejima,  Azlan  Mohamed, Matt Heydon,  Rustam, Henry Bernard, Gono Semiadi, Gabriella Fredriksson,  Ramesh  Boonratana,  Andrew  J. Marshall, Norman T-L. Lim, Dave M. Augeri, Jason Hon, John Mathai, Tim van Berkel, Jedediah Brodie, Anthony  Giordano,  Jon  Hall,  Brent  Loken,  Sophie Persey,  David  W.  Macdonald,  Jerrold  L.  Belant,
Stephanie Kramer-Schadt, Andreas Wilting, Predicted  distribution  of  the  common  palm  civet Paradoxurus hermaphroditus (Mammalia: Carnivora:  Viverridae)  on  Borneo,  in: The  Raffles Bulletin  of  Zoology  Supplement  No.  33 ,  National University of Singapore, Singapore, 2016.
[10]  M.  I.  Mokhtar,  S.M.I.  Munir,  Revisiting  the  Fiqh  of halal-haram  animals:  An  analysis  on  Malaysian fatwa  relating  to  animal  care  and  use,  in:    1st International Halal Management Conference (IHMC 2017), Sejong University, South Korea, 2017.
[11]  Hamizah Hussin, Mohd Anuar Ramli, Coffee Luwak Manufacturing From Halalan Tayyiban Perspectives, al-Qanatir: International Journal of Islamic Studies , 11, 1, (2018) 1-14
[12]  Majels  Ulama  Indonesia,  Fatwa  Mejalis  Ulama Indonesia  Nomor:  07  Tahun  2017  Tentang  Kopi Luwak,  in:  M.U.  Indonesia  (Ed.)  07/2017,  Majels Ulama Indonesia, Jakarta, 2017.
[13]  M.  Hadipernata,  S.  Nugraha,  Process  technology  of luwak  coffee  through  bioreactor  utilization, IOP Conference  Series:  Earth  and  Environmental  Science , 102,  (2018)  012092 http://dx.doi.org/10.1088/1755- 1315/102/1/012092
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 22 (2) (2019): 58 – 66 64 [14]  Udi  Jumhawan,  Sastia  Prama  Putri,  Yusianto,  Erly Marwani,  Takeshi  Bamba,  Eiichiro  Fukusaki, Selection of Discriminant Markers for Authentication  of  Asian  Palm  Civet  Coffee  (Kopi Luwak):  A  Metabolomics  Approach, Journal  of
Agricultural and Food Chemistry , 61, 33, (2013) 7994-
8001 http://dx.doi.org/10.1021/jf401819s
[15]  Udi  Jumhawan,  Sastia  Prama  Putri,  Yusianto, Takeshi Bamba, Eiichiro Fukusaki, Application of gas chromatography/flame  ionization  detector-based metabolite fingerprinting for authentication of Asian palm civet coffee (Kopi Luwak), Journal of Bioscience and  Bioengineering ,  120,  5,  (2015)  555-561 https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2015.03.005
[16] Diding Suhandy, Meinilwita Yulia, The Use of Partial Least  Square  Regression  and  Spectral  Data  in  UV- Visible  Region  for Quantification  of  Adulteration  in Indonesian Palm Civet Coffee, International Journal of Food Science , 2017, (2017) 7 http://dx.doi.org/10.1155/2017/6274178 [17]  Shinta  Widyaningtyas,  Sucipto  Sucipto,  Yusuf Hendrawan,  Deteksi  Pemalsuan  Kopi  Luwak Menggunakan  Sifat  Biolistrik  dan  Jaringan  Saraf Tiruan, Jurnal Teknologi Pertanian , 19, 3, (2019) 161- 172
[18]  Rubiyo,  Juanity  Towaha,  Pengaruh  Fermentasi terhadap Cita rasa Kopi Luwak Probiotik, Buletin Riset Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri , 4, 2,
(2013) 175-182
[19] Muhammad Fauzi, Nur Wahyu Hidayati, Perubahan Karakteristik  Kimia  Kopi  Luwak  Robusta In  vitro dengan Variasi Lama Fermentasi dan Dosis Ragi, in: Seminar  Nasional  Hasil  Penelitian  dan  Pengabdian Masyarakat 2016, Politeknik Negeri Jember, Jember, 2016.
[20] Luis  Federico  Martinez,  Murat  Omer    Balaban, Quality  Enhancement  of  Coffee  Beans  by  Acid  and Enzyme Treatment, in: U. Patent (Ed.), US, 2009.
[21]  Sinar Tani, Kopi luwak probiotik temuan BPTP Bali, in:  Tabloid Sinar Tani, Sinar Tani, Jakarta, 2010.
[22] Mulyana  Hadipernata,  Rudy  Tjahjohutomo,  Iceu Agustinisari,  Eka  Rahayu,  Teknologi  proses  dan keamanan pangan kopi luwak, in:  Seminar Nasional Teknologi Inovatif Pascapanen Pertanian III, Bogor, 2011.
[23] Mareike  Kraatz,  Lactobacilli  and  other  lactic  acid- related  bacteria  in  the  mucosal  proximal gastrointestinal tract of pigs: a review of ecology for two  derivative  approaches  for  isolation  of  novel species, Current  Research,  Technology  and  Education Topics  in  Applied    Microbiology  and  Microbial Biotechnology , 1, (2010) 674 – 686
[24] Stephanie  Chan,  Emmanuel  Garcia,  Comparative Physicochemical  Analyses  of  Regular  and  Civet Coffee, The Manila Journal of Science , 7, 1, (2011) 19- 23
[25] Sony  Suhandono,  Heri  Setiadi,  Tati  Kristianti,  Ali Budhi  Kusuma,  Andini  Warih  Wedaringtyas,  Demi Tristan Djajadi, I Nyoman Pugeg Aryantha, Diversity of  culturable  Bacterial  in  various  parts  of  luwak’s (Paradoxurus hermaprodithus
javanica)
gastrointestinal  tract, Microbiology  Indonesia , 10,  2,
(2016) 65-70
[26] Sri  Laksmi  Dewi,  Isolasi  Bakteri  Xilanolitik  Dan Selulolitik  Dari  Feses  Luwak,  Departemen  Biologi, Institut Pertanian Bogor, Bogor
[27] Pandudamai  Insani  Taufiq,  Fermentasi  Kopi Menggunakan  Bakteri  Xilanolitik  dari  Luwak, Departemen  Ilmu  dan  Teknologi  Pangan,  Institut Pertanian Bogor, Bogor
[28] Siti  Zahiroh,  Fermentasi  Biji  Kopi  Menggunakan Bakteri  Selulolitik,  Xilanolitik  dan  Proteolitik  Asal Luwak,  Departemen  Teknologi  Agroindustru, Institut Pertanian Bogor, Bogor
[29] Hazirur  Rohman,  Produksi  Kopi  Secara  Enzimatis Menggunakan  Bakteri  Proteolitik  dan  Kombinasi Bakteri  Selulolitik  dan  Xilanolitik  Dari  Luwak, Departemen  Teknologi  Agroindustri,  Institut Pertanian Bogor, Bogor
[30] Nur Richana, Produksi dan Prospek Enzim Xilanase dalam  Pengembangan  Bioindustri  di  Indonesia, Buletin AgroBio , 5, 1, (2002) 29-36
[31]  Maggy  Thenawidjaja  Suhartono,  Enzim  dan bioteknologi,  PAU  Bioteknologi,  Institut  Pertanian Bogor, Bogor, 1989.
[32] Prabuddha Bansal, Mélanie Hall, Matthew J. Realff, Jay  H.  Lee,  Andreas  S.  Bommarius,  Modeling cellulase  kinetics  on  lignocellulosic  substrates, Biotechnology  Advances ,  27,  6,  (2009)  833-848 https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2009.06.005
[33] Kementerian Pertanian, Peraturan Menteri Pertanian Republik Indonesia Nomor 37/Permentan/KB.120/6/2015 Tentang Cara Produksi  Kopi  Luwak  Melalui  Pemeliharaan  Luwak yang Memenuhi Prinsip Kesejahteraan Hewan, in: K. Pertanian  (Ed.)  No.  37/Permentan/KB.120/6/2015, Kementerian Pertanian, Jakarta, 2015.
[34] Israyanti,  Perbandingan  Karakteristik  Kimia  Kopi Luwak  dan  Kopi  Biasa  Jenis  Kopi  Arabika  (Cafeea arabica.  L)  dan  Robusta  (Cafeea  canephora.  L), Program  Studi  Teknologi  Pertanian,  Universitas Hasanuddin, Makassar
[35] I. Filya, G. Ashbell, Y. Hen, Z. G. Weinberg, The effect of  bacterial  inoculants  on  the  fermentation  and aerobic stability of whole crop wheat silage, Animal Feed  Science  and  Technology ,  88,  1,  (2000)  39-46 https://doi.org/10.1016/S0377-8401(00)00214-5
[36] Michael  J.  Jr.  Pelczar,  E.C.S.  Chan,  Dasar-Dasar Mikrobiologi, UI Press, Jakarta, 2005.
[37] Badan  Standardisasi  Nasional,  Biji  Kopi,  in:  B.S. Nasional (Ed.) SNI 2907:2008, Badan Standardisasi Nasional, Jakarta, 2008.
[38] Naeli  Farhaty,  Muchtaridi  Muchtaridi,  Tinjauan Kimia  dan  Aspek  Farmakologi  Senyawa  Asam Klorogenat  Pada  Biji  Kopi  :  Review, Farmaka ,  14,  1,
(2016) 214-227
[39] H.D.  Belitz,  W.  Grosch,  P.  Schieberle,  Lehrbuch  der Lebensmittelchemie,  Springer  Berlin  Heidelberg, 2007.
[40] Kenneth  Todar,  Todar's  Online  Textbook  of Bacteriology,  in, www.textbookofbacteriology.net , 2018.
[41]  Ana  Farida,  Evi  Ristanti  R,  Andri  Cahyo  Kumoro, Penurunan  Kadar  Kafein  dan  Asam  Total  Pada  Biji Kopi  Robusta  Menggunakan  Teknologi  Fermentasi
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 22 (2) (2019): 58 – 66
Anaerob Fakultatif dengan Mikroba Nopkor MZ-15, Jurnal Teknologi Kimia dan Industri , 2, 3, (2013) 70-75
[42] Adriana Farah, Carmen Marino Donangelo, Phenolic compounds  in  coffee, Brazilian  Journal  of  Plant Physiology , 18, (2006) 23-36 http://dx.doi.org/10.1590/S1677- 04202006000100003
[43] Adriana  Dillenburg  Meinhart,  Lucas  Caldeirão, Fernanda Mateus Damin, José Teixeira Filho, Helena Teixeira  Godoy,  Analysis  of  chlorogenic  acids isomers and caffeic acid in 89 herbal infusions (tea), Journal  of  Food  Composition  and  Analysis ,  73,  (2018) 76-82 https://doi.org/10.1016/j.jfca.2018.08.001 [44] Rachid Bel-Rhlid, Dinesh Thapa, Karin Kraehenbuehl,  Carl  Erik  Hansen,  Lutz  Fischer, Biotransformation  of  caffeoyl  quinic  acids  from green coffee extracts by Lactobacillus johnsonii NCC 533, AMB Express , 3, (2013) 28-28
http://dx.doi.org/10.1186/2191-0855-3-28
[45] Yi-Fang  Chu,  Coffee:  Emerging  Health  Effects  and Disease Prevention, Wiley, 2012.
[46] Meenakshi Arya, L. Jagan Mohan Rao, An Impression of  Coffee  Carbohydrates, Critical  Reviews  in  Food Science  and  Nutrition ,  47,  1,  (2007)  51-67 http://dx.doi.org/10.1080/10408390600550315
[47] Dietrich  Fengel,  Gerd  Wegener,  Wood:  chemistry, ultrastructure, reactions, De Gruyter, 2011.
[48] Anuj K. Chandel, G. Chandrasekhar, Messias Borges Silva, Silvio Silvério da Silva, The realm of cellulases in  biorefinery  development, Critical  Reviews  in
Biotechnology , 32, 3, (2012) 187-202 http://dx.doi.org/10.3109/07388551.2011.595385
[49] Fatria  Isrami,  Agustina  L.  N.  Aminin,  Aktivitas Selulase  dan  Xilanase  dari  Komplek  Enzim Lignoselulolitik  Termostabil  Hasil  Penguraian Batang Pisang, Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi , 17, 1,
(2014) 17-22 https://doi.org/10.14710/jksa.17.1.17-22
[50] Raj  Kumar,  Sompal  Singh,  Om  V.  Singh, Bioconversion of lignocellulosic biomass:
biochemical  and  molecular  perspectives, Journal  of Industrial Microbiology & Biotechnology , 35, 5, (2008) 377-391 http://doi.org/10.1007/s10295-008-0327-8
[51]  A.  T.  W.  M.  Hendriks,  G.  Zeeman,  Pretreatments  to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource  Technology ,  100,  1,  (2009)  10-18 https://doi.org/10.1016/j.biortech.2008.05.027
[52] Deepa Deswal, Yogender Pal Khasa, Ramesh Chander Kuhad,  Optimization  of  cellulase  production  by  a brown  rot  fungus  Fomitopsis  sp.  RCK2010  under solid state fermentation, Bioresource Technology , 102, 10, (2011) 6065-6072 https://doi.org/10.1016/j.biortech.2011.03.032 [53] Ramesh  Chander  Kuhad,  Rishi  Gupta,  Ajay  Singh, Microbial Cellulases and Their Industrial Applications, Enzyme  Research ,  2011,  (2011)  10 http://doi.org/10.4061/2011/280696
[54] Anton  Susilo,  Produksi  Kopi  Luwak  Sintesis  Secara Enzimatis  menggunakan  Bakteri  Xilanolitik  dan Kombinasi dengan Bakteri Proteolitik dan Selulolitik,  Departemen  Teknologi  Agroindustri,
Institut Pertanian Bogor, Bogor
[55] Li  Wan  Yoon,  Teck  Nam  Ang,  Gek  Cheng  Ngoh, Adeline  Seak  May  Chua,  Fungal  solid-state
fermentation and various methods of enhancement in  cellulase  production, Biomass  and  Bioenergy ,  67,
(2014) 319-338
https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2014.05.013
[56] Y. H. Percival Zhang, Michael E. Himmel, Jonathan R. Mielenz,  Outlook  for  cellulase  improvement: Screening  and  selection  strategies, Biotechnology Advances , 24, 5, (2006) 452-481 https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2006.03.003 [57] M.  Dashtban,  H.  Schraft,  W.  Qin,  Fungal bioconversion of lignocellulosic residues; opportunities & perspectives, International Journal of Biological  Sciences ,  5,  6,  (2009)  578-595 http://doi.org/10.7150/ijbs.5.578
[58] Paul  Held,  Enzymatic  digestion  of  polysaccharides part  II :  Optimization  of  polymer  digestion  and glucose production in microplates, ” Biofuel Res., hal. 5,  2012.,  in:    Applications  notes:  Biofeul  Research, BioTek, 2012.
[59] S.  Subramaniyan,  P.  Prema,  Biotechnology  of Microbial  Xylanases:  Enzymology,  Molecular Biology,  and  Application, Critical  Reviews  in Biotechnology , 22, 1, (2002) 33-64 10.1080/07388550290789450
[60] Michael  P.  Coughlan,  Geoffrey  P.  Hazlewood, Hemicellulose  and  hemicellulases,  Portland  Press, 1993.
[61] Kunamneni  Adinarayana,  Poluri  Ellaiah,  Davuluri Siva Prasad, Purification and partial characterization of  thermostable  serine  alkaline  protease  from  a newly  isolated  Bacillus  subtilis  PE-11, AAPS
PharmSciTech , 4, 4, (2003) E56-E56 http://doi.org/10.1208/pt040456
[62] Peter James Baker, Keiji Numata, Polymerization of Peptide Polymers for Biomaterial Applications, in: F. Yılmaz (Ed.) Polymer Science , IntechOpen, 2013.
[63] Murna Muzaifa, Dian Hasni, Anshar Patria, Febriani, Amhar Abubakar, Sensory and Microbial
Characteristics of Civet Coffee, International Journal on  Advanced  Science,  Engineering  and  Information Technology (IJASEIT) , 8, 1, (2018) 165-171
[64] L. M. Cintas, M. P. Casaus, C. Herranz, I. F. Nes, P. E. Hernández,  Review:  Bacteriocins  of  Lactic  Acid Bacteria, Food Science and Technology International , 7, 4,  (2001)  281-305 http://doi.org/10.1106/r8de- p6hu-clxp-5ryt
[65] Mulyana  Hadipernata,  Sigit  Nugraha,  Identifikasi Fisik,  Kimia  dan  Mikrobiologi  Biji  Kopi  Luwak sebagai  Dasar  Acuan  Teknologi  Proses  Kopi  Luwak Artificial, in:  Seminar Insentif Riset SINas (INSINas 2012), Bandung, 2012.
[66] S. Radha, A. Sridevi, R. Himakiran Babu, V. J. Nithya, N. B. L. Prasad, G. Narasimha, Medium Optimization for  Acid  protease  production  from  Aspergillus  sps under  Solid  state  fermentation  and  mathematical modelling  of  protease  activity, Journal  of Microbiology and Biotechnology Research , 2, 1, (2012) 6-16
[67] Grażyna Budryn,  Ewa  Nebesny,  Anna  Podsędek, Dorota  Żyżelewicz,  Małgorzata  Materska,  Stefan Jankowski,  Bogdan  Janda,  Effect  of  different extraction  methods  on  the  recovery  of  chlorogenic acids,  caffeine  and  Maillard  reaction  products  in coffee beans, European Food Research and Technology ,
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 22 (2) (2019): 58 – 66 66 228, 6, (2009) 913-922 http://doi.org/10.1007/s00217-008-1004-x
[68] Dennis  D.  Miller,  Food  Chemistry:  A  Laboratory Manual, Wiley, 1998.
[69] J.R.  Vercellotti,  A.J.  St  Angelo,  A.M.  Spanier,  Lipid oxidation  in  foods:  An  overview, ACS  Symposium series-American Chemical Society (USA) , (1992)
[70] Ivon  Flament,  Yvonne  Bessière-Thomas,  Coffee flavor chemistry, John Wiley & Sons, 2002.