Copyright: ©2022 by the authors. Submitted for possible open-access publication under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International (CC BY-SA) license
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.9 No.1 June 2022 Page 9-12 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
Effect of pH, Temperature, and Metal Activator on The Activity of Fibrinolytic Enzymes Produced by Pseudomonas Aeruginosa Ts 6.4
Pengaruh pH, Suhu, dan Aktivator Logam Terhadap Aktivitas Enzim Fibrinolitik yang dihasilkan Pseudomonas Aeruginosa Ts 6.4
Siti Halima Hanum 1) , Achmad Toto Poernomo 1) * , Sudjarwo Sudjarwo 1) , Shofiatur Rosyidah 1)
1 Department of Pharmaceutical Science, Faculty of Pharmacy, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
*Corresponding author E-mail: achmad-t-p@ff.unair.ac.id
Article History:
Received: February 17, 2022; Revised: April 1, 2022; Accepted: May 22, 2022; Online: June 30, 2022

## ABSTRACT
Fibrinolytic enzymes were found in several microorganisms, including Pseudomonas aeruginosa TS 6.4, which  was  isolated  from  sea  cucumbers  ( Paracaudina  australis ).  Sea  cucumbers  possessed  many pharmacological activities, such as antithrombotic and antihyperlipidemic effects. In addition, fibrinolytic enzymes  had  been  identified  in  Stichopus  japonicus,  one  of  the  sea  cucumber  species.  The  activity  of fibrinolytic  enzymes  was  influenced  by  pH,  temperature,  activators,  inhibitors,  and  the  concentration of enzyme-substrate. This study aimed to determine the pH and optimum temperature of fibrinolytic enzyme activity of Pseudomonas aeruginosa TS 6.4. The optimum pH was achieved at pH 5-6, while the optimum temperature was reached at 50°C. The effect of the addition of metal activators CaCl2, MnCl2, MgCl2, ZnCl2, and CoCl2 on the activity of fibrinolytic enzymes was  also studied. The results showed that the fibrinolytic activity of Pseudomonas aeruginosa TS 6.4 was affected by Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, and Co2+.
Keywords: Pseudomonas aeruginosa TS 6.4, Fibrinolytic Enzyme Activity, pH, Temperature, Metal activator

## ABSTRAK
Enzim fibrinolitik ditemukan pada beberapa mikroorganisme, termasuk Pseudomonas aeruginosa TS 6.4 yang  diisolasi  dari  teripang  ( Paracaudina  australis ).  Teripang  memiliki  banyak  aktivitas  farmakologis seperti  antitrombotik  dan  antihyperlipidemi.  Selain  itu,  Sticophus  japonicus  salah  satu  spesies  teripang terbukti mengandung enzim fibrinolitik. Aktivitas enzim fibrinolitik dipengaruhi oleh pH, suhu, aktivator, inhibitor, dan konsentrasi enzim-substrat. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pH dan suhu optimum aktivitas  enzim  fibrinolitik  dari Pseudomonas  aeruginosa TS  6.4.  pH  optimum  dicapai  pada  pH  5  -  6, sedangkan  suhu  optimum  dicapai  pada  50 o C.  Efek  dari  penambahan  aktivator  logam  CaCl2,  MnCl2, MgCl2, ZnCl2, CoCl2 pada aktivitas enzim fibrinolitik juga telah diteliti. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas fibrinolitik Pseudomonas aeruginosa TS 6. dipengaruhi oleh Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, dan Co2+.
Kata kunci: Pseudomonas aeruginosa TS 6.4, Aktivitas enzim fibrinolitik, pH, Suhu, Aktivator logam

## PENDAHULUAN
Enzim  fibrinolitik  merupakan  salah  satu  enzim golongan protease yang dapat digunakan untuk memecah bekuan  fibrin.  Enzim  protease  dibagi  menjadi  empat family  yakni  protease  serin,  protease  aspartat,  protease serin, dan metalloprotease (Kotb, 2012). Aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain suhu, pH,  dan  aktivator.  pH  berpengaruh  terhadap  kecepatan aktivitas enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi. Hal ini disebabkan  konsentrasi  ion  hidrogen  mempengaruhi struktur dimensi enzim dan aktivitasnya. Bila konsentrasi ion  hidrogen  berubah  dari  konsentrasi  optimal,  aktivitas enzimatik  secara  progresif  hilang  sampai  pada  akhirnya
menjadi  tidak  fungsional.  pH  merupakan  faktor  yang mempengaruhi  stabilitas  enzim.  Enzim  dapat  berbentuk ion positif, ion negatif, atau zwitter ion. Aktivitas masing- masing  berada  pada  daerah  stabilitas  pH  optimal. Sebagian  besar  enzim intrasel  memiliki  aktivasi  optimal pada  pH  5,0-9,0.  Perubahan  ionisasi  juga  dapat  dialami oleh  substrat  atau  kompleks  enzim-  substrat,  sehingga berpengaruh  terhadap  aktivitas  enzim  (Noviyanti  et  al., 2013)
Suhu juga memiliki peran penting untuk menunjang aktivitas  optimal  dari  enzim.  Apabila  suhu  semakin dinaikkan pada satu titik enzim akan menjadi tidak stabil dan  mulai  mengalami  denaturasi.  Apabila  digambarkan pada  suatu  kurva  adanya  denaturasi  dapat  dilihat  dari
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.9 No.1 June 2022 Page 9-12 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
kurva  yang  mulai  menurun,  biasanya  kurva  yang dihasilkan merupakan puncak asimetris hal ini disebebkan karena  pada  saat  kenaikan  suhu  kurva  menaik  relatif lambat,  namun  pada  saat  terjadi  denaturasi  kurva  akan menurun secara signifikan. Dari penjabaran tersebut dapat disimpulkan  bahwa  pada  suhu  rendah  reaksi kimia  akan berjalan  lambat  namun  pada  suhu  tinggi  secara  umum reaksi  kimia  berjalan  cepat.  Dengan  demikian  apabila enzim  bekerja  pada  suhu  optimum  kecepatan  reaksi enzimatis adalah maksimum. Namun bila enzim bekerja pada suhu melewati suhu optimumnya dapat menyebabkan  terjadinya  denaturasi  enzim  sehingga menurunkan kecepatan reaksi (Dennison, 2002; Wuryanti, 2004).
Ion logam umumnya berperan sebagai aktivator atau inhibitor enzim yang mempengaruhi kerja enzim pada sisi aktif  katalitiknya.  Biasanya  enzim  hanya  akan  aktif  jika ada  kofaktor  (Sajuthi  et  al.,  2010).  Logam  tersebut membantu reaksi katalitik dengan cara mengikat substrat pada  sisi  pemotongan  selain  berperan  dalam  pengikatan enzim  dengan  substrat,  beberapa  logam  juga  dapat mengikat  enzim  secara  langsung  untuk  menstabilkan konformasi  aktifnya  atau  menginduksi  formasi  sisi pengikatan  atau  sisi  aktif  suatu  enzim.  Mekanisme  ion logam  dapat  memperbesar  aktivitas  enzim  yaitu  dengan menjadi bagian integral dari sisi aktif, merubah konstanta kesetimbangan  dari  reaksi  enzimatis,  merubah  muatan listrik,  mengusir  ion  inhibitor,  dan  menukar  ion  yang kurang efektif pada sisi aktif enzim atau substrat (Baehaki and  Budiman,  2011).  Untuk  memaksimalkan  aktivitas enzim, maka penting untuk diketahui, pH, suhu optimum serta aktivator yang dapat memberikan aktivitas optimal. Oleh  sebab  itu,  pada  penelitian  ini,  akan  dilakukan karakterisasi dari Pseudomnas aeruginosa TS 6.4 sebagai bakteri penghasil enzim fibrinolitik.

## METODOLOGI PENELITIAN

## Bahan
Pseudomonas  aeruginosa TS  6.4  hasil  isolasi  dari teripang, nutrient broth®, nutrient agar®, skim milk agar, fibrin  bovine  blood  Simagchem®,  aquadest,  NaCl, agarose,  methylene  blue,  buffer  phosphate,  Nattokinase, divalent  metals  as  acivators  (CaCl2,  MnCl2,  MgCl2 ZnCl2, dan CoCl2. (Sigma)).

## Uji Aktivitas Proteolitik
Aktivitas  proteolitik  diukur  dalam  media  agar  susu Skim. Media SMA mengandung 10 mg bubuk susu skim dan  1,5  gram  agar  yang  dilarutkan  dalam  100  mL aquadest.  Tujuh  sumur  yang  dibuat  di  pelat  SMA menggunakan  tabung  kapiler.  Sekitar  20  µL  suspensi bakteri ditempatkan di setiap sumur dan diinkubasi pada 37°C  selama  24  jam.  Zona  jelas  hidrolisis  skim  telah muncul  dari  sampel  yang  memproduksi  protease. Diameter zona bening diamati dan diukur.

## Uji Aktivitas Fibrinolitik
Aktivitas  fibrinolitik  diukur  dengan  metode  plat fibrin.  Pelat  fibrin  terdiri  dari  0,3  g  fibrin  dan  2  g  agar dalam 100 mL dapar fosfat (pH 7,8). Tiga sumur dibuat pada pelat fibrin menggunakan tabung kapiler. Sekitar 20 µL  larutan  enzim  ditempatkan  di  setiap  sumur  dan diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  24  jam.  Aktivitas fibrinolitik  diamati  dengan  mengukur  zona  transparan.
Zona  transparan  menunjukkan  degradasi  fibrin.  Semua percobaan dilakukan tiga kali (dimodifikasi dari Ashipala dan He, 2008).
Uji Aktivitas Enzim terhadap Pengaruh pH dan Suhu Optimasi pH sedang dilakukan dengan mempertahankan  pH  menggunakan  buffer  fosfat  0,1  M (5,0-8,0).  Larutan  enzim  dicampur  dengan  phospate buffer. Tiga sumur dibuat pada pelat fibrin menggunakan tabung kapiler. Sekitar 20 µL larutan enzim ditempatkan di  setiap  sumur  dan  diinkubasi  pada  berbagai  suhu  (40- 80 o C) selama 24 jam.

## Uji  Aktivitas  Enzim  terhadap  Pengaruh  Aktivator Logam
Pengaruh  aktivator  logam  dilakukan  dengan mencampur  larutan  enzim  dan  larutan  logam  0,05  M. Larutan  ditempatkan  dalam  media  fibrin  dan  diinkubasi pada suhu optimum selama 24 jam. Aktivator logam yang digunakan  adalah  CaCl2,  MnCl2,  MgCl2  ZnCl2,  dan CoCl2.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil Uji Aktivitas Proteolitik
Hasil yang didapat menujukkan hasil positif karena terbentuk  zona  jerrnih  disekitar  sumur  sehingga  enzim fibrinolitik yang dihasilkan Pseudomonas aeruginosa TS 6.4  dapat dinyatakan  memiliki  enzim  proteolitik.  Indeks proteolitik  diperoleh  dari  perbandingan  diameter  zona jernih  dengan  diameter  sumur.  Dari  hasil  perhitungan zona jernih didapatkan hasil rata – rata indeks fibrinolitik
Pseudomonas aeruginosa TS 6.4 sebesar 2,47±0,04.
Gambar 1 . Hasil Uji Aktivitas Enzim Proteolitik pada Media (SMA) 10%
Gambar 2 . Hasil Uji Aktivitas Enzim Fibrinolitik pada Media  Fibrin  Plate  (a)  Rep. ke-1;  (b) Rep. ke-2; (c) Rep. ke-3
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.9 No.1 June 2022 Page 9-12 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048

## Hasil Uji Aktivitas Fibrinolitik
Zona  jernih  yang  terbentuk  disekitar  sumuran menunjukkan  adanya  aktivitas  enzim  fibrinolitik  yang dihasilkan oleh Pseudomonas aeruginosa TS 6.4. Indeks fibrinolitik didapatkan dengan membandingkan diameter zona  jerih yang dihasilkan  dengan diameter  sumur  yang
dibentuk seperti yang tertera ( Tabel 1 ).
Dari hasil uji fibrinolitik menggunakan metode fibrin plate dengan penampak noda methylene blue didapatkan bahwa  enzim  fibrinolitik Pseudomonas  aeruginosa TS 6.4  memiliki  aktivitas  fibrinolitik  lebih  besar  dari  pada kontol positif yakni nattokinase. Hal ini dapat dilihat dari rata-rata indeks fibrinolitik dimana Psudomonas aeruginosa  TS  6.4  memiliki  rata-rata  sebesar  3,47±0,04 dan  nattokinase  memiliki  rata-rata  lebih  kecil  yakni 2,82±0,01.  Enzim  fibrinolitik  Pseudomonas  aeruginosa TS 6.4 memiliki aktivitas untuk mendegrasi substrat fibrin 1,2 kali lebih besar dari pada nattokinase.

## Hasil Uji Aktivitas Fibrinolitik terhadap Pengaruh pH dan Suhu
Suhu  dan  variasi  pH  digunakan  untuk  menentukan suhu  optimum  adalah  enzim  fibrinolitik  dalam  kisaran
40ºC hingga 80ºC dan pH 5 ke-8. Pada  hasil  di  atas  dapat  dilihat  bahwa  pada  suhu 40°C  dan  50°C,  aktivitas  tertinggi  diperoleh  pada  pH  5 dengan  rerata  masing-masing  3,36  dan  3,66  ( Tabel  2 ).
Sedangkan  pada  suhu  60°C,  aktivitas  enzim  fibrinolitik tertinggi  dicapai  pada  pH  6,0  dengan  rata-rata  2,96. Namun dari ketiga suhu (40°C; 50°C; dan 60°C) tersebut, suhu  optimal  untuk  aktivitas  enzim  fibrinolitik  dicapai pada  suhu  50°C.  Hal  ini  dapat  dilihat  pada  Gambar  2 bahwa  pada  pH  5,0;  6,0;  dan  7,0  terjadi  peningkatan
aktivitas fibrinolitik sejalan dengan kenaikan suhu. Pada suhu  60°C  dan  70°C  tidak  menghasilkan  enzim fibrinolitik ( Gambar 2 ).
Hasil  ini  juga  didukung  dengan  analisa  statistik menggunakan program SPSS two way ANOVA, di mana hasil mean difference untuk pH 5,0; 6,0; dan 7,0 adalah yang  terbesar.  Namun  saat  diuji  dengan  homogenous subset, pH 5,0; 6,0; dan 8,0 berada dalam satu kolom dan pH 7,0 dan 8,0 juga berada dalam satu kolom. Untuk suhu optimal  juga  ditunjukkan  dengan  nilai  mean  difference terbesar pada suhu 50°C, selain itu pada uji homogenous subset, suhu  50°C  berada  pada  kolom  yang  berbeda dengan  suhu  40°C  dan  60°C.  Dari  pemaparan  di  atas, dapat  ditarik  kesimpulan  bahwa  aktivitas  enzim fibrinolitik yang dihasilkan oleh Pseudomonas aeruginosa TS 6.4 optimal pada suhu 50°C dan pada pH 5,0 – 6,0.

## Hasil  Uji  Aktivitas  Fibrinolitik  terhadap  Pengaruh Aktivator Logam
Enzim fibrinolitik dalam aktivitas mereka membutuhkan kofaktor tambahan. Sebagian besar enzim membutuhkan non-protein co-factor untuk katalisis. Ko- faktor biasanya sebagai elemen jejak dengan konsentrasi kecil dapat meningkatkan aktivitas. Dalam penelitian ini, semua  ion  logam  berasal  dari  klorida,  bukan  yang  lain. Hal  ini  dihindari  bahwa  ionisasi  selalu  seragam  dalam garam yang sama. Dalam pelaksanaan kation ditambahkan  ke  larutan  enzim  sehingga  mendapat konsentrasi yang sama 0,05 M pada saat aktivitas enzim aktivitas fibrinolitik.
Pada  hasil  dapat  dilihat  bahwa  aktivitas  enzim fibrinolitik  meningkat  dengan  adanya  penambahan  ion logam. Penambahan ion logam Ca2+ terjadi peningkatan indeks fibrinolitik sebesar 1,02 kali, dimana pada kontrol memiliki indeks fibrinolitik 3,53 dan setelah penambahan ion  Ca2+  indeks  fibrinolitik  menjadi  3,61.  Pada penambahan  ion  Mn2+  dan  Zn2+  terjadi  peningkatan indeks  fibrinolitik  sebesar  1,05  kali  yakni  masing  – masing dari 3,53 menjadi 3,68 dan 3,69. Penambahan ion logam  Mg2+  dan  Co2+  juga  memiliki  hasil  sama  yakni terjadi peningkatan indeks fibrinolitik pada sebesar 1,08 kali  dimana  masing-masing  memiliki  nilai  indeks fibrinolitik sebesar 3,79 dan 3,75 ( Gambar 3 ).
Hasil  ini  juga  didukung  dengan  analisa  stastistika menggunakan program  SPSS one  way  ANOVA  dimana hasil means different terbesar adalah pada aktivator logam MgCl2  dengan  nilai  0,25.  Pada  uji  homogenous  subset menyatakan  bahwa  tidak  terdapat  perbedaan  bermakna pada  penambahan  ion  Mg2+  dan  Co2+  yang  memiliki nilai  subset  tertinggi,  sehingga  pada  penambahan  ion
Tabel  1 .  Hasil  Pengukuran  Diameter  Zona  Jernih  pada  Uji Aktivitas Enzim Fibrinolitik
Item Rata-rata Pseudomonas aerunginosa TS 6.4 3,47±0,04 Nattokinase (kontrol positif) 2,82±0,01
Tabel  2 .  Pengaruh  pH  dan  Suhu  Terhadap  Aktivitas  Enzim Fibrinolitik pH Suhu 40 50 60 Rata-rata Indeks Fibrinolitik ± SD 5,0 3,36±0,09 3,66±0,12 2,68±0,03 6,0 3,12±0,00 3,62±0,06 2,96±0,08 7,0 3,14±0,06 3,51±0,01 2,79±0,02 8,0 3,34±0,11 3,69±0,02 2,63±0,01
Gambar  2 .  Diagram  Pengaruh  pH  dan  Suhu  Terhadap Aktivitas Fibrinolitik
4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 3.66 3.36 3.62  3.51 3.14 3.34 3.12 2.69 2.66 2.96 2.79 2.63 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 40 50 60 Suhu ( o C)
Gambar  3 .  Diagram  Pengaruh  Aktivator  Logam  pada Suhu  Optimal  terhadap  Aktivitas  Enzim Fibrinolitik
Gambar 2 . Hasil Uji Aktivitas Enzim
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.9 No.1 June 2022 Page 9-12 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
logam Mg2+ maupun Co2+ menghasilkan aktivitas enzim fibrinolitik yang sama.

## KESIMPULAN
Pada  penelitian  kali  ini  didapatkan  perbedaan  hasil pengaruh  pH,  suhu,  dan  penambahan  aktivator  logam terhadap  aktivitas  enzim  fibrinolitik  yang  dihasilkan Pseudomonas  aeruginosa  TS  6.4  Aktivitas  Enzim fibrinolitik  pseudomonas  aeruginosa  TS  6.4  optimum pada  suhu  50oC  pada  pH  5  –  6,  dan  meningkat  pada penambahan  ion  Ca2+,  Mn2+,  Mg2+,  Zn2+,  dan  Co2+. Peningkatan  tertinggi  didapat  pada  penambahan  ion logam Mg2+ dan Co2+ karena ktivitas enzim dipengaruhi oleh  logam,  maka  enzim  digolongkan  dalam  kelompok metalloprotease.

## DAFTAR PUSTAKA
Baehaki,  A.  and  Budiman,  A.  (2011)  'Isolasi  dan karakterisasi  protease  dari  bakteri  tanah  rawa Indralaya,  Sumatera  Selatan' Jurnal  Teknologi dan Industri Pangan , XXII(1), pp.37-42.
Dennison,  C.  (2013) A  Guide  to  Protein  Isolation , Springer Science & Business Media.
Ekowati,  J.  and  Diyah,  N.W.  (2013).  'Aktivitas antinosiseptif  dan  uji  in  silico  terhadap cyclooxigenase  dari  asam  p-metoksisinamat  dan asam  m-metoksisinamat' Berkala  Ilmiah  Kimia Farmasi , 2(1), pp.32-39.
Kotb, E. (2012) Briefs in Microbiology , Springer Science
& Business Media.
Noviyanti,  T.,  Ardiningsih,  P.  and  Rahmalia,  W.  (2013) 'Pengaruh  temperatur  terhadap  aktivitas  enzim protease  dari  daun  sansakng  (Pycnarrhena cauliflora Diels)' Jurnal Kimia Khatulistiwa , 1(1), pp.1-6.
Sajuthi,  D.,  Suparto,  I.,  Yanti  and  Praira,  W.  (2010). 'Purifikasi dan pencirian enzim protease fibrinolitik  dari  ekstrak  jamur  merang', Makara Sains , 14(2), pp.145-150.
Wuryanti (2004) 'Isolasi dan penentuan aktivitas spesifik enzim bromelin dari nanas (Ananas comosus L.)', Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi , pp.83-87.