ISSN: 1410-8917 e-ISSN: 2597-9914
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 224 – 231

## Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi
Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa

## Utilization and Characterization of Oyster Shell as Chitosan and Nanochitosan
Lia Handayani a,* , Faisal Syahputra b , Yayuk Astuti c
a Fisheries Product Technology Department, Faculty of Fisheries, Abulyatama University, Aceh, Indonesia b Fisheries Product Technology Department, Faculty of Fisheries, Abulyatama University, Aceh, Indonesia c Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: liahandayani_thp@abulyatama.ac.id https://doi.org/10.14710/jksa.21.4.224-231
A r t i c l e   I n fo

## A b s t r a c t
Article history: Received: 1 August 2018 Revised: 25 October 2018
Accepted: 27 October 2018 Online: 31 October 2018
Keywords: Chitin ; Chitosan ;
Nanochitosan ; Oyster Shells Oyster is one of bivalve groups widely consumed by human, thus, it results in producing huge waste shells affecting the environment. One way to increase the value of oyster shells is to process them into chitosan. This study aims to isolate chitin then synthesize it  into  chitosan  and  convert  chitosan  into  nano-sized  chitosan  and  analyze  the characteristics.  The  steps  to  produce  chitosan  from  waste  shells  included demineralization using HCl 1 N and deproteinization using NaOH 3%. The next step was to convert chitin into chitosan through a deacetylation process using NaOH 50%. After chitosan was formed, it was continued to convert chitosan into nano chitosan particles using ion gelation method with the addition of surfactant (tween 80) and crosslinker (TPP 0.1% and 0.5%). The results showed that yield of transformation chitin into chitosan was 61.1%. Meanwhile, the yield calculated from initial weight of raw material was 18.33% with deacetylation degree value equal to 89.14%. Based on morphological analysis using SEM, the size of chitosan particles was not distributed homogeneously that was in the range of 892 nm- 1.54 μm, while the nano chitosan particle size obtained was uniformly formed in the range of 679 nm-910 nm.

## A b s t r a k
Kata Kunci: Cangkang Tiram; Kitin; Kitosan; Nanokitosan Tiram merupakan salah satu golongan bivalvia yang banyak dikonsumsi masyarakat, sehingga menghasilkan limbah berupa cangkang yang dapat mengganggu lingkungan. Salah satu cara untuk meningkatkan nilai cangkang tiram adalah mengolahnya menjadi kitosan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  dan  mengkarakterisasi  kitin kemudian mensintesisnya menjadi kitosan lalu mengkonversi kitosan menjadi kitosan berukuran  nano  serta  mengkarakterisasinya.  Adapun  tahapan  yang  dilakukan  untuk mensisntesis kitosan meliputi demineralisasi menggunakan HCl 1 N dan deproteinansi menggunakan  NaOH  3%.  Sedangkan  tahapan  berikutnya  adalah  mengubah  kitin menjadi kitosan melalui proses deasetilasi menggunakan NaOH 50%. Setelah kitosan terbentuk, dilanjutkan mengubah kitosan menjadi kitosan nanopartikel menggunakan metode gelasi ionik dengan penambahan surfaktan (tween 80) dan reagen crosslink (TPP 0,1% dan 0,5%). Rendemen hasil penelitian transformasi kitin menjadi kitosan adalah 61,11%  sedangkan  jika  dihitung  dari  berat  awal  bahan  baku  adalah  18,33%  dengan derajat  deasetilasinya  sebesar  89,14%.  Berdasarkan  analisis  morfologi  menggunakan SEM,  ukuran  partikel  kitosan  terdistribusi  tidak  homogen  antara  892  nm-1,54  µm, sedangkan ukuran partikel nanokitosan yang diperoleh terdistribusi merata antara 679 nm-910 nm.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 224 – 231

## 1. Pendahuluan
Indonesia  merupakan  negara  kepulauan  sehingga memiliki  potensi  kekayaan  hasil  laut  yang  tinggi. Kekayaan hasil laut tersebut dapat berupa dari golongan ikan,  crustacea,  bivalvia  maupun  hasil-hasil  perikanan lainnya. Salah satu hasil laut Indonesia golongan bivalvia yang sangat digemari oleh masyarakat adalah tiram atau dalam  Bahasa  Aceh  disebut tirom dan  dalam  Bahasa Inggris disebut oyster. Kegemaran masyarakat Indonesia mengkonsumsi tiram dikarenakan kandungan gizi yang tinggi dan rasa yang khas, namun cangkang tiram tidak dimanfaatkan  secara  optimal  sehingga  tingginya  daya konsumsi  tiram  oleh  masyarakat  menyebabkan meningkatnya  jumlah  limbah  padat  cangkangnya sehingga  menjadi  masalah  lingkungan  yang  baru, diantaranya pencemaran perairan, penumpukan pembuangan,  bau  tidak  sedap  dan  merusak  estetika lingkungan.  Bau  amis  yang  busuk  akibat  penumpukan cangkang  tiram  dilingkungan  menyebabkan  serangga atau penyebab penyakit lainnya juga berkumpul sehingga akan berdampak terhadap kesehatan masyarakat sekitar. Cangkang  tiram  yang  dibuang  keperairan  juga menyebabkan aliran sungai menjadi terganggu.
Limbah  yang  dihasilkan  tersebut  membutuhkan penanganan  khusus  agar  tidak  terus  menerus  menjadi penyebab pencemaran. Komposisi kimia cangkang tiram mengandung  lebih  dari  90%  CaCO 3 yaitu  mencapai (95,99%),  SiO 2 (0,69%),  Al 2 O 3 (0,42%),  MgO  (0,65%), P 2 O 5 (0,20%),  Na 2 O  (0,98%),  SrO  (0,33%)  dan  SO 3 (0,72%)  [1].  Kadar  CaCO 3 menunjukkan  kadar  mineral atau abu, sesuai dengan penelitian yang telah dilakukan [2],  kadar  abu  tepung  cangkang  tiram  adalah  sebesar 94,78%.  Cangkang  tiram  memiliki  kesamaan  dengan cangkang kerang bulu yaitu merupakan golongan bivalvia yang mengandung CaCO 3 >70% sehingga memiliki sifat kimia yang sama pula. Limbah-limbah perikanan seperti cangkang crustaceae maupun bivalvia mengandung kitin. Kitin merupakan salah satu senyawa organik utama yang terdapat  pada  kelompok  crustaceae,  insekta,  fungi, mollusca  dan  arthropoda.  Cangkang  udang,  lobster  dan kepiting  merupakan  salah  satu  sumber  dasar  penghasil kitin,  karena  diketahui  memiliki  kandungan  kitin  yang cukup  tinggi.  Rata-rata  cangkang  kering  antropoda mengandung 20-50% kitin. Kitin juga diketahui terdapat pada kulit siput, kepiting, kerang dan bekicot [3]. Jumlah kitin  tertinggi  terdapat  dalam  cangkang  kepiting  yaitu hingga  50%-60%,  sedangkan  cangkang  udang  42%- 57%, tulang cumi-cumi dan kulit kerang masing-masing 40%  dan  14%-35%  [4].  Cangkang/kulit  kerang  bulu memiliki  rendemen  kitosan  sebesar  3,75%  dengan derajat deasetilisasi (DD) mencapai 80,6% [5].
Salah  satu  turunan  dari  kitin  yang  banyak dimanfaatkan  dalam  berbagai  bidang  industri  adalah kitosan. Penggunaanya yang sangat luas mendorong para peneliti untuk memodifikasi sifat fisika dan kimia kitosan untuk  mengoptimalkan  fungsi  nya.  Modifikasi  yang sedang dikembangkan diantaranya adalah memodifikasi ukuran  dan  sifat  permukaannya.  Modifikasi  ukuran kitosan  secara  fisik  dilakukan  dengan  mengubahnya menjadi  ukuran  nanopartikel  [6].  Mengubah  kitosan
menjadi ukuran nano akan mengoptimalkan reaksi yang dibentuk  oleh  kitosan  saat  diaplikasikan.  Beberapa penelitian mengenai modifikasi ukuran kitosan menjadi nano telah dilakukan, diantaranya nanokitosan cangkang udang  vannamei  dengan  penambahan  TPP  0,1% berukuran  400-450  nm,  nanokitosan  dari  cangkang lobster  berukuran  357-1631  nm  [7,  8].  Kitosan  dengan penambahan  NaTPP  0,001%  menghasilkan  partikel nanokitosan  berukuran  389-877  nm  [9].  Berdasarkan uraian  diatas,  maka  perlu  dilakukan  penelitian  dengan memanfaatkan  limbah  padat  cangkang  tiram  menjadi kitosan  sehingga  dapat  meningkatkan  nilai  ekonomis hasil  samping  produk  perikanan.  Selain  itu,  juga  perlu dilakukan  modifikasi  terhadap  kitosan  yang  diperoleh sehingga  dapat  diketahui  apakah  dengan  penambahan NaTPP  0,1%  sebagai  agen crosslink dapat  menghasilkan kitosan  berukuran  nano  seperti  penelitian-penelitian terdahulu.  Pemanfaatan  cangkang  tiram  saat  ini  masih sangat  minim,  sedangkan  penelitian  mengenai  kitosan cangkang  tiram  belum  pernah  dilakukan  oleh  para peneliti,  dengan  demikian  penelitian  ini  merupakan terobosan  awal  untuk  pemanfaatan  cangkang  tiram menjadi  nanokitosan.  Untuk  mencapai  tujuan-tujuan yang  telah  diuraikan  tersebut  maka  perlu  dilakukan sintesis kitosan, nanokitosan serta melakukan karakterisasi.

## 2. Metode Penelitian

## 2.1. Alat dan Bahan
Bahan  baku  utama  yang  digunakan  sebagai  sampel adalah cangkang tiram yang diperoleh dari perairan Alue Naga, Kecamatan Syiah Kuala, Kota Banda Aceh, HCl 1 N ( p.a .,Merck),  NaOH  3  N  (Merck),  NaOH  50%  (Merck), aquades,  kertas  lakmus,  kertas  saring  whatman, CH 3 COOH  1%,  Tween  80  (0,2%),  TPP  (tripoliphosfat) 0,1%  dan  0,5%.  Sedangkan  Alat-alat  yang  digunakan adalah gelas beker (pyrex), labu ukur (pyrex), gelas ukur (pyrex), batang pengaduk, corong gelas, pipet tetes, pipet ukur, hot plate magnetic stirrer, Fourier Transform Infra Red (FTIR)  (Shimadzu), Scanning  Electron  Microscopy (SEM) merek JEOL-6510 LA.

## 2.2. Preparasi dan Karakterisasi Bahan Baku Tepung Cangkang Tiram
Persiapan  bahan  baku  adalah  modifikasi  dari Handayani  dan  Syahputra  [2]  perbedaannya  terdapat pada  tingkat  kehalusan  yaitu  hanya  hingga  ukuran  60 mesh  menggunakan planetary  ball-mill selama  12  jam, kemudian  tepung  cangkang  tiram  dikarakterisasi menggunakan  analisis  kadar  air,  kadar  abu  dan  kadar protein.  Selanjutnya  dilakukan  isolasi  kitin  yang dilanjutkan  dengan  proses  sintesis  menjadi  kitosan. Adapun  tahapan-tahapan  dari  proses  tersebut  adalah deproteinasi, demineralisasi dan deasetilasi.
2.3. Ekstraksi dan Karakterisasi kitosan [10]

## 2.3.1. Demineralisasi
Proses  ekstraksi  dilakukan  dengan  menggunakan sampel  cangkang  tiram  kering  sebanyak  60  g  melalui proses pretreatment perendaman  menggunakan  larutan HCl  1  N  dengan  perbandingan  sampel  dan  pelarut  (1:7)
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 224 – 231
selama  48  jam.  Kemudian  dilakukan  remaserasi menggunakan  pelarut  HCl  1  N  (1:5)  selama  1  jam,  lalu disaring dan dilakukan perendaman kembali menggunakan HCl 1 N (1:7 b/v) pada suhu 80°C selama 1 jam,  dilanjutkan  dengan  netralisasi  pH  residu  yang dihasilkan. Setelah tahap demineralisasi ini selesai, maka dilanjutkan ke tahap deproteinasi.

## 2.3.2. Deproteinasi
Residu  yang  telah  mengalami  demineralisasi, diekstraksi menggunakan larutan NaOH 3 N (1:8 b/v) pada suhu  80°C  selama  2  jam dengan  kecepatan  pengadukan 100  rpm.  Residu  yang  diperoleh  dilakukan  penyaringan dan  netralisasi  pH.  Setelah  tahapan  deproteinasi  ini selesai  maka  residu  yang  diperoleh  merupakan  kitin. Setelah  kitin  diperoleh  maka  dilanjutkan  pembuatan kitosan, yaitu melalui tahap deasetilasi.

## 2.3.3. Deasetilasi
Tahap deasetilasi dilakukan dengan merendam kitin dalam  pelarut  NaOH  50%  (1:10  b/v)  pada  suhu  120°C selama  1  jam  disertai  pengadukan  dengan  magnetik. Kemudian  sampel  didiamkan  selama  10  jam,  dan dilanjutkan  kembali  dengan  pemanasan  pada  150°C disertai  pengadukan  1000  rpm  selama  1  jam.  Lalu dilakukan  penyaringan  dan  residu  dicuci  hingga  pH netral.  Netralisasi  ini  dilakukan  setiap  akhir  tahapan demineralisasi, deproteinansi dan deasetilasi. Setelah pH residu  netral,  dilakukan  pengovenan  dengan  suhu  80°C selama  8  jam.  produk  akhir  dari  tahapan  ini  adalah kitosan.
Setelah kitosan diperoleh, ditimbang dan dilakukan karakterisasi  melalui  analisis  proksimat  dan  analisis gugus  fungsi  menggunakan  FTIR.  Kemudian  kitosan dilanjutkan ke tahap berikutnya yaitu pembuatan kitosan berukuran nano.

## 2.4. Pembuatan Kitosan menjadi Nanokitosan
Pembuatan  dan  karakteristik  nanopartikel  kitosan (modifikasi metode [8]). Pembuatan nanopartikel kitosan diawali  dengan  3  g  kitosan  serbuk  dilarutkan  dalam  60 mL asam asetat 1% hingga membentuk gel. Penambahan aquades  hingga  1  L  dan  dilakukan  proses  homogenisasi menggunakan magnetic stirrer dengan  kecepatan  1500 rpm  selama  1,5  jam.  Kemudian  ditambahkan  25  mL emulsifier (tween 80) 0,2%. Penambahan surfaktan non ionik polysorbate (tween 80) dilakukan tetes demi tetes ke dalam  larutan  kitosan  yang  telah  mengalami pemotongan/pemisahan gel, larutan didiamkan teraduk selama  60  menit  dengan  kecepatan  1500  rpm.  Lalu penambahan 200 mL tripoliphospat (TPP) 0,1% sambil di aduk  dengan  kecepatan  1200  rpm  selama  2  jam.  Lalu dilakukan  pengeringan.  Langkah  yang  sama  diulang untuk  sampel  berikutnya  namun  dengan  variasi penambahan  tripoliphospat  dengan  konsentrasi  0,5%. Hasil  terbaik  dilakukan  analisis Scanning  Electron Microscopy ( SEM).

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1. Karakteristik Bahan Baku Tepung Cangkang Tiram
Tepung cangkang tiram yang lolos ayakan 60 mesh dilakukan analisis kadar abu, kadar air dan kadar protein. Hasilnya disajikan pada Tabel 1 berikut ini:
Tabel 1. Komposisi kimia raw material (tepung cangkang tiram) Parameter Nilai ± stdev (%) Kadar Abu 95,08 ± 0,14 Kadar Air 0,17 ± 0,16 Kadar N-total 1,73 ± 0,25 Keterangan: n = 3 (tiga kali ulangan)
Jumlah  kadar  abu  bahan  baku  yang  tinggi menunjukkan tinggi pula kadar mineral yang terkandung didalamnya.  Mineral  dalam  cangkang  tiram  berupa kalsium yang bersenyawa dengan karbonat. Hasil analisis kadar abu  pada  tepung  cangkang  tiram  adalah  95,08%, tidak  jauh  berbeda  dengan  penelitian  sebelumnya  yaitu 94,78%  [2].  Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan  beberapa peneliti terdahulu yaitu komposisi CaCO 3 pada cangkang tiram adalah 95,99% [1], C angkang moluska terdiri dari 95%  kalsium  karbonat  dan  5%  matriks  organik  [11]. Cangkang  kerang  mengandung  95-99%  CaCO 3 [12,  13] . Kadar  air  yang  rendah  disebabkan  oleh  proses penjemuran  yang  sangat  lama.  Selain  itu,  proses penepungan  juga  ikut  mengurangi  kadar  air  yang terkandung  didalamnya,  hal  ini  disebabkan  oleh  panas yang dikeluarkan mesin planetary ball mill s elama proses penggilingan.  Kadar  air  yang  rendah  pada  cangkang kerang-kerangan  juga  telah  dilaporkan  oleh  beberapa peneliti  [2,  14,  15]  secara  berturut-turut 0,11%; 0,54% dan  0,85%.  Kadar  N-total  tepung  cangkang  tiram  yang digunakan sebagai bahan baku pembuatan kitosan adalah sebesar 1,73%. Hasil yang diperoleh ini tidak jauh berbeda dengan  penelitian  sebelumnya  yaitu  1,69%  [2].  Hal  ini juga diperkuat oleh laporan peneliti lain bahwa cangkang kijing mengandung 1,85% kadar N-total [16].

## 3.2. Isolasi Kitin dan Kitosan dari Cangkang Tiram

## 3.2.1. Demineralisasi
Tahap pertama yang dilakukan adalah demineralisasi  yaitu proses  penghilangan  mineral  pada cangkang  tiram  menggunakan  HCl  1  N.  Pemilihan  HCl sebagai pelarut dikarenakan mineral dapat larut dengan baik  pada  larutan  asam  membentuk  garam  klorida. Ekstraksi  berulang  ini  dilakukan  dengan  tujuan  agar penghilangan mineral yang terkandung dalam cangkang tiram berlangsung maksimal, berdasarkan hasil analisis tepung  cangkang  tiram  kadar  abu  yang  terkandung didalamnya  adalah  95,08%  sesuai  dengan  penelitian sebelumnya  kadar  abu  pada  cangkang  tiram  adalah sebesar  94,78%  [2].  Kandungan  mineral  yang  terdapat dalam  cangkang  tiram sebagian  besarnya adalah  CaCO 3 . Proses ekstraksi menggunakan HCl ini menghasilkan gas CO 2 yang ditandai dengan terbentuknya banyak buih dan gelembung-gelembung  udara  sekitar  5-10  menit. Mineral  yang  ada  pada  kitin  akan  hilang  dengan
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 224 – 231
terbentukya  CaCl 2 yang  dapat  dipisahkan  dari  residu. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:
CaCO 3(s) + 2HCl (l) → CaCl 2(l) + H 2 O (l) + CO 2(g)
Setelah  proses  demineralisasi  selesai,  maka diperoleh kitin bebas mineral namun masih mengandung protein sehingga dilanjutkan ke tahap deproteinasi.

## 3.2.2. Deproteinasi
Tahap  ini  merupakan  proses  penghilangan  protein dengan  menggunakan  NaOH  3  N.  Perlakuan  pada  tahap ini  akan  mengakibatkan  lepasnya  ikatan  antara  protein dengan  kitin  baik  yang  terikat  dengan  ikatan  kovalen maupun  terikat  secara  fisik.  Protein  akan  lepas  dan berikatan dengan ion Na + membentuk Na-proteinat yang larut  dalam  air  sehingga  protein  yang  terlepas  akan hilang  pada  tahap  penyaringan  dan  pencucian.  Pelarut basa  yang  digunakan  berupa  NaOH  dengan  konsentrasi tinggi,  suhu  tinggi  serta  pengadukan  yang  dapat meningkatkan  efisiensi  proses  deproteinasi.  Setelah proses deproteinasi ini selesai, maka hasil yang diperoleh adalah  berupa  kitin.  Kitin  yang  diperoleh  dianalisis menggunakan  FTIR  untuk  mengetahui  gugus  fungsi. Spektra yang dihasilkan dapat dilihat pada Gambar 1.

## 3.2.3. Deasetilasi
Untuk mendapatkan kitosan, kitin yang diperoleh di proses  lebih  lanjut  melalui  deasetilasi.  Tahap  ini merupakan  proses  penghilangan  gugus  asetil  (-COCH 3 ) dengan  gugus  hidrogen  sehingga  gugus  amida  (- NHCOCH 3 )  berubah  menjadi  gugus  amina  (-NH 2 ).
Pemutusan ikatan amida yaitu antara gugus asetil dengan gugus  nitrogen  agar  dapat  membentuk  gugus  amina digunakan  larutan  larutan  alkali  yaitu  NaOH  dengan konsentrasi 50% pada suhu 120°C selama 1 jam disertai pengadukan menggunakan magnetic stirrer . Penggunaan konsentrasi  dan  suhu  yang  tinggi  dapat  mempengaruhi derajat  deasetilasi  kitosan  yang  dihasilkan.  Semakin tinggi  konsentrasi  basa  yang  digunakan  maka  akan semakin banyak pula jumlah ion OH - yang bereaksi, dan semakin tinggi suhu yang digunakan, maka kemungkinan  antar  partikel  untuk  saling  bertumbukan akan semakin tinggi, sehingga laju reaksi yang dihasilkan juga  semakin  besar.  Presentase  transformasi  kitin menjadi  kitosan  adalah  sebesar  61,11%.  Kitosan  yang dihasilkan  dikarakterisasi  menggunakan  FTIR  dan dilanjutkan  untuk  perlakuan  menjadi  nanopartikel kitosan. Spektra FTIR kitosan dapat dilihat pada Gambar 2.

## 3.3. Rendemen Kitin Kitosan
Rendemen  merupakan  persentase  yang  dihasilkan dari  berat  bahan  baku  awal,  semakin  tinggi  nilai rendemennya  maka  semakin  baik  pula  proses  yang dilakukan.  Tingkat  keberhasilan  suatu  proses  dapat dilihat  dari  besarnya  nilai  rendemen  yang  diperoleh. Tahapan pembuatan kitin kitosan melalui 3 tahap, yaitu demineralisasi, deproteinasi dan deasetilasi.
Tabel 2. Rendemen Kitin dan Kitosan Produk Nilai ± stdev (%) Kitin 30,01 ± 0,08 Kitosan 61,11 ± 0,11
Keterangan: n = 2 (dua kali ulangan)
Tabel 2 menunjukkan rendemen kitin yang diperoleh adalah  sebesar  30%,  rendemen  kitosan  yang  diperoleh dari  perhitungan  jumlah  kitin  adalah  sebesar  61,11%. Sedangkan  besarnya  rendemen  kitosan  jika  dihitung berdasarkan  jumlah  sampel  bahan  baku  awal  tepung cangkang  tiram  adalah  sebesar  18,33%.  Nilai  rendemen ini  lebih  besar  dibandingkan  penelitian  terdahulu, kitosan  dari  cangkang  kerang  bulu  yaitu  37,5%  dan rendemen kitosan jika dihitung dari jumlah bahan baku awal tepung cangkang kerang bulu hanya sebesar 3,75% [5].

## 3.4. Karakterisasi Kitin Kitosan

## 3.4.1. Hasil Uji FTIR Kitin dan Kitosan
Kitin  dan  kitosan  yang  diperoleh  dikarakterisasi menggunakan FTIR untuk mengetahui gugus aktif yang terkandung didalamnya. Spektra FTIR pembentukan kitin dan kitosan hasil penelitian dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Prediksi gugus fungsi kitin dan kitosan cangkang tiram
Prediksi Gugus Fungsi Bilangan gelombang (cm -1 ) Kitin [17] Kitin [18] kitin hasil penelitian OH dan uluran NH 3448 3474,73 3554,15 Regangan C-H alifatik 2891,1 2883,58 2518,21 C=O ulur 1680- 1640 1660,71 1794,47 N-H bengkokan 1560- 1530 1554,63 1686,28 CH 3 1419,5 1431,18 1406,84 C-O-C 1072,3 1072,42 873,43 N-H kibasan 750-650  707,88 711,89
Spektra  kitin  cangkang  tiram  hasil  penelitian  tidak jauh  berbeda dengan  kitin  cangkang  udang  windu  yaitu pita  serapan  pada  bilangan  gelombang  3554,45  cm -1 disebabkan  oleh  vibrasi  pembengkokan  amida,  pada bilangan gelombang 1670,35 cm -1 muncul serapan akibat dari  vibrasi  peregangan  NH 2 (amina  sekunder)  [19]. Spektrum  FTIR  kitin  dari  cangkang  tiram  dapat  dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Spektra FTIR (A) Kitin (B) Kitosan (C) Nanokitosan, TPP 0,1% (D) Nanokitosan, TPP 0,5%
Spektrum  FTIR  yang  terlihat  pada  Gambar  1 menunjukkan  adanya  serapan  yang  muncul  pada bilangan gelombang 3551,15 cm -1 hal ini diakibatkan oleh adanya gugus fungsi OH ulur dan NH ulur sesuai dengan penelitian  [19]  pada  bilangan  gelombang  3554,45  cm -1 . Pita serapan yang sedang juga ditunjukkan pada bilangan gelombang  2518,21  cm -1 yang  menunjukkan  adanya gugus fungsi CH 2 ulur. Pada bilangan gelombang 1686,28 cm -1 menunjukkan  adanya  serapan  gugus  C=O  amida, gugus  fungsi  C-O-C  menyebabkan  pita  serapan  pada bilangan gelombang 1082 – 1031 cm -1 dan pada bilangan gelombang 873,43 cm -1 terjadi serapan yang disebabkan oleh  adanya  mineral  silika.  Spektra  kitin  dari  cangkang kerang darah memiliki pita serapan yang disebabkan oleh mineral silika pada bilangan gelombang 873,75 cm -1 [20].
Pada bilangan gelombang 3745 – 3418 cm -1 muncul pita serapan yang disebabkan oleh gugus fungsi OH dan NH.  Serapan  berikutnya  muncul  pada  bilangan gelombang  2291  cm -1 yang  mengindikaskan  adanya vibrasi peregangan simetris gugus fungsi CH alifatik. Pita serapan  yang  muncul  pada  bilangan  gelombang  1953- 1792  cm -1 diakibatkan  oleh  vibrasi  peregangan  gugus fungsi  C=O  amida  sekunder.  Pita  serapan  selanjutnya yang terbentuk adalah pada bilangan gelombang 1457 – 1407 cm -1 yang disebabkan oleh gugus fungsi C-O dan C- H.  Semetara  serapan  yang  terbentuk  pada  bilangan gelombang 998 – 965 cm -1 merupakan akibat dari adanya gugus C-O-C. Adanya kandungan silika pada kitosan dari cangkang  tiram  ditandai  dengan  terbentuknya  pita serapan  pada  bilangan  gelombang  871,67  cm -1. Hal  ini menandakan  bahwa  SiO 2 yang  terkandung  dalam cangkang tiram belum hilang setelah mengalami proses
deproteinasi  maupun  demineralisasi.  Cangkang  tiram mengandung 1,25% SiO 2 [21].

## 3.4.2. Mutu Kitosan
Untuk mendapatkan kitosan, kitin yang diperoleh di proses  lebih  lanjut  melalui  deasetilasi.  Tahap  ini merupakan  proses  penghilangan  gugus  asetil  (-COCH 3 ) dengan  gugus  hidrogen  sehingga  gugus  amida  (- NHCOCH 3 )  berubah  menjadi  gugus  amina  (-NH 2 ).  Mutu suatu  kitosan  ditentukan  oleh  besarnya  derajat deasetilasi (DD), semakin besar nilai DD maka gugus NH 2 yang  ada  pada  kitosan  semakin  banyak.  Derajat deasetilasi  dapat  dihitung  dari  spekta  infrared  (FT-IR) yang dihasilkan menggunakan metode garis dasar ( base line ) [22]. Derajat deasetilasi (DD) yang diperoleh sebesar 89,14%  dan  reaksi  deasetilasi  kitin  menjadi  kitosan sebagai berikut [23]:
Nilai  derajat  deasetilasi  menunjukkan  mutu  suatu kitosan  yang  berkaitan  dengan  kemurniannya,  semakin tinggi  nilai  DD  suatu  kitosan  maka  semakin  baik  pula mutunya. Semakin tinggi derajat deasetilasi kitosan maka semakin  banyak  gugus  amina  pada  rantai  molekul kitosan,  sehingga  kitosan  semakin  reaktif  karena banyaknya gugus amina yang menggantikan gugus asetil [24].  Derajat  deasetilasi  kitosan  yang  dihasilkan  pada penelitian  ini  adalah  sebesar  89,14%.  Nilai  DD  kitosan dari  cangkang  tiram  yang  dihasilkan  ini  tidak  jauh berbeda  dengan  nilai  DD  kitosan  hasil  penelitian- penelitian  sebelumnya  yang  juga  dibuat  dari  cangkang kerang-kerangan seperti nilai DD kitosan yang disintesis dari  cangkang  kerang  bulu  yaitu  sebesar  80,6%  [5].  DD kitosan  dari  cangkang  bekicot  77,99%  [25],  DD  kitosan dari cangkang rajungan 70,70% [26]. Perbedaan nilai DD ini  disebabkan  oleh  proses  deasetilasi  yang  berbeda. Proses  deasetilasi  sangat  dipengaruhi  oleh  konsentrasi dan  perbadingan  (pelarut  dan  jumlah  sampel)  serta faktor pemanasan.

## 3.5. Nanokitosan

## 3.5.1. Karakteristik Nanokitosan
Pembuatan  nanokitosan  dilakukan  dengan  dua variasi  yaitu  dengan  penambahan  TPP  0,1%  dan  0,5%. Penambahan  Tripoliposfat  (TPP)  berfungsi  sebagai reagen  c rosslinker membentuk  kitosan-TPP  melalui ikatan intermolekul dan intramolekul dengan reaksi ionik [27]  sehingga  dapat  menurunkan  derajat swelling (pembengkakan),  meningkatkan  sifat  biokompabilitas [9]  yaitu  kemampuan  suatu  material  untuk  bekerja selaras dengan tubuh tanpa menimbulkan efek lain yang berbahaya,  serta  dapat  memperkecil  ukuran  partikel sehingga  memperluas  permukaan  dan  meningkatkan daya adsorpsi kitosan [28]. Lamanya waktu homogenisasi pada saat penambahan TPP mempengaruhi kehomogenan  ukuran  partikel,  begitu  pula  dengan konsentrasi TPP yang ditambahkan, akan mempengaruhi kestabilan  dan  kekuatan  matrik  nanokitosan  yang
O H H H NHCOCH3 H OH CH2OH H O H H H NHCOCH3 H OH CH2OH H O O NaOH O H H H NH2 H OH CH2OH H O H H H NH2 H OH CH2OH H O O n n Kitin Kitosan
terbentuk sehingga membuat nanopartikel semakin kuat dan sulit terpecah [29]. Oleh sebab itu pada penelitian ini dilakukan  penambahan  konsentrasi  TPP  yang  berbeda.
Pembuatan nanokitosan pada penelitian ini menggunakan metode gelasi ionik dan pengecilan ukuran dengan magnetic  stirrer ,  karena  metode  ini  merupakan suatu  metode  yang  sederhana  untuk  membuat  partikel berukuran  nano.  Beberapa  penelitian  pembuatan nanokitosan  menggunakan  metode  ini  telah  dilakukan salah  satunya  membuat  nanokitosan  dari  cangkang udang  vannamei  [8].  Tween  80  merupakan  suatu surfaktan yang ditambahkan pada pembuatan nanokitosan  dengan  metode  gelasi  ion,  penambahan tween  80  ini  berfungsi  sebagai  pengemulsi  agar menstabilkan  partikel-partikel  kitosan  yang  telah terbentuk menjadi emulsi, sehingga pemecahan partikel akan  semakin  efektif  serta  diharapkan  dapat  mencegah terjadinya  aglomerasi.  Penambahan  surfaktan  tween  80 sebagai pengemulsi pada kitosan dilakukan karena tween 80 bersifat non toksik, TPP dan tween 80 merupakan zat tambahan  pangan  yang  diperbolehkan  dengan  batas maksimum penggunaan 70 mg/kg berat badan.

## 3.5.2. Analisis Gugus Fungsi Nanokitosan (Uji FTIR)
Gambar  1  menunjukkan  spektra  FTIR  nanokitosan dengan  penambahan  TPP  0,1%  dan  TPP  0,5%  .  FT-IR akan  mendeteksi  gugus-gugus  fungsi  yang  adal  pada kitosan seperti OH, NH, C-C. Sedangkan pada kitin FT-IR akan mendeteksi gugus-gugus tambahan lainnya seperti C=O dan CH. Spektra nanokitosan yang dihasilkan tidak jauh  berbeda dengan  spektra kitosan,  hanya ada sedikit pergeseran  bilangan  gelombang  yang  disebabkan  oleh adanya  penambahan  tripoliposfat  (TPP)  dan  tween  80. Spektra pada nanokitosan dengan penambahan TPP 0,1% terlihat  adanya  pita  serapan  pada  bilangan  gelombang 3697-3638  cm -1 yang  disebabkan  oleh  adanya  gugus fungsi OH dan NH. Sedangkan pada penambahan TPP 0,5 %  pita  serapan  muncul  pada  bilangan  gelombang  3399 cm -1 . Selanjutnya untuk nanokitosan dengan penambahan TPP 0,1 % terbentuk spektra pada bilangan gelombang 1405 cm -1 yang diakibatkan oleh adanya gugus fungsi  CH.  Sedangkan  untuk  nanokitosan  dengan penambahan  TPP  0,5%  serapan  terjadi  pada  bilangan gelombang 1410 cm -1. Hasil ini tidak jauh berbeda dengan spektra  kitosan  yang  dihasilkan  yaitu  1407  cm -1 . Nanokitosan  memiliki  pita  serapan  pada  bilangan gelombang 1412,31 cm -1 [9] 1637,32 cm -1 muncul karena adanya reaksi antara ion ammonium dan ion fosfat dari TPP  (0,1%),  1645  cm -1 [27]  sedangkan  dengan penambahan  TPP  (0,5%)  puncak  serupa  tidak  terbaca, namun untuk crosslink nanokitosan-TPP 0,1% dan 0,5% sama-sama  muncul  rentangan  yang  disebabkan  oleh jembatan  oksigen  yang  disebabkan  oleh  vibrasi rentangan  P-O, masing-masing pada  bilangan gelombang 1030,29 cm -1 dan 1029,37 cm -1 , serupa dengan penelitian terdahulu pada bilangan gelombang 1026 cm -1 [30]  dan  pada  1155  cm -1 [27].  Nanokitosan  dengan penambahan TPP 0,1 % menghasilkan spektra yang lebih baik  dari  penambahan  TPP  0,5%,  yaitu  terbentuknya puncak yang disebabkan oleh adanya crosslink antara ion fosfat  dan  ion  ammonium.  Penambahan  reagen crosslinker  TPP  0,1%  merupakan  konsentrasi  yang
optimum untuk membentuk partikel nanokitosan [8, 31]. Nanokitosan  hasil  terbaik  ini  dilanjutkan  untuk  uji morfologi  menggunakan  SEM  agar  dapat  dibandingkan dengan morfologi kitosan.

## 3.5.3. Morfologi (Uji SEM)
Hasil nanokitosan terbaik dengan variasi konsentrasi  tripoliphospat  dilanjutkan  untuk  uji morfologi  dan  melihat  distribusi  ukuran  partikel  yang diperoleh, kemudian dibandingkan dengan kitosan atau bahan awal sebelum dijadikan nanokitosan. Perbandingan  morfologi  kitosan  dengan  nanokitosan dikarakterisasi menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM). Adapun hasil gambar permukaan dari kitosan  dan  nanokitosan  disajikan  pada  Gambar  2  dan Gambar 3.
Gambar 2. Image SEM Morfologi Kitosan pada pembesaran 5000x
Gambar 3. Image SEM Morfologi Nanokitosan pada pembesaran 5000x
Hasil  uji  SEM  sebagaimana  terlihat  pada  gambar  2 dan  3  menunjukkan  bahwa  ukuran  partikel  kitosan terdistribusi  tidak  homogen  yaitu  antara  892  nm-1,54 µm,  sedangkan  ukuran  partikel  nanokitosan  yang diperoleh  terdistribusi  merata  antara  679  nm-910  nm. Namun  nanokitosan  yang  dihasilkan  mengalami aglomerasi, yaitu penggumpalan yang disebabkan karena ikatan  kuat  yang  terbentuk  antar  partikel  biasanya
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 224 – 231 230
disebut caking [32].  Hal  ini  dapat  disebabkan  karena proses pengeringan yang tidak menggunakan spray dryer hanya menggunakan oven kemudian dihaluskan dengan mortar. Ukuran partikel yang berbentuk padatan dengan kisaran  10-1000  nm  dapat  dikatakan  sebagai nanopartikel [33], polimer alam maupun polimer buatan yang  berukuran  10-1000  nm  (1  µm)  dapat  disebut nanopartikel  [34],  partikel  dengan  koloid  padat berukuran  1-1000  nm  juga  dapat  disebut  sebagai nanopartikel  [35],  dengan  demikian  dapat  disimpulkan bahwa  kitosan  yang  dihasilkan  berukuran  nano. Aglomerasi dapat terjadi pada kondisi tertentu secara tak terduga  yang merupakan suatu  fenomena  alam.  Banyak hal  yang  dapat  menyebabkan  terjadinya  aglomerasi, mekanisme  utama  yang  dapat  menyebabkan  partikel bahan  membentuk  ikatan  ialah  ikatan  mekanis,  ikatan fisika  kimia  (termasuk moisture  caking ),  pengisian elektrostatis, plastic-flow bonding atau  kombinasi keempatnya [36].

## 4. Kesimpulan
Rendemen kitin yang diperoleh adalah sebesar 30% dari  jumlah  bahan  baku  awal  tepung  cangkang  tiram, rendemen  kitosan  yang  diperoleh  dari  deasetilasi  kitin adalah  sebesar  61,11%.  Sedangkan  besarnya  rendemen kitosan jika dihitung berdasarkan jumlah sampel bahan baku  awal  adalah  sebesar  18,33%.  Derajat  deasetilasi kitosan  yang  diperoleh  adalah  89,14%.  ukuran  partikel kitosan  yang  diperoleh  antara  892  nm-1,54  µm, sedangkan  ukuran  partikel  nanokitosan  yang  diperoleh adalah antara 679 nm-910 nm.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Yoon  Gyo  Lee,  Ki-Chul  Chung,  Seung  Gon  Wi,  Jae Chang  Lee,  Hyeun-Jong  Bae,  Purification  and properties  of  a  chitinase  from  Penicillium  sp.  LYG 0704, Protein Expression and Purification , 65, 2, (2009) 244-250 http://dx.doi.org/10.1016/j.pep.2008.12.004
[2]  Lia  Handayani,  Faisal  Syahputra,  Isolasi  dan Karakterisasi  Nanokalsium  dari  Cangkang  Tiram (Crassostrea  Gigas), Jurnal  Pengolahan  Hasil Perikanan  Indonesia  (JPHPI) ,  20,  3,  (2018)  516-523 http://dx.doi.org/10.17844/jphpi.v20i3.19776
[3] Kjell M. Va˚rum, Olav Smidsrød, Chitosans, in: A.M. Stephen,  G.O.  Phillips,  P.A.  Williams  (Eds.) Food Polysaccharides  and  Their  Applications ,  CRC  Press, Boca Raton, 2006, pp. 497-520.
[4]  Marganof, Potensi Limbah Udang sebagai Penyerap Logam  Berat  (Timbal,  Kadmium  dan  Tembaga)  di Perairan, in, Institut Pertanian Bogor, Bogor, 2003.
[5]  Budi  Hastuti,  Nurina  Tulus,  Sintesis  Kitosan  dari Cangkang  Kerang  Bulu  (Anadara  inflata)  sebagai Adsorben  Ion  Cu 2+ , Seminar  Nasional  Kimia  dan Pendidikan Kimia VIII , Surakarta, (2015)
[6]  Dwi  Wahyono,  Ciri  Nanopartikel  Kitosan  dan Pengaruhnya  Pada  Ukuran  Partikel  dan  Efisiensi Penyalutan Ketoprofen, Sekolah Pascasarja, Institut Pertanian Bogor, Bogor
[7]  Annisa Ulfa Safitri, Aktivitas Antibakteri
Nanopartikel  Kitosan  Berbasis  Cangkang  Lobster Terhadap  Bakteri  Staphylococcus  Aureus  Dan
Staphylococcus Epidermidis, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
[8]  Desie  Rachmania,  Karakteristik  nano  kitosan cangkang  udang vannamei  (Litopenaeus  vannamei) dengan metode gelasi ionik, Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan  Indonesia  (JPHPI) ,  14,  2,  (2011)  78-84 http://dx.doi.org/10.17844/jphpi.v14i2.5315
[9]  Dessy  Kurniasari,  Sri  Atun,  Pembuatan  dan Karakterisasi  Nanopartikel  Ekstrak  Etanol  Temu Kunci  (Boesenbergia  pandurata)  pada  Berbagai Variasi  Komposisi  Kitosan, Jurnal  Sains  Dasar ,  6,  1,
(2017) 31-35 https://doi.org/10.21831/jsd.v6i1.13610
[10] Pipih  Suptijah,  Agoes  M  Jacoeb,  Nani  Deviyanti, Karakterisasi  dan  bioavailabilitas  nanokalsium cangkang udang Vannamei (Litopenaeus vannamei), Jurnal Akuatika , 3, 1, (2012) 63-73
[11]  Roberto  Acevedo,  Andrés  Soto  Bubert,  M.  Jiménez Guevara,  M  Belmar,  Microstructure  of  calcite  and aragonite  in  some  Chilean  gastropods  and  bivalves molluscs, Asian Journal of Spectroscopy , 14, 3, (2010) 63-76
[12] M. C. Barros, P. M. Bello, M. Bao, J. J. Torrado, From waste  to  commodity:  transforming  shells  into  high purity  calcium  carbonate, Journal  of  Cleaner Production , 17, 3, (2009) 400-407
https://doi.org/10.1016/j.jclepro.2008.08.013
[13] Nobutake  Nakatani,  Hitoshi  Takamori,  Kazuhiko Takeda,  Hiroshi  Sakugawa,  Transesterification  of soybean oil using combusted oyster shell waste as a catalyst, Bioresource Technology , 100, 3, (2009) 1510- 1513 https://doi.org/10.1016/j.biortech.2008.09.007
[14] Sri  Purwaningsih,  Pipih  Suptijah,  Isolasi  dan Karakterisasi  Nano  Kalsium  dari  Cangkang  Kijing Lokal  (Pilisbryoconcha  exilis)  dengan  Metode Presipitasi,  Departemen  Teknologi  Hasil  Perairan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
[15] Harry Permana, Optimalisasi pemanfaatan cangkang kerang  hijau  (Perna  viridis  L.)  dalam  pembuatan kerupuk, Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
[16] Asadatun  Abdullah,  Nurjanah,  Yulia  Kusuma Wardhani,  Karakteristik  fisik  dan  kimia  tepung cangkang kijing lokal (Pilsbryoconcha exilis), Jurnal Pengolahan  Hasil  Perikanan  Indonesia  (JPHPI) ,  13,  1,
(2010) 48-57 http://dx.doi.org/10.17844/jphpi.v13i1.1215 [17] Barbara H. Stuart, Infrared Spectroscopy: Fundamentals and Applications, Wiley, 2004.
[18] Sry  Agustina,  I  Made  Dira  Swantara,  I  Nyoman Suartha,  Isolasi  kitin,  karakterisasi  dan  sintesis kitosan  dari  kulit  udang, Jurnal  Kimia ,  9,  2,  (2015) 271-278
[19] Edward  J.  Dompeipen,  Marni  Kaimudin,  Riardi  P Dewa,  Isolasi  Kitin  dan  Kitosan  dari  Limbah  Kulit Udang, Majalah  BIAM ,  12,  1,  (2016)  32-39 http://dx.doi.org/10.29360/mb.v12i1.2326
[20] Syaiful  Bahri,  Erwin  Abd  Rahim,  Syarifuddin Syarifuddin,  Derajat  Deasetilasi  Kitosan  dari Cangkang Kerang Darah dengan Penambahan NaOH secara  Bertahap, KOVALEN ,  1,  1,  (2015)  36-42 https://doi.org/10.22487/j24775398.2015.v1.i1.5161
[21] B.-Y. Zhong, Q. Zhou, C. F. Chan, Y Yu, Structure and property  characterization of oyster  shell  cementing
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 224 – 231 231
material, Chinese Journal of Structural Chemistry , 31, 1,
(2012) 85-92
[22] Julian G. Domszy, George A. F. Roberts, Evaluation of infrared  spectroscopic  techniques  for  analysing chitosan, Die Makromolekulare Chemie , 186, 8, (1985)
1671-1677 http://dx.doi.org/10.1002/macp.1985.021860815
[23] George  A.F.  Roberts,  Chitin  Chemistry,  Macmillan Education UK, 1992.
[24] Tri  Winarni  Agustini,  Sri  Sedjati,  The  Effect  of Chitosan  Concentration  and  Storage  Time  on  the Quality  of  Salted-Dried  Anchovy  (Stolephorus heterolobus), Journal  of  Coastal  Development ,  10,  2,
(2013) 63-71
[25] Triana Kusumaningsih, Abu Masykur, Usman Arief, Pembuatan  kitosan  dari  kitin  cangkang  bekicot (Achatina fulica), Biofarmasi , 2, 2, (2004) 64-68
[26] Emma Rochima, Karakterisasi Kitin dan Kitosan Asal Limbah  Rajungan  Cirebon  Jawa  Barat, Buletin Teknologi Hasil Perikanan , 10, 1, (2007) 9-22
[27] Devika R. Bhumkar, Varsha B. Pokharkar, Studies on effect of pH on cross-linking of chitosan with sodium tripolyphosphate: A technical note, AAPS PharmSciTech , 7, 2, (2006) E138-E143
http://dx.doi.org/10.1208/pt070250
[28] Puji  Rahayu,  Khabibi  Khabibi,  Adsorpsi  Ion  Logam Nikel(II)  oleh  Kitosan  Termodifikasi  Tripolifosfat, Jurnal  Kimia  Sains  dan  Aplikasi ,  19,  1,  (2016)  21-26 10.14710/jksa.19.1.21-26
[29] Wen-Li  Du,  Shan-Shan  Niu,  Ying-Lei  Xu,  Zi-Rong Xu, Cheng-Li Fan, Antibacterial activity of chitosan tripolyphosphate  nanoparticles  loaded  with  various metal ions, Carbohydrate Polymers , 75, 3, (2009) 385- 389 https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2008.07.039
[30] Mardiyah Kurniasih, Nurul Hidayat Aprilita, Indriana Kartini, Sintesis dan Karakterisasi Crosslink Kitosan Dengan Tripolifosfat pH 3, Molekul , 6, 1, (2011) 19-24 http://dx.doi.org/10.20884/1.jm.2011.6.1.86
[31] Swara  Yudhasasmita,  Andhika  Puspito  Nugroho, Sintesis  dan  Aplikasi  Nanopartikel  Kitosan  Sebagai Adsorben Cd dan Antibakteri Koliform, Biogenesis , 5, 1, (2017) 42-48 https://doi.org/10.24252/bio.v5i1.3432
[32] Dianita  Indah  Prahmila,  Aplikasi  Nano  Kitosan sebagai  Pengawet  Alami  Fillet  Nila  Merah (Oreochromis  sp.)  Selama  Penyimpanan  Suhu Chilling,  Departemen  Teknologi  Hasil  Perairan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
[33] V.  J.  Mohanraj,  Y  Chen,  Nanoparticles – A  Review, Tropical  Journal  of  Pharmaceutical  Research ,  5,  1,
(2006) 561-573
[34] Jörg  Kreuter,  Nanoparticulate  systems  for  brain delivery of drugs, Advanced Drug Delivery Reviews , 47,
1,  (2001)  65-81 https://doi.org/10.1016/S0169- 409X(00)00122-8
[35] Kalpana Nagpal, Shailendra Kumar Singh, Dina Nath Mishra, Chitosan Nanoparticles: A Promising System in Novel Drug Delivery, Chemical and Pharmaceutical
Bulletin , 58, 11, (2010) 1423-1430 http://dx.doi.org/10.1248/cpb.58.1423
[36] Jairo  Paternina,  Preventing  moisture  caking,  the unwanted  agglomeration,  in:    Powder  and  Bulk Engineering Magazine, 2014.