Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri Malang Disetujui: 11 Oktober 2020
Jl. Soekarno Hatta No. 9, Malang 65141, Indonesia
© 2020 Politeknik Negeri Malang
E-mail: yanty.maryanty@polinema.ac.id

## Pembuatan Asam Laktat dari Selulosa oleh Bakteri Lactobacillus delbrueckii dengan Selulase dari Bakteri
Bacillus subtilis dan Bacillus circulans

## Yanty Maryanty*, Fandi Lintang Wahyu Saputra, Robby Prasetyo
Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri Malang, Jl. Soekarno Hatta 9 Malang *E-mail: yanty.maryanty@polinema.ac.id

## ABSTRAK
Bakteri asam laktat memanfaatkan gula sebagai sumber energi, pertumbuhan, dan menghasilkan metabolit berupa asam  laktat  selama  proses  fermentasi.  Gula  berupa  monomer  glukosa  dapat  diperoleh  dari  hidrolisis  atau pemutusan  ikatan  pada  selulosa. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  memproduksi  asam  laktat dari  media  selulosa menggunakan m etode Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF). SSF diharapkan bermanfaat untuk pengembangan  produksi  asam  laktat  yang  efektif  dari  limbah  lignoselulosa. Pada  tahap  pertama,  selulosa digunakan oleh Bacillus subtilis dan Bacillus circulans untuk memproduksi enzim selulase. Tahap kedua, enzim selulase  kemudian  digunakan  untuk  sakarifikasi  selulosa  menghasilkan  glukosa.  Glukosa  yang  diperoleh difermentasi oleh Lactobacillus delbrueckii menghasilkan asam laktat. Proses pada tahap kedua ini terjadi secara simultan,  setelah  itu  proses  fermentasinya  digunakan  metode  SSF,  dengan  variasi  konsentrasi  enzim  selulase untuk  proses  sakarifikasi  berasal  dari Bacillus  subtilis dan Bacillus  circulans . Proses  awal  pembuatan  enzim selulase menggunakan bakteri Bacillus subtilis dan Bacillus circulans sebagai variabel dan waktu inkubasi selama 84 jam. Enzim selulase selanjutnya digunakan untuk mendegradasi media selulosa dalam proses SSF menjadi glukosa yang selanjutnya akan difermentasi oleh Lactobacillus delbrueckii . Pada proses SSF dengan inokulum Bacillus  circulans diperoleh  asam  laktat  tertinggi  pada  kadar  enzim  selulase  10%  yaitu  1,29%  dan  dengan inokulum Bacillus subtilis pada kadar enzim selulase 5% yaitu 1,24%.
Kata kunci : Asam laktat, Bacillus circulans, Bacillus subtilis , selulosa, selulase.

## ABSTRACT
Lactic acid bacteria use sugar as an energy source, growth, and produce metabolites in the form of lactic acid during  the  fermentation  process.  This  research  aimed  to  make  lactic  acid  from  cellulose  used  Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF). Cellulose is composed of glucose monomers. This method is expected to be useful for the development of significant lactic acid production from lignocellulosic waste. In the first stage, cellulose was used by Bacillus subtilis and Bacillus circulans to produce cellulase enzymes. In the second stage, the  cellulase  enzyme  is  then  used  to  saccharify  cellulose  to  produce  glucose.  The  glucose  fermented  by Lactobacillus  delbrueckii to produce  lactic  acid.  The  fermentation  process  uses  the  SSF  method  with various concentrations  of  cellulase  enzymes.  The  initial  process  by  making  cellulase  enzymes  first  used  the  bacteria Bacillus subtilis and Bacillus circulans as variables, and the incubation time was 84 hours. The cellulase enzyme is  then  used  to  degrade  cellulose  media  in  the  SSF  process  into  glucose,  which  will  then  be  fermented  by Lactobacillus  delbrueckii .  In  the  SSF  process  with Bacillus  circulans inoculum,  the  highest  lactic  acid  was obtained  at  10%  cellulase  enzyme  levels,  amounting  to  1.29%,  and  with Bacillus  subtilis inoculums  at  5% cellulase enzyme levels, amounting to 1.24%.
Keywords : Bacillus circulans, Bacillus subtilis , cellulase, cellulose, lactic acid.

## 1. PENDAHULUAN
Asam laktat, secara alami mengandung asam organik yang banyak manfaatnya. Pada saat ini,  penelitian  mengenai  asam  laktat
berkembang  semakin  pesat  karena  asam laktat  memiliki  potensi  yang  besar  dalam pemanfaatannya  pada  berbagai  aspek  pada industri pangan maupun non-pangan seperti
bahan pengawet pada industri pangan, pakan ternak ( feedstock ). Sementara untuk industri non-pangan digunakan pada industri farmasi, industri  tekstil  maupun  bahan  kimia  untuk industri kosmetik.
Salah  satu  pemanfaatan  asam  laktat  yaitu dalam  bentuk  polimernya  menjadi  bahan baku  plastik  ramah  lingkungan  yang  dapat didegradasi  yaitu  PLA  ( Poly  Lactic Acid )/poli  asam  laktat  [1,2].  Dikarenakan sifat  yang  unik  dari  PLA,  asam  laktat memiliki  potensi  menjadi  bahan  pengganti untuk digunakan di pabrik plastik degradable dan  menjadi  komoditas  yang  sangat  besar sebagai  bahan  kimia  antara.  Asam  laktat sendiri  secara  alami  juga  mengandung  dua isomer  optik,  D-(-)-asam  laktat  dan  L-(+)- asam laktat. Akan tetapi, D-asam laktat tidak dapat dicerna oleh tubuh manusia atau dalam kata  lain  berbahaya  untuk  dikonsumsi, berbeda  dengan  L-asam  laktat  yang  dapat dicerna tubuh manusia dan banyak digunakan dalam industri makanan dan farmasi [3]. Asam laktat dapat diproduksi melalui sintesis kimia  maupun  proses  fermentasi.  Proses sintesis asam laktat terjadi melalui hidrolisa laktonitril yang berasal dari asetaldehida dan hidrogen sianida. Sementara itu, pembentukan  asam  laktat  secara  biologis dapat  dihasilkan satu  isomer atau campuran isomer asam laktat yang berbeda tergantung oleh  mikroorganisme,  substrat,  dan  kondisi pertumbuhan  yang  digunakan.  Adapun pembentukan  asam  laktat  melalui  proses secara  kimia  hanya  dapat  menghasilkan campuran dari kedua isomer asam laktat [4]. Asam  laktat  secara  biologis  dihasilkan  oleh bakteri asam laktat (BAL).
BAL membutuhkan gula untuk aktivitas metabolism  dan  perkembangbiakan  sel dengan salah satu produk metabolik sekunder berupa asam laktat.
Gula  berupa  glukosa  merupakan  penyusun utama  dari  pati  maupun  polimer  selulosa. Untuk menghindari persaingan dengan sektor pangan,  sumber  gula  dari  selulosa  sangat potensial  untuk  digunakan  BAL  dalam menghasilkan  asam  laktat.  Kandungan selulosa  banyak  terdapat  pada  limbah
biomassa lignoselulosa tanaman. Pemanfaatan  limbah  lignoselulosa  saat  ini dikembangkan  sebagai  alternatif  pengganti pembuatan asam laktat melalui sentesis kimia dibanding melalui cara biologis.
Metode SSF merupakan salah satu biokoversi material  karbohidrat  yang  lebih  efektif karena  pada  proses  ini  penggunaan  enzim penghidrolisis  substrat  karbohidrat  dan fermentasi  turunan  glukosa  hasil  hidrolisis oleh  mikroba  terjadi  dalam  satu  tahapan proses.  SSF  ini  telah  digunakan  untuk memproduksi  asam  laktat  dari  bahan  dasar pati  dengan  bakteri  asam  laktat  diantaranya spesies  Lactobacillus  dan  Lactococcus  [5]. Namun  metode  SSF  belum  banyak diterapkan untuk biokonversi selulosa murni menjadi asam laktat.
Keberhasilan  proses  fermentasi  sangat dipengaruhi  oleh  keberhasilan  dalam mengoptimalkan faktor-faktor dari pertumbuhan  mikroba  yang  diinginkan. Faktor-faktor  tersebut  akan  memberikan kondisi  yang  berbeda  untuk  setiap  mikroba sesuai dengan lingkungan hidupnya masing- masing  sehingga  mempengaruhi  kinetika fermentasinya  [6].  Perbedaan  bahan  baku sumber  glukosa  menyebabkan  perbedaan adaptasi mikroorganisme. Hal tersebut dapat diamati salahsatunya dengan kurva pertumbuhan  yang  merupakan  bagian penting  dari  suatu  penelitian  karena  dapat menggambarkan  karakteristik  kolonisasi bakteri [7].
Penelitian  ini  dilakukan  dalam  upaya pemanfaatan  sumber  gula  dari  biomassa lignoselulosa  untuk  menghasilkan  asam laktat. Bacillus  subtilis dan Bacillus circulans dipilih untuk menghasilkan enzim selulase. Selulase digunakan untuk memecah selulosa dari biomassa lignoselulosa menjadi monomer glukosa. Glukosa yang dihasilkan selanjutnya  dikonversi  menjadi  asam  laktat oleh  bakteri  asam  laktat Lactobacillus delbrueckii. Produksi  asam  laktat  ini dilakukan  secara  simultan  menggunakan metode  SSF.  Penelitian  ini  juga  dilakukan untuk  mengetahui  pengaruh  konsentrasi crude selulase  pada  pembentukan  asam
laktat.  Hasil  penelitian  ini  diharapkan menjadi  salah  satu  alternatif  produksi  asam laktat  yang  diproduksi  dari  limbah lignoselulosa,  sehingga  dapat  mengurangi pemakaian  sumber  pati  yang  merupakan salah satu bahan pangan manusia.

## 2.  METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  dilakukan  melalui  metoda eksperimental yang meliputi beberapa tahap berkesinambungan  Dalam  proses  penelitian ini dibutuhkan alat - alat antara lain incubator shaker,  autoclave, jarum  ose,  timbangan analitik, pH meter, Erlenmeyer, dan peralatan titrasi, Spektrofotometer UV-Vis. Sedangkan  bahan-bahan  yang  dibutuhkan dalam proses ini antara lain Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Lactobacillus delbruckii, media Nutrient Agar (NA) (Merck), media de Man  Rogosa  Sharpe agar  (MRS)  (Oxoid), Nutient  Broth  (NB),  Hidroksipropil  Metil Selulosa  (Hpmc),  Buffer  Sitrat-fosfat  pH  5, Kertas Indikator pH universal, air demineralisasi  steril,  DNS  (Himedia),  dan larutan induk glukosa.
Tahapan-tahapan yang dilakukan pada proses ini dibagi menjadi beberapa tahap.
2.1. PEREMAJAAN  STRAIN Bacillus subtilis DAN Bacillus circulans Pembuatan media pada percobaan ini dengan menggunakan  NA,  dengan  cara  melarutkan NA  instan  sebanyak  20  gram  ke  dalam erlenmeyer  dan  menambahkan  1000  mL aquades,  memanaskannya  diatas  hot  plate diikuti oleh pengadukan. Setelah larutan NA homogen,  disterilisasi  dengan  autoclave. Larutan  NA  kemudian  didinginkan  dan dimiringkan  dalam  tabung  reaksi.  Setelah dingin, diinokulasi dengan Bacillus  subtilis , Bacillus  circulans ,  dan Lactobacillus delbrueckii lalu  diinkubasi  selama  lebih kurang 24 jam.

## 2.2. PEMBUATAN INOKULUM CAIRAN
Sebanyak 8 gram NB dilarutkan dalam 1000 mL  akuades.  Disterilisasi  dalam  autoclave selama 30 menit pada suhu 121 ⁰ C. Bacillus
subtillis, Bacillus circulans, dan Lactobacillus  delbrueckii dari  agar  miring ditambahkan  sebanyak  1  ose  ke  dalam  NB yang sudah disterilisasi. Kemudian diinkubasi  pada  rotary shaking  incubator selama 24 jam pada suhu 37°C dan kecepatan agitasi 150 rpm.

## 2.3. PEMBUATAN KURVA PERTUMBUHAN
Pembuatan  kurva  standar  dan  kurva pertumbuhan Bacillus  subtillis dan Bacillus circulans dilakukan  dengan  menggunakan medium  NB.  Sebelum  pembuatan  kurva standar  dan  kurva  pertumbuhan,  perlu dilakukan  aktivasi  terhadap  isolat  bakteri yang  digunakan.  Pertama  10  mL  dalam tabung  reaksi  diinokulasi  satu  ose  kultur kerja,  dinkubasi  24  jam  pada  suhu  37 ⁰ C. Aktivasi  kedua  yaitu  menginokulasi  90  mL NB dengan 10 mL kultur pertama. Aktivasi ketiga  dilakukan  dengan  memindahkan  25 mL  dari  tabung  kedua  kedalam  Erlenmeyer ukuran 500mL isi 225 mL NB dan diinkubasi kembali  pada  suhu  37 ⁰ C  selama  24  jam. Setelah  diinkubasi,  inokulum  dianalisa terlebih  dahulu  dengan  spektrofotometri untuk menyamakan optikal densitinya untuk kurva  pertumbuhan.  Pada  pembuatan  kurva pertumbuhan  ini,  bakteri  ditumbuhkan  pada media  selulosa  dan  dianalisa  menggunakan spektrofotometri  dengan  interval  sampling waktu pertumbuhan setiap 12 jam selama 120 jam [8], dengan beberapa modifikasi.

## 2.4. UJI AKTIVITAS ENZIM SELULASE
Aktivitas  enzim  ditentukan  menggunakan metode  DNS  yang  dimodifikasi.  Suspensi sampel bakteri disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang merupakan  ekstrak  enzim  kasar  diuji aktivitas  enzimnya.  Sebanyak  1,8  ml substrast  (1%  selulosa  CM-Cellulose (Sigma))  ditambah  dengan  0,2  ml  enzim ekstrak  kasar,  dikocok  kuat  dengan  vortex, selanjutnya  diinkubasi  30  menit  pada  suhu 50 ⁰ C,  aktivitas  enzim  dihentikan  pada  air mendidih  selama  5  menit.  Setelah  itu,  dari
larutan  tersebut  diambil  sebanyak  1  ml  dan ditambah  dengan  1  ml  DNS,  dipanaskan  di air mendidih selama 5-10 menit. Absorbansi diukur  pada  λ  540  nm  menggunakan spektrofotometer.  Perlakuan  kontrol  dan blanko  dilakukan  secara  bersamaan  dengan metode  dan  tahapan  yang  sama  pada pengujian sampel. Kontrol merupakan enzim yang  telah  diinaktivasi  terlebih  dahulu direaksikan  dengan  substrat,  sedangkan blanko tidak menggunakan enzim melainkan menggunakan buffer sitrat-fosfat pH 5 yang direaksikan  dengan  substrat.  CMC,  Avicel, Selobiosa merupakan substrat yang digunakan  untuk  melihat  masing-masing aktivitas dari endoglukanase, eksoglukanase dan selobiose, berturut-turut. endoglukanase, eksoglukanase  dan  selobiose  merupakan jenis  dari  enzim  selulase.  Aktivitas  enzim selulase  diukur  pada  setiap  waktu  sampling sehingga diketahui waktu optimum produksi enzim  selulase  [9-12].  Metode  DNS  dapat mengukur kadar gula pereduksi dalam hal ini glukosa.  Semakin  banyak  glukosa  yang terbentuk  karena  adanya  aktivitas  selulase menghidrolisis selulosa, maka semakin besar aktivitas selulase.

## 2.5. PROSES SSF
Tahap  selanjutnya  adalah  proses  fermentasi dengan meggunakan metode SSF. Fermentasi ini menggunakan hasil sakarifikasi  selulosa  dengan  enzim  selulase dengan  berbagai  variasi  yaitu  5%,  7,5%, 10%, 12,5%, dan 15% pada temperatur ruang (28 0 C)  selama  0-5  hari  dengan  media selulosa.  Sedangkan  proses  fermentasi  hasil sakarifikasi  menggunakan  bakteri  asam laktat yaitu Lactobacillus delbrueckii .

## 2.6 ANALISA ASAM LAKTAT
Analisa  asam  laktat  dilakukan  dengan metode titrasi dan analisa dengan spektrofotometri  UV-Vis.  Uji  kuantitatif kadar  Asam  Laktat  dilakukan  secara alkalimetri  dengan  metode  titrasi.  Pertama masukkan 1 ml hasil yang telah difermentasi dan encerkan sampai 10 ml dengan aquades dalam  Erlenmeyer  250  ml,  ditambahkan  3
tetes  larutan  indikator  pp  1%.  Kemudian dilanjutkan  titrasi  dengan  larutan  NaOH 0,5x10 -2 N  hingga  terjadi  perubahan  warna merah  muda.  Kadar  asam  dihitung  sebagai asam laktat dengan rumus:
% 𝐴𝑠𝑎𝑚 𝐿𝑎𝑘𝑡𝑎𝑡
= (𝑉𝑥𝑁)𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑥 𝐵𝑀 𝐴. 𝐿𝑎𝑘𝑡𝑎𝑡 𝑥 100%
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝐵𝑎ℎ𝑎𝑛(𝑔)𝑥 1000
Dengan V= volum titran, N= Normalitas

## NaOH, BM= berat molekul

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  penelitian  ini  dilakukan  pembuatan asam laktat dari media selulosa oleh bakteri Lactobacillus delbueckii dengan selulase dari bakteri Bacillus  subtilis dan Bacillus circulans yang  diaplikasikan  sebagai  bahan baku  utama  pembuatan  plastik degradable . Asam  laktat  ini  diproduksi  dari  media selulosa murni melalui fermentasi menggunakan metode SSF.

## 3.1.  KURVA PERTUMBUHAN
Pembuatan  kurva  pertumbuhan  bertujuan untuk  menentukan  waktu  optimum Bacillus circulans dan Bacillus  subtilis dalam memproduksi  crude  enzim  selulase.  Setelah mengetahui waktu optimal Bacillus circulans dan Bacillus  subtilis berdasarkan  kurva pertumbuhan, waktu tersebut dapat digunakan dalam lama waktu pembibitan dan produksi crude selulase.
Gambar 1.  Kurva  pertumbuhan Bacillus circulans dan Bacillus  subtilis dalam media selulosa  ( ♦ Bacillus  circulans , ▲ Bacillus subtilis)
Seperti  yang  disajikan  Pada  Gambar  1 menjelaskan  bahwa  bakteri  mengalami  fase pertumbuhan yang cukup signifikan. Jumlah
0.00E+00 1.00E+08 2.00E+08 3.00E+08 4.00E+08 0 50 100 150 jum la h sel/m l Waktu (jam)
sel mula-mula yang diberikan sebesar 10 % b/v  dari  media  yang  digunakan  dengan kisaran jumlah sel 10 6 / ml. Pada kurun awal dapat  dikatakan  sebagai  fase  adaptasi Bacillus circulans terhadap media pertumbuhannya,  peningkatan  ukuran  sel, mulai  pada  waktu  sel  sedikit  mengalami pembelahan. Fase log atau fase eksponensial terjadi  pada  jam  ke-12  sampai  jam  ke-72. Pada  fase  ini  sel  berada  dalam  keadaan pertumbuhan  yang  seimbang.  Selama  fase ini,  masa  dan  volume  sel  meningkat  oleh faktor  yang  sama  dalam  arti  rata-rata komposisi  sel  dan  konsentrasi  metabolit relatif  tetap  konstan.  Fase  stasioner  terjadi pada jam ke-72 sampai jam ke-84. Pada fase ini,  bakteri  sudah  mulai  kehilangan  nutrien dan  terjadi  penumpukan  produk  metabolit. Fase  stasioner  terjadi  pada  saat  laju pertumbuhan  bakteri  sama  dengan  laju kematiannya.  Sehingga  jumlah  bakteri keseluruhan bakteri akan tetap. Keseimbangan  jumlah  keseluruhan  bakteri ini terjadi karena adanya pengurangan derajat pembelahan  sel.  Hal  ini  disebabkan  oleh kadar  nutrisi  yang  berkurang  dan  terjadi akumulasi produk toksik sehingga mengganggu pembelahan sel. Fase stasioner ini  dilanjutkan  dengan  fase  kematian  yang ditandai  dengan  peningkatan  laju  kematian yang melampaui laju pertumbuhan, sehingga secara  keseluruhan  terjadi  penurunan populasi  bakteri.  Pada  umumnya  waktu inkubasi  bakteri  24-48  jam.  Pengamatan dengan  interval  waktu  kurang  dari  12  jam dapat menghasilkan profil pertumbuhan dari fase adabtasi hingga fase kematian yang lebih baik. Pada kurva pertumbuhan, fase stasioner tidak terlalu terlihat dan langsung menunjukkan  fase  kematian.  Sehingga ditentukan  waktu  inkubasi  pada  jam  ke-72, dimana  pada  waktu  tersebut Bacillus circulans dan Bacillus subtilis menunjukkan pertumbuhan optimal.

## 3.2.  ANALISA AKTIVITAS ENZIM
Analisa  aktivitas  selulase  menggunakan metode DNS dan kurva baku glukosa dengan spektrofotometri. Metode DNS adalah untuk
menguji  konsentrasi  gula  reduksi  dari absorbansi yang terbaca pada grafik standar glukosa,  yang  kemudian  dari  kurva  standar tersebut  digunakan  untuk  menghitung konsentrasi  gula  pereduksi  dalam  sampel. Intensitas  warna  menunjukkan  banyaknya gula pereduksi dengan pengujian menggunakan  panjang  gelombang  540  nm. Apabila  semakin  tinggi  kadar  gula  reduksi yang  terdapat  dalam  sampel,  maka  akan semakin  banyak  pula  molekul  asam-3- amino-5-nitrosalisilat yang terbentuk, sehingga  absorbansi  sampel  akan  semakin tinggi.  Bila  terdapat  gula  reduksi  pada sampel,  maka  larutan  DNS  yang  awalnya berwarna kuning akan bereaksi dengan gula reduksi sehingga menimbulkan warna jingga kemerahan [10].
Sampel yang telah direaksikan dengan DNS selanjutnya ditentukan kadar gula pereduksinya dengan menggunakan spektrofotometer  UV-Vis.  Agar  dapat menentukan kadar gula reduksi pada sampel, terlebih  dahulu  dibuat  kurva  standar menggunakan  larutan  glukosa  yang  telah direaksikan  dengan  DNS  dan    ditentukan kadar  gula  reduksinya.  Panjang  gelombang yang digunakan 540 nm. Dari kurva standar tersebut  akan  didapatkan  persamaan  garis, yang menunjukan hubungan antara konsentrasi dan absorbansi dengan persamaan umum : Y=ax+b .....................................................(1)
dengan y merupakan  absorbansi, a merupakan  slope, x merupakan  konsentrasi sampel, dan b merupakan intersep.
Dengan mensubtitusi nilai absorbansi sampel ke persamaan tersebut, maka dapat diketahui konsentrasi  atau  kadar  gula  pereduksi  pada sampel. Dari persamaan ini, dapat dihitungan kadar  glukosa  sebagai  produk  dari  reaksi enzim  selulase  terhadap  substrat  pada beberapa  seri  konsentrasi  substrat  dengan menggunakan  data  hasil  pengamatan  nilai absorbansi dari tiap sampel [13].
Analisa  aktivitas  selulase  menggunakan metode DNS dan kurva baku glukosa dengan
spektrofotometri.  Inkubasi  yang  dilakukan selama  84  jam  tersebut  bertujuan  untuk mengecek  aktivitas  enzim  selulase  dan karakter dari enzim selulase yang dihasilkan. Aktivitas  enzim  diukur dari  jumlah  glukosa yang  dihasilkan  oleh  ekstrak  kasar  enzim. Enzim  selulase  bekerja  untuk  memutus ikatan  glikosidik  pada  selulosa  menjadi glukosa  (dimana  selulosa  adalah  polimer dengan  monomernya  yaitu  selobiose  yang merupakan gabungan dari dua unit glukosa). Secara  teoritik  reaksi  hidrolisis  selulase menjadi glukosa adalah sebagai berikut :
(C 6 H 10 O 5 )n + n H 2 O n C 6 H 12 O 6 .........(2)
Sedangkan  reaksi  parsial  selulosa  menjadi selobiosa sebagai berikut :
(C 6 H 10 O 5 )n + 𝑛 2 H 2 O 𝑛 2 (C 12 H 22 O 11 )....(3)
Sedangkan  reaksi  hidrolisis  selobiosa menjadi glukosa sebagai berikut : 𝑛 2 C 6 H 10 O 11 + 𝑛 2 H 2 O n C 6 H 12 O 6 ..........(4)
Gambar 2. Aktivitas eksoglukonase bakteri Bacillus subtilis (▲) dan Bacillus circulans ( ♦ ) pada media selulosa
Berdasarkan  Gambar  2,  dapat  dilihat penurunan aktivitas enzim setelah jam ke-84 dikarenakan adanya akumulasi produk yang telah terbentuk
sebelumnya
dan menyebabkan  penghambatan  bagi  enzim selulase  [14].  Hal  ini  juga  berlaku  pada penurunan  saat  pengujian  aktivitas  enzim eksoglukonase  (Gambar  2)  dan  glukosidase (Gambar 3).
Aktifitas  optimum eksoglukanase pada  jam ke-84  sebesar  26,54  U/ml  untuk Bacillus subtilis dan  sebesar  31,18  U/ml  untuk Bacillus circulans . Adapun aktifitas optimum
glukosidase pada  jam  ke-84  sebesar  388,20 U/ml  untuk Bacillus  subtilis dan  sebesar 731,72 U/ml untuk Bacillus circulans . Waktu yang  tepat  untuk  produksi  enzim  selulase ditentukan  dari  aktifitas  enzim  yang  telah dilakukan sebelumnya, yaitu dari jam ke-12 hingga  jam  ke-120.  Dilihat  dari  aktifitas enzim  masing-masing  bakteri  dan  substrat diperoleh  waktu  optimum  yang  sama  yaitu pada jam ke-84.
Gambar 3.  Aktivitas  glukosidase  bakteri
Bacillus subtilis (▲) dan Bacillus
circulans ( ♦ ) pada media selulosa

## 3.3.  PENENTUAN  WAKTU  TERBAIK SSF
Profil  pembentukan  asam  laktat  yang dilakukan ini merupakan langkah awal untuk mendapatkan  kadar  asam  laktat  tertinggi dengan cara menentukan waktu yang terbaik pada proses SSF. Dapat dilihat pada Gambar 4, asam  laktat  yang diperoleh terdapat  pada jam ke 48, sehingga pada jam ke 36-lah yang dijadikan  waktu  yang  terbaik  dalam  proses SSF.
Gambar 4. Profil pembentukan asam laktat dengan  konsentrasi  enzim  selulase  10%
Bacillus subtilis (▲) dan Bacillus circulans ( ♦ )

## 3.4.  PEMBUATAN ASAM LAKTAT
Produksi asam laktat oleh bakteri Lactobacillus  delbrueckii yang  diperoleh 0 500 1000 0 50 100 150 ak tiv ita s en zim (U/m l) waktu (jam) 0 10 20 30 0 50 100 150 ak tiv ita s en zim (U /m l) waktu (jam) 0.00% 0.05% 0.10% 0.15% 0 50 100 150 K ad ar a sa m la kta t (% ) Waktu (jam)
seperti terlihat pada Gambar 5. Selama proses SSF crude selulase  yang  ditambahkan dengan variasi, yaitu 5%; 7,5%; 10%; 12,5%; 15%. Lama fermentasi sesuai dengan waktu yang  terbaik  pada  saat  pembentukan  asam laktat  menggunakan  kadar  enzim  selulase 10% yaitu selama 36 jam.
Gambar 5.  Kurva  kadar  asam  laktat Lactobacillus delbrueckii dari enzim selulase hasil  sakarifikasi Bacillus  susbtilis (░)  dan Bacillus circulans ( ■ ) dalam media selulosa
Lactobacillus delbrueckii bersifat homofermentatif yang mampu menghasilkan 2-asam  laktat  [15]  sehingga  mendapatkan hasil  yang  terbaik  pada  pemberian  kadar enzim  sebesar  5%  untuk Bacillus  subtilis dengan media selulosa dengan menghasilkan asam  laktat  1,24%.  Berbeda  dengan  bakteri Bacillus circulans pada kadar enzim yang ke 10%  dengan  media  selulosa  menghasilkan 1,29%  asam  laktat.  Sedangkan  untuk  kadar enzim  yang  lain  hasil  kadar  asam  laktatnya mengalami  kenaikan  dan  penurunan  yang tidak beraturan hal ini dikarenakan interaksi enzim  dengan  substrat  yang  semakin  lama menyebabkan semakin banyak glukosa yang terbentuk.  Namun,  pada  waktu  hidrolisis tetrtentu konsentrasi glukosa akan mengalami penurunan.
Penurunan disebabkan oleh adanya akumulasi  produk  yang  telah  terbentuk sebelumnya
dan menyebabkan penghambatan bagi enzim selulase. Inhibitor enzim selulase berupa produk dari hidrolisis selulosa  yaitu  glukosa  dan  selobiosa. Selobiosa menghambat enzim eksoglukonase sedangkan  glukosa  menghambat  enzim  - glukosidase [16].
Pada penelitian yang telah dilakukan Huang [2], menyebutkan bahwa waktu yang terbaik untuk metode SSF ini adalah 36-48 jam. Hal ini sesuai dengan hasil yang diperoleh dalam penelitian ini, untuk waktu optimum inkubasi pada  metode  SSF  yaitu  36  jam.  Disamping itu, fermentasi dengan hasil terbaik pada pH 6,0  dan  suhu  30 0 C  untuk  proses  SSF  yang menghasilkan asam laktat dengan perolehan asam  laktat  0,87-0,97  g/g  pati  bersamaan dengan  pembentukan  biomassa  1,5-2,0  g/L. Pada  penelitian  ini  juga  digunakan  variabel yang tetap pada suhu yang mendekati dengan penelitian  tersebut  dengan  hasil  yang  kami dapat 1,24% asam laktat dari Bacillus subtilis dengan  kadar  enzim  5%  dan  1,29%  asam laktat  dari Bacillus  circulans dengan  kadar enzim 10%.
Pramudyanti et  al (2004)  telah  melakukan kajian  tentang  pengaruh  pH  terhadap produksi  asam  laktat  dalam  kajian  tersebut, dilakukan pada variable pengontrolan pH 5, 6,  7  dan  diperoleh  hasil  tertinggi  untuk produksi  asam  laktat  metode  SSF  dengan pengaturan  pH  pada  pH  6,0  dengan  hasil 35,75  g/L.  Sedangkan  pada  penelitian  ini tidak dilakukan pengaturan pH [17].

## 4.  KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian, waktu optimum pertumbuhan untuk sakarifikasi oleh bakteri Bacillus subtilis dan Bacillus circulans yaitu pada  fase  stasioner  di  jam  ke-84. Bacillus circulans dapat menghasilkan enzim selulase lebih  tinggi  daripada Bacillus  subtilis. Bacillus circulans menghasilkan asam laktat tertinggi.  Variasi  enzim  selulase  yang digunakan  pada  metode  SSF  ini  ialah  5%, 7,5%,  10%,  12,5%  dan  15%  menghasilkan konsentrasi  asam  laktat  1,24%;  0,98%; 0,84%;  0,98%;  dan  1,02%  dari Bacillus subtilis . Pada variasi konsentrasi yang sama Bacillus circulans menghasilkan asam laktat sebagai  berikut:  1,15%;  0,75%;  1,29%; 1,20%  ;  dan  1,15%.  Hasil  terbaik  pada metode SSF ini yaitu pada konsentrasi enzim 5%  untuk Bacillus  subtilis dengan  media selulosa  yang  menghasilkan  asam  laktat sebesar 1,24% dan bakteri Bacillus circulans
0.0% 0.5% 1.0% 1.5% 5% 7.5% 10% 12.5% 15% K ons ent ra si A sa m L ak ta t (%) Konsentrasi Enzim (%)
pada kadar enzim 10% menghasilkan 1,29% asam laktat.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  Pemerintah Indonesia melalui pendanaan Hibah Bersaing.

## DAFTAR PUSTAKA
[1].   R. Datta, S. P. Tsai, P. Bonsignore, S. H.  Moon,  J.  R.  Frank,  Technological and economic potential  of poly(lactic acid)  and  lactic  acid  derivatives, FEMS Microbiol. Rev. , vol. 16, no. 2 – 3, hal. 221 – 231, 1995.
[2].   L. P. Huang, B. Jin, P. Lant, J. Zhou, Simultaneous  saccharification  and fermentation of potato starch wastewater to lactic acid by Rhizopus oryzae  and  Rhizopus  arrhizus, Biochem.  Eng.  J. ,  vol.  23,  no.  3,  hal. 265 – 276, 2005.
[3].  C. Åkerberg, K. Hofvendahl, B. Hahn- Hägerdal,  G.  Zacchi,  Modelling  the influence of pH, temperature, glucose and  lactic  acid  concentrations  on  the kinetics  of  lactic  acid  production  by Lactococcus  lactis  ssp.  lactis  ATCC 19435  in  whole-wheat  flour, Appl.
Microbiol. Biotechnol. , vol. 49, no. 6, hal. 682 – 690, 1998.
[4].  P.  Yin,  N.  Nishina,  Y.  Kosakai,  K. Yahiro, Y. Park, M. Okabe, Enhanced production  of  L(+)-lactic  acid  from corn  starch  in  a  culture  of  Rhizopus oryzae  using  an  air-lift  bioreactor, J. Ferment. Bioeng. , vol.  84, no. 3, hal. 249 – 253, 1997.
[5].  P. Cheng, R. E. Mueller, S. Jaeger, R. Bajpai,  E.  L.  Iannotti,  Lactic  acid production from enzyme-thinned corn starch using Lactobacillus mylovorus, J.  Ind.  Microbiol. ,  vol.  7,  no.  1,  hal.
27 – 34, 1991.
[6] Y.  H.  Pratiwi,  O.  Ratnayani,  I.  N. Wirajana,  Perbandingan  Metode  Uji Gula  Pereduksi  Dalam  Penentuan Aktivitas α -L-Arabinofuranosidase Dengan Substrat Janur Kelapa (Cocos
Nucifera), J. Kim. , vol. 12, no. 2, hal.
134 – 139, 2018.
[7] Y.  Maryanty,  S.  B.  Sumitro,  A.  Tri, Suharjono, Effect of Particle Size and Pretreatment on Cellulose
Degradation  of  Rice  Straw  from Agricultural  Land  in  Malang, Int.  J. ChemTech  Res. ,  vol.  10,  no.  4,  hal.
600 – 610, 2017.
[8] Y.  Maryanty,  dan  T.  Anisa, Pembuatan Asam Laktat Dari Molase Dan Limbah Cair Tahu Menggunakan Lactobacillus Bulgaricus dan Rhizopus  Oryzae,  in:  Prosiding Seminar  Nasional  Rekayasa  Proses Industri Kimia, 2020 [9]   A.  Sharah,  R.  Karnila,  Desmelati, Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri  Asam  Laktat  yang  Diisolasi dari Ikan Peda Kembubg ( Rastrelliger sp. ), J. Online Mhs. Bid. Perikan. dan Ilmu  Kelaut. ,  vol.  2,  no.  2,  hal.  1 – 8,
2015.
[10]   Purkan, H. Purnama, dan S. Sumarsih, Produksi Enzim Selulase dari aspergillus niger Menggunakan
Sekam Padi dan Ampas Tebu sebagai Induser., J. Ilmu Dasar , no. 2, hal. 95 – 102, 2015.
[11]  B. Adney dan J. Baker, Measurement of  Cellulase  Activities:  Laboratory Analytical Procedure (LAP), 2008.
[12].  I.  R.  Pramudyanti,  T.  Purwoko,  A. Pangastuti,  Pengaruh  Pengaturan  pH dengan  CaCO3  terhadap  Produksi Asam  Laktat  dari  Glukosa  oleh
Rhizopus oryzae, Bioteknologi , vol. 1, no. 1, hal. 19 – 24, 2004.
[13]  Yuliana,  Kinetika  Pertumbuhan  Baktei Asam  Laktat  Isolay  T5  yang  Berasal dari  Tempoyak, Jurnal  teknologi industri  dan  hasil  pertanian ,  vol.  73, no.2, hal. 108-116, 2008.
[14]  I.  P.  Wood,  A.  Elliston,  P.  Ryden,  I. Bancroft,  I.  N.  Roberts,  K.  W. Waldron,  Rapid  quantification  of reducing
sugars in biomass hydrolysates: Improving the speed and precision  of  the  dinitrosalicylic  acid assay, Biomass  and  Bioenergy ,  vol. 44, hal. 117 – 121, 2012.
[15].   K.  S.  Ambriyanto,  Isolasi  dan
Karakterisasi Bakteri Aerob Pendegradasi  Selulosa  dari  Serasah Daun  Rumput  Gajah  ( Pennisetum purpureum  schaum ),  skripsi,  Biologi, Institut Teknologi Sepuluh Nopember, 2010.
[16]  Y.  Maryanty,  K.  Widjayanti,  S. Rulianah,  F.  Krisna.,  T.  Endahwati,
Meiliefiana,  W.  P.  Juwita,  Effect concentration  addition  of  crude cellulase  by  aspergillus  niger  on  rice straw media for biodeingking application, in: AUN/SEED-Net
Regional  Conference  on  Chemical Engineering, 2014.
[17]  V. M. Talantan, Marina, O. Lambui, I. N.  Suwastika,  Uji  Aktivitas  Selulase Dari  Jamur  Selulolitik  Asal  Tanah Danau  Kalimpa’a  Sulawesi  Tengah,
Nat. Sci. J. Sci. Technol. , vol. 7, no. 3, hal. 323 – 333, 2018.