THE  EFFECTIVENESS  OF PHALERIA  MACROCARPA’S  LEAF  NANOEMULSION  GEL  ON STAPHYLOCOCCUS AUREUS BIOFILM THICKNESS (IN VITRO)
Rosa Pratiwi*, Irma Dewi Ratnawati * , Feny Nursyaputri**, Recita Indraswary***

## ABSTRACT
Background: Periodontal disease often occurs in the oral cavity with 75.6-78.3% at the age of 35-44 years. One of the causes of periodontal disease  is  the  accumulation  of  Staphylococcus  aureus  biofilm  in  the early  colonization  of  the  formation  of  the  dental  pellicle.  Phaleria macrocarpa,  also  known  as  Gods  Crown,  is  a  traditional  plant  with antibacterial  properties  that  can  be  used  in  the  health  sector. Nanoemulsion  gel  technology  has  the  advantage  of  increasing  the stability  of  the  material.  Aim  the  study  to  determine  the  ratio  of  the effectiveness  of  Phaleria  macrocarpa’s  leaf  nanoemulsion  gel  10%, 20%, 30% to decrease Staphylococcus aureus biofilm thickness.
Method:  This  research  method  was  in  vitro  experimental  laboratory research using a post-test control design. Thirty samples were divided into  five  groups:  Phaleria  macrocarpa’s  leaf  nanoemulsion  gel  10%, 20%,  30%,  positive  control  using  chlorhexidine  gluconate  0.2%  and negative control using aqua dest. Samples were incubated for 4 and 8 hours.  Optical  density  readings  were  carried  out  to  see  the  biofilm thickness after being given a Gods Crown leaves nanoemulsion gel Results: The mean of Phaleria macrocarpa’s leaf nanoemulsion gel, 30%,  produced  the  lowest  average  optical  density  value.  The incubation time of 4 hours resulted in a lower optical density value than 8  hours.  The  Kruskal-Wallis  was  p>0.05  showed  there  was  no difference in biofilm thickness in each group.
Conclusion:  the  effectiveness  of  the  nanoemulsion  group  of  Dewa crown leaf gel with a concentration of 30% was better than the 0.2% chlorhexidine gluconate gel and sterile distilled water group.

## PENDAHULUAN
Penyakit  periodontal  banyak  terjadi pada  rentang  usia  35-44  tahun  sebesar  75,6- 78,3%  menurut  data  Riset  Kesehatan  Dasar (RISKESDAS) tahun 2018 1 .
Penyakit periodontal  yang  sering  dijumpai  adalah gingivitis dan periodontitis 2 . Gingivitis digambarkan  dengan  gingiva  berwarna  merah kebiruan yang mengalami pembesaran karena edema,  serta  sering  ditandai  dengan  mudah berdarah  jika  terdapat  stimulasi  seperti
menyikat  gigi 3,4 .  Gingivitis  yang  tidak  segera ditangani akan berlanjut menjadi periodontitis 5 . Periodontitis  merupakan  peradangan  pada jaringan  pendukung  gigi  yang  disebabkan mikroorganisme  yang  akan  menyebabkan destruksi tulang alveolar dan ligamen periodontal. Penyakit periodontal dapat disebabkan oleh beberapa faktor seperti faktor lokal, sistemik, dan lingkungan 3 .
* Department of Periodontology Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Islam Sultan Agung ** Undergraduate student. Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Islam Sultan Agung *** Department of Oral Biology Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Islam Sultan Agung
Correspondence: rosapratiwi@unissula.ac.id
Keywords:
Biofilm; Phaleria macrocarpa ’s leaf;
Nanoemulsion gel; Optical density; Staphylococcus aureus .
Salah  satu  faktor  lokal  terjadinya penyakit  periodontal  yaitu  akumulasi  plak 6 . Terdapat interaksi akumulasi bakteri plak pada permukaan  gigi  dengan  sel  imun  tubuh  yang sering  ditemukan  pada  keadaan  kebersihan rongga  mulut  yang  buruk 7,8 .  Plak  merupakan kesatuan lapisan tipis protein biofilm dari saliva yang  bersifat  lunak  dan  transparan  dengan hasil  agregasi  mikroorganisme  yang  saling melekat pada permukaan gigi 9,10 .
Tahapan  pembentukan  plak  terdapat tiga  tahapan,  yaitu  kolonisasi  awal  dengan pembentukan dental pelikel, kolonisasi sekunder,  dan  maturasi  plak.  Kolonisasi  awal plak diawali dengan terbentuknya lapisan tipis yang  merupakan  kontaminasi  selapis  biofilm dari  saliva  (glikoprotein)  pada  permukaan jaringan  dengan  flora  normal  rongga  mulut, serta  debris  makanan  yang  melekat  pada permukaan gigi yang disebut pelikel 7 . Kolonisasi sekunder ditandai dengan terjadinya penurunan  jumlah  bakteri  gram  positif  aerob dan meningkatnya jumlah bakteri gram negatif anaerob 8 .  Tahap  maturasi  plak  yaitu  proses metabolisme  bakteri  secara  terus  menerus dengan  bertambah  banyaknya  jumlah  koloni bakteri  dari  sesil  menjadi  bentuk  motil 5,10 . Apabila proses ini terjadi secara terus menerus pada  kurun  waktu  yang  cukup  lama  dengan kebersihan  rongga  mulut  yang  buruk  disertai respon imun yang tidak adekuat menyebabkan terjadinya  proses  inflamasi  pada  jaringan pendukung gigi dan mengalami kerusakan 11 . Salah satu bakteri penyebab plak yaitu Staphylococcus aureus 10 . Staphylococcus aureus merupakan  bakteri  flora  normal  di dalam  rongga  mulut  gram  positif  yang berbentuk bulat membentuk koloni secara tidak teratur  seperti  buah  anggur 12 . Staphylococcus aureus merupakan  bakteri  fakultatif  anaerob yang  tidak  bergerak  dan  tidak  membentuk
spora,  serta  dapat  tumbuh  dan  berkembang secara optimum pada suhu 37 o C 13 . Staphylococcus  aureus mempunyai  selaput polisakarida  yang  berperan  sebagai  virulensi bakteri yang menimbulkan penyakit berspektum luas. Staphylococcus aureus dapat melakukan  pembelahan  sel  secara  cepat  dan menyebar luas ke jaringan serta memproduksi bahan  ekstraseluler  yang  mengakibatkan infeksi  pada  manusia.  Infeksi  lokal  ditandai dengan  nyeri,  reaksi  inflamasi  kuat  dan terlokalisir 14 .
Pertumbuhan  bakteri Staphylococus aureus penyebab plak perlu dilakukan pengendalian dengan memanfaatkan tanaman herbal  yang  memiliki  kandungan  senyawa antibakteri  dalam  bentuk  sediaan  nanoemulsi gel  daun  mahkota  dewa 15,16 .  Kandungan senyawa antibakteri pada daun mahkota dewa yaitu  flavonoid,  tanin,  alkaloid,  triterpenoid, saponin,  dan  polifenol 17 .  Kandungan  tersebut terbukti  dapat  menghambat  pertumbuhan  dan perkembangan bakteri Staphylococcus aureus dalam proses pembentukan plak 18 . Kandungan dalam  daun  mahkota  dewa  seperti  flavonoid akan  mengganggu  aktivitas  permeabilitas dinding  bakteri  yang  akan  menyebabkan bakteri  lisis,  tanin  berperan  mengikat  protein dalam  pembentukan  dinding  sel  bakteri, alkaloid  berperan  mengganggu  penyusunan peptidoglikan  sel  bakteri  yang  mengakibatkan dinding  sel  bakteri  tidak  terbentuk  sempurna, dan  saponin  berperan  dalam  mengganggu permeabilitas  dinding  sel  bakteri  dengan  cara merusak membrane sitoplasma 17,19 .
Penelitian-penelitian  yang  sudah  ada didapatkan  bukti  bahwa  daun  mahkota  dewa lebih  efektif  dalam  menghambat  bakteri  gram positif, seperti Staphylococcus aureus dibandingkan dengan bakteri gram negatif. Hal ini  disebabkan  dari  komponen  penyusun
membran  sel  bakteri  gram  positif  dan  bakteri gram  negatif  yang  berbeda.  Membran  sel bakteri  gram  positif  terdiri  atas  peptidoglikan sebanyak 50% dan tidak mengandung
lipopolysaccharides ,  sedangkan  bakteri  gram negatif  terdiri  dari  peptidoglikan  sebanyak  2- 10% dan lipopolysaccharides 20 .
Kemajuan  ilmu  pengetahuan  dan teknologi seiring berkembangnya zaman memperkenalkan  tentang  stabilisasi  sistem terdispersi dan produksi dalam bentuk nanoemulsi gel. Nanoemulsi gel secara efektif digunakan  untuk  meningkatkan  stabilitas bahan aktif dan ketersediaan hayati 21 . Nanoemulsi gel merupakan penghantar bersifat  hidrofobik  yang  berukuran  droplet  1- 100 nm yang terdiri dari sistem dispersi koloid yang dicampurkan dengan basis gel 22,23 .
Selain  bahan  herbal  masih  banyak dokter  gigi  menggunakan  bahan  kimia  untuk upaya  pengendalian  plak  yaitu chlorhexidine
gluconate
0,2%
gel 24 . Penggunaan chlorhexidine dalam  jangka  panjang  akan menimbulkan  efek  samping  yaitu  perubahan rasa kecap, iritasi mukosa, staining , keseimbangan  flora  normal  rongga  mulut terganggu,  dan xerostomia 25 . Chlorhexidine merupakan  bahan  yang  sering  digunakan sebagai  antibakteri  kelompok  kontrol  positif dalam  penelitian. Chlorhexidine yaitu  zat antimikroba berspektrum luas yang merupakan salah  satu gold  standard untuk  mencegah terbentuknya  plak  dengan  cara  menghambat proses  pertumbuhan  dan  perkembangan  plak sehingga mencegah terjadinya penyakit periodontal 26 .
Berdasarkan penjelasan tersebut penulis  ingin  melakukan  penelitian  untuk mengetahui  efektivitas  nanoemulsi  gel  daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) terhadap
ketebalan  biofilm  bakteri Staphylococcus aureus ( In Vitro ).

## METODE
Penelitian  ini  telah  mendapat  ijin  dari
Komite Tim Etik Penelitian Fakultas
Kedokteran  Gigi  Universitas  Islam  Sultan Agung  dengan  nomor  236/B.1-KEPK/SA- FKG/2020.  Jenis  penelitian  adalah  penelitian eksperimental  laboratorium  secara in  vitro dengan desain true experimental post test only control group.
Sampel  berjumlah  30  buah  yang terbagi dalam 10 kelompok. Kelompok nanoemulsi  gel  daun  mahkota  dewa  dengan konsentrasi  10%,  20%,  30%, chlorhexidine gluconate  0,2% gel,  dan aquades  steril yang tiap  kelompok  dibagi  menjadi  waktu  inkubasi biofilm 4 jam dan 8 jam dengan masing-masing dilakukan 3 kali pengulangan.
Penelitian dilakukan dengan pengumpulan saliva oleh satu orang responden agar  saliva  yang  digunakan  sebagai  sampel homogen. Pengumpulan saliva dengan metode spitting  out .  Metode spitting out adalah pengambilan  saliva  yang  dilakukan  dengan cara  mengumpulkan  saliva  di  dasar  mulut selama  5  menit,  kemudian  dimasukkan  ke dalam  gelas  ukur.  Responden  mengunyah permen  karet  xylitol  selama  5  menit  untuk menstimulus  saliva  agar  laju  saliva  yang didapatkan banyak.
Kriteria responden yaitu kesehatan umum baik, tidak  memiliki  riwayat  penyakit  sistemik, penyakit tiroid, dan tidak sedang mengonsumsi antibiotic dan memiliki surat keterangan uji tes PCR dengan hasil negatif .
Ekstrak  daun  mahkota  dewa  dibuat menggunakan  metode  maserasi.  Sebanyak 250  gram  daun  mahkota  dewa  yang  telah
dibersihkan menggunakan air mengalir dipotong  kecil-kecil  kemudian  dikeringkan. Daun  mahkota  dewa  yang  telah  kering dihaluskan menggunakan blender. Selanjutnya merendam  250  gram  serbuk  daun  mahkota dewa dalam 1000 ml pada larutan etanol 96% sampai  seluruhnya  terendam  selama  24  jam dengan  bantuan shanker. Ekstrak  disaring untuk  memisahkan  ampas  dan  filtratnya. Selanjutnya  filtrat  dievaporasi  menggunakan rotary  evaporator pada  suhu  50 C  untuk menguapkan semua etanol sehingga didapatkan ekstrak kental daun mahkota dewa.
Ekstrak  yang  sudah  siap  selanjutnya dilakukan pembuatan nanoemulsi ekstrak daun mahkota  dewa  dengan  cara  menyampurkan ekstrak daun mahkota dewa dengan 3,6 gram Tween 80 dengan 100 gram aquadest sampai homogen  menggunakan  alat homogenizer dengan kecepatan 1000 rpm selama 30 menit. Larutkan  0,1  gram  metil  parabean  dan  0,02 gram  propil  parabean  ke  dalam  10  gram propilen  glikol  beserta palm  oil kemudian ditambahkan  ke  dalam  campuran  bahan sebelumnya dan dihomogenkan kembali menggunakan over  stirrer .  Kemudian  satukan fase  minyak  dan  air  hingga  homogen menggunakan over  stirrer dengan  kecepatan 1000 rpm selama 1 jam.
Pembuatan  basis  gel  diawali  dengan mencampurkan HMPC 4000 dengan aquadest hingga terdispersi seluruhnya dan homogen di dalam  mortir.  Diamkan  campuran  tersebut selama  1  jam  sampai  terbentuk  massa  gel. Setelah  terbentuk  massa  gel  dilakukan penambahan 0,1 gram metil parabean, 2 gram
propil parabean dan 2 gram gliserin kemudian diaduk hingga homogen. Kemudian campurkan basis gel dengan seluruh formulasi nanoemulsi gel  daun  daun  mahkota  dewa  dalam  suhu ruangan  menggunakan  alat homogenizer dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit.
Dilakukan  pembiakan  murni  bakteri Staphylococus  aureus yang  akan  digunakan dalam
penelitian
tersebut. Bakteri Staphylococus  aureus diinokulasi  terlebih dahulu dalam media nutiren agar. Bakteri yang sudah  diinokulasi  kemudian  diinkubasi  pada suhu  37 o C  selama  24  jam. Setelah  itu, dilakukan uji ketebalan biofilm dengan metode microtiter  plate  biofilm  assay menggunakan media well-plate steril  yang  sudah  dilapisi saliva kemudian diinkubasi pada suhu ruangan dengan  waktu  4  jam  dan  8  jam.  Selanjutnya dibilas  dengan Phospate  Buffer  Saline (PBS) kemudian diberi bakteri Staphylococcus aureus dan  pengaplikasian  nanoemulsi  gel  daun mahkota  dewa  dengan  berbagai  konsentrasi (10%,  20%,  30%),  diberikan chlorhexidine gluconate 0,2% gel sebagai kontrol positif dan aquades  steril sebagai  kontrol    negatif  yang diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  48  jam. Setelah diinkubasi dilakukan pencucian dengan  PBS  dan aquadest  steril serta pewarnaan  menggunakan crystal  violet 1%
kemudian dilakukan pencucian kembali menggunakan aquadest steril dibiarkan sampai kering dan ditambahkan etanol 96% diinkubasi selama  15  menit  dalam  suhu  ruangan.
Kemudian  dilakukan  analisa  hasil  sampel dengan metode ELISA-reader .

## HASIL
Berdasarkan  hasil  pembacaan  nilai optical  density biofilm Staphylococcus  aureus (Tabel 1) didapatkan nilai rerata paling rendah yaitu kelompok  nanoemulsi  gel  daun  mahkota
dewa  konsentrasi  30%    dalam  waktu  inkubasi saliva 4 jam yang artinya memiliki kemampuan keefektifan  paling  tinggi  dalam  menghambat ketebalan  biofilm  bakteri Staphylococcus aureus.
Berdasarkan data hasil yang didapatkan kemudian  dilakukan  uji  normalitas  dan  uji homogenitas (Tabel 2). Uji normalitas dilakukan  dengan  menggunakan  metode Saphiro-Wilk dengan  hasil  nilai  beberapa kelompok  seperti  kelompok  konsentrasi  10% dalam 8 jam, kelompok konsentrasi 20% dalam 4 jam, dan kelompok konsentrasi 30% dalam 4 jam  merupakan  data  terdistribusi  tidak  normal (p<0,05).  Uji  homogenitas  dengan  Uji Levene
didapatkan  semua  nilai  yaitu  p<0,05  yang berarti semua data tidak homogen.
Berdasarkan hasil data yang didapatkan menunjukkan  data  terdistribusi  tidak  normal dan  tidak  homogen,  sehingga  dilakukan  uji nonparametrik yaitu Kruskal-Wallis didapatkan nilai  p=  0,088  sehingga  nilai  p>0,05  yang berarti  tidak  terdapat  perbedaan  signifikan pada ketebalan biofilm masing-masing kelompok (Tabel 3).
Tabel 1. Nilai rerata optical density Kelompok Sampel Rerata 1 2 3 Nanoemulsi gel konsentrasi 10% 4 jam 3,132 2,068 1,619 2,273 Nanoemulsi gel konsentrasi 10% 8 jam 3,269 3,264 2,355 2,963 Nanoemulsi gel konsentrasi 20% 4 jam 2,610 1,785 1,767 2,054 Nanoemulsi gel konsentrasi 20% 8 jam 3,161 3,100 2,402 2,888 Nanoemulsi gel konsentrasi 30% 4 jam 2,256 2,243 1,372 1,957 Nanoemulsi gel konsentrasi 30% 8 jam 2,990 2,758 2,028 2,592 Kontrol + 4 jam 2,518 2,437 2,288 2,414 Kontrol + 8 jam 3,356 3,346 3,296 3,333 Kontrol – 4 jam 3,073 2,966 2,857 2,965 Kontrol – 8 jam 3,284 3,221 3,173 3,226
Tabel 2. Uji Normalitas dan Uji Homogenitas Kelompok N Saphiro-Wilk Levene Sig. Sig. Konsentrasi 10% (dalam 4 jam) 3 ,560 ,030 Konsentrasi 10% (dalam 8 jam) 3 ,009 Konsentrasi 20% (dalam 4 jam) 3 ,036 Konsentrasi 20% (dalam 8 jam) 3 ,138 Konsentrasi 30% (dalam 4 jam) 3 ,025 Konsentrasi 30% (dalam 8 jam) 3 ,445 Kontrol Positif (dalam 4 jam) 3 ,677 Kontrol Positif (dalam 8 jam) 3 ,298
Kontrol Negatif (dalam 4 jam) 3 ,990 Kontrol Negatif (dalam 8 jam) 3 ,851 Tabel 3. Nilai rerata standar deviasi dan uji Kruskal-Wallis
Kelompok N Mean Std. Dev Kruskal-Wallis (Sig.) Konsentrasi 10% (dalam 4 jam) 3 2,273 ,777 ,088 Konsentrasi 10% (dalam 8 jam) 3 2,963 ,526 Konsentrasi 20% (dalam 4 jam) 3 2,054 ,482 Konsentrasi 20% (dalam 8 jam) 3 2,888 ,422 Konsentrasi 30% (dalam 4 jam) 3 1,957 ,507 Konsentrasi 30% (dalam 8 jam) 3 2,592 ,502 Kontrol Positif (dalam 4 jam) 3 2,414 ,117 Kontrol Positif (dalam 8 jam) 3 3,333 ,032 Kontrol Negatif (dalam 4 jam) 3 2,965 ,108 Kontrol Negatif (dalam 8 jam) 3 3,226 ,056

## DISKUSI
Penggunaan herbal sebagai agen terapeutik meningkat pesat beberapa tahun terakhir ini. Salah satu herbal yang sering digunakan adalah mahkota dewa  ( Phaleria  macrocarpa ).  Tanaman  ini  dapat dimanfaatkan baik buah  maupun  daunnya. Penelitian-penelitian  yang  dilakukan  sebelumnya menunjukkan bahwa tanaman ini dapat bermanfaat sebagai anti bakteri, anti inflamasi, antioksidan dan bahan  sebagai  anti  kanker.  Hasil  uji  toksisitas menunjukkan  bahwa  ekstrak  daun  mahkota  dewa ( Phaleria  macrocarpa )  relatif  aman.  Efek  samping penggunaan mahkota dewa sebagai agen terapeutik lokal hampir tidak ditemukan. Penelitian lain  ada  yang  menyebut  bawa  ekstrak  mahkota dewa  dapat  menyebabkan  peningkatan  hormon testosterone, karena kandungan saponinnya.
Hasil  nilai optical  density pada  penelitian mengenai efektivitas nanoemulsi gel daun mahkota dewa  terhadap  ketebalan  biofilm Staphylococcus aureus yang terbentuk pada kelompok nanoemulsi gel daun mahkota dewa dengan konsentrasi 10%, 20%,  30%,  kelompok  kontrol  positif  ( chlorhexidin gluconate 0,2% gel), dan kelompok kontrol negatif ( aquades  steril )  menunjukkan  bahwa  nanoemulsi gel  daun  mahkota  dewa konsentrasi  30%  dalam waktu  inkubasi  4  jam memiliki  efek  antibakteri terbesar  dalam  menghambat  ketebalan  biofilm bakteri Staphylococcus aureus.
Nilai  rerata optical  density menunjukkan ketebalan  biofilm  bakteri Staphylococcus  aureus. Semakin  rendah  nilai  rerata optical  density yang diperoleh  mengartikan  bahwa  pada  kelompok perlakukan tersebut paling optimal dalam menurunkan
ketebalan
biofilm
bakteri Staphylococcus aureus. Sedangkan semakin tinggi nilai  rerata optical  density yang  diperoleh  pada kelompok  perlakuan  mengartikan  bahwa  biofilm bakteri Staphylococcus  aureus yang  terbentuk semakin tebal.
Hasil  rerata  nilai optical  density penelitian didapatkan  pengurangan  warna  biru  pada  media well-plate setiap  kenaikan  konsentrasi  formulasi nanoemulsi  gel  daun  mahkota  dewa  ( Phaleria macrocarpa ).  Penelitian  mengenai  nanoemulsi  gel daun  mahkota  dewa  konsentrasi  30%  memiliki insensitas  warna  yang  lebih  terang  dibandingkan kelompok  penelitian  konsentrasi  10%  dan  20%. Disimpulkan bahwa kelompok penelitian nanoemulsi  gel  daun  mahkota  dewa  konsentrasi 30%  mempunyai  daya  antibakteri  yang  terbesar dari kelompok penelitian konsentrasi yang lain 14 .
Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian sebelumnya  yang  menunjukkan  bahwa  ekstrak daun mahkota dewa konsentrasi 10% sudah efektif menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Pada penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa  semakin  besar  konsentrasi  yang  diberikan maka  akan  semakin  besar  zona  hambat  yang terbentuk pada bakteri Staphylococcus aureus 17 .
Penelitian  sebelumnya  mengenai  ekstrak daun mahkota dewa efektif menghambat pertumbuhan bakteri Eschericia coli, Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter Actinomycetemcomitans, dan Treponema
denticola, serta multispecies biofilm.  Disimpulkan bahwa daun mahkota dewa mempunyai komponen antimikroba  yang  mempunyai  kemampuan  berupa zona hambat yang luas 20 .
Ekstrak  daun  mahkota  dewa  dengan konsentrasi  yang  tinggi  mempunyai  efisiensi  yang besar  dalam  menghambat  pertumbuhan  bakteri pembentukan  biofilm.  Penelitian  sebelumnya diketahui  menggunakan  bentuk  formulasi  ekstrak, tetapi  pada  penelitian  ini  menggunakan  bentuk formulasi  nanoemulsi  gel.  Formulasi  nanoemulsi gel berupa partikel kecil yang berukuran 1-100 nm yang  efektif  untuk  meningkatkan  stabilitas  bahan aktif dan mudah dalam pengaplikasian 22 .
Hasil  penelitian  pada  perbedaan  fase inkubasi saliva selama 4 jam dan 8 jam didapatkan hasil nilai optical density pada waktu inkubasi 4 jam lebih  rendah  dibandingkan  waktu  inkubasi  8  jam pada  semua  kelompok  percobaan.  Hal  ini disebabkan  karena  pada  inkubasi  saliva  4  jam biofilm bakteri Staphylococcus aureus masih tahap kolonisasi  awal  yang  mudah  dihambat  dengan senyawa bioaktif antibakteri dari formulasi nanoemulsi  gel  daun  mahkota  dewa.  Sedangkan inkubasi saliva selama 8 jam didapatkan hasil nilai OD  lebih  tinggi  daripada  inkubasi  selama  4  jam karena
pembentukan biofilm bakteri Staphylococcus  aureus sudah  melewati  tahap maturasi  plak  sehingga  daya  hambat  senyawa antibakteri  kurang  berpenetrasi  kedalam  matriks biofilm. Bentuk pertahanan diri bakteri pada biofilm fase inkubasi 8 jam dengan membentuk extracellular polymeric substances (EPS) 14,27,28 .
Penelitian ini membandingkan efek antibakteri  nanoemulsi  gel  daun  mahkota  dewa dengan chlorhexidine  gluconate 0,2%  gel  dan aquades pada  biofilm  bakteri Staphylococcus aureus yang  dilihat dari  hasil  nilai  rata-rata optical density . Chlorhexidine gluconate 0,2% gel yaitu zat antimikroba  berspektum  luas  yang  merupakan salah  satu gold  standard untuk  pencegahan  plak dalam bidang kedokteran gigi.
Pada  perlakuan  kelompok  nanoemulsi  gel daun  mahkota  dewa  konsentrasi  10%,  20%,  dan 30% dengan masing-masing inkubasi 4 jam dan 8 jam  mempunyai  nilai  rerata optical  density lebih rendah yaitu 2,273; 2,963; 2,054; 2,888; 1,957 dan 2,592  dibandingkan  perlakuan  kelompok  kontrol positif  dengan chlorhexidine  gluconate 0,2%  gel dan aquades dengan  masing-masing  inkubasi  4 jam dan 8 jam yaitu 2,414; 3,333; 2,965 dan 3,226. Berdasarkan  hasil  yang  didapatkan  disimpulkan bahwa  nanoemulsi  gel  daun  mahkota  dewa  lebih
efektif  daripada chlorhexidine  gluconate 0,2%  gel dan aquadest
Pada daun mahkota dewa memiliki kandungan  senyawa  antibakteri  yaitu  flavonoid, tanin, alkaloid, triterpenoid, saponin, dan polifenol 17,29 . Flavonoid, tanin, alkaloid, dan saponin merupakan  zat  antibakteri  dalam  daun  mahkota dewa  yang  dapat  mengikat  protein  dalam pembentukan  dinding  sel  bakteri,  mengganggu penyusunan  peptidoglikan  sel  bakteri,  merusak membran sitoplasma yang menyebabkan permeabilitas  dinding  bakteri  terganggu  sehingga dinding  sel  bakteri  tidak  terbentuk  sempurna  dan bakteri lisis 12,19,20 .
Chlorhexidine memiliki  efek  bakteriostatik dan efek bakterisidal terhadap semua jenis mikroba baik  bakteri  gram  positif  dan  bakteri  gram  negatif. Chlorhexidine mempunyai efek aktivitas yang tinggi pada bakteri gram positif ( Staphylococcus aureus ) 24 . Mekanisme  kerja chlorhexidine efektif dalam menghambat maupun membunuh pertumbuhan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif  karena chlorhexidine mempunyai  molekul muatan positif (kation) dan bakteri sebagian besar bermolekul  muatan  negatif  (anion) 25 .  Hal  ini menyebabkan  terjadinya  perlekatan  yang  kuat antara chlorhexidine dengan membran sel bakteri, sehingga terjadi perubahan permeabilitas lingkungan  membran  sitoplasma  pada  bakteri menyebabkan keluarnya senyawa intraseluler. Sel bakteri  akan  mengalami  kerusakan  sehingga chlorhexidine dapat  dengan  mudah  berpenetrasi pada  seluruh  permukaan  plak    dan  menghasilkan proliferasi  organisme  baru,  serta  menyebabkan terjadinya  ostolisis 26 . Chlorhexidine adalah  obat yang  memiliki  toksisitas  rendah  dan  indeks terapeutik tinggi 25 .
Penggunaan chlorhexidine dalam  kurun waktu yang lama akan menimbulkan efek samping, seperti perubahan rasa kecap, iritasi mukosa, mulut
kering,  keseimbangan  flora  normal  rongga  mulut terganggu,  dan  perubahan  warna  pada  gigi,  lidah serta  bahan  tambal  resin  komposit 30,31 .  Efek samping penggunaan chlorhexidine dapat diminimalis  dengan  tanaman  tradisional  seperti daun  mahkota  dewa  ( Phaleria  macrocarpa )  yang efek sampingnya lebih minimal 16 .
Berdasarkan hasil uji nonparametrik Kruskal- Wallis didapatkan  nilai  p=0,088  sehingga  nilai p>0.05 yang berarti tidak terdapat perbedaan yang signifikan  ketebalan  biofilm  pada  masing-masing kelompok  nanoemulsi  gel  daun  mahkota  dewa ( Phaleria  macrocarpa ).  Hal  ini  mungkin  terjadi akibat  kondisi  lingkungan  yang  tidak  mendukung seperti  kondisi  iklim,  suhu,  hama,  dan  penyakit tanaman.  Kondisi  lingkungan  ini  mempengaruhi nutrisi  tanaman  untuk  tumbuh  kembang  sehingga kualitas  kandungan  antibakteri  tanaman  kurang mampu signifikan khasiatnya 32 .
Faktor  lain  yang  mempengaruhi  juga berdasarkan  kualitas  dari  nanoemulsi  gel  daun mahkota dewa. Kualitas dari nanoemulsi dipengaruhi  berdasarkan  perbandingan  ekstrak dan  emulsi  gel  yang  berpengaruh  pada  viskositas nanoemulsi  gel,  tempat  penyimpanan  dan  lama penyimpanan.  Beberapa  hal  yang  mempengaruhi zona  hambat  yaitu  metode  uji,  media  kultur,  dan kecepatan difusi zat bakteri 33 .
Keterbatasan penelitian yang
telah dilaksanakan ini yaitu tidak munculnya nilai optical density hasil  pembacaan  karena  terlalu  pekatnya warna sampel penelitian akibat crystal violet . Cara mengatasi  supaya  hasil  nilai optical  density dapat muncul dengan cara melakukan pembilasan ulang. Penelitian  yang  dilakukan  pada  masa  pandemi  ini kurang  intens  karena  protokol  kesehatan  yang mengharuskan  menjaga  jarak  tetapi  hal  ini  dapat kita  atasi  sehsingga  komunikasi  masih  berjalan dengan  baik.  Waktu  penelitian  yang  lebih  lama
dikarenakan jumlah antrian penelitian banyak yang menyita waktu.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  mengenai  efektivitas nanoemulsi  gel  daun  mahkota  dewa  terhadap ketebalan biofilm bakteri Staphylococcus aureus ( in vitro )  dapat  disimpulkan  bahwa  efektivitas  pada kelompok  nanoemulsi  gel  daun  mahkota  dewa dengan  konsentrasi  30%  lebih  baik  apabila dibandingkan  kelompok chlorhexidine  glucanate 0,2% gel dan aquades steril.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terimakasih kami sampaikan Universitas  Islam  Sultan  Agung  (UNISSULA) Semarang atas dukungan yang telah diberikan.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Kementrian Kesehatan Republik Indonesia.  2018.  Laporan  Nasional  Riset
Kesehatan Dasar 2018. 1 –582.
2.  Tyas,  W.  E.,  Susanto,  H.  S.,  Adi,  M.  S., Udiyono,  A.  2016.  Gambaran  Kejadian Penyakit  Periodontal  pada  Usia  Dewasa Muda  (15-30  Tahun)  Di  Puskesmas Srondol Kota Semarang. 4(4). 510 –513.
3.  Kinane,  D.  F.  2019.  Causation  and Pathogenesis  of  Periodontal  Disease. 25(February
2001). 8 –20. doi: 10.1034/j.1600-0757.2001.22250102.x.
4.  Tonetti,  M.  S.,  Jepsen,  S.,  Jin  L.,  Corgel, J.O. 2017. Impact of The Global Burden of Periodontal  Diseases  On  Health,  Nutrition and Wellbeing of Mankind: A Call for Global Action. Journal  of  Clinical  Periodontology . 44(5). 1 –7. doi: 10.1111/jcpe.12732.
5.  Lamster,  I.  B.  and  Pagan,  M.  2017. Periodontal  Disease  and  The  Metabolic Syndrome. International  Dental  Journal . 67(2). 67 –77. doi: 10.1111/idj.12264.
6.  Newman,  M.  Takei,  H.,  Klokkevold,  P. Carranza, F. 2019. Clinical Periodontology Thirteen  Edition .  13th  edn.  Philadelphia: Elsevier.
7.  Homenta, H. 2016. Infeksi Biofilm Bakterial. Jurnal e-Biomedik . 4(1). 1 –11.  doi: 10.35790/ebm.4.1.2016.11736.
8.  Lesouhaitier,  O. et al. 2019. Host  Peptidic Hormones Affecting Bacterial Biofilm Formation and Virulence. Journal of Innate Immunity . 11. 227 –241. doi:
10.1159/000493926.
9.  Lindhe,  J.  and  Lang,  N.  P.  2015. Clinical Periodontology and Implant Dentistry Sixth Edition . Journal  of  Chemical  Information and Modeling .
doi:
10.1017/CBO9781107415324.004.
10.  Jamal,  M.,  Tasneem,  U.  Hussain,  T., Andleeb,  S.  2015.  Bacterial  Biofilm:  Its Composition,  Formation  and  Role  in Human  Infections. Research  &  Reviews:
Journal of Microbiology and Biotechnology . 4(3). 1 –14.
11.  Papapanou, P. N. et al. 2018. Periodontitis: Consensus Report of Workgroup 2 of The
2017 World Workshop on The
Classification  of  Periodontal  and  Peri- Implant  Diseases  and  Conditions. Journal of  periodontology .  89(Suppl  1).  S173 – S182. doi: 10.1002/JPER.17-0721.
12.  Astriyani,  W.,  Surjowardojo,  P.,  Susilorini, T.  E.  2017.  Daya  Hambat  Ekstrak  Buah Mahkota  Dewa  (Phaleria  macrocarpa  l.) dengan  Pelarut  Ethanol  dan  Aquades terhadap  Bakteri  Staphylococcus  aureus Penyebab  Mastitis  pada  Sapi  Perah.
Journal  of  Tropical  Animal  Production . 18(2). 8 –13. doi:
10.21776/ub.jtapro.2017.018.02.2.
13. Ma’ruf, M. T., Setiawan, S., Putra, B. P. D. 2017.  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Buah Mahkota  Dewa  (Phaleria  macrocarpa) Terhadap
Staphylococcus
aureus.
13(2).16 –23. doi.org/10.46862/interdental.v13i2.360
14.  Otto,  M.  2018.  Staphylococcal  Biofilms. Journal Microbiology Spectrum . 6(4). 3 –23. doi: 10.1128/microbiolspec.gpp3-0023- 2018.
15.  Chellapa, P. et al. 2015. Nanoemulsion and Nanoemulgel  As  A  Topical  Formulation. IOSR Journal of Pharmacy . 5(10). 43 –47.
16.  Fajri, N., Ayuzar, E. and Ezraneti, R. 2016. Efektivitas  Serbuk  Daun  Mahkota  Dewa (Phaleria  macrocarpa)  terhadap  Bakteri Edwardsiella  tarda. Acta  Aquatica  Aguatic Sciences  Journal .  3(1).  23 –25.  doi: 10.29103/aa.v1i1.299.
17.  Hestiyani, R. A. N. and Handini, T. O. 2019. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Mahkota Dewa Terhadap Bakteri Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA).
Prosiding  Seminar  Nasional  dan  Call  for Papers . 3(November). 184 –190.
18.  Novaryatiin, S., Chusna, N. and Amelia, D. 2018.  Uji  Daya  Hambat  Ekstrak  Etanol Daun Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa Boerl.,)  Terhadap  Bakteri  Staphylococcus aureus. Jurnal Surya Medika . 4(1). 28 –35. doi: 10.33084/jsm.v4i1.153.
19.  Afnizar, M., Mahdi, N. and Zuraidah. 2016.
Uji  Aktivitas  Anti  Bakteri  Ekstrak  Daun Mahkota Dewa Phaleria macrocarpa Terhadap  Bakteri  Staphylococcus  aureus. Prosiding  Seminar  Nasional  Biotik  2016 . 293 –300.
20.  Radita, D. C. and Widyarman, A. S. 2019. Mahkota Dewa (God’s Crown) Fruit Extract Inhibits  The  Formation  of  Periodontal Pathogen  Biofilms  In  Vitro. Journal  of Indonesian  Dental  Association .  2(2).  57 – 62. doi: 10.32793/jida.v2i2.404.
21.  Eid,  A.  M.,  El-Enshasy,  H.  A.,  Aziz,  R.,
Elmarzugi,  N.  A.  2014.  Preparation,
Characterization  and  Anti-Inflammatory Activity of Swietenia macrophylla Nanoemulgel. Journal  of  Nanomedicine and  Nanotechnology .  5(2).  1 –10.  doi:
10.4172/2157-7439.1000190.
22.  Sharma,  A. et  al. 2016.  Nanogel  -  An Advanced Drug Delivery Tool: Current and Future. Artificial  Cells,  Nanomedicine  and Biotechnology . 44(1). 165 –177.  doi: 10.3109/21691401.2014.930745. 23.  Imanto, T., Prasetiawan, R., Wikantyasning, E. R. 2019. Formulasi dan Karakterisasi Sediaan Nanoemulgel
Serbuk  Lidah  Buaya  (Aloe  Vera  L.)’,
Pharmacon:  Jurnal  Farmasi  Indonesia . 16(1). 28 –37. doi:
10.23917/pharmacon.v16i1.8114.
24.  Kusuma  Yosi,  Komang  J.  Putra  Pinatih, Hendrayana  M.  A.  2019.  Efek  Sinergis Kombinasi  Chlorhexidine  dan  Alkohol terhadap  Daya  Hambat  Pertumbuhan Staphylococcus  aureus. E-Jurnal  Medika Udayana .  8(3).  139 –146.  Available  at: https://ojs.unud.ac.id/index.php/eum/article /view/48937
25.  Rondhianto,  Wantiyah,  and  Putra,  F.  M.
2016.  Penggunaan  Chlorhexidine  0,2% dengan Povidone Iodine 1% Dekontaminasi Mulut terhadap Dekontaminasi  Mulut  Terhadap  Kolonisasi
Staphylococcus aureus pada Pasien Pasca Operasi  Anastesi  Umum. NurseLine .  1(1). 176 –183.
Available at: http://publications.lib.chalmers.se/records/f ulltext/245180/245180.pdf%0Ahttps://hdl.h andle.net/20.500.12380/245180%0Ahttp:// dx.doi.org/10.1016/j.jsames.2011.03.003% 0Ahttps://doi.org/10.1016/j.gr.2017.08.001
%0Ahttp://dx.doi.org/10.1016/j.precamres. 2014.12.0.
26.  Panesa,  M.  R.,  Saputera,  D.  and  Budiarti, L.  Y.  2018.  Efektivitas  Daya  Hambat Ekstrak Etanol Daun Kersen Dibandingkan Klorheksidin  Glukonat  0,2%  Terhadap Staphylococcus aureus. Jurnal Kedokteran Gigi DENTIN . 2(1). 79 –84. 27.  Maryati, M., Wijaya, C. H., Adawiyah, D. R.
and  Bachtiar, B. M. 2017. Potensi Hambat Permen  Lunak  Sirih  dan  Pinang  terhadap
Pembentukan Biofilm
Streptococcus
mutans. Journal  Teknologi  dan  Industri Pangan . 28(2). 150 –158.
https://doi.org/10.6066/jtip.2017.28.2.150
28.  Nugrahani, N., Kunarti, S. and Setyowati, L.
2016.  Konsentrasi  Efektif  Daya  Antibiofilm Kitosan Cangkang Udang
Terhadap Streptococcus viridans. Conservative Dentistry Jurnal . 6(2). 47 –51.
http://dx.doi.org/10.20473/cdj.v6i2.2016.10 5-109
29.  Faried,  A. et  al. 2016.  Potential  of Indonesian  Herbal  Medicine,  Phaleria macrocarpa  (Scheff.)  Boerl,  for  Targeting Multiple  Malignancy  Signaling  Pathways: An Introductory Overview. European
Journal  of  Medicinal  Plants .  11(2).  1 –17.
doi: 10.9734/ejmp/2016/20760. 30.  Kholisa, Purwanto and Hernawati, S. 2018. Potensi  Ekstrak  Buah  Delima  Merah
(Punica granatum Linn) terhadap Penurunan  Jumlah  Koloni  Streptococcus mutans (The Potential of Red Pomegranate Fruit  Extract  (Punica  granatum  Linn)  on The  Reduction  Number  of  Streptococcus mutans colony). e-JPK . 6(2). 351 –357.
31.  Wardani,  R.,  Jekti,  D.  S.  D.,  and  Sedijani, P.  2018.  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak
Kulit  Buah  Jeruk  Nipis  (Citrus  aurantifolia
Swingle)  terhadap  Pertumbuhan  Bakteri Isolat Klinis. Journal Penelitian Pendidikan IPA . 5(1). 10.29303/jppipa.v5i1.101 32.  Wahab et al. 2020. Uji Aktivitas Antimikroba Ekstrak  Daun  Mahkota  Dewa  (Phaleria macrocarpa) dengan
Metode Difusi Cakram. Indonesian Journal Of Fundamental Sciences . (1). 8-15. https://doi.org/10.26858/ijfs.v6i1.13940
33.  Syauqi, A. 2018. Pengaruh Suhu
Perebusan  Daun  Sirih  Merah  Terhadap
Daya  Hambat  Bakteri Staphylococcus
aureus Penyebab  Mastitis  pada  Sapi Perah.
MADURANCH: Jurnal Ilmu
Peternakan . 75 –80.