## EFEK ANTI MIKROBA EKSTRAK BUNGA CENGKEH ( SYZYGIUM AROMATICUM)

## TERHADAP METHICILLIN-RESISTANT  STAPHYLOCOCCUS AUREUS (MRSA)
SECARA IN VITRO .
Afaf   Azizah 1 ,  Irma  Suswati 1 ,  Sulistyo  Mulyo  Agustin 1
1 Fakultas  Kedokteran,  Universitas  Muhammadiyah  Malang Jl.  Bendungan  Sutami  188  A  Malang,  65145
Email  :  afafazizah86@gmail.com

## ABSTRAK
Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) merupakan salah satu bakteri penyebab infeksi, angka kejadiannya cukup tinggi. MRSA resisten terhadap beberapa antibiotik seperti beta-laktam(18%), rifampisin (6,7%), floroquinolon (84%), linezolid (1,3%) dan ampicillin (93,4%). Ekstrak bunga cengkeh mempunyai efek antimikroba karena mengandung eugenol, flavonoid,  tannin,  saponin,  alkaloid  dan  phenol  yang  dapat  merusak  struktur  sel  bakteri.Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  efek  antimikroba  ekstrak  bunga  cengkeh (Syzygium  aromaticum) terhadap  MRSA  secara in  vitro .Metode  yang digunakan experimental  post  test  only  group  design dengan  metode  dilusi  tabung  berbagai  konsentrasi  ekstrak  bunga  cengkeh 0,39%,  0,195%,  0,097%,  0,049%,  0,024%,  0,012%,  0,006%,  0,003%.  Analisis  data  menggunakan One  Way  Anova .Hasil penelitain menunjukkan Kadar Bunuh Minimal (KBM) adalah 0,39%. Uji One Way Anova p=0,000 (p<0,05) menunjukkan terdapat perbedaan signifikan antara konsentrasi ekstrak bunga cengkeh dengan jumlah koloni MRSA. Ekstrak bunga cengkeh dapat membunuh MRSA dengan cara merusak struktur sel bakteri. Kesimpulan yang dapat ditarik adalah ekstrak bunga cengkeh (Syzygium aromaticum) mempunyai efek antimikroba terhadap MRSA secara in vitro.
Kata kunci : Ekstrak bunga cengkeh (Syzygium aromaticum) , MRSA, KBM.

## ABSTRACT
Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the bacteria  that causes  infections, the rate of occurrence is quite high. MRSA is resistant to several antibiotics such as beta-lactam (18%), rifampicin (6.7%), floroquinolone (84%),  linezolid  (1.3%)  and  ampicillin  (93.4%).  Clove  flower  extract  has  an  antimicrobial  effect  containing  eugenol, flavonoids, tannins, saponins, alkaloids and phenols that can damage the structure of bacterial cells. Objective from this experiment is to find out the effect of  antimicrobial clove flower extract (Syzygium aromaticum) against MRSA in vitro. The method used experimental post test only group design with tube dilution method various concentration of clove flower extract 0,39%, 0,195%, 0,097%, 0,049%, 0,024%, 0,012%, 0,006%, 0,003%. Data analysis used One Way Anova. The results showed  that Minimum  BactericidalConsentration (MBC) was 0.39%.  One  Way Anova  test  p  = 0.000  (p  <0,05) showed significant difference between clove flower extract concentration and number of MRSA colonies. Clove flower extract can killed MRSA by damaging the structure of bacterial cells. The conclusion from this study is the clove flower extract (Syzygium aromaticum) has an antimicrobial effect on MRSA in vitro.
Keywords : clove flower extract (Syzygium aromaticum), MRSA, MBC

## 32 VOLUME 13 NOMOR 1 JUNI 2017

## PENDAHULUAN
Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) sering menyebabkan penyakit infeksi akibat tindakan invasif   di  rumah  sakit (Nurkusuma  DD,  2009). Beberapa penyakit yang disebabkan MRSA seperti pneumonia, selulitis, endokarditis, osteomyelitis, luka diabetes  dan  luka  pasca  operasi (Liu  C, 2011) .  Di India, angka kejadian luka diabetes dengan MRSA positif di Departemen Mikrobiologi sebesar 69,8% dan  luka  non  diabetes  sebesar  38,4% (Rani  RV, 2014) . Sedangkan di RS Dokter Kariadi Semarang, luka  pasca  operasi  dengan  MRSA  positif menunjukkan angka yang cukup tinggi yaitu sebesar 58,8  % (Nurkusuma  DD,  2009) . MRSA  merupakan  strain  dari Staphylococcus aureus yang  resisten  terhadap  meticillin  dan  lebih dari  80%  isolat Staphylococcus  aureus yang  diteliti, resisten  terhadap  golongan  antibiotik  beta-laktam (EARS.2013) . Annual  Report  of   the  European Antimicrobial  (EARS.2013).  Resistance  Surveillance Network melaporkan  bahwa  beberapa  antibiotik yang  resisten  terhadap  MRSA  dibeberapa  negara seperti  beta-lactam  (18%),  rifampisin  (6,7%), floroquinolon (84%) dan linezolid (1,3%). Dan dari 30 sampel isolat Staphylococcus aureus ditemukan 93.4% telah resisten terhadap ampicillin dan 6.6% isolate kuman  masih  sensitif  terhadap  ampicillin
Dari  data  tersebut,  MRSA  resisten  terhadap beberapa  obat.  Resisten  antibiotik  ini  dikarena perubahan  genetik  yang  disebabkan  oleh  paparan terapi  antibiotik  yang  tidak  rasional (Nurkusuma DD,  2009) .  Oleh  karena  itu,  dibutuhkan  suatu pengobatan  alternatif  tambahan  seperti  misalnya bunga cengkeh ( Syzigium  aromaticum ) (Nurdjannah  N. 2004) .  Bunga  cengkeh  memiliki  beberapa  manfaat sebagai analgesik, antiemetik, antijamur, antiseptik, antiinflamasi dan salah  satunya sebagai antibakteri (Pramod,  K  2010) .  Kemampuan  bunga  cengkeh sebagai antibakteri karena bunga cengkeh memiliki minyak  atsiri  yang  mengandung  eugenol,  tanin, saponin, flavanoid, alkoloid dan phenol. Mekanisme antibakteri pada bunga cengkeh yaitu menyebabkan perubahan  pada  komponen  makromolekul  dari bakteri  seperti  merusak  membran  sel,  membran protein inaktif secara irreversible dan menyebabkan kerusakan  asam  nukleat (Apriyani  YM,  2015) . Penelitian  sebelumnya  menunjukkan  ektrak bunga  cengkeh  dapat  menghambat Escherichia  coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumonie pada konsentrasi
(KHM)  6,25  mg/ml  dan  dapat  membunuh  pada konsentrasi  (KBM)  25  mg/ml  pada Escherichia  coli dan 50 mg/ml  pada Klebsiella pneumoni  (Oshomoh O E, 2015) . Hasil penelitian pendahuluan ekstrak bunga cengkeh  terhadap  MRSAdidapatkan  KBM  pada konsentrasi  0,39%,  sedangkan  KHM  tidak  dapat dinilai disebabkan ekstrak bunga cengkeh berwarna keruh atau coklat kehitaman, sehingga berpengaruh pada penilaian tingkat kejernihan.

## METODE  PENELITIAN
Desain penelitian ini true eksperimental, dengan menggunakan Post  test  only  control. Metode  yang dipakai  adalah  dilusi  tabung  (tube  dilution  test) . Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan  Februari  2017 selama  ±  1  minggu  di  Laboratorium  Biomedik Fakultas  KedokteranUniversitas  Muhammadiyah Malang.Populasi yang dipakai bakteri MRSA biakan murni  yang  diperoleh  dari  Laboratorium Mikrobiologi  Fakultas  Kedokteran  Universitas Brawijayamenggunakan simple random sampling.
Ekstrak  bunga  cengkeh  dibuat  dengan  cara bunga  cengkeh  dicuci  kemudian  dikeringkan  di bawah  sinar  matahari.  Setelah  kering  bahan dihaluskan  dengan  blender  sehingga  didapatkan bentuk  serbuk.  Maserasi  dimulai  dengan  cara menuangkan etanol 96% ke dalam wadah maserasi sampai  seluruh  serbuk  terendam  dan  pelarut dilebihkan  ±  2  cm  di  atas  permukaan  serbuk bunga  cengekeh.  Dalam  penelitian  ini  digunakan pelarut etanol 96% karena etanol dapat mengangkat atau lebih memperkuat kandungan yang aktif pada bunga cengkeh. Bahan direndam dan ditutup selama 24 jam. Setelah 24 jam, lakukan penyaringan bahan dengan  kain  saring  sampai  tidak  ada  cairan  yang menetes  dari  bahan.  Cairan  hasil  penyaringan dipindahkan  pada  labu  evaporator  dan  diletakkan pada  evaporator.Proses  evaporasi  sampai  volume kecil hasil ekstraksi berkurang dan menjadi kental. Hasil evaporasi kemudian ditampung dalam cawan panguap  kemudian  dioven  selama  ±  2  jam  pada suhu 80 o C untuk menguapkan pelarut yang tersisa sehingga  didapatkan  hasil  ekstrak  bunga  cengkeh 100%.
Perbenihan cair bakteri dinilai absorbansinya dengan  spektrofotometer  pada  gelombang  cahaya 540  nm.  Dari  nilai  absorbsi  dapat  diperkirakan jumlah kuman pada perbenihan cair dengan kalibrasi yang sudah diketahui yaitu absobansi 0,1 ekuivalen
33 dengan jumlah kuman sebesar 10 8 CFU/ml (Murray P  R, 2013) .  Untuk  mendapatkan  suspensi  dengan kepadatan 10 8 CFU/ml sebanyak 10 ml dibutuhkan 2  ml  suspensi  awal  untuk  dicampur  dengan  8  ml Nutrient Broth sebagai pengencer. Setelah didapatkan perbenihan  cair  dengan  jumlah  kuman  10 8 CFU/ ml,  dilakukan  pengenceran  dengan  menggunakan Nutrient  Broth sampai  didapatkan  perbenihan  cair dengan  jumlah  kuman  10 6 CFU/ml.

## HASIL  DAN  PEMBAHASAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, KHM ekstrak bunga cengkeh tidak dapat dianalisis sebab  tabung  tampak  keruh  dikarenakan  oleh kekeruhan ekstrak bunga cengkeh sedangkan KBM terdapat pada konsentrasi 0,39% dengan hasil berupa penurunan  jumlah  koloni  MRSA  sampai  99,9% dari  kontrol  kuman.  Hasil  penelitian  tersebut menunjukkan  semakin  tinggi  konsentrasi  ekstrak bunga  cengkeh menyebabkan  semakin tinggi  pula penurunan jumlah rata-rata koloni bakteri MRSA.
Efek antimikroba ekstrak bunga cengkeh terhadap  MRSA  belum  pernah  ada  yang  meneliti sebelumnya,  tetapi  sudah  ada  penelitian  efek antimikroba  ekstrak  bunga  cengkehterhadap beberapa  Gram  negatif,  yaitu: P.  mirabilis,  E.  coli dan K.  Pneumoniae  (Oshomoh  O  E,  2015) .  Dalam penelitian tersebut, KHM terdapat pada konsentrasi 6,25mg/ml  sedangkan  KBM  pada P.  mirabilis sebesar  25  mg/ml  dan  KBM  pada E. coli sebesar 50  mg/ml.  Perbedaan  KHM  tersebut  dengan penulis  dikarenakan  ekstrak  yang  digunakan  tidak keruh yang didapatkan dari metode ekstraksi dengan pelarut  air,  sedangkan  penelitian  penulis menggunakan  metode  maserasi  dengan  pelarut etanol sehingga berpengaruh pada penilaian tingkat kejernihan.  Perbedaan  hasil  KBM  penelitian sebelumnya,  dengan  hasil  penelitian  penulis dimungkinkan karena perbedaan kadar konsentrasi. Jika  pada  penelitian  sebelumnya  menggunakan konsentrasi50mg/ml,  25mg/ml,  12,5mg/ml  dan 6,25  mg/ml  sedangkan  pada  penelitian  penulis KBM  ditemukan  dengan  konsentrasi  0,39%  atau jika  dikonversi  menjadi  4mg/ml.  Hasil  tersebut menunjukkan bahwa ektrak bunga cengkeh memiliki efek antimikroba dengan konsentrasi yang terkecil pada MRSA dibandingkan E.coli dan P.mirabilis . Hal ini  kemungkinan  dikarenakan  perbedaan  dinding sel bakteri dimana bakteri MRSA merupakan bakteri
gram  positif  yang  hanya  terdiri  dari  lapisan peptidoglikan dan asam teikoat dan juga mempunyai kandungan  lipid  yang  rendah  (1-4%)  sehingga memudahkan  bahan  bioaktif  antibakteri  masuk  ke dalam  sel  sedangkan  gram  negatif  memiliki  3 lapisan  (lipoprotein,  lapisan  tengah,  dan lipopolisakarida)  dan  mempunyai  peptidoglikan dengan  kandungan  lipid  yang  tinggi  (11-12%) (Jawetz,, 2013) .  Kandungan ekstrak  bunga  cengkeh yang  kemungkinan  berkaitan  erat  dengan  dinding sel  bakteri  yaitu  eugenol,  flavanoid  dan  alkaloid. Selain  dinding  sel  bakteri,  pelarut  ekstrak  juga berpengaruh  dalam  menentukan  KBM.  Fungsi pelarut  etanol  sendiri  untuk  menarik  lebih  banyak kandungan  zat  aktif  pada  ekstrak  bunga  cengkeh dibandingkan  pelarut  air  dikarenakan  etanol mempunyai  polaritas  yang  tinggi.  Etanol  juga mempunyai titik didih yang rendah dan cenderung aman,  tidak  beracun  dan  tidak  berbahaya (Azis Tamzil,  2014) .
Hasil uji normalitas Shapiro Wilk didapatkan sig    p>0.05  sehingga  menunjukan  sebaran  data normal,  lalu  dilanjutkan  dengan  uji  homogenitas Levene didapatkan  sig.  p>0.05  yang  menunjukkan varian  data  homogen.  Hasil  penelitian  penulis menunjukkan  adanya  perbedaan  yang  signifikan antara  konsentrasi  ekstrak  bunga  cengkeh denganjumlah  koloni    MRSAper  cawan.  Hal  ini ditunjukkan  dari  hasil  analisis One  Way ANOVA dengan  nilai  signifikansi  p  <  0.05  yaitu  p  = 0.000.Untuk  mengetahui  konsentrasi  ektrak  bunga cengkeh  mana  saja  yang  berbeda  secara  bermakna pengaruhnya  terhadap  jumlah  koloni,  maka dilakukan  uji post  hoc  (Bonferroni ).  Hasil  uji post  hoc (Bonferroni )  didapatkan  perbedaan  jumlah  koloni percawan  yang  signifikan  sudah  tampak  pada konsentrasi  0,39%  hingga  0,003%  dibandingkan konsentrasi 0%.
Efek  antimikroba  pada  bunga  cengkeh disebabkan  karena  bahan-bahan  aktif  yang terkandung di dalamnya, yaitu eugenol, tanin, saponin, flavonoid,  fenol  dan  alkaloid.    Keenam  bahan tersebut  dapat  mempengaruhi  strukturMRSA. Eugenol  merupakan  senyawa  hidrofobik  yang dengan  mudah  melewati  dan  merusak  dinding  sel bakteri  gram  negatif  yang  memiliki  konsentrasi lipid  yang  tinggi (Maryati,  2007) .  Tanin  memiliki aktivitas  antibakteri  yang  berhubungan  dengan kemampuannya  untuk  menginaktifkan  adhesi  sel mikroba,  menginaktifkan  enzim,  dan  menggangu

## 34 VOLUME 13 NOMOR 1 JUNI 2017
transport protein pada lapisan dalam sel. Tanin juga mempunyai  target  pada  polipeptida  dinding  sel sehingga pembentukan dinding sel menjadi kurang sempurna. Hal ini menyebabkan sel bakteri menjadi lisis karena tekanan osmotik maupun fisik sehingga sel  bakteri  akan  mati (Smullen  J.,  2007) .  Saponin dapat  menjadi  antibakteri  karena  zat  aktif permukaannya  mirip  detergen,  akibatnya  saponin akan menurunkan tegangan permukaan dinding sel bakteri  dan  merusak  permeabialitas  membran. Rusaknya  membran  sel  ini  sangat  mengganggu kelangsungan  hidup  bakteri (Sirait,  M.  2007) . Flavonoid  memiliki  aktivitas  antibakteri  dalam melawan bakteri gram positif maupun gram negatif. Aktivitas flavonid diduga disebabkan oleh aktivitas gugus  alkohol  senyawa  flavonoid  yangmengikat peptidoglikan di dinding sel, selain itu gugus alkohol flavonoid juga mampu merusak membran sel bakteri melalui  pengikatan  pada  lipopolisakarida (Jawetz, 2013) .  Mekanisme  antibakteri  fenol  dalam membunuh  mikroorganisme  yaitu  dengan mendenaturasi  protein  sel.  Ikatan  hidrogen  yang terbentuk antara fenol dan protein mengakibatkan struktur protein menjadi rusak (Ahmed, Bahar 2007) . Mekanisme  antibakteri  alkaloid  yaitu  komponen alkaloid  diketahui  sebagai  interkelator  DNA  dan menghambat  enzim  topoisomerase  sel  bakteri (Karou, 2005) . Bahan aktif tersebut, mana saja yang spesifik memberikan pengaruhterhadap pertumbuhan  bakteri  MRSA  belum  diteliti.
Faktor  yang  mampu  mempengaruhi pertumbuhan  MRSA  terdiri  dari  faktor  internal yaitu  sensitivitas  bakteri  tersebut,  yaitu  sifat  dari bakteri  itu  sendiri  mengenai  seberapa  sensitif  atau bahkan  resisten  terhadap  paparan  ekstrak.  Salah satu  faktor  eksternal  yang  mampu  mempengaruhi penelitian  ini  yaitu  tingkat  keasaman  media  kultur (pH),  suhu,  cahaya  dan  aktivitas  air.  Kondisi  pH sangat  penting  untuk  pertumbuhan  bakteri  karena enzim tertentu hanya akan mengurai nutrisi sesuai aktivitasnya  pada  pH  tertentu.  Derajat  keasaman (pH)  yang  optimal  pada  media  kultur  dibutuhkan agar  tidak  menjadi  perancu  pada  uji  efek antimikroba. pH yang optimum untuk pertumbuhan MRSA  yaitu  7,4  dan  suhu  optimum  untuk pertumbuhan  MRSA  adalah  37 0 C.  Faktor  suhu sudah diminimalisir dengan penggunaan inkubator yang  suhunya  akan  stabil  pada  suhu  optimal  bagi pertumbuhan MRSA . Cahaya juga merupakan faktor yang berperan dalam mempengaruhi pertumbuhan
MRSA  yang  sudah  diminimalisir  pula  dengan penggunaan  inkubator (Vasanthakumari,  R,  .2007) . Keterbatasan  dari  penelitian  ini  adalah KHM  yang  tidak  dapat  ditentukan  dikarenakan kekeruhan ekstrak bunga cengkeh sehingga tabung tampak  keruh.  Keterbatasan  lain  yaitu  metode maserasi dengan pelarut etanol yang tidak mampu mengeluarkan zat aktif spesifik pada bunga cengkeh (isolasi zat aktif).

## KESIMPULAN
1.  Ekstrak  bunga  cengkeh  ( Syzigium  aromaticum ) mempunyai  efek  antimikroba  terhadap  MRSA secara in vitro
2. KBM ekstrak bunga cengkeh ( Syzigium aromaticum ) terhadap  pertumbuhan  MRSA  adalah  0,39%.

## DAFTAR  PUSTAKA
Ahmed, Bahar 2007. Chemistry  Of  Natural Products. New Delhi.Department ofPharmaceutical Chemistry Faculty  of   Science  Jamia  Hamdard
Apriyani YM,  Priani  SE,  Gadri A, 2015, Aktivitas Antibakteri  Minyak  Batang  Kayu  Manis (Cinnamomum burmanni Nees Ex Bl) terhadap Bakteri  Propionibakterium  acnes , Prosiding Penelitian SPeSIA Unisba, 348-353
Azis  Tamzil,  Febrizky  Sendry,  Mario  AD.  2014. Pengaruh  Jenis  Pelarut  Terhadap  Persen Yieldalkaloid dari Daun Salam India ( Murraya koenigii) .  Jurusan  Teknik  Kimia , Fakultas Teknik, Universitas Sriwijaya. No. 2, Vol. 20, April  2014
EARS.2013. Antimicrobial  Resistance  Surveillance  in Europe. Stockholm:  ECDC;  Europa.  pp  59- 61
Jawetz,  Melnick,  &  Adelberg’s.  2013. Medical Microbiology  Twenty-Seventh  Edition. McGraw- Hill  Companies.  US
Joshi B, Sah GP, Basnet BB, et al. 2011. Phytochemical extraction  and  antimicrobial  propertiesof  different medicinal plants: Ocimum sanctum (Tulsi),Eugenia caryophyllata  (Clove),  Achyranthes  bidentata (Datiwan) and Azadirachta indica (Neem) . Journal of   Microbiology  and  Antimicrobials  Vol.
3(1),  pp.  1-7
Karou, Damintoti. Savadogo Aly. 2005. Antibacterial activity  of  alkaloids  from  Sida  acuta . African Journal of  Biotechnology .  4(12):  1452  -1457
Liu C, Bayer A, Cosgrove SE, et al. 2011. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of  America  for  the  Treatment  of  Methicillin- Resistant Staphylococcus Aureus Infections in Adults and Children . Clinical Practice Guidelines: 52 pp  1-38
Maryati, Fauzia SR, Rahayu T. Uji aktivitas antibakteri minyak  atsiri  daun  kemangi  (Ocimum basillum L.) terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Jurnal Penelitian Sains &  Teknologi. Vol. 8,  No.  1,  2007; 30 – 38.
Murray  P  R,  Rosenthal  S  K,  Pfaller  A  M.  2013.
Medical Microbiology 8 Edition . Elsevier Health Sciences.  Canada  p.334-336 Nurdjannah  N.  2004.  Disferifikasi  Penggunaan Cengkeh. Bogor: Balai Besar Penelitian dan Pengembangan  Pasca  Panen  Pertanian. Perspektif  vol  3:  Hal  61-70
Nurkusuma DD,  2009,  Faktor  Yang Berpengaruh Terhadap  Kejadian  Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) Pada Kasus Infeksi  Luka  Pasca  Operasi  Di  Ruang Perawatan  Bedah  Rumah  Sakit  Dokter Kariadi  Semarang,  Phd  Thesis,  Universitas Diponegoro,  Semarang.p  44-48
Oshomoh  O  E,  Idu  M,  Udinyiwe  O  C.  2015.
Phytochemical Screening and Antimicrobial Sensitivity of  Clove Flower (Syzygium aromaticum, L. Merrill and  Perry)  Bud  on  Dental  Pathogens . Ijppr.Human,  2015;  Vol.  3  (2):  1-13. Pramod,  K.,  S.H.  Ansari  and  J.  Ali.  2010. Eugenol : a natural compound with versatile pharmacological actions .  Natural  Product  Communications 5(12)  :  1999-2006.p    12
Rani RV, Nithyalakshmi J. 2014. A comparative study of Diabetic and Non-diabetic wound infectionswith special reference to MRSA and ESBL . IJCMAS: Volume  3  Number  12  (2014)  pp.  546-554 Sirait,  M.  (2007).  Penuntun  Fitokimia  Dalam Farmasi.  Bandung:  Penerbit ITB.  Hal.  158- 159
Smullen  J.,  Koutsou,  G.  A.,  Zumbe,  A.  &  Storey,
D.  M.,  2007, The  Antibacterial  Activity  of Plant  Extracts  Containing  Polyphenols  Against Streptococcus mutans ,  Caries  Res.,41,  342-349
Triana  D.  2014.  Frekuensi  â-Lactamase  Hasil Staphylococcus  aureus Secara  Iodometri  Di Laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas Kedokteran  Universitas  Andalas.  Jurnal Gradien  Vol.  10  No.  2  Juli  2014  :  992-995 Vasanthakumari,R  .2007. Textbook  of   Microbiology New Delhi : BI Publications WHO.2014. Antimicrobial Resistance Global Report on Surveillance .  June  ed.France:  WHO  Press.p
10-21