## Prevalensi Polimorfisme Gen CYP2B6*9 pada Populasi Jawa
The Prevalence of CYP2B6*9 Gene Polymorphisms in Javanese Population
Faisal Rahman 1 , Zullies Ikawati 1* , Viren Ramadhan 1 , Ahmad Hamim Sadewa 2 1 Magister Farmasi Klinik, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada 2 Program Studi Magister Ilmu Biomedik, FKKMK, Universitas Gadjah Mada Corresponding author: Zullies Ikawati; Email: Zullies Ikawati
Submitted: 15-10-2020 Revised: 10-11-2020 Accepted: 10-11-2020

## ABSTRAK
Polimorfisme enzim mempengaruhi respon obat baik secara langsung maupun tidak langsung. Varian genetik CYP2B6 berkontribusi pada perubahan metabolisme obat dan konsentrasi plasma. Polimorfisme nukleotida tunggal CYP2B6 yang diketahui, CYP2B6*9 (c.516G> T, g.15631, Q172H, rs 3745274) di ekson 4 menunjukkan variabilitas antar-etnis yang cukup besar. Penelitian ini bertujuan untuk  mengetahui  frekuensi  polimorfisme CYP2B6*9 pada  populasi  suku  Jawa  di  Indonesia. Sebanyak  89  subjek  sehat  berpartisipasi  dalam  penelitian  ini.  Polimorfisme CYP2B6*9 dianalisis dengan metode modifikasi alel-spesifik PCR untuk mengkonfirmasi prevalensi SNP dari 516G> T di ekson  4.  Analisis  ini  melibatkan  89  orang  subjek  uji.  Distribusi  genotipe  516G/T CYP2B6 pada populasi Jawa teridentifikasi sebagai berikut: GG - 4,5%, GT - 88,8% dan TT - 6,7%. Frekuensi alel 516G/T dari gen CYP2B6 dalam populasi adalah G = 48,92% dan T = 51,08%. Tidak ada perbedaan signifikan yang  diamati antara jenis  kelamin (p>0,05,  OR = 1,473,  95%  CI [0,809-2,684]). Urutan berbasis  populasi  dianalisis  dengan  metode  Hardy-Weinberg.  Polimorfisme  gen CYP2B6*9 ditemukan  pada  populasi  suku  Jawa.  Penelitian  lebih  lanjut  diperlukan  untuk  mengeksplorasi dampak varian ini pada respons klinis obat.
Kata kunci: CYP2B6*9 ; polimorfisme gen; nested PCR

## ABSTRACT
Enzyme  polymorphisms  influence  drug  response  either  directly  or  indirectly.  The  genetic variant CYP2B6 contributes  to  changes  in  drug  metabolism  and  plasma  concentrations.  Known polymorphisms of the CYP2B6 single nucleotide, CYP2B6*9 (c.516G> T, g.15631, Q172H, rs 3745274) in exon 4 show considerable inter-ethnic variability. This study aims to determine the frequency of CYP2B6*9 polymorphisms in the Javanese population in Indonesia. A  total of 89 healthy subjects participated  in  this  study. CYP2B6*9 polymorphisms  were  analyzed  by  the  allele-specific  PCR modification method to confirm the SNP prevalence of 516G> T in exon 4. This analysis included 89 test subjects. The distribution of genotype 516G / T CYP2B6 in the Java population was identified as follows: GG – 4.5%, GT – 88.8%, and TT – 6.7%. The 516G / T allele frequencies of the CYP2B6 gene in  the  population  were  G  =  48.92%  and  T  =  51.08%.  No  significant  differences  were  observed between the sexes (p>0.05; OR = 1.473; 95% CI [0.809-2.684]). Population-based sequences were analyzed by the Hardy-Weinberg method. CYP2B6*9 gene polymorphism was found in the Javanese population. Further research is needed to explore the impact of this variant on the clinical response of drugs.
Keywords : CYP2B6*9 ; gene polymorphism; nested PCR

## PENDAHULUAN
CYP2B6 adalah  enzim  metabolik  utama untuk  sejumlah  obat.  Obat-obatan  yang dimetabolisme terutama  oleh CYP2B6 meliputi artemisinin, bupropion, siklofosfamid, efavirenz,  ketamin,  dan  metadon  (Zanger  dan Klein, 2013). Beberapa polimorfisme nukleotida tunggal  (SNP)  telah  diidentifikasi  di CYPs dan dikaitkan dengan perubahan aktivitas enzimatik
sehingga  menyebabkan  kegagalan  pengobatan (Zanger dan Schwab, 2013).
CYP2B6 merupakan  enzim  yang  sangat polimorfik  dengan  lebih  dari  100  SNP  yang dijelaskan,  banyak  haplotipe  kompleks  dan frekuensi  etnis  dan  ras  yang  berbeda (Turpeinen dan Zanger, 2012, Zanger dan Klein, 2013). Varian genetik CYP2B6 yang dikarakterisasi secara  fungsional  berkontribusi
Faisal Rahman, et al
pada  perubahan  metabolisme  obat  dan konsentrasi  plasma  yang  berbeda,  sehingga individu diklasifikasikan sebagai pemetabolisme yang buruk atau cepat (Telenti dan  Zanger,  2008).  Varian  genetik CYP2B6 didokumentasikan  sebagai  prediktor  yang berguna  dari  farmakokinetik  dan  respon  obat (Rakhmanina dan Anker, 2010). Analisis SNP ini dapat berguna
untuk meningkatkan kemanjuran obat dan dapat mengurangi potensi toksisitas obat sebelum pengobatan (Peko et al ., 2019). Polimorfisme CYP2B6 telah  dibuktikan mempengaruhi  respon  farmakologis  dan toksikologi  terhadap  obat  yang  bermakna secara  klinis  (Hananta et  al .,  2018).  Alel defisiensi fungsional yang paling umum adalah G15631T  ( CYP2B6*9 )  yang  merupakan  bagian dari  haplotipe CYP2B6*6 [Q172H,  K262R].  Ini mempengaruhi  proses  penyambungan  dan menyebabkan ekspresi enzim yang lebih rendah di hati (Hassani Idrissi et al ., 2018). Dalam  penelitian  sebelumnya,  frekuensi CYP2B6*6 pada  orang  Melayu  sehat,  Cina  dan India masing-masing adalah 25,4%, 13,9% dan 18,5%,  sedangkan  frekuensi CYP2B6*6 pada pasien  etnis  Melayu  dengan  ketergantungan opioid  yang  menerima  MMT  adalah  19,3% (Musa et  al .,  2012).  Prevalensi  polimorfisme CYP2B6 juga telah diteliti pada penduduk Timor endemik  malaria  di  Nusa  Tenggara  Timur, Indonesia.  Frekuensi CYP2B6*9 (516G>  T), CYP2B6*4 (785A>  G)  dan CYP2B6*6 (516G>  T dan 785A> G) adalah 40,6%, 29,2% dan 22,9%, masing-masing.  Prevalensi  polimorfisme  gen CYP2B6 lebih tinggi dibandingkan pada populasi Melayu, Cina Han, India, dan Mesir (Hananta et al ., 2018). Data sebaran CYP2B6*9 khususnya pada penduduk  Jawa  di  Indonesia  sangat  terbatas. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui frekuensi CYP2B6*9 pada  penduduk  Jawa  di Indonesia.

## METODOLOGI
Rancangan dan Subjek Penelitian Studi ini adalah studi cross sectional yang dilakukan pada penduduk asli Jawa di  wilayah Yogyakarta.  Total  ada  89  relawan  sehat  yang terdiri  dari  37  laki-laki  dan  52  perempuan. Kriteria  inklusi  subjek  adalah  subjek  yang dinyatakan  sehat  oleh  tim  dokter  dan  subjek merupakan  generasi  ketiga  suku  asli  jawa (memiliki ayah, ibu, kakek, nenek dari suku asli
Jawa), yang diperoleh melalui wawancara lisan maupun  tertulis  mengenai  riwayat  keluarga. Usia  subjek  berkisar  antara  22  sampai  dengan 55  tahun.  Teknik  pengambilan  sampel  adalah dengan cara konsekutif sampling yaitu mencari subjek  penelitian  yang  memenuhi  kriteria inklusi  dan  eksklusi  sampai  terpenuhi  jumlah sampel  yang  diperlukan.  Pengambilan  data dilakukan  selama  periode  April-Mei  2019. Penelitian  ini  telah  mendapatkan  persetujuan dari komite etik FKKMK UGM No KE/FK/0558/EC/2018. Pengumpulan sampel dan ekstraksi DNA Pengambilan sampel darah utuh sebanyak 3 mL untuk masing-masing partisipan, dikumpulkan  dengan  menggunakan  tabung antikoagulan  EDTA.  DNA  genom  diekstraksi dari leukosit darah dan dimurnikan menggunakan QIAamp®  DNA  Blood  Mini purification  Kit (Qiagen,  Hilden,  Jerman). Konsentrasi  DNA  ditentukan  menggunakan spektrofotometer  Biochrom  (NanoVue  Plu s  ™) sebelum  amplifikasi  reaksi  rantai  polimerase (PCR).
Genotipe CYP2B6*9 (516G> T) Genotipe  alel CYP2B6*9 dilakukan dengan metode nested PCR dan analisis spesifik alel yang dimodifikasi. Alel CYP2B6*9 (516G> T) dihasilkan  dari  mutasi  G>  T  pada  posisi  516- nukleotida di ekson 4. Primer khusus untuk PCR pertama: forward primer  (5'-TAA-ACT-GGA- GCT -AAT-AAT-CAA-3 ') dan reverse primer (5'- CTC-AGT-CTC-TCT-CTG-ACT-CTA-3'). Amplikonnya berukuran 616 pasang basa (bp).  Untuk  amplifikasi  PCR  kedua,  urutan forward p rimer  adalah  5′ -  GAC-CCC-ACC-TTC- CTC-TTC-CAG- 3  ′  dan  5′ -  GAC-CCC-ACC-TTC- CTC-TTC-CAT- 3  ′  untuk  alel  G  dan  T  masing - masing, sedangkan urutan reverse primer sama dengan  untuk  PCR  pertama.  Kedua  alel menghasilkan  ukuran  fragmen  388  bp  dan ditampilkan  di  dua  sumur  gel  berbeda  dari sistem elektroforesis.
Campuran reaksi memiliki  volume  total  25  μL,  terdiri  dari  1  μL gDNA  sebagai  template,  12,5  μL  Campuran Merah  MyTaq  HS,  2  ×  (Bioline),  primer (konsentrasi akhir 0,3 μM), dan air suling ganda (ddH2O).  Kondisi  siklus  ditunjukkan  pada Tabel  I.  Produk  reaksi  PCR  pertama  kemudian dianalisis  dengan  1,5%  elektroforesis  gel agarosa  dalam  buffer  1  ×  TBE  (Tris,  Borate, EDTA).
Prosedur untuk PCR kedua sama dengan prosedur  PCR  pertama,  dengan  produk  PCR pertama  sebagai  cetakan  DNA  dan  primer spesifik alel (konsentrasi akhir 0,25μM).
Analisis statistik Peserta  dibagi  menjadi  dua  kelompok, laki-laki  dan  perempuan.  Frekuensi  alel  dan genotipe  untuk  SNP  ditentukan  dengan penghitungan  langsung.  Analisis  prevalensi polimorfisme  gen CYP2B6*9 dilakukan  dengan menghitung  proporsi  frekuensi  alel  dan memeriksa  deviasi  dari  Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). Analisis statistik dilakukan dengan  uji  chi-square  dan  rasio  peluang menggunakan  paket  statistik  SPSS  (IBM  SPSS Statistics  for  Windows, Version 23.0).  Data ditunjukkan dalam distribusi prevalensi dalam bentuk  tabel  dengan confidence  interval (CI) 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis Nested PCR dengan amplikon 388 bp  menghasilkan  dua  fragmen  untuk  genotipe GT dan satu fragmen untuk genotipe GG atau TT. Gambar  1  menunjukkan  hasil  elektroforesis dalam gel agarosa 1,5% yang diamplifikasi pada PCR.
Prosedur  genotipe  untuk  polimorfisme 516G>T dari gen CYP2B6 menunjukkan jumlah pemetabolisme  yang  buruk  (TT,  6  dari  89), sedangkan jumlah cepat (GG, 4 dari 89). Secara umum, dalam populasi yang diteliti, persentase distribusi genotipe adalah sebagai berikut: GG - 4,5%,  GT – 88,8%  dan  TT  -  6,7%.  Distribusi genotipe  dan  alel  polimorfisme  516G>  T  pada penduduk  Indonesia,  baik  laki-laki  maupun perempuan  dalam  penelitian  ini,  serta  hasil analisis  statistik  datanya  dapat  dilihat  secara berurutan pada Tabel II dan Tabel III.
Dari  seluruh  partisipan,  heterozigot (G/T) merupakan genotipe yang paling banyak ditemukan pada populasi ini yaitu sebanyak 79 (88,8%).  Tidak  ada  perbedaan  signifikan  yang ditemukan antara jenis kelamin dalam frekuensi polimorfisme 516G> T, nilai p> 0,05 (p = 0,205), (OR  =  1,473;  CI  95%  [0,809-2,684]).  Semua distribusi  frekuensi  polimorfisme CYP2B6*9 pada penelitian ini tidak memiliki deviasi yang signifikan dari HWE.
Penelitian  ini  menggunakan  metode Nested  Allele-Specific  untuk  menganalisis variasi  genetik  dari  gen CYP2B6*9 varian CYP2B6 . Penggunaan dua pasang oligonukleotida  dalam  Nested  Allele-Specific memungkinkan penghitungan siklus yang lebih
Gambar 1. Hasil analisis genotipe CYP2B6*9 pada subjek Jawa
Tabel I. Kondisi siklus PCR untuk genotipe gen CYP2B6*9
Kondisi siklus Waktu 1st PCR 2nd PCR Pre-denaturasi 02:00 menit 94°C Denaturasi 00:30 menit 94°C Penempelan 00:30 menit 52°C 66°C Pemanjangan - 72°C – 01:00 menit 72°C – 00:45 menit Final extention 07:00 menit 72°C Total siklus - 28 20
Faisal Rahman, et al
tinggi, sehingga meningkatkan sensitivitas PCR. Peningkatan  spesifisitas  reaksi  berasal  dari pengikatan  dua  set  primer  terpisah  pada template  target  yang  sama  (Green  dan Sambrook, 2019).
Penelitian  tentang  frekuensi  genotipe CYP2B6*9 di  Indonesia  telah  dilakukan  pada etnis  Timor  di  daerah  endemis  Malaria, Kabupaten  Amanatun  Selatan,  Provinsi  Nusa Tenggara  Timur.  Berdasarkan  data  pada Tabel  III,  frekuensi  genotipe wild  type pada populasi  Jawa  4,5%  sedangkan  pada  populasi Timor  sebesar  40,6%.  Frekuensi  genotipe mutan  homozigot  pada  populasi  Jawa  sebesar 6,7%,  sedangkan  pada  populasi  Timor  sebesar 27,1%. Frekuensi genotipe heterozigot merupakan genotipe yang paling dominan pada penduduk  Jawa  yaitu  88,8%  dibandingkan dengan penduduk Timor yaitu 27,1% (Hananta dkk.,  2018).  Melalui  analisis  χ2  did apatkan  p- value antara frekuensi genotipe CYP2B6*9 pada penduduk  Jawa  dan  penduduk  Timor  adalah 0,000,  sehingga  p  <0,05.  Dengan  demikian frekuensi  genotipe CYP2B6*9 pada  populasi Jawa  dan  Timor  berbeda  signifikan.  Frekuensi alel  yang  berbeda  antar  populasi  disebabkan oleh  proses  demografi  yang  netral  seperti fenomena selancar dan adaptasi lokal (Hofer et al .,  2009).  Alel  T  cenderung  lebih  tinggi  pada wanita, tetapi  tidak  signifikan  secara   statistik
(p>0,05). Hal  ini  menunjukkan  bahwa  sebaran polimorfisme  gen CYP2B6*9 antara  jantan  dan betina di Jawa hampir sama.
G15631T ( CYP2B6*9 ) adalah alel defisiensi  fungsional  yang  paling  umum  yang merupakan  bagian  dari  haplotipe CYP2B6 *6 [Q172H,  K262R]  (Zanger  dan  Klein,  2013). Secara fenotip, homozigot TT adalah pemetabolisme  yang  buruk.  Pada  golongan  TT homozigot,  obat  dalam  bentuk  bebas  lebih banyak  karena  tidak  dimetabolisme  dengan baik  oleh  hati  sehingga  menjadi  sangat  toksik. Ketika  individu  ini  diberikan  obat  dalam prodrug, efek obat menurun yang menyebabkan kegagalan  pengobatan  dan  akumulasi  prodrug dalam  darah.  Kondisi  ini  dapat  meningkatkan efek samping obat. Ketika obat diberikan dalam bentuk  aktif,  laju  sekresi  menurun,  dan konsentrasi  obat  aktif  dalam  darah  meningkat seiring  dengan  potensi  efek  samping,  oleh karena  itu,  dosis  yang  lebih  rendah mungkin  diperlukan  pada  individu  ini  untuk mengurangi efek samping (Hananta dkk., 2018). GT  heterozigot  dicirikan  oleh  aktivitas perantara dari enzim CYP2B6 (dosis terapeutik yang  dianjurkan  dari  obat),  dan  GG  homozigot adalah  pemetabolisme  cepat.  Pada  kelompok homozigot, GG dianjurkan untuk meningkatkan dosis  obat  (Scibona  dkk.,  2015).  Data farmakogenetik        untuk CYP2B6*9 sangat
Tabel II. Distribusi frekuensi genotipe CYP2B6*9 pada pria dan wanita pada populasi
Jawa Genotipe Pria Wanita Total p-value n (%) Mutan homozigot (T/T) 5 (13,5) 1 (1,9) 6 (6,7) 0,000 Heterozigot (G/T) 32 (86,5) 47 (90,4) 79 (88,8) Wildtype (G/G) 0 (0) 4 (7,7) 4 (4,5) Total 37 (100) 52 (100) 89 (100) HWE (χ2 value ) 21,48 ( p > 0,05) 34,43 ( p > 0,05) 53,62 ( p > 0,05)
Tabel III. Distribusi frekuensi genotipe CYP2B6*9 pada pria dan wanita pada populasi
Jawa Genotypes Ethnic groups p-value Javanese (%) Timorian (%) Wildtype (G/G) 4 (4,5) 39 (40,6) 0.000 Heterozygous (G/T) 79 (88 , 8) 31 (32,3) Homozygous mutant (T/T) 6 (6,7) 26 (27,1) TOTAL 89 (100) 96 (100) HWE (χ 2 value) 53,62 ( p > 0,05)
0,56 ( p > 0,05)
terbatas.  Diperlukan  studi  tentang  pengaruh polimorfisme  gen
CYP2B6 pada  respon farmakologis dan toksikologi terhadap obat.

## KESIMPULAN
Kesimpulannya,  penelitian  ini  telah mengidentifikasi  varian  alel CYP2B6*9 pada populasi  di  Jawa.  Studi  ini  memberikan kerangka kerja untuk studi masa depan tentang peran  varian  polimorfik  gen CYP2B6*9 dalam genesis  berbagai  penyakit  atau  desain  studi farmakogenetik  dan  farmakokinetik  masa depan  dari  substrat CYP2B6*9 pada  populasi Jawa.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Fakultas Farmasi UGM dan Laboratorium Riset Terpadu FKKMK UGM.

## DAFTAR PUSTAKA
Green,  M.  R.  and  Sambrook,  J.  2019, Nested Polymerase Chain Reaction (PCR), United States of America, John Inglis. Hananta,  L.,  Astuti,  I.,  Sadewa,  A.  H.,  Alice,  J., Hutagalung,  J.  and  Mustofa  2018,  The Prevalence of CYP2B6 Gene Polymorphisms in Malaria-endemic Population  of  Timor  in  East  Nusa
Tenggara Indonesia, Osong  public health and research perspectives, 9, 192-196. Hassani  Idrissi,  H.,  El  Khorb,  N.,  Akoudad,  A., Habbal, R. and Nadifi, S. 2018, Association of CYP2B6 (G15631T)  polymorphism with  Clopidogrel  resistance  and  genetic predisposition  to  Acute  Coronary Syndromes  (ACSs)  in  Morocco, Gene Reports, 11, 244-249.
Hofer, T., Ray, N., Wegmann, D. and Excoffier, L. 2009,  Large  allele  frequency differences
between  human  continental  groups  are more  likely  to  have  occurred  by  drift during  range  expansions  than  by selection, Ann Hum Genet, 73, 95-108. Musa, N., Zulkafli, M. I., Talib, N., Mohamad, N.,
Fauzi, H. and Ismail, R. 2012, Haplotypes frequencies  of CYP2B6 in  Malaysia, J Postgrad Med, 58, 235-41.
Peko,  S.  M.,  Gueye,  N.  S.  G.,  Vouvoungui,  C., Koukouikila-Koussounda, F., Kobawila, S. C.,  Nderu,  D. ,  et  al. 2019,  Cytochrome
P450 CYP2B6 *6  distribution  among Congolese individuals with HIV,
Tuberculosis and Malaria infection, Int J Infect Dis, 82, 111-116.
Rakhmanina,  N.  Y.  and  Anker,  J.  N.  V.  D.  2010, Efavirenz in the therapy of HIV infection,
Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 6 . Scibona, P., Vazquez, C., Cajal, A. R., Argibay, P. F. and  Belloso,  W.  H.  2015,  Prevalence  of CYP2B6 polymorphisms in Argentinians: the role of genetic testing, Genet Mol Res,
14, 16594-9.
Telenti,  A.  and  Zanger,  U.  M.  2008, Pharmacogenetics  of  anti-HIV  drugs, Annu Rev Pharmacol Toxicol, 48, 227-56. Turpeinen,  M.  and  Zanger,  U.  M.  2012,
Cytochrome P450 2B6: function, genetics, and clinical relevance, Drug Metabol Drug Interact, 27, 185-97.
Zanger,  U.  M.  and  Klein,  K.  2013,
Pharmacogenetics  of  cytochrome  P450
2B6 ( CYP2B6 ): advances
on polymorphisms,
mechanisms, and clinical relevance, Front Genet, 4, 24. Zanger, U. M. and Schwab, M. 2013, Cytochrome P450  enzymes  in  drug  metabolism: regulation  of  gene  expression,  enzyme activities, and impact of genetic variation,
Pharmacol Ther, 138, 103-41.
Tabel IV. Distribusi frekuensi alel CYP2B6*9 pada pria dan wanita populasi Jawa
Allele Male n (%) Female n (%) Total n (%) p-value OR* T 42 (46.2) 49 (53.8) 91 (100) 0.205 1.473 G 32 (36.8) 55 (63.2) 87 (100) Total 74 (41.6) 104 (58.4) 178 (100)
* Odds Ratio (OR), 95% CI (confidence interval) [0.809 – 2.684]