UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SPONS Stylissa sp. DENGAN MENGGUNAKAN METODE DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)
ANTIOXIDANT ACTIVITY TEST OF SPONGE Stylissa sp. USING THE DPPH METHOD (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Samuel I. M. Sibarani 1) , Adithya Yudistira 1) , Deby A. Mpila 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115 *samuelcbrave01@gmail.com

## ABSTRACT
Habitat  of  sponge  Stylissa  sp.,  were  under  the  sea  and  these  sponges  contain  active compounds,  which  are  more  active  than  the  compounds  produced  by  terrestrial  plants. Antioxidants are inhibitors of oxidation reactions due to the free radicals, which can cause weak damage to unsaturated cells, cell wall membranes, blood vessels, DNA bases, and lipid tissue, that causing disease. The study was conducted to determine the antioxidant activity of ethanol  extracts    of  sponge  Stylissa  sp.,  which  is  located  on  the  Bangka  Island,  Likupang District,  North  Minahasa  Regency.  Sponge  Stylissa  sp.,  was  extracted  by  maceration  with using ethanol. Testing of antioxidant activity was carried out by the DPPH method measured by  a  UV-Vis  spectrophotometer.  The  results  of  the  study  showed  that  ethanol  extracts  of sponge  Stylissa  sp.,  has  antioxidant  activity  in  each  concentration  and  the  highest  at  a concentration of 100 mg / L. The conclusion is a ethanol extract of sponge Stylissa sp. have high  antioxidant  activity  with  a  concentration  of  25  mg/L  (77,40%),  concentration  of  50 mg/L (85,63%), concentration of 75 mg/L (88,66%), and concentration 100 mg/L (88,96%).
Key words : Stylissa sp. Sponge, Antioxidant, DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

## ABSTRAK
Habitat  dari  spons Stylissa sp.  terdapat  di  bawah  laut  dan  spons  ini  mengandung  senyawa aktif yang persentase keaktifannya lebih besar dibandingkan dengan senyawa-senyawa yang dihasilkan  oleh  tumbuhan  darat.  Antioksidan  adalah  zat  penghambat  reaksi  oksidasi  akibat radikal  bebas  yang  dapat  menyebabkan  kerusakan  lemah  tak  jenuh,  membran  dinding  sel, pembuluh  darah,  basa  DNA,  dan  jaringan  lipid sehingga  menimbulkan  penyakit.  Penelitian dilakukan untuk mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak etanol biota laut spons Stylissa sp. yang  terdapat  di  pulau  Bangka,  Kecamatan  Likupang,  Kabupaten  Minahasa  Utara.  Spons Stylissa sp.  ini diekstrak dengan metode maserasi  menggunakan etanol.  Pengujian  aktivitas antioksidan  ini  dilakukan  dengan  metode  DPPH  yang  diukur  dengan  alat  spektrofotometer UV-Vis. Hasil dari penelitian menunjukan bahwa ekstrak etanol spons Stylissa sp. memiliki aktivitas  antioksidan  disetiap  konsentrasi  dan  yang  tertinggi  pada  konsentrasi  100  mg/L. Kesimpulan yang didapat bahwa ekstrak etanol spons Stylissa sp. memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi dengan konsentrasi 25 mg/L (77,40%), konsentrasi 50 mg/L (85,63%), konsentrasi 75 mg/L (88,66%), dan konsentrasi 100 mg/L (88,96%).
Kata Kunci : Spons Stylissa sp., Antioksidan, DPPH ( 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)
PENDAHULUAN Sebagai negara
kepulauan,
Indonesia  memiliki  sumber  daya  alam hayati laut yang besar. Salah satu sumber daya  alam  tersebut  yaitu  ekosistem terumbu  karang.  Ekosistem  terumbu karang  bisa  hidup  lebih  dari  300  spesies karang,  lebih  dari  200  spesies  ikan  dan ratusan spesies moluska, krustasea, spons, alga,  lamun  dan  biota  lainnya.  Spons merupakan salah satu komponen penyusun terumbu karang yang mempunyai  potensi  bioaktif  sebagai antibakteri,  antikanker  dan  antijamur yang belum banyak dimanfaatkan. Hewan laut  ini  mengandung  senyawa  aktif  yang persentase keaktifannya lebih besar dibandingkan  dengan  senyawa-senyawa yang  dihasilkan  oleh  tumbuhan  darat (Suparno, 2005).
Antioksidan adalah senyawa kimia yang  dapat  digunakan  untuk  melindungi kompenen  biologi  seperti  lipida,  protein, vitamin  dan  DNA  melalui  perlambatan kerusakan,  ketengikan  atau  perubahan warna  yang  disebabkan  oleh  oksidasi (Suryanto,  2012).  Antioksidan  diketahui dapat  menghambat  kerja  radikal  bebas. Sebagai salah satu upaya untuk mengoptimalkan pemanfaatan bahan alam laut Indonesia,  dilakukan  penelitian dengan  tujuan  awal  menguji  aktivitas antioksidan dan mengidentifikasi senyawa  berkhasiat  sebagai  antioksidan (Hanani et al., 2005).
Akhir-akhir ini
penggunaan senyawa  antioksidan  berkembang  dengan pesat  baik  untuk  makanan  maupun pengobatan.  Penggunaan  sebagai  obat makin  berkembang  seiring  dengan  makin bertambahnya pengetahuan tentang aktivitas  radikal  bebas  terhadap  beberapa penyakit  degeneratif  seperti  penyakit jantung dan kanker (Boer, 2000). Radikal bebas  adalah  adalah  suatu  molekul  yang relatif tidak stabil dengan atom yang pada orbit  terluarnya  memiliki  satu  atau  lebih elektron  yang tidak  berpasangan  (Robins, 2007).
Penelitian  sebelumnya  tentang  uji aktivitas  antioksidan  beberapa  spons  laut dari  kepulauan  Seribu,  Jakarta.  Metode  uji antioksidan  yang  digunakan  adalah  metode peredaman radikal bebas DPPH ( 1,1-difenil- 2-pikrilhidrazil ).  Metode  ini  memerlukan sedikit sampel, sederhana, mudah, cepat, dan peka  untuk  mengevaluasi  antioksidan  dari senyawa  bahan  alam  (Hanani et  al., 2005). Berdasarkan  uraian  latar  belakang  tersebut, peneliti  menganggap  bahwa    penelitian tentang “Uji aktivitas antioksidan pada spons Stylissa sp.  dengan  menggunakan  metode DPPH ( 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil )” perlu di lakukan.

## METODOLOGI PENELITIAN

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan  November  2019  –  Juli  2020  di laboratorium penelitian lanjutann (Farmakognosi,  Laboratorium  Fitokimia  dan laboratorium  Analisis  Farmasi)  Program Studi  Farmasi,  Fakultas  Matematika  dan Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Universitas  Sam Ratulangi.

## Bentuk Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental  laboratorium  untuk  menguji aktivitas  antioksidan  dengan  menggunakan metode  DPPH  dari  ekstrak  etanol  spons Stylissa sp . yang  diperoleh  dari  pulau Bangka.

## Alat dan Bahan Alat
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu,  labu  ukur  10  mL, erlenmeyer  200  mL,  cawan  petri,  wadah botol, spatula, gelas arloji, timbangan digital, spektrofotometer  UV-Vis, aluminium  foil , corong, mikro pipet, tabung reaksi, vacuum .
Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian  ini,  yaitu  kertas  saring,  etanol 96%,  DPPH,  spons Stylissa sp . dan  serbuk Vitamin C p.a sebagai pembanding.

## Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel
Sampel  diambil  di  pulau  Bangka, Kecamatan Likupang, Kabupaten Minahasa Utara menggunakan alat bantu (masker dan snorkel).  Sebelum  diambil  sampel  difoto menggunakan kamera bawah laut, kemudian  diambil  dan  dimasukan  kedalam kantong  plastik  jepit  yang  sudah  disiapkan kemudian disimpan dalam kotak pendingin setelah  itu  dibawa  ke  Laboratorium Farmakognosi  Program  Studi  Farmasi Universitas Sam Ratulangi.

## Preparasi Sampel
Spons Stylissa sp . yang  sudah diambil,  dicuci  kembali  dan  dipotong- potong kecil, kemudian dimasukkan kedalam  wadah  botol,  sampel,  yang didalam  botol  diisi  dengan  etanol  96% sebanyak 200 mL.

## Ekstraksi
Spons Stylissa sp . sebanyak  80  g dimaserasi  dengan  pelarut  etanol  96% sebanyak 200 mL dengan 3 kali pengulangan  selama  72  jam.  Sampel kemudian  disaring  untuk  mendapatkan filtrat.  Hasil  yang  didapatkan  kemudian diuapkan  menggunakan  oven  sehingga menghasilkan  ekstrak  kental  dari  sampel. Ekstrak  kental  yang  didapatkan  disaring kembali  dengan  cara  dilarutkan  ke  dalam etanol sebanyak 25 mL kemudian dimasukan  kedalam  oven  pemanas  untuk mendapatkan  ekstrak  kasar  dari  sampel spons Stylissa sp . penyaringan ini dilakukan untuk menghilangkan sisa garam pada ekstrak kental.

## Pembuatan Larutan Stok 100 mL
Sebanyak  100  mg  ekstrak  spons Stylissa sp . dilarutkan dalam 100 mL etanol 96%  dengan  masing-masing  konsentrasi 25,  50,  75,  dan  100  mg/L.  Rumus  yang dipakai, yaitu:
Hasil yang didapatkan dari hasil 𝑉1 dipipet dan ditambahkan etanol 96% hingga
mencapai  tanda  batas  10  mL,  kemudian  di pindahkan  kedalam  tabung  reaksi  dan ditutup  dengan  menggunakan  aluminium foil  untuk  digunakan  pada  perlakuan berikutnya.

## Pembuatan Larutan DPPH
DPPH  ditimbang  Sebanyak  4  mg dan  dilarutkan  dalam  etanol  96%  100  mL, dan  buat  larutan  stok  DPPH  sesuai konsentrasi  yang  sama  dengan  konsentrasi pada larutan stok sebelumnya yaitu 25,  50, 75,  100  mg/L.  masing-masing  konsentrasi ditambahkan  etanol  sampai  tanda  batas  10 mL.  larutan  yang  dibuat  untuk  uji  aktivitas antioksidan  yaitu  ekstrak  etanol  spons Stylissa  sp. dipipet  sebanyak  2  mL dimasukkan kedalam tabung  reaksi dengan masing-masing  konsentrasi  25,  50,  75,  dan 100  mg/L  dan  ditambahkan  2  mL  larutan DPPH  kedalam  masing-masing  konsentrasi dan divortex selama 5 detik sebanyak 3 kali pengulangan.

## Pembuatan Larutan Vitamin C
Vitamin  C  p.a  ditimbang  sebanyak 10  mg  dan  dilarutkan  dalam  etanol  96% sebanyak  10  mL,  kemudian  buat  larutan stok  untuk  konsentrasi  25,  50,  75,  dan  100 mg/L  dengan  ditambahkan  etanol  96% sampai  tanda  batas  10  mL  pada  masing- masing larutan sebanyak 3 kali pengulangan. Sampel vitamin C p.a dipipet sebanyak  2  mL  dimasukkan  kedalam tabung reaksi dengan masing-masing konsentrasi  25,  50,  75,  dan  100  mg/L  dan ditambahkan  2  mL  larutan  DPPH  kedalam masing-masing  konsentrasi  dan  divortex selama 5 detik sebanyak 3 kali pengulangan.  Diuji  pada  spektrofotometer UV-Vis  dengan  panjang  gelombang  517 nm.
Pengujian  Larutan  Kontrol  DPPH  dan Aktivitas  Antioksidan  dengan  Metode DPPH Larutan kontrol DPPH diuji menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis dengan panjang gelombang 517 nm sebagai absorbansi  kontrol  dalam  pengujian  ini. Sampel  diinkubasi  selama  30  menit  pada suhu 37  C. Untuk mengetahui aktivitas dari
𝑽 𝟏 x 𝑴 𝟏 = 𝑽 𝟐 x 𝑴 𝟐
penangkal radikal bebas tersebut, diuji pada spektrofotometer.  Berubahnya  warna  ungu menjadi warna kuning menunjukan efisiensi  penangkal  radikal  bebas.  Diukur absorbansi  pada  spektrofotometer  UV-Vis dengan panjang gelombang 517 nm setelah diinkubasi  selama  30  menit  berubahnya warna  menjadi  kuning  menunjukan  bahwa, masing-masing  konsentrasi  menunjukan efisiensi  penangkal  radikal  bebas  diuji dengan  spektrofotometer  UV-Vis  dengan panjang  gelombang  517  nm.  Kemudian diamati perbandingannya dengan vitamin C p.a  sebagai  standar.  Aktivitas  penangkapan radikal  bebas  (persen  inhibisi)  dihitung sebagai  persentase  berkurangnya  warna
DPPH dengan menggunakan rumus:

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas dari penangkal radikal bebas, diuji pada spektrofotometer UV-Vis. Data  persentase  inhibisi  ekstrak  etanol spons Stylissa sp.  dan  Vitamin  C  (p.a) sebagai  pembanding  disajikan  pada  tabel  1 berikut:
Tabel  1. Hasil  pengujian  perbandingan  ekstrak  etanol  spons Stylissa sp.  dengan  vitamin  C (p.a).

## KONSENTRASI
Ekstrak dan Vitamin C PENGULANGAN RATA - RATA I II III 25 mg/L Ekstrak 79.20% 77.40% 75.60% 77.40% Vit. C 86.30% 86.40% 83.60% 85.43% 50 mg/L Ekstrak 85.80% 85.70% 85.40% 85.63% Vit. C 86.80% 87.30% 86.90% 86.90% 75 mg/L Ekstrak 88.10% 89.00% 88.90% 88.66% Vit. C 87.70% 86.20% 86.60% 86.83% Ekstrak 88.90% 89.40% 88.60% 88.96% 100 mg/L Vit. C 86.60% 86.40% 87.00% 86.66%
𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒔𝒊 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍
% 𝒊𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒔𝒊 = 𝟏 − 𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒔𝒊 𝒌𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 × 𝟏𝟎𝟎%
Substansi  bioaktif  terutama  yang terdapat  pada  biota  laut  yang  tidak bertulang  belakang  (avertebrata)  seperti spons,  koral  dana  tunikata.  Biota  tersebut mengandung  senyawa  aktif  yang  lebih banyak  dibandingkan  alga  dan  tumbuhan darat.  Subtansi  kimia  yang  disekresikan karang  lunak  sebagai  senyawa  metabolit sekunder. Menarik untuk dikaji
pemanfaatannya  sebagai  sumber  bahan obat-obatan  alami.  Senyawa  bioktif  yang terdapat pada Stylissa sp. sangat dipengaruhi  oleh  mikroba  simbionnya, maka  variasi  dari  senyawa  bioaktif  sangat tinggi (Apri, 2014).
Uji  aktivitas  ini  menggunakan metode  DPPH  ( 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil ) karena  metode  ini  adalah  metode  yang paling  sederhana,  mudah,  cepat  dan  peka serta  hanya  memerlukan  sedikit  sampel untuk  mengevaluasi  aktivitas  antioksidan dari senyawa bahan alam sehingga digunakan  secara  luas  untuk  menguji kemampuan senyawa yang berperan sebagai  pendonor  electron  (Molyneux, 2004).  Pada  uji  DPPH  digunakan  panjang gelombang 517  nm, larutan DPPH tersebut diukur  pada  panjang  gelombang  400 sampai  600  nm  dan  hasil  yang  didapat adalah 0,815.
Sampel  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  spons Stylissa sp. dimana  sampel  ini  diekstraksikan  dengan menggunakan  metode  maserasi. metode  ini juga digunakan untuk mengekstrak zat aktif yang mudah larut dalam cairan pengekstrak,  tidak  mengandung  dalam pengekstrak serta tidak mengandung benzoin.  Keuntungan  dari  metode  ini adalah  peralatannya  mudah  ditemukan  dan pengerjaannya sederhana. Metode ekstraksi pada  sampel Stylissa sp.  menggunakan maserasi.  Maserasi  merupakan  salah  satu metode  ekstraksi  yang  dilakukan  melalui perendaman  serbuk  bahan  alam  dalam larutan  pengekstrak.  Sedangkan  pelarut yang  digunakan  untuk  sampel  tersebut adalah  etanol  96%  karena  pelarut  ini hampir  bisa  melarutkan  semua  senyawa organik,  baik  polar  atau  pun  non  polar. Konsentrasi yang digunakan untuk spons
Stylissa sp.  adalah  25,  50,  75,  dan  100 mg/L.  masing-masing  dari  konsentrasi tersebut dicampurkan dengan larutan DPPH  kemudian  divortex  dan  diinkubasi selama  30  menit  pada  tempat  yang  gelap. Kemudian setelah sampel diinkubasi masing-masing  dari  ekstrak  dilakukan pengukuran absorbansi dengan
menggunakan  alat  spektrofotometer  UV- Vis  dengan  panjang  gelombang  517  nm pada setiap konsentrasi dilakukan sebanyak 3 kali.
Hasil penelitian didapat bahwa pada tabel  1  menunjukkan  nilai  persentase inhibisi  pada  ekstrak  etanol  spons Stylissa sp.  yang  memiliki  aktivitas  antioksidan radikal bebas dan ekstrak tersebut mengalami  peningkatan  dari  konsentrasi rendah  25  mg/L  dengan  nilai  77,40% sampai  pada  konsentrasi  yang  tinggi  100 mg/L  mendapatkan  nilai  rata-rata  88,96%, ini  menunjukan  bahwa  sampel  tersebut memiliki  kadar  antioksidan  yang  tinggi. Menurut  Molyneux  (2004)  nilai  standard kadar antioksidan adalah 50%. Untuk hasil pengujian perbandingannya digunakan Vitamin  C  (p.a)  dan  hasil  aktivitas antioksidan pada Vitamin C (p.a) ada  yang lebih  tinggi  dari  ekstrak  etanol  spons stylissa sp.  dan  ada  yang juga lebih  rendah dari ekstrak etanol spons Stylissa sp.
Vitamin  C  (p.a)  digunakan  sebagai pembanding kontrol positif karena berfungsi  sebagai  antioksidan  sekunder yaitu  menangkap  radikal  bebas,  mencegah terjadinya reaksi berantai, aktivitas antioksidannya  sangat  tinggi,  dan  mudah diperoleh. Vitamin C ini mempunyai gugus hidroksi  bebas  yang  bertindak  sebagai penangkap  radikal  bebas.  Hasil  penelitian diatas menunjukkan sama dengan pernyataan  Green  (2004)  bahwa  nilai tingkat  inhibisi  akan  meningkat  seiring meningkatnya konsentrasi sampel dikarenakan  semakin  banyak  senyawa antioksidan  pada  sampel  yang  dapat menangkal radikal bebas.
Sampel ini memiliki kadar antioksidan  yang  lebih  besar  dibandingkan dengan  sampel  yang  berada  di  pulau lembeh karena sampel yang berada di pulau
Bangka  memiliki  kadar  antioksidan  rata- rata  pada  konsentrasi  25  mg/L  (77,40%), konsentrasi 50
mg/L (85,63%),
konsentrasi          75      mg/L  (88,66%),  dan konsentrasi  100  mg/L  (88,96%)  sedangkan sampel  yang  berada  di  pulau  Lembeh memiliki  kadar  antioksidan  yaitu    pada konsentrasi    25      mg/L    (65,90%), konsentrasi  50  mg/L (66,30%), konsentrasi 75 mg/L  (69,30%),  dan  konsentrasi  100 mg/L (70,26%) (Ikhrar, 2019).
Menurut Gozcelioglu
dan Konuklugil  (2012)  kadar  yang  terdapat pada Stylissa sp.  memiliki  potensi  bioaktif yang  sangat  besar,  dimana  kandungan bioaktif  tersebut  dikelompokkan  dalam kelompok  besar  yaitu  antiflamantory, antitumor, antivirus, antimalara dan antibiotik.  Spesies  ini  memiliki  senyawa metabolit sekunder berupa alkaloid, steroid dan  terpenoid,  dimana  berguna  untuk menghalangi predator bersaing untuk ruang dengan  organisme  spesies  lain,  untuk komunikasi dan untuk perlindungan terhadap infeksi.

## KESIMPULAN
Kesimpulan  yang  diperoleh  yaitu ekstrak  etanol  spons Stylissa sp.  memiliki aktivitas antioksidan pada setiap konsentrasi          25          mg/L      (77,40%), konsentrasi 50 mg/L (85,63%), konsentrasi 75  mg/L  (88,66%),  konsentrasi  100  mg/L (88,96%)  dan  aktivitas  tertinggi  terdapat pada konsentrasi 100 mg/L.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut tentang senyawa aktif yang terkandung  dalam  ekstrak  etanol  spons Stylissa sp.  dengan  konsentrasi  yang  lebih tinggi dari 100 mg/L dan pada pengujiannya memakai  metode FRAP, RP, dan  FC  lalu  bandingkan  dengan  hasil penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Apri,  R.  2014.  Kandungan  Senyawa Bioaktif  Sinularia  sp.  Lobophytum sp.  dari  Perairan  Pulau  Pongkok Bangka  Selatan.  [Thesis].  Sekolah
Pascasarjana Istitut Pertanian Bogor. Boer,  Y.  2000.  Uji  Aktivitas  Antioksidan Ekstrak Kulit Buah Kandis ( Garcinia  parvifolia  Miq ). Jurnal Matematika dan IPA . 1(1) : 26-33. Green,  R.J.  2004. Antioxidant  Activity  Of Peanut Plant Tissues . North caroline state university departemen of food science, Raleigh.
Gozceliogle,  B  dan  Konuklugil,  B.  2012.
Qualitaive  Detection  of  Some Secondary  Metabolites  from  Three Turkish  Marine  Sponges, Fabad  J. Pharm. Sci. 37 : 73-78.
Hanani,  E,  Mui’im  A,  Sekarini,  R,  dan Wiryowidagdo, S. 2005. Identifikasi Senyawa  Antioksidan  dalam  Spons Callispongia sp.  dari  Kepulauan Seribu. Jurnal  Ilmi  Kefarmasian.
2(3) : 127-133.
Ikhrar,  S.  2019.  Uji  Aktivitas  Antioksidan Stylissa sp.  dengan  Metode  DPPH
(1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) . Pharmacon Jurnal . 8(4) : 210-211. Molyneux,  P.  2004.  The  use  of  the  stable free  radikal diphenyl  picrylhydrazyl (DPPH)  for  estimating  antioxidant activity. Journal Science of
Technology . 26(2) : 211-219. Robins.  2007. Buku  Ajar  Patologi .  Vol  1,
Edisi  7.  Penerbit  Buku  Kedokteran EGC, Jakarta.
Suparno. 2005. Kajian Bioaktif Spons Laut
(porifera: Demospongiae )  Suatu Peluang Alternatif Pemanfaatan Ekosistem Karang Indonesia Dalam Dibidang Farmasi . Jurnal Perikanan  Indonesia . 24(21) :  41- 45. Suryanto,  E.  2012. Fitokimia  Antioksidan . Putra Media Nusantara, Manado.