## EFEK PEMBERIAN KALSITRIOL (1α,25 (OH) 2 D 3 ) TERHADAP KADAR CYCLIC AMP KULTUR KARDIOMIOSIT
Cut Sidrah Nadira *
Bagian Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Malikussaleh Lhokseumawe-Aceh, 24352, Indonesia
* Corresponding Author: sidrahnadira@gmail.com

## Abstrak
Defisiensi  kalsitriol  dapat  meningkatkan  faktor  risiko  terjadinya  penyakit kardiovaskular. Hal ini dikaitkan dengan penurunan fosforilasi troponin I (TnI) di Ser23/24.  Fosforilasi  TnI  di  Ser23/24  berperan  dalam  regulasi  Mg-ATPase miofilamen  dan  sensitivitas  miofilamen  terhadap  Ca 2+ yang  selanjutnya mempengaruhi  respon  frekuensi  dan  kekuatan  ejeksi  ventrikel.  Ser23/24  TnI  ini diketahui  merupakan  substrat  spesifik  PKA.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mempelajari  apakah  efek  kalsitriol  terhadap  peningkatan  fosforilasi  TnI mempunyai  jalur  mekanisme  aksi  yang  juga  melalui  cAMP/PKA.  Penelitian  ini merupakan eksperimental murni menggunakan rancangan pre-post test with control group dengan  sampel  kultur  primer  kardiomiosit Sprague-Dawley jantan  dewasa. Kardiomiosit diinkubasi  kalsitriol  selama  5  menit  kemudian  kadar  cAMP  diukur menggunakan metode ELISA. Hasil penelitian tidak menunjukkan adanya korelasi antara peningkatan  TnI terfosforilasi dengan  kadar cAMP (p>0,05). Penelitian ini masih belum dapat membuktikan adanya jalur aktivasi cAMP/PKA oleh kalsitriol dalam mekanisme peningkatan TnI terfosforilasi pada kardiomiosit.
Kata kunci: cAMP;  kalsitriol; kontraktilitas; kardiomiosit; troponin I.
CALCITRIOL (1α,25 (OH) 2 D 3 ) EFFECT ON CYCLIC AMP LEVEL OF CULTURED CARDIOMYOCYTES

## Abstract
Calcitriol  deficiency  increases  the  risk  of  cardiovascular  diseases.  It  is  associated with  decreasing  phosphorilated-TnI  at  Ser23/24.  Phosphorilated  Ser23/24-TnI contributes  in  regulation  of  myofilament  Mg-ATPase  and  Ca 2+ sensitivity  which control ventricular ejection force and frequency response. Ser23/24-TnI is known to  be  one  of  PKA  specific  substrat.  The  aim  of  this  research  is  to  studi  if  the calcitriol  effect  on  increasing  cardiomyocytes  phosphorylated-TnI  involves cAMP/PKA  signaling cascade.  This is a true experimental study by pre-post test with control group design. It used primary cultured cardiomyocytes of adult male Sprague-Dawley  ventricles  as  the  samples.  Cardiomyocytes  was  incubated  in calcitriol  for  5  minutes,  then  cAMP  level  was  measured  by  ELISA  method.  The results  showed  decreasing  of  cAMP  level  in  each  groups,  and  there  was  also  no significant correlation observed between increased phosphorylated-troponin I and cAMP  level  in  this  research  (p>0,05).  In  this  research,the  involvement  of cAMP/PKA  signaling  cascade  in  elevated  cardiomyocytes  phosphorylated-TnI was still undetermined.
Keywords : calcitriol; contractility; cardiomtocytes; cAMP; phosphorilated-troponin I.

## Pendahuluan
Berbagai
penelitian menunjukkan bahwa  defisiensi  vitamin  D  berkaitan dengan peningkatan faktor risiko terjadinya penyakit  kardiovaskular.  Rendahnya  kadar 25(OH)D 3 serum  berkorelasi  positif  dengan derajat  klasifikasi  gagal  jantung  menurut New  York  Heart  Association (NYHA). 1
Kardiomiosit  pada  kondisi  gagal  jantung tidak  mampu  meningkatkan  kemampuan kontraksi  dan  kecepatan  relaksasinya  jika diberi  stimulus  stress  ataupun  latihan. 2,3
Penurunan  kontraktilitas  ini  karena  adanya penurunan  densitas  reseptor  β  dan down regulation dari  reseptor  β,  penurunan aktivitas  PKA  serta  fosforilasi  troponin  I pada  Ser23/24. 4,5 Penurunan  fosforilasi troponin  I  akan  menyebabkan  terjadinya penurunan  kecepatan  pergerakan  filament ( sliding filament) dan peningkatan sensitivitas  kalsium  yang  berakibat  pada penurunan  kemampuan  kontraksi  dan kecepatan relaksasi kardiomiosit. 4,5
Peran  kalsitriol  pada  jalur  konduksi sinyal,  kontraksi  miokardium,  serta  fungsi diastolik 6,7 terjadi  melalui  regulasi  influks kalsium;  pelepasan  kalsium  cadangan intraseluler  dari  retikulum  sarkoplasma; modulasi adenilat siklase, fosfolipase C, dan aktivitas  protein  kinase;  serta  perubahan status  fosforilasi  protein  seluler  seperti phospholamban dan troponin I. 7,8,9
Fosforilasi  troponin  I  dapat  diperantarai oleh  protein  kinase  A  (PKA)  maupun protein kinase C (PKC). 10 Jalur  mekanisme  kalsitriol  dalam transduksi sinyal dan kontraktilitas kardiomiosit masih diperdebatkan.
Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan mempelajari  keterlibatan  jalur  cAMP/PKA oleh kalsitriol terhadap peningkatan fosforilasi  TnI  pada  kultur  kardiomiosit tikus.

## Metode Kultur Kardiomiosit
Kultur primer kardiomiosit berasal dari tikus  jantan  galur  Sprague-Dawley  usia dewasa  (≥16  minggu).  Metode  isolasi  dan kultur  kardiomiosit  yang  dipakai  pada penelitian  ini  menggunakan  modifikasi metode  Yamashita et  al. (1997),  dimana jantung tikus dieksisi, dicuci dengan larutan PBS  dingin  kemudian  dicacah  sampai dengan  ukuran  1-2  mm. 11 Enzim  yang digunakan  pada  proses  digesti  ini  adalah kolagenase  1  mg/mL 11 dan  medium  yang digunakan  adalah  Dulbecco  Modified
Eagle’s Medium (DMEM) yang mengandung FBS 10%, Penisillin/Streptomisin  1%,  dan  Fungizone 0,5%.  Hasil  kultur  kardiomiosit  kemudian disubkultur  di  wadah  kultur  24  sumuran menggunakan medium kultur yang mengandung FBS 10% pada 24 jam pertama dan  FBS  5%  pada  24  jam  kedua.  Kultur kardiomiosit  tersebut  selanjutnya  dibagi menjadi
kelompok
pretest (tanpa
perlakuan),  K(-)  (ethanol  0,2%  +  aminofilin 63,3  x  10 -6 M),  D1  (kalsitriol  0,5  x  10 -8 M  + aminofilin  63,3  x  10 -6 M),  D2  (kalsitriol  1  x 10 -8 M  (4,2  ng/mL)  +  aminofilin  63,3  x  10 -6 M), D3  (kalsitriol 2 x 10 -8 M (8,4 ng/mL) + aminofilin 63,3 x 10 -6 M), dan K(+) (epinefrin 2  x  10 -6 M  +  63,3  x  10 -6 M).  Waktu  inkubasi untuk  setiap  kelompok  adalah  5  menit. Jumlah  sampel  yang  digunakan  adalah  4 sampel  untuk  kelompok  pre-test  dan  4 sampel  untuk  masing-masing  kelompok post  test.  Jumlah    kardiomiosit  yang digunakan untuk pemeriksaan kadar cAMP adalah 4x10 5 sel per sampel.

## Analisis kadar cAMP
Kadar cAMP diperiksa menggunakan teknik ELISA  sesuai  dengan  manual  produk ( Rat/Mouse  cAMP  parameter  assay  kit –  RnD #KGE012),  dengan  hasil  pengukuran dinyatakan dalam satuan pmol/mL

## Statistik
Data  kadar  cAMP  dianalisis  menggunakan Wilcoxon  signed  ranks  test dan  Uji Kruskal Wallis yang  dilanjutkan  dengan  uji Mann Whitney. Korelasi  antara  peningkatan fosforilasi  troponin  I  dan  kadar  cAMP dianalisis menggunakan uji korelasi Pearson.
Hasil dan Pembahasan Hasil
Kadar cAMP Penurunan  kadar  cAMP  yang  bermakna (p<0,05)  dijumpai  pada  kelompok  D2,  D3, dan K(+) (Gambar 1).
Gambar  1.  Diagram  batang  rerata  kadar  cAMP  ± simpangan  baku  sebelum  dan  sesudah  inkubasi: ethanol  0,2%  +  aminofilin  63,3  x  10 -3 M  (K(-)); kalsitriol 0,5 x 10 -8 M + aminofilin 63,3 x 10 -3 M (D1);
kalsitriol  10 -8 M  +  aminofilin  63,3  x  10 -3 M  (D2); kalsitriol  2  x  10 -8 M  +  aminofilin  63,3  x  10 -3 M  (D3); dan  epinefrin  2  x  10 -6 M  +  aminofilin  63,3  x  10 -3 M (K(+))  selama  5  menit.  Pada  kelompok  D2,  D3,  dan K(+)  dijumpai  penurunan  kadar  cAMP  yang bermakna.
Perbedaan kadar cAMP yang bermakna (p<0,05)  dijumpai  antara  kelompok  K(-) dengan  kelompok  D2,  D3,  dan  K(+);  dan antara  kelompok  D1  dengan  kelompok  D2 dan D3 (p<0,05) (Tabel 2).
Tabel 2. Hasil analisis Kruskal-Wallis kadar cAMP setelah perlakuan selama 5 menit
N Median (minimum dan maksimum) (pmol/mL) P Kadar cAMP post test K(-) 4 287.84 (227.38 - 340.63) a,b,c 0,010 D1 4 274.49 (270.74 - 311.70) d,e D2 4 213.32 (165.80 - 245.12) a,d D3 4 175.09 (165.80 - 239.72) b,e K(+) 4 177.55 (165.80 – 179.90) c
Uji  Kruskal-Wallis. Keterangan:  K(-): kelompok  ethanol  0,2%  +  aminofilin  63,3  x 10-3 M; D1: kelompok kalsitriol 0,5 x 10 -8 M +  aminofilin  63,3  x  10-3  M;  D2:  kelompok kalsitriol  10 -8 M  +  aminofilin  63,3  x  10-3  M; D3:  kelompok  kalsitriol  2  x  10 -8 M  + aminofilin  63,3  x  10-3  M;  dan  K(+): kelompok  epinefrin  2  x  10 -6 M  +  aminofilin 63,3 x 10-3 M.
Uji post hoc Mann-Whitney:
a. Kadar  cAMP  kelompok  K(-)  berbeda bermakna dengan kelompok D2
b. Kadar  cAMP  kelompok  K(-)  berbeda bermakna dengan kelompok D3
c. Kadar  cAMP  kelompok  K(-)  berbeda bermakna dengan kelompok K(+)
d. Kadar  cAMP  kelompok  D1  berbeda bermakna dengan kelompok D2
e. Kadar  cAMP  kelompok  D1  berbeda bermakna dengan kelompok D3
Uji  korelasi  Spearman  antara  kadar cAMP  dengan  kelompok  dosis  kalsitriol menunjukkan  adanya  korelasi  yang  kuat dengan  arah  korelasi  negatif  (p=0,002,  r  =  - 0,785).
Hubungan  antara  fosforilasi  troponin  I dan kadar cAMP
Uji  korelasi  Pearson  menunjukkan tidak  adanya  korelasi  yang  bermakna  (p >0,05) antara peningkatan fosforilasi
troponin  I  dan  penurunan  kadar  cAMP setelah inkubasi kalsitriol selama 5 menit.

## Pembahasan
Regulasi
respon frekuensi dan kekuatan  pada  proses  ejeksi  ventrikel  oleh troponin I diduga melalui proses transduksi langsung  sinyal  fosforilasi-yang-diinduksi oleh  PKA  yang  dihantarkan  troponin  I  ke sisi  regulatorik  troponin  C.  Ini  akan mengubah  sensitifitas  dan  afinitas  troponin C  terhadap  ion  kalsium,  meningkatkan siklus pertukaran ion kalsium pada troponin C dan meningkatkan percepatan relaksasi. 12 Semakin  panjang  sarkomer  otot  teregang, maka  semakin  tinggi  pula  sensitivitas troponin C terhadap ion kalsium, taut antar filament juga semakin sempit dan pelepasan dan  pengambilan  kembali  ion  kalsium  dari dan  oleh  retikulum  sarkoplasma  juga semakin  besar.  Keadaan  ini  terjadi  sebagai mekanisme  persiapan  untuk  menghasilkan kekuatan  kontraksi  yang  lebih  besar  pada depolarisasi berikutnya. 13,14
Pemberian  kalsitriol  akut  secara langsung meregulasi kecepatan dan kekuatan kontraksi kardiomiosit. 6
Peningkatan  percepatan  kontraksi  dan relaksasi  ini  terjadi  bersamaan  dengan peningkatan  fosforilasi  troponin  I  dan phospholamban kardiomiosit. 7 Fosforilasi troponin  I  dapat  diperantarai  oleh  protein kinase  A  (PKA)  maupun  protein  kinase  C (PKC). 10 Untuk  mengetahui  keterlibatan jalur  cAMP/PKA  dalam  mekanisme  aksi kalsitriol  terhadap  fosforilasi  troponin  I, pada  penelitian  ini  dilakukan  pemeriksaan kadar  cAMP.  Akan  tetapi  tidak  dijumpai adanya  peningkatan  kadar  cAMP  pada kelompok
D1,D2,D3 maupun K(+). Keterlibatan cAMP/PKA dalam mekanisme aksi kalsitriol terhadap peningkatan troponin  I  yang  terfosforilasi  pada penelitian  ini  belum  dapat  dibuktikan.  Hal ini  kemungkinan  disebabkan  oleh  kurang optimalnya dosis aminofilin yang diberikan
sebagai  penghambat  fosfodiesterase  (PDE), sehingga  degradasi  cAMP  terjadi  dengan cepat  dan  tidak  lagi  dijumpai  adanya peningkatan  saat  dilakukan  pemeriksaan ELISA.  Kemungkinan  lain  yang  mungkin terjadi  adalah  adanya  aktivasi  jalur  aksi kalsitriol  selain  cAMP/PKA.  Sisi  fosforilasi spesifik  Ser  23/24  sebelumnya  diketahui sebagai  sisi  fosforilasi  spesifik  troponin  I yang  menjadi  target  PKA.  Akan  tetapi, beberapa  isozim  PKC  ternyata  dapat menyerupai aktivitas PKA dengan memfosforilasi  substrat  spesifik  PKA troponin  I  di  Ser23/24. 15,16 Ser23/24 troponin  I  dapat  difosforilasi  oleh  PKC-δ 10 dan  juga  PKCβ II . 2 Fosforilasi  troponin  I  di Ser23/24  baik  oleh  PKA  maupun  PKC berperan dalam regulasi sensitivitas miofilamen  terhadap  Ca 2+ dan  Mg-ATPase miofilamen. 15,16

## Kesimpulan
Pemberian kalsitriol dapat meningkatkan  fosforilasi  troponin  I  secara bermakna, akan tetapi
keterlibatan cAMP/PKA dalam mekanisme aksi kalsitriol  tersebut  belum  dapat  dibuktikan pada penelitian ini.

## Daftar Pustaka
1. Pilz S, März W, Wellnitz B, Seelhorst U, Fahrleitner-Pammer  A,  Dimai  HP  et  al . Association of vitamin D deficiency with heart  failure  and  sudden  cardiac  death in  a  large  cross-sectional  study  of patients referred
for coronary angiography.  J  Clin  Endocrinol  Metab 2008;93:3927-3935.
2. Messer  AE,  Jacques  AM,  Marston  SB. Troponin I phosphorylation and regulatory  function  in  human  heart muscle:  dephosphorylation  of  Ser23/24 on  troponin  I  could  account  for  the contractile  defect  in  end-stage  heart failure.
J Mol Cell Cardiol 2007;42(1):247-59.
3. Pi  Y,  Zhang  D,  Kemnitz  KR,  Wang  H, Walker JW. Protein kinase C and A sites on troponin I regulate myofilament Ca 2+ sensitivity  and  ATPase  activity  in  the mouse myocardium. J Physiol 2003;552(3):845-57.
4. Messer  AE,  Marston  SB.  Investigating the  role  of  uncoupling  of  troponin  I phosphorilation from
changes in myofibrillar  Ca 2+ -sensitivity  in  the pathogenesis  of  cardiomyopathy.  Front Physiol 2014;5:315.
5. Bodor  GS,  Oakeley  AE,  Allen  PD, Crimmins  DL,  Ladenson  JH,  Anderson PAW. Troponin I phosphorilation in the normal  and  failing  adult  human  heart. Circulation 1997;96(5):1495-500.
6. Zhao  G,  Simpson  RU.  Interaction between  vitamin  D  receptor  with caveolin-3  and  regulation  by  1,25- dihydroxyvitamin  D3  in  adult  rat cardiomyocytes.  J  Steroid  Biochem  Mol Biol 2010;121(1-2):159–63.
7. Green  JJ,  Robinson  DA,  Wilson  GE, Simpson  RU,  Westfall  MV.  Calcitriol modulation  of  cardiac  contractile performance via protein kinase C. J Mol Cell Cardiol 2006;41(2):350–9.
8. Ün  İ,  Kurt  AH,  Batuş  A,  Büyükafşar  K. Alfacalcidol  suppresses  α-receptor– mediated  vasoconstriction  via  an endothelium  dependent  mechanism. Turk J Med Sci 2013;43:238–244.
9. Tishkoff  DX,  Nibbelink  KA,  Holmberg KH,  Dandu  L,  Simpson  RU.  Functional vitamin  D  receptor  (VDR)  in  the  T- tubules  of  cardiac  myocytes:  VDR knockout  cardiomyocyte  contractility.
Endocrinology 2008;149(2):558-564.
10. Rapundalo ST. Cardiac protein phosphorylation: functional and pathophysiological correlates. Cardiovasc Res 1998;38(3):559–88.
11. Yamashita  N,  Hoshida  S,  Nishida  M,
Igarashi  J,  Taniguchi  N,  Tada  M  et  al . Heat shock-induced
manganese superoxide  dismutase  enhances  the tolerance  of  cardiac  myocytes  to hypoxia–reoxygenation  injury.  J  Mol Cell Cardiol  1997;29:1805–1813.
12. Solaro RJ, Rosevear P, Kobayashi T. The unique function of cardiac troponin I in the control of cardiac muscle contraction and  relaxation.  Biochem  Biophys  Res Commun 2008;369(1): 82-87.
13. Hoit BD, Walsh RA. Normal physiology of  the  cardiovascular  system.  In  Fuster V,  Walsh  RA,  O'Rourke  RA,  Poole- Wilson  P,  editors.  Hurst's  The  Heart. New York: McGraw-Hill, 2008:83-109.
14. Guyton AC, Hall JE. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Ed. 11. Jakarta: EGC, 2008.
15. Noland TA, Guo X, Raynor RL, Jideama NM, Averyhart-Fullard V, Solaro J, Kuo JF.  Cardiac  troponin  I  mutants: phosphorylation  by  protein  kinases  C and A and regulation of Ca 2+ -stimulated MgATPase  of  reconstituted  actomyosin S-1. J Biol Chem 1995;270:25445-54.
16. Swiderek  K,  Jaquet  K,  Meyer  HE, Schachtele  C,  Hofmann  F,  Heilmeyer LMG.  Sites  phosphorylated  in  bovine cardiac
troponin T and I: Characterization by 'P-NMR
spectroscopy  and  phosphorylation  by protein  kinases.  Eur  J  Biochem 1990;190:575-82.