## PERBANDINGAN EFEKTIVITAS DOSIS EKSTRAK BIJI ALPUKAT YANG DIPROSES DENGAN MILLING TERHADAP PENURUNAN KADAR GULA DARAH PADA TIKUS

## THE EFFECTIVITY OF MILLED AVOCADO SEED EXTRACT TOWARDS BLOOD SUGAR LEVEL IN RATS
Clarence Marks Alief 1 , Jojor Lamsihar Manalu 2, *
1 Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Unika Atma Jaya, Jalan Pluit Raya no. 2, Jakarta Utara 14440
2 Departemen Fisiologi dan Biokimia, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Unika Atma Jaya, Jalan Pluit Raya no. 2, Jakarta Utara 14440
* Korespondensi: jojor.lamsihar@atmajaya.ac.id

## ABSTRACT
Background: Diabetes is a metabolic disease of which the pancreas is unable to produce insulin, a hormone that  regulates  blood  sugar  level  or  the  body  is  unable  to  use  insulin  effectively.  Diabetes  causes  several problems such as vision impairment, cardiovascular diseases, renal diseases and other illnesses. Diabetes is usually  treated  with  anti-diabetic  medication  or  with  insulin.  However,  nowadays  people  are  looking  into alternative  treatments  which  use  natural  ingredients.  One  such  ingredient,  among  others  is  avocado  seed (Persea Americana Mill.) extract. Avocado seeds is chosen for this research, as it has astringent and flavonoids which are proven to have anti-diabetic effect.
Method:  This  is  an  experimental  study  using  Sprague-Dawley  strain  rats.  The  rats  were  separated  into  4 groups, group  as a negative control, and group II, III, and IV as experimental groups. The rats in the test group were  injected  with  alloxan  to  induce  diabetes,  then  the  rats  were  given  avocado  seed  extract  of  different concentration every day for five days. The avocado seed extract is obtained by first milling the seeds, so they become soft powder, and then extracting the seed using maceration.
Results: Treatment with avocado seed extract caused a decrease in blood sugar level in group II, III, and IV. One Way Anova statistical test resulted in a value of p=0,046 therefore the decrease in blood sugar level was significant. However, Tukey HSD statistical test result showed that no test group is significantly different from one another.
Conclusion: Treatment with avocado seed extract(dose of 150mg/kg, 300mg/kg, and  450mg/kg) caused a decrease  in  blood  sugar  that  is  statistically  significant,  however  no  dose  of  the  avocado  seed  extract  is significantly more effective than the other.
Key Words: avocado seed, extract, diabetes, hyperglycemia, blood sugar level

## ABSTRAK
Latar  Belakang: Diabetes  adalah  penyakit  metabolik  yang  disebabkan  oleh  pankreas  yang  tidak  mampu memproduksi insulin (hormon yang mengatur kadar gula darah) atau tubuh yang tidak dapat menggunakan insulin secara efektif. Diabetes dapat menyebabkan gangguan penglihatan, penyakit kardiovaskuler, penyakit ginjal  dan  penyakit  lainnya.  Diabetes  biasa  diobati  dengan  obat  kimia  anti-diabetes  atau  dengan  insulin. Namun  saat  ini,  masyarakat  sudah  mulai  mencari  pengobatan  alternatif  yang  menggunakan  bahan  alami. Salah satu bahan alami yang dapat dipakai sebagai pengobatan alternatif untuk diabetes adalah ekstrak biji alpukat ( Persea americana Mill.). Biji alpukat dipilih karena memiliki zat aktif seperti astringen dan flavonoid yang sudah diteliti memiliki efek anti-diabetes.
Metode: Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental menggunakan hewan uji tikus Sprague-Dawley . Kelompok tikus dibagi menjadi 4, yaitu kelompok I sebagai kelompok kontrol negatif, dan kelompok II, III dan IV.  Kelompok  tikus  perlakuan  diinjeksi  dengan  aloksan  sehingga  menginduksi  kondisi  diabetes,  kemudian tikus diberikan ekstrak biji alpukat dengan konsentrasi berbeda setiap hari selama 5 hari. Ekstrak biji alpukat diperoleh  dengan  menggiling  biji  alpukat  sehingga  menjadi  serbuk  halus,  lalu  ekstraksi  dilakukan  dengan menggunakan metode maserasi.
Hasil: Setelah pemberian ekstrak biji alpukat, terdapat penurunan kadar gula darah pada kelompok II, III, dan IV.  Dari  uji  statistik one  way  anova mendapatkan  hasil    p=  0,046,  maka  penurunan  kadar  gula  darah mendapatkan hasil bermakna. Namun berdasarkan hasil uji statistik Tukey HSD , kelompok uji tidak ada yang berbeda secara signifikan antara satu dan lainya.

## ARTIKEL PENELITIAN
Kesimpulan: Pemberian ekstrak biji alpukat ( dosis of 150mg/kg, 300mg/kg, and 450mg/kg ) menyebabkan penurunan kadar gula darah yang bermakna secara statistik, namun tidak terdapat dosis ekstrak yang paling efektif dari antara ketiganya.
Kata Kunci: biji alpukat, ekstrak, diabetes, hiperglikemia, kadar gula darah

## PENDAHULUAN
Glukosa adalah zat penting yang digunakan untuk proses respirasi sel dalam tubuh manusia. Namun bila glukosa dalam darah terlalu tinggi dapat menyebabkan berbagai penyakit. Salah satu penyebab  glukosa  dalam  darah  terlalu  tinggi  (hiperglikemia)  adalah  diabetes.  Diabetes  adalah penyakit metabolik yang disebabkan oleh pankreas yang tidak mampu memproduksi insulin (hormon yang mengatur kadar gula darah) atau tubuh yang tidak dapat menggunakan insulin secara efektif. 1 Pada  tahun  2012  terdapat  1,5  juta  orang  meninggal  karena  komplikasi  diabetes.  Diabetes merupakan  penyakit  urutan  ke  delapan  yang  menyebabkan  kematian  terbanyak  pada  manusia. 2 Diabetes dapat menyebabkan gangguan penglihatan, penyakit kardiovaskuler, penyakit ginjal dan penyakit lainnya. 3 Diabetes biasa diobati dengan obat-obat kimia anti-diabetes atau dengan insulin, serta  implementasi  gaya  hidup  sehat  sehingga  kadar  gula  darah  dapat  normal 4 .  Namun  saat  ini, masyarakat sudah mulai mencari pengobatan alternatif yang menggunakan bahan alami. Salah satu bahan  alami  yang  dapat  dipakai  sebagai  pengobatan  alternatif  untuk  diabetes  adalah  ekstrak  biji alpukat ( Persea americana Mill.).
Penelitian  oleh  Yunita  Ebrilianti  Oktaria  pada  tahun  2013  menyatakan  bahwa  ekstrak  biji alpukat yang diujinya terhadap tikus menurunkan gula darah, yang paling terlihat pada hari ke-10 yaitu gula darah mendekati batas normal. 5 Yunita menggunakan etanol untuk ekstraksi biji alpukat pada  penelitiannya.  Penelitian  oleh  Ezejiofor  pada  tahun  2013  membuktikan  bahwa  ekstrak  biji alpukat yang dibuat dengan cara direbus mampu menurunkan kadar gula dalam darah pada tikus yang diabetes. 6 Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa biji alpukat bersifat anti-diabetik dan juga  protektif  terhadap  organ-organ  tertentu.  Kedua  penelitian  tersebut  menunjukkan  bahwa  ada dampak  dari  biji  alpukat  terhadap  gula  darah,  namun  belum  mempertimbangkan  ukuran  sebagai variabel yang dapat berdampak pada hasil dan juga efektivitas ekstrak pada dosis yang lebih kecil. Maka dari itu peneliti melakukan uji dengan dengan dosis yang lebih kecil dan skala biji alpukat yang lebih kecil dengan metode milling untuk membuat serbuk biji alpukat .
Milling adalah proses materi padat diolah sehingga menjadi lebih kecil untuk kegunaan tertentu. Dalam  penelitian  ini  biji  alpukat  diproses  dengan milling sebelum  diekstraksi,  sehingga  memiliki ukuran partikel yang lebih kecil. Ukuran partikel yang lebih kecil menjadikan luas permukaan lebih besar,  sehingga  mampu  meningkatkan  kualitas  ekstrak.  Peneliti  ingin  menemukan  ekstrak  yang lebih efektif dan dosis optimal ekstrak biji alpukat dengan pemberian dosis variasi yang lebih kecil dan ekstrak yang diproses milling terlebih dahulu.

## METODE
Desain  penelitian  ini  menggunakan  metode  penelitian  eksperimental in  vivo menggunakan model hewan. Kadar gula darah tikus diukur pada 3 waktu, yaitu sebelum diinduksi dengan aloksan, sesudah  diinduksi  dengan  aloksan  dan  setelah  perlakuan  ekstrak  biji  alpukat  selama  5  hari. Penelitian  dilaksanakan  di  dua  lokasi  yaitu  Laboratorium  Biokimia-Kimia  FKIK  Unika  Atma  Jaya, Pluit,  Jakarta  Utara  dan Indonesian  Medical  Education  and  Research  Institute (IMERI)  Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (FKUI).
Ekstrak  biji  alpukat  dibuat  dengan  teknik  ekstraksi  maserasi  pada  biji  alpukat  yang  sudah diproses dengan metode milling. Biji alpukat pertama diperoleh dari  alpukat dengan memisahkan biji dengan daging dan kulit buah. Biji yang dipisahkan kemudian dikupas dan dipotong menjadi tipis dan kecil menggunakan pisau. Bagian biji alpukat yang kecil ini kemudian dikeringkan. Kemudian dilakukan milling dengan  memproses  biji  alpukat  penggiling  selama  10  menit  sehingga  menjadi serbuk  biji  alpukat  yang  halus.  Ekstraksi  dengan  metode  maserasi  kemudian  dilakukan  dengan merendam serbuk biji alpukat dengan etanol 96%. Pemilihan etanol dilakukan berdasarkan polaritas dan  kelarutan  sehingga  memudahkan  pemindahan  senyawa  kemudian  disaring  dan  diproses dengan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak. 7
Penelitian ini menggunakan hewan uji tikus Rattus norvegicus galur Sprague Dawley. Tikus yang digunakan adalah tikus Sprague Dawley jantan dengan berat 140-250 gram dengan umur 2-4 bulan dan mempunyai kondisi diabetes (kadar gula darah sewaktu lebih dari 200 mg/dL)
Peneliti menggunakan 3 ekor tikus dengan drop out sebanyak 2 tikus sehingga terdapat 5 tikus pada setiap kelompok. Sampel dibagi menjadi 4 kelompok sehingga jumlah tikus total adalah 20. Pembagian kelompok tikus adalah kelompok I, yaitu tikus kontrol yang diabetes yang tidak diberi ekstrak biji alpukat, kelompok II adalah tikus diabetes yang diberi ekstrak biji alpukat 150mg/kgBB, kelompok III merupakan tikus diabetes yang diberi ekstrak biji alpukat 300mg/kgBB dan kelompok IV adalah tikus diabetes yang diberi ekstrak biji alpukat 450mg/kgBB. Untuk menentukan estimasi besar  sampel,  peneliti menentukan  sendiri  jumlah  tikus  yang  hendak  dipakai  dengan  mengacu pada degree of freedom . Setelah dihitung dengan formula E=n-t dengan t adalah jumlah kelompok dan n adalah jumlah sampel. Didapatkan hasil 16 maka sampel dianggap mewakili karena E=10-20.
Tikus diaklimatisasi selama 7 hari. Tikus kelompok II, III dan IV akan dipuasakan selama 16 jam  dengan  tujuan  untuk  memaksimalkan  efek  obat  yang  dapat  bersaing  dengan  glukosa  yang memiliki  bentuk  serupa  secara  molekuler 8 kemudian,  dilakukan  induksi  dengan  aloksan  dengan injeksi intraperitoneal dosis 170 mg/kgBBlalu diberikan waktu minimal 48 jam untuk mengkondisikan diabetes. 9,10 Kemudian  tikus  diberikan  ekstrak  biji  alpukat  yang  diproses  dengan  metode milling secara sonde lambung. Setelah lima hari, maka kadar gula darah pada tikus diukur. Penelitian ini disetujui oleh  Komisi Etik FKIK UNIKA Atma jaya,  dengan no penelitian 29/07/KEP-FKUAJ/2019. Analisis dilakukan menggunakan uji Shapiro-Wilk, one-way Anova dan post hoc Tukey HSD.
Pengukuran kadar gula darah pada tikus coba dilakukan tiga kali, pada saat sebelum induksi aloksan, 48 jam setelah induksi aloksan, dan setelah dilakukan intervensi dengan ekstrak biji alpukat. Hasil pengukuran dari gula darah terpapar pada tabel 1.
Kadar gula darah sewaktu yang normal pada tikus adalah sekitar tidak lebih dari 180mg/dL. Bila di atas 180mg/dL maka dianggap diabetes sehingga diterima sebagai sampel 11 . Tikus perlakuan mengalami kenaikan tinggi pada setiap kelompok setelah induksi aloksan. Bila dilihat dari penurunan gula tiap kelompok, maka perubahan terbesar terjadi pada kelompok II (dosis 150mg/dL).
Tabel 1. Rerata kadar gula darah sebelum induksi, sesudah induksi, dan sesudah intervensi
Variabel Kelompok Rerata sebelum induksi aloksan Rerata sesudah induksi aloksan Rerata setelah intervensi ekstrak  biji alpukat Kadar gula darah (mg/dL) I 106,60 115,00 106,00 II 74,33 512,33 308,33 III 57,33 386,33 257,33 IV 65,66 448,00 343,00
Gambar 1. Grafik penurunan rerata kadar gula darah tikus
Uji normalitas dilakukan dengan menggunakan uji Shapiro-Wilk pada perubahan kadar gula darah setelah induksi aloksan. Kelompok I, II, III dan IV secara berurutan didapatkan nilai p sebesar 0,298; 0,353; 0,591; dan 0,305. Hasil tersebut menyatakan bahwa distribusi data normal (p>0,05) sehingga dilanjutkan dengan uji statistik menggunakan one-way ANOVA . Hasil uji statistik dengan one-way  ANOVA pada  kelompok  I,  II,  III,  dan  IV  didapatkan  nilai  p=0,00,  menunjukkan  bahwa terdapat perubahan bermakna pada kadar gula darah setelah induksi aloksan (p<0,05).
Uji  normalitas  kadar  gula  darah  setelah  intervensi  ekstrak  biji  alpukat  memberikan  nilai  p secara berurutan pada kelompok I, II, III, dan IV yaitu 0,862; 0,481; 0,117; dan 0,694. Hasil tersebut menyatakan  bahwa  distribusi  data  normal  (p>0,05),  sehingga  dilanjutkan  dengan  uji  statistik menggunakan one-way ANOVA . Hasil uji statistik dengan one-way ANOVA pada kelompok I, II, III, dan  IV  didapatkan  nilai  p=0,046,  menggambarkan  terjadi  perubahan  bermakna  pada  kadar  gula darah setelah diberikan ekstrak basah biji alpukat (p<0,05).
Tabel 2 .Tabel hasil Tukey HSD No Perlakuan Nilai p 1 Kontrol (I) vs Dosis 150 (II) 0.123 2 Kontrol (I) vs Dosis 300 (III) 0.309 3 Kontrol (I) vs Dosis 450 (IV) 0.062 4 Dosis 150 (II) vs 300 (III) 0.947 5 Dosis 150 (II) vs 450 (IV) 0.983 6 Dosis 300 (III) vs 450 (IV) 0.802

## DISKUSI
Hasil pemeriksaan pada hari kelima menunjukkan adanya penurunan kadar gula darah yang bermakna pada ketiga kelompok. Penurunan kadar gula darah pada tikus percobaan disebabkan oleh  kandungan  tanin  pada  biji  alpukat 12 .  Tanin  juga  tergolong  sebagai  astringen  yang  berperan untuk  melindungi  permukaan  usus  manusia  dengan  mempresipitasi  protein  selaput  lendir  usus, sehingga melapisi usus dan menghambat absorpsi glukosa yang menyebabkan peningkatan gula darah  tidak  terlalu  cepat  pada  penderita  diabetes. 13 Alpukat  juga  mengandung  flavonoid  yang menurut  penelitian  membantu  regenerasi  sel  beta  pancreas  dan  meningkatkan  efektivitas  insulin dalam membantu sel menyerap glukosa. 14 Alpukat mempunyai banyak dampak terhadap penderita diabetes  dalam  menurunkan  gula  darah  seperti  yang  terlihat  pada  kadar  gula  darah  tikus  pada penelitian ini.
Gambar  1  menunjukkan  perubahan  dari  kadar  gula  darah  tiap  kelompok.  Sumbu  X menunjukan  kelompok  perlakuan  pada  tikus  yaitu  kelompok  II,  III  dan  IV,  sedangkan  sumbu  Y menunjukkan penurunan kadar gula darah dengan satuan mg/dL. Penurunan terbesar terjadi pada kelompok II (dosis 150mg/kgBB), yaitu terdapat penurunan rerata kadar gula darah sebanyak 204 mg/dL.  Pada  kelompok  III  (dosis  300  mg/kgBB)  terdapat  penurunan  129  mg/kgdL,  sedangkan kelompok IV (dosis 450 mg/kgBB) terdapat  penurunan 105 mg/dL. Berdasarkan penurunan pada
kadar gula darah, maka dosis 150 mg/dL adalah dosis yang paling efektif dalam menurunkan kadar gula darah, meskipun tidak bermakna secara statistik dibandingkan 2 dosis lainnya.
Penurunan kadar gula darah yang berkurang dengan meningkatnya dosis ekstrak tidak sesuai ekspektasi peneliti. Pada obat-obatan konvensional, terdapat relasi dosis-efek yang proporsional. Berdasarkan law  of  mass  action kepada  kurva  konsentrasi-efek,  jika  konsentrasi  zat  aktif  yang dikonsumsi lebih banyak maka akan terjadi peningkatan efek obat . 15 Namun pada penelitian ini dosis terendah justru menyebabkan penurunan kadar gula darah yang paling tinggi.
Efektivitas yang menurun saat dosis meningkat menunjukkan bahwa dosis efektif lebih rendah dari  300  mg/kgBB.  Pada  penelitian  tahun  2013,  tidak  ada  perbedaan  yang  signifikan  antara efektivitas  dosis  biji  alpukat  dengan  dosis  300,  600,  dan  1200  mg/kgBB. 4 Penurunan  kadar  gula darah  pada  setiap  kelompok  pada  penelitian  tersebut  tidak  berbeda  jauh  saat  dosis  ditingkatkan lebih dari 300 mg/kgBB. Penelitian lain menyatakan bahwa dosis toksik untuk biji alpukat adalah 500 mg/kgBB sehingga pada saat dosis meningkat mendekati 500 mg/kgBB efektivitas dari ekstrak biji alpukat berkurang. 14
Perbandingan  efektivitas  dari  ekstrak  biji  alpukat  yang  diproses  dengan milling 10  menit dengan penelitian lainnya dilakukan pada dosis yang sama yaitu 300 mg/kgBB. 4 Penurunan kadar gula darah pada penelitian ini adalah 129 mg/dL, sedangkan pada penelitian sebelumnya terdapat penurunan 103,8mg/dL. Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak yang diproses dengan metode milling menghasilkan  penurunan  yang  lebih  besar.  Namun  belum  dilakukan  uji  statistik  untuk membandingkan  dengan  hasil  penelitian  yang  diproses  dengan  metode  non- milling ,  maupun dengan penelitian lain yang mempunyai jumlah hari uji yang sama.
Keterbatasan  penelitian  berada  pada  alat  pemeriksa  kadar  gula  darah  (glukometer)  yang digunakan  serta  perilaku  tikus  percobaan.  Glukometer  yang  digunakan dapat  memberikan  hasil yang  sedikit  berbeda  berdasarkan  jumlah  darah  yang  diteteskan.  Perilaku  tikus  coba  tidak  dapat diregulasi sepenuhnya.

## SIMPULAN
Seluruh  dosis  ekstrak  biji  alpukat  dalam  penelitian  ini  menyebabkan  penurunan  kadar  gula darah  yang  bermakna  secara statistikdengan  hasil.  Penurunan  terbanyak  adalah  pada  dosis  150 mg/kgBB,  namun  tidak  bermakna  secara  statistik.  Perlu  penelitian  lebih  lanjut  untuk  mengetahui dosis optimal  untuk memaksimalkan efektivitas ekstrak biji alpukat  yang akan digunakan sebagai terapi pada diabetes.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti mengucapkan terima kasih kepada Animal Research Facilities (ARF) IMERI FKUI.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Situasi dan Analisis Diabetes. DKI Jakarta: Pusat Data dan Informasi KEMENTERIAN KESEHATAN RI; 2014:2.
2. Global report on diabetes. Geneva: World Health Organization; 2016
3. Diabetes - Symptoms and causes [Internet]. Mayo Clinic. 2018 [cited 21 November 2018]. Available from: https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/diabetes/symptoms-causes/syc-20371444
4. Asif M. The prevention and control the type-2 diabetes by changing lifestyle and dietary pattern. Journal of Education and Health Promotion. 2014;3(1):1.
5. Oktaria Y. Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak Etanol Biji Alpukat (Persea americana Mill.) terhadap Tikus Galur Wistar yang diinduksi Aloksan. Surakarta: Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta ; 2013.
6. Ezejiofor  A,  et al.  Hypoglycaemic  and  Tissue-Protective  Effects of  the  Aqueous  Extract  of  Persea americana  Mill. Seeds on Alloxan-Induced Albino Rats. Malays J Med Sci. 2013;20(5).
7. Susanty S, Bachmid F. Perbandingan Metode Ekstraksi Maserasi dan Refluks Terhadap kadar Fenolik dari Ekstrak Tongkol Jagung(Zea mays L.). Jurnal Konversi. 2016;5(2):87.
8. Ighodaro O, Adeosun A, Akinloye O. Alloxan-induced diabetes, a common model for evaluating the glycemic-control potential of therapeutic compounds and plants extracts in experimental studies. Medicina. 2017;53(6):365-374.
9. Andrews K. Intraperitoneal (IP) Injection in Rats and Mice SOP [Internet]. Animalcare.ubc.ca. 2019 [cited 19 March 2019].
Available from:
https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/TECH%2010%20IP%20Injections%20in%20t
10.  Intraperitoneal Injection in the Mouse – Procedures With Care [Internet]. Procedureswithcare.org.uk. 2019 [cited 4
July 2019]. Available from: http://www.procedureswithcare.org.uk/intraperitoneal-injection-in-the-mouse/
11.  Wang Z, et al. [Estimation of the normal range of blood glucose in rats]. Pubmed [Internet]. 2010 [cited 10 April 2020];. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20459020
12.  Ejiofor  NC,  Ezeagu  IE,  Ayoola  M,  Umera  EA.  Determination  of  the  chemical  composition  of  avocado  (Persea americana) seed. Adv Food Technol Nutr Sci Open J. 2018; SE(2): S51-S55.
13.  Marella S. Flavonoids-The Most Potent Poly-phenols as Antidiabetic Agents: An Overview. Modern Approaches in Drug Designing. 2017;1(3).
14.  Padilla-Camberos  E,  Martínez-Velázquez  M,  Flores-Fernández  JM,  Villanueva-Rodríguez  S.  Acute  Toxicity  and Genotoxic Activity of Avocado Seed Extract ( Persea americana Mill. Mill., c.v. Hass ). The Scientific World Journal. 2013:1 –4.
15.  Aronson  J,  Ferner  R.  The  law  of  mass  action  and  the  pharmacological  concentration-effect  curve:  resolving  the paradox  of  apparently  non-dose-related  adverse  drug  reactions.  British  Journal  of  Clinical  Pharmacology. 2015;81(1):56-61.