Jurnal Agrotek  Tropika,  Februari  2023,  Vol  11,  No.  1,  pp.  89  -  95 DOI  :  http://dx.doi.org/10.23960/jat.v11i1.5141 ISSN:  2337-4993  (Print),  2620-3138  (Online)
PENGARUH  KOMBINASI BAP (6- Benzylaminopurine ) DAN  2,4-D ( Dichlorophenoxy acetic acid ) UNTUK PEMBENTUKAN KALUS TEBU ( Saccharum officinarum L.) MELALUI METODE THIN CELL LAYER
EFFECT  OF COMBINATION OF BAP  (6-Benzylaminopurine) AND  2,4-D (Dichlorophenoxy acetic acid) ON CALLUS FORMATION OF
SUGARCANE  (Saccharum  officinarum  L.)  THROUGH

## THIN  CELL LAYER  METHOD
Velia Nurul Hidayah 1 dan Parawita Dewanti 2*
1 Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Jember,
2 Fakultas Pertanian, Universitas Jember, Jember, Indonesia Email : parawita.faperta@unej.ac.id
* Corresponding Author, Diterima:  16 Okt. 2021, Direvisi: 22 Des. 2021, Disetujui: 29 Jan. 2022

## ABSTRACT
Sugarcane is one of commercial crops in Indonesia. Tissue culture method has been used widely for sugarcane propagation. Thin Cell Layer (TCL) was one of the tissue culture techniques for sugarcane that used 1-2 mm explants taken from pieces of plant organs. The aim of this study was to obtain the best combination media to propagate sugarcane from in vitro explant by using TCL technique. This research was conducted at the CDAST, University of Jember using a Completely Randomized Design (CRD) with two factors, namely the concentration of BAP (0 ppm and 0,5 ppm) and the concentration of 2,4-D (3 ppm and 3,5 ppm). There were 4  treatment  combinations  with  3  replications,  there  were  12  experimental  units.  The  data  obtained  will then be analyzed using the Analysis of Variance (ANOVA) and continued with the Duncan Multiple Range Test  (DMRT)  at  a  95%  confidence  level.  The  best  results  in  sugarcane  micro  propagation  through  TCL method were in the A1B2 treatment (0 ppm BAP and 3,5 ppm 2,4-D) with an average callus formation time of 3 days and an average callus formation percentage of 93%.
Key words: 2,4-D, BAP, sugarcane, Thin Cell Layer

## ABSTRAK
Tanaman tebu merupakan salah satu tanaman perkebunan komersial di Indonesia. Kultur jaringan telah banyak dilakukan untuk perbanyakan tanaman tebu.. Thin Cell Layer (TCL) merupakan salah satu teknik dari kultur jaringan untuk tanaman tebu yang menggunakan eksplan berukuran 1-2 mm yang diambil dari potongan organ tanaman.tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan kombinasi media untuk perbanyakan tebu dari eksplan in vitro menggunakan teknik TCL. Penelitian ini dilakukan di Labroratorium Kultur Jaringan CDAST Universitas Jember dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor yaitu konsentrasi BAP (0 ppm dan 0,5 ppm) dan konsentrasi 2,4-D (3 ppm dan 3,5 ppm). Terdapat 4 kombinasi perlakuan dengan 3  kali  ulangan  sehingga  terdapat  12  satuan  percobaan.  Data  yang  diperoleh  selanjutnya  akan  di  analisis dengan menggunakan Analiyis Of Variance (ANOVA) dan dilanjutkan dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada tingkat kepercayaan 95%. Hasil yang terbaik dalam mikropropagasi tebu melalui metode Thin Cell Layer yakni pada perlakuan A1B2 (0 ppm BAP dan 3,5 ppm 2,4-D) dengan rerata waktu pembentukan kalus selama 3 hari dan rerata persentase pembentukan kalus 93%.
Kata kunci:  2,4-D, BAP, tebu, Thin Cell Layer

## 1.PENDAHULUAN
Tanaman Tebu  ( Saccharum  officinarum L.) merupakan salah satu tanaman perkebunan yang banyak di budidayakan di Indonesia. Perbanyakan tebu dapat dilakukan dengan sistem konvensional menggunakan bagal. Bagal merupakan bibit tebu yang  berasal  dari  batang  tebu  dengan  2-3  mata tunas yang belum tumbuh (Thomas, 1992), namun menurut Azizi et  al. (2017)  perbanyakan  tebu dengan menggunakan bagal memliki kekurangan yakni memerlukan lahan yang luas, memerlukan tanaman  induk  dan  tenaga  kerja  yang  banyak, waktu  tanam  dipengerahi  musim,  dan  mudah terserang penyakit, selain dapat dilakukan dengan menggunakan  bagal  perbanyakan  tebu  dapat dilakukan melalui kultur jaringan. Salah satu teknik kultur jaringan yang saat ini banyak di gunakan yaitu melalui  somatik  embriogenesis. Teknik  somatik embriogenesis merupakan suatu proses sel tubuh tanaman yang dapat berkembang menjadi individu baru  melalui  tahap  perkembangan embrio  tanpa melaui  penyatuan gamet. Menurut Purnamaningsih (2002) keuntungan dari somatik embriogenesis yakni mampu menghasilkan jumlah propagula yang tidak terbatas dalam waktu yang singkat.
Menurut  Saadat  &  Hennerty  (2002)  faktor yang mempengaruhi tingkat muktiplikasi tunas in vitro yakni komposisi media, jenis hormon, jenis eksplan  dan  ukuran  eksplan  yang  digunakan. Metode Thin Cell Layer (TCL) merupakan metode perbanyakan  tanaman  secara  mikro  dengan menggunakan eksplan <1-2 mm yang dihasilkan dari potongan organ. Organ yang digunakan seperti pada bagian batang (epikotil/hipokotil), akar, daun, organ  bunga  (stigma  dan  ovary),  kotiledon  dan embrio (da Silva, 2008). Penggunaan metode TCL dapat diterapkan pada somatik embriogenesis untuk tujuan mendapatkan embrio somatik yang tinggi dan memiliki tingkat regenerasi yang tinggi.
Kelebihan  dari  metode  TCL  yakni  mampu menghasilkan planlet yang lebih banyak, selain itu juga efesien dalam penggunaan eksplan, dengan metode  TCL  hanya  memerlukan  eksplan  yang sedikit  yang  diambil  dari  tanaman in  vitro , dibandingkan    dengan  metode  kultur  jaringan biasanya yang membutuhkan eksplan dari lapang. Pemanfaatan  TCL  lainnya  juga  dapat memungkinkan isolasi sel dari sel spesifik atau ada lapisan spesifik yang diinginkan, karena melalui potongan yang sangat tipis sehingga diharapkan terdapat sifat-sifat tertentu dari adanya potongan tipis  tersebut.  Hasil  dari  metode  TCL  dapat
digunakan  sebagai  bahan  transformasi  gen. Efesiensi  transformasi  dapat  ditingkatkan  dari penggunan TCL dikarenakan dengan penggunaan eksplan yang sangat tipis akan lebih kecil terjadi adanya kimera. Secara jauh lagi penggunaan TCL dapat  digunakan  sebagai  proses  pembungaan secara in-vitro Metode TCL banyak digunakan pada tanaman monokotil dan dikotil yang memiliki nilai jual yang tinggi. Metode TCL sering digunakan pada tanaman  anggrek,  tanaman  obat  dan  tembakau, namun baru-baru ini metode TCL juga digunakan tanaman sayur-sayuran dan pangan (Dobranszki & da Silva, 2015).
Penggunaan zat pengatur tumbuh dalam kultur jaringan  merupakan  faktor  yang  berpengaruh terhadap pembentukan embrio somatik dan planlet pada  tanaman  tebu  (Sholeha et  al .,  2015). Penambahan zat pengatur tumbuh kombinasi auksin dan  sitokinin  yakni  2,4-D  dan  BAP  mampu mempengaruhi  proses  pembentukan  embrio somatik paling baik  (Naz et al. ,  2008)  Menurut Jalaja et  al (2008)  penggunaan  2,4-D  dengan konsentrasi  3-4  mgL -1 paling  efektif  untuk menginduksi pembentukan kalus tanaman tebu. Hal tersebut diperkuat oleh penelitian Widuri (2010) Penggunaan  2,4-D  pada  waktu  induksi  kalus dengan konsentrasi 3 mgL -1 mampu mempercepat waktu induksi kalus dengan waktu 15 hari. Menurut Rao (2015) Penggunaan kombinasi 2,4-D dan BAP dengan konsentrasi 2,4-D 3,5 mgL -1 + 0,5 mgL -1 BAP  merupakan  konsentrasi  terbaik  dalam menginduksi  kalus  tebu.  Oleh  karena  itu,  dapat dilakukan  uji  konsentrasi  yang  sesuai  pada penggunaan zat pengatur tumbuh BAP dan 2,4-D melalui  metode Thin  Cell  Layer ,  untuk perbanyakan tebu menjadi lebih efisien dan dapat menjadi sebuah inovasi baru dalam perbanyakan tanaman tebu melalui kultur jaringan

## 2. BAHAN  DAN  METODE
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Bioteknologi, CDAST ( Center for Defelopment  of  Advanced  Scinces  and Technology )  Universitas  Jember  mulai  Bulan Februari 2020 sampai April 2021.
Alat yang digunakan standart kultur jaringan dan Laminar Air Flow (LAF). Bahan tanam yang digunakan yakni  tunas bassal invitro tebu varietas bulu  lawang,  media  dasar  MS (Murashige  & Skoog), agar kultur jaringan, casein hidrolisat, L- prolin, L-Glutamine, Arginin, Sukrosa, PVP, Alhohol 70%, Alkhohol 96% , 2,4-D dan BAP.
Penelitian ini menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 2 faktor yaitu faktor pertama konsentrasi  BAP (0  ppm dan  0,5 ppm) dan faktor kedua yakni konsentrasi 2,4-D (3 ppm dan 3,5 ppm).
Terdapat 4 kombinasi perlakuan yang masing- masing kombinasi perlakuan diulang 3 kali, sehingga terdapat 12  satuan percobaan dengan tiap ulangan terdapat 10 eksplan. Kombinasi yang didapatkan yakni A1B1 (BAP 0 ppm dan 2,4-D 3 ppm) , A1B2 (BAP 0 ppm dan 2,4-D 3,5 ppm), A2B1 (BAP 0,5 ppm dan 2,4-D 3 ppm), A2B2 (BAP 0,5 ppm dan 2,4-D 3,5 ppm).
Bahan tanam yang digunakan yakni tunas basal in-vitro tebu  varietas  bulu  lawang,  tunas  basal diambil  dari  plantlet  yang  berumur  satu  bulan. Planlet tebu kemudian dilakukan subkultur dengan media  MS  0  untuk  mendapatkan  tunas  baru. Tanaman yang memenuhi kriteria diambil dari botol kultur kemudian dibersihkan dari sisa media didalam LAF, setelah itu dilakukan pemotongan pada bagian basalnya dengan ukuran 0,5 cm dari pangkal dengan menggunakan pisau scalpel . Pemotongan eksplan sekitar 1-2 mm. Satu batang tebu hanya bisa diambil dengan 3 irisan saja. Gambar 1 merupakan bahan tanam yang digunakan dalam penelitian.
Induksi kalus dilakukan pada media  dengan komposisi  media  MS  +  Vitamin  Pyridoxine  + Thiamine + Casein Hidrolisate + Agar + Sukrosa. Eksplan untuk tahapan induksi kalus diambil pada bagian basal tanaman tebu, yaitu merupakan bagian bawah batang yang berbatasan langsung dengan akar. Bagian ini dipilih karena memiliki banyak sel meristematik yang memiliki kemampuan tumbuh lebih baik dibandingkan bagian atas batang. Induksi kalus dilakukan selama 17 hari pada kondisi ruang gelap  dengan  suhu  23 0 C-25 0 C.  Indikator keberhasilan eksplan yakni dengan dicirikan warna putih kekuningan dan mengkilat atau glossy dengan tekstur  remah,  selanjutnya  kalus  akan  dipindah pada media proliferasi.
Variabel pengamatan yang diamati yaitu waktu pembengkakan eksplan, persentase pembentukan kalus, dan morfologi kalus hasil induksi kalus.

## 3. HASIL  DAN  PEMBAHASAN
Berdasarkan  hasil Anova  diketahui  bahwa faktor  tunggal  BAP,  faktor  tunggal  2,4-D  dan inetraksi antara BAP dan 2,4-D berpengaruh sangat nyata terhadap waktu pembengkakan eksplan dan persentase  pembentukan  kalus  tebu.  Gambar  2 merupakan  grafik  dari  waktu  pembengkakan eksplan.

## 3.1 Waktu  Pembengkakan  Eksplan  (Hari)
Hasil analisis menunjukan bahwa penambahan konsentrasi BAP 0 ppm dan 2,4-D 3,5 ppm pada perlakuan A1B2 dan konsentrasi BAP 0 ppm dan 2,4-D 3 ppm pada perlakuan A1B1  memberikan pengaruh  dengan  rerata  tercepat  dalam  waktu pembengkakan eksplan yakni dengan rerata waktu 3  hari,  sedangkan  penambahan  BAP  0,5  ppm memberikan pengaruh waktu pembengkakan lebih lambat yakni selama 5-6 hari.

## 3.2  Persentase  Pembentukan  Kalus
Hasil analisis (Gambar 3) menunjukan bahwa penambahan konsentrasi BAP 0 ppm dan 2,4-D 3,5  ppm  pada  perlakuan A1B2  memberikan persentase  terbaik  dalam  pembentukan  kalus dengan rerata persentase 93%, sedangkan dengan adanya  penambahan  BAP  0,5  ppm  memberikan respon terbaik dalam persentase pembentukan kalus
Gambar 1. Bahan Tanam dan Hasil Induksi. (A) Bagian basal yang digunakan induksi dibagian tanda hitam, (B) Contoh hasil induksi pada hari 0.

## Gambar 2. Waktu Pembengkakan Eksplan
Keterangan: Angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama menunjukkan  hasil  yang  berbeda  tidak nyata pada Uji Jarak Berganda Duncan (UJD) dengan taraf nyata 5%.
tebu  yakni  sebesar  70%  yang  ditujukan  pada perlakuan A2B2 dengan konsentrasi penambahan BAP 0,5 ppm dan 2,4-D 3,5 ppm.

## 3.3  Morfologi  Kalus
Hasil penelitian pada pengamatan morfologi kalus tebu terdapat 2 jenis morfologi kalus yaitu, kalus yang bersifat embriogenik dan kalus yang bersifat  non  embriogenik.  Kalus  yang  bersifat embriogenik dicirikan karakteristik kalus remah ( friable ), glossy (mengkilat) dan berwarna putih kekuningan  dapat  dilihat  pada  Gambar  4A, sedangkan  kalus  yag  bersifat  non  embriogenik memiliki ciri kalus kompak, kalus tampak basah dan berwarna  coklat  hingga  kehitaman  yang menandakan  bahwasannya  kalus  mengalami browning sehingga tidak dapat berdiferensiasi ke tahap selanjutnya dapat dilihat pada Gambar 4B. Pengamatan morfologi kalus berlangsung selama 17  hari  yakni  selama  waktu  induksi  kalus. Sedangkan untuk Gambar 5A merupakan morfologi dari  penanaman  eksplan  yang  dilakukan  secara melintang yakni memiliki karakteristik volume kalus lebih kecil dibanding dengan penanaman eksplan yang dilakukan secara membujur dapat dilihat pada Gambar  5B,  namun  penanaman  eksplan  secara melintang  lebih  cepat  merespon  dalam pembentukan somatic embriogenesis dibandingkan dengan  penanaman  yang  dilakukan  secara membujur dikarenakan penanaman yang dilakukan secara  melintang  bagian  eksplan  yang  terlukai terkena langsung oleh media sehinga memudahkan proses penyerapan proses penyerapan nutrisi pada media,  sedangkan  penanaman  yang  dilakukan secara  membujur  eksplan  yang  terkena  media hanya  bagian  sisi  samping  kiri  dan  kanan  saja sehingga memperlambat proses penyerapan nutrisi pada media.
Tahap  awal  sebelum  pembentukan  kalus diawali  terlebih  dahulu  dengan  adanya pembengkakan (pembengkakan) atau munculnya jaringan putih bening seperti titk-titik air atau lendir pada bekas sayatan pada permukaan eksplan yang akan berkembang  membentuk bulatan  kecil dan bergaregat jelas (Waryastuti et al ., 2017). Respon pembengkakan pada eksplan berbeda-beda sesuai dengan  penambahan  zat  pengatur  tumbuh  yang digunakan  pada  media  tanam.  Penambahan  zat pengatur  tumbuh  pada  media  merupakan  faktor yang  paling  penting  dalam  pembelahan  sel, morfogenesis  eksplan  dan  dapat  menentukan keberhasilan  dalam  proses  diferensiasi  sel  pada
Gambar 4. Morfologi Kalus Embriogenik (A) dan Non Embriogenik(B)
Gambar 5. Morfologi Kalus Melintang (A) dan Membujur (B)

## Gambar 3. Persentase Pembentukan Kalus
Keterangan: Angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama menunjukkan  hasil  yang  berbeda  tidak nyata pada Uji Jarak Berganda Duncan (UJD) dengan taraf nyata 5%.
jaringan tanaman yang dikulturkan (Quiroz-Figueroa et  al .,  2006).  Berdasarkan hasil  penelitian  yang dilakukan pemberian zat pengatur tumbuh 2,4-D tunggal memiliki respon pembengkakan lebih cepat dibandingkan  dengan  pemberian  zat  pengatur tumbuh kombinasi BAP dan 2,4-D. Penggunaan 2,4-D  tunggal  mampu  merespon  eksplan  untuk membengkak selama 3 hari saja, sedangkan untuk penambahan zat pengatur tumbuh kombinasi BAP dan 2,4-D mampu merespon eksplan basal untuk membengkak selama 5-6 hari.
Berdasarkan hasil penelitian dari 4 media yang digunakan, media yang paling baik untuk induksi
kalus  tebu  yakni  pada  media  A1B2  dengan konsentrasi 2,4-D 3,5 mg/l dengan rata-rata waktu pembengkakan  3  hari  dengan  persentase pembentukan kalus 93%. Kalus muncul dari bagian eksplan yang telah dilukai karena bagian tersebut menyerap lebih banyak nutrisi. Penambahan 2,4- D yang tinggi akan semakin mempercepat proses induksi kalus, penambahan 2,4-D yang tinggi akan mempermudah  proses  difusi  ke  dalam  jaringan tanaman pada area yang telah dilukai sehingga 2,4- D yang telah ditambahkan akan membantu auksin endogen  menstimulasi  dan  merangsang pembelahan  sel  terutama  pada  area  yang  telah dilukai (Yelnititis, 2021).  Auksin dalam hal ini 2,4- D  mampu  meningkatkan  pembentukan  embrio somatik setelah induksi kalus embriogenik (Almeida et  al .,  2018).  Penambahan  2,4-D  juga  dapat meningkatkan jumlah sel embriogenik yang tinggi dibandingkan dengan perlakuan kontrol tanpa 2,4- D pada saat proliferasi dengan menggunakan media cair (Alfian et al ., 2019)
Penggunaan  zat  pengatur  tumbuh  golongan auksin terutama pada 2,4-D banyak digunakan dalam menginduksi kalus dikarenakan dapat mengaktifkan ekspresi  gen  S omatic  Embriogenesis  Receptor Kinase yang dapat mendukung terjadinya somatik embriogenesis  (Gill et  al .,  2004).  2,4-D  dapat digunakan sebagai ZPT dan herbesida yang mampu mengaktifkan  hormon  ABA  dan  etilen. Pengingkatan hormon ABA mampu menginduksi ekspresi  protein  LEA  ( Leaf  embriogenesis Abundant ).  LEA  merupakan  protein  yang bertanggung  jawab  terhadap  perkembangan somatic embriogenesis (Grossmann, 2000). Selain itu, 2,4-D bersifat stabil dan tidak mudah rusak oleh cahaya  saat  sterilisasi  serta  dapat  merangang pemceahan  dan  pembesaran  sel  sehingga  baik digunakan untuk induksi (Maulana et al. , 2019). Menurut Chitra et al . (2005), tinggi rendahnya persentase pembentukan kalus embriogenik dapat dipengaruhi oleh konsentrasi hormon auksin sintetik yang  berfungsi  untuk  menginduksi  kalus embriogenik.  Penggunaan  2,4-D  dengan konsentrasi lebih dari 4 ppm mampu menyebabkan persentase kalus EC (Embriogenik) yang rendah dan dapat menurunkan kemampuan induksi kalus pada proses embriogenesis  tebu. (Maulidya et al ., 2020). Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi 2,4-D maka persentase kalus yang dihasilkan semakin tinggi pula, dapat dilihat pada perlakuan A1B2 (BAP 0 ppm dan 2,4- D 3,5 ppm) pembentukan kalus 93%. Sedangkan untuk perlakuan kombinasi 2,4-D dan BAP hasil
yang  paling  baik  yakni  pada  perlakuan A2B2 dengan konsentrasi BAP 0,5 mg/l dan 2,4-D 3,5 mg/l  dengan  rata-rata  waktu  pembengkakan eksplan 5 hari dengan rata-rata pembentukan kalus sebesar 70%.
Berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  perlakuan  dengan  pemberian  BAP  yang tinggi maka pembentukan kalus semakin lama. Hal ini dikarenakan ketidakseimbangan hormon endogen dan  eksogen  terutama  BAP  yang  diberikan. Menurut Abidin (1985) zat pengatur tumbuh dalam kondisi  tertentu  dengan  tinggi  rendahnya konsentrasi  ZPT  maupun  sifat  ZPT  itu  sendiri mampu menghambat kerja hormon endogen dan menganggu pertumbuhan dan perkembangan sel karena  sitokinin  endogen  dalam  tanaman  sudah cukup tinggi. Menurut George (1993) pembentukan kalus  pada  beberapa  tanaman  khususnya  pada tanaman monokotil, hanya membutuhkan sitokinin eksogen dalam konsentrasi yang sangat rendah (0- 0,1  mg/l). Ariati et  al. (2012)  menyebutkan konsentrasi ZPT yang diperlukan tergantung dari jenis eksplan, genotipe, kondisi kultur serta jenis ZPT yang digunakan.
Pengamatan  morfologi  menjadi  salah  satu faktor penting dalam penelitian ini. Morfologi kalus dapat  dibedakan  menjadi  2  jenis  yaitu  kalus embriogenik dan non embriogenik Karakteristik morfologi kalus embriogenik memiliki ciri kalus remah  ( friable ),  mengkilat,  dan  berwarna  putih kekuningan.  Sebaliknya  non  embriogenik  yakni kalus kompak, basah dan berwarna coklat hingga kehitaman  yang  menandakan  kalus  tidak berkembang  ke  tahap  somatik  embriogenesis. Adanya  peristiwa browning menghambat penyerapan  nurisi  oleh  eksplan,  hal  tersebut menyebabkan  penurunan  proses  pengkalusan. Selama proses pemotongan batang basal zat fenolik yang  sebagian  besar  berada  di  vakuola  akan tercampur dengan  isi  dari  plastida  dan  organel- organel lainnya, oleh karena itu warna gelap akan muncul.  Peristiwa  tersebut  akan  menghambat aktivitas enzim dan dapat menyebabkan kematian pada eksplan (Gill et al ., 2004).

## 4. KESIMPULAN
Perlakuan A1B2 (BAP 0 ppm dan 2,4-D 3,5 ppm)  memberikan  respon  terbaik  dalam mikropropagasi  tebu  melalui  metode Thin  Cell Layer dengan rerata waktu pembengkakan eksplan tercepat  selama  3  hari  dan  rerata  persentase pembentukan kalus tertinggi 93%.

## 5. UCAPAN  TERIMA  KASIH
Penelitian ini didukung oleh Hibah Pendukung IDB Batch 2 tahun 2020 dengan nomer kontrak 2598/UN25.3/LT/2020  dari  Dr.  Ir    Parawita Dewanti  M.P,  Prof  Dr.  Ir.  Bambang  Sugiharto, M.Agr.Sc  dan  Wahyu  Indra  Duwi  Fanata,  SP. M.Sc., Ph.D Universitas Jember.

## 6.  DAFTAR  PUSTAKA
Abidin,  Z.  1985. Dasar-Dasar  Pengetahuan tentang  Zat  Pengatur Tumbuh. Angkasa Bandung. Bandung.
Alfian, F. Narulita, N. N. Afdhoria, P. Dewanti, D. P. Restanto, & B. Sugiharto. 2019. Liquid Culture  of  Somatic  Embryogenesis  Cell Proliferation  of  Sugarcane  ( Saccharum officinarum ). International  Journal  of Agriculture and Biology . 21 (4): 905-910. Almeida, R. O., S. D. A. Silva, & L. F. Dutra. 2018. Induction of Somatic Embryogenesis and  Plant  Regeneration  of  sugarcane  cv. RB925345 from somatic embryos. Scientia Agraria Paranaensis . 17 (2): 165–169. Ariati, S. N., Waenati, Muslimin, & I. N. Suwastika. 2012.  Induksi  Kalus  Tanaman  Kakao ( Theobroma  cacao L.)  pada  Media  MS dengan  Penambahan  2,4-D,  BAP  dan Air Kelapa. Natural  Science:  Journal  of Science and Technology .  1 (1):  78–84.
Azizi, A. A. Aini, I. Roostika T, & D. Efendi. 2017. Multiplikasi Tunas  In Vitro  Berdasarkan Jenis  Eksplan  pada  Enam  Genotipe Tebu
( Saccharum  officinarum L.). Industrial Crops Research Journal. 23 (2): 90–97. Chitra, M., K. P. Martin, C. Sunandakumari, & P. V.  Madhusoodanan.  2005.  Somatic Embryogenesis,  Encapsulation,  and  Plant Regeneration  of Rotula  aquatica .,  a  Rare
Rhoeophytic  Woody  Medicinal    Plant. In Vitro Cellular and Developmental Biology- Plant. 41 (1): 28–31. da Silva, JA. T. 2008. Plant Thin Cell Layers: Challeng- ing the Concept. International Journal of Plant Developmental Biology . 2 (1): 79–81. Dobranszki,  J.,  &  J.  A.  T.  da  Silva.  2015. Adventitious Shoot Regeneration from Leaf Thin  Cell  Layers  in  Appple. Scientia Horticulturae . 127 (3): 460–463.
George, E. F. 1993. Plant Propagation by Tissue Culture. Part 1: The technology (No. Ed. 2) Exegetics Limited.
Gill, N. K., R. Gill, & S. S. Gosal. 2004. Factors Enhancing  Somatic  Embryogenesis  and Plant  Regeneration  in  Sugarcane ( Saccharum officinarum L.) Indian Journal of Biotechnology. 3 : 119–123.
Grossmann, K. 2000. Mode of Action of Auxin Herbicides: a New Ending to a Long, Drawn Out Story. Trends in Plant Science . 5 (12):
502–508.
Jalaja, N. C., D. Neelamathi, & T. V. Screenivasan. 2008.  Micropropagation  for  Quality  Seed Production  in  Sugarcane  in Asia  and  the Pacific.  FAO/APCoAB/APAARI.
Maulana,  R.,  D.  P.  Restanto,  &  Slameto.  2019. Pengaruh Konsentrasi 2,4- Dichlorophenoxy- acetic Acid (2,4-D)  terhadap Induksi  Kalus Tanaman  Sorgum. Jurnal  Bioindustri (Journal of Bioindustry). 1 (2): 138–148. Maulidya, A. U. K., B. Sugiharto, P. Dewanti, & T. Handoyo. 2020. Expression of Somatic Embryogenesis-related  Genes  in Surgarcane  ( Saccharm  officinarum L.). Journal  of  Crop  Science  and Biotechnology . 23 : 207–204.
Naz,  S., A. Ali.,  & A.  Siddique.  2008.  Somatic Embryogenesis  and  Planlet  Formation  in Different  Varieties  of  Sugarcane ( Saccharum officinarum L.) HSF-243 and HSF-245. Sarhad  Journal  of Agriculture .
24 (4): 593–598.
Purnamaningsih,  R.  2002.  Regenerasi  Tanaman melalui  Embriogenesis  Somatik  dan Beberapa  Gen  yang  Mengendalikannya. Bul. Agrobio 5 (2): 51–58.
Quiroz-Figueroa, F. R., R. Rojas-Herrera, R. M. Galaz-Avalos, & V. M. Loyola-Vargas. 2006. Embryo  Production  through  Somatic Embryogenesis Can be Used to Study Cell Differentiation in Plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture . 86 : 285–301.
Rao,  A.  S.  2015.  Callus  Induction  and Organogenesis in Surgarcane ( Saccharum officinarum L.)  var  93v297.  International Letters of Natural Sciences . 48: 14–22.
Saadat, Y. A.  &  M.J.  Hennerty.  2002.  Factors Affecting the Shoot Multiplication of Persian Walnut  ( Juglans  regia L.). Scientia Horticulturae. 95 (3): 251–260.
Sholeha,    W.,  B.  Sugiharto,  D.  Setyati,  &  P. Dewanti.  2015.  Induksi  Somatik Embriogenesis  Menggunakan  2,4- Dichlorophenoxyacetic  Acid (2,4-D) dan Kinetin pada Eksplan Gulungan Daun Muda
Tanaman Tebu. Ilmu Dasar. 16 (1): 17–22.
Thomas, A. N. S. 1992. Tanaman Obat Tradisional II. Kanisius. Yogyakarta. Hal. 9–10. Waryastuti, D. E., L. Setyobudi, & T. Wardiyati. 2017. Pengaruh Tingkat Konsentrasi 2,4-D dan BAP pada Media MS terhadap Induksi Kalus Embriogenik  Temulawak  ( Curcuma xanthorrhiza Roxb.). Doctoral  dissertation. Universitas Brawijaya.
Widuri, L. I. 2010. Induksi Somatik Embriogenesis Tanaman  Tebu  Transgenik  Bebas  Virus ( Saccharum officinarum L.) Sut Event 02 Menggunakan  2,4-D  dan  BAP. Skripsi . Agroteknologi. Universitas Jember. Yelnititis. 2021. Pembentukan Embrio Somatik dari Eksplan  Daun  Ramin,  Spesies  Tanaman Langka. Jurnal Pemuliaan  Tanaman Hutan . 6 (1): 129–135.