p-ISSN 2354-6565 /e-ISSN 2502-3438
PRODUKSI PENISILIN OLEH Penicillium chrysogenum L112 DENGAN VARIASI KECEPATAN AGITASI PADA FERMENTOR 1 L
Saadah D. Rachman 1 , Agus Safari 1 , Fazli 1 , Dian S. Kamara 1 , Abubakar Sidik 1 , Linar Z. Udin 2 , Safri Ishmayana 1
1 Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran, Jln. Raya Bandung-Sumedang km. 21 Jatinangor, Sumedang, Jawa Barat 45363
2 Pusat Penelitian Kimia Terapan LIPI Bandung, Jln. Cisitu-Sangkuriang Bandung 40135 Corresponding author email: ishmayana@unpad.ac.id

## ABSTRAK
Penisilin  merupakan  golongan  antibiotika  β-laktam  yang  memiliki  nilai  komersial  tinggi  karena digunakan  secara  luas  untuk  memproduksi  antibiotik  semisintetik  lain  (amoksilin,  ampisilin)  serta mempunyai  kemampuan  mengatasi  infeksi  yang  disebabkan  oleh  bakteri.  Proses  produksi  penisilin pada skala industri dilakukan dalam skala besar memerlukan kondisi agitasi optimum. Penelitian ini dilakukan  untuk  mengetahui  pengaruh  agitasi  terhadap  pembentukan  penisilin  dari Penicillium chrysogenum L112, yang mempunyai aktivitas antibiotika tertinggi terhadap beberapa bakteri uji. P. chrysogenum L112  yang  telah  diregenerasi  pada  suhu  30°C  selama  7  hari  disuspensikan  dengan  air suling  steril.  Suspensi  ini    diinokulasikan  ke  dalam  media  vegetasi  sebanyak  2%  (v/v).  Selanjutnya diaktivasi  pada  120  rpm  dan  28°C  selama  60  jam.  Hasil  aktivasi  diinokulasi  ke  dalam  media fermentasi sebanyak 10% (v/v), fermentasi menggunakan fermentor skala 1 L dengan kondisi pH 7, aerasi 1 vvm, suhu 28°C selama 240 jam. Kecepatan agitasi divariasikan pada 100, 150 dan 200 rpm. Setiap 24 jam dilakukan pengambilan contoh untuk keperluan analisa yang meliputi pengukuran pH, berat  kering  sel,  uji  aktivitas  antibiotika  dan  konsentrasi  glukosa.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa agitasi dan waktu inkubasi berpengaruh terhadap kemampuan Penicillium chrysogenum L112 dalam menghasilkan penisilin. Setiap bakteri uji memberikan respon yang berbeda terhadap aktivitas antibiotika  penisilin  yang  dihasilkan.  Aktivitas  antibiotika  penisilin  terbaik  ditunjukkan  pada  agitasi 150 rpm pada waktu inkubasi 192 jam dengan aktivitas penghambatan tertinggi terhadap Escherichia coli dengan zona bening 37 mm.
Kata Kunci :  penisilin, antibiotika, Penicillium chrysogenum , fermentasi

## ABSTRACT
Penicillin refers to a group of β-lactam antibiotics with high commercial value because it is precursor for  semi  synthetic  antibiotics  such  as  amoxicillin  and  ampicillin.  It  also  has  high  antibacterial activity.  Penicillin  production  in  industrial  scale  uses  large  fermentation  reactor  which  require optimum  agitation.  The  present  study  was  conducted  to  investigate  the  effect  of  agitation  speed  on penicillin  production  using  Penicillium  chrysogenum  L112,  which  have  high  antibiotics  activity against  some bacteria.  P. chrysogenum  L112  which regenerated  at  30°C  for  7 days  was  suspended with  distilled  water.  The  suspension  was  inoculated  to  vegetation  media  to  reach  2%  (v/v)  final concentration. It was then followed by activation at 28°C for 60 hours with 120 rpm agitation speed. The activated culture was inoculated to fermentation media to give 10% (v/v) final concentration in a 1 L fermenter at pH 7 and 28°C, aeration of 1 vvm, for 240 hours. Agitation speed was varied at 100, 150 and 200 rpm. Sample was collected every 24 hours and checked for its pH, dry cell weight, and antibiotics  activity.  The  results  of  the  present  study  indicate  that  agitation  speed  and  time  of incubation  affected  the  P.  chrysogenum  ability  to  produce  penicillin.  The  crude  extract  showed different  effect  when  tested  against  different  bacteria,  which  indicate  different  amount  of  penicillin produced. The best antibiotics activity was found at 150 rpm agitation speed, incubation time of 192 hours. The highest inhibition was found for Escherichia coli which showed 37 mm clear zone.
Keywords :   penicillin, antibiotics, Penicillium chrysogenum, fermentation

## PENDAHULUAN
Antibiotika  adalah  substansi  alamiah  hasil metabolisme  sekunder  mikroorganisme  yang mempunyai kemampuan untuk menghambat atau membunuh mikroorganisme lain. Definisi tersebut  sangat  terbatas  karena  sangat  banyak molekul  yang  diperoleh  melalui  sintesis  kimia, mempunyai  aktivitas  terhadap  mikroorganisme. Sekarang  istilah  antibiotika  berarti  semua substansi  baik  yang  berasal  dari  alam  ataupun sintetik  yang  mempunyai  toksisitas  selektif terhadap  satu  atau  beberapa  mikroorganisme tujuan,  tetapi  mempunyai  toksisitas  lemah terhadap  inang  (manusia  atau  hewan)  dan  dapat diberikan melalui jalur umum  (Elander 2003).
Penisilin  pertama  kali  diterapkan  untuk aplikasi  klinik  tahun  1942.  Beberapa  kelebihan penisilin  yaitu  mempunyai  spectrum  yang  luas, aktif  terhadap bakteri gram positif  dan mempunyai  toksisitas  yang  rendah  sehingga penggunaan penisilin G dengan dosis tinggi tidak menyebabkan alergi  (Crueger & Crueger 1984). Keberadaan  gen  yang  berperan  pada  proses biosintesis  penisilin  dipercaya  sangat  penting untuk  organimse  penghasil  sehingga  dapat bersaing  dengan  organisme  lainnya,  namun molekul  ini  kemungkinan  juga  berperan  dalam proses  signaling  (Weber et  al .  2012).  Salah  satu jamur  yang  dikenal  luas  dapat  menghasilkan penisilin adalah Penicillium chrysogenum (Houbraken et  al .  2012; Kardos & Demain , 2011).
Produksi  penisilin  dipengaruhi  oleh  banyak faktor, diantaranya oksigen terlarut, karbondioksida  terlarut,  glukosa,  serta  variasi fraksi volume fase abiotik dan biotik (Birol et al . 2002; Rani et al . 2003; El-Sabbagh et al . 2006). Penelitian yang dilakukan oleh Birol et al . (2002) menunjukkan    bahwa  produksi  penisilin  G optimum  mencapai  0,059  g/L  dengan  waktu inkubasi  150  jam,  suhu  25°C,  serta  oksigen terlarut  1,16  mmol/L.  El-Sayed  &  Rehm  (1987) melakukan  produksi  penisilin  G  dengan  metode amobilisasi P.  chrysogenum ATCC  10238 menggunakan  kalsium  alginat  dalam  kolom  dan fermentor.  Rani et  al .  (2003)  juga  melakukan penelitian  produksi  penisilin  G  menggunakan continuous  stirred  tank  reactor dengan  metode amobilisasi P.  chrysogenum dengan  agar. Produksi penisilin G maksimum mencapai 0,641 g/L dengan kondisi media fermentasi terdiri dari laktosa  monohidrat  0,13  g/L,  asam  fenil  asetat 0,004  g/L  dan  amonia  0,4  mL  pada  suhu  27°C pH  6  serta  waktu  inkubasi  120  jam.  Kondisi
stirred  tank  yang  digunakan  adalah  volume  1  L, tinggi  cairan  16  cm,  L/D  (diameter  tank  4,338 cm,  kecepatan  aerasi  1  L/(L  menit),  kecepatan agitasi  300  rpm  dan  kecepatan  alir  umpan  25 mL/jam.
Agitasi  merupakan  salah  satu  faktor  yang cukup  penting  dalam  memproduksi  penisilin (Smith & Lilly 1990) karena setiap mikroorganisme,  termasuk P.  chrysogenum L112,  memerlukan  kecepatan  agitasi  tertentu untuk  dapat  memproduksi  penisilin  secara maksimal.  Pembentukan  produk  metabolisme mikroorganisme  sering  menyebabkan  perubahan oksigen terlarut serta komposisi media fermentasi. Untuk mempertahankan pertumbuhan yang cepat, kecepetan agitasi harus diatur  pada  kondisi  optimum  mikroorganisme tersebut.  Oleh  karena  itu  pada  penelitian  ini dilakukan  variasi  kecepatan  agitasi  untuk mencari  kecepatan  agitasi  untuk  menghasilkan penisilin maksimum.

## METODE PENELITIAN

## Bahan
Mikroorganisme. Mikrorganisme yang digunakan  untuk  memproduksi  penisilin  G adalah Penicillium  chrysogenum L112  yang diperoleh dari Pusat Pengembangan dan Penelitian  Kimia  Terapan  LIPI  Bandung.  Selain itu  untuk  bakteri  uji  digunakan Bacillus  subtilis , Salmonella  thypi , Staphylococcus  aureus ,  dan Eschericia  coli yang  juga  diperoleh  dari  Pusat Pengembangan  dan  Penelitian  Kimia  Terapan LIPI Bandung.
Bahan kimia. Ekstrak ragi, asam fenil asetat, bakto pepton, potato dextrose agar, glukosa, agar bakto,  susu  bubuk,  anti  foam,  natrium  karbonat, kalium-natrium  tatarat,  natrium  bikarbonat, natrium  sulfat  anhidrat,  asam  sulfat  pekat, ammonium molibdat tetrahidrat, natrium hidrogen  arsenat  heptahidrat,  metil  merah,  metil biru,  alkohol,  natrium  hidroksida,  asam  klorida dan air suling.
Alat.
Inkubator, shaker incubator, autoklaf, fermentor,  mikropipet,  alat  sentrifugasi,  oven, neraca  analitis,  pH  meter,  spektrofotometer, kawat ose, penangas air, dan alat-alat gelas yang umum digunakan di laboratorium.

## Metode
Regenerasi  P.  chrsogenum  L112. Sebanyak satu ose biakan P. chrysogenum L112
dipindahkan  ke  media  agar  miring  steril  (2% PDA).  Selanjutnya  diinkubasi  pada  suhu  30°C selama 7 hari.
Regenerasi  bakteri  uji. Sebanyak  satu  ose biakan bakteri diambil dan dipindahkan ke media agar miring steril (2,3% nutrien agar). Selanjutnya  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama 48 jam.
Aktivasi. Biakan P.  chrysogenum L112  yang telah  diregenerasi  disuspensikan  dengan  air suling steril. Suspensi jamur (2% v/v dari media vegetatif)  diinokulasikan  ke  dalam  media vegetatif  yang  mengandung  3,4%  b/v  susu  skim dan  3,5%  b/v  glukosa    dan  diaktivasi  dengan kecepatan  pengocokan  120  rpm  selama  60  jam pada suhu 28°C.
Fermentasi. Hasil  aktivasi  diinokulasikan (inokulum  yang  ditambahkan  10%  dari  volume media  fermentasi)  ke  dalam  media  fermentasi (mengandung  11%  b/v  susu  skim,  5%  b/v glukosa,  1%  b/v  ekstrak  ragi,  1%  b/v  bakto pepton, 1 mg/L antifoam, dan 1 mg/L asam fenil asetat),  kemudian  diinkubasi  dengan  variasi agitasi  selama  240  jam  pada  suhu  28°C. Fermentasi  dilakukan  dengan  menggunakan fermentor  skala  1  L.  Kondisi  fermentor  yang digunakan:  pH  7,  aerasi  1  vvm  (volume  gas  per volume  larutan  per  menit),  suhu  28°C.  Agitasi divariasikan pada 100, 150 dan 200 RPM. Setiap 24  jam  dilakukan  pengambilan  contoh  untuk keperluan analisis.
Penentuan  berat  kering  sel. Contoh  hasil sampling  disentrifugasi  pada  3000  RPM  selama 30  menit.  Selanjutnya  dicuci  dengan  asam klorida  0,5  N  dan  air  suling.  Endapan dikeringkan  dalam  oven  pada  suhu  70°C  selama 72  jam  atau  sampai  didapatkan  berat  kering  sel yang konstan.
Pengukuran  pH. Nilai  pH  contoh  hasil sampling diukur dengan menggunakan pH meter yang telah dikalibrasi terlebih dahulu.
Uji  aktivitas  antibiotika. Sebanyak  10  μL suspensi  bakteri  dicampurkan  dengan  16  mL larutan  agar  yang  telah  disterilkan  dan  masih dalam keadaan cair dan dihomogenkan. Selanjutnya dituangkan dalam cawan Petri steril. Setelah media agar membeku kemudian dilubangi  sehungga  terbentuk  lubang  dengan diameter  10  mm.  kemudian  10  μL  supernatan dimasukkan ke dalam lubang. Selanjutnya media agar  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  24  jam. Zona  bening  yang  terbentuk  kemudian  diukur untuk menentukan aktivitas antibiotika. Semakin
luas  zona  bening,  semakin  tinggi  aktivitas antibiotika.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Berat kering sel. Pengukuran berat kering sel dilakukan setiap 24 jam dan hasilnya ditunjukkan pada  Gambar  1.  Dari  Gambar  1  dapat  dilihat bahwa berat kering sel cenderung naik pada jam ke-48  kecuali  untuk  media  dengan  agitasi  100 RPM. Pada jam ke-168 sampai jam ke-240 berat kering  sel  cenderung  turun  untuk  semua  jenis variasi  agitasi.  Berat  kering  sel  tertinggi  terjadi pada  jam  ke-144  yaitu  mencapai  0,124  g/mL. Berat  sel  yang  meningkat  karena  sel  mengalami pertumbuhan  sehingga  jumlah  sel  semakin banyak,  akibatnya  berat  kering  sel  akan  terus bertambah.
Pertumbuhan  terjadi  pada  fase  eksponsial menyebabkan  terjadi  kenaikan  berat  kering  sel yang  cukup  baik.  Pada  fase  ini  sel  mulai  aktif melakukan  metabolisme  seperti  sintesis  produk asam  seperti  asam  piruvat,  asam  nukleat  dan senyawa  makromolekul  lainnya  (Volk  & Wheeler,  1993).  Selama  fase  eksponensial,  sel- sel berada dalam keadaan yang stabil. Bahan sel baru  terbentuk  dengan  laju  konstan  tetapi  bahan yang  baru  itu  sendiri  bersifat  katalis  sehingga massa bertambah secara eksponsial. Berat kering sel  turun  disebabkan  oleh  nutrien  yang  semakin berkurang karena dikonsumsi oleh P. chrysogenum untuk pertumbuhan dan metabolisme, akibatnya sel harus bersaing untuk mendapatkan nutrien yang dibutuhkan. Untuk sel yang  tidak  mampu  bersaing  akan  mengalami kematian  sel.  Banyaknya  sel  yang  mati  akan menyebabkan  berat  kering  sel  menjadi  turun, pada jam ke-24 berat kering sel cenderung turun karena  sel  terlebih  dahulu  harus  melakukan adaptasi terhadap media cair setelah sebelumnya dibiakkan dalam media padat sehingga pertumbuhan  tidak  segera  terjadi  (Volk  & Wheeler, 1993).
Pada jam ke-144 berat kering sel mulai turun karena  sel  mulai  memasuki  fase  kematian.  Pada fase ini biasanya pertumbuhan berhenti atau laju kematian lebih tinggi dibandingkan laju pertumbuhan  sel,  sehingga  jumlah  sle  akan berkurang  (Volk  &  Wheeler  1993).  Hal  ini menandakan pergantian sel, beberapa sel tumbuh dengan  nutrisi  yang  dihasilkan  oleh  sel-sel  yang mati dan mengalami lisis.
Gambar 1. Perubahan berat kering sel selama proses fermentasi
Gambar 2. Perubahan pH media fermentasi selama produksi penisilin
Gambar 3. Diameter zona hambatan hasil pengujian media fermentasi P. chrysogenum terhadap B. subtilis , S. aureus , S. typhi dan E. coli dengan kecepatan aerasi (A) 100 (B) 150 dan (C) 200 RPM.
A
B C
pH Media Fermentasi. Koffler et al . (1945) dan  Deo  &  Gaucher  (1984)  mengemukakan bahwa  nilai  pH  tidak  konstan  selama  fermentasi berlangsung. Nilai pengukuran pH selama proses fermentasi  ditampilkan  pada  Gambar  2.  Dari Gambar 2 dapat dilihat bahwa dari media dengan agitasi 200 dan 150 RPM pada jam ke-24 sampai jam  ke-72  pH  turun  menjadi  5,31  dan  5,28  dan pada  jam  ke-96  sampai  jam  ke-168  pH  naik menjadi  7,96  dan  8,16.  Pada  jam  ke  192  pH turun  menjadi  7,81  dan  7,97.  Pada  jam  ke-216 sampai  jam  ke-240  pH  kembali  naik  menjadi 9,24  dan  8,79.  Untuk  media  dengan  kecepatan agitasi  100  RPM  pada  jam  ke-24  naik  menjadi 6,86.  Pada  jam  ke  48  sampai  jam  ke  240  turun mejadi  6,15.  Perubahan  pH  ini  terjadi  karena selama  berlangsungnya  fermentasi  terbentuk asam-asam organik seperti asam asetat dan asam piruvat  (Judoamidjojo  dkk  1992).  Senyawa- senyawa  asam  yang  terbentuk  ini  menyebabkan pH media menjadi turun, selanjutnya asam-asam ini  digunakan  oleh P.  chrysogenum untuk keperluan  pertumbuhan  dan  dihasilkannya  basa nitrogen (Koffler et al . 1945).
Aktivitas  antibiotika. Aktivitas  antibiotika diujikan  terhadap  dua  bakteri  Gram  negatif  ( S. thypi dan E.  coli )  dan  dua  bakteri  Gram  positif ( B.  subtilis dan S.  aureus ).  Hasil  pengujian ditunjukkan  pada  Gambar  3.  Pada  kecepatan agitasi  200  RPM  aktivitas  antibiotika  terhadap bakteri  uji  memberikan  pola  yang  hampir  sama, yaitu  diameter  hambatan  cenderung  naik  pada jam  ke-120  dan  tetap  tinggi  sampai  jam  ke-192. Pada  jam  ke-216  diameter  hambatan  cenderung turun.  Aktivitas  antibiotika  tertinggi  terdeteksi pada jam ke-192 untuk semua bakteri yang diuji. Diameter  hambatan  untuk B.  subtilis , S.  aureus , S.  typhi dan E.  coli masing-masing  sebesar  12, 14,  15  dan  16  mm.    Pada  kecepatan  agitasi  150 RPM, aktivitas antibiotika tertinggi untuk bakteri Gram negatif S. thypi dan E. coli juga terdeteksi pada jam ke-192 masing-masing dengan diameter  hambatan  sebesar  25  dan  26  mm. Sedangkan untuk bakteri Gram positif B. subtilis dan S.  aureus aktivitas  antibiotika  terdeteksi lebih  awal,  yaitu  pada  jam  ke-168  dengan diameter  hambatan  masing-masing  sebesar  21 dan  25  mm.  Kecepatan  agitasi  100  RPM memberikan  aktivitas  antibiotika  yang  mirip dengan  kecepatan  agitasi  150  RPM,  yaitu aktivitas  tertinggi  untuk  bakteri  Gram  negatif pada  jam  ke-192  dan  untuk  Gram  positif  pada jam  ke-168.  Namun,  aktivitas  antibiotika  yang dihasilkan  dengan  kecepatan  agitasi  100  RPM lebih  rendah  dibandingkan  dengan  aktivitas
antibiotika  dengan  kecepatan  agitasi  150  RPM. Pada    kecepatan  agitasi  100  RPM  aktivitas tertinggi  terdeteksi  untuk  S.  thypi  dengan diameter hambatan 19 mm pada jam ke-192.

## KESIMPULAN
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa kecepatan agitasi mempengaruhi produksi penisilin  yang  ditunjukkan  dengan  aktivitas antibiotika yang berbeda ketika kecepatan agitasi yang digunakan  pada proses fermentasi berbeda. Kecepatan  agitasi  paling  baik  ditunjukkan  pada produksi  penisilin  dengan  kecepatan  agitasi  150 RPM dengan diameter hambatan sebesar 26, 25, 25  dan  21  mm  masing-masing  untuk E.  coli , S. typhi, S. aureus dan B. subtilis .

## DAFTAR PUSTAKA
Birol,  G,  Ündey,  C,  Parulekar,  SJ  &  Cinar,  A 2002,  'A  morphologically  structured  model for  penicillin  production', Biotechnology  and Bioengineering , vol 77, no. 5, pp. 538-552.
Crueger,  W  &  Crueger,  A  1984, Biotechnology: a textbook of industrial microbiology , Sinauer Associates, Inc., Sunderland.
Deo, YM &
Gaucher, GM 1984, 'Semicontinuous  and  continuous  production of  penicillin-G  by Penicillium  chrysogenum cells  immobilized  in  κ-carrageenan  beads', Biotechnology  and  Bioengineering ,  vol  26, pp. 285-295.
Elander,  RP  2003,  'Industrial  production  β- lactam antibiotics', Applied Microbiology and Biotechnology , vol 61, pp. 385-392.
El-Sabbagh, N, McNeil, B & Harvey, LM 2006, 'Dissolved  carbon  dioxide  effects  on  growth, nutrient consumption, penicillin synthesis and morphology  in  batch  cultures  of  Penicillium chrysogenum', Enzyme and Microbial Technology , vol 39, pp. 185–190. El-Sayed, AMM & Rehm, HJ 1987,
'Semicontinuous penicillin production by two Penicillium chrysogenum strains immobilized in calcium alginate beads', Applied Microbiology  and  Biotechnology ,  vol  26,  no. 3, pp. 211-214.
Houbraken,  J,  Frisvad,  JC,  Seifert,  KA,  Overy,
DP  &  Tuthill,  DM  2012,  'New  penicillin- producing Penicillium species and an overview  of  section  Chrysogena', Persoonia , vol 29, pp. 78–100.
Judoamidjojo, M, Darwis, AA & Said, EG 1992, Teknologi Fermentasi , Bumi Aksara , Jakarta.
Kardos,  N  &  Demain,  AL  2011,  'Penicillin:  the medicine  with  the  greatest  impact  on therapeutic  outcomes', Applied  Microbiology and Biotechnology , vol 92, pp. 677-687.
Koffler,  H,  Emerson,  RL,  Perlman,  D  &  Burris, RH  1945,  'Chemical  changes  in  submerged penicillin fermentation',
Journal of Bacteriology , vol 50, no. 5, pp. 517-548.
Rani,  SA,  Jetty,  A  &  Ramakrishna,  SV  2003, 'Penicillin  production  in  continuous  stirred tank  reactor  by Penicillium  chrysogenum immobilized in agar', Chemical and
Biochemical  Engineering  Quarterly ,  vol  17,
no. 2, pp. 119-122.
Smith,  JJ  &  Lilly,  MD  1990,  'The  effect  of agitation  on  the  morphology  and  penicillin production  of Penicillium  chrysogenum ', Biotechnology  and  Bioengineering ,  vol  35, pp. 1011-1023.
Volk,  WA  &  Wheeler,  MF  1993, Mikrobiologi Dasar , Erlangga, Jakarta.
Weber,  SS,  Bovenberg,  RAL  &  Driessen,  AJM 2012, 'Biosynthetic concepts for the production of β-lactam antibiotics',
Biotechnology Journal , vol 7, pp. 225–236.