## ALCHEMY : JOURNAL OF CHEMISTRY

## Artikel Penelitian

## Aktivitas Antibakteri Membran Nanokomposit Kitosan/Nanopartikel Perak
Doni Notriawan 1* , Nesbah 2 , Gustria Ernis 1 , Muhammad Adeng Fadhila 1 , Risky Hadi Wibowo 3 , Reza Pertiwi 4 , Vinolla Ilfanisari 1
1 Program Studi D3 Laboratorium Sains, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Bengkulu, Indonesia, 38371
2 Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Bengkulu, Indonesia, 38371 3 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Bengkulu, Indonesia, 38371
4 Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Bengkulu, Indonesia, 38371
INFO ARTIKEL ABSTRAK Sejarah Artikel Diterima 28 Desember 2020 Direvisi 14 April 2021 Tersedia online 15 Juni 2021 *Penulis korespondensi doninotriawan@unib.ac.id The  aim  of  this  study  was  to  make  and  test  the  antibacterial  activity  of chitosan/silver  nanoparticles  nanocomposite  membranes.  Nanocomposite membranes  were synthesized by chitosan with pluronic using acetic acid as a solvent. Silver nanoparticles were synthesized using the green synthesis method and the makasar fruit ( Brucea javanica L. Merr) peel extract as a bioreductor. The silver nanoparticles were composited with a chitosan/pluronic mixture and printed on a glass plate. Nanocomposite membranes were characterized using the FTIR spectrophotometer and the scanning electron microscope (SEM). Nanocomposite membrane were tested for antibacterial activity against Escherechia coli . The UV- Vis spectra showed the formation of silver nanoparticles which were indicated by the absorption at 454 nm and the absorbance value of 0.405. Characterization using FTIR showed no new functional groups formed in the composites of chitosan and pluronic. SEM results showed the difference between the chitosan membrane and  the  nanocomposite  membrane.  The  surface  of  nanocomposite  membrane showed  uneven  compared  to  the  chitosan  membrane.  Nanocomposite membranes have antibacterial activity to inhibit E. coli growth.
Keywords: nanocomposite, chitosan/silver nanoparticles, antibacterial Penelitian ini bertujuan untuk membuat dan menguji aktivitas antibakteri membran nanokomposit kitosan/nanopartikel perak. Membran nanokomposit dibuat dengan mensintesis  kitosan  dengan  pluronik  menggunakan  pelarut  asam  asetat. Nanopartikel  perak  disintesis  menggunakan  metode green  synthesis dengan ekstrak  kulit  buah  makasar  ( Brucea  javanica L.  Merr)  sebagai  bioreduktor. Nanopartikel perak dikompositkan dengan campuran kitosan/pluronik dan dicetak di  atas  plat  kaca.  Membran  nanokomposit  dikarakterisasi  menggunakan spektrofotometer  FTIR  dan scanning  electron  microscope (SEM).  Membran nanokomposit  dilakukan  uji  aktivitas  antibakteri  terhadap Escherechia  coli . Spektra  UV-Vis  menunjukkan  terbentuknya  nanopartikel  perak  yang  ditandai adanya  serapan  pada  panjang  gelombang  454  nm  dan  absorbansi  0,405. Karakterisasi dengan FTIR menunjukkan tidak adanya gugus fungsi baru yang terbentuk  pada  komposit  dari  kitosan  dan  pluronik.  Hasil  SEM  menunjukkan adanya  perbedaan  antara  membran  kitosan  dengan  membran  nanokomposit. Permukaan  membran  nanokomposit  terlihat  tidak  rata  dibandingkan  membran kitosan.  Membran  nanokomposit  memiliki  aktivitas  bakteri  sehingga  dapat mengambat pertumbuhan bakteri E. coli .
Kata kunci: nanokomposit, kitosan/nanopartikel perak, antibakteri

## 1. Pendahuluan
Kitosan  merupakan  polimer  alami  terbesar  kedua  setelah  selulosa.  Kitosan  ramah  lingkungan  karena  bersifat biokompatibel, biodegradabel. dan aktivitasnya dapat diaplikasikan dalam bidang perikanan, pertanian, lingkungan industri, kecantikan, farmasi, kesehatan, dan pangan. Kitosan memiliki aktivitas antibakteri dan telah banyak diaplikasikan dalam bidang kesehatan sebagai film antibakteri [1]. Kitosan dapat dikompositkan dengan material lain untuk meningkatkan sifat yang diinginkan.
Aktivitas antibakteri dari kitosan dapat ditingkatkan dengan mengkompositkan kitosan dengan material yang memiliki aktivitas antibakteri. Komposit merupakan kombinasi dua material atau lebih yang berbeda dan berlainan sifat, dimana material yang satu berfungsi sebagai komponen matriks (bahan pengikat) sedangkan material lainnya berfungsi sebagai komponen filler (bahan pengisi) [2]. Penelitian nanokomposit kitosan dengan nanopartikel perak sebagai film antibakteri dan mampu meningkatkan aktivitas antibakteri [3].
Aktivitas antibakteri dari kitosan dapat ditingkatkan dengan mengkompositkan kitosan dengan material yang memiliki aktivitas antibakteri. Komposit merupakan kombinasi dua material atau lebih yang berbeda dan berlainan sifat, dimana material yang satu berfungsi sebagai komponen matriks (bahan pengikat) sedangkan material lainnya berfungsi sebagai komponen filler (bahan pengisi) [2]. Penelitian nanokomposit kitosan dengan nanopartikel perak sebagai film antibakteri dan mampu meningkatkan aktivitas antibakteri [3]. Nanopartikel perak (AgNP) memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Pada dekade  terakhir  telah  berkembang  biosintesis  nanopartikel  perak.  Biosintesis  nanopartikel  perak  merupakan  sintesis nanopartikel perak menggunakan pereduksi dari bahan alam. Beberapa bahan alam mampu menjadi agen pereduksi dalam biosintesis nanopartikel perak seperti Capsicum annuum L. [4], Azadirachta [5], dan Brucea javanica L. Merr [6] .
Nanopartikel  perak  memiliki  sifat  antimikrobial  yang  efektif  pada  bermacam-macam  organisme  termasuk  bakteri patogen. Oleh karena itu, nanopartikel perak dapat diaplikasikan dalam proses desinfeksi pada pengolahan air maupun air limbah. Sintesis nanopartikel perak dapat dilakukan dengan berbagai cara salah satunya sintesis nanopartikel perak secara kimia  menggunakan  senyawa  pereduksi  trisodium  sitrat  yang  dicampurkan  pada  larutan  perak  nitrat  (AgNO 3 )  [7]. Mekanisme  nanopartikel  perak  dalam  menghambat  bakteri  terjadi  dengan  cara  berinteraksi  dengan  membran  bakteri. Proses penghambatan diawali dengan nanopartikel perak menumpuk di permukaan membran bakteri, menembus ke dalam bakteri,  dan  mengakibatkan  terjadinya  perubahan  permeabilitas  membran  bakteri.  Proses  tersebut  menyebabkan kerusakan  pada  bakteri  dan  akhirnya  membunuh  bakteri.  Perusakan  membran  bakteri  dipengaruhi  oleh  parameter nanopartikel  perak yang meliputi  ukuran,  bentuk, dan  permukaan. Nanopartikel  perak yang memiliki  ukuran  yang  kecil dapat berinteraksi dengan lapisan lignin pelindung pada bakteri dengan lebih baik [8].
Wang dkk [9] melakukan penelitian mengkompositkan kitosan dengan nanopartikel perak. Kitosan pada penelitian tersebut berfungsi sebagai agen pereduksi dari sintesis nanopartikel perak. Pada penelitian ini akan dilakukan sintesis nanokomposit kitosan dengan nanopartikel perak yang sebelumnya disintesis dengan kulit buah Brucea javanica L. Merr dan ditambahkan surfaktan pluronik . Pluronik merupakan surfaktan yang berfungsi sebagai porogen dan menambah sifat hidrofilik dari membran [10].

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1. Bahan
Bahan yang digunakan penelitian ini yaitu kitosan (Farmasi Grade), pluronik (Poloxamer 407), AgNO 3 (Merck), kulit buah makasar ( Brucea javanica L. Merr) dan asam asetat 99% (p.a).

## 2.2. Biosintesis Nanopartikel Perak
Biosintesis nanopartikel perak dengan agen pereduksi dari buah makasar. Nanopartikel perak disintesis dengan cara 4 mL 0,001 N AgNO 3 direaksikan dengan 1 mL ekstrak kulit buah makasar. Campuran koloid kemudian dikarakterisasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis untuk mengetahui apakah nanopartikel perak sudah terbentuk. Nanopartikel perak yang terbentuk akan dikompositkan dengan membran kitosan/pluronik.

## 2.3. Pembuatan Membran Nanokomposit
Pembuatan nanokomposit diawali dengan membuat campuran kitosan/pluronik dengan perbandingan 1,5 kitosan dan pluronik (variasi 0,25 dan 0,5) dilarutkan dengan larutan asam asetat 1%. Campuran dilakukan pengadukan selama 1 jam dengan  tujuan  agar  kitosan  dan  pluronik  larut  sempurna.  Campuran  kemudian  ditambahkan  nanopartikel  perak  hasil sintesis. Campuran diaduk kembali selama 30 menit agar nanopartikel perak tersebar merata. Campuran dicetak diatas kaca dan didiamkan hingga asam asetat yang terkandung dalam campuran menguap.

## 2.4. Karakterisasi Membran Nanokomposit
Karakterisasi  membran  menggunakan scanning  electron  microscope (SEM)  dan  spektrofotometer  FTIR.  SEM digunakan untuk melihat morfologi permukaan membran dan spektrofotometer FTIR bertujuan untuk melihat gugus fungsi yang terdapat pada membran.

## 2.5. Uji Aktivitas Antibakteri
Bakteri target yang digunakan pada pengujian ini adalah Escherichia coli ATCC 8739. Satu ose bakteri target E. coli dikulturkan pada media Tryticase Soy Broth (TSB) dan diinkubasi pada inkubator goyang selama 24 jam pada suhu 27°C. Sebanyak 1 mL atau 1% suspensi bakteri target diinokulasikan ke dalam 100 mL media Tryticase Soy Agar (TSA) yang masih cair, dihomogenkan dengan magnetic stirrer selama 2 menit dan dituangkan ke dalam cawan petri steril. Setelah bakteri target di dalam media TSA memadat, sampel perlakuan kemudian diinokulasikan di atas media TSA. Perlakuan dibentuk seperti kertas cakram berdiamater 6 mm yang terdiri dari P1 (membran nanokomposit), membran kitosan, kontrol negatif (air) dan kontrol positif (krim silver sulfadiazine 0,015 mg dilarutkan dalam 100 mL aqua demineralisasi). Sebanyak 20 µL perlakuan kontrol positif diteteskan ke dalam kertas cakram steril. Pengujian perlakuan diinkubasi selama 24 jam pada  suhu  30°C.  Tiap  pengujian  perlakuan  dilakukan  pengulangan  sebanyak  2  kali.  Aktivitas  bakteri  dari  perlakukan ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri target.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1. Biosintesis Nanopartikel Perak
Pembuatan nanopartikel perak dengan memodifikasi metode yang dilakukan oleh [6]. Pembuatan dilakukan dengan menambahkan  ekstrak  kulit  kering  buah  makasar  dengan  larutan  AgNO 3 dengan  konsentrasi  0,001  N.  Terbentuknya nanopartikel  perak  terlihat  dengan  ciri-ciri  warna  campuran  yang  semula  kuning menjadi  coklat  keabuan  seperti  yang terlihat pada Gambar 1 .
(a) (b)
Gambar 1. (a). Perubahan warna campuran nanopartikel perak dari sintesis AgNO 3 dengan agen pereduksi kulit kering buah makasar dan (b) Hasil karakterisasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
Proses biosintesis nanopartikel perak menggunakan buah makasar terbentuk dikarenakan adanya reaksi yang terjadi antara  senyawa  polifenol  dengan  Ag + .  Buah  makasar  memiliki  kandungan  senyawa  polifenol,  tanin,  dan  alkaloid  [11]. Nanopartikel perak yang telah disintesis kemudian dikarakterisasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Karakterisasi ini dilakukan bertujuan menganalisis surface plasmon resonance (SPR) yang terjadi pada koloid nanopartikel perak [12]. Nanopartikel  perak  umumnya  memiliki  kisaran  serapan  pada  panjang  gelombang  410-455  nm.  Pada  biosintesis nanopartikel perak yang disintesis menggunakan buah makasar menunjukkan puncak serapan pada panjang gelombang 454 nm dengan nilai absorbansi 0,405. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa nanopartikel perak yang dihasilkan telah terbentuk.

## 3.2. Membran Nanokomposit
Pembuatan nanokomposit diawali dengan membuat campuran kitosan/pluronik dengan perbandingan 1,5 kitosan dan 0,5 pluronik dan dilarutkan dengan larutan asam asetat 1%. Campuran dilakukan pengadukan selama 1 jam dengan tujuan agar  kitosan  dan  pluronik  larut  sempurna.  Campuran  kemudian  ditambahkan  nanopartikel  perak  hasil  sintesis menggunakan  ekstrak  kulit  buah  makasar.  Membran  nanokomposit  dicetak  di  atas  kaca  yang  telah  diberi  pembatas. Membran nanokomposit yang terbentuk memiliki warna yang bening kecoklatan seperti pada Gambar 2 .
Spektrum ekstrak buah makasar Spektrum nanopartikel perak

## 3.3. Karakterisasi Membran Nanokomposit

## 3.3.1. Karakterisasi dengan FTIR
Hasil  karakterisasi  membran  kitosan/pluronik  menggunakan  FTIR  menunjukkan  adannya  tumpang  tindih  yang menandai membran mengandung komposit kitosan dan pluronik. Pada hasil spektrum dari pluronik menunjukkan adanya absorpsi pada 2800 dan 1000 cm -1 yang merupakan vibrasi regangan dari C-O-C dan CH 2 . Pada spektrum kitosan dan kitosan/pluronik memiliki kesamaan  hasil  spektrum  pada Gambar  3 yang  menunjukkan adanya  puncak yang tumpang tindih dari gugus OH dan NH. Pada membran kitosan dan nanokomposit terdapat puncak vibrasi regangan dari grup C-O- C pada 1000 cm -1 [13].
(A) (B)
Gambar 2. (A) Membran kitosan dan (B) Membran nanokomposit
Gambar 3. Hasil karakterisasi menggunakan spektrofotometer FTIR.

## 3.3.2. Karakterisasi dengan SEM
Karakterisasi menggunakan SEM bertujuan untuk melihat morfologi dari membran nanokomposit yang  dihasilkan. Morfologi membran nanokomposit dibandingkan dengan morfologi dari membran kitosan. Berdasarkan hasil karakterisasi menggunakan SEM menunjukkan adanya perbedaan morfologi membran kitosan dan nanokomposit. Membran kitosan menghasilkan  morfologi  membran  yang  halus  seperti  pada Gambar  4 .  Hasil  berbeda  ditunjukkan  dari  membran nanokomposit. Membran nanokomposit menghasilkan morfologi permukaan yang lebih kasar dan menunjukkan adanya
pori  pada  membran.  Pori  tersebut  terbentuk  dengan  adanya  pluronik  yang  berfungsi  sebagai  porogen.  Porogen  yang terbentuk  dikarenakan  adanya  penambahan  surfaktan  pada  sintesis  membran  nanokomposit.  Hal  ini  didukung  pada penelitian pembuatan membran selulosa asetat menggunakan pluronik menghasilkan membran yang memiliki pori.
Gambar 4 . Hasil karakterisasi menggunakan SEM: (A) Membran kitosan dan (B) Membran nanokomposit.

## 3.4. Uji Aktivitas Antibakteri Membran Nanokomposit
Uji  antibakteri  membran  nanokomposit  dilakukan  menggunakan  bakteri Escherichia  coli ATCC  8739.  Dari  hasil pengujian  membran  nanokomposit  menunjukkan  adanya  penghambatan  pertumbuhan  dari  bakteri.  Membran nanokomposit memiliki zona hambat yang lebih besar dibandingkan dengan membran kitosan ( Tabel 1) . Nanokomposit memiliki zona hambat lebih besar dikarenakan nanokomposit memiliki pori sehingga nanopartikel perak dapat terimobilisasi dengan baik. Membran kitosan memiliki diameter zona hambat tertinggi yaitu 7,6 mm. Membran nanokomposit memiliki zona hambat 13,6 mm dengan kandungan pluronik 0,25 g. Kitosan merupakan polimer yang memiliki sifat antibakteri. Hasil menunjukkan  adanya  peningkatan  aktivitas  antibakteri  pada  membran  nanokomposit.  Peningkatan  aktivitas  antibakteri terjadi dikarenakan adanya penambahan nanopartikel perak pada membran nanokomposit. Nanopartikel perak merupakan material nanopartikel yang memiliki sifat antibakteri. Membran nanokomposit MN1 dan MN2 memiliki hasil yang hampir sama dalam aktivitas antibakteri. Hal ini menunjukkan tidak ada pengaruh variasi pemberian pluronik pada membran.
Tabel 1 . Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri Perlakuan Diameter (mm) Kategori Zona Hambat Davis dan Stout [14] Ulangan 1  Ulangan 2 Ulangan 3 Rata-Rata Standar Deviasi Ki 1 7,6 7,2 6,7 7,16 0,45 Sedang Ki 2 6,5 6,7 7,1 6,76 0,30 Sedang Ki 3 7,4 7,1 6,7 7,06 0,35 Sedang MN1 1 8,5 8,3 7,9 8,23 0,30 Sedang MN1 2 13,6 12,9 13,3 13,26 0,35 Kuat MN1 3 8,8 8,3 8,7 8,6 0,26 Sedang MN2 1 8,2 8,8 9,4 8,8 0,60 Sedang MN2 2 7,5 9,2 8,8 8,5 0,88 Sedang MN2 3 8,2 8,5 8,0 8,23 0,25 Sedang K+ 11,5 11,2 10,9 11,2 0,30 Kuat K- (Akuades) - - - - - -
Ki adalah membran kitosan, MN1 adalah membran nanokomposit dengan perbandingan (1,5:0,25), MN2 adalah membran nanokomposit dengan perbandingan (1,5:0,5), K+ adalah kontrol positif, dan K- adalah kontrol negatif.
Nanopartikel perak telah banyak digunakan dalam bidang kesehatan. Nanopartikel perak dapat berfungsi sebagai antibakteri dikarenakan nanopartikel perak dapat berinteraksi dengan membran bakteri sehingga menyebabkan kerusakan membran bakteri yang selanjutnya akan membunuh bakteri. Nanopartikel perak pertama kali menyerang di permukaan
A B
membran  bakteri,  menembus  ke  dalam  bakteri,  dan  akhirnya  mengubah  permeabilitas  membran  bakteri.  Mekanisme tersebut  menyebabkan  kerusakan  pada  membran.  Sifat  antibakteri  dari  membran  nanopartikel  perak  bergantung  dari ukuran, bentuk, dan permukaan yang menentukan keberhasilan dalam merusak selaput bakteri. Nanopartikel perak dengan ukuran yang kecil dapat berinteraksi dengan lapisan lignin pelindung pada bakteri dengan lebih baik [8].

## 4. Kesimpulan
Membran  nanokomposit  yang  disintesis  menggunakan  kitosan/nanopartikel  perak  menghasilkan  membran  yang memiliki pori dan terkomposit. Pori-pori membran terbentuk dikarenakan menggunakan surfaktan pluronik. Nanopartikel perak  yang  digunakan  disintesis  menggunakan  metode  biosintesis  dengan  ekstrak  kulit  buah  makasar.  Membran nanokomposit memiliki sifat antibakteri yang menghambat pertumbuhan bakteri E. coli ATCC 8739.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih kepada Universitas Bengkulu selaku pemberi dana hibah penelitian pembinaan tahun 2020.

## Daftar Pustaka
[1] A. Regiel, S. Irusta, A. Kyzioł, M. Arruebo, & J. Santamaria, “Preparation and Characterization of Chitosan–Silver Nanocomposite Films and Their Antibacterial Activity against Staphylococcus aureus ,” Nanotecnology , vol. 24, no. 1,
2013.
[2] D. H. L. Chung, Composite Materials, Science and Applications 2 . London: Springer-Verlag, 2010.
[3] V. Thomas, M. M. Yallapu, B. Sreedhar, & S. K. Bajpal, "Fabrication, Characterization of Chitosan/Nanosilver Film and Its Potential Antibacterial Application," Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, vol. 20, no. 14, pp. 2129– 2144, 2009.
[4] S. Li, Y. Shen, A. Xie, X. Yu, L. Qiu, L. Zhang, & Q. Zhang, “Green Synthesis of Silver Nanoparticles using Capsicum annuum L. Extract,” Green Chemistry , vol. 9, no. 8, pp. 852-858, 2007.
[5] S. Ahmed, Saifullah, M. Ahmad, B. L. Swami, & S. Ikram, “Green Synthesis of Silver Nanoparticles using Azadirachta indica Aqueous Leaf Extract,” Journal of Radiation Research and Applied Sciences , vol. 9, no. 1, pp.1-7, 2016.
[6] S. Yudha, D. Notriawan, E. Angasa, T. E. Suharto, J. Hendri, & Y. Nishina, “Green Synthesis of Silver Nanoparticles using Aqueous Rinds Extract of Brucea javanica (L.) Merr at Ambient Temperature,” Materials Letters , vol. 97, pp.181- 183, 2013.
[7] A. Haryono, D. Sondari, S. B. Harnami, & M. Randy, “Sintesa Nanopartikel Perak dan Potensi Aplikasinya,” Jurnal Riset Industri , vol. 2, no. 3, pp. 155-163, 2008.
[8] K.  Zheng,  M.  I.  Setyawati,  D.  T.  Leong,  &  J.  Xie,  “Antimicrobial  Silver  Nanomaterials,” Coordination  Chemistry Reviews , vol. 357, pp.1-17, 2018.
[9] L.-S. Wang, C.-Y. Wang, C.-H. Yang, C.-L. Hsieh, S.-Y. Chen, C.-Y., Shen, J.-J. Wang, & K.-S. Huang, “Synthesis and  Anti-Fungal  Effect  of  Silver  Nanoparticles–Chitosan  Composite  Particles,” International  Journal  of Nanomedicine , vol. 10, pp. 2685-2696, 2015.
[10] S. Mulijani, D. Iswantini, R. Wicaksono, & D. Notriawan, “Optical Sensor Based Chemical Modification as a Porous Cellulose  Acetate  Film  and Its  Application for  Ethanol  Sensor,”  in IOP  Conference  Series:  Materials  Science  and Engineering International Conference on Advanced Material for Better Future 2017, vol. 333, no. 012014, 2018.
[11] A. Widiyantoro, E. R. P. Wardoyo, & E. Sayekti, "Activity of Makasar Fruit ( Brucea javanica L. Merr) on Radical Anion Superoxide in Vivo," Jurnal Penelitian Saintek , vol. 15, no. 1, 2010.
[12] A.  B.  Junaidi,  A.  Wahyudi,  &  D.  Umaningrum,  “Kajian  Sintesis  Nanopartikel  Perak  pada  Komposit  Kitosan  dan Polietilen Glikol: Efek Jenis Agen Pereduksi Organik,” dalam Prosiding Seminar Nasional Kimia Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 2015, pp. 148-156.
[13] E. Savitri, N. Soeseno, & T. Adiarto, “Sintesis Kitosan, Poli(2-Amino-2-Deoksi-D-Glukosa), Skala Pilot Project dari Limbah  Kulit  Udang  Sebagai  Bahan  Baku  Alternatif  Pembuatan  Biopolimer,”  dalam  Prosiding  Seminar  Nasional Teknik Kimia “Kejuangan”, 2010, pp. 1-10.
[14] W.W. Davis & T.R. Stout, “Disc Plate Method of Microbiological Antibiotic Assay,” Applied Microbiology , vol. 22, no. 1, pp. 659-665, 1971.