## BIOEDUSAINS:Jurnal Pendidikan Biologi dan Sains

## KRIOPRESERVASI SPERMA MANUSIA: SYSTEMATIC REVIEW
Diana Fadhilah 1 , Adam Raihan Priambada 2 , Zozy Aneloi Noli 3 , Rita Maliza 4
Universitas Andalas 1,2,3,4 ritamaliza@sci.unand.ac.id 4

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  jenis  metode  dan  efek kriopreservasi  sperma  manusia.  Penulisan  tinjauan  ini  dilakukan  melalui  metode review  literatur  dari  database  internasional  seperti  Scopus  dan  PubMed.  Hasil penelitian  menunjukkan,  dengan  adanya  pemilihan  metode  kriopreservasi, pemilihan  agen  krioprotektan  seperti  TAT-PRDX2,  canthaxanthin,  atau  ekstrak coleomic Holotheria  parva ,  dapat  meningkatkan  motilitas,  viabilitas,  dan integritas  sperma  setelah  kriopreservasi,  krioprotektan  agen  yang  tepat  bisa mempertahankan sel dari stress oksidatif dan fragmentasi DNA.
Kata Kunci : Kriopreservasi, Manusia, Sperma

## ABSTRACT
This  study  aims  to  identify  the  types  of  methods  and  effects  of  human  sperm cryopreservation.  This  review  was  written  using a  literature  review  method  from international databases such as Scopus and PubMed. The results of the research show  that  by  choosing  a  cryopreservation  method,  choosing  a  cryoprotectant agent such as TAT-PRDX2, canthaxanthin, or Holotheria parva coleomic extract, can  increase  sperm  motility,  viability  and  integrity  after  cryopreservation,  the right  cryoprotectant  agent  can  defend  cells  from  oxidative  stress  and fragmentation DNA.
Keywords : Cryopreservation, Human, Sperm

## PENDAHULUAN
Kriopreservasi  merupakan  suatu  proses  dimana  sel,  seluruh  jaringan  atau zat lain yang rentan terhadap kerusakan yang disebabkan oleh reaktivitas kimiawi atau waktu, diawetkan dengan cara mendinginkannya hingga suhu di bawah 0 o C. Kriopreservasi semen yaitu proses pengawetan sel sperma. Saat ini, kriopreservasi sperma  merupakan  cara  yang  paling  banyak  digunakan  untuk  mempertahankan fungsi  reproduksi  pada  pria  yang  menjalani  pengobatan  yang  bersifat gonadotoksik seperti kemoterapi atau radioterapi (Oberoi et al., 2014). Selain itu, kriopreservasi  sperma  juga  banyak  digunakan  pada  kasus-kasus  kelainan  lain seperti  penyakit  autoimun,  sindrom  mielodisplasia  yang  membutuhkan pengobatan  yang  dapat  mempengaruhi  fungsi  reproduksi.  Pasien  dengan oligospermia berat atau gangguan ejakulasi juga ditawarkan untuk kriopreservasi sperma dengan melakukan injeksi sperma intracytoplasmic (ICSI). Kriopreservasi sperma  juga  dianjurkan  untuk  pasien  dengan  penyakit  diabetes  atau  penyakit lainnya yang dapat menyebabkan kerusakan testis (Oberoi et al., 2014).
Meskipun  memiliki  berbagai  manfaat,  kriopreservasi  juga  berefek  yang merugikan  pada  spermatozoa.  Selain  kriopreservasi  menyebabkan  perubahan struktural  dan  fungsional,  juga  dapat  berdampak  negatif  yang  ditimbulkan  oleh
proses pembekuan atau pencairan pada DNA (Valcarce et al., 2013). Peningkatan reactive  oxygen  species (ROS)  selama  proses  kriopreservasi  menjadi  penyebab utama  perubahan  DNA  daripada  proses  lain  seperti  apoptosis.  ROS mempengaruhi  integrasi  DNA  yang  berdampak  pada abasic  sites,  cross-linking, dan modifikasi basa nitrogen atau kerusakan untai DNA.
Adanya  kerusakan  DNA  pada germ  line jantan  telah  dikaitkan  dengan berbagai  hasil  yang  merugikan  seperti  rendahnya  tingkat  pembuahan,  penurunan implantasi embrio, keguguran, kanker, dan penyakit lainnya. Selain itu, kerusakan DNA sperma juga berhubungan dengan peningkatan risiko kehilangan kehamilan setelah assisted  reproductive  technologies (ART)  seperti in  vitro  fertilization (IVF)  atau intracytoplasmatic  sperm  injection (ICSI)  (Valcarce  et  al.,  2013).
Berdasarkan  pernyataan  tersebut  maka  dilakukan  tinjauan  sistematis  untuk mengidentifikasi jenis metode dan efek kriopreservasi sperma manusia.

## METODE PENELITIAN
Metode  yang  digunakan  dalam  penulisan  ini  adalah  review  literatur. Sumber  pustaka  yang  digunakan  dalam  penyusunan  artikel  review  ini  dengan literature  review ini  melalui  Website  Jurnal  Internasional  seperti,  PubMed  dan Scopus.  Menggunakan  keyword Cryopreservation,  Human dan Sperm .  Untuk memilih  artikel  yang  digunakan  dalam  penulisan,  diperlukan  kriteria  inklusi  dan eksklusi berdasarkan tahun publikasi, bahasa, tipe literatur, tipe sumber, dan open access. Selain itu, topik penelitian juga diseleksi dengan cara screening judul dan abstrak artikel penelitian.
Gambar 1. Diagram PRISMA dalam Pemilihan Artikel

## HASIL PENELITIAN
Hasil penelitian mengenai jenis metode Kriopresevasi Sperma ditunjukkan pada Tabel 1 sebagai berikut:
Tabel 1. Jenis Metode Kriopreservasi Sperma
Metode Cara kerja Hasil Referensi Metode dengan kapsul agarosa 1 sperma manusia disuntikkan ke dalam kapsul dengan metode ICSI konvensional. Kemudian dikriopreservasi di atas lembaran polikarbonat atau nilon menggunakan uap nitrogen. Sebelum digunakan, kapsul dicairkan dan ditutup kembali. Spermatozoa motil dalam kapsul dihitung. Kapsul yang berisi spermatozoa dengan dinding agarosa tidak rusak setelah dipulihkan Tingkat pemulihan dan motilitas sperma cukup tinggi (Araki et al., 2015) Metode ultra- rapid freezing dan slow freezing Percobaan 1: 24 sampel semen digunakan untuk membandingkan tingkat pemulihan sperma setelah ultra-rapid freezing dan slow freezing. Percobaan 2: 18 sampel semen digunakan untuk membandingkan tingkat fragmentasi DNA sperma pasca-pencairan masing- masing teknik kriopreservasi Ultra-rapid freezing sperma dapat menjadi pilihan daripada slow freezing dengan hasil pemulihan yang lebih baik dan kerusakan DNA yang lebih sedikit (Riva et al., 2018) Metode ultra-low temperature refrigerator store dan liquid nitrogen store 200 mikroliter semen di transfer ke 1 ml cryovials di simpan dalam suhu -20 o C
selama 8 jam setelah itu dipindahkan ke penyimpanan -80 o C. 200
mikroliter semen di transfer ke 1 ml cryovials disimpan di campur 100 mikromili (2:1 v/v) test-yolk buffer (14% glycerol, 30% egg yolk , 1.98% glucose, dan
1.72% sodium citrate, pH 7.5) disimpan dalam suhu - 20 o C selama 8 jam setelah itu dipindahkan ke penyimpanan -80 o C dan disimpan dalam liquid
nitrogen Menyimpulkan bahwa penyimpanan sampel sperma yang rapi pada suhu -80 o C menyebabkan kerusakan yang lebih ringan pada DNA sperma daripada penyimpanan pada suhu -
196 o C yang dicampur dengan krioprotektan.
(Liu et al., 2016) Suplementasi protein TAT- PRDX2 pada media kriopreservasi Sampel semen dibagi menjadi tiga alikuot yaitu segar, kontrol kriopreservasi (tanpa aditif), dan kriopreservasi dengan protein TAT-PRDX2. Protein TAT-PRDX2 efektif memberikan efek krioprotektif pada spermatozoa dengan mengurangi tingkat ROS intraseluler (Liu et al., 2018)
Dilakukan pengukuran motilitas, viabilitas, potensi mitokondria, dan kerusakan DNA, serta tingkat ROS sperma. Penerapan getaran ultrasonik/ ultrasonic vibration (ULV) Dilakukan evaluasi sifat fisikokimia air dengan periode waktu yang berbeda dengan frekuensi ULV 28 kHz. Sampel semen kemudian diencerkan dengan media pembekuan yang mengandung air yang terpapar ULV dan selanjutnya dikriopreservasi. Perubahan sifat fisikokimia medium pembekuan kriopreservasi sperma manusia dengan menggunakan ULV dapat meningkatkan kualitas produk beku (Dariush et al., 2019) Kriopreservasi menggunakan canthaxanthin pada proses freeze-thaw Mengevaluasi efek dari canthaxanthin pada parameter sperma manusia selama proses pembekuan- pencairan Sepuluh mikromolar canthaxanthin secara signifikan meningkatkan motilitas total, viabilitas, normal morfologi, pengemasan kromatin, integritas akrosom dan denaturasi DNA dan fragmentasi (Najafi et al., 2019)
Hasil tinjauan sistematis mengenai efek kriopreservasi sperma ditunjukkan pada Tabel 2 sebagai berikut:
Tabel 2. Efek Kriopreservasi Sperma
Metode Efek Referensi Analisis semen dilakukan dengan pedoman WHO untuk 25 sampel. Sampel tersebut dicuci, dianalisis, dan dibekukan dengan nitrogen cair. Sampel semen kemudian dicairkan ( thawing ) dan dianalisis dengan cara yang sama setelah 20 menit dan 40 menit pencairan. Setelah itu dilakukan analisis statistik dari motilitas komparatif Motilitas sperma menurun setelah kriopreservasi namun, setelah thawing terjadi peningkatan yang signifikan dalam motilitas sperma (Oberoi et al., 2014) Sampel semen 30 pria dianalisis dalam keadaan segar dan kriopreservasi dengan uji Comel alkali dan netral Uji Comet alkali: terdapat peningkatan sekitar 10% dari single- strand Sperm DNA Fragmentation
(ssSDF) terlepas dari status kesuburan pria Uji Comet netral: double-strand Sperm DNA Fragmentation (dsSDF) tidak meningkat (Ribas-Maynou et al., 2014) Pendekatan gen kandidat dengan mengukur jumlah lesi yang dihasilkan oleh pembekuan atau pencairan gen-gen kunci (PRM1, BIK, FSHB, PEG1/MEST, ADD1, ARNT, UBE3A, SNORD116/ Kriopreservasi yang secara rutin digunakan menghasilkan lesi DNA (Valcarce et al., 2013)

## PWSAS) dengan menggunakan
PCR kuantitatif
Aditif baru extract coleomic
Holotheria parva, sebagai krioprotektan dan mencegah stress oxidatif. Penambahan extract coleomic Holotheria parva sebagai krioprotektan meningkatkan parameter sperma, mengurangi ROS, kerusakan DNA dan menaikan kemampuan fertilitas dari sperma (Khashavi et al., 2020) Suplementasi Melatonin dan Kafein sebagai agen krioprotektan dalam menaikan efek survival, viabilitas, motilitas pasca thawing sperma manusia Peningkatan yang signifikan pada kelompok Kafein dan Kafein + Melatonin terhadap motilitas dan aktivitas mitokondria (Pariz et al., 2019) Pengujian pre dan post pemanasan vakuola kepala spermatozoa dengan Motile Sperm Organelle Morphology Examination (MSOME), menguji fragmentasi DNA, dan potensial membran mitokondria Mempengaruhi vakuolisasi spermatozoa, struktur DNA, dan potensial membran mitokondria (Etebary et al., 2018) Efek penggunaan Platelet-Rich Plasma (PRP) autologus terhadap kualitas sperma manusia selama proses Platelet-Rich Plasma (PRP) autologus memiliki sebagian efek terhadap kriopreservasi sperma manusia (Yan et al., 2021) Pengujian trehalosa dan sukrosa terhadap motilitas, vitalitas, dan morfologi sperma setelah kriopreservasi Trehalosa sebagai krioprotektan non permeabel pada pemberian 50mM memiliki efek lebih baik daripada sukrosa dengan adanya pengujian terhadap motilitas, vitalitas dan Morfologi sperma pasca kriopreservasi (Suksai & Dhanaworavibul, 2019)

## PEMBAHASAN
Spermatozoa  manusia  mengalami  berbagai  tahap  pendinginan  dan pemanasan  selama  penyimpanan  semen.  Sperma  relatif  kurang  sensitif  terhadap kerusakan sel  yang terjadi selama pendinginan awal  yang cepat, disebabkan oleh fluiditas membran yang meningkat karena kandungan asam lemak tak jenuh yang tinggi pada lapisan lipid sel sperma (Oberoi et al., 2014).
Berbagai  teknik  telah  digunakan  untuk  menilai  kerusakan  DNA  sperma dalam kriopreservasi seperti TUNEL dan uji Comet. Uji Comet sperma dilakukan untuk membedakan antara kedua jenis kerusakan DNA tergantung pada apakah uji ini dilakukan dengan denaturasi alkali sebelumnya atau dengan kondisi netral. Uji Comet  memiliki  sensitivitas  yang  lebih  tinggi  dari  uji  SCD  karena  komponen elektroforesis  dari  uji  sebelumnya.  Tes  SCD  memiliki  sensitivitas  yang  sama dengan tes TUNEL dan SCSA (Ribas-Maynou et al., 2014).

## Jenis Metode Kriopreservasi
Metode  kriopreservasi single sperma  menggunakan  kapsul  agarosa  dapat diterapkan  melalui  ICSI  pada  pasien  dengan  spermatozoa  yang  sedikit.  Gel agarosa memiliki struktur jala dan dapat segera diserap oleh larutan krioprotektan. Sperma  dapat  dibekukan  dalam  kapsul  agarosa  dengan  merendamnya  selama beberapa  menit.  Selain  itu,  perangkat  yang  digunakan  untuk  pengawetan  sperma tidak menjadi racun bagi sel mamalia, maka bahan gel agarosa memiliki toksisitas
yang  rendah.  Metode  pemindahan  juga  harus  dipertimbangkan  dalam kriopreservasi  (Araki  et  al.,  2015).  Jika  terdapat  banyak  spermatozoa,  transfer dapat  dilakukan  dengan  menggunakan  pipet  secara  berkelompok,  namun  jika hanya  ada  satu  atau  beberapa  spermatozoa,  pipet  tidak  dapat  digunakan.  Oleh karena  itu,  beberapa  spermatozoa  biasanya  ditransfer  dengan  pipet  injeksi  untuk ICSI. Setelah diinjeksi ke dalam kapsul agarosa digunakan pipet kaca. Metode ini memungkinkan  spermatozoa  dipindahkan  melalui  beberapa  jenis  larutan  yang berbeda  (Araki  et  al.,  2015). Tingkat  pemulihan dan kelangsungan hidup sperma yang menggunakan mesh sheet (MS) cukup baik (Araki et al., 2015).
Berdasarkan  penelitian  Riva  et  al.,  (2018), ultra-rapid  freezing sperma manusia  dengan  krioprotektan non-permeable lebih  efektif  dan  lebih  aman dibandingkan  dengan  teknik slow  freezing yang  saat  ini  digunakan.  Motilitas berhubungan  dengan  integritas  DNA  sperma.  Motilitas  pasca  pencairan  lebih tinggi  pada  metode ultra  rapid  freezing dibandingkan  dengan slow  freezing , kemungkinan  karena  DNA  dari  sperma  yang  telah  divitrifikasi  mengalami  lebih sedikit  kerusakan  saat ultra-rapid  freezing dan  diberikan  krioprotektan non- permeable dengan konsentrasi yang rendah. Hal tersebut juga didukung dari hasil integritas  DNA  yang  diuji  dengan  teknik  TUNEL  (Riva  et  al.,  2018).  Telah ditemukan bahwa tingkat fragmentasi DNA yang lebih tinggi dan motilitas sperma lebih  rendah  setelah  pencairan  ketika  metode  kriopreservasi slow  freezing digunakan.
Faktor lain yang mempengaruhi motilitas sperma setelah pembekuan yaitu perubahan  membran  sperma,  kerusakan  mitokondria,  dan  peningkatan  produksi reactive  oxygen  species (ROS)  (Riva  et  al.,  2018).  Pada  penelitian  Liu  et  al.,
(2016)  melakukan ultra-slow  freezing dan rapid  freezing memiliki  perbedaan langkah  pada  perlakuan  dimana rapid  freezing melalui  tahapan  yang  sama pembekuan  dengan ultra-slow  freezing dan  juga  pemberian  jenis  krioprotektan yang  diberikan  untuk  rapid  freezing.  Penelitian  tersebut  tidak  sama  dengan penelitian  Riva  et  al.,  (2018)  sukrosa  dan  SSS,  hal  ini  adanya  juga  pengaruh pemberian krioprotektan yang tepat untuk dapat menjaga jaringan dan organ agar tetap dalam keadaan normal agar meminimalisir kerusakan pada DNA sperma. Kriopreservasi  membutuhkan  perlindungan  struktur  intraseluler  dan biomolekul  sebagai  agen  pelindung  yang  dapat  melewati  membran  sel.  Protein TAT  dari  HIV-1  memiliki  kemampuan  untuk  menghantarkan  protein  heterolog secara  in  vivo  maupun  in  vitro.  Penambahan  TAT-PRDX2  ke  media  pembekuan secara  signifikan  meningkatkan  motilitas  progresif  sperma  pasca  pencairan, motilitas total, dan viabilitas kelompok normozoospermik dan asthenozoospermik.  Namun  efek  perlindungan  untuk  DNA  dan  integritas mitokondria  hanya  pada  kelompok  normozoospermik  dan  asthenozoospermik. Namun  efek  perlindungan  untuk  DNA  dan  integritas  mitokondira  hanya  pada kelompok  asthenozoospermik.  Kadar  DFI  dan  ROS  yang  tinggi  serta  penurunan perlindungan  oleh  protein  PRDX2  pada  semen  segar  dari  pria  dengan asthenozoospermik  menyebabkan  sperma  lebih  rentan cryoinjury ,  namun  lebih baik daripada spermatozoa dari pria yang normozoospermik (Liu et al., 2018).
Peningkatan kualitas sperma pasca pencairan yang dikriopreservasi dalam media  pembekuan  yang  mengandung  molekul  air  yang  terpapar  ULV berhubungan  dengan  pembentukan  dan  pertumbuhan  kavitasi  gelembung.  ULV dapat  menginisiasi  dan  menginduksi  nukleasi  es  di  dalam  air  dan  larutan  berair
yang  didinginkan  pada  suhu  yang  sangat  dingin  untuk  jangka  panjang.  Hal tersebut  menyebabkan  terjadinya  kavitasi  akustik  dan  dapat  merusak  morfologi kristal es khususnya bentuk dan ukurannya. Perubahan bentuk kristal es amorf ini mengakibatkan  berkurangnya  kerusakan  pada  sperma  selama  kriopreservasi. Meskipun  begitu,  paparan  langsung  sperma  terhadap  ULV  memiliki  efek  yang merugikan pada parameter sperma seperti jumlah, persen motilitas, dan morfologi normal (Dariush et al., 2019).
Perkembangan  dari  ilmu  kriopreservasi  untuk  menjaga  kualitas  sperma manusia  agar  bisa  menjalankan  prosedur in  vitro  fertilisation .  Selama kriopreservasi  biasanya  terdapat  kejut  dingin  atau  di  kenal  dengan Cold  shock yang  akan  berhubungan  dengan  osmotik  stress  yang  merupakan  penyebab stress oxidative. Stress oxidative merupakan langkah awal terbentuknya reactive oxygen species (ROS)  yang  akan  merusak  membran  sperma  hingga  merusak  motilitas, vitalitas hingga fragmentasi DNA. Antioksidan diperlukan untuk bisa menjaga sel dari  stress  oxidatif.  Salah  satunya  Canthaxanthin  yang  merupakan  karotenoid diproduksi secara alami oleh ganggang, jamur, dan bakteri. Hal ini juga disintesis di  dalam  tubuh  oleh  mikroorganisme,  terutama Escherichia  coli .  Pada  penelitian Najafi  et  al.,  (2019)  meninjau  efek  dari  pemberian  canthaxanthin  yang dicampurkan kedalam media sel sperma canthaxanthin yang dapat meningkatkan parameter  sperma  seperti  motilitas,  viabilitas,  integritas  akrosom,  morfologi  dan integritas DNA setelah kriopreservasi.  Efek ini mungkin  disebabkan oleh  kinerja canthaxanthin  dalam  menjaga  integritas  membran,  membersihkan  radikal  bebas, menekan  aktivitas  caspase-3  dan  in-  meningkatkan  aktivitas  antioksidan  seperti superoksida dismutase.

## Efek Kriopreservasi Sperma
Kerusakan  oleh  Kriopreservasi  ( cryoinjury )  tidak  hanya  terbatas  pada proses  pembekuan,  tetapi  juga  dapat  terjadi  selama  proses  pencairan  ( thawing ) saat  es  mencair  atau  mengkristal  kembali  (Oberoi  et  al.,  2014).  Penurunan motilitas  spermatozoa  berkaitan  dengan  kerusakan  membran  mitokondria.  ATP yang  dihasilkan  oleh  fosforilasi  oksidatif  pada  membran  mitokondria  bagian dalam ditransfer ke mikrotubulus untuk menggerakkan motilitas. Oleh karena itu, penurunan  aktivitas  mitokondria  dapat  menurunkan  motilitas  spermatozoa. Meskipun motilitas tidak secara langsung berkaitan dengan kapasitas pembuahan, namun  motilitas  merupakan  salah  satu  faktor  terpenting  yang  mempengaruhi kualitas sperma (Oberoi et al., 2014).
Efek kriopreservasi pada uji Comet alkalin menunjukkan peningkatan 10% single-strand  Sperm  DNA  Fragmentation  (ssSDF),  sedangkan  uji  Comer  netral tidak  menunjukkan  efek  setelah  pencairan  ( thawing ).  Oleh  karena  itu,  hasil  ini menunjukkan  bahwa  rata-rata  10%  sel  sperma  yang  dikriopreservasi  memiliki integritas ssDNA yang lebih buruk daripada sebelum kriopreservasi. Hal tersebut menunjukkan bahwa kriopreservasi dapat mempengaruhi kapasitas kehamilan sel sperma tanpa meningkatkan risiko keguguran (Ribas-Maynou et al., 2014).
Kerusakan DNA dapat memberikan efek pada keturunan seperti apoptosis setelah  pembelahan  pertama,  penurunan  implantasi  embrio,  keguguran,  dan penyakit  pada  bayi  baru  lahir.  Tingkat  transkripsi  yang  berubah  untuk  berbagai gen yang terlibat dalam pertumbuhan dan diferensiasi. Selain itu, kerusakan DNA
sperma  juga  dapat  meningkatkan  risiko  keguguran  setelah  IVF  atau  ICSI (Valcarce et al., 2013).
Kriopreservasi  memiliki  efek  negatif  pada  kualitas  sperma  secara keseluruhan  dan  meningkatkan  produksi  ROS.  Penambahan  agen  Krioprotektan yang tepat merupakan salah satu kunci untuk mempertahankan motilitas viabilitas dari  sperma  pasca  vitrifikasi.  Adanya  penambahan  agen  krioprotektan  yang kurang  tepat  dikaitkan  juga  dengan  jenis  sel  yang  akan  di  kriopreservasi  serta metode freezing yang  harus  disesuaikan.  Seperti  penelitian  Liu  et  al.,  (2016) penambahan  agen  krioprotektan  yang  kurang  sesuai  dengan  metode rapid freezing . Khashavi  et  al.,  (2020)  melakukan  eksperimen dengan pembuatan agen krioprotektan  dari  extract  coleomic Holotheria  parva pada  dosis  extract  250 µg/ml memiliki motilitas sperma dan viabilitas sperma  yang tinggi dibandingkan kriopreservasi tanpa menggunakan extract.
Selain extract coleomic Holotheria parva ada banyak penelitian yang terus berkembang  untuk  mengeksplor  banyaknya  kandidat  krioprotektan  dalam melindungi kerusakan DNA dan peningkatan ROS pasca thawing . Penelitian Pariz et  al.,  (2019)  mengenai  peningkatan  fragmentasi  DNA  dan  produksi  ROS  pada pasca thawing dibandingkan  dengan  sampel  segar.  Adanya  suplemen  kafein  dan melatonin  memiliki  impact  yang  sangat  signifikan  dalam  menaikan  motilitas sperma  pada  kelompok  suplementasi  kafein  dan  menaikan  aktifitas  dari mitokondria pada Kafein  + Melatonin grup.  Penelitian  yang berkembang  dengan adanya metode metode untuk kriopreservasi, efek kriopreservasi dan penggunaan krioprotektan  harus  diperhatikan  pada  penyimpanan  sperma  manusia.  Hal  ini untuk menghindari adanya kerusakan dari sperma manusia akibat tidak sesuainya metode  kriopreservasi  yang  digunakan  dan  tidak  tepatnya  pemilihan  agen krioprotektan  untuk  melindungi  sperma  manusia  dalam  penyimpanan kriopreservasi ataupun pada saat pasca thawing .
Potensi  membran  mitokondria  menurun  hingga  hampir  31%  setelah vitrifikasi  dan  pembekuan  dalam  uap  nitrogen  cair.  Sperma  terdiri  dari  beberapa bagian yang terbungkus di dalam plasma dan membran mitokondria. Membran ini harus  tetap  utuh  dan  berfungsi  dengan  baik  untuk  menjaga  kompetensi  sel (Etebary  et  al.,  2018).  Mitokondria  merupakan  organel  yang  memproduksi  ATP yang  menjadi  sumber  utama  energi  oksidatif  sel.  Kriopreservasi  mengubah komposisi  plasma  spermatozoa,  akrosom,  dan  membran  mitokondria  sehingga mempengaruhi  reaksi  akrosom,  interaksi  gamet  dan  fungsi  mitokondria. Gangguan  membran  sperma  yang  disebabkan  oleh  kriopreservasi  diperkirakan disebabkan  oleh  perubahan  transisi  fase  cair  dan  peningkatan  peroksidasi  lipid (Etebary et al., 2018).
Kriopreservasi  merupakan  suatu  cara  untuk  mempertahankan  integritas dan vitalitas dari sperma manusia. Kriopreservasi selama bertahun-tahun dianggap sebagai metode penyimpanan sperma yang kurang berhasil karena hanya memiliki tingkat kelangsungan hidup pasca kriopreservasi sebesar 40 – 60%. Pembentukan kristal  es  intraseluler  dan  guncangan  osmotik  adalah  dua  penyebab  utama kematian  sperma  setelah  pembekuan  dan  pencairan.  Air  intraseluler  merupakan komponen  utama  setiap  sel.  Sampai  saat  ini,  sukrosa  sebagai  krioprotektan non- permeabel yang paling umum digunakan untuk mengawetkan sperma beku, tetapi penelitian  telah  menunjukkan  bahwa  trehalose  sebagai  krioprotektan non- permeabel dan memiliki sedikit manfaat (Suksai & Dhanaworavibul, 2019).
Pada  percobaan  perbandingan  antara  menggunakan  trehalosa  dan  sukrosa sebagai  krioprotektan non-permeabel setelah  pasca thawing dilakukan  evaluasi bahwa  penggunaan  trehalose  50mM  lebih  baik  daripada  penggunaan  50mM sucrose  dari  segi  progresif  mortilitas  (p-value=0.037,  total  motility  (p- value<0.001),  vitalitas  (p-value<0.001)  dan  morfologi  (p-value<0.001).  Dari mekanismenya  Trehalose  bekerja  berikatan  dengan  membran  lemak  sel  dan membentuk lapisan lipid padat  yang stabil. Hal ini membantu menjaga integritas sel  dan  mengurangi  kerusakan  sel  selama  proses  pengawetan  beku  (Suksai  & Dhanaworavibul, 2019).
Platelet-rich plasma (PRP), konsentrat trombosit autologus yang unik tiga hingga  tujuh  kali  lebih  besar  dari  konsentrasi  fisiologis,  adalah  digunakan  di berbagai bidang medis dan telah memperoleh hasil yang cukup besar efek aplikasi pada  ortopedi,  dermatologi,  stomatologi,  olahraga  obat-obatan  dan  reproduksi. Pada  penelitian  Yan  et  al.,  (2021)  menambahkan  PRP  sebagai  pengganti  agent krioprotektan  agar  bisa  melindungi  sel  sperma  pasca thawing ,  hal  hasil  PRP memiliki  efek  perlindungan  terhadap  vitalitas,  progresif  motilitas  dan  total motilitas  pada  konsentrasi  5%  namun  pemberian  PRP  tidak  berpengaruh  dalam mempertahankan  Integritas  membran  plasma,  Potensial  membran  mitokondria, pencegahan fragmentasi DNA dan reactive oxygen species intraseluler.

## SIMPULAN
Kriopreservasi  sperma  manusia  dapat  menyebabkan  kerusakan  pada  sel sperma,  terutama  pada  membran  mitokondria  dan  DNA.  Proses  pembekuan  dan pencairan  sperma  dapat  mengakibatkan cryoinjury dan  perubahan  komposisi plasma,  akrosom,  serta  membran  mitokondria,  yang  pada  gilirannya  dapat mempengaruhi  motilitas,  viabilitas,  dan  integritas  DNA  sperma.  Berbagai penelitian  telah  menunjukkan  bahwa  beberapa  metode  kriopreservasi,  seperti ultra-rapid  freezing dengan  krioprotektan non-permeable ,  memiliki  hasil  yang lebih baik dalam menjaga kualitas sperma setelah pencairan dibandingkan dengan teknik slow freezing yang lebih umum digunakan.
Selain  itu,  penambahan  agen  krioprotektan  yang  tepat,  seperti  TAT- PRDX2,  canthaxanthin,  atau  ekstrak  coleomic  Holotheria  parva,  dapat meningkatkan  motilitas,  viabilitas,  dan  integritas  sperma  setelah  kriopreservasi. Namun,  perlu  diperhatikan  bahwa  paparan  langsung  sperma  terhadap ultra-low vibration (ULV)  dapat  memiliki  efek  merugikan  pada  parameter  sperma.  Oleh karena  itu,  dalam  pengembangan  metode  kriopreservasi,  perlu  memperhatikan pemilihan metode, penggunaan agen krioprotektan yang sesuai, dan perlindungan terhadap  stress  oksidatif  untuk  meminimalkan  kerusakan  pada  sperma  manusia selama proses kriopreservasi dan pencairan.

## DAFTAR PUSTAKA
Araki, Y., Yao, T., Asayama, Y., Matsuhisa, A., & Araki, Y. (2015). Single Human Sperm  Cryopreservation  Method  Using  Hollow-Core  Agarose  Capsules. Fertility and Sterility , 104 (4), 1004–1009.
https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015.06.043
Dariush, G., Gholamhossein,  R., Rouhollah, F., Mahmood, G. S., Abdolhossein, S.,  Mohsen,  S.,  &  Loghman,  A.  (2019).  The  Application  of  Ultrasonic Vibration  in  Human  Sperm  Cryopreservation  as  a  Novel  Method  for  the
Modification  of  Physicochemical  Characteristics  of  Freezing  Media. Scientific Reports , 9 (1), 1-15. https://doi.org/10.1038/s41598-019-46424-0
Etebary,  S.,  Yari,  N.,  Khalili,  M.  A.,  Kalantar,  S.  M.,  &  Anvari,  M.  (2018). Testicular  Human  Spermatozoa  Cryopreservation  Correlation  between Sperm  Head  Vacuoles,  DNA  Fragmentation  and  Mitochondrial  Membrane Potential. Middle  East  Fertility  Society  Journal , 23 (4),  413–417. https://doi.org/10.1016/j.mefs.2018.07.001
Khashavi, Z., Homaei,  A., Koohnavard, F., Kamrani, E., Spinaci, M., Luwor, R. B.,  Archang,  M.,  Agarwal,  A.,  &  Henkel,  R.  (2020).  Novel  Additive  for Sperm Cryopreservation Media: Holotheria Parva Coelomic Cavity Extract Protects  Human  Spermatozoa  Against  Oxidative  Stress—A  Pilot  Study. Andrologia , 52 (6). https://doi.org/10.1111/and.13604
Liu,  J.,  Wang,  W.,  Liu,  X.,  Wang,  X.,  Wang,  J.,  Wang,  Y.,  Li,  N.,  &  Wang,  X. (2018).  Supplementation  of  Cryopreservation  Medium  with  TAT-
Peroxiredoxin  2  Fusion  Protein  Improves  Human  Sperm  Quality  and Function. Fertility and Sterility , 110 (6), 1058–1066.
https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2018.07.008
Liu, T., Gao, J., Zhou, N., Mo, M., Wang, X., Zhang, X., Yang, H., Chen, Q., Ao, L., Liu, J., Cui,  Z., & Cao, J. (2016). The  Effect of Two Cryopreservation Methods  on  Human  Sperm  DNA  Damage. Cryobiology , 72 (3),  210–215. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2016.04.004
Najafi, L., Halvaei, I., & Movahedin, M. (2019). Canthaxanthin Protects Human Sperm  Parameters  During  Cryopreservation. Andrologia , 51 (10). https://doi.org/10.1111/and.13389
Oberoi, B., Kumar, S., & Talwar, P. (2014). Study of Human Sperm Motility Post Cryopreservation. Medical  Journal  Armed  Forces  India , 70 (4),  349–353. https://doi.org/10.1016/j.mjafi.2014.09.006
Pariz,  J.  R.,  Raneá,  C.,  Monteiro,  R.  A.  C.,  Evenson,  D.  P.,  Drevet,  J.  R.,  & Hallak,  J.  (2019).  Melatonin  and  Caffeine  Supplementation  Used, Respectively, as Protective and Stimulating Agents in the Cryopreservation of Human Sperm Improves Survival, Viability, and Motility after Thawing compared  to  Traditional  TEST-Yolk  Buffer. Oxidative  Medicine  and Cellular Longevity , 2019 . https://doi.org/10.1155/2019/6472945 Ribas-Maynou, J., Fernández-Encinas, A., García-Peiró, A., Prada, E., Abad, C., Amengual,  M.  J.,  Navarro,  J.,  &  Benet,  J.  (2014).  Human  Semen Cryopreservation:  a  Sperm  DNA  Fragmentation  Study  With  Alkaline  and Neutral Comet Assay. Andrology , 2 (1), 83–87. https://doi.org/10.1111/j.2047-2927.2013.00158.x
Riva,  N.  S.,  Ruhlmann,  C.,  Iaizzo,  R.  S.,  López,  C.  A.  M.,  &  Martínez,  A.  G. (2018).  Comparative  Analysis  Between  Slow  Freezing  and  Ultra-Rapid Freezing  for  Human  Sperm  Cryopreservation. Jornal  Brasileiro  de Reproducao  Assistida , 22 (4),  331–337.  https://doi.org/10.5935/1518- 0557.20180060
Suksai, M.,  &  Dhanaworavibul, K.  (2019). Effects  of  Trehalose  and Sucrose  on Human  Sperm  Motility,  Vitality,  and  Morphology  After  Cryopreservation. Journal  of  Health  Science  and  Medical  Research , 37 (2),  101–107. https://doi.org/10.31584/jhsmr.201945
Valcarce,  D.  G.,  Cartón-García,  F.,  Riesco,  M.  F.,  Herráez,  M.  P.,  &  Robles,  V. (2013). Analysis of DNA Damage After Human Sperm Cryopreservation in Genes Crucial for Fertilization and Early Embryo Development. Andrology ,
1 (5), 723–730. https://doi.org/10.1111/j.2047-2927.2013.00116.x
Yan,  B.,  Zhang,  Y.,  Tian,  S.,  Hu,  R.,  &  Wu,  B.  (2021).  Effect  of  Autologous Platelet-Rich  Plasma  on  Human  Sperm  Quality  During  Cryopreservation. Cryobiology , 98 , 12–16. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2021.01.009