EFEK SITOTOKSIK EKSTRAK DIETIL ETER HERBA PEGAGAN EMBUN ( Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA MCF-7
Agustina Setiawati *) , Yohanes Dwiatmaka
Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Abstract: Triterpenoid saponin, hydrocosaponin A-F, isolated compound from Hydrocotyle sibthorpioides Lmk. performed cytotoxic activity on KB, Daoy and WiDr cancer cells. Methanolic extract of this herb was also investigated in inhibiting cancer development on liver and cervical cancer. Therefore, it is potential to be developed as chemopreventive agent. The objective of this study is to determine cytotoxic activity and compound in diethyl ether extract of Hydrocotyle sibthorpioides Lmk. herbs. The cytotoxic effect of extract on  MCF-7  breast  cancer  cell  line  was  assayed  using  MTT  method  while  phytochemical  analysis  was observed  using  normal  phase  Thin  Layer  Chromatoraphy  (TLC).  Diethyl  ether  extract  of    Hydrocotyle sibthorpioides had cytotoxic effect on MCF-7 cells with IC50 365 µg/mL. TLC analysis observed that the extract contain flavonoid compounds.
Keywords : Hydrocotyle sibthorpioides, MCF-7, cytotoxic, flavonoid

## 1. Pendahuluan
Kanker  merupakan  penyakit  seluler  dengan karakteristik  proliferasi  sel  yang  tidak  terkontrol (Hanahan  dan Weinberg,  2000). American  Cancer Society memperkirakan  terdapat  1.479.350  kasus kanker  yang  terdiagnosa  pada  tahun  2009.  Jenis kanker  yang  paling  banyak  diderita  perempuan adalah  kanker  payudara  (26%  dari  seluruh  kasus kanker),  dan  15%  kasus  menyebabkan  dengan kematian  (Jemal  dkk. , 2007).  Di  Indonesia,  kanker payudara  merupakan  kanker  terbesar  kedua  setelah kanker  servik    (Idamardi,  2007).  Pengembangan terapi  efektif  dalam  pengobatan  kanker  payudara sangat  diperlukan  untuk  menekan  jumlah  kematian penderita.
Pengobatan  kanker  yang  efektif  dan  efisien belum  ditemukan  (Sugiyanto,  2003).  Terapi  yang digunakan  untuk  pengobatan  kanker  payudara antara  lain  pembedahan  kemoterapi,  imunoterapi, radiasi  dan hormone  replacement  therapy (HRT). Pembedahan  tidak  efektif  lagi  untuk  sel  yang  telah bermetastasis.  Radioterapi  dan  kemoterapi  bekerja tidak  selektif  dan  tidak  aman  untuk  sel  normal (King,  2000).  Penemuan  obat  baru  sebagai  agen antikanker  dan  atau  kemopreventif  yang  selektif
perlu  dilakukan  untuk  mengatasi  hal  tersebut, diantaranya  dengan  menggunakan  bahan  alam yang  telah  dimanfaatkan  dalam  pencegahan maupun  pengobatan  kanker  (Walaszek  dkk., 2004).
Herba  pegagan  embun  mengandung  saponin triterpenoid  (Matsushita  dkk.,  2004)  yang  terbukti memacu  apoptosis  melalui  sitokrom  C  pada beberapa  jenis  sel  kanker  (Liu  dkk.,  2000). Saponin  triterpen  dalam H.  sibthorpioides , hydrocosaponin A-F terbukti mempunyai aktivitas sitotoksik  sedang  pada  sel  KB,  Daoy  dan  WiDr (Huang  dkk. b ,  2008).  Ekstrak  metanol H. sibthorpioides terbukti  menghambat  pertumbuhan kanker  pada  tikus  yang  ditransplantasi  karsinoma hepar  (S 180 )  dan  karsinoma  leher  rahim  (U 14 )  (Yu dkk.,  2007).  Dengan  demikian,  pegagan  embun ( Hydrocotyle  sibthorpioides Lmk.)  berpotensi sebagai agen kemopreventif.
Sel  kanker  payudara  MCF-7  memiliki overekspresi Bcl-2 sehingga menghambat apoptosis  dan  cenderung  menimbulkan  resistensi terhadap  agen  sitotoksik  (Weigert  dkk. , 2007). Resistensi  sel  MCF-7  juga  disebabkan  karena ekspresi  protein  P-glikoprotein  (PgP)  yang
mentransprot  keluar  obat-obat  sitotoksik  seperti doxorubicin,  paclitaxel,  vinkristin  (Wong  dkk. , 2006).  Sel  MCF-7  sesuai  untuk  digunakan  sebagai model  dalam  skrining  suatu  senyawa  sebagai  agen kemopreventif.
Penelitian  efek  sitotoksik  ekstrak  dietil  eter herba  pegagan  embun  ( Hydrocotyle  sibthorpioides Lmk.) terhadap  sel  kanker  payudara  MCF-7 dilakukan  untuk  mengetahui  efek  antikanker  herba pegagan embun ( Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.). Penelitian ini merupakan usaha skrining bahan alam sebagai agen kemopreventif yang lebih selektif dan aman digunakan pada pasien kanker.

## 2. Metode Penelitian
Bahan berupa herba pegagan embun yang telah berbunga dan tumbuh liar, diperoleh dari lingkungan  kampus  Universitas  Sanata  Dharma, Paingan,  Maguwoharjo,  Depok,  Sleman.  Pelarut yang  digunakan  untuk  ekstraksi  adalah  dietileter teknis.  Sel  kanker  payudara  MCF-7 cell  line yang digunakan  merupakan  koleksi  CCRC (Cancer Chemoprevention
Research Center) Fakultas Farmasi UGM. Sel ini ditumbuhkan  dalam medium penumbuh  DMEM (Dulbecco’s  modified  Eagle’s Medium )  yang  mengandung  FBS (Fetal  Bovine Serum ) 10% dan penisilin-streptomisin 1% (Gibco). Ekstrakilarutkan dalam Dimetil Sulfoksida (DMSO) (Sigma)  dengan  konsentrasi  tidak  lebih  dari  0,7%. Reagen  MTT  [3-(4,5-dimetil  thiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromida]. Larutan induk 5mg/mL dibuat  dengan  melarutkan  MTT  (Sigma,  Sigma- Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA) dalam phosphat buffer  saline (PBS).  Pereaksi  akridin  oranye- etidium bromida (AE). Larutan induk dibuat dari 50 mg  etidium  bromida  (Sigma,  Sigma-Aldrich  Corp, St.  Louis,  MO,  USA)  dan  15  mg  akridin  oranye (Sigma, Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA) dilarutkan  dalam  1  mL  metanol  95%,  ditambah  49 mL akuabides.
Alat  yang  digunakan  untuk  kerja in  vitro adalah: autoclav e  (Hirayama  HV-25  020585175, Hirayama  Manufacturing  Co.,  Jepang), laminar  air flow (LAF) hood (Labconco,  Gelman  Sciences), inkubator  CO 2 (Heraeus), inverted  microscope (Zeiss MC 80), haemocytometer (Nebauer improved 0,100  mm  Tiefe  Depth  Profondeur  0,0025  mm 2 , Germany), cell  counter, penangas  air  (Memmerth), neraca  analitik  (Ohauss),  mikropipet  (Pipetman ® neo  Gilson,  France), ELISA  reader (Bio-Rad
microplate  reader  Benchmark  serial no.  11565, Jepang), flowcytometer (FACS-Calibur), mikroskop  cahaya  (Nikon  YS100),  mikroskop fluoresens,  sentrifus  (Sorvall,  MC  12  V  9700869) dan vortex (Maxi  Mix  II, Thermolyne type 37600 mixer, Iowa, USA). Kamera digital (Canon Power Shoot  A460,  5,0  megapiksel)  digunakan  untuk mendokumentasikan pengamatan sel kanker secara mikroskopis.
Selain  alat-alat  di  atas,  alat  habis  pakai  yang digunakan  dalam  kerja in  vitro antara  lain: tissue culture  flask (25cm 2 Canted  Neck,  Nunc), tissue culture  dish diameter  10  cm  (Iwaki), conical  tube 15  mL  (BD  Falcon), yellow  tip dan blue  tip (Axigen), 96-well  plate (Nunc), microplate (96 well ,  Iwaki)  dan coverslip diameter  13  mm (Thermanox ® ).

## 2.1 Pembuatan simplisia dan ekstraksi
Herba  tumbuhan  pegagan  embun  terlebih dahulu  dibersihkan  dari  debu  dan  kotoran  dengan air  mengalir.  Herba  pegagan  embun  dikeringkan dengan  oven  berkipas  pada  40 o C,  selanjutnya diserbuk  dan  diayak  sehingga  diperoleh  serbuk herba  pegagan  embun  yang  cukup  halus.  Serbuk herba  pegagan  embun  dimaserasi  menggunakan dietileter 3 x 24 jam, filtrat (maserat) dikumpulkan menjadi  satu.  Maserat  kemudian  dipekatkan menggunakan  vaccum rotary  evaporator menjadi ekstrak kental  yang kemudian dikeringkan dengan freeze  dryer untuk  mendapatkan  ekstrak  kering. Dua macam ekstrak kering inilah yang selanjutnya digunakan  untuk  uji  sitotoksik  dan  uji  pemacuan apoptosis.

## 2.2 Analisis Kandungan Fitokimia dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Metode  KLT  dilakukan  menggunakan  sistem fase normal  dengan menggunakan fase diam  yang lebih  polar  dibandingkan  fase  gerak.  Fase  diam yang  digunakan  adalah plate selulosa.  Fase  gerak dalam  sistem  ini  adalah  n-butanol:asam  asetat:air (5:1:4  v/v).  Sampel  sebanyak  1  μL  ditotolkan menggunakan  Camag’s  linomat  pada  15  mm  dari dasar plate . Plate kemudian dimasukkan ke dalam chamber Wheaton yang telah dijenuhi dengan fase gerak.  Elusi  fase  gerak  dilakukan  sepanjang  150 mm. Plate kemudian  dikeringkan  sampai  semua fase  gerak  menguap  pada  suhu  kamar  dan dilakukan deteksi uap ammonia pada sinar tampak.
SETIAWATI, DWIATMAKA Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas 3

## 2.3 Uji Sitotoksik
Uji  sitotoksik  dilakukan  menurut  penelitian sebelumnya  oleh  Setiawati  dkk.  (2011),  Setiawati (2011)  dan  Setiawati  dkk.  (2014).  Sel  dengan kepadatan populasi 5 x 10 3 sel/100 µL didistribusikan  ke  dalam 96  well  plate selanjutnya diinkubasi  selama  24  jam  dalam  inkubator  CO 2 untuk  beradaptasi  dan  menempel  pada  sumuran. Larutan  ekstrak  dilarutkan  dalam  DMSO  1% sebagai  stok,  kemudian  diencerkan  dengan  media kultur  hingga  konsentrasi  tertentu.  Larutan  esktrak sebanyak  100  µL  dimasukkan  sumuran  dan diinkubasi  selama  24  jam.  Pada  akhir  inkubasi, media dalam sumuran dibuang, kemudian ditambahkan  PBS  100  µl  tiap  sumuran  untuk pencucian  dengan  PBS,  lalu  PBS  dibuang. Selanjutnya, pada masing-masing sumuran ditambahkan  MTT  5  mg/mL  dalam  100  µl  media kultur . Inkubasi MTT dilakukan selama 3 jam pada suhu 37°C agar MTT diabsorbsi sempurna oleh sel hidup.  Setelah  inkubasi,  larutan  MTT  dibuang dengan  membalik  plate,  kemudian  ditambahkan stopper SDS  untuk  melarutkan  garam  formazan. Sel  diinkubasi  selama  24  jam  dalam  suhu  kamar dan  terlindung  dari  cahaya.  Pada  akhir  inkubasi plate digoyang  menggunakan shaker selama  15 menit,  kemudian  plate  dibaca  dengan  ELISA reader pada λ 595 nm.

## 2.4 Analisis Data
Nilai Inhibition Concentration 50 (IC 50 )
merupakan konsentrasi yang menyebabkan penghambatan  pertumbuhan  50%  populasi  sel sehingga  dapat  diketahui  potensi  sitotoksisitasnya (Doyle  dan Griffiths,  2000).  Dalam  perhitungan IC 50 , diperlukan  data  absorbansi  masing-masing sumuran  yang  kemudian  dikonversi  ke  dalam persen  viabilitas  sel.  Persen  viabilitas  sel  (sel  yang hidup) dihitung menggunakan rumus:
% 100 x KM abs - KS abs KM abs - SP abs s viabilita
%  Keterangan: abs SP =  absorbansi sel dengan perlakuan abs KM =  absorbansi kontrol media abs KS
= absorbansi kontrol sel
Nilai  IC 50 dihitung  dengan  bantuan  program Microsoft Excell 2013 dari persamaan garis regresi linier  hubungan  antara  log  konsentrasi  dengan persen viabilitas sel (Setiawati, 2011).

## 3. Hasil dan Pembahasan
Dalam  penelitian  ini,  viabilitas  sel  dianalisis dengan metode MTT. Garam MTT diabsorbsi oleh sel hidup dan dipecah oleh suksinat dehidrogenase yang termasuk dalam rantai respirasi di mitokondria,  menjadi  formazan  (Gambar  1) (Doyle  dan  Griffiths,  2000).  Absorban  yang dihasilkan oleh formazan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. Metode MTT lebih sensitif dibandingkan  dengan  metode  sitotoksik  lain seperti  metode  LDH  dan  metode  protein  (Fotakis dan Timbrell,  2006).  Hasil  uji  memperlihatkan bahwa  ekstrak  dietileter  herba  pegagan  embun memiliki  aktivitas  sitotoksik  terhadap  sel  MCF-7 dengan  persamaan  regresi  Y=  -0,1814x  +  116,16 (R 2 =0,9798)  dan  harga  IC 50 365  µg/mL  Aktivitas sitotoksik  ekstrak  dietileter  pegagan  embun bersifat dose dependent (Gambar 2).
Dalam  penelitian  ini  juga  dilakukan  analisis kandungan  fitokimia  dari  ekstrak  dengan  metode KLT  fase  normal  (Gambar  3).  Berdasarkan  hasil KLT,  didapatkan  informasi  bahwa  senyawa  yang terdapat  dalam  ekstrak  adalah  golongan  senyawa flavonoid yang mempunyai tingkat kepolaran lebih tinggi  dibandingkan  rutin.  Sebaliknya,  hasil penelitian  Huang  dkk. b (2008)  menyebutkan bahwa  pegagan  embun  mengandung  senyawa- senyawa  yang  relatif  kurang  polar  dibandingkan flavonoid  antara  lain:  saponin  triterpen  tipe oleanan,  hidrocosaponin  A-F  yang  mempunyai  3 gugus  D-glukosa  dan  1  gugus  L-arabinosa. Senyawa-senyawa  terpen  tersebut  larut  dalam pelarut semi-polar seperti dietil eter. Kompleksitas  kandungan  senyawa  dalam  ekstrak kemungkinan menyebabkan efek sitotoksik ekstrak tersebut  tidak  spesifik  sehingga  IC 50 dari  ekstrak tersebut  terlalu tinggi.  Oleh karena itu, diperlukan penelitian  lebih  lanjut  mengenai  kandungan senyawa dalam ekstrak dietil eter pegagan embun.
4 SETIAWATI, DWIATMAKA

## Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas
Gambar 1. Formazan yang terbentuk oleh reaksi Enzim Suksinat Dehidrogenase dan MTT
Gambar 2. Efek ekstrak dietil eter herba pegagan embun ( Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) terhadap viabilitas sel kanker payudara MCF-7
Gambar  2. Kromatogram KLT ekstrak dietileter herba pegagan embun setelah dideteksi dengan uap ammonia pada sinar visibel
Keterangan:
1, 2 : ekstrak dietil eter 3 : standard rutin : bercak flavonoid rutin; : bercak diduga flavonoid
4. Kesimpulan
Ekstrak  dietil  eter  herba  pegagan  embun ( Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) mempunyai efek sitotoksik yang bersifat dose-dependent terhadap sel kanker payudara MCF-7.

## Ucapan Terima Kasih
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih  kepada Lembaga  Penelitian  dan  Pengabdian  Masyarakat, Universitas  Sanata  Dharma  yang  telah  membiayai penelitian  ini  melalui  Hibah  Penelitian  Internal tahun  anggaran  2010  dengan  nomor  kontrak 222/LPPM USD/X/2010.
DAFTAR PUSTAKA . Doyle, A. and  Griffiths J.B., 2000, Cell dan Tissue Culture for  Medical  Research, John  Willey  &  Sons  LTD, England.
Francis, G., Kerem, Z., Harrinder, P.S., Makkar, Becker, K., 2002, British Journal of Nutrition , 88: 587- 605. Gewies,  2003,  Introduction  to  Apoptosis, ApoReview ,  3 (1):1-26.
Hanahan,  D.  and  Weinberg,  R.A.,  2000,  The  hallmark  of cancer, Cell , 100, 57-70.
Huang,  H.,  Liauw,  C.,  Zhang,  L.,  Ho,  H.,  Kuo,  L.Y.,  shen, Y.,  Kuo,  Y. a ,  2004,  Triterpenoidal  saponins  from Hydrocotyle  sibthorpioides, Phytochemostry, 69(7): 1597- 1603.
Huang, S., Huang, G., Ho, Y., Lin, Y., Hung, H., Chang,  T., Chang,  M.,  Chen,  J.,  Chang,  Y.,  2008,  Antioxidant
1
2 3
SETIAWATI, DWIATMAKA Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas 5 and Antiproliferative Activities of the Four Hydrocotyle  species  from  Taiwan, Botanical  Studies ., 49: 311- 322.
Huang,  C.,  Liaw,  CC.,  Zhang,  L.,  Ho,  H.,  Kuo,  L.,  Shen,  Y., Kuo, Y., 2008, Triterpenoidal saponins from Hydrocotyle  sibthorpioides , Phytochemistry, 69(7): 1597- 1603.
Idamardi, 2007, Kanker Payudara , Yayasan Kanker Payudara Indonesia, Jakarta.
Jemal,  A.,  Siegel,  R.,  Ward,  E.,  Murray,  T.,  Jiaquan  Xu  and Michael J.T. 2007. Cancer Statistic 2007, CA Cancer J Clin., 57: 43-66.
King,  R.J.B.,  2000, Cancer  Biology ,  2nd  edition.,  Pearson Education Limited, London.
Matsushita A, Sasaki Y, Warashina T, Miyase T, Noguchi H, Velde  D.,  2004, New  oleanane  saponins  from hydrocotylesibthorpioides , 5: 1-6.
Mechetner, E., Kyshtoobayeva, A., Zonis, S., Kim, H., Stroup, R.,  Garcia,  R.,  Parker,  R.J.,  and  Fruehauf,  J.P.,  1998, Levels of Multidrug Resistance (MDR1) P- Glycoprotein  Expression  by  Human  Breast  Cancer Correlate  with in  vitro Resistance  to  Taxol  and Doxorubicin, Clinical Cancer Research , 4, 389-398. Schwartz,  G.K.  and  Shah,  M.A.  2005.  Targeting  the  Cell Cycle:  A  New  Approach  to  Cancer  Therapy .  J  Clin Oncol. 2: 9408-9421. Shigematsu,  N.,  Kuono,  I.,  Kawano,  N.,  1982,  Quercetin  3- (6″-caffeoylgalactoside) from Hydrocotyle
sibthorpioides , Phytochemistry, , 21(8): 2156- 2158. Setiawati, A., Susidarti RA., Meiyanto, E., 2010, Peningkatan Efek  Sitotoksik  Doxorubicin  oleh  Hesperidin  pada  Sel T47D, Bionatura , 13(2): 85- 92.
Setiawati,  A.,  2011,  Aktivitas  Sitotoksik  dan  Induksi Apoptosis Kelopak Bunga Rosella ( Hibiscus sabdariffa
L)  terhadap  Sel  Kanker  Payudara  (T47D), Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas , 7(2): 617- 622. Setiawati, A., Riswanto, FDO., Yuliani, SH., Istyastono, EP., 2014,  Anticancer  Activity  of  Mangosteen  Pericarp Dry Extract towards MCF-7 Breast Cancer Cell Line through  Estrogen  Receptor-α, Indo.  J  Pharm .,  25(3): 119- 124.
Sugiyanto,  Sudarto,  B.,  Meiyanto,  E.,  Nugroho,  A.E.,  dan Jenie U.A., 2003, Aktivitas Antikarsinogenik Senyawa  yang  Berasal  dari  Tumbuhan, Majalah Farmasi Indonesia , 14(4): 216-225.
Walaszek,  Z.,  Hanausek,  M.,  and  Slaga,  T.J.,  2004, Mechanisms  of  Chemoprevention, Suppl.  Am.  Coll. Phys. , 125, 128-133.
Weigert A., Tziepy N., Knethen A., Johann A., Schmidt H.,
Geisslinger  G.,  dan Brune  B.,  2007,    Tumor  Cell Apoptosis Polarizes Macrophages—Role of
Sphingosine-1-Phosphate ,  Molecular  Biology  of  the Cell, 18 : 3810–3819, Germany Wong.,  Bendayan.,  Rauth.,  Xue.,  Babakhaniyan.,  &  Wu,
2006, A Mechanistic Study of Enhanced Doxorubicin Uptake  and  Retention  in  Multidrug  Resistant  Breast Cancer  Cells  Using  A  Polymer-Lipid  Hybrid Nanoparticle  System, The  Journal  of  Pharmacology dan Experimental Therapeutics , 317 (3), 1372-1381. Yu, F., Yu, F., Mo, P.M., Guire, R., Li, R., Wang, R., 2007, Effect  of Hydrocotyle  sibthorpioides extract  on transplanted  tumor  and  immune  function  in  mice, 14(2): 166- 171.
Zeiss,  C.J,  2003,  The  Apoptosis-Necrosis  Continuum: Insights  from  Genetically  Altered  Mice.  Review. Vet Pathol . 40:481-495.