## EKSPRESI mRNA INTERLEUKIN-10 (IL-10) DALAM KAITANNYA
DENGAN PATOGENESIS MALARIA BERAT PADA MENCIT STRAIN BALB/C
YANG DIINFEKSI PLASMODIUM YOELII 17XL
Sri Wijayanti Sulistyawati 1,2,3 , Sukmawati Basuki 1,2 , Yoes Prijatna Dachlan 1,2
1 Departemen Parasitologi  Kedokteran, Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga,  Surabaya
2 Kelompok Studi Malaria, Lembaga Penyakit Tropis Universitas Airlangga, Surabaya
3Program Studi S2 Imunologi, Universitas Airlangga, Surabaya
e-mail: * yanti.parasito@gmail.com , sukmabas@yahoo.com , yoesdachlan.rspti@gmail.com

## Abstrak
Patogenesis malaria berat masih belum diketahui menyeluruh. Episode malaria berat  dapat  disebabkan  oleh  dua  keadaan,  produksi  tinggi  pada  fase  awal  IL-10  dan atau  kurangnya  produksi  IL-10  pada  fase  transisi.  Peran  IL-10  pada  malaria  masih belum jelas diketahui. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis ekspresi IL-10 dalam kaitannya dengan patogenesis malaria berat pada mencit strain BALB/c yang diinfeksi P. yoelii 17XL.
Penelitian  eksperimental laboratoris dengan rancangan “post test only control group design” dilakukan, dan menggunakan 24 mencit strain BALB/c, betina, usia 7-8 minggu,  yang  dibagi  menjadi  4  kelompok.  Mencit  BALB/c  diinfeksi  secara intraperitoneal dengan 1x10 5 P. yoelii 17XL, dan dikorbankan pada hari ke-3 dan ke-6 pasca infeksi. Parasitemia dan kadar hemoglobin diperiksa setiap hari. Jaringan limpa diambil  untuk  isolasi  RNA.  Ekspresi  mRNA  IL-10,  TNFα,  dan  IFNγ  dianalisis  dengan RT-PCR.
Mencit BALB/c dinfeksi dengan 1x10 5 P. yoelii 17XL  menunjukan infeksi letal, yang  ditandai  dengan  peningkatan  parasitemia  sejalan  dengan  penurunan  kadar hemoglobin, terjadi setelah hari ke-3 pasca infeksi. Ekspresi mRNA IL-10, begitu pula dengan  TNFα  dan  IFNγ  pada  hari  ke-3  paska  infeksi  menunjukan  peningkatan dibandingkan pada kontrol dan hari ke-6 paska infeksi.
Tidak  adanya  ekspresi  IL-10  pada  H6,  menunjukkan  kemungkinan  adanya kegagalan regulator mengontrol malaria berat pada infeksi P. yoelii 17XL  pada mencit BALB/c.
Kata kunci — mRNA IL-10, RT-PCR, patogenesis malaria berat, mencit BALB/c yang diinfeksi P. yoelii 17XL

## Abstract
The pathogenesis of severe malaria is still unsolved. The role of IL-10 in the pathogenesis of malaria  still  unclear.  This  study  was  aimed  to  analyze   mRNA  expression  of  IL-10  on  the pathogenesis of severe malaria in strain BALB/c mice infected with P. yoelii 17XL. The    laboratory    experimental    research    with    post    test    only-control    group    design    was conducted.  A  total  of  24  BALB/c  mice,  female,  age  7-8  weeks,  were  divided  into  4  groups. BALB/c mice were infected intraperitoneally with 1x10 5 P.   yoelii 17XL, and were sacrificed on Day-3 and Day-6 post infection. Parasite count and hemoglobin level were observed daily. Spleen tissues were collected for RNA isolation. mRNA expressions of IL-10, TNFα and IFNγ were analysed by RT-PCR technique.
BALB/c  mice  infected  with   P.  yoelii  17XL  caused  lethal  infection  with  signs  of  increas ing parasitemia  synchronize  with  the  decreasing  levels  of  hemoglobin  after  the  day-3  post- infection.  Expression  of  mRNA  of  IL-10,  TNFα,  and  IFNγ  were increased  on  the  day  3  post infection, compared with day 0 and day 6 post infection.
This study suggested that the absent of mRNA expression of IL-10 on day 6 may indicate the failure of regulator in controlling severe malaria in P. yoelii 17XL infection on BALB/c mice.
Keywords— mRNA IL-10, RT-PCR, pathogenesis of severe malaria, BALB/c mice infected by P.  yoelii  17XL
© Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
JBP Vol.20, No. 3, Desember 2018 – Sri Wijayanti Sulistyawati

## 1.    PENDAHULUAN
Malaria  merupakan  penyakit  parasit yang  terpenting.   Pada  tahun   2010,   terdapat 216 juta kasus malaria dan sedikitnya 655 ribu kematian  di  dunia,  terutama  pada  anak-anak yang  tinggal  di  Afrika  (WHO,  2010).  Sampai saat  ini,  di  Indonesia  malaria  masih  menjadi masalah  kesehatan.  Pada  tahun  2009  di Indonesia  terdapat  544.470  kasus  yang dilaporkan,  dengan  tingkat  kematian  sebesar 900  per  100.000  penduduk  (WHO-SEARO, 2011).
Fenotip  klinis  infeksi  malaria  sangat bervariasi  (Riley  et   al,  2006).   Keseluruhan pola  penyakit  dipengaruhi  secara  nyata  oleh umur  dan  reaksi  imun  yang  dialami  hospes (Schofield  and  Grau,  2005).  Alasan  yang mendasari  perbedaan tersebut  belum  dipahami sepenuhnya  (Angulo  and  Fresno,  2002). Pemahaman mengenai dasar imunologi mengenai  imunitas  protektif  terhadap  malaria dibutuhkan  seiring  dengan  peningkatan  multi resistensi  terhadap  anti  malaria  disertai resistensi vektor terhadap insektisida yang ada (Hassan et al, 2010; Niikura et al,2011).
Sebagian    besar    patologi infeksi    malaria    disebabkan    oleh    respon inflamasi  yang  berlebihan  terhadap  parasit. Sitokin regulatori interleukin-10 (IL-10) diketahui  berperan  penting  untuk  mengontrol inflamasi selama infeksi malaria dan memberikan  proteksi  terhadap  imunopatologi, akan  tetapi  dapat  pula  mengurangi  efektivitas mekanisme imun lainnya dalam mengeliminasi  parasit.  Untuk  mendisosiasi kedua    efek    IL-10    tersebut,    yang memungkinkan    kontrol    infeksi    dan pencegahan  patologi  berjalan  signifikan,  perlu pemahaman  yang  lebih  baik  mengenai  proses produksi  IL-10,  waktu  produksi,  dan  sel-sel yang memproduksi (Couper et al, 2008).
Data  mengenai  IL-10  pada manusia  masih  kontradiktif.  Proporsi  IL-10 bertambah    dengan    usia    dan    berbanding terbalik   dengan   kasus   malaria   berat,   dan respon  IL-10  terhadap  peptida Plasmodium bertahan  hingga  3  tahun  pada  masyarakat  dari wilayah  dengan  intensitas  transmisi  malaria yang  berbeda.  Pada  area  dengan  endemisitas rendah  respon  IFNγ  menurun  sesuai  dengan
waktu,  respon  IL-10  sel  MN  perifer  stabil hingga  6  tahun  (Freitas  do  Rosario  and Langhorne,  2012).  Penelitian  Long  et  al menemukan keterlibatan IL-10 dalam pencegahan keparahan penyakit, juga kemungkinan  bahwa  polimorfisme  IL-10 mempengaruhi      derajat      keparahan      malaria telah diinvestigasi, meskipun masih dipertentangkan  (Penman  and  Gupta,  2008). Kadar  IL-10  yang  tinggi  berhubungan  dengan penurunan  produksi  IFNγ  yang  menyebabkan anemia  yang  parah  pada  infeksi Plasmodium falciparum (Niikura  et  al,  2011) . Pada  anak- anak  di  Ghana  yang  menderita  malaria falsiparum,  kadar  IL-10  dalam  sirkulasi  yang rendah  berhubungan  dengan  anemia  malaria yang berat (Wilson et al, 2005). Namun, kadar IL-10  diiringi  TNFα  yang  tinggi  juga dilaporkan   pada   kasus   malaria   berat   dan dengan  komplikasi  serta  pada  malaria  anak dengan  parasitemia  yang  tinggi  (Othoro  et al,1999;  Keller  et  al,  2006).  Rasio  IL-10/TNF yang  rendah  berhubungan  dengan  anemia malaria  berat  (Niikura  et  al,  2011).  Hubungan antara IL-10 dengan sitokin lain penting dalam sistem imun terhadap malaria.
Pada    infeksi    malaria    di    mencit, diketahui  efek  negatif,  maupun  efek  protektif IL-10 terhadap respon inflamasi (Niikura et al, 2011). Sekresi IL-10 pada fase awal infeksi P. yoelii berhubungan  dengan  respon  IFNγ  dan TNFα  yang  tumpul  dan  memanjang  (Freitas do   Rosario   and   Langhorne,   2012).   Pada mencit  dengan IL-10-deficient terjadi  supresi peningkatan  parasitemia  selama  koinfeksi parasit  letal  dan  nonletal,  namun  terjadi kegagalan  eliminasi  parasit  komplit  dan menyebabkan kematian (Niikura et al, 2011).
Studi     mengenai severe     malaria dengan hewan coba penting untuk pemahaman mengenai  pathogenesis  malaria,  khususnya peranan    IL-10    pada    patogenesis severe malaria, penelitian  ini  bertujuan  untuk mendeteksi  ekspresi  mRNA  IL-10  pada  limpa mencit strain BALB/c yang diinfeksi P. yoelii 17XL dalam  kaitannya  dengan  patogenesis malaria berat .
© Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia

## 2.    METODE PENELITIAN
Jenis  penelitian  ini  adalah  penelitian eksperimental
laboratoris dengan menggunakan rancangan post test only control group  design (Zainuddin,  2000),  dan  telah layak  etik  (Keterangan  Kelaikan  Etik  KEPK FKUA  No  035/EC/KEPK/FKUA/2012)  dan dilakukan  di  Lembaga  Penyakit  Tropis  (LPT) Universitas Airlangga. Penelitian ini dilakukan selama 2 bulan.
Sampel penelitian adalah mencit strain BALB/c     sehat,  betina  dan  berusia  7   –  8 minggu  yang  diperoleh  dari  Laboratorium Penelitian  dan  Pengujian  Terpadu  (LPPT) Universitas  Gajah  Mada  (UGM)  sebanyak  24 ekor. Mencit dibagi menjadi 4 kelompok yaitu kelompok  kontrol  (kontrol  negatif),  kelompok perlakuan   (dibagi   menjadi   dua   kelompok, yaitu  H3  dan  H6), kelompok  survival  (kontrol positif).  Kelompok  perlakuan  dan  kelompok survival  merupakan  mencit  BALB/c  yang diinfeksi    secara    injeksi    intraperitoneal sebanyak  1x10 5 P.  yoelii  17XL .  Kelompok survival  merupakan  kelompok  perlakuan  yang diamati sampai mati.
P.  yoelii  17XL diperoleh  dari  Balai Penelitian    dan    Pengembangan    Kesehatan Republik  Indonesia,  Jakarta. P.  yoelii  17XL adalah  strain  parasit  yang  hanya  menginfeksi mencit.  Mencit  tersebut  akan  mengalami malaria  berat  yang  ditandai  dengan  anemia berat (Hb<5gr%) dan hiperparasitemia (parasitemia  darah  tepi>  5%)  (WHO,  2010), berakhir  dengan  kematian  (bersifat  letal). Sebelum  diinfeksi  dilakukan  dua  kali  pasase, kemudian  dilakukan  infeksi  sebanyak  1  x  10 5 P.    yoelii    17XL secara    intraperitoneal    pada setiap mencit. Selanjutnya dilakukan pengukuran  kadar  hemoglobin  (Hb)  dan parasitemia setiap hari.
Pemeriksaan  parasitemia  dan  kadar hemoglobin  dilakukan  setiap  hari  dengan menggunakan  sampel  darah  dari  ekor  mencit. Pengukuran kadar parasitemia dilakukan berdasarkan  ketentuan  WHO  (1991),  yaitu dengan  cara  menghitung  persen  parasit  di dalam  1.000  eritrosit  (termasuk  eritrosit  yang terinfeksi  parasit)  pada  sediaan  hapusan  darah tipis  yang  telah  dicat  dengan  larutan  Giemsa 5%   dalam phosphate   buffer   saline (PBS).
Sedangkan  pemeriksaan  Hb  dilakukan  dengan metode  sahli  (Assistent,  Germany)  dengan satuan  gr/dl  (Depkes  RI,  1991).  Mencit  pada kelompok  kontrol  dan  kelompok  perlakuan pada  hari  ketiga  paska  infeksi  (kelompok  H3) dan pada hari keenam paska infeksi (kelompok H6)  dikorbankan  dan  diambil  limpanya. Jaringan  limpa  yang  diperoleh  kemudian digunakan untuk isolasi RNA.
Ekspresi   mRNA   IL-10,   TNFα   dan IFNγ    dianalisis    dengan    tehnik    RT-PCR ( Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ),  dengan  tahap-tahap  ekstraksi  RNA untuk  mendapatkan  total  RNA  menggunakan reagen    TRIZOL    (Invitrogen    Life Technologies,  USA),  dilanjutkan  dengan penambahan    oligoDT    (AIT    Biotech, Singapore)  untuk  mendapatkan  mRNA  dan proses Reverse  Transcription menggunakan enzim  MMLV  (10.000  U cloned  moloney murine  leukemia  virus (MMLV) reverse transcriptase  enzyme) (Promega  Corporation, Madison,  USA)  untuk  mendapatkan  cDNA, selanjutnya  dilakukan  PCR  dengan  sampel cDNA.  Amplifikasi  cDNA  dilakukan  dalam larutan  PCR  yang  mengandung  10mM  Tris- HCl  (pH  8,6),  50  mM  KCl,  MgCl 2 pada konsentrasi akhir  1,5mM,  dNTPs  pada konsentrasi  akhir  0,2  mM,  50  pmol  setiap primer  2,5  U  Taq  DNA  polymerase  (Takara Ltd,  Japan).  Selanjutnya  cDNA  diamplifikasi dengan   primer   spesifik   mencit   (Genecraft Labs,  German)  sebagai  berikut  dalam  tabel  1. DNA diamplifikasi menggunakan siklus denaturasi pada suhu 94 o C selama 5 menit, 35 kali  siklus annealing pada  suhu  94 0 C  selama 1 menit, 60 o C selama 1 menit, 72 o C selama 1 menit  dan final  extension pada  suhi  72 o C selama 20 menit. Pada RT-PCR ini, digunakan β-actin sebagai kontrol internal.  Elektroforesis dilakukan  pada  10  µl  DNA  yang  telah diamplifikasi  dalam  1,5%  agarose-TAE  yang mengandung  ethidium  bromide  0,5  µg/ml. Selanjutnya  ekspresi  sitokin  dari  DNA  yang telah diamplifikasi diidentifikasi dibawah sinar ultra violet (UV) (Iwaki, Japan) dan didokumentasi  menggunakan  kamera  digital (Olympus Optical Co, Japan).
Data  yang  diperoleh  selanjutnya  dianalisis menggunakan student  t-test dan  korelasi Pearson dengan software SPSS.
© Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia

## Tabel   1.   Primer   yang   digunakan
untuk RT-PCR
Sitokin                          Nukleotida                                      Referensi
Grafik  1.  Masa  Hidup  Mencit  BALB/c  yang diinfeksi P.yoelii 17XL
Kadar   hemoglobin   mencit   BALB/c
TNFα sense GAAGCATGATCCGCGACG TGG Kita et al, 2000 yang   diinfeksi P.   yoelii   17XL cenderung mengalami penurunan selama perlakuan, yaitu antisen se GTAGACCTGCCCGGACTC CGCAA
pada  kelompok  H3  dari  11  g/dl  saat  sebelum
IL-10 sense TCAAACAAAGGACCAGCT GGACAACATACTG Kita et al, 2000 infeksi  menjadi  9,2  g/dl  pada  hari  ke-2  paska infeksi,  sedang  pada  kelompok  H6  dari  10,7 antisen se CTGTCTAGGTCCTGGAGT CCAGCAGACTCAA
g/dl  menjadi  9,8  g/dl.  Setelah  hari  ke-3  paska
IFNγ sense ACTGCCACGGCACAGTCA       Kita et al, 2000 infeksi      kadar      hemoglobin      mengalami penurunan  yang  semakin  besar  hingga  pada antisen se GCGACTCCTTTTCCGCTT
kelompok    H6    hari    ke-6    paska    infeksi
β-actin sense GTTACCAACTGGGACGAC A Kita et al, 2000 mencapai  kadar  hemoglobin  4,9  mg/dl  seperti dapat dilihat pada grafik 2. antisen se TGGCCATCTCCTGCTCGA A

## 3.    HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tahapan dan hasil sebagai berikut :
Mencit pada kelompok survival digunakan  untuk  melihat  masa  hidup  mencit BALB/c yang diinfeksi P.yoelii 17XL .
Didapatkan  bahwa  terdapat  sampel  yang homogen  karena  seluruh  mencit  kelompok survival  mati  pada  hari  ke-6,  seperti  dapat dilihat pada grafik 1.
*%survival dihitung berdasarkan persentase  jumlah mencit   BALB/c   yang   hidup   setelah   diinfeksi P.yoelii 17XL , diamati setiap hari
* Kadar  hemoglobin  diukur  menggunakan  metode Sahli (g/dl),  sediaan  darah  diambil  dari ujung  ekor (mean + SD). Jumlah mencit pada setiap kelompok
: 6 ekor.
Grafik  2.  Kadar  Hemoglobin  mencit  BALB/c yang  diinfeksi P.  yoelii 17XL  secara intraperitoneal.
Perbandingan   Hb   antara   kelompok H0, H3, dan H6 menunjukkan perbedaan yang signifikan  (p<0,05)  (lihat  tabel  2).  Hal  ini dibuktikan  pula  dengan  perbedaan  signifikan antara  kelompok  H0  dan  H6  (p<0,05),  serta kelompok  H3  dan  H6  (p<0,05),  namun  antara kelompok  H0  dan  H3  tidak  signifikan  (lihat tabel  2).  Sehingga  dapat  dikatakan  terjadi penurunan  kadar  hemoglobin,  yang  nyata terlihat  setelah  hari  ke-3  paska  infeksi.
© Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
Parasitemia  mencit  BALB/c  yang diinfeksi P.  yoelii  17XL diperiksa  setiap  hari setelah  infeksi.              Hasil  pemeriksaan menunjukkan    parasitemia  dapat  dideteksi mulai  hari  pertama  setelah  injeksi,  meskipun
Tabel   2.   Perbandingan   kadar   hemoglobin antara  kelompok H0,  H3  dan H6  pada Mencit
BALB/c yang diinfeksi P. yoelii 17XL
Variabel                              Kelompok*
parasitemia   yang   terjadi   pada   hari   pertama
H0                 H3                 H6 harga p
hingga   kedua   paska   infeksi   relatif   rendah, yaitu  pada  kelompok  H3  sebesar  0,33%  (hari ke-1)  dan  0,36%  (hari  ke-2),  pada  kelompok H6 sebesar 0,26%  (hari ke-1) dan 1,04% (hari ke-2).   Parasitemia   mulai   paten   pada   hari ketiga  setelah  infeksi,  dan  terus  meningkat dengan  cepat  hingga  mencapai  66,16  %  pada kelompok  H6  di  hari  keenam  paska  infeksi (lihat grafik 3).
Kadar Hemoglobin (g/dl)          10.67±0.82 a 9.2±1.17 a 4.9±1.8 b <0.0001 Parasitemia (% iRBC per 1000
eritrosit
normal)                 -              4.2±3.3 c 66.16±9.45 d 0.031 Notasi  huruf  a  dan  b  dalam  satu  baris  adalah  berbeda secara  signifikan  (p<0,05).  Notasi  huruf  c  dan  d  dalam satu baris adalah berbeda secara signifikan (p<0,05)
Tabel   3.   Tabel   korelasi   antara   variabel- variabel  pada  Mencit  BALB/c    yang  diinfeksi P. yoelii 17XL Parasitemia (% iRBC per 1000 eritrosit Kadar Hemoglobin (g/dl) normal) Parasitemia  (% iRBC  per  1000 eritrosit normal) Kadar - r=-0.898 p<0.0001 Grafik  3.  Parasitemia*  mencit  BALB/c  yang Hemoglobin r=-0.898 -
diinfeksi  10 5 P.  yoelii 17XL          secara intraperitoneal.
*Parasitemia   dihitung   berdasarkan   persentase   jumlah eritrosit  terinfeksi  dalam  1.000  eritrosit  normal  yang diperiksa  dari  sediaan  hapusan  darah  yang  dicat  Giemsa dan  diperiksa  dibawah  mikroskop  cahaya  dengan pembesaran 1.000x (mean + SD).
H3:  Kelompok  yang  dikorbankan  pada  hari  ke-3,  H6: Kelompok  yang  dikorbankan  pada  hari  ke-6,  Jumlah mencit pada setiap kelompok : 6 ekor.
Analisis  statistik  menunjukkan  adanya peningkatan  parasitemia  yang  signifikan  pada H6  bila  dibandingkan  dengan  H3  (p<0,05) (lihat tabel 2).
(g/dl) p<0.0001
Hubungan  antara  parasitemia  dengan Hb  menunjukkan  korelasi  yang  signifikan (p<0,01)  (lihat  tabel  3).  Hal  ini  menunjukkan terjadi  peningkatan  parasitemia  yang  nyata terlihat setelah hari  ke-3  paska infeksi,  sejalan dengan penurunan kadar hemoglobin.
Hasil  RT-PCR  pada  limpa  mencit BALB/c  yang  diinfeksi P.  yoelii  17  XL menunjukkan mRNA IL-10 pada H0 (sebelum diinfeksi) tidak terekspresi, begitu pula dengan IFNγ  dan  TNFα  pada  H0  (sebelum  diinfeksi) tidak terekspresi, sedangkan pada H3 (hari ke- 3  paska  infeksi)  terlihat  ekspresi  mRNA  IL- 10, IFNγ dan TNF α. Pada H6 (hari ke-6 paska infeksi)   mRNA   IL-10,   IFNγ   dan   TNF   α, kembali tidak terekspresi (lihat gambar 1).
© Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
JBP Vol.20, No. 3, Desember 2018 – Sri Wijayanti Sulistyawati
Gambar    1.    Hasil    pemeriksaan    RT- PCR  limpa  mencit  BALB/c  yang  diinfeksi P. yoelii 17XL .
Ket    :H0    ;    kontrol    negatif,    H3:    kelompok    yang dikorbankan pada hari ke-3 paska infeksi 1x10 5 P. yoelii 17XL ,  H6:  kelompok  yang  dikorbankan  pada  hari  ke-6 paska  infeksi  1x10 5 P.  yoelii  17XL ;  RT-:  sampel  yang tidak  diberi  enzim  MMLV;M:  marker  (penanda);RT+: kontrol internal (menggunakan β-actin)
Pemahaman  mekanisme  malaria  berat sangat  tergantung  pada  penelitian  dengan model malaria pada mencit (Zhu et al, 2012).
P. yoelii 17XL merupakan parasit yang dapat  menyebabkan  anemia  berat  (Weissberg et  al,  2012;  Fu  et  al,  2012;  Zhu  dll,2012; Totino  et  al,  2010;  Langhorne,  2005)  dan bersifat letal (Kobayashi et  al, 1996;Couper et al, 2008;Jaular et al, 2011)
Manifestasi yang didapat pada penelitian  ini  sejalan  dengan  hasil  penelitian lain  yang  serupa,  yaitu  adanya  anemia  (Fu  et al,  2012; Totino  et  al,  2010),  hiperparasitemia (Fahey and Spitalny, 1984; Zhu et al, 2012;Fu et  al,  2012;Totino  et  al,  2010;  Sanni  et  al, 2002;  Langhorne,  2002;  Scholzen,  2009).  Hal ini  menjelaskan  bahwa  model  infeksi  malaria P.  yoelii  17XL pada  mencit  BALB/c  ini  dapat digunakan     sebagai     hewan     coba     untuk
mempelajari imunopatogenesis malaria (Waisberg  et  al,  2012;Fu  et  al,  2012;Zhu dll,2012; Jaular et al, 2011; Totino et al, 2010; Couper  et  al,  2008;Langhorne,  2005).  Malaria berat  pada  model  hewan  coba  ini  terjadi  pada hari  ke-4  paska  infeksi  apabila  dilihat  dari tingkat parasitemia, sedangkan apabila
didasarkan   tingkat   anemia,   malaria   berat terjadi pada hari ke-6 paska infeksi.
Penelitian ini  menjelaskan patogenesis malaria berat dan letalitas yang terjadi, dengan manifestasi  utama  pada  anemia  berat  dan hiperparasitemia,  sesuai  dengan  kriteria  WHO tahun 2010.
Ciri khas yang membedakan infeksi P. yoelii strain  letal  dan  nonletal  adalah kemampuan P.  yoelii strain  letal  untuk menginvasi  eritrosit  matur,  produksi  dini sitokin  antiinflamatori,  dan  aktivasi  Treg CD4+CD25+ (Fu et al, 2012).
Hasil  analisis  RT-PCR  menunjukkan ekspresi   mRNA    IL-10,    TNF-α,    dan    IFN-γ yang meningkat pada H3, sedangkan pada H0 dan pada H6 tidak terekspresi. Hal ini berbeda dengan  beberapa  penelitian  sebelumnya  yang menyatakan  peningkatan  kadar  IL-10  yang terus  meningkat  pada  minggu  pertama  selama infeksi    malaria    mencit    (Couper    et    al, 2008;Kobayashi   et   al,   1996;   Shibui   et   al, 2009).  Berbeda  pula  dengan  penelitian  yang dilakukan  oleh  Millington  et  al  (2006),  yaitu dengan  eksperimen  malaria  in  vivo  dan  in vitro,  mendapatkan  hasil  kadar  sitokin  IL-10, IL-12,  dan  IL-2,  IFNγ      yang  sangat  rendah sejak hari pertama infeksi.
Perbedaan  hasil  yang  didapat  pada penelitian  ini  kemungkinan  karena  penelitian ini  menggunakan  RT-PCR  untuk  mengukur kadar  mRNA,  sedangkan  penelitian  Couper  et al,  2008;  Kobayashi  et  al,  1996;  Shibui  et  al, 2009,  dilakukan  dengan  menggunakan  ELISA untuk   mengukur   kadar   protein.   Perbedaan kadar  mRNA  dan  protein,  dapat  disebabkan ekspresi    protein    yang    sangat    rendah, sensitifitas teknik, proses sampel, dan perbedaan   area   transkripsi   dengan   protein yang dihasilkan (Pascal et al, 2008).
Pada penelitian ini diperkirakan terjadi produksi  dini  IL-10  pada  awal  infeksi  dan imunosupresi pada akhir infeksi.
© Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
Interpretasi  pada  fase  awal  (hari  ke-3 paska  infeksi)  sejalan  dengan  Hassan  et  al, yang  menyatakan  bahwa  produksi  IL-10 dengan konsentrasi tinggi pada fase awal yang paralel  dengan  produksi  TNFα  yang  persisten dan  nyata  akan  merubah  keadaan  dari  infeksi ringan  menjadi  bentuk  yang  berat.  Hal  ini didasarkan  pada  fakta  bahwa  produksi  pada fase  awal  dari  IL-10  menghambat  pelepasan IL-12  dan  konsekuensinya  menghambat  pula IFNγ  yang  dibutuhkan  untuk  klirens  parasit malaria.  Selain  itu,  sekresi  persisten  TNFα disertai dengan penurunan produksi  IL-10  dan TGF-β  selama  fase  transisi  dari  respon  imun innate menuju  respon  imun  adaptif  juga  akan menyebabkan  progresifisitas  ke  arah  malaria berat.
endemis dengan malaria tanpa komplikasi atau hiperparasitemia          (Trinchieri,          2001).
Masih terdapat hasil yang kontradiktif mengenai  IL-10  pada  infeksi  malaria  di manusia.
Pada  penelitian  ini,  tidak  didapatkan hasil  yang  persis  sama  dengan  yang  terjadi pada    manusia.    Perjalanan    dan    keparahan penyakit    tergantung    pada    usia,    konstitusi genetik,  imunitas  spesifik  malaria,  status nutrisi,  dan  paparan  terhadap  obat  antimalaria (Crawley  et  al,  2010).  Hal  ini  tidak  terjadi pada  model  hewan  coba  mencit,  yang merupakan keterbatasan hewan coba, sehingga gambaran  perjalanan  klinisnya  tidak  persis dengan pada manusia.
Interpretasi   pada   hari   ke-6   paska infeksi (late  infection) yaitu  tidak  didapatkan ekspresi   IL-10,   TNFα,   dan   IFNγ,   sejalan dengan penelitian Millington et al (2006).
Pada    penelitian    ini    didapatkan ekspresi  IL-10,  TNFα,  dan  IFNγ  pada  awal infeksi namun tidak didapatkan ekspresi IL-10 dan  sitokin-sitokin  lain  pada  akhir  infeksi, sehingga diperkirakan letalitas dan hiperparasitemia    yang    terjadi    disebabkan proses  inflamasi  pada  awal  infeksi  dan imunosupresi pada akhir infeksi.
Letalitas  parasit P.  yoelii  17XL terjadi karena  parasitemia  meningkat  persisten,  tidak terdapat respon Th1 yang efektif yang ditandai dengan  produksi  dini  IFNγ.  Hal  ini  sesuai dengan Zhu et al (2012).
Hiperparasitemia         yang         tinggi menunjukkan   kontrol    parasit   yang   tidak efektif,   yang   seharusnya   diperankan   oleh IFNγ,  IL-12,  dan  IL-18,  hal  ini  sesuai  dengan Wroczynska (2005).
Hasil  penelitian  ini  sejalan  dengan penelitian  pada  anak-anak  di  Ghana  yang terkena malaria falsiparum, kadar IL-10 dalam sirkulasi  yang  rendah  berhubungan  dengan anemia   malaria   yang   berat   (Wilson   et   al, 2005).  Namun,  kadar  IL-10  dan  TNFα  yang tinggi    juga    dilaporkan    pada    kasus    malaria berat   dan   dengan   komplikasi   serta   pada malaria  anak  dengan  parasitemia  yang  tinggi (Othoro  et  al,1999;  Keller  et  al,  2006).  Rasio IL-10  terhadap  TNF  yang  tinggi  dilaporkan pada  pasien  malaria  falsiparum  pada  daerah

## 4.    KESIMPULAN DAN SARAN
Terdapat    ekspresi    mRNA    IL-10, TNFα  dan  IFNγ  pada  model  mencit  BALB/c yang  diinfeksi P.  yoelii  17XL pada  hari  ke-3 paska  infeksi  dibandingkan  kontrol.  Hal  ini disertai  dengan  peningkatan  parasitemia  yang sejalan  dengan  penurunan  kadar  hemoglobin, nyata terlihat setelah hari ke-3 paska infeksi,
Namun pada hari ke-6  paska infeksi P yoelii  17XL pada  mencit  BALB/c  tidak didapatkan  ekspresi  mRNA  IL-10,  TNFα  dan IFNγ.  Tidak  adanya  ekspresi  mRNA  IL-10 pada  hari  ke-6  paska  infeksi  menunjukkan kemungkinan  adanya  kegagalan  regulator respon  imun  dalam  infeksi  malaria  berat. Diperkirakan  letalitas  dan  hiperparasitemia yang  terjadi  disebabkan  proses  inflamasi  pada awal  infeksi  dan  imunosupresi  pada  akhir infeksi.
Penelitian  lanjut  kadar  dan  ekpresi protein    IL-10    sangat  diperlukan    dengan interval waktu pemeriksaan yang lebih sempit, maupun  dengan  menggunakan  metode  lain seperti  ELISA,  Real  Time  PCR,  atau imunohistokimia,  untuk  menjelaskan  aspek molekular   pada   respon   imun   terhadap P. yoelii  17XL .  Juga  diperlukan  pemeriksaan komponen imun lain yang dapat menggambarkan  kondisi  imunosupresi  dan memperjelas  patogenesis  malaria  misalnya GM-CSF,  hitung  eritrosit,  hitung  monosit, hitung retikulosit, dan lain-lain
© Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kami  ucapkan  kepada  Bu  Rita Marletta  dan  Bpk  Ondri  Dwi  Sampurno  dari BALITBANGKES  atas  pemberian  isolat P. yoelii ,  Haruki  Uemura,  PhD  dari  Department of    Protozoology,    Institute    of    Tropical Medicine,  Nagasaki  University,  atas  bantuan sebagian  besar  alat  dan  bahan  penelitian,  dan segenap    staf    LPT    UNAIR    yang    telah membantu  pemeliharaan  hewan  coba  dan seluruh  staf  Kelompok  Studi  Malaria  yang telah membantu memperlancar penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Angulo  I  and  Fresno  M,  2002.  Cytokines  in the  Pathogenesis  of  and  Protection against Malaria.Clin.Diagn.  Lab. Immunol . 9(6):1145-1152.
Couper    KN    et    al,    2008.    IL-10    from CD4+CD252Foxp32CD1272 Adaptive      Regulatory      T      Cells Modulates   Parasite   Clearance   and
Pathology  during  Malaria  Infection.
PLoS Pathog 4(2): e1000004
Crawley  J,  Chu  C,  Nosten  F.  Malaria  in
children Lancet 2010; 375: 1468–81 Depkes RI : Petunjuk Pemeriksaan Laboratorium Puskesmas, 1991 . Jakarta: Departemen Kesehatan RI
Fahey   JR   and   Spitalny,   1984.Virulent   and
Nonvirulent  Forms  of  Plasmodium yoelii  Are  Not  Restricted  to  Growth Within  a  Single  Erythrocyte  Type. Infection   and   Immunity 44(1):151- 156 Freitas do Rosario AP and Langhorne J, 2012. T  cell-derived  IL-10  and  its  impact in  the  regulation  of  host  responses during        malaria. International Journal for Parasitology
Fu    Y,    Ding    Y,    Zhou    T,    et    al,2012.
Comparative      Histopathology      of Mice  Infected  With  the  17XL  and 17XNL     Strains    of Plasmodium yoelii.    Journal    of    Parasitology , 98(2):310-315 Hassan  et  al,2011.Cytokines  and  their  role in  modulating  the  severity  of Plasmodium   falciparum   malaria.
Khartoum  Medical  Journal 3  (1) :373-376
Jaular   LM   et   al,   2011.   Strain-spesific spleen remodelling in Plasmodium yoelii  infections  in  Balb/c  mice facilitates  adherence  and  spleen macrophage-clearance escape.
Cellular  Microbiology 13(1):109- 122
Keller  CC  et  al,  2006.  Acquisition  of Hemozoin  by  Monocytes  Down-
Regulates  Interleukin-12p40  (IL- 12p40) Transcripts and Circulating  IL-12p70  through  an IL-10-Dependent   Mechanism:   In
Vivo  and  In  Vitro  Findings  in Severe Malarial Anemia. Infection and Immunity 74(9):5249–5260
Kita  M,  Tong  L,  Tanaka  K,  Imanishi  J,
1992. Expression de
l’ARNmessager    des    cytokines chez  la  Souris  dans  des  condition physiologiques. Int Immunol 4 (4): 475-485
Kobayashi   F,  Morii  T,  Matsui  T,  et  al, 1996.   Production   of   interleukin 10   during   malaria   caused   by lethal  and  nonlethal  variants  of Plasmodium    yoelii    yoelii Parasitol Res (1996) 82:385-391 Langhorne   J   et   al,2008.   Immunity   to malaria:  more  questions  than answers. Nature immunology 9 (7)
: 725-732
Langhorne   J,   Quin   SJ,   andSanni   LA, 2002.    Mouse    models    of bloodstage malaria infections: immune  responses  and  cytokines involved in protection and pathology.  Dalam  (Perlmann  PT andBlomberg  M,  eds). Malaria Immunology, Chem. Immunol.
Basel :Karger 80:204–228
Long  G  H  et  al,2008.Experimental manipulation  of  immune-mediated disease  and  its  fitness  costs  for rodent  malaria  parasites. BMC Evolutionary Biology 8:128 Millington  OR,  Di  Lorenzo  C,  Phillips R.S,  Garside  P,  and  Brewer  J.M, 2006.   Suppression   of   adaptive
© Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
immunity    to    heterologous antigens during Plasmodium infection through hemozoin-
induced  failure  of  dendritic  cell function. J Biol 5: 5.
Niikura M,  Inoue  S,  Kobayashi F,  2010.
Role  of  Interleukin-10  in  Malaria:
Focusing    on    Coinfection    with
Lethal    and    Nonlethal    Murine Malaria     Parasite. Journal     of Biomedicine and Biotechnology :1-
8
Othoro C et al, 1999.A Low Interleukin- 10 Tumor Necrosis Factor-a Ratio Is     Associated     with     Malaria Anemia  in  Children  Residing  in  a Holoendemic  Malaria  Region  in Western  Kenya. The  Journal  of Infectious Diseases 179:279–82 Pascal LE, True LD, Campbell DS, et al, 2008.  Correlation  of  mRNA  and protein  levels:  Cell  type-specific gene     expression     of      cluster designation antigens in the prostate. BMC Genomics 9:246
Penman  B  and  Gupta  S, 2008. Evolution of virulence in malaria. Journal of Biology 7:22
Riley        EM  et  al,  2006.  Regulating immunity  to  malaria. Parasite
Immunology 28:35–49
Sanni   LA,   Fonseca   LF,   Langhorne   J,
2002. Mouse models of erythrocytic-stage  malaria  Dalam (Doolan     DL,     eds). Malaria Methods  and  Protocols .  Humana Press 72: 57-62
Schofield    L    and    Grau    GE.    2005. Immunological      Processes      in Malaria
Pathogenesis. Immunology. Nature
Publishing Group5 :722-735 Scholzen  A,  Minigo  G,  Plebanski  M,
C57BL/6    mice. Parasitol    Res 105:281–286.
Totino P RR, Magalhaes AD, Silva LA, et  al,.  2010,  Apoptosis  of  non- parasitized  red  blood  cells  in malaria:  a  putative  mechanism involved  in  the  pathogenesis  of anaemia. Malaria Journal 9:350 Trinchieri G, 2001. Regulatory Role of T Cells  Producing  both  Interferon  γ and   Interleukin   10   in   Persistent Infection. J.  Exp.  Med 194(10)  : F53-F57
Waisberg  M,  Vickers  BK,  Yager  SB,  et al,    2012.Testing    in   Mice    the Hypothesis  That Melanin Is Protective  in  Malaria  Infections. PlosOne 7(1): e29493 WHO,  1991. Basic  Malaria  Microscopy Part  I. Learner’s  Guide.  Geneva, Switzerland WHO,    2010, Guidelines    for    the treatment   of   Malaria ,   2nd   ed, Geneva, Switzerland WHO,  2010, World  Malaria  Report , Geneva, Switzerland WHO-SEARO,  2011. Malaria Situation , Geneva, Switzerland Wilson  JN  et  al,  2005.Analysis  of  IL10 haplotypic    associations    with severe      malaria. Genes      and Immunity 6: 462–466
Wroczynska  A,  Nahorski  W,  Bakowska A,  et  al,  2005.  Cytokines  and ClinicalManifestations of Malaria in  Adults  with  Severe  and Uncomplicated  Disease. Internat. Marit. Health 56: 1 – 4 Zainuddin  A,  2000. Metode  Penelitian. Program  Pasca  SarjanaUnair,
Surabaya , hlm 73-74 Zhu  X,  Pan  Y,  Zheng  L,  et  al,  2012, Polysaccharides from  the  Chinese 2009.    Heroes    or    villains?    T medicinal herb Achyranthes regulatory cellsin malaria bidentata  enhance  anti-malarial infection. Tr ends  in  Pa rasitology immunity  during  Plasmodium 26(1): 16-25 Shibui   A   et   al,   2009.   CD4+   T   cell response  in  early  erythrocytic stage    malaria:    Plasmodium berghei  infection  in  BALB/c  and yoelii   17XL   infection   in   mice. Malaria Journal 11:49