J. Kartika Kimia , November 2019, 2, (2), 57-62 Journal homepage : http://jkk.unjani.ac.id/index.php/jkk P-ISSN: 2655-1322     E-ISSN: 2655-0938

## Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Mikroalga Laut Chlorella Vulgaris Dengan Metode Stabilitas Sel Darah Merah Manusia

## Antiinflammatory Activity From Marine Microalgae Chlorella vulgaris Extract Used Human Red Blood Cells Stability Method (HRBC)
Dewi Kurnia 1,* , Nadya Prisdayanti 1 , Lia Marliani 1 , Idar 1 , Zeily Nurochman 2 1 Prodi Sarjana Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Bhakti Kencana, Bandung
2 Kelompok Keahlian Biokimia, Departemen Kimia, FMIPA, Institut Teknologi Bandung, Bandung *E-mail: dewi.kurnia@bku.ac.id
DOI: https://doi.org/10.26874/jkk.v2i2.34
Received : 13 Sept 2019, Revised : 28 Oct 2019, Accepted : 5 Nov 2019, O nline : 30 Nov 2019

## Abstrak
Obat-obatan yang biasa digunakan untuk mengatasi inflamasi adalah golongan steroid dan nonsteroid yang  bila  digunakan  dalam  jangka  panjang  dapat  menimbulkan  efek  samping  yang  merugikan. Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  aktivitas  antiinflamasi  dari  ekstrak  mikroalga Chlorella vulgaris . Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi bertingkat menggunakan n-heksana, kloroform, dan etanol 96%. Hasil pemantauan KLT menunjukan bahwa pada ekstrak Chlorella vulgaris terdapat senyawa  golongan  flavonoid,  fenol,  alkaloid,  dan  saponin  steroid.  Uji  aktivitas  antiinflamasi  ekstrak dilakukan dengan metode stabilitas sel darah merah ( Human Red Blood Cells - HRBC). Dari hasil uji aktivitas antiinflamasi menunjukan nilai IC 50 untuk ekstrak n-heksan; kloroform dan etanol berturut- turut sebesar 150,399; 83,852 dan  92,349 ppm dengan nilai IC 50 standar pembanding natrium diklofenak sebesar  54,149  ppm.  Ekstrak  kloroform  diketahui  memiliki  aktivitas  antiinflamasi  yang  paling  aktif yaitu sebesar 83,852 ppm. Hasil penelitian ini menunjukan bahwa ekstrak kloroform pada mikroalga Chlorella  vulgaris berpotensi  sebagai  agen  antiinflamasi  yang  dapat  dikembangkan  sebagai  obat antiinflamasi alternatif  dari bahan alam bahari.
Kata kunci: antiinflamasi, Chlorella vulgaris, Human Red Blood Cells (HRBC)

## Abstract
Medications commonly used to treat inflammation are steroids and non-steroids which, if used over a long  period,  can  cause  adverse  side  effects.  This  research  was  conducted  to  determine  the  anti- inflammatory  activity  of  the  Chlorella  vulgaris  microalgae  extract.  Extraction  was  carried  out  by multilevel maceration method using n-hexane, chloroform, and ethanol. TLC monitoring results showed that  the  Chlorella  vulgaris  extract  contained  flavonoid,  phenol,  alkaloid,  and  steroid  saponin compounds. The anti-inflammatory activity test of the extract was carried out used Human Red Blood Cell (HRBC) stability method with Na-diclophenac as a comparison standard. The results showed the inhibition  value  of  red  blood  cell  hemolysis  (IC 50 )  in  n-hexane,  chloroform  and  ethanol  extracts respectively  150.399;  83.852  and  92.349%  with  the  inhibition  value  of  Na-diclophenac  standard  of 55.149%.  Chloroform  extract  is  known  to  have  the  most  active  anti-inflammatory  activity  which  is 83.852  ppm.  The  results  of  this  study  indicate  that  the  chloroform  extract  in  Chlorella  vulgaris microalgae has the potential as an anti-inflammatory agent that can be developed as an alternative anti- inflammatory drug from natural marine materials.
Keywords: anti-inflammatory, Chlorella vurlgaris, Human Red Blood Cells (HRBC)
1 Pendahuluan
Inflamasi  merupakan  respon  kompleks biologi  dari  jaringan  pembuluh  darah  terhadap stimulus berbahaya seperti patogen, sel-sel tubuh yang rusak, atau iritan. Proses inflamasi memiliki tanda-tanda antara lain adalah rubor (kemerahan), kalor  (panas),  tumor  (pembengkakan),  dolor (nyeri), dan function laesa (perubahan fungsi) [1]. Hal  ini  merupakan  respon  protektif  yang dilakukan oleh tubuh terhadap kerusakan jaringan yang disebabkan oleh berbagai stimulus [2]. Saat ini,  sebagian  besar  penyakit  inflamasi  diobati dengan obat anti-inflamasi steroid dan nonsteroid yang menekan kadar sitokin pro-inflamasi, sintase nitrit  oksida  yang  dapat  diinduksi  (iNOS), siklooksigenase-2,  dan  prostaglandin  E2  (PGE2) [3].  Namun,  penggunaan  jangka  panjang  dari obat-obatan konvensional ini dapat menghasilkan efek samping yang merugikan [4].
Agen  antiinflamasi  baru  dari  sumber  alami dengan  efek  samping  yang  lebih  sedikit  adalah alternatif  yang  dapat  dikembangkan  untuk pemberian  jangka  panjang.  Salah  satu  agen alternatif  yang  sedang  diteliti  adalah  mikroalga. Mikroalga membentuk bagian dari sumber alami yang dapat menjadi sumber senyawa bioaktif, dan aktivitas anti-inflamasi mikroalga telah dilaporkan secara  luas  [5].  Beberapa  mikroalga  bahkan digunakan  sebagai  sumber  obat  obatan,dan dimanfaatkan  dalam  industri  farmasi.  Salah  satu mikroalga  yang  memiliki  potensi  sebagai  agen antiinflamasi adalah Chlorella vulgaris . Penelitian tentang aktivitas mikroalga Chlorella vulgaris telah banyak dilakukan, antara lain  pengujian  aktivitas  antibakteri,  antioksidan, antidiabetes dan antiinflamasi. Chlorella vulgaris diduga mampu menyembuhkan luka berdasarkan kemampuannya sebagai imunostimulan, memiliki aktivitas antiinflamasi, serta mendukung pembentukan  fibrin.  Chlorella  mengandung vitamin A (β-caroten), vitamin C, dan vitamin E [6] yang memiliki kemampuan sebagai imunostimulan [7].
Uji  aktivitas  antiinflamasi  dapat  dilakukan secara in  vitro atau in  vivo .  Penentuan  secara  in vivo  yang  sering  digunakan  adalah  induksi karagenan,  induksi  histamin,  dan  induksi  asam asetat. Penentuan secara in vitro didasarkan pada mekanisme  biokimia  spesifik  dan  digunakan untuk  skrining  awal  senyawa  antiinflamasi, misalnya  penghambatan  siklooksigenase  dan lipooksigenase, penghambatan makrofag, penghambatan protease dan uji stabilitas sel darah merah (HRBC) [8].
Sel  darah  merah  (eritrosit)  manusia  telah banyak  digunakan  sebagai  model  studi  interaksi obat dengan membran. Seperti obat yang memiliki efek  anestesi  dan  obat  anti  inflamasi  non  steroid (OAINS)  dapat  mencegah  lepasnya  hemoglobin (Hb) dari sel darah merah (eritrosit) ketika terjadi kondisi  hipotonik.  Teori  ini  digunakan  sebagai metode  yang  sangat  berguna  untuk  menilai aktivitas  antiinflamasi  dari  bermacam-macam senyawa  secara in  vitro [9].  Pada  penelitian  ini akan  dilakukan  uji  aktivitas  antiinflamasi  dari ekstrak mikroalga laut Chlorella vulgaris secara in vitro dengan  metode  stabilisasi  membran  HRBC ( Human Red Blood Cell).

## 2 Metode Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  dalam  beberapa tahapan.  Tahap  pertama  yaitu  aktivasi  dan kultivasi  mikroalga Chlorella  vulgaris .  dalam medium  Walne.  Tahap  kedua,  pemanenan mikroalga menggunakan alat sentrifuga Beckmann J2-HS dengan rotor besar (JA 10) pada kecepatan  5.000×g  selama  20  menit.  Supernatan kemudian dipisahkan dan pellet (biomassa basah) dikumpulkan. Tahap ketiga yaitu sampel mikroalga dilakukan pengeringan dengan metode Freeze  Dry .  Tahap  keempat  yaitu  karakterisasi simplisia  meliputi  penentuan  kadar  abu  total, kadar abu tidak larut asam, kadar sari larut etanol, kadar sari larut air, dan susut pengeringan. Tahap selanjutnya  adalah  pemecahan  sel  dan  ekstraksi dengan  cara  maserasi  bertingkat.  Sebanyak  10  g biomassa kering di maserasi dengan penambahan 50 mL n-heksan lalu disonikasi selama 10 menit dan diaduk dengan orbital shaker selama 24 jam, kemudian  dipisahkan  endapan  lalu  diuapkan  dan diambil  ekstrak  kental,  selanjutnya  tambahkan kloroform,  etanol  96%  kemudian  diuapkan  dan diambil  ekstrak  kental.  Tahap  kelima  yaitu pemantauan ekstrak dengan menggunakan metode kromatografi  lapis  tipis,  dilakukan  pemantauan pada ketiga ekstrak setelah itu disemprot dengan penampak bercak H 2 SO 4 , AlCl 3 , sitroborat, FeCl 3 , Liebermann Burchard, dan Dragendorf.
Tahap  selanjutnya  adalah  uji  stabilitas membran  dengan  menggunakan  sampel  darah yang  telah  disentrifugasi  dan  dicuci  dan  natrium diklofenak  sebagai  kontrol.  Darah  diambil  dari sukarelawan  yang  tidak  menggunakan  obat NSAID selama 2 minggu. Darah sebanyak 10 mL dimasukkan  ke  dalam  tabung  yang  telah  berisi larutan  alsever  sebanyak  10  mL.  Campuran  uji
terdiri dari 2 mL hiposalin; 1,0 mL 0,15 M dapar natrium  posfat  (pH  7,4);  0,5  mL  (10%  v/v) suspensi sel  darah  merah  dan  1,0  mL  sampel  uji dan larutan standar. Campuran uji diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit, dan kemudian larutan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 30 menit.  Absorbansi  larutan  diukur  pada  panjang gelombang 560 nm. Persentase inhibisi hemolisis dihitung dengan menggunakan rumus [10]:

## %𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 𝐻𝑒𝑚𝑜𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 = 𝐴 1 − 𝐴 2
𝐴 1 𝑥100%
Dimana: A 1 = serapan larutan kontrol A 2 = serapan larutan uji/larutan standar uji

## 3 Hasil dan Diskusi

## 3.1 Kultivasi Mikroalga Chlorella vulgaris
Mikroalga yang digunakan adalah mikroalga laut  Chlorella  vulgaris  yang  diperoleh  dari Laboratorium  Biokimia  ITB.  Kultur  diperoleh dalam keadaan axenic yaitu hanya memiliki satu jenis mikroalga dalam medium cair, tidat terdapat kontaminan  mikroorganisme  lainnya.  Bentuk  sel dari mikroalga Chlorella vulgaris adalah bulat dan berwarna hijau (Gambar 1).
Gambar 1. Mikroalga Chlorella vulgaris di bawah mikroskop dengan perbesaran 40x
Pengumpulan biomassa mikroalga dilakukan dengan  cara  kultivasi  menggunakan  bioreaktor sederhana.    Kondisi  lingkungan  kultivasi  antara lain  menggunakan  suhu  ruang  (±25-27  °C), fotoperiode 12:12 (gelap:terang) dengan intensitas cahaya  10.000  lux  dan  aerasi  selama  24  jam. Kultivasi mikroalga dilakukan dengan menggunakan  medium  Walne  dan  kepadatan  sel dimulai dari 1 x 10 6 sel/mL. Pemanenan dilakukan pada  hari  ke-8,  saat  pemanenan  dilakukan perhitungan  sel  rata-rata.  Untuk  mengetahui kepadatan  biomassa  yang  diperoleh,  kemudian pemanenan mikroalga Chlorella vulgaris dilakukan  dengan  menggunakan  alat  sentrifuga
Beckmann J2-HS dengan rotor besar (JA 10) pada kecepatan  8.000×g  selama  20  menit  sehingga diperoleh biomassa basah (Gambar 2). Selanjutnya  biomassa  basah  dikeringkan  cara beku-kering  agar  kandungan  air  pada  biomassa tidak  mengganggu  proses  ekstraksi  serta  sampel biomassa  mikroalga  bertahan  lama  dan  tidak ditumbuhi oleh jamur.
Gambar 2.  Biomassa Basah Hasil Sentrifuga Mikroalga Chlorella vulgaris

## 3.2 Proses Elektrodeposisi
Ekstraksi  menggunakan  metode  maserasi bertingkat  dengan  menggunakan  pelarut  n- heksana,  kloroform,  dan  etanol.  biomassa  kering yang  digunakan  10  gram  dengan  masing-masing pelarut  50  mL,  dilakukan  tiga  kali  pengulangan, dilakukan selama 24 jam. Hasil rendemen ekstrak dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel  1. Hasil  Rendemen  Ekstrak  Mikroalga
Chlorella vulgaris Pelarut Rendemen (%) n-heksana 10,8 Kloroform 42,2 Etanol 22,2
Pemantauan  ekstrak  n-heksana,  kloroform, dan  etanol  dilakukan  dengan  menggunakan  fase diam KLT Silika Gel F254 dengan menggunakan pengembang  n-heksana  –  etil  asetat  (7  :  3),  n- heksana – kloroform – etanol ( 5 : 4 :1), etil asetat –  etanol    -  aquadest  (  9  :  0,5  :0,5  ).  Penampak bercak  yang  digunakan  H 2 SO 4 10%,  FeCl 3 10%, AlCl 3 ,  sitroborat,  Dragendorf,  dan  Liebermann Burchard.  Hasil  dari  pemantauan  ekstrak  dapat dilihat pada Gambar 3.
Penampak  bercak  yang  dipakai  diantaranya H 2 SO 4 10%  sebagai  penampak  bercak  universal dimana  bisa  melihat  seluruh  komponen  senyawa dalam ekstrak. Lalu digunakan penampak bercak FeCl 3 10%  untuk  melihat  adanya  golongan senyawa  fenol  ditunjukkan  dengan  hasil  positif yaitu bercak berwarna biru kehitaman dengan latar kuning.  Kemudian  digunakan  penampak  bercak
AlCl 3 untuk  mendeteksi  flavonoid  dengan  hasil positif yaitu bercak warna biru.
Selanjutnya  digunakan  penampak  bercak sitroborat  untuk  melihat  adanya  golongan senyawa  flavonoid  ditunjukkan  dengan  hasil positif  yaitu  adanya  bercak  berwarna  kuning kehijauan  saat  dilihat  dibawah  sinar  lampu  UV 365 nm. Penampak bercak Liebermann Burchard
digunakan  untuk  menunjukkan  adanya  saponin steroid yang ditunjukkan dengan bercak berfluorosensi  hijau  dan  biru  dan  saponin triterpenoid  yang  ditujukkan  dengan  bercak berwarna  orange  kemerahan.  Penampak  bercak Dragendorf  digunakan  untuk  mendeteksi  adanya senyawa  alkaloid  ditandai  dengan  bercak berwarna coklat kehitaman.
Keterangan:     : positif bercak flavonoid
: positif fenol
: positif saponin steroid
: positif alkaloid
Gambar 3. Hasil pemantauan ekstrak mikroalga Chlorella vulgaris dengan KLT kromatogram lapis tipis ekstrak n-heksana, kloroform dan etanol dari mikroalga Chlorella vulgaris, fase diam silica gel F254 dan pengembang (A )  n-heksana – etil asetat (7 : 3), (B) n-heksana – kloroform – etanol ( 5 : 4 :1), (C) etil asetat – etanol  - aquadest ( 9 : 0,5 :0,5 ). (1) ekstrak n-heksana, (2) ekstrak kloroform, (3) ekstrak etanol, (a) Sinar UV λ 254 nm, (b) Sinar UV λ 366 nm, (c) penampak bercak sitroborat dibawah sinar UV 366 nm, (d) penampak bercak H 2 SO 4 10%, (e) penampak bercak FeCl 3 , (f) penampak bercak AlCl 3 , (g) penampak bercak Dragendorf, (h) penampak bercak Liebermann burchard.
Dari hasil ketiga pengujian dengan fase gerak non  polar,  semi  polar  dan  polar  yang  disemprot dengan beberapa macam penampak bercak dapat disimpulkan  bahwa  pada  ekstrak  non  polar diperkirakan  terdapat  senyawa    flavonoid,  fenol dan  saponin  steroid,  pada  ekstrak  semi  polar
diperkirakan  terdapat  senyawa  flavonoid  dan ekstrak  polar  terdapat  senyawa  flavonoid,  fenol, dan alkaloid.

## 3.3 Uji Aktivitas Anti-inflamasi
Stabilisasi  membran  sel  darah  merah  telah digunakan  sebagai  metode  untuk  mengetahui aktivitas  antiinflamasi  secara  in  vitro.  Pada pengujian  antiinflamasi  dari  ekstrak  mikroalga Chlorella  vulgaris  terlebih  dahulu  dibuat  larutan induk  dengan  konsentrasi  1000  ppm  yang dilarutkan  dengan  larutan  isosalin.  Kemudian dibuat larutan seri konsentrasi yaitu 20; 40; 60; 80; 100 dan 120 ppm. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan  spektrofotometri  dengan  panjang gelombang  560  nm.  Sampel  uji  yang  memiliki aktivitas  antiinflamasi  dilihat  dari  penurunan absorbansinya.  Semakin  besar  konsentrasi  yang digunakan  maka  semakin  kecil  absorbansinya, sehingga kestabilan pada membran semakin besar. Semakin  kecil  serapan  yang  terdeteksi  pada campuran  larutan  uji,  maka  membran  sel  darah merah semakin stabil dan sedikit mengalami lisis [11].  Setelah  pengukuran  dan  diperoleh  data absorbansi kemudian dihitung persen inhibisinya. Persen  inhibisi  adalah  kemampuan  suatu  sampel untuk menstabilisasi sel darah merah yang didapat dari  perbandingan  antara  absorbansi  kontrol  uji dengan  larutan  uji.  Hasil  pengujian  aktivitas antiinflamasi dapat dilihat pada Tabel 2.
Untuk  memperoleh  nilai  IC 50 dibuat  terlebih dahulu  kurva  persamaan  garis  regresi  linier (Gambar 4). Berdasarkan persamaan garis regresi linier  tersebut  didapat  nilai  IC 50 dari  Na diklofenak, ekstrak n-heksana, ekstrak kloroform, dan  ekstrak  etanol  berturut-turut  sebesar  54,149 ppm; 150,399 ppm; 83,852 ppm; dan 92,349 ppm.
Gambar 4. Kurva persen inhibisi hemolisis ekstrak Chlorella vulgaris
Tabel 2. Data aktivitas antiinflamasi ekstrak mikroalga
Chlorella vulgaris Ekstrak Konsentrasi (ppm) Inhibisi Hemolisis (%) IC 50 (ppm) n-heksana 20 40 60 9,390 21,429 28,411 150,399
80 100 120 31,902 34,952 39,567 Kloroform 20 40 60 80 100 120 5,337 18,900 34,751 51,164 63,804 69,823 83,852 Etanol 20 40 60 80 100 120 ppm 12,681 18,018 29,494 45,626 56,421 63,724 92,349 Na Diklofenak 20 ppm 30 ppm 40 ppm 50 ppm 60 ppm 70 ppm 80 ppm 90 ppm 100 ppm 26,685 35,273 44,342 50,401 55,297 60,353 66,774 68,941 71,268 54,149
Semakin  kecil  nilai  IC 50 berarti  aktivitas antiinflamasinya  semakin  besar.  Berdasarkan hasil  yang  didapat  nilai  IC 50 dari  Na  diklofenak, ekstrak  kloroform,  dan  ekstrak  etanol  tergolong aktif  karena  aktivitas  antiinflamasi  digolongkan sangat  aktif  bila  nilai  IC 50 kurang  dari  50  ppm, digolongkan  aktif  bila  nilai  IC 50 50  –  100  ppm, digolongkan sedang bila nilai IC 50 101–250 ppm, dan  digolongkan  lemah  bila  nilai  IC 50 250-500 ppm, serta digolongkan tidak aktif bila nilai IC 50 lebih besar dari 500 ppm.

## 4 Kesimpulan
Ekstrak n-heksan, kloroform, dan etanol dari mikroalga Chlorella  vulgaris memiliki  aktivitas antiinflamasi.  Nilai  IC 50 dari  standar  Na- diklofenak, ekstrak n-heksana, dan ekstrak etanol berturut-turut  sebesar  54,149;  150,399;  83,852 dan 92,349 ppm. Ekstrak kloroform memiliki nilai IC50  yang  paling  mendekati  nilai  standar  Na- diklofenak.  Sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa ekstrak  yang  memiliki  aktivitas  antiinflamasi tertinggi  dari  ketiga  pelarut  yang  digunakan adalah  ekstrak  kloroform  dengan  persentase inhibisi sebesar 69,283 ppm pada konsentrasi 120 ppm.
y = 0,5569x + 19,844 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 50 100 150 IC 50 (pp m ) Konsentrasi (ppm) Na diklofenak n-heksan

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan terimakasih penulis ucapkan kepada Kementerian  Riset,  Teknologi  dan  Pendidikan Tinggi  Republik  Indonesia  (Kemenristekdikti) atas  pendanaan  penelitian  ini  melalui  Hibah Penelitian Dosen Pemula (Nomor : 0009/P3M/E.PE/III/2019).

## Daftar Pustaka
[1] Akmalia,  Rina  Adilla,  dkk.  2016.  Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Rimpang Temu Kunci (Boesenbergia  pandurata)  secara  in  vitro. Samarinda.
[2] Mantovani,  A.,  Allavena,  P.,  Sica,  A.,  & Balkwill, F. (2008). Cancer-related inflammation, Nature , 454(7203), 436.
[3] Pohanka, M., Snopkova, S., Havlickova, K., Bostik,  P.,  Sinkorova,  Z.,  Fusek,  J.,  ...  & Pikula,  J.  (2011).  Macrophage-assisted inflammation and
pharmacological regulation of the cholinergic anti- inflammatory  pathway, Current  medicinal chemistry , 18(4), 539-551.
[4] McGettigan, P., & Henry, D. (2013). Use of non-steroidal  anti-inflammatory  drugs  that elevate  cardiovascular  risk:  an  examination of sales and essential medicines lists in low-, middle-,  and  high-income  countries. PLoS medicine , 10(2), e1001388.
[5] Jung, H. A., Jin, S. E., Ahn, B. R., Lee, C. M., &  Choi,  J.  S.  (2013).  Anti-inflammatory activity of edible brown alga Eisenia bicyclis
and its constituents fucosterol and phlorotannins in LPS-stimulated RAW264. 7 macrophages. Food and chemical toxicology , 59, 199-206.
[6] Bengwayan, P. T., Laygo, J. C., Pacio, A. E., Poyaoan, J.  L.  Z.,  Rebugio, J.  F.,  &  Yuson, A. L. L. (2010). A comparative study on the antioxidant  property  of  Chlorella  (Chlorella sp.)  tablet  and  glutathione  tablet. E- International  Scientific  Research  Journal , 2(1), 25-35.
[7] Sakai, M. (1999). Current research status of fish immunostimulants. Aquaculture , 172(1- 2), 63-92.
[8] Shen,  T.  Y.  (1981).  Toward  more  selective antiarthritic  therapy. Journal  of  medicinal chemistry , 24(1), 1-5.
[9] Kumar  V,  Zulfiqar  A.  B,  Dinesh  K,  N.A Khan,  I.A  Chashoo.  2011.  Evaluation  of Anti-Inflamatory Potensial of Leaf Extracs of Skimmia anquetilia. Asian Pasific Journal of Tropical Biomidicine . 627-630
[10] Shenoy,  S.K.S.,  Prabhu,  K.,  Maradi,  R., Bairy,  K.L  and  Shanbhag,  T.,  (2010). Evaluation of Antii-Inflammatory of Activity purpureae  in  Rats, Asian  Pasific  Journal  of Tropical Medicine : 193-195.
[11] Lutfiana. 2013. Uji Aktivitas Anti Inflamasi Ekstrak Daun Kelor (Moringa oleifera Lam) dengan  Metode  Stabilisasi  Membran  Sel Darah  Merah  secara  In  vitro.  Jakarta  :  UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.