## EXTRACTION AND IDENTIFICATION OF SULFATED POLYSACCHARIDE
FROM Gracilaria sp.
Ekstraksi dan Identifikasi Polisakarida Bersulfat Dari Sayur Karang G racilaria sp
Dominggus Malle 1* , Eirene Grace Fransina 2 , Feky Jansen 2
1 Faculty of Agriculture Pattimura University, Kampus Poka, Jl. Ir. M. Putuhena, Ambon 97134
2 Chemistry Department, Faculty of Mathematics and Natural Sciences Pattimura University, Kampus Poka, Jl. Ir. M. Putuhena, Ambon 97134
*Corresponding author, e-mail: d.malle@faperta.unpatti.ac.id
Received:  October 2013 Published: January 2014

## ABSTRACT
Polysaccharide from Gracilaria sp (locally known as “Sayur Karang”) was extracted using hot alkaline solutions (NaOH  and  KOH).  Fractionation  using  DEAE-Sepharose  Fast  Flow  column  showed  that  the  polysaccharide discharged  after  being  eluted  with  0.5  –  1.0  M  NaCl.  Spectroscopic  analysis  using  FTIR  showed  that  the polysaccharide contained hydroxyl  (3420 cm -1 (NaOH frcation) dan 3446 cm -1 (KOH frcation)), carbonyl (1642 cm -1 (NaOH  frcation) and 1644 cm -1 (KOH frcation)) and  sulphate (1271 cm -1 (NaOH  frcation) and 1262 cm -1 (KOH frcation)) groups proving that the polysaccharide is a sulphated polysaccharide. A further study is needed to  elucidate  the  structure  of  the  sulphated  polysaccharide  as  well  as  physiochemical  properties  of  the polysaccharide.
Keywords : Extraction, Sulphated polysaccharide, Gracilaria, FTIR

## PENDAHULUAN
Indonesia  sebagai  negara  kepulauan  dengan panjang  garis  pantai  81.000  km  merupakan kawasan  pesisir  dan  lautan  yang  memiliki berbagai  sumberdaya  hayati  yang  sangat  besar dan  beragam.  Berbagai  sumberdaya  hayati tersebut  merupakan  potensi  pembangunan  yang sangat penting sebagai sumber-sumber pertumbuhan ekonomi baru (Dahuri, 2000).
Rumput  laut  sebagai  salah  satu  komoditas ekspor  merupakan  sumber  devisa  bagi  negara dan budidayanya merupakan sumber pendapatan nelayan,  dapat  menyerap  tenaga  kerja,  serta mampu  memanfaatkan  lahan  perairan  pantai  di kepulauan  Indonesia  yang  sangat  potensial. Sebagai  negara  kepulauan,  maka  pengembangan rumput  laut  di  Indonesia  dapat  dilakukan  secara luas oleh para petani/nelayan.
Perkembangan  penelitian  rumput  laut  di Indonesia  telah  dimulai  sejak Ekspedisi  Siboga yang  dilakukan  antara  tahun  1899  -  1900. Penelitian  selanjutnya van  Bosse tahun  1913  - 1928 telah berhasil mengoleksi jenis rumput laut yang tumbuh di perairan Indonesia sebanyak 555
jenis.  Pada  penelitian van  Bosse tahun  1914  - 1916  di  Kepulauan  Kai  pada Ekspedisi  Danish menemukan  sebanyak  25  jenis  alga  merah,  28 jenis  alga  hijau,  dan  11  jenis  alga  coklat. Penelitian identifikasi jenis rumput laut berlanjut pada  penelitian Snellius-II tahun  1985  yang menemukan  41  jenis  alga  merah,  59  jenis  alga hijau,  dan  9  jenis  alga  coklat,  sedangkan  pada penelitian Buginesia-III pada tahun 1988 – 1990 ditemukan  sebanyak  118  jenis  alga  merah,  80 jenis  alga  hijau,  dan  36  jenis  alga  coklat (Basmal, 2001).
Di  bidang  industri,  ternyata  pengolahan rumput  laut  sudah  cukup  lama  dikenal  di Indonesia,  meskipun  dengan  teknologi  proses dan  peralatan  yang  sedehana.  Rumput  laut  telah diolah  menjadi  beragam  jenis  makanan,  di antaranya  kue,  puding,  dodol,  dan  agar. Hidroklorid  yang  terkandung  di  dalam  rumput laut merupakan alasan utama untuk menjadikannya  sebagai  bahan  baku  industri kosmetik, farmasi, cat, tekstil, pakan ternak,  dan industri lainnya (Anggadiredja dkk, 2008).
Sebagian  besar  rumput  laut  di  Indonesia diekspor  dalam  bentuk  kering.  Bila  ditinjau  dari segi  ekonomi,  harga  hasil  olahan  rumput  laut seperti  polisakarida  bersulfat  lebih  tinggi  dari pada  rumput  laut  kering.  Oleh  karena  itu,  untuk meningkatkan  nilai  tambah  dari  rumput  laut  dan mengurangi  impor  akan  hasil-hasil  olahannya, maka  pengolahan  rumput  laut  menjadi  produk polisakarida  bersulfat  di  dalam  negeri  perlu dikembangkan  (Istini & Suhaimi, 1998).
Polimer  karbohidrat  bersulfat  alam  dari berbagai sumber dapat memiliki banyak aktivitas fisiologis.  Dalam  beberapa  tahun  terakhir,  tes skrining aktivitas antivirus dari  ekstrak sejumlah ganggang  laut  telah  mengarah  pada  identifikasi sejumlah  polimer  karbohidrat  yang    memiliki efek penghambatan terhadap potensi virus herpes simpleks  (HSV)  tipe  1  dan  2,  sitomegalovirus manusia,  virus  defisiensi  kekebalan  tubuh manusia  tipe  1,  virus  pernapasan,  dan  virus influenza.  Polisakarida  ini  termasuk  fukoidan, galaktosa  bersulfat,  ulvans,  dan  mannans. Dengan  demikian,  potensi  antivirus  ekstrak polisakarida  bersulfat  dari  alga  menjadi  sangat menarik,  walaupun  ada  kekurangan  informasi tentang  struktur  kimia  dan  aktivitas  fisiologis (Mazumber dkk, 2002; Manoj dkk,2013).
Alga merah memiliki potensi beragam mulai dari produksi pangan sampai pada pemanfaatannya  dalam  bidang  medis.  Al-Fath (2011)  telah  melakukan  penelitian  terhadap  alga merah  jenis Eucheuma  alvarezii  Doty .  Hasil penelitian menunjukkan bahwa Eucheuma alvarezii Doty mengandung polisakarida bersulfat  kasar  (rendemen  58,90%),  polisakarida bersulfat murni (rendemen 54,36%), polisakarida bersulfat fraksi larut dalam KCl 2,5% (rendemen 60,34%),  dan  polisakarida  bersulfat  tidak  larut dalam KCl 2,5% (rendemen 34,53%).
Alga merah jenis Gracilaria sp yang dikenal dengan  nama  sayur  karang  juga  mengandung polisakarida  sulfat.  Tetapi  penelitian  tentang kandungan  polisakarida  sulfat  dalam  sayur karang ini belum pernah dilakukan. Sayur karang adalah  salah  satu  spesies  alga  merah  yang ditemukan  di  Ambon  dan  sekitarnya.  Sesuai dengan namanya, sayur karang biasanya dimanfaatkan  sebagai  sayuran  oleh  masyarakat setempat.  Pemanfaatan  sayur  karang  masih terbatas,  dibandingkan  potensinya  di  bidang farmasi  dan  industri  lainnya.  Oleh  karena  itu analisis  kandungan  karbohidrat  bersulfat  pada “sayur  karang”  sangat  penting  dilakukan  untuk
mendapatkan  informasi  ilmiah  tentang  manfaat fungsional yang dimiliki oleh “sayur karang” dan potensi  pegembangannya  sebagai  salah  satu sumber pangan fungsional.

## METODOLOGI

## Prosedur Penelitian

## 1. Ekstraksi karbohidrat bersulfat dengan larutan alkali
Ekstraksi  polisakarida  bersulfat  mengikuti prosedur  Okajima-Kaneko  dkk,  (2007)  dengan sedikit  modifikasi.  Sampel  kering  sebanyak  5  g dicuci  dengan  air  hingga  bersih,  dikeringkan, dipotong kecil-kecil dan kemudian dicuci dengan etanol  sebanyak  3  kali.  Setelah  itu  direndam masing-masing  dalam  larutan  NaOH  4%,  6%, dan 8% sebanyak 100 mL. Campuran selanjutnya dipanaskan pada suhu 75  C selama 3 jam  dan  kemudian  dinginkan  dan  selanjutnya didialisis  semalam.  Hasil  dialisis  disaring  lalu disentrifus  pada  3100  rpm  selama  15  menit. Hasil filtratnya diambil kemudian dirotavap pada 105  rpm  dengan  suhu  air  60  C.  Hasilnya dimasukkan  ke  dalam  etanol  dingin  (hasil rotavap  25  mL  dituangkan  perlahan-lahan  ke dalam  wadah  berisikan  100  mL  etanol  dingin). Akan  muncul  seperti  benang-benang  dalam larutan  etanol.  Larutan  disaring  dan  diambil endapan/benang-benang  tersebut  dan  kemudian larutkan  dalam  air.  Perlakuan  diatas  dilakukan pada  sampel  lain  dengan  menggunakan  larutan KOH.

## 2.  Pemurnian  dengan  kromatografi  penukar anion
Hasil extraksi ini kemudian dilarutkan dalam air  dan  dimasukkan  ke  dalam  kolom  pertukaran ion  (DEAE-Sepharose)  yang  telah  diekuilibrasi dengan  air.  Elusi  dilakukan  dengan  air  dan larutan  NaCl  0,1  M  ,  0,2  M,  0,3  M,  0,4  M,  0,5 M,  1,0  M,  1,5  M,  dan  2,0  M  (Mohsen  dkk, 2007).  Setiap  fraksi  yang  dikumpulkan  diuji dengan  metode  α-naftol-H 2 SO 4 .  Selanjutnya fraksi  yang  positif  akan  dilakukan  uji  dengan metode FTIR untuk menentukan gugus fungsi.

## 3. Analisis FTIR
Fraksi  DEAE-Sepharose  dari  ekstraksi dengan larutan NaOH dan KOH yang memberikan  hasil  positif  terbaik  dengan  uji  α- naftol-H 2 SO 4 (dari  elusi  dengan  konsentrasi eluen yang sama) dianalisis dengan
menggunakan  metode Spread  on  NaCl  Window pada  bilangan  gelombang  4000  –  600  cm -1 dan mengacu  pada  standar  uji  ASTM E 1252 ( Standard  Practice  for  General  Techniques  for Obtaining Infrared Spectra of Organic
Compound for Qualitative Analysis ).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## 1. Ekstraksi Polisakarida Bersulfat.
Sampel  rumput  laut Gracilaria sp.  yang secara  lokal  dikenal  dengan  nama  “Sayur Karang”  diperoleh  dari  perairan  Hukurila, Kecamatan  Leitimur  Selatan,  Kota  Ambon (Gambar  1).  Sample  basah  dijemur  hingga kering.  Selanjutnya  sampel  dibersihkan  dengan air  tawar  untuk  menghilangkan  garam  dan kotoran  yang  melekat.  Perlakukan  selanjutnya adalah perendaman sampel dengan larutan etanol 96% sebanyak 3 kali. Hal ini dimaksudkan untuk melarutkan komponen lemak dan menghilangkan pigment dalam sampel sehingga tidak mengganggu proses pemurnian.
Ekstraksi polisakarida dari sampel dilakukan secara  alkalis  dengan  menggunakan  natrium hidroksida  (NaOH)  dan  kalium  hidroksida (KOH)  dengan  variasi  konsentrasi  masing- masing 4%, 6% dan 8% pada suhu 75 o C selama 3  jam.  Ekstransi  polisakarida  secara  alkalis merupakan  salah  satu  metode  yang  umum (Okajima-Kaneko et al ., 2007). Untuk memisahkan molekul-molekul kecil dan menetralkan  pH  sampel  maka  sampel  hasil ekstraksi didialisis terhadap air dengan membran selulosa  dengan Molecular  Weight  Cut-off (MWCO)  sebesar  14.000  Dalton.  Hasil  dialisis
disentrifus  kemudian  dikonsentrasikan  dengan dirotavap  pada  suhu  40  C.  Hasil  rotavap merupakan sampel yang terkonsentrasi dilarutkan  dalam  etanol  dingin  dan  terbentuk benang-benang  putih  yang  adalah  polisakarida. Cara pengengapan dalam etanol dingin merupakan  metode  yang  lazim  dalam  proses isolasi  karbohidrat  bersulfat  (Boulhal et  al. , 2011; Silva et al ., 2011). 2.   Pemurnian Polisakarida dengan Kromatografi Penukar Ion
Sampel hasil dialisis selanjutnya difraksinasi dengan  kolom  pertukaran  ion  DEAE-Sepharose Fast Flow. Sampel difraksinasi dengan menggunakan  konsentrasi  NaCl  0,1  M;  0,2  M; 0,3  M;  0,4  M;  0,5  M;  1,0  M;  1,5  M  dan  2,0  M. Analisis  kualitatif  dengan  uji  fenol-H 2 SO 4 (Uji Molisch)  dari  hasil  fraksinasi  menunjukkan adanya  cincin  warna  ungu  antar  fasa  (gambar  3 dan  4).  Terbentuknya  cincin  furfural  ungu mengindikasikan adanya karbohidrat
(polisakarida) dalam sampel. Pemurnian polisakarida bersulfat umumnya dilakukan dengan  kolom  kromatografi  penukar  ion  seperti DEAE-cellulose  (Viana et  al. ,  2002).  Matriks penukar  ion  ini  memiliki  muatan  positif  yang akan mengikat gugus sulfat (muatan negatif) dari polisakarida bersulfat. Elusi senyawa
polisakarida  bersulfat  dari  maktriks  penukar  ion dilakukan  dengan  menggunakan  ion  konter ( counter  ion )  seperti  Cl - yang  ditambahkan  ke dalam larutan pengelusi.

## 3.  Analisis  Polisakarida  dengan  Spekroskopi FT-IR
Pengujian  dengan  FT-IR  dilakukan  untuk membuktikan  adanya  poliskarida  bersulfat. Spektra  IR  dari  sampel  yang  diekstraksi  dengan NaOH  dan  KOH  memiliki  bilangan  gelombang yang  cukup  khas  untuk  polisakarida  bersulfat (gambar 3 dan 4).  Signal pada 1271 cm -1 (fraksi NaOH) dan 1262 cm -1 (fraksi KOH) menunjukkan  uluran  S  O  asimetrik.  Signal  ini mendekati  nilai  1258  cm -1 (Zhang et  al., 2011) dan 1260 cm -1 (Moshen et al. , 2007) dan berada dalam kisaran 1250 – 1370 cm -1 yaitu  untuk
Gambar  1.  Sayur  karang Gracilaria sp.
vibrasi  uluran  S  O  asimetrik  dari  ester  sulfat (Bouhlal et  al. ,  2011).  Sedangkan  puncak  1642 cm -1 (fraksi NaOH) dan 1644 cm -1 (fraksi KOH) merupakan  uluran  vibrasi  C  O  dari  asam uronat,  salah  satu  komponen  polisakarida bersulfat.  Selanjutnya  signal  pada  3420  cm -1
(fraksi  NaOH)  dan  3446  cm -1 (fraksi  KOH)
merupakan  indikasi  gugus  fungsi  R  OH  (Ale et al. , 2011).
Hasil ini menunjukkan bahwa “sayur karang ( Gracilaria sp) mengadung karbohidrat bersulfat.  Ini  berarti  “sayur  karang”  dapat dijadikan sebagai sumber polisakarida bersulfat.
Gambar 2.. Hasil uji Molisch terhadap fraksi-fraksi dari sampel yang diekstraksi dengan NaOH (atas) dan KOH (bawah) (Keterangan: A= Bilas; B= Unbound ; 1= 0.1 M; 2= 0,2 M; 3= 0,3 M; 4= 0,4 M; 5= 0,5 M; 6= 1,0 M; 7= 1,5 M; dan 8= 2,0 M NaCl).
Gambar 3. Spektra FTIR sampel yang diekstraksi dengan larutan
NaOH
Gambar 4. Spektra FTIR sampel yang diekstraksi dengan larutan KOH

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa:
1. Polisakarida  bersulfat  dari  Sayur  Karang ( Gracilaria sp ) asal  Ambon dapat diekstraksi dengan  menggunakan  larutan  basa  yaitu NaOH dan KOH.
2. Hasil  analisis  FTIR  menunjukkan  bahwa karbohidrat  (polisakarida)  pada  sayur  karang mengandung  gugus  –OH  (hidroksil)  dan –S=O  (ester  sulfat).  Dengan  demikian  sayur karang  mengandung  polisakarida  bersulfat. Adanya  gugus  –C-O  pada  polisakarida bersulfat  mengindukasikan  bahwa  asam uronat  merupakan  salah  satu  komponen penyusun.

## DAFTAR PUSTAKA
Ale,  M.T.,  Maruyama,  H.,  Tamauchi,  H., Mikkelsen,  J.D.    and  Meyer,  A.S.  2011.
Fucose-Containing Sulfated Polysaccharides  from  Brown  Seaweeds Inhibit Proliferation of Melanoma Cells and
Induce Apoptosis by Activation of Caspase- 3 in Vitro . Mar. Drug. 9: 2605-2621.
Al-Fath,  H.N.  2011.  Isolasi,  Karakterisasi,  dan
Identifikasi Polisakarida Sulfat pada
Rumput  Laut  Jenis Eucheuma  alvarezii
Doty dari  Teluk  Waworada  Kabupaten Bima. Skripsi ,  Jurusan  Kimia  FMIPA Universitas Negeri Malang.
Anggadireja,  J.T.,  Zatnika,  A.,  Purwoto,  H.,  & Istini,  S.,  2008. Rumput  Laut .  Penerbit Penebar Swadaya, Jakarta
Basmal  J.  2001. Perkembangan  Teknologi  Riset Penanganan  Pasca  Panen  dan Industri Rumput Laut. Forum Rumput Laut. Jakarta: Pusat  Riset  Pengolahan  Produk  dan  Sosial Ekonomi Kelautan dan Perikanan. Departemen  Kelautan  dan  Perikanan.  hlm 16-22.
Boulhal, R., Haslin, C., Chermann, J.C., Colliec- Jouault,  S.,  Singuin,  C.,  Simon,  G., Carentola,  S.,  Riadi,  H.  and  Bourgougnon,
N.    2011.    Antiviral  Activities  of  Sulfated Polysaccharides Isolated from Sphaerococcus coronopifolius ( Rhodophytha , Gigartinales )
and
Boergeseniella thuyoides ( Rhodophyta , Ceramiales ), Mar. Drugs 9: 1187-1209 Dahuri,  R.,  2000. Pendayagunaan  Sumberdaya Kelautan  untuk  Kesejahteraan  Rakyat
(Kumpulan Pemikiran ). LISPI.  ISBN : 979- 96004-0-5 Istini,  S.  &  Suhaimi.,  1998, Manfaat  dan
Pengolahan Rumput Laut , Lembaga Oseanologi Nasional, Jakarta.
Manoj,  S.G.M.,  Mahesh,  K.P.  S.,  Vasanthi,  M.
and Anant, A. 2013. Anticoagulant property of sulphated polysaccharides extracted from marine brown algae collected from Mandapam Island, India. Afr. J. Biotechnol. 12(16):1937-1945
Mazumber,  S.,  Ghosal,  P.  K.,  Pujol,  C.  A., Carlucci,  M.  J.,  Damonte,  E.  B.,  Ray,  B., 2002,  Isolation,  Chemical  Investigation  and Antiviral Activity from Gracilaria corticata
( Gracilariaceae ,  Rhodophyta). Int.  J.  of Bio. Macromolecules . 31, 87-95 Mohsen,  Asker,M.S,  Mohamed,S.F.,    Ali,  F.M. and El-Sayed O.H. 2007. Chemical Structure  and  Antiviral  Activity  of  Water- soluble  Sulfated  Polysaccharides  from Surgassum  latifolium. J.  Appl.    Sci.  Res , 3(10): 1178-1185
Okajima-Kaneko,  M.,  Ono,  M.,  Kabata,  K.,
Kaneko,  T.  2007.  Extraction  of  novel sulfated  polysaccharides  from Aphanothece sacrum (Sur.)  Okada,  and  its  spectroscopic characterization. Pure Appl. Chem. , 79 (11): 2039–2046.
Silva,  R.O.,  dos  Santos,  G.M.P.,  Nicolau, L.A.D.,  Lucetti,  L.T.,  Santana,  A.P.M.,  de Souza  Chaves,  L.,  Barros,  F.C.N.,  Freitas, A.L.P.,  Souza,  M.H.L.P.,  Medeiros,  J.V.R. 2011. Sulfated-Polysaccharide Fraction from  Red  Algae  G racilaria  caudata Protects Mice Gut  Against Ethanol-Induced Damage. Mar. Drugs , 9: 2188-2200.
Viana,  G.S.B.,  Freitas,  A.L.P.,    Lima,  M.M.L. Vieira,  L.A.P.  Andrade,  M.C.H.  and Benevides,  N.M.B.  2002.  Antinociceptive activity  of  sulfated  carbohydrates  from  the red  algae Bryothamnion  seaforthii (Turner) Kütz.  and B . triquetrum (S.G.  Gmel.)  M. Howe . Braz. J. Med. Biol. Res. 35: 713-722 Zhang,  H.,    Wang,  Z.Y.,  Yang,  L.,  Yang,  X., Wang,  X.  and    Zhang,  Z.  2011. In  Vitro
Antioxidant Activities of Sulfated
Derivatives  of  Polysaccharides  Extracted from Auricularia auricular . Int. J. Mol. Sci.
12:3288-3302