Abstrak  Penelitian ini bertujuan  untuk  menentukan  kadar dan  jenis  asam  lemak  yang  terkandung  dalam  ragi Rhodotorula  gracilis.  Lipid  diekstraksi  menggunakan campuran  pelarut  kloroform:metanol  (2:1  v/v).  Lipid  yang diperoleh  kemudian  ditransesterifkasi  dengan  BF 3 -metanol 14%. Hasil transesterifikasi dianalisis menggunakan Kromatografi lapis Tipis dan Kromatografi Gas–Spektroskopi Massa  (KG-SM).  Kadar  lipid  total  ragi  R.  gracilis yang diperoleh sebesar 0,0841 g/g sel kering (8,4107%). Total metil ester  yang  diperoleh  dari  hasil  transesterifikasi  sebesar 83,86%.  Hasil  Analisis  asam  lemak  menunjukkan  ada  lima jenis  metil  ester  yang  teridentifikasi  yaitu  asam  tridekanoat 0,98%,  asam heksadekanoat  (asam  palmitat)  15,37%,  asam heptadekanoat  2,09%,  asam  9-oktadekanoat  (asam  oleat) 58,88%, dan asam oktadekanoat (asam stearat) 6,54%.
Kata  kunci:  Lipid; asam  lemak; metil  ester; transesterifkasi; BF 3 -metanol; Rhodotorula gracilis

## I. PENDAHULUAN
Ragi  ( yeast )  termasuk  kelompok  jamur  yang  tidak dapat  membentuk  miselium  dan  dapat  tumbuh  serta berkembang  biak  lebih  cepat  daripada  jamur.  Ragi  mampu menghasilkan  energi  dari  senyawa  organik  dalam  kondisi aerob  maupun  anaerob  sehingga  dapat  tumbuh  dalam kondisi ekologi yang berbeda [1] .
Kandungan  utama  dari  ragi  adalah  protein, karbohidrat  dan lipid.  Persentase ketiga  komponen tersebut bervariasi  tergantung  jenis  ragi.  Sebagai  contoh, Saccharomyces  cerevisiae memiliki  kandungan  protein sebesar  55,4%,  karbohidrat  28%  dan  lipid  45% [2] , sedangkan R.  gracilis memiliki  kandungan  protein  sebesar 20%,  karbohidrat  20%  dan  lipid  51% [3] .  Identifikasi  atau taksonomi  mikroorganisme  lebih  banyak  menggunakan karakteristik  morfologi.  Cara  seperti  ini  memiliki kelemahan  yaitu  adanya  kemungkinan  perbedaan  kriteria secara  morfologi  diantara  para  peneliti [4] .  Oleh  karena  itu, diperlukan  studi-studi  taksonomi  secara  lebih  mendalam, tidak  hanya  berdasarkan  pada  karakteristik  morfologi  saja tetapi juga fisiologis, kimiawi dan ciri-ciri genetik [5] . Komposisi asam lemak yang terkandung dalam suatu mikroorganisme dapat digunakan untuk taksonomi [6] . Asam lemak  memiliki  variasi  struktur  yang  banyak  sehingga berpotensial  digunakan  sebagai  biomarker. Kegunaannya adalah  meramalkan  komposisi  asam  lemak  suatu mikroorganisme  berdasarkan  komposisi  asam  lemak  yang dimiliki  oleh  mikroorganisme  lain  dalam  satu  marga. Misalnya, delapan jenis ragi dari marga Pichia sp diketahui mengandung  komposisi  asam  lemak  yang  hampir  sama yaitu  asam  lemak  palmitat,  asam  lemak  palmitoleat,  asam lemak  stearat,  asam  lemak  oleat,  dan  asam  lemak  linoleat, sedangkan  perbedaannya  hanya  ditemui  pada  asam  lemak linolenat.  Beberapa  spesies  tidak  memiliki  asam  lemak linolenat,  seperti P.  haplophila , P.  etchellsii ,  dan P.
sorbitophila [7] . Beberapa jenis ragi dari marga Rhodotorula juga  memiliki  kesamaan  komposisi  asam  lemak. Rhodotorula  glutinis memproduksi  asam  lemak  palmitat hingga  30,06%;  stearat  hingga  39,65%;  oleat  hingga 28,46%  dan  linoleat  8,01% [8] .  Komposisi  asam  lemak R. rubra yaitu asam lemak oleat hingga 47%, linoleat 8% dan palmitat 37%. Komposisi asam lemak R. minuta yaitu asam palmitat  hingga 15%, stearat  hingga 5%,  oleat  hingga 30% dan linoleat hingga 13% [9] .
Berdasarkan uraian di atas, maka pada penelitian ini dilakukan identifikasi asam lemak dari ragi R. gracilis untuk mengetahui komposisi asam lemaknya. Hasil transesterifikasi  asam  lemak  yang  diperoleh dianalisis berdasarkan  karakterisasi  Kromatografi  lapis  Tipis  (KLT) dan Kromatografi Gas-Spektrometri Massa KG-MS).

## II. METODOLOGI PENELITIAN

## 2.1 Pembuatan Media
Media padat dibuat menggunakan bahan-bahan yang terdiri  dari  (g/L):  glukosa  10,  agar  15,  pepton  7,5  dan ekstark  ragi  7,5. Media  cair  dibuat  menggunakan  bahan- bahan  yang  terdiri  dari  (g/L):  glukosa  10,  pepton  7,5  dan ekstrak ragi 7,5.

## 2.2 Penentuan Kurva Pertumbuhan Bakteri
Satu  koloni R.  gracilis dibiakkan  dalam  media  cair, kemudian  setiap  enam  jam  diukur  absorbansinya  pada panjang  gelombang  maksimum  untuk  mengetahui turbiditasnya.

## 2.3 Produksi Biomassa dan Sel Kering
Satu  ose  biakan  ragi  diinokulasi  ke  dalam  media cair  dan  digoyang  dengan shaker 120  rpm.  Selanjutnya dilakukan pemanenan pada jam ke 18.

## 2.4 Ekstraksi Lipid Total
Sel  kering  yang  diperoleh  digerus  kemudian diekstrak  sebanyak  lima  kali  menggunakan  pelarut  50  ml kloroform:metanol (2:1 v/v) dengan cara direfluks selama 1 jam pada temperatur 45-50 °C.

## 2.5 Reaksi transesterifikasi
Lipid  yang  diperoleh  kemudian  diubah  menjadi metil  ester  menggunakan  pelarut  kloroform:metanol  (2:1 v/v), reagen BF 3 -metanol dan ko-pelarut toluena.

## 2.6 Analisis asam lemak
Metil  ester  yang  diperoleh  kemudian  dianalisis dengan KLT dan KG-SM

## Identifikasi Asam Lemak dari Ragi Rhodotorula gracilis
Dyah Oktavia, Refdinal Nawfa
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
e-mail : refnawfa@chem.its.ac.id
III. HASIL DAN DISKUSI 3.1 Kurva Pertumbuhan Pada penelitian ini digunakan metode turbidimetri.  Setelah  dilakukan  pengukuran  absorbansi terhadap  waktu,  diperoleh  kurva  pertumbuhan  seperti  pada Gambar 3.1.
Gambar 1 Kurva pertumbuhan R. gracilis
Gambar  1  menunjukkan  bahwa  fase  pertumbuhan dipercepat berlangsung pada ±6 jam pertama. Pada fase ini ragi merombak materi dalam medium agar dapat digunakan sebagai nutrisi untuk pertumbuhannya. Ragi mengalami fase eksponensial  pada  jam  ke-8  hingga  jam  ke-36.  Fase eksponensial  ditandai  dengan  peningkatan  biomassa  secara signifikan meskipun tidak diikuti dengan laju yang konstan. Fase  ketiga  adalah  fase  stasioner yang  terjadi  beberapa setelah  jam  ke-36. Ragi  mengalami  laju  pertumbuhan maksimum pada fase ini, namun jumlah sel yang mati juga bertambah  karena  nutrisi  dalam  medium  semakin berkurang.  Biomassa  tidak  akan  mengalami  banyak perubahan.
Pemanenan sebaiknya  dilakukan pada akhir fase log karena  pada  saat  itu  ragi  aktif  melakukan  pembelahan sehingga  biomassa  yang  dihasilkan  mencapai  jumlah  yang optimal  dan  belum  dihasilkan  banyak  metabolit  toksik. Berdasarkan  Gambar 3.1  pemanenan  ragi  dilakukan  pada jam  ke-18  karena  pada  jam  tersebut  ragi  mengalami pertumbuhan paling cepat.

## 3.2 Hasil analisis KLT
Hasil  kromatogram  KLT  menunjukkan  perbedaan kepolaran  senyawa  sebelum  (lipid)  dan  sesudah  proses transesterifkasi  (metil  ester).  Hasil  analisis  KLT  pada  lipid memberikan  noda  yang  berada  di  tengah  plat  KLT. Sedangkan hasil analisis KLT pada metil ester memberikan noda  yang  berada  di  batas  atas  plat  KLT.  Perbedaan  Rf antara  kedua  hasil  analisis  tersebut  menunjukkan  bahwa metil  ester  telah  terbentuk  pada  reaksi  transesterifikasi. Semakin  tinggi  nilai  Rf  menunjukkan  bahwa  senyawa semakin nonpolar.

## 3.3. Hasil Analisis KG-SM
Komposisi  asam  lemak  dalam  ragi  dapat  dianalisis menggunakan  KG-SM  dengan  mengubahnya  terlebih dahulu  menjadi  turunannya  yang  lebih  volatil  yaitu  dalam bentuk metil ester.
Reagen  BF 3 dalam  metanol  digunakan  untuk mengubah  asam  lemak  menjadi  metil  esternya pada  reaksi transesterifikasi.  Senyawa  tersebut  sekaligus  berfungsi sebagai  katalis  asam  lewis  untuk  mempercepat  reaksi transesterifikasi [10] . Penambahan toluena sebagai ko-pelarut bertujuan untuk membentuk sistem monofase.
Lipid  yang  berwarna  kuning  kecoklatan  berubah membentuk  dua  lapisan  setelah  reaksi  transesterifikasi. Lapisan  atas  berwarna  kuning  bening  dan  merupakan lapisan  metil  ester,  sedangkan  lapisan  bawah  yang  lebih keruh  merupakan  lapisan  gliserol.  Kedua  lapisan dipisahkan.  Lapisan  atas  dicuci dengan  aquades  untuk memisahkan  gliserol,  sisa  metanol,  dan  BF3  yang  terlarut dalam lapisan metil ester.
Metil ester yang diperoleh dari reaksi transesterifikasi  selanjutnya  dianalisis  menggunakan  KG- SM untuk  mengetahui  jenis  metil  ester  yang  terkandung dalam sampel uji. Hasil analisis KG-SM dapat dilihat pada Gambar 3.3.
Gambar 2 Hasil kromatogram reaksi transesterifikasi
Dari  prediksi  senyawa  hasil  analisis  KG-SM, diketahui terdapat lima jenis metil ester yang teridentifikasi seperti pada Tabel 3.1.
Tabel 1 Metil ester hasil analisis KG-SM
No Nama Senyawa Waktu retensi % Luas area 1 Asam tridekanoat 7,50 0,98 2 Asam heksadekanoat 9,92 15,37 3 Asam heptadekanoat 11,60 2,09 4 Asam 9-oktadekanoat 3,24 58,88 5 Asam oktadekanoat 13,85 6,54

## 3.4. Pendekatan Taksonomi dari R. gracilis
Dari  hasil  analisis  KG-SM,  diketahui  terdapat  lima jenis  metil  ester  yang  teridentifikasi  dari R.  gracilis yaitu asam  tridekanoat,  asam  heksadekanoat  (asam  palmitat), asam heptadekanoat, asam 9-oktadekanoat (asam oleat) dan asam  oktadekanoat  (asam  stearat)  dengan  persentase masing-masing 0,98%, 15,37%, 2,09%, 58,88% dan 6,54%. Pada  penelitian  sebelumnya,  diketahui  komposisi  asam lemak R.  glutinis terdiri  dari  asam  palmitat  30,06%,  asam oleat  28,46%,  asam  stearat  39,65%,  dan  asam  linoleat 8,01%.  Pada  penelitian  lain  diketahui  bahwa R.  rubra mengandung asam palmitat 37%, asam oleat 47%, dan asam linoleat  8%.  Komposisi  asam  lemak R.  minuta antara  lain asam palmitat 15%, asam oleat 30%, asam stearat 5%, dan asam  linoleat  13%. R.  mucilaginosa TJY15a  mengandung asam palmitat 22,3%, asam oleat 63,5%, asam stearat 5,2%, dan  asam  palmitoleat  1,8% [11] .  Hasil  penelitian  tersebut menunjukkan  persamaan  komposisi  asam  lemak  diantara kelima ragi  yaitu asam  palmitat dan asam  oleat, sedangkan asam  tridekanoat  dan  asam  heptadekanoat  hanya  terdapat
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 20 40 60 A bs or ba ns i Waktu Inkubasi (Jam) asam heksadekanoat asam 9-oktadekanoat asam oktadekanoat asam heptadekanoat asam tridekanoat
pada R.  gracilis ,  asam  stearat  tidak  ditemukan  dalam R. rubra , asam linoleat tidak ditemukan dalam R. gracilis dan R.  mucilaginosa TJY15a,  dan  asam  palmitoleat  hanya terdapat pada R. mucilaginosa TJY15a.
IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, diperoleh  kesimpulan  bahwa  biomassa  sel  kering  yang dihasilkan  sebanyak  3,2720  g  per  2000  mL  media  cair (1,6360  g/L). Massa  lipid  yang  diperoleh  dari  ekstraksi biomassa  ragi  yaitu  0,2752  g  atau  sebesar  0,0841  g/g  sel kering  (8,41%). Total  metil  ester  yang  dihasilkan  pada reaksi  transesterifikasi  yaitu  83,86%. Analisis  asam  lemak menggunakan  alat  KG-SM  menunjukkan  beberapa  jenis metil  ester  yaitu  asam  tridekanoat  0,98%,  asam heksadekanoat (asam palmitat) 15,37%, asam heptadekanoat  2,09%,  asam  9-oktadekanoat  (asam  oleat) 58,88% dan asam oktadekanoat (asam stearat) 6,54%.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]    Wina,  E.  1999.  “Pemanfaatan  Ragi  (Ragi)  sebagai Pakan  Imbuhan  untuk  Meningkatkan  Produktivitas Ternak Ruminansia”. Wartazoa 9(2): 1-9.
[2]    Amotz,  A.B.,  Fishler,  R.  dan  Schneller,  A.  1987. “Chemical  Composition of Dietary Species  of  Marine Unicellular  Algae  and  Rotifers  with  Emphasize  on Fatty Acids”. Marine Biology 95, 31-36.
[3] Evans, C.T. dan Ratledge,
C. 1984.
“Phosphofructokinase  and  the  Regulation  of  the  Flux of  Carbon  from  Glucose  to  Lipid  in  the  Oleaginous Ragi Rhodosporidium  toruloides ”.  Journal  of  General Microbiology 130, 3251-3264.
[4]      Niiyama,  Y.  1996.  “Morphology  and  Systematics  of Anabaena Strains  in  National  Science  Museum”. Japanese Journal of Phycology 44, 1-8.
[5]  Castenholz,  R.W.  dan  Waterbury,  J.B.  1989. “Cyanobacteria:  Bergey’s  Manual  of  Systematic Bacteriology”. Vol. 3, 1710-1727.
[6]   Welch, D.F. 1991. “Application of Cellular Fatty Acid Analysis”. Clinical Microbiology Reviews 4, 422–438.
[7]    Viljoen, B.C., Kock, J.L.F., dan Britz, T.J. 1988. “The Significance  of  Long-chain  Fatty  Acid  Composition and  Other  Phenotypic  Characteristics  in  Determining Relationships  Among  Some Pichia and Candida Species”. Journal of General Microbiology 134, 1893– 1899.
[8]    Easterling,  E.R.,  French,  W.T.,  Hernandez,  R.  dan Licha, M. 2009. “The Effect of Glycerol as A Sole and Secondary  Substrate  on  the  Growth  and  Fatty  Acid Composition  of Rhodotorula  glutinis ”.  Bioresource Technology 100, 356-361.
[9]      Saxena,  V.,  Sharma,  C.D.,  Bhagat,  S.D.,  Saini,  V.S. dan  Adhikari.  D.K.  1998.  “Lipid and  Fatty  Acid Biosynthesis  by Rhodotorula  minuta ”.  JAOCS  75(4): 501-505.
[10]  Klopfenstein,  W.  E.  1971.  “On  Methylation  of Unsaturated  Acids  using  Boron  Trihalide–Methanol Reagents”. Journal of lipid research 12(6), 773 – 776.
[11]  Li, M., Liu, G.L., Chi, Z., dan Chi, Z.M. 2009. “Single Cell  Oil  Production  from  Hydrolysate  of  Cassava Starch  by  Marine-Derived  Yeast Rhodotorula mucilaginosa TJY15a”. Biomass and bioenergy 34(1): 101-107.