Menara Perkebunan , 2008,  76 (1), 47-60

## Pola aktivitas enzim ligninolitik
Pleurotus ostreatus pada limbah sludge pabrik kertas
Activity pattern of ligninolytic enzyme of Pleurotus ostreatus in sludge waste of paper factory

## Happy WIDIASTUTI & TRI-PANJI
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia

## Summary
Sludge is  a  solid  waste  abundantly available on paper factory that is economically unutilized  and  tends  to  pollute  environment. This  waste  can  be  used  as  growth  media  for oyster  mushroom  ( Pleurotus  ostreatus) as edible  mushroom  and  ligninolytic  enzymes production  as  well . A  research  has  been conducted  to  study  the  activity  pattern  of ligninolytic  enzymes  of  oyster  mushroom grown  on  the  sludge  waste  of  recycle  paper factory.  Six  treatments  were  examinated consisted of three media combinations (sawdust,  sludge,  sludge  mixed  with  sawdust), with and without supplementing with rice bran, lime,  and  gypsum,  and  two  mushroom  strains Bogor  oyster  mushroom  (JTB)  and  China Taipei  oyster  mushroom  (JTT).  Monitoring  of ligninolytic  enzyme  activity consisting  of laccase, mangan peroxidase (Mn-P) and lignin peroxidase (Li-P), was subsequently regularly started  since  inoculation,  at  vegetative  phase (four  and  six  weeks),  primordial  formation, phase  of  fruiting  body  formation,  and  two weeks  after  formation  of  fruiting  body.  Each treatment was repeated three times, so that 216 bag  logs  of  oyster  mushroom  cultures  were performed.  The  results  showed  that  laccase, Mn-P, and Li-P activities could be observed on sludge  or  mixture  of  sludge+sawdust  media inoculated  with P.  ostreatus .  Generally,  the highest  activity  of  ligninolytic  enzymes especially for laccase and MnP were observed at  the  first  vegetative  growth  phase  i.e.  before emerging primordial of fruiting body (1.697 & 2.113 U/mL, 4.394 & 2.314 U/mL  respectively
for  JTB  and  JTT  laccase  and  JTB  &  JTT  Mn- P).  The  highest  Li-P  activity  was  affected  by the  kind  of  media  and  strain  of  inoculum.  In sludge  medium,  the  highest  Li-P  activity  was observed in  vegetative growth phase (2.706 & 4.014  U/mL  respectively  for  JTB  and  JTT) while  in  a  mixture  of  sludge  +  sawdust  the highest activity of that enzyme was observed in primordial phase of growth (2.509 & 1.9 U/mL respectively  for  JTB  and  JTT).  Addition  of supplement to the sludge increased ligninolytic activity,  while  laccase  activity  of  sludge  was suggested  could  be  more  enhanced  by  mixing the  sludge  with  sawdust  and  enrich  with  rice bran, gypsum and lime.
[ Keywords : Ligninolytic      enzyme, sludge waste, Pleurotus  ostreatus ,  polute environment].

## Ringkasan
Sludge merupakan  limbah  padat  yang tersedia  melimpah  di  pabrik  kertas  dan  belum dimanfaatkan secara ekonomis sehingga berpotensi  mencemari  lingkungan.  Limbah  ini dapat  dimanfaatkan  sebagai  medium  tumbuh jamur konsumsi seperti jamur tiram ( Pleurotus ostreatus )  dan  penghasil  enzim  ligninolitik. Penelitian  dilakukan  untuk  mempelajari  pola aktivitas  enzim  ligninolitik  jamur  tiram  pada limbah sludge pabrik  kertas  selama  fase vegetatif  sampai  setelah  fase  generatif.  Enam perlakuan  yang  diuji  berupa  tiga  kombinasi komposisi  medium  (serbuk  gergaji, sludge, campuran sludge dan  serbuk  gergaji),  dengan

## Widiastuti & Tri Panji
dan tanpa pengayaan, yaitu penambahan dedak, kapur,  dan  gipsum,    serta  dua  strain  jamur tiram  Bogor  (JTB)  dan  jamur  tiram  China Taipei  (JTT).  Pengamatan  aktivitas  enzim ligninolitik meliputi lakase, mangan peroksidase  (Mn-P)  dan  lignin  peroksidase (Li-P) dilakukan sejak saat inokulasi, pada fase vegetatif  (empat  dan  enam  minggu),  pada  saat pembentukan  primordia,  fase  tubuh  buah,  dan dua  minggu  setelah  pembentukan  tubuh  buah. Masing-masing  perlakuan  diulang  tiga  kali sehingga  terdapat  216 bag  log jamur  tiram.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  aktivitas ligninolitik  dijumpai  pada  medium sludge dan campuran sludge +serbuk  gergaji  yang  diino- kulasi P. ostreatus. Aktivitas enzim ligninolitik tertinggi  khususnya  lakase  dan  MnP  teramati pada fase pertumbuhan vegetatif pertama yaitu sebelum  terbentuknya  primordia  (1,697  & 2,113  U/mL,  4,394  &  2,314  U/mL    masing- masing  untuk  lakase  JTB  dan  JTT  dan  MnP JTB & JTT). Aktivitas LiP tertinggi dipengaruhi  oleh  jenis  medium  dan  strain inokulum.  Pada  medium sludge ,  aktivitas  LiP tertinggi dijumpai pada fase vegetatif (2,706 & 4,014  U/ml  masing-masing  untuk  JTB  dan JTT)  sedangkan  pada  medium  campuran sludge +serbuk  gergaji,  aktivitas  enzim    ter- tinggi  dijumpai    pada fase  primordia  (2,509  & 1,9  U/ml  berturut-turut  untuk  JTB  dan  JTT). Pengayaan sludge meningkatkan  aktivitas ligninolitik,  sedangkan  aktivitas  lakase  pada sludge diduga dapat lebih ditingkatkan dengan menambahkan serbuk gergaji disertai
pengayaan berupa gipsum, dedak, dan kapur.

## Pendahuluan
Sludge (lumpur  hasil  pengolahan limbah) merupakan salah satu jenis limbah yang  dihasilkan  pabrik  kertas.  Jumlah limbah jenis ini paling besar dibandingkan dengan  limbah  padat  lainnya  yaitu sekurangnya  sebesar  20  ton  per  hari  di satu  pabrik  kertas.  Limbah  ini  belum dimanfaatkan  secara  ekonomis  dan  dapat menimbulkan  pencemaran  lingkungan. Salah  satu  cara  untuk  mengatasinya  ialah
dengan  mendaur  ulang  limbah  tersebut menjadi bahan yang bermanfaat.
Limbah industri pertanian pada umumnya merupakan limbah ligno- selulosa yang merupakan bahan campuran yang  sulit  didegradasi  dibandingkan dengan  jenis  polisakarida  lainnya.  Lignin yang  terkandung  dalam  limbah  ligno- selulosa  menyebabkan  limbah  ini  sulit terdegradasi.  Bagaimanapun  juga,  banyak dilaporkan  bahwa  jamur  pelapuk  putih (JPP)  adalah  jamur  yang  paling  efisien mendegradasi  lignin,  dan  salah  satu  JPP yang  telah  banyak  dikenal  ialah  jamur tiram  ( Pleurotus  ostreatus )  yang  dapat dikonsumsi.
Secara umum jamur merupakan orga- nisme  yang  tidak  memiliki  klorofil, sehingga tidak dapat  menggunakan  energi matahari  untuk  menghasilkan  senyawa kimia  yang  diperlukan  untuk  pertumbuh- annya.  Sebagai  penggantinya,  jamur memiliki  berbagai  enzim  ekstra  seluler seperti  enzim  ligninolitik  yang  dapat mendegradasi  senyawa  organik  kompleks untuk  membentuk  senyawa  yang  larut yang selanjutnya dapat diserap oleh jamur untuk  memenuhi  kebutuhan  nutrisinya. Jamur  tiram  pada  umumnya  dibudidaya- kan  menggunakan  serbuk  gergaji  sebagai medium  tumbuh  (Gunawan,  1990)  seperti kayu  albizia  yang  mengandung C  organik 26,4%.  Jamur  ini  bersifat  saprofitik  dan termasuk  dalam  JPP  karena  mampu merombak  selulosa  dan  lignin.  Widiastuti &  Gunawan  (1988)  melaporkan  bahwa medium sludge pabrik  kertas  yang  ber- bahan baku kayu dapat digunakan sebagai medium tanam jamur tiram.
Enzim  lignoselulolitik  sangat  poten- sial pemanfaatannya pada beberapa indus- tri misalnya industri pulp dan kertas untuk biopulping (Bourbonnais et al ., 1992), de- kolorisasi limbah tekstil (Gianfreda et al .,
Pola aktivitas enzim ligninolitik Pleurotus ostreatus pada limbah sludge . .....
1999), biosensor (Yaropolov et al ., 1994), pendegradasi  organopulutan  seperti  TNT (trinitro-toluena),  poliklorinated  bifenils (PCBs), organoklorin, PAH dan pengawet kayu  (Pointing,  2000),  juga  dalam fermentasi  teh  dan  kopi  dan  vinifikasi (Lante et al ., 1992), sedangkan Mn-P dari Bjerkandera sp.  galur  BOS55  untuk biobleaching (Moreira et  al., 1997). Aplikasi  enzim  ligninolitik  dalam  industri merupakan teknologi yang ramah lingkungan.
Produksi  lakase  sangat  dipengaruhi oleh  konsentrasi  nitrogen  dalam  medium kultur (Gianfreda et al ., 1999) dan sumber karbon  yang  digunakan  (Galhaup et  al ., 2003).  Selain  itu,  hasil  penelitian  juga menunjukkan bahwa penambahan Cu pada medium pertumbuhan secara nyata meningkatkan  sintesis  lakase  dan  regulasi sintesis isoform lakase lainnya pada tahap transkripsi  gen  pada Trametes  versicolor , P.ostreatus ,  dan Ceriporiopsis  subver- mispora (Collin & Dobson 1997,
Karahanian et  al .,  1998,  Palmieri et  al .,
2000). Penelitian lain menunjukkan bahwa aktivitas  enzim  ligninolitik  di  samping dipengaruhi  oleh  komposisi  substrat,  dan terdapatnya  kosubstrat  juga  dipengaruhi oleh  umur  kultur,  khususnya  dalam kaitannya  dengan  fase  perkembangan jamur.  Percobaan  ini  dilakukan  untuk menetapkan  pola  aktivitas  enzim  lignino- litik  jamur  tiram  yang  ditumbuhkan  di limbah sludge pabrik  kertas  dari  fase vegetatif hingga setelah fase generatif.

## Bahan dan Metode
Penelitian  dilakukan  di  Balai  Pene- litian  Bioteknologi  Perkebunan  Bogor. Sludge segar  diperoleh  dari  pabrik  kertas di Bekasi, serbuk gergaji Albizia falcataria didapat  dari  penggergajian
kayu  di  Sukabumi , dan  bibit  jamur  tiram JTB dan JTT diperoleh dari Lab Mikologi IPB.  Pada  saat  awal  dilakukan  analisis kadar C,  dan N sludge dan serbuk  gergaji (Tabel  1).  Kecuali  bahan  pengaya  yang terdiri dari  dedak,  kapur,  dan  gipsum  dari sumber  lokal,  bahan  lain  yang  digunakan memiliki spesifikasi p.a.

## Pembiakan  jamur  dan  analisis  aktivitas enzim ligninolitik
Persiapan  isolat  dilakukan  dengan peremajaan P.  ostreatus pada  medium PDA.  Inokulum  dibuat  dengan  menum- buhkan  kultur  pada  medium  biji  sorghum yang  diinkubasi  pada  suhu  kamar  selama dua  minggu.  Sebelum  digunakan  sebagai medium,  serbuk  gergaji  terlebih  dahulu direndam  semalam  menggunakan  air PAM,  sedangkan  untuk sludge hanya dilakukan  pengaturan  kadar  air  (50-60%). Sludge dan serbuk gergaji ditimbang pada wadah yang berbeda atau dicampur sesuai perlakuan  (serbuk  gergaji, sludge ,  cam- puran sludge dan  serbuk  gergaji  50:50, v/v). Hal yang sama juga dilakukan untuk perlakuan  pengayaan  berupa  penambahan dedak (12,5%), kapur (2,8%), dan gipsum (1,5%)  (Widiastuti  &  Gunawan,  1988). Keenam jenis medium selanjutnya dikom- poskan  selama tiga  hari dan   selanjutnya medium  sebanyak  1 kg  dimasukkan   ke
Tabel 1.  Kadar karbon dan nitrogen sludge dan serbuk gergaji.
Table 1.  Carbon and nitrogen concentration of sludge and sawdust. Analisis Analysis Sludge Serbuk gergaji Sawdust Karbon ( carbon ) (%) Nitrogen ( nitrogen ) (%)
Rasio CN Carbon nitrogen ratio 40,24 0,32 126 47,7 0,29 164

## Widiastuti & Tri Panji
dalam  kantong  plastik  tahan  panas. Setelah bag  log dipasterisasi  selama delapan  jam  65 0 C  sebanyak  dua  kali dengan selang waktu satu malam, selanjutnya  medium  diinokulasi  dengan bibit  jamur  tiram  JTB  atau  JTT  sebanyak 10  g/ bag  log .  Semua bag log yang  telah diinokulasi diinkubasi pada suhu 22-28 0 C . Setelah  miselium  menutupi bag  log (dua bulan),  tutup bag  log dibuka  dan  kondisi ruang  dilembabkan.  Pengamatan  dilaku- kan  terhadap  aktivitas  enzim  ligninolitik pada  saat  inokulasi,  fase  vegetatif  (empat dan  enam  minggu),  primordia,  pemben- tukan tubuh buah, dan dua minggu setelah pembentukan tubuh buah.
Analisis  enzim  ligninolitik  dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan ekstraksi  enzim  dari  kultur  medium  padat tersebut.  Ekstraksi  dilakukan  mengguna- kan bufer fosfat (pH 7) pada perbandingan medium  dan  bufer  1:2  (v/v)  dan  ekstrak kasar  enzim  yang  diperoleh  disentrifugasi dengan  kecepatan  5000  rpm,  selama 10  menit,  pada  suhu  0-4 0 C  hingga diperoleh  ekstrak  yang  jernih.  Ekstrak kasar enzim selanjutnya dianalisis aktivitas masing-masing enzim ligninolitik pada  pH  5  (Widiastuti et  al .,  2007) meliputi  lakase  (Niku-Poavola et  al ., 1988), Mn-P (Widiastuti et al ., 2007), dan Li-P (Tien & Kirk, 1984).

## Analisis data
Perlakuan  yang  diuji  ialah  komposisi medium (serbuk gergaji, sludge , campuran serbuk  gergaji+ sludge 50:50  (%  v/v)) dengan  dan  tanpa  pengayaan,  dan  strain jamur  tiram  (JTB  dan  JTT)  dengan  tiga ulangan  untuk  setiap  perlakuan.  Analisis aktivitas  enzim  ligninolitik  dilakukan  ter- hadap  ekstrak  kasar  enzim  yang  merupa- kan komposit dari tiga ulangan .

## Hasil dan Pembahasan

## Pertumbuhan miselium
Pada  tahap  peremajaan  di  medium PDA, pertumbuhan miselium antara jamur tiram China Taipei (JTT) dan jamur tiram Bogor  (JTB)  berbeda. Miselium  JTT nampak  tumbuh  lebih  cepat  dan  tebal dibandingkan dengan JTB. Hal yang sama juga diperoleh ketika kedua jamur tersebut ditumbuhkan pada sorghum sebagai inokulum.
Pada  semua  medium  produksi  yang diuji,  miselium  kedua  jamur  dapat tumbuh. Namun demikian JTT tidak dapat membentuk  tubuh  buah  pada  medium sludge saja  baik  dengan  maupun  tanpa pengayaan,  sedangkan  tubuh  buah  JTB tidak terbentuk hanya pada medium sludge tanpa pengayaan.

## Aktivitas enzim ligninolitik pada medium serbuk gergaji
Pada  medium  serbuk  gergaji,  baik JTB  maupun  JTT  menghasilkan  enzim ligninolitik  (Tabel  2).  Aktivitas  lignino- litik  maksimum  baik  Mn-P,  Li-P  maupun lakase untuk JTT ialah pada fase vegetatif. Hal  yang  sama  juga  dijumpai  pada  JTB kecuali  aktivitas  Li-P  ialah  pada  fase primordia (generatif). Secara umum aktivitas  Mn-P  dan  lakase  terjadi  selama fase  perkembangan  jamur  dari  saat vegetatif  hingga  fase  setelah  generatif. Pada  serbuk  gergaji  aktivitas  Mn-P maksimum  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  aktivitas  Li-P  dan  lakase.  Pada medium  serbuk  gergaji  aktivitas  lignino- litik  JTB  maksimum  lebih  tinggi  diban- dingkan  dengan  yang  berasal  dari  JTT (Tabel  2).  Hasil  ini  menunjukkan  bahwa pada  medium  serbuk  gergaji  dengan kandungan    karbon  yang      tinggi  (47,7%)
Pola aktivitas enzim ligninolitik Pleurotus ostreatus pada limbah sludge . .....
Tabel  2.    Aktivitas  enzim  ligninolitik  ekstrak  enzim  kasar  jamur  tiram  JTB  dan  JTT    pada  medium serbuk  gergaji  dari  saat  inokulasi  (vegetatif)  hingga  dua  minggu  setelah  tubuh  buah  (setelah fase generatif).
Table 2.  Activity of ligninolytic enzyme of crude enzyme extract of oyster mushroom JTB and JTT grown on  sawdust  media  at  inoculation  (vegetative)  up  to  two  weeks  after  fruiting  body  formation (after generative phase)
Lakase Laccase U/uL Mn-P U/uL Li-P U/uL Waktu/fase ( Period/phase ) JTB JTT JTB JTT JTB JTT Vegetatif ( Vegetative )
4 minggu ( weeks )
6 minggu ( weeks )
Generatif ( Generative ) Primordia ( Primordial ) Tubuh buah ( Fruiting body ) Setelah generatif  ( Mature ) Setelah tubuh buah ( After fruiting body ) 1,030 1,664 1,458 1,576 0,477 1,438 1,183 1,168 0,743 1,361 2,369 5,923 1.074 0,579 0,372 2,700 3,416 1,253 0,647 2,603 tt 0,806 2,045 0,591 tt tt 1,792 0,717 tt tt
Keterangan ( Note ): tt : tidak terdeteksi  aktivitas enzim ( undetected enzyme activity )
dan  N  yang  rendah  (0,29%),  serta  rasio C/N  yang  lebih  tinggi  (164)  jamur  tiram aktif  mengekskresikan  enzim  ligninolitik. Lankinen  (2004)  melaporkan  bahwa kandungan  N  yang  rendah  dapat  meng- induksi aktivitas ligninolitik JPP.

## Aktivitas enzim  ligninolitik  pada medium sludge
Hasil  analisis  menunjukkan  bahwa limbah sludge bereaksi sedikit masam (pH 6,7),  mengandung  40,24%  C,  0,32%  N, rasio C/N 126, selulosa 33,65% dan lignin 31,65%. Karakteristik sludge dalam penelitian ini berbeda dengan sludge yang digunakan  dalam  penelitian  Widiastuti  & Gunawan  (1988). Sludge yang  digunakan Widiastuti  &  Gunawan  (1988)  ialah sludge yang  berasal  dari  pabrik  kertas yang  berbahan  baku    kayu  yang  mem- punyai  kandungan  C  yang  lebih  rendah (29,85%  C),  kandungan  N  yang  sedikit lebih  tinggi  (0,361%  N)  dan  nilai  rasio C/N  yang  jauh  lebih  rendah  (83).  Dalam
penelitian  ini sludge berasal  dari  pabrik kertas  berbahan baku  kertas  karton  bekas. Perbedaan  bahan  baku  menghasilkan karakteristik sludge yang berbeda.
Pola  aktivitas  enzim  ligninolitik  pada medium sludge saja  tidak  berbeda  diban- dingkan  dengan  medium  serbuk  gergaji khususnya  aktivitas  enzim  maksimum ialah  pada  fase  vegetatif  (empat  sampai enam  minggu).  Walaupun  demikian, aktivitas  ligninolitik  pada  medium sludge dari  fase  primordia  hingga  tubuh  buah tidak  teramati  pada  medium  ini,  karena tidak  ada  pembentukan  primordia  dan tubuh  buah  baik  pada  JTB  maupun  JTT (Tabel  3).  Aktivitas  Mn-P  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  aktivitas  lakase  dan LiP  pada  JTB.  Sedangkan  pada  JTT aktivitas  Li-P  maksimum  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  aktivitas  lakase  dan Mn-P. Aktivitas lakase dan Mn-P maksimum  dari  JTB  lebih  tinggi  diban- dingkan dengan yang dihasilkan dari JTT, sedangkan  untuk  Li-P  terjadi  hal  yang

## Widiastuti & Tri Panji
Tabel 3.  Aktivitas enzim ligninolitik ekstrak enzim kasar jamur tiram JTB dan JTT pada medium sludge dari saat inokulasi (vegetatif) hingga dua minggu setelah tubuh buah (setelah fase generatif).
Table 3.  Activity of ligninolytic enzyme of crude enzyme extract of oyster mushroom JTB and JTT grown on sludge media at inoculation (vegetative) until two weeks after fruiting body formation (after generative phase).
Lakase Laccase U/uL Mn-P U/uL Li-P U/uL Waktu/fase ( Period/phase ) JTB JTT JTB JTT JTB JTT Vegetatif ( Vegetative )
4 minggu ( weeks )
6 minggu ( weeks )
Generatif ( Generative ) Primordia ( Primordial ) Tubuh buah ( Fruiting body ) Setelah generatif ( Mature ) Setelah tubuh buah ( After fruiting body) 0,176 1,542 - - - 0,222 0,220 - - - 2,507 1,763 - - - tt 2,314 - - - 1,470 0,591 - - - 0,161 2,473 - - -
Keterangan ( Note ): tt : tidak terdeteksi aktivitas enzim ( undetected enzyme activity ) - : tidak dilakukan analisis ( not analyzed )
sebaliknya,  yaitu  aktivitas  Li-P  JTT  lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas  Li-P JTB.
Aktivitas  enzim  ligninolitik  yang dihasilkan  oleh  jamur  tiram  di  dalam medium sludge lebih rendah dibandingkan dengan  aktivitas  enzim  ligninolitik  pada medium  serbuk  gergaji,  kecuali  aktivitas Li-P  pada  JTT.  Hasil  ini  menunjukkan bahwa sludge lebih  berpotensi  sebagai medium  produksi  enzim  Li-P  oleh  JTT dibandingkan  dengan  serbuk  gergaji, namun tidak demikian halnya untuk lakase dan Mn-P. Rendahnya aktivitas lakase dan Mn-P  pada  medium sludge diduga disebabkan terdapatnya unsur-unsur mikro non  esensial  yang  relatif  tinggi  seperti  Pb dan  B.  Hasil  analisis  pendahuluan menunjukkan bahwa kandungan Pb dan B sludge ialah  23,2  ppm  dan  94,4  ppm. Selain  itu,  kedua  enzim  tersebut  adalah katalis  reaksi  oksidasi  sehingga  aerasi sangat mempengaruhi aktivitasnya. Secara fisik sludge memiliki  struktur  yang  lebih
padat  sehingga  aerasi  lebih  rendah dibandingkan dengan serbuk gergaji. Hasil analisis  menunjukkan  bahwa  aktivitas kedua enzim ini pada medium sludge baik oleh  JTB  maupun  JTT  lebih  rendah dibandingkan  dengan  aktivitas  enzim tersebut  pada  medium  serbuk  gergaji. Lebih rendahnya aktivitas lakase dan Mn- P  pada  medium sludge dibandingkan dengan  serbuk  gergaji  diduga  disebabkan aerasi  pada sludge yang  kurang  baik dibandingkan dengan serbuk gergaji.
Aktivitas enzim ligninolitik pada medium campuran sludge dan serbuk gergaji
Pada medium campuran serbuk gergaji  dan sludge, aktivitas  enzim ligninolitik  pada  umumnya  mencapai puncak  pada  minggu  keenam  (vegetatif) (1,586  dan 1,870  U/mL  untuk  lakase  JTB dan JTT; 3,912 & 2,121 U/mL untuk Mn- P JTB dan JTT) sedangkan aktivitas  Li-P dari  JTB  maksimum  teramati  pada
Pola aktivitas enzim ligninolitik Pleurotus ostreatus pada limbah sludge . .....
fase  pembentukan  primordia  (generatif) yaitu  2,509  U/mL  (Tabel  4).  Periode  ini sama  dengan  periode  aktivitas  maksimum Li-P  JTB  pada  medium  serbuk  gergaji. Hasil  ini  menunjukkan  adanya  pergeseran aktivitas Li-P tertinggi pada JTB dibandingkan dengan penggunaan medium sludge saja.  Walaupun  demikian  pada medium  campuran sludge dan  serbuk gergaji,  aktivitas  enzim  Li-P  dari  JTB lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas enzim Li-P di medium serbuk gergaji saja atau sludge saja.  Selain  itu,  pada  medium campuran sludge dan  serbuk  gergaji, aktivitas  Mn-P  dan  Li-P  JTB  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  aktivitas  Mn-P  dan Li-P  dari  JTT,  sedangkan  aktivitas  lakase JTT  pada  medium  campuran sludge dan serbuk  gergaji  lebih  tinggi  dibandingkan dengan JTB.
Penambahan  serbuk  gergaji  pada sludge dapat  meningkatkan  aktivitas enzim  ligni-nolitik  JTB,  sedangkan  untuk JTT  hanya  untuk  enzim  lakase  yang
meningkat.  Di  antara  ketiga  enzim ligninolitik  yang  dianalisis,  aktivitas lakase  tampak  paling  stabil  dari  fase vegetatif    hingga  fase  setelah  tubuh  buah yaitu  1,183-1,586  U/mL  pada  JTB  dan 1,016-1,870  U/mL  pada  JTT,  sedangkan untuk Mn-P dan Li-P penurunan aktivitasnya lebih tinggi khususnya setelah pembentukan tubuh buah.

## Aktivitas  enzim  ligninolitik  pada  medium serbuk gergaji yang diperkaya
Pada medium serbuk gergaji yang di- perkaya dengan dedak, kapur, dan gipsum, aktivitas Mn-P tertinggi JTB teramati pada minggu  keenam  (2,948  U/mL).  Aktivitas lakase maksimum untuk
JTB
(1,905 U/mL)  ialah   pada  fase   vegetatif sedangkan  Li-P  mencapai  puncak  pada fase
pembentukan tubuh buah (2,133  U/mL).  Pada  JTT  aktivitas  Mn-P maksimum  ialah   pada   fase   vegetatif, sedangkan   untuk   lakase dan Li-P terjadi
Tabel  4.    Aktivitas  enzim  ligninolitik  ekstrak  enzim  kasar  jamur  tiram  JTB  dan  JTT    pada  medium sludge + serbuk gergaji dari saat inokulasi (vegetatif) hingga dua minggu setelah tubuh buah (setelah fase generatif).
Table 4.  Activity of ligninolytic enzyme of crude enzyme extract of oyster mushroom JTB and JTT grown on  sludge+  sawdust  media  at  inoculation  (vegetative)  until  two  weeks  after  fruiting  body formation (after generative phase)
Lakase Lacasse U/uL Mn-P U/uL Li-P U/uL Waktu/fase ( Period/phase ) JTB JTT JTB JTT JTB JTT Vegetatif ( Vegetative )
4 minggu ( weeks )
6 minggu ( weeks )
Generatif ( Generative ) Primordia ( Primordial ) Tubuh buah ( Fruiting body ) Setelah generatif ( Mature ) Setelah tubuh buah ( After fruiting body ) 1,183 1,586 1,507 1,310 1,444 1,016 1,870 1,021 1,486 1,387 1,424 3,912 1,708 2,631 tt tt 2,121 2,025 1,419 tt 1,080 1,111 2,509 1,487 tt 0,233 1,900 0,771 0,627 tt
Keterangan  ( Note ): tt : tidak terdeteksi aktivitas enzim ( undetected enzyme activity )

## Widiastuti & Tri Panji
pada  fase  generatif  (Tabel  5).  Selain  itu, pada  medium  ini,  aktivitas  Mn-P  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  Li-P  dan lakase,  baik  yang  dihasilkan  oleh  JTB maupun  JTT.  Aktivitas  Mn-P  dan  Li-P maksimum yang dihasilkan oleh JTB lebih tinggi  dibandingkan  dengan  yang  dihasil- kan  oleh  JTT,  tetapi  sebaliknya  untuk lakase.  Hasil  ini  menunjukkan  bahwa pengayaan  serbuk  gergaji  tidak  mem- pengaruhi  pola  aktivitas  Mn-P,  namun menurunkan aktivitas tertingginya. Pengayaan  serbuk  gergaji  memperlambat aktivitas  Li-P,  yaitu  dari  fase  vegetatif menjadi  generatif,  khususnya  pada  JTT. Pengayaan  menurunkan  aktivitas  maksi- mum Mn-P, namun meningkatkan aktivitas Li-P tertinggi.
Aktivitas  enzim  ligninolitik  pada  medium sludge yang diperkaya
Pada  medium sludge yang  diperkaya terlihat  bahwa  enzim  ligninolitik  yang aktif  lebih  dahulu  ialah  Li-P,  baik  yang
dihasilkan  oleh  JTB  maupun  JTT. Aktivitas  lakase  dan  Mn-P  baru  nampak pada minggu keenam (vegetatif) dan pada minggu ini pula aktivitas lakase dan Mn-P mencapai  puncaknya.  Aktivitas  Li-P mencapai puncak pada saat vegetatif, yaitu minggu  keempat  untuk  JTB  dan    minggu keenam  untuk  JTT  (Tabel  6).  Hasil  ini menunjukkan bahwa secara umum aktivitas  tertinggi  enzim  ligninolitik  ialah pada  fase  vegetatif.  Pola  ini  sama  dengan pola  pada  medium sludge yang  tidak diperkaya,  yaitu  aktivitas  ligninolitik tertinggi ialah pada fase vegetatif. Kecuali Li-P,  aktivitas  lakase  dan  Mn-P  dari  JTB lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  JTT. Walaupun    demikian,   aktivitas    enzim ligninolitik  JTT  pada  fase  generatif  tidak dapat  teramati  karena  tidak  dijumpai primordia  dan  tubuh  buah.  Pengayaan sludge meningkatkan  aktivitas  enzim ligninolitik  tertinggi,  kecuali  Mn-P  yang dihasilkan  oleh  JTT.  Pengayaan  medium
Tabel  5.    Aktivitas  enzim  ligninolitik  ekstrak  enzim  kasar  jamur  tiram  JTB  dan  JTT    pada  medium serbuk gergaji yang diperkaya dari saat inokulasi (vegetatif) hingga dua minggu setelah tubuh buah (setelah fase generatif).
Table 5.  Activity of ligninolytic enzyme of crude enzyme extract of oyster mushroom JTB and JTT grown enriched  sawdust  media  at  inoculation  (vegetative)  until  two  weeks  after  fruiting  body formation (after generative phase).
Lakase Laccase U/uL Mn-P U/uL Li-P U/uL Waktu/fase ( Period/phase ) JTB JTT JTB JTT JTB JTT Vegetatif ( Vegetative )
4 minggu ( weeks )
6 minggu ( weeks )
Generatif ( Generative ) Primordia ( Primordial ) Tubuh buah ( Fruiting body ) Setelahgenerative( Mature ) Setelah tubuh buah ( After fruiting body ) 1,07 1,905 0,528 0,366 1,563 1,009 0,644 1,313 0,382 1,116 tt 2,948 1,446 tt 2,920 0,689 2,08 tt tt 0,895 tt 0,502 2,097 2,133 tt tt 1,523 1,219 1,828 tt
Keterangan  ( Note ): tt : tidak terdeteksi aktivitas enzim ( undetected enzyme activity )
Pola aktivitas enzim ligninolitik Pleurotus ostreatus pada limbah sludge . .....
Tabel 6. Aktivitas enzim ligninolitik ekstrak enzim kasar jamur tiram JTB dan JTT  pada medium sludge diperkaya  dari  saat  inokulasi  (vegetatif)  hingga  dua  minggu  setelah  tubuh  buah  (setelah  fase generatif).
Table 6.  Activity of ligninolytic enzyme of crude enzyme extract of oyster mushroom JTB and JTT grown on enriched sludge media at inoculation (vegetative) until two weeks after fruiting body (after generative phase).
Lakase Laccase U/uL Mn-P U/uL Li-P U/uL Waktu/fase ( Period/phase ) JTB JTT JTB JTT JTB JTT Vegetatif ( Vegetative )
4 minggu ( weeks )
6 minggu ( weeks )
Generatif ( Generative ) Primordia ( Primordial ) Tubuh buah ( Fruiting body ) Setelah generatif ( Mature ) Setelah tubuh buah  ( After fruiting body ) 0,141 1,606 0,528 0,963 0,7 tt 0,412 - - - tt 4,394 1,446 1,405 tt tt 2,151 - - - 2,706 0,43 1,971 0,896 tt 1,398 4,014 - - -
Keterangan  ( Note ): tt : tidak terdapat aktivitas enzim ( undetected e nzyme activity ) -  : tidak dilakukan analisis ( not being analyzed )
sludge yang diinokulasi JTB, menginduksi pembentukan tubuh buah, sedangkan pada JTT  pengayaan  tidak  berpengaruh  ter- hadap pembentukan tubuh buah. Terdapat- nya  vitamin  B  dalam  dedak  diduga  dapat meningkatkan aktivitas enzim ligninolitik. Pada  medium sludge yang  diperkaya, enzim  ligninolitik  yang  stabil  dari  fase vegetatif hingga generatif ialah lakase dan Li-P yang dihasilkan oleh JTB.
Aktivitas  enzim  ligninolitik  pada  medium campuran sludge dan serbuk gergaji yang diperkaya
Pengamatan aktivitas ligninolitik pada medium    campuran sludge dan   serbuk gergaji  yang  diperkaya  menunjukkan bahwa aktivitas lakase (1,697 & 2,113  U/mL  masing-masing  untuk  JTB dan  JTT)  dan  Mn-P  (2,672  &  1,57  U/mL masing-masing   untuk   JTB    dan   JTT )
tertinggi terjadi pada fase vegetatif (empat sampai enam minggu), sedangkan aktivitas  Li-P  tertinggi  pada  JTB  tercapai pada  fase  generatif  (0,717  U/mL). Aktivitas  Li-P  tidak  teramati  sejak  fase pembentukan tubuh buah. Aktivitas lakase dan  Li-P  yang  dihasilkan  oleh  JTT  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  yang  dihasil- kan  oleh  JTB,  sedangkan  untuk  Mn-P terjadi hal yang sebaliknya (Tabel 7).
Pengayaan  meningkatkan  aktivitas lakase tertinggi, baik yang dihasilkan oleh JTB maupun JTT, sedangkan untuk Mn-P dan Li-P pengayaan menurunkan aktivitas dan  stabilitas  enzim  ini.  Aktivitas  enzim yang  stabil  dari  fase  vegetatif  hingga generatif ialah lakase yang dihasilkan oleh JTB(dalam  kisaran  1,294  –  1,697  U/mL). Hasil ini sama dengan yang dijumpai pada medium  campuran sludge dan  serbuk gergaji tanpa pengayaan.

## Widiastuti & Tri Panji
Tabel  7.    Aktivitas  enzim  ligninolitik  ekstrak  enzim  kasar  jamur  tiram  JTB  dan  JTT    pada  medium sludge +  serbuk  gergaji  diperkaya  dari  saat  inokulasi  (vegetatif)  hingga  dua  minggu  setelah tubuh buah (setelah fase generatif).
Table 7.  Activity of ligninolytic enzyme of crude enzyme extract of oyster mushroom JTB and JTT grown on  enriched  sludge+  sawdust  media  at  inoculation  (vegetative)  until  two  weeks after  fruiting body (after generative phase).
Lakase Laccase U/uL Mn-P U/uL Li-P U/uL Waktu/fase ( Period/phase ) JTB JTT JTB JTT JTB JTT Vegetatif ( Vegetative )
4 minggu ( weeks )
6 minggu ( weeks )
Generatif ( Generative ) Primordia ( Primordial ) Tubuh buah ( Fruiting body ) Setelah generatif ( M ature) Setelah tubuh buah ( After fruiting body ) 1,697 1,6 1,461 1,294 1,507 1,4 2,113 - 1,375 1,273 tt 2,672 1,061 0,317 1,915 1,57 tt - tt tt tt 0,627 0,717 tt tt tt 1,452 - tt
tt
Keterangan ( Note ): tt : tidak terdeteksi aktivitas enzim ( undetected en zyme activity ) - : tidak dilakukan analisis ( not being analyzed )

## Aktivitas enzim ligninolitik secara umum
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan bahwa  aktivitas  tertinggi  enzim  lignino- litik  pada  umumnya  terjadi  pada  pem- bentukan  miselium  atau  fase  vegetatif, yaitu  berkisar  antara  empat  sampai  enam minggu,  sedangkan  pada  saat  fase generatif terjadi penurunan aktivitas enzim tersebut  (Tabel  8).  Hasil  serupa  juga dilaporkan  Ohga et  al .  dan  Singh et  al. dalam Machado  &  Matheus  (2006),  yang menunjukkan  bahwa  aktivitas  tertinggi lakase  untuk  sebagian  besar  fungi  seperti Agaricus  bisporus , P.  sajorcaju dan Lentinula  edodes ialah  pada  tahap kolonisasi  (miselium)  dan  penurunan aktivitas  enzim  terjadi  awal  pembentukan primordia.  Hal  serupa  juga  dikemukakan Durrant et al . (1991). Hasil serupa dilapor- kan  Xie et  al. (2001),  bahwa  aktivitas lakase  dan  Mn-P  pada Pleurotus sp.  yang ditumbuhkan  pada  medium  cair  mencapai
maksimum pada hari ke 10.  Namun, hasil ini sedikit berbeda dengan yang dilaporkan  Vladimir et  al .  (2003)  pada P.  ostreatus .  Dalam  penelitiannya  ditun- jukkan  bahwa  aktivitas  Mn-P  tertinggi terjadi  saat  kolonisasi  dan  awal  pem- bentukan  primordia  dan  kemudian  terjadi penurunan aktivitas Mn-P. Penurunan Mn- P  akan  diikuti  dengan  peningkatan aktivitas  lakase  hingga  pembentukan tubuh  buah.  Selanjutnya  pada  fase miselium  terjadi  kembali  peningkatan aktivitas Mn-P. Hal yang sama juga terjadi pada  medium sludge kecuali  untuk aktivitas  Mn-P.  Aktivitas  Mn-P  tertinggi terlihat  lebih  awal  (minggu  keempat  dan keenam, 2,507 & 2,314 U/mL), baik yang dihasilkan  oleh  JTB  maupun  JTT.  Untuk medium sludge yang  dicampur  serbuk gergaji,  aktivitas  lakase  JTB  maksimum (1,586  U/mL)    muncul  lebih  awal demikian  pula  aktivitas  Mn-P  yang dihasilkan  JTT  (2,121  U/mL),  walaupun
Pola aktivitas enzim ligninolitik Pleurotus ostreatus pada limbah sludge......
Tabel 8.   Pola aktivitas enzim ligninolitik dua galur jamur tiram dari fase vegetatif hingga generatif pada enam medium yang diuji.
Table  8.    Activity  pattern  of  two  strain  oyster  mushroom  from  vegetative  to  generative  phase  in  six sludge media examined.
JTB JTT Medium/Enzim Media/Enzyme Vegetatif Vegetative Generatif Generative Setelah generatif Mature Vegetatif Vegetative Generatif Generative Setelah generatif Mature Serbuk gergaji ( Sawdust) Lakase ( Laccase ) MnP LiP Sludge Lakase ( Laccase ) MnP LiP
Sludge +Serbuk gergaji Sludge + sawdust Lakase ( Laccase )
MnP LiP Serbuk gergaji+pengaya Sawdust + enriched sludge
Lakase ( Laccase ) MnP LiP Sludge +pengaya
Sludge + enriched sludge
Lakase ( Laccase ) MnP LiP
Sludge +serbuk gergaji+pengaya
Sludge +sawdust+enriched sludge Lakase ( Laccase ) MnP LiP vvv vvv v vv vv vv vvv vvv vv vv vv v vv vvv vv vv vvv v vv v vv - - - v vv vv v v vv v v v v v v v v - - - - vv - - vv vv - v - - vv vv - vvv vvv vv v vv vv vvv vv vv v vv V v vv vvv vv v v v v - - - - vv v v vv - vv - - - v - - vv vv - - - - vv - - v v - - - - v - -
Keterangan (Notes): v =rendah ( small ); vv = sedang ( moderate ); vvv = tinggi ( high )

## Widiastuti & Tri Panji
masih  dalam  fase  yang  sama  yaitu vegetatif. Perbedaan ini diduga disebabkan komposisi medium yang digunakan.
Ford et  al. (2007)  mengemukakan bahwa  umur  kultur  merupakan  salah  satu faktor  yang  mempengaruhi  biodegradasi PCP (pentaklorophenol) di samping adanya kosubstrat, dan komposisi substrat. Bagaimanapun  juga,  hasil  penelitian  ini menunjukkan bahwa  medium  yang meng- hasilkan aktivitas  enzim  ligninolitik  yang relatif  stabil  dari  saat  inokulasi  hingga setelah  fase  tubuh  buah  untuk  lakase berturut-turut ialah medium serbuk gergaji, sludge +serbuk  gergaji, sludge yang diperkaya, dan sludge +serbuk gergaji  yang  diperkaya,  sedangkan  untuk Mn-P  dan  Li-P  stabilitas  enzim  dalam penelitian ini tidak terlihat.
Becker  &  Sinitsyn  (1993),  Martinez et  al .  dan  Giardina et  al. dalam Lankinen (2004) mengemukakan bahwa P. ostreatus merupakan  jamur  yang  menghasilkan kombinasi  lakase  dan  Mn-P.  Hal  yang sama  juga  dikemukakan  Hatakka et  al .
(1994),  bahwa  Li-P  tidak  terdeteksi  baik dalam kultur cair maupun kultur padat dari substrat  lignoselulosa.    Namun  demikian Akhmedova (1996) dalam Caramelo et al. (1998)  menjumpai  adanya  aktivitas  Li-P pada P.  ostreatus .  Hal  yang  hampir  sama juga  dikemukakan  Chen et  al .  (1991), bahwa P.  chrysosporium tidak  mem- produksi  peroksidase  pada  kultur  cair, namun  pada  kultur  padat  yang  me- ngandung karbon rendah dengan penambahan sumber N dalam bentuk NH 4 dijumpai  aktivitas  Li-P.  Mester et  al . (1995) juga menunjukkan adanya peningkatan  aktivitas  peroksidase  sebagai respons  terhadap  konsentrasi  N  yang tinggi. Penelitian ini mendeteksi enzim Li- P  dengan  aktivitas  yang  tinggi  pada medium sludge yang  diperkaya.  Hal  ini diduga  disebabkan  lebih  rendahnya  C/N
rasio  atau  lebih  tingginya  kandungan  N dalam sludge dibandingkan dengan serbuk gergaji.
Aktivitas lakase, Mn-P dan Li-P dapat dijumpai  pada  limbah sludge atau  yang mengandung sludge yang  diinokulasi P.  ostreatus ,  namun  aktivitas  tersebut lebih  rendah  dibandingkan  dengan  serbuk gergaji.  Aktivitas  lakase  tertinggi  untuk JTB  dan  JTT  ialah  pada  medium campuran  serbuk  gergaji  dan sludge yang diperkaya  yaitu  sebesar  1,697  U/mL  dan 2,113  U/mL  (setara  dengan  4,24  U/g  dan 5,28  U/g).  Aktivitas  lakase  tertinggi  ini lebih  rendah  jika  dibandingkan  dengan aktivitas lakase A. bisporus yang dilaporkan  Bonnen et  al .  (1994)  yaitu sebesar 8,5 U/g.
Aktivitas Mn-P  tertinggi  dalam  pene- litian  ini  ialah  pada  medium sludge yang diperkaya  yaitu  mencapai  4,394  U/mL atau  setara  dengan  21,95  U/g  yang dihasilkan oleh JTB. Bonnen et al . (1994) menunjukkan  bahwa  aktivitas  Mn-P  ialah 2,4  U/g.  Aktivitas  enzim  pada  penelitian Bonnen et  al .  (1994)  lebih  kecil dibandingkan  dengan  aktivitas  Mn-P tertinggi  yang dihasilkan dalam penelitian ini.  Aktivitas  MnP  dalam  penelitian  ini juga  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan yang  dilaporkan  Xianghua et  al. (2007). Xianghua et al. (2007) melaporkan bahwa produksi  enzim  Mn-P  yang  dihasilkan oleh P.  chrysosporium ialah  sebesar 380 U/L, dan dengan penambahan glukosa aktivitasnya meningkat menjadi 666 U/L.
Pada medium sludge saja yang diper- kaya dijumpai aktivitas Li-P tertinggi baik pada  JTB  (2,706  U/mL  setara  13,53  U/g) maupun JTT (4,014 U/mL, setara 20,07  U/g).  Hasil  ini  menunjukan  bahwa sludge mempunyai  potensi  sebagai  sub- strat  enzim  LiP  dan  MnP  yang  diduga disebabkan  terdapatnya  unsur  mikro esensial seperti Mn dan Fe yang dperlukan
Pola aktivitas enzim ligninolitik Pleurotus ostreatus pada limbah sludge......
untuk  aktivitas  kedua  enzim  tersebut. Walaupun demikian perbaikan aerasi pada sludge diduga dapat memperbaiki aktivitas enzim tersebut.

## Kesimpulan
Aktivitas lakase, Mn-P dan Li-P dapat dijumpai  pada  limbah sludge yang diinokulasi P.  ostreatus. Aktivitas  enzim ligninolitik dipengaruhi oleh tahap perkembangan  jamur.  Pada  umumnya aktivitas  enzim  ligninolitik  tertinggi  ialah pada  fase  vegetatif  yaitu  mencapai  2,113; 4,394  dan  4,014  U/mL  masing  masing untuk  lakase,  Mn-P  dan  Li-P  yang teramati  pada  medium sludge +serbuk gergaji  yang  diperkaya, sludge yang diperkaya,  dan sludge yang  diperkaya.
Tidak  terbentuknya  tubuh  buah  pada media sludge dan  kaitannya  dengan morfologi  miselium  dan  pola  aktivitas enzim  merupakan  kajian  yang  dapat dipelajari  dalam  usaha  meningkatkan produksi  tubuh  buah  jamur  pada  medium sludge saja.

## DAFTAR PUSTAKA
Bonnen,  A.,  M.  L.H.  Anton    &  A.  B.  Orth.
(1994).  Lignin-degrading  enzymes  of  the commercial  button  mushroom Agaricus bisporus . Appl.  Environ.  Microbiol., 60 , 960-965.
Bourbonnais,  R.  &  G.  Price  (1992).  Demethy- lation  and  delignification  of  kraft  pulp  by Trametes  versicolor laccase  in  the precence  of  2,2’  azinobis  (3-ethylen thiazoline-6  sulphonate). Appl.  Microbial. Biotechnol ., 36, 823-827.
Caramelo, L., Martinez M. J. & A. T. Martinez (1998). A search for ligninolytic peroxidase in the fungus Pleurotus eryngii involving  alpha  keto  g  thiomethylbutyric acid  and  lignin  model  dimmers. Appl. Environ. Microbiol. , 60 , 916-922.
Chen, A.H.C., C.G. Dosoretz & H. E Grethlein
(1991).  Ligninase  production  by  immobi- lized  cultures  of Phanerochaete  chryso- sporium grown  under  nitrogen-sufficient conditions. Enzyme  Microb.  Technol ., 13, 404-407.
Collins,  P.  J.  &  A.  D.  Dobson  (1997). Regulation of laccase gene transcription in
Trametes versicolor . Appl. Environ.
Microbiol ., 63 , 3444-3450.
Durrant, A. J., D.A.Wood & R. B. Cain (1991).
Lignocellulose biodegradation by
Agaricus  bisporus during  solid  substrate fermentation. J.  Gen.  Microbiol ., 137 , 751-755.
Ford, C. I., M. Walter, G. I. Northcott, H. J. Di, K.  C.  Cameron  &  T.  Trower  (2007). Fungal inoculum properties : Extracellular enzyme expression and pentachlorophenol removal by new Zealand Trametes species in  contaminated  field. J.  Environ.  Qual.,
36, 1749-1759.
Galhaup,  C.,  H.  Wagner,  B.  Hinterstoisser  & D.  Haltrich  (2003).  Increased  production of  laccase  by  the  wood  degrading basidiomycete Trametes pubescens . Enzyme Microb. Technol., 30 , 529-536.
Gianfreda,  I.,  F.  Xu  &  J.  M  Bollag  (1999).
Laccase  a  useful  group  of  oxidoreductive enzymes. Biorem. J. , 3 , 1-25.
Gunawan,  A.W.  (1990). Budidaya  Jamur Tiram (Audio  Visual).  Bogor,  PAU  Ilmu
Hayat, Institut Pertanian Bogor.  22p.
Hatakka, A. (1994). Lignin Modifying enzyme from  selected  white-rot  fungi:  Production and  role  in  lignin  degradation  FEMS Microbiol. Rev ., 13 , 125-135.
Karahanian,  E.,  G.  Corsini,  S.  Lobos  &
R. Vicufia (1998). Structure and expression  of  a  laccase  gene  from  the ligninolytic  basidiomycete Ceriporiopsis subvermi-ispora . Biochim.  Biophys.  Acta,
1443 , 65-74.

## Widiastuti & Tri Panji
Lankinen,  P.  (2004).  Ligninolytic  enzymes  of the basidiomycetes fungi Agaricus bisporus and Phlebia  radiate on  ligno- cellulose-containing  media.  ( Disertasi ) Division  of  Microbiology  Department  of Applied  Chemistry  and  Microbiology. Viikki Biocenter, University of Helshinki, Finland. 23 Nov 2004.
Lante,  A.,  A.  Crapisi,  G.  Pasini,  A.  Zamorani & P. Spettoli (1992). Immobilized laccase for  must  and  wine  processing, Enzyme Eng ., 11 , 558-562.
Machado,  K.  M.  G.  &  D.  R.  Matheus  (2006). Biodegradation of remazol briliant blue R by ligninolytic enzymatic complex produced by Pleurotas ostreatus . Brazilian. J. Microbiol., 37, 468-473.
Mester,  T.  Pena  M.  &  J.  A.  Field  (1995). Nutrient regulation of extracellular peroxidases  in  the  white  rot  fungus Bjerkandera sp  strain  BOS55. Appl. Environ. Microbiol. Biotechnol., 44 , 778- 784.
Moreira,  M.T,    G.  Feijoo,  R.  Sierra-Alvarez, J.M  Lema  &  J.  A.  Field    (1997). Biobleaching  of  oxygen  delignified  kraft pulp  by  several  white  rot  fungal  strains. J. Biotechnol . ,53, 237-251.
Niku-Poavola, M. L., E. Karhunen, P. Salola & V. Raunia (1988). Ligninolytic enzyme of the  white-rot  fungus Phlebia  radiata . Biochem. J ., 254, 877-884.
Palmieri,  G.,  P.  Giardina,  C.  Bianco., B. Fontanella & G. Sannia (2000). Copper induction  of  laccase  isoenzymes  in  the lignolytic  fungus Pleurotus  ostreatus . Appl. Environ. Microbiol ., 66 , 920-924.
Pointing,  S.  B.,  E.  B.  G.  Jones  & L. L. P. Vrijmoed (2000). Optimization of laccase production by Pycnoporus sanguines in  submerged  liquid  culture. Mycologia, 92 , 139-144.
Tien,  M.  &  T.  K.  Kirk  (1984).  Lignin- degrading  enzyme  from Phanerochaete
chrysosporium :  Purification,  characte- rization,  and  catalytic  properties  of  a unique  H 2 O 2 -requiring  oxygenase. In Proc.  Natl.  Acad.  Sci. USA, 81 ,  2280- 2284.
Vladimir,  E.,  E.  David,  K.  Eva,  T.  Nino  &
K. Tamar (2003). Lignocellulolytic enzyme  activity  during  growth  and fruiting  of  the  edible  and  medicinal mushroom Pleurotus  ostreatus (Jacq.  Fr) Kumm. (Agaricomycetideae). Internai.  J. Medicinal Mushroom , 5 , 193-198
Widiastuti,  H.  &  A.  W.  Gunawan  (1991). Pemanfaatan limbah pabrik kertas sebagai campuran  medium  dalam  budidaya  jamur tiram ( Pleurotus  ostreatus ). Dalam: Darnaedi  D. et  al. (Ed), Prosiding Seminar  Ilmiah  dan  Kongres  Nasional Biologi  X,  24-26  September 1991.  Bogor,
Perhimpunan  Biologi  Indonesia  dan  PAU Ilmu Hayat IPB.
Widiastuti, H., Siswanto & Suharyanto (2007). Optimasi  pertumbuhan  dan  aktivitas enzim  ligninolitik  dari Omphalina sp  dan Pleurotus ostreatus pada fermentasi padat. Menara Perkebunan, 75, (2), 93-105.
Xie,  J.,  Sun  X,  I.  Ren  &  Y.  Z.  Zhang  (2001). Studies  on  lignocellulolytic  enzymes production  and  biomass  degradation  of Pleurotus sp2  and Trametes gallica in wheat  straw  cultures. Sheng  Wu  Gong
Cheng Xue Bao, 17, (5), 575-578.
Xianghua,  W.,  F.  Yan  &  Z.    Xiaoyan  (2007). Influence  of  glucosa  feeding  on  the ligninolytic  enzyme  production  of  the white rot fungus
Phanerochaeta chrysosporium. Front Environ. Sci. Engin. China, 1, (1), 89-94.
Yaropolov,  A.  I.,  O.  V.  Scorobogat’ka,
S  S  Vartanov  &  S.  D.  Varvolomeyev
(1994).  Laccase:  properties,  catalytic mechanism, and applicability. Appl.
Biochem. Biotechnol., 49 , 257-280.