## UJI PENGIKATAN KOLESTEROL OLEH EKSTRAK METANOL BEKATUL BERAS KETAN HITAM SECARA IN VITRO
Dewi Kurnia*, Nenden Ayu Lisniawati, Deden Indra Dinata Sekolah Tinggi Farmasi Bandung *email: dewi.kurnia@stfb.ac.id
Received 11 May 2019 Accepted 28 June 2019

## Abstrak
Beras  ketan    hitam  merupakan  varietas  lokal  yang  mengandung  pigmen  paling  baik, dibandingkan  dengan  beras  putih  atau  beras  warna  lain.  Warna  hitam  pada  beras  ketan hitam  berasal  dari  lapisan  bekatul  dan  bagian  bulir  berasnya  yang  mengandung  pigmen antosianin berwarna ungu. Bekatul beras ketan hitam mengandung serat serealia yang baik bagi organ pencernaan. Pada penelitian ini dilakukan pengujian pengikatan kolesterol oleh ekstrak  metanol  bekatul  beras  ketan  hitam.  Ekstraksi  dilakukan  dengan  cara  maserasi menggunakan  metanol  70%  dalam  kondisi  asam  (penambahan  HCl  1%).  Uji  pengikatan kolesterol oleh ekstrak metanol bekatul beras ketan hitam dilakukan secara in vitro dengan metode pembentukan kompleks kolesterol dengan FeCl 3 . Serapan kolesterol bebas diukur menggunakan spektrofotometer sinar tampak pada serapan maksimum panjang gelombang 526  nm.  Randemen  ekstrak  yang  diperoleh  adalah  sebesar  17,53%.  Identifikasi  ekstrak menggunakan  KLT  dengan  eluen  butanol  :  asam  asetat  :  air  (4,5:1:4,5)  menunjukan adanya  senyawa  golongan  antosianin.    Hasil  uji  pengikatan  kolesterol    menunjukkan bahwa  ekstrak  metanol  bekatul  beras  ketan  hitam  dengan  konsentrasi  20  ppm  dapat menurunkan  kolesterol  sebesar  47,46%.  Peningkatan  konsentrasi  ekstrak  menunjukan semakin besar pula penurunan kadar kolesterol bebas.
Kata kunci: bekatul beras ketan hitam, pengikatan kolesterol, antosianin, in vitro, spetkrofotometer sinar tampak

## Abstract
Black glutinous rice is a local variety that contains the best pigments, as opposed to white rice or other color rice.  The black color in  black glutinous rice comes from  the lining of the  bran  and  the  layer  of  the  heat  which  contain  a  purple  anthocyanin  pigment.  Black glutinous  rice  bran  contains  a  good  cereal  fiber  for  the  digestive  organs.  In  this  study, cholesterol  binding  testing  was  conducted  on  the  extract  of  methanol  bran  in  black glutinous  rice.  Extraction  is  carried  out  by  maceration  using  methanol  70%  in  acidic conditions  (HCl  1%).  Test  cholesterol  binding  by  the  extract  of  the  black  glutinous  rice bran  in  vitro  by  the  forming  cholesterol  complexes  with  FeCl 3 method.  Free  cholesterol uptake  is  measured  using  spectrophotometers  visible  at  maximum  absorption  of  526  nm wavelengths. The extract yield obtained was 17.53%. Identification of extracts using TLC with eluent buthanol : acetic acid : water (4.5:1:4,5) indicates the presence of anthocyanin compounds. The results of cholesterol binding test showed that the ethanol extract of black glutinous rice bran with a concentration of 20 ppm can lower cholesterol by 47.46%. An increase  in  the  concentration  of  the  extract  showed  more  reduction  in  free  cholesterol levels.
Keywords: Black  glutinous  rice  bran,  cholesterol  binding,  in  vitro,  anthocyanin, spectrophotometer visible

## Pendahuluan
Jumlah
penderita
penyakit kardiovaskular  dari  tahun  ke  tahun mengalami  peningkatan  yang  cukup tinggi.  Salah  satu  faktor  penyebabnya adalah  pola  makanan  yang  kurang  baik, misalnya  mengkonsumsi  makanan  cepat saji,  gorengan,  merokok,  dan  minuman beralkohol. Mengkonsumsi makanan yang berlemak    dapat  meningkatkan  kadar kolesterol dalam plasma. Kadar kolesterol tinggi  dalam  darah  dapat  membentuk endapan  pada  dinding  pembuluh  darah sehingga menyebabkan penyempitan pembuluh darah yang disebut aterosklerosis. Penyempitan pada pembuluh  darah  jantung  menyebabkan penyakit  jantung  koroner  dan  bila mengendap  pada  pembuluh  darah  di  otak menyebabkan  penyakit  serebrovaskuler (Sudiarti, 2011). Oleh karena itu, menjaga asupan makanan agar tidak menyebabkan kadar  kolesterol  tinggi  dalam  plasma sangat  penting  untuk  menurunkan  faktor resiko  terjadinya    penyakit  jantung koroner (PJK).
Bekatul  adalah  bagian  terluar  dari bagian  bulir,  termasuk  sebagian  kecil endosperm berpati. Biasanya pemanfaatan bekatul  padi  lebih  banyak  ditujukan sebagai pakan ternak. Bekatul beras ketan hitam  merupakan  fiber  yang  kaya  akan serat  dan  sering  dihilangkan  pada  saat penggilingan  beras . Bekatul  ini  telah diteliti  mengandung  senyawa  bioaktif diantaranya tokoferol, tokotrienol, oryzanols,  vitamin  B  kompleks,  dan senyawa fenolik. Kandungan yang penting  adalah  antosianin  yaitu  suatu suatu pigmen alami  yang termasuk dalam keluarga besar flavonoid yang larut dalam air,  yang bertanggung jawab memberikan warna  merah,  ungu,  dan  biru  pada tanaman    (Zhang et  al. ,  2010).  Pada penelitian  yang  dilakukan  oleh  Fajrin (2010),  diketahui  bahwa    ekstrak  etanol
beras  ketan  hitam  mengandung  senyawa antioksidan  jenis  antosianin  yang  dapat menghambat oksidasi Low Density Lipoprotein (LDL) pada tikus putih jantan yang  diberi  perlakuan  minyak  goreng bekas pakai. Karena LDL yang teroksidasi  dapat  menyebabkan viskositas darah menjadi lebih kental dan menyebabkan
resiko terjadinya penyumbatan
pembuluh darah (asterosklerosis) menjadi lebih tinggi.
Dari  ketiga  jenis  beras  yaitu  beras putih,  beras  merah  dan  bersa  hitam, diketahui kadar antosianin tertinggi terdapat  pada  ekstrak  bekatul  beras (Widarta,  Nocianitri  and  Sari,  2013). Ekstrak  bekatul  beras  hitam  memiliki kandungan  total  fenolik  yang  tinggi  dan aktivitas  sebagai  peredam  radikal  bebas seperti  beras  merah.  Sedangkan  ekstrak bekatul beras putih menunjukkan kandungan fenolik dan aktivitas antioksidan  terendah.
Bekatul beras mengandung serat serealia, yakni serat pangan yang kualitasnya  paling  baik  bagi  organ pencernaan.  Selain  itu,  dalam  bekatul tersebut  juga  terkandung  minyak  nabati yang  kaya  akan  asam  amino,  vitamin  B dan  mineral.  Kandungan  bekatul  juga memberikan efek kenyang dan membersihkan saluran pencernaan. Manfaat  lainnya  juga  dapat  menurunkan kadar gula dan kolesterol darah, sehingga sangat bermanfaat untuk mencegah penyakit  diabetes  dan  penyakit  lain  yang berhubungan  dengan  kolesterol  seperti aterosklerosis dan PJK (Sarasvati, 2008).

## Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  adalah  neraca analitik, gelas piala, gelas ukur, labu ukur, corong,  kaca  arloji,  cawan  penguap, kertas saring, evaporator, pipet tetes, pipet
volum  dan  bulp,  batang  pengaduk, spatula,  camber,  tabung  reaksi,  vortex, termometer,    penangas  air,  evaporator, sentrifuga, mikropipet, kuvet, spektrofotometer UV- Vis . Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah ketan hitam,  metanol  70%,  metanol  p.a,  HCl pekat,  CH 3 COOH,  butanol,  NaOH,  plat KLT  GF 254 ,  aquadest,  kolesterol  murni, FeCl 3, isopropanol.

## Prosedur Penelitian
Sampel  bekatul  beras  ketan  hitam diambil  dari  penggilingan  padi  di  Desa Sukajaya,  Sumedang  Selatan.  Sampel yang    didapat  diayak  dan  disimpan  di dalam  wadah  tertutup  dan  tempat  gelap. Sebanyak  300  gram  sampel  diekstraksi dengan  teknik  maserasi  menggunakan 1000  ml  larutan  metanol  70%  dalam suasana  asam  (penambahan  HCl  1%). Proses  maserasi  dilakukan  dalam  wadah botol  kaca  berwarna  gelap  selama  3x24 jam dengan penggantian pelarut setiap 24 jam. Kemudian ekstrak disaring menggunakan  kertas  saring  dan  filtrat yang  diperoleh  kemudian  dipekatkan dengan evaporator (Suhartatik, 2013).

## Analisis Kualitatif Antosianin Uji Warna
Ke  dalam  tabung  reaksi,  sebanyak  1 mL  ekstrak  bekatul  beras  ketan  hitam ditambahkan  1  mL  HCl  2M  kemudian dipanaskan  sampai  mendidih  selama  5 menit. Ekstrak dinyatakan positif
mengandung  antosianin  jika  berubah menjadi  warna  merah.  Selanjutnya  bila ditambahkan  NaOH  2M  tetes  per  tetes warna  merah  tersebut  akan  berubah menjadi  warna  hijau  biru  dan  memudar secara perlahan (Harborne, 1998).

## Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Fase  diam  yang  digunakan  adalah silica  gel  GF254  dengan  fase  gerak butanol:asam  asetat:aquades  (4,5:1:4,5). Pita  hasil  pemisahan  diamati  di  bawah lampu  sinar  UV  dan  nilai  Rf  dari  pita
yang  dihasilkan  dibandingkan  dengan tabel  referensi  antosianin  (Harborne, 1998).

## Pembuatan Larutan
Larutan  induk  kolesterol  1000  ppm dibuat  dengan  menimbang  100    mg kolesterol  dilarutkan  dengan  isopropanol dalam  labu  ukur  100  ml.  Larutan  FeCl 3 dibuat  dengan  cara  melarutkan  sebanyak 8,4 gram FeCl 3 dalam 100 mL asam asetat 1%.  Pereaksi  ini  disimpan  dalam  botol gelap.  Pembuatan  larutan  induk  ekstrak bekatul  1000  ppm  dilakukan  dengan melarutkan    10  mg  ekstrak  bekatul  ketan hitam dalam labu ukur 100 ml, selanjutnya  dilarutkan  dengan  metanol sampai tanda batas.

## Pembuatan Kurva Standar Kolesterol
Dari  larutan  induk  kolesterol  1000 ppm  dibuat  seri  pengenceran  dengan konsentrasi  80;  100;  120;  140;  160;  dan 180  ppm.  Selanjutnya  pada  setiap konsentrasi  diambil  sebanyak  2,5  ml  ke dalam  tabung  reaksi.  Masing-masing konsentrasi  ditambahkan  2  ml  pereaksi FeCl 3 .  Kemudian  di  vortex  dan  dibiarkan selama  30  menit  pada  suhu  kamar. Larutan dibaca absorbansinya
menggunakan spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 526 nm. Kurva  standar  in  digunakan  untuk menentukan  konsentrasi  kolesterol  yang tersisa.

## Pembuatan  Larutan  Uji  Ekstrak  Bekatul Beras ketan Hitam
Dari  larutan  induk  ekstrak  bekatul beras  ketan  hitam  1000  ppm  diambil sebanyak  100  μl,  120  μl;140  μl;  160  μl; 180 μl; dan 200 μl,  dimasukkan kedalam labu  ukur  10  ml,  selanjutnya  dilarutkan dengan  metanol  sampai  tanda  batas. Konsentrasi  larutan  yang  dihasilkan adalah 10; 12; 14; 16; 18; dan 20 ppm.

## Pengukuran Kadar Kolesterol Bebas
Sebanyak  5  mL  dari  masing-masing konsentrasi  larutan  uji  ekstrak  diambil kemudian  masing-masing  ditambahkan  5 ml larutan kolesterol 180 ppm. Campuran larutan  dihomogenkan  dan  diinkubasi selama  60  menit  pada  suhu  37 0 C, kemudian  disentrifuga  selama  5  menit dengan  kecepatan  4000rpm.  Sebanyak  5 mL  supernatan  yang  dihasilkan  diambil kemudian  ditambahkan  dengan  2  ml pereaksi
FeCl 3 ,
selanjutnya dihomogenkan  dan  didiamkan  selama  30 menit  pada  suhu  kamar.  Pengukuran serapan  larutan  dilakukan  menggunakan spektrofotometer  sinar  tampak  dengan panjang  gelombang  526  nm  (Puspitasari, 2014).  Kurva  standar  digunakan  untuk menentukan  konsentrasi  kolesterol  yang tersisa.  persentasi  penurunan  kolesterol dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut :
𝐴 = 𝐶 − 𝐵 𝐵 × 100%
Dimana :
A = persentase penurunan kolesterol B = konsentrasi kolesterol akhir C = konsentrasi kolesterol awal

## Hasil dan Pembahasan
Teknik  ekstraksi  yang  dilakukan  pada penelitian  ini  adalah  metode  maserasi. Maserasi  merupakan  proses  perendaman sampel  dengan  pelarut  organik  yang digunakan  pada  suhu  ruangan.  Hal  ini dilakukan  untuk  memperoleh  senyawa antosianin yang bersifat termolabil.
Metode  maserasi  ini  adalah  metode  yang sangat  menguntungkan  untuk  senyawa yang  termolabil.  Pada  proses  ekstraksi juga  dilakukan  penambahan  HCl  hal  ini dimaksudkan untuk menstabilkan senyawa  antosianin  yang  terkandung dalam  kulit  ari  ketan  hitam.  Stabilitas antosianin  dipengaruhi  oleh  pH,  oksigen, suhu  dan  cahaya  (Samber  dkk,  2011).
Antosianin memiliki cincin aromatik yang mengandung gugus polar (hidroksi, karboksi,  metoksi)  dan  residu  glikosil yang menghasilkan molekul polar dengan keadaannya  yang  polar,  antosianin  lebih mudah  larut  dalam  pelarut  polar  seperti metanol  sedangkan  asam  klorida  dalam pelarut  akan  mendenaturasi  membran  sel kemudian  melarutkan  pigmen  antosianin keluar  dari  sel.  Dari  hasil  pemekatan filtrat  diperoleh  ekstrak  sebanyak  52,59 gram  atau  setara  dengan  randemen 17,53% terhadap berat sampel.
Ekstrak  pekat  selanjutnya  dianalisis secara kualitatif dengan  pengujian warna. Pengujian warna dilakukan dengan penambahan  HCl  dan  NaOH.  Dari  hasil pengujian  warna  diketahui  senyawa  yang terkandung  pada  kulit  ari  ketan  hitam adalah  senyawa  antosianin.  Hal  ini ditunjukan  pada  saat  penambahan  HCl 2M  yang  kemudian  dipanaskan  terjadi perubahan warna dari warna hitam (warna ekstrak)  menjadi  warna  merah.  Sampel yang telah dipanaskan tersebut ditambahkan NaOH 2M, kemudian terjadi perubahan  warna  dari  merah  menjadi hijau  kebiruan,  namun  warna  tersebut perlahan-lahan memudar.
a.
b.
Gambar  1 .  Uji  warna  antosianin;  a) penambahan HCl 2M; b) Penambahan NaOH 2M
Perubahan  warna  pada  gambar  1 disebabkan oleh adanya perubahan struktur  pada  antosianin  akibat  pengaruh ion  H + dan  ion  OH - .  Dibawah  ini merupakan  perubahan  struktur  yang terjadi:
a. b. O + OH OH H OR 1 OH HO O OH OH H OR 1 OH HO OH - H + OH
Gambar 2 . (a) antosianin dalam kondisi asam dan (b) antosianin dalam kondisi basa (Hayati, dkk. 2012)
Salah satu kestabilan senyawa antosianin  yaitu  dipengaruhi  oleh  pH. Senyawa  antosianin  lebih  stabil  dalam suasana asam dibandingkan dengan
suasana basa. Identifikasi  selanjutnya  menggunakan kromatografi lapis tipis untuk
membuktikan  senyawa  yang  terkandung pada  sampel  bekatul  beras  ketan  hitam adalah  senyawa  antosianin.  Fase  diam yang  digunakan  yaitu  silika  gel  GF 254 dengan  fase  gerak  BAA  (butanol:asam asetat:aquadest  =  4,5:1:4,5).  Penggunaan fase  gerak  BAA  dikarenakan  fase  gerak tersebut  memberikan  hRf  sedang  yaitu berkisar antara 68-71. Polaritas fase gerak akan  menentukan  kecepatan  migrasi  zat terlarut yang selanjutnya akan menentukan  nilai  Rf.  Fase  gerak  yang memiliki  polaritas  yang  rendah  akan meminimalkan serapan komponen terhadap  campuran  pelarut  sehingga hingga Rf akan meningkat secara signifikan.  Hasil  identifikasi  antosianin dari  ekstrak  kulit  ari  ketan  hitam dibandingkan dengan hasil sesuai literatur Harborne (1998). Plat KLT hasil pemisahan  kemudian  diamati  dibawah sinar  UV  366  nm.  Terdapat  noda berwarna  magenta  dengan  hRf  70  yang menunjukan  bahwa  pita  tersebut  adalah senyawa antosianin (Gambar 3).
Gambar  3 .  Hasil  identifikasi  dengan  KLT dibawah sinar UV 366 nm
Untuk keperluan uji pengikatan kolesterol  secara in  vitro ,  dibuat  kurva larutan  deret  standar  kolesterol  yang untuk  mendapatkan  persamaaan  regres linier.  Analisis  dilakukan  menggunakan spektrofotometer  sinar  tampak  pada panjang  gelombang  526.  Berikut  adalah data  serapan  deret  dan  kurva  kalibrasi untuk standar kolesterol.
Magenta
Tabel 1 . Data serapan standar kolesterol Konsentrasi (ppm) Serapan 80 0,377 100 0,390 120 0,412 140 0,423 160 0,437 180 0,450
Gambar 4 . Kurva kalibrasi standar kolesterol
Berdasarkan  hasil  pengukuran  serapan deret standar kolesterol diperoleh persamaan  linear  y  =  0,0007  x  +  0,3188 dengan  nilai  r  =  0,9958.  Persamaan  ini digunakan  pada  perhitungan  kolesterol bebas  yang  tidak  terikat  oleh  sampel ekstrak bekatul beras ketan hitam.
Pengujian pengikatan kolesterol dilakukan  secara in  vitro oleh  sampel ekstrak  bekatul    ketan  hitam  pada berbagai  konsentrasi.  Hal  ini  bertujuan untuk melihat  pengaruh  konsentrasi ekstrak  kulit  ari  bekatul  ketan  hitam terhadap  kemampuannya  untuk  mengikat kolesterol. Sampel dengan konsentrasi 10, 12,  14,  16,  18,  dan  20  ppm  ditambahkan dengan  larutan  kolesterol  180  ppm. Supernatan  yang  dihasilkan  pada  proses sentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan  pereaksi  FeCl 3 untuk  membentuk senyawa  komplek  berwarna.  Intansitas warna  yang  dihasilkan  terjadi  karena reaksi  antara  kolesterol  bebas  dengan FeCl 3. Warna  yang  terbentuk  kemudian diukur  pada  panjang  gelombang  526  nm.
Berikut  asalah  data  serapan  kolesterol bebas setelah penambahan ekstrak bekatul ketan hitam.
Tabel 2. Kadar Kolesterol bebas setelah direaksikan dengan ekstrak bekatul Kons ekstrak (ppm) Kadar kolesterol bebas (ppm) % Penurunan Kolesterol 10 178,75 0,69 12 166 7,78 14 138,85 22,86 16 121,74 32,38 18 113,14 37,14 20 94,57 47,46
Data  pada  Tabel  2  menunjukkan bahwa  pada  konsentrasi  tertinggi  20  ppm ekstrak  kulit  ari  ketan  hitam  mempunyai kemampuan  tertinggi  sebagai  penurun kolesterol yaitu sebesar 47,46%.
Penurunan kolesterol bebas terjadi seiring dengan semakin meningkat dengan meningkatnya  konsentrasi  ekstrak  yang ditambahkan.  Ekstrak bekatul beras ketan hitam  dapat  menurunkan  konsentrasi kolesterol karena adanya senyawa antosianin,  mekanisme  kerjanya  yaitu dengan  menghambat  proses  aterogenesis dengan  mengoksidasi  lemak  jahat  dalam tubuh,  sehingga  kolesterol  yang  terdiri dari  lemak  jahat  dapat  segera  larut. Kandungan  senyawa  antosianin  juga diketahui  dapat  melindungi  integritas  sel endotel  yang  melapisi  dinding  pembuluh darah  sehingga  tidak  terjadi  kerusakan (Fajrin, 2010).

## Kesimpulan
Ekstrak bekatul ketan hitam berpotensi menurunkan  kolesterol  secara in  vitro .
Hal  ini  ditunjukan  oleh  pengikatan kolesterol  tertinggi  pada  konsentrasi ekstrak 20 ppm yaitu penurunan kolesterol  bebas  sebesar  47,46  %. Semakin besar konsentrasi ekstrak
bekatul,  maka  semakin  banyak  kolesterol yang  dapat  diikat  sehingga  kolesterol
bebas semakin sedikit.

## Daftar Pustaka
Fajrin,  F.  A.  (2010)  :  Aktivitas  Ekstrak Etanol Ketan Hitam Untuk Menurunkan Kadar Kolesterol, Jurnal  Farmasi  Indonesia, 5 ,  63  - 69.
Harborne,  J.  B.  (1998)  :  Phytochemical Methods  A  Guide to Modern
Techniques of Plant Analysis,
Springer  Science  &  Business  Media,
London, 67.
Hayati, E.K.,  Budi,  U.S.,  dan Hermawan, R.  (2012)  :  Konsentrasi  Total Senyawa Antosianin  Ekstrak kelopak Bunga  Rosella  ( Hibiscus  sabdariffa L.)  Pengaruh  Temperatur  dan  pH, Jurnal Kimia , 2 , 138 – 147.
Puspitasari,  Melia.  (2014). Efek  Iridiasi Gamma Terhadap Kemampuan Kitosan  Dalam  Menurunkan  Kadar Kolesterol  Secara  In  Vitro ,  Skripsi sarjana Farmasi, UIN Syarif
Hidayatullah, Jakarta.
Samber  dkk.  (2011)  :  Karakteristik Antosianin  Sebagai  Pewarna  Alami. Seminar Nasional Pendidikan Biologi
FKIP UNS.
Sarasvati  Tim.  (2008)  :  Rainbow  Diet,
PT. Gramedia Pustaka Utama,
Jakarta.
Sudiarti,  T  dan  Indrawani,  Y.M.  (2011)  :
Gizi dan Kesehatan Masyarakat Edisi
1, Rajawali Pers, Jakarta.
Suhartatik,  N.,  Cahyanto,  M.N.,  Raharjo, S.,  dan  Rahayu,  E.S.  (2013)  :
Aktivitas  Antioksidan  Antosianin Beras Ketan Hitam Selama Fermentasi, Jurnal  Teknologi  dan Industri Pangan , 24 , 115 - 119.
Widarta,  I.W.R.,  Nocianitri,  K.A.,  dan Sari,  L.P.I.P.,  (2013)  :  Ekstraksi Komponen  Bioaktif  Bekatul  Beras
Lokal Dengan Beberapa Jenis Pelarut, Jurnal  Aplikasi  Teknologi Pangan , 2 , 75 - 79.
Zhang,  M.  W. et  al. (2010)  ‘Phenolic profiles  and  antioxidant  activity  of black rice bran of different commercially  available  varieties’,
Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry , 58(13), pp.  7580–7587. doi: 10.1021/jf1007665.