## Tingkat  Fertilisasi  Oosit  Sapi  Silangan  Simmental  Peranakan  Ongole Secara In Vitro
(In Vitro Fertilization Rate Of Bovine Simmental Ongole Crossbred Oocytes)
Hermilinda Parera 1 , Bambang Hadisutanto
1. Program Studi Kesehatan Hewan, Politeknik Pertanian Negeri Kupang, Jalan Adisucipto Penfui Kupang E-mail: milindaparera81@gmail.com . 2 Program Studi Produksi Ternak, Politeknik Pertanian Negeri Kupang, Jalan Adisucipto Penfui Kupang. E- mail: bhadisutanto@gmail.com

## Abstrak
Salah satu  program   crossbreeding di  Indonesia melalui  inseminasi  buatan (IB) menggunakan  betina lokal  Peranakan Ongole (PO) disilangkan dengan Simmental, menghasilkan keturunan sapi Simmental Peranakan Ongole (SimPO) yang memiliki  keunggulan  bobot  lahir  tinggi  dan  pertumbuhan  yang  cepat.  Sapi  SimPO  (Fenotip)  F2  diduga  mengalami penurunan performan reproduksi sehingga tingkat kebuntingan menjadi rendah. Keberhasilan kebuntingan dapat terjadi apabila oosit dapat terfertilisasi. Tujuan dari penelitianini untuk mengetahui tingkat fertilisasi secara in vitro pada oosit sapi SimPO. Oosit sapi dari ovarium yang berasal dari rumah pot\ong hewan (RPH), dikelompokkan berdasarkan jenis sapi PO  (kontrol)  dan    SimPO.  Oosit  dengan  kualitas  A  dan  B  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini.  Oosit  difertilisasi menggunakan semen beku sapi Simmental dengan konsentrasi 5 x 10 6 sel/ml pada media Brackett oliphant (BO). Tingkat fertilisasi in vitro ditentukan dengan pewarnaan aceto orcein 1% untuk melihat terbentuknya polimorfonuklear (PMN) 10 jam setelah inseminasi. Berdasarkan hasil penelitian ini tingkat fertilisasi secara in vitro sapi SimPO dan sapi PO tidak menunjukkan perbedaan yang nyata.
Kata kunci : tingkat fertilisasi in vitro, SimPO

## Abstract
Crossbreeding program by artificial insemination in Indonesian have use from Simmental and Limousin to local cows of Ongole Grade. Offspring from this crossbred called SimPO and LimPO which has advantages such as a large  birth  weight  and  rapid  growth.  The  disadvantages  of  SimPO  cows  are  decreased  of  reproduction performance of  Fenotipe 2 (F2) such as pregnancy rate being lower. Pregnancy stage  will occur when oocyte had fertilized and had reached to embryos cleavage stage.The aims of this research was to determined in vitro fertilization rate of SimPO and LimPO oocyte. Ovaries from local abbotoir grouped into PO (control), SimPO. Cumulus-oocyte  complexes quality A and B were used for this research. Oocytes  were fertilized using frozen semen  of  Simmental    with  concentration  5  x  10 6 cells  /  ml  in  Brackett  oliphant  (BO)  medium.  In  vitro fertilization rate to observed polymorphonuclear (PMN) formation 10 hours after insemination using 1% aceto orcein staining to fertilized oocytes. Fertilized oocytes were washed were transferred into culture and incubated at 38,5 ° C, with 5% CO2 and  95% humidity. These results indicate that in vitro fertilization rate of oocytes did not any significant differences between groups Keywords : in vitro fertilization rate, Crosbred, SimPO

## Pendahuluan
Dalam  rangka  meningkatkan    populasi  ternak untuk  mencukupi  kebutuhan  dalam  negeri  maka pemerintah melakukan program pegembangan peternakan seperti crosbreeding. Simmental Peranakan  Ongole  (SimPO)  merupakan  salah  satu hasil  program  crossbreeding  ternak  sapi  di  Indonesia. Keunggulan  beternak  sapi  SimPO  memiliki  bobot lahir  yang  tinggi,  adaptasi  yang  baik  dengan lingkungan  dan  pakan  serat  kasar  serta  memiliki penampilan  yang  eksotik.  Fenomena  yang  terjadi dilapangan  berdasarkan  pengamatan  padasapi  SimPO dimana  Fenotip  2  (F2)  diduga  mengalami  penurunan
performan  reproduksi  sehingga  tingkat  kebuntingan menjadi  rendah.Keberhasilan  kebuntingan dapat terjadi  apabila  oosit  dapat  terfertilisasi  dan  berhasil mencapai  fase  pembelahan  sel.  Teknologi  reproduksi bantuan  atau  Assisted  Reproduction  Technology (ART)  seperti  produksi  embrio  melalui  proses (maturasi,  fertilisasi  dan  pembelahan)  secara  in  vitro merupakan  teknologi  yang  dapat  digunakan  sebagai metode  dalam memberikan  informasi  masalah infertilitas  pada  ternak  (Karja  et  al.,  2010).  Fertilisasi in  vitro  menghasilkan  embrio  dengan  berbagai  tahap perkembangan  dalam  jumlah  yang  banyak.  Secara genetik  perkembangan  embrio  dipengaruhi  oleh
bangsa  pejantan  dan  bangsa  betina.  Penelitian fertilisasi  oosit  secara  in  vitro  pada  sapi  hasil crossbreeding  seperti  SimPO  masih  sangat  terbatas. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  tingkat fertilisasi  secara  in  vitro  pada  oosit  sapi  Simmental Peranakan  Ongolesebagai  salah  satu  hasil  program crossbreeding.

## Materi dan Metode Koleksi oosit
Oosit  dari  ovarium  sapi  yang  berasal  dari rumah  potong  hewan  (RPH),  segera  sesudah  sapi disembelih dibersihkan jaringanyang menempel, dikelompokan  berdasarkan  jenis  sapi  PO  (kontrol), SimPO.  Ovarium  dicuci  dengan  NaCL  0,9%  yang disuplementasi  dengan  penisilin  100.000  IUdan streptomycin  sulfat 100  mg(Wonderindo,  Indonesia). Ovarium ditempatkan dalam termos yang berisi larutan yang  sama  dengan  suhu  35  -  37°C  dan  dibawa  ke laboratorium  dalam  waktu  tidak  lebih  dari  2  jam setelah  pemotongan.  Oosit  diaspirasi  dari  folikel  yang berukuran  2-6  mm  dengan  mengunakan  jarum  18  G yang  dihubungkan  dengan Syiringe  disposable 5  ml. Oosit  yang  dilapisi  oleh  sel-sel  kumulus  atau  hanya dikelilingi  lebihdari  2  lapis  sel  kumulus  dengan ooplasma  yang  homogen  yang  digunakan  untuk penelitian ini.

## Maturasi in vitro
Oosit dimaturasi dalam media maturasi berupa tissue  culture  medium -199  (Gibco  Laboratoris,  Grang Isldan,  NY)  yang  disuplementasi  dengan fetal  bovine serum 5%,  FSH  0,  02  IU/ml  (Sigma  St.  Louis,  MO, USA),  Taurine  0,05  gr  (Sigma  St.  Louis,  MO,  USA) dan gentamycin 50 μ g/ml  (Sigma,  St.  Louis,  MO, USA).  Oosit  dimaturasi  dengan  cara  memindahkan oosit  dalam polystyrene  culture  dish (Falcon,  Lincoln Park,  NJ,  USA)  (35x10)  pada  drop-drop  yang  berisi media  maturasi  yang  telah  ditutupi  dengan  mineral  oil (Sigma  St.  Louis,  MO,  USA).  Satu  drop  maturasi berisi  100 μ l  media  maturasi,  kemudian  diinkubasi dalam inkubator CO 2 5%, kelembaban 95%, pada suhu 38.5°C selama 24 jam (Budiyanto et al. , 2006).

## Fertilisasi oosit in vitro
Oosit  yang  mengalami  maturasi  dicuci2  kali dengan Brackett oliphant (BO) yang ditambah BSA 2% (Sigma),  Heparin  50  mg  (Novo  Industry  A/S,  Osaka, Jepang),  Sodium  Piruvat  (Sigma)  dan gentamycin
(Sigma  chemical  Co.St.  Louis  MO,  USA).  Oosityang telah dimaturasi dimasukkan ke dalam drop spermatozoa.  Satu  drop  sperma  berisi  100 μ l. Selanjutnya  10-15oosit  dimasukkan  dalam  tetes  yang berisi  spermatozoa  diatas  dan  diinkubasi  dalam inkubator  CO 2 5%,  kelembaban  95%,  pada  suhu 38,5°C selama 10 jam.

## Status fertilisasi
Status  fertilisasi  dievaluasi  10  jam  setelah inseminasi.  Pengamatan  terhadap  status  fertilisasi dengan  pengecatan acetoorcein 1%  (1%  orcein  dan 45%  acetic  acid)  dan  diperiksa  dibawah  mikroskop fase  kontras.  Status  fertilisasi  ditentukan  dengan pembentukan Polimorfonuklear (PMN).

## Analisis Hasil
Rancangan  penelitian  yang  digunakan  adalah rancangan  acak  lengkap  (RAL),  dengan  lima  kali ulangan.  Persentase  jumlahoosit  yang  mencapai  fase- fase  fertilisasi  dan  pembelahan  sel  ditransformasi dalam bentuk arc-sin . Data yang sudah ditransformasikan kemudian dianalisis dengan analysis of  varian (ANOVA)  dan  dilanjutkan  dengan  Uji  Beda Nyata Terkecil Fisher menggunakan Statview program(Abacus concepts, Inc., Berkeley, CA, USA).

## Hasil dan Pembahasan Tingkat Fertilisasi In vitro
Fertilisasi atau pembuahan secara in vitro melibatkan    penetrasi  ovum  oleh  spermatozoa, aktivitas  ovum,  pembentukan  pronukleus  jantan  dan betina  serta  pertautan  kromosommaternal  paternal membentuk  genom  (Elder  dan  Dale,  2011).  Tingkat fertilisasi  adalah  jumlah  oosit  yang  mempunyai  2 pronukleus  (2PN)  yaitu  jantan  dan  betina.Dalam penelitian  ini  tingkat  fertilisasi  oosit  diambil  dari  data ditemukannya polimorfonuklear (PMN) dari pronukleus  jantan  dan  betina  yang  terlihat  pada pengecetan aceto  orcein pada  10  jam  sesudah inseminasi.  Oosit  yang  tidak  terfertilisasi  hanya mempunyai  1  PN,  sedangkan  oosit  yang  terfertilisasi lebih  dari  1  sperma  mempunyai  lebih  dari  2  PN (polispermi) dan oosit terfragmentasi adalah oosit yang tidak  mencapai  perkembangan  metafase  II  (MII). Tingkat  fertilisasi in  vitro pada  oosit  sapi  POdan SimPO  dengan  terbentuknya  pronukleus  dilihat  pada gambar 1.
Gambar  1.Status  inti  oosit  setelah  fertilisasi in  vitro .  Tanda  panah  menunjukan  statusinti  pada  tahap:  A.  1 Pronukleus (PN), B. 2PN, C. 3PN dan D. Fragmentasi.
Tabel 1. Arcsin Tingkat Fertilisasi in vitro Oosit Sapi PO, SimPO dan LimPO *
Jenis Sapi Jumlah Oosit Mean ± SEM (n) fertilisasi pada tahap** 1 PN 2PN >2PN Fragmentasi PO 40 33.4±2.7(15) 42.3±2.8(19) 4.4±0.3(2) 2.1±0.1(9) SimPO 50 32.1±2.1(16) 36.2±1.8(18) 6.0±0.2(3) 2.6±0.2(13)
 Tiap perlakuan dalam penelitian ini diulang sebanyak lima kali, presentase disajikan dalam bentuk Mean ± SEM ** P: Pronukleus
Tabel  1  memperlihatkan  hasil  penelitian  tingkat fertilisasi  dengan  terbentuknya  dua  pronukleus  (2PN) yang  diperoleh  dari  oosit  sapi  POdan  SimPO  tidak berbeda  (P>  0,05).  Dalam  penelitian  ini  spermatozoa yang  digunakan  adalah  sperma  beku  dari  sapi Simmental  ( Bos  taurus )  dan  oosit  yang  digunakan adalah oosit SimPO ( Bostaurus x Bos indicus ) dan PO ( Bos  indicus ).  Penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan Zi et al. (2009), tidak terdapat perbedaan pembentukan 2PN yaitu pronukleus jantan dan betina pada oosit sapi crossbreeding ( Bos  grunnines x Bos  taurus ).  Hal  ini berbeda  dengan  pendapat  Goldbard  dan  Warner (1982),  yang  mengatakan  perkembangan  embrio dipengaruhi oleh bangsa pejantan dan betina.
Berdasarkan data diatas tingkat fertilisasi pada sapi  PO  dan  SimPO  tidak  berbeda,  hal  ini menunjukkan  bahwa  tingkat  fertilisasi  oosit  tidak hanya  ditentukan  oleh  genetik  namun  ada  faktor  lain yang  mempengaruhi  fertilisasi.  Kegagalan  fertilisasi dapat  disebabkan  oleh  beberapa  hal,  antara  lain:  (1) proses  maturasi  inti  maupun  sitoplasma  yang  kurang sempurna  karena  kualitas  oosit  yang  rendah  (2)
kegagalan  spermatozoa  melakukan  kapasitasi  dan reaksi  akrosom  sehingga  spermatozoa  tidak  mampu membuahi oosit, (3) kegagalan spermatozoa mengalami kondensasi dalam sitoplasma oosit sehingga  terjadi  kegagalan  pembentukan  pronukleus jantan (Crozet et al . 1995).
Faktor lain yang juga mempengaruhi kemampuan  fertilisasi in  vitro adalah  dihasilkan Reactive oxygen species. Spermatozoa mati menghasilkan Reactive  oxygen  species menyebabkan peroksidasi  membran  lipid,  mengurangi  fluiditas membran  dan  fungsi  sperma. Reactive  oxygen  species yang  tinggi  merusak  metabolisme  spermatozoapada mediafertilisasi in  vitro .Kim et  al .  (2002)  mengatakan Reactive  oxygen  species meningkatdi  bawahkondisi in vitro yang  menggunakanCO 2 5%.  Dalam  penelitian  ini kemungkinan  tidak  ada  perbedaan  terbentuknya Reactive  Oxygen  Species pada  PO  dan  SimPO.  Hal baru  dari  data  ini  bahwa  sapi  SimPO  masih  dapat mengalami  proses  fertilisasi,  sehingga  masih  bisa mengalami perkembangan lebih lanjut.

## Kesimpulan
Tingkat  fertilisasi  oosit  secara in  vitro pada  sapi  PO dan SimPO tidak menunjukan perbedaan yang nyata.

## Saran
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut untuk mengetahui  kemampuan  berkembang  sampai  stadium blastosis dari oosit sapi SimPO.

## Ucapan Terimakasih
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Rumah Potong  Hewan  Giwangan  Yogyakarta  yang  telah menyediakan ovarium untuk penelitian ini serta semua pihak yang telah membantu dalam penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Budiyanto, A., T. Otoi, P. Wongsrikeao, M. Taniguchi, R.  Shimizu,  H.  Watari  and  Nagai,  T.  2006.
Effect of maturation culture period of oocytes on  the  sex  ratio  of  in  vitro  fertilized  bovine embryos. Journal  of  Reproduction  and Development52 : 123-127.
Crozet,  N,  M.  Dahirel  and  L.  Gall.  2000. Meiotic competence  of  in  vitro  grown  goat  oocytes. Journal  of  Reproduction  and  Fertility  118: 367-373.
Elder,  K,and  B.  Dale.2011. In  Vitro  Fertilzation ,  (ed) 3th.Cambridge University Press. Pp 50-81.
Goldbard,  S.B  and  C.M.  Warner.1982. Gene  affect  the timing of early mouse embryo development. Journal of Biological Reproductions 27: 419-424.
Karja, N.W.K, W.P. Aqshani, Y.P. Kusumawati, V.G. Pravitasari dan Gustari, S. 2010. Fetal bovine serum  meningkatkan  maturasi  inti  oosit kelinci setelah dimaturasi secara in vitro. Jurnal Veteriner 11 (3): 173-178 Kim,  B.,  Sang,  C.,  Kwang,  S.,  Bok,  K.,  Chang-Hee, H.,  Jong-Heung,  K.,  Chae-Sik,  L.,  2002, Effect of Medium Milieu on Sperm Penetration  and  Pronuclear  Formation  of Bovine Oocytes Matured In vitro . Theriogenology.  57: 2093–2104. Zi, X.D., R.H.Yin, S.W. Chen, G.N Lian, D.W. Zhang and Guo, CH. 2009. Developmental competence of embryos derived from reciprocal  in  vitro  fertilization  between  Yak (Bos grunniens) and cattle (Bos taurus) .Journal of Reproduction and
Development Vol 55 No 5.