ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (2) (2017) : 84 – 91
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi Bakteri Termofilik Sumber Air Panas Gedongsongo dengan Media Pengaya MB ( Minimal Broth ) dan TS (Taoge Sukrosa) serta Identifikasi Fenotip dan Genotip
Dewi Nuritasari a , Purbowatiningrum Ria Sarjono a* , Agustina L.N. Aminin a
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: purbowatining@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords:
thermophilic bacteria, Gedong songo hot springs, 16S rRNA, extracellular enzymes
Thermophilic bacteria is a bacteria that can survive at high temperatures where one of the habitat is the source of hot water. Indonesia has many potential hot water as a habitat for thermophilic  bacteria.  In  this  research,  thermophilic  bacteria  was  isolated  from Gedongsongo  hot  springs  using  minimal  approach  MB  media  (Minimal  Broth)  and  TS (Taoge Sukosa) and of phenotypes identification with microbiology test including gram staining and morphology and genotypic identification using gene nucleotide sequence of 16S  rRNA  and  phylogenetic  tree  construction  using  Phylip  3.68  ed  program  Distance matrix method (Neighbor joining). A qualitative extracellular enzyme identification was performed  using  selective  media  including  cellulase  test, α -amylase  test,  protease  test and P-galactosidase test. From the research, it was obtained two isolates of thermophilic bacteria,  namely  GS_MBan  isolate  and  GS_TSan  isolate.  The  GS_MBan  isolate  had  a resemblance  to  the  bacterial  group  of Anoxybacillus  sp. up  to  94-99%,  rod  in  shaped, gram-positive  bacteria,  have  extracellular  enzyme  a-amylase,  protease  and  P- galactosidase  and  do  not  show  the  potential  of  extracellular  cellulase  enzyme.  The GS_TSan isolate resembled the bacterial group Thermoanaerobacterium sp. of 78-86%, rod-shaped, gram-negative bacteria, have extracellular α -amylase and protease enzymes and  did  not  show  potential  extracellular  enzyme  P-galactosidase  and  cellulase.  The GS_TSan  isolate  resembled  the  bacterial group Thermoanaerobacterium  sp. of  78-86%, rod-shaped,  gram-negative  bacteria,  had  an  extracellular α -amylase  and  protease enzymes and do not show potential extracellular enzyme P-galactosidase and cellulase.

## A b s t r a k
Kata kunci: bakteri termofilik,
sumber air panas Gedongsongo, 16S rRNA,enzim ekstraseluler
Bakteri termofilik merupakan bakteri yang mampu bertahan hidup pada suhu tinggi di mana salah satu habitatnya adalah sumber air panas. Indonesia memiliki banyak sumber air panas yang potensial sebagai habitat bakteri termofilik. Dalam penelitian ini dilakukan isolasi  bakteri  termofilik  sumber  air  panas  gedongsongo  dengan  menggunakan pendekatan minimal media MB ( Minimal Broth ) dan TS (Taoge Sukosa) serta identifikasi fenotip  dengan  uji  mikrobiologi  yang  meliputi  pewarnaan  gram  dan  morfologi  dan identifikasi  genotip  dengan  menggunakan  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  dan konstruksi  pohon  filogenetik  dengan  menggunakan  program  Phylip  3.68  ed.  metode Distance  matrix  (Neighbour  joining) . Identifikasi  enzim  ekstraseluler  secara  kualitatif dilakukan dengan menggunakan media selektif yang meliputi uji selulase, uji a-amilase, uji protease dan uji P-galaktosidase. Dari penelitian diperoleh dua isolat tunggal bakteri termofilik  yaitu  isolat  GS_MBan  dan  isolat  GS_TSan.  Isolat  GS_MBan  memiliki kemiripan dengan bakteri kelompok Anoxybacillus sp. sebesar 94-99%, berbentuk batang,
bakteri  gram  positif,  memiliki  enzim  ekstraseluler  a-amilase,  protease  dan  P- galaktosidase  serta  tidak  menunjukkan  potensi  adanya  enzim  ekstraseluler  selulase. Isolat GS_TSan memiliki kemiripan dengan bakteri kelompok Thermoanaerobacterium sp. sebesar 78-86%, berbentuk batang, bakteri gram negatif, memiliki enzim ekstraseluler a-amilase dan protease serta tidak menunjukkan potensi adanya enzim ekstraseluler P- galaktosidase dan selulase.

## 1. Pendahuluan
Bakteri  ekstermofil  merupakan  mikroorganisme yang  tumbuh  dengan  subur  pada  lingkungan  ekstrem. Salah  satu  jenis  bakteri  ekstremofil  adalah  bakteri termofilik  yang  dapat  didefinisikan  sebagai  organisme yang dapat hidup pada suhu tinggi [1]. Bakteri termofilik memiliki  habitat  yang  bermacam-macam  seperti  di letupan  hidrothermal  [2,  3],  sumber  air  panas  [4,  5], tumpukan kompos [6], atau pemanas air [7]. Bakteri jenis termofilik  tersebut  sering  diteliti  untuk  mengetahui protein termostabilnya.
Identifikasi  jenis-jenis  bakteri  secara  mikrobiologi konvensional  dapat  dilakukan  dengan  menggunakan media  selektif  yang  mampu  membedakan  antara  jenis bakteri  satu  dengan  yang  lain.  Selain  itu,  identifikasi jenis-jenis bakteri juga dapat dilakukan dengan metode fenotip,  yaitu  melalui  uji  morfologi  dan  biokimia  [8]. Akan  tetapi  cara  identifikasi  ini  memiliki  beberapa kekurangan  dengan  adanya  keterbatasan  media pengkulturan [9]. Oleh karena itu ilmuwan mengembangkan  identifikasi  secara  genotip  untuk mengganti  metode  konvensional  tersebut.  Uji  genotip memiliki banyak keuntungan diantaranya lebih mudah, lebih  valid  dan  lebih  cepat.  Uji  genotip  dilakukan berdasarkan  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  karena memiliki  sifat  lestari  dan  diturunkan  dari  generasi  ke generasi dengan urutan yang tetap [10], 1994). Selain itu, identifikasi  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  ternyata dapat  digunakan  untuk  menentukan  hubungan kekerabatan  bakteri  berdasarkan  konstruksi  pohon filogenetiknya dan untuk mengidentifikasi bakteri yang belum diketahui jenisnya.
Berdasarkan  penelitian  Aminin dkk. [11]  diperoleh beberapa bakteri unik khas Gedongsongo dari kelompok Thermus dan Beta-proteobacteria yang ditumbuhkan pada minimal  media  MB (Minimal  Broth) dan  TS  (Taoge Sukrosa) dalam kondisi anaerob yang terdeteksi sebagai kultur campuran. Berdasarkan penelitian tersebut, maka pada  penelitian  ini dilakukan isolasi bakteri  sumber  air panas Gedongsongo dengan pendekatan minimal media MB  dan  TS  untuk  mendapatkan  isolat  tunggal  dan dilakukan  karakterisasi  berdasarkan  uji  fenotip  dan genotip.  Uji  fenotip  meliputi  uji  morfologi  dan identifikasi  kualitatif  enzim  ekstraseluler  yaitu  uji selulase,  uji  P-galaktosidase,  uji  a-amilase  dan  uji protease. Uji genotip dilakukan berdasarkan identifikasi urutan nukleotida gen 16S rRNA dan  pembuatan  pohon filogenetik.

## 2. Metodologi

## Sampling
Sampel  air  diambil  dari  sumber  air  panas Gedongsongo,  daerah  gunung  Ungaran,  Jawa  Tengah, Indonesia  (110 o 22’23.4”E;  07 o 12’08.5”S;  dan  ketinggian 1400 m dpl) dan dimasukkan ke dalam tabung bertutup berisi media. Dua media sederhana telah dipilih sebagai sumber  karbon  dan  mengandung  vitamin  dan  mineral yang  dibutuhkan  untuk  pertumbuhan  bakteri,  yaitu TS (0,02% (v/v) filtrat taoge dan 0,04% (w/v) sukrosa dan MB (0,02% (w/v) beef extract, 0,02% (w/v) pepton, dan 0,01% (w/v) NaCl) [12].

## Pembiakan dalam media MB dan TS
Hasil sampling kemudian diinkubasi pada suhu 55 o C. Inkubasi  dilakukan  pada  kondisi  anaerob  dengan meletakan  tabung-tabung  yang  berisi  biakan  ke  dalam toples dengan nyala lilin untuk mengurangi ketersediaan oksigen.  Inkubasi  dihentikan  dan  sel  dipanen  setelah adanya  kekeruhan  pada  media.  Bakteri  yang  telah tumbuh  kemudian  ditumbuhkan  kembali  pada  media padat  dengan  menggunakan  metode  tuang  untuk mendapatkan koloni tunggalnya.

## Uji pewarnaan gram
Pewarnaan  gram  dilakukan  dengan  menambahkan pewarna  gram  secara  bertahap.  Kaca  preparat  yang digunakan  dibersihkan  dengan  alkohol  kemudian dipanaskan  di  dekat  nyala  api.  Isolat  bakteri  kemudian diambil dengan  menggunakan  jarum ose dan  diratakan pada kaca preparat, lalu dipanaskan di dekat api sambil digoyang-goyangkan  hingga  isolat  kering.  Saat pemanasan diusahakan agar api tidak terkena langsung. Isolat  bakteri  ditetesi  dengan  kristal  ungu,  didiamkan selama 1 menit, dicuci dengan akuades dan dikeringkan dengan  cara  dianginkan.  Hasil  pewarnaan  kristal  ungu ditetesi iodin, didiamkan selama 1 menit, diicuci dengan akuades dan dikeringkan. Hasil pewarnaan iodin ditetesi dengan  alkohol  absolut,  didiamkan  selama  30  detik, dicuci  dengan  akuades  dan  dikeringkan.  Langkah terakhir,  hasil  yang  diperoleh  dari  pewarnaan  dengan alkohol absolut ditetesi dengan safranin kemudian dicuci dengan  akuades.  Hasil  pewarnaan  safranin  kemudian dikeringkan  dan  hasilnya  diamati  dengan  mikroskop [13].

## Isolasi DNA kromosom

## Metode Zhou modifikasi
Kultur  bakteri  dimasukkan  ke  dalam  mikrotub  1,5 mL,  kemudian  disentrifugasi  dengan  kecepatan  5000 rpm selama 5 menit untuk memperoleh pelet sel. Pelet sel dicampur dengan 300 pL buffer ekstraksi DNA (100mM
Tris-HCl [pH 8,0], 100mM Na-EDTA [pH 8,0], 100 mM sodium fosfat [pH 8,0] dan  1,5  M  NaCl).  Larutan ditambah dengan 10 pL proteinase K (20mg/mL) dan 0,2 g  pasir  laut  steril  dalam  1,5  mL  mikrotub  dengan penggojogan  selama  10  menit.  Setelah  digojog, ditambahkan 30 pL 20% SDS (Sodium Dodesil Sulfonat) dan sampel diinkubasi pada suhu 60°C selama 1 jam dan digojog  setiap  15-20  menit.  Supernatan  dikumpulkan menjadi  satu  setelah  disentrifugasi  pada  5.000  rpm selama  10  menit  pada  suhu  ruang  dan  dipindahkan  ke dalam  mikrotub.  Supernatan  ditambah  dengan kloroform-isoamil alkohol (24:1, v/v) pada volume yang sama. Fase cair didapatkan kembali dengan sentrifugasi dan  pengendapan  dengan  1  volume  isopropanol  pada suhu  ruang  selama  15  menit.  Pelet  kasar  asam  nukleat didapat dengan sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit  pada  suhu  ruang,  lalu  dicuci  dengan  etanol  70% dingin,  dan  dilarutkan  kembali  dalam  dd  H 2 O  steril sampai memberi volume akhir 50 pL [12].

## Metode freeze thawing modifikasi
Kultur  bakteri  dimasukkan  ke  dalam  mikrotub  1.5 mL,  kemudian  disentrifugasi  dengan  kecepatan  5000 rpm selama 5 menit untuk memperoleh pelet sel. Pelet sel disuspensikan  ke  dalam  100pL  ddH 2 O  steril  kemudian disentrifugasi  dengan  kecepatan  5000  rpm  selama  10 menit  sebanyak  tiga  kali.  Pelet  sel  yang  diperoleh kemudian disuspensikan kembali ke dalam 100 pL ddH 2 O steril.  Suspensi  sel  kemudian  dipanaskan  di  dalam  air mendidih  selama  20  menit  dan  dilanjutkan  dengan pendinginan dengan temperatur -20 o C selama 10 menit. Setelah pendinginan, suspensi sel disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang.

## Amplifikasi gen 16S rRNA
Sampel DNA kromosom yang diperoleh selanjutnya diamplifikasi secara in vitro dengan metode PCR. Bagian gen  16S  rRNA  diamplifikasi  menggunakan  satu  set primer  universal  27F-  1492R,  pasangan  primer  27F: 5’AGA  GTT  TGA  TCC  TGG  CTC  AG  3’  (posisi  8 -27, penomoran  urutan  basa E.coli) dan  1492R:  5’GGT  TAC CTT  GTT  ACG  ACT  T  3’  (posisi  1492 -1510,  penomoran urutan basa E.coli ) [14]. Sebanyak 5 pL templat DNA hasil lisis  dimasukkan  ke  dalam  mikrotub,  kemudian ditambah 43 pL Mega Mix Blue PCR kit, 1 pL primer 27F dan 1  pL  1492R.  Tiap  sampel  kemudian  dimasukkan  ke  alat PCR  dan  dikerjakan  sebanyak  30  siklus  [15].  Tahap denaturasi  dilakukan  pada  suhu  94 o C  selama  1  menit, tahap annealing dilakukan  pada  suhu  54 o C  selama  45 menit , dan  tahap extension dilakukan  pada  suhu  72 o C selama 2 menit tahap. Pada siklus ke 30, tahap extension dilakukan  selama  10  menit  dan  dilanjutkan  dengan penurunan suhu sampai 4 o C.

## Elektroforesis fragmen gen 16S rRNA
Sebanyak 0,2 gram agarosa dilarutkan ke dalam 20 mL  TBE  (Tris  Borat  EDTA)  1X  kemudian  dipanaskan hingga mendidih. Hasil pemanasan kemudian ditambahkan  dengan  4pL  etidium  bromida  dan  diaduk agar tercampur sempurna lalu dituang ke dalam cetakan yang telah dipasangi sisir untuk membuat sumur-sumur (well) dan didiamkan hingga padat. Setelah gel memadat,
sisir kemudian dilepas. Proses selanjutnya sebanyak 3 pL hasil  PCR  dimasukkan  ke  dalam  sumur  ( well )  gel kemudian  dimasukkan  ke  dalam  alat  elektroforesis hingga  terendam  oleh  larutan  TBE  1X  dan  dilakukan pengelektroforesisan terhadap sampel dengan arus 400 mA dan tegangan 100 V. Elektroforesis dihentikan apabila pergerakan  sampel  telah  sampai  pada  ujung  gel.  Gel kemudian  diamati  di  bawah  sinar  ultraviolet menggunakan  lampu  UV  Transiluminator  untuk mengetahui pola pita-pita DNA [15].

## Analisis sekuensing
Hasil  PCR  yang  sudah  terbukti  mengandung fragmen  gen  16S  rRNA  disekuensing  di  Korea  oleh Macrogen Sequencing Service. Hasil yang diperoleh berupa urutan DNA forward dan reverse kemudian diedit dengan menggunakan program DNASTAR (EditSeq dan SeqMan) untuk  menggabungkan  dua  sekuen  DNA.  Program EditSeq  dipilih  lalu  data  sekuen  DNA  dimasukkan  dan dihasilkan output. Hasil (output) dari  program  EditSeq kemudian  digunakan  sebagai input pada  program SeqMan.  Hasil (output) dari  program  Seqman  berupa urutan DNA utuh selanjutnya dibandingkan dengan data GenBank dan dilakukan studi filogeni.

## Studi filogeni
Hasil  sekuensing  isolat  GS_MBan  dan  isolat GS_TSan dibandingkan dengan data GenBank menggunakan  program  BLASTN (Basic  Local  Allignment Search Tool Nucleotide) yang terdapat pada NCBI (National
Centre of Biotechnological Information)
(www.ncbi.nlm.nih.gov).  Hasil  berupa  data  urutan nukleotida  DNA  kromosom  bakteri-bakteri  terdekat kemudian  dilakukan  studi  filogeni  dengan  penjajaran menggunakan  program  Clustal  W,  konstruksi  pohon filogenetik  dengan  program  PHYLIP  3.68  (seqboot, DNAdist,  neighbor  dan  consense)  dan  Phylodendron (online). Hasil BLASTN diedit dengan menghapus bagian subject hingga  menyisakan  bagian query pada  data penjajaran  nukleotida  untuk  masing-masing  spesies bakteri  dan  meng-copy  dalam  bentuk  notepad. Selanjutnya dilakukan penjajaran urutan nukleotida gen 16S rRNA dari isolat GS_MBan dan isolat GS_TSan dan bakteri  lainnya  dalam  program  Clustal  W  sehingga dihasilkan  4  data output dengan  format  ‘.aln’,  ‘. msf, ‘.dnd’, dan ‘.phy’. Output dalam format ‘.phy’ digunakan dalam tahap selanjutnya.
Konstruksi  pohon  filogenetik  terhadap  isolat GS_MBan  dan  isolat  GS_TSan  dilakukan  dengan menggunakan  program  Phylip (Phytogeny  Inference Package) 3.68 ed. dan dipilih program seqboot, DNAdist, neighbor  dan  consense.  Hasil  penjajaran  dengan program  Clustal  W  dalam  format  ‘.phy’  digunakan sebagai data input pada program seqboot dan diperoleh output  yang  kemudian  digunakan  sebagai input pada program  DNAdist. Output dari  program  DNAdist kemudian  digunakan  sebagai input pada  program neighbor dan output dari neighbor dijadikan sebagai input pada  program  consense.  Selanjutnya, output dari consense  dalam  bentuk  data newick dimasukkan  pada program Phylodendron dengan mengakses (http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-
form.html)  secara online sehingga  diperoleh  gambar pohon filogenetiknya.

## Identifikasi enzim fi-galaktosidase
Sebanyak 25 pL nutrien dan 25 mL air sumber yang telah dibe ri 0,25 g laktosa sebagai induser dimasukkan ke  dalam  tabung  lalu diautoklaf. Sebanyak  10 pL  kultur bakteri  diinokulasikan  ke  dalam  media  yang  telah diautoklaf  lalu  diinkubasi  sampai  timbul  kekeruhan. Sebanyak  0,1  mL  ONPG  ditambahkan  pada  kultur tersebut  kemudian  sampel  diinkubasi  selama  5  jam. Aktivitas  enzim  p-  galaktosidase  ditunjukkan  dengan timbulnya warna kuning pada kultur [16].
Identifikasi enzim α -amilase
Sebanyak 30 mL air sumber ditambah dengan 30 pL nutrien,  0,45  g  bacto  agar  dan  0,3  g  pati  diautoklaf kemudian dituang ke dalam cawan petri. Setelah media memadat, sebanyak 0,5 pL kultur bakteri diinokulasikan ke  media  kemudian  diinkubasi  sampai  koloni  bakteri tumbuh.  Dilakukan  penggenangan  terhadap  hasil inkubasi dengan larutan iod untuk mengetahui aktivitas enzim a-amilase yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekitar bakteri [17].

## Identifikasi enzim protease
Sebanyak  10  mL  air  sumber  dimasukkan  ke  dalam tabung reaksi kemudian ditambah dengan 10 pL nutrien dan  diautoklaf.  Sebanyak  0,3  g  gelatin  ditambahkan  ke dalam media dan 20 pL kultur bakteri diinokulasikan lalu diinkubasi  sampai  timbul  kekeruhan  pada  larutan. Tabung tersebut kemudian dimasukkan ke dalam lemari es selama 24 jam. Aktivitas enzim protease ditunjukkan dengan  tetap  mencairnya  larutan  setelah  didinginkan [18].

## Identisikasi enzim selulase
Sebanyak 30 mL air sumber ditambah dengan 30 pL nutrien,  0,45  g  bacto  agar  dan  0,15  g  CMC  diautoklaf kemudian dituang ke dalam cawan petri. Setelah media memadat, sebanyak 0,5 pL kultur bakteri diinokulasikan ke  media  kemudian  diinkubasi  sampai  bakteri  tumbuh. Dilakukan penggenangan terhadap hasil inkubasi dengan larutan  congo  red  1%  selama  20  menit  lalu  dilakukan pencucian  dengan  larutan  NaCl  1M.  Aktivitas  enzim selulase  ditunjukkan dengan  terbentuknya  zona bening di sekitar bakteri [19].

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Pembiakan Kultur Bakteri
Sampel  air  diambil  dari  sumber  air  panas Gedongsongo  yang  mempunyai  pH  6  dan  suhu  68 o C kemudian  dikulturkan  pada  media  MB (Minimal  Broth) dan TS (Taoge-Sukrosa) dengan kondisi minimal sebagai media  pertumbuhan  bakteri  mengacu  pada  penelitian sebelumnya  [11].  Media  MB  terdiri  dari  pepton  sebagai sumber  nitrogen  organik, beef  extract sebagai  sumber karbon dan pelengkap fungsi nutrisi dari pepton dengan menyumbang mineral-mineral dan NaCl yang berfungsi sebagai sumber mineral.
Media  TS  terdiri  dari  ekstrak  taoge  dan  sukrosa sebagai  sumber  makronutrien  dan  mikronutrien  yang dibutuhkan bagi pertumbuhan bakteri [20]. Penumbuhan bakteri  dilakukan  pada  suhu  55 o C  mengacu  pada penelitian  sebelumnya  dengan  teknik candle  jar (nyala lilin  dalam  toples)  untuk  mengurangi  ketersediaan oksigen  di  lingkungan.  Bakteri  yang  telah  tumbuh  di media cair kemudian ditumbuhkan kembali dalam media padat untuk mendapatkan single colony nya seperti pada gambar 1.
a.

## b.
Gambar 1. Pertumbuhan bakteri pada media padat (a) Pertumbuhan bakteri pada media MB (b) Pertumbuhan bakteri pada media TS
Dari  hasil  pewarnaan  gram  (gambar  2)  diketahui bahwa bakteri isolat GS_MBan merupakan bakteri gram positif  berbentuk  batang  dan  bakteri  isolat  GS_TSan merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang.
a.

## b.
Gambar 2. Hasil pewarnaan gram terhadap bakteri isolat GS_MBan dan isolate GS_TSan (a) Bakteri isolat GS_MBan (b) Bakteri isolat GS_TSan

## Amplifikasi Gen 16S rRNA Secara In Vitro
Identifikasi secara genotipik  terhadap  bakteri  yang telah  diisolasi  memerlukan  templat  DNA  kromosom untuk  proses  PCR.  Langkah  awal  untuk  identifikasi
genotipik adalah isolasi DNA kromosom yang dilakukan dengan  menggunakan  dua  metode  yaitu  metode  Zhou dan freeze  thawing (beku  leleh).  Perusakan  dinding  sel pada metode Zhou dilakukan secara fisik menggunakan pasir  laut  steril  dan secara  kimiawi menggunakan  SDS, sedangkan metode freeze thawing menggunakan prinsip perubahan temperatur ekstrim untuk perusakan dinding sel.
DNA  kromosom  hasil  isolasi  baik  dengan  metode Zhou  maupun freeze-thawing kemudian  digunakan sebagai  templat  amplifikasi  fragmen  gen  16S  rRNA dengan metode PCR. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan  dua  primer  uji  (27F  dan  1492R)  yang  akan membatasi  amplifikasi  bagian  depan (forward) pada urutan 8 - 27 dan bagian belakang (reverse) pada urutan 1492 - 1510 berdasarkan penomoran urutan basa E. coli. Hasil PCR dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa dan divisualisasi dengan bantuan lampu UV [15] seperti pada gambar 3.
Gambar 3. Elektrofogram fragmen gen 16S rRNA hasil PCR
Keterangan : Sumur 1 = Marker; Sumur 2 = kontrol negatif; Sumur 3 = pita DNA E. coli; Sumur 4 = pita DNA
isolat GS_MBan metode freeze-thawing; Sumur 5 = pita DNA isolat GS_TSan metode freeze-thawing; Sumur 6 = pita DNA isolat GS_MBan metode Zhou; Sumur 7 = pita isolat GS_TSan metode Zhou Dari elektroforegram yang tampak pada gambar 3, menunjukkan bahwa amplifikasi gen 16S rRNA baik dengan metode Zhou maupun metode freeze-thawing telah berhasil dilakukan dengan baik. Hal ini terbukti dengan adanya pita-pita tunggal pada daerah sumur gel masing-masing amplikon yang sejajar dengan marker 1500pb yang merupakan ukuran fragmen gen 16S rRNA.  Namun  pada  sumur  gel  yang  berisi  hasil amplifikasi  (amplikon)  DNA  isolat  GS_TSan  (sumur  7) tidak terdapat jejak pita.

## Analisis Hasil Sekuensing
Hasil  sekuensing  berupa  data  elektroforegram seperti  tampak  pada  gambar  4.  Diperoleh  urutan  basa nukleotida  isolat  GS_MBan  dan  isolat  GS_TSan  yang kemudian urutan nukleotida tersebut digunakan sebagai dasar  konstruksi  pohon  filogenetik  untuk  mengetahui hubungan kekerabatannya.

## Studi Filogeni
Urutan  nukleotida  yang  diperoleh  dari  sekuensing kemudian  dibandingkan  dengan  data  pada Genebank menggunakan  program  BLASTN  pada website National Center  of  Biotechnology  Information  (NCBI).  Hasil pembandingan  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  isolat GS_MBan dan isolat GS_TSan dengan data dari BLASTN pada  gambar  5  menunjukkan  bahwa  isolat  GS_MBan mempunyai  kemiripan  dengan  99  bakteri  termofilik yang  lain  dengan  tingkat  homologi  sebesar  9499% sedangkan  isolat  GS_TSan  menunjukkan  kemiripan dengan  95  bakteri  termofilik  yang  lain  dengan  tingkat homologi  sebesar  78-86%  di  mana  dari  kelompok  ini masih  banyak  bakteri  yang  belum  terkulturkan (uncultured).
Konstruksi  pohon  filogenetik  dilakukan  dengan menggunakan  program Phylip  3.68  ed, metode distance matriks. Data Newick yang merupakan hasil dari running program  Phylip  6.38  dimasukkan  dalam  program
Phylodendron-Phylogenetic tree printer
(http:Ziubio.bio.indiana.edu) untuk mendapatkan pohon filogenetiknya.  Hasil  konstruksi  pohon  filogenetik seperti tampak pada gambar 5 dan gambar 6.
Gambar 4. Sebagian elektroforegram hasil sekuensing (Adenin (A)= hijau; Guanin (G)= hitam; Sitosin (C)=biru; dan Timin (T)= merah)
Tabel 1. Perbandingan bakteri hasil isolasi
Bakteri terdekat Kemiripan urutan nukleotida Karakter Ref. Isolat bakteri Bakteri terdekat Isolat GS_MBan Anoxybacillus contaminant strain 16222 98% Anaerob, batang, suhu tumbuh 55oC, potensi a- amilase, protease, P-galaktosidase Anaerob fakultatif; batang; suhu max. 60°C; suhu opt. 40- 50°C; pH opt. 7; potensi a-amilase, protease, katalase, pereduksi nitrat [21] Isolat GS_TSan Thermoanaerobacterium sp. kpu04 86% Anaerob, batang, suhu tumbuh 55oC, potensi a- amilase, protease Bakteri termofilik, anaerob, digunakan dalam produksi etanol [22] Gambar 5. Hasil konstruksi pohon filogenetik isolat GS_MBan dengan program Phylip 3.68 ed. metode
Distance Matriks menggunakan model Tree diag (Keterangan: A= Anoxybacillus ; G= Geobacillus ; U= Uncultured )
Ket:  Warna  biru=  isolat  GS_MBan;  Warna  merah= spesies  lain  yang  mempunyai  hubungan  kekerabatan terdekat dengan isolat GS_MBan; Warna hitam= spesies lain yang dibandingkan
Gambar 6. Hasil konstruksi pohon filogenetik isolat GS_TSan dengan program Phylip 3.68 ed. metode Distance Matriks menggunakan model Tree diag (keterangan: U= Uncultured )
Ket:  Warna  biru=  isolat  GS_TSan;  Warna  merah= spesies  lain  yang  mempunyai  hubungan  kekerabatan terdekat dengan isolat GS_TSan; Warna hitam= spesies lain yang dibandingkan
Tabel  1  menyajikan  perbandingan  bakteri  hasil isolasi  dengan  bakteri  yang  memiliki  hubungan kekerabatan  terdekat  berdasarkan  fragmen  gen  16S rRNA.

## Uji enzim ekstraseluler termostabil
Enzim a-amilase adalah enzim yang menghidrolisis ikatan  a-1,4  glikosida  secara  acak  di  bagian  dalam molekul  baik  pada  amilosa  maupun  amilopektin  dan menghasilkan  glukosa  sebagai  produk  akhirnya.  Uji positif terhadap uji enzim α -amilase adalah terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri. Zona bening ini diakibatkan adanya aktivitas amilolitik enzim a-amilase  yang  dihasilkan  oleh  bakteri.  Zona  bening terjadi  karena  amilum  telah  terhidrolisis  menjadi glukosa  (Melliawati,  dkk.,  2006) sehingga  iodium  tidak terjerap pada aliran spiral amilum (amilosa), sedangkan warna  biru  terjadi  karena  adanya  molekul  iodium  yang masuk dalam aliran spiral amilum (amilosa).
Enzim  protease  merupakan  enzim  yang  mampu menghidrolisis  protein  menjadi  asam-  asam  amino penyusunnya. Gelatin sebagai salah satu senyawa protein yang  mempunyai  struktur  Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu- 4Hyp-Gly-Pro-  dan  dengan  adanya  enzim  protease (gelatinase) akan terurai menjadi asam-asam aminonya. Gelatin  merupakan  senyawa  protein  kompleks  yang memadat pada proses pendinginan. Dengan keberadaan protease,  ikatan  peptida  pada  gelatin  terputus  yang menyebabkan  gelatin  terdegradasi.  Efek  dari  degradasi gelatin  adalah  gelatin  tidak  memadat  pada  proses pendinginan [23].
Enzim  P-galaktosidase  dapat  menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Dalam uji enzim ini laktosa berfungsi sebagai induser dan ONPG sebagai substrat.  ONPG  yang  berwarna  kuning  pucat  akan dihidrolisis  oleh  enzim  P-galaktosidase  menjadi galaktosa dan ONP yang berwarna kuning.
Selulosa  mampu  dihidrolisis  oleh  enzim  selulase dengan  menghidrolisis  ikatan  P-1,4-  glikosidik  dalam polimer dan melepaskan glukosa [24]. Untuk mendeteksi adanya  enzim  selulase  maka  digunakan  CMC  sebagai substrat. Dalam reaksi ini, CMC (carboxymethil cellulose) akan  dihidrolisis  menjadi  glukosa  oleh  selulase.  Uji positif terhidrolisisnya CMC ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri saat penggenangan dengan congo red sedangkan daerah yang tidak ditumbuhi bakteri akan berwarna merah. Congo red akan  membentuk  ikatan  hidrogen  dengan  polisakarida sehingga menghasilkan warna merah.
Dari  hasil  uji  enzim  ekstraseluler  secara  kualitatif diketahui  bahwa  isolat  GS_MBan  memiliki  potensi enzim  ekstraseluler  a-amilase,  protease  dan  P-
galaktosidase  sedangkan  isolat  GS_TSan  memiliki potensi enzim ekstraseluler a-amilase dan protease.

## 4. Kesimpulan
Bakteri  termofilik  sumber  air  panas  Gedongsongo dapat  diisolasi  dengan  menggunakan  pendekatan minimal media dalam kondisi anaerob dan diperoleh dua isolat tunggal yaitu isolat GS_MBan dan isolat GS_TSan. Isolat  GS_MBan  memiliki  kemiripan  dengan  bakteri kelompok Anoxybacillus sp. sebesar 94-99%; merupakan bakteri  anaerob,  berbentuk  batang,  gram  positif, memiliki enzim ekstraseluler a-amilase, protease dan P- galaktosidase.  Isolat  GS_TSan  memiliki  kemiripan dengan  bakteri  kelompok Thermoanaerobacterium  sp. sebesar 78-86%; merupakan bakteri anaerob, berbentuk batang,  gram  negatif,  memiliki  enzim  ekstraseluler α - amilase dan protease.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Z.  Elnasser,  A.  Maraqa,  W.  Owais,  A.  Khraisat, Isolation and Characterization of New Thermophilic Bacteria  in  Jordan, The  Internet  Journal  of Microbiology , 3, 2, (2006)
[2]  Alexander  Slobodkin,  Barbara  Campbell,  S.  Craig Cary,  Elizaveta  Bonch-Osmolovskaya,  Christian Jeanthon, Evidence for the presence of thermophilic Fe(III)-reducing  microorganisms  in  deep-sea hydrothermal vents at 13°N (East Pacific Rise), FEMS Microbiology  Ecology ,  36,  2-3,  (2001)  235-243 10.1111/j.1574-6941.2001.tb00844.x
[3]  Yoshihiko Sako, Satoshi Nakagawa, Ken Takai, Koki Horikoshi, Marinithermus hydrothermalis gen. nov., sp.  nov.,  a  strictly  aerobic,  thermophilic  bacterium from  a  deep-sea  hydrothermal  vent  chimney, International  Journal  of  Systematic  and  Evolutionary Microbiology , 53, 1, (2003) 59-65 doi:10.1099/ijs.0.02364-0
[4]  Thomas  D.  Brock,  Katherine  M.  Brock,  Robert  T. Belly, Richard L. Weiss, Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature, Archiv  für  Mikrobiologie ,  84,  1,  (1972) 54-68 10.1007/BF00408082
[5]  Sudhir  Kumar,  Koichiro  Tamura,  Masatoshi  Nei, MEGA3:  Integrated  software  for  Molecular Evolutionary  Genetics  Analysis  and  sequence alignment, Briefings  in  bioinformatics ,  5,  2,  (2004) 150-163 http://dx.doi.org/10.1093/bib/5.2.150
[6]  Jin-Woo  Bae,  Sung-Keun  Rhee,  Ja  Ryeong  Park, Byung-Chun  Kim,  Yong-Ha  Park,  Isolation  of uncultivated anaerobic thermophiles from compost by supplementing cell extract of Geobacillus toebii in enrichment  culture  medium, Extremophiles ,  9,  6,
(2005)  477-485 http://dx.doi.org/10.1007/s00792- 005-0467-y
[7]  Thomas  D.  Brock,  Kathryn  L.  Boylen,  Presence  of Thermophilic  Bacteria  in  Laundry  and  Domestic Hot-Water  Heaters, Applied  Microbiology ,  25,  1,
(1973) 72-76
[8]  Kellie  Matzinger,  The  Importance  of  16S  rRNA Bacterial Spore Identification, in:  Spore News, Mesa Labs, 2004.
[9]  Mark  G.  Wise,  J.  Vaun  McArthur,  Lawrence  J. Shimkets,  Bacterial  diversity  of  a  Carolina  bay  as
determined by 16S rRNA gene analysis: confirmation of  novel  taxa, Applied  and  Environmental Microbiology , 63, 4, (1997) 1505-1514
[10] C. Allmang, M. Mougel, E. Westhof, B. Ehresmann, C. Ehresmann,  Role  of  conserved  nucleotides  in building  the  16S  rRNA  binding  site  of  E.  coli ribosomal protein S8, Nucleic Acids Research , 22, 18,
(1994) 3708-3714
[11]  Agustina L. N. Aminin, Fida Madayanti Warganegara, Pingkan  Aditiawati,  Simple  enrichment  and independent cultures to expand bacterial community analysis  from  gedongsongo  hot  spring, Journal  of Bioscience and Bioengineering , 106, 2, (2008) 211-214
[12] Agustina L. N. Aminin, Fida Madayanti Warganegara, Pingkan Aditiawati, Akhmaloka, Culture- Independent and culture-dependent approaches on microbial community analysis at Gedongsongo (GS-
2)  hot  spring, International  Journal  of  Integrative Biology , 2, 3, (2008) 145-152
[13] R. McClelland, Gram's stain: the key to microbiology, Medical Laboratory Observer , 33, 4, (2001) 20-22, 25- 28; quiz 30-21
[14] Y.  K.  Lee,  H.  J.  Jung,  H.  K.  Lee,  Marine  bacteria associated  with  the  Korean  brown  alga,  Undaria pinnatifida, Journal  of  Microbiology ,  44,  6,  (2006) 694-698
[15] Joseph Sambrook, David William Russell, Molecular Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor Laboratory Press, 2001.
[16] Ekaterina V. Pestova, Donald A. Morrison, Isolation and  Characterization  of  Three  Streptococcus pneumoniae Transformation-Specific Loci by Use of a  lacZ  Reporter  Insertion  Vector, Journal  of Bacteriology , 180, 10, (1998) 2701-2710
[17] Artini  Pangastuti,  Dinamella  Wahjuningrum, Antonius  Suwanto,  Isolasi,  Karakterisasi,  dan Kloning  Gen  Penyandi α -Amilase  Bakteri  Halofil Moderat asal Bledug Kuwu, Hayati , 9, 1, (2002) 10-14
[18] M. Castañeda-Agulló, Studies on The Biosynthesis of Extracellular  Proteases  By  Bacteria  :  I.  Serratia Marcescens. Synthetic and Gelatin Media, The Journal of General Physiology , 39, 3, (1956) 369-375
[19] Hidayah Ariffin, Mohd Ali Hassan, Umi Kalsom Md Shah,  Norhafizah  Abdullah,  Farinazleen  Mohd Ghazali,  Yoshihito  Shirai,  Production  of  bacterial endoglucanase from pretreated oil palm empty fruit bunch by bacillus pumilus EB3, Journal of Bioscience and  Bioengineering ,  106,  3,  (2008)  231-236 https://doi.org/10.1263/jbb.106.231
[20] Nining  Betawati  Prihantini,  Dini  Damayanti,  Ratna Yuniati,  Pengaruh  konsentrasi  medium  ekstrak tauge  (MET)  terhadap  pertumbuhan  Scenedesmus isolat Subang, Makara Journal of Science , 11, 1, (2007) 1-9 http://dx.doi.org/10.7454/mss.v11i1.213
[21] Elke  De  Clerck,  Marina  Rodríguez-Díaz,  Tom Vanhoutte, Jeroen Heyrman, Niall A. Logan, Paul De Vos, Anoxybacillus contaminans sp. nov. and Bacillus gelatini sp. nov., isolated from contaminated gelatin batches, International  Journal  of  Systematic  and Evolutionary  Microbiology ,  54,  3,  (2004)  941-946 http://dx.doi.org/10.1099/ijs.0.02960-0
[22] Kohji  Miyazaki,  Chagan  Irbis,  Junya  Takada,  Aya Matsuura, An ability of isolated strains to efficiently cooperate  in  ethanolic  fermentation  of  agricultural
plant  refuse  under  initially  aerobic  thermophilic conditions:  Oxygen  deletion  process  appended  to consolidated  bioprocessing  (CBP),
Bioresource Technology , 99, 6, (2008) 1768-1775
https://doi.org/10.1016/j.biortech.2007.03.045
[23] Frank B. Armstrong Amstrong, Buku Ajar Biokimia, EGC, 1995.
[24] Yukiko  Nishida,  Ken-ichi  Suzuki,  Yuya  Kumagai, Hiroyuki  Tanaka,  Akira  Inoue,  Takao  Ojima, Isolation  and  primary  structure  of  a  cellulase  from the  Japanese  sea  urchin  Strongylocentrotus  nudus,
Biochimie , 89, 8, (2007) 1002-1011
https://doi.org/10.1016/j.biochi.2007.03.015