## PENGARUH KONSENTRASI SUBSTRAT HIDROLISAT TAPIOKA DAN AKSEPTOR MINIMAL PADA PEMBENTUKAN SIKLODEKSTRIN

## [The Effect of Tapioca Hydrolisate  Concentration and Minimal Acceptor on Cyclodextrin Production]

## Amran Laga
Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Pertanian Universitas Hasanuddin
Diterima  2 Januari 2008 / Disetujui  27 Desember   2008

## ABSTRACT
Substrate concentration is an important factor that influences the effectiveness of starch convertion to cyclodextrin by CGTase activity.    The  aims  of  this  research  were  to  produce  maximum  cyclodextrin  at  a  high  concentration  of  substrate  and  to  compare cyclodextrin production at an acceptor minimal process by using ethanol and water at a various substrate concentration. This  research was conducted by liquefy tapioca until reaching hydrolysis degree  (HD) of 5 %.  The hydolysate was then fractionated its acceptor by using water and ethanol 65 %.  The best result obtained was determinated by statistical method, i.e. analysis of varians (anova). If there was  a difference Duncan test was then used. The results were then used as substrate by suspending into phosphate buffer pH 6.0 (0.2 M). It was added CGTase into the substrate and processed at a temperature of 60  C for 260 minutes. The results showed that the tapioca hydrolysate substrate at HD of 5 % with a minimum acceptor at concentration of 10 – 35 % could produce cyclodextrin with relative stable of conversion degree (65.73 – 67.49 %). In the minimum acceptor process by using ethanol, the maximum amount of substrate that could be used was 30 % (w/v).  It produced cyclodextrin of 206.78 ± 1.43 g/l and the conversion value was 68.93 %.  On the other hand, the amount of substrate concentration that could be used up to 35% (w/v) by using water as a minimum acceptor.  It produced cyclodextrin of 225.76 ± 4.0 g/l with convesion value of 64.50 %.
Key words : Cyclodextrin, CGTase, hydrolysis degree, acceptor minimal, substrate concentration

## PENDAHULUAN
Siklodekstrin  merupakan  pati  termodifikasi dalam  bentuk  oligosakarida  non-pereduksi  berbentuk cincin,  tersusun  dari  6,  7,  atau  8  unit  glukosa. Berdasarkan  jumlah  glukosa  yang  menyusun, siklodekstrin  dibedakan  atas  α,  β,  dan  γ-siklodekstrin (Blackwood and  Bucke, 2000).  Siklodekstrin merupakan produk  modifikasi  dari  pati  dengan  aktifitas  enzim CGTase (siklodrekstrin glikosil transferase).
Siklodekstrin  dapat  dimanfaatkan  dalam berbagai  industri  antara  lain  pada  industri  pangan, farmasi,  kimia,  dan  kosmetik.  Pada  industri  pangan, siklodekstrin  digunakan  sebagai  antioksidan  dan pengikat  flavor  serta  senyawa-senyawa  volatil  lainnya. Dalam  industri  farmasi,  siklodekstrin  digunakan  untuk perbaikan  sifat  fisik,  kimia,  dan  biologi  obat-obatan. Dalam industri pertanian digunakan untuk meningkatkan kelarutan komponen kimia pestisida dan insektisida yang sulit  larut  dalam  air.  Siklodekstrin  dapat  berinteraksi dengan  senyawa  lain  (molekul  tamu)  kemudian membentuk  kompleks  inklusi  dengan  keseimbangan dinamik  (Vokk et  al. 1991).  Kompleks  inklusi  yang terbentuk  dapat  menimbulkan  sifat  baru  pada  molekul tamu  tersebut,  seperti  peningkatan  stabilitas  dan peningkatan  kelarutan  dalam  air  (Oakes et  al. l99l). Ilustrasi  pembentukan  kompleks  inklusi  siklodekstrin dengan senyawa lain dapat dilihat pada Gambar 1.
Kondisi  substrat  merupakan  faktor  penting yang  mempengaruhi  efektivitas  konversi  pati  menjadi siklodekstrin  oleh  aktivitas  CGTase.  Pati  gelatinisasi pada konsentrasi tinggi sulit digunakan karena viskositas pasta yang tinggi. Viskositas tapioka tergelatinisasi pada konsentrasi  5  dan  10  %  (b/v)  adalah  sebesar  2360  cP dan  15360  cP.    Kondisi  tersebut  tidak  memungkinkan untuk digunakan pada konsentrasi 10 % (b/v) atau lebih.
Tapioka terlebih dahulu dilikuifikasi menggunakan  α-amilase  untuk  mengatasi  hambatan viskositas  pada  penggunaan  substrat  dengan konsentrasi  tinggi.    Namun,  proses  likuifikasi  akan menimbulkan  masalah  baru  dengan  terbentuknya komponen  oligosakarida  dan  gula  sederhana  yang berpotensi menghambat reaksi pembentukan siklodekstrin.  Menurut  Schmid  (1989)  bahwa  proses likuifikasi pati menggunakan α-amilase akan menghasilkan pati rantai pendek berupa maltooligosakarida  dan  gula  sederhana  yang  bersifat sebagai akseptor. Maltooligosakarida atau akseptor yang terdapat  di  dalam  medium  reaksi  pada  konsentrasi  DE melebihi 20 %  menyebabkan terjadinya reaksi coupling dan  disproporsionasi,  sehingga  menghambat  reaksi pembentukan siklodekstrin.
OH HO HO HO OH OH OH OH OH CH2OH Modifikasi aktifitas kimia molekul tamu Modifikasi sifat fisik molekul tamu Asam organik Alkohol Keton Aromatik Stabilisasi Enkapsulasi molekul Anion halogen Amin Asam Aldehid Alifatik OH HO HO HO OH OH OH OH OH CH2OH OH HO HO HO OH OH OH OH OH CH2OH Modifikasi aktifitas kimia molekul tamu Modifikasi sifat fisik molekul tamu Asam organik Alkohol Keton Aromatik Stabilisasi Enkapsulasi molekul Anion halogen Amin Asam Aldehid Alifatik
Gambar 1 Ilustrasi pembentukan kompleks inklusi siklodekstrin dengan berbagai senyawa
Berdasarkan  permasalahan  tersebut  maka komponen  gula  sederhana  dan  oligosakarida  (maltosa, maltotriosa,  dan  maltotetraosa)  yang  terdapat  di  dalam hidrolisat  pati  perlu  diminimalkan,  sehingga  reaksi siklisisasi pembentukan  siklodekstrin dapat berlangsung optimal.  Pemisahan  komponen  oligosakarida  rantai pendek  dan  gula  sederhana  dalam  hidrolisat berdasarkan  tingkat  kelarutannya  dalam  suatu  pelarut. Menurut  Houghton  dan  Raman  (1998),  penggunaan pelarut  untuk  fraksinasi  senyawa  kimia  dilakukan berdasarkan  tingkat  polaritasnya,  misalnya  pelarut dengan  polaritas  tinggi  untuk  fraksinasi  senyawa kelompok  gula  dan  asam-asam  amino.  Berdasarkan tingkat kelarutan komponen oligosakarida rantai pendek dan gula sederhana (gula pereduksi) yang bersifat polar maka  digunakan  pelarut  air  dan  etanol  untuk memisahkan  atau  meminimalkan  komponen  gula pereduksi tersebut.
Tujuan  penelitian  adalah  menghasilkan siklodekstrin  yang  maksimal  pada  penggunaan  substrat konsentrasi  tinggi,  mendapatkan  konsentrasi  substrat yang  optimal  untuk  menghasilkan  siklodekstrin  yang maksimal,  dan  membandingkan  perolehan  siklodekstrin pada  proses  minimalisasi  akseptor  (oligosakarida  rantai pendek  dan  gula  sederhana)  menggunakan  air  dengan etanol pada variasi konsentrasi substrat.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan  utama  yang    digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  tapioka  (Gunung  Agung)  dan α-amilase  (Termamyl  120  KNU/g),  CGTase  (Toruzyme 3.0 KNU/g) yang diperoleh dari Novo Nordisk (Denmark). Tapioka  yang  digunakan  mengandung  pati  sebesar 84.59  %  yang  terdiri  dari  komponen  amilosa  23.74  % dan  amilopektin  76.26  %.  Alat-alat  yang  digunakan meliputi shaker  inkubator (Barnstead/Lab-line  Max Q 4000), spektrofotometer (UV/VIS spectrophotometer SP- 3000 Plus OPTIMA JAPAN), pH meter (Dakton pH 510 Series),  mikropipet  (Eppendorf  Adjustabele  Volume Pipettors), sentrifugasi (Heraeus Labofuge A), "hot plate" (Hot  plate  Stirer  CB  302  Stuart),  oven  (Memmert), kromatografi gas (GC), viskositometer   ( Brokokfield DV- E Viscositometer) dan peralatan gelas.

## Metode
Persiapan  substrat  dimulai  dengan  proses likuifikasi  tapioka  dengan  penambahan  α-amilase sebanyak  0.10  %  (b/bk  substrat)  ke  dalam  suspensi tapioka.  Suspensi tapioka dipanaskan hingga mencapai suhu 66  C untuk memperoleh hidrolisat dengan tingkat DH  5.    Hidrolisat  yang  diperoleh  disimpan  dalam  ruang pendingin  selama  48  jam,  kemudian  fraksi  encer dipisahkan  dan  endapan  yang  diperoleh  disuspensikan ke dalam pelarut yang digunakan (air dan etanol 65  %) dengan perbandingan 1 : 2. Campuran tersebut disimpan kembali  dalam  ruang  pendingin  selama  24  jam, kemudian  fraksi  encer  dipisahkan  dan  endapan  yang
diperoleh  digunakan  sebagai  substrat  untuk  produksi siklodekstrin.
Substrat  yang  diperoleh  pada  proses minimalisasi  akseptor  (gula  sederhana)  menggunakan air  disuspensikan  ke  dalam  bufer  fosfat  pH  6.0  (0.2  M) sesuai dengan konsentrasi yang diperlukan (10 – 40  % (b/v)).    Substrat  kemudian    ditambahkan  etanol  10  % (v/v)  dan  CGTase  sebanyak  100  U/gram  substrat. Proses  selanjutnya  substrat  diinkubasi  dalam  inkubator goyang  dengan  kecepatan  200  rpm  pada  suhu  60  C selama 260 menit.
Substrat  yang  diperoleh  pada  perlakuan minimalisasi  akseptor  menggunakan  etanol,  sebelum disuspensikan  ke  dalam  bufer  fosfat  pH  6.0  (0.2  M), terlebih  dahulu  dilakukan  pengukuran  kadar  alkohol (etanol) dengan kromatografi gas.  Selanjutnya substrat ditambahkan  CGTase  sebanyak  100  unit/g  substrat. Lalu  diinkubasi  dalam  inkubator  goyang  dengan kecepatan 200 rpm pada suhu 60  C, selama 260 menit. Parameter  yang  diamati  meliputi  kadar  gula pereduksi  substrat  (metode  DNS),  DE  (dextrosa equivalen)  substrat,  kadar  pati  substrat  ditentukan secara  spektrofotometer  (metode  iod),  viskositas substrat  metode  Jane  dan  Chen  (1992),  kadar  gula pereduksi  produk  (metode  DNS),  DE  (dekstrosa equivalen)  produk    dan  perolehan  siklodekstrin  serta nilai konversi substrat menjadi siklodekstrin.    Perolehan siklodekstrin ditentukan dengan metode Kitahata (1988), yakni  selisih  total  gula  (metode  fenol-asam  sulfat) dengan kadar gula pereduksi (metode DNS). Penelitian  disusun  dengan  rancangan  acak lengkap  pola  faktorial  (2  x  7).  Faktor  pertama  adalah jenis  pelarut  (air  dan  etanol)  dan  faktor  kedua  adalah konsentrasi substrat dengan 7 taraf (10, 15, 20, 25, 30, 35  dan  40)  %.  Percobaan  dilakukan  dengan  ulangan sebanyak  3  kali.  Jika  perlakuan  berpengaruh  nyata dilanjutkan dengan uji Duncan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pengaruh  konsentrasi  substrat  terhadap  gula pereduksi  dan DE substrat
Pengukuran  gula  pereduksi  dan  DE  substrat dimaksudkan  untuk  memperoleh  gambaran  gula pereduksi  dan  DE  awal  sebelum  terjadi  reaksi.    Gula pereduksi  dan  DE  substrat  diupayakan  seminimal mungkin karena gula pereduksi awal dalam jumlah yang cukup akan memacu reaksi transglikosilasi intermolekuler (reaksi dengan akseptor) dan menghambat  reaksi  transglikosilasi  intramolekuler (reaksi pembentukan siklodekstrin).
Hasil  pengamatan  gula  pereduksi  substrat berkisar antara 1.23 – 6.93 g/l dan DE substrat berkisar antara  0.52  -  1.73  %.  Hasil  analisis  sidik  ragam  gula pereduksi dan DE substrat, masing-masing berpengaruh
sangat  nyata  pada  perlakuan  minimalisasi  akseptor, konsentrasi  substrat  dan  interaksi  antara  kedua perlakuan tersebut.
Gula  pereduksi  substrat  terendah  diperoleh pada perlakuan minimalisasi akseptor menggunakan air dengan konsentrasi substrat 10 % (b/v).  Sebaliknya gula pereduksi  substrat  tertinggi  diperoleh  pada  perlakuan minimalisasi  akseptor  menggunakan  air  dengan konsentrasi  substrat  40  %  (b/v).    DE  substrat  terendah diperoleh  pada  perlakuan  minimalisasi  akseptor menggunakan  etanol  pada  konsentrasi  substrat  40  % (b/v),  sedang  DE  tertinggi  diperoleh  pada  perlakuan minimalisasi  akseptor  menggunakan  air  dengan konsentrasi substrat 40 % (b/v).  Hasil uji lanjut Duncan (α=0.05)  pada  perlakuan  konsentrasi  substrat  terhadap gula  pereduksi  menunjukkan  perbedaan  yang  nyata antara  satu  dengan  lainnya,  sedangkan  DE  susbtrat tidak  berbeda  nyata  satu  dengan  lainnya  kecuali terhadap  perlakuan  konsentrasi  10  %.  Profil  perubahan gula  pereduksi  dan  DE  pada  penggunaan  variasi konsentrasi  substrat  dengan  minimalisasi  akseptor menggunakan air dan etanol dapat dilihat pada Gambar 2.
Penggunaan  air  dan  etanol  pada  proses minimalisasi akseptor hidrolisat menunjukkan penurunan yang efektif.  Hal ini disebabkan  karena gula sederhana hasil  hidrolisat  dapat  larut  dengan  baik  dalam  air  dan etanol.
Kemampuan  gula  sederhana  larut  dalam  air dan etanol, dipengaruhi oleh interaksi antara pelarut (air dan etanol) dengan gula, serta antara gula satu dengan gula yang lain. Etanol merupakan pelarut organik dengan tingkat  polaritas  sedang  (4.3)  dibandingkan  dengan tingkat  polaritas  air  yang  tinggi  (10.2)  (Hougton  dan Raman,  1998).  Pada  tingkat  polaritas  tersebut  terjadi gaya tarik-menarik antara gula dengan gula, serta antara gula  dengan  pelarut  yang  seimbang  dalam  medium dispersi.  Hal  ini  menyebabkan  gula  -  gula  sederhana dalam  medium  tidak  dapat  menyatu,  sehingga  tidak terjadi pengendapan gula sederhana.
Kemampuan pelarut tersebut untuk melarutkan gula  sederhana  disebabkan  oleh  tiga  hal:  (1)  pelarut tersebut mempunyai polaritas yang tinggi (Houghton dan Raman, 1998), (2) ukuran molekul gula sederhana relatif kecil  dan  (3)  gula  sederhana  memiliki  sejumlah  gugus hidroksil .

## Pengaruh  konsentrasi  substrat  terhadap  kadar pati dan viskositas substrat
Pengukuran  kadar  pati  dimaksudkan  untuk mengetahui  jumlah  pati  dalam  substrat  setelah  proses likuifikasi  dan  minimalisasi  akseptor,  sebelum  reaksi pembentukan  siklodekstrin.  Demikian  pula  halnya dengan  viskositas  substrat,  dimaksudkan  untuk memperoleh  gambaran  tingkat  kekentalan  medium sebelum  reaksi  berlangsung,  karena  akan  berpengaruh dalam proses pengadukan dan reaksi enzimatis .
Hasil  pengamatan  kadar  pati  dari  semua perlakuan  berkisar  antara  82.35  –  343.48  g/l.  Hasil analisis  sidik  ragam  perlakuan  minimalisasi  akseptor, konsentrasi  substrat,  dan  interaksi  antara  kedua perlakuan  tersebut  berpengaruh  sangat  nyata  terhadap kadar pati substrat.  Kadar pati terendah diperoleh pada perlakuan minimalisasi akseptor menggunakan air pada konsentrasi  substrat  10  %.  Sebaliknya  kadar  pati tertinggi diperoleh pada perlakuan minimalisasi akseptor menggunakan etanol dengan konsentrasi substrat 40 % (b/v).  Hasil  uji  lanjut  Duncan  (α=0.05)  untuk  berbagai kombinasi  perlakuan  menunjukkan  perbedaan  yang nyata,  kecuali  perlakuan  minimalisasi  akseptor
menggunakan  air  dan  etanol  pada  masing-masing konsentrasi substrat 15 % dan 10 % tidak berbeda nyata terhadap kadar pati substrat.
Kadar pati rata - rata lebih besar pada perlakuan minimalisasi  akseptor  menggunakan  etanol  daripada perlakuan  minimalisasi  akseptor  menggunakan  air (Gambar  2).  Hal  tersebut  disebabkan  terjadinya penurunan  proporsi  kandungan  maltooligosakarida  dan gula sederhana di dalam substrat. Penurunan komponen tersebut  disebabkan  karena  proses  pengenceran  yang dilakukan  untuk  mereduksi  kelebihan  etanol  di  dalam substrat.  Proses  ini  menyebabkan  peningkatan  kadar pati secara proporsional.
Gambar 2  Pengaruh konsentrasi substrat terhadap gula pereduksi (GP) dan DE  substrat dengan minimalisasi akseptor menggunakan air dan etanol
Gambar  3      Pengaruh  konsentrasi  substrat  terhadap  kadar  pati  (KP)  dan    viskositas  (Vis)  substrat  dengan  minimalisasi  akseptor menggunakan air  dan etanol
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 10 15 20 25 30 35 40 Konsentrasi Substrat (%) G P Su b s tra t (g /l ) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 DE Su b s tra t (% ) GP (Air) GP (E-OH) DE (Air) DE (E-OH) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 10 15 20 25 30 35 40 Konsentrasi Substrat (%) K ad ar P ati (g/l ) 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 V iskosi tas ( cP ) Pati (Air) Vis (Air) Vis (E-OH)
Pati (E-OH)
Peningkatan  kandungan  pati  substrat  tersebut diikuti  dengan  peningkatan  viskositas  substrat.    Hasil pengukuran  viskositas    substrat  dari  semua  perlakuan berkisar  antara  5.20  –  5,366.67  cP.  Hasil  analisis  sidik ragam  terhadap  perlakuan  minimalisasi  akseptor, konsentrasi  substrat,  dan  interaksi  antara  kedua perlakuan  tersebut  berpengaruh  sangat  nyata  terhadap viskositas substrat.  Viskositas terendah diperoleh pada perlakuan  minimalisasi  akseptor  menggunakan  etanol dengan  konsentrasi  substrat  10  %  (b/v),  sedangkan viskositas tertinggi diperoleh pada perlakuan minimalisasi  akseptor  menggunakan  etanol  pada  taraf konsentrasi substrat 40 % (b/v).  Hasil uji lanjut Duncan (α:0.05) untuk semua kombinasi perlakuan, menunjukkan perlakuan minimalisasi akseptor menggunakan  air dan etanol pada  konsentrasi substrat 10,  15,  20,  25  dan  30  %  tidak  berbeda  nyata  satu dengan  yang  lainnya,  tetapi  berbeda  nyata  terhadap perlakuan konsentrasi 35 dan 40 %.
Viskositas  substrat  yang  diperoleh  pada perlakuan  minimalisasi  akseptor  menggunakan  etanol, rata  -  rata  lebih  besar  (1,019.03  cP)  daripada penggunaan  air  (463.05  cP).    Perbedaan  tersebut disebabkan  karena  pada  perlakuan  minimalisasi akseptor menggunakan etanol, kadar pati rata-rata lebih besar daripada perlakuan menggunakan air.   Perlakuan konsentrasi  substrat  antara  10  sampai  25  %  diikuti dengan  peningkatan  viskositas  substrat,  tetapi peningkatan  konsentrasi  substrat  tersebut  tidak berpengaruh  nyata  terhadap  viskositas  substrat. Peningkatan  konsentrasi  substrat  yang  lebih  besar (30 – 40 %) menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap viskositas substrat.
Secara  umum  peningkatan  viskositas  substrat disebabkan  oleh  peningkatan  kadar  pati  substrat. Menurut  Lee  dan  Kim  (1991)  peningkatan  konsentrasi pati  dengan  perlakuan  pemanasan  akan  diikuti  dengan peningkatan viskositas secara eksponensial. Selanjutnya  Jane  dan  Chen  (l992)  melapor  bahwa peningkatan  konsentrasi  larutan  amilosa  diikuti  dengan peningkatan  viskositas  secara  liniar,  sedangkan peningkatan  konsentrasi  larutan  amilopektin  juga meningkatkan  viskositas  walaupun  tidak  secara  liniar (bersifat kuadratik).
Peningkatan viskositas pasta disebabkan oleh banyaknya air yang terikat melalui ikatan H pada gugus hidroksil  dari  komponen  amilosa  dan  amilopektin, sehingga pergerakan air menjadi berkurang. Peningkatan viskositas tersebut merupakan efek sinergis dari ukuran molekul, interaksi antara komponen amilosa dan  amilopektin,  dan  konsentrasi  komponen  tersebut (Jane dan Chen, 1992).
Penggunaan hidrolisat tapioka sebanyak 10 % (b/v) sebagai substrat menunjukkan viskositas yang lebih kecil (5.76 cP), dibandingkan dengan tapioka 10 % (b/v) tergelatinisasi  (15,360  cP).  Viskositas  tertinggi (5,366.67  cP)  diperoleh  pada  perlakuan  minimalisasi
akseptor  menggunakan  etanol  dengan  konsentrasi substrat  40  %  (b/v)  (Gambar  3).    Keadaan  tersebut menunjukkan  bahwa  tapioka  terlikuifikasi  pada  tingkat DH 5, masih efektif digunakan hingga konsentrasi 35 % (b/v).  Lee dan Kim (1991) melaporkan bahwa viskositas pati  jagung  pada  konsentrasi  7  dan  10  %  yang dipanaskan  (gelatinisasi),  memiliki  viskositas  sebesar 770.1  dan  30,003.4  cP.  Akibatnya  penggunaan  pati tersebut tidak dapat melebihi konsentrasi 7 %.
Viskositas hidrolisat tapioka pada tingkat DH-5 lebih  rendah  dibandingkan  dengan  viskositas  tapioka gelatinisasi  pada  tingkat  konsentrasi  yang  sama.    Hal tersebut  disebabkan oleh terjadinya pemotongan rantai molekul  pati  secara  acak,  sehingga  pati  dengan  rantai molekul  panjang  dirubah    menjadi  rantai  molekul  lebih pendek.
Panjang  rantai  polisakarida  menurut  Rapaille dan  Van  Hemedrijeck  (1992)  menentukan  tingkat viskositas  pasta.    Polisakarida    berantai  pendek  akan membentuk  pasta  dengan  kekentalan    lebih  rendah dibandingkan dengan pasta pati yang mempunyai rantai polisakarida lebih panjang. Tingkat viskositas pasta juga dipengaruhi  oleh  interaksi  antara  molekul  pati  seperti lilitan  antara  molekul  -  molekul  bercabang  (Jane  dan Chen, 1992).

## Pengaruh  konsentrasi  substrat  terhadap  gula pereduksi dan DE  produk
Pengukuran  gula  pereduksi  dan  DE  produk dimaksudkan  untuk  memperoleh  gambaran  aktivitas katalisis  dari  CGTase  selama  reaksi  berlangsung. Pengkuran  tersebut  perlu  dilakukan  mengingat  CGTase selain melakukan reaksi siklisasi yang akan menyisakan sejumlah rantai pendek yang bersifat pereduksi, CGTase juga  mengatalisis  reaksi coupling yaitu  reaksi dekomposisi  siklodekstrin  dan  reaksi  disproporsionasi. Aktivitas  reaksi coupling tersebut  sangat  dipengaruhi oleh  jumlah  gula  pereduksi  dalam  medium  reaksi.  Gula pereduksi  akan  bersifat  sebagai  akseptor  dalam  reaksi dekomposisi siklodekstrin.
Hasil  pengukuran  gula  pereduksi  produk  dari semua perlakuan berkisar antara 19.65 – 72.06 g/l. Hasil analisis  sidik  ragam  perlakuan  minimalisasi  akseptor, konsentrasi  substrat,  dan  interaksi  antara  kedua perlakuan  tersebut  berpengaruh  sangat  nyata  terhadap gula  pereduksi  substrat.  Gula  pereduksi  terendah diperoleh  pada  perlakuan  minimalisasi  akseptor menggunakan  air  dengan  konsentrasi  substrat  10  % (b/v), sedangkan gula pereduksi tertinggi diperoleh pada perlakuan  dengan  menggunakan  air  pada  konsentrasi substrat  35  %  (b/v).  Hasil  uji  lanjut  Duncan  (α=0.05) pada  perlakuan  konsentrasi  substrat  terhadap  gula pereduksi  produk,  menunjukkan  perbedaan  yang  nyata antara  perlakuan  satu  dengan  yang  lainnya,  kecuali pada perlakuan konsentrasi 35 dan 40 % tidak berbeda nyata.
Hasil  perhitungan  DE  produk  berkisar  antara 17.58  –  23.70  %.  Nilai  DE  terendah  diperoleh  pada perlakuan  menggunakan  etanol  pada  konsentrasi substrat 40  % (b/v), sedang DE tertinggi juga diperoleh pada  perlakuan  menggunakan  etanol  dengan konsentrasi substrat 20 % (b/v).  Hasil uji lanjut Duncan (α=0.05)  pada  perlakuan  konsentrasi  substrat  terhadap DE  produk  menunjukkan  perbedaan  yang  tidak  nyata antara perlakuan konsentrasi 10, 15, 25, 30, dan 35 %, tetapi berbeda nyata terhadap perlakuan konsentrasi 20 dan 40 %.
Peningkatan  kadar  gula  pereduksi  produk (Gambar  4)  seiring  dengan  peningkatan  konsentrasi substrat,  tetapi  nilai  DE  produk  tidak  mengalami peningkatan.    Hal  ini  menunjukkan  bahwa  peningkatan gula  pereduksi  merupakan  peningkatan  secara proporsional,  sebagai  produk  samping  dari  peningkatan aktivitas pembentukan siklodekstrin.
Aktivitas  siklisasi  substrat  pati  membentuk siklodekstrin  akan  menyisakan  sejumlah  komponen rantai  pendek  yang  tidak  dapat  dikonversi  menjadi siklodekstrin.  Akumulasi rantai pendek tersebut menye- babkan  peningkatan  kadar  gula  pereduksi.    Menurut Kitahata  (1988)  dan  Tankova  (1998)  pembentukan siklodekstrin  dari  substrat  (pati  atau  maltooligosakarida) melalui reaksi siklisasi CGTase, juga menghasilkan gula sederhana  (molekul  rantai  pendek).  Pembentukan siklodekstrin dan gula sederhana tersebut melalui reaksi seperti berikut:
siklisasi Gn                                                            G (n-x)  +  cGx
Keterangan:
Gn  =  Rantai  lurus  maltooligosakarida  yang  mengandung  n sebagai unit dari   1,4-α-D-glukopiranosa cGx  =  Siklodekstrin      dengan    x    sebagai    unit    1,4-α-D- glukopiranosa
Peningkatan  konsentrasi  substrat  menunjukan nilai  DE  produk  tetap  stabil  (Gambar  4).  Hal  tersebut menunjukkan  terhambatnya  aktivitas  reaksi  nonsiklisasi (disproporsionasi  dan coupling ).  Fenomena  ini  juga dipengaruhi oleh penggunaan substrat dengan akseptor minimal,  serta  penambahan  etanol  10  %  (v/v)  yang berperan  dalam  pembentukan  kompleks  inklusi  dengan siklodekstrin, sehingga reaksi coupling dapat dicegah.
Kompleks  inklusi  yang  terbentuk  antara siklodekstrin  dengan  molekul  tamu  menimbulkan  sifat baru  dari  molekul  tersebut  (Oakes et  al .  1991).
Selanjutnya  Blackwood  dan  Bucke  (2000)  melaporkan bahwa terbentuknya kompleks inklusi antara siklodekstrin  dengan  pelarut  organik  menyebabkan perubahan  konformasi  struktur  siklodekstrin,  sehingga kontak  antara  siklodekstrin  dengan  CGTase  terhambat. Perubahan  struktur  siklodekstrin  tersebut  menyebabkan CGTase  tidak  dapat  mengenali  sisi  aktif  siklodekstrin, sehingga terbebas dari proses hidrolisis
Gambar 4  Pengaruh konsentrasi substrat terhadap gula pereduksi (GP) dan DE produk  dengan minimalisasi akseptor menggunakan air dan etanol 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 10 15 20 25 30 35 40 Konsentrasi Substrat (%) GP P rod u k (g/ l) 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 DE P rod u k (%) GP (Air)
GP (E-OH) DE (Air) DE (E-OH)
Proses  pembentukan  kompleks  inklusi  antara siklodekstrin dengan etanol merupakan suatu cara untuk menghindari degradasi siklodekstrin. Akibatnya pembentukan  gula  pereduksi  berkurang  selama  reaksi. Hal  tersebut  nampak  dari  nilai  DE  produk  yang    relatif stabil.  Penambahan etanol 10 % (v/v) ke dalam medium reaksi  dapat  menghambat  laju  pembentukan  gula pereduksi  selama  reaksi  pembentukan  siklodekstrin berlangsung (Lee dan Kim, 1991; Blackwood dan Bucke, 2000).

## Pengaruh  konsentrasi  substrat  terhadap perolehan siklodekstrin dan  nilai  konversi
Perolehan  siklodekstrin  dari  semua  perlakuan berkisar antara 65.22 – 225.76 g/l dengan nilai konversi antara  36.43  –  68.93  %.  Hasil  analisis  sidik  ragam menunjukkan  bahwa  penggunaan  jenis  pelarut  air  dan etanol  untuk  minimalisasi  akseptor  dan  variasi konsentrasi  substrat  serta  interaksinya  berpengaruh sangat  nyata  terhadap  perolehan  siklodekstrin  dan  nilai konversi.
Nilai  konversi  terendah  (36.43  %)  diperoleh pada  perlakuan  minimalisasi  akseptor  menggunakan etanol  dengan  konsentrasi  substrat  40  %,  sedangkan nilai  konversi  tertinggi  (68.93  %)  diperoleh  pada perlakuan  minimalisasi  akseptor  menggunakan  etanol dengan konsentrasi substrat 30%. Perlakuan konsentrasi substrat  antara  10  –  30  %  (b/v)  menghasilkan siklodekstrin  dengan  nilai  konversi  yang  stabil  pada kisaran  65.73  –  67.49  %.  Uji  lanjut  Duncan  pada perlakuan tersebut tidak bebeda nyata satu dengan yang lainnya. Namun, pada penggunaan konsentrasi substrat yang  lebih  tinggi  (35  dan  40  %  b/v)  nilai  konversi menurun menjadi 55.50 % dan  40.14 %). Hasil lanjut uji Duncan penurunan nilai konversi tersebut berbeda nyata satu  dengan  lainnya.  Stabilnya  tingkat  konversi pembentukan  siklodekstrin  pada  penggunaan  substrat antara 10 – 30 % (b/v) (Gambar 5), menunjukkan bahwa penggunaan substrat hidrolisat tapioka dengan akseptor minimal  pada  tingkat  DH-5  merupakan  kondisi  substrat yang optimal untuk dikonversi menjadi siklodekstrin.
Perlakuan  peningkatan  konsentrasi  substrat cenderung  diikuti  dengan  peningkatan  perolehan siklodekstrin  (Gambar  5).  Perlakuan  minimalisasi akseptor menggunakan air, siklodekstrin tertingi (225.76 g/l)  diperoleh  pada  penggunaan  substrat  35  %  (b/v), sedangkan  untuk  minimalisasi  akseptor  mengunakan etanol, siklodekstrin tertinggi (206.78 g/l) diperoleh pada penggunaan substrat 30 % (b/v).
Perolehan  siklodekstrin  sebesar  225.76  g/l pada  perlakuan  minimalisasi  akseptor  mengunakan  air dengan  konsentrasi  substrat  35  %  (b/v)  merupakan perolehan  siklodekstrin  tertinggi  dari  semua  kombinasi perlakuan.  Perolehan  siklodekstrin  tersebut  pada  uji lanjut  Duncan  (α=0.05)  menunjukkan  perbedaan  yang nyata  terhadap  semua  kombinasi  perlakuan  lainnnya. Perolehan  siklodekstrin  sebesar  206.78  g/l  pada
perlakuan  minimalisasi  akseptor  mengunakan  etanol dengan  konsentrasi  substrat  30  %  (b/v)  pada  uji  lanjut Duncan  (α=0.05)  menunjukkan  perbedaan  yang  nyata terhadap  semua  kombinasi  perlakuan  lainnya,  tetapi tidak  berbeda  nyata  terhadap  perlakuan  minimalisasi akseptor  mengunakan  air  dengan  konsentrasi  substrat 30  %  (b/v)  dengan  perolehan  siklodekstrin  sebesar 198.18 g/l.
Pembentukan  siklodekstrin  yang  maksimal tersebut disebabkan karena beberapa hal, yakni substrat yang  digunakan  mempunyai  struktur  yang  lebih sederhana,  terhambatnya  pembentukan  gula  pereduksi selama  reaksi,  dan  degradasi  siklodekstrin  dapat dihambat  karena  terbentuknya  kompleks  inklusi  antara siklodekstrin  dengan  etanol.  Menurut  Tankova  (l998) penambahan pelarut organik ke dalam campuran reaksi akan  meningkatkan  perolehan  siklodekstrin  50  –  55  %, karena terbentuknya kompleks inklusi antara siklodekstrin  dengan  pelarut  organik,  sehingga siklodekstrin yang terbentuk tidak mengalami hidrolisis. Perlakuan minimalisasi akseptor menggunakan etanol  pada  konsentrasi  substrat  antara  15  –  30  %, menunjukkan  perolehan  siklodekstrin  dan  nilai  konversi lebih  besar  daripada  perlakuan  minimalisasi  akseptor menggunakan  air  pada  taraf  konsentrasi  yang  sama (Gambar  5).    Hal  tersebut  dapat  disebabkan  oleh  dua faktor, (1) karena kadar gula pereduksi dan DE substrat lebih  kecil  pada  perlakuan  minimalisasi  akseptor menggunakan  etanol  daripada  perlakuan  menggunakan air,  dan  (2)  kadar  pati  substrat  lebih  besar  pada perlakuan  minimalisasi  akseptor  menggunakan  etanol daripada perlakuan menggunakan air.
Perlakuan  peningkatan  konsentrasi  substrat sampai  35  %  pada  perlakuan  minimalisasi  akseptor menggunakan  air  menunjukkan  perolehan  siklodekstrin yang  maksimal  (225.76  g/l)  dengan  konversi  64.50  %. Sebaliknya  pada  perlakuan  minimalisasi  akseptor menggunakan etanol perolehan siklodekstrin mengalami penurunan  (163.09  g/l)  dengan  konversi  46.60  %. Perolehan  tersebut  menunjukkan  produksi  siklodekstrin pada perlakuan minimalisasi akseptor menggunakan air dapat  digunakan  sampai  konsentrasi  35  %  (b/v).  Pada produksi  siklodekstrin  dengan  perlakuan  minimalisasi akseptor  menggunakan  etanol  konsentrasi  substrat maksimum  digunakan  sampai  30  %  (b/v).  Perolehan siklodekstrin tersebut menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan perolehan siklodekstrin (146.5 g/l) pada  penggunaan  substrat  konsentrasi  30  %  (b/v) (perlakuan  1  –  30  %  pati  terlikuifikasi)  yang  dilaporkan Mattsson et al . (1991). Pembentukan siklodekstrin yang berlangsung optimal  sampai tingkat konsentrasi substrat 30  – 35  % (b/v) disebabkan oleh jumlah gula pereduksi substrat dan gula pereduksi yang terbentuk selama reaksi rendah dan viskositas  pasta  yang  kecil,  serta  rantai  molekul  pati dalam substrat relatif panjang (DH-5).
Reaksi  pembentukan  siklodekstrin  menurut Schmid  (1989)  hanya  dapat  efisien  jika  substrat  yang digunakan nilai DE-nya tidak melebihi 20 %.  Selain itu, menurut  Kitahata  (1988)  substrat  yang  hanya mengandung  amilosa  atau  amilopektin  maka  katalisis CGTase semata-mata mengkatalisis reaksi transglikosilasi  intramolekuler  untuk  menghasilkan siklodekstrin,  sehingga  selama  reaksi  berlangsung siklodekstrin terus mengalami peningkatan.
Perlakuan  konsentrasi  substrat  35  %  (b/v) dengan  minimalisasi  akseptor  menggunakan  etanol, menunjukkan  penurunan  perolehan  siklodekstrin  dan nilai  konversi.  Fenomena  tersebut  disebabkan  karena viskositas  substrat  telah  mencapai  nilai  1,525  cP. Akibatnya  antara  enzim  dengan  substrat  tidak  dapat berinteraksi dengan baik.  Faktor lain yang berpengaruh adalah  aktivitas  CGTase  terhambat  akibat  peningkatan konsentrasi substrat yang semakin besar.   Kedua faktor tersebut  terjadi  karena  adanya  peningkatan    kadar  pati substrat  yang  signifikan  (303.87  g/l)  dibandingkan dengan  kadar  pati  substrat  (287.63  g/l)  pada penggunaan  air  dengan  tingkat  konsentrasi  substrat yang  sama  (35  %,  b/v).  Pengaruh  faktor  tersebut semakin jelas pada perlakuan konsentrasi substrat 40 % (b/v)  dengan  perolehan  siklodekstrin  dan  nilai  konversi semakin kecil (Gambar 5).
Penggunaan  substrat  dengan  konsentrasi  yang tinggi umumnya menunjukkan produkktivitas siklodekstrin  yang  rendah.    Hal  tersebut  seperti  yang dilaporkan Mattsson et al. (1991) pada penggunaan pati jagung  terlikuifikasi  dengan  penambahan  etanol
mengalami  penurunan  derajat  konversi  dari  70  % menjadi 48.83 % pada peningkatan konsentrasi substrat (1  -  30  %).    Fenomena  yang  sama  dilaporkan  Lee  dan Kim  (1991)  pada  penggunaan  pati  jagung  tanpa likuifikasi  dengan  beberapa  tingkat  konsentrasi  substrat (5  –  20  %)  dihasilkan  siklodekstrin  maksimal  (50  g/l) pada konsentrasi substrat 15 %.

## KESIMPULAN
Penggunaan  hidrolisat  tapioka  dengan akseptor  minimal pada    tingkat DH-5 dapat digunakan sebagai  substrat  sampai  konsentrasi  30  –  35  %  (b/v) dengan perolehan siklodekstrin yang maksimal.
Penggunaan  substrat  hidrolisat  tapioka  pada tingkat DH-5 menunjukkan viskositas yang relatif rendah hingga tingkat konsentrasi substrat 30 % (145.47 cP).
Peningkatan  konsentrasi  substrat  antara 10  –  30  %  (b/v)  diikuti  dengan  peningkatan  perolehan siklodekstrin  (65.73  –  202.48  g/l)  dengan  derajat konversi yang relatif stabil (65.73 – 67.49 %).
Perlakuan minimalisasi akseptor menggunakan etanol,  substrat  maksimum  digunakan  sampai konsentrasi  30  %  (b/v)  dengan  perolehan  siklodekstrin 206.78 ± 1.43 g/l dan nilai konversi sebesar 68.93 %. Perlakuan minimalisasi akseptor menggunakan air,  substrat  dapat  digunakan  sampai  konsentrasi  35  % (b/v)  dengan  perolehan  siklodekstrin  sebesar  225.76 ± 4.0 g/l dan nilai konversi 64.50 %.
Gambar  5  Pengaruh  konsentrasi  substrat  terhadap  perolehan  siklodekstrin  (SD)  dan  nilai  konversi  (NK)  dengan  minimalisasi  akseptor menggunakan air  dan etanol 0 40 80 120 160 200 240 10 15 20 25 30 35 40 Konsentrasi Substrat (%) S ikl od ekstr in ( g /l ) 20 30 40 50 60 70 80 N ilai K on versi ( % )
SD (Air) SD (E-OH)
NK (Air) NK (E-OH)

## DAFTAR PUSTAKA
Blackwood AD, Bucke C. 2000. Addition of polar organic solvents can improve the product selectivity of cyclodextrin glycosyltransferase solvent effects on  CGTase. J  Enzyme  and  Microbial  Technol 27: 704-708.
Houghton  PJ,    Raman  A.  1998. Laboratory  Handbook for  The  Fractination  of  Natural  Extracts . London: Chapman and Hall.
Jane  JL,  Chen  JF.  1992.    Effect  of  amylose  molecular size  and  amylopectin  branch  chain  length  on paste  properties  of  starch. J  Cereal  Chem 69(1): 60-65.
Kitahata  S.1988.  Cyclomaltodextrin  glucanotransferase. p 154-163.  Di dalam: The Amylase Research Society of Japan (ed ).  Handbook of Amylases and  Related  Enzymes .  Oxford:  Pergamon Press.  .
Lee  YD,  Kim  HS.  1991.    Enzymatic  production  of cyclodextrin from unliquefied corn starch in an attrition  bioreactor. J  Biotechnol  and  Bioeng 37(4): 795-891.
Mattsson P,  Korpela T,   Pavilainen S,  Makela M. 1991. Enhanced conversion of starch to cyclodextrin in  ethanolic  solutions  by Bacillus  circulan var alkalophilus
cyclomaltodextrin glucano-
transferase. App  Bichem  and  Biotechnol 30:
17-28.
Oakes,  J.V.,  Shewmaker,  C.K.    and  Stalker,  D.M.  l99l. Production  of  cyclodextrins.  A  novel carbohydrate in the tubers of transgenic potato plant. J Biotechnol 9(l0): 982-987.
Rapaille,  A.  and  van  Hemelrijeck,  J.  1992.    Modified starch. Di  dalam:  Imeson    A,  editor.
Thickening  and  Gelling  Agents  for  Food . Madras : Blackie Academic & Profesional.
Schmid  G.  1989. Cyclodextrin  glycosyltransferase production:    Yield  Enhancement  by Overexpression  of  Cloned  Genes. TIBTECH 7(9): 244-247. Tankova A.1998. Bacterial cyclodextrin glucanotransferase. J  Enzyme  and  Microbial Technol 22: 678-686.
Uitdehaag JCM, Kalk KH, Veen BA van der,   Dijkhuizen L,  Dijkstra  BW.1999. The  cyclization mechanism  of  cyclodextrin  glycosiltransferase as  revealed  by  g-cyclodextrin-CGTase complex  at  1.8  resolution. J  Biol  Chem 274: 34868-34876.
Vokk R,  Menert A, Saar EK. 1991.  Inclusion complexes with  essential  oils  and  spices.    Biotechnology of α-cyclodextrin.  R&D. BFE 8(9): 510-516