## KAJIAN TOKSISITAS DARI TUBUH BUAH Ganoderma lucidum DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BST)

## R OSS N URUL R OHMAH , N UNIEK I NA R ATNANINGTYAS , A RI A SNANI
Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, Jalan dr. Suparno 63 Purwokerto 53122

## A B S T R A C T
Ganoderma lucidum is polyporus fungi from Basidiomycetes which can be used as traditional medicines. Toxicity test with Brine Shrimp Lethality Test (BST) method using Artemia salina was conducted to find out toxic effect of G.lucidum . An extract would have toxic effect if the LC 50 < 1000 µg/ml. The aims of this experiment were to know about the toxicity level from G.lucidum with Brine Shrimp Lethality Test (BST) method and determined the concentration of fruiting body extract of G.lucidum which had the best toxicity effect in LC 50 . There were two extraction methods used in this experiment, first one stage extraction and then multilevel extraction with hexane, ethyl acetate, and ethanol. Each solvent was made in 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, and 125 ppm. This process was repeated for three times. This experiment used G.lucidum extract which was tested to A.salina and secunder compound metabolit test from the most toxic G. lucidum was done with phytochemical analysis. The result indicated that fruiting body extract from G.lucidum could kill A.salina because all extract was positively contained alkaloid and terpenoid but negatively contained flavonoid. Fruiting body extract from G.lucidum which had lowest LC 50 wass ethyl asetat extract with one stage extraction in concentration 53,70 ppm and highest LC 50 was ethanol extract with multilevel extraction in concentration 501,18 ppm.
K EY W ORDS : Brine Shrimp Lethality Test (BST), Ganoderma lucidum, LC50, Toxicity
Penulis korespondensi: A NISA K ARTIKA S ARI | email: yozzroses@gmail.com

## P E N D A H U L U A N
Ganoderma lucidum merupakan jamur poliporus dari kelas Basidiomycetes yang dikenal dengan nama Reishi atau Lingzi di negara Cina dan Jepang. Makromorfologi G. lucidum berbentuk setengah lingkaran dan berwarna merah kecoklatan dengan tepi merah kehitaman, membentuk zona konsentris, dan bagian bawah terdapat pori-pori tempat keluarnya spora. Permukaan atasnya halus dan berkilat, memiliki tangkai yang berwarna seperti tudungnya (Suryanto et al ., 2005). Tubuh buah G. lucidum mengandung lemak, protein, germanium organik, polisakarida, dan adenosin. Jamur ini juga mengandung komponen antitumor berbobot molekul rendah, seperti flavonoid, tanin, alkaloid, terpenoid, dan steroid (Mizuno, 1997). Beberapa  senyawa  aktif  dari G. lucidum yang telah  diketahui  memiliki  aktivitas biologi  adalah golongan  polisakarida  dan  terpenoid yang dapat memberikan toksisitas dan efek antikanker. Kemampuan tersebut menjadikan G. lucidum diindikasikan  untuk pengobatan kanker (Widodo, 2006).
Brine shrimp lethality test (BST) adalah salah satu metode yang digunakan untuk melacak senyawa bioaktif yang terdapat di dalam bahan alam menggunakan larva Artemia salina .  Larva udang ini digunakan sebagai hewan uji pada metode BST dikarenakan pertumbuhan pada fase nauplius identik dengan pertumbuhan sel kanker yaitu mitosis (Kresnamurti et al , 2008). Keuntungan penggunaan metode BST ini adalah waktu yang dibutuhkan cepat, biaya murah, pengerjaan sederhana, tidak perlu aseptik, tidak ada peralatan khusus, sampel sedikit, dan hasilnya dapat dipercaya sebelum dilanjutkan pada uji klinis (Meyer et al ., 1982). A. salina
merupakan organisme sejenis udang-udangan yang berukuran kecil dan dikenal dengan nama brine shrimp . Brine shrimp hidup di kadar garam yang tinggi (15-300 per mil), 25 0 C-30 0 C, dan pH 7,3-8,4 (Djarijah,1995). Larva A. salina telah digunakan sebagai uji bioaktivitas dan terdapat korelasi positif antara uji toksisitas udang laut ( Brine Shrimp Toxicity ) dengan potensi suatu senyawa sebagai antikanker. Uji toksisitas dilakukan dengan mengamati kematian hewan percobaan yang dianggap sebagai pengaruh ekstrak kasar yang diuji. Uji toksisitas dimaksudkan untuk memaparkan adanya efek toksik dan untuk meneliti batas keamanan dalam kaitannya dengan penggunaan senyawa yang ada dalam ekstrak tersebut.Sifat toksisitas diketahui berdasarkan jumlah kematian larva akibat pemberian ekstrak G. lucidum yang mengandung senyawa antikanker. Menurut Meyer et al. (1982), suatu ekstrak bersifat toksik terhadap A. salina apabila mempunyai harga LC 50 -nya < 1000 µg/ml. Metode ekstraksi yang digunakan untuk mendapatkan ekstrak tubuh buah G. lucidum yaitu dengan menggunakan metode maserasi. Metode ini merupakan metode ekstraksi sederhana yang dilakukan dengan cara merendam sampel dalam pelarut organik pada temperatur ruangan dan terlindung dari cahaya. Pemilihan pelarut harus berdasarkan polaritas dari senyawa yang akan diisolasi. Senyawa polar akan lebih mudah larut dalam pelarut polar dan senyawa non polar akan lebih mudah larut dalam pelarut non polar. Derajat polaritas tergantung pada konstanta dielektrik. Makin besar konstanta dielektrik makin polar pelarut tersebut  Sudarmadji et al ., (1989) dalam Putranto (2010).

## M E T O D E
Perlakuan yang dicobakan dengan menggunakan 3 jenis pelarut, yaitu heksana, etil asetat dan etanol. Ekstraksi dilakukan dengan 2 jenis metode yaitu bertahap dan bertingkat.  Masing-masing larutan dibuat dalam 4 konsentrasi yaitu 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm dan 125 ppm yang diulang sebanyak 3 kali.
Serbuk tubuh buah Ganoderma lucidum diekstraksi menggunakan metode ekstraksi bertahap dan bertingkat, hingga didapatkan ekstrak kental tanpa pelarut. Kemudian dilakukan uji toksisitas  dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Tahap pertama yang dilakukan yaitu menetaskan telur Artemia salina menggunakan air laut. Telur udang akan menetas menjadi udang-udang kecil yang disebut nauplii setelah dua hari. Hasil ekstraksi tubuh buah G. lucidum masing-masing diambil 50 mg dan ditambahkan 2 tetes pereaksi tween 80 dilarutkan dalam 5 ml air laut, sehingga diperoleh larutan induk 10000 ppm. Larutan induk dari tiap ekstrak diambil 0,5 ml;  0,25 ml; 0,125 ml; dan 0,0625 ml menggunakan mikropipet dan diulang sebanyak 3 kali. Kemudian ekstrak diencerkan menggunakan air laut menjadi 5 ml dengan konsentrasi akhir ekstrak 1000, 500, 250, dan 125 ppm.
Masing-masing vial diisi 10 ekor larva udang dengan air laut secukupnya, diberi 2 tetes larutan ragi (3 mg/ml air laut) sebagai nutrisi kemudian diberi sampel uji dengan volume tertentu dan diencerkan dengan air laut hingga 5 ml. Tabung uji dan kontrol diinkubasi dalam keadaan terbuka dan mendapat cahaya selama 24 jam. Jumlah larva udang yang masih hidup untuk tiap-tiap konsentrasi dihitung dan dicatat untuk menentukan persentase kematian udang dan menghitung nilai LC 50 . Bila dalam larutan kontrol terdapat larva udang yang mati, maka jumlah larva udang yang hidup dalam larutan kontrol dikurangi jumlah larva udang yang hidup dalam larutan uji. Persentase kematian larva udang dihitung dengan rumus sebagai berikut :
= ∑ larva hidup kontrol − ∑larva hidup perlakuan ∑ larva hidup kontrol 𝑥 100%
Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis menggunakan analisis probit untuk menentukan harga LC 50 . Bila masing-masing ekstrak yang diuji memiliki nilai LC 50 kurang dari 1000 ppm, maka ekstrak tersebut bersifat toksik.
Uji ada tidaknya kandungan kimia secara kualitatif dilakukan dengan menggunakan uji warna. Uji Alkaloid dilakukan dengan cara 2 ml sampel dilarutkan dalam 2 ml HCL 2%, dipanaskan 5 menit pada suhu 70 o C dan disaring menggunakan kertas saring. Filtrat yang diperoleh ditetesi pereaksi Dragendroff sebanyak 2-3 tetes. Adanya senyawa alkaloid ditunjukkan dengan terbentuknya endapan jingga. Uji Flavonoid dilakukan dengan cara 2 ml sampel dilarutkan dalam 2 ml metanol, kemudian ditambah serbuk Mg dan 5 tetes HCl pekat. Adanya senyawa flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah atau jingga.  Uji Terpenoid  dilakukan dengan cara 2  ml sampel ditambah dengan 1 ml pereaksi Lieberman-Burchard. Adanya senyawa terpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu.
H A S I L D A N P E M B A H A S A N
Berdasarkan data primer berupa jumlah larva A.salina yang masih hidup pada tiap vial uji setelah diinkubasi selama 24 jam pada konsentrasi 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm dan 125 ppm, terlihat bahwa semakin tinggi
konsentrasi ekstrak semakin banyak larva yang mati, sedangkan pada vial kontrol tidak ditemukan larva yang mati.
Gambar 1 dan Gambar 2 menunjukkan bahwa persentase kematian A.salina pada perlakuan ekstrak bertahap dan bertingkat etanol, etil asetat dan heksana semakin tinggi pada konsentrasi yang tinggi pula yaitu pada konsentrasi 125 ppm. Sesuai dengan pernyataan Chowdhury et al ., (2005) bahwa rata-rata persentase mortalitas akan meningkat sesuai dengan meningkatnya konsentrasi setiap sampel dan hampir semua komponen bioaktif bersifat toksik pada dosis tinggi. Nilai LC 50 didapatkan berdasarkan perhitungan analisis probit dimana persentase kematian larva dikonversikan ke dalam tabel probit, kemudian dihitung slope (a) dan intersep (b) sehingga didapatkan persamaan garis (Mursyidi, 1985). Dari keseluruhan hasil uji toksisitas metode bertahap dan bertingkat ekstrak etanol, etil asetat dan heksana didapatkan hasil bahwa LC 50 berada dibawah 1000 ppm dan diatas 30 ppm, sehingga ekstrak tersebut dapat dianggap toksik.
Menurut Sumantri (1996), semakin tinggi LC 50 yang dihasilkan, maka semakin rendahnya toksisitas dan semakin rendah LC 50 mencerminkan tingginya tingkat toksisitas. Tingkat toksisitas tersebut dapat diartikan sebagai potensi aktivitasnya sebagai antikanker, karena semakin rendah harga LC 50 maka senyawa tersebut semakin toksik dan semakin berpotensi sebagai antikanker. Menurut Meyer et al (1982), suatu ekstrak dianggap sangat toksik apabila memiliki nilai LC 50 dibawah 30 ppm, dianggap toksik pada LC 50 30-1000 ppm dan dianggap tidak toksik bila nilai LC 50 diatas 1000 ppm. Berdasarkan hasil uji fitokimia ekstrak tubuh buah G.lucidum dengan metode bertingkat atau bertahap, ternyata menunjukkan hasil negatif flavonoid, namun positif mengandung alkaloid dan terpenoid.
Tabel 1. Uji toksisitas ekstrak tubuh buah G.lucidum dengan berbagai pelarut dan metode ekstraksi Metode Ekstrak Nilai LC 5 Bertingkat Etanol 501,18 ppm Etil Asetat 194,98 ppm Heksana 190,54 ppm Bertahap Etanol 162,18 ppm Etil Asetat 53,70 ppm Heksana 63,09 ppm Tabel 2. Hasil uji metabolit sekunder ekstrak tubuh buah G.lucidum dengan uji warna Metode Ekstrak Flavonoid  Alkaloid  Terpenoi d Bertingkat Etanol - + + Etil Asetat - + + Heksana - + + Bertahap Etanol - + + Etil Asetat - + + Heksana - + +
Gambar 1. Histogram pengaruh ekstrak G.lucidum (ekstraksi bertahap) terhadap persentase mortalitas A.salina
Gambar 2. Histogram pengaruh ekstrak G.lucidum (ekstraksi bertingkat) terhadap persentase mortalitas A.salina

## K E S I M P U L A N
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, dapat diambil kesimpulan sebagai berikut:
1. Ekstrak tubuh buah G.lucidum mampu mematikan larva A.salina . 2. LC 50 ekstrak tubuh buah G.lucidum yang terkecil adalah ekstrak etil asetat dengan metode bertahap yaitu pada konsentrasi 53,70 ppm dan LC 50 tertinggi adalah ekstrak etanol metode bertingkat yaitu pada konsentrasi 501,18 ppm.

## U C A P A N T E R I M A K A S I H
Terimakasih  kami ucapkan kepada Riset Unggulan DIPA Unsoed 2011 yang telah mendanai penelitian ini.

## D A F T A R P U S T A K A
Chowdhury NS, Karim MdR,  Rana  MdS. 2005. In Vitro Studies on Toxicology Property of The Root and Stem Bark Extracts of Oroxylum indicum . Dhaka University Journal of Pharmaseutical Sciences. 4: 1-4.
Djarijah AS. 1995. Pakan Ikan Alami. Yogyakarta: Penerbit Kanisius.
Kresnamurti  A, Tutuk B, Gracesania V. 2008. Perbandingan Uji
Sitotoksik Asam Anakardat Dan Asam Anarkardat Jenuh dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test . Jurnal Obat Bahan Alam. VII(1): 98-107.
Meyer  BN,  Ferrigni  NR,  Putman  JE,  Jacobsen  LB,  Michols  DE, Laughlin JL. 1982. Brine Shrimp: A convenient General Bioassay for active plant contituent. Planta Medica. 45: 31-34.
Studies on bioactive substances and medical effect of reishi ( Ganoderma lucidum )  [Internet].  1997.  Mizuno T. tersedia di: http://www.canited.com/reishi97d-1.htm.
Mursyidi  A. 1985. Statistika Farmasi dan Biologi. Bandung:  Ghalia Indonesia.
Putranto HA. 2010. Kajian Sifat Fisikokimia Ekstrak Rumput Laut Coklat ( Sargassum duplicatum ) Menggunakan Berbagai Pelarut dan Metode Ekstraksi  [skripsi]. Universitas Jenderal Soedirman-Purwokerto.
Sumantri,  Martono  E. 1996. Daya Insektisida dari Senyawa 5-etil karbamil-2, 2-dimetil-1, 3 benzodioksol. Prosiding tamu ilmiah lustrum X dan reuni V;  Yogyakarta.  Universitas Gajah Mada: Fakultas Farmasi.
Suryanto D, Andriani  S,  Nurtjahja  K. 2005. Keragaman  Genetik Ganoderma spp. dari Beberapa Tempat di Sumatera Utara. Jurnal Ilmiah Pertanian KULTURA. 40:2.
Widodo AN. 2006. Toksisitas Ekstrak Ganoderma Lucidum Terhadap Hepar Dengan Melihat Kadar Enzim Gamma Glutamyl Transferase  Tikus Wistar  [skripsi]. Universitas Diponegoro- Semarang.
46 66 70 96 66 73 83 90 63 80 86 93 0 20 40 60 80 100 120 125 ppm 250 ppm 500 ppm 1000 ppm Mo rt al ita s (% ) Konsentrasi (ppm) Etanol Etil Asetat Heksan 36 40 50 60 46 50 63 96 46 50 60 96 0 20 40 60 80 100 120 125 ppm 250 ppm 500 ppm 1000 ppm Mo rt al ita s (% ) Konsentrasi (ppm) Etanol Etil Asetat Heksan