## ALCHEMY : JOURNAL OF CHEMISTRY

## Artikel Penelitian

## Pemisahan Senyawa Aktif Fraksi Petroleum Eter dan Etil Asetat Hasil Hidrolisis Ekstrak Etanol Hydrilla verticillata dari Ranu Grati Pasuruan
Suci Amalia*, Ahmad Ghanaim Fasya, Faiqatul Hasanah, Dewi Yuliani
Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang, Indonesia, 65144
INFO ARTIKEL ABSTRAK

## Riwayat Artikel
Diterima 27 September 2018 Direvisi 12 Oktober 2018
Tersedia online 30 Desember 2018
* Email penulis korespondensi: amel_kimiaa@kim.uin-malang.ac.id
Hydrilla  verticillata is  one  of  water  plants  that  has  some  bioactivities.  The presence  of  secondary  metabolites  in H.  verticillata is  responsible  for  the bioactivity. The purpose of this study was to determine and separate bioactive compounds  from  fraction  of  petroleum  ether  (PE)  and  ethyl  acetate  (EA)  as  a result of hydrolysis of H. verticillata ethanol extract. H. verticillata was extracted by maceration method using ethanol solvent, hydrolyzed with hydrochloric acid and  partitioned  respectively  with  petroleum  ether  and  ethyl  acetate.  Crude ethanol extract, PE and EA fraction were identified their secondary metabolites. The phytochemical test results showed H. verticillata ethanol extract containing alkaloid  compounds,  flavonoids,  tannins,  saponins,  triterpenoids,  and  steroids. PE  fraction  contained  steroids  and  terpenoids,  while  EA  fraction  contained flavonoids,  steroids,  and  triterpenoids.  Analytical  thin  layer  chromatography analysis showed n-hexane : ethyl acetate (4:1) eluent as the best mobile phase for separating steroids. The preparative thin layer chromatography analysis of H. verticillata fraction using n-hexane : ethyl acetate (8:2) as mobile phase produced 17 and 14 spots of PE and EA fractions, respectively.
Keywords: Hydrilla verticillata , thin layer chromatography, phytochemicals
Hydrilla  verticillata merupakan  salah  satu  tanaman  air  yang  banyak  memiliki bioaktivitas.  Adanya  metabolit  sekunder  pada H.  verticillata yang  bertanggung jawab  terhadap  bioaktivitas  ini.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui dan  memisahkan  senyawa  aktif  dari  fraksi  petroleum  eter  (PE)  dan  etil  asetat (EA)  hasil  hidrolisis  ekstrak  etanol H.  verticillata .  Ekstrak  diperoleh  dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol, dihidrolisis dengan asam klorida dan dipartisi masing-masing dengan petroleum eter dan etil asetat. Ekstrak kasar etanol,  fraksi  PE  dan  EA  diuji  kandungan  metabolit  sekundernya.  Hasil  uji fitokimia  menunjukkan  ekstrak  etanol H.  verticillata mengandung  senyawa alkaloid,  flavonoid,  tanin,  saponin,  triterpenoid,  dan  steroid.  Fraksi  PE mengandung steroid dan terpenoid, sedangkan fraksi EA mengandung flavonoid, steroid, dan triterpenoid. Hasil analisis KLTA menunjukkan eluen n-heksana : etil asetat (4:1) sebagai fasa gerak terbaik untuk memisahkan steroid. Hasil analisis KLTP  fraksi H. verticillata menggunakan perbandingan fasa gerak n-heksana : etil asetat (8:2) menghasilkan spot fraksi PE dan EA berturut-turut sebanyak 17 dan 14 spot.
Kata Kunci: Hydrilla verticillata , kromatografi lapis tipis, uji fitokimia

## 1. Pendahuluan
Hydrilla  verticillata adalah  tumbuhan  air  yang  ditemukan  pada  ekosistem  danau  [1].  Tumbuhan  ini  telah  banyak dimanfaatkan  untuk  berbagai  produk  di  beberapa  negara.  Di  India  dan  Amerika,  pemanfaatan  metabolit  primer H. verticillata diantaranya sebagai suplemen [2], pupuk organik [3, 4], fitoremediasi pada pengolahan limbah [5, 6], makanan ikan,  dan  bahan  kemasan  kepiting  [3].  Kandungan  senyawa  metabolit  sekunder  pada H. verticillata juga  dimanfaatkan sebagai antitumor [7], antikonvulsan [8], antimalaria  [9], antimikroba [10], dan antioksidan [11].
Eksplorasi H.  verticillata di  danau-danau Indonesia  belum  banyak  dilakukan. Ranu  Grati,  Pasuruan adalah salah satu danau yang dengan jumlah populasi H. verticillata yang melimpah berdasarkan observasi. Selain itu, H. verticillata belum  banyak  juga  dimanfaatkan  oleh  masyarakat  Indonesia.  Beberapa  penelitian  menunjukkan  bahwa H.  verticillata banyak  mengandung  metabolit  sekunder.  Hasil  skrining  fitokimia H.  verticillata ekstrak  etanol  mengandung  senyawa alkaloid,  triterpenoid,  flavonoid  dan  saponin  [10].  Hafiz  [12]  menyebutkan  bahwa  ekstrak  metanol H.  verticillata mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, triterpenoid, saponin, tanin, triterpenoid, dan steroid.
Isolasi senyawa metabolit sekunder merupakan salah satu tahapan penting sebelum proses pemisahan. Ekstraksi senyawa  bahan  alam  banyak  dilakukan  dengan  maserasi  dengan  pelarut  polar  [13].  Pemisahan  metabolit  sekunder dibantu dengan reaksi hidrolisis untuk memutus ikatan glikosida dan proses partisi untuk memisahkan metabolit sekunder berdasarkan sifat kepolaran yang berbeda [14]. Pada penelitian ini akan dilakukan pemisahan fraksi petroleum eter dan etil asetat H. verticillata yang berasal dari Ranu Grati Pasuruan.

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1. Bahan
Sampel penelitian ini adalah Hydrilla verticillata dari danau Ranu Grati, Pasuruan. Pelarut yang digunakan adalah etanol  96%  (Merck),  petroleum  eter  96%  (Merck),  dan  etil  asetat  96%  (Merck).  Uji  fitokimia  menggunakan  HCl  1  N, reagen Mayer dan Dragendorff, HCl 2% (b/b), HCl pekat, metanol 50% (v/v), serbuk logam Mg, FeCl 3 1% (b/v), gelatin, kloroform, asam asetat anhidrat, H 2 SO 4 pekat, diklorometana, dan pereaksi Liberman-Burchard.

## 2.2. Preparasi Sampel
Pengambilan H.  verticillata dilakukan  di  permukaan  Danau  Ranu.  Sampel  basah  dimasukkan  ke  dalam  wadah plastik  untuk  dilakukan  uji  taksonomi.  Biomassa H.  verticillata dikeringkan  di  bawah  sinar  matahari  sampai  kering. Biomassa kering dihaluskan dengan ukuran 90 mesh sehingga diperoleh serbuk H. verticillata sebagai sampel. Analisis kadar air sampel menggunakan metode thermogravimetri berdasarkan AOAC [15].

## 2.3. Ekstraksi Senyawa Aktif
Sebanyak 100 g  sampel dimaserasi menggunakan 300 mL pelarut etanol selama 24 jam. Pengocokan dilakukan dengan shaker selama  3  jam  dengan  kecepatan  1200  rpm  dan  disaring.  Residu  hasil  maserasi  dilarutkan  kembali menggunakan pelarut yang sama sebanyak 3 kali pengulangan. Lima gram ekstrak etanol pekat dihidrolisis selama 1 jam dengan  penambahan 10 mL  asam  klorida  2  N  sambil  diaduk.  Selanjutnya  ditambahkan larutan NaHCO 3 jenuh hingga netral, kemudian dipartisi dengan petroleum eter sebanyak 3 kali. Proses partisi dilakukan juga dengan pelarut etil asetat. Hasil partisi digunakan untuk identifikasi golongan senyawa aktif H. verticillata.

## 2.4. Uji Fitokimia

## 2.4.1. Uji Alkaloid
Ekstrak  ditambah  0,5  mL  HCl  2%  dimasukkan  dalam  tabung  reaksi  1  dan  2.  Tabung  1  ditambahkan  2-3  tetes reagen Dragendorff dan adanya alkaloid ditunjukkan dengan endapan jingga. Ekstrak pada tabung 2 ditambahkan 2-3 tetes reagen Mayer dan adanya alkaloid ditunjukkan endapan kekuning-kuningan.

## 2.4.2. Uji Flavonoid
Ekstrak  dilarutkan  dalam  1-2  mL  metanol  panas  50%.  Kemudian  ditambah  logam  Mg  dan  4-5  tetes  HCl  pekat. Warna merah, kuning atau jingga pada larutan menunjukkan adanya flavonoid.

## 2.4.3. Uji Saponin
Ekstrak  ditambah  air  (1:1)  sambil  dikocok  selama  1  menit  dan  apabila  terbentuk  busa  ditambahkan  HCl  1  N. Saponin ditunjukkan dengan busa yang terbentuk dapat bertahan selama 10 menit dengan ketinggian 1-3 cm.

## 2.4.4. Uji Tanin
Uji tanin dapat dilakukan dengan FeCl 3 1% dan larutan gelatin. Uji dengan FeCl 3 dilakukan dengan memasukkan 3 tetes  larutan  FeCl 3 1%  pada  ekstrak.  Warna  hijau  kehitaman  atau  biru  tinta  menunjukkan  adanya  tanin.  Uji  dengan larutan  gelatin  dilakukan  pada  2  mg  ekstrak  kasar  yang  ditambahkan  dengan  larutan  gelatin.  Endapan  putih menunjukkan adanya tanin.

## 2.4.5. Uji Triterpenoid dan Steroid
Ekstrak  ditambahkan  0,5  mL  kloroform  dan  0,5  mL  asam  asetat  anhidrat.  Larutan  ditambahkan  dengan  1-2  mL H 2 SO 4 pekat. Triterpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut, sedangkan steroid ditunjukkan dengan warna hijau kebiruan pada larutan.

## 2.5. Pemisahan Senyawa Aktif Hasil Partisi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

## 2.5.1. Kromatografi Lapis Tipis Analitik (KLTA)
Sebanyak  0,01 g  sampel  (fraksi  PE  dan  EA)  dilarutkan dalam  2,5 mL  diklorometana  (setara  dengan 4000  ppm), kemudian ditotolkan ±  1  cm  dari  bawah plat  silika  gel  F 254 ukuran  1x10 cm 2 .  Selanjutnya,  plat  dikeringkan dan  dielusi dengan  eluen yang  sesuai.  Pengembang  (fasa  gerak)  untuk  golongan  senyawa  steroid  adalah  n-heksana  :  etil  asetat dengan perbandingan 9:1; 8:2; 7:3; dan 6:4. Noda-noda pada permukaan plat diamati menggunakan sinar UV, kemudian ditentukan nilai Rf ( retention factor ) masing-masing noda. Eluen terbaik ditentukan dari banyaknya noda yang terpisah. Noda disemprot dengan reagen Liebermann-Burchard, dimana spot yang diduga senyawa steroid ditentukan dari warna noda yang tampak di bawah lampu UV. Eluen yang terbaik selanjutnya digunakan untuk KLTP.

## 2.5.2. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
Ekstrak  pekat  0,01  g  dilarutkan  dalam  2,5  mL  diklorometana  (setara  dengan  4000  ppm),  kemudian  ekstrak  ini ditotolkan  pada  plat  silika  gel  GF 254 ukuran  20x10  cm 2 .  Selanjutnya,  plat  silika  dielusi  dengan  eluen  terbaik  dari  hasil analisis KLTA. Noda hasil pemisahan diamati dan dihitung Rf noda. Setelah itu, Rf yang diperoleh dibandingkan dengan Rf hasil analisis KLTA. Spot yang diduga merupakan senyawa steroid dikerok dan dilarutkan dalam petroleum eter untuk selanjutnya  disentrifugasi.  Pelarut  dalam  supernatan  yang  diperoleh  diuapkan  dengan  gas  N 2 hingga  diperoleh  isolat pekat. Hasil isolat dari KLTP dicek dengan KLTA menggunakan eluen yang terbaik hasil KLTP.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1. Pengambilan dan Preparasi Sampel
Teknik  pengambilan  sampel  dilakukan  dengan  pertimbangan  secara  subjektif  [16].  Sampel  yang  diambil  adalah seluruh bagian tumbuhan utuh yang berada di permukaan air dimana jarak antara permukaan dengan dasar air ±2 m. Hasil pengamatan menunjukkan 3 titik pertumbuhan H. verticillata yang melimpah. Hasil uji taksonomi yang dilakukan di Laboratorium  Taksonomi  Universitas  Brawijaya  menunjukkan  bahwa  tumbuhan  yang  diambil  dari  Danau  Ranu  Grati termasuk dalam genus Hydrilla dan spesies Hydrilla verticillata (L.f) Royle.
Preparasi sampel dimaksudkan untuk mempermudah proses ekstraksi. Hasil penghalusan dari sampel basah 8 Kg diperoleh  serbuk  halus  sebanyak  1  Kg.  Kadar  air H.  verticillata basah  dan  kering  masing-masing  sebesar  91,68  dan 8,22%.  Kandungan  air  yang  tinggi  dapat  mempersulit  pelarut  untuk  mengekstrak  senyawa  aktif  yang  terdapat  pada sampel.  Gugus  hidrogen pada  air  dapat  membentuk  ikatan hidrogen  dengan  pelarut  sehingga  air  dalam  sampel  akan terikat oleh pelarut [17]. Kadar air maksimum yang disyaratkan agar proses ekstraksi dapat berlangsung maksimal yaitu 10% [18].

## 3.2. Ekstraksi Senyawa Aktif
Ekstraksi menggunakan pelarut etanol, dan hasil partisi menggunakan pelarut petroleum eter dan etil asetat. Hasil rendemen dari masing-masing ekstrak ditunjukkan pada Tabel 1 dimana fraksi etil asetat hasil partisi dari ekstrak etanol memiliki  rendemen  tertinggi.  Hal  ini  dimungkinkan  karena H.  verticillata banyak  mengandung  senyawa  semipolar. Umumnya senyawa aktif di alam masih dalam bentuk glikosidanya (terikat pada gugus gula) sehingga akan terekstrak pada pelarut polar.
Tabel 1. Hasil Rendemen Ekstrak H. verticillata Sampel Rendemen (%) (b/b) Ekstrak kasar: Etanol 12,72 Fraksi: Petroleum eter 30,27 Fraksi: Etil asetat 38,80

## 3.3. Uji Fitokimia
Hasil  uji  fitokimia  menunjukkan  ekstrak  etanol  mengandung  alkaloid,  flavonoid,  saponin,  tanin,  steroid  dan triterpenoid.  Fraksi  petroleum  eter  (PE)  mengandung  steroid  dan  triterpenoid.  Fraksi  etil  asetat  (EA)  mengandung flavonoid, steroid dan triterpenoid.

## 3.4. Pemisahan Senyawa Aktif dengan KLT
Pada  hasil  KLTA  yang  diperoleh  eluen  terbaik  untuk  pemisahan  senyawa  steroid  adalah  n-heksana  :  etil  asetat dengan perbandingan 4:1. Spot yang dihasilkan dari fraksi PE dan EA berturut-turut 8 dan 7 spot ( Tabel 2 dan 3 ). Pada fraksi  PE  diperoleh  3  isolat  yang  berwarna  hijau  atau  biru  yang  diduga  kuat  merupakan  senyawa  steroid  yaitu  isolat dengan Rf = 0,443; 0,860 dan 0,949. Pada fraksi EA diperoleh dua isolat yang diduga steroid yaitu isolat dengan Rf = 0,397 dan 0,538 yang masing-masing berwarna hijau.
Tabel 2. Hasil Pemisahan KLTA Fraksi Petroleum Eter (PE) H. verticillata
Untuk  memperoleh  senyawa  aktif  yang  terkandung  pada  masing-masing  fraksi  PE  dan  EA  dilakukan  pemisahan menggunakan KLTP untuk mengisolasi senyawa steroid H. verticillata dari campuran senyawa metabolit sekunder. Hasil analisis KLTP menggunakan perbandingan eluen n-heksana : etil asetat (8:2) pada fraksi PE dihasilkan 17 spot dengan 4 spot yang diduga senyawa steroid, yaitu isolat dengan Rf = 0,505 berwarna biru keunguan, Rf = 0,627 berwarna hijau kebiruan, Rf = 0,780 berwarna biru keunguan dan Rf = 0,880 hijau kebiruan. Adapun fraksi EA menghasilkan 14 spot dengan 4 spot yang diduga senyawa steroid, yaitu isolat dengan Rf = 0,122 berwarna biru, Rf = 0,867 berwarna biru, Rf = 0,939 berwarna hijau kebiruan dan Rf = 0,983 berwarna biru.
Eluen Jumlah noda Warna Rf Dugaan senyawa n-Heksana : etil asetat (9:1) 8 Merah 0,102 - Merah 0,179 - Biru keunguan 0,230 - Hijau 0,294 Steroid Merah 0,371 - Biru 0,435 - Hijau 0,512 Steroid BIru 0,576 - n-Heksana : etil asetat (8:2) 8 Orange 0,250 - Biru 0,354 - Hijau 0,443 Steroid Merah muda 0,518 - Merah 0,569 - Merah 0,607 - Hijau 0,860 Steroid Hijau 0,949 Steroid n-Heksana : etil asetat (7:3) 6 Merah 0,518 - Merah keunguan 0,594 - Merah 0,683 - Merah 0,734 - Merah 0,797 - Hijau terang 0,936 Steroid Merah 0,518 - n-Heksana : etil asetat (6:4) 9 Merah 0,487 - Merah 0,537 - Merah tua 0,600 - Merah 0,670 - Merah 0,737 - Merah 0,787 - Merah kehitaman 0,850 - Merah 0,912 - Hijau 0,962 Steroid
Tabel 3. Hasil Pemisahan KLTA Fraksi Etil Asetat (EA) H. verticillata
Tabel 4. Hasil Pemisahan KLTP Senyawa Steroid Fraksi Petroleum Eter (PE) H. verticillata No. Nilai Rf Warna Dugaan senyawa 1. 0,010 Orange - 2. 0,030 Merah keunguan - 3. 0,050 Merah muda - 4. 0,060 Orange - 5. 0,080 Merah muda - 6. 0,105 Merah muda - 7. 0,140 Merah muda - 8. 0,172 Merah muda - 9. 0,222 Merah tua - 10. 0,255 Merah muda - 11. 0,377 Merah muda - 12. 0,405 Merah - 13. 0,483 Merah - 14. 0,505 Biru keunguan Steroid 15. 0,627 Hijau kebiruan Steroid 16. 0,780 Biru keunguan Steroid 17. 0,880 Hijau kebiruan Steroid
Eluen Jumlah noda Warna Rf Dugaan senyawa n-Heksana : etil asetat (9:1) 9 Merah 0,064 - Merah 0,090 - Merah tua 0,129 - Merah 0,168 - Merah 0,207 - Merah kehitaman 0,298 - Merah 0,337 - Hijau 0,558 Steroid Hijau 0,610 Steroid Merah 0,064 - n-Heksana : etil asetat (8:2) 7 Merah 0,051 - Merah 0,089 - Merah 0,153 - Merah kehitaman 0,236 - Merah 0,282 - Hijau 0,397 Steroid Hijau 0,538 Steroid n-Heksana : etil asetat (7:3) 10 Merah 0,303 - Merah 0,392 - Merah 0,430 - Merah 0,531 - Merah 0,582 - Merah keunguan 0,607 - Merah keunguan 0,687 - Merah kehitaman 0,734 - Merah 0,797 - Hijau 0,949 Steroid n-Heksana : etil asetat (6:4) 9 Merah 0,375 - Merah 0,450 - Merah 0,487 - Merah kehitaman 0,575 - Merah 0,650 - Merah 0,712 - Merah 0,775 - Merah kehitaman 0,825 - Hijau 0,875 Steroid
Tabel 5. Hasil Pemisahan KLTP Senyawa Steroid Fraksi Etil Asetat (EA)
H. verticillata No. Nilai Rf Warna Dugaan senyawa 1. 0,078 Merah keunguan - 2. 0,122 Biru - 3. 0,172 Merah keunguan - 4. 0,256 Orange - 5. 0,283 Merah keunguan - 6. 0,422 Merah muda - 7. 0,489 Merah muda menyala - 8. 0,550 Merah muda menyala - 9. 0,633 Merah tua - 10. 0,667 Merah muda - 11. 0,767 Merah tua - 12. 0,867 Biru - 13. 0,939 Hijau kebiruan - 14. 0,983 Biru Steroid

## 4. Kesimpulan
Rendemen yang  diperoleh  pada  filtrat  PE  dan  EA  dari H. verticillata masing-masing  sebesar  30,27  dan  38,80%. Hasil pengujian fitokimia ekstrak metanol H. verticillata menunjukkan kandungan senyawa alkaloid, flavonoid, triterpenoid, steroid,  saponin  dan  tanin.  Hasil  analisis  KLTA  menunjukkan  eluen  n-heksana  :  etil  asetat  (4:1)  sebagai  fasa  gerak terbaik  untuk  memisahkan  steroid.  Hasil  analisis  KLTP  dari H.  verticillata menggunakan  perbandingan  fasa  gerak  n- heksana : etil asetat (8:2) dengan spot yang dihasilkan dari fraksi PE dan EA berturut-turut sebanyak 17 dan 14 spot.

## Ucapan Terima Kasih
Terima  kasih  kepada  penyelenggara  bantuan  penelitian  pengembangan  program  studi  Lembaga  Penelitian Pengabdian Masyarakat (LP2M) UIN Maulana Malik Ibrahim Malang atas dana penelitian dan semua pihak yang telah membantu penelitian ini.

## Daftar Pustaka
[1] F. Goltenboth, K. H. Timotius, P. P. Milan, & J. Margraf, Ekologi Asia Tenggara . Jakarta: Salemba Teknika, 2012.
[2] Lotus  Superfoods,  “Give  Your  Energy  and  Mood  a  Major  Boost  with  This  Powerful  Green  Superfood,” lotussuperfoods.com. [Online].  Available:  http://www.lotussuperfoods.com/hydrilla-verticillata-green-superfood- powder. [Accessed 17 Februari 2019].
[3] M. K. Misra, A. Panda, & D. Sahu, “Survey of Useful Wetland Plants of South Odisha,” Indian Journal of Traditional Knowledge , vol. 11, no. 4, pp. 658–666, 2012.
[4] M. N. Tanor, “ Hydrilla verticillata Sebagai Sumber Hara pada Sistem Budidaya Kacang Tanah,” Eugenia , vol. 10, no.1, pp. 92-101, 2004.
[5] A. Anis, “Penurunan Kadar n-Total dan p-Total pada Limbah Cair Tahu dengan Metode Fitoremediasi Aliran Batch dan Kontinyu Menggunakan Tanaman Hydrilla verticillata ,” Jurnal Spektra , vol. 9, no. 18, pp. 9-14, 2011.
[6] J. Silalahi, “Analisis Kualitas Air dan Hubungannya dengan Keanekaragaman Vegetasi Akuatik di Perairan Balige Danau Toba,” Tesis, Universitas Sumatera Utara, Medan, 2010.
[7] H. Araki, M. Inoue, & T. Katoh, “Total Synthesis and Absolute Configuration of Otteliones A and B, Novel and Potent Antitumor Agents from a Freshwater Plant,” Organic Letters, vol. 5, no. 21, pp. 3903-3906, 2003.
[8] B. Das, D. Pal, & A. Haldar, “Pharmacognostical and Physiochemical Study of the Aquatic Weed Hydrilla verticillata (L.F.) Royle Known as Nutrient Power House,” International Journal of Research in Pharmacy and Science, vol. 5, no. 1, pp. 1–6, 2015.
[9] S.W.  Annie,  R.  Raveen,  M.  G.  Paulraj,  T.  Samuel,  &  S.  Arivoli,  “Screening  of Hydrilla  verticillata (L.F.)  Royle (Hydrocharitaceae)  Crude  Leaf  Extracts  for  Larvicidal  Efficacy  against  the  Filarial  Vector Culex  quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae),” International Journal of Entomology Research , vol. 1, no. 3, pp. 43-48, 2016.
[10] P.  Prabha  &  J.  Rajkumar,  “Phytochemical  Screening  and  Bioactive  Potential  of Hydrilla  verticillata ,” Journal  of Chemical and Pharmaceutical Research , vol. 7, no. 3, pp. 1809-1815, 2015.
[11] D. K. Pal & S. B. Nimse, “Little Known Uses of Common Aquatic Plant, Hydrilla verticillata (Linn . f .) Royle,” Asian Journal of Chemistry , vol. 5, no. 2, pp. 108-111, 2006.
[12] M.  N.  Hafiz,  “Uji  Toksisitas  Ekstrak  Kasar  Metanol,  Kloroform  dan  n-Heksana Hydrilla  verticillata (L.f)  Royle  dari Dana Ranu Kab. Pasuruan terhadap Larva Udang Artemia salina Leach,” Skripsi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2016.
[13] A. N. Kristanti, S. N. Aminah, M. Tanjung, & B. Kurniadi, Buku Ajar Fitokimia . Surabaya: Airlangga University Press, 2008.
[14] S.  Handoko,  “Pemisahan  Senyawa  Steroid  Fraksi  Petroleum  Eter  (PE)  Mikroalga Chlorella sp.  dengan  Metode Kromatografi  Kolom  Pembuatan  Fasa  Diam  Cara  Basah  dan  Kering,”  Skripsi,  Universitas  Islam  Negeri  Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2016.
[15] AOAC, Official Method of Analysis 11 th Edition. Washington DC: Association of Official Analytical Chemist,1984.
[16] S. Hadi, Metodologi Penelitian Jilid 3. Yogyakarta: Andi Press, 2004.
[17] J. B. Harborne, Metode Fitokimia Terbitan ke II . Bandung:  ITB Press, 1987.
[18] F. G. Winarno, Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka, 1997.