## Borneo Journal Of Medical Laboratory Technology

## PENDAHULUAN
Staphylococcus  aureus ( S.  aureus )  merupakan  bakteri Gram  positif,  berbentuk  kokus,  yang  sel-selnya membentuk  kelompok  seperti  anggur  dan  tidak bergerak  (Erlin et  al. ,  2020). S.  aureus merupakan patogen  oportunistik  yang  dapat  menyebabkan
berbagai  penyakit  yang  dapat  sembuh  sendiri  hingga mengancam jiwa pada manusia (Akinola et al. , 2022). S. aureus adalah salah satu spesies bakteri yang sering kali teridentifikasi  menjadi  sumber  penginfeksi  dan  telah meningkat  penemuan  kasus  resistensinya. S.  aureus telah diidentifikasi sebagai organisme yang
Optimasi Konsentrasi Primer Dan Suhu Annealing Dalam Mendeteksi Gen Blaz Pada Bakteri Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus Di Udara
Optimization of Primary Concentration and Annealing Temperature in Detecting Blaz Gene in Airborne Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Bacteria
Anisah Mardiana 1
Kurnia Ritma Dhanti 2*
Kurniawan 3
Retno Sulistyowati 4
1 Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Purwokerto, Indonesia
*2 Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Purwokerto, Indonesia
3 Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Purwokerto, Indonesia
4 Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Purwokerto, Indonesia *email: kurniaritmadhanti@ump.ac.id

## Abstrak
Staphylococcus  aureus adalah  spesies  bakteri  yang  sering  kali  teridentifikasi menjadi sumber penginfeksi dan telah meningkat penemuan kasus resistensinya. Resistensi  terhadap  antibiotik  golongan  Penisilin pada S.  aureus dikaitkan  oleh plasmid  yang  memuat  gen bla-Z pengkode ß-Laktamase.  Beberapa  faktor  yang dapat dimodifikasi untuk mendapatkan hasil pengujian yang optimal dalam PCR yaitu  suhu annealing dan  konsentrasi  primer.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengidentifikasi  konsentrasi  primer  dan  suhu annealing yang  menghasilkan produk  PCR  dengan band terbaik  dalam  mendeteksi  gen blaZ pada  bakteri Metichilin  Resistant  Staphylococcus  aureus (MRSA).  Desain  penelitian  yang digunakan  dengan  metode  eksperimental.  Hasil  penelitian  yang  didapat  yaitu produk PCR dengan konsentrasi primer 10 µM terlihat jelas, tebal dan bersih, dibandingkan  konsentrasi  primer  5  µM.  Dengan  hasil band terbaik  pada  suhu annealing 61.8 ° C  dan  58.7 ° C.  Penelitian  ini  menyimpulkan  konsentrasi  primer untuk  mendapatkan  hasil band yang  terlihat  dengan  jelas  yaitu  10  µM.  Suhu annealing 61.8 ° C  menghasil band paling  baik  pada  kode  sampel  R.PG.U4, R.V.U2, dan R.151.U2. Sedangkan kode sampel R.IGD.U5 hasil band paling baik pada suhu annealing 58.7 ° C.

## Kata Kunci:
Gen blaZ; Konsentrasi Primer; PCR; Suhu Annealing .
Keywords : blaZ Gene; Primer Concentration; PCR; Annealing Temperature.

## Abstract
Staphylococcus aureus is a species of bacteria that is often identified as a source of infection and has increased the number of cases of resistance. Resistance to Penicillin- class antibiotics in S. aureus is associated with plasmids containing the blah-Z gene encoding  ß-Lactamase.  Some  factors  that  can  be  modified  to  obtain  optimal  test results in PCR are annealing temperature and primary concentration. This study aims to  identify  the  primary  concentration  and  annealing  temperature  that  produce  PCR products  with  the  best  band  in  detecting  the  blaZ  gene  in  Metichilin  Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) bacteria. The research design used used experimental methods.  The  results  of  the  study  obtained  were  PCR  products  at  primary concentrations of 10 μ M were clearly visible, thick and clean, compared to primary concentrations  of  5 μ M.  Annealing  temperature  with  the  best  band  results  at temperatures  of  61.8  °C  and  58.7°C.    This  study  concluded  the  primary concentration  to  obtain  a  clearly  visible  band  result  of  10 μ M.  The  annealing temperature  of  61.8°C  produced  the  best  band  in  the  sample  code  R.PG.  U4, R.V.U2, and R.151.U2 temperatures. While the sample code R.IGD. U5 band results best at annealing temperature 58.7°C.
menyebabkan infeksi saluran pernapasan bagian bawah terbanyak keempat, menurut penelitian yang dilakukan di satu lokasi rumah sakit (Halim & Setiawan, 2020). Beberapa strain S. aureus dapat resisten secara fenotip terhadap  beberapa  golongan  antibiotik  (Akinola et  al. , 2022). Resistensi terhadap antibiotik golongan Penisilin pada S. aureus dikaitkan oleh plasmid yang memuat gen bla-Z pengkode  ß-Laktamase  (Pratiwi et  al. ,  2019).
Methicillin  Resistant  Staphylococcus  aureus (MRSA) merupakan  bakteri S.aureus yang  telah  mengalami resistensi  yang  disebabkan  oleh  perubahan  genetik (Pristianingrum et al. , 2021). S. aureus mempunyai daya ketahanan  akibat  perubahan  genetik  yang  disebabkan oleh terapi antibiotik yang irasional  (Suyasa & Mastra, 2020).  Penyebaran  MRSA  dirumah  sakit  dapat  terjadi melalui  peralatan  medis,  pakaian,  udara  serta  melalui kontak  langsung  dengan  staf  medis.  Oleh  karean  itu MRSA  yang  bersifat  multiresisten  terhadap  antiseptik dan antibiotik harus diwaspadai (Erlin et al. , 2020).
Teknik  PCR  memiliki  beberapa  tahapan  penting,  salah satunya  yaitu  tahap annealing (penempelan  primer).
Suhu annealing merupakan  suhu  yang  memungkinkan primer menempel pada DNA cetakan (Hutabarat et al. , 2021). Tinggi rendahnya Suhu annealing yang digunakan dapat ditentukan berdasarkan nilai melting temperature (Tm)  pada  masing-masing  primer,  yang  suhu terendahnya  5 ° C  dibawah melting  temperature (Tm) (Herman et  al. ,  2017).  Menemukan  kondisi  suhu annealing yang optimal sangat penting, karena berkaitan dengan spesifitas dan sensitivitas hasil PCR (Anggisti & Roslim, 2018).
Beberapa  faktor  yang  dapat  dimodifikasi  untuk mendapatkan  hasil  pengujian  yang  optimal  dalam  PCR yaitu  suhu annealing dan  konsentrasi  primer (Triyaningsih et  al. ,  2022).  Primer  dengan  konsentrasi yang  terlalu  tinggi  atau  terlalu  rendah,  dapat mempengaruhi sensitivitas saat reaksi PCR berlangsung (Yustinadewi et  al. ,  2018),  hal  ini  dapat  berpengaruh terhadap hasil saat dilakukan pembacaan menggunakan UV  transiluminator.  Hasil  yang  terlihat  dapat  berupa
band yang  muncul  dengan  jelas  dan  tebal  atau  dapat muncul  dengan  samar  dan  tipis  (Wasiati et  al. ,  2022). Oleh  karena  itu  optimasi  suhu annealing dan konsentrasi  primer  perlu  dilakukan  terlebih  dahulu untuk  memperoleh  produk  PCR  dengan band yang baik dan sesuai target (Pratiwi et al. , 2019).

## METODE PENELITIAN
Bahan  yang  digunakan  adalah  sampel  DNA  bakteri MRSA  kode  R.PG.U4,  R.IGD.U5,  R.V.U2,  R.151.U2, agarose,  1x TAE Buffer ,  mikro  tip,  mikrotube, tube PCR,  MyTaq TM HS  Red  Mix  (Bioline  Reagents  Ltd.), Primer  gen blaZ (IDT), Ethidium  bromide , loading  dye (Geneaid),  DNA  ladder  100bp  (Geneaid), dan aquabides ( ddH2O ).
Sebanyak  1.5  ml  kultur  bakteri  MRSA  yang  sudah ditumbuhkan  pada  media Lactose  Broth (LB)  diambil sebagai  sampel,  kemudian  diekstraksi  menggunakan High  Pure  PCR  Template  Preparation  Kit (Roche)  yang berisi binding buffer, lisis buffer, elution buffer, wash buffer dan  inhibitor  removal  buffer .  Prosedur  ekstraksi menggunakan  panduan  dari High  Pure  PCR  Template Preparation  Kit (Roche),  kemudian  sampel  DNA  hasil ekstraksi  disimpan  dalam  suhu  -20 ° C  dan  digunakan sebagai sampel DNA template pada proses PCR.
Proses  PCR  dilakukan  dengan  menggunakan  mesin Mastercycler  Nexus  Gradient (Eppendorf)  dengan pengaturan  pemrogaman  tahap  predenaturasi  pada suhu 95 ° C dalam waktu 5 menit, tahap denaturasi pada suhu  94 ° C  dalam  waktu  15  detik,  tahap  penempelan primer  ( annealing )  menggunakan  gradient  suhu  52 ° C, 54.2 ° C,  58.7 ° C,  61.8 ° C,  dan  64 ° C  dalam  waktu  30 detik,  tahap extension (pemanjangan)  pada  suhu  72 ° C dalam  waktu  1  menit  dan  tahap final  extension (pemanjangan  akhir)  pada  suhu  72 ° C  dalam  waktu  5 menit  sebanyak  30  siklus  pengulangan.  Amplifikasi DNA  templat  menggunakan  primer  gen blaZ (Intergrated DNA Technologies). Komposisi campuran untuk  PCR  dalam  satu  reaksi  25  µL  adalah  12.5  µL MyTaqTM HS Red Mix (Bioline Reagents Ltd.), primer
forward konsentrasi 5 µM dan 10 µM masing-masing 2 µL,  primer reverse konsentrasi  5  µM  dan  10  µM masing- masing 2 µL, 5 µL DNA dan sebanyak 6.5 µL aquabides (ddH 2 O).
Hasil  amplifikasi  PCR  dielektroforesis  menggunakan konsentrasi 1% gel agarose dan 1 µL pewarna ethidium bromide . Satu well terdiri dari 5 µL amplikon dan 1 µL loading  dye (Geneaid).  Elektroforesis  dilakukan  selama 30  menit  dengan  arus  listrik  100  volt  menggunakan TAE buffer 1X,  kemudian  divisualisasi  dengan  UV Transilluminator.  Panjang  pita  molekul  DNA  hasil elektroforesis dapat diketahui dengan membandingkan DNA Ladder (Geneaid) yang berukuran 100 bp. Isolat MRSA  yang  positif  teridentifikasi  gen blaZ ditandai dengan terbentuknya pita ( band ) pada 173 bp (Akinola et al. , 2022).

## HASIL DAN PEMBAHASAN HASIL
Gambar 1. Visualisasi elektroforesis hasil PCR gen blaZ dari sampel kode R.PG.U4 dengan konsentrasi primer 10 µM (A) dan 5 µM (B) diikuti variasi suhu annealing 54.2 ° C (1,4), 58.7 ° C (2,5), 61.8 ° C (3,6) dan M (Marker).
Gambar 2. Visualisasi elektroforesis hasil PCR gen blaZ dari sampel kode R.IGD.U5 dengan variasi suhu annealing 52 ° C (1), 54.2 ° C (2), 58.7 ° C (3), 61.8 ° C (4), 64 ° C (5) dan M (Marker).
Gambar 3. Visualisasi elektroforesis hasil PCR gen blaZ dari sampel kode R.V.U2 dengan variasi suhu annealing 52 ° C (1), 54.2 ° C (2), 58.7 ° C (3), 61.8 ° C (4), 64 ° C (5) dan M (Marker).
Gambar 4. Visualisasi elektroforesis hasil PCR gen blaZ dari sampel kode R.151.U2 dengan variasi suhu annealing 52 ° C (1), 54.2 ° C (2), 58.7 ° C (3), 61.8 ° C (4), 64 ° C (5) dan M (Marker).
Gambar 1 menunjukkan hasil elektroforesis DNA blaZ dengan target band 173 bp pada variasi suhu annealing 54.2 ° C  (1,4),  58.7 ° C  (2,5),  61.8 ° C  (3,6).  Hasil  PCR dengan  konsentrasi  primer  10  µM  (A)  menghasilkan pita  ( band) yang  jelas,  bersih,  tebal,  dan  terang dibandingkan dengan konsentrasi primer 5 µM (B) pita ( band) terlihat  lebih  pudar  atau  samar.  Gambar  2,  3 dan  4  menunjukkan  pita  ( band )  hasil  PCR  gen blaZ variasi suhu annealing 52 ° C (1), 54.2 ° C (2), 58.7 ° C (3), 61.8 ° C (4), dan 64 ° C (5) sesuai dengan ukuran target yaitu  173  bp.  Hasil  elektroforesis  pita  ( band )  terlihat jelas,  tebal  dengan  panjang  pita  ( band) sesuai  target, dan DNA ladder (M) dapat terpisah dengan baik.
Hasil  PCR  ditentukan  secara  kualitatif  dengan visualisasi  menggunakan  elektroforesis  gel  agarose. Proses  elektroforesis  akan  memisahkan  pita  DNA berdasarkan  berat  molekul  kemudian  dibandingkan dengan pita penanda DNA (DNA Ladder)  (Fitri et al., 2021).  Hasil  elektroforesis  yang  optimal  ditunjukkan dengan band yang  bersih,  tebal,  dan  sesuai  dengan
ukuran  target  (Wahyudiningsih  &  Sartika,  2020). Berbeda  dengan  konsentrasi  primer  5  µM,  Gambar  1 dengan  kode  sampel  R.PG.  U4  menunjukkan  bahwa pada  konsentrasi  primer  10  µM  dapat  menghasilkan pita (band) yang bersih, tebal, dan terang. Konsentrasi primer  yang  tidak  mencukupi  atau  berlebihan  dapat mencegah  amplifikasi  dan  menyebabkan  tumbukan primer  dimer  ( band yang  terbentuk  diikuti band lain yang  tidak  spesifik)  (Setyawati  &  Zubaidah,  2021). Berdasarkan suhu annealing yang digunakan band paling tebal,  terang,  dan  jelas  dihasilkan  oleh  suhu  61.8 ° C dibandingkan dengan suhu 54.2 ° C dan 58.7 ° C.
Deteksi  gen blaZ dengan  metode  molekuler  seperti PCR  merupakan  standar  emas  untuk  konfirmasi β - laktam  saat  membandingkan  uji  fenotipik  (Akinola et al. , 2022). Beberapa tahapan yang terlibat dalam proses PCR  yaitu  denaturasi, annealing dan  ekstensi  berulang (Yuenleni, 2019). Penelitian ini menggunakan algoritma gradien  untuk  melakukan  variasi  suhu annealing .  Nilai Tm  yang  menguntungkan  untuk  mendeteksi  gen blaZ pada  bakteri Staphylococcus  aureus adalah  antara  52- 58°C (Pratiwi et al. , 2019).
Berdasarkan  Gambar  2  hasil  PCR  dengan  kode sampel  R.IGD.U5  pada  suhu annealing 58.7 ° C menunjukkan hasil band yang lebih padat dan lebih jelas dari  pada  suhu annealing 52 ° C,  54.2 ° C,  61.8 ° C,  dan 64 ° C.  Berdasarkan  Gambar  3  hasil  PCR  dengan  kode sampel  R.V.U2  pada  suhu annealing 61.8 ° C menunjukkan hasil band yang lebih padat dan lebih jelas dibandingkan  pada  suhu annealing 52 ° C,  54.2 ° C, 58.7 ° C,  dan  64 ° C.  Berdasarkan  gambar  4  hasil  PCR dengan  kode  sampel  R.151.U2  pada  suhu annealing 61.8 ° C  menunjukkan  hasil band yang  lebih  padat  dan lebih  jelas  dibandingkan  pada  suhu annealing 52 ° C, 54.2 ° C, 58.7 ° C, dan 64 ° C.
Suhu annealing yang  tepat  dapat  menghasilkan  pita
(band) yang  baik  saat  visualisasi  hasil  optimasi  primer dan  dapat  digunakan  untuk  mendapatkan  fragmen DNA target menggunakan teknik PCR (Herman et al. , 2017).  Proses  menempelnya  primer  pada  DNA
template  (cetakan  DNA)  secara  signifikan  dipengaruhi oleh Suhu annealing (Herman et al. , 2018). Primer tidak akan menempel pada template dengan baik ketika suhu annealing terlalu tinggi, ditunjukkan dengan bertambah tipisnya band yang  terbentuk.  Sementara  primer  yang menempel  pada  titik  perlekatan  tidak  spesifik diakibatkan  karena  suhu annealing yang  terlalu  rendah (Nariska et al. , 2022). Hal tersebut akan menghasilkan amplifikasi  fragmen  lokus  yang  tidak  sesuai  dengan target,  pita  DNA  tunggal  yang  tebal  atau  pita  DNA berkerumun  (tidak  memisah)  menunjukan  DNA  yang diekstraki dalam kondisi utuh dan memiliki konsentrasi tinggi (Setyawati & Zubaidah, 2021).

## KESIMPULAN
Konsentrasi primer yang digunakan  dalam mendeteksi gen blaZ untuk  mendapatkan  hasil band yang  terlihat dengan  jelas  yaitu  konsentrasi  primer  10  µM. Berdasarkan  variasi  suhu annealing yang  digunakan, suhu annealing 61.8°C dapat menghasil band paling baik pada  kode  sampel  R.PG.U4,  R.V.U2,  dan  R.151.U2 suhu.  Sedangkan  kode  sampel  R.IGD.U5  hasil band paling baik pada suhu annealing 58.7°C.

## DAFTAR PUSTAKA
Akinola,  O.T.,  Okedigba,  I.  and  Elutade,  O.O.  (2022) ‘Occurrence,  antibiotic  susceptibility  and  resistance genes  among  Staphylococcus  aureus  isolated  from keypads  of  automated  teller  machines  (ATM)  in  a private  university,  Nigeria’, Scientific  African ,  15. Available
at: https://doi.org/10.1016/j.sciaf.2022.e01111.
Anggisti,  L.  and  Roslim,  D.I.  (2018)  ‘Optimization  of annealing  temperature  for  amplification  of  actin  gene in  pandan  (Pandanus  sp)’, Jurnal  Dinamika  Pertanian , XXXIV, pp. 95–100. Available at: https://journal.uir.ac.id/index.php/dinamikapertanian/art icle/download/5411/2618/.
Erlin,  E. et  al. (2020)  ‘Deteksi  Methicilin  Resistant Staphylococcus  aureus  (MRSA)  Sebagai  Penyebab Infeksi Nosokomial Pada Alat-Alat di Ruang Perawatan Bedah’, Quagga:  Jurnal  Pendidikan  dan  Biologi ,  12(2),  p.
137.
Available at: https://doi.org/10.25134/quagga.v12i2.2671.
Fitri,  R.R.A.,  Farida  and  Prasetio,  E.  (2021) ‘Perbandingan  Metode  PCR  Konvensional  Dengan Metode  PCR  Portable  Kit  Untuk  Deteksi  Wssv  Pada Udang  Vannamei’, Jurnal  Ruaya :  Jurnal  Penelitian  dan Kajian  Ilmu  Perikanan  dan  Kelautan ,  9(1),  pp.  54–62. Available at: https://doi.org/10.29406/jr.v9i1.2615.
Halim,  S.V.  and  Setiawan,  E.  (2020)  ‘Seftarolin, Antibiotik  Baru  dengan  Aktivitas  Anti-MRSA:  Sebuah Kajian  Efektivitas,  Keamanan,  dan  Biaya  Penggunaan’, Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy) (e- Journal) , 6(1), pp. 160–180. Available at: https://doi.org/10.22487/j24428744.2020.v6.i1.15015.
Herman et al. (2017) ‘Optimasi Suhu Annealing Untuk Primer  g-SSR  Dan  EST-SSR  Pada  Kacang  Hijau  (Vigna radiata  L  .)’, Jurnal  Dinamika  Pertanian ,  XXXIII(1),  pp. 95–102.
Herman,  Nainggolan,  M.  and  Roslim,  D.I.  (2018) ‘Optimizing  Temperature  Annealing  for  Four  Primary RAPD in Mung bean ( Vigna radiata L .)’, XXXIV(Yusuf 2010), pp. 41–46.
Hutabarat,  M.S. et  al. (2021)  ‘Aplikasi  Teknik Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)  dalam  Mendeteksi Streptococcus pneumoniae Menggunakan Gen
Autolysin  (LytA)  sebagai  Faktor  Virulensi  dari Spesimen  Klinis  Sputum’, Jurnal  Biotek  Medisiana
Indonesia , 9(2), pp. 90–98. Available at: https://doi.org/10.22435/jbmi.v9i2.4412.
Nariska,  H.,  Lestari,  P.  and  Karima,  R.  (2022) ‘Optimasi  Metode  Polymerase  Chain  Reaction- Restriction  Fragment  Length  Polymorphism(PCR- RFLP)  untuk  Deteksi  Polimorfisme  Gen  MTHFR (C677T)  pada  Pasien  Leukemia  Limfoblastik  Akut (LLA)Anak’, pp. 1–13.
Pratiwi,  A.,  Sari,  R.  and  Apridamayanti,  P.  (2019) ‘Optimasi suhu desain primer gen blaZ resistensi pada bakteri  Staphylococcus  aureus  secara  in  silico’, Jurnal Mahasiswa  Farmasi  Fakultas  Kedokteran  UNTAN ,  4(1), pp. 3–12.
Pristianingrum,  S. et  al. (2021)  ‘Deteksi  Metichilin Resistance  Staphylococcus  Aureus  (MRSA)’, Jurnal Analis Medika Biosains (JAMBS) , 8(1), pp. 7–12.
Setyawati,  R.  and  Zubaidah,  S.  (2021)  ‘Optimasi Konsentrasi  Primer  dan  Suhu  Annealing  dalam Mendeteksi  Gen  Leptin  pada  Sapi  Peranakan  Ongole (PO) Menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR)’, Indonesian Journal of Laboratory , 4(1), p. 36. Available at: https://doi.org/10.22146/ijl.v4i1.65550.
Suyasa,  I.B.O.  and  Mastra,  N.  (2020)  ‘Gambaran Methicillin  Resistant  Staphylococcus  aureus  (MRSA) Pada  Petugas  Kesehatan  RSUD  Wangaya  Kota Denpasar’, Meditory :  The  Journal  of  Medical  Laboratory ,
8(1), pp. 46–52. Available at: https://doi.org/10.33992/m.v8i1.1074.
Triyaningsih, T. et al. (2022) ‘Optimization of qRT-PCR Annealing  Temperature  of  WRKY45  Gene  for Detection of  Resistance  Genes  Against  Xanthomonas oryzae  pv. oryzae on  Black  Rice  Cempo  Ireng’, Jurnal ILMU  DASAR ,  23(1),  p.  23.  Available  at: https://doi.org/10.19184/jid.v23i1.24181.
Wahyudiningsih,  T.S.  and  Sartika,  D.  (2020)  ‘Gene detection optimization of Stelechocarpus burahol ( Bl .) Hook f . & Th . using direct PCR kit’, 14(2), pp. 95– 101.
Wasiati, A.R., Bimantara, A. and Anindita, N.S. (2022) ‘Optimasi  Dan  Uji  Sensitivitas  Primer  Polymerase Chain  Reaction  (PCR)  Gen  RNA-Dependent  RNA Polymerase  (RDRP)  SARS-COV-2  Asal  Indonesia’, Jurnal Universitas ’Aisyiyah Yogyakarta [Preprint].
Yuenleni,  Y.  (2019)  ‘Langkah-Langkah  Optimasi  Pcr’, Indonesian Journal of Laboratory , 1(3), p. 51. Available at: https://doi.org/10.22146/ijl.v1i3.48723.
Yustinadewi,  P.D.,  Yustiantara,  P.S.  and  Narayani,  I. (2018)  ‘Mdr-1  Gene  1199  Variant  Primer  Design Techniques  in  Pediatric  Patient  Buffy  Coat  Samples With  Lla’, Metamorfosa:  Journal  of  Biological  Sciences , 5(1), p. 105. Available at: https://doi.org/10.24843/metamorfosa.2018.v05.i01.p1 6.