Efek Ekstrak Metanol dan Partisi dari Kulit Batang Kayu Jawa (Lannea coromandelica Houtt. Merr.)  terhadap Pertumbuhan Sel HeLa dan MCF-7
Effect of Methanol Extract and Partition of Java Bark (Lannea coromandelica Houtt. Merr.) on HeLa and MCF-7 Cell Growth
Nadyah Haruna 1 , Zakiah Anugerah Hamzah 2 , Syamsuri Syakri 3 , Isriany Ismail 3 , Nursalam Hamzah 3 ,
1 Jurusan Pendidikan Kedokteran, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Alauddin Makassar Kampus I. Jl. Sultan Alauddin No.63, Kota Makassar
2 Mahasiswa Jurusan Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Alauddin Makassar Kampus II. Jl. HM Yasin Limpo No.36, Samata, Kabupaten Gowa
3 Jurusan Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Alauddin Makassar Kampus II. Jl. HM Yasin Limpo, No.36, Samata, Kabupaten Gowa
Kontak sur-el : nursalam.hamzah@uin-alauddin.ac.id

## ABSTRAK
Tujuan  penelitian  ini  adalah  menentukan  efek  ekstrak  metanol  dan  partisi  kulit  batang  kayu  jawa  dalam menghambat pertumbuhan sel  kanker HeLa dan sel  kanker MCF-7. Simplisia kulit  kayu dimaserasi  menggunakan pelarut  metanol.  Ekstrak  kemudian  dipartisi  secara  partisi  cair  padat  menggunakan  pelarut  heksan.  Pemisahan menghasilkan  partisi  larut  heksan  dan  partisi  tidak  larut  heksan.  Pengukuran  aktivitas  inhibisi  pertumbuhan  sel dilakukan menggunakan metode MTT Assay terhadap sel HeLa, sel MCF-7 dan sel Vero. Senyawa yang dikandung diidentifikasi  dengan  beberapa  pereaksi  golongan.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ekstrak  metanol,  partisi tidak  larut  heksan  dan  partisi  larut  heksan  dapat  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker  Hela  dengan  nilai  indeks selektivitas,  berturut-turut,  2,04;  1,85  dam  4,19.  Sedangkan  untuk  sel  MCF-7,  indeks  selektivitas,  berturut-turut, 1,91; 1,44 dan 2,13. Partisi larut heksan dapat memiliki potensi sebagai antikanker dengan selektivitas yang baik.
Kata Kunci : Lannea Coromandelica, HeLa, MCF-7, Vero

## ABSTRACT
The aim of this research was to determine the effect of methanol extract and partition of Java wood bark in inhibiting the growth of HeLa and MCF-7 cancer cells. Dried bark is macerated using methanol as a solvent. The extract  then  partitioned  by  solid  liquid  partition  using  hexane  solvent.  The  separation  result  hexane  soluble partition  and  hexane  insoluble  partition.  Measurement  of  cell  growth  inhibition  activities  were  carried  out  using MTT Assay method for HeLa, MCF-7 and Vero cells. The compounds in samples are identified by several chemical group reagents. The results showed that methanol extract, hexane insoluble partition and hexane soluble partition could  inhibit  Hela  cancer  cell  growth  with  selectivity  index  values,  respectively,  2.04;  1.85  and  4.19.  For  MCF-7 cells,  the  selectivity  index  is,  respectively,  1.91;  1.44  and  2.13.  Soluble  hexane  partitions  can  have  potential  as anticancer with good selectivity.
Keywords : Lannea Coromandelica, HeLa, MCF-7, Vero

## PENDAHULUAN
Kanker adalah penyebab kematian tertinggi di dunia dengan posisi ke dua setelah penyakit  jantung.  Angka  kejadian  penyakit kanker  di  seluruh  dunia  terus  meningkat  dan
diperkirakan  terdapat  lebih  dari  satu  juta pasien kanker baru setiap tahunnya. Berdasarkan  data  American  Cancer  Society, bahwa  pada  tahun  2017,  1.688.780  kasus kanker  baru  dan  600.920  kematian  akibat
kanker  diproyeksikan  terjadi  di  Amerika Serikat.  (Siegel,  Miller,  &  Jemal,  2017). Informasi di tingkat global dunia menunjukkan bahwa satu dari tujuh kematian terbesar  disebabkan  oleh  kanker,  dengan insiden  penyebab  kematian  kanker  lebih banyak  daripada  AIDS,  tuberkulosis,  dan malaria. Kejadian kanker yang akan membludak  di  masa  depan  pun  diprediksi oleh  sebab  adopsi  gaya  hidup  yang  diketahui meningkatkan risiko kanker, seperti merokok, pola  makan  yang  buruk,  kurangnya  aktivitas fisik  dan  sebagainya  (American  Cancer Society, 2015)
Secara nasional prevalensi penyakit kanker  pada  penduduk  semua  umur  di Indonesia  tahun  2013  sebesar  1,4‰  atau diperkirakan  sekitar  347.792  orang.  Provinsi D.I. Yogyakarta memiliki prevalensi tertinggi untuk  penyakit  kanker,  yaitu  sebesar  4,1‰. Berdasarkan estimasi jumlah penderita kanker Provinsi  Jawa  Tengah  dan  Provinsi  Jawa Timur  merupakan  provinsi  dengan  estimasi penderita  kanker  terbanyak,  yaitu  sekitar 68.638  dan  61.230  orang.  Diketahui  pula bahwa  Penyakit  kanker  serviks  dan  payudara merupakan penyakit kanker dengan prevalensi  tertinggi  di  Indonesia  pada  tahun 2013 (Kementrian Kesehatan, 2015)
Kemoterapi  adalah  langkah  pengobatan yang  efektif  untuk  melawan  kanker.  Obat sitotoksik pada terapi kemoterapi menyebabkan  kematian  sel  kanker  (Dan Grander's  Group,  2015).  Namun  dalam pengaplikasiannya menuai banyak efek
samping  dan  resistensi  antikanker  itu  sendiri. Terapi antikanker ditujukan untuk membunuh sel  kanker  tanpa  merusak  sel  inangnya.  Hal ini  menjadi  sulit  karena  sel  kanker  juga merupakan  sel  manusia  juga.  Di  lain  pihak, folikel  rambut,  epitelium  saluran  pencernaan dan sumsum tulang juga mengalami pembelahan  secara  terus  menerus.  Oleh Karena  itu,  penggunaan  terapi  antikanker akan menyebabkan efek samping pada sel-sel tersebut  (Nugroho,  2014).  Terapi  kemoterapi dapat  menginduksi  terjadinya  myelosuppresi, neutropenia,  anemia  dan  trombositopenia (Tia, Lui, Chua, & Strebel, 2015). Timbulnya efek  samping  oleh  pengobatan  kemoterapi disebabkan  oleh  selektifitas  yang  rendah dari agen kemoterapi tersebut.
Kemoterapi  sitotoksik  selalu  menjadi andalan terhadap pengobatan kanker (Kumler, Stenvang,  Moreira,  Brunner,  &  Nielsen, 2015). Namun, oleh beberapa agen kemoterapi  dapat  menyebabkan  resisten (Luca,  et  al.,  2015).  Kemoterapi  antrasiklin sering  digunakan  dalam  pengobatan  berbagai penyakit berbahaya. Tetapi dalam pengaplikasiannya menemui beberapa keterbatasan oleh perkembangan efek samping yang serius, terutama kardiotoksisitas dan menjadi tidak efektif oleh adanya  resistensi  multi  obat  (Czepas  & Gwozdzinski, 2014).
Salah satu jenis tumbuhan yang digunakan secara empiris oleh sebagian masyarakat yang berpotensi  sebagai  antikanker  adalah  kayu jawa [Lannea  coromandelica (Houtt.)  Merr].
Tanaman  ini  mengandung  sejumlah  senyawa kimia  dengan  aktivitas  farmakologi  yang bervariasi.  Dosis  LC 50 ekstrak  metanol  kulit batang  kayu  jawa  adalah  53,6  ug/ml  (Reddy, Joy,  &  Kumar,  2011).  Tujuan  penelitian  ini yakni  untuk  menentukan  aktivitas  ekstrak metanol  dan  partisi  larut  dan  tidak  larut heksan yang paling selektif terhadap penghambatan  pertumbuhan  sel  kanker  HeLa dan MCF-7.

## METODOLOGI

## Ekstraksi
Bagian  tanaman  yang  digunakan  adalah kulit batang. Sampel diperoleh dari Kabupaten  Takalar.  Sampel  dikeringkan  dan diserbukkan. Serbuk kering kulit batang kayu jawa  sebanyak  1800  g  diekstraksi  dengan metode maserasi menggunakan metanol  5000 ml.

## Partisi
Partisi  dilakukan  dengan  metode  partisi cair-padat  sebanyak  20,51  g  menggunakan pelarut n-heksan sebanyak 1700 ml, sehingga diperoleh partisi larut heksan dan partisi tidak larut heksan.

## Uji Sitotoksik MTT
Sampel  dipreparasi  dengan  dilarutkan dalam  Dimetil  sulfoksida  (DMSO)  sehingga diperoleh  larutan  dengan  konsentrasi  500 ppm.  Kontrol  sel  menggunakan  hanya DMSO.  Kontrol  blangko  hanya  berisi  media. Kontrol  positif  berisi  obat  Cisplatin  dan Doxorubicin.
Sel  HeLa  dan  MCF-7  dimasukkan  ke dalam plat sumuran 96 yang berisi 5 × 10 3 sel dalam Dulbecco's  Modified  Eagle's  medium . Plat diinkubasi dalam inkubator CO 2 sehingga sel melekat. Media diberi larutan ekstrak 500 ppm  sebanyak  100µL.  Sel-sel  diinkubasi selama  24  jam  dan  kemudian  dicuci  dengan larutan dapar fosfat (PBS) sebelum penambahan 100 𝜇 L reagen MTT 0,5 mg/mL ke  dalam  setiap  sumur.  Inkubasi  lagi  selama 2-4  jam  di  dalam  inkubator  CO 2 ,  setelah  itu periksa  kondisi  sel  di  bawah  mikroskop inverted.  Sel  yang  masih  hidup  ditandai dengan  morfologi  seperti  berduri  atau berbentuk  Kristal  oleh  formazan  yang terbentuk  akibat  penyerapan  MTT  ke  dalam sel  kanker  tersebut,  sedangkan  sel  yang  mati ditandai  dengan  morfologi  yang  bulat-bulat. Selanjutnya  tambahkan  dengan  stopper  SDS 10% dalam 0,01 N HCl sebanyak 100 µl. Jika selesai,  maka  bungkus  plate  dengan  kertas lalu  diamkan  selama  semalaman  di  tempat yang  gelap  atau  jauh  dari  jangkauan  sinar matahari.  Setelah  didiamkan,  analisis  nilai absorbansinya  pada elisa  reader dengan panjang gelombang 595 nm.
Persentase  penghambatan  sel  dan  indeks selektivitas dihitung dengan rumus berikut
% 𝑆𝑒𝑙 𝑀𝑎𝑡𝑖 = 𝑆𝑃 − 𝐾𝐵 𝐾𝑆 − 𝐾𝐵 𝑥 100%
𝐼𝑛𝑑𝑒𝑘𝑠 𝑆𝑒𝑙𝑒𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 = % 𝑆𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑖 𝑘𝑎𝑛𝑘𝑒𝑟 % 𝑆𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑖 𝑉𝑒𝑟𝑜 dimana  KS=  serapan  kontrol  sel  tanpa sampel,  KB  =  serapan  kontrol  blangko  tanpa sampel  dan  sel,  SP  =  serapan  sampel perlakuan.

## Uji Golongan Senyawa

## Uji Alkaloid
Pereaksi  Mayer  disiapkan  baru  dengan melarutkan  campuran  merkuri  klorida  (1,36 g)  dan  kalium  iodida  (5  g)  dalam  air  (100,0 ml).  Pereaksi  Dragendorff  dibuat  dengan mencampur 8 gram Bi(NO 3 )3.H 2 O dilarutkan dalam  30  ml  HNO 3 pekat  dan  27,2   gram  KI dilarutkan dalam 50 ml air, lalu kedua larutan tersebut  dicampurkan  dan  dibiarkan  selama 24  jam,  lalu  diencerkan  dengan  air  hingga 100  ml.  Pereaksi  Wagner  dibuat  dengan melarutkan 2 g iodium dan 6 g KI dalam air, dicukupkan hingga 100 ml.
Ekstrak  sebanyak  5  mg  digerus  dengan penambahan  kloroform  hingga  larut.  Sampel ditambahkan  0,5  mL  asam  sulfat  1  M, kemudian  dikocok  perlahan.  Didiamkan beberapa  saat  sampai  terbentuk  dua  lapisan.
Lapisan atas yang jernih dibagi dua, 1 bagian ditambahkan  2-3  tetes  pereaksi  Dragendorff dan  bagian  berikutnya  ditambahkan  2-3  tetes pereaksi  Mayer.  Endapan  merah  bata  yang terbentuk  oleh  pereaksi  Dragendorf  dan endapan putih atau krem oleh pereaksi Meyer menunjukkan  adanya  senyawa  golongan alkaloid.

## Uji Flavonoid
Sebanyak 5 mg sampel dilarutkan dalam 1- 2  mL  metanol  panas  50  %.  Kemudian ditambah logam Mg dan 4-5 tetes HCl pekat. Terbentuk larutan berwarna merah atau jingga menunjukkan adanya flavonoid

## Uji Terpenoid
Sebanyak  5  mg  sampel  dilarutkan  dalam kloroform. Campuran ini selanjutnya ditambah  dengan  1-2  mL  H2SO4  pekat melalui  dinding  tabung  tersebut.  Jika  hasil yang diperoleh berupa cincin kecoklatan atau violet  pada  perbatasan  dua  pelarut  maka ekstrak tersebut menunjukkan adanya triterpenoid,  sedangkan  jika  hasil  yang diperoleh  terbentuk  warna  hijau  kebiruan maka  ekstrak  tersebut  menunjukkan  adanya steroid.

## Uji Fenol
Sebanyak  5  mg  sampel  dilarutkan  dengan 2  mL  etanol  96%  dan  ditambahkan  3  tetes larutan  FeCl 3 1%.  Terbentuknya  warna  hitam kebiruan  mengindikasikan  adanya  senyawa golongan fenolik.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tujuan  utama  kemoterapi  kanker  adalah merusak  secara  selektif  sel  tumor  yang berbahaya  tanpa  mengganggu  sel  normal. Tujuan  ini  masih  mengalami  kegagalan  dan hingga  sekarang ini  masih  sedikit  sekali obat antikanker  yang  bekerja  secara  selektif  untuk pengobatan  jenis  kanker  tertentu.  Sel  kanker itu  lebih  rentan  terhadap  senyawa  yang bersifat sitotoksik karena sel kanker umumnya  terus  membelah  dengan  cepat dibandingkan  sel  normal.  Namun,  antikanker umumnya bekerja dengan cara membunuh sel yang  sedang  berkembang,  sehingga  masih memungkinkan  antikanker  dapat  menyerang sel  normal  yang  sedang  dalam  proses
pembelahan  sel.  Itulah  timbulnya  efek samping sebab ketidakselektifan atau selektifitas  yang  rendah  dari  obat-obat kemoterapi itu sendiri.
Aktivitas antiproliferasi ekstrak dan partisi kayu  jawa  terhadap  sel  HeLa  dan  MCF-7 dievaluasi  dengan  uji  MTT.  Konsentrasi ekstrak dan partisi yang digunakan (500 ppm) diuji  terhadap  sel-sel  kanker  dan  sel  normal. Sel HeLa dan MCF-7 menunjukkan kerentanan  terhadap  sampel  yang  diberikan ditunjukkan  dengan  adanya  sel  kanker  mati. Jumlah  sel  kanker  yang  hidup  yang  terpapar dengan perlakuan ekstrak dan partisi berkurang  (lihat  tabel  1).  Ekstrak  metanol menunjukkan  penghambatan  terkuat,  baik untuk  sel  HeLa  maupun  sel  MCF-7,  tetapi selektivitas  tertinggi  kurang  baik.  Aktivitas antiproliferasi  untuk  partisi  larut  heksan paling  kecil,  tetapi  indeks  selektivitas  paling tinggi,  baik  terhadap  sel  HeLa  dan  MCF-7. Walaupun  aktivitas  partisi larut  heksan  kecil,
nilai  ini  masih  lebih  besar  daripada  cisplatin. Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  partisi  larut heksan  memiliki  aktivitas  sitotoksik  yang lemah,  tetapi  selektivitas  yang  baik  terhadap sel kanker HeLa dan MCF-7. Sampel dengan indeks  selektivitas  yang  lebih  besar  dari  3 memiliki  potensi  yang  besar  sebagai  obat kanker yang selektif (Chothiphirat, Nittayaboon,  Kanokwiroon,  Srisawat,  & Navakanitworakul, 2019).
Golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak  dan  partisi  didominasi  oleh  senyawa alkaloid dan terpenoid (lihat tabel 2). Ekstrak metanol  positif  terhadap  seluruh  golongan senyawa. Berdasarkan laporan Sivaraj (2018), ekstrak metanol mengandung senyawa terpenoid  seperti  alfa  pinen; pentadecanoic acid-14-methyl  methyl  ester; phytol ; 9,5- octadecadienoic acid methyl ester ; undecanoic  acid  -2-  nonyl  methyl  ester ;  dan octanoic  acid,  tetradecyl  ester .  Ekstrk metanol juga mengandung 3,5-Bis(1,1-

## Tabel 1. Hasil uji sitotoksisitas dan Indeks selektivitasnya
Sampel Sel Mati (%) Indeks Selektivitas HeLa MCF-7 Vero HeLa MCF-7 Ekstrak Metanol 100,0 93,0 48,8 2,05 1,91 Partisi Tidak Larut Heksan 96,0 74,3 51,8 1,85 1,44 Partisi Larut Heksan 29,2 14,9 7,0 4,20 2,13 Cisplatin 24,8 - - Doxorubicin - 54,8 32,8 Tabel 2. Hasil Identifikasi Golongan Senyawa Sampel Alkaloid Terpenoid  Flavonoid  Fenolik Dragendorff  Meyer  Wagner Liebermen Bourchart AlCl3 FeCl3 Ekstraksi Metanol - + + + + + Partisi Tidak larut heksan  + - - + - + Partisi larut heksan - - + + - -
dimethylethyl)phenol ; 5-hydroxy-6,7,8 – trimethoxy-2,3-dimethyl
chromone ,
merupakan senyawa gologan fenolik. Alkaloid Piperazine-1-(2-adamantyl-)-4- benzoyl juga  dapat  ditemukan  dalam  ekstrak metanol  kulit  batang  kayu  jawa.  Islam  & Tahara  (2000)  juga  melaporkan  kandungan flavonoid (2R,3S)-(+)-3′,5-dihydroxy-4′,7- dimethoxydihydro flavonol , (2R,3R)-(+)- 4′,5,7-trimethoxydihydro  flavonol , (2R,3R)-
(+)-4′,7-di-O-methyldihydro quercetin ,
(2R,3R)-(+)-4′,7-di-O-methyldihydro kaempferol , dan (2R,3R)-(+)-4′-O- methyldihydroquercetin yang  diperoleh  dari  . Subramanian  &  Nair  (1971)  melaporkan penemuan  senyawa  golongan  kuinon  seperti physcion anthranol B dan physcion, terpenoid β-sitosterol, flavonoid Quercetin-3- arabinoside dan fenolik ellagic acid . Alkaloid Piperazine-1-(2-adamantyl-)-4-benzoyl diduga  berperan  pada  aktivitas  antikanker pada  kayu  jawa  (Sivaraj,  Pavithra,  Srivastav, & Arumugam, 2018).

## KESIMPULAN
Partisi  tidak  larut  heksan  berpotensi menjadi  antikanker  dengan  selektivitas  yang baik.

## PENGHARGAAN
Penghargaan  kepada  Kementerian  Agama atas Hibah Penelitian Terapan dan Pengembangan Tahun 2017

## DAFTAR PUSTAKA
American  Cancer  Society.  (2015). Global Cancer  Facts  and  Figure  3rd  Section.
Atlanta: American Cancer Society. Chothiphirat, A., Nittayaboon, K., Kanokwiroon, K., Srisawat, T., &
Navakanitworakul,  R.  (2019).  Anticancer Potential  of  Fruit  Extracts  fromVatica diospyroidesSymington  Type  SS  and TheirEffect  on  Program  Cell  Death  of Cervical  Cancer  Cell  Lines. The  Scientific World Journal .
Czepas,  J.,  &  Gwozdzinski,  K.  (2014).  The flavonoid  quercetin:  Possible  solution  for anthracyclines-induced  cardiotoxicity  and multidrug  resistence. Biomedicine  & Pharmacotheraphy ,  1149-1159;  Volume 68, Issue 8.
Dan Grander's Group. (2015). Mechanisms of action  of  anti-cancer  drugs. .  Retrieved April  16,  2017,  from  Oncology-Pathology
Karolinska
Institutet:
file:///C:/Users/Microssoft/Downloads/SK RIPSI%20ZAKIAH/mechanisms-of- action-of-anti-cancer-drugs.htm Islam,  M.  T.,  &  Tahara,  S.  (2000). Dihydroflavonols
from Lannea coromandelica. Phytochemistry, 54 (8), 901-907.
Kementrian  Kesehatan.  (2015). Pusat  Data dan Informasi Kanker. Jakarta. Kumler, I., Stenvang, J., Moreira, J., Brunner, N.,  &  Nielsen,  D.  L.  (2015).  Drug transporters  in  breast  cancer:  responses  to anthracyclines and taxanes. Expert Review of Anticancer Theraphy , 1075-1092; Volume 15, Issue 9.
Luca,  A.  D.,  D'Alessio,  A.,  Maiello,  M.  R., Gallo,  M.,  Chicchinelli,  N.,  Pergameno, M.,  .  .  .  Normanno,  N.  (2015).  Evaluation of the pharmacokinetics of Ixabepilone for the  treatment  of  breast  cancer. Expert
Opinion on Drug Metabolism & Toxicology ,  1177-1185;  Volume  11,  Issue 7.
Nugroho,  A.  E.  (2014). Farmakologi. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Reddy,  A.  K.,  Joy,  J.  M.,  &  Kumar,  C.  A. (2011). Lannea coromandelica: The
Researcher’s  Tree. Avinash  Kumar  Reddy et al./Journal of Pharmacy Research , 577- 579.
Siegel,  R.  L.,  Miller,  K.  D.,  &  Jemal,  A. (2017).  Cancer  Statistics. CA:  A  Cancer Journal  for  Clinicans ,  7-30;  Volume  67, Issue 1.
Sivaraj,  C.,  Pavithra,  B.,  Srivastav,  A.,  & Arumugam,  P.  (2018).  GC-MS  Analysis, Antibacterial  and  Anticancer  Activities  of Bark  Extract  of  Lannea  coromandelica (Houtt.)  Merr. International  Journal  Of Pharmaceutical  Sciences  And  Research , 3047-3051 .
Subramanian,  S.  S.,  &  Nair,  A.  G.  (1971). Polyphenols  of  Lannea  coromandelica. Phytochemistry, 10 (8), 1939-1940.
Tia, L. J., Lui, A. G., Chua, N. S., & Strebel, H.  M.  (2015).  Chemotheraphy-induced neutropenia, anemia and thrombocytopenia,  among  Filipino  breast cancer patients on adjuvant chemotehraphy. Original  Article ,  26; Volume 49 No.2.