Menara Perkebunan , 2009, 77(2), 106-119.

## Potensi Pseudomonas fluorescens strain KTSS untuk bioremediasi merkuri di dalam tanah
The Potential use of Pseudomonas fluorescens KTSS  strain formercury bioremediation in the soil
Laksmita Prima SANTI &  Didiek Hadjar GOENADI
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Jl. Taman Kencana No.1 Bogor 16151, Indonesia
Diterima tgl 7 Mei 2009/Disetujui tgl 30 Juli 2009

## Abstract
Heavy  metals  are  widespread  pollutants  in soil  and  become  environmental  concern  as  they are non-degradable and highly persistent.  Solid and/or  liquid  wastes  containing  toxic  heavy metals may be generated in various industrial or mining  processes.  A  heavy  metal  resistant bacterium may be present in the soil and mining site. As they already preconditioned by abundant heavy  metals  contaminant,  the  use  of  these bacterium is assumed to be effective in improving metals  reduction.  To  obtain  bacterial  isolates highly  capable  of  mercury  (Hg)  reduction, isolation  activities  have  been  conducted  at selected  sites  of  mining  locations  in  South Sumatera.  The  highly  potential  bacteria possessing mercury reducing capability has been isolated  from  this  site  i.e. Pseudomonas fluorescens KTSS  strain.  Inoculating  of  25%
(v/w) suspension of P. fluorescens KTSS strain in soil  material  added  5000  ppb  of  mercury,  could reduced  about  53.3%  of  mercury  soil  contents. Best  vegetative  growth  performance  of  cocoa seedlings was shown by the application of 15-15- 15  NPK  conventional  fertilizers  in  combination with the addition of 1.6 – 3.25 g of P. fluorescens KTSS  bio-ameliorant/seed.  A  Greenhouse experiment  results  of  cocoa  seedlings  were  in concordance with those obtained from field trials of paddy.
[ Key words :  Soil bio-ameliorant,  heavy     metal, cacao seedling, paddy.]

## Abstrak
Logam  berat  merupakan  jenis  polutan  yang terdistribusi  secara  luas  di  dalam  tanah  dan mendapat perhatian secara khusus karena sifatnya yang tidak dapat terdegradasi serta dapat bertahan lama  di  dalam  lingkungan.  Limbah  padat dan/atau cair yang dihasilkan dari berbagai proses industri  dan  pertambangan  mengandung  logam berat toksik. Jenis bakteri yang resisten terhadap logam berat mungkin berada di dalam tanah dan di lokasi tambang. Apabila bakteri tersebut dapat beradaptasi  pada  lingkungan  dengan  tingkat kontaminasi  logam  berat  yang  tinggi,  maka diasumsikan  bahwa  penggunaan  bakteri  tersebut sangat efektif dalam meningkatkan reduksi logam berat.  Untuk  memperoleh  isolat  bakteri  yang memiliki  kemampuan  mereduksi  merkuri  (Hg), maka  satu  rangkaian  kegiatan  isolasi  telah dilakukan di lokasi tambang terpilih di Sumatera Selatan. Bakteri potensial pereduksi merkuri yang telah  diisolasi  dari  lokasi  ini  diidentifikasi sebagai Pseudomonas  fluorescens strain  KTSS. Inokulasi sebanyak 25% (v/b) suspensi P. fluore- scens strain  KTSS  ke  dalam  bahan  tanah  yang telah  ditambah  dengan  5000  ppb  merkuri,  dapat mereduksi  sekitar  53,3%  kandungan  merkuri  di dalam  tanah.    Pertumbuhan  terbaik  dari  bibit kakao  diperoleh  dari  perlakuan  pupuk  NPK  15- 15-15 yang dikombinasikan dengan   1,6 – 3,25 g bioamelioran P.  Fluorescens strain KTSS/bibit. Pengujian  bioamelioran P.  fluorescens strain KTSS di lapang pada tanaman padi memberikan pola  keefektifan  yang  sama  dengan  hasil pengujian terhadap bibit kakao yang dilakukan di rumah kaca.
[ Key words :  Bioamelioran tanah,  logam berat, pembibitan kakao, padi]

## Santi & Goenadi

## Pendahuluan
Upaya  penanggulangan  bahaya  pen- cemaran  yang  diakibatkan  oleh  merkuri telah banyak dilakukan. Berdasarkan asumsi bahwa  baik  tanaman  maupun  bakteri  me- rupakan  agens  biologi  penting  yang  dapat digunakan  untuk  bioremediasi,  maka beberapa  tahun  terakhir  ini  bidang  mikro- biologi  terapan  dan  biologi  molekular  men- jadi  dasar  pengembangan  teknologi  bio- remediasi  dengan  memanfaatkan  bakteri yang  dapat  mereduksi  merkuri.  Hasil  pene- litian Benyehuda et al . (2003) menunjukkan respons  penghambatan  pertumbuhan  yang sangat bervariasi dari bakteri aerobik kemo- heterotrop  yang  diisolasi  dari  dasar  permu- kaan  sedimen  di  dalam  medium  pepton- tripton-yeast-glukosa (PTYG) dengan kertas cakram yang mengandung    2 µmol Cr(VI), 50 nmol Hg(II), dan  500 nmol Pb(II).  Hal ini  diduga  karena  bakteri  Gram  positif  dan Gram  negatif  secara  prinsip  memiliki perbedaan  satu  dengan  lainnya  dalam  hal interaksi dengan logam (Giller et al .,  1998).
Bakteri Gram negatif menunjukkan toleransi terhadap  logam  yang  lebih  besar  daripada Gram  positif  karena  memiliki  struktur dinding  sel  yang  lebih  kompleks  yang mampu  mengikat  dan  mengimobilisasi  ion logam  termasuk  Hg 2+ .  Ahmad et  al. (2005) mengemukakan  bahwa  kemampuan  bakteri menghasilkan  polisakarida  ekstraselular dapat  melindungi  sel  dari  pengaruh  toksik logam  berat.    Hasil  penelitiannya  memberi- kan indikasi bahwa  bakteri heterotrof yang ditumbuhkan  di  dalam  medium  yang mengandung  merkuri  dengan  konsentrasi 150-200  µg/g  akan  mengalami  penurunan viabilitas  setelah  21  hari  inkubasi. Kontaminasi  yang  diakibatkan  oleh  logam berat  di  alam  tidak  bersifat bio-degradable . Namun demikian, sejumlah logam berat dan metaloid  pengkontaminan  penting  bersifat kurang  larut  dan  lebih  volatil  dalam  bentuk tereduksi  apabila  dibandingkan  dalam
bentuk  teroksidasi.    Reaksi  reduksi  merkuri merupakan  salah  satu  contoh  reaksi  reduksi logam  larut  menjadi  bentuk  volatil  dengan persamaan reaksi sebagai berikut:
Hg(II)+[H 2 ] à Hg(0)+2 H - (Alloway, 1995).
Merkuri  merupakan  salah  satu  jenis polutan  yang  bersifat  toksik.  Umumnya merkuri  dihasilkan  dari  sumber  emisi industri,  dan  didistribusikan  secara  global dari  sumber  pengendapannya  melalui atmosfer  ke  permukaan  bumi.  Bergantung pada  kondisi  redoks,  merkuri  terbentuk dalam  tiga  tingkatan  valensi  yang  berbeda, yaitu  sebagai  Hg o ,  Hg 2 2+ ,  dan  Hg 2+ .  Sifat penting merkuri lainnya adalah kemampuan- nya dalam mengikat ion sulfida secara kuat. Di  dalam  larutan  tanah,  fraksi  Hg 2+ hanya terbentuk dalam beberapa menit saja.  Fraksi utama akan terikat dalam mineral tanah atau dijerap  pada  permukaan  tanah,  serta senyawa  anorganik  dan  organik  lainnya. Kadar  merkuri  di  dalam  tanah  sangat bervariasi dan tergantung tingkat kedalaman khususnya  pada  tanah-tanah  alami.  Hal  ini berarti  bahwa  kedalaman  pengambilan contoh  tanah  merupakan  suatu  pedoman yang  penting  untuk  memperoleh  akurasi data.  Pada tanah yang diolah, kadar merkuri dalam  lapisan  olah  dengan  kedalaman 0-20  cm  cukup  homogen  karena  adanya pengelolaan tanah (Alloway, 1995).
Sejumlah  bakteri  resisten  terhadap merkuri  telah  diisolasi  dari  berbagai  jenis lingkungan.  Umumnya  bakteri  tersebut  ter- masuk  dalam  kelompok baik bakteri  Gram negatif maupun Gram positif (Nascimento & Chartone-Souza, 2003).  Bakteri ini memili- ki  mekanisme  untuk  mendetoksifikasi merkuri [operon resisten merkuri ( mer )] ber- dasarkan  pada  mekanisme  reduksi  intra- selular Hg 2+ menjadi bentuk non-toksik Hg o oleh  enzim  merkuri  reduktase.  Pilot  plan untuk pengembangan teknologi bioremediasi merkuri  pada  limbah  industri  dilaporkan
Potensi Pseudomonas fluorescens strain KTSS untuk bioremediasi…….
oleh  Dobler  (2003)  dengan  memanfaatkan Pseudomonas  putida .    Beberapa  bakteri aerobik dan fakultatif  mengkatalisasi proses reduksi  Hg(II)  men-jadi  Hg(0)  seperti Bacillus , Pseudomonas , Corynebacterium ,
Micrococcus dan Vibrio . Pseudomonas maltophilia dapat  mereduksi  Cr 6+ yang bersifat mobile dan  toksik  menjadi  bentuk immobile dan  nontoksik  Cr 3+ serta meminimumkan mobilitas ion toksik lainnya di  lingkungan  seperti  Hg 2+ ,  Pb 2+ dan  Cd 2+ (Blake et  al .,  1993;  Park et  al., 1999).
Reduksi  oleh  bakteri  tersebut  dapat digunakan  sebagai  strategi  remediasi  untuk endapan  terkontaminasi  (Mullen,  1998). Percepatan  laju  reduksi  Hg(II)  oleh  bakteri sangat  memungkinkan  untuk  digunakan dalam  teknik  bioremediasi in  situ di  tanah atau air yang tercemar (Barkay et al., 1991;
Goldstein et  al .,  1988).  Siklus  dasar  reaksi merkuri  di  dalam  tanah  dilakukan  oleh bakteri  dan  hasilnya  meliputi  transformasi aerobik  dan  anaerobik  yaitu  dari  Hg(II)  ke monometil  Hg  dan  selanjutnya  menjadi metana  dan  Hg(0).  Proses  metilasi  ini merupakan  awal  proses  detoksifikasi  bagi bakteri  bersangkutan  yang  kemudian dilanjutkan  dengan  proses  reduksi  Hg(II) menjadi Hg(0).  Dinamika merkuri di dalam tanah  sangat  dipengaruhi  oleh  nilai  Eh. Pada Eh  >0,4 v, merkuri larut berada dalam bentuk  Hg(II)  dan  dalam  kondisi  reduksi lemah  0,2-0,4  v,  sebagai  Hg(0)  atau  Hg(II) dan  semakin  reduktif  menjadi  Hg(0)  atau HgS (Klein & Thayer, 1995). Berdasarkan  kegiatan  penelitian  yang dilakukan  di  Balai  Penelitian  Bioteknologi Perkebunan  Indonesia,  telah  diperoleh  17 isolat  bakteri  yang  berpotensi  mereduksi logam  berat.  Bakteri-bakteri  tersebut  diiso- lasi dari empat lokasi yang diduga mengan- dung  logam  merkuri  yaitu  Tambang  batu bara Bukit Asam-Sumatera Selatan, tambang batu  bara  dan  tambang  emas  dan  intan  di Kalimantan  Selatan,  serta  tambang  emas Pongkor  dan  Cikotok  Jawa  Barat.    Hasil
seleksi awal menunjukkan bahwa P. fluores- cens strain  KTSS  dapat  tumbuh  baik  di dalam  medium  agar  Luria  Bertani  dengan kandungan  4000  ppm  merkuri.  Namun demikian,  diperlukan  pengujian  lebih  lanjut dengan  menggunakan  bahan  tanah  dan kondisi lapang untuk memperoleh gambaran yang lebih nyata mengenai potensi tersebut. Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan menetapkan  potensi P.  fluorescens strain KTSS yang diisolasi dari tambang batu bara Bukit  Asam-Sumatera  Selatan  dalam  mere- duksi  merkuri  di  dalam  bahan  tanah  serta potensi  pengembangannya  sebagai  bioame- lioran  untuk  tanah  bermasalah  terhadap merkuri.

## Bahan dan Metode

## Mikroorganisme
Bakteri yang digunakan dalam penelitian  ini  yaitu P.  fluorescens strain KTSS  yang diisolasi dari tambang batu bara wilayah  penambangan  PT  Tambang  Batu Bara  Bukit  Asam,  Sumatera  Selatan. Identifikasi  isolat  ini  diperoleh  berdasarkan sifat  fisiologinya  menggunakan Microbact Identification  Kits .  Biakan  dipelihara  di dalam  agar  miring  berisi  medium  Luria Bertani  (per  liter  medium):  1,0  g  Tripton, 0,5 g ekstrak khamir, 0,5 g NaCl, 1,5 g bacto agar, pH 7,2.

## Penyiapan inokulum
Isolat bakteri yang akan diuji ditumbuhkan  dalam  50  mL  medium  cair Luria Bertani (LB) selama 48 jam pada suhu 28 o C  di  atas  mesin  pengocok  dengan kecepatan 200 rpm.

## Penyiapan bioamelioran
Bahan  pembawa  yang  digunakan sebagai  bioamelioran  terdiri  dari  zeolit

## Santi & Goenadi
berdiameter  1-3  mm,  biochar  (80  mesh), MgSO 4 kalsinasi  (100  mesh),  dan  bahan aktif  ( Pseudomonas  fluorescens strain KTSS)  dengan  perbandingan  9  :  0,5  :  0,5  : 0,6.  Masing-masing  bahan  pembawa disterilisasi  terlebih  dahulu  di  dalam  oven bersuhu  105 o C  selama  empat  jam.    Zeolit granul  digunakan  sebagai  inti,  sementara biochar dan MgSO 4 kalsinasi masing-masing digunakan  sebagai  pelapis  dan  pengikat. Perbanyakan  inokulan  bakteri  dilakukan  di dalam  medium  LB.  Pencampuran  bahan dilakukan  dengan  menggunakan double- cone  mixer selama  lima  menit  dan  disertai dengan  inokulasi  6%  (v/b) Pseudomonas fluorescens strain  KTSS  ke  dalam  bahan pembawa  dengan  menggunakan  sprayer bertekanan tinggi. Bioamelioran ini memiliki  spesifikasi  bentuk  granul  ber- diameter  1-3  mm  berwarna  abu-abu  gelap, pH  7,3,  kadar  air  16,3  dan  jumlah  populasi Pseudomonas  fluorescens strain  KTSS sebanyak 10 7 - 10 8 CFU/gram contoh.
Penetapan  potensi P.  fluorescens strain KTSS.
Lima  puluh  gram  bahan  tanah dimasukkan  ke  dalam  100  mL  Erlenmeyer. Sterilisasi  bahan  tanah  dilakukan  meng- gunakan  Autoklaf  121 0 C  selama  satu  jam dalam  tiga  hari  berturut-turut.    Selanjutnya ke  dalam  10  buah  Erlenmeyer  yang  berisi bahan  tanah  steril  tersebut  masing-masing ditambahkan  5000  ppb  merkuri  dan diinkubasi  dalam  kondisi  statis  selama  24 jam.  Setelah  itu  sebanyak  0,  25,  dan  50% (v/b)  suspensi  bakteri  dengan  populasi  10 8 – 10 12 koloni/mL  (CFU)  diinokulasikan  ke dalam  bahan  tanah  steril  yang  telah mengandung  merkuri.    Inkubasi  dilanjutkan dalam  kondisi  statis  selama  tujuh  hari  pada suhu 28 o C. Pada akhir inkubasi, konsentrasi merkuri  terlarut  air  yang  terdapat  di  dalam bahan tanah dianalisis dengan menggunakan
Atomic Absorbtion Spectrophotometer
(AAS).  Dalam  pengujian  ini  digunakan strain  unggul  bakteri  pereduksi  merkuri lainnya yang  berasal  dari  Kalimantan Selatan (SAKS) sebagai pembanding.

## Analisis merkuri terlarut air
Sebanyak  5  g  bahan  tanah  yang mengandung  suspensi P.  fluorescens dimasukkan  ke  dalam  100  mL  botol  kocok plastik, kemudian ditambah 50 mL air suling dan  dikocok  selama  dua  jam  dengan kecepatan  200  rpm.  Inkubasi  dilanjutkan selama 24 jam pada suhu 28 o C.  Pada akhir inkubasi,  suspensi  tersebut  dikocok  selama 30 menit  kemudian disaring  dengan  kertas saring  Whatman  93  dan Sartorius 0,45 µM untuk  memperoleh  larutan  jernih  dan mencegah  suspensi  bakteri  terikut  dalam penetapan  merkuri  terlarut  air.  Penetapan merkuri  dilakukan  dengan  menggunakan Atomic Absorbtion
Spectrophotometer (AAS, Shimadzu AA6300) (AOAC, 2000).

## Analisis total merkuri di dalam bahan tanah dan tanaman
Sebanyak 1 g bahan tanah atau bagian tanaman (daun) kering oven dimasukkan ke dalam  100  mL  Erlenmeyer,  kemudian ditambah  dengan  5-7  mL  HNO 3 pekat  dan 1  mL  HCLO 4 pekat.    Erlenmeyer  ditutup dengan kaca penutup dan diinkubasi selama 24  jam  pada  suhu  28 o C.  Selanjutnya suspensi  bahan    tanah  atau  daun  di  dalam Erlenmeyer  dipanaskan  secara  perlahan ( 100-150 o C)  selama  lebih  kurang  tiga  jam sampai  uap  berwarna  cokelat  berkurang. Suhu  alat  pemanas  dinaikkan  hingga mencapai 200 o C sampai terbentuk uap putih di dalam suspensi tersebut. Setelah uap putih berkurang,  sebanyak  1  mL  suspensi  yang tertinggal  di  dalam  Erlenmeyer  didinginkan hingga  mencapai    suhu  ruang,  kemudian dipindahkan  ke  dalam  50  mL  labu  ukur
Potensi Pseudomonas fluorescens strain KTSS untuk bioremediasi…….
(pyrex),  dan  volume  ditepatkan  menjadi 50  mL  dengan  penambahan  aquades  dan dilakukan  pengocokan  sampai  homogen. Suspensi  disaring  terlebih  dahulu  dengan kertas  saring  Whatman  93  sebelum penetapan  total  merkuri  dengan Atomic Absorbtion Spectrophotometer (AAS, Shimadzu  AA6300).    Metode  penetapan merkuri dengan AAS dilakukan tanpa nyala api,  tetapi  dihibridisasi  dengan  SnCl 2 dan H 2 O  membentuk  kabut  dalam  alat vapour generation  accesories (VGA).  Lampu katoda  merkuri  dipasang  pada  panjang gelombang  (λ)  253,5  nm  dan  cahayanya diarahkan  supaya  dapat  menembus  kabut dari larutan tersebut (AOAC, 2000).
Penetapan  potensi  reduksi  merkuri  dengan bioindikator bibit kakao di rumah kaca.
Kegiatan  penelitian  disusun  dalam rancangan  acak  lengkap  dengan  lima  per- lakuan  dan  lima  ulangan.  Sebagai  medium tanam  digunakan  bahan  tanah  asal  desa Bantar  Karet,  Kecamatan  Nanggung, Leuwiliang-Jawa  Barat.  Pengambilan  bahan tanah  dilakukan  di  kedalaman  0-20  cm. Bahan  tanah  selanjutnya  diayak  mengguna- kan  ayakan  5  mm  dan  diaduk  hingga homogen.  Sebanyak  10  kg  bahan  tanah homogen  dimasukkan  ke  dalam  ember plastik  berkapasitas  15  L  yang  telah dilubangi  bagian  bawahnya.  Setiap  ember plastik  ditanami  dengan  satu  bibit  kakao lindak  klon Upper  Amazon  Hybrid (UAH) umur dua minggu. Pengamatan pertumbuhan vegetatif  bibit  kakao  dilakukan  setiap  bulan selama  tiga  bulan.  Peubah  yang  diamati meliputi:  (i)  tinggi  bibit,  (ii)  jumlah  daun, (iii)  panjang  akar,  dan  (iv)  berat  basah  dan kering  batang,  daun,  dan  akar  bibit  kakao. Seluruh  perlakuan  memperoleh  pemupukan masing-masing 18 g (100%) dan 9 g (50%) pupuk   NPK   15-15-15.   Aplikasi      bio-
amelioran  berbahan  aktif P.  fluorescens strain  KTSS  dilakukan  bersamaan  dengan aplikasi  pupuk  NPK  15-15-15.  Analisis bahan  tanah  meliputi  kadar  N  (metode Kjeldahl),  P 2 O 5 dan  K 2 O  (terekstrak  HCl 25%),  C  organik  (Walkley-Black),  pH, KTK-metode Bower ( US Salinity Lab. Staff 1954) dan  konsentrasi  total merkuri (AAS). Adapun  rancangan  perlakuan  sebagai berikut:
A. 100% dosis pupuk NPK. B. 100% dosis pupuk NPK +1,60g bioamelioran P. fluorescens strain KTSS/ bibit. C. 100% dosis pupuk NPK + 3,25 g bioamelioran P. fluorescens strain KTSS/bibit. D. 50% dosis pupuk NPK + 3,25 g bioamelioran P. fluorescens strain KTSS/bibit. E. Tanpa pupuk (Blanko).
Data  yang  diperoleh  diolah  dengan  analisis sidik ragam dan untuk membandingkan hasil dari  tiap  perlakuan  dilakukan  uji  lanjut dengan  Uji  Jarak  Berganda  Duncan  taraf 5%  (Steel & Torrie, 1980).
Penetapan  potensi  reduksi  merkuri  dengan bioindikator  padi  varietas  Ciherang  di lapang
Kegiatan  penelitian  dilakukan  di  desa Bantar  Karet,  Kecamatan  Nanggung, Leuwiliang  (Jawa  Barat).  Hasil  analisis tanah  yang  dilakukan  pada  saat  penelitian sebagai  berikut  :  0,26%  N;  0,003%  P 2 O 5; 0,006% K 2 O; 2,64% C-organik;  16,46 meq/ 100g  KTK,  21,1  ppm  Hg  dan  pH  4,4. Penelitian  menggunakan  rancangan  acak kelompok  (RAK)    dan  tiga  ulangan  dengan perlakuan :
A. 100% dosis pupuk NPK B.  100% dosis pupuk NPK + 37,5 kg
Santi & Goenadi
bioamelioran P.fluorescens strain KTSS /ha C. 100% dosis pupuk NPK + 75,0 kg bioamelioran P. fluorescens strain KTSS/ha D.  50% dosis pupuk NPK + 75,0 kg bioamelioran P. fluorescens strain KTSS/ha E. Tanpa pupuk (Blanko)
Dosis  pupuk  anjuran  lapang  adalah 300  kg  NPK  Phonska  (15-15-15)  +  200  kg urea/ha.  Bioamelioran  diberikan  satu  hari sebelum tanam dengan cara pembenaman ke dalam  tanah.  Sementara  itu,  300  kg  NPK Phonska  (15-15-15)  diberikan  sekaligus pada  tujuh  hari  setelah  tanam  (HST). Selanjutnya  200  kg  pupuk  urea  diberikan secara  sebar  ( broadcast )  sebanyak  tiga  kali pemupukan  pada  umur  tanaman  7,  21  dan 42  HST.  Ukuran  petak:    5  x  6  m  dengan pembatas  petak  berupa  pematang  dengan lebar 20-30 cm, tinggi 30 cm.  Padi varietas Ciherang ditanam-pindah pada umur 15 hari setelah pembibitan, dan selanjutnya ditanam dengan  sistem  legowo  2  :  1  berjarak  tanam 12,5  x  25  x  50  cm,  dengan  dua  bibit  per lubang  tanam.  Pengambilan  sampel  tanah dilakukan  pada  15  titik  lalu  dikompositkan untuk  dianalisis  sifat  kimia  tanah  dan kandungan  merkuri.  Pengamatan  terhadap perkembangan jumlah anakan (rumpun) dan tinggi tanaman (cm) pada 7, 14, 21, 42, dan 63 HST dilakukan dengan mengukur sampel tanaman  sebanyak  10  rumpun  per  petak perlakuan.  Sementara  itu,  peubah  yang diamati  untuk  mengetahui  produktivitas tanaman  meliputi:  (i)  jumlah  anakan produktif,  (ii)  malai  isi,  (iii)  gabah  kering panen  (GKP),  dan  (iv)  gabah  kering  giling (GKG).  Data yang diperoleh diolah dengan analisis sidik ragam dan untuk membanding- kan  hasil  dari  tiap  perlakuan  dilakukan  uji
lanjut  dengan  Uji  Jarak  Berganda  Duncan taraf  5%  (Steel & Torrie, 1980).

## Hasil dan Pembahasan
Penetapan potensi Pseudomonas fluorescens dalam  mereduksi  merkuri  di    dalam  bahan tanah
Berdasarkan hasil penelitian ini,
pemberian  inokulan P.  fluorescens strain KTSS  sebanyak  25%  (v/b)  ke  dalam  50  g bahan  tanah  steril  dengan  masa  inkubasi selama    tujuh  hari  pada  suhu  28 o C  dapat menurunkan  konsentrasi  merkuri  lebih banyak  jika  dibandingkan  dengan  tanpa inokulan ataupun perlakuan dengan P.  fluorescens strain  SAKS  (isolat  pemban- ding).  Jumlah suspensi P. fluorescens strain KTSS maupun SAKS yang ditambahkan ke dalam bahan tanah dengan konsentrasi 25% (v/b)  lebih  optimal  menurunkan  konsentrasi merkuri jika dibandingkan dengan 50% (v/b) (Gambar 1).
Apabila  dibandingkan  dengan  tanpa inokulan, maka potensi reduksi merkuri oleh P.  fluorescens strain  KTSS  dan  SAKS masing-masing  sebesar  53,3  dan  40,1% untuk 25% (v/b) serta 41,9 dan 16,3% untuk 50%  (v/b)  suspensi  inokulan.  Namun demikian,  hasil  ini  perlu  dikaji  lebih  lanjut untuk  penerapan  atau  penelitian  di  lapang. Pada  kondisi  lapang,  merkuri  mungkin berada  dalam  tiga  tingkat  valensi  yang berbeda.  Hal  ini  sangat  tergantung  pada kondisi redoks yang memungkinkan sebagai Hg 0 dan Hg 2+ .  Bentuk Hg 0 dan Hg 2+ sering dijumpai  di  dalam  tanah.  Lebih  lanjut dikemukakan  bahwa  redoks  potensial,  pH dan konsentrasi Cl - merupakan peubah kunci dalam  menetapkan  spesifikasi  bentuk merkuri  di  dalam  larutan  tanah  (Alloway, 1995).  Hanya   beberapa  menit  saja  fraksi
Potensi Pseudomonas fluorescens strain KTSS untuk bioremediasi…….
Hg 2+ berada  di  dalam  tanah,  sebagian  besar fraksi  akan  terikat  di  dalam  mineral  tanah atau  diabsorbsi  pada  permukaan  padat, bahan an-organik dan organik. Oleh  karena itu  di  dalam  kegiatan  penelitian  ini, konsentrasi  merkuri  yang  dapat  diukur kembali  di  dalam  bahan  tanah  dengan perlakuan  tanpa  inokulan  berkurang  cukup signifikan jika dibandingkan dengan pemberian  awal  sebesar  5000  ppb.  Namun konsentrasi  merkuri  terlarut  air  yang  tersisa di dalam bahan tanah tanpa inokulan bakteri ini  masih  lebih  tinggi  (1670  ppb)  jika dibandingkan  dengan  perlakuan  inokulasi 25%  (v/b)  suspensi P.  fluorescens strain KTSS  dan  SAKS  yaitu  masing-masing  780 dan 1000 ppb.
Mengenai  mekanisme  transformasi merkuri  yang  dilakukan  oleh  bakteri, Barkay (2000) menjelaskan ada empat jenis mekanisme  enzimatis  terkait  dengan  hal
tersebut yaitu: (i) reduksi Hg 2+ menjadi Hg 0 , (ii)  pemecahan  senyawa  organomerkuri (termasuk  MeHg + ),  yang  menghasilkan bentuk Hg 0 , (iii) metilasi Hg 2+ , dan oksidasi Hg 0 menjadi  Hg 2+ .    Reaksi  reduksi  dan pemecahan  senyawa  organomerkuri  dilaku- kan  oleh  enzim  dan  protein  ( mer )  operon dari  bakteri  yang  resisten  terhadap  merkuri dengan  produk  akhir  Hg 0 .    Operon mer memiliki  situs  pelekatan  spesifik  untuk protein  (merT,  merP,  dan  merC)  yang mentransport Hg 2+ ke dalam sitoplasma dan mencegah  penghancuran  sel.    Di  dalam  sel, Hg 2+ direduksi  oleh  NADPH  menjadi  Hg 0 oleh  enzim  merkuri  reduktase  (merA). Beberapa  operon mer bakteri  mengandung gen merB yang mengkodekan enzim merkuri liase.  Enzim  ini  dapat  mendetoksifikasi senyawa  organomerkuri  termasuk  MeHg 2+ dan Me 2 Hg.
Gambar 1.  Pengaruh dosis inokulan P. fluorescens strain KTSS dan SAKS terhadap konsentrasi merkuri terakumulasi di dalam bahan tanah setelah tujuh hari inkubasi pada suhu ruang. Tanda bar (I) adalah standar error (SE).
Figure 1.   The effect dosage of P. fluorescens KTSS and SAKS strain on mercury accumulation in the soil after seven days incubation at ambient temperature. Bar (I) is an error standard (ES).
I I I I I 2000 1600 1200 800 400 0 0%            25%              50%            25%                50% Ko nse nt ra si Hg ( pp b) te ra ku m ula si da la m ta na h Ac cu m ula tio n of H g (p pb ) co nc en tr atio n in th e so il m ate ria l Suspensi P.flourescences strain KTSS dan  SAKS (% v/b) P.flourescences strain KTSS and  SAKS suspension (% v/w) Tanpa inokulan Without inoculan SAKS KTSS

## Santi & Goenadi
Penetapan  potensi  reduksi  merkuri  dengan bioindikator bibit kakao di rumah kaca
Berdasarkan pengamatan diketahui bahwa tinggi, jumlah daun, dan panjang akar bibit  kakao  memberikan  hasil  pertumbuhan yang  baik  dengan  perlakuan  100%  dosis pupuk  NPK  yang  dikombinasikan  3,25g bioamelioran/bibit  (perlakuan  C).  Penim- bangan  terhadap  berat  basah  dan  berat kering  batang,  daun,  dan  akar  bibit menghasilkan  data  yang  konsisten  terhadap hasil  pengukuran  pertumbuhan  vegetatif bibit kakao lindak klon UAH (Tabel 1). Berdasarkan  data  yang  diperoleh  pada Tabel 1 maka penetapan akumulasi merkuri di  dalam  bahan  tanah  dan  daun  bibit  kakao dilakukan  dengan  menganalisis  akumulasi
merkuri  pada  perlakuan  C,  perlakuan  A (pemberian  pupuk  NPK)  dan  perlakuan  E (tanpa  pupuk).  Hasil  yang  diperoleh disajikan  pada  Tabel  2.  Hasil  penelitian  ini mengindikasikan  bahwa  dengan  pemberian bioamelioran P.  fluorescens strain  KTSS pada bahan tanah sebagai media tanam bibit kakao  maka  dalam  jangka  waktu  tiga  bulan setelah  tanam,  akumulasi  merkuri  terkon- sentrasi  di  daerah  sekitar  perakaran  bibit. Konsentrasi  merkuri  total  yang  terdapat  di dalam  bahan  tanah  dengan  perlakuan bioamelioran (perlakuan C) lebih tinggi jika dibandingkan perlakuan pemberian NPK 15- 15-15  saja  (perlakuan  A)  ataupun  tanpa pupuk  (perlakuan  E).  Hal  ini  diduga  bahwa dengan  pemberian  bioamelioran P.  fluore- scens strain  KTSS  dapat  menghambat
Tabel 1.     Pertumbuhan bibit kakao lindak klon UAH umur  tiga  bulan setelah tanam dengan perlakuan bioamelioran berbahan aktif P. fluorescens strain KTSS.
Table 1.     Seedlings growth of cacao UAH clone with NPK fertilizer and bio-ameliorant of P. fluorescens KTSS strain treatments, three months after planting.
*) Angka dalam kolom yang sama yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji jarak ganda Duncan  (P>0,05).
*) Figures in  the same  column  followed  by similar letter (s) are   not   significantly  different  according  to Duncan Multiple Range Test (P>0.05).
Keterangan ( Explanation ) : (A) 100% dosis pupuk NPK. (B) 100% dosis pupuk NPK + 1,60 g bioamelioran P. fluorescens strain KTSS/bibit. (C) 100% dosis pupuk NPK + 3,25 g bioamelioran P. fluorescens strain KTSS/bibit. (D)   50% dosis pupuk NPK + 3,25 g bioamelioran P. fluorescens strain KTSS/bibit.
(E) Tanpa pupuk (Blanko).
Perlakuan Treatments Peubah Parameters Tinggi (cm) Height (cm) Jumlah Daun (helai) Number of leaf Panjang Akar (cm) Root length (cm) Berat basah batang (g) Wet weight of stem (g) Berat basah daun (g) Wet weight of leaf (g) Berat basah akar (g) Wet weight of root (g) Berat kering batang (g) Dry weight of stem (g) Berat kering daun (g) Dry weight of leaf (g) Berat kering akar (g) Dry weight of  root (g) A 30,2 ab *) 18,3 a 39,0 ab 4,7 a 7,1 b 2,8 d 1,6 abc 2,7 b 1,7 ab B 34,2 a 18,0 a 42,7 a 5,6 a 8,1 ab 4,4 bc 2,1 a 3,0 ab 1,6 bc C 34,2 a 18,3 a 45,7 a 5,2 a 10,3 a 6,1 a 1,8 ab 3,4 a 2,0 a D 33,5 a 18,0 a 30,3 b 5,1 a 9,7 a 4,6 b 1,5 bc 3,3 ab 1,4 bc E 25,2 b 13,7 b 36,8 ab 4,2 a 6,6 b 3,8 c 1,3 c 2,7 b 1,3 c
Potensi Pseudomonas fluorescens strain KTSS untuk bioremediasi…….
translokasi  merkuri  ke  jaringan  daun  bibit kakao.  Konsentrasi  merkuri pada daun bibit kakao  dengan  perlakuan P.  fluorescens strain  KTSS    jauh  lebih  rendah  (<  0,2  ppb) apabila  dibandingkan  dengan  perlakuan pupuk NPK 15-15-15 (404,8 ppb) dan tanpa pupuk  (66,3  ppb).  Hasil  penelitian  ini mendukung  penelitian sebelumnya sebagai- mana  dikemukakan  oleh  Alloway  (1995) bahwa  ketersediaan  merkuri  di  dalam  tanah yang  ditranslokasikan  ke  dalam  jaringan tanaman akan rendah karena pada umumnya ada  kecenderungan  merkuri  akan  teraku- mulasi di akar atau daerah sekitar perakaran. Fenomena  ini  mengindikasikan  bahwa  akar tanaman akan menyimpannya sebagai barier untuk pengambilan merkuri. Peran
P.  fluorescens strain  KTSS  dalam  hal  ini cukup  signifikan  terhadap  terjadinya  proses aku-mulasi  merkuri  di  daerah  sekitar perakaran  (bahan  tanah)  melalui  penjerapan logam  tersebut  ke  dalam  sel  bakteri, sehingga  konsentrasi  total  merkuri  yang terukur  pada  jaringan  daun  bibit  kakao sangat  rendah.    Beberapa  strain P.  fluore- scens lebih dikenal  sebagai plant  growth-
promoting  rhizobacteria (PGPR)  yang memiliki kemampuan menghasilkan aktivitas deaminase 1-amino siklopropana-1- karboksilat (ACC), asam indol asetat (IAA) dan  siderofor  (Shilev et  al .,  2007).  Dengan kemampuan adaptasi yang tinggi dari bakteri ini akan memungkinkan terbentuk simbiosis dengan  tanaman  sebagai  mikrosimbion. Mikrosimbion  penting  dalam  memini- malisir  pengaruh  polutan  di  dalam  tanah terutama  polutan  logam  berat  yang  bersifat mobile. Indikasi  adanya  akumulasi  Pb  dan Cd  pada  bagian  tanaman  kakao,  khususnya dalam  biji  telah  dilaporkan  oleh  Goenadi et al . (1993).
Penetapan  potensi  reduksi  merkuri  dengan bioindikator  padi  varietas  Ciherang  di lapang
Lokasi  penelitian  berada  di  dalam wilayah  Kecamatan  Nanggung  Provinsi Jawa Barat, dekat tambang emas.  Berdasar- kan  analisis  awal  bahan  tanah  dari  lahan yang digunakan untuk uji penetapan potensi reduksi  merkuri  oleh  isolat P. fluorescens
Tabel 2.  Rata-rata total merkuri yang terdapat di dalam bahan tanah dan daun bibit kakao tiga bulan setelah tanam.
Table 2. Means of total mercury  in the soil material and cocoa seedling leaf, three months after planting.
Perlakuan Treatments Rata-rata total merkuri Means of  total mercury bahan tanah (ppb) soil material (ppb) daun bibit kakao (ppb) cacao seedling leaf (ppb) 100% dosis pupuk NPK
Full rate of 15-15-15 NPK fertilizer dosages
100% dosis pupuk NPK 15-15-15 + 3,25 g bioamelioran P. fluorescens strain KTSS/bibit Full rate of 15-15-15 NPK fertilizer dosages +3,25 g bioameliorant/seed
Tanpa pupuk (Blanko) Blank
915 2439 797,3 404,8 < 0,2 66,3

## Santi & Goenadi
strain KTSS tersebut diketahui bahwa kadar merkuri  mencapai  21,1  ppm.    Kontaminasi merkuri dalam tanah yang terdapat di lokasi ini  dapat  terjadi  karena  proses  alamiah seperti  pelapukan  batuan,  pengolahan  emas dengan  cara  amalgamasi,  dan  kegiatan industri  lainnya  yang  menggunakan  bahan baku merkuri.
Selama kegiatan penelitian berlangsung, pengamatan  pertumbuhan  padi  dilakukan dalam  lima  periode  hari  setelah  tanam (HST).    Pada  pengamatan  akhir  (63  HST  ) diketahui  bahwa  pemberian  100%  dosis pupuk  NPK  15-15-15  yang  dikombinasikan dengan  37,5–75  kg  bioamelioran/ha  umum- nya  menghasilkan  pertumbuhan  vegetatif dan  produksi  yang  lebih  baik  apabila dibandingkan dengan pemberian 100% dosis pupuk NPK 15-15-15 saja.  Indikasi ini ter- utama terlihat pada jumlah anakan (rumpun) dan  malai  isi.  Sementara  itu  peubah  tinggi tanaman, gabah kering panen (GKP), anakan produktif,  dan  gabah  kering  giling  (GKG) walaupun  hasil  yang  diperoleh  lebih  tinggi, tetapi berdasarkan uji statistik tidak berbeda nyata  dengan  perlakuan  100%  dosis  pupuk NPK  15-15-15.    Produktivitas  padi  varietas Ciherang  yang  ditunjukkan  melalui  hasil penimbangan  GKG  untuk  perlakuan  100% dosis pupuk NPK 15-15-15 dan 37,5- 75 kg bioamelioran/ha  berturut-turut  adalah  13,74 dan  13,84  kg/30  m 2 .  Jika  dikonversi  dalam satu  hektar  maka  nilai  GKG  tersebut menjadi 4,58 dan 4,61 ton/ha (Tabel 3).
Pengaruh  pemberian  bioamelioran  ber- bahan aktif P. fluorescens strain KTSS yang diperoleh  dari  kegiatan  di  lapang  masih memerlukan  uji  lanjut  untuk  memperoleh konsistensi  data.  Pengujian  disarankan minimal dalam dua periode musim tanam di tempat  yang  sama.  Selain  itu  pula konsistensi hasil diperlukan melalui uji multi lokasi  dengan  kondisi  masalah  logam  berat di  dalam  tanah.  Data  analisis  laboratorium menunjukkan bahwa ada sedikit peningkatan nilai pH tanah dengan perlakuan pupuk dan
bioamelioran  jika  dibandingkan  dengan tanpa pupuk. Sementara itu kadar merkuri di dalam tanah dengan pemberian bioamelioran cenderung  lebih  rendah  jika  dibandingkan dengan  pemberian  pupuk  NPK  15-15-15 atau  tanpa  pupuk  (Tabel  4).    Di  lain  pihak, kandungan  merkuri  di  dalam  beras  dari lokasi uji tidak berbeda antar perlakuan.
Sebagaimana  yang  dikemukakan  oleh Alloway (1995)  bahwa   jumlah   merkuri di dalam  tanah  pertanian    dapat    bertambah karena  adanya  aplikasi  pupuk,  kapur  dan kotoran  ternak.    Namun  demikian,  asumsi bahwa  pemberian  pupuk  NPK  dapat meningkatkan konsentrasi merkuri di dalam bahan  tanah  perlu  dikaji  lebih  dalam mengingat  banyak  faktor  di  dalam  tanah yang dapat mempengaruhi mobilisasi logam ini,  antara  lain  pencucian,  jumlah  bahan organik  (Yin et  al .,  1996),  pengikatan  oleh ion-ion  bermuatan  negatif  dalam  larutan tanah,  pH  tanah,  kondisi  redoks,  dan penjerapan oleh liat (Alloway, 1995).  Tanah di lokasi percobaan memiliki pH 4,4.  Pada kondisi  tersebut,  merkuri  diduga  dalam bentuk HgCl 2 .  Hal ini  sesuai dengan yang dikemukakan  Alloway  (1995)  bahwa  pada pH  di  bawah  5,5  bentuk  merkuri  yang dominan  di  dalam  larutan  tanah  adalah HgCl 2 o , dan pada pH tersebut bahan organik mungkin  juga  dapat  berperan  dalam penjerapan merkuri.
Kadar  bahan  organik  2,53-3,04%  yang termasuk  katagori  sedang  di  lokasi penelitian ini akan berdampak meningkatkan pertumbuhan  dan  aktivitas P.  fluorescens strain KTSS. Interaksi antara bahan organik dan  bakteri  memungkinkan  bagi  penjerapan dan  reduksi  konsentrasi  merkuri  terlarut  di dalam  tanah.  Hasil  ini  mendukung  per- nyataan  Ettler et  al .  (2007)  bahwa kontaminasi  merkuri  lebih  banyak  dijumpai pada  tanah-tanah  masam,  dimana  konsen- trasi total merkuri yang terjerap dalam tanah masam akan lebih tinggi apabila dibanding- kan dengan bentuk terlarut.
Potensi Pseudomonas fluorescens strain KTSS untuk bioremediasi…….
Tabel 3.  Pertumbuhan dan produktivitas padi varietas Ciherang dengan perlakuan bioamelioran berbahan aktif P. fluorescens strain KTSS.
Table 3.  Growth and productivity of paddy Ciherang variety with bio-ameliorant of P. fluorescens KTSS strain applications.
Perlakuan ( Treatments ) Peubah  ( Parameter ) Tinggi tanaman Plant height (cm) Jumlah anakan Number of tribes Anakan produktif Productive tribes Malai isi Fertile spikelet Gabah kering panen Grain dry yield (kg/30 m 2 ) Gabah kering giling Grain dry mill (kg/30 m 2 ) 100% dosis pupuk NPK 15-15-15 Full rate of 15-15-15 NPK fertilizer dosages 84,6 a *) 16,7 abc 18,5 ab 83,9 b 16,2 a 13,72 a 100% dosis pupuk NPK 15-15-15 + 37.5 kg bioamelioran/ha Full rate of 15-15-15 NPK fertilizer dosages +37,5 kg bioameliorant/ha 86,5 a 18,1 ab 23,0 a 117,9 a 16,6 a 13,74 a 100% dosis pupuk NPK 15-15-15 + 75 kg bio-amelioran/ha Full rate of 15-15-15 NPK fertilizer dosages +75 kg bioameliorant/ha 87,2 a 19,2 a 21,9 a 114, a 16,2 a 13,84 a 50% dosis pupuk NPK 15-15-15 + 75 kg bio-amelioran/ha 50%  of 15-15-15 NPK fertilizer dosages +75 kg bioameliorant/ha 80,9 a 13,8 c 16,9 ab 113,7 a 12,6 b 10,79 b Tanpa pupuk (Blanko) Blank 73,4 b 14,5 bc 14,7 b 86,3 b 12,2 b 10,25 b
*) Angka dalam kolom yang sama yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji jarak ganda Duncan (P>0,05).
*) Figures   in   the  same column   followed by   similar letter (s) are not  significantly  different  according to Duncan Multiple Range Test (P>0.05).

## Santi & Goenadi
Tabel 4.  Analisis kimia bahan tanah Bantar Karet-Nanggung yang diperlakukan dengan bioamelioran, 92 hari setelah tanam.
Table 4.  Chemical   analysis   of   Bantar Karet-Nanggung  soil   by  bio-ameliorant treatments, 92 days after planting.
Perlakuan ( Treatments )
Analisis  ( Analysis )
pH P 2 O 5 (%) C-org (%) Rata-rata kadar merkuri  dalam tanah Contain  mean of mercury in the soil (ppm) Rata-rata kadar merkuri dalam beras Contain  mean of mercury in rice (ppm) 100% dosis pupuk NPK 15-15-15 Full rate of 15-15-15 NPK fertilizer dosages 5,2 0,06 2,86 10,0 0,6 100% dosis pupuk NPK 15-15-15 +37,5 kg bioamelioran/ha Full rate of 15-15-15 NPK fertilizer dosages +37,5 kg bioameliorant/ha 5,3 0,06 3,00 7,4 0,5 100% dosis pupuk NPK 15-15-15 +75 kg bioamelioran/ha Full rate of 15-15-15 NPK  fertilizer dosages +75 kg bioameliorant/ha 5,4 0,06 3,04 6,9 0,5 50% dosis pupuk NPK15-15-15 + 75 kg bioamelioran/ha 50% of 15-15-15 NPK fertilizer dosages +75 kg bioameliorant/ha 5,1 0,05 2,64 6,5 0,5 Tanpa pupuk (Blanko) Blank 4,9 0,06 2,53 7,9 0,5

## Kesimpulan
Pseudomonas  fluorescens strain  KTSS memiliki  potensi  mereduksi  logam  merkuri. Jumlah suspensi P. fluorescens strain KTSS yang  ditambahkan  ke  dalam  bahan  tanah dengan konsentrasi 25% (v/b) lebih optimal menurunkan konsentrasi merkuri jika diban- dingkan  dengan  50%  (v/b).  Peran P.  fluo- rescens strain  KTSS  cukup  signifikan  ter- hadap  terjadinya  proses  akumulasi  merkuri di  daerah  sekitar  perakaran  bibit  kakao sehingga  dapat  menghambat  translokasi merkuri ke dalam jaringan daun bibit kakao dalam    waktu  tiga  bulan  setelah  tanam.
Pemberian  100%  dosis  pupuk  NPK  15-15- 15 yang dikombinasikan dengan 37,5–75 kg bioamelioran P.  fluorescens strain  KTSS/ha menghasilkan  pertumbuhan  vegetatif  dan produksi  padi  yang  lebih  baik  serta  kadar merkuri  di  dalam  tanah  yang  lebih  rendah apabila  dibandingkan  dengan  pemberian 100% dosis pupuk NPK 15-15-15 atau tanpa pupuk  (blanko).  Namun  demikian,  diperlu- kan justifikasi lebih lanjut mengenai indikasi potensi P.  fluorescens strain  KTSS  dalam mereduksi  merkuri  melalui  uji  coba  dua musim tanam atau uji multi lokasi di lapang dan  rumah  kaca  dengan  menggunakan beberapa  jenis  bahan  tanah  yang  berbeda.
Potensi Pseudomonas fluorescens strain KTSS untuk bioremediasi…….

## Ucapan Terima Kasih
Terima  kasih  disampaikan  kepada Kepala  Unit  Penyuluh  Teknis  Daerah (UPTD)  -  Penyuluh  Pertanian  wilayah Leuwiliang yang telah memberikan bantuan secara  langsung  maupun  tidak  langsung dalam  pelaksanaan  kegiatan  penelitian  di desa  Bantar  Karet,  Kecamatan  Nanggung, Jawa  Barat.  Kepada  Sdri  Nina  Mardiana, SSi dan Drs. Subandry Gunawan diucapkan penghargaan atas partisipasinya di laboratorium  dan  di  lapang.  Kegiatan penelitian  ini  dapat  terlaksana  atas  biaya APBN TA 2007-2008.

## Daftar Pustaka
Ahmad  I,  S  Hayat,  A  Ahmad,  A  Inam,  & Samiullah  (2005).  Effect of heavy metal on survival of certain groups of indigenous soil microbial  population .    J  Appl  Sci  Environ Mgt 9(1), 115-121.
AOAC (2000). AOAC International Suite 500 W . Horwitz ed .  (17t h ed . )  North  Frederick Avenue, Maryland-USA
Alloway  BJ    (1995). Heavy  Metal  in  Soils . London, Blackie Academic and Professional.
Barkay T (2000).  Mercury cycle. Encyclopedia of Microbiology 3, 171-181.
Barkay  T,  RR  Turner,    A  vanden  Brook  & C  Liebert    (1991).    The  relationship  of Hg(II) volatilization from a freshwater pond to  the  abundance  of mer genes  in  the  gene pool of the indigenous microbial community. Microb Ecol 21,151-161.
Benyehuda G, J Coombs, PL Ward,  D Balkwill & T Barkay (2003).  Metal resistance among aerobic  chemohetero-trophic  bacteria  from the  deep  terrestrial  subsurface .  Can  J
Microbiol 49,151-156.
Blake  RC,  DM  Choate,  S  Bardhan,  N  Revis, LL Barton & TG Zocco  (1993).  Chemical
transformation of toxic metals by Pseudomonas strain from a toxic waste site. Environ Toxic Chem 12, 1365-1376.
Dobler  IW    (2003).    Pilot  plant  for  bio- remediation of mercury-containing industrial wastewater. Appl  Microbiol  Biotechnol 62, 124-133.
Ettler V, J Rohovec, T Navratil &  M Mihaljevic (2007).  Mercury distribution in soil profiles polluted  by  lead  smelting. Bull  Environ Contam Toxicol 78, 12-16.
Giller    KE,  E  Witter  &  SP  McGrath    (1998). Toxicity  of  heavy  metals  to  microorganisms and  microbial  processes  in  agricultural  soils:
a review. Soil  Biol Biochem 30,1389-1414.
Goenadi  D.H,  K  Stahr  &  B  Volkle  (1993). Cadmium  and  lead  contents  of  cocoa  from selected cocoa plantations in Indonesia. In: Int  Conf  on  Cocoa  Economy ,  Denpasar  - Bali, 19-22 October 1993.
Goldstein RW, BH Olsen & DB Porcella  (1988). Conceptual  model  of  genetic    regulation  of mercury  biogeochemical  cycling. Environ Technol Lett 9, 957-964.
Klein  DA  &  JS  Thayer    (1995).    Interaction between  soil  microbial    community  and organometallic compounds. In :   JM Bollag &  G  Stotzky  (eds). Soil  Biochemistry .  6. New York, Marcel Dekker, Inc.
Mullen  MD    (1998).    Transformations  on  other elements. In: DM  Sylvia,  JJ  Fuhrmann, PE Hartel & DA Zuberer. ( eds ). Principles and  Applications  of  Soil  Microbiology . New  Jersey,  Prentice  Hall,  Upper  Saddle River.
Nascimento AMA &  E Chartone-Souza.  (2003). Operon  mer:  Bacterial  resistance  to mercury  and  potential  for  bioremediation of contaminated environments. Genet  Mol Res 2(1), 92-101.
Park  CH,  M  Keyhan  &  A  Matin    (1999). Purification   and   characterization    of

## Santi & Goenadi
chromate  reductase  in Pseudomonas putida . Abs.  Gen.  Meet  American  Soc. Microbiol . , 99 ,536-540.
Shilev  S,  AF  Lopez,  MS  Prieto  &  EDS  Puebla (2007).    Induced  protein  profile  change  in arsenate  tolerant  and  sensitive Pseudo- monas  fluorescens strains. J  Environ  Eng Land Manag 25(4), 221-226.
Steel RGD &  JH Torrie (1980). Principles and Procedures  of  Statistics . A  Biometrical
Approach .  2 nd ed.    New  York,  McGraw- Hill.
U.S. Salinity Laboratory Staff  (1954).  Diagnosis and improvement of saline and alkali soils. Agricultural Handbook No. 60.
Yin  YJ,  HE  Allen,  YM  Li,  CP  Huang    & P  F  Sanders    (1996).    Adsorption  of mercury  (II)  by  soil:  effects  of  pH, chloride,  and  organic  matter. J  Environ Qual 25, 837-844.