## VALIDASI  METODE PENENTUAN  SAKARIN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

## Agus Kembaren dan Tiasina Harahap
Dosen Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Medan, Medan Alumni Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Medan email: agus.kembaren@yahoo.co.id
Abstract. This  research  was  aimed  to  validation  analytical  method  of  Saccarine  and  to  determine saccarine  consentration  in  soft  drink  High  Performance  Liquid  Chromatography.  Sodium  Saccarine salts are used as standard.  Sodium Saccarine salts  dissolve in mobile phase methanol : fosfat buffer (60:40).  Concentration  of  standard  saccarine  solution  made  in  20,  40,  60,  80,  and  100  ppm.  HPLC Agilent Technology 1260 Infinitely Series, Poroshell/C18 column-  50 mm lenght- id 4.6 mm - particles size 2.7 µm, UV-detector in λ 265 nm, injection volume 20 µL , and flow rate 1 mL/minutes were used in  this  research.  Method  validation  parameters  were  determined  by  linierity,  precision,  accuracy, LOD,  LOQ,  and  selectivity.  The  results  show  that  lineariy  with  R  =  0.998702,  precision  with  RSD  = 0.192%, accuracy with % recovery = 100.26%, LOD = 0.172 ppm, LOQ = 0.573, and selectivity with R s =  0.2.  Testing  for  the  „Sprite  Zero‟  soft  drink  show  that  117.6  mg/kg  saccarine  (under  the  maximum content in carbonated/noncarbonated soft drink). Conclution from this research is,  HPLC method can use in analysis saccarine content in soft drink
Kata kunci: metode penentuan,  sakarin, kromatografi kinerja tinggi
PENDAHULUAN Validasi metode analisis merupakan  suatu  tindakan  penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan  percobaan  laboratorium untuk  membuktikan  bahwa  parameter tersebut  memenuhi  persyaratan  untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Dengan  kata  lain  tujuan  dari  validasi metode analisis adalah untuk mengkonfirmasi atau memastikan metode  analisis  yang  dipakai  sesuai untuk peruntukannya. Adapun parameter-parameter  tersebut  antara lain  adalah  akurasi  (kecermatan), presisi (keseksamaan), selektifitas, linieritas dan rentang, batas deteksi dan batas  kuantitas,  ketangguhan  metode, kekuatan metode.
Akurasi,  adalah  ukuran  yang menunjukkan  derajat  kedekatan  hasil analis  dengan  kadar  analit  yang sebenarnya.  Kecermatan  dinyatakan sebagai  persen  perolehan  kembali ( recovery )  analit  yang  ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi  galat  sistematik  tersebut
seperti  menggunakan  peralatan  yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan  pelarut  yang  baik,  pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat  asas  sesuai  prosedur.  Kriteria penerimaan  akurasi  (% recovery ) adalah 98% - 102% (Mulyati, dkk. 2011, Shabir, 2003).
% Perolehan kembali
( recovery )= x 100%
C p = konsentrasi sampel yang diperoleh dari pengukuran (praktek). C t = konsentrasi sampel teoritis.
Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil  uji  individual,  diukur  melalui penyebaran  hasil  individual  dari  rata- rata  jika  prosedur  diterapkan  secara berulang  pada  sampel-sampel  yang diambil  dari  campuran  yang  homogen. Kriteria  seksama  diberikan  jika  metode memberikan  simpangan  baku  relatif atau  koefisien  variasi  2%  atau  kurang (Harmita,  2004).  Menurut  Shabir (2003), prosedur spesifik untuk penentuan presisi suatu metode dilakukan minimal sembilan penentuan untuk menentukan range dari prosedur
(tiga  konsentrasi  dengan  tiga  kali pengulangan pada masing-masing konsentrasi).  Presisi  dapat  dihitung dengan cara sebagai berikut :
1. Hasil  analisis  adalah  x 1 ,  x 2 ,  x 3 , x 4 ,.......,  x n maka  simpangan bakunya adalah SD = 2. Simpangan  baku  relatif    (SBR) adalah :
SBR = x 100% Selektifitas  atau  spesifisitas  suatu metode  adalah  kemampuannya  yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat  dan  seksama  dengan  adanya komponen lain yang ada dalam matriks sampel.  Selektivitas  seringkali  dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan  ( degree  of  bias )  metode yang  dilakukan  terhadap  sampel  yang mengandung  bahan  yang  ditambahkan berupa  cemaran,  hasil  urai,  senyawa sejenis,  senyawa  asing  lainnya,  dan dibandingkan  terhadap  hasil  analisis sampel yang tidak mengandung bahanlain yang ditambahkan. Penyimpanagn hasil jika ada merupakan  selisih  dari  hasil  uji keduanya.  Pada  metode  analisis  yang melibatkan  kromatografi,  selektifitas ditentukan  melalui  perhitungan  daya resolusinya (R s ) dimana syarat resolusinya adalah ≥ 1,5 (Shabir, 2003). Resolusi adalah ukuran yang menunjukkan bagaimana dua peak yang dihasilkan terpisah dengan baik. Menurut Food and Drug Administration (1994),  rumus  resolusi (R s ) adalah sebagai berikut :
R s = dimana :
t R = retention time of analyte, dan t w = peakwidth measured at baseline.
Linearitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk memberikan  responsecara  langsung atau  tidak  langsung,  dengan  bantuan
transformasi  matematik  yang  baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Wells dan Dantus, 2005).  Linearitas  suatu  metode  diuji untuk  memastikan  adanya  hubungan linier  antara  konsentrasi  analit  dengan respon  detektor.  Koefisien  korelasi  (R) adalah  parameter  yang  menunjukkan adanya  hubungan  linier  antara  respon analitik  (luas  area)  dengan  konsentrasi analit yang diukur pada kurva kalibrasi. Suatu  metode  dikatakan  memenuhi kriteria  lineritas  jika  nilai  koefisien korelasi (R) mendekati 1 (Novelina, dkk. 2009). Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit  yang  sudah  ditunjukkan  dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima.  Menurut  Shah, et  al. (2000) dalam Wells dan Dantus (2005),prosedur untuk penentuan linearitas  suatu  metode  dilakukan minimal  dengan  tiga  konsentrasi  yang menggambarkan range dari  kurva kalibrasi  yaitu  konsentrasi  yang  dekat dengan nilai LOQ, konsentrasi pertengahan,  dan  konsentrasi  yang merupakan  batas  terendah  dari  kurva kalibrasi. Sebagai parameter adanya
hubungan  linier  digunakan  koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linier Y =  ax  +  b.  Hubungan  linier  yang  ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau -1 bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai  a  menunjukkan  kepekaan  analisis terutama instrumen yang digunakan. Batas  deteksi,  adalah  jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi  yang  masih  memberikan respon  signifikan  dibandingkan  dengan blangko.  Batas  deteksi  merupakan parameter  uji  batas.  Batas  kuantitasi merupakan  parameter  pada  analisis renik  dan  diartikan  sebagai  kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat  memenuhi  kriteria  cermat  dan seksama.
Pada  analisis  instrumen  batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu  dihitung  simpangan  baku  respon blanko  dan  formula  dibawah  ini  dapat digunakan untuk perhitungan :
Q = dimana :  Q =  Batas  deteksi atau  Batas  kuantitas.,      k  =  3  untuk batas  deteksi  atau  10  untuk  batas kuantitas,   SD = Standar Deviasi intersep pada persamaan regresi linier., S  =  Slope  dari  persamaan  regresi  linier (nilai a pada y = ax+b) (ICH, 1996) Ketangguhan metode adalah derajat  ketertiruan  hasil  uji  yang diperoleh  dari  analisis  sampel  yang sama  dalam  berbagai  kondisi  uji normal,  seperti  laboratorium,  analisis, instrumen,  bahan  pereaksi,  suhu,  hari yang berbeda, dll. Ketangguhan biasanya  dinyatakan  sebagai  tidak adanya  pengaruh  perbedaan  operasi atau  lingkungan  kerja  pada  hasil  uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal  antara  laboratorium  dan  antar analis. Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi  yang  kecil  dan  terus menerus  dan  mengevaluasi  respon analitik  dan  efek  presisi  dan  akurasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organic fase gerak (1%),  pH  fase  gerak  (±  0,2  unit)  dan perubahan  temperature  kolom  (±  2  - 3°C). Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium.  Identifikasi  sekurang  – kurangnya  3  faktor  analisis  yang  dapat mempengaruhi  hasil  bila  diganti  atau diubah (Harmita, 2004).
METODE Penelitian dilakukan di Laboratorium  Kimia  FMIPA  UNIMED Jl.  Williem  Iskandar  Psr  V  Medan Estate, Medan. Penelitian ini berlangsung  selama  5  bulan,  selain perencanaan dan analisis data.
Alat dan bahan Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  sebagai  berikut  : Natrium  Sakarin  (Supelco),  Standar Natrium  Siklamat  (Supelco),  Methanol
HPLC Grade (Merck), KH 2 PO 4 (Merck),
K 2 HPO 4 (Merck),  Aquades,  dan Aquabides.  Semua  bahan  kimia  yang digunakan  memiliki  kemurnian  yang tinggi (pa).
Peralatan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  sebagai  berikut  : KCKT  ( HPLC  Agilent  Technology  1260 Infinitely  Series) detektor  UV,  Kolom C 18 ,  Neraca  analitik,  Kertas  saring, penyaring  vakum,Vial  dan  alat-alat gelas yang biasa digunakan di laboratorium  kimia.  Semua  peralatan merupakan  milik  Laboratorium  Kimia Universitas Negeri Medan. Prosedur Kerja Kolom yang digunakan Poroshell/C18-panjang 50 mm, diameter dalam  4,6 mm dengan ukuran partikel  2,7  µm,  Detektor    UV  set  pada panjang  gelombang  265  nm,  Volume Injeksi 20 µL, Fase Gerak Dafar Posfat : Metanol (60:40), Laju Alir 1 mL/menit, Temperatur Kolom 24 o C Sebanyak  0,9524  g  K 2 HPO 4 dan 1,2551  g  dan  KH 2 PO 4 ditimbang  dan dimasukkan  kedalam  labu  takar  500 mL.  Sediaan  ini  dilarutkan  dengan  25 mL  metanol  dan  aquabides  sampai tanda tera, lalu dihomogenkan.
Larutan  baku  diperoleh  dengan menimbang  sebanyak  100  mg  standar Na-  sakarin  lalu  dimasukkan  ke  dalam labu 100 mL dan dilarutkan dengan fase gerak sampai tanda tera, dihomogenkan (larutan  mengandung  1.000  ppm). Persiapan standar yang akan digunakan dengan  membuat  deret  standar  yang memiliki konsentrasi  20, 40, 60, 80dan 100  ppm.  Larutan-larutan  tersebut diperoleh  melalui  pengenceran  dengan memipet 1, 2, 3, 4 dan 5mL larutan baku standar  sakarin  1.000  ppm  diencerkan dengan  fase  gerak  hingga  volume  50 mL.  Larutan  kemudian  disaring,  dan siap untuk digunakan.

## Preparasi sampel
Ditimbang  kurang  lebih  0.5293  g sampel  dimasukkan  kedalam  labu  ukur 50  mL  kemudian  tambahkan  larutan fase gerak hingga tanda batas, dihomogenkan  dan  disaring.  Filtrat
S O C O O NNa NH 2 O SO 2 S O C O O NH
yang  dihasilkan  kemudian  dimasukkan ke  dalam  vial.  Larutan  siap  untuk diinjeksikan ( Novelina, dkk. 2009). Beberapa  aspek  yang  diukur  dalam validasi  metode  adalah  selektifitas, linieritas,  presisi,  akurasi,  limit  deteksi, limit  kuantitasi.  Penetapan  selektifitas dilakukan  dengan  membandingkan hasil  analisis  sampel  yang  megandung cemaran,  hasil  urai,  senyawa  sejenis, senyawa  asing  lainnya  atau  pembawa placebo  (sediaan  farmasi)  dengan  hasil analisis  sampel  lain  dengan  kondisi kerja  yang  sama.  Sedangkan  uji linieritas diperoleh dari data pengukuran  larutan  deret  standar  yang telah  dibuat  sehingga  diperoleh  kurva kalibrasi dan persamaan regresinya. Uji presisi dilakukan dengan cara pengulangan  ( repeatability )  3  kali larutan  standar  yang  di  buat  sesuai prosedur  yang  diinjeksikan  pada  hari yang sama sehingga diperoleh data yang akan dinyatakan nilai presisinya sebagai simpangan  baku  relatif  (%  SBR).  Uji akurasi (uji perolehan kembali) dilakukan  dengan  membuat  larutan standar sesuai prosedur diulangi sebanyak  3  kali  dan  masing-masing diinjeksikan  ke  dalam  alat  KCKT.  Nilai akurasi dinyatakan sebagai % recovery . Pengukuran  limit  deteksi  dilakukan dengan  mengolah  data  yang  diperoleh
dari hasil pengukuran linieritas standar sehingga  diperoleh  nilai Limit  of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ) .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sekilas Sakarin dan metode analisis Sakarin  ditemukan  secara  tidak sengaja oleh Fahbelrg dan Remsen pada tahun  1987.  Ketika  pertama  kali ditemukan  sakarin  digunakan  sebagai pengawet,  tetapi  sejak  tahun  1900 digunakan  sebagai  pemanis  (Cahyadi, 2006).  Sakarin  adalah  pemanis  buatan yang  memiliki  struktur  dasar Sulfinida Benzoat tidak  menghasilkan  kalori.
Sakarin  jauh  lebih  manis  dibandingkan sukrosa  dengan  perbandingan  rasa manis kira-kira 350 kali lebih tinggi dari kemanisan sukrosa (angka perbandingan  ini  berdasarkan  nilai ambang batas) (Woodroof, 1974).Rumus  molekul  sakarin  adalah C 7 H 5 NO 3 S dan berat molekulnya 183,18. Sakarin memiliki struktur kimia terlihat pada  gambar  1.a.    Sakarin  lebih  stabil dalam  bentuk  garam  sehingga  sering dijumpai dalam bentuk garam Natriumnya  dengan  struktur  seperti terlihat pada gambar 1.b. a b Gambar 1. Struktur Kimia a)Sakarin, b)Na-Sakarin Dalam perdagangan dikenal dengan nama glucid, gucide, garantose, saccharimol,  saccharol  dan  sykosa. Secara umum, garam sakarin berbentuk kristal  putih,  tidak  berbau  atau  berbau aromatik lemah, dan mudah larut dalam air,  serta  berasa  manis  (SNI  01-6993- 2004).  Penggunaan  sakarin  tergantung dari intensitas kemanisan yang dikehendaki.  Pada  konsentrasi  tinggi,
sakarin  akan  menimbulkan  rasa  pahit- getir (nimbrah), hal ini disebabkan oleh kemurnian  yang  rendah  dari  proses sintesis  (Winarno,  1991).  Natrium sakarin didalam tubuh tidak mengalami metabolisme  sehingga  diekskresikan melalui  urine  tanpa  perubahan  kimia. Sakarin  memiliki  tingkat  kemanisan relatif  sebesar  300  sampai  dengan  500 kali  tingkat  kemanisan  sukrosa  tanpa
nilai  kalori  (SNI  01-6993-2004).  Nilai kalori  :  0  kkal/g  atau  setara  dengan  0 kJ/g dan ADI ( Acceptable Daily Intake ) : 5 mg/kg berat badan.
Sakarin  banyak  dipakai  sebagai pengganti  gula  pada  penderita  kencing manis  atau  untuk  makanan  yang berkalori  rendah.  Meskipun  masih diperbolehkan  sebagai  pemanis  bahan makanan  di  Amerika  Serikat    namun pemakaiannya  sangat  dibatasi.  Pada tahun  1971,  suatu  penelitian  yang dilakukan  oleh Wisconsin  Alumni ResearchFoundation(WARF) membuktikan  bahwa  sakarin  tergolong pada zat penyebab kanker (carcinogen). Dari  15  ekor  tikus  yang  diberi sakarin,  5%  atau  7  ekor  diantaranya menderita kanker pada kantung empedu  setelah  memakan  sakarin dalam  ransumnya  selama  2  tahun
(Wightman,  1977  dalam  Djojosoebagio dan  Wiranda,  1996).  Kemudian    pada tahun 1977, Canada‟s Health Protection Branch melaporkan  bahwa  sakarin bertanggung  jawab  terhadap  terjadinya kanker  kantung  kemih.  Sejak  itu, sakarin  dilarang  digunakan  di  Kanada kecuali  sebagai  pemanis  yang  dijual  di apotek  dengan  mencantumkan  label peringatan  (Cahyadi,  2006).  Menurut Sinulingga  (2011),  penggunaan  sakarin yang  berlebihan,  dapat  menimbulkan bahaya  bagi  kesehatan  manusia,  antara lain migran atau sakit kepala, kehilangan daya ingat, bingung, insomnia,  iritasi,  asma,  hipertensi, diare, sakit perut, alergi, impotensi dan gangguan  seksual,  kebotakan,  kanker otak dan kanker kantung kemih. Untuk menghindari dampak tersebut  diatas  maka  telah  ditetapkan batasan  maksimum  sakarin  kategori minuman ringan berkarbonasi dan non- karbonasi  sebesar  500  mg/kg  (SNI  01- 6993-2004).  Namun,  terkait  masalah penambahan  pemanis  buatan  dalam minuman masih terdapat kadar sakarin atau  garamnya  yang  melebihi  ambang batas  dalam  minuman  yang  beredar  di pasaran seperti pada penelitian Ranitha Sinulingga  (2004)  yang  mendapatkan kadar  natrium  sakarin  dalam  es  doger yang  termasuk  kategori  minuman jajanan  yang  dipasarkan  di  SD  Negeri
No.  064025  Jln.  Flamboyan  Kelurahan Simpang  Selayang  Kecamatan  Medan Tuntungan  sebanyak  310,5  mg/kg  dari batas  maksimal  300  mg/kg  yang ditetapkan  SNI  01-6993-2004  begitu juga  dengan  penelitian  yang  dilakukan Subani (2008) yang mendapatkan kadar natrium  sakarin  sebesar  564  mg/kg dalam  sirup  markisa  pohon pisang  dari batas  maksimal  300  mg/kg  yang ditetapkan SNI 01-6993-2004. Metode analisis yang dapat dilakukan  untuk  analisis  sakarin  dalam minuman antara lain adalah spektrofotometri (MA PPOM No.47/MA/93), volumetri, dan kromatografi cair kinerja tinggi. Namun beberapa  metode  tersebut  memiliki beberapa  kelemahan  seperti  pada spektrofotometri  memilki  kelemahan yaitu  membutuhkan  banyak  perlakuan pada  sampel  yang  dikhawatirkan  akan memperbesar  kesalahan  pengukuran, terlalu  banyak  jumlah  bahan  yang digunakan, dan waktu yang dibutuhkan relatif  lama.  Kemudian  pada  metode volumetri  meski  merupakan  metode yang memiliki kelebihan seperti murah, tahan dan mampu memberikan ketepatan  (presisi)  yang  tinggi  namun keterbatasan  metode  ini  adalah  bahwa metode  ini  kurang  spesifik.  Metode Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi  juga memilki  beberapa  kelemahan  namun dibanding  dengan  metode  yang  lainnya metode  ini  lebih  banyak  memiliki kelebihan untuk proses analisis.

## Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi  cair,  pada  awalnya dilakuka dalam kolom gelas berdiameter  besar  dalam  kondisi tekanan  atmosfer.  Waktu  yang  dibutuh untuk  suatu  analisis  relatif  lama.  Pada akhir  tahun  1960-an,  telah  dilakukan berbagai  upaya  untuk  mengembangkan kromatografi  cair  sehingga  dapat mengimbangi penggunaan kromatografi gas.  Upaya-upaya  tersebut  kemudian menghasilkan High Performance Liquid  Chromatography  (HPLC) atau Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi (KCKT). Kemajuan teknologi instrumentasi  dan  pengepakan  kolom telah mempercepat pemanfaatan
menjadi  setara  dengan  kromatografi
gas.
Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi (KCKT)  atau  High  Pressure  Liquid Chromatography  (HPLC)  merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.  KCKT  termasuk  metode analisis  terbaru  yaitu  suatu  teknik kromatografi  dengan  fasa  gerak  cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan  metode  lainnya  (Snyder  dan Kirkland, 1979; Johnson dan Stevenson,
1978).  Kelebihan  itu  antara  lain: mampu  memisahkan  molekul-molekul dari suatu campuran, mudah mengoperasikannya,  kecepatan  dan kepekaan  yang  tinggi,  resolusi  yang
baik,  dapat  menggunakan  bermacam- macam  detektor,  mudah  melakukan " sample  recovery "  ,  dapat  pula ditandemkan dengan intrumen lain. Sebagai  mana  instrumen  lainnya, KCKT juga memiliki kelemahan/kekurangan. Kekurangan metode  ini  antara  lain  :  larutan  harus dicari  fase  diamnya  terlebih  dahulu, mengetahui  kondisi  yang  optimum antara pelarut, analit dan gradien elusi, dan  harganya  yang    relatif  mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian sangat terbatas.
Komponen-komponen
Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi  dapat dilihat pada gambar 2. Gambar 2. Diagram Blok KCKT Sebagaimana metode analisis lainnya,  analisis  dengan  KCKT  tentu memerlukan validasi metode (penentuan  kinerja  analitis).  Terkait keberadaan  di  Laboratorium  Kimia FMIPA  Unimed  dan  berdasarkan pernyataan-pernyataan  diatas  maka dilakukanlah penelitian untuk mempelajari validasi metode penentuan kadar  sakarin  dalam  minuman  ringan dengan  menggunakan  Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Hasil Uji Linieritas Standar
Uji  linieritas  adalah  suatu  metode analisis  yang  dilakukan  untuk  melihat kemampuan  suatu  metode  analisis dalam  memberikan  respon  yang  baik padaberbagai macam konsentrasi analit. Koefisien korelasi (R) adalah parameter yang  menunjukkan  adanya  hubungan linier  antara  respon  analitik  (luas  area) dengan  konsentrasi  analit  yang  diukur pada kurva kalibrasi. Tabel 1. Luas Area, Tinggi Puncak dan Waktu Retensi Kromatogram Larutan Standar Sakarin   Dengan Konsentrasi 20, 40, 60, 80, 100 ppm. No  Konsentra si Replikasi Luas Area Tinggi Puncak R t (menit) 1 20 ppm 1 1673,98804 296,82367 0,583 2 1664,66931 290,26624 0,581 3 1663,93774 285,81686 0,581 2 40 ppm 1 3239,83179 545,77930 0,574 2 3233,34473 539,02576 0,577 3 3222,23438 526,70325 0,570 3 60 ppm 1 5122,33253 813,26843 0,565
2 5131,63281 787,13086 0,569 3 5117,39355 813,57080 0,562 4 80 ppm 1 6504,45020 1013,06299 0,563 2 6508,63379 979,13727 0,566 3 6496,99268 967,48199 0,561 5 100 ppm 1 8525,14746 1088,20728 0,555 2 8499,14160 1109,39282 0,550 3 8501,92383 1114,08960 0,551 Pada  penelitian  ini  larutan  standar sakarin  dipreparasi  dengan  fase  gerak sehingga  diperoleh  konsentrasi  20,  40,
60,  80,  100  ppm  yang  kemudian diinjeksikan  sebanyak  tiga  kali  untuk setiap  konsentrasi  kedalam  KCKT sehingga  menghasilkan  respon  analitik berupa  luas  area  kromatogram,  tinggi puncak kromatogram dan waktu retensi (R t ).  Data  luas  area,  tinggi  puncak
kromatogram  dan  waktu  retensi  dapat dilihat  pada  Tabel  1.  Dari  data  pada Tabel  1.    dapat  dicari  persamaan  garis regresi  linier  untuk  setiap  tahap replikasi  (pengulangan)  dari  deret konsentrasi  standar.  Persamaan  regresi linier untuk setiap replikasi (pengulangan)  deret  standar  dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Nilai a, b dan R pada persamaan garis regresi linier untuk setiap   replikasi deret standar. Replika Nilai Pada Persamaan Garis Regresi Linier (y = ax+b) a b R 1 84,834686 -76,931173 0,998665 2 84,721168 -75,785644 0,998751 3 84,753652 -84,722708 0,998692 84,769835 -79,146508 0,998702 Dari  tabel  2.    dapat  dilihat  bahwa dari  ketiga  replikasi  yang  dilakukan nilai  koefisien  korelasi  (R)  rata-rata adalah 0,998702 dimana nilai ini sangat baik karena mendekati 1. Suatu metode dikatakan  memenuhi  kriteria  lineritas jika  nilai  koefisien  korelasi  (R) mendekati  1  (Novelina,  dkk.  2009).
Nilai koefisien korelasi (R) ini menunjukkan  bahwa  metode  analisis yang digunakan telah memenuhi kriteria linieritas dari rentang konsentrasi  20-100  ppm.  Dengan demikian dapat dikatakan  bahwa KCKT ini  memberikan  respon  analitik  yang baik terhadap deret konsentrasi standar yang dianalisis.
Hasil  Uji  Presisi  ,  akurasi,  limit deteksi dan selektifitas
Uji  presisi  dilakukan  dengan  cara mempreparasi  larutan  standar  sakarin dengan  fase  gerak  sehingga  diperoleh konsentrasi 20, 40, 60, 80 dan 100 ppm kemudian  diinjeksikan  kedalam  KCKT sebanyak tiga kali untuk masing-masing konsentrasi. Kemudian sebagai hasilnya diperoleh  luas  area  kromatogram. Perhitungan  kadar  dapat  dilakukan dengan  menggunakan  persamaan  garis regresi  linier  dari  kurva  kalibrasi (perhitungan dapat dilihat pada lampiran  2).  Hasil  perhitungan  dengan berdasarkan  persamaan  garis  regresi linier  menunjukkan  bahwa  rata-rata  % SBR  (Simpangan  Baku  Relative)  pada range konsentrasi  20-100  ppm  adalah 0,192%. Presisi suatu metode dikatakan telah  memenuhi  syarat  keberterimaan jika  nilai  dari  %  SBR  ≤  2%  (Harmita, 2004). Dari hasil presisi yang diperoleh,
dapat  disimpulkan  bahwa  metode  yang digunakan  telah  memenuhi  syarat keberterimaan.  Hal  ini  juga  menjadi suatu informasi bahwa sistem operasional  alat  dan  analis  memiliki nilai presisi yang baik terhadap metode dengan respon yang relatif konstan. Akurasi  merujuk  pada  pengertian ketepatan  atau  kecermatan,  dimana merupakan  ukuran  yang  menunjukkan derajat  kedekatan  hasil  yang  diperoleh dalam analisis dengan nilai sebenarnya. Akurasi memenuhi syarat keberterimaan  jika  nilai  %  perolehan kembali  ( recovery )  adalah  98%  -  102%
(Mulyati, dkk. 2011, Shabir, 2003). Pada penentuan  nilai  akurasi  ini  tidak berbeda jauh dengan presisi. Penentuan
dilakukan  dengan  cara  mempreparasi larutan  standar  sakarin  dengan  fase gerak  sehingga  diperoleh  konsentrasi 20,  40,  60,  80  dan  100  ppm  kemudian diinjeksikan  kedalam  KCKT  sebanyak tiga kali untuk masing-masing konsentrasi.  Luas  area  kromatogram yang dihasilkan masing-masing dimasukkan  kedalam  persamaan  garis regresi  linier  yang  telah  diperoleh  dari kurva  kalibrasi  deret  standar.  Kadar analit  yang  terukur  untuk  setiap konsentrasi dirata-ratakan, maka diperoleh % perolehan kembali
( recovery )  100,26%  yang  berada  pada rentang 97,06% - 103,02% dalam range konsentrasi  20-100  ppm.  Hasil  uji akurasi  dapat  dilihat  pada  tabel  3. Tabel 3. Data Hasil Uji Akurasi No Konsentrasi Standar Teoritis (C t ) Konsentrasi Praktek (C p ) Rata-Rata % Recovery 1 20 ppm 20,604 103,02% 2 40 ppm 39,058 97,64% 3 60 ppm 61,377 102,28% 4 80 ppm 77,651 97,06% 5 100 ppm 101,308 101,31% Rata-rata 100,26% Nilai rata-rata hasil dari uji akurasi yang menunjukkan % recovery 100,26% menunjukkan  bahwa  tingkat  akurasi metode ini memenuhi syarat keberterimaan.  Menurut  Mulyati,  dkk. (2011), Shabir (2003), kriteria penerimaan  akurasi  (% Recovery ) adalah  98%  -  102%.  Hasil  % recovery yang  berada  pada  rentang  97,06%  - 103,02%  juga  merupakan  indikator kecenderungan  terjadinya  kesalahan acak  yang  terjadi  pada  praktek  yang disebabkan  oleh  senyawa  pengganggu yang  masih  terbawa  oleh  matriks meskipun  telah  dilakukan  penyaringan. Oleh karena adanya senyawa pengganggu ini menyebabkan konsentrasi  yang  terukur  oleh  alat sebagian  lebih  rendah  dan  sebagian yang  lain  lebih  tinggi  dari  100%. Menurut Novelina, dkk. (2009) kesalahan acak ini dapat diminimalisasi dengan  melakukan  sonikasi  terhadap larutan uji pada rentang waktu tertentu. Pembahasan mengenai limit deteksi  dan  limit  kuantitasi  ini  tidak dapat  dipisahkan  karena  keduanya memiliki  hubungan  yang  sangat  kuat. Secara  praktis  cara  evaluasi  keduanya dapat  dikatakan  tidak  ada  perbedaan yang  signifikan.  Perbedaan  antara keduanya  hanya  pada  sifat  kuantitatif data  yang  diperoleh  (Novelina,  dkk. 2009).  Limit  deteksi  diartikan  sebagai konsentrasi  analit  terendah  yang  dapat dideteksi  tetapi  tidak  secara  kuantitatif sedangkan  untuk  limit  kuantitasi diartikan  sebagai  konsentrasi  terendah dari  analit  yang  dapat  dideteksi  secara kuantitatif.
Pada penelitian ini perhitungan dari limit deteksi dan limit kuantitasi  diperoleh  dari  nilai  intersep dari  persamaan  garis  regresi  linier kurva kalibrasi (lihat tabel 2) yang telah dihasilkan.  Pada  penelitian  ini  nilai limit  deteksi  (LOD)  yang  diperoleh 0,172  ppm  sedangkan  nilai  limit kuantitasi (LOQ) 0,573 ppm.
Uji  selektifitas  pada  penelitian  ini dilakukan dengan cara membandingkan kromatogram standar sakarin yang akan dianalisis dengan kromatogram senyawa  lain  sebagai  pembanding, dalam  penelitian  ini  senyawa  yang digunakan  sebagai  pembanding  adalah siklamat.  Kromatogram  yang  diperoleh berasal  dari  kondisi  kromatografi  Cair Kinerja  Tinggi  yang  sama  yaitu  dengan konsentrasi  1000  ppm,  volume  injeksi 20 µL, panjang gelombang UV 265 nm.
Retensi  dari  siklamat0,443  menit  (t R1 ) dansakarin 0,462 menit (t R2 ) dibandingkan  dan  diperoleh    nilai resolusi  (R s )  sebesar  0,2.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  keselektifitasan KCKT  ini  belum  baik  karena  hanya menghasilkan  resolusi  (R s )  <  1,5 sedangkan menurut Shabir (2003) peak analit  harus  mempunyai  resolusi  ≥  1,5 dari  seluruh  komponennya.  Dari  nilai resolusi  yang  diperoleh  menunjukkan bahwa  tidak  boleh  melakukan  analisis terhadap  senyawa  sakarin  pada  kondisi kerja  analisis  untuk  sakarin  dengan kehadiran  siklamat  didalamnya  karena hal  ini  akan  mengganggu  analisa terhadap  senyawa  sakarin  sendiri.  Hal lain  yang  dapat  dilakukan  untuk mengatasi  ketidakselektifan  metode  ini adalah dengan meminimalisir kesalahan acak  yang  terjadi  selama  penelitian seperti melakukan penyaringan terhadap semua komponen yang
digunakan dengan cermat, menggunakan  pelarut  murni  yang khusus untuk HPLC karena penggunaan  pelarut  murni  non  HPLC menyebabkan  adsorpsi  ireversibel  dari kotoran  pada  kolom.  Kotoran  ini memblokir  situs  adsorpsi,  mengubah selektifitas  kolom,  serta  melakukan homogenitas larutan uji dengan sonikasi  pada  rentang  waktu  tertentu (Novelina,  dkk.  2009).  Kromatogram standar  sakarin  dan  standar    siklamat dapat dilihat pada gambar 3.

## Hasil penentuan kadar sampel
Uji  kadar  sampel  pada  penelitian ini  dilakukan  dengan  cara  menimbang sampel  Sprite  Zero  sebanyak  0,5293 gram,  dimasukkan  kedalam  labu  ukur 50 mL dan dilarutkan dengan fase gerak sampai  tanda  tera  kemudian  disaring dengan  kertas  saring.  Larutan  sampel diinjeksi  kedalam  KCKT  dan  dilakukan pengulangan  sebanyak  lima  kali.  Luas area  kromatogram  yang  dihasilkan  dari setiap injeksi sampel dirata-ratakan dan diperoleh  rata-rata  luas  area  sebesar 0,552.  Dari  luas  area  rata-rata  yang diperoleh  dapat  dihitung  kadar  sakarin dalam sampel dengan cara memasukkan  nilai  luas  area  kedalam persamaan  garis  regresi  linear  kurva kalibrasi.  Kadar  sakarin  yang  terdapat dalam  sampel  sebesar  117,6  mg/kg.
a) Siklamat b) sakarin Gambar 3.  Kromatogram Standar
Jumlah  ini  menunjukkan  kadar sakarin  yang  masih  berada  di  bawah dari jumlah maksimum yang diperbolehkan untuk kategori minuman ringan berkarbonasi dan non-karbonasi yaitu  500  mg/kg  (SNI  01-6993-2004).
Dari  analisis  penentuan  kadar  sakarin dengan  sampel  Sprite  Zero,  sampel  ini memiliki  kadar  sakarin  yang  aman untuk dikonsumsi.
KESIMPULAN Berdasarkan  hasil  penelitian,  maka dapat dikemukakan beberapa kesimpulan sebagai berikut : 1. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi  dapat  digunakan  untuk penentuan kadar sakarin ditunjukkan  oleh  limit  deteksi sebesar 0,172 ppm, limit kuantitasi  sebesar  1,573  ppm, koefisien korelasi (R) pada parameter linieritas sebesar 0,998702,  nilai  %  Simpangan Baku  Relatif  (uji  presisi)    sebesar 0,192%,  nilai  % recovery (uji akurasi)  sebesar  100,  26%,  dan nilai  resolusi  (uji  selektifitas) sebesar 0,2.
2. Hasil  dari  penentuan  kadar sakarin  dalam  minuman  ringan merek  Sprite  Zero  sebesar  117,6 mg/kg,  kadar    yang  terdapat dalam  kemasan  sampel  108 mg/kg dan persen perbedaan hasil sebesar 8,9%. Nilai ini menunjukkan  jumlah  yang  masih berada  dibawah  dari  jumlah maksimum  yang  dianjurkan  oleh pemerintah sebesar 500 mg/kg.

## DAFTAR PUSTAKA
Badan  Standarisasi  Nasional-BSN,  SNI 01-6993-2004, Bahan  Tambahan Pangan Pemanis Buatan – Persyaratan  Penggunaan  Dalam Produk Pangan , Jakarta. Cahyadi,  Wisnu.,  (2006), Analisis  dan Aspek Kesehatan Bahan Tambahan  Pangan, Bumi  Aksara, Jakarta.
Djojosoebagio,  Soewondo.,  dan  G.
Wiranda.,  (1996), Fisiologi  Nutrisi
Volume  I ,  Penerbit  Universitas
Indonesia, Jakarta.
FDA,  (1994), Reviewer  Guidance :Validation  of  Chromatographic Methods. Food and Drug Administration  :  Center  for  Drug Evaluation and Research. Harmita, (2004), Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,  Review  Artikel, Majalah  Ilmu  Kefarmasian , Vol.  I No.3  :  117-135  ISSN    :  1693-9883, Departemen  Farmasi  FMIPA  –  UI,
Jakarta. ICH,  (1994), Text  on  Validation  of Analytical Procedures: Q2A. Recommended for Adoption  at  Step  4  of  the  ICH Process. International  Conference of Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use. Johnson,  E.  L.,  and  Steven  son,  R., (1978), Basic Liquid Chromatography , Varian, California. MA PPOM No.45/MA/92. Mulyati,  Ade  Heri.,  Sutanto,  dan Apriyani,  Dewi.,  (2011),  Validasi
Metode  Analisis  Kadar  Ambroksol Hidroklorida Dalam Sediaan Tablet Cystelis  Secara  Kromatografi  Cair Kinerja  Tinggi, Jurnal  Ekologia , Vol. 11 No.2 :  36  –  45,  FMIPA,  Universitas Pakuan, Bogor.
Novelina,  Yus  Maria.,  Sutanto,  dan
Fatimah,  Alia.,  (2009),  Validasi Metoda  Analisis  Penetapan  Kadar Senyawa Siklamat dalam Minuman Ringan, Prosiding PPI Standarisasi
2009 , Jakarta. Shabir,  G.  A.,  (2003),  Validation  of High- Performance Liquid chromatography Methods for Pharmaceutical analysis: understandingthe  differences  and similarities between validation requirements  of  the  US  Food  and Drug  Administration,  the  US Pharmacopeia and the International Conference on Harmonization. J.  Chromatogr.  A 987 : 57-66.
Shah, V.P., Midha, K.K., Findlay, J. W.,
Hill,  W.  M.,  Hulse,  J.  D.,
McGilveray, I. J., McKay, G., Miller, K. J., Patnaik, R. N., Powell, M. L., Tonelli,  A.,  Viswanathan,  C.  T.,
Yacobi,  A.,  (2000),  Bioanalytical method  validation:  a  revisit  with  a decade  of  progress. Pharm.  Res.
17(12): 1551-1557.
Sinulingga, Ranitha., (2011), Penentuan
Kadar  Sakarin  Dalam  Beberapa Jenis  Minuman  Jajanan  Yang Dipasarkan  di  SD  Negeri  No. 064025 Jln. Flamboyan Kelurahan Simpang  Selayang  Kecamatan Medan Tuntungan Secara Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi , Skripsi, FMIPA Universitas Sumatera Utara. Snyder, L. R., and Kirkland J.J., (1979), Introduction  to  modern  liquid chromatography.  second  edition, John  Wiley  &  Sons,  Inc  NewYork, Chihester, Briebane, Toronto, Singapore.
Subani,  (2008),
Penentuan  Kadar Natrium  Benzoat,  Kalium  Sorbat, dan Natrium Sakarin Dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja  Tinggi  (KCKT)  Di  Balai Besar  Pengawasan  Obat  dan Makanan  Medan ,  Karya  Ilmiah, Program  Studi  Diploma  III  Kimia Analis FMIPA Universitas Sumatera Utara. Wells, Margaret., and Dantus, Mauricio., (2005), Analytical Instrumentation Handbook “Validation of Chromatographic
Methods” , Merck & Co. Inc,
Rahway, NJ, USA. Winarno,  G.F.,  (1991), Kimia  Pangan dan  Gizi ,  PT.  Gramedia  Pustaka Utama, Jakarta.
Woodroof,  J.G.,  and  G.F,  Philips., (1974), Beverages  :  Carbonated and  Noncarbonated, The  AVI Publishing Company, Inc, Westport, Connecticut.