DOI: https://doi.org/10.24114/jbio.v7i3.29015

## JBIO: JURNAL BIOSAINS
(The Journal of Biosciences)
http://jurnal.unimed.ac.id/2012/index.php/biosains email : jbiosains@unimed.ac.id
PERTUMBUHAN DAN METABOLIT SEKUNDER Chlorella sorokiniana YANG DIKULTUR PADA LIMBAH CAIR TAHU
Devy Susanty* 1 , Ade Ayu Oksari 2 1 Program studi kimia, FMIPA, Universitas Nusa Bangsa, Jl. KH. Sholeh Iskandar Km. 4, Tanah Sareal, Bogor
2 Program Studi Biologi, FMIPA, Universitas Nusa Bangsa, Jl. KH. Sholeh Iskandar Km. 4, Tanah Sareal, Bogor *email korespondensi : dvsusanty@gmail.com
Diterima:  Oktober 2021; Direvisi: November 2021; Disetujui: Desember 2021

## ABSTRAK
Pemanfaatan limbah sebagai media kultur dapat menekan biaya produksi dan menjadi salah satu cara penanganan limbah. Limbah cair tahu (LCT) merupakan salah satu limbah yang banyak dihasilkan dan berpotensi sebagai media tumbuh Chlorella sorokiniana . Hal ini karena LCT telah diketahui mengandung makronutrien seperti nitrogen, fosforus, dan kalium. Penelitian ini bertujuan menentukan pertumbuhan C. sorokiniana pada media LCT, menentukan kandungan metabolit sekunder dan total fenolik pada ekstrak etanol C. sorokiniana yang dikultur pada media limbah tahu. Mikroalga dikultur pada konsentrasi media LCT  15,  20,  25,  dan  30%.  Pertumbuhan  terbaik  diperoleh  pada  media  LCT  dengan  konsentrasi  30%. Biomassa  mikroalga  yang  diperoleh  dari  hasil  kultivasi  pada  media  terbaik  diekstraksi  menggunakan metode maserasi berulang dengan pelarut etanol. Metabolit sekunder pada ekstrak dianalisis dengan uji fitokimia. Hasil uji menunjukkan keberadaan golongan senyawa alkaloid, flavonoid, tanin, dan terpenoid. Uji  total  fenolik  dengan  pereaksi  Folin  Ciocalteau  menghasilkan  14,16  mg  GAE/g  dan  total  flavonoid ekstrak adalah 40,59 mg QE/g yang menunjukkan bahwa ekstrak tersebut berpotensi memiliki aktivitas hayati seperti antimikroba dan antioksidan.
Kata Kunci : Chlorella sorokiniana , limbah cair tahu, flavonoid, metabolit sekunder, fenolik
GROWTH AND SECONDARY METABOLITES of Chlorella sorokiniana CULTURED IN TOFU LIQUID WASTE

## ABSTRACT
Utilizing waste as a culture medium can reduce production costs and become a way of  handling waste. Tofu liquid waste (LCT) is one of the wastes that is produced and has the potential as a growth medium  for  Chlorella  sorokiniana.  LCT  has  been  known  to  contain  macronutrients  such  as  nitrogen, phosphorus,  and  potassium.  This  study  aims  to  determine  the  growth  of  C.  sorokiniana  on  LCT  media, determine the content of secondary metabolites and total phenolics in the ethanol extract of C. sorokiniana cultured on tofu waste media. Microalgae were cultured at LCT media concentrations of 15, 20, 25, and 30%. The best growth was obtained on LCT media with a concentration of 30%. The microalgae biomass obtained from cultivation on the best media was extracted using the repeated maceration method with ethanol as solvent. The secondary metabolites in the extract were analyzed by phytochemical test. The test results showed the presence of alkaloids, flavonoids, tannins, and terpenoids. Total phenolic test with Folin Ciocalteau reagent gave 14.16 mg GAE/g, and total flavonoid extract was 40.59 mg QE/g which indicated that the extract has potential as antimicrobial and antioxidant.
Keywords: Chlorella sorokiniana,, tofu liquid waste, flavonoids, secondary metabolites, phenolic

## Pendahuluan
Mikroalga  merupakan  mikroorganisme yang  bermanfaat  di  berbagai  bidang  di  antaranya bidang energi (Makareviciene et al ., 2011; Li et al. , 2011)  dan  kesehatan  (Olasehinde et  al ,  2019). Pemanfaatan mikroalga di bidang kesehatan terkait dengan  kandungan  senyawa  yang  terdapat  dalam mikroalga  tersebut.  Salah  satu  mikroalga  yang dapat  dimanfaatkan  ialah Chlorella  sorokiniana . Ekstrak  spesies ini  mengandung  fenol  dan flavonoid  yang  mendukung  kemampuannya sebagai antioksidan (Olasehinde et al , 2019; Hamed et al ., 2017; Petruk et al. , 2019). Media  kultur  merupakan  hal  penting dalam memanfaatkan C. sorokiniana . Pemanfaatan limbah pada kultur mikroalga dapat menekan biaya produksi dan menjadi salah satu solusi penanganan limbah.  Jenis  mikroalga  ini  diketahui  mampu tumbuh baik pada limbah (Qiu et al , 2020) seperti limbah domestik (Ramanna et al , 2014) dan limbah peternakan (Chen et al , 2020; Susanty and Oksari, 2020).
Salah  satu  limbah  yang  juga  dapat dimanfaatkan sebagai media kultur Chlorella ialah limbah cair tahu. Di Indonesia, banyak industri tahu dengan limbah cair sekitar sekitar 20 juta m 3 /tahun (Widayat et al. , 2016). Pengolahan limbah cair tahu yang  masih  belum  baik  oleh  sebagian  industri dapat menimbulkan masalah pencemaran pada air sungai (Kesuma et al. , 2013). Agar limbah ini tidak terbuang  dan  mencemari  air  sungai,  maka sebaiknya  dimanfaatkan  untuk  media  kulur mikroalga.  Limbah  tersebut  dapat  digunakan sebagai media kultur mikroalga karena mengandung nutrisi seperti karbon, nitrogen, dan fosforus  (Syaichurrozi et  al .,  2017).  Beberapa mikroalga  diketahui  dapat  tumbuh  pada  limbah cair tahu seperti Chlorella pyrenoidosa (Munir et al. , 2017) dan Chlorella sp. (Aulia et al. , 2017). Potensi C.  sorokiniana untuk hidup  pada limbah cair  tahu belum diketahui. Untuk itu, penelitian ini bertujuan mengevaluasi  pertumbuhan C.  sorokiniana pada berbagai  konsentrasi  limbah  cair  tahu  dan kandungan  metabolit  sekunder  dalam  ekstrak etanolnya.

## Bahan dan Metode
Alat dan Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini ialah kultur mikroalga C. sorokiniana (InaCCM 38), limbah  cair  tahu  (LCT)  yang  berasal  dari  daerah Ciriung,  Kabupaten  Bogor,  alkohol  96%,  larutan NaOH  2N,  asam  tanat,  asam  klorida,  asam  sulfat, asam asetat anhidrida, 2,2-difenil-1-pikril hidrazil (DPPH) (Sigma-Aldrich), etanol 96%, FeCl 3 , reagen Folin-Ciocalteau (Merck),  kloroform,  kuersetin (Himedia),  Na 2 CO 3 ,  reagen  Dragendorff,  reagen Mayer,  reagen  Wagner,  pita  Mg,  AlCl 3 10%,  dan kalium asetat 1M.
Alat yang digunakan ialah lampu TL (3000- 4000  lux),  hemositometer, laminar  air  flow , sentrifus (Hettich Zentifugen EBA 20),
spektrofotometer  ultraviolet-tampak  (UV-Vis) (Optizen ™ POP– Smart), dan peralatan kaca.

## Persiapan Media LCT
Media  LCT  disiapkan  dalam  4  ragam konsentrasi,  yaitu  15,  20,  25,  dan  30%  (v/v)  dan diatur pH 7. Media LCT disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 ° C dan tekanan 1 atm.
Kultivasi pada media LCT (Azhar et al., 2017) C.  sorokiniana dikultivasi  pada  media  LCT steril,  pada  suhu  ruang  dan  pencahayaan  dari lampu dengan intensitas 3000 ⎯ 4000 lux. Densitas sel  dihitung  dengan  hemositometer.  Laju pertumbuhan  spesifik  mikroalga  ( k )  dihitung dengan rumus:
k = 3,22 log( 𝑛1 𝑛0 ) 𝑇1−𝑇0 Keterangan: n 1 : kepadatan sel pada hari ke- n n 0 : kepadatan sel awal (sebelumnya) T 1: hari ke- n T 0 : hari sebelumnya
Ekstraksi Biomassa  sel  dengan  pertumbuhan  terbaik diekstraksi  dengan  etanol  96%  [1:10  (b/v)], menggunakan shaker selama  3  hari.  Ekstrak diuapkan  pada  suhu  50 o C  (tekanan  1  atm) menggunakan penguap putar hingga  tidak ada lagi pelarut yang menetes. Sisa pelarut yang masih ada diuapkan.

## Uji Fitokimia Ekstrak
Kandungan  bioaktif  ekstrak  etanol  diuji secara  kualititatif,  meliputi  alkaloid,  terpenoid, flavonoid, saponin, dan tanin (Harbone, 1987).

## Uji Total Fenolik (Azaman et al., 2017)
Total  fenolik  ditentukan  dengan  metode Folin  Ciocalteau . Sebanyak  50  mg  ekstrak  etanol dilarutkan dengan akuades hingga volume larutan 50 mL. Sebanyak 1 mL larutan tersebut diambil dan ditambah  reagen  10%  sebanyak  2,5  mL,  dan didiamkan  selama  5  menit.  Setelah  itu  2,5  mL Na 2 CO 3 7,5% ditambahkan dan didiamkan kembali selama  45  menit  dalam  ruang  gelap.  Asam  galat sebagi standar juga direaksikan dengan cara yang sama dengan konsentrasi deret 5, 10, 15, 20, dan 25 mg/L. Absorbans diukur pada panjang gelombang 760  nm.  Total  fenol  ekstrak  sampel  dinyatakan dengan rumus :
Total fenol (mg GAE g ) =  c V m Keterangan: c = kadar dari kurva standar (mg/L)
V = volume sampel (L) m = bobot sampel (g)
Uji Total Flavonoid (Azizah et al., 2014 (modifikasi) Ekstrak  etanol  (50  mg)  ditimbang  dan dilarutkan dalam akuades hingga 50 mL. Sebanyak 1 mL larutan ditambahkan  0,2 mL AlCl 3 10%, 0,2 mL kalium asetat 1 M dan 3 mL etanol, kemudian dicukupkan  dengan  akuades  hingga  volume  akhir 10  mL.  Setelah  30  menit,  serapan  larutan  diukur pada  panjang gelombang 425 nm. Flavonoid  total ditentukan dengan menggunakan rumus:
Total flavonoid mgQE/g =  𝑐 𝑉 𝑚

## Hasil  dan Pembahasan
Pertumbuhan  Chlorella  sorokiniana  pada  Media Limbah Cair Tahu (LCT)
C. sorokiniana memperlihatkan kemampuan tumbuh baik dalam media LCT,  pada semua  konsentrasi.  Namun,  pertumbuhan  terbaik ialah pada konsentrasi media LCT 30%. Pada media LCT 30%, mikroalga ini langsung dapat beradaptasi dan  jumlah  selnya  meningkat  hingga  hari  ke-7 dengan kepadatan sel 3,98 ×10 6 sel/mL. Kepadatan sel  tertinggi  pada  media  lainnya  ialah  2,56  ×  10 6 sel/mL (konsentrasi 25% dan hari ke-6), 2,12 ×10 6 sel/mL (konsentrasi 20% dan hari ke-4), 1,81 ×10 6 sel/mL  (konsentrasi  15%  dan  hari  ke-4). Kepadatan sel dari hari pertama hingga hari ke-14 dapat dilihat pada Gambar 1.
Kemampuan  tumbuh C.  sorokiniana pada media  limbah  cair  tahu  dapat  dilihat  dari  laju pertumbuhannya  (Tabel  1).  Pada  hari  pertama, tampak  pertumbuhan  cepat  pada  semua konsentrasi media. Namun, laju pertumbuhan hari kedua  melambat.  Pada  media  LCT  dengan konsentrasi  15  dan  20%,  spesies  Chlorella  ini mampu  tumbuh hingga hari ke-4. Pada LCT 25%, kemampuan tumbuh masih terjadi hingga hari ke-6 dan melambat di hari berikutnya.  Pada media LCT 30%,  mikroalga ini masih  mampu tumbuh hingga hari ke-7.
Gambar  1. Kepadatan  Sel Chlorella sorokiniana pada  Berbagai  Konsentrasi  Media Limbah Cair Tahu
Rata-rata  kepadatan  sel  yang  tinggi  pada media  LCT  30%  disebabkan  jumlah  LCT  yang diberikan  sudah  sesuai  sehingga C.  sorokiniana mampu  memanfaatkan  sumber  nutrien  tersebut dengan  efektif.  Hal  ini  sejalan  dengan  pernyataan Munir et al. (2017), bahwa kadar nutrien yang tepat dapat diserap ke dalam sel yang berperan penting dalam  proses  biosíntesis  dan  digunakan  dalam metabolisme.  Nutrien  dalam  media  memengaruhi kemampuan  mikroalga  untuk  beradaptasi  dan tumbuh.  Jumlah  serta  rasio  nitrogen:fosforus memengaruhi laju pertumbuhan mikroalga (Lee et al., 2013).
Berdasarkan  data  pertumbuhan  tersebut, dapat diketahui juga bahwa limbah cair tahu dapat dijadikan  media  tumbuh C.  sorokiniana. Hal  ini karena LCT mengandung makronutrien seperti N, P,  dan  K  yang  dibutuhkan  oleh  mikroalga.  LCT mengandung  nitrogen  13,8  mg/L,  fosforus  29,6 mg/L, dan kalium 511 mg/L (Gisela, 2021).
Pertumbuhan C.  sorokiniana pada  media LCT terlihat tidak mengalami fase lag, sebagaimana terlihat pada laju pertumbuhan yang tinggi di hari pertama. Ini  menandakan  bahwa  spesies tersebut mampu  beradaptasi  dan  menyerap  nutrisi  dari media.  Laju  pertumbuhan  pada  LCT  30% berfluktuasi  meskipun  kepadatan  sel  meningkat hingga hari ke-7. Hal ini dapat disebabkan oleh sel yang mampu bertahan dan berkembang, meskipun ada juga yang mati (Hanifa et al., 2019).
Tabel  1. Laju  Pertumbuhan Chlorella sorokiniana pada  Berbagai  Variasi  Konsentrasi  Media  Limbah Cair Tahu  (LCT)
0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 0 5 10 15 K e p ad atan se l ( sel /m L) Hari ke- 15 20 25 30

## Fitokimia Ekstrak Etanol
Ekstrak etanol dari kultur pada media LCT 30%  diketahui  mengandung  alkaloid,  flavonoid, steroid, dan fenolik (Tabel 2). Kandungan golongan senyawa  tersebut  menunjukkan  bahwa  ekstrak etanol  berpotensi  untuk  dikembangkan  dalam bidang  kesehatan.  Flavonoid  dilaporkan  memiliki aktivitas hayati sebagai antioksidan (Pradhan et al ., 2021), antimikrob dan antikanker (Jayshree et al. , 2016). Alkaloid banyak ditemukan pada tumbuhan dan  juga  memiliki  aktivitas  sebagai  antikanker, antijamur, dan antibakteri (Gutierrez et al ., 2012). Kandungan  metabolit  sekunder  dipengaruhi  oleh beberapa  faktor,  salah  satunya  ialah  metode pengolahan  (Pyo et  al .,  2014).  Dalam  hal  ini pengolahan  dalam  memperoleh  ekstrak,  yaitu dengan  maserasi  dalam  pelarut  etanol.  Etanol mampu  mengekstraksi  hampir  seluruh  metabolit yang  ada  pada  sel.  Teknik  maserasi  juga memungkinkan terjaganya metabolit sekunder dari kerusakan atau penguapan.
Tabel 2. Uji Fitokimia Ekstrak Chlorella sorokiniana
No  Pengujian Hasil 1 Alkaloid a.Wagner b. Dragendorff c. Mayer ++ 2 Flavonoid
++
3 Steroid/triterpenoid + 4 Fenolik/Tanin + 5 Saponin -
Keterangan: (+)  : sedikit (++): cukup banyak (-)  : Tidak ada

## Total Fenolik Ekstrak Etanol
Ekstrak etanol C. sorokiniana yang dikultur pada media LCT 30% memiliki total fenolik 14,16 mg GAE/g . Kadar ini tidak begitu berbeda dengan temuan Olasehinde et al . (2019) yang menunjukkan hasil total fenolik ekstrak etanol dari spesies yang sama  yang  dikultur  dengan  media  BG-11,  yakni 14,21  mg  GAE/g.  Total  fenolik  diperoleh  lebih tinggi pada ekstrak dengan pelarut yang lebih polar dibandingkan pelarut nonpolar. Ekstrak dari kultur pada  vinase  tebu  (dengan  tambahan  N,  P,  dan  K sebanyak  20,  5,  dan  20  g/L)  mengandung  total fenolik  15,28  mg  GAE/g  (Ansilago et  al .,  2021). Total  fenolik  pada  penelitian  Lai  dan  Sun  (2017) dengan  ekstraksi  menggunakan  etanol  75%  pada tepung C. sorokiniana yang diperoleh dari  Taiwan Chlorella  Manufacturers,  Ltd.,  hanya  3,17  GAE/g. Dengan demikian, kandungan metabolit sekunder pada  suatu  spesies  dipengaruhi  oleh  lingkungan media  tumbuh  dan  prosedur  ekstraksinya.
Ekstraksi  dengan  pelarut  etanol  dan  metanol menunjukkan  hasil  yang  lebih  tinggi  untuk  total fenolik dibandingkan ekstraksi dengan pelarut etil asetat  dan  aseton  (Safafar et  al .,  2015).  Senyawa fenolik  dalam  Chlorella  yang  sama  juga mengandung  asam  kafeat,  asam  ferulat,  asam p - kumarat,    dan  asam  sinamat.  Goiris et  al .  (2014) menambahkan  bahwa  pada  Chlorella,  senyawa fenolik  terbanyak  ialah  floroglusinol  dan  asam p - kumarat.

## Total Flavonoid Ekstrak Etanol
Total  flavonoid  ekstrak  etanol C. sorokiniana yang  dikultur  pada  media  LCT  30% ialah  40,59  mg  QE/g . Dari  spesies  yang  sama, Olasehinde et al . (2019) melaporkan total flavonoid ekstrak  etanol  11,54  mg  QE/g,  lebih  rendah daripada ekstrak diklorometana (18,36 mg QE/g). Kandungan  flavonoid  pada  ekstrak  dari  media vinase tebu (dengan tambahan N, P, dan K sebanyak 20,  5,  dan  20  g/L)  mengandung  total  flavonoid 72,30  mg  QE/g  (Ansilago et  al .,  2021).  Asam p - kumarat merupakan salah satu prekursor penting pada  biosintesis  flavonoid  (Goiris et  al .,  2014). Asam  organik  tersebut  diketahui  merupakan komponen  mayor  pada  Chlorella  membentuk naringenin  kalkon  yang  kemudian  dapat membentuk  naringenin  (Gambar  2).  Naringenin menjadi awal terbentuknya apigenin. Apigenin juga merupakan  komponen  mayor  pada  Chlorella. Senyawa  lainnya  yang  dapat  disintesis  ialah daidzein,  luteolin,  genistein, dan  kuersetin (Goiris et al ., 2014).
Gambar  2. Jalur  metabolism  beberapa  flavonoid pada Chlorella  vulgaris .  Abu  tu:  komponen  mayor dan  abu  muda:  komponen  minor.  PCA:  asam  p- kumarat,NC: naringenin kalkon, PHL: Phloretin, LG: likuiritigenin, D: Daidzein, A: Apigenin, G; Genistein, L: Luteolin: DK: Dihidrokamferol, DQ:
Dihidrokuisetin, K: Kamferol, Q: Kuersetin (Goiris et al., 2014).
Kesimpulan C.  sorokiniana dapat  tumbuh  pada  media limbah cair tahu dengan pertumbuhan terbaik pada konsentrasi  media  30%.  Hasil  uji  fitokimia menunjukkan  adanya  golongan  senyawa  alkaloid, flavonoid, tanin dan terpenoid. Ekstrak mengandung sekitar 14 mg GAE/g total fenolik dan sekitar  40  mg  QE/g  total  flavonoid,  Hal  ini menunjukkan bahwa ekstrak mengandung senyawa  fenolik  dan  flavonoid  yang  dapat berpotensi sebagai antimikroba dan antioksidan.

## Ucapan Terimakasih
Penulis mengucapkan terimakasih kepada kemenristek dikti yang telah mendanai penelitian ini dengan skema penelitian dosen pemula

## Daftar Putaka
Aulia,  M.,  Istirokhatun,  T.,  Sudarno.  (2017). Penyisihan Kadar COD dan Nitrat melalui Kultivasi  Chlorella  sp  dengan  Variasi Konsentrasi  Limbah  Cair  Tahu. J  Tek Lingkung , 6(2),1-9.
Ansilago, M., Ramos, M. M., Mussury, R.M., Carvalho, E.M. (2021). Enhancing secondary metabolite  production  by  Chlorella sorokiniana  using  an  alternative  medium with  vinasse. Research,  Society  and Development, 10  (5),e49710515237.  DOI: 10.33448/rsd-v10i5.15237.
Azaman,  A.,  Nagao,  S.  N.,  Yusoff,  N.,  Tan,  F.  M.,  & Yeap,  S.  K.  (2017).  A  comparison  of  the morphological and biochemical characteristics  of  chlorella  sorokiniana and  chlorella  zofingiensis  cultured  under photoautotrophic and mixotrophic conditions. PeerJ , (5), 1-22. https://doi.org/10.7717/peerj.3473
Azizah,  D.  N.,  Kumolowati,  E.,  &  Faramayuda,  F. (2014).      Penetapan      kadar      flavonoid metode AlCl 3 pada  ekstrak  metanol  kulit buah  kakao (Theobroma  cacao L.). Jurnal Ilmiah Farmasi .2(2):33-37
Chen,  C.Y.,  Kuo,  E.W.,  Nagarajan,  D., et  al .  (2020). Cultivating  Chlorella  sorokiniana  AK-1 with  swine  wastewater  for  simultaneous wastewater  treatment  and  algal  biomass production. Bioresour  Technol ,  302,  1-10. doi:10.1016/j.biortech.2020.122814 Gisela,  D.  (2021). Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak Etanol  Chlorella  Sp.  Terhadap  Bakteri Staphylococcus Aureus Dan Escherichia coli. (Skripsi). Universitas Nusa Bangsa. Bogor.
Gutierrez,  R.M.P.,  Gonzalez,  A.M.N.,  Ramirez,  A.M.
(2012). Compounds Derived from Endophytes:  A  Review  of  Phytochemistry and  Pharmacology. Current  Medicinal Chemistry , 19 (18), 2992 – 3030.
Goiris,  K.,  Muylaert,  K.,  Voorspoels,  S.,  Noten,  B.,
Paepe,  D.D., et  al .  (2014)  Detection  of flavonoids  in  microalgae  from  different evolutionary lineages. J Phycol 50(3), 485- 492.
Hamed,  S.M.,  Selim,  S.,  Klöck,  G.,  AbdElgawad,  H. (2012).  Sensitivity of  two  green microalgae  to  copper  stress:  Growth, oxidative  and  antioxidants  analyses. Ecotoxicol Environ Saf . doi:10.1016/j.ecoenv.2017.05.048 Hanifa, F., Nasution,S.,  Siregar, S.H. (2019). Effect of
Salinity  Difference  and  Fertilizer  Dose Walne  against  Chlorella  sp  Population Growth in Laboratory Scale. JOM. 6, 1-13. Harbone,  J.B.  (1996).  Metode  Fitokmia  Penuntun Cara  Modern  Menganalisis  Tumbuhan.
Bandung: Penerbit ITB
Jayshree,  A.,  Jayashree,  S.,  and  Thangaraju,  N.
(2016). Chlorella vulgaris and Chlamydomonas  reinhardtii:  Effective
Antioxidant,  Antibacterial  and  Anticancer Mediators. Indian J Pharm Sci , 78 (5), 575- 581.
Kesuma  DD,  Widyastuti  M.  (2013).  Pengaruh Limbah  Industri  Tahu  Terhadap  Kualitas Air  Sungai  Di  Kabupaten  Klaten. Bumi Indones , 2 (1), 115-124.
Lai,  P.F.H,    and  Sun,  T.C.  (2017).  Optimizing extraction process and characterization of antioxidant  ingredients  from  chlorella sorokiniana. MOJ  Food  Process  Technol . 5(1), 202-210. DOI: 10.15406/mojfpt.2017.05.00114 Lee, S.H, et al . (2013). Increased Microalgae Growth and Nutrient Removal Using Balanced N:P Ratio in
Wastewater. Journal
of
Microbiology and Biotechnology , 23 (1), 92- 98. https://doi.org/10.4014/jmb.1210.10033 Li,  Y.,  Chen,  Y.F.,  Chen,  P., et  al .  (2011). Characterization  of  a  microalga  Chlorella sp.  well  adapted  to  highly  concentrated municipal  wastewater  for  nutrient removal and biodiesel production. Bioresour  Technol .  102,  5138-5144. doi:10.1016/j.biortech.2011.01.091 Makareviciene, P.D.V, Andrulevičiūtė, V., Skorupskaitė, V., Kasperovičienė, J. (2011 ). Cultivation of Microalgae Chlorella sp. and Scenedesmus  sp.  as  a  Potentional  Biofuel Feedstock. Environ Res Eng Manag , 3(57), 21-27. doi:10.5755/j01.erem.57.3.476 Munir,  F.,    Hariyati,  R  dan  Wiryani,  E.  (2017).
Pengaruh  Limbah  Cair  Tahu  Terhadap Pertumbuhan Chick Dalam Skala Laboratorium. Jurnal Biologi , 6(2), 84-92.
Olasehinde,  T.A.,  Odjadjare,  E.C.,  Mabinya,  L.V.,
Olaniran, A.O., Okoh, A.I. (2019). Chlorella
DOI: https://doi.org/10.24114/jbio.v7i3.29015
sorokiniana  and  Chlorella  minutissima exhibit  antioxidant  potentials,  inhibit cholinesterases and modulate disaggregation  of  β -amyloid  fibrils. Electron J Biotechnol . doi:10.1016/j.ejbt.2019.03.008
Pradhan,  B.,  Patra,  S.,  Dash,  S.R. et  al. (2021). Evaluation of the anti-bacterial activity of methanolic extract of Chlorella vulgaris Beyerinck [Beijerinck] with special reference to antioxidant modulation. Futur J Pharm Sci 7 ( 17), 1-11. https://doi.org/10.1186/s43094-020- 00172-
Petruk,  G.,  Gifuni,  I.,  Illiano,  A., et  al .  (2018). Simultaneous  production  of  antioxidants and  starch  from  the  microalga  Chlorella sorokiniana. Algal  Res ,  34,  164-174. doi:10.1016/j.algal.2018.07.012 Pyo,  Y.H.,  Jin,    Y.J.,  and  Hwang,  J.Y.  (2014).
Comparison of the Effects of Blending and Juicing  on  the  Phytochemicals  Contents and  Antioxidant  Capacity  of  Typical Korean Kernel Fruit Juices. rev. Nutr. Food Sci . 19(2),108-114.
Qiu, S., Shen, Y., Zhang, L., Ma, B., Amadu, A.A., Ge, S. (2020). Antioxidant assessment of
wastewater-cultivated Chlorella sorokiniana  in  Drosophila  melanogaster. Algal Res ., 46, 101795. doi:10.1016/j.algal.2020.101795
Ramanna,  L.,  Guldhe,  A.,  Rawat,  I.,  Bux,  F.  (2014). The  optimization  of  biomass  and  lipid yields of Chlorella sorokiniana when using wastewater  supplemented  with  different nitrogen  sources. Bioresour  Technol ,  168,
127-135.
Safafar,  H.,  Wagenen,  J.V.,  Møller,  P.,  Jacobsen,  C.
(2015). Carotenoids, Phenolic Compounds and  Tocopherols  Contribute  to  the Antioxidative Properties of Some Microalgae  Species  Grown  on  Industrial Wastewater.  Mar.  Drugs,  13,  7339 – 7356. doi:10.3390/md13127069 Susanty,  D.,  and  Oksari,  A.A.  (2020).  Growth  and secondary metabolites content of chloroform  extract  of  Chlorella  sp.  and Chlorella sorokiniana cultured on chicken broiler waste media. Nusant Biosci ., 12 (1), 28-32. doi:10.13057/nusbiosci/n120105
Syaichurrozi  I,  Jayanudin  J.  Kultivasi  Spirulina Platensis  Pada  Media  Bernutrisi  Limbah Cair  Tahu  Dan  Sintetik. J  Bahan  Alam Terbarukan . 2017;5(2):68-73.
doi:10.15294/jbat.v5i2.7398
.