## UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL DAUN BAWANG MEKAH (Eleutherine americana Merr.) TERHADAP GAMBARAN HISTOPATOLOGI PARU TIKUS (Rattus norvegicus) WISTAR JANTAN PASCA PAPARAN ASAP ROKOK
Hafidzah Ramadhaniyah Al Idrus 1,*) , Iswahyudi 2 , Sri Wahdaningsih 3 1. Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura
2. Bagian Kimia Farmasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura
3. Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura

## ABSTRACT
Exposure to cigarette smoke is one of the exogenous free radicals. Exposure to cigarette smoke is associated with lung  inflammation,  oxidative  stress  and  lipid  peroxidation.  Compounds  that  can  inhibit  the oxidation  reaction  by binding  free  radicals  known  as  antioxidants.  Eleutherine  americana  Merr.  leaves  has  an  antioxidant  activity  in invitro study. The aim of this work was to study E.americana leaves as a natural antioxidant that reduce the level of lung damage from exposure to cigarette smoke in male wistar rats and study effective dose of E.americana leaves to reduce  the  level  of  lung  damage.    The  leaves  of  E.americana  extracted  by  maceration  method  for  6  days  using ethanol 70%. Rats were divided into six groups of four animals each : exposed to ambient air (GroupA), exposed to cigarette  smoke  (Group  B),  exposed  to  cigarette  smoke  and  treated  with  ethanol  extract  of  E.americana  leaves  at dose 45mg/kg bw, 90mg/kg bw, 180mg/kg bw (Group C,D,E), exposed to cigarette smoke and treated with vitamin E dose  18mg/kg bb(Group  F).  All  rats  were  treated  for  14  days  using  3  cigarettes  non  filtered  each  day by  using  a smoking chamber. After 14 days rats were killed. Right lungs were removed for histopathology. The results showed that dose 45mg/kg bw, 90mg/kg bw, 180mg/kg bw can reduce the level of lung damage to the enlarge of alveolar, thickening of the alveolar wall and inflammatory cell infiltration. Dose 180mg/kg bw as an effective dose to reduce the level of lung damage that compare to normal control.

## Keywords : Antioxidant, Eleutherine americana, Lung histopathology, Cigarette smoke

## I. PENDAHULUAN

## Latar Belakang
Penggunaan rokok didunia semakin meningkat jumlahnya. Sebanyak 32.9 % penggunaan rokok pada pria  dan  18.4  %  penggunaan  rokok  pada  wanita. Sekitar  60  %  pria  dan  4,5  %  wanita  di  Indonesia adalah  perokok.  Tingginya  jumlah  perokok  aktif berbanding  lurus  dengan  jumlah  perokok  pasif  yang terpapar asap rokok orang lain (second hand smoke) 1 . Rokok  mengandung  lebih  dari  4.000  zat berbahaya.  Radikal  bebas  yang  dihasilkan  dari  asap rokok  mengakibatkan  terjadinya  penebalan  pada dinding  alveolus,  pelebaran  lumen  alveolus  dan peradangan  pada  alveoulus  yang  ditandai  dengan meningkatnya jumlah leukosit dan alveolar makrofag 2,3 .
Senyawa  yang  dapat  menghambat  reaksi oksidasi  dengan  cara  mengikat  radikal  dan  molekul yang  sangat  reaktif,  sehingga  dapat  menghambat kerusakan  sel  disebut  sebagai  antioksidan.  Beberapa penelitian  antioksidan  yang  pernah  dilakukan menunjukkan  bahwa  beberapa  tanaman  seperti teh dan  wortel memiliki  aktivitas  antioksidan  dengan mengurangi  kerusakan  paru-paru  tikus  yang  terpapar asap rokok 2-4 .
Salah satu jenis tanaman yang memilki potensi sebagai  antioksidan  yaitu  tanaman  bawang  mekah (Eleutherine  americana)  yang  dapat  dikenal  dengan nama  bawang  dayak,  termasuk  dalam  famili Iridaceae dan  berasal  dari  Amerika  Tropis.  Bawang mekah  memiliki  kandungan  berupa  polifenol, alkaloid, saponin, fenolik, dan flavonoid. Masyarakat di  berbagai  daerah  di  Kalimantan  Barat  umumnya menggunakan  bagian  umbi  bawang  mekah  dalam pengobatan  tumor  secara  tradisional.  Umbi  bawang mekah  digunakan  dengan  cara  dibuat  dalam  bentuk rebusan  dan  diminum,  sedangkan  bagian  daunnya jarang dimanfaatkan 5-6,10 .
Beberapa  penelitian  yang  pernah  dilakukan terhadap  tanaman  bawang  mekah  memberikan  hasil bahwa  bulbus  bawang  mekah  mempunyai  aktivitas sebagai  antibakteri  dan  sebagai  antioksidan  dengan IC 50 sebesar  25,3339  µg/mL.  Penelitian  aktivitas antioksidan  ekstrak  etanol  70%  daun  bawang  mekah menggunakan metode DPPH memiliki efek peredaman  radikal  bebas  dengan  nilai  IC 50 sebesar 31,97437 µg/mL 7-10 .
Penelitian  diatas  menjadi  dasar  dilakukannya pengujian  aktivitas  antioksidan  dari  ekstrak  etanol daun bawang mekah secara in vivo pada tikus jantan
yang  terpapar  asap  rokok.  Pengujian  ini  dilakukan dengan  mengukur  derajat  kerusakan  histopatologis paru-paru  tikus  wistar  jantan  yang  terpapar  asap rokok    setelah  pemberian  ekstrak  etanol  70  %  daun bawang  mekah.  Pengamatan  histopatologi  paru  yang dilakukan meliputi pengamatan lebar lumen alveolus, pelebaran  dinding  alveolus  dan  infiltrasi  sel  radang. Hasil  dari  pengamatan  ini  akan  dilakukan  penilaian dengan  diberi  skor  berdasarkan  tingkat  kerusakan masing-masing parameter.

## II. METODOLOGI
A. Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan analitik  (Precisa), blender  simplisia (IlinQi FZ-10), waterbath (Memmert WNB 22), oven (Memmert  UP400),  desikator,  peralatan  bedah, smoking  chamber berukuran  38,5  x  28,5  x  22,5  cm, mikroskop (Zeiss Primo Star®).

## B. Bahan
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah  daun  bawang  mekah,  etanol  70%,  etanol  p.a, serbuk  magnesium  (Merck®),  larutan  HCl  2  N, larutan  HCL  pekat,  larutan  FeCl3  1%,  pereaksi Dragendorff,    pereaksi  Meyer,  perekasi  Wagner, larutan H2SO4 2N, larutan H2SO4 pekat, asam asetat glasial, vitamin E, Carboxy Methyl Cellulose (CMC), aquades, aluminium foil, kertas saring.

## C. Hewan Uji
Hewan  uji  yang  digunakan  dalam  penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) galur wistar jantan. Sampel diperoleh secara acak yang memenuhi kriteria inklusi yaitu tikus putih wistar jantan, umur 2 – 3 bulan, berat badan 100- 200 gram, dan tidak cacat secara  anatomi.  Sedangkan  kriteria  eksklusinya adalah  pada  masa  adaptasi  tikus  yang  tampak  sakit secara fisiologis  dan  terdapat  penurunan  berat  badan yang drastis.

## D. Tahap Penelitian

## 1. Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Daun bawang mekah dipanen dari kebun di di Jalan  Arteri  Supadio,  Desa  Limbung,  Kecamatan Sungai  Raya,  Kabupaten  Kubu  Raya,  Kalimantan Barat.  Daun  yang  diambil  berumur  3-4  bulan.  Daun bawang  mekah  yang  telah  dikumpulkan,  dicuci  dan dirajang halus. Kemudian daun dikeringkan dibawah sinar matahari secara tidak langsung, daun yang telah kering  disimpan  dalam  wadah  kering  dan  tertutup rapat.

## 2. Pembuatan Ekstrak
Metode  ekstraksi  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  ekstraksi  maserasi.  Simplisia daun  bawang  mekah  sebanyak  200g  direndam dengan pelarut etanol 70% dalam bejana selama 6x24 jam,  setiap  1x24  jam  pelarut  diganti  dan  dilakukan pengadukan  sesering  mungkin.  Kemudian filtrat disaring dan dipekatkan dengan rotary evaporator dan waterbath hingga diperoleh ekstrak kental.

## 3. Penetapan Susut Pengeringan
Penetapan susut pengeringan adalah pengukuran  sisa  zat  setelah  pengeringan  pada temperatur 105ºC selama 30 menit atau sampai berat konstan  yaitu  tidak  terjadi  lagi  perubahan  bobot (tidak  lebih  dari  5%).  Ekstrak  ditimbang  sebanyak 2,9072 gram ;  2,04  gram  ;  2,1514  gram,  masing- masing dimasukkan  ke dalam botol timbang dangkal bertutup  yang  sebelumnya  telah  dipanaskan  pada suhu  105ºC  selama  30  menit  dan  telah  ditara. Sebelum  ditimbang  ekstrak  diratakan  dalam  botol timbang,  dengan  menggoyangkan  botol.  Kemudian dimasukkan kedalam ruang pengering, buka tutupnya.  Keringkan  pada  suhu  105ºC  hingga  bobot tetap.  Sebelum  setiap  pengeringan,biarkan  botol dalam  keadaan  tertutup  mendingin  dalam  desikator hingga suhu kamar 11 .

## 4. Skrining Fitokimia Pemeriksaan Alkaloid
Ekstrak  ditambahkan  dengan  0,5-1  mL  asam sulfat 2 N dan dikocok sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan  asam  (atas)  dipipet  dan  ditambahkan kloroform  dan  amonia.    Kemudian  dimasukkan  ke dalam  tiga  buah  tabung  reaksi.  Tabung  reaksi pertama  ditambahkan  dua  tetes  pereaksi  Mayer. Tabung reaksi  kedua ditambahkan dua tetes pereaksi Dragendorff.  Tabung  reaksi  ketiga ditambahkan  dua tetes  pereaksi  Wagner.  Adanya  senyawa  alkaloid ditandai  dengan  terbentuknya  endapan  putih  pada tabung  reaksi  pertama  dan  timbulnya  endapan berwarna coklat kemerahan pada tabung reaksi kedua dan ketiga 12 .

## Pemeriksaan Flavonoid
Larutan  ekstrak  sebanyak  2  ml  ditambah dengan  0,5  mL  asam  klorida  pekat  (HCl  pekat)  dan beberapa  miligram  serbuk  logam  Mg.  Adanya flavonoid  ditandai  dengan  warna  merah,  orange  dan hijau  tergantung  pada  struktur  flavonoid  yang terkandung dalam sampel 12 . Pemeriksaan Saponin Ekstrak sebanyak 50 mg dimasukkan ke dalam tabung  reaksi,  lalu  ditambahkan  dengan  air  20  mL
dan  dikocok  dengan  kuat  selama  15  menit.  Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya busa dengan tinggi 2 cm 12 .

## Pemeriksaan Triterpenoid dan Steroid
Larutan  ekstrak  sebanyak  1  ml  ditambahkan dengan  3  tetes  CH 3 COOH  asetat  dan  1  tetes  larutan H 2 SO 4 pekat.  Warna  berubah  menjadi  merah, menunjukkan adanya kelompok senyawa triterpenoid. Warna biru menunjukkan adanya steroid 12 .

## Pemeriksaan Fenol
Larutan ekstrak  diteteskan  di  atas  pelat  tetes dan  ditambah  larutan  FeCl 3 1%.  Hasil  positif  yaitu timbul warna biru kehitaman 12 .

## Pemeriksaan Tanin
Ekstrak  ditambahkan  dengan  Gelatin  1%  dan NaCl  10%.  Hasil  positif  yaitu  timbul  endapan  putih 12 .

## 5. Pengujian Aktivitas Antiokisdan Perlakuan Hewan
Seluruh  tikus  Wistar  diadaptasikan  selama tujuh  hari.  Hari  kedelapan  tikus  diberi  paparan  asap rokok  setiap  harinya  selama  14  hari.  Proses pemaparan  dilakukan  dalam smoking  chamber.  Satu jam  setelah  pemaparan  asap  rokok,  tikus  diberi ekstrak  etanol  sesuai  variasi  dosis. Seluruh  hewan percobaan  diadaptasikan  selama  tujuh  hari.  Tikus yang  diadaptasi  akan  diberikan  makan  dan  minum secukupnya.  Kemudian  hewan  percobaan  dipilih secara  acak  dibagi  menjadi  enam  kelompok. Kelompok  A  merupakan  kelompok  normal  tanpa paparan asap rokok dan hanya  diberi suspensi CMC 1%  Kelompok  B  adalah  kelompok  kontrol  negatif yang  hanya  diberikan  paparan  asap  rokok  dan suspensi CMC 1%. Kelompok C, D dan E adalah  kelompok  perlakuan  yang  diberikan paparan asap  rokok  dan  ektrak  etanol  daun bawang  mekah dengan dosis 45, 90 dan 180 mg/kg BB. Kelompok F adalah  kelompok  kontrol  postif  yang    diberikan paparan asap rokok dan vitamin E dosis 18mg/kg BB.

## Pengamatan Histopalogi Paru
Preparat  diamati  dibawah mikroskop  dalam  5 lapangan  pandang,  yaitu  pada  keempat  sudut  dan bagian  tengah  preparat,  dengan  perbesaran  100x  dan 400x.  Sasaran  yang  dibaca  adalah  persentase pelebaran  lumen  alveolus,  penebalan  dinding alveolus, infiltrasi  sel radang  dengan kriteria sebagai berikut 3,13 : a. Skoring pelebaran lumen dan penebalan dinding
SKOR 0 : tidak ada perubahan histologis SKOR  1  :  terjadi  kerusakan  pada  kurang  dari sepertiga lapang pandang SKOR2 : terjadi kerusakan pada sepertiga hingga duapertiga lapang pandang SKOR 3  :  terjadi  kerusakan  pada  lebih  dari duapertiga lapang pandang
b. Skoring infiltrasi sel radang SKOR 0 : tidak ada perubahan histologis SKOR  1  :  infiltrasi  sel  radang    pada  kurang  dari sepertiga lapang pandang
SKOR  2  :  infiltrasi  sel  radang  kerusakan pada sepertiga hingga duapertiga lapang pandang SKOR  3  :  infiltrasi  sel  radang  pada  lebih  dari duapertiga lapang pandang
Nilai  skor  dari  ketiga  paramter  kemudian  dirata- ratakan,  hasil  rata-rata  tersebut  dikali  100%  untuk mendapatkan  nilai  persen  derajat  kerusakannya. Kemudian  hasil  presentase  derajat  kerusakan  paru yang  telah  didapat  diklasifikasikan  berdasarkan tingkat kerusakan paru yang terdiri dari 14 :
Tabel 1. Penentuan Tingkat Kerusakan Paru No Presentase Derajat Kerusakan Tingkat Kerusakan 1. 0% Tidak terjadi kerusakan 2. <30% Kerusakan Ringan 3. 30-60% Kerusakan Sedang 4. >60% Kerusakan Berat

## 6. Analisis Data
Data  kuantitatif  yang  diperoleh  dianalisis dengan  program  analisis  statistik.  Data  kerusakan paru  diolah  dengan  uji Shapiro  Wilk untuk  uji normalitas data. Uji homogenitas dilakukan menggunakan  uji Levene Test. Data  yang  didapat tidak  terdistribusi  dan  tidak  homogen,  maka selanjutnya data dianalisis menggunakan uji nonparametrik yaitu uji Kruskal-Wallis untuk melihat ada  atau  tidaknya  perbedaan  pada  kelompok percobaan.  Jika  terdapat  perbedaan,  maka  minimum harus  terdapat  satu  kelompok  yang  berbeda  dari kelompok  lain.  Kemudian  dilanjutkan  dengan melakukan  analisis post  hoc untuk  mengetahui pasangan kelompok mana yang mempunyai perbedaan  signifikan  dari  semua  kelompok  dengan menggunakan uji Mann Whitney.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Pengambilan dan Pengolahan Sampel Sampel  tanaman  yang  berupa  daun  diambil dari  kebun  bawang  mekah  yang  berada  di  Jalan Arteri  Supadio,  Desa  Limbung,  Kecamatan Sungai Raya,  Kabupaten  Kubu  Raya,  Kalimantan  Barat. Pengambilan sampel dilakukan pada bulan November 2013.  Daun yang diambil berumur 3-4 bulan, hal ini dikarenakan  pada  umur  3-4  bulan,  daun  bawang mekah telah memiliki kandungan senyawa aktif yang optimal. Bagian  yang  diambil  adalah  bagian  daun yang  bebas  hama  dan  kerusakan.  Daun  bawang mekah  yang  telah  dikumpulkan,  dicuci  dan  dirajang halus.  Kemudian  daun  dikeringkan  dibawah  sinar matahari  secara  tidak  langsung,  daun  yang  telah kering  disimpan  dalam  wadah kering  dan  tertutup rapat.

## 2. Ektraksi
Maserasi  dilakukan  dengan  merendam  200 gram  simplisia  daun  bawang  mekah  dalam  etanol 70%  sebanyak  1  liter.  Maserasi  dilakukan  selama  6 hari  sehingga  total  pelarut  yang  digunakan  adalah  6 liter.  Setelah  dilakukan  proses maserasi,  maserat yang  diperoleh  dievaporasi  menggunakan  evaporator pada  suhu  60 o C  dengan  kecepatan  100  rpm.  Hasil ekstrak  yang telah  dievaporasi  kemudian  dipekatkan menggunakan waterbath dengan  suhu  60 o C.  Hasil ekstrak yang diperoleh adalah 35,7 gram dengan nilai rendemen 17,85 %.
3. Penetapan Susut Pengeringan Hasil pemeriksaan penetapan susut pengeringan  untuk  ekstrak  etanol  daun  bawang mekah yang diperoleh yaitu 19,55%. Ekstrak dengan persentase 19,55 % termasuk  dalam  rentang  ekstrak kental yaitu 5-30% 11,15 .
4. Skrining Fitokimia
Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia
Keterangan:  (+)  positif  :  terdeteksi;  (-)  negatif:  tidak terdeteksi.
Hasil yang  diperoleh  pada  tabel  2,  dapat  dilihat bahwa  pada  ekstrak  etanol  70%  dari  daun  bawang mekah mengandung senyawa yang  tergolong alkaloid,  flavonoid,  saponin,  fenolik,  steroid  dan triterpenoid.

## 5. Pengujian Aktivitas Antioksidan Perlakuan Hewan Uji
Pengujian aktivitas antioksidan yang dilakukan secara in  vivo menggunakan  hewan  uji  tikus  putih jantan  galur  wistar.  Penggunaan  tikus  putih  sebagai hewan  uji  dikarenakan  tikus  putih  telah  dikenal sebagai  model  hewan  percobaan  yang  baik,  mudah ditangani,  dapat  diperoleh  dalam  jumlah  besar,  dan memberi  hasil  nilai  ulangan  yang  dapat  dipercaya. Pemilihan  galur  wistar  dikarenakan  tikus  wistar mempunyai  kemampuan  metabolisme  yang  relatif cepat  sehingga  lebih  sensitif  bila  digunakan  dalam penelitian  yang  berhubungan  dengan  metabolisme tubuh. Pemilihan tikus putih jantan dikarenakan tikus jantan  tidak  memiliki  fase  estrus  sehingga  kondisi biologis tubuh lebih stabil dibanding tikus betina 16-18 . Hewan  uji  yang  digunakan  diadaptasikan selama  7  hari  sebelum  diberi  perlakuan.  Adaptasi dengan  lingkungan  laboratorium  bertujuan  agar hewan uji terbiasa dan tidak mengalami stress akibat lingkungan  yang  baru.  Adaptasi  dilakukan  dengan memberikan  makan  dan  minum  kepada  hewan  uji. Perlakuan  ini  bertujuan  untuk  meningkatkan  berat badan  tikus  hingga  sesuai  dengan  berat  badan  yang diinginkan  pada  pengujian.  Berat  badan  yang digunakan  pada  saat  pengujian  ialah  berkisar  antara 100-200 gram. Selain itu hewan uji juga diperhatikan kesehatannya.  Hewan  uji  yang  digunakan  ialah hewan  uji  yang  sehat  dan  tidak  adanya  kecacatan fisik  seperti  buta,  berjalan  tidak  sejajar  atau mengalami  luka-luka.  Hal  ini  bertujuan  untuk menyeragamkan  kondisi  dari  hewan  uji  sehingga akan  meminimalisir  kesalahan  yang  berasal  dari hewan  uji dan  untuk  memastikan hewan  uji  dalam kondisi sehat.
Setelah  diadaptasi,  hewan  uji  diberi  perlakuan dengan  dikondisikan  seperti  perokok  pasif  yang terpapar  asap  rokok.  Jumlah  rokok  yang  digunakan adalah  tiga  batang  pada  setiap  kali  pemaparan. Jumlah  rokok  pada  tiap  kali  pemaparan  didasarkan pada nilai LD50 nikotin pada tikus yaitu 50mg/kg bb 19 .  Pemaparan  asap  rokok  dilakukan  saat  pagi  hari pada  jam  yang  sama  selama  14  hari  pengamatan. Pemaparan  dilakukan  pada  pagi  hari  dikarenakan tikus  akan menjadi semakin  agresif  pada  siang  hari. Tikus yang agresif pada siang hari dikarenakan tikus termasuk  hewan  nokturnal  yaitu  hewan  yang  aktif pada  malam  hari  dan  akan  tidur  pada  siang  hari.
No Perlakuan Hasil 1 Alkaloid + 2 Flavonoid + 3 Saponin + 4 Triterpenoid dan Steroid + 5 Tanin - 6 Fenolik +
Rokok  dipaparkan  secara  akut  selama  14  hari manggunakan smoking chamber. Paparan akut dipilih berdasarkan  penelitian  yan  dilakukan  oleh  Khabour et  al (2014)  dan  Van der  Vaart et  al (2004) menunjukkan  asap  rokok  yang  dipaparkan  secara akut  akan  memberikan  hasil  yang  sensitif  untuk menyelidiki  efek  spesifik  dari  asap  rokok  pada  stres oksidatif  dan  inflamasi,  serta  paparan  akut  sudah dapat  menyebabkan  terjadinya  kerusakan  elastisitas pada  jaringan  paru. Smoking  chamber dilengkapi dengan ventilasi dan dua buah pompa udara 20,21 .
Asap rokok yang dihirup akan masuk kedalam tubuh  melalui  saluran  pernapasan.  Paru  berperan sebagai alat pernapasan utama pada sistem pernapasan. Sehingga ketika radikal bebas asap rokok masuk  kedalam  tubuh,  maka  organ  yang  terkena dampak  secera  langsung  adalah  paru.  Dampak kerusakan  paru  akibat  asap  rokok  dapat  diamati dengan  parameter  berupa  adanya  pelebaran  pada lumen alveolus, penebalan pada dinding alveolus dan infiltrasi sel radang. Mekanisme terjadinya kerusakan paru  akibat  asap  rokok  adalah  tubuh  akan  merespon asap  rokok  sebagai  antigen  yang  akan  memicu keluarnya  mediator  inflamasi.  Ketika  jumlah  radikal bebas  yang  masuk  berlebihan  dan  tubuh  tidak  dapat mencegahnya maka akan terjadi kerusakan pada paru melalui  mekanisme  stres  oksidatif.  Stres  oksidatif yang  terjadi  secera  terus  menerus  mengakibatkan terjadinya  penumpukan  hasil  kerusakan.  Selanjutnya stres  oksidatif  menyebabkan  peroksidasi  lipid  yang akan  menimbulkan  kerusakan  sel  dan  inflamasi. Proses  inflamasi  akan    mengaktifkan  sel  alveolar makrofag  sebagai  pertahanan  pertama,  aktivasi  sel tersebut  akan menyebabkan  dilepaskannya  faktor kemotatik  neutrofil,  seperti  interleukin  8  dan leukotrien B4 yang merangsang neutrofil melepaskan protease  yang  dapat  merusak  jaringan  ikat  parenkim paru  dengan  menyebabkan  terjadinya  elastisitas berlebihan  pada  paru  sehingga  timbul  kerusakan dinding  alveolar  dan  hipersekresi  mukus.  Selain  itu radikal bebas akan menyebabkan terjadinya inaktivasi  α1 -anti  trypsin  yang  berperan  sebagai  anti protease  Ketidakseimbangan  antara  protease  dengan antiprotese  yang  terdapat  pada  jaringan  alveolar menyebabkan  degradasi  jaringan  paru 3,13,22-24 . Pengamatan  yang  dilakukan  pada  hewan  uji menujukkan  adanya  perubahan  pada  hewan  uji sebelum  dan  sesudah  diberi  paparan  asap  rokok. Perubahan yang terjadi menunjukkan terjadinya stres pada  hewan  uji.  Perubahan  yang  terjadi  meliputi dehidrasi  yang  ditandai  dengan  hewan  uji  yang berkeringat,  keaktifan  hewan  uji  yang  menurun, detak  jantung  yang  lebih  cepat,  bunyi  seperti  mengi
pada  saat  bernapas  dan  meningkatnya  suhu  tubuh hewan.
Hewan  uji  diberi  perlakuan  selama  14  hari, kemudian  dilakukan  pengorbanan  atau  terminasi hewan  uji  pada  masing – masing  perlakuan. Terminasi  dilakukan  dengan  dislokasi  servikalis tanpa  dibius  menggunakan  kloroform,  hal  ini disebabkan kloroform dikhawatirkan dapat mempengaruhi  hasil  histopatologi  pada  paru  tikus. Setelah  dilakukan  dislokasi  tulang  leher,  hewan dibedah  dan  paru  sebelah  kanan.  Digunakan  paru sebelah  kanan  dikarenakan  pada  penelitian  yang menggunakan  inhalasi  pada  tikus,  paru  kanan  akan menunjukkan  hasil  yang  lebih baik,  serta  pada  paru kanan  memiliki  jumlah  lobus  yang  lebih  banyak sehingga  akan  mempermudah  dalam  pengamatan paru 25 . Kemudian    hewan  paru  diproses  menjadi preparat histopatologi. Pembuatan preparat histopatologi  paru  dilakukan  Laboratorium  Patologi Anatomi RSUD Dr. Soedarso.

## Pengamatan Histopatologi Paru
Pengamatan  terhadap  gambaran  histopatologi paru digunakan untuk mengetahui pengaruh pemberian  ekstrak  etanol  daun  bawang  mekah terhadap  penurunan  kerusakan  paru  akibat  paparan asap  rokok.  Adapun  penyiapan  preparat  dan pembacaan hasil histopatologi paru dibantu oleh ahli patologi dan anatomi. Parameter kerusakan paru yang dihitung skornya mencakup pelebaran lumen alveolus, penebalan dinding alveolus dan infiltrasi sel radang.  Ketiga  parameter  tersebut  merupakan kelainan patologi  yang paling sering digunakan pada pengamatan preparat histopatologi paru.
Metode yang digunakan yaitu dengan pemberian  skor  (skoring)  agar  dapat  mengukur sejauh  mana  kerusakan  yang  ditimbulkan  maupun pemulihan  yang  terjadi  berdasarkan  keadaan  sel  dan jaringan. Pembacaan hasil preparat histopatologi paru diamati  dengan  cara blind  test yaitu  keseluruhan preparat  yang  sebelumnya  sesuai  dengan  nama  tiap kelompok  diubah  dengan  diberi  kode  yang  berbeda oleh  orang  lain  yang  tidak  melakukan  penelitian  ini, kemudian  preparat  yang  telah  diberi  kode  tertentu tadi selanjutnya dilakukan pembacaan skoring derajat kerusakan  paru.  Cara  perhitungan  derajat  kerusakan menggunakan metode kuadran.

## Analisis Hasil Histopatologi Paru
Hasil  histopatologi dianalisis  berdasarkan parameter  pelebaran  lumen  alveolus,  penebalan dinding  alveolus  dan  infiltrasi  sel  radang.  Parameter derajat  kerusakan  pada  pelebaran  lumen  alveolus menunjukkan terjadinya emfisema. Emfisema
merupakan  keadaan  paru  yang  mempunyai  kenaikan ukuran  lebih  dari  normal  pada  rongga  udara  bagian distal sampai bronkhiolus terminal dan destruksi pada dinding alveoli. Hal Hal ini dapat terjadi karena asap rokok  menginduksi  sel  epitel  untuk  memproduksi sitokin yang menstimulus pelepasan dan mengaktivasi pada neutrofil dan makrofag. Selain itu asap  rokok  menginaktivasi  antiprotease.  Proses  ini akan menyebabkan ketidakseimbangan antara protease  dan  antiprotease  yang  akan  menyebabkan degrdasi  pada  paru  sehingga  terjadi  pelebaran  pada lumen alveolus. Parameter kerusakan berupa infiltrasi sel  radang  ditimbulkan  karena  radikal  bebas  asap rokok  memicu  respon  imun  dengan  adanya infiltrasi leukosit terutama neutrofil pada pembuluh darah paru dinding  alveolus.  Penumpukan  sel  radang  pada dinding  alveolus  menyebabkan  terjadinya  penebalan pada struktur dinding alveolus. Adapun hasil skoring paru berdasarkan  klasifikasi  tingkat  kerusakan terdapat  pada  tabel  3, adapun  grafik  presentase kerusakan  paru  dapat  dilihat  pada  gambar 1,  adapun gambaran perubahan histopatologi paru pada pelebaran  lumen  alveolus  dapat  dilihat  pada  gambar 2,  perubahan  pada  penebalan  dinding  dan  infiltrasi sel radang dapat dilihat pada gambar 3.

## Tabel 3. Hasil Tingkat Kerusakan Paru
Perlakuan Derajat kerusakan (Mean±SD) Klasifikasi Tingkat Kerusakan Normal 40,150±3,101 Sedang Negatif 91,450±0,404 Berat Dosis 45mg/kg bb 76,850±9,489 Berat Dosis 90mg/kg bb 65,350±4,689 Berat Dosis 180mg/kg bb 50,175±7,349 Sedang Vitamin E 43,100±0,025 Sedang
Hasil  skoring  paru  berdasarkan  klasifikasi tingkat  kerusakan,  terlihat  kelompok  yang  memiliki kerusakan  paling  rendah  adalah  kelompok  normal, namun pada kelompok normal terjadi kerusakan paru dengan  tingkat  kerusakan  sedang.  Terjadinya kerusakan  pada  kelompok  normal  dapat  disebabakan karena  adanya  variabel  luar  yang  tidak  bisa dikendalikan,  seperti  kondisi  psikologis  tikus  yang
dipengaruhi oleh lingkungan sekitar, seperti lingkungan  yang  terlalu  gaduh,  pemberian  perlakuan berulang  kali,  dan  perkelahian  antar  tikus.  Selain  itu dalam  kondisi  normal,  radikal  bebas  sudah  terdapat di  dalam  tubuh.  Radikal  bebas  jenis  ini  disebut endogenous  free  radical.  Secara  alami,  tubuh  juga telah  mempunyai  antioksidan  sebagai  inhibitor  yang bekerja  menghambat  oksidasi  dengan  cara  bereaksi dengan  radikal  bebas  reaktif  membentuk  radikal bebas yang relatif stabil.
Hasil  skoring  derajat  kerusakan  paru  paling tinggi  terdapat  pada  kelompok  perlakuan  kontrol negatif yaitu 91,450. Hasil skoring kelompok negatif yang  dibandingka  dengan kelompok  kontrol  normal memiliki nilai perbedaan yang paling signifikan yaitu p=0,01 (p<0,05).

## Gambar 1. Grafik Presentase Kerusakan Paru
Hal  ini  disebabkan  pada  kelompok  kontrol normal, hewan uji tidak diberikan paparan asap rokok sedangkan  pada  kelompok  kontrol  negatif  hanya diberikan asap rokok tanpa asupan antioksidan. Hasil ini  sesuai  dengan  literatur  yang  ada  bahwa  radikal bebas  yang  berasal  asap  rokok  dapat  mengakibatkan terjadinya  kerusakan  pada  paru  melalui  mekanisme asap  rokok  menyebabkan  terjadinya  stres  oksidatif yang  merusak  alveolus  paru.  Oksidan  yang  terdapat dalam asap rokok menyebabkan peningkatan protease akibat  aktivasi  neutrofil  dan  defisiensi  antiprotease. Antiprotease  dihambat  oleh  radikal  bebas  sehingga membuat  ketidakseimbangan  antara  radikal  bebas dan antioksidan.
40.15
91.45
76.85
65.35 50.175 43.1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Pe rs en tas e Ke ru sak an P ar u Kelompok Perlakuan Normal Negatif Dosis 45mg/kg bb
Dosis 90mg/kg bb Dosis 180mg/kg bb
Vitamin E
Kelompok  perlakuan  dosis  bertingkat  esktrak etanol  daun  bawang  mekah  dianalisis  dengan dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol  negatif,  hal ini bertujuan untuk mengetahui besarnya kemampuan penurunan  derajat  kerusakan  paru oleh  ekstrak. Analisis  pada  kelompok  perlakuan  yang  diberikan dosis  bertingkat  ekstrak  etanol  daun  bawang  mekah yang  terdiri  dari  dosis  I  (45mg/kg  bb),  dosis  II (90mg/kg  bb)  dan  dosis  III  (180mg/kg  bb)  dengan
kelompok  kontrol  negatif  menunjukkan  adanya perbedaan yang signifikan antara kelompok perlakuan  dosis dengan  kelompok kontrol  negatif dengan  nilai  signifikansi  yaitu  0,019  (p<0,05).  Hasil tersebut  menunjukkan  adanya  penurunan kerusakan paru.
Gambar  2.  Gambaran  Parameter  Pelebaran  Lumen  Alveolus  :  a.  Kelompok  Normal;  b. Kelompok Kontrol  (-);  c.  Kelompok  Dosis  45mg/kg  bb;  d.  Kelompok  Dosis  90mg/kg  bb;  e.
1 C D 2 1 2 1 E 1 1 A B 1 2 F
Kelompok  Dosis 180mg/kg  bb;  f.  Kelompok  kontrol  (+).  Keterangan  :  (1).  Lumen  Alveolus Normal (2); Pelebaran Lumen Alveolus. Perbesaran 100x.
Gambar  3.  Gambaran  Penebalan  Dinding  Alveolus  dan  Infiltrasi  Sel  Radang  :  a.  Kelompok Normal; b. Kelompok Kontrol (-); c. Kelompok Dosis 45mg/kg bb; d. Kelompok Dosis 90mg/kg bb; e.  Kelompok  Dosis  180mg/kg  bb;  f.  Kelompok kontrol  (+). Keterangan  :  (1).  Penebalan dinding Alveolus; (2) infiltrasi sel radang. Perbesaran 400x.
C D E F B 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 A 1

## 2
Penentuan  dosis  efektif pada  ekstrak  etanol daun bawang mekah dilakukan dengan membandingkan  kelompok  perlakuan  dosis  dengan kelompok  kontrol normal.  Hasil  analisis  antara kelompok  perlakuan  dosis dengan kelompok  kontrol normal  menunjukkan nilai  yang  berbeda  signifikan (p>0,05).  Kelompok perlakuan  dosis  yang  memilki nilai signifikansi paling kecil dibandingkan kelompok dengan kelompok perlakuan dosis lainnya yaitu pada kelompok  perlakuan  dosis  III.  Kelompok  perlakuan dosis ini memiliki  tingkat  kerusakan  paling mendekati  normal. Sehingga  kelompok perlakuan dosis  III  merupakan  kelompok  dosis  yang  efektif dalam  penurunan  derajat  kerusakan  paru  akibat paparan  asap  rokok. Selain  itu Kelompok  perlakuan dosis III  yang  dianalisis  dengan  kelompok  kontrol positif menunjukkan  penurunan  tingkat  kerusakan yang  tidak  signifikan  yaitu p=0,386  (p>0,05). Sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  dosis  III  ekstrak etanol  daun  bawang  mekah  sama  efektifnya  dengan vitamin  E  untuk  menurunkan  derajat  kerusakan  paru akibat asap rokok.
Ekstrak  etanol  daun  bawang  mekah  dapat menurunkan  derajat  kerusakan  paru  diduga  karena mengandung  beberapa  senyawa  seperti  alkaloid, flavonoid,  saponin,  fenolik,  steroid  dan  triterpenoid. Senyawa alkaloid dapat menurunkan derajat kerusakan paru diduga karena memilki peran sebagai antiprotease.  Senyawa  alkaloid  berperan  sebagai antiprotease  dalam  menghambat  rhodesain  and cathepsin  L 26 .  Senyawa  flavonoid  diduga  memiliki aktivitas  antioksidan  untuk  menurunkan  derajat kerusakan paru dengan berperan dengan menghambat pelepasan  pada  sel-sel  radang  seperti  alveolar makrofag  dan  neutrofil 27 .  Saponin  dapat  berperan berperan sebagai antioksidan diduga karena memiliki peran  sebagai  inhibitor  protease  dalam  menghambat pelepasan  sitokin  seperti  TNF-alpha,  IL-1beta,  IL-2 dan  interferon-gamma 28 .  Senyawa  fenolik  dapat berperan  sebagai  antioksidan  diduga  karena  dapat menghambat  masuknya  makrofag  alveolar  dan neutrofil ke dalam lumen alveolus 3 . Senyawa steroid dan  triterpenoid dapat  berperan  sebagai  antioksidan diduga  karena  dapat  berperan  sebagai  inhibitor protease pada aktivitas tripsin 29 .

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian aktivitas antioksidan  ekstrak  etanol  daun  bawang  mekah terhadap  gambaran  histopatologi  paru  tikus  (Rattus norvegicus)  wistar  jantan  yang  diberi  asap rokok dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  etanol  daun bawang  mekah  dapat  menurunkan  derajat  kerusakan paru-paru  akibat  paparan  asap  rokok  pada  hewan  uji tikus jantan galur wistar. Dosis efektif ekstrak etanol daun  bawang  mekah  yang  dapat  menurunkan  derajat
kerusakan  paru-paru  akibat  paparan  asap  rokok  pada hewan  uji  tikus  jantan  galur  wistar  adalah  dosis 180mg/kg BB.

## DAFTAR PUSTAKA
1. World  Health  Organization. WHO  Report:  the global  tobacco  epidemic.  Indonesia:  World Health Organization; 2013.
2. Winarsi. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas : Potensi  dan  Aplikasinya  dalam  Kesehatan. Yogyakarta : Kanisius; 2007. p. 138-281.
3. Lenzatti  Manuella,    Alan  Lopes,  Thiago  S. Ferreira,  Roberto  Soares  de  Moura,    Angela Resende,  Luis  Cristovao  Porto,  Samuel  Santos Valenc. Mate  Tea  Ameliorates  Emphysema  In Cigarette  Smoke-Exposed  Mice.  Experimental Lung  Research.  2011  Juni-Oktober.  ISSN  : 0190-2148. 246-257.
4. Khairani  M. Pengaruh  Pemberian  Wortel (Daucus carota)  Terhadap  Jumlah  Sel  Radang limfosit  Submukosa  Bronkiolus  Tikus  (Rattus norvegicus)  Strain  Wistar  yang  Dipapar  Asap Rokok Kretek Subkronik. Skripsi. 2008. Universitas Brawijaya.
5. Kirana  Ramaniya. Pengaruh  Pemberian  Teh Hijau (Cammelia sinensis) Terhadap Kerusakan Struktur  Histologis  Alveolus  Paru  Mencit  yang Dipapar  Asap  Rokok.  Skripsi.  2009.  Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.
6. Galingging  R.  Y. Bawang  Dayak  (Eleutherine palmifolia)  sebagai  Tanaman  Obat  Multifungsi. Warta  Penelitian  dan  Pengembangan  Badan Penelitian  dan  Pengembangan  Pertanian. 2009. 15 (3) : 10-16.
7. Nur  A.  M. Kapasitas  Antioksidan  Bawang Dayak  (Eleutherine  palmifolia)  Dalam  Bentuk Segar,  Simplisia dan  Keripik,  pada  Pelarut Nonpolar,  Semipolar  dan  Polar.  Skripsi. 2011. Institut Pertanian Bogor.
8. Dwiyana  U.  D. Penentuan  Aktivitas  Antibakteri Umbi  Bawang  Mekah  (Eleutherine  americana (L.) Merr ) terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia  coli  Beserta  Profil  Kromatografi Lapis  Tipis.  Skripsi.  2012.  Fakultas  Kedokteran Universitas Tanjungpura.
9. Ifesan  B.  O.  T,  Ibrahim  D,  Voravuthikunchai  S. Antimicrobial  Activity  of  Crude  Ethanolic Extract  from Eleutherine  americana. J. Food-
Agri  and    Env.  2010.  Juli-Oktober. 8  (3-4)  : 1233-1236.
10. Kuntorini  E.  M,  Astuti  M.  D. Penentuan Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Etanol  Bulbus Bawang  Dayak  (Eleutherine  americana  Merr.). J. Sains dan Terapan Kimia. 2010. Januari. 4(1) : 15-22.
11. Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia. Parameter  Standar  Umum  Ekstrak  Tumbuhan Obat.  Jakarta  :  Departemen  Kesehatan  Republik
; 2000. p. 5, 9-12.
12. Raaman  N. Phytochemical  Techniques.  New Delhi: Jai Bharat Printing Press; 2006. p. 21-22.
13. Nurliani  Anni,  Santoso  Heri  Budi,  Rusmiati. Efek Antioksidan Ekstrak Bulbus Bawang Dayak (Eleutherine palmifolia) pada Gambaran Histopatologis  Paru-paru  Tikus  yang  Dipapar Asap Rokok. Bioscintiae. 2012. 9(1): 60-69.
14. Hansel  T.T,    Barnes  P.J. An  Atlas  of  Chronic Obstructive Pulmonary Disease. London: Parthenon Publishing Group. 2004. p: 22-36
15. Voight  R.  1995. Buku  Pelajaran  Teknologi Farmasi.  Yogyakarta  :  UGM  Press  ;  1995.  p. 561, 567-569, 577.
16. Gelfand  EW. Pro:  Mice  Are  a  Good  Model  of Human  Airway  Disease.  Am J  Respir  Crit  Care Med. 2002 Juli. 166(1):5-8.

## 17. Aminah  R. Pengembangan  Model  Kesehatan
Koloni  Tikus  dan  Mencit  Percobaan  Ditinjau dari  Aspek  Hematologis,  Parasitologis,  dan Histologis. Center for Research and Development of Disease Control. 2004.
18. Sihombing  M,  Raflizar.  2010. Status  Gizi  dan Fungsi  Hati  Mencit  (  Galur  Cbs- Swiss)  Dan Tikus  Putih  (Galur  Wistar)  di  Laboratorium Hewan  Percobaan  Puslitbang  Biomedis  Dan Farmasi. Media Litbang Kesehatan. 10:12-15
19. Bradbury steven. Reregistration Eligibility Decision  (RED)  Document  For  Nicotine. EPA. maret 2008. 40:11
20. Khabour,  Alzoubi  KH,  Bani-Ahmad  M,  Dodin A, Eissenberg T, Shihadeh A. Acute exposure to waterpipe tobacco smoke induces changes in the oxidative  and  inflammatory  markers  in  mouse lung.  Inhal  Toxicol. [Internet] 2012  Agustus [Dikutip Juli 2014] ; 24(10): 67-75.
21. H van der Vaart, D S Postma, W Timens, N H T Ten Hacken. Acute effects of cigarette smoke on inflammation  and  oxidative  stress:  a  review. Thorax. 2004. 59:713 – 721

## 22. Halliwell, B, Whiteman, M. Measuring Reactive
Species  and  Oxidative [Internet] Damage  In Vivo And In Cell Culture: How Should You Do It and  What  Do  Theresults  Mean  ?. Br  J Pharmacol. 2004. 142, 231-255.
23. Supranto  J. Teknik  Sampling  untuk  Survei  dan Eksperimen. Jakarta : PT Rineka Cipta ; 2000
24. Samuel Santos, Valenc A, Katia Da Hora, Paulo Castro,  Vera  Gonc,  Alves  Moraes,  La´Is Carvalho,  Lu´Is  Crist  ´Ov˜Ao  De  Moraes Sobrino  Porto. Emphysema  and  Metalloelastase Expression in Mouse Lung Induced by Cigarette Smoke.  Toxicologic  Pathology.  2004  April. ISSN: 0192-6233. 32(3) : 351-356.
25. Kittel  B,  Ruehl-Fehlert  C,  Morawietz  G, Klapwijk J, Elwell MR, Lenz B, O'Sullivan MG, Roth  DR,  Wadsworth  PF. Revised  guides  for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 2. Exp Toxicol Pathol. 2010.55: 413 – 431.
26. Abdelmohsen Usama Ramadan,Matthias Szesny, Eman  Maher  Othman,  Tanja  Schirmeister, Stephanie  Grond,  Helga  Stopper    and  Ute Hentschel. Antioxidant and Anti-Protease Activities  of  Diazepinomicin  from  the  Sponge- Associated Micromonospora Strain RV115. Mar. Drugs. 2012. ISSN : 1660-3397. 10 : 2208-2221.
27. Lago  João  Henrique  G,  Alessandra  C.  Toledo- Arruda,  Márcia  Mernak,  Kaidu  H.  Barrosa Milton A. Martins, Iolanda F. L. C. Tibério  and Carla  M.  Prado. Structure-Activity  Association of  Flavonoids  in  Lung Diseases. Molecules. 2014. ISSN 1420-3049. 19 : 3570-3595.
28. NgTB, Cheung Randy CF, Ye X J, Wong Jack H and  Ye  X  Y. Protease  Inhibitors,  Lectins, Antifungal  Protein  and  Saponins  in  Soybean. www.intechopen.com. Diunduh  tanggal  16 Agustus 2014.
29. Hodges  LD, Kweifio-Okai  G, Macrides  TA. Antiprotease  effect  of  anti-inflammatory  lupeol esters. Mol  Cell  Biochem . 2003  Oct;252(1- 2):97-101.