## ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID DALAM DAUN BELUNTAS (Pluchea indica L.)
Yohanes Adithya Koirewoa 1) , Fatimawali 1) , Weny Indayany Wiyono 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
2) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
3) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRAK
Telah dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid dalam daun beluntas (Pluchea indica L.). Isolasi dilakukan dengan cara ekstraksi maserasi menggunakan pelarut etanol 96% p.a selama 7 hari dan partisi menggunakan pelarut n-heksana yang menghasilkan ekstrak kental daun beluntas. Ekstrak yang  diperoleh  dipisahkan  dengan  Kromatografi  Lapis  Tipis  menggunakan  eluen  n-butanol  :  asam asetat : air (BAA) (4:1:5). Isolat 3, hasil dari pemisahan Kromatografi Lapis Tipis positif mengandung senyawa  golongan  flavonoid.  Dari  spektrum  Ultra  Violet - Visibel,  dapat  diduga  bahwa  senyawa flavonoid  tersebut  merupakan  golongan  flavonol,  yang  dapat  dilihat  dari  rentang  panjang gelombangnya yaitu antara 250-280 nm (pita II) dan 350-385 nm (pita I). Kata kunci: beluntas, flavonoid, Kromatografi Lapis Tipis, Spektrofotometer UV-Vis

## ISOLATION AND IDENTIFICATION FLAVONOID COMPOUNDS IN BELUNTAS LEAF (Pluchea indica L.)

## ABSTRACT
Isolation  and  identification  flavonoid compounds  in  beluntas  leaf  (Pluchea  indica L.)  have  been conducted. Isolation was carried out by using 96% p.a ethanol solvent of maceration extraction for 7 days   and partition using n-heksana  solvent to obtain concentrated beluntas leaf  extract. The extract was purified by thin layer chromatography using eluent n-butanol : asetic acid : water (BAA) (4:1:5). Isolate 3, result from thin layer chromatography contain flavonoid compound. Ultra Violet - Visible spectra showed that the flavonoid compound was flavonol, with characteristic wavelengths from 250 to 280 nm for band II and 350-385 nm for band I. Keywords: beluntas, flavonoid, Thin Layer Chromatography, UV-Vis Spectrophotometer

## PENDAHULUAN
Indonesia  memiliki  banyak  jenis  tanaman yang dapat  dibudidayakan  karena  bermanfaat dan  kegunaannya  besar  bagi  manusia  dalam hal  pengobatan.  Dalam  tanaman  ada  banyak komponen  kimia  yang  dapat  digunakan sebagai obat. Pada saat ini, banyak orang yang kembali menggunakan bahan-bahan alam yang dalam  pelaksanaannya  membiasakan  hidup dengan menghindari bahan-bahan kimia sintesis dan lebih mengutamakan bahan-bahan alami.  Ada  banyak  pengobatan  dengan  bahan alam  yang  dapat  dipilih  sebagai  solusi mengatasi  penyakit  yang  salah  satunya  ialah
penggunaan  ramuan  obat berbahan  herbal (Kardinan  dan  Kusuma,  2004).  Salah  satu tumbuhan  yang  mengandung  senyawa  obat yaitu beluntas (Pluchea indica L.).
Beluntas  umumnya  tumbuh  liar  di  daerah kering pada tanah yang keras dan berbatu, atau ditanam sebagai tanaman pagar. Tumbuhan ini memerlukan  cukup  cahaya  matahari  atau sedikit  naungan,  banyak  ditemukan  di  daerah pantai  dekat  laut  sampai  ketinggian  1.000  m dpl.  Daun  beluntas  mengandung  alkaloid, flavonoid,  tanin,  minyak  atsiri,  natrium, kalium,  aluminium,  kalsium,  magnesium,  dan fosfor. Sedangkan akarnya mengandung flavonoid  dan  tanin  (Dalimartha,  1999).  Daun
beluntas  berbau  khas  aromatis  dan  rasanya getir,  berkhasiat  untuk  meningkatkan  nafsu makan (stomatik), penurun demam (antipiretik), peluruh  keringat  (diaforetik), penyegar, TBC  kelenjar,  nyeri  pada  rematik dan  keputihan  (Dalimartha,  1999).  Penelitian- penelitian  telah  dilakukan  dan  menunjukkan bahwa  daun  beluntas  memiliki  aktivitas antibakteri  karena  adanya  senyawa  flavonoid (Purnomo,  2001).  Penelitian  ini  bertujuan untuk    mengisolasi  dan  mengidentifikasi senyawa  flavonoid  yang  terdapat  dalam  daun beluntas  (Pluchea  indica L.).  Dari  proses isolasi  akan  didapatkan  isolat-isolat  suatu senyawa  atau  kumpulan  senyawa  sehingga dapat mempermudah untuk melakukan identifikasi  senyawa-senyawa  yang  terdapat dalam simplisia. Sedangkan identifikasi diperlukan  untuk  mengetahui  jenis  senyawa flavonoid yang berada dalam simplisia.

## METODOLOGI PENELITIAN

## Bahan
Bahan  yang digunakan pada penelitian ini adalah daun beluntas (Pluchea indica L.) yang diambil  dari  tanaman  yang  terdapat  di  daerah kampus  Universitas  Sam  Ratulangi dalam keadaan  segar.  Bahan  kimia  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  n-heksana,  n- butanol, asam asetat, metanol, etanol 96% p.a, amoniak,  serbuk  seng,  asam  klorida,  plat kromatografi lapis tipis (KLT) dan aquades.

## Peralatan
Alat – alat yang digunakan pada penelitian adalah  oven,  neraca  analitik,  blender,  pipet tetes,  Chamber  KLT,  Lampu  UV  254  nm  dan 366 nm, Sentrifuge, Spektrofotometer UV-Vis, aluminium  foil, vacum  rotary evaporator, peralatan gelas laboratorium dan kertas saring.

## Cara Kerja
Sebanyak  50  gram  serbuk  simplisia  daun beluntas  dimasukkan  ke  dalam Erlenmeyer (500  ml)  kemudian  direndam  dengan  250  ml pelarut  etanol  96%  p.a,  ditutup  dengan aluminium  foil dan  dibiarkan  selama  7  hari, sambil  sesekali  dikocok.  Ekstrak  yang diperoleh  dipekatkan  dengan  menggunakan vacum rotary  evaporator pada  suhu  70 o C sehingga  diperoleh  ekstrak  pekat  daun beluntas. Ekstrak pekat daun beluntas dicampurkan dengan etanol 96% p,a kemudian
dipartisi  dengan  n-heksana.  Ekstrak  yang diperoleh  dilakukan  uji  fitokimia  flavonoid. Ekstrak  yang  positif  mengandung  flavonoid dilanjutkan  untuk  di  isolasi  dan  pemurnian dengan  teknik  kromatografi  lapis  tipis  (KLT) menggunakan  fase  diam  GF254 dengan ukuran  20  cm  x  20  cm  dan  fase  gerak campuran dari n-butanol-asam asetat-air
(BAA) (4:1:5). Selanjutnya isolat relatif murni diidentifikasi  menggunakan  spektrofotometer Ultra Violet – Visibel.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil
Untuk mendapatkan ekstrak daun beluntas, mula-mula  daun  beluntas  diambil  dan  dicuci. Setelah  itu  dikeringkan dengan  diangin- anginkan  pada  udara  terbuka  dan  kembali  di oven pada  suhu  40  °C  selama  3  hari.  Sampel yang telah kering diblender lalu diayak dengan ayakan  nomor  65  mesh. Sampel  yang diperoleh berupa serbuk  sebanyak  100  g. Metode  ekstraksi  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  ekstraksi  maserasi.  Hasil maserasi  yang  di  dapat  kemudian  dipisahkan pelarutnya dengan menggunakan vacum rotary evaporator dengan  suhu  70°C.  Filtrat  yang diperoleh  berwarna  hijau  pekat.  Filtrat  hasil penyaringan  difraksinasi  dengan  metode ekstraksi  cair-cair  menggunakan  corong  pisah dengan  pelarut  n-heksana.  Untuk  mengetahui kandungan  kimia  dalam  tanaman  dilakukan skrining  fitokimia.  Dari  skrining  fitokimia yang dilakukan, diperoleh hasil yang menunjukkan  sampel  positif  mengandung flavonoid. Isolasi senyawa flavonoid daun beluntas dilakukan
dengan metode kromatografi  lapis  tipis  (KLT).  KLT  yang digunakan  terbuat  dari  silika  gel  dengan ukuran  20  cm  x 20  cm  GF254  (Merck).  Plat KLT  silika gel GF254  diaktifasi dengan  cara dioven pada  suhu  100  ºC  selama  1  jam  untuk menghilangkan  air  yang  terdapat  pada  plat KLT (Sastrohamidjojo, 2007).
Ekstrak kental hasil ekstraksi dilarutkan  dengan  etanol  96%  p.a,  kemudian ditotolkan sepanjang
plat dengan menggunakan  pipet  mikro pada  jarak  1  cm dari  garis  bawah  dan  1  cm  dari  garis atas. Selanjutnya  dielusi  dengan  menggunakan eluen yang  yang memberikan hasil pemisahan terbaik pada KLT yaitu n-butanol : asam asetat :  air  (BAA)  dengan  perbandingan  (4:1:5).
Hasil  KLT  seperti  pada  gambar  1  kemudian diangin-anginkan dan diperiksa di bawah sinar UV  pada  panjang  gelombang  366  nm.  Noda yang  terbentuk  yaitu  sebanyak  3  noda,  noda- noda tersebut lalu dilingkari dan dihitung nilai Rfnya.  Pemisahan  dengan  KLT  menghasilkan harga Rf dari noda pertama sebesar 0,69. Noda kedua  memiliki  nilai  Rf sebesar  0,78  dan noda ketiga memiliki nilai Rf sebesar 0,89.
Gambar 1.  Foto  plat  hasil  KLT  ekstrak  daun beluntas dengan eluen BAA
(4:1:5) dengan sinar UV 366 nm
Tabel 1. Nilai Rf dan warna noda hasil KLT
Nilai Rf dan warna noda dapat dilihat pada tabel  1. Setelah  disinari  dengan  lampu  UV panjang  gelombang  366,  noda  pertama menghasilkan  warna  hijau  muda.  Noda  kedua menghasilkan  warna  merah  muda  dan  noda ketiga  menghasilkan  warna  hijau.  Dari  ketiga noda yang tampak, noda ketiga yang berwarna hijau  diduga  mengandung  karena  setelah
diuapi  dengan  amoniak  terjadi  perubahan warna sedikit pada noda ketiga yaitu berubah dari warna hijau  ke  hijau  tua. Noda-noda  hasil  KLT dikerok  dan  dilarutkan  dalam  pelarut  metanol sebanyak  4  ml,  kemudian  diidentifikasi menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Pembanding rutin yang dipakai dalam mengisolasi  ialah  kuersetin,  yang  merupakan pembanding  rutin  yang  biasanya  di  pakai untuk  mengisolasi  senyawa  flavonoid.  Dari hasil  KLT,  Kuersetin  memiliki  noda  warna kuning  setelah  diperiksa  di  bawah  sinar  UV pada panjang gelombang 366 nm dan memiliki Rf  sebesar 0,64.
Metode yang digunakan untuk identifikasi ialah metode spektrofotometer UV-Vis. Ketiga isolat  hasil  KLT  yang  telah  dikerok  dan disentrifuge  kemudian  dibaca  pada  alat spektrofotometer UV-Vis menggunakan pelarut  baku  metanol. Dari  ketiga  isolat tersebut,  isolat  ketiga  yang  memiliki  hasil spektrum  senyawa  flavonoid  yaitu  flavonol seperti yang bisa dilihat pada gambar 2.
Gambar  2. Spektrum  UV-Vis  pada  panjang gelombang 200-400 nm.
Dari hasil  spektrum  yang  tampak, terdapat dua  pita pada  isolat  ketiga.  Pita  pertama mempunyai  panjang  gelombang  372  nm  pada absorbansi  0,252  dan  pita  kedua  mempunyai panjang  gelombang  276  nm  pada  absorbansi 0,532  ini  menandakan  bahwa  isolat  yang dibaca  positif mengandung  flavonol.  Hal  ini diperkuat oleh markham (1988) bahwa rentang serapan spektrum flavonol mempunyai
panjang  gelombang  350-385  nm  pada  pita pertama  dan  pita  kedua  pada  panjang gelombang 250-280 nm.
Jika  dibandingkan  dengan  pembading rutin  flavonol yaitu  kuesertin  seperti  pada gambar  3  hasil  yang  didapat  mempunyai rentang  separan  yang  sama  yaitu  pita  pertama
terdapat  antara  panjang  gelombang  350-385 nm yaitu 377 nm dan pita kedua pada panjang gelombang 250-280 nm yaitu 280 nm. Hal ini memperkuat  hasil  yang  di  dapat  bahwa  isolat ketiga positif mengandung flavonol .
Gambar 3. Spektrum UV-Vis pembanding rutin kuersetin pada panjang gelombang 200-400 nm.

## Pembahasan
Daun  beluntas  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  daun  beluntas  yang diambil  dari  tanaman  yang  terdapat  di  daerah kampus  Universitas  Sam  Ratulangi.  Daun yang  diambil  ialah daun  yang  berada  pada pertengahan ranting,
karena kadar flavonoidnya lebih  tinggi  daripada  kadar flavonoid  pada  daun  beluntas  yang  masih muda  atau  berada  di  pucuk.  Pengeringan sampel dilakukan secara alami yaitu dikeringkan  dengan  diangin-anginkan  pada udara  terbuka  dengan  tidak  dikenai  sinar matahari  langsung,  kira-kira pada  suhu kamar yaitu  25-30°C  selama  2  minggu  untuk menghilangkan  air  dan  mencegah  terjadinya perubahan  kimia  (daun  cepat  busuk  sehingga dapat  menghasilkan  mikroorganisme  yang dapat merubah senyawa kimia yang terkandung  di  daun  tersebut).  Daun  beluntas kembali di oven pada suhu 40 °C selama 3 hari agar  air  yang  masih  terdapat  dalam  daun beluntas  dapat  lebih  diminimalisir.  Sampel yang telah kering diblender untuk memperluas permukaan serta membantu pemecahan dinding  dan  membran  sel,  sehingga lebih mudah  memaksimalkan proses ekstraksi. Ekstraksi  merupakan  proses  pemisahan suatu  zat  berdasarkan  perbedaan  kelarutannya
terhadap  dua  cairan  tidak  saling  larut  yang berbeda  (Rahayu,  2009).  Metode  yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstraksi maserasi. Maserasi adalah salah  satu metode  pemisahan  senyawa  dengan  cara perendaman  menggunakan  pelarut  organik pada  temperatur  ruangan.  Proses  ekstraksi  ini tidak dilakukan dengan metode soxhlet karena dikhawatirkan ada golongan senyawa flavonoid  yang  tidak  tahan panas,  selain  itu senyawa  flavonoid  mudah  teroksidasi  pada suhu  yang  tinggi.  Proses  maserasi  sangat menguntungkan  dalam  isolasi  senyawa  bahan alam  karena  selain  murah  dan  mudah dilakukan, dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran  sel  akibat  perbedaan  tekanan  antara di  dalam  dan  di  luar  sel,  sehingga  metabolit sekunder  yang  ada  dalam  sitoplasma  akan terlarut  dalam  pelarut.  Pelarut  yang  mengalir ke  dalam  sel  dapat  menyebabkan  protoplasma membengkak  dan  bahan  kandungan  sel  akan larut  sesuai  dengan  kelarutannya  (Lenny, 2006).
Semakin lama waktu ekstraksi,
kesempatan  untuk  bersentuhan  makin  besar sehingga hasilnya juga bertambah sampai titik jenuh  larutan.  Kontak  antara  sampel  dan pelarut  dapat  ditingkatkan  apabila  dibantu
dengan pengocokan agar kontak antara sampel dan  pelarut  semakin  sering  terjadi,  sehingga proses  ekstraksi  lebih  sempurna.  Pelarut  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  etanol 96% p.a. Pemilihan pelarut ini karena senyawa flavonoid  yang  ada  dalam  daun  beluntas merupakan  senyawa  yang  bersifat  polar sehingga harus dilarutkan dengan pelarut yang bersifat  polar.  Suatu  molekul  bersifat  polar apabila tersusun atas atom-atom yang berbeda dan  molekul  yang  tersusun  atas  atom-atom yang sama. Vacum yang dipakai dalam proses maserasi  berfungsi  untuk  mempermudah proses penguapan pelarut dengan memperkecil tekanan  dalam vacum daripada  di  luar ruangan,  sehingga  temperatur  di  bawah  titik didih dan pelarut dapat menguap.
Warna hijau pekat pada filtrat terbentuk karena  pelarut  yang  digunakan  tidak  hanya mengekstraksi senyawa  flavonoid  melainkan juga  mengekstraksi klorofil  yang  ada  dalam tumbuhan. Filtrat hasil penyaringan difraksinasi  dengan  metode  ekstraksi  cair-cair menggunakan  corong  pisah  dengan  pelarut  n- heksana  untuk  memisahkan  senyawa-senyawa nonpolar  seperti  klorofil,  triterpen,  lemak  dan senyawa  nonpolar  lain.  Penambahan  n- heksana  sebanyak  100  ml  memisahkan senyawa nonpolar yang ada dalam ekstrak dan meningkatkan koefisien distribusi.
Penambahan n-heksan menyebabkan terbentuk 2  fase  dan  terdapat  endapan  pada  dinding dasar  corong  pisah  yang  berwarna  cokelat, karena  kedua  pelarut  tersebut  memiliki  berat jenis  dan  kepolaran  yang  berbeda.  Berat  jenis n-heksana  lebih  besar  dari  pada  etanol sehingga  lapisan  n-heksana  berada di  bagian bawah  dan  lapisan  etanol  berada  di  bagian atas.
Pemisahan  senyawa  flavonoid  daun
beluntas dilakukan dengan metode
kromatografi lapis tipis (KLT). KLT merupakan  suatu  metode  pemisahan  suatu senyawa berdasarkan perbedaan distribusi dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam yang  digunakan  ialah  plat  silika  gel  yang bersifat polar, sedangkan eluen yang digunakan sebagai  fase  gerak bersifat  sangat polar  karena  mengandung  air.  Kepolaran  fase diam dan fase gerak hampir sama, tetapi masih lebih  polar  fase  gerak  sehingga  senyawa flavonoid yang dipisahkan terangkat mengikuti  aliran  eluen,  karena  senyawa flavonoid bersifat polar. KLT  yang digunakan terbuat  dari  silika  gel  dengan  ukuran  20  cm  x
20  cm  GF254  (Merck).  Penggunaan  bahan silika  karena  pada umumnya  silica  digunakan untuk memisahkan senyawa asam-asam amino, fenol, alkaloid, asam lemak, sterol dan terpenoid.  Plat  KLT  silika gel GF254
diaktifasi dengan  cara  dioven pada  suhu  100 ºC  selama  1  jam  untuk  menghilangkan  air yang terdapat pada plat KLT
(Sastrohamidjojo, 2007).
Eluen  yang  dipakai  dalam  KLT  ialah eluen  campuan  n-butanol  :  asam  asetat  :  air (BAA)  (4:1:5)  yang  mampu  memberikan pemisahan terbaik. Karena dari komposisinya, eluen  tersebut  bersifat  sangat  polar  sehingga bisa memisahkan senyawa flavonoid yang juga bersifat  polar.  Eluen  yang  baik  ialah  eluen yang bisa memisahkan senyawa dalam jumlah yang banyak yang ditandai dengan munculnya noda.  Noda  yang  terbentuk  tidak  berekor  dan jarak  antara  noda  satu  dengan  yang  lainnya jelas (Harborne, 1987).
Spektrofotometer  UV-Vis  merupakan suatu metode yang digunakan untuk identifikasi  struktur  dari  suatu  senyawa. Metode  ini  digunakan  untuk  mengidentifikasi senyawa  flavonoid  yang  didapat  dari  hasil pemisahan  senyawa  dengan  KLT.  Pemakaian kuersetin  dalam  Spektrofotometer  UV-Vis sebagai pembanding rutin dikarenakan kuersetin merupakan senyawa yang paling luas penyebarannya  dan  25%  terdapat  pada tumbuhan. Flavonol  merupakan  salah  satu jenis flavonoid yang paling banyak ditemukan dalam  bunga  maupun  daun  tumbuhan,  hanya sedikit  sekali  yang  ditemukan  pada  bagian tanaman  yang  berada  di  bawah  permukaan tanah. Flavonol terdiri atas kuersetin, kaemferol,  dan  mirisetin.  Kuersetin  umumnya merupakan  komponen  terbanyak  dalam  suatu tanaman.

## KESIMPULAN
Dari  hasil penelitian  yang  telah  dilakukan dapat  disimpulkan  bahwa  flavonoid  dapat  di isolasi  dan  di  identifikasi  dari  daun  beluntas dengan  metode  kromatografi  lapis  tipis  dan spektrofotometer  UV-Vis  dan  jenis  senyawa flavonoid yang ditemukan ialah flavonol.

## SARAN
Perlu  adanya  penelitian  lebih  lanjut tentang  identifikasi  jenis  senyawa  flavonoid yang  ada  pada  daun  beluntas  menggunakan metode  spektrofotometer  lain  seperti  MS, NMR  dan  IR  dan perbandingan  kandungan
flovonoid pada daun beluntas yang ditanam di berbagai lokasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Dalimartha,  S.  1999.  Atlas  Tumbuhan  Obat Indonesia.  Jilid  I.  Trubus  Agriwidya  : Jakarta.
Harborne,  J.  B.  1987.  Metode  Fitokimia.  Jilid II. Penerbit ITB : Bandung.
Hariana,  A.  2006.  Tumbuhan  Obat  dan Khasiatnya.  Seri  1.  Penebar Swadaya  : Jakarta.
Kardinan,  A.,  Kusuma  F.,  R.  2004.  Meniran Penambah  Daya  Tahan  Tubuh  Alami. Agromedia pustaka : Jakarta.
Lenny,  S.  2006. Isolasi  dan  Uji  Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan  Metoda  Uji  Brine  Shrimp.  F- MIPA  Universitas Sumatera  Utara  : Medan.
Markham,  R.K.  1988. Cara  Mengidentifikasi Flavonoid. ITB : Bandung.
Purnomo,  M.  2001.  Isolasi  Flavonoid  dari Daun  Beluntas  (Pluchea  indica Less) yang Mempunyai Aktivitas Antimikroba.
Terhadap Penyebab Bau Keringat. Universitas Airlangga.
Rahayu,  L.  2009. Isolasi  dan  Identivikasi senyawa  flavonoid  dari  Biji  Kacang Tunggak (Vigna unguiculata L.). Universitas Brawijaya Malang.
Sastrohamidjojo, H. 2007.
Dasar-Dasar
Spektrosfotokopi, edisi  kedua,  cetakan kedua. Penerbit Liberty : Jogjakarta