DAYA ANTIBAKTERI TEPUNG CACING TANAH ( Lumbricus rubellus ) TERHADAP PERTUMBUHAN BAKTERI Vibrio harveyi SECARA IN VITRO
ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF EARTHWORM POWDER ( Lumbricus rubellus ) TO Vibrio harveyi GROWTH’S IN VITRO
Ekasari, Wahju Tjahjaningsih dan Yudi Cahyoko
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp. 031-5911451

## Abstract
Vibrio  harveyi is  the  most  common  pathogenic  agent  of Penaeus  monodon and  causing  large economic losses to the shrimp farming  industry. Antibiotic has been used as the diseases treatment, but it has  been  banned  due  to  the  side  effects.  This  problem  was  required  an  alternative  solution  by  using natural material, such as earthworm powder ( L. rubellus ).
This  research  was  conducted  to  know  the  bacterial  growth  inhibition V.  harveyi by  using earthworm  powder  ( L.  rubellus ).  The  research  method  is  experimental  and  data  analysis  done descriptively. Inhibition of V. harveyi growth was tested using disc diffusion method. Earthworm powder concentrations  are  0,  25,  50,  75,  100  %  (w/v)  and  chloramphenicol  disc  (30µg),  each  treatment  was repeated three times. The  main parameter observed was the size of diameter inhibition zone (mm) which formed around the disc paper after incubation within 24 hours. The data analysis was done descriptively by comparing sensitivity level each treatment.
Results showed that earthworms powder ( L. rubellus ) from the lowest concentration (25% w/v) to the highest concentration (100% w / v) were not able to inhibit V. harveyi growth.
Keywords : antibacterial activity, earthworm powder ( L. rubellus ), V. harveyi

## Pendahuluan
Produksi udang windu ( Penaues monodon )  yang  merupakan  komoditas  ekspor dengan  nilai  ekonomi  tinggi  sejak  awal  tahun 1990-an  terus  mengalami  penurunan  (Umar, 2009).  Salah  satu  penyebab  turunnya  produksi udang  windu  di  Indonesia  adalah  adanya serangan  bakteri  pathogen  (Izzati,  2007)  salah satunya Vibrio  harveyi .  Bakteri  ini  umumnya menyerang  larva udang pada stadia zoea , mysis dan awal pasca larva dan serangan ini umumnya terjadi  sepanjang  tahun  yang  puncaknya  biasa terjadi  pada  bulan  Juli  sampai  September (Prayitno, 2005).
Penanganan  yang  umum  dilakukan untuk mengatasi vibriosis dengan menggunakan antibiotika (Rukyani, 1999). Namun
penggunaan  antibiotika  dapat  menimbulkan masalah  baru  seperti  resistensi  bakteri,  retensi bahan  toksik  dan  residu  bagi  tubuh  konsumen, yang pada  akhirnya  berdampak pada penolakan hasil perikanan (Maryani dkk., 2002).
Permasalahan  ini  menyebabkan  perlunya  solusi alternatif penanganan vibriosis tanpa menggunakan antibiotika. Penelitian ini
mencoba untuk menemukan alternatif
penggunaan  bahan  antibakteri  yang  diperoleh dari  bahan alami,  yaitu tepung cacing tanah ( L.
rubellus )  yang  diharapkan  dapat  menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi secara in vitro . Tepung  cacing  tanah  ( L.  rubellus ) mengandung  zat  aktif  antibakteri  (Julendra, 2003),  enzim lysozyme ,  agglutinin,  faktor  litik
(Puwaningroom,  2010)  dan  kandungan  protein yang  cukup  tinggi,  yaitu  sebesar  64-76  %  dari bahan  kering  (BK)  (Palungkun,  2008)  serta mengandung  asam  amino  prolin  sekitar  15  % dari 62 asam amino (Cho et al ., 1998). Aktivitas antibakteri L.  rubellus berasal  dari  Lumbricin  I yang  merupakan  senyawa  peptida  antimikroba yang  berhasil  diisolasi  dan  dikarakterisasi  dari cacing  tanah  ( L.  rubellus )  (Cho et  al .,  1998). Cho et al . (1998) menyatakan bahwa hasil uji in vitro menunjukkan  Lumbricin  I  mempunyai aktivitas  antimikroba  berspektrum  luas,  yaitu menghambat bakteri Gram positif, bakteri Gram negatif dan jamur.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  daya  antibakteri  tepung  cacing tanah  ( L.  rubellus )  terhadap  pertumbuhan bakteri V.  harveyi yang  tampak  dari  diameter zona hambat, sehingga nantinya dapat memberikan  informasi  tentang  daya  antibakteri tepung  cacing  tanah  ( L.  rubellus )  terhadap pertumbuhan bakteri V. harveyi secara in vitro .

## Metodologi
Penelitian  ini  dilakukan  di  Balai Karantina Ikan Kelas I Juanda, Surabaya,   pada bulan Juni - Juli 2011. Adapun bahan penelitian yang  digunakan  adalah  isolat V.  harveyi ,  yang diperoleh  dari  Balai  Besar  Pengembangan Budidaya  Air  Payau  Jepara.  Cacing  tanah diperoleh dari penjual cacing di sepanjang Jalan Jagir,  Surabaya.  Media Nutrient  Agar (NA) (ditambah  NaCl  2%),  akuadest  steril,  kertas disk, NaCl fisiologis, standar Mc Farland 0.5, kloramfenikol  disk  (30  µg),  reagen  uji pewarnaan  Gram  (Gram  A,  B,  C,  D), paper oxidase ,  H 2 O 2 3%,  Oxidative-  Fermentative (OF) test  medium ,  paraffin, Tryptic  Soy  Iron Agar (TSIA), Motility  Indol  Ornithin (MIO) test  medium , Simmon’s  Citrat  medium, Urease medium, Arginin medium ,  Gelatin medium , Phenol  Red  Broth  Sugar,Lysine  Iron  Agar (LIA), Thiosulphate  Citrat  Bilesalt  Sucrose Agar (TCBSA),  reagen  uji  MRVP,  reagen Kovacs.
Peralatan  penelitian  yang  digunakan meliputi blender ,  timbangan,  cawan  petri, tabung  reaksi,  rak  tabung  reaksi, vortex , pembakar  bunsen,  ose, needle ,  mikroskop, object glass , beaker glass , erlenmeyer, autoclave , pinset, mikropipet, pipetip, inkubator,  spatel  bengkok, hot  plate  stirrer , jangka sorong.
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental yang dilakukan  secara in  vitro dengan  menggunakan uji  sensitivitas  metode  difusi  disk  dengan mencari  konsentrasi  hambat  minimal  larutan antibakteri yang dapat menghambat pertumbuhan  bakteri V.  harveyi .  Adapun pelaksanaan  penelitian  ini  adalah  sebagai berikut:
a. Pembuatan Tepung Cacing Tanah
Cacing tanah yang digunakan diidentifikasi  terlebih  dahulu  agar  cacing  yang diproses benar-benar spesies L. rubellus . Proses pembuatan  tepung  cacing  tanah  dilakukan dengan  menggunakan  metode  Singgih  (2006) dalam Adam  (2007).  Cacing  tanah  dibersihkan dari  tanah  dan  kotoran  lainnya  yang  menempel dengan menggunakan air yang mengalir. Cacing tanah  kemudian  dikeringkan  dengan  cara dijemur  selama  1-2  hari  hingga  kering.  Cacing yang  telah  kering  selanjutnya  dihaluskan dengan blender hingga  menjadi  tepung  cacing tanah.
b. Identifikasi Bakteri Sebagai langkah awal,  dilakukan peremajaan  terhadap  koloni  bakteri V.  harveyi dengan  cara  ditanam  pada Thiosulphate  Citrat Bilesalt  Sucrose  Agar (TCBSA)  sebagai  media
selektifnya,  kemudian  dilakukan  pewarnaan Gram  dan  uji  biokimia  untuk  memastikan bahwa  isolat  yang  digunakan  benar-  benar murni V. harveyi
c.  Penyiapan Suspensi Bakteri
Pembuatan  suspensi  bakteri  dilakukan dengan  cara  melakukan  pengenceran  bertingkat hingga  diperoleh  suspensi  bakteri  dengan tingkat  kekeruhan  yang  setara  dengan  standar Mc Farland 0.5 (1X10 7 sampai 1x10 8 CFU/ml) (Quelab,  2005).  Penggunaan Mc  Farland 0.5
(1X10 7 sampai  1x10 8 CFU/ml)  sebagai  standar dikarenakan  bakteri V.  harveyi mengakibatkan infeksi pada post  larva dan  juvenil P. monodon dengan  kepadatan  bakteri  10 2 -10 3 CFU/ml  dan pada post larva dan juvenil P. vannamei dengan kepadatan  bakteri  10 6 -10 7 CFU/ml  (Saulnier et al ., 2000).
Pengenceran bertingkat dilakukan dengan  cara  menyiapkan  empat  buah  tabung reaksi,  tabung  pertama  diisi  dengan  NaCl fisiologis  sebanyak  10  ml,  sedangkan  tabung kedua  sampai  keempat  diisi  dengan  NaCl fisiologis  sebanyak      9  ml.  Kemudian  koloni bakteri  pada  media  (NA  ditambah  NaCl  2%) diambil  sebanyak  4  sampai  5  koloni,  kemudian dicampur  dengan  10  ml  NaCl  fisologis dan dihomogenkan dengan cara di vortex . Kemudian dilakukan pengenceran bertingkat dengan menambahkan 1 ml suspensi bakteri dari tabung 1 ke tabung 2, suspensi kemudian dihomogenkan  dengan  cara  di vortex, demikian seterusnya  hingga  tabung  keempat.  Kemudian keempat  tabung  tersebut  disetarakan  tingkat kekeruhannya dengan standar Mc Farland 0.5. d. Penyiapan Larutan Tepung Cacing Tanah ( L. rubellus ) Tepung cacing tanah ( L. rubellus ) yang akan  digunakan  dalam  penelitian  ini  dilarutkan dalam air (Purwaningroom, 2010) karena bahan aktif  yang  terkandung  dalam  tepung  cacing tanah, Lumbricin , merupakan asam amino yang kaya  akan  prolin  yang  bersifat  larut  dalam  air (Gold Biotechnology, 2009). Konsentrasi tepung  cacing  tanah  ( L.  rubellus )  yang  akan diuji cobakan mengacu pada penelitian sebelumnya  (Damayanti  dkk,  2009;  Julendra dan Sofyan, 2007) yaitu sebesar 0%, 25%, 50%, 75%  dan  100%  (b/v).  Dimana  %  b/v menyatakan  jumlah  gram  zat  dalam  100  ml larutan,  sebagai  pelarut  dapat  digunakan  air/ pelarut lain (Departemen Kesehatan, 1995).
Proses penyiapan larutan tepung cacing tanah  dilakukan  dengan  cara  sebagai  berikut, sebanyak  5  tabung  reaksi  steril  disiapkan  dan diberi  nomor  satu  sampai  lima.  Setiap  tabung diisi  dengan  1  ml  akuadest  steril,  kemudian  ke dalam  tabung  nomor  satu  sampai  lima  secara
berurutan  ditambahkan  tepung  cacing  tanah sebanyak  0  g,  0.25  g,  0.5  g,  0.75  g  dan  1  g. Kemudian  campuran  dihomogenkan  dengan cara  di vortex ,  selanjutnya  disentrifus  dengan kecepatan  1000  rpm  selama  5  menit.  Dari proses  ini  endapan  tepung  cacing  tanah  akan terpisah  dengan  supernatan,  kemudian  masing- masing  supernatan  dipindahkan  ke  tabung reaksi steril baru dengan menggunakan mikropipet.
e. Pengisian Kertas Disk
Kertas  disk  disterilkan  terlebih  dahulu dengan  meletakkan  kertas  disk  dalam  cawan petri dan disterilkan dalam autoclave selama 15- 20 menit pada suhu 121 o C (Windyaanita, 2006). Selanjutnya  kertas  disk  yang  telah  disterilkan, dimasukkan  ke  dalam  5  tabung  reaksi  yang berisi  supernatan  tepung  cacing  tanah  dengan konsentrasi  berbeda  yang  telah  disiapkan sebelumnya.  Setiap  tabung  berisi  tiga  buah kertas  disk,  dan  dibiarkan  selama  15-20  menit agar  zat  aktif  dalam  supernatan  tepung  cacing tanah  dapat  meresap  ke  dalam  kertas  disk (Windyaanita, 2006).
Untuk perlakuan kontrol positif
digunakan  kertas  disk  yang  telah  berisi antibiotika kloramfenikol, karena kloramfenikol memiliki  sensitivitas yang sangat  tinggi terhadap V. harveyi (Uma et al ., 2005), dimana pada dosis 30 µg/kertas disk mampu menghasilkan diameter zona hambat sebesar 25- 31 mm (Rattanachuay, et al ., 2010).
f.   Pengujian  Aktivitas  Antibakteri  dengan Metode Difusi Disk Sebanyak  200  μL    suspensi  bakteri V. harveyi yang telah disetarakan tingkat kekeruhannya  dengan  standar Mc  Farland 0.5, diinokulasikan ke dalam cawan petri yang berisi media  NA  (ditambah  NaCl  2%)  yang  telah
memadat,  kemudian  suspensi  bakteri  diratakan dengan  spatel  bengkok  dan  dibiarkan  selama 15-20 menit agar bakteri dapat meresap dengan baik  (Windyaanita,  2006).  Kertas  disk  yang telah  disiapkan  sebelumnya,  diletakkan  di  atas permukaan  media  dengan  pinset  steril  dan dibiarkan  selama  15-20  menit  agar  bahan antibakteri  dalam  kertas  disk  tersebut  dapat berdifusi  dengan  baik  ke  dalam  media  sebelum pertumbuhan bakteri berlangsung (Windyaanita, 2006).  Kemudian  cawan  petri  diinkubasi  pada suhu ruang selama 24 jam.
Variabel yang diamati dalam penelitian ini  adalah  ukuran  diameter  zona  hambat  (zona jernih)  (mm)  yang  terbentuk  di  sekitar  kertas disk  yang  diukur  pada  jam  ke-24  setelah inkubasi  dengan  menggunakan  jangka  sorong (Dewi, 2010). Variabel bebas berupa konsentrasi tepung cacing tanah yaitu 0, 25, 50, 75, dan 100 % (b/v). Variabel terkontrol berupa suhu,  lama  inkubasi  dan  volume  suspensi  dan konsentrasi bakteri yang diberikan dalam setiap cawan petri.
Data  hasil  penelitian  berupa  diameter zona  hambat  pertumbuhan  bakteri V.  harveyi oleh  antibakteri  tepung  cacing  tanah  ( L. rubellus )  dan  kloramfenikol.  Data  tersebut disajikan secara deskriptif .

## Hasil dan Pembahasan
Setelah dilakukan uji identifikasi terhadap isolat bakteri yang digunakan, diketahui  bahwa  isolat  tersebut  merupakan bakteri Vibrio  harveyi .  Hasil  zona  hambat pertumbuhan bakteri V. harveyi dengan menggunakan tepung cacing tanah ( L. rubellus ) sebagai  antibiotika  alami  dan  kloramfenikol sebagai  antibiotika  kimiawi  dapat  dilihat  pada Tabel 1.
Tabel 1.  Zona  Hambat  yang  Terbentuk  dibandingkan  dengan  Standar  Umum  Antibiotika Kloramfenikol
Konsentrasi Tepung Cacing Tanah ( L. rubellus)
Diameter Zona Hambat (mm) Kriteria Diameter Zona Hambat Antibiotika Kloramfenikol Tidak Peka (≤ 12mm) Cukup Peka (13-17 mm) Sangat Peka (≥18mm) 100% 0 √ - - 75% 0 √ - - 50% 0 √ - - 25% 0 √ - - 0% 0 √ - - Kloramfenikol 30 µg 29 - - √
Berdasarkan    hasil  penelitian  yang telah  dilakukan  secara in  vitro tentang  daya antibakteri  tepung  cacing  tanah  ( L.  rubellus ) terhadap  bakteri V.  harveyi ,  yang  tercantum dalam  Tabel  1,  dapat  diketahui  bahwa  tepung cacing  tanah  ( L.  rubellus )  pada  konsentrasi terendah  (25%)  hingga  konsentrasi  tertinggi (100%)  tidak  memiliki  efektivitas  dalam menghambat  pertumbuhan  bakteri V.  harveyi . Kloramfenikol  mempunyai  efektivitas  yang sangat  peka  dalam  menghambat  pertumbuhan bakteri V.  harveyi ,  hal  ini  sesuai  dengan pendapat Uma et al. (2005) dan Rattanachuay et al. (2010) yang menyatakan bahwa kloramfenikol memiliki sensitivitas yang sangat tinggi terhadap V. harveyi. Hasil  yang  diperoleh  dalam  penelitian ini, berbeda dengan hasil penelitian sebelumnya yang  menyatakan  bahwa  tepung  cacing  tanah ( L. rubellus ) secara in vitro mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri Escherichia coli (Julendra  dan  Sofyan,  2007), Salmonella pullorum (Damayanti  dkk.,  2009;  Julendra, 2005), Salmonella  typhi (Purwaningroom, 2010),  serta  penelitian  secara in  vivo mampu meningkatkan  nilai  kelulushidupan  ikan  lele dumbo  ( Clarias  gariepinus )  (Adam,  2007)  dan ikan  mas  ( Cyprinus  carpio )  (Asfanti,  2008) yang diinfeksi dengan Aeromonas hydrophylla.
Peneliti sebelumnya menyatakan bahwa tepung cacing tanah ( L. rubellus ) mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri  baik  Gram positif  maupun  Gram  negatif,  dikarenakan tepung  cacing  tanah  ( L.  rubellus )  mengandung bahan  aktif  antibakteri  lumbricin  (Cho et  al ., 1998;  Julendra  dan  Sofyan,  2007;  Damayanti dkk., 2009 dan Julendra, 2005), enzim lysozime , aglutinin,  dan  faktor  litik  (Purwaningroom, 2010).  Lumbricin,  merupakan  senyawa  peptida antimikroba yang kaya akan asam amino prolin dari  total  62  asam  amino  (15%  prolin  dalam rasio  molar  dengan  berat  molekul  7231  Da). Lumbricin  menunjukkan  aktifitas  antimikroba in  vitro pada  sejumlah  besar  mikroorganisme tanpa aktivitas hemolitik (Cho et al ., 1998).
Mekanisme  kerja  lumbricin  dalam menghambat  pertumbuhan  bakteri  hingga  saat ini  masih  belum  diketahui  secara  pasti,  namun tingginya  kandungan  prolin  dalam  lumbricin merupakan  faktor  yang  tidak  diragukan  lagi sebagai  salah  satu  faktor  yang  berperan  dalam mekanisme  kerja  lumbricin  sebagai  suatu antimikroba  (Cho et  al., 1998).  Dari  beberapa peptida  antimikroba  yang  juga  mengandung asam  amino  prolin  dalam  jumlah  tinggi,  juga mempunyai  mekanisme  kerja  dan  spektrum yang berbeda-beda dalam menghambat pertumbuhan bakteri (Cho et al ., 1998).
Terdapat suatu penyebab yang mengakibatkan tepung cacing tanah ( L. rubellus ) tidak mampu menghambat pertumbuhan  bakteri V.  harveyi secara in  vitro . Penyebab  tersebut  diduga  karena  bakteri V. harveyi resisten  terhadap  bahan  aktif  dalam tepung  cacing  tanah  ( L.  rubellus )  melalui beberapa mekanisme. Yeaman and Yount (2003) menyatakan,  salah  satu  mekanisme  resistensi peptida  antimikroba  disebabkan  karena  adanya produk  ekstraseluler  yang  dihasilkan  oleh bakteri berupa enzim proteolitik seperti peptidase  atau  protease.  Pendapat  ini  juga didukung  oleh  Whitelock et  al .  (1996)  yang menyatakan bahwa beberapa bakteri
memproduksi  enzim  proteolitik  yang  dapat mendegradasi  peptida  antimikroba  sehingga menjadi  resisten. V.  harveyi merupakan  bakteri yang juga mampu menghasilkan enzim protease (Sarkar et  al .,  2010),  sehingga  diduga  bahwa tepung  cacing  tanah  ( L.  rubellus )  tidak  mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri V.  harveyi . Hal ini disebabkan sebelum melakukan aktivitas antimikroba,  bahan  aktif  dalam  tepung  cacing tanah  ( L.  rubellus )  yang  berupa  senyawa peptida  telah  terdegradasi  terlebih  dahulu  oleh enzim protease yang diproduksi oleh V. harveyi . Selain  itu,  terdapat  dugaan  lain  yang menyebabkan tepung cacing tanah  ( L. rubellus ) tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri V.  harveyi ,  yaitu  asam  amino  prolin  yang terkandung  dalam  bahan  aktif  tepung  cacing tanah  (lumbricin),  dimanfaatkan  oleh V. harveyi ,  karena  ternyata V.  harveyi mampu memanfaatkan  L-prolin  (Bergey’s  Manual, 2005),  sehingga  tepung  cacing  tanah  ( L.
rubellus ) tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri V.harveyi .
Selain  kedua  dugaan  tersebut,  terdapat dugaan  lain  yang  menyebabkan  tepung  cacing tanah  ( L.  rubellus )  tidak  mampu  menghambat pertumbuhan  bakteri V.  harveyi secara in  vitro , yaitu  disebabkan  muatan  positif  total  dari lumbricin  hanya  +1  (Cho et  al .,  1998). V. harveyi , sebagai bakteri Gram negatif, memiliki lapisan  dalam  yang  tersusun  atas  peptidoglikan yang  tipis,  sedangkan  membran  terluar  disusun oleh  peptidoglikan yang  tebal, sehingga membran  sel bakteri bermuatan negatif.
Sedangkan  kationisitas  (tingkat  muatan  positif) tidak  diragukan  lagi  merupakan  faktor  yang penting  untuk  daya  tarik  elektrostatika  awal peptida  antimikroba  terhadap  muatan  negatif membran  fosfolipid  bakteri  (Yeaman  and Yount,  2003).  Mekanisme  kerja  peptida antimikroba  diawali  dengan  interaksi  awal antara  peptida  antimikroba  dengan  sel  target
(bakteri)  akibat  pengaruh  daya  elektrostatika (Yeaman and Yount, 2003). Terdapat hubungan yang  kuat  antara  tingkat  kationisitas  peptida antimikroba dengan aktivitas antimikroba (Besalle et al ., 1992; Matsuzaki et al ., 1996 dan Dathe et  al .,  1997 dalam Yeaman  and  Yount, 2003), dimana secara umum, dengan meningkatnya kationisitas maka aktivitas antimikroba juga meningkat (Dathe et al ., 1997 dalam Yeaman  and  Yount,  2003).  Dalam penelitian  yang  lain,  yang  menguji  daya antibakteri beberapa peptida antimikroba sintetis  terhadap V.  harveyi ,  diketahui  bahwa peptida antimikroba sintesis tersebut, yang total muatan  positifnya  bervariasi  antara  +3  hingga +6,  ternyata  mempunyai  daya  antibakteri terhadap V.  harveyi (Chou et  al .,  2008).
Sehingga  dengan  demikian,  karena  muatan positif  total  lumbricin  hanya  +1,  sedangkan membran  sel  bakteri V.  harveyi bermuatan negatif, maka lumbricin tidak mampu melakukan interaksi awal melalui daya elektrostatika, sehingga mekanisme kerja selanjutnya yang dapat mengakibatkan kerusakan pada membran sel bakteri tidak dapat terjadi, sehingga lumbricin dalam tepung cacing tanah  ( L.  rubellus )  tidak  mampu  menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi .

## Kesimpulan
Dari  penelitian  ini  dapat  disimpulkan bahwa  tepung  cacing  tanah  ( L.  rubellus )  tidak dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri V. harveyi secara in  vitro .  Sehingga  disarankan untuk  tidak  menggunakan  tepung  cacing  tanah sebagai  salah  satu  cara  pengobatan vibriosis . Selanjutnya  dapat  dilakukan  penelitian  lanjutan untuk  mengetahui  faktor  yang  menyebabkan tepung  cacing  tanah    ( L.  rubellus )  tidak  dapat menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi .

## Daftar Pustaka
Adam,  M.  2007.  Pengaruh  Pengobatan  Ikan Lele  Dumbo  ( Clarias  gariepinus )  yang Terinfeksi Bakteri Aeromonas hydrophila dengan Menggunakan Ekstrak Cacing Tanah ( Lumbricus rubellus ). Jurusan Manajemen Sumberdaya Perairan. Fakultas Perikanan. Universitas Brawijaya. Malang 95 hal Asfanti,  M.I.  2008.  Pengaruh  Pemberian Tepung Cacing Tanah ( Lumbricus rubellus )  terhadap  Kekebalan  Tubuh
Ikan  Mas  ( Cyprinus  carpio ).    Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Universitas Brawijaya. Malang Bergey. 2005. Manual of Systematic Bacteriology. 2 nd Edition. Volume 2. Part B. Proteobacteria. Gammaproteobacteria. Pp 524-525.
Cho,  J.  H.,  C.  B.  Park,  Y.  G.  Yoon  and  S.  C. Kim. 1998. Lumbricin I, a novel proline- rich  antimicrobial  peptide  from  the earthworm:  purification,  cDNA  cloning and  molecular  characterization.  Biochim Biopys Acta. 1408: 67-76.
Chou,  H.,  Kuo,  T.,  Chiang,  J.,  Pei,  M.,  Yang, W., Yu, H., Lin, S., and Chen, W. 2008. Design and synthesis of cationic antimicrobial  peptides  with  improved activity  and  selectivity  against Vibrio spp. International Journal of Antimicrobial Agents 32: 130-138. Damayanti,  E.,  A.  Sofyan,  H.  Julendra  dan  T.
Untari.  2009.  Pemanfaatan  Tepung Cacing  Tanah  ( Lumbricus  rubellus ) sebagai  Agensia  Anti-Pullorum  dalam Imbuhan  Pakan  Ayam  Broiler.  Jurnal Ilmu Ternak Veteriner 14(2): 83-89.
Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia.
1995.  Farmakope  Indonesia.  Edisi  4. Kadar Larutan. Hal 1.
Dewi, F. K. 2010. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Mengkudu ( Morinda citrifolia L.) Terhadap Bakteri Pembusuk Daging  Segar.  Jurusan  Biologi.  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam. Universitas Sebelas Maret.
Surakarta. 38 hal.
Gold  Biotechnology.  2009.  Material  Safety
Data Sheet: D-Proline. 4 pp.
Izzati,  M.  2007.  Skreening  Potensi  Antibakteri pada  Beberapa  Spesies  Rumput  Laut terhadap  Bakteri  Patogen  pada  Udang Windu. Bioma. IX (2) : 62-67.
Julendra,  H.  2003.  Uji  Aktivitas  Antibakteri dari  Cacing  Tanah  ( Lumbricus  terestris ) sebagai  Bahan  Pakan  Ayam  terhadap Pertumbuhan Bakteri Salmonella pullorum secara In Vitro . 9 hal.
Julendra,  H.  2005.  Pengaruh  Penambahan Tepung  Cacing  Tanah  ( L.  rubellus ) sebagai Suplemen Pakan terhadap
Aktivitas Salmonella  pullorum dengan Uji secara In Vitro . 7 hal.
Julendra,  H  dan  A.  Sofyan.  2007.  Uji In  Vitro
Penghambatan Aktivitas Escherichia coli dengan Tepung Cacing Tanah
( Lumbricus  rubellus ).  Media  Peternakan 30 (1): 1-7.
Maryani, D. Dana, dan Sukenda. 2002. Peranan Ekstrak  Kelopak  dan  Buah  Mangrove Sonneratia  caseolaris (L)  terhadap Infeksi  Bakteri Vibrio  harveyi pada
Udang  Windu  ( Penaeus  monodon Fab.). Akuakultur Indonesia I (3) : 129-138.
Palungkun,  R.  2008.  Sukses  Beternak  Cacing Tanah Lumbricus  rubellus .  Penebar Swadaya. Jakarta. hal.  5-15.
Prayitno,  A.  2007.  Uji  Sensitifitas  Flavonoid Rumput Laut ( Eucheuma cottoni ) Sebagai Bioaktif Alami Terhadap Bakteri Vibrio Harveyi . Jurnal Protein 15
(2) : 66-71.
Purwaningrrom,  D.L.  2010.  Uji In  Vitro Pengaruh  Jenis  Tepung  Cacing  Tanah ( Lumbricus  rubellus dan Pheretima aspergillum ) dengan Variasi Suhu
Pengolahan  (50°,  60°  dan  70°)  terhadap Penghambatan Pertumbuhan Bakteri Salmonella thypi . Fakultas Ilmu Biologi.
Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim. Malang. 98 hal.
Quelab.  2005.  Mc  Farland  Standard.  Diakses melalui http:/www.quelab/htmleng/ 2900a/html pada 10 Oktober 2011. Rattanachuay, P., D. Kantachote, M. Tantirungkij,  T.  Nitoda  and  H.  Kanzaki.
2010.  Inhibition  of  Shrimp  Pathogenic Vibrios  by  Extracellular  Compounds from a Proteolytic Bacterium Pseudomonas  sp.  W3.  Journal  of Biotechnology 13(1) : 1-11. Rukyani,  A.  1999.  Beberapa  Jenis  Penyakit Sebagai Kendala Utama Budidaya Udang dan Cara Pengendaliannya.
Badan Litbang Pertanian.
Sarkar, S., A. Pramanik, A. Mitra, J. Mukherjee.
2010.  Bioprocessing  Data  for  the
Production  of  Marine  Enzymes.  Marine
Drugs ISSN 1660-3397: 1323-1371.
Saulnier,  D.,  H.  Philipe.,  G.  Cyrille.,  L.  Peva and  A.  Dominique.  2000.  Experimental Infection  Models  for  Shrimp  vibriosis studies:  a  review  .  Aquaculture,  191  :
133-144. Uma,  A.,  K.  Saravanabava,  R.  Singaravel  and A. Koteeswaran. 2005. Antibiotic Resistant Vibrio  harveyi Isolated  from
Swollen  Hindgut  Syndrome  (SHG) Affected Penaeud  monodon Post  Larcae from  Commercial  Shrimp  hatcheries.
Tamilnadu Veterinary and Animal
Sciences  University,  Madhavaram  Milk Colony, Chennai. 4 pp. Umar.  2009.  Potensi  Isolat Bacillus sp.  Lts  40 menghambat pertumbuhan Vibrio harveyii penyebab vibriosis dan meningkatkan  sentasan  udang  windu ( Penaeus monodon Fab.) Institut Pertanian Bogor. Bogor. hal 20-23. Whitelock,  J.M.,  Murdoch,  A.D.,  Iozzo,  R.V., Underwood, P.A. 1996. The Degradation of  Human  Endothelial  Cell-derived Perlecan  and  Release  of  Bound  Basic Fibroblast Growth Factor by Stromelysin,  Collagenase,  Plasmin,  and Heparanases",  Journal  of  Biological
Chemistry 271 (17): 10079–10086.
Windyaanita,  H.  2006.  Daya  Antibakteri  Buah Mengkudu  ( Morinda  citrifolia L.)  yang Diekstraksi  dengan  Etanol  dan  yang Diekstraksi dengan Air Terhadap
Aeromonas  hydrophilla Secara In  Vitro . Universitas Airlangga Surabaya. 57 hal. Yeaman,  M.  R.  and  Yount,  N.  Y.  2003.
Mechanisms  of  Antimicrobial  Peptide Action  and  Resistance.  Pharmacological Reviews 55 (1) : 27-55.