## VALIDASI METODE ANALISIS DALAM PENETAPAN KADAR BENZO(A)PIREN PADA IKAN BAKAR
Windi Astuti 1) , Sri Sudewi 1) , Henki Rotinsulu 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Benzo  (a)  pyrene  is  carcinogenic  compounds  formed  by  incomplete  combustion  of  organic compounds during processing. This research was conducted by validating analytical methods used in the determination of the levels of benzo (a) pyrene and determines levels of benzo (a) pyrene in grilled fish. Determination  of  Benzo  (a)  was  carrid  out  by  High  Performance  Liquid  Chromatography  (HPLC). Optimization of benzo (a) pyrene was carrid out with a combination of  mobile phase, acetonitrile : water (90:10) and (85:15) with a flow rate of 1,0 and 1,5 mL/min. Validation of  analysis methods was carrid out by the linearity test, accuracy test, precision test and  limits of detection test and quantity limit (LOD & LOQ) using a standard solution of benzo (a) pyrene. The results showed that the choosen condition of mobile  phase,  acetonitrile  :  water  (90:10)  and  flow  rate  1,0  mL/min.  The  linearity  value  resulted  r 2 = 0,9017.  Accuracy  test  gives  an  average  value  of  100,00    recovery;  101,73    and  97,67%.  an  intraday precision  test  result  of  0,01;  0,54  and  0,00%  and  interday;  0,01;  0,02  and  0,01%.  Value  of    limit  of detection and limit of quantity (LOD & LOQ) was 13,53 and 45,11μg/L. The levels of benzo (a) pyrene in grilled  fish  in  restaurant  X  in  Manado  City  15,397  µg/L.  Validation  of  analytical  methods  has  already defined in accordance with the terms. The level of benzo (a) pyrene in grilled fish can be determined by using    High  Performance Liquid  Chromatography  (HPLC).  The  result  level  of  Benzo  (a)  pyrene  of  no- treatment group and treatment group without wrapping with variable time 60 minutes are exceeds 10 µg which is maximum limit set Food and Drug Regulatiory Agency Republic of Indonesia (FDRA RI).
Keywords : Validation of analysis methods, grilled fish, benzo (a) pirene, HPLC.

## ABSTRAK
Benzo(a)piren  merupakan  senyawa  karsinogenik  yang  terbentuk  akibat  pembakaran  tidak sempurna dari senyawa organik selama proses pengolahan. Penelitian ini dilakukan dengan memvalidasi metode  analisis  yang  digunakan  dalam  penetapan  kadar  benzo(a)piren  dan    mengetahui  kadar benzo(a)piren  dalam  ikan  bakar.  Metode  penentuan Benzo(a)piren  dilakukan  dengan  Kromatografi  Cair Kinerja  Tinggi  (KCKT).  Optimasi  penetapan  benzo(a)piren  dilakukan  dengan  kombinasi  Fase  gerak Asetonitril : Aquades (90:10) dan (85:15) dengan laju alir 1,0 dan 1,5 mL/menit . Validasi metode analisis dilakukan  dengan  uji  linearitas,  uji  akurasi,  uji  presisi  dan  uji  batas  deteksi  dan  batas  kuantitas  dengan menggunakan  larutan  standar  benzo(a)piren.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  kondisi  optimum terpilih  pada  fase  gerak  Asetonitril  :  Aquades  (90:10)  dan  laju  alir  1,0  mL/menit.  Nilai  linearitas  yang dihasilkan  r 2 =  0,9017.  Uji  akurasi  memberikan  nilai  rata-rata  perolehan  kembali  100,00;  101,73    dan 97,67%.  Uji  presisi  memberikan  hasil pada  intraday 0,01; 0,54 dan 0,00%  dan interday  0,01; 0,02   dan 0,01%.  Uji  batas  deteksi  dan  batas  kuantitas    memberikan  hasil  yaitu  13,53  dan  45,11µg/L.  Kadar benzo(a)piren yang dihasilkan pada ikan bakar di rumah makan kota manado yaitu 15,397 µg/L. Validasi metode  analisis  sesuai  dengan  syarat  yang  sudah  ditetapkan.  Kadar  benzo(a)piren  pada  ikan  bakar  bisa ditetapkan  dengan  menggunakan  menggunakan  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi  (KCKT).  Kadar benzo(a)piren  yang  dihasilkan  oleh  rumah  makan  di  kota  manado  melebihi  dari  batas  maksimum  yang ditetapkan Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia (BPOM RI) yaitu sebesar 10 µg/L.
Kata Kunci : Validasi metode analisis, Benzo(a)piren, ikan bakar, KCKT

## PENDAHULUAN
Ikan  merupakan  salah  satu  sumber protein  hewani  yang  banyak  dikonsumsi oleh  masyarakat  di  kota  Manado,  terutama pengolahannya  dengan  cara  dibakar.  Ikan bakar  adalah  ikan  yang  dihasilkan  melalui proses  pembakaran,  di  mana  dalam  proses pembakaran tersebut menghasilkan senyawa karsinogenik  penyebab  kanker.  Senyawa karsinogenik tersebut adalah HAP (hidrokarbon aromatik polisiklik). HAP (hidrokarbon
aromatik polisiklik)  merupakan  golongan  senyawa organik yang memiliki  dua atau lebih cincin aromatik  yang  dihasilkan  dari  pembakaran yang  tak  sempurna  bahan  bakar  fosil,  kayu, atau  selama  pengolahan  makanan  seperti pembakaran  dan  pengasapan  (  Chen  dkk, 2005). Environmental  Protection  Agency (EPA)  menetapkan  15  jenis  HAP  yang berbahaya  dari  100  jenis  HAP  yang diketahui, salah satunya adalah benzo(a)piren (Chen dan Chen, 2005).
Senyawa  benzo(a)piren  merupakan salah  satu  senyawa  hidrokarbon  aromatik polisiklik  yang  memiliki  karsinogenisitas paling  kuat  bagi  manusia  sehingga  sering dijadikan  standar  bagi  keberadaan  senyawa HAP pada makanan.  Hidrokarbon aromatik polisiklik  dapat  masuk  ke  dalam  tubuh manusia  melalui  berbagai  cara  seperti respirasi atau pernapasan, terabsorpsi melalui  pori-pori  kulit  dan  masuk  ke  dalam tubuh  melalui  makanan  dan  minuman  yang dikonsumsi (Lukitaningsih dkk, 2001). Tujuan  Penelitian  ini  yaitu menentukan kadar  senyawa  benzo(a)piren  dalam  ikan bakar.
Validasi  metode  analisis  adalah proses  pengujian  karakter  kinerja  metode
analisis melalui serangkaian uji laboratorium. Tujuannya yaitu untuk menjamin  bahwa  metode  analisis  yang digunakan  mampu  memberikan  hasil  yang cermat dan handal hingga dapat dipercaya.

## BAHAN DAN CARA KERJA Alat
Seperangkat  instrument  HPLC,  alat- alat  gelas,  timbangan  analitik,  lemari pendingin,  sentrifugasi, rotary  evaporator , mikrofilter.

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  adalah Ikan,  Ikan  bakar,  daun  pisang,  allumunium foil, Aquades , benzo(a)piren (pa), asetonitril  (pa),  methanol  (grade  HPLC), Na 2 SO 4 Anhidrat, etil asetat.

## Cara Kerja Pengambilan Sampel
Sampel  ikan  mentah  diambil  dari Rumah Makan X di kota Manado.

## Pembuatan Larutan Standar
a. Stok standar larutan 1 Larutkan 2,5 mg benzo(a)piren dalam 50 mL  asetonitril  dalam  50  mL  labu  takar  dan encerkan  sampai  tanda  dengan  asetonitril. Konsentrasi akhir benzo(a)piren 50 mg/L.
b. Stok standar larutan 2
Tambahkan 1 mL stok  larutan standar 1 ke  dalam  50  mL  labu  takar  dan  encerkan samapai tanda dengan asetonitril. Konsentrasi  akhir  benzoapiren  menjadi  1 mg/L.
c. Stok standar larutan 3
Tambahkan 1 mL stok larutan standar 2 ke  dalam  50  mL  labu  takar  dan  encerkan
sampai tanda dengan asetonitril. Konsentrasi akhir benzoapiren menjadi 20 µg/L.

## Optimasi Fase Gerak dan Laju Alir
Larutan  Standar  Benzoapiren  pada konsentrasi  20  µg/L  diinjeksikan  sebanyak 20 µL pada komposisi fase gerak Asetonitril :  Aquades  pada  perbandingan    (90:10)  dan (85:15)    dengan  perbandingan  fase  gerak terpilih  laju  alir    1,0  dan  1,5  mL/menit  dan deteksi pada panjang gelombang 254 nm.

## Perlakuan Sampel
a. Penyiapan sampel Sampel ikan mentah dibersihkan, kemudian  diberi  perlakuan  yaitu  bagian  I ikan dibakar tanpa pembungkusan, bagian II ikan  dibakar  dengan  menggunakan  daun pisang, bagian III ikan dibakar menggunakan allumunium foil.Pada masing- masing  bagian  ikan,  dibakar  dalam  waktu 30,  45,  dan  60  menit.  Setelah  itu,  sampel ikan bakar diblender hingga halus kemudian dikeringkan  dalam  oven  100 ⁰ C  hingga kandungan  air  habis  (Lukitaningsih  dkk, 2001).
b. Ekstraksi sampel Masukkan 2 g Na 2 SO 4 Anhidrat dan 2 g sampel  ke  dalam  50  mL  tabung  centrifuge kemudian  tambahkan  20  mL  etil  asetat. Campurkan selama 1 menit untuk mengekstrak,  kemudian  sentrifugasi  ekstrak selama  2  menit  pada  8000  rpm,  ambil supernatant.  Kemudian  tambahkan  20  mL etil  asetat  ke  residu  dan  ekstrak  kedua kalinya dengan cara yang sama.
Supernatant I dan II ( masing-masing 20 mL)  dievaporasi  pada  suhu  55 0 C    takar  dan encerkan  sampai  tanda  batas  dengan  etil
asetat.  Sebelum  diinjeksi  larutan  disaring terlebih dahulu dengan penyaring 0.45 µm.

## Penetapan Kadar Sampel
Sampel  disuntikkan  ke  dalam  HPLC pada  kondisi  yang  sudah  di  optimasi  (  Fase gerak  (asetonitril  :  aquades  ),  laju  alir  (1.0, dan 1.5 mL/menit))

## HASIL DAN PEMBAHASAN Optimasi Fase Gerak Dan Laju Alir
Penetapan kadar Benzo(a)piren dilakukan  pada  kondisi  optimum  yang terpilih  dengan High  Performace  Liquid
Cromatography menggunakan kolom symmetry C 18 dengan  dua  kondisi,  pertama kecepatan  alir  1,0  mL/menit,  panjang gelombang 254 nm dan volume penyuntikan 20  µL.  Komposisi  fase  gerak  semula  terdiri dari  Asetonitril  :  Aquades  (90:10)  .  Pada komposisi  ini,  waktu  retensi  Benzo(a)piren yaitu  10,048    menit.    Kemudian  dilakukan modifikasi fase gerak yaitu komposisi kedua Asetonitril  :  Aquades  (85:15)  waktu  retensi Benzo(a)piren  yaitu  8,580    menit  dengan menggunakan  laju  alir  1,5  mL/menit. Namun  hasil  optimasi  ini  memberikan  data kromatogram dengan puncak yang berdekatan dengan senyawa yang lain.
Hasil  dari  kedua  metode  tersebut, dipilihlah metode pertama yaitu menggunakan komposisi fase gerak Asetonitril : Aquades (90:10) dan kecepatan alir 1,0 mL/menit. Metode ini dipilih karena menghasilkan plat teoritis yang lebih banyak dari  pada  komposisi  fase  gerak  yang  lain, HETP ( Height Equivalent Theoritical Plate ) yang  lebih  kecil.  Faktor  kapasitasnya memenuhi persyaratan (1-10) serta asimetris yang  baik  (<2,5)  sebagaimana  tercantum pada Tabel 1.
Tabel  1 .  Hasil  penetapan  komposisi  fase gerak  pada  konsentrasi  20  µg/L,  dengan kecepatan  alir  1,0  mL/menit  dan  1,5 mL/menit , panjang gelombang 254 nm dan volume penyuntikan 20 µL.
Fa se ge ra k Tr (me nit) Luas punc ak (mV ) N HE TP Fakt or kap asita s Asi metr
is
90 : 10 10, 048 0 9012 195 1398 3,275 7 0,0 01 0 7,03 84 1,00 00 85 : 15 8,5 800 1005 6086 1631, 8764 0,0 09 1 4,54 98 0,75 00 Keterangan : Tr = Time Retention (waktu retensi)
N
= Plat teoritis
HETP = Height Equivalent Theoritical Plate

## Validasi Metode Analisis Benzo(a)pirene
Pembuatan  Kurva  Kalibrasi  dan  Uji Linearitas Benzo(a)pirene
Uji  ini  dilakukan  pada  seri  larutan standar Benzo(a)piren dengan tiga konsentrasi yaitu 0,1 µg/L; 0,5 µg/L dan 1,0 µg/L.  Dari  uji  ini  diperoleh  persamaan regresi  liniear  dan  koefisien  korelasi  (r). Hasil  uji  ini  diperoleh  persamaan  Y  = 23050X + 760,74 dan koefisien korelasi (r 2 ) 0,9017. Kurva kalibrasi dari persamaan garis tersebut terdapat pada Gambar 1.
Gambar 1. Kurva kalibrasi Benzo(a)piren

## Uji Akurasi
Uji  Akurasi  dilakukan  dengan  3 konsentrasi  sampel    yaitu  pada  0,1  µg/L,; 0,5 µg/L dan 1,0 µg/L dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali untuk masing- masing  konsentrasi.  Syarat  hasil  uji  akurasi adalah % diff dengan nilai ≤ 15%. Hasil uji rata-rata dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel. 2 . Hasil uji rata-rata akurasi
C (µg/L ) Rata- rata Luas Punca k (mV) Rata-rata Konsentra si terukur (µg/L) Rata- rata peroleha n kembali (%) % diff rata - rata 0,1 3229,6 7 0,10 100,00 0,0 0 0,5 4816,6 7 0,47 101,73 5,2 0 1,0 6897,0 0 0,97 97,67 - 6,7 0
y = 23050x + 760,74 R² = 0,9017 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 0,5 1 1,5 L u as P u n cak (m V) Konsentrasi (µg/L) luas area Linear (luas area)

## Uji Presisi
Uji  dilakukan  dengan  menggunakan 3 konsentrasi yaitu pada 0,1 µg/L;  0,5 µg/L dan  1,0  µg/L.  Dilakukan  pengulangan sebanyak  3  kali  untuk  masing-masing konsentrasi, dilakukan pada pengujian intra- hari  (dalam  1  hari)  dan  inter-hari  (selama  2 hari).  Syarat  hasil  uji  presisi  adalah simpangan baku relatif atau %RSD ( Relative Standard  Deviation )  dari  masing-masing konsentrasi  dengan  nilai  ≤  15  %.  Hasil  Uji rata-rata  presisi  dapat  dilihat  pada  Tabel  3 dan 4.
Tabel 3 . Hasil uji rata-rata presisi hari pertama
C (µg/L) Rata-rata Luas Puncak (mV) SD RSD (%) 0,1 3229,67 0,44 0,01 0,5 4816,67 28,81 0,54 1,0 7170,00 0,00 0,00 Tabel 4 . Hasil uji rata-rata presisi hari kedua C (µg/mL) Rata-rata Luas Puncak (mV)
SD RSD (%) 0,1 2410,67 0,44 0,01 0,5 1421,30 0,31 0,02 1,0 1455,67 0,44 0,01
Uji  Batas  Deteksi  (LOD)  dan  Batas Kuantitas (LOQ)
Uji  batas  deteksi  dan  batas  kuantitas dilakukan  untuk  mengetahui  batas  deteksi dan  batas  kuantitas  terendah  dari  larutan
(benzo(a)piren) yang masih dapat menghasilkan  data  dengan  akurasi  dan presisi  yang  baik.  Batas  deteksi  yang diperoleh dari pengujian sebesar 13,53 µg/L dan  batas  kuantitas  45,11    µg/L.  Data mengenai  uji  batas  deteksi  dan  batas kuantitas dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Hasil uji batas deteksi, batas kuantitas dan koefisien fungsi
Parameter Nilai Simpangan Baku Residual (S y/x) 3432,15 Limit Deteksi (LOD) 13,53 µg/L Limit Kuantitas (LOQ) 45,11 µg/L Penetapan Kadar Benzo(a)piren Tabel 6 . Hasil Penetapan kadar Benzo(a)piren  dalam  Sampel  ikan  Bakar dirumah makan X Kota Manado
Sampe l Ikan Bakar Ruma h Maka n Kota Mana do Luas Punca k (mV) Rata- rata Wakt u retens i (meni
t)
Kadar Teruk ur (µg/L) Keterang an
X 35566 2 10,23 7 15,39 7 D
Keterangan : D : Terdeteksi TD : Tidak terdeteksi

## PEMBAHASAN
Pada  penelitian  ini  telah  dilakukan penetapan  kadar  Benzo(a)piren  dalam  ikan bakar.  Penelitian  ini  dilakukan  sebagai pengujian  terhadap  makanan  dari  segi
keamanannya.  Namun  sebelum  dilakukan penetapan  kadar  perlu  dilakukan  optimasi dan validasi agar mendapatkan metode yang terbaik  untuk  analisa  kadar  Benzo(a)piren dalam  ikan  bakar.  Metode  analisis  dengan menggunakan  alat  HPLC  ini  dipilih  karena memiliki banyak kelebihan di antaranya cara kerjanya sederhana dan sensitif.
Hal  yang  pertama  kali  dilakukan adalah  penetapan  komposisi  fase  gerak  dan laju  alir.  Penetapan  komposisi  fase  gerak dan  laju  alir  pada  kondisi  optimum  yang terpilih  dengan High  Performance  Liquid Cromatography menggunakan kolom symetry (C 18 )  pada  dua  kondisi,  pertama kecepatan  alir  1,0  mL/menit,  panjang gelombang 254 nm dan volume penyuntikan 20  µL.  Komposisi  fase  gerak  semula  terdiri dari  Asetonitril  :  Aquades  (90  :  10).  Pada komposisi  ini,  waktu  retensi  benzo(a)piren yaitu  10,048  menit.    Dimana  hasil  dari kondisi  pertama  menunjukkan  plat  teoritis (N)  13983,275    ,  HETP  0,0010,  faktor kapasitasnya 7,0384 dan asimetri atau faktor pengekorannya 1,0000. Kemudian dilakukan modifikasi fase gerak yaitu komposisi kedua Asetonitril : Aquades (85 : 15) waktu retensi benzo(a)pirene  yaitu  8,580  menit  dengan menggunakan  laju  alir  1,5  mL/menit.  Pada kondisi kedua dihasilkan kondisi kromatogram  yang  sangat  berdekatan , hasil plat  teoritisnya  (N)  1631,8764,  HETP 0,0091  ,  faktor  kapasitasnya  4,5498  dan asimetrinya 0,7500.
Jika dibandingkan dari kedua kondisi tersebut  kondisi  pertama  memberikan  hasil parameter  yang  memenuhi  persyaratan karena semakin banyak lempeng teoritis (N) maka  pemisahan  semakin  baik.  Semakin
panjang  L  (panjang  kolom)  maka  semakin banyak jumlah lempeng teoritis dan efisiensinya semakin bagus.  Sedangkan jika HETP semakin rendah maka efisiensi kolom semakin  baik.  Sehingga  dipilihlah  kondisi pertama sebagai parameter terhadap penetapan  kadar  benzo(a)piren  selanjutnya. Sedangkan jika dilihat dari kedua komposisi fase  gerak  tersebut,  terlihat  bahwa  semakin tinggi  konsentrasi  asetonitril  dan  laju  alir yang  digunakan  maka  waktu  retensi benzo(a)piren semakin cepat namun resolusinya  semakin  berkurang.  Hal  ini disebabkan  oleh  semakin  banyaknya  fase organik (kepolaran berkurang) maka afinitas ikatan  analit  terhadap  kolom  yang  nonpolar akan  semakin  berkurang  sehingga  analit tidak  tertahan  secara  kuat  pada  kolom  dan terelusi  lebih  cepat,  namun  hal  ini menyebabkan  resolusinya  juga  berkurang  ( Snyder dkk, 2010).
Validasi metode Benzo(a)piren menggunakan  HPLC  dilakukan  dengan tujuan  untuk  memastikan  bahwa  metode tersebut akurat dan dapat digunakan sebagai metode untuk penetapan kadar Benzo(a)piren  dalam  ikan  bakar.  Validasi metode  yang  dilakukan  adalah  validasi sebagian dengan mempertimbangkan bahwa metode  yang  dilakukan  pada  penelitian  ini merupakan  modifikasi  dari  metode  yang telah  dilakukan  sebelumnya.  Parameter validasi  yang  dilakukan  meliputi  linearitas, akurasi,  presisi,  limit  deteksi  dan  limit kuantitas.
Liniearitas  merupakan  kemampuan metode  anlisis  yang  memberikan  respon yang  secara  langsung  proporsional  terhadap konsentrasi  analit  dalam  sampel.  Dari
percobaan dibuat larutan standar Benzo(a)piren  dengan  konsntrasi  0,1;  0,5 dan  1,0  µg/L.  Didapatkan  hasil  persamaan garis  regresi  liniear  Y  =  23050X  +  760,74 dan koefisien korelasi (r 2 ) 0,9017. Koefisien korelasinya  menunjukkan  hasil  yang  cukup baik  sesuai  dengan  kriteria  linearitas  untuk senyawa  induk  pada  tingkat  koefisien korelasi 0,9000 (Hasan, 2006).
Uji akurasi dilakukan untuk mengetahui  kedekatan  hasil  penetapan  yang diperoleh  dengan  hasil  sebenarnya.  Akurasi diperiksa  dengan  menghitung  perbedaan nilai  yang  terukur  dengan  nilai  sebenarnya (%diff).  Pada  uji  akurasi  ini  digunakan  3 konsentrasi  yaitu  0,1  ;  0,5  dan  1,0  µg/L. Persyaratan  yang  ditentukan  adalah  %diff ±15%  (Gandjar  &  Rohman,  2007).  Pada konsentrasi  0,1  µg/L  diperoleh  hasil  %diff rata-rata  sebesar  0,00%,  konsentrasi  0,5 µg/L  diperoleh  %diff  rata-rata  sebesar 5,20%  dan  konsentrasi  1,0  diperoleh  %diff rata-rata sebesar -6,70%. Kemudian dihitung juga nilai perolehan kembalinya (% Recovery)  dengan  cara  membandingkan konsentrasi  benzo(a)piren  yang  terukur dengan  kadar  benzo(a)piren  sebenarnya dikalikan 100%. Nilai uji perolehan kembali pada konsentrasi 0,1 µg/L berkisar 100,00% , konsentrasi 0,5 µg/L berkisar 101,73% dan konsentrasi  1,0  µg/L  berkisar  97,76%. Perolehan  kembali  disyaratkan  pada  kisaran 80  -110%  pada  tiap  level  (Yuwono  & Indrayanto, 2005).
Berdasarkan  ketiga  konsentrasi  yang telah  diperoleh,    perolehan  kembali  dari  ke tiga konsentrasi tersebut telah sesuai dengan persyaratan  yang  ada.  Perbedaan  hasil perolehan kembali dan % diff ini disebabkan
oleh  luas  area  puncak  yang  timbul  saat pembacaan  di  sistem  HPLC  .  Keakuratan data  tersebut  disebabkan  oleh  sistem  yang ada  karena  sistem  tersebut  berubah-ubah. Pengujian perolehan kembali dilakukan pada tiga  konsentrasi  dengan  tujuan  untuk memeberikan  batas  range  bahwa  pada konsentrasi  demikian  analit  yang  terukur pada  daerah  tersebut  masih  terbaca  dengan baik oleh detektor.
Presisi adalah ukuran yang menunjukan  derajat  kesesuaian  antara  hasil uji  individual,  diukur  melalui  penyebaran hasil  individual  dari  rata-rata  jika  prosedur diterapkan secara berulang pada sampel. Uji presisi  dilakukan  intra-hari  dan  inter-hari, pada  pengujian  intra-hari,  konsentrasi  yang digunakan  yaitu  0,1  µg/L  diperoleh  %RSD ( Relative Standard Deviation) sebesar
0,01%,  pada  konsentrasi  0,5  µg/L  sebesar
0,59%  dan  konsentrasi  1,0  µg/L  diperoleh 0,00%. Sedangkan pada pengujian inter-hari %RSD  ( Relative  Standard  Deviation) yang diperoleh  dari  konsentrasi  0,1  µg/L  yaitu 0,01%,  konsentrasi  0,5  µg/L  yaitu  0,02% dan  1,0  µg/L  yaitu  0,01%.    Terlihat  dari kedua data intra-hari dan inter-hari selama 2 hari  berturut-turut  hasil  %RSD  (Relative Standard Deviation) ≤ 15 %. Hasil ini sesuai dengan teori yang mengatakan bahwa untuk senyawa-senyawa dengan pengukuran kadar sekelumit, nilai %RSD dapat diterima jika ≤ 15%  (Gandjar  &  Rohman,  2007).  sehingga bisa dikatakan pada uji presisi ini memenuhi syarat.  Uji  ini  dilakukan  intra-hari  dan  inter hari selama 2 hari untuk memastikan bahwa setelah  sediaan  disimpan  masih  stabil  dan tidak mengganggu hasil analisa.
Langkah selanjutnya adalah penetapan batas deteksi dan batas kuantitasi. Batas  deteksi  merupakan  jumlah  terkecil analit  dalam  sampel  yang  dapat  dideteksi yang masih memeberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitas merupakan kuantitas  terkecil  analit  dalam  sampel  yang masih  dapat  memenuhi  kriteria  akurat  dan seksama.  Batas  deteksi  dan  batas  kuantitasi dihitung  dari  persamaan  regresi  yang diperoleh  dari  kurva  kalibrasi  (Ermer  and Burgess,  2005).  Hasil  dari  uji  batas  deteksi ini  adalah  13,53  µg/L  dan  batas  kuantitasi sebesar 45,11 µg/L.
Penetapan  kadar  benzo(a)piren  pada ikan  bakar  yang  ada  dirumah  makan  X  di Kota Manado yaitu 15,397 µg/L.
Kandungan benzo(a)piren yang terdapat dalam sampel dirumah makan X di Kota Manado melebihi batas yang dianjurkan oleh The Joint FOA/WHO Expert Committee  on  Food  Additivies (JEFTA) yaitu  10  μg/kg  atau  10  ppb.  Besarnya kandungan benzo(a)piren disebabkan karena proses  pembakaran  yang  terlalu  lama,  suhu yang  tinggi  dan  jarak  pembakaran  antara ikan dan api yang terlalu dekat. Waktu, suhu dan  jarak  pembakaran  merupakan  variabel yang sangat berpengaruh pada pembentukan senyawa HAP selama proses pembakaran.

## KESIMPULAN
1. Kondisi  optimum  untuk  penetapan kadar  Benzo(a)piren  secara  HPLC
dengan  fase  gerak  Asetonitril  :
Aquades  (90:10),  dan  laju  alir  1,0 mL/menit. Hasil Validasi
menunjukkan  bahwa  metode  analisis
yang dilakukan sudah cukup memenuhi persyaratan untuk
linearitas (r 2 =9,017), akurasi  (%diff ≤ 15)  ,  presisi  (%  RSD  ≤  15),  batas deteksi  (13,53  µg/L)  dan  batas kuantitas  (45,11  µg/L).    Secara keseluruhan metode yang telah divalidasi bisa digunakan untuk penetapan kadar Benzo(a)piren.
2. Berdasarkan  hasil  penelitian  yang dilakukan  kadar  benzo(a)piren  dalam ikan  bakar  dirumah  makan  X  yaitu 15,397 µg/L.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim.  2010.  Peraturan  Kepala  Badan POM  RI  Tentang  Penetapan  Batas Maksimum  Cemaran  Mikroba  dan Kimia dalam Makanan. Buletin Keamanan  Pangan . 7 .  8-9.  Badan POM RI.
Chen, J., and Chen, S. 2005. Removal of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Low Density Polyethylene from Liquid Model and Roasted Meat. Food Chemistry ., 90 : 461-469.
Farhadian,  A.  2010. Polycyclic  Aromatic Hydrocarbons  In  Grilled  Beef  and Chicken and Their Reduction Through Various Treatments , Tesis diterbitkan, Faculty Food Science and Technology Scope, Universiti Putra Malaysia.
Farhadian,  A.,  Jinap  S.,  Hanifah  H.N.,  and Zaidul  I.S.    2011.  Effects  of  Meat Preheating  and  Wrapping  on  The Levels of Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons in Charcoal-grilled
Meat, Food Chemistry . 124 : 141-146.
Lukitaningsih,  E.,  Sudarmanto,  A.,  dan
Noegrohati,  S.    2001.  Analisis Kandungan Senyawa  Hidrokarbon
Polisiklik  Aromatik  dalam  Daging
Olahan. Majalah Farmasi  Indonesia .
12 (3): 103-108.
Snyder,  L.  R.,  Kirkland,  J.J.,  and  Dolan, J.W.  2010. Introduction  to  Modern
Liquid Cromatography, John Wiley &
Sons, Inc., New Jersey. USA