## Jurnal Penelitian Kehutanan Wallacea
Akreditasi LIPI: 764/AU1/P2MI-LIPI/10/2016 Akreditasi KEMENRISTEKDIKTI: 36b/E/KPT/2016
eISSN 2407-7860 pISSN 2302-299X
www.jurnal.balithutmakassar.org

## ISOLASI DAN POTENSI BAKTERI FIKSASI NITROGEN SIMBIOTIS DARI BINTIL AKAR
Falcataria moluccana (Miq.) Barneby & J.W.Grimes UNTUK MENDUKUNG REKLAMASI LAHAN BEKAS TAMBANG NIKEL
(Isolation and Potency of Symbiotic Nitrogen Fixation Bacteria from Nodules of Falcataria moluccana (Miq.) Barneby & J.W.Grimes for Supporting Nickle Postmining Area Reclamation)
Ramdana Sari and Retno Prayudyaningsih*
Balai Penelitian dan Pengembangan Lingkungan Hidup dan Kehutanan Makassar Jalan Perintis kemerdekaan Km. 16 Makassar Kode Pos 90243, Sulawesi Selatan, Indonesia
Article Info ABSTRAK Article History: Received 18 May 2020;
received in revised form 1
August 2020; accepted 4
August 2020. Available online since 31 August 2020
Kata Kunci: Isolasi, Sengon, Fiksasi nitrogen, Rhizobium , Bradyrhizobium
Keywords: Isolation, Sengon, Nitrogen fixation, Rhizobium, Bradyrhizobium
How to cite this article: Sari, R., & Prayudyaningsih, R. (2020). Isolation and potency of Symbiotic Nitrogen Fixation Bacteria from Nodules of Falcataria moluccana (Miq.) Barneby & J.W.Grimes for Supporting Nickle Postmining Area Reclamation . Jurnal Penelitian Kehutanan Wallacea, 9 (2), 111-120. doi: http://dx.doi.org/10.18 330/jwallacea.2020.vol9iss 2pp111-120
Tambang  nikel  merupakan  salah  satu  penyumbang  devisa  terbesar  di  Indonesia,  juga meninggalkan lahan dengan sifat fisik, kimia dan biologi tanah yang buruk. Kondisi lahan seperti itu berpengaruh langsung terhadap pertumbuhan tanaman sehingga menghambat upaya  reklamasi.  Penanaman  jenis-jenis  legum,  salah  satunya  sengon  laut  ( Falcataria moluccana ), pada reklamasi lahan bekas tambang bertujuan untuk memperbaiki sifat-sifat tanah. Tanaman legum mempunyai rasio C/N rendah sehingga introduksi mikroorganisme tanah penambat nitrogen merupakan salah satu alternatif yang dapat digunakan untuk mengembalikan  kesuburan  tanah.  Bakteri  penambat  nitrogen  mampu  menyediakan senyawa  nitrogen  yang  bisa  langsung  dimanfaatkan  oleh  tanaman.    Selain  itu, pemanfaatan jenis tanaman cepat tumbuh seperti sengon laut cocok untuk  memulihkan lahan  kritis.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  melakukan  isolasi  dan  karakterisasi  bakteri fiksasi nitrogen simbiotis dari bintil akar sengon laut sehingga dapat dibuat inokulum dan diaplikasikan  pada  tanaman  di  lahan  bekas  tambang  nikel.  Sebanyak  5  isolat  bakteri diperoleh dari bintil akar sengon laut yang tergolong pada genus rhizobium (3 isolat) dan Bradyrhizobium (2 isolat). Semua isolat yang diperoleh berbentuk batang, Gram negatif dan  tidak  membentuk  endospora.  Uji  fisiologis  yang  dilakukan  menunjukkan  bahwa kelima  isolat  bersifat  aerob,  motil,  tumbuh  optimal  pada  media  YEMA  ( Yeast  Extract Mannitol  Agar )  dengan  pH  6  dan  7,  tetapi  tidak  tumbuh  pada  pH  4.  Uji  potensi  yang meliputi Acetylen  Reduction  Assay dan  uji Indole  Acetic  Acid menunjukkan  bahwa isolat A3.1  SL  5  memiliki  nilai  tertinggi,  yaitu  9,01  ppm  dan  0,447  ppm  dan  berpotensi dikembangkan sebagai inokulum.

## ABSTRACT
Nickel mine is one of the contributors foreign to exchange earners in Indonesia. However, the former mining area creates a complex problem in the physical, chemical, and biological soil properties which directly affect the ability of plant growth for restoration. The planting of legume species, one of them is sengon laut (Falcataria moluccana), in the reclamation of ex- mining  land  aims  to  improve  soil  properties.  Legume  plants  have  low  C/N  ratio  so  the introduction of nitrogen-fixing soil microorganisms is  one alternative that can be used  to improve soil fertility. Nitrogen fixing bacteria can provide nitrogen compounds that can be directly utilized by plants. In addition, the utilization of fast-growing species such as sengon laut is suitable for rehabilitation of critical lands. This study aims to isolate and characterize symbiotic  nitrogen  fixation  bacteria  so  it  can  be  made  as  inoculum  and  applied  on revegetation in nickel postmining area. Five bacterial isolates were obtained from nodules of sengon laut belonging to genus Rhizobium (3 isolates) and Bradyrhizobium (2 isolates). All isolates obtained were rod-shaped, Gram negative and did not have endospores. Physiological tests showed that all isolates were aerobic, motile, grew optimally on YEMA media at pH 6 and 7, but did not grow at pH 4. Initial potential test of Acetylen Reduction Assay and IAA test showed that A3.1 SL 5 isolate has the highest value (9.01 ppm and 0.447 ppm) and potential to be inoculum.
Read online: Scan this QR code with your Smart phone or mobile
device to read online.
*Corresponding author. Tel: +62 411554049 Fax: +62 411554058 E-mail address: prayudya93@yahoo.com (R. Prayudyaningsih)

## I. PENDAHULUAN
Tingginya  potensi  kekayaan  mineral seperti  nikel  di  Indonesia  menyebabkan banyak investor asing berminat menanamkan modalnya  (Suciana  &  Surdin, 2016 ).  Kondisi ini
berpengaruh positif terhadap pertumbuhan  ekonomi  Indonesia,  terlebih tambang  nikel  merupakan  salah  satu penyumbang terbesar devisa negara. Selain itu, kegiatan  penambangan  nikel  juga  membuka peluang  kerja  bagi  masyarakat.  Oleh  karena itu, sampai saat ini ketergantungan Indonesia terhadap  penerimaan  sektor  energi  dan sumber daya mineral masih tinggi. Mempertimbangkan  kondisi  tersebut  maka Kementerian Energi dan Sumber Daya Mineral (ESDM)  membuat  suatu  kebijakan  untuk meningkatkan  peran  sektor  ESDM  (Usman, 2011 ). Nikel dapat ditemukan pada lapisan bumi dekat  dengan  permukaan  tanah.  Untuk memperoleh mineral ini diperlukan penggalian  yang  dikenal  dengan  sistem penambangan terbuka ( open pit mine method ) (Dariah et  al ., 2010 ).  Kegiatan  ini  tentunya menimbulkan  kerugian  seperti  hilangnya vegetasi  penutup  lahan  yang  meninggalkan masalah  serius,  baik  dari  sifat  fisik,  kimia maupun  biologi  tanah.  Utami  ( 2009 ) menjabarkan  bahwa  kerusakan  tanah  secara fisik  dapat  dilihat  dari  porositas  tanah  yang rendah, nilai bulk density yang meningkat dan pori  drainase  yang  menurun.  Hal  ini  terjadi karena  penggunaan  alat-alat  berat  selama penambangan menyebabkan terjadinya pemadatan  tanah.  Begitu  pula  dengan  aspek kimia, sistem penambangan terbuka menyebabkan  nilai  Kapasitas  Tukar  Kation (KTK) rendah, terjadinya perubahan pH serta menurunnya  kandungan  unsur-unsur  hara esensial  di  dalam  tanah.  Kerusakan  pada kedua  aspek  tersebut  tentunya  akan berpengaruh pada keberadaan mikroorganisme  tanah.  Kondisi  tanah  yang buruk  seperti  ini  akan  berdampak  negatif terhadap  fungsi  dan  perkembangan  akar tanaman.
Undang-undang  No.  4  Tahun  2009 tentang bahan mineral dan batubara memberi aturan yang tegas bahwa pemegang izin usaha penambangan harus melaksanakan reklamasi pasca  penambangan.  Akan  tetapi,  upaya  ini terkadang  mengalami  hambatan,  salah
satunya disebabkan oleh kondisi lahan miskin unsur  hara  sehingga  tanaman  sangat  sulit untuk  tumbuh.  Dengan  demikian,  untuk mendukung  keberhasilan  reklamasi  lahan bekas  tambang  nikel  dapat  dicapai  melalui introduksi  mikroorganisme  tanah  yang bersimbiosis dengan akar tanaman. Penelitian yang  dilakukan  oleh  Leomo et  al .  ( 2013 ) menunjukkan  bahwa  rhizobakteri  yang diaplikasikan  pada  lahan  bekas  tambang dapat  menyediakan  hara  yang  cukup seimbang sehingga mampu memacu pertumbuhan legum jenis cover crop . Rhizobia merupakan salah satu kelompok mikroorganisme  tanah  yang  bersimbiosis dengan  tanaman  legum  dan  mampu menyediakan hara, khususnya unsur nitrogen, untuk  dimanfaatkan  secara  langsung  oleh tanaman  dalam  proses  metabolisme.  Bakteri yang bersimbiosis dengan bintil akar tanaman legum  ini  telah  terbukti  dapat  memacu pertumbuhan tanaman, khususnya pada lahan marginal (Widawati et al ., 2015 ). Sengon laut ( Falcataria moluccana (Miq.) Barneby & J.W.Grimes) merupakan salah satu jenis  legum  yang  memiliki  nilai  Indeks  Nilai Penting  (INP)  tertinggi  pada  lahan  bekas tambang nikel PT. Stargate Pasific Resources, sebesar  223,21  untuk  fase  pancang  dan tergolong  jenis  yang  tumbuh  cepat  ( fast growing  species )  (Prayudyaningsih et  al. , 2015 ).  Oleh  karena  itu,  tanaman  ini  cocok dipilih untuk reklamasi lahan bekas tambang. Akan  tetapi  masih  sedikit  penelitian, khususnya di Indonesia, mengenai pemanfaatan  bakteri  rhizobia  pada  lahan bekas  tambang  nikel  yang  diintroduksi  pada tanaman  kehutanan.  Bahkan  belum  ada penelitian  yang  mengkaji  bakteri  fiksasi nitrogen simbiotik indigenous dari bintil akar sengon  laut  untuk  diaplikasikan  dalam reklamasi  lahan  kritis,  terlebih  pembuatan inokulumnya. Oleh karena itu, hasil penelitian ini  akan  memberikan  informasi  baru  yang mampu melengkapi informasi-informasi sebelumnya  terkait  pemanfaatan  bakteri fiksasi nitrogen simbiotis. Sebagai tahap awal, pembuatan inokulum, isolasi, dan karakterisasi bakteri fiksasi nitrogen simbiotis perlu dilakukan untuk memperoleh informasi  mengenai  sifat  bakteri  yang potensial dalam mendukung upaya reklamasi lahan kritis, seperti pada lahan bekas tambang nikel.

## II. METODE PENELITIAN
A. Lokasi dan Waktu Penelitian Pengambilan sampel bintil akar dilakukan bulan Agustus 2015 pada tanaman sengon  laut  yang  ditanam  di  lahan  bekas tambang nikel PT. Stargate Pasific Resources, Kabupaten Konawe Utara, Sulawesi Tenggara. Tanaman  sengon  laut  tersebut  berumur  2 tahun dengan rata-rata diameter 1,31 cm dan tinggi  2,37  m.  Tanaman  tersebut  ditanam  di lahan yang sebelumnya telah ditaburi top soil . Penanaman  sengon  laut  merupakan  bagian dari  kegiatan  revegetasi  untuk  reklamasi lahan bekas tambang nikel. Proses isolasi dan karakterisasi bakteri fiksasi nitrogen dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Balai Penelitian  dan  Pengembangan  Lingkungan Hidup  dan  Kehutanan  (BP2LHK)  Makassar yang dilakukan pada bulan September 2015- Juni 2016. Uji potensi isolat rhizobia dilakukan di  Laboratorium  Mikrobiologi  BP2LHK Makassar dan Laboratorium Balai Besar Pasca Panen Pertanian, Bogor.

## B. Alat dan Bahan Penelitian
Alat  dan  bahan  yang  digunakan  untuk pengambilan sampel di lapangan adalah botol sampel, linggis, gunting, silica gel, dan kapas. Alat  dan  bahan  yang  digunakan  di laboratorium adalah Laminary Air Flow (LAF), autoclave ,  timbangan  digital,  inkubator, hot plate ,  stirrer,  erlenmeyer,  gelas ukur, spatula, labu  semprot,  jarum  ose  (lurus  dan  bulat), mikroskop,  bintil  akar,  media Yeast  Extract Mannitol  Agar (YEMA),  pewarna  Gram,  H 2 O 2 3%, media Sulfit Indole Motility Agar (SIMA), Malachite Green , Safranin 5%, minyak emersi, akuades.  Alat  dan  bahan  yang  digunakan dalam uji potensi awal adalah spektrofotometer, shaker ,  sentrifuse,  media Luria  Bertani (LB)  cair  yang  mengandung triptofan dan reagen Salkowsky.

## C. Prosedur Kerja
1. Pengambilan bintil akar Pengambilan  bintil  akar  legum  dimulai dengan menentukan pohon yang akan diambil bintil  akarnya.  Setelah  menemukan  bintil akar,  maka  bintil  tersebut  dipotong  dengan menggunakan cutter /gunting lalu tanah yang menempel pada bintil dibersihkan. Bintil akar yang  dipilih  adalah  bintil  yang  berukuran
cukup  besar  dan  apabila  dibelah  berwarna merah muda.

## 2. Isolasi Bakteri Penambat Nitrogen
Bintil  akar  dicuci  dengan  air  mengalir untuk  menghilangkan  tanah  yang  menempel pada  permukaannya  lalu  direndam  dalam etanol  95%  selama  5–10  detik,  selanjutnya dicuci  dengan  aquadest  steril.  Bintil  akar kemudian direndam pada H 2 O 2 3% selama 3– 4  menit  lalu  dicuci  dengan  aquadest  steril untuk  menghilangkan  H 2 O 2 3%  dari  bintil (pencucian dilakukan sebanyak 5 kali). Bintil akar  kemudian  dikeringkan  lalu  ditumbuk dengan mortar dan selanjutnya ditambahkan 1  tetes  larutan  NaCl  0,85%.  Suspensi kemudian  diinokulasi  pada  media  YEMA. Koloni  yang  tumbuh  dengan  morfologi berbeda kemudian ditumbuhkan pada media YEMA  dengan  penambahan Congo  Red (CR) sebanyak 10 ml/L untuk menguji kemurnian isolat serta media YEMA dengan penambahan Bromthymol  Blue (BTB)  sebanyak  5  ml/L untuk melihat sifat dan kecepatan tumbuhnya. Metode  ini  mengacu  pada  Somasegaran  dan Hoben ( 1994 ).

## 3. Karakterisasi Bakteri Fiksasi Nitrogen
Kultur  murni  yang  telah  diperoleh kemudian dikarakterisasi secara mikroskopik dengan  melakukan  pewarnaan  Gram  dan pewarnaan  endospora,  serta  uji  biokimia berupa uji motilitas, uji ketahanan pH dan uji katalase  (Somasegaran  &  Hoben, 1994 ). Tingkat kemasaman tanah (pH) di lahan bekas tambang  nikel/lokasi  penelitian  adalah  5,85 (Prayudyaningsih et al ., 2015 ). Nilai pH tanah di  lokasi  penelitian  dapat  dijadikan  dasar menentukan kisaran pH dalam uji ketahanan pH  untuk  karakterisasi  jenis  bakteri  yang diperoleh.

## 4. Uji ARA dan IAA
Untuk  memperoleh  isolat  Rhizobia  yang potensial,  maka  dilakukan  proses  seleksi dalam  2  tahap  pengujian,  yaitu  uji  ARA ( Acetylene  Reduction  Assay )  dan  uji kandungan  IAA  ( Indole  Acetic  Acid ).  Metode ini mengacu pada Sudrajat et al . ( 2013 ).

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Isolasi Bakteri Fiksasi Nitrogen Simbiotis
Sebanyak  5  isolat  bakteri  rhizobia berhasil diisolasi dari bintil akar sengon laut
yang  ditanam  di  lahan  bekas  tambang  nikel, khususnya dari areal yang sebelum dilakukan revegetasi  telah  ditaburi  top  soil.  Sari  dan Prayudyaningsih  ( 2016 )  sebelumnya  juga berhasil  memperoleh  7  isolat  rhizobia  dari areal yang sama tetapi sumber isolat berasal dari tanah bukan dari bintil akar sengon laut. Sengon  laut  adalah  jenis  pohon  yang  dapat dipilih untuk revegetasi lahan bekas tambang. Jenis tanaman ini merupakan tanaman pionir (Hakim, 2016 )  yang  umumnya  mampu bertahan  pada  lahan-lahan  kritis  karena adanya  bantuan  mikroorganisme  potensial, seperti  rhizobia  yang  tumbuh  pada  bintil akarnya  (Howieson  &  Dilworth, 2016 ). Menurut  Sari  dan  Prayudyaningsih  ( 2018 ), bintil  akar  sengon  laut  yang  terbentuk  dari simbiosis  dengan  rhizobia  memiliki  tipe indeterminate dengan  banyak  percabangan pada bintilnya.
Kelima  isolat  tersebut  dipilih  karena tumbuh baik pada media YEMA (terlihat dari pertumbuhan  koloni  bakteri  yang  menyebar di  permukaan  media)  dan  memiliki  bentuk morfologi koloni yang berbeda-beda ( Tabel 1 ). Media YEMA merupakan media selektif untuk menumbuhkan bakteri rhizobia. Isolat A1.1 SL 1 memiliki bentuk koloni bulat dengan elevasi terangkat. Isolat tersebut memiliki tepi (batas) koloni  yang  rata  dan  nampak  jelas keseluruhan, sedangkan isolat A1.1 SL 8, A3.3 SL 3, A.3.1 SL 5, dan A3.3 SL 4 memiliki bentuk
koloni  yang  tidak  beraturan  dengan  elevasi datar  (tidak  cembung)  dan  tepi  koloni bergelombang.  Permukaan  koloni  kelima isolat  tersebut  licin  ( smooth )  dan  memiliki lendir  disebut extracelluler  polysaccharida (EPS)  yang  mengindikasikan  semua  isolat termasuk  dalam  kelompok  bakteri  rhizobia. Warna  koloni  bervariasi,  ada  yang  berwarna putih, putih kecokelatan, dan cokelat. Shetta et al. ( 2011 ) menyatakan lendir transparan yang dihasilkan  oleh  koloni  bakteri  rhizobia berubah menjadi kecokelatan setelah diinkubasi selama 3 x 24 jam pada suhu 28°C. Selain  itu,  komposisi  dan  kadar  EPS  yang dimiliki  oleh  mikroorganisme  tergantung pada jenis mikroorganisme itu sendiri, umur biofilm  dan  keadaan  lingkungan  yang berbeda-beda  (Mayer et  al., 1999 ).  Isolat bakteri rhizobia yang diisolasi oleh Gyorgy et al . ( 2010 ) dari padang rumput di pegunungan Ciuc  di  Transylvania,  Romania,  umumnya memiliki  bentuk  bulat  (satu  isolat  dengan bentuk tidak  beraturan ),  elevasi  koloni terangkat  ataupun datar dengan  tepi  koloni yang jelas keseluruhan ataupun
bergelombang serta warna koloni kuning dan krem.
Semua isolat kemudian diinokulasi pada media  YEMA  yang  ditambahkan  larutan indikator Congo  Red (CR)  dan Bromthymol Blue (BTB).  Somasegaran  dan  Hoben  ( 1994 ) menyatakan rhizobia tidak memiliki
Tabel 1 . Karakteristik morfologi koloni bakteri Rhizobia Table 1 . Morphological characteristics of Rhizobia colony bacteria
Isolat
( Isolate ) Karakteristik morfologi koloni (Morphological characteristic of colony) Bentuk (Shape) Kemiringan (Elevation) Tepi (Margin) Permukaan (Surface) Warna (Colour) A1.1 SL 1 Circular Raised Entire Smooth Putih kecokelatan (brownish white) A1.1 SL 8 Irregular Flat Undulate Smooth Putih kecokelatan (brownish white) A3.3 SL 3 Irregular Flat Undulate Smooth Putih (white) A3.1 SL 5 Irregular Flat Lobate Smooth Cokelat (Brown) A3.3 SL 4 Irregular Flat Lobate Smooth Putih (White) Keterangan (Remarks) : A1. 1.SL.1= isolat ke 1 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A1 pada plot ke-1 (1 st isolate from sea sengon root nodule in the A1 revegetation area in the 1 st plot) A1.1. SL.8 = isolat ke 8 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A1 pada plot ke-1 (8 th isolate from the nodules of sengon laut roots in the A1 revegetation area in the 1 st plot) A3.3. SL.3 = isolat ke 3 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A3 pada plot ke-3 (3 rd isolate from the nodules of sengon laut roots in the A1 revegetation area in the 3 rd plot) A3.1. SL.5 = isolat ke 5 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A3 pada plot ke-1 (5 th isolate from the nodules of sengon laut roots in the A3 revegetation area in the 1 st plot) A3.3. SL.4 = isolat ke 4 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A3 pada plot ke-3 (4 th isolate from the nodules of sengon laut roots in the A1 revegetation area in the 3 rd plot)
kemampuan untuk menyerap larutan indikator CR sehingga isolat yang ditumbuhkan  pada  media  YEMA+CR  akan berwarna  putih  ataupun  pink  pucat  (sedikit menyerap CR), sedangkan uji BTB merupakan uji  sederhana  untuk mendeterminasi  apakah isolat  termasuk  dalam  bakteri  rhizobia tumbuh  cepat  atau  tumbuh  lambat.  Respon isolat rhizobia dapat dilihat pada Tabel 2 . Bakteri rhizobia yang ditumbuhkan pada media  YEMA+CR  hanya  mampu  menyerap sedikit  warna  merah  dari  larutan  indikator. Hal  ini  terlihat  dari  warna  koloni  pink  pucat pada  semua  isolat  yang  diperoleh.  Isolasi rhizobia  yang  dilakukan  oleh  Sari  & Prayudyaningsih ( 2016 ) dari areal yang sama dengan  sumber  isolat  adalah  sampel  tanah menunjukkan  hasil  yang  sedikit  berbeda. Sebanyak  7  isolat  yang  diperoleh,  4  isolat berwarna  pink  pucat  dan  3  isolat  berwarna putih  ketika  ditumbuhkan  dalam  media YEMA+CR  (Sari  &  Prayudyaningsih, 2016 ). Hasil  penelitian  ini  juga sejalan  dengan  hasil penelitian  yang  dilakukan  oleh  Deshwal  dan Chaubey  ( 2014 )  bahwa  isolat Rhizobium leguminosarum yang diisolasi dari bintil akar Pisum
sativum
menunjukkan ketidakmampuan  dalam menyerap  CR  ketika ditumbuhkan  pada  media  YEMA  yang mengandung  larutan  indikator  tersebut. Abubakar  ( 2015 )  menyatakan  bahwa  isolat yang tidak mampu menyerap CR termasuk ke dalam  kelompok  rhizobia  yang  dapat bersimbiosis dengan akar tanaman. Hal yang membedakan antara bakteri rhizobia dengan
bakteri  penambat  nitrogen  nonsimbiotis adalah kemampuan penyerapan CR
(Howieson  &  Dilworth, 2016 ).  Selain  itu, Purwaningsih et al . ( 2002 ) menyatakan isolat bakteri  fiksasi  nitrogen  yang  tumbuh  pada media  YEMA+CR  dan  mampu  menyerap larutan  CR  tergolong  ke  dalam  kelompok bakteri penambat nitrogen nonsimbiotis.
Pertumbuhan  isolat  bakteri  pada  media YEMA+BTB menunjukkan hasil yang bervariasi untuk kelima isolat ( Tabel 2 ). Tiga isolat  mampu  mengubah  warna  media  yang pada awalnya berwarna biru menjadi kuning. Sementara  media  pertumbuhan  pada  dua isolat  lainnya  tidak  mengalami  perubahan warna  (biru).  Berdasarkan  respon  terhadap uji  yang  diberikan,  3  isolat  yang  mampu mengubah media menjadi kuning termasuk ke dalam genus Rhizobium, sedangkan isolat yang tidak  mampu  mengubah  warna  media termasuk  genus Bradyrhizobium .  Jenis  isolat rhizobia  yang  diisolasi  oleh  Sari  dan Prayudyaningsih  ( 2016 )  dari  sampel  tanah pada areal yang sama juga memperoleh genus Rhizobium dan Bradyrhizobium .  Sementara Datta et  al .  ( 2015 )  menumbuhkan  isolat Rhizobium ( R.  phaseoli , R.  trifolii dan R. leguminosarum ) dan Bradyrhizobium japonicum pada media YEMA yang ditambahkan  BTB  dan  memperoleh  hasil bahwa  isolat Rhizobium mampu  tumbuh setelah  inkubasi  2  x  24  jam  dan  mengubah warna  media  yang  semula  biru  menjadi kuning  karena  adanya  produksi  asam  oleh bakteri  (golongan fast  growing  Rhizobia ),
Tabel 2. Sifat isolat bakteri rhizobia berdasarkan respon terhadap larutan indikator Table 2. Properties of rhizobia bacteria isolates according to response to indicator solution
No. Isolat (Isolate) Uji CR (CR test) Uji BTB (BTB test) 1. A1.1 SL 1 Pink pucat ( pale pink ) Biru (Blue) 2. A1.1 SL 8 Pink pucat ( pale pink ) Kuning (Yellow) 3. A3.3 SL 3 Pink pucat ( pale pink ) Kuning (Yellow) 4. A3.1 SL 5 Pink pucat ( pale pink ) Kuning (Yellow) 5, A3.3 SL 4 Pink pucat ( pale pink ) Biru (Blue)
Keterangan ( Remarks ) : CR: Congo Red ; BTB: Bromthymol Blue
A1. 1.SL.1= isolat ke 1 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A1 pada plot ke-1 (1 st isolate from sea sengon root nodule in the A1 revegetation area in the 1 st plot) A1.1. SL.8 = isolat ke 8 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A1 pada plot ke-1 (8 th isolate from the nodules of sengon laut roots in the A1 revegetation area in the 1 st plot) A3.3. SL.3 = isolat ke 3 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A3 pada plot ke-3 (3 rd isolate from the nodules of sengon laut roots in the A1 revegetation area in the 3 rd plot) A3.1. SL.5 = isolat ke 5 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A3 pada plot ke-1 (5 th isolate from the nodules of sengon laut roots in the A3 revegetation area in the 1 st plot) A3.3. SL.4 = isolat ke 4 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A3 pada plot ke-3 1 (4 th isolate from the nodules of sengon laut roots in the A1 revegetation area in the 3 rd plot)
sedangkan B.  japonicum tumbuh  setelah inkubasi  3x24  jam  dan menunjukkan  respon negatif  terhadap  uji  BTB  (golongan slow growing Rhizobia ) .
B. Karakterisasi Bakteri Fiksasi Nitrogen Setelah  dilakukan  pemurnian  bakteri, pengujian  dilanjutkan  dengan  pewarnaan Gram dan endospora, katalase, motilitas serta ketahanan  pH  (isolat  ditumbuhkan  pada media  YEMA  pH  4,  5,  6,  7,  dan  8).  Hasil  uji dapat dilihat pada Tabel 3 . Kelima isolat bakteri rhizobia memiliki bentuk  seperti  batang  ( bacil ).  Pada pewarnaan Gram, sel terlihat berwarna merah karena menyerap safranin (Gram Negatif). Sel bakteri  rhizobia  yang  telah  diwarnai  dengan menggunakan Malachite green tidak menunjukkan  adanya  organel  sel  yang berwarna  hijau  ( Gambar  1 ).  Hal  ini membuktikan bahwa rhizobia tidak memiliki endospora yang umumnya digunakan mikroorganisme  bertahan  pada  kondisi ekstrem.  Sheu et  al .  ( 2016 )  menyatakan bahwa  kelompok  bakteri  dari  genus Rhizobium merupakan  bakteri  Gram  Negatif, tidak  membentuk  spora,  berbentuk  batang,
aerobik dan kemoorganotropik.
Isolat  rhizobia  yang  diperoleh  mampu menggunakan oksigen tersedia untuk diubah menjadi  energi  ( aerob ).  Hal  ini  terlihat  pada hasil uji katalase. Setelah penambahan reagen H 2 O 2 3% terbentuk gelembung pada preparat uji. Pengujian yang dilakukan oleh Shahzad et al .  ( 2012 )  menggunakan  isolat R.  trifolii dari bintil akar alfalfa memberikan respon positif terhadap  pemberian  peroksida  ini,  demikian juga  pada R.  ipomoeae sp.  nov.  (Sheu et  al ., 2016 ).  Uji  katalase  dilakukan  untuk mendeteksi  adanya  enzim  katalase  yang dimiliki  suatu  mikroorganisme.  Enzim  ini mampu merombak H 2 O 2 yang dihasilkan oleh bakteri menjadi H 2 O dan O 2 (Datta et al ., 2015 ). H 2 O 2 merupakan  suatu  senyawa  yang dihasilkan  dari  respirasi  aerob  bakteri  dan bersifat  toksik  bagi  bakteri  itu  sendiri sehingga  harus  dipecah  oleh  enzim  katalase (Hemraj et al ., 2013 ).
Inokulasi  isolat  pada  media  SIM  Agar menunjukkan  adanya  rambatan-rambatan  di sepanjang  tusukan  ose,  menunjukkan  bahwa isolat memiliki flagela yang digunakan untuk berpindah  tempat.  Pada  uji  ketahanan  pH, isolat mampu tumbuh pada media dengan pH
Tabel 3. Karakteristik bakteri fikasasi nitrogen Table 3. Characteristic of nitrogen fixing bacteria
Isolat
( Isolate ) Pewarnaan Gram ( Gram staining ) Pewarnaan Endospora ( Endospora staining ) Katalase ( Catalase ) Motilitas ( Motility ) Ketahanan pH ( pH resistetance ) 4 5 6 7 8 A1.1 SL 1 Basil, Gram Negatif ( bacillus, gram negative ) -
+ + - + + + +
A1.1 SL 8 Basil, Gram Negatif ( bacillus, gram negative ) - + + - + + + +
A3.3 SL 3 Basil, Gram Negatif ( bacillus, gram negative ) - + + - + + + +
A3.1 SL 5 Basil, Gram Negatif ( bacillus, gram negative ) - + + - + + + +
A3.3 SL 4 Basil, Gram Negatif ( bacillus, gram negative ) - + + - + + + + Keterangan ( Remarks ): (˗ ): hasil negatif terhadap uji (negative to the test) (+): hasil positif terhadap uji (positive to the test) A1. 1.SL.1= isolat ke 1 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A1 pada plot ke-1 (1 st isolate from sea sengon root nodule in the A1 revegetation area in the 1 st plot)
A1.1. SL.8 = isolat ke 8 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A1 pada plot ke-1 (8 th isolate from the nodules of sengon laut roots in the A1 revegetation area in the 1 st plot) A3.3. SL.3 = isolat ke 3 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A3 pada plot ke-3 (3 rd isolate from the nodules of sengon laut roots in the A1 revegetation area in the 3 rd plot) A3.1. SL.5 = isolat ke 5 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A3 pada plot ke-1 (5 th isolate from the nodules of sengon laut roots in the A3 revegetation area in the 1 st plot) A3.3. SL.4 = isolat ke 4 dari bintil akar sengon laut di areal revegetasi A3 pada plot ke-3 1 (4 th isolate from the nodules of sengon laut roots in the A1 revegetation area in the 3 rd plot)
8 (basa) tapi tidak mampu tumbuh pada pH 4 (asam).  Batas  toleransi  keasaman  isolat rhizobia  yaitu  pada  pH  5.  Pertumbuhan optimum terlihat pada media dengan pH 6 dan 7.  Hasil  ini  sejalan  dengan  hasil  penelitian Pawar et  al .  ( 2014 )  yang  menginokulasi bakteri rhizobia pada media YEMA dengan pH bervariasi  dan  memperoleh  hasil  bahwa pertumbuhan optimum rhizobia pada pH 6,5– 7,5, sedikit pertumbuhan pada pH 4 dan tidak mampu  tumbuh  pada  media  dengan  pH  3,5. Hasil yang serupa juga dikemukakan oleh Zahran et al . ( 2012 ) bahwa isolat rhizobia yang  diperoleh  dari  bintil  akar  gandum mampu  tumbuh  pada  pH  6  –  8,  beberapa memiliki toleransi pada pH 3,5 – 4 (asam) dan pH 9 – 10 (basa).
Prayudyaningsih
et al. ( 2015 ) melaporkan bahwa lahan bekas tambang nikel yang  menjadi  lokasi  pengambilan  sampel bintil  akar  sengon  laut  memiliki  keasaman tanah  yang  tergolong  agak  masam  yaitu  pH 5.85.  Oleh  karena  itu,  aplikasi  inokulum rhizobia  di  areal  tambang  nikel  masih dimungkinkan karena kondisi pH tanah masih mendukung pembentukan bintil akar. Menurut Novriani ( 2011 ), umumnya rhizobia tidak  mampu  membentuk  bintil  pada  akar legum  bahkan  mati  pada  tanah  masam, optimal  pada pH netral serta mampu survive pada  kondisi  sedikit  alkali.  Rata-rata  tinggi tanaman  sengon  di  lokasi  penelitian  adalah
237,5 cm dan diameter batang 1,31 cm pada umur  2  tahun.  Pertumbuhan  sengon  laut ini, khususnya  diameter,  cenderung  lebih  lambat dibanding  yang  tumbuh  di  lahan  bekas tambang  lain.  Syauqie et  al .  ( 2019 ) menyebutkan rata-rata pertumbuhan diameter sengon laut di lahan bekas tambang batu bara pada umur 1 tahun adalah 1,07 cm. Aplikasi  inokulum  rhizobia  diharapkan  akan lebih  memacu  pertumbuhan  tanaman  dalam kegiatan  revegetasi  untuk  reklamasi  lahan bekas  tambang  nikel.  Pada  akhirnya diharapkan  pemulihan  lahan  bekas  tambang nikel juga akan lebih cepat.

## C. Uji Potensi Isolat Rhizobia
Untuk  mengetahui  potensi  awal  isolat rhizobia  maka  dilakukan  uji  ARA  dan  uji kandungan  hormon  IAA.  Uji  ARA  dilakukan untuk mengukur laju fiksasi nitrogen. Semakin tinggi  aktivitas  enzim  nitrogenase,  yang ditunjukkan  oleh  semakin  besarnya  jumlah gas  asetilen  (C 2 H 2 )  yang  direduksi  dalam  uji ARA,  maka  semakin  tinggi  pula  kemampuan isolat  dalam  menambat  N 2 dari  atmosfer (Arsyad,  2007).  Sementara  uji  IAA  dilakukan untuk mengetahui kemampuan isolat menghasilkan hormon pertumbuhan IAA yang dikenal dengan nama auksin. Hasil pengujian potensi  isolat  rhizobia  dapat  dilihat  pada Gambar 2 . Rangel et  al .  ( 2016 )  yang  memperoleh isolat  rhizobia  dari  lahan  tambang  Zn
Gambar 1. (a) sel Rhizobia berbentuk batang (basil) dan berwarna merah (Gram negatif) pada pewarnaan Gram; (b) tidak terlihat adanya endospora pada saat pemberian Malachite Green (perbesaran 40x) Figure 1. (a) Rhizobia cell in bacil shape and red colored (gram negative) in gram staining; (b) Endospores appearance in Malachite Green addition (magnifation 40x)
b a
menyatakan bahwa    umumnya    isolat-isolat tersebut
memiliki potensi sebagai bioremediasi  yang  mampu  menambat nitrogen  bebas  dan  menghasilkan  hormon pertumbuhan, seperti IAA ( Indole Acetic Acid ). Hasil  pengujian  yang  dilakukan  pada penelitian  ini  terlihat  bahwa  A3.1  SL  5 memiliki nilai uji ARA dan uji IAA yang paling tinggi, yaitu 9,01 ppm dan 0,447 ppm sehingga berpotensi untuk dijadikan inokulum rhizobia.
Inokulasi  isolat  rhizobia  terhadap tanaman Acacia mangium pada tanah masam bekas tambang menunjukkan bahwa
pemberian isolat tersebut dapat
meningkatkan  kadar  amonium,  nitrat  tanah, kadar  N  total  dan  serapan  N  tanaman (Permatasari, 2011 ). Oleh karena itu, dengan adanya  potensi  yang  dimiliki  oleh  bakteri rhizobia,  menjadikan  isolat  ini  cocok  untuk diaplikasikan pada kegiatan pemulihan lahan marginal, seperti lahan bekas tambang nikel.

## IV. KESIMPULAN
Isolasi  bakteri  fiksasi  nitrogen  simbiotis dari  bintil  akar  sengon  laut  menghasilkan  5 isolat  dengan  karakteristik  yang  bervariasi. Kelompok  bakteri  rhizobia  ini  memiliki bentuk  koloni  bulat  (1  isolat)  dan  tidak beraturan (4 isolat) dengan permukaan koloni licin. Empat koloni memiliki elevasi datar dan terangkat,  tepi  koloni  yang  jelas  dan bergelombang. Warna koloni isolat bervariasi dari  warna  putih,  putih  kecokelatan,  dan cokelat.  Sebanyak  2  isolat  termasuk  dalam kelompok Bradyrhizobium ( slow  growing rhizobia )  dan  3  isolat  lainnya  termasuk kelompok Rhizobium ( fast  growing  rhizobia ). Semua isolat merupakan bakteri Gram Negatif, berbentuk  batang  ( bacil ),  tidak  memiliki endospora,  aerob,  dan  motil.  Semua  isolat tidak  mampu  tumbuh  pada  kondisi  asam dengan pH 4, tapi tumbuh pada pH 5, 6, 7, dan 8  dengan  pertumbuhan  optimum  pada  pH  6
Gambar 2 .  Uji potensi isolat rhizobia: (A) Hasil uji ARA; (B) Hasil uji IAA
Figure 2 . Pontential test of rhizobia isolates: (A) ARA test; (B) IAA test 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 A1.1 SL 1 A1.1 SL 8 A3.3 SL 3 A3.3 SL 4 A3.1 SL 5 K on sen tr as i (p p m ) Isolat Rhizobia 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 A1.1 SL 1 A1.1 SL 8 A3.3 SL 3 A3.3 SL 4 A3.1 SL 5 K o n sen tr asi ( p p m ) Isolat Rhizobia b a
dan  7.  Uji  potensi  ARA  dan  hormon  IAA menunjukkan  bahwa  isolat  A3.1  SL  5 mempunyai  kemampuan  terbaik  dalam mereduksi gas asetilen sebesar 9,01 ppm dan menghasilkan hormon IAA terbanyak sebesar 0,447  ppm  sehingga  memiliki  potensi  untuk dikembangkan sebagai inokulum.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  kepada  Edi Kurniawan,  Hajar  dan  Fajri  sebagai  teknisi litkayasa yang telah membantu penulis selama pengambilan  sampel  di  lapangan.  Ucapan terima  kasih  juga  penulis  ucapkan  kepada Andi Sri Rahmah Dania dan Hartini yang telah membantu  proses  isolasi  dan  pengujian  di laboratorium.  Kami  juga  menyampaikan terima  kasih  secara  khusus  kepada  PT. Stargate  Pasific  Resources  yang  telah memberikan  izin  pengambilan  sampel  dan melakukan  penelitian  di  lahan  bekas tambangnya.

## KONTRIBUSI PENULIS
RS dan RP berperan sebagai kontributor utama.  RS  melaksanakan  penelitian,  analisis hasil,  menginterpretasi  hasil  dan  penulisan naskah.  Sementara  RP  bertindak  sebagai koordinator penelitian, konseptualisasi penelitian,  melaksanakan  penelitian  dan penulisan naskah.

## KONFLIK KEPENTINGAN
Penulis tidak memiliki hubungan keuangan  atau  pribadi  satu  sama  lain  yang mungkin secara tidak wajar dapat mempengaruhi  objektivitas  dalam  menulis artikel ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Abubakar, F. (2015). Isolation and characterisation of  indigenous  rhizobia  and  response  to inoculation  by  promiscuous  soybean  in  the Nigerian savanna . Ahmadu Bello University. Arsyad,  R.  H.  (2007). Penggunaan  Rhizobium  dan Mikroba  Pelarut  Fosfat  (MPF)  Untuk Memperbaiki  Pertumbuhan  Bibit  Akasia (Acacia  mangium  dan  Acacia  crassicarpa) . Bogor:  Institut  Pertanian  Bogor.  Skripsi. Tidak dipublikasikan
Dariah, A., Abdurachman, A., & Subardja, D. (2010). Reklamasi  lahan  eks-penambangan  untuk perluasan areal pertanian. Jurnal Sumberdaya Lahan , 4 (1), 1–12 .
Datta,  A.,  Singh,  R.  K.,  &  Tabassum,  S.  (2015)..
Isolation,  Characterization  and  Growth  of Rhizobium Strains under Optimum Conditions for Effective Biofertilizer
Production. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res.,32 (34), 199–208. Deshwal,  V.,  &  Chaubey,  A.  (2014).  Isolation  and characterization of Rhizobium leguminosarum  from  root  nodule  of Pisum sativum L. Journal of Academia and Industrial Research. , 2 (8), 464–467.
Gyorgy, E., Mara, G., Mathe, I., Laslo, E., Marialigeti, K.,  Albert,  B.,  Oancea,  F.,  &  Lanyi,  S.  (2010). Characterization and diversity of the nitrogen fixing  microbiota  from  a  specific  grassland habitat  in  the  Ciuc  Mountains. Romanian Biotechnological Letters , 15 (4), 5474–5481.
Hakim,  E.  H.  (2016).  Penataan  lahan  kawasan pesisir pasca penambangan pasir besi Pantai Selatan  Kabupaten  Tasikmalaya. Jurnal Geografi , 4 (24), 15–23 .
Hemraj, V., Diksha, S., & Avneet, G. (2013). A review on  commonly  used  biochemical  test  for bacteria. Innovare Journal of Life Science , 1 (1), 1–7.
Howieson, J. G., & Dilworth, M. J. (2016). Working with rhizobia (J. Howiensen & M. J. Dilworth (eds.);  Issue  January).  Australian  Center  for International Agriculture Research (ACIAR).
Leomo,  S., Mudi, L. A., & Alam, S. (2013). Aplikasi rizobakteri pada cover crop dalam mempengaruhi  sifat  kimia  tanah  bekas tambang  nikel .  Jurnal  Agroteknos. 3 (1),  26– 33.
Mayer,  C.,  Moritz,  R.,  Kirschner,  C.,  Borchard,  W., Maibaum, R., Wingender, J., & Flemming, H. C.
(1999). The role of intermolecular interactions:  studies  on  model  systems  for bacterial biofilms. Int.J.Biol.Macromol. , 26 (1), 3–16.
Novriani.  (2011).  Peranan  Rhizobium  dalam Meningkatkan  Ketersediaan  Nitrogen  bagi Tanaman Kedelai. AgronobiS, 3 (5), 35–42. Pawar, V. A., Pawar, P. R., Bhosale, A. M., & Chavan, S. V.  (2014).  Effect  of  Rhizobium  on  Seed Germination and Growth of Plants. Journal of Academia and Industrial Research , 3 (2),  84  - 88.
Permatasari, M. (2011). Uji Inokulum Rhizobia dan Pengaruhnya  Terhadap  Pertumbuhan  Acacia mangium Pada Tanah Masam Bekas Tambang . Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Prayudyaningsih, R., Mangopang, A. D., Broto, B. W., Sari,  R.,  Kurniawan,  E.,  Hajar,  &  Ansari,  F. (2015). Eksplorasi  Mikroba  Tanah  Simbiotik, Pemilihan  Jenis  Tumbuhan  Lokal  dan Keanekaragaman  Hayati  Lahan  Bekas
Tambang  Nikel .  Laporan  Hasil  Penelitian. Balai  Litbang  LHK  Makassar.  Tidak dipublikasikan.
Purwaningsih,  S.,  Dan,  B.,  &  Kerja,  C.  (2002). Isolation of population and characterization of Rhizobium  bacteria  in  soil  from  Gunung Halimun  National  Park  ,  West  Java .  Berita Biologi 6 (April), 167–171.
Rangel, W. M., Thijs, S., Janssen, J., Oliveira Longatti, S. M., Bonaldi, D. S., Ribeiro, P. R. A., Jambon, I., Eevers,  N.,  Weyens,  N.,  Vangronsveld,  J.,  & Moreira, F. M. S. (2016). Native rhizobia from Zn  mining  soil  promote  the  growth  of Leucaena leucocephala on contaminated soil. International  Journal  of  Phytoremediation , 19 (2), 142–156.
Sari, R., & Prayudyaningsih, R. (2016). Populasi dan Jenis Bakteri Penambat Nitrogen Simbiotik di Lahan  Bekas  Tambang  Nikel.  In  M.  Litaay, Syahribulan,  Fahruddin,  R.  Umar,  &  Sardiani (Eds.), Seminar  Nasional  Biologi:  Peranan Biologi  Dalam  Peningkatan  Konservasi Keragaman  Hayati (pp.  475–483).  Fakultas MIPA Universitas Hasauddin.
Sari,  Ramdana,  &  Prayudyaningsih,  R.  (2018). Perkembangan bintil akar pada semai sengon laut  ( Paraserianthes  falcataria (L)  Nielsen). Info Teknis EBONI , 15 (2), 105–119. Shahzad, F., Shafee, M., Abbas, F., Babar, S., Tariq, M. M.,  &  Ahmad,  Z.  (2012).  Isolation  and biochemical  characterization  of  rhizobium meliloti from root nodules of Alfalfa ( Medico sativa ). Journal of Animal and Plant Sciences , 22 (2), 522–524.
Shetta, N D, A.-S. and M. A.-A. (2011). Identification and characterization of Rhizobium associated with woody legume trees grown under Saudi Arabia Condition. Am-Euras J. Agric. & Environ. Sci. , 10 (3), 410–418.
Sheu, S. Y., Chen, Z. H., Young, C. C., & Chen, W. M. (2016).  Rhizobium  ipomoeae  sp.  nov., isolated  from  a  water  convolvulus  field. International  Journal  of  Systematic  and Evolutionary Microbiology , 66 (4), 1633–1640 .
Somasegaran, P., & Hoben, H. J. (1994). Handbook for  Rhizobia:  Methods  in  Legume-Rhizobium Technology (P.  Somasegaran  &  H.  J.  Hoben (eds.)). Springer-Verlag.
Suciana,  &  Surdin.  (2016).  Persepsi  masyarakat petani  pengeloaan  pertambangan  nikel terhadap  hasil  produksi  sawah  di  Desa Watumbohoti. Jurnal  Penelitian  Pendidikan Geografi , 1 (1), 53–68.
Sudrajat,  D.,  Mulyana,  N.,  &  Ardhari,  A.  (2013).
Seleksi mikroba rizosfer indigen untuk bahan bioaktif  pada  inokulan  berbasis  kompos iradiasi. Prosiding Seminar Nasional Matematika, Sains Dan Teknologi , 97–110. Syauqie, A., Hatta, M., Priaymadi, B. J., & Kissinger. (2019).  Pengaruh  pemberian  kompos  dan posisi lereng terhadap pertumbuhan sengon (Paraserianthes falcataria) di lahan revegetasi  bekas  tambang  batu  bara. EnviroScienteae , 15 (2), 146–153 .
Usman, E. (2011). Prospek pengembangan sumber daya  nikel  Laterit  di  Kawasan  Timur Indonesia. M&E , 9 (2), 17–25. Utami, H. (2009). Kajian Sifat Fisik, Sifat Kimia dan Sifat  Biologi  Tanah  Paska  Tambang  Galian  C pada  Tiga  Penutupan  Lahan .  Bogor:  Institut
Pertanian Bogor (IPB). Widawati,  S.,  S.  dan  S.  (2015).  Isolasi  dan  uji efektivitas Plant Growth Promoting Rhizobacteria  di  lahan  marginal  pada pertumbuhan tanaman kedelai (Glycine max L.  Merr.)  var.  Wilis. Prosiding  Seminar Nasional Masyarakat  Biodiversitas Indonesia ,
1 , 59–65 .
Zahran, H. ., Abdel-Fattah, M., Yasser, M. ., Mahmoud, A.  M.,  &  Bedmar,  E.  .  (2012).  Diversity  and environmental stress  responses of Rhizobial Bacteria  from  Egyptian  Grain  legumes. Australian  Journal  of  Basic  and  Applied Sciences , 6 (10), 571–583.