BIOTROPIKA Journal of Tropical Biology
https://biotropika.ub.ac.id/
Vol. 9   |   No. 1   |   2021  |   DOI: 10.21776/ub.biotropika.2021.009.01.07

## KRIOPRESERVASI MATA TUNAS UBI KAYU LOKAL INDONESIA: FAKTOR PENENTU KEBERHASILAN

## CRYOPRESERVATION OF LOCAL INDONESIAN CASSAVA BUDS: FACTORS AFFECTING SUCCESSFUL RATE
Enny Sudarmonowati 1) , Nurhamidar Rahman 1)* , N. Sri Hartati 1)

## ABSTRAK
Kriopreservasi  (penyimpanan  dalam  suhu  -198ºC)  merupakan  pilihan  untuk menyimpan  dalam  jangka  panjang  bahan  tanaman  ubi  kayu  yang  selama  ini menggunakan “shoot tips” atau “axilary buds” dari planlet in vitro. Ada beragam faktor  yang  memengaruhi  keberhasilan  kriopreservasi.  Oleh  karena  itu,  tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kemampuan regenerasi empat genotip ubi kayu  lokal  Indonesia  (Manggu,  Mentega  2,  Kristal  Merah,  dan  Nangka) menggunakan  mesi  ceptode  kriopreservasi.  Keempat  genotip  ubi  kayu  itu  diberi perlakuan  variasi  persentase  larutan  krioprotektan  berbeda  (87%  gliserol,  5% DMSO  atau  10%  DMSO  sendiri  atau  dikombinasikan),  metode  pencairan (thawing), lama penyimpanan dalam nitrogen cair (45 menit atau 3 minggu). Stek mini ubi kayu yang sudah diberi perlakuan tersebut selanjutnya ditumbuhkan pada media regenerasi secara in vitro dengan media MS, di tisu yang dibasahi air atau larutan  hara  makro  MS.  Hasil  pengamatan  menunjukkan  bahwa,  daya  hidup tertinggi (40%) adalah mata tunas merekah tanpa bagian batang genotip Manggu dan Nangka yang direndam dalam larutan kombinasi 87% gliserol dan 5% DMSO yang  dicairkan  cepat  dalam  water  bath,  dibiakkan  pada  tisu  lembab  setelah disimpan dalam nitrogen cair 3 minggu. Penggunaan mata tunas dari batang ubi kayu  merupakan  yang  pertama  dan  berhasil  diregenerasikan  menjadi  tanaman setelah  penyimpanan  di  tangki  nitrogen.  Hasil  penelitian  ini  mempermudah  dan mempersingkat prosedur kriopreservasi bagian tanaman ubi kayu sehingga dapat mendukung pelestarian plasma nutfah dalam jangka panjang.
Kata kunci: DMSO, gliserol, kriopreservasi, mata tunas, ubi kayu lokal Indonesia

## ABSTRACT
Cryopreservation (storage at -198ºC) is an option for long-term storage of cassava plant material which has been using “shoot tips” or “axilary buds” from in vitro plantlets. Various factors influence the success of cryopreservation. Therefore, the aim of this study was to determine the regeneration ability of four local Indonesian cassava  genotypes  (Manggu,  Mentega  2,  Kristal  Merah,  Jackfruit)  using  the cryopreservation method. The four cassava genotypes were treated with different percentage variations of cryoprotectant solution (87% glycerol, 5% DMSO or 10% DMSO alone or in combination), thawing method, storage time in liquid nitrogen (45 minutes or 3 weeks). The mini cassava cuttings that have been treated are then grown  on  the  regeneration  medium  in  vitro  with  MS  media,  in  tisu  soaked  with water or MS macro nutrient solution. The results of the observation showed that the highest survival rate (40%) was the buds bursting without the stem parts of the Manggu  and  jackfruit  genotypes  immersed  in  a  combination  solution  of  87% glycerol  and  5%  DMSO  which was  quickly  thawed  in  a  water  bath,  cultured  on moist  tisu  after  being  stored  in  nitrogen.  liquid  3  weeks.  The  use  of  buds  from cassava  stems  was  the  first  and  was  successfully  regenerated  into  plants  after storage  in  the  nitrogen  tank.  The  results  of  this  study  simplify  and  shorten  the procedure for cryopreservation of parts of the cassava plant so that it can support the preservation of germplasm in the long term.
Keywords: DMSO,  glycerol,  cryopreservation,  buds,  Indonesian  cassava  local genotypes
Diterima   : 29 Desember 2020
Disetujui   : 30 Maret 2021

## Afiliasi Penulis:
1) Puslit bioteknologi LIPI

## Email korespondensi:
*nurhamidarr@yahoo.com

## Cara sitasi:
E.  Sudarmonowati,  N.  Rahman, N.S. Hartati. 2021. Kriopreservasi mata  tunas  ubi  kayu  lokal Indonesia:
Faktor
penentu keberhasilan .  Journal of  Tropical Biology 9 (1): 56-68.

## PENDAHULUAN
Ubi  kayu  ( Manihot  esculenta Grantz.) merupakan salah satu sumber pangan penting di Indonesia  yaitu  termasuk  tiga  besar  sebagai sumber karbohidrat. Ubi kayu unggul mempunyai  kandungan  nutrisi  tinggi  dan berpotensi  besar  untuk  dimanfaatkan  sebagai bahan baku makanan sehat dan bergizi. Selain itu,  Ubi  kayu  juga  mempunyai  kadar  HCN tinggi  yang  dapat  dimanfaatkan  untuk industri non pangan bernilai tinggi. Ubi kayu digunakan sebagai  pangan  untuk  dikonsumsi  langsung maupun  industri  seperti  tepung  mocaf,  tepung tapioka, pelet (pakan ikan), gaplek, gula pasir, gasohol, protein sel tunggal, dan asam sitrat [1].
Dewasa ini, pemenuhan kebutuhan bibit ubi kayu  semakin  meningkat  karena  program diversifikasi  pangan  dan  cadangan  pangan strategis sehingga diperlukan upaya penyimpanan  bahan  tanaman  ubi  kayu  dalam waktu  lama,  tidak  berubah  secara  genetik  dan tidak memerlukan banyak ruang. Penyimpanan plasma nutfah  di  lapang  dalam  bentuk koleksi tanaman maupun di laboratorium dalam bentuk bagian  dari  tanaman  atau  organ  reproduktif seperti  biji  dan  embrio  diperlukan  untuk mengatasi kebutuhan lahan luas serta kepunahan karena serangan hama dan penyakit atau bencana alam lainnya.
Indonesia  mempunyai  15  varietas  unggul baru (VUB) ubi kayu, selain genotip lokal yang mempunyai  keunggulan  seperti  Manggu, Mentega  2,  dan  Kristal  Merah.  Potensi  hasil Manggu  mencapai  70-80  ton/ha  [2].  Genotip Mentega  2  mempunyai  warna  kulit  luar  umbi krem  dan  warna  daging  kekuningan  yang mengindikasikan  mengandung  beta  karoten lebih tinggi dari pada ubi putih. Kristal Merah merupakan genotip andalan yang dapat tumbuh di  lahan  masam.  Manggu,  Mentega  2,  dan Kristal Merah termasuk genotip yang mempunyai  pati  resisten  tinggi.  Pati  resisten berasosiasi dengan kandungan amilosa sehingga amilosa tinggi umumnya mempunyai pati  resisten  tinggi.  Pati  resisten  baik  untuk kesehatan  karena  berfungsi  serat  pangan  yang diperlukan oleh tubuh.
Sampai  saat  ini,  budi  daya  ubi  kayu  masih menggunakan  stek  batang  bagian  bawah, sehingga  jumlah  ketersediaan  bibit  menjadi terbatas  karena  bagian  tengah  dan  bagian  atas tidak  tidak  dapat  dimanfaatkan.  Selain  itu, penyimpanan  dalam  bentuk  stek  batang  tidak dapat  bertahan  lama,  sehingga  penyimpanan harus dilakukan dalam bentuk lonjoran batang panjang  dari  pangkal hingga  dekat  pucuk.  Hal ini memerlukan tempat penyimpanan yang luas
dan  terbatas  lama  penyimpanannya.  Budidaya menggunakan  mata  tunas  dari  stek  ubi  kayu belum pernah dilakukan hingga saat ini karena bahan tanaman terkecil yang pernah dilakukan adalah  stek  mini  [3,  4].  Oleh  karena  itu, diperlukan  sistem  budidaya  yang  lebih  efisien menggunakan  mata  tunas  ubi  kayu  dengan metode  pendekatan  kultur  jaringan  tanaman. Sistem kultur jaringan tanaman, dapat memperbanyak jumlah bakalan atau bibit umbi kayu dalam waktu yang singkat.
Pada  penelitian  ini,  teknik  kriopreservasi atau penyimpanan dalam nitrogen cair digunakan. Teknik kriopreservasi yaitu penyimpanan  sampel  pada  suhu  -196ºC menggunakan  larutan  krioprotektan,  sehingga tidak  memungkinkan  proses  biokimia  terjadi dan tidak menimbulkan mutasi saat diregenerasikan  setelah  penyimpanan.  Teknik kriopreservasi  memerlukan  keahlian  dalam pengerjaannya.  Menurut  [4],  salah  satu  faktor penentu  keberhasilan  teknik  ini  yaitu,  ukuran bagian tanaman harus kecil untuk menghindari kematian  organ  tanaman  karena  pembentukan kristal es dari kandungan air yang ada dalam sel. Penggunaan  stek  mini  ubi  kayu  (5-10  cm) sudah  terbukti  dapat  diregenerasikan  menjadi tanaman  dewasa  dan  menghasilkan  umbi. Namun, ukuran tersebut masih terlalu besar bila disimpan dengan metoda kriopreservasi karena masih  terdapat  kandungan  air  di  dalam  organ yang  menyebabkan  terjadinya  kristalisasi  es semakin tinggi [4].
Beberapa hasil penelitian terkait penyimpanan  ubi  kayu  telah  dilaporkan, umumnya menggunakan tunas apikal atau tunas samping  ( leaf  bud ) planlet  in  vitro yang ukurannya  sudah  kecil  [5,6].  Selain  itu, kriopreservasi  ubi  kayu  di  Indonesia  yang dilakukan pada tunas pucuk dari planlet in vitro dengan  menggunakan  teknik  vitrifikasi  juga pernah diteliti oleh [7]. Kriopreservasi ubi kayu dengan organ mata tunas hingga saat ini belum pernah  dilaporkan.  Penggunaan  mata  tunas akan  melengkapi  keterbatasan  jumlah  tunas apikal atau aksilar plantlet in vitro . Keberhasilan  penyimpanan  dalam  jangka panjang akan mengurangi biaya sub kultur dan media in vitro karena dapat ditanam langsung di tanah.
Metode  kriopreservasi  memerlukan  larutan krioprotektan  yang  berfungsi  untuk  mencegah pembentukkan  kristal  es  akan  tetapi  larutan tersebut  juga  bersifat  toksik  pada  saat ekuilibrasi  dan  setelah thawing [8].  Larutan krioprotektan  di  antaranya  yaitu  gliserol, DMSO,  dan  lain  sebagainya,  tergantung prosedur  yang  digunakan.  DMSO  umumnya
digunakan dengan campuran larutan lain seperti gliserol atau PVP. Masing-masing jenis larutan mempunyai  fungsi  dan  keunggulan  berbeda. Pada kriopreservasi bagian jaringan atau organ hewan,  DMSO  dan  gliserol  sangat  umum dipakai  dibandingkan  pada  jaringan  tanaman. Krioprotektan  yang  digunakan  harus  mudah larut  dalam  air  dan  harus  mempunyai  bobot molekul yang kecil agar lebih cepat menyusup ke  dalam  sel  dan mengurangi  toksisitas  akibat osmolaritas yang tinggi [9]. Sedangkan gliserol memiliki  peran  untuk mencegah  pengumpulan molekul  H 2 O  dan  kristalisasi  es  pada  daerah titik beku larutan.
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk memperoleh  prosedur  penyimpanan  jangka panjang  ubi  kayu  yang  praktis  menggunakan stek  super  mini  dan  mata  tunas  dari  batang tanaman  ubi  kayu  Manggu,  Mentega  2,  dan Kristal  Merah  dengan  teknik  kriopreservasi pembekuan  cepat.  Penelitian  dilakukan  dalam rangka  mendukung  penyediaan  bibit  unggul lokal Indonesia.

## METODE PENELITIAN
Bagian  tanaman  dan  genotip. Bagian tanaman  ubi  kayu  lokal  (Manggu,  Mentega  2, Kristal  Merah)  yang  akan  dipreservasi  adalah stek  super  mini  (1  dan  2  ruas  buku)  yang mempunyai satu mata tunas berjarak 0,5; 1; dan 2 cm (Gambar 1), mata tunas belum  dan yang sudah  merekah  (Gambar  2).  Sampel  ubi  kayu genotip Manggu dan Mentega 2 berjumlah satu buku  dipotong  dengan  jarak  dari  mata  tunas yaitu 0,5; 1; 2 cm. Sampel ubi kayu berjumlah dua buku dipotong dengan jarak dari mata tunas yaitu 1 cm. Sumber stek dan mata tunas berasal dari  tanaman  ubi  kayu  koleksi  Kebun  Plasma Nutfah  Pusat  Penelitian  Bioteknologi  LIPI  di Cibinong  Science  Centre  –  Botanic  Gardens (CSC-BG),  Cibinong,  Jawa  Barat.  Masing-
masing  perlakuan  berjumlah  10-30  sampel. Stek  super  mini  dan  mata  tunas  ubi  kayu bersumber dari tanaman induk genotip Manggu dan Kristal Merah berumur umur 10 bulan dan diambil dari posisi tunas 10 cm dari permukaan tanah  yang  mata  tunasnya  sudah  merekah  dan belum merekah.
Larutan krioprotektan. Larutan krioprotektan  yang  digunakan  mempunyai komposisi  (1)  87%  gliserol,  5%  DMSO,  10% DMSO; (2) 87% gliserol dan 10 % DMSO; (3) 87%  gliserol  dan  5%  DMSO.  Larutan krioprotektan  komposisi  1  digunakan  untuk stek  super  mini  yang  oleh  beberapa  peneliti digunakan  untuk  tunas  pucuk in  vitro sedangkan komposisi 2 dan 3 digunakan untuk mata tunas.
Prosedur  kriopreservasi.  Kriopreservasi stek super mini berbagai ukuran . Sampel yang telah ditiriskan 1 jam (kering angin) di atas tisu setelah perendaman dalam larutan krioprotektan  selama 1 jam, kemudian direndam  dalam  larutan  fungisida  Agrep  (20 g/L)  dan  Dithane  M-45  (40  g/L)  dalam  1  L aquades selama 1 jam.  Selanjutnya pencucian dilakukan  dengan  akuades.  Sampel  dibungkus dengan  aluminium  foil  dan  dimasukkan  ke tabung berisi nitrogen cair selama 1 jam dan 1 hari  dengan  uap  nitrogen  cair  minimal  suhu  - 40℃.  Jumlah  sampel  sebanyak  30  stek  super mini.
Kriopreservasi  mata  tunas  tanpa  bagian batang  utama. Mata  tunas  direndam  dalam larutan krioprotektan yang mengandung kombinasi  87%  gliserol  dan  10%  DMSO  atau dalam larutan 5% DMSO hingga seluruh bagian tanaman  terendam  selama  1  jam.  Mata  tunas dibungkus  dengan  aluminium  foil  dan  ditetesi larutan  krioprotektan.  Selanjutnya,  sampel dicelupkan dalam tangki nitrogen cair, masing- masing ada yang direndam selama 45 menit dan ada yang direndam selama 3 minggu.
(a) (b)
(c) (d)
Gambar 1. Contoh ukuran stek super mini ubi kayu (a) 1 buku 0,5 cm; (b) 1 buku 1 cm; (c) 1 buku persegiempat; (d) 2 buku 1 cm

## a                               b
Gambar 2 . Mata tunas Manggu (a) dan Kristal Merah  (b)  dengan  bagian  kayu  batang  yang sudah merekah (atas) dan yang belum merekah (tengah); mata tunas tanpa bagian kayu (bawah) yang  belum  merekah  (kiri)  dan  merekah (kanan)
Prosedur  pencairan  (Thawing).  Thawing dilakukan dengan dua cara (1) secara perlahan, yaitu pencairan dilakukan di suhu ruang dengan membuka aluminium foil dan dibiarkan selama 1 jam lalu diserap airnya dengan kertas serapan; (2)  secara  cepat,  yaitu  melalui  perendaman dalam water bath pada suhu 60ºC selama 1 jam, lalu ditanam di media regenerasi. Thawing stek super mini dilakukan secara perlahan sedangkan thawing mata tunas dilakukan secara cepat  untuk  menghindari  kematian  pada jaringan sel tanaman.
Media  dan  bahan  untuk  regenerasi. Media  regenerasi  untuk  stek  super  mini. Stek supermini  ditanam  langsung  pada  campuran media  tanah,  pasir,  arang,  dan  tanah  (1:1:1:1) dalam  baki  plastik  ukuran  53x38x16  cm. Penambahan campuran fungisida (20 g/L Agrep dan  40  g/L  Dithane  M-45)  dilakukan  untuk menghindari pertumbuhan jamur saat penanaman setelah penyimpanan dalam nitrogen cair.
Media  regenerasi  untuk  mata  tunas .  Mata tunas diletakkan pada tisu yang dibasahi dengan air atau dengan larutan hara makro Murashige dan  and  Skoog  atau  MS.  Media  regenerasi in vitro untuk mata tunas adalah media MS yang mengandung 0,01 mg/l NAA dan 0,5 mg/l BAP dan 20% sukrosa. Sebelum perlakuan kriopreservasi,  pra  penelitian  dilakukan  untuk
memperoleh  ukuran  terkecil  yang  dapat diregenerasi  dan  media  terbaik  yang  dapat menghasilkan  daya  hidup  tertinggi:  (1)  Stek super  mini  diperkecil  dari  yang  semula berukuran hingga 2 buku menjadi hanya 1 buku dengan  ukuran  1  cm;  (2)  Mata  tunas  dengan bagian  buku  ditanam  di  tanah;  (3)  Mata  tunas tanpa bagian buku dibiakkan di tisu lembab.
Pemeliharaan bahan tanaman saat regenerasi .  Stek  super  mini  atau  mata  tunas disiram setiap hari menggunakan sprayer . Baki diletakkan  di  tempat  teduh,  tidak  terkena matahari  langsung.  Mata  tunas  yang  telah disimpan  dalam  nitrogen  cair  yang  dibiakkan secara in vitro pada media MS tetap dibiakkan pada  media  yang  sama  tanpa  subkultur.  Suhu ruang  kultur  adalah  28ºC  dengan  kelembaban udara 70%. Penyinaran dilakukan selama 8-16 jam terang, dan 16-8 jam gelap.
Pengamatan dan analisis data. Pengamatan  dilakukan  pada  umur  tanam  3,  6, 12,  24  hingga  48  Hari  Setelah  Tanam  (HST). Parameter  pengamatan  meliputi  persentase daya  hidup  dan  tinggi  tunas  semua  perlakuan dan  kontrol.  Data  yang  diperoleh  kemudian didanalisis  engan  menggunakan  SPSS  versi 21.0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh  bagian  tanaman,  ukuran  stek batang super mini dan mata tunas pada daya hidup.  Pada  media  tumbuh  tisu  basah .
Berdasarkan  pengamatan,  hasil  menunjukkan bahwa  stek  super  mini  ukuran  0,5  cm  dapat hidup  100%  pada  semua  genotip  sehingga secara  ideal,  ukuran  ini  yang  akan  bertahan hidup  setelah  penyimpanan  di  nitrogen  cair (Tabel 1, Gambar 3). Mata tunas tanpa bagian stek  batang  dari  semua  genotip  yang  dicoba dapat  hidup  pada  tisu  lembab,  baik  yang dibasahi  dengan  air  atau  larutan  hara  makro, sehingga menjadi bagian tanaman terkecil yang ideal  untuk  penyimpanan  jangka  panjang (Tabel  2  dan  3,  Gambar  4).  Oleh  karena  stek super  mini  masih  berukuran  besar,  untuk memperkecil kerusakan sel akibat pembentukan kristal  es,  penyimpanan  hanya  dilakukan dengan uap nitrogen cair dalam tangki nitrogen. Mata  tunas  yang  merekah  maupun  tidak merekah pada kedua genotip ubi kayu (Manggu dan Kristal Merah) pada semua perlakuan dan kontrol  memiliki  daya  hidup  rendah  <40% setelah 48 HST dan tidak berbeda nyata setelah didesikasi dalam 87% gliserol dan DMSO 10% sebagai  krioprotektan  selama  45  menit  dan  3 minggu (Tabel 4).
Pada  Tabel  5  menunjukkan  daya  hidup genotip  ubi  kayu  Manggu  lebih  tinggi dibanding genotip lainnya, sebesar 52%. Tetapi daya hidup genotip Manggu masih lebih rendah dibandingkan tanaman kontrol dengan perlakuan tidak direndam krioprotektan meskipun tidak berbeda nyata setelah didesikasi dalam 87% gliserol dan DMSO 5%.
Pada media tumbuh tanah. Stek mini yang berhasil  hidup  setelah  desikasi  dalam  87% gliserol  sebagai  krioprotektan  selama  1  jam hanya  stek  mini  Manggu  berukuran  1  cm dengan  2  buku  yang  disimpan  selama  1  jam dalam  uap  nitrogen  cair  di  tangki  walaupun hanya 3% (Tabel 6, Gambar 5). Tidak ada stek mini  yang  hidup  pada  perlakuan  larutan krioprotektan  lain.  Hal  ini  menunjukkan  jenis dan  komposisi  larutan  krioprotektan  dan genotip  tanaman  memengaruhi  daya  hidup.
Demikian juga dengan tidak adanya daya hidup yang  ditemukan  pada  stek  mini  Mentega  2 setelah perlakuan nitrogen cair.
Perbedaan  genotip  memberikan  perbedaan respon hal ini juga seperti disimpulkan oleh [10] yang  dalam  penelitiannya  membandingkan sembilan kultivar Ribes nigrum L. Penggunaan mata  tunas  dipilih  karena  kemampuan  mata tunas  dalam  regenerasi  dan  ukuran  lebih  kecil dari stek. [11] menyatakan bahwa pertumbuhan mata tunas dipengaruhi letak atau posisinya di batang.  Pada  klon  tertentu  jumlah  yang merekah,  tinggi,  dan  total  berat  kering  lebih tinggi  dari  mata  tunas  dari  bagian  atas  induk berumur  enam  bulan.  Sedangkan  dari  induk berumur  empat  bulan  tidak  menimbulkan pengaruh nyata. Pada klon lain, mata tunas dari bagian  bawah  batang  induk  lebih  baik dibandingkan dari bagian atas.
Tabel 1 . Regenerasi stek mini ubi kayu Manggu, Mentega 2, Kristal Merah berbagai ukuran pada media tanah dan pasir untuk memperoleh ukuran terkecil dan tertinggi daya hidupnya pada 14 HST
Genotip Ukuran Stek Daya Hidup (%) Manggu 1 buku 0,5 cm 100 1 buku 1 cm 100 2 buku 1 cm 100 Mentega-2 1 buku 0,5 cm 100 1 buku 1 cm 100 2 buku 1 cm 100 Manggu 0,5 cm 100 1,0 cm 100 2,0 cm 100 Kristal Merah 0,5 cm 100 1,0 cm 100 2,0 cm 100 a. b. c. d. Kristal Merah Manggu
Gambar 3. Regenerasi tunas dengan stek jarak 0,5; 1,0; dan 2,0 cm dari mata tunas Kristal Merah (a) dan kontrol (b), Manggu (c) dan kontrol (d) pada 13 HST, untuk menentukan stek mini terkecil dengan daya hidup tinggi
Tabel 2 . Daya hidup mata tunas dengan atau tanpa batang ubi kayu Manggu dan Kristal Merah pada media  tisu  yang  dibasahi  dengan  air  dan  hara  makro  untuk  memperoleh  ukuran  terkecil  yang  dapat diregenerasi pada 13 HST
Genotip Bagian tanaman Media tisu dengan air Media tisu dengan hara makro Daya hidup (%) Tinggi tanaman (cm) Daya hidup (%) Tinggi tanaman cm) Manggu Mata tunas dengan bagian batang 33,3 1,5 0 0 Mata tunas tanpa bagian batang 33,3 1 0 0 Kristal Merah Mata tunas dengan bagian batang 50 4 0 0 Mata tunas tanpa bagian batang 50 3 0 0
Tabel 3 . Daya hidup mata tunas tanpa bagian batang ubi kayu genotip Manggu dan Kristal Merah pada tisu dengan air atau hara makro untuk memperoleh ukuran terkecil yang dapat diregenerasi pada 13 HST
Genotip Bagian tanaman Daya hidup (%) Daya hidup (%) media tisu dengan air media tisu hara makro Manggu Mata tunas merekah 80 80 Mata tunas tidak merekah 80 20 Kristal Merah Mata tunas merekah 100 80 Mata tunas tidak merekah 80 40
Tabel 4 . Daya hidup mata tunas tanpa bagian batang ubi kayu genotip Manggu dan Kristal Merah pada tisu dengan penambahan gliserol 87% dan DMSO10% untuk memperoleh ukuran terkecil yang dapat diregenerasi pada 48 HST pada berbagai perlakuan kriopreservasi
Jenis Ubi kayu Perlakuan Persentase daya hidup mata tunas merekah setelah hari ke-48 Persentase daya hidup mata tunas tidak merekah setelah hari ke-48 Manggu Krioprotektan disimpan 45’ 20 ± 20a 20 ± 20a disimpan 3 minggu di LN2 20 ± 20a 20 ± 20a Tanpa Krioprotektan disimpan 45’ 36 ± 16a 36 ± 16a disimpan 3 minggu di LN2 20 ± 20a 20 ± 20a Kontrol direndam 20 ± 20a 20 ± 20a tidak direndam 20 ± 16a 36 ± 16a Kristal Merah Krioprotektan disimpan 45’ 36 ± 16a 20 ± 20a disimpan 3 minggu di LN2 20 ± 20a 20 ± 20a Tanpa Krioprotektan disimpan 45’ 36 ± 16a 20 ± 20a disimpan 3 minggu di LN2 36 ± 16a 20 ± 20a Kontrol direndam 20 ± 20a 20 ± 20a tidak direndam 36 ± 16a 20 ± 20a Keterangan: LN2= Liquid Nitrogen
Tabel 5. Daya hidup mata tunas tanpa bagian batang Ubi Kayu genotip Manggu dan Kristal Merah pada tisu dengan penambahan gliserol 87% dan DMSO 5% untuk memperoleh ukuran terkecil yang dapat diregenerasi pada 48 HST pada berbagai perlakuan Kriopreservasi
Jenis Ubi Kayu Perlakuan Persentase daya hidup mata tunas Manggu Krioprotektan disimpan 45’ 36 ± 16a disimpan 3 minggu di LN2 52 ± 12a Tanpa Krioprotektan disimpan 45’ 36± 16a disimpan 3 minggu di LN2 36 ± 16a Kontrol direndam 36 ± 16a tidak direndam 68 ± 8a Kristal Merah Krioprotektan disimpan 45’ 36 ± 16a disimpan 3 minggu di LN2 36 ± 16a Tanpa Krioprotektan disimpan 45’ 36 ± 16a disimpan 3 minggu di LN2 36 ± 16a Kontrol direndam 52± 12a tidak direndam 52 ± 12a Nangka Krioprotektan disimpan 45’ 36 ± 16a disimpan 3 minggu di LN2 52 ± 12a Tanpa Krioprotektan disimpan 45’ 36 ± 16a disimpan 3 minggu di LN2 36 ± 16a Kontrol direndam 52 ± 12a tidak direndam 52 ± 12a Keterangan: LN2= Liquid Nitrogen
(a) (b)                                   (c)                                       (d)
Kristal Merah
(a)                                          (b)                                 (c)                                       (d)
Manggu
Gambar  4. Regenerasi mata tunas  Kristal Merah  dan  Manggu  hasil  perlakuan  yang  tumbuh  di  tisu dibasahi air pada 13 HST (a = kontrol tidak direndam, b = kontrol direndam, c = perlakuan direndam, d = perlakuan tidak direndam)
Tabel 6 . Persentase hidup stek super mini ubi kayu Manggu dan Mentega 2 yang direndam dalam 87% gliserol setelah penyimpanan di tangki nitrogen 1 jam atau 1 hari
Genotip Ukuran stek Daya hidup setelah penyimpanan di tangki nitrogen (%) 1 jam 1 hari Manggu 1 buku 0,5 cm 0 0 1 buku 1 cm 0 0 2 buku 1 cm 3 0 Mentega 2 1 buku 0,5 cm 0 0 1 buku 1 cm 0 0 2 buku 1 cm 0 100
Gambar 5. Stek mini 2 buku ubi kayu genotip Manggu, disimpan dalam nitrogen cair (LN2) selama 1 jam yang hidup. kontrol (A) dibandingkan yang disimpan di Liquid Nitrogen (LN2) (B dan C); stek yang hidup setelah disimpan di LN2
Menurut [12], penggunaan mata tunas selain bahan  tanaman  lainnya  yang  umum  dipakai juga  dilakukan  di  nanas.  Alasan  keterbatasan jumlah  bibit  bila  hanya  menggunakan crown tidak  dapat  memenuhi  perkebunan.  Jumlah tunas  yang  terbentuk  dan  tinggi  tunas  terbaik adalah  perlakuan  kontrol,  sedangkan  jumlah daun dan panjang akar terbaik diperoleh dengan menggunakan sari bawang merah.
Pada kultur in vitro , penggunaan mata tunas dari  ketiak  daun planlet umur  enam  bulan
menunjukkan  daya  bertunas  tertinggi.  [13] menyatakan  ubi  kayu  mempunyai  aktivitas metabolik,  laju  pertumbuhan  daun  dan  batang lebih  tinggi  pada  umur  3  –  6  bulan  setelah tanam.  Kualitas  tunas  merekah  tertinggi  dari mata tunas diambil dari bagian lunak di bagian atas  ( herbaceous  apical  stem )  karena  lebih sedikit level lignifikasi jaringan. Hasil ini juga sama dengan [14], yang melaporkan bahwa stek bagian  atas  (apikal)  dengan  level  lignifikasi lebih  rendah  mempunyai  kondisi  fisiologis
A B
C
yang sesuai seperti adanya auksin dan senyawa penting  lainnya  untuk  berakar  di plantlet Lavandula angustifolia L.
Penyimpanan dalam nitrogen cair selama 45 menit atau 1 jam sudah dapat menjadi indikator kemampuan sampel mata tunas disimpan dalam jangka panjang (dorman). Penyimpanan dalam uap  nitrogen  dengan  kisaran  suhu  sekitar  - 140˚C juga  dilakukan pada  tunas  dorman dari kebun  buah Ribes  nigrum L  [15].  Hasil  ini memberikan  harapan  bahwa  stek  super  mini dapat disimpan dalam jangka panjang. Namun memerlukan prosedur pemberian anti jamur dan penyakit lainnya karena semakin besar sampel, kemungkinan  mengandung  bakteri  atau  jamur lebih  banyak.  Oleh  karena  itu,  sebelum disimpan  di  tangki  nitrogen,  sampel  direndam dalam larutan fungisida Agrept 2 % dan Dithane 20 % selama 1 jam perendaman.
Bila dibandingkan mata tunas tanpa bagian batang,  persentase hidup Manggu  dan  Nangka mencapai  lebih  tinggi  yaitu  40%  setelah penyimpanan  dalam  nitrogen  cair  selama  3 minggu  dalam  keadaan  terendam  (Gambar  6 dan  7).  Hal  ini  juga  lebih  praktis  karena  tidak memerlukan  perendaman  dalam  fungisida karena relatif lebih bersih. Status pertumbuhan mata  tunas  menentukan  daya  regenerasi  di media  tumbuh.  Daya  regenerasi  mata  tunas yang  belum  merekah  lebih  rendah  dari  pada mata  tunas  yang  sudah  merekah.  Hal  ini dimungkinkan  karena  dormansi  (Tabel  3). Pemecahan  dormansi  dapat  dilakukan  dengan pemberian stress , namun pada ubi kayu, setelah penyimpanan  dalam  nitrogen  cair  baik  pada perlakuan  larutan  krioprotektan  kombinasi dengan  5%  maupun  10%  DMSO,  mata  tunas yang  belum  atau  tidak  merekah  mempunyai daya  hidup  lebih  rendah  bahkan  tidak  tumbuh hingga umur 48 HST (Gambar 8 dan 9). Hal ini berbeda  dengan  jenis  tanaman  lain  seperti kelompok blueberry ( Vaccinium ) pada penelitian yang dilakukan [16] yang menggunakan mata tunas dorman dari cabang.
Gambar  6. Regenerasi  mata  tunas  ubi  kayu genotip  Nangka  (B),  Manggu  (C)  yang  hidup dibandingkan  kontrol  (A)  pada  media tisu dibasahi  air  setelah  disimpan  dalam  nitrogen cair selama 45 menit
Gambar  7 .    Regenerasi  mata  tunas  ubi  kayu genotip Nangka (2) dan Manggu (3) yang hidup dibandingkan  kontrol  (1)  pada  media tisu dibasahi  air  setelah  disimpan  dalam  nitrogen cair 3 minggu
Penggunaan  mata  tunas  yang  disimpan dalam jangka panjang sudah banyak dilakukan di  tanaman  hortikultura  berkayu  seperti  apel dan  lainnya.  Umumnya  metode long-term preservation (kriopreservasi)  digunakan  untuk penyimpanan bud (tunas yang belum merekah) tanaman buah-buahan bernilai ekonomi tinggi. Sedangkan pada kelompok blueberry ( Vaccinium )  digunakan  ranting  dengan  tunas dorman  dipotong  70  mm  dengan  minimal  2 buku,  desikasi, slowly  cooled ,  lalu  disimpan dalam  uap  nitrogen  cair.  Daya  hidup  tertinggi adalah yang diambil di pertengahan Desember hingga  pertengahan  Januari.  Hal  ini  juga mengindikasikan  bahwa  periode  pengambilan bahan  tanaman  juga  berpengaruh.  Daya  hidup berkorelasi  negatif  dengan  perlakuan  suhu sebelum  perlakuan  namun  tidak  berkorelasi dengan  dormansi  tunas,  kadar  air,  diameter ranting, jumlah tunas, dan panjang ranting dan lamanya  desikasi.  Daya hidup  dapat mencapai 52%  and  80%  bila  dorman  tunas  dipanen setelah  10  hari  dengan  rata-rata  suhu  ruang kurang dari 11,2 °C.
Pengambilan  tunas  dorman  pada  suhu  ini sangat penting sebelum diperlakukan penyimpanan di uap nitrogen cair [16]. Hal ini sesuai  dengan  hasil  yaitu  stek  mini  ubi  kayu dengan  1-2  mata  tunas  akan  mempunyai  daya hidup lebih tinggi bila hanya menggunakan uap nitrogen  cair,  tidak  direndam.  Hal  ini dikarenakan  kandungan  air  yang  banyak  akan menjadi  kristal  es  bila  direndam  di  nitrogen cair.  Pada  tanaman  buah  berkayu  lainnya, perlakuan slow cooling (pendinginan bertahap) sebelum dicelup di nitrogen cair lalu disimpan hanya dalam uap nitrogen cair juga merupakan yang  terbaik  seperti  pada  mata  tunas  dorman Ribes  nigrum L.  dengan  daya  hidup  mencapai 83% [15].
Penggunaan  metode slow  cooling sudah lama  digunakan  dan  memberikan  daya  hidup tunas pucuk ubi kayu secara in vitro lebih tinggi dibandingkan  langsung  perendaman  dalam nitrogen  cair  [17].  Teknik  ini  dapat  dicoba untuk  penyimpanan  mata  tunas  namun memerlukan tahapan lebih panjang, A B C
A B C
Gambar 8 . Persentase hidup mata tunas ubi kayu Manggu dan Kristal Merah (KM) dengan perlakuan krioprotektan 87% gliserol dan 10% DMSO dan disimpan dalam nitrogen cair pada 3, 6, 12, 24, dan 48 HST
Gambar 9. Persentase hidup mata tunas ubi kayu Manggu, Kristal Merah, Nangka dengan dan tanpa perlakuan krioprotektan 87% gliserol dan 5% DMSO dan disimpan dalam nitrogen cair pada 3, 6, 12, 24, dan 48 HST
sedangkan tujuan dari penelitian yang dilakukan adalah menentukan prosedur praktis untuk  menyimpan  mata  tunas  ubi  kayu.  Agar prosedur lebih praktis juga pernah dicoba oleh [10] pada mata tunas dorman Ribes nigrum L. dengan  melakukan  pencelupan  langsung  pada nitrogen  cair  tanpa slow  freezing namun melakukan  penyimpanan  langsung  dicelup  di nitrogen cair setelah desikasi selama tujuh hari di  suhu  -20˚C.  Hanya  yang  penyimpanan  di 20˚C yang dapat hidup di lapang saat dilakukan okulasi  langsung.  Walaupun  tidak  ada  yang hidup  setelah  pencelupan  dalam  nitrogen  cair, namun apabila mata tunas langsung dipisahkan dari bagian berkayu saat setelah thawing di air pada suhu ruang dan dibiakkan secara in vitro .
Membiakkan mata tunas ubi kayu secara in vitro setelah penyimpanan di nitrogen cair telah dilakukan  namun  belum  berhasil  karena kontaminasi  yang  diakibatkan  bagian  berkayu mengandung  banyak  kontaminan  (bakteri  dan jamur). Perlu dilakukan optimasi sterilisasi bila
mata  tunas  batang  ubi  kayu  akan  dibiakkan secara in vitro.
Pengaruh komposisi larutan krioprotektan  dan  lamanya  perendaman. Perendaman  dalam  1  jam  diduga  terlalu  lama bila konsentrasi kombinasi larutan kriprotektannya terlalu tinggi. Larutan krioprotektan  berfungsi  untuk  melindungi kerusakan  sel  akibat  pembentukan  kristal  es. Semakin besar ukuran bagian tanaman, semakin memerlukan perlindungan yang lebih kuat dari krioprotektan.  Gliserol  pada  konsentrasi  87% kemungkinan  kurang  sesuai  atau  tidak  cukup kuat  melindungi  stek  mini  ubi  kayu.  Oleh karena itu, untuk penyimpanan mata tunas ubi kayu digunakan kombinasi dengan DMSO pada konsentrasi  5%  dibandingkan  dengan  10%. Untuk penyimpanan jangka panjang mata tunas tanpa  bagian  batang,  konsentrasi  5%  DMSO dikombinasikan  dengan  87%  gliserol  yang terbaik karena 10% DMSO berefek lebih toksik sehingga persentase hidup tertinggi hanya 20%
yang diperoleh dari mata tunas varietas Kristal Merah (Gambar 8 dan 9).
Krioprotektan  yang  umum  digunakan  pada pembekuan  semen  hewan  ternak  seperti  ayam adalah gliserol. Namun, gliserol dapat berdampak  negatif  setelah  jangka  waktu tertentu  seperti  yang  dilaporkan  [18]  yaitu penggunaan gliserol sebagai krioprotektan pada proses  pembekuan  memberikan  hasil  yang sangat  buruk  pada  tingkat  fertilitas  ayam kampung.  Oleh  karena  itu,  perlu  digunakan larutan  lain  seperti  DMSO.  Senyawa  DMSO adalah  campuran  organosulfur  dengan  rumus kimia  (CH 3 )2SO  dan  mempunyai  bobot molekul  rendah  yaitu  78,13  g/mol  sehingga lebih  cepat  masuk  ke  dalam  sel  pada  proses pembekuan.  Senyawa  DMSO  juga  memiliki titik  beku  yang  tinggi  yang  dapat  mencegah pembentukan  kristal  es.  Konsentrasi  DMSO optimal  sangat  bervariasi,  pada  hewan  untuk semen  itik  yang  terbaik  adalah  10%  [19], sedangkan  pada  berbagai  jenis  ayam  yang terbaik adalah 5% [20].
Perendaman  langsung  (atau  pembekuan cepat)  dalam  nitrogen  cair  tanpa  perlakukan pendinginan  sebelumnya memerlukan  desikasi atau  penyimpanan  pada  suhu  dingin  atau pendinginan/pembekuan  secara  bertahap ( slow freezing ) memerlukan kriprotektan. Dari komposisi  larutan  krioprotektan  yang  dicoba, 5%  DMSO  merupakan  yang  terbaik  karena menghasilkan  daya  hidup  tertinggi  hingga mencapai  40%  pada  Nangka  dan  Manggu. Konsentrasi ini diduga masih toksik untuk mata tunas  karena  mata  tunas  kontrol  yang  tidak disimpan dalam nitrogen cair juga mempunyai daya hidup 60% (Gambar 10 dan 11).
Perlakuan perendaman dalam larutan krioprotektan  kombinasi  87%  gliserol  dan  5% DMSO  membuktikan  bahwa  tanpa  perlakuan ini  selama  1  jam,  tidak  ada  mata  tunas  yang hidup  atau  daya  hidup  hanya  20%  pada  dua
genotip  yang  dicoba  yaitu  Manggu,  Nangka, dan  Kristal  Merah  (Gambar  11).  Bila  larutan krioprotektan tidak sesuai, tidak dapat melindungi  atau  bahkan  menjadi  meracuni sehingga tidak ada yang hidup.
[21] menyimpulkan bahwa komposisi media dan  larutan  krioprotektan  sebelum  disimpan dalam  nitrogen  cair  atau  sebelum  perendaman sangat  menentukan  keberhasilan  regenerasi setelah penyimpanan. Walaupun belum dilakukan  penyimpanan  dalam  nitrogen  cair, tunas ubi kayu yang dikultur pada media untuk menahan  pelayuan  yaitu  mengandung  AgNO 3 dan glutamin dapat mengurangi atau memperlambat  penguningan  daun.  Pada  ubi jalar, walaupun belum berhasil disimpan dalam nitrogen  cair,  namun  penggunaan  etilen  glikol lebih  baik  daripada  DMSO  memberikan pertumbuhan lebih baik setelah perendaman.
Pengaruh  lama  penyimpanan  dalam nitrogen  cair. Lamanya  penyimpanan  dalam nitrogen  cair  tidak  berpengaruh  terhadap persentase  daya  hidup  mata  tunas  ubi  kayu karena  daya  hidup  mata  tunas  tanpa  bagian batang  yang  disimpan  selama  45  menit  sama dengan yang disimpan selama 3 minggu.  Pada genotip Manggu dan Nangka, mata tunas yang disimpan selama 3 minggu bahkan mempunyai daya hidup lebih tinggi yaitu 40% dibandingkan bila  disimpan  selama  45  menit  (Gambar  11). Hal  ini  sesuai  dengan  hasil  penelitian  di beberapa  tanaman  atau  hewan  bahwa  apabila bertahan  dalam  30-45  menit,  akan  bertahan hingga  waktu  tak  terbatas  karena  indikator cukup 30 menit bila benar-benar terendam dan sudah  terlindungi  dengan  pra  perlakuan  atau dalam  larutan  krioprotektan  yang  sesuai. Teknik  kriopreservasi  menunjukkan  tidak ditemukannya  abnormalitas  secara  morfologi kalus  embriogenik Dioscorea  bulbifera L. dengan metode encapsulation-vitrification setelah dikulturkan pada media regenerasi [22].
Gambar 10. Persentase hidup mata tunas ubi kayu Manggu dan Kristal Merah yang merekah dan tidak merekah pada 48 HST pada perlakuan krioprotektan 87% gliserol dan 10% DMSO   setelah disimpan dalam nitrogen cair 45 menit dan 3 minggu
Gambar 11. Persentase hidup mata tunas yang merekah pada ubi kayu Manggu, Kristal Merah (KM), dan Nangka pada 48 HST pada perlakuan krioprotektan 87% gliserol dan 5% DMSO setelah disimpan dalam nitrogen cair 45 menit dan 3 minggu
Pengaruh  metode  kriopreservasi  dan thawing  (pencairan).  Thawing (pencairan) lambat dengan didiamkan di suhu ruang selama 1  jam  kurang  sesuai  untuk  stek mini  ubi  kayu sehingga  digunakan  pencairan  secara  cepat dengan  dimasukkan  dalam water  bath suhu 60ºC  untuk  mata  tunas  ubi  kayu  Nangka,
Manggu,  dan  Kristal  Merah.  Tunas  dorman Ribes nigrum L memerlukan pencairan lambat setelah penyimpanan dalam nitrogen cair [15].
Metode kriopreservasi sangat memengaruhi keberhasilan.  Metode  yang  digunakan  adalah pembekuan  cepat  dengan  alasan  untuk kepraktisan aplikasi. Sebagian besar menggunakan  bahan  tanaman in  vitro dan berhasil  diregenerasikan  setelah  penyimpanan dalam  nitrogen  namun  memerlukan  prosedur yang sesuai. Teknologi vitrifikasi dan enkapsulasi  dehidrasi  telah  berhasil  pada beberapa tanaman in vitro seperti ubi kayu [7], tanaman berkayu mangium dan sengon [23, 24, 25], dan pada kalus embriogenik kakao dengan metode  enkapsulasi dehidrasi  [26].  Kombinasi metode enkapsulasi dehidrasi-vitrifikasi bahkan juga  dilakukan  pada  tunas  pucuk in  vitro ubi kayu [27].
Pengaruh  media  regenerasi. Media  atau metode  regenerasi  sangat  berpengaruh  pada kemampuan  hidup  jaringan  atau  bagian tanaman setelah mengalami perendaman dalam nitrogen  cair  dengan  suhu  -198ºC.  Pemberian larutan hara makro tidak memberikan pengaruh positif  sehingga  pelembaban  dengan  air  lebih banyak  memberikan  daya  hidup  lebih  tinggi pada mata tunas ubi kayu yang tidak disimpan dalam  nitrogen  cair.  Oleh  karena  itu, mekanisme regenerasi untuk mata tunas setelah disimpan dalam nitrogen cair adalah membiakkan  dalam  tisu  yang  dibasahi  air. Penggunaan  larutan  hara  makro  MS  medium
diduga  terlalu  tinggi  mengandung  nutrisi tertentu  yang  tidak  diperlukan  mata  tunas sehingga berakibat meracuni.
Penanaman  di  media  MS  dan  agar menyebabkan  kontaminasi,  hal  ini  diduga karena  proses  sterilisasi  mata  tunas  ubi  kayu belum  optimum  yang  masih  terdapat  bagian kayu  batang.  Hal  ini  mengakibatkan  semua sampel  setelah  penyimpanan  dalam  nitrogen cair terkontaminasi jamur dan bakteri.
Regenerasi  dalam  media  agar  secara in  vitro dilakukan  untuk  meningkatkan  daya  hidup blackcurrant  yang  apabila  langsung  ke  media tanah,  daya  hidupnya  akan  lebih  rendah  atau bahkan mati [10]. Hal ini karena media in vitro dapat  mencukupi  kebutuhan  hara  sampel setelah perlakuan pembekuan.

## KESIMPULAN
Keberhasilan  kriopreservasi  mata  tunas  ubi kayu  tergantung  genotip,  ukuran  dan  bagian mata  tunas,  komposisi  larutan  krioprotektan, lamanya  perendaman,  media,  dan  prosedur regenerasi  setelah  perendaman  dalam  nitrogen cair  sehingga  apabila  faktor  tersebut  tidak optimal  akan  menyebabkan  persentase  daya hidup  rendah.  Ukuran  mata  tunas  dan  kondisi mata tunas menentukan prosedur kriopreservasi yang  paling  sesuai.  Semakin  besar  ukuran, metode penyimpanan hanya dalam uap nitrogen cair  sedangkan  mata  tunas  saja  tanpa  bagian stek  batang,  dapat  direndam  di  nitrogen  cair hingga  tiga  minggu  yang  mengindikasikan dapat  disimpan  selama  tidak  waktu  terbatas. Hasil  yang  diperoleh  merupakan  terobosan penyimpanan  jangka  panjang  bahan  tanaman ubi  kayu  atau  tanaman  berkayu  tropis  yang berbiak  vegetatif  lainnya  yang  tidak  perlu secara in  vitro dan  lebih  praktis.  Agar  daya
hidup  mata  tunas  yang  merekah  setelah kriopreservasi semakin meningkat yaitu mencapai lebih dari 40%, diperlukan penelitian lebih lanjut antara lain pra perlakuan mata tunas pada  suhu  <18ºC,  mengubah  komposisi  dan menurunkan konsentrasi larutan krioprotektan, mengurangi  waktu  perendaman,  memperbaiki mekanisme dan media regenerasi.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Rismayani (2007) Usahatani dan pemasaran  hasil  pertanian.  Medan  USU Press
[2] Pusat Data dan Sistem Informasi Pertanian (2016)  Outlook  Komoditas  Pertanian Tanaman Pangan: Ubi Kayu. Kementerian Pertanian74 p.
[3] Adrian  (2012).  Pertumbuhan  akar  dan tunas stek batang mini tanaman ubi kayu. Prosiding  Seminar  Hasil-hasil  Penelitian dan  Pengabdian  Kepada  Masyarakat. Universitas Lampung. 11-18
[4] Nahar  EN,  Tan  SI  (2012)  Cassava  mini cutting as a source of planting materials. J. Trop. Agric. And Fd. Sci. 40(1): 145-151.
[5] Escobar RH, Mafla G, Roca WM (1997) A methodology for recovering cassava plants from  shoot  tips  maintained  in  liquid nitrogen. Plant Cell Reports 16:474–478.
[6] Charoensub R, Phansiri S, Yongmanitchai W,  Sakai  A  (2003)  Kriopreservasi  rutin pada apeks ketiak yang ditanam secara in vitro  ( Manihot  esculenta Crantz)  dengan vitrifikasi:  pentingnya  kultur  mononodal sederhana. Scientia  Horticulturae 98 (4): 485-492.
[7] Roostika I, Mariska I, Sunarlim N (2004) Penyimpanan ubi kayu ( Manihot utilissima )  secara  kriopreservasi  dengan teknik vitrifikasi. J.
Bioteknologi Pertanian 9(1): 8-13.
[8] Suidzinska A, Lukaszewicz E (2008) The effect of breed on freezability of semen of fancy fowl. Anim. Sci. Pap. Rep 26: 331 – 340.
[9] Kostaman  T,  Yusuf  T  L,  Fachrudin  M, Setiadi  MA  (2018)  Effectiveness  of DMSO concentration on recovery rate and viability  of  primordial  germ  cell  of  Gaok chicken. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner 22(1): 30-37. [10] Green J, Grout B, (2010) Direct cryopreservation  of  winter  buds  of  nine cultivars of blackcurrant ( Ribes nigrum L).
Cryo Letters 31 (4): 341-346.
[11] Neves  RDJ,  Souza  LS,  Oliveira  EJD (2020)  A  leaf  bud  technique  for  rapid
propagation of cassava ( Manihot esculenta Crantz). Scientia Agricola 77(2): e20180005.
[12] Warid W, Effendi RS, Widianti RA (2018) Respon  mata  tunas  crown  terhadap  jenis perangsang  tumbuh  pada  perbanyakan tanaman  nanas.  Jurnal  Bioindustri  1  (1): 73-82.
[13] Sari,  R  (2017)  Evaluasi  keragaman karakter morfologi  dan  agronomi  delapan populasi F1 ubi kayu di Bandar Lampung. Digital Repository Unila.
[14] de Bona CM, Masetto MAM, Deschamps C,  Biasi  LA  (2012)  Rooting  induction  of different
Lavandula
angustifolia accessions  by  auxin  application. Semina: Ciências Agrárias 33(1): 175-182.
[15] Rantala S, Kaseva J, Karhu S,  Veteläinen M,  Uosukainen  M,   Häggman  H  (2019) Cryopreservation  of Ribes  nigrum (L.) dormant buds: recovery via in vitro culture to  the  field.  Plant  Cell,  Tisu  and  Organ Culture (PCTºC) 138:109–119.
[16] Jenderek  MM,  Tanner  JD,  Ambruzs  BD, West M, Postman JD, Hummer KE (2017) Twig pre-harvest temperature significantly influences  effective  cryopreservation  of Vaccinium dormant buds . Cryobiology 74:
154-159.
[17] Sudarmonowati  E,  Henshaw  GG  (1992)
Pengaruh perlakuan awal dan krioprotektan terhadap daya hidup embrio somatik  ketela  pohon  yang  dibekukan. Prosiding  Seminar  Hasil  Penelitian  dan Pengembangan
Bioteknologi. 11-12
Pebruari 1992. Bogor.
[18] Sumantri, Gunawan A (2016) Penggunaan Dimethyl  sulfoxide  sebagai  krioprotektan dalam pembekuan semen ayam kampung. Jurnal  Veteriner 17(2):  300- 308.
[19] Kostaman T, Setioko AR (2011)
Perkembangan penelitian teknik kriopreservasi  untuk  penyimpanan  semen unggas. Wartazoa 21(3): 145-152.
[20] Bebas W, Laksmi DNDI. (2014) Pengaruh berbagai  konsentrasi  dimethy  sulfoxide terhadap kualitas semen beku ayam hutan hijau post  thawing . Jurnal  Ilmu  dan Kesehatan Hewan 2(2): 105-115.
[21] Roostika I, Mariska I (2017) Pemanfaatan teknik  kriopreservasi  dalam  penyimpanan plasma  nutfah  tanaman. Buletin  Plasma Nutfah 9 (2): 10-18.
[22] Ming-Hua HSRY (2010) In vitro conservation  of  rare  and  endangered Emmenopterys  henryi Oliv.  Germplasm.
Bulletin of Botanical Research 30 (2): 191- 196.
[23] Priadi  D,  Sudarmonowati  E  (1996) Vitrification  of Acacia  mangium and
Paraserianthes  falcataria shoot  tips: Effect  of  vitrification  solutions  and thawing  temperature.  Proceedings  of International Workshop on Biotechnology and Development of Species for Industrial Timber  Estate,  June,  1995,  Cibinong, Indonesia.
[24] Sudarmonowati  E,  Rosmithayani  ES, Mulyaningsih,  Priadi  D,  Sakai  A  (1998) Cryopreservation  of  shoot  tips  of  two leguminous  trees  ( Acacia  mangium and Paraserianthes falcataria ). Proceedings of International Workshop on Cryopreservation of Tropical Plant Germplasm.    October)  20-27  October, 1998, Tsukuba, Japan
[25] Priadi  D,  Sudarmonowati  E,  Arifani  R, Farisy  S  (2000)      Kriopreservasi  sengon ( Paraserianthes  falcataria )  dan  mangium ( Acacia  mangium Willd.)  dengan  metode enkapsulasi dehidrasi.  Prosiding Seminar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi  III.  Cibinong,  7-9  Maret 2000. [26] Pancaningtyas S (2013). Evaluasi kuantitas  dan  hiperhidrisitas  embrio somatik  kakao  pada  kultur  padat,  kultur cair, dan subkultur beruntun. Pelita Perkebunan 29 (1): 10-19.
[27] Charoensub  R,  Hirai  D,  Sakai  A  (2004)
Cryopreservation  of  in  vitro-grown  shoot tips of cassava by encapsulation- vitrification  method.  CryoLetters  25:  51- 58.