UJI POTENSI Bacillus sp. DAN Escherichia coli

## DALAM MENGHASILKAN INDOLE ACETIC ACID (IAA) TANPA MENGGUNAKAN TRIPTOFAN PADA MEDIA PERTUMBUHAN
Muhammad Asril Program Studi Biologi, Institut Teknologi Sumatera

## Abstract:
Indole  Acetic  Acid  (IAA)  is  the  important  phytohormone  for  boosting  plant- growth promotion. It is related with amino acid tryptophan as a precursor for building  IAA.  However  some  bacteria  such  as  Bacillus sp .  and  Escherichia coli  enable  to  produce  IAA  without  L-tryptophan  on  culture  medium  via  the tryptophan independent pathways.  This study aims to determine the potential of  indigenous  Bacillus  sp.  and  E.  coli  isolate  in  producing  IAA  via  Trp- independent  pathways  (without  L-  tryptophan).  The  stage  of  this  study consists  of  growing  of  isolate  on  liquid  media  without  tryptophan  and measuring  the  levels  of  IAA  using  Salkowsky  method.  Bacillus  sp  and Escherichia coli could produce IAA with the concentration of 0,0236 mmol/L and 0,024 mmol/L, respectively. The concentration of IAA produced by these bacteria  is  quite  low  because  of  their  ability  to  synthesis  IAA  from  the independent  tryptophan  pathway.  The  independent  tryptophan  pathway means  these  bacteria  could  synthesize  IAA  without  using  tryptophan  as  a precursor on their growth medium.
Keyword: Bacillus sp., Escherichia coli, IAA, tryptophan

## 1. Pendahuluan
Hormon  tanaman  merupakan  senyawa  organik  yang  disintesis  pada  salah  satu  bagian  tanaman kemudian ditransfer ke beberapa bagian yang lain. Hormon ini berperan dalam pertumbuhan tanaman, salah satunya  auksin.  Auksin  atau  nama  lainnya  IAA  (Indole  Acetic  Acid)  merupakan  hormon  tumbuh  yang memegang  peranan  penting  untuk  memacu  pertumbuhan  dan  perkembangan  tanaman  [1].  IAA  disintesis dalam berbagai bagian tubuh tanaman dan pada umumnya akan berasosiasi dengan bagian-bagian tubuh tanaman  yang  sedang  aktif  dan  berkembang  seperti  pada  semua  jenis  meristem  ujung  tunas.  Sumber hormon  IAA  yang  alami  tidak  hanya  dihasilkan  oleh  tumbuhan  saja  tetapi  juga  dihasilkan  oleh  bakteri  [2]. Salah satu keuntungan menggunakan bakteri sebagai sumber IAA karena pertumbuhan mikrob sangat cepat dibandingkan  dengan  pertumbuhan  tanaman  dalam  menghasilkan  hormon  IAA.  Selain  itu,  produksi biomassa  dari  mikrob  lebih  efisien  daripada  memproduksi  IAA  dari  biomassa  tanaman.  Mikroba  yang mampu menghasilkan IAA dapat meningkatkan perpanjangan dan pembelahan sel, perkembangan jaringan, respon  terhadap  cahaya  dan  gravitasi  sehingga  permukaan  akar  menjadi  lebih  luas  [3]  dan  akhirnya tanaman  mampu  menyerap  nutrisi  dari  tanah  lebih  banyak.  L-triptofan  merupakan  asam  amino  yang berfungsi sebagai prekursor dalam biosintesis IAA pada tanaman dan mikroba [4].
L-triptofan (L-Trp) sebagai prekursor fisiologis IAA, baik pada tanaman maupun pada mikroba. [5]. Penambahan  L-triptofan  pada  media  kultur  dapat  meningkatkan  produksi  IAA  [1].  L-triptofan  mengandung sumber  senyawa  aktif  yang  dapat  memicu  pertumbuhan  mikrobiota  dalam  memproduksi  IAA.  Bakteri penghasil  IAA  mensintesis  hormon  tersebut  melalui  jalur tryptophan  dependent  pathway dengan  senyawa intermediet indolepyruvic acid [6]. Beberapa jenis bakteri diketahui mampu meproduksi IAA melalui jalur ini antara lain Pseudomonas [5] , Bacillus subtilis [7], Arthrobacter agilis [8], Azotobacter [9]. Karena tingginya harga triptofan komersial, diperlukan eksplorasi bakteri yang mampu mensintesis IAA tanpa menggunakan triptofan pada media kultur pertumbuhannya.
Beberapa bakteri mampu memproduksi IAA tanpa menggunakan triptofan sebagai prekursor melalui jalur  triptofan  independen,  salah  satunya  kelompok  bakteri Bacillus sp.  [10].  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini bertujuan  untuk  mengukur  produksi  IAA  dari  bakteri indigenous ( Bacillus sp.  dan Escherichia  coli )  yang ! 82
ditumbuhkan pada media tanpa triptofan sehingga dapat diketahui potensi dari kedua jenis bakteri tersebut dalam menghasilkan IAA melalui jalur triptofan independen.

## 2. Metode

## 2.1 Alat-alat Penelitian
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  autoklaf  OSK  6500,  Ogawa  Seiki,  oven Memmert UN 55, inkubator goyang Memmert, UV-Vis spektrofotometer merk Evolution Thermoscientific.

## 2.2 Bahan-bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan di dalam penelitian ini adalah bakteri uji Bacillus sp. isolat lokal   dan Escherichia coli ATCC 25922 yang merupakan koleksi dari IPB Culture Collection (IPBCC). Penelitian ini menggunakan media Nutrient Broth (NB) tanpa menggunakan L-tryptofan sebagai media pertumbuhan. Pengujian  kadar  IAA  menggunakan  reagen  Salkowski yang  terdiri  dari  150  ml  H 2 SO 4 pekat,  7,5  ml FeCl 3 .6H 2 O  (0,5M).  Bahan-bahan  tersebut  dilarutkan  dalam  250  ml  akuades.  Sedangkan  standar pengukuran auksin yang digunakan pada penelitian ini yaitu indole acetic acid (IAA) sintesis.

## 2.3 Peremajaan Kultur Bakteri Uji
Isolat Bacillus sp. dan Escherichia coli diremajakan pada media Nutrient Broth (NB) tanpa L-triptofan didalam Erlenmeyer 250 ml, kemudian diinkubasi pada inkubator goyang pada suhu 37 0 C selama 48 jam. Isolate dilakukan dengan 3 kali pengulangan.

## 2.4 Pembuatan Kurva Standar IAA
Pembuatan kurva standar IAA menggunakan konsentrasi bertingkat dari larutan stok IAA (0,1 mg/ml atau 100 ppm). Larutan stok tersebut dibuat variasi konsentrasi standar IAA dari konsentrasi 0 ppm hingga 50 ppm (Tabel 1).

## Tabel 1. Variasi Konsentrasi IAA

## 2.5 Pengukuran Kadar IAA
Pengukuran kadar IAA Kultur masing-masing bakteri diambil 1,5 ml lalu disentrifugasi pada 10000 rpm selama 15 menit. Supernatan tersebut diambil dan dijadikan sebagai sampel untuk pengukuran kadar IAA. Analisis kadar IAA dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 520 nm. Masing-masing larutan standar IAA, blanko (hanya berisi akuades) serta sampel supernatan bakteri diambil  sebanyak  1  ml,  kemudian  ditambah  dengan  4  ml  reagen  Salkowski.  Masing-masing  larutan dihomogenkan  dengan  menggunakan  vortex  secara  perlahan  sampai  homogen,  kemudian  diinkubasi selama  20  menit  di  ruang  gelap.  Kemudian  masing-masing  larutan  diukur  absorbansinya  menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang ( λ ) 520 nm. Hasil pengukuran absorbansi pada larutan standar IAA  dibuat  kurva  standarnya,  lalu  diperoleh  regresinya.  Analisis  data  menggunakan  Ms.  Excel  dalam pembuatan grafik.
Konsentrasi IAA (ppm) Akuades (ml) IAA stock (ml) 0 1 0 10 0,9 0,1 20 0,8 0,2 30 0,7 0,3 40 0,6 0,4 50 0,5 0,5

## 3. Hasil dan Pembahasan
Bakteri Bacillus sp. dan E. coli yang ditumbuhkan pada media tanpa L- triptofan dalam waktu 48 jam menunjukkan produksi IAA yang tidak begitu tinggi. Kadar IAA dari Bacillus sp. sebesar 4.139 ppm / 0.0236 mmol/L  sedangkan E.  coli memiliki  konsentrasi  IAA  sebesar  4,202  ppm  atau  setara  dengan  0,024  mmol/L (Gambar  1).  Beberapa  faktor  dapat  mempengaruhi  produksi  IAA  oleh  bakteri,  salah  satunya  jenis  isolat. Isolat Bacillus sp. sudah dikenal memiliki kemampuan memproduksi IAA. Beberapa penelitian melaporkan bahwa terdapat 4 strain Bacillus spp yang mampu menghasilkan IAA sebesar 28,10 - 66,20 ppm (28,10 – 66,20 mg/L) [11]. Sedangkan E. coli hanya menghasilkan IAA sebanyak 19 µg/ml [12].

## Gambar 1. Kadar konsentrasi IAA pada masing-masing isolat.
Selain  jenis  isolat,  kadar  IAA  juga  dipengaruhi  oleh  keberadaan  triptofan  didalam  media. Triptofan merupakan prekursor dalam pembentukan IAA. Triptofan digunakan oleh mikroba sebagai sumber nitrogen untuk memproduksi IAA. Secara alami triptofan di alam diperoleh dari eksudat akar [13] dan sel mikroba [2], sedangkan  secara  buatan  triptofan  ditambahkan  didalam  media  produksi  IAA.  Sebagian  besar  bakteri tergantung  dengan  keberadaan  triptofan  baik  yang  diperoleh  dari  eksudat  akar  maupun  pada  media pertumbuhan atau sering disebut dengan IAA triptofan dependent salah satunya Bacillus amyloliquefaciens FZB42  [14].  Pada  penelitian  ini,  media  yang  digunakan  untuk  pertumbuhan  bakteri  uji  tidak  mengandung triptofan,  akan  tetapi  kedua  jenis  bakteri  ini  mampu  menghasilkan  IAA  walaupun  dalam  jumlah  sedikit. Kedua  jenis  bakteri  ini  mampu  mensintesis  IAA  tanpa  menggunakan  L-tryptofan  sebagai  prekursornya. Bakteri  yang  mampu  mengahsilkan  IAA  tanpa  L-tryptofan  pada  medium  pertumbuhannya  melalui  jalur triptofan independen yaitu jalur sintesis IAA tanpa menggunakan triptofan sebagai prekursor.
Secara  garis  besar  terdapat  tiga  mekanisme  pembentukan  IAA  yaitu  (1)  triptofan  diubah  menjadi asam indolpiruvat melalui reaksi transmisi, (2) asam indolpiruvat kemudian diubah menjadi indolasetaldehida melalui  reaksi  dekarboksilasi,  dan  (3)  tahap  akhir  adalah  oksidasi  indolasetaldehida  menghasilkan  asam indolasetat (IAA). Triptofan mengalami dekarboksilasi menjadi triptamin, kemudian triptamin dioksidasi dan dideaminisasi untuk menghasilkan indolasetaldehida. Molekul tersebut akan mengalami oksidasi lebih lanjut untuk  menghasilkan  asam  indolasetat.  Sedangkan  jalur  pembentukan  IAA  apabila  tanpa  adanya  triptofan maka  akan  melalui  jalur  triptofan–independent.  Jalur  ini  bercabang  dari  indol-3-gliserolfosfat  atau  indol, meskipun demikian belum ada enzim yang telah dikarakterisasi pada jalur ini (Gambar 1) [2].
Penggunaan  jalur  triptofan  independen  telah  banyak  dilakukan  oleh  bakteri  salah  satunya Bacillus sp. Dua isolat Bacillus yaitu Paenibacillus sp. dan Bacillus sp. mampu menghasilkan IAA pada media yang tidak  mengandung  triptofan  yaitu  sebesar  1,4-1,9  µg/ml  [10].  Sintesis  IAA  melalui  jalur  ini  dilakukan  oleh bakteri baik oleh Bacillus sp. maupun E. coli dengan cara menggunakan asam amino aromatik lain sebagai substrat untuk menghasilkan IAA [15]. Asam amino aromatik yang digunakan yaitu fenilalanin, tirosin bahkan aspartat. Asam amino ini digunakan sebagai satu-satunya sumber nitrogen oleh bakteri untuk memproduksi IAA.  Keberadaan  asam  amino  ini  hanya  mampu  memproduksi  IAA  dalam  jumlah  sedikit  seperti  yang ditunjukkan oleh Pantoea agglomerans [16].
K o n se n tr as i I A A (m m o l/L ) 0.0234 0.0236 0.0237 0.0239 0.024 Isolat Bacillus sp. Escherichia coli
Gambar 2 Jalur biosintesis IAA [2].

## 4. Kesimpulan
Kedua  jenis  isolat  bakteri  mampu  menghasilkan  Indole  Acetic  Acid  (IAA)  tanpa  menggunakan  L- trytofan  sebagai  prekursor  pada  media  pertumbuhannya. Escherichia  coli mensintesis  IAA  sebesar  0,024 mmol/L  lebih  tinggi  daripada Bacillus sp.  yang  memiliki  konsentrasi  IAA  sebesar  0,0236  mmol/L.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  Kedua  jenis  bakteri  ini  memiliki  potensi  sebagai  penghasil  IAA  tanpa  menggunakan prekursor L-triptofan.

## 5. Daftar Pustaka
[1] T.K.  Dewi,  J.  Suryanggono,  D,  Agustiyani,  “  Isolasi  dan  ujiaktivitas  bakteri  penghasil  hormone tumbuh  IAA  (indole-3-acetic  acid)  dan  bakteri  perombak  protein  dari  tanah  pertanian Tual,  Maluku Tenggara” Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon, vol 2, No.2, pp. 271-276, 2016
[2] S.  Spaepen,  J.  Vanderleyden,  Y.  Okon,  “Plant  growth-promoting  acions  of  rhizobacteria”, Adv  Botl Res, vol. 51, pp. 283-320, 2009
[3] R. S. D. P. Raj, G. R. Rex. “ Modified medium for isolation and preliminary screening of indole acetic acid (IAA) producing bacteria from soil samples”. Int. J.Modn. Res. Revs, vol. 2, no. 9, pp. 275-276, 2014
[4]      N.B. Patil, M. Gajbhiye, S.S. Ahiwale, A.B. Gunjal, B.P. Kapadnis. “Optimization of Indole 3-acetic acid (IAA) production by Acetobacter diazotrophicus L1 isolated from sugarcane.Intl J Environment Sci, vol.2, no. 1, pp. 307-314, 2011
[5] S.  Tabatabei,  P.  Ehsanzadeh,  H.  Etesami,  H.  A.  Alikhani,  B.R.  Glick,  “Indole-3-acetic  acid  (IAA) producing Pseudomonas isolates  inhibit  seed  germination  and α -amylaseactivity  in  durum  wheat ( Triticum turgidum L.)”. Spanish Journal of Agricultural Research, vol 14, no. 1, pp.1-10, 2016
[6] B.  Mohite,  “Isolation  and  characterization  of  indole  acetic  acid  (IAA)  producing  bacteria  from rhizospheric soil and its effect on plant growth”. J. Soil Sci Plant Nutr. Vol. 13, no. 3, pp. 638-649, 2013
[7] S.  Reetha,  G.  Bhuvaneswari,  P.  Thamizhiniyin,  T.R.  Mycin,  “Isolation  of  indole  acetic  acid  (IAA) producing  rhizobacteria  of Pseudomonas  fluorescens and Bacillus  subtilis and  enhance  growth  of onion ( Allium cepa L)”, Intl J Curr MIcrobiol and Apl Sci, vol. 3, no. 2, pp.568-574, 2014
[8] M.  Ozdal,  O.  G.  Ozdal,  A.  Sezen,  O.  F.  Algur  and  E.  B.  Kurbanoglu,  “Continuous  production  of indole-3-acetic acid by immobilized cells of Arthrobacter agilis ,” 3 Biotech, vol. 7, pp.1-6, April 2017
[9] M.  M.  Sahasrabudhe,  “Screening  of  rhizobia  for  indole  acetic  acid  production,”  Ann  Biological Research, vol. 2, pp. 460-468, 2011
[10] J.  J.  Acuna,  M.  A.  Jorquera,  O.  A.  Martinez,  D.  Menezes-Blackburn,  P.  Greiner  and  M.  L.  Mora, “Indole  acetic  acid  and  phytase  activity  produced  by  rhizosphere  bacilli  as  effected  by  pH  and metals,” J Soil Sci Plant Nutrition, vol. 11, pp.1-12, 2011.
[11] K. M. Lwin, M. M. Myint, T. Tar and W. Z. M. Aung, “Isolation of plant hormone (indole-3-acetic acid- IAA) producing rhizobacteria and study on their effects on maize seedling,” Engineering Journal, vol. 16, pp.137-144, 2012
[12] B.  Ali,  A.  Sabri,  K.  Ljung,  and  S.  Hasnain,  “Quantification  of  indole-3-acetic  acid  from  plant associated Bacillus spp.  And  their  phytostimulatory  effect  on vigna  radiata L.,”World  J  Microbiol Biotechnol, vol. 25, pp.519-526, 2009
[13] F. Ahmad,  I. Ahmad  and  M.  S.  Khan,  “Indole  acetic  acid  production  by  the  indigenous  isolated  of Azotobacter and fluorescent Pseudomonas in the presence and absence of tryptophan,” Turk J Biol, vol. 29, pp.29-34, 2005.
[14] E.E. Idris, D.J. Iglesias, M.Talon and R. Borris, “Trytophan-dependent production of indole-3-acetic acid  (IAA)  affects  level  of  plant  growth  promotion  by Bacillus  amyloliquefaciens FZB42,”  Mol  Plant Microbe Interact, vol. 20, pp. 619-626, June 2007
[15] A. G. Moat, J. W. Foster, and M. P. Spector. Microbial Physiology. New York (US): Wiley-Liss, 2002
[16] E.  Sergeeva,  D.  Hirkala,  and  L.  Nelson,  “Production  of  indole-3-acetic  acid,  aromatic  amino  acid aminotransferase  activities  and  plant  growth  promotion  by Pantoea  agglomerans rhizosphere isolates,” Plant and Soil, vol. 297, pp.1-13, 2007.