Perubahan  Ukuran  Folikel  Ovarium  dan  Kualitas  Oosit  pada Ovarium Domba Lokal Pasca Preservasi dengan Waktu yang Berbeda. (The  Changes  of  Ovarian  Follicles  Size  and  Oocytes  Quality  from  Local Sheeps’ Ovarium after Preservation with Different Time)
Nurul Ikhwan 1 , Nurcholidah Solihati 2 , Siti Darodjah Rasad 2 , Rini Widyastuti 2
Alumni Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran Tahun 2015 1
Laboratorum Reproduksi Ternak dan Insemianasi Buatan Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran 2 e-mail: ikhwanspt@gmail.com

## Abstract
Preservasi  merupakan  salah  satu  upaya  penanganan  ovarium  untuk  mempertahankan kualitas oosit yang telah diambil dari tubuh ternak agar dapat dimanfaatkan untuk Fertilisasi In Vitro.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  waktu  preservasi  ovarium  domba lokal terhadap ukuran folikel dan kualitas oosit. Sampel yang digunakan adalah ovarium domba lokal yang diperoleh dari tempat pemotongan hewan setempat.  Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan  metode  eksperimental,  dengan  pemberian  tiga  perlakuan  dan  enam  kali  ulangan yaitu: P1= preservasi ovarium pada suhu 37 o -38 o C selama 2 jam, P2= preservasi ovarium pada suhu 4 o -5 o C selama 11-12 jam, dan P3= preservasi ovarium pada suhu 4 o -5 o C selama 24-25 jam. Hasil  penelitian  menunjukan  waktu  preservasi  ovarium  memberikan  pengaruh  berbeda  nyata terhadap ukuran folikel kualitas oosit.
Kata kunci : domba lokal , folikel, oosit, preservasi

## Abstract
Preservation  is  one  of  method  for  handling ovaries  to  maintain  the  quality  of  oocytes that had been taken from cattle that can be used for In Vitro Fertilization. The aims of this study is  to  determine  the  effect  of  a  local  sheep  ovarian  preservation  to  the  follicle  size  and  oocyte quality.  The  sample  used  is  a  local  sheep  ovaries  were  obtained  from  a  local  slaughterhouse. This  research  was  conducted  by  using  experimental  methods  with  three  treatment  and  six replications  i.e:  P  1=  ovaries  preservation  temperature  of  37 o -38 o C  for  2  hours,  P2=  ovaries preservation  in  temperature  4 o -5  °  C  for  11-12  hours,  and  P3=  ovaries  preservation  at  a temperature of 4 o -5 ° C for 24-25 hours. The results showed that the times of preservationhave significantly different to the size of the follicle and oocyte quality . Keyword: local sheeps, follicle, oocyte, preservation
Pendahuluan
Pemotongan  domba  tahun  2013  di Provinsi Jawa Barat telah mengalami peningkatan  sebanyak  0,25%  dibandingkan dengan  tahun  2012  (Dinas  Peternakan  Jawa Barat, 2013). Upaya untuk memenuhi permintaan konsumsi  daging  domba  bagi  masyarakat diperlukan  suatu  cara  agar  jumlah  populasi  dan produksi ternak terus meningkat. Salah satu  cara yang  dapat  dilakukan  yaitu  melalui  penerapan teknologi In Vitro Fertilization (IVF).
Teknologi IVF memerlukan ketersediaan gamet  jantan  maupun  gamet  betina.  Salah  satu sumber  gamet  betina  yang  cukup  potensial adalah  ovarium  yang  berasal  dari  Tempat Pemotongan Hewan (TPH). Pemanfaatan ovarium  dari  TPH  merupakan  cara  yang
ekonomis,  namun  lokasi  TPH  yang  jauh  dengan laboratorium  kemungkinan  akan  menyebabkan penurunan  kualitas  oosit  pada  saat  transportasi ovarium dari TPH ke laboratorium.
Preservasi  merupakan  salah  satu  upaya penanganan ovarium agar
dapat mempertahankan kualitas oosit selama transportasi.  Salah  satu  perubahan  yang  terjadi pada  ovarium  selama  proses  preservasi  adalah perubahan  ukuran  folikel  dan  kualitas  oosit. Ukuran  folikel  dapat  mengalami  peningkatan maupun  penyusutan  ukurannya  dan  terjadi kerusakan  sel yang diakibatkan oleh berhentinya suplai  darah  dan  kekurangan  oksigen  ( hypoxia ). Salah  satu  upaya  untuk  meminimalisir  efek tersebut  adalah  dengan  pengaturan  waktu  dan
suhu    dan  media  preservasi  yang  tepat  selama proses preservasi.
Kualitas oosit dapat dipertahankan dengan  mengatur  waktu  dan  suhu  yang  tepat selama  proses  preservasi,  sehingga  cara  tersebut dapat  mendukung  teknologi  IVF.  Sejauh  ini preservasi  ovary  telah  dilakukan  kambing  (Silva et  al .,  2003),  anjing  (Lopes,  2008)  dan  sapi (Ackay et al ., 2008, Widyastuti dan Rasad, 2015) Namun  demikian,  penelitian  tentang perubahan ukuran folikel dan kualitas oosit pada domba  lokal  pasca  preservasi  dengan  berbagai waktu  belum  banyak  dilakukan.Penelitian  ini bermaksud  untuk  mengetahui  pengaruh  waktu preservasi  ovarium  terhadap  perubahan  ukuran folikel  dan  kualitas  oosit  domba  lokal  paska preservasi.  Hasil  dari  penelitian  ini  diharapkan mampu  memberikan  informasi  ilmiah  bagi  para peneliti  maupun  akademisi  sebelum  melakukan penelitian IVF.

## Materi dan Metode Pengambilan Ovarium
Ovarium  diambil  dari  domba  lokal  betina di  TPH.  Ovarium  dibersihkan  dengan  media NaCl  0.9%  yang  telah  ditambahkan  dengan antibiotik penicillin 100  IU/ml  dan streptomycin 0,1  mg/ml kemudian  memasukan  media  beserta ovarium  ke  dalam  wadah  lalu  wadah  tersebut disimpan di dalam termos.

## Preservasi Ovarium
Preservasi  ovarium  dilakukan  di  dalam termos  dengan  suhu  37 o -38 o C  selama  2  jam  dan di  dalam  lemari  pendingin  dengan  suhu  4 o -5 o C selama 11-12 jam dan 24-25 jam.
Pengamatan Perubahan Ukuran Folikel
Ovarium Pasca Preservasi Folikel diukur menggunakan jangka sorong.  Pengukuran  dilakukan  dua  kali  yaitu sebelum preservasi (awal) dan  setelah preservasi (akhir).  Folikel  difoto  dengan  kamera  yang berguna  untuk  identifikasi  perubahan  ukuran diameter.
Koleksi dan Evaluasi Oosit
Oosit  dikoleksi  dengan  metode slicing menggunakan  pisau  dan  pinset  (Engcong  dan Karja,  2013).  Oosit  yang  telah  dikoleksi, kemudian dievaluasi menjadi 4 kelompok kriteria kualitas yaitu A, B, C, dan D berdasarkan lapisan
sel  kumulus  dan  gambaran  sitoplasma  (Gordon, 2003). Oosit yang dikelompokan ke dalam:
1. Kualitas  A  jika  oosit  memiliki  lima  lapis atau  lebih  sel  kumulus  dengan  sitoplasma yang   homogen dan berwarna hitam.
2. Kualitas  B  adalah  oosit  yang  memiliki kurang dari lima lapisan sel kumulus dengan sitoplasma  yang  homogen  dan  berwarna hitam.
3. Kualitas  C  adalah  oosit  yang  terlihat  masih sedikit  lapisan  sel  kumulus,  zona  pellucida yang  terlihat  dan  sitoplasma  yang  tidak homogen.
4. Kualitas  D  adalah  oosit  yang  memiliki sitoplasma transparan, zona pellucida terlihat  atau  bahkan  tidak  ada  sama  sekali dan  lapisan  sel  kumulus  hampir  hilang bahkan hilang seluruhnya.
Analisis Data
Penelitian dilakukan dengan metode eksperimental. Rancangan percobaan yang digunakan  adalah  Rancangan  Acak  Lengkap (RAL).  Pengulangan  dilakukan  sebanyak  6  kali dengan 3 perlakuan preservasi ovarium yaitu P 1 = suhu 37 o -38 o C selama 2 jam (kontrol), P 2 = suhu 4 o -5 o C selama 11 - 12 jam, dan P 3 = suhu 4 o -5 o C selama 24 - 25 jam.
Diameter  folikel  yang  dikelompokan berdasarkan  kriteria  ukuran  kemudian  dihitung nilai  perubahan  diameter  sebelum  dan  sesudah preservasi  ovarium,  kemudian  analisis  statistik menggunakan  tabel  analisis  ragam  (uji  F).  Oosit yang  telah  dikelompokan  berdasarkan  nilai persentase kriteria kualitasnya kemudian tranformasi  data  ke  dalam  bentuk  Akar  Kuadrat untuk dilakukan analisis ragam (Gaspersz, 1995).

## Hasil dan Pembahasan
Ukuran  folikel  dan  kualitas  oosit  pasca preservasi  menunjukkan  hasil  yang  berbeda  di setisp  perlakuan.  Hasil  penelitian  pada  Tabel  1 mengenai  pengaruh  waktu  preservasi  ovarium terhadap  diameter  folikel  domba  lokal  bahwa preservasi  ovarium  berdampak  pada  rataan perubahan  diameter  folikel  yang  mengakibatkan penyusutan  ukuran.  Rataan  penyusutan  diameter folikel yang tertinggi yaitu pada P1 sebesar 0,217 mm, selanjutnya pada P2 sebesar 0,168 mm, dan penyusutan  terkecil  pada  P3  sebesar  0,152  mm.

## Tabel 1. Rataan Perubahan Diameter Folikel Setelah Preservasi Ovarium
Ulangan Perlakuan P1 P2 P3 ......................................   mm  ......................................... 1 0,230 0,194 0,151 2 0,188 0,188 0,118 3 0,194 0,148 0,181 4 0,186 0,175 0,179 5 0,222 0,101 0,151 6 0,280 0,199 0,131 Total 1,300 1,005 0,911 Rata-rata 0,217 0,168 0,152 Keterangan : P1 : Preservasi ovarium pada suhu 37 o -38 o C selama 2 jam (kontrol). P2 : Preservasi ovarium pada suhu 4 o -5 o C selama 11-12 jam. P3 : Preservasi ovarium pada suhu 4 o -5 o C selama 24-25 jam.
Hasil  analisis  statistik  dari  ketiga perlakuan tersebut menunjukan bahwa preservasi ovarium berbeda nyata terhadap diameter folikel, maka  terima  H 1 .  Hasil  berbeda  nyata  ini  perlu dilakukan uji lanjut Duncan yang hasilnya bahwa P1 berbeda nyata terhadap P2 dan P3, sedangkan P2 tidak berbeda nyata terhadap P3.
Hasil berbeda nyata menunjukan pada P1 telah memberikan pengaruh terhadap penyusutan ukuran  diameter  folikel  tertinggi  dikarenakan folikel  tidak  lagi  mendapatkan  suplai  darah seperti  kondisi  di  dalam  tubuh.  Hal  ini dikarenakan  darah  memiliki  fungsi  membawa nutrisi  bagi  jaringan  maupun  organ  di  dalam tubuh.  Kondisi  tersebut  diduga  menjadi  faktor terjadi penyusutan atau mengecilnya ukuran pada jaringan  folikel.  Kondisi  ini  disebut  atrofi.  Hal ini  sependapat  dengan  Kumar  dkk  (2013),  atrofi
merupakan  kondisi  pengecilan  ukuran  pada jaringan maupun organ.
Berbeda  dengan  P2  maupun  P3  yang mengalami  penyusutan  ukuran  folikel  lebih rendah  dibandingkan  dengan  P1  pada  suhu  37 o - 38 o C.  Hal  ini  dikarenakan  preservasi  ovarium yang  telah  dilakukan  pada  P2  maupun  P3  suhu 4 o -5 o C  dapat  menekan  angka  penyusutan  ukuran diameter  folikel.  Kondisi  ini  diduga  bahwa  suhu 4 o -5 o C dapat memperlambat aktifitas metabolisme  sel  di  dalam  folikel  sehingga ukuran  diameter  tidak  menyusut  terlalu  tinggi. Dugaan  ini  sejalan  dengan  Petrucci  dkk  (2010), manfaat  preservasi  pada  suhu  dingin  yaitu  4 o C untuk  memperlambat  kerja  metabolisme  sel sehingga akumulasi asam dapat dihambat sampai waktu tertentu.
A B C D
Gambar 1. Kriteria Kualitas Oosit Domba Lokal (Pengamatan dengan Microscope Inverted Software DP-2 BSW Pembesaran 20 x 10) Penyusutan ukuran diameter folikel pada kondisi  P2  maupun  P3  tidak  hanya  diakibatkan oleh  melambatnya  aktifitas  metabolisme  sel namun  diduga  pula  telah  terjadi  kerusakan dinding membran folikel saat ovarium dipisahkan  dari  tubuh  ternak  dan  suplai  darah yang  terhenti  dapat  juga  menyebabkan  iskemia. Iskemia  diduga  dapat  mengakibatkan  perubahan metabolisme  sel  dari  aerob  menjadi  anaerob. Menurut  Wongsrikeao et  al (2005),  kondisi anaerob menunjukan metabolisme sel-sel ovarium  akan  menghasilkan  asam  laktat  dan asam  fosfat  sehingga  meningkatkan  jumlah  ion H+  yang  mudah  masuk  ke  dalam  pori-pori membran plasma. Zat cair yang mudah masuk ke dalam membran akan mengakibatkan mekanisme fisiko  kimia.  Mekanisme  fisiko  kimia  yaitu perpindahan  larutan  NaCl sebagai  media preservasi  menuju  cairan  yang  berada  di  dalam folikel  mengakibatkan  ukuran  folikel  membesar yang  dikenal  dengan  hipotonis.  Dugaan  tersebut sejalan dengan Carvalho et al (2001), akumulasi asam dan peningkatan ion-ion akan menyebabkan  perubahan  pH  dan  osmolalitas membran  selular  menjadi permeable ,  sehingga larutan  masuk  ke  intrasel  yang  menyebabkan degenerasi sel. Menurut Bone (1988), penggunaan  NaCl  fisiologis  yang  merupakan larutan elektrolit dapat mengakibatkan mekanisme  osmosis  terhadap  folikel  maupun oosit di dalamnya.
Oleh karena itu, semakin lama preservasi berlangsung maka perpindahan volume suatu zat cair  dari  media  preservasi  akan  semakin  banyak menuju  suatu  jaringan  maupun  organ.  Hal  ini bahwa  pada  P3  menunjukan  penyusutan  ukuran diameter folikel lebih kecil dibandingkan dengan P2.  Artinya  pada  P3  telah  terjadi  masuknya larutan  NaCl  ke  dalam  folikel  lebih  banyak dibandingkan  dengan  P2  walaupun  secara statistika  tidak  berbeda  nyata  diantara  kedua perlakuan tersebut.
Rataan  persentase  jumlah  kualitas  oosit A  dan  B  menunjukan  angka  tertinggi  terdapat
pada P1 yaitu 75,50% diikuti pada perlakuan P2 telah  menunjukan  adanya  penurunan  rataan persentase  jumlah  kualitas  oosit  A  dan  B  yaitu 57,83%,  dan  selanjutnya  rataan  persentase jumlah  kualitas  oosit  A  dan  B  terus  menurun pada P3 yaitu berjumlah 13,00%. Hasil uji lanjut menunjukan  kualitas  oosit  A  maupun  oosit  B baik  P1  atau  P2  memberikan  pengaruh  berbeda nyata terhadap P3, namun P1 tidak berbeda nyata terhadap  P2.  Secara  lebih  rinci,  kualitas  oosit pasca preservasi dapat diamati pada  Tabel 2.
Menurut Gordon (2003), kualitas oosit A dan  B  dapat  digunakan  sebagai  bahan  dasar dalam penerapan teknologi IVF untuk memproduksi  embrio.  Hasil  berbeda  nyata  P1 waktu  preservasi  ovarium  saat  transportasi dengan  lama  perjalanan  2  jam  pada  suhu  37 o - 38 o C  menunjukan  rataan  jumlah  persentase kualitas  oosit  A  dan  B  yang  paling  tinggi dibandingkan  dengan  P2  maupun  P3.  Hal  ini menguatkan  penelitian  yang  telah  dilakukan Engcong dan Karja (2013), preservasi pada suhu 37 o -38 o C  selama  2  jam  menghasilkan  jumlah kualitas  oosit  A  paling  tinggi  dibandingkan selama  5-7  jam  maupun  8-10  jam  dan  suhu media  yang  diatur  mendekati  kondisi  yang hampir sama dengan suhu di dalam tubuh ternak kisaran  37 o -38 o C.  Lokasi  antara  TPH  dengan laboratorium  yang  merupakan  tempat  untuk mengoleksi  oosit  memiliki  jarak  yang  perlu ditempuh,  hal  ini  mengakibatkan  ovarium  perlu dipreservasi  terlebih  dahulu.  Perlakuan  P1  yang diberikan merupakan upaya untuk mempertahankan  kualitas  oosit  pada  keadaan ovarium  masih  segar  ( fresh )  selama  2  jam  pada suhu 37 o -38 o C.  Hal ini  sependapat dengan Choi et al (2004); Engcong dan Karja (2013); Tellado et  al (2014),  melakukan  preservasi  ovarium karena  adanya  jarak  yang  perlu  ditempuh  antara TPH  dengan  laboratorium  sehingga  perlu  diatur suhu  tertentu  selama  perjalanan  (transportasi) guna  kualitas  oosit  agar  dapat  dipertahankan.

## Tabel  2.  Rataan  Persentase  Jumlah  Oosit  Berdasarkan  Kriteria  Kualitas  Oosit  Setelah Preservasi Ovarium
Perlakuan Jumlah Oosit Rataan Jumlah Oosit A B C D ............................................. % ......................................... P1 86 32,67 42,83 21,67 2,83 P2 95 28,33 29,50 19,00 23,67 P3 73 0,00 13,00 47,50 39,50 Keterangan : P1 : Preservasi ovarium pada suhu 37 o -38 o C selama 2 jam.
P2
: Preservasi ovarium pada suhu 4 o -5 o C selama 11-12 jam.
P3
: Preservasi ovarium pada suhu 4 o -5 o C selama 24-25 jam
Preservasi  ovarium  P2  dengan  waktu preservasi  11-12  jam  pada  suhu  4 o -5 o C  kualitas oosit A dan B dari jumlah rataan keduanya yaitu 57,83%,  data  tersebut  menunjukan  bahwa perlakuan pada P2 telah terjadi penurunan rataan jumlah  persentase  kualitas  oosit  dibandingkan dengan  P1  yaitu  75,50%.  Kondisi  ini  diduga karena adanya pengaruh lama preservasi ovarium maupun  suhu  yang  diberikan  terhadap  kualitas oosit. Dugaan ini sejalan dengan Klumpp (2001) dan  Gordon  (2003),  faktor  seperti  waktu  dan suhu penyimpanan ovarium sangat mempengaruhi kualitas oosit. Umumnya pada P2 rataan  jumlah  persentase  kualitas  oosit  A  dan  B masih  dapat  dikatakan  baik  karena  jumlahnya lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  rataan  jumlah persentase  kualitas  oosit  C  dan  D  (42,67%). Hasil  ini  menguatkan  pendapat  Engcong  dan Karja  (2013), preservasi  ovarium  pada  suhu  4 o C selama 8-10 jam menunjukan persentase kualitas oosit A dan B masih dapat dipertahankan, hal ini pun  sesuai  dengan  dugaan  sementara  bahwa preservasi ovarium yang dilakukan pada suhu 4 o - 5 o C  selama  11-12  jam  diduga  masih  mampu mempertahankan tingkat kriteria  kualitas oosit A dan  B  yang  dapat  dijadikan  sebagai  sumber genetik potensial teknologi IVF.
Preservasi ovarium P3 selama 24-25 jam pada 4 o -5 o C (suhu dingin) menunjukan penurunan  rataan  jumlah  persentase  kualitas oosit  A  dan  B  yakni  13,00%  .  Hal  ini  diduga akibat  preservasi  suhu  dingin  apabila  dilakukan semakin  lama  akan  menyebabkan  rataan  jumlah persentase kualitas oosit A dan B terus menurun. Hasil  ini  sependapat  dengan  Carvalho et  al (2001),  oosit  domba  lebih  rentan  terhadap  suhu dingin  karena  membran  lipid  pada  oosit  tidak mampu  bertahan  pada  suhu  dingin.  Suhu  dingin dapat  menyebabkan  hilangnya  integritas  dari membran oosit (Wongsrikeao et al ., 2005).
Seiring lama preservasi berlangsung seperti  pada  P3  tanpa  adanya  penambahan  jenis zat apapun ke dalam media preservasi mengakibatkan  persentase  jumlah  kualitas  oosit A  dan  B  yang  didapat  terjadi  penurunan  secara drastis.  Oleh  karena  itu,  kondisi  tersebut  akan menyebabkan  lamanya  iskemia.  Sebaliknya apabila  terdapat  penambahan  zat  yang  dapat memberikan  nutrisi  maka  kualitas  oosit  dapat dipertahankan  walaupun  preservasi  selama  24 jam.  Dugaan  ini  sependapat  dengan  Khillare (2008),  penambahan  zat  seperti  serum  sebanyak 15%  ke  dalam  media  preservasi  pada  suhu  5 o C (dingin)  akan  mempertahankan  kualitas  oosit selama 24 jam.

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  dan  pembahasan  maka dapat  diambil  simpulan  sebagai  berikut  ini: Waktu preservasi ovarium memberikan pengaruh yang  nyata  terhadap    ukuran  folikel  dan  kualitas oosit.

## Ucapan Terima Kasih
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Tim  Dosen  di  Laboratorium  Reproduksi  Ternak dan  Inseminasi  Buatan  Fakultas  Peternakan Universitas Padjadjaran.

## Daftar Pustaka
Akcay.E.,  Oysal,  O.,  Yavas,  I  &  U.  An., 2008.The  effects  of  serum,  steroid  and gonadorophins on in vitro maturation and fertilization  of  bovine  oocytes. J.  Anim. And Vet. Advances 7: 178-183.
Bone, J.F. 1988. Animal Anatomy and Physiology. 3 th ed.  Prentice-Hall,  Inc.  A Division of Simon & Schuster Englewood Cliffs. New Jersey USA. 19,
368, 412.
Carvalho  F.C.,  C.M.  Lucci,  J.R.  Silva,  E.R. Andrade,  S.N.  Báo,  and  J.R.  Figueiredo. 2001.  Effect  of  Braun-Collin  and  Saline Solution  at  The  Different  Temperature and  Incubation  Time  on  The  Quality  of Goat  Preantral  Follicles  Preserved  in Situ. Animal  Reproduction  Science 66: 195-200.
Choi,  Y.H.,  L.M.  Roasa,  C.C.  Love,  S.P. Brinsko, and K. Hinrichs. 2004. Blastocyts  Formation  Rates  In  Vitro  and In  Vitro  Maturation  Equine  Oocyts Fertilized Intracytoplasmic Sperm Injection. Biology  Reproduction 70:
1231-1238.
Dinas  Peternakan  Jawa  Barat.  2013. Statistik Pemotongan  Ternak  Tahun  2012-2013 . Available at : http://disnak.jabarprov.go.id  (diakses  17 April 2015, jam 14:06 WIB).
Engcong,  D.M.  dan  N.W.  Karja.  2013.  Kualitas Oosit  Domba  dari  Ovarium  Setelah Penyimpanan  pada  Suhu  dan  Periode Waktu  yang  Berbeda. Acta  Veterinaria Indonesiana 1(2): 44-49. Gaspersz,  V.  1995. Teknik  Analisis  dalam Penelitian  Percobaan,  Jilid  1 .  Tarsito. Bandung. 123-131, 198-204.
Gordon,  I.  2003. Laboratory  of  Production Cattle Embryo . 2 nd ed. CABI Publishing.
Wallingford.
Kumar,  V.,  A.K.  Abbas.,  and  J.C.  Aster.  2013. Cell Injury, Cell Death, and Adaptations. In:  Robbins. Basic  Pathology .  9 th ed. Elsevier Inc. Canada. 5-17. Khillare,  K.P.  2008. Recovery  and  Preservation of  Goat  Follicular  Oocytes .  Veterinary
World,  Vol.1  (3).  Departement  of Gynecology  and  Obstetrics,  Collage  of Veterinary and Animal Science. Parbhani. 73-74.
Klumpp,  A.  M.  2001. The  Effect  of  Holding Bovine  Oocytes  in  Follicular  Fluid  on
Subsequent  Fertilization  and  Embryonic Development .  Thesis.  Loumurna  State University. California. 20.
Lopez,  A.P.,  R.R.  Santo.,  J.J.  Holland.  C.M,. Aline.  P.M.Robert.,  N.C.  Claudio.,
C.Campello.,  J.  Roberto,,V.V  Sonia., N.B.K.  Jewgenew..  J.R.  Figuerido., 2008. Short-Term Preservation of Canine Preantral Follicles: Effects of Temperature, Medium and Time. Animal
Reproduction Science . 114:201-214.
Petrucci,  R.H.,  F.G.  Herring,  and  J.D.  Madura. 2010. General  Chemistry  Prinsiple  and Modern  Application .  10 th ed.  Prentice- Hall Inc.
Silva,  J.R.V.,  Alline,.  Regiane  R.D.S.,  Sonia H.F.C.,  Ana,  P.R.R.,  Marcos,  A..L.F., Vanessa, P.M.,  Jose, R.F., 2003. Degeneration  rate  of  goat  primordial follicles maintained in TCM 199 or PBS at  different  temperatures  and  incubation times.
Ciência Rural, Santa Maria.33:913-919.
Tellado,  M.N.,  G.M.  Alvarez.,  G.C.  Dalvit.,  and
P.D.  Cetica.  2014. The  Conditions  of
Ovary  Storage  Affect  The  Quality  of Porcine Oocytes . Advances in Reproductive  Sciences  (2).  School  of Veterinary Sciences, University of Buenos Aires. Argentina. 57-67.
Widyastuti,  R.,  Rasad,  S.D.  2015.Tingkat Kematangan  Inti  Oosit  Sapi  Setelah  24 Jam Preservasi Ovarium. Agripet . 15 (2)
: 72-78
Wongsrikeao, P., T. Otoi, N.W. Karja, B. Agung, M.  Nii,  and  T.  Nagai.  2005.  Effect  of Ovary Storage Time and Temperature on DNA  Fragmentation  and  Development of Porcine Oocytes. Jurnal of
Reproduction  and  Development 51:  87-
97.