Published by: IOCSCIENCE

## Fruitset Sains : Jurnal Pertanian Agroteknologi
Journal homepage: www.iocscience.org/ejournal/index.php/Fruitset

## TRANSFORMASI GEN Hd3a PADA TANAMAN KENTANG (Solanum tuberosum
L.)  KULTIVAR IPB CP (CHIP POTATO) 1 MELALUI  Agrobacterium tumefaciens
Nonozisokhi Gea 1 , Karunia Gea 2*
1,2 Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Nias Raya, Nias, Indonesia Email: geakarunia@gmail.com
*korespondensi

## Abstract
Potato Cv IPB (Chip Potato) 1 is a modified potato finding from potato cv Atlantik with the iiradiating dose of 15 gray in BATAN  (National  Atomic  Energy  Agency).  In  Indonesia,  these  potatoes  are  used  as    chips.  Tuber  is  plant  organ  that changes  by  other  organs  in  plants  and  serves  as  a  storage  of    certain  substances.    There  is  a  manner  to  increase  the production  of  potato  tubers  with  induce  of    tuber.  Gen  heading  date  3a  (Hd3a)  is  one  of  the  genes  that  can  regulate flowering time  in  rice.  Gen  Hd3a  can also  induce  flowering  in  some  plants  such  as  Jatropha,  Nicotiana  benthamiana, Saussurea involucraten and potato. In addition to induce flowering of these genes can induce formation tuber  in potato cv  Andigena.  This  study  aims  to  introduce  Hd3a  gene  with  promoter  35S  into  potato  plants  cv  IPB  CP1  to  induce formation  of  tubers.  Introductions  Hd3a  gene  into  potato  cv  IPB  CP  1  were  calculated  by    co-cocultivation  A.. tumefaciens-mediated of  LBA 4404. Transformation by 157 explants from Internode produce transformation efficiency, and regeneration efficiency  was 16.4% and 23.1%  respectively. There are six putative transgenic shoots can survive on callus induction medium containing 15 mg / L of antibiotic hygromycin . Analysis of the six putative plant trangenik have done  by    PCR  with  35S-F  and  Hd-R  primers.    PCR  analysis  showed  that  all  six  of  these  plants  are  transgenic  potato containing Hd3a gene with  CaMV 35S promoter.
Keywords : Agrobacterium tumefaciens, Hd3a Gene, IPB CP 1

## Abstrak
Kentang cv IPB CP (Chip Potato) 1 merupakan kentang hasil  modifikasi dari kentang kultivar Atlantik dengan meradiasi pada  dosis  15  gray  di  BATAN  (Badan  Tenaga  Atom  Nasional).  Di  Indonesia  kentang  ini  digunakan  sebagai  kentang olahan seperti keripik. Umbi adalah organ tumbuhan yang mengalami perubahan bentuk dari organ lain pada  tumbuhan yang  berfungsi  sebagai  tempat  penyimpanan  zat  tertentu.  Salah  satu  cara  untuk  meningkatkan  produksi  umbi  kentang dengan  melakukan  induksi pengumbian.  Gen heading  date  3a  (Hd3a) merupakan  salah  satu  gen  yang dapat    mengatur waktu pembungaan pada padi. Gen Hd3a juga dapat menginduksi pembungaan pada beberapa tanaman lain seperti jarak pagar, Nicotiana  benthamiana,  Saussurea  involucraten dan  kentang.  Selain  menginduksi  pembungaan  gen  ini  dapat menginduksi  pembentukkan  umbi  pada  kentang  cv  Andigena.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengintroduksikan  gen Hd3a dibawah kendali promotor 35s ke dalam tanaman kentang cv  IPB CP1 untuk menginduksi pembentukkan umbi. Introduksi  gen Hd3a ke  dalam  kentang  cv  IPB  CP  1  dilakukan  dengan  menggunakan    metode  kokultivasi  melalui A. tumefaciens LBA 4404. Transformasi terhadap 157 eksplan dari internode  menghasilkan efesiensi transformasi 16.4 %, efesiesnsi regenerasi sebesar 23.1% serta 6 tunas transgenik putatif. Keenam tunas transgenik putatif ini dapat bertahan hidup  pada  media  induksi  kalus  yang  mengandung  15  mg/L  antibiotik  higromisin.  Analisis  terhadap  6  tunas  tanaman trangenik  putatif  dilakukan    dengan  menggunakan  PCR  dengan  primer  35S-F  dan  Hd-R.  Analisis  PCR  menunjukkan bahwa keenam tanaman tersebut merupakan kentang transgenik yang mengandung gen Hd3a di bawah kendali promotor 35S CaMV.
Keywords : Agrobacterium tumefaciens, Hd3a Gene, IPB CP 1

## 1. Pendahuluan
Kentang ( Solanum tuberosum L.) merupakan tanaman pangan global keempat dunia setelah  beras,  gandum  dan  jagung.  Umbinya  kaya  akan  pati  dan  nutrisi  lainnya.  Kentang kultivar    IPB  CP1  ( Chip  Potato  1 )  merupakan  varietas  kentang  baru  hasil    modifikasi secara fisika dari  kentang cv Atlantik. Di Indonesia kentang kultivar Atlantik dikonsumsi sebagai  kentang  olahan  seperti  keripik  ( chip ).  Kentang  Atlantik  dimutasi  dengan  sinar radiasi pada dosis 15 gray di Badan Tenaga Atom Nasional (BATAN) dan menghasilkan kentang  kultivar  IPB  CP1.  Kentang  kultivar  IPB  CP1  memiliki    bentuk  daun  oval
memanjang,  bentuk  umbi  agak  bulat,  warna  kulit  umbi  putih,  daging  umbi  putih, kandungan pati tinggi, dan kandungan gula rendah (Suharsono. et al., 2016).
Umbi  adalah  organ  tumbuhan  yang  mengalami  perubahan  bentuk  dari  organ  lain pada    tumbuhan  yang  berfungsi  sebagai  tempat  penyimpanan  zat  tertentu.  Pembentukkan umbi  terdiri  dari  beberapa  tahap  proses  yang  kompleks  dimulai  dari  pembentukan  dan pertumbuhan stolon, induksi pengumbian, inisiasi umbi dan pertumbuhan umbi (Aksenova et  al.,  2012).  Produksi  dari  tanaman  kentang  ditentukan  oleh  pembentukkan  umbi.  Salah satu  cara  untuk  meningkatkan  produksi  umbi  kentang    dengan  melakukan  induksi pengumbian  (Dianawati et al., 2013).
Gen heading date 3a (Hd3a) merupakan salah satu gen yang dapat  mengatur waktu pembungaan  pada  padi.  Gen Hd3a ortolog  gen flowering  locus  T  (FT) pada Arabidopsi thaliana .  Gen Hd3a pertama  kali  diidentifikasi  sebagai quantitative  trait  locus (QTL) (Monna  et  al.,  2002;  Yamamoto  et  al.,  1998).  Protein  dari  gen  ini  dapat  menginduksi pembungaan  padi  pada  kondisi  hari  pendek  (Kojima  et  al.,  2002).  Gen Hd3a telah diisolasi oleh (Tamaki et al., 2007) dari padi yang menunujukkan bahwa Hd3a disintesis di daun  dan  bergerak  ke  meristem  pucuk  batang  untuk  menginduksi  pembungaan  sehingga Hd3a merupakan signal pembungaan atau disebut florigen. Pembungkaman Hd3a dengan RNA interference (RNAi)  dapat  menunda  pembungaan  pada  tanaman  Japonica  trangenik (Komiya  et  al.,  2008).  Gen  ini  telah  diintroduksikan  pada  beberapa  tanaman  seperti Saussurea involucrata (Li et al., 2011), Jatropha curcas L (Sulistyaningsih Y.C, 2012) dan Nicotiana  benthamiana (Syafitri,  2012).  Tanaman-tanaman  transgenik  tersebut  berbunga lebih  awal  dibandingkan  dengan  tanaman  non  transgenik.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa protein Hd3a dapat menginduksi pembungaan.
Tanaman  kentang  cv  andigena  berbunga  dan  berumbi  jika  ditanam  di  hari  pendek tetapi tidak berbunga dan berumbi jika ditanam di  hari panjang. Ekspresi gen Hd3a pada kentang  andigena  transgenik  menyebabkan  tanaman  kentang  tersebut  berbunga  di  hari panjang. Hal ini menunjukkan bahwa protein Hd3a dapat menginduksi pembungaan pada tanaman  kentang.  Selain  menginduksi  pembungaan,  kentang  cv  andigena  trangenik  yang mengekspresikan  gen Hd3a juga  menghasilkan  umbi  di  hari  panjang  sedangkan  kentang non  trangenik  tidak  menghasilkan  umbi.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  protein Hd3a menginduksi pembentukkan umbi (Navarro et al., 2011).
Teknologi  terbaru  yang  dapat  digunakan  untuk  menghasilkan  varietas  baru  pada tanaman  adalah  melalui  metode  rekayasa  genetika  yaitu  dengan  transformasi  genetik. Transformasi genetik merupakan proses introduksi  gen dari satu organisme ke organisme lain yang memungkinkan untuk memunculkan sifat yang diharapkan tanpa mengubah sifat lain  (PAMBUDI  A.,  2009). Introduksi  gen  dengan  bantuan Agrobakterium  tumefaciens telah  banyak  dilakukan.  Hal  ini  disebabkan    karena  metode  tersebut    dapat  dilakukan dengan  peralatan  laboratorium  yang  sederhana  dan  sisipan  gen  tunggal  berpeluang  lebih tinggi dibanding transformasi langsung, sehingga stabilitas ekspresi gen lebih tinggi (Dai et al., 2001; G & D, 1996; Rahmawati, 2006). Keberhasilan introduksi gen Hd3a melalui A. tumefaciens pada beberapa kultivar kentang telah banyak dilakukan seperti  kultivar baraka (Bustomi,  2012),  Agria  (L.,  2015),  Jala  ipam  (Widiarti,  2016)  dan  Nooksack  (H,  2016). Gen Hd3a yang telah berhasil diintroduksikan pada Kentang cv Baraka dibawah kendali promotor  rolC  menghasilkan  umbi  pada  kondisi  in  vitro,  sedangkan  non  trangenik    tidak berumbi  pada  umur  yang  sama  (Bustomi,  2012).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk
mengintroduksikan  gen Hd3a dibawah  kendali  promotor 35s ke  dalam  tanaman  kentang cv IPB CP1 untuk menginduksi pembentukkan umbi.

## 2. Bahan dan Metode
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan  Desember  2021-April  2022  di  Laboratorium Biomolekuler  dan  Selluler  Tanaman  dan    Laboratorium Biotechnology  Indonesia-The Netherland (BIORIN),  Pusat Penelitian Sumberdaya Dan Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini berupa eksplan tanaman kentang cv IPB CP  1    berumur  4  minggu    yang  ditanam  secara  in  vitro . Bakteri  yang  digunakan  untuk transformasi  adalah Agrobacterium  tumefaciens galur  LBA4404  yang  mengandung plasmid  pC1300  yang  membawa  gen Hd3a di  bawah  kendali  promoter 35S (Sulistyaningsih  Y.C,  2012) yang  dipautkan  dengan  gen  resistensi  terhadap  higromisin ( hpt ).  Peta  fisik  daerah  T-DNA  dari  plasmid  pC1300- Hd3a disajikan  pada  Gambar  1. Primer  35S-F  dan  Hd-R  digunakan  untuk  menganalisis  integrasi Hd3a di  dalam  genom tanaman transgenik secara PCR. Bahan lain yang digunakan adalah media Murashiage and Skoog (MS) untuk media pertumbuhan tanaman in vitro dan media M4 untuk induksi kalus serta M4 yang mengandung higromisin sebagai media seleksi.
Gambar 1. Peta fisik daerah T-DNA dalam pC1300 -Hd3a . LB: left border, RB: right border, 35S Pro: promoter 35SCaMV, CA: daerah poly A dari 35S CaMV, Hd3a: heading date 3a, hpt: hygromycin phosphotransferase
Metode penelitian yang dilakukan adalah sebagai berikut :
2.1 Persiapan Eksplan dan Perbanyakan Tanaman
Tanaman  in  vitro  kentang  diperbanyak  dengan  menggunakan  stek  buku  tunggal, (internode)  ditanam  pada  media  MS0  (MS  instan  4.33  g/l  +  Vitamin  +  Sukrosa  30  g/l  + Agar powder 3 g/l) dan MS2 makro (media MS0 yang ditambah 1x stok makro) selama 4 minggu. Eksplan kemudian ditumbuhkan di ruang kultur dengan suhu 24 0 – 25 0 C, dengan pencahayaaan 2000 – 3000 lux.
2.2 Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium  tumefaciens asal  stok  gliserol  ditumbuhkan  selama  36  jam  pada media LB cair yang deitambahkan dengan Kanamicin 50 mg/L + Rifamisisin 25 mg/L pada suhu  28 0 C,  dalam  ruang  gelap  dan  dishaker.  Setiap  melakukan  transformasi,  bakteri dikultur kembali   dalam media LB  cair selama 12  jam pada  suhu 28 0 C, di  ruang gelap dan di shaker hingga  OD 600 mencapai 0.5.
2.3 Transformasi genetik kentang cv IPB CP 1
Sebelum melakukan transformasi, internode ditanam di dalam media prekultur (MS instan  4.33  g/l  +  Myo  inositol  0.1  g/l  +  Glukosa 16  g/l  +  2,4-D  2  mg/L +  BA  3  mg/l    +
Vitamin  MS  5  mg/l  +  Gelrite  2.5  g/l  )  selama  12  jam  dalam  ruang  gelap.  Biakkan Agrobacterium tumefaciens yang mempunyai OD 600 = 0.5 disentrufuse  dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit, endapannya (pelet) di larutkan dengan media kokultivasi cair (MS instan 4.33 g/l + Myo inositol 0.1 g/l + Glukosa 16 g/l + 2,4-D 2 mg/L + BA 3 mg/l  + Vitamin MS 5 mg/l + Acetosiringon 20 mg/L).
Transformasi  dilakukan  dengan  metode  kokultivasi  menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Internode ukuran 0.5–1 cm direndam di dalam endapan A. Tumefaciens yang sudah dilarutkan dengan media kokultivasi cair selama  10 menit, kemudian digoyang pada suhu  ruang.  Eksplan  selanjutnya  dikeringkan  dengan  tisu  steril  dan  ditanam  pada    media kokultivasi  padat  (MS  instan  4.33  g/l  +  Myo  inositol  0.1  g/l  +  Glukosa  16  g/l  +  2,4-D  2 mg/L  +  BA  3  mg/l    +  Vitamin  MS  5  mg/l  +  Gelrite  2.5  g/l  + Asetosiringon 40  mg/L) selama  3  hari  di  ruang  gelap.  Tahapan  ini  bertujuan  agar  bakteri  dapat  menginfeksi eksplan.

## 2.4 Seleksi, regenerasi dan perbanyakan tunas
Setelah  ditanam  3  hari  di  media  kokultivasi  padat,  eksplan  dicuci  dengan  air  steril sebanyak  3  kali  ,  dan  perendaman  terakhir  dengan  air  steril  yang  mengandung    larutan antibiotik ( cefotaxime 200 mg/L) selama 10 menit. Ekplan  dikeringkan dengan tisu steril dan ditanam di media regenerasi tunas M4 (MS instan 4.33 g/l + Sukrosa 30 g/l + Kasein hidrolisat 0.2 g/L + Myo inositol 0.1 g/l + Gelrite 3  g/L  + BA 3 mg/L + IAA  2 mg/L + GA3 1 mg/L + Vitamin   MS 5 mg/L + Cefotaxime 100 µg/L). Setelah 2 minggu eksplan ditanam  di  media  M4  tanpa  higromisin  kemudian  dipindahkan  ke  media  M4  yang mengandung  higromisin.  Setelah  tunas  muncul,  di  sub  kultur  ke  media  MS  dan diperbanyak selanjutnya dijadikan sebagai bahan isolasi genom untuk konfiramsi tanaman trangenik putatif.

## 2.5 Optimasi media seleksi Kentang cv IPB CP 1
Optimasi  media  seleksi  higomisin  dilakukan  pada  eksplan  tanaman  kentang  cv  IPB CP 1 yang telah diberikan perlakuan transformasi. Eksplan tanaman kentang cv IPB CP 1 tanpa perlakuan transformasi digunakan sebagai kontrol.

## 2.6 Identifikasi Tanaman Putatif Transgenik dengan PCR
Identifikasi  tanaman  putatif  transgenik  diawali  dengan  mengisolasi  DNA  genom. Isolasi  DNA  genom  dilakukan  berdasarkan  metode  (Suharsono,  2002)  yang  dimodifikasi (CTAB  2  %  0.1  M  Tris-HCL,  20  ml  0.5  EDTA,  1.4  M  NaCl,  PVP  1  %,  pH  8.0).  DNA hasil  isolasi  selanjutnya  diamplifikasi  dengan Polimerase  Chain  Reaction (PCR).  PCR dilakukan menggunakan primer spesifik  untuk trangen Hd3a, yaitu primer 35S-F (5’-CCA AGC TCT  ATC TGT CAC  TTC  ATC-3’)  dan   Hd-R :  (5’-CTA GGG  GTA GAC CCT CCT  GCC-3’).    Pasangan  primer  ini  digunakan  untuk  analisis  transgen Hd3a di  bawah kendali promoter 35S CaMV. PCR menggunakan primer Act-F (5- ’ATGGCAGATGCCGAGGATAT-3’)  dan  Act-R  (CAGTTGTGCGACCACTTGCA-3’) yang  dirancang berdasarkan gen aktin tanaman kedelai digunakan sebagai kontrol internal DNA tanaman kentang.
Hasil  PCR  diperiksa  menggunakan  gel  agarosa  konsentrasi  0.7-1  %  dalam  larutan buffer penyangga 1 kali TAE (40 mM Tris-acetate, 1mM EDTA) pada tegangan 100 volt selama  30  menit.  Pita  DNA  pada  agarosa  divisualisasi  dengan  cahaya  UV  setelah  gel diendam  pada  larutan  ethidium  bromida  (0.5  µg/ml)  selama  10  menit  (Fatchiyah  et  al., 2011). Hasil foto elektroforesis didokumentasikan dengan gel-doc.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1 Optimasi media seleksi pada kentang cv IPB CP 1
Kentang  cv  IPB  CP  1  merupakan  kentang  baru  hasil  modifikasi  secara  fisik  dari kentang  cv  atlantik  sehingga  diperlukan  optimasi  pada    media  induksi  kalus  untuk menyeleksi tanaman transgenik yang tahan terhadap antibiotik higromisin. Pada penelitian ini telah dilakukan optimasi  seleksi terhadap tanaman transforman, dengan menggunakan tanaman  nontransforman  sebagai  kontrol.    Hasilnya  menunjukkan  bahwa  kalus    kentang transforman  sebagian dapat  bertahan  hidup dan sebagaian juga tidak bertahan hidup atau berwarna  coklat  (browning)  pada  media  seleksi  yang  mengandung  15    mg/L  higromisin (gambar  2a),  sedangkan  kalus  kentang  non  transforman  seluruh    eksplannya  tidak  dapat hidup pada media seleksi yang mengandung 15 mg/L higromisin (gambar 2b) . Konsentrasi dari antibiotik ini sedikit lebih tinggi dari penelitian sebelumnya pada  tanaman kentang cv atlantik trangenik putatif  sebesar  10 mg/L higromisin (Manguntungi, 2014). Integrasi T- DNA  pC1300- Hd3a yang  mengandug  gen hpt ini  ke  dalam  kentang  cv  IPB  CP  1  telah mengekspresikan hygromycin  photosphotranferase yang  dapat  resisten  terhadap higromisin  sehingga  tanaman  dapat  tumbuh  pada  media  yang  mengandung  higromisin. Kecoklatan  kalus  pada  media  seleksi  diakibatkan  karena  adanya  aktivitas  enzim  oksidase yang disintesis dan tersedia pada kondisi oksidatif ketika jaringan dilukai  (Riley, 2000)
Gambar 2. Keadaan kalus tanaman  yang tahan higromisin dengan kalus yang tidak tahan higomisin ( browning ) pada media seleksi.  A. Kalus tanaman dengan perlakuan tranformasi tahan terhadap antibiotik higromisin, B. Kalus tanaman tanpa perlakuan transformasi tidak tahan terhadap antibiotik higromisin.

## 3.2 Transformasi tanaman kentang cv IPB CP 1
Transformasi  dilakukan  pada  tanaman  kentang  cv  IPB  CP  1  yang  telah  berumur  4 minggu  dengan  menggunakan    ruas  (internode)  tanaman  sebagai  eksplan.  Sebelum melakukan transformasi, eksplan terlebih dahulu di tanam di media prekultur selama 1 hari untuk  menginisiasi  pembentukkan  kalus.  Transformasi  dilakukan  dengan  metode kokultivasi  melalui Agrobacterium  tumefaciens. Internode  yang  berukuran  0.5-1  cm direndam  didalam Agrobacterium  tumefaciens OD 600 =0.5  yang  sudah  dilarutkan  dengan media  kokultivasi  cair  yang  mengandung acetosiringon. Penambahan acetosiringon bertujuan  mengaktifkan  gen vir untuk  meningkatkan  efektivitas  infeksi A.  Tumefaciens (Rashid  et  al.,  2010) . Internode  di  dalam  campuran  digoyang  selama  10  menit  kemudian dikeringkan  dengan  tissu  steril.  Selanjutnya,  eksplan  ditanam  di  media  kokultivasi  padat yang  disimpan  di  ruang  gelap  selama  3  hari.  Perlakuan  ini  bertujuan  untuk  memberikan kesempatan kepada A. Tumefaciens untuk menginfeksi tanaman.
Setelah  3  hari  ditanam  di  media  kokultivasi,  eksplan  dicuci  dengan cefotaxime dan ditanam di media regenerasi dan seleksi.  Kedua media tersebut mengandung zat pengatur
B 1 cm 1 cm A
tumbuh  (ZPT)  yang  terdiri  dari Indole  Acetic  Acid (IAA), Benziladenin (BA)    dan Giberellic  Acid (GA 3 )  dengan  penambahan higromisin pada  media  seleksi.  Penggunaan cefotaxime baik pada saat transformasi maupun pada media induksi kalus bertujuan untuk mematikan A. Tumefaciens yang masih hidup di sekitar tanaman transforman.
Eksplan  yang  telah  ditranformasikan  dipindahkan  setiap  dua  minggu  pada  media yang  baru.  Tujuannya  agar  ketersediaan  akan  hara  mineral  dan  hormon  tanaman  tetap cukup  untuk  membantu  pembentukan  tunas  lebih  cepat.  Eksplan  tanaman  mulai mengalami  perubahan  bentuk  setelah  ditanam  pada  media  induksi  kalus  (gambar  3b). Eksplan yang telah ditanam mulai membentuk kalus sejak 2 minggu pertama pada media induksi kalus.  Penambahan zat pengatur tumbuh  2,4-D  pada media kokultivasi berperan sebagai  inisiasi  kalus.  Selain  itu,  GA 3 pada  media  regenerasi  berfungsi  dalam  regenerasi, poliferasi dan pemanjangan tunas tanaman (Li et al., 2011)
Gambar 3. Perubahan  eksplan  tananaman  kentang  cv  IPB  CP  1  pada  media  regenerasi  setelah ditansfomasikan.  A.  Eksplan  tanaman  kentang  cv  IPB  CP  1      setelah  pencucian,  B. Eksplan tanaman kentang cv IPB CP 1  yang mulai membentuk kalus setelah 2 minggu pada media regenerasi.
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  kalus-kalus  transgenik  membentuk  tunas sejak    minggu  ke-4  pada  media  induksi  kalus  (gambar    4a).  Pada  perkembangan selanjutnya di media induksi kalus yang mengandung 15 mg/L higromisin beberapa tunas yang  terbentuk  sebagian  tumbuh  membesar    namun  beberapa  mengalami  kematian (gamabar 4b). Hal ini  menunjukkan bahwa tunas yang bertahan hidup pada media seleksi kalus  yang  mengandung  15  mg/L  higromisin  merupakan  kandindat  tanaman  trangenik putatif.  Tunas  tanaman  tranggenik  putatif  yang  mencapai  panjang  1-2  cm  dipotong  dan dipindahkan  pada  media  MS  yang  mengandung  15  mg/L  higromisin.  Tujuaannya  untuk pemanjangan dan perbanyakan (gambar 4c).
Gambar 4. Perkembangan  tanaman  trangenik  kentang  IPB  CP  1 putatif.    A.  Kalus  yang  terus berkembang pada media seleksi, B. Kalus yang beregenerasi membentuk tunas, C. Tunas tanaman  trangenik  putatif  yang  dipindahkan  pada  media  MS  yang  mengandung higromisin.
A C B 1 cm 1 cm 1 cm A B 1 cm 1 cm
Transformasi  genetik  kentang  menggunakan A  tumefaciens telah  berhasil  dilakukan pada 157 eksplan dari internode dengan jumlah kalus yang resistensi terhadap higromisin sebanyak 26 kalus,  sehingga efesiensi transformasi yang diperoleh  sebesar 16.4 %. Dari 26  kalus  yang  resistensi  higromisisn,  ada  6  kalus  yang  beregenerasi  menjadi  tanaman sehingga  efesiensi  regenerasinya  adalah  sebesar  23.1  %.  Efesiensi  transformasi  dengan menggunakan internode sebagai eksplan pada kentang cv IPB CP 1 tergolong lebih rendah dibanding  efesiensi  transformasi  kentang  atlantik  16.67  %,  sedangkan  efesiensi regenerasinya    lebih  tinggi  diabandingkan  dengan  efesiensi  regenerasi  pada  kentang  cv atlantik sebesar 20 % (B., 2014). Perbedaan efesiensi yang sangat sedikit ini menunjukkan bahwa  transformasi  genetik  pada    kentang  cv  IPB  CP  1  dengan  menggunakan  internode masih tergolong rendah (Han et al., 2015).
Gen Hd3a yang menggunakan promotor 35 S telah diintroduksikan ke dalam kentang kultivar  yang  berbeda.  Efesiensi  transformasi  pada  tanaman  kentang  kultivar  Nooksack sebesar  25  %  sedangkan  efesiensi  regenerasi  10  %    (H,  2016)  dan  pada  kentang  cv  Jala Ipam  efesiesnsi  transformasi    sebesar  7  %  sedangkan  efesiensi  regenerasi  sebesar  100  % (Widiarti,  2016). Respon  regenerasi  yang tidak sama  dapat  terjadi karena  kultivar, jenis dan  usia  eksplan  serta  kombinasi  hormon  yang  berbeda-beda  (Chakravarty    Wang- Pruski, 2010).
Tabel  1. Efisiensi Transformasi dan regenerasi ruas tunas tanaman kentang cv IPB CP 1 dengan gen Hd3a.

## 3.3 Identifikasi Tanaman Putatif Transgenik dengan PCR
Dari  159  internode  yang  telah  ditransformasikan  terdapat  6  internode  yang membentuk  kalus  dan  berhasil  bertunas.  Tunas  transgenik  putatif  tersebut  mampul bertahan  hidup  pada  media  seleksi.  Keenam  trangenik  putatif  dianalisis  dengan  PCR menggunakan sepasang  primer (35S-F dan Hd-R). Tujuannya untuk  mengetahui integrasi gen Hd3a di  dalam  genom  tanaman  tersebut.  Hasilnya  menunjukkan  bahwa  semua tanaman  mengandung  gen Hd3a dengan  memunculkan  pita  yang  berukuran  914  pb (gambar  5b).  Fragmen  DNA  914  bp  terdiri  dari  promotor  35  S  CaMV  dan  gen Hd3a. Untuk  melakukan  kontrol  internal  terhadap  kualitas  DNA  tanaman  hasil  isolasi  maka dilakukan PCR menggunakan primer  gen aktin tanaman (gambar 5a). Gen aktin termasuk housekeeping  gene ,  yaitu  gen  yang  memiliki  tingkat  ekspresi  yang  stabil  di  berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan tanaman (Tu et al., 2007).
Jumlah eksplan awal Jumlah eksplan yang membentuk kalus Jumlah kalus resisten higromisin Jumlah   kalus beregenerasi Jumlah tanaman trangenik putatif Efesiensi transformasi Efesiensi regenerasi 159 110 26 6 6 16.4 % 23.1%

## M      NT         1          2            3          4          5            6

## M        NT        1           2            3           4          5          6
Gambar 5. Analisis  integrasi  Gen Hd3a pada  tanaman  kentang  cv CP  1 trangenik.  A.  Hasil PCR DNA menggunakan primer Act-F dan  Act-R,  B. Hasil PCR DNA Trangenik menggunakan 35-F dan HD-R.  M = msrks, P= DNA Plasmid pCambia1300- Hd3a, NT=DNA kentang cv CP 1 non trangenik, 1-6 = DNA kentang cv CP 1 trangenik.

## 4. Simpulan
Penyisipan  gen Hd3a dengan  promotor  35S  melalui  perantara Agrobakterium tumefaciens ke  dalam  kentang  cv  IPB  CP  1 telah  berhasil  dilakukan.  Ada  enam  tanaman trangenik  putatif  yang  bertahan  hidup    pada  media  seleksi  yang  mengandung  15  mg/L higromisin. Hasil analisis PCR   menunjukkan bahwa keenam  tanaman kentang trangenik putatif tersebut mengandung gen Hd3a.
Perlu dialakukan uji lebih lanjut berupa analisis ekspresi gen Hd3a untuk mengetahui ekspresi  transgen  pada  tanaman    trangenik.  Selain  itu,  dilakukan  analisi  morfologi  pada tanaman  transgenik  untuk  mengetahui  pengaruh  gen Hd3a terhadap  pembungaan  dan pengumbian tanaman.

## 5. Referensi
Aksenova,  N.  P.,  Konstantinova,  T.  N.,  Golyanovskaya,  S.  A.,  Sergeeva,  L.  I.,    Romanov,  G.  A.  (2012). Hormonal regulation of tuber formation in potato plants. In Russian Journal of Plant Physiology (Vol. 59, Issue 4, pp. 451–466). https://doi.org/10.1134/S1021443712040024
B., M. (2014). Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar atlantik dengan penyandi gen lisozim melalui perantara Agrobakterium tumefaciens . Institut Pertanian Bogor. Bustomi.  (2012). Transformasi  genetik  kentang  (Solanum  tuberosum  L.)  kultivar  Baraka  dengan  gen pembungaan Hd3a . Institut Pertanian Bogor.
Chakravarty, B.,  Wang-Pruski, G. (2010). Rapid regeneration of stable transformants in cultures of potato by improving factors influencing Agrobacterium-mediated transformation. Advances in Bioscience and Biotechnology , 01 (05), 409–416. https://doi.org/10.4236/abb.2010.15054 Dai,  S.,  Zheng,  P.,  Marmey,  P.,  Zhang,  S.,  Tian,  W.,  Chen,  S.,  Beachy,  R.  N.,    Fauquet,  C.  (2001). Comparative  analysis  of  transgenic  rice  plants  obtained  by  Agrobacterium-mediated  transformation and particle bombardment.
Molecular Breeding , 7 (1), 25–33. https://doi.org/10.1023/A:1009687511633
Dianawati,  M.,  Ilyas,  S.,  Wattimena,  G.  A.,    Susila,  A.  D.  (2013).  Produksi  Umbi  Mini  Kentang  Secara Aeroponik  Melalui  Penentuan  Dosis  Optimum  Pupuk  Daun  Nitrogen. Jurnal  Hortikultura , 23 (1),  47. https://doi.org/10.21082/jhort.v23n1.2013.p47-55 Fatchiyah, E.L., A.,  S., W. S. dan R. (2011). Biologi Molekuler Prinsip Dasar Analisis . Erlangga.
G,  H.,    D,  C.  M.  (1996).  Agrolistic”  transformation  of  plant  cells:  integration  of  T-strands  generated  in
550
914 A B
planta. Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America , 93 (December), 14978–14983. H,  N.  (2016). Perakitan  tanaman  kentang  (Solanu  tuberosum  L.)  kultivar  Nooksack  Transgenik  yang mengandung gen Hd3a . Institut Pertanian Bogor.
Han, E. H., Goo, Y. M., Lee, M. K.,  Lee, S. W. (2015). An efficient transformation method for a potato (Solanum  tuberosum  L.  var.  Atlantic). Journal  of  Plant  Biotechnology , 42 (2),  77–82. https://doi.org/10.5010/JPB.2015.42.2.77
Kojima, S., Takahashi, Y., Kobayashi, Y., Monna, L., Sasaki, T., Araki, T.,  Yano, M. (2002). Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes transition to flowering downstream of Hd1 under short- day conditions. Plant and Cell Physiology , 43 (10), 1096–1105. https://doi.org/10.1093/pcp/pcf156 Komiya, R., Ikegami, A., Tamaki, S., Yokoi, S.,  Shimamoto, K. (2008). Hd3a and RFT1 are essential for flowering in rice. Development , 135 (4), 767–774. https://doi.org/10.1242/dev.008631 L., S. (2015). Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar agria dengan gen pembungaan Hd3a . Institut Pertanian Bogor.
Li, M., Li, H., Hu, X., Pan, X.,  Wu, G. (2011). Genetic transformation and overexpression of a rice Hd3a induces early flowering in Saussurea involucrata Kar. et Kir. ex Maxim. Plant Cell, Tissue and Organ Culture , 106 (3), 363–371. https://doi.org/10.1007/s11240-011-9927-5
Monna, L., Lin, H. X., Kojima, S., Sasaki, T.,  Yano, M. (2002). Genetic dissection of a genomic region for a  quantitative  trait  locus,  Hd3,  into  two  loci,  Hd3a  and  Hd3b,  controlling  heading  date  in  rice. Theoretical and Applied Genetics , 104 (5), 772–778. https://doi.org/10.1007/s00122-001-0813-0 Navarro, C., Abelenda, J. A., Cruz-Oró, E., Cuéllar, C. A., Tamaki, S., Silva, J., Shimamoto, K.,  Prat, S.
(2011).  Control  of  flowering  and  storage  organ  formation  in  potato  by  FLOWERING  LOCUS  T. Nature , 478 (7367), 119–122. https://doi.org/10.1038/nature10431
PAMBUDI  A.  (2009).  Teknik  Transformasi  Genetik  Beberapa  Tanaman  Menggunakan  Agrobacterium tumefaciens.
In Depertemen Biologi .
http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123456789/11541/G09apa1.pdf;jsessionid=A742E721B510 BF933979D9C6F0647AE0?sequence=2 Rahmawati,  S.  (2006).  Status  Perkembangan  Perbaikan  Sifat  Genetik  Padi  Menggunakan  Transformasi Agrobacterium. Jurnal AgroBiogen , 2 (1), 36. https://doi.org/10.21082/jbio.v2n1.2006.p36-44
Rashid, H., Agricultural, N., Khan, M. H., Technology, I.,  Malik, S. A. (2010). Effect of bacterial culture density and acetos.pdf . January 2015 .
Riley,  P.  A.  (2000).  Tyrosinase  kinetics:  A  semi-quantitative  model  of  the  mechanism  of  oxidation  of monohydric  and  dihydric  phenolic  substrates. Journal  of  Theoretical  Biology , 203 (1),  1–12. https://doi.org/10.1006/jtbi.1999.1061
Suharsono., G.A., W., N., D., D., I., I., A., A., N.,  H, R. (2016). Pendaftaran varietas kentang cv IPB CP 1 . Suharsono. (2002). Konstruksi pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Hayati , 9 (3), 67–70. Sulistyaningsih Y.C. (2012). Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) . Institut Pertanian Bogor.
Syafitri, L. N. (2012). Transformasi Genetik  Nicotiana benthamiana Dengan Gen  Pembuangan Hd3a Dari Padi . 86.
Tamaki,  S.,  Matsuo,  S.,  Hann,  L.  W.,  Yokoi,  S.,    Shimamoto,  K.  (2007).  Hd3a  protein  is  a  mobile flowering signal in rice. Science , 316 (5827), 1033–1036. https://doi.org/10.1126/science.1141753 Tu, L., Zhang, X., Liu, D., Jin, S., Cao, J., Zhu, L., Deng, F., Tan, J.,  Zhang, C. (2007). Suitable internal control genes for qRT-PCR normalization in cotton fiber development and somatic embryogenesis. In Chinese Science Bulletin (Vol. 52, Issue 22, pp. 3110–3117). https://doi.org/10.1007/s11434-007-0461- 0
Widiarti.  (2016). Transformasi  genetik  tanaman  kentang  (Solanu  tuberosum  L.)  kultivar  Jala  Ipam  dengan gen Hd3a . Institut Pertanian Bogor.
Yamamoto, T., Kuboki, Y., Lin, S. Y., Sasaki, T.,  Yano, M. (1998). Fine mapping of quantitative trait loci Hd-1,  Hd-2  and  Hd-3,  controlling  heading  date  of  rice,  as  single  Mendelian  factors. Theoretical  and Applied Genetics , 97 (1–2), 37–44. https://doi.org/10.1007/s001220050864.