Pancaningtyas Pelita Perkebunan 29(1)  2013, 10-19

## Evaluasi Kuantitas dan Hiperhidrisitas Embrio Somatik Kakao Pada Kultur Padat, Kultur Cair, dan Subkultur Beruntun
Evaluation  of  Quantity  and  Hyperhydricity  of  Cocoa  Somatic  Embryo Obtained from Solid  Culture, Liquid Culture,  and Sequence  Subculture
Sulistyani Pancaningtyas 1*)
1) Pusat  Penelitian  Kopi  dan  Kakao  Indonesia,  Jl.  PB.  Sudirman  No.  90,  Jember,  Indonesia.
*) Alamat  penulis  ( corresponding  author ):  listya.1606@gmail.com Naskah diterima ( received ) 17 Oktober 2012, disetujui ( accepted ) 21 Desember 2012.

## Abstrak
Penelitian  yang  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  kultur  pada  media padat,  media  cair,  dan  subkultur  beruntun  terhadap  kuantitas  dan  hiperhidrisitas embrio somatik kakao telah dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Pusat Penelitian Kopi  dan  Kakao  Indonesia.  Materi  yang  digunakan  adalah  kalus  embriogenik, yang selanjutnya  dikulturkan  pada  media ekspresi  embrio  somatik  di  media padat dan  media  cair  dengan  komposisi  media  yang  sama,  yaitu  menggunakan  media dasar MS dengan penambahan hormon Adenin (0,025 mg/L). Bahan pemadat yang digunakan pada media padat adalah gelrit (3 g/L), dan klon yang digunakan adalah Sca  6.  Penelitian  terdiri  atas  dua  kegiatan,  yaitu  1)  pengaruh  jenis  media  kultur dan  2)  pengaruh  subkultur  beruntun  pada  media  padat.  Parameter  yang  diamati adalah  bobot  massa  kalus  embriogenik,  jumlah  embrio  somatik,  ukuran  embrio somatik  pada  berbagai  tahap  perkembangan  embrio,  yakni  globular,  torpedo,  dan kotiledon, baik itu embrio normal maupun embrio yang mengalami hiperhidrisitas. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  produksi  embrio  somatik  pada  media  cair lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  media  padat.  Regenerasi  embrio  somatik  pada kultur padat menghasilkan persentase embrio yang mengalami abnormalitas akibat hiperhidrisitas  tertinggi  pada  fase  kotiledon  bening  sebesar  60%.  Sementara  itu, regenerasi  embrio  somatik  pada  kultur cair  menghasilkan  persentase  embrio  yang mengalami  abnormalitas  akibat  hiperhidrisitas  tertinggi  pada  fase  globular  dan kotiledon  bening  sebesar  37%. Semakin  sering  dilakukan  subkultur  maka  tingkat abnormalitas embrio akan semakin meningkat,  sedangkan  jumlah embrio  semakin menurun.
Kata  kunci : Kakao,  hiperhidrisitas,  embrio  somatik,  media  padat,  media  cair,  subkultur, in vitro.

## Abstract
Research  aimed  to  study  the  effect  of  solid  culture,  liquid  culture,  and sequence  subculture  on  quantity  and  hyperhydricity  of  somatic  embryo  was carried  out  at  Laboratory  of  Biotechnology,  Indonesian  Coffee  and  Cocoa Research  Institute.  Materials  used  in  this  study  were  embryogenic  calli transferred  on  somatic  embryos  expression  both  in  solid  and  liquid  media with  the  same  media  composition,  namely  MS  medium  with  the  addition  of Adenine  (0.025  mg/L).  Gelling  agent  used  in  solid  media  was  gelrite  (3  g/L). Clones used in this study was Sca 6. This research consisted of two trials, namely 1)  effect  of  medium  type  (solid  and  liquid),  and  2)  sequence  subculture  (four
subcultures).  This  results  showed  that  the  production  of  somatic  embryos in  liquid  medium  was  higher  than  in  the  solid  medium.  Regeneration  of somatic  embryos  on  solid  medium  culture  showed  the  highest  percentage  of abnormality  embryos  due  to  hyperhydricity  at  the  cotyledonary  phase  60%. Meanwhile,  the  regeneration  of  somatic  embryos  in  liquid  culture  showed the  highest  percentage  of  abnormality  embryos  due  to  hyperhydricity  at the  globular  and  cotyledonary  phase  37%.  Frequent  subculture  increased abnormal  embryos and decreased  the  number  of  somatic  embryos.
Key words: Cacao,  hyperhydricity,  somatic  embryos,  solid  culture,  liquid  culture,  subcul- ture, in  vitro .

## PENDAHULUAN
Hiperhidrisitas  adalah  perubahan morfologi, anatomi dan fisiologi yang terjadi pada jaringan tanaman yang sering ditemu- kan pada perbanyakan tanaman secara kultur in  vitro (Ziv,  1991).  Hiperhidrisitas (sebelumnya  dikenal  sebagai  vitrifikasi) adalah kelainan fisiologis yang menyebabkan hidrasi  berlebihan,  lignifikasi  rendah, gangguan fungsi stomata dan berkurangnya kekuatan mekanik tanaman yang dihasilkan kultur jaringan. Secara umum, gejala utama hiperhidrisitas adalah karakteristik tanaman menjadi sukulen, ditandai dengan kekurangan klorofil  dan  kandungan  air  yang  tinggi. Secara khusus, tipis atau kurangnya lapisan kutikula, berkurangnya jumlah sel palisade, letak  stomata  tidak  teratur,  dinding  sel kurang  berkembang  dan  besarnya  ruang intraseluler  di  lapisan  sel  mesofil  telah digambarkan sebagai  beberapa  perubahan anatomi  yang  berhubungan  dengan  hiper- hidrisitas (Franck et al ., 2004).
Fenomena hiperhidrisitas banyak terjadi pada  perbanyakan in  vitro menggunakan kultur  cair  dan  padat  (Olmos,  2006). Terjadinya hiperhidrisitas dapat menyebab- kan kehilangan hasil yang cukup signifikan dan masalah-masalah lain dalam perbanyakan secara komersial. Hiperhidrisitas telah banyak dipelajari  pada  pertumbuhan  tanaman secara in vitro di antaranya kentang  (Park et al .,  2004),  lidah buaya  (Ivanova et  al .,
2006), anyelir (Saher et al ., 2004), dan bunga matahari (Mayor et al ., 2003). Hiperhidrisitas dapat disebabkan oleh konsentrasi sitokinin yang tinggi (Kadota et al ., 2001), kapasitas retensi air yang tinggi ketika botol tertutup rapat,  konsentrasi  bahan  pemadat  yang rendah (Ivanova & van Staden, 2011), dan konsentrasi  amonium  yang  tinggi  (Franck et al ., 2004).
Hiperhidrisitas  dapat  dikendalikan dengan  memodifikasi  kondisi  ruang/botol kultur. Mengatur kelembaban relatif dalam botol merupakan salah satu parameter yang penting  untuk  dikendalikan.  Penggunaan membrane permeable gas dapat membantu, karena  memungkinkan  terjadi  pertukaran uap  air  dan  gas  lain  seperti  etilen  dengan lingkungan sekitarnya.  Penggunaan  bahan pemadat pada konsentrasi yang tinggi dan dengan  kekuatan  lebih  tinggi  dapat mengurangi  risiko  hiperhidrisitas.  Hiper- hidrisitas  juga  dapat  dikendalikan  dengan pendinginan (Perez-Tornero, 2001), peng- gunaan  sitokinin-meta-topolin,  kombinasi kandungan sitokinin yang lebih rendah dan amonium  nitrat,  penggunaan  nitrat  atau glutamin sebagai sumber  nitrogen tunggal dan  penurunan  rasio  NH 4 + :  NO 3 - dalam medium (Bairu et al. , 2007). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh kultur padat dan cair terhadap kuantitas dan hiper- hidrisitas embrio somatik kakao dan pengaruh subkultur beruntun terhadap kuantitas dan hiperhidrisitas embrio somatik kakao.

## Pancaningtyas

## BAHAN DAN METODE
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia.  Klon  yang  digunakan  adalah Sca 6. Penelitian terdiri atas dua kegiatan, yaitu 1) Pengaruh jenis media kultur pada tahap  ekspresi  embrio  somatik,  dan 2)  Pengaruh  subkultur  beruntun  pada tahap ekspresi embrio somatik.  Parameter yang  diamati  adalah  bobot  massa  kalus embriogenik, jumlah embrio, ukuran embrio somatik pada berbagai tahap perkembangan embrio somatik, yakni globular, torpedo, dan kotiledon, baik itu embrio normal maupun embrio yang mengalami hiperhidrisitas.
Bahan penelitian yang digunakan adalah kalus  embriogenik  yang  diperoleh  dari tahap  multiplikasi  kalus  embriogenik. Dalam penelitian ini difokuskan pada tahap ekspresi embrio somatik pada media padat dan  media  cair  dengan  komposisi  media yang  sama,  yaitu  menggunakan  media dasar  MS  dengan  penambahan  hormon Adenin  (0,025  mg/L).  Bahan  pemadat yang  digunakan  pada  media  padat  adalah gelrit (3 g/L).
Embrio somatik yang terbentuk selanjut- nya dikulturkan selama empat minggu dalam kondisi gelap selama dua minggu dan terang selama dua minggu, dengan fotoperiodisitas 16 jam. Pengamatan dilakukan setiap satu minggu  untuk  parameter  ukuran  embrio, persentase embrio normal, persentase embrio yang mengalami hiperhidrisitas dan rata-rata jumlah  embrio  hasil  perbanyakan.  Untuk membandingkan  tingkat  multiplikasi  dan pertumbuhan  embrio  somatik  pada  media padat dan media cair, dilakukan pengukuran bobot  segar  kalus  embriogenik  setelah dikulturkan  selama  enam  minggu.  Gejala hiperhidrisitas ditunjukkan dengan ciri-ciri hipokotil  sukulen/transparan,  warna  hijau yang  terbentuk  pada  tahap  lebih  lanjut (kecambah)  lebih  muda/pucat  karena
kurangnya  klorofil,  dan  morfologi  embrio mengalami abnormalitas.
Pengaruh perlakuan terhadap parameter yang  diamati  diuji  dengan  analisis  ragam ( variance analysis ) dan apabila hasilnya nyata (P<0,05) maka dilakukan uji lanjut dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam  penelitian  ini,  selama  periode kultur empat minggu dilakukan perbandingan terhadap metode perbanyakan embrio somatik kakao yaitu menggunakan media padat dan media  cair.  Perbandingan  tersebut  untuk mengetahui bobot segar  biomassa, jumlah dan  morfologi  embrio.  Hasil  tersebut disajikan pada Gambar 1 dan 2.
Dari hasil penelitian ini diketahui bahwa bobot  segar  biomassa  kalus,  jumlah  dan morfologi embrio berbeda nyata antara kultur pada media padat dan media cair. Rata-rata bobot segar biomassa pada media cair adalah 8,4 mg sedangkan pada media padat adalah 1,2 mg (Gambar 1). Bobot tersebut diperoleh dari  hasil  proliferasi  kalus  embriogenik ±1  mg  pada  awal  kultur.  Lebih  lanjut, proporsi  embrio  somatik  yang  terbentuk dalam kalus setelah regenerasi pada media cair mencapai 74%, sedangkan pada media padat mencapai 43%. Jumlah embrio dalam satu  populasi  adalah  816  embrio  pada media cair dan 171 embrio pada media padat, dengan frekuensi pembentukan embrio fase torpedo  sekitar  27%  pada  media  cair  dan 62% pada media padat (Gambar 2).
Dari penelitian ini diperoleh hasil bahwa pada media cair embrio somatik fase globular berkembang  lebih  dominan  dibandingkan dengan embrio somatik fase torpedo. Data pada  Gambar  1  &  2  menunjukkan  bahwa regenerasi menggunakan media cair meng-
Gambar 2. Produksi embrio  somatik  dan frekuensi  pembentukan embrio fase torpedo setelah empat minggu kultur.
Figure 2. Somatic embryo production and frequency of torpedo phase formation after four weeks of culture.
Media cair ( Liquid medium )
Media padat  ( Solid  medium )
816a
171b 27b
62a
Jumlah embrio Number of somatic embryo
Frekuensi  pembentukan  embrio  fase  torpedo,  % Frequency the formation of torpedo phase, %
Gambar 1. Produksi  biomassa  dan  proporsi embrio  somatik  dalam  kalus setelah  empat minggu  kultur.
Figure 1. Biomass production and somatic embryo proportion in the callus after four weeks of culture.
Media cair ( Liquid medium ) Media padat  ( Solid  medium ) 8.4a 43b 74a 1.2b Bobot segar, mg Fresh weight,  mg
Proporsi  embrio  somatik dalam  kalus,  %
Somatic embryo proportion in callus, %

## Pancaningtyas
hasilkan  lebih  banyak  embrio  somatik dibandingkan dengan media padat. Hal ini dapat dikatakan bahwa penggunaan metode kultur yang berbeda antara media padat dan media cair, secara signifikan menghasilkan bobot segar biomassa, proporsi embrio yang terbentuk, jumlah embrio dalam satu populasi, dan  frekuensi  pembentukan  embrio  fase torpedo yang berbeda pula. Dengan demikian dapat dijelaskan bahwa jenis media kultur dalam  penelitian  ini  dapat  mempengaruhi kualitas dan kuantitas embrio somatik kakao.
Saat  ini, perbanyakan tanaman  kakao untuk  memproduksi  klon-klon  unggul dapat dilakukan dengan teknologi somatik embriogenesis. Hal ini dimungkinkan untuk produksi dalam skala besar pada berbagai genotipe (Maximova et al ., 2002). Namun demikian, penerapan teknologi perbanyakan menggunakan media padat ini periode kultur cukup  lama  dalam  menghasilkan  embrio (6-8  bulan),  dan  memerlukan  biaya  per tanaman relatif tinggi (Traore et al ., 2003).
Dalam penelitian ini diketahui  bahwa tingkat  produksi  embrio  somatik  kakao menggunakan  media  padat  relatif  rendah.
Hal  ini  dikarenakan  hanya  sedikit  embrio yang  dapat  dihasilkan  dari  kalus  embrio- genik.  Hal  serupa  juga  telah  dihasilkan Maximova et  al .  (2002)  dan  Niemenak et al . (2008) menggunakan klon yang sama yaitu  Sca  6  dapat  memproduksi  10,2 ±  1,9  embrio  per  eksplan  setelah  kultur selama  12  bulan  dengan  menggunakan media padat.
Diketahui  bahwa  pada  media  padat (Tabel 1),  jumlah embrio somatik bening/ transparan lebih tinggi dibandingkan dengan embrio yang normal berwarna putih tulang. Jumlah  tertinggi  diperoleh  pada  embrio somatik fase globular bening. Namun apabila dilihat  dari  morfologi  embrio  somatik, persentase embrio tertinggi yang mengalami abnormalitas  adalah  pada  fase  kotiledon bening yaitu 60%. Ukuran embrio pada setiap fase, baik  embrio  somatik  berwarna  putih maupun  yang  bening  tidak  berbeda,  yaitu embrio  somatik  fase  globular  berukuran 0,1  mm,  torpedo  0,40-0,43  mm  dan  fase kotiledon berukuran 0,7 mm. Embrio somatik yang  bening  mempengaruhi  pertumbuhan dan  morfologi  embrio,  bahwa  tingkat
Tabel  1. Morfologi dan jumlah embrio somatik pada kultur media padat
Table  1. Morphology and number of somatic embryos in solid medium culture
Parameter pengamatan ( Observed parameters )
Fase embrio somatik Somatic embryo stages Globular  putih 3.67 d 10.67 c 0.10 c White  globular Torpedo putih 2.33 d 13.67 c 0.40 b White torpedo Kotiledon  putih 2.67 d 6.33 c 0.70 a White cotyledon Globular bening 68.33 a 7.33 c 0.10 c Transparent globular Torpedo bening 25.67 b 27.67 b 0.43 b Transparent torpedo Kotiledon bening 18.67 c 60.00 a 0.70 a Transparent cotyledon
Catatan ( Note ): Angka-angka  dalam  kolom  yang  sama  yang  diikuti  oleh  huruf  yang  sama  menunjukkan  tidak  berbeda  nyata menurut uji Duncan pada taraf 5% ( Figures in the same column followed by the same letter are not significantly different according to Duncan test at 5% level ).
Embrio somatik  abnormal
Abnormality of somatic embryos
(%) Jumlah embrio  somatik Number of somatic  embryos Ukuran embrio somatik Size of somatic embryos
(mm)
abnormalitas embrio juga tinggi. Hal ini dapat disebabkan  karena  embrio  yang  bening telah  mengalami  hiperhidrisitas.  Embrio yang  mengalami  hiperhidrisitas  akan terganggu  pertumbuhannya  karena  tidak berfungsinya meristem primer, dan terkadang menyebabkan  kematian  pucuk  karena nekrosis (Gaspar et al ., 1991).
Produksi  embrio  somatik  pada  media padat  menunjukkan  keragaman  fase embrio (Gambar 3), bahwa jumlah embrio yang  berkembang (torpedo  dan  kotiledon) lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  embrio fase  globular  (Tabel  1).  Ketidaksesuaian pertumbuhan  embrio  akan  menghambat pertumbuhan  embrio  pada  fase  yang lebih  awal  (globular),  sehingga  tingkat abnormalitas embrio pada tahap perkembang- an lebih lanjut menjadi fase torpedo maupun kotiledon akan tinggi. Meskipun  pada tahapan perkembangan  embrio  yang  lebih  lanjut, embrio bening akan berubah menjadi embrio yang  berwarna  putih,  tetapi  tidak  terjadi perubahan  morfologi  embrio  yang  telah mengalami abnormalitas. Hal ini disebabkan embrio mengalami defisiensi dinding sel atau deposisi selulosa dan lignin (Kevers et al ., 1988).  Penambahan  konsentrasi  bahan pemadat  diharapkan  dapat  mengurangi
embrio yang abnormal akibat hiperhidrisitas. Menurut  Ivanova  &  van  Staden  (2011), penggunaan gelrit secara signifikan meng- hasilkan tingkat multiplikasi yang rendah dan meningkatkan hiperhidrisitas empat kali lebih tinggi (65%) dibandingkan dengan pemadat agar. Gelrit dinyatakan dapat mendorong dan mempercepat hiperhidrisitas pada beberapa spesies  (Franck et  al .,  2004;  Tsay et  al ., 2006). Namun demikian, hiperhidrisitas dapat diatasi  dengan  meningkatkan  konsentrasi gelrit hingga 16 g/L.
Dari  penelitian  ini  dapat  dijelaskan bahwa  proses  produksi  embrio  somatik kakao  dapat  dilakukan  dengan  kultur  cair dan  kultur  padat.  Namun,  untuk  tujuan produksi tanaman dalam skala banyak atau untuk  komersialisasi  dibutuhkan  suatu metode yang lebih efisien untuk multiplikasi kalus embriogenik, yaitu menggunakan media cair.  Umumnya,  sistem  kultur  cair  lebih diterima  untuk  sistem  otomatisasi  untuk mendapatkan  hasil  yang  lebih  baik  dalam pertumbuhan  yang  cepat  dan  tingkat perbanyakan  yang  lebih  tinggi.  Namun, sistem ini terkadang memiliki kendala dalam penggunaannya karena terjadi abnormalitas secara  fisiologi,  khususnya hiperhidrisitas (Preil, 2005).
Gambar 3. Morfologi  embrio somatik pada  kultur media padat  (A  = normal,  B =  abnormal). Figure 3. Morphology of somatic embryo in solid medium culture ( A = normal, B = abnormal ).
A B

## Pancaningtyas
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa produksi  embrio  somatik  menggunakan media  cair  menghasilkan  jumlah  embrio somatik  cukup  tinggi  untuk  masing- masing fase perkembangan embrio. Namun demikian, jumlah embrio somatik tertinggi diperoleh  pada  fase  globular.  Dari  satu populasi  kalus  embriogenik  dihasilkan berturut-turut sebanyak 105 dan 235 embrio somatik  fase  globular  putih  dan  bening. Persentase embrio somatik abnormal paling rendah ditunjukkan oleh embrio somatik fase kotiledon  berwarna  putih  yaitu  6,67%. Ukuran embrio somatik pada masing-masing fase  perkembangan  tidak  berbeda  nyata, kecuali pada fase kotiledon. Ukuran embrio somatik fase kotiledon berwarna putih adalah 0,70 mm dan fase kotiledon bening adalah 1,03 mm. Hal ini dikarenakan embrio somatik pada fase kotiledon berwarna bening sebagian besar sudah memiliki radikula (calon akar).
Pada  penelitian  ini  diketahui  bahwa produksi  embrio  somatik pada  media  cair menghasilkan  jumlah  yang  lebih  banyak dibandingkan  pada  media  padat  dengan
morfologi pertumbuhan embrio yang lebih seragam,  yaitu  sebagian  besar  pada  fase globular  (Gambar  4).  Terjadinya  hiper- hidrisitas  pada  kultur  media  cair  memang tidak  dapat  dihindari,  akan  tetapi  dapat dikurangi melalui beberapa cara di antaranya dengan memodifikasi kondisi atmosfer pada lingkungan  kultur,  metode  pengendalian secara  fisik  dan  kimiawi  (Olmos,  2006), serta mengurangi intensitas perendaman dan subkultur pada media cair.
Dalam  penelitian  ini  juga  dipelajari pengaruh  subkultur  beruntun  massa  kalus embriogenik  pada  media  padat  terhadap terjadinya embrio somatik  abnormal.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  perlakuan subkultur menurunkan jumlah embrio somatik tetapi  meningkatkan  massa  kalus  maupun embrio somatik yang mengalami hiperhidri- sitas (abnormal). Semakin sering dilakukan subkultur maka semakin tinggi abnormalitas embrio somatik. Hal yang sama terjadi pada parameter massa kalus, yaitu  semakin sering dilakukan  subkultur  maka  semakin  tinggi massa kalus yang dihasilkan (Gambar 5).
Parameter pengamatan ( Observed parameters )
Tabel  2. Morfologi dan jumlah embrio somatik pada media cair
Table  2. Morphology and number of somatic embryos in liquid medium culture
Catatan ( Note ): Angka-angka  dalam  kolom  yang  sama  yang  diikuti  oleh  huruf  yang  sama  menunjukkan  tidak  berbeda  nyata menurut uji Duncan pada taraf 5% ( Figures in the same column followed by the same letter are not significantly different according to Duncan test at 5% level ). Globular  putih 105 ab 15.00 c 0.10 d White  globular Torpedo putih 43.33 b 16.67 c 0.47 c White torpedo Kotiledon  putih 27.33 b 6.67 d 0.70 b White cotyledon Globular bening 234.67 a 37.00 a 0.10 d Transparent globular Torpedo bening 5.67 b 26.33 b 0.53 c Transparent torpedo Kotiledon bening 15.00 b 37.00 a 1.03 a Transparent cotyledon Fase embrio somatik Somatic embryo stages
Ukuran embrio somatik Size of somatic embryos (mm) Embrio somatik  abnormal Abnormal somatic embryos (%) Jumlah embrio  somatik
Number of somatic  embryos
Gambar 4. Morfologi embrio somatik pada media cair (A = embrio somatik pada suspensi kalus embriogenik, B = embrio fase kecambah).
Figure 4. Morphology somatic embryo on liquid medium ( A = somatic embryos on suspension of embryogenic calli, B = cotyledonary phase embryo ).
A B
11a 400a 7a 17a 111.5a 13a 24a 86.5a 32a 45a 42.5a 50a 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 450.0 Ka lus (Ca llus) Jumlah Embrio (Number of embryo) Embrio Abnorma l (Abnorma l
embryo)
Gambar 5. Pengaruh subkultur beruntun terhadap produksi kalus, kuantitas dan hiperhidrisitas embrio somatik. Figure 5. Effect of sequence subculture on callus production, quantity and hyperhydricity of somatic embryo.
Kalus Jumlah embrio Embrio abnormal
Callus
Number of  embryos Abnormal  embryos SC1 SC2 SC3 SC4
Keterangan ( Notes ): SC = subkultur. Angka-angka dalam kelompok yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak  berbeda  nyata  pada  taraf  uji  Duncan  pada  taraf  5%  ( SC  =  subculture.  Figures  in  the  same  group followed by the same letter are not significantly different to Duncan at 5% level ).

## Pancaningtyas
Teisson & Alvard (1995) menyatakan bahwa frekuensi perendaman dalam media cair  dapat  mendorong  produksi  embrio. Namun demikian perbanyakan mengguna- kan  media  cair  selain  dapat  mendorong multiplikasi  embrio  somatik  kakao  juga menimbulkan  terjadinya  dampak  negatif karakter  morfologi  seperti  hiperhidrisitas. Hal ini dapat dihindari dengan mengurangi waktu  kultur  dalam  media  cair,  karena semakin lama jaringan tanaman terkena media cair, maka akan menjadi penyebab terjadinya hiperhidrisitas (Albarran et al ., 2005). Hal serupa  juga dapat  dilihat  pada  Gambar 5, bahwa  dengan  semakin  sering  dilakukan subkultur, maka tingkat abnormalitas embrio juga akan meningkat. Embrio dengan tingkat abnormalitas yang rendah, secara morfologi dan  fisiologi  kualitas  embrionya  baik, sehingga  dapat  tumbuh  menjadi  tanaman normal (planlet) dan tingkat kematian saat diaklimatisasi  menjadi  rendah.  Embrio somatik yang mengalami abnormalitas akibat hiperhidrisitas, akan kehilangan kemampuan untuk menghasilkan kecambah normal.

## KESIMPULAN
Dari  serangkaian  penelitian  ini  dapat disimpulkan bahwa:
1. Produksi  embrio  somatik  kakao  pada media  cair  lebih  tinggi  dibandingkan dengan media padat.
2. Regenerasi embrio somatik pada kultur padat  menghasilkan  persentase  embrio dengan  abnormalitas  akibat  hiper- hidrisitas  tertinggi  pada  fase  kotiledon bening  (60%),  sedangkan  regenerasi embrio somatik pada kultur cair meng- hasilkan persentase embrio dengan tingkat hiperhidrisitas tertinggi pada fase globular dan kotiledon bening (37%).
3. Semakin sering dilakukan subkultur maka tingkat abnormalitas embrio somatik dan produksi massa kalus semakin meningkat.

## DAFTAR PUSTAKA
Albarran,  J.;  B.  Bertrand;  M.  Lartaud  & H. Etienne (2005). Cycle characteristics in a temporary immersion bioreactor affect  regener ation,  morph ology, water  and  mineral  status  of  coffee ( Coffea  arabica )  somatic  embryos. Plant Cell Tissue Organ Culture , 81,
27–36.
Bairu, M.; W. Stirk; K. Dolezal & J. van Staden (2007).  Optimizing  the  micropropa- gation  protocol  for  the  endangered Aloe polyphylla : Can metatopolin and its derivatives serve as replacement for benzyladenine and zeatin?. Plant Cell Tissue Organ Culture , 90, 15–23.
Franck, T.; C. Kevers; T. Gaspar; J. Dommes; C. Deby; R. Greimers; D. Serteyn & G.  Deby-Dupon t  (2004).  Hyper - hydricity  of Prunus  avium shoots cultured on gelrite: a controlled stress r espon se. Plant  Physiology  and Biochemistry , 42, 519–527.
Ivanova, M. & J. van Staden (2011). Influence of gelling agent and cytokinins on the con trol  of  hyperhidricity  in Aloe polyphylla . Plant  Cell Tissue Organ Culture , 104, 13–21.
Ivan ova,  M.;  O.  Novak;  M.  Str n ad  & J.  van  Staden  (2006).  Endogenous cytokinins  in  shoots  of Aloe  poly- phylla cultured in vitro in relation to hyperhydricity, exogenous cytokinins and  gelling  agents. Plant  Growth Regulation , 50, 219–230.
Kadota,  M.;  K.  Imizu  &  T.  Hirano  (2001). Double-phase  in  vitro  culture  using sorbitol  increases  shoot  prolifera- tion  and  reduces  hyperhydricity  in Japanese pear. Science Horticulture , 89, 207–215.
Kevers, C.; R. Goldberg; J. Chu-Ba & T. Gaspar
(1988).  Composition  of  the  walls  of stem and leaves of vitrifying carnation.
Biologia Plantarum , 30, 219–223.
Maximova,  S.N.;  L.  Alemano;  A.  Young; N. Ferriere; A. Traore & M.J. Guiltinan (2002). Efficiency, genotypic variabi-
lity,  and  cellular  origin  of  primary and secondary somatic embryogenesis of Theobroma cacao L. In Vitro Cell Developmental  Biology  Plant ,  38,
252–259.
Mayor,  M.L.;  G.  Nestares;  R.  Zorzoli  & L.A.  Picardi  (2003).  Reduction  of hyperhydricity  in  sunflower  tissue culture. Plant  Cell  Tissue  Organ Culture , 72, 99–103.
Niemenak, N.; K. Saare-Surminski; C. Rohsius; D.O. Ndoumou & R. Leiberei (2008).
Regeneration  of  somatic  embryos  in Theobroma  cacao L.  in  temporary immersion bioreactor and analyses of free amino acids in different tissues. Cell  Biology  and  Morphogenesis ,
27, 667–676.
Olmos, E. (2006). Prevention of hyperhydricity in  plant  tissue  culture.  p.  285–288.
In: J.A. Teixeira da Silva (Ed.). Flori- culture,  Ornamental  and  Plant  Bio- technology . Spain.
Park, S.W.; J.H. Jeon; H.S. Kim; Y.M. Park; C. Aswath & H. Joung (2004). Effect of sealed and vented gaseous  micro- environment  on  hyperhydricity  of potato shoot in vitro. Science  Horti- culture , 99, 199–205.
Preil,  W.  (2005).  Gen er al  intr oduction :
A  personal  reflection  on  the  use  of liquid  media  for  in  vitro  culture. p.  1–18. In: A.K.  Hvoslef-Eide  & W. Preil (Eds.). Liquid Culture Systems for  In  Vitro  Plant  Propagation .
Spinger, Berlin.
Saher, S.; A. Piqueras; E. Hellin & E. Olmos (2004).  Hyperhydricity  in  micropro- pagated carnation shoots: the role of oxidative  stress. Plant  Physiology ,
120, 152–161.
Teisson,  C.  &  D.  Alvard  (1995).  A  new concept  of  plant  in  vitro  cultivation liquid medium: temporary immersion. p. 105–110. In: M. Terzi et al . (Eds.). Current  Issues  in  Plant  Molecular and  Celluler  Biology .  Kluwer Academic  Publishers,  Dordrech t,
Netherlands.
Traore, A.; S. Maximova & M. Guiltinan (2003). Micr opr opagation  of Theobroma cacao using somatic embryo derived plant. In  Vitro  Cell  Developmental Biology Plant , 39, 332–337.
Tsay, H-S.; C-Y. Lee; D.C. Agrawal & S. Basker (2006). Influence of ventilation closure, gelling agent and explant type on shoot bud proliferation and hyperhydricity in Scrophularia yoshimurae a medicinal plant. In  Vitro  Cell  Developmental Biology Plant , 42, 445–449.
Ziv, M. (1991). Vitrification: Morphological and physiological disorder of in vitro plant. p.  45–69. In: P.G.  Debergh   & R.H. Zimmerman  (Eds.). Micropropa- gation : Technology and Application . Kluwer   Academic  Publish er s, Dordrecht, Netherlands.
*********.