## OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR SIPROFLOKSASIN DALAM MEDIA MUELLER HINTON BROTH
MENGGUNAKAN HPLC ( High Performance Liquid Chromatography )
Maya Dian Rakhmawatie 1* , Afiana Rohmani 2
1,2 Jurusan S1 Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Muhammadiyah Semarang
* Email : mayapriambodo83@gmail.com

## ABSTRAK
Model  kinetika  in  vitro  telah  dikembangkan  untuk  menggambarkan  simulasi farmakokinetika  antibiotika  sesuai  dengan  profil  farmakokinetika  pada  tubuh  manusia. Untuk  melakukan  penelitian  model  kinetika  in  vitro,  salah  satu  faktor  penting  untuk dianalisis  adalah  kadar  obat dalam  media bakteri  yang  disesuaikan dengan  kadar  obat dalam tubuh manusia.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan analisis optimasi dan validasi penetapan kadar antibiotik  siprofloksasin  dalam  media  Mueller  Hinton  Broth  (MHB),  menggunakan kromatografi  cair  kinerja  tinggi  (HPLC)  UV  Vis  pada  panjang  gelombang  275  nm. Pemisahan  kromatografi  dilakukan  menggunakan  kolom  C 18 (250  x  4,6  mm;  4,6  µm; Knauer  Jerman).  Fase  gerak  isokratik  terdiri  dari  0,02  M  buffer  natrium  dihidrogen fosfat  pH  ±  3,0  dan  asetonitril  (65:35,  v/v).  Fase  gerak  mengandung  5  mM  trietilamin sebagai  agen  pasangan  ion.  Laju  fase  gerak  konstan  0,8  mL/menit,  pada  suhu  kolom 42  C, dan tekanan kolom berkisar 183 – 198 kgf.
Metode  yang  digunakan  selektif  dapat  memisahkan  puncak  area  kromatogram  dengan media  MHB.  Waktu  retensi  berada  pada  3,74  menit  (SD  0,04;  CV  1,06%).  Metode  ini valid  dan  linear  pada  rentang  konsentrasi  0,1  –  10  µg/mL  (r 2 =  0,992).  Sensitivitas ditunjukkan dengan nilai LOD dan LLOQ sebesar 1,24 µg/mL dan 4,12 µg/mL. Stabilitas sampel yang diukur pada penyimpanan 7 hari suhu 2 – 8  C menunjukkan nilai perolehan kembali hasil simpan sebesar 93,80%.
Kata kunci : HPLC; media Mueller Hinton Broth; siprofloksasin.

## 1. PENDAHULUAN
Tes  kerentanan  bakteri  terhadap  agen  antibiotik  dapat  digunakan  untuk mempelajari  kejadian  resistensi.  Model  tes  kerentanan  bakteri  dapat  dilakukan  secara in vitro maupun in  vivo (Greenwood,  2000).  Sekarang  ini  telah  dikembangkan  model in vitro yang menggambarkan simulasi farmakokinetik suatu antibiotik sesuai dengan profil farmakokinetik  pada  tubuh  manusia.  Metode  ini  dapat  digunakan  untuk  menganalisis kejadian resistensi, serta identifikasi dan optimalisasi parameter farmakokinetik/farmakodinamik  (PK/PD)  (Gloede et  al .,  2010).  Optimalisasi  parameter PK/PD  tersebut  dibutuhkan,  mengingat  usaha  penemuan  antibiotik  baru  telah  jarang dilakukan pada dasawarsa terakhir (Drussano, 2007)
Antibiotik  yang  telah  dilaporkan  banyak  mengalami  resistensi  adalah siprofloksasin.  Antibiotik  tersebut  dapat  digunakan  untuk  berbagai  macam  infeksi, bahkan  menjadi  pilihan  utama  untuk  infeksi  shigelosis  (WHO,  2005),  demam  tifoid (WHO,  2003),  dan  beberapa  tipe  infeksi  saluran  kemih  (SIGN,  2006).  Karena  beberapa alasan  tersebut,  maka  perlu  dilakukan  beberapa  penelitian  kinetik in  vitro untuk mengoptimalkan penggunaan siprofloksasin.
Untuk  melakukan  penelitian  model in  vitro ,  salah  satu  faktor  penting  yang  di analisis  adalah  kadar  obat  yang  akan  disesuaikan  dengan  kadar  obat  di  dalam  tubuh manusia.  Kadar  obat  tersebut  akan  menentukan  parameter  farmakokinetik  suatu antibiotik.  Untuk  analisis  kadar  obat  di  dalam  darah,  cairan  yang  digunakan  adalah sampel  darah  yang  diubah  menjadi  plasma  atau  serum.  Untuk  model  kinetik in  vitro , cairan  yang  harus  dianalisis  kadar  obatnya  adalah  media  yang  digunakan  untuk menumbuhkan bakteri (Donatus, 1985).
Salah  satu  metode  yang  dapat  digunakan  untuk  menetapkan  kadar  obat  dalam cairan hayati atau media bakteri adalah metode kromatografi menggunakan HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ). Untuk mendapatkan ketelitian pengukuran kadar obat,  maka  validasi  dan  optimasi  terhadap  alat  HPLC  mutlak  dilakukan.  Pemilihan metode kromatografi didasarkan beberapa hal, baik berdasarkan molekul obat yang akan dianalisis,  model/kondisi  kromatografi  HPLC  yang  digunakan,  serta  perangkat  yang menyusun kinerja HPLC tersebut (Hadjar, 2011).
Penelitian yang mengkaji validasi dan optimasi kadar siprofloksasin dalam media bakteri  masih  jarang  dilakukan.  Penelitian  validasi  dan  optimasi  kadar  siprofloksasin dalam  media  bakteri  pernah  dilakukan  menggunakan  model  HPLC  dengan  kondisi kromatografi  yang  berbeda.  Penelitian  tersebut  menggunakan  media  Mueller  Hinton Broth  (Difco,  Inc)  dan  menggunakan  sistem  HPLC  Hewlett-Packard  1050,  sistem penghantar  solven  HP  1050  autoinjeksi,  detektor  UV/Vis  HP  1050,  dan  tekanan  kolom rata-rata  83  psi.  Detektor  dioperasikan  pada  panjang  gelombang  280  nm.  Pemisahan kromatografi  dilakukan  menggunakan  kolom  Alltech  Adsorbosphere  HS  C 18 7U  (150  x 4,6 mm, ukuran partikel 7 µm). Fase gerak  menggunakan 0,02 M buffer natrium fosfat- asetonitril (65:35, v/v), pH 3, mengandung triethylamine 0,2% dan sodium dodesil sulfat 0,2%  sebagai  agen  pasangan  ion.  Fase  gerak  dialirkan  dalam  kolom  dengan  kecepatan konstan 1,75 mL/menit pada suhu 25  C (Wright et al , 1998).
Berdasarkan  uraian  di  atas,  maka  perlu  dilakukan  penelitian  mengenai  validasi dan  optimasi  penetapan  kadar  siprofloksasin  dalam  media  bakteri  untuk  meningkatkan sensitivitas dan selektivitas  alat yang digunakan  untuk menetapkan kadar siprofloksasin. Semakin tinggi sensitivitas dan selektivitas suatu metode penetapan kadar, maka metode tersebut akan dapat menunjukkan kadar yang sebenarnya dalam cairan yang di analisis.
2. METODE PENELITIAN

## 2.a. Alat dan bahan penelitian
Media bakteri yang digunakan adalah Mueller Hinton Broth (Himedia, India). Zat aktif siprofloksasin murni yang digunakan dalam percobaan didapatkan dari PT. Phapros (Semarang,  Indonesia)  dengan  tingkat  kemurnian  99,5%.  Bahan  lain  yang  digunakan adalah  Natrium  diHidrogen  Fosfat  (NaH 2 PO 4 )  (Zur  analyse,  Merck),  trietilamin, asetonitril gradient grade for liquid chromatograph (Merck  kGA),  asam Fosfat  (H 3 PO 4 ) 85%, Natrium Hidroksida (NaOH), dan akuabides steril (Ikapharmindo, Indonesia).
Alat  yang  digunakan  adalah  sistem  HPLC,  vortex,  sentrifugator,  mikropipet, yellow tip,  tabung  reaksi,  dan microtube  ependorf .  Kondisi  kromatografik  sistem  HPLC menggunakan  HPLC  Shimadzu  (Japan),  dengan  system  deliveri  pelarut  LC-10  AD  VP, detektor UV/Vis SPD-10 AV VP, kolom oven CTO-10 AC VP, koleksi fraksi FRC-10A, degasser  DGU-14A,  dan  dikontrol  system  SCL-10A  VP.  Data  serapan  UV/Vis diinterprestasikan oleh software Shimadzu Class VP pada sistem komputer dos. Detektor UV/Vis  dioperasikan  pada  panjang  gelombang  275  nm.  Pemisahan  kromatografi menggunakan  kolom  C 18 (250  x  4,6  mm  I.D.,  ukuran  partikel  4,6  µm)  (Knauer,  Berlin Jerman).  Fase  gerak  yang  digunakan  adalah  0,02  M  buffer  Natrium  diHidrogen  Fosfat dan asetonitril (65:35, v/v) dan mengandung 5 mM trietilamin sebagai agen pasangan ion.
pH fase gerak dibuat ± 3,0 yang disesuaikan menggunakan  asam fosfat encer.  Laju fase gerak  konstan  (isokratik)  0,8  mL/menit  pada  suhu  kolom  42ºC.  Tekanan  pada  kolom berkisar antara 183 kgf hingga 198 kgf.

## 2.b. Cara penelitian
Tahapan  penelitian  dimulai  dengan  optimasi  metode  analisis,  dengan  urutan langkah berikut:
1. Penetapan panjang gelombang optimum analisis Optimasi panjang gelombang dilakukan pada panjang  gelombang 272, 275, dan 280 nm  menggunakan  larutan  standar  siprofloksasin  100  µg/mL  dalam  media  Mueller Hinton Broth.
2. Pemilihan komposisi fase gerak analisis. Larutan  standar  siprofloksasin  100  µg/mL  dalam  media  Mueller  Hinton  Broth diinjeksikan  dalam  kolom  kromatografi,  kemudian  dilihat  pemisahan  antara  area kromatogram siprofloksasin dan media Mueller Hinton Broth yang paling baik.
3. Pemilihan suhu kolom Suhu kolom diuji pada suhu 30 dan 42  C.
Setelah  optimasi  metode  penetapan  kadar  siprofloksasin  dalam  media  Mueller Hinton  Broth  menggunakan  HPLC  selesai  dilakukan,  langkah  berikutnya  adalah melakukan  validasi  metode  meliputi  selektivitas,  sensitivitas,  linearitas,  presisi  dan akurasi, serta stabilitas (Muchohi et al ., 2011).
3. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.a. Optimasi Metode
Faktor  yang  dapat  mempengaruhi  kerja  HPLC  dalam  penetapan  kadar siprofloksasin  dalam  media  adalah  pH  fase  gerak,  suhu  kolom,  volume  asetonitril  dan fase  aqueous  di  fase  gerak.  Suhu  kolom  dapat  mempengaruhi  waktu  retensi  dan  bentuk puncak  kromatogram.  Hasil  optimasi  penelitian  sebelumnya  menunjukkan  suhu  kolom 42  merupakan  suhu  yang  paling  optimal  dalam  penetapan  kadar  siprofloksasin (Sibinovic,  2005).  Optimasi  pada  suhu  HPLC  30  C  menghasilkan  profil  kromatogram dengan puncak ganda. Hasil optimasi pada suhu 42  C, menghasilkan profil kromatogram yang  utuh  satu  puncak,  tinggi  dan  sempit.  Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa menggunakan suhu 42  C lebih sensitif dibandingkan menggunakan suhu 30  C. Fase gerak dijaga agar pHnya  tetap 3,0 ± 0,1 dengan penggunaan buffer. Buffer yang  digunakan  dalam  penetapan  kadar  siprofloksasin  adalah  buffer  natrium dihidrogenfosfat. Penjagaan pH fase gerak diperlukan untuk mengoptimalkan pemisahan dengan senyawa lain. Penggunaan trietilamin pada fase gerak adalah sebagai penetralisir asam  atau  basa,  serta  stabilisasi  hidrokarbon  terklorinasi  dalam  struktur  siprofloksasin (BASF, 2001). Selain itu, trietilamin digunakan untuk memodifikasi bentuk puncak area yang lebih baik (Singh et al ., 2009).
Komposisi  fase  gerak  mempengaruhi  waktu  retensi  siprofloksasin.  Tipe  HPLC yang  digunakan  adalah  HPLC  fase  terbalik  dengan  fase  diam  C 18 silika  non  polar, sedangkan fase gerak polar sedang yang terdiri dari campuran buffer natrium dihidrogen fosfat  dengan  asetonitril.  Pemisahan  antara  media  Mueller  Hinton  Broth  dengan siprofloksasin  yang  lebih  baik  didapatkan  dari  penggunaaan  kolom  C 18 .  Komposisi asetonitril  :  buffer  natrium  dihidrogen  fosfat  (35:65)  adalah  komposisi  yang  paling  baik digunakan saat menggunakan kolom C 18 .
Panjang gelombang yang digunakan dalam optimasi adalah 272 nm, 275 nm, dan 280  nm.  Panjang  gelombang  tidak  mempengaruhi  waktu  retensi,  akan  tetapi mempengaruhi sensitivitas. Waktu retensi siprofloksasin 100 µg/mLdalam media Mueller
Hinton  Broth  menggunakan  panjang  gelombang  272  nm  adalah  2,283  menit,  275  nm adalah  2,292  menit,  dan  280  nm  adalah  2,217  menit.  Pada  penggunaan  panjang gelombang  275  nm didapatkan  puncak  kromatogram  yang  lebih  sempit,  tinggi,  dan  luas area  kromatogram  lebih  besar.  Meskipun  demikian,  penelitian  sebelumnya  oleh  Singh (2009)  mengatakan  serapan  maksimum  siprofloksasin  berada  pada  panjang  gelombang 272,2 nm.
3.b. Validasi Metode
Hasil  validasi  metode  penetapan  kadar  siprofloksasin  dalam  media  Mueller Hinton  Broth  menggunakan  HPLC  dilakukan  dengan  melihat  selektivitas,  sensitivitas, linearitas, presisi dan akurasi, serta stabilitas (Muchohi et al ., 2011).
Selektivitas,  hasil  kromatogram  menunjukkan  area  siprofloksasin  berada  pada waktu  retensi 3,74 menit (SD 0,04 dan CV 1,06%), sedangkan fase  gerak memiliki  area di daerah waktu retensi 3,83 menit ( Gambar 1-3 ).
Gambar  1.  Profil  kromatogram  fase  gerak  asetonitril  :  buffer  natrium dihidrogen  fosfat  pH  3,0  menggunakan  kolom  C18  dengan  suhu kolom 42  C, panjang gelombang 275 nm
Gambar  2.  Profil  kromatogram  media  MHB,  menggunakan  kolom  C18  dengan suhu kolom 42  C, panjang gelombang 275 nm, dan fase gerak buffer natrium dihidrogen fosfat pH 3,0 : asetonitril (65:35, v/v)
Gambar  3.  Profil  kromatogram  siprofloksasin  3,0  µg/mL  dalam  media  MHB,
menggunakan  kolom  C18  dengan  suhu  kolom  42  C,  panjang gelombang 275 nm, dan fase gerak buffer natrium dihidrogen fosfat pH 3,0 : asetonitril (65:3, v/v)
Sensitivitas,  hasil  validasi  menunjukkan  LOD  siprofloksasin  1,24  µg/mL  (SD 0,09  dan  CV  6,92%).  Nilai  limit  deteksi  1,24  µg/mL  memberikan  kemungkinan  tidak terpantaunya kadar obat yang rendah selama fase absorpsi dan eliminasi, sehingga dapat menimbulkan  kesalahan  penetapan  model  dan  harga  parameter  farmakokinetik.  Nilai LLOQ siprofloksasin 4,12 µg/mL (SD 0,29 dan CV 7,06%). LLOQ atau limit kuantifikasi adalah konsentrasi terendah yang dapat ditetapkan dengan presisi atau repeatabilitas yang masih dapat diterima (Hakim, 2011).
Linearitas  kurva  kalibrasi,  dilakukan  dengan  menggunakan  5  seri  kadar siprofloksasin  dalam  media,  yaitu  0,1;  0,5;  1,0;  3,0;  dan  10,0  µg/mL.  Persamaan  kurva baku dari rata-rata 6 replikasi seri kadar adalah Y = (B) 37006x + (A) 28314 dan r 2 0,992. Rata-rata nilai B adalah 37126 (SD 248,90 dan CV 0,67 %), sedangkan rata-rata nilai A adalah 28314 (SD 929,70 dan CV 3,28%). Nilai r 2 sendiri rata-rata adalah 0,992 (SD 0,00 dan CV 0,13%).
Akurasi  dan  presisi,  sampel  siprofloksasin  dibuat  dalam  tiga  standar  dengan konsentrasi diketahui yaitu 1,0 µg/mL 3,0 µg/mL, dan 10,0 µg/mL; replikasi 6 kali. Jika metode  didahului  proses  ekstraksi  sampel,  maka  akurasi  yang  dicapai  hendaknya  tidak kurang  dari  75%,  dengan  kata  lain  kesalahan  analisis  sistematik  tidak  lebih  dari  25% (Hakim,  2011).  Untuk  akurasi,  RE  yang  diterima  ±  15%,  kecuali  jika  konsentrasi  di bawah LLOQ nilai RE ≤ 20% (Muchohi et al ., 2011). Hasil validasi menunjukkan akurasi untuk  tiga  kadar  siprofloksasin  dalam  media  Mueller  Hinton  Broth  yaitu  1,0  µg/mL  3,0 µg/mL, dan 10,0 µg/mL memiliki kesalahan sistematik kurang dari 25%.
Presisi yang baik akan menghasilkan pengukuran berulang pada kadar yang sama dengan  variasi  yang  relatif  rendah.  Pada  kadar  obat  yang  tinggi,  presisi  yang  dapat dicapai  cukup  tinggi,  yaitu  nilai  koefisien  variasi  di  bawah  5%.  Pada  kadar  obat  yang rendah,  koefisien  variasi  hendaknya  tidak  lebih  dari  10%  (Hakim,  2011).  Hasil  validasi menyatakan  nilai  koefisien  variasi  untuk  kadar  1,0  µg/mL  adalah  6,35%.  Untuk  kadar yang  lebih  tinggi  yaitu  3,0  µg/mL  dan  10,0  µg/mL  memiliki  nilai  koefisien  variasi  di bawah 5%, yaitu masing-masing 2,06% dan 1,20%.
Stabilitas, kriteria stabil, jika standar deviasi kadar yang diukur pada sampel yang disimpan dibandingkan sampel baru sekitar ± 15% (Muchohi et al ., 2011). Sampel yang akan dianalisis kadar siprofloksasinnya disimpan maksimal 7 hari dalam refrigerator suhu
2-8  C. Sementara (Khan et al ., 2011) menyatakan bahwa stabilitas sampel dalam freezer bertahan dalam kurun waktu 6 bulan.
Hasil  uji  stabilitas  dilakukan  pada  larutan  standar  konsentrasi  0,5  µg/mL.  Uji dilakukan  dengan  membandingkan  luas  area  kromatogram  antara  larutan  standar  0,5 µg/mL  baru  dengan  larutan  standar  0,5  µg/mL  yang  telah  disimpan  dalam  refrigerator suhu  2-8  C  selama  7  hari.  Hasil  stabilitas  perbandingan  menunjukkan  larutan  standar simpan  rata-rata  memiliki  luas  area  kromatogram  93,80%  dari  luas  area  kromatogram larutan standar baru.

## 4. KESIMPULAN
1. Kondisi  optimum  untuk  penetapan  kadar  siprofloksasin  dalam  media  Mueller Hinton  Broth  menggunakan  HPLC  kolom  C 18 (250  x  4,6  mm,  4,6  µm;  Knauer Jerman)  adalah  panjang  gelombang  275  nm,  suhu  kolom  42  C,  tekanan  kolom 183-198  kgf.  Fase  gerak  isokratik  terdiri  dari  0,02  M  buffer  natrium  dihidrogen fosfat  pH  ±  3,0  dan  asetonitril  (65:35,  v/v),  mengandung  5  mM  trietilamin,  dan laju alir 0,8 mL/menit.
2. Hasil  validasi  menunjukkan  metode  analisis  valid  dan  linear  pada  rentang konsentrasi  0,1  –  10  µg/mL  dengan  r 2 =  0,992.  Sensitivitas  ditunjukkan  dengan nilai  LOD  dan  LLOQ  masing-masing  sebesar  1,24  µg/mL  dan  4,12  µg/mL. Stabilitas  pada  suhu  2  –  8  C  selama  7  hari,  ditunjukkan  dengan  nilai  perolehan kembali hasil simpan sebesar 93,80%.
3. Untuk  penelitian  selanjutnya,  perlu  dikembangkan  metode  ekstraksi  lain  untuk pemisahan  siprofloksasin  dengan  media  Mueller  Hinton  Broth  agar  dapat diperoleh nilai perolehan kembali yang lebih baik.

## 5. DAFTAR PUSTAKA
BASF.  2001.  Triethylamine.  Technical  Data  Sheet.  New  Jersey:  BASF  corporation chemical divisions. Diakses 25 Januari 2012 dari www.basf.com
Donatus,  Imono  Argo.  1985.  Strategi  penelitian  farmakokinetik.  Cermin  Dunia Kedokteran (37):41-8.
Drussano,  G.L.  2007.  Pharmacokinetics  and  pharmacodynamics  of  antimicrobial. Clin Infect Dis . 45:589-95. Gloede, J., Scheerans, C., Derendorf, H., and Kloft, C. 2010. In vitro pharmacodynamic models  to  determine  the  effect  of  antibacterial  drugs. J  Antimicrob  Chemother 65:186-201.
Greenwood, D. 2000. Detection of antibiotik resistance in vitro . Int J Antimicrob Agents 14:303-306.
Hadjar, Mohammad Makin Ibnu. 2011. Teknik analisis obat dalam cairan biologis dengan GLC dan HPLC.
Hakim, L. 2011. Farmakokinetik. Bursa ilmu: Yogyakarta. Muchohi, S.N., Thuo, N., Karisa, J., Muturi, A., Kokwaro, G.O., and Maltland, K., 2011.
Determination  of  ciprofloxacin  in  human  plasma  using  high-performance  liquid chromatography  coupled  with  fluorescent  detection:  aplication  to  a  population pharmacokinetics  study  in  children  with  severe  malnutrition. J  Chromatog  B Analyt Technol Biomed Life Sci 879(2):146-152.
Sibinovic.  2005.  Ruggedness  testing  of  an  HPLC  method  for  the  determination  of ciprofloxacin. J.Serb.Chem.Soc 70(7):979-986.
SIGN.  2006.  Management  of  suspected  bacterial  urinary  track  infection  in  adults:  a national  clinical  guideline.  Edinburg:  Scottish  Intercollegiate  Guidelines Network. Available at www.sign.ac.uk
Singh,  R.,  Maithani,  M.,  Saraf,  S.K.,  Saraf,  S.,  and  Gupta,  R.C.  2009.  Simultaneous estimation  of  ciprofloxacin  hydrochloride,  ofloxacin,  tinidazole,  and  ornidazole by reverse phase-high performace liquid chromatography. Eurasian J Anal Chem 4(2):161-167.
WHO, 2003. Background document: The diagnosis, treatment, and prevention of typhoid fever. Geneva: WHO press.
WHO. 2005. Guidelines for the control of shigellosis, including epidemics due to shigella dysenteriae type I. Geneva: WHO press.
Wright,  DH.,  Herman,  VK.,  Konstantinides,  FN.,  and  Rotschafer,  JC.  1998. Determination of quinolone antibiotiks in growth media by reversed-phase high- performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B, 709: 97-104