## Indonesian Journal of Pure and Applied Chemistry
journal homepage: http://jurnal.untan.ac.id/index.php/IJoPAC

## AMPLIFIKASI PCR DOMAIN D1/D2 28S rDNA MENGGUNAKAN PRIMER

## ITS1
DAN ITS4 SAMPEL DNA DARI
Candida tropicalis

## YANG DIISOLASI DENGAN METODE PENDINGINAN
Hermansyah 1*, Novian Sutami 1, dan Miksusanti 1
1 Jurusan Kimia MIPA Universitas Sriwijaya, Jalan Raya Palembang Prabumulih KM 32 Indralaya, Ogan Ilir, Sumatera Selatan
* Corresponding author: hermansyah@unsri.ac.id ARTICLE INFO ABSTRACT Article history: Received 21 May 2018 Accepted 28 May 2018 Available online 26 June 2018 Keywords: Yeast C. tropicalis DNA isolation cooling method PCR Electrophoresis The purpose of this research was to isolated DNA from the yeast C. tropicalis with  freeze  thawing  method -20 0 C  conducted  on  3 colonies  of C.  tropicalis .    Each  colony      threated  variations  of cooling, 3x15 minutes, 3x25 minutes and 3x35 minutes, to break the  cell  walls.    Subsequently  all  the  samples  amplified  with  3 variations of PCR cycles, 15 cycles, 25 cycles and 35 cycles, after all of the samples isolated by freeze thawing method -20 0 C. Its was known  that  sample  A 15 has  the  smallest  concentration  of  DNA yeast C. tropicalis , ie 50 µg/mL, while sample C 35 had the largest concentration of DNA yeast C. tropicalis, ie 225 µg/mL. The result of the research indicated that the best condition can be reached in 3x35  minutes.  On  35th  cycle  has  clearer C. tropicalis DNA  bands than the 25th and 15th PCR cycle. C. tropicalis DNA bands at 35th cycles there were 7 DNA bands were detected and bright bands on a  long  35  minutes  cooling.  In  the  25th  and  the  15th  cycle,  there was  no  DNA  bands  were  detected  in  all  samples.  Based  on  the results obtained, the amplification process must be carried out at least  35  times  cycles  so  that  the C.  tropicalis DNA  bands  can  be detected.
© 2018 IJoPAC. All rights reserved

## 1. Pendahuluan
Candida adalah jamur golongan yeast yang terdiri dari banyak spesies, namun hanya sekitar 17  spesies  yang  dilaporkan  dapat  menginfeksi  manusia.  Spesies  tersebut  antara  lain Candida albicans, Candida  glabrata,  Candida  parapsilosis,  Candida  tropicalis,  Candida  krusei,  Candida kefyr, Candida guilliermondii, Candida lusitaniae, Candida dubliniensis . Beberapa metode telah dilakukan untuk mengidentifikasi spesies Candida misalnya dengan cara fermentasi, asimilisasi dan secara molekuler. Candida tropicalis telah diidentifikasi sebagai spesies yeast patogen yang umum dari kelompok Candida non albicans [1] . Pada  penelitian  ini  metode  yang  digunakan  untuk  menganalisis  DNA  dari  sel Candida tropicalis secara molekuler menggunakan PCR yaitu suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara invitro . Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama yaitu sampel, DNA  cetakan,  enzim  DNA  polimerase,  oligonukleotida  primer,  (dNTP)  deoksiribonukelotida trifosfat, dan komponen pendukung lain adalah senyawa buffer.
Menurut [2] , umumnya daerah yang digunakan untuk identifikasi yeast hingga tingkat spesies yaitu daerah ITS dan D1/D2 gen LSU. Daerah D1/D2 adalah daerah sepanjang 600 nukleotida dari  ujung  5’  gen  LSU  rRNA.  Daerah ITS1 dan ITS2 yang  mengapit  gen  5,8S.  Daerah  tersebut pada yeast umumnya berukuran 300-900 pb [3] . Variasi sequence yang lebih tinggi dari daerah D1/D2 LSU dimiliki oleh daerah ITS karena daerah  tersebut  merupakan  daerah noncoding yang  memiliki  laju  mutasi  lebih  tinggi  dari daerah coding (SSU  dan  LSU).  Oleh  karena  itu  analisis  sequence  daerah ITS dapat  digunakan untuk mengidentifikasi spesies-spesies yang berkerabat dekat [4] .
Domain D1/D2  adalah domain 600 nukleotida pada ujung 5' dari subunit besar (28S) DNA. Sebuah studi oleh [5] menunjukkan bahwa sebagian besar spesies yeast dapat diidentifikasi dari urutan  perbedaan  domain  D1/D2. Studi  lebih  dari  500  spesies yeast ascomycetous telah menunjukkan  bahwa  strain  sejenis  umumnya  memiliki  kurang  dari  1%  nukleotida  substitusi dalam  domain  ini,  sedangkan  spesies  biologi  dipisahkan  oleh  lebih  dari  jumlah  substitusi tersebut.
Identifikasi molekuler memerlukan tahapan awal yaitu isolasi DNA genom. Prinsip isolasi DNA  yaitu  mendapatkan  DNA  murni  yang  tidak  tercampur  dengan  komponen  sel  lainnya. Tahapan utama pada isolasi DNA yeast yaitu penghancuran dinding sel yeast . Proses tersebut dapat  dilakukan  dengan  metode  mekanik  dan  lisis.  Metode  isolasi  yang  digunakan mempengaruhi  kualitas  dan  kuantitas  DNA  yang  dihasilkan.  Contoh  metode  mekanik  untuk menghancurkan dinding sel yeast antara lain yaitu penggunaan sonikasi, mortar (grinding), dan boiling. Metode isolasi DNA yeast secara mekanik dapat dilakukan dengan cepat namun kualitas DNA yang dihasilkan tidak terlalu baik [5] .
Keberhasilan amplifikasi DNA pada PCR ditentukan oleh ketersediaan sampel DNA sebagai template,  DNA  taq  polymerase,  primer,  oligonukleotida,  buffer.  Ketersediaan  sampel  DNA sebagai  template  (cetakan)  akan  sangat  dipengaruhi  metode  isolasi  DNA  yang  digunakan. Dinding sel C. tropicalis dapat dilisis dengan berbagai cara misalnya secara enzimatis, dengan berbagai zat kimia maupun secara fisik seperti pendinginan pada freezer.
Metode  lisis  yang  umum  digunakan  antara  lain  yaitu  penggunaan  bahan-bahan  kimia  dan beberapa  enzim  yang  dapat  menyebabkan  lisis  dinding  sel yeast. Contoh  bahan-bahan  kimia tersebut  yaitu  nitrogen  cair  dan sodium  dodecylsulfate  (SDS), sedangkan  contoh  enzim  yang dapat digunakan dalam proses isolasi DNA yeast yaitu zymolyase maupun litikase . Isolasi DNA juga dapat menggunakan kit komersial yang merupakan penggabungan antara metode lisis dan mekanik,  contohnya  yaitu wizard ® genomic DNA purification kit [6] . Baik  metode  mekanik maupun  metode  lisis  memerlukan  bahan-bahan  yang  relatif  mahal.  Oleh karena  itu  pada penelitian  ini  isolasi  DNA  menggunakan  teknik  yang  sederhana,  mudah  dan  murah  yaitu mengisolasi dengan cara pendinginan di dalam freezer pada suhu -20 0 C dapat merusak dinding sel walaupun hasilnya tidak sama. Metode pendinginan di dalam freezer pada suhu -20 0 C dan dilakukan  vortex  dapat  merusak  dinding  sel  sehingga  isolasi  DNA  dapat  digunakan  template DNA  untuk  diamplifikasi PCR dan  elektroforesis,  dengan  berhasilnya  metode  ini,  ada kemungkinan  metode  ini  dapat  digunakan  untuk  spesies Candida yang  lain,  sehingga  dapat membantu isolasi DNA dengan mengidentifikasi spesies-spesies yeast Candida .
2. Bahan dan  Metode

## 2.1. Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah yeast  C.  tropicalis ,  media Sabouroud yang terdiri atas 1% pepton, 4% glukosa, dan 1% bakto agar, spritus, media cair (1% pepton dan 4% glukosa), larutan buffer TAE, alkohol 70%. buffer PCR terdiri dari ; (100 mM
Tris} pH HCl 3-8, 15 mM MgCl 2 500 mM KCl, 1% Triton X-100), 1 µL dNTP (10 mM), 5 µL setiap primer (10 M), 0-5 µL (2-5 U) polimerase Taq DNA dan 50 µL akuades steril.

## 2.2. Metode Persiapan Media Sabouroud
Media  Sabouroud  Agar  disiapkan  dengan  cara  berikut  :  bakto  agar  sebanyak  1  g ditambahkan 1 g pepton dan 4 g glukosa dilarutkan di dalam 120 mL akuades steril dibuat di dalam erlenmeyer 250 mL di aduk hingga homogen dipanaskan menggunakan penangas hingga larut. Media  disterilisasi  menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121 0 C,  tekanan  1  atm  selama  15 menit [7] .  Media  cair  Sabouroud  disiapkan  dengan  cara  yang  sama  tetapi  tanpa  penambahan bakto agar. Media agar didinginkan hingga suhu 65 0 C  kemudian dituangkan ke 3 cawan petri masing-masing 30 mL secara aseptik, dibiarkan hingga memadat.

## Peremajaan yeast C. tropicalis
Teknik  pemurnian yeast dilakukan  berdasarkan  metode  gores  menggunakan  jarum  ose dan  digoreskan  ke  permukaan  medium sabouroud agar  dengan  pola  zig-zag  dengan  harapan pada  ujung  goresan  hanya  sel-sel yeast tunggal  yang  terlepas  dari  ose  dan  menempel  ke medium.  Sel-sel yeast tunggal  ini  akan  membentuk  koloni  tunggal  yang  kemudian  dapat dipindahkan  ke  medium, selanjutnya  agar  didapatkan  biakan  murni, proses  pemurnian yeast dilakukan dengan cara memindahkan satu ose yeast pada medium selektif secara aseptik. Yeast kemudian diinkubasi dengan posisi terbalik dalam inkubator pada suhu 37 0 C selama 24 jam, setelah 24 jam akan terlihat koloni-koloni yeast C. tropicalis tumbuh.

## Pembuatan inokulum yeast C. tropicalis
Kultur  dibuat  dengan  mengambil  satu  koloni C.  tropicalis dengan  jarum  ose  lalu dipindahkan secara perlahan ke dalam media cair, pekerjaan dilakukan secara aseptik di ruang laminar airflow .  Kultur  dibuat  dari  3  koloni yeast C. tropicalis yang  berbeda,  diinkubasi  pada suhu 37 0 C  selama  24  jam,  pertumbuhan  sel  akan  terlihat  dengan  media  cair  akan  menjadi keruh.

## Pengukuran  Optical  Density  (OD) dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Vis
Larutan blanko dibuat 500 µL akuades steril dan 500 µL media cair tanpa isolat yeast C. tropicalis dimasukkan kedalam kuvet. Larutan sampel dibuat 900 µL akuades steril dan 100 µL media cair yang berisi sel C. tropicalis dimasukkan ke dalam kuvet, kemudian diukur OD dengan menggunakan  alat  spektrofotometer  UV-Vis  pada λ 660 nm.  Berdasarkan data OD dapat digunakan untuk menghitung jumlah sel C. tropicalis.

## Isolasi DNA yeast C. tropicalis dengan menggunakan Metode Pendinginan
Sampel isolat yeast C. tropicalis diambil  dari media cair pada 3 tabung reaksi yang berisi kultur C. tropicalis untuk metode pendinginan di sentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 12.000 rpm, kemudian diambil pelet sel dan dibuang supernatannya. Pada setiap tabung diambil pelet sebanyak 10 µL untuk 3 tube ependorf yang berbeda dan ditambahkan 200 µL akuades steril masing masing tube ependorf di vortex selama 45 detik, lalu dilakukan metode  dengan menggunakan freeze thawing, didinginkan pada suhu -20 o C masing-masing pada temperatur  3 x 15; 3 x 25, dan 3 x 25 menit dengan 3x pengulangan.

## Isolasi DNA dengan Metode Standar
Total DNA genom diisolasi dari kultur fase seimbang. Sel sel yang dikultur di dalam 50 mL tabung  berisi  10  mL YPDA kaldu pada suhu  30 0 C  dengan  kecepatan  sentrifugasi  200  rpm. Sel dipanen menggunakan sentrifugasi 5000 rpm di 4 0 C dalam waktu 5 menit, dicuci dengan 20 mL air steril sebanyak 3 kali, disuspensi dalam 200 µ L lisis penyangga (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA dan 0.5% SDS), lalu lisis pada vortex mixer dengan kecepatan tinggi pada 0.2 g gelas  kaca,  setelah  ada  gangguan  terhadap  sel,  disentrifugasi  pada  5000  rpm  dan  4 0 C  dalam waktu  5  menit.  Supernatan  dikumpulkan  di  dalam  mikrosentrifugasi,  dan  500  µL  campuran fenol,  kloroform,  isoamylalkohol  dalam  rasio  25:24:1  (v/v/v)  telah  ditambahkan,  selain  itu, campuran tersebut dicampurkan dengan cara dilakukan vortex, dan disentrifugasi pada 12000 rpm dan 4 0 C dalam waktu 10 menit dan dipindahkan ke sebuah 1,5 mL mikrosentrifuge baru. Satu mL etanol 95% (v/v) dicampurkan ke supernatan dan langsung dicampur dengan inversi, kemudian disimpan pada 20 0 C dalam waktu 2 jam untuk memicu DNA yang genom, selanjutnya sampel  tersebut  di sentrifugasi  pada  12000  rpm dan  4 0 C  dalam  waktu  10  menit.  Supernatan dengan hati-hati dibuang untuk mempertahankan butir DNA yang genom, setelah itu 1 mL 75% (v/v) air dingin/es etanol digunakan untuk mencuci butir DNA genom sebanyak tiga kali, dan butir DNA dikeringkan di inkubator pada 37 0 C dalam waktu satu jam. Genom DMA disuspensi dalam 200 µL air steril dan disimpan pada -20 0 C untuk digunakan pada saat elektroforesis [8] .

## Menentukan Konsentrasi DNA C. tropicalis
Sampel yeast C. tropicalis yang telah diisolasi dengan metode pendinginan sehingga didapat DNA yeast  C.  tropicalis untuk  menghitung  konsentrasi  DNA.  Pada  pembuatan  larutan  blanko diambil sebanyak 1 mL akuades steril dimasukkan ke dalam kuvet. Pada larutan sampel diambil 10 µL kultur C. tropicalis yang telah diisolasi (pada tube ependorf ), dimasukkan ke dalam kuvet ditambahkan 990 µL akuades steril, diukur dengan menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis pada λ 260 nm.
Amplifikasi DNA yeast C. tropicalis dengan menggunakan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction )
Amplifikasi DNA C. tropicalis dilakukan dengan menggunakan PCR JumpStart TM REDTaq TM ReadyMixa Reaction Mix, sesuai dengan protokol dari perusahaan yang terdiri atas : 20 mM Tris- HCl pH 8,3 4 mM MgCl 2, 100 mM KCl, 1% Triton X-100), 0,4 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, TTP), 0,002% gelatin, inert dye, stabilizers , 0.1 unit/mL Taq DNA Polymerase, JumpStart Taq antibody. Reagen tersedia 20, 100 dan 800 reaksi (volume reaksi default adalah 50 uL). Amplifikasi PCR dibuat  campuran  reagen  sebanyak  10 µL  dengan  komposisi  :  ReadyMixa  Reaction  Mix 5  µL, Primer ITS1 10 5 µM  0,1 5 µL, Primer ITS4 10 5 µM  0,1 5 µL, DNA sample 3 10 5 µM  0,1 5 µL), air  steril  1,8  µL. Amplifikasi  menggunakan  PCR  dilakukan  dengan  kondisi  sebagaiberikut  : denaturasi  94 o C  selama  2  menit,  pada annealing 55 o -68 o C  selama  30  detik, extension 72 o C selama 2 menit diikuti satu siklus  final  ekstensi  72 o C  selama  5 menit.

## DNA elektroforesis
Gel  agarosa  1%  dibuat  dengan  cara  melarutkan  1 g  agarosa  dengan  100  mL  TAE  ( Tris Acetate EDTA )  1x,  dididihkan  dengan  menggunakan  penangas  hingga  larutan  menjadi  bening dan  mendidih,  kemudian  larutan  agarosa  dituang  pada gel caster dan  disisipkan  sisir  ( comb ) untuk  membuat  sumur,  dibiarkan  hingga  padat. Gel  diletakkan  pada chamber elektroforesis, dengan posisi sumur pada muatan (-), kemudian buffer TAE dituangkan hingga gel terendam, dengan tidak melebihi garis batas maksimum buffer. Sampel DNA yeast C. tropicalis dan larutan
loading  dye dengan  perbandingan  (1:1)  dimasukkan  pada  masing-masing  sumur,  selanjutnya elektroda  dihubungkan  dengan power  supply dan  dinyalakan  hingga  50  menit,  pada  voltase 220V. Gel agarosa kemudian direndam ke dalam larutan etidium bromida selama ± 20 menit, kemudian  dimasukkan  ke dalam gel  documentation untuk mengamati  hasil  pita  DNA  yang teramplifikasi dan mendokumentasikan hasil elektroforesis.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Koloni C.tropicalis merupakan eukaryot tingkat rendah memiliki karakter morfologi mirip seperti  y east lainnya.  Sehingga untuk mengidentikasi spesies perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut misalnya melalui uji biokimia asimilasi atau fermentasi, atau karakter urutan DNA nya. Yeast C.  tropicalis diremajakan  pada  media  agar  sabouroud  di  dalam  cawan  petri,  diinkubasi selama  24  jam  seperti  pada  Gambar  1.    Ciri-ciri  makroskopik  yang  umumnya  diamati  yaitu warna, profil, serta tepi koloni pada medium padat dan keberadaan endapan (sediment), pelikel (pellicle), cincin (ring), dan  pulau-pulau (islets) pada  medium  cair [6],[9] .  Koloni  tersebut berwarna kuning dan sebagian koloni berbentuk koloni tunggal, koloni C. tropicalis berukuran 3,0-5,5  x  4,0-9,0  µm  sehingga  yang  diambil  menggunakan  jarum  ose  koloni  yang  tidak terkontaminasi dan berbentuk tunggal.
Gambar 1. Kultur C.  tropicalis dalam media agar sabouroud setelah diinkubasi shaker pada suhu ruangan selama 24 jam.
Hasil    Isolasi    DNA    C.   tropicalis  dengan  cara  Pendinginan  di dalam  Freezer  pada Suhu -20 0 C .
DNA  diisolasi  dari  isolat  koloni  yang  dikultivasi  pada  selama  18  jam  hingga  fase eksponensial yaitu pada saat kultur sel memiliki kerapatan optis atau OD 660 lebih kurang 1,0.  Sel yang  dikumpulkan  dengan  cara  sentrifugasi  untuk  selanjutnya  dilisis  dengan  metode  free thawing  Pada  Gambar  2  memperlihatkan  bahwa  kultur yeast  C.  tropicalis yang  sudah diremajakan dibuat pada media cair diinkubasi shaker selama 24 jam.
Setelah kultivasi terlihat kultur menjadi keruh karena jumlah sel semakin meningkat. Sel dikumpulkan pada fase eksponensial yaitu ketika kultur memiliki OD λ 660 nm = 1.0 seperti yang terlihat pada Gambar 2, selanjutnya sel dilisis dengan metode pendinginan.
Gambar 2.  Kultur sel setelah diinkubasi selama 18 jam berada dalam fase eksponensial memiliki OD 660 = 1.0
C.  tropicalis dapat  dipecah  atau  dilisis  dinding  selnya  dengan  metode  pendinginan  di dalam freezer -20 0 C. Metode ini simpel, murah, dan cepat.  Dengan menggunakan variasi waktu pendinginan 15, 25 dan 35 menit sel menjadi rigid sehingga ketika di vorteks selama 45 detik sel akan mudah rusak.  Untuk mendapatkan hasil lisis yang lebih sempurna, sel di dinginkan dan di vorteks sebanyak 3 kali.
Konsentrasi DNA C. tropicalis menggunakan  Spektrofotometri UV-VIS pada λ 260 nm.
Pengukuran kuantitas dan kualitas DNA dapat dilakukan menggunakan spektrofotometri. Sampel yang mengandung DNA dan RNA memiliki absorbansi maksimal pada λ 260 nm. Kuantitas DNA dalam suatu sampel dapat dihitung berdasarkan nilai absorbansi pada panjang gelombang tersebut.  Sebuah  sampel  memiliki  nilai  absorbansi  1  pada λ 260 nm  memiliki  konsentrasi  DNA sebanyak  50µg/mL  (Rapley  and  Heptinstall,  1998).    Hasil  pengukuran  konsentrasi  DNA terhadap hasil lisis kultur C.tropicalis seperti yang dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Konsentrasi DNA C. tropicalis yang dihasilkan pada berbagai waktu pendinginan. A 15 ; A25; A35 = sampel C.tropicalis k oloni A dengan pendinginan dalam freezer tiga kali 15,  25  dan  35  menit.    B 15  ; B25;  B35  =    sampel C.tropicalis  k oloni  B  dengan pendinginan dalam freezer tiga kali 15, 25 dan 35 menit.  C 15  ; C25; C35 =  sampel C.tropicalis k oloni C dengan pendinginan dalam freezer tiga kali 15, 25 dan 35 menit.
Pada Gambar 3. menunjukkan bahwa nilai konsentrasi DNA dari C. tropicalis baik koloni A, B  ataupun  C,  makin  meningkat  waktu  pendinginan  menyebabkan  umumnya  lisis  sel  semakin baik yang ditandai dengan meningkatnya jumlah DNA.  Dengan waktu pendinginan 15, 25, dan 35  menit,  umumnya  pendinginan  35  menit  lebih  baik  dari  25  menit,  dan  lebih  tinggi  dari  15 menit.  Kecuali pada koloni B, dimana pendinginan 35 menit menghasilkan DNA yang lebih kecil dari  25  menit.    Sedangkan  diantara  koloni  A,  B  dan  C baik pada  pendinginan  15,  25,  dan  35 menit, jumlah DNA tertinggi terdapat pada koloni C . DNA.  Konsentrasi yang tertinggi pada lama pendinginan 35 menit menghasilkan  konsentrasi DNA 225 µg/mL.
0 50 100 150 200 250 Ko ns en tra si DN A ( µg /m L )
A 15 A 25 A 35 B 15 B 25 B 35 C 15 C 25 C 35 sampel DNA metode pendinginan
Amplifikasi  DNA  dengan PCR dalam berbagai  Siklus PCR yang  dideteksi  dengan Elektroforesis
Berdasarkan  hasil  siklus PCR yang  telah  dilakukan,  pada    35  siklus  hasil  pembacaan template  DNA  pada  elektroforesis  paling  tinggi  dibandingkan  dengan  25  dan  15  siklus PCR , terlihat pada  35 siklus, template DNA yang terbaca 8 buah sampel terdiri dari 2 buah sampel pendinginan pada freezer 15 menit, dan 3 buah sampel pendinginan pada freezer 25 menit, serta 3 buah sampel pendinginan didalam freezer 35 menit. Pada  25  siklus  amplifikasi  DNA  yang  diamati  menggunakan  sampel  DNA  yang  diisolasi dengan pendinginan tidak ada yang terdeteksi, sementara amplifikasi DNA sampel yang diisolasi dengan metode standar dapat dideteksi. Pada 15 siklus PCR baik sampel standar DNA maupun sampel yang diuji tidak ada yang terdeteksi hal ini disebabkan baik 15 siklus maupun 25 siklus PCR belum bisa digunakan untuk pengujian sampel karena siklus tersebut terlalu singkat untuk pemanjangan untai DNA, sehingga kondisi terbaik untuk amplifikasi PCR pada freeze thawing harus pada 35 siklus agar dapat dideteksi dengan menggunakan elektroforesis. Amplifikasi  gen  28S  rDNA  memiliki  kualitas  pita  produk  yang  terlihat  terang  dan  tebal, serta  sejajar  satu  sama  lain dimana  menghasilkan  pola  pita  tunggal  DNA  yang menandakan bahwa primer dan suhu annealing yang digunakan sudah tepat. Hasil amplifikasi PCR fragmen gen pengkode 28S rDNA  menggunakan pasangan primer ITS1 dan ITS4  seperti pada Gambar 4. Hasil ini jika dibandingkan dengan pita yang dihasilkan amplifikasi DNA menggunakan tempalte DNA yang dilisis dengan protokol standar yang digunakan pada bidang yeast genetic molecular kurang terang pitanya, walaupun masih dapat dilihat dengan baik.
Berdasarkan  hasil  yang  didapat  seperti  terlihat  pada  Gambar  5.  pita  yang  tidak  terlihat dimiliki oleh isolat 5. Pada lajur 6,7,8,9,12 dan 13 menunjukkan pita DNA yang menyala terang. Menurut Restu et al ., (2012), produk isolasi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA  yang  terlihat  tebal dan  bersih,  serta  pita  DNA  yang  menyala  terang. Lajur  5  tidak memperlihatkan  adanya  pita  DNA,  hal  ini  dimungkinkan  karena  konsentrasi  DNA  yang dihasilkan pada saat isolasi DNA terlalu rendah sehingga tidak dapat diamplifikasi menggunakan PCR dan tidak terlihat ketika divisualisasikan pada gel agarosa. Amplifikasi PCR terdapat DNA yang  terlihat  jelas  dan  terang,  karena  pada  saat  proses PCR berlangsung  terjadi  amplifikasi fragmen gen 28S rDNA sehingga konsentrasi DNA meningkat. Pada lajur 8 dan 9 pita DNA yang dihasilkan lebih terang dibandingkan lajur 10 yang seharusnya lebih terang, hal ini dikarenakan konsentrasi  mempengaruhi  intensitas  pita  DNA  yang  dihasilkan. Utami et  al .,  (2012) menyatakan  bahwa  kualitas  DNA  yang  baik  memiliki  konsentrasi DNA  yang  tinggi  dan  juga ditandai  dengan  tingginya  intensitas  pita  DNA  yang  dihasilkan. [11] munculnya  satu  pita menunjukkan  bahwa  pasangan  primer  yang  digunakan  bersifat  spesifik  dan  hanya  menempel pada posisi yang diharapkan.
1   2   3    4    5   6    7    8   9    10  11 12 13 14  15
Gambar  4.  Hasil  elektroforesis  DNA.  Profil  fragmen  DNA  hasil  amplifikasi  PCR  35  siklus menggunakan primer ITS1 dan ITS4.
Ukuran fragmen DNA yang dihasilkan dari amplifikasi dengan menggunakan primer ITS1 dan ITS4 sejajar dengan marka penanda DNA yang berada pada ukuran  500 pb sesuai dengan target  amplifikasi.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  fragmen  DNA  yang  teramplifikasi  memiliki ukuran sekitar ± 500 pb.
Salah  satu  faktor  penting  yang  mempengaruhi  kualitas  deteksi  molekular  berbasis PCR ialah  pemilihan  primer  dan  suhu annealling yang  tepat amplikon  DNA  yang  tervisualisasikan sebagai  pita  DNA  yang  terang  dan  tebal  pada  penelitian  ini  memiliki  konsentrasi  dan  tingkat kemurnian yang tinggi, hal ini ditunjukkan pada sampel dengan metode standar yang memiliki tingkat ketebalan pita DNA yang terang.  Pada metode pendinginan di dalam freezer -20 0 C tidak ada  sampel  DNA  yang  terdeteksi  hal  ini  dimungkinkan    25  siklus masih  terlalu singkat  untuk dilakukan  amplifikasi PCR dengan  melisis  dinding  sel  dengan  cara  fisik  menggunakan pendinginan pada freeze -20 0 C (Gambar 5).  Begitu juga jika amplifikasi dilakukan dengan 15 siklus PCR, tidak ada sampel DNA yang terdeteksi seperti pada Gambar 6.
Gambar  5.  Hasil  elektroforesis  DNA.  Profil  fragmen  DNA  hasil  amplifikasi  PCR  25  siklus menggunakan primer ITS1 dan ITS4.

## .
Gambar  6.  Hasil  elektroforesis  DNA.  Profil  fragmen  DNA  hasil  amplifikasi  PCR  15  siklus menggunakan primer ITS1 dan ITS4.

## Menurut
[12] ,  konsentrasi  DNA  yang  rendah  mengindikasikan  bahwa  DNA  masih terkontaminasi  oleh  protein  dan  RNA,  dimana  RNA  dan  protein  sebagai  pengotor  ikut terekstraksi selama proses isolasi berlangsung, meskipun demikian, pelet DNA ini tetap dapat digunakan  untuk  amplifikasi PCR karena  isolat  DNA  dengan  kualitas  yang  baik  tidak  menjadi syarat mutlak  dalam PCR .  Pada  15  siklus PCR tidak  ada  sampel  yang  terdeteksi hanya marka yang  terdeteksi,  hal  ini  dimungkinkan  15  siklus  juga  terlalu  singkat  sehingga  belum  bisa digunakan untuk sampel DNA yang diisolasi dengan pendinginan freezer -20 0 C.

## 4. Kesimpulan
1. DNA C.  tropicalis dapat  diisolasi  dengan  cara  pendinginan  berulang  di  dalam freezer pada  suhu -20 0 C  yang  tertinggi  pada  lama  pendinginan  35  menit  dengan  konsentrasi DNA 225 µg/mL.
2. Kondisi optimum amplifikasi DNA C. tropicalis menggunakan PCR dicapai pada 35 siklus PCR pada sampel A 35, B 35 dan C 35 dilihat pada pita DNA hasil elektroforesis yang tebal dan terang.

## Ucapan terima kasih
Penulis mengucapkan terima kasih kepada DIPA Unsri yang telah mendanai penelitian ini.

## Referensi
[1] Jawetz. (2008). Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : EGC.
[2] James, S.A and Stratford M. (2003). Spoilage yeast with emphasis on the genus. Woodhed publishing limited Cambridge. 171-191.
[3] Fujita,  S.I.,  Senda,  Y.,  Nakaguchi,  S.,    and  Hashimoto,  T.  (2011).  Multiplex  PCR  Using Internal Transcribed Spacer 1 and 2 Regions for Rapid Detection and Identi cation of Yeast Strains, Journal of Clinical Microbiology , 39, 10: 3617-3622.
[4] Ciardo,  G.,  Luttgen  G.  And  Siminiceanu  G.  (2001).  Strategy  for  symbolic  state  space generation. Construction and analysis  of  system. Italy  :  Springer verlag.
[5] Kurtzman, C. P. and Robnett, C. J. (1998). Identiﬁcation and phylogeny of ascomycetous yeasts  from  analysis  of  nuclear  large  subunit  (26S)  ribosomal  DNA  partial  sequences. Antonie van Leeuwenhoek, 73 : 331–371. Microbiol Biotechnol . 43 : 242.
[6] Retno A. (2008). Metode isolasi DNA. Jakarta : Universitas Indonesia.
[7] Samaranayake, L.P. (2006) Essential microbiology for dentistry. USA : Elsevier limited. [8] Hermansyah., Novia., Sugiyama, M. and Harashima S. (2015). Candida tropicalis isolated from Tuak, a North Sumatera Indonesian Traditional Beverage, for Bioethanol Production.
[9] Barnett,  J.A.,  Payne  R.W.,  and  Yarrow  D.  (2000). Yeast .  Characteristic  and identification. Cambridge University Press, 9 : 11-39.
[10] Rapley R. and Heptinstall J. (1998). UV spectrophotometric analysis of ribonucleic acids. Isolation and characterization protocols. Totowa : Humana Press Inc.
[11] Ratnayani, K., Yowani, S.C. and Syane, L. (2009). Amplifikasi framen 0,4 kb daerah D-Loop DNA  mitokondria  lima  individu  suku  Bali  tanpa  hubungan  kekerabatan  dengan  metode PCR. Jurnal Kimia, 3 : 14-20.
[12] Ethica, S.M., Nataningtyas, D.R., Lestari, P., Istini, Semiarti, E., Widada, J., and Raharjo, T.J. (2013).  Comparative  evaluation  of  conventional  versus  rapid  methods  for  amplifiable genomic DNA isolation of cultured Azospirillium sp. JG. 3. Indo. J. Chem, 13 : 248-253.