Perbandingan  efektifitas  pretreatment  ozonolisis  dan hydrothermal
pressure
dalam meningkatkan kandungan tanin dan kafein ekstrak kulit biji kakao (Theobroma cacao L.)
Ozonolysis and hydrothermal pressure pretreatments for increasing  tannin  and  caffeine  contents  of  cocoa  bean shell extract (Theobroma cacao L.)
Duhita Diantiparamudita Utama 1 , Mohammad Djali 2 , Yana Cahyana 2 , Melia Siti Ajijah 1
1 Fakultas Pertanian, Universitas Insan Cendekia Mandiri. Jl. Pasir Kaliki No 199 Bandung 40162, Indonesia
2 Fakultas  Teknologi  Industri  Pertanian,  Universitas  Padjadjaran.  Jl.  Raya  Bandung Sumedang KM 21, Jatinangor 45365, Indonesia
Korespondensi: duhitautama@gmail.com
Submit:
12 Januari 2024
Direvisi: 20 Februari 2024
Diterima: 22 Februari 2024
Abstract.  Cocoa  bean  shell,  often  considered  as  waste  in  chocolate  production processes, contain bioactive compounds such as tannins and caffeine. To facilitate the  extraction  of  these  bioactive  compounds,  delignification  pretreatment  methods such as ozonolysis and hydrothermal pressure are required. The aim of this research was to compare the effectiveness of ozonolysis and hydrothermal pressure methods in enhancing the yield of tannin and caffeine compounds in cocoa bean shell extracts. Ozonolysis  pretreatment  was  conducted  using  an  ozonizer  device,  while hydrothermal pressure pretreatment utilized an autoclave. Extraction was performed using  the  maceration  method.  Data  analysis  was  conducted  using  a  Randomized Block Design (RBD) tested with Analysis of Variance (ANOVA) followed by Duncan Multiple  Range  Test  (DMRT).  The  results  showed  that  both  ozonolysis  and hydrothermal  pressure  pretreatment  before  the  extraction  process  effectively increased  the  yield  of  bioactive  compounds  in  cocoa  bean  shell  extracts.  These pretreatment methods exhibited a positive influence on the yield of total tannins and antioxidant  activity,  while  no  significant  effect  was  observed  on  caffeine  content. Ozonolysis pretreatment yielded the highest increase in caffeine content by 49.79%, resulting  in  1.083  mg/g,  while  hydrothermal  pressure  pretreatment  yielded  the highest  increase  in  total  tannin  content  by  55.19%,  resulting  in  9.42  mg/g. Additionally, it was found that higher tannin concentrations correlated with higher antioxidant activity values.
Keywords: Caffein, cocoa bean shell, hydrothermal pressure, ozonolysis, tannin.
Abstrak .  Kulit  biji  kakao,  yang  sering  dianggap  sebagai  limbah  dalam  proses produksi  cokelat,  mengandung  senyawa-senyawa  bioaktif  seperti  tanin  dan  kafein. Guna  mempermudah  ekstraksi  senyawa-senyawa  bioaktif  tersebut,  diperlukan metode pretreatment delignifikasi  seperti  ozonolisis  dan hydrothermal  pressure . Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membandingkan efektivitas metode ozonolisis dan hydrothermal pressure dalam meningkatkan perolehan senyawa tanin dan kafein pada ekstrak kulit biji kakao. Pada metode pretreatment ozonolisis menggunakan alat ozonizer, sedangkan pada metode hydrothermal pressure menggunakan alat autoklaf Sementara ekstraksi yang dilakukan yaitu dengan metode maserasi. Metode analisis data  yang  digunakan  yaitu  Rancangan  Acak  Kelompok  (RAK)  yang  diuji  dengan Analisis Varian (ANOVA) serta dilanjutkan Duncan Multiple Range Test (DMRT).
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  perlakuan pretreatment ozonolisis  dan hydrothermal  pressure sebelum  proses  ekstraksi  terbukti  meningkatkan  perolehan senyawa bioaktif ekstrak kulit biji kakao. Metode pretreatment tersebut menunjukkan pengaruh  positif  terhadap  perolehan  senyawa  total  tanin  dan  aktivitas  antioksidan, sedangkan  pada  senyawa  kafein  tidak  menunjukkan  pengaruh  nyata.  Metode pretreatment ozonolisis  menunjukkan  hasil  terbaik  dalam  meningkatkan  perolehan kadar kafein sebesar 49,79% yaitu menjadi sebanyak 1,083 mg/g. sementara metode pretreatment hydrothermal pressure memberikan hasil terbaik dalam meningkatkan perolehan total tanin sebesar 55,19% yaitu menjadi sebanyak 9,42 mg/g. Selain itu diketahui  juga  bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  tanin,  semakin  tinggi  pula  nilai aktivitas antioksidan yang dihasilkan.
Kata-kata Kunci: Hydrothermal pressure , kafein, kulit biji kakao, ozonolisis, tanin.

## PENDAHULUAN
Kakao  ( Theobroma  cacao L.)  dikenal  sebagai  tanaman  penting  yang  menghasilkan  biji  kakao yang digunakan  dalam  berbagai  produk  seperti  cokelat, minuman,  dan makanan  ringan.  Peningkatan konsumsi kakao di Indonesia dalam bentuk cokelat instant dan cokelat bubuk tercatat fluktuatif selama periode  2010-2019,  dengana  angka  pertumbuhan  tahunan  rata-rata  sebesar  20,31%  dan  85,72% (Rohmah, 2022). Proses pengolahan biji kakao menghasilkan limbah berupa kulit biji kakao, yang jika tidak dikelola dengan baik dapat menyebabkan dampak lingkungan dan ekonomi yang signifikan. Kulit biji kakao adalah produk sampingan utama dari industri cokelat, dipisahkan dari kotiledon selama proses pra-panggangan  atau  setelah  proses  panggang  (Rosyidi et  al. ,  2019).  Menurut  Kim et  al. (2004), persentase  kulit  biji  kakao  terhadap  total  berat  biji  kakao  kering  mencapai  10-12%,  sehingga peningkatan produksi kakao berpotensi mengakibatkan peningkatan limbah kulit biji kakao. Sementara itu, kulit biji kakao memiliki potensi sebagai sumber senyawa bioaktif, termasuk tanin dan kafein, yang memiliki manfaat kesehatan yang dapat dieksploitasi. Komposisi kimia kulit biji kakao setelah proses panggang ( roasting ) dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Kandungan senyawa kimia pada kulit biji kakao setelah proses pemanggangan ( roasting ) Parameter Jumlah Energi (kcal/100 g) 122.00 Air (%) 3,60-13,13 Abu (g/100 g) 5,96-11,42 Protein (g/100 g) 10,30-27,40 Lemak (g/100 g) 1,50-8,49 Karbohidrat (g/100 g) 7,85-70,25 Serat pangan (g/100 g) 39,25-66,33 Polifenol - Total fenol (mg GAE/g) 3,12-94,95 - Total flavonoid (mg CEQ/g) 1,65-40,72 - Total tannin (mg CEQ/g) 1,70-25,30 Metilxantin - Kafein (g/100 g) 0,04-0,42 - Teobromin (g/100 g) 0,39-1,83
Sumber: Rojo-Poveda et al . (2020)
Senyawa kimia kulit biji kakao tidak jauh berbeda dengan senyawa kimia kulit buah kakao dan senyawa  kimia  biji  kakao  (Yumas,  2017).  Rojo-Poveda et  al .  (2020)  menyebutkan  bahwa  kulit  biji kakao memiliki kandungan total fenolik sebesar 1,65-40,72 mg CEQ/g. Tingginya kandungan senyawa fenolik pada kulit biji kakao diduga akibat terjadinya difusi senyawa fenolik dari keping biji ke kulit biji selama proses fermentasi (Albertini et al ., 2015). Dinding sel dan membran utuh pada bahan tanaman merupakan  hambatan  utama  difusi molekul,  sehingga  meningkatkan  permeabilitasnya menjadi  kunci untuk  meningkatkan  hasil  dan  laju  ekstraksi  senyawa  yang  diinginkan.  Meningkatkan  permeabilitas
dinding  sel  dan  membran  melalui  berbagai  metode  pra-perlakuan  ( pretreatment )  menjadi  strategi penting untuk memaksimalkan ekstraksi senyawa bermanfaat dari bahan tanaman (Zhao et al ., 2014).
Metode pretreatment meliputi perlakuan fisik, biologi, dan kimia. Berbagai metode pretreatment memiliki  kelebihan  dan  kekurangannya  masing-masing.  Dalam  metode  fisik  (tekanan  tinggi,  medan listrik  berdenyut,  ultrasonikasi)  memiliki  keunggulan  hemat  energi,  ramah  lingkungan,  cepat,  dan sebagian besar senyawa bioaktif tetap utuh. Meski begitu, pretreatment fisik memiliki kelemahan seperti biaya  tinggi,  pilihan  pelarut  terbatas,  dan  distribusi  energi  tidak  seragam.  Dalam  metode  biologis, diterapkan  berbagai  enzim  pengurai  dinding  sel  untuk  memecah  dinding  sel  atau  membran  dan mengurangi resistensi internal secara keseluruhan untuk memindahkan senyawa bioaktif dari matriks internal  ke  larutan  eksternal.  Namun,  metode  biologi  memiliki  kelemahan  sifat  enzim  yang  sensitif dipengaruhi oleh pH dan suhu, karakteristik bahan baku, pelarut, dan lingkungan, serta beberapa enzim mahal atau tidak stabil terhadap lingkungan. Dalam metode kimia, diperkenalkan berbagai bahan kimia untuk  meningkatkan  permeabilitas  membran  dalam  atau luar. Pretreatment kimia  lebih  efektif untuk jaringan  yang  sangat  terlignifikasi.  Meskipun  metode  kimia  berdampak  pada  masalah  lingkungan, keefektifannya  yang  tinggi  dalam  mendegradasi  dinding  sel  pada  serat  tanaman  membuat  sebagai pretreatment yang  perlu  dipertimbangkan.  Untuk  jaringan  yang  sangat  terlignifikasi  tersebut, pretreatment kimia merupakan metode yang lebih tepat untuk diterapkan (Zhao et al ., 2014).
Pretreatment delignifikasi,  seperti pretreatment ozonolisis  (kimia)  dan pretreatment hydrothermal pressure (fisik), dianggap sebagai metode yang efektif untuk mengurai lignin dalam bahan lignoselulosa, sehingga memfasilitasi pelepasan senyawa bioaktif. Delignifikasi sendiri bertujuan untuk mendegradasi  lignin  secara  selektif  sehingga  dapat  mengurai  ikatan  kimia  (ikatan  hydrogen,  ikatan kovalen  atau  ikatan van  der  waals )  dengan  komponen  kimia  lain  pada  bahan  berlignoselulosa  tanpa merusak  komponen  lainnya  (Agustini  &  Efiyanti,  2015).  Beberapa  penelitian  sebelumnya  telah mengungkapkan  bahwa  ekstraksi  senyawa  bioaktif  dari  kulit  biji  kakao  dapat  menjadi  lebih  efisien dengan penerapan metode pretreatment delignifikasi. Misalnya, penelitian oleh  Travani et al . (2013) menyoroti  efektivitas pretreatment ozonolisis  dalam  memecah  lignin  pada  berbagai  bahan berlignoselulosa.  Selain  itu  Schultz-Jensen et  al .  (2011)  menyatakan  bahwa pretreatment ozonolisis menghasilkan perolehan produk degradasi dari lignin (sumber unik senyawa aromatik terbarukan) dan hemiselulosa. Pola pelepasan berurutan dari berbagai produk degradasi (misalnya fenol, benzena, asam lemak)  selama pretreatment menunjukkan  bahwa  ozonolisis  akan  menjadi pretreatment yang  tepat untuk mendapatkan produk turunan lignin.
Sementara  itu,  penelitian  Hidayat  (2013)  membahas  penerapan pretreatment  hydrothermal pressure yaitu kemampuan tenaga uap dalam mengurai struktur kompleks lignoselulosa. Menurut Ruiz et al . (2020) hydrothermal pressure adalah salah satu metode pretreatment yang paling matang secara teknologi  untuk  bahan  baku  lignoselulosa.  Degradasi  komponen  lignin,  hemiselulosa,  dan  selulosa sebagai  pengikat  metabolit  sekunder  pada  kulit  kopi  mempengaruhi  hasil  ekstraksi  senyawa  bioaktif (Kurniawati, 2015).
Namun,  hingga  saat  ini,  perbandingan  langsung  antara  metode pretreatment ozonolisis  dan pretreatment hydrothermal pressure dalam konteks ekstraksi tanin dan kafein dari kulit biji kakao masih merupakan aspek yang perlu diteliti lebih lanjut. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengisi kesenjangan  pengetahuan  ini  dan  bertujuan  untuk  mengevaluasi  metode pretreatment yang  paling efektif dalam meningkatkan perolehan senyawa tanin dan kafein dari ekstrak kulit biji kakao.
Berdasarkan  penelitian  tersebut,  diharapkan  dapat  memberikan  kontribusi  signifikan  dalam pemahaman tentang potensi limbah kulit biji kakao sebagai sumber senyawa bioaktif, serta memberikan pandangan yang lebih jelas terkait penerapan metode pretreatment delignifikasi dalam konteks ekstraksi tanin  dan  kafein.  Penelitian  ini  diharapkan  dapat  memberikan  dasar  ilmiah  yang  kuat  untuk pengembangan metode ekstraksi yang efisien dan berkelanjutan dari limbah kulit biji kakao.

## BAHAN DAN METODE

## Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan  Juli-September  2019  di  Laboratorium  Terpadu  Politeknik Kesehatan,  Kementerian  Kesehatan  Bandung  dan  Laboratorium  Kimia  Fakultas  Teknologi  Industri Pertanian Universitas Padjadjaran.

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah ozonizer set, tabung stainless steel , autoklaf, botol schott,  neraca,  toples  kaca  tertutup,  pompa  vakum, rotary  evaporator ,  labu  ukur,  HPLC (High Performance  Liquid  Chromatography), spektrofotometer  UV-Vis,  dan  pipet  ukur.  Bahan  yang digunakan  yaitu  serbuk  kulit  biji  kakao  berukuran  100  mesh  dengan  varietas  criolo  dari  Dusun Gambiran,  Kabupaten  Gunung  Kidul,  Yogyakarta,  akuades  (Brataco,  Indonesia),  kertas  saring (Whatman, China ),  methanol  (Brataco,  Indonesia),  etanol  70%  (Brataco,  Indonesia),  larutan  standar kafein  (Sigma-Aldrich, Germany ),  larutan  Folin-Ciocalteu  (Sigma-Aldrich, Germany ),  Na 2 CO 3 (Brataco, Indonesia), dan asam tanat (Sigma-Aldrich, Germany ).

## Pretreatment Ozonolisis
Dalam  prosedur pretreatment ozonolisis,  perangkat  yang  digunakan  adalah  ozonizer  set (generator ozon, tabung oksigen, dan laptop). Sebanyak 100 gram serbuk kulit biji kakao dimasukkan ke dalam tabung stainless steel tertutup berukuran 1 liter, dengan celah lubang untuk selang gas ozon pada bagian penutupnya. Gas ozon dialirkan ke dalam wadah dengan laju oksigen sebesar 2 L/menit selama 1 menit dengan konsentrasi 18 ppm. Setelah proses pengozonan selesai, sampel dibiarkan selama 10 menit, dan dilakukan homogenisasi dengan memutar wadah sampel setiap 2 menit, secara horizontal atau vertikal (Utama et al ., 2021).

## Pretreatment Hydrothermal Pressure
Dalam prosedur pretreatment hydrothermal pressure , perangkat yang digunakan adalah autoklaf. Sebanyak 100 gram serbuk kulit biji kakao dimasukkan ke dalam botol schott berukuran 1 liter. Botol schott yang berisi sampel kemudian ditutup rapat dan ditempatkan dalam autoklaf  bertekanan 2 atm, dengan suhu 129 o C selama 5 menit (Utama dkk., 2021).

## Ekstraksi
Dalam prosedur ekstraksi, metode yang digunakan adalah maserasi dengan menggunakan pelarut etanol  70%.  Serbuk  kulit  biji  kakao  yang  telah  dilakukan  berbagai  perlakuan pretreatment (tanpa pretreatment , pretreatment ozonolisis, dan pretreatment hydrothermal pressure ) dimasukkan ke dalam toples kaca yang tertutup rapat. Selanjutnya, 500 mL etanol 70% ditambahkan ke dalam toples berisi sampel,  dan  campuran  diaduk  hingga  homogen.  Untuk  melindungi  dari  paparan  cahaya  langsung, seluruh  permukaan  toples  ditutup  dengan aluminium  foil ,  lalu  disimpan  pada  suhu  ruang  (25-27 o C) selama 24 jam. Hasil maserasi dilakukan penyaringan dengan menggunakan alat pompa vakum yang sudah  dilapisi  dengan  kertas  saring  whatman.  Filtrat  hasil  penyaringan  dilakukan  proses  selanjutnya yaitu  pengkonsentrasian  menggunakan rotary  evaporator selama  1  jam  dengan  suhu  40  °C  hingga pelarut menguap sepenuhnya (Utama dkk., 2021).

## Analisis Total Tanin
Ekstrak  cair  kulit  biji  kakao,  sebanyak  500  mg  dilarutkan  dalam  metanol  dalam  labu  ukur berukuran 10 mL untuk membentuk larutan stock sampel. Larutan stock sampel kemudian diencerkan 4 kali dalam labu ukur berukuran 5 mL, ditanda batas dengan menggunakan metanol, dan homogenisasi dilakukan.  Sebanyak  0,5  mL  dari  larutan  sampel  hasil  pengenceran  dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur berukuran  25  mL,  diikuti  dengan  penambahan  7  mL  akuades  dan  1,25  mL  pereaksi  Folin-Ciocalteu 50%. Campuran ini dicampur dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Setelah periode inkubasi, 2,5 mL Na 2 CO 3 jenuh ditambahkan ke dalam larutan, dicampur, dan diinkubasi selama 5 menit lagi pada
suhu ruang. Setelah itu, larutan diencerkan dengan penambahan akuades hingga mencapai tanda batas, homogenisasi,  dan  inkubasi  60  menit  di  suhu  27-30 o C.  Kemudian,  larutan  uji  dimasukkan  kedalam spektrofotometer UV-Vis untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 760 nm, menggunakan asam  tanat  sebagai  standar  dengan  konsentrasi  bervariasi  (50;  100;  150;  200;  250;  300;  350  ppm) (AOAC, 2005).

## Analisis Kafein
Ekstrak  cair  kulit  biji  kakao,  sebanyak  500  mg  dilarutkan  dalam  metanol  ke  dalam  labu  ukur berukuran  10  mL  untuk  membuat  larutan  stok  sampel.  Konsentrasi  kafein  ditentukan  menggunakan HPLC dengan kolom Supelcosil LC-18 (250 x 4,6 mm, 5 μm) dan deteksi pada panjang gelombang 267 nm. Larutan standar kafein dibuat dengan beberapa konsentrasi yaitu 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Fase gerak terdiri atas air (eluen A), metanol (eluen B), dan larutan asam ortofosfat 0,1% (eluen C) dengan perbandingan (A:B:C, 80:19,9:0,1, v/v) dan kecepatan alir 1,0 mL/menit. Perhitungan dilakukan dengan menggunakan kalibrasi eksternal dan larutan standar kafein 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Hasil analisis kafein diukur dalam satuan mg/g (Coco et al ., 2007).

## Analisis Data
Metode  analisis  data  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu  Rancangan  Acak  Kelompok (RAK)  yang  diuji  dengan  Analisis  Varian  (ANOVA)  serta  dilanjutkan Duncan  Multiple  Range  Test (DMRT).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kandungan Tanin
Jumlah  total  tanin  dalam  setiap  ekstrak  diukur  dengan  menggunakan  TAE  ( Tannic  Acid Equivalent ).  Asam  tanat  digunakan  untuk  membuat  kurva  standar  dan  hasil  akhir  dinyatakan  dalam miligram ekivalen asam tanat (TAE) per 1 gram sampel (Diniyah et al ., 2020). Hasil analisis rata-rata nilai total tanin dari ekstrak kulit biji kakao dapat ditemukan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Kandungan total tanin hasil perlakuan berbagai pretreatment terhadap ekstrak kulit biji kakao
Faktor perlakuan TAE (mg/g) Tanpa Pretreatment 6,07 ± 0,24 a Pretreatment Ozonolisis 9,37 ± 0,22 b Pretreatment Hydrothermal Pressure 9,42 ± 0,16 b
Keterangan:  Rata-rata  perlakuan  yang  ditandai  dengan  huruf  yang  berbeda  menyatakan  berbeda  nyata  pada  taraf  uji  5% berdasarkan uji lanjut Duncan.
Berdasarkan  Tabel  2,  dari  hasil  rata-rata  perlakuan  pada  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa sampel  kulit  biji  kakao  tanpa  perlakuan pretreatment berbeda  nyata  dengan  perlakuan pretreatment ozonolisis dan hydrothermal pressure . Sementara perlakuan pretreatment ozonolisis tidak berbeda nyata dengan perlakuan pretreatment hydrothermal pressure . Selain itu, jika dibandingkan nilai rata-rata yang diperoleh didapat bahwa seluruh perlakuan pretreatment baik ozonolisis maupun hydrothermal pressure menunjukkan  nilai  rata-rata  total  tanin  yang  lebih  tinggi  dibandingkan  tanpa pretreatment .  Hal  ini menunjukkan bahwa pretreatment delignifikasi terbukti mampu meningkatkan perolehan senyawa total tanin pada ekstrak kulit biji kakao.
Hasil analisis kadar total tanin ekstrak kulit biji kakao tanpa perlakuan (Tabel 2) menunjukkan nilai TAE 6,07 mg/g. Kandungan total tanin kulit biji kakao ini sesuai dengan penelitian sebelumnya oleh Rojo-Poveda et al . (2020) yaitu berada dalam rentang 1,70-25,30 mg/g. Perbedaan nilai TAE dapat disebabkan  oleh  beberapa  faktor  yang  mempengaruhi  kandungan  total  tanin  pada  bahan,  antara  lain adalah perbedaan varietas, asal didapatkannya, cara ekstraksi dan jenis pelarut yang digunakan.
Pada  Tabel  2  dapat  dilihat  bahwa  pada  ekstrak  kulit  biji  kakao  setelah  dilakukan  perlakuan pretreatment ozonolisis menghasilkan  kadar total  tanin  sebanyak  9,37 mg/g  atau  terjadi  peningkatan sebesar  54,61%  dibandingkan  dengan  tanpa  perlakuan pretreatment (6,07  mg/g).  Hal  tersebut menunjukkan bahwa pretreatment ozonolisis terbukti dapat meningkatkan perolehan total tanin pada ekstak  kulit  biji  kakao.  Berbeda  dengan  penelitian  Yan et  al .  (2012)  menyatakan  bahwa  terjadi penurunan kadar tannin pada tepung sorgum seiring dengan meningkatnya kadar ozon akibat pemberian ozon secara berulang. Hal ini terjadi karena ozon dapat menurunkan makromolekul seperti lignin, dan pati, namun degradasi yang serupa dapat terjadi pada tanin dalam kulit biji kakao yang diberi perlakuan ozon karena perlakuan ozon dapat mengubah struktur beberapa kelompok fungsional dalam molekul tanin.  Jika  dibandingkan  dengan  penelitian  Yan  et  al.  (2012),  peningkatan  kadat  total  tanin  pada penelitian ini disebabkan karena jumlah paparan ozon yang tidak berulang disertai dengan konsentrasi ozon yang optimal sehingga cukup untuk mendegradasi lignin saja.
Selain itu hasil penelitian tersebut juga menunjukkan bahwa pretreatment hydrothermal pressure menunjukkan  kadar  total  tanin  tertinggi  yaitu  9,42  mg/g  atau  terjadi  peningkatan  sebesar  55,19% dibandingkan dengan tanpa perlakuan pretreatment (6,07 mg/g). Hal ini didukung oleh Shonisani (2010) yang  menyatakan  bahwa  jumlah  tanin  meningkat  seiring  dengan  peningkatan  temperatur  dan  waktu pemanasan. Selain itu menurut Kusumaningsih dkk . (2015) efek pemanasan berpengaruh terhadap kadar tanin, semakin tinggi suhu ekstraksi, kadar tanin juga semakin meningkat.
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  dilakukan,  perlakuan pretreatment baik  ozonolysis  maupun hydrothermal  pressure menghasilkan  perolehan  total  tanin  yang  lebih  tinggi  dibandingkan  tanpa pretreatment .  Hal  ini  menunjukkan  bahwa pretreatment delignifikasi  baik  menggunakan  metode pretreatment ozonolisis  maupun hydrothermal  pressure terbukti  berpengaruh  nyata  dalam meningkatkan  perolehan  senyawa  total  tanin  pada  ekstrak  kulit  biji  kakao.  Meningkatnya  perolehan senyawa total tanin pada ekstrak kulit biji kakao disebabkan karena degradasi lignin dan hemiselulosa sehingga mengakibatkan pelepasan senyawa polifenol. Menurut Deaville et al. (2010) tanin merupakan senyawa  kimia  yang  tergolong  dalam  senyawa  polifenol,  sehingga  dengan  terbebasnya  senyawa polifenol, maka senyawa tanin pun ikut terlepas sehingga nilai rata-rata perolehan senyawa total tanin pada ekstrak kulit biji kakao menjadi meningkat.
Kandungan tanin pada suatu bahan pangan dapat mempengaruhi aktivitas antioksidan dari bahan pangan tersebut. Dewi dkk. (2021) menyatakan bahwa kulit biji kakao mengandung senyawa polifenol dengan total fenolik mencapai 1,65-40,72 mg CEQ/g dimana senyawa polifenol merupakan senyawa yang  berperan  sebagai  sumber  antioksidan.  Temuan  ini  didukung  oleh  penelitian  dari Utama dkk. (2021) yang menyatakan bahwa kulit biji kakao setelah menjalani pretreatment ozonolisis dan pretreatment  hydrothermal  pressure menunjukkan  adanya  aktivitas  antioksidan.  Informasi  lebih lanjut mengenai nilai aktivitas antioksidan pada kulit biji kakao dapat ditemukan dalam Tabel 3.
Tabel 3. Aktivitas antioksidan dengan berbagai pretreatment pada ekstrak kulit biji kakao
Faktor perlakuan IC 50 (ppm) Tanpa Pretreatment 1361,18 Pretreatment Ozonolisis 559,24 Pretreatment Hydrothermal pressure 277,14 Sumber: Utama dkk . , (2021)
Menurut  Utama  dkk.,  (2021)  terdapat  peningkatan  aktivitas  antioksidan  pada  kulit  biji  kakao setelah diberikan perlakuan pretreatment baik ozonolisis maupun hydrothermal pressure . Semakin kecil nilai  IC 50 ,  mengindikasikan  tingkat  aktivitas  antioksidan  yang  lebih  tinggi.  Guna  mengevaluasi hubungan  antara  jumlah  tanin  keseluruhan  dan  aktivitas  antioksidan  pada  kulit  biji  kakao,  dapat diperlihatkan melalui grafik korelasi. Gambaran tentang korelasi antara jumlah tanin keseluruhan dan aktivitas antioksidan pada kulit biji kakao dapat disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. Korelasi total tanin dengan aktivitas antioksidan kulit biji kakao
Gambar  1  memperlihatkan  adanya  korelasi  erat  antara  jumlah  tanin  keseluruhan  dan  aktivitas antioksidan yang dihasilkan, yang dijelaskan melalui persamaan garis linier. Model regresi ini memiliki koefisien  determinasi  (R 2 )  sebesar  0,9435,  yang  menunjukkan  bahwa  94,35%  dari  variasi  aktivitas antioksidan dapat dijelaskan oleh jumlah tanin keseluruhan, sementara 5,65% sisanya dipengaruhi oleh faktor-faktor  lain.  Koefisien  korelasi  (r)  sebesar  0,971,  menandakan  bahwa  terdapat  hubungan  yang sangat erat antara jumlah tanin keseluruhan dan aktivitas antioksidan. Koefisien korelasi (r) yang positif menyiratkan  bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  tanin  keseluruhan,  semakin  tinggi  nilai  aktivitas antioksidan yang dihasilkan dari ekstrak kulit biji kakao.
Banyaknya  senyawa  total  tanin  menunjukkan  hubungan  positif  dengan  besarnya  aktivitas antioksidan pada ekstrak kulit biji kakao. Menurut Momuat et al . (2019) dalam penelitiannya, terdapat hubungan  yang  kuat  antara  kandungan  komponen  fenolik  (senyawa  fenolik,  flavonoid  dan  tanin terkondenasi)  dengan  aktivitas  antioksidan  dari  empelur  segar  dan  kering.  Hal  ini  dikarenakan  tanin memiliki fungsi sebagai antioksidan sekunder, karena tanin memiliki kemampuan mengkelat ion besi dan memperlambat oksidasi (Amarowicz, 2007).

## Kandungan Kafein
Penentuan kafein ekstrak kulit biji kakao dilakukan menggunakan HPLC. Adapun hasil analisis nilai rata-rata kafein ekstrak kulit biji kakao disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4. Kandungan kafein hasil perlakuan berbagai pretreatment terhadap ekstrak kulit biji kakao
Faktor perlakuan Kafein (mg/g) Tanpa Pretreatment 0,723 ± 0,244 a Pretreatment Ozonolisis 1,083 ± 0,338 a Pretreatment Hydrothermal pressure 0,996 ± 0,111 a
Keterangan:  Rata-rata  perlakuan  yang  ditandai  dengan  huruf  yang  berbeda  menyatakan  berbeda  nyata  pada  taraf  uji  5% berdasarkan uji lanjut Duncan.
Berdasarkan  Tabel  4  rata-rata  perlakuan  pada  penelitian  ini  yaitu  antara  perlakuan  tanpa pretreatment , pretreatment ozonolisis,  dan pretreatment  hydrothermal  pressure seluruhnya menunjukkan hasil tidak berbeda nyata satu sama lain. Hal ini menunjukkan bahwa hasil analisis kadar kafein  dari  setiap  perlakuan  tidak  menunjukkan  perubahan  yang  signifikan,  atau  dapat  dikatakan perlakuan pretreatment delignifikasi  tidak  mempengaruhi  jumlah  perolehan  senyawa  kafein  pada ekstrak kulit biji kakao. Namun, jika dibandingkan nilai rata-rata yang diperoleh, didapat bahwa seluruh
y = -285,12x + 3095 R² = 0,9435 0,000 200,000 400,000 600,000 800,000 1000,000 1200,000 1400,000 1600,000 0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000 9,000 10,000 Ak tiv ita s An tio k sid a n (p p m ) Total Tanin (mg/g)

## Korelasi Total Tanin-Aktivitas Antioksidan
perlakuan pretreatment baik  ozonolisis  maupun hydrothermal  pressure menunjukkan  nilai  rata-rata kafein yang lebih tinggi dibandingkan tanpa pretreatment . Hal ini menunjukkan bahwa pretreatment delignifikasi mampu meningkatkan perolehan senyawa kafein pada ekstrak kulit biji kakao walaupun sangat kecil.
Pada  perlakuan pretreatment ozonolisis  menunjukkan  nilai  kafein  tertinggi  yaitu  1,083  mg/g dibandingkan dengan pretreatment hydrothermal pressure (0,996 mg/g) dan tanpa pretreatment (0,723 mg/g). Sebagaimana yang dapat dilihat bahwa hasil analisis dari kadar kafein ekstrak kulit biji kakao tanpa pretreatment adalah sebesar 0,723 mg/g atau 0,723%. Kandungan kafein kulit biji kakao ini lebih rendah  dibandingkan  penelitian  sebelumnya  oleh  Botella-Martínez et  al .  (2021)  yang  menemukan bahwa kandungan kafein pada kulit biji kakao berkisar antara 4,02 hingga 6,13 mg/g. Perbedaan nilai kafein ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor yang mempengaruhi tergantung pada varietas kakao, kondisi tanah, dan metode pengolahan.
Pada  Tabel  4 dapat  dilihat  bahwa pretreatment ozonolisis menunjukkan  kadar kafein  tertinggi yaitu  1,083  mg/g  atau  terjadi  peningkatan  sebesar  49,79%  dibandingkan  dengan  tanpa pretreatment (0,723  mg/g).  Dengan  meningkatnya  rata-rata  perolehan  senyawa  kafein  maka  didapat  bahwa pretreatment ozonolisis  terbukti  dapat  mendegradasi  dinding  sel  pada  kulit  biji  kakao.  Menurut Takashina et al . (2017) pada penelitiannya dalam mendegradasi kafein pada limbah pengolahan kopi dengan menggunakan konsentrasi ozon 5-15 ppm dan waktu reaksi 15-45 menit menunjukkan bahwa semakin  tinggi  konsentrasi  ozon  maka  semakin  tinggi  tingkat  degradasi  kafein,  serta  semakin  lama waktu pengozonan maka semakin tinggi pula tingkat degradasi kafein pada periode waktu 15-30 menit, setelah 30 menit terjadi penurunan tingkat degradasi. Pada penelitian ini digunakan waktu yang sangat singkat  yaitu  1  menit  dengan  laju  alir  oksigen  2L/menit  dan  konsentrasi  18  ppm,  sehingga  tidak menunjukkan  perubahan kadar kafein yang signifikan.  Perubahan  kadar  kafein yang  tidak  signifikan menunjukkan bahwa senyawa kafein tidak mudah teroksidasi akibat perlakuan pretreatment ozonolisis. Metode  ozonolisis  ini  memiliki  keunggulan,  diantaranya  pengoperasian  dalam  keadaan  suhu  dan tekanan  rendah,  selektivitas  tinggi  terhadap  lignin,  dan  tidak  menghasilkan  residu  beracun.  Metode pretreatment ozonasi  memiliki  keunggulan  dalam  hal  mendegradasi  lignin  pada  suhu  dan  tekanan lingkungan  tanpa  meninggalkan  sisa  cemaran  bagi  lingkungan  sehingga  dapat  menjadi  pilihan  bagi produk yang membutuhkan kondisi tersebut.
Selain  itu  hasil  penelitian  tersebut  juga  menunjukkan  bahwa  perlakuan pretreatment hydrothermal  pressure menghasilkan  kadar  kafein  sebanyak  0,996  mg/g  atau  terjadi  peningkatan sebesar  37,74%  dibandingkan  dengan  tanpa pretreatment (0,723  mg/g).  Kenaikan  kandungan  kafein dapat  disebabkan  karena  terjadinya  degradasi  dinding  sel  akibat  pemanasan  menggunakan  autoklaf, sehingga senyawa kafein yang terikat di dalamnya dapat teridentifikasi. Menurut Hidayat (2013), tenaga uap memiliki kemampuan untuk mendegradasi struktur kompleks lignoselulosa. Pada penelitian Wu et. al .  (2011),  menyatakan  bahwa  suhu pretreatment yang  lebih  tinggi  (50 o C)  memudahkan  proses pelepasan  hemiselulosa  dan  lignin  serta  laju  delignifikasi  bisa  mencapai  90%.  Sementara  senyawa kafein  tidak  menunjukkan  terjadinya  degradasi  akibat pretreatment hydrothermal  pressure yang disebabkan karena waktu yang digunakan singkat yaitu 5 menit. Hal ini didukung oleh Kuncoro dkk. (2018) yang telah melakukan penelitian pengukusan biji kopi menggunakan autoklaf dengan suhu (110- 120 o C)  selama  7  jam,  menyatakan  bahwa  semakin  tinggi  suhu  dan  semakin  lama  pengukusan menggunakan autoklaf menunjukkan adanya kecenderungan penurunan kafein pada biji kopi walaupun nilainya kecil.

## SIMPULAN
Berdasarkan hasil yang didapat pada penelitian ini, dapat diambil kesimpulan bahwa perlakuan pretreatment ozonolisis  dan hydrothermal  pressure sebelum  proses  ekstraksi  terbukti  meningkatkan perolehan  senyawa  bioaktif  ekstrak  kulit  biji  kakao.  Metode pretreatment tersebut  menunjukkan pengaruh  positif  terhadap  perolehan  senyawa  total  tanin  dan  aktivitas  antioksidan  sedangkan  pada senyawa kafein tidak menunjukkan pengaruh nyata. Metode pretreatment ozonolisis menunjukkan hasil terbaik  dalam  meningkatkan  perolehan  kadar  kafein  sebesar  49,79%  yaitu  menjadi  sebanyak  1,083 mg/g.  Sementara  metode pretreatment hydrothermal  pressure memberikan  hasil  terbaik  dalam
meningkatkan  perolehan  total  tanin  sebesar  55,19%  yaitu  menjadi  sebanyak  9,42  mg/g.  Selain  itu diketahui juga bahwa semakin tinggi konsentrasi tanin, semakin tinggi pula nilai aktivitas antioksidan yang dihasilkan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini menggunakan fasilitas laboratorium yang dimiliki oleh Fakultas Teknologi Industri Pertanian  Universitas  Padjadjaran  dan  Politeknik  Kesehatan  Kemenkes  Bandung.  Untuk  itu,  peneliti mengucapkan  banyak  terimakasih  atas  dukungan  fasilitas  dan  bimbingan  teknis  selama  pelaksanaan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Agustini,  L.,  &  Efiyanti,  L.  (2015).  Pengaruh  perlakuan delignifikasi  terhadap  hidrolisis  selulosa  dan  produksi etanol dari limbah berlignoselulosa. Jurnal Penelitian Hasil Hutan. 33(1), 69-80.
Albertini, B., Schoubben, A., Guarnaccia, D., Pinelli, F., Vecchia, M.D., Ricci, M., Renzo, G.C.D., & Blasi, P.
(2015).  Effect  of  fermentation  and  drying  on  cocoa  polyphenols .  Journal  of  agricultural  and  food chemistry . 63(45), 9948-9953. Amarowicz,  R.  (2007).  Tannins:  the  new  natural  antioxidants?. European  Journal  of  Lipid  Science  and Technology. 109, 549–551. AOAC.  (2005). Official  Methods  of  Analysis  of  AOAC  International (18th  ed.).  Arlington:  Assoc.  Off.  Anal. Chem.
Botella-Martínez, C., Lucas-Gonzalez, R., Ballester-Costa, C., Pérez-Álvarez, J.Á., Fernández-López, J., Delgado- Ospina, J., Chaves-López, C.,  & Viuda-Martos, M.  (2021). Ghanaian  cocoa (Theobroma cacao L.) bean shells  coproducts:  Effect  of  particle  size  on  chemical  composition,  bioactive  compound  content  and antioxidant activity. Agronomy . 11(2), 401. Coco, F.L., Lanuzza, F., Micali, G., & Cappellano, G. (2007). Determination of theobromine, theophylline, and caffeine in by-products of cupuacu and cacao seeds by high-performance liquid chromatography . Journal of Chromatographic Science . 45(5), 273–275.
Deaville,  E.R.,  Givens,  D.I.,  Mueller-Harvey,  I.  (2010).  Chestnut  and  mimosa  tannin  silages:  Effects  in  sheep differ  for  apparent  digestibility,  nitrogen  utilisation  and  losses .  Animal  Feed  Science  and  Technology . 157(3-4), 129-138.
Dewi, I.G.A.M., Putra, G.P.G., & Wrasiati, L.P. (2021). Karakteristik ekstrak kulit biji kakao ( Theobroma cacao L.) sebagai sumber antioksidan pada perlakuan suhu dan waktu maserasi. Jurnal Rekayasa dan Manajemen Agroindustri . 9(1), 1-12. Diniyah, N., Bulgis, U.M., & Marchianti, A.C.N. (2020). Antioxidant activity and phytochemical compositions of Mucuna  pruriens  L.  in  different  conditions  of  time  and  temperature  extraction. IOP  Conf.  Ser.:  Earth Environ. Sci. 1177 012042.
Hidayat, M.R. (2013).  Teknologi pretreatment bahan lignoselulosa dalam proses produksi bioetanol.  Biopropal Industri, 4(1), 33-48.
Kim, K.H., Lee, K.W., Kim, D.Y., Park, H.H., Kwon, I.B.,  & Lee, H.J. (2004).  Extraction and fractionation of glucosyltransferase inhibitors from cacao bean husk. Process Biochemistry . 39(12), 2043–2046. Kuncoro, S., Sutiarso, L., Karyadi, J.N.W., & Masithoh, R.E. (2018). Kinetika reaksi penurunan kafein dan asam klorogenat biji kopi robusta melalui pengukusan sistem tertutup. Agritech, 38(1), 105-111.
Kurniawati,  N.  (2015).  Ekstraksi  senyawa  polifenol  melalui  degradasi  biomassa  lignoselulosa  kulit  kopi menggunakan konsorsium aktinomiset. Tesis. Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor: Tidak diterbitkan.
Kusumaningsih, T., Asrilya, N.J., Wulandari, S., Wardani, D.R.T., & Fatikhin, K. (2015). Pengurangan kadar tanin pada ekstrak stevia rebaudiana dengan menggunakan karbon aktif. Alchemy , 11(1), 81-89.
Momuat,  L.I.,  Suryanto,  E.,  Rantung,  O.,  Korua,  A.,  &  Datu,  H.  (2019).  Perbandingan  senyawa  fenolik  dan aktivitas antioksidan antara sagu baruk segar dan kering. Chemistry Progress. 8(1), 17-24.
Rohmah,  Y. (2022). Outlook Komoditas  Perkebunan  Kakao  (Susanti,  A.A.  &  Widiyanto,  R.K.P.  (eds.)).  Pusat Data dan Sistem Informasi Pertanian Sekretariat Jenderal - Kementerian Pertanian.
Rojo-Poveda, O., Barbosa-Pereira, L., Zeppa, G., & Stévigny, C. (2020). Cocoa bean shell—A by-product with nutritional properties and biofunctional potential. Nutrients . 12(4), 1123.
Rosyidi,  D.,  Purwadi,  &  Thohari,  I.  (2019).  Characteristics  of  catechin  extracted  from  cocoa  husks  using microwave assisted extraction (MAE). Biodiversitas , 20(12), 3626–3631.
Ruiz, H.A., Conrad, M., Sun, S.N., Sanchez, A., Rocha, G.J.M., Romaní, A., Castro, E., Torres, A., Rodríguez- Jasso,  R.M.,  Andrade,  L.P.,  Smirnova,  I.,  Sun,  R.C.,  &  Meyer,  A.S.  (2020).  Engineering  aspects  of
hydrothermal  pretreatment:  From  batch  to  continuous  operation,  scale-up  and  pilot  reactor  under biorefinery concept . Bioresource technology . 299 , p.122685.
Schultz-Jensen, N., Kádár, Z., Thomsen, A.B, Bindslev, H., & Leipold, F. (2011). Plasma-assisted pretreatment of wheat straw for ethanol production . Appl. Biochem. Biotechnol . 165(3-4), 1010–1023.
Shonisani, N.  (2010). Effect of brewing temperature and duration on quality of black tea (Camellia sinensis and eual (50:50) combination of bush tea (Athrixia phylicoides dc.) and black tea. Mini-Dissertation. Faculty of Science and Agriculture (School of Agricultural and Environmental Sciences), University of Limpopo. Takashina, T.A., Leifeld, V., Zelinski, D.W., Mafra, M.R., & Igarashi-Mafra, L. (2017). Application of response surface methodology for coffee effluent treatment by ozone and combined ozone/UV. Ozone: Science & Engineering. 40(4), 293–304.
Travaini,  R.,  Otero,  M.D.M.,  Coca,  M.,  Da-Silva,  R.,  &  Bolado,  S.  (2013).  Sugarcane  bagasse  ozonolysis pretreatment: Effect on enzymatic digestibility and inhibitory compound formation . Bioresour. Technol. 133, 332–339.
Utama, D. D., Djali, M., & Cahyana, Y. (2021). Kajian perbandingan metode pretreatment ozonasi dan pemanasan uap bertekanan terhadap polifenol dan aktivitas antioksidan ekstrak kulit biji kakao ( Theobroma cacao L.). Pontianak Nutrition Journal . 4(1), 86-92.
Wu, L., Arakane, M., Ike, M., Wada, M., Takai, T., Gau, M.,  & Tokuyasu, K. (2011 ). Low temperature alkali pretreatment  for  improving  enzymatic  digestibility  of  sweet  sorgum  bagasse  for  ethanol  production . Biosource Technology. 102(7), 4793-4799.
Yan,  S.,  Wu,  X.,  Faubion,  J.,  Bean,  S.R.,  Cai,  L.,  Shi,  Y.,  Sun,  X.S.,  &  Wang,  D.  (2012). Ethanol-production performance of ozone-treated tannin grain sorghum flour . Cereal Chemistry Journal. 89(1), 30–37. Yumas,  M.  (2017).  Pemanfaatan  limbah  kulit  ari  biji  kakao  ( Theobroma  cacao L.)  sebagai  sumber  antibakteri Streptococcus mutans. Jurnal Industri Hasil Perkebunan. 12(2), 7–20.
Zhao,  S.,  Baik,  O.D.,  Choi,  Y.J.,  &  Kim,  S.M.  (2014 ). Pretreatments  for  the  efficient  extraction  of  bioactive compounds from plant-based biomaterials . Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54(10), 1283– 1297.