## Kinetika Enzim Nitrilase Dari Sel Utuh Rhodococcus spp Pada Biotransformasi Mandelonitril

## R. Haryo Bimo Setiarto
Peneliti Bidang Biokimia Mikrobiologi Pusat Penelitian Biologi LIPI
Jalan Raya Jakarta-Bogor Km 46, Cibinong Science Center. Telephone: 081327025330,  Email: haryobimo42@yahoo.com

## Diterima Desember 2010 disetujui untuk diterbitkan Mei 2011 Abstract
Rhodococcus spp can be used as mandelonitrile substrate for carbon and nitrogen source in life cycle of metabolism. They have potential of activity biotransformation for produced (R/S)-mandelic acid from  mandelonitrile.  (R/S)-mandelic  acid  is  an  important  biotransformation  product  for  production  of pharmaceuticals such as semisynthetic penicillins, cephalosporins, antitumor agents, antiobesity agents and antiinflamation agents. This research was conducted to determine the enzyme kinetics (Km and Vmax) of nitrilase from Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 (induction acetonitrile 1000 mM - mandelonitrile 100 mM) with florometric methods, spectrophotometer analysis ( ë = 413 nm). This research was carried out by assaying nitrilase enzyme activities in various concentration of mandelonitrile subtrates which were between 10 mM – 100 mM with 10 mM interval. The result showed that the enzyme kinetics of nitrilase from Rhodococcus TPIK (Km was 72.303 mM and Vmax was 2.075 mM/ml cell/minute), Rhodococcus LP3 (Km was 47.048 mM and Vmax was 1.942 mM/ml cell/minute), Rhodococcus GLB5 (Km was 34.375 mM and Vmax was 2.083 mM/ml cell/minute). Nitrilase enzyme from Rhodococcus GLB5 have smallest Km value. So we can interpretationed, this enzyme have good complexity Enzyme-Substrate, high affinity with substrate, and high speed reaction for forms product mandelic acid. Keywords: enzyme kinetics (Km, Vmax), nitrilase enzyme, Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5

## Abstrak
Rhodococcus spp  dapat  digunakan  sebagai  substrat  mandelonitrile  dan  sumber  karbon  dan nitrogen  dalam  siklus  hidup  metabolisme.  Bakteri  ini  memiliki  potensi  biotransformasi  aktivitas  untuk diproduksi  (R  /  S)-asam  dari  mandelic  mandelonitrile.  (R  /  S)-asam  mandelic  adalah  produk biotransformasi  penting  untuk  produksi  obat-obatan  seperti  penisilin  semisintetik,  sefalosporin,  agen antitumor, agen antiobesity dan agen antiinflamasi. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan kinetika enzim (Km dan Vmaks) dari nitrilase dari Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 (induksi asetonitril 1000 mM - mandelonitrile 100 mM) dengan metode florometric, analisis spektrofotometer ( ë = 413 nm). Penelitian ini dilakukan  dengan  pengujian  aktivitas  enzim  nitrilase  dalam  berbagai  konsentrasi  subtrates mandelonitrile yang berusia antara 10 mM - 100 mM dengan selang 10 mM. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kinetika enzim nitrilase dari Rhodococcus TPIK (Km adalah 72,303 mM dan Vmaks adalah 2,075 mM / ml sel / menit), Rhodococcus LP3 (Km adalah 47,048 mM dan Vmaks adalah 1,942 mM / ml sel / menit), Rhodococcus GLB5 (Km adalah 34,375 mM dan Vmaks adalah 2,083 mM / ml sel / menit). Enzim Nitrilase  dari Rhodococcus GLB5  memiliki  nilai  terkecil  Km.  Jadi  kita  bisa  interpretationed,  enzim  ini memiliki kompleksitas baik Enzim-Substrat, afinitas tinggi dengan substrat, dan reaksi kecepatan tinggi untuk asam produk bentuk mandelic.
Kata kunci: kinetika enzim (Km, Vmax), nitrilase enzim, Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5
nitril  hidratase  dan  amidase.

## Pendahuluan
R h o d o c o c c u s   s p p . m a m p u memanfaatkan  senyawa  sianida  dengan toksisitas  tinggi  seperti  mandelonitril sebagai  sumber  C  dan  N  pada  proses metabolismenya.  Beard  dan  Page  (1998), melaporkan  bahwa Rhodococcus spp
Produk  hasil mampu  memproduksi  enzim  nitrilase  yang
biotransformasi senyawa mandelonitril yaitu
dapat  mengkonversi  substrat  mandelonitril
asam  mandelat  termasuk  dalam  golongan menjadi asam mandelat. Hasil penelitian lain
utama  metabolit  styrena  yang  sangat
oleh  Martinkova  dan  Klempier  (1998)
berman-faat  untuk  berbagai  industri  kimia,
menunjukkan  bahwa Rhodococcus  spp
biokimia  maupun  industri  farmasi m a m p u   m e l a k u k a n   b i o t r a n s f o r m a s i
1991, Jiao et al.,, 2008 . senyawa nitril dengan menghasilkan enzim
Dari  hasil penelitian  terbaru  diketahui  bahwa  ada beberapa  jalur  metabolisme  enzimatis  lain yang  dapat  digunakan  untuk  memproduksi asam mandelat diantaranya adalah meman- faatkan enzim reduktase, lipase, rasemase, dan esterase (Guo et al., 2009, Jiao et al.,, 2008,  Ju et  al.,, 2010). (Utkin et al., )
Asam  mandelat  merupakan  asam
salah  satu  parameter  kinetika  enzim
karboksilat  yang  secara  stereoisometrik (Wiseman, 1989). Parameter kinetika enzim
memiliki  gugus  pusat  kiral  yang  saling
yang  lain  adalah  konstanta Michaelis- berinteraksi  dengan  kelompok  gugus Menten , yang lebih dikenal dengan Km. Km hidroksil  dan  karbonil  dari  enantiopure  di-
merupakan  konsentrasi  substrat  yang tartarat  (Jiao et  al., 2008,  Yu et  al., 2008),
separuh  dari  lokasi  aktifnya  telah  terisi Karena  bersifat  kiral  maka  senyawa  ini apabila  kecepatan  reaksi  enzim  telah memiliki  dua  konformasi  stereoisometrik mencapai  ½  Vmaks  (Wiseman,  1989). yaitu (S)-asam mandelat (stereoisomer) dan Menurut  Whitaker  (1996),  nilai  Km  dapat
(R)–asam mandelat (enantiomer) (He et al., digunakan  untuk  menentukan  ukuran
2008).  (R)-asam  mandelat  bermanfaat afinitas  enzim-substrat  (E-S)  yang sebagai  antitumor,  prekursor  semisintetik merupakan suatu indikator kekuatan ikatan p e n i s i l i n ,   c e p h a l o s p o r i n   d a n   o b a t
kompleks  E-S.  Selain  digunakan  sebagai
antiobesitas  Yamamoto et al., 1991, Kaul et
ukuran  afinitas  E-S  (enzim-substrat),  nilai
al., 2004) (S)-asam  mandelat  digunakan
Km  juga  berhubungan  dengan  tetapan untuk  sintesis  alternatif  cyclopentenon  dan keseimbangan  disosiasi  kompleks  E-S
s e n y a w a   n o n s t e r o i d a l   p a d a   o b a t
menjadi  E  dan  S.  Apabila  nilai  Km  kecil antiinflamasi  seperti
berarti  kompleks  E-S  mantap  dan  afinitas
Mateo et  al., 2006 Ada enzim  terhadap  substrat  tinggi,  sedangkan
beberapa  metode  enzimatis  yang  dapat
bila  nilai  Km  besar  afinitasnya  menjadi dilakukan  untuk  memproduksi  enan-tiomer rendah. Harga Km enzim sangat bervariasi murni  dari  asam  mandelat  maupun  produk
tergantung  dari  jenis  substrat,  lingkungan turunannya.  Hal  tersebut  diantaranya
dan kekuatan ion. melakukan  hidroksilasi  asimetris  dari Penelitian  ini  bertujuan  menentu-kan senyawa 2 - fenil asetat (Chen et al., 2007, kinetika  enzim  nitrilase  dari  sel  utuh Ju  et.  al.  2010),  degradasi  enantioselektif Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 melalui nilai senyawa  rasemat dari  asam mandelat  dan
K m   d a n   V m a k s   s e l a m a   p r o s e s memanfaatkan  klorin  untuk  menggan-tikan
biotransformasi  mandelonitril.  Dengan
produk  turunannya  (Huang et  al., 2006,  Ju diketahuinya  Km  dan  Vmaks  dapat et. al, 2010), reduksi asimetris dari senyawa dilakukan  optimasi  untuk  meningkatkan asam benzoil format (Yang et al., 2006), dan jumlah  produk  asam  mandelat  melalui hidrolisis  enantioselektif  dari  senyawa peningkatan  Vmaks  dan  penurunan  Km. mandelonitril maupun senyawa ester asam Metode yang digunakan untuk menentukan mandelat (He et al., 2007, Ju et al., 2010). Km dan Vmaks dari sel utuh Rhodococcus
Dapat  dilaporkan  pula  bahwa  hidrolisis
T P I K ,   L P 3 ,   G L B 5   a d a l a h   m e t o d e
secara enzimatis ester asam mandelat dan fluorometer  berbasis  spektrofotometri produk turunan yang digantikan  oleh klorin dengan perlakuan peningkatan konsentrasi dapat diperoleh pada fase organik (Wang et mandelonitril  secara  bertahap  (Roth  1971,
al., 2008, Ju et al., 2010). Benson et al., 1975). Metode ini digunakan untuk  menganalisis  secara  tidak  langsung jumlah  produk  (R/S)-asam  mandelat  yang terbentuk  selama  proses  biotransformasi Km  dan  Vmaks dengan  mengukur  pembentukan  senyawa Rhodococcus spp tersebut   Dalam  reaksi ammonia (NH ) sebagai produk sampingan.
3
enzim  dikenal  kecepatan  reaksi  hidrolisis,
Hipotesis  penelitian  ini  adalah  apabila  nilai penguraian  atau  reaksi  katalisasi  yang
Km  enzim  nitrilase  dalam  sel  utuh disebut velocity  ( V).  Harga  V  dari  suatu
Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 kecil berarti reaksi  enzimatis  akan  meningkat  dengan kompleks E-S mantap, afinitas enzim tinggi bertambahnya  konsentrasi  substrat  [S], terhadap substrat, laju reaksi pembentukan akan tetapi setelah [S] meningkat lebih lanjut produk asam mandelat tinggi sedangkan bila akan  sampai  pada  kecepatan  yang  tetap.
Km besar berlaku kebalikannya. Pada  konsentrasi  enzim  tetap  (tertentu) Materi dan metode harga  V  hampir  linier  dengan  [S].  Pada
Materi  yang  digunakan  antara  lain kondisi V tidak dapat bertambah lagi dengan
media  mineral  (komposisi  0.4475  gram bertambahnya  [S]  disebut  kecepatan
Na HPO .2H O, 0.1 gram KH PO , 0.1 gram
2 4 2 2 4 maksimum  (Vmaks).  Vmaks  merupakan MgSO 7H O, 0.01 gram CaCl .7H O, 0.001 4. 2 2 2
( celecoxib  dan deracoxib  ( ).
Salah  satu  alternatif  untuk  meng- optimasi enzim nitrilase adalah menentukan kinetika  enzim  nitrilase  yaitu  dengan menentukan dari  sel
. . Setiarto, Kenetika Enzim Nitrilase Dari Sel Utuh Rhodococcus :  102-109

## Kinetika Enzim Nitrilase Dari Sel Utuh Rhodococcus spp Pada Biotransformasi Mandelonitril

## R. Haryo Bimo Setiarto
Peneliti Bidang Biokimia Mikrobiologi Pusat Penelitian Biologi LIPI Jalan Raya Jakarta-Bogor Km 46, Cibinong Science Center.
Telephone: 081327025330,  Email: haryobimo42@yahoo.com

## Diterima Desember 2010 disetujui untuk diterbitkan Mei 2011

## Abstract
Rhodococcus spp can be used as mandelonitrile substrate for carbon and nitrogen source in life cycle of metabolism. They have potential of activity biotransformation for produced (R/S)-mandelic acid from  mandelonitrile.  (R/S)-mandelic  acid  is  an  important  biotransformation  product  for  production  of pharmaceuticals such as semisynthetic penicillins, cephalosporins, antitumor agents, antiobesity agents and antiinflamation agents. This research was conducted to determine the enzyme kinetics (Km and Vmax) of nitrilase from Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 (induction acetonitrile 1000 mM - mandelonitrile 100 mM) with florometric methods, spectrophotometer analysis ( ë = 413 nm). This research was carried out by assaying nitrilase enzyme activities in various concentration of mandelonitrile subtrates which were between 10 mM – 100 mM with 10 mM interval. The result showed that the enzyme kinetics of nitrilase from Rhodococcus TPIK (Km was 72.303 mM and Vmax was 2.075 mM/ml cell/minute), Rhodococcus LP3 (Km was 47.048 mM and Vmax was 1.942 mM/ml cell/minute), Rhodococcus GLB5 (Km was 34.375 mM and Vmax was 2.083 mM/ml cell/minute). Nitrilase enzyme from Rhodococcus GLB5 have smallest Km value. So we can interpretationed, this enzyme have good complexity Enzyme-Substrate, high affinity with substrate, and high speed reaction for forms product mandelic acid.
Keywords: enzyme kinetics (Km, Vmax), nitrilase enzyme, Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5

## Abstrak
Rhodococcus spp  dapat  digunakan  sebagai  substrat  mandelonitrile  dan  sumber  karbon  dan nitrogen  dalam  siklus  hidup  metabolisme.  Bakteri  ini  memiliki  potensi  biotransformasi  aktivitas  untuk diproduksi  (R  /  S)-asam  dari  mandelic  mandelonitrile.  (R  /  S)-asam  mandelic  adalah  produk biotransformasi  penting  untuk  produksi  obat-obatan  seperti  penisilin  semisintetik,  sefalosporin,  agen antitumor, agen antiobesity dan agen antiinflamasi. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan kinetika enzim (Km dan Vmaks) dari nitrilase dari Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 (induksi asetonitril 1000 mM - mandelonitrile 100 mM) dengan metode florometric, analisis spektrofotometer ( ë = 413 nm). Penelitian ini dilakukan  dengan  pengujian  aktivitas  enzim  nitrilase  dalam  berbagai  konsentrasi  subtrates mandelonitrile yang berusia antara 10 mM - 100 mM dengan selang 10 mM. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kinetika enzim nitrilase dari Rhodococcus TPIK (Km adalah 72,303 mM dan Vmaks adalah 2,075 mM / ml sel / menit), Rhodococcus LP3 (Km adalah 47,048 mM dan Vmaks adalah 1,942 mM / ml sel / menit), Rhodococcus GLB5 (Km adalah 34,375 mM dan Vmaks adalah 2,083 mM / ml sel / menit). Enzim Nitrilase  dari Rhodococcus GLB5  memiliki  nilai  terkecil  Km.  Jadi  kita  bisa  interpretationed,  enzim  ini memiliki kompleksitas baik Enzim-Substrat, afinitas tinggi dengan substrat, dan reaksi kecepatan tinggi untuk asam produk bentuk mandelic.
Kata kunci: kinetika enzim (Km, Vmax), nitrilase enzim, Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5
nitril  hidratase  dan  amidase.

## Pendahuluan
R h o d o c o c c u s   s p p . m a m p u memanfaatkan  senyawa  sianida  dengan toksisitas  tinggi  seperti  mandelonitril sebagai  sumber  C  dan  N  pada  proses metabolismenya.  Beard  dan  Page  (1998), melaporkan  bahwa Rhodococcus spp
Produk  hasil mampu  memproduksi  enzim  nitrilase  yang
biotransformasi senyawa mandelonitril yaitu dapat  mengkonversi  substrat  mandelonitril
asam  mandelat  termasuk  dalam  golongan menjadi asam mandelat. Hasil penelitian lain
utama  metabolit  styrena  yang  sangat oleh  Martinkova  dan  Klempier  (1998)
berman-faat  untuk  berbagai  industri  kimia, menunjukkan  bahwa Rhodococcus  spp
biokimia  maupun  industri  farmasi m a m p u   m e l a k u k a n   b i o t r a n s f o r m a s i
1991, Jiao et al.,, 2008 . senyawa nitril dengan menghasilkan enzim
Dari  hasil penelitian  terbaru  diketahui  bahwa  ada beberapa  jalur  metabolisme  enzimatis  lain yang  dapat  digunakan  untuk  memproduksi asam mandelat diantaranya adalah meman- faatkan enzim reduktase, lipase, rasemase, dan esterase (Guo et al., 2009, Jiao et al.,, 2008,  Ju et  al.,, 2010).
(Utkin et al., )
Asam  mandelat  merupakan  asam
salah  satu  parameter  kinetika  enzim karboksilat  yang  secara  stereoisometrik
(Wiseman, 1989). Parameter kinetika enzim memiliki  gugus  pusat  kiral  yang  saling
yang  lain  adalah  konstanta Michaelis-
berinteraksi  dengan  kelompok  gugus
Menten , yang lebih dikenal dengan Km. Km hidroksil  dan  karbonil  dari  enantiopure  di-
merupakan  konsentrasi  substrat  yang tartarat  (Jiao et  al., 2008,  Yu et  al., 2008), separuh  dari  lokasi  aktifnya  telah  terisi Karena  bersifat  kiral  maka  senyawa  ini
apabila  kecepatan  reaksi  enzim  telah memiliki  dua  konformasi  stereoisometrik
mencapai  ½  Vmaks  (Wiseman,  1989). yaitu (S)-asam mandelat (stereoisomer) dan
Menurut  Whitaker  (1996),  nilai  Km  dapat (R)–asam mandelat (enantiomer) (He et al., digunakan  untuk  menentukan  ukuran 2008).  (R)-asam  mandelat  bermanfaat
afinitas  enzim-substrat  (E-S)  yang sebagai  antitumor,  prekursor  semisintetik
merupakan suatu indikator kekuatan ikatan p e n i s i l i n ,   c e p h a l o s p o r i n   d a n   o b a t
kompleks  E-S.  Selain  digunakan  sebagai antiobesitas  Yamamoto et al., 1991, Kaul et ukuran  afinitas  E-S  (enzim-substrat),  nilai al., 2004) (S)-asam  mandelat  digunakan
Km  juga  berhubungan  dengan  tetapan untuk  sintesis  alternatif  cyclopentenon  dan
keseimbangan  disosiasi  kompleks  E-S s e n y a w a   n o n s t e r o i d a l   p a d a   o b a t
menjadi  E  dan  S.  Apabila  nilai  Km  kecil antiinflamasi  seperti
berarti  kompleks  E-S  mantap  dan  afinitas Mateo et  al., 2006 Ada enzim  terhadap  substrat  tinggi,  sedangkan beberapa  metode  enzimatis  yang  dapat
bila  nilai  Km  besar  afinitasnya  menjadi dilakukan  untuk  memproduksi  enan-tiomer
rendah. Harga Km enzim sangat bervariasi murni  dari  asam  mandelat  maupun  produk
tergantung  dari  jenis  substrat,  lingkungan turunannya.  Hal  tersebut  diantaranya
dan kekuatan ion.
melakukan  hidroksilasi  asimetris  dari
Penelitian  ini  bertujuan  menentu-kan
senyawa 2 - fenil asetat (Chen et al., 2007, kinetika  enzim  nitrilase  dari  sel  utuh Ju  et.  al.  2010),  degradasi  enantioselektif
Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 melalui nilai senyawa  rasemat dari  asam mandelat  dan
K m   d a n   V m a k s   s e l a m a   p r o s e s memanfaatkan  klorin  untuk  menggan-tikan
biotransformasi  mandelonitril.  Dengan produk  turunannya  (Huang et  al., 2006,  Ju diketahuinya  Km  dan  Vmaks  dapat et. al, 2010), reduksi asimetris dari senyawa
dilakukan  optimasi  untuk  meningkatkan asam benzoil format (Yang et al., 2006), dan jumlah  produk  asam  mandelat  melalui hidrolisis  enantioselektif  dari  senyawa
peningkatan  Vmaks  dan  penurunan  Km.
mandelonitril maupun senyawa ester asam
Metode yang digunakan untuk menentukan
mandelat (He et al., 2007, Ju et al., 2010).
Km dan Vmaks dari sel utuh Rhodococcus Dapat  dilaporkan  pula  bahwa  hidrolisis
T P I K ,   L P 3 ,   G L B 5   a d a l a h   m e t o d e
secara enzimatis ester asam mandelat dan
fluorometer  berbasis  spektrofotometri produk turunan yang digantikan  oleh klorin
dengan perlakuan peningkatan konsentrasi dapat diperoleh pada fase organik (Wang et mandelonitril  secara  bertahap  (Roth  1971,
al., 2008, Ju et al., 2010). Benson et al., 1975). Metode ini digunakan untuk  menganalisis  secara  tidak  langsung jumlah  produk  (R/S)-asam  mandelat  yang terbentuk  selama  proses  biotransformasi Km  dan  Vmaks dengan  mengukur  pembentukan  senyawa
Rhodococcus spp tersebut   Dalam  reaksi
ammonia (NH ) sebagai produk sampingan.
3 enzim  dikenal  kecepatan  reaksi  hidrolisis,
Hipotesis  penelitian  ini  adalah  apabila  nilai penguraian  atau  reaksi  katalisasi  yang
Km  enzim  nitrilase  dalam  sel  utuh disebut velocity  ( V).  Harga  V  dari  suatu Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 kecil berarti reaksi  enzimatis  akan  meningkat  dengan
kompleks E-S mantap, afinitas enzim tinggi bertambahnya  konsentrasi  substrat  [S],
terhadap substrat, laju reaksi pembentukan akan tetapi setelah [S] meningkat lebih lanjut
produk asam mandelat tinggi sedangkan bila akan  sampai  pada  kecepatan  yang  tetap.
Km besar berlaku kebalikannya.
Pada  konsentrasi  enzim  tetap  (tertentu)
Materi dan metode harga  V  hampir  linier  dengan  [S].  Pada
Materi  yang  digunakan  antara  lain
kondisi V tidak dapat bertambah lagi dengan
media  mineral  (komposisi  0.4475  gram bertambahnya  [S]  disebut  kecepatan
Na HPO .2H O, 0.1 gram KH PO , 0.1 gram
2 4 2 2 4
maksimum  (Vmaks).  Vmaks  merupakan
MgSO 7H O, 0.01 gram CaCl .7H O, 0.001
4. 2 2 2 (
celecoxib  dan
deracoxib  ( ). Salah  satu  alternatif  untuk  meng- optimasi enzim nitrilase adalah menentukan kinetika  enzim  nitrilase  yaitu  dengan menentukan dari  sel . .
gram  FeSO .7H O,  0.01  gram  ekstrak
Kinetika  Enzim  Nitrilase  dari  Sel  Utuh
4 2
Rhodococcus  TPIK,  LP3,  GLB5  Pada
khamir,  1  ml  mikroelement  dan  1  liter
Biotransformasi Mandelonitril
akuades),  mikroelement  (komposisi  0.1
Langkah  awal  yang  harus  dirancang
gram  ZnSO .7H O,  0.03  gram  MnCl .4H O,
4 2 2 2 dalam  penentuan  Km  dan  Vmaks  enzim 0.3 gram H BO , 0.2 gram CoCl .6H O, 0.01 3 3 2 2 nitrilase  dari  sel  utuh Rhodococcus TPIK, gram  CuCl .2H O,  0.02  gram  NiCl .6H O, 2 2 2 2 LP3,  GLB5  adalah  memberikan  perlakuan 0.90  gram  Na MoO .2H O,  0.02  gram 2 4 2 variasi  konsentrasi  mandelonitril  berturut- Na SeO   dan  1  liter  akades),  asetonitril 2 3
turut dari 0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40
Aldrich, mandelonitril Aldrich, buffer fosfat 50
mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM
mM  (NaH PO /  Na HPO )  pH  7.2,  buffer
2 4 2 4 dan  100  mM.  Seluruh  variasi  konsentrasi fosfat  0.2  M  (NaH PO /  Na HPO )  pH  7.4, 2 4 2 4
tersebut  selanjutnya  diujikan  pada  sel
NH Cl Merck, sel Rhodococcus TPIK, LP3, 4 Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 yang telah GLB5  (koleksi  laboratorium  Biokimia diinduksi  dengan  asetonitril  1000  mM-
Mikrobiologi Pusat Penelitian Biologi LIPI).
mandelonitril 100 mM.
Kultivasi  dan  Pemanenan  Biomassa  Sel
Preparasi kontrol (mandelonitril 0 mM)
Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 dilakukan  dengan  mencampurkan  100 ì l Proses  kultivasi Rhodococcus TPIK, suspensi sel Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 LP3,  GLB5  dilakukan  pada  media  mineral + 900 ì l buffer fosfat 50 mM pH 7.2 hingga yang diinduksi dengan asetonitril 1000 mM -
diperoleh  volume  akhir  sebesar  1  ml  ke mandelonitril  100  mM.  Inokulasi  dilakukan dalam  tube  eppendorf  ukuran  2  ml. secara aseptik pada laminar air flow dengan
Preparasi untuk perlakuan mandelonitril 10 OD awal 0.5. Kultivasi dilakukan pada suhu mM (100 ì l suspensi sel Rhodococcus TPIK, 0 ruang  (27 C)  dan  diagitasi  dengan  shaker
LP3, GLB5 + 1.2 ì l substrat mandelonitril + orbital kecepatan 120 rpm/menit selama 144
898.8 ì l  buffer  fosfat  50  mM  pH  7.2), jam.  Kekeruhan  (optical  density)  sel
mandelonitril  20  mM  (100 ì l  suspensi  sel
Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  diukur
Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  +  2.4 ì l s e t i a p   h a r i   ( t i a p   2 4   j a m )   d e n g a n
substrat mandelonitril + 897.6 ì l buffer fosfat spektrofotometer  UV-Vis  pada ë =  600  nm 50 mM pH 7.2), mandelonitril 30 mM (100 ì l untuk mengamati laju dan fase pertumbuhan
suspensi sel Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5
sel. Setelah Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 +  3.6 ì l  substrat  mandelonitril  +  896.4 ì l berhasil ditumbuhkan dalam media mineral
buffer fosfat 50 mM pH 7.2), mandelonitril 40 yang diinduksi dengan asetonitril 1000 mM – mM (100 ì l suspensi sel Rhodococcus TPIK, mandelonitril  100  mM.  Tahap  selanjutnya
LP3, GLB5 + 4.8 ì l substrat mandelonitril + adalah melakukan peremajaan sehingga sel
895.2 ì l  buffer  fosfat  50  mM  pH  7.2), dapat tumbuh dengan stabil dan diharapkan mandelonitril  50  mM  (100 ì l  suspensi  sel memiliki  aktivitas  biotransformasi  yang Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  +  6.0 ì l
tinggi. substrat mandelonitril + 894 ì l buffer fosfat
Pemanenan  sel Rhodococcus TPIK,
50 mM pH 7.2), mandelonitril 60 mM (100 ì l LP3,  GLB5  dilakukan  dengan  metode
suspensi sel Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5
sentrifugasi  menggunakan  High  Speed +  7.2 ì l  substrat  mandelonitril  +  892.8 ì l Refrigerated  Sentrifuge  Kubota  6500
buffer fosfat 50 mM pH 7.2), mandelonitril 70 dengan  kecepatan  9000  rpm  selama  15 mM (100 ì l suspensi sel Rhodococcus TPIK, 0 menit pada suhu 4 C. Pellet berisi biomassa LP3, GLB5 + 8.4 ì l substrat mandelonitril + sel yang diperoleh dari hasil sentrifugasi lalu 891.6 ì l  buffer  fosfat  50  mM  pH  7.2), dicuci dengan buffer fosfat 50 mM (NaH PO /
2 4
mandelonitril  80  mM  (100 ì l  suspensi  sel
Na HPO )  pH  7.2 sebanyak  tiga  kali
Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  +  9.6 ì l
2 4 menggunakan  prosedur  sentrifugasi  yang substrat mandelonitril + 890.4 ì l buffer fosfat sama.  Biomassa  sel Rhodococcus TPIK, 50 mM pH 7.2), mandelonitril 90 mM (100 ì l LP3, GLB5 diencerkan menggunakan buffer suspensi sel Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5
fosfat  50  mM  (NaH PO /  Na HPO )  pH  7.2
+  10.8 ì l  substrat  mandelonitril  +  889.2 ì l
2 4 2
4
buffer  fosfat  50  mM  pH  7.2),  dan hingga  diperoleh  suspensi  sel  konsentrasi mandelonitril  100  mM  (100 ì l  suspensi  sel 10 % (b/v). Setelah dilakukan pengenceran,
Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  +  12 ì l suspensi sel divortex hingga homogen dan
0
substrat mandelonitril + 888 ì l buffer fosfat disimpan pada suhu -20 C.
50 mM pH 7.2).
Preparasi  Sampel  Untuk  Penentuan

## Biosfera 29 (1) Mei 2011
Seluruh  campuran  reaksi  tersebut o-phthalaldehyde  mercaptoethanol  dalam divorteks, kemudian diinkubasi selama 1 jam buffer  fosfat  dan  50 ì l  kontrol  supernatan
0
substrat  mandelonitril,  sel Rhodococcus pada  suhu  ruang  (27   C),  dan  dishaker
TPIK,  GLB5  dan  LP3.  Setelah  seluruh
dengan  kecepatan  120  rpm/menit.  Tahap
campuran  reaksi  baik  standar  NH , sampel berikutnya  adalah  menghentikan  reaksi
3
enzimatis  dengan  menambahkan  HCl  4  N
maupun kontrol dibuat selanjutnya divorteks sebanyak  1  ml,  lalu  divorteks.  Untuk
hingga  homogen  dan  dilakukan  inkubasi menetralkan  pH  dilakukan  penambahan selama  20  menit.  Keberadaan  NH   pada
3
NaOH  4  N  sebanyak  1  ml.  Untuk
c a m p u r a n   r e a k s i   d e n g a n   m e t o d e
menentukan Km dan Vmaks enzim nitrilase
fluorometer  secara  empiris  ditunjukkan yang berasal dari aktivitas sel Rhodococcus
dengan  terbentuknya  warna  kuning TPIK,  LP3,  GLB5  dilakukan  sentrifugasi
berfluoresensi  hijau.  Setelah  itu  dilakukan p a d a   c a m p u r a n   r e a k s i   t e r s e b u t pengukuran  nilai  absorbansi  dengan menggunakan  centrifuge  high  speed  Mini spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang Spin  Eppendorf  dengan  kecepatan  10000 gelombang 413 nm.
rpm  selama  10  menit.  Lalu  supernatannya Nilai  absorbansi  dikonversi  menjadi d i a m b i l   u n t u k   m e l a k u k a n   a n a l i s i s konsentrasi  NH   yang  terbentuk  selama 3 selanjutnya. biotransformasi mandelonitril menjadi asam Analisis Km dan Vmaks Enzim Nitrilase dari
m a n d e l a t .   S e b a g a i m a n a   d i k e t a h u i
Sel  Utuh Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5 berdasarkan  stoikiometri  bahwa  selama Pada Biotransformasi Mandelonitril dengan proses  biotransformasi  mandelonitril Metode Fluorometer menjadi  asam  mandelat,  jumlah  NH 3 Reagent kimia yang digunakan untuk (ammonia)  yang  terbentuk  sebanding uji  aktivitas  biotransformasi Rhodococcus dengan  jumlah  produk  asam  mandelat. TPIK, LP3, GLB5 pada mandelonitril dengan Sehingga  konsentrasi  NH   yang  terbentuk 3
metode  fluorometer  dibuat  dengan
dapat  dianalogikan  menjadi  konsentrasi
mencampurkan  91  ml  buffer  fosfat  0.2  M
produk asam mandelat. Penentuan kinetika
(NaH PO / Na HPO ) pH 7.4, 4.5 ml reagent 2 4 2 4
enzim nitrilase (Km dan Vmaks) didasarkan
pertama (o-phthalaldehyde (75 mM) Aldrich
atas plot grafik hubungan antara konsentrasi sebanyak 50 mg yang dilarutkan pada 5 ml substrat [S] yang dinyatakan dalam satuan ethanol  absolut)  dan  4.5  ml  reagent  kedua
mM dan aktivitas total enzim nitrilase dalam (2-mercaptoethanol  (72  mM)  Aldrich sel  utuh Rhodococcus spp (V)  yang sebanyak 25 ì l yang dilarutkan dalam 5 ml dinyatakan dalam satuan mM/ml sel.menit. ethanol  absolut)  hingga  diperoleh  volume
Selanjutnya  dibuat  tabel  [V]  dan  [S]  dan akhir  100  ml.  Seluruh  senyawa  tersebut
dikonversi  menjadi  1/[V]  dan  1/[S]  serta selanjutnya  diaduk  dengan  magnetic  stirer
dibuat plot grafik hubungan antara 1/[V] dan sampai diperoleh reagent yang homogen.
1/[S].  Lalu  ditentukan  nilai  Vmaks  dan  Km
Analisis  produk  NH menggunakan 3 yang  didasarkan  atas  persamaan  kurva
metode  fluorometer  dilakukan  dengan Lineweaver-Burk (Whitaker,  1996).  Hal terlebih  dahulu  membuat  campuran  reaksi
tersebut  dilakukan  dengan  persamaan 1 5 0 0 ì l   r e a g e n t   o - p h t h a l a l d e h y d e
Michaelis-Menten: 1/[V]  =  1/Vmaks  + mercaptoethanol dalam buffer fosfat dan 50 Km/Vmaks.(1/[S]) , bila 1/[V] = Y dan 1/[S] = ì l  sampel  supernatan  sel Rhodococcus X , maka rumusnya dapat ditulis menjadi Y = TPIK,  LP3,  GLB5  yang  telah  diinkubasi
a + bX , sehingga konstanta a = 1/Vmaks dan selama  1  jam.  Selanjutnya  dilakukan
konstanta b  =  Km/Vmaks .  Dengan preparasi  standar  NH untuk  analisis 3 demikian,  bila  harga  1/Vmaks  diketahui spektrofotometer  dengan  komposisi maka nilai Vmaks didapat, begitu pula nilai campuran  reaksi  1500 ì l  reagent  o- Km  akan  juga  didapat  dari  persamaan  b  = phthalaldehyde  mercaptoethanol  dalam Km/Vmaks. buffer  fosfat  dan  50 ì l  standar  ammonia
Hasil dan Pembahasan (NH ) konsentrasi 0 mM, 1 mM, 2mM, 3 mM,
3
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa 4 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 12 mM, 15 mM,
aktivitas  enzim  nitrilase  dalam  sel  utuh 18  mM  dan  20  mM.  Kontrol  substrat mandelonitril,  kontrol    sel Rhodococcus
Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  meningkat TPIK,  LP3,  GLB5  dianalisis  dengan s e c a r a s i g n i f i k a n   s e j a l a n   d e n g a n membuat campuran reaksi 1500 ì l reagent meningkatnya  konsentrasi substrat  (tabel
Setiarto, Kenetika Enzim Nitrilase Dari Sel Utuh Rhodococcus :  102-109
gram  FeSO .7H O,  0.01  gram  ekstrak Kinetika  Enzim  Nitrilase  dari  Sel  Utuh
4 2
Rhodococcus  TPIK,  LP3,  GLB5  Pada khamir,  1  ml  mikroelement  dan  1  liter
Biotransformasi Mandelonitril akuades),  mikroelement  (komposisi  0.1
Langkah  awal  yang  harus  dirancang gram  ZnSO .7H O,  0.03  gram  MnCl .4H O,
4 2 2 2 dalam  penentuan  Km  dan  Vmaks  enzim 0.3 gram H BO , 0.2 gram CoCl .6H O, 0.01 3 3 2 2
nitrilase  dari  sel  utuh Rhodococcus TPIK,
gram  CuCl .2H O,  0.02  gram  NiCl .6H O,
2 2 2 2 LP3,  GLB5  adalah  memberikan  perlakuan 0.90  gram  Na MoO .2H O,  0.02  gram 2 4 2
variasi  konsentrasi  mandelonitril  berturut-
Na SeO   dan  1  liter  akades),  asetonitril 2 3
turut dari 0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40
Aldrich, mandelonitril Aldrich, buffer fosfat 50
mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM mM  (NaH PO /  Na HPO )  pH  7.2,  buffer
2 4 2 4
dan  100  mM.  Seluruh  variasi  konsentrasi fosfat  0.2  M  (NaH PO /  Na HPO )  pH  7.4,
2 4 2 4
tersebut  selanjutnya  diujikan  pada  sel NH Cl Merck, sel Rhodococcus TPIK, LP3,
4
Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 yang telah GLB5  (koleksi  laboratorium  Biokimia
diinduksi  dengan  asetonitril  1000  mM- Mikrobiologi Pusat Penelitian Biologi LIPI).
mandelonitril 100 mM.
Kultivasi  dan  Pemanenan  Biomassa  Sel
Preparasi kontrol (mandelonitril 0 mM)
Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 dilakukan  dengan  mencampurkan  100 ì l Proses  kultivasi Rhodococcus TPIK,
suspensi sel Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 LP3,  GLB5  dilakukan  pada  media  mineral + 900 ì l buffer fosfat 50 mM pH 7.2 hingga yang diinduksi dengan asetonitril 1000 mM -
diperoleh  volume  akhir  sebesar  1  ml  ke mandelonitril  100  mM.  Inokulasi  dilakukan
dalam  tube  eppendorf  ukuran  2  ml. secara aseptik pada laminar air flow dengan
Preparasi untuk perlakuan mandelonitril 10 OD awal 0.5. Kultivasi dilakukan pada suhu mM (100 ì l suspensi sel Rhodococcus TPIK, 0 ruang  (27 C)  dan  diagitasi  dengan  shaker LP3, GLB5 + 1.2 ì l substrat mandelonitril + orbital kecepatan 120 rpm/menit selama 144 898.8 ì l  buffer  fosfat  50  mM  pH  7.2), jam.  Kekeruhan  (optical  density)  sel
mandelonitril  20  mM  (100 ì l  suspensi  sel Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  diukur Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  +  2.4 ì l s e t i a p   h a r i   ( t i a p   2 4   j a m )   d e n g a n
substrat mandelonitril + 897.6 ì l buffer fosfat spektrofotometer  UV-Vis  pada ë =  600  nm 50 mM pH 7.2), mandelonitril 30 mM (100 ì l untuk mengamati laju dan fase pertumbuhan suspensi sel Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 sel. Setelah Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 +  3.6 ì l  substrat  mandelonitril  +  896.4 ì l berhasil ditumbuhkan dalam media mineral
buffer fosfat 50 mM pH 7.2), mandelonitril 40 yang diinduksi dengan asetonitril 1000 mM – mM (100 ì l suspensi sel Rhodococcus TPIK, mandelonitril  100  mM.  Tahap  selanjutnya
LP3, GLB5 + 4.8 ì l substrat mandelonitril + adalah melakukan peremajaan sehingga sel 895.2 ì l  buffer  fosfat  50  mM  pH  7.2), dapat tumbuh dengan stabil dan diharapkan
mandelonitril  50  mM  (100 ì l  suspensi  sel memiliki  aktivitas  biotransformasi  yang
Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  +  6.0 ì l tinggi.
substrat mandelonitril + 894 ì l buffer fosfat Pemanenan  sel Rhodococcus TPIK, 50 mM pH 7.2), mandelonitril 60 mM (100 ì l LP3,  GLB5  dilakukan  dengan  metode suspensi sel Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 sentrifugasi  menggunakan  High  Speed +  7.2 ì l  substrat  mandelonitril  +  892.8 ì l Refrigerated  Sentrifuge  Kubota  6500
buffer fosfat 50 mM pH 7.2), mandelonitril 70 dengan  kecepatan  9000  rpm  selama  15 mM (100 ì l suspensi sel Rhodococcus TPIK, 0 menit pada suhu 4 C. Pellet berisi biomassa LP3, GLB5 + 8.4 ì l substrat mandelonitril + sel yang diperoleh dari hasil sentrifugasi lalu 891.6 ì l  buffer  fosfat  50  mM  pH  7.2), dicuci dengan buffer fosfat 50 mM (NaH PO / 2 4 mandelonitril  80  mM  (100 ì l  suspensi  sel Na HPO )  pH  7.2 sebanyak  tiga  kali Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  +  9.6 ì l 2 4 menggunakan  prosedur  sentrifugasi  yang substrat mandelonitril + 890.4 ì l buffer fosfat sama.  Biomassa  sel Rhodococcus TPIK, 50 mM pH 7.2), mandelonitril 90 mM (100 ì l LP3, GLB5 diencerkan menggunakan buffer
suspensi sel Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 fosfat  50  mM  (NaH PO /  Na HPO )  pH  7.2 +  10.8 ì l  substrat  mandelonitril  +  889.2 ì l 2 4 2 4
buffer  fosfat  50  mM  pH  7.2),  dan hingga  diperoleh  suspensi  sel  konsentrasi
mandelonitril  100  mM  (100 ì l  suspensi  sel 10 % (b/v). Setelah dilakukan pengenceran,
Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  +  12 ì l suspensi sel divortex hingga homogen dan 0 substrat mandelonitril + 888 ì l buffer fosfat disimpan pada suhu -20 C.
50 mM pH 7.2).
Preparasi  Sampel  Untuk  Penentuan
104
Seluruh  campuran  reaksi  tersebut o-phthalaldehyde  mercaptoethanol  dalam divorteks, kemudian diinkubasi selama 1 jam
buffer  fosfat  dan  50 ì l  kontrol  supernatan 0 substrat  mandelonitril,  sel Rhodococcus pada  suhu  ruang  (27   C),  dan  dishaker
TPIK,  GLB5  dan  LP3.  Setelah  seluruh dengan  kecepatan  120  rpm/menit.  Tahap
campuran  reaksi  baik  standar  NH , sampel berikutnya  adalah  menghentikan  reaksi
3 enzimatis  dengan  menambahkan  HCl  4  N
maupun kontrol dibuat selanjutnya divorteks sebanyak  1  ml,  lalu  divorteks.  Untuk
hingga  homogen  dan  dilakukan  inkubasi menetralkan  pH  dilakukan  penambahan
selama  20  menit.  Keberadaan  NH   pada 3
NaOH  4  N  sebanyak  1  ml.  Untuk
c a m p u r a n   r e a k s i   d e n g a n   m e t o d e menentukan Km dan Vmaks enzim nitrilase
fluorometer  secara  empiris  ditunjukkan yang berasal dari aktivitas sel Rhodococcus dengan  terbentuknya  warna  kuning TPIK,  LP3,  GLB5  dilakukan  sentrifugasi
berfluoresensi  hijau.  Setelah  itu  dilakukan p a d a   c a m p u r a n   r e a k s i   t e r s e b u t
pengukuran  nilai  absorbansi  dengan menggunakan  centrifuge  high  speed  Mini
spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang Spin  Eppendorf  dengan  kecepatan  10000
gelombang 413 nm.
rpm  selama  10  menit.  Lalu  supernatannya
Nilai  absorbansi  dikonversi  menjadi d i a m b i l   u n t u k   m e l a k u k a n   a n a l i s i s konsentrasi  NH   yang  terbentuk  selama 3 selanjutnya. biotransformasi mandelonitril menjadi asam
Analisis Km dan Vmaks Enzim Nitrilase dari
m a n d e l a t .   S e b a g a i m a n a   d i k e t a h u i Sel  Utuh Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5 berdasarkan  stoikiometri  bahwa  selama Pada Biotransformasi Mandelonitril dengan
proses  biotransformasi  mandelonitril
Metode Fluorometer menjadi  asam  mandelat,  jumlah  NH 3 Reagent kimia yang digunakan untuk
(ammonia)  yang  terbentuk  sebanding
uji  aktivitas  biotransformasi Rhodococcus
dengan  jumlah  produk  asam  mandelat.
TPIK, LP3, GLB5 pada mandelonitril dengan Sehingga  konsentrasi  NH   yang  terbentuk
3 metode  fluorometer  dibuat  dengan
dapat  dianalogikan  menjadi  konsentrasi
mencampurkan  91  ml  buffer  fosfat  0.2  M
produk asam mandelat. Penentuan kinetika (NaH PO / Na HPO ) pH 7.4, 4.5 ml reagent
2 4 2 4 enzim nitrilase (Km dan Vmaks) didasarkan pertama (o-phthalaldehyde (75 mM) Aldrich
atas plot grafik hubungan antara konsentrasi sebanyak 50 mg yang dilarutkan pada 5 ml
substrat [S] yang dinyatakan dalam satuan
ethanol  absolut)  dan  4.5  ml  reagent  kedua
mM dan aktivitas total enzim nitrilase dalam
(2-mercaptoethanol  (72  mM)  Aldrich
sel  utuh Rhodococcus spp (V)  yang sebanyak 25 ì l yang dilarutkan dalam 5 ml dinyatakan dalam satuan mM/ml sel.menit. ethanol  absolut)  hingga  diperoleh  volume
Selanjutnya  dibuat  tabel  [V]  dan  [S]  dan
akhir  100  ml.  Seluruh  senyawa  tersebut
dikonversi  menjadi  1/[V]  dan  1/[S]  serta selanjutnya  diaduk  dengan  magnetic  stirer
dibuat plot grafik hubungan antara 1/[V] dan sampai diperoleh reagent yang homogen.
1/[S].  Lalu  ditentukan  nilai  Vmaks  dan  Km
Analisis  produk  NH menggunakan
3
yang  didasarkan  atas  persamaan  kurva
metode  fluorometer  dilakukan  dengan
Lineweaver-Burk (Whitaker,  1996).  Hal terlebih  dahulu  membuat  campuran  reaksi
tersebut  dilakukan  dengan  persamaan 1 5 0 0 ì l   r e a g e n t   o - p h t h a l a l d e h y d e
Michaelis-Menten: 1/[V]  =  1/Vmaks  + mercaptoethanol dalam buffer fosfat dan 50
Km/Vmaks.(1/[S]) , bila 1/[V] = Y dan 1/[S] = ì l  sampel  supernatan  sel Rhodococcus X , maka rumusnya dapat ditulis menjadi Y = TPIK,  LP3,  GLB5  yang  telah  diinkubasi a + bX , sehingga konstanta a = 1/Vmaks dan selama  1  jam.  Selanjutnya  dilakukan
konstanta b  =  Km/Vmaks .  Dengan preparasi  standar  NH untuk  analisis 3 demikian,  bila  harga  1/Vmaks  diketahui spektrofotometer  dengan  komposisi
maka nilai Vmaks didapat, begitu pula nilai campuran  reaksi  1500 ì l  reagent  o-
Km  akan  juga  didapat  dari  persamaan  b  = phthalaldehyde  mercaptoethanol  dalam
Km/Vmaks.
buffer  fosfat  dan  50 ì l  standar  ammonia
Hasil dan Pembahasan (NH ) konsentrasi 0 mM, 1 mM, 2mM, 3 mM,
3
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa
4 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 12 mM, 15 mM,
aktivitas  enzim  nitrilase  dalam  sel  utuh
18  mM  dan  20  mM.  Kontrol  substrat mandelonitril,  kontrol    sel Rhodococcus Rhodococcus TPIK,  LP3,  GLB5  meningkat TPIK,  LP3,  GLB5  dianalisis  dengan
s e c a r a s i g n i f i k a n   s e j a l a n   d e n g a n membuat campuran reaksi 1500 ì l reagent meningkatnya  konsentrasi substrat  (tabel
1,2,3). Peningkatan aktivitas enzim nitrilase
dari sel utuh Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 masih  terus  berlangsung  hingga  perlakuan
belum  mencapai  Vmaks  (laju  reaksi konsentrasi  mandelonitril  100  mM.  Hal
maksimumnya)  atau  dapat  pula  dikatakan tersebut menunjukkan bahwa enzim nitrilase bahwa enzim tersebut belum jenuh.
Tabel 1 Aktivitas biotransformasi enzim nitrilase dari sel utuh Rhodococcus TPIK.
Table 1. Biotransformation activity of nitrilase enzyme of intact cells of Rhodococcus TPIK. No Konsentrasi substrat mandelonitril (mM) [S] Aktivitas total biotransformasi (mM/ml sel.menit) [V] 1/[S] 1/[V] 1 0 0 0 0 2 10 0.2597 0.100 3.850 3 20 0.4883 0.050 2.048 4 30 0.5272 0.033 1.897 5 40 0.6163 0.025 1.622 6 50 0.7480 0.020 1.337 7 60 0.8488 0.016 1.178 8 70 0.9341 0.014 1.071 9 80 1.1822 0.012 0.846 10 90 1.2093 0.011 0.827 11 100 1.3023 0.010 0.768
Tabel 2 Aktivitas biotransformasi enzim nitrilase dari sel utuh Rhodococcus LP3.
Table 2. Biotransformation activity of nitrilase enzyme of intact cells of Rhodococcus LP3. No Konsentrasi substrat mandelonitril (mM) [S] Aktivitas total biotransformasi (mM/ml sel.menit) [V] 1/[S] 1/[V] 1 0 0 0 0 2 10 0.376 0.100 2.659 3 20 0.485 0.050 2.062 4 30 0.698 0.033 1.433 5 40 0.783 0.025 1.277 6 50 0.934 0.020 1.071 7 60 0.988 0.016 1.012 8 70 1.097 0.014 0.911 9 80 1.248 0.012 0.801 10 90 1.291 0.011 0.775 11 100 1.388 0.010 0.720
Tabel 3 Aktivitas biotransformasi enzim nitrilase dari sel utuh Rhodococcus GLB5. Table 3. Biotransformation activity of nitrilase enzyme of intact cells of Rhodococcus GLB5 No Konsentrasi substrat mandelonitril (mM) [S] Aktivitas total biotransformasi (mM/ml sel.menit) [V] 1/[S] 1/[V] 1 0 0 0 0 2 10 0.500 0.100 2.000 3 20 0.798 0.050 1.253 4 30 0.829 0.033 1.206 5 40 0.957 0.025 1.045 6 50 1.043 0.020 0.959 7 60 1.186 0.016 0.843
106
No Konsentrasi substrat mandelonitril (mM) [S] Aktivitas total biotransformasi (mM/ml sel.menit) [V] 1/[S] 1/[V] 8 70 1.236 0.014 0.809 9 80 1.368 0.012 0.731 10 90 1.589 0.011 0.629 11 100 1.647 0.010 0.607 Penentuan  Km  dan  Vmaks  enzim Selanjutnya  dari  persamaan  regresi  Y  = nitrilase dalam sel utuh Rhodococcus TPIK
0.515  +  24.23  X,  maka  diperoleh:  0.515  =
didasarkan  atas  persamaan  garis  regresi 1/Vmaks  sehingga  Vmaks  =  1.942  mM/ml grafik hubungan antara 1/[S] dan 1/[V] (Tabel sel.menit dan 24.23 = Km/Vmaks sehingga 1),  seperti  disajikan  pada  Gambar  (a). Km = 47.048 mM. Penentuan Km dan Vmaks Selanjutnya  dari  persamaan  regresi  Y  = enzim nitrilase dalam sel utuh Rhodococcus 0.482  +  34.85  X,  maka  diperoleh:  0.482  = GLB5  didasarkan  atas  persamaan  garis 1/Vmaks  sehingga  Vmaks  =  2.075  mM/ml regresi grafik hubungan antara 1/[S] dan 1/V sel.menit dan 34.85 = Km/Vmaks sehingga (Tabel 3), seperti disajikan pada Gambar (c).
Km = 72.303 mM. Nilai Km dan Vmaks enzim
Selanjutnya  dari  persamaan  regresi  Y  = nitrilase  dalam  sel  utuh Rhodococcus LP3 0.480  +  16.50  X,  maka  diperoleh:  0.48  = didasarkan  atas  persamaan  garis  regresi 1/Vmaks  sehingga  Vmaks  =  2.083  mM/ml grafik hubungan antara 1/[S] dan 1/[V] (Tabel sel.menit dan 16.50 = Km/Vmaks sehingga 2),  seperti  disajikan  pada  Gambar  (b). Km = 34.375 mM.
(a) (b)

## (c)
Gambar  1  Grafik  Line  Weaver  Burk  persamaan  Michaelis-Menten  untuk  kinetika  laju  reaksi enzim  nitrilase  pada  sel  utuh  (a) Rhodococcus TPIK,  (b) Rhodococcus LP3,  (c) Rhodococcus GLB5
Figure 1.  Line Weaver Burk graph of Michaelis-Menten similarity for the kinetics of reaction rate of nitrilase enzyme on intact cells of (a) Rhodococcus TPIK, (b) Rhodococcus LP3, (c)
Rhodococcus GLB5
Setiarto, Kenetika Enzim Nitrilase Dari Sel Utuh Rhodococcus :  102-109 107

## 1,2,3). Peningkatan aktivitas enzim nitrilase
dari sel utuh Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5
masih  terus  berlangsung  hingga  perlakuan belum  mencapai  Vmaks  (laju  reaksi konsentrasi  mandelonitril  100  mM.  Hal maksimumnya)  atau  dapat  pula  dikatakan
tersebut menunjukkan bahwa enzim nitrilase
bahwa enzim tersebut belum jenuh.
Tabel 1 Aktivitas biotransformasi enzim nitrilase dari sel utuh Rhodococcus TPIK.
Table 1. Biotransformation activity of nitrilase enzyme of intact cells of Rhodococcus TPIK. No Konsentrasi substrat mandelonitril (mM) [S] Aktivitas total biotransformasi (mM/ml sel.menit) [V] 1/[S] 1/[V] 1 0 0 0 0 2 10 0.2597 0.100 3.850 3 20 0.4883 0.050 2.048 4 30 0.5272 0.033 1.897 5 40 0.6163 0.025 1.622 6 50 0.7480 0.020 1.337 7 60 0.8488 0.016 1.178 8 70 0.9341 0.014 1.071 9 80 1.1822 0.012 0.846 10 90 1.2093 0.011 0.827 11 100 1.3023 0.010 0.768
Tabel 2 Aktivitas biotransformasi enzim nitrilase dari sel utuh Rhodococcus LP3.
Table 2. Biotransformation activity of nitrilase enzyme of intact cells of Rhodococcus LP3.
No
Konsentrasi substrat mandelonitril (mM) [S] Aktivitas total biotransformasi (mM/ml sel.menit) [V] 1/[S] 1/[V] 1 0
0 0
0 2 10 0.376 0.100 2.659 3 20 0.485 0.050 2.062 4 30 0.698 0.033 1.433 5 40 0.783 0.025 1.277 6 50 0.934 0.020 1.071 7 60 0.988 0.016 1.012 8 70 1.097 0.014 0.911 9 80 1.248 0.012 0.801 10 90 1.291 0.011 0.775 11 100 1.388 0.010 0.720
Tabel 3 Aktivitas biotransformasi enzim nitrilase dari sel utuh Rhodococcus GLB5.
Table 3. Biotransformation activity of nitrilase enzyme of intact cells of Rhodococcus GLB5
No Konsentrasi substrat mandelonitril (mM) [S] Aktivitas total biotransformasi (mM/ml sel.menit) [V] 1/[S] 1/[V] 1 0 0 0 0 2 10 0.500 0.100 2.000 3 20 0.798 0.050 1.253 4 30 0.829 0.033 1.206 5 40 0.957 0.025 1.045 6 50 1.043 0.020 0.959 7 60 1.186 0.016 0.843
106
No Konsentrasi substrat mandelonitril (mM) [S] Aktivitas total biotransformasi (mM/ml sel.menit) [V] 1/[S] 1/[V] 8 70 1.236 0.014 0.809 9 80 1.368 0.012 0.731 10 90 1.589 0.011 0.629 11 100 1.647 0.010 0.607 Penentuan  Km  dan  Vmaks  enzim
Selanjutnya  dari  persamaan  regresi  Y  =
nitrilase dalam sel utuh Rhodococcus TPIK
0.515  +  24.23  X,  maka  diperoleh:  0.515  = didasarkan  atas  persamaan  garis  regresi
1/Vmaks  sehingga  Vmaks  =  1.942  mM/ml grafik hubungan antara 1/[S] dan 1/[V] (Tabel
sel.menit dan 24.23 = Km/Vmaks sehingga 1),  seperti  disajikan  pada  Gambar  (a).
Km = 47.048 mM. Penentuan Km dan Vmaks
Selanjutnya  dari  persamaan  regresi  Y  =
enzim nitrilase dalam sel utuh Rhodococcus 0.482  +  34.85  X,  maka  diperoleh:  0.482  =
GLB5  didasarkan  atas  persamaan  garis 1/Vmaks  sehingga  Vmaks  =  2.075  mM/ml
regresi grafik hubungan antara 1/[S] dan 1/V sel.menit dan 34.85 = Km/Vmaks sehingga
(Tabel 3), seperti disajikan pada Gambar (c).
Km = 72.303 mM. Nilai Km dan Vmaks enzim
Selanjutnya  dari  persamaan  regresi  Y  = nitrilase  dalam  sel  utuh Rhodococcus LP3
0.480  +  16.50  X,  maka  diperoleh:  0.48  = didasarkan  atas  persamaan  garis  regresi
1/Vmaks  sehingga  Vmaks  =  2.083  mM/ml
grafik hubungan antara 1/[S] dan 1/[V] (Tabel
sel.menit dan 16.50 = Km/Vmaks sehingga 2),  seperti  disajikan  pada  Gambar  (b).
Km = 34.375 mM.
(a)
(b)

## (c)
Gambar  1  Grafik  Line  Weaver  Burk  persamaan  Michaelis-Menten  untuk  kinetika  laju  reaksi enzim  nitrilase  pada  sel  utuh  (a) Rhodococcus TPIK,  (b) Rhodococcus LP3,  (c)
Rhodococcus GLB5
Figure 1.  Line Weaver Burk graph of Michaelis-Menten similarity for the kinetics of reaction rate of nitrilase enzyme on intact cells of (a) Rhodococcus TPIK, (b) Rhodococcus LP3, (c) Rhodococcus GLB5
Berdasarkan  eksperimen  ini  dapat memiliki  Km  47.048  mM  dan  nilai  Vmaks dilaporkan bahwa enzim nitrilase dalam sel
1.942 mM/ml sel.menit, enzim nitrilase dari
utuh Rhodococcus GLB5  memiliki  nilai  Km
sel  utuh Rhodococcus GLB5  memiliki  Km terkecil  jika  dibandingkan  dengan  enzim
34.375  mM  dan  Vmaks  2.083  mM/ml nitrilase pada sel Rhodococcus sp. lainnya sel.menit.  Enzim  nitrilase  dalam  sel  utuh (TPIK dan LP3). Hal ini dikarenakan sel utuh Rhodococcus GLB5  memiliki  afinitas  tinggi Rhodococcus GLB5  mampu  membentuk
terhadap  substrat  mandelonitril,  mampu produk  asam  mandelat  dan  mencapai membentuk kompleks E-S yang mantap dan setengah  dari  Vmaks  meskipun  hanya
memiliki  laju  reaksi  pembentukan  produk menggunakan  konsentrasi  substrat asam  mandelat  yang  lebih  tinggi  bila mandelonitril  yang  relatif  rendah  (34.375 dibandingkan  dengan  sel Rhodococcus
mM).  Apabila  dibandingkan  dengan  sel yang lain.
Rhodococcus  LP3  yang  memerlukan konsentrasi substrat mandelonitril yang lebih
Ucapan Terima Kasih tinggi  yaitu  47.048  mM  maupun  sel
Terima  kasih  yang  sebesar-besarnya
Rhodococcus  TPIK  yang  memerlukan
penulis ucapkan kepada seluruh staf peneliti konsentrasi  72.303  mM  untuk  mencapai
dan teknisi di Laboratorium Biokimia Bidang setengah  dari  Vmaks.  Dapat  diketahui
Mikrobiologi  Pusat  Penelitian  Biologi  LIPI bahwa dengan nilai Km terkecil berdasarkan
Cibinong atas bantuan, masukan dan kerja teori kinetika kimia, maka sel Rhodococcus
samanya  sehingga  kegiatan  penelitian  ini
G L B 5   m a m p u   m e l a k u k a n   p r o s e s
berjalan sukses.
biotransformasi mandelonitril menjadi asam mandelat  dengan  lebih  efektif  dan  efisien.
Daftar Pustaka Hal  tersebut  juga  menunjukkan  bahwa  sel Beard,  T.M.  and  Page,  M.I.,  1998.
Rhodococcus GLB5  mampu  menghasilkan Enantioselective  biotransformations
enzim  nitrilase  dengan  afinitas  tinggi
using  Rhodococci.  Antonie  van terhadap  substrat  mandelonitril,  mampu
Leeuwenhoek, 74: 99–106.
membentuk kompleks E-S yang mantap dan
Benson,  J.  R.  and  Hare,  P.E.,  1975.  O- memiliki  laju  reaksi  pembentukan  produk
phthalaldehyde: Fluorogenic detection
asam  mandelat  yang  lebih  tinggi  bila
of  primary  amines  in  the  picomole dibandingkan  dengan  sel Rhodococcus r a n g e .   C o m p a r i s o n   w i t h
yang  lain.  Perbedaan  nilai  Vmaks  dan  Km
fluorescamine  and  ninhydrin.  Proc.
seperti  di  laporkan  oleh  eksperimen
Natl. Acad. Sci., 72: 619-622.
tersebut,  berhubungan  dengan  tingkat kemurnian  enzim  nitrilase.  Enzim  nitrilase yang murni memungkinkan sisi-sisi aktifnya dapat bereaksi secara lebih baik, sehingga a k a n   m e n i n g k a t k a n   a k t i v i t a s biotransformasinya  yang  berdampak  pada penurunan nilai Km. Selain itu enzim nitrilase yang diekstraksi dari sel yang berbeda akan memiliki  sifat-sifat  berbeda,  terutama responnya  terhadap  kondisi  lingkungan seperti:  suhu,  pH  dan  konsentrasi  NaCl
I n t e g r a t i o n   o f   n e w l y   i s o l a t e d
optimum untuk aktivitasnya. Perlu dilakukan
biocatalyst  and  resin-based  in  situ
lagi  riset  lebih  lanjut  untuk  lebih
product  removal  technique  for  the
mengoptimalkan  aktivitas  biotransformasi
asymmetric  synthesis  of  ( R )-methyl dan memurnikan enzim nitrilase tersebut.
mandelate.  Bioprocess  Biosystem
Kesimpulan Engineering, 10: 449-456.
Kinetika enzim nitrilase dalam sel utuh Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 pada proses biotransformasi mandelonitril menjadi asam mandelat  ditunjukkan  dengan  nilai  Km  dan Vmaks.  Enzim  nitrilase  dari  sel  utuh Rhodococcus TPIK memiliki Km 72.303 mM dan  Vmaks  2.075  mM/ml  sel.menit,  enzim nitrilase  dari  sel  utuh Rhodococcus LP3
Chen, Y.Z., Xu, J.Z., Xu, X.Y., Xia, Y., Lin, H., Xia,  S.W.,  and  Wang,  L.X.,  2007. Enantiocomplementary preparation of (S)- and (R)-mandelic acid derivatives via á -hydroxylation of 2-arylacetic acid derivatives  and  reduction  of á - ketoester using microbial whole cells. Te t r a h e d r o n :   A s y m m e t r y,   1 8 : 2537–2540.
Guo,  J.L.,  Mu,  X.Q.,  and  Xu,  Y.,  2009.
He, Y.C., Xu, J.H., Xu, Y., Ouyang, L.M., and Pan,   J., 2007. Biocatalytic synthesis of (R)-(- )-mandelic acid from racemic mandelonitrile  by  a  newly  isolated nitrilase-producer  Alcaligenes  sp. ECU0401.  Chin.  Chem.  Lett.,  18: 677–680.
He, Y.C., Xu, J.H., Pan, J., Ouyang, L.M., and
Xu,  Y.,  2008.
Mateo,  C.,  Chmura,  A.,  Rustler,  S.,  Van Rantwijk, F., Stolzb, A., and Sheldon, R . A . ,   2 0 0 6 .   S y n t h e s i s   o f enantiomerically  pure  (S)-mandelic acid  using  an  oxynitrilase–nitrilase bienzymatic  cascade:  a  nitrilase surprisingly  shows  nitrile  hydratase Huang,  H.R.,  and  Xu,  J.H.,  2006. activity.  Tetrahedron:  Asymmetry,  17: Preparation of (S)-mandelic acid from 320–323. racemate  using  growing  cells  of Pseudomonas  putida  ECU1009  with (R)-mandelate  degradation  activity. Biochem. Eng. J., 30: 11–15. Utkin, I.B., Yakimov, M.M., Matveeva, L.N., Jiao, F. Kozlyak,  E.I.,  Rogozhin,  I.S., Solomon,  Z.G.,  Bezborodov,  A.M., 1991.  Degradation  of  styrene  and ethylbenzene  by  Pseudomonas species Y2. FEMS Microbiol. Lett., 77: 237–241. Ju, X., Yu, H.L., Pan , J., Wei, D.Z., and Xu, Wang,  P.Y.,  Tsai,  S.W.,  Chen,  T.L.,  2008. J.H.,  2010.  Bioproduction  of  chiral Improvements of enzyme activity and mandelate  by  enantioselective enantioselectivity  via  combined deacylation  of á acetoxyphenylacetic substrate  engineering  and  covalent acid using whole cells of newly isolated immobilization.  Biotechnol.  Bioeng., Pseudomonas  sp.  ECU1011. Appl. 101: 460–469.
Microbiol. Biotechnol., 86: 83 – 91. Kaul,  P.,  Banerjee,  A.,  Mayilraj,  S.,  and Banerjee,  U.C.,  2004.  Screening  for enantioselective  nitrilases:  kinetic resolution of racemic mandelonitrile to (R)  -   mandelic  acid  by  new  bacterial isolates. Tetrahedron: Asymmetry, 15: 207–211.
Preparation  of  R- mandelic acid and its derivatives from racemates  by  enantioselective degradation  with  a  newly  isolated bacterial  strain  Alcaligenes  sp.
ECU0401.  Bioprocess  Biosyst.  Eng., 31:445–451. Roth,  H.,  1971.  Fluorescence  reaction  for amino  acids.  Anal.  Chem.,  43:  880- 882. P., Chen, X.Q., Yang, L., and Hu, Y.H., 2008.  Enantioselective  extraction  of mandelic acid enantiomer using ester alcohol L - tartarate as chiral selector. Latin American Applied Research, 38:
249-252.
Whitaker,  J.R.,  1996.  Enzymes. In O.  R. Fennema  (Ed.).  Food Chemistry.  3rd Edition. Marcel Dekker Inc., New York. Wiseman, A., 1989. Handbook of Enzymes Biotechnology . 2nd. Edition. Ellis Howard, New York. Yamamoto,  K.  and  Oishi,  K.,  1991. Production  of  (R)  -  Mandelic  Acid  from
Martinkova,  L.,  Klempier,  N.,  and
Mandelonitrile    by Alcaligenes  faecalis Prepechlova,  I.,  1998.  Chemo- ATCC  8750.  Applied  and  Environmental
selective  biotransformation  of  nitriles
Microbiology, 57 (10): 3028-3032.
by Rhodococcus  equi A4.  Biotech- nology Letters, 20 (10): 909–912.
Setiarto, Kenetika Enzim Nitrilase Dari Sel Utuh Rhodococcus :  102-109
Berdasarkan  eksperimen  ini  dapat memiliki  Km  47.048  mM  dan  nilai  Vmaks dilaporkan bahwa enzim nitrilase dalam sel
1.942 mM/ml sel.menit, enzim nitrilase dari utuh Rhodococcus GLB5  memiliki  nilai  Km sel  utuh Rhodococcus GLB5  memiliki  Km terkecil  jika  dibandingkan  dengan  enzim 34.375  mM  dan  Vmaks  2.083  mM/ml nitrilase pada sel Rhodococcus sp. lainnya sel.menit.  Enzim  nitrilase  dalam  sel  utuh (TPIK dan LP3). Hal ini dikarenakan sel utuh Rhodococcus GLB5  memiliki  afinitas  tinggi Rhodococcus GLB5  mampu  membentuk terhadap  substrat  mandelonitril,  mampu produk  asam  mandelat  dan  mencapai membentuk kompleks E-S yang mantap dan setengah  dari  Vmaks  meskipun  hanya memiliki  laju  reaksi  pembentukan  produk menggunakan  konsentrasi  substrat asam  mandelat  yang  lebih  tinggi  bila mandelonitril  yang  relatif  rendah  (34.375 dibandingkan  dengan  sel Rhodococcus mM).  Apabila  dibandingkan  dengan  sel yang lain.
Rhodococcus  LP3  yang  memerlukan konsentrasi substrat mandelonitril yang lebih
Ucapan Terima Kasih tinggi  yaitu  47.048  mM  maupun  sel
Terima  kasih  yang  sebesar-besarnya Rhodococcus  TPIK  yang  memerlukan
penulis ucapkan kepada seluruh staf peneliti konsentrasi  72.303  mM  untuk  mencapai
dan teknisi di Laboratorium Biokimia Bidang setengah  dari  Vmaks.  Dapat  diketahui
Mikrobiologi  Pusat  Penelitian  Biologi  LIPI bahwa dengan nilai Km terkecil berdasarkan
Cibinong atas bantuan, masukan dan kerja teori kinetika kimia, maka sel Rhodococcus
samanya  sehingga  kegiatan  penelitian  ini G L B 5   m a m p u   m e l a k u k a n   p r o s e s berjalan sukses.
biotransformasi mandelonitril menjadi asam mandelat  dengan  lebih  efektif  dan  efisien. Daftar Pustaka
Hal  tersebut  juga  menunjukkan  bahwa  sel
Beard,  T.M.  and  Page,  M.I.,  1998.
Rhodococcus GLB5  mampu  menghasilkan Enantioselective  biotransformations
enzim  nitrilase  dengan  afinitas  tinggi
using  Rhodococci.  Antonie  van terhadap  substrat  mandelonitril,  mampu
Leeuwenhoek, 74: 99–106.
membentuk kompleks E-S yang mantap dan
Benson,  J.  R.  and  Hare,  P.E.,  1975.  O- memiliki  laju  reaksi  pembentukan  produk
phthalaldehyde: Fluorogenic detection asam  mandelat  yang  lebih  tinggi  bila
of  primary  amines  in  the  picomole dibandingkan  dengan  sel Rhodococcus r a n g e .   C o m p a r i s o n   w i t h yang  lain.  Perbedaan  nilai  Vmaks  dan  Km
fluorescamine  and  ninhydrin.  Proc.
seperti  di  laporkan  oleh  eksperimen
Natl. Acad. Sci., 72: 619-622.
tersebut,  berhubungan  dengan  tingkat kemurnian  enzim  nitrilase.  Enzim  nitrilase yang murni memungkinkan sisi-sisi aktifnya dapat bereaksi secara lebih baik, sehingga a k a n   m e n i n g k a t k a n   a k t i v i t a s biotransformasinya  yang  berdampak  pada penurunan nilai Km. Selain itu enzim nitrilase yang diekstraksi dari sel yang berbeda akan memiliki  sifat-sifat  berbeda,  terutama responnya  terhadap  kondisi  lingkungan seperti:  suhu,  pH  dan  konsentrasi  NaCl
I n t e g r a t i o n   o f   n e w l y   i s o l a t e d optimum untuk aktivitasnya. Perlu dilakukan
biocatalyst  and  resin-based  in  situ lagi  riset  lebih  lanjut  untuk  lebih
product  removal  technique  for  the mengoptimalkan  aktivitas  biotransformasi
asymmetric  synthesis  of  ( R )-methyl dan memurnikan enzim nitrilase tersebut.
mandelate.  Bioprocess  Biosystem
Kesimpulan
Engineering, 10: 449-456.
Kinetika enzim nitrilase dalam sel utuh Rhodococcus TPIK, LP3, GLB5 pada proses biotransformasi mandelonitril menjadi asam mandelat  ditunjukkan  dengan  nilai  Km  dan Vmaks.  Enzim  nitrilase  dari  sel  utuh Rhodococcus TPIK memiliki Km 72.303 mM dan  Vmaks  2.075  mM/ml  sel.menit,  enzim nitrilase  dari  sel  utuh Rhodococcus LP3
Chen, Y.Z., Xu, J.Z., Xu, X.Y., Xia, Y., Lin, H., Xia,  S.W.,  and  Wang,  L.X.,  2007. Enantiocomplementary preparation of (S)- and (R)-mandelic acid derivatives via á -hydroxylation of 2-arylacetic acid derivatives  and  reduction  of á - ketoester using microbial whole cells. Te t r a h e d r o n :   A s y m m e t r y,   1 8 : 2537–2540.
Guo,  J.L.,  Mu,  X.Q.,  and  Xu,  Y.,  2009.
He, Y.C., Xu, J.H., Xu, Y., Ouyang, L.M., and Pan,   J., 2007. Biocatalytic synthesis of (R)-(- )-mandelic acid from racemic mandelonitrile  by  a  newly  isolated nitrilase-producer  Alcaligenes  sp. ECU0401.  Chin.  Chem.  Lett.,  18: 677–680. He, Y.C., Xu, J.H., Pan, J., Ouyang, L.M., and
108
Xu,  Y.,  2008.
Mateo,  C.,  Chmura,  A.,  Rustler,  S.,  Van Rantwijk, F., Stolzb, A., and Sheldon, R . A . ,   2 0 0 6 .   S y n t h e s i s   o f enantiomerically  pure  (S)-mandelic acid  using  an  oxynitrilase–nitrilase bienzymatic  cascade:  a  nitrilase surprisingly  shows  nitrile  hydratase
Huang,  H.R.,  and  Xu,  J.H.,  2006.
activity.  Tetrahedron:  Asymmetry,  17:
Preparation of (S)-mandelic acid from 320–323. racemate  using  growing  cells  of Pseudomonas  putida  ECU1009  with (R)-mandelate  degradation  activity. Biochem. Eng. J., 30: 11–15.
Utkin, I.B., Yakimov, M.M., Matveeva, L.N.,
Jiao, F. Kozlyak,  E.I.,  Rogozhin,  I.S., Solomon,  Z.G.,  Bezborodov,  A.M.,
1991.  Degradation  of  styrene  and ethylbenzene  by  Pseudomonas species Y2. FEMS Microbiol. Lett., 77:
237–241. Ju, X., Yu, H.L., Pan , J., Wei, D.Z., and Xu,
Wang,  P.Y.,  Tsai,  S.W.,  Chen,  T.L.,  2008.
J.H.,  2010.  Bioproduction  of  chiral Improvements of enzyme activity and mandelate  by  enantioselective
enantioselectivity  via  combined
deacylation  of á acetoxyphenylacetic substrate  engineering  and  covalent acid using whole cells of newly isolated immobilization.  Biotechnol.  Bioeng.,
Pseudomonas  sp.  ECU1011. Appl.
101: 460–469.
Microbiol. Biotechnol., 86: 83 – 91. Kaul,  P.,  Banerjee,  A.,  Mayilraj,  S.,  and Banerjee,  U.C.,  2004.  Screening  for enantioselective  nitrilases:  kinetic resolution of racemic mandelonitrile to (R)  -   mandelic  acid  by  new  bacterial isolates. Tetrahedron: Asymmetry, 15: 207–211.
Preparation  of  R- mandelic acid and its derivatives from racemates  by  enantioselective degradation  with  a  newly  isolated bacterial  strain  Alcaligenes  sp. ECU0401.  Bioprocess  Biosyst.  Eng., 31:445–451.
Roth,  H.,  1971.  Fluorescence  reaction  for amino  acids.  Anal.  Chem.,  43:  880- 882.
P., Chen, X.Q., Yang, L., and Hu, Y.H., 2008.  Enantioselective  extraction  of mandelic acid enantiomer using ester alcohol L - tartarate as chiral selector. Latin American Applied Research, 38: 249-252.
Whitaker,  J.R.,  1996.  Enzymes. In O.  R. Fennema  (Ed.).  Food Chemistry.  3rd Edition. Marcel Dekker Inc., New York. Wiseman, A., 1989. Handbook of Enzymes Biotechnology . 2nd. Edition. Ellis Howard, New York.
Yamamoto,  K.  and  Oishi,  K.,  1991. Production  of  (R)  -  Mandelic  Acid  from Martinkova,  L.,  Klempier,  N.,  and
Mandelonitrile    by Alcaligenes  faecalis Prepechlova,  I.,  1998.  Chemo-
ATCC  8750.  Applied  and  Environmental
selective  biotransformation  of  nitriles Microbiology, 57 (10): 3028-3032. by Rhodococcus  equi A4.  Biotech- nology Letters, 20 (10): 909–912.