## SKRINING BAKTERI VIBRIO SP ASLI INDONESIA SEBAGAI PENYEBAB PENYAKIT UDANG BERBASIS TEHNIK 16S RIBOSOMAL DNA

## SCREENING OF INDONESIAN ORIGINAL BACTERIA VIBRIO SP AS A CAUSE OF SHRIMP DISEASES BASED ON 16S RIBOSOMAL DNA-TECHNIQUE
Feliatra Felix*, Titania T Nugroho**, Sila Silalahi*, and Yuslina Octavia*
*) Marine Microbiology Laboratory, Department of Marine Science, Faculty of Fishery and Marine
Science, University of Riau, Pekanbaru-Indonesia, feliatra@yahoo.co.id
**) Biochemistry Laboratory, Faculty of Science and Mathematics, University of Riau, Pekanbaru

## ABSTRACT
Shrimp  disease  caused  by  Vibrio  sp  is  one  of  the  main  limiting  factors  in  the  increasing production in shrimp farming. This disease may kill the shrimp and cause high loss in shrimp culture in South East and East Asia. Samples of 10 individuals of a ten months cultured giant tiger prawn as well as 1 liter pond water and sea waters were collected from shrimp pond in Bengkalis Island, Sumatra. Samples of shrimps were also collected from Jepara shrimp pond in Central  Java  and  they  were  selected  by  looking  at  their  behavior  and  unhealthy  physical characteristics.  Amplification,  rDNA  16s  sequencing  and  bioinformatics  analysis  to  identify Vibrio  species  were  conducted  in  Biotech  Center,  BPPT  Serpong  Banten.  The  results  of  DNA sequencing of each bacteria isolate were compared to DNA sequence from international DNA bank  database.  Tracing  were  made  by  BLAST  (Basic  Local  Alignment  Search  Tool)  system accessed  through  the  internet  at  http://www./ncbi.nlm.nih.gov/blast.  The  result  of  this  study found  seven  strains  of  Vibrio  sp  bacteria  where  five  of  which  (V.  alginolyticus,  V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. shilonii and V. vulnificus) were already registered in the world gen  bank  with  homolog  level  above  97%.  Meanwhile,  another  two  strain  found  in  this  study were not found in the list of world gen bank and therefore are considered as native Vibrio  sp bacteria from Indonesia.
Keywords: Vibrio sp, bacteria, shrimp, aquaculture, fish disease

## ABSTRAK
Penyakit  udang  merupakan  salah  satu  faktor  penghambat  dalam  peningkatan    produksi  udang. Salah  satunya  adalah  penyakit  yang  disebabkan  oleh  bakteri Vibrio sp . Penyakit  ini  dapat menyebabkan  kematian  yang  tinggi  dan  dianggap  sebagai  penyebab  kematian  massal  dalam budidaya  udang  di  wilayah  Asia  Tenggara  dan  Asia  Timur.  Sampel  udang  windu  ( Penaeus monodon )  berumur  sekitar  2  bulan  diambil  sebanyak  10  ekor  dari  tambak  udang,  demikian halnya  air  tambak    dan  air  laut  diambil  sebanyak  1  liter    dari  Pulau  Bengkalis,  Sumatera Indonesia.  Demikian  juga  dengan  sampel  udang  yang  diambil  dari  Laut  Jawa  di  Jepara Indonesia. Sampel diambil dengan memperhatikan tingkah laku dan fisik udang dengan kondisi tidak sehat.  Amplifikasi, sekuensing 16S rDNA, dan analisis bioinformatika untuk mengetahui spesies Vibrio dilakukan di Biotech Center BPPT Serpong, Banten . Hasil sequensing DNA tiap isolat  bakteri  dibandingkan  dengan  sekuen  DNA  pada  DNA  Database  Bank.  Penelusuran dilakukan  melalui  sistem  BLAST  (Basic  Local  Alignment  Search  Tool)  yang  diakses  melalui The  World  Wide  Web  dengan  alamat  situs  http://www/ncbi.nlm.nih.gov/blast.  Berdasar  hasil penelitian  diperoleh  tujuh  strain  bakteri  Vibrio  sp,  lima  strain  diantaranya  sudah  ada  secara internasional pada gen Bank Dunia, yaitu Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, Vibrio shilonii, dan Vibrio vulnificus. dengan tingkat homolog diatas 97%, sedangkan dua  strain  diantaranya  merupakan  strain  yang  belum  terdaftar  secara  Inernasional  dalam  gen bank dunia, dan  ini diyakini merupakan Vibrio sp asli Indonesia.
Kata Kunci: Vibrio sp, bakteri, udang, budidaya,penyakit ikan

## I. PENDAHULUAN
Budidaya udang memberikan kontribusi  yang  besar  bagi  produksi sektor  perikanan  Indonesia.  Ekspor produksi udang Indonesa pernah mencapai  50%  dari    seluruh  ekspor perikanan pada tahun 2002 dan menempati  urutan  lima  besar  dalam komoditas  ekspor  non  migas.  Dalam menjaga  kelangsungan  produksi  udang yang telah memberikan devisa yang besar bagi  negara,  maka  berbagai  faktor  yang menyebabkan  terhambatnya  produksi udang perlu diperhatikan.
Berbagai  kegagalan  panen  yang terjadi  pada  tambak  udang  di  Indonesia menjadi fenomena yang sangat merugikan  petani  tambak.  Kegagalan panen  biasanya  disebabkan  serangan bakteri Vibrio yang  mengakibatkan kematian udang dalam  waktu  yang  cepat dan  dalam  jumlah  yang  besar.  Udang yang terserang Vibrio umumnya ditandai dengan  gejala  klinis,  di  mana  udang terlihat  lemah,  berwarna  merah  gelap atau  pucat,  antena  dan  kaki  renang berwarna  merah.  Bakteri  ini  merupakan jenis  patogen  yang  menginfeksi  dan menyebabkan penyakit pada saat  kondisi udang lemah dan faktor lingkungan yang ekstrim (Lopillo, 2000).
Indonesia  yang  merupakan  salah satu  produser  udang  terbesar  di  dunia, merupakan hal yang sangat penting untuk mengetahui jenis bakteri yang menyebabkan  kematian  pada  udang,  hal ini  diyakini  bahwa  akan  ada  jenis Vibrio sp  asli  Indonesia  yang  kemungkinan tidak  ditemui  pada  negara  lain,  karena keragaman  jenis  bakteri Vibrio sp  masih sangat sedikit dipelajari dan dianalisi.
Terjadinya  kematian  udang  akibat serangan bakteri Vibrio ini membuat para petani tambak udang mengalami kerugian  yang  besar.  Potensi  penyebaran Vibrio yang  demikian  besar  hendaknya segera diatasi dengan melalukan berbagai
upaya  penanggulangan.  Dalam  upaya penanggulangan  terhadap  kemungkinan serangan Vibrio ,  perlu  dilakukan  deteksi bakteri  jenis Vibrio secara  tepat,  karena pada  lokasi  perairan  yang  berbeda  dapat memiliki  keragaman  spesies Vibrio yang berbeda pula.
Salah  satu  teknologi  terbaik  yang mampu  mengidentifikasi  spesies Vibrio adalah dengan mengetahui struktur DNA, yakni  dengan teknik sekuens 16S rDNA. Dalam mempelajari bakteri Vibrio penyebab  penyakit  udang,  teknik  ini merupakan  teknik  yang  relatif  baru  yang belakangan sering diterapkan karena bisa dibandingkan  dengan  basis  data  di  Gen Bank untuk mengetahui kemiripan homologi  DNA  dengan  bakteri  yang sejenis. Skrining bakteri menggunakan teknik  sekuens  16S  rDNA  merupakan suatu  teknik  dalam  mengidentifikasi suatu  spesies  organisme.  Teknik  ini dilakukan  dengan  menganalisa  struktur atau susunan basa DNA yang terdapat di daerah  16S  DNA.  Seiring  semakin berkembangnya dunia bioteknologi, usaha  untuk  menentukan  jenis  spesifik bakteri  penyebab  penyakit  pada  udang secara tepat dan efisien sangat diperlukan,  guna  mempermudah  dalam menanggulangi penyebaran penyakit yang  disebabkan  oleh  bakteri  patogen pada budidaya tambak udang.
Saat  ini,  banyak  ahli  taksonomi mikrobiologi  menerima  bahwa  studi molekuler, terutama analisa asam nukleat merupakan metode terbaik dan terpercaya  untuk  menandakan  spesies dan menentukan hubungan antara organisme yang berbeda. Analisis sekuens DNA mewakili referensi terakhir untuk  mengenali  subtipe  dalam  satu spesies  atau  skrining  mikroba.  Idealnya, perbandingan  di  antara  strain-strain dalam  suatu  spesies  dapat  diketahui melalui DNA (Lusiano, 2007).
Basis  data  untuk  bakteri-bakteri dari  genus Vibrio telah  dibentuk,  dan terus  berkembang  dengan  penemuan- penemuan  spesies  baru.  Basis  data  ini dapat diakses secara virtual di Gen Bank yang terdapat pada situs
http://www/ncbi.nlm.nih.gov/blast  (Harth et al. , 2007).
Setiap spesies bakteri memiliki ciri- ciri  molekuler  yang  dapat  membedakan- nya dari satu spesies dengan spesies yang lain dalam satu genus (Andrito, 2007).
Identifikasi  menggunakan  teknik sekuens  16S  rDNA  mendapatkan  bakteri pada  udang  windu,  air  tambak,  dan  air laut didominasi oleh genus Vibrio . Genus Vibrio merupakan  patogen  oportunistik, yaitu  organisme  yang  dalam  keadaan normal ada dalam lingkungan pemeliharaan  lalu  berkembang  dari  sifat yang  saprofit  menjadi  patogenik  karena kondisi lingkungan memungkinkan.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  spesies  bakteri Vibrio sp yang  menyebabkan  penyakit  pada  udang windu di lokasi budidaya di tambak,yang merupakan bakteri Vibrio sp asli Indonesia, dan akan memperkaya khazanah gen dan basis data di Gen Bank dunia.

## II. METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan  Mei-Juli  2009.  Waktu  tersebut meliputi  pengambilan  sampel  udang, sampel  air  tambak,  dan  sampel  air  laut pada  tambak  budidaya  udang  Pulau Bengkalis  Sumatera,  dan  bulan  Agustus- Desember  2009  untuk  pengambilan sampel  udang  dan  air  tambak  dari BBPBAP  (Balai  Besar  Pangembangan Budidaya  Air  Payau)  Jepara.  Isolasi bakteri Vibrio dilakukan di Laboratorium
Terpadu Jurusan Ilmu Kelautan Universitas Riau. Selanjutnya, amplifikasi  PCR  ( Polymerase  Chain Reaction )
dan sekuensing DNA
dilakukan  di  Biotech  Center,  Balai Pengkajian  Pengembangan  Teknologi
(BPPT) di Serpong, Propinsi Banten.
Bahan  yang  digunakan  adalah udang windu ( Penaeus monodon ), sampel  air  laut,  air  tambak,  TCBS  agar Merck , TSA agar Merck , TSI agar Merck , larutan  kristal  violet,  safranin,  iodine, immersion  oil,  hidrogen  peroksida  3% (H 2 O 2 ),  tetrametyl-p-phenylendiamein  1 %,  alkohol,  aquabides,  spirtus,  NaCl  0,9 %,  MR-VP  broth,  reagent  metil  red, kultur  bakteri,  fastPrep®  DNA  Kit (USA),  agarosa,  buffer  TAE  1x,  loading dye  6x,  SYBR  safe,  marker  DNA  1  kb DNA  Ladder (Fermentas;#SM0311/2/3 ),
Taq  DNA  polymerase,  PCR  buffer  10x, dNTPs mix, primer 9F (5’- GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 765R (5'-CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3'), 1114R, (5'-
CCCGGAACCCAAAAACTTTG-3'), MgCl2 25 mM.
Peralatan  yang  digunakan  pada penelitian ini adalah: homogenizer Tomy MS-100R,  mesin  sentrifuse  Tomy/MX- 301,  Mikropipet  Gilson  2-20  µl  (seri 05043C) 50-200 µl (seri 05044C) buatan Perancis,  PCR  thermal  cycler  (Takara Thermal  Cycler  Dice-model  TP  600  v 2.00),    UV  Trans  illuminator  unit, Electrophoresis BioRad, Gel documentation  system,  dan  AB  3130 Genetic Analyzer. Metode  penelitian  yang  digunakan adalah  eksperimen,  untuk  mengetahui dengan melakukan isolasi dan identifikasi  morfologi  dan  kimia Vibrio dari udang windu, air tambak dan air laut.
Sepuluh  ekor  sampel  udang  windu ( Penaeus  monodon )  berumur  sekitar  2 bulan  diambil  dari  tambak  udang  di Bengkalis, Sumatera Indonesia.
Demikian  juga  dengan  sampel  udang yang  diambil  dari  Laut  Jawa  di  Jepara Indonesia. Sampel diambil dengan memperhatikan  tingkah  laku  dan  fisik udang.  Ciri  udang  yang  diambil  yakni
bergerak  lambat  terhadap  respon  yang diberikan,  lemah,  dan  memiliki  warna yang  lebih  pucat  dibandingkan  udang yang  lain.  Udang  sampel  dimasukkan  ke dalam ice box sebagai wadah penyimpanan  sementara.  Untuk  sampel air  laut  dan  tambak,  pengambilan dilakukan  dengan  botol  ukuran  1000  ml pada tambak udang dan air laut di pinggir pantai di Pulau Bengkalis. Sampel udang dicuci, dikeringkan, lalu ditimbang. Berat 46,4 gram dan diencerkan kedalam 417,6 ml  air  laut  yang  sudah  steril  (10 -1 )  dan diencerkan  sampai  pengenceran  ke  10 -3 . Pengenceran sampel air tambak
dilakukan  sama  dengan  pengenceran pada sampel udang. Demikian pula untuk sampel  air  laut.  Selanjutnya  dilakukan penanaman  bakteri  pada  media  TCBS yang diambil  1 ml dari pengenceran 10 -2
dan  10 -3 untuk  masing-masing  sampel pada  cawan  petri  yang  telah  disiapkan dengan media TCBS.
Koloni  yang  tumbuh  direinokulasi pada  media  yang  baru.  Setiap  koloni berbeda  yang  diperoleh  direinokulasi sebanyak  tiga  ulangan  menggunakan media  TSA.  Penyimpanan  isolat  bakteri Vibrio dilakukan  pada  suhu  4°C  dalam refrigator dan siap untuk digunakan pada pengujian selanjutnya.
Pengamatan  yang  dilakukan  secara
langsung diidentifikasi (secara
morfologi)  antara  lain  :  pengamatan bentuk  sel,  warna  koloni,  ukuran  koloni dan  tipe  koloni.  Selain  itu,  uji  coba biokimia  juga  dilakukan  terhadap  uji bakteri.  Uji  morfologi  maupun  uji biokimia  yaitu  :  Pewarnaan  Gram, Pertumbuhan  pada  Medium  TSI  Agar, Uji Katalase, uji Oksidase, Uji Metil Red, Isolasi  DNA Vibrio ,  Reaksi  Polimerisasi Berantai,  Elektroforesis  dan  Pengamatan Hasil PCR,  Purifikasi Gel Elektroforesis, Sekuensing dan Analisis BLAST ,
Analisis BLAST dilakukan dengan mengedit  urutan  DNA  hasil  sekuensing dengan  menterjemahkan  N  menjadi  basa
sesuai  elektroferogram.  Urutan  DNA dicopy ke program  Notepad.  Selanjutnya dilakukan  penelusuran  melalui  website http://www.ncbi.nih.nlm.gov/.  Data  yang diperoleh dari hasil sekuensing dianalisis menggunakan    teknik  BLAST,  paket program  Clustal  X,  Genedoc,  Treeview dan  Bioedit.  Kemudian  hasil  analisis disajikan secara deskriptif  dalam bentuk tabel dan gambar. Penyejajaran
( Allignment )  sekuens  sampel  dengan sekuens  dari  data  base  semua  DNA Vibrio yang diteliti dilakukan menggunakan  program allignment dari paket  Clustal  X.  Untuk  memperoleh dendogram  digunakan program  N-J pada Clustal X dengan tingkat 100 x bootstrap.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel udang windu ( P. monodon ) diambil  dari  tambak  di  Bengkalis  Riau,
Sumatera  dan  di  tambak  BBPBAP Jepara, Jawa Tengah, Indonesia. Berdasarkan  hasil  isolasi Vibrio dari udang, air tambak dan air laut menggunakan medium agar TCBS diperoleh  7  isolat  bakteri Vibrio yang murni  dengan  memperhatikan  warna, bentuk  dan  ukuran  koloni.  Untuk memudahkan  dalam  mengidentifikasi selama  penelitian,  ketujuh  isolat  tersebut diberi kode A, B, C, D, E, F, dan G. Pada pengkulturan  selanjutnya,  media  yang digunakan  adalah  agar  TSA Merck . Adapun  ketujuh  isolat  yang  diteliti, semua  koloni  isolat  bakteri  berbentuk koma (Tabel 1).
Semua  isolat Vibrio menunjukkan hasil  oksidase  dan  katalase  positif.  Uji menggunakan  medium  agar  TSI  untuk memperlihatkan  terjadinya  fermentasi glukosa  dan  sukrosa  serta  gas  H 2 S dengan  memperhatikan  warna  pada  agar miring  dan  agar  tegak.  Semua  isolat adalah  Glukosa  positif  sedangkan  untuk sukrosa,  A,  C  dan  E  adalah  negatif  dan sisanya adalah positif. Secara umum ciri-
Tabel 1. Hasil Pewarnaan, Pengamatan Morfologi dan biokimia
________________________________________________________________________ No Isolat Gram Bentuk sel Warna koloni Motil Oksi dase Kata lase Metil red Glu kosa Suk rosa H2S Kons. DNA (ng/µl) 1 A - koma Kuning + + + + + - + 108,43 2 B - koma Biru Hijau + + + - + + + 115,56 3 C - koma Kuning + + + + + - + 106,99 4 D - koma Hijau + + + + + + + 62,87 5 E - koma Biru Hijau + + + - + - - 62,87 6 F - Koma Kuning + + + - + + + 69,92 7 G - koma Kuning + + + - + + + 83,91
ciri  masing-masing  strain  dapat  dilihat pada Tabel 1.
Konsentrasi  genom  DNA  dari
masing-masing isolat yang sudah diekstraksi  dapat  diketahui.  Konsentrasi ini  membandingkan  ekstrak  DNA  dalam satuan  nano  gram  per  1  mikro  liter  air, berkisar  antara  62,87  ng/ug  sampai 115,56  ng/ug,  yang  mana  konsentrasi tertinggi merupakan isolat D  dan konsentrasi  terendah  adalah  isolat  H  dan I (Tabel 1)
Menggunakan  marker  DNA  1  Kb Ladder,  semua  fragmen  DNA  yang terlihat  pada  gel  agarose berukuran 1500 pb.  Besarnya  ukuran  ini  sesuai  dengan ukuran yang diharapkan dari gen-gen 16S rDNA bakteri  yaitu antara 1500-1600 bp (Lusiano, 2007).
Hasil  elektroforesis  menunjukkan ketujuh  fragmen  DNA  dari  isolat Vibrio yang  bisa  dilanjutkan  hingga  proses sekuensing, dengan menggunakan primer 8F,  765R,  dan  1114R,  dilakukan  satu arah  sebanyak  satu  kali  pada  setiap primer  yang  digunakan.  Panjang  basa yang  diperoleh  pada  DNA  A  526  pb,  D 1015  pb,  E  420  pb,  H  1020  pb,  dan  I 1020 pb.
Sistem BLAST (Basic Local Aligment  Search  Tool )  melalui  situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
dapat mencari nama spesies, persentase homologi DNA hasil sekuens. Pengajuan ( Submit )  ke  Gen  Bank  dilakukan  guna
mendapatkan nomor akses dan memperoleh  kode  strain  sesuai  yang diinginkan oleh peneliti, yang merupakan susunan basa  yang dimiliki oleh masing- masing strain (Tabel 2). Menurut Handayani (2008) homologi  sekuens  16S  rDNA  dari masing-masing  isolat  bakteri  dengan sekuens  16S  rDNA  dari  database GenBank  dapat  diketahui  bahwa  tidak ada  sekuens  16S  rDNA  bakteri  yang identik. Hasil BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool ) melalui http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, menunjuk- kan  bahwa  kelima  strain  adalah Vibrio alginolyticus,  Vibrio  parahaemolyticus, Vibrio  harveyi,  Vibrio  shilonii, dan
Vibrio vulnificus. Hal ini diyakini bahwa bakteri-bakteri tersebut memiliki persamaan  sekuens  melebihi  97%  dari yang ada pada gen Bank Dunia (Tabel 3) . Sedangkan dua strain lain sudah diyakini merupakan  genus Vibrio sp,  tetapi spesiesnya belum diketahui . Strain keenam memiliki kesamaan sebesar 93% dengan  bakteri Vibrio 6G2.  Sedangkan strain ketujuh memiliki persentase homologi 94% dengan beberapa kandidat bakteri  yang  disebut  sebagai Uncultured bacteriu. Isolat  ketujuh  yang  memiliki top  score  adalah Uncultured  bacterium clone nbw171g06c1 16S ribosomal RNA gene  partial  sequence.  Berdasarkan informasi yang diperoleh dengan
Tabel 2. Sekuens Gen 16S rDNA Isolat Sekuen Gen 16S rDNA A 5’ TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCT GGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCT GAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGA GTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAA ACGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGAC CTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGT TGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTG AGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCC TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCT GATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAA GCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGTTAATAGCATTTGACGTTAGCG ACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTA 3’ B 5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGC GGCAGGCCTAAGACATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCTTAA
CCTTCGGGGAACGATAACGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT GCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGAT GGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCG GGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTG AGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGG ATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGC AGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTT TCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGTAGTTAATAGCTGCATTATTTGACG TTAGCGACAGAAGAAGCACCGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAG CGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCA ACCTCGGAATAGCATTTGAAACCTGCAGACTAGAGTACTGTAGAG GGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGA AGGAAT 3’
C
5’ TTTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAAC
GCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTA TCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGT GAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGG AAACGATGGCTAATACCGCATAATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGG ACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTA GTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCT GAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCC TGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAA 3’ D
5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGG
CGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTAACTGACC CTTCGGGTGACGTTAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCC TGGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAA TACCGCATAATGCCTTCGTGCCAAAGAGTGGGACCTTAGGGCCTCTCG CGTCAGGAGATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCT CACCAAGGCGACGATACCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACAC TGGAAGTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGA AGATGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCAGTGAGGAAGGCGGGT
ACGTTAATAAGTGCTCGTTTGACGTTAGCTGCAGAAGAAGCACCGGCT AACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATC GGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTCGTTAAGTCAGATG TGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCATTTGAAACTGGCGGACT AGCGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGCAATGCG
TAGAGATCTGAAGGAATAC 3’ E
5’ CAGGCCTAACACATGTAAGTCGAGCGGCAGC
ACAGAGAAACTTGTTTCTCGGGTGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAA TGCCTGGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATCACCATTGGAAACGAT
GGCTAATACCGCATGATGCCCTTGATTATAATGAACAGGAGCCAAA GAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGAAATGCCCAGGCGGG ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTA GCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAAGTGAGACACGGT CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG CGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAGGGCCTTCG GGTTGTAAAGCACTTTCAGTTGTGAGGAAGGGGGTGTTGTGAATAG CAGCATCATTTGACGTTAGCAACAGAAGAAGCACCGGCGAACTCC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAACGTTAATCGGA ATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCACATGT GAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGAGACTGGCAAA CTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGTA ATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGTCCCCCT GGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG GTTTGCGAAGACGCAGGTGTGCCTTCGGGAGCTCTGAGACAG 3’
F

## 5’TGCCATACGGNCCAAATGGGGGGACCTTCNGGCCTCTCCNCGT
CAGGATATGCCTAAGTAGTGCGATTAGCTGAGTTGGNGAGGNA
ATGGCTCACCATATGGCACNATCCCTCAGCTGGTCTGACCAGGA TGATGACCCCACNGGAACTGATACACGCTNCANACATCCTACGG AGAGGCCACCTAGCGCGGGGAGATATTGCACAATGGGCACANC TGATGCTACCCTTGCCGCGTGTGATGAATAAAGGCCTCTCGGGT TAGATAAAGCCACTTTCAATCTTGAGGCAAGGCTAGGCGTAGTT AATACCTGCGTTACTTGACGTTCANCGANATAACAGGCACCGAG CCTAACATCCGTAGCCAGCACCCTTCAGTAATACGGTAGAGTCC AGNGTTCATCNNAATTACTGGNCCTTAAAACNNATGCATGTGNA TTTGTTAAATACAATATGTGAAAANCCCGGGGTCTCAACCCTCG AAAATCACCTATTTGA’3 3’AAATTTCCCGCGGGCATTCTGATCCAATTNTCCTAGCGAAGGA AAACTTCATGGAGTTTTNCCTGCAGACCTAAATACGGACTGGGA GCGCCTTTTTGGGGATTGGGTCACTATCTTTCCCTTGCTGCCTTC GGGTATGCGCCCTTGTAGCAGGGGGGTAGCCCTACTCGGAAGG GCCATGATGACTTGACGTCCTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCAC CGGGAGTCCTCCTGGAGTTCCCGACATTAATCGCTGGCAAACAG GGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGAATTAACCCAAAATTTCGC AACACGAGGTGACTACCTCCATGGGGCACCTGTTCTCAAAGTTC CCAAAGGCAAGAATCCATCTCCGGACTCCCCAGGCGGATCTAAT TTAACGCGTTACTCCAGAAAGCCCCGGGCTCAAGGCCCCCAACC CTCCAAGATATACATGGTTTTAAGGGGTGGGACTACCCAGGGGT ATCTAAACTCTGTTTTGCCCCCCAAAAGTTCTCTGGATGTCAAG AGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAAATTAAAACACATGC TTCCCCCGCTTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTTGAGTTTTA TACTTGCGACCGGTTAAGCTTTTCGGCATTCTGAAATGTTGAAT ATTCGGGGTCTAGGGGGGCCGTCCTTCCACCACGGGGGTAGTTC CTTTAAAATACCAAAAACCCATTTCCCCCCGCCTCCTCCCTGGA AATATTTGACCCCCCCTCCTGAGAGTGAATTCTAAAGGGTGCTG AGGTTTCAAAAGGGTTAAATCTCGCGAGGGGTGTAAGCCCCCG GCGGCTTATTTCCCACTCACGGAATTTAAAAAAAACCCAACCTC
GG 1 GGGGGGGGCCTTTTCAG’5
G 3’CGTTCCCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGC
TTCATATAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAAC TTTATGGGATTTGCTTGACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTATT GTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGAGGGCATGA TGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGT CAACTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGCTTAAGGG TTGCGCTCGTTGCGGGACTTAAACCAACATCTCACGACACGAGC TGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGG AAAACTCTATCTCTAGAGGGGTCAGAGGATGTCAAGATTTGGTA AGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTT GTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTACT CCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACT’5
mengakses  kode  tersebut  menunjukkan bahwa  bakteri  dengan  kode  akses  ini bukanlah  bakteri Vibrio sp melainkan suatu  spesies  bakteri  yang  diperoleh  dari sedimen.  Tetapi  dari  morfologi  dan  hasil uji  biokimianya  menunjukkan    bahwa
isolat  ketujuh  merupakan  suatu  bakteri dari  genus Vibrio (Tabel  1),  kemudian didukung juga oleh strain ini dapat tubuh pada  media  TCBS,  yang  merupakan media spesifik bakteri Vibrio sp.
Tabel 3. Hasil BLAST dan Submit ke GenBank
Isolat Bakteri Strain Kode Akses Homologi (%) A Vibrio alginolyticus FNS A08 FJ404761 98 B Vibrio parahaemolyticus FNS C08 FJ404763 99 C Vibrio harveyi FNS B08 FJ404762 98 D Vibrio shilonii FNS D08 FJ404764 98 E Vibrio vulnificus FNS E08 FJ404765 98 F unculture bacterium 1 FNY F08 EU854942.1 93 G Unculture bacterium 2 FNY G08 GQ075650.1  94
Hal ini di duga bahwa kedua strain tersebut  merupakan  spesies Vibrio asli Indonesia  yang  belum  ada  dalam  gen bank  Dunia.  Hal  ini  dikuatkan  oleh Hagstrom et  al. (2000)  menyatakan bahwa isolat yang mempunyai persamaan sekuens 16S rDNA  lebih besar dari 97% dapat  mewakili  spesies  yang  sama. Sedangkan  persamaan  sekuens  antara 93%-97%  dapat  mewakili  identitas  pada tingkat genus tetapi berbeda pada tingkat spesies.
Pohon  filogenetik  ( Phylogenetic trees ) membuat percabangan yang menghubungkan  titik  ( nodes ),  yang merupakan unit taksonomi, seperti spesies atau gen sedangkan akar pohonnya merupakan titik yang bertindak sebagai  nenek  moyang  untuk  seluruh
organisme yang sedang dianalisis (Pramana, 2007).
Penyejajaran  ( Allignment )  sekuens sampel  dengan  sekuens  dari  basis  data Gen  Bank  dilakukan  menggunakan program  Clustal  X.  Untuk  memperoleh pohon filogenetik digunakan program N- J  pada  Clustal  X  dengan  tingkat  100  x bootstrap,  kemudian  hasil  dalam  bentuk pohon  filogenetik  dapat  dilihat  pada program  Treeview.  Pohon  filogenetik berguna  untuk  menunjukkan  hubungan kekerabatan  dari  setiap  spesies  yang dilihat berdasarkan
karakteristik molekuler  antar  spesies  maupun  antar strain  dalam  spesies  yang  sama.  Pohon filogenetik  dari  beberapa  spesies  bakteri Vibrio dapat  dilihat  pada  Gambar  1-6 berikut ini.
Gambar 2 . Pohon filogenetik Vibrio parahaemolyticus FNS C08 Gambar 3. Pohon filogenetik Vibrio harveyi FNS B08 Gambar 4. Pohon filogenetik Vibrio shilonii FNS D08
Gambar 5. Pohon filogenetik Vibrio vulnificus FNS E08
Gambar 6. Pohon filogenetik bakteri strain G dan Strain H
Dari  ketujuh  isolat  dapat  dilihat tingkat kekerabatan dari bakteri Vibrio sp yang  ada,  kelima  isolat  sudah  dipastikan merupakan  isolat  yang  sudah  ada,  tetapi isolat  G  dan  Isolat  H  dari  hasil sekuensing  dan  pohon  philogenetik  tidak merupakan  dari  bakteri Vibrio sp  yang sudah  ada.  Tetapi  dari  hasil  morfologi dan  hasil  uji  biokimianya  menunjukkan bahwa  isolat  G  dan  H  merupakan  suatu bakteri dari genus Vibrio, oleh karena itu dapat  disimpulkan  secara  sementara bahwa  isolat  G  dan  H  adalah  bakteri spesies baru dari Vibrio .
Berdasarkan hasil identifikasi molekuler, V.  alginolyticus FNS  A08 diperoleh dengan tingkat homologi 98 % dengan  panjang  basa  526  pb  dan  strain FNS  A08.  Bakteri  ini  bersifat  gram negatif,  katalase  positif,  oksidase  positif dan termasuk ke dalam bakteri motil.
V.  alginolyticus dicirikan  dengan pertumbuhannya  yang  bersifat  koloni pada  media  padat  non  selektif.  Ciri  lain adalah,  fermentasi  glukosa,  laktosa, sukrosa,  dan  maltosa,  membentuk  kolom berukuran  0,8-1,2  cm  yang  berwarna
kuning  pada  media  TCBS  (Buwono, 2004).
Toksin  mematikan  diproduksi  oleh V.  alginolyticus strain  Swy  asli  diisolasi dari  udang  kuruma  ( Penaeus  japonicus) sakit yang dipurifikasi  dengan Fast Protein  Liquid  Chromatography dengan interaksi hydrophobic ( Sepharose  Hig fenil  Performance )  kromatografi  dan gel filtration columns . Toksin tersebut adalah alkaline serine  protease ,  menunjukkan aktivitas  maksimal  pada  pH 8 sampai 11 (Liu, dan Lee, 1999).
V.    parahaemolyticus FNS  C08 mempunyai  ciri  koloni  berwarna  biru sampai  kehijauan,  mempunyai  sifat fermentatif, glukosa, laktosa, sukrosa dan produksi  gas  positif.  Sedangkan,  metil red  dan  H 2 S  negatif.  Hasil  identifikasi molekuler  dengan  homologi  99  % menunjukkan bahwa patogen ini mempunyai panjang basa 1015 pb.
V. parahaemolitycus memiliki diameter  3-5  mm,  warna  koloni  biru kehijauan,  pusat  koloni  berwarna  hijau tua,  memiliki  banyak  flagela  (Richie, 2005).  Bakteri V.  parahaemolitycus adalah  bakteri  halofilik  gram  negatif yang  terdistribusi  di  perairan    pantai tropis di seluruh dunia dan menyebabkan gastroenteristis (De Paola et al , 1998).
Thermostable  direct  haemolysin
(TDH), merupakan faktor virulensi utama dari V.    parahaemolyticus ,  tidak  bersifat racun jika dipanaskan pada suhu a 60-70 0 C,  tetapi  akan  bersifat  racun  kembali jika  dipanaskan  lebih  tinggi  dari  80 0 C. Fenomena  yang  berlawanan  ini  dikenal dengan efek Arrhenius , telah mengingatkan  peristiwa  yang  belum terjelaskan  selama  100  tahun.  Hal  ini menunjukkan bahwa efek ini berhubungan dengan perubahan struktural pada protein yang
menghasilkan  fibrilus  (Fukui et  al.,
2005). V. harveyi strain FNS B08
mempunyai  ciri  koloni  berwarna  kuning
pada  media  TCBS,  mempunyai  sifat fermentatif,  metil  red,  glukosa  dan sukrosa positif. Sedangkan laktosa produksi gas dan H 2 S negatif.
Berdasarkan  hasil  identifikasi  molekuler, bakteri  ini  diperoleh  dengan  tingkat homologi 98 % dengan panjang basa 420 pb.
Liu  dan  Lee  (1999)  menyatakan bahwa Cysteine  protease ,  merupakan  zat yang  diproduksi  oleh  bakteri  patogen bercahaya V.  harveyii strain  820514, yang diisolasi dari udang windu ( Penaeus monodon) sakit. Protease mematikan bagi P.  monodon dengan  kadar  LD 50 dari  0,3 µg  protein  per  gram  udang.    Selanjutnya disebutkan  bahwa  C ysteine  protease merupakan toksin utama yang diproduksi oleh  bakteri  ini.  Protease  ini  merupakan toksin cysteine  protease pertama    yang ditemukan pada Vibrio . Selain  itu, V.  harveyi strain  VIB
645,  sangat  patogen  terhadap  jenis salmon dan menghasilkan produk ektraseluler  dengan  tingkat  aktivitas hemolytic yang  tinggi  terhadap  eritrosit ikan,  ditemukan  mengandung  dua  gen hemolysin yang  berhubungan  erat  (vhhA dan  vhhB).  Sedangkan  mayoritas  strain yang diuji  hanya terdapat gen hemolysin tunggal  (Zhang,  Meaden,  dan  Austin, 2001).
Vibrio  shilonii mempunyai  ciri koloni berwarna hijau pada media TCBS, mempunyai  sifat  fermentatif,  metil  red, glukosa,  laktosa  dan  sukrosa  positif. Sedangkan produksi gas dan H 2 S negatif. Berdasarkan  hasil  identifikasi  molekuler, bakteri  ini  diperoleh  dengan  tingkat homologi  98  %  dengan  panjang  basa 1020 pb, dan tipe strain FNS D08.
Model  sistem  pemutihan  karang oleh  bakteri  telah  dipelajari  secara ekstensif . Setiap musim panas, sedikitnya  selama  12  tahun  terakhir, sekitar  70%  karang  sudah  menunjukkan terjadinya  pemutihan.  Organisme  yang menyebabkan  pemutihan  karang  ini
adalah V.  shilonii .  Patogen  ini  mengikat galactoside yang mengandung sel reseptor  dalam  lendir  karang,  dan kemudian  menembus  lapisan  karang,  di mana    bakteri  berkembang,  mencapai  > 10 8 bakteri/cm3  jaringan. V.  shilonii menghasilkan
toksin
(PYPVYAPPPVVP)  yang  menghalangi fotosintesis  intraselular zooxanthellae .
Pada  musim  dingin,  ketika  suhu  air  laut turun  di  bawah  20°C, V.  shilonii tidak bisa  bertahan  pada  karang  inang  dan karang  pulih  kembali  (Koren  dan Rosenberg, 2006).
Pemutihan karang disebabkan adanya  infeksi  dari  bakteri  spesifik (sebagai  bantahan  terhadap  pendapat pengaruh  tekanan  lingkungan)  terjadi ketika zooxanthellae hilang akibat pengaruh  toksin  yang  diproduksi  oleh bakteri  patogen.  Pemutihan  karang  oleh bakteri  terjadi  di  laut  Mediterania  pada karang  scleractinian Oculina  patagonica oleh V.  shilonii (patogen)  dan  di  lautan India dan di laut Merah pada karang laut Pocillopora  damicornis oleh Vibrio coralliilyticus patogen  (Haim et  al ., 2002).
V. vulnificus mempunyai ciri koloni berwarna  biru  sampai  hijau  pada  media TCBS,  mempunyai  sifat  fermentatif  dan glukosa  positif.  Sedangkan  metil  red, laktosa,  sukrosa,  produksi  gas  dan  H 2 S negatif.  Dari  identifikasi  molekuler, bakteri  ini  diperoleh  dengan  tingkat homologi  98  %  dengan  panjang  basa 1020 pb dan tipe strain FNS E08.
Bakteri V.  vulnificus berwarna  biru sampai  hijau  pada  TCBS,  ada  beberapa yang  tumbuh swarming (bakteri  tumbuh menutupi  seluruh  permukaan  koloni datar/flat). Diameter koloni mencapai 2-3 mm,  tumbuh  bagus  pada  media  TCBS pada suhu 37 °C (Prajitno, 1995).
Selama  menginfeksi, V.  vulnificus menjangkau usus dan kemudian menyerang aliran darah dengan
menembus  dinding mucosal usus  inang
yang  mengakibatkan  septisemia.  Lee, et al ,  (2008)    menemukan  bahwa  toksin RtxA V.  vulnificus yang  dikeluarkan melalui RtxE transporter berperan terhadap  sitotoksisitas V.  vulnificus melawan sel epitel usus.

## IV. KESIMPULAN DAN SARAN
Dari hasil penelitian didapat bahwa isolat  bakteri  yang  berhasil  diidentifikasi dengan menggunakan analisis 16S rDNA dari perairan Indonesia (kepulauan Bengkalis, Sumatera dan  dari tambak di Jepara,  Jawa),  lima  strain  diantaranya sudah  terdaftar  secara  internasional  pada gen Bank Dunia, yaitu Vibrio alginolyticus,  Vibrio  parahaemolyticus,
Vibrio  harveyi,  Vibrio  shilonii, dan
Vibrio vulnificus. dengan tingkat homolog  diatas  97%,  sedangkan  dua strain diantaranya merupakan strain  yang belum  terdaftar  secara  Internasional dalam  gen  bank  dunia,  dan    ini  diyakini merupakan Vibrio sp asli Indonesia.
Perlu  dilakukan  penelitian  lanjutan terhadap  kadar  toksik,  dan  kemampuan bahaya  yang disebabkan terhadap udang, dan  upaya  pencegahan  perkembangann bakteri  tersebut  untuk  menghambat pertumbuhan  bakteri Vibrio sp  pada budidaya  udang  windu  khususnya  dan pada  budidaya  perikanan  umumnya. Kemudian  perlu  dilakukan  penelitian mendalam  terhadap  kedua  strain  yang diduga  merupakan  strain  asli  Indonesia yang diharapkan bisa menjadi pengkayaan  strain Vibrio sp  pada  gen bank bakteri dunia.

## DAFTAR PUSTAKA
Alcamo, I, E, 1983. Laboratory Fundamentals  of  Microbiology. Addison Wesley Publishing Company, Inc. New York. 324 pp. Andrito, W. 2007. Karaterisasi Molekuler Bakteri  Probiotik  pada  Saluran
Pencernaan  Ikan  Kerapu  Bebek ( Chromileptes  altivelis )  Berbasis Teknik  16  S  rDNA.  Skripsi, Faperika Universitas Riau. Pekanbaru. (Tidak diterbitkan). Buwono,  D.  2004.  Jenis  Penyakit  pada Ikan (Finfish) Budidaya Air Payau. Balai Besar Pengembangan Budidaya  air  Payau  Jepara.  Online <http://www.dkp.go.id/content.php ?c=1843>.
De Paola, A, C.A. Kaysner, and B. John. 1998.  Environmental  Investigation of Vibrio parahaemolitycus in oyster after Outbreakes in Washington, Texas and New York. Online <http://www.aem.asm.org/egi/cont ent/full/66/11/4649>.
Fukui  T.,  K.  Shiraki,  D.  Hamada,  K. Hara,  T.  Miyata,  S.  Fujiwara,  K. Mayanagi,  K.Yanagihara.  2005.
Thermostable  direct  hemolysin of
Vibrio parahaemolyticus is a Bacterial Reversible Amyloid Toxin. Biochemistry, 44(29):9825– 9832. Online <http://pubs.acs.org/cgi- bin/abstract.cgi/bichaw/2005/44/i2 9/abs/bi050-311s.html>.  (Diakses 05 November 2008). Handayani, A. 2008. Karakteristik Molekuler Bakteri Vibrio sp Penyebab  Penyakit  pada  Udang Windu  ( Paneus  monodon )  dengan
Sekuence  DNA  16S.  Pekanbaru. Skripsi Faperika Unri. (tidak
diterbitkan). Hagstrom,  A.,  J.F.  Pinhassi,  and  U.L. Zweiefel.  2000.  Biogeoghraphycal Diversity Among Marine Bacterioplankton. Aquatic Microbial Technology Aquatic
Microbial  Technology ,    21:  231- 244. Haim, B. 2002. Disease Overview. Coral Disease Identification
and
Information.
<http://www.coral.noaa.gov/seakey s/real_data.shtml/>.    (Diakses  16 September 2008) Harth,  E.,  J.  Romero,  R.  Torres,    and  R. Espejo. 2007. Intragenomic Heterogenity and Intergenomic Recombination among Vibrio parahaemolitycus 16S rDNA. Microbiology ,  153: 2640-2647. Liu,  P.C.  and  K.K.  Lee.  1999.  Cysteine Protease  is  a  Major  Exotoxin  of Pathogenic Luminous Vibrio harveyi in  The  Tiger  Prawn, Penaeus monodon . Letters in Applied  Microbiology ,    28(6):428- 430.
Lopillo,  R.  2000.  Isolasi  dan  Identifikasi
Bakteri  Heterotropik  pada  Tambak yang  Antagonis  Terhadap Vibrio harveyi dan Vibrio parahaemolyticus . Skripsi, Faperikan Unri. Pekanbaru, 27 hal. Lusiano, A. 2007. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Hidrokarbonoklastik dengan Sekuens  16S  rDNA  dari  Sedimen Perairan  Dumai.  Skripsi.  Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Universitas Riau.
Parjitno.  1995.  Primadona  Penyakit Udang Windu di Tambak. Makalah Penelitian  Nasional  Keterampilan dan  Bina  Usaha  Mandiri  bidang Budidaya  Air  Payau  dan  tawar. Malang: Mahasiswa Pemuda Pedesaan  Brawijaya.  Malang.  17 hal. Radjasa,  K.  O.  2006.  Rapid  Grouping  of Marine  Psychrotrophic  Bacteria Using  Restriction  Fragent  Length Polymorphism  Analysis  of  PCR Amplified 16S. Internet. <http://www.karnaradjasa.com>. Reed,  A.P.  and  R.F.  Floyd.  2002.  Vibrio Infection  of  Fish.  University  of <http://edis.ifas.ufi.edu/pdffiles/FA /FAO3600.pdf>.
Rhodes, A. N., J. W. Urbance, H. Youga, H.  Corlew-Newman,  C.  A.  Reddy, M.  J.  Klug,  J.  M.  Tiedje,  D.  C.
Fisher,  1998.  Identification  of Bacterial  Isolates  Obtained  From intestinal  Contents  Associated with 12.000 years old Mastodon Remain. Appl.  Environ.  Microbiol .
64: 651-658.
Richie, J.P. 2005. Analisis Bakteri Vibrio Pada  Udang  Windu  ( Penaeus monodon )  Tambak  di  Bengkalis Propinsi  Riau.  Skripsi,  Faperikan UNRI. Pekanbaru (tidak diterbitkan). Wren,  B.W.  1992.  Bacterial  Exotoxin
Interaction.  In  Moleculer  Biology of  Bacterial  Infections.  Current Status  and  Future  Prospective. (Eds.  C.  E.  Hormacce,  C.W.  Penn and C.I. Smith). P.127-148. Cambridge University Press.
Zhang,  X.H.,  P.G.  Meaden,  ,  and  B.
Austin. 2001. Duplication of
Hemolysin  Genes  in  a  Virulent Isolate  of Vibrio  harveyi . Applied and  Environmental  Microbiology , 67(7): 3161-3167.