## DETEKSI  KRISTAL  PROTEIN  PADA  ISOLAT BACILLUS  SP . DENGAN PEWARNAAN COOMASSIE BRILLIANT BLUE
Detection of Protein Crystals in Bacillus sp. with the Coomassie Brilliant Blue Staining
Maria Denada Siallagan, Christina Nugroho Ekowati, Sumardi, Emantis Rosa.
Email: mariadenadasiallagan@gmail.com
Abstract Bacillus is one of the genera of bacteria that has the potential to be developed in the field of biotechnology. Bacillus is able to produce protein crystals during the stationary phase in its life cycle. This protein crystal is a protoxin that is active will be pathogenic in insects. In this study, protein  crystal  staining  was  carried  out  using  coomassie  brilliant  blue  dye  on  the  isolate  of Bacillus sp. with isolate code B1, B2, and B3. Before being stained, the three isolates were bred on Nutrient Broth (NB) medium at pH 5, pH 7, and pH 9, then incubated for 72 hours. Based on research results, the three isolates were detected to produce protein crystals. Crystal protein of  Bacillus sp. on media with a pH of 5 and pH 7 located at the end of the spore, while the protein crystal of Bacillus sp. isolate  on media with a pH of 9 located on the outside of the spores.
Keywords : Protein  crystals, Bacillus, coomassie brilliant blue
Abstrak Bacillus  merupakan  salah  satu    marga  bakteri  yang  memiliki  potensi  untuk  dikembangkan dalam bidang bioteknologi. Bacillus mampu menghasilkan kristal protein selama fase stasioner dalam siklus hidupnya. Kristal protein ini merupakan protoksin yang dalam keadaan aktif akan bersifat  patogenik  pada  serangga.  Pada  penelitian  ini,  dilakukan  pewarnaan  kristal  protein menggunakan pewarna coomassie brilliant blue pada isolat Bacillus sp. dengan kode isolat B1, B2, dan B3. Ketiga isolat tersebut dibiakkan pada media Nutrient Broth (NB) dengan pH 5, pH 7,  dan  pH  9,  selama  72  jam.  Hasil  penelitian  menunjukkan  ketiga  isolat  tersebut  terdeteksi meghasilkan kristal protein. Kristal protein isolat Bacillus sp. pada media dengan pH 5 dan pH 7 terletak di bagian ujung spora, sementara kristal protein isolat Bacillus sp. pada media dengan pH 9 terletak pada bagian luar spora.
Kata Kunci : Kristal protein, Bacillus, coomassie brilliant blue

## PENDAHULUAN
Bacillus merupakan baketri Gram positif berbentuk  batang  yang  memiliki  beragam kemampuan fisiologis. Bacillus sering digunakan  dalam  bidang  bioteknologi.  Hal  ini dikarenakan Bacillus memiliki  kemampuan unik  untuk  bereplikasi  dengan  cepat,  tahan terhadap  kondisi  lingkungan  yang  buruk  serta memiliki  kemampuan  sebagai  biokontrol. Bacillus mampu  menghasilkan  endospora. Endospora  yang  dihasilkan  tersebut  dapat berbentuk  bulat,  oval,  elips  atau  silinder. Pembentukan  spora  ini  dipengaruhi  oleh beberapa  faktor  diantaranya  pH,  oksigen  dan suhu  lingkungan.  Pada  pH  lingkungan  yang cenderung  konstan  sporulasi  tidak  akan terpengaruh  secara  signifikan,  namun  jika terjadi  penurunan  atau  kenaikan  pH  secara signifikan maka hal tersebut akan mempengaruhi efisiensi sporulasi.
Pada fase sporulasi, Bacillus menghasilkan  kristal  protein  yang  merupakan toksin  bagi  serangga.  Berdasarkan  penelitian Icgen,  dkk.  mengenai  pengaruh  pH  pada pembentukan  kristal  protein  diketahui  bahwa kristal  protein  terbentuk  pada  pH  5,5-8,5 namun  pH  yang  efisien  dalam  proses pembentukan kristal protein Bacillus thuringiensis adalah pH 5,5-6,5. Kristal protein ini memiliki kemampuan membunuh serangga secara spesifik pada ordo Diptera, Lepidoptera, Coleoptera,  dan  Nematoda.  Kristal  protein dalam  bentuk  protoksin  akan  aktif  menjadi toksin pada midgut serangga yang memiliki pH basa.
Keberadaan kristal protein Bacillus yang dikultur pada media dengan berbagai pH masih sedikit  sekali  diteliti.    Oleh  karena  itu,  dalam penelitian  ini  dilakukan  deteksi  kristal  protein Bacillus sp. yang dikultur pada pH 5, pH 7, dan pH 9 menggunakan coomassie brilliant blue .

## BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2020  di  Laboratorium  Mikrobiologi  Jurusan Biologi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
Peremajaan Isolat Bacillus sp. Isolat Bacillus sp.  merupakan    koleksi Laboratorium  Mikrobiologi  Jurusan  Biologi Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam, Universitas Lampung. Isolat Bacillus sp. ini  diisolasi  dari  biji  kopi    yang  ada  di  kebun kopi Desa Sumber Rejo, Kabupaten
Tanggamus, Lampung, yang diberi kode isolat
B1,  B2,  dan  B3.  Ketiga  isolat  tersebut diinokulasikan pada media Nutrient Broth (NB) pada  pH  5,  pH  7,  dan  pH  9  yang  kemudian diinkubasi selama 72 jam pada suhu ruang.

## Pembuatan Larutan Coomassie Briliant Blue
Coomassie o,1 gram dilarutkan ke dalam 30 mL metanol,  kemudian  ditambahkan  5  mL  asam asetat dan 65 mL aquades. Setelah itu, larutan diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 2 jam  kemudian  disaring  menggunakan  kertas Whatman no. 1 dan disimpan di suhu 20°C.

## Pewarnaan Kristal Protein
Satu ose Bacillus sp. diinokulasikan pada gelas objek yang steril kemudian difiksasi. Setelah itu dibubuhkan  pewarna coomassie  brilliant  blue dan  didiamkan  selama  3  menit.  Kemudian objek  dibilas  dengan  air  mengalir  lalu dikeringkan  dan  diamati  dibawah  mikroskop dengan perbesaran 1000x.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  pengamatan  kristal  protein  pada  isolat Bacillus sp. dengan kode B1, B2, dan B3 yang telah dikultur pada pH 5, pH 7, dan pH 9 ditampilkan pada  gambar  1-9  dan  pada  tabel.  Selain  itu dilakukan juga pengamatan pada E. coli sebagai kontrol negatif.
a b c K S K S B K
Gambar 1. Kristal protein dan sel isolat Bacillus pada  berbagai  macam  pH  media, ilustrasi kristal protein  dan  spora  ada  di  bagian gambar kanan atas .
a. Isolat Bacillus sp. B1 pH 5
b. Isolat Bacillus sp. B1 pH 7
c. Isolat Bacillus sp. B1 pH 9
d. Isolat Bacillus sp. B1 pH 5
e. Isolat Bacillus sp. B2 pH 7 f. Isolat Bacillus sp. B2 pH 9
g. Isolat Bacillus sp. B3 pH 5
h. Isolat Bacillus sp. B3 pH 7 i. Isolat Bacillus sp. B3 pH 9 j. Isolat E. coli
Keterangan : k adalah kristal protein, s adalah
spora,  E adalah E. coli , B adalah Bacillus sp., adalah spora, adalah kristal protein Tabel 1. Letak Kristal Protein Isolat Bacillus Pada Berbagai Macam pH No Isolat Letak Kristal Protein pH 5 pH 7 pH 9 1. Bacillus sp. B1 Ujung spora Ujung spora Luar spora. 2. Bacillus sp. B2 Ujung spora Ujung spora Luar spora 3. Bacillus sp. B3 Ujung spora Ujung spora Luar spora 4. E. coli - Tidak menghasilkan kristal protein - Pada  pengamatan  di  bawah  mikroskop binokuler dengan  perbesaran 1000x, diketahui bahwa isolat Bacillus sp. dengan kode B1, B2,
dan B3 menghasilkan kristal protein baik di pH 5, pH 7, maupun pH 9. Pada proses pewarnaan,
Coomassie  Brilliant  Blue berikatan  dengan
d e f g j i h B K K S K S K K S B K S E
protein  melalui  interaksi  ionik  antara  gugus asam  sulfonat  dan  gugus  amino  positif.  Pada isolat  B1,  B2  dan  B3  yang  diinkubasi  pada media NB dengan pH 9, kristal protein berada diluar spora. Hal ini dapat disebabkan oleh pH basa  yang  mendukung  autolisis  spora  dan mengaktifkan toksin kristal protein.
Berdasarkan gambar, kristal protein  pada isolat B1  memiliki  bentuk  yang  lebih  oval dibandingkan dengan isolat B2 dan B3. Hal ini menunjukkan Bacillus memiliki  jenis  kristal protein  yang  berbeda-beda.  Sementara  pada isolat E.  coli tidak  terlihat  adanya  kristal protein. Isolat Bacillus sp. dengan kode B1, B2, dan  B3  ini  memiliki  potensi  sebagai bioinsektisida  karena  memiliki  kristal  protein. Pada penelitian Nair, dkk. dilakukan pengamatan kristal protein
Bacillus thuringiensis dengan mikroskop fluoroscence . Bagian  kristal  protein  pada  pengamatan tersebut terlihat berwarna hijau dan berpendar, serta bentuknya oval.

## KESIMPULAN
Isolat Bacillus sp.  dengan kode isolat  B1,  B2, dan  B3  mampu  menghasilkan  kristal  protein pada  pH  5,  pH  7,  maupun  pH  9  dan  dapat dideteksi dengan melakukan pewarnaan menggunakan coomassie brilliant blue .

## DAFTAR PUSTAKA
Blaskesley, R. W., Boezi, J. A . 1977. A New Staining  Technique  for  Proteins  in
Polyacrylamide Gel Electrophoresis.  J. Chromatog , 569 ,
75-196.
Bravo,  A.,  Gill,  S.S.,  Soberon,  M. .  2005. Bacillus  thuringiensis Mechanisms  and
Use In: Comprehensive Molecular Insect Science.  Elsevier  BV,  Amsterdam,  pp. 175-206. Chengchen Xu, Bi- Cheng Wang, Ziniu YU dan Ming Sun . 2014. Structural Insights inti Bacillus thuringiensis Cry, Cyt and Parasporin Toxins. Toxins , 6 , 2732-2270. Compant S., Duffy B., Nowak J., dkk . 2005. Use of plant growth promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects. Appl Environ Microbiol , 71 (9): 4951-4959.
Hatmanti, Ariani . 2000. Pengenalan Bacillus spp.. Oseana , Vol. XXV (1), 31-41. Icgen, Y., Bulent Icgen, dan Gulay Ozcengiz. 2002. Regulation of crystal protein biosynthesis by Bacillus thuringiensis I. Effect of mineral elements and pH. Elsevier Research in Microbiology 153 , 599-604.
Monteiro,  M.S.,  Joao  J.  Clemente,  Adriano O. Henriques, Rui J. Gomes, Manuel J. Carrondo, dan Antobio E. Cunha . 2005.  A  Procedure  for  High-Yield Spore  Production  by Bacillus subtilis . Biotechnol , 21 (1026-1031).          775- 806.
Nair,  M . S.,  Marianne  M.  Lee,  Astrid Bonnegarde-Bernard, Julie A.
Wallace,  Donald  H.  Dean,  Michael C.  Ostroeski,  Richard  W.  Burry, Prosper  N.  Boyaka,  Michael  K. Chan .  2015.  Cry  Protein  Crystals:  A Novel  Platform  for  Protein  Delivery. Research Article.