## Amplifikasi Gen COI dan 16s rRNA dari Invertebrata Laut Plakobranchus ocellatus
Fitria Eka Aprilia 1) , Aris Soewondo 1) , Widodo 1) , Abdul Hamid A. Toha 2)
1) Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Brawjaya, Malang
2) Jurusan Perikanan, Fakultas Peternakan, Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Negeri Papua, Manokwari, Papua Barat Fitria eka aprilia: aprill.lia62@yahoo.com

## ABSTRAK
Studi mengenai hubungan kekerabatan, evolusi dan identifikasi spesies secara molekuler tidak  terlepas  dari  isolasi  DNA  dan  amplifikasi  gen  COI  dan  16s  rRNA.  Keberhasilan  isolasi DNA  dan  amplifikasi  gen  COI  dan  16S  rRNA  merupakan  langkah  awal  yang  penting  untuk studi mengenai hubungan kekerabatan, evolusi dan identifikasi spesies. Penilitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi gen COI dan 16S rRNA dari invertebrata laut yang diambil dari Raja Ampat,  Plakobranchus  ocellatus.  Sepasang  primer  COI  universal  LCO-1490  dan  HCO-2198 digunakan untuk mengamplifikasi fragmen gen COI dari P.ocellatus, sedangkan amplifikasi gen 16s  rRNA  menggunakan  sepasang  primer  16Sar-L  dan  16Sbr-L.  Fragmen  gen  COI  dan  16S rRNA berhasil teramplifikasi dengan panjang amplikon masing-masing sekitar 680 bp dan 450 bp.
Kata kunci: COI, gen, identifikasi, Plakobranchus ocellatus dan 16S rRNA

## ABSTRACT
The  first  important  step  to  study  about  organism  relationship,  evolution  and  species identification  are  DNA isolation and  amplification  of 16S rRNA  and  COI  genes.  This  research aimed  to  amplify  COI  and  16S  rRNA  genes  of  marine  invertebrates  taken  from  Raja  Ampat, Plakobranchus ocellatus. A pair of COI universal primer LCO-1490 and HCO-2198 was used for ampification  a  fragment  COI  gene  P.ocellatus,  while  a  fragment  of  the  16s  rRNA  gene  was amplified using 16Sbr-L and 16Sar-L primer. Either  a fragment COI or 16S rRNA genes was successfully amplified, with a length amplicon about 680 bp and 450 bp, respectively.
Keywords : COI, gene, identification, Plakobrancus ocellatus, and 16S rRNA

## PENDAHULUAN
Studi mengenai identifikasi spesies, evolusi dan hubungan kekerabatan tidak terlepas dari  isolasi  DNA  dan  ampifikasi  gen.  Gen  COI dan  16S  rRNA    adalah  gen  yang  sering digunakan  dalam  studi  identifikasi  spesies, evolusi dan hubungan kekerabatan [1]
Gen COI dari genom mitokondria merupakan  gen  standar  yang  sering  digunakan sebagai gen penanda pada identifikasi hewan [2]. Gen  COI  merupakan  Gen  COI  memiliki  dua keunggulan.  Pertama,  primer  universal  dari  gen
ini  sangat  kokoh,  sehingga  mampu  mengenali ujung  5’  dari  sebagian  besar  kelompok  hewan. Kedua,  gen  COI  memiliki  evolusi  molekuler yang paling tinggi dibandingkan dengan gen-gen di  mitokondria  yang  lain,  sehingga  memiliki variasi  intraspesifik  rendah,  tetapi  interspesifik divergensinya tinggi antara taksa yang berdekatan  [3].  Penanda  lain  yang  sering digunakan untuk mendukung identifikasi spesies adalah  gen  dari  mitokondrial  juga  yaitu  16S rRNA.  Gen 16S rRNA merupakan gen penanda lain yang berguna dalam identifikasi spesies dan
untuk  menggambarkan  hubungan  filogenetik antara organisme laut [4].
Gen  16S  rRNA  digunakan  sebagai penanda standar DNA barcoding untuk melengkapi COI [5]. Beberapa peneliti menggunakan  gabungan  data  sekuen  gen  COI dan  16S  rRNA  untuk  menyimpulkan  hubungan kekerabatan  melalui  pohon  filogeni  pada kelompok  hewan  yang  memilki  tingkat  cryptic tinggi, seperti kelompok Moluska [1] [6] [7] [8].
Tujuan dari penelitian ini yaitu mengamplifikasi  gen  COI  menggunakan  primer universal LCO-1490 dan HCO-2198 [9] dan gen 16S  rRNA  menggunakan  primer  16Sar-L  dan
16Sbr-L [10]
dari invertebrata laut
Plakobranchus ocellatus.

## METODE PENELITIAN
Pengambilan sampel. Spesimen Plakobranchus ocellatus diambil pada tanggal 13 Mei 2013 di Mios  con,  Waigeo,  Raja  Ampat, Papua.
Ekstraksi  dan  Amplifikasi  DNA.  DNA diekstraksi    dengan    Gsync    DNA    Extraction Kit (Geneaid). Langkah-langkah ekstraksi mengikuti  petunjuk  produk.  DNA    yang    telah diisolasi
diamplifikasi. Fragmen gen mitokondria  CO1  diamplifikasi  menggunakan sepasang primer LCO-1490 (5’- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’) dan HCO-2198 (5’-TAAACTTCAGGG TGACCAAAAAATCA-3’)  [9]  dan    fragmen gen  16S  rRNA  diamplifikasi  menggunakan primer 16Sar-L (5’-CG
CCTGTTTATCAAAAACAT-3’)  dan  16Sbr-H (5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’) [10]. Total volume reaksi yang digunakan untuk PCR  yaitu  25  µl.  Campuran  yang  digunakan untuk PCR antara lain ddH2O  12µl,  PCR  mix (Kapa  Taq Extra  HotStart  Ready Mix  PCR kit) 10  µl,  masing-masing  primer  (10  µM)  sebanyak 1  µl,  dan  1  µl    DNA  template.  Program  PCR  : hot  start    95°C    selama    3    menit,  denaturation 95°C  selama  30  detik, annealing 50°C  selama 30    detik,  extension  72°C    selama    1    menit  (30 siklus),    dan  post  extension  72°C    selama    1 menit.  Sampel  hasil  PCR disimpan pada suhu - 20°C.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Isolasi DNA Plakobranchus
ocellatus. DNA diisolasi dari jaringan Plakobranchus  ocellatus  menggunakan  Gsync DNA  Extraction  Kit  (Geneaid).  Hasil  isolasi DNA    dilihat  keberhasilannya  dengan  uji kualitatif elektroforesis gel agarose 1%. Berdasarkan  hasil  uji  kualitatif  isolasi  DNA, DNA    berhasil  diisolasi,    ditandai    dengan terdapat  pita tipis pada  gel  agarose  (Gambar 1, ditunjuk  oleh tanda panah).
Gambar  1.  Hasil  uji  kualitatif  isolasi  DNA  pada  gel agrose 1%. 1: Plakobranchus ocellatus
Amplifikasi  fragmen  gen  COI  dan  16S rRNA.  Sepasang  primer    universal  LCO-1490 dan    HCO-2198  [9]  mampu  mengamplifikasi secara  spesifik  gen  COI  pada  Plakobranchus ocellatus dengan  panjang  amplikon sekitar 680 bp.  Fragmen  gen  16S  rRNA  dari  P.ocellatus berhasil  diamplifikasi  menggunakan  primer 16Sar-L  dan  16Sbr-L  [10]  dengan  panjang amplikon  sekitar  450  bp.  Panjang  amplikon  gen COI dan 16S rRNA yang teramplifikasi ini sudah sesuai dengan penelitian Takano [8].

## 1
Gambar  2.  Hasil  uji  kualitatif  hasil  amplifikasi  pada gel  agarosa  1,5%.  M:  marker,  1:  Gen COI, dan 2: gen 16s RNA.
Gen  COI  memiliki  keunggulan,  primer universalnya  LCO-1490  dan  HCO-2198  [9]  dari gen  ini  sangat  kokoh,  sehingga  mampu mengenali  ujung  5’  dari  sebagian  besar kelompok  hewan,  meskipun  tidak  semuanya, tetapi  mewakili  sebagian  besar  dari  filum animalia [3].

## KESIMPULAN
Fragmen gen COI dan 16s rRNA  berhasil diamplifikasi dari invertebrata laut,
Plakobranchus ocellatus dengan panjang amplikon masing-masing sekitar 680 bp dan 450 bp.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  P.  Hamid  selaku ketua  proyek  MBRAI,  USAID  sebagai  pemberi dana,  P.Widodo  dan  P.Aris  selaku  pembimbing penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]   Feng,  Y.,  Q.  Li,  L.  Kong,  dan  X.  Zheng. 2011.  DNA  barcoding  and  phylogenetic analysis  of  Pectinidae  (Mollusca:  Bivalvia) based on mitochondrial COI and 16S rRNA genes. Mol Biol Rep (2011) 38:291–299.
[2]   Hebert,  P.D.N.,  A.  Cywinska,  S.  L.  Ball, &    J.R.    deWaard.    2003.  Biological identifications    through    DNA    barcodes. Proc.  R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 270, 313– 321.
[3]   Hajibabaei,  M.,  M.A.  Smith,  D.H.  Janzen, J.J  Rodriguez,  J.B  Whitfield,  &    P.D.N. Hebert.  2006.  A  minimalist  barcode  can identify    a  specimen  whose  DNA  is degraded. Mol Ecol Notes 6:959–964.
[4]  Guo,  X.D.,  D.  Chen,  T.  J.  Papenfuss,  N.B. Ananjeva,  D.A.  Melnikov,  Y.  Wang.  2011 Phylogeny  and  divergence  times  of  some racerunner  lizards  (Lacertidae:  Eremias) inferred from mitochondrial 16S rRNA gene segments.  Molecular  Phylogenetics  and Evolution 61 (2011) 400–412.
[5]  Vences,  M.,  M.  Thomas,  A.  van  der Meijden,  Y.Chiari  dan  D.R  Vieites.  2005. Comparative performance of the 16S rRNA gene  in  DNA  barcoding  of  amphibians. Frontiers in Zoology  2005, 2 :5.
[6]  Christa,  G.,  L.  Wescott,  T.F.  Schaberle, G.M.  Konig,    &  H.  Wagele. 2012. What remains  after  2  months  of  starvation? Analysis  of  sequestered    algae    in    a photosynthetic    slug,    Plakobranchus ocellatus  (Sacoglossa,  Opisthobranchia),  by barcoding. Planta.
[7]  Ni, L., Q. Li, L. Kong, S. Huang, dan L. Li. 2012. DNA barcoding and phylogeny in the family  Mactridae  (Bivalvia:Heterodonta): Evidence  for  cryptic  species.  Biochemical Systematics and Ecology 44 (2012) 164-172
[8]   Takano,  T.,    Y.M.    Hirano,    C.D. Trowbridge,  Y.J.    Hirano  dan  Yasuyuki Watano.  2013.  Taxonomic    clarification    in the genus Elysia (Gastropoda:  Sacoglossa): E. atroviridis and E. setoensis. Amer. Malac. Bull. 31(1): 25–37 (2013).
[9]  Folmer, O., M. Black, W. Hoeh, R. Lutz, & R.  Vrijenhoek.  1994.  DNA  primers    for amplification of mitochondrial Cytochrome    c  Oxidase    subunit    I    from diverse  metazoan  invertebrates. Molecular Marine  Biology  and  Biotechnology (1994) 3(5), 294-299..
[10]  Palumbi,  S.,  A.  Martin,  S.  Romano,  W.  O. McMillan,  L.  Stice,  dan  G.  Grabowski. 1991.  The  Simple  Fool’s  Guide  to  PCR. Version  2.0.  Department  of  Zoology  and Kewalo  Marine  Laboratory,  University  of Hawaii, Honolulu, Hawaii.`

## M      1       2
700 bp 500 bp