Hasil Penelitian

## HIDROLISIS IKAN BERNILAI EKONOMI RENDAH SECARA ENZIMATIS MENGGUNAKAN PROTEASE BIDURI

## [Enzymatic Hydrolysis of Low Economic Value Fishes using Biduri’s Protease]
Yuli Witono 1) *, Iwan Taruna 2) , Wiwik Siti Widrati 1) dan Amelia Ratna 1)
1) Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Jember, Jember
2) Laboratorium Enjiniring Hasil Pertanian, Jurusan Teknik Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Jember, Jember
Diterima 20 November 2013 / Disetujui 08 Agustus 2014

## ABSTRACT
Fish  protein  hydrolyzate  is  a  product  obtained  from  the  decomposition  of  fish  proteins  into  short-chain  compounds  due  to  the  hydrolysis process either by enzymes, acids, or bases. The purpose of this study  was to optimize the production of fish  protein hydrolyzate from the low economic value fishes including 'bibisan' (Apogon albimaculosus), 'baji-baji' (Platycephalidae cymbacephalus), and the 'lidah' (Cynoglossus lingua) obtained  from  Talango  Island,  Madura.  Production  of  fish  protein  hydrolyzate  was  conducted  using  (Calotropis  gigantea)  protease  at  various concentrations  (0,  0.7,  1.4,  and  2.1  Unit/g)  and  at  various  hydrolysis  times  (0,  1.5,  and  3  h).  The  experimental  design  was  a  Completely Randomized Design with two factors and the experiments  were carried out in triplicates. The results showed that interactions between protease concentrations  and  hydrolysis  times  significantly  affected  (at  5%  level  test)  the  soluble  proteins,  maillard  products,  and  the  level  of  rancidity measured as thiobarbituric acid (TBA). The best fish hydrolyzate product based on the soluble protein parameter was resulted from 2.1 unit/g of biduri’s protease with a hydrolysis time of 1.5 h. The hydrolyzate produced had 3.51% of soluble proteins, a maillard value of 0.63, and rancidity levels of 12.21 mmol TBA/kg.
Keywords: biduri protease, hydrolyzate, low economic value fishes, soluble protein

## ABSTRAK
Hidrolisat  protein  ikan  merupakan  produk  yang  dihasilkan  dari  penguraian  protein  ikan  menjadi  senyawa-senyawa  berantai  pendek  karena adanya proses hidrolisis baik oleh enzim, asam, maupun basa. Tujuan penelitian ini adalah melakukan optimasi produksi hidrolisat protein dari ikan yang  bernilai  ekonomi  rendah  yang  didapat  dari  Pulau  Talango,  Madura.  Ikan  tersebut  meliputi  ‘bibisan’  ( Apogon  albimaculosus ),  ‘baji-baji’ ( Platycephalidae  cymbacephalus ),  dan  ‘lidah’  ( Cynoglossus  lingua ).  Produksi  hidrolisat  protein  dari  ikan  ini  dilakukan  dengan  hidrolisis menggunakan enzim protease dari tanaman biduri ( Calotropis gigantea ). Perlakuan dengan protease dari tanaman biduri dilakukan pada berbagai konsentrasi enzim (0; 0.7; 1.4; and 2.1 Unit/g) dan waktu hidrolisis (0; 1.5; dan 3 jam). Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap dengan dua perlakuan dan diulang sebanyak tiga kali. Hasil penelitian menunjukkan bahwa interaksi konsentrasi protease biduri dan lama hidrolisis berpengaruh nyata (α=5%) terhadap protein terlarut, nilai produk maillard dan tingkat ketengikan. Hidrolisat terbaik  berdasarkan kelarutan  protein  diperoleh  dari  perlakuan  2.1  Unit  protease  biduri/g  dan  lama  hidrolisis  1.5  jam  dengan  karakteristik  hidrolisat  meliputi  kadar protein terlarut 3.51%; nilai produk maillard 0.63; dan nilai TBA (tingkat ketengikan) 12.21 (mmol/kg).
Kata kunci: hidrolisat, ikan bernilai ekonomi rendah, protease biduri, protein terlarut

## PENDAHULUAN
1
Ikan sebagai salah satu bahan pangan merupakan sumber protein  hewani  yang  tinggi.  Protein  merupakan  komponen  gizi terbesar yang terdapat dalam daging ikan (30–80%), sehingga ikan  merupakan  sumber  protein  hewani  yang  potensial.  Ikan segar  merupakan  ikan  yang  baru  saja  ditangkap,  belum disimpan,  atau  diawetkan  dan  mempunyai  mutu  yang  tidak berubah  serta  tidak  mengalami  kerusakan  (SNI,  2006).  Ikan segar  mudah  mengalami  kerusakan  setelah  ditangkap  yang akan  diikuti  oleh  proses  pembusukan.  Perubahan  pada  ikan setelah  ditangkap  dan  selama  penyimpanan  meliputi  aktivitas mikroba, enzim autolysis dan reaksi kimia yang dapat dijadikan
*Penulis Korespondensi: E-mail: yuliwitono.ftp@unej.ac.id
indikator  mutu.  Kemunduran  mutu  ikan  juga  dapat  dideteksi dengan  pengujian  secara  kimiawi  seperti  kandungan total volatile  base (TVB), thiobarbituric  acid (TBA), trimethyl  amine (TMA), dan amina biogenik, terutama histamin.
Kerusakan ikan ini menyebabkan mutu ikan menjadi rendah, bahkan  dari  penanganan  yang  kurang  tepat  atau  sortasi  ikan untuk  keperluan  industri  pengolahan  ikan,  dihasilkan  banyak sekali ikan yang bermutu rendah. Apalagi sewaktu panen raya, jumlah  ikan  yang  inferior  (bernilai  ekonomi  rendah)  berlimpah dan tidak dapat tertangani secara optimal. Beberapa jenis ikan inferior  yang  potensial  untuk  dimanfaatkan  sebagai  protein fungsional dalam bentuk hidrolisat protein ikan terdapat di Pulau Talango,  Madura  yang  meliputi  ‘bibisan’  ( Apogon albimaculosus ),  ‘baji-baji’  ( Platycephalidae  cymbacephalus ), dan  ‘lidah’  ( Cynoglossus  lingua ).  Hidrolisis  enzimatis  protein ikan potensial sebagai sumber komponen bioaktif peptida yang
Hasil Penelitian
belum banyak dikembangkan. Hidrolisat protein ikan (HPI) telah terbukti  memiliki  efek  hipokolesterolemik  (Wergedahl et  al . 2004),  antioksidan  (Je et  al .  2008),  dan  anti-inflamasi (Marchbank et  al .  2009).  Salah  satu  contoh  pemanfaatan  HPI adalah untuk pembuatan pepton yang digunakan sebagai media pertumbuhan  mikroorganisme  dan  dibutuhkan  dalam  per- kembangan  bioteknologi  (Wijayanti,  2009).  Hidrolisat  protein pangan  memiliki  aplikasi  yang  luas  sebagai  komponen  gizi, industri makanan, kesehatan dan kosmetik (Radha et al . 2008). Hidrolisat  protein  juga  dapat  digunakan  untuk  meningkatkan rasa makanan.
HPI dapat diproduksi secara kimia dan enzimatis. Hidrolisis enzimatis  merupakan  pilihan  metode  paling  aman  dan  lebih menguntungkan  dibanding  metode  kimiawi,  karena  metode  ini menghasilkan  asam-asam  amino  bebas  dan  peptida  dengan rantai  pendek  yang  bervariasi.  Produk  tersebut  mempunyai rentang kegunaan yang lebih luas dalam industri pangan (Kunst, 2000). Salah satu enzim protease yang dapat digunakan untuk pembuatan HPI adalah protease dari tanaman biduri ( Calotropis gigantea ).  Ekstrak  dari  tanaman  biduri  baik  dari  bagian  getah, batang maupun daun potensial sebagai sumber enzim protease (Witono et  al .  2007).  Hasil  karakterisasi  enzim  protease  dari tanaman  biduri,  berdasarkan  spesifikasinya,  mengindikasikan secara  kuat  termasuk  dalam  golongan  eksopeptidase  (Witono dan Kang, 2010) yang sesuai untuk aplikasi dalam pembuatan hidrolisat protein flavour enhancer .
Penelitian HPI dari ikan bernilai ekonomi rendah dari pulau Talango  Madura  menggunakan protease  biduri  hingga  saat  ini belum pernah dilakukan. Dalam penelitian ini dilakukan proses produksi  secara  enzimatis  dengan  variasi  konsentrasi  enzim dan lama hidrolisis untuk menentukan perlakuan terbaik dengan melakukan analisa pada kadar protein terlarut, absorbansi nilai produk  maillard,  warna  dan  tingkat  ketengikan  dari  hidrolisat protein  ikan  yang  dihasilkan  untuk  menentukan  perlakuan terbaik.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan utama yang digunakan adalah tiga jenis ikan bernilai ekonomi rendah meliputi ‘bibisan’ ( Apogon albimaculosus ), ‘baji- baji’ ( Platycephalidae cymbacephalus ), dan ‘lidah’ ( Cynoglossus lingua )  yang  didapatkan  dari  pulau  Talango,  Madura,  Jawa Timur.  Enzim  protease  biduri  diperoleh  dari  ekstrak  getah tanaman  biduri  melalui  metode  Witono et  al .  (2006)  dengan aktivitas spesifik 0.14 Unit/mg.

## Pengambilan dan preparasi sampel
Ikan  bernilai  ekonomi  rendah  yang  digunakan  adalah  ikan segar  yang  diperoleh  dari  hasil  tangkapan  nelayan  di  pulau Talango  Madura.  Ikan  diidentifikasi  jenisnya  di  Laboratorium Taksonomi, Fakultas Perikanan, Universitas Brawijaya Malang, kemudian dihilangkan kepala, kotoran, kulit dan tulangnya untuk mendapatkan fillet ikan.

## Produksi hidrolisat protein ikan
Fillet ikan sebanyak 100 g dengan komposisi ikan bibisan: baji-baji:  lidah  =  1  :  1  :  1,  ditambah  dengan  aquades  dengan perbandingan  bahan:  aquades  =  1  :  2.  Larutan  yang  didapat kemudian  dikondisikan  pada  pH  7.0  (pH  meter  merk Jen  Way type 3320,  Jerman)  dan  ditambah  enzim  protease  biduri  pada berbagai  konsentrasi  (0;  0.7;  1.4;  dan  2.1  Unit/g).  Inkubasi dilakukan dalam penangas pada suhu 55°C selama 0; 1.5; dan 3  jam.  Kemudian  sampel  dididihkan  menggunakan  penangas listrik  ( Gerhardt )  pada  suhu  100°C  selama  10  menit  untuk menghentikan  proses  hidrolisis.  Sampel  dikeringkan  pada  alat pemanas  (Memmert)  suhu  60°C  selama  ±18  jam.  Hidrolisat kering  yang  didapat  kemudian  dihaluskan  hingga  ukuran  80 mesh .

## Parameter pengamatan
Variabel  yang  diamati  meliputi  warna  metode  Hutching (1994)  menggunakan colour  reader (Minolta)  yang  meng- hasilkan nilai atribut L, a, dan b. Nilai o Hue dihitung dari nilai a dan b yang diperoleh menggunakan persamaan °Hue = arc tan (a/b). Kadar protein terlarut menggunakan metode Lowry (1951 dalam  Walker,  2002)  dengan  modifikasi,  tingkat  ketengikan menggunakan  metode  TBA  dengan  modifikasi  (Subagio et  al . 2002), dan nilai produk maillard (Hofmann et al . 1999). Analisa data  menggunakan  analisa  ragam  (ANOVA)  dan  jika  terdapat perbedaan  nyata  dilanjutkan  dengan  uji  Tukey  pada  taraf  5% untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kadar protein terlarut
Optimasi  perlakuan  dalam  penelitian  ini  dilakukan berdasarkan  analisis  kadar  protein  terlarut.  Uji  lanjut  Tukey (Tabel  1)  menunjukkan  bahwa  hidrolisis  0  jam  menggunakan protease  biduri  0.7  Unit/g  tidak  terdapat  perbedaan  nyata, sedangkan  perbedaan  nyata  ditunjukkan  pada  konsentrasi enzim  1.4  Unit/g  dan  2.1  Unit/g.  Perlakuan  2.1  Unit/g  meng- hasilkan  kadar  protein  terlarut  tertinggi  yang  menunjukkan perbedaan nyata jika dibandingkan perlakuan lainnya, sedang- kan  penambahan  enzim  0.7  Unit/g  dan  1.4  Unit/g  tidak  me- nunjukkan  perbedaan  nyata.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa protease biduri dapat bekerja pada suhu ruang sesaat setelah ditambahkan pada substrat, walaupun kondisi optimal kerjanya pada  suhu  55°C.  Protease  biduri  termasuk  dalam  golongan eksopeptidase  yang  terdiri  dari  karboksi-ekso-peptidase  yang memotong  peptida  dari  arah  gugus  karboksil  terminal  dan amino-eksopeptidase dari gugus terminal (Mubarik et al . 2000). Hidrolisis menggunakan konsentrasi enzim 2.1 Unit/g dan waktu inkubasi  1.5  jam  merupakan  perlakuan  terbaik  dengan  kadar kelarutan  protein  tertinggi  sebesar  3.509%.  Penelitian  lain (Koeswardani et al . 2011) dalam pembuatan ikan rucah meng- gunakan  enzim  papain  5%  dan  waktu  inkubasi  1  jam  meng- hasilkan kadar protein terlarut sebesar 12.53%.
Hasil Penelitian
Enzim protease mampu menghidrolisis ikatan peptida pada protein.  Faktor-faktor  yang  mempengaruhi  proses  hidrolisis meliputi  rasio  enzim  dan  substrat,  perbedaan  jenis  enzim,  pH, waktu dan suhu hidrolisis (Dumay et al . 2006). Hidrolisis protein ikan  menggunakan  protease  dari  tanaman  dan  mikroba  lebih sesuai untuk menghasilkan HPI jika dibandingkan protease dari hewan (Bhaskar et al . 2008).  Enzim protease biduri diindikasi- kan secara kuat termasuk dalam golongan eksopeptidase yang mampu  menghasilkan  fragmen  peptida  dan  asam  amino sehingga  sesuai  untuk  produksi flavour  enhancer (Witono  dan Kang,  2010).  Hidrolisis  menggunakan  enzim  protease  lainnya dari  golongan  endopeptidase  hanya  mampu  menghasilkan fragmen peptida (Kaneda et al .  1997) sehingga kurang sesuai digunakan dalam produksi flavour enhancer.
Tabel 1.  Kadar  protein  terlarut  pada  HPI  dari  ikan  bernilai  ekonomi rendah dengan konsentrasi enzim protease biduri dan waktu hidrolisis yang berbeda Waktu (Jam) Konsentrasi Enzim (Unit/g) Protein Terlarut (%) 0 0 2.244±0.009 a 0 0.7 2.405±0.299 a 0 1.4 3.017±0.045 bc 0 2.1 3.034±0.082 bc 1.5 0 2.384±0.211 a 1.5 0.7 3.046±0.040 bc 1.5 1.4 3.248±0.047 cd 1.5 2.1 3.509±0.055 d 3 0 2.534±0.269 a 3 0.7 2.685±0.055 ab 3 1.4 3.261±0.246 cd 3 2.1 3.436±0.078 cd
Keterangan: *Huruf yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan nyata antar perlakuan berdasarkan hasil uji lanjut Tukey pada taraf 5%
Perubahan  konsentrasi  enzim  protease  biduri  berbanding lurus dengan  perubahan kadar protein terlarut  dalam hidrolisat yang  dihasilkan.  Hal  ini  dikarenakan  enzim  protease  men- degradasi  protein  menjadi  peptida  pendek  dan  asam  amino yang  mudah  larut.  Rasio  enzim:substrat  (konsentrasi  enzim) berbanding  lurus  dengan  derajat  hidolisa.  Peningkatan  enzim protease  meningkatkan  jumlah  nitrogen  terlarut  dari  hidrolisat selama proses hidrolisis (Wang et al . 2007). Dalam penelitian ini konsentrasi  enzim  terbesar  (2.1  Unit/g)  merupakan  perlakuan terbaik dengan kadar protein terlarut tertinggi. Hal ini didukung oleh penelitian Bhaskar et al . (2008), yang menyebutkan bahwa enzim  protease  dari  jenis alcalase dapat  bekerja  optimal menghidrolisis protein limbah jeroan pada konsentrasi 1.5% dan dinyatakan  pada  konsentrasi  ini  derajat  hidrolisis  memasuki fase  stasioner.  Penelitian  hidrolisis  ikan  rucah  menggunakan enzim  papain  yang  dilakukan  oleh  Koesoemawardani et  al . (2011)  mendapatkan  kondisi  optimal  pada  konsentrasi  enzim 5%.  Penggunaan  enzim  di  atas  jumlah  optimal  tidak  memberi pengaruh terhadap kadar protein terlarut karena selama proses tidak  ada  penambahan  substrat  dan  substrat  yang  tersedia sudah habis digunakan selama proses hidrolisis.
Kadar protein terlarut hidrolisat juga dipengaruhi oleh waktu hidrolisis.  Hidrolisis  pada  saat  0  jam  dilakukan  untuk  me- ngetahui  pengaruh  penambahan  enzim  sesaat  setelah ditambahkan  pada  substrat.  Hasil  penelitian  menunjukkan
adanya  peningkatan  kadar  protein  terlarut  dengan  adanya peningkatan konsentrasi enzim. Hal ini mengindikasikan enzim protease biduri dapat bekerja pada suhu ruang sesaat setelah ditambahkan pada substrat.  Peningkatan lama hidrolisis  dari 0 jam  ke  1.5  jam  berpengaruh  tehadap  kenaikan  kadar  protein terlarut  pada  seluruh  perlakuan.  Haslaniza et  al. (2010) menyatakan  bahwa  semakin  lama  waktu  hidrolisis,  aktivitas proteolisis  meningkatkan  degradasi  protein  semakin  luas  dan dihasilkan  derajat  hidrolisis  yang  lebih  tinggi  sehingga  kadar protein  terlarut  semakin  besar  pula.  Hal  berbeda  terjadi  pada peningkatan  lama  hidrolisis  dari  1.5  jam  ke  3  jam  yang menunjukkan  penurunan  yang  tidak  berbeda  nyata,  kecuali pada  perlakuan  konsentrasi  enzim  0  Unit/g  yang  tetap  me- nunjukkan  adanya  peningkatan.  Penurunan  kadar  protein terlarut  pada  hidrolisis  selama  3  jam  diduga  karena  semakin lama  hidrolisis,  lebih  banyak  asam  amino  non  polar  terbentuk seperti  glisin,  alanin,  valin,  leusin,  isoleusin  dan  prolin  dari fragmen  peptida-peptida  larut  air.  Secara  umum  penambahan lama hidrolisis dari kondisi optimal tidak memberikan pengaruh terhadap  nilai  protein  terlarut  dalam  hidrolisat  karena  selama proses  tidak  ada  penambahan  substrat  dan  substrat  yang tersedia  sudah  habis  digunakan  (Koesoemawardhani et  al . 2011).
Kelarutan  yang  tinggi  dari  HPI  pada  berbagai  pH  dapat diaplikasikan  pada  produk  pangan.  Selain  itu,  hal  ini  mem- pengaruhi  komponen  fungsional  HPI  lainnya  seperti  sebagai pengemulsi  dan  komponen  buih  (Gbogouri et  al .  2004).  HPI yang  didapat  melalui  hidrolisis  enzimatis  terkontrol  memiliki komponen  nutrisi  yang  baik  seperti  keseimbangan  komposisi asam amino dan kelarutan yang tinggi, tetapi utamanya diguna- kan untuk nutrisi hewan (Nolsoe dan Undeland, 2009).

## Nilai produk maillard
Reaksi  maillard  ( browning  non  enzymatic )  merupakan reaksi  antara  gugus  karbonil  dan  gugus  amina  primer  yang melibatkan  reaksi  kondensasi  (Miao  dan Roos,  2004).  Salah satu  aplikasi  produk  maillard  dalam  bidang  pangan  adalah pembentukan flavour yang  dihasilkan  dari  reaksi  antara  gula reduksi  dan  senyawa-senyawa  amino  untuk  membentuk glikosamin  (Motrram,  1998).  Gugus  amino  residu  lisin  yang terikat pada peptida dan protein berperan penting dalam reaksi disebabkan  kereaktifannya  yang  tinggi.  Selain  itu  gugus  α- amino terminal juga berperan dalam reaksi maillard.
Hasil  penelitian  menunjukkan  konsentrasi  protease  biduri dan waktu hidrolisis berpengaruh nyata (α=0.05) terhadap nilai absorbansi  produk  maillard  HPI  dari  ikan  bernilai  ekonomi rendah (Gambar 1). Semakin besar konsentrasi protease biduri dan semakin lama hidrolisis, maka nilai produk maillard dari HPI yang  dihasilkan  semakin  tinggi.  Hasil  ini  didukung  oleh  hasil penelitian Subagio et al . (2002) yang menunjukkan bahwa nilai absorban  produk  maillard  dari  hidrolisat  tempe  kedelai meningkat seiring dengan semakin lamanya waktu hidrolisis.
Lisin adalah jenis asam amino yang paling reaktif bereaksi dengan  gula  reduksi,  sedangkan  sistein  adalah  asam  amino yang paling tidak reaktif.  Residu lisin protein pada awal reaksi berikatan  dengan  gula  reduksi  membentuk  senyawa  turunan deoksiketosil-lisin  sebagai  laktulosil-lisin.  Pada  tahap  selanjut- nya,  senyawa  laktulosil-lisin  terdekomposisi  menghasilkan
Hasil Penelitian
pramelanoidin  yang  dapat  bereaksi  dengan  asam  amino  lain pada rantai samping protein yang berakibat terhadap kerusakan beberapa  jenis  asam  amino  esensial  dan  terbentuknya  ikatan silang antar rantai protein (Hurrell et al . 1979).
Gambar 1.  Nilai  produk  maillard  HPI  dari  ikan  bernilai  ekonomi rendah  pada  berbagai  konsentrasi  protease  biduri  dan lama  hidrolisis.  Nilai  dinyatakan  dalam  rata-rata  ± standard deviasi
Assoumani et  al (1994)  menyatakan  bahwa  jumah  asam amino  yang  berkurang  selama  berlangsungnya  reaksi  mailard juga dipengaruhi oleh jenis gulanya. Fruktosa adalah gula yang sangat  reaktif,  sehingga  memberikan  efek  kehilangan  asam amino  yang  cukup  besar  dibandingkan  jenis  gula  lainnya. Setelah  fruktosa,  sifat  kereaktifan  gula  selanjutnya  dari  yang terbesar  berturut-turut  adalah  glukosa,  galaktosa,  mannose, arabinose, xilosa dan ribose.

## Warna
Perbandingan  nilai  a  dan  b  dapat  diintrepretasikan  dalam nilai  °Hue  [arc  tan  (b/a)].  Nilai  °Hue  dari  semua  perlakuan (Tabel  2)  antara  74.1-74.7  yang  termasuk  kategori  warna kuning kemerahan. dan tidak terdapat perbedaan nyata warna antar  perlakuan.  Dari  hasil  penelitian  menunjukkan  perlakuan konsentrasi  enzim  dan  lama  hidrolisis  dapat  menyebabkan warna  HPI  lebih  gelap  walaupun  tidak  berbeda  nyata.  Warna yang lebih gelap pada HPI ini terjadi karena pada saat proses hidrolisis terjadi pemutusan ikatan peptida oleh enzim protease menghasilkan  gugus  amina  yang  merupakan  bahan  pereaksi maillard,  dimana  pada  keadaan  ini  gugus  amina  protein berikatan dengan gugus aldehid atau keton dari gula pereduksi sehingga  terbentuk polimer nitrogenous berwarna cokelat atau yang disebut melanoidin (DeMan, 1999).
Faktor rasio gula terhadap asam amino berpengaruh secara nyata  terhadap  reaksi  pembentukan  warna.  Makin  meningkat- nya  jumlah  asam  amino  pada  produk  hidrolisis  enzim  me- nyebabkan  makin  banyak  terjadi  pembentukan  warna.  Gugus karbonil  dari  gula  reduksi  dan  gugus  asam  amino  bebas merupakan  komponen  penting  dalam  reaksi  maillard.  Asam amino  lisin  adalah  jenis  asam  amino  yang  paling  cepat menghasilkan warna yang disebabkan oleh gugus karbonil pada asam  amino  ini  sangat  reaktif.  Sebaliknya  asam  amino  sistein adalah yang paling lambat menghasilkan warna. Oleh karena itu
bahan pangan yang mengandung asam amino lisin akan lebih mudah menjadi cokelat.
Tidak adanya perbedaan warna perlakuan dalam penelitian dapat  disebabkan  karena  ikan  tidak  mengandung  karbohidrat (Ahmed et  al .  2012)  sehingga  menurunkan  potensi  terjadinya reaksi  maillard  berlebih  akibatnya  perubahan  warna  dapat ditekan. Hal ini berbeda dari hasil penelitian Palupi et al . (2010) yang  menyatakan  pada  hidrolisis Volvoriella  volvaceae , semakin lama waktu hidrolisis, semakin gelap warna hidrolisat.
Tabel 2.  Nilai °Hue  HPI  dari  ikan  bernilai  ekonomi  rendah  dengan konsentrasi enzim protease biduri dan waktu hidrolisis yang berbeda Waktu (Jam) Konsentrasi Enzim (Unit/g) o Hue 0 0 74.5±0.1 0 0.7 74.4±0.2 0 1.4 74.4±0.1 0 2.1 74.7±0.1 1.5 0 74.3±0.1 1.5 0.7 74.6±0.2 1.5 1.4 74.6±0.4 1.5 2.1 74.4±0.2 3 0 74.5±0.2 3 0.7 74.3±0.2 3 1.4 74.1±0.4 3 2.1 74.2±0.2

## Tingkat ketengikan
Ketengikan  disebabkan  akibat  lepasnya  komponen  asam lemak  bebas  yang  terdapat  pada  minyak  baik  akibat  lipolisis maupun reaksi oksidatif. Lipolisis adalah proses hidrolisis ikatan ester  pada  lemak  (triasilgliserol)  sehingga  menghasilkan  asam lemak  bebas  dan  gliserol,  sedangkan  reaksi  oksidatif disebabkan oleh reaksi oksidasi lemak dan minyak. Asam lemak bebas  rantai  pendek  akan  menghasilkan  bau  khas  yang  tidak sedap  yang  dikenal  dengan  istilah  tengik.  Terbentuknya  asam lemak  bebas  dengan  6–10  rantai  hidrokarbon  dapat  me- nunjukkan kerusakan pada minyak (Rahman, 2007).
Penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa  aktivitas proteolitik  oleh  enzim  protease  pada  hidrolisat  tempe  akan meningkatkan nilai ketengikan produk. Kenaikan ketengikan ini dapat disebabkan karena proses hidrolisis mendorong terbuka- nya  selubung-selubung  minyak,  yang  kemudian  terekspos sehingga  mudah  mengalami  oksidasi.  Disamping  itu,  dengan adanya  proses  hidrolisis  oleh  enzim  protease  akan  terjadi penguraian  protein  yang  menghasilkan  peptida  rantai  pendek dan  asam  amino  sehingga  protein  yang  dalam  bentuk  awal dapat  berfungsi  sebagai  antioksidan  menjadi  rusak  dan  hilang sifat  fungsionalnya  sehingga  tidak  dapat  menghambat  proses oksidasi pada hidrolisat tempe (Subagio et al. 2002).
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  konsentrasi  protease biduri  dan  waktu  hidrolisis  berpengaruh  (α=0.05)  terhadap tingkat  ketengikan  HPI  dari  ikan  bernilai  ekonomi  rendah (Gambar 2). Semakin besar konsentrasi protease biduri, maka tingkat  ketengikan  (nilai  TBA)  HPI  dari  ikan  bernilai  ekonimi rendah  semakin  menurun  walaupun  tidak  berbeda  nyata, berbeda  dengan  hasil  penelitian  pada  hidrolisat  tempe sebelumnya. Hal ini diduga karena enzim protease biduri yang
0.19
0.27 0.29 0.34
0.22 0.31
0.62 0.63 0.27 0.44 0.55 0.60 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0 0.7 1.4 2.1 Ab so rb an si Konsentrasi Enzim (Unit/gram) 0 jam 1.5 jam 3 jam
Hasil Penelitian
digunakan  dalam  bentuk crude (kasar).  Witono et  al .  (2006) melaporkan  bahwa  enzim  protease  yang  diekstrak  secara langsung  dari  tumbuhan  (batang  dan  daun)  biduri  masih mengandung klorofil. Menurut Dalimartha (2003) suatu protease kasar  juga  dapat  mengandung  saponin,  flavonoid,  polifenol, tanin, dan kalsium oksalat. Flavonoid dan polifenol merupakan antioksidan,  maka  semakin  banyak  konsentrasi  ekstrak  kasar enzim  yang  ditambahkan  semakin  banyak  kandungan antioksidan  dalam  hidrolisat.  Hal  ini  menyebabkan  tingkat ketengikan  pada  hidrolisat  dari  ikan  bernilai  ekonomi  rendah semakin  kecil  dengan  adanya  peningkatan  konsentrasi  enzim. Antioksidan  dapat  menghambat  proses  ketengikan  karena antioksidan  lebih  reaktif  bereaksi  dengan  oksigen  daripada reaksi  oksigen  dengan  lemak.  Molekul  aktif  dari  antioksidan menggagalkan  terbentuknya  peroksida  dengan  mengikat oksigen  yang  menyebabkan  penghambatan  ketengikan  pada bahan.  Sifat  antioksidatif  dari crude  protease biduri  ini merupakan fenomena yang menarik untuk ditelaah lebih lanjut.
Gambar 2.  Tingkat ketengikan HPI dari ikan bernilai ekonomi rendah pada  berbagai  konsentrasi  protease  biduri  dan  lama hidrolisis.  Nilai  dinyatakan  dalam  rata-rata  ±  standard deviasi

## KESIMPULAN
Perlakuan  terbaik  proses  produksi  hidrolisat  dari  ikan  ber- nilai  ekonomi  rendah  adalah  penggunaan  enzim  dengan konsentrasi  protease  biduri  sebesar  2.1  Unit/g  dan  waktu hidrolisis  1.5  jam.  Hidrolisat  terbaik  memiliki  karakteristik  sifat kadar protein terlarut, nilai produk maillard,  warna, dan tingkat ketengikan  berturut-turut  3.509%;  0.634  (kuning  kemerahan), dan 12.210 (mmol/kg).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada  DITLITABMAS Direktorat  Jenderal  Pendidikan  Tinggi  atas  dana  hibah penelitian  kompetitif  strategis  nasional  nomor:  112/SP2H/PL/ DIT.LITABMAS/V/2013 tanggal 13 Mei 2013 atas nama Dr. Yuli Witono, S.TP.,MP.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmed S, Rahman AFMA, Mustafa MG, Hossain MB, Nahar N. 2012. Nutrient composition of  indigenous and exotic fishes of  rainfed  waterlogged  paddy  fields  in  Lakshmipur, Bangladesh.  World  J  Zoo  7:  135-140.  DOI:  10.5829/ idosi.wjz.2012.7.2.63162.
Assoumani  MB,  Maxime  D,  Nguyen  P.  1994.  Evaluation  of  a lysine-glucose  Maillard  model  system  using  three  rapid analytical methods. Food Chem 46: 383-387.
Bhaskar N, Benila T, Radha C, Lalitha RG. 2008. Optimization of  enzymatic  hydrolysis  of  visceral  waste  proteins  of  Catla ( Catla  catla )  for  preparing  protein  hydrolysate  using  a commercial  protease.  Bioresource  Technol  99:  335-343. DOI: 10.1016/j.biortech.2006.12.015.
Dalimartha S. 2003. Biduri (Calotropis gigantea [Wild.] Dryand. ex W.T.Ait.). Pdpersi Jakarta.
DeMan JM. 1999. Principles of Food Chemistry, 3rd Ed. Aspen Pub. Inc. Gaithersbury, Maryland.
Dumay  J,  Donnay-Moreno  C,  Barnathan  G,  Jaouen  P,  Berge. 2006.  Improvement  of  lipid  and  phospholipid  recoveries from  sardine  ( Sardina  pilchardus )  viscera  using  industrial proteases. Process Biochem 41: 2327-2332. DOI: 10.1016/j. procbio.2006.04.005.
Gbogouri GA, Linder M, Fanni J, Parmentier M. 2004. Inﬂuence of hydrolysis degree on the functional properties of salmon byproduct  hydrolysates.  J  Food  Sci  69:  C615–C622.  DOI: 10.1111/j.1365-2621.2004.tb09909.x.
Haslaniza H, Maskat MY, wan Aida WM, Mamot S. 2010. The effects  of  enzyme  concentration,  temperature  and incubation time on nitrogen content and degree of hydrolysis of  protein  precipitate  from  cockle  ( Anadara  granosa )  meat wash water. Int Food Res J 17: 147152.
Hofmann  T,  Bors  W,  Stettmajer  K.  1999.  Studies  on  radical intermidiates  in  the  early  stage  of  the  nonenzymatic browning reaction of carbohydrates and amino acids. J Agr Food Chem 47: 379 -390.
Hurrell RF, Lerman P, Carpenter KKJ. 1979. Reactive lysine in foodstuffs  as  measured  by  dye-binding  procedure.  J  Food Sci  44:  1221-1227.  DOI:  10.1111/j.1365-2621.1979.tb03 485.x.
Hutching  JB.  1994.  Food  Colour  and  Apperance.  Glasgow: Blackie Academic and Professional.
Je JY, Qian ZJ, Lee SH, Byun HG, Kim SK. 2008. Purification and antioxidant properties of bigeye tuna ( Thunnus obesus ) dark  muscle  peptide  on  free  radicalmediated  oxidative systems. J Med Food 11: 629-637.
Koesoemawardani  D,  Nurainy  F,  Hidayati  S.  2011.  Proses pembuatan  hidrolisat  protein  ikan  rucah.  Jurnal  Natur Indonesia 13: 256 -261.
Kunst  A.  2000.  Enzymatic  modification  of  soy  proteins  to improve  their  functional  properties.  Magazine  Industrial Protein 8: 9-11.
Marchbank  T,  Elia  G,  Playford  RJ.  2009.  Intestinal  protective effect of a commercial fish protein hydrolysate preparation.
19.13 18.72 17.5 15.87 17.3 16.69 15.06 12.21 16.48 15.67 13.84 12.41 0 5 10 15 20 25 0.0% 0.5% 1.0% 1.5% N ila i T BA (m m ol/ kg ) Konsentrasi enzim (Unit/gram)
0 jam 1.5 jam 3 jam
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Regul Peptides 155: 105-109. DOI: 10.1016/j.regpep.2009. 02.003.
Miao S, Roos YH. 2004. Comparison of nonenzymatic browning kinetics in spray-dried and freeze-dried carbohydrate-based food  model  systems.  J  Food  Sci  69:  322–331.  DOI: 10.1111/j.1365-2621.2004.tb13637.x.
Motrram  DS.  1998.  Umami  Flavor  of  Meat,  In  Flavor  of  Meat, Meat  Products  and  Seafoods,  Shahidi  F.  (Ed.).  Blackie Academic and Professioonal, London.
Mubarik  NR,  Suwanto  A,  Suhartono  MT.  2000. Isolasi  dan Karakterisasi  Protease  Ektraseluler  dari  Isolat  Bakteri Termofilik  Ekstrim.  [Prosiding].  Seminar  Nasional  Industri Enzim  dan  Bioteknologi  II.  Mikrobiologi,  Enzim  dan Bioteknologi Dalam Perspektif Ekonomi dan Industri. Badan Pengkajian  dan  Penerapan  Teknologi,  Jakarta,  15-16 Februari 2000. 151–158.
Nolsoe H, Undeland I. 2009. The acid and alkaline solubilisation process for the isolation of muscle proteins: State of the art. Food  Bioprocess  Technol  2:  1-27.  DOI:  10.1007/s11947- 008-0088-4.
Palupi  NW,  Windrati  SW,  Tamtarini.  2010.  The  effect  of enzymatic  hydrolysis  on  the  properties  of  protein hydrolysate  from  paddy  mushroom.  Makara  Teknologi  14: 73-76.
Radha  C,  Kumar  PR,  Prakash  V.  2008.  Preparation  and characterization  of  a  protein  hydrolysate  from  an  oilseed flour mixture. Food Chem 106:  1166-1174. DOI: 10.1016/j. foodchem.2007.07.063.
Rahman  MS.  2007.  Handbook  of  Food  Preservation,  2 nd Ed. CRC Press. Boca Raton.
[SNI] Standar Nasional Indonesia. 2006. SNI 01-2729.3 -2006. Ikan  Segar  –  Bagian  3:  Penanganan  dan  pengolahan. Badan Standardisasi Nasional, Jakarta
Subagio  A,  Hartanti  S,  Windrati  WS,  Unus,  Fauzi  M,  Herry  B.
2002.  Kajian  sifat  fisikokimia  dan  organoleptik  hidrolisat tempe hasil hidrolisis protease. J Teknol Industri Pangan 8: 204–210.
Wang  JS,  Zhao  MM,  Zhao  QZ,  Bao  Y,  Jiang  YM.  2007. Characterization  of  hydrolysates  derived  from  enzymatic hydrolysis of wheat gluten. J Food Sci 72: C103–C107. DOI: 10.1111/j.1750-3841.2006.00247.x.
Walker JM. 2002. The Protein Protocols Handbook. 2nd Ed. 3– 10. Humana Press, New Jersey.
Wergedahl  H,  Liaset  B,  Gudbrandsen  OA,  Lied  E,  Espe  M, Muna Z, Mork S, Berge RK. 2004. Fish protein hydrolysate reduces plasma total cholesterol, increases the proportion of HDL  cholesterol,  and  lowers  acyl-CoA:  Cholesterol acyltransferase  activity  in  liver  of Zucker  rats .  J  Nutr  134: 1320-1327.
WIjayanti  AT.  2009.  Kajian  Penyaringan  dan  Lama Penyimpanan  dalam  Pembuatan  Fish  Peptone  dari  Ikan Selar Kuning ( Caranx leptolepis ). [Skripsi]. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor Witono  Y,  Subagio  A,  Susanto  T,  Widjanarko  SB.  2006.
Membandingkan  Kinerja  Protease  Biduri  dengan  Protease Komersial.  [Prosiding].  Seminar  Nasional  -  Perhimpunan Ahli  Teknologi  Pangan  Indonesia  (PATPI),  Yogyakarta  2-3 Agustus 2006.
Witono  Y,  Aulanni’am,  Subagio  A,  Widjanarko  SB.  2007. Purifikasi  dan  karakterisasi  parsial  enzim  protease  dari tanaman  biduri  ( Calotropis  gigantean ).  J  Teknol  Industri Pangan 18: 1-9.
Witono  Y,  Woo  Won  Kang.  2010.  Specific  Characteristic  of Novel  Cystein  Protease  from  Indonesian  ‘Biduri’  Plant ( Calotropis  gigantea ).  [Proceeding]  The  Korea  Food Conference  and  Symposium,  Incheon  Korea  17-18  June 2010.