## AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN EFEK HEPATOPROTEKTIF DAUN BAKAU API-API PUTIH

## Antioxidant Activity and Hepatoprotective Effect of Green Mangrove Leaves
Safrina Dyah Hardiningtyas 1 *, Sri Purwaningsih 1 , Ekowati Handharyani 2
1Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Jalan Agatis, Bogor 16680 Jawa Barat Telepon (0251) 8622909, 8622907, Faks. (0251) 8622907
2Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan,
Institut Pertanian Bogor, Jalan Agatis Bogor 16680 Jawa Barat
Telepon (0251) 8629469, 8629470, Faks. (0251) 8629459 *Korespodensi: saf.tyas@gmail.com
Diterima 21 Januari 2014/Disetujui 04 April 2014

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan ekstrak kasar daun api-api putih yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik, menentukan kandungan fitokimia dan efek Hepatoprotektif ekstrak kasar yang dipilih secara in vivo. Daun api-api putih diekstrak menggunakan tiga jenis pelarut, yakni metanol, etil asetat dan n-heksana. Dalam uji in vivo dilakukan evaluasi terhadap kadar malondialdehid (MDA), enzim aspartat transaminase (AST), enzim alanin transaminase (ALT), dan histopatologi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstraksi daun api-api putih dengan pelarut etil asetat menghasilkan aktivitas antioksidan terbaik dengan kandungan fitokimia terdiri dari flavonoid dan steroid/triterpenoid. Pemberian ekstrak etil asetat daun api-api putih pada tikus yang telah diinduksi CCl 4 dapat menormalkan berbagai parameter biokimia stres oksidatif (kadar MDA, AST, dan ALT) dibandingkan dengan standar Silymarin. Ekstrak daun api- api  putih  berpotensi  untuk  melindungi  hati  tikus  dari  kerusakan  oksidatif  yang  diinduksi  CCl 4 .  Efek Hepatoprotektif ekstrak daun api-api putih berkorelasi dengan aktivitas antioksidannya.
Kata kunci: antioksidan, Avicennia marina , ekstrak, hepatoprotektor
Abstract This research aimed to extractthe antioxidant compound of green Mangrove (Avicennia marina) leave and to test the effect hepato protective of crude extract selected in vivo model. In vivo test was performed by evaluated malondialdehyde (MDA) level, enzyme of aspartate transaminase (AST) dan alanine transaminase (ALT) level, and histopathology. The result showed that extraction A. marina leaf with ethyl acetate display the best antioxidant activity. Phytocemical of ethyl acetate extract of A.marina leaf contained flavonoid and  steroid/triterpenoid.Treatment  with  ethyl  acetate  extract  of  A.  marina  leaves  normalized  various biochemical parameters of oxidative stress (MDA, AST, and ALT level) in compared to Silymarin standard. A. marina leaves extract could be proposed to protect the liver against CCl 4 -induced oxidative damage in rats. The hepatoprotective effect might be correlated with its antioxidant and free radical scavenger effects.
Keyword: antioxidant, Avicennia marina , extract, hepatoprotective

## PENDAHULUAN
Hati  adalah  organ  tubuh  yang  berfungsi dalam  menetralisir  zat  toksik  yang  masuk dalam  tubuh,  serta  menjadi  sasaran peningkatan konsentrasi radikal bebas. Radikal bebas merupakan sekelompok zat kimia yang
sangat reaktif karena memiliki satu atau lebih elektron  yang  tidak  berpasangan  (Halliwell dan  Gutteridge  2007).  Konsentrasi  radikal bebas yang tidak seimbang dengan antioksidan dapat menimbulkan stres oksidatif pada tubuh. Stres oksidatif dapat menyebabkan peroksidasi
Aktifitas antioksidan dan efek hepatoprotektif, Hardiningtyas et al.
lipida sehingga dapat menyebabkan kerusakan sel  dan  menimbulkan  penyakit  degeneratif, misalnya  penyakit  liver  (Sen et  al. 2010) sehingga  perlindungan  terhadap  organ  hati sangat diperlukan untuk mencegah kerusakan oksidatif yang berlanjut.
Kerusakan  akibat  radikal  bebas  dalam tubuh tersebut dapat diatasi dengan antioksidan. Antioksidan  didefinisikan  sebagai  suatu substansi  yang  dapat  menunda,  mencegah, atau menghilangkan kerusakan oksidatif pada molekul target, contoh protein, lipida dan DNA (Halliwell dan Gutteridge 2007). Tubuh secara alami  memproduksi  zat  antioksidan  endogen yang  mampu  mengatasi  efek  radikal  bebas, tetapi  saat  pasokan  radikal  bebas  meningkat dibutuhkan pasokan zat antioksidan dari luar. Antioksidan  dapat  berasal  dari  bahan  alami dan sintentik. Sumber antioksidan alami telah banyak dilaporkan berasal dari tanaman. Salah satu  tanaman  yang  dapat  dijadikan  sebagai sumber  antioksidan  alami  adalah  bakau  jenis api-api putih ( Avicennia marina ).
Bakau  api-api  putih  merupakan  salah satu  jenis  bakau  yang  tersebar  di  seluruh Indonesia  dengan  kondisi  yang  melimpah (Noor et  al. 2006).  Daun  api-api  putih dimanfaatkan oleh masyarakat pesisir sebagai bahan  pangan  dan  obat-obatan.  Pengalaman secara tradisional, bakau ini di beberapa daerah telah digunakan untuk sayuran serta mengobati berbagai jenis penyakit, contoh hepatitis, kusta, rematik,  cacar,  bisul,  dan  obat  luka  bakar (Bandaranayake 2002; Noor et al. 2006). Hasil  penelitian  yang  dilakukan  oleh Bunyapraphatsara et  al. (2004);  Vadlapudi dan  Naidu  (2009)  menunjukkan  bahwa  daun api-api  putih  memiliki  aktivitas  antioksidan. Berdasarkan  pemahaman  tersebut,  diperoleh suatu  pemikiran  bahwa  dengan  memperoleh senyawa  bioaktif  ekstrak  daun  api-api  putih yang  memiliki  aktivitas  antioksidan,  maka dapat  berpotensi  untuk  menanggulangi kerusakan  oksidatif  pada  hati.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mendapatkan  ekstrak  kasar daun  api-api  putih  yang  memiliki  aktivitas antioksidan  terbaik,  menentukan  kandungan
fitokimia dan efek Hepatoprotektif ekstrak kasar yang dipilih secara in vivo .

## BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah daun bakau api-api putih yang diambil di Kawasan Hutan Mangrove Blanakan,  Subang,  bahan  kimia untuk ekstraksi daun api-api putih, pengujian antioksidan,  antioksidasi  lipida  (kadar malondialdehida, enzim aspartat transaminase (AST),  enzim  alanin  transaminase  (ALT)), dan histopatologi hati hewan coba. Peralatan yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah timbangan analitik (Max 410 g and HF400), vakum  rotari  evaporator  (Buchi  Rotavapor R-210), dan spektofotometer (UV-Vis RS UV- 2500).

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  dalam  dua  tahap percobaan.  Tahap  pertama  adalah  preparasi, ekstraksi,  dan  analisis  aktivitas  antioksidan. Tahap dua adalah pengujian efek Hepatoprotektif daun api-api putih secara in vivo .

## Preparasi Sampel Daun Api-api Putih
Sampel daun api-api putih dikumpulkan dan  dibersihkan  dari  kotoran  menggunakan akuades,  kemudian  dilakukan  pengeringan. Proses pengeringan dilakukan menggunakan sinar  matahari  selama  4  hari.  Daun  api- api  putih  kering  dijadikan  serbuk  halus menggunakan  mesin  penepung  dengan saringan sebesar 100 mesh . Serbuk daun bakau api-api  putih  kering  kemudian  diekstraksi dengan perlakuan jenis pelarut.

## Ekstraksi dan Pengujian Antioksidan
Ekstraksi  secara  tunggal  dilakukan dengan  metode  maserasi  menggunakan pelarut  metanol,  etil  asetat  atau  n-heksana p.a dengan perbandingan sampel dan pelarut 1:5  (b/v)  selama  24  jam.Tahap  selanjutnya, dilakukan filtrasi untuk memisahkan pelarut dengan  sampel.  Filtrat  yang  terkumpul dipisahkan  antara  pelarut  dan  ekstraknya
menggunakan vacum rotary evaporator pada suhu  37°C  hingga  diperoleh  ekstrak  kasar berbentuk pasta. Ketiga sampel tersebut diuji aktivitas antioksidan dengan metode (DPPH) (Hanani et al. 2005). Ekstrak kasar daun api- api putih yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik  dianalisis  fitokimia  menurut  metode Harbone (1987), untuk mengetahui golongan senyawa bioaktif pada ekstrak tersebut.

## Pengujian  Efek  Hepatoprotektif  secara

## In Vivo
Tikus  putih  Sprague  Dawley  berumur 8  minggu  dengan  berat  badan  (180-210)  g yang  digunakan  pada  percobaan  terlebih dahulu  diadaptasikan  dalam  kandang selama  kurang  lebih  satu  minggu  sebelum digunakan  untuk  penelitian.  Tikus  diberi pakan standar dan minum ad libitum selama percobaan  dilakukan.  Tikus  ditimbang  dan dikelompokkan  menjadi  4  kelompok  (n=3) di  dalam  kandang  secara  terpisah  pada  hari terakhir adaptasi. Kelompok perlakuan adalah sebagai berikut:
Kelompok  1: Kontrol negatif (normal) Kelompok  2:  Kontrol  positif,  yaitu  tikus diinduksi  CCl 4 dengan  dosis  0,5  mL/kg  BB secara  intraperitonial  (Sengupta et  al. 2011) pada hari pertama.
Kelompok  3:  Perlakuan  ekstrak  daun api-api  terpilih.  Tikus  diinduksi  pada  hari pertama,  kemudian  diberikan  ekstrak  api- api  terpilih  (dilarutkan  dalam  0,5%  Tween 80)  secara  oral  sebanyak  0,5  mL  pada  hari ke-2  sampai  hari  ke-8.  Dosis  ekstrak  yang diberikan merupakan konversi dari nilai IC 50 pada uji in vitro.
Kelompok  4:  Perlakuan  hepatoprotektor standar, yaitu silymarin. Tikus diinduksi pada hari  pertama,  kemudian  diberikan  silymarin (dilarutkan  dalam  0,5%  Tween  80)  dosis  25 mg/kg BB secara oral pada hari ke-2 sampai hari ke-8.
Sampel  darah  digunakan  untuk menganalisis  kadar  enzim  AST  dan  enzim ALT  (kit  AMP  diagnostic®),  sedangkan  hati untuk  pengamatan  preparat  histopatologi hati (Kiernan 1990) dan analisis kadar MDA (Capeyron et al. 2002).

## Analisis data
Data  pengujian  rendemen  ekstrak, aktivitas  antioksidan,  kadar  MDA,  kadar enzim AST dan enzim ALT dianalisis dengan analisis ragam menggunakan rancangan acak lengkap  (RAL).  Untuk  melihat  perbedaan antar  perlakuan  dilakukan  pengujian  lanjut menggunakan  uji Tukey .  Data  kandungan fitokimia  dan  gambaran  histopatologi dianalisis secara deskriptif dan kuantitatif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Daun  Api- api Putih
Jenis pelarut yang digunakan merupakan faktor utama yang menentukan hasil ekstraksi atau  rendemen  ekstrak.  Rendemen  hasil ekstraksi  dengan  jenis  pelarut  berbeda disajikan  pada  Gambar  1,  sedangkan hubungan  jenis  pelarut  dengan  aktivitas antioksidan (rataan IC 50 ) ekstrak daun api-api putih disajikan pada    Gambar 2.
Ekstrak  etil  asetat  menunjukkan aktivitas antioksidan terbaik, namun aktivitas Gambar  1  Rendemen  hasil  ekstraksi  dengan  jenis pelarut berbeda. Gambar 1 Hubungan jenis pelarut dengan aktivitas antioksidan  (nilai  I C 50 )  ekstrak  daun bakau api-api putih
Aktifitas antioksidan dan efek hepatoprotektif, Hardiningtyas et al.
antioksidan ekstrak kasar daun bakau api-api tersebut  masih  lebih  rendah  dibandingkan dengan aktivitas antioksidan  BHT dan vitamin C  dengan  nilai  IC 50 masing-masing  sebesar 5,86 ppm dan 8,26 ppm. Perbedaan aktivitas antioksidan  pada  setiap  ekstrak  tersebut diduga  berkaitan  dengan  tipe  antioksidan yang terkandung di dalamnya. Menurut Yang et  al. (2011),  tipe  antioksidan  berdasarkan kelarutannya terdiri dari antioksidan lipofilik (larut  dalam  nonpolar)  dan  antioksidan hidrofilik (larut dalam polar). Aktivitas  antioksidan  ekstrak  etil  asetat yang  paling  tinggi  dibandingkan  dengan ekstrak  yang  lain  diduga  disebabkan  oleh pelarut  etil  asetat  yang  bersifat  semipolar sehingga  mengandung  senyawa  aktif antioksidan  baik  yang  bersifat  hidrofilik maupun  lipofilik.  Menurut  Cano et  al.
(2003),  etil  asetat  dapat  digunakan  untuk mengekstrak  komponen  lipofilik  dari  fase aqueous  serta  diduga  mampu  mengekstraksi beberapa  komponen  hidrofilik  dari  fase aqueous. Pelarut n-heksana digunakan untuk mengekstrak  komponen  lipofilik  dari  fase aqueous,  sedangkan  metanol  mengekstrak komponen hidrofilik dari fase aqueous.
Yeum et  al. (2004;  2009)  menyatakan bahwa  antioksidan  hidrofilik  dan  lipofilik dapat  bekerja  secara  sinergis  sehingga memiliki  kemampuan  yang  kuat  dalam melindungi  sistem  biologis  dan  mengurangi kerusakan  yang  disebabkan  oleh reactive oxygen  species (ROS).  Antioksidan  lipofilik contoh  tokoferol,  sebagai  penangkap  radikal oksigen  yang  dapat  menghambat  inisiasi dan  propagasi  pada  reaksi  rantai  oksidatif dalam  sistem  hidrofobik.  Menurut  Wu et al. (2004),  antioksidan  hidrofilik  terutama komponen  fenolik  bekerja  secara  mudah dalam  mendonorkan  satu  atom  hidrogen pada ROO
• .

## Kandungan Fitokimia Ekstrak Terpilih
Kandungan  fitokimia  ekstrak  etil  asetat daun  bakau  api-api  putih  yang  diduga berperan  sebagai  antioksidan  adalah
flavonoid  dan  steroid  atau  triterpenoid (Tabel 1). Menurut Setzer (2008), triterpenoid atau  steroid  merupakan  senyawa  aktif  yang termasuk  dalam  jenis  antioksidan  lipofilik. Menurut  Middleton et  al. (2000),  flavonoid merupakan  senyawa  aktif  yang  termasuk dalam  jenis  intermediet  antioksidan  yang berperan  sebagai  antioksidan  hidrofilik  dan lipofilik. Flavonoid merupakan senyawa yang berperan  sebagai  antioksidan.  Mekanisme antioksidan dari flavonoid adalah menangkap ROS  secara  langsung,  mencegah  regenerasi ROS  dan  secara  tidak  langsung  dapat meningkatkan  aktivitas  antioksidan  enzim antioksidan  seluler  (Akhlaghi  dan  Bandy 2009).  Flavonoid  merupakan  senyawa  yang paling efektif sebagai scavanger spesies reaktif, misalnya  super  dioksida,  radikal  peroksil, dan  peroksinitrit  dengan  cara  mentransfer atom  H+  (Middleton et  al. 2000;  Akhlaghi dan  Bandy  2009).  Pencegahan  terbentuknya ROS  oleh  flavonoid  dilakukan  dengan beberapa cara, yaitu menghambat kerja enzim xantin  oksidase  dan  Nicotinamide  Adenine Dinucleotide  Phosphate  (NADPH)  oksidase, serta  mengkelat  logam  (Fe2+  dan  Cu2+) sehingga dapat mencegah reaksi redoks yang dapat menghasilkan radikal bebas (Akhlaghi dan Bandy 2009; Atmani et al. 2009).
Menurut  Lotito  dan  Fraga  (2000), flavonoid  merupakan  antioksidan  yang berperan  dalam  melindungi  antioksidan lipofilik  sehingga  dapat  menguatkan
Tabel  1  Kandungan  fitokimia  eksrak  etil asetat daun bakau api-api putih Analisis Fitokimia Hasil a. Alkaloid - Wagner - - Meyer - - Dragendorf - b. Steroid/Triterpenoid + c. Flavonoid + d. Saponin (uji busa) - Keterangan: +: ada    - : tidak ada
antioksidan seluler. Beberapa penelitian juga menunjukkan  bahwa  aktivitas  antioksidan flavonoid  berkaitan  erat  dengan  pencegahan timbulnya  beberapa  penyakit,  misalnya penyakit  kardiovaskular  (Akhlaghi  dan Bandy  2009),  kanker/tumor  (Brusselmans et al. 2004), dan penyakit liver (Jin et al. 2010; Pinzaru et al. 2011).
Tabel 1 menunjukkan bahwa kandungan fitokimia  ekstrak  etil  asetat  daun  bakau  api- api  putih  yang  diduga  berperan  sebagai antioksidan  adalah  flavonoid  dan  steroid atau  triterpenoid.  Menurut  Setzer  (2008), triterpenoid atau steroid merupakan senyawa aktif  yang  termasuk  dalam  jenis  antioksidan lipofilik.  Menurut  Middleton et  al. (2000), flavonoid  merupakan  senyawa  aktif  yang termasuk dalam jenis intermediet antioksidan yang berperan sebagai antioksidan hidrofilik dan lipofilik.
Flavonoid  merupakan  senyawa  yang berperan  sebagai  antioksidan.  Mekanisme antioksidan dari flavonoid adalah menangkap ROS  secara  langsung,  mencegah  regenerasi ROS,  dan  secara  tidak  langsung  dapat meningkatkan  aktivitas  antioksidan  enzim antioksidan  seluler  (Akhlaghi  dan  Bandy 2009).  Flavonoid  merupakan  senyawa  yang paling efektif sebagai scavanger spesies reaktif, misalnya  super  dioksida,  radikal  peroksil, dan  peroksinitrit  dengan  cara  mentransfer atom  H+  (Middleton et  al. 2000;  Akhlaghi dan Bandy 2009).  Pencegahan terbentuknya ROS  oleh  flavonoid  dilakukan  dengan beberapa cara, yaitu menghambat kerja enzim xantin  oksidase  dan Nicotinamide  Adenine Dinucleotide  Phosphate (NADPH)  oksidase, serta  mengkelat  logam  (Fe 2+ dan  Cu 2+ ) sehingga dapat mencegah reaksi redoks yang dapat menghasilkan radikal bebas (Akhlaghi dan Bandy 2009; Atmani et al. 2009). Lotito  dan  Fraga  (2000)  menyatakan bahwa  flavonoid  merupakan  antioksidan yang berperan dalam melindungi antioksidan lipofilik  sehingga  dapat  menguatkan antioksidan seluler. Beberapa penelitian juga menunjukkan  bahwa  aktivitas  antioksidan
flavonoid  berkaitan  erat  dengan  pencegahan timbulnya  beberapa  penyakit,  misalnya penyakit kardiovaskular (Akhlaghi dan Bandy 2009),  kanker  atau  tumor  (Brusselmans et al. 2004), dan penyakit liver (Jin et al. 2010;
Pinzaru et al. 2011). Triterpenoid  atau  steroid  merupakan senyawa  yang  memiliki  peranan  sebagai antioksidan.    Menurut  Topcua et  al. (2007), mekanisme  antioksidan  dari  triterpenoid adalah  dengan  cara  menangkap/scavenging spesies  reaktif,  misalnya  superoksida,  dan mengkelat  logam  (Fe 2+ dan  Cu 2+ ).  Hasil penelitian Abrosca et al. (2006) menunjukkan bahwa  senyawa  triterpenoid  dari  Annurca aple  memiliki  aktivitas  sebagai  antioksidan dan dapat menghambat peroksidasi lipida.  Aktivitas  biologi  dari  triterpenoid/ steroid  selain  antioksidan  adalah  sebagai hepatoprotektor  dan  analgesik  (Fai  dan
Tao  2009),  antitumor  (Feng et  al. 2006), antiproliferatif  (Nugraheni et  al. 2011),  dan memberikan  efek  imunodulator  (Martin 2006).
Analisis Efek Hepatoprotektor dari Ekstrak Etil Asetat Daun Bakau Api-api Putih Hepatoprotektor adalah senyawa atau  zat  yang  berkhasiat  melindungi  sel sekaligus  memperbaiki  jaringan  hati yang  rusak  akibat  pengaruh  zat  toksik (Panjaitan 2008). Pemberian hepatoprotektor dapat dilakukan untuk pencegahan (preventif) atau  penyembuhan  (kuratif)  (Kumarappan et  al. 2011).  Penelitian  ini  mengamati  efek hepatoprotektor  ekstrak  daun  bakau  api- api  putih  secara  kuratif,  hal  ini  berdasarkan pengetahuan  masyarakat  yang  secara tradisional memanfaatkan bakau api-api putih sebagai obat hepatitis. Karbon tetraklorida merupakan senyawa kimia  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini sebagai  hepatotoksin.  Menurut  Al-Shabanah et  al. (2000),  karbon  tetraklorida  (CCl 4 ) adalah agen hepatotoksik yang menghasilkan radikal  bebas  triklorometil  (CCl 3 ),  yang ketika diinduksi pada hati tikus sangat mirip
JPHPI 2014, Volume 17 Nomor 1
Aktifitas antioksidan dan efek hepatoprotektif, Hardiningtyas et al.
dengan  sirosis  pada  manusia.  Suja et  al. (2004)  melaporkan  bahwa  perubahan  yang berhubungan  dengan  kerusakan  hati  akibat induksi CCl 4 sangat mirip dengan perubahan pada  pasien  hepatitis  virus  akut.  Beberapa parameter  perubahan  yang  diamati  pada penelitian  ini  adalah  kadar  malondialdehida (MDA)  pada  hati,  kadar  enzim  serum  AST dan (ALT) serta histopatologi hati.

## Kadar MDA pada Hati
Malondialdehida  (MDA)  merupakan senyawa  sitotoksik  yang  dihasilkan  dari proses  peroksidasi  lipid,  pada  akhir  tahapan peroksidasi (Huang et al. 2011). Pengukuran MDA digunakan sebagai indikator kerusakan oksidatif asam lemak tak jenuh pada sel yang menyebabkan  langsung  perubahan  struktur dan fungsi (Klaunig et al. 2009). Kadar MDA pada hati dari kelompok tikus yang diberikan perlakuan disajikan pada Gambar 3.
Hasil  analisis  ragam  menunjukkan bahwa  perlakuan  yang  diberikan  pada  tikus memberikan  pengaruh  yang  nyata  terhadap kadar  MDA  hati  (p<0,05).  Hasil  uji  lanjut menunjukkan  bahwa  terjadi  peningkatan kadar  MDA  pada  tikus  yang  diinduksi CCl 4 .  Kadar  MDA  mengalami  penurunan setelah  diberikan  ekstrak  etil  asetat  daun bakau  api-api  putih  dan  sylimarin  (p<0,05). Hal  ini  menunjukkan  bahwa  ada  indikasi perlindungan dan penghambatan peroksidasi lipida  yang  berlanjut  oleh  ekstrak  etil  asetat. Efek  penghambatan  peroksidasi  lipida  pada ekstrak  etil  asetat  daun  bakau  api-api  putih
disebabkan  oleh  sifat  antioksidan  senyawa flavonoid  dan  steroid/triterpenoid  yang terkandung didalamnya.
Menurut  Akhlaghi  dan  Bandy  (2009); Topcua et  al. (2007),  triterpenoid  dan flavonoid  merupakan  senyawa  yang  bersifat antioksidan  yang  dapat  mengatasi  dan mencegah  radikal  bebas.  Hasil  penelitian Nugraheni et al. (2011) menunjukkan bahwa triterpenoid  dapat  menghambat  peroksidasi lipid pada tahap inisiasi dengan menghambat radikal  peroksil  serta  di  tahap  akhir  dengan menghambat  produk  sekunder,  misalnya malondialdehid. Bastona dan Leroux (2007); Ghosh et al. (2010) melaporkan triterpenoid dapat menghambat aktivitas enzim sitokrom P 450 sehingga  proses  peroksidasi  lipid  akibat radikal bebas dapat dicegah. Hasil penelitian Androutsopoulos et al. (2010); Quintieri et al.
(2011)  juga  menunjukkan  bahwa  flavonoid dapat menghambat aktivitas enzim sitokrom P 450 .

## Kadar AST dan ALT Darah Tikus
Kadar  enzim  serum  AST  dan  ALT merupakan parameter klinis yang menggambarkan intergritas sel hati (hepatosit)
(Giannini et  al. 2005).  Hasil  pengukuran kadar AST dan ALT darah tikus dalam serum tikus  jantan  strain  Sprague  Dawley  (n  =  3) disajikan pada Gambar 4. Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlakuan yang diberikan pada tikus berpengaruh nyata (α=0,05) pada kadar  enzim  AST  serum.  Hasil  uji  lanjut menunjukkan  bahwa  induksi  CCl 4 sebanyak 0,5  mL/kg  BB  mengakibatkan  terjadinya peningkatan kadar enzim AST serum. Kadar enzim AST serum pada kelompok tikus yang induksi CCl 4 dan kelompok normal berbeda secara  nyata  (p<0,05).  Peningkatan  kadar enzim AST serum pada kelompok tikus yang induksi  CCl 4 tersebut  secara  keseluruhan tidak  terlalu  mencolok,  hanya  satu  kali  lipat dari kelompok normal. Peningkatan tersebut masih  dalam  kategori  “mild”  atau  ringan (kenaikan  amino  transferase  1-3  kali  lipat) (Thapa dan Walia 2007).
Gambar 3 Kadar MDA pada hati dari kelompok tikus yang diberikan perlakuan.
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlakuan  yang  diberikan  pada  tikus  tidak berpengaruh  nyata,  (p<0,05)  pada  kadar enzim  ALT  serum,  walaupun  demikian  ada indikasi perubahan kadar enzim ALT serum pada  tikus  yang  telah  diinduksi  CCl 4 dan diberi  ekstrak  etil  asetat  daun  api-api  putih. Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa  ekstrak etil asetat mampu memberikan perlindungan atas kerusakan pada sel hati yang disebabkan oleh  radikal  bebas  yang  dihasilkan  oleh metabolisme CCl 4 . Menurut  Giannini et  al. (2005),  kadar enzim  ALT  dan  AST  dalam  darah  tersebut mencerminkan  kerusakan  yang  terjadi  di dalam  sel-sel  hati.    Enzim  ALT  dan  AST merupakan enzim yang mengkatalis transfer grup α-amino dari alanin dan aspartat menuju grup asam    α-ketogutarat untuk membentuk oksaloasetat  dan  asam  piruvat.  Enzim  ini banyak  terdapat  dalam  hati.  Enzim  ALT terdapat  pada  sitosol  sedangkan  enzim  AST terdapat dalam sitosol dan mitokondria. Hasil penelitian Badria et al. (2011) menunjukkan bahwa  tikus  yang  diinduksi  CCl 4 akan mengalami  peningkatan  kadar  enzim  AST dan ALT serum. Kadar AST dan ALT serum berkorelasi  dengan  terjadinya  inflamasi, steatosis,  nekrosis,  dan  fibrosis  pada  hati tikus. Stockham dan Scott (2002) berpendapat bahwa kadar enzim AST di dalam darah akan meningkat bila terjadi kerusakan sel hati yang parah  dan  disertai  nekrosis  sehingga  enzim
dari mitokondria juga ikut keluar sel. Perubahan  kadar  enzim  AST  dan  ALT serum  pada  kelompok  tikus  yang  diberikan ekstrak  etil  asetat  daun  api-api  diduga berkaitan  dengan  kandungan  senyawa ekstrak,  yaitu  flavonoid  dan  triterpenoid/ steroid  yang  berperan  sebagai  antioksidan. Antioksidan  merupakan  suatu  senyawa yang  dapat  menetralisir  suatu  radikal  bebas. Menurut Wang et al. (2004), bahwa senyawa- senyawa  golongan  triterpenoid  bersifat antioksidan  sehingga  mampu  mengurangi jumlah  metabolit  CCl 4 sehingga  sel-sel hati  dapat  terlindungi  dari  kerusakan  dan stabilitas membran sel hati serta aktivitasnya tetap  terjaga.  Sharma  dan  Shukla  (2011) menyatakan bahwa efek antioksidan flavonoid adalah dapat meningkatkan proses regenerasi.

## Gambaran Histopatologi Hati Tikus
Kerusakan  oksidatif  pada  hati tikus  dapat  dilihat  dengan  gambaran histopatologinya.  Gambaran  keadaan histopatologis  hati  semua  tikus  pada setiap  kelompok  yang  diamati  dengan perbesaran  4000  kali  dapat  dilihat  pada Gambar 4.
Gambar  4  menunjukkan  bahwa  ada perbedaan kondisi histopatologi hati pada setiap kelompok tikus. Hasil pengamatan mikroskopik  sel  hati  pada  kelompok normal  (Gambar  4A)  menunjukkan bahwa tidak ada perubahan yang spesifik;
Gambar 4 Rataan pengukuran kadar enzim AST (A) dan enzim ALT (B) dalam serum tikus jantan strain Sprague Dawley (n = 3).
JPHPI 2014, Volume 17 Nomor 1
Aktifitas antioksidan dan efek hepatoprotektif, Hardiningtyas et al.
sel hati memiliki inti dan sitoplasma yang jelas.  Sel-sel  hepatosit  tersusun  teratur dengan  jarak  yang  sama.  Gambaran histopatologi sel hati pada kelompok yang diinduksi CCl 4 0,5 mL/kg BB (Gambar 4B) menunjukkan banyak sel yang mengalami degenerasi, nekrosis (kematian sel), serta terjadi  infiltrasi  sel  Kupffer  yang  aktif pada daerah sinusoid. Degenerasi  sel  ditandai  oleh  bentuk sel yang abnormal yang ditunjukkan oleh sel yang membesar, inti sel membesar, inti sel  mengecil,  bahkan  sitoplasma  sudah tidak berinti. Nekrosis sel ditandai dengan terlihatnya  inti  sel  yang  mengalami penyusutan dan warna sitoplasma menjadi gelap. Sel Kupffer yang aktif menandakan adanya  senyawa  toksik  yang  masuk  ke dalam jaringan, misalnya CCl 4 , kemudian ada  usaha  fagositosis  oleh  sel-sel pertahanan lokal. Menurut Jaeschke et al. (2002), sel Kupffer berfungsi dalam proses
fagositosis,  selain  itu  sel  ini  berperan dalam  menghasilkan  mediator  sitotoksik misalnya ROS dan mediator pro-inflamasi, misalnya sitokin dan kemokin. Hasil  dari  beberapa  penelitian menunjukkan  bahwa  induksi  CCl 4 dapat menyebabkan kerusakan sel yang ditandai dengan perubahan histopatologi sel. Muriel et  al. (2001)  berpendapat  bahwa  induksi CCl 4 menyebabkan  aktifnya  sel  Kupffer, yang  dapat  memediasi  kerusakan  hati dan  memicu  terjadinya  peroksidasi  pada hati.  Menurut  Al-Shabanah et  al. (2000),
CCl 4 dapat menyebabkan peroksidasi lipid sehingga dapat menurunkan intergritas sel sampai  menyebabkan  nekrosis  sel.  Hasil penelitian Panjaitan (2008) menunjukkan bahwa  induksi  CCl 4 0,1  mL/kg  BB menyebabkan  degenerasi  sel-sel  hati, bahkan pada kelompok yang mendapatkan CCl 4 (1  dan  10)  mL/kg  BB  mengalami steatosis  multifokal  (akumulasi  lemak
(a) (b) (c) (d)
Gambar 4 Histopatologi hati tikus pada kelompok normal (A), kelompok yang diberi CCl4 (B), selanjutnya ekstrak etil asetat daun bakau api-api putih (C), silymarin dosis 25 mg/kg BB (D). Pewarnaan H&E.  Keterangan: degenerasi sel (D), sel nekrosis (N), sel Kupffer (K). (Bar = 30 µm).
pada sel hati). Hasil pengamatan mikroskopik kelompok  yang  diberi  perlakuan  ekstrak etil asetat daun bakau api-api putih dosis 182  ppm  sebanyak  0,5  mL  (Gambar  4C) dan  perlakuan  silymarin  dosis  25  mg/kg BB  (Gambar  4D)  menunjukkan  adanya efek  perlindungan  dan  pemulihan  sel hati  dari  CCl 4 .  Hasil  tersebut  ditandai oleh  respon  degenerasi  dan  nekrosis dalam jumlah yang sedikit. Degenerasi sel adalah penurunan fungsi sel yang bersifat reversible maupun irreversible . Pemberian ekstrak  etil  asetat  dan  silymarin  tersebut diduga  dapat  mengembalikan  fungsi  sel hati  sehingga  peningkatan  jumlah  sel yang  nekrosis  atau  sel irreversible dapat dicegah.
Efek  perlindungan  dan  pemulihan pada  tikus  yang  diberi  ekstrak  etil  asetat daun bakau api-api putih diduga berkaitan dengan  kandungan  senyawa  antioksidan yang  terdapat  pada  ekstrak  tersebut. Menurut  Bastona  dan  Leroux  (2007), senyawa  golongan  triterpenoid  memiliki kemampuan  dalam  memelihara  stabilitas membran sel hati sebagai antioksidan dan scavanger terhadap ROS. Menurut Sharma dan  Shukla  (2011),  efek  antioksidan flavonoid meningkatkan proses regenerasi dengan  cara  mendestruksi  radikal  bebas, menyediakan  substrat  kompetitif  untuk lipid tak jenuh dalam membran dan atau mempercepat  mekanisme  perbaikan membran sel yang rusak.
Hasil penelitian Sahreen et al. (2011) menunjukkan bahwa efek Hepatoprotektif ekstrak  metanol  daun Carissa  opaca pada  tikus  yang  diinduksi  CCl 4 secara signifikan  disebabkan  oleh  kandungan antioksidan  dan  kandungan  penstabil membran  sel  pada  ekstrak  tersebut. Menurut  Karthikeyan et  al. (2008),  efek hepatoprotektor ekstrak alga coklat Padina boergesenii ditunjukkan oleh kemampuan ekstrak  tersebut  dalam  menghambat peroksidasi  lipid  dan  menurunkan  kadar
enzim  amino  transferase  (AST  dan ALT).  Punitha  dan  Rajasekaran  (2011) melaporkan bahwa hepatoprotektor dapat  memperbaiki  integritas  sel  dan menstimulus  aktivitas  antioksidan  enzim (superoksida  dismutase,  katalase,  dan glutation peroksidase).
KESIMPULAN Kondisi ekstraksi terbaik untuk mendapatkan  aktivitas  antioksidan  daun bakau  api-api  putih  menggunakan  pelarut  etil asetat selama 24 jam memiliki potensi sebagai hepatoprotektor,  karena  dapat  menurunkan kadar  MDA  hati,  kadar  enzim  AST  dan  ALT darah,  serta  mengurangi  lesio  histopatologi jaringan hati.

## DAFTAR PUSTAKA
Abrosca  BD,  Fiorentino  A,  Monaco  P, Oriano P, Pacifico S. 2006. Annurcoic acid:  a  new  antioxidant  ursane triterpene  from  fruits  of  cv.  Annurca apple. Food Chemistry 98: 285–290.
Achiliya  GS,  Wadodkar  SO,  Dorle  AK. 2004.  Evaluation  of  hepatoprotective effect of Amakadi ghrita against carbon tetrachloride  induced  hepatic  damage in rats. Journal Ethnopharmacology 90: 229-232. Akhlaghi M, Bandy B. 2009. Review article: mechanisms  of  flavonoid  protection against myocardial ischemia– reperfusion  injury. Journal  Molecullar and Cellular Cardiology 46: 309–317.
Al-Shabanah  OA,  Alam  K,  Nagi  MN,  Al- Rikabi  AC,  Al-Bekairi  AM.  2000. Protective effect of aminoguanidine, a nitric oxide synthase inhibitor against CCl 4 -induced  hepatotoxicity  in  mice. Life Science 66: 265-270. Androutsopoulos  VP,  Papakyriakou  A, Vourloumis D, Tsatsakis AM, Spandidos DA. 2010. Dietary flavonoids in cancer therapy and prevention: substrates and inhibitors  of  cytochrome  P 450 CYP1 enzymes. Pharmacology and Theraphy
Aktifitas antioksidan dan efek hepatoprotektif, Hardiningtyas et al.
126:9-20.
Atmani D, Chaher N, Atmani D, Berboucha
M,  Debbache  N,  Boudaoud  H.  2009. Flavonoids  in  human  health:  from structure to biological activity. Current Nutrition and Food Science 5:225-237.
Badria  AF,  El-Belbasi  HI,  Sobh  MM, Badria  FA.  2011.  Parallelism  study between  biochemical,  immunological and  histochemical  parameters  of  liver injury induced by carbon tetrachloride on rats. Journal American Science 7(5):
581-591.
Bandarnayake  WM.  2002.  Bioactivities, bioactive  compounds  and  chemical constituents  of mangrove plants.
Wetlands  Ecology  Management 10: 421-452
Bastona  E,  Leroux  FR.  2007.  Inhibitors  of steroidal  cytochrome  P 450 enzymes  as targets  for  drug  development. Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery 2:31-58. Bunyapraphatsara N, Jutiviboonsuk A,  Sornlek  P,  Therathanathorn  W, Aksornkaew  S,  Fong  HHS,  Pezzuto JM, KosmederJ. 2004. Pharmacological studies of plants in the mangrove forest. Thai  Journal  Phytopharmacy 10(2):1-
12.
Brusselmans  K,  Vrolix  R,  Verhoeven G,  Swinnen  JV.  2004.  Induction  of cancer  cell  apoptosis  by  flavonoids  is associated with their ability to inhibit fatty acid synthase activity.
The Journal Biology Chemistry 280(7):5636–5645. Cano  A,  Acosta  M,  Arnao  MB.  2003. Hydrophilic and lipophilic antioxidant  activity  changes  during on-vine ripening of tomatoes
( Lycopersicon esculentum Mill.). P ostharvest Biology and Technology 28: 59–65.
Capeyron,  Julie  C,  Eric  B,  Jean  P,  Piere MR,  Claude  LL,  Benard  D.  2002  A diet  cholesterol  and  deflcient  in  vite incudes lipid peroxidation but does not
enhace antioxidant enzyme expression in rat liver. Biochemisrtry 13: 296-301. Fai  YM,  Tao  CC.  2009.  Literature  review onpharmacutical activities of oleanolic acid. Natural  Product  Medica 2:  291- 298.
Feng Y, Li XM, Duan XJ, Wang BG. 2006. A new acylated iridoid glucoside from Avicennia  marina . Chinese  Chemical Letters 17(9): 1201-1204.
Ghosh  J,  Das  J,  Manna  P,  Sil  PC.  2010. Arjunolic acid, a triterpenoid saponin, prevents  acetaminophen  (APAP)- induced liver and hepatocyte injury via the  inhibition  of  APAP  bioactivation and  JNK-mediated  mitochondrial protection. Free  Radical  Biology
Medicine 48(4): 535-553.
Giannini  EG,  Testa  R,  Savarino  V.  2005.
Liver  enzyme  alteration:  a  guide  for clinicians. CMAJ 172(3): 367-379.
Halliwell  B,  Gutteridge  JMC.  2007. Free Radicals  In  Biology  And  Medicine .  Ed ke-4.  Oxford,  UK:  Oxford  University
Press.
Hanani  E,  Mun’im  A,  Sekarini  R.  2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callyspongia sp. dari Kepulauan Seribu. Majalah  Ilmu  Kefarmasian 2(3): 127-133.
Harborne  JB.  1987. Metode  Fitokimia . Padmawinata K, Soediro I, penerjemah. Bandung:  ITB.  Terjemahan  dari: Phytochemical Methods .
Huang  B,  Ban  X,  He  J,  Tong  J,  Tian  J,
Wang  Y.  2011.  Hepatoprotective and antioxidant activity of ethanolic  extracts  of  edible  lotus ( Nelumbo  nucifera Gaertn.)  leaves. Food Chem. 120: 873-878.
Jaeschke  H,  Gores  GJ,  Cederbaum  AI, Hinson  JA,  Pessayre  D,  Lemasters  JJ. 2002. Mechanisms  of  hepatotoxicity. Toxicol . l Scie . 65: 166–176.
Jin  YKJ,  Russell  RM,  Aldini  G.  2010. Antioxidant  activity  and  oxidative stress:  an  overview.  Di  dalam:  Aldini
G, Yeum KJ, Niki E, Russell RM, editor.
Biomarkers  for  Antioxidant  Defense and Oxidative Damage: Principles and
Practical  Applications. Iowa,  USA: Blackwell Publishing. Karthikeyan  DR,  Manivasagam  T,
Subramanian  P,  Somasundaram  ST, Anantharaman  P,  Balasubramanian  T. 2008.  Antioxidant  activity  of  brown alga Padina boergesenii against carbon tetrachloride  induced  liver  fibrosis  in rats. Seaweed Res. Util. 30: 157-163. Kiernan  JA.  1990. Histological  and
Histochemical  Methods:  Theory  and
Practice .  Ed  ke-2.  Kanada:  Pergamon Press. Klaunig  JE,  Corthals  SM,  Kamendulis
LM,  Philip  BK.  2009. Role  of  The Kupffer  Cell  in  Hepatotoxicity  and Hepatocarcinogenesis . Di dalam: Sahu  SC,  editor. Hepatotoxicity  from Genomics to in vitro and in vivo Models. West  Sussex,  England:  John  Wiley  &
Sons Ltd.
Kumarappan C. Vijayakumar M, Thilagam
E,  Balamurugan  M,  Thiagarajan  M,
Senthil  S,  Das  SC,  Mandal  SC.  2011. Protective  and  curative  effect  of polyphenolic extract from Ichnocarpus
frutescense leaves  on  experimental hepatotoxicity by carbon tetrachloride and  tamoxifen. Ann.  of  Hepat .10(1):
63-72.
Lotito SB, Fraga CG. 2000. Catechins delay lipid  oxidation  and  alpha-tocopherol and beta-carotene depletion following ascorbate  depletion  in  human plasma. Proceeding  of  The  Society  for Experimental  Biology  and  Medicine 225: 32–38.
Martin KR. 2006. Targeting apoptosis with dietary bioactive agents. Experimental Biology and Medicine 231: 117-129. Middleton  E  Jr,  Kandaswami  C, Theoharides  TC.  2000.  The  effects  of plant  flavonoids  on  mammalian  cells: implications  for  inflammation,  heart
disease,  and  cancer. Pharmacology Review 52: 673–751.
Muriel  P,  Alba  N,  Perez-Alvarez  VM,
Shibayama  M,  Tsutsumi  VK.  2001. Kupffer  cells  inhibition  prevents hepatic lipid peroxidation and damage induced  by  carbon  tetrachloride. T oxicology and Pharmacology 130:219– 226. Noor  YR,  Khazali  M,  Syadipura  INN. 2006. Panduan  Pengenalan  Mangrove di  Indonesia.  Bogor :  Wetlands Internatinal. Nugraheni  M,  Santoso  U,  Suparmo,
Wuryastuti  H.  2011.  Potential  of Coleus  tuberosus  as  an  antioxidant and  cancer  chemoprevention  agent.
International  Food  Research  Journal
18(4): 1471-1480.
Panjaitan  RGP.  2008.  Pengujian  aktivitas hepatoprotektor  akar  pasak  bumi ( Eurycoma longifolia Jack.). [disertasi].
Bogor  (ID):  Sekolah  Pasca  Sarjana,
Institut Pertanian Bogor.
Pinzaru  IA,  Hădărugă  DI,  Hădărugă NG,  Corpaş  L,  Grozescu  I,  Peter  F. 2011.  Hepatoprotective  flavonoid b i o c o n j u g a t e / β - c y c l o d e x t r i n nanoparticles:dsc-molecular modeling correlation. Digest Journal of Nanomaterial  and  Biostructure 6(4): 1605-1617.
Punitha  SC,  Rajasekaran  M.  2011. Antioxidant  mediated  defense  role  of Wedelia  calendulacea herbal  extract against  CCl 4 inducedtoxic  hepatitis. Journal  of  Applied  Pharmaceutical Science 1(9): 111-115.
Quintieri L, Palatini P, Moro S, Floreani M.
2011.  Inhibition  of  cytochrome  P450 2c8-mediated drug metabolism by the flavonoid diosmetin. Drug Metabolism Pharmacokinetics 26(6): 559-568.
Sahreen  S,  Khan  MR,  Khan  RA.  2011.
Hepatoprotective  effects  of  methanol extract  of Carissa  opaca leaves  on CCl 4 -induced  damage  in  rats. BMC
Aktifitas antioksidan dan efek hepatoprotektif, Hardiningtyas et al.
Complement  Alternative  Medicine 11(48): 1-9.
Sen  S,  Chakraborty  R,  Sridhar1  C, Reddy  YSR,  De  B.  2010.  Free radicals,  antioxidants,  diseases  and phytomedicines:  current  status  and future  prospect. International  Journal of  Pharmaceutical  Science  Review  and Research 3(1): 91-100.
Sengupta  M,  Sharma  GD,  Chakraborty B.  2011.  Hepatoprotective  and immunomodulatory  properties  of aqueous  extract  of Curcuma  longa in carbon tetra chloride intoxicated Swiss albino  mice. Asian  Pacific  Journal  of
Tropical Biomedicine 1: 193-199. Setzer  WN.  2008.  Non-intercalative triterpenoid inhibitors of topoisomerase ii: a molecular docking study. Compounds Journal 1: 13-17. Sharma N, Shukla S. 2011. Hepatoprotective potential  of  aqueous  extract  of Butea monosperma against  CCl 4 induced damage in rats. In press : 1-11. Stockham SL, Scott MA. 2002. Fundamentals of Veterinary Clinical Pathology . Ed ke- 1.  Iowa  state  Pr.  Blackwell  Publishing Co. hlm. 433-486. Suja  SR,  Latha  PG,  Pushpangadan  P, Rajasekharan  S.  2004.  Evaluation of hepatoprotective effects of
Helminthostachys  zeylanica (L.)  Hook against  carbon  tetrachloride-induced liver damage in Wistar rats. Journal of Ethnopharmacology 92(1): 61-66. Thapa  BR,  Walia  A.  2007.  Liver  funcion tests  and  their  interpretation. Indian
Journal of Pediatics 74(7):663-671. Topcua T, Ertasb A, Kolakb U, Öztürk M,
Ulubelen A. 2007. Antioxidant activity tests on novel triterpenoids from Salvia
macrochlamys
. ARKIVOC 7: 195-208.
Vadlapudi  V,  Naidu  KC.  2009.  Evaluation of  antioxidant  potential  of  selected mangrove plants. Journal of Pharmaceutical  Research 2(11):  1742- 1745. Wang  BJ,  Liu  CT,  Tseng  CP,  Yu  ZR.  2004. Hepatoprotective  and  antioxidant effects  of Bupleurum  kaoi Liu  (Chao et  Chuang)  extract  and  its  fractions fractionated  using  supercritical  CO 2 on  CCl 4 -induced  liver  damage. Food and  Chemical  Toxicology 42(4):  609
617.
Wu X, Beecher GR, Holden JM, Haytowitz
DB,  Gebhardt  SE,  Prior  RL.  2004. Lipophilic and hydrophilic antioxidant capacities  of  common  foods  in  the United  States. Journal  of  Agriculture Food Chemistry 52: 4026-4037 Yang J, Kim JS, Sa YJ, Kim MO, Jeong HJ,
Yu  CY,  Kim  MJ.  2011.  Antioxidant, antibacterial and α-glucosidase inhibitory  activities  of  different extracts  of Cortex  moutan . African Journal  of  Biotechology 10(46):  9438- 9444.
Yeum  KJ,  Russell  RM,  Krinsky  NI,  Aldini
G.  2004.  Biomarkers  of  antioxidant apacity  in  the  hydrophilic  and lipophilic  compartments  of  human plasma. Archives. Biochemistry Biophysics 430: 97-10.
Yeum KJ, Beretta G, Krinsky NI, Russell RM. Aldini.  2009.  Synergistic  interactions of antioxidant nutrients in a biological model system. Nutrition 25(7-8): 839- 846.
Zhang ZS, Li D, Wang LJ, Ozkan N, Chen XD,
Mao ZH, Yang HZ. 2007. Optimisation of ethanol-water extraction of lignans from  flaxseed. Journal  of  Separation and Purification Technology 57: 17-24.