Menara Perkebunan , 2006, 74(1), 32-42

## Aktivitas ACCase mesokarp kelapa sawit dan kloning fragmen gen penyandi ACCase subunit biotin karboksilase
ACCase activity of oil palm mesocarp and cloning of gene fragment encoding biotin carboxylase subunit of ACCase
Asmini BUDIANI 1) , Djoko SANTOSO 1) , Hajrial ASWIDINNOOR 2) & Antonius SUWANTO 3)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia
2) Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor,  Indonesia
3) Fakultas MIPA,  Jurusan Biologi, Institut Pertanian Bogor, Bogor, Indonesia

## Summary
Genetic  engineering  to  produce  high yielding  oil  palm  might  be  done  by  over expressing  gene  encoding  key  enzyme  for  oil biosynthesis  in  the  oil  palm  mesocarp,  one  of which  is  ACCase.  The  objective  of  this research  was  to  analyze  ACCase  activity  of mesocarp from several developmental stages of fruit  and  to  clone  conserved  region  cDNA  of gene  encoding  biotin  carboxylase  subunit  of ACCase  (BC-htACCase)  from  oil  palm mesocarp. Activity of ACCase was analyzed by HPLC.  Amplification  of  cDNA  was  done  by means  of  reverse  transcriptase  polymerase chain  reaction  (RT-PCR)  using  degenerate heterologous  primer  on  several  annealing temperature  and  MgCl 2 concentration.  The cDNA  fragment  of  RT-PCR  product  was cloned, sequenced and analyzed to confirm that the cloned cDNA was conserved region of BC- htACCase.  The  result  showed  that  ACCase activity  increased  from  the  14  week  to  the  20 week-old  fruit,  and  then  decreased.  Using heterologous degenerate primers, cDNA fragments  of  BC-htACCase  conserved  region (469 bp) can be specifically amplified at 60 o C annealing  temperature  with  2  mM  MgCl 2 concentration. The  result  of  BlastX  analysis showed  that  the  sequence  of  cloned  cDNA fragment  was  highly homologous  with  the conserved  region  of  BC-htACCase  from Glycine  max, Arabidopsis  thaliana,  Nicotiana tabacum, and Brassica  napus with  243,  237, 236,  231  bit  score,  and E.  value 2e-63,  1e-61, 2e-61 and 5e-60, respectively.
[ Keywords : htACCase,    biotin    carboxylase, oil palm, RT-PCR].

## Ringkasan
Rekayasa  genetika  untuk  menghasilkan bibit  kelapa  sawit  berdaya  hasil  tinggi  dapat ditempuh  dengan  meningkatkan  ekspresi  gen penyandi enzim kunci biosintesis minyak pada kelapa  sawit,  salah  satunya  adalah  ACCase. Tujuan  penelitian  ini  adalah  menguji  aktivitas ACCase  mesokarp  beberapa  tahap  perkem- bangan  buah  sawit  dan  mengklon  fragmen cDNA  daerah  konservatif  gen  penyandi ACCase  heteromerik  subunit  biotin  karbok- silase  (BC-htACCase)  dari  mesokarp  buah sawit.  Aktivitas  ACCase  dianalisis  dengan HPLC.  Amplifikasi  cDNA  dilakukan  dengan teknik  RT-PCR  menggunakan  primer degene- rate heterologus pada berbagai suhu penempelan  dan  konsentrasi  MgCl 2 .  Fragmen cDNA  hasil  RT-PCR  diklon,  disekuen  dan dianalisis untuk mengkonfirmasi bahwa cDNA terklon adalah daerah konservatif BC- htACCase . Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  aktivitas  ACCase  meningkat  dari  buah berumur  14  minggu  hingga  buah  berumur 20  minggu,  kemudian  menurun  kembali Dengan primer degenerate heterologus , fragmen  cDNA  daerah  konservatif  BC- htACCase  (469 pb) dapat diamplifikasi secara spesifik  pada  suhu  penempelan  60 o C  dan konsentrasi MgCl 2 2 mM. Hasil analisis BlastX dari  sekuen  DNA  fragmen  terklon  menunjuk- kan  bahwa  sekuen  tersebut  mempunyai homologi  tinggi  antara  lain  dengan  gen
Budiani et al.
penyandi  BC-htACCase  dari Glycine  max , Arabidopsis  thaliana , Nicotiana  tabacum dan Brassica  napus , masing-masing  dengan  skor 243, 237, 236, 231 bit, dan E. value 2e-63, 1e- 61, 2e-61 dan 5e-60.

## Pendahuluan
Peningkatan  produksi  melalui  penye- diaan  bibit  unggul  berdaya  hasil  tinggi merupakan salah satu upaya strategis yang terus dilakukan untuk memenuhi kebutuh- an minyak sawit yang semakin meningkat dari tahun ke tahun (Asmono et al ., 1999). Secara  konvensional  usaha  tersebut  ter- kendala sempitnya keragaman genetik dan lamanya  siklus  pemuliaan  kelapa  sawit. Salah  satu  pendekatan  alternatif  yang dapat  ditempuh  untuk  membantu  menga- tasi  masalah  tersebut  adalah  rekayasa metabolisme  biosintesis  minyak  melalui peningkatan  ekspresi  gen-gen  kunci  bio- sintesis  minyak.  Untuk  tujuan  tersebut diperlukan  ketersediaan  gen-gen  yang terlibat  dalam  biosintesis  minyak  dan pemahaman  mengenai  regulasi  ekspresi- nya.
Biosintesis  minyak/triasilgliserol  me- rupakan  proses  multikompartemen  yang secara  garis  besar  dibagi  ke  dalam  tiga tahapan, yaitu (1) biosintesis malonil-CoA dari  asetil-CoA,  (2)  biosintesis  asam lemak  menggunakan  asetil-CoA  dan malonil-CoA  sebagai  prekursor,  dan  (3) biosintesis  triasilgliserol  melalui  lintasan Kennedy.  Biosintesis  malonil-CoA  dari asetil-CoA  dikatalisis  oleh  enzim  asetil- CoA karboksilase (ACCase). Pada tanaman  reaksi  tersebut  dijumpai  baik pada  plastid maupun pada  sitosol. Malonil-CoA  pada  plastid  diperlukan untuk  pembentukan  asam  lemak,  sedang- kan malonil-CoA dalam sitosol digunakan untuk  pemanjangan  rantai  karbon  asam lemak  dan  untuk  sintesis  senyawa  lain seperti flavonoid (Choi et al ., 1995).
Dua  bentuk  ACCase  yang  berbeda secara  fisik  telah  diidentifikasi  pada tanaman,  yaitu  ACCase  homomerik  (hm- ACCase) dan ACCase heteromerik (ht-AC Case)  (Li  &  Cronan  1992;  Sasaki et  al., 1993, 1995; Alban et al ., 1994; Shorrosh et al ., 1994, 1995). Ketiga domain (BCCP, BC  dan  CT)  dari  ht-ACCase  merupakan protein  yang  dapat  dipisahkan,  sedangkan pada  hm-ACCase  ketiga  domain  terdapat dalam  satu  polipeptida.  Ht-ACCase  juga ditemukan  pada  bakteri  (Li  &  Cronan, 1992),  sedangkan  hm-ACCase  juga terda- pat  pada  sitosol  fungi  (Haβlacher et  al ., 1993) dan hewan (Takai et al ., 1988).
Berbagai  hasil  penelitian  menunjuk- kan  adanya  korelasi  antara  aktivitas ACCase  dengan  kecepatan  sintesis  asam lemak  maupun  dengan  akumulasi  minyak (Jin et  al .,  1998;  Francki et  al .,  2002). Pada tanaman barley , jagung dan tembakau,  ACCase  terbukti  merupakan enzim  pengendali  utama  arus  metabolit pada  alur  biosintesis  lemak  (Page et  al ., 1994;  Shintani  &  Ohlrogge  1995).  Gen penyandi  BC,  BCCP  dan  CT  dari  ht- ACCase  juga  telah  diklon  dari  berbagai tanaman,  di  antaranya  dari Arabidopsis thaliana (Choi et  al .,  1995), B.  napus (Schulte et  al., 1994,  1997),  jagung (Ashton et  al .,  1994)  dan  tembakau
(Shorrosh et al ., 1995). Demikian juga gen penyandi  hm-ACCase  (Egli et  al., 1993, Shorrosh et  al. 1994,  Anderson et  al ., 1995).  Namun  sejauh  ini  belum  ada publikasi  mengenai  ACCase  dari  kelapa sawit.  Studi  mengenai  ACCase  dan kloning gen penyandinya dari kelapa sawit diharapkan  akan  dapat  membantu  usaha peningkatan rendemen dan kualitas minyak  sawit.  Sebagai  langkah  awal  dari usaha  rekayasa  metabolisme  untuk  me- ningkatkan  rendemen  minyak,  penelitian ini  bertujuan  untuk  mempelajari  pola aktivitas ACCase pada mesokarp berbagai umur  buah  sawit  dan  mengklon  fragmen
Aktivitas ACCase mesokarp kelapa sawit dan kloning fragmen...
gen  penyandi  ht-ACCase  subunit  BC  dari mesokarp kelapa sawit.

## Bahan dan Metode

## Mesokarp buah sawit
Mesokarp buah sawit yang digunakan diambil dari buah sawit tipe Tenera. Buah sawit  dikupas  kulitnya  kemudian  meso- karp  dipotong-potong  dan  disimpan  pada suhu -80 o C sampai digunakan.
Analisis  aktivitas ACCase dari mesokarp berbagai tahapan perkembangan buah
Untuk  analisis  aktivitas  ACCase, digunakan mesokarp dari berbagai tingkat perkembangan buah, yaitu mulai dari buah muda  berumur  14  minggu  yang  kan- dungan  minyaknya  0,23%  hingga  buah masak  berumur  24  minggu  dengan  kan- dungan  minyak    56,62  %.  Mesokarp  dari setiap tahap perkembangan buah dianalisis minyak dan proteinnya dengan cara seperti yang telah dilaporkan sebelumnya (Budiani et al. , 2002). Aktivitas ACCase dari ekstrak protein mesokarp  buah  sawit  ditentukan  meng- gunakan HPLC ( High Performance liquid Chromatography ) dengan mengukur kece- patan  penurunan  konsentrasi  asetil-CoA dan  peningkatan  malonil-CoA  (Levert et  al., 2002).  Satu  unit  aktivitas  ACCase (U)  didefinisikan  sebagai  peningkatan konsentrasi  malonil  CoA  per  menit  oleh penambahan  1 µ L ekstrak enzim. Ekstrak protein  dipreinkubasi  pada  suhu  25 0 C selama    30  menit  dengan  2  mg/L  bovin serum  albumin  dan  10  mM  potassium sitrat.  Reaksi  dimulai  dengan  mentransfer 50  µL  ekstrak  yang  telah  diinkubasi  ke dalam campuran reaksi    (50 µM Tris, pH 7,5,  6 µM asetil-CoA,  2 mM ATP, 7 mM KHCO 3 ,  8  mM  MgCl 2 ,  1  mM  ditiotreitol dan  1  mg/mL  bovin  serum  albumin)
hingga  volume  total    200  µL,  kemudian diinkubasi  selama  5-20  menit  pada  suhu 25 0 C.  Reaksi  dihentikan  dengan  menam- bahkan  50  µL  10%  asam  perklorat, kemudian  disentrifugasi  pada  10.000  g selama  tiga  menit.  Supernatan  digunakan untuk  analisis  HPLC.  Fase  mobil  yang digunakan adalah 10 mM KH 2 PO 4 , pH 6,7 (solven  A)  dan  MeOH  (solven  B).  Untuk mendapatkan  kondisi  pemisahan  asetil- CoA dari malonil-CoA dilakukan optimasi kondisi  HPLC  yang  meliputi  kecepatan alir ( flow rate ) dan gradien fase mobil.

## Isolasi RNA dari mesokarp buah sawit
RNA  total  diisolasi  dari  jaringan mesokarp  dengan  metode  Chang et  al., (1993)  yang  dimodifikasi,  menggunakan bufer  yang  mengandung  CTAB  sebagai- mana  dilaporkan  sebelumnya  (Budiani et  al. ,  2004).  Pada  tahap  akhir  isolasi, RNA  dimurnikan  dari  kontaminan  DNA dengan  menambahkan  0,1  volume  LiCl 8M  ke  dalam  RNA  total,  kemudian campuran diinkubasi di es selama dua jam, dilanjutkan  sentrifugasi  30  menit  pada 13.000  rpm,  dengan  suhu  4 o C.  Pelet dilarutkan dalam  200 µ L DEPC  – treated water, ditambah 0,1 volume Na-asetat 3M dan  2  volume  etanol  absolut,  kemudian didinginkan  pada  suhu    –20 o C  selama 30 menit. Setelah sentrifugasi, pelet dicuci dengan  70  %  etanol  dingin.  RNA  yang diperoleh  diuji  kualitas  dan  kuantitasnya dengan    jalan  elektroforesis   pada    gel agarose  1%  dan  dengan  mengukur absorbansinya  pada  panjang  gelombang 260  dan 280 nm.
Amplifikasi cDNA daerah konservatif BC- htACCase dengan RT-PCR
Untuk mengamplifikasi fragmen cDNA  daerah  konservatif BC-htACCase , dirancang  primer heterologus degenerate
Budiani et al.
berdasarkan  hasil  translasi  balik  poli- peptida  yang  memiliki  homologi  dengan BC-htACCase (Budiani et  al. ,  2002) dikombinasikan  dengan  hasil  penjajaran sekuen  gen  yang  sama  dari  tanaman  lain. Perancangan primer dilakukan mengguna- kan  program  Primer3  (http://www.bio tools.umassmed.edu/). Sebagai input sekuen  digunakan  gen  yang  sama  dari tanaman B.  napus. Output  primer  yang diperoleh  kemudian  dicocokkan  kembali dengan  hasil  penjajaran  sekuen  gen  yang sama dari berbagai tanaman lain, sehingga diperoleh  pasangan  primer degenerate BC-F  (5’-GAAGCACCWTCYCCTGCM YT-3’)  dan  BC-R  (5’-CKHGTTGGRGC CCAYACRAT-3’).  Amplifikasi  daerah konservatif BC-htACCase dilakukan dengan Reverse Transcryptase-Poly- merase Chain Reaction (RT-PCR). Sintesis  utas  pertama  cDNA  dilakukan menggunakan kit Superscript First Strand cDNA  Synthesis dengan  primer  heksamer acak  (Invitrogen) dan templat RNA total. Selanjutnya  cDNA  utas  pertama  diguna- kan  sebagai  cetakan  untuk  amplifikasi fragmen daerah konservatif BC-htACCase , menggunakan pasangan primer  BC-F dan BC-R.  Reaksi  PCR  dilakukan  dengan program sebagai berikut: satu siklus dena- turasi  awal  pada  suhu    94 o C  selama  dua menit,  35  siklus  masing-masing  terdiri dari denaturasi pada suhu 94 o C selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 50 o C – 60 o C selama 45 detik, dan ekstensi pada suhu  70 o C  selama  dua  menit.  Selanjutnya reaksi  diakhiri  dengan  ekstensi  pada  suhu 70 o C  selama  empat  menit.  Untuk  men- dapatkan  hasil  amplifikasi  yang  terbaik, selain variasi suhu penempelan, PCR juga dilakukan  pada  beberapa  konsentrasi MgCl 2, yaitu  1,5,  2,0,  dan  3,0  mM.  Hasil amplifikasi dicek pada gel agarose.
Kloning  dan  analisis  fragmen  DNA  hasil RT-PCR
Hasil  amplifikasi  dimurnikan  dari gel menggunakan kit QIAquick Gel Extraction dari QIAGEN dan diligasikan pada vektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen) kemudian diklon  ke  dalam E.  coli kompeten  sesuai prosedur  yang  tersedia  dalam  buku petunjuk . Seleksi  sel  transforman  dilaku- kan pada medium padat LB yang mengan- dung 50 mg/L kanamisin dan 40 mg/L X- Gal. Analisis adanya fragmen terklon pada koloni  putih  dilakukan  dengan  PCR menggunakan  primer  BC-F  dan  BC-R. Plasmid  rekombinan  diisolasi  dari  koloni positif  menggunakan  kit QIAprep  Spin Miniprep (QIAGEN),  didigesti  dengan enzim  restriksi Eco RI  dan  disekuen. Sekuen  DNA  yang  diperoleh  kemudian dianalisis  menggunakan  Blast  (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov) untuk mengetahui homologinya dengan BC-htACCase .

## Hasil dan Pembahasan
Aktivitas  ACCase  mesokarp    berbagai tahap perkembangan buah
Aktivitas  ACCase  meningkat  mulai buah  berumur  14  minggu  hingga  20 minggu,  yaitu  dari  4,7  x  10 -2 unit  hingga 22 x 10 -2 unit, kemudian menurun kembali pada  buah  berumur  22  minggu  dan  24 minggu, meskipun rendemen minyak pada tahap  tersebut  masih  terus  meningkat (Gambar  1).  Aktivitas  ACCase  tertinggi terjadi pada awal fase logaritmik dari pola peningkatan  rendemen  minyak.  Hal  ini menunjukkan  tingginya  kebutuhan  akan ACCase  untuk  sintesis  asam  lemak  yang digunakan  baik  dalam  sintesis  minyak maupun untuk membran.
Aktivitas ACCase mesokarp kelapa sawit dan kloning fragmen...
Adanya  korelasi  antara  kecepatan  akumu- lasi  minyak  dengan  aktivitas  ACCase telah  dilaporkan  pada  biji  kedelai      (Jin et  al. ,  1998)  dan  spesies  Lupin  (Francki et  al .,  2002).  Hasil  penelitian  Jin et  al. (1998)  menunjukkan  adanya  hubungan yang  sangat  dekat  antara  kecepatan akumulasi  minyak  dan  aktivitas  ACCase pada biji kedelai yang sedang berkembang dari  berbagai  varietas  dengan  kandungan minyak  yang  berbeda.  Sejalan  dengan hasil penelitian tersebut, Lupinus mutabilis yang    kandungan    minyaknya 16% ternyata mempunyai aktivitas ACCase  dua  kali  lebih  tinggi  dibanding- kan  dengan L.  angustifolius (Francki et  al., 2002).  Dengan  demikian  ACCase merupakan  target  yang  baik  untuk rekayasa  genetika  dalam  pengembangan varietas dengan kandungan minyak tinggi.
Sebagian  besar  asam  lemak  diguna- kan  untuk  sintesis  membran  sel  dan lemak/minyak  tersimpan.  Oleh  karena  itu pola  aktivitas  ACCase  untuk  suatu tanaman  bersifat  spesifik,  tergantung kebutuhan  asam  lemaknya.  Pola  aktivitas ACCase  yang  dihasilkan  pada  penelitian
ini  menunjukkan  bahwa  pada  mesokarp buah  sawit,  ACCase  mempunyai  peran kunci  dalam  regulasi  akumulasi  triasil- gliserol  atau  minyak.  Oleh  karena  itu langkah  berikutnya  yang  perlu  dilakukan adalah  mempelajari  regulasi  ekspresi  dan mengklon gen-gen yang menyandinya.
Amplifikasi DNA daerah konservatif BC- htACCase dengan RT-PCR
Gambar  2  menunjukkan  hasil  RT- PCR  untuk  amplifikasi  fragmen BC- htACCase menggunakan  pasangan  primer BC-F  dan  BC-R  pada  berbagai  suhu penempelan dan konsentrasi MgCl 2. Nampak bahwa suhu penempelan maupun konsentrasi  MgCl 2 sangat  berpengaruh terhadap  intensitas  dan  spesifisitas  hasil amplifikasi.   Pada   konsentrasi   Mg Cl 2 yang  sama,  semakin  tinggi  suhu  penem- pelan,  intensitas  fragmen  DNA  yang dihasilkan  semakin  rendah  namun  sema- kin  spesifik.  Sebaliknya  pada  suhu penempelan  yang  sama,  semakin  tinggi konsentrasi  Mg  semakin  tinggi  intensitas fragmen  DNA  hasil  PCR,  tetapi  spesifi-
Gambar 1.  Pola aktivitas ACCase dan rendemen minyak mesokarp berbagai  umur buah sawit.
Figure 1.   Pattern of ACCase activity and oil content of several oil palm fruit ages.
24.10 -2 14 16 18 20 22 24 Umur (minggu)/ Age (week) 0 10 20 30 40 5 0 60 Aktivitas ACCase/ ACCase activity Kandungan minyak/ Oil content (%) A k ti v it as A C C as e / A C C a se a ct iv it y ( U ) 20.10 -2 16.10 -2 12.10 -2 8.10 -2 4.10 -2 0 K an d u n g an m in y ak / O il c o n te n t ( % )
Budiani et al.
sitasnya  semakin  rendah.  Kondisi  ampli- fikasi yang spesifik untuk fragmen daerah konservatif BC-htACCase berukuran sekitar  500  pb  diperoleh  pada  suhu penempelan  60 o C  dengan  konsentrasi MgCl 2 1,5 - 2 mM.
Amplifikasi  suatu  fragmen  DNA dengan  mesin  PCR  dipengaruhi  oleh beberapa   faktor,   di   antaranya     adalah jumlah  siklus  amplifikasi,  suhu  penem- pelan,  spesifisitas  primer  dan  konsentrasi ion  Mg.  Tingginya    spesifisitas      primer yang  berarti  basa-basa dari  primer saling komplemen  dengan  basa-basa  dari  kedua ujung fragmen  DNA  yang akan  diampli- fikasi  merupakan  penentu  dapat  tidaknya
fragmen DNA target diamplifikasi. Dalam merancang  primer  terdapat  beberapa  ke- tentuan  umum,  di  antaranya  adalah panjang  primer  antara  18-28  nukleotida, tersusun  oleh  50 – 60% G+C  dan  kedua primer mempunyai titik leleh yang seban- ding  (Innis  &  Gelfand,  1990).  Pada percobaan  ini  digunakan  primer degene- rate ,  yang  cara  perancangannya  didasar- kan pada  hasil penjajaran  daerah  konser- vatif    gen  penyandi  BC-htACCase  dari berbagai tanaman digabung dengan informasi  polipeptida  hasil  sekuensing protein mesokarp buah sawit yang menun- jukkan  homologi  dengan  BC-htACCase. Dengan  pendekatan  ini,  diharapkan  dari
Gambar 2.  Hasil  RT-PCR  untuk  fragmen  BC-htACCase  pada  (A)  berbagai  suhu  penempelan  dan konsentrasi  MgCl 2 (lajur  1-5  berturut-turut  pada  suhu  55,  57,  58,  59  dan  60 0 C;  a,  b,  c berturut-turut pada konsentrasi MgCl 2 1,5; 2,0 dan 3,0 mM), (B) berbagai suhu penempelan (lajur 1-8 berturut-turut 50 – 58 0 C) dengan konsentrasi MgCl 2 1,5 mM dan (C) pada suhu 60 0 C dengan konsentrasi MgCl 2 2 mM. M = 1 kb plus DNA-ladder
Figure 2. RT-PCR  product  of  BC-htACCase  fragment  (A)  at  several  annealing  temperatures  and MgCl 2 concentrations  (lanes 1-5 = 55, 57, 58, 59, and 60 o C  respectively; a, b, c = 1.5; 2.0 and 3.0  mM MgCl 2 ) , (B),  at  different  annealing  temperatures    (lanes  1-8  =  50  –  58 0 C respectively); (C) at temperature 60 o C and Mg Cl 2 2.0 mM. M =  1 kb plus DNA-ladder
a b c M  1    2    3   4    5   1    2    3   4   5    1    2    3   4 5 B 500 bp M     1     2     3     4     5      6 C M     1     2     3 500 bp A
Aktivitas ACCase mesokarp kelapa sawit dan kloning fragmen...
beberapa  oligonukleotida  dalam  primer yang  digunakan  ( degene-rate ),  ada  oligo- nukleotida  yang  benar-benar  komplemen dengan DNA target.
Proses  penempelan  primer  dengan templat  DNA  atau  RNA  juga  sangat dipengaruhi  oleh  suhu.  Pedoman  umum untuk  suhu  penempelan  adalah  5 0 C di bawah  titik  leleh  (Tm)  primer  (Innis  & Gelfand,  1990).  Pada  penggunaan  primer degenerate optimasi  suhu  penempelan menjadi  semakin  penting,  karena  primer yang  digunakan  merupakan  campuran beberapa  oligonukleotida  yang  mem- punyai  susunan  basa  yang  berbeda sehingga Tm-nya juga berbeda-beda. Oleh karenanya  optimasi  kondisi  amplifikasi sangat diperlukan dengan mencoba berbagai  suhu  pada  proses  penempelan primer.
Hasil  seleksi  koloni  transforman  me- nunjukkan  efisiensi  transformasi  yang tinggi  sebagaimana  ditunjukkan  oleh banyaknya  jumlah  koloni  putih  yang tumbuh  pada  media  seleksi  (data  tidak ditampilkan).  Analisis  PCR  dari  koloni putih  hasil  transformasi  fragmen BC- htACCase yang  telah  dimurnikan  dari  gel menunjukkan  bahwa  kesepuluh  koloni yang dianalisis mengandung sisipan DNA dengan  ukuran  seperti  yang  diinginkan (Gambar  3A).  Hasil  ini  dikonfirmasi kembali  melalui  isolasi  plasmid  rekom- binan dan digestinya dengan Eco RI. Elek- troforesis  hasil  digesti  plasmid  rekom- binan  mengkonfirmasi  hasil  tersebut. Empat  dari  lima  plasmid  rekombinan (lajur  1,  2,  4  dan  5)  yang  diisolasi mengandung  sisipan  DNA  yang  sesuai ukurannya (Gambar 3B).
Hasil  sekuensing  DNA  fragmen BC- htACCase terklon  yang  telah  dimurnikan dari  gel  menunjukkan  bahwa  ukuran fragmen  tersebut  adalah  469  pb  (Gambar 4).  Baik    hasil  analisis  BlastX  maupun BlastN  dari  sekuen  DNA  membuktikan
kebenaran  fragmen  terklon  sebagai  frag- men  dari BC-htACCase .  Hal  ini  ditunjuk- kan  oleh  tingginya  homologi  antara sekuen asam amino yang merupakan hasil translasi  DNA  terklon  dengan  sekuen asam  amino  subunit  biotin  karboksilase ACCase heteromerik dari beberapa tanaman lain, di antaranya adalah G. max , A  thaliana,  N.  tabacum ,  dan B.    napus masing-masing  dengan  skor  243,  237, 236,  231  bit,  dan E.  value 2e-63,  1e-61, 2e-61 dan 5e-60. (Tabel  1 ). Hasil analisis BlastN juga menunjuk- kan  homologi  yang  tinggi  antara  sekuen DNA  terklon  dengan  gen  BC-htACCase dari G.  max , B.  napus , A.  thaliana , N. tabacum, M. truncatula , dan
R..  communis masing-masing  dengan skor 306, 191, 131, 127, 103 dan 70, serta E-value 3e-80, 1e-45, 1e-27, 2e-26, 3e-19 dan  5e-09  (data    lengkap    tidak    disaji- kan). Suatu sikuen DNA dinilai memiliki homologi tinggi apabila memiliki E-value (nilai  peluang)  maksimal  e-4  atau  men- capai  skor  minimal  50  bits  (Claverie  & Notredame, 2003). Makin rendah E-value dan  makin  tinggi  skor,  makin  signifikan dan  makin  tinggi  homologi  protein  atau sekuen nukleotida yang dianalisis.
Keberhasilan  rekayasa  metabolisme minyak yang telah dilaporkan sampai saat ini  lebih  banyak  ditujukan  untuk  mengu- bah  kualitas  minyak,  seperti  meningkat- kan  kandungan  stearat,  oleat,  γ-linolenat, laurat dan lain sebagainya, dengan enzim target  rekayasa  antara  lain  stearoil-ACP ∆-9 desaturase, oleoil-∆-12 dan ∆-6 desa- turase,  dan  asil-ACP  tioesterase  (Thelen &  Ohlrogge,  2002).  Sedangkan  laporan mengenai  manipulasi  genetik  untuk peningkatan  produksi minyak  masih sangat  terbatas.  Kenaikan  kandungan minyak  dalam  biji B.  napus sebesar  5% diperoleh  setelah  ditransformasi  dengan suatu  konstruk  yang  mengandung  gen penyandi  hm-ACCase,  promoter   napin

## Budiani et al.
Gambar 3.  (A) PCR koloni hasil transformasi fragmen DNA daerah konservatif gen BC-htACCase; (B) Hasil digesti plasmid rekombinan yang diisolasi dari koloni putih dengan Eco RI.
Figure 3.  (A) Colony PCR of transformation product of conserved region BC-htACCase DNA fragment; (B) Digestion product of recombinant plasmid isolated   from white colonies using EcoRI.
Tabel 1.  Protein dan spesies tanaman asalnya hasil analisis BlastXyang menunjukkan homologi  dengan fragmen DNA hasil RT-PCR terklon.
Table 1.  Protein and plant species origin from BlastX analysis output showing homology with the cloned DNA fragment of RT-PCR result.
No.  aksesi bank gen Protein homolog Spesies Skor (bit) E-value gi|3219361|gb|AAC23573.1| Biotin karboksilase prekursor Glycine max 243 2e-63 gi |10178099| dbj |BAB11486.1| Asetil-CoA karboksilase, subunit biotin karboksilase Arabidopsis thaliana 237 1e-61 gi | 7438127 | pir | T02431| Asetil-CoA karboksilase, subunit biotin karboksilase Nicotiana tabacum 236 2e-61 gi|14388188|gb|AAK60339. 1| Biotin karboksilase Brassica napus 231 5e-60 gi|67923410|ref|ZP00516889.1| Asetil-CoA karboksilase, biotin karboksilase Crocosphaera watsonii WH8501 187 8e-47 gi|16331500|ref|NP_442228. 1| Biotin karboksilase Synechocystis sp. PCC 6803 185 5e-46 gi|33635438|emb|CAE21763.1 | Asetil-CoA karboksilase, subunit biotin karboksilase Prochlorococcus  marinus str. MIT 313 182 3e-45 gi|22299351|ref|NP_682598.1| Biotin karboksilase Thermosynechococcus elongatus BP-1 175 4e-43 gi|53764313|ref|ZP_00160077.2 | Biotin karboksilase Anabaena variabilis 174 7e-43 gi|71674004|ref|ZP_00671752.1 | Asetil-CoA karboksilase, biotin karboksilase Trichodesmium erythraeum 173 2e-42
A M  1     2    3    4    5   6    7 8    9 10 500 bp bp B 500 bp M  1  2   3 4 5
Aktivitas ACCase mesokarp kelapa sawit dan kloning fragmen...
Gambar 4.  Susunan nukleotida fragmen BC-htACCase terklon (Kedua anak panah menunjukkan  posisi primer BC-F dan BC-R).
Figure 4.   Nucleotide sequence of the cloned BC-htACCase  fragment (the  two arrows  indicated BC-F and BC-R primer positions).
dan gen transit peptida.  Transfer  konstruk tersebut memungkinkan import hm- ACCase  ke  dalam  plastid  sehingga  akti- vitas  ACCase  plastid  meningkat  (Roesler et  al .,  1997).  Usaha  meningkatkan  level ACCase  juga  berhasil  dilakukan  hanya dengan  mengover-ekspresikan accD ,  gen penyandi  subunit  β-CT  pada  tanaman tembakau.  Promoter  dari accD diganti dengan  promoter  NEP  ( nuclear-encoded RNA  polymerase )  dan  promoter  PEP ( plastid-encoded  RNA  polymerase ).  Level ACCase  plastid  dan  kandungan  asam lemak  dalam  daun  meningkat,  tetapi kandungan  asam  lemak  biji  tidak  berbeda dengan  tipe  liarnya.  Di  samping  itu, transforman  ternyata  memproduksi  biji dua  kali  lebih  banyak,  sehingga  jumlah minyak  biji  yang  dihasilkan  pertanaman meningkat (Sasaki & Nagano, 2004).

## Kesimpulan dan Saran
ACCase  merupakan  salah  satu  enzim kunci  dalam  akumulasi  minyak  pada mesokarp  kelapa  sawit.  Fragmen  DNA
berukuran  469  pb  telah  diklon  dari  meso- karp  buah  kelapa  sawit  dan  terkonfirmasi sekuennya  sebagai  bagian  dari  gen penyandi  salah  satu  subunit  heteromerik ACCase, yaitu biotin karboksilase. Berdasarkan  sekuen  tersebut  disarankan untuk  mengklon  gen  lengkapnya.  Dengan telah  diklonnya  fragmen BC-htACCase dan  diketahui  sekuennya,  peluang  untuk melakukan  penelitian  berikutnya  semakin terbuka.  Selain  untuk  mendisain  primer yang  akan  digunakan  untuk  meng- amplifikasi gen lengkap, informasi sekuen yang  diperoleh  dapat  digunakan  dalam studi  regulasi  ekspresi  gen  tersebut  yang akan berguna dalam upaya perakitan bibit sawit berdaya hasil tinggi.

## Daftar Pustaka
Alban,  C.,  P.  Baldet  &  R.  Douce  (1994). Localization  and  characterization  of  two structurally different forms of acetyl-CoA carboxylase in young pea leaves, of which one  is  sensitive  to  aryloxy-phenoxypro- prionate herbicides. Biochem. J., 30 , 557-
565.
GAAGCACCTTCTCCTGCCTTGACGCCTGAGCTACGGAAAGCTATGGGTGATGC AGCTGTAGCTGCTGCTGCATCTATAGGTTACATTGGTGTTGGAACTGTGGAAT TTCTCTTGGATGAAAGAGGTACCTTCTACTTCATGGAGATGAACACCAGGATT CAGGTAGAGCACCCTGTCACTGAAATGATTTCTTCAACCGACTTGATTGAAGA ACAAATTCGAGTTGCTCTTGGAGAGAGGCTGACATACAAGCAGGAAGACATT GTTCTGAGAGGACATTCAATTGAATGCCGGATTAATGCAGAAGATGCCTTCAA AGGATTTCGTCCAGGGCCTGGAAAGATYACATCATACTTGCCATCTGGAGGTC CATTTGTGAGAATGGATAGTaCATGTTTATCCAGGCTATGTGGTTCCCCCAAGC TATGACTCCTTGYTAGGAAAGCtTTATCGTATGGGCCCCAACAAG

## Budiani et al.
Anderson,  J.V.,  S.M.  Lutz,  B.G.  Gengenbach &  J.W.  Gronwald  (1995).    Genomic sequence  for  a  nuclear  gene  encoding acetyl- Coenzyme A carboxylase (Accession no. L42814) in soybean. Plant Physiol., 109 , 338-340.
Ashton  A.R.,  C.L.  Jenkins  &  P.R.  Whitfeld (1994). Molecular cloning of two different cDNAs  for  maize  acetyl-CoA  carboxy- lase. Plant Mol. Biol., 24 ,  35-49.
Asmono  D.,  M.  Ikhwan,  E.  Suprianto  & K.  Pamin  (1999).  Oil  palm  breeding  in Indonesia toward 21 st century:
Achievement  and  prospect. In.  Proc. Seminar Towards Sustainable  Agriculture in  Humid  Tropics  Facing  21 st Century :. Bandar Lampung  Indonesia,  Sept  1999. p. 125 – 132.
Budiani,  A.,  D.  Santoso,  H.  Aswidinnoor, A.  Suwanto  &  S.  Sudiatso  (2002).
Isolation  and  characterization  of  protein differentially  expressed  during  oil  palm mesocarp development. Menara Perkebunan , 70 (1), 1-11.
Budiani,  A.,  D.  Santoso,  H.  Aswidinnoor, A.  Suwanto  &  S.  Sudiatso  (2004). Kloning  parsial  gen  penyandi  enoil-ACP reduktase  dari  mesokarp  buah  kelapa sawit  ( Elaeis  guineensis Jacq.). Menara Perkebunan , 72 (1), 28-37.
Chang,  S.,  J.  Puryear  &  J.  Cairney  (1993).  A simple  and  efficient  method  for  isolating RNA  from  pine  trees. Plant  Mol.    Biol. Rep., 11, 98 – 100.
Choi, J-K, F. Yu, E.S. Wurtele & B.J. Nikolau (1995).  Molecular  cloning  and  charac- terrization  of  the  cDNA  coding  for  the biotin-containing subunit of the   chloro- plastic  acetyl-CoA  carboxylase. Plant Physiol ., 109, 619-626.
Claveri, J. &  C. Notredame (2003). Bioinfor- matics  for  Dummies .    New  York,  Wiley Publishing.  p. 215-238.
Egli, M.A., B.G. Gengenbach, J.W. Gronwald, D.A.  Somers  &  D.L.  Wyse  (1993).
Characterization of maize acetyl- coenzyme A carboxylase. Plant Physiol.,
101, 499-506.
Francki,  M.G.,  P.  Whitaker,  P.M.  Smith  & C.A. Atkins (2002). Differential
expression  of  a  novel  gene  during  seed triacylglycerol  accumulation  in  lupin species  ( Lupinus  angustifolius L.  and L. mutabilis L.). Functional & Intregative
Genomics, 26, 292-300.
Ha β lacher  M.,  A.S.  Ivessa,  F.  Paltauf  & S.D. Kohlwein (1993). Acetyl-CoA Carboxylase  from  yeast  is  essential enzyme  and  is  regulated  by  factors  that control phospholipid metabolism. J.  Biol. Chem ., 268, 10946 –10952.
Innis,  M.  A.  &  D.  H.  Gelfand  (1990). Optimization  of  PCR. In Innis,  MA, D.H.  Gelfand,  J.J.  Sninsky  &  T.J.  White. (eds) PCR Protocols a Guide to Methods and  Application .  London,  Academic
Press, Inc. p. 3-11
Jin,  E.S.,  J.H.  Orf  &  J.W.  Gronwald  (1998). Oil accumulation and acetyl-CoA carboxylase activity in developing soybean  seed. TEKTRAN  US  Dept  of Agriculture, Agricultural Research Service. Levert K L, Grover L Waldrop & Jacqueline M Stephens (2002).  A biotin analog inhibits acetyl-CoA  carboxylase  activity  and adipogenesis. J. Biol. Chem., 277 , 16347-
16350 .
Li,  S-J  &  Je.  Jr.  Cronan  (1992).  The  gene encoding the biotin carboxylase subunit of
Escherichia  coli acetyl-CoA  carboxylase.
J. Biol. Chem., 267 , 855-863.
Page,  R.A.,  S.  Okada  &  J.L.  Harwood  (1994). Acetyl-CoA  carboxylase  exerts  strong flux control over lipid synthesis in plants. Biochimica  et  Biophysica  Acta, 1210,
369-372.
Roesler, K., D. Shintani, L. Savage, S.  Boddupali  &  J.  Ohlrogge  (1997).
Targeting of the Arabidopsis homomeric .
Aktivitas ACCase mesokarp kelapa sawit dan kloning fragmen...
acetyl-coenzyme A carboxylase  to plastid of   rapeseed. Plant Physiol., 113, 75-81.
Sasaki,  Y.,  K.  Hakamada,  Y.  Suama, Y.  Nagano,  I.  Furusawa  &  R.Matsuno (1993).    Chloroplast-encoded  protein  as  a subunit  of  acetyl-CoA  carboxylase  in  pea plant. J.  Biol.  Chem., 268, 25118-25123.
Sasaki, Y., T.  Konishi   & Y. Nagano  (1995). The compartementation of acetyl- coenzyme  A  carboxylase  in  plants. Plant Physiol., 108, 445-449.
Sasaki,  Y.,  &  Y.  Nagano  (2004).  Plant  acetyl- CoA  carboxylase:  structure,  biosynthesis, regulation,  and  gene  manipulation  for plant breeding. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 1175-1184.
Schulte, W., J. Schell & R. Topfer (1994).  A gene encoding acetyl-coenzyme A carboxylase  from Brassica  napus. Plant Physiol., 106, 793-794.
Schulte, W., R. Topfer, R. Srracke, J. Schell & N.  Martini    (1997).    Multi-fuctional acetyl-CoA  carboxylase  from Brassica napus is  encoded  by  multi-gene  family  : indication  for  plastidic  localization  of  at
least one isoform. In Proc. Natl. acad Sci.,
94, 3465-3470.
Shintani,  D.K.  &  J.B.  Ohlrogge  (1995). Feedback inhibition of fatty acid synthesis in  tobacco  suspension  cells. Plant  J,. 7, 577-578.
Shorrosh,  B.S.,  R.A.  Dixon  &  J.B.  Ohlrogge (1994). Molecular cloning, charac- terization  and  elicitation  of  acetyl-CoA carboxylase  from  alfalfa. In Proc.  Natl. Acad. Sci. , 91, 4323-4327.
Shorrosh,  B.S.,  K.R.  Roesler,  D.  Shintani, F.J.  van  de  Loo  &  J.B.  Ohlrogge  (1995).
Structural  analysis,  plastid  localization and  expression  of  the  biotin  carboxylase subunit of acetyl-coenzyme A carboxylase from  tobacco. Plant  Physiol., 108, 805  – 812.
Takai, T., C. Yokoyama, K. Wada & T. Tanabe (1988). Primary  structure of chicken liver acetyl-CoA  carboxylase  deduced  from cDNA  sequence. J.  Biol.  Chem., 263 , 2651 – 2657.
Thelen,  J.J.  &  JB  Ohlrogge  (2002).  Metabolic engineering  of  fatty  acid  biosynthesis  in plants. Metabolic Engin., 4, 12-21.