Intek Akuakultur.  Volume 5.  Nomor 1.  Tahun 2021.  E-ISSN .  Halaman 62-69
Pengaruh Perbedaan Durasi Waktu Thawing terhadap Tingkat Motilitas dan Tingkat Viabilitas Sperma Beku Kerapu Kertang Epinephelus lanceolatus
Adi Wiranto 1 , Henky Irawan 1 , Muzahar 1
1 Jurusan Budidaya Perairan, Fakultas Ilmu Kelautan  dan  Perikanan, Universitas Maritim Raja Ali Haji.

## INFO NASKAH ABSTRAK
Kata kunci:
Durasi, Kerapu Kertang,
Motil, Sperma Beku , Thawing
Pembuatan sperma beku ikan kerapu kertang ( E. lanceolatus ) telah berhasil dilakukan untuk  mendukung  produksi  kerapu hybrid di  Indonesia. Thawing sperma  beku merupakan salah satu kunci dalam keberhasilan pembuahan, namun penelitian tentang pengaruh durasi waktu thawing terhadap tingkat motilitas dan tingkat viabilitas sperma beku  ikan  kerapu  kertang  ( E.  lanceolatus )  belum  pernah  dilakukan.  Penelitian  ini bertujuan  mengetahui  pengaruh  perbedaan  durasi  waktu thawing sperma  beku  ikan kerapu  kertang  ( E.  lanceolatus )  untuk  mengetahui  tingkat  motilitas  dan  tingkat viabilitas  sperma.  Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan  Desember  2020  di  Balai Perikanan Budidaya Laut Batam, Kota Batam, Provinsi Kepulauan Riau. Metode yang digunakan adalah  eksperimental  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan  4 perlakuan dan 3  kali ulangan yaitu 3 detik, 9 detik, 15 detik,  21 detik. Analisis  data menggunakan ANOVA dan uji lanjut Duncan’s menunjukkan motilitas terbaik terjadi pada  21  detik  (69,99±4,74),  viabilitas  sperma  terbaik  terjadi  pada  21  detik (54,29±1,76).  Hasil  penelitian  yang  diperoleh  menunjukkan  perlakuan  21  detik merupakan perlakuan terbaik .
Gedung FIKP Lt. II Jl. Politeknik Senggarang, 29115, Tanjungpinang, Telp : (0771- 8041766, Fax. 0771-7004642. Email: 160254243025@student.umrah.ac.id , henkyirawan@umrah.ac.id , muzahar@umrah.ac.id .
Effect of Different Thawing Durations on Motility Rate and Viability Rate of Cryopreserved Sperm Giant Grouper Epinephelus lanceolatus

## Adi Wiranto, Henky Irawan, Muzahar
Department of Aquaculture, Faculty of Marine Science and Fisheries, Raja Ali Haji Maritime University.
ARTICLE INFO

## ABSTRACT
Keywords: Cryopreserved Sperm, Duration, Giant Grouper, Motile, Thawing The production of cryopreserved sperm giant grouper has been successfully carried out to support produced hybrid grouper in Indonesia. Thawing cryopreserved sperm is one of key to successfully insemination. However, research on the effect of thawing time of cryopreserved sperm giant grouper ( E. lancolatus ) on motility rate and viability rate has not been conducted. This research aims to determine the effect of different duration thawing  of  cryopreserved  sperm giant  grouper  ( E.  lanceolatus )  on  motility  rate  and viability  rate.  This  research  was  conducted  in  December  2020  at  Batam  Marine Aquaculture Fisheries Center, Batam City, Kepulauan Riau Province. The method used was  experimental  completely  randomized  design  (CRD)  with  4  treatments  and  3 replications, namely 3 seconds, 9 seconds, 15 seconds, 21 seconds. Data analysis used ANOVA and Duncan’s continued test showed that the best motility happened in 21 seconds (69,99±4,74), the best sperm viability happened in 21 seconds (54,29±1,76).
The results obtained indicate that 21 seconds is the best treatment.
Gedung FIKP Lt. II Jl. Politeknik Senggarang, 29115, Tanjungpinang, Telp : (0771- 8041766, Fax. 0771-7004642. Email: 160254243025@student.umrah.ac.id , henkyirawan@umrah.ac.id , muzahar@umrah.ac.id .
Intek Akuakultur.  Volume 5.  Nomor 1.  Tahun 2021.  E-ISSN .  Halaman 62-69

## PENDAHULUAN
Ikan kerapu kertang ( Epinephelus lanceolatus ) merupakan salah satu jenis ikan kerapu  yang  tidak  memiliki  nilai  ekonomis  di  pasar  domestik  Indonesia  tetapi spermatozoa  ikan  kerapu  kertang  memiliki  nilai  ekonomis  sebagai  bahan  utama menghasilkan kerapu hybrid . Salah satu jenis ikan kerapu hybrid yang sudah dapat diproduksi  untuk  memasok  kebutuhan  budidaya  di  Indonesia  adalah  ikan  kerapu cantang hasil persilangan antara ikan kerapu macan ( E. fuscoguttatus ) betina dan ikan  kerapu  kertang  ( E.  lanceolatus )  jantan  (Ismi  &  Asih,  2011)  dengan kemampuan  pertumbuhan  lebih  cepat  serta  tahan  terhadap  penyakit,  dan  ikan kerapu tiktang hasil persilangan antara ikan kerapu batik ( E. microdon ) betina dan ikan kerapu kertang ( E. lanceolatus ) jantan (Muslim et al., 2019).
Salah  satu  upaya  yang  bisa  dilakukan  untuk  membantu  memproduksi  kerapu hybrid di Indonesia melalui teknik pembekuan sperma ( cryopreservation ). Teknik pembekuan  ini  lebih  mudah  karena  dalam  melakukan  pemijahan  buatan  tidak membutuhkan  induk  serta  mudah  diaplikasikan.  Penanganan  pemijahan  buatan mempunyai  peran  besar  dalam  keberhasilan  pemijahan  buatan,  karena  prosedur pelaksanaan pemijahan buatan mulai dari pengamatan induk, penanganan sperma beku, pencairan  sperma  beku  ( thawing )  sangat  mempengaruhi  keberhasilan perkawinan (Hoesni, 2014). Selain teknik cryopreservasi, teknik pencairan sperma beku  merupakan  prosedur  yang  penting  dalam  inseminasi  buatan  karena penggunaan  metode  pencairan  yang  tidak  tepat  akan  menyebabkan  kerusakan spermatozoa sehingga menurunkan kualitas spermatozoa. sehingga mengakibatkan penggunaan  suhu  dan  waktu  pada  pencairan  sperma  beku  di  lapangan  sangat beragam (Hoesni, 2014).
Penelitian  tentang  teknik  pembekuan  sperma  pada  ikan  kerapu  kertang  telah berhasil  dilakukan  (Fan et  al., 2013;  Pratiwi et  al .,  2019;  Sudrajat et  al .,  2019;
Widyaningsih et  al .,  2019;  BPBL  Batam unpublished ).  Salah  satu  kendala  yang dihadapi  dalam  prosedur  pembekuan  sperma adalah  angka  motilitas  dan viabilitasnya tidak tentu disebabkan prosedur thawing yang bervariasi (Bozkurt & Yavas,  2017),  oleh  karena  itu  pemanfaatkan  suhu  dan  waktu  pada  saat thawing sperma beku  perlu dilakukan seperti pada spesies Epinephelus akaara (He et al., 2011),  spesies Ctenopharyngodon  idella (Yavas  &  Bozkurt  2011),  spesies Bocachico prochilodus  magdalenae (Martínez  &  Pardo,  2013),  spesies Ciprinus carpio (Bozkurt & Yavas, 2017), durasi yang tepat untuk pencairan sperma beku ikan kerapu kertang belum diketahui.
Penelitian  penggunaan  durasi  waktu  yang  berbeda  pada thawing sperma  beku ikan  kerapu  kertang  untuk  mengetahui  penggunaan  durasi  waktu  terbaik  dalam menentukan tingkat motilitas serta viabilitas spermatozoa penting dilakukannya.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan  Desember  2020  di  Balai  Perikanan Budidaya  Laut  Batam  (BPBL  Batam),  Pulau  Setokok,  Kota  Batam  Provinsi Kepulauan Riau. Alat yang digunakan yaitu styrofoam, mikroskop (Olympus BX- 53), komputer ( Dell ), container nitrogen , stopwatch, gunting, tisu gulung, ember, pipet tetes, kaca preparat, cover glass, Waterbath, penjepit, tisu, teko, botol . Bahan
Intek Akuakultur.  Volume 5.  Nomor 1.  Tahun 2021.  E-ISSN .  Halaman 62-69
yang digunakan adalah straw sperma beku kerapu kertang (0,5 ml), nitrogen cair, air laut, eosin, air tawar. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan 3 kali ulangan menggunakan straw masing  masing  percobaan  0,5  ml  mengacu  pada  penelitian (BPBL  Batam unpublished, dan modifikasi metode Kiriyakit et al . 2011) , Adapun perlakuannya adalah:
1. Kontrol (K): Durasi waktu thawing sperma beku selama 3 detik (BPBL Batam unpublish )
2. Perlakuan 1 (P1): Durasi waktu thawing sperma beku selama 9 detik
3. Perlakuan 2 (P2): Durasi waktu thawing sperma beku selama 15 detik
(Kiriyakit et al., 2011)
4. Perlakuan 3 (P3): Durasi waktu thawing sperma beku selama 21 detik

## Prosedur Penelitian
1. Persiapan Alat dan Bahan
Alat  dan  bahan  penelitian  yang  digunakan  disiapkan  lebih  dulu  sebelum memulai proses thawing , fokus mikroskop diatur dengan pembesaran 1000x yang dihubungkan  dengan  komputer,  kemudian  suhu  air  dipanaskan  menggunakan waterbath pada  suhu  37 o C  di  dalam  wadah  yang  berisi  air  tawar,  selanjutnya pewarna eosin disiapkan menggunakan botol.
2. Penanganan Sperma Beku
Sperma  beku  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  berasal  dari  BPBL  Batam yang  telah  dibekukan  sebelumnya  menggunakan straw (0,5  ml)  disimpan  dalam container liquid  nitrogen kemudian  dipindahkan  pada styrofoam yang  telah  diisi dengan nitrogen cair.
3. Thawing
Proses thawing atau pengeceran spermatozoa dalam straw dilakukan pada suhu 37°C dengan cara 1 straw yang diambil dari container nitrogen direndam ke dalam wadah  air  tawar  yang  telah  diatur  dengan  suhu  37°C,  kemudian  dihitung  waktu menggunakan stopwatch sesuai  durasi  perlakuan,  setelah  itu  sperma  diambil menggunakan penjepit, kemudian bagian bawah dari straw dipotong menggunakan gunting,  selanjutnya  spermatozoa  diencerkan  menggunakan  air  laut  lalu  diamati performa  spermatozoa  menggunakan  mikroskop  Olympus  BX-53  dengan perbesaran  1000x yang tersambung dengan komputer  serta dilakukan perekaman untuk meminimalisir bias.
4. Parameter yang diamati
4.1 Motilitas Sperma
Motilitas  sperma  diamati  menggunakan  mikroskop  perbesaran  1000x  dengan cara sperma sebanyak 1 tetes dari straw diletakkan di kaca preparat dan diaktifkan
Intek Akuakultur.  Volume 5.  Nomor 1.  Tahun 2021.  E-ISSN .  Halaman 62-69
dengan  air  laut  sebanyak  1  tetes  dari  pipet  tetes  kemudian  ditutup  menggunakan coverglass kemudian  diamati  dan  dilakukan  perekaman.  Perhitungan  motilitas sperma  berasal  dari  rekaman  video  pengamatan  dan  dihitung  menggunakan perangkat  lunak  ImageJ  OpenCASA  ( Computer  Assisted  Sperm  Analysis )  menu Motility  Analysis dengan  pengaturan default ,  sperma  katagori  motil  apabila  nilai Curvilinear velocity (VCL) > 5 µm/s (Fan et al., 2013) dan Average-path velocity (VAP) < 120 yang terdeteksi olen OpenCASA (Alque´zar-Baeta et al., 2019).
4.2 Viabilitas Sperma
Pengukuran  viabilitas  sperma  dilakukan dengan  cara  sperma  sebanyak  1  tetes dari  s traw dicampur dengan  1  tetes  pewarna  eosin  dari  pipet  tetes  kemudian menggunakan coverglass . Perhitungan viabilitas sperma berasal dari rekaman video pengamtan  dan  dihitung  menggunakan  perangkat  lunak  ImageJ  OpenCASA ( Computer Assisted Sperm Analysis) dengan menu Viability Analysis pengaturan default (Alque´zar-Baeta et al., 2019) .

## 5. Analisis Data
Analisis data dilakukan  menggunakan analysis of variance (ANOVA) dengan interval keparcayaan 95 % dan jika terdapat perbedaan nyata dilakukan uji lanjut Duncan dengan perangkat lunak SPSS 22.0.

## Hasil
A. Motilitas Sperma
Motilitas sperma adalah persentase jumlah sperma yang bergerak pasca thawing dalam  periode  waktu  tertentu.  Nilai  motilitas  sperma  disajikan  dalam  bentuk diagram seperti ditampilkan pada gambar 1.
Gambar 1. Motilitas sperma beku kerapu kertang (Keterangan: Kontrol: 3 detik, P1: 9 detik, P2: 15 detik, P3: 21 detik).
Hasil uji ANOVA menunjukan bahwa durasi waktu thawing memberikan pengaruh nyata  terhadap  motilitas  sperma  beku  ikan  kerapu  kertang  (P<  0,05).  Hasil penelitian  motilitas  sperma  terbaik  berturut  turut  adalah  P3  (69,99±4,74),  P2 (63,35±6,11), P1 (43,68±11,92), K (35,39±1,04).
35.39 ± 1,04 a 44.99 ±8,73 a 56.76 ±3,29 b 69.99 ±4,74c 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 Kontrol P 1 P 2 P 3 M o ti lit as (%)

## B. Viabilitas Sperma
Viabilitas  sperma  adalah  persentase  jumlah  sperma  hidup  yang  diamati  pasca thawing dengan  kategori  sperma  hidup  tidak  mampu  menyerap  bahan  pewarna. Nilai viabilitas sperma disajikan dalam bentuk diagram  ditampilkan pada gambar 2.
Gambar 2. Viabilitas sperma beku kerapu kertang (Keterangan: Kontrol: 3 detik, P1: 9 detik, P2: 15 detik, P3: 21 detik).
Hasil uji ANOVA menunjukan bahwa durasi waktu thawing memberikan pengaruh nyata terhadap viabilitas sperma beku ikan kerapu kertang dengan (P< 0,05). Hasil penelitian viabilitas sperma beku terbaik berturut turut adalah P3 (54,29±1,76), P1 (53,16±2,87), P2 (51,96±3,86), K (42,74±3,85).

## PEMBAHASAN
Faktor  yang  mempengaruhi  tingkat  motilitas  sperma  beku  adalah  durasi  serta suhu yang digunakan pada saat thawing karena penggunaan durasi serta suhu yang tidak  tepat  bisa  menyebabkan  terciptanya  kristal  es  pada  spermatozoa  sehingga menyebabkan sperma mengalami kerusakan (Leung, 1991). Pelaksanaan thawing dianjurkan untuk dilakukan secara cepat dengan kombinasi antara suhu dan durasi perendaman  yang  sesuai  untuk  mencegah  terbentuknya  kristal  es  ( re- crystallization )  (Yang  &  Tiersch,  2009).  Menurut  Yavas  &  Bozkurt  (2011) penggunaan suhu terbaik dalam pelaksanaan thawing berkisar antara 30 o C – 40 o C. Menurut  Lahnsteiner  (2000)  rasio  penggunaan diluent dan  sperma  dalam pembuatan dilution berpengaruh terhadap sperma yang dibekukan, serta perbedaan spesies juga akan mempengaruhi rasio dilution yang digunakan. Fan et al. (2013) menyatakan rasio perbandingan dilution yang berbeda bisa mempengaruhi tingkat motil sperma ikan kerapu kertang. Selain itu, penggunaan larutan pengenceran juga bisa mempengaruhi performa motil sperma (Tumanung et al., 2015). Bila  dibandingkan  dengan  penelitian  Fan et  al. (2013),  penggunaan cryoprotectant jenis dimethyl sulfoxide dan ekstender jenis MPRS memiliki tingkat motilitas  yang  besar  yaitu  lebih  dari  90%  sedangkan  pada  hasil  data  yang didapatkan  motilitas  tertinggi  hanya  mencapai  69,99±4,74  %.  Hal  ini  diduga penggunaan dilution ( cryoprotectant +  ekstender)  yang  berbeda  menyebabkan kemampuan dilution dalam  mempertahankan  kondisi  sperma  sebenarnya  juga
42.74 ±3,85a
53.16 ±2,87 b 51.96± 3,86 b 54.29 ± 1,76 b 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 Kontrol P 1 P 2 P 3 V iab ili tas ( % )
Intek Akuakultur.  Volume 5.  Nomor 1.  Tahun 2021.  E-ISSN .  Halaman 62-69
berbeda.  Menurut  Penaranda et  al. (2009) , penggunaan cryoprotectant terutama DMSO meningkatkan osmolalitas yang  memberikan pengaruh terhadap motilitas sperma  pasca thawing .  Penggunaan cryoprotectant yang  berbeda  juga  mampu memberikan pengaruh terhadap motilitas sperma (Irawan, 2010). Agarwal (2011), menyebutkan bahwa ekstender yang baik adalah ekstender yang telah sesuai pada kondisi seminal plasma spesies tertentu. Idealnya extender yang digunakan bersifat isotonic,  memiliki  kapasitas  penyangga  yang  baik,  nutrisi,  antioksidan  dan  anti bakteri,  serta  mampu  mempertahankan  kualitas  dengan  baik,  nilai  pH  ekstender yang  digunakan  juga  berpengaruh  terhadap  motilitas  sperma,  hal  ini  disebabkan sperma  akan  bersifat immotile saat  berada  dalam  kantung  seminal  plasma  lalu sperma  akan  aktif  ketika  kondisi  osmolalitas  perairan  tidak  isotonik  terhadap kantung seminal plasma (Irawan, 2012; Irawan, 2014). Spermatozoa membutuhkan energi untuk tetap melakukan metabolisme dasar dan saat motil terjadi, ekstender digunakan  untuk  mendukung  energi  retensi  yang  digunakan  untuk  metabolisme dasar dan motil (Agarwal, 2011).
Perbedaan  nilai  viabilitas  diduga  karena  durasi thawing yang  digunakan  pada perlakuan  K  terlalu  singkat  sehingga  tingkat  viabilitas  sperma  perlakuan  K mengalami  penurunan  drastis.  Yavas  &  Bozkurt  (2011)  menyatakan  bahwa prosedur thawing sangat penting dalam menjaga viabilitas spermatozoa, prosedur thawing  yang  dilakukan  harus  ditingkatkan  untuk mencejah  terjadinya  fenomena terbentuknya kristal es ( re-crystallization ). Menurut Agarwal (2011), bahwa suhu yang  digunakan  saat thawing sangat  penting  terhadap  pengaruh  viabilitas spermatozoa pasca pendinginan. Perbedaan hasil penelitian Kiriyakit et al. (2011) dengan data yang diperoleh terkait viabilitas sperma dari seluruh perlakuan hal ini diduga karena perbedaan jenis ekstender yang digunakan pada pembekuan sperma sebelumnya. Jenis ekstender yang digunakan Kiriyakit et al. (2011) yaitu MFR (~
438  mOsm/kg)  hampir  mendekati  susunan  kimiawi  seminal  plasma  ikan  kerapu kertang (~ 429 mOsmol/kg) sehingga lingkungan sperma yang isotonik inilah yang menyebabkan sperma immotile dengan baik.

## KESIMPULAN
Kesimpulan dari penelitian adalah:
1. Penggunaan durasi waktu thawing yang berbeda berpengaruh terhadap motilitas sperma, serta viabilitas sperma.
2. Perlakuan P3 (37 o C selama 21 detik) thawing memberikan hasil terbaik terhadap motilitas sperma, viabilitas.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  kepala  dan  staff  Balai  Perikanan Budidaya Laut Batam yang telah membantu berjalannya penelitian terutama Bapak Kadari, Bapak Sahidan Muhlis, Bapak Wibowo, Bapak Anggit.

## DAFTAR PUSTAKA
Agarwal  NK.  2011.  Cryopreservation  of  Fish  Semen.  Himalayan  Aquatic Biodiversity  Conservation  &  New  Tools  in  Biotechnology.  Transmedia Publication.
Intek Akuakultur.  Volume 5.  Nomor 1.  Tahun 2021.  E-ISSN .  Halaman 62-69
Alque´zar-Baeta C, Gimeno-Martos S, Miguel-Jime´nez S, Santolaria P, Ya´niz J, Palacı ´n I, et al . 2019. OpenCASA:  A new open-source and scalable tool for sperm quality analysis. PLoS Comput Biol 15(1): e1006691.
BPBL Batam. unpublished . Balai Perikanan Budidaya Laut. Kriopreservasi Sperma Kerapu Kertang di Balai Perikanan Budidaya Laut Batam.
Fan B, Liu XC. Meng ZN, Tan BH, Wang L, Zhang HF, Zhang Y, Wang YX, Lin HR. 2013. Cryopreservation of Giant Grouper Epinephelus lanceolatus (Bloch, 1790) sperm. Journal of Applied Ichthyology 30 (2): 334–339.
He  Q,  Lu  G,  Che  K,  Zhao  E,  Fang  Q,  Wang  H,  Liu  J,  Huang  C,  Dong  Q. 2011.  Sperm  Cryopreservation  of  the  Endangered  Red  Spotted  Grouper, Epinephelus  akaara ,  with  a  Special  Emphasis  on  Membrane  Lipids. Aquaculture. 318: 185– 190
Hoesni  F.  2014.  Pengaruh  Motilitas  Spermatozoa  Semen  Beku  Sapi  Perah Berpengercer Susu Skim dengan Metode Thawing yang Berbeda. Jurnal Ilmiah Universitas Batanghari Jambi 14 (4): 80-86.
Irawan  H.  2012.  Pengaruh  Larutan  Elektrolit  dan  Non  Elektrolit  pada  Tingkat Osmolalitas  yang  berbeda  terhadap  Motilitas  Sel  Sperma  Ikan  Mas  ( Cyprinus Carpio ). Dinamika Maritim. 2(1): 1-7.
Irawan H. 2014. Pengaruh pH pada Ekstender terhadap Daya Simpan dan Motilitas sel Sperma Ikan Mas ( Cyprinus. carpio ). Dinamika Maritim. 3(2): 30-39.
Irawan  H.,  Vuthiphandcha,  V.,  Nimrat,  S.  2010.  The  Effect  of  Extenders, Cryoprotectants  and  Cryopreservation  Methods  on  Common  Carp  ( Cyprinus carpio ) Sperm. Animal Reproduction Science. 122: 236-243.
Ismi  S,  Asih  YN.  2011.  Pengamatan  Perkembangan  Benih  Kerapu  Hybrid Persilangan  antara  Kerapu  Macan  ( Epinephelus  fuscoguttatus )  dan  Kerapu Kertang ( Epinephelus lanceolatus ). Prosiding Seminar Nasional Kelautan VII. 100-104.
Kiriyakit A, Wenresti GG, Amrit NB. 2011. Successful hybridization of groupers ( Epinephelus  coioides  x  Epinephelus  lanceolatus )  using  cryopreserved  sperm. Aquaculture 320: 106-112.
Lahnsteiner  F.  2000.  Semen  cryopreservation  in  the  Salmonidae  and  in the Northern Pike. Aquacult. Res. 31, 245–258.
Leung  LKP.    Principles  of  Biological  Preservation,  in:  B.G.M.  Jamieson  (Ed.), Fish  Evolution  and  Systematics:  Evidence  from  Spermatozoa,  Cambridge University Press, London, 1991, pp. 231–234.
Intek Akuakultur.  Volume 5.  Nomor 1.  Tahun 2021.  E-ISSN .  Halaman 62-69
Martínez  JG,  Pardo  SC.  2013.  Effect  of  Freezing  and  Thawing  Rates  on  Sperm Motility  in Bocachico  prochilodus  magdalenae ( Pisces,  Characiformes ).  Rev MVZ Córdoba 18 (1): 3295-3303.
Muslim  AB,  Wahyuni  S,  Widodo  AP,  Pujiati.  2019.  Produksi  Benih  Kerapu Hybrida  Tiktang  Hasil  Persilangan  Ikan  Kerapu  Batik  Betina  dengan  Kerapu Kertang Jantan. Perekayasaan Budidaya Air Payau dan Laut. 14: 49-56.
Penaranda DS, Perez L, Gallego V, Jover M, Asturiano JF.
2009. Improvement of European eel sperm cryopreservation
method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology 59, 119–126.
Pratiwi  TP,  Abinawanto  A,  Lestari  R,  Bowolaksono  A,  Zavitri  NG.  2019. The  Effect  of  Egg  Yolk  as Natural  Cryoprotectant  on  Giant Grouper  ( Epinephelus  lanceolatus )  Spermatozoa  Motility.  Proceedings  of  the 4th International Symposium on Current Progress in Mathematics and Sciences.
Sudrajat  AK,  Abinawanto  A,  Lestari  R,  Bowolaksono  A,  Zavitri  NG.  2019.
The  Combination  Effect  6  %  of  Glycerol  and  Skim  Milk  on Spermatozoa Motility of Giant Grouper Epinephelus lanceolatus (Bloch 1970) After  Frozen.  Proceedings  of  the  4th  International  Symposium  on  Current Progress in Mathematics and Sciences.
Tumanung S, Sinjai HJ, Watung JC. 2015. Penambahan Madu dalam Pengenceran Sperma  untuk  meningkatkan  Motilitas,  Fertilisasi,  dan  Daya  Tetas  Telur  Ikan Mas ( Cyprinus carpio L. ). Jurnal Budidaya Perairan. 3(1): 51-58.
Widyaningsih  W,  Abinawanto  A,  Lestari  R,  Bowolaksono  A,  Zavitri  NG.
2019. Effect of various Concentrations of Palm Date ( Phoenix dactylifera L . ) on Spermatozoa Motility of Giant Grouper ( Epinephelus lanceolatus ). Proceedings of  the  4th  International  Symposium  on  Current  Progress  in  Mathematics  and Sciences.
Yang  HP,  Tiersch  TR.  2009.  Current  Status  of  Sperm  Cryopreservation  in Biomedical Research Fish Models: Zebrafish, Medaka, and Xiphophorus. Comp Biochem Physiol 149: 224–232.
Yavas  I,  Bozkurt  Y.  2011.  Effect  of  Different  Thawing  Rates  on  Motility  and Fertilizing  Capacity  of  Cryopreserved  Grass  Carp  ( Ctenopharyngodon  Idella ) Sperm. Biotechnol & Biotechnol. 25 (1): 2254-2257.