Karakterisasi ekstrak kasar, Perceka et al.

## PENDAHULUAN
Proses  diskolorasi  pada  krustasea  disebut melanosis  atau blackspot .  Proses  ini  terjadi secara  alami  pada  saat  postmortem  karena adanya  polimerisasi  komponen  fenol  menjadi pigmen berwarna hitam. Melanin atau blackspot pada  udang  tidak  berbahaya  bagi  konsumen, akan  tetapi  dapat  menurunkan  penerimaan konsumen dan menurunkan nilai jual terhadap komoditi  tersebut.  Polifenoloksidase  (PPO) disebut juga fenoloksidase (PO) atau tirosinase (EC.1.14.18.1)  yang  mengkatalisis  hidroksilasi
monohidroksifenol (aktivitas monofenolase atau kresolase)  dan  mengoksidasi  o-dihidroksifenol menjadi o-kuinon (aktivitas katekoloksidase dan difenolase). O-kuinon akan bereaksi secara non- enzimatik dengan keberadaan oksigen sehingga membentuk melanin (Kim et al . 2000). Polifenoloksidase  disintesis  dari  proPPO.
ProPPO  merupakan  bentuk  tidak  aktif (zimogen)  dari  enzim  PPO.  ProPPO  dapat diaktifkan  menjadi  PPO  oleh  enzim-enzim protease  yaitu  tripsin  atau  enzim  endogenous. Sistem ini memainkan peranan penting di dalam

## KARAKTERISASI EKSTRAK KASAR POLIFENOLOKSIDASE DARI UDANG VANAME

## Characterization of Crude Polyphenoloxidase from White Shrimp

## Medal Lintas Perceka, Tati Nurhayati*, Mala Nurilmala
Medal Lintas Perceka, Tati Nurhayati*, Mala Nurilmala Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga, Jalan Agatis, Bogor 16680 Jawa Barat Telepon (0251) 8622909-8622906, Faks. (0251) 8622907
*Korespondensi: nurhayati7870@yahoo.com Diterima 06 Maret 2014/Disetujui 01 April 2014 Abstrak
Polifenoloksidase (PPO) merupakan enzim yang bertanggung jawab terhadap proses diskolorasi yang disebut melanosis. Blackspot atau melanosis merupakan proses penurunan mutu yang terjadi pada udang selama  penanganan  dan  penyimpanan  postmortem.  Penelitian  bertujuan  untuk  mengevaluasi  aktivitas enzim  PPO  udang  vaname  dan  mengkarakterisasi  enzim  yang  meliputi  suhu,  pH,  konsentrasi  substrat optimum  serta  kinetika  enzim.  Enzim  PPO  telah  berhasil  diisolasi  dari  karapas  udang  vaname  dengan ekstraksi buffer fosfat (1:3). Enzim ini dikarakterisasi menggunakan L-DOPA sebagai substrat spesifiknya. Ekstrak kasar PPO memiliki aktivitas optimum pada suhu 35 ° C, pH 6 dan konsentrasi L-DOPA sebesar 10 mM. Nilai Km dan Vmaks PPO untuk substrat L-DOPA adalah sebesar 1,17 mM dan 285,71 U.
Kata kunci: L-Dihidroksifenilalanin, Litopenaeus vannamei , melanosis, polifenoloksidase
Abstract
Polyphenoloxidase  is  responsible  for  discoloration  called  melanosis  ( blackspot ).  It  is  one  of  the problems  that  occur  in  shrimp  during  postmortem  handling  and  storage.  The  objectives  of  this  study were to evaluate the polyphenoloxidase activity and characterize this activity including temperature, pH, substrat concentration and enzyme kinetics. PPO has been isolated from carapace of white shrimp by buffer phosphate extraction (1:3).  Polyphenoloxidase (PPO) from white shrimp using L-dihidroxyphenylalanine (L-DOPA) as a spesific substrate was characterized. The crude PPO activity was optimal at temperature 35 ° C, pH 6 and L-DOPA concentration 10 mM. The K m and V max values of the PPO for L-DOPA were 1.17mM and 285.71. U respectively.
Keywords: L-Dihidroxyphenilalanine, Litopenaeus vannamei , melanosis, polyphenoloxidase
mikro  (Axygen),  inkubator  (Thermoline),  dan freezer.

## Metode Penelitian
Penelitian  dilakukan  dalam  dua  tahap yaitu ekstraksi enzim PPO dari karapas udang dan karakterisasi enzim tersebut. Karakterisasi enzim  PPO  meliputi  suhu,  pH,  konsentrasi substrat optimum, dan kinetika enzim.
Ekstraksi Enzim Polifenoloksidase (Simpson et al . 1987)
Karapas udang dihaluskan sampai menjadi bubuk.  Sampel  dicampur  dengan  bufer  fosfat 0,05  M  pH  7,2  yang  mengandung  1  M  NaCl dan  0,2%  Brij  35  (1:3).  Campuran  diaduk secara kontinu pada suhu 4°C selama 30 menit, kemudian  dilakukan  sentrifugasi  dengan kecepatan  8.000  g  pada  suhu  4°C  selama  30 menit menggunakan sentrifuse dingin.
Pengukuran Aktivitas Enzim PPO (modifikasi Nirmal dan Benjakul 2009) Pengukuran aktivitas enzim PPO dilakukan menggunakan substrat L-DOPA. Ekstrak kasar
PPO  sebanyak  200  µL  ditambahkan  dengan 1.200  µL  L-DOPA  15  mM  yang  dilarutkan dalam air deionisasi, 800 µL bufer fosfat 0,05 M, pH 6 dan 200 µL air deionisasi. Campuran tersebut kemudian diinkubasi selama 3 menit pada  suhu  35oC.  Pembentukan  dopakrom diamati secara spektrofotometri pada panjang gelombang  475  nm.  Satu  unit  aktivitas  PPO didefinisikan  sebagai  peningkatan  absorbansi sebesar 0,001 pada 475 nm/menit/mL.
Penentuan  Suhu  dan  pH  Optimum (modifikasi Bono et al . 2010)
Penentuan suhu optimum aktivitas enzim PPO  dilakukan  dengan  melakukan  variasi suhu  inkubasi.  Ekstrak  kasar  PPO  sebanyak 200 µL ditambahkan dengan 1.200 µL L-DOPA 15 mM yang dilarutkan dalam air deionisasi, 800 µL bufer fosfat 0,05 M pH 6 dan 200 µL air deinosasi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, dan 45°C selama 3  menit.  Campuran  yang  telah  diinkubasi
respon  imun,  pengerasan  kutikula  dan  proses penyembuhan luka pada krustasea (Sugumaran dan Nellaiappan 2000).
Udang merupakan sumberdaya perikanan yang  memiliki  nilai  ekonomis  penting  sebagai andalan ekspor Indonesia selain tuna, cakalang dan  tongkol.  Volume  ekspor  hasil  perikanan Indonesia  mencapai  802  ribu  ton  dengan nilai  US$  2,6  milyar  pada  tahun  2013,  udang memberikan  sumbangan  besar  terhadap  nilai ekspor  hasil  perikanan  Indonesia.  Komoditi udang  memberikan  kontribusi  sebesar  33,10% terhadap volume dan nilai ekspor hasil perikanan (KKP 2013).
Udang merupakan komoditi yang mudah mengalami  kerusakan  dengan  masa  simpan yang  terbatas  karena  adanya  pembentukan melanin  atau  lebih  dikenal  sebagai blackspot ,  terutama  selama  penanganan  dan penyimpanan.  Udang  vaname  ( Litopenaeus vannamei ) merupakan spesies yang memiliki nilai  ekonomis  penting  di  Indonesia  karena memiliki nilai pasar yang tinggi. Studi tentang enzim  PPO  penyebab blackspot pada  udang vanname Indonesia belum pernah dilakukan. Karakterisasi enzim PPO dari udang vaname sangat penting dilakukan untuk menemukan formula  atau  cara  yang  tepat  dalam mengontrol  proses  pembentukan blackspot pada  udang  tersebut.  Tujuan  penelitian  ini untuk  mengevaluasi  aktivitas  enzim  PPO udang vaname dan menentukan karakteristik enzim yang meliputi stabilitas terhadap suhu, pH,  konsentrasi  substrat  optimum,  dan kinetika enzim.

## BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan pada penelitian adalah  udang  vaname  ( Litopenaeus  vannamei ) yang  diperoleh  dari  Ever  Fresh  Market, Pejompongan,  Jakarta  Pusat,  air  deionisasi, bufer  sodium  fosfat  (Merck),  bufer  sodium asetat (Merck), NaCl (Merck), Brij 35 (Merck), dan  L-DOPA  (Sigma).  Alat  yang  digunakan pada  penelitian  ini  adalah  sentrifuse  (Sorvall), spektrofotometer (Spectro UV-VIS 2500), pipet
Karakterisasi ekstrak kasar, Perceka et al.
diukur pada panjang gelombang 475 nm. Penentuan  pH  optimum  aktivitas  enzim PPO  dilakukan  dengan  melakukan  variasi pH bufer yang digunakan. Ekstrak kasar PPO sebanyak  200  µL  dicampur  dengan  1.200  µL L-DOPA  15  mM  yang  dilarutkan  dalam  air deionisasi, 800 µL bufer asetat 0,05 M pH 5,5 serta bufer fosfat 0,05 M pH 6; 6,5; 7; 7,5 dan terakhir  ditambahkan  200  µL  air  deionisasi. Campuran  tersebut  diinkubasi  pada  suhu optimum  yang  telah  diperoleh  sebelumnya selama  3  menit  dan  diukur  pada  panjang gelombang 475 nm.

## Penentuan Substrat Optimum dan Kinetika
Enzim (modifikasi Cong et al . 2005)
Campuran  yang  terdiri  dari  enzim,  bufer dengan  pH  optimum,  air  deionisasi  serta L-DOPA pada konsentrasi 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15 mM diinkubasi pada suhu optimum selama 3 menit. Campuran tersebut kemudian diukur pada  panjang  gelombang  475  nm.  Parameter kinetik  yang  meliputi  K m dan  V maks ditentukan menggunakan plot Lineweaver-Burk.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Suhu Optimum Enzim PPO
Aktivitas  enzim  PPO  tertinggi  dicapai pada  suhu  35°C  (Gambar  1).  Aktivitas  PPO mengalami  sedikit  penurunan  sebelum mencapai suhu optimum, hal ini diduga energi kinetik  molekulnya  yang  belum  mencapai keadaan maksimum. Aktivitas PPO menurun drastis  setelah  melewati  suhu  35°C,  hal  ini disebabkan  enzim  merupakan  protein  yang akan mengalami denaturasi pada suhu tinggi.
Enzim mengalami kerusakan dan aktivitasnya menurun pada saat terjadinya denaturasi. Hasil penelitian ini sama dengan penelitian Benjakul et  al .  (2005)  dan    Suhandana et  al . (2013) yang menyatakan bahwa PO dari karapas udang kuruma dan PPO karapas udang windu ( Penaeus  monodon )  menunjukkan  aktivitas maksimumnya pada suhu 35°C. Zamorano et al . (2009) menyatakan bahwa PPO dari karapas deep  water  pink  shrimp memiliki  kestabilan yang tinggi pada suhu (30-35)°C. Benjakul et al. (2005) menyatakan bahwa PO dari karapas udang kuruma tidak  stabil  pada  suhu  tinggi. Pemanasan pada suhu 70°C dan 80°C selama 30  menit  dapat  menghilangkan  aktivitas  PO udang kuruma .
Suhu  optimum  PPO  berbagai  krustasea bervariasi  tergantung  pada  spesies  dan  lokasi anatomi yang digunakan. Montero et al . (2001) menyatakan  bahwa  suhu  optimum  PPO  dari karapas udang tiger ( Penaeus japonicus ) berada pada  suhu  40°C  dan  60°C  serta  stabil  pada suhu  dibawah  35°C.  Hasil  Garcia-Carreno et al . (2008), suhu optimum PO dari hemosianin whiteleg  shrimp berada  pada  suhu  45°C. Menurut Fan et al . (2009), suhu optimum PO dari  hemosianin  kepiting Charybdis  japonica berada  pada  suhu  40°C.  Fan et  al .  (2011) menyatakan  bahwa  suhu  optimum  PO  dari brine shrimp ( Artemia sinica ) berada pada suhu 50°C. Enzim PPO dari karapas udang vaname ( L.vannamei )  memiliki  suhu  optimum  yang lebih  rendah  dibandingkan  dengan  krustasea lainnya yang telah diteliti. Perbedaan ini diduga disebabkan  oleh  perbedaan  bobot  molekul, spesies,  suhu  habitat,  musim,  dan  perbedaan
Gambar 1 Suhu optimum PPO udang vaname ( L. vannamei )
et  al .  2013)  yang  memiliki  pH  optimum  7; serta lebih tinggi dari PPO karapas deep water pink  shrimp ( Parapenaeus  longirostris )  yang memiliki  pH  optimum  4,5.  Montero et  al .
(2001) menyatakan bahwa pH optimum PPO dari  karapas Penaeus  japonicus berada  pada pH 5 dan 8 tetapi paling stabil pada kisaran pH  basa.  Benjakul et  al .  (2005)  menyatakan bahwa PO cephalotorax kuruma prawn stabil pada  kisaran  pH  3-10.  Perbedaan  nilai  pH optimum  diduga  oleh  perbedaan  spesies, perbedaan  kondisi  pertahanan  tubuh  yang meliputi  habitat  dan  invasi  patogen,  serta perbedaan konformasi enzim pada bagian sisi aktifnya.

## Kinetika Enzim
Enzim  PPO  yang  menggunakan  L-DOPA sebagai substrat spesifiknya mencapai aktivitas maksimum  pada  saat  konsentrasinya  10  mM. Aktivitas  PPO  berada  pada  keadaan  yang relatif  konstan  ketika  konsentrasi  L-DOPA di  atas  10  mM  (Gambar  3).  Semakin  tinggi
kondisi pertahanan tubuh.
pH Optimum Enzim PPO
Aktivitas  enzim  PPO  udang  vaname mencapai  maksimum  pada  pH  6,  kemudian ketika nilai pH dinaikkan di atas 6, aktivitasnya mulai  menurun  (Gambar  2).  Nilai  pH  akan menentukan  konformasi  enzim  berdasarkan keadaan asam amino pada sisi aktifnya. Enzim PPO pada pH 6 diduga memiliki konformasi yang  paling  sesuai  dengan  substratnya membentuk  kompleks  enzim-substrat  yang tepat  sehingga  dapat  menghasilkan  produk secara maksimal.
Nilai  pH  optimum  PPO  dari  karapas udang  vaname  lebih  rendah  dibandingkan dengan  PO  karapas  udang  kuruma yang memiliki  pH  optimum  6,5  (Benjakul et  al . 2005),  PO  hemosianin  white  leg  shrimp memiliki  pH  optimum  7,6  (Garcia-Carreno et  al .  2008);  PPO  hemosianin  kepiting Charybdis japonica (Fan et al . 2009), PO dari Artemia  sinica (Fan et  al .  2011)  serta  PPO dari  karapas Penaeus  monodon (Suhandana
Gambar 2 pH optimum PPO udang vaname ( L.vannamei ).
Gambar 3 Konsentrasi substrat optimum PPO udang vaname ( L. vannamei ).
Karakterisasi ekstrak kasar, Perceka et al.
konsentrasi  substrat  maka  kecepatan  enzim semakin meningkat dan pada saat tertentu akan mencapai keadaan konstan.
Nilai K m dan V maks ditentukan berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk dengan membuat grafik  1/[S]  sebagai  sumbu  x  dan  1/V  sebagai sumbu y (Gambar 4). Berdasarkan persamaan garis tersebut diperoleh nilai K m sebesar 1,17 mM dan V maks sebesar 285,71 U. Nilai K m menyatakan tetapan  disosiasi  kompleks  enzim-substrat. Semakin kecil nilai Km menunjukkan kompleks enzim-substrat  semakin  baik  sehingga  enzim memiliki afinitas yang tinggi terhadap substrat.
Fan et al . (2009) menyatakan bahwa nilai Km  PO  dari  hemosianin  kepiting Charybdis japonica untuk  substrat  L-DOPA  adalah  2,90 mM  dan  tirosin  7,33  mM.  Fan et  al .  (2011) menyatakan  bahwa  nilai  Km  PO brine  shrimp ( Artemia  sinica )  yaitu  sebesar  4,2  mM  untuk substrat L-DOPA dan 10,9 mM untuk katekol. Suhandana et al . (2013) menyatakan nilai Km PPO  dari  karapas  udang black  tiger ( Penaeus monodon )  untuk  substrat  L-DOPA  adalah 5,42  mM.  Gimenez et  al. (2010)  menyatakan bahwa  enzim  PO  dari  jeroan  lobster  Norway ( Nephrops  norvegicus )  memiliki  afinitas  yang lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  PO  dari karapas lobster untuk substrat katekol. Nilai K m PO dari jeroan lobster Norway adalah sebesar 5,97  dan  karapas  sebesar  19,40  mM.  Nilai  K m PPO karapas udang vaname adalah yang paling rendah dibandingkan dengan krustasea lainnya, hal  ini  menunjukkan  bahwa  enzim  PPO  dari karapas  udang  vaname  memiliki  afinitas yang  paling  tinggi  terhadap  substrat  L-DOPA
dibandingkan dengan spesies lainnya.
Golongan insekta, enzim PPO dklasifikasikan  menjadi  3  golongan  yaitu golongan laccase (E.C  1.10.3,  p-difenol:  O2 oksidoreduktase),  golongan catecholoxidase (E.C.1.10.3.1, difenol: O2 oksidoreduktase) dan golongan  tirosinase  (E.C.1.14.18.1  monofenol, L-DOPA: O2 oksidoreduktase). PPO golongan tirosinase  dapat  mengoksidasi  monofenol dan  difenol,  sedangkan  golongan laccase dan catecholoxidase menunjukkan  afinitas  yang tinggi terhadap difenol (Cong et al . 2005).

## KESIMPULAN
Aktivitas optimum enzim PPO pada suhu 35°C, pH 6, dan konsentrasi L-DOPA sebesar 10  mM.  Enzim  PPO  dari  karapas  udang vaname memiliki afinitas yang tinggi terhadap substrat  L-DOPA  dengan  nilai  K m dan  V maks yaitu 1,17 mM dan 285,71 U.

## DAFTAR PUSTAKA
Benjakul  S,  Visessanguan  W,  Tanaka  M.  2005. Properties of phenoloxidase isolated from the cephalothorax  of  kuruma  prawn  ( Penaeus japonicus) . Food Biochemistry 29(5): 470–485. Bono  G,  Badalucco  C,  Corrao  A,  Cusumano  S, Mammina  L,  Palmegiano  GB.  2005.  Effect of  temporal  variation,  gender,  and  size  on curticle polyphenoloxidase activty  in-deep water  rose  shrimp  ( Parapeneus  longirostris ).
Food Biochemistry 29(5): 470–485.
Cong R, Sun W, Liu G, Fan T, Meng X, Yang L, Zhu L. 2005. Purification and caracterization of  phenoloxidase  from  clam Ruditapes philippinarium. Fish and Shellfish Immunology 18(1): 61-70.
Fan T, Zhang Y, Yang L, Yang X, Jiang G, Yu M,Cong R.  2009.  Identification  and  characterization of hemocyanin-derived phenoloxidase from the  crab Charybdis  japonica . Comparative Biochemistry and Physiology 152(2): 144-149.
Fan  T,  Jing  Z,  Fan  X,  Yu  M,  Jiang  G.  2011. Purification  and  characterization  of phenoloxidase  from  brine  shrimp Artemia sinica. Acta Biochemistry and Biophysic Science 43(9): 722-728.
Garcia-Carreno FL, Cota K, Toro MAND. 2008.
Gambar 4 Persamaan Lineweaver-Burk untuk menentukan nilai K m dan V maks
Phenoloxidase  activity  of  hemocyanin in  whiteleg  shrimp Penaeus  vannamei : conversion,  characterization  of  catalytic properties, and role in postmortem melanosis. Journal  of  Agricultural  and  Food  Chemistry 56(15): 6454–6459.
Gimenez  B,  Martinez-Alvarez  O,  Montero  P, Gomez-Guillen MDC. 2010. Characterization of  phenoloxidase  activity  of  carapace  and viscera from cephalothorax of Norway lobster
( Nephrops  norvegicus ). Food  Science  and Technology 43(8): 1240-1245.
[KKP]  Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan. 2013. Kelautan dan Perikanan dalam Angka.
Jakarta:  Pusat  Data,  Statistik  dan  Informasi,
Sekretariat  Jenderal,  Kementerian  Kelautan dan Perikanan.
Kim  J,  Marshall  MR,  Wei  C.  2000.
Polyphenoloxidase.  Di  dalam:  Haard  NF,
Simpson  BK,  editor. Seafood  Enzymes: Utilization  and  Influence  on  Postharvest
Seafood Quality .  New York: Marcel Dekker,
Inc. hlm 271-316.
Montero  P,  Avalos  A,  Perez-Mateos  M.  2001.
Characterization  of  polyphenoloxidase  of prawns  ( Penaeus  japonicus ).  Alternatives
to  inhibition:  additives  and  high-pressure treatment. Food Chemistry 7: 317–324.
Nirmal  NP,  Benjakul  S.  2009.  Effect  of  ferulic acid  on  inhibition  of  polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp ( Litopenaeus vannamei ) during iced storage. Food Chemistry 116: 323–331. Simpson  BK,  Marshall  MR,  Otwell  WS.
1987.  Phenoloxidase  from  shrimp
( Penaeus  setiferus ):  purification  and  some properties. Journal of Agricultural and Food
Chemistry 35: 918-921.
Sugumaran  M,  Nellaiappan  K.  2000. Characterization  of  a  new  phenoloxidase inhibitor  from  the  cuticle  of Manduca sexta. Biochemical  and  Biophysical  Research Communication 268(2): 379–383. Suhandana  M,  Nurhayati  T,  Ambarsari  L.
2013.  Karakterisasi  ekstrak  kasar  enzim polyphenoloxidase  dari  udang  windu ( Penaeus  monodon ). Jurnal  Ilmu  dan Teknologi Kelautan Tropis 5(2): 343-354. Zamorano  JP,  Martinez-Alvarez  O,  Montero  P, Gomez-Guillen MDC. 2009. Characterisation and tissue distribution of polyphenoloxidase of  deep  water  pink  shrimp  ( Parapenaeus longirostris ). Food Chemistry 112: 104–111.