PENGARUH PREVENTIF EKSTRAK DAUN DEWANDARU ( Eugenia uniflora. L ) TERHADAP KADAR Malondialdehyde (MDA) DAN HISTOPATOLOGI DUODENUM PADA TIKUS
PUTIH ( Rattus norvegicus ) MODEL GASTROENTERITIS INDUKSI

## Escherichia coli
The Preventive Effects of Dewandaru Leaf Extract ( Eugenia uniflora ) on

## Malondialdehyde
(MDA) Levels and Duodenal Histopathology in White Rat ( Rattus norvegicus )
Gastroenteritis Models of Escherichia coli Induction Results
Aidia Latifatul Fajeria 1 *, Sri Murwani, S 1 , Nurina Titisari 1
Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya *email: aidiadiadia@gmail.com

## ABSTRAK
Daun  dewandaru  ( Eugenia  uniflora  L. )  memiliki  kandungan  utama  tannin,  flavonoid  dan saponin.  Kandungan  zat  yang  bersifat  antibakteri  dan  antioksidan  pada  dewandaru  mampu mengurangi  penggunaan  antibiotik  dalam  mengobati  penyakit  gastroenteritis.  Gastroenteritis merupakan suatu inflamasi yang terjadi pada saluran pencernaan melibatkan lambung dan usus yang ditandai  dengan  muntah,  diare.  Gastroenteritis  disebabkan  oleh Escherichia  coli yang  memiliki endotoksin  berupa  Lipopolisakarida  (LPS).  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui pengaruh  preventif  ekstrak  daun  dewandaru  ( Eugenia  uniflora  L. )  dalam  menurunkan  kadar Malondialdehyde (MDA) dan perbaikan histopatologi duodenum pada tikus putih ( Rattus norvegicus ) model gastroenteritis hasil infeksi Escherichia coli . Penelitian ini bersifat eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dan terdiri dari lima kelompok, yaitu kontrol negatif, kontrol positif (diinjeksi Escherichia coli ) dan tiga kelompok preventif (diinjeksi Escherichia coli dan preventif dengan dosis ekstrak daun dewandaru yang berbeda yaitu 300, 400, dan 500 mg/kg BB). Induksi Escherichia coli dengan  dosis  1  x  10 6 cfu/mL  peroral  sebanyak  1  mL  pada  hari  kedelapan  penelitian,  yang sebelumnya telah diberi preventif ekstrak daun dewandaru selama 7 hari. Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah histopatologi duodenum dan kadar Malondialdehyde (MDA). Data yang diperoleh dianalisis menggunakan dianalisis secara statistik menggunakan one-way ANOVA ( α =0,05). Hasil  dari  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak  daun  dewandaru  tidak  dapat  menghambat adanya kerusakan pada duodenum dan kenaikan kadar MDA. Kesimpulan penelitian ini ekstrak daun dewandaru  tidak  berpengaruh  mencegah  gastroenteritis  hasil  induksi Escherichia  coli berdasarkan kerusakan duodenum dan kenaikan kadar MDA.
Kata  kunci:  Gastroenteritis, Escherichia  coli ,  Ekstrak,  Daun  Dewandaru,  Gambaran  Histopatologi, Kadar MDA.

## ABSTRACT
Dewandaru  leaves  ( Eugenia  uniflora  L .)  have  the  main  content  of  tannins,  flavonoids  and saponins. The content of antibacterial and antioxidant substances in dewandaru can reduce the use of antibiotics in the treatment of gastroenteritis disease. Gastroenteritis is an inflammation that occurs in the  digestive  tract  involving  the  stomach  and  intestines  characterized  by  vomiting,  diarrhea. Gastroenteritis is caused by Escherichia coli that has endotoxin in the form of Lipopolysaccharide (LPS). The purpose of this study was to investigate the effect of preventive dewandaru leaves extract ( Eugenia uniflora L .) in reducing levels of Malondialdehyde (MDA) and improvement of duodenal histopathology in white rat ( Rattus norvegicus ) gastroenteritis model of Escherichia coli infection result. This study was experimental  using  Completely  Randomized  Design  (RAL)  and  consisted  of  five  groups:  negative control, positive control (injected Escherichia coli ) and three preventive groups (injected Escherichia coli and  preventive  dose  with  different  dewandaru  leaves  extracts  of  300,  400,  and  500  mg/kg  BW). Escherichia coli infection with dose of 1 x 10 6 cfu/mL orally as much as 1 mL on the eighth day of research,  which  previously  been  given  preventive  dewandaru  leaves  extract  in  7  days.  Parameters observed  in  this  study  were  duodenal  histopathology  and Malondialdehyde (MDA)  levels.  The  data obtained were analyzed using statistically analyzed using one-way ANOVA ( α = 0.05). The results of this study indicate that dewandaru leaf extract can’t inhibit the deterioration of the duodenum and elevated  levels  of  MDA.  The  conclusion  of  this  study  dewandaru  leaf  extract  has  no  effect  on preventing Escherichia  coli induced  gastroenteritis  based  on  duodenal  damage  and  elevated  MDA levels.
Keywords:  Gastroenteritis, Escherichia  coli ,  Dewandaru  Leaves,  Extract,  Duodenal,  Histopathology, MDA Levels.

## PENDAHULUAN
Gastroenteritis merupakan infeksi pada lambung,  usus  halus,  dan  usus  besar  yang disebabkan  oleh  berbagai  agen  infeksius seperti virus ( Norovirus dan Astrovirus ), bakteri ( E. coli, Salmonella, Campylobacter, Shigella, dan Vibrio  cholera )  dan  parasit  ( Giardia  lamblia ). Terjadinya gastroenteritis ditunjukkan dengan gejala  klinis  seperti  diare, abdominal  pain ,  dan vomit  (Malone et  al., 2014).  Infeksi gastroenteritis  dapat  mengarah  ke  diare  non inflamasi dan inflamasi tergantung pada agen kausatif.  Infeksi  gastroenteritis  biasanya ditransmisikan  melalui  rute  fekal-oral  dan makanan  yang  terkontaminasi.  Dari  beberapa penyebab,  salah  satu  penyebab  yang  sering terjadi pada gastroenteritis non inflamasi yaitu Escherichia coli (Ogunseitan and Robbins, 2011).
Gastroenteritis  merupakan  salah  satu penyakit yang masih banyak dijumpai, hal ini
dapat dilihat dari hasil survey pada tahun 2010 menyebutkan kasus penyakit ini pada ayam di daerah  Jawa  Barat  mencapai  19-40%. Sedangkan, kerugian ekonomi akibat kematian unggas berupa meningkatnya biaya perawatan dan pengobatan (Supar, 2010).
Escherichia  coli merupakan  salah  satu bakteri flora normal pada saluran pencernaan (Manning,  2010). Escherichia  coli berperan dalam  pertahanan  tubuh  melalui  kompetisi terhadap  nutrisi  sehingga  pertumbuhan organisme  patogen  lain  terhambat.  Selain  itu, E.coli menjaga pH optimal untuk pertumbuhannya  sehingga  mikroorganisme patogen akan mati pada pH tersebut karena pH tersebut tidak sesuai dengan yang dibutuhkan beberapa  mikroorganisme  patogen  untuk bertahan  hidup.  Namun, E.  coli juga  dapat menyebabkan infeksi ketika saluran pencernaan terganggu (Sanders, 2012).
Escherichia  coli dapat  menempel  ke  mukosa
intestinal dan mensekresikan enterotoksin atau sitotoksin (Ericson et al., 2008).
Lipopolysaccharides (LPS)  merupakan  toksin yang  dimiliki E.  coli .  Pelepasan  LPS  dapat menyebabkan inflamasi pada saluran gastrointestinal.  Inflamasi  yang  terjadi  pada mukosa intestin dapat menyebabkan gangguan absorpsi  makanan  (Chaudhary and Adamson, 2016).  Pengeluaran  cairan  dan  elektrolit  yang berlebihan  karena  kerusakan  pada  mukosa intestin  menyebabkan  diare  (Walker and Whittlesea, 2012).
Menurut  Watson and Preedy  (2013), tanpa  adanya  inflamasi,  penyembuhan  tidak akan  terjadi.  Inflamasi  dapat  diklasifikasikan menjadi  inflamasi  akut  dan  kronis.  Sistem imun  pada  inflamasi  akut  merespon karakteristik  agen  infeksius  atau  debris  yang disebabkan  oleh  luka,  dengan  menghasilkan gejala seperti pembengkakan, sakit, kemerahan, imobilitas, dan panas. Munculnya gejala  tersebut  disebabkan  oleh  peningkatan produksi  leukosit  dalam  merespon  jaringan yang  terpapar  antigen.  Selama  inflamasi kronis,  jaringan  akan  meningkatkan  produksi reactive oxygen species (ROS) sebagai biomarker inflamasi  yang  dapat  menghasilkan  stres oksidatif.
Stres  oksidatif  didefinisikan  sebagai ketidakseimbangan  antara  produksi  radikal bebas  dan  mekanisme  antioksidan.  Produksi radikal bebas yang berlebihan atau kurangnya antioksidan akan mengarah ke stres oksidatif. Radikal  bebas  merupakan  atom  atau  molekul dengan  elektron  yang  tidak  berpasangan sehingga  menyebabkan  reaktifitas  tinggi. Apabila mekanisme antioksidan gagal menangani  ROS,  makromolekul  seperti  lipid, asam nukleat, dan protein maka akan beresiko teroksidasi.  Hal  ini  mengarah  ke  disintegrasi struktur,  malfungsi,  bahkan  perubahan  pada epitop dan pengenalan oleh sistem imun. Lipid sangat  sensitif  terutama  terhadap  kerusakan oksidatif.  Jumlah  produk  peroksidasi  lipid terutama malondialdehyde (MDA) dapat diukur
untuk  menghitung  keparahan  stres  oksidatif (Watson, 2015).
Antioksidan
berfungsi mencegah terhimpunnya  senyawa-senyawa  oksidan, menurunkan  reaksi  oksidasi,  memutus, menghambat, menghentikan dan menstabilkan radikal bebas. Beberapa penelitian menyebutkan  bahwa  kelompok  senyawa flavonoid  memiliki  aktivitas  sebagai  donor hidrogen  dan  mereduksi  radikal  bebas  di dalam  jaringan  (Prakash,  2001).  Fungsi senyawa tanin dan saponin sebagai antibakteri dapat  menghambat  perkembangan  bakteri, sehingga  menurunkan  derajat  kerusakan jaringan  yang  ditandai  dengan  berkurangnya hemoragi  dan  membantu  sel  epitel  untuk melakukan  proliferasi  secara  normal  tanpa gangguan  dari  toksin  bakteri  (Pringgoutomo dkk, 2002).
Berdasarkan  latar  belakang  yang  telah diuraikan,  penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui pengaruh ekstrak daun dewandaru  ( Eugenia  uniflora )  terhadap  kadar MDA dan histopatologi duodenum pada Tikus ( Rattus  norvegicus )  model  gastroenteritis sebagai  tindakan  pencegahan  terhadap gastroenteritis pada hewan.

## MATERI DAN METODE

## Alat dan Bahan
Peralatan  yang  dipergunakan  dalam penelitian  ini,  antara  lain  bak  pemeliharaan hewan  coba,  tempat  pakan,  tempat  minum, timbangan  tikus,  sonde  lambung.  Preparasi organ  duodenum  membutuhkan  seperangkat alat bedah minor, silet, hand glove, pot organ dan masker. Pembuatan preparat histopatologi membutuhkan  pisau  scalpel,  pinset, freezer , mesin microtome ,  pisau microtome ,  inkubator, object glass , cover glass , dan mikroskop cahaya. Pengukuran kadar MDA membutuhkan kuvet, spektrofotometri,  mortar,  tabung eppendorf , pipet  tetes,  mikro  pipet,  mikro tube ,  lemari pendingin,  seperangkat  alat  sentrifugasi
(tabung sentrifugasi, alat sentriugasi), inkubator, vortex , tissue .
Bahan yang digunakan dalam
penelitian  ini  adalah  tikus  putih  ( Rattus norvegicus) berumur 8-12 minggu dengan berat 150-200  gram,  daun  dewandaru  ( Eugenia uniflora ), pakan  dan  air  minum  hewan  coba, bakteri E.  coli. Bahan  untuk  pembuatan preparat histopatologi adalah organ duodenum direndam pada formalin 10%, NaCl fisiologis  0,9%,  formalin  10%,  etanol  absolut 96%, aquades steril, alkohol, etanol bertingkat (70%, 80%, 90%, 95% dan etanol absolut), xylol ,
parafin
dan pewarna histopatologi Hematoxylen-Eosin .  Bahan  untuk  pengukuran kadar MDA adalah PBS-azida 1%, larutan stok MDA ( malondialdehyde tetrabutylammonium salt ) dan 8 µ m/ml, 100 µ l TCA 10%, 250 µ l HCl 1 N, Na-Thio 1%.

## Persiapan Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan adalah 20 ekor  tikus  putih  ( Rattus  norvegicus )  strain Wistar ,  berjenis  kelamin  jantan,  berumur  2-3 bulan, dan memiliki rata-rata bobot badan 200 gram. Hewan coba diaklimatisasi selama 7 hari, diberi pakan standar dan air minum secara ad libitum .  Hewan  coba  dibagi  menjadi  5 kelompok  perlakuan,  yaitu  kelompok  A (kontrol  negatif)  yang  terdiri  dari  tikus  tanpa induksi  dan  preventif,  kelompok  B  (kontrol positif) adalah tikus yang diinduksi Esherichia coli dan  tidak  diberi  preventif,  kelompok  C tikus yang diinduksi E. coli dan diberi preventif ekstrak  daun  dewandaru  ( Eugenia  uniflora ) dengan dosis 300 mg/kg BB, kelompok D tikus yang  diinduksi E.  coli dan  diberi  preventif ekstrak  daun  dewandaru  dengan  dosis  400 mg/kg  BB,  dan  kelompok  E  tikus  yang dinduksi E.  coli dan  diberi  preventif  ekstrak daun dewandaru dengan dosis 500 mg/kg BB. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 4 ekor tikus.  Penggunaan  hewan  coba  dalam penelitian  ini  telah  mendapatkan  persetujuan
laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya No. 670-KEP-UB.

## Tata laksana Pembuatan Hewan Coba Model Gastroenteritis
Pembuatan hewan coba model gastroenteritis dilakukan dengan
menginjeksikan Escherichia  coli standar  Mc Farland  1  (3  x  10 8 cfu/mL)  sebanyak  10 6 CFU/ml  (1  mL/hari  dosis  tunggal)    pada  16 ekor  tikus  dari  4  kelompok  perlakuan (kelompok  B,  C,  D,  dan  E)  (Astawan  dkk., 2011).  Injeksi Escherichia  coli dilakukan  setiap hari selama 7 hari dengan cara sonde lambung
Pembuatan Sediaan Ekstrak Daun Dewandaru ( Eugenia uniflora ) Prosedur  pembuatan  ekstrak  daun dewandaru  ( Eugenia  uniflora )  menggunakan metode  maserasi.  Proses  ekstraksi  dilakukan menggunakan  etanol  70%,  hal  tersebut dikarenakan  zat  aktif  seperti  flavonoid  yang terkandung  didalam  daun  dewandaru  akan terlarut dalam etanol. Etanol dengan nama lain etil  alkohol  merupakan  pelarut  yang  sering digunakan dalam ekstraksi tanaman. Sebagian besar  senyawa  dengan  berat  molekul  rendah seperti  saponin,  dan  flavonoid  larut  didalam pelarut  etanol.  Daun  dewandaru  ditimbang sebanyak  100  g  dan  dilakukan  pembasahan dengan  pelarut  etanol  70%  sebanyak  100  ml. Masukkan serbuk yang telah dibasahi dengan pelarut ke dalam toples, diratakan dan sambil ditambahkan  pelarut  etanol  70%  sampai terendam (pelarut yang digunakan minimal 2 kali  berat  atau  lebih).  Pelarut  yang ditambahkan  sebanyak  500  ml.  Tutup  toples dengan rapat selama 24 jam. Dan di shaker di atas  shaker  digital  rpm  50  (Materia  Medica, 2017).
Ekstrak cair disaring dengan penyaring kain.  Ekstrak  tersebut  ditampung  dalam Erlenmeyer.  Ampas  dari  ekstrak  dimasukkan lagi  dalam  toples  dan  ditambahkan  pelarut sampai terendam (minimal pelarut 5 cm diatas permukaan),  dalam  hal  ini  digunakan  500  ml
pelarut  etanol.  Biarkan  24  jam  diatas  shaker dengan  kecepatan  50  rpm.  Hasil  ekstrak  cair pertama  dan  kedua  dijadikan  satu  dan diuapkan  dengan  menggunakan rotary evaporator .  Diperlukan  waktu  2  jam  untuk evaporasi. Ekstrak
yang dihasilkan dievaporasi/diuapkan diatas water bath selama 2 jam. Dari 100 g serbuk daun dewandaru yang diekstraksi  dengan  menggunakan  pelarut etanol 70% sebanyak 1 L dihasilkan ekstrak 20 ml (Materia Medica, 2017).
Tata  Laksana  Pemberian  Preventif  Ekstrak  Daun Dewandaru (Eugenia uniflora)
Pemberian  preventif  dilakukan  pada hari  ke  8  sampai  hari  ke  14.  Ekstrak  daun dewandaru diberikan pada kelompok preventif  C,  D,  dan  E  secara per-oral melalui sonde  lambung.  Ekstrak  daun  dewandaru terlebih  dahulu  disuspensikan  ke  dalam  PBS sebanyak  1  mL  sebelum  diberikan  ke  hewan coba. Pemberian terapi dilakukan 1 kali sehari selama 7 hari.

## Euthanasi Hewan Coba dan Isolasi Organ
Euthanasi  pada  tikus  dilakukan  pada hari ke 22 setelah seluruh perlakuan. Euthanasi tikus  dilakukan  dengan  cara  dislokasi  leher kemudian  direbahkan  pada  posisi  rebah dorsal.  Lalu  dilakukan  pembedahan  pada bagian  abdomen  dan  pengisolasian  organ duodenum.  Organ  duodenum  dibilas  dengan NaCl-fisiologis  0,9%,  kemudian  dimasukkan pada  plastik  klip  (Junquiera and Carneiro, 2007).

## Pengukuran Kadar MDA Duodenum
Jaringan duodenum diambil dari setiap sampel sebanyak 0,1 gram dan dipotong kecil- kecil  lalu  digerus  dalam  mortar.  Kemudian ditambahkan 1 mL aquades. Homogenant yang terbentuk  dipindahkan  ke  dalam  microtube dan ditambahkan 100 µL TCA, 250 µL HCl 1N, dan  100  µL  Na-thio  1%.  Pada  setiap penambahan  reagen,  larutan  dihomogenkan dengan vortex. Larutan lalu diinkubasi dalam waterbath  pada  suhu  100ºC  selama  20  menit dan  dibiarkan  dingin  pada  suhu  ruang. Kemudian  larutan  disentrifugasi  dengan kecepatan  3500  rpm  selama  10  menit.
Supernatan  yang  terbentuk  diambil  dan ditambahkan  aquades  sebanyak  3500  µL. Kemudian larutan tersebut diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 532 nm  dan  diplotkan  pada  kurva  standar  yang telah  dibuat  untuk  menghitung  konsentrasi sampel (Repetto et al ., 2012).
Pembuatan  Preparat  Histopatologi  Duodenum dengan Pewarnaan HE
Proses
pembuatan preparat histopatologgi  terdiri  dari  fiksasi,  dehidrasi dan  infiltrasi,  penjernihan,  infiltrasi  paraffin, embedding,  sectioning, penempelan  di  gelas objek,  dan  pewarnaan.  Fiksasi  dilakukan dengan  cara  jaringan  dimasukkan  ke  dalam larutan  PFA  4%.  Fiksasi  dilakukan  untuk mencegah kerusakan pada jaringan, menghentikan  proses  metabolisme  dan mengeraskan materi yang lunak agar jaringan dapat  diwarnai.  Dehidrasi  dilakukan  dengan alkohol bertingkat dari konsentrasi 70% 24 jam, etanol 80 % 2 jam, etanol 90% , 95%, dan etanol absolut  20  menit.  Penjernihan  dengan  cara direndam jaringan dalam larutan xylol I selama 20 menit dan  xylol II selama 30 menit. Infiltrasi dan embeeding dilakukan  dengan  blok  parafin pada    inkubator  bersuhu  56-58 o C.  Cetakan dijepit dalam mikrotom dan jaringan dipotong ketebalan  5  µm.  Sediaan  disimpan  dalam inkubator  suhu  38-40 o C  selama  24  jam. Deparafinasi dilakukan dengan xylol I dan II. Rehidrasi  dengan  menggunakan  etanol absolut,  95%,90%,80%,70%.  Kemudian  dicuci dengan  air  mengalir.  Pewarnaan Hematoxylin 10  menit  lalu  dicuci  dengan  air  mengalir. Pewarnaan  eosin  dilakukan  selama  5  menit. Dehidrasi  dilakukan  dengan  etanol  absolut, 95%,90%,80%,  70%. Mountain dengan entellan. Pengamatan  histopatologi  dilakukan  dengan menggunakan  mikroskop  cahaya    (Junquiera and Carneiro, 2007).

## Analisis Data
Penelitian  ini  menggunakan  analisis kuantitatif statistik OneWay ANOVA terhadap kadar MDA dan dilanjutkan dengan uji Tukey menggunakan α =5%. Gambaran histopatologi
jaringan  duodenum  diamati  secara  deskriptif melalui  pengamatan  terhadap  adanya  erosi epitel pada vili dan sel-sel radang
HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Preventif Ekstrak Daun Dewandaru Terhadap Kadar Malondialdehyde (MDA)  Duodenum  Tikus
Model Gastroenteritis
Hasil pengukuran MDA menggunakan metode Thiobarbituric Acid (TBA) menunjukkan bahwa  pemberian  ekstrak  daun  dewandaru secara  preventif  dapat  menurunkan  kadar MDA duodenum pada tikus model gastroenteritis.  Pada  tikus  normal  (kontrol negatif)  terukur  kadar  MDA  duodenum sebesar 0,536 ng/mL. Dalam keadaan normal, MDA akan tetap dihasilkan selama terjadinya biosintesis prostaglandin dalam sel. Malondialdehyde (MDA) juga dihasilkan sebagai produk  dari  peroksidasi  lipid  terutama polyunsaturated  fatty  acid (PUFA),  yang merupakan  reaksi  berantai  akibat  abstraksi hidrogen  atau  penambahan  oksigen  radikal dan  akan  mengakibatkan  kerusakan  oksidatif pada  PUFA  yang  banyak  terdapat  pada membran sel (Repetto et al., 2012). Berdasarkan  hasil Post  Hoc dengan  uji Tukey  didapatkan  hasil  bahwa  kelompok preventif  P1  (300  mg/kg  BB),  P2  (400  mg/kg BB),  dan  P3  (500  mg/kg  BB)  tidak  berbeda signifikan dibandingkan kelompok K+ (kontrol positif)  (p<0,05).  Jika  dibandingkan  dengan kelompok  K-  (Kontrol  negatif),  kelompok preventif  P1  (300  mg/kg  BB),  P2  (400  mg/kg BB),  dan  P3  (500  mg/kg  BB)  memiliki perbedaan yang signifikan. Hal ini menunjukkan  bahwa  semua  kelompok preventif tidak dapat menurunkan kadar MDA tikus  putih  ( Rattus  norvegicus )  model gastroenteritis dibandingkan dengan kelompok kontrol positif. Pada preventif antar kelompok P1, P2, dan P3 menunjukkan rentang perbedaan  efek  preventif  yang  cukup  sedikit. Namun,  hanya  kelompok  P1  (300  mg/kg  BB) yang  berhasil  menurunkan  kadar  MDA  jika dibandingkan  pada  kelompok  K-  (kontrol negatif). Perbedaan nilai antar perlakuan dapat dilihat pada Tabel 5.1 berikut ini.

## Tabel 5.1 Rata-rata, Standar Deviasi, dan Hasil Uji Tukey Kadar MDA
Keterangan : notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan antar perlakuan (p<0,05).
Kelompok  K(+)  menunjukkan  jumlah kadar  MDA  yang  lebih  tinggi  dari  pada kelompok  K(-)  dan  menunjukkan  adanya perbedaan yang signifikan (p<0,05) ( Tabel 5.1 ). Tingginya  kadar  pada  kelompok  K(+)  terjadi akibat  kerusakan  sel-sel  di  duodenum  yang disebabkan  adanya  infeksi  dari  bakteri Escherichia coli. E. coli merupakan bakteri gram negatif  yang  mempunyai  endotoksin  berupa LPS pada membran sel. Lipopolisakarida (LPS) atau endotoksin akan disekresikan oleh E. coli ketika  bakteri  tersebut  lisis.  Lipopolisakarida (LPS)  kemudian  akan  berikatan  dengan  LBP membentuk kompleks LPS-LBP. Lipopolisakarida terikat pada reseptor spesifik CD14  dan  TLR4  pada  makrofag.  Kompleks LPS-LBP  mentransfer  LPS  ke  CD14  yang terdapat  di  permukaan  sel  makrofag.  Setelah berikatan dengan LPS, CD14 akan berinteraksi dengan  TLR4  menyebabkan  aktivasi  dari  NF- kB (Hongwei et al., 2005). Nuclear Factor-kB (NF- kB)  merupakan  faktor  trankripsi  pada makrofag  yang  akan  meningkatkan  produksi dari sitokin dan mediator inflamasi. Makrofag yang  teraktivasi  mensekresikan  sitokin proinflamasi  IL-1,  IL-6  dan  TNF- α .  Pelepasan sitokin  proinflamasi  pada  jaringan  akan menyebabkan sel memproduksi oksigen toksik untuk  proses respiratory  burst yaitu reactive oxygen species (ROS) (Short, 2004).
Menurut  Arief  (2008),  suatu  keadaan dimana  tingkat reactive  oxygen  species (ROS)
Perlakuan Rata-Rata kadar MDA Kontrol negatif (A) 0,536± 0,14 ! Kontrol positif (B) 0,948± 0,09 " Dosis terapi 300 mg/kg BB (C) 0,872± 0,05 " Dosis terapi 400 mg/kg BB(D) 0,874± 0,03 " Dosis terapi 500 mg/kg BB (E) 0,898± 0,05 "
melebihi  pertahanan  antioksidan  endogen akan  menyebabkan  stress  oksidatif.  Keadaan ini  mengakibatkan  kelebihan  radikal  bebas, dan akan bereaksi dengan lemak, protein, asam nuklear  seluler,  sehingga  terjadi  kerusakan lokal dan disfungsi organ tertentu. Kerusakan oksidatif  yang  ditimbulkan  akibat  tingginya produksi ROS ditandai dengan diproduksinya senyawa  aldehida  reaktif  yaitu  MDA. Kelompok  perlakuan  dari  pemberian  dosis ekstrak  daun  dewandaru  300  mg/kg  BB,  400 mg/kg  BB  dan  500  mg/kg  BB  meningkat dibandingkan  dengan  kontrol  negatif.  Pada kontrol positif meningkat sebesar 76,82% lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol negatif.
Berdasarkan skrining fitokimia  daun tanaman  dewandaru  mengandung  flavonoid, tanin,  dan  saponin.  Flavonoid  dan  tanin digunakan  sebagai  antioksidan  eksogen  dan antibakteri.  Flavonoid  akan  berikatan  dengan DNA bakteri sehingga menyebabkan kerusakan permeabilitas dinding sel, mikrosom,  dan  lisosom  bakteri.  Selain  itu flavonoid berperan sebagai antioksidan karena memiliki  gugus  hidroksil  yang  terikat  pada karbondioksida  sehingga  dapat  menangkap radikal  bebas  dengan  menyumbangkan  satu atom  hidrogen.  Sementara  itu  senyawa  tanin dapat  menginaktivasi  adhesi  sel  mikroba sehingga  bakteri  tidak  dapat  melakukan perlekatan  pada  sel  epitel  dan  menstimulasi sel-sel  fagosit  yang  berperan  dalam  respon imun seluler (Utami et al , 2007).
Malondialdehida (MDA)
dapat terbentuk apabila reactive oxygen species (ROS) bereaksi  dengan  komponen  asam  lemak  dari membran  sel  sehingga  terjadi  reaksi  berantai yang  dikenal  dengan  peroksidasi  lipid. Peroksidasi  lipid  merupakan  proses  oksidasi asam  lemak  tak  jenuh  rantai  panjang  yang menyebabkan  terputusnya  rantai  asam  lemak menjadi  berbagai  senyawa  toksik  dan  juga menyebabkan  kerusakan  pada  membran  sel karena  menghasilkan  produk  akhir  MDA (Yunus, 2001). MDA dapat digunakan sebagai indeks peroksidasi lipid dan alat ukur aktivitas radikal bebas secara tidak langsung (Suryohudoyo,  2000).  Infeksi Escherichia  coli pada hewan coba dapat meningkatkan radikal
bebas  dalam  tubuh  sehingga  menyebabkan stress oksidatif yang memicu peroksidasi lipid. Jadi,  kadar  MDA  paling  tinggi  dimiliki  oleh kelompok tikus kontrol positif.
Hasil  analisis  kadar  MDA  pada penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  kelompok tikus  gastroenteritis  (kontrol  positif)  kadar MDA  mengalami  peningkatan  karena  adanya infeksi,  sedangkan  kontrol  negatif  mengalami penurunan.  Dosis  kelompok  P1,  P2,  dan  P3 mengalami  peningkatan  karena  kelompok perlakuan  tidak  mampu  untuk  mencegah kerusakan  pada  saat  kerusakan  jaringan sehingga  MDA  meningkat.  Tingginya  kadar MDA terjadi akibat stress oksidatif yang secara tidak langsung menunjukkan tingginya radikal bebas.  Radikal  bebas  yang  terbentuk  tidak diimbangi oleh antioksidan endogen, sehingga memicu  terjadinya  peroksidasi  lipid  dengan produk  akhir  MDA.  Pemberian  ekstrak  daun dewandaru  sebagai  preventif  kurang  mampu menurunkan  tingkat  stress  oksidatif  karena kurangnya  dosis  yang  diberikan.  Dosis perlakuan  300  mg/kg  BB  dan  400  mg/kg  BB dan  500  mg/kg  BB  dengan  ekstrak  daun dewandaru  tidak  berbeda  nyata  dengan kontrol  positif  yang  dinilai  belum  mampu untuk  menurunkan  kadar  MDA  sehingga diperlukan dosis yang lebih tinggi.
Pengaruh Preventif Ekstrak Daun Dewandaru Terhadap Gambaran
Histopatologi  Duodenum  Tikus  Model Gastroenteritis
Pengamatan  parameter  histopatologi duodenum  dilakukan  untuk  mengetahui gambaran inflamasi berdasarkan histopatologi. Seperti  struktur  epitel,  sel-sel  radang,  dan  sel goblet pada masing-masing sampel dilakukan menggunakan  mikroskop  dengan  perbesaran 100x, dan 400x yang ditunjukkan pada Gambar A sampai dengan Gambar E berikut ini.
B
Gambar 1 . Gambaran Histopatologi
duodenum (perbesaran 100x dan 400x). Terjadi infiltrasi  sel  radang,  hipertrofi  sel  goblet  dan struktur  sel  epitel  yang  terjadi  erosi  pada kelompok  terapi  C,  D,  dan  E  dibandingkan kelompok B (kontrol positif).
Keterangan : Tanda panah gambar B, C, D dan E  menujukkan  adanya  kelainan  (daerah  yang abnormal).
Hasil  penelitian  pengaruh  preventif ekstrak  daun  dewandaru  terhadap  gambaran histopatologi  duodenum  dengan  pewarnaan hematoxyline-eosin (HE)  dianalisa  secara deskriptif  menggunakan  mikroskop  cahaya dengan  perbesaran  100x  dan  400x  dengan mengamati  struktur  vili,  sel  epitel  dan  sel goblet ( Gambar A sampai dengan Gambar E ). Gambaran histologi duodenum normal terdiri dari  empat  lapisan,  yaitu  tunika  mukosa, tunika  submukosa,  muskularis  eksterna,  dan tunika serosa (Eroschenko, 2008).
Tunika mukosa terdapat vili, sel epitel, dan sel goblet. Kelompok tikus sehat ( Gambar A ) menunjukkan gambaran histologi duodenum  tikus  sehat  yang  tanpa  diberi perlakuan  induksi E.  coli .  Terlihat  tidak  ada kerusakan  pada  struktur  vili,  sel  epitel  dan terdapat  sel  goblet.  Gambaran  histopatologi kontrol negatif dan kontrol positif yang diamati adalah perubahan pada struktur vili, sel epitel, dan  sel  goblet.  Pengamatan  dilakukan  untuk mengetahui perubahan gambaran histopatologi  kontrol  positif  setelah  diberi perlakuan induksi E.coli secara peroral.
Kelompok  kontrol  positif  ( Gambar  B ) menunjukkan adanya kerusakan pada struktur jaringan  duodenum  dibandingkan  dengan kontrol  negatif.  Deretan  sel  epitel  kolumner pada  bagian  mukosa  mengalami  erosi  dan sebagian ada yang menghilang, berkurangnya sel  goblet  karena  adanya  erosi  epitel    dan terdapat  infiltrasi  sel  radang  karena  terjadi kerusakan  yang  disebabkan  adanya E.  coli sehingga  menyebabkan  inflamasi.  Gambaran histopatologi duodenum yang diberi perlakuan  ekstrak  daun  dewandaru  dengan dosis preventif  300 mg/kg BB, 400 mg/kg BB, 500  mg/kg  BB  menunjukkan  adanya kerusakan  terhadap  susunan  sel  epitel kolumner  pada  mukosa  jika  dibandingkan dengan kontrol negatif. Erosi epitel yang masih ditemukan  dan  sel  radang  yang  ditemukan juga  jumlahnya  masih  banyak  seiring  dengan volume  pemberian  ekstrak  daun  dewandaru yang  meningkat  ( Gambar  C sampai  dengan Gambar  E ).  Kelompok  perlakuan  1  ( Gambar C )  yang  diberi  ekstrak  daun  dewandaru dengan  dosis  300  mg/kg  BB,  terlihat  adanya erosi vili, terdapat sel goblet, ditemukan sedikit sel  radang  neutrofil  maupun  makrofag  dan gambaran  epitel  vili  duodenum  yang menyerupai  normal.  Kelompok  tikus  putih perlakuan  2  ( Gambar  D )  yang  diberi  ekstrak daun  dewandaru  400  mg/kg  BB,  struktur  sel epitel mengalami erosi pada beberapa area, sel goblet  mengalami  hipertrofi  dan  infiltrasi  sel radang  makrofag  dan  neutrofil  yang  lebih banyak.  Kelompok  perlakuan  3  ( Gambar  E ) yang  diberikan  ekstrak  daun  dewandaru  500 mg/kg  BB,  terlihat  adanya  struktur  sel  epitel mengalami  erosi,  sel  goblet  mengalami hipertrofi,  dan  terdapat  infiltrasi  sel  radang makrofag dan neutrofil. Kelompok perlakuan 1 mengalami kerusakan histopatologi yang lebih sedikit  dibandingkan  P2  dan  P3.  Kerusakan histopatologi  duodenum  yang  paling  rusak pada perlakuan 2 dibandingkan perlakuan 3.
Geboes  (2003)  mengatakan  bahwa inflamasi  pada  duodenum  ditandai  dengan kerusakan  pada  lapisan  mukosa,  yaitu  pada
E C D
bagian vili dan hilangnya sel goblet. Sel goblet yang hilang ini disebabkan karena adanya erosi epitel  yang  menyebabkan  berkurangnya  sel goblet pada kelompok kontrol positif ( Gambar B ).  Sel  goblet  mensintesis  dan  mensekresikan mukus  glikoprotein  berbentuk  gel  untuk melindungi  sel-sel  epitelium  intestinal  dari invasi bakteri. Aktivasi sitokin yang dilepaskan oleh sel Th-2 merangsang sel goblet. Pada usus yang terinfeksi berat, dapat ditemukan jumlah sel  goblet  yang  sangat  banyak.  Hal  ini menunjukkan adanya infeksi bakteri maka sel goblet  akan  mengalami  proliferasi  yang bertujuan mempertahankan hidup dari infeksi (Balqis et al. , 2015).
Infeksi E.coli yang bersifat patogen pada kelompok kontrol positif akan menempel pada lapisan mukosa sehingga dapat menyebabkan erosi sel-sel epitel permukaan dan peradangan pada  usus  halus.  Selain  itu,  pada  kelompok kontrol positif juga ditemukan adanya infiltrasi sel  radang,  yaitu  neutrofil,  monosit  dan limfosit.  Kumar et  al (2013)  menyebutkan bahwa enterotoksin yang dihasilkan oleh E. coli berupa  toksin  labil  panas  dan  toksin  stabil panas.  Enterotoksin  mengaktivasi  berbagai mediator  inflamasi  seperti  komplemen  dan sitokin. Mediator inflamasi tersebut menyebabkan  vasodilatasi  pembuluh  darah serta  meningkatkan  permeabilitas  pembuluh darah.  Akibatnya,  sel-sel  inflamasi,  salah- satunya neutrofil dan limfosit menuju jaringan usus  yang  terinfeksi  untuk  melakukan perlawanan  sistem  imun  dengan  bakteri patogen ( Gambar B ).
Kelompok perlakuan yang mendapatkan preventif ekstrak daun dewandaru  pada  ( Gambar  C sampai  dengan Gambar  E )  nampak  masih  terjadi  kerusakan struktur epitel vili, ini dikarenakan pemberian preventif  ekstrak  daun  dewandaru  yang berperan  sebagai  antibakteri  dan  antioksidan kurang  mampu  menghambat  kerusakan struktur  epitel  vili.  Adanya  perubahan  pada jaringan  antara  kelompok  kontrol  dan perlakuan  disebabkan  oleh  adanya  zat antioksidan  seperti  flavonoid  (Supratanda, dkk., 2014).
Mekanisme  senyawa  flavonoid  yang mungkin  terjadi  pada  kelompok  perlakuan adalah  zat  flavonoid  dapat  menetralisir senyawa  radikal  bebas  dan  mencegah terjadinya  reaksi  berantai  dengan  cara mendonorkan  elektronnya  kepada  radikal bebas  sehingga  menjadi  stabil.  Selain  itu antioksidan  akan  mengurangi  oksidatif  lebih lanjut  dari  asam  lemak  pada  fosfolipid sehingga  regenerasi  dapat  berlangsung  lebih cepat (Tappi, 2013). Daun dewandaru memiliki aktivitas  sebagai  antioksidan  secara in  vitro , dengan  mekanisme  kerja  menangkap  radikal bebas  yang  merupakan  salah  satu  penyebab kerusakan  sel.  Hasil  penelitian  tersebut menunjukkan  aktivitas  penangkap  radikal pada  ekstrak  etanol,  etil  asetat  dan  kloroform dengan  nilai IC 50 ( Inhibitory  Concentration ) (Utami  dkk.,  2005).  Penelitian  lain  juga menyatakan bahwa daun dewandaru memiliki aktivitas  menangkap  radikal  bebas  dengan nilai IC 50 ekstrak heksana, kloroform, etil asetat dan air (Velaquez et al ., 2003).
Cotran et al (2003), menyebutkan bahwa toksin  bakteri,  seperti  LPS  pada  bakteri  gram negatif dapat memicu terbentuknya kompleks LPS-LBP dan menggertak aktivasi komplemen. Komplemen  berperan  sebagai  stimulus  bagi sel-sel radang polimorf (PMN) dan makrofag. Polimorfonuklear (PMN) dan makrofag dalam memproses  antigen  akan  menginduksi terjadinya  inflamasi  pada  jaringan.  Reaksi inflamasi  memunculkan  tanda  klinis  berupa perubahan  vaskuler  yaitu  vasodilatasi, sehingga  terjadi  peningkatan  aliran  darah setempat  dan  perubahan  mikrovaskuler  yaitu peningkatan permeabilitas, sehingga memungkinkan  sel  endotel  pecah  dan  terjadi akumulasi  eritrosit  pada  jaringan  (hemoragi) (Arimbi  dkk.,  2015).  Gambaran  histopatologi duodenum  berkaitan  dengan  dosis  preventif yang  diberikan.  Penyebab  destruksi  epitel duodenum  adalah  toksin  bakteri  yang menimbulkan  peningkatan  metabolisme  sel tubuh sehingga sel menggalami stress oksidatif yang memicu peroksidasi lipid dengan produk akhir  peningkatan  MDA.  Fungsi  senyawa flavonoid sebagai antioksidan dapat meredam terjadinya stress oksidatif yang diukur melalui
penurunan  kadar  MDA,  sehingga  derajat kerusakan jaringan dapat menurun.
Fungsi  senyawa  tanin  dan  saponin sebagai  antibakteri  dapat  menghambat perkembangan bakteri, sehingga menurunkan derajat  kerusakan  jaringan  yang  ditandai dengan berkurangnya hemoragi dan memberi kesempatan  sel  epitel  untuk  melakukan proliferasi secara normal tanpa gangguan dari toksin bakteri. Sel epitel duodenum beregenerasi  secara  normal  dalam  waktu  tiga sampai enam hari. Kemampuan regenerasi sel didasarkan  pada  jenis  sel.  Sel  epitel  traktus digestivus  termasuk  sel  yang  bersifat  labil, dimana  sel  ini  memiliki  kemampuan regenerasi  yang  tinggi.  Sel  labil  mempunyai waktu istirahat yang singkat, sehingga sel yang hilang  dapat  menstimuli  sel  baru  pada  fase istirahat  untuk  memasuki  masa  mitosis  sel (Pringgoutomo  dkk.,  2002).  Proliferasi  sel tersebut  dapat  memperbaiki  struktur  villi duodenum.
Pada  penelitian  ini  hasil  histologi duodenum P1, P2 dan P3 ( Gambar C-Gambar E ) dengan dosis 300 mg/kg, BB, 400 mg/kg BB, 500 mg/kg BB masih kurang efektif. Pemberian ekstrak  daun  dewandaru  belum  mampu menghambat  sintesis  dinding  sel  bakteri, sehingga sel epitel tidak dapat berkesempatan untuk  berproliferasi  lebih  baik.  Seharusnya pemberian  preventif  juga  akan  menguatkan fungsi  antioksidan  tubuh  sehingga  sel  tubuh tetap dapat mengimbangi jumlah radikal bebas yang  timbul  akibat  infeksi E.  coli. Pada penelitian ini terbukti bahwa preventif ekstrak daun  dewandaru  belum  mampu  mencegah kerusakan jaringan duodenum pada tikus yang diinfeksi E. coli .

## KESIMPULAN
Dari  hasil  penelitian  ini  dapat disimpulkan  bahwa  pemberian  ekstrak  daun dewandaru  ( Eugenia  uniflora  L )  dengan  dosis 300 mg/kg BB, 400 mg/kg BB, dan 500 mg/kg BB tidak dapat digunakan menurunkan kadar malondialdehyde (MDA) duodenum dan belum optimal dalam mencegah kerusakan gambaran
histopatologi jaringan duodenum dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol positif. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut berkaitan  dengan  penentuan  dosis  preventif ekstrak  daun  dewandaru  ( Eugenia  uniflora  L ) yang lebih tepat pada kondisi gastroenteritis.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  segenap  staf Laboratorium
UPT Materia Medica, Laboratorium  Faal  FK  UB,  Laboratorium Mikrobiologi  FK  UB  serta  Laboratorium Parasitologi  FK  UB  yang  telah  membantu menyiapkan  fasilitas  yang  diperlukan  selama penelitian berlangsung.

## DAFTAR PUSTAKA
Arimbi,  A.A.,  R.  Darsono,  H.  Plumeriastuti, T.V. Widiyatno dan D. Legowo. 2015. Buku  Ajar  Patologi  Umum  Veteriner Edisi 2. Airlangga Press. Surabaya.
Astawan,  M.,  T.  Wresdiyati,  I.I  Arief,  dan  E. Suhesti. 2011. Gambaran Histopatologi Tikus  Putih (Rattus  norvegicus) yang Diinfeksi Escherichia coli Enteropatogenik dan Diberikan Probiotik [Skripsi]. Fakultas Kedokteran  Hewan.  Institut  Pertanian Bogor.
Balqis, U., M. Hanafiah, J. Connie, M. Nur, A. Siti,  dan  F.  Yudha.  2015.  Jumlah  Sel Goblet  pada  Usus  Halus  Ayam Kampung  ( Gallur  domesticus )  yang Terinfeksi Ascaridia  galli secara  Alami. Jurnal Medika Veterinaria , 9(1): 1-6.
Chaudhary,  K.,  and  E.  Adamson.  2016. The Prime  Prepare  and  Repair  Your  Body  for Spontaneous  Weight  Loss .  Harmony Books. USA.
Cotran,  R.S.,  V.  Kumar,  and  T.  Collins.  2003. Pathology  Basic  of  Disease  6th  ed .  WB Saunders Co. Philadelphia, 3(2): 20-21.

## Geboes,  K.  2003.  Histopathology  of  Crohn’s
Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Pathology , 11(18): 255-276.
Hongwei,  Q.,  A.W.  Cynthia,  J.L.  Sun,  Z. Xueyan,  and  N.B.  Etty.  2005.  LPS Induces CD4 Genes Expression Through The Activation of NF-kB and STAT-1 α In Macrophage and Microglia.
Blood , 106(9): 3114-3122.
Kumar,  V.,  Abbas,  and  A.K.  Aster.  2013. Robbins  Basic  Pathology .  Elsevier Saunders. Philadelphia, USA. Malone, L. K., K. R. Fletcher, and L. M. Plank. 2014  . Advanced  Practice  Nursing  in  the Care  of  Older  Adults .  Davis  Company. Philadelphia.
Manning,  S.  D.  2010. Deadly  Diaseases  and Epidemics;  Escherichia  coli  Infections Second Edition . Chelsea House Publishing. USA.
Ogunseitan,  O.,  and  P.  Robbins.  2011. Acute Gastroenteritis . Sage Publications. USA.
Prakash,  A.  2001.  Antioxidant  Activity.
Medallion Laboratories Analitical Progress , 19(2): 16-23.
Pringgoutomo,  S.,  H.  Sutisna  dan  A.  Tjarta. 2002. Buku  Ajar  Patologi  1 .  UI  Press.
Jakarta. Repetto, M., J. Semprine dan A. Boveris. 2012. Lipid Peroxidation Chemical Mechanism,  Biological  Implications and  Analytical  Determination.  Dalam
Lipid  Peroxidation, Angel  Catala  (Ed), InTech, DOI:10.5772/45943.
Sanders, M.J. 2012. Mosby’s Paramedic Textbook Fourth  Edition .  Jones  &  Barlett Learning. USA.
Short,  M.A.  2004.  Linking  the  sepsis  triad  of inflammation, coagulation, and supressed  fibrinolysis  to  infants. Ads
Neonatal Care, 11(5)258-73.
Supar.  2001.  Pemberdayaan  Plasma  Nutfah
Mikroba Veteriner dalam
Pengembangan  Peternakan:  Harapan Vaksin E. coli Enterotoksinogenik , Enteropatogenik , dan Verotoksigenik Isolat Lokal untuk Pengendalian Kolibasilosis Neonatal.  Balai  Penelitian  Veteriner. Bogor.
Suryohudoyo, P. 2000. Oksidan, Antioksidan dan Radikal  Bebas .  Ilmu  Kedokteran Molekuler . Sagung  Seto.  Jakarta.  31- 46.
Utami,  W.  2007.  Daya  Hambat  Ekstrak  Daun Dewandaru  ( Eugenia  uniflora  L. ) Terhadap Aktivitas GST Kelas PI Ginjal Tikus  Secara  In  Vitro.  Universitas Muhammadiyah Surakarta. Jurnal Penelitian  Sains  &  Teknologi ,  8(2):  110- 118.
Utami, W., M. Da’i, dan Y.S. Sofiana,. 2005. Uji
Aktivitas  Penangkap  Radikal  dengan Metode DPPH serta Penetapan
Kandungan Fenol dan Flavonoid dalam Ekstrak Kloroform, Ekstrak Etil Asetat, Ekstrak  Etanol  Daun  Dewandaru (Eugenia uniflora L. ) . Pharmacon , 6 (1): 5- 9
Watson,  R.  R.  2015. Modulation  of  Sleep  by Obesity, Diabetes, Age, and Diet . Elsevier.
USA.
Watson, R. R., and V. R. Preedy. 2013. Bioactive Food  As  Interventions  for  Arthritis  and Related  Inflammatory  Diseases .  Elsevier.
UK.
Yunus,  M.  2001.  Pengaruh  Antioksidan
Vitamin  C  terhadap  MDA  Eritrosit Tikus Wistar Akibat Latihan Anaerobik. Jurnal Pendidikan Jasmani, 9(1): 9-16.