## ANTIOXIDANT ACTIVITY OF PINING ( Hornstedtia alliacea )
BY USING DPPH METHOD
Firman Gustaman, Winda Trisna Wulandari, Vera Nurviana, Keni Idacahyati

## STIKes Bakti Tunas Husada, Jl. Cilolohan No. 36 Tasikmalaya
Korespondensi: Firman Gustaman (firmangustaman@stikes-bth.ac.id)

## ARTICLE HISTORY
Received: 19 December 2019 Revised: 27 January 2020              Accepted: 31 January 2020

## Abstract
Indonesia  is  an  archipelagic  country  located  in  the  equatorial  zone  and  famous  for having  a  diversity  of  plant  species,  but  not  all  of  this  potential  can  be  utilized  as industrial materials, especially medicinal plants. Pining ( Hornstedtia alliacea ) is a plant that is still underutilized in the health sector due to the lack of information about the phytochemicals of the plant. In this study, phytochemical screening of pining was done to determine the content of alkaloids, triterpenoids/steroids, flavonoids, tannins, and saponins as well as testing the antioxidant activity by using DPPH method. The result of  phytochemical  screening  shows  that  pining  has  flavonoids,  quinones, monoterpenes, and sesquiterpenes in ethanol, ethyl acetate and n -hexane extracts. In antioxidant testing, ethyl acetate extract has the most powerful antioxidant potential with an IC 50 value of 23.43 ppm which is classified as a strong antioxidant.
Key words: antioxidant, flavonoids, Pining ( Hornstedtia alliacea )

## AKTIVITAS ANTIOKSIDAN BUAH PINING ( Hornstedtia alliacea ) DENGAN MENGGUNAKAN METODE DPPH

## Abstrak
Indonesia  merupakan  negara  kepulauan  yang  berada  pada  zona  khatulistiwa  dan terkenal memiliki keanekaragaman jenis tanaman, tetapi potensi ini belum semuanya dapat  dimanfaatkan  sebagai  bahan  industri  khususnya  tanaman  berkhasiat  obat. Buah  pining  ( Hornstedtia  alliacea )  merupakan  tanaman  yang  masih  sedikit dimanfaatkan  dalam  bidang  kesehatan  dikarenakan  masih  minimnya  informasi mengenai  fitokimia  dari  tanaman  tersebut.  Skrining  fitokimia  tanaman  buah  pining ( Hornstedtia  alliacea )  dilakukan  untuk  mengetahui  kandungan  senyawa  alkaloid, triterpenoid/steroid,  flavonoid,  tanin,  dan  saponin,  serta  pengujian  aktivitas antioksidan  menggunakan  metode  DPPH.  Hasil  skrining  fitokimia    yang  diperoleh menunjukkan hasil positif untuk flavonoid, kuinon, monoterpen dan seskuiterpen pada ekstrak  etanol,  etil  asetat  dan n -heksana.  Pada  pengujian  antioksidan,  ekstrak  etil asetat memiliki potensi antioksidan yang paling kuat dengan nilai IC 50 sebesar 23,43 ppm yang tergolong antioksidan kuat.
Kata kunci: antioksidan, flavonoid, pining ( Hornstedtia alliacea )

## Pendahuluan
Radikal  bebas  merupakan  molekul  yang  sangat  reaktif  yang  memiliki  elektron tidak berpasangan dalam orbital terluarnya. 1 Radikal  bebas dapat terbentuk di dalam tubuh  akibat  proses  produk  samping  metabolisme.    Penyakit  degeneratif  seperti diabetes  mellitus,  hipertensi,  stoke,  peyakit  autoimun  hingga  kanker  dapat disebabkan oleh radikal bebas. 1
Senyawa yang dapat memperlambat terjadinya oksidasi sehingga memperlambat terjadinya penyakit kronik dan  melindungi tubuh dari serangan radikal bebas  adalah  antioksidan.  Antioksidan  juga  mampu  memperlambat  terjadinya penyakit kronik yang disebabkan penurunan spesies oksigen reaktif (ROS) terutama radikal  hidroksil  dan  radikal  superoksida. 2,3 Indonesia  mempunyai  kekayaan  alam yang memiliki berbagai jenis tumbuhan yang berkhasiat bagai obat, tetapi potensi ini belum semuanya dapat dimanfaatkan. 4 Secara turun-temurun masyarakat Indonesia telah  memanfaatkan  berbagai  jenis  tanaman  sebagai  bahan  obat  tradisional  untuk pencegahan maupun pengobatan terhadap berbagai macam penyakit. 5 Buah pining (Hornstedtia alliacea) mengandung senyawa bahan alam golongan Flavonoid seperti Flavones, Flavonones, Flavonol, Flavanonols, anidins Anthocy, Aurones, Flavanoid, Chromones Furan, Biflavones, Isofavones, Isoflavanones, Chaocones, Xanthone dan Dihydrocalcones  yang  dapat  bertindak  sebagai  Antioksidan. 6 ( Hornstedtia  alliacea ) adalah sejenis tumbuhan penghasil buah anggota suku jahe-jahean ( Zingiberaceae ). 7 Rimpang Zingiberaceae merupakan aromatik kuat dan pada umumnya mengandung minyak  atsiri  yang  telah  dilaporkan  mempunyai  sifat  antioksidan,  antiinflamasi  dan antimicrobial. 8 Zingiberaceae juga  dapat  digunakan  pada  penyakit  kronis  seperti osteoarthritis, rheumatoid artritis, dan depresi. 9
Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) dipilih sebagai pengujian antioksdian . Metode ini merupakan metode yang  konvensional, sederhana, cepat mudah, reliabel dan  praktis  untuk    melakukan  skrinning  aktivitas  penangkap  radikal  beberapa senyawa. 1

## Metode

## Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah rotary  evaporator timbangan analitik, mesh , oven ,  gelas  ukur,  , vortex  mixer ,  , rotary  evaporator ,  dan spektrofotometer  UV-Vis,  ,  blender,  desikator,  gelas  kimia,  mikropipet,  labu Erlenmeyer, magnetik stirrer.

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam peneltian ini adalah etanol, etil asetat, n -heksana reagen mayer,  reagen  wagner  dan  (DPPH)  1,1-difenil-2-pikrilhidrazil.  Sampel  yang digunakan  yaitu  buah  pining  yang  diambil  dari  kecamatan  Cikatomas  kabupaten Tasikmalaya, reagen dragendorff.

## Prosedur

## Ekstraksi Sampel
Ekstraksi   yang dilakukan  menggunakan  metode maserasi   bertingkat   dengan 7   sampel   serbuk simplisia  buah pining.   pelarut  yang  digunakan  adalah pelarut dengan  kepolaran  makin  meningkat  yaitu n -heksana,  etil  asetat,  dan  etanol  70% masing-masing pelarut yang digunakan sebanyak 100mL (1:10).   Serbuk   simplisia ditimbang   10 g, dimasukkan  ke  dalam   erlenmeyer 250 mL. Maserasi  pertama simplisia  direndam  dengan  100 mL n -heksan selama 24 jam sambil sesekali diaduk
(setiap  6  jam),  setelah  24  jam,  residu  dipisa hkan dari filtrat dan ampas simplisia dikeringkan  dengan  oven    pada    suhu    50 ̊C.    Setelah    residu    kering    dilakukan dimaserasi  kembali  selama  24  jam  dengan  etil asetat  100  mL  sambil  sesekali diaduk  (setiap  6 jam), setelah 24  jam residu dipisahkan dari  filtrat, setelah maserasi dengan    etil    asetat    selesai,    residu  dikeringkan    kemudian    dimaserasi    dengan pelarut etanol  70%  dengan  prosedur  yang  sama.  Ekstrak yang  diperoleh  dari etanol  70%  dimasukkan  ke dalam  labu  100  mL  dan  digenapkan  sampai  batas ditambahkan   dengan   etanol   70%   lalu   ekstrak dituangkan selama 24 jam. Filtrat selanjutnya dilakukan pengujian.

## Skrining Fitokimia 1.  Pembuatan Pereaksi
a)  Pereaksi Mayer Sebanyak 1,36 g HgCl 2 dilarutkan dalam 60 mL  akuades. Pada bagian yang lain  larutkan  pula  5  g  KI  dalam  10  mL  akuades.  Kedua  larutan  ini  kemudian dicampur dan diencerkan dengan akuades sampai 100 mL. Reagen ini harus disimpan dalam botol yang berwarna coklat, agar tidak terjadi kontak langsung dengan cahaya.
b)  Pereaksi Dragendorff Sebanyak  8  g  KI  dilarutkan  dalam  20  mL  akuades,  sedangkan  pada  bagian yang lain dilarutkan 0,85 g bismut subnitrat dalam 10 mL asam asetat glasial dan  40  mL  akuades.  Kedua  larutan  ini  kemudian  dicampurkan.  Larutan disimpan  dalam  botol  berwarna  coklat.  Dalam  penggunaannya,  larutan  ini diencerkan dengan 2/3 bagian larutan 20 mL asam asetat glasial dalam 100 mL akuades.
c)  Pereaksi Wagner
Sebanyak  1,27  g  I 2 dan  2  g  KI  dilarutkan  dalam  5  mL  akuades.  Larutan  ini kemudian  diencerkan  dengan  akuades  hingga  100  mL.  Endapan  yang terbentuk disaring dan disimpan dalam botol berwarna coklat.

## 2.  Uji Alkaloid
Beberapa mL ekstrak buah pining, ditambahkan dengan 2 mL kloroform dan 2 mL amonia lalu disaring. Filtrat kemudian ditambahkan 3-5 tetes H 2 SO 4 pekat lalu dikocok hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan atas dipindahkan ke dalam tiga tabung reaksi masing-masing 2,5 mL. Ketiga larutan ini dianalisis dengan pereaksi Mayer,  Dragendorff  dan  Wagner  sebanyak  4-5  tetes.  Terbentuknya  endapan menunjukkan  bahwa  sampel  tersebut  mengandung  alkaloid.  Reaksi  dengan pereaksi  Mayer  akan  terbentuk  endapan  putih,  dengan  pereaksi  Dragendorff terbentuk endapan merah jingga dan dengan pereaksi wagner terbentuk endapan coklat. 10

## 3.  Uji Flavonoid
Beberapa mL ekstrak buah  pining,  ditambahkan  dengan 100 mL air  panas, didihkan selama 5 menit, kemudian disaring. Filtrat sebanyak 5 mL ditambahkan 0,05  g  serbuk  Mg  dan  1  mL  HCl  pekat,  kemudian  dikocok  kuat-kuat.  Uji  positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga. 10

## 4.  Uji Steroid dan Triterpenoid
Beberapa  mL  ekstrak  buah  pining  ditambahkan  dengan  CH 3 COOH  glasial sebanyak 10 tetes dan H 2 SO 4 pekat sebanyak 2 tetes. Larutan dikocok perlahan
dan dibiarkan selama beberapa menit. Uji positif Steroid jika menghasilkan warna biru atau hijau, sedangkan triterpenoid menghasilkan warna merah atau ungu. 10

## 5.  Uji Saponin
Beberapa  mL  ekstrak  buah  pining,  ditambahkan  dengan  10  mL  air  sambil dikocok  selama  1  menit,  lalu  ditambahkan  2  tetes  HCl  1  N.  Bila  busa  yang terbentuk  tetap  stabil  selama  kurang  lebih  7  menit,  maka  ekstrak  positif mengandung saponin. 10

## 6.  Uji Tanin
Beberapa mL ekstrak buah pining, ditambahkan dengan 10 tetes FeCl 3 10%. Ekstrak  positif  mengandung  tanin  apabila  menghasilkan  warna  hijau  kehitaman atau biru kehitaman. 10

## Uji Aktivitas Antioksidan
Ekstrak buah pining dengan variasi konsentrasi 1, 0,5 dan 0,2 mg/L sebanyak 5 mL  ditambahkan  larutan  DPPH  sebanyak  2  mL  dan  divortex  selama  2  menit. Perubahan warna dari larutan DPPH menunjukkan aktivitas antioksidan. Absorbansi DPPH  diukur  dengan  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis pada  λ  =  517  nm. Aktivitas  antioksidan  sebagai  persentase  berkurangnya  warna  DPPH  atau  dikenal dengan %Inhibisi:
% Inhibisi = (1- absorbansi sampel absorbansi kontrol )x 100 %

## Pembahasan

## Hasil Ekstraksi Buah Pining
Ekstraksi  yang  dilakukan  terhadap  buah  pining  dengan  menggunakan  etanol diperoleh ekstrak kental sebanyak  41,77 gram dengan persentase rendemen 4,1%. Ektraksi  buah  pining  menggunakan  etil  asetat  diperoleh  ektrak  kental  sebanyak 52,023 gram dengan presentase rendemen 5,2%. Ektraksi buah pining menggunakan n -heksan 23,125 g dengan presentase rendemen sebanyak 2,3%.

## Hasil Skrining Fitokimia
Berdasarkan  Tabel  1  pada  ekstrak  buah  pining  menunjukan  adanya metabolit sekunder  yang  terkandung  yaitu  flavonoid,  saponin,  kuinon,  monoterpenoid  dan seskuiterpenoid, serta senyawa albumin dari identifikasi albumin.
Tabel 1. Hasil Penafisan Fitokimia Simplisia dan Ekstrak Etanol, ektrak etil asetat dan ekstrak N-Hexan buah pining
No Metabolit Sekunder Reagen Hasil Simplisia Ekstrak Etanol Ekstrak Etil asetat Ekstrak n- Heksana 1. Flavonoid HCl Pekat, Logam Mg + + + + 2. Saponin HCl pekat + + - + 3. Kuinon NaOH 1N + + + + 4. Steroid Pereaksi Lieberman- Buchard - - + - 5. Tanin dan polifenol Lar. Gelatin 1%, FeCl 3 +/- + +/- +/- 6. Alkaloid Peraksi Mayer, Wagner, Dragendorff + + + - 7. Monoterpenoid Lar. Vanilin 10% + + + + 8. Seksuiterpenoid Asam Sulfat pekat + + + + 9. Triterpenoid CH 3 COOH glasial dan
larutan H 2 SO 4 pekat + + + -
Keterangan :  (+) Positif = Terdapat senyawa metabolit sekunder. (-) Negatif  = Tidak terdapat senyawa metabolit sekunder.
Berdasarkan hasil penafisan fitokimia bahwa simplisia dan esktrak etanol, ektrak etil  asetat  dan  ekstrak n -heksan  buah  pining  mengandung  senyawa  metabolit sekunder  seperti  flavonoid,  kuinon,  monoterpenoid,  seskuiterpenoid.  Flavonoid bersifat antimikroba yang dapat membentuk kompleks dengan protein ekstraseluler terlarut  serta  dinding  sel  mikroba  flavonoid  bersifat  antiinflamasi  sehingga  dapat mengurangi  peradangan  serta  membantu  mengurangi  rasa  sakit,  bila  terjadi perdarahan atau pembengkakan pada luka. 11,12 Selain sebagai antimikroba, golongan flavonoid  juga  memiliki  aktivitas  sebagai  antioksidan,  antivirus,  antiinflamasi. 13 kardioprotektif,    antidiabetes,  antikanker.  Flavonoid  yang  memiliki  aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol, isoflavon, kateksin, flavonol dan kalkon. Aktivitas antioksidan  dari  senyawa  alamiah  yang  berasal  dari  tanaman  seperti  flavonoid disebabkan adanya gugus hidroksil pada struktur molekulnya. 14
Seskuiterpen dan moniterpen berfungsi sebagai antibakteri. Mekanisme aksi dari senyawa  tersebut  dalam  menghambat  pertumbuhan  bakteri,  belum  banyak dilaporkan,  beberapa  penelitian  menyebutkan  bahwa  lipofilitas  senyawa  tersebut menyebabkan  terpenoid  bekerja  dengan  cara  mengganggu  fungsi  membran  sel bakteri. 12,11

## Uji Antioksidan
Metode  yang  digunakan  untuk menentukan  aktivitas  antioksidan  dari  biji  buah pining  adalah  metode  DPPH.  Absorbansi  DPPH  diukur  dengan  menggunakan spektrofotometri UV-VIS pada panjang gelombang maksimal DPPH yaitu pada 516 nm. Vitamin C digunakan sebagai pembanding pada pengukuran ini. Berikut adalah hasil dari pengujian aktivitas antioksidan vitamin C, ekstrak etanol, etil asetat dan n - heksana dari biji buah pining.

## Pengujian Aktivitas Antioksidan dari Vitamin C sebagai Standar
Hasil pengujian aktivitas antioksidan vitamin C dapat dilihat pada grafik dibawah ini:
Gambar 1. Grafik Aktivitas Antioksidan Vitamin C
Parameter  kekuatan  senyawa  sebagai  antioksidan  dapat  dilihat  dari  nilai  IC 50 nya. Apabila nilai IC 50 kurang dari 50 ppm dikategorekan sangat kuat, apabila antara 50-100 ppm termasuk kategori kuat, apabila antara 101-150 ppm termasuk sedang dan lemah apabila antara 150-200 ppm. 15 Nilai IC 50 untuk vitamin C adalah sebesar 4,19 ppm yang tergolong antioksidan yang sangat kuat

## Aktivitas Antioksidan Biji Buah Pining
Biji  buah  pining  diekstraksi  dengan  tiga  pelarut  yang  memilik  perbedaan kepolaran  yaitu  etanol,  etil  asetat  dan n -heksana.  Ketiga  ekstrak  tersebut  diuji aktivitas antioksidannya. Hasil pengujiannya dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Grafik Pengujian Aktivitas Antioksidan Biji Buah Pining Ekstrak Etanol (a); etil asetat (b); n -heksana (c)
Berdasarkan hasil pengujian antioksidan diperoleh nilai IC 50 untuk ekstrak etanol adalah sebesar 28,27 ppm, etil asetat sebesar 23,43 ppm dan n -heksana adalah 44 ppm.  Ketiga  ekstrak  biji  buah  pining  memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  tergolong
y = 7,0723x + 20,342
R² = 0,9991 0 20 40 60 80 0 2 4 6 8 % In h ib is i Konsentrasi (ppm) y = 1,0235x + 21,07 R² = 0,9984 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 % I n h ib is i Konsentrasi (ppm) a y = 1,3098x + 19,329 R² = 0,9995 0 20 40 60 80 0 20 40 % I n h ib is i Konsentrasi (ppm) b y = 0,7004x + 19,2 R² = 0,9989 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 % In h ib is i Konsentrasi (ppm) c
sangat kuat. 14 Diantara ketiga ekstrak biji buah pining, ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan yang paling tinggi atau yang memiliki nilai IC 50 terendah adalah ekstrak etil  asetat.  Hasil  pengujian  aktivitas  antioksidan  ini  sesuai  dengan  hasil  skrining fitokimia yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid pada ekstrak etil asetat yang dapat berperan sebagai antioksidan.
Mekanisme  peredaman  radikal  bebas  DPPH  oleh  antioksidan  adalah  dengan adanya  donor atom  H dari  senyawa  antioksidan  yang menyebabkan  radikal  bebas menjadi stabil. Hal ini ditandai dengan perubahan warna ungu menjadi warna kuning (terbentuknya pikrilhidrazil).
Gambar 3. Reaksi Radikal Bebas DPPH dengan Antioksidan. 16

## Kesimpulan
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  buah  pining  mengandung  senyawa metabolit sekunder diantaranya flavonoid, kuinon, monoterpenoid dan seskuiterpenoid. Buah pining memiliki aktivitas antioksidan tertinggi pada ekstrak etil asetat dengan nilai IC 50 sebesar 23,43 ppm yang tergolong sangat kuat.

## Daftar Pustaka
1.  Salamah  N,  Widyaningsih  W,  Izati  I,  Susanti  H.  Aktivitas  penangkap  radikal bebas  ekstrak  etanol  ganggang  hijau  Spirogyra  sp.  dan  Ulva  lactuca  dengan metode DPPH. J Ilmu Kefarmasian Indones. 2015;13(2):145 –50.
2.  Wahdaningsih  S,  Erna  Prawita  Setyowati  Subagus  Wahyuono.  Aktivitas penangkap radikal bebas dari batang pakis (Alsophila glauca J. Sm). Maj Obat Tradisional. 2011;16(3):156 – 160.
3.  Handayani  V,  Ahmad  AR,  Sudir  M.  Uji  aktivitas  antioksidan  ekstrak  metanol bunga dan daun patikala (Etlingera elatior (Jack) R.M.Sm) menggunakan metode DPPH. Pharm Sci Res. 2014;1(2):86 –93.
4.  Rahman  N,  Bahriul  P,  Diah  A.  Uji  aktivitas  antioksidan  ekstrak  daun  salam (Syzygium  Polyanthum)  dengan  menggunanakan  1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil.  J Akad Kim. 2014;3(3):143 –9.
5.  Agus S, Agustin W. Kemampuan air rebusan daun salam ( Eugenia polyantha W ) dalam menurunkan jumlah koloni bakteri Streptococcus sp . Capability of boiling water of bay leaf ( Eugenia polyantha W ) for reducing Streptococcus sp. colony. Maj Farm Indones. 2009;20(3):112 –7.
6.  Elim  HI,  L.  Mapanawang  A.  Electronics  physical  system  of  large  antioxidant structure  in  herbal  medicine  based  zingiberaceae  fruit:  understanding  and application. Nanotechnol Appl. 2018;1(1):1 –4.
7.  Seaver  FJ.  A  preliminary  study  of  the  genus  lamprospora.  Mycologia. 1914;6(1):5.
8.  Praptiwi,  Jamal  Y,  Wulansari  D,  Fathoni  A,  Palupi  K,  Nurainas,  et  al.  Skrining aktivitas  antioksidan  beberapa  tumbuhan  suku  zingiberaceae.  Pros  SEMNAS Biodiversitas. 2015;4(MAY):188 –92.
9.  Lakhan SE, Ford CT, Tepper D. Zingiberaceae extracts for pain: A systematic review and meta-analysis. Nutr J. 2015;14(1):1 –10.
10.  Harborne JB. Metode fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. Bandung: Penerbit ITB;1987.
11.  Simões  M,  Bennett  RN,  Rosa  EAS.  Understanding  antimicrobial  activities  of phytochemicals against multidrug resistant bacteria and biofilms. Nat Prod Rep. 2009;26(6):746 –57.
12.  Saleem  M,  Nazir  M,  Ali  MS,  Hussain  H,  Lee  YS,  Riaz  N,  et  al.  Antimicrobial natural products: An update on future antibiotic drug candidates. Nat Prod Rep. 2010;27(2):238 –54.
13.  Wang Q, Jin J, Dai N, Han N, Han J, Bao B. Anti-inflammatory effects, nuclear magnetic resonance identification, and high-performance liquid chromatography isolation of the total flavonoids from Artemisia frigida. J Food Drug Anal [Online]. 2016;24(2):385 –91. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jfda.2015.11.004
14.  Pokorny  J,  Yanishlieva  N,  Gordon  M.  Antioxidants  in  food.  Cambridge:
Woodhead Publishing Limited; 2001.
15.  Molyneux P. The Use of the  stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Songklanakarin J Sci Technol. 2004;26(December 2003):211 –9.
16.  Teixeira  J,  Gaspar  A,  Garrido  EM,  Garrido J,  Borges F.  Hydroxycinnamic  acid antioxidants: An electrochemical overview. Biomed Res Int. 2013;1-11.