## OPTIMASI EKSTRAKSI PROTOPORPHYRIN-IX DARI KERABANG TELUR PUYUH ( Coturnix Coturnix L.)
Harry Setiawan 1 , Cucun Alep Riyanto 1 , Dewi K.A.K.Hastuti 1 , dan Yohanes Martono 1,*
1 Program Studi Kimia, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Kristen Satya Wacana Jl. Diponegoro 52-60, Salatiga 50711, Jawa Tengah, Indonesia
* Email: yohanes.martono@staff.uksw.edu
Diterima: 19 Mei 2017. Disetujui: 13 Januari 2018. Dipublikasikan: 31 Januari 2018
Abstract: The textile industry uses a lot of synthetic dyes because it is easy in staining and cheap, but has a bad impact on the environment. Awareness of the importance of protecting the environment makes textile companies try to re-use natural dyes. The quail eggshell has a protoporphyrin IX that can be used as a dye. The optimum conditions of protoporphyrin IX extraction  from  quail  eggshell  need  to  be  studied  more  in  terms  of  solvent  composition, method,  and  extraction  cycle . Quail  eggshell  was  dried  and  then  extracted  using  methanol 96% and HCl (v/v) (HCl (concentrated) and HCl 5%, v/v). The extraction process performed for 30  minutes  by  using  two  methods,  maceration  and  ultrasonic.  Optimization  of  extraction cycle was carried out for up to 5 cycles. The assay protoporphyrin was done using UV-VIS spectroscopy and determined using the Lambert-Beer equation. The extract was fractionated using a chloroform in the ratio 1: 2 v/v (chloroform: extract). The organic phase was scanned using UV – Vis spectroscopy. Quail eggshell extract contained protoporphyrin. It can be seen from  the  spectra  and  has  been  already  matched  with  spectra  protoporphyrin  standard. Optimum conditions of protoporphyrin extraction were obtained by using methanol 96% and HCl (c) 5% (v/v). Extraction was performed using maceration method. Protoporphyrin content in  the  extract  was  1.92 × 10 -2 %  w/w.  Optimum  protoporphyrin  extraction  cycle  was achieved at 3 cycles. Protoporphyrin extract was fractionated with chloroform. Fractionation with  chloroform  caused  structural  changes  into  protoporphyrin  dimethyl  ester  and  made discoloration of extract solution.
Key words: Extraction, quail eggshell, optimization, protoporphyrin
Abstrak: Industri  tekstil  banyak  menggunakan  pewarna  sintetik  karena  mudah  dalam pewarnaan  dan  murah,  tetapi  memiliki  dampak  yang  buruk  bagi  lingkungan  sekitar. Kesadaran  akan  pentingnya  menjaga  lingkungan  membuat  peusahaan  tekstil  mencoba kembali  menggunakan  pewarna  alami.  Kerabang  telur  puyuh  memiliki  protoporphyrin  IX yang  dapat  digunakan  sebagai  pewarna.  Kondisi  optimum  ekstraksi  protoporphyrin IX  dari kerabang  telur  puyuh  perlu  diteliti  lebih  lagi  ditinjau  dari  komposisi  pelarut,  metode,  dan siklus  ekstraksi.  Kerabang  telur  puyuh  dikeringkan  kemudian  diekstraksi  menggunakan pelarut metanol 96% dan HCl  (v/v) (HCl (p) dan HCl 5%, v/v) dengan metode maserasi dan ultrasonik.  Siklus  ekstraksi  dioptimalkan  dengan  variasi  hingga  5  siklus.  Penetapan  kadar
protoporphyrin  dilakukan    dengan  menggunakan  spektroskopi  UV-VIS  berdasarkan persamaan Lambert-Beer. Ekstrak difraksinasi menggunakan klorofom dengan rasio 1 : 2 v/v (klorofom : ekstrak). Fase organik dipindai dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ekstrak  kerabang  telur  puyuh  mengandung protoporphyrin  IX,  terlihat  dari  hasil  spektra  yang  cocok  dengan  spektra  protoporphyrin standard . Kondisi ekstraksi protoporphyrin yang optimum didapatkan dengan menggunakan pelarut  metanol  96%  dan  HCl (p) 5%  (v/v)  secara  maserasi.  Siklus  ekstraksi  protoporphyrin yang optimal adalah 3 siklus dengan kadar protoporphyrin dalam ekstrak adalah 1,92 × 10 -2 % b/b.
Kata Kunci: Ekstraksi, kerabang telur puyuh, optimasi, protoporphyrin

## PENDAHULUAN
Pada  masa  sekarang,  perusahaan tekstil  banyak  menggunakan  pewarna yang berasal dari senyawa sintetik karena mudah dalam pewarnaan serta harga yang murah  (Prabhu  &  Bhute,  2012),  tetapi penggunaan  senyawa  sintetik  dalam industri  tekstil  dapat  menyebabkan pencemaran  lingkungan  sebab  senyawa ini  tidak  dapat  terdegradasi  di  alam (Prabhu et al ., 2011). Selain itu, pewarna sintetis  juga  bersifat  karsinogenik  dan menyebabkan  alergi  (Prabhu  &  Bhute, 2012). Oleh karena itu, perusahaan tekstil mencoba  kembali  untuk  menggunakan zat  pewarna  alami  karena  tingginya tingkat  kesadaran  untuk  menciptakan lingkungan  yang  sehat  (Prabhu et  al .,
2011; Samanta & Agarwal, 2009).
Zat  pewarna  alami  didapatkan  dari bahan  –  bahan  alam  seperti  hasil  ekstrak tumbuhan  atau  hewan  (Kwartiningsih, Setyawardhani,  Wiyanto,  &  Triyono,
2009)  contohnya  adalah  pigmen  dalam kerabang  telur  puyuh.  Kerabang  telur puyuh  belum  banyak  dimanfaatkan padahal  memiliki  pigmen  protoporphyrin IX  (Gosler et  al .,  2006  dalam  Gosler,
Connor,  &  Bonser,  2011)  yang  dapat digunakan  sebagai  pewarna  alami. Protoporphyrin  IX  merupakan  pigmen utama  dalam  telur  yang  berwarna  coklat (Zhao,  Xu,  Liu,  Li,  &  Yang,  2006). Kondisi dalam
mengekstraksi protoporphyrin  IX  perlu  diperhatikan agar  proses  ekstraksi  dapat  dilakukan secara efektif dan efisien.
Pengukuran  protoporphyrin  IX  pada ekstrak  kerabang  telur  puyuh  dapat ditentukan  dengan  pengukuran  panjang gelombang maksimal menggunakan spektroskopi UV – Vis (Mukhriani, 2014) dengan  menggunakan  nilai  absorptivitas molar  ( ɛ )  dari  protoporphyrin  IX  dalam HCl 1,5 M (Hunter, Sampson, & Ferreira, 2008)  dan  distandardisasi  dengan  cara membandingkan kurva absorbansi
panjang  gelombang  maksimum  dengan kurva standard protoporphyrin  IX  dalam metanol - HCl.
Protoporphyrin  IX  dapat  diekstraksi dari  kerabang  telur  ayam  (Dean et  al. , 2011),  kerabang  telur  puyuh  jepang (Duval,  Cassey,  Miksík,  Reynolds,  & Spencer,  2013),  dan    telur  –  telur  dari unggas  yang  lain  (Thomas,  Hauber, Hanley,  Waterhouse,  Fraser,  &  Gordon, 2015).  Pelarut  yang  digunakan  dalam ekstraksi  protoporphyrin  IX  beragam, seperti HCl 2 M dan asetat (Dean, Miller, & Brückner, 2011), metanol H 2 SO 4 8,5%
(Duval et al. , 2013), dan methanol H 2 SO 4 5% (Cassey et al. , 2012). Protoporphyrin IX dimetil ester dapat diidentifikasi lebih lanjut  dengan  melakukan  fraksinasi menggunakan  klorofom.  Setelah  itu, dipindai  dengan  spektrofotometer  UV  –
Vis (Grinsten, 1947).
Ekstraksi protoporphyrin  IX  dengan  menggunakan ultrasonik banyak dilakukan pada sampel bakteri (Wang et al ., 2016), alga (Pasquet et  al. ,  2011),  dan  sel  hewan  (Wang,
Hannafon, Lind, & Ding, 2015).
Pada  penelitian  -  penelitian  tersebut, penelitian  mengenai  kondisi  optimum ekstraksi protoporphyrin
IX dari kerabang  telur  puyuh  Indonesia  yang ditinjau  dari  pelarut  dan  metode  yang digunakan  belum  pernah  dilakukan. Berdasarkan  latar  belakang  tersebut,
maka  perlu  dilakukan  penelitian  untuk memperoleh  ekstrak  protoporphyrin  IX dari  kerabang  telur  puyuh  Indonesia, menstandardisasi  ekstrak  kerabang  telur puyuh  berdasarkan  kandungan  dan spektra protoporphyrin IX, dan menentukan  kondisi  optimum  ekstraksi protoporphyrin IX (metode ekstraksi) dari kerabang telur puyuh.

## METODE

## Alat dan Bahan
Sampel limbah kerabang telur puyuh diperoleh  dari  pedagang  di  Pasar  Projo Ambarawa.  Bahan  yang  digunakan diantaranya  metanol,  HCl,  NaCl,  dan klorofom.  Semua  bahan  yang  digunakan berderajat  PA  ( pro-analysis )  diperoleh dari E-Merck, German.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya
Spektrofotometer (Optizen, 2120), neraca dengan ketelitian 0,01g (Ohaus, TAJ602), neraca  analitis  dengan  ketelitian  0,1  mg (Ohaus,  PA214), moisture  analyzer (Ohaus,  MB  25),  pH  meter  (Hanna  HI
9812),  corong  pisah,  dan  ultrasonikator (Krisbow Ultrasonic  cleaner DSA50- GL 2 -2.5L).
Metoda  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:

## Preparasi Sampel (Kombado, 2014)
Kulit  telur  puyuh  dikeringkan  dalam drying  cabinet selama  24  jam.  Setelah kering sampel dihaluskan dan diayak (20 mesh).

## Ekstraksi  Protoporphyrin  IX  (Wang  et al., 2007)
Lima puluh gram serbuk telur puyuh dimaserasi dalam metanol 96%-HCl  5% (v/v)  (HCl (p) dan  HCl  5%).  Sampel diektraksi  dengan  menggunakan  metode maserasi  dan  ultrasonik.  Maserasi dilakukan secara bertingkat dengan waktu masing-masing selama 30 menit.
Perbandingan  yang  digunakan  antara sampel  dan  pelarut  tiap  waktu  maserasi adalah  1:10  ( ).  Setelah  proses ekstraksi,  ekstrak  dipindai  dengan spektrofotometer  UV-VIS  pada  kisaran panjang  gelombang  200  –  700  nm  untuk menentukan panjang gelombang
maksimal.

## Fraksinasi Protoporphyrin IX (Duval et al., 2013)
Fraksinasi  larutan  ekstrak  dilakukan dengan  menambahkan  kloroform  pada rasio kloroform : fase aqueous = 1:2, v/v. Fase organik diambil dan ditambahkan 10 mL NaCl 10% lalu dikocok dengan kuat, kemudian  fase  organik  dipisahkan.  Fase organik  dipindai  dengan  menggunakan spektrofotometer  UV-VIS  pada  kisaran
panjang  gelombang  200  –  700  nm  untuk menentukan panjang gelombang maksimal. Standardisasi  ekstrak  kerabang  telur puyuh berdasarkan kandungan
protoporphyrin  IX  dilakukan  dengan pemindaian ekstrak kerabang telur puyuh pada  kisaran  panjang  gelombang  200– 700nm.
Kandungan protoporphyrin IX dalam ekstrak  kerabang  telur  puyuh  diukur berdasarkan persamaan 1 berikut:
A 407 = ε b.C ...........................(1)
Keterangan : A 407 : Absorbansi ekstrak pada panjang gelombang 407 nm.
Ε
: absortivitas molar porfirin dalam pelarut 1,5M HCl pada panjang gelombang 407 nm (297.000 L mol -1 cm -1 )
B
: panjang jalan masuk sinar atau lebar kuvet yaitu 1cm C : konsentrasi protoporphyrin IX dalam ekstrak kerabang telur puyuh (L mol -1 )

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Proses  ekstraksi  menjadi  langkah awal  yang  penting.  Penentuan  pelarut, metode, serta siklus pada proses ekstraksi berpengaruh  pada  hasil  serta  konsentrasi dari  senyawa  yang  akan  diisolasi (Mukhriani, 2014).
Ekstraksi
protoporphyrin  menggunakan  metode maserasi  dengan  pelarut  methanol  –  HCl (Kennedy  &  Vevers,  1973).  Penggunaan pelarut  ini  akan  menyebabkan  metilasi pada  kelompok  karboksil  dan  hidrolisis
atau transmetilasi ester atau pembentukan ikatan  glikosida,  selain  itu  dapat menghilangkan  logam  yang  terdapat  di protoporphyrin  seperti  zinc  (Gorchein,
Lim, & Cassey, 2008).

## Pelarut  metanol-HCl  (HCl(p)  dan  HCl
5%)
Spektra hasil pemindaian ekstrak HCl
5%  dan  HCl (p) menunjukkan  hasil  yang sangat  berbeda  ( Gambar  1 ).  Ekstraksi dengan menggunakan metanol – HCl 5% tidak  dapat  mengekstrak  sepenuhnya protoporphyrin  IX  ditunjukkan  dengan tidak adanya titik puncak yang signifikan pada  panjang  gelombang  421  nm
( Gambar 1a. ).
Hal  ini  dikarenakan  hampir  95% komponen  pada  kerabang  telur  puyuh adalah  CaCO 3 (Mann  &  Mann,  2015) sehingga  HCl  habis  bereaksi  dengan CaCO 3 terlebih  dahulu  sebelum  dapat mengekstrak  protoporphyrin  IX.  HCl menjadi  komponen  yang  penting  dalam pengekstrakan yaitu untuk proses demetalisasi  sehingga  protoporphyrin  IX dapat  memutuskan  ikatannya  dengan  ion logam yang ada sehingga dapat terekstrak dalam  bentuk  protoporphyrin  IX  saja (Gorchein, Lim, & Cassey, 2008). Dalam penelitian  ini,  kadar  protoporphyrin  IX yang  terekstrak  dengan  HCl  5%  adalah
1,81  x  10 -5 %  (b/b)  sedangkan
menggunakan HCl (p) terekstrak 1,84 x 10 -
2 % (b/b). (a) (b)
Gambar  1 .  (a)    Spektra  protoporphyrin  IX  pada pelarut  metanol  –  HCl  (HCl  5%)  pada  kisaran panjang  gelombang  200  –  700  nm  dengan  tidak terdapat  panjang  gelombang  maksimum.  (b) Spektra protoporphyrin IX pada pelarut metanol – HCl (HCl (p) ) pada kisaran panjang gelombang 200
– 700 nm dengan panjang gelombang maksimum 421 nm.

## Metode  ekstraksi  secara  maserasi  dan ultrasonik
Spektra protoporphyrin IX dari kedua metode ekstraksi menunjukkan hasil yang berbeda  ( Gambar  2 ).  Spektra  yang memiliki  kesamaan  dengan  spektra protoporphyrin  IX  standard  adalah spektra  yang  menggunakan  metode maserasi  ( Gambar  2a ).  Spektra  dari metode  ultrasonik  menunjukkan  hasil
yang  berbeda  dari  spektra  standard protoporphrin  IX  tetapi  memiliki  nilai panjang  gelombang  yang  sama  dengan protoporphyrin IX ( Gambar 2b ).
(a) (b)
Gambar  2 .  (a)  Spektra  protoporphyrin  IX menggunakan  metode  maserasi  pada  kisaran panjang gelombang 200 – 700 nm dengan panjang gelombang  maksimum  421  nm.  (b)  Spektra protoporphyrin IX menggunakan metode ultrasonik  pada  kisaran  panjang  gelombang  200  – 700  nm  dengan  panjang  gelombang  maksimum 421 nm.
Pada  spektra  ekstrak  protoporphyrin yang diekstraksi secara ultrasonik, hampir terbentuk  puncak  panjang  gelombang yang  lain  dan  mengalami  perubahan bentuk pada bentuk spektranya,
ultrasonik  memberikan  energi  sehingga membuat kromofor pada struktur
protoporphyrin  IX  mengalami  perubahan kompleks  donor  –  aseptor  elektron intramolekular,  perubahan  kompleks kromofor  tak  jenuh  terkonjugasi  dan perubahan dalam disosiasi atau protonasi pada  gugus  karboksil  (Kaiser  &  Berhe, 2014). Hal ini membuat struktur protoporphyrin  IX  terdekomposisi  dan diduga berubah menjadi bentuk isoporphyrin  (Xu et  al., 2015).  Kadar protoporphyrin  IX  yang  didapat  dengan metode  ultrasonik  adalah  1,88  x  10 -2 %
(b/b)  sedangkan  kadar  protoporphyrin yang  didapat  menggunakan  metode maserasi adalah 1,92 x 10 -2 % (b/b).

## Siklus ekstraksi
Siklus yang digunakan adalah 5 kali. Pada setiap siklus tidak terjadi perubahan bentuk spektra, tetapi mengalami penurunan  intensitas  penyerapan  radiasi elektromagnetik  dalam  nilai  absorbansi. Pada  spektra  terjadi  pergeseran  secara hipokromik,  pergeseran  spektra  ini menunjukkan  perubahan  nilai  intensitas yang semakin kecil yang disebabkan oleh perubahan  pelarut  atau  berkurangnya konsentrasi  senyawa  yang  terlarut (Musiam & Alfian, 2017).
Pada siklus pertama didapatkan kadar protoporphyrin  IX  1,84  x  10 -2 %,  pada siklus  kedua  1,82  x  10 -2 %,  pada  siklus
ketiga 1,79 x 10 -2 %, pada siklus keempat
1,72 x 10 -2 % dan pada siklus kelima 1,56 x  10 -2 %.  Penambahan  siklus  ekstraksi
masih dapat dilakukan untuk memaksimalkan pengambilan protoporphyrin  IX  karena  pada  siklus kelima masih banyak terdapat protoporphyrin IX.
Gambar 3 . Spektra 5 siklus ekstraksi protoporphyrin IX pada kisaran panjang gelombang 200 – 700 nm terdapat panjang gelombang maksimum 421nm silklus 1 ( ), siklus 2 ( ), siklus 3 ( ) siklus 4 ( ), siklus 5 (  )

## Fraksinasi kloroform
Pada  proses  fraksinasi  dengan kloroform,  ekstrak  yang  berwarna  biru kehijauan  berubah  menjadi  cokelat. Kedua sampel dipindai dengan menggunakan  spektroskopi  UV  –  Vis untuk  mengetahui  spektranya.  Hasil pemindaian  spektra  ditunjukkan  pada Gambar 4a. dan Gambar 4b.
Pada Gambar  4b .  terlihat  adanya perubahan pola serapan radiasi elektromagnetik  pada  kisaran  panjang gelombang  407  nm,  507  nm,  540  nm, 575  nm,  dan  631  nm.  Perubahan panjang gelombang maksimum dikarenakan  terjadinya  perubahan  pada sisi  kromofor  di  protoporphyrin  IX
(Kaiser & Berhe, 2014).
Gambar  4 .  (a)    Spektra  protoporphyrin  IX  pada fraksi  metanol  HCl  pada  kisaran  panjang gelombang  200  –  700  nm  dengan  panjang gelombang  maksimum  421  nm.  (b)  Spektra protoporphyrin  IX  pada  fraksi  kloroform  pada kisaran  panjang  gelombang  200  –  700  nm dengan  panjang  gelombang  maksimum  407  nm, 507 nm, 540 nm, 575 nm, 631 nm
Perbedaan  warna  yang  diserap menghasilkan  perubahan  pada  panjang
gelombang maksimum sehingga
menyebabkan terjadinya perubahan warna  pada  larutan  ekstrak  (Day  & Underwood, 2002). Pada proses fraksinasi dengan kloroform, protoporphyrin  mengalami  alkoholisis
(gugus  asam  karboksilat)  sehingga menjadi  dimetil  ester  protoporphyrn (Arita,  Dara,  &  Irawan,  2008).  Dimetil ester  protoporphyrin  memiliki  5  panjang gelombang maksimal, yaitu pada 407 nm,
507  nm,  540  nm,  575  nm  dan  631  nm (Grinsten, 1947).

## Stabilitas ekstrak protoporphyrin IX
Setelah  proses  ekstraksi,  diambil salah  satu  sampel  lalu  dilakukan penyimpanan  di  dalam  lemari  pendingin selama  14  hari  untuk  menguji  stabilitas protoporphyrin  IX  yang  sudah  terekstrak tersebut.  Pada  hari  pertama  didapatkan absorbansi pada 411 nm adalah 2,066 dan pada  hari  ke  –  14  didapatkan  nilai absorbansi 411 nm sebesar 2,244.
(a) (b)
Gambar  5. (a)  Spektra  protoporphyrin  IX  pada hari ke – 0 pada kisaran panjang gelombang 200 – 700 nm dengan panjang gelombang maksimum 421 nm. (b) Spektra protoporphyrin IX pada hari ke  –  14  pada  kisaran  panjang  gelombang  200  – 700  nm  dengan  panjang  gelombang  maksimum 421 nm
(a) (b)
Kenaikan  nilai  absorbansi  ini  dapat terjadi  karena  ketika  pengukuran  terjadi penguapan  pelarut  metanol  sehingga menyebabkan protoporphyrin IX menjadi lebih  pekat.  Pola  spektra  ekstrak protoporphyrin  IX  tidak  mengalami perubahan  yang  bermakna  ( Gambar  5 ).
Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa ekstrak  protoporphyrin  IX  stabil  selama 14  hari  pada  penyimpanan  dalam  lemari pendingin.
Menurut  Samiullah,  Roberts,  & Chousalkar (2016),  protoporphyrin  IX dalam  bubuk  kerabang  telur  segar  dan pada  kerabang  telur  yang  telah  disimpan dalam  kondisi  dingin  (20  –  25 ° C)  diatas 6-7  tahun  tidak  mengalami  perubahan sama  sekali,  tetapi  ketika  umur penyimpanan  kerabang  telur  mencapai kurang lebih 150 tahun, akan mengalami degradasi  warna  yang  disebabkan  oleh infeksi  jamur  pada  kerabang  telur  dan terjadi reaksi dengan senyawa kimia pada tempat  penyimpanan  tersebut  (Cassey, Maurer,  Duval,  Ewen,  &  Hauber , 2010).
Namun  demikian,  tingkat  kestabilan
protoporphyrin IX pada ekstrak kerabang telur puyuh perlu diteliti lebih lagi untuk menentukan  tingkat  kestabilan  terbaik dari protoporphyrin IX tersebut.

## KESIMPULAN
Protoporphyrin  IX  dapat  diekstraksi dari  kerabang  telur  puyuh  dengan  kadar mencapai  1,92 × 10 -2 %  (b/b).  Kondisi optimum  untuk  melakukan  ekstraksi protoporphyrin  IX  dari  kerabang  telur puyuh  adalah  menggunakan  pelarut metanol-HCl  5  %  v/v  (HCl (p) )  dengan metode  maserasi.  Penelitian  lebih  lanjut dapat dilakukan untuk aplikasi protoporphyrin  IX  sebagai  pewarna tekstil.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih kepada  Kemenristek  DIKTI  melalui pembiayaan  Penelitian  Dosen  Pemula tahun  2017  dengan  nomor  kontrak 058/SPK-PDP/PRV/4/2017  yang  telah membantu pembiayaan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Arita, S., Dara, M. B., & Irawan, J. 2008,
Pembuatan  metil  ester  asam  lemak dari  CPO  off  grade  dengan  metode esterifikasi-transesterifikasi, Jurnal Teknik  Kimia ,  vol.  15,  no.2,  hh.  34-
43.
Cassey, P., Maurer, G., Duval, C., Ewen,
J. G., & Hauber, M. E.. 2010, Impact
of  time  since  collection  on  avian eggshell  color:  a  comparison  of museum  and  fresh  egg  specimens. Behavioral Ecology and Sociobiology ,  vol.  64,  no.10,  hh. 1711-1720.  http://dx.doi.org/10.1007
/s00265- 010-1027-8
Cassey,  P.,  Thomas,  G.  H.,  Portugal,  S.
J., Maurer, G., Hauber, M. E., Grim,
T., Lovell, P. G., & Mik š ík, I. 2012,
Why  are  birds’  eggs  colorful? Eggshell  pigments  co-vary  with  life- history  and  nesting  ecology  among British  breeding  non-passerine  birds.
Biological  Journal  of  the  Linnean Society ,  vol.  106,  no.3,  hh.  657-672. http://dx.doi.org/10.1111/j.1095- 8312.2012.01877.x
Day, R. A. Jr & Underwood, A. L. 2002,
Spektrofotometri. In H. Wibi H., S.T.
&  L.  Simarmata,  S.  T.  (Eds.), Analisis  Kimia  Kuantitatif .  Edisi
Keenam  (hh.  382-421).  Jakarta:
Penerbit Erlangga.
Dean,  M.  L.,  Miller,  T.  A,  &  Brückner,
C.  2011,  Egg-citing!  Isolation  of protoporphyrin  IX  from  brown eggshells and its detection by optical spectroscopy and chemiluminescence. Journal of Chemical  Education ,  vol.  88,  no.6, hh. 788 – 792. http://dx.doi.org/10.1021/ed100093h
Duval,  C.,  Cassey,  P.,  Miksík,  I.,
Reynolds,  S.  J.,  &  Spencer,  K.  A.
2013, Condition-dependent strategies of eggshell pigmentation: an experimental study of Japanese quail (Coturnix  coturnix  japonica), The Journal  of  Experimental  Biology , vol. 216, hh. 700 – 708.
http://dx.doi.org/10.1242/jeb.077370
Gorchein,  A.,  Lim,  C.  K.,  &  Cassey,  P.
2008,  Extraction  and  Analysis  of Colorful  Eggshell  Pigments  Using
HPLC and HPLC/Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Biomedical Chromatography ,  vol.  23,  no.6,  hh.
602-606.
http://dx.doi.org/10.1002/bmc.1158
Gosler,  A.  G.,  Connor,  O.  R.  &  Bonser,
R.  H.  C.  2011,  Proptoporphyrin  and Eggshell Strength: Preliminary Findings  from  A  Passerine  Bird. Avian Biology Research , vol. 4, no.4, hh. 214-223. https://dx.doi.org/10.3184/17581551 1X13207833399666 Grinsten, M. 1947, Studies of Protoporphyrin  :  VII.  A  Simple  and Improved Method for The Preparation  of  Pure  Protoporphyrin from  Hemoglobin. Journal  of
Biological  Chemistry ,  vol.  167,  hh.
515-519.
Hunter,  G.  A.  Sampson,  M.  P.,  &
Ferreira,  G.  C.  2008,  Metal  Ion Substrate Inhibition of Ferrochelatase. The  Journal  of Biological  Chemistry ,  vol.  283, no.35, hh. 23685-23691. https://dx.doi.org/10.1074/jbc.M8033 72200
Kaiser,  M.,  &  Berhe,  A.  A.  2014,  How does  sonication  affect  the  mineral and  organic  constituents  of  soil aggregates?. Journal  of  Plant
Nutrition  and  Soil  Science ,  vol.  000, hh. 1-17. http://dx.doi.org/10.1002/jpln.201300
339
Kennedy,  G.  Y.  &  Verves,  H.  G.  1973,
Eggshell  pigments  of  the  Araucano fowl. Comparative Biochemistry and
Physiology  Part  B:  Comporative.
Biochemistry ,  vol.  44,  hh.  11-25. http://doi.org/10.1016/0305- 0491(73)90336-2 Kombado, A. R. 2014 , Limbah Kerabang Telur  Puyuh  (Cortunix  cortunix japonica)  sebagai  Pewarna  Alami Kain  Batik  (Pengaruh  Jenis  Fiksatif terhadap  Ketuaan  dan  Ketahanan Luntur.  Ditelaah  dengan  Metode Pengolahan  Citra  Digital  RGB) . Skripsi. Salatiga: Universitas Kristen Satya Wacana.
Kwartiningsih, E., Setyawardhani, D. A.,
Wiyatno, A. & Triyono, A. 2009, Zat Warna Alami Tekstil dari Kulit Buah Manggis. Ekuilibrium ,  vol.  8,  no.1, hh. 41-47.
Mann,  K.  &  Mann,  M.  2015,  Proteomic analysis  of  quail  calcified  eggshell matrix: a comparison to chicken and turkey eggshell proteomes. Proteome Science, hh. 13-22. https://dx.doi.org/10.1186/s12953- 015-0078-1 Mukhriani, T. 2014, Ekstraksi,
Pemisahan Senyawa, dan Identifikasi
Senyawa  Aktif. Jurnal  Kesehatan , vol. 7, no.2, hh. 361-367.
Musiam, S., & Alfian, R. 2017, Validasi Metode  Spektrofotometri  IV  pada Penetapan  Kadar  Asam  Mefenamat dalam  Sediaan  Tablet  Generik. Jurnal Ilmiah Ibnu Sina , vol. 2, no.1,
hh. 31-43.
Pasquet,  V.,  Chérouvrier,  J.  R.,  Farhat,
F., Thiéry, V., Piot, J. M., Bérard, J.
P.,  Kaas,  R.,  Serive,  B.,  Patrice,  T., Cadoret,  J.  P.,  &  Picot,  L.  2011, Study  on  the  microalgal  pigments extraction  process:  Performance  of microwave assisted extraction. Process  Biochemistry ,  vol.  46,  no.1, hh. 59-67. https://doi.org/10.1016/j.procbio.201 0.07.009
Prabhu, K. H., & Teli, M. D. 2011, Eco- dyeing  using  Tamarindus  indica  L. seed coat tannin as a natural mordant for textiles with antibacterial activiry.
Journal  of  Saudi  Chemical  Society ,
vol. 18, no.6, hh. 864-872. https://doi.org/10.1016/j.jscs.2011.10
.014
Prabhu,  K.  H.,  &  Bhute,  A.  S.  2012,
Plant  based  natural  dyes  and mordants  :  A  Review. Journal  of Natural Product and Plant Resource .,  vol.  2,  no.6,  hh.  649  –
664.
Samiullah,  S.,  Roberts,  J.  &  Chousalkar, K.  2016,  Infectious  bronchitis  virus and  brown  shell  colour:  Australian strains  of  infectious  bronchitis  virus affect  brown  eggshell  colour  in commercial  laying  hens  differently.
Avian  Pathology ,  vol.  45,  no.6,  hh.
552-558.
http://dx.doi.org/10.1080/03079457.2 016.1184744
Samanta,  A.  K.,  &  Agarwal,  P.  2009,
Application  of  Natural  Dyes  on Textiles. Indian  Journal  of  Fibre  & Textile  Research ,  vol.  34,  hh.  384-
399.
Thomas,  D.  B.,  Hauber,  M.  E.,  Hanley, G., Waterhouse, G. I. N., Fraser, S. &
Gordon, K. C. 2015, Analysing avian
eggshell  pigments  with  Raman
spectroscopy. The Journal of Experimental  Biology ,  vol.  218,  hh. 2670-2674.
https://dx.doi.org/10.1242/jeb.12491
7
Wang,  S.,  Hannafon,  B.  N.,  Lind,  S.  E.,
&  Ding,  W.  Q.  2015,  Zinc protoporphyrin suppresses beta- catenin  protein  expression  in  human cancer cells: the potential involvement  of  lysosome-mediated degradation. PLoS One , https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0127413
Wang,  Y.,  Wu,  X.,  Chen,  J.,  Amin,  R.,
Lu,  M.,  Bhayana,  B.,  Zhao,  J., Murray,  C.  K.,  Hamblin,  M.  R., Hooper,  D.  C.,  &  Dai,  T.  2016, Antimicrobial  blue  light  inactivation of  gram-negative  pathogens  in biofilm: In vitro and in vivo studies. The  Journal  of  Infectious  Diseases , vol.  213,  no9,  hh.  1380-1387. https://doi.org/10.1093/infdis/jiw070
Wang, X. T.,  Deng, X. M.,  Zhao, C. J.,
Li, J. Y.,  Xu, G. Y.,  Lian, L. S. &
Wu,  C.  X.  2007,  Study  of  the deposition  process  of  eggshell pigments using an improved dissolution  method. Poultry  Science, vol.  86,  no.10,  hh.  2236–2238. https://doi.org/10.1093/ps/86.10.2236
Xu,  H.,  Sun,  X.,  Yao,  J.,  Zhang,  J., Zhang, Y., Chen, H., Dan, J., Tian, Z.
& Tian, Y. 2015, The decomposition of protoporphyrin IX by ultrasound is dependent  on  the  generation  of
hydroxyl radicals. Ultrasonics
Sonochemistry, vol  27,  hh.  623-630.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ultsonch.2 015.04.024
Zhao, R, Xu, G. Y.,  Liu, Z. Z.,  Li, J. Y.
&  Yang,  N.  2006,  A  Study  on Eggshell  Pigmentation:  Biliverdin  in
Blue-Shelled Chickens. Poultry Science, vol.  85,  no.3,  hh.  546-549.
https://doi.org/10.1093/ps/85.3.5.