## PENGARUH pH DAN WAKTU FERMENTASI UNTUK MENGHASILKAN ENZIM AMILOGLUKOSIDASE DARI Aspergillus niger

## Fatmawati Nur
Jurusan Biologi UIN Alauddin Makassar E-mail: fatenurkhalik@yahoo.com
Abstract: This study is aimed to know the ability of Aspergillus niger in producing amyloglucosidase enzyme through fermentation technology by exploiting marquisa waste's peel and coated seed under the condition of variation pH and fermentation time.  Design  used  is  Randomized  Complete  Block  along  with  the  respective variation  of  pH  is  pH  4.0, 4.5,  5.0,  and 5.5,  through fermentation  time is 3,  4,  5 , and  6  x  24  hours,  duplo,  which  is  analyzed  with  F  test,  then  tested  with  Least Significant  Difference  (LSD).  The  result  of  study  shows  the  highest  glucose concentration  representing  job  of  amyloglucosidase  enzyme  at  coated  seed substract is fermentation time 5 x 24 hours pH 4.5 which amounts 51.964 µg/ml.
Keywords: Amyloglucosidase enzyme, Fermentation time, Marquisa waste, pH

## PENDAHULUAN
etiap kegiatan industri senantiasa berkaitan dengan berbagai transaksi, aktivitas lain, dan memberikan  pengaruh  terhadap  lingkungan.  Industri  merupakan integrasi  seluruh  proses fisika kimia yang mentransformasikan bahan baku, energi, dan tenaga kerja menjadi produk dan limbah. Limbah industri merupakan suatu produk industri yang belum memiliki nilai ekonomi dan biasanya terbuang percuma ke lingkungan.
Di Sulawesi Selatan, salah satu industri yang berkembang dengan baik adalah industri sari buah markisa yang ditopang oleh keberadaan perkebunan  markisa baik dari  jenis  markisa ungu  ( Passiflora  edulis )  maupun  markisa  kuning/konyal  ( Passiflora  ligularis )    dari daerah-daerah  produsen  utama:  Gowa,  Tana  Toraja,  Sinjai    dan    Bantaeng    (Studi Suplai  Industri  Markisa  Di  Sulawesi  Selatan,  2009).  Industri  ini  memproduksi  sirup markisa  untuk  konsumsi  domestik  bahkan  dieksport  ke  beberapa  negara.  Untuk  kepentingan produksi dibutuhkan buah markisa dalam jumlah yang sangat besar setiap bulannya.
Limbah  markisa  yang  berupa  kulit,  biji,  dan  selaput  biji  dalam  jumlah  yang  sangat  besar setiap  hari  dibuang  pada  suatu  tempat  terbuka  dan  bertumpuk,  bahkan  ada  yang  terbuang  ke perairan.  Hal  ini  menyebabkan  lingkungan  tercemar  dan  menjadi  masalah  pokok  dalam kehidupan.  Limbah  ini  dapat  menjadi  sumber  penyakit  dan  menimbulkan  bau  yang  tidak  sedap bagi lingkungan sekitarnya karena pada kulit markisa yang terbuang terdapat selaput pembungkus biji yang sangat gampang ditumbuhi oleh mikroorganisme pembusuk.
Walaupun  demikian,  limbah  markisa  seyogyanya  dapat  dianggap  sebagai  sumber  daya tambahan  yang  dapat  dimanfaatkan,  termasuk  dijadikan  medium  fermentasi  mikroorganisme mengingat  buangan  limbah  industri  ini  masih  mengandung  bahan  organik  dan  nutrien  utamanya polisakarida/BETN  (Bahan  Ekstrak  Tanpa  Nitrogen).  Kulit buah markisa mengandung BETN
S
18 _ Jurnal Teknosains, Volume 13, Nomor 1, Januari-Juni 2019 , hlm. 17 – 26
49.60%,  biji  markisa  yang  berwarna  hitam  mengandung  BETN  18.87%,  dan  selaput pembungkus biji yang berwarna kuning mengandung BETN 49.90% (Djarre, 1994).
Molekul-molekul  sederhana  seperti  gula  dan  komponen  lain  yang  larut  di  sekelilingnya dapat  langsung  digunakan.  Molekul-molekul  lain  yang  lebih  kompleks  seperti  Bahan  Ekstrak Tanpa Nitrogen (polisakarida) sebagai sumber karbon yang masih terdapat di dalam substrat harus dipecah  dahulu  sebelum  diserap  ke  dalam  sel  (Hardjo,  Indrasti,  dan  Bantacut,  1989).  Untuk memecahkan  molekul  besar  menjadi  sederhana,  mikroorganisme  mengeluarkan  enzim  tertentu ke  lingkungannya  sesuai  dengan  jenis  zat  yang  akan  diuraikan.  Enzim  yang  dikeluarkan  oleh mikroorganisme ke lingkungan, lazim disebut enzim ekstraselluler (Smith, 1993).
Salah  satu  enzim  ekstraselluler  yang  dapat  memecahkan  senyawa  kompleks  polisakarida adalah  enzim  amiloglukosidase  yang  sangat  penting  digunakan  dalam  bidang  produksi alkohol,  roti,  juice,  dan  pati  (Rahman,  1992).  Mikroorganisme  yang  dapat  menghasilkan enzim  ini  telah  diujikan  melalui  penelitian  dengan  proses  isolasi  dan  penapisan  jamur penghasil amiloglukosidase dari limbah tapioka. Didapatkan bahwa isolat terbaik adalah Aspergillus  oryzae,  Aspergillus  sydowi ,  dan Aspergillus  niger .  Produksi  glukosa tertinggi  dihasilkan  oleh  ubi  jalar  yang  diinokulasi  dengan  ekstrak  kasar  enzim  dari Aspergillus niger (Indriani, 2008).
Melihat  potensi  limbah  dan  mikroorganisme seperti  tersebut  di  atas , maka  penggunaan limbah  markisa  sebagai  medium  fermentasi  oleh Aspergillus  niger untuk  menghasilkan  enzim amiloglukosidase selain mengurangi jumlah limbah markisa dalam upaya mengatasi  pencemaran lingkungan, juga dapat memberikan sumbangan informasi untuk industri mikrobial.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  potensi  kandungan  nutrien  dalam limbah markisa dan bagian buah markisa yang paling bagus dimanfaatkan oleh Aspergillus niger sebagai medium fermentasi untuk menghasilkan enzim amiloglukosidase.

## Limbah Markisa
Buah  markisa  (siuh)  termasuk  buah  buni  (bacca),  adalah  buah  dengan  dua  lapisan,  yaitu lapisan luar yang tipis agak menjangat atau kaku, dan lapisan dalam yang tebal, lunak dan berair. Biji-biji  terdapat  bebas  dalam  bagian  yang  lunak.  Buah  yang  tidak  begitu  tebal  kulit  buahnya seringkali mempunyai sifat agak kaku seperti kulit, tidak lunak, dan tidak berdaging, biji bebas di dalam, yang dimakan adalah selaput biji (arillus) (Popenoe, 1974).
Kulit  buahnya  tipis, liat. Bagian dalam  diliputi lapisan (endocarp) yang  putih  warnanya. Data  penelitian  menunjukkan  bahwa  buah  markisa  terdiri  atas  kulit  51%  dan  isi  49% yang  terbagi  atas  biji  20.2%  dan  sari  buah  28.8%  (Syamsu,  2009).  Biji  banyak,  hitam warnanya,  dilapisi  dengan  selaput  (arillus)  yang  asam  manis  rasanya  dan  harum  semerbak baunya,  mengandung  12%  protein,  18%  gula,  vitamin  A,  vitamin  B1,  dan  vitamin  C,  sehingga banyak diproduksi menjadi sirup, soda, jelly, dan selei (Wood and Sinnluh, 1986).
Bahan  buangan  berupa  kulit,  biji,  dan  selaput  yang  masih  mengandung  air,  protein, lemak,  serat,  karbohidrat,  serta mineral, telah  diusahakan pengolahannya.  Kulit  buah  markisa kering  yang  memiliki  kandungan  gizi  bahan  kering  88.38%  dengan  protein  kasar 8.43%,  NDF  55.95%,  ADF  37.98%  dan  hemiselulosa  17.97%  diolah  menjadi  makanan ternak  (Syamsu,  2009),  sedangkan  endocarp  yang  mengandung  pektin  dapat  dijadikan  bahan untuk jelly (Rismunandar, 1986).
Kulit  buah  markisa  mengandung  air  17.09%,  protein  6.98%,  lemak  1.25%,  serat 34.78%,  Bahan  Ekstrak  Tanpa  Nitrogen  49.60%,  abu  7.39%,  Ca  0.12%,  dan  P  0.88%  .  Biji markisa  yang  berwarna  hitam  mengandung  air  9.15%,  protein  9.18%,  lemak  23.96%,  serat 46.34%, Bahan Ekstrak Tanpa Nitrogen 18.87%, abu 1.65%, Ca 0.08%, dan P 2.56%. Selaput pembungkus  biji  yang  berwarna  kuning  mengandung  air  10.36%,  protein  17.35%,  lemak
Fatmawati Nur, Pengaruh pH dan Waktu Fermentasi untuk Menghasilkan Enzim… _ 19
10.08%,  serat  18.77%,  Bahan  EkstrakTanpa  Nitrogen  49.90%,  abu  3.90%,  Ca  0.14%,  dan  P 3.07% (Djarre, 1994).

## Aspergilllus niger
Aspergillus  terdapat  dimana-mana,  baik  di  daerah  kutub  maupun  daerah  tropik,  dan hampir pada semua substrat. Disamping adanya species yang patogen, ada pula species yang dimanfaatkan  oleh  manusia  dalam  perindustrian.  Aspergillus  banyak  digunakan  dalam  studi tentang  enzimologi,  biokimia,  pembuatan  asam  sitrat,  asam  glukonat,  dan  beberapa  asam organik lainnya (Dwijosepoetro, 1978).
Aspergillus  niger merupakan  salah  satu  spesies  yang  paling  umum  dan  mudah diidentifikasi  dari  genus Aspergillus ,  famili Moniliaceae ,  ordo Monoliales dan  kelas Fungi imperfecti . Aspergillus niger dapat tumbuh dengan cepat, diantaranya digunakan secara  komersial  dalam  produksi  asam  sitrat,  asam  glukonat  dan  pembuatan  berapa enzim  seperti  amilase,  pektinase,  amiloglukosidase  dan  sellulase  ( Aspergillus  niger, 2007).
Mengenai  morfologinya,  bahwa  ciri  khas  yang  dimiliki  kapang  ini  ialah  cara bagaimana  konidia  terbentuk,  sedang  untuk  membedakan  species  yang  satu  dengan  yang lainnya  digunakan  terutama  kriteria  warna  (Dwijosepoetro,  1978). Miselium  Aspergillus terdiri  atas  hifa  bersekat-sekat,  berinti  banyak.  Pembentukan  konidia  dimulai  dari  ujung- ujung  hifa  yang  tumbuh  menegak.  Pada  pangkal  hifa  terdapat  suatu  alas  yang  disebut  sel kaki. Pada suatu waktu ujung dari hifa yang menegak ini menggelembung merupakan vesikel. Pada  permukaan  vesikel  tumbuh  tubuh  buah  berupa  botol  yang  umumnya  menghasilkan konidia.  Pembentukan  konidia  dimulai  dari  ujung,    jadi    konidia    yang    paling  tua  ialah konidia  yang paling  ujung. Sel-sel  penghasil  konidia disebut sterigma. Bagian hifa di bagian bawah vesikel sampai ke kaki disebut konidiophora (Dwijosepoetro, 1978).
Aspergillus niger memiliki bulu dasar berwarna putih atau kuning dengan lapisan konidiospora  tebal  berwarna  coklat  gelap  sampai  hitam.  Kepala  konidia  berwarna hitam,  bulat,  cenderung  memisah  menjadi  bagian-bagian  yang  lebih  longgar  dengan bertambahnya  umur.  Konidiospora  memiliki  dinding  yang  halus,  hialin  tetapi  juga berwarna coklat ( Aspergillus niger, 2007).
Kenampakan  konidiophora  berupa  panjang  pendek,  besar  kecil,  serta  halus  kasarnya, menjadi  kriteria  dalam  pembedaan  species.  Begitu  pula  halnya  keragaman  konidia  terutama dalam  hal  warna  dan  ukuran.  Konidia  berbentuk  bulat  dapat  ditemukan  pada Aspergillus niger, hemisperikel  pada Aspergillus  tricola, elips  pada Aspergillus  elevatus, dan  bentuk kolumnar pada Aspergillus flavus (Prescott, 1959).
Seperti  halnya  mikroorganisme  yang  lain, Aspergillus  niger memiliki  kurva pertumbuhan  dengan  tiga  fase  yang  berbeda,  yakni  masing-masing  fase  awal  (lag  phase), fase  eksponensial  (log  phase),  dan  fase  stasioner.  Fase  awal  adalah  sejak  inolukasi  sel  pada medium  dan  merupakan  periode  adaptasi.  Selama  fase  ini  massa  sel  dapat  berubah  tanpa adanya  suatu  perubahan  jumlah  sel.  Fase  logaritmik/fase  ekponensial  dicirikan  oleh  suatu garis  lurus  antara  Ln  X  melawan  waktu.  Periode  ini  adalah  keadaan  pertumbuhan  yang seimbang atau mantap, dengan laju pertumbuhan spesifik, konstan. Fase stasioner terjadi bila seluruh  sel berhenti  membagi  diri  atau  bilamana  sel-sel  hidup  telah  mencapai  keseimbangan dengan  sel-sel  mati,  yakni  dengan  kecepatan  kematian.  Meskipun  pertumbuhan  telah  terhenti, metabolisme  dan  akumulasi  produk  masih  terjadi.  Massa  sel  total  dapat  tetap  konstan,  tetapi jumlah  sel  hidup  cenderung  menurun.  Pada  saat  ketahanan  hidup  menurun,  lisis  mungkin  terjadi dan massa sel akan menurun (Sa’id, 1987).
20 _ Jurnal Teknosains, Volume 13, Nomor 1, Januari-Juni 2019 , hlm. 17 – 26

## Enzim Amiloglukosidase
Enzim  ialah  senyawa  protein  yang  disintesiskan  di  dalam  sel  secara  biokimiawi. Enzim  berperan  sebagai  katalisator  pada  reaksi  kimia  yang  berlangsung  dalam    organisme, memiliki  sifat dan spesifikasi tertentu (Gaman and Sherrington,  1992). Komponen enzim dapat berupa protein murni atau gabungan antara protein dengan gugus kimiawi lainnya. Bagian enzim yang terdiri dari protein bersifat termolabil (tidak tahan panas) diberi nama apoenzim. Sedangkan bagian  lain  yang  bukan  protein  bersifat  termostabil  (tahan  panas)  diberi  nama  gugus  prostetik (bagian  yang  aktif).  Apoenzim  dengan  gugus  prostetik  merupakan  satu  kesatuan  yang  disebut holoenzim (Kertesz and Collogen, 1976).
Bagian  gugus  prostetik  terdiri  dari  molekul  organik  yang  berat  molekulnya  lebih  rendah daripada  apoenzim,  dinamakan  koenzim.  Beberapa  enzim  mengandung  vitamin  sebagai pelengkap. Tetapi dalam beberapa hal, bagian gugus prostetik suatu enzim berupa logam untuk menjadi  teraktivasi.  Ion-ion  itu  dianggap  sebagai  koenzim  anorganik  (kofaktor),  dan  keduanya dibutuhkan untuk membuat suatu enzim menjadi aktif (Pelczar dan Chan, 2006).
Beberapa  karakteristik  enzim  yaitu,  setiap  reaksi  metabolisme  di  dalam  sel maupun  di  luar  sel  akan  berperan  enzim-enzim  tertentu  dan  spesifik.  Artinya,  enzim bersifat  spesifik  dalam  melaksanakan  fungsinya,  enzim  dapat  digunakan  berulang- ulang.  Kerja setiap enzim  spesifik pada kisaran  suhu tertentu (tidak  bekerja pada suhu ekstrim) dan pH tertentu. Maka kerja enzim dipengaruhi oleh suhu dan pH. Kerja enzim juga dipengaruhi oleh substratnya (Apa dan Bagaimana: Tentang Enzim, 2009).
Enzim  merupakan  biokatalis  yaitu  senyawa  yang  diproduksi  oleh  organisme. Secara garis besar sumber enzim dapat digolongkan menjadi tiga, yaitu hewan, tanaman dan  mikroorganisme.  Namun  saat  ini,  enzim  yang  diproduksi  dalam  skala  industri sebagian  besar  diperoleh  dari  mikroorganisme  (Apa  dan  Bagaimana:  Tentang  Enzim, 2009).  Dari sumber tumbuhan dan hewan mungkin timbul banyak persoalan, yakni untuk enzim yang berasal dari tumbuhan, persoalan yang timbul adalah variasi musim, konsentrasi rendah dan biaya  proses  yang  tinggi.  Sedangkan  yang  diperoleh  dari  hasil  samping  industri  daging  mungkin persediaan enzimnya terbatas dan ada persaingan dengan pemanfaatan lain (Smith, 1993). Selain itu, jaringan tanaman maupun hewan mengandung bahan  yang kemungkinan berbahaya seperti  senyawa  fenolik  (pada  tanaman),  inhibitor  enzim  dan  protase  (Apa  dan Bagaimana: Tentang Enzim, 2009).
Oleh  karena  itu  peningkatan  sumber  enzim  sedang  dilakukan  yaitu  mikroorganisme penghasil enzim yang sudah dikenal atau penghasil enzim baru lainnya, dengan cara membiakkan mikroorganisme  penghasil  enzim  yang  dikehendaki  pada  medium  tertentu  kemudian  diekstraksi dan  akhirnya  dimurnikan.  Sebagai  sumber  enzim,  mikroorganisme  memiliki  beberapa kelebihan  jika  dibandingkan  dengan  hewan  maupun  tanaman,  yaitu  :  produksi  enzim pada  mikroorganisme  lebih  murah,  kandungan  enzim  dapat  diprediksi  dan  dikontrol, pasokan  bahan  baku  terjamin,  dengan  komposisi  konstan  dan  mudah  dikelola.  Selain itu,  enzim  mikroorganisme  ada  yang  disekresikan  ke  luar  sel  sehingga  memudahkan proses  isolasi  dan  pemurniannya  (Smith,  1993).  Setidaknya  ada  3  keuntungan  yang berkaitan dengan enzim ekstra sel : pertama, tidak memerlukan proses penghancuran sel saat  memanen  enzim  (proses  penghancuran  sel  tidak  selalu  mudah  dilakukan  dalam skala  besar).  Kedua,  enzim  protein  yang  disekresikan  keluar  sel  umumnya  terbatas jenisnya. Ini berarti enzim ekstrim sel terhindar dari kontaminasi berbagai jenis protein. Ketiga,  secara  alami  enzim  disekresikan  keluar  sel  umumnya  lebih  tahan  terhadap proses denaturasi (Apa dan Bagaimana: Tentang Enzim, 2009).
Fatmawati Nur, Pengaruh pH dan Waktu Fermentasi untuk Menghasilkan Enzim… _ 21

## Faktor-faktor Penting untuk Produksi Enzim
Untuk  keberhasilan  sebuah  proses  fermentasi,  ada  beberapa  faktor  penting  yang  harus diperhatikan untuk fermentasi enzim sebagai berikut (Sa’id, 1987) :
1. Seleksi Strain
Pada  saat  merancang  fermentasi  enzim,  hal  yang  penting  untuk  dikerjakan  adalah menggunakan  strain  mikroorganisme  yang  paling  aktif  yang  tersedia.  Jika  strain  tidak tersedia,  maka  harus  dilakukan  seleksi  strain  dengan  mengambil  kultur  dari  alam  atau  dari koleksi kultur dan melakukan pengujian-pengujian aktivitas enzim.
Mikroorganisme adalah kunci keberhasilan atau kegagalan suatu fermentasi. Oleh karena itu  mikroorganisme  yang  digunakan  harus memiliki  keunggulan  yang  diperlukan  untuk keberhasilan  suatu  proses  fermentasi.  Ciri-ciri  di  bawah  ini  perlu  dimiliki  oleh  strain mikroorganisme yang superior, yaitu :
- Strain  sel  tersebut  harus  merupakan  kultur  yang  murni,  bukan  hanya  bebas  dari mikroorganisme-mikroorganisme lain, tetapi juga harus bebas dari faga.
- Secara genetik, strain tersebut harus stabil.
- Strain tersebut harus siap dapat memproduksi berbagai sel vegetatif, spora, atau unit-unit reproduktif  lainnya.  Khusus  untuk  kasus Basidiomycetes, karena  hanya  menghasilkan miselium, maka jarang digunakan dalam industri fermentasi.
- Strain  tersebut  harus  mampu  tumbuh  dengan  cepat  dan  kuat  sesaat  seteiah  diinokulasi pada  tangki  pembibitan,  atau  wadah  lain  yang  digunakan  untuk  mempersiapkan  suatu industri fermentasi.
- Strain  tersebut  harus  dapat  menghasilkan  produk  yang  diinginkan  dalam  jangka  waktu yang pendek.
- Jika  memungkinkan,  strain  tersebut  hendaknya  mampu  melindungi  dirinya  sendiri  dari kontaminasi.  Cara  melindungi  dirinya  sendiri  dapat  berupa  penurunan  pH,  mampu tumbuh  pada  suhu  tinggi,  atau  mampu  dengan  cepat  menghasilkan  suatu  inhibitor mikrobial yang diinginkan.
- Strain tersebut harus mampu disimpan untuk jangka waktu yang lama sekali.
- Strain  tersebut  hendaknya  mampu  memproduksi  produk  yang  diinginkan,  tanpa menghasilkan  produk  lain  yang  bersifat  beracun  (senyawaan  beracun).  Produk  yang diinginkan  tersebut  harus  dapat  dengan  mudah  dipisahkan  dari  senyawaan-senyawaan atau bahan-bahan lainnya.
- Strain  tersebut  hendaknya  mudah  menerima  perubahan  oleh  bahan-bahan  mutagenik tertentu. Program mutasi dapat dilakukan dengan tujuan   untuk   mengembangkan   strain tersebut   sehingga   mampu meningkatkan prdoduksinya.
2. Perbaikan Fermentasi
Bilamana  sebuah  strain  mikroorganisme  yang  baik  telah  diperoleh,  paramater-parameter fermentasi  harus  diatur  sampai  titik  optimum  untuk  memaksimumkan  pertumbuhan  dan produksi enzim. Diantara parameter yang penting adalah suhu, pH, dan transfer oksigen. Hal penting  lainnya  adalah  nutrien  untuk  mikroorganisme,  khususnya  senyawaan  yang mengandung karbon, nitrogen, fosfor, sulfur dan garam-garam mineral.
Seringkali penambahan surfaktan (senyawa aktif permukaan) diperlukan, khususnya bila enzim  yang  diproduksi  adalah  enzim-enzim ekstraselluler.  Surfaktan-surfaktan non ionik umumnya  lebih  disukai  dari  senyawaan  amoniak  atau  kationik  yang  dapat  menyebabkan keracunan pada mikroorganisme.
3. Pengenalan puncak siklus pertumbuhan
Bilamana  fermentasi  dilaksanakan  dengan  sistem  kultur  batch,  urutan-urutan  siklus pertumbuhan  yang  mengandung  konsentrasi  enzim  yang  tinggi  haruslah  diketahui.  Pada
22 _ Jurnal Teknosains, Volume 13, Nomor 1, Januari-Juni 2019 , hlm. 17 – 26
beberapa  kasus,  produksi  enzim  dengan  cepat  menghilang  setelah  mencapai  aktivitas puncaknya.  Di  lain  pihak,  sebuah  kemostat  dapat  lebih  berguna  untuk  prcduksi  enzim, karena  beberapa  pembentukan  enzim  dapat  dikontrol  kecepatan  pertumbuhannya,  yang dapat dijaga konstan pada kultur sinambung.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  dilakukan  dalam  beberapa  tahapan  yang  tujuannya  mengarah  kepada potensi  limbah  yang  berupa  kulit  dan  selaput  biji  markisa  sebagai  medium  fermentasi Aspergillus  niger sehingga  menghasilkan  enzim  amiloglukosidase  dengan  perlakuan kombinasi pH dan waktu fermentasi yang bervariasi. Urutan tahapan penelitian sebagai berikut :
1. Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat dari gelas disterilkan pada oven suhu 180 °C selama 2 jam. Sedangkan alat dari logam seperti  ose  dan  jarum  spoit  disterilkan  pada  lampu  spiritus.  Untuk  Sterilisasi  medium dilakukan pada otoklaf suhu 121 °C tekanan 2 atm selama 15 menit.
2. Penyiapan Medium PDA (Potato Dextrose Agar) Medium PDA disterilkan pada otoklaf 121 °C tekanan 2 atm selama 15 menit. Dimasukkan ke dalam botol roux, ditutup dengan kapas, dan dimiringkan dalam keadaan masih panas sampai agar membeku.
3. Pengolahan Limbah Markisa Selaput biji  dan kulit dikeringkan  di bawah sinar matahari, kemudian dihaluskan menjadi tepung untuk keperluan medium fermentasi.
4. Pembuatan Inokulum Aspergillus  niger yang  ditumbuhkan  pada  medium  PDA  umur  4  x  24  jam  suhu  kamar, ditambahkan  cairan    yang      terdiri      dari      0.1%      tween  80  dan  0.9%  NaCI  fisiologis, kemudian  dikeruk  dan  dikocok  hingga  semua  mikroorganismenya  lepas.  Suspensi  ini digunakan sebagai inokulum yang akan dimasukkan ke dalam medium fermentasi.
5. Pembuatan Medium Fermentasi
Medium   yang  masing-masing   berisi  selaput  biji  dan  kulit markisa dalam bentuk tepung (8%), NaH 2 PO 4 (4.7%), CaCI 2 (0.1%), KCI (0.02%), MgCI 2 .6H 2 O (0.02%), diatur pHnya  menjadi  4.0,  4.5,  5.0,  dan  5.5,  kemudian  ditambahkan  buffer  sitrat.  Selanjutnya medium  disterilkan  pada  otoklaf  suhu  121  °C  tekanan  2  atm  selama  15  menit.  Setelah medium  dingin,  diinokulasi  dengan  inokulum Aspergillus  niger sebanyak  1  ml  pada volume medium 100 ml, difermentasikan pada shaker, suhu kamar dengan dua kali ulangan. Pengambilan sampel enzim dilakukan pada waktu fermentasi 3, 4, 5, dan 6 x 24 jam.
6. Penentuan Konsentrasi Glukosa Standar
Zat D - glukosa 200 mg dilarutkan air suling sampai volume 1000 ml. Larutan dipindahkan ke dalam 11 tabung reaksi dengan volume yang ditentukan sebagai berikut:  0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,  1.2,  1.4,  1.6,  1.8,  dan  2.0  (ml).  Ke  dalam  tiap-tiap  tabung  reaksi  ditambahkan  1.6  ml reagent  Nelson  A  dan  0.4  ml  reagent  Nelson  B,  kemudian  dikocok.  Semua  tabung dipindahkan ke dalam water bath suhu 100 °C selama 10 menit dengan mulut tabung ditutup kelereng.  Tabung-tabung  dipindahkan  ke  air  es  selama  5  menit,  kemudian  ditambahkan  ke dalamnya 2 ml reagent arsenomolibdat dan 4.9 ml air suling. Tabung dikocok sampai   semua CO 2 keluar,  disentrifuge  pada  5000  rpm  selama  10  menit.  Kerapatan  optis  (serapan  cahaya) diukur pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 520 nm.

## 7. Penentuan Konsentrasi Glukosa Medium Fermentasi
Konsentrasi  glukosa  medium  fermentasi  ditentukan  dengan    urutan    langkah  sebagai berikut (Paleg, 1959):
a. Satu ml larutan 1% pati terlarut diisikan ke dalam 22 tabung reaksi, 21 tabung reaksi diinkubasikan  dalam  penangas  air  suhu  100°C,  dan  1  tabung  untuk  standar diinkubasikan ke dalam penangas air suhu 42 °C, masing-masing selama 5 menit.
b. Ke  dalam  tabung  yang  telah  diatur  pHnya  5.0  ditambahkan  0.1  ml  enzim  hasil pengenceran  10  kali  (kecuali  tabung  reaksi  untuk  standar,  ditambahkan  0.1  ml  air suling). kemudian diinkubasikan pada suhu pengujian 60 °C. Reaksi dibiarkan selama 10 menit.
c. Setelah 10 menit, reaksi dihentikan dengan jalan memindahkan tabung-tabung tersebut ke dalam penangas air 100 °C selama 10 menit. Hasil hidrolisis selama 10 menit  tersebut  ditentukan  konsentrasi  glukosanya  dengan  metode  Somogy-Nelson. Urutan langkah penentuan tersebut adalah sebagai berikut:
- Ke dalam masing-masing tabung reaksi ditambahkan 1.6 ml reagen Nelson A, kemudaian 0.4 ml reagen Nelson B. Campuran dikocok, kemudian mulut tabung ditutup kelereng dan dipanaskan dalam penangas air suhu 100°C selama 10 menit, kemudian didinginkan dalam es selama 5 menit.
- Ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 2 ml reagen Arsenomolibdat dan 4.9 ml air suling. Tabung dikocok dengan kuat sambil menutup mulut tabung dengan ibu jari hingga seluruh gas CO 2 keluar. Hasilnya disentrifuge pada 5000 rpm selama   10 menit   (jika   terjadi   endapan),   kemudian   diukur   ODnya  pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 520 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian  ini  dilakukan  dengan  memanfaatkan  limbah  markisa  sebagai  medium fermentasi  untuk Aspergillus  niger sehingga  kapang  tersebut  dapat  menghasilkan  enzim amiloglukosidase  yang  dapat  mendegradasi  kandungan  pati  pada  medium  tersebut  menjadi glukosa sebagai sumber karbon, sehingga dapat diserap masuk ke dalam selnya.
Proses fermentasi dilakukan pada medium cair, suhu kamar, variasi pada pH 4.0,  4.5,  5.0, dan  5.5,  diesktraksi  pada  waktu  fermentasi  ke  3,  4,  5  dan  6  x  24  jam  dengan  menggunakan sentrifuge  3000  rpm  selama  10  menit.  Dari  analisis  sidik  ragam,  degradasi  pati  oleh  enzim amiloglukosidase memperlihatkan  konsentrasi  glukosa interaksi  pH  dan  waktu fermentasi pada medium  kulit  dan  selaput  biji  yang  berbeda  nyata  pada  taraf  1%.  Uji  lanjut  dengan  Least Significant  Difference  (LSD)  (Gomez  and  Gomez,  1983)  memperlihatkan  hasil  seperti  tampak pada tabel 1.
Tabel  1.  Konsentrasi  Glukosa  Hasil  Degradasi  Pati  1%  oleh  Enzim  Amiloglukosidase  dari Aspergillus niger Kombinasi Waktu Fermentasi dan pH.
NO PERLAKUAN (Waktu Fermentasi dan pH) KONSENTRASI GLUKOSA (µg/ml) Kulit Selaput Biji 1 T 1 P 1 0.916  e/x 16.083  e/y 2 T 1 P 2 2.272  e/x 20.359  de/y 3 T 1 P 3 5.421  de/x 10.236  f/y 4 T 1 P 4 0.236  e/x 7.026  f/y
24 _ Jurnal Teknosains, Volume 13, Nomor 1, Januari-Juni 2019 , hlm. 17 – 26
5 T 2 P 1 3.260  de/x 26.347  cd/y 6 T 2 P 2 5.483  de/x 38.384  b/y 7 T 2 P 3 7.828  d/x 31.470  c/y 8 T 2 P 4 0.359  e/x 25.174  d/y 9 T 3 P 1 21.470  ab/x 41.470  b/y 10 T 3 P 2 22.828  ab/x 51.964  a/y 11 T 3 P 3 25.915  a/x 50.298  a/y 12 T 3 P 4 18.693  b/x 40.112  b/y 13 T 4 P 1 11.347  c/x 23.878  d/y 14 T 4 P 2 21.223  ab/x 30.112  cd/y 15 T 4 P 3 14.310  bc/x 27.520  cd/y 16 T 4 P 4 9.001  cd/x 25.668  d/y Keterangan : T 1 = 3 x 24 jam P 1 = pH 4.0 T 2 = 4 x 24 jam P 2 = pH 4.5 T 3 = 5 x 24 jam P 3 = pH 4.0 T 4 = 6 x 24 jam P 4 = pH 5.5
Pada  tabel  1  tampak  bahwa  penggunaan  substrat  limbah  markisa  sebagai  medium fermentasi dapat memacu Aspergillus niger untuk mengeluarkan enzim amiloglukosidase guna menguraikan pati yang terdapat pada substrat menjadi glukosa.
Hasil  analisis  pengukuran  pada  spektrofotometer  panjang  gelombang  520  nm  dan berdasarkan persamaan regresi larutan glukosa standar y =  0.10909 + 8.0909.10 -3 X, didapatkan konsentrasi glukosa tertinggi pada substrat kulit markisa adalah 25.915 µg/ml, merupakan kerja enzim  amiloglukosidase  yang  dihasilkan  pada  waktu  fermentasi  5  x  24  jam  pH  5.0.  Hasil  ini tidak  berbeda nyata  dengan  beberapa perlakuan yaitu  pada waktu fermentasi 5  x  24  jam pH  4.5 senilai  22.828  µg/ml,  waktu  fermentasi  5  x  24  jam  pH  4.0  senilai  21.47  µg/ml,  dan  waktu fermentasi 6 x 24 jam pH 4.5 senilai 21.223 µg/ml.
Pada  tabel  1  tampak  bahwa  konsentrasi  glukosa  tertinggi  didapatkan  pada  substrat selaput biji yang merupakan kerja enzim amiloglukosidase pada waktu fermentasi 5 x 24 jam pH 4.5 senilai 51.964 µg/ml yang tidak berbeda nyata dengan perlakuan pada waktu fermentasi 5 x 24 jam pH 5.0 senilai 50.298 µg/ml.
Dari  kedua  jenis  substrat  yang  digunakan,  ternyata  penggunaan  selaput  biji  menghasilkan enzim  yang  mampu  mendegradasi  pati  lebih  banyak  dibandingkan  dengan  substrat  kulit  untuk perlakuan  yang  sama  (tabel  1  dan  gambar  2).  Ini  disebabkan  oleh  kandungan  polisakarida  yang mengandung amilopektin pada kulit dapat menghambat kerja enzim karena ikatan rantainya panjang dan  bercabang  sehingga  susah  diuraikan.  Sementara  pada  selaput  biji,  kandungan  polisakaridanya hanya  mengandung  amilum  dengan  rantai  lurus  sehingga  lebih  mudah  bagi  enzim  untuk menguraikannya.  Walaupun  demikian,  kedua  jenis  substrat  dari  limbah  markisa  tersebut  dapat digunakan  sebagai  medium  fermentasi  yang  dapat  merangsang Aspergillus  niger menghasilkan enzim amiloglukosidase yang banyak digunakan untuk produksi alkohol, roti, juice, dan pati.

## KESIMPULAN
1. Kandungan  nutrien  dalam  limbah  markisa  dapat  dimanfaatkan  oleh Aspergillus  niger sebagai  medium  fermentasi  untuk  menghasilkan  enzim  amiloglukosidase.  Konsentrasi
Fatmawati Nur, Pengaruh pH dan Waktu Fermentasi untuk Menghasilkan Enzim… _ 25
glukosa  tertinggi  didapatkan  pada  substrat  selaput  biji  yang  merupakan  kerja  enzim amiloglukosidase pada waktu fermentasi 5 x 24 jam pH 4.5 senilai 51.964 µg/ml.
2. Substrat  selaput  biji  markisa  dapat  dimanfaatkan  oleh Aspergillus  niger sebagai  medium fermentasi  lebih  baik  dibandingkan  dengan  substrat  kulit  markisa  untuk  menghasilkan enzim amiloglukosidase pada perlakuan yang sama.

## DAFTAR PUSTAKA
Apa  dan  Bagaimana  :  Tentang  Enzim.  (2009). Jendela  Informasi  Sains .  Sidoarjo:  Science Areahttp://y121d1.blogspot.com/ (08-07-2009).
Aspergillus niger . (2007). Media Komunikasi Permi . Malang: Universitas Brawijaya. http://permimalang.wordpress.com/  (12-12-2007).
Djarre, M.T. Potensi Limbah Buah Markisa (Passiflora edulis Sims) Sebagai Bahan Makanan Ternak Ruminansia . (1994). Ujung Pandang: Fakultas Peternakan dan Perikanan Universitas Hasanuddin.
Dwidjosepoetro, D. (1978). Pengantar Mikologi. Bandung: Alumni.
Gaman, P.M., and K.B. Sherrington. (1992). llmu Pangan. Pengantar llmu Nutrisi dan Mikrobiologi. Terjemahan oleh Mardijati Gardjito, Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
Gomez, K.A. and A.A. Gomez. (1983). Statistical Producere for Agriculture Research. 2 nd ; New York:  John Wiley and Sons Inc.
Hardjo,  S.,  N.S  Indrasti  dan  T.  Bantacut.  (1989). Biokonversi  :  Pemanfaatan  Limbah  Industri  Pertanian Bogor: PAU Pangan dan Gizi IPB.
Indriani, R. Ine Dewi. (2001). Isolasi dan Penapisan Jamur Penghasil Glukoamilase dari Limbah Tapioka untuk  Produksi  Glukosa  Cair  dari  Substrat  Pati  Mentah  Ubi  Jalar  ( Ipomoea  batatas Lenk.)  dan Ganyong ( Canna edulis Kerr.). [ Tesis ] Bandung: ITB Central Library. http://digilib.itb.ac.id/ (23- 06-2008).
Kertesz, Z.I. and R.I. Me Collogen. (1976). Enzim Acting on Pectin Subtances dalam Tipson, R.S. and H. Derek, eds. Advances in Carbohydrat and Biochemistry. London:  Academic Press.
Paleg,  L.G.  (1959).  Citrit  Acid  Interference  in  the Estimation  of  Reducing  Sugars  with  Alkalin Copper Reagens. Anal. Chem . 31, 1902 – 1904.
Pelczar, Michael J. dan E.C.S. Chan. (2006). Dasar-dasar Mikrobiologi 1. Terjemahan oleh R.S. Hadioetomo, dkk. Jakarta: Universitas Indonesia Press.
Popenoe, W. (1974). Manual of Tropical and Subtropical Fruit. New York: Hafner Press, A Division of Mac Millan Publishing Co. Inc.
Prescott, S.C. (1959). Industrial Microbiology. New York: Mc Graw Hill Publishing Company Ltd.
Rahman, A. (1992). Teknologi Fermentasi Industrial. Jakarta:  Arcan.
Rismunandar. (1986). Mengenal Tanaman Buah-buahan. Bandung: Sinar Baru.
Sa'id, E.G. (1987). Bioindustri: Penerapan Teknologi Fermentasi. Jakarta: Mediyatama Sarana Perkasa.
Smith,  J.E.  (1993). Prinsip  Bioteknologi. Terjemahan  oleh  V.F.  Sumo,  B.  Sumantri,  dan  Subono.  Jakarta: Gramedium Pustaka Utama.
Studi  Suplai  Industri  Markisa  Di  Sulawesi  Selatan.  Smallholder  Agribusiness  Development  Initiative , (2008). Makassar:  SADI. http://www.sadi.or.id/ (01-06-2009).
Syamsu,  Jasmal  A.  dan  Syahriani.  (1999).  Daya  Cerna  In  Vitro  Kulit  Buah  Markisa  (Passiflora  edulis Sims)  yang  Disuplementasi  dengan  Urea  Molases  Blok .  Prosiding  Seminar  Nasional  II  Ilmu Nutrisi  dan  Makanan  Ternak ,  Bogor:  Fakultas  Peternakan  Institut  Pertanian  Bogor  dan  Asosiasi Ilmu  Nutrisi  dan  Makanan  Ternak  Indonesia  (AINI)  147-148  ISSN  1410-4423. http://jasmal.blogspot.com.html (27 Mei 2009).
26 _ Jurnal Teknosains, Volume 13, Nomor 1, Januari-Juni 2019 , hlm. 17 – 26
Wood,  Roff  J.G.  and  B.  Sinnluh.  (1986). Commercial  Fruit  Processing. Westport,  Connecticut:  AVI Publishing Company Inc.