## Identifikasi Begomovirus yang Berasosiasi dengan Penyakit Kuning pada Mentimun di Jawa Barat dan Bali
Identification of Begomovirus Associated with Yellowing Disease on Cucumber Plants in West Java and Bali
Rizki Haerunisa 1* , Gede Suastika 1 , dan Tri Asmira Damayanti 1
Diterima 04 Februari 2016/Disetujui 16 Maret 2016

## ABSTRACT
A survey conducted from several cucumber cultivation area of West Java and Bali found some plants  showing  yellow  mosaic,  vein  banding,  and  stunting  symptoms,  caused  by  Begomovirus infection. This study aimed to detect and determine incidence of Begomovirus on cucumber plants, and analyze variation of Begomovirus coat protein gene in West Java dan Bali. Leaf samples from 50 plants were taken randomly from each location in Sumedang, Karawang, Sukabumi (West Java) and Tabanan, Gianyar, Klungkung (Bali).  Disease incidence was determined based on serological assay  using  specific  antiserum  of  Tomato  leaf  curl  New  Delhi  virus  (ToLCNDV)  dan  Squash  leaf curl virus (SLCV). Incidence of ToLCNDV and SLCV were 28-100% and 30-80%, respectively. PCR using  Begomovirus  degenerate  primers  successfully  amplified  coat  protein  gene  about  ±  550bp. There  were  three  Begomovirus  species  associated  with  yellowing  disease  on  cucumber  plant  i.e Squash leaf curl China virus (SLCCNV), ToLCNDV, and Ageratum yellow vein virus (AYVV). Based on  nucleotide  sequences  analysis,  it  was  found  that  isolate  SLCCNV  had  highest  nucleotide homology with SLCCNV isolate Malaysia (EF197940) about 94.5%, and was considered as a strain “China”,  whereas  ToLCNDV  has  highest  nucleotide  similarity  with  ToLCNDV  isolate  Indonesia (AB613825) about 99.4% and was considered as a strain “Indonesia”. The AYVV sequences showed highest nucleotide AYVV isolate Nicotiana benthamiana from Indonesia (AB100305) about 92.1%.
Keywords: Cucumis sativus, Dot immunobinding assay, Squash  leaf curl China virus,  Tomato leaf curl New Delhi virus

## ABSTRAK
Survei yang dilakukan di beberapa pertanaman mentimun di Jawa Barat dan Bali menemukan gejala mosaik kuning, daun keriting, penebalan tulang daun, dan kerdil akibat infeksi Begomovirus . Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan menghitung insidensi penyakit yang disebabkan oleh Begomovirus pada  tanaman  mentimun,  serta  menganalisis  keragaman  gen  protein  selubung Begomovirus di  Jawa  Barat  dan  Bali.  Sampel  daun  diambil  secara  acak  sebanyak  50  tanaman  dari tiap  lokasi  pertanaman  mentimun  di  Sumedang,  Karawang,  dan  Sukabumi  (Jawa  Barat),  Tabanan, Gianyar, dan Klungkung (Bali). Deteksi Begomovirus dan insidensi penyakit ditentukan dengan uji serologi DIBA menggunakan antiserum Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) dan Squash leaf curl virus (SLCV). Insidensi ToLCNDV dan SLCV berturut-turut berkisar 28-80% dan 30-80%. Deteksi dengan teknik PCR menggunakan primer universal Begomovirus berhasil mengamplifikasi gen  protein  selubung  berukuran  ±  550  pb.  Hasil  perunutan  nukleotida  menunjukkan  terdapat  tiga spesies Begomovirus yang menginfeksi tanaman mentimun di Jawa Barat dan Bali, yaitu Squash leaf curl China virus (SLCCNV), ToLCNDV, dan Ageratum yellow vein virus (AYVV). Isolat SLCCNV Bali memiliki kesamaan nukleotida dan asam amino terhadap isolat SLCCNV dari negara lainnya berkisar antara  89.8-94.5%  dan  94.2-96.3%,  dan  dikelompokkan  ke  dalam  strain  “Cina”.  ToLCNDV  isolat Jawa Barat dan Bali memiliki kesamaan nukleotida dan asam amino berkisar antara 92.8-99.4% dan
1 Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor Jl. Kamper, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680, Indonesia e-mail: rizkihaerunisa2008@gmail.com (*penulis korespondensi)
97.3-99.4%  dengan  isolat  ToLCNDV  dari  negara  lainnya,  tergolong  ke  dalam  strain  “Indonesia”. Gen  protein  selubung  AYVV  Bali  memiliki  kesamaan  nukleotida  dan  asam  amino  berkisar  antara 89.5-92.1%  dan  94.7-95.2%,  dengan  kesamaan  tertinggi  dengan  isolat  AYVV  asal  Indonesia  yang menginfeksi Nicotiana benthamiana .
Kata kunci: Cucumis sativus , Dot immunobinding assay, Squash leaf curl China virus, Tomato leaf curl New Delhi virus .

## PENDAHULUAN
Begomovirus merupakan kelompok virus  dari  famili  Geminiviridae penyebab penyakit  yang  cukup  penting  pada  beberapa komoditas  hortikultura  di  berbagai  daerah tropis  maupun  subtropis.  Penyakit  yang disebabkan  oleh Begomovirus di  Indonesia dilaporkan  cukup  banyak  pada  beberapa pertanaman hortikultura, seperti Pepper yellow leaf  curl  virus (PYLCV)  dengan  insidensi mencapai  100%,  dan  epidemi  penyakit  terjadi di  sentra-sentra  produksi  cabai  di  Indonesia terutama  di  Pulau  Jawa  pada  tahun  2000 sampai  2003, Tomato  yellow  leaf  curl  virus (TYLCV) mencapai 50-70% di Jawa Barat dan Jawa Tengah (Aidawati et al., 2005; Sulandari et  al., 2006),  dan Mungbean  yellow  mosaic India  virus (MYMIV)  yang  menginfeksi kacang panjang dengan insidensi penyakit 80- 100% di Jawa (Nurulita et al., 2015).
Mentimun ( Cucumis sativus L.)
merupakan salah satu jenis sayuran dari famili Cucurbitaceae yang  sudah  populer  ditanam petani  di  Indonesia.  Sejak  tahun  2008, pertanaman  mentimun  di  Klaten,  Jawa Tengah,  terserang  penyakit  daun  keriting kuning.  Daun  mentimun  mengalami  mosaik hijau kekuningan.
Penyakit
tersebut berasosiasi  dengan  infeksi Tomato  leaf  curl New  Delhi  virus (ToLCNDV)  dan  telah menyebar  ke  beberapa  kabupaten  lainnya antara  lain  Bogor,  Tegal,  Sukoharjo,  dan Sleman  (Mizutani et  al., 2011;  Septariani et al., 2014).  Penyakit  kuning  pada  mentimun juga  ditemukan  di  Kabupaten  Tabanan, Provinsi  Bali.  Gejala  yang  timbul  yaitu  daun menguning dan adanya penebalan tulang daun ( vein  banding ).  Penyebab  penyakit  kuning  di Bali berbeda dengan yang dilaporkan sebelumnya  di  wilayah  Jawa  Barat  dan  Jawa Tengah.  Penyakit  tersebut  berasosiasi  dengan Squash  leaf  curl  China  virus (SLCCNV) (Wiratama et al., 2015).
Deteksi  dan  identifikasi  penyakit  yang disebabkan  oleh Begomovirus umumnya menggunakan  teknik  PCR  ( Polymerase  Chain
Reaction ).  Identifikasi Begomovirus pada tanaman tomat menggunakan primer Degenerate dan spesifik Gen AV1
menunjukkan  bahwa  semua  contoh  tanaman menghasilkan  amplikon  yang  berukuran  780 bp (Santoso et al ., 2013). Identifikasi terhadap Begomovirus menggunakan  pasangan  primer universal  seperti  PAL1v1978/  PAR1c715 berhasil  mendeteksi  MYMIV  (Nurulita et  al., 2015),  primer  pAV494/  pAC1048  berhasil mendeteksi PepYLCV (Sulandari et al ., 2006), dan primer SPG1/SPG2 berhasil mengidentifikasi Tomato  yellow  leaf  curl
Kanchanaburi  virus pada  tanaman  terung (Kintasari et  al. ,  2013).  ToLCNDV  telah diketahui  menginfeksi  tanaman  mentimun  di Kabupaten  Bogor  dan  Subang  (Jawa  Barat), Kabupaten  Tegal  dan  Sukoharjo  (Jawa Tengah),  serta  Kabupaten  Sleman  (DIY Yogyakarta),  sedangkan  SLCCNV  diketahui menginfeksi  tanaman  mentimun  di  Kabupaten Tabanan  (Bali).  Keberadaan  kedua  virus tersebut  perlu  diketahui  guna  mengetahui sebaran  virus  sekaligus  insidensi  penyakit  di beberapa daerah lainnya. Deteksi Begomovirus pada pertanaman mentimun dilakukan melalui teknik  PCR  dilanjutkan  dengan  proses perunutan  DNA  untuk  mengetahui  identitas spesies Begomovirus .  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mendeteksi  dan  menghitung  insidensi penyakit  yang  disebabkan  oleh Begomovirus pada  tanaman  mentimun,  serta  menganalisis keragaman gen protein selubung Begomovirus di Jawa Barat dan Bali.

## BAHAN DAN METODE

## Pengambilan Sampel Tanaman Mentimun
Sampel tanaman mentimun sakit diambil dari pertanaman mentimun di
Kecamatan Karawang Barat, Kabupaten Karawang, Kecamatan Cibadak dan Kecamatan Parung Kuda, Kabupaten Sukabumi, Kecamatan Ujung Jaya, Kabupaten
Sumedang  (Jawa  Barat),  serta  Kecamatan Baturiti,  Kabupaten  Tabanan,  Kecamatan Payangan, Kabupaten Gianyar, dan Kecamatan Klungkung,  Kabupaten  Klungkung  (Bali). Setiap  Kabupaten  dipilih  dua  lahan  mentimun sebagai  tempat  pengambilan  sampel.  Sampel yang  dikoleksi  yaitu  daun  mentimun  yang menunjukkan  gejala  kekuningan  sebanyak  50 daun  pada  setiap  lokasi.  Deteksi  dan identifikasi  virus  dilakukan  di  Laboratorium Virologi  Tumbuhan,  Departemen  Proteksi
Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Deteksi Sampel Mentimun Terinfeksi
Begomovirus
Metode  DIBA  dilakukan  menggunakan antibodi  spesifik  ToLCNDV  dan  SLCV (Deutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen und Zellkulturen) sesuai metode yang digunakan  Anggraini  dan  Hidayat  (2014).
Sebanyak  0.1  g  sampel  digerus  dalam tris buffer saline (TBS) dengan perbandingan 1:10 (b:v)  (TBS:  Tris-HCl  0.02  M  dan  NaCl  0.15 M, pH 7.5). Sebanyak 2 µL suspensi tanaman diteteskan  ke  atas  membran  nitroselulosa. Setelah  tetesan  sampel  kering,  membran direndam  di  dalam  10  mL  larutan blocking non-fat milk 2% dalam TBS yang mengandung Triton  X-100  dengan  konsentrasi  akhir  2%. Membran  diinkubasi  pada  suhu  ruang  sambil digoyang  menggunakan  EYELA multi  shaker dengan  kecepatan  50  rpm  selama  1  jam. Membran  selanjutnya  dicuci  5  kali  dengan dH 2 O,  tiap  pencucian  berlangsung  5  menit sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Membran nitroselulosa direndam dalam 2.5  mL  TBS  yang  mengandung  1µL  antibodi pertama  ditambah non-fat  milk dengan konsentrasi  akhir  2%,  dan  diinkubasi  selama semalam  pada  suhu  4 0 C.  Membran  dicuci kembali  dengan  Tween  0.05%  dalam  TBS (TBST)  sebanyak  5  kali  sambil  digoyang dengan  kecepatan  100  rpm,  masing-masing selama 5 menit.
Membran nitroselulosa direndam dalam
2.5  mL  TBS  yang  mengandung  1µL  antibodi kedua  (konjugat)  ditambah non-fat  milk dengan  konsentrasi  akhir  2%,  kemudian
diinkubasi  selama  2  jam  sambil  digoyang dengan  kecepatan  50  rpm.  Membran  dicuci kembali dengan TBST sebanyak 5 kali sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm.
Tahap  terakhir,  membran  direndam dalam 10 mL bufer AP (Tris-HCl 0.1 M, NaCl 0.1  M,  MgCl 2 5  mM,  pH  9.5)  yang mengandung  1  tablet nitro  blue  tetrazolium (NBT)  dan bromo  chloro  indolil  phosphate (BCIP)  untuk  pewarnaan.  Reaksi  positif apabila terjadi perubahan warna putih menjadi ungu  pada  membran  nitroselulosa  yang  telah ditetesi  cairan  tanaman  dan  reaksi  dapat dihentikan dengan  merendam  membran dalam dH 2 O.  Reaksi  positif  ditandai  terbentuknya warna  ungu  pada  membran  nitroselulosa. Insidensi  penyakit  yang  disebabkan  oleh Begomovirus dihitung  dengan  menggunakan rumus:
IP = Σ x100%
Identifikasi Begomovirus melalui  Teknik PCR
DNA  total  diekstraksi  dari  tanaman mentimun terinfeksi Begomovirus menggunakan metode  Doyle  dan  Doyle  (1987). Hasil ekstraksi  berupa  DNA  total  diamplifikasi dengan  PCR  menggunakan  primer  universal gen  protein  selubung  pAV494/pAC1048 dengan  amplikon  berukuran  ±  550  pb  (Wyatt dan  Brown,  1996).  Visualisasi  produk  PCR dilakukan  dengan  elektroforesis  menggunakan gel agarosa 1.5%.
Perunutan dan Analisis DNA Begomovirus
Perunutan nukleotida hasil PCR dilakukan  di  First  Base,  Malaysia.  Hasil sekuen  dianalisis  menggunakan Basic  Local Alignment  Tool (BLAST)  dan ClustalW multiple  alignment dengan BioEdit V7.05. Analisis  filogenetika  menggunakan Molecular Evolutionary  Genetics  Analysis (MEGA  6) (Tamura et al ., 2013).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyakit Kuning pada Tanaman Mentimun di Jawa Barat dan Bali
Survei  pada  pertanaman  mentimun  di Jawa  Barat  dan  Bali  menunjukkan  adanya
variasi  gejala  penyakit  yang  disebabkan  oleh Begomovirus .  Gejala  yang  umum  ditemukan antara  lain  mosaik  kuning  pada  lamina  daun disertai  penebalan  tulang  daun  ( vein  banding ) (Gambar  1).  Adanya  variasi  gejala  infeksi Begomovirus di  lapangan  dipengaruhi  oleh varietas  mentimun  yang  berbeda  pada  saat pengamatan.  Mentimun  varietas  Sabana  yang ditanam  di  Sumedang  menunjukkan  gejala mosaik  kuning  dan vein  banding ,  sedangkan varietas  Bandana  di  Karawang  didominasi oleh  gejala  klorosis,  mosaik  kuning,  dan vein banding .  Mentimun  varietas  Vanessa  di Sukabumi  menunjukkan  gejala  mosaik  hijau muda,  dan  tepian  daun  yang  menggulung  ke atas ( cupping ) (Gambar 1).
Gejala  pada  pertanaman  mentimun  di Bali sedikit berbeda dengan yang ditemukan di Jawa  Barat.  Pertanaman  mentimun  jepang  di Tabanan  dan  Gianyar  didominasi  gejala  daun menguning,  penebalan  tulang  daun,  dan tanaman  menjadi  kerdil,  sedangkan  gejala yang  teramati  di  Klungkung  yaitu  gejala mosaik  hijau  pada  lamina  daun,  tepian  daun melengkung  ke  atas,  dan  penebalan  tulang daun.  Wiratama et  al. (2015)  menyatakan bahwa  gejala  penyakit  pada  pertanaman mentimun  di  Bali  berasosiasi  dengan  infeksi SLCCNV.  Gejala  paling  parah  ditemukan  di Tabanan,  yaitu  tanaman  menjadi  kerdil  dan tidak menghasilkan buah sama sekali. Menurut Flock  dan  Mayhew  (1981), Squash  leaf  curl virus (SLCV) yang menginfeksi labu pada saat persemaian  akan  menyebabkan  kematian,  dan apabila  menginfeksi  pada  fase  vegetatif  maka
akan  menyebabkan  tanaman  kerdil,  daun keriting,  tulang  daun  menjadi  lebih  tebal,  dan proses pembungaan akan menjadi terhambat.
Infeksi ToLCNDV dan SLCCNV dapat terjadi  secara  tunggal  maupun  ganda  di lapangan  dengan  gejala  yang  hampir  sama. Gejala  infeksi  SLCV  pada  beberapa  tanaman Cucurbitaceae  diantaranya  yaitu  daun  mosaik kuning,  penebalan  tulang  daun,  daun  keriting, berkurangnya area lamina daun, dan mengalami  malformasi  (Singh et  al., 2008; Tahir et al., 2010). ToLCNDV dapat menginfeksi tanaman  Cucurbitaceae,  Solanaceae,  dan gulma.  Gejala  umum  yang  ditimbulkan  oleh ToLCNDV  antara  lain  daun  mosaik  kuning, keriting,  penebalan  tulang  daun,  malformasi sehingga menyebabkan hasil produksi menurun (Tiwari et  al .,  2010;  Pratap et  al .,  2011). Variasi  gejala  infeksi Begomovirus pada mentimun  di  lapangan  dapat  disebabkan adanya infeksi campuran dua virus atau lebih. Infeksi  tunggal  SLCV  pada  tanaman  melon menyebabkan  gejala  klorosis  ringan  dan sedikit  keriting,  sedangkan  infeksi  yang disebabkan  oleh Watermelon  chlorotic  spot virus (WmCSV)  berupa  klorosis  dengan bercak  kuning.  Infeksi  ganda  SLCV  dan WmCSV  menyebabkan  gejala  mosaik  kuning disertai  penebalan  tulang  daun,  dan  tanaman menjadi kerdil. Infeksi ganda juga menghambat  pembentukan  “netting”  pada buah, perubahan bentuk buah, dan menyebabkan  penurunan  hasil  mencapai  80%
(Ringwald dan Lapidot, 2011).
Gambar 1. Variasi gejala penyakit kuning yang ditemukan di lapang. (a) mosaik hijau, (b) klorosis,
(c) vein banding , (d) rugose , (e) kuning dan vein banding , (f) mosaik kuning, (g) kerdil, (h) mosaik hijau dan cupping .
a b c d
e f
g h
Infeksi  ganda  antara  SLCCNV  dan Loofa yellow mosaic virus (LYMV) berasosiasi  dengan  penyakit  mosaik  pada tanaman Cucurbitaceae di Vietnam menyebabkan  mosaik  kuning  dan  tanaman kerdil (Revill et al ., 2003).
Laporan  mengenai  infeksi  ganda  antara ToLCNDV  dan  SLCCNV  pada  tanaman Cucurbitaceae  masih  sedikit.  Penyakit  mosaik kuning  pada  tanaman  labu  di  India  diketahui disebabkan oleh dua virus yang berbeda, yaitu ToLCNDV di daerah India bagian selatan dan SLCCNV di India bagian utara (Maruthi et al ., 2007).  Gejala  infeksi  antara  ToLCNDV  dan SLCCNV  yang  ditemukan  di  Jawa  Barat  dan Bali  sulit  untuk  dibedakan,  maka  diperlukan deteksi  serologi  atau  asam  nukleat  untuk memastikan virus penyebabnya.
Hasil  deteksi  DIBA  menunjukkan infeksi ToLCNDV mendominasi semua lokasi pengamatan (Tabel 1). Insidensi penyakit oleh ToLCNDV  berkisar  50%  sampai  dengan 100%,  kecuali  di  Sukabumi  sebesar  28%. Infeksi SLCV ditemukan di semua pertanaman mentimun  di  Bali.  Insidensi  penyakit  paling tinggi  ditemukan  di  Kabupaten  Tabanan (80%), sedangkan paling rendah ditemukan di Gianyar (42%).
Infeksi  SLCV  di  India  menyebabkan insidensi  penyakit  pada  tanaman  labu  sebesar 45%-100%.  Insidensi  penyakit  yang  tinggi  ini dipengaruhi  oleh  penggunaan  benih  hibrida
sepanjang  musim  tanam  dan  budidaya tanaman  monokultur  (Maruthi et  al., 2007). Variasi gejala pada berbagai varietas mentimun di Jawa Barat dan Bali mengindikasikan  adanya  infeksi  campuran dengan  virus  lainnya.  Infeksi  campuran  akan menghasilkan  penyakit  yang  lebih  kompleks, salah  satunya  ditunjukkan  dengan  gejala  yang lebih  parah  dibandingkan  infeksi  tunggal. Infeksi  ganda  antara  ToLCNDV  dan  SLCV terdeteksi  pada  semua  sampel  Bali,  berkisar antara  32%  sampai  dengan  64%,  dan  juga  di Sumedang serta Karawang sebesar 52% dan 28%.
Interaksi antar virus dalam suatu infeksi campuran  dapat  bersifat  sinergis,  antagonis, maupun  aditif  berdasarkan  ekspresi  gejala, ekspresi gen, replikasi, dan pergerakan virus di dalam  sel  maupun  ke  seluruh  bagian tumbuhan. Konsentrasi virus Pepper huasteco virus (PHV)  dan Pepper  golden  mosaic  virus (PGMV)  pada N.  benthamiana meningkat pada  saat  infeksi  campuran  menunjukkan kedua  virus  tersebut  berinteraksi  secara sinergis dalam proses replikasi virus (Mendez- Lozano et  al., 2002).  Interaksi  sinergis  juga terjadi  antara African  cassava  mosaic  virus (ACMV)  dan East  African  cassava  mosaic virus (EACMV)  pada  tanaman  ubi  kayu ditandai gejala mosaik, keriting, dan malformasi  pada  daun  yang  lebih  parah  bila dibandingkan dengan infeksi tunggal
ACMV/EACMV.
Tabel 1. Insidensi penyakit oleh Begomovirus berdasarkan deteksi serologi DIBA Lokasi1 1) Varietas Insidensi penyakit (%) 2) ToLCNDV SLCV ToLCNDV + SLCV Sumedang- 1 Sabana 41/50 (82) 0/50 (0) 0/50 (0) 2 Sabana 40/50 (80) 28/50 (56) 26/50 (52) Sukabumi- 1 Vanessa 25/50 (50) 0/50 (0) 0/50 (0) 2 Bandana/Wulan 14/50 (28) 0/50 (0) 0/50 (0) Karawang- 1 Bandana 48/50 (96) 15/50 (30) 14/50 (28) 2 Bandana 38/50 (78) 0/50 (0) 0/50 (0) Tabanan   - 1 Spring Swallow 35/50 (70) 37/50 (74) 28/50 (56) 2 Roberto 35/50 (70) 40/50 (80) 27/50 (54) Gianyar Sema 43/50 (86) 21/50 (42) 21/50 (42) Klungkung- 1 Lokal 34/50 (68) 23/50 (46) 16/50 (32) 2 Lokal 50/50 (100) 32/50 (64) 32/50 (64) Keterangan: 1) Karawang-1=  lahan 1 di  Kecamatan  Karawang  Barat,  Karawang-2=  lahan  2  di  Kecamatan  Karawang Barat;  Sumedang-1=  lahan  1  di  Kecamatan  Ujung  Jaya,  Sumedang-2=  lahan  2  di  Kecamatan  Ujung Jaya; Sukabumi-1= lahan 1 di Kecamatan Cibadak, Sukabumi-2= lahan 2 di Kecamatan Parung Kuda; Klungkung-1=  lahan  1  di  Kecamatan  Klungkung,  Klungkung-2=  lahan  2  di  Kecamatan  Klungkung, Tabanan-1= lahan 1 di Kecamatan Baturiti, Tabanan-2= lahan 2 di Kecamatan Baturiti; Gianyar= lahan di Kecamatan Puyangan.
2) Insidensi penyakit = n/N × 100%, n= jumlah tanaman positif terdeteksi virus, N= total tanaman yang diuji. Angka dalam kurung menyatakan persentase insidensi penyakit.
Peningkatan  konsentrasi  ACMV  pada fase awal infeksi dan EACMV pada fase akhir infeksi  menunjukkan  interaksi  sinergis  akibat infeksi  ganda  ACMV  dan EACMV  (Fondong et  al., 2000).  Infeksi  campuran  antar Begomovirus dapat  menyebabkan  proses rekombinasi  sehingga  menghasilkan  strain atau  bahkan  spesies  baru  yang  lebih  ganas pada  lingkungan  tertentu  (Mendez-Lozano et al., 2003).  Keberadaan  SLCCNV  pada pertanaman  mentimun  di  Jawa  Barat  dan infeksi ganda antara ToLCNDV dan SLCCNV di  Jawa  Barat  dan  Bali  merupakan  temuan baru dari penelitian ini.
Identifikasi Begomovirus pada Tanaman Mentimun dengan Teknik PCR a. Deteksi  Menggunakan  Primer Universal pAv494 dan pAc1048
Deteksi Begomovirus yang  menginfeksi tanaman mentimun dengan PCR berhasil mengamplifikasi  DNA  semua  isolat  yang mewakili setiap lokasi pengambilan sampel  yaitu isolat  SM  (Sumedang),  SK  (Sukabumi),  K (Karawang),  KA  (Klungkung),  TA  (Tabanan), dan G (Gianyar). Amplikon gen protein selubung Begomovirus yang dihasilkan  berukuran ~550 pb (Gambar  2).  Gen  protein  selubung Begomovirus merupakan  daerah  yang  sangat conserved dalam genom Begomovirus, sehingga  dapat  digunakan untuk identifikasi  dari Begomovirus . Gen  protein selubung  berperan  dalam  proses  enkapsidasi partikel virus, penularan melalui serangga vektor, dan  diduga  terlibat  dalam  pergerakan  virus  di dalam tumbuhan (Brown et al., 2012).
b. Perunutan dan Analisis DNA Begomovirus Hasil BLAST nukleotida isolat Begomovirus dari  Jawa  Barat  dan  Bali menunjukkan terdapat tiga
spesies
Begomovirus yang  berhasil  teridentifikasi, yaitu  SLCCNV,  ToLCNDV,  dan Ageratum yellows  vein  virus (AYVV).  Menurut  Brown et al. (2012), suatu isolat virus dinyatakan satu spesies Begomovirus yang  sama  apabila memiliki kesamaan nukleotida lebih dari 89%. Hasil  perunutan  nukleotida  menunjukkan bahwa  isolat  asal  Tabanan  (TA)  termasuk  ke dalam spesies SLCCNV, isolat asal Sumedang (SM),  Karawang  (K),  Sukabumi  (SK),  dan Klungkung  (KA)  termasuk  ke  dalam  spesies
ToLCNDV, sedangkan isolat asal Gianyar (G) termasuk  ke  dalam  spesies  AYVV.  Hasil perunutan nukleotida ini mengkonfirmasi hasil deteksi  serologi  DIBA  bahwa ToLCNDV  dan SLCCNV  merupakan Begomovirus yang menginfeksi tanaman mentimun di Jawa Barat dan  Bali.  Adapun  isolat  virus  asal  Gianyar yang  teridentifikasi  sebagai  AYVV  sangat mungkin  terjadi.  Antiserum  AYVV  belum tersedia untuk deteksi serologi, tanaman gulma sebagai  tanaman  inang  utama  AYVV  banyak ditemukan  di  sekitar  lahan  pengambilan sampel di Bali.
SLCCNV isolat Tabanan, Bali memiliki persentase  kesamaan  nukleotida  tertinggi (94.5%) dengan isolat SLCCNV asal Malaysia (Tabel  2).  Analisis  kesamaan  nukleotida  ini sesuai dengan laporan Wiratama et al. (2015), bahwa  SLCCNV  isolat  Indonesia  memiliki kedekatan  dengan  isolat  SLCCNV  asal Malaysia  berdasarkan  hasil  amplifikasi  gen TrAp dan Rep sebesar  91%.  SLCCNV  isolat Tabanan memiliki similaritas kurang dari 89% dengan dua isolat Begomovirus yang menginfeksi  cabai  sebagai outgroup yaitu Tomato leaf curl Kanchanaburi virus
(TLCKV)  dan Pepper  yellow  leaf  curl Indonesia virus (PYLCIV).
Gambar  2.  Hasil  amplifikasi  gen  protein selubung Begomovirus meng-
gunakan primer universal pAv494 dan pAc1048. Lajur M = marker  1kb  DNA  ladder;  SM= isolat asal Sumedang; SK= isolat asal  Sukabumi;  K=  isolat  asal Karawang;  KA=  isolat  asal Klungkung;  TA=  isolat  asal Tabanan; G= isolat asal Gianyar.
1000 pb 550 pb 250 pb
Tabel 2. Kesamaan SLCCNV isolat Tabanan dengan isolat yang terdapat di GenBank
Isolat Protein selubung (%) 1) Tanaman inang Nomor aksesi nt aa SLCCNV-MAS 94.5 95.8 Cucumis sativus EF197940 SLCCNV-PHI 92.4 96.3 Sechium edule EU487031 SLCCNV-THA 91.9 94.7 Benincasa hispida EU543562 SLCCNV-VIE 93.0 94.2 Cucurbita moschata KC857509 SLCCNV-CHN 92.1 94.7 C. moschata KC171648 SLCCNV-PAK 89.5 95.8 C. pepo AM286794 SLCCNV-IND 89.8 96.8 C. moschata DQ026296 TLCKV 76.9 76.9 Capsicum annum KF446675 PYLCIV 77.4 77.4 Capsicum annum NC008283 Keterangan: 1) Persentase tingkat kesamaan isolat virus didapatkan dari perhitungan menggunakan BioEdit v7.0.5. nt= nukleotida, aa= asam amino
Berdasarkan hasil BLAST pada
GenBank, isolat Klungkung, Karawang, Sukabumi, dan Sumedang memiliki kesamaan nukleotida  dan  asam  amino  tertinggi  dengan isolat  ToLCNDV  asal  Klaten,  Indonesia (AB613825)  (Tabel  3). ToLCNDV  isolat  KA, K, SK, dan SM memiliki kesamaan nukleotida yang  rendah  dengan  dua  isolat Begomovirus yang  diketahui  menginfeksi  tanaman  cabai  di
Indonesia yaitu TLCKV dan PYLCIV berkisar 67.5%  sampai  dengan  78.5%.  Kesamaan nukleotida antar ToLCNDV isolat Klungkung, Karawang,  Sukabumi,  Sumedang,  dan  Klaten (AB613825)  sangat  tinggi  mencapai  96%- 99.8%.  Hal  ini  menunjukkan  keragaman  gen protein  selubung  ToLCNDV  asal  Indonesia tidak dipengaruhi oleh faktor geografis.
Tabel 3. Kesamaan nukleotida dan asam amino ToLCNDV isolat Sumedang, Karawang, Sukabumi, dan Klungkung dengan ToLCNDV isolat lainnya yang terdaftar pada GenBank
Isolat 1) Klungkung Karawang Sukabumi Sumedang Nomor aksesi nt aa nt aa nt aa nt aa ToLCNDV-IDN 97.3 99.4 97.0 99.4 96.3 97.9 97.2 99.4 AB613825 ToLCNDV-THA1 94.2 98.9 94.7 98.9 94.0 97.3 94.9 98.9 AB368448 THA2 94.2 98.9 94.7 98.9 94.0 97.3 94.9 98.9 AB330079 ToLCNDV-IND1 94.2 98.9 94.4 98.9 93.7 97.3 94.4 98.9 KM269350 IND2 94.0 98.9 94.0 98.9 93.3 96.8 94.2 98.9 KJ744258 IND3 93.8 98.9 93.8 98.9 93.1 97.3 94.0 98.9 FN645905 IND4 93.5 98.4 93.8 98.4 93.1 96.8 94.0 98.4 AM286433 IND5 93.1 98.9 93.5 98.9 92.8 97.3 93.7 98.9 KC207815 ToLCNDV-PAK1 94.4 98.9 94.4 98.9 93.7 97.3 94.5 98.9 KC914896 PAK2 94.0 97.9 94.0 97.9 93.3 96.3 94.2 97.9 DQ116885 ToLCNDV-TAI 93.3 98.4 93.7 98.4 93.1 96.8 93.7 98.4 GU180095 TLCKV 68.4 78.0 68.5 78.0 67.5 75.9 68.7 78.0 KF446675 PYLCIV 71.0 78.5 71.2 78.5 70.5 76.9 71.3 78.5 NC008283 Keterangan : 1) ToLCNDV-IDN,  ToLCNDV  asal  Indonesia  yang  menginfeksi C.  sativus ;  ToLCNDV-TH1,  isolat ToLCNDV asal  Thailand  yang  menginfeksi C.  melo ; ToLCNDV-TH2,  isolat  ToLCNDV asal Thailand  yang  menginfeksi C.  sativus ;  ToLCNDV-IND1,  isolat  ToLCNDV asal  India  yang menginfeksi Citrullus  lanatus ;  ToLCNDV-IND2,  isolat  ToLCNDV  asal  India  yang  menginfeksi Momordica  charantia; ToLCNDV-IND3,  isolat  ToLCNDV  asal  India  yang  menginfeksi Lagenaria siceraria ; ToLCNDV-IND4, isolat ToLCNDV asal India yang menginfeksi C. moschata ; ToLCNDV- IND5,  isolat  ToLCNDV  asal  India  yang  menginfeksi Luffa  cylindrical; ToLCNDV-PK1,  isolat ToLCNDV asal Pakistan  yang  menginfeksi Chenopodium album ; ToLCNDV-TW, isolat ToLCNDV asal Taiwan yang menginfeksi C. melo var. makuwa ; TLCKV, isolat Tomato leaf curl Kanchanaburi virus asal Indonesia yang  menginfeksi C. annum ; PYLCIV, isolat Pepper yellow leaf curl Indonesia virus asal Indonesia yang menginfeksi C. annum .
2) Persentase tingkat kesamaan isolat virus didapatkan dari perhitungan menggunakan BioEdit v7.0.5. nt= nukleotida, aa= asam amino.
Analisis nukleotida menunjukkan
bahwa isolat Gianyar, Bali memiliki kesamaan nukleotida tertinggi (92.1%) dengan Ageratum yellows  vein  virus asal  Indonesia  yang menginfeksi tanaman N. benthamiana . Namun, AYVV isolat Bali memiliki kesamaan asam  amino  tertinggi  (95.8%)  dengan  AYVV yang  menginfeksi  tomat  Amerika  serikat sebesar 95.8% (Tabel 4).

## Analisis Filogenetika
Analisis filogenetika menunjukkan bahwa  isolat  SLCCNV  Bali  mengelompok dengan isolat SLCCNV asal Malaysia, Filipina, Thailand,  Vietnam,  dan  Cina,  dan  terpisah dengan  isolat  SLCCNV  asal  India  dan Pakistan (Gambar 3).
Menurut  Tahir et  al. (2010),  SLCCNV dibedakan menjadi dua strain virus berdasarkan  lokasi  geografis  yaitu  strain
“India”  dan  “Cina”.  SLCCNV  strain  “India” diketahui  hanya  menyebar  di  wilayah  India dan  Pakistan,  sedangkan  strain  “Cina” ditemukan di Cina dan Vietnam (Revill et al., 2003; Tahir et al., 2010). Berdasarkan analisis filogenetika, SLCCNV isolat Bali termasuk ke dalam strain “Cina”.
Hasil  analisis  filogenetika  ToLCNDV menunjukkan bahwa isolat Sukabumi, Karawang, Sumedang, dan Klungkung membentuk  satu cluster dengan  ToLCNDV
isolat  Klaten,  Indonesia  dan  terpisah  dengan ToLCNDV isolat dari Negara lainnya
(Gambar  4).  ToLCNDV  isolat  Tegal,  Sleman, Sukaharjo,  dan  Bogor  memiliki  kesamaan nukleotida yang tinggi sebesar lebih dari 95% dengan  isolat  ToLCNDV  asal  Klaten,  dan diklasifikasikan  sebagai  strain  “Indonesia” (Mizutani et al., 2011; Septariani et al ., 2014).

## Tabel 4. Kesamaan nukleotida dan asam amino AYVV isolat Gianyar dengan isolat yang terdapat di GenBank
Isolat Protein selubung (%) 1) Tanaman inang Nomor aksesi nt aa AYVV-IND 92.1 95.2 Nicotiana benthamiana AB100305 AYVV-PHI 91.6 95.2 Synedrella nodiflora KC577539 AYVV-CHN 90.9 95.2 Sonchus oleraceus AM940137 AYVV-USA 91.2 95.8 Solanum lycopersicum KR094067 AYVV-THA 90.2 94.7 Sauropus androgynous JN809820 AYVV-TAI 89.5 95.2 N. tabacum EF458639 AYVV-CHN 90.6 95.2 Ageratum conyzoides KJ016235 TLCKV 74.5 80.6 Capsicum annum KF446675 PYLCIV 72.4 79.5 C. annum NC008283 Keterangan  : 1) Persentase  tingkat  kesamaan  isolat  virus  didapatkan  dari  perhitungan  menggunakan  BioEdit  v7.0.5. Nt= nukleotida, AA= asam amino
Gambar 3. Pohon filogenetika Squash leaf curl China virus yang menginfeksi tanaman mentimun di Bali  menggunakan  perangkat  MEGA  6.0  dengan  metode Neighbour  Joining dengan bootstrap 1000x.
SLCCNV_CHN_Labu (KC171648) SLCCNV_VIE_Labu (KC857509)
SLCCNV_THA_Beligo (EU543562))
SLCCNV_MAS_Mentimun(EF197940)
SLCCNV_PHI_Labu siam (EU487031)
SLCCNV_IDN_Tabanan
SLCCNV_PAK_Waluh (AM286794)
SLCCNV_IND_Labu (DQ026296) TLCKV_IDN_Cabai (KF446675) PYLCIV_IDN_Cabai (NC008283) 100 100 81 93
Gambar 4. Pohon filogenetika ToLCNDV yang menginfeksi tanaman mentimun di Jawa Barat dan Bali  menggunakan  perangkat  MEGA  6.0  dengan  metode Neighbour  Joining dengan bootstrap 1000x.
Gambar  5.  Pohon  filogenetika  AYVV  yang  menginfeksi  tanaman  mentimun  di  Bali  menggunakan perangkat MEGA 6.0 dengan metode Neighbour Joining dengan bootstrap 1000x.
AYVV  merupakan  salah  satu  spesies Begomovirus yang  menginfeksi  tanaman gulma Ageratum  conyzoides .  Isolat  AYVV Bali  memiliki  kekerabatan  yang  cukup  jauh dengan AYVV isolat Indonesia yang menginfeksi N.  benthamiana meskipun  hasil kesejajaran  nukleotida  dan asam  amino  cukup tinggi. Hasil pengamatan yang dilakukan pada lahan  mentimun  di  Bali  menunjukkan  adanya beberapa  jenis  gulma  yang  tumbuh  di  sekitar tanaman  utama,  salah  satunya A.  conyzoides yang  menguning.  Diduga  gulma  tersebut sebagai  tanaman  reservoir  AYVV  pada pertanaman mentimun. AYVV memang belum
pernah  dilaporkan  menginfeksi  secara  alami pada tanaman mentimun di Indonesia. Namun, keberadaan  gulma  yang  merupakan  tanaman inang utama dari AYVV banyak ditemukan di pada  lahan  pertanaman  mentimun  di  Bali. Diduga,  AYVV  yang  ada  pada  gulma A. conyzoides diakuisisi oleh B. tabaci kemudian terbawa  secara  alami  pada  saat  serangga makan pada tanaman mentimun.
Penyakit kuning pada tanaman mentimun di  Jawa  Barat  dan  Bali  disebabkan  oleh  dua spesies Begomovirus yaitu Tomato  leaf  curl New  Delhi  virus dan Squash  leaf  curl  China virus . ToLCNDV  merupakan Begomovirus yang
ToLCNDV_IDN_Karawang ToLCNDV_IDN_Sumedang ToLCNDV_IDN_Sukabumi ToLCNDV_IDN_Klungkung
ToLCNDV_IDN_Mentimun (AB613825)
ToLCNDV_TAI_MELON (GU180095) ToLCNDV_THA_Melon (AB368448) ToLCNDV_THA_Mentimun (AB330079) ToLCNDV_PAK_Tomat (DQ116885) ToLCNDV_IND_Labu (AM286433) ToLCNDV_IND_Semangka (KM269350) ToLCNDV_IND_Paria (KJ744258) ToLCNDV_IND_Labu botol (FN645905) ToLCNDV_PAK_Chenopodium (KC914896)
TOLCNDV_IND_Belustru (KC207815) TLCKV_IDN_Cabai (KF446675) PYLCIV_IDN_Cabai (NC008283) 100 97 94 97 95 99 73 65 79 AYVCV_PHI_Jotang kuda (KC577539) AYVV_CHN_Tempuyung (AM940137) AYVV_IDN_Tembakau (AB100305) AYVV_USA_Tomat (KR094067)
AYVV_THA_Katuk (JN809820)
AYVV_TAI_Tembakau (EF458639)
AYVV_CHN_Babadotan (KJ016235) AYVV_IDN_Gianyar TLCKV_IDN_Cabai (KF446675) PYLCIV_IDN_Cabai (NC008283) 100 99 89
mendominasi pertanaman mentimun di provinsi  Jawa  Barat,  Jawa  Tengah,  D.I Yogyakarta,  dan  Bali  dengan  insidensi penyakit  28-100%  (Septariani et  al., 2014). SLCCNV  pertama  kali  dilaporkan  pada pertanaman  mentimun  di  Bali,  dan  saat  ini diketahui keberadaannya di Kabupaten Karawang dan  Sumedang  (Jawa  Barat).  ToLCNDV  dan SLCCNV  ditularkan  secara  efektif  melalui kutukebul Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae)  secara  persisten  sirkulatif  non- propagatif.  Peningkatan  insidensi Begomovirus berasosiasi  dengan  ledakan  populasi B.  tabaci sebagai  serangga  vektor,  terutama B.  tabaci biotipe B dan Q (Maruthi et al., 2007).
ToLCNDV merupakan masalah penting pada tanaman hortikultura di Asia (Maruthi et al., 2007;  Mizutani et  al., 2011;  Pratap et  al., 2011).  Virus  ini  memiliki  kisaran  inang  yang sangat  luas  dan  telah  diketahui  terdapat  23 isolat  yang  dilaporkan  dari  tanaman  inang yang berbeda (Padidam et al., 1995; Tiwari et al., 2010). SLCCNV memiliki karakter biologi dan  molekuler  yang  mirip  dengan  ToLCNDV (Brown et  al. ,  2012).  Selain  Cucurbitaceae, SLCCNV juga dilaporkan mampu menginfeksi secara  alami  pada  tanaman Chenopodium murale,  Convolvulus sp., Prosporis  farcta, Malva  parviflora (Al-Musa et  al., 2008). Tanaman  gulma  dikenal  sebagai  tanaman reservoir  dan  berperan  dalam  epidemiologi penyakit  yang  disebabkan  oleh Begomovirus. Gulma  berperan  dalam  menjaga  keberadaan virus  beserta  serangga  vektornya  tetap  hidup dan menyebabkan outbreak pada musim tanam selanjutnya. A.  conyzoides dikenal  sebagai inang  alami Begomovirus .  Gulma  ini  banyak ditemukan pada berbagai pertanaman hortikultura  dan  umumnya  menunjukkan gejala  pemucatan  tulang  daun  dan  mosaik kuning  (Khan et  al., 2014).  Meskipun Ageratum  yellow  vein  virus yang  menginfeksi pertanaman  mentimun  di  Gianyar  bukan menjadi  masalah  utama,  namun  hal  ini  perlu perhatian  lebih  lanjut.  Infeksi  lebih  dari  dua spesies Begomovirus akan  menyebabkan gejala yang lebih parah.
Infeksi  ganda  antara  ToLCNDV  dan SLCCNV pada pertanaman mentimun di Jawa Barat  dan  Bali  merupakan  temuan  pertama pada  penelitian  ini.  Kedua Begomovirus tersebut  memiliki  karakteristik  biologis  dan molekuler yang mirip. Hal ini dapat menyebabkan  terjadinya  rekombinasi  dan
berpotensi  menghasilkan  strain  baru  yang lebih  ganas  (Fondong et  al .,  2000).  Faktor utama yang berperan dalam munculnya spesies baru  dan  penyebarannya  antara  lain  adanya evolusi  keragaman  virus,  perubahan  sistem dan  intensitas  budidaya  tanaman,  perubahan biologi  serangga  vektor,  introduksi  tanaman baru,  introduksi  gen  inang  yang  rentan  pada saat  persilangan,  meningkatnya  pertukaran produk  pertanian  secara  global,  jaringan transportasi  antar  benua,  dan  perubahan kondisi iklim global (Khan et al., 2014).

## KESIMPULAN
Penyakit kuning pada tanaman
mentimun  di  Jawa  Barat  dan  Bali  disebabkan oleh infeksi tunggal dan campuran Squash leaf curl China virus, Tomato leaf curl New  Delhi virus, dan Ageratum  yellow  vein  virus .
ToLCNDV  merupakan  virus  yang  dominan menginfeksi  mentimun  di  lapangan  dengan insidensi penyakit 28-100%. SLCCNV terdeteksi  di  Tabanan,  Klungkung,  Gianyar, Karawang,  dan  Sumedang  dengan  insidensi penyakit  30-80%.  Keberadaan  SLCCNV  pada pertanaman  mentimun  di  Jawa  Barat  dan infeksi ganda antara ToLCNDV dan SLCCNV di  Jawa  Barat  dan  Bali  merupakan  temuan baru  dari  penelitian  ini.  Berdasarkan  analisis runutan  nukleotida  dan  asam  amino  gen protein  selubung  diketahui  bahwa  ToLCNDV dan  SLCCNV  pada  tanaman  mentimun  di Jawa  Barat  dan  Bali  adalah  ToLCNDV  strain Indonesia dan SLCCNV strain China.

## DAFTAR PUSTAKA
Aidawati,  N.,  S.H.  Hidayat,  R.  Suseno,  P. Hidayat, S. Sujiprihati. 2005. Identifikasi Geminivirus yang  menginfeksi  tomat berdasarkan  pada  teknik polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism . J. Mikrob.
Indones. 10(1): 29-32.
Al-Musa,  A.,  G.  Anfoka,  S.  Misbeh,  M. Abhary,  F.H.  Ahmad.  2008.  Detection and molecular characterization of Squash  leaf  curl  virus (SLCV)  in Jordan.  J.  Phytopathol . 156:  311-316. DOI: 10.1111/j.1439-0434.2007.01389.x.
Anggraini, S., S.H. Hidayat. 2014. Sensitivitas metode  serologi  dan  polymerase  chain reaction untuk mendeteksi Bean common mosaic  Potyvirus pada  kacang  panjang. J. Fitopatol. Indones. 10(1): 17-22.
Brown, J.K., C.M. Fauquet, R.W. Briddon, M. Zerbini, E. Moriones, J. Navas-Castillo. 2012.  Family  Geminiviridae.  p.  351- 373. In M.Q.A.  Kings,  M.J.  Adams,
E.B.  Carstens,  E.J.  Lefkowitz,  (eds). Virus  Taxonomy:  Ninth  Report  of  the International  Committee  on  Taxonomy of Viruses. Elsevier, Inc.
Doyle,  J.J.,  J.L.  Doyle.  1987.  A  rapid  DNA isolation  procedure  for  small  quantities of  fresh  leaf  tissues.  Phytochem.  Bull. 19: 11-15.
Flock, R.A., D.E. Mayhew. 1981. Squash leaf curl,  a  new  disease  of  cucurbits  in California. Plant Dis. 65: 75-76.
Fondong,  V.N.,  J.S.  Pita,  M.E.C.  Rey,  A.de Kochko,  R.N.  Beachy,  C.M.  Fauquet. 2000.  Evidence  of  synergism  between African cassava mosaic virus and a new double - recombinant geminivirus infecting cassava in Cameroon. J. Gen. Virol. 81: 287-297.
Khan,  M.S.,  A.K.  Tiwari,  S.K.  Raj,  A. Srivastava,  S.H.  Ji,  S.C.  Chun.  2014. Molecular epidemiology of Begomovirus occuring  on  some  vegetables,  grain legume,  and  weed  species  in  the  Terai Belt  of  North  India.  J.  of  Plant  Dis. Protec. 121(2): 53-57.
Kintasari, T., D.W.N. Septariani, S. Sulandari,
S.H. Hidayat. 2013. Tomato yellow leaf curl  Kanchanaburi  virus penyebab penyakit  mosail  kuning  pada  tanaman terung  di  Jawa.  J.  Fitopatol.  Indones. 9(4): 127-131.
Maruthi,  M.N.,  A.R.  Rekha,  V.  Muniyappa. 2007.  Pumpkin  yellow  vein  mosaic disease  is  caused  by  two  distinct Begomoviruses : complete viral sequences and  comparative  transmission  by  an indigenous Bemisia  tabaci and  the
introduced
B-biotype. Bulettin OEPP/EPPO Bulletin 37:412-419. Méndez-Lozano,  J.,  I.  Torres-Pacheco,  C.M. Fauquet,  R.F.  Rivera-Bustamant.  2003.
Interactions between Geminiviruses in a naturally  occurring  mixture: Pepper huasteco  virus and Pepper  golden mosaic virus . Phytopathol. 93: 270-277.
Mizutani, T., B.S. Daryono, M. Ikegami, K.T. Natsuaki.  2011.  First  report  of Tomato leaf  curl  New  Delhi  virus infecting cucumber  in  Central  Java,  Indonesia. Disease Notes. 95(11): 1485.
Nurulita,  S.,  S.H.  Hidayat,  K.H.  Mutaqin,  J. Thomas. 2015. Molecular characterization of Begomovirus infecting  yard  long bean ( Vigna unguiculata subsp.
sesquipedalis L.)  in  Java,  Indonesia. Biotropia . 22(1): 53-60. DOI: 10.11598/ btb.2015.22.1.401
Pratap,  D.,  A.R.  Kashikar,  S.K.  Mukherjee. 2011.  Molecular  characterization  and infectivity  of  a Tomato  leaf  curl  New Delhi  virus variant  associated  with newly  emerging  yellow  mosaic  disease of eggplant in India. Virol. J. 8(305): 1- 13.
Revill, P.A., C.V. Ha, S.C. Porchun, M.T. Vu, J.L. Dale. 2003. The complete nucleotide  sequence  of  two  distinct Geminiviruses infecting  cucurbits  in Vietnam.  Archiv.  Virol . 148:  1523- 1541. Ringwald, T.S., M. Lapidot. 2011.
Characterization of a synergistic interaction  between  two  Cucurbit- infecting Begomoviruses : Squash  leaf curl  virus  a nd Watermelon  chlorotic stunt  virus. Phytopathol . 101(2):  281- 289. DOI: 10.1094/PHYTO-06-10-0159.
Santoso,  T.J.,  S.H.  Hidayat,  M.  Herman, Sudarsono. 2013. Aplikasi teknik Polymerase  Chain  Reaction (PCR) menggunakan  primer Degenerate dan spesifik  Gen AV1 untuk  mendeketsi Begomovirus pada  tomat  ( Lycopersicon
esculentum Mill.).  J.  Hort.  Indonesia. 4(3): 140-149.
Septariani,  D.N.,  S.H.  Hidayat,  E.  Nurhayati. 2014.  Identifikasi  penyebab  penyakit daun  keriting  pada  tanaman  mentimun. Jurnal  Hama Penyakit Tumbuhan Tropika. 14(1): 80-86.
Singh,  R.,  S.K.  Raj,  V.  Prasad.  2008.

## Molecular characterization of a strain of
Squash  leaf  curl  China  Virus from North  India.  J.  of  Phytopathol . 156: 222-228.  DOI:  10.1111/j.1439-0434.
2007.01347.x.
Sulandari,  S.,  R.  Suseno,  S.H.  Hidayat,  J. Harjosudarmo,  S.  Sosromarsono.  2006.
Deteksi dan kajian inang virus penyebab penyakit daun keriting kuning cabai. Hayati . 13(1): 1-6.
Tahir,  M.,  M.S.  Haider,  R.W.  Briddon.  2010. First  report  of Squash  leaf  curl  China virus in  Pakistan.  Austr.  Plant  Dis. Notes . 5: 21-24.
Tamura,  T.,  G.  Stecher,  D.  Peterson,  A. Filipski,  S.  Kumar.  2013.  MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis  Version  6.0.  Mol.  Biol.  Evol. 30(12): 2725-2729. Tiwari,  A.K.,  P.K.  Sharma,  M.S.  Khan,  S.K.
Raj,  G.P.  Rao.  2010.  Molecular detection  and  identification  of Tomato leaf  curl  New  Delhi  virus isolate causing yellow mosaic disease in Bitter gourd ( Momordica charantia ), a medicinally  important  plant  in  India. Medicinal Plants . 2(2): 117-123.
Wiratama,  I.D.M.P.,  G.N.A.S.  Wirya,  N.N.P. Anyani,  I.D.N.  Nyana,  G.  Suastika. 2015. Laporan pertama infeksi Begomovirus pada  tanaman  mentimun di Bali. J. Fitopatol. Indones . 11(5): 175- 178.
Wyatt,  S.D.,  J.K.  Brown.  1996.  Detection  of subgroup III Geminivirus isolates in leaf extracts  by  degenerate  primers  and polymerase chain reaction. Phytopathol. 86: 1288-1293.