Vol. 05 No. 3, Desember 2014, Hal 167-173 ISSN: 2086-8227

## TEKNIK STERILISASI EKSPLAN DAN INDUKSI TUNAS DALAM MIKROPROPAGASI TEMBESU
( Fagraea fragrans ROXB)
Explant Sterilization and Shoot Induction Techniques in Micropropagation of Tembesu (Fagraea fragrans Roxb. )
Rhomi Ardiansyah 1 , Supriyanto 1 , Arum Sekar Wulandari 1 , Benny Subandy 2 , Yuli Fitriani 2
1 Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan, IPB
2 Pusat Perbenihan dan Persemaian Rumpin, Kementerian Kehutanan, Bogor

## ABSTRACT
Tembesu (Fragraea  fragans Roxb) is  important  tree  species  for  furniture  due  to  its  decorative  structure,  but  its propagation facing to the problems on seed availability. Determining explant sterilization technique of tembesu ( Fagraea fragrans Roxb.)  in  in  vitro  condition  is  needed  to  produce  aseptic  explants  for  shoot  induction  in  micropropagation techniques. Shoot induction of explants depends on plant growth regulator and growth medium compositions. This study was aimed (1)to analyzing the effect of sodium hypochlorite 10% in sterilization process to obtain aseptic explants, (2) to find out plant growth regulator and growth medium composition on shoot induction of tembesu ( F. fragrans Roxb.) in in vitro condition. This study was conducted at  Tissue Culture Laboratory , Rumpin Seed Source and Nursery Center , The Ministry  of  Forestry , Bogor  on  February  –  June  2014.  Explants  were  sterilized  using  sodium  hypochlorite  (NaOCl 5.25%) at 10% of concentrations in various durations (5, 10, 15, and 20 minutes).  Shoot induction was done using MS medium, MS modified medium, and MS added with 15% coconut water that combined with 1.5 ppm of BAP. The result showed that explants soaked in sodium hypochlorite 10% within 20 minutes was recommended for explants steriliziton technique  of  tembesu.  Combination  treatment between  BAP 1.5  ppm  and  MS  modified  medium  was  the  most  favorable culture medium for shoot induction of tembesu.
Keyword: Benzylaminopurine , Fagraea fragrans, micropropagation, Murashige-Skoog modified, sodium hypochlorite

## PENDAHULUAN
Eksplan yang digunakan pada teknik mikropropagasi harus  bebas  dari  kontaminan,  seperti  fungi  dan  bakteri. Teknik  sterilisasi  permukaan  banyak  digunakan  untuk menghilangkan kontaminan yang terdapat pada permukaan  eksplan.  Selama  proses  sterilisasi,  eksplan harus  tetap  hidup  dan  hanya  kontaminan  yang dieliminasi  (Oyebanji et  al .  2009).  Oleh  karena  itu, sterilisasi  permukaan  dilakukan  dengan  merendam eksplan  dalam  larutan  disinfektan  dengan  konsentrasi tertentu selama periode tertentu.
Sterilan,  atau  disinfektan,  yang  biasa  digunakan untuk  sterilisasi  permukaan  eksplan  adalah  natrium hipoklorit  (NaOCl)  atau  kalsium  hipoklorit  (Ca[OCl] 2 ) (Dodds  dan  Roberts  1985).  Senyawa  hipoklorit  sangat efektif  dalam  mengurangi  kontaminasi  pada  teknik mikropropagasi (Bhojwana dan Razdan 1996; Oyebanji et  al. 2009).  Penggunaan  Ca(OCl) 2 atau  NaOCl mempunyai kelebihan dan kekurangan dan memberikan hasil  yang  berbeda  untuk  setiap  jenis  eksplan  yang digunakan.  Sterilan  Ca(OCl) 2 memilki  pH  yang  stabil namun dapat merusak jaringan pada bagian pomotongan eksplan  sedangkan  NaOCl  memiliki  pH  yang  tidak stabil,  bersifat  toksik,  namun  tidak  merusak  jaringan. Sterilan  NaOCl  digunakan  sebagai  sterilan  dalam berbagai  teknik  sterilisasi  eksplan  dengan  konsentrasi dan  lama  perendaman  yang  berbeda  (Dumani et  al.
2007; Khan et al. 2007; Peiris et al. 2012; Goswami dan Handique 2013; Olowe et al. 2014)
Eksplan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah eksplan  tembesu.  Tembesu  ( Fagraea  fragrans Roxb.), jenis  lokal  yang  berpotensi  di  daerah  Jambi,  Sumatera Selatan,  Lampung  (Asmaliyah et  al. 2012)  dan Kalimantan  Barat  (Rosalia  2008).  Tembesu  merupakan jenis  tanaman  pionir  yang  dapat  tumbuh  di  areal  bekas terbakar  dan  padang  rumput.  Kayu  tembesu  dapat digunakan  untuk  kayu  konstruksi  bangunan,  jembatan, tiang listrik, dan furniture serta bagian kulit batang dan daun dari jenis ini dapat digunakan sebagai obat-obatan (Putra et al. 2011).
Sampai  saat  ini,  perbanyakan  vegetatif  tembesu dilakukan  dengan  metode  stek  batang  yang  memiliki persentase  keberhasilan  sebesar  92%  (Sofyan  dan Muslimin  2007).  Perbanyakan  secara  mikropropagasi masih  terbatas,  antara  lain  dilakukan  Lee  dan  Rao (1986)  menghasilkan  tunas  adventif  tembesu  melalui metode  mikropropagasi,  namun  secara  teknis  tidak dijelaskan dengan lengkap.
Metode mikropropagasi dapat dideskripsikan sebagai  multiplikasi  tanaman  secara in  vitro dengan menggunakan  media  buatan  aseptik  yang  mengandung larutan nutrisi, bahan organik, dan hormon (zat pengatur tumbuh  (ZPT)).  Metode  mikropropagasi  yang  sering digunakan untuk produksi bibit secara komersial adalah teknik  kultur  tunas.  Kultur  tunas  adalah  perbanyakan
tanaman dengan cara merangsang (proliferasi) pertumbuhan tunas aksilar atau adventif yang sudah ada pada  eksplan  (Sulistiani  dan  Yani  2012).  Pertumbuhan tunas,  aksilar  atau  adventif,  pada  eksplan  dipengaruhi oleh penggunaan ZPT (khususnya sitokinin) pada media tumbuh (George et al . 2008).
Sitokinin  berfungsi  untuk  mendorong  sintesis protein  dan  berpartisipasi  dalam  pengaturan  siklus  sel (Srivastava  2002;  George et  al .  2008).    Sitokinin berperan dalam banyak proses fisiologi dan perkembangan  tumbuhan,  termasuk  pematangan  daun, mobilisasi  nutrisi,  dominansi  apikal,  pembentukan  dan pengaktifan  meristem  pucuk  apikal,  perkembangan bunga, pemecahan dormansi pucuk, dan perkecambahan benih  (Taiz  dan  Zeiger  2002).  Pada  kegiatan mikropropagasi,  sitokinin  sintetik  banyak  digunakan untuk  mendorong  pertumbuhan  pucuk,  baik  itu  lateral maupun adventif. Sitokinin sintetik  yang paling banyak digunakan  antara  lain  benziladenin  (BA/BAP)  dan kinetin  (Srivastava  2002).  Benziladenin  (BA/BAP) dapat  mendorong  petumbuhan  pucuk  aksilar  namun menghambat pemanjangan pucuk (George et al . 2002).
Morfogenesis  tanaman  pada  media  mikropropagasi juga  dipengaruhi  oleh  total  nitrogen  yang  terdapat  di dalam  media  (George et  al .  2002).  Media  mikro- propagasi  yang  biasa  digunakan  untuk  mikropropagasi adalah  media  MS  (Murashige  dan  Skoog  1962).  Pada media  ini,  total  nitrogen  yang  terdapat  di  dalam  media adalah  60  µM  dengan  rasio  NO 3 - :NH 4 + adalah  2:1. Rasio  nitrat  dan  ammonium  pada  media  kultur  dapat mempengaruhi  aktivitas  ZPT  (George et  al .  2002). Penelitian  ini  bertujuan  (1)  untuk  mendapatkan  teknik sterilisasi  yang  tepat  untuk  menghasilkan  eksplan tembesu steril dan (2) menganalisis pengaruh komposisi media tumbuh terhadap induksi tunas tembesu.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di Tissue Culture Laboratory , Rumpin  Seed  Source  and  Nursery  Center , KOICA,  Bogor.  Waktu  pelaksanaannya  pada  bulan Februari sampai dengan Juni 2014.

## Alat dan Bahan
Bahan  yang  digunakan  antara  lain  bagian  tunas (apikal  atau  lateral)  tembesu  ( F.  fragrans )  berukuran  2 sampai  dengan  3  cm,  fungisida  (bahan  aktif  propineb 70%),  bakterisida  (bahan  aktif  streptomicyn  sulfate 6.41%),  media  Murashige-Skoog (MS)  (Murashige  and Skoog 1962), air kelapa ( coconut water (CW)), akuades steril,  deterjen,  alkohol  70%, tween 20,  natrium hipoklorit  (NaOCl  5.25%),  dan  benzilaminopurin (BAP).  Alat  yang  digunakan  antara  lain laminar  air flow cabinet (LAF), botol kultur, cawan petri, dan gelas ukur.

## Metode Penelitian
Sterilisasi  eksplan  dilakukan  dengan  cara  dicuci menggunakan  deterjen  (2g/L,  10  menit),  direndam
dalam  fungisida  kontak  (3  g/L,  2  jam),  dan  bakterisida (3  g/L,  1  jam)  yang  dilakukan  di  luar  LAF.  Perkejaan berikutnya  dilakukan  di  dalam  LAF,  eksplan  direndam dalam  larutan  NaOCl  konsentrasi  10%  (v/v)  dan tween 20  (2  tetes).  Lama  perendaman  bervariasi  bergantung pada  perlakuan.  Setelah  eksplan  disterilasi  kemudian ditanam pada media MS.
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian  ini  adalah  rancangan  acak  lengkap  dengan satu  faktor  yaitu  waktu  perendaman  NaOCl  10%  (v/v) dengan  4  taraf  perlakuan  (5,  10,  15,  dan  20  menit). Setiap  perlakuan  terdiri  atas  3  ulangan,  setiap  ulangan terdiri  atas  10  eksplan.  Total  eksplan  yang  digunakan adalah 4x3x10=120 eksplan.
Pengamatan  dilakukan  selama  4  minggu.  Peubah yang diukur yaitu:
Persentase  hidup  eksplan  aseptik:  jumlah  eksplan yang  dapat  hidup  dan  aseptik,  dengan  kriteria memiliki pertumbuhan pucuk dan/atau akar dibandingkan dengan jumlah seluruh eksplan.
Persentase  kontaminasi:  jumlah  eksplan  yang mengalami  kontaminasi  bakteri  dan/atau  fungi dibandingkan dengan seluruh jumlah eksplan.
Persentase  pencokelatan  ( browning ):  jumlah  eksplan yang  mengalami  pencokelatan  dibandingkan  dengan jumlah seluruh eksplan.
Eksplan  yang  telah  aseptik  kemudian  dipindahkan ke  media  induksi  tunas.  Media  yang  digunakan  untuk induksi  tunas  yaitu  MS,  MS  modifikasi  (NO 3 - :NH 4 + , 3:1,  total  N  80  µM),  dan  MS  dengan  tambahan  air kelapa  (CW)  150  mL/L.  Rancangan  percobaan  untuk tahap induksi tunas yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap dengan satu faktor yaitu komposisi  media  tumbuh  (MS0,  MS  modifikasi, MS+CW 15%, MS+BAP 1.5 ppm, MS modifikasi+BAP 1.5  ppm,  dan  MS+CW  15%+BAP  1.5  ppm).  Setiap perlakuan  terdiri  atas  3  ulangan  dan  setiap  ulangan terdiri  atas  5  eksplan,  sehingga  total  eksplan pengamatan berjumlah 6x3x5=90 eksplan.
Pengamatan  dilakukan  selama  4  minggu.  Peubah yang diukur yaitu:
Panjang tunas: panjang tunas baru yang tumbuh. Jumlah  daun:  selisih  jumlah  daun  akhir  pengamatan dan awal pengamatan.
Warna  daun:  hasil  pengukuran  warna  daun menggunakan bagan warna daun (BWD).
Jumlah tunas: selisih jumlah tunas akhir pengamatan dan awal pengamatan.
Perilaku organogenesis: deskripsi perilaku organogenesis yang terjadi selama waktu pengamatan

## Analisis Data
Data  yang  diambil  kemudian  dianalisis  meng- gunakan sofware Microsoft Excel , SAS Version 9.1 , dan Minitab Version 16 . Untuk menentukan perbedaan antar perlakuan dilakukan uji jarak berganda Duncan (Mattjik dan Sumertajaya  2000).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Sterilisasi eksplan
Kontaminasi merupakan masalah paling umum yang ditemui  pada  teknik  mikropropagasi.  Umumnya  ada empat sumber kontaminan yaitu: (1) pada tanaman baik internal  maupun  eksternal,  (2)  media  kultur  yang  tidak disterilisasi dengan baik, (3) kondisi lingkungan, dan (4) cara  kerja  yang  salah  (Onwubiko et  al. 2013). Kontaminan  yang  berasal  dari  berbagai  sumber,  seperti fungi  dan  bakteri,  dapat  mengurangi  produktivitas  dan tingkat keberhasilan kultur (Colgecen et al. 2011).
Kondisi  eksplan  yang  aseptik  merupakan  syarat untuk    dapat  meningkatkan  keberhasilan  eksplan tumbuh  dan  aseptik  sehingga  dapat  dilanjutkan  ke tahapan berikutnya pada teknik miropropagasi. Tahapan ini disebut dengan tahap inisiasi.
Pada  proses  penelitian  ini,  sebelum  melaksanakan tahap  inisiasi,  sumber  eksplan  dikarantina  selama  4 minggu di bedeng persemaian.  Selama dalam karantina dilakukan  penyemprotan  sumber  eksplan  menggunakan fungisida (3 gr/L, 1 minggu sekali), bakterisida (3 gr/L, 1 minggu  sekali), dan pestisida/insektisida (10 mL/L, 2 minggu  sekali).  Penyemprotan  ini  bertujuan  untuk menghindarkan sumber eksplan dari hama dan penyakit. Kegiatan  ini  juga  bertujuan  untuk  meminimalkan
terjadinya  kontaminasi  fungi  dan  bakteri  pada  kegiatan sterilisasi.
Sterilisasi  menggunakan  NaOCl  10%  (v/v)  dengan waktu    5,  10,  15,  dan  20  menunjukkan  bahwa  lama waktu  perendaman  mempengaruhi  persentase  hidup eksplan  dan  kontaminasi.  Eksplan  yang  disterilisasi dengan  waktu  5-10  menit  memiliki  nilai  100% terkontaminasi,  baik  fungi  mau  pun  bakteri  (Tabel  1). Hal  ini  dikarenakan  perendaman  dengan  NaOCl  10% (v/v)  selama  5-10  menit  masih  belum  dapat menghilangkan  keberadaan  agen  kontaminan  yang terdapat  pada  permukaan  eksplan.  Penambahan  waktu perendaman  menjadi  15-20  menit  menghasilkan terjadinya  peningkatan  jumlah  eksplan  tembesu  aseptik dengan  persentase.  Tabel  1  menunjukkan  bahwa perlakuan  perendaman  NaOCl  10%  (v/v)  selama  20 menit  merupakan  metode  sterilisasi  paling  baik  dengan nilai persentase eksplan aseptik 33.33%.
Kontaminasi  terjadi  mulai  dari  hari  ke-3  setelah penanaman.  Kontaminan  yang  pertama  kali  muncul adalah  kontaminasi  fungi.  Hifa  fungi  terdapat  pada seluruh  bagian  eksplan.  Hifa  ini  kemudian  menutupi seluruh  bagian  eksplan  pada  hari  ke-4  dan  ke-5  setelah penanaman (Gambar 1). Kontaminasi fungi juga muncul pada  hari  ke-7  setelah  penanam.  Hanya  sedikit  eksplan yang  tetap  tumbuh  dan  aseptik  sampai  akhir pengamatan.
Gambar 1   Eksplan hasil sterilisasi; (a) eksplan terkontaminasi, (b) awal munculnya kontaminasi pada bagian atas eksplan, (c) eksplan aseptik.
Keseimbangan antara konsentrasi bahan sterilan dan lama  perendaman  harus  ditentukan  secara  empiris karena  adanya  sifat  fitotoksis  dari  sterilan  (Bhojwana dan Razdan 1996; Oyebanji et al . 2009; Badoni&Chauhan  2010).  Perendaman  dengan  sterilan NaOCl  1%  selama  8  menit  menghasilkan  persentasi hidup  eksplan  aseptik  pada  mikropropagasi  kentang ( Solanum  tubersumi ) kultivar „Kufri Himalini‟ (Badoni dan  Chauhan  2010).  Pada  mikropropagasi Prunus mariana ,  perendaman  dengan  NaOCl  10%  selama  20 menit  menghasilkan  persentase  hidup  eksplan  terbaik
(Amiri et  al. 2013).  Sterilisasi  permukaan  pada  benih cowpea ,  padi, dan  sorgum    menggunakan  NaOCl  3.5% yang  direndam  selama  30  menit  sangat  efektif  dalam menghasilkan  benih  aseptik  (Oyebanji  2009).  Namun, pada  mikropropagasi  ubi  manis,  penggunaan  seterilan NaOCl  tidak  efektif  dalam  penghambatan  mikroba  dan hanya menghasilkan eksplan aseptik yang sangat sedikit (Onwubiko et al. 2013).
Percobaan  konsentrasi  NaOCl  tergantung  pada kondisi  eksplan  yang  disterilisasi.  Pada  eksplan  yang sekulen  harus  menggunakan  konsentrasi  yang  lebih
Tabel 1  Pengaruh  lama  perendaman  NaOCl  10%  terhadap  persentase  eksplan  hidup,  kontaminasi,  dan pencokelatan pada eksplan tembesu
Waktu peremdaman Persentase eksplan hidup (%)* Persentase kontaminasi (%)* Persentase Pencokelatan (%) 5 menit 0 b 100 a 0 10 menit 0 b 100 a 0 15 menit 26.67 ± 11.55 a 73.33 ± 11.55 b 0 20 menit 33.33 ± 23.09 a 66.67 ± 23.09 b 0
Data  sudah  ditranformasi  menggunakan  metode  arcsin;  Angka  yang  diikuti  oleh  huruf  yang  sama  pada  kolom  yang  sama  menunjukkan  tidak berbeda nyata pada uji Duncan p-value < α ; * : Berpengaruh nyata pada taraf (α) 0.05 ( p-value < α); ns : Tidak berpengaruh nyata pada taraf (α) 0.05 ( p-value > α).
a b c
rendah,  begitu  juga  sebaliknya.  Pada  keseluruhan eksplan  terdapat  bakteri  yang  tumbuh  pada  bagian bawah  eksplan  yang  berdekatan  langsung  dengan media.  Namun  keberadaan  bakteri  tersebut  tidak mematikan eksplan. Pada beberapa eksplan, kemunculan bakteri ini diikuti dengan munculnya fungi yang  tumbuh  pada  bagian  bawah  eksplan.  Bentuk kontaminasi seperti ini hanya terjadi pada sebagian kecil eksplan merupakan kontaminasi endogen.
Sterilisasi  menggunakan  NaOCl  10%  (v/v)  tidak dapat  menghilangkan  100%  kotaminasi,  baik  fungi maupun  bakteri.  Hal  ini  bukan  berarti  bahwa  tembesu tidak dapat diperbanyak dengan teknik  mikropropagasi. Eksplan aseptik yang berasal dari sterilisasi harus segera dipindahkan  ke  media  multiplikasi  supaya  dapat menghasilkan  banyak  tunas  baru  yang  kemudian  akan menjadi planlet.

## Induksi tunas
Perlakuan media dengan penambahan  ZPT BAP 1.5 ppm  menhasilkan  jumlah  tunas  yang  berbeda  nyata (Tabel 2). Semua perlakuan berpengaruh nyata terhadap penambahan ZPT BAP 1.5 ppm.
Penggunaan  ZPT  BAP  pada  induksi  tunas  tembesu sangat  berpengaruh  terhadap  jumlah  tunas  yang dihasilkan.  Induksi  tunas  pada  eksplan  terjadi  pada minggu  kedua  setelah  tanam.  Hal  ini  terlihat  dari munculnya  tunas-tunas  berukuran  kecil  pada  bagian ketiak  daun  dan,  pada  beberapa,  terdapat  tunas  yang tumbuh  pada  daun  (Gambar  2).  Pada  periode  ini  ada eksplan yang terlihat mulai membengkak dan membetuk kalus berwarna hijau muda.
Pada  media  MS  modifikasi,  konsentrasi  ion  nitrat ditingkatkan menjadi 60 mM dan ion amonium tetap 20 mM.  Ion  amonium  tidak  dinaikkan  karena  memiliki sifat  toksik.  Amonium  dapat  menyebabkan  klorosis pada  daun,  pertumbuhan  kerdil  yang  kemudian  terjadi nekrosis  (pencokelatan)  dan  akhirnya  mati  (Marschner 2012).  Pertumbuhan  dan  morfogenesis  pada  kultur jaringan dipengaruhi oleh ketersedian nitrogen di media tumbuh (George et al . 2008).
Secara  umum,  pembentukan  tunas  pada  eksplan tembesu  dipengaruhi  oleh  penambahan  ZPT  BAP  pada setiap  perlakuan,  baik  MS,  MS  modifikasi,  dan  MS dengan  tambahan  air  kelapa.  Perlakuan  dengan tambahan  ZPT  BAP  memiliki  jumlah  tunas  yang  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  perlakuan  tanpa  ZPT. Untuk parameter panjang tunas terlihat bahwa perlakuan
tanpa  ZPT  memiliki  nilai  tertinggi  dari  pada  perlakuan dengan  tambahan  ZPT.  Hal  ini  disebabkan  BAP  dapat mendorong petumbuhan pucuk aksilar namun menghambat pemanjangan pucuk (George et al . 2002).
Untuk  parameter  jumlah  daun,  terlihat  bahwa perlakuan  MSmod+BAP  memiliki  nilai  tertinggi kemudian  diikuti  oleh  perlakuan  MS0.  Hal  ini menunjukkan jumlah daun berhubungan dengan jumlah tunas dan panjang tunas. Banyaknya tunas yang muncul akan  berpengaruh  terhadap  jumlah  daun  yang  muncul, dan  begitu  pula  dengan  panjang  tunas.  Namun  analogi ini  tidak  sepenuhnya  terjadi  pada  semua  eksplan.  Ada beberapa  eksplan  yang  memiliki  panjang  tunas  yang tinggi  namun  jumlah  daun  yang  sedikit,  seperti  pada perlakuan  MSmod.  Hal  ini  dapat  terjadi  karena  pada perlakuan  ini,  pertumbuhan  eksplan  mengarah  pada pemanjangan  internode  dan  tidak  memunculkan  tunas baru,  atau  pemanjangan  tunas  apikal.  Subkultur  tunas pada  media  tanpa  ZPT  berdampak  positif  pada pemanjangan  tunas  dan  menghambat  pembentukan kalus (Ali 2009).
Penggunaan  ZPT  BAP  untuk  induksi  tunas  sudah digunakaan  pada  mikropropagasi  beberapa  jenis tanaman hutan. Pada mikropropagasi Azadirchta indica A.  Juss,  penambahan  BAP  1  µM  (0.2  mg/L)  dan  GA 3 0.5  µM,  menghasilkan  pertumbuhan  tunas  kerdil  dan tidak  memanjang  (Chaturvedi et  al. 2004).  Pada mikroropagasi Exavacum effine , BAP 5 µM menghasilkan  eksplan  bertunas  sebesar  15  dari  18 sample (Kapchina-Toteva VM et al . 2005). Penggunaan BAP  sudah  sering  diaplikasikan  pada  mikropopagasi tanaman  (Piatczak  dan  Wysokinska  2003;  Holobic  dan Blinda 2005; Janatrhanam dan Sumathi 2010; Pant et al . 2010; Baluprakash et al . 2011; Behera dan Raina 2012; Tao et al . 2012; Nalini dan Velayutham 2013).
Penggunaan air kelapa dalam kegiatan mikropropagasi  sudah  banyak  dilakukan  pada  beberapa penelitian.  Penggunaan  air  kelapa  digunakan  sebagai pengganti  ZPT  sintetik  yang  dijual  di  pasaran.  Hal  ini karena  air  kelapa  merupakan  endosperma  cair  yang banyak  mengandung  ZPT  yang  dibutuhkan  untuk pertumbuhan  tanaman  seperti  auksin,  sitokinin,  dan giberelin,  dengan  konsentrasi  kandungan  yang  berbeda untuk tiap tingkatan kemasakan buah kelapa. Air kelapa juga  mengandung  gula  (sumber  karbohidrat)  dan  gula alkohol yang dapat memperbaiki pertumbuhan secara in vitro (Wattimena 1991).
Tabel 2  Pengaruh  komposisi  media  tumbuh  jumlah  tunas,  panjang  tunas,  jumlah  daun  dan  warna  daun  pada mikropropagasi tembesu.
Perlakuan Jumlah tunas** Panjang tunas* Jumlah daun* Warna daun** MS0 1.333 ± 0.882 b 4.4167 ± 0.984 a 4.333 ± 1.453 ab 1.0833 ± 0.1443 a MSmod 0.389 ± 0.096 b 3.0533 ± 0.632 ab 1.944 ± 0.585 bc 0.7778 ± 0.1925 a MS+CW 0 b 0 c 0 c 0 c MS+BAP 8.667 ± 4.333 a 1.9033 ± 0.532 bc 2.889 ± 2.694 bc 0.7778 ± 0.1925 a MSmod+BAP 11.861 ± 3.350 a 2.3067 ± 0.833 ab 6.778 ± 2.546 a 0.6667 ± 0.3333 ab MS+CW+BAP 2.667 ± 2.517 b 2.778 ± 2.546 ab 2.889 ± 2.524 bc 0.3333 ± 0.3333 bc
Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan p-value < α  (0.05); * : Berpengaruh nyata pada taraf (α) 0.05 ( p-value < α);  **
: Berpengaruh sangat nyata pada taraf (α) 0.01 ( p-velue < α).
Teknik Sterilisasi Eksplan dan Induksi Tunas 171 Penggunaan air kelapa dan BAP dapat menggantikan  penggunaan  zeatin  pada  media  kultur Olive  ( Olea  europeae L.).  Multiplikasi  tunas  tertinggi terdapat pada media kultur dengan tambahan zeatin 9.12 µM  dan  BAP  8.87  µM  yang  ditambahkan  dengan  50 mg/L  (Piexe et  al .  2007).  Air  kelapa  saja  tidak  cukup
untuk  menghasilkan proliferasi tunas  yang  memuaskan, namun  dalam  beberapa  kasus  juga  dapat  meningkatkan jumlah tunas per eskplan. Kombinasi air kelapa dengan ZPT  dapat  meningkatkan  dua  kali  lipat  hasil multiplikasi  daripada  media  dengan  air  kelapa  saja (Piexe et al . 2007; Sandoval et al . 2014).
Gambar 2  Pertumbuhan  tunas  yang  terdapat  pada  daun  pada  awal  dan  akhir  pengamatan;  a.  perlakuan MSmod+BAP, b. Perlakuan MS+BAP.
Gambar 3  Pertumbuhan  eksplan  pada  perlakuan  MS+CW15%;  a.  pertumbuhan  tunas  pada  perlakuan  dengan tambahan ZPT, b. dan c. pencokelatan pada perlakuan tanpa ZPT.
Pada  perlakuan  media  dengan  tambahan  air  kelapa terjadi  kematian  eksplan  yang  disebabkan  oleh  bakteri. Pada eksplan tembesu, untuk semua perlakuan, terdapat bakteri  yang  tumbuh  pada  media.  Bakteri  ini  tidak menyebabkan kematian pada seluruh eksplan, kalau pun terjadi kematian eksplan, kematian hanya terjadi dengan persentasi  yang  kecil.  Perbedaan  terjadi  pada  media yang ditambahkan dengan air kelapa 15%. Pertumbuhan bakteri pada perlakuan ini dapat membuat eksplan mati (Gambar  3b  dan  3c).  Eksplan  awalnya  resisten  dengan adanya  bakteri  ini,  namun  pada  akhirnya  eksplan mengalami  pengcoklatan  dan  kemudian  mati.  Jumlah kematian  eksplan  sangat  banyak  terjadi  pada  perlakuan media  dengan  tambahan  air  kelapa.  Kematian  yang terjadi  pada  perlakuan  ini  mencapai  100%,  terutama pada perlakuan tanpa tambahan ZPT.
Perlu  adanya  perlakuan  tambahan  pada  media dengan  tambahan  air  kelapa.  Dari  hasil  multiplikasi tunas  pada  media  dengan  tambahan  air  kelapa menunjukkan  pertumbuhan  tunas  yang  memuaskan (Gambar  3a),  namun  terjadi  banyak  kematian  eksplan yag disebabkan oleh adanya bakteri yang tumbuh secara cepat  pada  media.  Perlu  adanya  modifikasi  perlakuan pada  media  supaya  pertumbuhan  eksplan  dapat  tetap baik  dan  keberadaan  bakteri  tidak  sampai  mematikan eksplan.  Potensi  air  kelapa  sangat  baik  pada  penelitian ini  sehingga  sangat  diperlukan  kombinasi  yang  tepat dalam mengkomposisikan media ini.

## SIMPULAN DAN SARAN
Sterilisasi  eksplan  untuk  mendapatkan  eksplan aseptik  dibutuhkan  kegiatan  karantina  semai  sebelum disterilisasi  untuk  mendapatkan  eksplan  yang  sehat. Eksplan  tembesu  aseptik  dapat  dihasilkan  dengan perendaman NaOCl 10% (v/v) selama 20 menit dengan persentase keberhasilan 33.33%.
Media  MS  modifikasi  dengan  tambahan  BAP  1.5 ppm  mampu  menginduksi  tunas  adventif  dan  aksiler untuk  menghasilkan  jumlah  tunas  tertinggi  dari  pada perlakuan lainnya.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian  ini  didukung  oleh Rumpin  Seed  Source and Nursery Center , Ministery of Forestry , Bogor.

## DAFTAR PUSTAKA
Amiri  S,  Ashtari  S,  Abdullah  HB,  Nazari  SA, Khodadadi  E,  Khodadadi  E,  Sabzi  M.  Control contamination  during  micropropagation  process  of rootstock  Mariana  ( Prunus  mariana ). Annals  of Biological Research 4(3):149-151.
Ali  YH.  2009.  Tissue  culture  in  Sudan  forest in  vitro germination and micro-propagation of Acacia tortilis subspp. Spirocarpa ,  a  multipurpose  forest  tree. Journal  of  Genetic  Engineering  and  Biotechnology 7(1):3-10.
b
a
b a c
Anshari  GZ.  2006. Dampak  Pengelolaan  Kolaboratif Menyelamatkan  Taman  Nasional  Danau  Sentarum. Bogor (ID): CIFOR.
Asmaliyah, Imanullah A, Dawiati W. 2012. Identifikasi dan potensi kerusakan rayap  pada tanaman tembesu ( Fagaea  fragrans )  di  kebun  percobaan  Way Hanakau,  Lampung  Utara. Jurnal  Penelitian  Hutan Tanaman 9(4):187-194.
Badoni  A,  Chauhan  JS.  2010.  In  vitro  sterilization protocol for micropropagation of Solanum tubersum cv. “Kufri Himalini”. Acedemia Arena 2(4): 24-28.
Baluprakash  T,  Arumugasamy  K,  Paulsamy  S, Udhayasankar  MR,  Danya  U.  2011. In  vitro regeneration of Exacum wightianum Arn. (Gentianaceae)-  an  endemic  medical  plant  from  the Nilgiris,  Weatern  Ghats. Journal  of  Applied Pharmacentical Science 01(10):167-171.
Behera  MC,  Raina  R.  2012. Gentiana  kurro Royle  –  a critically endangered bitter herb. Int J Arom Plants 2
(1):22-29.
Bhojwani  SS,  Razdan  MK.  1996. Plant  Tissue  Culture Theory and Practice, a Revised Edition . Amsterdam (NED): Elsevier.
Chaturvedi R, Razdan MK, Bhojwana SS. 2004. In vitro clonal  propagation  of  an  adult  tree  of  neem ( Azhadirachta  indica A.  Juss.)  by  forced  axillary branching. Plant Science 166:501-506.
Colgecen  H,  Koca  U,  Toker  G.  2011.  Influence  of different  sterilization  methods  on  callus  initiation and  production  of  pigmented  callus  in Arnebia densiflora Ledeb. Turk J Biol. 35:513-520.
Dodds  JH,  Robert  LW.  1985. Experiment  in  Plant Tissue  Culture .  2 nd editon .  New  York  (US):
Cambridge University Press.
Dumani  A,  Yoldas  O,  Isci  AS,  Kuksal  F,  Kayar  B, Polam  E.  2007.  Disinfection  of  artificially contaminated  Redilon cones  with chlorhexidine and sodium  hypochlorite  at  different  time  exposures. J Tripleo. 103(3):82-85.
Goerge  EF,  Hall  MA,  de  Klerk  GJ.  2008. Plant Propagation  by  Tissue  Culture .  3 rd edition . Dordrecht (NED): Springer.
Goswami  NK,  Handique  PJ.  In  vitro  sterilization protocol  for  micropropagation  of  Musa  (AAA group) ‟Amritsagar‟ Musa (AAB  group) „Malbhog‟ and  Musa  (AAB  group)  „Chenichampa‟  Banana. Indian Journal of Applied Research 3(6):51-54.
Holobic I, Blinda R. 2006. In vitro culture introduction for ex  situ conservation  of  some  rare  plant  species. Rom J Biol - Plant Biol. 51:13-23.
Janatrhanam  B,  Sumathi  E.  2010.  In  vitro  plant Regeneration from Shoot tip Explants of Exacum  travancoricum  Beedi. Plant  Tissue  Cult  & Biotech. 29(2):113-118
Kapchina-Toteva  VM,  Lakimova  ET,  Chavdarov  IP. 2005.  Effect  of  cytokinins  on in  vitro cultured
Exacum affine Balf. Di dalam: Guev B, Niklova M, Donev  A,  editor. Balkan  Scientific  Conferene  of Biology ;  2005  May  19-21,  Plovdiv,  Bulgaria. Plovdiv (BG): University of Plovdiv. hlm 714-722.
Khan  SA,  Rashid  H,  Chaudhary  MF,  Chaudhary  Z.
2007. Optimization of explant sterilization condition in  sugarcane  cultivars. Pakistan  J  Agric  Res. 20(3- 4):119-123.
Lee SK, Rao AN. 1986. In vitro regeneration of planlet in Fagaea  fragrans Roxb  –  a  tropical  tree. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture 7:43-51.
Marschner Petra. 2012. Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants . 3 rd edition. London (UK): Elsevier Science.
Martawijaya  A,  Kartasujana  I,  Mandang  YI,  Prawira SA,  Kadir  K.  1992. Atlas  Kayu  Indoneisa  Jilid  II . Bogor (ID): Balitbang Kehutanan.
Murashige  T,  Skoog  F.  1962.  A  revised    medium  for rapid  growth  and  bioassays  with  tobacco  tissue cultures. Physiologia Plantarum 15:473-497.
Nalini  P,  Velayutham  P.  2013.  In  vitro  mass propagation  of Enistemma  littor Blume  from  shoot tip  explants. Journal  of  Biology,Agriculture  and Healthcare 3(5):72-79.
Olowe O, Adesoye A, Ojoba O, Amusa O, Liamngee S. 2014.  Effect  of  sterilization  and  phytohormones  on shoot tip culture of Telfairia occidentalis . Journal of Natural Science Research 4(2):53-58.
Onwubiko  NC,  Nkogho  CS,  Anyanwu  CP,  Onyeishi GC.  2013.  Effect  of  different  concentration  of sterilant and exposure time on sweet potato ( Ipomea batatas Lam)  esplants. International  Journal  of Current Microbiology and Applied Sciences 2(8):14- 20.
Oyebanji  OB,  Nweke  O,  Odebunmi  O,  Galadima  NB, Idris  MS,  Nnodi  UN,  Afolabi  AS,  Oghadu  GH. Simple,  effective  and  economical  explant-surface sterilization protocol for cowpea, rica, and sorghum seeds. African Journal of Biotechnology 8(20):5395- 5399.
Pant M, Bisht P, Gusain MP. 2010. In vitro propagation through  axillary  bud  culture  of Swertia  chirata Buch.-Ham ex Wall: an endangered medicinal herb. IJIB 10(1):48-53.
Peiris  SE,  de  Silva  EDUD,  Edussuriya  M,  Attanayake AMURK,  Peiris  BCN.  2012.  CSUP  thechnique:  a low  cost  sterilization  method  using  natrium hipoklorit to replace the use of expensive equipment in  micropropagation. J  Natn  Sci  Foundation  Sri Lanka 40(1):49-54.
Piatczak  E,  Wysokinska  H.  2003. In  vitro regeneration of Centaurium  erythraea Rafn  from  shoot  tips  and othe  seddling  explant. Acta  Societa  Botanicorium Poloniae 72(4):283-288.
Putra  CAS,  Manuri  S,  Heriyanto,  Sibagariang  C.  2011. Pohon-Pohon  Hutan  Alam  Rawa  Gambut  Merang . Palembang (ID): MRPP-GIZ.
Rosalia  N.  2008.  Penyebaran  dan  karakteristik  tempat tumbuh  pohon  tembesu  [tesis].  Bogor  (ID):  Institut Pertanian Bogor.
Sofyan  A,  Muslimin  I.  2007.  Pengaruh  asal  bahan  dan media  stek  terhadap  pertumbuhan  stek  batang Tembesu  ( Fagraea  fragrans Roxb). Ekspose  Hasil- hasil  Penelitian ,  2007  Sept  20,  Padang,  Indonesia. Bogor  (ID):  Pusat  Penelitian  dan  Pengembangan Hutan dan Konservasi Alam. hlm 201-206.
Srivastava  LM.  2002. Plant  Growth  and  Development: Hormones  and  Environment .  California    (US): Elsevier Science.
Sulistiani  E,  Yani  SA.  2012. Produksi  Bibit  Tanaman dengan  Menggunakan  Teknik  Kultur  Jaringan . Bogor (ID): Seameo-Biotrop.
Taiz  L,  Zeiger  E.  2002. Plant  Physiology .  Edisi  ke-3.
Sunderland (ENG): Sinauer Associates, Inc.
Tao H, Jing X, Lina Y, Haitao W.  2012. An efficienst method  for  plant  regeneration  from  calli  of  swertia musottii,  an  endangered  medicinal  herb. American Journal of Plant Sciences 3:904-908.
Wattimena GA. 1998. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman . Bogor (ID): IPB Press.