## PEMANFAATAN EKSTRAK KASAR SPONS UNTUK MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN RESPON IMUN NON SPESIFIK IKAN NILA
(Oreochromis niloticus)
(The use of Sponge Crude Extract to Increase Growth and Immune Response of Nile Tilapia Oreochromis niloticus )
Merlyn D. Manurung 1 , Reiny A. Tumbol 2* , Henneke Pangkey 2 , Deiske A. Sumilat 2 , Remy E. P. Mangindaan 2
1) Program Studi S2 (Magister) Ilmu Perairan , Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Sam Ratulangi, Manado.
2) Program Studi Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Sam Ratulangi, Manado.
* Author Correspondent: email: reinytumbol@yahoo.com

## ABSTRACT
This study aims to examine the effect of sponge crude extract addition to the  fish  feed  on  growth  and  non-specific  immune  response  of  nile  tilapia  ( O. niloticus ) and determine the most effective dose of the extract in raising the growth and the non-specific immune response of nile tilapia ( O. niloticus ). The sponge sample was macerated and then evaporated using a rotary vacuum evaporator until the sample became a paste and mixed with feed. The fish were fed for 14 days respectively as much as 5% of body weight per day with feeding frequency of two times a day. The results showed that addition of sponge crude extract to the  fish  feed  gave  good  effect  on  the  growth  and  the  non-specific  immune response of nile tilapia ( O. niloticus ) with best dose of  40 g / kg feed.
Keywords: Sponge extract, fish immune response, fish growth, immune response, immunostimulant.

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk menguji pengaruh penambahan ekstrak kasar spons  pada  pakan  ikan  terhadap  pertumbuhan  dan  respon  imun    non  spesifik ikan  nila  ( Oreochromis  niloticus )  serta  menentukan  dosis  ekstrak  kasar  spons yang  paling  efektif  dalam  meningkatkan  pertumbuhan  dan  respon  imun  non spesifik  ikan  nila  ( Oreochromis  niloticus ).  Sampel  spons  dimaserasi  kemudian dievaporasi menggunakan rotary vacuum evaporator sehingga diperoleh ekstrak kasar berbentuk pasta yang kemudian dicampurkan pada pakan. Ikan uji diberi pakan  perlakuan  5%  dari  bobot  biomassa  selama  14  hari  dengan  frekuensi pemberian  pakan  dua  kali  sehari.  Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa penambahan ekstrak kasar spons pada pakan ikan memberikan pengaruh yang baik terhadap pertumbuhan dan respon imun non spesifik ikan nila ( Oreochromis niloticus ), yang mana dosis yang terbaik adalah 40 gr / Kg pakan.
Kata Kunci : Ekstrak spons, respon imun ikan, pertumbuhan ikan, respon imun, imunostimulan.

## PENDAHULUAN
Penanggulangan  penyakit  yang disebabkan  oleh  infeksi  bakteri  pada ikan umumnya telah dilakukan dengan pemberian antibiotik. Namun pemberian  antibiotik  ternyata  dapat menimbulkan masalah. Menurut Abubakar et al . (2011), antibiotik dapat memicu  berbagai  mikroba  patogen menjadi  resisten  jika  penggunaannya tidak  sesuai  dengan  dosis  yang dikarenakan  kurangnya  pengetahuan
dibidang  kesehatan.  Oleh  karena  itu diperlukan  alternatif  dalam  upaya pencegahan maupun penanggulangan penyakit. Janis et al. (2016) mengemukakan bahwa upaya
pencegahan  penyakit  yang  efektif adalah  dengan memanfaatkan  bahan- bahan  bersifat  imunostimulan  yang berasal  dari  materi  biologis  dan/atau zat  sintetis  yang  dapat  meningkatkan aktivitas pertahanan non spesifik serta merangsang organ
pembentuk antibiotik dalam tubuh.
Spons  laut  diketahui  menjadi tempat  hidup  beberapa  jenis  bakteri yang  jumlahnya  mencapai  40%  dari biomassa  spons.  Simbiosis  yang terjadi  antara  bakteri  dengan  spons laut menyebabkan organisme ini sebagai invertebrata laut yang memiliki potensi  antibakteri  yang  lebih  besar dibandingkan dengan organisme darat dan laut lainnya (Kanagasabhapathy et al., 2005).  Dari  15.000  jenis  spons  di berbagai  perairan  dunia  baru  sekitar
7.000  spons  yang  telah  dilaporkan. Sejauh  ini,  beragam  penelitian  spons yang telah dipublikasikan menunjukkan perolehan senyawa yang memiliki  aktivitas  biologik  yang  tinggi sebagai  anti  kanker,  anti  HIV,  anti jamur,  dan  anti  bakteri  (Reha et  al ., 2013). Spons berpotensi untuk dikembangkan dalam bidang pengobatan, diantaranya sebagai antibakteri  (Ngantung et  al., 2016). Selain  antibakteri,  spons  juga  diyakini merupakan
sumber daripada imunostimulan. Penelitian terkait dengan  imunostimulan  dari  biota  laut seperti alga laut telah banyak dilaporkan,  seperti  aplikasi  ekstrak rumput laut sebagai agen
imunostimulan  sistem  pertahanan  non spesifik  pada  udang  ( Litopennaeus vannamei )  yang  telah  dilaporkan  oleh Ridlo & Pramesti (2009).
Spons  merupakan  salah  satu komponen  ekosistem  terumbu  karang yang sangat potensial sebagai sumber bahan aktif. Hal ini dapat terjadi karena ketika spons mengalami gangguan dari organisme di sekitarnya, spons
melakukan  biosintesis  senyawa  aktif sebagai  respon  pertahanan  sistem metabolisme  sel.  Aktifitas  biosintesis dimaksud  sangat  dipengaruhi  oleh perubahan bioekologinya (Reha et al. , 2013).  Ketersediaan  spons  melimpah di  perairan  Sulawesi  Utara,  sehingga perlu  dilakukan  pengkajian  terkait manfaatnya sebagai bahan imunostimulan  yaitu  bahan  penguat sistem kekebalan tubuh untuk meningkatkan respon imun non spesifik ikan nila ( Oreochromis niloticus ). Penelitian  ini  bertujuan  untuk menguji pengaruh penambahan ekstrak  kasar  spons  pada  pakan  ikan terhadap  pertumbuhan  dan  respon imun non spesifik ikan nila ( Oreochromis niloticus ) serta menentukan dosis ekstrak kasar spons yang paling efektif dalam meningkatkan pertumbuhan dan
respon  imun  non  spesifik  ikan  nila ( Oreochromis niloticus ).

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  dilaksanakan  selama dua bulan yakni bulan Agustus sampai dengan  September  2018.  Identifikasi spons dan proses evaporasi dilakukan di  Laboratorium  Biologi Molekuler  dan Farmasitika  Laut;  proses  ekstraksi,
pengujian aktifitas antibakteri dilaksanakan di Laboratorium Kesehatan  Ikan,  Lingkungan  dan Toksikologi; sedangkan untuk
pemeliharaan  ikan  uji  dilaksanakan  di Laboratorium  Teknologi  Akuakultur Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Sam Ratulangi.

## Ekstraksi dan Evaporasi
Sampel  spons  yang  diperoleh sebanyak  220  g  dibuat  dengan  cara maserasi.  Sampel  dipotong  kecil-kecil dimasukan kedalam Erlenmeyer, kemudian  direndam  dengan  alkohol 96% sebanyak 440 mL, ditutup dengan aluminium  foil  selama  1x24  jam.
Sampel yang direndam disaring menggunakan kertas saring
menghasilkan  filtrat  1  dan  debris  1. Debris  1  kemudian  ditambah  dengan larutan  etanol  sebanyak  120  mL, ditutup  dengan  aluminium  foil  dan dibiarkan  selama  1x24  jam,  sampel tersebut disaring menggunakan kertas saring menghasilkan filtrat 2 dan debris 2. Debris 2 kemudian ditambah dengan larutan  etanol  sebanyak  120  mL, ditutup  dengan  aluminium  foil  selama 1x24  jam,  sampel  tersebut  di  lalu disaring  menggunakan  kertas  saring menghasilkan  filtrat  3  dan  debris  3. Filtrat  1,  2,  dan  3  dicampur  menjadi satu kemudian disaring. Diambil sebanyak  1  liter  campuran  filtrat (1+2+3) lalu dievaporasi menggunakan rotary  evaporator  sehingga  diperoleh ekstrak kasar (berbentuk pasta). Ekstrak kasar yang diperoleh sebanyak 42 gram.

## Persiapan Pakan
Pakan  yang  digunakan  adalah pellet komersil (FF-999). Pakan tersebut ditimbang sesuai dosis
pemberian pakan yang ditentukan yaitu 5%  dari  bobot  biomassa.  Ekstrak spons  (berbentuk  pasta)  ditimbang sesuai  dosis  yang  ditentukan  yaitu  20 g/kg pakan; 40 g/kg pakan dan 60 g/kg pakan.  Setelah  ditimbang,  masing- masing  bagian,  dimasukan  kedalam tube  lalu  disuspensi  dengan  akuades sampai  dengan  25  ml.  Pakan  yang telah ditimbang sesuai dosis ditempatkan  pada  wadah.  Ekstrak spons yang diencerkan dengan akuades,  tiap  dosisnya  dimasukan kedalam botol sprayer untuk disemprotkan  pada  pakan.  Pakan dikering anginkan sampai benar-benar kering,  lalu  di  simpan  dalam  lemari pendingin  sampai  saat  digunakan. Pencampuran    pakan  dengan  ekstrak spons ini dilakukan setiap 1 kali dalam seminggu.
Pemberian pakan perlakuan mengandung Ekstrak Kasar Spons Ikan nila berukuran 5-8 cm akan ditempatkan di dalam wadah akuarium dengan masing-masing akuarium
berisi  10  ekor  ikan.  Jumlah  akuarium yang  akan  digunakan  yakni  12  buah dengan  perincian  3  perlakuan  dengan penambahan ekstrak kasar spons dan untuk  tiap  perlakuan  akan  dilakukan tiga kali ulangan. Ikan nila akan diberi pakan perlakuan selama 14 hari.

## Rancangan Percobaan
Penelitian ini akan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri  dari  4  perlakuan  dengan  3  kali ulangan.

## Analisis Statistik
Untuk mengkaji pengaruh perlakuan ekstrak kasar spons terhadap  pertumbuhan  dan  respon imun  non  spesifik  ikan  nila,  maka dilakukan  uji  analisis  ragam.  Apabila pemberian ekstrak kasar spons memeberikan  pengaruh  yang  nyata, maka  dilakukan  uji  lanjut Tukey Honestly  Significant  Difference  (HSD) untuk mengevaluasi perbedaan pengaruh  antar  perlakuan.  Analisis ragam  maupun  uji  lanjut Tukey  HSD dikerjakan dengan menggunakan program IBM SPSS Statistics.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Laju Pertumbuhan Spesifik
Berdasarkan  hasil  analisis  ragam laju pertumbuhan spesifik ikan nila yang diberi  pakan  dengan  penambahan ekstrak  kasar  spons  diperoleh  nilai signifikansi  (sig.)  sebesar  0.009  yakni terdapat  perbedaan  secara  signifikan antar  perlakuan.  Dapat  dilihat  bahwa laju  pertumbuhan  spesifik  ikan  nila (disajikan pada Gambar 1) menunjukan hasil terbaik pada perlakuan C (dengan penambahan  ekstrak  kasar  spons  40 g/Kg  pakan)  yaitu  45.05%  disusul  oleh perlakuan  B  (dengan  penambahan ekstrak  kasar  spons  20  g/Kg  pakan) yaitu 27.99% dan perlakuan D (dengan penambahan  ekstrak  kasar  spons  60 g/Kg pakan) yaitu 23.25%. Laju pertumbuhan spesifik yang paling rendah adalah  pada perlakuan A (tanpa penambahan ekstrak kasar spons) yaitu sebesar  17.57%.  Hasil  uji  lanjut Tukey HSD memperlihatkan  bahwa  terdapat
perbedaan yang signifikan antara perlakuan  A  (tanpa  perlakuan)  dan perlakuan C (dengan penambahan 40 gr ekstrak kasar spons/Kg pakan), sedangkan untuk antar perlakuan lainnya tidak berbeda secara signifikan.
Gambar 1. Laju Pertumbuhan Spesifik (%)
Selama  penelitian  berlangsung ikan  uji  pada  perlakuan  C  (dengan penambahan  40  gr  ekstrak  kasar spons/kg  pellet)  sangat  rensponsif terhadap pemberian pakan, disusul oleh perlakuan  B  (dengan  penambahan  20 gr  ekstrak  kasar  spons/Kg  pakan). Berbeda dengan ikan uji pada perlakuan  D  (dengan  penambahan  60 gr ekstrak kasar spons/Kg pakan), ikan menunjukan  respon  negatif  terhadap pakan. Hal ini dapat disebabkan karena penambahan ekstrak kasar spons pada perlakuan  D  lebih  banyak  dari  semua perlakuan sehingga dapat terjadi perubahan pada tekstur, aroma bahkan rasa dari pakan sehingga menyebabkan respon  ikan  terhadap  pakan  menjadi menurun. Penyebab lain yang mungkin yakni  kandungan  dari  ekstrak  kasar spons  yang  ditambahkan  pada  pakan dapat  saja  bersifat  racun  bagi  ikan  uji. Berbagai  upaya  terkait  peningkatan pertumbuhan biota akuakultur memang telah  banyak  dilakukan.  Wang et  al.
(2016)  menjelaskan  bahwa  berbagai formulasi pakan telah diupayakan untuk meningkatkan  pertumbuhan.  Selain  itu dalam  menjaga  lingkungan  tetap  baik, probiotik,  vitamin  dan  imunostimulan dapat  digunakan  untuk  mengendalikan dan membunuh bakteri pathogen, selain
itu juga untuk meningkatkan pertumbuhan  ikan  budidaya.  Lebih lanjut  dijelaskan  bahwa  salah  satu metode yang menjanjikan untuk mengendalikan  infeksi  akuakultur  dan memperkuat  mekanisme  pertahanan ikan yaitu melalui pemberian profilaksis probiotik  dan  herbal  (Gibson et  al., 1997; Harikrishnan et al., 2003;
Sharifuzzaman & Austin, 2009).

## Total Leukosit
Hasil  analisis  ragam  menunjukan bahwa  penambahan  ekstrak  kasar spons pada pakan memberikan pengaruh  yang  signifikan  pada  total leukosit. Hal ini ditunjukan dengan nilai signifikansi  (sig.)  sebesar  0.009.  Hasil uji  lanjut Tukey  HSD menunjukan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan  antara  perlakuan  C  (dengan penambahan  40  gr  ekstrak  kasar spons/kg  pakan)  dengan  perlakuan  A (tanpa perlakuan), juga pada perlakuan C  (dengan  penambahan  40  gr  ekstrak kasar spons /kg pakan) dan perlakuan B (dengan  penambahan  20  gr  ekstrak kasar  spons/kg  pakan);  sedangkan antar  perlakuan  lainnya  tidak  terdapat perbedaan  signifikan.  Rataan  total leukosit ikan uji disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2. Total Perhitungan Leukosit
Jumlah leukosit pada ikan berkisar  antara  20.000-150.000  per  ml darah.  Leukosit  mempunyai  peranan dalam  pertahanan  seluler  dan  humoral organisme  terhadap  zat-zat  asingan (Effendi,  2003).  Leukosit  bergerak bebas  dan  merupakan  sel  fungsional dalam sistem imun bawaan.
Terdapat perbedaan yang signifikan  antara  perlakuan  C  (dengan penambahan  40  gr  ekstrak  kasar spons/kg  pakan)  dengan  perlakuan  A (tanpa perlakuan), diduga akibat penambahan  ekstrak  kasar  spons dalam  pakan  yang  diberikan  pada  ikan uji  pada  perlakuan  C.  Menurut  Kresno
(2001)  dalam  Utami et  al. (2013) peningkatan  sel  leukosit  merupakan refleksi  keberhasilan  sistem  imunitas ikan  dalam  mengembangkan  respon imunitas  seluler  (non  spesifik)  sebagai pemicu untuk respon kekebalan.
Supriyadi et  al .  (2006)  menambahkan bahwa respon yang diberikan ikan untuk menambah daya tahan tubuhnya dengan  meningkatkan  jumlah  leukosit yang  mempunyai  fungsi  sebagai  sel pertahanan.  Pemberian  pakan  dengan penambahan  ekstrak  kasar  spons terbukti dapat meningkatkan total leukosit, terutama pada perlakuan C.
Gambar 3. Pengamatan sel leukosit (perlakuan A,B,C,D)
Peningkatan total leukosit menandakan bahwa terjadi peningkatan jumlah sel-sel leukosit (makrofag) yang melakukan aktivitas fagositosis /
pemangsaan sel ragi roti yang merupakan  benda  asing.  Hal  ini menggambarkan  kemampuan  sel-sel leukosit untuk memangsa benda-benda asing  dalam  rangka  pertahanan  diri. Pada  kegiatan  budidaya  tidak  dapat dihindari  adanya  serangan  bakteri.
Aeromonas hydrophila dan Pseudomonas  sp .  adalah  dua  jenis bakteri patogen yang sering menginfeksi ikan nila yang dibudidayakan. Aeromonas hydrophila dapat menyebabkan eksophthalmia, lesi pada sirip,  dan  ulser  pada  tubuh  bahkan mengalami perdarahan
hebat.
Pseudomonas  sp .  dapat  menyebabkan cedera  pada  organ  internal  seperti mengubah konsistensi ginjal dan jantung (Hardi et al ., 2018). Penelitian terkait ekstrak tumbuhan  herbal  untuk  pengendalian penyakit telah banyak diterapkan dalam budidaya ikan. Efektivitas ekstrak tumbuhan untuk pengendalian penyakit sangat beragam. Aplikasi pakan Azadirachta  indica , Ocimum  sanctum dan Curcuma longa dapat meningkatkan kekebalan tubuh, respon imun  dan  resistensi  ikan  mas  yang terinfeksi A.  hydrophila .  Mangrove ( Avicennia  marina )  yang  diekstrak daunnya terbukti menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas
fluorescens , Pseudomonas aeruginosa , Vibrio  parahaemolyticus dan Vibrio anguillarum yang diisolasi dari ikan hias air  laut  (Hardi  et  al.,  2018).  Pada penelitian  ini,  penambahan  ekstrak spons  pada  pakan  dapat  menstimulasi peningkatkan total leukosit yang
berperan penting pada sistem
kekebalan  tubuh  non-spesifik.  Namun demikian, masih perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk
membuktikan bahan aktif yang berperan sebagai  stimulan  peningkatan  sistem kekebalan tubuh dari ikan.

## Aktifitas Fagositosis
Hasil analisis ragam memperlihatkan adanya perbedaan aktifitas fagositosis yang signifikan pada setiap  perlakuan,  ditandai  dengan  nilai signifikansi (sig.) 0.000 (p<0.05).
Hasil  uji  lanjut Tukey  HSD menunjukan bahwa terdapat perbedaan signifikan  antar  perlakuan,  yaitu  pada perlakuan  A  (tanpa  perlakuan)  dengan perlakuan C (dengan penambahan 40 gr ekstrak  kasar  spons  /Kg  pakan); perlakuan  A  (tanpa  perlakuan)  dengan perlakuan D (dengan penambahan 60 gr ekstrak kasar spons/Kg pakan); perlakuan B (dengan penambahan 20 gr ekstrak kasar spons/Kg pakan) dengan perlakuan C (dengan penambahan 40 gr ekstrak  kasar  spons  /Kg  pakan); perlakuan B (dengan penambahan 20 gr ekstrak kasar spons/Kg pakan) dengan perlakuan D (dengan penambahan 60 gr ekstrak kasar spons/Kg pakan); perlakuan C (dengan penambahan 40 gr ekstrak kasar spons/Kg pakan) dengan perlakuan D (dengan penambahan 60 gr ekstrak kasar spons/Kg pakan).
Meningkatnya  aktifitas  fagositosis mengindikasikan  adanya  peningkatan respon imun non spesifik pada ikan uji. Dengan  adanya  peningkatan  respon imun  non  spesifik  pada  ikan  uji diharapkan  dapat  menekan  angka kerugian  ketika  terjadi  infeksi  bakteri. Hal  ini  sejalan  dengan  pendapat Anderson  (1992),  yang  menyatakan bahwa  tindakan  pencegahan  dengan cara meningkatkan mekanisme pertahanan  non-spesifik  yakni  dengan pemberian imunostimulan
dapat dilakukan untuk menekan kerugian yang mungkin  ditimbulkan  apabila  terjadi wabah penyakit.
Imunostimulan  merupakan  zat yang  dapat  meningkatkan  daya  tahan tubuh  terhadap  serangan  penyakit, dalam  hal  ini  bukan  meningkatkan respon imun spesifik ( acquired immune respon ),  akan  tetapi  meningkatkan respon  imun  non-spesifik  baik  melalui
mekanisme pertahanan humoral maupun  pertahanan  seluler  (Sakai, 1999).  Lebih  lanjut  Anderson  (1992) menyatakan bahwa ikan telah diketahui
lebih mengandalkan mekanisme sistem kekebalan non-spesifiknya atau bawaan
(innate immune sistem) dari pada sistem kekebalan spesifiknya.
Gambar 4. Aktivitas Fagositosis ikan nila ( O. niloticus ) dengan pemberian pakan mengandung ekstrak kasar spons
Gambar 5. Aktivitas Fagositosis ikan nila ( O. niloticus ) dengan pemberian pakan mengandung ekstrak kasar spons

## KESIMPULAN
Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa penambahan ekstrak  kasar  spons  pada  pakan  ikan memberikan pengaruh yang baik terhadap pertumbuhan dan respon imun
non  spesifik  ikan  nila  ( Oreochromis niloticus ), yang mana dosis yang terbaik adalah 40 gr / Kg pakan.

## Saran
Berdasarkan  hasil  penelitian  ini, diketahui  bahwa  pemberian  pakan dengan  penambahan  ekstrak  kasar
spons  efektif  dalam  meningkatkan pertumbuhan maupun respon imun non spesifik  ikan  nila,  sehingga  dapat direkomendasikan sebagai berikut: (1)  Industri  pakan  ikan  dapat  membuat pakan  ikan  yang  inovatif,  yaitu  dengan menggunakan  ekstrak  kasar  spons sebagai  tambahan  dalam  formulasi pakan (2)  Kandungan  maupun  karakteristik protein aktif dalam ekstrak kasar spons dapat diteliti lebih lanjut, sehingga dapat lebih efektif dalam pemanfaatannya.

## DAFTAR PUSTAKA
Abubakar,  H.,  Wahyudi,  A.T.,  Yuhana, M.,  2011.  ‘Skrining  Bakteri  yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp.  Sebagai  Penghasil  Senyawa Antimikroba’. Ilmu Kelautan 16 (1), 35-40.
Austin B. & Austin DA. 1993. ‘Bacterial fish  Pathogens.  In  Disease  in Farmed  and  wild  fish’.  Ellis Horwood Ltd, Publisher, Chichester, England. Baiano  J.C.F.  &  Barnes  A.C.,  2009. ‘Towards control of Streptococcus iniae’. Emerging Infectious Diseases 15(12), 1891-1896.
Balouiri, M., Sadiki, M. & Ibnsouda, S.K. 2016.  ‘Methods  for  in  vitro evaluating antimicrobial activity: A review’. Journal of Pharmaceutical Analysis 6 (2016), 71 –79.
Cockerill, F. R., Wikler, M. A., Alder, J., Dudley,  M.  N.,  Eliopoulos,  G.  M.,
Ferraro,  M.  J.,  Hardy,  D.  J.  & Hecht,  D.  W.  2012.  ‘Methods  for Dilution Antimicrobial Susceptibility  Tests  for  Bacteria That Grow Aerobica lly’, Approved Standard —Ninth  Edition  32(2) viewed  16  December  2018,  from https://clsi.org/standards/products /microbiology/documents/m07/
Davis, W. W.  & Stout, T. R. 1971. ‘Disc
Plate  Method  of  Microbiological Antibiotic Assay’, American Society  for  Microbiology  22  (4), 659-670. Delamare-Deboutteville,  J.,  Bowater,
R., Condon, K., Reynolds, A., Fisk, A.,  Aviles,  F.,  &  Barnes,  A.C.,
2015.  ‘Infection  and  pathology  in Queensland grouper, Epinephelus lanceolatus,  (Bloch),  caused  by exposure to Streptococcus
agalactiae  via  different  routes’.
Journal  of Fish  Diseases  38  (12), 102-135. Devi,  P.,  Ravichandran, S.,  Ribeiro,  M. and Ciavatta, M.L. 2013. ‘Antifungal  potential  of  Marine sponge  extract  against  plant  and fish  pathogenic  fungi’.  Journal  of Oceanography and Marine Research 1(3), 1-4. Evans, J.J., Wiedenmayer, A.A., Klesius,  P.H.  and  Shoemaker, C.A. 2004, ‘Survival of Streptococcus  agalactiae  from frozen  fish  following  natural  and experimental infections’. Aquaculture 233, 15 –21.
Evans, J.J., Klesius, P.H. & Shoemaker,
C.A.  2006.  ‘An  overview  of Streptococcus in warmwater fish’.
Aquac. Health Int. (7), 10-14.
Hardi, E.H., Saptiani, G., Kusuma I. W. & Nugroho, R.A. 2018. ‘Evaluation of  Traditional  Plant  Extracts  for Innate  Immune  Mechanism  and
Disease  Resistance  Against  Fish Bacterial  Aeromonas  hydrophila and Pseudomonas sp.’ Earth and Environmental Science 139. Viewed  on  10  December  2018, from https://doi.10.1088/1755- 1315/139/1/012003 Hastuti,  S.D.,  2013.  ‘Applications bacteria Streptococcus agalactiae As Antigen Vaccine Candidate for Disease Prevention Streptococcosis in Tilapia (Oreochromis Sp)’. Jurnal Gamma, 8(2), 64-79. Hudzicki,  Jan.  2009.  ‘Kirby-Bauer  Disk Diffusion Susceptibility Test
Protocol’.  American  Society  for
Microbiology. Viewed 6 April 2018, from www.asmscience.org
Janis,  O.  A.  P.,  Tumbol,  R.  A.,  &
Longdong, S. 2 016.  ‘Efikasi Bakasang  sebagai  imunostimulan
pada pakan sidat (Anguilla marmorata) terhadap infeksi Aeromonas hydrophila’. Budidaya
Perairan 4 (2), 37 – 43.
Kanagasabhapathy,  M.,  Sasaki,  H., Nakajima, K., Nagata, K., Nagata, S.  2005.  ‘Inhibitory  Activities  of Surface Associated Bacteria Isolated From the Marine Sponge Pseudoceratina purpurea’. Microbes and Environments 20(3), 178-185. Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan,
2017.  Pastikan  Pasokan  Benih,
KKP Kembangkan Teknologi Corong.  DJPB,  21  Nov  2017, viewed 6 April 2018, from
http://kkp.go.id/djpb/artikel/331- pastikan-pasokan-benih-kkp- kembangkan-teknologi-corong Kurniawan, A., 2012. Penyakit Akuatik. Pangkalpinang: UBB Press. Latundra,  A.,  I.,  &  Ahmad,  A.,  2012.
Isolasi  dan  Karakterisasi  Protein Bioaktif  dari  Beberapa  Jenis Spons sebagai Antimikroba’. viewed  2  December  2004,  from http://repository.unhas.ac.id/bitstr eam/handle/123456789/1645/Ilha m%20paper%20Jember%20sem nas%202012.pdf?sequence=1. Lusiastuti,  A.M.,  Taukhid,  Kusrini,  E.  & Hadie  W.  2009.  ‘Sequence analysis of Streptococcus agalactiae,  a  pathogen  causing streptococcosis in tilapia (Oreochromis niloticus)’. Indonesian Aquaculture Journal 4 (2), 87-95. Lusiastuti,  A.M.,  Purwaningsih,  U.  & Sumiati, T. 2010. ‘Isolasi Bakteriofaga  Anti  Streptococcus agalactiae  dari  Darah  Ikan  Nila (Oreochromis  niloticus)’.  Jurnal Riset Akuakultur 5(2), 237-243 Lusiastuti, A.M., Textor, M., Seeger, H., Akineden O. & Zschock, M. 2012. ‘The occurrence of Streptococcus agalactiae  sequence  type  261 from  fish  disease  outbreaks  of tilapia  Oreochromis  niloticus  in
Indonesia’. Aquaculture Research
45, 1260-1263.
Mokodompit,  A.,  Boekoesoe,  L.  & Mustapa, M.A. 2015. ‘Uji Efektifitas Antibakteri Ekstrak Etanol Spons Laut (Porifera:Demospongiae) terhadap  bakteri  Staphylococcus aureus  dan  Escherchia  coli’. Skripsi. Universitas Negeri Gorontalo. Newman,  D.J.  and  Cragg,  G.M.  2012. ‘Natural  products  as  sources  of new drugs over the 30 years from 1981  to  2010’.  J.  Nat.  Prod.  75, 311 –335.
Ngantung,  A.E.C.,  Sumilat,  D.A.,  Bara, R.A.  2016.  ‘Uji  Aktivitas  Anti
Bakteri  dari  Spons  Dictyonella funicularis dan Phyllospongia lamellosa yang Diambil dari Perairan  Bunaken’.  Jurnal  Pesisir dan Laut Tropis 2 (1) O’Neill, J. 2014. ‘Antimicrobial
Resistance:  Tackling  a  Crisis  for the Health and Wealth of  Nations’. Antimicrobial Resistance 4, 1-16 Post, G. 1987. Textbook of Fish Health. United Stated: T.F.H. Publications, Inc,  for  Revised  and  Explanded Edition. Viewed 6 April 2018, from https://www.amazon.com/Textboo k-Fish-Health-George- Post/dp/0866224912 Rashid, M. M., Sardar, M. & Islam, M.R. 2002. ‘In Vitro Phagocytic Study of Blood  Leucocytes  and  Peritoneal
Macrophages  of  Walking  Catfish Clarias batrachus Against Aeromonas hydrophila and Escherichia  coli’.  Bangladesh  J. Fish 6 (1), 35-41. Reha,  W.,  Noor,  A.,  Ahmad,  A.,  Nafie, N.L., Salama, D. 2013. ‘Karakterisasi  Protein  Aktif  dari Spons  dan  Mikroba  Simbionnya sebagai Usaha Awal Menuju Agen Imunostimulan’.  Marina  Chimica Acta 14 ( 1) Safari, W.F., 2015. ‘Aktivitas Antibakteri dan  Antikanker  Ekstrak  Kasar Metabolit Bakteri yang Berasosiasi dengan  Spons  dan  Deteksi  Gen Penyandi  NRPS’.  Tesis.  Institut Pertanian Bogor.
Sakai,  M.  1999.  ‘Current  Research Status  of  Fish  Immunostimulan’. Aquaculture 172, 63-92. Selvin J. & Lipton, A.P. 2004. ‘Dendrilla nigra,  a  marine  sponge,  as potential  source  of  antibacterial substances  for  managing  shrimp diseases’.  Aquaculture  236,  277– 283.
Sugiani,  D.,  Sukenda,  Enang,  H.& Lusiastuti, A. M. 2012. ‘Pengaruh Ko-Infeksi  Bakteri  Streptococcus agalactiae  dengan  Aeromonas hydrophila  Terhadap  Gambaran Hematologi dan Histopatologi Ikan
Tilapia  ( Oreochromis  niloticus)’.
Researchgate.  Viewed  9  April 2018, from https://www.researchgate.net/publ ication/309962814
Supriyadi,  H.  2006.  Infeksi  Bakteri
Streptococcus  iniae  pada  Ikan Budidaya  di  Indonesia.  Media
Akuakultur 1(2), 71-74.
Taukhid,  Lusiastuti,  A.M.,  Sumiati,  T., 2014. ‘Application of Streptococcus  agalactiae  vaccine to  prevent  streptococcosis  on tilapia culture, Oreochromis niloticus’,  Berita  Biologi  13  (3), 245-253. Taukhid & Purwaningsih, 2011. ‘Penapisan Isolat Bakteri Streptococcus spp. Sebagai
Kandidat Antigen dalam Pembuatan Vaksin, serta Efikasinya untuk Pencegahan Penyakit  Streptococcosis  pada Ikan  Nila,  Oreochromis  niloticus’, Jurnal Riset Akuakultur 6 (1), 103- 118. Wang,  W.,  Sun,  J.,  Liu,  C.  &  Xue  Z. 2016. ‘Application of Immunostimulants in Aquaculture: Current  Knowledge  and  Future Perspectives’. Aquaculture Research  48  (1).  Viewed  10 December 2018, from https://doi.org/10.1111/are.13161 Wewengkang,  D.S.,  Sumilat,  D.A.,
Rotinsulu,  A.  2014.  ‘Karakterisasi dan  Bioaktif  Antibakteri  Senyawa Spons  Haliclona  sp.  dari  Teluk Manado’.  Jurnal  LPPM  Bidang Sains dan Teknologi  I (1) Woods N. K. Niwasabutra, R. Acevedo, J. Igoli, N.A. Altwaijry, J. Tusiimire,
A.I.  Gray,  D.G.  Watson,  V.A. Ferro.  2017.  ‘Natural  Vaccine Adjuvants and Immunopotentiators Derived From Plants,  Fungi,  Marine  Organisms, and Insects. In: Immunopotentiators  in  Modern Vaccines’.  Second  Edition,    211-
229.