## PENGUJIAN INFUSA REBUSAN BUNGA TELANG ( CLITORIA TERNATEA ) SEBAGAI PEWARNA ALAMI SEDIAAN APUS DARAH TEPI (SADT)
Fajar Husen 1 , Nur Aini Hidayah Khasanah 2*
Departemen Teknologi Laboratorium Medis, Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan (STIKes) Bina Cipta Husada Purwokerto
Diterima: 2 Desember 2022       Direvisi: 6 Agustus 2023       Diterbitkan: 31 Juli  2023

## ABSTRACT
Telang  flower  (Clitorea  ternatea)  is  a  flower  that  belongs  to  the  endemic  plants  that  are  often  found  in  Ternate.  C.  ternatea belongs to the Fabaceae family of leguminous plants and is the world's most prominent family of flowering plants. C. ternatea contains a lot of blue pigments or cyanos known as anthocyanins. These dyes have great potential as alternative dyes to replace methylene blue and are potential  blood cell dyes. This study aimed to  examine the potential of the anthocyanin  content in the butterfly pea flower infusion as a natural differential dye for erythrocytes and leukocytes. This research method is descriptive in nature, in which the results of making cytological preparations in the form of capillary smears of human blood are stained with butterfly pea flower infusion at a concentration of 10%. The stained spots were then observed using a light microscope at 400x magnification.  The  colouring  results  of  butterfly  pea  flowers  were  compared  with  a  standard  dye,  Giemsa  dye.  The  results showed that a 10% concentration of butterfly pea flowers stained erythrocytes but did not stain leukocytes well, while Giemsa's staining  significantly  stained  well.  The  results  also  showed that  butterfly  pea  flower  infusion  could  only  differentiate  stained erythrocytes and unstained leukocytes but could not differentiate the types of leukocytes. Further research can be carried out by extracting  anthocyanins  from  butterfly  pea  flowers  and  fractionating  them  to  isolate  single  anthocyanin  compounds  that  can potentially be dyed.
Keywords: alternative dye, Clitorea terntea, cytology, infusion method, natural dye.

## PENDAHULUAN
Pemeriksaan  apusan  darah  tepi  (SADT) menjadi bagian penting pada pemeriksaan hematologi  dan  parasitologi.  Pemeriksaan  SADT sering  digunakan  untuk  tujuan  diagnostik  dalam hematologi  untuk  mengamati  bentuk,  warna  dan ukuran  eritrosit;  bentuk  dan  jumlah  leukosit  serta jumlah  dan  warna  trombosit  (Yulianingsih  Anwar &  Nurhamsiah,  2018).  SADT  juga  masih  menjadi
gold standar dalam identifikasi parasit Plasmodium penyebab malaria ( Wantini & Huda, 2021).
Salah  satu  faktor  yang  menentukan keakuratan  pemeriksaan  SADT  adalah  kualitas hasil pewarnaan. Kualitas hasil pewarnaan ditentukan  oleh  kualitas  pewarna  yang  digunakan. Bahan  yang  dapat  digunakan  sebagai  pewarna  sel darah  salah  satunya  adalah  Giemsa.  Giemsa merupakan pewarna sintetis yang tersusun dari tiga jenis pewarna yaitu eosin, methylene blue, dan azur
(Wantini  &  Huda,  2021).  Berdasarkan  Material Safety  Data  Sheet  (MSDS)  eosin  dan  methylene blue  dapat  menimbulkan  efek  buruk  bagi  tubuh kita, antara lain iritasi pada saluran pencernaan saat tertelan,  sianosis  saat  terhirup,  dan  iritasi  saat bersentuhan  dengan  kulit  bahkan  karsinogenik. Selain  itu,  penggunaan  pewarna  sintetis  memiliki dampak  buruk  bagi  lingkungan  terutama  air  yang tercemar  limbah  kimia  tersebut  dan  tanaman  di sekitar pembuangan (Islawati et al., 2021). Sebagai upaya  mengurangi  penggunaan  Giemsa,  saat  ini banyak  diteliti  bahan  alami  yang  dapat  digunakan sebagai  alternatif  pengganti  pewarna  sintetis tersebut.
Bunga telang ( Clitorea ternatea ) merupakan  bunga  yang  tergolong  ke  dalam tumbuhan  endemik  yang  banyak  dijumpai  di wilayah  beriklim  tropis. C.  ternatea termasuk  ke dalam  famili  Fabaceae  atau  tumbuhan  polong- polongan  dan  termasuk  famili  tumbuhan  berbunga terbesar di Dunia. C. ternatea banyak mengandung pigmen biru pekat atau cyanos dan dikenal sebagai antosianin golongan  ternatin  (Suryana,  2021) . Antosianin  merupakan  suatu  senyawa  pembentuk zat  warna  alami  pada  tumbuhan  yang  dapat memberikan  warna  orange,  merah,  serta  ungu  dan dapat  ditemukan  pada  tumbuhan  berwarna  merah, ungu,  merah  gelap  seperti  pada  buah  berry  serta tanaman  seperti  bunga  telang . Tanaman  ini  biasa tumbuh sebagai tanaman hias yang dapat digunakan sebagai  pewarna  alami  pada  produk  pangan  yang tidak  berbahaya  bagi  tubuh  (Angriani,  2019)  dan
banyak  memberikan  manfaat  bagi  kesehatan (Marpaung, 2020) .  Penelitan  (Tirtasari & Prasetya, 2020)  menunjukkan  bahwa  pewarnaan  jaringan tumbuhan  menggunakan  ekstrak  bunga  telang diperoleh  hasil  yang  hampir  sama  dengan pewarnaan  sintetik  safranin. Berdasarkan  alasan tersebut, zat  warna  yang  terkandung  dalam  bunga telang  memiliki  potensi  yang  besar  sebagai  bahan pewarna alternatif alami untuk mewarnai sel darah.
Tujuan  dilakukannya  pewarnaan  ini  untuk melihat  atau  mengamati  struktur  morfologi  sel darah pada SADT menggunakan pewarna alternatif alami berupa infusa rebusan bunga telang ( Clitoria ternatea )  serta  membandingkan  hasil  pewarnaan SADT  menggunakan  Giemsa  dengan  infusa rebusan  bunga  telang  ( Clitoria  ternatea ).  Pada penelitian  ini  digunakan  infusa  rebusan  karena merupakan  proses  penyarian  yang  paling  umum digunakan untuk mencari kandungan zat aktif yang larut  dalam air  dari  bahan-bahan  nabati,  serta mudah  diaplikasikan  dan  tidak  memerlukan persiapan  yang  lama  meskipun  penyarian  dengan cara  ini  menghasikan  sari  yang  tidak stabil  dan mudah  tercemar  oleh  bakteri  dan  kapang  sehingga sari  yang  diperoleh  dengan  cara ini  tidak  boleh disimpan  lebih  dari  24  jam  (Nur  Oktavia  et  al., 2020).

## METODE
Jenis penelitian ini adalah deskriptif, dengan membandingkan hasil pembuatan preparate sitologis,  parameter  yang  diamati  adalah  warna
eritrosit,  warna  leukosit  secara  umum,  serta  warna dari  jenis  leukosit  (neutrofil,  limfosit,  monosit, eosinofil,  dan  basophil).  Penelitian  dilakukan  di Laboratorium  Hematologi  Dan  Kimia  Klinik, STIKes  Bina  Cipta  Husada  Puwokerto.  Bahan penelitian meliputi bunga telang kering yang sudah dikeringkan  dengan  oven  pada  suhu  40-45 o C, beaker glass , hotplate dan magnetic stirrer, mortar dan  pestle,  alumunium  foil,  thermometer  air  raksa, lancets  kapiler,  alkohol  swab,  kertas tissue , mikroskop  cahaya, object  glass , cover  glass ,  dan kamera.
Prosedur kerja yang dilakukan meliputi a. Pembuatan infusa bunga telang ( C. ternatea ) Bunga  telang  yang  sudah  dipetik  kemudian dikeringkan  dengan  menggunakan  oven  dengan suhu  40-45 o C.  Bunga  yang  Sudah  mongering, kemudian di tumbuk halus dengan menggunakan mortar  dan  pestle.  Simplisia  bunga  yang  sudah ditumbuk  halus  kemudian  dimasukkan  beaker glass ,  dan  diisi  dengan  10  mL  akuades  steril.
Selanjutnya  adalah  proses  pemanasan  suspensi simplisia  dengan  menggunakan hotplate denga suhu  45-65 o C.  Tahapan  selanjutnya  adalah proses penyaringan/ filtrasi dengan menggunakan  kertas  saring.  Suspensi  infusa kemudian  di  cek  suhunya  dengan  menggunakan thermometer. Suhu infusa pada rentang 40-45 o C yang nanti akan digunakan sebagai pewarna.
b. Pengamatan  preparat  sitologis  apusan  darah kapiler
Pembuatan  preparat  apusan  darah  dimulai dengan  dilakukan  dengan  membersihkan  jari manis  tangan  kiri  menggunakan  alkohol swab , kemudian jari ditusuk dengan lancets disposable, setelah  darah  keluar  kemudian  diteteskan  pada object  glass kurang  lebih  2-3  mikroliter.  Tahap selanjutnya  dengan  menggunakan object  glass lain  yang  steril,  tetesan  darah  di apus  ke depan, sampai  terbentuk  apusan  yang  tipis  dan  rata. Setelah  apusan  mengering,  kemudian  apusan ditetesi  dengan  methanol  3-4  tetes,  selama  5 menit  untuk  tahapan  fiksasi,  setelah  itu dilakukan  pencucian  dengan  akuades  steril,  dan setelah  apusan  mengering  selanjutnya  ditetesi infusa  bunga  telang  ( C.  ternatea )  dan  Giemsa (sebagai  data  pembanding)  selama  5  menit. Tahapan  selanjutnya  dilakukan  pencucian,  dan kemudian  diamati  di  bawah  mikroskop  cahaya dengan perbesaran 1000x.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan  menunjukkan  bahwa  pewarnaan  infusa bunga  telang  ( C.  ternatea )  dapat  mewarnai  sel leukosit. Sementara hasil dengan pewarna pembanding  yaitu  Giemsa  mewarnai  dengan  baik sel  leukosit.  Walaupun  granula  sel  tidak  dapat teramati  namun  hal  ini  sudah  dapat  menunjukkan bahwa  infusa C.  ternatea yang  mengandung antosianin  dapat  mewarnai  sel  dengan  cukup  baik (Gambar 1. A).
Gambar 1. Hasil pewarnaan sediaan apusan darah tepi (SADT)
Keterangan  Gambar:  Infusa  bunga  telang  ( C. ternatea )  [A],  dan  menggunakan  pewarna  Giemsa [B]. Perbesaran 1000x
Gambar 1. B menunjukkan bahwa pewarnaan  Giemsa  dapat  mewarnai  dengan penampakan sel leukosit berwarna merah muda dan terang  dan  sedikit  keungu-biruan.  Sementara  hasil pewarnaan dengan infusa C. ternatea menunjukkan warna  yang  lebih  pekat,  ungu-kebiruan  dan  lebih gelap.  Pewarnaan  dengan  infusa C.  ternatea dilkaukan  dengan  takaran  600  µL  untuk  setiap swab apusan darah. Beberapa faktor yang mungkin berpengaruh  adalah  lamanya  perbusan  mahkota bunga  telang,  suhu  yang  digunakan  dalam perbusan,  jumlah  atau  banyaknya  sampel  mahkota bunga  yang  digunakan,  serta  tingkat  keasaman.
Dalam  pembuatan  infusa C.  ternatea pH diukur  dan  berada  pada  rentang  6.0-7.3  sementara untuk  pewarna  Giemsa  berada  pada  rentang  7.0- 8.0.  Faktor  lainnya  yang  mempengaruhi  zat  warna dapat masuk ke dalam sel selain pH pewarna yang
digunkanan  yaitu  viskositas  dan  densitas  pewarna. Tingkat  kepekatan  pewarna  dapat  menjadi  salah satu  faktor  yang  dapat  mempengaruhi  tingkat kecerahan  dan  kepekatan  pewarna  pada  sel. Semakin  tinggi  viskositas  dan  densitas  pewarna kemungkinan  zat  warna  dapat  masuk  ke  dalam  sel lebih  cepat.  Zat  warna  yang  terlalu  encer  atau  cair dapat  menyebabkan  lamanya  zat  warna  masuk  ke dalam  sel.  Sel  darah  yang  tersusun  atas  fosfolipid bilayer akan lebih mudah zat warna dengan tingkat keasaman  yang  cukup  tinggi  dan  viskositas  warna yang  besar.  Zat  warna  dengan  terlalu  banyak pelarut  terutama  air  suling  atau  akuades  dapat menyebabkan  penurunan  kemampuan  zat  warna untuk dapat masuk. Kadar pH darah manusia secara normal  berada  pada  rentang  7.3  sampai  dengan 7.45,  dan  berada  pada  rentang  normal  menuju sedikit  basa.  Kondisi  keseimbangan  pH  antara pewarna  yang  asam  dan  kondisi  intraseluler  sel darah  merah  yang  cenderung  normal  ke  basa, memberikan  peluang  ikatan  zat  pewarna  untuk mudah terikat secara stabil pada sel darah. Pewarna Giemsa  cenderung  basa  sehingga  sangat  mudah mengikat  dan  mewarnai  nucleoprotein  dan  dapat mewarnai  dengan  baik  granula  dari  jenis  jenis limfost (seperti neutrophil, basophil dan eosinophil) (Nirmala Sari et al., 2022).
Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak bunga telang ( C. ternatea ) dapat mewarnai jaringan pada tumbuhan, dimana senyawa antosianin  yang  memiliki  pigmentasi  warna  biru dapat  mewarnai  sel  bawang  merah  dengan  warna
ungu  kebiruan  sampai  merah  keunguan.  Pada pewarnaan  sel  dan  jaringan  tumbuhan  ini,  ekstrak bunga  telang  dapat  mewarnai  dengan  baik  seperti dinding  sel,  sitoplasma  bahkan  inti  sel  (nucleus) (Tirtasari  &  Prasetya,  2020).  Selain  itu  bunga telang  juga  mengandung  berbagai  senyawa fitokimia  lain  seperti  flavonoid  dan  flavon (Sumartini & Ikrawan, 2020).
Dalam  proses  pembuatan  infusa,  dilakukan perebusan dengan suhu 75-90 o C, hal ini dilakukan agar  senyawa  antosianin  dapat  diekstrak  dan dikeluarkan  dari  simplisia  bunga  telang  secara maksimal. Penelitian sebelumnya juga menunjukkan  bahwa  antosianin  dapat  secara maksimal didapatkan dengan suhu maksimal 90 o C (Charurungsipong et al., 2020). Faktor yang sangat mempengaruhi  zat  warna  dapat  terserap  dengan baik  pada  sediaan  preparate  apusan  darah  tepi (SADT), diantaranya yaitu tingkat ketebalan apusan yang  dibuat,  kebersihan object  glass yang digunakan,  waktu  dan  teknik  fiksasi  yang dilakukan,  ketebalan  dan  tingkat  konsentrasi/ kepekatan  dari  zat  pewarna  yang  digunakan (Rofiqoh  &  Taufikurohmah,  2013),  serta  lamanya waktu  yang  digunakan  pada  proses staining (pewarnaan) (Rivenson et al., 2019).
Penelitian  dengan  menggunakan  pewarna Giemsa serta Hematoxilin-eosin juga menunjukkan perubahan  warna  pada  sel  dan  jaringan  yang  ter- inflamasi,  dimana  sel  dan  jaringan  menunjukkan warna  yang  sedikit  gelap  dibandingkan  sel  atau jaringan  normal  (Ratnaningtyas  et  al.,  2022).
Pewarna yang baik dengan konsentrasi yang cukup selain  dapat  mewarnai  sel  maupun  jaringan,  juga dapat membedakan secara jelas strukur sel maupun jaringan  yang  diwarnai,  karena  masing-masing bagian  sel  atau  jaringan  memiliki  daya  afinitas berbeda  dalam  menyerap  pewarna  yang  digunakan (Rofiqoh & Taufikurohmah, 2013). Riset sebelumnya juga menunjukkan bahwa infusa bunga telang cenderung kurang baik dan tidak representatif  untuk  mewarnai  sel-sel  darah  putih (leukosit),  namun  konsentrasi  25%  dengan  cukup baik  mewarnai  sel  darah  merah  (eritrosit)  dengan cukup baik (Khasanah et al., 2023).
Penelitian  mengenai  potensi  dari  infusa bunga  telang  ( C.  ternatea )  dapat  dikembangan lebih  lanjut,  seperti  ekstraksi  dan  isolasi  senyawa antosianin,  agar  dapat  dikembangkan  lebih  lanjut sebagai  pewarna  alternatif  alami,  terutama  dalam pembuatan  apusan  darah  tepi  (SADT),  sehingga dapat meminimalisir risiko pencemaran lingkungan,  mengingat  bahan  yang  digunakan bersifat alami.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan  bahwa  infusa  bunga  telang  memiliki potensi  sebagai  pewarna  alami  alternatif  untuk mewarnai sel darah, dan cukup dapat membedakan dengan  baik  antara  sel  darah  merah  (eritrosit), namun  sedikit  kurang  baik  dalam  mewarnai  sel darah  putih  (leukosit).  Hasil  juga  menunjukkan bahwa  leukosit  terwarnai  biru-keunguan  dengan
penampakan  sedikit  gelap,  sementara  eritrosit menunjukkan warna sedikit gelap.

## DAFTAR PUSTAKA
Angriani,  L.  (2019).  The  Potential  of  Extract Butterfly Pea Flower (Clitoria ternatea L.) as a Local Natural Dye for Various Food Industry. Canrea Journal: Food Technology, Nutritions,
and Culinary Journal , 2 (1), 32–37. https://doi.org/10.20956/canrea.v2i1.120 Charurungsipong, P., Tangduangdee, C., Amornraksa,  S.,  Asavasanti,  S.,  &  Lin,  J. (2020). Improvement of Anthocyanin Stability in  Butterfly  Pea  Flower  Extract  by  Co- pigmentation  with  Catechin. E3S  Web  of
Conferences , 141 , 3–6. https://doi.org/10.1051/e3sconf/202014103008
Islawati,  Asriyani  Ridwan,  &  Rahmat  Aryandi.
(2021).  Ekstrak  Betasianin  dari  Umbi  Bit (Beta  vulgaris)  sebagai  Pewarna  Alami  pada Sediaan Apusan Darah Tepi. Jurnal Kesehatan Panrita Husada , 6 (2), 152–160. https://doi.org/10.37362/jkph.v6i2.644
Khasanah,  N.  A.  H.,  Husen,  F.,  &  Yuniati,  N.  I.
(2023).  Pewarnaan  Sediaan  Apusan  Darah Tepi  (SADT)  Menggunakan  Infusa  Bunga Telang  (Clitorea  ternatea). Jurnal  Kesehatan Dan Science , 19 (1), 67–78.
Marpaung,  A.  M.  (2020).  Tinjauan  manfaat  bunga telang  (clitoria  ternatea  l.)  bagi  kesehatan manusia. Journal  of  Functional  Food  and Nutraceutical ,
1 (2), 63–85.
https://doi.org/10.33555/jffn.v1i2.30
Nirmala Sari, A., Tazkiya, A., & Mafira, Y. (2022).
Ekstrak  Air  Bunga  Kencana  Ungu  ( Ruellia simplex ) Sebagai Pewarnaan Alternatif Preparat  Sediaan  Apusan  Darah  Tepi  (Sadt). Prosiding Seminar Nasional Biotik , 9 (2), 195. https://doi.org/10.22373/pbio.v9i2.11662
Nur  Oktavia,  S.,  Wahyuningsih,  E.,  &  Deti Andasari,  S.  (2020).  Skrining  Fitokimia  Dari Infusa  Dan  Ekstrak  Etanol  70%  Daun  Cincau Hijau(Cyclea  barbata  Miers). Jurnal  Ilmu Farmasi , 11 (1), 2685–1229.
Ratnaningtyas,  N.  I.,  Hernayanti,  H.,  Ekowati,  N., &  Husen,  F.  (2022).  Ethanol  extract  of  the mushroom Coprinus comatus exhibits antidiabetic  and  antioxidant  activities  in streptozotocin-induced diabetic rats.
Pharmaceutical  Biology , 60 (1),  1126–1136. https://doi.org/10.1080/13880209.2022.20740 54
Rivenson, Y., Liu, T., Wei, Z., Zhang, Y., de Haan, K.,  &  Ozcan,  A.  (2019).  PhaseStain:  the digital staining of label-free quantitative phase microscopy images using deep learning. Light: Science and Applications , 8 (1), 1–11. https://doi.org/10.1038/s41377-019-0129-y Rofiqoh,  &  Taufikurohmah.  (2013).  Pengaruh Infiltrasi  Nanogold  Terhadap  Peningkatan Kualitas Jaringan Dan Kuantitas Merkuri Pada Lambung  Mencit  (Mus  Musculus)  Setelah Terpapar  Merkuri  (Effect  On  Nanogold Infiltration Quantity And Quality Improvement Mercury In Mice Stomach (Mus Musculus). UNESA  Journal  of  Chemistry , 2 (3).
Sumartini,  &  Ikrawan,  Y.  (2020).  Analisis  Bunga Telang  ( Clitoria  ternatea )  Dengan  Variasi  Ph
Metode  Liquid  Chromatograph-Tandem  Mass Spectrometry (Lc-Ms/Ms) Sumartini Sumartini. Pasundan Food Technology Journal , 7 (2), 70–77. https://doi.org/10.23969/pftj.v7i2.2983
Suryana,  M.  R.  (2021).  Ekstraksi  Antosianin  Pada Bunga  Telang  (Clitoria  Ternatea  L.):  Sebuah Ulasan. Pasundan  Food  Technology  Journal , 8 (2),
45–50.
https://doi.org/10.23969/pftj.v8i2.4049
Tirtasari,  N.  L.,  &  Prasetya,  T.  (2020).  Pengaruh Rasio  Berat  Bunga  Telang  (Clitoria  ternatea. L)  dan  Volume  Pelarut  Asam  Sitrat  terhadap Pewarnaan  Preparat  Jaringan  Tumbuhan. Indonesian Journal of Chemical Science , 9 (3), 201–204.
Wantini,  S.,  &  Huda,  M.  (2021). Pengaruh Konsentrasi  dan  Waktu  Pengecatan  Giemsa Pada  Pemeriksaan  Mikroskopik  Malaria  The Effect  Of  Concentration  And  Time  Of  Giemsa Staining  On  Microscopic  Examination  Of Malaria . 10 (1).
Yulianingsih  Anwar,  A.,  &  Nurhamsiah.  (2018). Penentuan  Kriteria  Penilaian  Kesan  Jumlah Leukosit  Pada  Pemeriksaan  Apusan  Darah Tepi. Jurnal Kesehatan Panrita Husada , 3 (2), 27–34. https://doi.org/10.37362/jkph.v3i2.156