Nataprawira, Dewi et al., (2022) Optimasi Gelred sebagai Pewarna DNA dalam Biologi Molekuler, Syntax Literate : Jurnal Ilmiah Indonesia (7)12, http://dx.doi.org/10.36418/syntax-literate.v7i12.9981 E-ISSN: 2548-1398 Published by: Ridwan Institute
Syntax  Literate:  Jurnal  Ilmiah  Indonesia  p–ISSN:  2541-0849  e- ISSN: 2548-1398 Vol. 7, No. 12, Desember 2022

## OPTIMASI GELRED SEBAGAI PEWARNA DNA DALAM BIOLOGI MOLEKULER
Sari M. Dewi Nataprawira 1 , Erick Sidarta 2 , Arlends Chris 3
Departemen Histologi, Universitas Tarumanagara 1,3
Departemen Biologi Universitas Tarumanagara 2
Email: sarid@fk.untar.ac.id, ericksi@fk.untar.ac.id, arlendsc@fk.untar.ac.id

## Abstrak
Pewarnaan  DNA  merupakan  sebuah  proses  penting  dalam  elektroforesis  gel  agarosa. Proses ini memungkinkan penggunanya untuk melihat pita asam deoksiribonukleotida (DNA)  hasil  dari  proses  amplifikasi  oleh  teknik  polymerase  chain  reaction  (PCR) ataupun  modifikasinya  seperti  metode  restriction  fragment  length  polymorphism (RFLP). Pewarna DNA yang umum digunakan dalam proses tersebut adalah ethidium bromide  yang  memiliki  bahaya  karena  bersifat  mutagenik.  Pewarna  DNA  Gelred merupakan alternatif untuk ethidium bromide yang dinilai memiliki tingkat keamanan yang lebih baik untuk penggunanya. Penelitian ini bertujuan untuk melihat kemampuan Gelred  sebagai  pewarna  DNA,  cara  terbaik  untuk  menggunakannya  serta  melihat sensitivitasnya.  Pada  penelitian  ini  100-1000  bp  DNA  Ladder  dengan  konsentrasi berbeda  digunakan  sebagai  penanda  untuk  membandingkan  metode  terbaik  (pre-cast, post-staining dan pre-loading/pre-staining) untuk menggunakan Gelred. Selain itu dua buffer  elektroforesis  umum  (TAE  dan  TBE)  digunakan  untuk  membandingkan  hasil pewarnaan  DNA.  Hasil  dari  penelitian  ini  didapatkan  bahwa  Gelred  mempengaruhi migrasi  DNA  pada  gel  agarosa.  Migrasi  tersebut  juga  dipengaruhi  oleh  jenis  buffer yang digunakan, konsentrasi agarosa, ukuran DNA, konsentrasi DNA dan metode yang digunakan (pre-cast, post-staining atau pre-loading/pre-staining). Metode terbaik untuk mendapatkan hasil visualisasi  yang tajam adalah metode pre-cast dengan buffer TAE, dengan  kelemahannya  adalah  konsentrasi  dan  panjang  DNA  sangat  mempengaruhi visualisasi. Metode yang paling stabil untuk digunakan adalah metode pre-loading/pre- staining  dengan  buffer  TAE  dengan  kelemahan  visualisasi  pita  DNA  yang  dihasilkan tidak  setajam  metode  pre-cast.  Menurut  hasil  penelitian  ini  peneliti  menyarankan penggunaan metode pre-loading/pre-staining dengan buffer TAE apabila menggunakan Gelred yang disebabkan oleh efisiensi dan kecepatan proses.
Kata Kunci : Gelred, Pre-Cast, Pre-Loading, Pre-Staining, Elektroforesis, Agarose.

## Abstract
DNA  staining  is  an  essential  process  when  using  agarose  gel  electrophoresis  to visualize  DNA  band.  This  process  is  used  when  the  user  needs  to  visualize  the amplified  DNA  band  after  polymerase  chain  reaction  (PCR)  method  or  its  modified
methods  such  as  restriction  fragment  length  polymorphism  (RFLP).  The  most commonly  used  DNA  staining  is  ethidium  bromide  which  also  known  has  mutagenic effect. Gelred is offered as an alternative to ethidium bromide which offer safety to the user. This study was aimed to investigate the capabilities of Gelred as DNA staining, the best method of staining using Gelred, and determine the sensitivity of the Gelred. In this  study,  100-1000  bp  DNA  ladder  with  different  dilution  were  used  as  marker  to compare  different  staining  method  (pre-cast,  post-staining  and  pre-loading/pre- staining).  This  study  showed  that  Gelred  affect  DNA  migration  in  agarose  gel electrophoresis.  The  DNA  migration  also  affected  by  the  buffer  used,  agarose  gel concentration, DNA size and concentration and the method used for staining. The best method  which  gave  a  sharp  contrast  band  was  pre-cast  method  using  TAE  buffer, although it need optimization for DNA concentration used for visualization. The most stable  method  was  pre-loading/pre-staining  using  TAE  buffer,  although  the  DNA visualization was not as sharp as pre-cast method. The author recommended the use of pre-loading/pre-staining method with TAE buffer when using Gelred for efficiency and fast result.
Keywords : Gelred, Pre-Cast, Pre-Loading, Pre-Staining, Elektrophoresis, Agarose.

## Pendahuluan
Teknik  PCR  dan  gel  elektroforesis  merupakan  teknik  yang  tidak  bisa  dipisahkan. Hal ini karena hasil dari teknik PCR berupa amplicon , yaitu DNA yang telah diperbanyak oleh  teknik  PCR,  harus  dibaca  dengan  melakukan  gel  elektroforesis.(Williams,  2001) Dalam  melakukan  gel  elektroforesis,  agarosa  murni,  buffer,  aliran  listrik,  pemberat  DNA dan  pewarna  yang  mampu  berinterkalasi  dengan  DNA  merupakan  hal  yang  dibutuhkan untuk  melakukan  proses  tersebut  (J.  Sambrook  i  D.  W.  Russell,  2001).  Dari  bahan-bahan yang telah disebutkan diatas, pewarna yang mampu berinterkalasi dengan DNA merupakan bahan  kimia  yang  paling  berbahaya  terhadap  operator  yang  bekerja.(Debroy  et  al.,  2022) Salah  satu  pewarna  yang  mampu  berinterkalasi  dengan  DNA  yang  sering  dipakai  di laboratorium DNA adalah ethidium bromide.(Lee et al., 2012b)
Ethidium  bromide  merupakan  mutagen  karena  dapat  berinterkalasi  dengan  DNA utas  ganda  yang  terdapat  pada  manusia.  Adanya  interkalasi  tersebut  dapat  mengakibatkan gangguan  dalam  proses  biologis  dari  suatu  sel  seperti  replikasi  DNA  dan  transkripsi.  Di dalam laboratorium yang bergerak di bidang rekayasa DNA, ethidium bromide merupakan senyawa  yang  populer  digunakan  karena  harganya  yang  murah,  stabil  dan  memiliki sensitivitas  yang  tinggi  dalam  proses  visualisasi  DNA.(Lee  et  al.,  2012a)  Dalam penggunaannya,  operator  yang  bekerja  harus  memiliki  pelatihan  yang  cukup  untuk menangani  ethidium  bromide.  Selain  itu,  operator  juga  harus  mampu  mengolah  limbah yang dihasilkan dari ethidium bromide tersebut sebelum dibuang (Borst, 2005).
Sekarang  ini,  telah  banyak  alternatif  dari  ethidium  bromide  yang  dapat  digunakan untuk  visualisasi  hasil  elektroforesis  DNA  seperti  FAST  BLAST(Choi  et  al.,  2010),
SYBRSAVE(Scientific,  n.d.),  GELRED,  GELGREEN(Haines  et  al.,  2015)  dan  lainnya. Sekalipun  tidak  dapat  menandingi  harga  dari  ethidium  bromide,  Gelred  diklaim  memiliki keunggulan  daripada  ethidium  bromide  seperti  memiliki  sensitivitas  yang  lebih  tinggi, aman  untuk  pekerjanya  dan  pengolahan  limbah  yang  tidak  berbahaya  (Biotium,  n.d.-a; Haines  et  al.,  2015).  Sekalipun  demikian,  Gelred  juga  memiliki  kelemahan  seperti mengganggu  mobilitas  dari  DNA  ketika  dilakukan  proses  elektroforesis.  Pada  penelitian sebelumnya,  hasil  dari  elektroforesis  DNA  dengan  menggunakan  Gelred  mengakibatkan retardasi  yang  berlebihan  dari  DNA  yang  dielektroforesis  menggunakan  agarosa  yang dicampur dengan Gelred (metode pre-cast ). Hal tersebut mengakibatkan kemunculan pita- pita  yang  tidak  rata  sehingga  menyulitkan  untuk  dilakukan  analisis.  Beberapa  saran  telah diajukan  oleh  pembuat  untuk  melakukan  beberapa  variasi  konsentrasi  agar,  penggunaan buffer TBE, menggunakan metode post-staining dan bahkan variasi konsentrasi dari Gelred yang  digunakan.  Sebuah  komunikasi  singkat  oleh  Huang  et  al.  bahkan  menyarankan metode pre-loading untuk digunakan dengan Gelred (Huang et al., 2010).
Berdasarkan  yang  telah  dipaparkan  sebelumnya,  Gelred  merupakan  alternatif  yang menarik  untuk  digunakan  selain  ethidium  bromide.  Akan  tetapi,  faktor-faktor  yang mempengaruhi laju mobilitas dalam pengunaan Gelred belum diinformasikan. Penelitian ini bertujuan  melihat  kemampuan  Gelred  sebagai  pewarna  DNA,  faktor  yang  mempengaruhi pengunaan  Gelred  seperti  konsentrasi  DNA  dan  ukuran  DNA,    metode  terbaik  untuk digunakan dengan Gelred dan sensitivitasnya.

## Metode Penelitian

## 1. Sampel uji
Sampel yang digunakan adalah DNA ladder dengan ukuran 100 – 1000 bp (PCR Ranger, kode katalog 11400, Norgen Biotek, Kanada)
2. Elektrofresis dengan metode pre-cast
Agarosa  dengan  konsentrasi  2%  dan  1%  dibuat  dengan  menggunakan  buffer TAE  1X  dan  TBE  1X  sebagai  pelarut  dan  ditambahkan  1%  Gelred  sebelum  dicetak. DNA  ladder  dimasukkan  dengan  berbagai  konsentrasi  yaitu:  1X  (tanpa  pengenceran), 0.8X,  0.6X,  0.4X,  0.2X  dan  0.1X  dan  dielektroforesis  dengan  kondisi  80  A  selama  50 menit.
3. Elektroforesis dengan metode post-staining
Agarosa  dengan  konsentrasi  2%  dengan  buffer  TAE  1X  sebagai  pelarut  dibuat tanpa  menambahkan  Gelred.  DNA  ladder  dimasukkan  dengan  berbagai  konsentrasi yaitu:  1X  (tanpa  pengenceran),  0.8X,  0.6X,  0.4X,  0.2X  dan  0.1X  dan  dielektroforesis dengan  kondisi  80  A  selama  50  menit.  Setelah  elektroforesis  dilakukan  pewarnaan dengan  merendam  agar  hasil  elektroforesis  dalam  larutan  berisi  Gelred  3X  pada  alat orbital shaker selama 30 menit.
4. Elektroforesis dengan metode pre-loading/pre-staining
Agarosa  dengan  konsentrasi  2%  dengan  buffer  TAE  1X  dan  TBE  1X  sebagai pelarut  dibuat  tanpa  menambahkan  Gelred.  DNA  ladder  dengan  berbagai  konsentrasi yaitu:  1X  (tanpa  pengenceran),  0.8X,  0.6X,  0.4X,  0.2X  dan  0.1X  ditambahkan  2  µl Gelred  dengan  berbagai  pengenceran  yaitu  tanpa  pengenceran,  50X  pengenceran  dan 100X pengenceran dan dielektroforesis dengan kondisi 80 A selama 50 menit.

## Hasil dan Pembahasan
Gambar 1. Hasil elektroforesis: (A) 2% agarose metode pre-cast, (B) 1% agarose metode pre-cast, (C) 2% agarose metode post-staining, (D) keterangan DNA Ladder yang digunakan ( https://norgenbiotek.com/product/pcr-sizer-100-bp-dna-ladder ).
Pada  gambar  1  dapat  dilihat  perbandingan  dari  hasil  elektroforesis  yang  dilakukan dengan berbagai variasi. Pada gambar 1A dapat dilihat bahwa pemisahan DNA ladder pada agarosa  dengan  konsentrasi  2%  dengan  metode pre-cast kurang  baik  untuk  pita  DNA
berukuran  700  sampai  1000  bp  ( base  pair –  pasang  basa)  dengan  konsentrasi  sesuai rekomendasi produk. Sementara proses pemisahan yang baik terjadi pada DNA ladder yang semakin  diencerkan  sampai  ke  konsentrasi  DNA  ladder  0.2X  nya.  Hal  ini  menunjukkan bahwa konsentrasi dan ukuran dari pita DNA mempengaruhi migrasi yang terjadi pada gel agarosa  yang  telah  dicampurkan  dengan  Gelred.  Dari  percobaan  ini  dapat  dilihat  bahwa pada  konsentrasi  agarosa  2%  dengan  metode  pre-cast,  pita  DNA  yang  digunakan  untuk menganalisa harus berada pada kondisi konsentrasi maksimal 78 ng/ml untuk ukuran 100 – 500 bp dan 31.2 ng/ml untuk ukuran 700 – 1000 bp.
Pada  gambar  1B  dapat  dilihat  pemisahan  DNA  ladder  yang  baik  pada  agarosa dengan  konsentrasi  1%  pada  kondisi  DNA  ladder  tanpa  pengenceran  sampai  diencerkan 0.4X.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  konsentrasi  agarosa  juga  mempengaruhi  migrasi  DNA pada metode pre-cast. Salah satu penjelasan mengenai proses migrasi ini dapat disebabkan oleh struktur dari Gelred itu sendiri, Gelred terdiri dari dua subunit ethidium bromide yang dihubungkan  oleh  spacer  oksigen.(Crisafuli  et  al.,  2015;  Huang  et  al.,  2010)  Hal  ini membuat  Gelred  memiliki  ukuran  yang  besar  dan  juga  yang  memberikan  manfaat keamanan  pengguna  seperti  kemampuannya  untuk  tidak  menembus  kulit.  Gelred  yang ditambahkan  ke  dalam  agarosa  akan  membentuk  matriks  pemisahan  yang  pada  setiap bagian matriksnya terdapat  molekul  tersebut.  Hal  ini mengakibatkan interkalasi  yang kuat antara DNA  yang melalui matriks berisi Gelred tersebut sehingga terjadi retardasi migrasi DNA yang berlebihan.
Salah  satu  saran  yang  dianjurkan  oleh  vendor  dari  produk  adalah  menggunakan metode  post-staining,  yaitu  sebuah  metode  dimana  proses  pewarnaan  dilakukan  setelah proses  elektroforesis  berakhir.(Biotium,  n.d.-b,  n.d.-a)  Proses  ini  nampaknya  dibuat  untuk mengatasi  masalah  migrasi  DNA  pada  metode  pre-cast.  Akan  tetapi,  pada  penelitian  ini dapat dilihat (gambar 1C) bahwa pemisahan  yang terjadi sekalipun cukup baik, pita DNA tidak  terlihat  tegas.  Hal  ini  dapat  disebabkan  oleh  adanya  perlakuan  staining  dimana agarosa  didiamkan  dalam  larutan  pewarna  berisi  Gelred  selama  30  menit.  Perlakuan tersebut  mengakibatkan  DNA  yang  sudah  tidak  bergerak  oleh  proses  tarikan  listrik berdifusi  ke  sekitarnya.  Pada  gambar  1  juga  dapat  dilihat  bahwa  perbedaan  jarak  migrasi antara  metode pre-cast dengan post-staining yang  membuktikan  bahwa  Gelred  yang terdapat di dalam agarosa mempengaruhi migrasi DNA.
Gambar 2. Hasil elektroforesis DNA ladder pada menggunakan buffer TBE: (A) 2% agarosa metode pre-cast, (B) 1% agarosa metode pre-cast, (C) 2% agarosa metode pre-loading/pre-staining dengan 100X pengenceran Gelred .
Pada  gambar  2  dapat  dilihat  hasil  elektroforesis  menggunakan  buffer  TBE.  Buffer ini  merupakan  buffer  umum  yang  menjadi  alternatif  TAE.  Salah  satu  keunggulan  buffer TBE ini adalah kemampuannya untuk migrasi DNA yang lebih cepat. Hal ini dapat terlihat dari kecepatan migrasi DNA ladder yang lebih cepat jika dibandingkan dengan buffer TAE. Pada  elektroforesis  menggunakan  buffer  TBE  settingan  elektroforesisnya  adalah  20  menit dengan  kekuatan  50  Ampere.  Akan  tetapi  dapat  dilihat  dari  gambar  2  bahwa  pemisahan untuk DNA dengan ukuran antara 600 – 1000 bp kurang baik. Hal ini menunjukkan bahwa TBE  jauh  lebih  baik  digunakan  untuk  DNA  yang  berukuran  dibawah  600  bp.    Hasil  ini juga  didukung  oleh    Miura  et  al.  yang  menyatakan  bahwa  TBE  jauh  lebih  baik  untuk pemisahan DNA  dalam ukuran kecil (Y et al., 1999).
Gambar 3. Elektroforesis DNA ladder pada 2% agarosa dengan metode pre- loading/pre-staining menggunakan buffer TAE: (A) tanpa pengenceran Gelred, (B) 50X pengenceran Gelred, (C) 100X pengenceran Gelred.
Pada  gambar  3  dapat  dilihat  hasil  pemisahan  yang  baik  dari  DNA  ladder  yang digunakan  dengan  metode pre-loading/pre-staining .  Pada  metode  ini  DNA  yang  diujikan dicampur  terlebih  dahulu  dengan  Gelred  dan  dilakukan  elektroforesis.  Pengenceran  dari pewarna  Gelred  yang  digunakan,  50X  dan  100X,  tidak  mempengaruhi  sensitivitas  dari pembacaan  pita  DNA.  Akan  tetapi,  apabila  dibandingkan  dengan  metode pre-cast ,  pita DNA  dari  metode pre-loading/pre-staining terlihat  tidak  setajam  metode  pre-cast.  Hal  ini akan sangat berpengaruh apabila terdapat dua pita yang memiliki ukuran yang tidak terlalu jauh berbeda sehingga akan mempersulit pembacaan hasil. Metode pre-loading/pre-staining telah  disarankan  oleh  Hall,  sekalipun  tidak  termasuk  dalam  troubleshooting  oleh  vendor, mengingat efisiensi penggunaan yang lebih sedikit daripada yang disarankan.  (Hall, 2020) Pada penelitian ini, dapat dilihat juga kestabilan metode ini dalam semua konsentrasi DNA yang dilakukan.

## Kesimpulan
Pewarna DNA Gelred merupakan alternatif baru dari ethidium bromide yang dapat digunakan  dalam  pewarnaan  DNA.  Dalam  penelitian  ini  nampak  bahwa  migrasi  DNA menggunakan  Gelred  dipengaruhi  oleh  jenis  buffer  yang  digunakan,  konsentrasi  agarosa,
1x   0.8x  0.6x  0.4x  0.2x   0.1x      1x   0.8x  0.6x  0.4x  0.2x  0.1x       1x   0.8x  0.6x  0.4x  0.2x  0.1x
ukuran  DNA,  konsentrasi  DNA  dan  metode  yang  digunakan  (pre-cast,  post-staining  atau pre-loading/pre-staining.  Untuk  mendapatkan  visualisasi  pita  DNA  yang  tajam,  metode terbaik adalah metode pre-cast dengan kelemahannya adalah perlunya optimasi konsentrasi agarosa, ukuran DNA dan konsentrasi  yang digunakan. Sementara itu metode yang paling stabil  untuk  digunakan  adalah  metode  pre-loading/pre-staining  dengan  kelemahan visualisasi pita DNA yang dihasilkan tidak setajam metode pre-cast. Buffer terbaik menurut penelitian  ini  adalah  buffer  TAE  yang  dapat  memberikan  perbedaan  yang  jelas  untuk visualisasi pita DNA dengan ukuran dari 100 -1000 bp.
Peneliti menyarankan untuk  menggunakan metode pre-loading/pre-staining dengan konsentrasi  Gelred  yang  sudah  encerkan  50x  untuk  setiap  amplicon  yang  akan dielektroforesis dan penggunaan buffer TAE.

## BIBLIOGRAFI
Biotium. (n.d.-a). GelRed® & GelGreen® - DNA Stains | EtBr Alternatives | Biotium, Inc. 2018.
Biotium. (n.d.-b). GelRed® and GelGreen® troubleshooting . 2018.
Borst,  P. (2005). Ethidium DNA agarose  gel  electrophoresis:  How it started. IUBMB Life (International Union of Biochemistry and Molecular Biology: Life) , 57 (11), 745–747. https://doi.org/10.1080/15216540500380855.
Choi,  H.  J.,  Ko,  M.,  &  Ahn,  J.  H.  (2010).  DNA  fingerprinting  using  PCR:  a  practical forensic  science  activity. Http://Dx.Doi.Org/10.1080/00219266.2008.9656148 , 43 (1), 41–44. https://doi.org/10.1080/00219266.2008.9656148.
Crisafuli,  F.  A.  P.,  Ramos,  E.  B.,  &  Rocha,  M.  S.  (2015).  Characterizing  the  interaction between  DNA  and  GelRed  fluorescent  stain. European  Biophysics  Journal :  EBJ , 44 (1–2), 1–7. https://doi.org/10.1007/S00249-014-0995-4.
Debroy,  A.,  Yadav,  M.,  Dhawan,  R.,  Dey,  S.,  &  George,  N.  (2022).  DNA  dyes:  toxicity, remediation  strategies  and  alternatives. Folia  Microbiologica , 67 (4),  555–571. https://doi.org/10.1007/s12223-022-00963-8.
Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., & Linacre, A. (2015). Properties of nucleic acid staining  dyes  used  in  gel  electrophoresis. Electrophoresis , 36 (6),  941–944. https://doi.org/10.1002/ELPS.201400496.
Hall,  A.  C.  (2020).  A  comparison  of  DNA  stains  and  staining  methods  for  Agarose  Gel Electrophoresis. BioRxiv , 568253. https://doi.org/10.1101/568253.
Huang,  Q.,  Baum,  L.,  &  Fu,  W.  L.  (2010).  Simple  and  practical  staining  of  DNA  with GelRed in agarose gel electrophoresis. Clinical Laboratory , 56 (3–4), 149–152.
J. Sambrook i D. W. Russell. (2001). Molecular cloning : a laboratory manual, III. In Red. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press . https://doi.org/10.3724/SP.J.1141.2012.01075.
Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., & Kim, Y. H. (2012a). Agarose gel electrophoresis for  the  separation  of  DNA  fragments. Journal  of  Visualized  Experiments , 62 . https://doi.org/10.3791/3923.
Lee,  P.  Y.,  Costumbrado,  J.,  Hsu,  C.  Y.,  &  Kim,  Y.  H.  (2012b).  Agarose  Gel Electrophoresis  for  the  Separation  of  DNA  Fragments. Journal  of  Visualized Experiments : JoVE , 62 , 3923. https://doi.org/10.3791/3923.
Scientific, T. (n.d.). SYBR Safe Frequently Asked Questions | Thermo Fisher Scientific - ID . 2018.
Williams,  L.  R.  (2001).  Staining  nucleic  acids  and  proteins  in  electrophoresis  gels.
Biotechnic and Histochemistry , 76 (3), 127–132.
https://doi.org/10.1080/bih.76.3.127.132.
Y, M., H, W., & T, K. (1999). TBE, or not TBE; that is the question: Beneficial Usage of Tris-Borate  for  Obtaining  a  Higher  Resolution  of  Small  DNA  Fragments  by  Agarose Gel Electrophoresis. Nagoya Medical Journal , 43 (1), 1–6.

## Copyright holder:
Sari M. Dewi Nataprawira, Erick Sidarta, Arlends Chris (2022)

## First publication right:
Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia
This article is licensed under: