## Jurnal Ilmiah Farmako Bahari
Extraction and Characterization of Chitin and Chitosan from Black Soldier Fly ( Hermetia illucens )
Dhini Annisa Rahmasari Kanto 1 ; Agus Dana Permana 2 ; Rukman Hertadi 3
1 Program Studi Kimia, Universitas Garut, Jalan Jati No. 42B, Garut
2 Program Studi Biologi, Institut Teknologi Bandung, Jalan Ganesha No. 10, Bandung 3 Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung, Jalan Ganesha No. 10, Bandung
Corresponding author: Dhini Annisa RK (dhini.annisa@uniga.ac.id)

## ARTICLE HISTORY
Received: 21 November 2018                   Revised: 11 December 2018                   Accepted: 16 January 2019

## Abstract
Chitin and chitosan is a widely used biopolymer in many areas. This kind of polymer is  mainly  found  in  crustaceae  and  insects. Hermetia  illucens is  one  of  the  insects that has chitin content in its shell. The source of chitin decides the physicochemistry of the extracted chitin. This study aims to extract chitin from H. illucens and convert it into  chitosan.  Chitin  and  chitosan  were  then  characterized  using  infrared spectroscopy  and  electron  microscope.  Chitin  extraction  from H.  illucens produced 17.93%  randemen.  The  deacetylation  of  chitin  resulted  in  chitosan  that  has distinctive  characteristic  for  chitosan.  The  resulted  chitosan  has  74.74% deacetylation  degree.  Scanning  of  chitin  and  chitosan  using  electron  microscope showed that chitosan morfology was more rough than that of chitin.
Key words: chitin, chitosan, deacetylation, hermetia illucens

## Ekstraksi dan Karakterisasi Kitin dan Kitosan dari Lalat Serdadu Hitam ( Hermetia illucens )

## Abstrak
Kitin  dan  kitosan  merupakan  polimer  yang  banyak  digunakan  dalam  berbagai aplikasi. Polimer jenis ini banyak ditemukan di organisme krustaseae dan serangga. Hermetia  illucens merupakan  salah  satu  serangga  yang  memiliki  kandungan  kitin pada  cangkangnya.  Sumber  organisme  kitin  menentukan  sifat  fisikokimia  dari  kitin yang  diekstraksi.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengekstraksi  kitin  dari H.  illucens dan mengubahnya menjadi kitosan. Kitin dan kitosan yang diperoleh dikarakterisasi menggunakan  spektroskopi  inframerah  dan  mikroskop  elektron.  Ekstraksi  kitin  dari H.  illucens menghasilkan  randemen  sebanyak  17,93%.  Hasil  deasetilasi  kitin tersebut menunjukkan bahwa kitosan yang diperoleh memiliki sifat yang khas untuk kitosan.  Derajat  deasetilasi  yang  diperoleh  sebesar  74,74%.  Pencitraan  dengan menggunakan mikroskop  elektron  menunjukkan morfologi  permukaan  kitosan  lebih kasar dan rapat daripada morfologi permukaan kitin.
Kata kunci: deasetilasi, kitin, kitosan, hermetia illucens
Farmako Bahari
Vol. 10 ; No. 1; Januari 2019 Halaman 23-32

## Pendahuluan
Kitin merupakan polisakarida alami yang dianggap sebagai salah satu biopolimer yang paling melimpah. Dalam berbagai penelitian, kitin telah berhasil ditemukan dan diisolasi dari beberapa organisme krustaseae, arakhnida, dan serangga 1;2;3;4 . Salah satu  serangga  yang  memiliki  kandungan  kitin  pada  cangkangnya  adalah  lalat Hermetia  illucens .  Penelitian Wasko 5 merupakan  studi  pertama  yang menunjukkan karakter fisikokimia kitin yang diekstrak dari larva dan lalat dewasa H. illucens . Hermetia  illucens ,  dikenal  juga  dengan  lalat  serdadu  hitam  (BSF),  merupakan spesies  lalat  yang  berasal  dari  daerah  Amerika.  Fase  hidup  lalat  ini  dimulai  dari telur,  larva, prepupa, pupa kemudian menjadi lalat dewasa. Uniknya, H. illucens ini hanya mengonsumsi makanan dan minuman pada fase larva hingga pupa. Setelah menjadi  lalat  dewasa,  lalat  ini  tidak  lagi  makan  dan  minum,  melainkan  hanya menggunakan  cadangan  nutrisi  yang  telah  dikumpulkan  pada  fase  sebelumnya. Karena  itu,  lalat  ini  sering  disebut  sebagai  lalat  yang  bukan  merupakan  vektor penyakit 6 . Wasko 5 menunjukkan bahwa kitin yang diekstrak dari H. illucens mempunyai sifat fisikokimia  yang  berbeda  dibandingkan  dengan  kitin  lain  yang  pernah  ditemukan sebelumnya.  Dengan  demikian, H.  illucens ini  merupakan  sumber  baru  biopolimer kitin yang menarik untuk diteliti dan digunakan dalam berbagai aplikasi biokimia dan bioteknologi.
Kitin  dapat  diolah  melalui  proses  deasetilasi  untuk  menghasilkan  kitosan.  Kitin merupakan homopolimer b (1  4) N-asetil-D-glukosamin 7 . Adapun kitosan diperoleh dengan cara membuang gugus asetil dari molekul kitin tersebut. Variasi kitosan dari berbagai  organisme  terletak  pada  kandungan  gugus  asetil  pada  kitosan.  Derajat deasetilasi (DD) kitosan merupakan salah satu parameter penting yang menentukan karakteristik dan sifat fisikokimia dari kitosan 8 .
Kitin  dan  kitosan  banyak  digunakan  dalam  berbagai  aplikasi,  seperti  kemasan makanan 9 ,  pertanian 10 ,  farmasi 11 ,  biomedis 12 ,  dan  imobilisasi  enzim 13 .  Banyaknya bidang  aplikasi  tersebut  disebabkan  sifat  fisikokimia  kitin  dan  kitosan  yang dipengaruhi  oleh  sumber  organisme  kitin  dan  kitosan  tersebut.  Oleh  karena  itu, penentuan sifat fisikokimia kitin dan kitosan dari berbagai sumber sangat diperlukan agar  kitin  dan  kitosan  yang  diperoleh  dapat  digunakan  untuk  keperluan  penelitian dan aplikasi lebih luas.

## Metode

## Alat
Pencitraan  morfologi  permukaan  dilakukan  dengan  menggunakan  mikroskop elektron  JEOL-JSM-6510LA(Analytical/Analytical  low  vacuum  SEM)  dari  Jepang. Adapun  spektrum  inframerah  diukur dengan menggunakan  Fourier  Transform  Infra Red (FTIR) Perkin Elmer dari USA.

## Bahan
Bahan-bahan  kimia  yang  digunakan  di  antaranya  kitin  dan  kitosan  dari  Merck, natrium  hidroksida,  asam  klorida,  kalium  permanganat,  asam  oksalat  dari  Sigma- Aldrich.

## Prosedur Rinci
Penelitian ini merupakan serangkaian tahapan yang meliputi isolasi kitin dari lalat dewasa H. illucens , karakterisasi kitin, produksi kitosan, dan karakterisasi kitosan.
Vol. 10 ; No. 1; Januari 2019 Halaman 23-32
A.  Produksi H. illucens
Produksi H.  illucens dilakukan  melalui  kerja  sama  dengan  Sekolah  Ilmu Teknologi  Hayati  (SITH)  Institut  Teknologi  Bandung  (ITB).  Kandang  untuk  lalat dewasa disimpan di Laboratorium Uji Toksikologi SITH ITB.

## B.  Ekstraksi Kitin
Sampel  lalat  dewasa H.  illucens dicuci,  dikeringkan  hingga  beratnya  konstan, kemudian  dihaluskan  dengan  menggunakan  mesin  penghalus.  Sampel  direfluks dalam larutan NaOH 1 M selama enam jam untuk menghilangkan protein. Hasilnya difiltrasi  dan  dicuci  dengan  menggunakan  akua  demineralisasi.  Selanjutnya ditambahkan  larutan  HCl  selama  36  jam  pada  temperatur  ruang  untuk menghilangkan  kandungan  mineral.  Sampel  difiltrasi  dan  dicuci  kembali.  Untuk menghilangkan  pigmen  yang  terkandung,  sampel  direndam  dalam  larutan  KMnO 4 1%  (w/v)  selama  1  jam  dan  diikuti  dengan  larutan  asam  oksalat  untuk membersihkan sisa-sisa KMnO 4 . Filtrasi dan pencucian dengan menggunakan akua demineralisasi  dilakukan  kembali.  Kitin  selanjutnya  dikeringkan  pada  temperatur 60 o C. Randemen kitin dihitung dengan menggunakan rumus berikut.
...(1)

## C.  Deasetilasi Kitin
Kitosan diperoleh dari deasetilasi kitin melalui tahapan berikut. Kitin yang telah diperoleh  sebelumnya  dicampurkan  dengan  50%  (w/v)  NaOH  (15  mL/g)  pada temperatur  100 o C  selama  delapan  jam.  Campuran  diaduk  sesekali  supaya homogen.  Setelah  difiltrasi,  residu  yang  diperoleh  dicuci  dengan  menggunakan akua  demineralisasi  panas  beberapa  kali  hingga  netral.  Kitosan  yang  diperoleh dikeringkan pada 50 o C selama 24 jam.
D.  Karakterisasi  Kitin dan  Kitosan  dengan  Spektroskopi  Inframerah Fourier- Transform (FTIR)
Spektrum  FTIR  sampel  dalam  bentuk  serbuk  direkam.  Kitin  telah  dikeringkan dalam  oven  pada  temperatur  60 o C  selama  48  jam.  Sampel  uji  disiapkan  dengan menggunakan metode KBr- disk .

## E.  Derajat Deasetilasi (DD) kitosan
Derajat  deasetilasi  kitosan  dihitung  berdasarkan  spektrum  IR  dengan menggunakan rumus berikut.
...(2)

## F.  Pencitraan Kitin dan Kitosan dengan Mikroskop Elektron (SEM)
Pencitraan  dengan  mikroskop  elektron  (SEM)  dilakukan  pada  voltase  20  kV yang  diakselerasi.  Morfologi  permukaan  kitin  dan  kitosan  diuji  pada  perbesaran 5000× dan 10.000×. Sebelum diuji, sampel di coating dengan emas (Au).
Vol. 10 ; No. 1; Januari 2019 Halaman 23-32

## Hasil

## Persentase kitin
Isolasi  kitin  dari  lalat  dewasa H.  illucens menghasilkan  kitin  sebanyak  17,93% (w/w) dari berat sampel total.

## Karakterisasi kitin dan kitosan
Kitin  dan  kitosan  yang  diperoleh  dikarakterisasi  dengan  menggunakan spektroskopi  infra  merah  (IR)  dan  mikroskop  elektron (SEM).  Derajat  deasetilasi kitosan dapat dihitung berdasarkan spektrum IR yang diperoleh.

## Spektrum IR kitin
Spektroskopi IR digunakan untuk mengetahui gugus-gugus fungsi yang terdapat dalam kitin hasil isolasi.
Gambar 1. Spektrum IR kitin hasil isolasi. Puncak khas kitin pada bilangan gelombang 3270 cm -1 , 3111 cm -1 , 1655 cm -1 , dan 1555 cm -1 ditandai dengan lingkaran merah. 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2500 3000 3500 4000 4500 1/cm 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %T 3 4 4 6 .7 9 3 2 6 9 .3 4 3 1 1 1 .1 8 2 9 2 4 .0 9 1 6 5 4 .9 2 1 5 5 4 .6 3 1 4 3 5 .0 4 1 3 7 7 .1 7 1 3 2 1 .2 4 1 2 5 9 .5 2 1 1 5 5 .3 6 1 1 1 4 .8 6 1 0 7 4 .3 5 1 0 2 8 .0 6 9 5 2 .8 4 8 9 6 .9 0 6 9 6 .3 0 6 1 3 .3 6 kit
Vol. 10 ; No. 1; Januari 2019 Halaman 23-32
Gambar 2. Spektrum IR kitin standar. Puncak khas kitin pada bilangan gelombang
3265 cm -1 , 3107 cm -1 , 1659 cm -1 , dan 1560 cm -1 ditandai dengan lingkaran merah.

## Spektrum IR kitosan
Spektroskopi  IR  digunakan  juga  untuk  menganalisis  gugus-gugus  fungsi  yang terdapat pada kitosan yang diperoleh.
Gambar 3. Spektrum IR kitosan hasil isolasi. Puncak khas kitosan pada bilangan gelombang 3379 cm -1 , 1638 cm -1 , dan 1595 cm -1 ditandai dengan lingkaran merah.
500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2500 3000 3500 4000 4500 1/cm -0 15 30 45 60 75 90 %T 3 4 4 6 .7 9 3 2 6 5 .4 9 3 1 0 7 .3 2 2 9 3 1 .8 0 2 8 8 9 .3 7 1 6 5 8 .7 8 1 5 6 0 .4 1 1 4 1 7 .6 8 1 3 7 9 .1 0 1 3 1 3 .5 2 1 2 5 9 .5 2 1 2 0 3 .5 8 1 1 5 7 .2 9 1 1 1 6 .7 8 1 0 7 4 .3 5 1 0 2 6 .1 3 9 5 0 .9 1 8 9 6 .9 0 7 5 0 .3 1 7 0 2 .0 9 5 7 8 .6 4 kitsdr 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2500 3000 3500 4000 4500 1/cm -0 15 30 45 60 75 90 %T 3 4 4 4 .8 7 3 3 7 9 .2 9 2 9 2 0 .2 3 2 8 8 7 .4 4 1 6 3 7 .5 6 1 5 9 5 .1 3 1 4 2 1 .5 4 1 3 8 1 .0 3 1 3 2 5 .1 0 1 2 5 1 .8 0 1 1 5 1 .5 0 1 0 9 3 .6 4 1 0 3 5 .7 7 8 9 4 .9 7 6 6 3 .5 1 5 9 9 .8 6 5 2 2 .7 1 dhini
Vol. 10 ; No. 1; Januari 2019 Halaman 23-32
Gambar 4. Spektrum IR kitosan standar. Puncak khas kitosan pada bilangan gelombang 1657 cm -1 dan 1582 cm -1 ditandai dengan lingkaran merah.

## Derajat deasetilasi kitosan
Berdasarkan  spektrum  IR  masing-masing,  diperoleh  derajat  deasetilasi  (%  DD) untuk kitosan hasil isolasi dan kitosan standar sebagai berikut.
Tabel 1. Derajat deasetilasi kitosan standar dan kitosan hasil isolasi
Sampel kitosan % DD Kitosan standar 78,70 Kitosan hasil ekstraksi 47,14 Kitosan hasil ekstraksi (deasetilasi ulang) 74,74

## Morfologi permukaan kitin dan kitosan
Morfologi  permukaan  kitin  dan  kitosan  dianalisis  dengan  menggunakan mikroskop elektron (SEM) pada perbesaran 5.000× dan 10.000×.
500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2500 3000 3500 4000 4500 1/cm 30 40 50 60 70 80 90 100 %T 3 4 4 6 .7 9 2 9 2 2 .1 6 2 8 8 1 .6 5 1 6 5 6 .8 5 1 5 8 1 .6 3 1 4 2 1 .5 4 1 3 7 9 .1 0 1 3 2 1 .2 4 1 2 6 1 .4 5 1 1 5 3 .4 3 1 0 8 3 .9 9 1 0 3 1 .9 2 8 9 6 .9 0 6 6 3 .5 1 6 1 7 .2 2 kitsdr
Vol. 10 ; No. 1; Januari 2019 Halaman 23-32
Gambar 5. Morfologi permukaan kitin hasil ekstraksi pada perbesaran 5.000× (A) dan 10.000× (B) dan morfologi permukaan kitosan hasil ekstraksi pada perbesaran 5.000×
(C) dan 10.000× (D)
Berikut ini morfologi permukaan kitin dan kitosan standar (MERCK).
Gambar 6. Morfologi permukaan kitin standar pada perbesaran 10.000× (A) dan 25.000× (B) dan morfologi permukaan kitosan standar pada perbesaran 5.000× (A) dan 10.000× (B)
C D B A A B C D
Vol. 10 ; No. 1; Januari 2019 Halaman 23-32

## Pembahasan

## Persentase kitin
Hasil  isolasi  kitin  dari  lalat  dewasa H.  illucens menghasilkan  kitin  sebanyak 17,93% (w/w) dari berat sampel total. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ulat sutera mengandung 20% kitin 14 , sedangkan lebah mengandung 10,3% kitin 15 . Adapun  kitin  dari  udang  dan  hewan  kelompok  krustaseae  mengandung  10% tergantung  pada  spesiesnya 3 .  Pada  penelitian  ini,  kitin  diperoleh  dengan persentase  yang  cukup  baik  dibandingkan  dengan  serangga  lainnya.  Walaupun masih cukup rendah jika dibandingkan dengan kitin dari hewan krustaseae, namun hasil ini menunjukkan bahwa H. illucens dapat menjadi sumber kitin alternatif yang menarik.

## Spektrum IR kitin
Spektrum  IR  yang  diperoleh  menunjukkan  bahwa  kitin  hasil  isolasi  memiliki puncak  pada  bilangan-bilangan  gelombang  yang  khas  untuk  kitin.  Spektrum  IR kitin  hasil  isolasi  dibandingkan  dengan  spektrum  IR  kitin  standar.  Hasilnya menunjukkan  bahwa  kedua  spektrum  hampir  sama.  Artinya,  kitin  telah  berhasil diisolasi  dari  lalat  dewasa H.  illucens .  Pada Gambar  3.1 dan 3.2 terlihat  bahwa gugus-gugus fungsi yang khas untuk kitin berupa vibrasi ulur C=O, vibrasi regang C=O  dan  vibrasi  tekuk  N –H,  serta  vibrasi  regang  C–N  ditunjukkan  berturut-turut oleh puncak pada bilangan gelombang 1655 cm -1 , 1630 cm -1 , dan 1555 cm -1 untuk kitin  hasil  isolasi  dan  pada  1659  cm -1 ,  1630  cm -1 ,  dan  1560  cm -1 untuk  kitin standar.  Puncak-puncak  ini  menunjukkan  bahwa  struktur  kitin  yang  diperoleh berupa kitin alfa 17 .

## Spektrum IR kitosan
Spektrum  IR  kitosan  yang  diperoleh  menunjukkan  puncak  untuk  gugus-gugus fungsi yang khas untuk kitosan. Spektrum tersebut juga memiliki kemiripan dengan spektrum  IR  kitosan  standar.  Spektrum  IR  kitosan  menunjukkan  menurunnya intensitas puncak pada 1656 cm -1 dan meningkatnya intensitas puncak pada 1590 cm -1 . Hal ini menunjukkan bertambahnya gugus NH 2 karena proses deasetilasi 14 .

## Derajat deasetilasi
Derajat  deasetilasi  menunjukkan  tingkat  keberhasilan  proses  deasetilasi. Kitosan  standar memiliki  derajat  deasetilasi  sekitar  78,70%.  Adapun  kitosan  hasil isolasi  awalnya  hanya memiliki  derajat  deasetilasi  sekitar  47,14%, namun setelah dilakukan deasetilasi ulang, derajat deasetilasi meningkat hingga 74,74%. Kitosan dari  udang  memiliki  derajat  deasetilasi  74%,  sedangkan  kitosan  dari  lebah  madu memiliki derajat deasetilasi 96% 3 . Artinya, kitosan yang dihasilkan sudah memiliki kualitas yang cukup baik untuk dapat digunakan pada tahap selanjutnya.

## Morfologi permukaan kitin dan kitosan
Hasil  pencitraan  dengan  menggunakan  mikroskop  elektron  (SEM)  pada perbesaran  5.000×  dan  10.000×  menunjukkan  bahwa  morfologi  permukaan kitosan lebih kasar dan lebih rapat daripada morfologi permukaan kitin. Pencitraan dengan  menggunakan  mikroskop  elektron  juga  dilakukan  pada  kitin  dan  kitosan standar, yakni yang berasal dari kulit udang (MERCK). Jika dibandingkan dengan morfologi  permukaan  kitin  dan  kitosan  hasil  ekstraksi,  morfologi  permukaan  kitin dan  kitosan  standar  ini  cukup  berbeda.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  perbedaan
Vol. 10 ; No. 1; Januari 2019 Halaman 23-32
sumber  organisme  yang  digunakan  untuk  ekstraksi  kitin  dan  kitosan mempengaruhi sifat dan karakteristik kitin dan kitosan yang diperoleh.

## Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa kitin dan kitosan telah berhasil diekstraksi dari lalat dewasa H. illucens . Randemen kitin yang diperoleh sebesar 17,93 (w/w) dari berat sampel total. Kitosan yang diperoleh dari hasil  deasetilasi  kitin  memiliki  derajat  deasetilasi  sebesar  74,74%.  Morfologi permukaan kitosan lebih kasar dan lebih rapat daripada morfologi permukaan kitin.

## Daftar Pustaka
1. Erdogan  S,  Kaya  M.  High  similarity  in  physicochemical  properties  of  chitin  and chitosan  from  nymphs  and  adults  of  a  grasshopper.  Int  J  Biol  Macromol  [serial online]. 2016;89(2016);118-26. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2016.04.059
2. Kaya  M,  Baran  T,  Erdogan  S, et  al .  Physicochemical  comparison  of  chitin  and chitosan  obtained  from  larva  and  adult  Colorado  potato  beetle  ( Leptinotarsa decemlineata ).  Mater  Sci  Eng  C  [serial  online].  2014;45(2014);72-81.  DOI: 10.1016/j.msec.2014.09.004
3. Marei  NH,  El-Samie  EA,  Salah  T, et  al .  Isolation  and  characterization  of  chitosan from  different  local  insects  in  Egypt.  Int  J  Biol  Macromol  [serial  online]. 2016;82(2016);871-77. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2015.10.024
4. Sjaifullah  A,  Santoso  AB.  Autolytic  isolation  of  kitin  from  wite  shrimp  ( Penaues vannamei )  waste.  Proc  Chem  [serial  online].  2016;18(2016);49-52.  DOI: 10.1016/j.proche.2016.01.009
5. Wasko  A,  Bulak  P,  Berecka  MP, et  al .  The  first  report  of  the  physicochemical structure of kitin isolated from Hermetia illucens . Int J Biol Macromol [serial online]. 2016;92(2016);316-20. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2016.07.038
6. Cickova  H,  Newton  GL,  Lacy  RC, et  al .  The  use  of  fly  larvae  for  organic  waste treatment. Waste Manage [serial online]. 2015;35(2015);68-80. DOI: 10.1016/j.wasman.2014.09.026
7. Austin  PR,  Brine  CJ,  Castle  JE.  Chitin:  New  facets  of  research.  Science [serial online].1981;212(4496);749-53. DOI: 10.1126/science.7221561
8. Kumari  S,  Rath  PK.  Extraction  and  characterization  of  chitin  and  chitosan  from (Labeo rohit) fish scales. Proc Mater Sci [serial online]. 2014;6(2014);482-89. DOI: 10.1016/j.mspro.2014.07.062
9. Wang  H,  Qian  J,  Ding  F.  Emerging  chitosan-based  films  for  food  packaging applications.  J  Agric  Food  Chem  [serial  online].  2018;66(2);395-413.  DOI: 10.1021/acs.jafc.7b04528
10. Zeng  D,  Luo  X,  Tu  R.  Application  of  bioactive  coatings  based  on  chitosan  for soybean seed protection. Int J Carbohydr Chem [serial online]. 2012;2012(104565);[5 p.]. DOI: 10.1155/2012/104565
Vol. 10 ; No. 1; Januari 2019 Halaman 23-32
11. Dash  M,  Chiellini  F,  Ottenbrite  RM, et  al .  Chitosan –  a  versatile  semi-synthetic polymer in biomedical applications. Prog Polym Sci [serial online]. 2011;36(8);981- 1014. DOI: 10.1016/j.progpolymsci.2011.02.001
12. Yang  TL.  Chitin-based  materials  in  tissue  engineering:  applications  in  soft  tissue and  epithelial  organ.  Int  J  Mol  Sci  [serial  online].  2011;12(2011);1936-63.  DOI: 10.3390/ijms12031936
13. Silva  DF,  Rosa  H,  Carvalho  AFAC, et  al .  Immobilization  of  papain  on  chitin  and chitosan  and  recycling  of  soluble  enzyme  for  deflocculation  of Saccharomyces cerevisiae from  bioethanol  distilleries.  Enzyme  Res  [serial  online].  2015;2015;[10 p.]. DOI: 10.1155/2015/573721
14. Paulino  AT,  Simionato  JI,  Garcia  JC, et  al .  Characterization  of  kitosan  and  kitin produced from silkworm crysalides. Carbohydr Polym [serial online].
2006;64(2006);98-103. DOI: 10.1016/j.carbpol.2005.10.032
15. Kaya  M,  Sargin  I,  Al-jaf  I, et  al .  Characteristic  of  corneal  lens  kitin  in  dragonfly compound  eyes.  Int  J  Biol  Macromol  [serial  online].  2016;89(2016);54-61.  DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2016.04.056
16. Jang MK, Kong BG, Jeong YI, et al . Physicochemical characterization of α-chitin, β- chitin, and γ-chitin separated from natural resources. J of Polym Sci A Polym Chem [serial online]. 2004;42(2004);3423-32. DOI: 10.1002/pola.20176