## Uji Invivo Ekstrak Dunaliella salina pada Pakan Komersil terhadap Gejala Klinis dan Patologi Anatomi Ikan Kerapu Cantang Pascainfeksi Viral Nervous Necrosis (VNN)
In-Vivo Test of Dunaliella salina Extract to Commercial Feed on Clinical Symptoms and Anatomical Pathology of Cantang Grouper after Viral Nervous Necrosis (VNN) infection
Rani Yuwanita * , Ating Yuniarti
Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Jalan Veteran Malang, Jawa Timur, 65145, Indonesia
*Korespondensi: raniyuwanita@ub.ac.id

## ABSTRAK
Viral  Nervous  Necrosis (VNN)  merupakan  patogen  yang  sering  ditemukan menginfeksi ikan kerapu cantang dan menyebabkan kematian masal hingga 100% dalam waktu  yang  singkat.  VNN  disebabkan  oleh  infeksi Nodavirus yang  menginfeksi  sistem saraf dan penglihatan pada ikan. Salah satu upaya pencegahan terhadap infeksi VNN pada ikan kerapu cantang adalah dengan menambahkan ekstrak Dunaliella salina yang memiliki kandungan β-karoten, nephtalene , tetradekana dan fenol yang berperan sebagai antivirus, anti  mikroba  dan  anti  inflamasi.  Tujuan  penelitian  ini  untuk  menguji  potensi  ekstrak D . salina terhadap gejala klinis dan patologi anatomi ikan kerapu cantang pascainfeksi VNN. Ekstrak D.  salina dengan  dosis  250,  300,  350  dan  400mg/kg  pakan  ditambahkan  pada pakan  pellet  komersil  merk  Stella  B2  dengan  kandungan  protein  42%.  Pakan  diberikan pada ikan kerapu cantang berukuran 7-9 cm selama 10 hari pemeliharaan. Selanjutnya ikan diuji  tantang  menggunakan  VNN  sebanyak  0,2  ml/ekor  melalui  metode  injeksi. Pengamatan gejala klinis dan patologi anatomi diamati selama 96 jam pasca infeksi. Gejala patologi  klinis  ikan  yang  terinfeksi  VNN  tampak  berputar-putar,  berenang  secara horizontal, inflasi gelembung renang, perubahan warna sirip pektoral menjadi kemerahan, pembengkakan  organ  limfa,  organ  hati  menguning  dan  warna  tubuh  yang  menggelap. Senyawa  yang  ditemukan  pada  ekstrak D . salina dapat  digunakan  untuk  meningkatkan respon imun dan menurunkan jumlah kematian ikan kerapu cantang yang diinfeksi VNN. Penambahan  ekstrak D . salina yang  lebih  tinggi  dari  pada  dosis  lainnya  dapat meningkatkan  sistem  imun  sehingga  kelangsungan  hidupnya  (SR)  lebih  tinggi  seiring dengan meningkatnya dosis yang diberikan.
Kata kunci: Dunaliella salina , Kerapu Cantang, Patologi VNN

## ABSTRACT
Viral Nervous Necrosis (VNN) is a pathogen that is often found infecting cantang grouper and causing mass mortality of up to 100% in a short time. VNN is caused by a Nodavirus  infection  that  infects  the  nervous  and  visual  systems  of  fish.  One  of  the prevention efforts against VNN infection in cantang grouper is to add Dunaliella salina extract  which  contains  -carotene,  nephtalene,  tetradecane  and  phenol  which  acts  as antiviral, anti-microbial and anti-inflammatory. The purpose of this study was to examine the  potency  of  D.  salina  extract  against  clinical  symptoms  and  anatomical  pathology  of cantang  grouper  after VNN  infection.  D.  salina extract  with  doses of  250,  300,  350  and 400mg/kg  of feed  was  added to  commercial pelleted feed  of the  Stella  B2  brand  with  a protein content of 42%. Feed was given to cantang grouper measuring 7-9 cm for 10 days
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2022.Vol.6.No.2.215
of maintenance. Furthermore, the fish were challenged using VNN as much as 0.2 ml/head through the injection method. Observations of clinical symptoms and anatomical pathology were observed for 96 hours after infection. Symptoms of clinical pathology of fish infected with  VNN  appear  to  be  circling,  swimming  horizontally,  inflation  of  the  swim  bladder, discoloration of the pectoral fins to reddish, swollen lymph organs, yellowing of the liver and darkening of the body color. The compounds found in the extract of D. salina can be used to increase the immune response and reduce the number of deaths of cantang grouper infected with VNN. The addition of D. salina extract which was higher than other doses could  increase  the  immune  system  so  that  its  survival  (SR)  was  higher  as  the  dose increased.
Keywords: Dunaliella salina, Cantang Grouper, VNN Pathology

## PENDAHULUAN
Ikan kerapu cantang ( Epinephelus fucoguttatus x Epinephelus  lanceolatus ) adalah  ikan  kerapu  hibrid  yang  menjadi komoditas ekspor penting ke Hongkong, Jepang, Singapura dan Cina (Dedi, et al . 2018).  Sutarmat  dan  Yudha  (2013) menambahkan, larva ikan kerapu cantang hasil  hibridisasi  mempunyai  pertumbu- han  lebih  cepat  dibandingkan  dengan kerapu macan. Pada kerapu hibrida umur 90 hari mempunyai rata-rata panjang 12 cm,  sedangkan  rata-rata  panjang  kerapu macan  mencapai  sekitar  7  cm.  Ikan kerapu  cantang  menunjukkan  selera makan yang baik dan pertumbuhan yang lebih  cepat  sehingga  mudah  untuk dibudidaya (Luin, et al ., 2013).
Tingkat  mortalitas  yang  tinggi pada  benih  maupun  larva  ikan  kerapu menjadi  kendala  utama  dalam  kegiatan budidaya (Roza, et al ., 2006). Penyebab kematian  masal  ikan  kerapu  dapat disebabkan oleh infeksi VNN (Hakim, et al .,  2016)  yang  mampu  menyebabkan kematian  hingga  100%  dalam  waktu singkat dengan menginfeksi sistem saraf pusat  dan  penglihatan  ikan  (Tarsim, et al ., 2013). Penyakit VNN telah mengin- feksi lebih dari 40 spesies ikan pada fase larva  dan juvenil,  namun  pada  beberapa spesies ikan, VNN juga dapat menyerang ikan dewasa (Nazari, et al ., 2014). Larva dan  juvenil  kerapu  akan  terserang  VNN pada suhu 24,5°C-26°C yang merupakan suhu optimal dalam proses infeksi VNN. VNN  biasanya  menyerang  pada  larva umur 7-45 hari karena sistem saraf yang
masih  sederhana  (Sudaryatma, et  al ., 2012).
Salah satu manfaat alga yang dapat memproduksi agen antivirus telah
banyak  diketahui.  Akan  tetapi  hanya beberapa  penelitian  saja  yang  telah membuktikan  bahwa  adanya  komponen penghambat infeksi virus pada mikroalga laut.  Beberapa  jenis  mikroalga  yang memiliki  aktivitas  antivirus  antara  lain Spirulina  platensis , Chlorella  vulgaris dan Dunaliella salina (Priyadarshani dan Rath,  2012).  Mikroalga  D. salina dilaporkan  memiliki  kandungan  β- karoten  yang  mencapai  lebih  dari  14% dari berat keringnya. β-karoten dan lutein merupakan karotenoid utama dari mikroalga  D. salina dengan  persentase sebanyak  90%  dan  5%  dari  total karotenoid (Hexin, et al ., 2016). Pigmen karotenoid mengandung aktivitas
antioksidan  pada  hewan  akuatik,  selain itu juga dapat meningkatkan fungsi imun dan  meningkatkan  resistensi  penyakit pada  hewan tingkat tinggi  (Madhumathi dan  Rengasamy,  2011). Kandungan  β- karoten  pada D.  salina juga  berfungsi sebagai nutrisi esensial dan dapat diubah tubuh menjadi vitamin A, serta bertindak sebagai  antioksidan  lemah  (Hadiyanto dan  Azim,  2012). D.  salina diketahui menjadi salah satu jenis mikroalga hijau yang dapat memproduksi fenol (Duan, et al ., 2017). Fenol pada D. salina memiliki fungsi  sebagai  senyawa  anti  mikroba, anti  oksidan,  antivirus,  anti  alergi  dan anti  inflamasi  (Cepeda, et  al .,  2018). S enyawa  polisakarida  juga  ditemukan pada D.  salina sebanyak  12-40%  yang
dapat  dimanfaatkan  sebagai  antitumor dan  antivirus  (Dai, et  al .,  2010). Supamattaya, et  al .  (2005)  menyatakan bahwa  pemberian  ekstrak D.  salina dengan  dosis  300  mg/kg  pakan  dapat menghambat  kematian  ikan  atau  udang. Tujuan  penelitian  ini  untuk  menguji potensi ekstrak D. salina terhadap gejala klinis  dan  patologi  anatomi  ikan  kerapu cantang pascainfeksi VNN.

## Materi dan Metode Materi
Ikan  uji  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah ikan kerapu cantang ukuran 7-9 cm yang diperoleh dari BBAP Situbondo  dan  telah  diadaptasikan  sela- ma 7 hari.

## Pembuatan Ekstrak D. salina
Sebanyak 250 gr tepung D. salina yang  digunakan  pada  penelitian  ini diperoleh dari Balai Perikanan Budidaya Air  Payau  (BPBAP)  Situbondo.  Ekstrak D. salina didapatkan dengan mengguna- kan  metode  maserasi  (perendaman) selama  24  jam  dan  disimpan  dalam kondisi  gelap.  Tepung D.  salina diren- dam  menggunakan  pelarut  n-heksana dengan  perbandingan  1:5  (g/ml).  Filtrat yang  dihasilkan  ditampung  dan  dikum- pulkan  kemudian  dievaporasi  menggu- nakan  rotator  evaporator  dengan  suhu 50 o C  hingga  filtrat  mengental.  Hasil evaporasi  yang  didapatkan  berbentuk pasta  kemudian  ditimbang  sesuai  dosis yang telah ditentukan.

## Repelleting
Pakan  yang  digunakan  pada penelitian  ini  adalah  pakan  pellet  merk Stella B2 dengan penambahan ekstrak D . salina .  Keduanya  ditimbang  terlebih dahulu  sesuai  dosisnya,  pelet  dihancur- kan  sampai  halus  dan  ekstrak D . salina ditambahkan  ke  dalamnya.  Sebagai perekat,  pakan ditambahkan tepung kanji sebanyak  10  gram  secara  sedikit  demi sedikit  sambil  diaduk-aduk.  Setelah semua  bahan  tercampur  rata,  pelet dicetak  ulang  dengan  menggunakan
cetakan  manual  agar  tidak  merusak kandungan  bioaktif D . salina ,  lalu  pelet dikeringkan  dan  disimpan  sebelum diberikan  ke  ikan  kerapu  cantang. Penyimpanan  hasil repelleting tidak boleh  lebih  dari  14  hari  agar  tidak mereduksi  atau  merusak  senyawa  aktif yang  terkandung  dalam  mikroalga D . salina (Udiarta, et al., 2015).

## Isolasi Virus
Pembuatan inokulum virus mengunakan  organ  mata  dan  otak  ikan kerapu cantang yang digerus mengguna- kan pellet pastle , lalu ditambahkan PBS ph  7,2  dengan  perbandingan  1:3  yang selanjutnya  disentrifugasi  dengan  kece- patan 3000 rpm selama 10 menit. Super- natan  yang  telah  didapat,  disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 selama 30 menit. Supernatan kemudian disaring menggunakan  membran  filter  ukuran 0,45 µm (Mahardika, et al ., 2004).

## Pemberian Pakan
Selama  10  hari  masa  pemeliha- raan,  ikan  kerapu  cantang  diberi  pakan hasil repelleting yang  mengandung ekstrak D . salina 2 kali sehari, pada pagi dan  sore  hari  sebanyak  5%  dari  berat biomassa  secara ad  libitum .  Selama penelitian,  dilakukan  pengukuran  suhu, pH,  salinitas  dan  DO  setiap  hari  pada pagi dan sore untuk mengontrol kualitas air.

## Uji Tantang VNN
Metode  uji  tantang  yang  diguna- kan mengacu pada hasil uji LD 50 di tahap sebelumnya yaitu  dilakukan  pada  ma- sing-masing ikan dengan menyuntik-kan sebanyak  0,2  ml  virus  VNN/ekor  ikan dengan  konsentrasi  10 4 pada  bagian intraperitonial.  Selanjutnya  ikan  dipeli- hara  dalam  kontainer  yang  ditambah aerasi.
Pengamatan Gejala Klinis dan Patologi Anatomi
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2022.Vol.6.No.2.215
Pengamatan  gejala  klinis  dilaku- kan selama 5 hari dengan interval waktu 12  jam  atau  hingga  mencapai  LD 50 . Pengamatan  ini  dilakukan  terhadap perubahan warna tubuh, nafsu makan dan tingkah  laku  pasca  infeksi.  Pengamatan patologi anatomi dilakukan pada 96 jam pascainfeksi  VNN.  Untuk  mengetahui patologi  anatomi,  tubuh  ikan  kerapu cantang  dibedah  kemudian  diamati organ-organnya yang meliputi sirip limfa dan hati.

## Deteksi VNN dengan PCR
Amplifikasi  dilakukan  2  kali  agar fragmen  VNN  terlihat  lebih  spesifik. First  step  PCR menggunakan  sepasang primer  yang mengacu pada  OIE  (2019), yaitu  F2  (5’-CGT-GTC-AGT-CAT- GTC-TCG-CT-3’)  dan  R3  (5’-CGA- GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3’) dengan  reagen  dari GoTaq  PCR  Core System ( Promega ),  sedangkan nested
PCR menggunakan GoTaq Green Master Mix dengan  sepasang  primer  yang digunakan  mengacu  pada  OIE  (2019), yaitu  NF2  (5’-GTT-CCC-TGT-ACA- ACG-ATT-CC-3’)  dan  NR3  (5’-GGA- TTT-GAC-GGG-GCT-GCT-CA-3’). Setelah  itu  produk  PCR  dielektroforesis pada 1,5% agarose gel selama 30 menit dengan  larutan  TAE  1X  sebanyak  500 mL dengan voltase 100-150 V. Langkah terakhir yaitu pembacaan hasil menggunakan UV  Gel  Documentation .
Hasil  positif  VNN  apabila  terlihat  garis perpendaran  pita  DNA  ( band )  dengan 294 bp ( base pair).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Gejala  Klinis  Ikan  Kerapu  Cantang
Pascainfeksi
Gejala  klinis  ikan  kerapu  cantang yang diinfeksi VNN dengan pemberikan ekstrak D . salina disajikan pada Gambar 1 dan Tabel 1.
Gambar 1. Gejala Klinis Ikan Kerapu Cantang Pasca Infeksi VNN. (a) warna tubuh ikan menggelap; (b) ikan berenang miring; (c) ikan bergerombol di tepi bak; dan (d) ikan berdiam di dasar bak
a
b c
d

## Tabel 1. Gejala Klinis Pascainfeksi VNN
Waktu Pengamatan (jam) Dosis D. salina (mg/kg) Gejala Klinis Nafsu Makan Tingkah Laku Warna Tubuh 12 0 Normal Berenang aktif Normal 250 Normal Berenang aktif Normal 300 Normal Berenang aktif Normal 350 Normal Berenang aktif Normal 400 Normal Berenang aktif Normal 24 0 Normal Berenang aktif Normal 250 Normal Berenang aktif Normal 300 Normal Berenang aktif Normal 350 Normal Berenang aktif Normal 400 Normal Berenang aktif Normal 36 0 Normal Berenang aktif Normal 250 Normal Berenang aktif Normal 300 Normal Berenang aktif Normal 350 Normal Berenang aktif Normal 400 Normal Berenang aktif Normal 48 0 Menurun Berenang pasif 50% menghitam 250 Menurun Berenang pasif Normal 300 Menurun Berenang pasif Normal 350 Normal Berenang aktif Normal 400 Normal Berenang aktif Normal 60 0 Menurun Berenang pasif 50% menghitam 250 Menurun Berenang pasif, berdiam di dasar 50% menghitam 300 Menurun Berenang pasif, berenang miring Normal 350 Normal Berenang mayoritas pasif Normal 400 Normal Berenang aktif, beberapa berdiam di dasar Normal 72 0 Menurun Berenang pasif, beberapa berenang miring 50% menghitam 250 Menurun Berenang pasif, berdiam di dasar dan tubuh miring 50% menghitam 300 Menurun Berenang pasif, beberapa miring 50% menghitam 350 Menurun Berenang pasif, berdiam di dasar 25% menghitam 400 Normal Berenang aktif 25% menghitam 84 0 Menurun Berenang pasif, tubuh miring 50% menghitam 250 Menurun Berenang pasif, tubuh miring 50% menghitam
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2022.Vol.6.No.2.215
300 Menurun Berenang pasif, tubuh miring 50% menghitam 350 Menurun Berenang pasif, berdiam di dasar 25% menghitam 400 Menurun Berenang pasif 25% menghitam 96 0 Menurun Berenang pasif, tubuh miring, berdiam di dasar 50% menghitam 250 Menurun Berenang pasif, tubuh miring, berdiam di dasar 50% menghitam 300 Menurun Berenang pasif, tubuh miring 50% menghitam 350 Menurun Berenang pasif, berdiam di dasar 50% menghitam 400 Menurun Berenang pasif 25% menghitam
VNN  dapat  menginfeksi  sistem imun  non  spesifik  dan  sistem  imun spesifik  ikan.  VNN  dapat  ditularkan melalui  air  dari  ikan  yang  terinfeksi  ke ikan  yang  sehat  dalam  waktu  4  hari. Kemungkinan yang menjadi jalan masuknya  VNN  ke  dalam  sel  inang adalah  bagian  sel  epitel  pada  rongga hidung  kemudian  mencapai  saraf olfac- tory dan menginvasi lobus olfactory. Di tempat  ini  virus  akan  melakukan replikasi.  Sel  epitel  pada  kulit  dan  usus juga  memungkinkan  menjadi  jalan masuknya  virus  VNN.  Ketika  berada pada  tubuh  inang,  VNN  melakukan perbanyakan  diri  dan  menyebar  pada organ  target  melalui  aliran  darah sehingga  menyebabkan  terjadinya  lesi pada  bagian  endokardium.  VNN  juga menyerang  bagian  CNS  dengan  cara perpindahan axonal melewati saraf otak, kemudian  virus  tersebut  melakukan replikasi  pada  organ  target,  sehingga terjadi  vakuolasi  pada  otak  ikan  yang terserang  VNN  (Woo  dan  Cipriano, 2017). Sudaryatma, et al . (2012) menam- bahkan bahwa virus yang masuk melalui permukaan tubuh dapat langsung berepli- kasi di epitel permukaan saluran pencer- naan  dan  masuk  ke  dalam  sistem  saraf pusat melalui saraf perifer nervus vagus.
Ikan kerapu cantang mulai mengalami kematian pada waktu 72 jam pasca infeksi. Menurut Sumaryam, et al . (2011),  pada  umumnya  gejala  klinis
penginfeksian VNN terjadi dalam waktu yang  lama  sehingga  bisa  menampakkan gejala  khas.  Hal  tersebut  juga  sesuai dengan  laporan  Johnny, et  al .  (2007) yang  menyatakan  bahwa  gejala  klinis pada  ikan  setelah  diuji  tantang  dengan VNN    adalah  penurunan  nafsu  makan yang  mulai  terlihat  pada  hari  ke  2, sehingga  pada  24-36  jam  pasca  infeksi belum  terlihat  tanda-tanda  infeksi  VNN yang  jelas.  Selain  itu,  hasil  gejala  klinis ikan yang terinfeksi VNN adalah whier- ling atau  berenang  memutar,  menenga- dah,  berdiam  diri  di  dasar  seolah-olah mati,  dan  warna  tubuh  menjadi  lebih gelap.  VNN  menyerang  syaraf  otak, sehingga  motorik  rusak.  Hal  tersebut mengakibatkan tidak seimbangnya antara keinginan makan maupun keseimbangan dalam air dengan motorik. VNN menye- rang bagian otak sehingga menyebabkan ikan berenang berputar, mengambang di permukaan  dengan  perut  menghadap  ke atas  dan  pigmentasi  yang  lebih  pekat pada  warna  ikan.  Menurut  Setyorini, et al .  (2008),  penggelapan  warna  tubuh akibat infeksi VNN berhubungan dengan produksi lendir. Sebagai respon fisiologis, ikan yang terinfeksi virus akan memproduksi  lendir  berlebih  dan  selan- jutnya  produksi  lendir  akan  menurun drastis  sehingga  tubuh  ikan  terasa  kesat dan kulit berwarna lebih gelap.
D.  salina merupakan  salah  satu mikroalga laut yang dapat memproduksi
agen antivirus. Pemberian D . salina pada pakan mampu menambah daya cerna dan ketahanan  tubuh  ikan  dan  udang  karena ada  kandungan  karotenoidnya  (Ibanez dan Cifuentes, 2013). Kandungan karote- noid  pada D . salina terakumulasi  di dalam  globula  lemak  di  antara  tilakoid dan terletak di dalam kloroplas yang kaya akan asam lemak omega 3 yang diketahui dapat  meningkatkan  pertumbuhan  ikan dan  menjaga  kestabilan  suhu  tubuh (Cakmak, et  al .,  2014).   Pigmen  karote- noid  pada D.  salina juga  mengandung aktivitas antioksidan yang dapat mening- katkan  fungsi  imun  dan  meningkatkan resistensi  penyakit  pada  hewan  tingkat tinggi  (Madhumathi  dan  Rengasamy, 2011). Karotenoid dibutuhkan ikan untuk perlindungan  intrasel  melalui  stabilitas membran, survival dan  pertumbuhan dengan membuang radikal oksigen bebas (Yunanto, et al ., 2013). Selain karotenoid,  adanya  polisakarida  yang terkandung dalam D. salina mempunyai peran  sebagai  antivirus,  antitumor, antioksidan, antikanker dan immunomodulator (Interclinical Laboratories,  2010).  Polisakarida  dari mikroalga mampu mencegah infeksi dari beberapa  virus  pada  proses  absorpsi sampai  tahap  uncoating. D.  salina juga dapat  meningkatkan  aktivitas  sel  NK yang  berperan  dalam  proses  fagositik
pada  tubuh  ikan  (Chuang, et  al .,  2014). Sel Natural  Killer (NK cell )  berperan dalam  membatasi  penyebaran  virus dengan  cara  melisiskan  sel-sel  yang terinfeksi virus pada tahap awal penginfeksian.

## Patologi Anatomi
Pengamatan patologi anatomi menunjukkan  adanya  perubahan  warna sirip pektoral menjadi kemerahan (Gambar  2a),  organ  limfa  membengkak (Gambar  2b)  dan  organ  hati  menguning (Gambar 2c). Pembengkakan pada limpa ikan yang terserang VNN diduga karena pada  organ  tersebut  mendapatkan  aliran darah  yang  mengandung  bahan  genetik replikasi  dari  virus  VNN  langsung  dari jantung  dan  pembuluh  darah  balik  dari otak. Hal tersebut mengakibatkan terjadinya  pembengkakan  pada  organ internal  terutama  hati  dan  limpa  yang dilewati  oleh  aliran  darah.  Perubahan pada  organ  internal,  terutama  hati  dan limpa akan terjadi akibat adanya viremia pada ikan yang terinfeksi virus penyebab VNN  (Lio-Po  dan  Pena,  2004).  VNN bersifat neurotropik dan dapat bereplikasi dalam  saraf  dan  dapat  secara  cepat menyerang  organ  lain  yang  dilalui  oleh sistem saraf perife (Korsnes, 2008).
Gambar 2. Lesi  Anatomi  Ikan  Kerapu  Cantang  pasca  infeksi  VNN.  (a)  sirip  pektoral kemerah-merahan;  (b)  pembengkakan  pada  organ  limfa;  dan  (c)  organ  hati menguning
a b c
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2022.Vol.6.No.2.215

## PCR
Hasil  uji  PCR  yang  di  lakukan menunjukkan  hasil  positif  (+)  VNN, yang ditandai dengan adanya band yang sejajar  dengan  ukuran  marker  (294  bp) yang  digunakan  yakni  pada  kontrol negatif  VNN  dan  sampel  ikan  yang terinfeksi VNN (Gambar 3) . Berdasarkan hasil uji PCR tersebut didapatkan  hasil  bahwa  sampel  ikan kerapu  cantang  yang  diuji  positif terinfeksi  oleh  VNN  karena  terdapat band yang sejajar dengan ukuran marker 294 bp atau sejajar dengan kontrol positif VNN yaitu pada 294 bp. Sementara pada kontrol  negatif  VNN  tidak  ditemukan adanya kemunculan band yang
menunjukkan  bahwa  hasil  uji  PCR tersebut  akurat  karena  tidak  mengalami kontaminasi  ketika  sedang  melakukan prosedur pengujian PCR. Hasil pengujian PCR  tersebut  juga  sesuai  dengan  gejala
klinis  dan  patologis  yang  ditimbulkan setelah  ikan  diinfeksi  dengan  VNN. Nodavirus  sebagai  agen  penyebab  VNN pada ikan dapat dideteksi keberadaannya meskipun  tanpa  adanya  gejala  klinis (Novriadi, et  al .,  2014).  PCR  dapat digunakan untuk menentukan keberadaan  suatu  penyakit,  selain  itu PCR  juga  dapat  digunakan  untuk menentukan  kandungan  materi  genetik baik  DNA  maupun  RNA  (Fajri, et  al ., 2015).

## Survival Rate (SR)
Setelah  uji  tantang  didapatkan nilai  SR  yang  berbeda-beda  setiap perlakuan dengan total 28 ekor ikan mati pada  96-108  jam  pasca  infeksi  VNN. Dari  50  ekor  ikan  pada  penelitian, menyisakan  22  ekor  ikan  hingga  hari kelima pascainfeksi VNN (Tabel 2).
Gambar 3. Hasil Elektroforesis Ikan Kerapu Cantang Positif VNN. Keterangan: 1. Marker, 2. Kontrol Positif, 3. Kontrol negatif, 4. Sampel 1 Positif VNN
Tabel 2.   SR Ikan Kerapu Cantang Selama Penelitian
Dosis D. salina (mg/kg) Jumlah ikan awal (ekor) Jumlah ikan akhir (ekor) SR (%) 0 10 1 10 250 10 2 20 300 10 4 40 350 10 5 50 400 10 6 60
Tabel 3. Hasil Pengukuran Parameter Kualitas Air Selama Pemeliharaan
Parameter Nilai Literatur (Adipu, et al ., 2013) Suhu (ºC) 27-30 24-32 Derajat Keasaman (pH) 7,11-7,82 7,0-8,5 Oksigen Terlarut (DO) (ppm) 5,1-8,2 5,0-8,2 Salinitas (ppt) 31-34 28-35 Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa ikan kerapu cantang yang diijeksi 0,2 ml VNN mencapai LD 50 atau kematian 50% pada hari ke-5 pasca infeksi.  Kelangsungan  hidup  paling tinggi  terjadi  pada  perlakuan  dengan pemberian  dosis D.  salina 400mg/kg pakan,  yaitu  mencapai  60%.  Senyawa yang  ditemukan  pada  ekstrak D . salina dapat  digunakan  meningkatkan  respon imun  pada  tubuh  ikan.  Selain  itu, senyawa yang terkandung dalam ekstrak D . salina berguna  sebagai  antimikroba dan antioksidan untuk menekan produksi radikal bebas yang berlebihan. Flavonoid dan tanin juga berfungsi sebagai antivirus yang  dapat  menghambat  pertumbuhan VNN  dan  mematikan sel  virus  sehingga menurunkan  jumlah  kematian  ikan kerapu  cantang.  Tingkat  kelulushidupan yang  rendah  pada  ikan  yang  terserang VNN diduga karena sifat dari virus VNN yang  tidak  dapat  dimatikan  dan  bersifat aktif  dalam  sel  inang  yang  mendukung kehidupannya.
Penambahan  ekstrak D . salina yang  lebih  tinggi  daripada  dosis  lainnya dan  dapat  meningkatkan  sistem  imun pada  ikan  kerapu  cantang  sehingga kelangsungan hidupnya (SR) lebih tinggi seiring dengan meningkatnya dosis yang diberikan.  Ikan  kerapu  cantang  pada dosis yang lebih tinggi (400 mg/kg) lebih tahan  terhadap  VNN  karena  kandungan β-karoten  yang  lebih banyak  pada  dosis tersebut  dapat  meningkatkan  aktivitas lysozyme . Chuang, et al . (2014)
mengatakan bahwa lysozyme merupakan zat yang disekresikan oleh leukosit yang berfungsi  untuk  meningkatkan  aktivitas fagositik  dan  aktivitas  sel  NK  ( Natural
Killer )  yang  berperan  dalam  proses fagositik.  NK cell merupakan  populasi limfosit  yang  dapat  berkontribusi  pada respon  perlindungan  terhadap  berbagai
infeksi  dan  menghasilkan  sitokin  dan kemokin  tertentu  dalam  jumlah  yang banyak.

## Kualitas Air
Hasil pengukuran parameter kualitas air pada bak-bak percobaan yang diukur  setiap  pagi  dan  sore  hari didapatkan  hasil  bahwa  kisarannya selama  penelitian  masih  berada  dalam kisaran  optimal  untuk  kelangsungan hidup  kerapu  cantang  selama  masa pemeliharaan (Tabel 3).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  tes  in  vivo  pada penelitian ini diketahui bahwa perubahan gejala  klinis  dan  patologi  ikan  kerapu cantang  yang  diberi  ekstrak D.  salina lebih  lambat  dibandingkan  yang  tidak diberi  sama  sekali,  dan  semakin  tinggi dosis yang diberikan, perubahan tersebut juga semakin berkurang.

## DAFTAR PUSTAKA
Adipu, Y., Lumenta. C, Kaligis. E dan H. J.  Sinjal.  (2013).  Kesesuaian lahan  budidaya  laut  di  perairan Kabupaten Bolaang Mongondow  Selatan,  Sulawesi Utara. Jurnal  Perikanan  dan
Kelautan Tropis . 9 (1): 19-26.
Cakmak,  Y.  S.,  Kaya.  M  and  M.  Asan-
Ozusaglam. (2014). Biochemical composition and bioactivity screening  of  various  extracts from Dunaliella  salina ,  a  green microalga. EXCLI  Journal . 13 : 679-690.
Cepeda,  G.  N.,  B.  B.  Santoso,  M.  M. Lisangan dan I. Silamba. (2018). Kandungan fenol, flavonoid dan terpenoid  ekstrak  metanol  daun
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2022.Vol.6.No.2.215
akway  ( Drimys  piperita Hook
f.). Agrotek . 1 : 35-40.
Chuang,  W.,  Ho.  Y,  Liao.  J  and  F.  Lu.
(2014). Dunaliella salina exhibits an antileukemic immunity  in  a  mouse  model  of WEHI-3 leukemia cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry . 62 (47):  11479- 11487. Dai, J., Wu. Y, Chen. S, Zhu. S, Yin. H, Wang.  M  and  J.  Tang.  (2010). Sugar compositional determination of polysaccharides from Dunaliella salina by modified  RP-HPLC  method  of precolumn derivatization with 1-
phenyl-2methyl-5-pyrazolone.
Carbohydrate  Polymers .  82  (3): 629-635.
Dedi,  H.  Irawan  dan  W.  K.  A.  Putra. (2018).  Pengaruh  pemberian hormone  tiroksin  pada  pakan pelet megami terhadap pertumbuhan  benih  ikan  kerapu cantang Epinephellus fuscoguttatus-lanceolatus . Intek
Akuakultur . 2 (2): 33-48.
Duan, W., F. Meng, Y. Lin and G. Wang.
(2017).  Toxicological  eﬀects  of phenol on four marine microalgae. Environmental Toxicology  and  Pharmacology .
52 : 170-176.
ajri, N. A., M. Ali dan S. N. Depamede.
(2015). Deteksi WSSV ( White Spote Syndrome  Virus )  pada  lobster  air tawar ( Procambarus clarkii ) menggunakan metode real-time PCR.  Jurnla  Sains  Teksnologi  dan
Lingkungan. 1(1): 30-36. Hadiyanto  dan  M.  Azim.  (2012).
Mikroalga:  Sumber  Pangan  dan
Energi Masa Depan. Edisi Pertama.  UPT  UNDIP  Press. Semarang. 138 hlm.
Hakim, M. A., Indriasih dan W. Wiyani.
(2016).  Penyakit  Ikan  Kerapu:
Bab  VII  Penyakit  Viral.  LP2IL. Serang. 75 hlm.
Hexin,  X.  Cui,  F.  Wahid,  F.  Xia,  C. Zhong  and  S.  Jia.  (2016). Analysis of the physiological and molecular responses of Dunaliella salina to macronutrient  deprivation. Plos One . 11 (3): 1-19.
Ibanez,  E  and  A.  Cifuentes.  (2013). Benefit of using algae as natural source  of  functional  ingredient. Journal  of  the  Science  of  Food and Agriculture . 93 (4): 703-709. InterClinical Laboratories. (2010). Dunaliella  salina-Marine  Phyto- plankton.  Practitioner  Informa- tion. Johnny,  F.,  Mahardika.  K,  Giri,  I.  N.  A dan D. Roza. (2007). Penambahan  vitamin  c  dalam pakan untuk meningkatkan imunitas  benih  ikan  kerapu macan, Epinephelus fuscoguttatus terhadap  infeksi Viral  Nervous  Necrosis.  Jurnal
Akuakultur Indonesia. 6 (1): 43 – 53. Korsnes,  K.  (2008).  Nervous  Necrosis Virus (VNN) in farmed Norwegian  fish  species.  Thesis of  Philosopiae  Doctor  (PhD) University  of  Bergen.  Norway: Bergen. Lio-Po,  G.  D  and  L.  D.  de  la  Pena. (2004). Viral Diseases Chapter 1. Aquaculture Department, Southeast Asian Fisheries Development Center. Philippines. Hlm 3-18. Luin,  M.,  F.  F.  Ching  and  S.  Senoo. (2013).  Sexual  maturation  and gonad  development  in  Tiger Grouper ( Epinephelus Fuscoguttatus ) X Giant Grouper ( E. Lanceolatus ) hybrid. J Aquac Res Development . 5 (2): 1-5.
Madhumathi,  M.  and  R.  Rengasamy.
(2011).  Antioxidant  status  of Penaeus  monodon fed  with Dunaliella  salina supplemented diet and resistance against WSSV. International  Journal  of Engineering Science and Technology . 3 (10): 7249-7159.
Mahardika,  K.  dan  I.  Mastuti.  (2013). Studi histopatologi: pembentukan sel-sel membesar pada organ ikan
kerapu setelah terinfeksi Megalocytivirus . Konferensi Akuakultur Indonesia. 132-138. Nazari,  A.,  M.  D.  Hassan,  M.  J. Zorriehzahra, T. I. Azmi and S. S. Arshad.  (2014).  Pathogenicity  of viral  nervous  necrosis  virus  for guppy  fish,  Poecilia reticulata . Irian Journal of Fisheries Science . 13 (1): 168-177.
Novriadi,  R.,  S.  Agustatik,  S.  Bahri,  D. Sunantara  dan  E.  Wijayanti. (2014).  Distribusi  patogen  dan kualitas lingkungan pada budidaya perikanan laut di Provinsi Kepulauan Riau. Depik .
3 (1): 83-90.
Roza,  D.,  F.  Johnny  dan  Tridjoko. (2006). Peningkatan respon imun non-spesifik benih Kerapu Bebek  ( Cromileptes  altivelis ) dengan imunostimulan dan bakterin  terhadap  infeksi Viral Nervous Necrosis (VNN). Jurnal
Perikanan . 8 (1): 25-35. Priyadarshani,  I.  dan  B.  Rath.  (2012). Commercial and industrial applications  of  micro  algae-  a review. J.  Algal  Biomass  Utln .
3 (4): 89-100.
Setyorini,  N.,  Khusnah.  A  dan  L. Widajatiningrum. (2008). Kelangsungan  hidup  ikan  koi ( Cyprinus carpio ) yang terinveksi  KHV  ( Koi  Herpes Virus ). Berkala Ilmiah Perikanan . 3 (1): 57-65.
Sudaryatma,  P.  E.,  A.  T.  Lestari,  N.  L.
Sunarsih,  K.  S.  Widiarti,  S.  N. Hidayah,  D.  Srinoto.  (2012). Imunositokimia Streptavidin Biotin : deteksi dini Viral Nervous  Necrosis  Virus pada lendir ikan Kerapu Macan ( Epinephelus fuscoguttatus ). Jurnal Sain Veteriner . 30 (1): 99- 109. Sumaryam., Kusyairi, Oetami. S, Suprapto. H dan G. C. de Vries. 2011.  Kultur  sel  otak  dan  mata ikan kerapu ( Chromileptes altivelis )  untuk  replikasi Viral Nervous Necrosis (VNN). Berita Biologi . 10 (4): 505-510. Sutarmat,  T  dan  H.  T.  Yudha.  (2013). Analisis  keragaan  pertumbuhan benih kerapu hibrida hasil hibridisasi kerapu macan ( Epinephelus fuscoguttatus ) dengan kerapu kertang ( Epinephelus  lanceolatus )  dan kerapu batik ( Epinephelus microdon ). J. Ris. Akuakultur . 8 (3): 363-372. Tarsim., A. Setyawan, E. Harpen dan A. R. Pratiwi. (2013). The effication of  Black  Cummin  ( Nigella sativa )  as  immunostimulant  in Humpback Grouper ( Cromileptes  altivelis )  againts VNN  (Viral  Nervous  Necrosis) infection. Seminar Nasional Sains dan Teknologi V Lembaga Penelitian Universitas Lampung. 525-532. Udiarta, P., E. N. Dewi dan Romadhoni. (2015). Pengaruh pemberian MgCO 3 dan  ZnCl 2 terhadap stabilitas kandungan pigmen klorofil pada mikroalga Spirulina platensis .  J ournal  of  Fisheries Science  and  Technology . 10 (2):
114-118.
Woo, P. T. K. and R. C. Cipriano. (2017). Fish Viruses and Bacteria Pathobiology  and  Protection. CABI. UK.  364 p . Yunanto, Y., H. P. Kusumaningrum dan S. Pujiyanto. (2013). Fusi protoplas  interspesies Chlorella pyrenoidosa dan Dunaliella salina . Jurnal Sains dan Matematika . 21 (1): 15-30.
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2022.Vol.6.No.2.215
©2022 by Authors, This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License .