DOI: http://dx.doi.org/10.29244/jhi.11.3.212-220
Tersedia online di http://journal.ipb.ac.id/index.php/jhi
Karakterisasi Fenotipe dan Genotipe Anggrek Phalaenopsis amabilis (L.) Blume Transforman Pembawa Konstruksi

## UBI::Cas9::U3::PDS3
Phenotype and genotype characterization of Phalaenopsis amabilis (L.) Blume Orchid Transformant Harboring Construct UBI::Cas9::U3::PDS3
Amarilis Andani Kesuma 1 , Sri Nopitasari 1 , Yasushi Yoshioka 2 , Shogo Matsumoto 3 , Endang Semiarti 1*

## Diterima 03 Desember 2020/Disetujui 26 Desember 2020

## ABSTRACT
Phalaenopsis  amabilis  (L.)  Blume  is  an  Indonesian  national  “Flower  of  Charm”  (“Puspa Pesona”), an ornamental plant that by using genetic engineering we could improve the flower quality. In this study, Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation and CRISPR/Cas9 genome editing system  was  used  to  edit  the  orchid  genome  more  specific  and  precisely.  Twelve  months  old  putative transgenic  plants  originated  from  protocorm  like  bodies  (PLBs)  transformation  harboring  the  T-DNA construct UBI::Cas9::U3::PDS3/plasmid pRGEB32. Proofing for the putative transformant plants were stably harboring the T-DNA constructs were conducted by genotype and phenotype characterization. The purpose of this study was to characterize genotypically and phenotypically the putative transformant of P. amabilis  harboring  T-DNA  constructs  UBI::Cas9::U3::PDS3  compared to  non-transformant.  Genotype characterization was carried out by detecting the integration of T-DNA harboring UBI::Cas9::U3::PDS3 on  the  P.  amabilis  genome  using  several  primers  for  HPT,  Cas9,  PDS3  and  trnL-F  (internal  control primers).  Phenotype  analysis  was  carried  out  by  observing  and  analyzing  chlorophyll  content  using spectrophotometric methods. The results showed that genome of putative P. amabilis transformant age 12 months  could  be  amplified  by  the  primers.  Phenotypic  analysis  of  P.  amabilis  transformant  showed  a change  in  plant  color  from  green  to  pale  (albino)  with  lower  chlorophyll  content  compared  to  non- transformant. This indicates that the CRISPR/Cas9 technology is able to edit the genome of orchids. Keywords: Chlorophyll,  CRISPR/Cas9,  orchid,  Phalaenopsis  amabilis  (L.)  Blume,  PHYTOENE DESATURASE 3 (PDS3), Transformant.

## ABSTRAK
Phalaenopsis  amabilis (L.)  Blume  adalah tanaman hias  “Puspa  Pesona  Indonesia”  yang  dapat ditingkatkan  kualitasnya  dengan  teknik  rekayasa  genetika.  Transformasi  genetik  dengan  perantara Agrobacterium  tumefaciens dan CRISPR/Cas9 digunakan  dalam  penelitian  ini  untuk  pengeditan  genom secara  lebih  spesifik  dan  presisi  pada target  sekuen  gen PHYTOENE  DESATURASE3 ( PDS3) yaitu  gen yang  berperan  penting  pada  biosintesis  kloroplas.  Dalam  penelitian  ini  digunakan  tanaman  transforman umur  12  bulan  yang  ditumbuhkan  dari  protokorm  yang  telah  diintegrasi  dengan  T-DNA  pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 /plasmid  pRGEB32.  Pembuktian  tanaman  transforman  tersebut  masih mengandung konstruksi T-DNA tersebut perlu dilakukan, yaitu dengan karakterisasi secara genotipe dan fenotipe. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi P. amabilis transforman pembawa T-DNA dengan  konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 secara  genotip  dan  fenotip  dibandingkan dengan P.  amabilis non-transforman.  Karakterisasi  genotipe  dilakukan  dengan  mendeteksi  integrasi  T-DNA  pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 pada genom anggrek P. amabilis menggunakan beberapa primer yaitu HPT,  Cas9,  PDS3  dan  trnL-F  (primer  kontrol  internal).  Analisis  karakter  fenotipe  dilakukan  dengan pengamatan morfologi dan analisis kadar klorofil menggunakan metode spektrofotometri. Hasil penelitian menunjukkan bahwa genom anggrek P. amabilis transforman pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 umur  12  bulan  dapat  teramplifikasi  oleh  semua  primer.  Analisis  fenotipe P.  amabilis transforman menunjukkan  adanya  perubahan  warna  tanaman  dari  hijau  menjadi  albino  dengan  kadar  klorofil  lebih rendah  jika  dibandingkan  dengan P.  amabilis non-transforman.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  teknologi CRISPR/Cas9 dapat digunakan untuk mengedit genom tanaman anggrek.
Kata  kunci:  Anggrek, CRISPR/Cas9 ,  Klorofil, Phalaenopsis  amabilis (L.)  Blume, PHYTOENE DESATURASE 3 ( PDS3 ), Transforman.
1 Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Indonesia Jl. Teknika Selatan, Sekip Utara, Yogyakarta, 55281
2 Graduate School of Science, Nagoya University, Japan
3 Graduate School of Bioagricultural Science, Nagoya University, Japan E-mail : endsemi@ugm.ac.id (*penulis korespondensi)

## PENDAHULUAN
Anggrek ( Orchidaceae ) adalah tanaman hias eksotis yang terdiri lebih dari 800 genus dan 20.000 - 30.000 spesies (Godo et al ., 2010; Pangestu et al., 2015). Salah satu genus anggrek  yang  cukup  dikenal  oleh  masyarakat adalah Phalaenopsis. Spesies  anggrek  genus Phalaenopsis yang  ditetapkan  menjadi  bunga nasional  Indonesia  adalah Phalaenopsis amabilis (L.)  Blume  dengan  sebutan  “Puspa Pesona  Indonesia”  (Puspitaningtyas  dan Mursidawati, 2010).
Peningkatan  kualitas  anggrek  dengan pembentukan anggrek variasi baru diperlukan untuk  mendapatkan  warna  bunga,  corak bunga, jumlah bunga dan  ukuran bunga yang sesuai dengan keinginan. Metode transformasi genetika  tanaman  merupakan  salah  satu  cara yang  digunakan  untuk  menghasilkan anggrek dengan  variasi  baru.  Prinsip  transformasi genetika  tanaman  adalah  menyisipkan  gen fungsional  ke  dalam  genom  tanaman  target, antara lain dengan bantuan mediasi dari bakteri Agrobacterium tumefaciens
untuk meningkatkan  kualitas  pemuliaan  tanaman (Hsing et al., 2016).
Teknologi CRISPR/Cas9 ( Clustered Regularly  Interspaced  Short  Palindromic Repeats )  merupakan  salah  satu  teknik  dalam rekayasa  genetika  untuk  menyunting  genom pada  titik  sekuen  spesifik  (Xu et  al., 2014). CRISPR/Cas9 memiliki efisiensi  mutasi yang tinggi  sehingga  dapat  terjadi  mutasi  tanpa reproduksi seksual. Mekanisme CRISPR/Cas9 dalam menyunting gen adalah dengan prinsip memotong untai ganda target dan menambahkan  rekombinasi  homolog  pada target (Zhang et al ., 2013).
Gen PHYTOENE  DESATURASE  3 ( PDS3 )  merupakan  gen  yang  berlokasi  di membran tilakoid. Umumnya gen PDS3 sering digunakan  sebagai common  maker  gene di berbagai  spesies  tanaman  karena  gen  ini mudah  dideteksi  (Semiarti et  al. ,  2020).  Gen PDS3 berperan  dalam  pengkodean phytoene desaturase ( phytoene  dehydrogenase )  dan berperan  sebagai  enzim  yang  mengkatalisis desaturasi  dari pyhtoene menjadi zeta- carotene selama biosintesis karotenoid.
Diketahui bahwa mutasi PDS3 dapat menyebabkan  gangguan  fungsi  plastida. Gangguan  fungsi  plastida  yang  dimaksud adalah  tidak  terdiferensiasinya  plastida  pada
tanaman.  Hal  tersebut  dapat  menghambat proses  pembentukan  tilakoid.  Tilakoid  dalam jumlah  minim  pada  tanaman  ditunjukkan dengan  penampakan  morfologis  yang  albino. Gen  ini  hanya  berinteraksi  dengan  gen-gen yang ada di organel fotosintetik sehingga sifat albino  yang  muncul  tidak  mempengaruhi viabilitas  tanaman  (Qin et  al. ,  2007; Brausemann et  al., 2017).  Penelitian  ini bertujuan untuk mengkarakterisasi P. amabilis diduga  transforman  pembawa  konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS secara  genotipe  dan fenotipe  serta  membandingkannya dengan P. amabilis non-transforman.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan Agustus –  Oktober  2020  di Laboratorium Bioteknologi, Fakultas Biologi, Universitas  Gadjah  Mada.  Sampel  yang digunakan  adalah  planlet P.  amabilis non- transforman dan transforman pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS umur  12 bulan  yang  kemudian  diamati  karakter fenotipe  dan  genotipenya.  Analisis  karakter fenotipe meliputi pengamatan karakter morfologi  dan  analisis  kadar  klorofil  serta dilakukan pengamatan preparat anatomi daun. Analisis karakter genotipe dengan mendeteksi integrasi T-DNA pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 pada  genom  anggrek P.  amabilis menggunakan  primer  spesifik untuk  gen HPT ,  gen Cas9 dan PDS3, serta fragmen  interspace  DNA  kloroplas  trnL-F sebagai kontrol internal.

## Pengamatan Karakter Morfologi
Sebanyak 69 planlet yang ditanam pada medium kultur in vitro New Phalaenopsis (NP)
+ activated charcoal (2 g L -1 ) diamati karakter morfologinya  yang  meliputi  jumlah  daun, panjang  daun,  lebar  daun  dan  warna  daun. Sampel didokumentasikan menggunakan kamera,  dihitung  jumlah  daun  dan  diukur panjang dan lebar daun dengan menggunakan jangka sorong. Warna daun kemudian diamati menggunakan Royal  Horticultural  Society Colour Chart (Fans 3/green group) edisi ke-6 (RHS Color Chart edisi ke-6). Data kuantitatif dari  jumlah,  panjang  dan  lebar  daun  diolah menggunakan Microsoft Excel 2016 .

## Analisis Kadar Klorofil
Preparasi  masing-masing  sampel  daun P. amabilis non-transforman  dan  transforman dilakukan dengan cara dipotong dan ditimbang masing-masing dengan  berat  ±  100  mg. Sampel diinkubasi pada suhu 20 °C selama 10- 15  menit,  kemudian  diekstraksi  dan  diukur kadar klorofilnya.
Sampel  sebanyak  0.1  g  diekstraksi dengan cara digerus menggunakan mortar dan pestel lalu dilarutkan dalam 2 mL metanol dan dimasukkan  ke dalam  gelas ukur. Mortar dan pestel  tersebut  dibilas  dengan  1.5  mL  pelarut (akuades) sebanyak tiga  kali lalu  dimasukkan ke dalam gelas ukur yang sama. Ekstrak ditera hingga  mencapai  volume  8  mL.  Sampel dimasukkan ke dalam tabung konikal (Biologix  volume  15  ml,  China)  dan disentrifugasi  selama  10  menit  dengan kecepatan  2500  rpm.  Supernatan  diencerkan menjadi 1 mL ekstrak dan dilarutkan ke dalam 4  mL  metanol  dan  dibaca  absorbansinya dengan  spektrofotometer  UV-Vis  (Shimadzu UV-Vis 1800, Japan) pada λ665 nm dan λ652 nm.
Hasil pengukuran kadar klorofil kemudian
dianalisis dan dihitung menggunakan  rumus  Porra et  al. (1989). Absorbansi  yang  telah  dibaca  pada  panjang gelombang 665 nm dan 652 nm dimasukkan ke rumus berikut:
[Ch a] = 16,29 A665 - 8,54 A652
[Ch b] = 30,66 A652 – 13,58 A665 Keterangan : [Ch a] = konsentrasi klorofil a [Ch b] = konsentrasi klorofil b

## Pembuatan  dan  Pengamatan  Preparat Anatomi Daun
Pembuatan  preparat  anatomi  daun dilakukan  menggunakan  metode embedding merujuk kepada Sutikno (2016). Daun anggrek P.  amabilis non-transforman  dan P.  amabilis transforman pembawa konstruksi DNA UBI::Cas9::U3::PDS3 dicuci  dengan  air hingga bersih, kemudian dikering anginkan di atas  kertas  tisu.  Kemudian  daun  dipotong dengan ukuran ±1 cm menggunakan silet lalu irisan  paradermal  diletakkan  di  atas  gelas benda,  ditambahkan  satu  tetes  akuades kemudian  ditutup  dengan  kaca  penutup. Preparat segar irisan paradermal daun diamati menggunakan  mikroskop  (Olympus  CX21, Japan)  perbesaran  400  kali  dan  optilab
(Miconos,  Indonesia)  untuk  mengetahui perbedaan  kloroplas  pada  tanaman  non- transforman dan transforman.

## Analisis Karakter Genotipe
Isolasi DNA genom tanaman dilakukan dengan  menggunakan  metode  Murray  & Thompson (1980) merujuk kepada Semiarti et al .  (2007)  dengan  modifikasi  kecepatan sentrifugasi.  Sebanyak 0.1  g  daun anggrek P. amabilis non-transforman  dan P.  amabilis transforman  masing-masing  digerus  sampai halus  menggunakan  mortar  dan  pestel  yang telah  ditambahkan  500  µL  larutan buffer ekstraksi DNA yang terdiri dari Cetyltrimethyl Ammonium Bromide 3% (CTAB 3%), EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0.7 M NaCl. Sampel diinkubasi  dalam waterbath pada  suhu  60˚C selama 30 menit. Larutan kloroform kemudian ditambahkan sebanyak 500 µL lalu dihomogenisasi  menggunakan shaker dengan kecepatan 140 rpm pada suhu ruang selama 30 menit.  Kemudian  tutup microtube dibuka selama 10 detik untuk mengeluarkan gas yang terbentuk selama homogenisasi dan selanjutnya  disentrifugasi  dengan  kecepatan 12  000  rpm  selama  5  menit.  Sampel  yang diambil yaitu lapisan berwarna bening ( aquous phase )  dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung  1.5 mL baru. Isopropanol ditambahkan dengan 1x volume sampel (1:1), kemudian diinversi dan diinkubasi  pada  pada  suhu  ruang  selama  5 menit. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan  12  000  rpm  selama  5  menit. Supernatan  lalu  dibuang  dan  pelet  DNA dibilas dengan alkohol 70% sebanyak 250 µL.
Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12  000 rpm selama 2  menit.  Pelet DNA  kemudian  dikeringkan  di  dalam inkubator dengan temperatur 37 o C atau suhu ruang  selama  15-30  menit.  Setelah  kering, pelet  DNA  dilarutkan  dengan  TE  (10T:0,1E) sebanyak  25  µL.  Sampel  DNA  yang  telah diperoleh  kemudian  dilakukan  pengujian kualitas  pada  gel  agarose  0.8%  dengan elektroforesis  dalam  1x  buffer  TAE  ( Tris Acetate EDTA ) dengan tegangan listrik 50 volt selama  30  menit.  Pengamatan      visualisasi kualitas  pita-pita  DNA  dilakukan  dengan pewarnaan  gel    agarose  menggunakan  1% larutan  EtBr  ( Etidium  Bromide )  selama  10 menit dan selanjunya diamati dengan menggunakan UV transilluminator (Extragene UV3CL,  Taiwan),  pemotretan  dilakukan
dengan kamera Canon SX430 IS (Japan).
Sampel  DNA  diamplifikasi  dengan beberapa primer spesifik untuk gen-gen PDS3 (Phytoene  Desaturase  3),  HPT  (Hygromycin
Phosphotransferase), Cas9 (CRISPR-
associated  protein  9) dan  primer  trnL-F
( interspace DNA  kloroplas  trnL  dan  trnF) sebagai kontrol internal menggunakan BioRad T100 Thermal Cycler dengan komposisi PCR ( Polymerase Chain Reaction ) sebagai berikut: 1  µL  DNA  (100ng/µL),  primer  1  µL  (20 pmol/µL),  12.5  µL  PCR  mix  MyTaq™  HS Red Mix 2x (Bioline) dan Nuclease-free water 9.5  µL  sehingga  volume  akhir  menjadi  25 µL.  Tahapan    PCR    meliputi  pre-denaturasi pada  kondisi    95  °C    selama    1  menit, denaturasi  95  °C    selama    15  detik, penempelan  primer  ( annealing )  untuk  trnL-F 57 °C, PDS3 60 °C, HPT 61 °C, Cas9 62 °C) selama 15 detik dan ekstensi 72 °C selama 10 detik dengan  35  siklus. Urutan sekuen primer yang  digunakan  akan  diberikan  berdasarkan permintaan.    Amplikon  di  cek  menggunakan gel  elektroforesis  dengan  konsentrasi  1.2% dengan tegangan 50 volt selama 30 menit. Gel agarose kemudian direndam dalam 1% larutan EtBr  selama  10  menit.    Pengamatan  DNA menggunakan UV transilluminator (Extragene
UV3CL,  Taiwan),  pemotretan  dilakukan dengan kamera Canon SX430 IS (Japan).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengamatan
morfologi menunjukkan  adanya  perbedaan  warna  daun antara P.  amabilis non-transforman  dan transforman pembawa
konstruksi
UBI::Cas9::U3::PDS3 (Gambar  1) . Anggrek P.  amabilis non-transforman  memiliki  daun berwarna hijau yang termasuk dalam kelompok warna Green Group 137 Moderate Olive  Green  B (Gambar  1  A) ,  Green  Group 143 Strong Yellow Green A (Gambar 1 B) , Green Group 143 Strong Yellow Green C
(Gambar 1 C). Anggrek transforman pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 memiliki karakter  fenotipe  daun  albino  yang  termasuk dalam  kelompok warna Yellow-Green Group 150 Light Yellow Green D (Gambar 1 D), daun berwarna  hijau-kekuningan  yang  termasuk dalam  kelompok warna Yellow-Green Group 149  Brilliant  Yellow  Green  A (Gambar  1  E), daun  berwarna  hijau  yang  termasuk  dalam kelompok  warna Green  Group  143  Strong Yellow Green C (Gambar 1 F).
Gambar 1. Karakter morfologis anggrek P. amabilis non-transforman dan P. amabilis transforman pembawa konstruksi DNA UBI::Cas9::U3::PDS3. Keterangan : (NT) Non-transforman, (T)  Transforman,  (A)  Kotak  warna  hijau  menunjukkan  RHS Color  Chart Edisi  ke-6 Green Group 137 Moderate Olive Green B, (B) Kotak warna hijau menunjukkan RHS Color Chart Edisi ke-6 Green Group 143 Strong Yellow Green A , (C) Kotak warna hijau menunjukkan RHS Color Chart Edisi  ke-6 Green Group 143 Strong Yellow Green C , (D) Kotak warna putih menunjukkan RHS Color Chart Edisi ke-6 Yellow-Green Group 150 Light Yellow Green D , (E) Kotak warna hijau-kekuningan menunjukkan RHS Color Chart Edisi ke-6 Yellow-Green Group 149 Brilliant Yellow Green A, (F) Kotak warna hijau menunjukkan RHS Color Chart Edisi ke-6 Green Group 143 Strong Yellow Green C . Skala: 1 cm.
Anggrek P.  amabilis non-transforman memiliki  daun berwarna hijau yang tergolong dalam kelompok warna green group sedangkan P. amabilis transfroman  pembawa konstruksi DNA UBI::Cas9::U3::PDS3 memiliki  tiga  jenis  variasi  warna  yaitu  daun albino/putih  dan  hijau-kekuningan  yang tergolong  dalam  kelompok  warna yellow- green  group serta  daun  berwarna  hijau  yang termasuk  kelompok green  group. Perbedaan ini  dipengaruhi  oleh  kadar  klorofil  dan morfologi  kloroplas  yang  terkandung  pada setiap tanaman (Gambar 2 dan Gambar 3). Diketahui  dari penelitian ini bahwa daun transforman memiliki fenotipe berwarna putih pucat atau albino. Hal ini terjadi diduga karena adanya mutasi pada genom tanaman. Berdasarkan penelitian Semiarti et al. (2020) ditemukan bahwa metode CRISPR/Cas9 dapat digunakan  untuk  mengedit  genom  pada protokorm  anggrek P.  amabilis. Analisis sekuen  pada  target PDS3 menunjukkan adanya  mutasi  dengan knock  out  system atau adanya  delesi  nukleotida  selama  proses perbaikan  internal  DNA.  Proses perbaikan DNA  ini  disebut  dengan  mutasi  gen non- homologous  end  joining (NHEJ)  yang menghasilkan  gen  yang  menjadi  non- fungsional  atau  ter- knock-out .  Mutasi  ini menginduksi  perubahan  pada  sekuen  asam amino  yang  terjadi  dan  dapat  mengganggu proses biosintesis karotenoid sehingga menyebabkan tidak terdiferensiasinya plastida.  Hal  tersebut  dapat  menghambat proses  pembentukan tilakoid.  Tilakoid  dalam jumlah  minimum  pada  tanaman  ditunjukkan dengan  penampakan  morfologis  albino  atau
munculnya bercak putih pada daun (Qin et al., 2007).
Warna hijau dan hjau-kekuningan pada P. amabilis transforman  di  duga  terjadi  karena pada  proses pengeditan  genom  menggunakan CRISPR/Cas9 terjadi  kesalahan  pemotongan target  site atau  sering  disebut  dengan off- targeted .  T-DNA  berhasil  masuk  ke  dalam genom  tanaman  namun  dimungkinkan  untuk terinsersikan  pada taget  site lain,  sedangkan yang  diharapkan  adalah  pengeditan  genom yang  bersifat targeted/knock  out sesuai  gen sasaran . Kesalahan pemotongan target site ini kemungkinan terjadi akibat PAM
( protospacer  adjacent  motif )  tidak  dapat mengenali target sekuen yang dituju (Zhang et al., 2015).
Parameter  morfologis P.  amabilis non- transforman  dan  transforman umur  12  bulan yang meliputi jumlah daun, panjang daun, dan lebar  daun  (Tabel  1)  menunjukkan  rerata jumlah daun pada P.  amabilis non- transforman  dan  transforman  berdaun  hijau adalah 4 ± 1 helai sedangkan pada P. amabilis transforman berdaun hijau-kekuningan adalah 3  ±  1  helai  dan  transforman  berdaun  albino adalah 2 ± 0 helai. Rerata panjang daun, non- transforman  adalah  16.06  ±  1.09  mm sedangkan  transforman  berdaun  hijau  adalah 14.78 ± 1.33 mm, transfroman berdaun hijau- kekuningan  adalah  14.55  ±  1.35  mm, transforman berdaun albino adalah 3.79 ± 1.12 mm.  Rerata  lebar  daun,  non-transforman adalah 4.86 ± 0.66 mm sedangkan transforman berdaun  hijau  adalah  4.76  ±  0.72  mm, transfroman berdaun hijau-kekuningan adalah 4.44 ± 1.99 mm, transforman berdaun albino adalah 2.02 ± 0.42 mm.
Tabel  1. Parameter  morfologis  daun P.  amabilis non-transforman  dan  transforman  pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3
Parameter (Rerata) Anggrek P. amabilis Non- transforman Transforman pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 Daun Hijau Daun Hijau- kekuningan Daun Albino Jumlah daun (helai) 4 ± 1 4 ± 1 3 ± 1 2 ± 0 Panjang daun (mm) 16.05 ± 1.09 14.78 ± 1.33 14.55 ± 1.35 3.79 ± 1.12 Lebar daun (mm) 4.86 ± 0.66 4.76 ± 0.72 4.44 ± 1.19 2.02 ± 0.42
Gambar  2. Kadar  klorofil P.  amabilis non- transforman  dan  transforman pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3. Detail  : (Ch a) Klorofil a, (Ch b) Klorofil b Tanaman dengan daun albino menunjukkan tingkat  pertumbuhan  daun yang lebih  rendah  dibandingkan  dengan  tanaman dengan  daun  berwarna  hijau  maupun  hijau- kekuningan,  yang  meliputi  jumlah  daun, panjang  daun  dan  lebar  daun . Namun demikian,  daun P.  amabilis non-transforman dan  transforman  berdaun  hijau  dan  berdaun hijau-kekuningan  memiliki  kemiripan  yang tinggi  dalam  jumlah  daun,  panjang  daun  dan lebar daun.
Gambar  3. Irisan  paradermal  daun P. amabilis non-transforman  dan transforman  pembawa  konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3. Detail  : (A)  Daun P.  amabilis non- transforman  (B)  Daun  hijau P. amabilis transforman  pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 (C)  Daun  hijau-kekuningan P. amabilis transforman  pembawa konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 (D)  Daun  albino P.  amabilis transforman  pembawa  konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3. Skala  :
100 μm
Kadar klorofil pada daun non-trasforman lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  daun transforman  (Gambar 2). Total kadar klorofil non-transforman adalah 1.152 mg L -1 (klorofil a = 0.641 mg L -1 ; klorofil b = 0.511 mg L -1 ) sedangkan total kadar klorofil pada transforman berdaun hijau adalah 1.112 mg L -
1 (klorofil a = 0.600 mg L -1 ; klorofil b = 0.512 mg  L -1 ),  total  kadar  klorofil  transforman berdaun hijau-kekuningan adalah 0.972 mg L -
1 (klorofil a = 0.408 mg L -1 ; klorofil b = 0.564 mg  L -1 ),  total  kadar  klorofil  transforman berdaun albino adalah 0.456 mg L -1 (klorofil a = 0.170 mg L -1 ; klorofil b = 0.286 mg L -1 ). Kadar  klorofil  berkaitan  dengan  jumlah  dan kondisi  morfologis  serta  fisiologis  dari kloroplas.  Daun berwarna pucat atau bahkan albino  mengandung  klorofil  namun  dengan kadar yang lebih rendah dibandingkan dengan daun  berwarna  hijau  segar.  Kadar  klorofil yang  berbeda  menunjukkan  bahwa  adanya perbedaan  jumlah  domain  asam  amino  FtSH pada tanaman yang disebabkan oleh terjadinya
mutasi  gen.  Kloroplas  merupakan  struktur perkembangan  dari  proplastid.  Mutasi  gen PDS3 dapat  menyebabkan  perkembangan kloroplas  terganggu  dan  dapat  menyebabkan daun mengalami defisiensi pigmen (Qin et al. , 2007).
Gambar 3 menunjukkan irisan
paradermal  daun  (penampang  samping  atau sejajar epidermis) P. amabilis non- transforman  dan P.  amabilis transforman. Terdapat  kloroplas  dewasa  berwarna  hijau pada P.  amabilis non-transforman  dan P. amabilis transforman berdaun hijau, sedangkan  pada  transforman  berdaun  hijau- kekuningan terdapat kloroplas dewasa berwarna  hijau-kekuningan. P.  amabilis transforman berdaun albino memiliki kloroplas  yang  belum  sempurna  terbentuk (proplastida)  dan  berwarna  sangat  pucat bahkan putih. Hal ini kemungkinan dikarenakan perkembangan proplastida menjadi  kloroplas  terhambat  dan  mengalami defisiensi (Qin et al., 2007).
Gambar  4. Deteksi  integrasi  konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 pada genom P. amabilis . M : 100 bp ( GeneRuler ) ; Lajur 1: P. amabilis non-transforman,  Lajur  2-9: P. amabilis transforman  pembawa  konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3.
Karakterisasi genotipe dilakukan dengan  deteksi  integrasi  konstruksi  T-DNA pembawa  konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 pada  anggrek P.  amabilis transforman  yang dibandingkan dengan non-transforman.
Gambar  4  menunjukkan  genom  DNA P.
amabilis transforman  umur 12 bulan terbukti positif terintegrasi secara stabil membawa T-
DNA dengan konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 dengan teramplifikasinya fragmen gen HPT (545 bp) dan Cas9 (402  bp) (Gambar  4  lajur  2-9). Fragmen  DNA  trnL-F  (1  200  bp)  dan  gen PDS3 (280  bp)  setiap  sampel  tanaman  dapat teramplifikasi  (Gambar  4  lajur  1-9).  Hal  ini disebabkan  trnL-F  merupakan interspace DNA  spesifik  yang  berlokasi  di  genom kloroplas pada setiap tanaman. Oleh sebab itu, trnL-F  tepat  digunakan  sebagai  kontrol internal pada tanaman (Hao et al., 2009). Gen PDS3 ( PHYTOENE DESATURASE3 ) terdapat di membran tilakoid dan berperan pada proses pembentukan tilakoid dan biosintesis karotenoid.  Nama  lain  dari  gen  AT4G14210 ini adalah DL3145C, FCAALL.28, PIGMENT DEFECTIVE  226 (Qin et  al., 2007).  Pada umumnya gen PDS3 sering digunakan sebagai gen  penanda  di  berbagai  spesies  tanaman karena tanaman  mutan pds3 mudah  dideteksi secara  morfologis  (Semiarti et  al., 2020; Nopitasari et al., 2019). Mutasi pada struktur gen PDS3 dapat  menyebabkan  fenotipe tanaman  menjadi  albino  atau  terdapat  bercak putih  pada  daunnya  (Koschmieder et  al ., 2017). Gen HPT ( HYGROMYCIN PHOSPOTRANSFERASE ) adalah gen resisten
terhadap  antibiotik  higromisin,  berfungsi sebagai marka untuk seleksi transforman pada medium  kultur in vitro . Jika organisme  dapat bertahan  hidup  pada  medium  kultur  yang mengandung  antibiotik  higromisin  maka organisme  tersebut  otomatis  terseleksi  dan menjadi  kandidat  transforman  (Ouwerkerk et al., 2001).

## KESIMPULAN
Anggrek P. amabilis transforman umur 12  bulan  tetap  stabil  membawa  konstruksi UBI::Cas9::U3::PDS3 pada genomnya.
Fenotipe P.  amabilis transforman  hasil genome editing dengan CRISPR/Cas9 menunjukkan adanya perubahan  warna daun, antara  lain  menjadi  hijau  kekuningan  dan albino dengan kadar klorofil yang lebih rendah jika  dibandingkan  dengan P.  amabilis non- transforman.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  terima  kasih kepada  Kementerian  Riset  dan  Teknologi RI/BRIN yang telah  memberikan  dana  untuk penelitian  ini  dengan  hibah  Desentralisasi Skema Penelitian Dasar Unggulan Perguruan Tinggi  (PDUPT)  2020  dengan  kontrak  No.:
6/AMD/KP.PTNBH/2020 dan Surat Perjanjian No: 2723/UN1/DITLIT/DIT- LIT/PT/2020  yang  merupakan  lanjutan  dari Hibah  Penelitian  Kerjasama  Luar  Negeri (PKLN) dengan kontrak
No.:
2791/UN1.DITLIT/DIT-LIT/LT/2019, dan Hibah  Japan  Society  for  the  Promotion  of Sciences (JSPS)-BJRP 2018-2020 kontrak No. 219/D3/PG/2019.

## DAFTAR PUSTAKA
Brausemann, A., S. Gemmecker., J.
Koschmieder.,  Ghisla,  S.,  P.  Beyer.,  O.
Einsle.  2017.  Structure  of  Phytoene Desaturase Provides Insights into Herbicide Binding anad Reaction Mechanisms  Involved  in  Carotene Desaturation.  Structure.  25:1222-1232. http://dx.doi.org/10.1016/j.str.2017.06.0 02
Godo,  T.,  M.  Komori.,  E.  Nakaoki.,  T.
Yukawa., K. Miyoshi. 2010. Germination  of  Mature  Seeds  of Calanthe tricarinata Lindl., an Endangered  Terrestrial  Orchid,  by
Asymbiotic  Culture In  Vitro.  In  Vitro Cell  Dev  Biol  Plant.  46:323-328. https://doi.org/10.1007/s11627-009- 9271-1
Hao, C., B.L. Huang., S.L. Chen., J. Mu. 2009. Evolution  of  the  chloroplast  trnL-trnF region  in  the  gymnosperm  lineages taxaceae and cephalotaxaceae. Biochemical Genetics. 47:351-169. https://doi.org/10.1007/s10528-009- 9233-7
Hsing, Hong-Xian., Yi-Jyun, Lin., Chii-Gong, Tong.,  Min-Jeng,  Li.,  Yun-Jin,  Chen., Swee-Suak,  Ko.  2016.  Efficient  and heritable transformation of Phalaenopsis orchid. Bot Stud. 57:1-12. https://doi.org/10.1186/s40529-016- 0146-6
Koschmieder,  J.,  M.  Fehling-Kaschek.,  P, Schaub., S. Ghisla., A, Brausemann., J,
Timmer.,  P.  Beyer.  2017.  Plant-type phytoene desaturase: Functional
evaluation  of  structural  implications.
PLoS ONE. 12(11): e0187628. https://doi.org/doi:10.1371/journal.pone
.0187628
Nopitasari, S., Y. Setiawati., M.D. Lawrie., A. Purwantoro., J. Widada., A.B. Sasongko., Y. Yoshioka.,
S. Matsumoto.,  K.  Ninomiya.,  Y.  Asano., E.  Semiarti.  2019.  Development  an Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 for Phalaenopsis  amabilis (L.)  Blume
Genome Editing System. Prosiding The 6th International Conference on Biological Science ICBS 2019. https://doi.org/10.1063/5.0015868
Ouwerkerk,  P.B.F.,  R.J.  Hoge.,  A.H.  Meijer. 2001.  Glucocorticoid-inducible  gene expression in rice. Planta . 213:370-378.
https://doi.org/10.1007/s004250100583
Pangestu,  F.,  S.A.  Aziz.,  D.  Sukma.  2015.
Karakterisasi Morfologi Anggrek Phalaenopsis Hibrida. Jurnal Hortikultura Indonesia. 5(1):29-35. https://doi.org/10.29244/jhi.5.1.29-35
Porra, R.J., W.A. Thompson., P.E. Kricdeman.
1989. Determination pf Accurate Extinction Coefficients and Simultaneous  Equations  for  Assaying Chlorophylls  a  and  b  Extracted  with
Four Different Solvents:  Verification of the Concentration of Chlorophyll Standards by Atomis Absorption Spectoscopy. Biochimica  et  Biophysica Acta. 975:384-394. https://doi.org/10.1016/s0005-
2728(89)80347-0
Puspitaningtyas,  D.M.  &  Mursidawati.  2010. Koleksi  Anggrek  Kebun  Raya  Bogor . UPT Balai Pengembangan Kebun Raya- LIPI. Bogor
Qin G., Gu H., Ma  L., Peng Y., Deng X.W., Chen  Z  and  Qu  L.  2007.  Disruption  of phytoene  desaturase  gene  results  in albino  and dwarf phenotypes  in Arabidopsis  by  impairing  chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis. Cell  Research  volume  17,  pages471– 482https://doi.org/10.1038/cr.2007.40
Semiarti, E., A. Indrianto., A. Purwantoro., S. Isminingsih.,  N.  Suseno.,  T.  Ishikawa., Y. Yoshioka., Y. Machida., C. Machida.
2007. Agrobacterium -mediated transformation of the wild orchid species Phalaenopsis amabilis. Plant
Biotechnology.  24:  265-272.  DOI: 10.5511/plantbiotechnology.24.265
Semiarti, E., S, Nopitasari., Y, Setiawati., M.D
Lawrie., A. Purwantoro., J. Widada., K. Ninomiya.,  Y.  Asano.,  S.  Matsumoto., Y.  Yoshioka.  2020.  Application  of CRISPR/Cas9 genome  editing  system for  molecular  breeding  of  orchids. Indonesian  Journal  of  Biotechnology. 25(1):61-68. https://doi.org/10.22146/ijbiotech.39485
Sutikno.  2016.  Buku  Panduan  Mikroteknik Tumbuhan.  Laboratorium  Struktur  dan Perkembangan  Tumbuhan.  Universitas Gadjah Mada.
Xu,  R.,  H.  Li.,  R.  Qin.,  L.  Wang.,  L.  Li.,  P. Wei.,  J.  Yang.  2014.  Gene  targeting using  the Agrobacterium  tumafaciens - mediated CRISPR-Cas system  in  rice. Springer Open Journal. 7:5. https://doi.org/10.1186/s12284-014- 0005-6
Zhang,  X.  H.,  L.Y.  Tee.,  X.G.  Wang.,  Q.S. Wang.,  Q.S.  Huang.,  S.H.  Yang.  2015.
Off-target  Effect  in  CRISPR/Cas9 mediated Genome
Engineering.
Molecular  Therapy-Nucleic  Acids.  4:1- 6. https://doi.org/10.1038/mtna.2015.37
Zhang, Y., N. B.J. Heidrich., C.W. Ampattu.,
C.W.  Gunderson.,  H.S.  Seifert.,  C. Schoen.,  J.  Vogel.,  E.J.  Sontheimer. 2013.  Processing-independent CRISPR
RNAs  limit  natural  transformation  in Neisseria  meningitidis.  Mol.  Cell, 50:488-503. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2013.05 .001