SINTESIS ANTIGEN AFLATOKSIN M 1 -OVA ALBUMIN (Ova) SEBAGAI

## PEREAKSI AGAR GEL PRECIPITATION TEST (AGPT)
Angriani Fusvita
Akademi Analis Kesehatan Kendari Email : angrianif@yahoo.com

## ABSTRACT
Synthesis  aflatoksin  M 1 -Ova albumin (Ova)  antigen  used  as  Agar Gel Precipitation Test (AGPT)  reagent.  The  AFM 1 -Ova  antigen  was  synthesized  by  reacting  AFM 1 standard  and Ova  albumin  using  carboxymethoxylamine  hemihydrochloride  (CMO)  as  intermediate reactions.  The component of Reagent were AFM 1 -Ova antigen and antibody G (Ig G/serum) used  for  AGPT.  The  result  of  AFM 1 -Ova  Antigen  synthesis  were  3,45  mg/ml.  AGPT  result showed  bond  precipitation  reaction  beetween  specific  antibody  with  AFM 1 -Ova  antigen. Therefore synthesis  of AFM 1 -Ova antigen can be used to serology reagent test as AGPT.
Keywords : Aflatoxin, Ova albumin, Aspergillus flavus, Antigen
Agar Gel Precipitation Test (AGPT)

## PENDAHULUAN
Aflatoksin adalah sekelompok senyawa  yang  terdiri  dari  kumarin  dan cincin furan rangkap dua, yang mikotoksinnya  terjadi  secara  alamiah  dan diproduksi oleh banyak spesies Aspergillus, diantaranya adalah Aspergillus  flavus  Aspergillus  parasiticus dan Aspergillus  nomius.  A.flavus hanya menghasilkan  aflatoksin  B,  sedangkan A.parasiticus dan A. nomius menghasilkan aflatoksin B dan G (Lunggani, 2007;Tekinsen dan Tekinsen, 2005).
Aflatoksin  M 1 (AFM 1 )  merupakan hasil  hidroksilasi  metabolit  aflatoksin  B 1
(AFB 1 ).  Ketika  hewan  ruminansia  diberi makan  dengan  pakan  yang  mengandung AFB 1 ,  metabolit  ini  dapat  diubah  menjadi AFM 1 .  Dengan  demikian,  konsentrasi AFM 1 dalam  susu  dan  hasil  olahannya tergantung  pada  tingkat  paparan  dan jumlah  AFB 1 yang  tertelan  (Pei et  al.,
2009). AFB 1 dikenal sebagai hepatokarsinogen paling kuat pada mamalia  (Virdis et  al., 2008).  Meskipun toksisitas  AFM 1 kurang  dari  senyawa induknya  AFB 1 ,  akan  tetapi  senyawa  ini dikenal  juga  bersifat  hepatotoksik  dan karsinogenik (Lee et al ., 2009).
Sintesis AFM 1 -Ova diperlukan sebagai  pereaksi  dalam    pengujian serologi. Gholib (2005) menyatakan salah satu uji serologi adalah dengan menggunakan Agar Gel Precipitation Test (AGPT). Agar Gel Precipitation Test lebih dikenal  sebagai  double  immunodifution
test  atau  ouchterlony´s  double  difution yang  paling  sering  digunakan  untuk menganalisis antigen dan antibodi. Prinsip dari  uji  ini  yaitu  adanya  ikatan  antibodi spesifik dengan antigen.
Antigen  merupakan  dua  makna yang berbeda yaitu sebagai imunogen jika digunakan  untuk  memproduksi  antibodi dan  sebagai  antigen  penangkap  antibodi dalam teknik immunoassai (Maryam 2007).  AFM 1 memiliki  bobot  molekul rendah  (BM=328)  atau  disebut  senyawa hapten  sehingga  harus  dikonjugasikan dengan  protein  pembawa  seperti  Ova albumin  (Ova)  untuk  dapat  menangkap antibodi dalam uji  serologi. Tujuan penelitian  ini  adalah  mensintesis  antigen AFM 1 -  Ova  sebagai  pereaksi Agar  Gel Precipitation Test (AGPT).

## METODE PENELITIAN Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  standar  AFM 1 dari Aspergillus flavus yang dikonjugasi dengan Ova albumin sebagai antigen dan antibodi G (Ig G) kelinci . Bahan kimia lain yang digunakan adalah carboxymethoxylamine  hemihydrochloride (CMO),  larutan  refluks  (piridin,  methanol dan  air  suling),  asam  asetat  glasial, kloroform,  carbodiimide  (EDC),  Phospate Buffer Saline (PBS) dan N-
hydroxysuccinimide  (NHS).  EDC  dan larutan  NHS.  Alat-alat  yang  digunakan dalam penelitian ini meliputi
Agar Gel Precipitation Test (AGPT)
khoromatografi lapis tipis (TLC ) , Evaporator,  kaca  preparat,  cawan  petri, Hot  plate ,  pengaduk  magnet  ( magnetic stirrer , sentrifuge dan spektrofotometer .
Antigen yang disintesis dari AFM 1 - Ova  dan  Antibodi  G  (Ig  G)  digunakan sebagai pereaksi untuk Agar Gel Precipitation  Test (AGPT).  Pengujian  ini dilakukan  dengan  berdasarkan  teknik presipitasi  (pengendapan)  antigen  oleh antibodi yang sesuai (spesifik).
a. Persiapan aflatoksin M 1 - CMO
Metode yang digunakan oleh Wang et al. (2011) yang telah dimodifikasi dengan mempersiapkan AFM 1 -CMO memungkinkan konjugasi pembawa protein  atau  enzim.  Percobaan  dimulai dengan 0,5 mg aflatoksin M 1 menambahkan 1,5
mg carboxymethoxylamine  hemihydrochloride (CMO), yang dilarutkan dalam 6 ml larutan refluks  (1,0  ml  piridin,    4,0  ml  methanol dan  1,0  ml  air  suling)  dalam  labu  ukur. Setelah  itu  reaksi  campuran  direflux dengan  lembut  selama  2,5  jam  secara terus-menerus  dengan  magnetik  stirer, labu  ukur  dibungkus  dalam  aluminium  foil dan  disimpan    pada  suhu  30 o C  semalam.
Menggunakan  Evaporator  untuk    reaksi campuran  sampai  hasil  akhir  1  ml,  dari sisa    campuran  1  ml  tersebut  dan aflatoksin M 1 standar  diamati dengan TLC plate. TLC Plate dilarutkan dalam kloroform : metanol (9: 1) ditambah  1,5% asam asetat glasial, dan diamati di bawah
sinar  UV  pada  panjang  gelombang  365 nm.  Hasil  reaksi  AFM 1 -CMO    diambil dengan  dikeruk  silika  gel  dari  TLC  plate dan  dilarutkan  ulang  dengan  kloroform, kemudian  disentrifuge  selama  5  menit untuk  menghilangkan  residu  silika  gel. AFM 1 -CMO  dikering  anginkan    untuk tahap sintesis dengan Ova.
b. Sintesis AFM 1 -Ova
AFM 1 -CMO disintesis dengan mengkonjugasikan Ova dan menambahkan larutan carbodiimide (EDC)  dan  N-hydroxysuccinimide  (NHS). EDC  disiapkan  (1,0  mg  EDC  dalam  0,01 ml  DMF)  dan  larutan  NHS  (0.8  mg  dari NHS  di  0.01  ml  DMF)  setelah  itu ditambahkan  ke  aflatoksin  M 1 -CMO    (0,5 mg  aflatoksin  M 1 -CMO  dalam  0,13  ml DMF). Hasil reaksi disimpan di suhu 30 0 C selama  2  jam  dengan  pengadukan magnetik  stirer  secara  terus  menerus. Dari campuran  tersebut berisi 150 µl. Ova (1.5 mg Ova dalam 1,0 ml 0,1 M NaHCO3, pH 8,3) yang telah disiapkan ditambahkan bertetes-tetes ke botol tersebut,  dan  disimpan  pada  suhu  30 o C.
Setelah  reaksi,  campuran  dalam  botol  di dialisis    dengan  larutan  0,01  M  buffer fosfat mengandung 0,15 NaCl M [phosphate  buffered  saline  (PBS)  pH  7,5] selama 72 jam dengan dua kali pertukaran buffer. Setelah dialisis, campuran dikumpulkan untuk di diamati dengan TLC plate dan dilanjutkan Agar Gel Precipitation Test (AGPT)
Agar Gel Precipitation Test (AGPT)

## c. Agar Gel Precipitation Test (AGPT)
Uji  ini  dilakukan  untuk  antigen AFM 1 -Ova.  Agar  gel  dibuat  dengan melarutkan agarose 0,4 % dan 1,2 g PEG 6000,  0,1  %  Na  azide  dalam  25  ml  PBS pH  7,4  dan  25  ml  air  suling  pH  7,4. Larutan  ini  dipanaskan  sampai  larut  dan warna  larutan  menjadi  bening.  Kemudian larutan  dipipet  sebanyak  3,75  ml,  dicetak pada  gelas  obyek  dan  ditunggu  sampai memadat.  Kemudian dibuat sumur-sumur dengan  puncher  diameter  2-3  mm,  satu sumur di tengah dimasukkan 25 µl antigen AFM 1 -Ova dan 6 sumur dimasukkan 25 µl antibodi  G  (IgG/serum).  Gelas  obyek diletakkan di atas kertas yang basah agar terjaga  kelembabannya.  Reaksi  dibaca setelah  24  jam.  Reaksi  positif  ditunjukkan dengan  adanya  pita  presipitasi  di  antara sumur antigen dan serum.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sintesis AFM 1 – Ova
Konjugat  AFM l -CMO  yang  diamati dengan kromatografi lapis tipis memiliki R f =  0,9.  Hasil  pengukuran  Ova  pada
konjugasi
AFM 1 -Ova menggunakan larutan standar Ova dengan konsentrasi 0, 0,25,  0,5,  1,0  dan  2,0  ng/mL  dan  diukur dengan  menggunakan  spektrofotometer. Hasil pengukuran absorbansi dan penghitungan Ova terpapar pada Gambar 1  dan  Tabel  1.  Dengan  menggunakan persamaan  linier  regresi  y  =  ax  +  b  dari kurva larutan standar Ova, maka diperoleh konsentrasi  Ova  dalam  antigen  AFM l- Ova sebesar 3,45 mg/mL (Tabel 1). Jumlah ini
cukup  banyak  untuk  digunakan  pada imunisasi  mencit  (sebagai  imunogen)  dan sebagai antigen penangkap untuk AGPT .
Tabel 1. Hasil pengukuran spektrofotometer standar Ova dan antigen AFM 1- Ova Bahan yang dipakai Absorbansi (280 nm) Blanko (PBS 0,01 M) 0 Ova (0,25 mg/ml) 0,109 Ova (0,5 mg/ml) 0,239 Ova (1 mg/ml) 0,384 Ova (2 mg/ml) 0,598 AFM 1 -Ova (mg/ml) 1,05
Gambar 1 Kurva standar Ova dalam antigen AFM 1 -Ova

## Agar Gel Precipitation Test  (AGPT)
Pada percobaan ini, antigen AFM1-Ova yang diperoleh dengan mereaksikan AFM1 dan Ova menghasilkan senyawa yang dapat bereaksi  positif  dengan  antobodi  yang terlihat  pada  Gambar  2.  Reaksi  positif tersebut  ditandai  dengan  terbentuknya garis presipitasi diantara satu sumur yang
Agar Gel Precipitation Test (AGPT)
berisi  Antigen  AFM1-Ova  dan  antibodi  G (Ig G/serum). Hal ini menunjukkan adanya homologi antara antigen dan antibodi yang dicerminkan oleh adanya garis presipitasi. Angi et  al .,  2009  menyatakan  pada  uji presipitasi, pengikatan antara antigen dan antibodi  memerlukan  struktur  yang  cocok antara  keduanya.  Ketika  suatu  antibodi yang berdifusi ke agar memiliki kecocokan atau  homolog  dengan  antigen  maka  akan terlihat garis presipitasi.
Gambar  2. 1 Reaksi  positif  dari  uji  AGPT (a)  antigen  AFM1-Ova    (b) antibodi  G  (IgG/serum)  (p)
garis presipitasi 2 Reaksi negatif  uji  AGPT  (a)  antigen AFM1-Ova  (b) PBS

## KESIMPULAN
1.  Hasil  sintesis  AFM 1 -Ova  diperoleh sebanyak 3,45 mg/ml
2.  Hasil  AGPT  menunjukkan  adanya reaksi  pembentukan  pita  presipitasi ikatan antibodi spesifik dengan antigen AFM 1 -Ova.

## SARAN
Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan membandingkan  pengujian  yang  bersifat kuantitatif  seperti  High  performance  liquid
chromatography  (HPLC)  atau  enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA).

## UCAPAN TERIMAH KASIH
Terima  kasih  kepada    Balai  Besar Penelitian Veteriner bogor Jawa Barat dan kepada Akademi Analis Kesehatan Kendari  sebagai  institusi  asal  Peneliti yang telah memberikan dukungan sehingga penelitian dapat berjalan dengan baik.

## DAFTAR PUSTAKA
Angi,  A.H.,  Wibawan,  I.W.T.,  Murtini,  S. 2009.  Kemampuan  netralisasi antibodi spesifik Avian Influenza H5 terhadap beberapa virus H5N1 Isolat lapang. Forum pascasarjana. 32 (1): 55-66 . Gholib,  D.  2005.  Pengembangan  teknik serologi untuk pemeriksaan Aspergillosis  ayam. JITV. 10
(2): 143-149.
Lee,  J.  E.,  Kwak,  B.  M.,  Ahn,  J.  H.,  &
Jeon, T. H. 2009. Occurrence of aflatoxin M1 in raw milk in South Korea  using  an  immunoaffinity column and liquid chromatography. J Food Control . 20 : 136 –138.
Lunggani  AT.  2007. Kemampuan  Bakteri Asam Laktat Dalam Menghambat  Pertumbuhan  dan Produksi Aflatoksin B2 Aspergilllus flavus BIOMA ISSN:  1410-8801. 9 (2):  45 –
51.
Maryam,  R.  2007.  Produksi  antibodi monoklonal menggunakan konjugat fumonisin B1- Ovaalbumin  sebagai  antigen untuk  deteksi  fumonisin  secara imunoasai.  Bogor:  Indonesia:
IPB, Dr.Disertasi.
Agar Gel Precipitation Test (AGPT)
Pei,  S.C.  Zhang,  Y.Y.  Eremin,  S.G.  Lee,
W.J. 2009. Detection of aflatoxin  M1  in  milk  products from  China  by  ELISA  using monoclonal  antibodies. J  Food Control . 20 :1080 –1085.
Tekinsen,  K.K.  dan  Tekinsen,  O.C. 2005.Aflatoxin M 1 in white pickle and  van  otlu  (herb)  cheeses consumed  in  southeastern  in Turkey. Food  Control . 7 :565 –
568.
Virdis,  S.  Corgiolu,  G.  Scarano,  C.  Pilo, A.L.  De  Santis  E.P  L.  2008. Occurrence  of  aflatoxin  M1,  in tank  bulk  goat  milk  and  ripened goat  cheese. J  Food  Control .
19 : 44 –49.
Wang, J.J. Liu, B.H. Hsu, Y.T. Yu, F.Y, 2011. Sensitive Competitive Direct Enzyme-Linked Immunosorbent Assay And Gold Nanoparticle Immunochromatographic Strip For Detection Aflatoksin M 1 In Milk. J Food Control . 22 :64-969.