KARAKTERISTIK SEL KANKER ORAL BARU (Sp-C1) DAN UJI HAMBATAN PERTUMBUHAN SEL Sp-C1 MENGGUNAKAN TERAPI GEN pcDNA3.1
-p27Kip1 mutant type in vitro
(CHARACTERISTICS OF NEW ORAL CANCER CELL (Sp-C1) AND TEST OF Sp-C1 CELL GROWTH INHIBITION USING A pcDNA 3.1-p27Kip1 mutant type gene in vitro)

## Supriatno
Departemen Oral Medicine Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Gadjah Mada Jl. Denta Sekip Utara, Yogyakarta

## Abstract
Primary cell of oral cancer (cell Sp-C1) has some characteristics of cell growth and protein expression of anti-apoptosis and  positive  regulatory  protein  of  cell  cycle.  Characteristics  of  Sp-C1  cell  are  important  to  know  and  facilitate  the researchers used an in vitro model of oral cancer cells. The aim of study was to introduce new types of oral cancer cells (cell Sp-C1) with their characteristics and to examine the cell growth inhibition of Sp-C1 using mutant type p27Kip1 gene therapy in vitro . Isolasion of Sp-C1 cell was derived from cervical lymph node tissue of tongue cancer patient. From the isolation  procedure  was  found  fibroblasts  and  oral  cancer  primary  cells  were  incubated  at  refrigerator  -80 0 C.  Growth inhibition of Sp-C1cell was transfected with  mutant type  p27Kip1 and  pcDNA3.1-neo (empty  vector) using the  MTT assay. Results of study revealed that characteristics of Sp-C1 cell growth was relative fast and highly protein expression of p45Skp2,  α-tubulin, cyclin-dependent  kinase -2  (CDK-2),  cyclin-E, metastatic  associated  protein -1  (MTA-1)  and  anti- apoptosis  protein  maspin.  Furthermore,  Sp-C1-pcDNA3.1-p27Kip1  mt  was  significantly  suppressed  the  cell  growth compared with pcDNA3.1-neo (P< 0.05). In conclusion, Sp-C1 cells have certain characteristics and appropriate for an in vitro studies model of oral cancer. pcDNA3.1-p27Kip1 mt had strongly potential inhibition of Sp-C1 cell growth. Method of gene transfer in vitro had a simple procedure and a new strategy of gene therapy against oral cancer cells.
Key words : cell characteristic, Sp-C1, p27Kip1 mt, protein expression, anti-apoptosis

## Abstrak
Sel  primer  kanker  oral  (sel  Sp-C1)  mempunyai  beberapa  karakteristik  pertumbuhan  sel  dan  ekspresi  protein  anti- apoptosis  maupun  protein  regulator  positif  siklus  sel.  Karakteristik  sel  Sp-C1  penting  diketahui  untuk  memudahkan peneliti menggunakan model in vitro sel kanker oral. Tujuan penelitian adalah memperkenalkan jenis sel kanker oral baru (sel Sp-C1) dengan karakteristiknya, serta  menguji hambatan pertumbuhan sel Sp-C1 mengunakan terapi  gen p27Kip1 mt secara in vitro . Isolasi sel Sp-C1 berasal dari jaringan limfonodi servikal yang termetastasis kanker lidah. Proses isolasi didapatkan fibroblas dan sel primer kanker oral yang diinkubasi pada refrigerator -80 0 C. Hambatan pertumbuhan sel Sp- C1 diperlakukan dengan terapi gen pcDNA3.1 -p27Kip1 mt dan pcDNA3.1-neo ( empty vector ) menggunakan uji MTT. Hasil penelitian menunjukkan karakteristik pertumbuhan sel Sp-C1 yang relatif cepat dan ekspresi protein p45Skp2, α- tubulin, cyclin-dependent  kinase -2  (CDK-2),  cyclin-E, metastatic  associated  protein -1  (MTA-1)  dan  protein  anti- apoptosis  maspin.  Selanjutnya,  sel  transfektan  Sp-C1-pcDNA3.1-p27Kip1  mt  mempunyai  potensi  hambatan pertumbuhan  sel  yang  signifikan  dibandingkan  pcDNA3.1-neo  (P<  0.05).  Kesimpulan,  sel  Sp-C1  mempunyai karakteristik  tertentu  dan  dapat  digunakan  sebagai  model  penelitian in  vitro kanker  mulut.  pcDNA3.1-p27 Kip1 mt mempunyai potensi hambatan pertumbuhan sel Sp-C1 yang kuat. Metode transfer gen secara in vitro merupakan prosedur yang sederhana dan suatu strategi baru terapi gen terhadap sel kanker oral.
Kata kunci : karakteristik sel, Sp-C1, p27Kip1 mt, ekspresi protein, anti-apoptosis

## PENDAHULUAN
Kanker  oral  merupakan  penyakit  dengan  karak- teristik  gangguan  atau  kegagalan  mekanisme  pe- ngaturan  multiplikasi  organisme  multiseluler  se- hingga terjadi perubahan perilaku sel yang tidak ter- kontrol  di  rongga  mulut.  Kanker  oral  disebabkan rusaknya mekanisme pengaturan dasar perilaku sel, khususnya mekanisme pertumbuhan dan diferensia- si  sel.  Kanker  tersebut  ditandai  dengan  kerusakan DNA,  menyebabkan pertumbuhan otonom  yang ti- dak merespons faktor regulasi pertumbuhan normal. Kanker oral mempunyai angka kematian yang ting- gi. 1 Dari seluruh jenis kanker pada manusia, kanker leher-kepala menempati urutan ke-6, dan paling ba- nyak kasus yang timbul adalah kanker oral. Kanker oral  merupakan  kanker  ganas  yang  mempunyai rerata lamanya hidup paling rendah diantara kanker ganas mayor. Kanker oral mempunyai persentase 2- 5% dari seluruh kanker pada manusia. 2 Kanker oral merupakan  salah  satu  masalah  kesehatan  utama yang  ditunjukkan  dengan  tingginya  insidensi  pe- nyakit  tersebut  di  belahan  dunia.  Di  negara-negara Asia  Tenggara,  kanker  oral  adalah  bentuk  paling umum dan insidensinya sepertiga dari semua kanker manusia. 1 Kanker  oral  ditandai  dengan  tingginya tingkat  invasi  dan  metastasis  ke  limfonodi  re- gionnal,  serta  kekambuhan  lokal  pasca  pengobatan awal,  kemungkinan  terjadinya  mikro-invasi  dan/ atau  mikro-metastasis  sel-sel  kanker  primer. 2 Peng- obatan  kanker  oral  secara  konvensional  termasuk radioterapi kemoterapi, pembedahan dan kombinasi ketiganya  masih  belum  memuaskan.  Namun,  ting- kat  kelangsungan  hidup  secara  keseluruhan  masih belum  meningkat  secara  signifikan  dalam  dua  de- kade terakhir. 3 Prognosis kanker oral juga tidak ber- ubah  selama  10  tahun  terakhir. 4 Kondisi  tersebut mengindikasikan  perlunya  upaya  terus  meningkat- kan modalitas pengobatan.
Pengobatan  kanker  oral  sampai  saat  ini  masih belum  maksimal.  Penelitian-penelitian  terus  di- lanjutkan  dan  dilakukan  untuk  mendapatkan  hasil pengobatan yang  efektif dan  efisien  secara in  vitro, in  vivo ,  dan  klinis  menggunakan  tanaman  herbal, obat  sintetis  atau  kemoterapi  serta  terapi  lain  ter- masuk  terapi  gen. 5 Namun  demikian,  model  pe- nelitian in vitro menggunakan jenis biakan sel kan- ker oral baru perlu pula dilakukan. Manfaat sel kan- ker  oral  baru  ini  memudahkan  peneliti  mengguna- kan model sel kanker oral dari manusia untuk jenis penelitian in vitro. Dalam penelitian ini, diperkenal- kan  jenis  sel  kanker  oral  baru  (Sp-C1)  dengan karakteristiknya  dan  uji  hambatan  pertumbuhan  sel Sp-C1  menggunakan  terapi  gen  p27Kip1 mutant type (mt) in vitro .
Salah  satu  anggota  famili  Cip/Kip  dari cyclin- dependent  kinase (CDK)  inhibitor  adalah  p27Kip1 yang mengatur pertumbuhan sel secara negatif pada fase G1-S siklus sel dengan menonaktifkan aktivitas kinase  komplek  cyclin  E/Cdk-2  maupun  Cyclin A/Cdk-2. 6 Rendahnya ekspresi p27Kip1 berhubung- an  dengan  prognosis  buruk  dan  tingkat  keganasan tinggi  pada  beberapa  kanker  manusia,  termasuk kanker  kolon, 7 payudara, 8 gastrik, 9 paru, 10 prostat adenokarsinoma, 11 ovarian, 12 tiroid 13 dan  limfoma maligna. 14 Disrupsi  atau  kelainan  mekanisme  pe- ngaturan  siklus  sel oleh p27Kip1 berhubungan  erat dengan pertumbuhan dan perkembangan sel kanker. Defi-siensi  p27Kip1  menyebabkan  perkembangan tumor endokrin dan ukuran tubuh yang besar, serta menyebabkan hiperplasi organ multipel. 15 Walaupun aktivitas  p27Kip1  dapat  sebagai  penghambat  per- tumbuhan  beberapa  jenis  kanker  manusia,  tetapi mekanisme regulasi hambatannya pada kanker solid masih belum jelas.
Sel  Sp-C1  merupakan  sel  kanker  primer  solid rongga mulut yang diisolasi dari pasien kanker lidah yang  telah bermetastasis  ke  limfonodi  regional,  be- lum  melibatkan  jaringan  otot  dan  mempunyai  di- ferensiasi  ringan  ( mild  differentiation ).  Sel  Sp-C1 hasil  isolasi  dapat  tumbuh  cepat  jika  dibiakkan  da- lam media dengan serum lebih dari 10 %. Sel Sp-C1 telah  banyak  diteliti  sebagai  model in  vitro dengan menginduksi sel tersebut menggunakan obat herbal, sintetis dan terapi gen. 16-22
Tujuan  penelitian  ini  adalah  memperkenalkan jenis  sel  kanker  baru  dirongga  mulut  (sel  Sp-C1) dengan karakteristiknya, serta menguji daya hambat pertumbuhan  sel  Sp-C1  menggunakan  terapi  gen p27 Kip1 mt in vitro .

## BAHAN DAN METODE
Metode isolasi sel  kanker oral  Sp-C1 berasal  dari jaringan limfonodi servikal yang telah termetastasis sel  kanker  lidah.  Jaringan  kanker  oral  segar  dalam cawan  petri  (Ǿ=  60  mm)  berisi  larutan phosphate buffer saline (PBS, Sigma-Aldrich, USA) steril dan penisilin-streptomisin  (Penstrep;  Gibco,  USA)  di- bawa  ke  laboratorium.  Pada  jaringan  tersebut  di- lakukan  proses  fisik  dengan  memotong-motong menjadi  bagian  kecil  dalam laminar-flow clean bench steril (Thermo scientific, USA). Hasil proses diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu  37 0 C.  Pe- meriksaan menggunakan mikroskop cahaya (Olym- pus, Japan) dilakukan untuk mengetahui pertumbuh- an  dan  perkembangan  sel  baru.  Hasil  pemeriksaan menggunakan mikroskop cahaya menunjukkan ada- nya  pertumbuhan  jaringan  fibroblas  baru  dan  sel baru. Selanjutnya  sel  baru  diberi   tanda  atau  label
pada cawan petri Isolasi  sel  fibroblas  dilakukan  menggunakan Whatmann paper yang  telah  direndam  larutan EDTA-Trypsin  0,25%  (Sigma-Aldrich,  USA)  da- lam cawan petri (Falcon, USA). Selanjutnya, cawan petri  ditambahkan Dulbecco’s Modified Eagle  Me- dia (Sigma-Aldrich,  USA)  10% Foetal  bovine  se- rum (FBS,  Moregate,  Australia).  Sel  fibroblas  di- inkubasi pada suhu 37 0 C setelah serial tripsinasi di- lakukan.  Kemudian,  sel  fibroblast  baru distock dan disimpan dalam refrigerator suhu -80 0 C.
Isolasi  sel  kanker  oral  baru  dilakukan  dengan prosedur  yang  sama,  yaitu Whatmann  paper yang telah  direndam  larutan  EDTA-Trypsin  0,25% (Sigma-Aldrich, USA) diletakkan pada dasar cawan petri  sesuai  dengan  tanda  atau  label  yang  telah  di- buat  dan  diinkubasi  pada  suhu  37 0 C.  selama  ±  5 menit. Whatmann  paper dipindah  ke  petri  baru berisi  DMEM  10%  FBS  dan  diinkubasi  selama  24 jam. Serial prosedur tripsinasi dilakukan sampai di- peroleh  sel  baru  bebas  fibroblast.  Sel-sel  baru  ter- sebut dikloning dengan label clone -1 sampai dengan clone -10.  Sel  baru  dengan  pertumbuhan  yang  ter- cepat dan sehat adalah sel yang dipelihara dan diberi nama atau label baru, yaitu Sp-C1.
Karakteristik sel kanker oral (Sp-C1) baru berasal dari penderita kanker lidah yang telah bermetastasis ke  limfonodi  servikal.  Sel  Sp-C1 diisolasi dari  lim- fonodi  servikal    pasca neck  dissection .  Sel  Sp-C1 mempunyai  diferensiasi  baik  ( well  differentiation ) dan  belum  mengalami  invasi  ke  jaringan  otot.  Da- lam  kultur  sel,  Sp-C1  tumbuh  cepat  dalam Dul- becco’s  Modified  Eagle  Media (DMEM;  Sigma- Aldrich, USA) 10% FBS (Foetal Bovine Serum,, te- tapi  akan  tumbuh  lambat  jika  menggunakan  media Rosswell  Park  Memorial  Institute (RPMI)  1640 (Sigma-Aldrich, USA). Morfologi sel Sp-C1 terlihat bentuk sel tidak beraturan seperti bulat oval, lonjong dan  pipih,  tidak  berkontak  interseluler  atau  hidup mandiri  jika  belum  penuh  pertumbuhannya  (belum confluent ). Sel Sp-C1 yang sehat selalu melekat erat di  dasar  cawan  Petri  (Falcon,  USA)  dan  tidak  me- ngambang  di  permukaan  media,  kecuali  sel  yang telah mati. Sel Sp-C1 mempunyai karakteristik kuat terhadap ekspresi protein p45Skp2, αtubulin, cyclin- dependent  kinase -2  (CDK-2),  cyclin-E, metastatic associated protein -1 (MTA-1), p27Kip1,dan protein anti-apoptosis  termasuk  maspin.  Sel  Sp-C1  mem- punyai  sifat  tumorigenisitas  positif  terhadap  tikus Nude  dan  tumorigenisitas  negatif  terhadap  mencit Wistar maupun tikus Sprague Dawley.
Konstruksi  ekspresi  vektor  mamalia  pcDNA3.1- p27 Kip1 mt ( containing sense-oriented human mutant type p27 Kip1 cDNA)  dilakukan  sebagai  berikut: pcDNA3.1  (+)  (Invitrogen,  USA)  merupakan  eks-
presi  vektor  mamalia  yang  berisi  promoter  sito- megalo  virus.  pcDNA3.1  (+)  dilarutkan  dengan AgeI  (Takara  Biomedicals,  Japan)  dan  NheI (Takara),  kemudian  didefosforilasi  menggunakan calf  intestinal  alkaline  phosphatase (Roche  Diag- nostics, Germany). Fragmen p27 Kip1 mt [mutasi dari Thr-187/Pro-188  (ACGCCC) menjadi  Met-187/Ile- 188  (ATGATC)  disiapkan  dari  ekspresi  vektor pORF9-p27  mt  yang  termasuk  artifisial  p27 Kip1 mt (Invivo  Gen,  USA).  Selanjutnya  fragmen  terikat dengan pcDNA3.1 (+). Dengan menggunakan anali- sis sequencing , ikatan fragmen tersebut dikonfirmasi menggunakan  primer  spesifik  p27 Kip1 –SQP1:  5’- ATGTCAAACGTGCGAGTGTC-3’  untuk  p27 Kip1 cDNA  manusia. Sequencing DNA  ditentukan  de- ngan metode dideoxy chain termination mengguna- kan fluorescens-labeled primer  dan thermo  seque- nase  cycle  sequencing kit. 23 Pada  penelitian  ini, plasmid cDNA3.1-p27 Kip1 mt dan cDNA3.1-neo di- peroleh  dari  Dr.  Koji  Harada  ph.D  (Department  of Therapeutic  Regulation  for  Oral  Tumor,  Institute of  Health  Biosciences,  Tokushima  University,  Ja- pan). 16
Sel  Sp-C1  (2x10 4 sel/sumur)  yang  telah  ditrans- feksi  dengan  pcDNA3.1-neo  (kontrol)  dan  pcDNA 3.1-p27 Kip1 mt  ( treatment ) dibiakkan  dalam  cawan petri  96  sumuran  (Falcon,  USA)  dengan  media DMEM  10%  FBS  (Sigma-Aldrich,  USA).  Setelah 24  jam,  media  diganti  dengan  medium  yang  me- ngandung  Geneticine  (Sigma-Aldrich,  USA)  atau tidak  mengandung  Geneticine.  Setelah  24  dan  48 jam inkubasi, 20 μl 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT, 5 mg/ml PBS) (Sigma-Aldrich, USA) dimasukkan ke dalam setiap sumuran.  Setelah  4  jam  inkubasi,  media  kultur dibuang dan diganti dengan 100 μl DMSO (Nacalai tesque,  Japan).  Densitas  optik  (OD)  diukur  pada panjang gelombang 540 nm menggunakan Bio-Rad microplate  reader (Bio-Rad,  USA).  Penelitian  di- lakukan dengan 6 kali replikasi. 17
Analisis  statistik  dilakukan  dengan  program  Stat Work  menggunakan  komputer  Macintosh  (Cricket Software,  Philadelphia,  PA).  Perbandingan  statistik antar  kelompok  dilakukan  dengan  uji  LSD.  Per- bedaan signifikan ditentukan dengan p < 0,05.

## HASIL
Sel  Sp-C1  sebagai  model  penelitian in  vitro sel kanker oral mempunyai morfologi dan pertumbuhan sel  spesifik.  Morfologi  sel  Sp-C1  dan  ekspresi beberapa  protein  hasil  analisis  menggunakan Wes- tern bloting ditunjukkan pada Gambar 1. Morfologi sel Sp-C1 tampak tidak beraturan seperti bulat, bulat oval, lonjong dan pipih. Sel Sp-C1 yang sehat selalu
melekat  erat  di  dasar  cawan  petri  dan  tidak  me- ngambang  di  permukaan  media,  kecuali  sel  mati. Sel Sp-C1 mempunyai ekspresi protein spesifik ter- utama  protein  anti-apoptosis  (maspin  dan  MTA-1), protein regulasi negatif siklus sel (komplek CDK 2- Cyclin  E),  protein  pemacu  tumor  (p45Skp2)  dan satu protein regulasi positif siklus sel jika sel Sp-C1 ditransfeksi dengan gen p27Kip1 mt, yaitu p27Kip1.
Gambar 1. Karakteristik sel kanker oral baru (sel Sp-C1) A.  Morfologi  dan  pertumbuhan  sel  Sp-C1 yang  belum confluent .  B.  Ekspresi  beberapa protein  yang  dihasilkan  sel  Sp-C1  melalui analisis Western bloting
Relatif  jumlah  sel  kanker  Sp-C1  yang  telah  di- transfeksi  dengan  pcDNA3.1-neo  atau  pcDNA3.1- p27 Kip1 mt  dievaluasi  dengan  membandingkan  ab- sorbansi setiap sel pada hari ke-1 dan 2 mengguna- kan  uji  MTT.  Terlihat  perbedaan  bermakna  terjadi pada  sel  Sp-C1  transfektan.  Jumlah  sel  Sp-C1 pcDNA3.1-p27 Kip1 mt  menunjukkan  hambatan  per- tumbuhan yang bermakna dibandingkan dengan Sp- C1 pcDNA3.1-neo (P< 0,05). Hambatan sel Sp-C1 pcDNA3.1-p27 Kip1 mt  pada jam ke-48 lebih kuat di- bandingkan  jam  ke-24.  Besarnya  hambatan  sel  Sp- C1  transfektan  pada  jam  ke-24  dan  -48  berturut- turut  sebesar  37%  dan  45,4%  (Gambar  2).  Per- bedaan kekuatan hambatan tersebut dikarenakan sel Sp-C1  lebih  lama  berkontak  dengan  gen  p27Kip1 mt dan paparan dosis yang lebih tinggi pada jam ke- 48,  menyebabkan  toksik  pada  sel  kanker  oral  ter- sebut.  Selain  itu,  fungsi  p27Kip1  sebagai  regulator negatif  siklus  sel,  menyebabkan  hambatan  per- tumbuhan yang lebih tinggi pada jam ke-48.
Gambar 2.  Uji  hambatan  pertumbuhan  sel  Sp-C1  meng- gunakan  transfeksi  gen  pcDNA3.1-p27Kip1 mt  dan  pcDNA3.1-neo  yang  diinkubasi  se- lama 24 dan 48 jam. * P< 0,05

## PEMBAHASAN
Kultur  sel  Sp-C1  yang  dibiakkan  dalam  cawan petri  berisi  DMEM  10%  FBS  mempunyai  ke- cepatan  pertumbuhan  yang  lebih  tinggi  dibanding- kan  sel  yang  dibiakkan  dalam  media  RPMI  1640 10%  FBS.  Kondisi  tersebut  merupakan  salah  satu karakteristik sel kanker oral Sp-C1 baru. Gambaran spesifik dan unik lain termasuk tumorigenisitas yang dapat  bersifat  positif  atau  negatif  tergantung  jenis tikus yang digunakan dalam penelitian. Tumorigeni- sitas  positif  tampak  pada  jenis  tikus Nude dengan latar  belakang  Balb/C  yang  diinjeksi  sel  Sp-C1 xenograft sebanyak  1x10 6 sel/tikus  pada  bagian punggung  tikus,  sedangkan  tumorigenisitas  negatif terjadi  pada  tikus  Wistar  maupun  Sprague-Dawley yang  diinjeksi  sel  Sp-C1.  Hasil  tersebut  mungkin karena  kedua  jenis  tikus  tersebut  mempunyai  daya tahan  tubuh  atau  imun  tubuh  yang  baik,  sehingga sel-sel  Sp-C1  yang  diinjeksikan  secara xenograft dapat  dilisiskan. 16 Karakteristik  lain  sel  kanker  oral Sp-C1adalah  ekspresi  protein  anti-apoptosis  dan regulasi  negatif  siklus  sel  yang  kuat.  Protein  anti- apoptosis atau inhibitory apoptosis protein (IAP) se- perti  protein  maspin  dan  MTA-1  terekspresi  pada sel  Sp-C1.  Begitu  pula  protein  Cdk-2  dan cyclin E yang  merupakan  regulator  negatif  siklus  sel  ter- ekspresi  pada  sel  Sp-C1  melalui  analisis Western bloting (Gambar 1). Semua protein tersebut merupa- kan protein pemicu tumor ( tumor promoter protein ) yang merupakan ciri khas sel kanker.
Ekspresi tinggi pada salah satu marker protein sel kanker oral, yaitu protein p45Skp2 yang merupakan co-aktivator  p27Kip1  mengindikasikan  bahwa  Sp- C1  merupakan  sel  kanker  oral  dengan  agresivitas pertumbuhan  sel  dan  metastasis  tinggi.  Dilaporkan bahwa  tingginya  ekspresi  p45Skp2  menunjukkan prognosis  buruk  dan  tingkat  keganasan  tinggi  pada penderita kanker kolon, 18 limfoma, 19 gastrik, 21 oral, 17 dan paru. 22 p45Skp2 knock-out (-/-) pada tikus Nude menunjukkan pertumbuhan sel kanker lebih lambat dan meningkatkan aktivitas apoptosis dibandingkan kontrol atau p45Skp2 (+/+). 2
Hasil  penelitian  menggunakan  sel  Sp-C1  yang ditransfeksi dengan gen pcDNA3.1-p27Kip1 mt dan pcDNA3.1-neo ( empty vector ) menunjukkan bahwa sel Sp-C1-pcDNA3.1-p27Kip1 mt dapat meningkat- kan hambatan pertumbuhan sel kanker pada jam ke- 24  sebesar  37%  dan  jam  ke-48  sebanyak  45,4%. Hasil  penelitian  tersebut  menunjukkan  bahwa hambatan sel Sp-C1 disebabkan oleh gen p27 Kip1 mt dan  bukan  oleh  efek  non  spesifik  seperti  toksisitas vector atau  plasmid.  Dilaporkan  bahwa  transfeksi pcDNA3.1-p27Kip1  mt  pada  sel  Sp-C1  yang  di- injeksikan xenograft pada  punggung  tikus  me- Edisi Cetak Dentika Dental Journal, Desember 2014 (ISSN: 1693-671X)
ningkatkan  hambatan pertumbuhan  sel dengan  me- nurunnya ukuran volume tumor tanpa menimbulkan gangguan pada berat badan tikus dan  efek  sistemik di  tubuh 23 .  pcDNA3.1-p27 Kip1 mt  dilaporkan  lebih resisten terhadap degradasi ubiquitin-proteasom dan lebih  stabil  dibandingkan  p27Kip1 wild  type (wt), sehingga p27 Kip1 mt mempunyai aktivitas antitumor lebih kuat dibandingkan p27Kip1 wt. 15
Penggunaan  plasmid  (cDNA3.1)-neo  terhadap  pc DNA3.1-p27Kip1 mt dimaksudkan  sebagai  kontrol vektor  atau  plasmid  yang  tidak  diberi  perlakuan apapun  ( empty  vector ).  Dikarenakan  gen treatment menggunakan  pcDNA3.1  yang  ditransfeksi  dengan p27Kip1 mt menjadi pcDNA3.1-p27Kip1 mt, maka idealnya  sebagai  kontrol  internal  menggunakan pcDNA3.1-neo. Supriatno et al . 15 melaporkan peng- gunaan pcDNA3.1-neo sebagai kontrol internal ter- hadap  pcDNA3.1-p27Kip1  mt  dan  pcDNA3.1- p27Kip1 wild type (wt) yang bioaktivitas antitumor- nya  sangat  berbeda  dibandingkan  kontrol  pada  sel kanker leher-kepala.
Kesimpulan, sel Sp-C1 merupakan sel kanker oral baru  kultur primer  yang berasal dari  jaringan  epitel limfonodi  servikal  termetastasis  kanker  lidah  yang mempunyai  karakteristik  pertumbuhan  sel  yang  re- latif  cepat  dalam  DMEM  10%  FBS,  melekat  erat pada  dasar  cawan  petri  dan  mempunyai  ekspresi protein  spesifik  terutama  protein  regulator  positif siklus  sel dan protein anti-apoptosis.  Sel  Sp-C1  co- cok digunakan untuk model penelitian in vitro kan- ker mulut. pcDNA3.1-p27 Kip1 mt mempunyai poten- si  hambatan  pertumbuhan  sel  Sp-C1  yang  kuat. Metode transfer gen secara in vitro merupakan pro- sedur  yang  sederhana dan suatu  strategi baru  terapi gen terhadap sel kanker oral.

## Daftar Pustaka
1. Petersen PE, Yamamoto T. Improving the oral health of  older  people:  the  approach  of  the  WHO  Global Oral  Health  Programme.  Comm  Dent  Oral Epidemiol 2005; 33(2): 81-92.
2. Supriatno,  Yuletnawati  SE,  Widiasto  A.  Effect  of intratumoral  injection  of  mutant  type  p27Kip1 followed by in vivo electroporation on radiotherapy- resistant human oral tongue cancer xenografts. Mol Med Report 2011; 4(1): 41-6.
3. Almofti  A,  Uchida  D,  Begum  NM,  Tomizuka  Y, Iga H, Yoshida H, Sato M. The clinico-pathological significance of the expression of CXCR4 protein in oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol 2004; 25: 65-71
4. Ford PJ, Farah CS. Early detection and diagnosis of oral  cancer:  Strategies  for  improvement.  J  Cancer Pol2013; 1: e2-e7.
5. Harada  K,  Supriatno,  Kawashima  Y,  Yoshida  H, Sato  M.  S-1  inhibits  tumorigenicity  and  angio-
genesis  of  human  oral  squamous  cell  carcinoma cells  by  suppressing  expression  of  phosphorylated Akt,  vascular  endothelial  growth  factor  and  fibro- blast  growth  factor-2.  Int  J  Oncol  2007,  30(2): 365-374.
6. Karthiga  A,  Tripathi  SK,  Shanmugam  R, Suryanarayanan V, Singh SK. Targeting the cyclin- binding groove site to inhibit the catalytic activity of CDK2/cyclin  A  complex  using  p27(KIP1)-derived peptidomimetic inhibitors. J Chem Biol 2014; 8(1): 11-24.
7. Lu H, Li H, Mao D, Zhu Z, Sun H. Nrdp1 inhibits growth  of colorectal cancer  cells  by  nuclear  reten- tion of p27. Tumour Biol  2014; 35(9): 8639-43.
8. Huang J, Zhou N, Watabe K, Lu Z, Wu F, Xu M, Mo  YY.  Long  non-coding  RNA  UCA1  pro- motes breast tumor  growth  by  suppression  of p27 (Kip1). Cell Death Dis 2014; 5(1): e1008-9.
9. Wu  X,  Liu  T,  Fang  O,  Leach  LJ,  Hu  X,  Luo  Z. miR-194  suppresses  metastasis  of  non-small cell lung  cancer through  regulating  expression  of BMP1  and p27(kip1).  Oncogene  2014;  33(12): 1506-14.
11.   Pandhare-Dash  J,  Mantri  CK,  Gong  Y,  Chen  Z, Dash  C.  XMRV  accelerates  cellular  proliferation, transformational  activity,  and  invasiveness  of pros- tatecancer  cells  by  down  regulating p27(Kip1). Prostate 2012; 72(8): 886-97.
12.   Skirnisdottir I, Seidal T. Association of p21, p27 and p53 status to histological subtypes and prognosis in low-stage  epithelial  ovarian  cancer.  Cancer   Geno- mics Proteomics 2013; 10(1): 27-34.
13.    Kotb  MH,  Zaher  AM,  Abd  El-Wahab  MA, Abulkheir  IL,  Hussein  M,  Salem  SS.  Prognostic value  of p27 in  follicular thyroid carcinoma  and  its relation to radioactive iodine response: does it aid in the  modification  of  risk  stratification?  Appl Immunohistochem  Mol  Morphol  2014;  22(7): 511-7.
14.   Seki  R,  Ohshima  K,  Okamura  T.  [Prognostic significance of Skp2 and p27(kip) in diffuse large B cell lymphoma.  Rinsho  Ketsueki  2010;  51(12): 1741-7.
15.   Wolf  G,  Schanze  A,  Stahl  RA,  Shankland  SJ, Amann K. p27(Kip1) Knockout mice are protected from  diabetic  nephropathy:  evidence  for p27(Kip1) haplotype  insufficiency.    Kidney  Int  2005;  68(4): 1583-9.
16.   Glover  CE,  Gurley  KE,  Kim  KH,  Stoner  B,  Ferro ML,  Kemp  CJ.  Endocrine  dysfunction  in  p27Kip1 deficient  mice  and  susceptibility  to  Wnt-1  driven breast cancer. Carcinogenesis 2009; 30(6): 1058-63.
17.   Supriatno,  Harada  K,  Yoshida  H,  Sato  M.  Basic investigation  on  the  development  of  molecular targeting  therapy  against  cyclin-dependent  kinase inhibitor p27 Kip1 in head and neck cancer cells. Int J Oncol 2005; 27: 627-635.
18.   Supriatno.  Intratumoral  injection  of  pcDNA3.1- p27Kip1  followed  by  elektroporation  on  a  human tongue  base  cancer   cell   xenograft.  Dent  J  2009;
21:1-8.
19.     Bochis OV, Irimie A, Pichler M, Berindan-Neagoe I. The role of Skp2 and its substrate CDKN1B (p27) in colorectal cancer. J Gastrointestin Liver Dis 2015; 24(2): 225-34.
20.   Kullmann  MK, Grubbauer  C,  Goetsch  K,  Jäkel  H, Podmirseg  SR,  Trockenbacher  A  et  al . The  p27- Skp2 axis  mediates  glucocorticoid-induced  cell cycle arrest in T-lymphoma cells. Cell cycle 2013;
12(16): 2625-35.
21.   Ma  XM,  Liu  JH,  Guo  JW,  Liu  Y,  Zuo  LF. Correlation  of   Skp2 expression  in gastric   carci- noma to  expression  of  P27  and  PTEN.  Ai Zheng. 2006; 25(1): 56-61.
22.   Hung  WC,  Tseng  WL,  Shiea  J,  Chang  HC. Skp2 overexpression  increases  the  expression  of MMP-2  and  MMP-9  and  invasion  of lung  can- cer cells.Cancer Lett 2010; 288(2): 156-61.