p-ISSN 2354-6565 /e-ISSN 2502-3438
OPTIMASI INDUKSI KALUS TANAMAN CABE JAWA ( Piper retrofractum Vahl)

## DENGAN BERBAGAI VARIASI ZAT PENGATUR TUMBUH
1 Fahrauk Faramayuda, 2 Elfahmi, 1 Riska Sigit Ramelan
1 Fakultas Farmasi, Universitas Jenderal Achmad Yani, Jl. Terusan Jend. Sudirman Cimahi
2 Sekolah Farmasi, Institut Teknologi Bandungm, Jl. Ganesha No. 10 Bandung Corresponding author email: ramayuda_f@yahoo.com

## ABSTRAK
Cabe jawa ( Piper retrofractum Vahl) merupakan tanaman obat yang berpotensi untuk dikembangkan dengan  metode  kultur  jaringan.  Tujuan  dari  penelitian  ini  untuk  mengetahui  pengaruh  zat  pengatur tumbuh (ZPT) yaitu 2,4 dichlorophenoxiacetic asam (2,4-D), 6 -benzilaminopurin (BAP) dan kinetin terhadap  pertumbuhan  kalus  dan  produksi  metabolit  sekunder  dari  cabe  jawa.  Penelitian  ini menggunakan rancangan dengan dua perbandingan ZPT yaitu 2,4-D : BAP (0 : 0,5ppm, 0,5 : 0,5ppm, 0,5 : 0ppm) dan 2,4 : Kinetin (0 : 0,5ppm, 0,5 : 0,5ppm, 0,5 : 0 ppm). Data yang dikumpulkan adalah data  kualitatif  (morfologi  kalus  termasuk  tekstur,  warna  kalus  dan  metabolisme  sekunder)  dan  data kuantitatif  (kalus  berat  basah  dan  berat  kering).  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  penambahan ZPT 2,4-D:BAP (0,5ppm:0,5ppm) sebagai konsentrasi optimum untuk menginduksi kalus. Metabolit sekunder dari kalus cabe jawa dianalisis dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) mengguakan fase  gerak  n-heksan  :  etil  asetat  (3:7)  dan  toluen  :  etil  asetat  (1:1).  Berdasarkan  hasil  KLT  tersebut menunjukkan  pola  kromatogram  kalus  cabe  jawa  yang  menunjukkan  senyawa  steroid,  triterpenoid dan flavonoid.
Kata Kunci : Daun Cabe Jawa, Kultur Jaringan, Zat Pengatur Tumbuh, Kromatografi Lapis Tipis.

## ABSTRACT
Piper retrofractum Vahl is a medicinal plant potentially to be developed with in vitro culture method. The objectives of the research were to study the effect of 2,4-dichlorophenoxiacetic acid (2,4-D), 6- benzilaminopurin  (BAP)  and  kinetin  on  callus  growth  and  secondary  metabolism  production  from Piper retrofractum Vahl. The research used factorial completely randomized design with two factors 2,4-D : BAP (0 : 0,5ppm, 0,5 : 0,5ppm, 0,5 : 0ppm) and 2,4:Kinetin (0 : 0,5ppm, 0,5 : 0,5ppm, 0,5 : 0 ppm).  Data  that  be  collected  were  qualitative  data  (callus  morphology  included  texture,  colour  of callus and secondary metabolism from Thin Layer Chromatography’s method) and quantitative data (callus wet weight and callus dry weight). The result of the research indicated that the treatment with addition  plant  regulation  2,4-D  :  BAP  (0,5  ppm  :  0,5  ppm)  on  MS  medium  as  an  optimum combination  concentration  to  induce  callus.  Secondary  metabolites  was  analyzed  by  qualitative methods for callus and cabe jawa leaves without in vitro culture using Thin Layer Chromatography (TLC)  eluted  by  n-hexane :  acetate  etil  (3:7)  and  toluene  :  acetate  etil  (1:1).  Based  on  TLC  results show that callus cabe jawa containing steroid, triterpenoids and flavonoid.
Keyword : Cabe Jawa leaves, Plant Tissue Culture, Growth Hormone, Thin Layer Chromatography.

## PENDAHULUAN
Cabe  jawa  telah  lama  dikenal  sebagai tanaman yang banyak digunakan dalam jamu dan obat  tradisional.  Bagian  yang  sering  digunakan adalah buah yang sudah tua tetapi belum masak, akar,  dan  daun  yang  dikeringkan (1) .  Cabe  Jawa ( Piper  retrofractum Vahl)  memiliki  kandungan kimia  yaitu  zat  pedas  piperin,  kavisin,  asam palmitat,  asam  tetrahidropiperik,  1-undensilenil- 3,4-  metilendioksibenzen,  piperidin,  minyak asiri,  isobutildeka-trans-2-trans-4-dinamid,  dan
sesamin (2) .  Kultur  jaringan  tanaman  adalah metode  atau  teknik  mengisolasi  jaringan,  organ, sel  maupun  protoplas  tanaman  yang  sering  kita sebut  eksplan  didalam  media  yang  aseptik sehingga dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman  utuh  seperti  induknya (3) .  Di  bidang farmasi, teknik kultur jaringan sangat menguntungkan  karena  dapat  mendapatkan metabolit  sekunder  untuk  keperluan  obat-obatan dalam jumlah besar dan dalam waktu singkat (3) . Prinsip  utama  dari  teknik  kultur  jaringan  adalah
setiap  organ  tanaman  dapat  menjadi  tanaman baru  apabila  ditumbuhkan  dalam  kondisi  yang aseptik (3) .  Media  buatan  yang  dapat  dijadikan media  pertumbuhan  kalus  cabe  jawa  yaitu Murashige  dan  Skoog (MS).  Bagian  tanaman yang  digunakan  pada  penelitian  ini  yaitu  daun cabe  jawa.  Selain  media  buatan,  kultur  jaringan harus  mengandung  zat  pengatur  tumbuh  (ZPT) untuk mempengaruhi pertumbuhan morfogenesis dalam  kultur  sel,  jaringan  dan  organ.  Untuk mempercepat  pertumbuhan  pada  kultur  jaringan maka  diperlukan  suatu  Zat  Pengatur  Tumbuh (ZPT). Variasi  ZPT  yang  digunakan  diantaranya 2,4 -diphenylphenoxyacetic  acid (2,4D)  yang merupakan  ZPT  golongan    Auksin.  Sedangkan ZPT golongan
Sitokinin
adalah 6 - benzilaminopurin (BAP) dan Kinetin.

## METODE PENELITIAN
Alat Dan Bahan. Determinasi tanaman Cabe Jawa  dilakukan  di  Laboratorium  Taksonomi Jurusan Biologi FMIPA Universitas Padjadjaran, dan  menunjukkan  bahwa  tumbuhan  tersebut adalah  benar  tanaman  cabe  jawa  ( Piper retrofractum Vahl).  Eksplan  cabe  jawa  yang digunakan adalah bagian pucuk daun Cabe Jawa. Penanaman  eksplan  dilakukan  dengan  cara mengambil  tanaman  yang  sebelumnya  telah disterilisasi,  lalu  pucuk  tanaman    dipotong dengan    menggunakan sterile  blade kemudian tanamkan  eksplan  dalam  media  dengan  isi  zat pengatur tumbuh (ZPT) dengan konsentrasi yang tepat untuk menumbuhkan kultur cabe jawa. Dan di  inkubasi  dalam  suhu  dan  kelembaban  terjaga. Setelah  tumbuh  kalus,  dilakukan  analisis metabolit  sekunder  terhadap  kalus  kultur  cabe jawa dengan kromatografi lapis tipis (KLT).
Pemeriksaan Makroskopik. Dilakukan pada simplisia  Daun  Cabe  Jawa  ( Piper  retrofractum Vahl)  meliputi  karakteristik  fisik  seperti  bentuk, ukuran, warna, dan bau.
Pemeriksaan  Mikroskopik. Pemeriksaan dengan mikroskopik binokuler dilakukan terhadap  daun  cabe  jawa  dan  kalus  cabe  jawa. Pengamatan  menggunakan  mikroskop  meliputi tipe stomata dan rambut penutup.
Pembuatan  Ekstrak  Daun  Cabe  Jawa. Dilakukan  dengan  metode ekstraksi  dingin  yaitu dengan maserasi menggunakan pelarut bertingkat diantaranya n-heksan, etil asetat dan etanol.
Penapisan Fitokimia Simplisia Dan Ekstrak Daun Cabe Jawa. Identifikasi alkaloid, flavonoid,  tanin,  polifenol,  saponin,  steroid- triterpenoid,  monoterpenoid-seskuiterpenoid  dan kuinon
Analisis Metabolit Sekunder dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Digunakanperbandingan pengembang yaitu toluen : etil asetat (1:1) dan etil asetat : n-heksan (7:3) Selanjutnya dilakukan identifikasi kandungan dengan memberikan penampak bercak  yang  spesifik  seperti  H 2 SO 4 10%  dalam metanol,  Sitroborat  dan  Liebermann-Bouchard. Profil KLT ekstrak  kalus dan  eksplan  cabe jawa hasil  kultur  jaringan  dibandingkan  dengan eksplan cabe jawa kontrol dan ekstrak daun cabe jawa yang tumbuh dihabitat asalnya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan untuk  menumbuhkan tanaman cabe jawa dengan teknik kultur jaringan dan menganalisis metabolit sekunder hasil kultur jaringan.  Sebelum  dilakukan  penanaman  dengan metode  kultur  jaringan,  dilakukan  sterilisasi terlebih  dahulu  pada  daun  cabe  jawa.  Sterilisasi daun  cabe jawa  dilakukan  dengan  menggunakan Alkohol  70%  selama  1  menit  kemudian dilakukan  perendaman  pada  natrium  hipoklorit konsentrasi  2%  v/v  selama  5  menit,  kemudian dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali masing- masing  selama  1  menit  dengan  tujuan  untuk membersihkan  daun  dari  larutan  alkohol  dan natrium  hipoklorit.    Konsentrasi  ZPT  yang menunjukkan aktivitas biologi pada eksplan cabe jawa yaitu 2,4-D (0.5ppm), 2,4-D-BAP (0.5ppm:0.5ppm)    dan  kinetin  (0.5ppm).  2,4-D (0.5ppm)  dan  kinetin  (0.5ppm)  ditandai  dengan menggulungnya eksplan dan pertambahan ukuran volume, sedangkan perbandingan konsentrasi ZPT pada 2,4-D-BAP (0.5ppm:0.5ppm)    menunjukkan  terbentuknya kalus.  Salah  satu  indikator  adanya  pertumbuhan dalam  kultur  jaringan  adalah  munculnya  kalus pada    eksplan.  Kalus  merupakan  sel-sel  yang muncul bergerombol pada salah satu atau seluruh irisan eksplan (4) . Kalus yang muncul dari daerah bekas  pelukaan  akan  berwarna  putih,  lama kelamaan  berubah  menjadi  kalus  yang  berwarna hijau.    Tahapan    pembentukan    kalus  pada eksplan  yaitu  kalus  yang  muncul  pada  bekas potongan    pada    eksplan    awalnya  bersifat remah,    selanjutnya    ketika    sel    terus berproliferasi    maka    lama-kelamaan    kalus menjadi  kompak  dan    berwarna    putih (5) .  Kalus yang    berwarna  putih    merupakan    jaringan embrionik  yang belum  mengandung  kloroplas, tetapi  memiliki    kandungan    butir    pati    yang tinggi.  Dengan,  penambahan    zat    pengatur tumbuh  terutama    sitokinin    dan    stimulus
cahaya  proplastid    yang    terdapat    dalam jaringan  parenkim    tersebut    berdiferensiasi menjadi  plastid  yang  mengandung  klorofil, sehingga  kalus    berubah    menjadi    berwarna
hijau.  Rasio  sitokinin  dan  auksin    menentukan morfogenesis  yang  terjadi  pada  kultur  kalus (6) . Kalus  yang  ditempatkan  pada    media    dengan rasio.
Tabel 1. Kalus  Cabe  Jawa  ( Piper  retrofractum Vahl)  Hasil  Kultur  Jaringan.Dengan  Perbandingan  Zat Pengatur Tumbuh.
ZPT Perubahan Eksplan Cabe Jawa Kontrol (tanpa ZPT) Minggu ke 1 Minggu ke 2 Minggu ke 3 Minggu ke 4 2,4-D (0.5ppm) Minggu ke 1 Minggu ke 2 Minggu ke 3 Minggu ke 4
Kinetin (0.5 ppm)
Minggu ke 1 Minggu ke 2 Minggu ke 3 Minggu ke 4 2,4-D:BAP (0.5ppm:0.5 ppm) Minggu ke 1 Minggu ke 3 Minggu ke 7 Minggu ke 9
Sitokinin    lebih  tinggi    daripada    auksin biasanya menghasilkan banyak tunas dan sedikit akar sedangkan  kalus  yang  ditempatkan  pada media (7) Sedangkan pada konsentrasi ZPT 2,4-D (0,5ppm)  dan  Kinetin  (0,5ppm)  tidak  muncul kalus.  Kalus    yang    tidak    muncul    ini dimungkinkan    karena    auksin    endogen  pada eksplan   cabe jawa    belum  mampu  menginduksi kalus,  dengan  kata  lain  eksplan    mempunyai kandungan    auksin    yang  rendah,    sehingga masih membutuhkan  tambahan  auksin  eksogen pada    media    kultur  dan  auksin  eksogen  yang ditambahkan  belum  bisa  menumbuhkan  kalus. Hal  ini  yang  terjadi  pada  eksplan  yang ditambahkan ZPT auksin 2,4-D (0.5ppm).
Setelah muncul kalus pada eksplan cabe jawa kemudian  dilakukan  ekstraksi  untuk  dianalisis
senyawa-senyawa  yang  terkandung  dalam  kalus cabe  jawa  secara  kualitatif  dengan  metode kromatografi  lapis  tipis.  Tak  hanya  kalus, eksplan  cabe  jawa  yang  menggulung  pun dianalisis  metabolit  sekundernya.  Ekstraksi dilakukan  dengan  cara  bertingkat,  dimana  kalus dan  eksplan  cabe  jawa  yang  menggulung diekstraksi,  metode  ekstraksi  yang  digunakan yaitu  maserasi  menggunakan  pelarut  bertingkat yaitu  n-heksan  untuk  menarik  senyawa  yang bersifat  non  polar,  etil  asetat  untuk  menarik senyawa  yang  lebih  bersifat  semi  polar  dan etanol  untuk  menarik  senyawa  yang  lebih bersifat  polar.  Setelah  itu  dianalisis  dengan kromatografi lapis tipis.
(a) (b) (c) (d) (e) (f)
Gambar 1. Profil  kromatogram  kalus  cabe  jawa,  fase  diam  KLT  GF254,  fase  gerak  toluen:etil  asetat  (1:1), (a)  visual  (b)  UV  254  nm  (c)  UV  365  nm  (d)  penampak  bercak  Liebermann-Bourchard  (e) penampak bercak Sitroborat (f) penampak bercak H 2 SO 4 10% metanol
(a)
(b) (c)
(d)
(e) (f)
Gambar 2. Profil kromatogram  kalus cabe jawa,  fase diam KLT GF254, fase gerak etil asetat:n-heksan (7:3), (a)  visual  (b)  UV  254  nm  (c)  UV  365  nm  (d)  penampak  bercak  Liebermann-Bourchard  (e) penampak bercak Sitroborat (f) penampak bercak H 2 SO 4 10% metanol
Secara  visual  daun  cabe  jawa  hasil  kultur jaringan dengan fase gerak toluen:etil asetat (1:1) terdeteksi  adanya  bercak  berwarna  gelap  pada nomor  8,9,11  dengan  Rf  0.4.  Pada  UV  365  nm terdeteksi  adanya  bercak  biru  pada  nomor 7,8,10,11,13,14  dengan  Rf  0.4,  bercak  biru kehijauan  pada  nomor  7,8,10,11,  dengan  Rf 0.5, dengan  fase  gerak  etil  asetat  :  n-heksam  (7:3) menunjukkan bercak hitam dibawah UV 254 nm pada  nomor  8,10,11  dengan  Rf  0.5.Terdapat bercak  berfluoresensi  biru  dibawah  UV  365  nm pada  nomor  8,11,13,14  dengan  Rf  0.5.  Terdapat bercak  kuning  berfluoresensi  pada  nomor 8,10,13,14  dengan  Rf  0.6.  Terdapat  bercak  biru berfluoresensi  pada  nomor  8,10,11  dengan  Rf 0.64.
Setelah  ekstrak  cabe  jawa  di  KLT  dengan perbandingan  fase  gerak  etil  asetat  :  n-heksan (7:3)  dan  etil  asetat  :  toluen  (1:1),  dilakukan pengamatan  adanya  senyawa  organik  pada
ekstrak  cabe  jawa  dengan  penyemprotan  pada plat KLT menggunakan penampak bercak H 2 SO 4 10%  dalam  metanol  yang  kemudian  dilakukan pemanasan  pada  plat  KLT.  Adanya  senyawa organik ditandai dengan perubahan warna bercak pada plat KLT  setalah pemanasan. Secara visual pada  daun  cabe  jawa  tanpa  kultur  jaringan terdapat  perubahan  warna  dari  bercak  hijau menjadi berwarna coklat, pada kalus dan eksplan cabe  jawa  kultur  jaringan  juga  terdeteksi  secara visual  namun  karena  konsentrasi  ekstrak  yang sedikit sehingga bercak yang timbul tidak begitu jelas,  bercak  hitam  pada  kalus  dan  eksplan  cabe jawa terdapat pada nomor  8 dengan Rf 0.5  dan 0.6.  terdapat  bercak  hitam    pada  nomor  13 dengan Rf 0.5 dan 0.6.
Dilakukan  analisis  dengan  penampak  bercak spesifik  diantaranya  Liebermann-Bouchard  dan Sitroborat.  Pada  plat  KLT  yang  disemprot penampak  bercak  Liebermann-Bouchard  terlihat
bercak  berwarna  hijau  dan  coklat  pada  ekstrak cabe  jawa  non  kultur,  ekstrak  etil  dan  n-heksan kalus  cabe  jawa,  dan  ekstrak  etanol  ekplan  cabe jawa dengan zpt kinetin 0.5ppm. ini menunjukkan  senyawa  golongan  triterpenoid, golongan  steroid  yang  ditandai  bercak  hijau, Kemungkinan  adanya  senyawa  flavonoid  pun pada semua esktrak kalus dan eksplan cabe jawa ditunjukkan  dengan  bercak  yang  memancarkan warna  lebih  terang  pada  UV  366  nm  setelah disemprot  penampak  bercak  sitroborat.seperti bercak  biru,  biru  kehijauan.  Pada  pengembang toluen : etil asetat (1:1) bercak biru lebih terang, bercak kuning lebih terang, dan bercak biru lebih terang    pada  pengembang  etil  asetat  :  n-heksan (7:3).
Ada  beberapa  tanaman  yang  mengandung senyawa  metabolit  sekunder  tertentu  yang  dapat ditingkatkan produksinya melalui kultur jaringan, tetapi  pada  beberapa  tanaman  yang  lain,  kultur jaringan  justru  tidak  berhasil  meningkatkan kandungan  metabolit  tanaman (8) .  Ekspresi metabolit sekunder pada tanaman yang dikulturkan  selain  tergantung  dari  jenis  eksplan yang  dipakai  juga  terkait  dengan  jenis  dan konsentrasi  dari  zat  pengatur  tumbuh  yang ditambahkan  dalam  media.  Pemberian  zat pengatur  tumbuh  pula  dapat  mempengaruhi produksi  metabolit  sekunder,  hal  ini  disebabkan zat  pengatur  tumbuh  yang  ditambahkan  dapat menyebabkan  perubahan  fisiologi  dan  biokimia tumbuhan  melalui  pengaturan  kerja  enzim.  ZPT akan menginduksi sintesis enzim yang ekspresinya tergantung sintesis RNA dan protein. Peningkatan  jumlah  enzim  yang  terlibat  dalam metabolit  sekunder  juga  akan  meningkatkan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Daun  cabe  jawa  ( Piper  retrofractum Vahl) dapat menghasilkan kalus pada perbandingan Zat Pengatur  Tumbuh  (ZPT)  2,4-D  :  BAP  0.5ppm  : 0.5ppm dan menghasilkan respon perkembangan eksplan lebih cepat pada ZPT 2,4-D 0.5ppm dan Kinetin  0.5ppm.  Terdapat  perbedaan  pola Kromatografi  Lapis  Tipis  antara  eksplan  cabe jawa  dan  daun  cabe  jawa  tanpa  kultur  jaringan menggunakan pengembang n-heksan : etil asetat
(3:7)  dan  toluene  :  etil  asetat  (1:1).  Hasil  KLT dari ekstrak kalus cabe jawa dan ekstrak eksplan cabe  jawa  dengan  teknik  kultur  jaringan kemungkinan  mengandung  senyawa  steroid, triterpenoid  dan  flavonoid. Perlu  dilakukan analisis dan isolasi lebih lanjut untuk mengetahui kadar  senyawa  metabolit  sekunder  dan  struktur senyawa yang terkandung pada kalus cabe jawa.

## DAFTAR PUSTAKA
Badan POM RI.. Acuan Sediaan Herbal . Jakarta.
2010; 5: 10.
Cronquist,  Arthur.  An  Integrated  System  Of Classification  Of  Flowering  Plants.  The  New York  Botanical  Garden.  United  States  of America:  Columbia  University  Press;  1981. Hal. 87-89.
Fransworth,  N.R.  Biological  and  Phytochemical Screening of Plants, J. Pharm.Sci.
Washington  D.C  :  American  Pharmaceutical Association. 1966; 55(3): 243-269.
Gunawan,  L.  W.  Teknik  Kultur  Jaringan Tumbuhan . Bogor  :  Laboratorium  Kultur Jaringan  Tanaman.PAU  Bioteknologi  IPB. 1992.
Hendaryono,  Sriyanti  P  Daisy.,  Ari  Wijayani. Teknik  Kultur  Jaringan;    Pengenalan  dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern.    Yogyakarta:  Kanisius; 1994.
Hutapea,  Johnny,  Ria,  Dr.,  dkk.  Inventaris Tanaman  Obat  Indonesia  III . Jakarta:  Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan;1994.
Kieber,    Joseph    J.  The    Arabidopsis    Book:
Cytokinins.  American  Society  of    Plant Biologists.  University    of    North  Carolina, Biology Department : Carolina. 2002.
Tsuro, M et al. Comparative  Effect of Different Types    of    Cytokinin    for  Shoot    Formation and    Plant  Regeneration    in    Leaf-derived Callus  of    lavender.    (Lavandula    vera    DC). Laboratory    of    Plant    Breeding    Science, Faculty  of  Agriculture,  Kyoto  Prefectural University. Japan. 1998.  606-8522.