## Pengaruh Pemberian Fenitoin Oral dan Vitamin C Oral terhadap Jumlah Kolagen dan Diameter pada Fistula Enterokutan Tikus Wistar
1 2,3 2

## Gede Pambudi Utomo , Ignatius Riwanto , Trilaksana Nugroho
Latar belakang : Enterocutaneous fistula (ECF) adalah salah satu tantangan bagi banyak ahli  bedah  di  dunia.  Meskipun  terdapat  perkembangan  dalam  perawatan  medis  dan tekhnik operasi, namun morbiditas dan mortalitas terkait ECF masih tinggi. Keberhasilan dalam  tatalaksana  ECF  memerlukan  perawatan  yang  komprehensif  dan  sumber  daya yang mahal, dimana tidak terjangkau oleh sebagian masyarakat Indonesia. Fenitoin dan Vitamin  C  adalah  obat  yang  murah  dan  telah  menunjukan  manfaat  baik  dalam penyembuhan  luka. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  apakah  pemberian fenitoin dan vitamin C akan meningkatkan kolagenisasi dan menurunkan diameter ECF pada tikus wistar. Kemudian untuk mengevaluasi apakah pemberian kombinasi fenitoin dan  vitamin  C  memberikan  hasil  yang  lebih  baik  dibandingkan  pemberian  tunggal fenitoin atau fitamin C.
Metode : Peneliti membuat caecostoma sebagai model ECF pada 24 ekor tikus. Tikus kemudian  dibagi  menjadi  empat  kelompok  perlakuan  dengan  :  perawatan  NaCl, Kombinasi  fenitoin-vitamin  C,  Fenitoin  saja  dan  Vitamin  C  saja.  Pengamatan  hasil dilakukan pada hari ke-7 dengan mengamati deposisi kolagen dan mengukur diameter ECF.
Hasil  : Penelitian ini menunjukan perbedaan kolagenisasi dan penurunan diameter ECF bermakna  secara  statistik  ( p <0,05)  pada  tiap  kelompok  perlakuan  jika  dibandingkan kelompok  kontrol  (5,521  ±  2,552  %;  9,395  ±  0,582  mm).  Penelitian  ini  juga mengungkapkan bahwa pemberian kombinasi fenitoin dengan vitamin C (28,110 ± 6,535 %; 5,742 ± 0,394 mm) memberikan hasil yang lebih baik ( p <0,05) dibanding pemberian tunggal fenitoin (15,448 ± 5,184 %; 8,101 ± 0,822 mm) atau vitamin C (19,118 ± 4,190 %; 6,883 ± 0,744 mm).
Simpulan : Kami menyimpulkan baik fenitoin maupun vitamin C memiliki efek baik dalam penyembuhan  ECF.  Pemberian  kombinasi  Fenitoin  dan  vitamin  C  terbukti  lebih bermanfaat dibandingkan pemberian tunggal.
Kata kunci : Enterocutaneous fistula , Fenitoin, Vitamin C, kolagen, Diameter fistula
1 Program Studi Ilmu Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang, Indonesia
2 Sub Bagian Bedah Digestive Rumah Sakit Umum Pusat Dokter Kariadi/ Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang, Indonesia
3 Program Studi Ilmu Biomedis Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro/ Rumah Sakit Umum Pusat Dokter Kariadi Semarang, Indonesia
Abstrak
Original Article Med Hosp 2022; vol 9 (3) : 256–265 p-ISSN: 2301-4369 e-ISSN: 2685-7898 https://doi.org/10.36408/mhjcm.v9i3.766
Diajukan: 04 Juli 2022 Diterima: 10 Agustus 2022
Afiliasi Penulis: Program Studi Ilmu Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang, Indonesia
Korespondensi Penulis: Gede Pambudi Utomo Jalan Dr. Sutomo 16, Semarang Jawa Tengah 50244, Indonesia
E-mail: gedepambudi@rocketmail.com
Background  : Enterocutaneous  fistule  (ECF)  is  one  of  the  most  challanging  problem  for  many  surgeon  accross  the  world.  Despite advancements in medical treatment and surgical technique, the morbidity and mortality ascociated with ECF remains high. Success in managing ECF need comprehensive treatment and expensive resources, that many people in Indonesia couldn't afford. Phenytoin and Vitamin C are medications which is not only cheap but also has been shown positive effect on wound healing. The aim of this study was to determine, whether phenytoin and vitamin C administration would increase collagen deposition and reduce the diameter of ECF in wistar rats. Furthermore to evaluate whether combining phenytoin with vitamin C would give better result in ECF healing compared to phenytoin or vitamin C alone.
Methods : We made caecostoma as the ECF model on 24 rats. The rats were divided into four groups: normal saline-treated, phenytoin- th
vitamin C combined, phenytoin only and vitamin C only group. The results were observed on day 7 , by assessing the collagen deposition and macroscopically by meassuring diameter of the fistule.
Results : This study showed significant ( p <0.05) increase in collagenation and reduction of ECF diameter in all treatment group compared to normal saline-treated group (5.521 ± 2.552 %; 9.395 ± 0.582 mm). This study also revealed that, combination of phenytoin-vitamin C (28.110 ± 6.535 %; 5.742 ± 0.394 mm) gave better result ( p <0.05) compared to phenytoin (15.448 ± 5.184 %; 8.101 ± 0.822 mm) or vitamin C (19.118 ± 4.190 %; 6.883 ± 0.744 mm) alone.
Conclusion : We conclude that both phenytoin and vitamin C show positive effect on ECF healing. The combination of phenytoin and vitamin C appears to be more benificial than single administration.
Keywords : Enterocutaneous fistule, Phenytoin, Vitamin C, Collagen, Fistule diameter

## Abstract

## Effect Phenytoin and Vitamin C Therapy to Collagen Deposition and Diameter of Enterocutaneous Fistula in Wistar Rat

## PENDAHULUAN
Fistula  enterokutan  atau Enterocutaneous  fistula (ECF) adalah  suatu  keadaan  adanya  hubungan  yang  tidak normal antara traktus gastrointestinal (GI) intraabdomen 1–3 dengan  kulit.   ECF  masih  menjadi  momok  yang 1,4 menakutkan bagi ahli bedah di dunia hingga saat ini. Hal ini karena sebanyak 75% dari semua kejadian ECF adalah  akibat  langsung  dari  operasi  laparoskopi  atau laparotomi  (iatrogenik),  Sedangkan  etiologi  ECF  dari proses  penyakit  seperti  radang  usus,  patologi divertikular,  trauma,  radiasi  dan  keganasan  hanya 2,3,5,6 berkisar 25% dari semua kejadian ECF. 90% pasien ECF  akan  mengalami  morbiditas  mulai  dari  eksoriasi kulit,  dehidrasi,  hingga  sepsis.  Mortalitas  yang disebabkan  oleh  ECF  berkisar  antara  5–20%  dan tergantung  pada  sejumlah  faktor  seperti  infeksi  dan 2,7 karakteristik  fistula.   Angka  kematian  untuk  sebagian besar  prosedur  bedah  elektif  kurang  dari  2%,  namun pada  pasien  dengan  ECF  angka  kematian  meningkat 6,7 hingga  berkisar  dari  6%  hingga  48%.   ECF  juga meningkatkan  beban  keuangan  dengan  menambah panjang  hari  rawat  rumah  sakit  dan  unit  perawatan
2, 8 intensif.
Tatalaksana  ECF  masih  menjadi  tantangan  bagi dunia kedokteran. Keberhasilan dalam manajemen ECF 1,6 membutuhkan  pendekatan  multidisiplin.   Dengan penanganan  yang  komprehensif,  disebutkan  bahwa tingkat  penutupan  spontan  ECF  dengan  manajemen konservatif adalah mulai dari 5–20%, sedangkan angka penutupan ECF dengan tindakan operatif berkisar antara
1,8 75–85%.  Terapi konservatif yang dilakukan antara lain, resusitasi  cairan,  kontrol  sepsis,  terapi  nutrisi  dan elektrolit,  kontrol output ,  serta  perawatan  luka  dan 1,2 kulit.
Metode  yang  perawatan  luka  yang  terbukti bermanfaat  dalam  mengurangi output ECF  dan meningkatkan  penutupan  spontan  ECF  adalah menggunakan negative pressure wound therapies (NPWT) 3,9 atau yang sering dikenal vacuum assisted closure (VAC). Penggunaan  VAC  selama  7  hari  telah  terbukti  efektif menurunkan output ECF  pada  98%  pada  pasien  yang diteliti. VAC juga terbukti melindungi kulit sekitar fistula agar  tidak  terjadi  kontak  dengan  effluent  sehingga
9 mencegah  terjadinya  maserasi  kulit.   Penelitian m e n u n j u k a n   b a h w a   p e n g g u n a a n   V A C   a k a n menurunkan produksi sitokin pro-inflamasi dan matrix metalloproteinase (MMPs)  yang  berperan  dalam 10–12 mendegradasi  kolagen. Namun,  penggunaan  VAC memerlukan  sumber  daya  yang  besar  sehingga aplikasinya  sulit  diterapkan  di  rumah  sakit  dengan fasilitas  yang  kurang  dan  perekonomian  masyarakat yang rendah.
Salah  satu  bahan  yang  banyak  diteliti  sebagai bahan  penyembuhan  luka  adalah  fenitoin.  Fenitoin (diphenylhydantoin)  mulai  diperkenalkan  pada  tahun 1937  sebagai  terapi  kejang  yang  terbukti  efektif  dan masih digunakan sampai saat ini. Efek stimulasi fenitoin terhadap  pertumbuhan  jaringan  ikat  pada  ginggiva menunjukkan  kemungkinan  untuk  digunakan  dalam 13,14 penyembuhan  luka. Beberapa  mekanisme  kerja fenitoin  yang  diketahui  dapat  mendukung  terjadinya
penyembuhan  luka  antara  lain  adalah  stimulasi proliferasi  dari  fibroblas,  meningkatkan  angiogenesis, meningkatkan  pembentukan  jaringan  granulasi, antagonis  glukokortikoid,  menurunkan  aktifitas kolagenase,  peningkatan  deposit  kolagen,  penurunan eksudat  pada  luka  serta  ditemukan  pula  adanya  efek 15–17 antibakteri. Jaber et  al mengamati  manfaat  fenitoin 16,18 intravena  dalam  mengobati  fistula  gastrointestinal. Penelitian  lain  menenujukan,  pemberian  fenitoin sistemik  pada  pasien  ECF  akan  menurunkan  aliran 19,20 efluen serta menurunkan ukuran fistula. Pada pasien dengan high  output ECF,  direkomendasikan  untuk mendapat  terapi  tambahan  zinc  dengan  dosis ditingkatkan  hingga  50%,  dan  vitamin  C  dengan  dosis ditingkatkan  hingga  5–10  kali  dosis  normal. Suplementasi  vitamin  C  pada  beberapa  penelitian 5,21,22 terbukti  mempercepat  proses  penyembuhan  luka. Valsangkar et al menyebutkan bahwa pada penelitiannya angka  kejadian  fistula  yang  terjadi  pada  populasi 23 kekurangan vitamin C adalah 60%.
Tujuan  akhir  keberhasilan  terapi  adalah penutupan  spontan  ECF.  Uraian  di  atas  telah menjelaskan bahwa vitamin C telah terbukti membantu penyembuhan ECF lewat perannya dalam pembentukan jaringan  fibrosa  dan  kolagen,  sedangkan  fenitoin  juga telah terbukti membantu percepatan penutupan fistula, melalui  perannya  sebagai  anti  kolagenase  yang mencegah  degradasi  fibroblast  maupun  kolagen. Kombinasi  vitamin  C  yang  merangsang  terbentuknya kolagen  dikombinasikan  dengan  fenitoin  sebagai  anti kolagenase,  diduga  akan  mempercepat  penyembuhan ECF dibandingkan dengan hanya pemberian vitamin C atau  fenitoin  saja.  Mekanisme  tersebut  menjadi  dasar bagi  peneliti  untuk  meneliti  kombinasi  pemakaian vitamin  C  dan  fenitoin  dibandingkan  hanya  vitamin  C atau fenitoin saja dengan mengamati diameter ECF dan jumlah kolagen sebagai marker kesembuhan ECF.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  eksperimental  ini  menggunakan  desain Randomized Controlled trial with post test only group design . Kelompok penelitian dibagi menjadi 4 yaitu kelompok, kelompok kontrol yang mendapat perawatan luka (kassa lembab–kering),  Perlakuan  1  yang  mendapatkan perawatan luka dan terapi kombinasi fenitoin-vitamin C oral, Perlakuan 2 yang mendapatkan perawatan luka dan terapi  fenitoin  oral,  Perlakuan  3  yang  mendapatkan perawatan  luka  dan  terapi  vitamin  C  oral.  Peneliti memberikan  perlakuan  secara  sonde  satu  kali  sehari dengan dosis fenitoin 0,01 mg/grBB dan dosis vitamin C 0,09 mg/grBB.
Penelitian  dilakukan  di  laboratorium  Biosience Universitas  Brawijaya  Malang,  menggunakan  24  ekor tikus  jantan  dari  galur  wistar.  Tikus  yang  digunakan berusia 8–10 minggu, dengan berat badan 150–200 gram
dan  tidak  memiliki  kelainan  anatomis.  Jika  selama perlakuan tikus tampak sakit (gerakan tidak aktif) atau mengalami penurunan berat badan > 10% atau tikus mati saat  penelitian  maka  akan  dieksklusi  dari  penelitian. Pembagian kelompok dilakukan secara random dengan pengambilan  undian,  dengan  pembagian  pada  tiap kelompok sebanyak 6 ekor sesuai ketentuan besar sampel menurut  WHO.  Selama  percobaan,  hewan  coba ditempatkan  pada  kandang  individual  dengan  siklus gelap–terang 12 jam dan diberi makanan dan minuman secara ad libitum . Sebelum perlakuan, Ijin etik hewan coba pada  penelitian  ini  telah  disetujui  komisi  etik.  Tikus menjalani  masa  aklimatisasi  selama  1  minggu.  Setelah aklimatisasi, tikus dilakukan prosedur pembuatan fistula 24 enterokutan dengan prosedur Bultmann et al , kemudian dilanjutkan perlakuan.
Pada hari ke-7, akan dilakukan terminasi hewan coba sekaligus pengambilan data. Pengukuran diameter fistula  dilakukan  pada  dua  titik,  di  tepi  batas  luka, selanjutnya  kedua  titik  difoto,  kemudian  pengukuran menggunakan software  ImageJ untuk  mendapatkan ukuran  yang  akurat.  Data  pengamatan  histopathologi jumlah  seluruh  tipe  kolagen  yang  didapatkan  dengan dengan  pewarnaan Sirius  red dengan Picrosirius  red kemudian  diukur  dengan  persentase  area  fraksi menggunakan aplikasi imageJ .
Setelah  data  terkumpul  dilakukan  data cleaning, coding dan tabulasi. Seluruh hasil dinilai dengan rerata ± standar deviasi. Setelah dilakukan uji normalitas (Saphiro Wilk) dan homogenitas (Lavene Static) , pengujian rerata pada  penelitian  ini  menggunakan  uji One  Way  Anova , dilanjutkan  dengan Post-Hoc  Test untuk  menilai perbedaan  antar  kelompok.  Hasil  dikatakan  bermakna apabila p > 0,05 dengan 95% interval kepercayaan tidak melewati angka 1. Analisa data dilakukan menggunakan SPSS versi 25 for Windows .

## HASIL

## Analisis Deskriptif Jumlah kolagen
Jumlah  kolagen  yang  terbentuk  pada  jaringan  fistula enterokutan diamati dengan dilakukan pengecatan sirius red .  Pengukuran  jumlah  kolagen  yang  terbentuk dilakukan  dengan  menilai  presentase  area  fraksi menggunakan  aplikasi imageJ .  Data  rata-rata  jumlah kolagen  pada  jaringan  fistula  enterokutan  pada  tiap kelompok dapat diamati pada Tabel 1.
Dari tabel 1, kita dapat mengamati rata-rata area fraksi  kolagen  terbanyak  adalah  pada  kelompok perlakuan  1  (P1)  yang  diberikan  terapi  kombinasi fenitoin  dan  vitamin  C  yaitu  sebesar  28,110  ±  6,535. Sedangkan rata-rata area fraksi kolagen yang paling kecil terdapat  pada  kelompok  kontrol  yang  mendapatkan perawatan  luka  dengan  kassa  lembab–kering  yaitu sebesar  5,521  ±  2,552.  Dari  hasil  uji  normalitas Shapiro–Wilk didapatkan  data  berdistribusi  normal
Pengaruh Pemberian Fenitoin Oral dan Vitamin C Oral terhadap Jumlah Kolagen dan Diameter pada Fistula Enterokutan Tikus Wistar
( p >0,05)  dan  dari  uji  homogenitas  data  diperoleh  nilai >0,05  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  data  yang diperoleh adalah homogen.

## Uji Statistik Jumlah Kolagen
Pemeriksaan  jumlah  kolagen  di  hari  ke-7  memberikan hasil  yang  berbeda  untuk  pada  tiap  kelompok.  Jumlah area fraksi kolagen terbesar terbanyak didapatkan pada kelompok  perlakuan  1  (P1)  yang  mendapatkan  terapi kombinasi  fenitoin  dan  vitamin  C  yaitu  sebesar  27,941 (20,426 – 37,062). Sedangkan jumlah area fraksi kolagen terkecil didapatkan pada kelompok kontrol yang hanya mendapatkan  perawatan  luka  dengan  kassa  lembab- kering dengan median sebesar 6,372 (1,376 – 8,037). Pada kelompok perlakuan 2 (P2) yang mendapat fenitoin oral
didapatkan  median  jumlah  area  fraksi  kolagen  adalah 16,947  (6,329  –  20,341),  sedangkan  jumlah  area  fraksi kolagen  untuk  kelompok  perlakuan  3  (P3)  yang mendapat terapi vitamin C adalah sebesar 18,763 (13,133 –   24,491).
Analisis statistik yang dilakukan dengan uji One Way Anova menunjukkan nilai signifikansi sebesar 0,0001 ( p <0,05)  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  rata-rata jumlah  kolagen  fistula  enterokutan  berbeda  secara signifikan. Analisis statistik dilanjutkan dengan uji Post Hoc untuk menguji beda antar kelompok.
Dari uji Post Hoc didapatkan perbandingan antara kelompok kontrol (K) dengan kelompok perlakuan (P1, P2,  P3)  berbeda  secara  signifikan  ( p <0,05).  Hasil  uji tersebut menunjukan peningkatan jumlah kolagen yang
Medica Hospitalia | Vol. 9, No. 3, November 2022
Kelompok

## TABEL 1
Analisis deskriptif, uji normalitas dan homogenitas jumlah kolagen
K (Kassa lembab – kering) Median (Min–Max) Homogenity test 5,521 ± 2,552 6,372 (1,376–8,037) Mean ± SD P (Shapiro–Wilk) 0,420* P1 (Fenitoin + Vitamin C) P2 (Fenitoin) P3 (Vitamin C)
28,110 ± 6,535
15,448 ± 5,184 19,118 ± 4,190 27,941 (20,426–37,062) 16,947 (6,329–20,341) 18,763 (13,133–24,491) 0,757* 0,334* 0,925* 0,128**
Keterangan: *Distribusi normal ( p > 0,05); ** Homogen ( p > 0,05)
Kassa lembab kering
Kelompok
Fenitoin dan Vitamin C Fenitoin Vitamin C ,000 Ju m la h K o la ge n 40,000 30,000 20,000 10,000
Gambar 1. Grafik boxplot dari jumlah kolagen fistula enterokutan dari tiap kelompok.
K: perawatan luka fistula dengan kassa lembab , P1: perawatan luka fistula dengan kombinasi fenitoin oral dan vitamin C oral, P2:  perawatan  luka  fistula  dengan  fenitoin  oral  (P2),  P3:  perawatan  luka  fistula  dengan  vitamin  C  oral  (P3).  Terdapat perbedaan  bermakna  secara  statistik  ( One  Way  ANOVA  P <0,05).  Serta  didapatkan  pula  perbedaan  bermakna  pada  tiap kelompok perlakuan jika dibandingkan kelompok kontrol; * signifikan P <0,05
lebih besar pada pemberian terapi fenitoin dan vitamin C baik  diberikan  secara  sendiri-sendiri  maupun  secara kombinasi dibandingkan dengan yang hanya diberikan perawatan luka dengan kassa lembab–kering.
Terdapat  perbedaan  jumlah  kolagen  pada kelompok  perlakuan  1  (P1)  dibandingkan  dengan kelompok perlakuan 2 (P2) dan berdasarkan uji post hoc didapatkan bahwa perbedaan tersebut bermakna secara statistik ( p <0,05). Hasil uji tersebut menunjukan bahwa kelompok  yang  mendapatkan  kombinasi  fenitoin  dan vitamin C mengalami peningkatan jumlah kolagen yang lebih  besar  dibandingkan  kelompok  yang  hanya mendapat fenitoin saja.
Sedangkan  perbandingan  jumlah  kolagen kelompok  P1  dengan  kelompok  P3,  didapatkan perbedaan  dengan  nilai  signifikansi  yang  bermakna ( p <0,05).  Hasil  perbandingan  tersebut  menunjukan bahwa pemberian terapi kombinasi fenitoin dan vitamin C meningkatkan jumlah kolagen yang lebih besar secara bermakna dibandingkan pemberian vitamin C saja.
Pengujian  dilanjutkan  dengan  membandingkan kelompok perlakuan P2 dibandingkan dengan kelompok perlakuan  P3.  Didapatkann  rata-rata  jumlah  kolagen pada  kelompok  P3  lebih  besar  dibandingkan  rata-rata jumlah kolagen pada kelompok P2. Namun dari hasil uji post hoc didapatkan perbedaan tersebut tidak bermakna secara  statistik  ( p >0,05),  menunjukan  bahwa  tidak terdapat  perbedaan  peningkatan  jumlah  kolagen  pada kelompok  yang  hanya  diberikan  fenitoin  saja dibandingkan kelompok yang mendapat vitamin C saja.

## Analisis Deskriptif Diameter Makroskopis Luka
Diameter makroskopis fistula enterokutan diukur setelah terminasi  dilakukan.  Diameter  fistula  enterokutan
diukur  menggunakan  program  komputer  ImageJ, kemudian data dari seluruh sampel dicatat dalam ukuran milimeter.  Data  rata-rata  diameter  fistula  enterokutan pada tiap kelompok dapat diamati pada Tabel 2.
Dari  tabel  2,  kita  dapat  mengamati  rata-rata diameter akhir terkecil adalah pada kelompok perlakuan 1  (P1)  yang  diberikan  terapi  kombinasi  fenitoin  dan vitamin  C  yaitu  sebesar  5,742  +  0,394.  Sedangkan  rata- rata  diameter  akhir  terbesar  terdapat  pada  kelompok kontrol yang mendapatkan perawatan luka dengan kassa lembab–kering yaitu sebesar 9,395 ± 0,582. Dari hasil uji normalitas Shapiro  Wilk didapatkan  data  berdistribusi normal ( p >0,05) dan dari uji homogenitas data diperoleh nilai > 0,05 sehingga dapat disimpulkan bahwa data yang diperoleh adalah homogen.

## Uji Statistik Diameter Akhir
Pemeriksaan  diameter  akhir  fistula  di  hari  ke-7 memberikan  hasil  yang  berbeda  untuk  pada  tiap kelompok.  Diameter  fistula  terkecil  didapatkan  pada kelompok  perlakuan  1  (P1)  yang  mendapatkan  terapi kombinasi fenitoin dan vitamin C dengan nilai median sebesar  5,742  mm  (5,201  –  6,388).  Sedangkan  median diameter  fistula  terbesar  didapatkan  pada  kelompok kontrol  yang  hanya  mendapatkan  perawatan  luka dengan  kassa  lembab–kering  yaitu  sebesar  9,541  mm (8.445  –  9,976).  Pada  kelompok  perlakuan  2  (P2)  yang mendapat  fenitoin  oral  didapatkan median diameter adalah  7,966  mm  (6,839  –  9,150),  sedangkan  untuk kelompok  perlakuan  3  (P3)  yang  mendapat  terapi vitamin C adalah sebesar 5,709 mm (5,824 – 7,809).
Analisis statistik yang dilakukan dengan uji One Way Anova menunjukkan nilai signifikansi sebesar 0,0001 ( p <0,05)  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  rata-rata
Pengaruh Pemberian Fenitoin Oral dan Vitamin C Oral terhadap Jumlah Kolagen dan Diameter pada Fistula Enterokutan Tikus Wistar
K P1 P2 P3
Gambar 2. Gambaran serat kolagen pada preparat histologi jaringan fistula enterocutan dengan pembesaran 100x.  Tampak kolagenisasi yang lebih meningkat pada kelompok yang mendapatkan kombinasi fenitoin dan vitamin C (P1) disusul kelompok yang mendapat vitamin C (P2) dan fenitoin (P3). Preparat histologi dibuat dengan pengecatan sirius red .
diameter  akhir  fistula  enterokutan  berbeda  secara signifikan. Analisis statistik dilanjutkan dengan uji Post Hoc untuk menguji beda antar kelompok.
Dari hasil uji Post Hoc didapatkan, perbandingan antara  kelompok  kontrol  (K)  dengan  kelompok perlakuan  (P1,  P2,  P3)  menunjukan  perbedaan  yang signifikan  ( p <0,05).  Hasil  uji  tersebut  menunjukan penurunan  diameter  yang  lebih  besar  pada  pemberian terapi  fenitoin  dan  vitamin  C  baik  diberikan  secara sendiri-sendiri  maupunn  kombinasi  dibandingkan dengan  yang  hanya  diberikan  perawatan  luka  dengan kassa lembab–kering.
Terdapat  perbedaan  diameter  akhir  pada kelompok perlakuan P1 dibandingkan dengan kelompok perlakuan  P2  dan  berdasarkan  uji post  hoc didapatkan
bahwa  perbedaan  tersebut  bermakna  secara  statistik ( p <0,05). Hasil uji tersebut menunjukan bahwa kelompok yang  mendapatkan  kombinasi  fenitoin  dan  vitamin  C mengalami  penurunan  diameter  yang  lebih  besar dibandingkan kelompok yang hanya mendapat fenitoin saja.
Sedangkan perbandingan kelompok perlakuan P1 dengan kelompok perlakuan P3, didapatkan perbedaan dengan nilai signifikansi yang bermakna ( p <0,05). Hasil perbandingan  tersebut  menunjukan  bahwa  pemberian terapi  kombinasi  fenitoin  dan  vitamin  C  menurunkan diameter  fistula  yang  lebih  besar  secara  bermakna dibandingkan pemberian vitamin C saja.
Pengujian  dilanjutkan  dengan  membandingkan kelompok perlakuan P2 dibandingkan dengan kelompok
Medica Hospitalia | Vol. 9, No. 3, November 2022
Kelompok TABEL 2
Analisis deskriptif diameter fistula K (Kassa lembab – kering) Median (Min–Max) Homogenity test* 9,395 ± 0,582 9,541 (8.445–9,976) Mean ± SD P (Shapiro–Wilk) 0,456* P1 (Fenitoin + Vitamin C) P2 (Fenitoin) P3 (Vitamin C)
5,742 ± 0,394
8,101 ± 0,822 6,883 ± 0,744 5,742 (5,201–6,388) 7,966 (6,839–9,150) 5,709 (5,824–7,809) 0,804* 0,708* 0,535* 0,410**
Keterangan : *Normal ( p > 0,05) **Homogen ( p > 0,05)
Kassa lembab kering
Kelompok
Fenitoin dan Vitamin C Fenitoin Vitamin C 5,000 D ia m et er F is tu la 10,000 9,000 8,000 6,000 7,000
Gambar 3. Grafik boxplot dari diameter akhir fistula enterokutan dari tiap kelompok. K: perawatan luka fistula dengan kassa lembab , P1: perawatan luka fistula dengan kombinasi fenitoin oral dan vitamin C oral, P2: perawatan luka fistula dengan fenitoin oral (P2), P3: perawatan luka fistula dengan vitamin C oral (P3). Terdapat perbedaan bermakna secara statistik ( One Way ANOVA P <0,05). Serta didapatkan pula perbedaan bermakna pada tiap kelompok perlakuan jika dibandingkan kelompok kontrol; * signifikan P <0,05
perlakuan  P3.  Dari  hasil  uji post  hoc didapatkan perbedaan  yang  signifikan  secara  statistik  ( p <0,05), menunjukan  bahwa  dimana  terapi  vitamin  C  lebih memperkecil diameter fistula daripada terapi fenitoin.

## DISKUSI
Pada  hari  ke-7  perlakuan  dilakukan  terminasi  hewan coba  sekaligus  pengambilan  data.  Pada  masa  ini  luka berada dalam fase proliferasi proses penyembuhan luka, sehingga  efek  peningkatan  jumlah  kolagen  dan  efek terhadap  penurunan  ukuran  fistula  dapat  diamati 26 dengan jelas.    Beberapa indikator yang dapat diamatai dari proses penyembuhan fistula adalah jumlah kolagen, jumlah  fibroblast,  angiogenesis,  jumlah  limfosit,  dan penurunan diameter fistula. Peneliti mengamati jumlah kolagen secara mikroskopis serta diameter fistula sebagai variabel  yang  secara  nyata  menggambarkan  proses penyembuhan fistula.

## Jumlah kolagen fistula enterocutan
Kolagen  merupakan  salah  satu  indikator  dalam  proses penyembuhan luka. Kolagen berperan pada semua fase penyembuhan luka. Pada fase hemostasis dan inflamasi, fibrillar  kolagen  berperan  penting  dalam  tahap  awal penyembuhan  luka  karena  dipercaya  sebagai  elemen kunci yang terlibat dalam peningkatan agregasi platelet 25 setelah cedera vaskular.  Pada fase proliferasi, kolagen berperan pada proses kontraksi luka yang dimulai segera setelah terjadi luka dan mencapai puncak pada 2 minggu 26 setelah  luka.   Pada  fase  Maturasi  dan  remodelling, terjadi  perubahan  komposisi  kolagen  dimana  kolagen tipe I yang lebih dominan pada fase awal terjadinya luka akan  digantikan  dengan  kolagen  tipe  III  hingga mendekati komposisi kolagen pada kulit sehat. Setelah beberapa  bulan  perubahan  dalam  komposisi  kolagen dalam  jaringan  yang  mengalami  penyembuhan  secara perlahan akan meningkatkan kekuatan jaringan hingga 27 maksimum sekitar 80% dari jaringan normal.
Dari  penelitian  ini,  dapat  diamati  peningkatan  jumlah kolagen  yang  signifikan  pada  seluruh  kelompok
perlakuan  P1,  P2  dan  P3  (kombinasi  fenitoin  dengan vitamin C, fenitoin saja dan vitamin C saja) dibandingkan dengan  kelompok  kontrol  K  yang  hanya  mendapat perawatan luka dengan kassa lembab–kering. Perbedaan ini menunjukan manfaat pemberian fenitoin dan vitamin C terhadap peningkatan jumlah kolagen, baik diberikan secara  kombinasi  maupun  secara  sendiri-sendiri. Temuan  ini  sejalan  dengan  penelitian  terdahulu mengenai  manfaat  fenitoin  dan  vitamin  C  terhadap peningkatan  kolagen.  Meena et  al pada  penelitiannya mengenai efek fenitoin pada luka bakar tikus putih juga menemukan bahwa terjadi peningkatan jumlah kolagen pada  kelompok  tikus  yang  diaplikasikan  fenitoin dibandingkan dengan kelompok kontrol yang mendapat
28 perawatan  dengan  normal  salin.   Penelitian  yang dilakukan  oleh  Kato et  al ,  didapatkan  peningkatan jumlah kolagen pada hipertrofi ginggiva pada manusia 29 yang  mendapatkan  terapi  fenitoin.   Penelitian  yang dilakukan oleh Mohammed et al pada luka full thickness tikus, menunjukan bahwa terdapat peningkatan jumlah kolagen  pada  tikus  yang  mendapat  vitamin  C dibandingkan  dengan  kelompok  yang  mengalami 21 defisiensi vitamin C. Hasil  uji Post  hoc antar  kelompok  perlakuan menunjukan  bahwa,  kelompok  perlakuan  P2  yang mendapat  terapi  kombinasi  fenitoin  dengan  vitaminC, mengalami peningkatan jumlah kolagen yang signifikan dibandingkan  kelompok  perlakuan  P2  dan  P3,  yang mendapat  terapi    fenitoin  saja  maupun  vitamin  C  saja. Hal  ini  menunjukan  bahwa  pemberian  kombinasi fenitoin  dan  vitamin  C  mampu  memberikan  efek akumulasi  jumlah  kolagen  secara  sinergis,  sehingga terjadi  peningkatan  kolagen  yang  bermakna  pada kelompok  kombinasi  fenitoin  dan  vitamin  C dibandingkan  pemberian  secara  sendiri-sendiri. Sebagian  besar  penelitian  tentang  pengaruh  vitamin  C terhadap  aktifitas  pembentukan  jaringan  ikat  telah dilakukan  dan  telah  menunjukkan  manfaat  vitamin  C
30 dalam sintesis, maturasi dan sekresi kolagen.    Vitamin C  bertindak  sebagai  kofaktor  pada  proses  sintesis kolagen. Pembentukan kolagen membutuhkan vitamin C
Pengaruh Pemberian Fenitoin Oral dan Vitamin C Oral terhadap Jumlah Kolagen dan Diameter pada Fistula Enterokutan Tikus Wistar
K P1 P2
P3
Gambar 4. Penampakan makroskopis fistula enterokutan setelah pemberian terapi. (K: Kelompok kontrol, P1: Kelompok yang diberikan fenitoin dan vitamin C, P2: Kelompok yang diberikan fenitoin saja, P3: Kelompok yang diberikan vitamin C saja)
untuk  hidroksilasi  prolin,  suatu  proses  yang memungkinkan molekul kolagen mencapai konfigurasi terbaik dan mencegah kolagen menjadi lemah dan rentan terhadap  kerusakan.  Vitamin  C  juga  meningkatkan mRNA  prokolagen  dan  diperlukan  untuk  mengekspor
31 molekul prokolagen keluar dari sel.  Sedangkan peran fenitoin  telah  diketahui  mampu  meningkatkan  jumlah kolagen  pada  luka  melalui  mekanisme  penurunan degradasi  kolagen.  Pada  jalur  degradasi  kolagen ekstraseluler, matrix  metalloproteinases (MMPs)  dan kolagenase bertanggung jawab untuk degradasi kolagen. Aktivitas  enzimatik  MMP  dikendalikan  oleh Tissue inhibitor matrix metalloproteinases (TIMP) yang fungsinya 32 untuk menghambat aksi MMPs.  Pada 2005, Kato et al menunjukkan  bahwa  ekspresi  gen  MMP-1,  2,  dan  3 menurun  jumlahnya  dengan  pemberian  fenitoin, sedangkan  TIMP  meningkat.  Kato et  al juga menyebutkan  bahwa  terjadi  penurunan  pembentukan 29 MMPs oleh makrofag dengan pemberian fenitoin.
Penelitian  ini  menunjukan  rata-rata  jumlah kolagen  pada  kelompok  perlakuan  P3  yang  mendapat terapi vitamin C, lebih meningkat dibandingkan rata-rata pada  kelompok  perlakuan  P3  yang  mendapat  terapi fenitoin.  Pengujian  secara  statistik  tidak  mendapatkan perbedaan  yang  bermakna  dari  kedua  kelompok tersebut.  Hal  tersebut  menunjukan  bahwa  fenitoin  dan vitamin  C  memiliki  manfaat  terhadap  peningkatan jumlah kolagen pada fistula enterokutan tikus wistar.
Peneliti  menggunakan  uji Intraclass  Correlation Coefficient (ICC)  untuk  mengetahui  kesepakatan (agreement) kolagenasi  pada  sampel  yang  diamati  oleh dua  ahli  patologi  anatomi.  Kami  mendapatkan kesepakatan (agreement) yang  sangat  baik  antara keduanya  (ICC  0.98  dengan Confidential  Interval  95% : 0,97–99).

## Ukuran Makroskopis Fistula Enterokutan
Salah  satu  indikator  dalam  proses  penyembuhan  luka 33 adalah  penurunan  diameter  luka.   Proses  penurunan diameter luka terjadi karena adanya kontraksi luka yang merupakan suatu proses dimana tepi luka dari semua sisi 26 tertarik  secara  sentripetal  pada  luka  yang  terbuka. Kontraksi  luka  merupakan  hasil  dari  kombinasi kekuatan traksi yang dihasilkan oleh migrasi fibroblast d a n   a k s i   f e n o t i p   f i b r o b l a s t   k h u s u s ,   y a i t u 34,35 myofibroblast.
Dari  penelitian  ini  tampak  perbedaan  diameter fistula  yang  signifikan  pada  seluruh  kelompok  yang mendapatkan  perlakuan  P1,  P2  dan  P3  (kombinasi fenitoin dengan vitamin C, fenitoin saja dan vitamin C saja)  dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol  K  yang hanya  mendapat  perawatan  luka  dengan  kassa lembab–kering.  Perbedaan  ini  menunjukan  manfaat pemberian  fenitoin  dan  vitamin  C  terhadap  proses penyembuhan  luka,  baik  diberikan  secara  kombinasi maupun  secara  sendiri-sendiri.  Temuan  mengenai
manfaat fenitoin ini serupa dengan hasil penelitian yang dilakukan  oleh  Usha et  al yang  menyebutkan  bahwa aplikasi fenitoin secara signifikan menurunkan area luka pada luka insisi tikus wistar dibandingkan dengan yang mendapat  perawatan  luka  dengan  kassa  lembab-
36 kering.  Manfaat fenitoin pada penyembuhan luka juga diamati oleh Meena et al , dimana   kelompok tikus putih yang  mendapat  terapi  fenitoin  terbukti  mengalami penurunan  area  luka  bakar  yang  signifikan dibandingkan  dengan  kelompok  yang  diberikan silversulfadiazin  dan  kelompok  yang  mendapat  terapi
28 dengan  normal  salin.   Penelitian  lain  yang  dilakukan oleh Hajong et al pada 100 orang pasien ulkus diabetes, menunjukan  bahwa  pemberian  fenitoin  mempercepat waktu yang dibutuhkan untuk terjadinya kontraksi luka 50%  dari  luka  awal  (13,42  hari)  dibandingkan  dengan pasien  yang  mendapatkan  perawatan  luka  dengan 14 normal  salin  (23,16  hari).   Penelitian  ini  juga menunjukan  manfaat  pemberian  vitamin  C  oral  yang secara  signifikan  menurunkan  diameter  fistula enterokutan  tikus  wistar  dibandingkan  dengan  yang hanya  dilakukan  perawatan  luka  dengan  kassa lembab–kering.  Hasil  temuan  tersebut  sejalan  dengan hasil penelitian Jagetia et al , yang menyebutkan bahwa pemberian  vitamin  C  mampu  meningkatkan  kontraksi
33 luka pada mencit yang terekspos radiasi sinar γ.  Bikker et  al melaporkan case  report mengenai  pasien  yang mengalami wound  dehiscence pasca  operasi laparatomy eksplorasi atas indikasi divertikulitis. Terjadi penurunan luas luka hingga sepertiga dari luas awal pada minggu ke 2  pemberian  vitamin  C,  dan  terjadi  penutupan  luka
37 secara spontan setelah 2,5 bulan pemberian vitamin C.
Hasil  uji Post  Hoc juga  menunjukan  bahwa kelompok P1 yang mendapat terapi kombinasi fenitoin dengan vitamin C mengalami penurunan diameter yang lebih besar daripada kelompok perlakuan lain, baik pada kelompok P2 maupun P3  yang hanya mendapat fenitoin saja maupun vitamin C saja. Hal ini menunjukan bahwa pemberian  kombinasi  fenitoin  dan  vitamin  C  mampu memberikan  efek  pengecilan  diameter  fistula enterokutan  secara  sinergis,  sehingga  diameter  fistula akhir  menjadi  lebih  kecil  dibandingkan  pemberian fenitoin dan vitamin C secara sendiri-sendiri. Pengecilan diameter luka adalah hasil dari terjadinya kontraksi luka, yang  merupakan  gabungan  dari  kekuatan  traksi  yang dihasilkan  oleh  migrasi  fibroblast  dan  aksi
34 myofibroblast.   Penelitian  terdahulu  menunjukan bahwa  fenitoin  memiliki  aksi  stimulasi  pada  fibroblast dan  akumulasi  kolagen  yang  merupakan  komponen
19 penting  dalam  kontraksi  luka,   sedangkan  vitamin  C bertindak sebagai kofaktor pada proses sintesis kolagen. Tanpa  kadar  vitamin  C  yang  cukup,  pembentukan
31 kolagen  akan  terganggu.   Myofibroblast  dan  kolagen berperan  penting  pada  proses  kontraksi  luka, pseudopodia  pada  myofibroblast  dapat  meluas  dan mengikat fibronektin ekstraseluler atau menempel pada
Medica Hospitalia | Vol. 9, No. 3, November 2022
serat  kolagen  dan  menarik  serat  kolagen  dengan 26 demikian menghasilkan kontraksi luka.  Penelitian yang dilakukan  Russel et  al memberikan  hasil  yang  menarik dimana pada hipertrofi ginggiva yang terinduksi fentoin ditemukan  peningkatan  jumlah  myofibroblast  dan
38 kolagen.   Kedua  komponen  tersebut  merupakan komponen  penting  dalam  proses  kontraksi  luka  yang
19 mengakibatkan pengecilan diameter luka.
Diameter  fistula  kelompok  P3  (vitamin  C) menunjukan pengecilan diameter fistula yang signifikan jika  dibandingkan  dengan  kelompok  P2  (fenitoin). Temuan ini menunjukan manfaat vitamin C lebih unggul dalam  memperkecil  diameter  fistula  dibandingkan manfaat  pemberian  fenitoin.  Kemampuan  vitamin  C dalam menurunkan diameter luka diperkirakan karena kemampuannya  dalam  meningkatkan  akumulasi kolagen, meningkatkan jumlah fibroblast serta menekan 30,33 produksi mediator pro inflamasi.
Penelitian mengenai manfaat pemberian fenitoin dan  vitamin  C  masih  dapat  disempurnakan  pada penelitian-penelitian di masa depan. Pada penelitian ini proses penyembuhan fistula hanya diamati hingga hari ketujuh  perlakuan  dimana  fase  penyembuhan  luka masih berlangsung, di masa mendatang dapat dilakukan penelitian dengan masa pengamatan yang lebih panjang sehingga  dapat  mengamati  fase  penyembuuhan  luka hingga tuntas. Karena keterbatasan peneliti, pengamatan kolagen  pada  penelitian  ini  dengan  metode histopatologi.  Pada  penelitian  selanjutnya  dapat d i t i n g k a t k a n   d e n g a n   m e n g g u n a k a n   m e t o d e imunohistokimia.  Sehingga  pengamatan  dapat  lebih akurat  dan  dapat  dilakukan  pengamatan  terhadap petanda  proses  penyembuhan  luka  lain  seperti growth factor , makrofag, dan mediator-mediator lain.

## SIMPULAN
Pemberian suplemantasi vitamin C, fenitoin oral   secara sendiri  ataupun  kombinasi  meningkatkan  kolagen  dan memperkecil  diameter  fistula  enterokutan  tikus  wistar, dan pemberian kombinasi lebih baik dibanding tunggal.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Dodiyi-Manuel  A,  Wichendu  PN.  Current  concepts  in  the management of enterocutaneous fistula. International Surgery Journal. 2018;5(6):f81–5.
2. Dumas R, Moore S, Sims C. Enterocutaneous Fistula: Evidence- based Management. Clin Surg 2017; 2. 2017;1435.
3. Gribovskaja-Rupp  I,  Melton  GB.  Enterocutaneous  fistula: proven  strategies  and  updates.  Clinics  in  colon  and  rectal surgery. 2016;29(02):130–7.
4. Okoli C, Oparocha D, Onyemkpa J. Enterocutaneous Fistula: Aetiology  and  management  outcome  in  a  tertiary  center  in Nigeria. Afrimedic Journal. 2013;4(1):17–21.
5. Haack CI, Galloway JR, Srinivasan J. Enterocutaneous fistulas: a  look  at  causes  and  management.  Current  surgery  reports. 2014;2(10):71.
6. Weledji E. Perspectives on enterocutaneous fistula: A review article. Med Clin Rev. 2017;3:5.
7. Wercka J, Cagol PP, Melo ALP, Locks GdF, Franzon O, Kruel NF. Epidemiology and outcome of patients with postoperative abdominal fistula. Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões. 2016;43(2):117–23.
8. Heimroth  J,  Chen  E,  Sutton  E.  Management  Approaches  for Enterocutaneous  Fistulas.  The  American  Surgeon. 2018;84(3):326–33.
9. Wainstein DE, Fernandez E, Gonzalez D, Chara O, Berkowski D.  Treatment  of  high-output  enterocutaneous  fistulas  with  a vacuum-compaction  device.  A  ten-year  experience.  World journal of surgery. 2008;32(3):430–5.
10. Lambert K, Hayes P, McCarthy M. Vacuum assisted closure: a review  of  development  and  current  applications.  European j o u r n a l   o f   v a s c u l a r   a n d   e n d o v a s c u l a r   s u r g e r y . 2005;29(3):219–26.
11. Limengka  Y,  Jeo  WS.  Spontaneous  closure  of  multiple enterocutaneous  fistula  due  to  abdominal  tuberculosis  using negative  pressure  wound  therapy:  a  case  report.  Journal  of Surgical Case Reports. 2018;2018(1):rjy001.
12. Wang W, Pan Z, Hu X, Li Z, Zhao Y, Yu A. Vacuum‑ assisted closure  increases  ICAM‑ 1,  MIF,  VEGF  and  collagen  I expression  in  wound  therapy.  Experimental  and  therapeutic medicine. 2014;7(5):1221–6.
13. Sengupta M, Banerjee P, Paul S, Sengupta J, Ghosh M. Healing effect of phenytoin on excisional wound in experimental albino rats. Muller J Med Sci Res. 2015;6:27–30.
14. Hajong R, Naku N, Hajong D, Anand M, Lenish K, Singh NM. Effect  of  topical  phenytoin  on  wound  healing.  Group. 2016;1(50):17.36.
15. Hagh  LG,  Karimi  B,  Moghimipour  E,  Abdi  Z,  Abdolalian  F, Rohani A. Histological Evaluation of Wound Healing Effect of Topical  Phenytoin  on  Rat  Hard  Palate  Mucosa.  Journal  of Research in Medical and Dental Science. 2018;6(2):466–72.
16. Jaber  SA,  Fallatah  BM,  Tayara  B,  Yami  H,  Abdelmoeti  M. Intravenous  phenytoin:  potential  new  therapy  for gastrointestinal fistulae. J Surg. 2013;1(3):11–4.
17. Shakeri  F,  Tebyanian  H,  Karami  A,  Babavalian  H,  Tahmasbi MH.  Effect  of  topical  phenytoin  on  wound  healing.  Trauma Monthly. 2017;22(5).
18. Jaber  S,  Rihy  Z,  Joseph  R,  Al-Khayat  M.  Does  phenytoin improve the healing of gastrointestinal fistulas? Case reports in gastroenterology. 2011;5(1):52–5.
19. Firmino F, Almeida AMPd, Alves GdS, Grandeiro DdS, Penna LHG. Scientific production on the applicability of phenytoin in wound  healing.  Revista  da  Escola  de  Enfermagem  da  USP. 2014;48(1):162–9.
20. Turan  M,  Saraydin  SU,  Canbay  E,  Karadayi  K,  Bulut  E, Cetinkaya Ö, et al . Positive effects of phenytoin on experimental colonic  anastomoses.  International  journal  of  colorectal disease. 2004;19(3):250–7.
21. Mohammed BM, Fisher BJ, Kraskauskas D, Ward S, Wayne JS, Brophy DF, et al . Vitamin C promotes wound healing through novel  pleiotropic  mechanisms.  International  wound  journal. 2016;13(4):572–84.
22. Dudrick SJ, Maharaj AR, McKelvey AA. Artificial nutritional support in patients with gastrointestinal fistulas. World journal of surgery. 1999;23(6):570–6.
23. Valsangkar N, Schmidt H, Nancy Strange R, Wooden W, Ceppa st EP. Is scurvy a 21  century diagnosis? Implications on surgical patients. 2019.
24. Bültmann O, Philipp C, Ladeburg M, Berlien H-P. Creation of a caecostoma in mice as a model of an enterocutaneous fistula. Research in experimental medicine. 1998;198(4):215–28.
25. McPherson  JM,  Piez  KA.  Collagen  in  dermal  wound  repair.
The molecular and cellular biology of wound repair: Springer; 1988. p. 471–96.
26. Li  J,  Chen  J,  Kirsner  R.  Pathophysiology  of  acute  wound healing. Clinics in dermatology. 2007;25(1):9–18.
27. Schultz GS, Chin GA, Moldawer L, Diegelmann RF. Principles of  Wound  Healing.  Mechanisms  of  Vascular  Disease:  A Reference Book for Vascular Specialists [Internet]: University of Adelaide Press; 2011.
28. Meena K, Mohan A, Sharath B, Somayaji S, Bairy K. Effect of topical phenytoin on burn wound healing in rats. 2011.
29. Kato  T,  Okahashi  N,  Ohno  T,  Inaba  H,  Kawai  S,  Amano  A. Effect  of  phenytoin  on  collagen  accumulation  by  human gingival fibroblasts exposed to TNF–α in vitro. Oral diseases. 2006;12(2):156–62.
30. Ronchetti  IP,  Quaglino  D,  Bergamini  G.  Ascorbic  acid  and connective tissue.  Subcellular biochemistry: Springer; 1996. p. 249–64.
31. Sharma S, Poddar R, Sen P, Andrews J. Effect of vitamin C on collagen  biosynthesis  and  degree  of  birefringence  in polarization  sensitive  optical  coherence  tomography  (PS- OCT). African Journal of Biotechnology. 2008;7(12).
32. Corrêa JD, Queiroz-Junior CM, Costa JE, Teixeira AL, Silva TA. Phenytoin-induced  gingival  overgrowth:  a  review  of  the molecular,  immune,  and  inflammatory  features.  ISRN dentistry. 2011;2011.
33. Jagetia  G,  Rajanikant  G,  Baliga  M,  Rao  K,  Kumar  P. Augmentation of wound healing by ascorbic acid treatment in mice exposed to γ–radiation. International journal of radiation biology. 2004;80(5):347–54.
34. Theoret  C.  Physiology  of  wound  healing.  Equine  wound management. 2016:1–13.
35. Teller P, White TK. The physiology of wound healing: injury through  maturation.  Perioperative  Nursing  Clinics. 2011;6(2):159–70.
36. Usha  N,  Sirisha  G.  IJBCP  International  Journal  of  Basic  and Clinical  Pharmacology.  International  Journal  of  Basic  and Clinical Pharmacology. 2016;5(6):2684.
37. Bikker  A,  Wielders  J,  Van  Loo  R,  Loubert  M.  Ascorbic  acid deficiency  impairs  wound  healing  in  surgical  patients:  Four case  reports.  International  Journal  of  Surgery  Open. 2016;2:15–8.
38. Dill  RE,  Iacopino  AM.  Myofibroblasts  in  phenytoin–induced hyperplastic connective tissue in the rat and in human gingival overgrowth. Journal of periodontology. 1997;68(4):375–80.

## Medica Hospitalia | Vol. 9, No. 3, November 2022