## KARAKTERISASI NANO PARTIKEL GLUKOSAMIN DARI KITOSAN DENGAN MENGGUNAKAN ULTRASONIKATOR DAN METODE BALL MILLING
(Characterization of Glucosamine Nano Particles from Chitosan Using Ultrasonicators and Ball Milling Methods)
Bhatara Ayi Meata 1 , Ginanjar Pratama 1 , Rifki Prayoga Aditia 1 , Afifah Nurazizatul Hasanah 1 , Dini Surilayani 1 , Aris Munandar 1 , Sakinah Haryati 1 , Uju 2 , Wini Trilaksani 2
1 Program Studi Ilmu Perikanan, Fakultas Pertanian, Universitas Sultan Ageng Tirtayasa Jl. Tirtayasa, Sindangsari, Kecamatan Pabuaran, Serang, Banten 42163
2 Departemen Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor
Jl.  Jalan Agatis, Kampus IPB Dramaga Bogor, Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor, Jawa Barat 16680 Corresponding author, e-mail: bhatara354@untirta.ac.id
Diterima : 4 November 2021 / Disetujui : 17 November 2021

## ABSTRAK
Konsumsi  oral  glukosamin  hidroklorida  dapat  memperburuk  efek  samping  pada  tubuh manusia, sehingga perkembangan nanopartikel dari glukosamin hidroklorida diperlukan sebagai sediaan topikal dalam mengatasi penyakit osteoarthritis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan karakteristik nanopartikel dari glukosamin cangkang udang yang dibuat secara ultrasonik dan ball milling . Untuk produksi glukosamin dari cangkang udang  digunakan  metode  hidrolisis  asam  menggunakan  larutan  HCL  37%,  kemudian dicuci dengan larutan IPA sampai terbentuk bubuk glukosamin, kemudian dilakukan uji rendemen dan FTIR. Pembuatan nanopartikel glukosamin dengan metode ultrasonik yaitu glukosamin dengan campuran HCl 37% yang disonikasi dengan alat ultrasonikator, dan metode  lainnya  menggunakan  ball  mill  untuk  menggiling  glukosamin  secara  fisiuntuk mendapatkan serbuk glukosamin nanopartikel. Serbuk yang diperoleh dari kedua metode tersebut  kemudian  dikarakterisasi  menggunakan  scanning  electron  microscope  (SEM) untuk mengetahui kondisi morfologi padatan. Hasil uji glukosamin diperoleh rendemen 83,65%,  dan  pola  absorpsi  spektrum Fourier  transform  infrared (FTIR)  menunjukkan 99,82%  sehingga  memenuhi  baku  mutu  yang  membuktikan  hidrolisis  glukosamin berhasil. Karakterisasi serbuk yang diperoleh dengan SEM bertujuan untuk mengetahui karakteristik ukuran nanopartikel glukosamin yang diperoleh. Bubuk partikel nano yang dihasilkan  berwarna  kuning-putih.  Hasil  foto  SEM  menunjukkan  morfologi  partikel dengan  permukaan  yang  tidak  rata.  Hasil  pengujian Scanning  Electron  Microscope (SEM)  menunjukkan  ukuran  partikel  glukosamin  dengan  metode  ultrasonik  dan ball milling masing-masing adalah 83,56 nm dan 61,16 nm.
Kata Kunci : ball milling , kitosan, nano partikel glukosamin, ultrasonikasi, SEM

## ABSTRACT
Oral consumption of  glucosamine hydrochloride  can worsen side effects  in  the human body, so the development of nanoparticles from glucosamine hydrochloride is needed as a  topical  preparation  in  treating  osteoarthritis.  This  study  aims  to  determine  the differences in the characteristics of nanoparticles from shrimp shell glucosamine made ultrasonic and ball milling. For the production of glucosamine from shrimp shells, the acid hydrolysis method was used using 37% HCL solution, then washed with IPA solution until glucosamine powder was formed, then the yield and FTIR tests were carried out. Preparation  of  glucosamine  nanoparticles  using  the  ultrasonic  method,  namely glucosamine  with  a  37%  HCl  mixture  sonicated  using  an  ultrasonicator,  and  another method  using  a  ball  mill  to  fission  glucosamine  to  obtain  powdered  glucosamine nanoparticles. The powder obtained from the two methods was then characterized using a scanning electron microscope (SEM) to determine the morphological condition of the solid. The results of the glucosamine test obtained a yield of 83.65%, and the absorption pattern of the Fourier transform infrared (FTIR) spectrum showed 99.82% so that it met the quality standards proving that glucosamine hydrolysis was successful. The powder characterization  obtained  by  SEM  aims  to  determine  the  size  characteristics  of  the glucosamine  nanoparticles  obtained.  The  resulting  powder  nanoparticles  are  yellow- white.  The  SEM  photo  results  show  the  morphology  of  the  particles  with  an  uneven surface.  The  results  of  the  Scanning  Electron  Microscope  (SEM)  test  showed  that  the particle size of glucosamine by ultrasonic and ball milling methods were 83.56 nm and 61.16 nm, respectively.
Keywords: ball milling, chitosan, glucosamine nano particles, ultrasonication, SEM

## PENDAHULUAN
Penggunaan kitosan telah banyak digunakan di berbagai bidang misalnya sebagai bahan  pengawet  pada  produk  perikanan  (Tayel,  2016),  agen  antibakteri  (Mahae  et  al., 2011),  dan  sebagai  antiperadangan  (Oliveira  et  al.  1995).  Salah  satu  kegunaan  kitosan dari  kulit  udang  untuk  menghasilkan  produk  yang  bernilai  ekonomis  tinggi  adalah produksi glukosamin.
Glukosamin merupakan salah satu turunan dari kitosan yang termasuk dalam gula amino dan terdapat dalam tubuh manusia. Senyawa ini sangat penting dibutuhkan sebagai prekursor dalam biosintesis protein glikosilat dan lipid di dalam tubuh. Hasil biosintesis ini  memproduksi  cairan  sinovial  yang  dapat  digunakan  sebagai  pelumas  pada  tulang rawan (Huskisson 2008).
Glukosamin merupakan turunan dari kitosan yang dikategorikan dalam gula amino dan berada di dalam tubuh manusia. Sebagai prekursor glikosilasi dan biosintesis protein lipid secara in vivo, senyawa ini sangat penting. Hasil biosintesis ini menghasilkan cairan sinovial yang dapat digunakan sebagai pelumas tulang rawan (Huskisson 2008).
Kemampuan untuk mensintesis glukosamin pada tubuh akan mengalami penurunan seiring  dengan  bertambahnya  umur.  Perubahan  ini  dipengaruhi  oleh  penurunan kemampuan proteoglikan dalam memproduksi glukosamin sehingga akan menyebabkan terjadinya penyakit osteoartritis  (Santhosh  dan Mathew 2008). Permintaan  glukosamin terus  meningkat  diiringi  dengan  semakin  besarnya  jumlah  penderita  ostheoathritis.
Prevalensi osteoartritis di  Indonesia dilaporkan mencapai 5% pada usia kurang dari 40 tahun, 30% pada usia 40-60 tahun, dan 65% pada usia lebih dari 61 tahun (Pratiwi et al. 2015). Menurut GVR (2016) kebutuhan glukosamin di dunia pada tahun 2015 mencapai 290  873.3  ton  sehingga  kedepannya  produksi  glukosamin  akan  semakin  meningkat bersamaan dengan jumlah penderita osteoartritis di dunia yang semakin besar, sementara produksi glukosamin di Indonesia masih belum ada dan diimpor dari negara lain dengan harga yang tinggi.

## METODE PENELITIAN

## Bahan
Penelitian  ini  menggunakan  kitosan  cangkang  udang  (Penaeus  monodon) komersial dari Monodon Group, Bogor, Indonesia, sebagai bahan utama. Bahan lain yang digunakan  adalah  asam  klorida  (HCl)  teknis  37%,  isopropil  alkohol  (IPA)  teknis,  dan bahan kimia lainnya untuk analisis.

## Metode
Tahapan  penelitian  ini  yaitu  1)  Pembuatan  glukosamin  dari  kitosan  cangkang udang; 2) Ultrasonikasi dan hidrolisis kitosan cangkang udang; 3) Karakterisasi kitosan cangkang udang.

## Hidrolisis kitosan cangkang udang
Hidrolisis kitosan dilakukan menggunakan larutan HCl 37% (perbandingan kitosan dan larutan HCl 1:9 (b/v), suhu 60 °C selama 90 menit. Larutan glukosamin dipresipitasi dengan isopropil alkohol (IPA) hingga endapan terbentuk. Setelah itu larutan dipisahkan dari endapan dan dilakukan pencucian menggunakan larutan IPA. Proses pencucian ini dilakukan  berulang  kali  sampai  tercapai  pH  3-5.  Selanjutnya  glukosamin  dikeringkan menggunakan oven pada suhu 50 °C selama 24 jam, kemudian dihitung rendemennya dan di uji FTIR untuk melihat derajat deasetilasi kitosan.

## Pembuatan nano partikel glukosamin (Modifikasi Ajavakom, Supsvetson, Somboot, & Sukwattanasinitt, 2012)
Proses ini menggunakan dua metode yaitu sonikasi menggunakan ultrasonikator dan metode ball milling. Glukosamin sebanyak 10 g dan larutan HCl 37% (perbandingan glukosamin  dan  larutan  HCl  1:9  (b/v),  suhu  60  °C  (20  kHz)  dimasukkan  ke  dalam ultrasonikator  selama  30  menit  sedangkan  glukosamin  dengan  metode ball  milling dimasukkan ke dalam alat ball milling dengan kecepatan 900 rpm selama 1 jam.

## Karakterisasi Nano Glukosamin
Karakterisasi  nanopartikel  yang  dihasilkan  dari  kedua  metode  dianalisis  ukuran partikelnya menggunakan alat SEM ( Scanning Electron Microscopy ).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Nano  partikel  adalah  kumpulan  atom-atom  berbentuk  partikel  padat  yang berikatan satu sama lain dengan diameter struktur kurang dari 100 nm (Poole dan Owens 2003). Berdasarkan teori kinetik molekul menyatakan bahwa molekul dapat bertumbukan satu  dengan  lainnya  dengan  diberikan  energi  mekanik  secara  terus-menerus  sehingga ukuran partikel molekul akan tereduksi hingga ukuran nano (Castro dan Mitchell 2002). Nano  partikel  glukosamin  pada  penelitian  ini  dibuat  dengan  menggunakan  alat ball
milling dengan ukuran diameter bola rerata berukuran sekitar 10-100 nm dan kapasitas sesuai skala laboratorium yaitu 5 kg.
Nano  glukosamin  dapat  dibedakan  secara  visual  dengan  menggunakan  SEM. Prinsip kerja SEM adalah sifat gelombang dari elektron berupa difraksi pada sudut yang sangat kecil (Masotti et al. 2007). Glukosamin sebelum digiling dengan ball milling telah disonikasi pada tahap sebelumnya sehingga ukuran partikel yang terbentuk sudah dalam ukuran  nano.  Ukuran  partikel  glukosamin  sebelum  digiling  yaitu  67.03-105  nm, sedangkan setelah digiling ukuran glukosamin menjadi 53.78-71.69 nm. Menurut Li et al. (2008) perlakuan ultrasonikasi pada senyawa dapat memecahkan partikel-partikelnya hingga  ukuran  yang  sangat  kecil  atau  berukuran  nano.  Perlakuan  ultrasonikasi  saat pembuatan glukosamin sudah dapat membentuk ukuran nano partikel pada glukosamin akhir. Namun pada hasil SEM keduanya menunjukkan penggumpalan sehingga bentuk nano  glukosamin  masih  saling  menempel.  Hal  ini  dikarenakan  tidak  adanya  tambahan bahan  penyalut  lain  seperti  Tween  80,  ketoprofen,  dan  lainnya  untuk  menghindari terjadinya  aglomerasi  atau  penggumpalan  nano  glukosamin.  Aglomerasi  juga  dapat terjadi pada nano glukosamin akibat jangka waktu penyimpanan  yang cukup lama dan penyimpanan yang kurang baik sebelum dilakukan analisis ukuran partikel.
Metode  pembuatan  glukosamin  dengan  ultrasonikasi  juga  telah  mengecilkan ukuran  partikel  glukosamin  sehingga  pembentukan  nano  partikel  glukosamin menggunakan  ultrasonikasi  dan  diberikan  bahan  penyalut  akan  meningkatkan  kualitas dari  pembuatan  nano  partikel  glukosamin.  Nano  partikel  glukosamin  ini  dapat diaplikasikan dalam bentuk emulsi untuk membentuk nanoemulsi glukosamin sehingga dapat  diterapkan  pada  berbagai  bentuk  sediaan  topikal.  Ukuran  partikel  suatu  material dapat  dibuat  menjadi  nanoemulsi  untuk  sediaan  topikal  yaitu  pada  rentang  20-600  nm sehingga memungkinkan penghantaran bahan aktif yang efektif untuk kulit (Gupta et al. 2010). Menurut Nadia et al. (2014) nano kitosan yang dibuat menggunakan metode gelasi ionik  memiliki  rerata  ukuran  partikel  yang  terbentuk  yaitu  228,74  nm  sedangkan  pada penelitian Suptijah et al. (2011) nano kitosan  yang dibuat menggunakan metode gelasi ionik dan ultrasonik memiliki rerata ukuran partikel yaitu 400 nm dan 1375 nm secara berturut-turut. Kitosan yang dibuat dalam bentuk nano partikel memiliki bentuk polimer sehingga  glukosamin  hidroklorida  yang  memiliki  bentuk  monomer-monomer  akan berukuran lebih kecil dibandingkan dengan kitosan.
Gambar 1. Glukosamin Hidroklorida
Perlakuan dengan magnetic stirrer dihasilkan ukuran partikel terkecil dan lebih stabil yaitu sebesar 400 nm (H1) dan 450 nm (H2). Perlakuan ultrasonik dan homogenizer dihasilkan  ukuran  pertikel  yang  lebih  besar  dan  tidak  stabil,  yaitu  dengan  perlakuan
Glukosamin sebelum digiling Glukosamin setelah digiling
ultrasonik didapatkan ukuran partikel sebesar 1222 nm (H1) dan 1600 nm (H2). Perlakuan homogenizer menghasilkan  ukuran  partikel  sebesar  1375  nm  (H1)  dan  2000  nm  (H2). Penelitian  BPPT  (2010)  menunjukkan  partikel  terkecil  dan  stabil  didapatkan  dengan perlakuan magnetic  stirrer sebesar  25,9  nm  (H1)  dan  28  nm  (H2).  Partikel  yang  lebih besar serta tidak stabil diperoleh dengan perlakuan ultrasonik dan homogenizer sebesar 1,2 nm (H1) dan 25 nm (H2) (Gambar 3) Hasil karakterisasi SEM kitosan nanopartikel yang dibuat dengan berbagai metode yaitu magnetic stirrer, ultrasonik, dan homogenizer menunjukan partikel yang berupa bulatan menyerupai bola dan berkerut. Nano partikel yang dihasilkan melalui perlakuan magnetic stirrer rata-rata berukuran sekitar 400-450 nm. Nanopartikel adalah butiran atau partikel padat dengan kisaran ukuran 10-1000 nm (Mohanraj dan Chen, 2006). Teori kinetik molekul gas menyatakan bahwa molekul gas sering bertumbukan satu dengan lainnya dan molekul-molekul yang bereaksi. Laju reaksi akan berbanding lurus dengan banyaknya tumbukan molekul per detik, atau berbanding lurus  dengan  frekuensi  tumbukan  molekul.  Semakin  cepat  putaran,  memperbesar intensitas molekul pelarut untuk bersentuhan dengan kitosan, sehingga semakin besarnya intensitas kecepatan putaran pada magnetic stirrer partikel yang dihasilkan semakin kecil (Chang, 2005). Penambahan jumlah tripolifosfat akan menurunkan jumlah nanopartikel kitosan (Shu dan Zhu, 2002). Penambahan surfaktan berfungsi untuk menstabilkan emulsi partikel  dalam  larutan  dengan  cara  mencegah  timbulnya  penggumpalan  (aglomerasi) antarpartikel (Keuteur, 1996). Partikel-partikel kitosan di dalam larutan terselimuti dan terstabilkan satu dengan yang lain dengan adanya surfaktan, sehingga proses pemecahan partikel  akan  semakin  efektif.  Partikel  yang  telah  terpecah  akan  kembali  terstabilkan dalam emulsi larutannya, sehingga mencegah terjadinya aglomerasi (Xu dan Du, 2003). Nano  partikel  glukosamin  yang  dihasilkan  memberikan  bentuk  yang  halus  dan  tidak menggumpal, namun perlu dilakukan pengecekan terhadap struktur nano emulsi dengan menggunakan SEM ( Scanning Electron Microscopy ).
 Hasil SEM perbesaran 100x
Glukosamin sebelum digiling Glukosamin setelah digiling Glukosamin sebelum digiling Glukosamin setelah digiling
 Hasil SEM perbesaran 1000x
 Hasil SEM perbesaran 10000x
 Hasil SEM perbesaran 50000x

## Glukosamin setelah digiling
Nanopartikel glukosamin yang terbentuk memiliki ukuran sesuai dengan standar yang telah ditentukan oleh SNI yaitu 1-100 nm. Ukuran partikel yang sangat kecil tersebut dimanfaatkan  untuk  mendesain  dan  menyusun  atau  memanipulasi  material  sehingga dihasilkan  material  dengan  sifat  dan  fungsi  baru.  Ukuran  nanopartikel  dapat mempengaruhi bio-distribusi dan efisiensi konsumsi fitofarmaka pada level sel dengan mempengaruhi daya rekat (adhesi) dan interaksi dalam sel. Nanopartikel dengan ukuran 250  nm  hingga  3  m  secara  invitro  mampu  bekerja  optimal  pada  fagositosis,  namun ukuran nanopartikel <200 nm lebih disukai karena sifat rute input yang akan lebih banyak (Biswas et al. 2014).

## KESIMPULAN
Pembuatan nanopartikel glukosamin dengan metode ultrasonik yaitu glukosamin dengan  campuran  HCl  37%  yang  disonikasi  dengan  alat  ultrasonikator,  dan  metode lainnya  menggunakan  ball  mill  untuk  menggiling  glukosamin  secara  fisiuntuk mendapatkan serbuk glukosamin nanopartikel. Serbuk yang diperoleh dari kedua metode tersebut  kemudian  dikarakterisasi  menggunakan  scanning  electron  microscope  (SEM) untuk mengetahui kondisi morfologi padatan. Hasil uji glukosamin diperoleh rendemen 83,65%,  dan  pola  absorpsi  spektrum Fourier  transform  infrared (FTIR)  menunjukkan 99,82%  sehingga  memenuhi  baku  mutu  yang  membuktikan  hidrolisis  glukosamin berhasil.

## DAFTAR PUSTAKA
Ajavakom  A,  Supsvetson  S,  Somboot  A,  Sukwattanasinitt  M.  2012.  Products  from microwave  and  ultrasonic  wave  assisted  acid  hydrolysis  of  chitin.  Journal  of Carbohydrates Polymers. 90: 73-77.
Biswas,  A.  K.,  M.R.  Islam,  Z.S.  Choudhury,  A.  Mostafa,  and  M.F.  Kadir  (2014).
Nanotechnology  based  approaches  in  cancer  therapeutics.  Advances  in  Natural
Sciences:  Nanoscience  and  Nanotechnology,  5(4).  https://doi.org/10.1088/2043- 6262/5/4/043001.
[BPPT].  2010.  Pembuatan  Partikel  Nano  Kitosan  dengan  Metode  Gelasi  Ionik Menggunakan  Magnetic  Stirrer.  Tanggerang:  Balai  Pengkaji  dan  Penerapan Teknologi.
Castro  CL,  Mitchell  BS.  2002.  Synthesis,  Functionalization  and  Surface  Treatment  of Nanoparticles. California (US): American Scientific Publishers.
Chang R. 2005. Kimia Dasar: Konsep-Konsep Inti Jilid 2. Jakarta: Erlangga.
Chang  YF,  Sitanggang  AB,  Wu  HS.  2011.  Optimizing  biotechnological  production  of glucosamine  as  food  ingredient  from  Aspergillus  sp.  BCRC  31742.  Journal  Food and Technology. 9: 75-82.
Gupta  PK,  Gupta  S,  Pandit  JK,  Kumar  A,  Sawaroop  P.  2010.  Pharmaceutical nanotechnology  novel  nanoemulsion  high  energy  emulsification  preparation, evaluation and application. Pharma Research. 10(3): 117-138.
[GVR] Grand View Research. 2015. Glucosamine Market Analysis by Application and Segment Forecasts to 2022. California (US): Grand View Research.
Huskisson  EC.  2008.  Glucosamine  and  chondroitin  for  osteoarthritis.  Journal  of International Medical Research. 36: 1161-79.
Keuteur J. 1996. Nanoparticles and microparticles for drug and vaccine delivery. Europe Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 189: 19-34.
Kurniawan  R,  Kushadiwijayanto  AA,  Risko  R.  2019.  Pengaruh  Kelengkapan  Data Pasang Surut Laut Terhadap Kualitas Hasil T_Tide. Jurnal Laut Khatulistiwa , 2(3): 137–143.
Li J, Cai J, Fan L. 2008. Effect of sonolysis on kinetics and physicochemical properties of treated chitosan. Journal of Applied Polymer Science. 109: 2417-2425.
Mahae  N,  Chalat  C,  Muhamud  P.  2011.  Antioxidant  and  antimicrobial  properties  of chitosan-sugar complex. Journal International Food Research. 18: 1543- 1551.
Masotti  A, Marino F, Ortaggi  G, Palocci  C. 2007. Fluorescence and scanning electron microscopy  of  chitosan/DNA  nanoparticles  for  biological  applications.  Journal Nanomedicine. 1(4):507-522.
Mohanraj  V.J.,  and  Chen  Y.  2006.  Nanoparticles  :  A  Review.  Tropical  Journal  of Pharmaceutical Research, 5 :1.
Nadia LMH, Suptijah P, Ibrahim B. 2014. Produksi dan karakterisasi nano kitosan dari cangkang  udang  windu  dengan  metode  gelasi  ionik.  Jurnal  Pengolahan  Hasil Perikanan Indonesia. 17(2): 119-126.
Oliveira  SA,  Felson  DT,  Reed  JI,  Cirillo  PA,  Walker  AM.  1995.  Incidence  of symptomatic  hand,  hip  and  knee  osteoarthritis  among  patients  in  a  health maintenance organisation. Journal Arthritis Rheumatology. 38: 1134-1141.
Poole  CP,  Owens  FJ.  2003.  Introduction  to  Nanotechnology.  New  Jersey  (US):  John Wiley and Sons.
Pratiwi RS, Susanto TE, Wardani YAK, Sutrisno A. 2015. Enzim kitinase dan aplikasi di bidang industri:  kajian pustaka. Jurnal  Pangan dan Agroindustri FTP UB. 3:  878- 887.
Shantosh  S,  Mathew  PT.  2008.  Preparation  of  glucosamine  and  carboxymethylchitin from shrimp shell. Journal of Applied Polymer Science 107: 280-285.
Shu,  X.Z.,  Zhu,  K.J.  2002.  Controlled  drug  release  properties  of  ionically  crosslinked chitosan  beads:  the  influence  of  anion  structure.  International  Journal  of Pharmaceutics. 233(1-2): 217-225.
Suptijah P, Jacoeb MA, Rachmania D. 2011. Karakterisasi nano kitosan cangkang udang vannamei (Litopenaeus vannamei) dengan metode gelasi ionik. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia. 17(2): 78-84.
Tayel  A.  Microbial  chitosan  as  a  biopreservative  for  fish  sausage.  2016.  International Journal of Biological Macromolecules. 93: 41-46.
Xu Y, Du Y. 2003. Effect of moleculer structure of chitosan on protein delivery properties of chitosan nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics 250(4):215-226.