BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 5, Nomor 4 (2023): 199-206 E-ISSN: 2714-8564

## Pengaruh pH dan Waktu Inkubasi Terhadap Pertumbuhan dan Produksi Metabolit Sekunder Miselium Lentinula edodes
Aurora Pradipta Amelia, Nuraeni Ekowati * , Nunek Ina Ratnaningtyas
Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, Jl. dr. Suparno 63 Purwokerto 53122 *Correspondent email : nuraeniekowati29@gmail.com
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  : 22/11/2022
Disetujui  : 02/12/2023

## Abstract
Shiitake mushroom ( Lentinula edodes ) is one of the edible mushrooms that produces secondary metabolites  with  potential  as  a  medicinal  compound.  Fungal  secondary  metabolites  can  be obtained by extraction from the fruiting body, mycelium, and the culture filtrate. The growth and production of fungal secondary metabolites can be influenced by external factors such as pH and incubation time. The purpose of this study is to determine the optimum pH of the medium and incubation time for the mycelium growth and to determine the secondary metabolites produced by L.  edodes .  The  study  was  conducted  experimentally  by  factorial  CRD  with  two  factors, namely the pH value (pH 3, 4, 5, and 6) and incubation time (15, 20, 25, and 30 days). So that there were 16 treatment combinations which were repeated 3 times. The independent variables of this study were pH and incubation time, and the dependent variable was mycelium growth and secondary metabolites produced. The main parameters of this study were the mycelium dry weight and the secondary metabolites produced, as well as the supporting parameters in the form of final pH of the growth medium. The results showed that pH of the medium and incubation time could increase the growth of L. edodes mycelium, but no interaction was found between them. The optimal pH value for the growth of L. edodes mycelium is in the pH range of 5-6 and the  optimal  incubation  time  is  in  the  range  of  20-30  days.  Based  on  the  Thin  Layer Chromatography test, mycelium and culture filtrate of L. edodes are known to contain secondary metabolites in the form of alkaloids, flavonoids, and terpenoids. Key Words: incubation time; Lentinula edodes ; pH value; secondary metabolites.
Abstrak Jamur shiitake ( Lentinula edodes ) merupakan salah satu jenis jamur pangan yang menghasilkan metabolit sekunder dengan potensi sebagai bahan obat. Metabolit sekunder jamur dapat diperoleh dengan  cara  ekstraksi  dari  tubuh  buah,  miselium,  maupun  filtrat  kulturnya.  Pertumbuhan  dan produksi metabolit sekunder jamur dapat dipengaruhi oleh faktor-faktor eksternal seperti pH dan waktu inkubasi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui nilai pH dan waktu inkubasi yang optimal bagi pertumbuhan miselium jamur L. edodes serta golongan metabolit sekunder yang dihasilkan.  Penelitian  dilakukan  secara  eksperimental  RAL  Faktorial  dengan  dua  faktor,  yaitu faktor pH (pH 3, 4, 5, dan 6) dan waktu inkubasi (15, 20, 25, dan 30 hari) sehingga terdapat 16 kombinasi perlakuan yang diulang sebanyak 3 kali. Variabel bebas penelitian berupa pH dan waktu inkubasi,  serta  variabel  terikat  berupa  pertumbuhan  miselium  dan  golongan  metabolit  sekunder yang  dihasilkan.  Parameter  utama  penelitian  ini  adalah  bobot  kering  miselium  dan  golongan metabolit  sekunder  yang  dihasilkan,  serta  parameter  pendukung  berupa  pH  akhir  medium pertumbuhan. Data bobot kering miselium dianalisis menggunakan ANOVA dan uji lanjut DMRT pada  tingkat ketelitian 95%,  sedangkan data  identifikasi golongan  metabolit  sekunder  dianalisis secara  deskriptif.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pH  medium  dan  waktu  inkubasi  dapat memengaruhi  peningkatan  pertumbuhan  miselium  jamur L.  edodes ,  namun  tidak  ditemukan interaksi antara keduanya. Nilai pH yang optimal untuk pertumbuhan miselium L. edodes berada pada  kisaran  pH  5-6  dan  waktu  inkubasi  yang  optimal  berada pada  kisaran  waktu  20-30  hari. Berdasarkan uji Kromatografi Lapis Tipis, miselium dan filtrat kultur jamur L. edodes diketahui mengandung senyawa metabolit sekunder dari golongan alkaloid, terpenoid, dan flavonoid. Kata kunci: Lentinula edodes , metabolit sekunder, pH, waktu inkubasi.

## PENDAHULUAN
Jamur  merupakan  salah  satu  kelompok organisme  penghasil  metabolit  bioaktif  yang  sangat beragam  dan  potensial  dalam  manfaatnya  untuk kesehatan.  Pengembangan  potensi  jamur  sebagai sumber bahan obat saat ini tengah menjadi perhatian para  peneliti,  terutama  jamur-jamur  dari  filum Basidiomycota  yang  diketahui  merupakan produsen molekul  bioaktif  dan  enzim  berharga  berupa metabolit primer maupun metabolit sekunder. Salah
satu  jamur  Basidiomycota  yang  memiliki  nilai penting karena manfaatnya sebagai jamur pangan dan obat adalah jamur shiitake ( Lentinula edodes ). Jamur ini  menempati  urutan  ke dua setelah  jamur  kancing ( Agaricus bisporus ) sebagai jamur pangan terpenting di  dunia  karena  memiliki  senyawa  bioaktif  yang berfungsi  sebagai  obat  dan  bahan nutraceutical , sehingga komoditasnya telah banyak dikembangkan di  negara-negara  maju  seperti  Cina  dan  Jepang (Tjokrokusumo, 2015).
Pemanfaatan  jamur  sebagai  salah  satu  sumber komponen bioaktif berkhasiat obat perlu diteliti lebih lanjut,  karena  informasi  ini  masih  sangat  minim diketahui  di  Indonesia  jika  dibandingkan  dengan pemanfaatan tumbuhan yang juga merupakan sumber komponen bioaktif. Menurut Newman et al. (2012), pada  rentang  tahun  1981-2010  metabolit  sekunder yang  diekstrak  dari  bahan  alam  telah  berkontribusi sebanyak lebih dari 50% terhadap penyediaan bahan obat.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  informasi mengenai  metabolit  sekunder  yang  dikandung  oleh suatu  bahan  alam,  khususnya  dalam  penelitian  ini adalah jamur, menjadi penting untuk diketahui dalam rangka meningkatkan nilai guna jamur sebagai bahan dasar pembuatan obat di Indonesia.
Bahan  aktif  berupa  metabolit  sekunder  yang dihasilkan  oleh  jamur  dapat  diperoleh  dari  tubuh buah  jamur,  biomassa  miselium,  maupun  dari supernatan/filtrat  kulturnya  (Ekowati et  al. ,  2011). Upaya  untuk  memperoleh  biomassa  miselium  dan filtrat  kulturnya  telah  dilakukan  oleh  Ekowati et  al. (2011) dengan cara kultivasi jamur pada medium cair dengan  proses  fermentasi  ( submerged  cultured ). Beberapa  faktor  yang  perlu  diperhatikan  ketika melakukan  proses  kultivasi  dalam  media  cair  yaitu nutrisi  dalam  medium  serta  kondisi  lingkungan tumbuhnya seperti pH medium dan waktu inkubasi.
Nilai  pH  dalam  medium  dapat  memengaruhi permeabilitas membran jamur dalam hal penyerapan nutrisi. Jika jamur berada pada pH yang tidak sesuai, penyerapan  nutrisinya  menjadi  tidak  optimal, sehingga  produksi  metabolit  dan  pertumbuhan miseliumnya  menjadi  terhambat  (Gunawan,  2004; Septiana & Simanjuntak, 2017). Rosnan et al. (2019) menyatakan bahwa tiap spesies jamur dapat tumbuh dengan  baik  dalam  berbagai  tingkatan  pH,  dengan kisaran  optimal  untuk  Basidiomycetes  seringkali berada di  lingkungan yang  sedikit  asam,  yaitu  pada pH  4-6.  Penelitian  Krupodorova et  al. (2019) menunjukkan bahwa pH terbaik untuk pertumbuhan L.  edodes yang  ditandai  dengan  tingginya  produksi miselium  berada  pada  pH  3,5-4,  dengan  aktivitas metabolit  bioaktif  terbaik  pada  pH  5,5.  Selain  itu, ditemukan  pula  pada  penelitian  Durán-Rivera et  al.
(2018) bahwa eritadinin pada jamur L. edodes , yaitu metabolit  sekunder  yang  terdiri  dari  alkaloid  purin dengan  fragmen  gula  teroksidasi  diproduksi  secara optimal pada pH 3-4.
Selain  pH,  waktu  inkubasi  juga  dapat memengaruhi  laju  pertumbuhan  miselium  jamur, karena dalam prosesnya jamur membutuhkan waktu tertentu untuk memecah sumber-sumber nutrien yang tersedia,  menyerap,  serta  menggunakannya  untuk pertumbuhan  dan  memproduksi  metabolit  sekunder seperti alkaloid, terpenoid, dan flavonoid (Tampubolon et  al. ,  2015).  Menurut  Ekowati et  al.
(2018),  jamur  yang  dikultivasi  pada  medium  cair akan  menghasilkan  metabolit  sekunder  pada  fase akhir pertumbuhannya atau pada fase stasioner. Fase inilah saat di mana jamur tumbuh dengan optimal dan
mulai  terjadi  penurunan  biomassa  miselium  karena menipisnya  kandungan  nutrien  dalam  medium. Menurut Syarifah et al. (2021), semakin lama waktu inkubasi, maka pertumbuhan miselium akan semakin meningkat  hingga  batas  tertentu,  dimana  produksi metabolitnya mencapai titik tertinggi. Hasil penelitian Listika (2015) menunjukkan bahwa waktu inkubasi  20-30  hari  adalah  waktu  terbaik  bagi Basidiomycota untuk memproduksi metabolit sekunder.  Krupodorova et  al. (2019)  menemukan bahwa  perbedaan  strain L.  edodes memiliki  waktu inkubasi  optimum  yang  berbeda  pula.  Pertumbuhan terbaik L.  edodes ditemukan  pada  kisaran  waktu inkubasi  15-28  hari  dengan  aktivitas  metabolit bioaktifnya  ditemukan  paling  baik  pada  waktu inkubasi 14-35 hari.
Metabolit sekunder merupakan senyawa organik yang dihasilkan dalam jumlah sedikit melalui jalur  metabolisme  sekunder.  Berdasarkan  jalur biosintesisnya, metabolit sekunder dapat dikategorikan  dalam  3  golongan  utama,  yaitu terpenoid, flavonoid, dan senyawa yang mengandung nitrogen  (sebagian  besar  merupakan  senyawa alkaloid).  Untuk  mengisolasi  senyawa-senyawa tersebut,  perlu  dilakukan  proses  ekstraksi,  yaitu penarikan  komponen/zat  aktif  dari  suatu  campuran padatan  dan/atau  cairan  menggunakan  pelarut tertentu  (Febrina et  al. ,  2015;  Iswanto et  al. ,  2016; Silalahi, 2017; Widyastuti & Tjokrokusumo, 2021). Ekstraksi secara dingin, salah satunya maserasi, pada  prinsipnya  tidak  memerlukan  pemanasan sehingga banyak digunakan karena dapat menghindari  kerusakan  komponen  senyawa  yang labil  dan  tidak  tahan  panas  (Hidayah et  al. ,  2016). Penggunaan  pelarut  dalam  proses  maserasi  perlu diperhatikan  agar  penarikan  senyawa  metabolit sekunder  dapat  berjalan  dengan  optimal.  Pemilihan pelarut  n-heksana  dan  kloroform  dimaksudkan  agar senyawa-senyawa  yang  memiliki  tingkat  kepolaran berbeda dapat terekstrak ke dalam pelarut yang sesuai (Mujipradhana, 2018). Setelah diekstraksi, kandungan senyawa metabolit sekunder dalam jamur dapat dideteksi keberadaannya dengan uji fitokimia, salah  satunya  menggunakan  teknik  Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Lantah et al. , 2017).
Kromatografi Lapis Tipis merupakan salah satu metode  pemisahan  kromatografi  yang  fleksibel  dan banyak  digunakan.  Metode  ini  memiliki  beberapa keuntungan, yaitu memiliki kepekaan tinggi sehingga menghasilkan  pemisahan  yang  lebih  sempurna  dan menggunakan  peralatan  yang  sederhana  sehingga dapat dilaksanakan dengan cepat (Afriyeni & Utari, 2016).

## MATERI DAN METODE
Penelitian  dilakukan  menggunakan  metode eksperimental  Rancangan  Acak  Lengkap  pola faktorial (RAL Faktorial) yang terdiri atas dua faktor. Faktor pertama berupa variasi nilai pH (pH 3, pH 4, pH  5,  dan  pH  6),  sedangkan  faktor  kedua  berupa
variasi  waktu  inkubasi  (waktu  inkubasi  selama  15, 20,  25,  dan  30  hari).  Total  16  kombinasi  perlakuan yang  terbentuk  diulang  sebanyak  3  kali  sehingga didapatkan 48 unit percobaan. Parameter utama yang diamati dalam penelitian ini berupa bobot biomassa kering  miselium  dan  golongan  senyawa  metabolit sekunder yang dihasilkan, serta parameter pendukung berupa pH akhir medium pertumbuhan.
a. Peremajaan Isolat Lentinula edodes (Maharani et al. , 2014)
Isolat  murni L.  edodes didapatkan  dari  tempat budidaya jamur di Sumedang, Jawa Barat. Isolat diremajakan  dalam  cawan  Petri  berisi  medium PDA, lalu diinkubasi hingga miselium memenuhi cawan.
b. Pembuatan Mushroom Complete Medium (MCM) (Kim et al. , 2002)
Bahan-bahan  yang  diperlukan  untuk  membuat medium MCM di antaranya yaitu 20 g glukosa,
0,46  g  KH 2 PO 4 ,  1  g  K 2 HPO 4 ,  0,5  g MgSO 4 .7H 2 O, 2 g pepton, dan 2 g yeast extract . Semua  bahan  dihomogenkan  dengan  akuades hingga mencapai volume akhir 1 L.
c. Pengaturan  pH  Awal  Medium  MCM  (Rasullah et al. , 2013)
Derajat  keasaman  (pH)  medium  MCM  diukur menggunakan pH meter sebelum melalui proses sterilisasi.  Elektroda  dimasukkan  ke  dalam medium  yang  telah  homogen,  lalu  pH  medium diatur sesuai dengan nilai yang telah ditentukan (pH  3,  4,  5  dan  6)  dengan  cara  menambahkan NaOH  1N  apabila  pH  terlalu  asam  dan  diberi HCl 1N apabila pH terlalu basa hingga pH yang diinginkan tercapai.
d. Kultivasi  Isolat  pada  Medium  Cair  MCM (Ekowati et al. , 2016)
Isolat jamur L. edodes hasil peremajaan dipotong dengan bor gabus berdiameter 5 mm, kemudian dimasukkan  ke  dalam  labu  Erlenmeyer  yang berisi  100  mL  medium  cair  sebanyak  5  plug isolat L. edodes . Medium yang telah diinokulasikan  isolat L.  edodes selanjutnya diinkubasi selama 15, 20, 25, dan 30 hari.
e. Pemanenan  dan  Penimbangan  Bobot  Miselium (Ekowati et al. , 2016)
Pemanenan  dan  penimbangan  bobot  miselium dilakukan  setelah  waktu  inkubasi  mencapai 15, 20,  25,  dan  30  hari.  Bobot  miselium  yang ditimbang  meliputi  bobot  basah  dan  bobot keringnya.  Miselium  dipanen  menggunakan kertas  saring  dengan  bantuan  pompa  vakum yang  dihubungkan  pada  labu  Buchner  untuk mempercepat  proses  penyaringan.  Miselium ditimbang untuk didapatkan data bobot basahnya, kemudian dioven pada suhu 40-50 o C selama dua hari. Miselium kering ditimbang, lalu data bobot keringnya dicatat.
f. Pengukuran pH Akhir Medium MCM (Rasullah et al. , 2013)
Nilai  pH  akhir  medium  pertumbuhan  diukur
menggunakan pH meter setelah proses pemanenan miselium. Elektroda dimasukkan ke dalam  medium,  lalu  ditunggu  hingga  pH  meter menunjukkan  angka  pH  yang  stabil.  Nilai  pH yang diperoleh selanjutnya dicatat.
g. Ekstraksi  Miselium  dan  Filtrat  Kultur  Jamur (Rochman et al. , 2020)
Ekstraksi Miselium Miselium kering dihaluskan dengan mortar dan pestle ,  lalu  dimasukkan  ke  dalam  labu Erlenmeyer  berisi  25  mL  n-heksan  dan diinkubasi  selama  1x24  jam.  Pelarut  diganti setelah  24  jam  dengan  cara  menyaring  ekstrak menggunakan  kertas  saring  sampai  didapatkan filtrat.  Setelah  dua  kali  pengulangan  ekstraksi menggunakan  n-heksan,  miselium  diekstraksi kembali  dengan  25  mL  kloroform  sebanyak  2 kali  (2x24  jam),  dengan  metode  yang  sama seperti ekstraksi menggunakan n-heksan.
Ekstraksi Filtrat Kultur Jamur Sebanyak 50 mL filtrat dicampur dengan 25 mL  n-heksan  dalam  corong  pemisah.  Corong pisah  selanjutnya  digoyangkan  selama  5  menit agar  kedua  larutan  tercampur,  setelah    itu didiamkan    hingga  terbentuk  lapisan  pemisah antara  pelarut  dan  filtrat.  Hasil  ekstraksi dipisahkan dan ditampung dalam labu Erlenmeyer.  Filtrat diekstraksi dua kali berturut- turut untuk masing-masing pelarut, dimulai dari pelarut n-heksan dan dilanjut dengan kloroform. Hasil  ekstraksi  miselium  dan  filtrat selanjutnya  dipekatkan  menggunakan hot  plate hingga  terbentuk  ekstrak  kental.  Ekstrak  yang didapat  selanjutnya  digunakan  untuk  proses identifikasi golongan metabolit sekunder.
h. Identifikasi  Golongan  Metabolit  Sekunder (Wagner et al. , 1984)
Identifikasi golongan metabolit sekunder ekstrak jamur dilakukan menggunakan metode Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT)  dengan pereaksi semprot untuk masing-masing golongan  metabolit  sekunder  yang  akan diidentifikasi.  Fase  diam  KLT  yang  digunakan adalah  plat silica  gel 60  F 254 yang  dipotong dengan  ukuran  10  x  5  cm,  yang  dielusi menggunakan  campuran  fase  gerak  n-heksan  : etil  asetat  :  asam  asetat  glasial  (7:3:0,1)  untuk ekstrak  kloroform  maupun  ekstrak  n-heksan. pereaksi  Dragrndorff  dan  NaNO 2 untuk mendeteksi keberadaan alkaloid,  pereaksi vanilin-asam sulfat untuk mendeteksi keberadaan terpenoid, dan pereaksi AlCl 3 untuk mendeteksi keberadaan flavonoid dalam sampel. Nilai Retardation  factor (Rf)  selanjutnya dihitung  untuk  masing-masing  bercak  yang tampak  pada  plat  kromatogram  menggunakan rumus sebagai berikut (Sastrohamidjojo, 1991):
Rf = jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik awal (cm) jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik awal (cm)
Gambar 1. Grafik Pertumbuhan Miselium Jamur L. edodes pada pH dan Waktu Inkubasi Berbeda
Data bobot kering miselium dianalisis menggunakan  ANOVA  pada tingkat  ketelitian  95% dan uji lanjut Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) pada  tingkat  ketelitian  yang  sama,  sedangkan  data hasil identifikasi metabolit sekunder dianalisis secara deskriptif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Derajat  keasaman  (pH)  dan  waktu  inkubasi merupakan  dua  hal  yang  memiliki  peran  penting dalam  memengaruhi  pertumbuhan  miselium  jamur pada  suatu  medium.  Berdasarkan  hasil  penelitian, diperoleh data pertumbuhan miselium yang berbeda pada  tiap  perlakuan,  meliputi  data  bobot  basah  dan bobot  kering  miselium.  Menurut  Keryanti et  al. (2020),  tingkat  pertumbuhan  miselium  lebih representatif  jika  dilihat  dari  data  bobot  kering daripada  bobot  basah  sel.  Bobot  kering  sel merupakan berat sebenarnya dari hasil metabolisme jamur selama pertumbuhan tanpa adanya kandungan air  dan  senyawa  terlarut  lain  dalam  sel,  sehingga tingkat pertumbuhan miselium diukur menggunakan data  bobot  kering  yang  dituangkan  dalam  bentuk grafik pada Gambar 1.
Berdasarkan Gambar 1, dapat diketahui bahwa bobot kering miselium jamur mengalami peningkatan  pertumbuhan  pada  rentang  waktu inkubasi  0-20  hari  pada  seluruh  medium.  Ketika memasuki  waktu  inkubasi  25  hari,  miselium  yang ditumbuhkan  pada  pH  medium  3  dan  4  terlihat mengalami  penurunan,  sedangkan  pertumbuhan miselium pada medium pH 5 dan 6 masih mengalami peningkatan.  Pertumbuhan  miselium  pada  waktu inkubasi 30 hari diketahui konstan pada medium pH 4  dan  mengalami  penurunan  pada  medium  dengan pH 3 dan 5, sedangkan medium dengan pH 6 masih mengalami peningkatan bobot hingga mencapai nilai tertinggi dari seluruh perlakuan.
Tingkat  pertumbuhan  miselium  terdiri  atas beberapa fase yang menurut Rendowaty et al. (2017) terbagi menjadi fase lag, fase log (eksponensial), fase stasioner, dan fase kematian. Jamur akan mengalami
pertumbuhan yang rendah karena masih beradaptasi pada  lingkungannya  ketika  berada  pada  fase  lag. Setelah  beradaptasi,  jamur  akan  memasuki  fase eksponensial,  yaitu  saat  dimana  bobot  jamur meningkat dengan pesat hingga mencapai pertumbuhan  optimumnya.  Fase  stasioner  terjadi ketika  pertumbuhan  jamur  menjadi  relatif  tetap karena  jumlah  pertumbuhan  sel  yang  seimbang dengan jumlah sel mati. Jamur banyak menghasilkan produk  buangan  pada  fase  ini  sehingga  dapat menghambat  pertumbuhan  sel  atau  toksik  bagi  sel. Fase  akhir  pertumbuhan  jamur,  yaitu  fase  kematian terjadi  ketika  bobot  miselium  mulai  mengalami penurunan.
Berdasarkan  hasil  penelitian,  setiap  perlakuan mencapai  pertumbuhan  optimum  pada  waktu  yang berbeda-beda.  Miselium  yang  ditumbuhkan  pada medium pH 3 dan 4 mencapai pertumbuhan optimum pada  waktu  inkubasi  20  hari,  pH  5  pada  waktu inkubasi  25  hari,  sedangkan  pH  6  pada  waktu inkubasi 30 hari. Miselium L. edodes diketahui mulai memasuki fase stasioner hingga fase kematian pada rentang waktu inkubasi 25-30 hari. Menurut Popa et al. (2021),  perbedaan  laju  pertumbuhan  sel  dalam medium  merupakan  dampak  dari  mekanisme  sel dalam  meregulasi  pH.  Derajat  keasaman  medium dapat  memengaruhi  fungsi  membran  sel  dalam  hal penyerapan  nutrisi  dari  lingkungan  ekstraseluler, serta  memengaruhi  aktivitas  enzimatik  sel  dalam pembentukan metabolit untuk pertumbuhannya.
Berdasarkan  hasil  uji  lanjut  DMRT  faktor  pH dapat  diketahui  bahwa  miselium  yang  ditumbuhkan pada  pH  5  menunjukkan  hasil  yang  tidak  berbeda nyata  dengan  perlakuan  pH  6.  Kedua  perlakuan menghasilkan  bobot  kering  yang  lebih  tinggi dibandingkan dengan perlakuan pH 3 dan 4. Hal ini menunjukkan bahwa rentang pH 5-6 merupakan nilai pH yang baik bagi pertumbuhan miselium L. edodes .
Hasil penelitian sesuai dengan pernyataan  Hakim et al. (2020), bahwa jamur dapat tumbuh dalam rentang pH yang luas mulai dari pH 3-8, dengan pH  optimal untuk pertumbuhannya berada pada kisaran pH 5-6. Ghada  (2011)  menemukan  bahwa  bobot    miselium
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0 15 20 25 30 B ob ot Ke rin g (gr am) Waktu Inkubasi (hari) pH 3 pH 4
Tabel 1. Hasil Uji Lanjut DMRT Pengaruh Faktor pH dan Waktu Inkubasi terhadap Bobot Kering Miselium L. edodes
No pH Waktu Inkubasi Perlakuan Bobot Kering (g) Perlakuan Bobot Kering (g) 1 P1 0,1450 ± 0,294 ab W1 0,1175 ± 0,395 a 2 P2 0,1367 ± 0,583 a W2 0,1700 ± 0,273 b 3 P3 0,1717 ± 0,289 b W3 0,1733 ± 0,454 b 4 P4 0,1758 ± 0,456 b W4 0,1683 ± 0,467 b
Keterangan: P1: pH 3; P2: pH 4; P3: pH 5; P4: pH 6; W1: Waktu inkubasi 15 hari; W2: Waktu inkubasi 20 hari; W3: Waktu inkubasi 25 hari; W4: Waktu inkubasi 30 hari
L.  edodes mengalami  peningkatan  secara  progresif seiring  dengan  bertambahnya  nilai  pH  medium. Bobot miselium terus mengalami peningkatan hingga nilai pH 6,5 dan di atas nilai pH tersebut bobot mulai mengalami penurunan.
Derajat  keasaman  merupakan  faktor  penting dalam mengatur permeabilitas membran sitoplasmik dalam proses pengangkutan nutrien dan reaksi enzim. Penyimpangan  pH  yang  jauh  dari  pH  ideal  bagi pertumbuhan  jamur  dapat  menghambat  proses metabolismenya  (Kusumaningrum et  al. ,  2017). Menurut Corneliyawati et al. (2018) & Hanna et al.
(2005), terganggunya transportasi ion H+ akibat pH lingkungan  yang  tidak  sesuai  dapat  menghambat proses penyerapan nutrisi yang berpengaruh terhadap pertumbuhan  jamur.  Nilai  pH  yang  optimum  akan memaksimalkan penyerapan nutrisi dengan meningkatkan  kinerja  enzim  dalam  membentuk kompleks  enzim  substrat,  sehingga  pemecahan nutrien  dapat  berjalan  dengan  optimal  dan  bisa dimanfaatkan oleh sel jamur untuk pertumbuhannya.
Penentuan  waktu  inkubasi  optimum  bagi pertumbuhan  jamur  juga  merupakan  faktor  yang penting  untuk  diketahui,  karena  hal  ini  berkaitan dengan  waktu  optimal  jamur  untuk  memproduksi senyawa metabolit sekunder. Hasil uji lanjut DMRT faktor waktu inkubasi menunjukkan bahwa miselium yang  ditumbuhkan  selama  20,  25,  dan  30  hari memiliki  rata-rata  bobot  kering  yang  tidak  berbeda nyata. Hal ini menunjukkan bahwa rentang waktu 20- 30  hari  merupakan  waktu  yang  baik  bagi pertumbuhan miselium L. edodes . Menurut Tampubolon et  al. (2015),  jamur  membutuhkan waktu tertentu untuk dapat memecah sumber nutrien yang  tersedia,  menyerap,  serta  menggunakannya untuk  pertumbuhan  dan  memproduksi  metabolit sekunder.  Hasil  penelitian  yang  didapat  sesuai dengan  pernyataan  Listika  (2015),  bahwa  waktu inkubasi  20-30  hari  merupakan  kisaran  waktu  yang baik  bagi  Basidiomycota  untuk  tumbuh  dan memproduksi metabolit sekunder.
Seiring  dengan  bertambahnya  waktu  inkubasi, pH  medium  diketahui  mengalami  perubahan  yang disebabkan  oleh  aktivitas  metabolit  jamur  selama pertumbuhannya (Tabel 2). Hasil penelitian menunjukkan  bahwa  medium  dengan  pH  awal  3 cenderung  mengalami  peningkatan  nilai  pH, sedangkan pH awal 4, 5, dan 6 cenderung mengalami penurunan.  Menurut  Martina et  al. (2015),
peningkatan pH akhir medium dapat diakibatkan oleh metabolisme nitrogen jamur selama pertumbuhannya sehingga terjadi penumpukan amonia. Penurunan pH medium, menurut Retnosari & Shovitri (2013), dapat disebabkan  oleh  akumulasi  bertahap  di  lingkungan ekstraseluler  jamur  dari  beberapa  asam  yang dilepaskan sebagai akibat dari proses metabolisme.
Tabel 2. Data pH Medium
Perlakuan Rata-Rata pH Awal pH Akhir P1W1 3 4,6 P1W2 3 3,1 P1W3 3 3,4 P1W4 3 3,7 P2W1 4 3,3 P2W2 4 3,2 P2W3 4 3,7 P2W4 4 3,7 P3W1 5 3,2 P3W2 5 3,0 P3W3 5 3,8 P3W4 5 4,5 P4W1 6 3,9 P4W2 6 3,5 P4W3 6 3,8 P4W4 6 4,8
Keterangan: P1: pH 3; P2: pH 4; P3: pH 5; P4: pH 6; W1: Waktu inkubasi  15  hari;  W2:  Waktu  inkubasi  20  hari;  W3: Waktu inkubasi 25 hari; W4: Waktu inkubasi 30 hari
Nilai pH dapat memengaruhi proses pembentukkan  metabolit  sekunder  jamur.  Menurut Septiana  &  Simanjuntak  (2017),  umumnya  jamur akan menghasilkan metabolit sekunder pada kisaran pH  yang  optimal  bagi  pertumbuhannya  dan  tidak ditemukan  senyawa  bioaktif  pada  pH  yang  terlalu ekstrim. Nofiani (2008) menyatakan bahwa pembentukan  metabolit  sekunder  diatur  oleh ketersediaan  nutrisi  dan  penurunan  kecepatan pertumbuhan. Nutrisi yang terbatas serta pertumbuhan yang mulai melambat akan menghasilkan sinyal yang mempunyai  efek regulasi untuk pembentukkan metabolit sekunder. Identifikasi golongan metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak  filtrat  dan  ekstrak  miselium L.  edodes dilakukan dengan metode KLT. Menurut Ekowati et al. (2018),  laju  pertumbuhan  jamur  berhubungan dengan  waktu  optimal  jamur  untuk  memproduksi
senyawa metabolit sekunder. Jamur diketahui mulai memproduksi  metabolit  sekunder  pada  fase  akhir pertumbuhannya,  atau  ketika  memasuki  fase stasioner, sehingga perlakuan pH 5 dan 6 pada waktu inkubasi  30  hari  dipilih  sebagai  sampel  uji  dalam penelitian.
Golongan  senyawa  yang  teridentifikasi  pada sampel  ditandai  dengan  munculnya  spot  warna tertentu  pada  plat  setelah  diberi  pereaksi  semprot. Hasil  identifikasi  dapat  dilihat  pada  Gambar  2. Berdasarkan hasil penelitian, dapat diketahui bahwa sampel  yang  diuji  menunjukkan  hasil  positif mengandung  alkaloid,  terpenoid,  dan  flavonoid. Kromatogram hasil uji alkaloid pada Gambar 2A dan 2D  yang  memunculkan  bercak  berwarna  kuning jingga  sesuai  dengan  pernyataan  Wagner et  al . (1984), bahwa alkaloid yang terdeteksi pada sampel akan  memunculkan  warna  jingga  kecoklatan  ketika disemprot  dengan  pereaksi  Dragendorff  yang dilanjutkan  dengan  NaNO2  untuk  meningkatkan visualisasi warna yang terbentuk pada plat. Alkaloid yang  terdeteksi  berada  pada  rentang  nilai  Rf  0,43- 0,96. Nilai Rf yang diperoleh sesuai dengan Harborne (1987),  yang  mendapatkan  bahwa  nilai  Rf  alkaloid berada  pada  kisaran  0,07-0,62,  serta  penelitian Forestryana  &  Arnida  (2020)  yang  menunjukkan bahwa  senyawa  alkaloid  terdeteksi  pada  nilai  Rf 0,09-0,96.
Kromatogram hasil uji terpenoid pada Gambar 2B dan 2E yang memunculkan bercak berwarna ungu kehitaman  sesuai  dengan  pernyataan  Wagner et  al .
(1984),  bahwa  sampel  yang  menunjukkan  hasil positif  terpenoid  ditandai  dengan  adanya  bercak berwarna  biru  ungu  atau  merah  ungu  gelap  setelah disemprot dengan pereaksi vanilin-asam sulfat. Nilai Rf  setiap  spot  yang  terdeteksi  berada  pada  rentang nilai  0,09-0,95.  Hasil  yang  diperoleh  berada  pada kisaran nilai yang sama seperti penelitian-penelitian sebelumnya,  diantaranya  Qolbi  &  Yuliani  (2018) yang  menemukan  nilai  Rf  terpenoid  pada  rentang 0,22-0,9. Identifikasi terpenoid yang dilakukan oleh Muhaimin et  al .  (2021)  menunjukkan  bahwa terpenoid terdeteksi pada nilai Rf 0,11; 0,6; dan 0,94. Kromatogram hasil uji terpenoid pada Gambar 2B  dan  2E  yang  memunculkan  bercak  berwarna kuning,  hijau,  dan  biru  sesuai  dengan  pernyataan Wagner et  al .  (1984),    bahwa  flavonoid  akan memunculkan fluoresensi  warna  kuning,  hijau,  atau biru  ketika  diamati  di  bawah  sinar  UV  366  nm. Perbedaan warna yang terbentuk tergantung dari tipe struktur senyawa golongan flavonoid yang terdeteksi. Nilai  Rf  setiap  spot  yang  diperoleh  berada  pada rentang  nilai  0,1-0,95.  Hasil  yang  diperoleh  sesuai dengan penelitian Forestryana & Arnida (2020) yang menemukan bahwa flavonoid memiliki rentang nilai Rf 0,18-0,98.
Gambar 2. Kromatogram Ekstrak N-Heksan Hasil Uji Alkaloid (A), Terpenoid (B), Flavonoid (C) Kromatogram Ekstrak Kloroform Hasil Uji Alkaloid (D), Terpenoid (E), Flavonoid (F)

## SIMPULAN
Derajat  keasaman  (pH)  dan  waktu  inkubasi dapat  memengaruhi  peningkatan  pertumbuhan miselium  jamur L.  edodes ,  namun  tidak  ditemukan interaksi  antara  keduanya.  Nilai  pH  yang  optimal untuk pertumbuhan miselium L. edodes berada pada kisaran  pH  5-6  dan  waktu  inkubasi  yang  optimal berada pada kisaran waktu 20-30 hari. Miselium dan filtrat kultur jamur L. edodes mengandung metabolit sekunder  dari  golongan  alkaloid,  terpenoid,  dan flavonoid.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  kepada  LPPM  Unsoed yang  telah  memberikah  hibah  penelitian  dengan Skim Riset Unggulan Unsoed Tahun 2021.

## DAFTAR REFERENSI
Afriyeni,  H.  &  Utari,  N.  W.,  2016.  Identifikasi  Zat
Warna  Rhodamin  B  pada  Lipstik  Berwarna Merah  yang  Beredar  di  Pasar  Raya  Padang . Jurnal Farmasi Higea , 8(1), pp. 59-64.
Corneliyawati, E., Massora., Khikmah. & Arifin, A. S., 2018. Optimalisasi Produksi Enzim Kitinase pada Isolat Jamur Kitinolitik dari Sampel Tanah Rizosfer. Edubiotik: Jurnal Pendidikan, Biologi, dan Terapan , 3(1), pp. 62-69.
Durán-Rivera,  B.,  Moreno-Suárez,  J.  R.,  Rodas,  F. R.,  Jiménez,  K.  M.  V.,  Castro-Restrepo,  D., 2018.  Enhancement  of  Eritadenine  Production Using  Three  Carbon  Sources,  Immobilization and  Surfactants  in  Submerged  Culture  with Shiitake Mushroom ( Lentinula edodes ) (Berk.) Singer). African  Journal  of  Food  Science , 12(12), pp. 374-382.
Ekowati, N., Kasiamdari, R. S., Pusposendjojo, N., & Soegihardjo,  C.  J.,  2011.  Daya  Antimikroba Metabolit  Bioaktif  Jamur  Shiitake  ( Lentinula edodes (Berk.) Pegler) yang Dikultur pada Tiga Jenis  Medium  Fermentasi. Majalah  Obat Tradisional , 16(3), pp. 132-137.
Ekowati,  N.,  Ratnaningtyas,  N.  I.  &  Mumpuni,  A., 2016.  Potensi  Jamur  Trametes  versicolor  dan Russula  sp.  dalam  Menghasilkan  B-Glukan Melalui  Proses  Fermentasi. Seminar  Nasional Pendidikan dan Saintek , pp. 142-146.
Ekowati, N., Maharning, A. R., Ratnaningtyas, N. I., Mumpuni,  A.  &  Izzah,  W.,  2018.  Eksplorasi dan Pola Pertumbuhan Fase Vegetatif Beberapa Jamur  Liar  pada  Medium  Cair. Prosiding Seminar Nasional LPPM Unsoed , 8(1), pp. 100- 111.
Febrina,  L.,  Rusli,  R.,  &  Muflihah,  F.,  2015. Optimalisasi  Ekstraksi  dan  Uji  Metabolit Sekunder  Tumbuhan  Libo  ( Ficus  variegate
Blume). J.  Trop.  Pharm.  Chem .,  3(2),  pp.  74- 81.
Forestryana,  D.  &  Arnida,  A.,  2020.  Skrining Fitokimia  dan  Analisis  Kromatografi  Lapis Tipis  Ekstrak  Etanol  Daun  Jeruju  ( Hydrolea spinosa L.). Jurnal  Ilmiah  Farmako  Bahari , 11(2), pp. 113-124.
Ghada,  M.  M.,  2011.  Optimization  of  Submerged Culture  Conditions  for  Mycelial  Biomass Production  by  Shiitake  Mushroom  ( Lentinus edodes ). Research  Journal  of  Agriculture  and Biological Sciences , 7(4), pp. 350-356.
Gunawan,  A.  W.  2004. Budidaya  Jamur  Tiram .
Depok: PT. Agro Media Pustaka.
Hanna.,  Tyasrini,  E.  &  Ratnawati,  H.,  2005.
Pengaruh pH terhadap Pertumbuhan
Salmonella typhii In Vitro. Maranatha Journal of Medicine and Health , 5(1), pp. 1-7.
Hakim,  L.,  Kurniatuhadi,  R.  &  Rahmawati.,  2020.
Karakteristik Fisiologis Jamur Halofilik Berdasarkan Faktor Lingkungan dari Sumur Air Asin di Desa Suak, Sintang, Kalimantan Barat.
BIOMA:  Jurnal  Biologi  Makassar ,  5(2), pp.227-232.
Iswanto, E. H., Praptana, R. H. & Guswara, A., 2016. Peran  Senyawa  Metabolit  Sekunder  Tanaman Padi  terhadap  Ketahanan  Wereng  Cokelat ( Nilaparvata  lugens ). Iptek  Tanaman  Pangan , 11(2), pp. 127-132.
Harborne, J. B., 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan Edisi I . Bandung: ITB Press.
Hidayah, N., Hisan, A. K., Solikin, A., Irawati, I., & Mustikaningtyas,  D.,  2018.  Uji  Efektivitas Ekstrak Sargassum muticum sebagai Alternatif Obat  Bisul  Akibat  Aktivitas Staphylococcus aureus . J. of Creativity Student, 1(2), pp. 1-9.
Keryanti.,  Faizal,  A.  &  Suhardi,  S.  H.,  2020. Pengaruh  Variasi  pH  Medium  terhadap Perolehan  Biomassa  Sel  dan  Laju  Konsumsi Substrat  Amonium  pada  Kultur  Suspensi  Sel Wortel  ( Daucus  carota L.). Jurnal  Ilmiah Teknik  Sipil  dan  Teknik  Kimia ,  5(2),  pp.  125- 134.
Kim,  S.  W.,  Hwang,  H.  J.,  Park,  J.  P.,  Cho,  Y.  J., Song, C. H., Yun, J. W., 2002. Mycelial Growth and Exo-Biopolymer Production by Submerged Culture  of  Various  Edible  Mushrooms  Under Different Media. Letters in Applied Microbiology , 34(1), pp. 56-61.
Krupodorova, T. A., Barshteyn, V. Y., Kizitska, T. O. &  Pokas,  E.  V.,  2019.  Effect  of  Cultivation Conditions on Mycelial Growth and Antibacterial Activity of Lentinula edodes and
Fomitropis  betulina . Czech  Mycology, 71(2), pp. 167-186.
Kusumaningrum,  I.  K.,  Zakia,  N.  &  Nilasari,  C., 2017. Pengaruh Derajat Keasaman (pH) Media Tanam  dan  Waktu  Panen  pada  Fortifikasi Selenium  Jamur  Tiram  Putih  ( Pleurotus ostreatus ). Journal Cis-Trans , 1(1), pp. 30-34.
Lantah, P. L., Montolalu, L. A. D. Y. & Reo, A. R., 2017.  Kandungan  Fitokimia  dan  Aktivitas Antioksidan  Ekstrak  Metanol  Rumput  Laut Kappaphycus alvarezii . Jurnal media Teknologi Hasil Perikanan , 5(3), pp. 73-79.
Listika,  D.  A.,  2015.  Potensi Pleurotus  sajor-caju, Hypsizigus ulmarius, dan Volvariella volvacea dalam Menghasilkan Metabolit Sekunder pada Dua  Jenis  Medium  Fermentasi  Berbeda.
Skripsi. Universitas Jenderal Soedirman.
Maharani, M. M., Ratnaningtyas, N. I. & Priyanto, S., 2014. Penggunaan Beberapa Medium Semisintetik  untuk  Produksi  Miselium  Jamur Maitake ( Grifola frondosa (Dickson: Fr.) S. F. Gray)  Isolat  Cianjur  dan  Ekstrak  Kasarnya. Scripta Biologica , 1(1), pp. 20-25.
Martina,  A.,  Linda,  T.  M.,  Zul,  D.,  Veronika,  N.  & Jelita, R., 2015. Aktivitas Ligninolitik Beberapa Jamur  Aphyllophorales  dan  Kemampuannya Mendegradasi  Lignin  pada  Lindi  Hitam. Al- Kauniyah, 8(1), pp. 27-31.
Mujipradhana,  V.  N.,  2018.  Aktivitas  Antimikroba dari Ekstrak Ascidian Herdmania momus pada Mikroba  Patogen  Manusia. Pharmacon, 7(3), pp. 338-347.
Newman,  D.  J.,  &  Cragg,  G.  M.,  2012.  Natural Products as Sources of New Drugs Over the 30 Years  from  1981  to  2010. Journal  of  Natural Products , 75(3), pp. 311-335.
Nofiani,  R.,  2008.  Urgensi  dan  Mekanisme Biosintesis  Metabolit  Sekunder  Mikroba  Laut. Jurnal Natur Indonesia , 10(2), pp. 120-125.
Popa, G., Nicolcioiu, B. M., Toma, R., Margarit, G., Groposila-Constantinescu, D.,
2021.
Assessment of The Growth Potential in Liquid Cultures  of  Some  Edible  and  Medicinal Mushrooms. Horticulture , 65(2), pp. 156-161.
Qolbi,  N.  &  Yuliani,  R.,  2018.  Skrining  Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol 70% Sepuluh Daun Tanaman  Terhadap Klebsiella  pneumoniae . Jurnal Farmasi Indonesia, 15(1), pp. 8-18.
Rasullah,  F.  F.  F.,  Nurhidayati,  T.  &  Nurmalasari., 2013.  Respon  Pertumbuhan  Tunas  Kultur
Meristem  Apikal  Tanaman  Tebu  ( Saccharum officinarum )  Varietas  NXI  1-3  secara  in  vitro pada  Media  MS  dengan  Penambahan  Arginin
dan Glutamin. Jurnal Sains dan Seni POMITS , (2(2), pp. 99-104.
Rendowaty, A., Djamaan, A. & Handayani, D., 2017. Waktu  Kultivasi  Optimal  dan  Aktivitas Antibakteri  dari  Ekstrak  Etil  Asetat  Jamur Simbion Aspergillus  unguis (WR8)  dengan Haliclona  fascigera . Jurnal  Sains  Farmasi  & Klinis , 4(1), pp. 49-54.
Retnosari, A. A. & Shovitri, M., 2013. Kemampuan Isolat Bacillus sp. dalam Mendegradasi Limbah Tangki Septik . Jurnal Sains dan Seni POMITS , 2(1), pp. 7-11.
Rochman,  R.  D.,  Sunartatie,  T.  &  Afiff,  U.,  2020. Eksplorasi  Antibakteri  dari  Kapang  Tanah Arboretum. Jurnal  Ilmu  Pertanian  Indonesia (JIPI), 25(3), pp. 456-461.
Rosnan,  N.  D.,  Chuen,  N.  &  Ngadin,  A.  A.,  2019. First  Record  of  in  vitro  Growth  Evaluation  of Wild Mushroom, Schizophyllum commune from Pulau Kapas in Malaysia. Asian J. Agric. Biol ., 7(4), pp. 602-609.
Sastrohamidjojo, H., 1991 . Kromatografi . Yogyakarta: Liberty.
Septiana,  E.  &  Simanjuntak,  P.,  2017.  Pengaruh Kondisi  Kultur  yang  Berbeda  terhadap Aktivitas  Antioksidan  Metabolit  Sekunder Kapang  Endofit  Asal  Akar  Kunyit .  Majalah Obat Tradisional , 22(1), pp. 31-36.
Silalahi,  M.,  2017. Boesenbergia  rotunda (L.). Mansfeld: Manfaat dan Metabolit Sekundernya. Jurnal EduMatSains , 1(2), pp. 107-118.
Tampubolon, Dewi B. M. S., Utomo, B. & Yunasfi., 2015.  Keanekaragaman  Jamur  Makroskopis  di Hutan  Pendidikan  Universitas  Sumatera  Utara Desa  Tongkoh  Kabupaten  Karo  Sumatera Utara. Artikel ilmiah . Medan: USU.
Tjokrokusumo,  D.,  2015.  Diversitas  Jamur  Pangan Berdasarkan  Kandungan  Beta-Glukan  dan Manfaatnya Terhadap Kesehatan. Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon , 1(6), pp. 1520-1523.
Wagner, H., Bladt, S. & Zgainski, E. M., 1984. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas . New York: Springer.
Widyastuti, N. & Tjokrokusumo, D., 2021. Manfaat Jamur  Konsumsi  (Edible  Mushroom)  dilihat dari  Kandungan  Nutrisi  serta  Perannya  dalam Kesehatan. Jurnal  Teknologi  Pangan  dan Kesehatan , 3(2), pp. 92-100.