Jurnal Klnm Sains dan Aplikasi, 2(2), 48-53, 1999
KARAKTERISASI ENZIM PENISILIN ASILASE
DARI ESCHERICIA COLI B-130.

## Nies Sud Mulyani
Laboratorium Biokimia, Jurusan Kimia F MIPA Universitas Diponegoro

## AMSTRAK
Telah dilakukan karakterisasi enzim penisilin asilase hasil isolasi dari Eschericia coli Karakterisasi meliputi pH optimum, temperatur optimum, tetapan Michaelis Menten (KJ, kecepatan maksimum (Vÿ). Aktivitas enzim penisilin asilase ditentukan dengan metode Komfeld pada X 538 nm. hasil penelitian menunjukkan bahwa pH optimum “ 7,5, temperatur optimum 55°C, tetapan Michaelis Menten (K«) = 0,86 (iM kecepatan reaksi maksimum (Vÿ) untuk pembetnukan produk 6-APA sebesar 147
|imol/mL enzim
B-130. Kata kxMci : Enxim, femhOm os Harr, karaktr Hr art.

## ABSTRACT
Enzym Penicyilin Acylase Characterisation of E. Coh B-130
Caracteritation as the optimum pH, the optimum temperature, the Michaelis Menten constant (Km) and the maximum rate. The activity of penicillin acylase was determined by Konmfeld method at X 538 nm The conclusion are the optimum pH was 7,5, the optimum temperature was 55°C.'The Michaelis Menten constant was 0,86 mM and the maximum rate of 6-APA was 147 mmol 6-APA/mL enzim
Keyword : Enzyme, penicillin acylase, caraclerlsatlon

## PENDAHULUAN
Akhir-akhir ini hampir sehiruh obat jadi farmaa sudah dapat dibuat di dalam negeri, tetapi sebagian besar bahan bakunya masih hams didatangkan dan luar negeti Hal ini disebabkan k arena Indonesia sampai saat ini belum mampu memenuhi kebutuhan akan bahan baku obat terutama untuk antibiotika.
Penisilin merupakan salah satu jenis antibiotika yang banyak digunakan untuk
pcngobatan berbagai penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme seperti jamnr, bakteri dan virus, karena kemampuan antimikrobanya cukup tinggf l). Penisilin termasuk antibiotik p laktam yang terdiri dari 6-APA (sebagai inti penisilin) dan rantai sampin g yang terikat pada Q dari asam 6-amino penisilanat (6-APA)(2).
No. ArHke!41/1999 (Biokimia)
48
Nies Suci Mulyani: Karakterisasi Enzym Penlcilin Asilase
H H i I R- -C-N—C—C— Sv I T II I I I V"CH3 C— N /* \ o' X CT3 H COOH O H ___ Asain -6- Amino Penisilanat (G-ARA ---- -*• p.antai Samping
Penisilin alam yang mula-mula dite- mukan oleh Fleming, diperoleh pada media biakan jamur Penicillium notatwrP\ Keku- rangan dari sifat penisilin alam tidak tahan panas, asam dan basa. sering menimbulkan alergi. Serta banyaknya kuman yang kebal terhadap antibiotika. temtama yang mampu mensintesa |3-laktanase(4). Hal inilah yang mendorong peneliti untuk memperoleh jenis penisilin barn yang sifatnya lebih baik dan penisilin alam.
sintetik adalah penyediaan inti molekul penisilin yaitu asam 6-amino penisilanat (6-APA). Senyawa 6-APA ini dapat diperoleh secara liidrolisis kimiawi, enzimatik maupun
fermentasi dari penisilin alam maupun secara
fermentasi. Yang ba-nyak dilakukan orang adalah cara enzimatik, karena biayanya relatif lebih niurah. Pada cara enzimatik. 6-APA diperoleh melalui re-aksi hidrlisis penisilin
dengan bantuan enzim penisilin asilase yang dapat diperoleh dari berbagai mikioorganisme(5). Penisilin asilase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis penisilin pada ikatan ainida yang menghu-bungkan rantai S3inping asil dengan inti pe-nisilin menjadi 6- APA dan asam kaiboksilat<2)
Dari penelitian yang telah dilakukan oleh Abraham dan kawan-kawan, diperoleh hasil bahwa perbedaan struktur samping dari penisilin menimbulkan sifat antibiotika yang bant. Penisilin yang diperoleh dengan cara ini disebut penisilin semisintetikÿ. Yang tnenjadi masalah utama dalam pembuatan penisilin semi
H H r’HH-v™3 /-"'or'cm v H COOH H H ° Ho J H COOH R — Penlÿlin asilasr R—COOH 0 H
Reaksi sintesis penisilin dikatalisis oleh enzim yang sama, hidrolisis berlangsung pada pH sedikit basa (7,5 - 9,0), sedangkan reaksi sintesis berlangsung pada pH sedikit asam.Keberhasilan dalam penyediaan 6-APA
dan pembuatan penisilin semi sintetik selain ditentukan oleh kualitas dari enzim penisilin asilase juga perlu diketahui kondisi optimum yang mempakan karakter dari enzim penisilin asilase yang digunakan(<5). Karena dengan
No. Aril A el : 41/1999 (Bloklmla)
menggunakan enzim penisilin asilase yang mempunyai aktivitas yang dnggi dan kondisi lingjoingan (tempera tur, pH) yang mendukung, maka produksi 6-APA sebagai inti penisilin akan meningkat demikian juga hasil penisilin semi sintetiknya.
HASIL dan PEMBAHASAN
a. Penentuan pH optimum enzim penisilin asilase.
Penentuan pH optimum enzim pe¬ nisilin asilase dilakukan berdasarkan pengu- kuran 6-APA hasil reaksi enzimatik antara enzim penisilin asilase dengan substrat benzil penisilin pada berbagai harga pH. Harga pH
yang menunjukkan jumlah 6-APA yang
tertinggi meiupakan pH optimum bagi kerja enzim penisilin asilase tersebut.
Pengaruh pH terhadap aktivitas en-zim penisilin asilase dapat dilihat dan tabel 1 dan gambar 1 berikut :
Dalam penelitian ini akan dicoba untuk mengetahui kondisi optimum enzim penisilin asilase hasil isolasi dan Eschericia coli B-130.

## TUJIJAN PENELITtAN
Memperoleh kondisi optimum dan parameter kinetik enzim penisilin asilase hasil isolasi dati bakteri Eschericia coli B-130. Tabel 1. Data penentuan pH optimum
••• : - -Akfi«a*»|M»inkpli|?: P 1 :|11| prot , ||g||

## METODOLOGI
Penelitian ini menggunakan enzim penisilin asilase hasil isolasi dari bakteri Eschericia coli B- 130 yang ditumbuhkan dalam medium Morita dan Iwata yang me-ngandung asam fenil asetat 0,2% sebagai penginduksi.
Hasil yang diperoleh kemudian di-fraksinasi dengan menggunakan ammonium sulfat secara bertingkat, dilanjutkan pemur-nian dengan kolom kromatografi DEAE-Sephacel.
Enzim yang diperoleh dari hasil pemumian terakhir, kemudian ditentukan pH optimum, temperatur optimum serta parame-ter kinetik Vm (kecepatan maksimum) dan Km (tetapan Michaelis Merrten). Pengukuran aktivitas enzim penisilin asilase dengan cara Komfeld, atas dasar pengukuran intensitas wama yang ditimbulkan oleh pereaksi Erlich pada panjang gelombang 538 nm dan kadar protein ditentukan dengan cara Lowry.
1 Unit aktivitas enzim dinyatakan sebagai ak-tivitas enzim yang dapat menghasilkan 1 pmol substrat ( bensilpenisilin ) pada kondisi per-cobaan. 6,5 5,24 7,0 7,78 7,5 . 14,55 8,0 9,08
8,5
6,04
/ 7ÿ f * T 77 T
Gambar 1. Pengaruh pH terhadap aktivitas
enzim penisilin asilase
50 No. Artike/ 41/1999 (Bloklmla)
Pada pH 7,5 diperoleh aktivitas enzim penisilin asflase tertinggi, olch karena itu pH tersebut merupakan pH optimum dan enzim penisilin asflase. Perubahan pH sangat mem- pengaruhi aktivitas enzim sebab pH dalam lamtan, menunjukkan jumlah ion IT yang ada dalam larutan.Sehingga perubahan pH-sangat mempengaruhi muatan listrik pada enzim maupun substrat. Pada enzim perubahan pH sangat mempengaruhi pusat aktif enzim yang terdiri dan asam-asam amino. Perubahan muatan perubahan kon-foimasi maupun perubahan muatan pada residu asam amino yang berfungsi sebagai pengikat substrat.
aktivitas enzim dapat dilihat pada tabel 2 dan gambar 2.
Tabel 2. Data penentuan temperatur optimum 27 1,89 37 2,01 40 2,93 listrik dapat mengakibatkan 45 3,42 50 9,76 55 14,56 60 8,64 65 5,72
b. Penentuan temp era tur optimum enzim
penisilin asilase.
/ / I
/
Laju reaksi yang dikatalisis oleh enzim seperti halnya reaksi kimia biasa yang akan meningkat dengan peningkatan suhu. Tetapi perlu diingat bahwa enzim seperti halnya semua protein yang akan mudah rusak konformasinya pada temperatur tertentu
Setiap enzim mempunyai temperatur optimum yang karakteristflc, pada temperatur tersebut enzim akan memflfld aktivitas tertinggi.
Penentuan temperatur optimum enzim penisflin asilase
dilakukan
berdasaikan pengukuran 6-APA yang terbentuk dari hasil reaksi antara enzim penisilin asilase dengan substrat benzil penisilin pada berbagai temperatur.Harga temperatur yang menun¬ jukkan jumlah 6-APA tertinggi merupakan temperatur optimum untuk kerja enzim
tcrsebutPengaruh
temperatur terliadap
e \ \ « 5 u 5 ii « » »
Garnbar 2. Pengaruh temperatur terhadap aktivitas enzim prnisilin asilase
Aktivitas enzim yang tertinggi diperoleh pada temperatur 55°C yang merupakan temperatur optimum untuk enzim tersebut Pada temperatur 27°C sampai 55°C terlihat adanya kenaikan aktivitas enzim dengan naiknya temperatur, sedangkan mulai 55°C
No. Artikel : 41/1999 (liokimia) 51
Junta/ Kimia Sains dan Apiikasi, 2(2), 48-5 J, 1999
sampai 65°C terlihat penurunan aktivitas enzim dengan naikiiya temperatur. Hal ini disebabkan kenaikan temperatur akan berpengaruh
terhadap ikatan-ikatan yang lemah seperd
ikatan hidrogen, sehingga akan
terjadi
pembukaan ikatan non kovalen pada struktur kwartemer menjadi struktur terder. Hal tersebut akan
menyebabkan perubahan
konfonnasi enzim terutama pada residu asani amino yang berfungsi untuk mengikat substrat
sehingga akan menurunkan aktivitas enzim penisilin asilase tersebuL
Dari data yang diperoleh dapat dianalisis dengan persamaan Lineweaver Burk yang merupakan kebahkan dari persaman Michaelis Menten berikut :
Vm . [S] v =
Kn.+ fS]
v : laju reaksi (aktivitas enzim)
Vm : laju reaksi maksimum K„, : tetapan Michaelis Menten
Km * [S] 1 V Vm + [S]
c. Pnieutuan parameter kinetik enzim
penisilin asilase.
Keefektifan enzim sebagai katalis dapat diperkirakan dari harga Vm dan K„ nya. Harga
Vm (kecepatan reaksi maksi-mum). sangat tergantung dari kadar enzim pada suatu larutan. Ini merupakan batas teoiids karena hanya dapat dicapai bila substrat terdapat dalam konsentrasi yang tinggi sekali, dan tidak ada produk yang menempati terapat aktif. Jadi merupakan kecepatan reaksi bila enzim telah dijenuhi oleh substrat.
Sedangkan K„ (tetapan Michaelis - Menten) merupakan kecenderungan bergabungnya enzim dengan substrat untuk menghasilkan produk.
Penentuan Vm dan K„ enzim penisilin asilase dilakukan berdasarkan pada pengukuran aktivitas enzim penisilin asilase pada berbagai konsentrasi substrat Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim penisilin asilase dapat dilihat pada tabel 3 dan gambar 3.
Km i
Vm * [S] V Vm
yang bila dibuat grafik 1/v vs 1/[S] akan diperoleh garis lurus. Titik potong antara garis dengan absis akan diperoleh 1/Vm sedangjean titik potong garis dengan ordinat akan diperoleh 1/Km
Tabd 3. Data penentuan Ka dan VB [S] 1/[S] 1/v v 0,5 96,636 111,912 117,004 125,151 127,188 132,888 140,428 160,795 0,01035 0,00894 0,00855 0,00799 0,00786 0,00756 0,00712 0,00622 2 1,0 1 1,5 0,67 2,0 0,50 2,5 0,40 3,0 0,33 3,5 0,29 4,0 0,25 V“ aktivitas enzim pmol 6-APA/mL enzim
No. Arttke/ 41/1999 (Bloklnda)
52

## UCAPAN TliRIMA KAS1H
0.030
Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesnr-besamya kepada DR. ivluhammad Wirahadikusumah (aim) dan DR. Muliawati Sinduwarta. staf pengajar Kimia FMEPA-ITB atas bantnan dan bimbingannya. 0025 0.020 0.015 § •--Si 0.C10 PUSTAKA
1. Gillman, G.A, L.S. Goodman., T.W. Rail., and F. Murad. “The Pharmacologi-cal Basis of
Therapeutics”, 7,h ed., Macmillan Publishing
Company, New York, 1985, 1115-1137.
2. Crueger, W., and A Crueger, “Biotech-nology A Textbook of Industrial Micro-biology”, Science Tech , Inc. Madison USA 1984, 178-
180, 197-206.
3. Perlman, D(editor)., “Advances in Apli-ed Microbiology”, vol XII, Academic Press,
New York, 1974
4. Carington, T.R.. Proc. R. Soc. London., 179, 321-333.
5 Huber, FM., R.R. Chauvette, and. B.G.
Jackson, "Chepalosporin & Penicillius”, Academic Press, New York, 1972, 27-37
Balashingham, et. al., “The Isolation and Kinetics of Penisillin Amidase from E.F..coh , Biochemical 1972.
1 5.00b I A O.000 0 0.(5 1.2 IS •3.6 -3 -2.4 -18 -12 -0.6 1/ts]
Gambar 3. Hubungan antara I V dan 1/[S] dari enzini penmlin asilase.
Dari gambar diperoleh nila Km sebesai 0,86 uM, sedangkan Vm 147,93 jmiol 6-APA/mL enzim

## KESIMPULAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa enzim penisilin asilase hasil isolasi dari
Eschericia coli optimum 7,5 temperatur optimum 55°C.
tetapan Michaelis Menten (KnO = 0,86 um d:ui kecepatan reaksi maksimum (Vm) = 147 pmol 6-APA/mL enzim. B-130 mempunyai pH 6. No. Artlkel : 41/1999 (KtokimJu) 53