## ISSN: 0215-7950
*Alamat penulis korespondensi: Departemen Proteksi Tanaman,  Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Jalan Kamper, Kampus IPB Dramaga, Jawa Barat 16680. Tel: +62 251 8629364, Faks: +62 251 8629364, Surel: supramana@apps.ipb.ac.id

## Volume 20, Nomor 2, Maret 2024
Halaman 66–76 DOI: 10.14692/jfi.20.2.66–76
Keefektifan Senyawa Bioaktif  Klon Pustaka Metagenomik sebagai Biokontrol Meloidogyne incognita dan Pemacu Pertumbuhan Tanaman
Effectiveness of the Bioactive Compound from Metagenomic Library Clones as Biocontrol of Meloidogyne incognita and Plant Growth Promoter
Ade Indra Maulana Sembiring, Giyanto, Supramana* Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor Jalan Kamper, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680
(diterima Desember 2023, disetujui Maret 2024)

## ABSTRAK
Metagenomik  merupakan  teknik  untuk  mengeksplorasi  sumber  daya  kekayaan  genetik  mikrob pada suatu lingkungan, termasuk mikrob yang dapat berperan sebagai agens biokontrol. Penelitian ini bertujuan mengetahui keefektifan senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh isolat klon pustaka metagenomik asal kakao (PMP7, PMC8, PMS14, PMC3, PMC13, PMC14, dan PMS11) sebagai agens pengendalian nematoda puru akar Meloidogyne incognita dan  pemacu  pertumbuhan  tanaman . Pengujian in vitro dilakukan menggunakan filtrat senyawa bioaktif dari tujuh klon pustaka metagenomik terhadap juvenil 2 nematoda pada cawan petri. Nematoda yang diberi perlakuan senyawa bioaktif diinkubasikan pada suhu 27 ℃ dan diamati mortalitasnya pada 24 jam setelah perlakuan. Karakterisasi fisiologi yang dilakukan terhadap isolat adalah pengujian produksi HCN, enzim kitinase, dan enzim protease. Pengujian secara in planta dilakukan pada pada tanaman mentimun var. Kitoh yang ditanam pada polibag. Nematoda juvenil 2 diinfestasikan pada masing-masing polibag dan perlakuan senyawa bioaktif diberikan dengan menyiramkan suspensi pada 14 dan 30 hari setelah tanam. Pengamatan dilakukan setiap minggu hingga puru terbentuk pada perakaran tanaman. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tujuh isolat klon pustaka metagenomik memiliki kemampuan nematisidal dengan tingkat mortalitas in vitro mencapai 96%–100% dan  mampu  memproduksi  enzim  protease  dengan  indeks  proteolitik  mencapai  0.13-0.6.  Pada  uji in planta isolat PMS11 mampu menekan keparahan puru akar dengan keefektifan penekanan mencapai 54.63%. Dua isolat, yaitu PMC8 dan PMS14 memiliki kemampuan memacu pertumbuhan tanaman yang terbaik.
Kata kunci: enzim protease, mortalitas, nematisidal, puru akar

## ABSTRACT
Metagenomics is a technique for exploring the genetic diversity of microbes in an environment, including  those  that  can  act  as  biocontrol  agents. This  research  aims  to  determine  the  effectiveness of bioactive compounds produced by the isolates of metagenomic library clones from cocoa (PMP7, PMC8, PMS14, PMC3, PMC13, PMC14, and PMS11) as agents for controlling root knot nematode
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Sembiring et al.
Meloidogyne incognita and promoting plant growth. In vitro testing was carried out using filtrates of bioactive compounds from seven metagenomic library clones on juvenile 2 nematodes in petri dishes. Nematodes treated with bioactive compounds were incubated at 27 ℃ and their mortality was observed 24 hours after treatment. The physiological characterization carried out on the clone isolates involved the production of HCN, chitinase and protease enzymes. In planta testing was carried out on cucumber plants var. Kitoh which were planted in polybags. Juvenile 2 nematodes were infested in each polybag and  bioactive  compound  was  given  by  watering  the  suspension  at  14  and  30  days  after  planting. Observations were conducted every week until galls were formed on the plant roots. The results showed that seven isolates of metagenomic library clones had nematicidal effect with an in vitro mortality rate of 96%–100% and were able to produce protease enzymes with a proteolytic index of 0.13–0.6. In the in planta test, PMS11 isolate was able to suppress the severity of root knots with suppression effectiveness reaching 54.63%. Two isolates, i.e. PMC8 and PMS14, showed the best ability to stimulate plant growth.
Keywords: mortality, nematicidal, protease enzyme, root gall

## PENDAHULUAN
Metagenomik merupakan teknik dasar penggunaan  biologi  molekuler  untuk  meng- analisis sumber daya kekayaan genetik mikrob dari  sampel  lingkungan  (Cortes-Lopez et al. 2020). Teknik ini memungkinkan diperolehnya gen-gen fungsional baru seperti gen pengkode antibiotik,  enzim,  maupun  senyawa  volatil antimikrob  yang  berasal  dari  mikrob  yang tidak dapat dikulturkan pada medium buatan (Sessitsch et al. 2012). Borneman et al. (1996) menyatakan  bahwa  hanya  1%  mikrob  di alam  yang  dapat  dikulturkan  pada  kondisi laboratorium  sehingga  sebagian  besar  yakni 99% mikrob yang tidak dapat dikulturkan belum diketahui  potensinya.  Teknik  metagenomik sangat  berpotensi  untuk  mempelajari  gen- gen  fungsional  yang  dapat  digunakan  dalam pengendalian  patogen  tumbuhan.  Sessitsch et al. (2012) telah menggunakan pendekatan metagenomik untuk menganalisis potensi bakteri  endofit  yang  berasosiasi  pada  akar tanaman  padi  yang  salah  satunya  berperan sebagai  agens  biokontrol  terhadap  patogen. Selain  itu,  pemanfaatan teknik  metagenomik juga  dilakukan  oleh  Permana  (2018)  dalam menginduksi  ketahanan  tanaman  kakao terhadap  penyakit  yang  disebabkan  oleh cendawan. Oleh karena itu, pendekatan yang sama juga dapat dilakukan untuk mengendali- kan patogen tanaman dari kelompok lain seperti nematoda parasit tumbuhan.
Salah satu genus dari nematoda yang bersifat parasit pada tumbuhan yakni, nematoda puru akar ( Meloidogyne ). Patogen ini merupakan genus nematoda yang memiliki kisaran inang yang luas yang diperkirakan lebih dari 5500 spesies  tumbuhan  (Trudgill  dan  Blok  2001). Nematoda  ini  dapat  menyebabkan  kerugian secara langsung maupun tidak langsung pada tanaman budi daya. Tanaman budi daya yang terserang nematoda puru akar akan terganggu pertumbuhannya  sehingga  mengakibatkan kematian pada serangan berat yang menyebab- kan  penurunan  produktivitas  hasil  budidaya (Mursyalatiyus  2018).  Salah  satu  spesies nematoda yang menyebabkan kerugian secara ekonomi ialah Meloidogyne incognita. Umumnya  pengendalian  nematoda  puru akar (NPA) dilakukan dengan penggunaan nematisida  sintetik,  penggunaan  kultivar resisten, dan rotasi tanaman (Luc et al. 2005). Akan tetapi, pengendalian menggunakan nematisida sintetik sering menyebabkan dampak yang  buruk  bagi  lingkungan.  Penggunaan kultivar  resisten  secara  terus  menerus  dan dalam jangka waktu yang lama dapat berubah menjadi tidak stabil akibat munculnya biotipe atau  ras  patogen  baru  (Carolan et al. 2017). Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengkaji  keefektifan  isolat  klon  pustaka metagenomik asal tanaman kakao dalam memacu pertumbuhan tanaman dan mengendali- kan nematoda puru akar M. incognita .

## BAHAN DAN METODE

## Pengambilan dan Perbanyakan
Meloidogyne spp. Inokulum nematoda puru akar Meloidogyne spp. diambil dari tanaman tomat yang  menunjukkan  gejala  menguning  dan kerdil  serta  pada  bagian  akarnya  terdapat puru yang disebabkan oleh Meloidogyne spp. Perbanyakan  inokulum  uji  diambil  dari  satu paket telur yang akan diinfestasikan pada per- akaran satu tanaman tomat untuk mendapatkan spesies yang sama. Tanaman tomat ditanaman pada polibag yang terdiri atas medium tanah yang  disterilisasikan  menggunakan  autoklaf untuk mengurangi kontaminasi patogen lain- nya.  Setiap  satu  paket  telur  diinkubasi  pada satu cawan petri berdiameter 9 cm berisi air  steril  sebanyak  6  mL  selama  tiga  hari dua malam pada suhu ruangan 27 o C hingga menetas menjadi juvenil 2 (J2) (Efendi et al. 2021).  Satu  paket  telur  yang  telah  menetas menjadi juvenil 2 memiliki kerapatan populasi berkisar 100 ekor per mL dan diinfestasikan pada perakaran satu tanaman tomat berusia 2 minggu setelah tanam (MST) pada polibag dengan medium tanah steril. Setelah tanaman tomat pada polibag bergejala puru dilakukan identifikasi spesies Meloidogyne berdasarkan karakter morfologinya dengan mengamati pola perineal nematoda betina yang mengacu pada A Guide to The Four Most Common Species of Root-Knot Nematodes ( Meloidogyne spp.),
With a Pictural Key Genera (Eisenback et al. 1981).
Pengujian in Vitro Filtrat Klon Pustaka Metagenomik terhadap Nematoda Puru Akar Pengujian in vitro klon pustaka metagenomik (KPM)  dilakukan  untuk  melihat  pengaruh senyawa  bioaktif  pada  filtrat  KPM  terhadap mortalitas J2 NPA. Persiapan supernatan filtrat KPM mengacu pada metode penelitian Sastrini (2016) yang dimodifikasi tanpa menggunakan shaker waterbath .  Sebanyak  7  isolat  klon pustaka metagenomik asal tanaman kakao, yaitu PMC3, PMC8, PMC13, PMS11, PMS14, PMP7, dan PMC14 koleksi dari Laboratorium
Bakteriologi  Tumbuhan,  Fakultas  pertanian, IPB University masing-masing klon ditumbuh- kan pada 50 mL medium Luria Bertani (LB) (0.5 g pepton, 0.25 g ekstrak yeast, 0.25 g NaCl, dan 50 mL air) dan ditambahkan 50 µg mL -1 ampisilin dan diinkubasi pada shaker 150  rpm  pada  suhu  ruang  selama  24  jam. Selanjutnya,  suspensi  ditambahkan isopropyl- β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) pada saat konsentrasi isolat KPM mencapai OD600 = 0.9-1.5 (fase logaritmik) kemudian diinkubasi  kembali  pada  kondisi  yang  sama selama  empat  hari.  Suspensi  selanjutnya disentrifugasi  (Thermo  Scientific,  Jerman) pada kecepatan 10 000 rpm selama 20 menit dan  dilanjutkan  dengan  disaring  mengguna- kan milipore berukuran  0.22  µm  (Membran Solution, Amerika Serikat). Pengujian in vitro mengacu  kepada  metode  Chen et al. (2018) yang  dilakukan  modifikasi  pada  jumlah J2  yang  digunakan  serta  waktu  inkubasi pengamatan  yang  dilakukan.  Nematoda  J2 hasil  perbanyakan  diekstraksi  kemudian dipanen dan diamati menggunakan mikroskop stereo,  serta  dihitung  menggunakan hand counter. Juvenil 2 M. incognita dihitung hingga mendapatkan jumlah individu 35 individu per 0.5 mL untuk dilakukan pengujian. Sebanyak 4.5  mL  filtrat  100%  dimasukkan  ke  dalam cawan petri dan ditambahkan 35 individu J2 M. incognita lalu diinkubasi pada suhu ruang. Percobaan dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap dengan 3 ulangan yang  terdiri  atas  perlakuan  filtrat  KPM  dan kontrol air. Pengamatan dilakukan pada 24 jam inkubasi.  Setelah  24  jam,  nematoda  dibilas menggunakan  air  steril  untuk  menghentikan pengaruh  nematisidal.  Selanjutnya  nematoda diinkubasi selama 4 jam pada air steril untuk memastikan  efek  nematisidal  dari  senyawa bioaktif  pada  filtrat  KPM.  Mortalitas  ter- koreksi  nematoda  dihitung  menggunakan rumus seperti berikut:
100 – Pc Pt = × 100%, dengan Po – Pc
Pt, % kematian terkoreksi; Po, % kematian pada perlakuan; dan Pc, % kematian pada kontrol.
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Sembiring et al.

## Pengujian Produksi HCN
Pengujian produksi HCN dilakukan dengan menggunakan metode Wei et al. (1991) yang dimodifikasi menggunakan perendaman kertas saring pada larutan cyanide detection solution (CDS) (2 g asam pikrat dan 8 g sodium karbonat (Na 2 CO 3 )  dalam  200  mL  akuades  steril) . Isolat klon pustaka metagenomik digoreskan pada medium tryptone soy agar (TSA) [30 g tryptone soy broth (TSB) (Himedia, India), 20 g agar bakto (Thermo Scientific, Jerman), 1000  mL  akuades]  +  4.4  g  L -1 glisin  yang mengandung 50 μg mL -1 ampisilin dan IPTG. Pada bagian tutup cawan petri diletakkan kertas  saring  berukuran  1  cm  ×  1  cm  yang telah  direndam  dengan  larutan  CDS  hingga berwarna kuning, lalu diinkubasi selama 7 hari. Adanya produksi HCN ditandai oleh adanya perubahan  warna  kertas  saring  dari  kuning cerah menjadi oranye kemerahan.
Pengujian Aktivitas Kitinolitik Pengujian  aktivitas  kitinolitik  mengacu pada metode Hariprasad et al. 2011  yang dimodifikasi menggunakan koloidal kitin 0.4%. Koloni tunggal isolat pustaka metagenomik yang  berumur  24  jam  digoreskan  pada medium kitin steril [30 g TSB (Himedia, India),  20  g  agar  bakto  (Thermo  Scientific, Jerman),  1000  mL  akuades]  yang  ditambah dengan koloidal kitin 0.4%. Pada medium tersebut  ditambahkan  50  μg  mL -1 ampisilin dan  IPTG.  Perlakuan  diinkubasi  pada  suhu ruang selama 24–72 jam. Zona bening pada medium akan terbentuk di sekitar koloni yang  mampu  menghasilkan  enzim  kitinase. Kemampuan degradasi kitin diukur dari waktu yang dibutuhkan lebih cepat dan indeks lisis. Pengukuran indeks lisis berdasarkan Muharni dan Widjajanti (2011)
B Indeks lisis = , dengan (A – B)
A, diameter zona bening dan B, koloni bakteri.
Pengujian Aktivitas Proteolitik Pengujian proteolitik menggunakan medium skim milk agar (SMA). Medium SMA dibuat dengan mencampurkan 30 g medium (TSB) (Himedia, India) dengan 20 g agar bakto
(Thermo Scientific, Jerman) yang ditambahkan 900  mL  akuades,  100  mL  susu  skim,  dan 50  μg  mL -1 ampisilin dan IPTG. Suspensi klon pustaka metagenomik digoreskan pada medium SMA dan diinkubasi selama 24 jam pada  suhu  ruang  dan  diamati  zona  bening yang terbentuk di sekitar koloni (Baehaki dan Budiman 2011).
Uji Keefektifan Senyawa Bioaktif Klon Pustaka Metagenomik dalam Menekan Keparahan Penyakit Puru Akar Pengujian  keefektifan  senyawa  bioaktif pada  filtrat  KPM  dilakukan  untuk  melihat kemampuannya  dalam  menekan  keparahan penyakit puru akar M. incognita dan pemacu pertumbuhan  tanaman  di  rumah  kaca.  Benih mentimun  varietas  Kitoh  (Tohoku  Seed  Co, Jepang)  yang  telah  disterilisasi  permukaan direndam  pada  filtrat  selama  45  menit. Kemudian  benih  ditaman  pada  polibag ber- ukuran 30 cm × 30 cm dengan medium tanah dan pasir steril 1:1 (v/v) yang disterilisasikan menggunakan  autoklaf.  Pada  usia  tanaman 2  dan  4  minggu  tanaman  diberikan  filtrat kembali sebanyak 10 mL dengan perbandingan 1:9 (filtrat:air steril). Pemberian filtrat dilaku- kan pada  pangkal  batang  tanaman  sebanyak 2 kali (2 dan 4 MST). Selanjutnya, sebanyak 500 ekor J2 M. incognita diinfestasikan pada tanaman  setelah  tiga  hari  pemberian  filtrat pada 2 MST. Seluruh perlakuan diinfestasikan nematoda J2 dengan tanaman kontrol tanpa pemberian filtrat KPM. Percobaan dilakukan dengan  RAL  yang  terdiri  dari  5  ulang  yang setiap  ulangannya  terdapat  3  unit  tanaman. Pengamatan karakteristik agronomis dilakukan setiap  minggu  selama  4  minggu  setelah  J2 dinfestasikan  (Munif et al. 2013). Minggu terakhir  pengamatan  dilakukan  perhitungan jumlah  puru  akar  dan  perhitungan  bobot kering  tanaman,  serta  perhitungan  persentasi keefektifan  isolat  KPM  dalam  menekan populasi nematoda di akar menggunakan rumus sebagai berikut:
P0 % keefektifan = × 100% , dengan P0 – Pt
∑ ∑
P0, puru pada akar tanaman kontrol; dan Pt, puru pada tanaman perlakuan.
Skor  keparahan  penyakit  puru  akar mengacu  pada  skala  persentase  keparahan penyakit  oleh  Barker (1985) dan dilakukan modifikasi menjadi perhitung jumlah puru akar dengan skala skoring 0–5. Skor 0, tanaman tidak memiliki puru; 1, terdapat 10 sampai 20 puru; 2, terdapat 21 sampai 50 puru; 3, terdapat 51 sampai 80 puru; 4, terdapat 81 sampai  100  puru;  dan  5,  terdapat  lebih  dari 100 puru.

## HASIL
Spesies Nematoda Puru Akar Paket telur yang diinfestasikan memiliki ciri berbentuk bulat berwarna putih (Gambar 1a). Tanaman tomat yang diinfestasikan satu paket telur Meloidogyne spp. menunjukkan gejala puru  akar  pada  2  bulan  setelah  inokulasi. Gejala  puru  akar  yang  terbentuk  akibat infeksi J2 M. incognita yang menyebabkan sel membengkak (Gambar 1b). Akar yang berpuru diamati  di  bawah  mikroskop  stereoskopik
menunjukkan keberadaan nematoda betina dalam  jaringan  akar  yang  berbentuk  seperti buah pir ( pyriform ) berwarna putih mengkilat (Gambar  1c).  Hasil  identifikasi  morfologi menggunakan pola perineal nematoda betina menunjukkan  nematoda  hasil  perbanyakan merupakan M. incognita. Pola perineal yang terdapat pada spesies nematoda ini memiliki ciri  khas  dengan  lengkungan  dorsal  yang tinggi dan menyempit (Gambar 1d).
Mortalitas Nematoda pada Perlakuan Senyawa Bioaktif Senyawa  bioaktif  pada  filtrat  KPM  asal tanaman  kakao  menyebabkan  mortalitas J2 M. incognita 96%–100%. Hal tersebut dilihat  dari  tidak  bergeraknya  nematoda  J2 pada  pengamatan  24  jam  perlakuan  filtrat lalu dicuci dan diinkubasi selama 4 jam untuk menghilangkan kandungan filtrat pada nematoda. Tujuh isolat bakteri, yaitu: PMC3, PMC8, PMC13, PMS11, PMS14, PMP7, dan PMC14  memberikan  pengaruh  penekanan yang nyata terhadap J2 M. incognita dibanding- kan perlakuan kontrol (Tabel 1).
Gambar  1    Nematoda  puru  akar  hasil perbanyakan pada tanaman tomat. a, paket telur; b, puru pada akar; c, nematoda betina dewasa; dan c, pola perineal Meloidogyne incognita pada perbesaran 40 × 10.
(Figure 1  Root-knot nematodes propagated on tomato plants. a, egg package; b, knots on roots; c, adult female nematode; and c, perineal pattern of Meloidogyne incognita at 40 × 10 magnification)
a b c d
Tabel  1    Mortalitas  juvenil  (J2) Meloidogyne incognita secara  in  vitro  pada  perlakuan  filtrat tujuh klon pustaka metagenomik dan diinkubasi 4 jam setelah dibilas
(Table  1    In  vitro  mortality  of  juveniles  (J2)  of Meloidogyne  incognita  treated  with  filtrates  of seven metagenomic library clones and incubated for 4 hours after rinsing)
Kode isolat ( Isolate code ) Mortalitas terkoreksi ( Corrected mortality ) (%)*
Kontrol air ( Water control ) 0.00 a PMC3 100.00 b PMC8 98.88 b PMC13 100.00 b PMS11 100.00 b PMS14 100.00 b PMP7 95.54 b PMC14 97.89 b
*Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata pada uji Tukey α 5%. (Value followed by the same letter in the same column are not significantly different based on the Tukey α test at α 5%).significant difference in the Tukey α test of 0.05 ) .
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Sembiring et al.

## Karakteristik Fisiologi Isolat Bakteri Klon
Pustaka Metagenomik Hasil  pengujian  menunjukkan  seluruh isolat klon pustaka metagenomik tidak mampu menghasilkan  enzim  kitinase  dan  senyawa hidrogen  sianida  (Tabel  2).  Hal  ini  ditandai dengan tidak terbentuknya zona bening pada medium kitin dan tidak terjadi perubahan warna pada kertas saring (Gambar 2 a-b). Akan tetapi, semua  isolat  mampu  memproduksi  enzim protease  dengan  terbentuknya  zona  bening pada medium skim milk agar . Isolat bakteri klon  pustaka  metagenomik  PMS14,  PMC3, PMC8,  dan  PMP7  menghasilkan  senyawa protease tertinggi, yaitu 0.51–0.61 (Tabel 3).

## Keefektifan Penekanan Puru Akar Secara
In Planta Data  yang  didapat menunjukkan  seluruh isolat klon pustaka metagenomik mampu
Tabel 2  Mekanisme antagonisme secara in vitro tujuh isolat klon pustaka metagenomik asal kakao terhadap Meloidogyne incognita
(Table 2  In vitro antagonistic mechanism of seven metagenomic library isolates from cocoa against Meloidogyne incognita)
Uji fisiologis ( Physiological tests )
Kode isolat ( Isolate code ) PMC3 PMC8 PMC13 PMC14 PMP7 PMS11 PMS14 HCN - - - - - - - Kitinolitik ( Chitinolytic ) - - - - - - - Proteolitik ( Proteolytic ) + +
+ + +
+ +
Gambar 2  Karakter fisiologi isolat bakteri klon pustaka metagenomik. a, bakteri tidak menghasilkan senyawa enzim kitinase; b, bakteri tidak menghasilkan senyawa HCN; dan c, bakteri memproduksi enzim protease (terbentuknya zona bening).
(Figure 2  Physiological characteristics of bacterial isolates from metagenomic library clones. a, bacteria do not produce chitinase enzyme compounds; b, bacteria do not produce HCN compounds; and c, bacteria produce protease enzymes (clear zone formed)).
a b c
menekan keparahan puru akar secara in planta. Ketujuh  isolat  klon  pustaka  metagenomik menunjukkan  pengaruh  penekanan  yang berbeda  nyata  dibandingkan  kontrol.  Isolat PMS11 menunjukkan skala kerusakan terkecil  yakni  2.6  dengan  rata-rata  jumlah puru mencapai 53 puru pada perakaran tanaman uji. Isolat tersebut juga memiliki keefektifan  penekan  puru  sebesar  54.63% yang  merupakan  persentase  keefektifan penekanan puru akar tertinggi (Tabel 4).
Pengaruh Isolat Bakteri Terhadap Pertumbuhan Tanaman Tanaman  yang  diberi  perlakuan  filtrat senyawa bioaktif KPM menunjukkan pengaruh yang  tidak  berbeda  nyata  dengan  kontrol pada tinggi tanaman. Akan tetapi, tanaman yang diberi perlakuan filtrar senyawa bioaktif isolat PMC 8 dan PMS14 memiliki rata-rata
Tabel 3  Indeks proteolitik dari tujuh isolat klon pustaka metagenomik asal kakao pada inkubasi 24 jam (Table 3  Proteolytic index of seven metagenomic library isolates from cocoa after 24 hours of incubation)
Perlakuan
( Treatment ) Diameter koloni bakteri ( Bacterial colony diameter ) (mm) Diameter zona bening ( Clear zone diameter ) (mm) Indeks proteolitik ( Proteolytic Index ) PMS14 0 7.75 a 11.25 a 0.45 a PMC3 0 9.58 ab 13.92 abc 0.46 a PMC14 10.58 abc 12.58 ab 0.19 a PMS11 11.25 abc 16.75 cd 0.49 a PMC8 13.00 bc 19.42 de 0.50 a PMC13 13.83 c 16.08 bcd 0.16a PMP7 14.25 c 21.33 e 0.53 a
*Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata pada uji Tukey α 5%. (Value followed by the same letter in the same column are not significantly different based on based on Tukey's test at α 5%.).
Tabel 4  Keefektifan tujuh senyawa bioaktif isolat klon pustaka metagenomik asal kakao dalam menekan keparahan penyakit puru akar Meloidogyne incognita secara in planta
(Table 4  Effectiveness of seven bioactive compounds of metagenomic library clone isolates from cacao in suppressing severity of root knot disease in planta caused by Meloidogyne incognita)
Kode isolat ( Isolate code ) Jumlah puru akar per tanaman ( Number of root galls per plant ) Keefektifan penekanan puru akar ( Effectiveness of emphasis root knot )
(%)
Skala kerusakan akar a ( Scale of root damage a )
Kontrol ( Control ) 124 b 0.00 a 4.5 c PMP7 69 a 40.55 b 3.1 ab PMC8 78 a 33.65 ab 3.6 b PMS14 65 a 43.64 b 3.1 ab PMC3 72 a 36.70 b 3.1 ab PMC13 62 a 46.16 b 3.0 ab PMC14 64 a 44.58 b 2.9 ab PMS11 53 a 54.63 b 2.6 a
*Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata pada uji Tukey α 5% (Value followed by the same letter in the same column are not significantly different based on based on Tukey's test at α 5%.). a Data  telah  ditransformasikan  dengan  transformasi  logaritma. (Data  has  been  transformed  with  logarithmic transformation).
diameter batang, bobot kering tajuk, bobot kering akar, serta jumlah daun dan bunga yang berbeda  nyata  dibandingkan  dengan  kontrol. Isolat PMC8 dan PMS14 memiliki persentase peningkatan bobot kering tajuk tertinggi, yaitu mencapai 155% dan 135% dibandingkan dengan kontrol. Kedua isolat juga memberikan pengaruh yang sangat baik terhadap kecepatan dan  jumlah  bunga  yang  dihasilkan  tanaman. Kedua  isolat  juga  menunjukkan  pengaruh terhadap jumlah bunga yang terbentuk yakni,
mencapai 7.73 dan 6.27 bunga pada usia tanaman 6 minggu (Tabel 5).

## PEMBAHASAN
Nematoda M. incognita hasil perbanyakan berhasil diidentifikasi secara morfologi melalui pengamatan  pola  perineal.  Nematoda  yang diperbanyak  dari  satu  paket  telur  memiliki keragaman  spesies  yang  sama,  yaitu M. incognita . Nematoda ini memiliki ciri
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Sembiring et al.
Tabel 5  Pengaruh tujuh senyawa bioaktif isolat bakteri klon pustaka metagenomik asal kakao terhadap pertumbuhan tanaman mentimun di rumah kaca pada 6 minggu setelah tanam
(Table 5  Effect of seven bioactive compounds of metagenomic library clone bacterial isolates from cocoa on the growth of cucumber plants in the greenhouse at 6 weeks after planting)
Kode isolat
( Isolate code ) Tinggi tanaman ( Plant height ) (cm) Panjang akar ( Root length ) (cm) Diameter batang ( Stem diameter ) (cm) Bobot kering tajuk ( Shoot dry weight ) (g) Bobot kering akar ( Root dry weight ) (g) a Jumlah daun ( Number of laves ) Jumlah bunga ( Number of flowers ) a Kontrol ( Control ) 239.60 a 15.86 a 0.37 a 3.84 a 0.14 a 20.07 a 0.20 a PMP7 237.60 a 21.16 abc 0.50 bc 6.52 cd 0.27 bc 21.73 ab 3.53 bc PMC8 229.80 a 22.21 abc 0.45 b 7.75 d 0.35 cd 22.40 b 7.73 c PMS14 222.93 a 24.08 bc 0.53 bc 7.15 cd 0.47 e 22.47 b 6.27 bc PMC3 224.87 a 28.09 c 0.56 c 6.27 bc 0.44 de 22.00 ab 4.33 bc PMC13 227.87 a 22.87 abc 0.56 c 4.96 ab 0.38 de 21.93 ab 4.93 bc PMC 14 230.87 a 19.92 ab 0.56 c 5.05 ab 0.26 b 21.27 ab 2.73 b PMS11 226.53 a 16.24 a 0.48 bc 3.93 a 0.23 b 19.80 a 0.27 a
Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata pada uji Tukey α 5%.  ( Value followed by the same letter in the same column are not significantly different based on based on Tukey's test at α 5%).
a Data telah ditransformasikan dengan transformasi logaritma. (Data has been transfomed with logarithmic transformation).
morfologi  khas  pada  daerah  perinealnya yakni  berupa  struktur  oval  bersudut  dengan lengkungan  dorsal/punggung  yang  tinggi berbentuk V terbalik (Uysal et al. 2017). Seluruh  isolat  bakteri  klon  pustaka metagenomik  berpotensi  sebagai  agens  pe- ngendali M. incognita secara in vitro, yaitu PMC3,  PMC8,  PMC13,  PMS11,  PMS14, PMP7,  dan  PMC14.  Isolat  bakteri  tersebut mampu  menghasilkan  enzim  protease yang  mampu  mematikan  nematoda  dengan presentase  yang  tinggi.  Hal  tersebut  dapat terlihat  dengan  terbentuknya  zona  bening pada medium skim milk agar (SMA) akibat aktivitas  lisisnya  medium  tersebut.  Enzim protease dapat mendegradasi protein yang ber- hubungan dengan organ dalam dan kutikula, serta  penghalang  fisik  yang  melindungi nematoda (Geng et al. 2016). Menurut Tikhonove et al. (2002) enzim protease akan menghancurkan  cangkang  telur  dan  kutikula nematoda.  Berdasarkan  penelitian  yang  di- lakukan  Thongkaewyuan  dan  Chairin  (2018), pemberian ekstrak kasar enzim protease dari cendawan Metarhizium guizhouense meng- akibatkan tidak terdeteksi adanya kandungan
protein  pada  telur  dan  J2  nematoda  yang telah  diberikan  perlakuan  tersebut.  Hal  ini menyebabkan terjadinya pembengkakan pada telur. Enzim protease juga akan menyebabkan cangkang telur nematoda kehilangan bentuknya akibat  lapisan  lipid  bagian  dalam  luruh  dan lapisan  kitin  bagian  tengah  menjadi  tipis (Khan et al. 2004). Senyawa  bioaktif  yang  dihasilkan  oleh bakteri klon pustaka metagenomik mampu menekan keparahan penyakit pada pengujian skala  rumah  kaca.  Seluruh  isolat  berpotensi dapat  menekan  keparahan  penyakit  dengan keefektifan berkisar  33.65%  hingga  54.63%. Hal tersebut dikarenakan senyawa bioaktif yang dihasilkan bakteri klon pustaka metagenomik dapat  menghasilkan  berbagai  efek  biologis, seperti  senyawa  yang  dapat  meningkatkan toleransi  tanaman  terhadap  patogen  maupun cekaman  lingkungan  (Doty et al. 2017). Salah  satu  mekanisme  yang  dilakukan  untuk menginduksi  ketahanan  tanaman  terhadap patogen ialah melaui induction of the immune system respon (ISR) pada tanaman inang (Nakkeeran et al. 2019).
Pengaruh  senyawa  bioaktif  isolat bakteri  klon  pustaka  metagenomik  terhadap pertumbuhan tanaman mentimun ditunjukkan dengan  perbedaan  nyata  karakter  agronomis tanaman  mentimun  yang  diberikan  perlakuan dengan tanaman kontrol tanpa perlakuan. Tanaman  yang  diberi  perlakuan  memiliki karakter  akar  yang  lebih  panjang,  diameter batang  yang  lebih  besar,  dan  bobot  kering yang lebih berat, serta jumlah daun dan bunga yang  lebih  banyak.  Hal  tersebut  disebabkan adanya senyawa plant growth promoting yang terkandung  dalam  senyawa  bioaktif  isolat bakteri klon pustaka metagenomik. Beberapa genus  bakteri  dapat  menghasilkan  senyawa plant growth promoting dan menginduksi ketahan  tanaman.  Bakteri  yang  banyak  ber- peran  sebagai  antimikroba  di  antaranya  dari genus Bacillus dan Pseudomonas. Bacillus spp. dapat menghasilkan banyak senyawa bioaktif seperti, senyawa volatil dan senyawa organik non  volatil.  Bakteri  ini  memiliki  sekitar 4.5%–15.4%  dari  seluruh  genomnya  yang berkembang menyintesis senyawa antimikroba serta senyawa bioaktif lainnya tergantung dari spesies  dan  strainnya  (Andric et al. 2020). Pseudomonas spp. memiliki spesies dan strain yang mampu menghasilkan senyawa bioaktif yang  berperan  sebagai  agens  biokontrol pengendali  penyakit  tanaman, plant growth promoting ,  dan  induksi  sistem  ketahan tanaman  (Couillerot et al. 2009). Hal ini disebabkan spesies dari genus ini memiliki genom  pengkode  senyawa  bioaktif  yang mensintesis  senyawa  antimikroba,  siderofor, biosurfaktan,  dan  lainnya  (Andreolli et al. 2018).

## DAFTAR PUSTAKA
Andreolli M, Zapparoli G, Angelini E, Lucchetta  G,  Lampis  S, Vallini  G.  2018. Pseudomonas protegens MP12: a plant growth-promoting endhophytic bacterium with  broad-spectrum  antifungal  activity againts  grapevine  phytopathogens. Microbiological  Research.  219(2019): 123–131.  DOI:  https://doi.org/10.1016/j. micres.2018.11.003.
Andric S, Meyer T, Ongena M. 2020. Bacillus responses  to  plant-associated  fungal and bacterial communities. Frontiers in Microbiology . 11(1350):1–9. DOI: https:// doi.org/10.3389/fmicb.2020.01350 . Baehaki  A,  Budiman  A.  2011.  Isolasi  dan karakterisasi  protease  dari  bakteri  tanah rawa  Indralaya,  Sumatera  Selatan.  Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. 22(1):37–42.
Barker  KR.  1985.  An  Advanced  Treatise on  Meloidogyne,  On  Methodology  Vol 2. Raleigh  (NC):  North  Carolina  State University.
Borneman  J,  Skroch  PW,  O’Sullivan  KM, Palus  JA,  Rumjanek  NG,  Jansen  JL, Nienhuis J, Triplett EW. 1996. Molecular microbial diversity of an agricultural soil in  Wisconsin.  Applied  Environmental Microbiology.  62(6):1935–1943.  DOI: https://doi.org/10.1128/aem.62.6.1935- 1943.1996.
Carolan  K,  Helps  J,  van  den  Berg  F,  Bain R,  Paveley  N,  van  den  Bosch  F.  2017 Extending  the  durability  of  cultivar resistance  by  limiting  epidemic  growth rates. Proceeding of the Royal Society B: Biological Sciences . 284:1–8. DOI: http:// dx.doi.org /10.1098/rspb.2017.0828. Chen  D, Wang  D,  Xu  C,  Chen  C,  Li  J, Wu W,  Huang  X,  Xie  H.  2018.  Nematicidal protease  genes  screened  from  a  soil metagenomic library to control Radopholus similis mediated  by Pseudomonas fluorescens pf36.  Applied  Microbiology and  Biotechnology . 102(7):3301–3314. DOI:  https://doi.org/10.1007/s00253-018- 8869-9.
Cortes-Lopez  NG,  Ordonez-Baquera  PL, Dominguez-Viveros  J.  2020.  Molecular tool  used  for  metagenomic  analysis. Review.  Revista  Mexicana  de  Ciencias Pecuarias . 11(4):1150–1173. DOI: https:// doi.org/10.22319/rmcp.v11i4.5202.
Couillerot O, Prigent-Combaret C, Caballero- Mellado  J,  Moenne-Loccoz  Y.  2009. Pseudomonas fluorescens and closely-related fluorescent  pseudomonas  as  biocontrol agents  of  soil-borne  phytopathogens. Letters  in  Applied  Microbiology.  48(5):
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Sembiring et al.
505–512. DOI: https://doi.org/10.1111/
j.1472765X.2009.02566.x . Doty SL, Freeman JL, Cohu CM, Burken JG, Firrincieli A, Simon A, Khan Z, Isebrands JG, Lukas J, Blaylock MJ. 2017. Enhanced degradation  of  TCE  on  a  superfund  site using  endophyte-assited  poplar  tree phytoremediation. Environmental Science and Technology . 51(17):10050–10058. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.est.7b01504.
Efendi  E,  Supramana,  Giyanto.  2021.
Potensi isolat bakteri asal gambut sebagai agens pengendali nematoda puru akar Meloidogyne incognita . Jurnal Fitopatologi Indonesia. 17(6):243–250. DOI: h t t p s : / / d o i . o r g / 1 0 . 1 4 6 9 2 / j f i . 17.6.243-250 . Eisenback  JD,  Hirschman  H,  Sasser  JN, Triantaphyllou AC. 1981. A Guide to The Four Most Common Species of Root-Knot Nematodes ( Meloidogyne spp.),  With a  Pictural  Key.  Washington  DC  (US): Cooperative  Publication  Departement of  Plant  Pathology  and  US  Agency International Development.
Geng C, Nie X, Tang Z, Zhang Y, Lin J, Sun M, Peng D. 2016. A novel serine protease, Sep1,  from Bacillus  firmus DS-1  has nematicidal activity and degrades multiple intestinal-  associated  nematode  proteins. Scientific Reports. 6:25012. DOI: https:// doi.org/10.1038/srep25012.
Hariprasad P, Divakara S, Niranjana S. 2011. Isolation and characterization of chitinolitic bacteria for the management of Fusarium wilt in tomato. Crop Protectection. 30(12): 1606–1612.  DOI:  https://doi.org/ 10.1016/j. cropro.2011.02.032.
Khan  A,  Williams  KL,  Nevalainen  HKM. 2004.  Effects  of Paecilomyces lilacinus protease  and  chitinase  on  the  eggshell structures  and  hatching  of Meloidogyne javanica juveniles.  Biological  Control. 31(3):346–352.  DOI:  https://doi. org/10.1016/j.biocontrol.2004.07.011. Luc  M,  Sikora  RA,  Bridge  J.  2005.  Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical  Agriculture.  Wallingford  (GB): CABI Publishing.
Muharni, Widjajanti H. 2011. Skrining bakteri kitinolitik antagonis terhadap pertumbuhan jamur  akar  putih  ( Rigidoporus lignosus ) dari  rizosfir  tanaman  karet.  Jurnal Penelitian Sains. 14(1):51–56.
Munif  A,  Hallmann  J,  Sikora  RA.  2013. The  influence  of  endophytic  bacteria  on Meloidogyne  incognita  infection  and tomato plant growth. Journal International Society  for  Southeast  Asian  Agricultural Sciences. 19(2):68–74.
Mursyalatiyus  IDE.  2018.  Potensi  bakteri endofit  asal  tanaman  tembakau  sebagai agens biokontrol nematoda puru akar ( Meloidogyne spp.)  [tesis].  Bogor  (ID): IPB University. Nakkeeran  S,  Vinodkumar  S,  Senthiraja  C, Renukadevi  P.  2019.  Antimicrobial peptides of Bacillus species: Biosynthesis, mode  of  action  and  their  role  in  plant disease  management.  Di  dalam:  Pandey RN, Chakraborty BN, Singh D, Sharma P, editor. Microbial Antagonists: Their Role in  Biological  Control  of  Plant  Diseases. New  Delhi  (IN):  Today  &  Tomorrow’s Printers and Publishers. hlm 487–514.
Permana  I.  2018.  Analisis  fungsional  dan genetik klon pustaka metagenom asal tanaman kakao ( Theobroma cacao ) sebagai penginduksi resistensi tanaman [skripsi]. Bogor (ID): IPB University.
Sastrini T. 2016. Konstruksi dan analisis pustaka metagenom yang mengekspresikan senyawa  bioaktif  untuk  mengendalikan Xanthomonas oryzae pv. oryzae [tesis]. Bogor (ID): IPB University. Sessitsch A, Hardoim P, Döring J, Weilharter A, Krause A, Woyke T, Mitter B, Hauberg- Lotte  L,  Friedrich  F,  Rahalkar  M et al . 2012.  Functional  characteristics  of  an endophyte  community  colonizing  rice roots as revealed by metagenomic analysis. Molecular Plant Microbe Interaction. 25(1):28–36. DOI: https://doi.org/10.1094/ MPMI-08-11-0204.
Thongkaewyuan  A,  Chairin  T.  2018.
Biological of Meloidogyne incognita by Metarhizium guizhouense and its protease.
Biological control . 126:142–146. DOI:
h t t p s : / / d o i . o r g / 1 0 . 1 0 1 6 / j . biocontrol.2018.08.005.
Tikhonove  VE,  Lopez-Llorca  LV,  Salinas J,  Jansson  HB.  2002.  Purification  and characterization  of  chitinases  from the  nematophagous  fungi Verticillium chlamydosporium and V. suchlasporium . Fungal  Genetics  and  Biology.  35(1): 67–78.  DOI:  https://doi.org/10.1006/ fgbi.2001.1312.
Trudgill  DL,  Blok  VC.  2001.  Apomictic, polyphagous root-knot nematodes:
exceptionally  successful  and  damaging biotrophic root pathogens. Annual Review Phytopathology.  39:53–77.  DOI:  https:// doi.org/10.1146/annurev.phyto.39.1.53.
Uysal  G,  Sogut  MA,  Elekcioglu  IH.  2017. Identification  and  distribution  of  root- knot nematode species ( Meloidogyne spp.)  in  vegetable  growing  areas  of  lake region  in  Turkey.  Turkish  Journal  of Entomology . 41(1):105–122. DOI: https:// doi.org/10.16970/ted.91225. Wei G, Kloepper JW, Tuzun S. 1991. Induction of  systemic  resistance  of  cucumber  to Colletotrichum orbiculare by select strains of  plant  growth-promoting  rhizobacteia. Phytopathology. 81(11):1508–1512. DOI: https://doi.org/10.1094/Phyto-81-1508 .