## Pengembangan Protokol  Isolasi DNA Genom Tanaman Durian Dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB

## Sundari
1, 2 Pendidikan Biologi, Universitas Khairun, Ternate * Corresponding authors : e-mail: sundariunkhair08@gmail.com Manuscript received: 27-07-2017 Revision accepted: 22--09-2017

## Abstrak
Protokol  dan  metode  sederhana,  efisien  untuk  isolasi    DNA  genom  tanaman  durian      yang  banyak mengandung  phenol  dan  residu  polisakarida  telah  dihasilkan.  Pada  penelitian  ini,  digunakan    protokol isolasi  DNA  tumbuhan    dengan  metode  CTAB  yang  dimodifikasi  sebagai  protokol  yang    efisien  untuk membuang  polisakarida,  phenol    dan    lendir  yang  sangat  melimpah  pada  tanaman  durian.  Obyek penelitian ini  terdiri dari protocol CTAB yang dimodifikasi   tahap inkubasi dan presipitasi   pemurnian DNA genom dari phenol dan polisakarida. Perbandingan 2  protokol  isolasi  DNA durian dengan CTAB standard  an  CTAB  modifikasi    menunjukkan  bahwa  metode    CTAB  modifikasi  menghasilkan    whole genom durian cukup murni rata rata 1,99 dan berhasil diamplifikasi  dengan PCR-RAPD.
Kata kunci: isolasi, DNA, polisakarida, CTAB, modifikasi, .

## Abstract
The simple and efficient  method for genomic DNA isolation protochol from durian , its woody fruit crops containing high polysaccharide levels has been described here. In the present study, using modified CTAB for  plant  DNA  isolation  protocols  were  studied  for  removing  the  highly  concentrated  polysaccharides from genomic DNA of woody fruit crops.This method involves the modified CTAB   at the incubate  and precipitate  procedure  employing  DNA  purification    step  to  remove  polysaccharides  and  phenol  residu. Compared with the two  studied DNA  isolation protocols of  durian using standart CTAB and modified CTAB  the everage yield  high quality DNA whole genom is 1,99 purity and DNA was suitable for PCR and RAPD analyses.
Keyword: isolation, DNA,  polysaccharides,  phenol residu, CTAB

## PENDAHULUAN
Salah satu upaya  dalam  program pemuliaan tanaman buah tropis di Indonesia pada saat ini adalah  kajian  keanekaragaman  dan    kekerabatan  genetic.  Diharapkan  melalui  kajian  ini  dapat diketahui  jarak  genetic  untuk  digunakan  sebagai  acuan  dalam  persilangan  antar  kerabat sehingga  diperoleh    sifat  unggul.  Beberapa  jenis  buah  tropis  yang  menjadi  focus    program pemuliaan tanaman adalah : mangga ( Mangifera indica L.) jeruk ( Citrus spp.), Leci ( Litchi chinensis
E-ISSN-2580-7129 Print- ISSN-1978-610X

## JURNAL TECHNO (JURNAL ILMU EKSAKTA)
Jurnal homepage : http://ejournal.unkhair.ac.id/index.php/Techno Volume 06 Nomor 02 Oktober 2017
S.), sirsat ( Annona squasoma L.), jambu (Pisidium guajava L.),pisang ( Musa spp.), delima  ( Punica granatum L)  Jojoba  ( Zizypus mauritiana M.), papaya ( Carica papaya L.), Nanas ( Ananas comosus L.) dan  durian (Durio zibethinus).  Sebagian besar tanaman ini merupakan jenis tanaman tahunan, berkayu, dan mengandung banyak komponen  polysaccharida.
Isolation DNA dengan kualitas tinggi merupakan hal yang esensial dalam riset  molekuler dan keanekaragaman  genetic.  Kontaminasi  Polysaccharida  merupakan  salah  satu  problem  dalam kegiatan  isolasi  DNA    pada  tanaman  berkayu.  Sampel  DNA  dari  tanaman  berkayu  sering terkontaminasi oleh polisakarida, fenol, dan derivatnya yang sangat mengganggu kualitas DNA genom yang dihasilkan (Fang et al. 1992; Porebski et al. 1997; Schlink and Reski 2002),  Kualitas DNA  genom  yang  dihasilakan  selama  isolasi  akan  mempengaruhi  daya  simpan  DNA  dan munculnya  enzim  dan  inhitor  pada  saat  tahap  amplifikasi  DNA  dan  sekuensing    (Lodi  et al.1994; Sharma et al. 2002).
Cetyl  Trimethyl  Ammonium  Bromide (CTAB)  merupakan  metode  yang  umum  digunakan  dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol (Lumaret et al. 1998; Jose dan Usha 2000). Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan  dinding  sel  (lisis),  pemisahan  DNA  dari  bahan  padat  seperti  selulosa  dan  protein, serta pemurnian DNA (Nicholl 1993; Surzycki 2000). Protokol isolasi DNA pada saat ini sudah banyak  dikembangkan  namun  protocol  tersebut  masih  bersifat  universal  bagi  tanaman  atau hewan  dan  mikroorganisme.  Beberapa  protocol  isolasi  DNA  dalam  paket  miniprep    kit  DNA extraction  untuk  tanaman  sudah  dilengkapi  dengan  bahan  dan  kolom  pembersih  polisakarida (Porebski et al. 1997; Schlink and Reski 2002) .
Pada  beberapa  jenis  tanaman  buah  tropis  masih  sangat  sulit  memisahkan  kontaminan polisakarida  dan  derivatnya  selama  proses  isolasi  DNA  sehinnga  proses  amplifikasi  DNA dengan PCR – RAPD, RFLP  maupun SSR menghasilan pita DNA yang sangat sedikit bahkan ada  yang  gagal  dalam  amplifikasi  DNA  (Luro  et  al.  1995;  .Porebski  et  al.  1997).  Tujuan penelitaian  ini  adalah  untuk  megembangkan  teknik  isolasi  DNA  genom  dari  tanaman  durian yang  merupakan  tanaman  berkayu  dan  berlendir  tinggi  dimodifikasi  dari  protocol  CTAB standar, modifikasi difokuskan pada menghilangkan kontaminan residu fenol dan polisakarida dari DNA melalui presipitasi PCI dan penamjangan waktu inkubasi.

## BAHAN DAN METODE
Bahan yang digunakan adalah  sampel  daun muda tanaman  durian lokal asal Ternate. Bahan lain yang digunakan adalah  Nitrogen cair,  Bufer CTAB CTAB (CTAB: 4,1 g NaCl, 10 g CTAB, 0,5 M EDTA pH 8,0, 18,61 g disodium etilendiamin tetra asetat 2H2O, 1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 g Trisma Base , 1,40 M NaCl, 29,22 g sodium khlorida, 2% PVP dan 0,20% ß-mercaptoetanol)., pvp,
ß-mercaptoetanol,  buffer  TE,  buffer  EDTA,  befer  TBE,  primer  RAPD  1-5  yang  mempunyai untaian nukleotida RAPD1, RAPD2, RAPD3, RAPD4, RAPD5, RAPD6, 3000 kb DNA ladder .

## Prosedur isolasi  DNA Genom
Isolasi DNA genom dari  sampel  daun durian lokal Ternate menggunakan metode CTAB (Doyle & Doyle, 1990  dan metode CTAB yang dimodifikasi peneliti). Sebanyak 0,05 gram daun segar digerus dengan mortal pistil steril dengan nitrogen cair dan ditambahkan buffer ekstrak {CTAB 2% , 1 M Tris-HCl (pH 8), 0,5M EDTA (pH 8),5 M NaCl, 7,5 M Amonium sulfat, dan 0,1 mg/µL RNAse } kemudian ditambahkan   2% β  mercaptoetanol, dan selanjutnya  inkubasi  suhu 60 0 C selama  30  menit,      kemudian  di  sentrifuse  pada  suhu  4 0 C,  13.000  rpm  selama  10  menit, Supernatan  ditambahkan  PCI  (phenol:  Chloroform:  Isoamilalkohol)  25:24:1  dan  disentrifuse pada  suhu  4 0 C,  13.000  rpm  selama  10,  selanjutnya  supernatan  ditambah  dengan  CI (chloroform:Isoamilalkohol)  24:1dan  disentrifuse  pada  suhu  4 0 C,  13.000  rpm  selama  5  menit, supernatan  dipindahkan  ke  tabung  ependof  baru  dan  ditambahkan  amonium  sulfat  7,5M sebanyak  0,1  volume  supernatan  mixgentle  dan  ditambahkan  alkohol  absolut  sebanyak  2,5 volume  supernatan  dan  dikocok,  selanjutnya  diinkubasi  pada  suhu  -20 0 C  selama    2    jam, selanjutnya  sentrifuge  selama  15  menit  pada  suhu  4 0 C  13.000  rpm,  kemudian  supernatan dibuang  dan  pelet  ditambah  alkohol  70%  sebanyak  500µL  dan  disentrifuse  selama  15  menit, buang supernatan dan pelet dikeringanginkan selama 1 jam selanjutnya ditambahkan buffer TE (pH  8)  sebanyak  50  µL dan  DNA  durian  siap  disimpan  pada  suhu  -20 0 C  untuk  jangka waktu lama.
Catatan :  modifikasi  CTAB  yang  dilakukan  peneliti  adalah  modifikasi  :1)  Konsentrasi  Bufer CTAB menjadi 3%; 2)  konsentrasi β mercaptoetanol menjadi 3%; 3) waktu inkubasi suhu 60 0 C dengan  3% β mercaptoetanol diperpanjang menjadi 180 menit; 4) proses pencucian dengan PCI menjadi 3- 4  kali cuci, dan 5) inkubasi suhu -20 0 C menjadi 18 jam.

## Kuantifikasi DNA Menggunakan Elektroforesis
DNA  dikuantifikasi  menggunakan  elektroforesis  pada  agarose  gel  1,5%.  Prosesnya,  1μl  stok DNA dicampur dengan 9 μl air suling dan 2μl loading dye . Campuran contoh lalu dimasukkan ke dalam sumuran gel dalam kamar elektroforesis yang telah diisi bufer TBE 1x ( Trisma Base , boric acid ,  dan  0,5  M  EDTA  pH  8,0).  Sebagai  pembanding  digunakan  marker  DNA ladder yang diletakkan  pada  sumur  pertama  kemudian  elektroforesis  dijalankan  pada  tegangan  70  volts sampai  DNA  bermigrasi/bergerak  lebih  kurang  1  cm  di  atas  batas  bawah.  Selanjutnya visualisasi  dengan  GelDoc  Uvtransluminator,  sedangkan  uji  kuantitatif  dilakukan  dengan mengukur konsentrasi dengan spektronanodrop.

## Amplifikasi RAPD PCR
Reaksi  amplifikasi  DNA  dengan  menggunakan  PCR  merk  Takara.  Jumlah  koktail  PCR    yang digunakan  adalah  10  µL  dengan  komposisi  5  µL  PCR  mix  merk  INTRON;  3  µL  DdH 2 O;  1  µL
Sundari. ISOLASI, DNA, POLISAKARIDA, CTAB, MODIFIKASI
primer  OPA  (1,  dan  19)  dan  1  µL  DAN  template.  Pengaturan  program  PCR  yang  digunakan adalah  sebanyak  45  siklus  yang  terdiri  dari  fase  Pradenaturasi    suhu  94 0 C  selama    5  menit; Denaturasi  suhu  94 0 C  selama    30  detik;   Anealing  suhu  37 0 C  selama    30 detik;    Ekstensi  suhu 72 0 C  selama    90  detik;  dan  Post  Ekstensi  suhu    72 0 C  selama    7  menit.  Selanjutnya  dilakukan tahap  elektroforesis  untuk  visualisasi  hasil  amplifikasi  DNA  durian  menggunakan  penanda molekuler  RAPD  dengan  menggunakan  2  primer  (Tabel  1).  Untuk  membandingkan  ukuran pasang  basa  antar  pita  DNA  hasil  amplifikasi  digunakan  marker  DNA  1000bp  plus  merk INTRON.
Tabel 1. Sekuen primer  OPA
Primer Seq 5 to 3 OPA-1 CAG GCC CTT C OPA-19 CAA ACG TCG G
Selanjutnya  hasil PCR ,  di elektroforesis  dengan  dimasukkan dalam sumuran gel 1,5% dalam kamar elektroforesis yang sudah diisi bufer TBE 1x, diisikan satu sumuran pertama dengan 3000 bp DNA ladder .Setelah itu elektroforesis dijalankan dengan daya 70 volt  sampai penanda loading dye berada sekitar 1 cm di atas batas gel bagian bawah.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Data  hasil    penelitian  ini  berupa  profil    DNA  genom  tanaman  durian  hasil  isolasi  dengan menggunakan  protocol isolasi DNA CTAB (Doyle &Doyle, 1990) dan CTAB modifikasi seperti gambar 1 dan 2 berikut:
Gambar 1: DNA durian (metode CTAB)              Gambar 2: DNA durian (CTAB modifikasi)
Profil  DNA  genom  tanaman  durian  dengan  protocol  CTAB  (Doyle&Doyle,  1990)  (gambar  1) Nampak  bahwa  DNA  genom  yang  dihasilkan  pada  10  sampel  tanaman  durian  mengalami smear dan DNA yang dihasilkan sangat tipis. Pada gambar 2 nampak bahwa DNA genom yang dihasilkan  dengan  protocol  CTAB  modifikasi  lebih  tebal  di  atas  namun  masih  terdapat  sisa kontaminasi  RNA  di  bawah.  Selanjutnya  data  konsentrasi  dan  kemurnian  DNA  seperti  pada table 2 berikut:

## Tabel 2. Data Kemurnian DNA Genom pada tanaman durian
Nomor Sampel Komurnian (metode CTAB) Kemurnian (CTAB modifikasi) 1 T1 2,10 1,79 2 T2 2,13 1,90 3 T3 0,99 1,99 4 T4 2.44 1,99 5 T5 2.11 2,01 6 T6 1,01 2,02 7 T7 1,02 2,05 8 T8 1,01 1,99 9 T9 2,10 1,02 10 T10 1,20 1,89
Hasil isolasi DNA genom tanaman durian dengan metode isolasi dengan CTAB menghasilkan DNA  dengan  kemurnian  yang  rendah  artinya  masih  terdapat  kontaminasi  polisakaridasi  dan phenol. Kemurnian DNA genom hasil isolasi  dengan protocol CTAB modifikasi  menunjukkan nilai yang mendekati DNA murni yaitu 1,90. DNA yang mengandung basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan  protein  atau  phenol  dapat  menyerap  cahaya  pada  280  nm.  Dengan  adanya perbedaan  penyerapan  cahaya  UV  ini,  kemurnian  DNA  dapat  diuji  secara  kuantitatif  dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm (Aras, dkk., 2003). Kemurnian DNA ditentukan dengan estimasi rasio absorbansi pada 260 nm sampai 280 nm (Å 260/ Å 280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1,8-2,0. (Sambrook, 2001).
Pada umumnya isolasi DNA pada tahap awal menggunakan nitrogen cair untuk melisis dinding sel  dapat  mengeluarkan  semua  isi  sel,  selanjutnya  ditampung  dalam  larutan  penyangga  yang berisi  Tris  HCl  dan  EDTA.  Namun    dinding  sel  juga  dapat  dipecahkan  dengan  penggerusan menggunakan  bufer  ekstraksi  diikuti  dengan  penghangatan  pada  suhu  65°C.Bahan  detergen seperti  sodium  dodecil  sulfat  (SDS),  sarkosil,  dan  CTAB  dapat  digunakan  untuk  proses  lisis (Subandiyah  ,2006).  Penggunaan  bufer  CTAB  sebagai  pengganti  nitrogen  cair  untuk  ekstraksi dapat  menghasilkan  produk  DNA  yang  berkualitas  yang  ditunjukkan  oleh  pita  DNA  genom (Gambar  1  dan  2).  Produk  isolasi    DNA  yang  berkualitas  baik  ditunjukkan  dengan  pita  DNA yang  terlihat  tebal  dan  bersih  bila  divisualisasi  menggunakan  gelDoc  elektroforesis.  Setelah proses elektroforesis DNA genom dan dihasilkan pita DNA yang berkualitas dilanjutkan proses PCR, yaitu metode in vitro yang secara cepat dapat  mengcopi sekuen-sekuen DNA target yang ada  di  dalam    whole  genom  DNA.  Selanjutnya  dilakukan  amplifikasi  DNA  dengan menggunakan PCR-RAPD dengan 2 primer OPA 1dan OPA 19. Hasil amplifikasi DNA seperti gambar 3 dan 4 berikut:
Sundari. ISOLASI, DNA, POLISAKARIDA, CTAB, MODIFIKASI
Gambar  3 : Profil RAPD Polimorfisme dari 10 sampel durian  dengan primer  OPA 1 (gambar kiri );  dan OPA 19 ( gambar kanan)
Profil  DNA  genom  hasil  amplifikasi  PCR-RAPD  dengan  metode  CTAB  modifikasi  seperti gmabar 4 berikut:
Gambar  4 : Profil RAPD Polimorfisme dari 10 sampel durian  dengan primer  OPA 1 (gambar kiri );  dan OPA 19 ( gambar kanan)
PCR-RAPD  menunjukkan bahwa protocol standar CTAB tidak efektif untuk proses amplifikasi DNA durian, hal ini dapat dilihat pada gambar 3 pita DNA yang terbentuk pada primer OPA 1 sangat jarang hamper tidak ada, sedangkan pada penggunaan OPA 19 terdapat 5 sampel DNA yang  dapat teramplifikasi dan sisanya kosong. Pada produk PCR-RAPD dengan menggunakan protocol CTAB modifikasi diketahui pada primer OPA 1terdapat 9 sampel DNA yang berhasil teramplifikasi dan pada primer OPA 19 terdapat 10 sampel DNA yang teramplifikasi. Produk PCR  akan menjadi DNA awal. Sekitar 105 kopi dari sekuen DNA target dengan mudah dapat divisualisasikan  sebagai  pita  diskret  dengan  ukuran  spesifik  ketika  diseparasi  pada elektroforesis gel agarose (Tridjatmiko, 2006).
Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) yaitu teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan  pada  amplifikasi  dari  segmen-segmen  DNA  acak  yang  menggunakan  primer tunggal  yang  sekuen  nukleotidanya  ditentukan  secara  acak.  Primer  tunggal  ini  biasanya berukuran  10  basa.  PCR  dilakukan  pada  suhu  anealing  yang  rendah  yang  memungkinkan
primer  menempel  pada  beberapa  lokus  pada  DNA.  Aturan  sederhana  untuk  primer  adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Subandiyah,  2006).
Pola pita DNA tanaman  durian yang dihasilkan dari isolasi DNA  menggunakan CTAB standar disajikan pada Gambar 3, sedangkan hasil isolasi DNA tanaman durian dengan menggunakan protocol CTAB modifikasi bufer yang berisi 3% CTAB, 1 M NaCl, 3% β - mercaptoetanol, dan 4% PVP  10    disajikan  pada  Gambar  4.  Bila  kedua  gambar  tersebut  dibandingkan  maka  pola  pita DNA  yang  dihasilkan  memiliki  ketebalan  yang  tidak  sama.  Dengan  demikian,  bufer  CTAB modifikasi  cukup  memenuhi  syarat  untuk  digunakan  dalam  isolasi  DNA  dari  tanaman  yang mengandung  karbohidrat  dan  fenol  tinggi  karena  tidak  merusak  DNA.  Bufer  CTAB  dengan kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel (Porebski et al . 1997; Surzycki 2000), sedangkan PVP dapat mengurangi broning akibat kandungan fenol pada daun muda (Porebski et al . 1997).

## KESIMPULAN
Teknik  isolasi  DNA  pada  tanaman  berkayu  memerlukan  protocol  yang  spesifik.  Protocol tersebut  dapat  dikembanagkan  dari  protocol  standar  yaitu  CTAB.  Pemisahan  DNA  dari kontaminan  seperti  protein,  lemak,  dan  karbohidrat  dapat  dilakukan  saat  isolasi  dengan modifikasi konsentrasi bahan, waktu inkubasi dan teknik presipitasi. Penggunaan bufer CTAB ditambah 3% β-mercaptoetanol dan PVP mampu mengurangi broning.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terimaksih  tak  terhingga  kepada  Dr.  Yayuk  Muliati,  M.Si  dan  Abdu Mas’ud M.Pd yang telah membantu pelaksanaan isolasi DNA, pemotretan gelDoc dan analisis data molekuler PCR-RAPD selama penelitian.

## REFERENCES
Aras,  S.,  A.  Duran  &  G.  Yenilmez.  2003.  Isolation  of  DNA  for  RAPD  Nalysis  From  Dry  leaf Material of some Hesperis L. specimens. Plant Molecular Biology Reporter. 21: 461a- 461f
Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15. Fang, G,
S.  Hammar  and  R.  Grumet.  1992.  A  quick  and  inexpensive  method  for  removing polysaccharides from plant genomic DNA. BioTechniques 13:52-57.
Fang  G,  Bammar  S,  Grumnet  R.  1992.  A  quick  and  inexpensive  method  for  removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biofeedback 13: 52-54.
Jose,  J.  and  R.  Usha.  2000.  Extraction  of  geminiviral  DNA  from  a  highly  mucilaginous  plant ( Abelmoschus esculentus ). Plant Mol. Biol. Rep. 18: 349-355.
Lodhi MA, Ye GN, Weeden NF, Reisch BI. 1994. Simple and efficientmethod for DNA extractions from grape vine cultivars and Vitis species. Plant Mol Biol Rep 12: 6-13.
Luro  FM,  Lorieux  JM,  Laigret  Bove,  Ollitrault  P.  1995.  Genetic  mapping of  an  integenric Citus hybrid using molecular markers. Fruit 49: 404-408.
Lumaret, R., H. Michaud, J.P. Ripoll, and L. Toumi. 1998. Chloroplast DNA extraction procedure for species high in phenolics and polysaccharides. p. 15-17. In A. Karp, P.G.
Nicholl, D.S.T. 1993. An Introduction to Genetic Engineering. Department of Biological Science, University of Praisly.
Porebski, S., L.G. Baily, and B.R. Baum. 1997. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for  plants  containing  high  polysaccharide  and  polyphenol  components.  Plant  Mol.  Biol. Rep. 15: 8-15.
Porebski  S,  Bailey  LG,  Baum  BR.  1997.  Modification  of  a  CTAB  DNA  extraction  protocol  for plants  containing  high  polysaccharide  and  ployphenol  components.  Plant  Mol  Biol  Rep 15: 8-15.
Isaac,  and  D.S.  Ingram  (Eds.).  Molecular  Tool  for  Screening  Biodiversity.  Chapman  and  Hall, London Schlink K, Reski R. 2002. Preparing high-quality DNA from Moss ( Physcomitrella patens ). Plant Mol Biol Rep 20: 423a-423f.
Sambrook  J,  Fritsch  EF,  Maniatis  T.  1989.  Molecular  Cloning  a  Laboratory  Manual.Edisi  ke-2.
Cold  Spring  Harbor  Laboratory.  New  York  Sharma  AD,  Gill  PK,  Singh  P.  2002.  DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharide-rich plants. Plant Mol Biol Rep 20: 415a- 415f.
Subandiyah,  S.  2006.  Polymerase  Chain  Reaction  untuk  Deteksi  atau  Identifikasi  Patogen Tumbuhan.  Beberapa  Metode  Ekstraksi  DNA.  Pelatihan  dan  Workshop  Identifikasi DNAdengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 43-50.
Surzycki,  S.  2000.  Basic  Techniques  in  Molecular  Biology.  Springer-Verlag,  Berlin,  Heidelberg, New York.
Tridjatmiko,  K.R.  2006.  Penggunaan  Metode  PCR  untuk  Deteksi  Cepat  Keragaman  DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 22-25.