Abstrak — Bacillus  thuringiensis merupakan  bakteri  gram  positif berspora penghasil protein toksin yang bersifat insektisidal, salah satunya  terhadap Spodoptera  litura  F .  dari  Ordo  Lepidoptera. Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  mengetahui  daya  bunuh B. thuringiensis terhadap  daya  bunuh  larva S.  litura F.  stadium instar 3, instar 4 dan instar 5. Sumber inokulum B. thuringiensis diambil dari tanah perkebunan Batu Malang. Isolasi menggunakan  medium  selektif  LB  (Luria  Bertani)  agar.  Isolat terpilih  di  identifikasi  dengan  panduan Bergey ’ s  Manual  of Determinative Bacteria dan pengamatan kristal protein. Isolat K2 dan  K9  teridentifikasi  sebagai B.  thuringiensis .  Aplikasi bioinsektisida  kultur B.  thuringiensis dalam  medium  Luria Bertani  cair  (72  jam)  dengan  kepadatan  sel  10 7 .  Isolat disemprotkan ke pakan larva instar 3, 4 dan 5. Kematian larva S. litura sudah  mulai  terjadi  pada  hari  pertama  setelah  aplikasi B. thuringiensis dan  presentase  kematian  meningkat  sampai  tujuh hari.  Hampir  seluruh  larva  yang  diuji  mengalami  kematian antara 70-100%.
Kata  Kunci — Bacillus  thuringiensis ,  Bioinsektisida,  Kristal protein, Spodoptera litura .

## I. PENDAHULUAN
LAT grayak ( Spodoptera litura F.) merupakan salah satu hama  daun  yang  mempunyai  kisaran  inang  beragam diantaranya  kedelai,  kacang  tanah,  kubis,  ubi  jalar,  kentang, sawi  dan  lain-lain. S.  litura F.  menyerang  tanaman  budidaya pada  fase  vegetatif  yaitu  memakan  daun  tanaman  yang  muda sehingga  tinggal  tulang  daun  saja  [1].  Pemberantasan  hama biasanya  menggunakan  insektisida  kimia.  Penggunaan insektisida  kimia  secara  terus  menerus  tanpa  melihat  kondisi ekosistem dapat menimbulkan dampak negatif yaitu terjadinya resistensi hama, insektisida dapat terakumulasi dalam tanaman sehingga berbahaya bagi konsumen dan mencemari lingkungan [2].
Aplikasi  insektisida  dapat    menyerang  spesies  yang  bukan sasaran.  Perbedaan  komposisi  kimia  dan  teknik  aplikasi insektisida  yang  satu  dengan  yang  lainnya  membawa  efek yang  berbeda  pula  pada  populasi  yang  bukan  sasarannya, termasuk  para  pekerja,  konsumen,  burung,  lebah  maupun serangga  yang  menguntungkan  [3],  alternatifnya  dapat dikembangkan  insektisida  yang  ramah  lingkungan  berupa bioinsektisida.  Salah  satu  sumber  bioinsektisida  ialah mikroorganisme tanah seperti Bacillus thuringiensis. Menurut [4], B.  thuringiensis dikenal  sebagai  agensia  bahan  baku pestisida  yang  yang  baik  dalam  pertanian,  aman  terhadap kesehatan konsumen dan ramah lingkungan.
B.  thuringiensis adalah  bakteri  gram-positif,  berbentuk batang  yang  memproduksi  kristal  protein  pada  saat  sporulasi [5].  Kristal  protein  tersebut  dinamakan δ -endotoksin (protein Cry )  yang  bersifat  lethal  jika  dimakan  oleh  serangga  yang peka  [6]. Ketika  masuk  ke  dalam  pencernaan,  δ -endotoksin masih  dalam  bentuk  molekul  yang  besar  dan  masih  dalam bentuk  protoksin  yang  tidak  aktif  dan  akan  aktif  pada lingkungan  basa  [7].  Kristal  ini  sebenarnya  hanya  merupakan protoksin  yang  jika  larut  dalam  usus  serangga  akan  berubah menjadi  poli-peptida  yang  lebih  pendek  (27-149  kd)  serta mempunyai  sifat  insektisidal.  Toksin  yang  telah  aktif berinteraksi  dengan  sel-sel  epithelium  di  midgut  serangga. Toksin B.  thuringiensis menyebabkan  terbentuknya  pori-pori (lubang  yang  sangat  kecil)  di  sel  membran  di  saluran pencernaan  dan  mengganggu  keseimbangan  osmotik  dari  sel- sel  tersebut.  Karena  keseimbangan  osmotik  terganggu,  sel menjadi  bengkak  dan  pecah  dan  menyebabkan  matinya serangga [5].
Kristal  protein  yang  dihasilkan  oleh B.  thuringiensis juga menyebabkan  pembengkakan,  pengelupasan,  dan  kerusakan pada  sel-sel  epitel  usus  tengah  ulat  grayak.  Perubahan  yang mendasar  pada  sel-sel  usus  tengah  yang  terinfeksi,  yaitu adanya  pembesaran  inti,  perubahan  retikulum  endoplasma hingga  konfigurasinya  menyerupai  vakuola,  serta  peluruhan atau  tidak  bersatunya  mikrofili  [8].  Sebagian  strain  dapat digunakan  untuk  bioinsektisida  pada  larva  Ordo  Lepidoptera [5]. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi  daya  bunuh B.  thuringiensis sebagai  bioinsektisida untuk membunuh larva S. litura F. stadium instar 3, 4 dan 5.

## II. METODOLOGI PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
A.
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium  Mikrobiologi  dan Bioteknologi  serta  Laboratorium  Zoologi,  Departemen Biologi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Institut  Teknologi  Sepuluh  Nopember,  Surabaya  pada  bulan Januari- Juni 2017.

## Cara Kerja B.
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahapan yakni isolasi dan purifikasi, generic assignment dan pengamatan kristal protein serta aplikasi B. thuringiensis terhadap larva S. litura F. instar 3, 4 dan 5. Tahapan tersebut akan dijelaskan sebagai berikut:

## Potensi Bacillus thuringiensis dari Tanah
Perkebunan Batu Malang sebagai Bioinsektisida terhadap Larva Spodoptera litura F.
Afriha Mafazah dan Enny Zulaika
Departemen Biologi, Fakultas Ilmu Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS)
e-mail : enny@bio.its.ac.id
U

## 1. Isolasi dan Purifikasi
Isolasi  dilakukan  dengan  cara  mensuspensikan  sebanyak  1 gram  sampel  ke  dalam  10  ml  garam  fisiologis  0,85%  steril dalam  tabung  reaksi,  kemudian  dihomogenkan.  Selanjutnya dilakukan  pengenceran  sampai  dengan  10 -6 [9].  Suspensi dipanaskan  pada waterbath pada  suhu  80 o C  selama  15  menit [10]. Sebanyak 0,1 ml secara aseptik diinokulasikan ke dalam media  selektif  Luria  Bertani  (LB)  agar  menggunakan  pipet mikro  dengan  metode spread  plate. Diinkubasi  pada  suhu ruang  selama  48  jam  (Rusmana  dan  Hadietomo,  1994).  Pada medium Luria Bertani, per liter mengandung 10 g tripton, 5 g yeast  extract ,  10  g  NaCl  dalam  15  g  agar  [4].  Keberhasilan isolasi ditandai dengan koloni yang tumbuh di media.
Koloni  yang  tumbuh  dipurifikasi  sampai  diperoleh  kultur murni.  Satu  ose  diambil  secara  aseptis,  diinokulasikan  ke media LB agar dengan metode 16 goresan dan diinkubasi pada suhu  ruang  ±  24  jam.  Koloni  yang  tumbuh  diamati  sampai diperoleh  koloni  yang  seragam.  Validasi  kemurniannya dilakukan dengan melihat bentuk sel menggunakan pewarnaan sederhana methylene  blue yang  diamati  di  bawah  mikroskop perbesaran  1000  kali  [9].  Jika  bentuk  sel  sudah  seragam, diasumsikan isolat bakteri telah murni.
2. Generic Assigment dan Pengamatan Kristal Protein
Isolat  terpilih  diidentifikasi  berdasarkan  buku  panduan Bergey ’ s Manual of Determinative Bacteria meliputi : a. Bentuk sel
Pewarnaan  bentuk  sel  digunakan  untuk  mengetahui apakah  isolat  mempunyai  bentuk  batang  yang  diasumsikan dari  genus Bacillus .  Isolat  diambil  1  ose,  kemudian digoreskan  di  atas  kaca  objek  yang  telah  diberi  akuades sebelumnya.  Preparat  difiksasi  di  atas  api  bunsen. Selanjutnya  preparat  ditetesi  dengan methylene  blue sebanyak  1-2  tetes,  didiamkan  30  detik.  Preparat  dibilas dengan  akuades  dan  didiamkan  hingga  kering.  Preparat ditutup  dengan  kaca  penutup  dan  diberi  tambahan  minyak imersi  sebanyak  1  tetes.  Diamati  dengan  mikroskop perbesaran 1000 kali[9].
b. Sifar gram
Pengamatan sifat gram untuk mengetahui apakah isolat bersifat Gram positif yang diasumsikan dari genus Bacillus. Isolat diambil sebanyak 1 ose, kemudian digoreskan di atas kaca  objek  yang  telah  diberi  akuades.  Preparat  difiksasi  di atas api bunsen, lalu ditetesi larutan  kristal violet sebanyak 2-3  tetes.  Preparat  didiamkan  1  menit,  dibilas  dengan akuades.  Preparat  ditetesi  larutan  Gram ’ s  iodine  sebanyak 2-3  tetes  dan  didiamkan  1  menit.  Selanjutnya  preparat dibilas  kembali  dengan  akuades.  Preparat  didekolorisasi dengan menggunakan etil alkohol 95% setetes demi setetes selama  20  detik  kemudian  dibilas  kembali  dengan  akuades dan  didiamkan  hingga  kering.  Preparat  ditetesi  safranin  ±1 menit  dan  dibilas  kembali  dengan  akuades,  didiamkan hingga  kering.  Preparat  ditutup  dengan  kaca  penutup  dan diberi  tambahan  minyak  imersi  sebanyak  1  tetes,  diamati dengan mikroskop perbesaran 1000 kali [9].
c. Endospora
Pengamatan  endospora  digunakan  untuk  mengamati apakah  isolat  mampu  menghasilkan  endospora  yang diasumsikan dari genus Bacillus. Isolat diambil sebanyak 1 ose,  kemudian  digoreskan  di  atas  kaca  objek  yang  telah
diberi  akuades.  Preparat  difiksasi  di  atas  bunsen. Selanjutnya  bagian  atas  preparat  ditutup  kertas  saring, ditetesi malachite  green hingga  menutupi  seluruh permukaan  kaca  objek.  Preparat  dipanaskan  selama  3-4 menit  di  atas  api  bunsen  dengan  bantuan  penangas  kasa. Selanjutnya kertas saring pada preparat dibuang dan dibilas dengan  akuades.  Preparat  diwarnai  dengan  safranin  ±1 menit dan dibilas kembali dengan akuades. Preparat ditutup dengan  kaca  penutup  dan  diberi  tambahan  minyak  imersi sebanyak  1  tetes,  diamati  dengan  mikroskop  perbesaran 1000 kali[9].
d. Motilitas
Uji  motilitas  digunakan  untuk  mengetahui  apakah  isolat bersifat  motil  atau  non  motil.  Uji  motilitas  dapat  diperoleh dari  uji  produksi  H 2 S  dan  gas.  Hasil  uji  positif  ditandai dengan  terbentuknya  sebaran  pada  daerah  bekas  inokulasi yang  berarti  bakteri  melakukan  aktifitas  pergerakan (motil)[9].
e. Uji kebutuhan oksigen
Pengamatan  kebutuhan  oksigen  digunakan  untuk mengetahui sifat bakteri aerob yang diasumsikan dari genus Bacillus.  Dibuat  medium Thioglicolat .  Isolat  berumur  24 jam  diambil  sebanyak  1  ose  kemudian  diinokulasikan  ke dalam  medium  Thioglicolat  secara  aseptis.  Selanjutnya inokulum pada tabung reaksi dihomogenkan dengan vortex agar  bakteri  terdistribusi  merata  dalam  medium.  Inokulum diinkubasi  selama  48  jam  pada  suhu  ruang,  kemudian diamati pola penyebaran bakteri[9].
f. Katalase
Gelas  objek  yang  telah  dibersihkan  dengan  alkohol  70% ditetesi  dengan  larutan  H 2 O 2 (Hidrogen  Peroksida)  3% sebanyak  1  tetes.  Isolat  diambil  sebanyak  1  ose    lalu digoreskan  secara  aseptis  pada  kaca  objek.  Isolat dihomogenkan    secara  manual  dan  diamati  hasilnya.  Hasil positif ditandai dengan timbulnya gas atau gelembung udara di sekitar goresan isolat bakteri[9].
g. Pengamatan kristal protein
Koloni  yang  telah  tumbuh  diinkubasi  selama  ±72  jam hingga  proses  sporulasi.  Selanjutnya  dilakukan  observasi mikroskopis untuk memastikan terbentuknya kristal protein disertai  endospora.  Koloni  yang  dipastikan  membentuk kristal  protein  dipanen  dan  disimpan  pada  agar  LB  miring, diberi nomer isolat[4].
3. Aplikasi Bacilus thuringiensis sebagai biopestisida
a. Persiapan suspensi B. thuringiensis terpilih
Masing-masing  isolat B.  thuringiensis yang  sudah disimpan  dalam  LB  miring  diambil  sebanyak  1  ose  dan diinokulasikan  pada  10  ml  medium  LB  cair  dalam Erlenmeyer, diinkubasi selama 18 jam di atas rotary shaker pada  suhu  ruang  [11].  Selanjutnya  kultur B.  thuringiensis tersebut dimasukkan ke dalam 90 ml media LB. Diinkubasi selama ±72 jam  [4]  pada suhu ruang di atas rotary shaker . Kepadatan  sel  yang  digunakan  untuk  uji  sebanyak  10 7 sel/ml  yang  dihitung  menggunakan Haemocytometer dengan perbesaran 1000 kali [12].
b. Pengujian toksisitas S. litura F.
Sebanyak  10  ekor  larva S.  litura F.  instar  3,  4  dan  5 dimasukkan  ke  dalam  masing-masing  wadah  plastik berbentuk balok yang berbeda. Pengujian dilakukan dengan
M =  A x 100% B
memberi  makan  larva S.  litura F.  pada  masing-masing wadah  dengan  dua  lembar  daun  sawi  ( Brassica  rapa L.) yang telah disemprot suspensi B. thuringiensis sebanyak 10 kali  semprot  (±4  mL).  Pemberian  makan  pada  ulat dilakukan  selama  tujuh  hari.  Masing-masing  perlakuan terdiri  atas  tiga  kali  ulangan.  Sebagai  kontrol  digunakan daun B. rapa L. yang disemprot dengan akuades steril. c. Parameter Pengamatan
Pengamatan  mortalitas  dilakukan  terhadap  mortalitas larva  serangga  yang  diamati  setiap  hari  selama  tujuh  hari. Virulensi  setiap  isolat  ditentukan  dengan  nilai  mortalitas pada larva-larva uji menurut [13] menggunakan rumus :
Keterangan : M = mortalitas (%)
A = jumlah serangga mati pada umur tertentu B = jumlah serangga yang diamati
Data hasil pengamatan akan  dianalisis dengan tabulasi data dan    tingkat  virulensi B.  thuringiensis ditetapkan  berdasarkan nilai mortalitas serangga uji menurut [14] yaitu :
a.  Virulensi tinggi, jika nilai mortalitas di atas 50%
b.  Virulensi sedang, jika nilai mortalitas 30% - <50% c.  Virulensi rendah, jika nilai mortalitas < 30%
d.  Tidak virulen, jika nilai mortalitas 0%

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi dan Purifikasi
A.
Isolat bakteri berasal dari empat perkebunan di Batu Malang Jawa  Timur  yaitu  perkebunan  sawi,  bunga,  kol  dan  bawang merah.  Medium  agar  selektif  yang  digunakan  adalah  LB (Lurian  Bertani)  karena  menurut  [10]  medium  tersebut  dapat menstimulus  pertumbuhan  spora  dan  protein  kristal.  Isolasi menggunakan  metode  cawan  sebar  ( spread  plate )  dengan pengenceran sampai dengan 10 -6 . Tujuan pengenceran supaya diperoleh  isolat  yang  tidak  padat  [9].  Koloni  yang  tumbuh adalah isolat yang diasumsikan sebagai Bacillus .
Hasil  seleksi pada  koloni  tunggal  diperoleh 20  isolat,  tujuh isolat dari perkebunan kol yaitu K2, K3, K4, K6, K7, K8, K9, lima  isolat  dari  kebun  bunga  yaitu  KB1,  KB4,  KB6,  KB7, KB8, lima isolat dari perkebunan sawi yaitu S2, S3, S5, S6, S9 dan  tiga  isolat  dari  perkebunan  bawang  merah  yaitu  B3,  B6, B7.  Selanjutnya  isolat  dipurifikasi  dengan  metode  16  gores pada  cawan  agar.  Koloni  yang  seragam  menunjukkan keberhasilan purifikasi (Gambar 1).
Gambar 1. Koloni Purifikasi dengan Metode 16 Goresan.
Hasil  purifikasi  untuk  masing-masing  isolat  diamati  selnya dengan  pewarnaan  sederhana methylene  blue .  Sel  yang  telah seragam menunjukkan bahwa sel diasumsikan terdiri dari satu genus (Gambar 2).
Gambar  2.  Pengamatan  Sel  dengan  Pewarnaan Methylene  Blue (Perbesaran 1000x).

## Generic Assigment
B.
Menurut  [15],  Identifikasi  dan generic  assignment digunakan  untuk  mengidentifikasi  apakah  isolat  termasuk anggota  genus  yang  sudah  ada  atau  genus  baru.  Identifikasi dilakukan dengan menggunakan panduan Bergey ’ s Manual of Determinative  Bacteriology [16].  Hasil  Identifikasi  terhadap 20 isolat menggunakan profile matching dengan karakter kunci sesuai genus Bacillus dapat dilihat pada (Tabel 1).
Tabel 1 . Identifikasi dengan Profile Matching berdasarkan karakter kunci genus Bacillus
Berdasarkan  Tabel  4.1  menggunakan profile  matching dengan karakter kunci genus Bacillus maka isolat K2, K9 dan B7  diidentifikasi  sebagai  genus Bacillus yang  mempunyai karakter  sel  berbentuk  batang,  Gram  positif,  motil,  memiliki endospora,  bersifat  aerob/fakultatif  anaerob  dan  katalase positif.  Menurut  [16],  genus Bacillus mempunyai  karakter kunci  sel  batang,  Gram  positif,  motil,  memiliki  endospora, bersifat  aerob/fakultatif  anaerob  dan  katalase  positif.  Untuk menentukan  bahwa  isolat  adalah Bacillus  thuringiensis maka dilakukan uji terbentuknya kristal protein.
Pengamatan Kristal Protein C.
Isolat  K2,  K9  dan  B7  yang  sudah  teridentifikasi  sebagai genus Bacillus ,  selanjutnya  diuji  dengan  ciri  spesifik terbentuknya endospora dan kristal protein. Isolat K2, K9 dan B7 dapat membentuk endospora tetapi hanya isolat K2 dan K9 yang  mampu  membentuk  endospora  sekaligus  membentuk kristal protein. (Gambar 3).
(1)
Gambar 3. (a) Sel B. thuringiensis isolat K2, (b) B. thuringiensis isolat K9, (c) B. thuringiensis isolat B7  yang tidak membentuk kristal protein.  Pengamatan dilakukan  dengan  mikroskop  cahaya  pada  perbesaran  1000x.  k=  kristal, s=endospora .
Kristal protein adalah ciri khas dari bakteri B. thuringiensis . Kemampuannya  membentuk  kristal  bersamaan  dengan pembentukan spora, yaitu pada waktu sel mengalami sporulasi. Kristal tersebut merupakan kompleks protein yang mengandung toksin (δ -endotoksin) yang terbentuk di dalam sel 2-3 jam setelah akhir fase eksponensial dan baru keluar dari sel pada  waktu  sel  mengalami  sporulasi  [17].  Selanjutnya  untuk aplikasi  pembuatan  bioinsektisida  yang  digunakan  adalah isolat K2 dan K9.
Kepadatan  sel B.  thuringiensis yang  digunakan  sebagai bioinsektisida  adalah  10 7 .  Berdasarkan  hasil  penelitian sebelumnya  yang  dilakukan  oleh  [18],  isolat B.  thuringiensis yang  memiliki  potensi  terbaik  dalam  membunuh  larva Aedes aegypti mempunyai kepadatan 10 7 sel/ml.
Aplikasi B. thuringiensis terhadap larva S. litura F. D.
Hasil uji toksisitas isolat K2 dan K9 terhadap larva S. litura instar  3,  4  dan  5  dapat  dilihat  pada  Tabel  4.3.  Isolat  K2  dan K9  dapat  bertindak  sebagai  bioinsektisida  karena  dapat membunuh  larva S.  litura pada  stadium  instar  3,  4  dan  5. Isolat  K9  lebih  tinggi  persen  membunuhnya  dibandingkan isolat K2 (Tabel 2)
Tabel 2.
Hasil Uji Toksisitas Isolat K2 dan K9 terhadap S. litura
Pada kontrol terjadi kematian larva S. litura instar 3, 4 dan 5 yang dimulai hari ketiga setelah aplikasi. Hal ini kemungkinan disebabkan  oleh  tidak  terkontrolnya  faktor  lingkungan  saat larva  dikirim  dari  tempat  pemesanan  sehingga  dengan lingkungan  baru  mengalami  tingkat  stress  yang  dialami  larva S. litura . Isolat K9 mulai aktif membunuh pada hari pertama aplikasi sedangkan  isolat  K2  mulai  aktif  membunuh  pada  hari  kedua setelah aplikasi sehingga isolat K9 lebih toksin dari isolat K2. B. thuringiensis diduga sudah masuk ke dalam saluran bagian tengah  menjadi  molekul  yang  toksin  sehingga  mematikan
larva S.  litura .  Menurut  [19],  bila  spora  dan  kristal  protein dimakan oleh serangga  yang  peka  maka akan terjadi paralisis yang mengakibatkan kematian inang. Kristal bakteri akan larut dalam  saluran  pencernaan  dan  mengeluarkan  toksin  yang dapat mematikan serangga.
Isolat  K9  lebih  cepat  membunuh  larva S.  litura dibandingkan  isolat  K2.  Menurut  [20],  adanya  perbedaan toksisitas  dapat  disebabkan  oleh  beberapa  faktor  antara  lain pH usus target, yaitu usus target tidak dapat melarutkan kristal protein  dalam  usus  tengah.  Ukuran  kristal  protein  sangat menentukan  konsentrasi  toksin  yang  larut  dalam  usus  tengah serangga.  Bila  ukuran  kristal  protein  besar,  maka  konsentrasi kristal  protein  yang  terlarut  juga  besar.  Pada  penelitian  ini tidak  dilakukan  pengukuran  pH  usus  dan  ukuran  kristal protein.
Mortalitas tertinggi terjadi pada larva S. litura instar 5. Hal tersebut  dimungkinkan  karena  laju  konsumsi  larva  tiap  instar berbeda-beda  sehingga  distribusi  spora  tidak  merata.  Laju konsumsi  larva S.  litura instar  5  lebih  banyak  dibandingkan dengan  larva  instar S.  litura 3  dan  4.  Hal  tersebut  dapat diketahui dari sisa daun Brassica rapa pada kotak yang berisi larva S.  litura .  Kotak  instar  5  paling  sedikit  menyisakan makanan  dibandingkan  dengan  kotak  yang  berisi  larva S. litura instar  3  dan  4.  Pada  hari  ke  tujuh  perlakuan  kontrol, larva S.  litura lebih  banyak  yang  hidup  dibandingkan  dengan perlakuan K2 dan K9.
Larva S. litura yang  mati akibat perlakuan B. thuringiensis dapat  diamati  dengan  ciri-ciri  fisik  seperti  tubuh  berwarna coklat  atau  hitam,  mengkerut,  melengkung,  kering  dan  kaku. Selain itu, perilakunya menjadi lamban dan akhirnya berhenti bergerak  dan  kadang-kadang  mengeluarkan  cairan  hijau  dari mulutnya  kemudian  kotorannya  menjadi  berair  (diare)  dan akhirnya  akan  mati  dengan  tubuh  menjadi  lembek.  Menurut [17],  gejala  serangan  bakteri  pada  serangga  diawali  dengan tanda-tanda  tidak  aktif,  nafsu  makan  berkurang,  lemah, serangga  mengalami  diare  dan  keluar  cairan  dari  beberapa bagian  tubuh.  Bangkai  larva  uji  dalam  penelitian  ini  berbau busuk  dan  semakin  hari  semakin  mengecil.  Selanjutnya  larva S.  litura tersebut  mulai  hancur.  Hal  ini  diperkuat  dengan pendapat yang disampaikan oleh [21] yang menemukan bahwa larva  yang  terinfeksi  bakteri B.  thuringiensis tubuhnya mengalami  pembengkakan  dan  berwarna  hitam  kecoklatan serta dalam waktu beberapa hari akan mengalami kehancuran. Sedangkan  larva S.  litura yang  mati  akibat  perlakuan  kontrol dalam  penelitian  ini  mempunyai  ciri-ciri  fisik  yang  masih bagus dan normal (Gambar 4)
Gambar  4.  Larva S.  litura yang  mati  akibat  perlakuan B.  thuringiensis ,  (a) berwarna hitam, kering dan kaku, (b) larva mengalami diare sebelum akhirnya mati, (c) larva yang mati akibat perlakuan kontrol. D= diare
Menurut  [22],  serangga  yang  peka  terhadap  bakteri B. thuringiensis termasuk  mempunyai  saluran  pencernaan  yang bersifat  alkali,  menghasilkan  mineral  dan  enzim  yang  dapat menghidrolisis  kristal  protoksin  menjadi  toksin.  Komponen toksin B.  thuringiensis disebut  delta  endotoksin.  Delta endotoksin berikatan dengan sel yang menempel pada dinding membran  usus  membentuk  lubang  pada  membran  dan mengganggu  keseimbangan  ion  dalam  usus.  Larva  serangga akan  berhenti  makan  kemudian  mati  [23].  Pembengkakan disebabkan  oleh  banyaknya  kation  yang  memasuki  sel  epitel melalui  pori-pori  yang  dibentuk  toksin  yang  diduga  spesifik terhadap  kation  seperti  K + dan  Na + .  Banyaknya  kation  dalam sel  menyebabkan  ketidakseimbangan  osmotik  sehingga menyebabkani lisis [8].
Berdasarkan  Tabel  4.3  pada  kontrol  setelah  hari  ke  tujuh, larva  instar  3,  4  dan  5  masih  hidup.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  pada  kontrol  benar-benar  tidak  ada  pengaruh B. thuringiensis .  Setelah  hari  ke  tujuh  larva  instar  3,  4  dan  5 mempunyai persentase hidup  >50%. Hal ini disebabkan larva mengalami  stress  pada  pengiriman  dari  lokasi  uji  Balai Penelitian Tanaman Pemanis dan Serat Malang.

## IV. KESIMPULAN
Bakteri B.  thuringiensis yang  diisolasi  dari  tanah perkebunan  di  daerah  Batu  Malang  dapat  membunuh  larva S. litura F.  Isolat  K9  mempunyai  daya  bunuh  terhadap  larva S. litura F lebih tinggi dibandingkan dengan isolat K2. Isolat K9 sudah  menyebabkan  mortalitas  mulai  hari  pertama  dan  pada hari  k e tujuh persentase kematiannya ≥80%. Sedangkan pada isolat K2 mulai terjadi mortalitas larva S. litura F pada hari ke dua  setelah  aplikasi  dan  pada  hari  ke  tujuh  persentase kematiannya ≥70%.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terimakasih  kepada  Dr.  Enny Zulaika, MP. atas dukungannya melalui pendanaan PNBP ITS tahun anggaran 2016 No. Kontrol 01711/IT2.11/PN.08/2016.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  J. H. Laoh, F. Puspita, and Hendra, “ Kerentanan Larva Spodoptera litura F. terhadap Virus Nuklear Polyhedrosis, ” J. Natur Indones. , vol. 5, no. 2, pp. 145 – 151, 2003.
[2]  K.  Untung, Dasar-Dasar  Pengelolaan  Hama  Terpadu .  Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada, 1996.
[3]  D.  Sande,  J.  Mullen,  M.  Wetzstein,  and  J.  Houston, “ Environmental Impacts from Pesticide Use: A Case Study of Soil Fumigation in Florida Tomato Production, ” Int. J. Environtmental Res. Public Heal. , 2011.
[4]  S.  Hermanto,  E.  Jusuf,  and  M.  H.  Shiddiqi, “ Eksplorasi  Protein  Toksin Bacillus thuringiensis dari Tanah di Kabupaten Tangerang, ” Valensi , vol. 3, no. 1, pp. 48 – 56, 2013.
[5]  H.  Hofte  and  H.  R.  Whiteley, “ Insecticidal  Crystal  Proteins  of  Bacillus thuringiensis, ” Microbiol. Rev. , vol. 53, no. 2, pp. 242 – 255, 1989. [6]  Bahagiawati, “ Penggunaan Bacillus thuringiensis sebagai Bioinsektisida, ”
Bul. Agrobio , vol. 5, no. 1, pp. 21 – 28, 2002.
[7]  V. N. Jisha, R. B. Smitha, and S. Benjamin, “ An Overview on the Crystal Toxins from Bacillus thuringiensis, ” J. Adv. Microbiol. , vol. 3, pp. 462 – 472, 2013.
[8]  Y. Tanada and H.K. Kaya, Insect Pathology . New York: Academic Press, 1993.
[9]  J.  P.  Harley  and  L.  M.  Prescott, Laboratory  Exercises  in  Microbiology . USA: The McGraw-Hill Companies, 2002.
[10] S.  Muharsini  and  A.  H.  Wardhana, “ Uji  Efikasi  Isolat  Lokal  Bacillus thuringiensis  yang  mempunyai  Gen  Cry  terhadap  Lalat  Chrysomya Bezziana  secara  In  Vitro, ” in Seminar  Nasional  Teknologi  Peternakan dan Veteriner 2005 , 2005.
[11] E.  Zulaika,  U.  Sholikah,  and  A.  Prasetya, “ Potensi  Bakteri  Bacillus sebagai  Agensia  Bioremediasi  Limbah  Industri  yang  Mengandung Merkuri, ” Institut Teknologi Sepuluh Nopember, 2012.
[12] E.  A.  Martin, Oxford  Concise  Medical  Dictionary ,  7th  ed.  New  York: Oxford University Press, 2007.
[13] A.  Khaeruni,  Rahayu,  and  N.  T.  Purnamaningrum, “ Isolasi  Bacillus thuringiensis  BERL.  dari  Tanah  dan  Patogenitasnya  terhadap  Larva Crocidolomia binotalis ZELL. pada Tanaman Sawi (Brassica juncea L.), ” J. Agroteknos Maret , vol. 2, no. 1, pp. 21 – 27, 2012.
[14] I.  Rusmana  and  R.  S.  Hadioetomo, “ Isolasi  Bacillus  thuringiensis  Berl. dari  Peternakan  Ulat  Sutera  dan  Toksisitasnya  terhadap  Larva Crocodolomia binotalis Zell. dan Spodoptera litura F, ” Hayati , vol. 1, no. 1, pp. 21 – 23, 1994.
[15] E.  Zulaika, “ Eksplorasi  Bakteri  Resisten  Merkuri  (BRM)  Endogenik Kalimas  Surabaya  yang  Berpotensi  sebagai  Kandidatus  Agensia Bioremediasi Pencemaran Merkuri, ” Universitas Airlangga, 2013. [16] J.  G.  Holt,  N.  R.  Krieg,  P.  H.  A.  Sneath,  J.  .  Staley,  and  S.  .  Williams, Bergey ’ s Manual of Determinative Bacteriology . Philadelphia: Lippincot Williams & Wilkins, 1994.
[17] Trizelia, “ Pemanfaatan  Bacillus  thuringiensis  untuk  pengendalian  hama Crocidolomia binotalis, ” Institut Pertanian Bogor, 2001. [18] E. K. Pratiwi, S. Samino, Z. P. Gama, and N. Nakagoshi, “ Uji Toksisitas Bacillus thuringiensis Asal Kota Nganjuk terhadap Larva Aedes aegypti, ” J. Biotropika , vol. 1, no. 4, 2013.
[19] M. Hadi, T. Udi, and R. Rully, Biologi Insekta Entomologi . Yogyakarta: Graha Ilmu, 2009.
[20] D.  Lantang  and  D.  Y.  Runtuboi, “ Karakterisasi  Bakteri  Bacillus thuringiensis asal Hutan Lindung Kampus Uncen Jayapura, serta Deteksi Toksisitasnya terhadap Larva Nyamuk Anopheles, ” J. Biol. Papua , vol. 4, no. 1, pp. 19 – 24, 2012.
[21] C.  P.  Blondine  and  U.  Widyastuti, “ Patogenitas  Isolat  Bacillus thuringiensis  setelah  Dikeringkan  pada  Suhu  Dingin  (Lyophilisasi) terhadap  Jentik  Aedes  aegypty  di  Laboratorium, ” Dunia  Kedokt. ,  vol. 131, pp. 10 – 12, 1997.
[22] Z.  P.  Gama,  N.  Nakagoshi,  Suharjono,  and  F.  Setyowati, “ Toxicity studies  for  indigenous  Bacillus  thuringiensis  isolates  from  Malang  city, East Java on Aedes aegypti Larvae, ” J. Trop. Biomed , vol. 13, 2013.
[23] A.  Bravo,  S.  S.  Gill,  and  M.  Soberon, “ Mode  of  Action  of  Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and Their Potential  for  Insect Control, ” Toxicon , vol. 49, no. 4, p. 423 – 435., 2007.