## Pengaruh Kitosan Terhadap Jumlah Osteoklas dan Osteoblas Pada Tikus Galur Wistar Model Menopause
Muhammad Nur 1
1 Akper Pemkab Pamekasan Madura Email : mnurfh@gmail.com

## ABSTRAK
Kitosan  merupakan  salah  satu  polimer  yang  melimpah  dan  tersebar  di  alam.  Memiliki  efek penyembuhan yang cepat bagi jaringan serta berpengaruh pada remodeling tulang. Tujuan penelitian ini  untuk  membuktikan  bahwa  pemberian  kitosan    mempengaruhi  penurunan  jumlah  osteoklas  dan peningkatan jumlah  osteoblas pada  tikus  putih  betina  galur Wistar model  menopaus  yang  dilakukan ovarektomi.Penelitian  ini  menggunakan    rancangan posttest  only  control  group  design. Total  sampel 30 ekor tikus dibagi menjadi tigakelompok secara acak, dibuat osteoporosis dengan model menopaus yangdilakukan  ovarektomi  pada  kelompok  kontrol  positif  dan  kelompok  perlakuan  yang  kemudian pada kelompok perlakuan diberi ektrak kitosan dosis tunggal 45 mg/hari melalui sonde / Nasogastric Tube (NGT).  K1  merupakan  kelompok  kontrol  negatif  (tanpa  dilakukan  ovarektomi  dan  tanpa kitosan), K2 merupakan kelompok kontrol positif (dengan ovarektomi tanpa kitosan), K3 merupakan kelompok  perlakuan  (dengan  dilakukan  ovarektomi  dan  pemberian  kitosan  45  mg/hari).  Hasil penelitian menunjukkan terdapat perbedaan  bermakna pada jumlah osteoblas antara K1 dengan K3, K2 dengan K3, dan perbedaan tidak bermakna di temukan pada kelompok K1  dengan K2. Sedangkan pada jumlah  osteoklas  hasil    penelitian  menunjukkan  terdapat  perbedaan    bermakna  pada  kelompok K1 dengan K2 dan  perbedaan tidak  bermakna ditemukanpada kelompokK1 dengan K3, K2 dengan K3.Kesimpulan  pada  penelitian  ini  menunjukkan  pemberian  kitosandosis  45  mg/  /hari  dapat meningkatkan  jumlah  osteoblas  secara  bermakna  pada  tikus  putih  betina  model  menopaus  dan menurunkan jumlah osteoklas yang dilakukan ovarektomi dengan pemberian kitosan.
Kata kunci: Kitosan, menopause, jumlah osteoklas, jumlah osteoblas

## ABSTRACT
Chitosan is one of the most abundant and dispersed polymers in nature. It has a rapid healing effect for tissues and has an effect on bone remodeling. The purpose of this study was to prove  that giving chitosan influenced the decrease of osteoclast number and increasing number of osteoblasts in female mice of wistar strain of ovariectomy menopause model.This study used a posttest only control group design. The total sample of 30 rats divided into three groups was randomized, osteoporosis was made with the menopausal model which was performed ovariectomy in the positive control group and the treatment group then in the treatment group was given chitosan extract of single dose of 45 mg / day via  Nasogastric  Tube  (NGT).  K1  was  a  negative  control  group  (without  ovariectomy  and  without chitosan),  K2  was  a  positive  control  group  (with  no  chitosan  ovariectomy),  K3  was  the  treatment group  (ovariectomy  and  chitosan  45  mg  /  day).The  results  showed  significant  differences  in  the number of osteoblasts between K1 and K3, K2 with K3, and no significant differences were found in the K1 group with K2. While the number of osteoclasts showed that there were significant differences in  K1  group  with  K2  and  no  significant  difference  was  found  in  K1  group  with  K3,  K2  with K3.Conclusions in this study showed that 45 mg / day of chitosan doses could significantly increase osteoblast counts in menopause female white rats and decrease the number of osteoclasts performed by ovariectomy with chitosan administration.
Keywords : Chitosan, Menopause, Osteoclast number, Osteoblast number

## PENDAHULUAN
Defisiensi  estrogen  pada  pascamenopaus  merupakan  faktor  terpenting  penyebab peningkatan  ketidakseimbangan  remodeling  tulang  [1,2].  Kondisi  ini  menimbulkan perubahan  keseimbangan  aktivitas  sitokin  proinflamasi  yang  mengakibatkan  resorpsi  tulang [3]  serta  gangguan  fungsi  osteoblas  akibat  termostat  hemostasis  tulang  yang  menjadi  tidak responsip terhadap stimulasi pembedahan mekanik sehingga terjadi penurunan pembentukan tulang  [4,5].  Percobaan  in  vivo  pada  tikus  galur  wistar  dengan  ovarektomi  menunjukan jumlah  dan  fungsi  Erα  KO  ( estrogen  reseptor  alpha  knock  out ).Hal  ini  menunjukan pengurangan  massa  tulang  akibat  pascaovarektomi  atau  menopause  yang  diawali  oleh menurunya sel osteoblas dan meningkatnya sel osteoklas. [6], mengungkapkan bahwa kitosan mampu  menekan  proses  osteoklastogenesis.  Hasil    penelitian  Salma  dan  [7]  menunjukkan pemberian kitosan 200  mg/hari  selama 30 hari  pada cavia  cobaya meningkatkan jumlah sel osteoblas dan menurunkan jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar.
Sampai  saat  ini  pilihan  pertama  untuk  pencegahan  dan  pengobatan  ketidakseimbangan resorpsi  dan  formasi  tulang  adalah  terapi  sulih  hormon  (TSH)  estrogen.Namun  penggunaan TSH estrogen sintetik dapat menimbulkan efek samping baik subjektif maupun objektif, serta risiko  kanker  payudara  danendometrium.Selain  diperlukan  pemantauan  yangcermat  saat terapi  maupun  pascaterapi,  harga  jual  sediaan  hormon  estrogen  relatif  mahal  untuk pemakaian  jangka  panjang.Maka  perlu  dicari  alternatif  lain  yang  dapat  memenuhi  kritria efektif, murah, alami (herbal), aman dan dapat diterima oleh wanita menopause.Konsep back to  nature saat  ini  sangat  populer  di  seluruh  dunia,  termasuk  dalam  dunia kedokteran.Pengobatan alternatif yang berasal dari alam berkembang sangat pesat.Dewasa ini pemanfaatan bahan alam menjadi fokus penelitian untuk pengobatan yang diharapkan mampu menjadi solusi alternatif bagi berbagai penyakit, diantaranya adalah pemanfaatan bahan aktif yang terdapat pada ekstrak cangkang udang yang didalamnya terkandung kitosan.
Kitosan  merupakan  salah  satu  polimer  yang  melimpah  dan  tersebar  di  alam.Memiliki  efek penyembuhan  yang  cepat  bagi  jaringan  serta  berpengaruh  pada  remodeling  tulang  [8]. Kitosan adalah polisakarida dengan berat molekul besar yang dihubungkan oleh ikatan β-1,4 glikosida  dan  tersusun  atas  N-asetil-glukosamin  dan  glukosamin  [9].   Struktur  kitosan memiliki  gugus  -OH  dan  -NH 2 yang  dapat  menghasilkan  ikatan  hidrogen  intra  dan intermolekul [10] sehingga menyebabkan kitosan tidak larut dalam air. Gugus-gugus kitosan tersebut  dapat  berinteraksi  atau  berikatan  kovalen  dan  menjadi  landasan   teknik drug
delivery [11].  Penggunaan  kitosan  sebagai drug  delivery sudah  banyak  dilakukan  dalam bidang  medis  seperti drug  delivery insulin  dan  antikanker  [12].  Kitosan  mempunyai kemampuan  mengikat,  sehingga  dapat  juga  diaplikasikan  pada  senyawa  bukan  obat  yaitu antioksidan  asam  askorbat .  [13], melaporkan  bahwa  kitosan  dapat  meningkatkan sintesiskolagen tipe I pada tahap awal, dan memfasilitasi diferensiasi sel-sel osteogenik pada percobaan in  vitro fibroblas  ligament  periodontal  manusia.  Kitosan  diketahui  dapat mempercepat  migrasi  sel  serta  membantu  pematangan  jaringan.Secara invitro ,  kemampuan kitosan  untuk  mendukung  adhesi  sel  dan  mempengaruhi  diferensiasi  sel  osteogenik  adalah sifat  klimia  yang  membuat  kitosan  dapat  digunakan  untuk  regenerasi  sel  tulang.  Secara in vivo, penelitian  menunjukan  bahwa  implan  membran  kitosan  pada  kranial  kucing  mampu menstimulasi  atau  memberikan  efek  pada  sel  stroma  disekeliling  jaringan.  Kitosan  juga digunakan  carrier  growth  factors  untuk  meningkatkan  pembentukan  tulang  pada  calvaria tikus  [12]. Pada penelitian ini, pengaruh  antiosteoporosis dari kitosan diberikan secara oral (personde) dikaji pada tikus putih betina yang dibuat menopaus agar mendapatkan keaaadaan osteoporosis dengan melakukan ovarektotomi.
Penelitian pada tikus post ovarektomi yang diberikan kitosan dengan dosis tunggal 45 mg/BBtikus/hari  membuktikan  terjadinya  penurunan  jumlah  osteoklas  dan  peningkatan jumlah  osteoblas.  Berkaitan  dengan  sifat  biologis  kitosan  yang  unggul,  seperti biokompatibilitas,  mudah  terdegradasi  tanpa  meninggalkan  racun,  tidak  karsinogenik,  serta memiliki  efek  anti  bacterial  dan  efek  penyembuhan  yang  cepat  bagi  jaringan.  [13], melaporkan  bahwa  kitosan  dapat  meningkatkan  sintesiskolagen  tipe  I  pada  tahap  awal,  dan memfasilitasi  diferensiasi  sel-sel  osteogenik  pada  percobaan in  vitro fibroblas  ligament periodontal  manusia. Yang  d iketahui  dapat  mempercepat  migrasi  sel  serta  membantu pematangan  jaringan.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  menentukan  apakah  pemberian kitosan meningkatkan  jumlah  osteoblas  dan  menurunkan  jumlah  osteoklas  pada  tikus  yang dilakukan ovarektomi sebagai model menopause.

## TINJAUAN PUSTAKA

## Kitosan
Kitosan  merupakan senyawa amino polisakarida rantai lurus tersusun oleh monomer glukosamin (poli-1,4-Dglukosamine) yang terhubung melalui ikatan (1-4) β-glikosidik, yang berasal dari kitin yang telah dideasetilasi. Kitosan merupakan biopolymer yang diperoleh dari deasetilasi kitin.Akhir-akhir ini kitosan sering diaplikasikan sebagai bahan multiguna karena mudah  didapat  dan  bersifat biodegradable .  Kitosan  diperoleh  dari  deasetilasi  chitin  melalui
proses kimia menggunakan enzim chitin diacetilase . Dalam penelitian ini kitosan didapat dari ekstrak  cangkang  udang  yang  produksi  bank  jaringan  rumah  sakit  Dr.  Soetomo  Surabaya mengandung protein (25-40%), kitin (15-20%) dan kalsium karbonat (45-50%) [14].

## Sifat Kitosan
Kitosan adalah polisakarida dengan berat molekul besar yang dihubungkan oleh ikatan β-1,4 glikosida  dan  tersusun  atas  N-asetil-glukosamin  dan  glukosamin  [15].   Struktur  kitosan memiliki  gugus  -OH  dan  -NH 2 yang  dapat  menghasilkan  ikatan  hidrogen  intra  dan intermolekul [16] sehingga menyebabkan kitosan tidak larut dalam air. Gugus-gugus kitosan tersebut  dapat  berinteraksi  atau  berikatan  kovalen  dan  menjadi  landasan teknik drug delivery [17].  Penggunaan  kitosan  sebagai drug  delivery sudah  banyak  dilakukan  dalam bidang  medis  seperti drug  delivery insulin  dan    antikanker  [18].  Kitosan  mempunyai kemampuan  mengikat,  sehingga  dapat  juga  diaplikasikan  pada  senyawa  bukan  obat  yaitu antioksidan  asam  askorbat . Sifat  alami  kitosan  diklasifikasikan  menjadi  sifat  biologi  dan sifatkimia.Gugus  amino  yang  dimiliki  kitosan  lebih  banyak  dibandingkan  chitinsehingga kitosan lebih bersifat basa dan nukleofilik.kitosan tidak larut dalam air dan beberapa pelarut organik seperti dimetilsufoksida, dimetilformanida, pelarut alkohol dan piridin. kitosan larut dalam asam organik/mineral encer melalui protonasi gugus amino bebas pada pH kurang dari 6,5. Kitosan larut dengan baik pada asam format, asam asetat dan asam glutamate. Kelarutan kitosanakan  menurun  dengan  bertambahnya  berat  molekul  kitosan  [19].  Ikatan  hydrogen intermolekuler    maupun  intramolekuler  pada  kitosan  lebih  rendah  dibandingkan  chitin sehingga  kitosan  lebih  mudah  diaplikasikan  dalam  beberapa  reagen  dan  mudah  dibentuk menjadi spons, larutan, gel, pasta, membran, dan serat.
Sifat  biologi  kitosan  antara  lain,  kitosan  bersifat  biokompatibel  yang  tidak  beracun, tidak dapat dicerna juga mudah diuraikan oleh mikroba. Menurut [19], bahwa kitosan bersifat kationik,  nontoksis, biodegradable ,  dan biokompatibel. Kitosan  dapat  berikatan  dengan  sel mamalia dan sel mikroba secara agresif dan mampu meningkatkan pembentukan tulang, serta menunjukkan aktvitas antibiotik melawan bakteri dan jamur.

## Manfaat Kitosan
Berdasarkan karakteristik kitosan yang biodegradable dan biocompatible , manifestasi penggunaan  kitosan  telah  banyak  dilakukan.  Dalam  bidang  pertanian,  tanaman  yang diberikan  kitosanakan  memiliki  ketahanan  yang  kuat  terhadap  jamur.    Dalam  bidang bioteknologi,  kitosan  berperan  dalam  imobilisasi  enzim,  pemisahan  protein  dan  regenerasi sel.  Dalam  industry  makanan,  kitosan  digunakan  sebagai  antioksidan,  pengawet  alami  dan
penyerap warna.Kitosan juga dimanfaatkan sebagai adsorben logam dan kerap kali digunakan dalam program diet karena dapat menurunkan kolesterol [19].
Berkaitan dengan sifat biologis kitosan yang unggul, seperti biokompatibilitas, mudah terdegradasi tanpa meninggalkan racun, tidak karsinogenik, serta memiliki efek anti bacterial dan  efek  penyembuhan  yang  cepat  bagi  jaringan.  [20],  melaporkan  bahwa  kitosan  dapat meningkatkan  sintesiskolagen  tipe  I  pada  tahap  awal,  dan  memfasilitasi  diferensiasi  sel-sel osteogenik pada percobaan in vitro fibroblas ligament periodontal manusia. Kitosan diketahui dapat mempercepat migrasi sel serta membantu pematangan jaringan.
Secara invitro ,  kemampuan  kitosan  untuk  mendukung  adhesi  sel  dan  mempengaruhi diferensiasi sel osteogenik adalah sifat klimia yang membuat kitosan dapat digunakan untuk regenerasi sel tulang.Secara in vivo, penelitian menunjukan bahwa implan membran kitosan pada kranial kucing mampu menstimulasi atau memberikan efek pada sel stroma disekeliling jaringan.  Kitosan  juga  digunakan  carrier  growth  factors  untuk  meningkatkan  pembentukan tulang pada calvaria tikus [21].

## Osteoporosis
Osteoporosis  berasal  dari  bahasan  Yunani,  osteo  berarti  tulang  dan  porosis  berarti  penuh rongga  [22].  Menurut  [23],  osteporosis  adalah  penyakit  tulang  sistemik  yang  ditandai penurunan  densitas  massa  tulang  dan  perburukan  mikroarsitektur  tulang  sehingga  tulang menjadi  rapuh  dan  mudah  patah.  [24],  mengemukakan  penurunan  densitas  massa  tulang disebabkan oleh ketidakseimbangan antara resorpsi tulang dan pembekuan tulang.

## Histologi Osteoblas
Pada  sel  osteoblas  manusia  dan  binatang,  IL-6  menunjukkan  efek  antiapoptotik,  in vitro  menunjukkan  antagonis  efek  proapoptotik  dari  glukokortikoid  [25].  Estrogen  juga mempunyai  efek  inhibisi  apoptosis  osteoblas  dan  osteosit  sehingga  berperan  dalam  control masa hidup kedua sel tersebut [26]. Estrogen melalui jalur instrinsik ( mithocondrial pathway) meningkatkan  produksi anti  apoptotic  protein seperti  Bclz  dan  Bcl  x  dan  penurunan preapoptotic  protein seperti  Bak,  Bax  dan  Bcm.  Peningkatan  Bcl  z  dan  Bcl  x  menghambat pengeluaran cytochrom c dari mitokondria sehingga tidak terjadi kompleks cytochrome c dan Apaf-1 ( apoptosis activating factor-1) , disamping Bcl z dan Bcl x juga menginhibisi Apaf-1. Protein lain yang dihambat pengeluarannya dari mitokondria adalah AIF ( apoptosis inducing factor) sehingga  tidak  terjadi  ikatan  dan  netralisir  inhibitor  apoptosis.  Hasil  akhir  dari  fase
inisiasi  ini adalah hambatan caspase cascade sehingga tidak berlanjut dengan fase  aksekusi sel [27].

## Histologi Osteoklas
Osteoklas
merupakan  sel  multinuklear  yang  jauh  lebih  besar  jika  dibanding  dengan  sel-sel tulang lainya.Ukuran osteoklas berkisar antara 20um  – 100um dengan jumlah inti mencapai 50  buah.Osteoklas  berasal  dari  diferansiasi  monosit/makrofag  yang  terdapat  ditulang  dan mensekresi  berbagai  asam  dan  ezim  yang  mencerna  tulang  dan  memudahkan fagositosisnya.Osteoklas  hanya  terdapat  pada  satu  bagian  kecil  tulang  pada  satu  waktu  dan memfagosit tulang sedikit demi sedikit, kemudian osteoklas menghilang dan digantikan oleh osteoblas untuk  menghasilkan tulang  yang baru  [28]. Osteoklas terbentuk  dari sel  precursor berupa stem sel hematopoetik yang disebut monosit. Osteoklas mengabsorbsi tulang dengan cara menempel pada permukaan tulang dan menurunkan pH sekitar sehingga mencapai kadar asam  sekitar  4,5.  Mineral  tulang  menjadi  larut  dan  kolagen  menjad  elektroni pecah.Diferensiasi  dan  fungsi  osteoklas  terutama  diatur  beberapa  factor  yaitu Macrophage Colony-Stimulating  Factor (M-CSF), Receptor  for  Activation  of  Nuclear  Factor  Kappa  8 Ligand (RANKL), dan Osteoprotogerin (OPG) [29].
Osteoklas  adalah  sel  multinukler  yang  terdiri  dari  banyak  mitokondria,  lisosom  dan ribosom  dengan  morfologi  bentuk  tepi  membrane  berkerut  karena  invaginasi  plasma membran (ruffled border). Osteoklas juga dilengkapi area yang disebut clear zone yang terdiri dari  berkas actin-likefilament yang  berfungsi  untuk  mutup  area  yang  akan  diresorpsi. Vacuolar  H + ATPase atau ATP-driven  proton  pump yang  terletak  ditepi  membran menyebabkan  area  bersifat  asam  sehingga  melarutkan  komponen  mineral  matriks  tulang. Sekresi metrix metalloproteinase (MMP), kolagenase dan gelatinase serta cathepsin K, B dan L (suatu lysosomal cysteine proteinase ) menyebabkan degradasi  komponen protein matriks tulang terutama kolagen [30].
Osteoklas  membentuk  enzim phsphohydrolase dan tartrate-resistant  acid phosphatase ( TRAPase).Enzim TRAPase dilepas kedalam lakuna tempat resorpsi tulang pada saat  pembongkaran  tulang,  diduga  berperan  untuk  melarutkan  mineral  matriks  tulang.  Pada saat pembongkaran tulang, osteoklas juga melepas collagen crosslink hasil degradasi matriks protein (kolagen tipe1) seperti pyridinium crosslink (free pyridinoline dan deoxypyridinoline ), cross-linked  telopeptide(N-telopeptides dan C-telopeptides  ) disamping
enzim TRAP dan kalsium, sebagai subtansi petanda biokimiawi resorpsi atau pembongkaran tulang [31, 32].

## Patofisiologi Osteoporosis
Menurut  [33],  osteoporosispada  dasarnyadisebabkan  olehpenyimpangandalam remodeling tulangyang menyebabkan kerapuhantulang. Dalam proses remodeling tulang, sel stroma  dan  osteoblas  menyintesis  dan  menjumlahkan  pada  membrane  selnya  suatu  anggota family Necrosis  Tumor  Factor (TNF)  yang  disebut  ligan  RANK.  Ligan  RANK  berikatan dengan suatu molekul reseptor yang dikenal dengan singkatan RANK ( receptor activator for nuclear  factor  k B)  yang  dijumlahkan  oleh  makrofag.  Diferensiasi  makrofag  menjadi osteoklas mengisyaratkan bahwa ligan RANK berikatan dengan reseptor RANK di makrofag. Selain itu, sel stroma juga menghasilkan sitokin yang disebut macrophage colony-stimulating factor yang melekat ke reseptor khusus di makrofag. Ligan RANK dan macrophage colony- stimulating  factor bekerja  bersama-samamengubah  makrofag  menjadi  osteoklas  yang meresorbsi tulang.
Aktivitas  osteoklastogenik  dijalur  ligan  RANK-RANK  di  atur  oleh  molekul  yang disebut osteoprotegerin (OPG) yang juga diekskresi sel stroma/osteoblas. OPG adalah suatu reseptor  pengikat  yang  dapat  mengikat  ligan  RANK  sehingga  tidak  dapat  berikatan  dengan reseptor RANK. Jika ligan RANK berikatan dengan OPG dan bukan dengan reseptor RANK maka pembentukan osteoklas akan terganggu sehingga resorbsi tulang menurun.
Factor  hormone  berperan  penting  dalam  timbulnya  osteoporosis  terutama pascamenopause.  Estrogen  dapat  merangsang  pembentukan  OPG  sehingga  menghambat pembentukan  osteoklas.  Namun  jika  terjadi  penurunan  kadar  estrogen  akan  menyebabkan peningkatan  produksi  IL-1,  IL-6,  dan Necrosis  Tumor  Factor (TNF)  oleh  monosit  dan sumsum  tulang  lainnya.  Sitokin  ini  yang  akan  meningkatkan  jumlah  precursor  osteoklas seningga resorbsi tulang juga akan meningkat. Selain itu, beberapa penelitian mengisyaratkan bahwa  defisiensi  estrogen  juga  menyebabkan  penurunan  aktivitas  osteoblastik  sehingga pembentukan tulang baru juga menurun. Hal ini yang akan menjadi factor penurunan massa tulang sehingga terjadi osteoporosis.

## METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian  ini  bersifat  eksperimental    laboratorisdengan  rancangan  penelitian  yang digunakan  adalah true  experimental melalui  pendekatan ThePostest  -  Only  ControlGroup Design. Adapun rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah randomized
post  test  only  control  group  design .Penelitian  ini  telah  dilakukan  padabulan  Mei  sampai dengan agustus 2014 di Laboratorium Biokimia FK Unair Surabaya, RS Hewan, FKH Unair Surabaya.Subjek  berupa  tikus  putih  galurwistar  ( Rattus  norvegicus L.)  berjumlah30ekor. Penentuan  besar  sampel  mengunakanrumus  Federer  [34]  yaitu  minimal  10  ekor  tikus perkelompok.

## Alat dan Bahan Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalampenelitian ini: kandang, sarung tangan, tempatair minum dan  makan  hewan,  alat-alat  gelas( Pyrex) ,  rotary  evaporator,  ayakan,  jarumsuntik  berujung Nasogastric  tube (NGT)  no.5dan  no.3, disposible  syringe 3ml,  jarum  suntik,gunting,  1. Bahan  penelitian  adalah  Kitosan,  Hewan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  tikus galur  wistar  putih  (galur  / wistar sebanyak  30  ekor,  jenis  kelamin betina ),  berat  badan  100  – 150  gram,  umur  2  –  3  bulan,  tikus  galur  wistar  ini  dipelihara  dengan  kondisi  yang  sama selama 20hari agar dapat beradaptasi.
Bahan  kimia  :  air  kemasan,  betadin,  éter,  ketamin,  larutan  formalin  buffer  10%,  xylol (MERCK),  gliserin,  paraffin,  larutan  EDTA  10%,  solusi polyvinylpyrolidone 7,5%,  larutan Hematoxylin Eosin, alkohol 70%; 80%; 95% dan 96%, egg albumin, dan entelan (MERCK), HCL, aquades dan larutan PBS .Carboxy methylcellulosse 1 % (CMC).

## HASIL
Hasil  penelitian  menunjukkan  terdapat  perbedaan  yang  bermakna  (p  <  0,05).Data deskriptif hasil penelitian  untuk jumlah sel osteoblas dan jumlah sel osteoklas dapat dilihat pada Tabel 5.1 dan 5.2 berikut:
Tabel  5.1.    Nilai  rerata  ( mean )  dan  simpang  baku  (SD)  sel  osteoblas  tikus  pada  kelompok K1, K2, dan K3.
Kelompok n Mean dan SD K1 K2 K3 10 10 10 115,60 ± 32,108 94,10 ± 28,006 149,73 ± 29,247
Tabel 5.2. Nilai rerata ( mean ) dan simpang baku (SD) sel osteoklas tikus pada kelompok  K1, K2, dan K3.
Kelompok n Mean dan SD K1 K2 K3 10 10 10 3,80 ± 2,044 11,50 ± 5,740
6,40 ± 3,777
Hasil  analisis  deskriptif  pada  kelompok  K3  sebagai  kelompok  perlakuan,didapatkan  hasil peningkatan  Osteoblas  dengan  mean±SD  =  149,50  ±  29,247  dibandingkan  K2  sebagai kelompok  kontrol  positif  mean±SD  =  94,10  ±  28,006,  adapun  hasil  analisis  deskriptif  pada kelompok  K3  sebagai  kelompok  perlakuan,didapatkan  hasil  penurunan  Osteoklas  dengan mean±SD  =  6,40  ±  3,777  dibandingkan  K2  sebagai  kelompok  kontrol  positif  dengan mean±SD = 11,50 ± 5,740,  menunjukkan bahwa pemberian kitosan dengan dosis 45 mg/hari dosis tungal selama 10 hari berpengaruh pada tikus dengan post ovarektomi.

## DISKUSI
Hasil  penelitian  yang  ditunjukkan  di  atas  merupakan  nilai  dari  jumlah  sel  osteoblas  dan jumlah  sel  osteoklasdari  tiap  kelompok  penelitian.  Pada  kelompok  kontrol  positif menunjukkan hasil uji normalitas osteoklas yang paling besar (0,523) yang berarti kelompok kontrol  positif  memiliki  potensi  pembentukan  tulang    yang  paling  kecil.  Sedangkan  pada kelompok  perlakuan  menunjukkan  hasil  uji  normalitas  osteoklas  yang  paling  kecil    (0,457) .Hal ini menunjukkan bahwa pada kelompok perlakuan memiki potensi dalam pembentukan tulang yang paling besar. Hasil penelitian [35], menunjukkan bahwa kitosan mampu menekan proses  osteoklastogenesis.  Osteoklastogenesis  tergantung  pada  interaksi  tertutup  antara prekursor  osteoklas  dan  sel  stromal  sumsum  tulang.  Sel  stromal  mensekresikan  sitokin  M- CSF ( macrophage-colony stimulating factor ),  yang penting untuk  diferensiasi  osteoklas dan makrofag  dari  prekursornya.  Sel  stromal  juga  mengekspresikan  molekul  yang  disebut RANKL ( receptor activator of nuclear factor Kβ ligand ) pada permukaan sel, yang molekul ini nantinya berinteraksi dengan reseptor permukaan sel lainnya yang terdapat pada prekursor osteoklas  yang  disebut  RANK  ( receptor  activator  of  nuclear  factor K β )  untuk  promosi diferensiasi  prekursor  osteoklas  menjadi  osteoklas  matang.  Interaksi  RANK-RANKL dihambat  molekul  lainnya  yang  disebut  sebagai osteoprotegerin (OPG)  dimana  berperan sebagai ligand untuk RANK dan dengan aksi ini maka menjadikan aksi inhibitor yang poten dalam pembentukan osteoklas.Hal ini menunjukkan bahwa pada kelompok perlakuan memiki densitas tulang yang paling besar. Nilai densitas tulang pada kelompok perlakuan yang diberi
Kitosan 45 mg/hari menunjukkan densitas tulang yang paling baik. Hal ini diduga diperankan oleh  Kitosan  yang  mampu  meregulasi  remodeling  tulang.  Kitosan  secara  progresif  akan menurunkan  produksi  prostaglandin  E2  [36]  dan  sitokin  inflamatori  yaitu  IL-1,  IL-6  dan TNF-α  [37].  Penurunan  prostaglandin  dan  sitokin  inflamatori  menyebabkan  pembentukan dan  aktivitas  osteoklas  terganggu  sehingga  menurunkan  tingkat  resorpsi  tulang.  Selain  itu, kitosanjuga dapat meningkatkan formasi dan diferensiasi osteoblas pada proses pembentukan tulang. Kitosan tersebut menunjukkan pengaruh menguntungkan bagi kesehatan tulang [38].

## KESIMPULAN
Pemberian  ekstrak  serbuk  kitosan  45mg/KgBB/hari  selama  10  hari,  dapat  menurunkan jumlah  Osteoklas  dan  meningkatkan  jumlah  Osteoblaspada  tikus  putih  betina  model menopause.

## Saran
Perlu penelitian lebih lanjut dengan bermacam-macam dosis untuk menentukan dosis optimal untuk  menurunkan  jumlah  osteoklas  dan  meningkatkan  jumlah  osteoblas.Perlu  dilakukan penelitian  tentang  uji  toksisitas  ekstrak  kitosan    sebelum  digunakan  sebagai  terapi  untuk menurunkan  jumlah  osteoklas  dan  meningkatkan  jumlah  osteoblas  pada  manusia.Perlu adanya  penelitian  lebih  lanjut  tentang  bagimana  pemanfaatan  yang  tepat  (sediaan,  dosis bahan  dan  tehnik  aplikasi),  serta  lama  terapi  efektif  dari  kitosan  sebagai  terapi  osteoporosis pascamenopaus.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Malole  M,  BN,  C  SU,  Pramono,  1989. Penggunaan  Hewan-hewan  Percobaan Dilaboratorium. Bogor, PAU Bioteknologi IPB.
2. Torres,  da  Silva,  2011. The  influence  of  Modified  Chitosan  Subtrates  on Osteoclastogenesis. Thesis  Fakultas  Kedokteran  Biomedika  Universitas  do  Porto,  p. 18-28
3. Pascasia    L  C  S,    2008. Fortifikasi  Tepung  Cangkang  Udang  Sebagai  Sumber Kalsium Pada Mie Basah [skripsi]. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan .Bandung, Universitas Padjadjaran.
4. Rivaldi,  D.  2011. Pangaruh  Pemberian  Extract  Daun  Pegangan  (Centella  asiatika) Terhadap  Kadar  Fosfor Dalam  Darah  Pada  Tikus  (Rattus  Norvegicus)  Ovarektomi. Artikel Ilmiah. Surabaya: Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga.
5. Bertens, APMG, Booij, LHDJ,  Flecknell, PA et al, 1993. Anaesthesia, Analgesia and euthanasia.  In:  Principles  of  laboratory  Animal  Sciences .  Eds  Zutphen,  L.F.M., Baumans, V. and Beynen, A.C., pp. 267-298, Amsterdam, Elsevier
6. Dick  IM,  Price RL, 2001. The Effect  Of Estrogen On Renal  Phosporus  Handling  In The Rat. Nephrol, Am Jaunal21 : 323-330
7. Effendy, at  all . 2011. Antibacterial,  Radical- Scavenging  Activities And  Cytotoxicity Properties  Of  Phaleria  Macrocarpa  (Scheff.) Boerl.  Leaves  In  Hepg2  Cell  Lines. IJPSR, Vol. 2(7): 1700-1706
8. Federer W, 1991. statistic and society :data collection and interpretation. 2nd ed. New York : Marcel Dekker
9. Johnson Delaney C, 1996. Exotic Companion Medicine Handbook for Veterenarians (2 Vol. Set). Lake Worth, FL: Zoological Education Network.
10. Salma dan Yohana Waspada12 Penyakit yang Merusak Tulang Anda. Redaksi Cerdas Sehat. PT. Niaga Swadaya, April 2013.
11. Sularsih, Soeprijanto. 2012. Perbandingan Jumlah Sel Osteoblas pada Penyembuhan Luka Antara Penggunaan Kitosan Gel 1% dan 2%.Jurnal Material Kedokteran Gigi . Vol. 1 (1):83-157.
12. Masir,  Okky,  2012. Pengaruh  Cairan  Cultur  Filtrate  Fibroblast  (CFF)  Terhadap Penyembuhan  Luka; Penelitian  eksperimental  pada  Rattus  Norvegicus  Galur Wistar. http://jurnal.fk.unand.ac.id . Diakses tanggal 12 Februari 2014 pukul 8.19
13. Morgan    G,  dan  Hamilton  C  2009. Panduan  Praktik  Obstetri  dan  Ginekologi  Buku Kedokteran. Terjemahan oleh Rusi M. Syamsi dan Ramona P. Kapoh. Jakarta:EGC.
14. NurdinS,  2002. Pengaruh  Pemberian  Tepung,  Tahu  dan  Tempe  kedelai  Dalam Ransum  Terhadap  Masa  Densitas  Tualang  Tikus  Betina  Ovariektomi.  [Thesis] , Bogor, Pasca Sarjana IPB
15. Nabil ,. 2005. Pemanfaatan Limbah Tualang Ikan Tuna(Thunus sp.) Sebagai Sumber Kalsium Dengan Metode Hidrolisis Protein. [skripsi]. Bogor, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
16. Honarkar H, and Barikani M,  2009. Application of Biopolymer 1 : Kitosan, Monatsh Chem, 140 : 1403-20
17. Kurniasih, Mardiyah dan Kartika, Dwi, 2011. Sintesis dan Karakterisasi Fisika-Kimia Kitosan. Jurnal Inovasi. Vol. 5 (1):42-48.
18. Mineralisasi
Tualang
Femur Tikus Menderita Osteodistrofia Fibrosa.[Skripsi]. Cirbon,Institud  Agama  Islam  Negeri  (IAIN)  Steekh  Nurjati Cirebon.
19. Rachman  IA,  1999. Paparan  Sinar  UV.  Beta  Terhadap  Remodelling  Tulang:  Study Eksperiment  Pada  M.Fascicularis  yang  Hipoestrogenis.  [Disertai]. Program  Pasca Sarjana UI. Jakarta.
20. Setyorini,  A,  Suandi,  I  Sidiarta,  dan  Suryawan.2009. Pencegahan  Osteoporosis dengan  Suplementasi  Kalsium  dan  Vitamin  D  pada  Panggunaan  Kortikosteroid Jangka Panjang. Jurnal Sari Pediatri, Vol. 11, No.1.
21. Sondakh,  J.  Sanger,  OMG.  &  Masengi,  JA.  2001. Perbandingan  Kadar  Fosfatase Alkali  Khas  Tulang  dan  Kalsium  Total:  pada  Wanita  Pascamenopause  dan  Masa Reproduksi. Maj Obstet Ginekol Ind. 25 (3): 187-190.
22. Wiyarsi,  Antuni,&  Priyambodo,  Erfan.  (2009). Pengaruh  Konsentrasi  Kitosan  dari Cangkang  Udang  terhadap  Efisiensi  Penjerapan Logam  Berat.  Fakultas  Kimia FMIPA  UNY.  staff.uny.ac.id/sites/default/files/132312678/Penelitian%20kitosan.pdf [2 September 2013]
23. Suharjo dan Noor Harini, Ekstraksi Kitosan dari Cangkang Udang Windu
24. (Penaeus  Monodon  Sp)  Secara  Fisik  –  Kimia  (Kajian  Berdasarkan  Ukuran  Partikel Tepung Chitn dan Konsentrasi NaOH). Vol.1 no.1, September 2005: 7 – 15
25. Taber,  Benzion. Kapita  Selekta  Kedaruratan  Obstetri  dan  Ginekologi .Terjemahan oleh Teddy Supriyadi dan Johanes Gunawan. 1994. Jakarta:EGC
26. Honarkar H, and Barikani M,  2009. Application of Biopolymer 1 : Kitosan, Monatsh Chem, 140 : 1403-20
27. Redaksi  Cerdas  Sehat.  2013. Waspada  12  Penyakit  yang  Merusak  Tulang  Anda . Jakarta:Penerbit Cerdas Sehat.
28. Sudoyo,  Setiyohadi,  Alwi,  Simadibrata,  dan  Setiati.  2009. Buku  Ajar  Ilmu  Penyakit Dalam Jilid III Edisi V . Jakarta Pusat:InternaPublishing.
29. Van Abel, M., J.G.J. Hoendrop, O. Dardenne, R. St Arnaud, C.H. Van Os, H.J.P.T.M. Van Leeuwen, and R.J.M. Bindels. 2002. 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Independent Stimulatory Effect of Estrogen On the Expression of ECAC1 In The Kidney. J. Am. Nephrol. 13:2102-2109
30. XuH.,  JK  Uno,  M  Inouye    L  Xu,  JB,  Dress  JF  Collin,  and  F.K.  Ghishan.  2003. Regulation of Intestinal NaPi-IIb contransporter gene expression by estrogen. J. Am. Physiol. Gastrointest. 285: 1317-1324.
31. Zairin  Noor,  Moh  Hidayat,  Agus  Hadian  Rahim  and  Sutiman  B.  Sumitro. Bone Microstructure  and  Atomic  Periodic  Disharmonization  in  Osteoporosis .  Unicersa Medicina. Vol. 31 no.2 May – August, 2012.
32. Yildiz A, Hayirli,  A, Okumus Z et  al . (2007) Physiological profile of  juvenile rats: effect of cage size and cage density . Laboratory Animals, 36, 28-38
33. Smeltzer dan Bare, 2002. Keperawatan Medikal Bedah . Volume 1. EGC,Jakarta,  hal. 119-120
34. Shor-posner,  G,  Brennan  ,  G,  Ian,  C .  et  al .  1994 Meal  Patterns  of  macronutrient intake  in  rats  with  particular  dietary  preferences .  American  Journal  of  Physiology, 266, R1395-402
35. Pusponegoro  AD,  2005. Luka    Dalam, Buku  Ajar  Ilmu  Bedah.  Edisi  ke-2.  Jakarta: EGC
36. Mawarda  P  C,  R.  Triana,  Nasrudin,  2011. Funsionalisasi  Limbah  Cangkang  Udang untuk  Meningkatkan  Kandungan  Kalsium  susu  Kedelai  Sebagai  Penambah  Gizi Masyarakat  [Program  Kreativitas  Mahasiswa,  Gagasan  Tertulis]. Bogor,  Institut Pertanian Bogor.
37. American Medical Association, 2004. Phycisians Dedicated to the Health of America, DC: APA, Third Edition. Washington Sularsih, Soeprijanto. 2012. Perbandingan Jumlah Sel Osteoblas pada Penyembuhan Luka Antara Penggunaan Kitosan Gel 1% dan 2%.Jurnal Material Kedokteran Gigi . Vol. 1 (1):83-157.
2009. Histolgi Umum , CV Sagung Seto, Jakarta, p. 106-7, 111.
38. Nurlena, 2005. Tampilan Kalsium Dan Fosfor Darah, Produksi Susu, Ion Kalium dan Jumlah Bakteri Susu Sapi Perah FriesiannHolstein Akibat Pemberian Aras Sauropus androginus  (L)  Mer  (Katu).  [Thesis]. Semarang,  Pasca  Sarjana  Universitas Diponegoro.