Penentuan tingkat ploidi pada poliploid patin siam Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878 hasil manipulasi genetik berdasarkan jumlah
nukleolus per sel [Ploidy level determination in genetically modified polyploid striped catfish Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878 based on the number of nucleoli per cell]
Muhammad Sami Daryanto 1 , Odang Carman 2 , Dinar Tri Soelistyowati 2 , Rahman 2
1 Program Studi Ilmu Akuakultur, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor 2 Departemen Budidaya Perairan, FPIK-IPB Jl. Agatis, Kampus IPB, Dramaga, Bogor 16680
Diterima: 9 September 2018; Disetujui: 26 Desember 2018

## Abstrak
Penentuan variasi jumlah maksimum nukleolus per sel pada individu diploid dan tetraploid patin siam Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878 dilakukan dalam upaya verifikasi ketepatan penghitungan nukleolus sebagai metode tidak langsung dalam identifikasi ikan poliploid. Penelitian ini bertujuan menentukan tingkat ploidi ikan patin siam berdasarkan jumlah maksimum nukleolus per sel. Diploid patin siam dihasilkan melalui fertilisasi buatan antara telur dan sperma tanpa kejutan suhu sedangkan tetraploid patin siam dihasilkan melalui fertilisasi antara telur dan sperma serta di induksi menggunakan kejutan suhu 4 o C dengan durasi kejutan 25 menit pada umur zigot 28 menit setelah fertilisasi  sesaat  sebelum  mitosis I.  Persentase  penetasan  kelompok  perlakuan  diploid 81,35±0,73%  dan  kelompok perlakuan  tetraploid  3,39±1,78%.  Sintasan  kelompok  perlakuan  diploid  88,67±5,25%  dan  kelompok  tetraploid 83,33±5,73% selama 15 hari pemeliharaan. Frekuensi satu, dua, tiga dan empat nukleoli per sel dihitung berdasarkan pengamatan 450-550 sel setiap individu yang diamati. Sel individu diploid memiliki satu dan maksimum dua nukleoli per  sel , sedangkan  individu  tetraploid  memiliki  satu,  dua,  tiga,  dan  maksimum  empat  nukleoli  per  sel . Anomali muncul melalui pewarnaan perak nitrat pada jumlah maksimum tiga nukleoli per sel menunjukkan individu tersebut tetraploid yang diverifikasi  menggunakan  metode penghitungan kromosom. Penentuan ploidi pada ikan patin siam menggunakan penghitungan jumlah nukleolus per sel memiliki potensi dalam identifikasi secara cepat.
Kata penting: nukleolus, patin siam, poliploid, tingkat ploidi.

## Abstract
The variation in the maximum number of nucleoli per cell in diploid and tetraploid striped catfish Pangasianodon hypophthalmus Sauvage,  1878  in  attempts  to  verify  the  validity  of  nucleoli  counting  as  an  indirect  method  for polyploidy identification in fish. The aim of this research was to determine ploidy level of striped catfish based on the maximum number of nucleoli per cell. The diploid striped catfish was produced by fertilizing eggs without thermal- shock  and  tetraploid  fish  was  obtained  by  fertilizing  eggs  and  applying  thermal-shock  induction  with  4 o C  for  25 minutes at zygotic age 28 minutes after fertilization prior to the first cleavage stage of zygote. The hatching rate of diploid group and tetraploid group were 81.35±0.73% and 3.39±1.78% and survival rate during the 15 days rearing were 88.67±5.25% and 83.33±5.73%, respectively. The frequency of one, two, three, and four nucleoli per cell were counted based on each sample observation of 450-550 cells. Cell of individual diploid had one nucleoli and maximum two nucleoli per cell, while tetraploid had one, two, three, and maximum four nucleoli per cell. Anomaly in the silver- stained appearance at the maximum number of three nucleoli per cell indicated tetraploid individuals as verified by chromosome counting method. Ploidy level determination of striped catfish using the number of nucleoli per cell has a potential for rapid identification.
Keywords: ploidy level, polyploidy, striped catfish, nucleoli

## Pendahuluan
Manipulasi set kromosom, salah satunya poliploidisasi  merupakan teknik rekayasa  gene- tik yang terbukti efektif dan penerapannya se-
derhana  dalam  memperbaiki  mutu  genetik  ikan patin  siam.  Metode  poliploidisasi  telah  umum dilakukan  dalam  berbagai  percobaan  bidang akuakultur tetapi tidak menjamin 100% individu poliploid terbentuk sehingga memerlukan meto- de  yang sederhana, cepat, dan akurat untuk pe-
_____________________________  Penulis korespondensi
Alamat surel: samidaryanto@gmail.com
nentuan tingkat ploidi. Namun metode yang da- pat diandalkan untuk mengidentifikasi poliploid dengan  cepat  masih  belum  tersedia.  Kombinasi beberapa teknik sederhana seperti penghitungan kromosom  dan  penghitungan  jumlah  nukleolus dapat  membantu  dalam  kecepatan,  ketepatan, mudah dan relatif lebih murah serta dapat dian- dalkan dalam manipulasi genom (Pradeep et al .
2014).  Beberapa  metode  yang  telah  diterapkan dalam  penentuan  tingkat  ploidi  antara  lain:
karyotyping atau  penghitungan  jumlah  kromo- som, penghitungan jumlah nukleolus, pengukur- an  inti  sel  darah  merah,  penghitungan  ukuran inti sel, penentuan kandungan DNA mengguna- kan flow  cytometry dan  mikrosatelit  (Bai et  al .
2011). Salah satu metode termudah dan tercepat dalam penentuan tingkat ploidi yakni penentuan jumlah  kandungan  DNA  menggunakan flow
cytometry dan mikrosatelit, tetapi memiliki kele- mahan  yakni  membutuhkan  biaya  peralatan yang besar (Mukti 2017). Walaupun pengukuran inti  sel  darah  merah  banyak  digunakan  seperti yang  dilaporkan  Caterina et  al .  (2014),  masih memiliki kelemahan yakni ukuran inti sel darah merah ikan triploid tidak selalu 1,5 kali lebih be- sar jika dibandingkan dengan diploid dan masih bergantung pada anti koagulan  yang digunakan untuk mengoleksi sampel darah sehingga mem- butuhkan  waktu  dalam  persiapan  sampel  dan pembuatan  preparat.  Alternatif  lain  dalam  pe- nentuan tingkat ploidi yakni penghitungan jum- lah  kromosom  yang  merupakan  metode  lang- sung  dan  paling  akurat  dalam  identifikasi  ting- kat ploidi karena mencerminkan set kromosom. Metode  ini  diyakini  membutuhkan  waktu  yang lebih lama, biaya yang relatif mahal, dan tingkat keahlian  tinggi  yang  menentukan  keberhasilan- nya (kelembaban, ketinggian penetesan suspen- si,  dan  teknik  dalam  pengeringan  preparat)  se-
hingga  tidak  praktis  dalam  penelitian  lapangan (Kim et al . 2017).
Berdasarkan  metode-metode  di  atas, penghitungan  jumlah  nukleolus  pada  sel  tubuh merupakan  metode  tidak  langsung  dalam  iden- tifikasi tingkat ploidi secara efektif dan efisien. Jumlah  nukleolus  meningkat  pada  beberapa kondisi  fisiologis  (sebagai  contoh  pertumbuhan oosit) tanpa diiringi peningkatan set kromosom (Carman et  al .  1992).  Pada interfase sel  soma- tik,  terdapat  hubungan  antara  jumlah  nukleolus yang terlihat dengan jumlah set kromosom. Sel tumbuhan atau hewan biasanya memiliki jumlah nukleolus  yang  tetap  sehingga  tingkat  ploidi berbagai  spesies  tersebut  dapat  dengan  mudah diperkirakan dengan  menghitung jumlah  nukle- olusnya. Hubungan antara jumlah nukleolus dan jumlah set kromosom telah digunakan pada ber- bagai spesies ikan seperti Oreochromis niloticus (Mukti 2016), Rhodeus uyekii (Gill et al . 2016),
dan Salvenilus  fontinalis (Jewsiewicka et  al . 2015).  Visualisasi  nukleolus  menggunakan pewarnaan perak nitrat sangat mudah diterapkan karena dapat digunakan pada ikan berumur mu- da,  menggunakan  berbagai  jaringan  spesimen tubuh  dalam  jumlah  sedikit,  dan  dapat  menen- tukan jumlah maksimum nukleolus per sel.
Pada penelitian ini, dilakukan penentuan tingkat  ploidi  ikan  patin  siam  menggunakan penghitungan  jumlah  maksimum  nukleolus  per sel  yang  diverifikasi  dengan  menggunakan penghitungan  jumlah  kromosom. Penelitian  ini bertujuan  menentukan  tingkat  ploidi  ikan  patin siam  berdasarkan  jumlah  maksimum  nukleolus per sel.

## Bahan dan metode

## Waktu dan tempat
Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan Januari  hingga  Juli  2018  di  Kantor  Cabang Dinas  Kelautan  dan  Perikanan  Wilayah  Utara (CDKPWU),  Instalasi  Cijengkol,  Kabupaten Subang.  Analisis  tingkat  ploidi  dilakukan  di Laboratorium  Reproduksi  dan  Genetika  Orga- nisme Akuatik, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,  Institut Pertanian Bogor.

## Pemijahan
Pemijahan  dilakukan  menggunakan  tek- nik  perangsangan  hormonal  dengan  dua  kali penyuntikan  pada  induk  betina  dan  satu  kali pada  induk  jantan.  Proses  pemijahan  dilakukan melalui penyuntikan hormon Human  Chorionic
Gonadotropin (hCG)  (Pregnyl ® )  dan  hormon sGnRHa+Domperidone  (Ovaprim ® ).  Induk  be- tina yang digunakan berumur 2-3 tahun dengan berat  3-5  kg  ekor -1 dan  induk  jantan  berumur 1,5-2  tahun  dengan  berat  1,5-2  kg  ekor -1 .  Pe- nyuntikan  pertama  pada  induk  betina  menggu- nakan  hormon  hCG  dengan  dosis  500  IU  kg -1
induk, 24 jam berikutnya dilakukan penyuntikan kedua menggunakan Ovaprim dengan dosis 0,6 mL kg -1 induk. Bersamaan dengan penyuntikan kedua pada induk betina, dilakukan penyuntikan induk  jantan  menggunakan  Ovaprim  dengan dosis  0,3  mL  kg -1 . Setelah  8-10  jam  dilakukan pengurutan ( stripping ) pada bagian abdominal.

## Produksi ikan diploid dan tetraploid
Telur dan sperma yang telah  difertilisasi dicuci  menggunakan  suspensi  tanah  untuk menghilangkan daya rekat telur. Telur yang di- gunakan berjumlah 5000 butir setiap kelompok.
Produksi ikan diploid dihasilkan melalui fertili- sasi  telur  dan  sperma  tanpa  diberi  induksi kejutan suhu. Ikan tetraploid diproduksi melalui fertilisasi  antara  telur  dan  sperma  dan  diberi
kejutan  suhu  dingin  pada  umur  zigot  28  menit setelah  fertilisasi  dengan  cara  merendam  zigot menggunakan  wadah  peletakan  zigot  ke  dalam
styrofoam berisi  air  bersuhu  4 o C  dengan  lama waktu  kejutan  selama  25  menit.  Zigot  diploid dan tetraploid selanjutnya dipindahkan ke dalam akuarium  inkubasi  pada  suhu  air  29-30 o C  dan menetas setelah 20-24 jam. Sesaat setelah mene- tas dilakukan  penghitungan  persentase  penetas- an dengan menghitung jumlah telur yang mene- tas per telur yang terbuahi.

## Pemeliharaan yuwana
Pemeliharaan  yuwana  dilakukan  selama 15  hari  dalam  wadah  bervolume  25  L  dengan kepadatan  yuwana  berjumlah  50  ekor  per  wa- dah. Yuwana diberi pakan naupli artemia 30-36 jam setelah menetas, selama empat hari dengan frekuensi  pemberian  tiga  jam  sekali.  Yuwana berumur  5-15  hari  diberi  pakan  cacing  sutera yang telah dicincang halus dan dicuci bersih de- ngan waktu pemberian lima jam sekali. Yuwana berumur  di  atas  15  hari  diberi  pakan  ikan  ko- mersial berupa tepung (Feng Li ® ) dengan kom- posisi  40% protein,  5% lemak,  2% serat  kasar, 13%  abu,  11%  kadar  air,  frekuensi  pemberian tiga kali sehari. Penggantian air dilakukan pada hari  ke  lima  setelah  yuwana  menetas  sebanyak 30% dari total volume air. Setelah itu penggan- tian  air  dilakukan  sebanyak  50%  dari  volume total.  Pada  hari  ke  15  pemeliharaan  dilakukan penghitungan  tingkat  sintasan  yuwana  dengan menghitung  jumlah  yuwana  yang  hidup  per jumlah yuwana yang ditebar.

## Pembuatan preparat nukleolus dan kromosom
Preparasi  nukleolus  dilakukan  dengan memfiksasi  sampel  yuwana  berumur  tujuh  hari menggunakan larutan Carnoy (1 Asam Asetat :
3 Etanol) selama 60  menit dengan  penggantian larutan baru setiap 30 menit. Sampel dapat lang- sung diproses atau disimpan di lemari pendingin bersuhu  4 o C  selama  beberapa  minggu.  Sampel didisosiasi  dengan  menambahkan  tiga  tetes Asam Asetat konsentrasi 50% pada gelas objek cekung  selama  6-10  detik.  Selanjutnya  dengan menggunakan  mikropipet  (ukuran  tip  200  µL), suspensi  sel  yang  terbentuk  dihisap  dan  dipin- dahkan ke gelas objek yang diletakkan pada hot plate hangat (suhu 45-55 o C). Suspensi sel yang berada  di  gelas  objek  tersebut  dihisap  kembali dengan  cepat  menggunakan  mikropipet  sehing- ga  membentuk  lingkaran  berdiameter  1-1,5  cm pada  gelas  objek.  Selanjutnya  setelah  preparat kering,  preparat  nukleolus  diwarnai  mengguna- kan perak nitrat dengan cara menambahkan dua tetes Larutan A (10 g AgNO 3 dilarutkan dalam 20  ml  Akuades)  dan  satu  tetes  larutan  B  (2  g Gelatin dilarutkan dalam 50 ml air kemudian di- tambahkan 50 ml Gliserin, setiap 10 ml larutan campuran  Gelatin+air+Gliserin  ditambah  dua tetes Asam Formiat). Preparat kemudian ditem- patkan dalam kotak pewarnaan bersuhu 40-45 o C selama 20 menit hingga berubah warna menjadi kuning  kecokelatan.  Preparat  nukleolus  dibilas dengan  Akuades  dan  dikering-anginkan  selan- jutnya  diamati  di  bawah  mikroskop  (Olympus CX41) pada pembesaran 400x  menurut  metode Howell & Black (1980) dengan beberapa modi- fikasi  ( hot  plate bersuhu  70 o C;  Larutan  A  (4  g AgNO 3 dilarutkan  dalam  8  ml  Akuades);  La- rutan B (2 g Gelatin dilarutkan dalam 100 ml air tanpa penambahan Gliserin, setiap 10 ml larutan campuran Gelatin+air ditambah satu tetes Asam Formiat)).  Penghitungan  nukleolus  dilakukan dengan  menghitung  450-550  sel  pada  setiap sampel.  Penentuan  tingkat  ploidi  dilakukan
dengan  cara  menghitung  jumlah  maksimum satu, dua, tiga dan empat nukleoli per sel.
Preparasi  kromosom  menggunakan  me- tode Kligerman  & Bloom (1977) dengan bebe- rapa  modifikasi  (0,005–0,01%  w/v  Kolkisin; Giemsa 4%). Preparasi kromosom teknik jaring- an padat ini, diawali dengan perendaman yuwa- na  menggunakan  larutan  Kolkisin  0,07  %  w/v (70  mg  Kolkisin  dalam  satu  liter  air  pemeliha- raan) selama enam hingga sembilan jam dan di- aerasi dengan baik. Kemudian yuwana direndam dalam  larutan  KCl  0,075  M  (5,6  g  KCl  dalam satu  liter  akuades)  selama  60  menit  dengan penggantian larutan baru setiap 30 menit. Yuwa- na tersebut difiksasi dengan larutan Carnoy se- lama 60 menit dengan penggantian larutan baru setiap 30 menit. Pembuatan preparat kromosom dilakukan dengan mendisosiasi sampel dan me- nambahkan  tiga  tetes  Asam  Asetat  konsentrasi 50% pada gelas objek cekung selama 6-10 detik. Selanjutnya  dengan  menggunakan  mikropipet (ukuran tip 200 µL), suspensi sel yang terbentuk dihisap dan dipindahkan ke gelas objek yang di- letakkan pada hot  plate hangat (suhu 45-55 o C). Suspensi sel yang berada di gelas objek tersebut dihisap  kembali  dengan  cepat  menggunakan mikropipet sehingga  membentuk  lingkaran ber- diameter  1-1,5  cm  pada  gelas  objek  dan  dilan- jutkan dengan pewarnaan menggunakan Giemsa 10% selama 20 menit. Setelah itu preparat kro- mosom  dibilas  dan  dikering-anginkan  selanjut- nya  diamati  di  bawah  mikroskop  (Olympus CX41)  pada  pembesaran  1000x.  Penentuan tingkat  ploidi  dilakukan  dengan  cara  menghi- tung jumlah kromosom (contoh: 59, 60, 61 kro- mosom) dalam setiap lingkaran preparat kromo- som yang paling banyak ditemukan pada setiap individu yuwana.

## Analisis statistik
Persentase penetasan dan tingkat sintasan dianalisis menggunakan sidik ragam (ANOVA) dan bila terdapat pengaruh perlakuan dilakukan uji lanjut Duncan’s Multiple Range Test pada ta- raf kepercayaan 95%. Uji statistik menggunakan perangkat lunak SPSS versi 22.0.

## Hasil
Persentase penetasan ikan diploid (tanpa perlakuan  kejutan  suhu)  adalah  81,35±0,73% sedangkan  ikan  tetraploid  (dengan  perlakuan kejutan  suhu)  adalah  3,39±1,78%.  Persentase penetasan  ikan  tetraploid  lebih  rendah  24  kali lipat  jika  dibandingkan  dengan  ikan  diploid. Tingkat  sintasan  setiap  kelompok  adalah 88,67%  untuk  diploid  sedangkan  tetraploid
83,33%  setelah  pemeliharaan  selama  15  hari (Tabel 1).
Persentase  penetasan  dan  sintasan  yang dihasilkan  berbeda  antara  ikan  diploid  dengan tetraploid.  Analisis  sidik  ragam  menunjukkan bahwa  nilai    persentase  penetasan  antara    ikan diploid  dan  tetraploid  terdapat  perbedaan  yang nyata (P<0,05). Analisis sidik ragam pada ting- kat  sintasan  menunjukkan  kelompok  ikan  di- ploid  dan  tetraploid  tidak  berbeda  secara  nyata (P>0,05).
Perbedaan  antara  jumlah  maksimum  nu- kleolus per sel individu diploid dengan individu tetraploid  dapat  dilihat  pada  Gambar  1.  Penga- matan nukleolus menunjukkan perbedaan warna antara  nukleus  dan  nukleolus.  Nukleus  terlihat berwarna  coklat  sedangkan  nukleolus  berwarna hitam. Tabel 1. Persentase penetasan dan tingkat sintasan kelompok diploid dan tetraploid patin siam Kelompok Persentase penetasan (%) Tingkat sintasan (%) Diploid 81,35±0,73a 88,67±5,25a Tetraploid 3,39±1,78b 83,33±5,73a
Keterangan :  Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang tidak sama berbeda nyata antar perlakuan pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan)
Gambar 1.  Pewarnaan nukleolus patin siam menggunakan perak nitrat. a Diploid memiliki maksimum dua nukleoli per sel dan b tetraploid memiliki maksimum empat nukleoli per sel. Nu : Nukleolus;
N : Nukleus. Tanda panah menunjukkan jumlah maksimum nukleolus. Bar = 20 µm a b N Nu Nu N
Identifikasi  tingkat  ploidi  menggunakan metode  penghitungan  nukleolus  yang  diwarnai dengan  perak  nitrat  menunjukkan  frekuensi  sel yang memiliki satu, dua, tiga, atau empat nukle- olus  disajikan  pada  Tabel  2. Nukleolus  ikan  p- atin siam diploid dan tetraploid memiliki variasi jumlah nukleolus dalam inti selnya. Pada peneli- tian  ini individu diploid  yang diamati  memiliki jumlah  nukleolus  satu  dan  maksimum  dua  nu- kleoli  per  sel.  Pada  setiap  individu  diploid  fre- kuensi sel yang ditemukan memiliki satu nukle- olus  per  sel  yakni  61,27±8,48%,  sedangkan jumlah  maksimum  dua  nukleoli  per  sel  adalah 38,73±8,48%.  Frekuensi  sel  dengan  satu,  dua, tiga  atau  empat  nukleoli  pada  tetraploid  patin siam  dapat  ditemukan  dengan  jumlah  maksi- mum  nukleoli  per  sel  empat. Frekuensi  sel  de- ngan jumlah  maksimum empat nukleoli per sel yang  ditemukan  pada  setiap  individu  tetraploid rendah yakni 0,69±0,64%.
Penghitungan  jumlah  kromosom  yang diwarnai  menggunakan Giemsa 10%  maka  di- dapatkan  jumlah  kromosom  yang  paling  sering ditemukan  pada  individu  diploid  berjumlah  60 (2n=60) sedangkan  pada  individu  tetraploid memiliki  kromosom  dengan  jumlah  120  (4n= 120) (Gambar 2).
Hubungan  antara  jumlah  maksimum  nu- kleolus yang diperoleh berkorelasi dengan ting- kat  ploidi  patin  siam  disajikan  pada  Tabel  3. Pengamatan  nukleolus  ikan  patin  siam  menun- jukkan semakin tinggi jumlah maksimum nukle- olus dalam satu sel yang ditemukan, maka akan semakin  tinggi  tingkat  ploidi.  Jumlah  maksi- mum dua nukleoli per sel menunjukkan tingkat ploidi diploid (2n), sedangkan jika jumlah mak- simum  empat  nukleoli  per  sel menunjukkan tingkat  ploidi  tetraploid  (4n).  Jika  dilihat  pada Tabel  3  terdapat  anomali  yang  muncul  pada jumlah maksimum tiga nukleoli per sel menun- jukkan tingkat ploidi tetraploid (4n).
Tabel 2.  Distribusi nukleolus patin siam diploid dan tetraploid
Ikan Jumlah a Jumlah nukleolus per sel (%) Satu Dua Tiga Empat Diploid 13 61,27±8,48 38,73±8,48 0 0 Tetraploid 27 58,71±12,60 37,13±9,16 3,72±4,73 0,69±0,64 Keterangan: a Jumlah individu yang diamati
Gambar 2. Kromosom patin siam yang diwarnai menggunakan Giemsa 10%. a, b Kromosom diploid dan
tetraploid. Bar = 5 µm
a
b
Tabel 3. Hubungan jumlah maksimum nukleolus dengan tingkat ploidi pada patin siam No. sampel Sebaran jumlah nukleolus per sel (%) Tingkat ploidi a Maks 1 2 3 4 1 2 210 (49,41) 215 (50,59) 2n 2 2 436 (67,49) 210 (32,51) 2n 3 4 256 (46,55) 245 (44,55) 37 (6,73) 12 (2,18) 4n 4 2 299 (56,52) 230 (43,48) 2n 5 4 165 (49,85) 145 (43,81) 16 (4,83) 5 (1,51) 4n 6 3 267 (50,76) 241 (45,82) 18 (3,42) 4n 7 3 292 (54,17) 244 (45,27) 3 (0,56) 4n 8 2 398 (72,76) 149 (27,24) 2n 9 2 297 (56,25) 231 (43,75) 2n 10 4 324 (60,22) 202 (37,55) 11 (2,04) 1 (0,19) 4n 11 4 268 (52,55) 194 (38,04) 40 (7,84) 8 (1,57) 4n 12 3 392 (72,06) 141 (25,92) 11 (2,02) 4n 13 3 326 (58,53) 226 (40,57) 5 (0,90) 4n 14 2 316 (57,45) 234 (42,55) 2n 15 3 369 (60,20) 235 (38,34) 9 (1,47) 4n 16 3 272 (50,09) 265 (48,80) 6 (1,10) 4n 17 4 175 (41,97) 213 (51,08) 22 (5,28) 7 (1,68) 4n 18 2 421 (79,89) 106 (20,11) 2n 19 4 319 (55,87) 225 (39,40) 24 (4,20) 3 (0,53) 4n 20 3 350 (68,09) 163 (31,71) 1 (0,19) 4n 21 4 415 (72,83) 150 (26,36) 3 (0,53) 1 (0,18) 4n 22 3 369 (60,20) 235 (38,34) 9 (1,47) 4n 23 2 295 (52,68) 265 (47,32) 2n 24 4 248 (43,82) 231 (40,81) 84 (14,84) 3 (0,53) 4n 25 2 327 (61,81) 202 (38,19) 2n 26 4 390 (74,71) 126 (24,14) 5 (0,96) 1 (0,19) 4n 27 2 360 (66,18) 184 (33,82) 2n 28 4 383 (74,66) 126 (24,56) 3 (0,58) 1 (0,19) 4n 29 4 212 (35,75) 283 (47,72) 94 (15,85) 4 (0,67) 4n 30 4 377 (61,00) 219 (35,44) 20 (3,24) 2 (0,32) 4n 31 3 364 (70,68) 145 (28,16) 6 (1,17) 4n 32 4 388 (80,50) 92 (19,09) 1 (0,21) 1 (0,21) 4n 33 4 242 (53,42) 204 (45,03) 5 (1,10) 2 (0,44) 4n 34 2 338 (62,71) 201 (37,29) 2n 35 2 306 (56,77) 233 (43,23) 2n 36 3 412 (75,74) 128 (23,53) 4 (0,74) 4n 37 4 373 (70,24) 156 (29,38) 1 (0,19) 1 (0,19) 4n 38 2 324 (56,54) 249 (43,46) 2n 39 4 327 (56,48) 233 (40,24) 17 (2,94) 2 (0,35) 4n 40 4 203 (34,23) 290 (48,90) 95 (16,02) 5 (0,84) 4n Keterangan: a Tingkat ploidi ditentukan dengan melihat jumlah maksimum nukleolus per sel setiap individu

## Pembahasan
Rendahnya  persentase  penetasan  kelom- pok individu tetraploid berkaitan dengan kejutan suhu yang ekstrem dan lama kejutan yang diteri- ma  zigot.  Hartono et  al .  (2016)  menyatakan guncangan, kejutan, dan perubahan suhu drastis sangat  berisiko  selama  periode  awal  embrio yang mengakibatkan banyaknya kematian zigot. Perlakuan kejutan suhu mengakibatkan kerusak- an pro nukleus, mengubah komposisi sitoplasma sel  telur,  kerusakan  benang  spindel,  terganggu- nya  aktivitas  enzim,  kerusakan  membran  zigot dan  selama  15  hari  pemeliharaan  yuwana,  sin- tasan antara kelompok diploid dengan kelompok tetraploid  memiliki  sintasan  yang  relatif  sama, yakni di atas 80% (Tabel 1). Sintasan yang lebih baik kemungkinan disebabkan oleh penanganan yuwana yang baik selama periode pemeliharaan. Piferrer  (2000)  menyatakan  penurunan  sintasan disebabkan oleh penanganan setelah induksi ke- jutan suhu yang kurang baik, bukan dari penga- ruh kejutan suhu terhadap embrio.
Berdasarkan penghitungan nukleolus, di- dapatkan  hubungan  antara  jumlah  maksimum nukleolus per sel dan tingkat ploidi yakni  pada individu  diploid  memiliki  jumlah  maksimum dua  nukleoli  per  sel,  sedangkan  pada  individu tetraploid jumlah maksimum empat nukleoli per sel. Dilihat dari proporsi jumlah maksimum nu- kleolus per sel, ditemukan indikasi bahwa pada individu tetraploid proporsi tersebut sangat ren- dah  (0,69%)  dibandingkan  dengan  individu  di- ploid  (38,73%).  Persentase  jumlah  maksimum nukleolus per sel yang lebih rendah pada indivi- du  tetraploid  diduga  disebabkan  penyatuan nukleolus  atau Nucleolar  Organizer  Regions
(NORs)  gagal  membentuk  nukleolus  selama siklus  sel  berlangsung  sehingga  mengakibatkan penurunan  jumlah  maksimum  nukleolus  yang
teramati (Verdun 2011). Penelitian yang dilaku- kan  Ibrahim  (2017)  pada  patin  siam  triploid menghasilkan frekuensi sel yang memiliki mak- simum  tiga  nukleoli  per  sel  dengan  persentase rendah  yakni  2,43-13,27%  dari  total  sel  yang diamati.  Berdasarkan  data  ini  dapat  dikemuka- kan  bahwa  semakin  tinggi  tingkat  ploidi  maka proporsi  dengan  jumlah  maksimum  nukleolus per selnya semakin rendah. Hal yang sama dite- mukan oleh Okumura et al . (2001) yakni terjadi penurunan  frekuensi  sel  dengan  jumlah  maksi- mum  tiga  nukleoli  per  sel pada  abalon  Pasifik
Haliotis  discus  hannai .  Carman et  al .  (1992) menyatakan  variasi  yang  terjadi  pada  jumlah maksimum nukleolus dapat disebabkan oleh ha- sil  penyatuan  dari  beberapa  nukleolus  menjadi satu bentuk akibat proses fisiologi selama siklus sel.  Penyatuan  ini  juga  ditemukan  pada  nukle- olus  sel  diploid  manusia  yang  sebenarnya  me- miliki  10  terbentuk  setelah  mitosis,  menurun jumlahnya  dan  meningkat  ukurannya  selama fase  G 1 tetapi  secara  cepat  tumbuh  dan  berga- bung  menjadi  satu  membentuk  satu  nukleolus yang  besar  (Farley et  al .  2015).  Anomali  yang ditemukan pada jumlah maksimum tiga nukleoli per  sel  menunjukkan  tetraploid  (4n).  Hal  yang sama ditemukan Carman et al . (1992) pada ikan mas dengan jumlah maksimum dua nukleoli per sel menunjukkan triploid (3n). Hal tersebut ter- jadi  berkaitan  dengan  kemampuan  pewarnaan menggunakan perak nitrat yang hanya mewarnai nukleolus  ( Nucleoli  Organizer  Regions /NORs) yang sedang aktif saat sintesis ribosom (Jankun et al . 2007). Hal lain yang diduga menyebabkan terjadinya anomali ini yakni dalam pembentuk- an  individu  tetraploid  kejutan  suhu  dilakukan untuk menghambat pembelahan sel saat mitosis I, di saat itu polar body II telah terlepas dari zi- got  beberapa  menit  setelah  fertilisasi  sehingga
tidak  mungkin  individu  yang  terbentuk  adalah individu triploid (Piferrer et al. 2009). Hubung- an jumlah  maksimum  nukleolus  per sel dengan tingkat  ploidi  memberikan  hasil  yang  cukup konsisten  (individu  diploid  memiliki  jumlah maksimum dua nukleoli per sel, sedangkan pada individu  tetraploid  jumlah  maksimum  empat nukleoli per sel) sehingga penghitungan jumlah nukleolus  sebagai  metode  tidak  langsung  dapat menjadi prediktor penentuan tingkat ploidi pada ikan  patin  siam.  Fenomena  rendahnya  proporsi sel  yang  memiliki  jumlah  maksimum  empat nukleoli  per  sel  pada  individu  tetraploid  tidak serta merta menunjukkan inkonsistensi penerap- an metode ini. Hal tersebut dapat diatasi dengan mengamati  lebih  banyak  sel  dalam  setiap  sam- pel (1500–2000 sel), sehingga sel yang memiliki jumlah  maksimum  empat  nukleoli per  sel  akan lebih banyak ditemukan jumlahnya.
Hubungan  antara  jumlah  nukleolus  dan jumlah  set  kromosom  telah  digunakan  untuk mengidentifikasi  poliploidi  pada  ikan.  Pada  in- terfase  sel  somatik,  terdapat  hubungan  antara jumlah  nukleolus  yang  terlihat  dengan  jumlah set  kromosom  (Schofer  &  Weipoltshammer 2018).  Verifikasi  penghitungan  nukleolus  de- ngan  menggunakan  metode  langsung  yakni penghitungan  kromosom  menunjukkan  bahwa semakin  tinggi  tingkat  ploidi  maka  semakin banyak pula jumlah kromosom yang ditemukan.
Hal yang sama ditemukan Ibrahim et al . (2017) pada  patin  siam  triploid  memiliki  jumlah  kro- mosom 1,5 kali lipat lebih banyak dibandingkan dengan  patin  siam  diploid.  Walaupun  penghi- tungan  kromosom  merupakan  metode  yang unggul dan tepat dalam penentuan tingkat ploi- di,  tetapi  analisis  kromosom  membutuhkan  ke- ahlian  yang  tinggi  dan  waktu  yang  relatif  lama (Caterina et  al . 2014). Penentuan tingkat ploidi
menggunakan  penghitungan  jumlah  nukleolus yang  diwarnai  dengan  perak  nitrat  dapat  dian- dalkan pada pekerjaan yang rutin maupun di la- pangan  karena  penerapannya  yang  sederhana, relatif  lebih  cepat,  dan  lebih  murah  dibanding- kan beberapa metode lainnya. Kim et al . (2017) menyatakan  sampel  preparat  nukleolus  dapat menggunakan berbagai jaringan spesimen tubuh dalam jumlah sedikit, dapat langsung dikerjakan di lapangan, dan dilakukan tanpa harus membu- nuh ikan. Keunggulan lainnya metode ini dapat diterapkan saat tahap awal embrio atau ikan ber- umur muda tanpa harus menunggu ukuran ikan besar  sehingga  dapat  mengurangi  biaya  tinggi dalam pemeliharaan sebelum identifikasi ploidi. Adanya  verifikasi  menggunakan  penghitungan kromosom  yang  hasilnya  berhubungan  dengan jumlah  maksimum  nukleolus,  meyakinkan bah- wa penghitungan nukleolus dapat menjadi meto- de yang dapat diandalkan dalam penentuan ting- kat ploidi.

## Simpulan
Penghitungan  jumlah  nukleolus  sebagai metode  tidak  langsung  dapat  menjadi  metode dalam penentuan tingkat ploidi pada ikan patin siam dengan sedikit kelemahan yaitu rendahnya jumlah maksimum empat nukleoli per sel dalam individu tetraploid.

## Persantunan
Penulis  berterima  kasih  kepada  Kemen- terian Pendidikan dan Kebudayaan atas bantuan beasiswa  dan  Kantor  Cabang  Dinas  Kelautan dan  Perikanan  Wilayah  Utara  yang  menyedia- kan tempat, bahan, dan materi selama penelitian.

## Daftar pustaka
Bai Z, Liu F, Li J, Yue GH. 2011. Identification of  triploid  individuals  and  clonal  lines in Carassius  auratus complex  using
microsatellites. International  Journal of Biological Sciences , 7(3): 279-285.
Carman  O,  Takashi  O,  Takashima  F.  1992. Variation  in  the  maximum  number  of nucleoli in diploid and triploid common carp. Nippon Suisan Gakkaishi , 58(12): 2303-2309.
Caterina  F,  Francesca  A,  Giuseppe  P,  Alessan- dro  Z,  Francesco  F.  2014.  Effect  of three  different  anticoagulants  and  sto- rage time on hematological parameters of Mugil  cephalus (Linneaus,  1758).
Turkish  Journal  of  Fisheries  Aquatic Sciences , 14(1): 615-621.
Farley KI, Surovtseva Y, Merkel J, Baserga SJ. 2015.  Determinants  of  mammalian nucleolar  architecture. Chromosoma , 124(3): 323-331.
Gil HW, Kong HJ, An CM, Kim BS, Lim SG,
Park  IS.  2016.  Cytogenetic  study  of diploid  and  induced  tetraploid  in Korean  rose  bitterling Rhodeus uyekii .
Springerplus , 5(1): 186-196.
Hartono DP, Witoko P, Purbosari N. 2016. The effect of  heat shock  on  the  tetraploidy of  catfish, Pangasius  hypophthalmus .
Bioflux , 9(3):  597-603.
Howell WM, Black DA. 1980. Controlled silver staining  of  nucleolus  organizer  region with protective colloidal developer: a 1
–  step  methods. Experientia ,  36(8): 1014-1015.
Ibrahim Y, Soelistyowati DT, Carman O. 2017.
Triploid striped catfish Pangasianodon hypophthalmus :  growth  performance and  gonadal  development. Jurnal
Akuakultur Indonesia , 16(1): 76-82.
Jankun  M, Kuzminski H,  Selezniow GF. 2007.
Ctyologic  ploidy  determination  in  fish – an example of two salmonid species.
Environmental  Biotechnology ,  3(2): 52-56.
Jewsiewicka  AS,  Kucinski  M,  Dobosz  S, Ocalewicz,  Jankun  M.  2015.  Chromo- somal characteristic and distribution of rDna  sequences  in  the  brook  trout
Salvelinus fontinalis (Mitchill,  1814). Genetica, 143(4): 425-432.
Kim HS, Chung KH, Son JH. 2017. Comparison of different ploidy detection methods in
Oncorhynchus mykiss ,  the  rainbow trout. Fisheries  and  Aquatic  Sciences , 20(29): 1-7.
Kligerman  AD,  Bloom  SE.  1977.  Rapid  chro- mosome preparations from solid tissues of  fishes. Journal  Fisheries  Research Board of Canada , 34(2): 266-269.
Mukti AT. 2016. Triploidi dan dimorfisme seks, performa  reproduksi  dan  produksinya pada  ikan  nila Oreochromis  niloticus,
Disertasi .  Institut  Pertanian  Bogor. Bogor Mukti AT. 2017. Metode penentuan ploidi pada ikan nila Oreochromis niloticus meng- gunakan  kombinasi sebaran  kromosom dan  nukleoli  secara  bersamaan. Jurnal Akuakultur  Sungai  dan  Danau ,  2(1):
43-50.
Okumura S, Furukawa S, Kawai T, Takahashi S,
Yamamori  K.  2001.  Comparison  of nucleoli number in diploid and triploid larva of Pacific abalone Haliotis discus hannai
. Fisheries  Science ,  67(1):  176- 178.
Piferrer F, Beaumont A, Falguiere JC, Flajshans M, Haffray P, Colombo L. 2009. Poly- ploid  fish  and  shellfish:  production, biology and applications to aquaculture for  performance  improvement  and genetic  containment. Aquaculture ,
293(3-4): 125
- 156.
Piferrer  F,  Cal  RM,  Alvarez-Blazquez  B, Sanchez L, Martinez P. 2000. Induction of triploidy in the turbot ( Scophthalmus maximus )  I.  Ploidy  determination  and the effects of cold shocks. Aquaculture , 188(1-2): 79–90.
Pradeep  PJ,  Srijaya  TC,  Jose  D,  Papini  A, Hassan A, Chatterji AK. 2014. Identifi- cation of diploid and triploid red tilapia by  using  erythrocyte  indices. Caryo- logia , 6(4): 485-492.
Schofer C, Weipoltshammer K. 2018. Nucleolus and  chromatin. Histochemistry  Cell Biology
, 150(3): 209-225.
Verdun  DH.  2011.  Assembly  and  disassembly of  the  nucleolus  during  the  cell  cycle.
Nucleus , 2(3): 189 -194.