Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Etanol  dan  Fraksi  Etil  Asetat  Daun  Kemangi  ( Ocimum  basilicum L.)  dengan Metode Fosfomolibdat
Warsi*, Gita Puspitasari Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta
*Corresponding author: warsisuryatmoko@gmail.com

## Abstract
Background : Antioxidant activity of ethanolic extract and ethyl acetate fraction of basil leaf have been studied previously  by  using  2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl  (DPPH)  method.  Testing  of  antioxidant  with  another mechanism  is  necessary  to  be  done  such  as  reducing  power  to  phosphomolybdate  for  measurement  of  total antioxidant capacity.  A compound is said  active as an antioxidant if giving  positive  results  in  several  different mechanisms. Basil leaf (Ocimum basilicum L.) contains main components of essential oils with various chemical structures, flavonoids and polyphenols compounds that pontential as an antioxidant. It need to be fractionated to obtain  more  specific  antioxidant  compounds. Objective :  The  aim  of  the  research  was  to  know  antioxidant potential of ethanolic extract and ethyl acetate fraction of basil leaf by phosphomolybdate method. Basil leaf was macerated  using  70%  ethanol  then  fractionated  with  ethyl  acetate. Methods :  The  ethanolic  extract  and  ethyl acetate fraction were analyzed for their antioxidant activity by phosphomolybdate reduction power method  with spectrophotometer at λ of 695 nm.  The  antioxidant  potential  of  the samples  were expressed as mg quercetine equivalent/g. Results : Data were analyzed  statistically using SPSS 16 with significancy level of 95%. The total antioxidant  capacity  from  basil  leaf  ethanolic  extract  with  concentration  of  1.50;  1.75;  2.00;  2.25;  2.50  and 2.75  mg/mL  were  47.292;  54.840;  57.870;  66.640;  77.234  and  84.754  mgQE/g,  respectively.  While  total antioxidant capacity from ethyl acetate fraction of basil leaf with series concentration of  0.50; 0.65; 0.80; 0.95; 1.10  and  1.25  mg/mL  were  44.720;  54.646;  66.936;  73.776;  84.606  and  94.210  mgQE/g,  respectively. Conclusion : This analysis  show that  total  antioxidant  activity of ethyl acetate fraction  was  higher  than  that  of basil leaf ethanolic extract.
Keywords: basil leaf, Ocimum basilicum, phosphomolybdate, ethyl acetate fraction

## Abstrak
Pendahuluan : Aktivitas antioksidan ekstrak etanol dan fraksi etil asetat daun kemangi telah diteliti sebelumnya dengan  metode 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ( DPPH).  Pengujian  tentang  aktivitas  antioksidan  dengan mekanisme lain perlu dilakukan, diantaranya ialah daya reduksi terhadap fosfomolibdat, untuk pengukuran daya antioksidan total. Suatu senyawa dikatakan aktif  sebagai antioksidan apabila positif terhadap  berbagai  jenis uji yang  mekanismenya  berbeda-beda.  Daun  kemangi  ( Ocimum  basilicum L.)  mengandung  komponen  utama minyak atsiri dengan struktur kimianya yang beragam, senyawa flavonoid dan polifenol yang berpotensi sebagai antioksidan.  Perlu  dilakukan  fraksinasi  supaya  diperoleh  senyawa  antioksidan  yang  lebih  spesifik. Tujuan : Penelitian  ini  berguna  untuk  mengetahui  potensi  antioksidan  dari  ekstrak  etanol  dan  fraksi  etil  asetat  daun kemangi  dengan  metode  fosfomolibdat.  Daun  kemangi  dimaserasi  menggunakan  etanol      70  %,  kemudian difraksinasi  dengan  etil  asetat. Metode :  Ekstrak  etanol  dan  fraksi  etil  asetat  dianalisis  aktivitas  antioksidannya dengan  metode  daya  reduksi  fosfomolibdat  yang  diukur  secara  spektrofotometri  pada  λ  695  nm.  Potensi antioksidan  sampel  dinyatakan  dalam  mg  ekuivalen quercetine /g. Hasil :  Data  yang  diperoleh  dianalisis  secara statistika  dengan  SPSS  16  pada  taraf  kepercayaan  95%.  Daya  antioksidan  total  ekstrak  etanol  daun  kemangi dengan  konsentrasi  1,50;  1,75;  2,00;  2,25;  2,50  dan  2,75  mg/mL  berturut-turut  ialah  47,292;  54,840;  57,870; 66,640;  77,234  dan  84,754  mgQE/g.  Sedangkan  daya  antioksidan  total  fraksi  etil  asetat  daun  kemangi  dengan seri  konsentrasi  0,50;  0,65;  0,80;  0,95;  1,10  dan  1,25  mg/mL  berturut-turut  adalah  44,720;  54,646;  66,936; 73,776; 84,606  dan  94,210  mgQE/g. Kesimpulan :  Analisis  ini  menunjukkan  bahwa  aktivitas  antioksidan total fraksi etil asetat lebih tinggi apabila dibandingkan dengan ekstrak etanol daun kemangi.
Kata kunci: daun kemangi , Ocimum basilicum, fosfomolibdat, fraksi etil asetat

## PENDAHULUAN
Pola  makan  masyarakat  modern  sedikit  banyak menimbulkan masalah terutama  apabila makanan yang dikonsumsi  tidak  seimbang,  diantaranya  konsumsi makanan  tinggi  karbohidrat  dan  lemak,  namun  tidak diperhatikan kebutuhan serat serta vitaminnya (Sartika, 2008). Kondisi tersebut dapat diperburuk akibat adanya pengaruh  lingkungan.  Gaya  hidup  yang  tidak  sehat seperti  merokok,  kebiasaan  tidur  terlalu  malam,  stres dan  sedikitnya  frekuensi  olahraga  dapat  memicu terbentuknya radikal bebas.
Radikal  bebas  yaitu  molekul  atau  fragmen molekul,  mengandung  satu  atau  lebih  elektron  yang tidak berpasangan dalam atom atau orbital molekulnya (Valko  dkk.,  2007).  Adanya  elektron  bebas  ini, sehingga menyebabkan molekul tersebut sangat reaktif. Radikal  bebas  merupakan  senyawa  antara  yang terbentuk  dalam  proses  alami  di  tubuh,  diantaranya sitotoksisitas, kontrol pembuluh darah dan neurotransmisi.  Radikal  bebas  dapat  menyerang komponen  seluler,  yaitu  protein,  DNA  dan  lipida, sehingga  dapat  mengalami  kerusakan.  Sel  normal melawan  efek  kerusakan  tersebut  melalui  enzim antioksidan  primer,  misalnya  superoksida  dismutase atau  katalase  (Sarma  dkk.,  2010).  Namun  demikian enzim  antioksidan  primer  di  tubuh  tidak  mampu menetralkan radikal bebas apabila jumlahnya melampaui  kemampuan  kapasitas  maksimal  enzim tersebut.
Oleh  karena  itu,  diperlukan    eksplorasi  sumber antioksidan, diantaranya  yang  berasal dari alam.  Salah satu  sumber  antioksidan  alami  adalah  daun  kemangi (Ocimum  basilicum L. ) .  Tanaman  kemangi  memiliki ketersediaan  yang  melimpah  di  Indonesia,  selain dimanfaatkan  sebagai  sayur  dan  lalap,  dapat  pula digunakan  sebagai  obat  tradisional.  Genus Ocimum , familia Lamiaceae mengandung asam fenolik, hidroksisinamat dan flavonoid yang berpotensi sebagai antioksidan  (Hakkim  dkk.,  2008).  Spesies Ocimum basilicum L.  mengandung  komponen  utama  minyak atsiri  dengan  struktur  monoterpen,  seskuiterpen  dan derivat fenilpropanoid (Chenni dkk., 2016). Komponen kandungan  utamanya  ialah  linalool  (52,42%),  metil eugenol (18,74%) dan 1,8-sineol (5,61%)
(Govindarajan  dkk.,  2013).  Selain  itu, Ocimum basilicum juga mengandung aglikon flavon (salvigenin dan  nevadensis)  dan  senyawa-senyawa  lain,  yaitu sirsileol,  sirsilineol,  eupatorin,  apigenin,  akasetin, apigenin 7,4’-dimetil eter (Grayer dkk., 1996).
Hasil  penelitian  sebelumnya,  dilaporkan  bahwa ekstrak etanol dan fraksi etil asetat daun kemangi aktif sebagai antioksidan yang diukur dengan metode DPPH (Warsi  &  Sholichah,  2017).  Metode  pengujian antioksidan  tersebut  berdasarkan  kemampuan  sampel dalam  mendonorkan  hidrogen  radikalnya  ke  radikal DPPH (Prabhavathi dkk., 2016). Mekanisme antioksidan  tersebut  terbatas  pada  senyawa  yang strukturnya  mengandung  gugus  hidroksil  (OH)  yang dapat dilepaskan sebagai hidrogen radikal. Oleh karena itu,  perlu  dilakukan  penelitian  tentang  aktivitas antioksidan  dengan  mekanisme  yang  lain,  diantaranya ialah daya reduksi terhadap fosfomolibdat. Antioksidan dengan  mekanisme  ini  berdasarkan  pada  pengukuran daya  antioksidan  total  suatu  sampel  (Rouzbahan  dkk., 2016).  Suatu  senyawa  dikatakan  aktif  sebagai antioksidan  apabila  positif  terhadap  berbagai  jenis  uji yang  mekanismenya  berbeda-beda.  Mengacu  pada penelitian-penelitian  sebelumnya  bahwa  suatu  ekstrak dari  tanaman  diuji  antioksidannya  dengan  berbagai metode  (Ravisankar dkk.,  2014;  Ahmed  dkk.,  2015; Moonmun dkk., 2017).

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan utama  yang digunakan  ialah daun kemangi ( Ocimum  basilicum Linn .) diperoleh  dari  daerah Muntilan,  Jawa  Tengah  pada  bulan  Desember  2015. Bahan-bahan  lain  yaitu quercetine (Sigma  Aldrich Co.USA),  ammonium  molibdat  dan  natrium  fosfat (E-Merck), etanol 70%, etil asetat serta petroleum  eter teknis.  Semua  bahan  yang  digunakan  kecuali dinyatakan lain berderajat pro analisis.

## Alat
Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini ialah spektrofotometer
UV-Vis
(UV-Vis 1800  Pharmaspec  Shimidzu)  dan halogen  moisturizer analyzer (Mettler Toledo).

## Metode

## Ekstraksi dan fraksinasi
Daun  kemangi  sebanyak  1,5  Kg  dikeringkan  di almari  pengering  pada  suhu  50°C.  Daun  kering kemudian  diblender  dan  diayak  dengan  ayakan  nomor 70  mesh.  Serbuk  daun  kering  sebanyak  200  g diawalemakkan  dengan  ditambahkan  petroleum  eter 1:4.  Ampas  hasil  pengawalemakan  dimaserasi  dengan etanol  70  %  dan  difraksinasi  menggunakan  etil  asetat mengikuti  prosedur  sebagaimana  telah  dilaporkan sebelumnya oleh Warsi & Sholichah (2017).

## Penetapan susut pengeringan serbuk simplisia
Simplisia daun kemangi ditetapkan susut pengeringan  menggunakan  alat halogen  moisturizer analyzer. Serbuk diletakkan di atas lempeng alumunium  foil  (khusus)  kemudian  dimasukkan  ke dalam  alat halogen  moisturizer  analyzer (Depkes  RI, 2008). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

## Analisis aktivitas antioksidan Pembuatan larutan fosfomolibdat
Sebanyak  3,0  mL  asam  sulfat  ditambahkan 0,199 gram natrium fosfat dan 0,247 gram ammonium molibdat. Ketiganya dilarutkan dalam aquadest hingga volume tepat 50,0 mL. Penentuan aktivitas antioksidan dengan  metode  ini  mengikuti  prosedur  yang  telah dilaporkan oleh Prieto dkk. (1999).
Penentuan operating time Sebanyak 1,0 mL larutan ekstrak etanol dan fraksi etil  asetat  daun  kemangi  ditambah  dengan  reagen fosfomolibdat  masing-masing  sebanyak  1,0  mL. Larutan  dipanaskan  pada  suhu  95°C  selama  60  menit. Larutan  kemudian  dibiarkan  hingga  mencapai  suhu ruang  (26°C).  Larutan  diambil  1,0 mL  dan ditambahkan  dengan  etanol  hingga  tepat  5,0  mL. Absorbansi  larutan  diukur  dengan  spektrofotometer UV-Vis panjang gelombang 695 nm selama 90 menit.

## Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Sebanyak 1,0 mL larutan ekstrak etanol dan fraksi etil  asetat  daun  kemangi  ditambahkan  reagen fosfomolibdat  masing-masing  sebanyak  1,0  mL. Larutan  dipanaskan  pada  suhu  95°C  selama  60  menit. Larutan  kemudian  dibiarkan  hingga  mencapai  suhu ruang  (26°C).  Larutan  diambil  1,0 mL  dan ditambahkan  dengan  etanol  hingga  tepat  5,0  mL. Campuran didiamkan hingga mencapai operating time.
Larutan  diukur  dengan  spektrofotometer  UV-Vis  pada panjang gelombang 500 - 900 nm.
Larutan blangko
Sebanyak 5,0 mL reagen fosfomolibdat ditambahkan  5,0  mL  etanol.  Larutan  diambil  1,0  mL dan  ditambahkan  dengan  etanol  hingga  tepat  5,0  mL. Campuran didiamkan hingga mencapai operating time . Larutan  digunakan  sebagai  blangko  pada  pengukuran sampel dengan spektrofotometer UV-Vis.
Pengukuran serapan quercetine Larutan quercetine dibuat  variasi berbagai konsentrasi  yaitu  0,5;  0,6;  0,7;  0,8;  0,9  dan 1,0  mg/10mL.  Masing-masing  seri  larutan  dipipet sebanyak  1,0  mL  dan  ditambahkan  1  mL  reagen fosfomolibdat.    Larutan  dipanaskan  pada  suhu  95°C selama  60  menit.  Larutan  dibiarkan  pada  suhu  kamar
hingga mencapai suhu ruang (26°C). Larutan kemudian diambil  1  mL  dan  ditambahkan  etanol  hingga  tepat 5,0  mL.  Campuran  didiamkan  hingga  mencapai operating  time .  Campuran  diukur  serapannya  dengan dengan  spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang maksimalnya. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.
Pengukuran  serapan  ekstrak  etanol  dan  fraksi  etil asetat
Ekstrak  etanol  dibuat  variasi  konsentrasi  1,50; 1,75; 2,00; 2,25; 2,50 dan 2,75 mg/mL. Sedangkan seri konsentrasi  fraksi  etil  asetat  yaitu  0,50;  0,65;  0,80; 0,95; 1,10 dan 1,25 mg/mL. Sebanyak 1,0 mL masing- masing  seri  larutan  tersebut  ditambahkan  1,0  mL reagen fosfomolibdat. Campuran dipanaskan pada suhu 95°C  selama  60  menit.  Larutan  dibiarkan  pada  suhu kamar  hingga  mencapai  suhu  ruang  (26°C).  Larutan kemudian  diambil  1,0  mL  dan  ditambahkan  etanol hingga  tepat  5,0  mL.  Campuran  didiamkan  hingga mencapai operating time . Campuran diukur serapannya dengan  spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang  maksimalnya.  Masing-masing  sampel replikasi sebanyak 5 kali.

## Analisis data
Aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol dan fraksi etil asetat dinyatakan dalam mg quercetine equivalent/gram (mgQE/g)  (Touré  dkk.,  2016). Parameter  tersebut  diperoleh  dari  persamaan  regresi linier  hubungan  antara  absorbansi versus konsentrasi quercetine (y = bx + a), dengan y = absorbansi sampel dan x = kadar. Nilai x yang diperoleh dari perhitungan tersebut  kemudian  dimasukkan  ke  persamaan  berikut ini:
Antioksidan = 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟  [ 𝑚𝑔 𝑚𝐿 ] 𝑥 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 (𝑚𝐿)𝑥 𝑓𝑝 𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑥 1 1000
Keterangan:  fp  =  faktor  pengenceran.  Data  aktivitas antioksidan  ekstrak  etanol  kemudian  dibandingkan dengan fraksi etil asetat yang dianalisis secara statistika dengan SPSS 16 pada taraf kepercayaan 95 %. Analisis dengan  uji Kolmogorof-Smirnov untuk  mengetahui normalitas data. Analisis dilanjutkan dengan uji Levene untuk  mengetahui  homogenitas  data.  Data  dikatakan terdistribusi  normal  dan  homogen  apabila  masing- masing hasil uji nilai signifikansi lebih besar dari 0,05. Data yang terdistribusi normal dan homogen, kemudian dilakukan  analisis  lebih  lanjut  dengan  uji  parametrik yaitu ANOVA satu jalan.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil ekstraksi dan fraksinasi Simplisia
daun kemangi dilakukan pengawalemakan  terlebih  dahulu  sebelum  dilakukan ekstraksi  menggunakan  petroleum  eter.  Hal  ini dilakukan untuk menyari senyawa non polar yang tidak dikehendaki  yang  terkandung  pada  simplisia  tersebut seperti  klorofil,  steroid,  terpenoid  dan  asam  lemak. Proses  ini  dilakukan  supaya  senyawa  non  polar  yang menutupi  lapisan  dinding  sel  dapat  dihilangkan, sehingga dapat memudahkan proses ekstraksi. Flavonoid  dalam  tanaman  bersifat  semi  polar  yang terdapat  pada  vakuola  (Harborne,  1996).  Lemak  pada dinding  sel  yang  menutupi  vakuola  juga  harus dihilangkan  terlebih  dahulu  untuk  mempermudah proses  ekstraksi.  Hasil  ekstraksi  dan  fraksinasi  tersaji pada Tabel 1.
Fraksinasi dilakukan dengan pelarut yang kepolarannya  berbeda  dari  ekstraksi,  sehingga  dapat memisahkan senyawa yang kepolarannya berbeda yang terkandung  pada  ekstrak.  Fraksinasi  dalam  penelitian ini  dilakukan  untuk  menyari  senyawa  polifenol  dan flavonoid.  Keberadaannnya  senyawa  tersebut  dalam ekstrak  dan  fraksi  etil  asetat  dari  ekstrak  etanol  daun kemangi  telah  dibuktikan  sebelumnya  oleh  Warsi  & sholichah  (2017).  Metode  fraksinasi  yang  digunakan dalam penelitian ini yaitu secara cair-cair menggunakan  pelarut  etil  asetat.  Etil  asetat  digunakan sebagai  pelarut  untuk  fraksinasi  karena  memiliki  sifat yang  semi  polar,  sehingga  diharapkan  dapat  menyari senyawa antioksidan yang semi polar.
Tabel 1. Rendemen ekstraksi dan fraksinasi Proses Bobot sampel (gram) Hasil (gram) Rendemen (%) Ekstraksi 200,00 100,05 50,05 Fraksinasi 5,00 0,84 16,80

## Hasil penetapan susut pengeringan
Penetapan  susut  pengeringan  serbuk  dilakukan untuk  mengetahui  banyaknya  komponen  air  dan senyawa-senyawa  yang  mudah  menguap  di  dalam simplisia  setelah  mengalami  proses  pengeringan dibawah  suhu  105°C.  Hasil  analisis  susut  pengeringan dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil penetapan susut pengeringan
Replikasi  Susut pengeringan (%) Rata-rata ± SD CV (%) 1 8,53 9,0 ± 0,42 4,20 2 9,30
3 9,18
Hasil  susut  pengeringan  serbuk  daun  kemangi menunjukkan bahwa kandungan air dan senyawa yang dapat  menguap  di  bawah  suhu  105°C,  seperti  minyak atsiri,  dalam  serbuk  kurang  dari  10%.  Susut pengeringan yang tidak terlalu tinggi dari hasil tersebut dapat  meminimalkan  pertumbuhan  kapang  dan  jamur pada  masa  penyimpanan.  Hasil  yang  diperoleh  telah memenuhi persyaratan dari Farmakope Herbal Indonesia (Depkes RI, 2008).

## Hasil analisis aktivitas antioksidan
Aktivitas antioksidan ekstrak etanol dan fraksi etil asetat  daun  kemangi  diukur  dengan  metode  daya reduksi  terhadap fosfomolibdat  dengan  standar quercetine .  Mekanisme  antioksidan metode ini berdasarkan  senyawa  yang  terkandung  dalam  sampel yang  mempunyai  daya  pereduksi.  Zat  tersebut mereduksi  fosfomolibdat  menjadi  fosfomolibdat  dan membentuk  senyawa  kompleks  fosfomolibdenum berwarna  hijau  kebiruan  (Moonmun  dkk.,  2017). Intensitas warna hijau-biru yang terbentuk dapat diukur secara  kuantitatif  menggunakan  spektrofotometer visibel.  Senyawa  fosfomolibdenum  dapat  terbentuk apabila  dilakukan  pemanasan  pada  suhu  95°C  selama 60 menit. Saat reaksi berlangsung, gugus karbonil dari apigenin  bereaksi  dengan  fosfomolibdat  membentuk fosfomolibdenum berwarna hijau kebiruan.
Metode  lain  yang  dapat  digunakan  untuk  analisis aktivitas  antioksidan,  diantaranya  ialah  metode β-carotene  bleaching , crocin  bleaching ,  thiobarbituric acid  (TBA)  dan  daya  reduksi  kalium  ferrisianida. Metode β-carotene dan crocin  bleaching berdasarkan kehilangan  warna  dari  senyawa  tersebut  karena terdegradasi  ikatan  rangkapnya  oleh  radikal  asam linoleat  dalam  emulsi  yang  diinisiasi  oleh  adanya oksigen.  Adanya  senyawa  antioksidan  dalam  sampel menghambat laju degradasi dari β-carotene dan crocin. Metode β-carotene sesuai  untuk  estimasi  potensi antioksidan  dari  minyak  atsiri  dan  senyawa-senyawa non  polar.  Sedangkan  metode crocin sesuai  untuk skrining  aktivitas  penangkapan  radikal.  Metode  TBA berdasarkan  pengukuran  inhibisi  produksi  substansi reaktif  asam  tiobarbiturat  dari  natrium  benzoat  karena pengaruh  radikal  bebas  oksigen  dari  reaksi  fenton. Dalam  metode  ini,  larutan  standard  yang  berisi kompleks Fe-EDTA bereaksi dengan hidrogen peroksida  dengan  reaksi  fenton  dan  terbentuk  radikal hidroksil.  Spesien  oksigen  reaktif  tersebut  kemudian mendegradasi  benzoat  dihasilkan  substansi  reaktif asam tiobarbiturat. Adanya senyawa antioksidan  dapat
menekan produksi substansi  reaktif asam tiobarbiturat. Adapun  pengujian  antioksidan  dengan  metode  daya reduksi  kalium  ferrisianida  berdasarkan  reduksi  ion ferri  (Fe 3+ )  menjadi  ferro  (Fe 2+ )  oleh  zat  antioksidan (Gupta, 2015).
Pada  pengukuran  aktivitasnya,  ekstrak  etanol  dan fraksi  etil  asetat  daun  kemangi  yang  berwarna kekuningan  direaksikan  dengan  reagen  fosfomolibdat dalam  suasana  asam  dan  suhu  tinggi  membentuk senyawa kompleks berwarna hijau-kebiruan. Fosfomolibdat merupakan suatu oksidator dari senyawa  amonium  molibdat  dan  natrium  fosfat  yang kemudian membentuk ammonium fosfomolibdat.
Metode  fosfomolibdat  dipilih  untuk  pengujian aktivitas  antioksidan  karena  proses  pembuatan  reagen yang  cepat  dan  mudah.  Selain  itu,  bahan-bahan  yang digunakan tersedia dan dapat diperoleh dengan mudah. Apabila ditinjau dari segi ekonomis, relatif lebih murah dan  kestabilan  senyawa  kompleks  yang  memiliki waktu  panjang,  sehingga  memudahkan  pengujian sampel.  Namun  metode  ini  juga  memiliki  kekurangan yaitu  suhu  inkubasi  yang  harus  tetap  dijaga  agar  tepat 95°C.  Suhu  yang  terlalu  tinggi  dapat  menyebabkan penguapan  larutan  sampel.  Untuk  mengatasi  hal  ini, sehingga  suhu  inkubasi  perlu  dikontrol  dengan  baik, supaya  selalu  tetap  95°C.  Pengontrolan  dilakukan dengan  mengatur  suhu  dalam waterbath tetap  terjaga 95°C.  Apabila  meningkat,  alat  diatur  lagi  supaya suhunya turun menjadi 95°C. Sebaliknya apabila turun, alatnya dapat diatur lagi supaya mencapai 95°C.
Hasil  penentuan operating  time untuk quercetine , ekstrak  etanol  dan  fraksi  etil  asetat  daun  kemangi berturut-turut  adalah  menit  ke  35  –  50,    25  –  57  dan 20  –  79  menit.  Hasil  penelitian  menunjukkan  terdapat perbedaan  waktu operating  time antara quercetine , ekstrak etanol dan fraksi etil asetat  daun kemangi. Hal ini  disebabkan  karena  terdapat  perbedaan  senyawa dalam quercetine ,  ekstrak  etanol  dan  fraksi  etil  asetat daun  kemangi  yang  bereaksi  dengan  fosfomolibdat. Sedangkan hasil penentuan panjang gelombang serapan maksimal  untuk quercetine ,  ekstrak  etanol  dan  fraksi etil asetat daun kemangi berturut-turut adalah 792, 786 dan  790  nm.  Panjang  gelombang  maksimal  yang diperoleh berbeda dengan teori (695 nm), hal ini karena tergantung  kekuatan  daya  reduksi  senyawa  dalam sampel  yang  bereaksi  dengan  reagen  fosfomolibdat. Oleh karena  itu,  intensitas  kompleks  warna hijau  yang dihasilkan  berbeda  dan  menyebabkan  pergeseran panjang gelombang serapan maksimal.
Quercetine digunakan  sebagai  standar  dalam pengukuran aktivitas antioksidan ini karena merupakan senyawa yang telah diketahui aktif sebagai antioksidan. Aktivitas  antioksidan quercetine berhubungan  dengan gugus orto dihidroksi pada posisi 3’ dan 4’ serta gugus OH  pada  posisi  3,  5  dan  7  (Hertiani,  2000), sebagaimana  tersaji  pada  Gambar  1.  Adanya  gugus hidroksi  pada  struktur  molekulnya  sehingga  mampu mendonasikan  elektron  pada  atom  hidrogennya  atau melalui  kemampuannya  mengkhelat  logam  (Redha, 2010).

## Gambar 1. Stuktur quercetine
Seri  konsentrasi  untuk quercetine adalah  0,5;  0,6; 0,7;  0,8;  0,9  dan  1,0  mg/10mL.  Pemilihan  seri konsentrasi tersebut berdasarkan linearitas dari serapan yang  dihasilkan,  yaitu  sebanding  dengan  kenaikan konsentrasi.  Hal  ini  karena  sebagai  kurva  baku  yang digunakan untuk menghitung aktivitas antioksidan dari sampel  dengan  parameter  nilai  kesetaraan.  Hasil pengukuran kurva baku quercetine tersaji pada Gambar 2.
Gambar 2. Hasil pengukuran kurva baku quercetine
Adapun  variasi  konsentrasi  ekstrak  etanol  yang digunakan  ialah  1,50;  1,75;  2,00;  2,25;  2,50  dan 2,75  mg/mL.  Sedangkan  seri  konsentrasi  untuk  fraksi etil  asetat  yaitu  0,50;  0,65;  0,80;  0,95;  1,10  dan 1,25  mg/mL.  Seri  konsentrasi  kedua  sampel  tersebut dipilih berdasarkan linearitas dari aktivitas antioksidannya  yang  dinyatakan  dengan  kesetaraan terhadap quercetine .  Berdasarkan  hasil  penelitian,
y = 1.0134x - 0.2199 R² = 0.9998 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0.5 1 1.5 A bsor ba nsi Konsentrasi (mg/10 mL) Kurva Baku Quercetine
aktivitas  antioksidan  ekstrak  etanol  dan  fraksi  etil asetat  daun  kemangi  tergantung  dosis.  Hal  ini menunjukkan bahwa nilai kesetaraan terhadap quercetine dari  ekstrak  etanol    dan  fraksi  etil  asetat daun kemangi semakin meningkat dengan bertambahnya konsentrasi (Gambar 3).
Hasil  pengukuran  dalam  berbagai  konsentrasi, fraksi  etil  asetat  yang  kadarnya  lebih  rendah menunjukkan  kesetaraan  yang  lebih  tinggi  apabila dibandingkan  ekstrak  etanol  daun  kemangi.  Hasil  ini dapat diambil salah satu konsentrasi untuk perbandingan,  diantaranya  fraksi  etil  asetat  daun kemangi dengan kadar 1,25 mg/mL menunjukkan nilai kesetaraan  sebesar  94,210  mgQE/gram.  Sedangkan ekstrak etanol daun kemangi dengan kadar 1,50 mg/mL mempunyai nilai kesetaraan 47,292 mgQE/gram.  Nilai kesetaraan fraksi etil etil asetat daun kemangi terhadap quercetine per gram ekstrak didefinisikan bahwa setiap 1  gram  ekstrak  kering  setara  dengan  94,210  mg quercetine .
Gambar 3. Diagram aktivitas antioksidan
Hasil  analisis  secara  statistika  dengan  uji Kolmogorov-Smirnov  diperoleh  nilai  P  >  0,05  dan Levene P 0,551 > 0,05; yang menunjukkan bahwa data terdistribsi  normal  serta  homogen.  Hasil  analisis dengan  ANOVA  satu  jalan  diperoleh  nilai  P  <  0,05. Hal ini  menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan  rata- rata  fraksi  etil  asetat  secara  signifikan  lebih  besar daripada  ekstrak etanol daun kemangi. Hasil ini sesuai dengan penelitian sebelumnya bahwa aktivitas antioksidan  fraksi  etil  asetat  lebih  tinggi  apabila dibandingkan  dengan  ekstrak  etanol  daun  kemangi yang  diuji  dengan  metode  penangkapan  radikal  bebas DPPH  (Warsi  &  Sholichah,  2017).  Berdasarkan penelitian  yang  dilakukan  oleh  Chenni  dkk.  (2016), daun kemangi  mengandung   komponen  utama  minyak atsiri. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol  daun
kemangi  kandungan  senyawa  terbesarnya  adalah minyak  atsiri.  Adanya  fraksinasi  lebih  lanjut  terhadap ekstrak  etanol  dengan  pelarut  etil  asetat  dapat mengisolasi  senyawa-senyawa  yang  aktif  sebagai antioksidan,  diantaranya  flavonoid  dan  polifenol  yang bersifat  semi  polar.  Selain  itu,  dapat  meminimalkan senyawa-senyawa  yang  lebih  non  polar,  misalnya minyak  atsiri.  Dengan  demikian  aktivitas  antioksidan fraksi  etil  asetat  lebih  tinggi  apabila  dibandingkan dengan ekstrak etanol daun kemangi.

## KESIMPULAN
Aktivitas  antioksidan  total  dari  fraksi  etil  asetat dalam  berbagai konsentrasi  adalah  lebih  tinggi  apabila dibandingkan  dengan  ekstrak  etanol  daun  kemangi yang dinyatakan dalam satuan mgQE/g.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmed,  D.,  Khan,  M.  M.  &  Saeed,  R.  (2015).
Comparative Analysis of Phenolics, Flavonoids, and  Antioxidant  and  Antibacterial  Potential  of Methanolic,  Hexanic  and  Aqueous  Extracts from Adiantum caudatum Leaves. Antioxidants;
4 ; 394-409.
Chenni,  M.,  Abed,  D.  E.,  Rakotomanomana,  N.,
Fernandez, X. & Chemat, F. (2016). Comparative  Study  of  Essential  Oils  Extracted from Egyptian Basil Leaves ( Ocimum basilicum
L.)  Using  Hydro-Distillation  and  Solvent-Free Microwave Extraction. Molecules ; 21; 113. Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia.  (2008).
Farmakope Herbal Indonesia . Edisi I.
Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia: Jakarta.
Govindarajan,  M.,  Sivakumar,  R.,  Rajeswari,  M.  &
Yogalakshmi, K. (2013). Chemical Composition and Larvicidal Activity of
Essential  Oil  from Ocimum  basilicum (L.) Against Culex tritaeniorhynchus, Aedes albopictus and Anopheles  subpictus (Diptera: Culicidae). Experimental  Parasitology ; 134; 7- 11.
Grayer, R. J., Bryan, S. E., Veitch, N. C., Goldstone, F. J.,  Paton,  A.  &  Wollenweber,  E.  (1996). External  Flavones  in  Sweet  Basil, Ocimum basilicum ,  and  Related  Taxa. Phytochemistry ; 43; 1041-1048.
Gupta,  D.  (2015).  Methods  for  Determination  Of Antioxidant  Capacity:  A  Review. International
Daun Kemangi terhadap Quercetine (mgQE/gram)
Journal of Pharmaceutical  Sciences  and
Research; 6; 546-566. Hakkim,  F.  L.,  Arivazhagan,  G.  R.  &  Boopathy,  R. (2008). Full Length Research Paper.
Antioxidant  Property  of  Selected Ocimum Species  and  Their  Secondary  Metabolite Content. Journal of Medicinal Plants Research ; 2; 250-257. Harborne,  J.  B.  (1996). Metode  Fitokimia:  penuntun cara  modern  menganalisis  tumbuhan. Edisi  2,
Cetakan ke-2. Diterjemahkan oleh
Padmawinata, K. dan Soediro, I. Bandung: ITB. Hertiani,  T.  (2000).  Uji  Daya  Antioksidan  Daun
Plantago major L. Majalah Farmasi Indonesia ; 11; 234.
Moonmun, D., Majumder, R. & Lopamudra, A. (2017).
Quantitative  Phytochemical  Estimation  and Evaluation  of  Antioxidant  and  Antibacterial Activity  of  Methanol  and  Ethanol  Extracts  of Heliconia rostrata . Indian Journal of Pharmaceutical Sciences ; 79; 79-90.
Prabhavathi,  R.  M.,  Prasad,  M.  P.  &  Jayaramu,  M.
(2016). In-vitro Antioxidant  Studies  of Cissus quadrangularis  (L) extracts .  European  Journal of Experimental Biology; 6(4); 1-6.
Prieto,  P.,  Pineda,  M.  &  Aguilar,  M.  (1999),
Spectrophotometric Quantitation of Antioxidant Capacity through the Formation of A Phosphormolybdenum Complex; Specific
Application  to the Determination of Vitamin E.
Analytical  Biochemistry; 269; 337-341.
Ravisankar,  N.,  Sivaraj,  C.,  Seeni,  S.,  Joseph,  J.  &
Raaman,  N.  (2014).  Antioxidant  Activites  and Phytochemical Analysis of Methanol Extract of
Leaves of Hypericum hookerianum .
International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences ; 6; 456-460.
Redha, A. (2010). Flavonoid: Struktur, Sifat Antioksidatif  dan  Perannya  dalam  Sistem Biologis. Jurnal Belia; 9; 196-202 .
Rouzbahan, S., Moein, S.  & Homaei, A. (2016). Total Antioxidant  Capacities  and  Reduction  of  Ferric ions  by Extracts of Three Medicinal Plants and Their  Fractions. Hormozgan  Medical  Journal; 20; 223-232.
Sartika,  R.  A.  D.  (2008).  Pengaruh  Asam  Lemak Jenuh,  Tidak  Jenuh  dan  Asam  Lemak  Trans terhadap Kesehatan. Jurnal Kesehatan
Masyarakat Nasional; 2; 154-160. Sarma, A. D., Mallick,  A. M.  &  Ghosh, A. K.  (2010). Free  Radicals  and  Their  Role  in  Different Clinical Conditions: An Overview.
International  Journal  of  Pharma  Sciences  and Research; 1; 185-192.
Touré, H. A., Bouatia,  M., Mojemmi, B., Mariko, M., Dackouo,  B.,  Benzeid,  H.,  Alouani,  I., Mamouchi,  M., Idrissi,  M.  O. B.  &  Draoui, M. (2016).  Evaluation  of  Antioxidant  Activities  of Two  Different  Solvent  Extracts  of  Green Prickly  Pear  ( Opuntia  ficus  indica L.  Mill.).
Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences; 7; 73-79.
Valko , M ., Leibfritz, D., Moncola, J., Cronin, M. T. D., Mazura,  M.  &  Telser,  J.  (2007).  Review,  Free Radicals and Antioxidants in Normal Physiological  Functions  and  Human  Disease. The  International  Journal  of  Biochemistry  and Cell Biology ; 39; 44-84.
Warsi  &  Sholichah,  A.  R.  (2017).  Phytochemical Screening and Antioxidant Activity of Ethanolic Extract  and  Ethyl  Acetate  Fraction  from  Basil Leaf  ( Ocimum  basilicum L.)  by  DPPH  Radical Scavenging  Method. International  Proceeding. IPCUAD2017,  IOP  Publishing,  IOP  Conf. Series:  Materials  Science  and  Engineering; 259; 012008.