## PERBEDAAN POLA PENGAMBILAN ENZIM LAKTOPEROKSIDASE DENGAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI

## PATTERN DIFFERENCES OF LACTOPEROXIDASE ENZYME IMOBILIZE USE CHROMATOGRAPHY METHOD
Hidayah, N., A. N. Al-Baarri, dan  C. Budiarti Fakultas Peternakan dan Pertanian, Universitas Diponegoro Kampus Tembalang, Semarang 50275   Indonesia
Email :nurhidayahsholeha@gmail.com

## ABSTRACT
The  research    was  carried  out    to  get  a  method  which  used  as  measuring  rod  of  lactoperoxidase  (LPO) imobilized, based on reduction of milk fat content by using chromatography and SP Sepharose Fast Flow resin (SP-FF). The study was conducted by using two treatments, a reduction from the fat content before coagulation of casein by rennet (T1), and after coagulation of casein by rennet (T2). The results showed that the T1 produced higher  quality  than  T2.  Differences  resulting  volume  of  raw  materials  was  possible  because  of  differences  in total casein, non-fatsolids, and moisture content in each sample. Differences of LPO immobilization time scales was possible because containt of non-fatsolids in each raw material. High or lowprotein content was influenced by  differences  in  the  origin  of  raw  materials  LPO  medium.  While  high-low  activity  LPO  influenced  the  non evenness LPOLPO attached to the resinSP-FF, also was possible because of the extent of sediment total non- fatsolids that can not be separated from raw materials LPO during immobilization.
Keywords : chromatography,  enzyme activity, lactoperoxidase, whey

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mencari  cara  atau  metode  yang  dapat  dijadikan  panduan  dalam pengambilan  laktoperoksidase  (LPO),berdasarkan  cara  pengurangan  kadar  lemak  susu  dengan  menggunakan metode kromatografi dan resin SP Sepharose Fast Flow (SP-FF). Penelitian dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yaitu pengurangan kadar lemak sebelum koagulasi kasein oleh rennet(T1) dan setelah koagulasi kasein oleh  rennet  (T2).  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  T 1 menghasilkan  kualitas  lebih  tinggi  daripada  T 2 . Perbedaan volume bahan baku yang dihasilkan dimungkinkan karena adanya perbedaan total kasein, bahan padat tanpa lemak, dan kadar air yang terkandung dalam susu pada masing-masing sampel. Rentang waktu imobilisasi LPO  berbeda,  diduga  karena  perbedaan  kandungan  bahan  padat  tanpa  lemak  (BPTL)  dalam  masing-masing bahan  baku.  Tinggi  rendahnya  kadar  protein  dipengaruhi  oleh  perbedaan  medium  asal  bahan  baku  LPO. Sedangkan tinggi-rendahnya aktivitas LPO selain dipengaruhi ketidakrataan LPO yang menempel pada resin SP- FF, juga diduga oleh pengaruh banyak sedikitnya endapan BPTL yang tidak dapat terpisah dari bahan baku LPO selama immobilisasi.
Kata Kunci : aktivitas enzim, kromatografi, laktoperoksidase, whey

## PENDAHULUAN
Salah  satu  komponen  bioaktif  protein susu  adalah  enzim  laktoperoksidase  (LPO). LPO telah dikomersialkan karena memberikan  banyak  manfaat  dan  memiliki nilai  ekonomi  tinggi  dalam  bidang  pangan, kesehatan  dan  industri.  Aplikasi  LPO  di Indonesia  masih  dalam  tahap  pengembangan karena  hingga  saat  ini  belum  ada  metode praktis  yang  digunakan  untuk  mengambil LPO  dari  dalam  susu.  Selama  ini,  LPO didapatkan  dari  whey  sehingga  proses konversi susu menjadi whey harus dilakukan dan  membutuhkan  tahapan  proses  yang panjang.  Prinsip  pengambilan  LPO  yaitu
dengan  memanfaatkan  teknologi  imobilisasi dengan  menggunakan  resin SPSepharose Fast Flow (SP-FF) dan bahan baku LPO yang berasal  dari  whey,  hasilnya  LPO  dapat menempel  pada  resin  dan  dapat  dengan mudah untuk dipisahkan atau diambil. Istilah pengambilan enzim sering disebut imobilisasi enzim.
Dalam  upaya  mendapatkan  LPO dengan aktivitas tinggi, maka lemak yang ada di dalam susu perlu untuk diminimalisir. Jika lemak  yang  terdapat  di  dalam  susu  tidak dihilangkan maka akan berpotensi menghambat  aktivitas  LPO.  Pemisahan lemak  dan  skim  susu  yang  lazim  dilakukan adalah dengan menggunakan metode sentrifugasi. Metode ini umumnya
dilaksanakan  pada  saat  kasein  susu  akan dikoagulasikan. Namun, oleh karena terbatasnya  alat  sentrifuge,  maka  pemisahan lemak  dengan  menggunakan  alat  ini  perlu diusahakan  seefisien  mungkin  terutama karena  kapasitas  alat  sentrifugasi  yang terbatas.
Tujuan  penelitian  adalah  untuk mencari
cara atau metode yang
dapatdijadikan  panduan  dalam  pengambilan LPO,berdasarkan  cara  pengurangan  kadar lemak  susu  dengan  menggunakanmetode kromatografi  dan  resin SP  Sepharose  Fast Flow (SP-FF).Manfaat  penelitian  untuk menginformasikan  kepada  pembaca  tentang metode  yang  praktis  dan  tepat  dalam pengambilan LPO.

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian  adalah  susu  segar  masing-masing perlakuan  2  liter,  resin SP  Sepharose  Fast Flow (SP-FF)  50  g,  aquades,  asam  laktat, rennet, 1 M NaCl dalam aquades 300 ml, 0,4 M  NaCl  dalam  0,1  M  PB  ( phospate  buffer ), alkohol  20%,  larutan    ABTS  dalam  10  mM asetat  buffer .  Peralatan  digunakan  adalah sentrifuge, microtube ukuran  15  ml , inkubator,  beaker  glass,  kuvet,  kolom silinder,  kain  saring  dengan  ukuran  30  cm  x 30 cm, pendingin, spektrofotometer.

## Tahapan Penelitian

## Pembuatan Bahan Baku LPO
Bahan  baku  LPO  didapatkan  dengan cara  menggunakan  dua  perlakuan.  Perlakuan I  yaitu  pengurangan  kadar  lemak  sebelum koagulasi  kasein  oleh  rennet  (T1).  Pertama, tahap  pengumpulan  susu.  Susu  segar sebanyak  2  liter  didapatkan  dari  peternakan milik  Fakultas  Peternakan  Universitas Diponegoro.  Kedua,  tahap  sentrifugasi.  Susu segar  disentrifugasi  dengan  kecepatan  6000 rpm  selama  10  menit  untuk  memisahkan antara krim (lemak) dan skim.
Ketiga,  tahap  pembuatan  whey dengan  cara  menambahkan  rennet  dan  asam laktat  ke dalam susu.  Selanjutnya,  susu  yang telah  tercampur  dengan  rennet  dan  asam laktat  dimasukkan  ke  dalam  inkubator.
Tunggu  selama  40  menit  agar  terbentuk koagulasi  kasein,  lalu  disaring  menggunakan kain  saring  ukuran.  Air  yang  keluar  disebut whey sedangkan padatannya disebut curd . Perlakuan  II  adalah  pengurangan kadar  lemak  setelah  koagulasi  kasein  oleh rennet  (T2).  Pertama,  tahap  pengumpulan susu. Kedua, tahap pembuatan whey. Ketiga, tahap  sentrifugasi  susu.  Proses  pada  tahap pengumpulan susu, pembuatan whey maupun sentrifugasi  susu  sama  seperti  proses perlakuan  I. Setelah perlakuan  I dan  II maka masing-masing perlakuan dilanjutkan dengan tahap  imobilisasi  yang  akan  menghasilkan LPO.

## Imobilisasi LPO
Pelaksanaan  imobilisasi  dilakukan pada dalam pendingin bersuhu 4 0 C. Sebelum kolom  digunakan  harus  dilakukan  preparasi. Preparasi kolom diawali dengan mengalirkan aquades 300 ml ke dalam kolom. Hasil aliran dibuang.  Selanjutnya  kolom  dialiri  penyerap berupa resin . Resin SP-FF dialirkan ke dalam kolom  hingga  memampat.  Resin  yang  telah memampat dalam kolom segera dialiri pelarut berupa  1  M  NaCl  dalam  aquades  sebanyak 300 ml. Hasil aliran dibuang. Kolom kembali dialiri dengan menggunakan aquades sebanyak  300  ml,  larutan  yang  keluar dibuang. Kolom siap digunakan.
Kolom  yang  telah  berisi  resin  yang memampat,  segera  dialiri  pelarut  berupa bahan  baku  LPO.Pelarut  dialirkan  ke  dalam kolom  dan  hasil  aliran  dibuang  karena  tidak mengandung  LPO.  Selanjutnya  kolom  dialiri 0,4  M  NaCl  dalam  0,1  M  PB.  Hasil  aliran yang  kemudian  ditampung  dalam microtube dengan  volume  10  ml  dan  diberi  label  dan disimpan  pada  pendingin.  Selanjutnya, masing-masing microtube diukur  kadar protein dan aktivitas enzim.

## Pengukuran Nilai Absorbansi

## Pengukuran Kadar Protein
Identifikasi  kadar  protein  dilakukan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm (Harborne, 1987). Untuk mendapatkan  nilai  kadar  protein  terlarut, maka  nilai  absorbansi  yang  didapatkan  dari pengukuran dikonversikan.

## Pengukuran Aktivitas LPO
Penentuan  aktivitas  LPO  dilakukan  dengan menggunakanABTS  sebagai  substratdibaca pada  panjang  gelom (Bardsley, 1985)

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Bahan Baku LPO
Penelitian  ini  menggunakan  susu segar  sebagai  sumber  bahan  baku  LPO. Pengambilan  LPO  pada  penelitian  dilakukan dengan  sentrifugasi  dan  pembuatan  whey. Perlakuan  pada  penelitian  ini  terletak  pada pengurangan  kadar  lemak,  yaitu  T 1 adalah sentrifugasi  dilanjut  pembuatan  whey. Sedangkan T 2 adalah proses pembuatan whey dilanjutkan  sentrifugasi.  Susu  segar  yang diperoleh  dari  peternakan  disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit. Dengan  demikian,  antara  krim  dan  skim terpisah,  lalu  krim  dibuang.  Hal  ini  sesuai dengan  pendapat  Suhartono  (1989)  bahwa pemisahan krim susu dapat dilakukan dengan menggunakan  sentrifuge.  Prinsip  kerja sentrifuge  adalah  penerapan  gaya  sentrifugal dengan  cara  pemusingan  (sentrifugasi)  untuk memisahkan  partikel  berdasarkan  densitas atau bobot jenisnya. Krim akan terakumulasi di  bagian  atas  sedangkan  skim  akan mengendap di bagian bawah.
Penelitian  ini  menggunakan  whey dengan  cara  menambahkan  0,25  ml  rennet dan  asam  laktat  secukupnya.  Rennet berfungsi  untuk  mengkoagulasikan  kasein sedangkan  asam  laktat  berfungsi  untuk membantu  proses  koagulasikasein  oleh rennet.  Hal  ini  sesuai  dengan  pendapat Schwimmer (1981) bahwa rennet merupakan bahan bioaktif yang awalnya merupakan hasil ekstraksi  abomasum  sapi  muda  yang digunakan  sebagai  starter  dalam  proses pembuatan  keju,  karena  mengandung  enzim khimosin dengan kadar tinggi.
Kasein  yang  telah  terkoagulasi selanjutnya dipotong-potong sehingga mengeluarkan cairan. Cairan yang keluar dari hasil  pemotongan  tersebut  adalah  whey sedangkan  padatannya  disebut curd .  Hal  ini sesuai  dengan  pendapat  Korhonen  dan Pihlanto-Leppälä  (2004)  bahwa  kasein  yang terkoagulasi  akan  membentuk curd . Curd cenderung  akan  mengalami  sineresis  yaitu
suatu  kontraksi  untuk  mengeluarkan  cairan yang  disebut  whey.  Volume  whey  yang dihasilkan  dari  masing-masing  perlakuan kemudian diukur. Perlakuan pertama (T 1 ) dan perlakuan  kedua  (T 2 )  ternyata  menghasilkan volume  yang  berbeda.Perbedaan  volume bahan  baku  LPO  dari  kedua  perlakuan ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Perbedaan volume bahan baku LPO
No. Perlakuan  Volume Bahan Baku LPO (ml) 1. T 1 1800 2. T 2 1780
Berdasarkan Tabel 1, diketahui bahwa volume  bahan  baku  LPO  pada  T 1 =1800  ml sedangkan  T 2 =1780  ml.  Volume  bahan  baku yang  dihasilkan  dari  dua  macam  perlakuan tersebut,  adalah  berbeda  dimungkinkan karena  adanya  perbedaan  total  kasein,  bahan padat  tanpa  lemak  (BPTL),  dan  kadar  air yang  terkandung  dalam  susu  pada  masing- masing  sampel.  Hal  ini  sesuai  dengan pendapat  Fox  dan  Mc  Sweeney  (1998),  dan Fox  (2003) bahwa komponen  penyusun  susu masing-masing  individu  sangat  bervariasi. Variasi tersebut dapat terjadi akibat pengaruh berbagai  faktor  diantaranya  spesies,  bangsa, kondisi  kesehatan,  pakan,  tingkat  laktasi  dan umur yang berbeda.

## Imobilisasi LPO
Dalam  penelitian  ini,  kolom  silinder yang  telah  terpasang  pada  penyangga kromatografi,  segera  dialiri  resin  SP-FF sampai memampat, segera dialiri bahan baku LPO.  Pelarut  dialirkan  ke  dalam  kolom  dan hasil aliran dibuang karena tidak mengandung  LPO.  Selanjutnya  kolom  dialiri 0,4 M NaCl dalam 0,1 M PB yang berfungsi untuk  memisahkan  protein  yang  bermuatan positif  dengan  resin  yang  bermuatan  negatif. LPO  keluar  dan  hasilnya  ditampung  dalam microtube dengan  volume  masing-masing microtube 10  ml.  Pemisahan  protein berdasarkan  cara  ini  adalah  sesuai  dengan Winarno  (2002)  bahwa  protein-protein  yang bermuatan  positif  dalam  kolom  kromatografi dapat dikeluarkan dengan penambahan garam
NaCl  atau  garam  lain  pada  larutan  buffer yang digunakan untuk mengeluarkan enzim.
Dalam penelitian ini, bahan baku LPO yang dialirkan ke dalam kolom membutuhkan waktu  yang  berbeda  dalam  menghasilkan LPO.  Perbedaan  rentang  waktu  imobilisasi LPO dariT 1 dan T 2 ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Rentang Waktu Imobilisasi No. Perlakuan Rentang Waktu Imobilisasi 1. T 1 20.00    03.00 2. T 2 19.45   03.00
Berdasarkan  Tabel  2,  menunjukkan bahwa perlakuan  I  (T 1 )  membutuhkan  waktu imobilisasi  untuk  menghasilkan  LPO  selama 8  jam  dari  pukul  20.00 03.00  sedangkan perlakuan II (T 2 ) selama 8 jam 15 menit yang dimulai dari pukul 19.45 03.00. T 1 membutuhkan waktu imobilisasi lebih singkat meskipun  volume  bahan  baku  LPO  lebih tinggi daripada T 2 . Rentang waktu imobilisasi LPO  yang  digunakan  pada  T 2 berlangsung lambat,  diduga  karena  kandungan  bahan padat  tanpa  lemak  (BPTL)  lebih  banyak sehingga  membutuhkan  proses  yang  lama untuk menghasilkan LPO.

## Kadar Protein
Absorbansi  setiap microtube diukur
Pengukuran  ini  dilakukan  dengan  tujuan mengetahui kadar protein. Kurva
absorbansihasil  imobilisasi  pada  T 1 dan T 2 ditunjukkan pada Gambar 1.
Berdasarkan  kurva  Gambar  1,  T 1 dan T 2 menunjukkan  kadar  protein  semakin menurun  seiring  bertambahnya  nomor microtube .  Kadar  protein  relatif  tinggi  pada fraksi  awal  yaitu microtube nomor  1  sampai 8,  kemudian  mulai microtube nomor  9 kandungan  kadar  protein  berangsur-angsur menurun  dan  hanya  mengalami  sedikit kenaikan.  Kromatografi  yang  digubakan dalam  penelitian  ini,  merupakan  pemisahan molekul  menurut  berat  molekulnya.  Saat bahan  baku  LPO  dialirkan  ke  dalam  kolom maka  partikel  dengan  ukuran  besar  akan bergerak  turun  lebih  cepat  dari  partikel  yang berukuran  kecil  karena  partikel  besar bergerak turun tanpa melalui pori-pori resin.
Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  yang dilakukan  oleh  Touch et  al .,  (2004)  bahwa protein  mempunyai  berat  molekul  besar sehingga  lebih  dahulu  diserap  dan  lebih dahulu keluar.
Berdasarkan  kurva  Ilustrasi  1,  T 1 dan T 2 memiliki  perbedaan  pada  nilai  kadar protein.  Nilai  kadar  protein  yang  dihasilkan T 1 lebih  tinggi  daripada  T 2 .  Nilai  kadar protein  tertinggi  pada  T 1 =4,290%  sedangkan T 2 =3,723%.  Nilai  kadar  protein  terendah pada  T 1 =  0,213%  sedangkan  T 2 =0,130%. Faktor  yang mempengaruhi tinggi rendahnya kadar  protein  adalah  perbedaan  medium  asal bahan  baku  LPO.  Bahan  baku  LPO  pada T 1 didapatkan  dengan  cara  sentrifugasi dilanjut dengan pembuatan whey adalah cara yang  lazim  digunakan.  Cara  ini  juga  sama seperti  yang  dilakukan  oleh  Touch et  al ., (2004)  sehingga  mendapatkan  kadar  protein relatif  tinggi  karena  LPO  adalah  enzim  yang terdapat  di  dalam  whey  dengan  kadar tertinggi.  Sementara  bahan  baku  pada  T 2 didapatkan  dengan  perlakuan  yang  berbeda dengan  T 1 sehingga  kadar  protein  yang didapatkan relatif rendah. Hal ini dimungkinkan  karena  sentrifugasi  yang dilakukan pada T 2 adalah sentrifugasi dengan muatan  rendah,  artinya  LPO  dimungkinkan terkonsentrasi  di  dekat axis ( microtube bagian  atas)  dan  tidak  ikut  terambil  untuk proses  selanjutnya  karena  muatan  komponen lain didalam sampel seperti kasein dan lemak, telah diambil melalui proses sebelumnya.

## Aktivitas LPO
Aktivitas LPO diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
pendapat  Bardsley  (1985)  bahwa  LPO mempunyai  absorbansi  maksimum  412. Kurva  nilai  aktivitas  laktoperoksidase  (LPO) pada T 1 dan T 2 ditunjukkan pada Gambar 2. Kurva  Gambar  2  perlakuan  I  (T 1 ), didapatkan  hasil  bahwa  tidak  semua microtube padaT 1 memiliki  aktivitas  LPO. Microtube yang  memiliki  aktivitas  LPO hanya  10 microtube dari  29  yang  diukur absorbansinya yaitu pada nomor 1; 4; 5; 6; 8; 10;  11;  12;  13;  15;  dan  16.  Puncak  tertinggi terdapat pada microtube 4; 8 dan 12.
Gambar  1.  Kurva  Nilai  Kadar  Protein  pada  absorbansi  280  nm  dengan  menggunakan spektrofotometer
Gambar 2. Kurva Hasil ABS (absorbansi) 412 nm dengan menggunakan spektofotometer
Sedangkan microtube 1; 5; 6; 10; 13; 15; dan 16 memiliki aktiitas LPO yang relatif rendah. Kurva  Gambar  2  perlakuan  II  (T 2 ), didapatkan hasil bahwa aktivitas LPO dari 29 microtube hanya  ada  pada microtube nomor tertentu,  yaitu microtube nomor  5  dan  15 sedangkan microtube nomor  lainnya  tidak terdapat aktivitas LPO.
Nilai  aktivitas  LPO  tertinggi  pada  T 1 maupun T 2 berada pada microtube awal yaitu T 1 microtube nomor  5  sedangkan  T 2 microtube nomor 2.
Kurva  T 1 dan  T 2 memiliki  perbedaan yaitu  sebanyak  11 microtube pada  T 1 memiliki aktivitas LPO sedangkan (T 2 ) hanya 2 microtube .  Perbedaan  mengenai  tinggi-
rendahnya  aktivitas  LPO  disebabkan  resin SP-FF  adalah  jenis  resin  penukar  ion sehingga dapat menarik ion yang berlawanan. Bahan  baku  LPO  menempel  pada  resin tersebut secara tidak merata dan turun berupa pita  dengan  laju  aliran  yang  berbeda  dan mengalir  keluar  kolom  sehingga  aktivitas yang  dihasilkan  juga  berbeda.  Hal  ini  sesuai dengan pendapat Gritter et. al ., (1991) bahwa dalam imobilisasi, kolom kromatografi dibuat dengan  cara  menuangkan  lumpuran  atau suspensi fase diam dalam pelarut yang sesuai ke  dalam  kolom  dan  dibiarkan  memampat atau  mengalir.  Komponen  yang  diinginkan akan  turun/keluar  dengan  laju  aliran  yang berlainan.
Dalam  penelitian  ini,  diduga  banyak sedikitnya  endapan  total  bahan  padat  tanpa Lemak (BPTL) yang tidak dapat terpisah dari bahan  baku  LPO  selama  imobilisasi  juga dapat mempengaruhi tinggi-rendahnya aktivitas  LPO.  Total  BPTL  T 1 lebih  rendah daripada  T 2 .  Hal  ini  karena  partikel  pada  T 1 terpisah secara sempurna pada saat
pembuatan  bahan  baku  LPO  sehingga  saat imobilisasi  lemak  dapat  dipisahkan  dengan baik.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa T 1 adalah metode  yang  dapat  dijadikan  panduan  dalam pengambilan  enzim  LPO  dari  susu  sapi karena  menghasilkan  kadar  protein  serta aktivitas LPO yang lebih tinggi daripada T 2 .

## DAFTAR PUSTAKA
Bardsley,  W.  G.  1985.  Steady-state  kinetics of  lactoperoxidasecatalyzed  reaction.  In K.  M.  Pruitt,  and  J.  O.  Tenovuo  (Eds.), The  lactoperoxidase  system:  Chemistry and  biological  significance  (pp.  55 87).
New York: Marcel Dekker.
Daulay,  D.  1991.  Fermentasi  Keju.  Pusat Antar  Universitas  Pangan  dan  Gizi.
Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Fox, PF., and Mc Sweeney PLH. 1998. Dairy Chemistry  and  Biochemistry.  London:
Blackie Academic and Profesional.
Fox,  PF.  2003.  The  major  constituents  of milk.  Di  dalam:  Smit  G,  editor.  Dairy Processing  Improving  Quality.  Boston: CRC Press LLC.
Gritter, J.R., Bobbit, J.M. and Schwarting, A.
E.  1991.  Pengantar  Kromatografi  Edisi Kedua.  Bandung.  ITB.  107-109,  140-
147, 160-163.
Harborne,  J.B.  1987.  Metode  Fitokimia. Penerbit ITB. Bandung.
Korhonen,  H.,  and  Pihlanto-Leppälä,  A.
2004. Milk - Derived Bioactive Peptides:
Formation  and  Prospects  for  Health Promotion.  In:  Handbook  of  Functional
Brien(eds). CRC Press , Boca Raton, FL, pp. 109   124 .
Schwimmer.  1981.  Sources  of  Food
Enzymology. Wesport Connecticut : The Avi Pub. Co. Inc. Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Direktorat Jenderal Pendidikan  Tinggi  Antar  Universitas Bioteknologi,  Institut  Pertanian  Bogor. 172-220. Touch, V., S. Hayakawa, S.  Yamada, dan S. Kaneko. 2004. Effects of a lactoperoxidase thiocyanate hydrogen peroxide system on Salmonella enteritidis  in  animal  or  vegetable  foods. 2004.  International  Journal  of  Food Microbiology 93, 175  183.
Winarno,  FG.  2002.  Kimia  pagan  dan  gizi.
Gramedia pustaka utama. Jakarta.