## PENENTUAN  β-KAROTEN DALAM BUAH   WORTEL (DAUCUS CAROTA) SECARA KROMATOGRAFI CAIR  KINERJA TINGGI ( U-HPLC)

## (Determine of β-Caroten in carrot (Daucus carota ) using Ultra High Performance
Liquid Chromatograph (U-HPLC))
Sonlimar Mangunsong 1 * , Rifqi Assiddiqy 2 , Eka Puspa Sari 3 , Priscila Natalia Marpaung 4 , Rahma Arum Sari 5
1 Program Studi Farmasi, Politeknik Kesehatan Kemenkes Palembang, Indonesia. Email: sonlimar@gmail.com
2 Program Studi Farmasi, Politeknik Kesehatan Kemenkes Palembang, Indonesia. Email: rassiddiqy@gmail.com
3 Program Studi Farmasi, Politeknik Kesehatan Kemenkes Palembang, Indonesia. Email: o09eka_x3@yahoo.com
4 Program Studi Farmasi, Politeknik Kesehatan Kemenkes Palembang, Indonesia. Email: priscilanataliamarpaung@gmail.com
5 Program Studi Farmasi, Politeknik Kesehatan Kemenkes Palembang, Indonesia. Email: rahmaarumsari149@gmail.com
Received: 28/2/2019                       Accepted: 26/3/2019                       Published online: 13/5/2019

## ABSTRAK
Pola    hidup  masyarakat  yang  cenderung  tidak  sehat menyebabkan  banyak radikal bebas di dalam tubuh yang dapat mengakibatkan berbagai penyakit terutama penyakit degeneratif.  Perlindungan  tubuh  dari  serangan  radikal bebas,  perlu  antioksidan  seperti  β-karoten.  Salah  satu sayuran    yang  mengandung  β-karoten  adalah  wortel, jumlahnya  sangat  banyak  dalam  pertanian.  Berdasarkan warnanya, maka kandungan β-karoten yang terdapat dalam wortel  menjadi  penentu    kandungan  beta  karoten  Metode ektraksi  yang  aman  dari  bahan  pelarut  kimia  mutlak diperlukan.  Untuk mengetahui kandungan β-karoten dalam wortel,    lebih    dahulu  dilakukan  penghalusan    dengan blender, kemudian sari difilter /dipisahkan dari ampasnya. Sari  yangdiperleh ditambahkan garam kalsium kemudian disentrifus  3000  rpm    15  menit.  Pelet  dipisahkan  dari larutannya, diuapkan hingga kering, Diukur pada panjang gelombang  450-460.  Pelet  sebagai  garam  kalsium betakaroten dianalisa dengan U-HPLC.  Pelet selanjutkan diukur pada panjang gelombang 460. ditetapkan kadarnya secara  kromatografi  cair  kinerja  tinggi  menggunakan kolom  C18  dan  fase  gerak  kloroform–metanol  (95:5) dengan laju alir 1 ml/menit pada panjang gelombang 460 nm.  Kandungan  β-karoten  dalam  pemeriksaan    sampai 92,5%.  Waktu retensi yang diperoleh adalah 1,903 menit. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  metode  ini  dapat digunakan untuk penarikan dan penetapan kadar β-karoten dalam   tanpa pelarut kimia organik.
Kata kunci  : β-karoten,  kromatografi  cair  kinerja  tinggi,

## HPLC

## ABSTRACT
The lifestyle of people who tend to be unhealthy causes a lot of  free  radicals  in  the  body  which  can  cause  various diseases,  especially  degenerative  diseases.  To  protect  the body  from  attacks  by  free  radicals,  the  body  needs
* Penulis untuk korespondensi: sonlimar@gmail.com
antioxidants  such  as  β-carotene.  One  of  the  vegetables containing β-carotene is “wortel” Daucus carota, that  is very large in agriculture. The spread of beta carotene from carrots  with  chemical  solvents  has  been  done  a  lot,  but without chemical solvents it has never been done. Based on the  color,  the  content  of  β-carotene  contained  in  carrots determines the content of beta carotene. The juice obtained by  calcium  salt  was  then  centrifuged  for  3000  rpm  15 minutes.  The  pellets  are  separated  from  the  solution, evaporated  to  dryness,  measured  at  a  wavelength  of  450- 460.  Pellets as beta-carotene calcium  salts  were analyzed by  U-HPLC.  The  next  pellet  is  measured  at  460 wavelengths.  The  levels  are  determined  by  high performance liquid chromatography using C18 column and the mobile phase of chloroform-methanol (95:5) with a flow rate of 1 ml / minute at a wavelength of 460 nm. The content of  β-carotene  in  the  examination  is  up  to  92,5%.  The retention time obtained is 1,903 minutes. The results showed that  this  method  can  be  used  for  the  withdrawal  and determination  of  β-carotene  levels  without  organic chemical solvents.
Keywords:    β-carotene,  High  Performance  Liquid Chromatography, HPLC

## PENDAHULUAN
Antioksidan belakangan ini telah banyak  dibicarakan bukan  hanya di kalangan ilmuwan tetapi  juga dalam masyarakat  yang semakin  menyadari  manfaatnya. 1 Selain dikenal sebagai senjata ampuh untuk menangkal  berbagai  penyakit,  antioksidan juga  dipercaya  bisa  membuat  awet  muda. 2 Seiring dengan perkembangan zaman,
Jurnal AcTion: Aceh Nutrition Journal, Mei 2019 (4)1: 36-41
http://dx.doi.org/10.30867/action.v4i1.151
menimbulkan  perubahan  pada  gaya  hidup masyarakat  yang  cenderung  menjalani  gaya hidup  yang  tidak  sehat  seperti  merokok, minum  minuman  keras,  mengkonsumsi junk food dan  terkena  paparan  sinar  ultraviolet secara  berlebihan.  Akibat  dari  gaya  hidup tersebut,  di  dalam  tubuh  banyak  terkandung radikal  bebas  yang  sangat  membahayakan tubuh.  Senyawa  radikal  bebas  ini  dapat terbentuk akibat dari proses kimia yang terjadi di  dalam  tubuh,  seperti  proses  oksidasi, metabolisme dan peradangan. 3,4
Dalam  jumlah  tertentu  radikal  bebas dibutuhkan  sebagai  bagian  dari  pertahanan tubuh.  Namun  pada  kenyataannya  radikal bebas sering terbentuk melebihi kebutuhannya  sehingga  peranannya  berubah menjadi liar  atau desktruktif (merusak) yang dapat menyebabkan berbagai penyakit seperti pengerasan pembuluh darah, jantung koroner, stroke,  kanker  dan  penuaan  dini.  Untuk melindungi tubuh dari serangan radikal bebas, maka  tubuh  memerlukan  antioksidan,  antara lain terdiri dari β-karoten, vitamin E, vitamin C dan selenium 3 . β-karoten merupakan salah satu antioksidan  yang  dapat  mencegah  penyakit. Senyawa antioksidan ini mampu menetralisir zat-zat  radikal  bebas  dalam  tubuh  yang merupakan sumber pemicu timbulnya berbagai penyakit terutama penyakit degeneratif. Secara alamiah β- karoten banyak terdapat pada buah-buahan seperti, labu, buah merah, semangka, mangga, tomat, melon dan cabe.  Salah  satu  sumber  utama    yang mengandung β-karoten adalah wortel. Wortel digolongkan kelompok sayur-sayuran, kandungan  β-karoten  yang  terdapat  pada wortel juga berbeda-beda. 3 Perbedaan kandungan  β-karoten  dalam  wortel  dan mengingat β-karoten adalah senyawa antioksidan  yang  bermanfaat  maka  untuk mengetahui  kandungan  β-karoten  diperlukan metode untuk menentukan kadarnya. 4,5
Pada penelitian ini dilakukan Isolasi dan Pemeriksaan    kadar    menggunakan  metode kromatografi  cair  kinerja  tinggi  dengan menggunakan  fase  balik.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mendapatkan  metode  yang tepat  dan  teliti  dalam  penentuan    β-karoten
pada  wortel,  serta  mengetahui  kandungan  β- karoten yang  dari wortel.

## METODE
Beberapa  penggunaan  bahan  yang dibutuhkan  dalam  beta  karoten  dalam  buah yaitu:  wortel,  yang  diperoleh  dari  Super market    Palembang,  bahan    β-karoten, kloroform    tetrahidrofuran  (THF),  metanol, aquabides, acetonitril grade HPLC.
Alat  yang  digunakan  dalam  penentuan β-karoten  yaitu  Kromatografi  cair  kinerja tinggi (U-HPLC Thermo Versi Ultimate 3000 series ), Spektrofotometer ultraviolet – cahaya tampak ( Analytic Jena specord 200 ), timbangan analitik ( Sartorius Dragon ), timbangan mikro ( Sartorius Dragon ), blender ( Philips ),  Rotavapor  ( Buchi  V-800 ),  corong pisah, alat-alat gelas, Kertas saring Whatman No 40.
1. Metode  Penetapan  Kondisi  Optimum HPLC/KCKT
a. Penetapan  panjang  gelombang  serapan maksimum β-karoten
Sejumlah  20  mg  β-karoten  isolate dimasukkan ke dalam labu tentukur 50-mL larutkan  dan  encerkan  dengan  kloroform hingga  tanda.  Kemudian  dipipet  sejumlah 2,5  mL  dimasukkan  ke  dalam  labu  labu tentukur 10-mL diencerkan dengan kloroform  sampai  tanda.  Selanjutnya dibuat
spektrum menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang 420- 500 nm. 6 b. Pemilihan fase gerak dan laju alir Sejumlah  20 mg β-karoten dimasukkan ke  dalam  labu  tentukur  50-mL  dilarutkan dan  diencerkan  dengan  kloroform  hingga garis    tanda.  Kemudian  dipipet  sejumlah 2,5  mL  dimasukkan  ke  dalam  labu  labu tentukur  10-  mL  diencerkan  dengan kloroform sampai tanda. Suntikkan sejumlah  20  μl  ke  dalam  alat  KCKT menggunakan  fase  gerak  methanol  - kloroform (95:5); metanol– tetrahidrofuran–air  (67:27:6);  kloroform- tetrahidrofuran-air  (67:27:6);  asetonitril- kloroform  (92:8);  klroform  –metanol
(95:5) dan kloroform-tetrahidrofuran- metanol  (70:25:5)  dengan  laju  alir  0,5 mL/menit dan 1 mL/menit. Fase gerak dan laju  alir  yang  dipilih  adalah  yang memberikan  pemisahan  terbaik  dengan waktu retensi yang tidak terlalu lama.

## 2. Identifikasi β -Karoten dalam Wortel
a. Pembuatan ekstrak/Isolat:
Wortel    segar  yang  telah  dipotong- potong dan dihaluskan, ditimbang sejumlah  100  g  (wortel),  50  g  diblender menggunakan      pelarut  air  mineral, kemudian  disaring.  Residu  dibilas  dengan Filtrat  yang  diperoleh  diberi  garam kalsium,  disentrifuse  3000  rpm  15  menit. Residu sebagai pellet adalah beta  karoten, dipekatkan  menggunakan  rotavapor  pada suhu 40 0 C. Disimpan dalam suhu dingin. b. Pembuatan larutan
Pembuatan  larutan  baku:  Sejumlah  10 mg  β-karoten  dimasukkan  ke  dalam  labu tentukur  50-mL  larutkan  dan  diencerkan dengan kloroform hingga tanda. Kemudian dipipet  sejumlah  2,5  mL  dimasukkan  ke dalam  labu  tentukur  10-mL  diencerkan dengan  kloroform  sampai  garis  tanda (Standar beta karoten). 7 c. Cara identifikasi :
Sejumlah larutan uji disuntikkan sebanyak  20  μl  ke  dalam  alat  KCKT, kemudian  dibandingkan  waktu  retensinya dengan waktu retensi baku β- karoten.
3. Analisis kuantitatif secara kromatografi cair kinerja tinggi
a. Uji kesesuaian sistem Uji  kesesuaian  sistem  dilakukan  untuk mengetahui  apakah  alat,  metode  dan kondisi membentuk sistim analisis tunggal. Sejumlah  20  μl  larutan  baku  β-  karoten disuntikkan  sebanyak 5  kali  ke dalam alat KCKT,  kemudian  diukur  luas  puncaknya dengan  kondisi  KCKT  yang  optimum, selanjutnya dihitung nilai simpangan baku relatifnya.
b. Penetapan  kadar  β-karoten  dalam  ekstrak
Wortel   secara KCKT.
Larutan uji  di sonikasi selama 10 menit. Masingmasing disuntikkan sebanyak 20 μl
ke  dalam  alat  KCKT  dan  diukur  luas puncaknya  dengan  kondisi  KCKT  yang optimum.  Kadar  β-karoten  isolat  dihitung menggunakan rumus berikut:
Kadar (μg/g) (Au/Ab) x Cb x fp x  VL B
Keterangan: Au = Luas puncak larutan uji Ab = Luas puncak larutan baku Cb = Konsentrasi betakaroten (μg/ml) Fp = Faktor pengenceran (ml) VL = Volume contoh (ml) B = Bobot contoh yang ditimbang (g)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis kualitatif β-karoten baku secara KCKT  pada ekstrak paprika diperoleh waktu retensi yang mendekati waktu retensi baku β- karoten.  Identifikasi  baku  beta  karoten diperoleh  dari  hasil  pengukuran. 3 Hasil identifikasi  β-karoten    baku  standar  dapat dilihat pada Gambar 1, 2 dan 3.  Pada Gambar 1.  Kromatogram  baku  β-karoten  dengan waktu  retensi  1.392  menit.    Pada    Gambar  2 adalah  Kromatogram  baku  β-karoten  dengan waktu  retensi  2.86  menit  kecepatan  alir  0.5 menit/mL.  Gambar  3  adalah  spekturm  baku beta karoten UV –Vis. 3
Gambar 4  adalah  spekturm isolat  beta karoten  UV  –Vis.    Gambar  5  adalah kromatogram isolat beta karoten wortel  hasil penelitian  dengan  U-HPLC    waktu  retensi 1,903 menit.
Gambar 1. Kromatograf baku β-karoten dengan waktu retensi 1,392 menit
Gambar 2. Kromatograf baku Beta Karoten yang menghasilkan: RT  2,86 menit dengan laju alir  0,5 mL/menit  fase mobil Kloroform: THF:Metanol=70:20:5
Gambar 3. Kromatograf  spektrum beta karoten baku pengukuran UV-vis pada panjang gelombang 450 nm 10
Gambar 4. Kromatograf  spektrum beta karoten baku pengukuran UV-vis pada panjang gelombang 460 nm pelarut kloroform. 10
Gambar 5. adalah Kromatogram Isolat beta karoten wortel  dengan waktu retensi 1.903 menit fase mobile kloroform dan methanol (95:5)
Isolasi  beta  karoten  dari  wortel  dengan pelarut  organik  telah  banyak  dilakukan,  salah satunya  penelitian  Fikselova,    meneneliti hubungan kombinasi pelarut dan suhu penyaringan. 6 Beta  karoten  bersifat  hidrofob sehingga  disebut  larut  dalam  pelarut  organik. Pelarut  organik  yang  sering    digunakan terutama  adalah  kloroform,  petroleum  eter, diklorometan,  dan  heksan.  Sifat  kimia  beta karoten terutama disebabkan banyaknya mengandung ikatan rangkap. 6,7 Pada penelitian ini  isolasi  beta  karoten  dari  wortel  digunakan tanpa  pelarut  organik,  prinsip  go  to  green. Ikatan  rangkap    pada  beta  karoten  dapat mengendap  dengan  garam  kalsium  sehingga prinsip  ini  digunakan  dalam  penelitian  untuk mendapatkan  beta  karoten  dari  sari  wortel. Kemudian  pemisahannya  digunakan  dengan cara  pengendapan  melalui  sentrifuse.  Pelet yang diperoleh adalah sebaga betakaroten yang berwarna  jingga.  Sehingga  banyak  buku referensi  melakukan  ekstraksi  dengan  pelarut organik. Meskipun demikian dalam penelitian ini tidak menggunakan pelarut organic namun menggunakan prinsip pengendapan sesuai sifat dan  prinsip    metode    yang  digunakan  dalam penelitian.  Beta  karoten  yang  diperoleh selanjut    diperlakukan  seperti  beta  karoten baku.  Menggunkan  UHPLC  berbeda  dengan beta  karoten  baku  menggunakan  HPLC. Namun belum sepenuhnya lengkap  dilakukan karena keterbatasan bahan  dan waktu.
Dari  hasil  penetapan  kondisi  optimum, menunjukan  bahwa  β-karoten  memberikan serapan  maksimum  pada  panjang  gelombang 460 nm dengan pelarut kloroform (Gambar 4). Pergeseran  panjang  gelombang  dari  450-460
adalah  memungkinkan  dipengaruhi  oleh  faktor pelarut  yang  digunakan  yang  berbeda  saat pengukuran
dibandingkan referensi. 7,8
Berdasarkan  hasil  percobaan,  perbandingan yang  terbaik  adalah  kloroform–metanol  (95:5) dengan  laju  alir  1  mL/menit,  sesuai  dengan waktu  retensi  yang  diperoleh    lebih  cepat  dan resolusinya  baik.  Fase  gerak  yang  lazim digunakan  sesuai  kondisi  adalah  kloroform, alkohol,  heksan,  methanol, asetonitril,  akuadest grade HPLC. 9,10 Selanjutnya dapat diberi larutan penunjang  seperti  THF. 11 Hasil  penetapan panjang gelombang dapat dilihat pada Gambar 5, hasil  pemilihan  fase  gerak  dan  laju  alir  terlihat pada  Gambar  5.  Meskipun  beberapa  penelitian telah  menunjukan  hasil  (waktu  retensi)  beta karoten yang berbeda dengan penelitian ini, oleh karena  fase  mobile  yang  dilakukan  adalah berbeda,  kecepatan  alir  yang  berbeda  dan  alat HPLC  yang  berbeda. 7,12 Sehingga  setiap pengukuran  RT  adalah  merupakan  kondisi optimal  yang  dilakukan  oleh  peneliti  dalam menghasilkan  kromatogram  dari  beta  karoten untuk menghasilkan RT yang relative cepat dan gambar peak yang jelas. 6,13,14
Pada penelitian ini telah dihasilkan waktu retensi  beta  karoten  adalah  1,903  menit menggunakan laju alir 1 mL/ menit dengan fase mobile  kloroform  :  methanol  (95:5)  hasil kromatograf Gambar
5.
Selanjutnya menggunakan  pembanding laju alir 1 ml/menit β-karoten baku dapat terpisah pada waktu retensi 1,392 menit. Perbaikan peak kromatogram dapat dilanjutkan  dengan  penambhan  kombinasi larutan  fase  mobile  dengan    kombinasi  THF sehingga diperoleh peak yang lebih tajam.  Dari hasil uji linearitas (Gambar 1), sehinga diperoleh nilai    untuk  larutan  baku  β-karoten  sebesar 0,9971. Nilai r tersebut menunjukkan nilai yang ideal  karena  mendekati  1,  sehingga  koefisien korelasi  antara  konsentrasi  larutan  dengan  luas puncak yang terdeteksi oleh KCKT adalah baik dan  dapat  digunakan  untuk  penelitian.    Dari penelitian  Serlahwaty 7 dan  Fikselova 9 telah memberikan  inspirasi  dalam  penelitian  ini terutama  dalam  penggunakan  data  baku  beta karoten.  Penelitian  lanjutan  sedang  dilakukan untuk  pembuatan  sediaan  formulasi  dan pembuatan beta karoten mendekati baku.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Metode    isolate    yang  digunakan      telah menghasilkan    beta  karoten    bentuk    garam kalsium  1  gram  /  100  Gram  wortel  basah. Pembuktian  dilakukan  dengan  kromatografi cair  kinerja  tinggi  (UHPLC)  menggunakan fase  diam  kolom    C18.  Fase  gerak  adalah campuran kloroform– metanol (95:5), laju alir 1,0  ml/menit  dengan  detektor  cahaya  tampak (visibel)  pada  panjang  gelombang  460  nm. Penetapan  terhadap  β-karoten  dalam  wortel, menghasilkan   kromatograf dan waktu retensi yang mirip dengan pola kromatograf baku.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan Terima Kasih disampakan kepada Politeknik Kesehatan Kemenkes Palembang  sebagai  pemberi  bantuan  dan dalam penelitian ini.  Laboratorium Kesehatan Palembang  tempat melakukan penentuan beta karoten dengan metode HPLC.

## DAFTAR PUSTAKA
1.   Winarsi  H.  β-karoten  dalam  buah.  In:
Antioksidan  Alami  Dan  Radikal  Bebas .
Jakarta: Kanisus; 2007.
http://bluejack.binus.ac.id.
2.   Böhm V, Puspitasari-Nienaber NL, Ferruzzi MG,  Schwartz  SJ.  Trolox  equivalent antioxidant capacity of different geometrical isomers of α-carotene, β-carotene, lycopene, and zeaxanthin. Journal of Agricultural and Food Chemistry . 2002;50(1):221-226.
3.   Belitz  HD,  Grosch  W,  Schieberle  P. Food Chemistry1070 .  Berlin:  Springer  Verlag; 2004.
4.   Stutz  H,  Bresgen  N,  Eckl  PM.  Analytical tools  for  the  analysis  of  β-carotene  and  its degradation products. Free radical research . 2015;49(5):650-680.
5.   Biranti  F,  Nursid  M,  Cahyono  B.  Analisis Kuantitatif  B-Karoten  dan  Uji  Akttvitas Karotenoid  dalam  Alga  Coklat  Turbinaria Decurrens. Jurnal  Sains  dan  Matematika . 2009;17(2):90-96.
6.   British Pharmaceutical Commission. British Pharmacopeia .  London:  The  Station  of Office; 2007.
7.   Serlahwaty  D,  Farida  Y,  Asriyana  T. Penetapan Kadar Beta Karoten dalam Buah
Paprika Merah, Kuning dan Hijau (Capsicum annuum Var. annuum L.) secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
[Determination  of  β-carotene  in  Red, Yellow and Green Pepper (Capsicum annuum  Var.  annuum  L.)  by  using  HPLC].
Wijaya,  H,  Giyatmi,  HE  Irianto,  A  Amar, RDE Wijayanti, E Wahyono, et al . 2009:1-7.
8.   Calvo  MM,  Dado  D,  Santa-María  G. Influence of extraction with ethanol or ethyl acetate on the yield of lycopene, β-carotene, phytoene and phytofluene from tomato peel powder. European  Food  Research  and Technology . 2007;224(5):567-571.
9.   Fikselová  M,  Šilhár  S,  Mareček  J, Frančáková H. Extraction of carrot (Daucus carota  L.)  carotenes  under  different conditions. Czech Journal of Food Sciences . 2008;26(4):268-274.
10.  Harborne  JB. Metode  Fitokimia .  Edisi
Kedu. Bandung: Institut Tehnologi
Bandung; 2000.
11.  Harwtz  W. Official  Method  of  Analysis  of AOAC  International  17th  Edition .  Vol  II. Virginia: AOAC International 12.  United State Pharmacopeia Convention. The United  States  Pharmacopeia  28  The National  Formulary  23 .  Roskville:  United states Pharmacopeia Convention inc 13.  Suharyani.  Penetapan  Kadar  Beta-Karoten dalam Sari Buah Merah (Pandanus conoldeus  Lam.)  secara  Kromatografi  Cair Kinerja Tinggi. 2007.
14.  Zakiah  N,  Yanuarman  Y,  Frengki  F, Munazar  M.  Aktifitas  Hepatoprotektif Ekstrak  Etanol  Daun  Sirsak  (Annona Muricata  L.)  Terhadap  Kerusakan  Hati Tikus  yang  Diinduksi  dengan  Parasetamol.
AcTion: Aceh Nutrition Journal . 2017;2(1):25-31. http://dx.doi.org/10.30867/action.v2i1.33