## Skrening Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Usus Ayam Broiler sebagai Kandidat Probiotik untuk Unggas
( Screening of Lactic Acid Bacteria Isolated from Broiler’s Intestine as Probiotic
Candidates for Poultry)
Nurbaiti 1) , Anwar Rosyidi 2) , dan Muhamad Ali 3)*
1) Program Magister Manajemen Sumberdaya Peternakan, Program Pascasarjana Universitas Mataram 2) Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram
Jl. Majapahit No. 62 Mataram, Indonesia, 83125.
email: ali.molbiotech@gmail.com
Diterima: 23 April 2016/Disetujui: 25 Mei 2016

## ABSTRACT
The use of probiotics is increasingly popular as an alternative replacement to antibiotic uses in stimulating health and growth of broiler chickens. The use of antibiotics may disturb the balance of the gut microbiota and play a significant role in the emerging of antibiotic resistance pathogens. Thus, the objective of this study was to isolate and  screen  lactic  acid  bacteria  (LAB)  from  the  intestine  of  broiler  chickens as  probiotic  candidates.  LAB  were initially  screened  by  phenotypic  assay.  Furthermore,  those strains  which  belonged  to  LAB were  screened  for inhibitory activity against E. coli. Results showed that a total of 4 isolates were considered as members of lactic acid bacteria indicating by the results of phenotypic assays: gram positive, catalase and oxidase negative, and able to perform carbohydrate fermentation. Out of the 4 isolates, only one isolate showed an inhibitory activity against the targeted pathogen. Further research is still needed to confirm the potential strain for probiotic in poultry. Key-words: probiotics, lactic acid bacteria, Escherichia coli, catalase test, carbohydrate fermentation

## PENDAHULUAN
Probiotik merupakan sel mikroorganisme (mikroba) hidup  maupun  hasil  metabolitnya  yang memiliki banyak manfaat untuk  mahluk  hidup. Menurut  regulasi  Uni  Eropa  (EC  Regulation)  No. 1831/2003  tentang  penggunaan  bahan  aditif  pada ternak,  probiotik  digolongkan  sebagai  bahan  aditif pakan kelompok fungsional 4 (b) sebagai “ gut flora stabilizer ” (Mikulski et  al.,  2012). Tamime  (2005) mendefinisikan  probiotik  sebagai  mikroba  hidup yang  secara  aktif  dapat  meningkatkan  kesehatan dengan  cara  menjaga  keseimbangan  flora  saluran pencernaan.
Penggunaan  probiotik  pada  ternak  sangat  luas. Untuk ternak unggas, manfaat probiotik diantaranya untuk meningkatkan kecernaan pakan, mengurangi jumlah mikroba patogen di  saluran  pencernaan sehingga dapat menjaga kesehatan ternak, meningkatkan  daya  tahan  tubuh, serta  membantu pertumbuhan (Ehrmann et  al.,  2002). Penambahan
mikroba hidup  ke  dalam  pakan  dapat  merangsang sistem  kekebalan  tubuh ternak (Toms  dan  Powrie, 2000  dan  Koenen et  al.,  2004)  serta  meningkatkan daya  tahan tubuh  non  spesifik  (Placha et  al,. 2010). Beberapa  hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa probiotik  dapat  memperbaiki  konversi  pakan, menurunkan  kematian (Mohan et  al.,  1995)  serta menghambat menempelnya patogen seperti Escherichia coli di usus (Coconnier et al., 1993).
Mekanisme  kerja  probiotik  cukup  beragam. Mikroba patogen sangat  aktif  merombak  zat-zat yang  terdapat  pada  kolon  guna  menghasilkan metabolit  toksik,  karsinogenik,  atau  metanogenik yang  berasal  dari  bahan  beracun,  obat-obatan, steroid  ataupun  metabolit  dari  bahan  pakan.  Pada hewan yang  peka,  metabolit  tersebut  sering menyebabkan kerusakan mukosa usus, bahkan dapat menyebabkan terbentuknya tumor atau penyakit lain sehingga  metabolit  toksik  tersebut  harus  dibuang. Probiotik  memiliki  peranan  dalam  menetralisir toksin  yang  dihasilkan  oleh  bakteri-bakteri  patogen,
Jurnal Ilmu dan Teknologi Peternakan Indonesia Volume 2 (1): 144 - 149; Juni 2016 ISSN: 2460-6669
http://jurnal.unram.ac.id/ dan jitpi.fpt.unram,ac,id
Nurbaiti, Anwar Rosyidi,, Muhamad Ali ( Skrening Bakteri Asam Laktat……….. )
serta menghambat pertumbuhan dari bakteri patogen tersebut  dengan  cara  mencegah  kolonisasinya  pada dinding  usus  halus.  Probiotik  mampu  mendesak mikroba  non-indigenous  (patogen)  keluar  dari ekosistem saluran pencernaan dan mengambil lokasi mikroba  patogen  tersebut (Fuller,  1992). Selain  itu, probiotik  juga  mampu  mempengaruhi  aktivitas enzim  pada  usus  halus,  mengasimilasi  kolesterol, serta  meningkatkan  pertumbuhan dan  kinerja ternak (Abun,  2008). Bahkan  probiotik  dapat  juga dimanfaatkan untuk mencegah pertumbuhan mikroba  lain  karena  kemampuannya  menghasilkan senyawa antibakteri yang disebut sebagai bakteriosin.
Ashayerizadeh et  al., (2009)  melaporkan  bahwa Lactobacillus merupakan salah satu spesies probiotik yang banyak digunakan pada ayam broiler selain Streptococcus, Bacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Aspergillus, Candida, dan Saccharomyces. Zhang et  al., (2003) menambahkan bahwa Lactobacillus yang  dinonaktifkan  dengan panas  dapat  memberikan  pengaruh  positif  terhadap perkembangan imunitas sel tubuh ayam broiler.
Menurut  Sari et  al. (2013), Lactobacillus merupakan mikroba utama  yang  terdapat  dalam saluran  pencernaan  ayam  broiler. Di  dalam  saluran pencernaan,  mikroba tersebut mampu menghasilkan asam  laktat  dan  asam  asetat  yang membuat  pH  di sekitarnya berkisar antara 4-5. Namun, bakteri asam laktat  tersebut  mampu  tumbuh  pada  suasana  asam tanpa adanya oksigen. Bakteri asam laktat, terutama Lactobacillus,  sangat  bervariasi (lebih  dari  150 spesies)  dengan  aktifitas  katabolik  yang  berbeda. Mengingat  pentingnya  peranan  bakteri  asam  laktat ini, isolasi telah dilakukan dari berbagai sumber baik baik dari  saluran  pencernaan  manusia  sampai  tanah maupun  sisa-sisa  hasil  pembusukan  tanaman (Boguta et al., 2014).
Pada penelitian ini telah dilakukan isolasi bakteri asam laktat dari usus ayam broiler yang dipotong di Narmada  Kabupaten  Lombok  Barat. Isolasi ini dilakukan  dalam  lingkungan  yang  sesuai  untuk pertumbuhan  bakteri  asam  laktat  (dalam kondisi anaerob menggunakan  media  selektif de  Man Rogosa  Sharpe (MRS), sehingga  didapat aneka bakteri  asam  laktat murni yang  sesuai  dengan harapan. Karakterisasi  selanjutnya  dilakukan  tidak hanya  untuk  mengkonfirmasi  ulang  keberadaan bakteri  asam  laktat  tersebut,  namun  juga  untuk melihat kemampuan bakteri tersebut dalam
menghambat bakteri patogen.

## MATERI DAN METODE
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium Mikrobiologi  dan  Bioteknologi  Fakultas  Peternakan Universitas  Mataram.  Penelitian  ini  menggunakan usus  halus  ayam broiler strain  Arbor  Acres  yang diperoleh dari  pedagang  ayam  potong di  Pasar Narmada Kabupaten Lombok Barat dengan umur 35 hari  sebanyak 6 ekor. Media  kultur  yang  digunakan adalah  media  selektif  (MRS  Agar  dan  Broth)  dan media Mueller Hinton Agar (MHA).

## Isolasi bakteri asam laktat
Usus halus ayam broiler dipotong sepanjang 2 cm dan  sebanyak  1  gram  feses  yang  terdapat  di  dalam potongan  usus  halus tersebut  dilarutkan  dalam  9  ml NaCl  fisiologis untuk  mendapatkan  pengenceran dengan  konsentrasi  1x10 -1 .  Homogenisasi  dilakukan menggunakan  vortex  untuk  kemudian  diambil sebanyak  100  µL dan  ditambahkan  dengan 900  µl NaCl  fisiologis untuk  mendapatkan  pengenceran dengan  konsentrasi  1x10 -2 .  Pengenceran  terus dilakukan  secara  berseri  sampai mendapatkan konsentrasi  1x10 -10 . Sebanyak 100  µL dari  masing- masing  pengenceran  di  atas dimasukkan  ke dalam petridisk diikuti  dengan  penuangan  media  MRS padat,  kemudian digoyang-goyang  agar  larutan sampel  dan  media  tercampur  rata.  Sampel  tersebut kemudian  didiamkan  pada  suhu  ruang  untuk kemudian dimasukkan ke dalam anaerobic jar yang berisi anaerobic sachet.  Inkubasi  dilakukan    pada suhu 37 0 C selama 2 x 24 jam sampai mendapatkan koloni bakteri yang tumbuh.

## Isolasi koloni dengan bentuk koloni dominan
Koloni tunggal yang tumbuh di media MRS agar diambil  dengan  jarum  ose steril  kemudian digoreskan  pada  media MRS agar baru secara zig- zag dengan  cara  menggerakkan  ujung  ose  ke  arah sisi  kanan  beberapa  kali.  Ujung  ose disteril dan didinginkan  kembali untuk  digunakan  melanjutkan penggoresan  sebelumnya  sampai  selesai. Cawan petri  kemudian  diinkubasi  24  jam dalam  keadaan anaerob pada suhu 37 0 C. Pada akhir masa inkubasi, koloni koloni yang tumbuh pada permukaan medium diperiksa dengan seksama untuk memastikan semua koloni  adalah  homogen. Koloni  yang tumbuh terpisah (koloni yang berbentuk sekumpulan sel dari
satu jenis saja) dikultur untuk selanjutnya dilakukan karakterisasi.
Pengecatan gram Prosedur pengecatan gram atau prosedur pewarnaan yang dilakukan adalah dengan mengikuti metode Dwidjoseputro  (1989)  yaitu  dengan  cara mengambil  biakan  bakteri  dari  stok  dan  kemudian diratakan di atas kaca preparat yang terlebih dahulu telah  ditetesi  dengan  NaCl  fisiologis.  Selanjutnya difiksasi di atas api bunsen untuk kemudian ditetesi dengan  zat  warna  kristal  violet  selama  2  menit. Preparat dibilas dengan air mengalir, ditetesi dengan larutan  iodine  kompleks untuk kemudian  ditunggu selama 1 menit. Preparat dibilas kembali dengan air mengalir  agar  zat  warna  meresap  pada  bakteri. Preparat  ditetesi  alkohol dan  ditunggu  selama  15 detik yang  dilanjutkan  dengan  pembilasan  kembali menggunakan air. Preparat ditetesi dengan zat warna safranin, ditunggu selama 1 menit, kemudian dibilas dengan air mengalir. Preparat kemudian dikeringkan dan  kemudian  diperiksa  dibawah  mikroskop pembesaran 100x setelah ditetesi minyak imersi.

## Uji katalase
Uji ini dilakukan dengan cara pertama-tama dibuat  ulasan  bakteri  pada  gelas  objek  kemudian ditambahkan  2-3  tetes  reagen  H 2 O 2 di atas preparat hingga  menutupi  permukaan  preparat. Perubahan yang  terjadi diamati di bawah  mikroskop. Hasil dikatakan positif  jika  terbentuk  gelembung  gas, demikian juga sebaliknya.

## Uji gula
Uji  ini  dilakukan  dengan  cara  mengambil isolat  bakteri    dari  stok  sebanyak  1  ose  kemudian diinokulasikan  kedalam  media  yang    mengandung glukosa,  laktosa,  sukrosa,  manitol,  dan  maltosa dengan  cara dimasukkan    ke dalam  media  tersebut. Inkubasi dilakukan pada temperatur 37 o C selama 2x 24  jam  dan  perubahan  warna  yang terjadi diamati secara  seksama.  Perubahan  warna  medium  menjadi kuning menandakan asam, warna merah menandakan  medium  menjadi  basa,  warna  hitam menandakan  terbentuknya H 2 S dan  jika  medium terangkat  menandakan  bahawa  mikroba  tersebut mampu menghasilkan gas.

## Uji daya hambat terhadap bakteri patogen
Uji  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  isolat bakteri  yang  berpotensi  sebagai  bakteri  probiotik penghasil  bakteriosin. Pengujian  terhadap  aktivitas daya  hambat  terhadap  mikroba  patogen (E.coli) dilakukan dengan  cara  meratakan  100 µL bakteri patogen (0,5  Mcparland) pada  media  MHA  dengan menggunakan  sprider.  Kemudian  dibuat  sumuran pada  media  MHA  yang  telah  ditumbuhi  bakteri patogen tersebut. Sebanyak 50 µL supernatan bakteri yang  telah  dinetralkan  pHnya  dimasukkan    pada masing-masing  sumuran  yang  telah  dibuat.  Sebagai kontrol positif telah digunakan antibiotik (50 µg/mL ampisillin). Aktifitas  antimikroba dapat  dilihat melalui  terbentuknya zona  bening  di sekitar sumuran.
Analisis data
Data yang diperoleh kemudian dianalisis menggunakan analisa  deskriptif, yaitu  dengan  cara memvisualisasikan  hasil  penelitian menggunakan gambar  dan tabel.  Hasil  visualisasi  tersebut kemudian dibandingkan dan dijelaskan. Besarnya aktifitas  antimikroba  ditentukan  dengan  melihat zona bening yang terbentuk di sekitar sumuran serta mengukur diameter zona tersebut dengan menggunakan jangka sorong.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi bakteri asam laktat dari usus ayam broiler
Isolasi ini dimulai dengan mengencerkan sampel berupa  isi  usus  dari  ayam  broiler  dengan pengenceran 10 1 sampai 10 10 yang  bertujuan  agar bakteri  yang  tumbuh  pada media  MRSA  yang  telah disediakan  tidak  terlalu  padat. Penggunaan  media MRS dengan kondisi anaerob akan dapat menyaring dan mencegah tumbuhnya bakteri lain selain bakteri asam  laktat. Setelah  diinkubasi  pada  suhu  37 0 C selam  2x24  jam  dalam  kondisi anaerob, tampak adanya  pertumbuhan  koloni  bakteri  pada  sampel nomor  1,  2,  dan  3  yang  masing-masing  merupakan hasil  pengenceran  10 -1 ,  10 -2 ,  dan  10 -3 .  Namun, jumlah koloni yang tumbuh pada petri nomor 1 dan 2  sangat  padat dan  banyak  yang  masih  menempel, sehingga  tidak dipergunakan  untuk  isolasi. Lain halnya  dengan  jumlah  koloni  bakteri  asam  laktat yang  tumbuh  pada  petri  nomor  3,  walaupun  cukup padat  namun semua  koloni  hampir  semua  terpisah. Pertumbuhan  bakteri  asam  laktat  tidak  ditemukan
Nurbaiti, Anwar Rosyidi,, Muhamad Ali ( Skrening Bakteri Asam Laktat……….. )
pada  petri  nomer  4-10,  yang  menunjukkan  bahwa bakteri  asam  laktat  tidak  ada  pada  jumlah pengenceran 10 -4 -10 -10 .
Hasil  penelitian ini menunjukkan  jumlah  bakteri asam laktat pada usus ayam broiler jauh lebih rendah dibandingkan dengan hasil penelitian yang dilakukan  oleh  Smith  (1965) maupun  hasil penelitian Abrar  dan  Raudhati  (2006).  Total  bakteri asam  laktat  yang  tumbuh  pada  saluran  pencernaan ayam pada masing-masing hasil  penelitian  di  atas adalah berturut-turut 8,2 x 10 10 cfu/mL dan 2,1 x 10 7 cfu/mL.  Perbedaan jumlah tersebut  diperkirakan karena  adanya perbedaan  umur  ayam  yang digunakan, pakan yang diberikan, kondisi kekebalan
(imunitas),  maupun  pemberian feed  additive pada ayam.

## Karakteristik isolat bakteri asam laktat
Karakterisasi pertama  yang  dilakukan  adalah berdasarkan penampakan luar (fenotip) bakteri yang diperoleh  dari  pengamatan  baik  menggunakan  mata telanjang maupun  menggunakan mikroskop. Bentuk koloni  bakteri  yang  tumbuh  pun  bermacam-macam dan  dengan  ukuran  yang  berbeda-beda  pula. Secara detail,  hasil  karakterisasi  isolat bakteri  asam  laktat yang  berhasil  diisolasi  dari  usus  ayam  broiler ditampilkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil karakterisasi isolat bakteri asam laktat yang berhasil diisolasi dari usus ayam broiler
Karakterisasi Isolat 1 2 3 4 Morfologi - Bentuk koloni Bulat (dari atas) Oval (seperti wijen) Oval (seperti wijen) Bundar datar - Bentuk pinggir Halus Halus Halus Halus - Bentuk penonjolan Timbul Timbul Timbul Datar - Warna koloni Putih Kuning Telur Kuning Telur Putih Pewarnaan gram dan pengamatan mikroskopis Warna merah (-) Warna merah (-) Warna merah (-) Warna merah (-) Batang (bacil) Batang (bacil) Batang (bacil) Batang (bacil) Uji katalase - - - - Uji gula-gula - Glukosa + - - - - Laktosa + - - - - Sukrosa + - - - - Maltosa - - - - - Manitol - - - - Keterangan: 1 – 4 = isolat bakteri asam laktat
Ke-4  isolat  bakteri  asam  laktat  yang  berhasil diisolasi  pada  penelitian  ini  memiliki  tiga  bentuk koloni,    yaitu  bulat,  oval,  dan  bundar  datar. Semua isolat tersebut memiliki bentuk pinggir yang halus, 3 isolat memiliki bentuk permukaan timbul (menonjol), dan  satu  isolat  berbentuk  datar.  Dilihat  dari  warna koloni, tiga isolat  berwarna  putih  dan  satu  isolat berwarna kuning telur.
Hasil  uji  katalase  menunjukkan  bahwa  semua bakteri  asam  laktat yang  berhasil  diisolasi negatif katalase,  yang  artinya  bakteri-bakteri  tersebut  tidak menghasilkan  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )  yang ditunjukkan  oleh  tidak  adanya  gelembung  pada reaksi.  Hasil  penelitian  ini  sesuai  dengan  kriteria
bakteri  asam  laktat  yang  menunjukkan  katalase negatif (Khedida et al., 2009).
Berdasarkan  uji  pewarnaan  gram,  semua  isolat berwarna  merah  yang  menunjukkan  bahwa  sel-sel bakteri tidak dapat menahan warna kristal violet dan safranin setelah  pencucian  dengan  alkohol  95% akibat dinding selnya yang tipis. Ciri ini merupakan ciri dari bakteri gram negatif. Hal sebaliknya terjadi pada  bakteri  gram  positif,  dimana sel-sel bakteri tebal dan mengandung peptidoglikan sehingga tidak dapat  melepaskan  warna  dan  akan  tetap  berwarna seperti warna kristal violet yaitu biru-ungu.
Nurbaiti, Anwar Rosyidi,, Muhamad Ali ( Skrening Bakteri Asam Laktat……….. )

## Uji aktivitas anti bakteri
Uji  aktivitas antibakteri ini  dapat  dilakukan dengan  mengamati  daya  hambat (zona  bening) bakteri  terhadap  tumbuhnya  bakteri  patogen  yang dalam  hal  ini  digunakan bakteri E.  coli.  Hasil  uji menunjukkan  bahwa  isolat  bakteri  asam  laktat  yang
diisolasi  dari  usus  ayam  broiler  tidak  mampu menghambat  bakteri E.  coli yang  ditumbuhkan dengan konsentrasi 0.5 Mcparland.
Ketika konsentrasi bakteri direduksi menjadi 0.12
Mcparland,  bakteri  asam  laktat  tersebut  terlihat memiliki aktifitas antibakteri (Gambar 1).
Gambar  1. Hasil  uji  aktifitas  antibakteri  bakteri  asam  laktat  yang  berhasil  diisolasi. No. 1  dan  2  kontrol  positif (menggunakan Enterococcus faecium), no. 3 isolat 38, no. 4 isolat 41(1), no. 5 isolat 41(2), no. 6 isolat 41(3),  no. 8  dan  9  kontrol  negatif  (air  steril),  dan no. 7 kontrol  positif (menggunakan  50  µg/ml ampisilin).
Adanya zona bening pada isolat no. 3, 4, 5, dan 6 berukuran  sama  dengan  ukuran  zona  bening  yang terbentuk  pada  isolat  no. 1  dan  2  menggunakan Enterococcus faecium yang telah terbukti
menghasilkan bakteriosin. Namun, aktifitas antibakteri  tersebut  jauh  lebih  rendah  dibandingkan dengan  pengunaan  antibiotik  ampisilin  dengan konsentrasi  50  µg/mL (no.  7).  Pengukuran  ukuran zona  bening yang  terbentuk  akibat  aktifitas antibakteri  bakteri  asam  laktat  tidak  dilakukan karena  berukuran  kecil. Aktifitas  antibakteri isolat- isolat  yang  berhasil  diisolasi  ini  lebih  rendah dibandingkan  dengan  bakteri  asam  laktat  yang berhasil  diisolasi  oleh  Sari et  al.  (2013)  yang  juga diperoleh dari usus ayam broiler. Adanya kemampuan  antibakteri  dari  bakteri-bakteri  tersebut menjadi  indikasi  bahwa  bakteri-bakteri  asam  laktat
yang  berhasil  tersebut  dapat  digunakan  sebagai probiotik untuk unggas.

## SIMPULAN
Bakteri  asam laktat telah  berhasil  diisolasi dari usus  ayam broiler  yang  dipotong  di  Pasar  Narmada Kabupaten  Lombok  Barat.  Semua  bakteri asam laktat  tersebut diduga  termasuk jenis Lactobasillus sp. Bakteri-bakteri  asam  laktat  tersebut  mampu membuat zona bening pada media yang ditumbuhkan dengan bakteri E. coli yang menunjukkan bahwa  bakteri-bakteri tersebut  dapat menghasilkan senyawa  antibakteri yang  efektif menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen E.  coli. Adanya kemampuan tersebut dapat menjadi indikasi bahwa  bakteri-bakteri  asam  laktat  yang  berhasil tersebut  dapat  digunakan  sebagai  probiotik  untuk unggas.
3 4 5 7 2 1 9 8 6
Nurbaiti, Anwar Rosyidi,, Muhamad Ali ( Skrening Bakteri Asam Laktat……….. )

## DAFTAR PUSTAKA
Abrar, A. dan E. Raudhati, 2006.  Produktifitas  dan aktifitas  mikroba  saluran  pencernaan  ayam broiler  yang  diberi  probiotik.  Penelitian  DIK-S. Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya.
Abun, 2008. Hubungan Mikroflora Dengan Metabolisme  Dalam  saluran  Pencernaan  Unggas dan  Monogastrik. Laporan  Penelitian. Fakultas
Peternakan. Universitas Padjajaran.
Andajani, R. 1997. Peran probiotik dalam
meningkatkan produksi unggas. Poultry
Indonesia, 26:19-20
Ashayerizadeh,  A., N.  Dabiri, O.  Ashayerizadeh,
K.H. Mirzadeh, H. Roshanfekr and M. Mamooee.
2009. Effect  of  dietary  antibiotic,  probiotic  and prebiotic  as  growth  promoters,  on  growth performance, carcass characteristics and hematological  indices  of  broiler  chickens. Pakistan  Journal of Biological Science. 12:  52-
57.
Boguta, A.M., Bringel, F., Martinussen, J., and P.R.
Jensen. 2014. Screening of lactic acid bacteria for their  potential  as  microbial  cell  factories  for bioconversion of lignocellulosic feedstock. Microbial Cell Factories, 13: 97.
Cole,  D.J.A.  1991.  The  role  of  the  nutritionist  in designing feed for the future in feed industry. T.P.
Lyons  (ed).  P roceeding  of  Altech’s.  Seventh
Annual Symposium. Altech Technical Publication. Nicholasville Kentucky:1-2.
Dwidjoseputro,  1989.  Dasar-Dasar  Mikrobiologi, Djambatan, Jakarta.
Ehrmann, M.A., P. Kurzak, J. Bauer and R.F. Vogel, 2002. Characterization  of  lactobacilli  towards their use as probiotic adjuncts in poultry. Journal of Applied Microbiology, 92: 966 – 975.
Fiol, F.D.S.D., A. Cristina, M. Tardelli, F.C.C
Marciano, M.C. Marques and  L.L. Sant'Ana.
2014. Obesity  and  the  use of  antibiotics  and probiotics  in  rats.  Experimental  Chemotherapy.
60:162 – 167.
Fuller,  R.  1992  .  History  and  Development  of Probiotics.  In:  Probiotics,  the  Scientific  Basis. Ed. London. 1-8.
Gordon, R.F.,  and  Jordan, F.T.W. 1982.  Poultry
Diseases.  2 nd Edition.  The  English  Language
Book Society, London.
Khedida, K., M. Faidc, A. Mokhtarib, A. Soulaymanib, and A. Zinedine. 2009.
Characterization  of  lactic  acid  bacteria  isolated from  the  one  humped  camel  milk  produced  in Morocco. Microbiological Research, 164; 81-91. Koenen, M. E., Kramer, J., van der Hulst, R., Heres, L., Jeurissen, S.H.M., and W.J.A. Oersma, 2004. Immunomodulation  by probiotic  lactobacilli  in layer- and  meat-type  chickens.  British Poultry. Science. 45:355 – 366. Mikulski, D.,  Jankowski, J.,  Naczmanski, J.,
Mikulska, M., and V. Demey. 2012.  Effects  of dietary  probiotic (Pediococcus  acidilactici) supplementation on performance, nutrient digestibility, egg traits, egg yolk cholesterol, and fatty acid profile in laying hens. Poultry Science, 91: 2691-2700.
Salminen, S., and Wright, A.V.  1998.  Lactic  Acid Bacteria:  Microbiology  and  Functional Aspects.
2 nd Ed. New York: Marcel Dekker, Inc. Sari, M.L., Abrar, A., dan Merint. 2013. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam  laktat pada usus ayam broiler. Agripet: 1: 43-48.
Smith, H.W.  1965.  Observations  on  the  flora  of  the alimentary  tract  of  animals  and  factors  affecting its  composition. Journal  of  Pathology  and Bacteriology. 89:95-122.
Tamimi, A.Y.  2005.  Probiotic  Dairy  Products. Society of Dairy Technology, Blackwell Publishing. United Kingdom.
Toms, C., and F. Powrie. 2001. Control of intestinal inflammation by regulatory T cells. Microbes and Infection. 3:929 – 935.
Zhang, H.H., Cao, Y.C., Bi, Y.Z., Hu, W.F., and X.
Fang. 2003. The effects of heat-killed Lactobacillus preparation  on  the  immunity  of broiler chickens. Veterinary Medicine. 35:14 – 15.
(In Chinese, abstract in English).
Ziemer,  C.J  and. G.R. Gibson.  1998.  A  review  of probiotic,  prebiotic  and symbiotic in  the functional  food  concept: prospective and  future strategies. International Dairy Journal 8:473-479.