## IDENTIFIKASI SECARA BIOMOLEKULER BAKTERI RESISTEN ANTIBIOTIK CEFIXIME DARI INDIVIDU PENGGUNA TUMPATAN GIGI AMALGAM
Ni Made Okayanti 1) , Fatimawali 1) , Trina E. Tallei 2)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
2) Jurusan Biologi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Amalgam  is  a  dental  fillings  which  containing  mercury  (Hg 2+ ).  The  presence  of  mercury  in amalgam  can  induce  the  growth  of  mercury  resistant  bacteria  and  affect  bacterial  resistance  to antibiotics, so that there may be a negative impact on urinary tract infection treatment (UTI) which can  lead  to  the  medication  failure.  The  objective  of  the  study  was  to  identify  mercury-resistant bacteria  and  antibiotic-resistant  bacteria  in  amalgam  dental  users.  This  research  is  descriptive explorative.  The  urine  sample  taken  from  1  participant  of  amalgam  fillings  user  and  1  participant who did not use amalgam fillings. The isolate bacteria were identified using morphology, phisiology and  biochemistry  tests  and  also  test  of  antibiotic  resistance  againts  Cefixime.  Isolates  of  mercury resistant bacteria and antibiotic-resistant bacteria were identified bio molecularly with the 16S rRNA gene.  The  test  results  showed  2  bacterial  isolates  resistant  to  all  test  antibiotics.    The  isolates  of antibiotic-resistant  bacteria  were  tested  in  biomolecular  identification  and  identified  as  Klebsiella pneumoniae.
Keywords  : Amalgam,  urine,  antibiotic  resistant  bacteria,  Cefixime,  16S  rRNA  gene,  Klebsiella pneumoniae.

## ABSTRAK
Amalgam  merupakan  tumpatan  gigi  yang  mengandung  merkuri  (Hg 2+) ).  Adanya  merkuri dalam amalgam dapat menginduksi tumbuhnya bakteri resisten merkuri dan mempengaruhi resistensi bakteri  terhadap  antibiotik,  sehingga  dapat  timbul  dampak  negatif  bagi  pengobatan  infeksi  saluran kemih  (ISK)  yang  berupa  terjadinya  kegagalan  pengobatan.  Tujuan  penelitian  adalah  untuk mengidentifikasi  bakteri  resisten  merkuri  dan  resisten  antibiotik  pada  pengguna  tumpatan  gigi amalgam.  Penelitian ini bersifat deskriptif eksploratif. Sampel urin berasal dari 1 partisipan pengguna tumpatan  gigi  amalgam  dan  1  partisipan  yang  tidak  menggunakan  tumpatan  gigi  amalgam.  Isolat bakteri yang diperoleh diidentifikasi dengan uji morfologi, fisiologi dan biokimia selain itu dilakukan juga  uji  resistensi  antibiotik  ciprofloxacin,  cefixime  dan  amoxicilin.  Isolat  bakteri  resisten  bakteri resisten antibiotik diidentifikasi secara biomolekuler dengan gen 16S rRNA. Hasil uji menunjukkan 2 isolat  bakteri  resisten  semua  antibiotik  uji.  Isolat  bakteri  tersebut  di  identifikasi  biomolekuler  dan teridentifikasi sebagai bakteri Klebsiella pneumoniae.
Kata  kunci :  Amalgam,  urin,  bakteri  resisten  antibiotik,  Cefixime,  gen  16S  rRNA, Klebsiella pneumoniae

## PENDAHULUAN
Amalgam  merupakan  campuran logam  yang  terdiri  atas  45-55%  logam merkuri,  sekitar  30%  perak  dan  sisanya yaitu  tembaga,  timah  dan  seng  (WHO, 2005). Penambalan gigi dengan menggunakan  tumpatan    amalgam  telah dilakukan  sejak  lebih  dari  160  tahun  yang lalu.  Sampai  sekarang  amalgam  masih digunakan oleh dokter gigi karena merupakan  bahan  tumpatan  yang  kuat, tahan  lama,  harganya  murah,  dapat beradaptasi  dengan  baik  dengan  cairan mulut dan pengerjaannya hanya dalam satu kali kunjungan ( Ranthore et al., 2012).
Adanya merkuri di dalam tumpatan amalgam membuat penambalan gigi berlubang  ini  sangat  banyak  diteliti, mengingat  efek  toksik  dari  merkuri. Menurut  (Silver  and  Phung,  2005)  dalam Fatimawali  (2013),  bakteri  yang  resisten terhadap  merkuri  mempunyai  kemampuan untuk  menurunkan  toksisitas  atau  dapat mendetoksifikasi merkuri melalui mekanisme  enzimatis.  Bakteri  ini  mampu untuk  mereduksi  ion  Hg 2+ menjadi  Hg 0 karena menghasilkan enzim merkuri reduktase. Hal ini diperkuat oleh penelitian Fatimawali (2013) yang mendapati adanya 3  isolat  bakteri  resisten  merkuri  dari  urin pasien di Puskesmas Bahu yang menggunakan  tumpatan  amalgam.  Ketiga isolat  bakteri  tersebut  dapat  menurunkan 100%  kadar  merkuri  dalam  media  kaldu nutrien.
Detoksifikasi  merkuri  oleh  bakteri resisten  merkuri  terjadi  karena  bakteri tersebut  memiliki  gen mer  operon (Dash and  Das  2012).  Apabila  bakteri  flora normal  di  urin  yang  resisten  Hg  juga resisten  terhadap  antibiotik,  maka  akan timbul  dampak  negatif  bagi  pengobatan infeksi  saluran kemih (ISK) pada individu
dengan  kondisi  tersebut,  yang  berupa terjadinya kegagalan pengobatan.
Dengan berkembangnya identifikasi  mikroorganisme  maka  saat  ini identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan metode berbasis molekuler dengan menggunakan  gen  16S  rRNA.  Identifikasi menggunakan  analisis  sekuens  gen  16S rRNA  dinilai  memberikan  hasil  yang sangat  akurat  dan  dapat  dijadikan  sebagai metode  diagnosis  dalam  aplikasi  klinis. Analisis  ini  dapat  menjawab  berbagai permasalahan  yang  berkaitan  dengan identifikasi berbasis mikrobiologi konvensional,  di  antaranya  yaitu    dapat digunakan  pada  mikroorganisme  yang tidak dapat dikultur serta menunjukan hasil yang  dapat  digolongkan  pada  genus  atau spesies  tertentu  yang  secara  fenotipik membingungkan atau belum pernah ditemukan  sebelumnya  (Clarridge,  2004; Kattar et al ., 2000)
Berdasarkan  latar  belakang  di  atas maka  perlu  dilakukan  penelitian  untuk mengetahui  resistensi  bakteri  pada  urin individu dengan tumpatan amalgam terhadap antibiotik. Antibiotik yang dipilih yaitu  Cefixime.  Pemilihan  antibiotik  ini berkaitan  dengan  penggunaannya  dalam pengobatan penyakit ISK. Selain itu, untuk mengetahui spesies bakteri resisten antibiotik tersebut, maka dilakukan analisis secara biokimiawi maupun molekuler terhadap gen 16S rRNA.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian  dilakukan  pada  bulan November 2016 sampai dengan September 2017,  di Laboratorium Mikrobiologi Program  Studi  Farmasi  dan  Laboratorium Mikrobiologi dan Genetika Jurusan
Biologi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam.
Jenis Penelitian dan Pengambilan

## Sampel
Metode  yang  digunakan  adalah metode deskriptif eksploratif. Sampel yang digunakan  adalah  bakteri dari  urin partisipan yang telah bersedia. Satu sampel diambil dari urin partisipan yang memiliki tumpatan  amalgam  dan  satu  sampel  urin lainnya  diambil  dari  partisipan  yang  tidak memiliki  tumpatan  amalgam.  Sampel bakteri diisolasi pada media nutrient agar . Sampel tersebut dimurnikan dan diidentifikasi  secara  morfologi,  fisiologi dan biokimia kemudian  diuji  resistensinya terhadap antibiotik Cefixime.

## Alat
Alat  dan  bahan  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  yaitu  Erlenmeyer ( Pyrex ),  gelas  ukur  ( Pyrex ),  gelas  kimia ( Pyrex ),  tabung  reaksi,  rak  tabung  reaksi,
pipet tetes, pipet mikro (CAPP), timbangan  analitik  ( aeADAM ® ),  batang pengaduk, cawan petri ( Pyrex ), jarum Öse, pinset,  inkubator  ( Incucell ), laminar  air flow (Biotek), autoklaf  (ALP),  mikroskop ( Olympus ), L-Glass, penggaris  berskala ( COMBO ® ), kertas label, plastik pembungkus, aluminium  foil ,  kapas,  kasa, seperangkat  alat  PCR  ( Biometra  T- Personal )  dan  elektroforesis  ( Biometra  T- Personal ), alat fotografi.
Bahan
Sampel  urin  dari  partisipan  yang bersedia,  akuades,  alkohol,  NaCl, yeast ekstrak,  trypton,  safranin,  kristal  violet, agar  bakteriologi, nutrient  agar  (NA) , nutrient  broth  (NB) , Simmo’s  Citrate Agar , triple  sugar  iron  agar  (TSIA) , lysin iron  agar  (LIA).  A lkohol  70%,  cakram antibiotik  Cefixime.  Kit  isolasi  DNA bakteri  (Geneaid),  primer  set  untuk  16S rRNA bakteri, MyTaq  HS Red Mix untuk amplifikasi  DNA  (Bioline),  ddH 2 O,  gel
agarosa,  1x  TAE  buffer,  loading  dye  dan etidium bromida.
Identifikasi  Bakteri  Secara  Morfologi, Fisiologi dan Biokimia
Identifikasi morfologi bakteri dilakukan dengan pewarnaan Gram, fisiologi bakteri diuji dengan uji motilitas, sedangkan  biokimia  bakteri  diuji  dengan uji  H 2 S,  katalase,  indol, citrat ,  fermentasi karbohidrat dan uji dekarboksilasi lisin.

## Uji Resistensi Terhadap Cefixime
Pengujian resistensi antibiotik dilakukan  dengan  beberapa  tahap  yaitu pembuatan  larutan Mc Farland,  suspensi bakteri  uji,  penanaman  cakram  serta pengukuran dan penetapan zona hambat.

## Isolasi DNA Genomik
Isolasi DNA Genomik dari kultur bakteri dilakukan dengan metode Genomic DNA Mini Kit (Geneaid). Sampel kultur bakteri dibiakan terlebih dahulu pada media LB ( lysogeny broth ) cair.
Amplifikasi  gen  16S  rRNA  dengan Teknik PCR
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan  mesin  PCR combi  block ( whatman  biometra  Germany ).  Primer yang  digunakan  untuk  proses  PCR  yaitu pasangan  primer  universal  bact  F1  ( forward )  dan  uni  B1  ( riverse ).  Cetakan yang digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA  yaitu  DNA  genomik  bakteri  yang telah diisolasi.

## Elektroforesis dan Visualisasi
DNA yang telah diamplifikasi kemudian diseparasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Gel direndam dalam campuran larutan TBE buffer dan etidium bromida. Visualisasi dilakukan dengan sinar UV pada UV-transiluminator.

## Sekuensing gen 16S rRNA
Sekuensing dilakukan untuk menentukan urutan nukleotida pada fragmen  DNA  yang  terdeteksi  dari  hasil
visualisasi DNA yang teramplifikasi dalam proses PCR menggunakan mesin
sekuensing
DNA otomatis. Proses sekuensing  dilakukan  dengan  mengirim data  diatas  ke  1 st BASE  Malaysia.  Hasil sekuensing  DNA  dianalisis  menggunakan metode  BLAST  melalui  media  Online NCBI,  untuk  mencari  kesamaan  urutan nukleotida gen 16S rRNA dalam menentukan spesies bakteri resisten antibiotik Cefixime.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri dari Urin
Sampel  urin  diisolasi  dari  2  orang partisipan usia dewasa yang bersedia. Satu orang  partisipan  menggunakan  tumpatan gigi  amalgam  dan  satu  orang  partisipan lainnya  tidak  menggunakan  tumpatan amalgam.  Partisipan  diminta  menampung urin porsi tengah pada pagi hari, dalam pot salep.  Urin  dari  partisipan  yang  berbeda diencerkan  sebanyak  7x  agar  supaya bakteri yang dihasilkan tidak terlalu pekat. Masing-masing suspensi bakteri diinokulasi  ke  dalam  media nutrient  agar (NA) plate untuk  menumbuhkan  bakteri yang  akan  digunakan  untuk  pengujian. Selanjutnya  dilakukan  pemurnian  dengan menginokulasi  bakteri  yang  tumbuh  pada media  NA  dengan  cara  digores  zig-zag pada  media    NA  yang  lain.  Hal  ini dilakukan  untuk  memisakan  bakteri- bakteri  agar  mendapatkan  isolat  bakteri yang murni.
Dari hasil pemurnian ini didapatkan 19 isolat  bakteri.  Kode isolat  - 1, -2, -3, -4, -5, -6, -8, -9, -10 untuk isolat bakteri  yang  berasal  dari  urin  partisipan yang tidak menggunakan tumpatan amalgam.  Kode  isolat  +1,  +2,  +3,  +4,  +5, +6,  +7,  +8,  +9,  +10  untuk  isolat    bakteri yang  berasal  dari  urin  partisipan  yang menggunakan tumpatan amalgam.
Setelah dilakukan pemurniaan, bakteri  yang  tumbuh  diinokulasi  kembali ke  media  NA  miring  untuk  dijadikan kultur  stok.    Isolat  bakteri  tersebut diregenerasi setiap 2 minggu sekali dengan cara  yang  sama  agar  supaya  bakteri  yang diinginkan tetap hidup.

## Uji Morfologi dan Fisiologi
Tabel 1. Hasil Pengujian Morfologi dan
Fisiologi No Uji Morfologi (Pewarnaan Gram) Uji Fisiologi (Motilitas) Bentuk Gram -1 Basil - + (weak) -2 Basil - + (weak) -3 Kokus + - -4 Basil - - -5 Kokus + - -6 Basil - - -8 Basil + + (weak) -9 Basil - - -10 Basil + + (weak) +1 Basil - + +2 Kokus + - +3 Basil - + +4 Basil - + +5 Basil - - +6 Kokus - + (weak) +7 Kokus + - +8 Kokus + - +9 Kokus + - +10 Kokus - - Ket : Kode  isolat  bakteri  dari  urin  partisipan tanpa amalgam : -1,-2,-3,-4,-5,-6,-8,-9,10
Kode isolat bakteri dari urin partisipan dengan amalgam : 1, +2, +3, +4, +5, +6, +7, +8,+9,+10
Pewarnaan  Gram  digunakan  untuk mengetahui  morfologi  sel  bakteri  serta untuk  membedakan  bakteri  Gram  positif dan  Gram  negatif  (Rostinawati,  2008). Bentuk  bakteri  ada  3  diantaranya  yaitu
bulat (kokus), batang (basil) dan lengkung atau koma (spiral) (Harti, 2012), sementara
pada penelitian ini hanya ditemukan isolat bakteri berbentuk kokus dan basil. Uji Biokimia Tabel 2. Hasil Pengujian Biokimia Uji Biokimia Kode Isolat Kata- lase Indol Fermentasi Karbohidrat H 2 S Sitrat Dekarboksi- lasi Lysin Glukosa Laktosa/ Sukrosa Gas -1 + - + + + + + - -2 + - + + + + + - -3 + - + + + - + - -4 + - + - - + + - -5 + - + - - - + - -6 + - + + + - + - -8 + - + + - - + - -9 + - + + + - + - -10 + - + - - - + - +1 + - + + + + + - +2 + - + + + - + - +3 + + + + + - + - +4 + + + + + - + - +5 + (weak) - + +
+ + (weak) + - +6 - - + - - + + - +7 + - + + + - + - +8 + - + + + + + - +9 + - + + + + + - +10 + - + - - + (weak) + -
Ket : Kode isolat bakteri dari urin partisipan -amalgam :  -1,-2,-3,-4,-5,-6,-8,-9,-10. Kode isolat bakteri dari urin partisipan +amalgam : +1, +2, +3, +4, +5, +6, +7, +8, +9, +10

## Hasil Identifikasi
Semua  data  yang  diperoleh  mulai dari  uji  fisiologi,  uji  biokimia  dan  uji morfologi digabungkan untuk menentukan famili  bakteri  dari  ke-19  isolat  bakteri
tersebut  kemudian  hasil  yang  diperoleh dibandingkan  dengan  buku Bergey’s Manual  Determinative  of  Bacteriology .
Bakteri-bakteri  yang  teridentifikasi  dapat dilihat dalam Tabel 3.
Tabel 3. Hasil Identifikasi Bakter i Kode Bakteri Genus Kode Bakteri Genus -1 Enterobacteriaceae +1 Enterobacteriaceae -2 Enterobacteriaceae +2 Staphylococcaceae
-3 Staphylococcaceae +3 Enterobacteriaceae -4 Enterobacteriaceae +4 Enterobacteriaceae -5 Staphylococcaceae +5 Enterobacteriaceae -6 Enterobacteriaceae +6 Veilonellaceae -8 Corynebacteriaceae +7 Peptostreptococcaceae -9 Enterobacteriaceae +8 Staphylococcaceae -10 Corynebacteriaceae +9 Staphylococcaceae +10 Veilonellaceae Bakteri teridentifikasi hingga tingkat  famili.  Isolat  -1,  -2,  -4,  -6,  -9,  +1, +3,  +4  dan  +5  teridentifikasi  sebagai bakteri  dari  famili  Enterobacteriaceae. Isolat  -3,  -5,  +2,  +8  dan  +9  dari  famili Staphyloccocaceae.  Isolat  -8  dan  -10  dari famili  Corynebacteriaceae,  isolat  +6  dan +10  dari  famili  Veilonellaceae,  sedangkan isolat
+7 dari famili Peptostreptococcaceae. Beberapa  bakteri  yang  termasuk dalam famili Enterobacteriaceae, Staphylococcaceae, Corynebacteriaceae
dan Peptostreptococcaceae
dapat ditemukan  pada  sampel  urin  (Holt et  al., 1994).  Pada  penelitian  ini,  urin  diambil dari partisipan yang sehat dan tidak sedang didiagnosa  mengalami  penyakit  ISK, sehingga  isolat  bakteri  dari  urin  dapat berupa  bakteri  flora  normal  pada  saluran kemih.  Meskipun  demikian,  penelitian- penelitian sebelumnya menemukan adanya isolat  bakteri  penyebab  ISK  dari  urin, tanpa  adanya  gejala  klinis  yang  berarti yang dialami oleh orang tersebut, sehingga bakteri  penyebab  ISK  dapat  pula  diisolasi pada penelitian ini, meskipun urin diambil dari  partisipan  yang  tidak  didiagnosa mengalami ISK.
Bakteri yang dapat diinokulasi dari sampel urin diantaranya yaitu bakteri flora normal  pada  saluran  kemih  dan  bakteri yang  bisa  menjadi  penyebab  ISK,  yaitu bakteri Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus  aureus,  Micrococcus  sp.,
Streptococcus  sp.,  Corinebacterium  sp.,
Propionibacterium
sp.,
Peptostreptococcus  sp.  dan Acinetobacter sp..  Escherichia  coli , Staphylococcus saprophyticus , Klebsiella pneumonia,
Pseudomonas  aeruginosa,  Streptoccocus faecalis, Mycobacterium tuberculosis ,
Proteus spp., Enterobacter spp.,
Moraxella , Acinetobacter, Salmonella, Enterococcus dan Citrobacter (Sukandar et al., 2008,  Jawetz et  al., 2010;  dan  Harti, 2012).
Beberapa jenis bakteri seperti yang disebutkan  di  atas  termasuk  dalam  famili Enterobacteriaceae, Staphylococcaceae, Peptostreptococcaceae dan Corynebacteriaceae. Bakteri Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus dan
Staphylococcus  saprophyticus termasuk dalam  famili  Staphylococcaceae.  Bakteri Escherichia  coli , Klebsiella  pneumonia,
Enterobacter spp., Proteus spp.,
Salmonella dan Citrobacter . Bakteri Peptostreptococcus  sp., termasuk  dalam famili  Peptostreptoccocaceae  dan  bakteri Corinebacterium  sp. termasuk  dalam famili peptostreptoccocaceae.
Uji Resistensi Antibiotik
Uji  resistensi  antibiotik  dilakukan pada media NA dengan dilakukan pengulangan  sebanyak  tiga  kali.  Bakteri dari setiap isolat disuspensikan pada NaCl dan  disesuaikan  kekeruhannya  dengan larutan Mc Farland 0.5 kemudian suspensi
ini  dicampurkan  dengan  media  NA. Setelah  media  padat  cakram  antibiotik Cefixime  ditempatkan  pada  permukaan media,  demikian  juga  dengan  kontrol negatif  berupa  kertas  saring  yang  sudah dicelupkan ke dalam akuades sebelumnya.
Cawan  petri  yang  berisi  cakram  antibiotik
Cefixime dan kontrol negatifnya diinkubasi selama 18 jam. Setelah diinkubasi  diamati  zona  hambat  yang terbentuk. Tabel 5. Hasil Pengujian Resistensi Antibiotik (mm) Kode Bakteri Diameter Zona Bening (mm) Cfx -1 9 -2 10 -3 12 -4 7 -5 7 -6 15 -8 17 -9 8 -10 8 Ket Hasil pengujian resistensi bakteri dari urin partisipan yang tidak menggunakan amalgam Kode Bakteri Diameter Zona Bening (mm) Cfx +1 16 +2 7 +3 7 +4 7 +5 7 +6 8
+7
10 +8 18 +9 7 +10 7 Ket   Hasil pengujian resistensi bakteri dari urin partisipan yang menggunakan amalgam Pengujian resistensi antibiotik dilakukan  sebanyak  tiga  kali.  Nilai  rata- rata  dari  zona  hambat  bakteri  ditunjukkan pada  Tabel  5.  Nilai  ini  kemudian dibandingkan dengan standar zona hambat antibiotik menurut Clinical and Laboratorium  Standart  Institute (CLSI) yang  ditunjukkan  pada  Tabel  6.  Hal  ini dilakukan untuk mengetahui respon bakteri terhadap antibiotik yang dinyatakan dengan suceptible,
intermediate dan resistant. Hasil pengujian resistensi bakteri terhadap antibiotik ditunjukkan  pada  Tabel  7,  persentase banyaknya  bakteri  dengan  hasil  uji suceptible, intermediate dan resistant pada isolat bakteri dari partisipan tanpa amalgam  ditunjukkan  pada  Tabel  8, sedangkan pada isolat bakteri dari partisipan  dengan  tumpatan  gigi  amalgam ditunjukkan  pada  Tabel  9.  Gambaran tingkat  resistensi  antibiotik  ditunjukkan pada grafik 1.
Tabel 6. Standar Diameter Zona Hambat Menurut CLSI Antibiotik S I R Cefixime ≥19 16-18 ≤15 Ket S = Suceptible, I= Intermediate, R= Resistant
Tabel 7. Hasil Pengujian Resistensi Antibiotik Kode Bakteri Resistensi Cfx -1 R -2 R -3 R -4 R -5 R -6 R -8 I -9 R
-10 R Ket : Hasil pengujian resistensi bakteri dari urin partisipan yang tidak menggunakan amalgam Cfx=Cefixime Kode Bakteri Resitensi Cfx +1 I +2 R +3 R +4 R +5 R
+6
R +7
R +8
I +9 R +10 R Ket: Hasil pengujian resistensi bakteri dari urin partisipan yang menggunakan
amalgam
Cfx=Cefixime,
Tabel 8. Persentase Resistensi Antibiotik dari Bakteri pada Urin Partisipan yang Tidak
Menggunakan Amalgam Antibiotik S I R Persentase (%) S I R Cefixime - 1 8 0% 11.1% 88.9% Ket : S = Suceptible, I= Intermediate, R= Resistant
Tabel 9. Persentase Resistensi Antibiotik dari Bakteri pada Urin Partisipan yang
Menggunakan Amalgam Antibiotik S I R Persentase (%) S I R Cefixime - 2 8 0% 20% 80% Ket : S = Suceptible, I= Intermediate, R= Resistant
Menurut  Utami  (2012),  resistensi terjadi  ketika  bakteri  berubah  dalam  satu atau lain hal yang menyebabkan turun atau hilangnya  efektivitas  obat,  senyawa  kimia atau  bahan  lainnya  yang  digunakan  untuk mencegah  atau  mengobati  infeksi.  Hasil pengujian antibiotik menunjukkan
tingginya resistensi bakteri terhadap antibiotik Cefixime.
Resistensi  bakteri  ini  dapat  terjadi karena  beberapa  penyebab.  Palilingan (2015)  dalam  tulisannya  memaparkan penyebab  terjadinya  resistensi,  yaitu:  1) penggunaan  antibiotik  yang  terlalu  sering, tidak  rasional,  tidak  adekuat  dan  tidak didahului  oleh  uji  sensitivitas;  2)  terapi
antibiotik  yang  lama  sehingga  dapat memudahkan timbulnya  kolonisasi  bakteri yang  resisten  antibiotik  akibat  mekanisme selective  pressure ;  dan  3)  perawatan  inap yang  cukup  lama  sehingga  meningkatkan resiko  untuk  terinfeksi  strain  bakteri resisten.
Identifikasi  Bakteri  dengan  Gen  16S rRNA
Untuk mengidentifikasi bakteri dengan menggunakan gen 16S rRNA yang pertama dilakukan ialah mengekstraksi RNA  bakteri  dengan  metode Genomic DNA  Mini  Kit (Geneaid)  yang  telah dimodifikasi.  Isolat  yang  dipilih  untuk dilakukan  ekstraksi  RNA  ialah  isolat  -6 dan -9.
Selanjutnya  untuk  mengamplifikasi RNA  maka  dilakukan  PCR  ( Polimerase Chain Reaction ). Pada tahap ini, dilakukan perbanyakan  (amplifikasi)  RNA  pada daerah  tertentu  yang  dibatasi  oleh  primer. Hasilnya  kemudian  digunakan  untuk sekuensing  DNA  (Fatimawali,  2016; Rahayu dan Nugroho, 2015).
RNA yang telah teramplifikasi dielektroforesis  terlebih  dahulu  sebelum dilakukan sekuensing.
Proses
elektroforesis  merupakan  uji  kualitatif untuk  mengukur  konsentrasi  RNA  yang diperoleh.  Berat  molekul  suatu  fragmen RNA dapat diperkirakan dengan membandingkan  laju  migrasinya  dengan laju migrasi fragmen RNA standar (marka
DNA) (Rahayu dan Nugroho, 2015). Pada penelitian  ini  yang  digunakan  ialah  marka berukuran  1  kb.  Hasil  elektroforesis menunjukkan  isolat  bakteri  memiliki kisaran  ukuran  1500  bp,  sesuai  dengan ukuran gen 16S rRNA yang diharapkan.
Sekuensing  bertujuan  dilakukan untuk  menentukan  urutan  nukleotida. Proses  sekuensing  dilakukan  dengan mengirim  data  diatas  ke  1 st BASE Malaysia.  Data  hasil  sekuensing  dibuka dengan  menggunakan  aplikasi Geneious . Aplikasi ini dapat didownload secara gratis diinternet.  Tampilan  pick  kromatogram yang  diperoleh  dari  hasil  sekuensing memperlihatkan  urutan  basa  nukleotida secara  nyata  dari  produk  amplifikasi gen16S  rRNA  yang  telah  dilakukan. Kualitas  kromatogram  diperlihatkan  oleh tingginya  peak  kromatogram.  Semakin tinggi  peak  maka  semakin  baik  kualitas kromatogram.
Urutan  nukleotida  yang  diperoleh kemudian  di- copy untuk  diproses  dengan BLAST  ( Basic  Local  Alignment  Search Tool ) yang diakses secara online melalui : https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi . Hasil  BLAST  menunjukkan  kesamaan urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  isolat yang  diperoleh  dengan  urutan  nukleotida gen  16S  rRNA  bakteri  yang  ada  pada GenBank. Hasil BLAST ditunjukkan pada Tabel 9.
Tabel 9. Spesies Bakteri yang Diperoleh dari Identifikasi dengan Gen 16S rRNA
No  Isolat
Bakteri Deskripsi Spesies
Max. Identity Query Cover 1 -6 Klebsiella pneumoniae 85% 100% 2 -9 Klebsiella pneumoniae 79% 98%
Berdasarkan hasil sekuensing, isolat bakteri  resisten  antibiotik  -6  dan  -9 merupakan  bakteri  yang  sama  yaitu Klebsiella  pneumoniae. Menurut  Holt et al. (1994),  bakteri Klebsiella  pneumoniae biasanya diisolasi dari urin pasien penderita  infeksi  saluran  kemih.  Hasil
identifikasi  ini  sejalan  dengan  hasil  uji morfologi,  fisiologi  dan  biokimia  yang mengarahkan bahwa isolat bakteri -6 dan - 9  adalah  bakteri  anaerob  Gram  negatif yang termasuk dalam famili enterobacteriaceae.

## DAFTAR PUSTAKA
Clarridge, J.E. 2004.  Impact of 16S rRNA
Gene Sequence Analysis for
Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Clin. Microbiol. Rev . 17(4) : 840-62
Dash, HR., and Das S. 2012.
Bioremediation of mercury and the importance  of  bacterial  mer  genes. International  Biodeterioration  & Biodegradation 75 :207-213.
Fatimawali.  2013.  Daya  Reduksi  Merkuri Isolat  Bakteri  yang  Diisolasi  dari Urine  Pasien  Di  Puskesmas  Bahu Manado .  Jurnal  Ilmiah  Farmasi.
2(3) :109-115.
Fatimawali. 2016. Toksikologi: Detoksifikasi Merkuri . Unsrat Press, Manado. Harti, A.S. 2012. Dasar-Dasar
Mikrobiologi Kesehatan . Nuha Medika, Yogyakarta.
Holt,  J.G.,  Krieg,  N.R.  Sneath,  P.H.A.,
Staley,  J.T.  and  William,  S.T. 1994. Bergey’s Manual of Determinative  Bacteriology  9 th .
William and Wilkins, Baltimore
Jawetz,  E.,  Melnick  G.E.  dan  Adelberg,
C.A. 2001. Mikrobiologi
Kedokteran. Edisi ke-1 . Penerjemah:  Bagian  Mikrobiologi Kedokteran  Universitas  Airlangga. Penerbit Salemba Medika, Surabaya Jawetz, E.,  Melnick, G.E.,. and Adelberg, C.A. 2010. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke-25 . Terjemahan Aryandhito Widhi Nugroho. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Kattar,  M.M.,  Chavez,  J.F.,  Limaye,  A.P.,
Rassoulian-Barrett,  S.L.,  Carlson,
L.C.  2000.  Application  of  16S rRNA gene sequencing to identifyBordetella  hinzii  as  the Causative Agent of Fatal Septicemia. J.Clin.  Microbiol . 38 : 789-94
Palilingan, W., Kepel, B. J. dan Fatimawali.  2015.  Uji  Resistensi Bakteri  Pseudomonas  Sp  yang Diisolasi  dari  Plak  Gigi  Terhadap
Merkuri dan Antibiotik Amoksisilin. Jurnal  e-Biomedik
(eBm) . 3(3) : 716-721
Rahayu,  D.A.  dan  Nugroho,  E.  D.2015.
Biologi Molekuler dalam
Perspektif  Konservasi .  Plantaxia, Yogyakarta.
Ranthore,  M.,Singh,  A.,  and  Pant,  V.A.
2012. The Dental Amalgam Toxicity  Fear:  A Myth  or Actualy.
Article. 19(8) :81-8
Rostinawati,  T.  2008. Skrining  dan
Identifikasi Bakteri Penghasil Enzim  Kitinase  dari  Air  Laut  di Perairan  Pantai  Pondok  Bali . Penelitian Mandiri. Fakultas
Farmasi  Universitas  Padjadjaran,
Jatinangor
Silver,  S.,  and  Phung,  L.T.  2005.  A bacterial view of the periodic table: genes  and  proteins  for  toxic inorganic  ions. JInd  Microbiol
Biotechnol. 32(11-12) : 587-605.
Sukandar,  E.Y.,  Andrajati,  R.,  Sigit,  J.I.,
Adnyana,K.,  Setiadi,  A.P.  dan Kusnandar. 2008. ISO Farmakoterapi .  ISFI  Penerbitan,
Jakarta.
WHO. 2005 . Mercury in Health Care [policy paper]. http://www.who.int/water_sanitatio n_health/medicalwaste/mercurypol paper.pdf. [25 September 2016