## UJI TINGKAT KONTAMINASI EKSPLAN
Centella asiatica (L.) Urban (Pegagan) DALAM KULTUR IN VITRO

## MELALUI PERBANDINGAN DUA METODE STERILISASI
Kartika Salam Juarna
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia kartikasalam@gmail.com

## Abstract
Research  has  been  conducted  to  determine  the  effect  of  sterilizer  combination  to  the  contamination  level  of Pegagan’s  (Centella  asiatica  L.  Urban  )  explant.  Lamina  and  petiolus  were  used  as  an  explant.  Sterilizer combination is divided into two groups; Methods 1 (M1) and Methods 2 (M2). M1 consists of 0,5% Tetracycline solution,  0,3%  Bayclean  solution,  0,7%  Dithane  suspension,  0,3%  Tetracycline  solution,  and  aquadest. Meanwhile, M2 consists of Dettol solution, alkohol 70%, 20% Bayclean solution, 0,3% Dithane suspension, and Aquadest.  The  difference  of  both  methods  were  on  the  presences  of  antibiotics  (Tetracycline)  in  M1  and desinfectans  (Bayclean)  in  M2.  Research  shows  that  lamina  sterilized  by  M2  has  less  contamination  than  M1, although  the  petiolus  show  the  same  level  of  contamination.  It  is  believed  to  be  related  to  the  structure  that makes lamina contaminated easily.
Keywords : Centella asiatica (L.) Urban, In Vitro Culture, Sterilization Methods

## PENDAHULUAN
Penggunaan tumbuhan sebagai tanaman  obat  telah  meluas  secara  global dan  mendapat  perhatian  dari  masyarakat. Tumbuhan  dapat  dikategorikan  sebagai tanaman  obat  apabila  tumbuhan  tersebut digunakan dalam pengobatan serta memiliki  senyawa  aktif  yang  berkhasiat sebagai  obat  dan  dapat  digunakan  untuk mencegah  atau  mengobati  suatu  penyakit (Hassan, 2012). Tumbuhan yang dimanfaatkan  sebagai  tanaman  obat  di hutan tropis Indonesia diperkirakan sebanyak  7.500  jenis  dari  30.000  jenis tumbuhan  yang  ada.  Namun,  baru  sekitar 200 jenis  yang telah dimanfaatkan sebagai bahan baku dalam industri obat tradisional (BPOM RI, 2004; Kotranas, 2006).
Beberapa  jenis  tanaman  obat  telah banyak  digunakan,  baik  untuk  pengobatan tradisional  maupun  untuk  pengobatan modern  (industri  obat).  Tanaman  obat seperti Centella  asiatica (L.)  Urban
(pegagan)  banyak  digunakan  di  India (Singh et  al., 2011)  dan  Indonesia  (Santa dan  Prajogo,  1992). Centella  asiatica (L.)
Urban  (sinonim Hydrocotyle asiatica Linn.)  (Singh et  al .,    2010)  yang  lebih dikenal  dengan  nama  lokal  pegagan  atau kaki kuda merupakan tumbuhan herba dari divisi Magnoliopyhta , kelas Magnoliopsida ,  bangsa Apiales ,  dan  suku Apiaceae ( Umbelliferae )  (BPOM  RI,
2008).  Pegagan  merupakan  tanaman  terna atau  herba  tahunan,  batang  berupa  stolon yang  menjalar  diatas  permukaan  tanah dengan  panjang  sekitar  10–80  cm.  Daun tunggal  tersusun  dalam  roset  yang  terdiri atas  2-10  daun,  berbentuk  seperti  ginjal ( reniformis ).  Tepi  daun  bergerigi  atau beringgit.  Tangkai  daun  tegak  dan  bagian dalamnya  berlubang.  Perbungaan  berupa bunga  majemuk  tipe  payung  tunggal ( umbella ), terisi atas 3–5 anak bunga. Buah dengan  2  daun  buah  dan  2  ruang.  Buah kecil  dengan  tipe schizocarpium .  Biji
dengan  perikarpium  yang  agak  tebal (BPOM, 2010; Soerjani et al .,  1987; Santa dan Prajogo, 1992).
Pegagan  telah  digunakan  sebagai tumbuhan  obat  selama  bertahun-tahun  di India, China, Srilanka, Nepal, dan Madagaskar  (Singh et  al .,    2010).  Secara tradisional  pegagan  digunakan  untuk penyakit  kulit  (BPOM  RI,  2010).  Selain itu,  pegagan  juga digunakan  untuk mengobati  sakit  perut,  batuk,  batuk berdarah, disentri, penyembuh luka, radang, pegal linu, asma, wasir, tuberkolosis.  lepra,  demam  dan  penambah selera  makan  (Januawati  dan  Muhammad, 1992;  Shukla et  al .,    1999;  Padua et  al .,
1999).
Pegagan  memiliki  berbagai  senyawa aktif  yang  dapat  dimanfaatkan  sebagai sumber  obat.  Senyawa  aktif  yang  dimiliki pegagan antara lain hidrokotilina (alkoholik), asiatikosida (glikosida), oksiasiatikosida  (saponin),  madekosida, asam madekosid. brahminosida, sesquiterpen, triterpenoid, asam lemak, dan minyak  atsiri  (Hashim,  2011;  Januawati dan Muhammad, 1992; HMPC, 2010).
Manfaat  yang  sangat  besar  untuk pengobatan  membuat  pegagan  banyak  di eksploitasi  di  alam  (Tiwari et  al .,    2000).
Singh  pada  tahun  2010  menyebutkan status konservasi pegagan masuk ke dalam spesies Endangered, kemudian  di  tahun 2013  berubah  menjadi Least  concern (IUCN  Red  List,  2013).  Hal  tersebut
mungkin  saja  disebabkan  karena  mulai banyak dilakukan pembudidayaan pegagan baik secara in vivo mapun secara in vitro .
Dewoto pada tahun 2007
mengemukakan bahwa telah terjadi peningkatan  permintaan  tanaman  obat  di Indonesia.  Hal  tersebut  disebabkan  oleh kecenderungan masyarakat untuk menggunakan  bahan  obat  alam.  Faktor yang  mendorong  hal  tersebut  ialah  obat sintesis lebih mahal dan lebih banyak efek sampingnya  (BPOM  RI,  2004;  Dewoto, 2007).  Permintaan  tanaman  obat  di  dunia diketahui  berjumlah  342.550  ton  pada tahun  1991-1998,  dimana  pada  masa tersebut  terjadi  peningkatan  permintaan obat  herbal  (Schippmann et  al .,    2002; Dewoto, 2007). Sementara itu di Indonesia, 15,6% masyarakatnya menggunakan  tanaman  obat  pada  tahun 2000  dan  jumlah  tersebut  meningkat menjadi  31,7%  pada  tahun  2001  (Dewoto, 2007).
Peningkatan  permintaan  tanaman obat  menyebabkan  suplai  tanaman  obat harus  tersedia  dalam  jumlah  yang  besar. Hal  tersebut  agak  sulit  dilakukan  jika masih  menggunakan  teknik  budidaya konvensional  atau  melalui  teknik in  vivo . Selain itu, permintaan suplai tanaman obat yang  semakin  tinggi  berakibat  pada tingginya eksploitasi di alam yang berpotensi mengurangi jumlah populasinya (Tiwari et  al., 2000;  Singh et  al., 2010). Oleh  sebab  itu,  salah  satu  cara  yang  dapat
dilakukan adalah dengan melakukan budidaya tanaman secara in vitro .
Kultur in vitro tumbuhan merupakan salah  satu  cara  pengembangan  materi biologis  tumbuhan  (sel,  jaringan,  organ) berdasarkan  teori  totipotensi  pada  media nutrisi  dalam  kondisi  aseptik.  Teori tersebut  mengemukakan  bahwa  setiap  sel hidup  mampu  mengekpresikan  semua informasi  genetik  yang  dimiliki  ke  dalam bentuk  organ utuh  sehingga setiap eksplan dapat  tumbuh  menjadi  semai  atau  anakan (Pierik,  1997;  Susilowati,  2003).    Prinsip tersebut  kemudian  dimanfaatkan  untuk melalukan  perbanyakan  tanaman  secara cepat  dan  dalam  jumlah  besar.  Proses perbanyakan tanaman melalui teknik kultur in  vitro memungkinkan  suatu  anakan memiliki sifat yang sama dengan induknya (Henuhili, 2013).
Teknik  kultur in  vitro tumbuhan sering  dilakukan  untuk  proses  budidaya tanaman hortikultura, termasuk di dalamnya  tanaman  obat.  Hal  tersebut disebabkan  karena  teknik  kultur in  vitro memiliki  beberapa  kelebihan  dibanding teknik budidaya tanaman lainnya.
Kelebihan  tersebut  antara  lain,  eksplan yang  digunakan  cukup  kecil,  waktu regenerasi  yang  relatif  cepat,  serta  sifat anakan yang cenderung seragam
(Suryowinoto, 1996; Abbas, 2011). Penelitian terkait budidaya pegagan secara in  vitro telah banyak dilakukan antara lain oleh  Patra et  al .    (1998),  Mohapatra et  al .
(2008),  Efrizal  (2009),  dan  Tiwari et  al . (2010).
Penelitian  kultur in  vitro pegagan juga  telah  dilakukan  di  Departemen Biologi  FMIPA  UI  sejak  tahun  2006. Penelitian  yang  dilakukan  antara  lain induksi  kalus  dari  eksplan  lamina  dan petiolus  oleh  Handayani  pada  tahun  2006 dan Azhari pada tahun 2007, serta induksi akar  adventif  dan  pemeriksaan  senyawa triterpenoid  dari  akar  adventif  oleh  Efrizal pada  tahun  2009.  Selanjutnya,  pada  tahun 2012  Febriyanti  melakukan  studi  tentang metode  sterilisasi  eksplan  yang  kemudian dimodifikasi  oleh  Novianti  pada  tahun 2013.
Masalah yang sering dijumpai dalam kultur in  vitro salah  satunya  adalah kontaminasi  eksplan.  Hal  tersebut  dapat menghambat proses kultur karena menyebabkan  eksplan  tidak  tumbuh  atau bahkan  mati.  Salah  satu  cara  yang dilakukan  untuk  meminimalkan  tingkat kontaminasi  adalah  dengan  melakukan sterilisasi  terhadap  eksplan  (Kartini,  1996; Pierik,  1997).  Terdapat  beberapa  metode sterilisasi  yang  telah  diterapkan  selama penelitian  kultur in  vitro pegagan  di Departemen  Biologi  FMIPA  UI.  Dua diantaranya  adalah  metode  sterilisasi  yang digunakan oleh Febriyanti pada tahun 2012 dan  Novianti  pada  tahun  2013.  Kedua metode tersebut memiliki perbedaan dalam pemberian antibiotik selama proses sterilisasi.  Selain  itu,  kondisi  lingkungan
yang  tidak  seragam  pun  diperkirakan menjadi  salah  satu  faktor  yang  kemudian menyebabkan  perbedaan  hasil.  Untuk  itu, perlu dilakukan pembandingan hasil tingkat  kontaminasi  eksplan  dari  kedua metode  sterilisasi  tersebut  dalam  kondisi lingkungan  yang  seragam.  Hal  tersebut bertujuan  agar  diketahui  metode  yang memperlihatkan  tingkat  kontaminasi  yang lebih rendah.

## METODOLOGI
Bahan
Eksplan  yang  digunakan  adalah bagian lamina (daun) dan petiolus (tangkai daun)  pegagan  ( Centella  asiatica L.
Urban).  Media  yang  digunakan  adalah media  agar-agar  dengan  kombinasi  agar- agar sebanyak 8 gram ditambah dengan  30 gram  gula  pasir  (dilarutkan  dengan akuades sampai 1 liter).
Cara Kerja Pembuatan dan sterilisasi media
Pembuatan  media  agar-agar  8% dilakukan  dengan  menggunakan  agar-agar [Swallow  Globe]  sebanyak  8  gram  dan gula  [Gulaku]  sebanyak  30  gram.  Suhu yang  digunakan  untuk  membuat  media agar-agar diatur stabil pada kisaran 100ºC, sedangkan  kuat  rotasinya  disesuaikan dengan  densitas  media.  Proses  pembuatan media  dibiarkan  sampai  larutan  yang sebelumnya berwarna kekuningan menjadi bening  sebagai  indikator  bahwa  larutan tersebut telah homogen.
Larutan  media  yang  telah  homogen kemudian  dituangkan  ke  botol  kultur dengan volume sekitar 10 ml pada masing- masing  botol  kultur.  Botol  kultur  yang telah  berisi  media  kemudian  disterilisasi menggunakan autoklaf. Penggunaan autoklaf diatur pada suhu 121ºC selama 15 menit. Larutan media yang telah disterilisasi  basah  kemudian  disimpan dalam  rak  kultur  selama  sepekan  untuk pengamatan kontaminasi media.

## Sterilisasi dan penanaman eksplan

## Metode 1
Eksplan dicuci dibawah air mengalir (15 menit)
Eksplan direndam dalam lar. Tetracyclin 0,5% (60 menit) Eksplan dibilas dengan akuades steril Susp. Dithane 0,7% + 2 tetes Tween 20  (5 menit) Larutan Bayclean 0,3% + 2 tetes Tween 20 (5 menit) Tetracycline 0,3 % + 2 tetes Tween 20 (5 menit) Dibilas Akuades steril (5 menit) Dibilas Akuades steril (10 menit)
Dipotong ukuran 1x1 cm. Tanam di media

## Metode 2

## HASIL DAN PEMBAHASAN Pengamatan Kontaminasi Eksplan dan Media
Pengamatan  kontaminasi  dilakukan satu  kali  per  pekan  untuk  memantau kondisi eksplan sekaligus melihat
keberhasilan sterilisasi eksplan.
Kontaminasi  yang  biasa  ditemukan  yaitu berupa  kontaminasi  bakteri,  khamir,  atau
kapang.  Kontaminasi  bakteri  ditandai dengan  warna  keruh  pada  media  dan terkadang  muncul  aroma,  kontaminasi khamir  ditandai  dengan  warna  keruh seperti susu sedangkan kontaminasi kapang ditandai dengan munculnya benang-benang  miselia  (Gamborg  dan Phillips, 1995).
Gambar 1. Histogram perbandingan tingkat kontaminasi lamina M1 dan M2 selama 4 pekan
Eksplan dicuci dibawah air mengalir (15 menit) Bersihkan dengan lar. Detol (25 tetes dalam 250 ml air) Bilas dengan air mengalir Lar. Bayclean 20% + 2 tetes Tween 20 (5 menit) Rendam dengan alkohol 70% (15 detik) Lar. Dithane 0,3% + 2 tetes Tween 20 (3 menit) Lar. Alkohol 70% (30 detik) Rendam dalam akuades steril (3 menit) Rendam dalam akuades steril (5 menit) Rendam dalam akuades steril (10 menit) Dipotong ukuran 1x1 cm. Tanam di media M1, 1, 4 M1, 2, 8 M1, 3, 9 M1, 4, 10 M2, 1, 0 M2, 2, 4 M2, 3, 5 M2, 4, 6 Ju m lah Bot o l Pekan ke- Perbandingan Tingkat Kontaminasi Lamina M1 dan M2 Selama 4 Pekan M1 M2
Secara  umum,  hasil  pengamatan kontaminasi  pada  eksplan  lamina  dan petiolus  menunjukkan  bahwa  eksplan lamina  lebih  rentan  terhadap  kontaminasi dibanding  eksplan  petiolus.  Hal  tersebut kemungkinan  disebabkan  oleh  struktur lamina  yang  pipih.  Struktur  tersebut berpotensi  untuk  membuat  lamina-lamina tersebut  saling  menempel  satu  sama  lain ketika  proses  sterilisasi  di  dalam  labu Erlenmeyer sehingga sterilisasi permukaan yang dilakukan kurang baik hasilnya. Hasil  pengamatan  eksplan  lamina  metode 1  (M1)  pada  pekan  pertama  menunjukkan kontaminasi  kapang  di  botol  nomor  2,  10, 11,  dan  14.  Pengamatan  pekan  kedua memperlihatkan  terjadinya  penambahan kontaminasi  sebanyak  4  botol  di  botol nomor  6,  7,  8,  dan  9.  Pekan  selanjutnya hanya  bertambah  satu  botol  yaitu  botol nomor  3  dan  di  pekan  terakhir  terjadi kontaminasi  di  botol  nomor  13  sehingga total kontaminasi lamina dengan menggunakan  metode  satu  sebanyak  10 botol. Kontaminasi yang terjadi di 10 botol tersebut semuanya merupakan kontaminasi kapang  yang  ditandai  dengan  munculnya benang-benang miselia berwarna kehitaman  yang  mulai  tumbuh  dari  tepian eksplan lalu menyebar ke seluruh permukaan media.

## Eksplan Lamina Daun
Hasil  pengamatan  eksplan  lamina metode  2  (M2)  sama  sekali  tidak menunjukkan kontaminasi di pekan
pertama.  Baik  eksplan  maupun  media semuanya  terpantau  dalam  keadaan  bersih dari  kontaminan.  Pekan  kedua,  hasil pengamatan memperlihatkan adanya kontaminasi  kapang  di  empat  buah  botol yaitu  botol  nomor  2,  7,  8,  dan  11.  Pekan selanjutnya kontaminasi  bertambah di  satu botol yaitu botol nomor 15. Pengamatan di pekan  terakhir  menunjukkan  kontamiasi tambahan  di  botol  nomor  1  sehingga  total akhir  kontaminasi  menjadi  6  buah  botol yang semuanya merupakan jenis kontaminasi kapang.
Pengamatan hasil dua metode sterilisasi  tersebut  memperlihatkan  bahwa metode 2 memberikan hasil sterilisasi yang lebih  baik  dibandingkan  metode  1. Sebanyak  10  botol  terkontaminasi  oleh kapang pada metode 1 sedangkan metode 2 hanya sebanyak 6 botol saja. Hasil tersebut membuktikan bahwa pemberian Tetracycline tidak  memberikan  hasil  yang lebih  baik  sehingga  hipotesis  awal  tidak terbukti.
Metode  dua  memberikan  hasil  lebih baik kemungkinan dikarenakan seri sterilan  yang  terdiri  dari  antiseptik  dan desinfektan  berefek  lebih  baik  terhadap penghambatan pertumbuhan mikroorganisme.  Zat  yang  terkandung  di dalam  antiseptik  Dettol  dan  desinfektan Bayclin membunuh mikroorganisme dengan  segera  sedangkan Tetracycline yang  merupakan  antibiotik  memerlukan waktu yang lebih lama dalam menghambat
sintesis  protein  bakteri  sehingga  ketika eksplan  dipindah  ke  sterilan  selanjutnya, proses  sintesis  protein  belum  benar-benar terhambat.

## Eksplan Petiolus Daun
Hasil  pengamatan  eksplan  petiolus
yang menggunakan metode 1
memperlihatkan  adanya  dua  botol  yang terkontaminasi pada pekan pertama. Pengamatan  di  pekan  kedua  menunjukkan adanya  penambahan  kontaminasi  kapang pada  botol  nomor  9  dan  kontaminasi bakteri  atau  khamir  pada  botol  nomor  7. Pengamatan pekan ketiga tidak menunjukkan adanya tambahan
kontaminasi.  Pengamatan  pekan  terakhir terdapat satu tambahan botol yang terkontaminasi  sehingga  total  kontaminasi pada  petiolus  metode  1  sebanyak  5  botol dengan  proporsi  empat  botol  dengan kontaminasi  jenis  kapang  dan  satu  botol dengan  kontaminasi  jenis  bakteri  atau khamir.
Hasil  pengamatan  eksplan  petiolus metode  2  tidak  memperlihatkan  adanya kontaminasi  pada  pekan  pertama.  Semua
botol  masih  dalam  keadaan  bersih  dari kontaminan.  Pekan  selanjutnya  botol nomor  13  terkontaminasi  oleh  jenis kapang.  Pekan  ketiga,  terdapat  tambahan tiga botol yang terkontaminasi oleh kapang yaitu  botol  nomor  1,  6,  dan  12.  Pekan terakhir  pengamatan  menunjukkan  botol nomor  2  juga  terkontaminasi  sehingga hasil akhir keseluruhan terdapat  lima buah botol  yang  terkontaminasi  dan  semuanya merupakan kontaminasi jenis kapang.
Hasil  pengamatan  eksplan  petiolus metode  2  tidak  memperlihatkan  adanya kontaminasi  pada  pekan  pertama.  Semua botol  masih  dalam  keadaan  bersih  dari kontaminan.  Pekan  selanjutnya  botol nomor  13  terkontaminasi  oleh  jenis kapang.  Pekan  ketiga,  terdapat  tambahan tiga botol yang terkontaminasi oleh kapang yaitu  botol  nomor  1,  6,  dan  12.  Pekan terakhir  pengamatan  menunjukkan  botol nomor  2  juga  terkontaminasi  sehingga hasil akhir keseluruhan terdapat  lima buah botol  yang  terkontaminasi  dan  semuanya merupakan  kontaminasi  jenis  kapang.
Gambar 2. Histogram perbandingan tingkat kontaminasi petiolus M1 dan M2 selama 4 pekan
M1, 1, 2 M1, 2, 4 M1, 3, 4 M1, 4, 5 M2, 1, 0 M2, 2, 1 M2, 3, 4 M2, 4, 5 Ju m lah Bot o l Pekan ke- Perbandingan Tingkat Kontaminasi Petiolus M1 dan M2 Selama 4 Pekan
Tabel 1. Rekapitulasi Kontaminasi Eksplan Centella asiatica L. Urban
Keterangan : B = Kontaminasi oleh bakteri/khamir, K = Kontaminasi oleh Kapang
Berdasarkan  hasil  pengamatan,  tingkat kontaminasi  eksplan  petiolus  metode  satu dan  metode  dua  memperlihatkan  hasil yang sama yaitu kontaminasi ditemukan di lima botol kultur. Hal tersebut kemungkinan  disebabkan  oleh  struktur morfologi  petiolus  yang  berbentuk  batang silindris. Struktur tersebut cenderung lebih memudahkan  proses  sterilisasi  eksplan karena petiolus tidak saling menempel saat perendaman  seperti  yang  terjadi  pada lamina. Akibatnya, hasil pengamatan tidak menunjukkan secara spesifik metode mana yang lebih baik untuk sterilisasi petiolus.

## Pengamatan respons eksplan dan media
Pengamatan  lain  yang  dilakukan adalah pengamatan respons eksplan.
Respons  eksplan  yang  diamati  dibagi menjadi  pencokelatan,  pemanjangan,  dan pelekukan. Kultur lamina dengan menggunakan  metode  satu  menghasilkan respons  pencokelatan  di  semua  eksplan, dan terdapat dua eksplan yang memperlihatkan  dua  respons  pelekukan, sedangkan  kultur  lamina  dengan  metode dua  memperlihatkan  pencokelatan  di semua eksplan.
Kultur petiolus metode satu memperlihatkan  hasil  delapan  eksplan mengalami  pencokelatan,  tiga  eksplan mengalami pelekukan, satu eksplan mengalami pemutihan, dua eksplan mengalami  pemanjangan,  satu  eksplan mengalami  pencokelatan  namun  hanya  di ujungnya  saja  dan  satu  eksplan  tidak memperlihatkan  respons  apa  pun.  Kultur petiolus  metode  dua  memperlihatkan  hasil delapan  eksplan  mengalami  pencokelatan, satu  eksplan  mengalami  pelekukan,  satu eksplan  mengalami  pencokelatan  namun hanya di satu sisi, satu eksplan mengalami pemutihan  dan  satu  eksplan  mengalami pemanjangan.
Respons  pencokelatan  dapat  terjadi karena  adanya  enzim  polifenol  oksidase yang  dilepaskan  oleh  tumbuhan  dalam kondisi oksidatif ketika jaringan tumbuhan mengalami  pelukaan.  Enzim  tersebut mengoksidasi senyawa fenol dengan oksidator  berupa  Cu +2 dan  oksigen  yang kemudian  menghasilkan  senyawa  quinon. Senyawa quinon ketika berinteraksi dengan  protein  akan  berubah  menjadi senyawa  melanat  yang  berwarna  cokelat.
Meto- de Eksplan Total Eksplan Jumlah Kontaminasi (per Pekan) Total Kontaminasi (%) Pekan 1 Pekan 2 Pekan 3 Pekan  4 B K Σ B K Σ B K Σ B K Σ 1 Lamina 15 0 4 4 0 8 8 0 9 9 0 10 10 66 % Petiolus 15 0 2 2 0 4 4 0 4 4 0 5 5 33 % 2 Lamina 15 0 0 0 0 4 4 0 5 5 0 6 6 40% Petiolus 15 0 0 0 0 1 1 0 4 4 0 5 5 33%
Senyawa  tersebut  jika  terakumulasi  dalam jumlah  banyak  akan  menjadi  racun  bagi tumbuhan (George dan Sherrington, 1984).
Reaksi pencokelatan ditemukan hampir di semua jenis eksplan baik eksplan lamina  maupun  eksplan  petilolus.  Hal tersebut  disebabkan  oleh  adanya  pelukaan yang terjadi pada jaringan eksplan sehingga  memicu  reaksi  sintesis  senyawa melanat  yang  berwarna  cokelat.  Peristiwa pencokelatan  dapat  dicegah  dengan  cara memberikan senyawa adsorban dan antioksidan.  Senyawa  adsorban    yang umum  digunakan  dalam  kultur in  vitro antara lain arang aktif dan polivinilpirolidon ,  sedangkan  antioksidan yang  umum  digunakan  adalah  asam askorbat (Abdelwahd et al .,  2008).
Hasil  pengamatan  lain  menunjukkan bahwa  terjadi  reaksi  pemanjangan  pada eksplan.  Biasanya  respons  pemanjangan diperlihatkan pada eksplan yang ditumbuhkan  dalam  media  yang  diberikan tambahan hormon. Namun, respons pemanjangan tetap ditemukan dalam media yang tidak diberikan hormon.  Hal  tersebut
dapat  terjadi  kemungkinan  karena  adanya aktivitas dari hormon endogen  yang masih terdapat  di  dalam  eksplan  sehingga memungkinkan  terjadinya  pertumbuhan eksplan.
Dengan  demikian,  dapat  dilihat bahwa  tingkat  kontaminasi  lebih  tinggi terjadi pada metode M1, sedangkan tingkat kontaminasi pada metode M2 masih cukup tinggi yaitu di atas 50%. Namun demikian, respons yang ditunjukkan oleh metode M1 beragam karena adanya respons pemutihan,  pelekukan,  dan  pemanjangan pada  beberapa  eksplan  sedangkan  pada metode  M2  secara  umum  lebih  banyak terlihat  respon  pencokelatan  yang  terjadi hampir di semua eksplan.

## KESIMPULAN
Pengamatan kontaminasi menunjukkan bahwa metode terbaik adalah metode 2 (M2) dengan kontaminasi lamina sebanyak  40%  dan  kontaminasi  petiolus sebanyak  33%.  Respons  eksplan  pada metode  M1  dan  M2  memperlihatkan adanya  respons  pencokelatan,  pelekukan, dan pemanjangan.

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas  B.  2011.  Prinsip  Dasar  Kultur Jaringan.  Penerbit  Alfabeta,  Bandung  : x +138 hlm.
Abdelwahd  RN,  Hakam  M,  Labhilili  SM, Udupa.  2008.  Use  of  an  adsorbent  and antioxidants  to  reduce  the  effects  of leached  phenolics  in in  vitro plantlet regeneration  of  faba  bean. African Journal  of  Biotechnology, 7(8):  997- 1002.
BPOM  RI.  2004.  Monografi  ekstrak tumbuhan  obat  Indonesia . Vol.  1. BPOM RI, Jakarta: xi + 159 hlm.
BPOM RI. 2010. Booklet Pegagan. BPOM
RI, Jakarta : iv + 14
Dewoto  HR.  2007.  Pengembangan  obat tradisional Indonesia menjadi fitofarmaka. Majalah Kedokteran
Indonesia, 57(7): 205-211.
Efrizal  RA.  2009.  Pemeriksaan  kelompok senyawa triterpenoid pada akar adventif hasil kultur in vitro daun Centella asiatica (L.)  Urban  (pegagan).  Skripsi S-1.  Departemen  Biologi.  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia. Depok: vii + 83 hlm.
Gamborg  OL  dan  GC  Phillips  (ed).  1995.
Plant  cell,  tissue  and  organ  culture: Fundamental  methods.  Springer-Verlag Berlin  Heidelberg,  New  York:  xxiv  + 358 hlm.
George  EF  dan  PD  Sherrington.  1984.
Plant  propagation  by  tissue  culture: Handbook  and  directory  of  commercial laboratory. Exegetics Limited, Basingstoke: viii + 709 hlm.
Hassan  BAR.  2012.  Medicinal  plants (important  and  uses). Pharmaceutica Analytica Acta, 3: 10.
Kartini E. 1996. Sterilan yang sesuai untuk budidaya in vitro tunas Curcuma xanthorriza Roxb. Chimera, 1(2):  56- 66.
Mohapatra  H,  DP  Barik  dan  SP  Rath. 2008.  A  brief  communication: In  vitro regeneration of medicinal plant Centella asiatica . Biologia  Plantarum, 52(2): 339-342.
Patra  A,  B  Rai,  GR  Rout,  P  Das.  1998. Successful  plant  regeneration  from callus  culture  of Centella  asiatica
(Linn.) Urban. Plant Growth Regulation, 24: 13-16. Pierik  RLM.  1997.  In  vitro  culture  of higher plants, 4th ed. Springer Science+Business  Media  Dordrecht,
Dordrecht: v + 348 hlm. Pribadi ER. 2009. Pasokan dan Permintaan Tanaman  Obat  Indonesia  Serta  Arah Penelitian dan Pengembangannya. Perspektif, 8 (1) : 52 – 64
Santa  GP  dan  B  Prajogo.  1992.  Studi taksonomi Centella asiatica (L.) Urban. Warta Tumbuhan Obat Indonesia, 1(2): 46-47.
Shukla A, AM Rasik, GK Jain, R Shankar,
DK Kulshrestha,  BN Dhawan. 1999. In vitro and in vivo wound healing activity of  asiaticoside  isolated  from Centella asiatica . Journal of
Ethnopharmacology, 65: 1-11.
Singh  S,  A  Gautam,  A  Sharma,  A  Batra.
2010. Centella asiatica L.: A plant with immense medicinal potential but threatened. International  Journal  of Pharmaceutical  Sciences  Review  and Research, 4(3): 9-17.
Suryowinoto M. 1996. Pemuliaan tanaman secara in vitro . Kanisius, Yogyakarta: 5-
-252 hlm.
Tiwari  KN,  NC  Sharma,  V  Tiwari,  BD Singh.  2000.  Micropropagation  of Centella  asiatica (L.),  a  valuable madicinal  herb. Plant  Cell,  Tissue  and Organ Culture, 63: 179-185.