## DESAIN PRIMER PCR SECARA IN SILICO UNTUK AMPLIFIKASI GEN COI
PADA KUPU-KUPU Papilio ulysses Linnaeus DARI PULAU BACAN
Suparman 1 , Hasna Ahmad 2 , Zulkifli Ahmad 2
1 Laboratorium Biologi FKIP Universitas Khairun-Ternate
2 Program Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Khairun-Ternate Email: suparman_bio@yahoo.com

## Abstract
The  insillico  research  was  conducted  to  produce  primer  sequence  of COI  gene  in  Butterfly  species  Papilio  ulyses  from  Bacan  Island  that will  be  used  in  gene  isolation.  The  COI  sub-unit I  is  a  barcode  gene that generally have special purposes in animal identification. It is also available  in  phyilogenetic  analysis.  The  first  step  of  method  is downloading  the  COI  DNA  sequence  of  Papilio  ulysses  from GeneBank  (NCBI).  Then  the  conserve  region  of  COI  sequence  is identified  to  determine  primer.  Primer  is  designed  with    primer designer  software  (Genamics  Expression)  in  two  direction  of  DNA reading  frame  that  are  :  forward  primer  (COI  Pu-F)  and  reverse primer  (COI Pu-R). The last step is primer confirmation with primer blast tool in NCBI. Primers of COI gene that are produced consist of two,  that  are  CGAAAATGACTTTATTCAACA  for  forward  primer (COI  Pu-R)  and  AGCAGTAATTCCAACAGCTC  for  reverse  primer (COI  Pu-R).  The  optimal  temperature  of  annealing  is  from  50,74 0 to 55,74 0 Celsius with PCR product around 567 base pair long. Key Words : PCR primer, in silico, COI gene, Papilio ulysses, Bacan island.
Indonesia  merupakan  negara yang  memiliki  sumber  kekayaan  dan keanekargamana  hayati  yang  tinggi. Keanekaragamana hayati tersebut terdapat  hampir  disemua  provinsi. Provinsi  Maluku  Utara  salah  satu provinsi  dengan  karagaman  hayati yang  tinggi  baik  dari  tumbuhan maupun hewan. Keanekaragaman tersebut  berada  dalam  berbagai  jenis ekosistem  yang  tersebar  di  banyak pulau  besar  maupun  kecil.  Saat  ini,
Provinsi Maluku Utara secara administratif, terbagi dalam
Kabupaten/Kota  yang  terdiri  dari Kota  Ternate  (Ternate),  Kota  Tidore
Kepulauan  (Soa  Sio),  Kabupaten Halmahera Barat (Jailolo), Kabupaten Halmahera Timur (Maba), Kabupaten Halmahera Utara (Tobleo), Kabupaten Halmahera Selatan (Bacan),  Kabupaten  Kepulauan  Sula (Sanana),  Kabupaten  Pulau  Morotai (Morotai),  dan  Kabupaten  Taliabu. Salah satu Kabupaten yakni Halmahera Selatan memiliki ekosistem  yang  beragam  baik  pantai, hutan,  maupun  gunung.  Selama  ini
15 Jurnal Pendidikan Matematika dan IPA Vol. 7. No. 1. Januari 2016: 14-24
pendataan  dan  kegiatan  eksplorasi flora  dan  fauna  di  kabupaten  tersebut belum dilakukan secara komprehensif dan  intensif.  Di  salah  satu  pulau terbesar,  yakni  Pulau  Bacan  terdapat kawasan  Cagar  Alam  Gunung  Sibela dengan  luas  ±23.024  ha  (BPS
Halmahera Selatan, 2015) yang memiliki  keanekaragaman  jenis  flora dan fauna cukup tinggi (Ahmad et al.,
2015). Potensi sumberdaya alam yang terdapat  di  kawasan  Cagar  Alam Gunung  Sibela,  menjadikan  kawasan ini sangat menarik untuk dikaji.
Berdasarkan  hasil  penelitian lebih  lanjut,  Ahmad  et  al.,  (2015) memaparkan  bahwa  telah  terdata berbagai  jenis  serangga.  Secara  rinci terdapat sebanyak 424 individu serangga  yang  terdata  dibeberapa lokasi  peneltian  di  Pulau  Bacan  dari 34 jenis kupu-kupu. Adanya berbagai jenis  kupu-kupu  di  pulau  Bacan  dan sekitarnya,  merupakan  daya  tarik tersendiri  dan  menambah  eksotisme pada  kawasan  Cagar  Alam  Gunung Sibela.
Kupu-kupu  di  ekosistemnya berperan  sebagai  polinator  dalam penyerbukan berbagai jenis bunga. Di sisi lain, kupu-kupu juga memberikan pesona  dan  keindahan  pada  alam dengan  akulturasi  warna  pada  tubuh dan  sayapnya.  Kupu-kupu  sangat penting  bagi  keberlangsungan  dan keseimbangan  ekosistem,  sehingga keberadaan kupu-kupu di alam menjadi salah satu indikator ekosistem. Penurunan jumlah populasi kupu-kupu di alam
disebabkan  oleh  adanya  alih  fungsi hutan,  penebangan  liar,  fragmentasi habitat,  dan  penangkapan  liar.  Salah satu  cara  untuk  mempertahankan populasi  kupu-kupu  di  alam  adalah dengan  melakukan  eksplorasi  jenis,
sosialisasi  kepada  masyarakat,  dan melakukan penangkaran.
Beberapa genus kupu-kupu yang terdapat di Gunung Sibela Pulau Bacan  yakni Papilio , Ornithopthera , Troides dan Graphium. Keempat genus  tersebut  berasal  dari  family Papilionidae.  Salah  satu  jenis  kupu- kupu yang teridentifikasi yakni Papilio  ulysses.  Papilio  Ulysses adalah  salah  satu  jenis  kupu-kupu yang  paling  terkenal,  secara  umum dikenal  pula  dengan  sebutan  kupu- kupu  biru  atau  kaisar  biru  ( blue emperor ). Papilio  ulysses merupakan bagian  dari  kelompok  kupu-kupu peacock  swallowtails dan  merupakan genus Papilio subgenus Achillides F.L. (Condamine, et al., 2012). Secara khusus species Papilio ulysses
merupakan  kupu-kupu  endemik  di sekitar  kepulauan  Maluku,  Papua, Solomon,  sampai  Benua  Australia (Condamine,  et  al.,  2012).  Gambar morfologi  dan  dan  peta  penyebaran endemik  kupu-kupu Papilio  ulysses tergambar pada gambar 1. Kupu-kupu Papilio ulysses memiliki  warna  yang  lebih  menarik dibandingkan  dengan  jenis  yang lainnya.  Warna  yang  atratif  dan mencolok tersebut menyebabkan kupu-kupu  jenis  ini  menjadi  buruan kolektor kupu-kupu.
Variasi  yang  luar  biasa  pada spesies  ini  menghasilkan  banyak subspecies  yang  tersebar  di  daerah tersebut. Sampai saat ini, sebanyak 14 subspesies  telah  dikenali  pada  daerah penyebarannya  (Braby  2000).  Salah satu  subspesiesnya  ialah Papilio  u. joesa , yang diakui sebagai subspecies endemik dengan penyebarannya  yang terbatas  di  Australia  serta  jarang ditemukan  (Sand  dan  New,  2002). Banyak  dari  spesies  kupu-kupu  yang
tidak  dimiliki  datanya  secara  lengkap mulai  dari  penyebaran  dan  jumlah perkiraan  individu  dari  tiap  spesies secara  rinci. Papilio  ulysses juga merupakan  salah  satu  speseis  yang masih  sangat  kurang  data  keberadaan jumlah dan kelimpahannya. Kekurangan data ini dapat
menimbulkan  kerugian  besar  secara imateri  karena  kepunahan  yang  tidak terduga  dapat  saja  terjadi  seiring dengan perubahan iklim global.
Informasi  mengenai  kupu-kupu spesies P.  ulysses secara  morfologi
dan  variasinya  masih  terbatas  dan kurang  dalam  publikasi  oleh  para peneliti  lokal.  Hal  ini  juga  terjadi pada  spesies  lain  dari  genus Papilio . Salah  satu  publikasi  oleh  peneliti Indonesia mengenai spesis dari genus Papilio diantaranya  ialah Papilio polytes oleh  Makhzuni  et  al.  (2013). Penelitian  tersebut  tentang  variasi morfologi  pada Papilio  polytes dari beberapa lokasi  yang  berbeda  di Sumatra Barat.
Gambar  1.  Morfologi  spesies Papilio  ulysses dan  peta  penyebarannya  meliputi Kepulauan Maluku, Papua, Solomon dan Australia (Condamine, et al., 2012).
Pada  dasarnya  data  morfology dan data genetika dari makhluk hidup sama  pentingnya.  Keduanya  dapat saling  melengkapi  dalam  identifikasi, analisis  kekerabatan  dan  keperluan taksonomi makhluk hidup.
Ketersediaan  data  genetika  dianggap lebih  praktis  dalam  penyimpanan karena  tidak  memerlukan  ruang  yang luas  dan  dapat  disimpan  dalam  bank gen  (gene  bank).  Data  genetika  juga diperlukan dalam mengantisipasi
ketiadaan  data  morfologi  karena kelanggaan  spesies  atau  spesies  yang telah punah. Oleh karena itu diperlukan  penelitian  yang  meliputi identifikasi,  filogenetik,  penyebaran,
kelimpahan  dan  data  ekologi Papilio ulysses. Penyediaan  data  genetik dapat dimulai dari data DNA barcode
spesies makluk hidup.
DNA barcode merupakan
urutan pasangan basa “base pair” (bp) pada  genom  yang  umumnya  pendek
17 Jurnal Pendidikan Matematika dan IPA Vol. 7. No. 1. Januari 2016: 14-24
sekitar  650  bp  (Hebert,  et  al.,  2003). Pada kelompok Hewan, DNA barcode , biasanya menggunakan bagian dari genom mitokondria yakni gen cytochrome  c  oxidase I  (COI). Hal ini dikarenakan gen COI umumnya memiliki kemampuan mutasi  yang  relatif  cepat,  sehingga dapat  membedakan  sampel  pada tingkatan taksonomi yang lebih rendah misalnya spesies atau individu (Burns, et al. , 2007). DNA Mitokondria ( mtDNA ) telah digunakan  secar  umum  di  kalangan peneliti  dalam  bidang  molekuler khususnya sebagai penanda molekuler  filogenetik  pada  kelompok hewan  khuusunya  phypada.  Hal  ini juga disebabkan, mitokondria merupakan genom yang sangat sederhana.  Urutan mtDNA telah menyediakan data-data penting dalam menganalisis  filogenetik,  sehingga pemilihan gen sebagai penanda molekuler  merupakan  langkah  yang sangat  signifikan.  Oleh  karena  itu, urutan  DNA  dari  gen  tertentu  sangat penting  untuk  didapatkan.  Dalam  hal identifikasi, urutan DNA dapat digunakan untuk menguji atau memastikan  bahwa  spesies  yang  di dapat  merupakan  objek  yang  diteliti,
dalam  hal  ini Papilio  ulyses .  Hasil penemuan  ini  akan  menjadi  dasar yang  sangat  penting  bagi  penelitian- penelitian  kupu-kupu Papilio  ulysses yang khusus endemik di Pulau Bacan. Untuk  menghasilkan  sepasang primer  spesifik  bagi  gen  COI  pada Papilio  ulysses ,  maka  diperlukan informasi  mengenai sekuen  gen meliputi lokasi gen dalam kromosom, panjang pasangan basa, dan informasi spesifik mengenai susunan dan persen basa  pada  gen  tersebut.  Kajian  dan pengembangan  informasi  mengenai
primer  DNA  yang  spesifik  untuk proses  amplifikasi  dengan  metode Polymerase  chain  reactions (PCR) untuk  gen  COI  pada Papilio  ulysses endemik  Pulau  Bacan  belum  pernah dilakukan. Penyediaan primer berdasarkan  desain  primer  spesifik sangat  diperlukan  untuk  penelitian selanjutnya. Penelitian berupa penelusuran tentang informasi sekuen gen  COI Papilio  ulysses yang menghasilkan  desain  primer  spesifik COI  yang  akurat  perlu  sangat  perlu dilakukan.  Penelitian  ini  bertujuan menghasilkan  urutan  primer  spesifik COI  pada Papilio  ulysses dengan menggunakan perangkat lunak komputer ( software ).

## METODE
1. Penentuan DNA Template Penelitian ini merupakan penelitian  berbasis in  silico dalam mendesain primer PCR dengan menggunakan analisis bioinformatika.
Pengambilan  dan  pengolahan  data yang  tersedia  pada  website  penyedia gen  dan  layanan  pengolahan/analisis gen dan DNA. Proses PCR ( Polymerase Chain Reaction ) memerlukan  sepasang  primer  sebagai pemicu terbentuknya DNA baru yang mirip  gen  target  seperti  proses replikasi DNA (Handoyo dan Rudiretna, 2001). Desain primer gen COI dimulai dengan  mengunduh sekuen  DNA  gen COI Papilio  ulysses yang  tersedia  di GenBank.  Gen  dikopi  dalam  bentuk pasta (.txt) dan dijadikan acuan untuk mencari  daerah  lestari.  Primer  yang dibuat  yakni  primer  untuk  dua  arah pembacaan DNA yakni primer forward  ( COI  Pu -F)  dan  primer reverse  ( COI  Pu -R).  Desain  primer dibuat  dengan  ketentuan  persen  GC
dari  masing-masing  primer  harus  di atas  50%,  perbedaan  suhu mealting ideal  antara  kedua  primer  F  dan  R maksimal  4ºC.  Panjang  masing- masing primer berkisar antara 15 basa sampai  25  basa.  Desain  primer  juga harus  menghindari  struktur  sekunder dan  primer  dimer  (Claverie,  & Notredame, 2007). 2. Desain primer gen COI
DNA primer diharapkan dapat menempel  pada  bagian  ujung  kedua urutan  gen  COI.  Hal  ini  agar  primer menghasilkan  panjang  gen  hasil amplifikasi  yang  maksimal.  Setelah mengikuti aturan tersebut, selanjutnya primer akan didesain dengan menggunakan software primer designer yakni Genamics Expression (http://www.genamics.com/expressio
n/order.htm).  Urutan  primer  yang telah  dihasilkan  selanjutnya akan dapat  di ujicoba  atau  dikonfirmasi secara insilico menggunakan perangkat  lunak blast primer pada NCBI untuk mengetahui posisi akurat penempelan  primer  pada  gen  COI secara bioinformatika.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
1. DNA template sebagai  cetakan primer DNA  template/cetakan  yang dijadikan  acuan  pada  desain  primer adalah sekuen gen COI yang terdapat di genebank (http://www.ncbi.nlm. nih.gov)  bersumber  dari  publikasi (Condamine,  et  al,  2012).  Nomor aksesi  Nukleotida:  gi|331271451|  gb| JF681034.1| Papilio  ulysses voucher CBGPFLC_00362 cytochrome oxidase  subunit  I  (COI)  gene, mitochondrial. Sekuen secara lengkap adalah :
1 cgaaaatgac  tttattcaac  aaatcataaa gatattggaa cattatattt tatttttggt
61   atttgagcaa  gaatattagg  aacttcatta agtttattaa ttcgaactga attaggaacc
121   ccaggatctt  taattggtga  tgatcaaatt tataatacta ttgttacagc tcatgctttt 181   attataattt tttttatagt tataccaatt ataattggag gatttggaaa ttgattagtt 241   cctctgatat  taggagctcc  tgatatagct ttcccccgaa taaataatat aagattttga
301   ttattacccccctcattaacacttttaatt  tca agaataa ttgtagaaaa tggagctgga
361   actggttgaactgtttatccccctctttca  tc aaacattg cccatggaag aagatcagta
421   gacttagtta  ttttctcctt  acatttagca ggtatttcct caattttagg agcaattaat
481   tttattacaa  caattattaa  tatacgtatt aataatatat catttgatca aataccttta
541   tttgtttgag  ctgttggaat  tactgcttta ttattacttc tttctttacc agtcttagca
601   ggtgctatta  ctatattatt  aacagatcga aatttaaata catctttttt tgatcctgca
661   ggaggaggag  atcctatttt  atatc  aac at ttattttgat tttttggtca tccagaagtt
721   tatattttaa  ttttaccagg  atttggaata atttctcata ttatttccca agaaagagga
781   aaaaaagaaa  catttgggtg  tttaggt  at aatttatgctataataacaat tggattatta
841   ggatttattg  tatgagctca  tcatatattt  a ctgttggca tagatactga tacacgagct
901   tattttacat  cagcaacaat  aattattgca gtacctacag gaattaaaat ttttagttga
961   ttagctactt  tacacggaac  ccaaattaat tacagaccat caattttatg aagattagga
1021  tttgtttttc  tttttactgt  aggaggatta actggagtaa ttttagcaaa ttcatcaatt
1081  gatgtaacct  tacatgatac  ttattatgta gtagctcact ttcattatgt tttatctata
1141  ggagctgttt  ttgctattat  aggaagattt attcattgat atcctttatt tactggactt
1201  tcattaaatt  cttacttttt  aaaaattcaa ttttttacta tatttattgg agtaaattta
1261 acatttttcc ctcaacattt tttagga 2. Urutan DNA primer yang dihasilkan DNA template selanjutnya digunakan  sebagai  master  untuk menjadi acuan primer dengan
19 Jurnal Pendidikan Matematika dan IPA Vol. 7. No. 1. Januari 2016: 14-24
software genamic expresion . Pembentukan primer dapat digambarkan  dengan  ilustrasi  DNA dan  primer  dari  dua  arah  seperti Gambar 2.
Gambar 2. Ilustrasi posisi primer Forward (F) dan primer Reverse (R) pada gen COI.
Primer forward dan reverse secara  bersama  dalam  amplifikasi secara invitro akan  menghasilkan urutan  DNA  COI  parsial  sepanjang 567  pasang  basa.  Penggunaan  DNA parsial dalam pengenalan dan
identifikasi  jenis  dapat  dianggap sahih.  Dalam  analisis  kekerabatan makhluk  hidup  penggunaan  DNA parsial  juga  telah  banyak  dilakukan, diantaranya  pada  analisis  filogenetik tanaman mangga (Suparman, Pancoro,  dan  Hidayat,  2013).  Pada kelompok hewan, DNA Parsial khususnya  gen  COI  juga  umum digunakan  dalam  analisis  molekuler misalnya  pada  hewan  kelompok Hemiptera  (Habeeb  &  Sanjayan,
2011).
Pasangan  primer  hasil  dari software genamic expression selanjutnya diujicoba dengan menggunakan  fungsi blast primer yang ada pada NCBI. Fungsi blast ini merupakan  simulasi  secara  insiliko yang  menunjukan  urutan  DNA  yang akan  dihasilkan  bila  sepasang  primer tersebut  digunakan  untuk  amplifikasi pada  saat  proses  PCR  dengan mengikuti  profil  yang  diseting  sesuai
dengan  hasil  desain  primer  tersebut. Simulasi  tersebut  akan  mengenai target  gen  yang  kita  inginkan  dalam hal  ini  gen  COI Papilio  ulysses jika data pada genebank telah tersedia gen yang  dimaksud.  Jika  belum  tersedia maka hasil blast primer akan mengenai  gen  yang  lain  yang  cocok dan saling melengkapi dengan primer tersebut. Hasil blast primer yang didapatkan  dari  fungsi  blast  primer NCBI  dengan  menggunakan  primer hasil desain ( COI PU -F dan COI PU -
R)  tergambar  pada  Gambar  3.
Sekuen gen COI yang akan didapatkan berdasarkan PCR menggunakan  primer  tersebut  ialah parsial gen COI yang panjangnya 567 pasang  basa  dari  1287.  Penggunaan sekuen  gen  yang  tidak  utuh  pada beberapa  kajian  dapat  dilakukan misalnya  pada  analisis  keragaman, analisis  filogenetik  atau  identifikasi jenis pada hewan
Hasil blast primer adalah hasil pencarian  gen  yang  telah  tersedia  di genebank dengan aplikasi yang disediakan oleh website , dalam hal ini website NCBI.
Gambar 3. Hasil blast primer pada website NCBI.
Prinsip kerja blast primer
secara sederhana mirip dengan amplifikasi    dengan  metode  PCR. Perinsip  dasarnya  yakni  primer  yang telah  dibuat  akan  menempel  pada potongan-potongan  gen  yang  telah ada  di genebank .  Penggunaan blast primer ini merupakan simulasi apakah  potongan  primer  yang  telah didesain  mengenai  sasaran  gen  yang ditargetkan.
Temperature Melting yang didapatkan merupakan hasil kalkulasi yang  direkomendasikan  oleh  aplikasi blast primer dalam  NCBI.  Suhu tersebut  sedikit  berbeda  dengan  yang direkomendasikan oleh hasil kalkulasi dari software DNA calculator pada www.biophp.org.  TM  untuk forward primer hasil  DNA  cacultaor  adalah 47,7 o C  dan  untuk primer  reverse
52,8 o C. Hasil ini menunjukan selisih sekitar 3-4 o C. Pada  hasil  kalkulasi  persen  GC untuk  masing-masing  primer  dengan menggunakan DNA calculator www.biophp  yakni  sekuen forward primer adalah  28,6  %  dan  sekuen reverse  primer adalah  45%.  Hal  ini bahwa hasil kalkulasi  persen GC  dari NCBI dan biophp menunjukan kesamaan  100%.  Perbedaan  dan kesamaan  pada  dua  indikator  dengan menggunakan  aplikasi  yang  berbeda dan dari seumber yang berbeda dalam pembuatan  primer  secara  insiliko akan  mendapatkan  hasil  yang  sedikit perbedaan.  Berdasarkan  hal  tersebut, maka  perlu  dilakukan  uji  coba  awal dalam  melakukan  amplifikasi  secara invitro  untuk  mendapatkan  sekuen gen  target  yang  sesuai  dalam  PCR menggunakan mesin PCR.
Tabel 1. Primer Forward dan Reverse (F dan R) yang didesain dengan software
genamic expresion . Primer Ukuran Panjang Produk GC TM Struktur Sekunder Dimer Basa basa % o C Forward ( COI PU -F) CGAAAA TGACTTT ATTCAA CA 21 567 28,6 50,7 NONE NO Reverse ( COI PU -R) AGCAGT AATTCC AACAGC TC 20 567 45,0 55,7 NONE NO
*TM : Temperature Melting adalah suhu penempelan primer pada gen target.
Beberapa  mesin  PCR  juga memiliki  sensitifitas  yang  berbeda, sehingga  secara  umum  kecocokan antara  hasil  kalkulasi  apliksi  secara insiliko  dengan  invitro  terkadang terdapat  perbedaan.  Perbedaan  ini biasanya dapat diatasi dengan percobaan  awal  PCR.  Berdasarkan sekuen  primer  yang  didesain  dengan metode simulasi insiliko menggunakan blast primer pada NCBI,  maka  profil  suhu  prediksi amplifikasi  gen COI untuk  PCR  dari genom kupu-kupu jenis Papilio ulysses diperkirakan sebagaimana tergambar dalam gambar 4.
Gambar 4. Desain profil suhu amplifikasi primer COI pada gen target.
Profil suhu pada gambar 4 dapat diartikan  yakni  :  tahap  persiapan denaturasi  pada  suhu  95 o C  selama lima  menit.  Tahap  denaturasi  selama 30  detik  pada  suhu  95 o C  yang dilanjutkan    dengan annealing pada
suhu  53 o C  selama  30  detik.  Tahap lanjutnya  yakni  pemanjangan  hasil annaealing DNA selama 2 detik pada suhu    72 o C.  Ketiga  tahapan  tersebut terjadi  sebanyak  30x  pengulangan yang dilanjutkan tahap akhir
pemanjangan  pada  suhu  72 o C  selama
10 menit. Suhu akhir 4 o C adalah suhu penyimpanan setelah amplifikasi selesai.
Pengulangan basa/ repeats pada primer  sebaiknya  tidak  memiliki urutan pengulangan dari 2 basa tetapi maksimum pengulangan 2 basa sebanyak 4 kali masih dapat ditoleransi.  Misalnya  ATATATAT. Primer juga sebaiknya tidak memiliki urutan  basa  yang  diulang  terus menerus. Pengulangan basa berurutan sampai 4 kali masih dapat ditoleransi.
Misalnya AGCGGGGGATGGGG memiliki urutan basa G diulang 5 kali berturut-turut.  Secara  manual,  suhu annealing optimum
sangat mempengaruhi  hasil  PCR.  Suhu Optimal  (Ta  Opt)  ini  dapat  dihitung dengan  cara  Ta  Opt  =  0.3  x(Tm  of primer) + 0.7 x(Tm  of product)  –  25. Penggunaan  profil  suhu  PCR  yang didapatkan akan sedikit  berbeda pada mesin yang berbeda. Hal ini umumnya  terjadi  karena  sensitifitas mesin  dan  alat  yang  digunakan  juga berbeda. Perbedaan penting umumnya terjadi pada suhu annealing.
3. Panjang  produk  hasil  PCR  dan suhu optimal
Panjang  basa  produk  hasil  PCR ialah  567  bp.  Panjang  basa  produk DNA target  gen COI yang dihasilkan merupakan  gen  parsial  yakni  hanya 567  bp  dari  1287  bp  gen  target  pada COI.  Ini  merupakan  hasil  terpanjang dibandingkan  dengan  primer  lainnya. Suhu annealing optimal diprediksikan antara  50-55  64  derajat  celsius.    Gen COI khususnya sub  unit  I merupakan salah  satu  gen  yang  umum  dijadikan sebagai  markah  genetik  atau  barkode khususnya  pada  kelompok  hewan. Aka  tetapi,  pada  awalnya  para  ahli juga  mengunakan  gen  COI  dalam
rekonstruksi filogenetik pada
tumbuhan,  misalnya  pada  kelompok tumbuhan  Araucariaceae  (Setoguchi, et al. , 1998) atau pada Angiospermae secara  umum  (Barrachlough,  et  al., 1996). Pada perkembangan selanjutnya,  khusus  pada  tumbuhan digunakan penanda yang lebih spesifik  pada  genom  kloroplas  yakni gen rbc L,  misalnya  pada  analisis filogenetik Genus Mangifera (Suparman,  Pancoro,  dan  Hidayat 2013). Dalam studi filogenetik molekuler,  gen  COI  dapat  digunakan dalam  analisis  karakteristik  genetik antar dan intra spesies (Folmer, et al., 1994). Sekuen DNA barkode memegang  peran  tambahan  yang penting  dalam  alur  kerja  taksonomi sehingga  barkoding  DNA  tidak  dapat tergantikan  untuk  analisis  taksonomi yang  menyeluruh  (Hajibabaei,  Singer &  Hickey,  2007).  Sekuen  DNA  dari beberapa  jenis  tumbuhan  atau  dari beberapa  spesiemen  dapat  digunakan untuk rekonstruksi dan analisis filogenetika.  Filogenetika  merupakan satu  bagian  yang  penting  dalam analisis  taksonomi  yang  menyeluruh, karena menyediakan informasi kekerabatan berdasarkan sejarah evolusi  gen  dan  jenis  dari  masing- masing sampel.
Primer  gen COI yang  telah dibuat  selanjutnya  akan  digunakan dalam  amplifikasi  gen  COI Papilio ulysess dari  beberapa  sampel . Hasil amplifikasi tersebut selanjutnya digunakan  untuk  rekonstruksi  pohon filogenetik  yang  dapat  memberikan informasi  kekerabatan  berdasarkan urutan  DNA  gen COI .  Hal  ini  tentu membutuhkan keakuratan dalam mendesain  dan  menghasilkan  primer
gen COI sehingga  menghasilkan produk PCR yang akurat.
4. Pemanfaatan  sekuen  DNA  primer dan sekuen DNA COI DNA  primer  sangat  penting dalam rangkaian analisis DNA.
Desain  DNA  primer  merupakan langkah awal yang menentukan keberhasilan  analisis  DNA.  Sekuen DNA  primer  akan  digunakan  dalam amplifikasi  dengan  metode  PCR. Hasil  sekuen  gen  yang  didapatkan dapat dimanfaatkan dalam identifikasi spesies, taksonomy dan  analisis kekerabatan. Hasil sekuen DNA yang didapatkan  pada  jenis Papilio  ulysses dari  hasil  PCR  nantinya  akan  dapat digunakan  sebagai  pembanding  dari data  morfologi  dalam  indentifikasi jenis.  Hal  ini  dikarenakan  data morfology  jenis  kupu-kupu  tersebut memiliki kesamaan yang tinggi dengan  jenis  lainnya  berdasarkan pengamatan langsung. Dalam penelitian  lebih  lanjut,  sekuen  DNA gen  COI Papilio  ulysses yang dihasilkan  dari  proses  PCR  nanti dapat  juga  diajukan  menjadi  DNA barcode pada spesies tersebut. Penyediaan sekuen DNA primer dalam konservasi genetik jenis makhluk  hidup  merupakan  salah  satu usaha konservasi secara tidak langsung  dalam  pelestarian  jenis. Sekuen  gen  hasil  amplifikasi  dengan primer PCR yang baik akan menghasilkan sekuen gen yang akurat.  Sekuen  gen  yang  akan dihasilkan,  dalam  hal  ini  gen  COI Papilio ulysses akan sangat membantu  dalam  usaha  pelestarian dan  konservasi  jenis  hewan  endemik
Pulau  Bacan  khsusunya  bagi  jenis kupu-kupu.

## SIMPULAN DAN SARAN
Primer gen COI sub unit I pada kupu-kupu Papilio  ulysses yang optimal  ialah  CGAAAATGACTT TATTCAACA  untuk  primer forward dan AGCAGTAATTCCAACAG CTC  untuk  primer reverse .  Suhu optimal berdasarkan perhitungan DNA calculator ialah 50,74-55,74 o C. Panjang Produk PCR yang
diperkirakan ialah 567 bp.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad,  H.,  Mas'ud,  A.,  Ahmad,  Z.,
2015.  Butterfly  on  the  Island Bacan  North  Mollucas  Province;
How Density. International Journal of  Engineering  Research and  Development .  Volume  11, Issue 01:01-07
Barrachlough,  T.G.,  Harvey,  P.H.,  & Nee,  S.  (1996)  :  Rate  of COI gene  sequences  evolution  and species diversification in flowering plants (Angiospermae). The  Royal  Society .  Proc.  R.  Soc.
Lond. B 263 , 589-591.
BPS Halmahera Selatan. 2015. Halmahera Selatan Dalam Angka .  Badan  Pusat  Statistik Kabupaten Halmahera Selatan.
Braby,  M.F.  (2000).  Butterflies  of Australia:  Their  Identification, Biology and Distribution. CSIRO Melbourne.
Burns, J.M., Janzen, D.H., Hajibabaei, M., Halwachs, W., & Hebert,  P.  D.  N.,  (2007).  DNA Barcodes of Closely Related (But Morphologically And Ecologically Distinct) Species Of Skipper  Butterflies  (Hesperiidae)
Can  Differ  By  Only  One  To Three  Nucleotides. Journal  Of
The  Lepidopterists’  Society :
61(3) :138–153
Claverie,  J.M.,  &  Notredame,  C. (2007) : Bioinformatics for Dummies 2 nd edition.Wiley Publishing, Inc. Indianapolis.
Condamine, F. L., Toussaint, E. F. A.,
Cotton,  A.M.,  Genson,  G.S., Sperling,  F.,  A.H.,  Kergoat,  G. J.,(2012) : Fine-scale biogeographical  and  temporal diversiﬁcation processes of peacock  swallowtails  (Papilio subgenus Achillides) in the Indo- Australian Archipelago. Cladistics 1 : 1–24. 10.1111/j.1096- 0031.2012.00412.x.  The  Willi Hennig Society.
Folmer, O., M. Black, W. Hoch, R. & Lutzand  R.  Vrijenhoek.  (1994). DNA  primers  for  amplification ofmitochondrial cytochrom coxidase  subunit  I  from  diverse metazoan invertebates . Molecular  Marine  Biology  & Biotechnology 3(5):294-299.
Habeeb,  S.K.M.,  &  Sanjayan,  K.P.,
(2011). Sequencing And Phylogenetic  Analysis  Of  The Mitochondrial Cytochrome C
Oxidase Subunit I Of Xycarenus
Laetus (Hemiptera:  Lygaeidae).
International  Journal  of  Plant, Animal and Environmental Sciences, 1(3): 85-92 Hajibabaei,  M.,  Singer,  G.A.C.,
Hebert,  P.D.N  &  Hickey,  D.A.
(2007)  :  DNA  barcoding:  how  it
complements
taxonomy, molecular phylogenetics and population  genetics. Trends  in Genetic. Handoyo. D., dan Rudiretna. A.,(2001).  Prinsip  Umum  dan Pelaksanaan  Polymerase  Chain Reaction  (PCR). Unitas , 9(1): 17-
29.
Hebert,  P.D.N.,  Cywinska,  A.,  Ball, S.L.,  &  DeWaard,  J.R.,  (2003). Biological identiﬁcations through
DNA  barcodes. Proc.  Biol.  Sci .
270: 313–321.
Makhzuni,  R.,  Syaifullah  &  Dahelm.
2013. Variasi Morfometri Papilio polytes L. (Lepidoptera: Papilionidae) di Beberapa Lokasi di Sumatera Barat. Jurnal Biologi
Universitas Andalas ( J. Bio. UA. )
2(1): 50-56. Sands,  D.P.A.,  &  New,  T.R.  (2002) The  Action  Plan  for  Australian Butterflies, Environment Australia, Canberra. Setoguchi,  H.,  Osawa,  T.A.,  Pintaud, J.C.,  Jaffre,  T.  &    Veillon,  J.M., (1998) : Phylogenetic Relationships within Araucariaceae  Based  on COI Gene Sequences, American Journal  of  Botany 85 (11):  1507–
1516.
Suparman,  Pancoro,  A.,  dan  Hidayat,
T., (2013). Phylogenetic Analysis of Mangifera base  on rbcL
sequences , Chloroplast  DNA. Scientific Papers-Series B, Horticulture . LVII: 235-240.