Motilitas dan Viabilitas Spermatozoa Itik Lokal ( Anas platyrhynchos )

## Setelah Penyimpanan Refrigerator dalam Ekstender Dikombinasi Berbagai Konsentrasi Krioprotektan Gliserol
Arie Amelia 1 , Dadang Mulyadi Saleh 2 , Hendro Pramono 1 *, dan Yulia Sistina 1 *
1 Fakultas Biologi, 2 Fakultas Peternakan, Universitas Jenderal Soedirman Kampus Karangwangkal Jl Dr Suparno PO Box 130 Purwokerto 53123 Email: yulia.sistina@unsoed.ac.id

## Diterima Nopember 2012 disetujui untuk diterbitkan Januari 2013

## Abstract
The economic value of ducks has increased one Day Old Duck  in large quantities and short time, effects on artificial insemination technologies improvement. Spermatozoa used for artificial insemination,  could  be derived from sperm preservation biotechnology, by  means to maintain  or  extend  their  viability  and  motility  of  those  spermatozoa.  Extenders  and cryoprotectant  are  needed  for  maintaining  sperm  motility  and  viability  during  storage  or preservation. This st udy aims to assess motility and viability of local ducks spermatozoa after six days srotrage in 3 different extenders (Ringer's lactate, Tris or PBS) in combination with 5 different  concentrations  (0,  2,  4,  6,  and  8%)  of  cryoprotectant  glycerol.  Results  showed  that sperm  motility  and  viability  was  very  highly  significant  (P<0.01)  different  among  treatments, extender  factor  as  well  as  duration  storage  time  also  very  highly  significantly  (P<0.01) affected motility and viability of treated sperm. However, glycerol concentration factor was not significant (P>0.05) affected motility and viability of the sperm. The best treatment, resulted in the highest percentage motility and viability of sperm with progressivity score >1, was the 8% glycerol in PBS storage for up to 2 days (75.00 ± 21.79% and 71.67±14.43%).  This protocol could be applied in artificial insemination trial.
Keywords : local ducks, sperm preservation, motility, viability, glycerol

## Abstrak
Nilai ekonomi itik  lokal yang  makin meningkat, meningkatakn  permintaan jumlah DOD dalam  jangka waktu pendek, efeknya langsung pada pengemabnagan teknologi pembuahan buatan.  Spermatozoa  yang  digunakan  ungtuk  pembuahan  buatan  dapat  berasal  dari bioteknologi  penyimpanan  gamet,  teknologi  memelihara  atau  memperpanjang  viabilitas  dan motilitas  spermatozoa.  Ekstender  and  krioprotektan  dibutuhkan  untuk  memelihara  motilitas dan  viabilitas  spermatozoa  selama  penyimpanan.  Tujuan  penelitian  untuk  menilai  motilitas dan  viabilitas spermatozoa itik lokal setelah penyimpanan 6  hari dalam 3 ekstender berbeda (Ringer's  lactate,  Tris  atau  PBS)  dikombinasi  dengan  5  konsentrasi  (0,  2,  4,  6,  atau  8%) krioprotektan  gliserol  berbeda.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  motilitas  dan  viabilitas secara  sangat  nyata  ( P <0.01)  berbeda  antar  perlakuan,  factor  ekstender  dan  faktor  lama penyimpanan juga sangat nyata ( P <0.01) mempengaruhi motilitas dan viabilitas spermatozoa perlakuan.  Namun,  factor  konsentrasi  gliserol  tidak  nyata  ( P >0.05)  mempengaruhi  motilitas dan  viabilitas  spermatozoa  perlakuan.  Perlakuan  terbaik,  menghasilkan  persentase  motilitas dan viabilitas tertinggi dengan skor progresivitas >1, adalah gliserol 8% dalam PBS disimpan 2  hari  (75.00  ±  21.79%  dan  71.67±14.43%).  Protokol  ini  dapat  diujicobakan  dalam  program inseminasi buatan.
Keywords: itik lokal, penyimpanan spermatozoa, motilitas, viabilitas, gliserol

## Pendahuluan
Itik  lokal  ( Anas  platyrhyncos )
makin diminati masyarakat, oleh karena itu peningkatan produktivitas dibutuhkan  melalui  teknik  inseminasi buatan untuk mengurangi jumlah pejantan  yang  dipelihara.  Inseminasi buatan (IB) yaitu memasukkan spermatozoa  (dalam  semen)  ke  dalam saluran  kelamin  betina  menggunakan alat (Toelihere,1993). Spermatozoa yang digunakan  untuk IB dapat berasal dari  spermatozoa  hasil  penyimpanan.
Teknologi  penyimpanan  spermatozoa ditujukan  untuk  memelihara  motilitas dan viabilitas hingga digunakan, membutuhkan  ekstender  untuk  me- melihara  fungsi  spermatozoa  hingga dibutuhkan.
Ekstender semen yang baik harus merupakan  larutan isotonis , bersifat
buffer (memelihara larutan dari
perubahan pH) dan mengandung nutrisi bagi  kelangsungan  hidup  spermatozoa (Depdiknas,  2001).  Ekstender  yang sering  digunakan  adalah  Ringer  laktat, Tris  dan  PBS.  Larutan  Ringer  laktat mengandung  senyawa  Na-laktat  yang diperlukan  untuk  memenuhi  kebutuhan ion  natrium  bikarbonat  yang  berfungsi untuk  mempertahankan  pH  larutan serta mampu mempertahankan tekanan osmotik larutan dan mengurangi abnormalitas spermatozoa (Sastrodihardjo  dan  Resnawati,  1999). Tris aminomethan atau  Tris  memiliki kelebihan  sebagai  ekstender  karena memiliki kapasitas buffer atau
penyangga  yang  baik  dan  mampu mempertahankan tekanan osmotik karena  mengandung  garam-garam  dan asam  amino  (Gazali  dan  Tambing, 2002). Phosphate  Buffered  Saline (PBS)  berfungsi  untuk  mengatur  pH dan  keseimbangan  osmolaritas  sel dengan  menyediakan  air  dan  ion organik penting (Cytospring, 2012). Untuk penyimpanan spermatozoa, selain ekstender diperlukan krioprotektan untuk mengurangi kerusakan akibat temperatur rendah, misalnya krioprotektan gliserol. Konsentrasi gliserol  yang  sudah  dilaporkan  adalah gliserol  7%  pada  itik  alabio  dan  entog 7%  (Setioko et  al., 2000),  gliserol  5% dan  7%    pada  ayam  (Sopiyana et.  al. , 2006).  Bagaimana  konsentrasi  gliserol dikombinasi ekstender mampu
memelihara  kualitas  spermatozoa  itik lokal  paska  penyimpanan.  Tujuan penelitian  ini  untuk  menilai  motilitas dan  viabilitas  spermatozoa  itik  lokal ( Anas  platyrhyncos )  sebelum  dan sesudah  disimpan  selama  beberapa hari,  dalam  temperatur  refrigerator, dalam ekstender penyimpanan
dikombinasi  dengan  berbagai  kon- sentrasi krioprotektan gliserol.

## Metode Penelitian
Penelitian eksperimental pola faktorial,  tiga  faktor,  rancangan  dasar Rancangan  Acak  Lengkap;  (1)  faktor ekstender,  ada  tiga  taraf,  yaitu  Ringer laktat  (kalsium  klorida  0,2  g/1000  ml, potassium  chloride 0,3  g/1000  ml, sodium  chloride 0,6  g/1000  ml,  sodium laktat  3,1  g/1000  ml), Tris  aminometan (6,64 g Tris hydroxymethyl- aminometan ,  3,72g  asam  sitrat,  2,74g fruktosa, 0,2g ampicilin, 0,2g streptonisin  dan  200  ml  aquades),  dan Phospat  Buffer  Saline /PBS(0,20g  KCl,
0,20g KH 2 PO 4 , 8g NaCl, 2,16g Na 2 PO 4 .7H 2 O  dalam  1  liter  H 2 O);  (2) faktor  krioprotektan  gliserol,  lima  taraf konsentrasi  gliserol  :  0,  2,  4,  6,  dan  8 %; (3) faktor lama  waktu penyimpanan, tujuh  taraf,  yaitu  0,  1,  2,  3,  4,  5  dan  6 hari. Spermatozoa diperoleh dari ejakulat  dengan  metode massage atau urut,  ejakulat  ditampung  menggunakan spuit  1  ml,  untuk  di- swim-up dalam ekstender    selama  30  menit  dalam temperatur  ruang  sesuai  Sistina et  al.
(1993).  Ekstender  penyimpanan  dibuat stok  konsentrasi  gliserol  dua  kali konsentrasi
perlakuan, dalam ekstender.  Pada  hari  eksperimen,  satu volume  stok  ekstender  penyimpanan, ditambah  satu  volume  spermatozoa swim-up (1:1),  dilabel,  untuk  diamati motilitas  dan  viabilitas  sebelum  dan sesudah  disimpan  dalam  refrigerator (temperatur 5 o C). Motilitas dan
progresivitas diamati menggunakan mikroskop  inverted  obyektif  40x,  dinilai proporsi  spermatozoa  bergerak,  0%
(tidak ada spermatozoa yang bergerak) hingga  100%  (semua  spermatozoa bergerak  tidak  dilihat  ada  yang  diam). Progresivitas  motilitas  dinilai  dengan skoring 0-5 sesuai Sistina et al. (1993). Viabilitas  spermatozoa  sesuai  Sistina dan Suryaningsih (2001)  dinilai dengan cara dihitung jumlah spermatozoa yang menyerap warna Trypan Blue
(spermatozoa  mati)  dan  yang  tidak menyerap  warna  transparan  (sebagai spermatozoa  hidup),  dihitung  per  slide minimal  200  ekor.  Data  ditransformasi
ke  akar  kuadrat  lalu  ke  arcus  sinus untuk  dianalisis  sidik  ragam  dengan software SPSS versi 17.

## Hasil dan Pembahasan
Kualitas  ejakulat  sebelum  di- gunakan  sebagai  sampel  dinilai,  dan hanya  ejakulat  dengan  kualitas  baik, sesuai  kriteria  Toelihere  (1993)  dan Partodihardjo  (1992)  yang  digunakan. Hasil pengamatan motilitas sper- matozoa  itik  lokal  dalam  ekstender penyimpanan dikombinasi gliserol selama  penyimpanan  hingga  6  hari, diperoleh  rerata  motilitas  spermatozoa antar  perlakuan  bervariasi,  tertinggi (10%)  setelah  6  hari  disimpan  dalam gliserol  2%  dalam  PBS  (Tabel  1). Setelah disimpan, motilitas sper- matozoa  secara  sangat  nyata  ( P <0,01) menurun,  rerata  tertinggi  diperoleh  dari perlakuan  gliserol  8%  dalam  PBS, penyimpanan  satu  hari  motilitasnya menurun  ke  86%,  lalu  penyimpanan  2, 3,  4,  5,  dan  6  hari  penyimpanan,
menjadi  75,  60,  49,  28,  dan  6  %, berturut-turut (Tabel 1).
Hasil  pengamatan  progresivitas menunjukkan  bahwa  ekstender  Tris, Ringer  lakat,  dan PBS  dari skor 4  hari ke-nol  penyimpanan,  menurun  dan yang skor progresivitas masih memberikan  skor  lebih  besar  dari  satu yaitu  ekstender  Tris  dan  RL,  ekstender PBS skor progresivitas pasca penyimpanan adalah satu. Pro-
gresivitas motilitas skor lebih besar dari satu  (skor  2  atau  3)  diperoleh  hanya hingga  hari  ke 2 penyimpanan. Hari  ke enam penyimpanan skor progre- sivitasnya satu. Hasil analisis membuktikan bahwa ekstender berinteraksi  secara  nyata  ( P <0,05) dengan gliserol dan juga antara gliserol dan  lama  hari  penyimpanan  juga berbeda nyata (P<0,05). Skor progresivitas motilitas dapat me- lengkapi  informasi  persentase  motilitas spermatozoa.
Tabel  1.  Rerata  (±SD)  Persentase  Motilitas  Spermatozoa  Itik  Lokal  ( Anas platyrhynchos )  Sebelum  dan  Sesudah  Penyimpanan  hingga  6  hari  Dalam Ekstender  Penyimpanan  Ringer  Laktat  (RL),  Tris  Amenomethan  (Tris),  atau Phosphate Buffer Salin  (PBS) Dikombinasi Krioprotektan Gliserol Konsentrasi 0- 8%.
Table  1.  Average  (±SD)  Percentage  Motility  of  Local  Duck  (Anas  platyrhynchos)
Spermatozoa  Before  and  After  Storage  In  Preservation  Extender  of  Lactate Ringer (RL), Trishydroxyaminomethane (Tris), or Phosphate Buffer Saline (PBS) in  Combination  With  Cryoprotectant  Glycerol  at  Concentration  0f  0%  to  8% Stored up to 6 days.
Hasil pengamatan viabilitas spermatozoa menunjukkan bahwa setelah penyimpanan,  rerata via- bilitasnya menurun seiring data motilitas  dan  progresivitas.  Viabilitas tertinggi  setelah  6  hari  penyimpanan yaitu  11%  dari  perlakuan  gliserol  8% dalam  PBS  (Tabel  2).  Viabilitas spermatozoa tertinggi pasca pe- nyimpanan  1,  3,  4,  dan  5  hari  yaitu berturut-urut 85%, 58%, 43%, dan 27% dari perlakuan ekstender penyimpanan yang  sama  yaitu  gliserol  8%  dalam PBS  dan  tertinggi  setelah  dua  hari penyimpanan yaitu 73% dari perlakuan gliserol 4% dan 6% dalam Ringer laktat sedikit  lebih  tinggi  dari  perlakuan gliserol  8%  dalam  PBS  =  71.00% (Tabel  2). Hasil analisis  data viabilitas
membuktikan  bahwa  perlakuan  secara sangat  nyata  ( P <0,01)  mempengaruhi viabilitas  spermatozoa.  Faktor  eks- tender  dan  lama  waktu  penyimpanan secara sangat nyata ( P <0,01) menentukan viabilitas. Interaksi ekstender  dan  waktu  penyimpanan nyata  ( P <0,05)  menentukan  viabilitas, serta  konsentrasi  krioprotektan  gliserol juga  interaksi  antara  ekstender  dan gliserol tidak berbeda nyata ( P >0,05).
Hasil  analisis  korelasi  antara data motilitas dan viabilitas sangat erat (nilai  koefisien  korelasi  Pearson  0,95), artinya  spermatozoa  yang  nampak motil berarti juga viabil, atau spermatozoa  yang  diam  tidak  motil berarti tidak viabil.
Tabel  2.  Rerata  (±SD)  Persentase  Viabilitas  Spermatozoa  Itik  Lokal  ( Anas platyrhynchos )  Sebelum  dan  Sesudah  Penyimpanan  hingga  6  hari  Dalam Ekstender Penyimpanan Ringer Laktat (RL), Trishidroksiaminometan (Tris), atau Phosphate Buffer Saline (PBS) Dikombinasi Krioprotektan Gliserol Konsentrasi 0- 8 %.
Table  2.  Average  (±SD)  Percentages  of  Local  Duck  (Anas  platyrhynchos)  Sperm Viability  Before  And  After  Storage  In  Preservation  Extender  of  Lactate  Ringer (RL),  Trishydroxyaminomethane  (Tris),  or  Phosphate  Buffer  Saline  (PBS)  in Combination With Cryoprotectant Glycerol at Concentration 0f 0 to 8 % Stored up to 6 days
Ket : RL: ekstender  ringer  laktat, TRIS:  ekstender tris aminomethan , PBS:  ekstender Phospat Buffer Saline, K= tanpa gliserol, 2G: gliserol 2%, 4G: gliserol 4%, 6G: gliserol 6%, 8G: gliserol 8%
Hasil  uji  lanjut  membuktikan bahwa  ekstender  penyimpanan  Ringer Laktat dengan Tris tidak berbeda nyata ( P >0,05),  Ringer  Laktat  dengan  PBS berbeda  sangat  nyata  ( P <0,01),  Tris dengan  PBS  berbeda  sangat  nyata ( P <0,01), artinya ekstender pe- nyimpanan terbaik adalah PBS. Tingginya  kemampuan  ekstender  PBS dalam menjaga pH larutan di- mungkinkan  akibat  kemampuan  PBS sebagai penyangga tidak bersifat racun bagi spermatozoa, sesuai argumentasi Medicago  (2012)  bahwa  PBS  bersifat isotonik  dan  non  toksik  terhadap  sel dan memiliki kemampuan untuk mempertahankan osmolaritas.
Gliserol  tidak  nyata  ( P >0,05) berbeda  antar  kelima  konsentrasi, membuktikan  bahwa  dengan  atau tanpa  gliserol  motilitas  dan  viabilitas spermatozoa pasca  penyimpanan tidak dipengaruhi.  Hasil  ini  bertentangan dengan  laporan  Rizal et  al. (2003) bahwa  gliserol  dalam  konsentrasi  yang tepat  akan  mengurangi  efek  negatif pada saat penyimpanan, berupa terjadinya peningkatan konsentrasi elektrolit  intraseluler  dan  terbentuknya kristal es, juga tak sesuai Supriatna dan
Pasaribu  (1992)  bahwa  gliserol  baik ikut  melindungi  membran  plasma  sel selama  kriopreservasi, serta Parks dan
Graham (1992) bahwa keutuhan membran plasma sel dilindungi gliserol, memberikan  efek  yang  baik  terhadap motilitas  maupun  viabilitas.  Motilitas spermatozoa  bergantung  pada  ATP hasil  metabolisme,  metabolisme  akan berlangsung dengan baik apabila membran  plasma  sel  ada  dalam keadaan yang  utuh (Park  and Graham, 1992; Gazali, 2001). Bagaimana konsentrasi gliserol menentukan efektifitas  viabilitas  diargumentasikan oleh  Toelihere  (1993),  gliserol  akan berdifusi ke dalam sel spermatozoa dan dipakai spermatozoa untuk meta- bolisme, menggantikan air yang bebas, menurunkan konsentrasi elektrolit intraseluler  serta  mengurangi  daya perusaknya terhadap spermatozoa. Gliserol  dapat  mencegah  kematian spermatozoa  karena  membuat  kristal es  yang  terbentuk  lembut,  sehingga viabilitas  spermatozoa  tetap  terjaga, karena  membran  plasma  tidak  rusak. Dengan demikian, gliserol yang terbukti efektif untuk kriopreservasi, hasil penelitian  ini  membuktikan  sebaliknya
tidak  efektif  untuk  preservasi  atau penyimpanan  6  hari  dalam  temperatur refrigerator.
Faktor lama penyimpanan terbukti bahwa sangat nyata ( P <0,01)
menentukan  motilitas  dan  viabilitas, artinya  semakin lama waktu  pe-
nyimpanan  semakin  menurun  motilitas dan  viabilitas  spermatozoa  perlakuan. Selama disimpan spermatozoa diharapkan tetap hidup, berme- tabolisme menggunakan substrat dalam ekstender penyimpanan (termasuk  gliserol)  dan  hasil  sampah metabolit akan menumpuk seiring  lama waktu  penyimpanan,  dan  meracuni spermatozoa  sehingga  mati.  Hasil  ini sesuai  laporan  Fauzi et  al. (2001) bahwa  lama  penyimpanan  menye- babkan  penurunan  motilitas  karena selama penyimpanan spermatozoa terus  hidup  dan  beraktivitas  dengan memanfaatkan energi hasil metabolism; juga laporan Siudzinska dan Lukaszewicz  (2008),  semakin  lama
penyimpanan  akan  semakin  banyak spermatozoa  yang  mati  yang  akan merubah  pH  menjadi  semakin  asam dan akibatnya akan mematikan spermatozoa  lainnya;  juga  penelitian Saleh  dan  Isyanto  (2011)  bahwa motilitas spermatozoa ayam kate menurun  seiring  lama  penyimpanan. Proses metabolisme spermatozoa akan menghasilkan asam laktat yang semakin tertimbun dan menurunkan pH selama penyimpanan sehingga menyebabkan penurunan motilitas (Toelihere, 1993). Faktor yang mempengaruhi viabilitas semen selama penyimpanan adalah motilitas, konsentrasi  spermatozoa,  dan  pH  atau derajat  keasaman  (Paulenz et  al., 2000). Untuk mengetahui faktor efektivitas medium penyimpanan diperlukan data berupa morfologi spermatozoa  juga  pengukuran  pH medium penyimpanan sebelum, selama dan sesudah penyimpanan.

## Simpulan
Spermatozoa  itik  lokal  pasca penyimpanan dalam medium bergliserol  selama  dua  hari  dalam refrigerator  menggunakan  ekstender PBS  memberikan  hasil  terbaik  dalam memelihara  motilitas  dan  viabilitas.
Konsentrasi gliserol 2-8% sama baiknya  dalam  memelihara  motilitas dan viabilitas spermatozoa itik lokal.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian  ini  terlaksana  dengan bantuan  berbagai  pihak,  terimakasih kepada Yusni Atifah, Chelsy Ryrgiyensi, pak Hartono, Virgian, Wigih, Atang,  Ma’ruf  dan  pak  Sufiriyanto.
Sumber  dana  LPPM  Unsoed  kontrak no. Kept 435/UN23/PN.01.00/2012
antara  Yulia  Sistina  dan  ketua  LPPM Universitas Jenderal Soedirman .

## Daftar Pustaka
Cytospring,  2012. Phosphate  Buffered Saline (PBS). http://www.cytospring.com. diakses  tanggal  27  Desember 2012.
Depdiknas,  2001. Teknik  Inseminasi Buatan  Pada  Ternak .  Modul Program  Keahlian  Budidaya Ternak.  Direktorat  Pendidikan.
Jakarta. Fauzi,  M.A.,  W.  S.  Rachmawati,  dan P.  Edy.  2001.  Pengaruh  Aras NaCl Fisiologis dan Lama Penyimpanan pada Suhu Ruang  Terhadap  Motilitas  dan Abnormalitas Spermatozoa Entog. Jurnal Animal Production 3(2): 45-52. Gazali, M. 2001. Kriopreservasi Semen  Entog  dalam  Upaya Produksi Itik Serati Menggunakan Teknologi Inseminasi Buatan . Tesis . Institut Pertanian Bogor. Gazali M., dan A.  N. Tambing. 2002. Kriopreservasi Sel Spermatozoa. Jurnal  hayati .  9
(1): 27-32.
Medicago,  2012. Phosphate  Buffered Saline (PBS ). http://www.medicago.se.  diakses tanggal 27 Desember 2012. Parks,  J.E.  and  J.  K.  Graham.  1992. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Journal Theriogenology. 38 : 202-222.
Partodiharjo,  S.  1992. Ilmu  Reproduksi
Hewan .  PT.  Mutiara  Sumber Widya. Jakarta. Paulenz,  H.,  E.  Kommisrud  and  P.O. Hofmo.  2000.  Effect  of  long- term storage at different tempertures  on  the  quality  of liquid  boar  semen. Journal
Reprod.  Dom.  Anim. 35:  83  – 85.
Rizal,  M.,  M.  R.  Toelihere,  T.  L. Yusuf,  B.  Purwantara  dan  P. Situmorang. 2003. Kualitas Semen  Beku  Domba  Garut dalam  Berbagai  Ko nsentrasi Gliserol. Jurnal  Ilmu  Ternak Veteriner. 7(3) : 194-199. Saleh, D. M. dan A.  Y. Isyanto. 2011. Pengaruh  Lama  Penyimpanan Terhadap Motilitas dan Fertilitas  Spermatozoa  Ayam Kate Lokal. Cakrawala Galuh 1
(6) : 1-6.
Sastrodiharjo,  S.  dan  H.  Resnawati. 1999. Inseminasi  Ayam  Buras
Meningkatkan  Produksi  Telur Mendukung  Pengadaan  DOC Unggul . Penebar Swadaya. Yogyakarta. Setioko A.  R., P.  Situmorang,  dan E. Triwulansingsih. 2000.
Pengaruh Diluen, Cryoprotectant, dan Waktu Equilibrisasi  Terhadap  Kualitas dan  Fertilitas  Spermatozoa  Itik dan  Entog .  Seminar  Nasional Peternakan dan Veteriner.
Sistina,  Y., M. Lin, and J. C. Rodger. 1993.  Lysophosphatidyl-coline disrupts the acrosome of tammar wallaby ( Macropus eugenii )  spermatozoa. Journal
Mol. Reprod. Dev . 35: 277-284.
Sistina, Y dan S. Suryaningsih. 2001. Viabilitas spermatozoa berbagai spesies setelah perlakuan  in  vitro. Biosfera 18 (2) : 98-106 Siudzinska,  A.,  dan  Lukaszewicz. 2008. Effect of semen extenders  and  storage  time  on sperm  morphology of  four
chicken  breeds .  J.  Appl.  Poul. Res . 17: 101-108. Sopiyana,  S., S. Iskandar, T. Susanti dan D. Yogaswara. 2006 . Pengaruh  Krioprotektan  DMA, DMF Dan Glycerol Pada Proses Pembekuan Semen Ayam Kampung. Seminar Nasional  Teknologi  Peternakan dan Veteriner. Supriatna,  I.  dan  F.  H.  Pasaribu. 1992. In Vitro Fertilisasi, Transfer Embrio dan Pembekuan Embrio . Pusat Antar Universitas. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Toelihere,  M.R.  1993. Inseminasi
Buatan Pada Ternak . Angkasa. Cetakan Ke-3. Bandung.