DOI: 10.24198/jit.v18i1.17307 Unpad Press                                                                                                            Available online at http://jurnal.unpad.ac.id/jurnalilmuternak

## PENGARUH  WAKTU  INKUBASI  PADA  PROSES SEXING SPERMA
BERBASIS GLUTATHIONE TERHADAP MOTILITAS DAN MEMBRAN PLASMA UTUH CHILLED SEMEN DOMBA LOKAL
A. Yusrina 1a , N. Solihati 2 , dan N. Hilmia 2 1 Program studi Reproduksi Ternak, Pascsarjana Fakultas Peternakan Universitas Padjdjaran
2 Staf Pengajar Fakultas Peternakan Universitas Padjdjaran a email : annisaayus@gmail.com

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  waktu  inkubasi  pada  proses sexing sperma berbasis glutathione terhadap  motilitas  dan  membran  plasma  untuh  (MPU) chilled semen  domba lokal.  Proses  pemisahan  sperma  X  dan  Y  dilakukan  dengan  menggunakan  metode  kolom bovine serum  albumin (BSA).  Penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperimental  menggunakan  Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan tiga perlakuan yaitu, 45 menit (T1), 60 menit (T2) dan 75 menit (T3). Data  dianalisis  menggunakan  analisis  ragam  dan  diikuti  dengan  uji  lanjut  berganda  Duncan.  Materi yang  digunakan  adalah  semen  segar  domba  lokal  dengan  motilitas  sperma ≥ 70%  dan glutathione sebanyak  5  mM.  Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa  persentase  motilitas  tertinggi  pada  fraksi  atas (sperma  X)  dan  fraksi  bawah  (sperma  Y)  terdapat  pada  perlakuan  T1  (69,73%  dan  68,82%)  diikuti oleh T2 (66,40% dan 64,55%) dan T3 (57,90% dan 57,65%).  Selain itu, hasil penelitian menunjukan bahwa persentase MPU sperma tertinggi pada fraksi atas dan fraksi bawah terdapat pada T1 (75,00% dan 71,33%), diikuti oleh T2 (69,92% dan 68,42%) dan  T3 (66,92% dan 65,58%). Hasil penelitian dapat  disimpulkan  bahwa  waktu  inkubasi  45  menit  merupakan  waktu  inkubasi  yang  optimum  pada proses sexing sperma berbasis glutathione , sehingga motilitas dan MPU chilled semen sexing domba lokal dapat dipertahankan.
Kata Kunci: waktu inkubasi, sexing sperma, glutathione , semen domba

## Abstract
The  aim  of  this  study  was  to  examine  the  effect  of  incubation  time  on  sexing  process  based  on glutathione to the motility and Intact Plasma Membrane (IPM) of chilled ram semen. The separation of  X  and  Y  sperm  conducted  by  using  BSA  method.  This  research  was  experimental  research  using completely randomized design (CRD) with three treatment namely, 45 minutes (T1), 60 minutes (T2) and  75  minutes  (T3).  Data  were  analyzed  using  Anova  followed  by Duncan's  multiple  range  test . Material used in this research was the fresh semen from ram with sperm motility ≥ 70% and 5 mM of glutathione. The result of this research showed that the highest percentage of motility in upper and bottom  fraction  belong  to  T1 (69.73%  and  68.82%),  followed  by  T2(66.40%  and  64.55%)and T3(57.90% and 57.65%). In a ddition, the result of this research that the highest percentage of IPM in upper  and  bottom  fraction  belong  to  T  (75.00%  and  71.33%),  followed by  T2(69.92%  and68.42%) and    T3  (66.92%  dan  65.58%). It  can  be  concluded  that  the  incubation  time  of  45  minute  is  the optimum  time  on  sexing  process  based  on  glutathione  so  that  the  motility  and  IPM  of  chilled  ram semen can be maintained.
Keywords :incubation time, sperm sexing, glutathione, ram semen
Pendahuluan Teknologi sexing sperma  merupakan teknologi yang dapat membantu menghasilkan keturunan  dengan  jenis  kelamin  sesuai  yang diinginkan,  melalui  proses  pemisahan  antara sperma  pembawa  kromosom  X  dan  sperma
pembawa kromosom Y. Teknik sexing sperma dapat dilakukan dengan menggunakan metode kolom Bovine  Serum  Albumin (BSA) . Prinsip pada  metode  kolom  BSA  yaitu  pemisahan sperma berkromosom X dan sperma berkromosom  Y  berdasarkan  pada  perbedaan
kecepatan  bergerak  (motilitas)  menembus kolom. Keberhasilan proses pemisahan sperma X  dan  sperma  Y  dengan  metode  ini dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor,  salah satunya yaitu lama atau waktu proses inkubasi sperma.  Waktu  inkubasi  yang  terlalu  singkat akan  menghasilkan  proporsi  sperma  X  dan sperma  Y  yang  sedikit,  sedangkan  waktu inkubasi  terlalu  lama  dapat  mengakibatkan peningkatan  kerusakan  pada  sel  sperma sehingga menurunkan kualitasnya.
Proses inkubasi diketahui dapat meningkatkan  produksi  radikal  bebas  yang sangat  berbahaya  bagi  sel  sperma.  Membran plasma  sperma  mengandung  banyak  asam lemak  tak  jenuh  ganda  atau Polyunsaturated Fatty  Acid (PUFA)  yang  sangat  rentan bereaksi  dengan  radikal  bebas.  PUFA merupakan komponen utama membran sperma dalam  menjaga  dan  mempertahankan  kondisi fisiologis  sperma  untuk  bertahan  hidup. Penggunaan glutathione pada  semen  domba dapat  membantu  mempertahankan  kualitas sperma  dari  kerusakan  radikal  bebas  selama proses sexing sperma  dan  bahkan  selama proses  penyimpanan  semen  pada  suhu  5  ºC (ekuilibrasi).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  pengaruh  waktu  inkubasi  pada proses sexing sperma  berbasis glutathione terhadap  motilitas  dan  membran  plasma  utuh chilled semen domba lokal

## Bahan dan Metode
Penelitian  dilakukan  pada  bulan  Maret 2018 di Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi  Buatan,  Faultas  peternakan, UNPAD,  Jatinangor.  Materi  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  yaitu  semen  domba  lokal berumur  3  tahun.  Semen  ditampung  dari domba  jantan  dengan  menggunakan  vagina buatan,  kemudian  semen  segar  di  evaluasi secara  makroskopis  dan  mikroskopis.  Semen yang  memenuhi  standar  (kualitas  baik)  dibagi menjadi  tiga  tabung  dan  diencerkan  1:  4 dengan    larutan Brackett  Oliphant (BO)  yang telah  ditambahkan  5  mM glutathione, kemudian  dilakukan  proses sexing sperma. Media  yang  digunakan  pada  proses sexing sperma  yaitu Bovine  Serum  Albumin (BSA) dengan konsentrasi kolom BSA 5 % dan 10 %.
Semen  yang  telah  diencerkan  kemudian diletakkan di atas permukaan kolom BSA dan di  inkubasi  pada  suhu  37ºC.  Proses  inkubasi
terdiri dari tiga waktu inkubasi yaitu 45 menit (T1),  60  menit  (T2)  dan  75  menit  (T3), masing-masing  perlakuan  diulang  sebanyak enam  kali.  Setelah  proses  inkubasi,  sperma dikoleksi dari masing-masing kolom BSA 5% (sperma X/betina) dan 10% (sperma Y/jantan) dan disimpan didalam tabung untuk kemudian disentrifugasi di dalam medium BO selama 10 menit  dengan  kecepatan  1800  rpm.  Pelet  sel sperma  kemudian  ditambahkan  dengan pengencer tris-kuning telur sebanyak 1 ml dan disimpan disuhu 5 ºC selama 3 jam, kemudian di  evaluasi  kualitasnya  secara  mikroskopis meliputi  motitas  dan  membran  plasma  utuh (MPU).
Evaluasi  motilitas  menggunakan  kamar hitung  neubauer,  sedangkan  MPU  dievaluasi menggunakan larutan HOS test. Pada evaluasi MPU  sperma  yang  diamati  sebanyak  200  sel sperma. Data dianalisis menggunakan ANOVA dan Uji berganda Duncan.

## Hasil dan Diskusi Kualitas Semen Segar Domba Lokal
Evaluasi  kualitas  pada  semen  segar dilakukan untuk menentukan kelayakan semen sebelum  proses sexing sperma.  Evaluasi dilakukan  secara  makroskopik  maupun mikroskopik. Warna, konsistensi dan pH hasil dari  pengamatan  sperma  segar  domba  lokal yang  digunakan  menunjukan  hasil  yang  baik yaitu    warna  krem  (putih  susu),  konsistensi kental dan rataan pH 6,8. Volume semen segar domba lokal memiliki kisaran antara 0,8-1 ml, dengan  rata-rata  volume  0,95  ml,  kemudian rataan  konsentrasi  sperma  total  yang  didapat masih  normal  yaitu  sebesar 321,8  x  10 7 /ml dengan  rataan  motilitas  sebesar  8 3,3%. Kualitas  semen  pada  penelitian  ini  tidak berbeda jauh dengan hasil penelitian Kewilaa, dkk  (2013)  bahwa  rata-rata  volume  semen domba  ekor  tipis  yaitu  0,99  ml,  konsentrasi total  3620,7  x 10 6 /ml  dengan  rataan  motilitas sebesar  75,36% .  Selain  itu,  rataan  MPU  pada semen  segar  yang  digunakan  yaitu  sebesar 83,2%. Berdasarkan hasil pengamatan menunjukkan bahwa semen segar domba lokal yang  digunakan  pada  penelitian  ini  memiliki kualitas yang baik, sehingga dapat disimpulkan  bahwa  semen  domba  tersebut memenuhi  persyaratan  untuk  digunakan penelitian lebih lanjut.
Tabel 1. Rataan Motilitas Chilled Semen Sexing Domba Lokal Perlakuan Fraksi Atas Bawah T1 69,73±2,00 a 68,82±2,00 a T2 66,40±2,14 b 64,55±1,91 b T3 57,90±1,45 c 57,65±2,14 c
Superskrip (a, b, c) yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Motilitas Chilled Semen Domba Lokal Motilitas merupakan salah satu indikator  utama  dalam  menentukan  kualitas semen.  Rataan  persentase  motilitas  pada sperma sexing dengan  tiga  waktu  inkubasi yang  berbeda  setelah  proses  ekuilibrasi disajikan pada Tabel 1.
Berdasarkan hasil anova bahwa perbedaan  waktu  inkubasi  berpengaruh  nyata (P<0,05) terhadap persentase motilitas sperma pada  fraksi  atas  (sperma  X)  dan  sperm  fraksi bawah  (sperma  Y).  Hasil  analisis  duncan menunjukan  persentase  motilitas  pada  semua perlakuan  berbeda  nyata.  Persentase  motilitas sperma  X  dan  sperma  Y  pada  perlakuan  T1 memiliki  persentase  lebih  tinggi  (P<0,05) dibandingkan  dengan  perlakuan  T2  dan  T3. Penurunan motilitas pada perlakuan T2 dan T3 disebabkan  oleh  waktu  inkubasi  yang  terlalu lama,  sehingga  meningkatkan  terjadinya kerusakan  pada  sperma.  Menurut  Storey (2008)  selama  proses  inkubasi  terjadi peningkatan  kadar  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 ) yang  memiliki  sifat  toksik  bagi  sel  sperma serta  merusak  membran  plasma,  sehingga menurunkan  motilitas  sperma.  Berdasarkan penelitian  Sunarti,  dkk  (2016)  bahwa persentase motilitas sperma sapi setelah sexing dengan  waktu  inkubasi  20  menit  pada  lapisan atas  maupun  bawah  (68,5  %  dan  60,27  %) lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  waktu inkubasi 35 menit (66,25% dan 60 %) dan 50 menit  (65%  dan  52,5%).    Selain  itu, berdasarkan  penelitian  Solihati,  dkk  (2017) persentase  motilitas  yang  lebih  tinggi  pada sperma X kambing etawah setalah sexing yaitu pada  waktu  inkubasi  45  menit  (75,89  %), sedangkan  pada  waktu  inkubasi  60  menit  dan 75  menit  mengalami  penurunan,  persentase motilitas  yang  dimiliki  yaitu  70,57%  dan 68,26%.  Hasil  persentase  motilitas  pada penelitian  ini  lebih  rendah  dikarenakan pengamatan  motilitas  dilakukan  setalah penyimpanan selama 3 jam pada suhu 5ºC.
Radikal  bebas  seperti  radikal  hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) diproduksi sel sperma secara alami  karena  sangat  dibutuhkan  dalam  proses kapasitasi  dan  motilitas  sperma,  akan  tetapi jumlahnya yang berlebihan dapat menginisiasi terjadinya  peroksidasi  lipid  (Khotari,  dkk., 2010).  Proses  peroksidasi  lipid  secara  terus menerus  pada  sel  sperma  akan  merusak membran  plasma  bahkan  menyebabkan hilangnya  komponen  PUFA  pada  membran, fungsi  enzim  dan  transporter  membran  yang terlibat  dalam  proses  inisiasi  motilitas  sperma (Nissen  dan  Kreysel.,  1983;  Hsieh,  dkk., 2006).  Membran  plasma  ekor  sperma mengandung banyak kanal ion terutama kanal ion Ca 2+ , kanal ion K + ,dan kanal ion Na + yang dibutuhkan dalam memicu pergerakan flagellum sperma (Asmarinah, 2010).
Berdasarkan  hal  tersebut  dapat  dikatakan bahwa  peroksidasi  lipid  pada  membran  dapat menganggu  proses  transportasi  kanal  ion tersebut kedalam membran sel, yang akhirnya menghambat motilitas sperma.
Proses sexing sperma dengan menggunakan glutathione dapat  membantu mempertahankan motilitas sperma baik setelah proses sexing maupun  setelah  penyimpanan pada  suhu  5  ºC  selama  3  jam.  Menurut  hasil penelitian  Anggrimani  dkk  (2018)  menyatakn bahwa  penggunaan  5  mM glutathione pada pengencer semen beku merupakan konsentrasi yang  cukup  baik  menginisiasi  fungsi mitokondria  yang  secara  langsung  dapat meningkatkan  tingkat  motilitas  sperma. Glutathione merupakan  antioksidan  yang berperan  dalam  mencegah  dan  meredam radikal  bebas  untuk  merusak  membran  sel (Winarsi, 2007). Glutahione akan bekerjasama dengan  antioksidan  alami  yaitu glutathione peroxide (GPx)  dalam  mengubah  radikal hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) menjadi air (H 2 O), sehingga  radikal  tidak  dapat  merusak  struktur membran sel sperma (Meserguer 2007).
Berdasarkan  hasil  penelitian  perlakuan T1  (45  menit)  memiliki  persentase  motilitas
sperma  lebih  tinggi  yaitu  sebesar  69,7%  pada sperma  X  dan  68,8%  pada  sperma  Y. Persentase motilitas pada penelitian ini sejalan dengan  hasil  penelitian  Sianturi,  dkk  (2007) menyatakan  bahwa  sperma sexing dengan waktu  inkubasi  15  menit  tanpa  penambahan glutathione setelah  penyimpanan  2  jam memiliki  persentase  motilitas  sebesar  55% pada  sperma  X  dan  60  %  pada  sperma  Y, sedangkan  pada  sperma sexing dengan penambahan  0,5  mM glutathione memiliki persentase  yang  lebih  tinggi  yaitu  65%  pada sperma X dan 63,9 % pada sperma Y.
Pengaruh  Waktu  Inkubasi  terhadap  MPU Chilled Semen Domba Lokal
Rataan  persentase  MPU  pada  sperma  sperma sexing domba  dengan  tiga  waktu  inkubasi yang  berbeda  setelah  proses  ekuilibrasi disajikan pada Tabel 2.
Berdasarkan  hasil  Anova  perbedaan waktu  inkubasi  berpengaruh  nyata  (P<0,05) terhadap  persentase  MPU  sperma  X  maupun pada  sperma  Y,  sedangkan  hasil  analisis Duncan  persentase  MPU  pada  semua perlakuan berbeda nyata. Sejalan dengan hasil pengamatan  pada  motilitas,  perlakuan  T1 memiliki  persentase  MPU  lebih  tinggi (P<0,05)  dibandingkan  dengan  perlakuan  T2 dan T3. Berdasarkan hasil pengamatan bahwa persentase  MPU  yang  dihasilkan  pada penelitian ini  setelah proses peyimpanan pada suhu  5ºC  selama  3  jam  (ekuilibrasi),  tidak berbeda  jauh  dengan  hasil  penelitian  Solihati, dkk  (2017)  pada  sperma sexing tanpa  proses ekuilibrasi  yaitu persentase MPU pada sperma X  setelah sexing dengan  waktu  inkubasi  45 menit memiliki persentase MPU sebesar 75,89 %  lebih  tinggi  (P<0,05)  dibandingkan  dengan waktu inkubasi 60 dan 75 menit yaitu masing- masing  memiliki  persentase  MPU  sebesar 70,57%  dan  68.26%.  Hasil  penelitian menunjukkan  terjadi  penurunan  persentase MPU  seiring  dengan  adanya  peningkatan waktu  inkubasi.  Menurut  Olmo  dkk,  (2014) bahwa  waktu  inkubasi  yang  terlalu  lama memicu  peningkatan  produksi  radikal  bebas. Radikal  bebas  yang  berlebihan  menyebabkan sperma  mengalami  peroksidasi  lipid  yang dapat  merusak  keutuhan  membran  plasma. Membran plasma yang rusak dapat
menganggu proses metabolisme sperma dalam menghasilkan  energi  untuk  pergerakannya (motilitas).  Fosfolipid  membran  sel  sperma domba  diketahui  banyak  mengandung  PUFA yang  sangat  rentan  terhadap  serangan  radikal bebas. Docosahexaenoic acid merupakan salah satu  komponen  PUFA  yang  paling  aktif bereaksi  dengan  radikal  bebas  bahkan memiliki  tingkat  pembentukan  peroksidasi lipid  dan  senyawa  aldehid  paling  tinggi dibandingkan  komponen  lainnya  (Else  dan Kraffe,  2015).  Peningkatan  peroksidasi  lipid dan  produksi  senyawa  aldehid  seperti malondialdehyde (MDA) dapat mengakibatkan tingginya kerusakan membran, penurunan fluiditas dan meningkatkan permeabilitas (Kothari, dkk., 2010).
Semakin  lama  waktu  inkubasi  maka  semakin banyak  pula  radikal  bebas  yang  dihasilkan sperma.  Radikal  bebas  merupakan  produk sampingan  hasil  metabolisme  sperma.  Proses metabolisme  semakin  meningkat  seiring dengan adanya peningkatan suhu yang dialami sel  sperma  (Susilawati,  2011;  Yuliani  dan Lukman, 2013). Penggunaan glutathione pada pengencer selama proses sexing dan penyimpanan pada suhu 5 ºC dapat membantu menstabilkan  struktur  membran  sperma dengan  cara  meminimalkan  pembentukan radikal  peroksida  dalam  reaksi  peroksidasi lipid.  Menurut  hasil  penelitian  Solihati,  dkk (2018) menyatakan bahwa penambahan 5 mM glutathione pada  pengencer  semen  domba dapat  mempertahankan  kualitas  MPU  sperma selama  proses  ekuilibrasi  dibandingkan dengan  pengencer  semen  tanpa  penambahan glutathione.  Glutathione adalah  senyawa tripeptida yang terdiri dari asam amino glisin, sistein  dan  asam  glutamat,  diketahui  bahwa kandungan  sulfidril  pada glutathione akan meredam aktivitas radikal bebas seperti radikal hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )  dan  radikal hidroksil  yang  dapat  memicu  terjadinya peroksidasi  lipid.  Radikal  hidrogen  peroksida (H 2 O 2 )  yang  terbentuk  akan  diubah  oleh antioksidan  katalase,  kemudian  pada  waktu yang  bersamaan glutathione dan glutathione peroxide (GPx)  saling  bekerjasama  dalam mengubah  radikal  H 2 O 2 melalui  sistem  yang kompleks  (Halliwell  &  Gutteridge  1999; Winarsi 2007) .
Tabel 2. Rataan MPU Chilled Semen Sexing Domba Lokal Perlakuan Fraksi Atas Bawah T1 75,00±2,66 a 71,33±1,32 a T2 69,92±2,61 b 68,42±1,85 b T3 66,92±1,62 c 65,58 ±1,20 c
Superskrip (a, b, c) yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05)

## Kesimpulan
Penggunaan  waktu  inkubasi  45  menit  pada proses  sexing  sperma  berbasis  antioksidan merupakan waktu inkubasi yang optimal untuk menghasilkan  motiltas  dan  MPU  chilled semen  domba  lokal  yang  baik.  Penggunaan glutathione memberikan perlindungan pada sel sperma sehingga kualitas chilled semen domba lokal dapat dipertahankan.

## Ucapan Terimakasih
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Kikin, Bapak Tohan dan rekan-rekan di Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan, Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran yang telah membantu pelaksanaan penelitian ini .

## Daftar Pustaka
Angrimani,  D.S.R.,  M.  Nichi.,  M.M.  Brito., G.K.V.  Kawai.,  B.R.  Rui.,  dan  J.D.A. Losano.,  N.M.G.  Vieira.,  M.C.P. Francischini., D.S.G. Cruz., N. Queiroz- Hazarbassanov.,  C.O.  Massoco.,  dan C.I.  Vannucchi.  2018. The  Use  of Reduced Glutathione (GSH) as Antioxidant for Cryopreserved Sperm in
Dogs. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec Vol 70  No 2: 419-428
Asmarinah.  2010. Peran  Molekul  Kanal  Ion pada  Fungsi  Spermatozoa .    Maj Kedokteran Indonesia, Vol 60 No 8.
Else, P.L dan E. Kraffe. 2015. Docosahexaenoic and Arachidonic Acid Peroxidation:  It's  A  within  Molecule Cascade. Biochimica  et  Biophysica Acta 1848: 417–421
Halliwell  B  &  Gutteridge  JMC  1999
Antioxidant  defence  enzymes:  the glutathione  peroxidase  family .  In:  Free radicals  in  biology  and  medicine,  3 th . Oxford: Oxford University Press : 140– 172.
Hsieh,  Y.Y.,  C.C.  Chang  dan  C.S.  Lin.  2006.
Seminal
Malondialdehyde Concentration  but  Not  Glutathione Peroxidase  Activity  is  Negatively Correlated  with  Seminal  Concentration and  Motility. International  Journal  of Biological Sciences 2: 23-29.
Kewilaa,  A.  I.,  Y.  S.  Ondho.,  dan  E.  T. Setiatin.  2013. Pengaruh  Berbagai  Jenis Pengencer  Air  Kelapa  Muda  dengan Penambahan  Kuning  Telur  yang  Berbeda terhadap  Kualitas  Spermatozoa  Semen Cair  Domba  Ekor  Tipis  (Det) .  Agrinimal, Vol. 3, No. 1: 1-9.
Kothari,  S.,  A.  Thompson.,  A.  Agarwal.,  S.S. Du  Plessis.  2010. Free  Radicals:  Their Beneficial  and  Detrimental  Effects  on Sperm  Function. Indian  Journal  of Experimental Biology Vol 48: 425-435
Meseguer, M., J.A.M. Conejero., L. Muriel, A. Pellicer,  J.  Remohí  and  N.  Garrido.  2007. The  Human  Sperm  Glutathione  System:  A Key  Role  in  Male  Fertility  and  Successful Cryopreservation. Drug Metabolism
Letters, 2007, Vol 1 No 2:  121-126.
Nissen  H.P  And  H.W.  Kreysel.  1983 . Polyunsaturated Fatty Acids in Relation to  Sperm  Motility. Andrologia  15  (3): 264-269.
Olmo, E. D., A. Bisbal., O. G. Alvarez., A. M. Morales., M.  Ramon., P. J. Rabadan.,L. A. Lopez., A. J. Soler., J. J. Garde., dan M.  R.  F.  Santos.  2014. Free-radical production after post-thaw incubation of ram  spermatozoa  is  related  to decreased  in  vivo  fertility .  Journal compilation CSIRO.
Sianturi,  R.  G.,  P.  Situmorang.,  E.
Triwulanningsih dan D.A. Kusumaningrum. 2007. Pengaruh Penambahan Glutathione dan Kolesterol pada Pemisahan Spermatozoa  X  dan  Y  dengan  Metode Kolom Albumin Telur. Seminar
Nasional  Teknologi  Peternakan  dan Veteriner: 207-213.
Solihati,  N.,  Soeparna.,  S.  D.  Rasad.,  dan  R. Ferlianthi.  2017. Proportion  and Quality  of  X-Y  Chromosome  Bearing Sperm  on  Diluted  Semen  after Incubation in Different Time of Etawah Crossbreed  Goat. The  7 th International Seminar on Tropical Animal
Production: 696-701.
Solihati,  N.,  S.D.  Rasad.,  R.  Setiawan.,  E.  N. Foziah.,  dan  E.  T.  Wigiyanti.  2018. Semen  Quality  of  Post-Thawed  Local Ram’s  in  Tris  Egg  Yolk  extender  with Different  Glutathione  Level .  IOP  Conf. Earth and Environmental Science 199. Storey,  B.  T.  2008. Mammalian  sperm metabolism:  oxygen  and  sugar,  friend and foe . Int. J. Dev. Biol. 52: 427-437
Sunarti,  T.  Saili  dan  L.  O.  Nafiu.  2016. Karakteristik  Spermatozoa  Sapi  Bali setelah  Sexing  Menggunakan  Metode Kolom  Albumin  dengan  Lama  Waktu Sexing  yang  Berbeda. JITRO  Vol  1 No.1: 65-76.
Susilawati. T. 2011. Spermatologi . .
Universitas  Brawijaya  Press.  Malang  : 15-45.
Winarsi,H.  2007. Antioksidan  Alami  dan Radikal  Bebas .  Penerbit  Kanisius. Yogyakarta Yuliani E dan H.Y. Lukman. 2013. Aplikasi Sperma Sexing Berbasis Antioksidan Terhadap Kualitas Dan Integritas Membran Serta Daya Fertilitas Induk Sapi Bali . Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 13 : 25-30.