## UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK METANOL MIKROALGA Chlorella sp.

## HASIL KULTIVASI DALAM MEDIUM EKSTRAK TAUGE (MET) PADA TIAP FASE PERTUMBUHAN
A. Ghanaim Fasya 1 , Umi Khamidah 1 , Suci Amaliyah 1 , Siti Khairul B. 1 , dan Romaidi 2
(1) Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang (2) Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang

## ABSTRACT
Chlorella  sp.  is  one  of  microalgae  Chorophyta  that  containing  kinds  of  important  compound  such  as flavonoid, tanin, phenolic compound, terpenoid, chlorophyll and karotenoid. The purpose of this research are to know antibacterial activity from extract of microalgae Chlorella sp. result from extraction with methanol solvent at  each  growth  phase  and  to  know  contains  of  active  compound  group  in  extract  of  microalgae  Chlorella  sp. Chlorella sp. was cultivated in Tauge Extract Medium (TEM) 4 % and harvesting of at ½ exponential phase, ¾ exponential phase, early stationary phase, stationary phase, and end of stationary phase. Extraction microalgae Chlorella sp. was estimated by maceration method using methanol solvent. Extraction microalgae Chlorella sp. was  performed  by  maceration  with  methanol  solvent.  Methanol  extract  from  each  phase  were  tested antibacterial  activity  used  diffusion  method  toward  E.  coli  and  S.  aureus  bacterium.  Identification  of  active compound was estimated by reagent tested on qualitative scale include alkaloid, falvonoid, steroid, triterpenoid, and  tanin.  The  result  showed  that  methanol  extract  of  Chlorella  sp.  which  has  higher  antibacterial  activity  is stationary phase with inhibition zone 9,9 mm toward  E. coli and 12,0 mm toward S. aureus. The results of the identification  of  the  compound  methanol  extract  of  microalgae  Chlorella  sp.contains  a  steroid  and  tanin compound class.
Keywords : Chlorella sp. Antibacterial, Tauge Extract Medium

## ABSTRAK
Chlorella sp. merupakan salah satu jenis  mikroalga  Chlorophyta  yang  mengandung berbagai  senyawa penting  yang  seperti  flavonoid,  tanin,  senyawa  fenolik,  terpenoid,  klorofil  dan  karotenoid.  Penelitian  ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak  mikroalga Chlorella sp. hasil ekstraksi dengan pelarut metanol pada tiap fase pertumbuhan  serta untuk  mengetahui kandungan golongan senyawa aktif dalam ekstrak mikroalga Chlorella  sp.  Chlorella  sp. dikultivasi  dalam  Medium  Ekstrak  Tauge  (MET)  4  %.  Pemanenan Chlorella sp. dilakukan pada fase ½ eksponensial, fase ¾ eksponensial, fase awal stasioner, fase stasioner, dan fase akhir stasioner. Ekstraksi mikroalga Chlorella sp. dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol dari masing-masing fase diuji aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi cakram terhadap bakteri E. coli dan S. aureus . Identifikasi golongan senyawa aktif dilakukan dengan menggunakan uji reagen  secara  kualitatif  yang  meliputi  alkaloid,  flavonoid,  steroid,  triterpenoid,  dan  tanin.  Hasil  penelitian menunjukkan bahwa ekstrak metanol Chlorella sp. yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi adalah pada fase stasioner dengan zona hambat sebesar 9,9 mm terhadap bakteri E. coli dan 12,0 mm terhadap bakteri S. aureus . Hasil  identifikasi  golongan  senyawa  aktif  menunjukkan  bahwa  ekstrak  metanol Chlorella  sp. mengandung golongan senyawa steroid dan tanin.
Kata Kunci : Chlorella sp. , Antibakteri, Medium Ekstrak Tauge.

## I. PENDAHULUAN
Mikroalga  adalah  mikroorganisme fotosintetik  dengan  morfologi  sel  yang bervariasi, baik uniseluler maupun multiseluler  (membentuk  koloni  kecil)
(Becker, 1994). Mikroalga memiliki keunggulan dibandingkan
dengan makroalga  dan  tumbuhan  tingkat  tinggi. Keunggulannya antara lain   hidupnya tidak
tergantung musim, tidak memerlukan tempat  yang  luas,  dan  tidak  memerlukan waktu  yang  lama  untuk  memanennya (Borowitzka, 1988).
Mikroalga  menghasilkan  beberapa vitamin  penting,  seperti  vitamin  A,  B 1 ,  B 2 , B 6 ,  B 12 ,  C,  E,  nikotinamida,  biotin,  asam folat,  dan  asam  pantotenat.  Pigmen  yang dihasilkan meliputi klorofil (0,5 sampai 1 %
dari  berat  kering),  karotenoid  (0,1  sampai 14 % dari berat kering), dan fikobiliprotein (Becker, 1994).
Salah  satu  jenis  mikroalga  dari golongan  Chlrophyta  adalah Chlorella  sp. Chlorella  sp. memiliki  potensi  sebagai pakan  alami,  pakan  ternak,  suplemen, penghasil komponen bioaktif bahan farmasi dan  kedokteran.  Dalam  bidang  pangan dapat  dikembangkan  untuk  pangan  sehat sebagai  sumber  protein,  vitamin,  dan mineral,  dalam  bidang  kedokteran  dapat bermanfaat untuk mencegah  penyakit kanker,  menurunkan  tekanan  darah  tinggi, menurunkan  kadar  kolesterol  darah  dan sebagainya  (Steenblock,  1996).  Komposisi kimia Chlorella sp. terdapat pada Tabel 1.
Tabel 1. Komposisi kimia Chlorella sp.
Komposisi Kimia Chlorella sp. (%) Karbohidrat 20,6 Protein 30,9 Lipid 20,1 Lain-lain 28,4 Sumber : Ben-Amotz, et al. (1987).
Beberapa penelitian melaporkan bahwa Chlorella  sp. merupakan  salah  satu mikroalga  yang  mempunyai  bioaktivitas sebagai  antibakteri.  Sriwardani  (2000) melaporkan  bahwa  ekstrak  kloroform mikroalga Chlorella sp. mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri E.  coli sebesar  46,2  %.  Abedin  dan  Taha  (2008) juga  melaporkan  bahwa  ekstrak  metanol Chlorella pyrenoidosa menghasilkan diameter  zona  hambat  sebesar  10  mm terhadap  bakteri E.  coli dan S.  aureus , sedangkan  ekstrak  etanol  menghasilkan diameter  zona  hambat  sebesar  25  mm terhadap  bakteri E.  coli dan  tidak menghasilkan  zona  hambat  terhadap S. aureus .
Yudha  (2008)  melaporkan  bahwa ekstrak  n-heksana  dan  ekstrak  etil  asetat mikroalga Dulaniella  sp. pada  fase  log terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus , Bacillus cereus , Eschericia coli , dan Vibrio harveyi menghasilkan diameter zona hambat berturut-turut sebesar 3, 4, 3, 5 mm,
serta  2,  2,  2,  3  mm,  sedangkan  ekstrak  n- heksana  dan  ekstrak  etil  asetat  mikroalga Dulaniella  sp. pada  fase  stasioner  terhadap bakteri uji yang sama berturut-turut nilainya adalah 2, 2, 1, 4 mm, serta 2, 3, 2, 4 mm.
Komponen  bioaktif  dari  mikroalga Chlorella  sp. yang  bisa  menghasilkan  efek farmakologis  didapatkan  dari  biomassa Chlorella  sp. Biomassa Chlorella  sp. merupakan akumulasi dari sel Chlorella sp. hasil kultivasi dalam medium kultur. Untuk menghasilkan pertumbuhan mikroalga yang baik  tentu  diperlukan  kondisi  lingkungan dengan  nutrien  yang  sesuai.Faktor-faktor yang  mempengaruhi  keberhasilan  kultivasi Chlorella  sp. adalah  kualitas  air  yang meliputi  suhu,  salinitas,  kekuatan  cahaya, dan pH (Rostini, 2007).
Salah  satu  medium  kultur  yang  bisa digunakan untuk medium kultivasi Chlorella  sp. adalah  Medium  Ekstrak Tauge  (MET).  Medium  Ekstrak  Tauge (MET)  merupakan  medium  kultur  alami yang  mengandung  komponen-komponen yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroalga Chlorella  sp. seperti  nitrogen dan  fosfor . Penggunaan  medium  ekstrak tauge menghasilkan pertumbuhan mikroalga  yang  sangat  pesat  dibandingkan dengan  medium  lainnya  yaitu  Medium  Air Laut  (MAL)  dan  Medium  Guillard  (MG) (Wulandari, et  al. ,  2010).  Medium  Ekstrak Tauge 4 % merupakan medium yang cocok untuk  kultivasi  mikroalga  (Prihantini, 2007).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  aktivitas  antibakteri  ekstrak metanol  mikroalga Chlorella  sp. pada  tiap fase  pertumbuhan  yang  dikultivasi  dalam Medium  Ekstrak  Tauge  (MET)  dan golongan senyawa aktif yang terkandung di dalamnya.

## II. METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia Organik, Bioteknologi Jurusan  Kimia  dan  Laboratorium  Ekologi Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi  UIN  Maulana  Malik  Ibrahim Malang pada bulan Maret – Mei 2013.

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  adalah  isolat Chlorella  sp. dari  Laboratorium  Ekologi UIN  Maulana  Malik  Ibarahim  Malang (bagian  yang  digunakan  adalah  biomassa
Chlorella sp. ). Medium kultur
menggunakan  bahan  tauge  kacang  hijau. Bakteri uji yang digunakan adalah
Escherichia coli dan Staphylococcus
aureus.
Bahan-bahan  kimia  yang  digunakan adalah  metanol p.a ,  media Nutrient  Agar (NA), media Nutrient Broth (NB), penisilin dan  streptomisin,  asam  asetat  anhidrat, kloroform,  H 2 SO 4 pekat,  HCl  2  %,  HCl pekat,  reagen  Dragendroff,  reagen  Mayer, reagen Wagner, larutan  gelatin, FeCl 3 1 %, metanol 50 %, logam Mg, dan akuades.

## Cara Kerja

## Pembuatan  Medium  Ekstrak  Tauge (MET) 4 %
Pembuatan  medium  ekstrak  tauge diawali  dengan  pembuatan  larutan  stok MET  yaitu  100  gram  tauge  direbus  dalam 500  mL  akuades  yang  mendidih  selama  1 jam.  Medium  ekstrak  tauge  dibuat  dengan cara  melarutkan  ekstrak  tauge  ke  dalam akuades dengan masing-masing konsentrasi 4 % (v/v) (Prihantini, et al ., 2005).
Kultivasi Chlorella  sp. dalam  Medium Ekstrak Tauge (MET)
Sebanyak  10  ml  isolat Chlorella  sp. diinokulasikan ke dalam masing-masing 60 ml  media  ekstrak  tauge  dalam  erlenmeyer 1000  mL  yang  ditempatkan  pada  ruang dengan  suhu  25  -  27  °C  dan  ditempatkan pada rak dengan pencahayaan menggunakan lampu TL 36 watt (intensitas cahaya 1000 - 4000 lux) dengan
fotoperiodisitas  14  jam  terang  dan  10  jam gelap (Prihantini, et al ., 2005).
Pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan  pada  proses  kultivasi  selama  15 hari untuk menentukan tiap fase pertumbuhan  dari Chlorella  sp. Medium Ekstrak  Tauge  (MET)  yang  mengandung Chlorella  sp. diambil  menggunakan  pipet
tetes dan diteteskan pada alat Haemacytometer .  Jumlah  sel Chlorella  sp. yang ada dalam kotak hitung Haemacytometer dihitung  secara  berkala setiap 24 jam sekali mulai hari ke-0 hingga hari  ke-15.  Jumlah  sel  yang  diperoleh selanjutnya  dihitung  berdasarkan  rumus sebagai  berikut  (Eaton, et  al .,  2005  dalam Merizawati, 2008) :
𝑁 = 𝑛 𝑥 16 ∑ 𝐾𝑏𝑖 16 𝑖=1 𝑥 1 10 −4
Keterangan : N = Kelimpahan individu (sel/mL) n =  Jumlah sel 16 =  Jumlah kotak kecil ∑ 𝐾𝑏𝑖 16 𝑖=1 =  Jumlah  kotak  kecil  yang diamati pada Haemacytometer 10 -4 =    Volume  air  sampel  yang menutupi  1  kotak  besar pada Haemacytometer
Hasil  perhitungan  tersebut,  dibuat grafik  hubungan  waktu  kultivasi  dengan jumlah sel Chlorella sp.
Pemanenan Biomassa Chlorella sp.
Pemanenan  biomassa  Chlorella  sp. dilakukan pada fase ½ eksponensial, fase ¾ eksponensial,  fase  awal  stasioner,  fase stasioner dan fase akhir stasioner. Pemanenan  dilakukan  dengan  cara  media kultur Chlorella  sp. disentrifugasi  selama 15  menit  dengan  kecepatan  3000  rpm. Biomassa Chlorella  sp. dipisahkan  dari cairannya kemudian dilakukan penimbangan.  Hasil  penimbangan  dicatat sebagai berat basah.
Preparasi Sampel Biomassa Chlorella sp. Sampel  biomassa Chlorella  sp. dari tiap-tiap  fase  pertumbuhan  yang  masih basah  diletakkan  di  wadah  terbuka  yang bentuknya  agak  datar  kemudian  dikering anginkan  pada  suhu  ruang  (25  -  30  °C) menggunakan kipas angin selama ±12 jam.
Selanjutnya  biomassa  yang  sudah  dikering anginkan tersebut ditimbang.
Ekstraksi  Maserasi  Biomassa Chlorella sp.
Biomassa Chlorella sp . dari tiap-tiap fase  pertumbuhan  yang  sudah  kering dimaserasi  menggunakan  pelarut  metanol selama 24 jam dengan perbandingan sampel terhadap pelarut 1 : 5 (w/v) dengan bantuan shaker  ±  5  jam,  kemudian  disaring.  Residu dimaserasi  2  kali  lagi  masing-masing selama 24 jam hingga filtrat yang diperoleh bening,  kemudian  di  saring.  Filtrat  yang diperoleh dikumpulkan dan dirotary evaporator hingga diperoleh ekstrak pekat.
Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol Mikroalga
Chlorella sp. terhadap E. Coli dan S. aureus
a. Pembuatan Media Agar
Sebanyak 2,3 gr Nutrient  Agar (NA) dilarutkan  dalam  100  mL  akuades  dalam beaker  glass  dan  dimasukkan  dalam erlenmeyer  dan  ditutup  kapas.  Media  cair ( Nutrient  Broth )  dibuat  dengan  cara sebanyak  0,9  gr Nutrient  Broth (NB) dilarutkan dalam 100 mL akuades, kemudian  dimasukkan  dalam  erlenmeyer dan  ditutup  dengan  kapas.  Suspensi  media agar  tersebut  dipanaskan  hingga  mendidih lalu  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi. Selanjutnya  disterilkan  dalam  autoklaf selama  15  menit  pada  suhu  121  ºC  dan tekanan 15 psi (per square inchi) (Volk dan Wheeler, 1993).
b. Peremajaan Bakteri
Biakan  murni S.  aureus dan E.  coli digoreskan secara aseptis dengan jarum ose pada  media  padat  agar  miring  dan  tabung media ditutup dengan kapas. Media tersebut diinkubasi selama 18 - 24 jam pada suhu 37 o C di dalam inkubator k emudian diletakkan dalam lemari pendingin.

## c. Pembuatan larutan Biakan Aktif
Satu  ose  bakteri  hasil  peremajaan biakan  murni S.  aureus  dan  E.  coli
dibiakkan  dalam  10  mL  media  cair  (NB) steril dan dihomogenkan.

## d. Uji Aktivitas Antibakteri
Ditambahkan  0,1  mL  larutan  biakan aktif  bakteri E.  coli dan S.  aureus dalam cawan  petri  steril.  Selanjutnya  media  agar padat  10 mL  yang telah  dipanaskan hingga mencair,  didinginkan  sampai  suhu    40  oC, dan  dituang  ke  dalam  cawan  petri  dan dihomogenkan.  Media  dibiarkan  hingga memadat.  Kertas  cakram  (diameter  5  mm) diresapkan  dalam  masing-masing  ekstrak Chlorella  sp. dan  kontrol  (kontrol  positif: penisilin dan streptomisin), (kontrol negatif: pelarut  dan  MET).  Kertas  cakram  tersebut diletakkan di atas permukaan media bakteri menggunakan  pinset  dan  ditekan  sedikit. Media  bakteri  yang  sudah  diberi  bahan antibakteri  diinkubasi  pada  suhu  37  oC selama  18-24  jam  dalam  inkubator. Diameter  zona  hambat  yang  terbentuk diukur  menggunakan  penggaris  untuk menentukan aktivitas antibakteri.
Uji  Golongan  Senyawa  Aktif  dengan  Uji Reagen
Uji golongan senyawa aktif dilakukan dengan uji reagen pada golongan metabolit sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, triterpenoid, steroid dan tanin.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Kultivasi Chlorella  sp. dalam  Medium
Ekstrak Tauge (MET) Kurva pertumbuhan mikroalga
Chlorella  sp. selama  15  hari  ditunjukkan pada  Gambar  1.  Dari  gambar  tersebut terlihat  bahwa  fase  eksponensial  dimulai pada  hari  ke-0  sampai  hari  ke-8  yang ditandai  dengan  jumlah  sel Chlorella  sp. yang terus meningkat. Fase ½ eksponensial terjadi  pada    hari  ke-4  dengan  kelimpahan sel 1.856.000 sel/mL dan fase ¾ eksponensial  terjadi  pada  dan  hari  ke-6 dengan kelimpahan sel 2.656.000 sel/mL.
Fase  stasioner  terjadi  pada  hari  ke-8 sampai  hari  ke-11  ditandai  dengan  laju pertumbuhan Chlorella sp. yang  cenderung konstan.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pada
fase stasioner, sel Chlorella sp. sudah tidak mengalami pembelahan sel secara signifikan  karena  berkurangnya  nutrien yang tersedia.
Gambar 1. Kurva pertumbuhan Chlorella sp. dalam MET
Kelimpahan sel pada hari ke-8 adalah 4.656.000  sel/mL  sehingga  pada  hari  ke-8 merupakan  fase  awal  stasioner  karena jumlah selnya tidak mengalami peningkatan yang  signifikan  dibandingkan  hari  ke-7. Kelimpahan  sel  pada  hari  ke-10  adalah 4.880.000  sel/mL  sehingga  hari  ke-10 merupakan  fase  stasioner.  Kurangnya ketersediaan  nutrien  juga  menyebabkan kelimpahan  sel  cenderung  berkurang  pada hari ke-11 yaitu 4.704.000 sel/mL, sehingga pada hari ke-11 sudah memasuki fase akhir stasioner.
Selama proses kultivasi, kultur Chlorella  sp. juga  mengalami  perubahan warna.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa kepadatan sel Chlorella sp. juga mengalami perubahan. Perubahan warna kultur Chlorella  sp. selama  kultivasi  dapat  dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Perubahan warna kultur Chlorella sp.
Pemanenan Biomassa Chlorella sp. Pemanenan  biomassa Chlorella  sp. dilakukan  pada  tiap-tiap  fase  pertumbuhan
yaitu  fase  ½  eksponensial  pada  hari  ke-4, fase  ¾  eksponensial  pada  hari  ke-6,  fase awal stasioner pada hari ke-8, fase stasioner pada  hari  ke-10,  dan  fase  akhir  stasioner pada hari ke-11.
Preparasi Sampel Biomassa Chlorella sp. Preparasi sampel biomassa mikroalga Chlorella  sp. dilakukan  dengan  cara pengeringanginan selama ±12 jam menggunakan  kipas  angin.  Pengeringan tidak dilakukan dengan menggunakan oven karena  dikhawatirkan  pengovenan  dengan suhu  tinggi  dapat  merusak  senyawa  yang terkandung di dalam biomassa Chlorella sp.
Tabel  2.  Perubahan  massa  biomassa mikroalga
Chlorella sp. setelah pengeringanginan Biomassa mikroalga Chlorella sp. Massa (g) Basah 400 Kering 55 Preparasi sampel dengan cara
pengeringanginan bertujuan untuk mengurangi kadar air pada sampel biomassa Chlorella  sp. Hal  ini  dilakukan agar  kerusakan  akibat  degradasi  oleh mikroorganisme  dapat  diminimalkan  serta mencegah tumbuhnya jamur sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lama dan tidak merusak  komposisi  kimia  di  dalamnya. Rendemen pengeringanginan biomassa basah Chlorella  sp. adalah  14,096  %  yaitu dari  ±400  gram  biomassa  basah,  setelah dikeringanginkan  diperoleh  ±55  gram biomassa  kering  yang  telah  berbentuk serbuk halus.
Ekstraksi  Maserasi  Biomassa Chlorella sp.
Ekstraksi  komponen  aktif  mikroalga Chlorella  sp. dilakukan  dengan  metode maserasi  dengan  pelarut  metanol.  Ekstrak metanol  yang  diperoleh  berupa  ekstrak kental  berwarna  hijau  tua.  Hasil  rendemen ekstrak  metanol  mikroalga Chlorella  sp. dapat dilihat pada Tabel 3.
0 1 2 3 4 5 6 0 5 10 15 20 J u m la h sel ( 1 0 6 sel /m L ) Hari ke- Kurva Pertumbuhan Mikroalga Chlorella sp.
Tabel  3.  Rendemen  ekstrak  metanol mikroalga Chlorella sp.
Mikroalga Chlorella sp. Rendemen (%) Fase ½ Eksponensial 10,273 Fase ¾ Eksponensial 11,525 Fase Awal Stasioner 12,182 Fase Stasioner 7,001 Fase Akhir Stasioner 6,890 Rendemen ekstrak metanol
mikroalga Chlorella  sp. pada  fase  ½ eksponensial  hingga  fase  awal  stasioner mengalami peningkatan. Hal ini disebabkan oleh  produksi  senyawa  hasil  metabolisme pada Chlorella  sp. juga  meningkat.  Pada fase  stasioner  hingga  fase  akhir  stasioner metabolit  yang  dihasilkan  oleh Chlorella sp. cenderung  tidak  bertambah  dan  telah banyak  digunakan  saat  fase  eksponensial, sehingga  rendemen  pada  fase  stasioner lebih kecil dibandingkan fase eksponensial.
Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol Mikroalga
Chlorella sp. terhadap E. Coli dan S. aureus Ekstrak  metanol Chlorella  sp. yang digunakan  untuk  uji  aktivitas  antibakteri adalah ekstrak dari setiap fase pertumbuhan,  yaitu  fase  ½  eksponensial, fase  ¾  eksponensial,  fase  awal  stasioner, fase  stasioner,  dan  fase  akhir  stasioner. Pengujian ini dilakukan pada konsentrasi 15 %  (b/v)  (Agustini  dan  Kusmiati,  2002) dengan  tujuan  untuk  menentukan  ekstrak yang memiliki aktivitas antibakteri terbaik.
Tabel  4.  Hasil  uji  aktivitas  antibakteri ekstrak metanol Chlorella sp.
Ekstrak Metanol
Chlorella sp. Zona Hambat (mm) E. coli S. aureus Fase ½ Eksponensial 6,5 3,3 Fase ¾ Eksponensial 6,7 8,4 Fase Awal Stasioner 7,4 10,6 Fase Stasioner 9,9 12,0 Fase Akhir Stasioner 7,3 11,0
Kontrol Pelarut - - Kontrol Media - - Penisilin 26,0 Streptomisin 19,3
Keterangan : Kontrol negatif : Metanol dan MET. Kontrol positif : Penisilin dan Streptomisin.
Tabel  4  menunjukkan bahwa ekstrak metanol Chlorella  sp. dari  fase  stasioner memiliki aktivitas antibakteri yang tertinggi dibandingkan  dengan  fase  lainnya.  Ekstrak metanol Chlorella  sp. dari  fase  stasioner mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri E.coli dengan  diameter  zona  hambat sebesar  9,9  mm,  sedangkan  pada  bakteri S. aureus adalah 12 mm.
Daya hambat ekstrak metanol Chlorella  sp. dari  fase  stasioner  terhadap bakteri E.coli tergolong  sedang  (5-10  mm) dan bakteri S. aureus tergolong kuat (10-20 mm) (Davis dan Stout, 1971 dalam Yudha, 2008).

## Uji Golongan Senyawa Aktif
Uji  golongan  senyawa  aktif  dengan menggunakan  reagen  menunjukkan  hasil positif  pada  golongan  senyawa  steroid  dan golongan senyawa tanin.
Tabel  5.  Hasil  pengamatan  uji  kandungan golongan  senyawa  aktif  ekstrak  biomassa Chlorella sp.
Golongan Senyawa Hasil Uji pada Ekstrak Metanol Alkaloid - Flavonoid - Tanin + Steroid + Triterpenoid   -
Keterangan: tanda +: terkandung  senyawa tanda - : tidak terkandung senyawa

## Steroid
Pengujian  golongan  senyawa  steroid dilakukan  dengan  penambahan  kloroform, asam  asetat  anhidrat  dan  H 2 SO 4 pekat  ke dalam  larutan  ekstrak.  Penambahan  H 2 SO 4 dilakukan  terakhir  kali  dan  dialirkan melalui dinding tabung sedikit demi sedikit. Ekstrak metanol Chlorella sp. mengandung golongan senyawa steroid karena
menunjukkan adanya perubahan warna dari hijau  kekuningan  menjadi  hijau  kebiruan setelah penambahan reagen tersebut.
Jika  dalam  larutan  uji  terdapat molekul  air,  maka  asam  asetat  anhidrat akan berubah menjadi  asam  asetat  sebelum reaksi berjalan dan turunan asetil tidak akan terbentuk.  Triterpenoid  memberikan  reaksi terbentuknya  cincin  kecoklatan  ketika senyawa  ini  ditetesi  asam  sulfat  pekat melalui dindingnya, sedangkan steroid akan menghasilkan warna hijau kebiruan (Robinson, 1995).
Steroid cenderung bersifat non polar. Golongan senyawa ini terdapat pada ekstrak metanol  (sifat  polar)  dimungkinkan  karena terikat  dalam  bentuk  glikosidanya  dimana unit  steroid  terikat  pada  suatu  gula. Glikosida  adalah  kombinasi  antara  suatu gula  dan  suatu  alkohol  yang  saling berikatan melalui ikatan glikosida.

## Tanin
Pengujian tanin pada ekstrak metanol biomassa Chlorella  sp. pada  penelitian  ini dilakukan  dengan  menggunakan  2  reagen, yaitu  FeCl 3 dan  larutan  gelatin.  Hasil  uji tanin  menggunakan  FeCl 3 adalah  negatif karena  tidak  menunjukkan  adanya  warna hijau  kehitaman  atau  biru  tua.  Sedangkan hasil uji tanin menggunakan larutan gelatin adalah  positif  karena  terbentuk  endapan putih di  dasar tabung pada ekstrak metanol biomassa Chlorella  sp. Endapan  putih terbentuk  karena  adanya  ikatan  hidrogen antara senyawaan tanin dengan gelatin.
Gelatin mengandung
protein sehingga terbentuk senyawa komplek tanin- protein, dikarenakan adanya ikatan hidrogen  antara  tanin  dan  protein  pada gelatin  sehingga  dapat  terbentuk  endapan putih.  Ikatan  hidrogen  ini  terbentuk  dari atom H yang berikatan dengan 2 atom yang memiliki  keelektronegatifan  yang  tinggi seperti  atom  N,  O  dan  F.  Ikatan  hidrogen yang  terbentuk  disebabkan  oleh  atom  H yang terikat dengan 2 atom O ataupun yang terikat  dengan  atom  O  dan  N  dari  struktur tanin dan gelatin.

## IV KESIMPULAN
1. Ekstrak  metanol  mikroalga Chlorella sp. dari  tiap-tiap  fase  mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri E. coli dan S.  aureus .  Zona  hambat  yang dihasilkan  ekstrak  metanol Chlorella sp. pada  fase  ½  eksponensial,  fase  ¾ eksponensial,  fase  awal  stasioner,  fase stasioner,  dan  fase  akhir  stasioner berturut-turut  adalah  6,5  mm,  6,7 mm, 7,4 mm, 9,9 mm, dan 7,3 mm terhadap bakteri E.  coli dan  3,3  mm,  8,4  mm, 10,6  mm,  12,0  mm,  dan  11,0  mm terhadap  bakteri S.  aureus .  Aktivitas bakteri tertinggi ekstrak metanol Chlorella sp. adalah pada fase stasioner.
2. Golongan  senyawa  ekstrak  metanol biomassa Chlorella  sp. adalah  steroid dan tanin.

## V. DAFTAR PUSTAKA
Abedin,  R.  M.  A.  dan  Taha,  H.  M.  2008. Antibacterial and Antifungal Activity of Cyanobacteria and Green
Microalgae,  Evaluation  of  Medium Components  by  Plackett-Burman Design for Antimicrobial  Activity of Spirulina platensis. Global Journal of Biotechnology  and  Biochemistry. Volume 3(1): 22-31.
Agustini,  N.  W.  S.  dan  Kusmiati.  2002.
Identifikasi dan Uji Aktivitas
Antibakteri  Senyawa  Aktif  Secara Maserasi dan Digesti dalam Berbagai Pelarut  dari  Mikroalga  Dulaniella salina. Seminar Nasional IX
Pendidikan Biologi FKIP UNS: 544- 551. Becker.  1994.  Microalgae  Biotechnology and Microbiology. London:
Cambridge University Press.
Ben-Amotz;  Fishler  dan  Schneller.  1987.
Chemical  Composition  of  Dietary
Species  of  Marine  Unicellular  Algae and Rotifers with  Emphasis on Fatty Acid.  Marine  Biology.  Volume  95: 31-36.
Borowitzka,  M.  A.  dan  Lesley,  J.  B.  1988. Microalgae  Biotechnology.  London:
Cambridge University Press. Davis,  W.  W.  dan  Stout,  T.  R.  1971.  Disc Plate  Method  of  Microbiological Antibiotic Assay. Journal of Microbiology. 22(4): 659-665. Eaton, A. D. et al. 1995. Standard Methods for  The  Examination  of  Water  and Wastewater. Washington DC: American Public Health Association. Merizawati.  2008.  Analisis  Sinar  Merah, Hijau dan Biru (RGB) untuk
Mengukur  Kelimpahan  Fitoplankton (Chlorella  sp.)  Skripsi  Diterbitkan. Bogor:  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu Kelautan IPB.
Prihantini,  N.  B.,  Putri,  B.  dan  Yuniati,  R.
2005. Pertumbuhan Chlorella sp. Dalam Medium Ekstrak Tauge (MET) Dengan Variasi pH Awal. Makara,  Sains,  Vol.  9(1)  :  1  - 6. Prihantini,  N.  B.,  Damayanti,  D.  dan Yuniati, R. 2007. Pengaruh Konsentrasi  Medium  Ekstrak  Tauge (MET) terhadap Pertumbuhan Scenedesmus Isolat Subang. Makara, Sains, Vol. (11): 1 - 9. Robinson,  T.  1995.  Kandungan  Senyawa Organik Tumbuhan Tinggi. Terjemahan Prof. Dr. Kosasih
Padmawinata. Bandung: ITB.
Rostini,  I.  2007.  Kultur  Fitoplankton (Chlorella  sp.  dan  Tetraselmis  chuii) pada  Skala  Laboratorium.  Skripsi Diterbitkan.  Jatinangor:  Universitas Padjajaran.
Sriwardani,  T.  2000.  Pemisahan  Ekstrak Intraseluler  dari  Mikroalga  Chlorella sp. dan Penentuan Konsentrasi Hambatan Minimum Terhadap
Bakteri dan Kapang Patogen. Skripsi
Diterbitkan. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Steenblock. 1996. Chlorella Makanan Sehat Alami.  Jakarta:  Gramedia  Pustaka Utama.
Volk,  W.A  dan  Wheeler,  M.F.  1993.
Mikrobiologi  Dasar,  Alih  Bahasa  : Markham. Jakarta: PT. Glora Aksara Pratama.
Wulandari,  A.  P.;  Naderia,  F.;  Pattalia,  A. E.  dan  Permata,  D.  R.  2010. Identifikasi  Mikroalgae  di  Sekitar Pantai  Pangandaran  dan  Potensi Pertumbuhannya pada Formulasi Medium  Ekstrak  Tauge  (MET). Prosiding Seminar Nasional Limnologi V Tahun 2010.
Jatinangor:  Jurusan  Biologi  FMIPA Universitas Padjadjaran. 535-542.
Yudha,  A.  P.  2008.  Senyawa  Antibakteri dari  Mikroalga  Dunaliella  sp.  pada Umur  Panen  yang  Berbeda.  Skripsi Diterbitkan. Bogor: Institut Pertanian Bogor.