## ARTIKEL PENELITIAN

## Ekspresi Relatif mRNA
Hypoxia Inducible Factor-1 α pada Sel Glioma Penderita

## NOVI SILVIA HARDIANY, MOHAMAD SADIKIN, SEPTELIA INAWATI WANANDI
Departement of Biochemistry & Molecular Biology FKUI
Diterima 3 Desember 2012; Direview 12 Desember 2012; Disetujui 21 Desember 2012

## ABSTRACT
Glioma is primary brain tumor which is frequently found in Indonesia. Glioma patient have lower life expectancy due to recurrence and resistance to treatment. Hypoxia is one of factors that influence the response to radiotherapy. This research analyzed the expression of HIF-1 α mRNA, as a hypoxia tissue marker, in low grade glioma compared to high grade glioma. Samples were 15 low grade glioma tissues, 6 high grade glioma tissues and 21 leucocyte cells from a particular glioma patient as a control of normal cell. The relative expression of HIF-1 α mRNA was quantitatively determined using Real Time RT-PCR. The result showed that relative expression of  HIF-1 α mRNA in high grade glioma were higher than low grade glioma, but it was not significant. Surprisingly, there were 73 % samples of low grade glioma which have high HIF-1 α mRNA expression with varying values compared with leucocyte cells as a control.  As well as, relative expression of HIF-1 α mRNA in 100 % high grade glioma samples were higher than the control with varying values. It could be concluded that there are variations in the degree of hypoxia in low grade and high grade glioma that may affect the success of radiotherapy.
Keyword: Glioma, mRNA HIF-1 α , hypoxia

## ABSTRAK
Glioma merupakan tumor otak primer yang cukup sering ditemukan di Indonesia di antara keganasan otak lainnya. Penderita glioma mempunyai angka harapan hidup yang rendah dikarenakan seringnya mengalami resistansi terapi. Hipoksia merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi respons terapi radiasi. Penelitian ini menganalisis ekpresi mRNA HIF-1 α , sebagai petanda jaringan hipoksia, pada glioma derajat rendah dibandingkan dengan glioma derajat tinggi. Sampel terdiri dari 15 jaringan glioma derajat rendah, 6 jaringan glioma derajat tinggi, dan 21 sel lekosit dari penderita glioma sebagai kontrol sel normal. Ekspresi relatif mRNA HIF-1 α ditentukan secara kuantitatif dengan menggunakan Real Time RT-PCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi mRNA HIF-1 α pada glioma derajat tinggi lebih tinggi dibandingkan dengan glioma derajat rendah, namun tidak bermakna secara statistik. Hal yang menarik yaitu ditemukan peningkatan ekspresi mRNA HIF-1 α dengan nilai yang bervariasi pada 73 % sampel glioma derajat rendah dibandingkan dengan sel lekosit sebagai kontrol sel normal. Begitu juga pada glioma derajat tinggi ditemukan peningkatan mRNA HIF-1 α dengan nilai yang bervariasi pada 100% sampel. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa terdapat variasi derajat hipoksia pada glioma derajat rendah dan derajat tinggi yang mungkin mempengaruhi keberhasilan terapi radiasi.
Kata kunci: Glioma, mRNA HIF-1 α , hipoksia
KORESPONDENSI: Dr. dr. Novi Silvia H, MBiomed Departemen Biokimia &
Biologi Molekuler FKUI Jl. Salemba Raya
No. 6 Jakarta Pusat, Telp (021) 3910734 Fax. (021) 3910190 Email: novi_s_h@yahoo.com

## PENDAHULUAN
G lioma  adalah  bentuk  tumor  otak  primer  yang paling sering ditemukan di Indonesia di antara keganasan otak lainnya. Penderita glioma mempunyai angka  harapan  hidup  yang  rendah  karena  sering mengalami  kekambuhan  dan  resistan  terhadap terapi. 1 Berdasarkan  klasifikasi  WHO,  glioma dibedakan menjadi glioma derajat keganasan rendah dan glioma derajat keganasan tinggi. 2 Sampai saat ini,  klasifikasi  WHO  tersebut  tidak  selalu  menjadi indikator  keberhasilan  terapi  radiasi. 3 Renindra et al.,  menemukan  bahwa  penderita  glioma  dengan derajat keganasan yang sama memberikan respons berbeda  terhadap  terapi  radiasi.  Glioma  derajat keganasan rendah menunjukkan respons radioterapi bervariasi,  yaitu  10  –  70  %.  Begitu  pula  dengan glioma  derajat  keganasan  tinggi  menunjukkan respons terhadap radioterapi yang bervariasi antara 30 – 70%. Dengan demikian, kemungkinan terdapat faktor lain yang mempengaruhi respons radioterapi, misalnya  kondisi  hipoksia  sel  tumor. 3 Tumor  solid  pada  manusia,  termasuk  glioma, mempunyai  status  oksigen  yang  kurang  baik dibandingkan dengan jaringan normal. Konsentrasi oksigen pada jaringan normal sekitar 40 – 60 mmHg. Kebalikannya, setengah dari tumor solid menunjukkan nilai kurang dari 10 mmHg, bahkan lebih kecil dari 10%  rentang  nilai  normal. 4 Kondisi  hipoksia  pada sel tumor tersebut akan menurunkan respons jaringan tumor  terhadap  terapi  radiasi  dikarenakan terapi radiasi memerlukan oksigenisasi yang baik. 4,5 Dengan adanya oksigen maka sensitivitas radiasi meningkat 2,5 – 3 kali. Mekanisme sensitisasi tersebut terjadi akibat  terikatnya  oksigen  oleh  radikal  bebas  dan akan membentuk peroksida yang lebih stabil sehingga memfiksasi  kerusakan  DNA  sel  tumor. 6 Hipoksia dapat dideteksi dengan suatu penanda jaringan  hipoksia  yaitu  HIF-1.  HIF-1  adalah  faktor transkripsi yang memegang peranan penting dalam menjaga  keseimbangan  oksigen,  baik  pada  tingkat seluler maupun pada tingkat sistemik. Molekul HIF- 1 merupakan heterodimer yang terdiri dari subunit α dan  subunit β .  Namun,  hanya  subunit α yang stabilitas dan aktivitasnya ditingkatkan pada kondisi hipoksia.  Dengan  demikian,  subunit  ini  yang dipercaya sebagai penanda jaringan yang hipoksia. 7 HIF-1 α sebagai petanda jaringan hipoksia dideteksi pada  kebanyakan  jenis  kanker  padat  seperti  pada kanker otak, kandung kemih, payudara, usus, ovarium, pankreas,  ginjal,  dan  prostat.  Secara  klinis, overekspresi  HIF-1 α bisa  dijadikan  sebagai marker pada penyakit-penyakit dalam kondisi agresif tinggi
dan  sulit  dilakukan  pengobatan.  HIF-1  akan mengaktifkan  gen  yang  memungkinkan  sel  tumor tetap  hidup  dan  berkembang  dalam  kondisi lingkungan  kanker  yang  hipoksik. 4 Pada penelitian ini dilakukan analisis ekspresi mRNA HIF-1 α pada glioma derajat keganasan rendah dan glioma derajat keganasan tinggi. Ekspresi mRNA HIF-1 α tersebut  dapat  menggambarkan  kondisi hipoksia  sel  tumor  yang  diperkirakan  akan mempengaruhi respons sel glioma terhadap terapi radiasi.

## MATERI DAN METODE
Penelitian  ini  merupakan  penelitian cross- sectional yang dilaksanakan di Laboratorium Biokimia & Biologi Molekular FKUI selama 6 bulan (Juni 2008 –  November  2008).  Sampel  terdiri  dari  15  jaringan glioma derajat keganasan rendah,  6 jaringan glioma derajat  tinggi,  dan  21  sel  lekosit  dari  penderita glioma yang sama sebagai kontrol sel normal karena sulit mendapatkan sel otak normal. Kriteria inklusi adalah pasien glioma yang yang didiagnosis glioma dengan  pemeriksaan  radiologi  serta  menjalani operasi  pengangkatan  tumor  dan  bersedia menandatangani informed consent. Kriteria eksklusi yaitu  apabila  hasil  pemeriksaan  Patologi  Anatomi (PA)  tidak  menunjukkan  glioma,  baik  menurut klasifikasi  WHO  ( grade  I-IV)  maupun  tipe  sel.
Sampel  berupa  jaringan  glioma  yang  diambil saat  pasien  menjalani  operasi  serta  darah  vena ( whole blood) yang diambil sebelum pasien menjalani terapi  radiasi  atau  kemoradiasi.  Jaringan  tumor langsung  dihomogenisasi  menggunakan Polytron Homogenizer  atau  disimpan  dalam  deep  freezer pada  suhu  -  80 ° C.  Sel  lekosit  diperoleh  dari  darah vena  pasien  sebanyak  3  mL  dan  disimpan  dalam tabung  EDTA  untuk  mencegah  pembekuan  darah. Sampel  darah  dapat  disimpan  pada  suhu  2  –  8 ° C maksimal selama 24 jam sebelum dilakukan  isolasi RNA. Prosedur pengambilan sampel telah disetujui oleh komite etik Fakultas Kedokteran UI  ( No. 235/ PT.02.FK/ETIK/2006).
Isolasi RNA total dari sel glioma dan sel lekosit menggunakan Aquapure RNA Isolation Kit (BioRad) dengan mengikuti instruksi dari kit. Sampel hidrasi RNA disimpan pada suhu -70 ° C sampai digunakan. Amplifikasi sampel RNA menggunakan iScript One Step RT-PCR Kit with SYBR Green (BioRad). Sintesis cDNA  dan  amplifikasi  dilakukan  pada  tabung  yang sama. Protokol reaksi adalah sintesis cDNA selama 10  minutes  pada  50 ° C,  inaktivasi iScript  Reverse
Ekspresi Relatif mRNA Hypoxia Inducible Factor-1 α pada Sel Glioma Penderita 1--5
transcriptase  selama  5  minutes  pada  95°C,  siklus PCR  (40  siklus)  selama  10  detik  pada  95 ° C;  30 pada 59°C (melalui proses optimasi); 30 detik pada 72 ° C,  analisis Melt  curves  selama  1  menit  pada 95 ° C;  1  menit  pada  55 ° C;  10  detik  pada  55 ° C (80  siklus,ditingkatkan  0,5 ° C  setiap  siklus).  Primer untuk  gen  HIF-1 α adalah  tgatgaccagcaacttgagg ( Forward)  dan  ttgattgagtgcagggtcag  (Reverse) dengan  produk  amplikon  sebesar  157  bp.  18S rRNA  digunakan  sebagai  standar  eksternal ( Housekeeping  gene ),  prosedur  amplifikasi  sama dengan  gen  HIF-1 α .  Primer  untuk  gen  18S rRNA  adalah  aaacggctaccacatccaag  ( Forward)  dan cctccaatggatcctcgtta  ( Reverse)  dengan  produk amplifikasi  155  bp.  Primer  untuk  HIF-1 α dan  18S rRNA didesain menggunakan program Primer3 dan Primer  Analysis  software.  Sekuen  untuk  HIF-1 α
(NM_001530)  dan  18S  rRNA  (X03205)  diperoleh dari NCBI Gene Bank. Aquabidest digunakan sebagai kontrol  negatif  untuk  menghindari  hasil  positif palsu.  Tingkat  ekspresi  mRNA  pada  sel  glioma ditentukan  secara  relatif  dengan  menggunakan rumus  PfaffI.

## HASIL
Pada gambar 1 terlihat hanya satu puncak pada analisis melting  curve  untuk  gen  HIF-1 α (A)  dan gen  18S  rRNA  (B).  Hal  ini  membuktikan  bahwa primer  yang  telah  didesain  spesifik  untuk  HIF-1 α dan 18S rRNA. Hasil elektroforesis produk Real Time RT  PCR  yang  menunjukkan  hanya  satu  pita  untuk gen  HIF-1 α (216  bp)  dan  gen  18S  rRNA  (155  bp) juga mendukung bahwa primer yang telah didesain spesifik  untuk  gen  tersebut.
NOVI SILVIA HARDIANY, MOHAMAD SADIKIN, SEPTELIA INAWATI WANANDI. 1-5
Gambar 1:  Melting Curve gen HIF-1 α (A) dan gen 18S rRNA (B). Hasil elektroforesis produk PCR  pada agarosa 1 % terlihat hanya 1 pita sebesar 157 bp untuk gen HIF-1 α dan 155 bp untuk gen 18S rRNA

## A
B
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi relatif mRNA  HIF-1 α lebih  tinggi  pada  glioma  derajat keganasan tinggi dibandingkan dengan glioma derajat keganasan rendah walaupun tidak bermakna secara statistik (gambar 2). Namun, terdapat hal yang menarik yaitu ditemukan ekspresi mRNA HIF-1 α yang meningkat pada 73% sampel glioma derajat rendah dibandingkan dengan  sel  lekosit  sebagai  kontrol  sel  normal. Peningkatan  mRNA  HIF-1 α pada  glioma  derajat keganasan  rendah  tersebut  bervariasi,  yaitu  20% sampel menunjukkan peningkatan 1,6 – 8,8 kali; 40% sampel menunjukkan peningkatan 10.7 - 20,1 kali dan 13,3% sampel menunjukkan peningkatan 31,2 - 60,02 kali. Sedangkan pada glioma derajat keganasan tinggi ditemukan  peningkatan  mRNA  HIF-1 α pada  100% sampel, walaupun peningkatan ekspresi mRNA HIF- 1 α tersebut juga bervariasi (40% sampel menunjukkan peningkatan 1,6 – 8,8 kali, 20% sampel menunjukkan peningkatan 10,7 – 20,1 kali dan 40% menunjukkan peningkatan 31,2 – 60,02 kali). Variasi tingkat ekspresi mRNA HIF-1 α tersebut dapat dilihat pada tabel 1.
Gambar 2: Tingkat ekspresi relatif mRNA HIF-1α ditemukan lebih tinggi pada glioma derajat keganasan tinggi dibandingkan dengan glioa derajat keganasan rendah (p > 0,05)

## DISKUSI
Penelitian sebelumnya di Departemen Biokimia &  Biologi  Molekuler  FKUI  pada  jaringan  jantung, otak, dan darah tikus yang diinduksi hipoksia sistemik menunjukkan  bahwa  mRNA  HIF-1 α pada  berbagai jaringan  tersebut  semakin  meningkat  apabila
perlakuan hipoksia diteruskan sampai 14 hari. Begitu pula dengan aktivitas HIF-1 α ditemukan meningkat seiring dengan peningkatan mRNA HIF-1 α . 8 Dengan demikian, peningkatan ekspresi mRNA HIF-1 α pada penelitian ini menunjukkan adanya kondisi hipoksia pada  sebagian  besar  sel  glioma.
Hipoksia  pada  sel  tumor  terjadi  karena  adanya area nekrotik, tertutupnya/‘ blocking’ pembuluh darah oleh  sel  tumor  dari  sirkulasi  darah,  kolapsnya pembuluh  darah  akibat  tekanan  intersisial  tumor yang  tinggi,  dan/atau  interupsi  dari  aliran  darah tumor.  Semua  faktor  tersebut  terjadi  karena  sifat alami  tumor  yang  rapuh,  tidak  teratur  serta  kaotik apabila  dibandingkan  dengan  pembuluh  darah jaringan  normal.  Proliferasi  sel  tumor  yang  begitu cepat disertai dengan terbentuknya area yang nekrotik dikarenakan  jarak  di  mana  oksigen  masih  dapat berdifusi  dalam  jaringan  yaitu  sekitar  150 µ m. 9 Tingginya  mRNA  HIF-1 α pada  penelitian  ini menunjukkan  suatu  respons  adaptif  sel  glioma terhadap  hipoksia,  sehingga  sel  glioma  dapat bertahan hidup dalam kondisi yang hipoksik. Evans et al., menunjukkan bahwa microenvironment yang hipoksik  pada  tumor  glia  dapat  mencetuskan modifikasi epigenetik post translasi pada gen tumor supresor seperti p53. Perubahan ini akan menghasilkan disregulasi  aktivitas  translasi  dan downstream pathway tumor glia. 10 Dimerisasi antara HIF-1 α dan HIF-1 β akan memediasi pertahanan sel tumor dalam kondisi hipoksia melalui modulasi lebih dari 40 gen yang terlibat dalam homeostatis glukosa, eritropoiesis, proliferasi,  apoptosis,  dan  angiogenesis. 11 Tingginya kadar relatif mRNA HIF-1 α diduga akan mengurangi sensitivitas sel glioma terhadap terapi radiasi  karena  terapi  radiasi  memerlukan  oksigen. Bachtiary et  al.,  melaporkan  bahwa  pada  kanker serviks,  overekspresi  HIF-1 α berhubungan  secara signifikan  dengan  respons  radiasi  di  mana  pasien dengan  ekspresi  HIF-1 α yang  berlebihan  hanya memberikan respons parsial terhadap terapi radiasi. 12 Selain  itu,  peningkatan  kadar  HIF-1 α pada  kanker serviks  dan  kanker  orofaring  berhubungan  dengan survival pasien, dimana pasein yang mengekspresikan HIF-1 α lebih  tinggi  mempunyai survival  yang rendah. 12,13
Tabel 1: Persentase sampel dengan tingkat ekspresi relatif mRNA HIF-1 α yang bervariasi Glioma % Sampel dengan Tingkat Ekspresi Relatif mRNA HIF-1α Rendah Tetap Tinggi < 0,9 x 0,9 – 1,1 x 1,6 – 8,8 x 10,7 – 20,1 x 31,2 – 60,02 x Derajat Rendah 20 % 6,7 % 20 % 40 % 13,3 % Derajat Tinggi - - 40 % 20 % 40 %
Ekspresi Relatif mRNA Hypoxia Inducible Factor-1 α pada Sel Glioma Penderita 1--5
Variasi  peningkatan  mRNA  HIF-1 α tersebut menunjukkan  perbedaan  derajat  hipoksia  pada  sel glioma,  yang  mungkin  berhubungan  dengan perbedaan respons sel glioma terhadap terapi radiasi. Dengan demikian, variasi peningkatan kadar relatif mRNA HIF-1 α tersebut mungkin dapat menjelaskan penelitian yang telah dilakukan oleh Renindra pada pasien glioma RSCM yang menunjukkan terdapatnya variasi  respons  terapi  radiasi  yang  luas  pada kelompok  glioma  dengan  derajat  keganasan  yang sama. 3 Namun, penelitian lanjutan yang menganalisis hubungan  ekspresi  gen  HIF-1 α dengan  respons terapi, survival dan derajat keganasan perlu dilakukan untuk  mendukung  pernyataan  tersebut.

## KESIMPULAN
Terdapat  variasi  derajat  hipoksia  pada  glioma derajat  rendah  dan  derajat  tinggi  yang  mungkin mempengaruhi  keberhasilan  terapi  radiasi.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Padmosantjojo  RM.  Brain  Tumors  in  Indonesia.  Proceedings  of  the 17 th Asia Pasific Cancer Congress; 2003; Bali, Indonesia
2.  Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 2007;114:97-109.
3.  Aman RA. Identifikasi faktor prediksi radiosensitivitas tumor sel glia: tinjauan  khusus  pada  angiogenesis,  proliferasi  sel  dan  apoptosis sebagai  perangai  biologik  tumor.  [Disertasi].  Jakarta:  Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2008.
4.  Vaupel  P.  Oxygen  transport  in  tumors:  characteristics  and  clinical implications. Adv Exp Biol. 1996; 388:341-51.
5.  Giatromanolaki  A,  Harris  AL.  Tumour  hypoxia,  hypoxia  signalling pathways and hypoxia inducible factor expression in human cancer. Anticancer Res 2001; 21(6B):4317-24
6.  Bristow RG, Hill RP. Molecular and cellular basis of radiotherapy. In: Tannock IF, Hill PH, editors. The basic science of oncology. New York:
Mc. Graw-Hill. Inc.Company, 1998; p. 295-321.
7.  Lee JW, Bae SH, Jeong JW, Kim SH, Kim KW. Hypoxia-inducible factor (HIF-1) α :  its protein stability and biological functions. Exp Mol Med.
2004; 36(1):1-12.
8.  Wanandi  SI,  Dewi  S,  Paramita  R.  Peran  protein  hypoxia  inducible factor-I α (HIF-I α )  terhadap  regulasi  gen  manganese  superoxide dismutase (MnSOD) pada induksi hipoksia sistemik. Oral Presentation. Seminar PBBMI; 15 Agustus 2008; Padang.
9.  Hall EJ, Giaccia AJ. Oxygen effect and reoxygenation. In: Radiobiology for the radiologist. Sixth ed. Lippincott Williams & Wilkins. 2006.p.85- 102.
10. Evans SM, et al. Hypoxia is important in the biology and aggression of human glial brain tumors. Clinical Cancer Research. 2004; 10:8177- 84.
11. Zagorska  A,  Dulak  J.    HIF-1:    the  knows  and  unknows  of  hypoxia sensing. Acta Biochim Polon. 2004; 51(3):563-85.
12. Bachtiary B, Schindl M, Potter R, Dreier B, Knocke TH, Hainfellner JA, Horvat R, Birner P. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1 alpha indicates  diminished  responsse  to  radiotherapy  and  unfavorable prognosis in patients receiving radical radiotherapy for cervical cancer. Clin Cancer Res. 2003; 32:117-20.
13. Aebersold  DM,  Burri  P,  Beer  KT,  Laissue  J,  Djonov  V,  Greiner  RH, Semenza  GL.  Expresion  of  hypoxia-inducible  factor-1 α :  a  novel predictive  and  prognostic  parameter  in  the  radiotherapy  of oropharyngeal cancer. Cancer Res. 2001; 61:2911-6.
NOVI SILVIA HARDIANY, MOHAMAD SADIKIN, SEPTELIA INAWATI WANANDI. 1-5