Pengaruh  Matriks  Kombinasi  Alginat:Gelatin  (2%:1%)  terhadap  Karakteristik  dan  Aktivitas  Antibakteri Mikrosfer Probiotik Lactobacillus acidophilus
Tutiek Purwanti* , Ria Puspita, Tristiana Erawati Departemen Farmasetika, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya
*Corresponding author: tutiek_purwanti@yahoo.com
Submitted: 17 Mei 2019 Accepted: 8 Juli 2019 Published online: 31 Juli 2019

## Abstract
Background : Microspheres is one of the drug delivery systems that can be use for oral or topical delivery. The effectiveness  of  the  microspheres  as  the  drug  delivery  system  is  influenced  by  the  polymer  matrix  component. Objective : The purpose of this study  was to determine the effect of combination matrix sodium alginate:gelatin (2%:1%)  on  the  characteristics  of  probiotic  microspheres  such  as  size,  entrapment  efficiency,  and  this antibacterial  activity. Methods :  The  microspheres  were  made  by  different  matrix  using  combination  matrix sodium  alginate:gelatin  (2%:1%)  (F-I),  probiotic  microspheres  with  3%  sodium  alginate  matrix  (F-II)  and probiotic  microspheres  with  3%  gelatin  matrix  (F-III).  The  probiotic  microspheres  are  made  by  extrusion technique, and dried using an oven. Results : The average particle size of F-I, F-II, and F-III were 8.03 µm, 9.69 µm,  and  5.40  µm,  respectively.  The  entrapment  efficiency  of    F-I,  F-II,  and  F-III  were  77.48%,  84.20%  and 87.93%  respectively,  while  the  antibacterial  activity    obtained  inhibitory  zone  diameter  of  F-I,  F-II,  and  F-III were 11.72 ± 0.58 mm, 9.8 ± 0.57 mm, and 9.27 ± 0.19 mm, respectively. The results of statistical test using the ANOVA method and followed by the HSD test  were known that there were significant differences between  F-I, F-II, F-III. Conclusion : It can be concluded that the probiotic microsphere F-I has a smaller size than F-I and greater  than  F-III.  Probiotic  microsphere  F-I  have  the  lowest  entrapment  efficiency,  but  have  the  greatest antibacterial activity compared to probiotic microsphere F-II and F-III.
Keywords : microsphere, extrusion, sodium alginate, gelatin, probiotic Lactobacillus acidophilus

## Abstrak
Pendahuluan :  Mikrosfer  adalah  salah  satu  sistem  penghantaran  obat  yang  dapat  digunakan  untuk menghantarkan  obat  pada  pemakaian  secara  oral  maupun  topikal.  Efektivitas  mikrosfer  sebagai  sistem penghantar  obat  antara  lain  dipengaruhi  oleh  polimer  penyusun  matriknya. Tujuan :  Tujuan  dari  penelitian  ini untuk mengetahui pengaruh matrik natrium alginate 2% : gelatin 1%  terhadap karakteristik mikrosfer probiotik yaitu  ukuran,  efisiensi  penjebakan,  dan  aktivitas  antibakteri  yaitu  diameter  zona  hambatnya. Metode :  Dibuat mikrosfer probiotik dengan matriks berbeda yaitu kombinasi alginate:gelatin (2%:1%) (F-I), matriks alginat 3% (F-II)  dan  matriks  gelatin  3%  (F-III).  Mikrosfer  probiotik  dibuat  dengan  teknik  ekstrusi  dan  dikeringkan menggunakan oven. Hasil : Hasil pemeriksaan karakteristik menunjukkan bahwa rerata ukuran partikel F-I, F-II, dan F-III berturut-turut adalah 8,03 µm, 9,69 µm, dan 5,40 µm. Efisiensi penjebakan F-I, F-II, dan F-III berturut- turut adalah  77,48 %, 84,20 %, dan 87,93 %. Sedangkan hasil uji aktivitas antibakteri, diperoleh diameter zona hambat F-I, F-II, dan F-III berturut-turut  adalah  11,72 ± 0,58 mm , 9,8 ± 0,57 mm, dan  9,27, ± 0,19 mm. Hasil uji statistik dengan metode ANOVA yang dilanjutkan uji HSD menunjukkan adanya perbedaan signifikan pada ukuran,  efisiensi  penjebakan  maupun    diameter  zona  hambat  antara  mikrosfer  probiotik  F-I,  F-II,  F-III. Kesimpulan :  Disimpulkan  bahwa  mikrosfer  probiotik  F-I  dengan  matriks  kombinasi  alginat:gelatin    (2%:1%) memiliki ukuran yang lebih kecil dari F-I (matriks alginat 3%) dan lebih besar dari F-III (matriks gelatin 3%).
Mikrosfer probiotik F-I memiliki harga efisiensi penjebakan paling rendah, tetapi memiliki aktivitas antibakteri paling besar dibandingkan dengan mikrosfer probiotik F-II dan F-III.
Kata kunci : mikrosfer, ekstrusi, natrium alginat, gelatin, probiotik Lactobacillus acidophilus

## PENDAHULUAN
Probiotik ( Lactobacillus acidophilus ) dalam jumlah  tertentu,  yaitu  ≥  10 7 cfu/g  dapat  memberikan efek  terapi  bagi  kesehatan,  khususnya  saluran pencernaan (Halász, 2009; Flourou-Paneri dkk., 2013). Beberapa  penelitian  yang  telah  dilakukan  juga menunjukkan  bahwa Lactobacillus  acidophilus dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri  penyebab  infeksi kulit  (Šušković  dkk.,  2010;  Lew  &  Liong,  2013).  Hal ini  disebabkan  karena  kandungan  metabolit  dari Lactobacillus  acidophilus yaitu  bakteriosin  dapat bersifat  sebagai  antibakteri.  Sehingga  probiotik  ini sangat  potensial  dikembangkan  untuk  penggunaan topikal  untuk  mengatasi acne , aging , rosaceae , dermatitis,  inflamasi kulit dan  infeksi  bakteri (Lannitti & Palmieri, 2010; Inostroza dkk., 2012).
Permasalahannya  adalah  probiotik  ini  tidak  stabil terhadap faktor suhu, kelembaban, pH, dan stres (Jood dkk.,  2012).  Sehingga  untuk  menjaga  stabilitas  dan memperpanjang  efek  farmakologi  yang  ditimbulkan, melalui  pola  pelepasan  diperlambat  diperlukan  sistem penghantaran  yang  sesuai  yaitu  mikrosfer  (Burgain dkk., 2011; Agnihotri dkk., 2012; Solanki dkk., 2013). Mikrosfer  dibuat  dengan  cara  mengenkapsulasi probiotik  menggunakan  matriks  kombinasi  natrium alginat-gelatin  dengan  penyambung  silang  larutan CaCl 2 .  Dipilih  metode  ekstrusi,  karena  memiliki beberapa  kelebihan  yaitu  sederhana,  murah,  mudah dilakukan, serta tidak menyebabkan kerusakan probiotik,  karena  tidak  memerlukan  suhu  tinggi maupun  pelarut  organik  (Manjanna  dkk,  2010;  Sahil dkk., 2011).
Karakteristik  mikrosfer  probiotik,  dalam  hal  ini ukuran,  efisiensi  penjebakan  dan  aktivitas  antibakteri dipengaruhi  oleh  jenis  dan  konsentrasi  matriks, konsentrasi cross  linker ,  pH  saat  pencampuran  larutan matriks dan suspensi probiotik sebelum proses ekstrusi. Dalam  proses  mikroenkapsulasi  dibutuhkan  suatu matriks  yang  biasanya  berupa  polimer  (Saijala  dkk., 2011).  Natrium  alginat  merupakan  polimer  alam  yang banyak  digunakan  dalam  proses  mikroenkapsulasi karena  sifatnya  yang  biokompatibel,  biodegradabel, larut dalam air, tidak toksik dan relatif murah. Natrium alginat  dapat  membentuk gel dengan kation bervalensi dua  antara  lain  ion  Ca 2+ ,  sehingga  pada  penelitian  ini
digunakan  larutan  CaCl 2 sebagai  bahan  penyambung silang.  Selain  keuntungan  yang  telah  disebutkan, ternyata  alginat  memiliki  kekurangan  yaitu  mikrosfer yang dihasilkan terlalu porus, sehingga kurang optimal dalam  melindungi  probiotik  dari  faktor  lingkungan. Struktur yang porus tersebut juga akan  mengakibatkan kemampuan menjebak probiotik rendah (Chávarri dkk., 2012).  Oleh  karena  itu  diperlukan  polimer  lain  untuk meminimalkan kekurangan tersebut. Gelatin merupakan  polimer  yang  bersifat  biodegradabel, biokompatibel,  stabil  pada  rentang  pH  yang  luas, murah,  memiliki  daya  pengembangan  yang  baik,  dan bisa mengalami sambung silang seperti natrium alginat (GMIA, 2012; Elzoghby, 2013).
Karena sifat amfoternya, gelatin dapat dikombinasikan  dengan  polisakarida  anionik  seperti natrium  alginat  (Li  dkk.,  2009).  Selain  itu  kombinasi natrium  alginat  dan  gelatin  sebagai  matriks  akan mengurangi  porositas,  karena  matriks  yang  terbentuk lebih kompak, sehingga ukuran partikel lebih kecil dan kemampuan menjebak lebih besar (Li dkk., 2009).
Dalam penelitian ini, dibuat tiga macam mikrosfer probiotik  yaitu  F-I  dengan  matriks  kombinasi  natrium alginat:gelatin  (2%:1%),  F-II  dengan  matriks  alginat 3%  dan  F-III  dengan  matriks  gelatin  3%.  Mikrosfer probiotik  ekstrusi  dikeringkan  menggunakan  oven dengan  temperatur  kurang  dari  40 o C.  Selanjutnya dilakukan  pemeriksaan  ukuran  partikel,  efisiensi penjebakan  dan  aktivitas  daya  hambat  terhadap pertumbuhan bakteri uji Staphylococcus auerus dengan mengukur diameter zona hambatnya.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Lactobacillus acidophilus dari Pusat Studi Pangan dan  Gizi  Universitas  Gajah  Mada, Staphylococcus aureus, gelatin  tipe  B  ( Pharmaceutical  Grade ), Natrium  alginat  ( Pharmaceutical  Grade ),  kalsium klorida  ( Food  Grade ),  air  suling  steril,  media de  Man Ragosa  Shorpe (MRS)  Broth  steril, Natrium  Klorida (Pro  Analisis),  Phosphate  Buffer  Salin (PBS)  steril ,
Agar AA ( Food Grade) dan Media Nutrien Agar (NA) steril.

## Alat
Plate  Stirer  (Dragon  Lab  MS  pro) , pH  meter SCHOTT  glass  mainz  tipe  CG  842,  spektrofotometer FTIR  (Jasco  FT-IR/5300),  alat  Ekstrusi,  Mikroskop Optik,  incubator (Memmert INB 500), Colony counter
(Suntex 570), Vortex (Labinco L46), Autoklaf (Huxley HL340), Thermoshaker (Gerhardl  Labshake),  Ultra sentrifugator Hermle Z36HK timbangan analitik, Oven, Cawan Petri, Ȏse, pipet mikro, jangka sorong.
Tabel 1. Formula mikrosfer probiotik Bahan Fungsi F-I F-II F-III *suspensi Probiotik: L. acidophilus Bahan Aktif 10 mL 10 mL 10 mL Gelatin tipe B Matriks 1,5 g  (1%) - 4,5 g (3%) Natrium alginat Matriks 3 g (2%) 4,5 g (3%) - Aquadest Pelarut 140 mL 140 mL 140 mL CaCl 2 1,5 M Cross linker 300 mL 300 mL 300 mL * suspensi probiotik diambil saat jumlah mikroba minimal 10 6 – 10 7 cfu/mL Keterangan:
F-I : Formula mikrosfer  probiotik dengan matriks kombinasi natrium alginat:gelatin (2%:1%) F-II : Formula mikrosfer probiotik dengan matriks natrium alginat 3% (sebagai kontrol) F-III   : Formula mikrosfer probiotik dengan matriks gelatin 3% (sebagai kontrol)

## Pembuatan mikrosfer probiotik
Dibuat  mikrosfer  probiotik  berbagai  formula dengan  matriks  yang  berbeda,  sesuai  komposisi  yang tertera pada Tabel 1. Diukur probiotik 5 mL dari starter yang  sudah  memenuhi  persyaratan.  Disiapkan  larutan natrium alginat dan gelatin dengan cara natrium alginat dan  gelatin  didispersikan  ke  dalam  aquadest  140  mL sambil  terus  diaduk  lalu  disterilisasi  pada  suhu  121 o C selama  20  menit.  Selanjutnya  masukkan  suspensi probiotik  ke  dalam  larutan  natrium  alginat-gelatin sambil  diaduk  sampai  homogen,  lakukan  pemeriksaan jumlah  koloni  menggunakan  metode  Angka  Lempeng Total  (ALT)  sebelum  dilakukan  proses  ekstrusi. Siapkan larutan kalsium klorida 1,5 M 300 mL sebagai larutan  penyambung  silang.  Disemprotkan    campuran suspensi  probiotik  dan  larutan  polimer  melalui noozle yang  di  bawahnya  sudah  ada  media  penampung  yaitu larutan kalsium klorida 1,5 M. Ukuran diameter noozle 45  µm,  jarak  antara noozle dengan  larutan  kalsium klorida 8 cm dan tekanan kompresor 40 Psi. Dilakukan pengadukan selama 1 jam dengan kecepatan 1000 rpm. Mikrosfer yang terbentuk dipisahkan dari larutan CaCl 2 dengan  cara  disentrifugasi  2500  rpm  selama  6  menit, lalu  dicuci  dengan  air  steril,  sampai  bebas  CaCl 2 . Dilakukan  penyaringan  dan  mikrosfer  probiotik  yang diperoleh  dikeringkan  menggunakan  oven  pada  suhu 40 o C selama  30  jam  (Poshadri  &  Kuna, 2010; Prasant dkk., 2011).
Penentuan ukuran partikel
Pengukuran ukuran partikel dilakukan menggunakan mikroskop optik yang dilengkapi dengan
micrometer okular dan obyektif (Martin, 2002) dengan sampel 300 partikel mikrosfer.

## Uji efisiensi penjebakan
Uji  efisiensi  penjebakan  dilakukan  menggunakan metode  Angka  Lempeng  Total  (ALT).  Uji  efisiensi penjebakan  dilakukan  untuk  melihat  adanya  pengaruh proses pembuatan mikrosfer terhadap viabilitas bakteri. Ditimbang  0,5  gram  mikrosfer  probiotik,  kemudian didispersikan  ke dalam 50  mL  larutan PBS steril  pada pH  7,4  dan  di shaker selama  2  jam.  Selanjutnya dilakukan  pengenceran  10x,  dan  dilakukan  plating pada media MRS agar. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam. Perhitungan jumlah koloni bakteri probiotik  diekpresikan  dengan  menggunakan  satuan colony  forming  units (cfu)/gram  (Mokarram  dkk., 2009).  Efisiensi  penjebakan  merupakan  perbandingan antara  jumlah koloni  sesudah dibuat  mikrosfer dengan jumlah  koloni  sebelum  dibuat  mikrosfer  dikalikan 100%.

## Uji aktivitas antibakteri Preparasi media uji
Bahan  media  nutrien  agar  (NA)  sebanyak  ±  23 gram dilarutkan didalam ± 1 liter air suling dan diaduk hingga homogen. Larutan dipanaskan dengan pemanasan  perlahan,  hingga  mendidih  selama  satu sampai  dua  menit.  Larutan  yang  sudah  homogen dituang  kedalam  wadah  dan  disterilkan  pada  suhu 121°C selama 15 menit.
Bahan  media nutrien  broth (NB)  sebanyak  ±  8 gram dilarutkan kedalam ± 1 liter air suling dan diaduk
hingga homogen. Larutan dipanaskan dengan pemanasan perlahan hingga mendidih selama satu atau dua  menit.  Setelah  homogen  larutan  dituang  kedalam wadah  dan  disterilkan  pada  suhu  121°C  selama  15 menit.

## Penyiapan sampel
Ditimbang  200  miligram  mikrosfer  probiotik, dicampur  dengan  10  mL  larutan  PBS  7,4  steril  dan  di shaker selama 2 jam.

## Penyiapan inokulum bakteri
Sebanyak 1 kawat Öse biakan murni S. aureus dari stok  biakan  dimasukkan  pada  media  NB.  Kemudian tabung disimpan dalam inkubator suhu 37°C selama 24 jam.  Sebanyak  5  mL  larutan  garam  fisiologis  (salin) ditambahkan ke dalam tabung, dikocok sampai seluruh biakan  terlepas  sehingga  didapatkan  1,4  x  10 8 cfu. Biakan  setara  dengan  absorban  0,885  diukur  dengan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  580  nm sampai  diperoleh  transmitan  25%  (Johnson  &  Levin, 2013).
Uji aktivitas daya hambat terhadap

## Staphylococcus aureus
Disiapkan  2  buah  tabung  reaksi  yang  masing- masing  berisi  media  NA  steril  sebanyak  8  mL  ( seed layer )  dan  10  mL  ( base  layer ).  Media base  layer dituangkan  kedalam  cawan  petri  steril,  dibiarkan memadat.  Masukkkan  3  µm  inokulum S.  aureus kedalam  tabung seed  layer pada  suhu  40  -  45°C, kemudian di vortex. Selanjutnya dituang secara merata pada  permukaan base  layer dalam  cawan  petri  dan biarkan  memadat.  Dibuat  lubang  atau  sumuran  pada agar dengan pipa pencetak sesuai dengan ketentuan. Isi masing-masing  lubang  tersebut  dengan  50  µL  yaitu  1 (kontrol  positif),  1  (kontrol  negatif),  1  (suspensi probiotik), 3  (sampel  F-I),  3  (sampel  F-II),  dan  3
(sampel F-III), kemudian  cawan petri dibungkus kertas dan  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  24  jam. Diameter  zona  terang  yang  terbentuk    diamati  dan diukur    menggunakan  jangka  sorong  (milimeter). Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik gentamisin sulfat,  sedangkan  kontrol  negatif  adalah  semua  bahan dalam  formula  selain  suspensi  probiotik.  Pengujian dilakukan  tiga  kali  replikasi  untuk  masing-masing sampel uji.

## Analisa data
Pengolahan  data  karakteristik  yaitu  ukuran, efisiensi  penjebakan  dan  aktifitas  anti  bakteri L. acidophilus dilakukan  secara  statistik  dengan  metode analisis  varian one  way ANOVA,  yang  dilanjutkan dengan  uji Honesty  Significant  Difference (HSD) Tukey dengan derajat kepercayaan 0,95 (α = 0,05).

## HASIL DAN PEMBAHASAN Morfologi mikrosfer probiotik
Dari  hasil  pengamatan  mikrosfer  probiotik  yang dilihat  di  bawah  mikroskop  optik  perbesaran  400x terlihat  mikrosfer  yang  sferis.  Hal  ini  disebabkan karena  pada  proses  pembuatan  larutan  polimer- probiotik    disemprotkan  melewati  lubang/pori  dengan ukuran    tertentu,  sehingga  membentuk droplet cair yang  sferis  dan  ketika  mengalami  pemadatan  akibat proses  sambung  silang  menghasilkan  mikrosfer  yang sferis juga (Joshi dkk., 2012).
Distribusi ukuran mikrosfer probiotik Hasil pengukuran mikrosfer probiotik menggunakan  mikroskop  dengan  skala  okuler  10  dan skala  objektif  40.  Digunakan  300  partikel  pada  setiap kali  pengukuran.  Hasil  penentuan  ukuran  partikel diperoleh  rerata  ukuran  mikrosfer  probiotik  seperti yang tercantum pada Tabel 2 berikut.
Tabel 2. Rerata ukuran mikrosfer probiotik Mikrosfer Probiotik Rata-rata Ukuran (µm) F-I   (Alginat:Gelatin (2%:1%)) 8,03 F-II  (Alginat 3%) 9,69 F-III (Gelatin 3%) 5,40
Rerata ukuran mikrosfer probiotik F-I, F-II, dan F- III  berturut-turut  adalah  8,03  µm,  9,69  µm,  dan 5,40  µm.  Ukuran  partikel  terkecil  pada  F-III  yaitu mikrosfer  probiotik  dengan  matrik  gelatin  3%  dan ukuran  terbesar  adalah  pada  F-II  yaitu  mikrosfer probiotik  dengan matrik natrium  alginat  3%. Sedangkan  F-I  yaitu  mikrosfer  probiotik  dengan matriks  kombinasi    natrium  alginat:gelatin  (2%:1%) memiliki ukuran  lebih besar dari F-III, lebih kecil dari
F-II.  Natrium  alginat  tersusun  atas  asam  guluronat (blok  G)  dan  manuronat  (blok  M).  Pada  proses sambung silang terjadi interaksi antara ion Ca 2+ dengan gugus  karboksil  pada  asam  guluronat  yang  saling berdekatan saja, sedangkan gugus karboksil pada asam manuronat  tetap  berjajar  horizontal  dalam  keadaan bebas,  sehingga  menyebabkan ukuran partikel  natrium alginat  lebih  besar  dibandingkan  dan  struktur  yang terbentuk  porus.  Sedangkan  pada  mikrosfer  probiotik
F-I  dengan  matriks  kombinasi  natrium  alginat-gelatin terbentuk struktur yang lebih kompak dengan porositas yang  rendah.  Sehingga  mikrosfer  yang  terbentuk memiliki ukuran lebih kecil.
Berdasarkan  distribusinya,  ukuran  dari    mikrosfer probiotik  F-I,  F-II,  dan  F-III  berkisar  antara  3  sampai 15  mikron,  sehingga  masih  memenuhi  persyaratan ukuran  untuk  mikrosfer  dengan  tujuan  penggunaan topikal.
Tabel 3 . Hasil perhitungan log ALT Lactobacillus acidophilus Formula ALT (cfu/mL) log ALT (cfu/mL) Sebelum dibuat mikrosfer Setelah dibuat mikrosfer Sebelum dibuat mikrosfer Setelah dibuat mikrosfer F-I 9,37 x 10 7 ± 3,51 x 10 6 1,15 x 10 6 ± 7,4 x 10 4 7,97 ± 0,01 6,06 ± 0,02 F-II 1,58 x 10 7 ± 1,07 x 10 6 1,08 x 10 6 ± 7,35 x 10 4 7,20 ± 0,03 6,03 ± 0,03 F-III 7,60 x 10 6 ± 7,94 x 10 5 1,02 x 10 6 ± 1,39 x 10 4 6,88, ± 0,04 6,01 ± 0,00
Keterangan: Data merupakan rata-rata dari replikasi 3x ± SD
Dari  Tabel  3  diketahui  bahwa  terjadi  penurunan jumlah koloni pada masing-masing mikrosfer probiotik,  sebagai  akibat  proses  ekstrusi.  Nilai  ALT terkecil terjadi pada F-III, namun  jumlah koloni ketiga mikrosfer  probiotik  masih  memenuhi  persyaratan viabilitas  yang  dibutuhkan  yaitu  10 6 -  10 7 cfu/mL (Flourou-Paneri dkk., 2013).
Tabel 4 . Efisiensi penjebakan mikrosfer probiotik Mikrosfer Probiotik Efisiensi Penjebakan (%) F I 77,48 ± 0,17 F II 84,20 ± 0,16 F III 87,93 ± 0,43 Keterangan:  Data  merupakan  rata-rata  dari  replikasi
3x ± SD
Dari  Tabel 4  dapat diketahui  bahwa  ada pengaruh proses  pembuatan  mikrosfer  terhadap  viabilitas Lactobacillus  acidophilus dalam  mikrosfer  yaitu terjadinya  penurunan  viabilitas  yang  ditunjukkan adanya penurunan jumlah koloni bakteri.
Efisiensi  penjebakan  diperhitungkan  sebagai jumlah  koloni  bakteri  sesudah  proses  (terjebak  dalam mikrosfer)  dibagi  dengan  jumlah  koloni  sebelum dilakukan  proses  ekstrusi  kemudian  dikalikan  100  %. Hasil  perhitungan  koloni  dengan  metode  ALT diperoleh  nilai  ALT  mikrosfer  probiotik  F-I,  F-II  dan F-III sebelum  ekstrusi  berturut-turut  adalah  9,37  x  10 7 ± 3,51 x 10 6 cfu/g, 1,58 x 10 7 ± 1,07 x 10 6 cfu/mL, dan 7,60 x 10 6 ± 7,94 x 105 cfu/mL. Nilai ALT dari ketiga formula  memenuhi  syarat  jumlah  probiotik  sebagai antibakteri  yaitu  10 6 -  10 7 cfu/mL  (Flourou-Paneri dkk.,  2013).  Nilai  ALT  F-I,  F-II  dan  F-III  setelah proses ekstrusi berturut-turut adalah 1,15 x 10 6 ± 7,4 x 10 4 cfu/mL, 1,08 x 10 6 ± 7,35 x 10 4 cfu/mL, dan 1,02 x 10 6 ±  1,39  x  10 4 cfu/mL.  Dari  data  ini  dapat disimpulkan bahwa ada pengaruh pembuatan mikrosfer terhadap  efisiensi penjebakan  bakteri  yaitu  mengalami penurunan jumlah bakteri yang hidup. Hasil penentuan
efisiensi  penjebakan  dari  ketiga  mikrosfer  berturut turut formula I, II, dan III adalah 77,48%, 84,20%, dan 87,93%. Hasil analisa statistik dengan One Way Anova dan post hoc HSD, diketahui bahwa terdapat perbedaan signifikan  pada  ketiga  mikrosfer  probiotik.  Efisiensi penjebakan  terendah  terjadi  pada  mikrosfer  probiotik F-I  dan  tertinggi  pada  mikrosfer  probiotik  F-III. Namun  ketiga  mikrosfer  probiotik  masih  memenuhi ketentuan viabilitas yang dipersyaratkan.

## Uji aktivitas antibakteri mikrosfer probiotik
Uji  aktivitas  antibakteri  dilakukan  menggunakan bakteri  uji S.  aureus dengan  cara  mengukur  diameter zona hambatnya. S. aureus adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan infeksi pada kulit. Hasil pengukuran  diameter  zona  hambat  ketiga  formula mikrosfer  probiotik  dapat  dilihat  pada  Tabel  5. Diameter  zona  hambat  mikrosfer  probiotik  F-I,  F-II, dan F-III berturut turut adalah 11,72 ± 0,58 mm, 9,8 ± 0,57  mm,  dan  9,27  ±  0,19  mm.  Setelah  dilakukan analisa  statistik One  Way Anova  dilanjutkan post hoc HSD, terdapat perbedaan signifikan aktivitas antibakteri  pada  ketiga  mikrosfer  probiotik  tersebut. Mikrosfer  probiotik  dengan  matriks  kombinasi  alginat dan  gelatin  memberikan  aktivitas  yang  lebih  besar dibanding  formula  dengan  polimer  tunggal,  baik natrium alginat 3% maupun gelatin 3%. Diameter zona hambat tertinggi dihasilkan oleh mikrosfer probiotik F- I yaitu sebesar 11,72 ± 0,58 mm.
Tabel 5 . Diameter zona hambat mikrosfe probiotik
Mikrosfer Zona Hambat (mm) Mikrosfer F-I 11,72 ± 0,58 Mikrosfer F-II 9,8 ± 0,57 Mikrosfer F-III 9,27  ± 0,19 Kontrol Positif 13,22  ± 0,01 Keterangan:
Data merupakan rata-rata dari replikasi 3x ± SD Kontrol positif = Gentamisin sulfat
Berdasarkan  hasil  Log  ALT  (setelah  ekstrusi dan oven) dan aktivitas menunjukan bahwa hasil Log ALT mikrosfer  probiotik  F-I  >  F-II  >  F-III,  dan  aktivitas antibakteri F-I > F-II > F- III. Terlihat bahwa harga log ALT  linier dengan aktivitas antibakteri, semakin  besar harga  log  ALT,  maka  semakin  tinggi  pula  aktivitas antibakterinya.
Efisiensi penjebakan F-III > F-II > F- I, namun uji aktivitas F-I > F- II > F-III. Hal ini menunjukan bahwa mikrosfer  probiotik  F-I  dengan  matriks  kombinasi natrium alginat-gelatin menghasilkan efisiensi penjebakan  terendah  namun  memberikan  aktivitas antibakteri paling tinggi dibanding formula lain. Hal ini dapat  dijelaskan  dengan  data  transmitan.  Dimana  % transmitan  F-I,  F-II  dan  F-III  berturut  turut  adalah 81,60%,  85,60%,  dan  89,50%.  Sedangkan  hasil efisiensi  penjebakan  pada  formula  I,  II  dan  III  adalah 77,48%,  84,20%,  dan  87,93%.  Semakin  rendah transmitan,  berarti  semakin  kecil  intensitas  cahaya yang  diteruskan.  Hal  dikarenakan  semakin  banyak jumlah  sel  bakteri.  Oleh  karena  itu,  pada  F-I  aktivitas antibakterinya  paling  tinggi,  meskipun  efisiensi penjebakannya  paling  rendah.  Hal  ini  disebabkan karena transmitan F-I paling rendah.
Setelah  dilakukan  kesetaraan konsentrasi  terhadap kontrol  positif  gentamisin  sulfat  dapat  disimpulkan bahwa mikrosfer probiotik F-I, F-II, dan F-III memiliki nilai  diatas  harga  MIC  gentamisin  sulfat.  Minimum Inhibitory  Concentration (MIC)  adalah  konsentrasi terendah  suatu  antibakteri  yang  dapat  menghambat kehidupan mikroorganisme lain (Kumar & Kar , 2014).
Kesetaraan  konsentrasi  mikrosfer  probiotik  F-I,  F-II, dan F-III dengan gentamisin sulfat secara berturut turut adalah  4,45 ppm,  1,19 ppm,  dan 0,30 ppm, sedangkan MIC gentamisin sulfat terhadap bakteri Staphylococcus aureus adalah  0,71  ppm  (Johnson  &  Levin , 2013).
Dapat  disimpulkan  bahwa  mikrosfer  probiotik  F-I  dan F-II mempunyai efektivitas sebagai antibakteri.

## KESIMPULAN
Mikrosfer  probiotik  dengan  matriks  kombinasi natrium  alginat-gelatin  (2%:1%)  memiliki  efisiensi penjebakan Lactobacilus acidophilus paling kecil,  dan aktivitas  antibakteri  terhadap Staphylococcus  aureus paling  besar  dibandingkan  dengan  mikrosfer  probiotik dengan matriks natrium alginat 3% dan matriks gelatin 3%.  Sedangkan  ukuran  partikelnya  lebih  kecil  dari mikrosfer  probiotik  dengan  matriks  natrium  alginat 3%, tetapi  lebih  besar dari  mikrosfer probiotik dengan matriks gelatin 3%.

## DAFTAR PUSTAKA
Agnihotri,  N.,  Mishra,  R.,  Goda,  C.  &  Arora,  M.
(2012). Microencapsulation - A Novel Approach in  Drug  Delivery:  A  Review. Indo  Global Journal of Pharmaceutical Sciences; 2; 1-20.
Burgain, J., Gaiani, C., M., Linder  & Scher, J. (2011).
Encapsulation  of  Probiotic  Living  Cells:  From Laboratory  Scale  to  Industrial  Applications. Journal of Food Engineering; 104; 467–483.
Chávarri,  M,  Marañó,  I.  &  Villarán,  C.  (2012). Encapsulation  Technology  to  Protect  Probiotic Bacteria. London: IntechOpen.
Elzoghby, A. E. (2013). Gelatin-based Nanoparticles as Drug  and  Gene  Delivery  Systems:  Reviewing three  Decades  of  Research. Journal  of Controlled Release; 172; 1075-1091.
Flourou-Paneri,  P.,  Christaki,  E.  &  Bonos,  E.  (2013). Lactic  Acid  Bacteria  as  Source  of  Functional Ingredients:  Lactic  Acid  Bacteria  –  R  &  D  for Food. London: IntechOpen.
GMIA.  (2012).  Gelatin  Handbook.  Massacusetts: Atlantic Gelatin/Kraft Foods Global Inc.
Halász, A. (2009). Food Quality and Standards Vol III: Lactic Acid Bacteria. Oxford: EOLSS Publication.
Inostroza,  E.  C., Yanez, B., Riquelme, G.  &  Storh, K. (2012).  Formulation  Based  on  the  Synthesis  of Microspheres  Made  from  Cross  Linked  Natural Gelatin,  Used  as  a  Carrier  for  Strains  of Probiotic Lactobaciillus spp.  for  Treating  Skin Wounds and/or Lesions. Paris: European Patient Application.
Johnson,  P.  J.  T.  &  Levin,  B.  R.  (2013).
Pharmacodynamics,  Population  Dynamics,  and the  Evolution  of  Persistence  in Staphylococcus aureus . PLOS Genetics; 9; 1-13.
Jood, S., Khetarpaul, N. & Goyal, R. (2012). Effect of Germination and Probiotic Fermentation on pH, Titratable  Acidity,  Dietary  Fibre,  β-glucan  and Vitamin  Content  of  Sorghum  Based  Food Mixtures. International  Journal  of  Food Sciences and Nutrition; 2; 1-4.
Joshi,  S.,  Patel,  P.,  Lin,  S.  &  Madan,  P.  L.  (2012). Development of Cross Linked Alginate Spheres by Ionotropic Gelation Technique for Controlled Release  of  Naproxen  Orally. Asian  Journal  of Pharmaceutical Science; 7; 134-142.
Kumar,  R.  &  Kar,  A.  (2014).  Microencapsulation  of Nutraceuticals  Using  Spray  Freeze  Drying Method:  A  Brief  Review. Indo  Global  Journal of Pharmaceutical Sciences; 4; 47-51.
Lannitti,  T.  &  Palmieri,  B.  (2010).  Therapeutical  Use of  Probiotic  Formulations  in  Clinical  Practice. Clinical Nutrition; 29; 701-725.
Lew,  L.  C.  &  Liong,  M.  T.  (2013).  Bioactives  from Probiotics  for  Dermal  Health:  Functions  and Benefits. Journal of Applied Microbiology; 114;
1241-1253.
Li,  X.  Y., Chen,  X.  G., Cha,  D.  S., Park,  H.  J. &  Liu,
C.  S.  (2009). Microencapsulation of  a  Probiotic
Bacteria with Alginate-Gelatin and Its
Properties. Journal  of Microen-capsulation;  26;
315-324.
Manjanna, K. M., Pramodkumar, T. M. & Shivakumar, B.  (2010).  Calcium  Alginate  Cross-linked Polymeric  Microbeads  for  Oral  Sustained  Drug
Delivery  in  Arthritis. Drug  Discoveries  and Therapeutics; 4; 109-122.
Martin,  M.  (2002).  Surfactans  and  Polymers  in  Drug
Delivery. New York: Marcel Dekker, Inc.
Mokarram, R. R., Mortazavi, S. A., Habibi, N. M. B. &
Shahidi, F. (2009). The Influence of Multi Stage Alginat  Coating  on  Survivability  of  Potential
Probiotic  Bacteria  in  Simulated  Gastric  and Intestinal  Juice. Food  Research  International;
42; 1040-1045.
Poshadri,  A.  &  Kuna,  A.  (2010).  Microen-capsulation Technology:  A  Review. The  Journal  of Research Angrau; 38; 86-102.
Prasant,  V.  V.,  Moy,  A.  C.,  Mathew,  S.  T.  & Manthapan,  R.  (2011).  Microspheres  -  An Overview. International  Journal  of Research in Pharmaceutical  and  Biomedical  Sciences;  2; 332-338.
Sahil,  K.,  Akanksha,  M.,  Premjeet,  S.,  Bilandi,  A.  &
Kapoor,  B.  (2011).  Microsphere:  A  Review. International Journal Of Research In Pharmacy And Chemistry; 1; 1184-1198.
Saijala,  A.,  Krishna,  P.,  Amareshwar  &  Chakravarty,
P.  (2011).  Different  Techniques  Used  for  the Preparation  of  Nanoparticles  using  Natural Polymers  and  Their  Application. International Journal  of  Pharmacy  and  Pharmaceutical Science; 3; 45-50.
Solanki,  H.  K.,  Pawar,  D.  D.,  Dushyant,  A.  S.,
Prajapati,  V.  D.,  Jani,  G.  K.,  Mulla,  A.  M., Thakar,  P.  M.  (2013).  Development  of Microencapsulation  Delivery  System  for  Long-
Term Preservation of Probiotis as Biotherapeutics Agent. BioMed Research
International; 2013; 1-21.
Šušković, J., Kos, B., Beganović, J., Leboš Pavunc, A.,
Habjanič, K. & Matošić, S. (2010). Antimicrobial  Activity  –  the  Most  Important Property  of  Probiotic  and  Starter  Lactic  Acid Bacteria. Food  Technology  and  Biotechnology; 48; 296-307.