## Isolasi dan Karakterisasi Morfologi Mikroorganisme pada Proses Fermentasi Kombucha Berbahan Baku Teh Hijau
( Camellia sinensis )
Anita Herawati Permana 1*) , Eva Yuliana 1 , Indah Aulia Nurhalisa 1
1) Program Studi Penjaminan Mutu Industri Pangan, Politeknik AKA Bogor Jl. Pangeran Sogiri No.283, Tanah Baru, Bogor Utara, Kota Bogor, Jawa Barat 16154
*) Email: anitahera@gmail.com (Received : 7 November 2021; Accepted: 14 Desember 2021; Published: 21 Desember 2021)

## Abstrak
Kombucha  merupakan  minuman  fungsional  hasil  fermentasi  larutan  teh  dan  gula  dengan  menggunakan  starter kultur  kombucha.  Starter  kultur  kombucha  berbentuk  lembaran  selulosa  yang  tersusun  atas  banyak  bakteri  dan khamir.  Jenis  bakteri  dan  khamir  yang  terlibat  dalam  proses  fermentasi  kombucha  sangat  bervariasi  sehingga perlu  diidentifikasi  keanekaragamanya.  Pada  penelitian  ini  dilakukan  isolasi  dan  karakterisasi  morfologi mikroorganisme selama proses fermentasi kombucha berbahan baku teh hijau. Fermentasi kombucha dilakukan selama  14  hari.  Pengukuran  pH  dilakukan  setiap  hari  untuk  menentukan  fase-fase  fermentasi.  Isolasi mikroorganisme dilakukan dari cairan kombucha pada tiap fase fermentasi. Seluruh isolat mikroorganisme yang diperoleh  dikarakterisasi  melalui  pengamatan  secara  morfologi,  pewarnaan  sederhana,  pewarnaan  gram, pewarnaan  spora,  dan  uji  motilitas.  Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh,  pada  cairan  kombucha  tidak  ditemukan adanya  khamir.  Jenis  mikroorganisme  yang  diperoleh  dari  cairan  kombucha  adalah  bakteri.  Hasil  karakterisasi mikroorganisme menyiratkan bahwa empat dari enam isolat bakteri yang diperoleh memiliki kemiripan dengan genus Acetobacter , dengan ciri-ciri berbentuk batang pendek, tidak memiliki spora, bersifat motil, dan termasuk ke dalam bakteri Gram negatif.
Kata kunci : Acetobacter ; Fermentasi; Kombucha; Ragi

## Abstract
Kombucha is a functional beverage made from tea and sugar that is fermented using a kombucha starter culture. Kombucha starter cultures are cellulose fiber sheets composed of  many bacteria and yeasts. The bacteria and yeasts in kombucha fermentation are very diverse, so  it is  necessary to identify the diversity. In this study, the isolation and characterization of microorganisms were carried out during the fermentation process of green tea- based kombucha. Kombucha fermentation was carried out for 14 days. pH measurements were taken everyday to determine the fermentation phase. Microorganisms were isolated from the kombucha liquid in each fermentation phase. All obtained microorganisms were characterized by morphological observations, simple staining, Gram staining,  endospore  staining,  and  motility  tests.  Based  on  the  results,  there  was  no  yeast  found  in  kombucha liquid.  The  type  of  microorganism  obtained  from  kombucha  liquid  was  bacteria.  Characterization  results suggested  that  four  of  the  six  isolates  met  the  requirements  of  Acetobacter,  i.e.,  short  rods,  not  having  spores, being motile, and belonging to Gram-negative bacteria.
Keywords : Acetobacter; Fermentation; Kombucha; Yeast

## PENDAHULUAN
Indonesia  merupakan  negara  tropis  yang mampu  menghasilkan  komoditas  teh  ( Camellia sinensis )  dalam  jumlah  besar.  Teh  memiliki  cita  rasa tinggi  dan  dapat  diolah  menjadi  berbagai  macam minuman, salah satunya adalah kombucha. Kombucha merupakan  minuman  fungsional  hasil  fermentasi larutan  teh  dan  gula  dengan  menggunakan  starter kultur  kombucha  yang  tersusun  atas Acetobacter xylinum dan  beberapa  jenis  khamir  (Frank,  1995).
Selain Acetobacter  xylinum, bakteri  yang  terdapat dalam  kombucha  diantaranya  adalah Acetobacter ketogenum dan Bacterium  gluconicum . Sementara khamir  yang  terdapat  dalam  kombucha  adalah Candida albicans , Saccharomyces , Pichia fermentants (Anugrah,
2015),
Brettanomyces , dan Zygosaccharomyces (Suhardini dan Elok, 2016). Kombucha dipercaya memiliki beberapa efek kesehatan antara lain sebagai antioksidan,
memperbaiki  mikroflora  usus,  dapat  meningkatkan ketahanan tubuh, menurunkan tekanan darah (Wistiana  dan  Elok,  2015),  menurunkan  berat  badan, menormalkan  fungsi  organ-organ  tubuh,  mengobati asam  urat,  dan  mencegah  kanker  (Frank,  1995). Kombucha  mengandung  berbagai  jenis  asam  organik seperti  asam  glukuronat,  asam  glukonat,  asam  asetat, asam  folat,  asam  amino,  vitamin,  dan  zat  lainnya. Waktu fermentasi kombucha berkisar antara 8-12 hari pada  suhu  18-20 o C,  sedangkan  pada  suhu  yang  lebih tinggi  fermentasi  berlangsung  lebih  singkat.  Pada umumnya, daerah beriklim tinggi (22-26 o C) melakukan  fermentasi  kombucha  selama  4-6  hari (Wistiana dan Elok, 2015).
Fermentasi kombucha dengan bantuan mikroorganisme  terbagi  menjadi  beberapa  tahapan, yaitu  konversi  gula  menjadi  etanol,  konversi  etanol menjadi  asam  asetat,  dan  konversi  sebagian  asam asetat  menjadi  karbon  dioksida  yang  menghasilkan sensasi  minuman  bersoda  dalam  kombucha.  Adanya kondisi  yang  berbeda  pada  tiap  fase  fermentasi  akan mempengaruhi  jenis  mikroorganisme  yang  terdapat dalam  kombucha.  Saat  ini,  belum  ditemukan penelitian yang
mengungkapkan
tentang keanekaragaman  mikroorganisme  selama  proses pembuatan  kombucha.  Pada  penelitian  ini  dilakukan isolasi  dan  karakterisasi  morfologi  mikroorganisme pada  proses  fermentasi  kombucha  berbahan  baku  teh hijau  ( Camellia  sinensis ).  Tujuan  dari  penelitian  ini adalah  memperoleh  profil  perubahan  pH  selama proses  fermentasi  kombucha,  memperoleh  koleksi isolat mikroorganisme  pada  proses  fermentasi kombucha, dan mengidentifikasi isolat mikroorganisme  yang  diperoleh  melalui  metode identifikasi klasik secara morfologi.

## BAHAN DAN METODE
Bahan  yang  digunakan  diantaranya  daun  teh hijau,  gula  pasir,  air,  aquades,  SCOBY,  aquades, media  PCA  ( plate  count  agar ),  media  SIM  ( sulfide indole  motility ),  media  NA  ( nutrient  agar ),  natrium asetat  0,02  M,  asam  asetat  0,02  M,  safranin,  kristal violet, malasit hijau, alkohol 95%, dan larutan lugol.
Pembuatan  kombucha  dilakukan  berdasarkan prosedur  dari  Naland  (2004).  Analisis  pH  kombucha dilakukan  dari  hari  satu  (1)  hingga  hari  empat  belas (14).  Pengukuran  pH  berdasarkan  SNI  06-6989.11- 2004 (Badan Standardisasi Nasional, 2004).
Isolasi mikroorganisme dari cairan kombucha dilakukan  dengan  metode  pengenceran  bertahap. Koloni  yang  tumbuh  diamati  warna,  ukuran,  dan bentuknya.  Koloni  tunggal  hasil  isolasi  dipindahkan dengan  ose  bulat  ke  dalam  media  agar  miring (Sabdaningsih dkk., 2013).
Seluruh isolat mikroorganisme yang diperoleh dilakukan pewarnaan sederhana, pewarnaan gram,  pewarnaan  spora  (Sabdaningsih  dkk.,  2013), dan uji motilitas (Harley, 2005).

## HASIL DAN PEMBAHASAN Profil Nilai pH Kombucha
Kombucha merupakan minuman hasil fermentasi larutan  teh  dan  gula  dengan  menggunakan  starter kultur  kombucha.  Salah  satu  indikator  bahwa  proses fermentasi telah berlangsung adalah adanya penurunan nilai  pH.  Perubahan  nilai  pH  kombucha  dapat  dilihat pada Gambar 1.
Nilai  pH  kombucha  mengalami  penurunan yang  signifikan  pada  awal  proses  fermentasi.  Pada awal  fermentasi,  pH  larutan  adalah  4,18  kemudian setelah  24  jam  fermentasi  pH  turun  menjadi  2,81. Selanjutnya  nilai  pH  cenderung  stabil  sampai  hari terakhir proses fermentasi yaitu 2,46.
Gambar 1. Profil Nilai pH Kombucha Selama Proses Fermentasi
Penurunan  pH  disebabkan  oleh  aktivitas metabolisme mikroorganisme selama proses fermentasi yang salah satunya adalah pembentukan by product berupa asam. Hal ini sesuai senada pernyataan Junior et  al. (2009),  bahwa  selama  awal  proses fermentasi, penurunan pH disebabkan oleh bakteri dan yeast yang  mengubah  sukrosa  menjadi  asam  organik. Frank  (1995),  menyatakan  bahwa  asam  organik  yang dihasilkan  selama  proses  fermentasi  kombucha diantaranya  adalah  asam  glukuronat,  asam  asetat, asam laktat, asam folat, dan asam amino.
Gambar 2. Hasil Pengamatan Morfologi Isolat A, B, C, E, dan F Karakterisasi Isolat
Identifikasi dan karakterisasi bakteri memerlukan  isolat  atau  biakan  murni  yang  diperoleh
dari isolasi mikroorganisme. Hasil biakan mikroorganisme  yang ditumbuhkan pada  media dapat dilihat pada Gambar 2.
Hasil  isolasi  yang  didapat  dari  proses  fermentasi kombucha  sebanyak  6  isolat.  Karakteristik  morfologi 6 isolat tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.
Dari  keenam  isolat  yang  didapatkan,  secara morfologi  dapat  diidentifikasi  bahwa  kesemuanya adalah  bakteri.  Keenam  isolat  tersebut  selanjutnya dimurnikan  kedalam  media  NA  miring.    Hasil pertumbuhan  bakteri  pada  media  agar  miring  NA adalah arboresen atau tumbuh seperti pohon dan dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Pertumbuhan biakan murni, Isolat C, B, A,
F, E, D pada media agar miring NA
Isolat  yang  dimurnikan  dipilih  berdasarkan perbedaan  kenampakan  morfologi  koloni,  baik  dari segi  warna,  elevasi,  tekstur  permukaan,  garis-garis radial,  lingkaran  konsentris  maupun  tetes  eksudat sehingga diperoleh isolat murni (Ed-Har et. al, 2017). Morfologi  koloni  isolat  yang  ditemukan  pada penelitian  ini  sesuai  dengan  pernyataan  Cappucino  & Sherman (2011) bahwa pada umumnya bentuk koloni pada  media  agar  lempeng  adalah  sirkuler,  tak beraturan,  dan  rizoid.    Elevasi  dapat  berbentuk  datar, naik,  cembung,  dan  umbonatus.    Tepian  dapat berbentuk  mulus,  bergelombang,  bergerigi,  lobatus, dan filamentus. Pada agar miring, pertumbuhan koloni adalah  filiformis,  ekinulatus,  bermanik,  menyebar, arboresen, dan rizoid.

## Karakterisasi Morfologi Sel Bakteri
Keenam  isolat  yang  didapatkan  diamati karakteristik morfologi selnya melalui reaksi terhadap pewarnaan  dan  uji  motilitas.  Pewarnaan  yang dilakukan  pada  isolat  pada  pengujian  ini  adalah sederhana,  Gram,  dan  spora.  Pewarnaan  sederhana bertujuan  untuk  mengetahui  ukuran  serta  bentuk bakteri,  bakteri  akan  mengikat  satu  jenis  pewarna tunggal  yang  diberikan.  Hasil  pewarnaan  sederhana dapat dilihat pada Gambar 4.
i                               ii
iii                             iv
v                             vi
Gambar 4.  Hasil Pewarnaan Sederhana pada Isolat (i) Isolat A, (ii) Isolat B, (iii) Isolat C, (iv) Isolat D, (v)
Isolat E, (v) Isolat F
Tabel 1.  Karakteristik Morfologi Isolat Selama Proses Fermentasi Kombucha
Isolat Bentuk Tepian Elevasi Warna Isolat Media A Tak beraturan Bergelombang Cembung Putih keruh PCA B Tak beraturan Bergelombang Datar Putih jernih PCA C Tak beraturan Mulus Datar Putih jernih PCA D Sirkuler Bergerigi Cembung Putih keruh PCA E Rizoid Filamentus Datar Putih jernih PCA pH 4 F Sirkuler Filamentus Naik Putih keruh PCA pH 4
Pada Gambar 4, dapat dilihat bahwa  keenam isolat memiliki  kesamaan  bentuk  morfologi  yaitu  batang pendek yang tunggal, berpasangan, serta berkelompok.    Bentuk  morfologis  sel  bakteri diantaranya  adalah  kokus,  basilus,  dan  spiral  dan susunannya adalah rantai, berkelompok, berpasangan,  dan  tetrad.    Dapat  dikatakan  bahwa keenam  isolat  tersebut  memiliki  bentuk  sel  basilus dengan  susunan  mono,  diplo  serta  streptobasilus. Salah  satu  cara  yang  masih  diperlukan  dalam taksonomi  bakteri  menurut  Campbell et . al (2000) diantaranya  adalah  pewarnaan  Gram,  cara  ini digunakan  untuk  memisahkan  anggota-anggota domain bakteri ke dalam dua kelompok berdasarkan  dinding  selnya.    Bakteri  Gram  positif memiliki  dinding  sel  yang  lebih  sederhana, sedangkan  bakteri  Gram  negatif  lebih  kompleks. Hasil  pewarnaan  Gram  pada  isolat  dapat  dilihat pada Gambar 5.
i                               ii
iii                             iv
v                             vi Gambar 5.  Hasil Pewarnaan Gram pada Isolat (i) Isolat A, (ii) Isolat B, (iii) Isolat C, (iv) Isolat D,
(v) Isolat E, (vi) Isolat F
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh,  keenam isolat  termasuk  kedalam  bakteri  Gram  negatif karena  menunjukkan  warna  merah.  Bakteri  Gram positif  hanya  memiliki  selapis  dinding  sel.  Setelah pemberian  alkohol  95%  pori-pori  pada  dinding  sel akan menyempit sehingga tidak akan terwarnai oleh pewarna  tandingan  dan  akan  menjaga  pewarna primer.  Bakteri  Gram  negatif  merupakan  bakteri
yang  tidak  mempertahankan  atau  menjaga  zat warna  primer.  Bakteri  ini  memiliki  tiga  lapis dinding  sel,  lapisan  terluarnya  tercuci  bersamaan dengan pewarna primer pada saat pencucian dengan alkohol,  sehingga  hasil  akhirnya  akan  terwarnai dengan pewarna tandingan.
Pewarnaan  ketiga  adalah  pewarnaan  spora. Pewarnaan ini bertujuan untuk mengetahui kepemilikan  spora  pada  bakteri.    Hasil  pewarnaan pada  isolat  memperoleh  hasil  seperti  pada  Gambar 6.
i                               ii
iii                             iv
v                             vi
Gambar 6.  Hasil Pewarnaan Spora pada Isolat (i) Isolat A, (ii) Isolat B, (iii) Isolat C, (iv) Isolat D, (v) Isolat E, (vi) Isolat F
Hasil  pewarnaan  spora  menunjukkan  bahwa hanya  isolat  A  dan  isolat  D  yang  memiliki  spora. Keberadaan  spora  teramati  dari  nampaknya  bagian warna hijau pada bakteri, sedangkan keempat isolat lainnya hanya memiliki sel vegetatif yang berwarna merah. Safranin yang merupakan pewarna tandingan  akan  memberi  warna  merah  kepada bagian  sel  bakteri  selain  endospora  (Harley  & Prescott  2002;  Tortora et.  al ,  2010).  Saat  diwarnai oleh  malasit  hijau,  sel  vegetatif  dapat  mengikat warna  tetapi  dapat  luntur  karena  ikatannya  tidak kuat.  Pada pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif  mudah  mengikat  warna  kembali. Oleh karena  itu,  hasil  pewarnaan  akhir  dari  sel  vegetatif adalah merah muda.

## Uji Motilitas
Untuk  melihat  kemampuan  organisme  motil, maka  dilakukan  uji  motilitas  dengan  menggunakan media  agar  SIM.  Hasil  uji  motilitas  bakteri  positif dapat  dilihat  dengan  adanya  pertumbuhan  bakteri pada permukaan media atau tidak hanya bekas pada tusukan,  sedangkan  bakteri  non  motil  tumbuh sepanjang  tusukan  (Harley,  2005).  Uji  motilitas bakteri  pada  penelitian  ini  dapat  dilihat  pada Gambar 7.
(a) (b)
(c)
Gambar 7.  Hasil Pengamatan Uji Motilitas (a) media tanpa bakteri (b) Bakteri E. Coli (kontrol positif) , Isolat A, B, C, (c) Isolat D, E, F.
Hasil  uji  motilitas  pada  keenam  isolat  yaitu motil.    Bakteri E.  Coli digunakan  sebagai  kontrol positif  karena  bakteri  tersebut  memiliki  sifat  motil. Hasil  positif  dapat  dilihat  dari  tersebarnya pertumbuhan  bakteri  pada  media  SIM  diluar  area bekas  tusukan.  Kekeruhan  pada  permukaan  media juga  menunjukan  tersebarnya  pertumbuhan  dan pergerakan  keenam  isolat.  Pengujian  motilitas bertujuan  untuk  mengetahui  kepemilikan  flagela pada  bakteri,  sehingga  dapat  disimpulkan  keenam isolat memiliki flagela.
Berdasarkan  serangkaian  uji  yang  dilakukan, ciri-ciri  karakteristik  morfologi  yang  ditemukan pada sebagian besar isolat dari kombucha memiliki kesamaan  dengan  genus Acetobacter.  Acetobacter berbentuk  elips  hingga  batang,  lurus,  atau  ramping dan beberapa tipe dapat berbentuk bulat, memanjang, bengkok atau berfilamen. Sel Acetobacter memiliki susunan sel tunggal, berpasangan atau rantai, dapat motil atau nonmotil, tidak  membentuk  endospora,  termasuk  ke  dalam bakteri  Gram  negatif,  serta  bersifat  aerob. Pernyataan  ini  juga  diperkuat  dengan  pernyataan Holt , et.  al, (1994);  Nainggolan  (2009)  bahwa genus Acetobacter memiliki  sel  berbentuk  batang dan  termasuk  ke  dalam  golongan  bakteri  Gram negatif.  Kondisi  pH  asam  yang  terbentuk  pada proses  fermentasi  juga  menunjukkan  adanya kesamaan karakteristik dengan Acetobacter . Bakteri Acetobacter termasuk  kelompok  bakteri  asam asetat,  yang  melalui  proses  oksidasi  metil  alkohol dapat menghasilkan asam asetat. Asam asetat inilah yang  berfungsi  sebagai  penekan  pertumbuhan mikroorgansime  lainnya,  terutama  mikroorganisme yang bukan asidofilik.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan, dapat  disimpulkan  bahwa  pada  fase  cairan kombucha  tidak  ditemukan  adanya  khamir.  Jenis mikroorganisme  yang  diperoleh  dari  fase  cairan kombucha  adalah  bakteri.  Empat  dari  enam  isolat bakteri memiliki kemiripan dengan genus Acetobacter karena  memenuhi  beberapa  parameter pengujian karakteristik morfologi bakteri.

## DAFTAR PUSTAKA
Anugrah,  S.T.  (2005). Pengembangan  Produk Kombucha  Probiotik  Berbahan  Baku  Teh Hitam  (Camellia  sinensis). Undergraduate thesis, Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Badan  Standardisasi  Nasional.  (2004). SNI  06- 6989.11-2004:  Air  dan  air  limbah  –  Bagian 11:  Cara  Uji  Derajat  Keasaman  (pH) dengan  menggunakan  alat  pH  meter. Badan Standardisasi Nasional. ICS 13.060.50 . Campbell,  N.A.,  J.B.  Reece  &  L.G.  Mitchell.
(2002). Biology (5th  ed) . Alih  Bahasa:
Wasmen Manalu.  Erlangga.  Jakarta.
Cappucino,  J.G.,  &  N.  Sherman.  (2014). Manual Laboraorium  Mikrobiologi (Edisi  Ke-8). Diterjemahkan  oleh  Nur  Miftahurrahmah.
Penerbit Buku Kedokteran.  Jakarta.
Frank,  G.W.  (1995). Kombucha . Translated  by Althea  Tysndale (8th  Ed).  Publishing  House Enssthaler. Australia.
Harley,  J.P.  (2005). Laboratory  Exercises  in Microbiology (Sixth Edition). The McGraw- Hill Companies, Inc.  New York . Holt,  J.G.,  N.R.  Krieg,  P.H.A.  Sneath,  J.T.  Staley,
&  S.T.  Williams.  (1994). Bergey’s  Manual of  Determinative  Bacteriology (9th  ed).
Baltimore: Williams and Wilkins . Junior,  R.J.S.,  R.A.  Batista,  S.A.  Rodrigues,  L.X. Filho,  &  A.S.  Lima.  (2009) Antimicrobial Activity of Broth Fermented with Kombucha Colonies. Journal  of  Microbial & Biochemical Technology (JMBT) 1:1 . Nainggolan,  J.    (2009). Kajian  Pertumbuhan Bakteri  Acetobacter  sp.  Dalam  Kombucha Rosela  Merah  (Hibiscus  sabdarifa)  Pada Kadar  Gula  dan  Lama  Fermentasi  Yang Berbeda .    Thesis,  Sekolah  Pasca  Sarjana Universitas Sumatera Utara, Medan.
Naland, H. (2004). Kombucha Teh Ajaib Pencegah dan Penyembuh Aneka Penyakit. Agromedia Pustaka. Jakarta.
Sabdaningsih,  A.,  Anto  B.,  Endang  K.  (2013). Isolasi  dan  Karakterisasi  Morfologi  Koloni Bakteri  Asosiasi  Alga  Merah (Rhodophyta) dari  Perairan  Kutuh  Bali. Jurnal  Biologi, Volume 2 No 2, Hal. 11-17.
Suhardini,  P.N.,  Elok  Z.  (2016).  Studi  Aktivitas Antioksidan  Kombucha  Dari  Berbagai  Jenis
Daun  Selama  Fermentasi. Jurnal  Pangan dan Agroindustri Vol. 4 No 1 p.221-229. Tortora,  G.  J.,  Funke,  B.  R.  &  Case,  C.  L.  (2010).
Microbiology  an  introduction (10 th edition). Pearson  edition,  Inc.,  Publishing  as  Pearson Benjamins  Cummings,  San  Francisco,  1301 Sansome. Wistiana,  D.,  Elok  Z.  (2015).  Karakteristik Kimiawi Dan Mikrobiologis Kombucha Dari
Berbagai  Daun  Tinggi  Fenol  Selama Fermentasi. Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 4 p.1446-1457.