## Pre-Screening Profil Protein Daging Sebagai Pengaruh Variasi Metode Penyembelihan Hewan

## Alvina Nur Aini
Program Studi Penjaminan Mutu Industri Pangan, Politeknik AKA Bogor Jl. Pangeran Sogiri No.283, Tanah Baru, Bogor Utara, Kota Bogor, Jawa Barat 16154
*) Email: alvinaakabogor@gmail.com (Received : 2 Juli 2021; Accepted: 7 Juli 2021; Published: 2 Agustus 2021)

## Abstrak
Perbedaan  proses  penyembelihan  dapat  mempengaruhi  respon  fisiologis  hewan  yang  dapat  diidentifikasi  melalui pola  ekspresi  protein.  Dalam  penelitian  ini  dilakukan  analisis  awal  protein  daging  untuk  menganalisis  pengaruh perbedaan  metode  penyembelihan,  yaitu  metode  halal  dan  nonhalal.  Penelitian  menggunakan  enam  ekor  tikus Wistar  sebagai  hewan  uji.  Kelompok  uji  pertama  diberi  perlakuan  penyembelihan  dengan  metode  halal,  yaitu dengan pemotongan pembuluh darah pada leher  hewan. Kelompok kedua diberi  perlakuan penyembelihan secara nonhalal, yaitu dilakukan metode dislokasi servikal. Analisis profil protein daging dilakukan dengan menggunakan Sodium  Dodecyl  Sulfate  Polyacrylamide  Gel  Electrophoresis  (SDS-PAGE).  Hasil  SDS-PAGE  menunjukkan beberapa pita protein tereskpresi pada berat molekul 116; 55; 48; 45; 41; 26; dan 17 kDa (kiloDalton), sedangkan hasil kuantifikasi pita protein menunjukkan sampel protein daging hasil penyembelihan nonhalal memiliki kuantitas lebih  tinggi  daripada  sampel  protein  daging  hasil  penyembelihan  halal.  Kuantitas  protein  yang  lebih  tinggi  pada penyembelihan  nonhalal  diduga  karena  lepasnya  protein  tertentu  ke  dalam  sistem  metabolisme  hewan  sebagai akibat dari respon stres yang diberikan.
Kata kunci: elektroforesis; halal; nonhalal; protein; SDS-PAGE

## Abstract
Differences in the process of slaughtering animals can affect the physiological responses of animals which can be identified  through  the  pattern  of  protein  expression.  In  this  study,  meat  protein  pre-screening  was  conducted  to analyze the effect of different slaughter methods, namely the halal and non-halal methods. The study used six Wistar rats  as  test  animals.  The  first  test  group  was  slaughtered  using  the  halal  method  that  was  by  cutting  the  blood vessels  in  the  neck  of  animals.  The  second  group  was  slaughtered  using  non-halal  method  that  was  the  cervical dislocation.  Meat  protein  analysis  was  performed  using  Sodium  Dodecyl  Sulfate  Polyacrylamide  Gel Electrophoresis  (SDS-PAGE).  SDS-PAGE  result  showed  several  protein  bands  expressed  at  molecular  weight  of 116; 55; 48; 45; 41; 26; and 17 kDa (kiloDalton), while the quantification results of protein bands showed that the protein samples from non-halal slaughtered meat had a higher quantity than the samples from the halal slaughter. The higher quantity of protein in non-halal slaughter was thought due to the release of certain proteins into animal's metabolic system as a result of the given stress response.
Keywords: electrophoresis; halal; non-halal; protein; SDS-PAGE

## PENDAHULUAN
Daging  merupakan  salah  satu  sumber  pangan yang  banyak  diminati  masyarakat.  Terkhusus  bagi masyarakat Muslim, pemilihan makanan mempertimbangkan  status  kehalalan.  Makanan  halal tidak  hanya  makanan  yang  berasal  dari  bahan  halal, namun  juga  berkaitan  dengan  proses  penyiapannya. Untuk  memperoleh  daging  halal,  hewan  harus disembelih  dengan  metode  halal,  yaitu  dengan memotong  kerongkongan,  esofagus,  dan  kedua pembuluh  darah  pada  leher  hewan.  Metode penyembelihan  selain  yang  dijelaskan  dalam  aturan
Islam  dianggap  tidak  halal,  seperti  memukul  dan mencekik hewan (Ma’mun dkk., 2006).
Penelitian mengenai analisis kehalalan pangan yang  selama  ini  banyak  dilakukan  adalah  penelitian mengenai penggunaan, pemalsuan, dan pencampuran komponen  nonhalal  dengan  komponen  halal,  seperti deteksi kandungan daging babi, lemak babi, dan lain sebagainya (Raharjo dkk., 2012; Maryam dkk., 2016; Rahmawati  dkk.,  2016).  Sebaliknya,  saat  ini  belum terdapat  analisis  yang  dilakukan  untuk  membedakan daging  dari  proses  penyembelihan  halal  atau nonhalal.  Pemantauan  proses  penyembelihan  perlu dilakukan  untuk  menjamin  bahwa  daging  hewan
berasal  dari  proses  penyembelihan  halal  dan  benar sehingga  layak  untuk  dikonsumsi  masyarakat Muslim.
Analisis  sampel  daging  yang  berasal  dari proses  penyembelihan  halal  ataupun  nonhalal  dapat dilakukan  dengan  pemeriksaan  terhadap  ekspresi protein  daging.  Salah  satu  metode  analisis  protein adalah Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). SDS-PAGE digunakan  untuk  memisahkan  biomolekul  seperti protein  berdasarkan  sifat  pergerakan  elektroforetik (pemisahan  komponen  atau  molekul  bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasi dalam sebuah medan  listrik).  SDS-PAGE  sering  digunakan  dalam analisis  sampel  biologis  karena  kemampuannya dalam memisahkan campuran kompleks dengan baik (Rosenberg, 1996).
Pada penelitian ini, analisis protein didasarkan pada protein spesifik yang terekspresi sebagai respon fisiologis  hewan,  yaitu  berkaitan  dengan  perlakuan penyembelihan yang dilakukan. Menurut Huang dkk. (2014), adanya perlakuan berbeda pada penyembelihan menyebabkan respon stres pada tubuh hewan  yang  dapat  tereskpresi  pada  protein  yang dihasilkan.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah menganalisis  profil  protein  daging  sebagai  langkah awal  dalam  mengidentifikasi  pengaruh  metode penyembelihan  halal  dan  nonhalal.  Penelitian  ini diharapkan  dapat  berkontribusi  sebagai  penelitian awal  ( pre-screening )  untuk  menyediakan  metode deteksi daging halal dan nonhalal.

## METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas laboratorium, peralatan bedah, tabung  konikal  15  mL, centrifuge ,  mikropipet, timbangan  elektrik, deep  freezer -80 ℃ ,  vortex, shaker incubator dan  elektroforesis  SDS-PAGE Mini Protean ® II Cell. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  enam  ekor  tikus  Wistar  ( Rattus norvegicus ,  usia  3  bulan,  berat  200  g  dan  jenis kelamin  jantan),  akuades,  Tris  HCl,  standar  protein Precision  Plus  Protein  Dual  Color ,  sodium  dodesil sulfonat  (SDS),  gel  pemisah  (akrilamida  10%), coomassie blue ,  glisin,  metanol,  asam  asetat  dan akuades.

## Penyembelihan hewan secara halal dan nonhalal
Enam  ekor  tikus  Wistar  ( Rattus  norvegicus ) digunakan  di  dalam  penelitian  sebagai  hewan  uji. Keenam  tikus  dibagi  menjadi  dua  kelompok perlakuan.  Kelompok  pertama  terdiri  dari  3  (tiga) ekor  yang  dieuthanasi  (dikorbankan)  menggunakan metode penyembelihan halal, yaitu dengan memotong  bagian  pembuluh  darah  leher.  Kelompok kedua  terdiri  dari  3  (tiga)  ekor  yang  dieuthanasi dengan  metode  dislokasi  servikal,  yaitu  dengan memutuskan  syaraf  pada  tulang  belakang  sehingga tikus  mati  tanpa  mengeluarkan  darah  (metode nonhalal).

## Ekstraksi protein
Sebanyak  0,5  g  daging  tikus  dari  kedua metode penyembelihan diambil dan ditambah dengan 2,5 mL larutan Tris HCl 0,05 M (pH 7-8), kemudian dihaluskan  hingga  homogen.  Sampel  protein  daging dihomogenkan dengan vortex selama 30  menit,  yang diikuti  dengan  sentrifugasi  pada  10.000  rpm  selama 20  menit  pada  suhu  4 ℃ .  Supernatan  yang  berisi ekstrak  protein  disimpan  pada  suhu  -80 ℃ sebelum elektroforesis.

## Elektroforesis
Proses
pemisahan sampel protein menggunakan  buffer  pemisah  yang  terdiri  dari  25 mM  Tris  HCl,  200  mM  glisin,  dan  0,1%  SDS  (b/v). Sebelum  dilakukan  elektroforesis,  disiapkan  gel akrilamida  10%  sebagai  gel  pemisah.  Sebanyak  20 µL  sampel  protein  daging  dari  penyembelihan  halal dan nonhalal (mengandung 25 µg protein) dimasukkan  ke  dalam  sumuran  yang  telah  tersedia pada  gel.  Elektroforesis  dijalankan  pada  tegangan 125  V  dan  arus  70  mA  selama  1,5  jam.  Setelah elektroforesis  selesai,  gel  diwarnai  dengan    larutan pewarna yang terdiri dari 0,3% coomassie blue , 45% metanol,  dan  10%  asam  asetat  (v/v)  selama semalaman  di  dalam shaker .  Gel  dipucatkan  dengan larutan destain yang  terdiri  dari  asam  asetat  dan metanol  hingga  menyisakan  warna  pita  protein. Masing-masing profil protein dianalisis berat molekul dan  intensitasnya  menggunakan software ImageJ 1.52a (Rasband, 2018).

## HASIL DAN PEMBAHASAN Penyembelihan Hewan Uji
Hewan  uji  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah  6  (enam)  ekor  tikus  Wistar  yang  dibagi menjadi 2 kelompok perlakuan. Kelompok penyembelihan  halal  (selanjutnya  disebut  kelompok halal) disembelih dengan tata cara halal, yaitu dengan memotong  pembuluh  darah  pada  bagian  leher, sedangkan  kelompok  berikutnya  yaitu  kelompok penyembelihan nonhalal (selanjutnya disebut kelompok  nonhalal),  dikorbankan  dengan  cara dislokasi servikal. Metode dislokasi servikal dilakukan dengan cara meletakkan benda tumpul atau ibu  jari  telunjuk  di  setiap  sisi  leher  tikus  untuk memberi  tekanan  ke  bagian  posterior  dasar  tulang tengkorak  dan  sumsum  tulang  belakang,  sementara tangan  lainnya  pada  bagian  ekor  lalu  ditarik  dengan cepat,  sehingga  terjadi  pemisahan  tulang  belakang dari tengkorak dan terjadi pemisahan sumsum tulang belakang dari otak (AVMA, 2013).
(a) (b)
Gambar 1. (a) Penyembelihan halal, (b) Penyembelihan nonhalal (dislokasi servikal)

## Ekstraksi Protein
Daging  kaki  bawah  dipilih  sebagai  sampel untuk  ekstraksi  protein.  Daging  kaki  bawah merupakan  jaringan  otot  rangka  yang  berfungsi sebagai  otot  gerak.  Menurut  DiFranco  dkk.  (2005), otot  rangka  bawah  seperti  otot  soleus,  tibialis anterior,  dan  ekstensor  digitorum  merupakan  sistem ekspresi protein mamalia yang sangat baik. Ekstraksi protein  menggunakan buffer  Tris HCl 0,05 M pH 7- 8. Buffer Tris HCl digunakan untuk melisiskan sel di dalam sistem biologi, sehingga isi sel akan keluar dan dapat  diekstraksi.  Buffer  Tris  HCl  juga  dapat melindungi protein dengan cara mempertahankan pH (Tan,  2018).  Protein  yang  telah  terekstraksi dipisahkan dari komponen padatan melalui sentrifugasi.  Protein  yang  bersifat  larut  air  berada sebagai supernatan.

## Hasil Pemisahan SDS-PAGE
Pemisahan  protein  daging  dilakukan  dengan teknik  SDS-PAGE.  Prinsip  SDS-PAGE  yaitu memisahkan  protein  berdasarkan  ukuran  molekulnya dengan  pemberian  arus  listrik.  Hasil  SDS-PAGE dapat  dilihat  pada  Gambar  2. Berdasarkan  hasil pemisahan  SDS-PAGE,  profil  protein  daging menghasilkan  pita-pita  protein  yang  terletak  pada kisaran berat molekul 17-116 kDa (kiloDalton). Pita- pita tersebut berada pada kisaran 116; 55; 48; 45; 41; 26; dan 17 kDa.
Gambar  2.  Profil  protein  hasil  pemisahan  SDS- PAGE. STD adalah standar protein; sumuran 1, 2, 3, 4,  5,  6  berturut-turut  adalah  sampel  halal  1,  halal  2, halal  3,  nonhalal  1,  nonhalal  2,  dan  nonhalal  3. Jumlah  sampel  protein  yang  dimasukkan  ke  setiap sumuran adalah 25 μg.
Untuk  memprediksi  jenis  protein  pada  setiap pita, dilakukan pembandingan berat molekul terukur/sampel  dengan  berat  molekul  teoritis. Pembandingan  dilakukan  menggunakan database The  UniProt  Consortium  (2019)  dan  The  UniProt Consortium (2021). Hasil  prediksi jenis-jenis protein dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Prediksi protein hasil SDS-PAGE
Kisaran BM (kDa) No. Prediksi Protein BM teoritis (kDa) a,b
116
41-55 26 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2-oksoglutarat dehidrogenase Dihidrolipoil dehidrogenase
Miosin- binding
Sitrat sintase Isositrat dehidrogenase Adenilosuksinat sintetase isoenzim Calreticulin Beta-enolase
Alfa-1-antiproteinase Aspartat aminotransferase
Calsequestrin-1 Fosfogliserat kinase Kreatin kinase Aktin, alfa- skeletal muscle Fruktose-bisfosfat aldolase Triosefosfat isomerase Proteasom subunit alfa Nukleosida difosfat kinase Mioglobin 116,2 54 52,8 51,8 50,9 50,2 48 47 46,6 46,4 46,4 44,5 43 42 39,3 26,8 26,4 17,3 17,1 a The UniProt Consortium (2019) b The UniProt Consortium (2021)
Berdasarkan  data  The  Uniprot  Consortium (2021),  protein  yang  teridentifikasi  merupakan kelompok  protein  sarkoplasma,  yaitu  protein  yang terlibat  dalam  proses  metabolisme  sel  hewan. Berdasarkan  hasil  pemisahan  SDS-PAGE,  terlihat bahwa  pita-pita  protein  terletak  pada  kisaran  berat molekul yang sama. Namun, ketebalan  beberapa pita antara  kelompok  halal  dan  nonhalal  terlihat  berbeda. Perbedaan  ketebalan  pita  dapat  dikonfirmasi  melalui analisis  kuantitatif.  Menurut  Mustofa  dkk.  (2006), ketebalan  pita  dikuantifikasi  dalam  bentuk  luas  area di  bawah  kurva  pada  kurva  densitograf.  Kuantifikasi dapat  dilakukan  dengan  sistem  digitalisasi  otomatis menggunakan software ImageJ. Kuantifikasi dilakukan  terhadap  pita  protein  pada  kisaran  berat molekul 26; 41; 45; dan 48 kDa. Pita-pita ini dipilih karena  merupakan  pita  yang  memberikan  gambaran visual  paling  jelas  diantara  pita-pita  lain.  Hasil kuantifikasi dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Kuantifikasi pita protein menggunakan software ImageJ 1.52a Berat molekul (kDa) Halal 1 Halal 2 Halal 3 Luas area (a.u.) Luas area (a.u.) Luas area (a.u.) 26 41 45 48 9058 11297 19471 14002 10236 10979 21898 13355 12388 11203 17731 13796 Berat molekul (kDa) Nonhalal 1 Nonhalal 2 Nonhalal 3 Luas area (a.u.) Luas area (a.u.) Luas area (a.u.) 26 41 45 48 18144 15436 24681 20477 17361 15696 21922 17887 19228 16107 22032 19178
Tabel  2  menunjukkan  kuantitas  pita  protein pada  penyembelihan  halal  dan  nonhalal  cenderung berbeda. Sampel nonhalal mempunyai luas area lebih besar dibandingkan sampel halal, yang berarti bahwa kuantitas  protein  sampel  nonhalal  lebih  tinggi  dari sampel  halal.  Zaman  dkk.  (2012)  telah  melakukan penelitian  pada  profil  protein  otot  ayam  yang dipengaruhi  oleh  variasi  metode  penyembelihan. Metode  pertama  yang  dilakukan  adalah  memotong leher  ayam  sampai  terputus  dari  tubuh  dan  metode kedua  adalah  memotong  sebagian  leher  tanpa terputus  dari  tubuh.  Protein  dengan  ekspresi  lebih tinggi ditemukan pada kisaran 35-66 kDa menggunakan  SDS-PAGE  dari  metode  kedua. Perbedaan  ini  dipengaruhi  oleh  respon  stres  yang diterima hewan selama proses penyembelihan.
Berdasarkan hasil kuantifikasi pada penelitian ini,  dapat  diduga  bahwa  penyembelihan  secara nonhalal mampu memicu lepasnya protein tertentu ke dalam sistem metabolisme sebagai akibat dari respon stres yang diberikan, sehingga kuantitas protein yang diekspresikan  pada  sampel  penyembelihan  nonhalal menjadi  lebih  tinggi.  Hasil  penelitian  ini  diharapkan dapat  berkontribusi  sebagai  penelitian  awal  ( pre- screening )  dalam  menyediakan  metode  deteksi daging  halal  dan  nonhalal.  Penelitian  lebih  lanjut perlu  dilakukan,  khususnya  menggunakan  instrumen analisis seperti Liquid Chromatography-Mass Spectrometry guna  memisahkan,  menganalisis  dan mengkuantifikasi protein dengan lebih komprehensif.

## KESIMPULAN
Hasil  pemisahan  SDS-PAGE  menunjukkan beberapa  pita  protein  tereskpresi  pada  kedua  sampel penyembelihan,  yaitu  pada  berat  molekul  116;  55; 48;  45;  41;  26;  dan  17  kDa.  Kuantitas  protein  yang lebih  tinggi  pada  penyembelihan  nonhalal  diduga karena  lepasnya  protein  tertentu  ke  dalam  sistem metabolisme  hewan  sebagai  akibat  dari  respon  stres yang diberikan.

## DAFTAR PUSTAKA
Anil,  M.H.  (2012). Effects  of  Slaughter  Method  on Carcass  and  Meat  Characteristics  in  the Meat  of  Cattle  and  Sheep .  Kenilworth: Agriculture  and  Holticulture  Development Board UK.
AVMA.  (2013). AVMA  Guidelines  for  The Euthanasia of Animals . Schaumburg:
American  Veterinary  Medical  Association (AVMA). DiFranco,  M.,  Neco,  P.,  Capote,  J.,  Meera,  P.,  & Vergara, J.L. (2005). Quantitative Evaluation  of  Mammalian  Skeletal  Muscle as  a  Heterologous  Protein  Expression System. Protein Expression and Purification , 47 , 281-288.
Huang,  J.C.,  Huang,  M.,  Yang,  J.,  Wang,  P.,  Xu, X.L.,  &  Zhou,  G.H.  (2014).  The  Effects  of Electrical  Stunning  Methods  on  Broiler
Meat  Quality:  Effect  on  Stress,  Glycolysis, Water Distribution, and Myofibrillar UltraStructures. Poultry Sci ence , 93 ,  2087– 2095. Ma’mun, M., Mura’i & Nurjannah. (2006). Tuntunan Penyembelihan  Binatang  Secara  Islam ,
Sleman: MUI Kabupaten Sleman.
Maryam,  S.,  Sismindari,  Raharjo,  T.J.,  Sudjadi  &
Rohman,  A.  (2016).  Analysis  of  Porcine Contamination
in Dendeng Using
Mitochondrial  D-Loop  686  and  cyt  b  Gene Primers  by  Real  Time  Polymerase  Chain Reaction, International  Journal  of  Food Properties, 19 , 187-195.
Mustofa,  L.,  Mahaputra,  L.,  Dachlan,  Y.P.,  Rantam, F.A.,  &  Hinting,  A.  (2006).  Analisis Densitometrik  Protein  Reseptor  Fertilisasi Pada  Zona  Pelusida  Kamibing  Sebagai Kandidat  Bahan  Imunokontrasepsi, Media Kedokteran Hewan, 22 .
Raharjo,  T.J.,  Cahyaningtyas,  W.,  Surajiman,  Istini,
&  Pranowo,  D.  (2012).  Validation  of  PCR- RFLP  Testing  Method  to  Detect  Porcine Contamination in Chicken Nugget.
Indonesian    Journal  of  Chemistry , 12 ,  302- 307.
Rahmawati,  Sismindari,  Raharjo,  T.J.,  Sudjadi,  &
Rohman,  A.  (2016).  Analysis  of  Pork Contamination in Abon Using
Mitochondrial DLoop22 Primers Using Real Time  Polymerase  Chain  Reaction  Method. International  Food  Research  Journal , 23 , 370-374. Rasband, W.S. (2018). ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/, Bethesda:
National Institutes of Health.
Tan, A. (2018). The Function of a Tris Buffer in DNA Extraction .  Accessed  on  5  Januari  2019 from www.sciencing.com.
The  UniProt  Consortium.  (2019).  UniProt:  A Worldwide  Hub  Of  Protein  Knowledge. Nucleic Acid Research , 47 , D506-D515. The  UniProt  Consortium.  (2021).  UniProt:  The Universal  Protein  Knowledgebase  In  2021. Nucleic  Acids  Research , 49 ,  D480-D489.
organism:"Rattus  norvegicus  (Rat) [10116]" AND proteome:up000002494 in UniProtKB. Zaman,  R.,  Hamzah,  M.N.,  Abdurrazq,  N.B., Hamzah,  M.S.,  &  Mohammad, T.T.  (2012). Effect of Different Methods of Slaughtering on  Protein  Expression  in  Chicken  Meat, Engineering IIUM Journal , 13 .