Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor

## PENAMBATAN MOLEKUL SENYAWA VOLATIL EKSTRAK DIKLOROMETANA SAMBILOTO TERHADAP JALUR PENSINYAL

## EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR
Muhammad Faisal 1) , Nurlaili 2) , Potchanapond Graidist 3,4) , Varomyalin Tipmanee 3) 1 Departemen Biomedik, Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Abdurrab 2 Departemen Kimia Sintesis, Program Studi Analis Kesehatan, Akademi Kesehatan Kartini Batam
3 Department of Biomedical Sciences and Engineering, Faculty of Medicine, Prince of Songkla University
4 The Excellence Research Laboratory of Cancer Molecular Biology, Prince of Songkla University email: faisal1310422008@gmail.com

## Abstrak
Onkoprotein Epidermal  Growth  Factor  Receptor telah  banyak  dipelajari  dalam  mengatasi perkembangan  sel  kanker.  Namun  hingga  kini  senyawa  penghambat  EGFR  masih menimbulkan masalah kesehatan lain. Ekstrak tumbuhan dipercaya dapat menjadi penghambat ekspresi  EGFR  tanpa  menimbulkan  masalah  kesehatan  lain.  17  senyawa  volatil  diketahui terdapat  dalam  ekstrak  diklorometana  dari  daun Andrographis  paniculata .  Penelitian  ini bertujuan untuk menganalisa interaksi antara senyawa volatil daun Andrographis paniculata dari  ekstrak  diklorometana  terhadap  jalur  pensinyal  EGFR.  Teknik in  silico penambatan molekul ligan-reseptor digunakan dalam studi ini. Struktur senyawa volatil diposisikan sebagai ligan,  sementara  onkoprotein  dalam  jalur  pensinyal  EGFR  seperti  EGFR,  PIK3CA,  KRAS- GTP, BRAF V600E dan AKT diposisikan sebagai reseptor. PyRx dan Biovia Discovery Studio digunakan  dalam  uji  penambatan  molekul  ini.  Sifat-sifat  senyawa  seperti  drug-likeness  dan lead-likeness diprediksi oleh web-tool seperti SwissADME dan Pre-ADME/Tox . Beta-amirin dan  stigmasterol  menunjukkan  energi  bebas  ikatan  yang  terkuat  pada  PIK3CA  dan  BRAF V600E masing-masingnya. Kedua senyawa tersebut secara struktur menunjukkan sifat drug- likeness dan  non-mutagenik.  Ringkasnya,  beta-amirin  dan  stigmasterol  dapat  berpotensi menjadi penghambat onkoprotein PIK3CA dan BRAF V600E. Studi in vitro dan model hewan perlu  dilakukan  untuk  memvalidasi  dosis  yang  aman  dari  penggunaan  beta-amirin  dan stigmasterol .
Kata Kunci: EGFR; Penambatan molekul; Sambiloto; Senyawa volatil

## Abstract
EGFR  oncoprotein  has  been  commonly  studied  in  combating  cell  cancer  development. However, until this moment the EGFR inhibitors were reported to cause other health issues. Plant extracts are trusted as the potential inhibitor of EGFR expression level without affect our  health.  We  previously  observed  seventeen  volatile  compounds  in  the  dichloromethane extract of Andrographis paniculata . Our objective was to analyze the interaction of volatile compounds  from  the  dichloromethane  extract  of Andrographis  paniculata on  EGFR signalling pathway. In silico technique with ligand-receptor molecular docking was used in this  study.  The  structure  of  volatile  compounds  was  set  as  the  ligands.  EGFR  signalling
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
pathway such as EGFR, PIK3CA, KRAS-GTP, BRAF V600E, and AKT protein structures were assigned as the receptors. PyRx and Biovia Discovery Studio were used in this docking study. Drug-likeness  and  lead-likeness  properties  were  appraised  by  SwissADME  and  Pre- ADME/Tox web tools. Beta-amyrin and stigmasterol showed the strongest binding affinity to PIK3CA and BRAF V600E, respectively. Those compounds structurally showed drug-likeness and  non-mutagenic.  Briefly,  beta-amyrin  and  stigmasterol  will  be  potentially  used  as  the inhibitors of selected oncoproteins. In vitro technique and animal model are suggested to be performed to validate the mutagenic mechanisms of beta-amyrin and stigmasterol.
Keywords: Bitter leaves; EGFR, Molecular docking; Volatile compounds

## 1. PENDAHULUAN
Kasus kematian akibat kanker telah dilaporkan sebanyak hampir 10 juta kasus kematian (IARC, 2020). Secara teori, pembelahan sel dikendalikan oleh dua jenis gen yaitu  onkogen  dan  gen tumor  suppressors .  Onkogen  dapat  mengekspresikan onkoprotein  yang  berfungsi  dalam  menjalankan  siklus  seluler.  Pembelahan  sel dikendalikan oleh protein seperti p53 dan pRb yang diekspresi oleh gen tumor Tumor Suppressor (Kontomanolis et al., 2020; Vélez-Cruz & Johnson, 2017). Namun, kedua gen  tersebut  dapat  dengan  mudah  mengalami  kerusakan  yang  disebabkan  oleh makanan dan hormon (Dolatkhah et al., 2018). Pertumbuhan sel yang tidak terkontrol dapat  menyebabkan  masalah  pada  organ  tubuh  dikarenakan  sel-sel  tersebut  dapat berkumpul yang disebut sebagai tumor.
Perkembangan sel kanker dipengaruhi oleh berbagai mekanisme molekuler yang berfungsi  mengatur laju  proliferasi  sel.  Berbagai  jenis  gen  dilaporkan terlibat  dalam perkembangan  sel  tumor.  Salah  satu  jenis  gen  tersebut Epidermal  Growth  Factor Receptor (EGFR). EGFR adalah sebuah protein transmembran yang berperan sebagai Receptor  Tyrosine  Kinase (RTK).  Masalah  yang  akan  timbul  apabila  protein  EGFR ekspresi  secara  berlebihan  yaitu  akan  menyebabkan  gagalnya  sel  dalam  apoptosis, meningkatnya  laju  proliferasi  sel,  meningkatkan  kecenderungan  angiogenesis,  dan invasi sel kanker (Wu et al., 2013).
Dalam  proses  perkembangan  sel  tumor,  onkoprotein  EGFR  akan mengekspresikan berbagai jenis protein lain. Growth factor receptor bound protein 2 (Grb2)  dan  protein the  son  of  sevenless (SOS)  merupakan  dua  jenis  protein  yang
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
terkoneksi  dengan  EGFR  dalam  mengaktifkan  sebuah  onkoprotein  bernama  Rat Sarcoma Virus (RAS-GTP) dengan memfosforilasi asam amino tirosin. Aktifnya RAS- GTP  mengakibatkan  onkoprotein  RAF  yang  mengalami  peningkatan  perkembangan sel  tumor  seperti  laju  proliferasi,  survival,  angiogenesis,  anti-apoptosis,  invasi  dan metastasis.  GRB2  mampu  merangsang  onkoprotein phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K), yang merupakan salah satu mediator dominan dalam jalur sinyal onkoprotein EGFR.  PI3K  memiliki  dua  sub-unit,  regulator  (p85)  dan  katalitik  (p110).  P110 merupakan  sub-unit  dengan  tiga  tipe  yang  berbeda,  yaitu  tipe  alfa  (PIK3CA),  beta (PIK3CB),  dan  gama  (PIK3CD).  Adapun  mutasi  pada  PIK3CA  (p110α)  dapat menyebabkan  kegagalan  pada  proses  apoptosis.  Peran  PIK3CA  sebagai  onkoprotein tidak terlepas dari perannya yang mampu memfosforilasi protein phosphatidylinositol-
4,5-biphosphate (PIP2)  menjadi phosphatidylinositol-3,4-5-triphosphate (PIP3)  dan mengaktifkan protein AKT (Alqahtani, Ayesh, & Halawani, 2020). Dengan kata lain, mutasi PIK3CA dapat menyebabkan ekspresi berlebihan pada protein AKT/PKB.
Hingga  saat  ini,  peneliti  masih  melakukan  pencarian  atas  penghambat onkoprotein  dengan  memadukan  ilmu  onkologi  dan  farmakologi.  Sebuah  penelitian mengungkapkan  bahwa  anti-EGFR  seperti cetuximab dapat  mengurangi  ekspresi EGFR pada pasien dengan ekspresi EGFR yang tinggi. Selain itu, aspirin juga dapat mengatur  laju  proliferasi,  apoptosis  dan  autofagi  sel  dengan  menghambat  enzim cyclooxygenase-2 (COX-2)  dan prostaglandin  E2 (PGE2),  kedua  protein  tersebut merupakan protein yang direkrut oleh PI3K (Chen et al., 2020; Falzone, Salomone, & Libra, 2018; Hamada, Nowak, & Ogino, 2017; Liu, Zhou, Xu, Wang, & Zhang, 2016). Namun  ditemukan  sebuah  dampak  toksisitas  pada  aspirin  dan  cetuximab  (Kwok  & Loke, 2010; Pinto et al., 2011).
Penggunaan bahan alam telah banyak dilakukan dalam pengobatan. Dalam dunia teknologi  modern,  senyawa  alam  telah  dapat  diisolasi  dan  memiliki  kecenderungan mampu menyerupai obat sintetik, yang lebih dikenal sebagai struktur analog (Atanasov et  al.,  2021).  Pencarian  senyawa  obat-obatan  hingga  saat  ini  masih  menjadi  sebuah
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
permasalahan dikarenakan tingginya harga senyawa kimia yang diperlukan. Terlebih lagi, kegagalan dalam eksperimen yang disebabkan sifat karsinogen dan mutagen pada senyawa  tersebut.  Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan  skrining  molekul  secara  virtual dengan metode penambatan molekul. Metode penambatan molekul merupakan salah satu  pendekatan  dengan  bantuan  komputer  dengan menggunakan  struktur  3  dimensi dari senyawa kimia dan protein-protein yang tersedia dalam sebuah database (Luo, Xie, & Marmorstein, 2008). Penelitian kami sebelumnya mengenai ekstrak daun sambiloto ternyata menghasilkan kesimpulan bahwa ekstrak diklorometana dari daun sambiloto dapat menghambat pertumbuhan sel kanker kolorektal (HT-29 dan SW-620) (Faisal et al.,  2021).  Pada  ekstrak  tersebut  kami  mendapatkan  17  senyawa  volatil  ekstrak diklorometana  daun  sambiloto.  Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan  penelitian  untuk menginvestigasi  interaksi  molekul  antara  17  senyawa  volatil  ekstrak  diklorometana daun sambiloto dengan protein-protein yang terlibat dalam jalur onkoprotein EGFR, seperti  EGFR,  PI3K,  KRAS-GTP,  BRAF  V600E  dan  AKT  secara  visual  dengan menggunakan PyRx dan Biovia Discovery Studio .

## 2. METODE PENELITIAN
Penelitian  dilakukan  pada  bulan  November  –  Desember  2021,  dengan menggunakan netbook dengan prosesor AMD A6-9225 RADEON R4, RAM 4.0 GB dengan  5  compute  cores  2C+3G,  Sistem  Operasi  Windows®  64-bit.  Software  yang digunakan  dalam  penambatan  molekul  dan  visualisasinya  adalah  PyRx  versi  0.8 (Python) dan Biovia Discovery Studio Client 2021 (Dassault System ѐs). Web-tool yang digunakan  dalam  mendukung  penelitian  ini  adalah  Swiss  ADME,  Pre-ADME/Tox, Pubchem, MolView dan RCSB ( Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB ). Penelitian ini dilakukan dengan metode uji molecular docking antara struktur reseptor dengan ligan.
Struktur reseptor didapatkan di Protein Data Bank database ( https://www.rcsb.org ). Penelitian ini menggunakan struktur onkoprotein yaitu EGFR [PDB ID: 5GNK] (Wang et al., 2017), PIK3CA [PDB ID: 3HHM] (Mandelker et al.,
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
2009),  KRAS  (KRAS-GTP)  [PDB  ID:  4LDJ]  (Hunter  et  al.,  2014),  BRAF  V600E [PDB ID: 4XV2] (Zhang et al., 2015) dan AKT [PDB ID: 6NPZ] (Chu et al., 2018). Struktur  protein  dibersihkan  dari  molekul  lain  termasuk  ligan  alami  dan  air  dengan program Biovia Discovery Studio Client 2021 (Dassault Systemѐs).
Sedangkan struktur ligan didapatkan dengan mengunduh ekstensi .sdf melalui database National Library of Medicine National Center of Biotechnology Information
(NLM-NCBI) ( https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ), 1-heptatriakotanol, (6beta,17beta)- dihidroksiandrosta-1,4,3-dien-3-on,  clionasterol,  asam  palmitat,  neophytadiena, stigmasterol,  6,10,14-trimetil-2-pentadekanon,  1,2-asam  benzendikarboksilat,  bis(2- etilheksil)  ester,  alfa-tokoferol,  2-metiltetradekanal,  trikosan,  beta-amirin,  2- oktilakrolein,  oktadekana,  2-asam  oksobutanoat  neopentil  ester,  3,7-dimetil-2,3- epoksioktanal, dan alkohol furfuril. Sebagai pembanding, inhibitor komersial pada tiap protein diunduh seperti anti-EGFR ( vandetanib , mobocertinib dan dacomitinib ), anti- PIK3CA  ( copanlisib , idelalilisib dan umbralisib ),  anti-KRAS  ( adagrasib dan sotorasib ), anti-BRAF ( encorafenib , vemurafenib dan dabrafenib ) dan anti-AKT ( AKT inhibitor VIII dan ipatasertib .
Semua  struktur  ligan  dioptimisasi  dengan  metode  minimisasi  energi  dengan formula force-field Merck Molecular Force-Field (MMFF94) dan dikonversi ke dalam ekstensi  .pdbqt. Grid  box diatur  secara  manual.  Hasil  dari  penambatan  molekul disimpan dalam ekstensi file .csv. Karakteristik ADMET senyawa diprediksi dengan dan Pre-ADME/Tox QSARHUB.
Model  konformasi  pada  tiap  interaksi  antar  molekul  dipilih  berdasarkan  nilai Root  Mean  Square  Deviation (RMSD).  Model  konformasi  yang  terpilih  merupakan model konformasi dengan RMSD terkecil. Biovia Discovery Studio digunakan dalam visualisasi interaksi molekul ligan dengan reseptor.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam  penelitian  kami  sebelumnya  diidentifikasi  17  senyawa  volatil  yang terkandung  dalam  ekstrak  diklorometana daun  sambiloto  yang  diidentifikasi  dengan instrument Gas Chromatography-Mass Spectrometer (GC-MS). Peneliti berhipotesis
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
bahwa  senyawa  volatil  tersebut  berperan  dalam  mekanisme  kerusakan  sel  kanker.
Dalam penelitian ini, seluruh struktur senyawa volatil dianalisis dengan menggunakan metode penambatan molekul. Analisis penambatan molekul saat ini telah menjadi tren dan berperan penting bagi peneliti bidang farmakologi dan biomedis dalam mendesain senyawa  yang  berpotensi  dalam  mengatasi  permasalahan  medis  (Pinzi  &  Rastelli, 2019).
Tabel 1. Energi bebas ikatan interaksi yang terbentuk antara ligan dengan reseptor
No Senyawa Energi bebas ikatan (Kkal/mol) EGFR PIK3CA KRAS BRAF AKT 1 1-heptatriakotanol -4,0 -4,9 -4,1 -6,3 -5.7 2 (6beta,17beta)-dihidroksiandrosta- 1,4,3-dien-3-on -7,6 -8,1 -7,7 -8,7 -7.9 3 clionasterol -8,9 -8,1 -7,5 -8,8 -7.7 4 asam palmitat -5,5 -5,4 -6,0 -5,8 -5.5 5 neophytadiena -5,0 -5,4 -5,6 -7,2 -5.3 6 stigmasterol -9,1 -8,2 -8,7 -10,3 -8.1 7 6,10,14-trimetil-2-pentadekanon -6,1 -5,5 -5,8 -7,2 -6.2 8 1,2-asam benzendikarboksilat, bis(2- etilheksil) ester -4,6 -6,0 -6,1 -7,8 -6.4 9 alfa-tokoferol -7,6 -7,3 -7,2 -8,9 -8.6 10 2-metiltetradekanal -5,4 -4,7 -5,8 -6,3 -5.5 11 trikosan -6,6 -4,9 -5,2 -6,8 -5.0 12 beta-amirin -9,1 -10,2 -7,7 -9,4 -9.0 13 oktadekana -5,5 -5,0 -5,2 -6,2 -5.3 14 2-oktilakrolein -5,0 -4,8 -5,0 -5,3 -5.0 15 2-asam oksobutanoat neopentil ester -4,7 -5,6 -5,3 -5,6 -5.3 16 3,7-dimetil-2,3-epoksioktanal -4,9 -4,6 -5,4 -5,5 -4.9 17 alkohol furfuril -4,0 -4,5 -4,4 -4,4 -4.6 18 Dacomitinib (EGFR inhibitor) -8,8 - - - - 19 Mobocertinib (EGFR inhibitor) -8,6 - - - - 20 Vandetanib (EGFR inhibitor) -9,2 - - - - 21 Copanlisib (PIK3CA inhibitor) - -8,7 - - - 22 Idelalisib (PIK3CA inhibitor) - -8,9 - - - 23 Umbralisib (PIK3CA inhibitor) - -9,5 - - - 24 Adagrasib (KRAS inhibitor) - - -6,9 - - 25 Sotorasib (KRAS inhibitor) - - -8,1 - - 26 Encorafenib (BRAF inhibitor) - - - -8,0 - 27 Vemurafenib (BRAF inhibitor) - - - -9,4 - 28 Dabrafenib (BRAF inhibitor) - - - -8,8 - 29 AKT Inhibitor VIII (AKT inhibitor) - - - - -11,5 30 Ipatasertib (AKT inhibitor) - - - - -8,9
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
Berdasarkan Tabel 1 dapat dilihat bahwa 2 di antara 17 senyawa volatil dari ekstrak diklorometana  daun  sambiloto  menunjukkan  angka  energi  bebas  ikatan  yang  tinggi terhadap  seluruh  onkoprotein.  Uji in  silico dengan  metode  penambatan  molekul mendapatkan bahwa beta-amirin dan stigmasterol mengindikasikan sebagai inhibitor onkoprotein  yang  berpotensi,  ditandai  dengan  skor  energi  bebas  ikatannya  yang terendah.  Beta-amirin  menghambat  PIK3CA  dengan  skor  energi  bebas  ikatan  yang rendah. Sedangkan  stigmasterol cenderung dapat menghambat protein BRAF (Tabel 1).
Gambar  1.  Visualisasi  interaksi  antara  beta-amirin  dengan  situs  ikatan  protein PIK3CA, (a) 3 dimensi, (b) 2 dimensi
Berdasarkan  hasil  visualisasi  interaksi  antar  molekul,  residu  asam  amino  yang terlibat dalam interaksi antara ligan-reseptor telah diidentifikasi dan diilustrasikan pada Gambar 1 dan 2. Beta-amirin menunjukkan skor energi bebas ikatan terbaik terhadap PIK3CA,  -10,2  kkal/mol.  Terdapat  residu  asam  amino  PIK3CA  yang  terlibat  dalam situs  aktif  yaitu  ILE800,  ILE848,  ILE932  yang  berikatan  pada  cincin  benzene  serta LYS776,  MET772,  TRP780,  ILE800,  TYR836,  ILE848,  VAL851,  MET922  dan ILE932 berikatan dengan atom karbon (Gambar 1).  Senyawa potensial lainnya yaitu stigmasterol  yang  menunjukan  skor  energi  bebas  ikatan  terbaik  terhadap  BRAF V600E,  -10,3  kkal/mol.  Dua  jenis  ikatan  kimia  juga  terbentuk  pada  interaksi  antara stigmasterol  dengan  BRAF  V600E.  GLY534  dengan  atom  hidrogen  stigmasterol
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
membentuk ikatan hidrogen. Hal menarik didapatkan bahwa atom karbon ke-4 pada stigmasterol  dengan  PHE583  membentuk  beberapa  jenis  ikatan  hidrofobik  yaitu pi- sigma dan  alkil.  Sementara  itu, cincin  benzene  pada  stigmasterol  membentuk ikatan hidrofobik alkil dengan ILE463, ALA481, LEU505, LEU514 dan TRP531  (Gambar
2).  Penelitian  ini  menitikberatkan  bahwa  beta-amirin  dan  stigmasterol  dapat menunjukan  tendensi  sebagai  penghambat  PIK3CA  dan  BRAF  V600E  pada  situs ikatan protein tersebut.
Gambar  2.  Visualisasi  interaksi  antara  stigmasterol  dengan  situs  ikatan  protein BRAV600E, (a) 3 dimensi, (b) 2 dimensi
Untuk  mengurangi  kegagalan  dalam  fase  klinis,  zat  kimia  yang  akan  kita gunakan sebagai pengobatan perlu diuji dari struktur kimianya. Penelitian ini dilakukan untuk mengevaluasi dan memprediksi sifat-sifat fisikokimia dari senyawa beta-amirin dan  stigmasterol.  Sifat  fisikokimia  seperti drug-likeness , lead-likeness ,  penyerapan gastrointestinal, sawar darah otak/ blood brain barrier (BBB), permeabilitas kulit dan toksisitas  (mutagenisitas  dan  karsinogenisitas)  telah  didapatkan  dari  web-tool SwissADME dan Pre-ADME/Tox QSARHUB . Berdasarkan parameter yang diprediksi beta-amirin dan stigmasterol memenuhi aturan Lipinski dan Veber. DL adalah aspek krusial dalam pengembangan obat untuk mengetahui keamanan dari senyawa tersebut.
Walaupun  begitu,  prediksi  dengan  menggunakan  komputasi  juga  masih  belum memenuhi persyaratan dalam kelayakan sebuah senyawa menjadi kandidat obat. DL juga dapat mendeskripsikan bioavailabilitas senyawa serta distribusi senyawa tersebut dalam  sistem  pencernaan.  Mekanisme  ini  merupakan  konsep  dasar  apakah  sebuah
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
senyawa  akan  mudah  dicerna  dan  ditransportasikan  ke  seluruh  tubuh (Bickerton,
Paolini,  Besnard,  Muresan,  &  Hopkins,  2012).  Dalam  prediksi SwissADME ,  beta- amirin  dan  stigmasterol  memiliki  skor  bioavailabilitas  0,55.  Hal  ini  merefleksikan bahwa kedua senyawa tersebut dapat diserap dengan baik oleh sel Caco-2 (sel epitel kolon)  yang  merepresentasikan  mekanisme  metabolisme  dalam  tubuh  manusia (Martin, 2005). Aspek lain yang perlu diperhatikan dalam desain senyawa obat adalah lead-likenss (LL)  dan  toksisitas.  Obat-obatan  normalnya  memiliki  satu  atau  lebih senyawa leader (Oprea,  Davis, Teague, &  Leeson,  2001;  Teague,  Davis,  Leeson,  &
Oprea, 1999). Tabel 2 memberikan informasi mengenai sifat fisikokimia beta-amirin dan stigmasterol yang tidak memenuhi syarat LL.
Tabel 2. Sifat Fisikokimia beta-amirin dan stigmasterol
Parameter Senyawa Beta-amirin Stigmasterol MW (g/mol) 426,72 412,69 M log P 6,92 6,62 X log P 9,15 8,56 HBA 1 1 HBD 1 1 NRB 0 5 PSA (Å) 20,23 20,23 Drug-likeness Lipinski Yes Yes Ghose No No Veber Yes Yes Egan No No Muegge No No Bioavailability score 0,55 0,55 LL No No Mut (-) (-) Carc (+) (+)
MW: Molecular Weight ; HBA: Hydrogen Bond Acceptor ; HBD: Hydrogen Bond Donor ; PSA: Polar Surface  Area ;  NRB: Number  Rotatable  Bond ;  LL: Lead-likeness ;  Mut: mutagenic  tendency ;  Carc: carcinogenic tendency
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
Mutagenisitas merupakan sebuah mekanisme yang sangat penting dalam proses perkembangan  sel  menjadi  keganasan  atau  kanker.  Faktor  terjadinya  mutasi  genetik pada  umumnya  adalah  makanan  ataupun  obat-obatan  yang  dikonsumsi. Structure- Activity  Relationship atau  dapat  disingkat  menjadi  SAR  kini  telah  menjadi  metode analisis yang dapat digunakan untuk mengukur tendensi dari senyawa dalam merubah sekuens  gen (Honma,  Kitazawa,  Kasamatsu,  &  Sugiyama,  2020).  Selain  itu, karsinogenisitas  juga  merupakan  aspek  yang  penting  dalam  menentukan  keamanan suatu  obat.  Konsensus World  Summit  on  Sustainable  Development (WSSD)  telah merancang persetujuan dan diputuskan untuk mengendalikan efek mutagenisitas dan karsinogenisitas  terhadap  konsumsi  obat-obatan  (European  Commision,  2013). Quantitative  Structure-Activity  Relationship (disingkat  QSAR)  merupakan  metode yang  diakui  oleh  WSSD  dapat  mengevaluasi  toksisitas  senyawa  yang  merupakan prinsip fundamental dalam eksplorasi senyawa obat (Honma et al., 2020). Akan tetapi evaluasi  dengan  komputasi  tidak  cukup  valid  untuk  menentukan  toksisitas  kandidat senyawa.  Perlu  dilakukan  uji  lebih  lanjut  dengan  studi in  vitro dan in  vivo dalam menentukan  dosis  atau  konsentrasi  yang  dapat  mengakibatkan  efek  toksik.  Dalam penelitian  ini,  didapatkan  bahwa  beta-amirin  dan  stigmasterol  tidak  memiliki  sifat mutagenisitas namun mempunyai kecenderungan dalam karsinogenisitas.
Tabel 3. Karakteristik farmakokinetik senyawa beta-amirin dan stigmasterol
Parameter Senyawa Beta-amirin Stigmasterol GI absorption Low Low BBB permeant No No Log K p -2,41 -2,74 P-gp substrate No No CYP2C9 inhibitor No Yes
Tabel  3  dalam  penelitian  ini  menggambarkan  bahwa  kedua  senyawa  tersebut memiliki  laju  absorpsi  yang  lambat  dengan  menganalisis  plot boiled-egg (Daina  &
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
Zoete,  2016).  Beta-amirin  merupakan  inhibitor  dari  sitokrom  P450  yang  berperan sebagai katalis reaksi oksidasi seperti obat eksogen dan karsinogen, ataupun senyawa yang bersifat toksik (Niwa, Yanai, Matsumoto, & Shizuku, 2019). Hal ini menandakan bahwa beta-amirin dapat diproses secara fisiologis oleh enzim sitokrom P450 CYP2C9. CYP2C9 adalah sebuah gen yang mengekspresikan sebuah enzim yang berperan dalam mengeliminasi  warfarin  yang  merupakan  senyawa  anti-koagulasi  (Jorgensen, FitzGerald, Oyee, Pirmohamed, & Williamson, 2012). Dengan kata lain, stigmasterol memiliki  kecenderungan  dalam  menstimulasi  penggumpalan  darah.  Log  K p merupakan  parameter  hasil  prediksi  yang  menunjukkan  suatu  senyawa  mempunyai sifat  permeabilitas  kulit.  Ambang  batas  dimana  suatu  senyawa  dapat  dikatakan permeabilitas pada kulit yaitu memiliki log K p > -2,5 cm/s (Pires, Blundell, & Ascher,
2015).  Berdasarkan  prediksi SwissADME ,  stigmasterol  memiliki  permeabilitas  kulit karena log  K p -2,74  cm/s,  sebaliknya  beta-amirin  memiliki log  K p -2,41  cm/s  yang dapat dikatakan beta-amirin mempunyai sifat permeabilitas kulit yang kurang baik.

## 4. KESIMPULAN DAN SARAN

## 4.1 Kesimpulan
Studi penambatan molekul dari senyawa volatil dari ekstrak diklorometana daun sambiloto menghasilkan  kesimpulan  bahwa  beta-amirin  dan  stigmasterol mempunyai potensi  penghambat  pada  PIK3CA  dan  BRAF  V600E  yang  termasuk  dalam  jalur pensinyal EGFR.  Dari  prediksi  ADMET, beta-amirin  dan  stigmasterol memiliki  sifat drug-likeness pada  aturan  Lipinski  dan  Veber  serta  mempunyai  skor  bioavailabilitas yang baik hanya saja memiliki kecenderungan dalam karsinogenisitas.

## 4.2 Saran
Berdasarkan  studi  yang  telah  dilakukan,  didapatkan  bahwa  beta-amirin  dan stigmasterol mempunyai sifat karsinogenik. Sehingga diperlukan penelitian mengenai uji efek karsinogen pada kedua senyawa tersebut untuk ambang batas dosis yang aman dalam penggunaan beta-amirin dan stigmasterol dalam pengobatan.
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor

## 5. REFERENSI
Alqahtani, A., Ayesh, H. S. K., & Halawani, H. (2020). PIK3CA gene mutations in solid  malignancies:  Association  with  clinicopathological  parameters  and prognosis. Cancers , 12 (1), 1–18. https://doi.org/10.3390/cancers12010093
Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M., Orhan, I. E., Banach, M., Rollinger, J. M., … Supuran, C. T. (2021). Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews Drug Discovery , 20 (3), 200–216. https://doi.org/10.1038/s41573-020-00114-z
Bickerton, G. R., Paolini, G. V, Besnard, J., Muresan, S., &  Hopkins, A. L. (2012). Quantifying the chemical beauty of drugs Europe PMC Funders Group. Nature Chemistry , 4 (2), 90–98. https://doi.org/10.1038/nchem.1243.Quantifying Chen,  Z.,  Wang,  C.,  Dong,  H.,  Wang,  X.,  Gao,  F.,  Zhang,  S.,  &  Zhang,  X.  (2020). Aspirin  has  a  better  effect  on  PIK3CA  mutant  colorectal  cancer  cells  by PI3K/Akt/Raptor pathway. Molecular Medicine , 26 (1), 1–13. https://doi.org/10.1186/s10020-020-0139-5 Chu, N., Salguero, A. L., Liu, A. Z., Chen, Z., Dempsey, D. R., Ficarro, S. B., … Cole, P.  A.  (2018).  Akt  Kinase  Activation  Mechanisms  Revealed  Using  Protein Semisynthesis. Cell , 174 (4), 897-907.e14.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.07.003
Daina, A., & Zoete, V. (2016). A BOILED-Egg to predict gastrointestinal absorption and  brain  penetration  of  small  molecules. ChemMedChem ,  1117–1121. https://doi.org/10.1002/cmdc.201600182
Dolatkhah, R., Somi, M. H., Shabanloei, R., Farassati, F., Fakhari, A., & Dastgiri, S. (2018). Main risk factors association with proto-oncogene mutations in colorectal cancer. Asian  Pacific  Journal  of  Cancer  Prevention , 19 (8),  2183–2190. https://doi.org/10.22034/APJCP.2018.19.8.2183
European  Commision.  (2013). Interpretation  of  the  WSSD  2020  Chemicals . Luxembourg.
Faisal,  M.,  Maungchanburee,  S.,  Dokduang,  S.,  Rattanburee,  T.,  Tedasen,  A.,  & Graidist,  A.  P.  (2021).  Dichloromethane  crude  extract  of  gymnanthemum extensum  combined  with  low  piperine  fractional  piper  nigrum  extract  induces apoptosis  on  human  breast  cancer  cells. Indian  Journal  of  Pharmaceutical Sciences , 83 (2), 247–260. https://doi.org/10.36468/pharmaceutical-sciences.770
Falzone, L., Salomone, S., & Libra, M. (2018). Evolution of cancer pharmacological treatments  at  the  turn  of  the  third  millennium. Frontiers  in  Pharmacology , 9 (NOV). https://doi.org/10.3389/fphar.2018.01300
Hamada, T., Nowak, J. A., & Ogino, S. (2017). PIK3CA mutation and colorectal cancer precision medicine. Oncotarget , 8 (14), 22305–22306.
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
https://doi.org/10.18632/oncotarget.15278
Honma, M., Kitazawa, A., Kasamatsu, T., & Sugiyama, K. ichi. (2020). Screening for Ames mutagenicity of food flavor chemicals by (quantitative) structure-activity relationship. Genes and Environment , 42 (1), 1–6. https://doi.org/10.1186/s41021- 020-00171-1
Hunter, J. C., Gurbani, D., Ficarro, S. B., Carrasco, M. A., Lim, S. M., Choi, H. G., … Westover, K. D. (2014). In situ selectivity profiling and crystal structure of SML- 8-73-1,  an  active  site  inhibitor  of  oncogenic  K-Ras  G12C. Proceedings  of  the National Academy of Sciences of the United States of America , 111 (24), 8895– 8900. https://doi.org/10.1073/pnas.1404639111
IARC.  (2020).  The  Global  Cancer  Observatory  -  All  cancers.  Retrieved  March  14, 2022, from Globocan website: https://gco.iarc.fr/today/home
Jorgensen, A. L., FitzGerald, R. J., Oyee, J., Pirmohamed, M., & Williamson, P. R.
(2012). Influence of CYP2C9 and VKORC1 on Patient Response to Warfarin: A
Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS ONE , 7 (8). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044064
Kontomanolis, E. N., Koutras, A., Syllaios, A., Schizas, D., Mastoraki, A., Garmpis, N., … Fasoulakis, Z. (2020). Role of oncogenes and tumor-suppressor genes in carcinogenesis:  A  review. Anticancer  Research , 40 (11),  6009–6015. https://doi.org/10.21873/anticanres.14622
Kwok, C. S., & Loke, Y. K. (2010). Critical overview on the benefits and harms of aspirin. Pharmaceuticals , 3 (5), 1491–1506. https://doi.org/10.3390/ph3051491
Liu, J., Zhou, Q., Xu, J., Wang, J., & Zhang, Y. (2016). Detection of EGFR expression in patients with colorectal cancer and the therapeutic effect of cetuximab. Journal of B.U.ON. , 21 (1), 95–100.
Luo, C., Xie, P., & Marmorstein, R. (2008). Identification of BRAF inhibitors through in  silico  screening. Journal  of  Medical  Chemistry , 51 (19),  6121–6127. https://doi.org/10.1021/jm800539g
Mandelker, D., Gabelli, S. B., Schmidt-Kittler, O., Zhu, J., Cheong, I., Huang, C. H., …  Amzel,  L.  M.  (2009).  A  frequent  kinase  domain  mutation  that  changes  the interaction  between  PI3Kα  and  the  membrane. Proceedings  of  the  National Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America , 106 (40),  16996–17001. https://doi.org/10.1073/pnas.0908444106
Martin, Y. C. (2005). A bioavailability score. Journal of Medicinal Chemistry , 48 (9), 3164–3170. https://doi.org/10.1021/jm0492002
Niwa,  T.,  Yanai,  M.,  Matsumoto,  M.,  & Shizuku,  M.  (2019).  Effect  of  Cytochrome P450  (CYP)  2D6  Genetic  Polymorphism  on  the  Inhibitory  Action  of Antidepressants  on  CYP2D6-Mediated  Dopamine  Formation  from  p-Tyramine.
Penambatan Molekul Senyawa Volatil Ekstrak Diklorometana Sambiloto Terhadap Jalur Pensinyal Epidermal Growth Factor Receptor
Journal  of  Pharmacy  and  Pharmaceutical  Sciences , 21 (1),  135–142. https://doi.org/10.18433/JPPS29673
Oprea, T. I., Davis, A. M., Teague, S. J., & Leeson, P. D. (2001). Is There a Difference between  Leads  and  Drugs?  A  Historical  Perspective. Journal  of  Chemical Information and Computer Sciences , 41 (3–6), 1308–1315.
https://doi.org/10.1021/ci010366a
Pinto, C., Barone, C. A., Girolomoni, G., Russi, E. G., Merlano, M. C., Ferrari, D., & Maiello,  E.  (2011).  Management  of  skin  toxicity  associated  with  cetuximab treatment  in  combination  with  chemotherapy  or  radiotherapy. The  Oncologist , 16 (2), 228–238. https://doi.org/10.1634/theoncologist.2010-0298
Pinzi,  L.,  &  Rastelli,  G.  (2019).  Molecular  docking:  Shifting  paradigms  in  drug discovery. International Journal of Molecular Sciences , 20 (18). https://doi.org/10.3390/ijms20184331
Pires,  D.  E.  V.,  Blundell,  T. L.,  &  Ascher,  D.  B.  (2015).  pkCSM:  Predicting  small- molecule pharmacokinetic and toxicity properties using graph-based signatures. Journal of Medicinal Chemistry , 58 (9), 4066–4072.
https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5b00104
Teague, S. J., Davis, A. M., Leeson, P. D., & Oprea, T. (1999). The design of leadlike combinatorial  libraries. Angewandte  Chemie  -  International  Edition , 38 (24), 3743–3748. https://doi.org/10.1002/(SICI)1521- 3773(19991216)38:24<3743::AID-ANIE3743>3.0.CO;2-U
Vélez-Cruz, R., & Johnson, D. G. (2017). The retinoblastoma (RB) tumor suppressor: Pushing back against genome instability on multiple fronts. International Journal of Molecular Sciences , 18 (8). https://doi.org/10.3390/ijms18081776
Wang, A., Li, X., Wu, H., Zou, F., Yan, X. E., Chen, C., … Liu, Q. (2017). Discovery of (R)-1-(3-(4-Amino-3-(3-chloro-4-(pyridin-2-ylmethoxy)phenyl)-1H- pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl)piperidin-1-yl)prop-2-en-1-one  (CHMFL-EGFR- 202)  as  a  Novel  Irreversible  EGFR  Mutant  Kinase  Inhibitor  with  a  Distinct Binding  Mode. Journal  of  Medicinal  Chemistry , 60 (7),  2944–2962. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6b01907
Wu, W. K. K., Wang, X. J., Cheng, A. S. L., Luo, M. X. M., Ng, S. S. M., To, K. F., … Yu, J. (2013). Dysregulation and crosstalk of cellular signaling pathways in colon carcinogenesis. Critical Reviews in Oncology/Hematology , 86 (3), 251–277. https://doi.org/10.1016/j.critrevonc.2012.11.009
Zhang, C., Spevak, W., Zhang, Y., Burton, E. A., Ma, Y., Habets, G., … Bollag, G. (2015). RAF inhibitors that evade paradoxical MAPK pathway activation. Nature , 526 (7574), 583–586. https://doi.org/10.1038/nature14982