Jurnal : Jurnal Kesehatan Prima Volume
: 8, No.2, Agustus 2014, Halaman : 1322-1335
ISSN Print
: 1978 – 1334, ISSN Online : 2460 – 8661

## ___________________________________________________________________________
Pancawati Ariami, Maruni Wiwin Diarti dan Yunan Jiwintarum: Jurusan  Analis Kesehatan Poltekkes Kemenkes Mataram, Jl. Prabu Rangkasari Dasan Cermen Sandubaya Mataram

## SENSITIVITAS MEDIA OGAWA DAN MEDIA LOWENSTEIN JENSEN TERHADAP HASIL PERTUMBUHAN KUMAN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Pancawati Ariami, Maruni Wiwin Diarti, Yunan Jiwintarum
Abstract :  Referring  to  the  national  TB  control  program,  the  diagnosis  made  by  microscopic  examination  of sputum  by  direct  and  definitive  diagnosis  by  culture  examination.  Direct  sputum  examination  is  the  gold standard method of microscopic examination of a recognized WHO TB and confirmation done by the method of culture.  Research  "Sensitivity  Test  Using  Ogawa  Medium  and  Lowenstein  Jensen  Medium  Againts Micobacterium tuberculosis Bacteria Growth Results ", performed to identify and compare the results of Ogawa medium  and  culture  on  Lowenstein-Jensen  medium  and  analyze  the  sensitivity  between  the  two  medium.  A descriptive observational study was conducted. Study sample is a sample saturated with a consecutive sampling. Sample size retrieval technique based on sample collection time, which is June 8 through July 18, 2011, a total of  53  samples.  Research  is  to  test  the  sensitivity  variables  as  independent  variables  and  the  growth  of Mycobacterium tuberculosis bacteria on the Ogawa medium and LJ medium as a bound variable. The results of the study, of 53 samples, 21 (39.6%) samples were negative, so that 32 (60.4%) samples tested positive for M tuberculosis and the total growth of 36 samples (67.9%). Lowenstein Jensen (LJ) medium is more sensitive than the  Ogawa  medium,  both  in  terms  of  speed  of  growth  and  in  the  number  of  colonies  that  grow.  For  the determination  of  Mycobacterium  species  needs  to  be  done  other  tests  to  confirm.  Culture  results  can  also  be used for comparison using the PCR method, OAT resistance by culture methods.
Kata Kunci: SensitivityOgawa Medium, Lowenstein Jenses Medium, The Growth Of M Tuberculosis

## LATAR BELAKANG
Mycobacterium tuberculosis ( M. tbc ) diperkirakan  menginfeksi  sepertiga  penduduk  dunia, 75%  termasuk  dalam    usia  produktif  (15-50  tahun). WHO  memperkirakan  bahwa  di  Indonesia  setiap tahun  terjadi  583.000  kasus  baru  dan  menyebabkan kematian  sekitar  140.000  (Depkes  R  I,  2000). Menurut  laporan  WHO,  penyakit  TB  Paru  di Indonesia  tercatat  320  kasus  per  100.000  penduduk pada  tahun  1991,  300  per  100.000  pada  tahun  1992 dan  247  kasus  pada  thun  1993.  Perkiraan  angka kejadian  untuk  semua  golongan  umur  pada  tahun 2000  dan  2005  adalah  243  dan  247  per  100.000 penduduk.  Selanjutnya  berdasarkan  hasil  Riskesdas tahun  2010  bahwa  periode prevalence TB  Paru
2009/2010  adalah  sebesar  725/100.000  penduduk. Lima  provinsi  yang  memiliki  angka  prevalensi  TB paling  tinggi  adalah:  Papua  1.441  per  100.000 penduduk,  banten  1.282  per  100.000  penduduk, Sulawesi  Utara  1.221  per  100.000  penduduk, Gorontalo  1.200  per  100.000  penduduk  dan  DKI jakarta  1.032  per  100.000  penduduk  (Asa,  2005; Riskesdas, 2010).
Provinsi NTB merupakan salah satu dari 33 provinsi yang merupakan daerah indikator pencapaian Milleneum  Development  Goals  (MDGs) bidang  kesehatan  pada  riset  kesehatan  dasar (Riskesdas)  tahun  2010.  Periode prevalence TB  di NTB 0,927% dan periode suspek TB adalah 2,877% (Riskesdas,  2010).  Di  kabupaten  Lombok  Timur menurut  laporan  Dikes  Lotim  bidang  P2PL  tahun
2010  cakupan  penemuan  penderita  baru  BTA  (+) adalah  763  (34%)  meningkat  dari  cakupan  tahun 2009  sebanyak  32%.  Puskesmas  Dasan  Lekong merupakan  salah  satu  puskesmas  di  Lombok  Timur dengan  jumlah  suspek  penderita  TB  619  orang dengan  pemeriksaan  mikroskopis  BTA  (+)  62  orang (Dikes Lotim, 2010).
Diagnosis
tuberkulosis (TB) paru ditegakkan berdasarkan gambaran klinik, pemeriksaan fisik, gambaran radiologik, pemeriksaan laboratorium  dan  uji  tuberkulin  (Retno,  2011). Diagnosis  laboratorium  tuberkulosis  (TB)  paru  yang rutin  dilaksanakan  adalah  tehnik  mikroskopis  BTA, dan  untuk  konfirmasi  dilakukan  kultur.  Rangkaian pemeriksaan identifikasi M tuberculosis dalam sekret atau  jaringan    merupakan  hal  utama  dalam menegakkan diagnosis tuberkulosis namun mempunyai  keterbatasan.  Pulasan  BTA  secara mikroskopis  dapat  mendeteksi  kurang  lebih  5000 kuman/ml  sputum,  sedangkan  metode  kultur  dengan 50  –  100  kuman/ml  sputum  sudah  dapat  tumbuh (Retno, 2011). Tehnik mikroskopis relatif cepat, tapi sensitivitas  dan  spesivisitas  relatif  rendah  dibanding dengan  tehnik  kultur  (Kalma,  2003).  Tanoue et.  al . (2002)  telah  melalukan  penelitian  pada  53  strain M tuberculosis untuk  mengevaluasi  konsistensi  tes kerentanan  menggunakan  dua  media  kultur  padat berbasis  telur,  Ogawa  dan  Lowenstein-Jensen  (LJ). Penelitian  dilaksanakan  untuk  menilai  perbedaan antar media dalam tes kerentanan untuk obat anti TB terhadap isoniazid, rifampisin, etambutol, streptomisin, dan obat alternatif lain.
Media LJ digunakan untuk diagnosis infeksi Mycobacterium,  uji  kerentanan  antibiotik  terhadap
isolat, membedakan perbedaan spesies Mycobacterium (berupa  morfologi koloni, kecepatan pertumbuhan, karakteristik biokimia, dan mikroskopis).  Media  LJ  lebih  dikenal  untuk  kultur Mycobacterium,  seperti  direkomendasikan  oleh International  Union  Against  Tuberculosis  (IUAT) . (Wikipedia, the free encyclopedia ).
Media  Ogawa  lebih  murah  dibandingkan dengan  Lowenstein-Jensen  karena  dibuat  tanpa asparagin.  Kandungan  garam-garam  mineral  yang telah  dicampur  dapat  disimpan  lama  sedangkan campuran pewarna tidak dapat disimpan lama karena mengendap  atau  berubah  menjadi  larutan  yang berwarna  sangat  pucat  (Weyer et.  al. ,  2006).
Pemeriksaan sputum secara langsung dengan metode mikroskopis  merupakan gold  standart pemeriksaan TB  yang  diakui WHO. Uji  konfirmasi  dilakukan dengan metode kultur. Walaupun banyak jenis kultur yang  dapat  digunakan  untuk  mengkultur  kuman M tuberculosis, namun  media  Ogawa  dan  LJ  secara rutin lebih disukai dan lebih sering dilaksanakan.
Kuman M  tuberculosis yang  sering  kontak dengan  OAT  dapat  berubah  bentuk  ( fragmented ), sehingga sulit atau bahkan tidak dapat diamati secara mikroskopis sehingga dilaporkan sebagai TB negatif. TB secara mikrokopis negatif bukan berarti kuman M tuberculosis sudah  mati.  Hal  ini  dapat  dikonfirmasi dengan  metode  lain,  misalnya  dengan  mengkultur kuman.  Media  Ogawa  dan  LJ  dapat  juga  digunakan untuk  menguji  kerentanan  pertumbuhan  kuman M tuberculosis terhadap  OAT.  Metode  kultur  adalah metode  yang  paling  murah  setelah  mikroskopis namun  memerlukan  waktu  lama.  Sedangkan  metode
lain  (ELISA,  PCR)  lebih  efisien  dari  sisi  waktu namun biaya pemeriksaan tinggi.

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian observasional  deskriptif,  dengan  populasi/sampel adalah  semua  penderita  TB  paru  yang  dinyatakan positif secara mikroskopis . Ukuran sampel penelitian berdasarkan  waktu  pengumpulan,  yaitu  sampel penderita  TB  paru  yang  dinyatakan  positif  secara mikroskopis,  yaitu  sebanyak  53  sampel  yang dikumpulkan  tanggal  8  Juni  sampai  dengan  18  Juli 2011.  Tehnik  sampling    dengan consecutive sampling, yaitu penderita suspek TB yang dinaytakan positif  secara  mikroskopis  dan  bersedia  dengan menandatangani inform consent .
Cara  Pengumpulan  Data,  berdasarkan  data primer  berupa hasil  identifikasi  sputum  dengan pulasan  BTA  (mikroskopis  langsung)  dari  penderita suspek  TB  Paru  yang  dinyatakan  positif  secara mikroskopis dengan pewarnaan BTA dengan metode Ziehl  Neelsen .  Data  lain  adalah  hasil  identifikasi sputum  berupa  pertumbuhan  kuman M  tuberculosis yang  diperoleh  dari  kultur  pada  media  Ogawa  dan media  LJ  dari  penderita  TB  paru  serta  membedakan hasil  pembiakan  pada  kedua  media  berdasarkan morfologi koloni dan kecepatan pertumbuhan kuman pada media kultur.
Analisis Data. Data tentang hasil identifikasi sputum dengan  pulasan  BTA  (mikroskopis  langsung)  pada penderita  suspek  TB  Paru  dilakukan  dengan mengumpulkan  hasil  pemeriksaan  mikroskopis  dari pewarnaan  sputum  BTA  dengan  metode Ziehl Neelsen diperoleh  sebanyak  53  sampel  dibuat
persentase  antara  data  sebelum  dan  sesudah pengolahan sputum. Data tentang perbandingan hasil kultur  sputum  pada  media  Ogawa  dan  media  LJ berdasarkan morfologi koloni dan kecepatan pertumbuhan  kuman.  Data  tentang  hasil  uji sensitivitas
pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis pada  media  Ogawa  dan  media  LJ.
Sensitivitas media LJ dihitung dengan cara
(+) LJ        x 100%
(+) Ogawa
Rincian cara kerja :
Pengambilan  sputum  untuk  BTA. Sebelum mengeluarkan sputum, pasien disuruh untuk berkumur-kumur  dengan  air  dan  pasien  harus melepas  gigi  palsu(bila  ada).  Sputum  diambil  dari batukkan  pertama  ( first  cough ).  Cara  membatukkan sputum:  Tarik  nafas  dalam  dan  kuat  (dengan pernafasan  dada),  batukkan  kuat  sputum  dari bronkus,  trakea,  mulut,  wadah  penampung.  Periksa sputum  yang  dibatukkan,  bila  ternyata  yang dibatukkan  adalah  air  liur/saliva,  maka  pasien  harus mengulangi  membatukkan  sputum.  Sebaiknya,  pilih sputum  yang  mengandung  unsur-unsur  khusus, seperti,  butir  keju,  darah  dan  unsur-unsur  lain.  Bila sputum  susah  keluar,  lakukan  perawatan  mulut. Perawatan  mulut  dilakukan  dengan  obat  glyseril guayakolat( expectorant )  200  mg  atau  dengan mengonsumsi  air  teh  manis  saat  malam  sebelum pengambilan  sputum.  Bila  sputum  juga  tidak  bisa didahakkan,  sputum  dapat  diambil  secara  aspirasi transtracheal , bronchial lavage , lung
biopsy. (Sumber: http://www.scribd.com)
Pengolahan  sputum  dan  dekontaminasi. Sampel sputum  dijaga  dari  ada  atau  tidaknya  BTA  dengan metode Ziehl Neelsen (ZN) . Sampel dicampur dengan vortex dan dibagi sama banyak dalam 2 bagian. Satu bagian  sampel  diproses  dengan  menambahkan  4 bagian  NaOH  4%  pada  satu  bagian  sputum  dan dicampur  pada  posisi  tegak  lurus  selama  15  menit. Campuran  tadi  diambil  0.1  ml  yang  langsung diinokulasi  pada  2  tabung  media  Ogawa  3%. Setengah  lainnya  diproses  dengan  menambahkan volume sama banyak NaOH 4% dan dihomogenisasi dengan vortex selama  15  menit.  Buffer  phosphate (pH  6.8)    ditambahkan  untuk  menetralisir  larutan, kemudian  diputar  pada  3000  rpm  selama  15  menit dan  supernatant  dibuang.  Dengan  menggunakan inoculum  0,1  ml  sedimen  diinokulasi  kedalam  2 tabung  medium  LJ.  Semua  tabung  kultur  diinkubasi pada  37 o C  dan  diamati  setiap  hari  dari  minggu pertama  masa  inkubasi  sampai  akhir  minggu  ke-8. (Sumber: Ang et. al. , 2011).
Metode  kultur  dengan  menggunakan  medium Ogawa  3% . Prosedur  untuk  mempersiapkan  biakan media  Ogawa  3%  berdasarkan  pada  petunjuk  yang tersedia  dalam  buku  pedoman, Minimum  Essentials of  Laboratory  Procedures  for  Tuberculosis  Control oleh the  Research  Institute  of  Tuberculosis,  Japan Anti-Tuberculosis  Association .  KH4PO4  sebanyak  3 gram  dan  1  gram  Natrium  glutamate  (vetsin) dilarutkan ke dalam 100 ml aquadest  dan disterilkan pada  121 0 C  selama  15  menit.  Ditambahkan  6  ml glycerol  dan malachite  green 2%  dalam  larutan garam  dingin.  Ditambahkan  200  ml  telur  yang  telah dihomogenkan  dengan  menambahkan  larutan  dan dicampur  dengan  hati-hati.  Setelah  dihomogenisasi,
medium  kasar  dibagikan  ke  dalam  tabung  bertutup. Tabung  kultur  dipanaskan  pada  90 o C  selama  1  jam.
(Sumber: Ang et. al. , 2011)
Metode  kultur  dengan  menggunakan    medium Lowenstein  Jensen  (LJ). Medium  Lowenstein Jensen  dipersiapkan  menurut  petunjuk  pabrik  (BBL, Merck).  Medium  pembiakan  disiapkan  dengan menimbang  18.65  gram  medium  dasar  LJ  dan dilarutkan ke dalam 300 ml aquadest. Ditambahkan 6 ml  glycerol  dan  10  ml  larutan  malachite  green  2%. Larutan  disterilkan  dalam autoclaved pada  121 o C selama    30  menit  dan  didinginkan.  Ditambahkan telur  yang  telah  dihomogenkan    500  ml  dan dicampurkan.  Medium  dibagikan  ke  dalam  tabung bertutup  alur  sebanyak  6-8  ml.  Tabung  biakan  ini dipanaskan  pada  85 o C  selama  50  menit.  Untuk mengecek  sterilitas,  disiapkan  media  pembiakan dengan  menginkubasi pada 37 o C selama 48 jam dan disimpan  dalam refrigerator bila  tidak  ada kontaminan  yang  terdeteksi.  Semua  tabung  ditutup dengan  ketat  untuk  mencegah  penguapan  selama penyimpanan. (Sumber: Ang et. al. , 2011)

## Tabel 1 Pembacaan hasil kultur
PEMBACAAN PENCATATAN  500 koloni +4 200 – 500 koloni +3 100 – 200 koloni +2 20 – 100 koloni +1 1 – 19 koloni Jumlah koloni Tidak ada pertumbuhan Negatif
Keterangan:
- Bila  terdapat  kontaminasi  pada  kultur,  segera laporkan dan ulangi pembuatan kultur
- Bila  kultur  positif  dan  pertumbuhan  dinilai sebagai M  tuberculosis ,  segera  laporkan  pada pihak berkepentingan.
- Pada  minggu  ke-4  dapat  dibuat  laporan sementara.
- Pada minggu ke-8 dibuat laporan akhir
(Sumber: Sjahrurachman, 2008)

## HASIL PENELITIAN
Identifikasi  sputum  pada  penderita  TB  paru dengan  metode  kultur  pada  media  Ogawa  dan media Lowenstein-Jensen (LJ)
Pengambilan  sampel  sputum  penderita adalah  sebagian  besar  sputum  pagi  dari  penderita kasus baru yang dinyatakan positif secara mikroskopis.  Sampel  dikumpulkan  sejak  8  Juni sampai  dengan  18  Juli  2011  yang  diperoleh  dari Puskesmas  Masbagik,  Dasan  Lekong,  Wanasaba, Labuan  Lombok,  Keruak,  Terara,  Aikmel,  Selong, Denggen,  Lepak,  Sakra,  Korleko,  Rensing,  Lendang Nangka  kabupaten  Lombok  Timur,  dan  Puskesmas Gerung Lombok Barat. Sampel dihomogenisasi pada tanggal  30  Juli  2011  dan  pada  tanggal  3  Agustus 2011  dikultur  pada  media  Ogawa  dan  Lowenstein- Jensen (LJ). Sampel  yang terkumpul sebanyak 56, 3 diantaranya  dinyatakan drop  out (sampel  no  23,  51, dan 52) karena identitas sampel tidak jelas.
Hasil  homogenisasi  sputum  di  bagi  tiga  (3) yaitu 1 effendrof untuk kultur dan dua effendrof lain untuk  ekstraksi  DNA  untuk    pemeriksaan  resistensi primer Mycobacterium    tuberculosa dengan  teknik nested  PCR .  Hasil  homogenisasi  dapat  dilanjutkan pemeriksaan langsung atau disimpan dalam lemari es suhu  –80 0 C.  Sputum  yang  telah  dihomogenisasi
untuk  pemeriksaan  kultur  maupun  PCR  di  cuci dengan  menggunakan  pZ  steril  sebanyak  3  kali  dan di cek pH 7,0.
Pada 53 sampel dikultur disertai dengan kontrol negatif  pada  media  Ogawa  &  LJ,  diperoleh  21 (39,6%) sampel negatif sehingga 32 (60,4%) sampel dinyatakan  positif M  tuberculosis secara  kultur.
Pertumbuhan  koloni  baik  yang  termasuk M tuberculosis  complex maupun  non  TB  serta kontaminan  &  jamur  sebanyak  36  sampel  (67,9%). Berdasarkan  morfologi  koloni  pada  media  Ogawa dan LJ, maka yang termasuk M tuberculosis complex 32/34  (94,1%)  pada  media  LJ,  dan  26/29  (89,7%) pada media Ogawa.
Perbandingan  hasil  kultur  media  Ogawa  dan media Lowenstein-Jensen terhadap hasil pertumbuhan kuman M tuberculosis
Media  yang  sudah  diinokulasi  diinkubasi  pada suhu  37 0 C  dan  diamati  sampai  minggu  ke-8.  Pada sampel  sputum  penderita  yang    pernah  mendapat pengobatan obat anti tuberculosis (OAT), bila kultur negatif  sampai  minggu  ke-8,  maka  inkubasi  kultur dilanjutkan  hingga  minggu  ke-12.    Beberapa  nomor sampel  ditemukan rapid  grower .  Hasil  pengamatan pada minggu ke-2 dan ke-3, seperti pada tabel 2 dan 3.

## Tabel 2. Pertumbuhan koloni hasil kultur sputum pada minggu ke-2
No No & kode sampel Pertumbuhan 1  Og 2, LJ 2 Koloni disekitar cairan biakan berwarna kuning pucat 2 Og 7 Koloni  tumbuh  di  atas  permukaan  cairan  biakan  berwarna  kuning  pucat,  warna  media  di sekitar koloni menjadi hijau tua. 3 LJ 9 Koloni kuning cerah, mengkilat, smooth . 4 LJ 16
Koloni  kuning  cerah,  mengkilat, smooth .  Koloni  tumbuh  diatas  permukaan  cairan,
menyebabkan warna media menjadi hijau tua 5 LJ 19 Jamur 6 LJ 24 Koloni kuning muda diatas permukaan cairan biakan, warna biakan menjadi hijau tua 7 Og 31 Jamur, koloni bagian tengah timbul, berlipat, dan berkerut di tengah 8 LJ 37 Koloni merah, penuh dipermukaan media, warna media menjadi kuning 9 Og 45 Koloni kuning terang, smooth , besar, warna media menjadi hijau tua
10 LJ 49
Koloni kuning pucat, smooth kecil2, di permukaan media

## Tabel 3. Pertumbuhan koloni hasil kultur sputum pada minggu ke-3
No No & kode sampel Pertumbuhan 1 Og 2, LJ 2 Koloni kuning pucat 2 LJ 3 Koloni bulat, mengkilat, smooth , kuning pucat
3 Og 7 Jamur 4 LJ 9 Koloni kuning terang, mengkilat, smooth 5 LJ 12 Koloni kuning pucat, kusam, kecil-kecil 6 Og 16 Koloni kuning pucat 7 LJ 16 Koloni terang 8 Og 17 Koloni kuning pucat, kusam, kecil-kecil 9 LJ 17 Koloni kuning pucat 10 LJ 19 Jamur, putih seperti kapas 11 LJ 21 Koloni kuning pucat, kusam, kecil-kecil 12 Og 24 Koloni kuning pucat, kusam, kecil-kecil 13 LJ 24 Koloni kuning pucat, kusam, kecil-kecil, jamur 14 Og & LJ 25 Jamur 15 Og & LJ 30 Koloni kuning pucat, sedikit 16 Og 31 Koloni kuning pucat, +2, jamur (+) 17 LJ 31 Koloni kuning pucat, +2 18 LJ 35 Koloni kuning pucat 19 Og & LJ 36 Koloni kuning pucat, kusam, kecil-kecil 20 Og 37 Koloni kuning terang 21 LJ 37 Koloni merah 22 Og & LJ 39 Koloni kuning, koloni Og < LJ 23 Og 45 Koloni jamur kuning menyebar, 1 koloni kuning mengkilat, koloni kusam bertumpuk 24 Og & LJ 49 Koloni kuning, Og < LJ 25 Og & LJ 54 Koloni kuning, sedikit
Pada  beberapa  media  LJ  maupun  Ogawa  terdapat juga pertumbuhan jamur maupun kuman kontaminan lain, seperti terlihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Media yang ditumbuhi jamur (media no 24, tabung paling kiri)
Sampai  minggu  ke-12  pertumbuhan  kuman pada  media  yang  masih  negatif  tidak  ditemukan adanya  pertumbuhan  koloni  (tetap  negatif).  Foto hasil  kultur  negatif  dan  positif  1-  4,  seperti  pada Gambar 2.
Perbandingan pertumbuhan koloni dari hasil kultur  pada  media  Ogawa  dan  media  LJ,  ternyata lebih sensitif pertumbuhan pada media LJ dibandingkan  dengan  pertumbuhan  koloni  kuman pada  media  Ogawa.  Beberapa  contoh  perbandingan hasil  kultur  sputum  dari  penderita  TB  paru,  bahwa sampel  no  LJ  49:  koloni  tumbuh  pada  minggu  ke-2, pada  media  Ogawa  baru  tumbuh  pada  minggu  ke-3. Sampel  no    47  &  46:  koloni  kuman  mulai    tumbuh pada minggu ke-4, tapi jumlah koloni berbeda kedua media yang dipergunakan.
Gambar 2. Hasil kultur berturut-turut dari kiri ke kanan: negatif,  positif 1, Positif 2, positif 3, dan positif 4.
Persentase  pertumbuhan  koloni  pada  media Ogawa  pada  minggu  pertama  sebesar  11,1%  (4/36), dan  pertumbuhan  terus  meningkat  sampai  minggu ke-8 mencapai 80,6% (29/36). Sedangkan pertumbuhan  koloni  pada  media  LJ  di  minggu pertama sama banyak dengan pertumbuhan  koloni di Ogawa yaitu 11,1% dan mencapai puncak pertumbuhan  sampai  minggu  ke-6  sebesar  94,4% (34/36).  Sensitivitas  antara  media  Ogawa  dan  media LJ  terhadap  pertumbuhan  koloni  dari  kultur  sputum penderita TB paru dapat diperhatikan pada Tabel 3.5 dan data selengkapnya dapat diamati pada Lampiran 3:  Tabel  perbandingan  hasil  kultur  positif  antara media  Ogawa  dan  media  LJdari  penderita  TB  paru. Sedangkan  sensitivitas  diantara  kedua  media  kultur dapat diamati pada Tabel 3.3 dibawah ini:
Tabel  3.  Sensitivitas  antara  media  Ogawa  dan media  LJ  terhadap  pertumbuhan    koloni  dari kultur sputum penderita TB paru
Minggu ke- %-ase pertumbuhan koloni pada media Ogawa Lowenstein Jensen 1 11,1 11,1 2 19,4 25,0 3 47,2 63,9 4 63,9 86,1 5 66,7 88,9 6 75,0 94,4 7 77,8 94,4 8 80,6 94,4
Analisa  hasil  uji  sensitivitas  menggunakan  media Ogawa  dan  media  LJ  terhadap  pertumbuhan kuman M tuberculosis
Berdasarkan  kecepatan  tumbuh  dan  jenis pigmen,  Mycobacterium  yang  diperoleh  dari  hasil kultur termasuk pada :
a. Non photochromogen (tanpa pigmen pada koloni) adalah  ditemukan  pada  hampir  semua  biakan, kecuali  yang  tidak  disebutkan  pada  golongan Rapid  Grower .  Koloni  kuman  yang  termasuk pada non  photochromogen seperti  yang  terlihat pada Gambar 3.

## Gambar 3. Koloni campuran non photochromogen
b. Scotochromogen (dengan  pigmen  koloni  kuning atau  orange).  Koloni  kuman  akan  berwarna  jika diinkubasi dalam keadaan gelap. Ditemukan pada 6  sampel  no  sampel:    9,  12,  21,  24,  40,  45.  Dari
ke-6  sampel,  hanya  sampel  no  9  dan  45  yang merupakan  koloni  tunggal scotochromogen ; sedangkan  sampel  no  12,  21,  24,  dan  40, pertumbuhan  koloni  ada  2  macam,    yaitu  yang termasuk non photochromogen dan scotochromogen, seperti yang dapat diamati pada Gambar 4.
Gambar 4. Koloni campuran non photochromogen dan scotochromogen
c. Rapid  grower ,  diantaranya  adalah M  flavescens,
M  thermiresistible,  M  marinum,  M  fortuitum- chelonae  complex .  Kebanyakan  kuman  golongan ini  berasal  dari  golongan  non  pathogen  bagi manusia.
Koloni  kuman  yang  termasuk rapid grower biasanya  akan  tampak  dalam  waktu  1 minggu; ditemukan pada no sampel 6,  27, dan 36 pada  media  LJ  dan  Ogawa;  no  31  (hanya  di media Ogawa); no 37 (hanya di media LJ) .

## PEMBAHASAN
Pemeriksaan  dengan  cara  kultur  lebih sensitif dan spesifik dibandingkan dengan pemeriksaan  sputum  secara  mikroskopis.  Melalui pemeriksaan  kultur,  diferensiasi  antara  bakteri  mati dan  hidup  serta  diferensiasi  antara M  tuberculosis
Gb. 4
Gb. 3
dan  NTM  dapat  dilakukan.  Selain  itu  pada  isolat yang  ditemukan,  dapat  dilakukan  uji  kepekaan sehingga  akan  mampu  memandu  pengobatan  lebih baik.  Untuk  mendapatkan  50%  kesempatan  BTA positif  diperlukan  kuman  BTA  pada  sputum  1000 kuman  per  ml,  sementara  dengan  tehnik  kultur  yang baik  hasil  positif  dapat  terjadi  walau  kuman  hidup berkisar  antara  10-100    kuman  per  ml.  Pada pemeriksaan mikroskopis langsung, hasil positif pada mayoritas   kasus baru terjadi jika jumlah  kuman per ml  sputum  minimal  5000  kuman,  sementara  untuk kultur  diperlukan  1000  kuman.  Pada  umumnya biakan  sputum  akan  meningkatkan  penemuan  kasus sekitar  20  –  30%  dari  jumlah  keseluruhan  TB  paru BTA  positif.  Oleh  sebab  itu,  pemeriksaan  kultur sangat  sangat  bermanfaat  untuk  kasus paucibasile seperti pada kasus TB ekstra paru, TB anak, dan TB sistemik (Sjahrurachman, 2008).
Biakan  sputum  merupakan  suatu  metode pemeriksaan  yang  kompleks,  membutuhkan  sarana, prasarana,  dan  peralatan  yang  lebih  mahal  dan pemeriksaan  mikroskopis  langsung.  Indikasi  utama melakukan pemeriksaan kultur apabila tiga kali BTA negatif,  sedang  yang  bersangkutan  dicurigai  TB karena  mempunyai  gejala  saluran  pernafasan, tersangka TB pada anak, spesimen berasal dari ekstra paru,  dari  seorang  tersangka  TB,  semua  yang berkaitan dengan TB-HIV.
Hal  lain  yang  mengindikasikan  diagnosis TB dengan kultur adalah kontak dekat dengan pasien BTA  positif,  tersangka  pasien  gagal  obat,  pasien DOTS  kategori-1  paduan  jangka  pendek  dengan BTA  positif  pada  akhir  bulan-5  atau  akhir  bulan-6, tersangka  pasien  gagal,  pasien  DOTS  kategori-2
paduan  jangka  pendek  dengan  BTA  positif  pada akhir  bulan-5  atau  akhir  bulan-8,  kambuh,  evaluasi pengobatan MDR/XDR (Sjahrurachman, 2008).
Mycobacteria  merupakan  mikroba  tahan asam,  serupa  dengan  rhodococcus  dan  Nocardia. Tingkat  ketahanan  Mycobacteria  terhadap  asam bervariasi.  Mycobacteria  ada  yang  bersifat  pathogen dan  ada  juga  yang  tidak  pathogen.  Mycobacteria tidak  pathogen  mudah  ditemukan  di  lingkungan manusia,  khususnya  dalam  air.  Mycobacteria lingkungan  ini  merupakan  cemaran  yang  harus diantisipasi agar tidak mengacaukan hasil pemeriksaan kultur dan uji kepekaan (Sjahrurachman, 2008).
Mycobacteria  yang  secara  medis  penting adalah M  tuberculosis,    M  bovis,M  africanum,  M microtii,  M  ulcerans,  M  leprae,  M  kansasii,  M marinum,  M  simiae,M  scrofulaceum,  M  szulgai,  M xenopi,  M  gordonae,  M  flavescens,  M  fortuitum- chelonae  complex,  M  avium-intracelluler  complex, dan M terra-triviale complex . Empat spesies pertama termasuk pada M tuberculosis complex .
Berdasarkan  sudut  pandang  kecepatan tumbuh  dan  jenis  pigmen,  dua  parameter  yang mudah diamati pada pemeriksaan kultur, Mycobacterium secara sederhana dibagi atas:
a. Photochromogen dengan  pigmen  koloni  kuning, jika  inkubasi  dilakukan  dengan  pencahayaan. Termasuk dalam golongan ini adalah M kansasii,
M marinum, M simiae, dan M asiaticum .
b. Non photochromogen (tanpa pigmen pada koloni) adalah M  tuberculosis  complex,  M  terrae complex,  M  gastrii,M  malmoense,  M  avium complex, M haemophilum, M xenopi.
c. Scotochromogen (dengan  pigmen  koloni  kuning atau  orange).  Koloni  kuman  akan  berwarna  jika diinkubasi  dalam  keadaan  gelap.  Yang  termasuk golongan  ini  adalah M  szulgai,M  flavescens,  M thermoresistible,  M  gordonae,  M  scrofuloceum, M xenopi.
d. Rapid grower , diantaranya adalah M flavescens,M  thermiresistible,    M  marinum,  M fortuitum-chelonae  complex .  Kebanyakan  kuman golongan ini berasal dari golongan non pathogen bagi manusia.
Kuman  yang  tidak  termasuk rapid  grower mempunyai  waktu  pembelahan  puluhan  jam, sehingga  koloni  yang  diisolasi  dari  specimen  ini biasanya mulai tampak setelah 2 minggu. Sementara koloni  kuman  yang  termasuk  rapid  grower  biasanya akan tampak dalam waktu 1 minggu (Sjahrurachman, 2008).
Kebanyakan  bahan  pemeriksaan  kultur Mycobacteria  mengandung  banyak  kuman  cemaran. Tidak  satupun  senyawa  penghambat  yang  dapat menjamin  100%  kuman  cemaran  akan  mati. Beberapa  kuman  resisten  seperti  Pseudomonas, Enterobacteriacea,  Streptococcus,  Bacillus,  dan jamur  masih  dapat  tumbuh  pada  media  kultur. Angka kejadian cemaran pasca inokulasi antara 3-5% merupakan  hal  yang  wajar.  Jika  pengolahan  bahan tidak  baik  atau  pengirim  terlambat,  angka  cemaran dapat  mencapai  10%  atau  lebih.  Sebaliknya  tidak pernah  teramatinya  cemaran,  juga  merupakan  tanda kurang  baik.  Tidak  adanya  cemaran  sama  sekali kemungkinan  akibat  pengolahan  bahan  yang  terlalu keras atau lama, dengan konsekuensi adalah isolation rate M tuberculosis juga akan berkurang (Sjahrurachman,  2008).  Pada  penelitian  ini  kuman cemaran  terdeteksi  total  sebanyak  9/53  (17%).
Sedangkan terdeteksinya pertumbuhan kultur kontaminan,  yaitu  meleburnya  sebagian  media  pada pertumbuhan  awal  (Hari  pertama  setelah  masa inkubasi)  ditemukan  pada  5  sampel  5/53  (9,4%) semua pada media LJ, yaitu sampel no 47, 35, 16, 6, dan  5.  Tingginya  angka  cemaran  (kontaminan)  pada hasil  pertumbuhan  sputum  kultur  kemungkinan disebabkan  oleh  jarak  waktu  pengumpulan  sampel dan pengolahan sputum.
Prinsip
kultur dan identifikasi Mycobacteria dimulai dengan menilai waktu pertumbuhan,  warna  pigmen,  morfologi  koloni,  dan hasil  pewarnaan  BTA.  Identifikasi  yang  lebih  rinci dilakukan dengan berbagai uji biokimia, uji toleransi pada    5%  NaCl  atau  hambatan  oleh thiophene  2 carboxylic  acid  hydrazine (TCH),  uji  pertumbuhan pada  media Mc  Conkey tanpa  kristal  violet,  uji molekuler, kromatografi cair atau tekanan tinggi. Uji biokimia  yang  dipakai  untuk  identifikasi  spesies Mycobacteria  antara  lain:  uji  niasin,  uji  reduksi nitrat,  uji  katalase,  uji  katalase  tahan  panas,  uji hidrolisa tween ,  uji  urease,  uji arilsulfatase ,  uji iron uptake , uji pengunaan sitrat, uji penggunaan inositol, uji  penggunaan  manitol,  uji  pirazinamidase,  uji reduksi telurit (Sjahrurachman, 2008). Penilaian hasil identifikasi  kultur  pada  penelitian  ini  didasarkan pada  waktu  pertumbuhan,  warna  pigmen,  dan morfologi  koloni  baik  pada  media  Ogawa  maupun pada media LJ.
Koloni M  tuberculosis yang  tumbuh  pada media  perbenihan  mempunyai  sifat  tidak  terjadi perubahan  warna  koloni  setelah  terpapar  cahaya,  uji akumulasi niasin positif, uji reduksi nitrat positif, uji katalase  tahan  panas    68 0 C  negatif,  dan  uji  PNB negatif.  Jika  fasilitas  laboratorium  tidak  memadai, identifikasi M  tuberculosis minimal  didasarkan  pada
hasil  pewarnaan,  kecepatan  tumbuh,  morfologi koloni,  uji  PNB  ,  dan  salah  satu  uji  dari  niasin, reduksi  nitrat,  katalase  tahan  panas  (Sjahrurachman, 2008).
Adapun  ciri-ciri M  tuberculosa merupakan sel  berbentuk  batang  lurus,  berukuran  0,4  x  3  um. Kuman  tidak  berspora  dan  tidak  berkapsul.  Pada pewarnaan  ZN  tampak  kuman  berwarna  merah dengan  latar  belakang  biru.  Pada  pewarnaan fluorokrom  berfluoresensi  dengan  warna  kuning jingga.  Kuman  sulit  diwarnai  dengan  cat  Gram,  tapi bila  berhasil  maka  hasilnya  adalah  Gram  positif. Pemeriksaan  menggunakan    mikroskop  elektron memperlihatkan  dinding  sel  yang  tebal,  mesosom yang  mengandung  lemak  (lipid).  Kandungan  lemak pada  kuman  ini  besar,  yaitu  lebih  dari  25% dibandingkan  kuman  Gram  positif  yang  hanya  0,5% dan  kuman  Gram  negatif  3%.  Besarnya  kandungan lipid  memberikan  sifat  khas  pada  Mycobacterium, yaitu  tahan  terhadap  kekeringan,  alkohol,  zat  asam, alkali, dan germisida tertentu. Menurut Barsdake dan Kim,  sifat  tahan  asam  dari Mycobacterium oleh perangkap  fukhsin  intrasel,  suatu  pertahanan  yang dihasilkan  dari  kompleks  mikolat  fuksin  yang terbentuk di dinding sel (Anonim, 2009).
Petumbuhan  kuman  Mycobacterium  sangat lambat, waktu pembelahan adalah 12-18 jam dengan suhu  pertumbuhan  optimum  37 0 C.  Kuman  dapat tumbuh  pada  media  buatan  yang  sederhana,  tapi pertumbuhan kuman yang diisolasi dari bahan klinik membutuhkan  media  kompleks.  Pada  perbenihan, pertumbuhan tampak setelah 2-3 minggu, membentuk  koloni  cembung,  kering,  warna  kuning gading. Mycobacterium mengandung sejumlah besar
kompleks lemak dengan berat molekul tinggi, antara lain ‘mycosid’ D wax, trehalose-6, 6-dimycolate , dan sulfolipid.  Mikosid  adalah  seri  dari  asam  mikolat yang  mengandung  glikolipid  atau  glikolipid  peptide, terdistribusi secara khas diantara spesies Mycobacterium  yang  berbeda.  Beberapa  mikosid terdapat  di  lapisan  luar  permukaan  sel  dan  berperan sebagai  reseptor  bakteriofag. D  wax adalah  suatu substansi yang terdiri dari asam mikolat, peptida, dan polisakarida. Substansi ini mempunyai sifat ‘adjuvant’ yang khas, antara lain: dapat meningkatkan  produksi  antibody  untuk  melawan antigen  proteinyang  digabungkan  dalam  emulsi minyak D wax menginduksi respon imun seluler ( cell mediated  immune/CMI ).  Oleh  karena  sifat  inilah, maka D  wax ikut  berperan  terhadap  patogenitas tuberkulosa  melalui  peningkatan  respon CMI (terutama  hipersensitivitas  tipe  lambat)  untuk melawan protein Mycobacterium. Penelitian menunjukkan  bahwa  komponen  akhir D  wax adalah N-acetyl muramil dipeptida (Anonim, 2009).
‘Cord  factor’ berhubungan  erat  dengan virulensi  kuman TB dimana  pada kultur  membentuk ‘ serpentine cord ’, yaitu susunan pararel dari kuman. Pembentukan ‘ cord ’ ini dihubungkan dengan adanya glikolipid  trehalose-6,6-mikolat  yang  berlokasi  di bagian  perifer  organisme.  Sejumlah  respon  biologik dapat  ditimbulkan  oleh  material  ini,  antara  lain bersifat  toksik  terhadap  tikus,  menghambat  migrasi leukosit polimorfonuklear, menginduksi perlindungan  terhadap  infeksi  kuman  virulen  dan menginduksi  pembentukan  granuloma  (Anonim, 2009).
Sulfalipid  adalah  suatu  glikolipid  yang berlokasi di perifer, material yang dapat memberikan respon  berupa  pengikatan  pewarnaan  merah  netral pada  galur M  tuberculosis yang  virulen.  Walaupun sulfolipid  sendiri  tidak  bersifat  toksik,  tetapi  bila digabungkan dengan ‘ cord factor ’ dapat memperkuat sifat toksik ‘ cord factor ’ (Anonim, 2009).
Tidak  semua  orang  menjadi  sakit  walaupun mendapat  infeksi.  Status  infeksi  suatu  masyarakat dapat  diketahui  dengan  tes  tuberkulin  pada  kulit. Kalau tes tuberkulin positif dianggap seseorang telah terinfeksi  oleh  basil  tuberculosis.  Dalam  hal  ini masih  terdapat  kekecualian  seperti  terjadinya  reaksi false  positif  dan  false  negatif  seperti  reaksi  positif setelah  mendapat  vaksinasi  BCG  ataupun  reaksi positif  akibat  infeksi  oleh Mycobacterium  atipik (Anonim, 2009).
Diagnosis  definitif  tuberkulosis  ditentukan dengan  menumbuhkan M.  tuberculosis pada  media kultur  dan  diidentifikasi  dengan  menggunakan  uji diferensial in vitro . Banyak media yang berbeda telah dirancang untuk kultur basil tuberkel dan diidentifikas  dalam  tiga  kelompok  utama,  yaitu media  yang  berbasis  telur,  media  berbasis  agar  dan media cair (Walt, 2011).
Media  yang  ideal  untuk  isolasi  basil tuberkel  harus  ekonomis  dan  sederhana  untuk dipersiapkan  dari  bahan-bahan  tersedia,  dapat menghambat  pertumbuhan  kontaminan,  mendukung pertumbuhan    sejumlah  kecil  basil  dan  memberi diferensiasi  awal  isolat  berdasarkan  morfologi koloni.  Untuk  kultur  spesimen  sputum,  media berbasis  telur  harus  menjadi  pilihan  utama,  karena memenuhi semua persyaratan ini. Hal ini meningkatkan  bukti  bahwa  media  cair  dapat memberikan  hasil  yang  lebih  baik  dengan  spesimen
lainnya. Walaupun dapat menekan biaya penggunaan rutin  dengan  spesimen  sputum,  dianjurkan  bahwa kedua  media  berbasis  telur  dan  media  cair  dapat digunakan  untuk  spesimen  non-berulang  (spesimen tunggal),  misalnya.  cairan  serebrospinal  dan  hasil biopsi.  Disarankan  bahwa  spesimen  sputum  semua kultur juga dilakukan pemeriksaan secara mikroskopis (Walt, 2011).
Persiapan  media  berbasis  telur,  media Lowenstein-Jensen  (LJ)  merupakan    media  yang paling  banyak  digunakan  untuk  kultur  tuberkulosis. Dianjurkan menggunakan modifikasi dari International  Union  Against  Tuberculosis  and  Lung Disease  (IUATLD) .  Media  LJ  mengandung  bahan yang  diperlukan  untuk  pertumbuhan M.  tuberculosis sementara  media  LJ  tanpa  gliserol  tapi  mengandung piruvat mendorong pertumbuhan M. bovis . Keduanya harus  digunakan  di  negara-negara  atau  wilayah pasien  yang  mungkin  terinfeksi  dengan  baik  oleh organisme ini (Walt, 2011).

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
1. Penentuan  pertumbuhan  koloni  berdasarkan morfologi  koloni,  kecepatan  tumbuh,  dan  jenis pigmen  yang  terbentuk.  Sampel  penderita  TB paru yang positif secara mikroskopis sebanyak 53 dikultur pada media Ogawa dan media Lowenstein  Jensen  (LJ).  Sejumlah  21  (39,6%) sampel  negative,  32  (60,4%)  sampel  dinyatakan positif M tuberculosis complex. Total pertumbuhan koloni baik M tuberculosis complex, non TB, kontaminan & jamur sebanyak 36  sampel  (67,9%).  Berdasarkan  morfologi koloni  pada  media  Ogawa  dan  LJ,  maka  yang termasuk M  tuberculosis  complex 32/34  (94,1%)
pada  media  LJ,  dan  26/29  (89,7%)  pada  media Ogawa.
2. Persentase  pertumbuhan  koloni  pada  media Ogawa  dan  LJ  pada  minggu  pertama  sama, sebesar  11,1%  (4/36).  Pertumbuhan  terus meningkat  sampai  minggu  ke-8  mencapai  80,6% (29/36)  pada  Ogawa.  Sedangkan  pertumbuhan koloni  pada  media  LJ  mencapai  puncak pertumbuhan  pada  minggu  ke-6  sebesar  94,4%
(34/36).
3. Sensitivitas diantara kedua media yang dipergunakan  menyatakan  bahwa  media  LJ  lebih sensitif  daripada  media  Ogawa,  baik  dari  sisi kecepatan  tumbuh  maupun  jumlah  koloni  yang tumbuh.

## Saran
1. Penentuan koloni M tuberculosis complex dan non TB menjadi M tuberculosis dan Mycobacterium lain hanya berdasarkan morfologi koloni , kecepatan tumbuh, dan jenis pigmen yang terbentuk perlu dilanjutkan pada penentuan cord factor , uji PNB dan uji Niasin serta uji-uji lain.
2. Berdasarkan hasil penelitian dianjurkan agar menggunakan media LJ sebagai media untuk konfirmasi hasil pemeriksaan mikroskopis.
3. Hasil kultur dapat juga digunakan untuk perbandingan menggunakan metode PCR, resistensi OAT dengan menggunakan kultur media, baik media cair maupun media padat.

## DAFTAR PUSTAKA
Ang  F,  RMT,  Myrna  T.  Mendoza,  MD,  Heidi  R. Santos,  Regina  Celada-Ong,  Carmela  P. Enrile,  Wilma  C.  Bulatao  and  Aileen  M. Aguila. 2011.
Isolation Rates of Mycobacterium  tuberculosis  from  Smear- negative and Smear-positive Sputum Specimen  Using  the  Ogawa  Culture Technique  and  the  Standard  Lowenstein Jensen Culture Technique . http://www.psmid.org.ph/vol30/vol30num2t opic1.pdf
Anonim. 2011. Tuberculosis Diagnosis. Wikipedia- the free encyclopedia . Dikutip dari: http://en.wikipedia.org/wiki/Tuberculosis_d iagnosis , tanggal 1 Mei 2011. 4:43 PM.
Asa ad Maidin M, 2005. Harapan dan Tantangan Aplikasi Reaksi Rantai Polymerase (PCR) Multipleks dalam Pemberantasan TB Paru di Indonesia (Suatu Pendekatan Biologi
Molekuler). Suplement. Vol 26.
CDC. 2010. TB Elimination-Diagnosis of Tuberculosis Disease . Dikutip dari: www.cdc.gov/tb , April 2010.
Depkes RI, 2006. Pedoman Nasional Penanggulangan Tuberkulosis ,  Edisi 2, cetakan pertama
Depkes RI, 2007. Pedoman Nasional Penanggulangan Tuberkulosis ,  Edisi 2, cetakan pertama
Dikes Lotim, 2010. Profil Bidang P2PL tahun 2010 .
Good Laboratory Practice . 1999. Pusat
Laboratorium Kesehatan. Depkes RI.
http://www.scribd.com/doc/9428282/Cara- pengambilan-penyimpanan-dan-pengiriman- spesimen-klinik Kalma. Deteksi Antibody Spesifik terhadap Mycobacterium  tuberculosis  dalam  Serum Penderita  Tuberculosis  Paru  Menggunakan
AIM  TB  Rapid  Card.  JBP  Vol.  5,  No  1, Januari 2003.
Misnadiarly. Pemeriksaan Laboratorium-
Tuberkulosis  dan  Mikobakterium  Atipik-
Identitas  Lengkap  Mikobakteria  dengan Atlas Berwarna . Dian Rakyat.
PDPI,  2006. Tuberkulosis-Pedoman  Diagnosis  & Penatalaksanaan di Indonesia . Dikutip dari http://www.klikpdpi.com.4/24/2011 4:15 PM Prabu,  2008. Diagnosis  Tuberculosis/TBC .  Dikutip dari : http://putraprabu.wordpress.com/2008/12/2 3/diagnosis-tuberkulosis-tbc/ Retno. 2001. Diagnosis Serologik pada Tuberkulosis Paru . Dikutip dari: http://members.fortunecity.com 4/24/2011 3;23 PM. Riskesdas, 2010. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan R.I. Jakarta 2010. Sjahrurachman  Agus.  2008. Modul-  Kultur  dan  Uji Kepekaan  M  tuberculosis  terhadap  Obat Anti Tuberculosis Lini Pertama .
Departemen Kesehatan RI.
Tanoue  S,  S  Mitaraif,  H Shishido,  2002. Comparative  Study  on  the  Use  of  Solid Media.  Lowenstein-Jensen  and  Ogawa  in the  Determination  of  Antituberculosis  Drug Susceptibility . Volume 82, Issue 2, Page 63- 67  (June  2002).  Elsevier  Science  Ltd. Abstract.
Walt  van  der  Martie, Rustomjee  Roxanna,  Mizrahi Valerie, Helden Paul van. 2011.
Tuberculosis  Part  III:  Culture  Media .  SA Health Info.Last up date: 22 June-2011.

## WHO.2010. Treatment of Tuberculosis Guidelines
Wikipedia,  28  April  2011  at  23:42. Tuberculosis , from  World  Health  Organization  (WHO) WHO  report  2008:  Global  tuberculosis control Retrieved on 13 April 2009.)