ISSN: 1410-8917
e-ISSN: 2597-9914
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (3) (2017): 142 - 145
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi

## Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Pengaruh Konsentrasi NaCl Terhadap Aktivitas Spesifik Protease Ekstraseluler dan Pertumbuhan Bakteri Halofilik Isolat Bittern

## Tambak Garam Madura
Rahmad Budiharjo a , Purbowatiningrum Ria Sarjono a dan Mukhammad Asy’ari a*
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: asyari@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords: halophilic bacteria, proteases, azocasein, NaCl, specific activity
Halophilic protease can be utilized on food fermentation, such as on the manufacturing of fish sauce. The objectives of this study are to obtain halophilic bacteria from bittern isolate of Madura salt ponds, to isolate extra cellular halophilic protease and to determine the influence of NaCl concentration on the specific activity of halophilic protease. Adaptations of  halophilic  bacteria  in  HSB  medium  (Halophile  Synthetic  Broth).  Protease  activity measurement  was  done  using  azocasein  substrat,  and  protein  concentration  was measured by lowry method. From this study, halophilic bacteria from the bittern isolate of  Madura  salt  embankment  were  obtained.  The  bacteria  grew  optimally  on  NaCl concentration  of  4%  (w/v)  with  highest  specific  activity  of  extra  cellular  halophilic protease of 58.537 unit/mg of protein measured on the fraction 4 (60-80%). Furthermore, it was also observed that NaCl addition could increase the enzyme’s specific activity to be 113.78 unit/mg of protein with the optimum NaCl concentration of 0.750 M.
.

## A b s t r a k
Kata kunci: bakteri halofilik, protease, azokasein, NaCl, aktivitas spesifik Protease  halofilik  dapat  dimanfaatkan  pada  proses  fermentasi  makanan  seperti  pada pembuatan kecap ikan. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh bakteri halofilik dari isolat  bittern  tambak  garam  Madura  dan  mengisolasi  protease  halofilik  ekstraseluler serta  menentukan  pengaruh  konsentrasi  NaCl  terhadap  aktivitas  spesifik  protease halofilik.  Bakteri  halofilik  ditumbuhkan  pada  media  HSB  ( Halophlie  Synthetic  Broth ). Penentuan  aktivitas  protease  dilakukan  dengan  menggunakan  substrat  azokasein  dan kadar protein  ditentukan dengan menggunakan metode Lowry. Berdasarkan penelitian diperoleh  bakteri  halofilik  isolat  bittern  tambak  garam  Madura  yang  tumbuh  optimal pada konsentrasi NaCl 4 %(b/v), dengan aktivitas spesifik protease halofilik ekstraseluler tertinggi pada fraksi 4 (60-80 %) sebesar 58,537 Unit/mg protein. Adanya penambahan garam NaCl dapat meningkatkan aktivitas protease halofilik. Pada penelitian ini, aktivitas spesifik protease halofilik meningkat menjadi 113,78 Unit/mg protein dengan konsentrasi optimal NaCl 0,750 M.

## 1. Pendahuluan
Madura merupakan salah satu sentra industri garam yang  cukup  besar  di  Indonesia.  Para  petani  garam umumnya  hanya  mengambil  kristal  garam  (NaCl)  saja, sedangkan  sisa  hasil  pemekatan  ( bittern )  belum termanfaatkan. Bittern mengandung  berbagai  macam
mineral  seperti  MgCl 2 ,  MgSO 4 ,  NaCl  dan  KCl  serta mikroorganisme  yang  tahan  terhadap  kadar  garam tinggi, salah satunya adalah bakteri halofilik [1]. Bakteri halofilik dibedakan berdasarkan kemampuan hidup pada kadar  NaCl  yang  berbeda-beda.  Jenis  bakteri  halofilik ”rendah”  mampu  tumbuh  optimal  pada  2– 5%  NaCl, jenis  ”sedang”  tumbuh  optimal  pada  5– 20%  NaCl  dan
jenis  ”ekstrim”  tumbuh  optimal  pada  20– 30%  NaCl. Sedangkan  bakteri  non  halofil  tumbuh  optimal  pada kadar garam kurang dari 2% NaCl [2]. Kemampuan hidup pada  kadar  garam  tinggi  dikarenakan  bakteri  halofilik mampu mengakumulasikan suatu zat organik terlarut di dalam  sitoplasmanya.  Tujuannya  adalah  untuk mencegah  hilangnya  cairan  dari  dalam  sel  akibat  dari tingginya  tekanan  osmotik  di  luar  sel  karena meningkatnya  konsentrasi  NaCl.  Zat  organik  terlarut meliputi glycine betaine dan ectoin [2].
Bakteri  halofilik  mampu  menghasilkan  enzim hidrolitik salah satunya adalah protease, yang berfungsi mengkatalisis  reaksi  hidrolisis  protein  menjadi oligopeptida  dan  asam-asam  aminonya  [3].  Penentuan aktivitas  protease  dilakukan berdasarkan berkurangnya substrat  azokasein  pada  kondisi  percobaan.  Satu  unit aktivitas  protease  didefinisikan  sebagai  besarnya aktivitas  enzim  yang  menyebabkan  perubahan absorbansi 1% per mL pada panjang gelombang 440 nm pada  kondisi  percobaan  [4].  Protease  halofilik  dapat dimanfaatkan  pada  proses  fermentasi  makanan  seperti pada pembuatan kecap ikan [1]. Enzim halofilik mampu bertahan  pada  kadar  garam  tinggi,  hal  ini  dikarenakan sebagian  besar  asam  amino  yang  menyusun  enzim halofil merupakan asam amino yang bersifat asam, yaitu asam  amino  yang  memiliki  rantai  samping  gugus karboksilat  (COOH),  misalnya  asam  glutamat  dan aspartat [5].
Salah  satu  faktor  yang  mempengaruhi  aktivitas protease  halofilik  adalah  adanya  garam,  terutama  NaCl [6,  7].  Kation  dari  garam  akan  mempertahankan kestabilan  struktur  protease  halofilik  melalui  cara berikatan  dengan  muatan-muatan  negatif  dari  gugus asam  pada  permukaan  protease  halofilik.  Selain  itu, adanya  kation  juga  berperan  dalam  efek shielding (perlindungan)  terhadap  pengaruh  kondisi  lingkungan [1].  Berdasarkan  penelitian  Vidyasagar dkk. [8]  berhasil menentukan  aktivitas  spesifik  protease  halofilik tertinggi  yaitu  sebesar  350  Unit/mg  pada  konsentrasi NaCl 20%.
Pengaruh  garam  NaCl tidak hanya pada pertumbuhan  bakteri  halofilik  tapi  aktivitas  enzim halofilik  juga.  Pada  penelitian  ini  telah  dilakukan penentuan pengaruh konsentrasi NaCl terhadap aktivitas spesifik protease ekstraseluler dan pertumbuhan bakteri halofilik isolat bitten tambak garam Madura.

## 2. Metode Penelitian

## Isolasi bakteri halofilik
Sampel  bittern  sebanyak  10  μL  diinokulasikan kedalam  100  mL  media Enrichment  halophile  Broth (EHB)yang  terditri  dari  3  g  glukosa;  1,5  g  tripton;  1,5  g yeast ekstrak; 1,5 g KH 2 PO 4 ; 30 g NaCl dan 30 ml bittern, kemudian  diinkubasi  dalam  orbital  shaker  inkubator pada temperatur 37 0 C selama 24 jam dengan kecepatan 250 rpm. Sebanyak 10 μL isolat bakt eri hasil dari media EHB  diinokulasikan  pada  media Enrichment  Halophile Agar (EHA),  menggunakan  dengan  metode  spread. Inkubasi dalam inkubator pada temperatur 37 0 C selama 24  jam.  Hasil  dari  metode  spread  selanjutnya
diinokulasikan  pada  media  EHA  dengan  metode..  Hasil dari metode streak diambil 1 ose pada goresan terakhir, kemudian diinokulasikan dalam media EHB.
Pengadaptasian bakteri pada media Halophile Synthetic Broth (HSB)
Pengadaptasian  dilakukan  dengan  mengganti komponen bittern dengan ASW ( Artificial Sea Water ) pada media. Isolat bakteri sebanyak 10 μL dari stok media EHB diinokulasikan  ke  dalam  100  mL  media  HSB. Pengadaptasian dilakukan dengan pengaturan komposisi bittern  dan  ASW,  kemudian  diinkubasi  dalam  shaker inkubator pada temperatur 37 0 C selama 24 jam dengan kecepatan 250 rpm.

## Uji morfologi dan pewarnaan Gram
Kultur  bakteri  dari  media  EHB  dan  HSB  ditambah dengan larutan kristal ungu, reagen gram iodin, larutan alkohol aseton dan safranin. Pengamatan morfologi dan pewarnaan  gram  dilakukan  menggunakan  mikroskop dengan perbesaran 1500X

## Penentuan konsentrasi optimal NaCl untuk pertumbuhan bakteri halofilik.
Sebanyak  10  μL  kultur  hasil  peremajaan  (sebagai starter)  diambil  dan  diinokulasikan  pada  50  mL  media HSB (variasi konsentrasi NaCl (%): 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 dan 20 ). Inkubasi dalam orbital shaker inkubator pada  suhu  37 0 C  selama  32  jam.  Hasil  inokulasi  bakteri halofilik  pada  media  HSB  dengan  variasi  konsentrasi NaCl,  selanjutnya  dilakukan  penentuan  aktivitas protease ekstrak kasar.

## Produksi enzim protease
Isolat  bakteri  hasil starter diambil  100  µL , diinokulasikan  pada  1  liter  media  HSB  dan  diinkubasi dalam orbital shaker inkubator pada suhu 37 0 C selama 32 jam  berdasarkan  kurva  pertumbuhan  bakteri  dan konsentrasi NaCl 4% berdasarkan penentuan konsentrasi  optimal  NaCl  untuk  pertumbuhan  bakteri halofilik.

## Fraksinasi dengan garam amonium sulfat
Enzim ekstrak kasar dimurnikan dengan fraksinasi amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 0-20% (F1), 20-40%  (F2),  40-60%  (F3),  60-80%  (F4),  80-100% (F5).  Endapan  dari  setiap  fraksi  dipisahkan  dengan sentrifugasi bertingkat, setrifugasi awal pada kecepatan 6000  rpm  selama  15  menit  dan  14000  rpm  pada sentrifuasi  berikutnya.  Endapan  yang  diperoleh kemudian dilarutkan dengan bufer fosfat 0,05 M, pH 8,0. Hasil  fraksinasi  kemudian  dimurnikan  kembali  melalui proses  dialisis  dengan  menggunakan  membran  selofan dan bufer fosfat 0,0005 M, pH 8,0.

## Uji aktivitas enzim
Aktivitas protease ditentukan berdasarkan kemampuan  protease  mengkatalisis  reaksi  hidrolisis ikatan peptida pada substrat azokasein 2 % (b/v) selama 30 menit. Untuk larutan sampel, sebanyak 2,25 mL bufer
fosfat 0,05 M pH 8,0 ditambah dengan aquades 0,625 mL dicampurkan  dengan  0,125  mL  larutan  azokasein  2  %, kemudian  diinkubasi  pada  suhu  40 0 C selama  5  menit dalam shaker  water  bath incubator .  Selanjutnya ditambahkan  0,5  mL  larutan  enzim,  dan  diinkubasi kembali  pada  kondisi  optimum  yaitu  40 0 C  selama  30 menit  dalam shaker  water  bath  inkubator .  Setelah  itu ditambahkan  1,5  mL  larutan  TCA  10  %.  Campuran dikocok dan diinkubasi  didalam  air  es  sesaat.  Untuk larutan blanko (t 0 ), sebanyak 2,25 mL bufer fosfat 0,05 M pH 8,0 ditambah dengan aquades 0,625 mL dicampurkan dengan  0,125  mL  larutan  azokasein  2%,  kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 30 menit dalam shaker water bath inkubator , setelah itu ditambahkan 1,5 mL TCA 10 % dan 0,5 mL larutan enzim yang telah dipanaskan. Campuran dikocok dan diinkubasi didalam air es sesaat.
Larutan blanko dan larutan sampel disentrifus pada 6000 rpm selama 30 menit. Masing-masing supernatan diukur absorbansinya  pada  440  nm  [9].  Kadar  protein  dapat ditentukan dengan menggunkan metode Lowry sehingga akan diperoleh nilai aktivitas spesifik protease.

## Penentuan konsentrasi optimal NaCl terhadap aktivitas spesifik protease
Penentuan  konsentrasi  optimal  NaCl  dilakukan dengan    menentukan  aktivitas  protease  ekstraseluler pada  berbagai  konsentrasi  NaCl  (M)  yaitu  0,125;  0,175; 0,225; 0,250; 0,500; 0,750; 0,100; 1,250 dan 1,500.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Koloni  tunggal  bakteri  halofilik  telah  berhasil diisolasi  dari  air  pekatan  sisa  ( bittern )  tambak  garam Madura menggunakan media Enrichment Halophile Broth (EHB).  Kultur  bakteri  halofilik  pada  media  EHB selanjutnya diadaptasikan pada media Halophile Synthetic Broth (HSB) secara bertahap agar diperoleh bakteri yang mampu  beradaptasi  pada  media  sintetis.  Tujuan  dari pengadaptasian adalah agar bakteri dapat ditumbuhkan kapan  dan  dimana  saja  tanpa  tergantung  pada  sumber alaminya  ( bittern ).  Bakteri  yang  ditumbuhkan  dalam media EHB dan HSB merupakan bakteri yang sama. Hal ini terlihat dari hasil morfologi berbentuk bulat ( coccus ) dan gram negatif.

## Penentuan konsentrasi optimal NaCl untuk pertumbuhan bakteri halofilik.
Penentuan  konsentrasi  optimal  NaCl  bertujuan untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri yang optimal dan  untuk  menentukan  jenis  bakteri  halofiliknya. Penginokulasian bakteri halofilik dilakukan pada media HSB  dengan  konsentrasi  NaCl  yang  berbeda,  selama waktu inkubasi 32 jam berdasarkan kurva pertumbuhan yang diperoleh. Perbedaan tingkat kekeruhan kultur pada berbagai konsentrasi NaCl menunjukkan adanya variasi pertumbuhan  bakteri  halofilik.  Pertumbuhan  optimal bakteri  halofilik  terjadi  pada  konsentrasi  NaCl  2%  dan 4%  ditunjukkan  oleh  nilai  (100-T)  sebesar  99,974  % (Gambar 1).
Gambar 1. Konsentrasi optimal NaCl untuk pertumbuhan bakteri halofilik.
Selain  melakukan  penentuan  konsentrasi  optimal NaCl  untuk  pertumbuhan  bakteri  halofilik,  pada penelitian  ini  juga  dilakukan  penentuan  aktivitas protease  ekstraseluler  yang  dihasilkan.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  konsentrasi  NaCl  4%  merupakan konsentrasi  optimal  NaCl  dengan  aktivitas  protease sebesar  12,8  Unit/mL  (Gambar  2),  sehingga  bakteri halofilik  ini  termasuk  jenis  halofilik “ rendah ” yang tumbuh optimal pada 2-5% NaCl.
Gambar 2. Aktivitas protease ekstrak kasar halofil pada berbagai konsentrasi NaCl
Pada  umumnya  jenis  bakteri  halofilik ”rendah” dapat  beradaptasi  dengan  konsentrasi  garam  tinggi melalui  mekanisme  akumulasi  zat  organik  di  dalam sitoplasmanya [2].

## Fraksinasi Amonium Sulfat Bertingkat
Fraksinasi  dilakukan  untuk  memurnikan  enzim secara bertingkat menggunakan garam amonium sulfat dengan  tingkat  kejenuhan  yang  berbeda  untuk memisahkan  enzim  protease  dari  protein  lainnya. Penambahan garam ammonium sulfat akan menurunkan kelarutan  protein  karena  terjadi  kompetisi  antara  ion garam  yang  ditambahkan  dengan  protein  yang  terlarut sehingga  terjadi  efek salting  out. Fraksinasi  ammonium sulfat dilakukan dengan tingkat kejenuhan 0-20% (F1), 20-40%  (F2),  40-60%  (F3),  60-80%  (F4),  80-100% (F5). Setiap tahap fraksinasi diikuti dengan uji aktivitas protease  yang  terdapat  di  dalamnya  sehingga  dapat ditentukan  fraksi  optimalnya.  Berdasarkan  tabel  1 menunjukkan  bahwa  aktivitas  spesifik  tertinggi diperoleh pada fraksi 4 (F4) yaitu sebesar 58,537 Unit/mg
protein,  sehingga  fraksi  ini  yang  digunakan  untuk penelitian lebih lanjut.

## Tabel 1. Hasil fraksinasi Amonium Sulfat protease ekstraseluler dari bakteri halofilik

## Penentuan konsentrasi optimal NaCl terhadap aktivitas spesifik protease halofilik
Aktivitas  spesifik  protease  halofilik  sebesar  113,78 Unit/mg  protein  diperoleh  pada  konsentrasi  optimal NaCl 0,75 M seperti disajikan pada gambar 3.
Gambar 3. Aktivitas spesifik protease halofilik pada berbagai konsentrasi NaCl

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  penelitian  diperoleh  bahwa  bakteri halofilik  isolat  bittern  tambak  garam  Madura  tumbuh optimal  pada  konsentrasi  NaCl  4  %  (b/v),  aktivitas spesifik  protease  halofilik  ekstraseluler  tertinggi  pada fraksi  4  (60-80  %)  sebesar  58,537  Unit/mg  protein. Penambahan  garam  NaCl  secara  umum  dapat meningkatkan  aktivitas  protease  halofilik.  Pada konsentrasi  NaCl  optimal  0,75  M  dapat  meningkatkan aktivitas  spesifik  protease  halofilik  sebesar  113,78 Unit/mg protein.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Aharon  Oren,  Halophilic  Microorganisms  and  their Environments,  Springer  Science  &  Business  Media, 2002.
[2]  Shiladitya  DasSarma,  Priya  DasSarma,  Halophiles, in: Encyclopedia of Life Science, Wiley, 2006.
[3]  Neil  D.  Rawlings,  Protease  Families,  Evolution  and Mechanism of Action, in: K. Brix, W. Stöcker (Eds.) Proteases:  Structure  and  Function ,  Springer  Vienna, Vienna, 2013, pp. 1-36.
[4]  Jesse Charney, Rudolph M. Tomarelli, A colorimetric method  for  the  determination  of  the  proteolytic activity  of  duodenal  juice, Journal  of  Biological Chemistry , 171, 2, (1947) 501-505
[5]  Clive Edwards, Microbiology of extreme environments, McGraw-Hill, 1990.
[6]  Janos  K.  Lanyi,  Salt-dependent  properties  of proteins  from  extremely  halophilic  bacteria, Bacteriological Reviews , 38, 3, (1974) 272-290
[7]  Janos  K.  Lanyi,  Joann  Stevenson,  Studies  of  the Electron  Transport  Chain  of  Extremely  Halophilic Bacteria:  IV.  Role  of  Hydrophobic  Forces  in  The Structure  of  Menadione  Reductase, Journal  of Biological Chemistry , 245, 16, (1970) 4074-4080
[8]  Malashetty Vidyasagar, S Prakash, Carol Litchfield, K Sreeramulu,  Purification  and  characterization  of  a thermostable,  haloalkaliphilic  extracellular  serine protease  from  the  extreme  halophilic  archaeon Halogeometricum  borinquense  strain  TSS101, Archaea , 2, 1, (2006) 51-57
[9]  Werasit  Kanlayakrit,  Preeyanuch  Bovornreungroj, Takuji  Oka,  Masatoshi  Goto,  Production  and characterization  of  protease  from  an  extremely halophilic  Halobacterium  sp.  PB407, Kasetsart Journal: Natural Science , 38, 5, (2004) 15-20
[NaCl] (M) A kt iv it as S pes if ik