Aplikasi Penciri Molekuler Uty dan Sry untuk Determinasi Unknown Sex Samples pada Sapi Bali
The Application of UTY and SRY Molecular Markers for Determination of Unknown Sex Samples in Bali Cattle
Indriawati *) , Slamet Diah Volkandari, Endang Tri Margawati Laboratorium Genetika Molekuler Hewan Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI
* E-mail: indr020@lipi.go.id

## ABSTRACT
An  investigation  involving  large  number  of  animals  is  often  resulting incomplete  or  in  accurate information such as animal parentage, or misidentify on sex due to unlabeled sex samples. A PCR method  by  applying  Y  chromosome  markers  (UTY  and  SRY)  facilitates  in  determination  of unknown  sex  problem.  This  study  was  intended  to determine  sex  from  unlabelled  sex  of  blood samples  by  applying  PCR  method  using  a  pooled-DNA  template.  Twenty  five  of  unknown  sex blood  samples  from  Nusa  Penida,  Bali  were  used  in  this  study.  The  samples  were  plotted  into  5 pooled-DNA  whith  each  pool  DNA  consisted  of  5  individuals  DNA.  Two  pairs  of  sex  primers, UTY  (58 o C)  and  SRY  (60 o C)  with  35  cycles  were  applied  to  amplify  the  samples.  The  result showed there was only one pooled-DNA (P4) amplified by UTY (484bp). Whereas re-PCR of the positive pooled-DNA (P4) using SRY primer, only one out of 25 samples determined as male Bali cattle (325bp). This finding suggests that UTY and SRY primers are suitable for sex determination and  the  pooled-DNA  could  be  used  as  an  efficient  PCR  method  both  in  consumables  and PCR process for sex determination.
Keywords: Determination, sex, unknown sample, pooled DNA, Bali cattle .

## PENDAHULUAN
Identifikasi  informasi  jenis  kelamin  pada sampel  yang  dikoleksi  sangat  penting  untuk berbagai  aspek.  Sebagai  contoh,  penentuan jenis kelamin dan asal usul ternak pada sampel fosil  (Svensson,  2010),  hewan  yang  sulit diketahui jenis kelaminnya secara visual seperti burung  (Rodriguez et  al.,  2005),  sampel  yang terkontaminasi  yaitu  sampel  jantan  diduga tercampur dengan sampel betina dan juga pada kasus kriminal atau forensik (Gill et al., 2001)
Dalam  dunia  peternakan,  determinasi  jenis kelamin  telah  diaplikasikan  dalam  bidang pemuliaan  ternak  (Xia-Hua et  al.,  2014), dalam  validitas  hasil  sexing  pada  kambing (Phua et  al.,  2003)  dan    penentuan  jernis kelamin  ternak  dari    sampel  maternal  plasma yang  berasal  dari  fetal  sapi  (da  Cruz et  al., 2012). Dalam industri peternakan, pengontrolan  rasio  jenis  kelamin  sangat penting,  misalnya  untuk  perusahaan  susu  yang berfokus  dengan  sapi  betina  dan    usaha  sapi potong  yang  cenderung  focus  pada  sapi  jantan karena  pertumbuhan  lebih  cepat  dan  efisiensi pakan lebih bagus (Silversides et al., 2001)
Metode  yang  pernah  digunakan  dalam identifikasi jenis kelamin pada sampel penelitian, diantaranya adalah flow cytometri/Cell  sorting (Tubman et  al.,  2004)
dan Polymerase  Chain  Reaction (PCR)  pada fragmen DNA spesifik jenis kelamin (Bischoff et  al.,  2002).  Metode  PCR  diketahui  efisien, akurat, sensitif dan cepat dalam mengidentifikasi  jenis  kelamin  pada  sampel daging  dari  berbagai  ternak    (Appa  Rao et  al., 1995; Gokulakrishnan et al., 2012)
Determinasi jenis kelamin pada mammalian adalah  menggunakan  sistem  kromosom  X-Y, dimana  kromosom  X  untuk  jenis  kelamin betina (XX) sedangkan Y untuk pejantan (XY). Penanda  genetik  pada  kromosom  Y  digunakan pada  penelitian  ini  karena  mempunyai  lebih sedikit  variasi  yang  terjadi  didalamnya  (Ginja et  al.,  2009).  Terdapat  dua  penanda  genetik yang digunakan yaitu Ubiquitously Transcribed  Y  Chromosome  Tetratricopeptide (UTY)  digunakan  untuk  mendeterminasi  jenis kelamin  dan Sex  determining-Region Y  (SRY) digunakan  untuk  konfirmasi  hasil  dari  gen UTY.  Gen  UTY merupakan  gen  yang  penting dalam  reproduksi  jantan,  sedangkan SRY merupakan  gen  yang  bertanggung  jawab terhadap  pembentukan  kelenjar  (prostat)  dan organ genital eksternal (Chang et al., 2013).
Hal  ini  mengartikan  bahwa  apabila  pada kromosom Y tidak ditemukan penanda genetik dimaksud  pada  individu  ternak  tersebut  maka organ  reproduksi  sepenuhnya  berkembang
menjadi  betina.    Penelitian  yang  melibatkan sejumlah populasi ternak seringkali menyebabkan  ketidak  lengkapan  data  (misal: jenis kelamin), terlewat dalam pendokumentasian yang menyebabkan keakurasian  data  diragukan.  Oleh  karena  itu, diperlukan  determinasi  jenis  kelamin  dalam usaha  validasi  data,  sehingga  dapat  digunakan sebagai materi dalam penelitian secara akurat.
Penelitian ini dimaksudkan untuk mendeterminasi  jenis  kelamin  pada  sapi  Bali yang tidak terlabel jenis kelamin (unknown sex samples)  pada  sampel  darah  dengan  penanda genetik,  yang  dilakukan  lebih  efisien  dalam proses,  waktu  dan  bahan  kimia  DNA  yang disusun dalam pooled-DNA template.

## METODE

## Koleksi Darah dan Isolasi DNA
Sebanyak 25 sampel darah segar sapi Bali dari Nusa Penida,  Bali  yang  dikoleksi  dari vena  jugularis dan ditampung  dalam  tabung Venoject mengandung antikoagulan  (EDTA).  DNA  dikoleksi  dengan metode Garam Pekat (Montgomery and Sise, 1990). Sampel  DNA  diplot  dalam  lima pooled-DNA  yaitu sebagai  P1,  P2,  P3,  P4  dan  P5,  masing-masing  plot berisi 5 sampel DNA individu sapi Bali.

## Polymerase Chain Reaction  (PCR)

## Amplifikasi DNA menggunakan metode Polymerase
Chain Reaction (PCR). Total volume  pereaksi PCR yang  digunakan  sebanyak  20µl,  terdiri  dari  2µl pooled-DNA,  10pmol    (Primer  F  UTY  dan  Primer UTYR) (Margawati et al., 2015) dan 10pmol Primer SRYF dan SRYR (Margawati et al., 2015) dan 16µl AccuPower PCR  Kit  (Bioneer). Program  PCR  yang digunakan  untuk  primer  UTY,  yaitu  pre-denaturasi 94 o C  5min;  35  siklus  (94 o C  selama  30  detik;  52 o C selama 30 detik; 72 o C selama 30detik); 72 o C selama 1 menit dan pendinginan 10 o C. Program PCR primer SRY  yang  digunakan  adalah  pre-denaturasi  94 o C 5 menit;  35  siklus  (92 o C  selama  60  detik;  60 o C
selama 60 detik; 72 o C selama 60 detik); 72 o C selama 7  menit  dan  pendinginan  10 o C  (Hartatik et  al., 2014).  Proses  amplifikasi  menggunakan  mesin thermalcycler (Techne TC-Plus).

## Analisa Hasil PCR
Produk  PCR  dielektroforesis  menggunakan  gel agarose  1%  dengan  1xTBE  buffer  dengan  aliran listrik 100 V selama 1 jam. DNA ladder 100pb (VC 100bp,  Vivantis)  digunakan  sebagai  ukuran  marker. Gel  agarose  direndam  dalam  larutan  mengandung 0.5µg/ml  EtBr  (AppliChem,  Germany)  selama  15 menit  dan  divisualisasi  diatas  UV transilluminator (MUV21, Major Science, USA). Gambar didokumentasikan dengan kamera digital.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan  hasil  amplifikasi  gen  UTY  pada kelima pooled-DNA  sapi  Bali,  diperoleh  satu pooled-DNA yang mengidentifikasikan sebagai kelamin  jantan.  Hal  tersebut  dibuktikan munculnya  pita  DNA  dengan  ukuran  484pb yang  sesuai  dengan  ukuran  target  gen  UTY (Gambar 1).
Pada  Gambar  1, dapat dilihat  bahwa  hanya ada  satu pooled-DNA  sampel  (P4)  yang berukuran  sesuai  dengan  penanda  genetik UTY,  yaitu    484pb.  Ukuran  target  gen  UTY tersebut sesuai dengan hasil penelitian sebelumnya pada bangsa Sapi (Gotherstorm et al.,  2005)    dan    fossil  bangsa  Sapi  (Svensson, 2010).    Ukuran  gen  UTY  pada  bangsa  Bison dan  Kerbau  berbeda,  yaitu  lebih  panjang  10 basa, yaitu 494pb (Gotherstorm et al., 2005).
Gen UTY berada pada ekson 19 kromosom Y  yang  dapat  digunakan  dalam  penelusuran asal  usul  sapi  Bali    (Kusdiantoro et al., 2009), sedangkan penanda genetik yang sama digunakan  untuk penelusuran  kemurnian  sapi Bali  dari  garis  keturunan  tetua  pejantan (Margawati et al, 2015).
( M)=DNA Ladder 100bp, (P1-P5)=DNA sapi Bali Unknown sex sample Gambar 1. Elektroforesis gen UTY pada lima pooled-DNA sapi Bali unknown sex sample.
(M)=DNA Ladder 100bp, (1-5)=DNA sapi Bali Unknown sex samples Gambar 2. Elektroforesis gen UTY hasil re-PCR pada pooled-DNA sapi Bali P4.
(M)=DNA Ladder 100bp, (1-5)=DNA sapi Bali Unknown sex samples Gambar 3. Elektroforesis gen SRY pada pooled-DNA sapi Bali P4
Pengulangan PCR (re-PCR) dilakukan pada pooled-DNA (no. P4) yang berisi 5 sampel sapi Bali  yang  positif  mendeteksi  adanya  gen  UTY (ukuran 484pb). Hasil re-PCR (1 pooled-DNA) tersebut,  diantaranya  ditemukan  satu  sampel berjenis  kelamin  jantan  (sampel  nomor  3, Gambar 2).
Pada Gambar 2  Lajur 3, pita amplikon  gen UTY  yang  muncul  pada  DNA  sampel  P4 menunjukkan  hanya  satu  individu  yang diketahui berjenis kelamin jantan. Oleh karena banyak  pita  UTY  muncul  (bersifat  tidak spesifik),  maka  pada  sampel pooled-DNA  P4 dikonfirmasi  lagi  dengan  penanda  genetik SRY.  Penanda  genetik  SRY  secara  spesifik dapat  digunakan  untuk  mengindentifikasi sampel  yang  tidak  diketahui  jenis  kelaminnya (Morikawa et al., 2011; Hua-Xia et al., 2014).
Gen  UTY  dalam  penelitian  ini  digunakan untuk  mendeterminasi  jenis  kelamin  pada unknown  sex  samples, sedangkan    SRY digunakan  untuk  mengkonfirmasi  hasil  PCR dari gen UTY.
Untuk memastikan keakurasian  identifikasi jenis  kelamin  pada  sampel  sapi  Bali  nomor  3, maka  dilakukan  PCR  menggunakan  penanda genetik Sex-determining Region Y (SRY) yang menyandi jenis kelamin jantan pada kromosom Y.  Hasil  PCR  menunjukkan  bahwa  sampel nomor  3  menghasilkan  pita  DNA  sebesar 325pb  yang  sesuai  dengan  ukuran  gen  target dari gen SRY (Gambar 3).
Pada  Gambar  3  Lajur  3,  dapat  dilihat  pita tunggal  gen  SRY  berukuran  325pb  pada sampel yang sama (Gambar 2 Lajur 3).
Menurut  Prasant et  al.,  (2008)  determinasi jenis  kelamin  menggunakan  SRY  memberikan hasil spesifisitas tinggi. Xiu-Hua et al., (2014), telah menggunakan gen SRY dalam mendeterminasi  jenis  kelamin  pada  sampel DNA  yang  berasal  dari  domba,  sapi  dan kambing.    Gen  SRY  berkembang  kuat  dalam identifikasi jenis kelamin. Hubungan yang kuat antara hasil analisis SRY dengan fenotip jantan dapat  diartikan  bahwa  gen  SRY  sangat  akurat sebagai
penanda  genetik  untuk  memprediksikan  jenis kelamin jantan  (Morikawa et al., 2011; Tozzo et al., 2013).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian,  metode  PCR dengan  penanda  genetik  yang  berasal  dari kromosom Y (UTY dan SRY) dapat digunakan untuk  mendeterminasi  jenis  kelamin  jantan pada  sampel  yang  tidak  berlabel  jenis  kelamin (unknown  sex  sample).  Selain  itu  Metode pooled-DNA dalam PCR dapat mengefisienkan penggunaan  bahan  maupun  pada  proses  PCR dalam mendeterminasi jenis kelamin.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  menggunakan  sebagian  dana penelitian program DIPA-LIPI TEMATIK TA. 2015.  Penulis  mengucapkan terima  kasih kepada  teknisi  lapang  yang  telah  membantu dalam koleksi darah di lapang.

## DAFTAR PUSTAKA
Appa Rao KBC, V Kesava Rao, BN Kowale &
SM. Totey. 1995. Sex Specific Identification  of  Raw  Meat  From  Cattle, Buffalo,  Sheep  and  Goat. Meat  Sciences 39: 123-126.
Bischoff  FZ,  MK  Sinacori  &  DD  Dang.  2002. Cell-Free Fetal DNA and Intact Fetal Cells in Maternal Blood Circulation: Implications for  First  and  Second  Trimester  Non-
Invasive Prenatal Diagnosis. Human Reproduction 8: 493 – 500. Chang  TC,  Yanga  Y,  EF Retzelc  &  WS  Liu. 2013. Male-Specific Region of The Bovine
Y Chromosome is  Gene Rich  with  A High Transcriptomic Activity in Testis
Development. Proceedings  of  National Academy of Science 110: 12373 – 12378. da Cruz AS, D Silva, EOA Costa, P De M-Jr , CC  da Silva,  DM  Silva  &  AD  da  Cruza. 2012.  Cattle  Fetal  Sex  Determination  by Polymerase  Chain  Reaction  Using  DNA Isolated  from  Maternal  Plasma. Animal
Reproduction Science 131: 49 – 53.
Gill  P,  C  Brenner,  B  Brinkmann,  B  Budowle, A  Carracedo,  MA  Jobling,  P  de  Knijff,  M
Kayser,  M  Krawczak  &  WR    Mayr.  2001. DNA  Commission  of  The  International Society of Forensic Genetics: Recommendations  on  Forensic  Analysis using  Y-chromosome  STRs. Forensic
Sciences International 124: 5 – 10.
Ginja C, LT da Gama & MC Penedo. 2009. Y chromosome Haplotype Analysis in Portuguese  Cattle  Breeds  using  SNPs  and STRs. Journal of Heredity. 100: 148 – 157. Gokulakrishnan P, RR Kumar, BD Sharma, SK
Mendiratta  &  D  Sharma.  2012.  Sex Determination of Cattle Meat by Polymerase  Chain  Reaction  Amplification of the DEAD Box Protein (DDX3X/DDX3Y) Gene. Asian- Australasian  Journal  Animal  Sciences
25(5): 733 – 737.
Hartatik  T,  TSM  Widi,  SD  Volkandari,  D Maharani  &  Sumadi.  2014.  Analysis  of DNA  Polymorphism  in  SRY  Gene  of
Madura Cattle Population. Procedia Enviromental Science 20: 365-369.
Kusdiantoro  M,  M  Olsson,  HTA  van  Tol,  S Mikko,  BH  Vlamings,  G  Andersson,  HR gues-Martinez,  B  Purwantara,  RW  Paling  , B  Colenbrander  &  JA  Lenstra.  2009.  On the Origin of Indonesian Cattle. PLoS ONE 4: e5490.
Margawati ET, Indriawati, SD Volkandari & M Ridwan. 2015. Identification of Pure Breed Bali  Cattle  by  Using  Molecular  Approach. Proceedings  of  The  6th  International Seminar  on  Tropical  Animal  Production
October 20-22, 426-431.
Montgomery GW & JA Sise. 1990. Extraction of  DNA  from  Sheep  White  Blood  Cells.
New Zealand Journal Agricultural Research 33: 437-441. Morikawa  T,  Y  Yamamoto  &  S  Miyaishi. 2011. A new Method for Sex Determination Based on Detection of SRY, STS  and  Amelogenin  Gene  Regions  with Simultaneous Amplification of Their Homologous  Sequences  by  a  Multiplex PCR. Acta Medica Okayama. 65: 113-122.
Rodriguez  C,  J  Bustamante,  BM  Cruz,  &  J Negro.  2005.  Evaluation  of  Methods  for Gender  Determination  of    Lesser  Kestrel Nestlings. Journal  of  Raptor  Research 3:127-133.
Silversides DW, N Pilon, R Behjani, A Boyer,
I  Daneau  &  J  Lussier.  2001.  Genetic Manipulation  of  Sex  Differentiation  and
Phenotype in Domestic animals.
Theriogenology 55: 51-63. Svensson,  EM.  2010.      Detecting  Sex  and Selection in Ancient Remains Using Single Nucleotide Polymorphisms. Acta Universitatis Upsaliensis. Digital
Comprehensive  Summaries  of  Uppsala Dissertations  from  the  Faculty  Science Technology. [Dissertation]. Tozzo P, A Giuliodori, S Corato, E Ponzano, D Rodriguez  &  L  Caenazzo.  2013.  Deletion of  Amelogenin  Y-locus  in  Forensic: Literature  Revision  and  Description  of  a Novel  Method  for  Sex  Confirmation.
Journal of Forensic Legal Medica 20: 387-
391.
Tubman LM, Z Brink, TK Suh & GE Seidel Jr.
2004.  Characteristics  of  Calves  Produced with Sperm Sexed by Flow Cytometry/Cell Sorting. Journal  of  Animal  Science 82: 1029-1036.
Xia-Hua  Z,    F    Xue-Hui,    Wangjin,  & Wu- Dengjun.  2014.  Sex  Identification  in Ruminant  using  SRY  and  Microsatellite Markers. Asian Journal of Animal
Biosciences 8: 98-105.