## IDENTIFIKASI IKAN GENUS MYSTUS DENGAN PENDEKATAN GENETIK

## Identification Of Mystus Fish With Genetic Approach
Taufik B. Pramono 1,2 , Diana Arfiati 2 , Maheno S. Widodo 2 , Uun Yanuhar 2
1 PS Budidaya Perairan, FPIK, Unsoed, Purwokerto, 53123, Indonesia
2 Program PascaSarjana, FPIK, UB, Malang, 65145, Indonesia *Korespondensi : tb1pram@yahoo.com

## ABSTRAK
Ikan-ikan dari Famili Bagridae di Indonesia mencapai 60 jenis dan salah satunya dari genus Msytus. Metode yang digunakan untuk identifikasi ikan yang sangat cepat dan akurat sangat  diperlukan.    DNA  barcoding  adalah  teknik  identifikasi  baru  dengan  pendekatan molekular. Gen CO1 diamplifikasi dan produk PCR disekuensing serta dianalisis dengan menggunakan  software  bioinformatika.    Pengeditan  hasil  sekuensing  dan  penentuan komposisi nukleotida dianalisis dengan software Mega5. Urutan DNA disejajarkan dengan ClustalW  vers.  1.4.  Sekuens  dibandingkan  dengan  data  GenBank  menggunakan  BLAST (Basic Local Aligment Search Tools) dan BOLDSystems.  Pohon filogenetik dibuat dengan menggunakan  metode  Neighbor_Joining.  Salah  satu  contoh  identifikasi  ikan  dari  genus Mystus yang telah dikonfirmasi adalah Mystus nigriceps menjadi Mystus singaringan .
Kata Kunci : Identifikasi, Mystus, DNA barcode

## ABSTRACT
The fish of the Bagridae Family in Indonesia reach  until 60 species and one of them is from the genus Msytus.  The method is used for fast and accurate species identification was needed. DNA barcoding was a new identification method with molecularly approach. The  CO1  gene  was  amplified  and  PCR  products  were  sequenced  and  analyzed  using bioinformatics  software.  Editing  of  sequencing  results  and  determining  the  nucleotide composition  were  analyzed  with  Mega5  software.  The  DNA  sequence  was  aligned  with ClustalW  vers.  1.4.  Sequences  are  compared  with  GenBank  data  using  BLAST  (Basic Local  Aligment  Search  Tools)  and  BOLDSystems.  Phylogenetic  tree  was  made  using Neighbor_Joining method. One example of the identification of fish from the confirmed Mystus genus is Mystus nigriceps being the Mystus singaringan .
Keywords : Identification, Mystus, DNA Barcoding

## PENDAHULUAN
Ikan air tawar di Indonesia yang telah  diidentifikasi  sekitar  1218  spesies dari 84 famili termasuk 1172 spesies asli dari  79  famili  dan  630  spesies  bersifat endemik.    Ikan  dari  Famili  Bagridae teridentifikasi  sebanyak  60  spesies. Uniknya, ikan dari Famili Bagridae tidak ditemukan  daerah  Wallacea  dan  Sahul,
hanya  ditemukan  di  Sundaland  (Hubert et.al., 2015).
Ikan-ikan  famili  Bagridae  juga ditemukan di DAS Serayu Jawa Tengah. Setijanto et.al. (1999) melaporkan bahwa terdapat tiga spesies ikan famili Bagridae di  Sungai  Serayu  dan  Mengaji  yaitu Mystus  gulio,  mystus  microcanthus  dan Mystus  nigriceps .  Putro  (2003)  dan Pramono (2010) di Sungai Klawing yang
masih  merupakan  DAS  Serayu,  masing- masing mendapatkan spesies ikan famili Bagridae  lain  yaitu  ikan  Baceman ( Mystus  nemurus )  dan  yaitu  ikan  Seng- garingan  ( Mystus  nigriceps ).    Penamaan spesies-spesies ikan dari Famili Bagridae yang telah ditemukan dan diteliti di DAS Serayu  tersebut  berdasarkan  karakter morfologi  yang  mengacu  pada  Kotellat et.al. (1993).
Penamaan dan determinasi spesies yang  benar  sangat  penting  untuk  mela- kukan kajian bioekologi dan kajian lain- nya.   Seiring dengan perkembangan bio- logi  molekuler,  telah  ditemukan  metode baru  untuk  identifikasi  spesies  berbasis DNA  yang  dikenal  dengan  DNA  Bar- coding (Floyd, et.al ., 2002; Hebert et.al ., 2003a; ).   DNA barcoding membe-rikan kecepatan  dan  keakuratan  dalam  identi- fikasi spesies dengan fokus analisis pada segmen  kecil  dari  mtDNA  (Muchlisin et.al .,  2013;  Karim et.al .,  2015).  DNA barcoding  dapat  menjadi  solusi  krisis taksonomi (Meier et.al. , 2006).
Penamaan spesies dari ikan Famili Bagridae  utamanya  ikan  Seng-garingan ( Mystus  nigriceps )  yang  telah  diteliti sebelumnya  perlu  diperjelas  dengan pendekatan genetik menggunakan meto- de DNA Barcoding.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengkon-firmasi penamaan spesies ikan dari  genus  Mystus  utamanya Mystus nigriceps secara  genetik menggunakan marker  gen  CO1.  Harapannya  dapat dijadikan dasar dalam manajemen sumberdaya  ikan  dan  konservasi  serta budidayanya selanjutnya.

## METODE PENELITIAN

## Ikan Uji
Sejumlah  18  ekor  ikan  uji dikoleksi  dari  Sungai  Klawing  Kabu- paten  Purbalingga  Provinsi  Jawa Tengah  pada  Februari    2017  dengan bantuan  nelayan  setempat.  Untuk keperluan idetinfikasi spesies diambil sebuah jaringan sirip ekor ( caudal fin ) dan  disimpan  dalam  larutan  etanol 95%.

## Ekstraksi DNA, PCR, dan Sekuensing
Ekstraksi  DNA  genom  dari sampel  menggunakan  metode  Quick DNA Tissue/Insect Miniprep Kit (Zymo Research). Gen CO1 diamplifikasi meng- gunakan  pasangan  primer  universal LCO1490: 5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg- 3’ dan HCO2198: 5’-taaacttcagggtgacca aaaaatca-3’ (Folmer et.al . , 1994).  Kom- posisi  reaksi  PCR  (25µl),  yaitu  12,5  µl PCR  Buffer  (2x), 0,5 µl  primer  forward (10  pmol/µl),  0,5  µl  primer  reverse  (10 pmol/µl),  KOD FX Neo (1.0U/µl), 1 µl template  DNA,  dan  5  µl  ddH 2 O. Amplifikasi  dilakukan  dalam  mesin Toyobo KOD FX Neo Catalog No KFX- 201.
Reaksi Polimerase Chain Reaction (PCR) dilakukan dalam 35 siklus dengan parameter  pre  denaturasi  awal  suhu 95 o C/3  menit,  denaturasi  98 o C/10  detik, annealing 50 o C/30 detik, extention 68 o C/ 1    menit.      Hasil  PCR  divi-sualisasi  de- ngan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v),
dimurnikan meng-gunakan Shrimp
Alkaline  Phosphotase (Amersham  Bio- sciences Corporation, Arlington Heights, Illinois,  USA)  dan Exonuclease (Amer- sham)  (SAP/EXO).  Sekuensing  2  arah (bi-directional)  dila-kukan  oleh  First Base  CO  (Malaysia)  menggunakan  Big Dye©  terminator  v3.1  cycle  sequencing kit Applied Biosystem.

## Analisis Data
Pengeditan  hasil  sekuensing  dan penentuan  komposisi  nukleotida  diana- lisis  dengan  software  Mega5  (Tamura et.al ., 2011).  Urutan  DNA  disejajarkan dengan ClustalW vers. 1.4 (Thompson et al. , 1997). Sekuens dibandingkan dengan data  GenBank  menggunakan  BLAST (Basic  Local  Aligment  Search  Tools) ( Altschul  et.al .,  1997)  dan  BOLDSys- tems  (Ratnasingham  dan  Hebert,  2007). Pohon  filogenetik  dibuat  dengan  meng- gunakan  metode  Neighbor  Joining (Saitou dan Nei, 1987).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  PCR  menunjukkan  gen CO1  teramplifikasi dengan panjang 697 bp  (Gambar 1).  Ukuran panjang ampli- fikasi  hasil  dalam  penelitian  ini  sama dengan penelitian yang dilakukan Folmer et.al. (1994),    yang  memperoleh  ukuran kurang lebih 700 bp.
Gambar 1. Hasil amplifikasi gen CO1 sampel ikan uji dari Sungai Klawing dalam gel agarose 1%. L1 adalah DNA Ladder dan A adalah sampel serta L2 adalah panjang garis gen (GeneRuler)
Sekuens  yang  diperoleh  ini  tidak ada  gap,  insersi  atau  delesi  dan  tidak memiliki stop kodon. Hal ini menunjukan bahwa  sekuens  ini  merupakan  gen struktural, COI (Gambar 2).
Homologi  untuk  menentukan identitas  spesies  dilakukan  analisis BLAST (Gambar 3) dan DNA Barcoding menggunakan  BOLD  system  (Gambar 4).
Adapun  dari  hasil  BLAST  dan
BOLD  system  menunjukkan  bahwa homologi  sekuens  sampel  ikan  uji memiliki kemiripan dengan ikan Mystus singaringan .  Hasil BLAST menunjukan identitas  atau  tingkat  kemiripan  men- capai  99%  dan  hasil  BOLD  mencapai 99,84%. Berdasarkan species page,  BIN Page  (Barcode  Index  Number),  dan filogenetik  dalam  BOLD  system  dinya- takan  bahwa  sampel  ikan  uji  ini  adalah spesies ikan Mystus singaringan . Hasil  identifikasi  spesies  ikan dari  Famili  Bagridae  dari  Sungai Klawing  Jawa  Tengah  yaitu  yang dulunya Mystus  nigriceps (Pramono, 2010) telah terkonfirmasi secara genetik dalam  penelitian  menggunakan  metode DNA Barcoding menjadi Mystus singaringan .
Hasil  identifikasi  sampel  uji ( KLW  PBG )    secara  genetik  ini  tidak terbantahkan adalah Mystus singaringan, kecuali    ada  spesies  sangat  mirip  secara genetik namun hal tersebut sangat jarang terjadi. Secara taksonomi, merujuk pada BOLD  system  dan  BLAST  merupakan Phylum  Chordata,  Kelas  Actinopterygii, Ordo  Siluriformes,  Famili  Bagridae  dan Genus  Mystus  serta  speciesnya Mystus singaringan .
Gambar 2 .  Hasil Sekuens sampel penelitian
Gambar 3. Hasil BLAST terhadap sekuens sampel penelitian
Gambar 4. Hasil BOLD System terhadap sekuens sampel penelitian
Gambar 5 . Bukti kedekatan sekuens penelitian dengan M. singaringan , filogenetik (atas) dan distribusi jarak (bawah). Unknown speciment adalah sampel penelitian.
Berdasarkan barcode
index number (BIN) dalam BOLD  system, secara  morfologi  (Gambar  6),  jarak pasangan  dan  sekuens    sampel  ikan Mystus singaringan dalam penelitian  ini masuk dalam satu klaster dengan ikan M. Singaringan yang  berasal  dari  Kediri Jawa  Timur (Hubert et.al ., 2015).  Nilai barcode  index  number memiliki  arti sebagai  sebuah  kerangka  online  yang mengelompokan  secara  algoritma  yang menghasilkan halaman web untuk setiap klaster.    Karena  klaster  menunjukkan kecocokan tinggi dengan spesies, sehingga  sistem  ini  dapat  digunakan untuk  verifikasi  identitas  spesies  juga keragaman  dokumen  ketika  informasi taksonomi  (Ratnasingham  dan  Hebert,
2013).
Gambar 6 . (A) Ikan M. singaringan dari
Sungai  Klawing  Jawa  Tengah;  (B)  Ikan Mystus  singaringan dari  Kediri  Jawa
Timur.
Gambar 7 .  Pohon Filogenetik
Kedekatan  antara  spesies  yang akan  diidentifikasi  dan  yang  menjadi rujukan  tidak  terbukti  dengan  spesies terdahulu, Mystus nigriceps . Berdasarkan analisis  filogenetik  sekuens  penelitian dengan  kode  KLW  PBG  dan  sekuens genus  yang  sama  diperoleh  bahwa spesies  penelitian  ini  lebih  dekat  pada Mystus singaringan (Gambar 7). Kekerabatan antara Mystus singaringan dan M  nigirceps sangatlah jauh  jika  dilihat  dari  pohon  filogenetik. Pohon filogenetik menggambarkan garis keturunan  evolusi  dari  spesies,  orga- nisme atau dari  satu nenek moyang ber- beda  (Hall,  2011).    Berdasarkan  pohon filogenetik  yang  dibuat  dapat  diketahui hubungan  genetik  antar  spesies  dalam satu  populasi  dan  antar  populasi.    Filo- geni  berguna  juga  untuk  mengorga-nisir
KU692660.1 Mystus singaringan KU692662.1 Mystus singaringan
KU692661.1 Mystus singaringan
KU692659.1 Mystus singaringan
KLW PBG
KU870465.1 Mystus cavasius
KJ936764.1 Mystus bleekeri
KX266834.1 Mystus bleekeri
KT364779.1 Mystus bleekeri
KJ936689.1 Mystus bleekeri
KX177968.1 Mystus vittatus
KU692658.1 Mystus nigriceps
0.005
pengetahuan  keragaman  biologis  untuk klasifikasi  struktural  dan  untuk  membe- rikan wawasan ke dalam peris-tiwa yang terjadi selama evolusi (Taylor, 2014).
Beberapa  penelitian  identifikasi spesies  ikan-ikan  di  perairan  tawar  dan laut  di  Indonesia  juga  dilakukan  dengan menggunakan  DNA  Barcoding  seperti yang  dilakukan  oleh  Muchlisin et.al. (2013) di Danau Laut Tawar Aceh, Bulu Babi di Teluk Cendrawasih  (Toha, et.al ,
2015),  Dahrudin et.al .  (2016)  di  Pulau Jawa dan Bali, dan Hubert et.al . (2016) di Dataran  Sunda,  Wallacea  dan  Sahul. Penggunaan DNA barcoding dapat men- jadi solusi krisis taksonomi (Meier et.al ., 2006) dan perspektif baru dalam ekologi dan  sistematika  ikan  (Hubert, et.al .,
2008), manajemen sumberdaya ikan dan konservasi (Hubert et.al, 2016).
DNA barcoding memberikan kecepatan  dan  keakuratan  dalam  iden- tifikasi  spesies  dengan  fokus  analisis pada  segmen  kecil  dari  mtDNA  (Much- lisin et.al .,  2013;  Karim et.al. ,  2015). Pada  eukariot,  mtDNA  terdiri  dari  mo- lekul  DNA  rantai  untai  ganda  yang berukuran  15-20  kb  (Hurst  dan  Jiggiins, (2005).  DNA barcoding bertujuan untuk menyediakan  metode  yang  kompeten untuk  identifikasi hingga tingkat spesies dengan  menggunakan  penanda  mole- kuler yang merupakan turunan dari lima wilayah  gen  cytochrome  c  oxidase  I (COI) (Hubert, et.al ., 2008). Penggunaan
Barcode ini sangat memungkinkan untuk mengidentifikasi  spesies  yang  berbeda dengan  variasi antar spesies yang cukup banyak  dan  variasi  intra  spesifik  yang rendah (Yao, et.al ., 2010).
Menurut    Hurst  dan  Jiggiins, (2005),  DNA  barcoding  memiliki  dua kelebihan yaitu, pertama bersifat haploid dan  dan  memiliki  wilayah  yang  sangat lestari  ( conserved )  sehingga  fragmen COI  secara  teknis  mudah  mengampli- fikasi  tanpa cloning pada ragam spesies. Kedua,  mitokondria  memiliki  ukuran populasi  yang  efektif  kira-kira  seper- empat dari penanda dan pada hewan rata- rata  memiliki  tingkat  evolusioner  yang tinggi.  Oleh karena itu memiliki tingkat deklarasi yang tinggi pula.  Spesies yang
relatif  dekat  pun  dapat  dibedakan menggunakan sekuens yang pendek.
Kelebihan  lain  DNA  barcoding adalah  dapat  mengidentifikasi  spesies yang  sulit  dibedakan  secara  morfologi (Hebert et.al .,  2004)  dan  menggunakan sampel  jaringan  yang  sangat  sedikit sehingga tidak harus mematikan hewan- nya.  Namun demikian, metode ini sangat tergantung  pada  tersedia  tidaknya  data sekuens  ( reference  sequences )  yang akurat  sebagai  pembanding  (Stoeckle, 2003).    Hasil  DNA  Barcoding  dapat digunakan  sebagai  studi  yang  lebih  luas misalnya studi filogenetik (Erickson dan Driskell,  2012;  Huang et.al .,  2016), filogeografi  (Yu,  2014)  dan  genetika populasi (Draft et.al ., 2010) serta, variasi genetik  untuk  stabilitas  dan  ketahanan populasi.

## KESIMPULAN
Analisis genetik berdasarkan fragmen  gen  CO1  menunjukkan  bahwa sampel  penelitian  dari  Sungai  Klawing Jawa  Tengah merupakan spesies Mystus singaringan .    Penelitian  selanjutnya  da- pat  dilakukan  mengkaji  keragaman  dan struktur genetik.

## DAFTAR PUSTAKA
Altschul,  S.F.,  Madden  T.L.,  Schaffer A.A.,  Zhang  J.,  Zhang  Z.,  Miller W.,  Lipman  D.J.  1997.    Gapped BLAST and PSI-BLAST : A New Generation  of  Protein  Database Search Program. Nucleic Acid Re- search 25 : 3389-3402.
Dahruddin,  H.,  Hutama  A.,  Busson  F., Sauri  S.,  Hanner  R.,  Keith  P., Hadiaty  R.K.,  Hubert  N.  2016. Revisiting  the  Ictyodiversity  of Java  and  Bali  through  DNA Barocdes  :  Taxonomic  Coverage, Identification  Accuray,  Cryptic Diversity  and  Identification  of Exotic  Species. Molecular  Eco- logy Resources : 1-12.
Draft,  K.J.,  Pauls,  S.U.,  Darrow,  K., Miller S.C., Hebert, P.D., Helgen,
L.E.,  Novotny,  V  and  Weiblen,
G.D.  2010. Population Genetics of
Ecological  Communities  With DNA  Barcodes  :  An  Example From  New  Guinea  Lepidoptera. PNAS 107 (1) : 5401-5046.
Erickson, D.L., and Driskell, A.C.  2012. Construction  and  Analysis  of Phylogenetik  Trees  Using  DNA Barcode Data. Methods Mol. Biol 85 (8) : 395-408.
Floyd,  R.,  Abebe  E.,  Papert  A.,  and Blaxter  M.    2002.    Molecular barcodes  for  soil  nematode  ideti- fication. Molecular Ecology 11 (4) : 839-850.
Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., and  Vrijenhoek  R.    1994.    DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase  sub  unit  I  from  diverse metazoan  invertebrates. Molecu- lar  Marine  Biology  and  Biotech- nology 3(5) : 294-299.
Frankham,  R.    1996.    Relationship  of Genetic  Variation  to  Population Size  In  Wildlife. Conservation Biology 10 (6) : 1500-1508.
Hebert, P. D.N., Cywinska A., Ball S.L., and  de  Ward  J.R.    2003a.    Bio- logical  Identifications  Through DNA Barcodes. Proceeding Royal Society  Part  B.    Biological  Sci- ences 270 (1512) : 313-322.
Hebert,  P.D.N.,  Penton,  E.H.,  Burns, J.M.,  Janzen,  D.H.,  and  Hall- wachs, W.  2004.  Ten Species In One  :  DNA  Barcoding  Reveals Cryptic  Species  In  The  Neo- tropical  Skipper  Butterfly  Astra- ptes  fulgerator. PNAS 101  (41)  : 14812-14817.
Huang,  Z.,  Yang,  C.,  and  Ke,  D.   2016. DNA Barcoding and Phylogenetic Relationships  In  Anatidae. Mito- chondrial  DNA 27  (2)  :  1042-
1044.
Hubert,  N.,  Kadarusman.,  A.  Wibowo., F.  Busson.,  D.  Caruso.,  S. Sulandari., N. Nafiqoh., L. Pouyaud.,  L.  Ruber.,  J.C.  Avare., F.  Herder.,  R.  Hanner.,  P.  Keith. R.K.  Hadiaty.    2015.    DNA Barcoding  Indonesian  Freshwater
Fishes : Challenges and Prospects.
DNA Barcodes 3 : 144-169.
Hughes,  A.R.,  Inouye,  B.D.,  Johnson, M.T.J.,  Underwood,  N.  And Vellend,  M.  2008.    Ecological Consequences  of  Genetic  Diver- sity. Ecology Letters 11 : 609-623.
Hurst, G. D. D. And Jiggins, F.M.  2005. Problems with Mitochondrial DNA  as  a  Marker  In  Population, Phylogeographics and Phylo- genetic  Studies  :  The  Effects  of Inherited Symbions. Proc R Soc B 272 : 1525-15234.
Karim,  A.,  Iqbal,  A.,    Akhtar,  R., Rizwan,  M.,    Amar,  A.,    Qamar, U., and Jahan, S.  2015.  Barcoding of  Fresh  Water  Fishes  From Pakistan.  Mitochondrial DNA : 1- 4.
Kottelat,  M.,  A.J.  Whetten.,  Sri  Nuraini K., dan Sutikna W.  1993.  Fresh- water Fishes of Western Indonesia and  Sulawesi.    CV  Java  Books.
Jakarta. 293 p.
Meier,  R.,  Shiyang  K.,  Vaidya  G.  And Peter K.L.N.  2006.  DNA Barco- ding and Taxonomy In Diptera. A Tale  of  High  Intraspesific  Varia- bility and Low Identification Suc- cess.  System Bio. 55 : 715-728.
Muchlisin,  Z.  A.,    Thomy  Z.,  Fadli  N., Sarong,  M.A.,  and  Siti-Azizah, M.N.    2013.  DNA  Barcoding  Of Freswater  Fishes  From  Lake  Laut Tawar,  Aceh Province,  Indonesia.
Acta  Ichtyiologica  Et  Piscatoria 43 (1) : 21-29.
Pramono, T. B.  2010.  Profil Reproduksi Ikan Senggaringan ( Mystus
nigriceps )  :  Dasar  Pengembangan Domestikasi dan Budidaya. Tesis. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Pratasik, S.B., Marsoedi., Arfiati D., and
Setyohadi  D.    2016.    Mitochon- drial  CO1  genetic  mareker-based species  diversity  of  cuttlefish (Chepalopod : Molusk) in Manado Bay  and  Lembeh  Strait,  Notrh Sulawesi,  Indonesia. AACL- Bioflux 9 : 1345-1354.
Putro,  S.  S.    2003.    Ekologi  Ikan Baceman  (Mystus  nemurus)  Di Sungai Klawing Kabupaten Purba- lingga  dan  Beberapa  faktor  yang Berkaitan dengan Domestikasinya. Tesis Magister  Sains  Ilmu  Ling- kungan.  Program  Pascasarjana Universitas  Jenderal  Soedirman. Purwokerto.
Ratnasingham  S.,  and  Hebert  P.D.N. 2007. BOLD : The Barcode of Life Data  system  (http://www.barco dinglife.org). Molecular  Ecology Notes 7 (3) : 355-364.
Saitou N., Nei  M. 1987.  The neighbor- joining methd : a  new method for reconstructing  phylogenetic  tress. Molecular Biology and Evolution. 4 (4) : 406-425.
Setijanto.,  Aryani,  E.,  dan  Proklama- siwati.    1999.    Distribusi  Altitu- dinal  Ikan  Sungai  :  Informasi Dasar Penggunaanya sebagai Indikator  Kualitas  Air  dan  Usaha Budidayanya. Laporan Hasil Pe- nelitian . Fakultas Biologi Unsoed. Tidak Dipublikasikan.
Stoeckle,  M.    2003.    Taxonomy,  DNA and The Barcode of Life.
BioScience 53 : 2-3.
Tamura,  K.,  Peterson, D.,  Peterson, N., Stecher, G.,  Nei, M.,  and Kumar, S.  2011.    Mega5  :  Molecular Evolutionary  Genetics  Analysis Using Maximum Likelihood, Evo-
lutionary  Distance  and  Maximum Parsimony  Methods. Mol.  Biol. Evol ., 1-9.
Taylor, D. R. And Aarssen, L. W. 1988. An  Interpratation  of  Phenotupic Plasticity  In  Agropyron  Repens (Gramineae). American Journal of Botany 75 (3) : 401-413.
Taylor, A.L. 2014.  Population Structure and  Phylogeography  of  Octopus cyanea  and  Lethrinus  Species  In The South-Western Indian Ocean.
Thesis. Unpublished.
Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F.,  Jeanmougin,  F.  And  Higgins, D.G.    1997.    The  ClustalIX  Win- dows  Interface  :  Felxible  Stra- tegies for multiple sequence align- ment  aided  by  quality  analysis tools. Nucleic Acids Research 25 :4876-4882.
Toha,  A.H.A.,  Sumitro,  S.B.,  Widodo., and  Hakim  L.    2015.    Color Diversity  and  Distribution  of  Sea Urchin  Tripneustes  gratilla  in Cendrawasih  Bay  Ecoregion  of
Papua,  Indonesia. Egyptian
Journal  of  Aquatic  Research 41  :
273-278.
Yao, H., Song J., Liu C., Luo K., Han., Li Y., and  Pang. 2010.  Use of ITS2 Region  as  The  Universal  DNA Barcode  for  Plants  and  Animals.
PloS  One  5 :e131102.  doi: 10.1371/jounal.pone.0013102
Yu,  S.  S.    2014.    DNA  Barcoding  and
Phylogeographic Analysis of Nippoacmea Limpets (Gastropoda : Lottidae) In China. Journal Mo-
llusca Stud . 80 (4) : 420-429.