## ISOLASI DAN IDENTIFIKASI AWAL BAKTERI ASAM LAKTAT HALOFIL PROTEOLITIK SELAMA FERMENTASI SAUS IKAN LELE ( CLARIAS SP)
Isolation and Early Identification of Halophilic Lactic Acid Bacteria Produce Proteolytic Enzyme during Catfish Sauce ( Clarias sp)
Niko Listiyo, Nanik Suhartatik, Kapti Rahayu Kuswanto

## ABSTRAK
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan isolat Bakteri. Asam Laktat (BAL) halofil yang mampu menghasilkan enzim proteolitik. Isolat yang diperoleh diidentifikasi awal untuk menentukan genus bakteri, sehingga didapatkan isolat yang potensial untuk dikembangkan sebagai kultur starter pada pembuatan kecap ikan lele.
Dalam penelitian ini, kecap ikan lele dibuat dengan kadar garam 10% dan difermentasi selama 3, 5 , dan 7 hari, dilakukan analisis total populasi BAL dengan cara ditumbuhkan pada medium deMann Rogosa Sharpe (MRS) yang telah ditambahkan CaCO 3 1%, NaCl 7% d an Na Azida. Pengujian isolat BAL penghasil enzim proteolitik, dilakukan dengan cara menumbuhkan pada medium yang ditambahkan kasein 2%. Bakteri asam laktat yang tumbuh pada medium dengan kadar garam 7%, selanjutnya dilakukan skrining sifat penghasil enzim proteolitik, dengan menumbuhkan pada medium yang ditambahkan kasein 2%. Isolat yang diperoleh, dikarakterisasi menggunakan metode standar antara lain: uji morfologi sel, pengecatan Gram, uji katalase, uji produksi gas, uji pertumbuhan pada suhu, dan pH.
Isolasi bakteri selama fermentasi kecap ikan lele, diperoleh isolat sebanyak 71 isolat bakteri penghasil asam. Namun berdasarkan uji konfirmasi hanya diperoleh 6 isolat BAL, dari 6 isolat tersebut dipilih 2 isolat BAL. Dengan melihat sifat-sifat karakterisitik fenotip yang muncul, berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, isolat diidentifikasi sebagai genus Pediococcus sp.
Kata kunci: BAL halofil proteolitik, isolasi, identifikasi, kecap ikan lele

## ABSTRACT
This research was aimed to getting halophilic Lactic Acid Bacteria (LAB) isolate(s) that produce protease enzyme in the process of catfish sauce, and to identify the genus of the bacteria. Halophilic LAB could be potent to be develop as a starter culture in fish sauce making.
Catfish sauce was made by adding 10% brine in to 100 g of catfish. In the days of 3, 5, dan 7d, samples were took and analyzed for the acid producer bacteria. The colony counting was done using deMann Rogosa Sharp (MRS) medium with the addition of 1% of CaCO3, 7% of NaCl, and Na Azida. For proteolytic enzyme, the medium was added by 2% of casein. Lactic acid bacteria was grown on medium with 7 % salt and screening proteolytic isolates with casein 2 %, the isolate(s) were isolated and characterized by using a standard method, among others are: cell morphologic, Gram staining, catalase test, gases production, growth  on different temperature, and pH value.
From the plating procedur, 71 isolates were took and consider as acid producer bacteria. But only 6 isolates were consider as lactic acid bacteria. The six isolates were tested for the proteolytic enzyme and only 2 isolates were protease producers. According to the Bergey’s manual of Bacteria Identifictation, the to isolates were identify as Pediococcus sp.
Keywords: Halophilic LAB, isolation, identification, catfish  sauce

## PENDAHULUAN
Saus berarti cairan yang digunakan sewaktu memasak atau dihidangkan bersama- sama makanan sebagai penyedap atau agar makanan kelihatan menarik. Sambal dan kecap merupakan saus utama pada sebagian besar masakan Indonesia. Saus ikan dibuat dari hasil fermentasi ikan-ikan kecil (teri), ikan hering, sarden , d an sisa limbah pengolahan ikan. Waktu yang dibutuhkan untuk fermentasi kecap ikan relatif lama. Hal ini dianggap merugikan karena juga akan menghabiskan banyak biaya (Afrianto dan Liviawaty, 1996). Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk mempercepat waktu fermentasi adalah menggunakan enzim untuk mempercepat proses fermentasi (Subroto et al ., 1985 dalam Hasnan, 1991). Kandungan garam yang tinggi mencegah pertumbuhan bakteri patogen yang menyebabkan pembusukan (Eyo, 2001).
Fermentasi ikan yang membutuhkan waktu lama bisa dipercepat dengan menggunakan enzim, seperti bromelin, papain, d an beberapa enzim lain (Orejana, 1982 dalam Hasnan, 1991). Proses fermentasi y ang terjadi pada ik an merupakan p roses penguraian secara biologis atau semibiologis terhadap senyawa-senyawa komplek terutama protein menjadi senyawa- senyawa yang lebih sederhana dalam keadaan terkontrol. Selama proses fermentasi, protein ikan akan terhidrolisis menjadi asam-asam amino dan peptida, kemudian asam-asam amino akan terurai  lebih lanjut menjadi komponen-komponen lain yang berperan dalam pembentukan cita rasa.
Menurut Buckle et al ., (1987), pada proses fermentasi ikan dengan menggunakan kadar garam tinggi, diperkirakan jenis BAL yang mampu tumbuh dan berkembang adalah dari genus Lactobacillus sp , Pediococcus sp, d an Leuconostoc sp. Bakteri asam laktat mempunyai sistem proteolitik yang kompleks, baik untuk pertumbuhan BAL itu sendiri dan juga memberi kontribusi yang nyata untuk pembentukan flavour pada produk fermentasi. Sehingga diduga adanya peran dari BAL yang bersifat proteolitik pada proses fermentasi ikan. Oktaviani (2015) baru-baru ini telah melakukan penelitian tentang proses pembuatan saus
ikan lele. Hasil penelitian menunjukkan bahwa saus ikan lele dapat dibuat pada kadar garam 7%. Adanya garam pada fermentasi saus ikan lele dapat melibatkan peran bakteri asam laktat halofil. Diduga terjadi perubahan komponen  akibat  aktivitas  BAL  halofilik yang bersifat proteolitik. Tujuan penelitian mendapatkan isolat dan identifikasi awal BAL halofil yang menghasilkan enzim protease pada proses pembuatan saus ikan lele. Hasil penelitian diharapkan dapat dimanfaatkan untuk  perbaikan  proses fermentasi, agar terkendali/stabil serta dapat diproduksi secara komersial.

## METODOLOGI PENELITIAN Bahan
Daging lele, limbah nanas, aquadest, garam dapur, NaCl, deMann Rogosa Sharp Agar (MRSA), indikator phenol red, kasein, alkohol 70%, larutan kristal violet, larutan lugol, aseton alkohol, safranin, minyak imersi, kristal CaCO 3 , larutan NaCl 0,85%, larutan Hidrogen Peroksida (H 2 O 2 ), larutan buffer pH 4,2, dan pH 8,5.
Alat
Stoples plastik (fermentor), pisau, telenan, panci, sendok, termometer, saringan, botol, timbangan, gelas ukur, dandang, kompor, dan baskom. Timbangan analitik, erlenmeyer, gelas ukur, laminar air flow cabinet , inkubator, refrigerator, kulkas, tabung reaksi, botol pengencer, cawan petri, kawat ose, kaca objek, cover glass, mikroskop cahaya, pipetman, tips biru-kuning, vortex, kertas tissue, tabung Durham, bunsen, gelas ukur, beaker glass, buret, pipet ukur, labu takar 100 ml, kertas saring, penangas air, dan centrifuge.

## Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksplorasi awal. P roses pembuatan kecap ikan lele berdasarkan dari penelitian sebelumnya yaitu Pemanfaatan Limbah Nanas (Ananas comosus L. Merr) pada Pembuatan Kecap Ikan Lele ( Clarias sp) (Oktaviani, 2015). Proses pembuatan kecap ikan lele dan pengambilan sampel ditunjukan dalam Ilustrasi 1.
Diambil daging (100 g)

## Dihancurkan
Inkubasi (3,5,7 hari) Dianalisis pada hari ke 3, 5, 7 hari

## Disaring
Filtrat Analisis Mikrobiologis: 1. Pengecatan Gram 2. Uji katalase
3. Uji gas Dibersihkan Dikukus (15 menit) + kristal garam basis 10% (b/b) Ampas Dihancurkan Isolasi BAL Isolat BAL Lele Limbah Nanas (10 g) Identifikasi BAL

## Ilustrasi 1. Diagram Alir Proses Penelitian
METODE Konfirmasi  isolat  bakteri asam  laktat meliputi pengamatan morfologis, pengecatan Gram, uji katalase, uji produksi gas, uji aktivitas proteolitik, dan uji tipe halofilik/halotoleran.

## Prosedur Analisis
1.  Isolasi  dan  Pemurnian  Isolat.
Isolasi  bakteri asam laktat menggunakan metode pour plate, dimana 1 ml kecap ikan lele hasil fermentasi dimasukkan ke dalam 9 ml larutan 0.85% garam fisiologis steril dan digojog. Kemudian dilakukan seria pengenceran sampai dengan 10 -6 dan ditumbuhkan pada media MRS agar yang sudah ditambahkan larutan CaCO 3 1% dan 7% NaCl. Diinkubasikan mikroaerofil, dengan cara pour plate dengan penambahan Na Azida dan inkubasi terbalik pada suhu 37°C selama 48 jam. Isolat yang membentuk zona jernih pada media MRS agar dan memiliki kenampakan berbeda diisolasi dan  dilakukan pemurnian  dengan metode  goresan ( streak
for single colony ) pada media yang sama. Perlakuan ini diulang minimal 3 kali sehingga akan diperoleh isolat murni. 2.  Uji Aktivitas Proteolitik Untuk uji proteolitik secara kualitatif, isolat ditumbuhkan lagi pada media MRS agar + 1% CaCO3, 7 % NaCl, dan 2% kasein. Serta media MRS agar + 1% CaCO3, 7 % NaCl, dan tanpa protein (kasein). Diamati zona jernih yang terbentuk.
3.  Uji penentuan tipe halofilik/halotoleran Uji pengujian ini adalah untuk menentukan bakteri termasuk dalam tipe bakteri bersifat halofilik atau halotoleran. Isolat ditumbuhkan pada media MRS agar + 1% CaCO3, 7 % NaCl dan media MRS agar + 1% CaCO3% tanpa NaCl. Kemudian diinkubasikan mikroaerofil pada inkubator bersuhu 37°C selama 24-48 jam. 4.  Identifikasi Bakteri Asam Laktat Identifikasi  BAL  dilakukan  terhadap isolat bakteri yang telah berhasil diisolasi dari kecap ikan lele, dikarakterisasi menggunakan
metode standar antara lain: uji morfologi sel, pengecatan Gram, uji katalase, uji produksi gas, uji pertumbuhan pada suhu, dan pH.

## Hasil dan Pembahasan
1.  Karakteristik Mikrobiologis Kecap Ikan Lele Pada penelitian ini dilakukan pengamatan terhadap total BAL dan total khamir. Karakteristik mikrobiologis kecap ikan lele dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Karakteristik Mikrobiologis Kecap Ikan
Lele selama Fermentasi Lama Fermentasi (hari) Total Bakteri Penghasil Asam cfu/ml Total Yeast 3 2,53 x 10 6 Ttd 5 4,33 x 10 7 Ttd 7 1,10 x 10 8 Ttd
Ket : Ttd = tidak terdeteksi
Selama fermentasi kecap ikan lele, pada fermentasi hari ke-3 jumlah total bakteri pembentuk asam sebanyak 2,53 x 10 6 cfu/ml kemudian pada fermentasi hari ke-5 jumlahnya meningkat menjadi 4,33 x 10 7 cfu/ml. Sampai dengan fermentasi hari ke-7 masih meningkat dengan jumlah populasi sebanyak 1,10 x 10 8 cfu/ ml. Peningkatan jumlah populasi bakteri selama fermentasi menunjukkan bahwa bakteri masih dalam keadaan fase pertumbuhan, ditandai dengan meningkatnya populasi bakteri secara berkelanjutan. Bahan baku ikan lele sebagai media untuk pertumbuhan bakteri masih mempunyai nutrisi kompleks, sehingga menunjang untuk fase pertumbuhan bakteri. Selama fermentasi juga dilakukan pengamatan terhadap pertumbuhan khamir.
Dari pengamatan yang dilakukan, pertumbuhan khamir/kapang tidak terdeteksi. Walaupun ada beberapa spesies khamir seperti Debaryomyces hansenii , Hortaea werneckii , dan Wallemia ichthyophaga yang mampu tumbuh hingga konsentrasi NaCl 3,0 M (Norkrans
1966; Prista et al., 2005), 5,0 M (Plemenitas et al ., 2008), dan 5,2 M (Zalar et al ., 2005 ). Hal ini disebabkan kondisi inkubasi selama fermentasi dalam  keadaan  mikroaerofilik. Sifat pertumbuhan BAL yang mendominasi dan bakteri memproduksi bakteriosin dapat menghambat pertumbuhan khamir. Bakteriosin didefinisikan sebagai senyawa antimikrobia yang disintesis oleh berbagai spesies bakteri termasuk kelompok bakteri asam laktat (BAL) di dalam ribosom. Bakteriosin merupakan senyawa protein yang mempelihatkan aktivitas antibakteri (bakterisida ataupun bakteriostatik) terhadap spesies bakteri yang bersifat sensitif. Protein ini seringkali aktif melawan spesies lain yang memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan mikroorganisme penghasil (Klaenhammer, 1988; Kaiser et al ., 1993 dalam Galvez et  al .,  2007).
2.  Isolasi dan Identifikasi BAL
Pada tahap isolasi dan pemurnian dipilih berdasarkan koloni yang menghasilkan zona jernih pada media MRS yang ditambah kalsium karbonat (CaCO3) 1%. Kalsium karbonat berfungsi sebagai buffer sekaligus seleksi awal pada bakteri penghasil asam laktat. Asam laktat akan menyebabkan zona jernih disekeliling koloni karena melarutkan kalsium karbonat sehingga dapat digunakan sebagai penanda awal koloni bakteri asam laktat (Seelly et al ., 2001). Pemilihan awal isolat berdasarkan zona jernih, bentuk dan ukuran koloni, untuk ditumbuhkan pada medium yang sama dengan medium goresan. Pemurnian  dilakukan  hingga diperoleh isolat murni.
Hasil isolasi diperoleh 6 isolat bakteri asam laktat dengan karakteristik disajikan dalam Tabel 2. Semua isolat berbentuk bulat (kokus), menghasilkan koloni dengan zona jernih pada media MRS yang ditambah kalsium karbonat 1%, bentuk sel berpasangan/tetrad, dan reaksi pengecatan Gram positif sebagai penanda awal isolat bakteri asam laktat.
Tabel 2. Perbandingan Karakteristik Fenotifik Kelompok BAL yang Diisolasi dari Kecap Ikan Lele dengan Genus Pediococcus dan Leuconostoc
karakteristik isolate kode isolate 553 U2 752 U2 754 U1 754 U2 757 U2 764 U2 Pediococcus a Leuconostoc a Morfologi sel Sel bulat + + + + + + + + Tunggal/rantai - - - - - - - + Berpasangan/tetrad + + + + + + + - Reaksi Gram (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) CO 2 dari glukosa (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) Produksi katalase (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Pertumbuhan pada kadar garam dan protein : NaCl 6,5 % ± ± NaCl 7 % + + + + + + NaCl 0% - - - - - - NaCl 7 % + protein 0% - - - - - - NaCl 7 %  + kasein 2 % + + + + + + Pertumbuhan pada suhu berbeda : 10° C ± + 15 ° C - - 45 ° C + + ± - 50 ° C - - Pertumbuhan pada pH berbeda : pH 4,2 + + pH 4,4 + ± pH 8,0 ± - pH 8,5 + + Ket: a sumber: Axelson (1983) dalam Salminem dan Wright (1983) (+): positif +: tumbuh (-): negatif -: tidak tumbuh
±: respon variasi antar spesies
Isolat yang diduga sebagai bakteri asam laktat kemudian diuji kemampuannya menghasilkan enzim protease pada media agar mengandung kasein. Hasil pengujian terlihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Isolat yang Membentuk Zona Jernih pada Media Agar + Kasein
Karakter kimiawi menunjukkan semua isolat tidak menghasilkan enzim katalase (katalase negatif). Enzim katalase diproduksi oleh beberapa genus bakteri seperti: Genus Staphylococcus sp , Micrococcus sp, dan Listeria sp. Hasil respirasi aerobik bakteri memproduksi komponen H 2 O 2. Penumpukan senyawa peroksida dapat menghasilkan radikal bebas bersifat toksik, yang selanjutnya akan merusak membran sel dan dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Sehingga bakteri melakukan mekanisme perlindungan diri dengan memproduksi enzim katalase. Enzim ini berfungsi untuk memecah H 2 O 2 menjadi H 2 O dan O 2 . Sedangkan enzim katalase tidak
diproduksi oleh bakteri anaerob obligat atau bakteri yang bersifat mikroaerofil.
Selanjutnya isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung kadar garam 7% dan media tanpa kadar garam. Dari hasil pengamatan isolat hanya tumbuh pada media yang mempunyai kadar garam 7%. Hal ini menunjukkan bahwa isolat bersifat halofil, yaitu isolat hanya mampu tumbuh pada lingkungan yang mempunyai kadar garam. Pengujian isolat bersifat proteolitik dilakukan secara kualitatif, ditumbuhkan pada media yang mengandung protein (kasein 2%) dan media tanpa protein. Dari penelitian didapatkan bahwa isolat hanya mempunyai kemampuan tumbuh pada media yang mengandung protein, serta membentuk zona jernih di sekitar koloni seperti terlihat pada.
Isolat dengan kode 762U 2 dan 763U 1 tidak mempunyai kemampuan tumbuh pada media agar + kasein, sehingga isolat bukan termasuk bakteri yang bersifat proteolitik. Sedangkan isolat dengan kode 754U 2 dan 553U 2 mempunyai kemampuan tumbuh dan menghasilkan zona jernih pada media agar + kasein, sehingga isolat dapat digolongkan pada kelompok bakteri yang bersifat proteolitik. Keempat isolat (764U 2 , 754 U 2 , 752 U 2 , dan 754 U 2 ) seperti pada Gambar 1. juga termasuk bakteri yang bersifat proteolitik. Pengujian juga dilakukan, dengan menumbuhkan isolat pada media dengan variasi suhu (15, 45, dan 50°C), dan pH (4,2 dan 8,5). Semua isolat tidak dapat tumbuh pada suhu 15°C dan 50°C, tetapi pada suhu 45°C, kedua isolat mampu tumbuh pada pH 8,5 dan 4,2. Karakteristik kedua isolat bakteri asam laktat tersebut dikaji berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al ., 1994) dengan melihat sifat-sifat fenotip yang muncul berdasarkan karakter, diduga kuat termasuk genus Pediococcus sp.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Selama fermentasi kecap ikan lele telah berhasil didapatkan 6 isolat BAL yang bersifat halofil  dan  mampu  menghasilkan  enzim proteolitik,  teridentifikasi  sebagai genus Pediococcus sp. Genus Pediococcus sp tersebut merupakan BAL halofil proteolitik yang tumbuh
selama fermentasi kecap ikan lele dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai kandidat kultur starter kecap ikan.
Berpedoman pada hasil penelitian yang diperoleh maka dapat disarankan sebagai berikut: Perlu dilakukan kajian karakteristik fenotitifik yang lebih mendalam dari isolat BAL tersebut, sehingga dapat diidentifikasi pada tingkat spesies. Untuk dapat digunakan sebagai kultur starter kecap ikan, perlu dilakukan uji potensi dan uji produksi enzim proteolitik dari isolat yang telah berhasil diisolasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Afrianto E, Liviawaty E. 1996. Pengawetan dan Pengolahan Ikan . Yogyakarta: Kanisius. Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M.
1987. Ilmu Pangan . (diterjemahkan oleh Purnomo H, Adiono).  Jakarta: UI-Press.
Eyo AA. 2001. Fish Processing Technology in the Tropics. New Bussa: University of Ilorin Press .
Galvez A, Abriouel H, Lopez RL, Omar NB. 2007. Bacteriocin-based  strategies  for  food preservation. International Journal of Food Microbiology . (120): 51-70.
Hasnan M. 1991. Pengaruh Penggunaan Enzim Papain selama Proses Hidrolisis Kecap Ikan. Skripsi . Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Holt JG, Krieg NL, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology . 9 th Edition. USA: Williams and Wilkins Baltimore. Klaenhammer TR. 1988. Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie . (70):  337-349. Norkrans B. 1966. Studies on Marine Occurring Yeasts: Growth Related to pH, NaCl Concentration and Temperature . Archives of Microbiology (54): 374-392. Oktaviani R. 2015. Pemanfaatan Limbah Nanas ( Ananas comosus L. Merr) pada Pembuatan Kecap Ikan Lele ( Clarias sp).
Skripsi. Surakarta: Fakultas Teknologi dan Industri Pangan, Universitas Slamet Riyadi.
Orejana. 1982 dalam Hasnan. 1991. Pengaruh Penggunaan Enzim Papain selama Proses Hidrolisis Kecap Ikan. Skripsi .
Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Plemenitas A, Vaupotic T, Lenassi M, Kogej T, Gunde CN. 2008. Adaptation of Extremely Halotolerant Black Yeast Hortaea werneckiito Increased Osmolarity: a Molecular Perspective at a Glance. Studies in Mycology (61): 67-75. Prista C, Loureiro-Dias MC, Montiel V, Garcia R, Ramos J. 2005. Mechanisms underlying the Halotolerant Way of Debaryomyces
hansenii . FEMS Yeast Research (5): 693-701. Seely HW, Vanden Mark PW, Lee  JJ. 2001. Microbes  in Action. A  Laboratory Manual of Microbiology . 4 edition. New York. W.H. Freeman and Comp. 265-266. Subr oto W, Hutuely L, Haerudin NH, Purnomo AH. 1985 dalam Hasnan. 1991. Pengaruh Penggunaan Enzim Papain selama Proses Hidrolisis Kecap Ikan. Skripsi . Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.