Uji Aktivitas Antidiabetes dan Antioksidan Kombinasi Ekstrak Etanol Herba Sambiloto ( Andrographis paniculata Ness) dan Daun Sambung Nyawa ( Gynura procumbens ) pada Tikus Diabetes Melitus yang Diinduksi Alloxan Antidiabetic and Antioxidant Test of Combination Extract Ethanol Herbs Sambiloto ( Andrographis paniculata Ness) and Sambung Nyawa Leaf ( Gynura procumbens ) in Diabetic Rats Inducted by Alloxan
Ratih Andriyani 1) , Yuniar Ning Tyas 2) , Farah Ayu Dinah 3)
Stikes Nasional Surakarta 1,2,3
ratihandriyani3@gmail.com; yuniarningtyas29061998@gmail.com; farahayud@gmail.com
Abstract : Diabetes melitus ( DM) is a disease indicated by hyperglycaemia because of abnormalities in  carbohydrate,  fat,  and  protein  metabolism  caused  by  the  decrease  of  insulin  sensitivity.  This research  was  conducted  to  find  the  more  effective  combination  of  Gynura  procumbens  and Andrographis  paniculata  ethanol  extract  to  decrease  blood  glucose,  LPO,  and  GSH  on  the  mouse which  was  inducted  with  alloxan  compared  to  separate  treatment.  This  research  used  pre  and  post randomized controlled group design research. The 40 lab animals which were categorized to 8 groups as follow: normal, negative (CMC-Na), positive (1.26 mg/kgBW dose of glibenclamide), 20.5 mg/kgBW of  Andrographis  paniculata  (SA  100),  140  mg/kgBW  dose  of  Gynura  procumbens  (SN  100),  SASN 75:25,  SASN  50:50  and  SASN  25:75.  The  lab  animal  groups,  except  the  normal  one  was  inducted with  160  mg/kgBW  of  alloxan  at  day  0,  continued  with  lab  animal  treatment  from  day  1  to  day  14. Blood  sampling  was  conducted  at  day  0,  day  7,  and  day  14.  Then,  at  day  14  a  surgery  to  take  the mouses’  livers  was  conducted  to  do  antioxidant  analysis.  The  obtained  data  in  the  form  of  blood glucose  level  at  day  1,  day  7,  and  day  14  was  measured  using  GOD-PAP  method.  All  data  then analyzed  with  ANOVA  test  with (α=0.05)  for  optimal  dose  of Gynura  procumbens  and  Andrographis paniculata ethanol extract combination namely SASN 50:50 could decrease the blood glucose level up to 42.86159%, decrease the LPO level up to 0,01666 μM/g, increase GSH level up to 2.5066 Mm free SH. The  combination  of  Gynura  procumbens  and  Andrographis paniculata  ethanol  extract was more effective to decrease blood glucose level compared to separate treatment.
Key word : Antidiabetic, Antioxidant, Herbs Sambiloto, Leaf Sambung Nyawa
Abstrak : Diabetes melitus (DM) merupakan penyakit yang ditandai dengan hiperglikemia disebabkan karena  abnormalitas  metabolism  karbohidrat,  lemak,  dan  protein  yang  disebabkan  oleh  penurunan sekresi insulin atau penurunan sesitivitas insulin. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kombinasi ekstrak  etanol  herba  sambiloto  dan  daun  sambung  nyawa  yang  lebih  efektif  menurunkan  kadar glukosa  darah,  kadar  LPO  dan kadar  GSH  pada tikus  yang  di induksi  aloksan  dibandingkan  dengan pemberian secara tunggal. Penelitian ini menggunakan penelitian pre dan post randomized controlled group  design.  Hewan  uji  sebanyak  40  ekor  yang  dibagi  menjadi  8  kelompok  yaitu:  normal,  negatif (CMC-Na),  positif  (glibenklamid  dosis  1,26  mg/kgBB),  sambiloto  dosis  20,5  mg/kgBB  (SA  100), sambung nyawa dosis 140 mg/kgBB (SN 100), SASN 75:25, SASN 50:50 dan SASN 25:75. Kelompok hewan uji, kecuali kelompok normal diinduksi aloksan dosis 160 mg/kgBB pada hari ke-0, dilanjutkan perlakuan hewan uji dari hari ke-1 sampai hari ke-14. Dilakukan sampling darah pada hari ke-0, hari ke-7, dan hari ke-14. Selanjutnya pada hari ke-14 dilakukan pembedahan untuk mengambil hati tikus dilakukan analisa antioksidan. Data yang diperoleh berupa kadar gula darah pada hari ke-0, hari ke-7, dan  hari  ke-14  diukur  menggunakan  metode  GOD-PAP.  Data  yang  diperoleh  dianalisis  dengan ANOVA  dengan  (α=0,05)  untuk  dosis  optimal  kombinasi  ekstrak  etanol  herba  sambiloto  dan  daun sambung  nyawa  yaitu  SASN  50:50  dapat  menurunkan  kadar  glukosa  darah  sebesar  42,86159%, menurunkan  kadar  LPO  seb esar  0,01666  μM/g,  meningkatkan  kadar  GSH  2,5066  Mm  free  SH. Kombinasi ekstrak etanol herba sambiloto dan daun sambung nyawa lebih efektif menurunkan kadar glukosa darah dibandingkan dengan pemberian secara tunggal.
Kata kunci : Antidiabetes, Antioksidan, Herba Sambiloto, Daun Sambung Nyawa

## I.  PENDAHULUAN
Diabetes melitus merupakan gangguan metabolism  yang  ditandai  dengan  hiperglikemia yang berhubungan dengan abnormalitas metabolisme  karbohidrat,  lemak,  dan  protein yang  disebabkan  oleh  penurunan  sekresi  insulin atau  penurunan  sensitivitas  insulin  (DiPiro et  al , 2005).  Diperkirakan  prevalensi  akan  meningkat
dua  kali  lipat  dari  8,4  juta  pada  tahun  2000 menjadi  21,3  juta  pada  tahun  2030  (Soegondo,
2007). Hiperglikemik
meningkatkan senyawa reaktive  oxygen  species (ROS)  baik  melalui proses enzimatik atau non enzimatik (Suastuti et al ., 2015).
Stess oksidatif merupakan ketidakseimbangan  antar  radikal  bebas  (pro
oksidan)  dan  antioksidan  yang  dipicu  karena kekurangan  atau  kelebihan  produksi  radikal bebas.  Radikal  bebas  dapat  menjadi  faktor penyebab  berbagai  macam  penyakit  misalnya, kanker,  jantung  koroner,  arterosklerosis,  dan penuaan  dini.  Tingginya  kadar  glukosa  di  dalam tubuh  juga  menjadi  faktor  meningkatnya  radikal bebas  didalam  tubuh.  Oleh  sebab  itu  tubuh  kita memerlukan  suatu  substansi  penting,  yakni antioksidan  yang  dapat  membantu  melindungi tubuh dari serangan radikal bebas dan meredam dampak negatifnya (Winarsih, 2003).
Antioksidan merupakan senyawa yang mempunyai struktur molekul yang dapat memberikan  elektronnya  dengan  cuma-cuma kepada  molekul  radikal  bebas  tanpa  tyerganggu sama sekali fungsinya dan dapat memutus reaksi bebas  radikal  bebas  (Kumalaningsih,  2007). Aioksidan  alami  yang  terkandung  di  dalam tumbuhan umumnya merupakan senyawa fenolik atau  polifenolik  yang  dapat  berupa  golongan flavonoid,  tununan  asam  sinamat,  kumarin, tokoferol, dan asam-asam polifungsional (Markham, 1998)
Obat  yang  sering  dikonsumsi  masyarakat untuk terapi Diabetes yaitu glibenklamid golongan sulfonylurea. Mekanisme kerja glibenklamid  yaitu  dengan  merangsang  sekresi hormone  insulin  dari  granul  sel βlangerhans pankreas  Gibenklamid  akan  mencapai  kadar optimal  pada  plasma  apabila  diminum  30  menit sebelum makan (Suherman, 2007).
Tanaman  sambiloto  merupakan  tanaman yang  dapat  digunakan  sebagai  antidiabetes. Kandungan sambiloto meliputi deoksi- andrografolid, andrografolid, noeandrografolid, 12 didehidroandrografolid,  dan  homoandrografolid (Hariana,  2006).  Kandungan  andrografolid,  zat utama yang bertanggung jawab terhadap aktivitas  farmakologi  (Widyawati,  2007;  Niranjan et al ., 2010) dan berkhasiat sebagai antidiabetes. Menurut  Koul  dan  Kapril  (1994)  kandungan senyawa diterpen yaitu andrographolide, andrographiside  dan  neoandrographolide  dapat menurunkan peroksidasi lipid.
Penelitian  terhadap  penurunan  kadar  gula darah  secara  dosis  tunggal  pernah  dilakukan oleh  Rosnaeni et  al .,  2010).  Hasil  penelitian menunjukkan  ekstrak  etanol  daun  sambiloto dosis  20,5  mg/kgBB  tikus  berefek  menurunkan kadar gula darah.
Daun  sambung  nyawa  merupakan  tanaman yang  dapat  digunajan  sebagai  antidiabetes. Kandungan  kimia  daun  sambung  nyawa meliputi flavonoid, saponin, tannin, dan terpenoid (Akowuah  et  al.,  2002).  Menurut  (Wahyuningsih, 2004) senyawa yang terkandung dalam sambung nyawa  mempunyai  aktivitas  dalam  menangkap radikal  bebas,  yang  dapat  digunakan  sebagi antioksidan.
Pada penelitian ekstrak daun sambung nyawa ( Gynura procumbens ) terhadap penurunan kadar gula  darah  secara  dosis  tunggal  pernah dilakukan  oleh  Sofia et  al .,  (2011).  Hasil penelitian  menunjukkan  ekstrak  etanol  daun sambung  nyawa  dosis  140  mg/kgBB  tikus berefek menurunkan kadar gula darah.

## II.  METODE PENELITIAN
Alat  dan  bahan  yang  digunakan  yaitu  neraca analitik  (Precisa),  penangas  air  (Memmert)  , vacuum  rotary  evaporator  (Heidolp)  dan  alat-alat gelas  lainnya  (Pyrex),  Spuit  injeksi,  spuit  oral, incubator,  oven, fotometer,  spektrofotometer  UV, ependorf  steril,  mikropipet,  sentifuge,  peralatan gelas, bluetip, yellowtip. Herba sambiloto ( Andrographis  paniculata  Ness )  dan  daun sambung  nyawa  ( Gynura  procumbens ),  etanol 70%,  CMC-Na, GOD-PAP, Aloksan,  aqua  pro injeksi,  Tris  HCl,  HCl,  NaOH,  TBA,  SDS,  asam asetat glacial, TCA, aquadest, disodium hydrogen phospat 0,3 M, ellman’s, sodium sitrat, tikus galur wistar 100-200 gram, pakan tikus.
Herba  Sambiloto  dan  daun  sambung  nyawa didapatkan  dari  Kabupaten  Boyolali.  Masing – masing  sampel  dikeringkan  menggunakan  oven dengan suhu 50 0 C selama 3 hari. Setelah kering, kemudian  dihaluskan  dengan  cara  diblender sampai  berbentuk  serbuk  halus  dan  ditimbang sebanyak  200  gram.  Sebanyak  200  gram masing-masing  serbuk  kering  herba  sambiloto dan daun sambung nyawa diekstraksi menggunakan  etanol  70%  dengan  metode maserasi.  Setelah  didapatkan  ekstrak  etanol kemudian  dipekatkan  diatas rotary  evaporator dan dilanjutlkan menggunakan waterbath . Selanjutnya  dihitung  masing-masing  rendemen yang diperoleh.
Metode  menggunakan  uji  efek  antidiabetes tipe  II  yang  diinduksi  aloksan  pada  tikus  putih jantan  galur  wistar  (100-200  gram)  sebanyak  40 ekor dibagi dalam delapan kelompok. Kelompok I (normal)  diberi  aquades,  kelompok  II  (kontrol negatif)  diberi  CMC-Na,  kelompok  III  (kontrol positif) diberi glibenklamid, kelompok IV (SA 100) diberi  dosis  ekstrak  etanol  herba  sambiloto 100%, kelompok V (SN 100) diberi dosis ekstrak etanol daun sambung nyawa 100%, kelompok VI (SASN  75:25)  diberi  dosis  kombinasi  ekstrak etanol  herba  sambiloto    dan  daun  sambung nyawa dengan perbandingan 75%:25%, kelompok  VII  (SASN  50:50)  diberi  dosis kombinasi  herba  sambiloto    dan  daun  sambung nyawa  dengan  perbandingan  50%:50%  dan kelompok  VIII  (SASN  25:75)  diberi  dosis kombinasi  herba  sambiloto    dan  daun  sambung nyawa dengan perbandingan 25%:75%
Semua  kelompok  hewan  uji  dinduksi  dengan aloksan  160  mg/kgBB  (Firmansyah  dkk,  2015) kecuali  kelompok  1  (kontrol  normal)  secara
intraperitoneal pada hari ke-0, dilanjutkan dengan perlakuan  hewan  uji  dari  hari  ke-1  sampai  hari ke-14  (Yasmiwar  dkk,  2016).  Pengambilan sampel  darah  untuk  mengukur  kadar  glukosa darah  dilakuan  pada  hari  ke-0  (sebelum  induksi aloksan),  ke-7  dan  ke-14.  Pengambilan  darah dilakukan  dengan  menggunakan  pipa  kapiler pada  vena  mata  tikus.  Sampel  darah  diukur menggunakan metode GOD-PAP untuk dianalisa kadar glukosa darah.
Untuk analisis aktivitas antioksidan digunakan organ  liver.  Organ  liver    di  cuci  dengan ice  cold normal salin e. Organ liver selanjutnya dikeringkan  dan  ditimbang,  sebesar  10%  dari jaringan  ini  selanjutnya  dihomogenkan  dan dilakukan  preparasi  dengan  larutan  0,15M  tris HCL (pH 7,4). Liver yang telah dihomogenkan ini digunakan untuk analisis LPO dan GSH.
Analisis kadar LPO berdasarkan metode yang dikembangkan  oleh  Ohkawa et  al., (1979). Jaringan  liver  dihomogenkan  dalam  0,1 M  buffer (Ph  7,4).  Kadar  lipid  peroksidase  dalam campuran  ini  ditentukan  berdasarkan  jumlah terbentuknya  malondialdehyde  (MDA).  Sejumlah 0,2  ml  liver  yang  telah  dihomogenkan  ditambah dengan 0,2 ml Sodium dodecyl sulfate (SDS) 8,1 %, 1,5 ml asam asetat 20% dan 1,5ml TBA 0,8%. Campuran dibuat sejumlah 4ml dengan menambahkan  aquadest,  dan  dihangatkan  pada suhu  9 5̊  C  selama  60 menit. Setelah  diinkubasi, selanjutnya diamkan dalam suhu kamar. Dengan volume  yang  sama  tambahkan  TCA  10% selanjutnya  dilakukan  sentrifugasi  selama  10 menit  pada  3000  rpm.  Lapisan  atas  yang terbentuk selanjutnya diambil dan diukur nilai OD pada  panjang  gelombang  532  nm  terhadap blanko  yang  tidak  diberikan  sampel.  Jumlah lipid peroksidation (LPO) dinyatakan dengan sejumlah mol thiobarbituric acid reaktive subtance (TBARS)/mg  protein  dengan  menggunakan koefisien ekstingsi 1,56 x 10 -5 M -1 cm -1 .
Pengukuran  kadar  GSH  dalam  sampel mengacu pada metode yang dikembangkan oleh Ellman et  al .,  (1959).  Untuk  mengkur  jumlah glutathione  (GSH)  jaringan  hati  dihomogenkan dalam  0,1  M  phosphate  buffer  (pH  7,4). Campuran yang telah dihomogenkan ini selanjutnya  ditambahkan  dengan  TCA  10  % kemudian  disentrifugasi  3000  rpm  selama  10 menit.  Ambil  500  µl  supernatant  dan  tambahkan dengan  2  ml  disodium  hydrogen  phospat  0,3  M, terakhir  tambahkan  sejumlah  200  µl  reagen Ellman’s  (5,  5’-dithiobis-2-nitrobenzoic  acid)  (0,4 mg/mL  dalam    sodium  citrate  1  %).  Larutan selanjutnya diukur pada 412 nm yang dibandingkan dengan blanko (Bose et al ., 2007).
III. HASIL Hasil determinasi terkait sampel yang digunakan  diketahui  bahwa  herba  sambiloto
tersebut  benar  adalah  herba  sambiloto  dengan nama  ilmiah Andrographis  paniculata (Burm.f.) Nees  dan  daun  sambung  nyawa  tersebut  benar adalah  daun  sambung  nyawa  dengan  nama ilmiah Gynura procumbens (Lour.) Merr.
Ekstraksi herba sambiloto dan daun sambung nyawa  dilakukan  dengan  teknik  maserasi  yaitu dengan  cara  perendaman  sampel  dalam  larutan etanol 70% sebanyak 7,5 kali dari bobot sampel. Maserasi  dilakukan  selama  5  hari  dengan pengadukan setiap hari.
Perlakuan  pada  hewan  uji  dilakukan  selama 14  hari  untuk  semua  kelompok.  Hasil  dari pengujian  kadar  glukosa  darah  dari  hari  ke  nol sampai hari ke 14 seperti pada gambar 1
Gambar 1. Grafik kadar glukosa darah (mg/dl) hewan uji masing-masing kelompok perlakuan.
Dapat  dilihat  pada  grafik  bahwa  semua kelompok  mempunyai  kadar  gula  darah  yang normal  pada  hari  ke-0  sebelum  induksi  aloksan. Semua  kelompok  mengalami  kenaikan  kadar glukosa darah pada hari ke-7 terutama kelompok negatif  yang  mengalami  kenaikan  terbanyak karena  kelompok  ini  tidak  diberikan  perlakuan obat  tetapi  hanya  diberikan  CMC-Na  yang  tidak memiliki  efek  pengobatan.  Untuk  hari  ke-7 sampai  hari  ke-14  kadar  glukosa  darah  pada setiap  kelompok  mengalami  penurunan  kecuali untuk kelompok negatif tetapi mengalami kenaikan  yang  berarti  pemberian  aloksan  dapat meningkatkan  kadar  gula  darah.  Selanjutnya data  yang  didapat  dihitung  nilai  AUC,  hasilnya sebagai berikut :
Gambar 2. Data AUC masing-masing kelompok uji setelah dilakukan perlakuan.
Dari  data  diatas  kontrol  negatif  memiliki  nilai AUC  terbesar  sedangkan  kontrol  positif  memiliki nilai  AUC  terkecil.  Nilai  AUC  menunjukkan kandungan  kadar  glukosa  dalam  darah, jika  nilai AUC  tinggi  maka  kandungan  glukosa  dalam darah  juga  besar.  Nilai  AUC  berbanding  terbalik dengan  persen  daya  hipoglikemik    (%DH)  dari suatu zat/obat.
Gambar 3. Data rata-rata daya hipoglikemik  (%) masing-masing kelompok perlakuan.
Persentase  daya  hipoglikemik  menunjukkan adanya  kemampuan  untuk  menurunkan  kadar glukosa  darah  dalam  suatu  penelitian.  Semakin besar  persentase  daya  hipoglikemik  maka semakin besar pula kemampuan untuk menurunkan  glukosa  darah.  Dari  data  tersebut dapat  dilihat  untuk  %DH  yang  paling  tinggi  baik dosis tunggal maupun kombinasi adalah kelompok  SASN  50:50  sebesar  42.86%.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  pemberian  kombinasi  lebih efektif  menurunkan  kadar  glukosa  darah  pada tikus  jantan  galur  wistar  yang  diinduksi  aloksan dibandingkan dengan pemberian secara tunggalnya.

## Gambar 4. Grafik  Data Kadar Nilai LPO
Dapat dilihat bahwa pada kontrol negatif atau pada  tikus  yang  hanya  diinduksikan  aloksan mempunyai grafik kadar MDA yang paling tinggi. Pada  penelitian  ini  kontrol  positif  mempunyai kadar  MDA  yang mendekati  kontrol  normal  yang menunjukkan bahwa pada kontrol positif ini dapat mempengaruh penurunan kadar MDA pada tikus Diabetes melitus yang diinduksi aloksan.
Kadar  Glutation  (GSH)  tikus  diabetes  yang diinduksi  aloksan  sebesar  0.7754µM/g  tissue ternyata  lebih  rendah  dibandingkan  tikus  normal (2.8650  µM/g  tissue)  (Winarsi et  al., 2012). Moussa  (2008)  bahwa  dalam  tubuh  penderita diabetes  aktivitas  GSH  menurun.  Pemberian aloksan menyebabkan nekrosis sel- sel  β pankreas  akibat  meningkatnya  stres  oksidatif (Euteuk,  2010),  sehingga  sekresi  insulin  akan menurun dan mengakibatkan hiperglikemia (Gong et al. , 2012).

## Gambar 5. Grafik  Data Kadar GSH
Nilai  kadar  GSH  adalah  berbanding  terbalik dengan  nilai kadar  LPO,  yang  dapat  dilihat  pada kontrol  negatif  memiliki  kadar  GSH  yang  paling rendah  dibandingkan  dengan  semua  kelompok artinya pemberian aloksan mampu menyebabkan kadar GSH pada penderita diabetes rendah.

## IV. PEMBAHASAN
Penelitian  ini  menggunakan  sampel  herba sambiloto  dan  daun  sambung  nyawa.  Sambiloto dan  daun  sambung  nyawa  yang  diperoleh selanjutnya  dicuci  dan  dikeringan.  Pengeringan bertujuan  untuk  menurunkan  kadar  air  dalam sampel,  mencegah  tumbuhnya  mikroorganisme (jamur),  dan  menghentikan  proses  enzimatik yang dapat  memicu pembusukan sampel sehingga simplisia dapat di simpan dalam jangka waktu  yang  lama.  Kadar  air  yang  baik  adalah kurang dari 10% (Winarno, 1997).
Proses sortasi kering dilakukan untuk memisahkan benda asing atau zat pengotor yang masih  terdapat  pada  simplisia  kering.  Kemudian dilakukan proses penyerbukan dengan menggunakan  blender  untuk  memperbesar  luas permukaan kontak antara sampel dengan pelarut atau  solvent  pada  proses  ekstraksi  sehingga hasil yang didapat lebih maksimal. Semakin luas bidang  kontak  antara  bahan  dengan  pelarutnya, maka  dapat  meningkatkan  efektivitas  ekstraksi. Selanjutnya  ditimbang  masing-masing  sebanyak 200  g  serbuk  kering  sampel  untuk  dilakukan proses ekstraksi.
Ekstraksi  bertujuan  untuk  menarik  senyawa metabolit sekunder dari sampel, serta menghilangkan  zat-zat  pengotor  yang  tidak dikehendaki  dalam  sampel.  Metode  ekstraksi
yang  dipilih  adalah  maserasi  karena  prosesnya yang  cukup  sederhana,  banyak  digunakan  serta tidak  memerlukan  pemanasan  yang  dapat merusak kandungan metabolit terutama andrografolida  dan  flavonoid  dalam  sampel. Maserasi  dilakukan  dengan  cara  peredaman sampel  dalam  etanol  70%  sebanyak  7.5  kali selama  5  hari  dengan  pengadukan  sekali  sehari untuk menjaga agar pelarut yang digunakan tidak mengalami  kejenuhan,  sehingga  hasil  yang tersari lebih maksimal. Etanol 70% dipilih karena lebih  bersifat  universal  untuk  menarik  senyawa target  yang  ingin  diambil  dari  sampel  yaitu andrografolid  dan  flavonoid.  Maserat  yang diperoleh  pada  hari  ke-5  selanjutya  disaring dengan menggunakan kain flannel dan dikentalkan dengan menggunakan rotary evaporator kemudian dilanjutkan dengan waterbath  hingga  diperoleh  ekstrak  kental  etanol herba sambiloto dan daun sambung nyawa.
Penelitian  ini  menggunakan  pengujian  efek diabetes  melitus  tipe  II.  Hewan  uji  yang digunakan  tikus  galur  wistar  100-200  gram  yang diinduksi  aloksan  dengan  dosis  160mg/kgBB hingga  kadar  glukosa  darah  mencapai  kadar glukosa  darah  diabetes.  Sebelum  perlakuan semua  tikus  diadaptasikan  pada  tempat  uji selama  7  hari.  Pengambilan  sampel  darah  untuk mengukur  kadar  glukosa  darah  dilakukan  pada hari ke-0 (sebelum induksi aloksan), ke-7 dan ke- 14. Pengukuran kadar glukosa darah menggunakan metode GOD-PAP. Prinsip pemeriksaan  dalam  metode  ini  adalah  glucose oxidase  mengkatalisis  reaksi  oksidasi  glukosa menjadi  asam  glukonat  dan  hidrogen  peroksida. Hidrogen  peroksida  yang  terbentuk  bereaksi dengan  phenol  dan  4-amino  phenazone  dengan bantuan enzim peroksidase menghasilkan quinoneimine  yang  berwarna  merah  muda  dan dapat  diukur  dengan  panjang  gelombang  546 nm.  Intensitas  warna  yang  terbentuk  setara dengan  kadar  glukosa  darah  yang  terdapat dalam sampel (Baroroh et al , 2011).
Dapat  dilihat  kelompok  positif  yang  diberi glibenklamid  pada  gambar  1  dimana  hari  ke-0 memiliki kadar gula darah normal yang meningkat  pada  hari  ke-7  kemudian  menurun pada  hari  ke-14.  Artinya  pemberian  glibenklamid dapat  menurunkan  kadar  gula  darah  dengan ekanisme  kerja  glibenklamid  yaitu  merangsang sekresi  hormon  insulin  dari  ganul  sel- sel  β Langerhans pankreas. Interaksinya dengan ATP- sensitive  K  channel pada  membran  sel –  sel  β menimbulkan depolarisasi membran dan keadaan  ini  akan  membuka  kanal  Ca.  Dengan terbentuknya  kanal  Ca,  maka  ion  Ca² + akan masuk  ke  dalam  sel  β  kemudian  merangsang granula  yang  berisi  insulin  dan  akan  terjadi sekresi insulin.
Dari  Gambar  2  menunjukkan  besarnya  AUC yang  berbeda-beda  selama  14  hari  karena pengaruh  perlakuan  yang  berbeda  pada  setiap kelompok.  Dari  data  diatas  kontrol  negatif memiliki  nilai  AUC  terbesar  sedangkan  kontrol positif menunjukkan nilai AUC terkecil. Nilai AUC menunjukkan  kandungan  kadar  glukosa  dalam darah,  jika  nilai  AUC  tinggi  maka  kandungan glukosa  dalam  darah  juga  besar.  Nilai  AUC berbanding terbalik dengan persen daya hipoglikemik  dari  suatu  zat/obat.  Semakin  kecil nilai  AUC,  maka  semakin  besar  persen  daya hipoglikemia suatu obat.
Persentase  daya  hipoglikemik  menunjukkan adanya  kemampuan  untuk  menurunkan  kadar glukosa  darah  dalam  suatu  penelitian.  Semakin besar  persentase  daya  hipoglikemik  maka semakin besar pula kemampuan untuk menurunkan glukosa darah. Dapat dilihat kelompok  positif  pada  gambar  3  menunjukkan nilai %DH yang paling tinggi yaitu sebesar 42.92 %.  Dari  kelima  kelompok  baik  tunggal  maupun kombinasi  pada  kombinasi  50:50  memiliki  %DH paling  tinggi  yaitu  sebesar  42.86%  mendekati dengan  %DH  kontrol  positif,  disusul  dengan kelompok SASN 75:25 sebesar 34.74%, kemudian  kelompok  SASN  25:75  sebesar 33.50%, kelompok SN 100 sebesar 32.44%, dan yang terakhir kelompok SA 100 sebesar 42.92%.
Persentase  daya  hipoglikemik  yang  didapat kemudian  dianalisis  secara  statistika  dengan menggunakan  ANNOVA  dimana  jika  p<0,05 artinya  terdapat  perbedaan  antar  kelompok  uji dan  hasil  didapatkan  adalah  p<0.05.  Untuk mengetahui  kelompok  mana  saja  yang  memiliki perbedaan  maka  dianalisis  menggunakan  Post Hoc  Test.  Dikatakan  berbeda  signifikan  jika  nilai p  pada  post  hoc  test  adalah  <0.05.  Pada  tabel statistic  dapat  dilihat  bahwa  nilai  signifikan kelompok  positif  dibandingkan  dengan  dosis tunggal  memiliki  nilai  p<0.05  artinya  antara kontrol  positif  dengan  dosis  tunggal  memiliki perbedaan  yang  signifikan.  Sedangkan  kontrol positif  dibandingkan  dengan  kombinasi  diperoleh nilai  signifikan  p>0.05  artinya  antara  kontrol positif  dengan  kelompok  kombinasi  memiliki perbedaan yang tidak signifikan, namun kelompok  pada  kombinasi  50:50  memiliki  nilai  p yang  paling  tinggi  sebesar  0.989    yang  artinya perbedaan  aktivitas  antidiabetes  yang  tidak signifikan  diantara  kedua  kelompok  ini.  Dengan demikian,  dapat  disimpulkan  bahwa  pemberian kombinasi  ekstrak  daun  stevia  dan  daun sambiloto lebih efektif menurunkan kadar glukosa darah  dibandingkan  dengan  pemberian  secara tunggal  dengan  dosis  optimal  kombinasi  SASN 50:50.
Sambiloto mengandung zat aktif andrografolid yang  dapat  menurunkan  kadar  glukosa  darah. Dari  uraian  ini  dinyatakan  ada  mekanisme  kerja
sebagai  anti  diabetes.  Ada  beberapa  dugaan mekanisme kerja sambiloto menghambat glukoneogenesis  (Zhang  X.F et  al ,  2000) menghambat alfa gukosidase di usus (Borhanuddin M, 1994; Husen dkk, 2004).
Ekstrak  etanol  daun  sambung  nyawa  juga mengandung  senyawa flavonoid yang  bersifat sebagai  antioksidan  yang  dapat  menekan aktivitas radikal bebas. Flavonoid bekerja dengan cara  menghambat  enzim alfa  amylase dan alfa glukosidase yang berfungsi menguraikan karbohidrat  menjadi  monosakarida  yang  dapat diserap  oleh  usus.  Penghambatan  pada  kedua enzim  ini  mengakibatkan  terganggunya  proses pemecahan  karbohidrat  menjadi  monosakarida sehingga  tidak  dapat  diserap  oleh  usus.  Dengan demikian,  kadar  gula  darah  tidak  meningkat setelah  mengkonsumsi  makanan  atau  minuman yang  mengandung  gula  atau  senyawa  yang dapat dipecah menjadi gula (Sofia et al., 2011). Lipid  peroksidase  merupakan  suatu  proses terjadinya  oksidasi  lipid  oleh  radikal  bebas  yang menyebabkan kerusakan membran yang mengandung  lipid.  Pembentukan  lipid  peroksida pada  PUFA  akan  mendorong  pembentukan Malondialdehid (MDA) sebagai produk dari reaksi peroksidase tersebut. Terbentunya MDA merupakan indikator utama yang dapat digunakan untuk analisis terjadinya lipid peroksidase.  Kadar  lipid  peroksidadapat  diukur dengan  metode  asam  tiobarbiturat  (TBA)  yang mengukur  adanya  MDA.  Prinsip  pengukuran metode  ini  adalah  TBA  akan  bereaksi  dengan gugus karbonil dari MDA yaitu satu molekul MDA akan  berikatan  dengan  dua  molekul  TBA sehingga membentuk senyawa kompleks berwarna merah yang kemudian diukur srapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532nm. Naiknya
thiobarbituroic  acid  reactive  substance (TBARS) atau  nilai  MDA  mengindikasikan  terjadinya kerusakan  terutama  pada  bagian  membran  sel yang diakibatkan oleh adanya radikal bebas.
Dapat  dilihat  baik  pada  tabel  maupun  grafik kadar  MDA menunjukkan  bahwa  pada  kelompok negatif  memiliki  kadar  yang  paling  tinggi dibandingkan  dengan  semua  kelompok  yang artinya pemberian aloksan mampu menyebabkan kerusakan  liver  yang  ditndai  dengan  tingginya kadar  lipidperoksidase.  Glibenklamid  sebagai kontrol  positif mampu mencegah  kerusakan  liver yang ditandai dengan rendahnya kadar lipidperoksidase.  Dari  data  diatas  juga  dapat dikatakan  bahwa  pemberian  dosis  baik  tunggal maupun  kombinasi  mampu  menurunkan  kadar lipid peroksidase
Untuk  mengetahui  apakah  antara  kontrol positif dan perlakuan mempunyai efektifitas yang sama  dalam  memperbaiki  kerusakan  hati  yang dikarenakan  stresss  oksidatif  yang  disebabkan
karena  terbentuknya  radikal  bebas  pada  kondisi hiperglikemia maka dilakukan perbandingan hasil analisis  antara  kontrol  positif  dengan  semua perlakuan  menggunakan  statistic.  Dapat  dilihat pada  tabel III menunjukkan  perbandingan  antara kontrol  positif  dan  perlakuan  dosis  tunggal didapatkan  hasil  p<0,05  yang  artinya  hasil  kadar pada kontol positif dengan dosis tunggal memiliki perbedaan  yang  signifikan.  Sedangkan  untuk dosis  kombinasi  didapatkan  nilai  p>0.05  yang artinya  hasil  kadar  antara  kontrol  positif  dngan kombinasi  memiliki  perbedaan  yang  tidak signifikan.  Dari  data  tersebut  dapat  disimpulkan bahwa  pemberian  kombinasi  lebih  efektif  dalam menurunkan kadar lipid peroksidase dibandingkan dengan pemberian secara tunggal.
Pemberian  aloksan  menyebabkan  nekrosis sel- sel  β  pankreas  yang  mengakibatkan meningkatnya  stres  oksidatif,  sehingga  sekresi insulin  akan  menurun  dan  mengakibatkan hiperglikemia.  Keadaan  stress  oksidatif  ini  dapat ditandai  dengan  rendah  nya  kadar  GSH (Glutation)  dan  tingginya  kadar  LPO.  Dibuktikan dengan  hasil  kadar  GSH  pada  tabel  dan  grafik kontrol  negative  memiliki  kadar  terendah  artinya pemberian aloksan mampu menyebabkan kondisi  stress  oksidatif.  Pada  kontrol  positif memiliki  kadar  GSH  yang  paling  tinggi  yang artinya Glibenklamid mampu memperbaiki keadaan  stress  oksidatif  akibat  hiperglikemi. Untuk  dosis  tunggal  dan  kombinasi  juga  dapat dilihat  pada  data  kadar  bahwa  baik  tunggal maupun kombinasi mampu memperbaiki keadaan stress oksidatif
Dari  data  tersebut  diolah  menggunakan statistic metode ANNOVA dengn hasil pada tabel V  bahwa  pada  kontol  positif  dibandingkan dengan  semua  kelompok  memiliki  nilai  p>0.05 artinya  antara  kontrol  positif  dengan  kelompok lain  memiliki  kadar  GSH  yang  berbeda  tidak signifikan.  Namun  nilai  p  yang  diperoleh  pada kelompok  kombinasi  memiliki  nilai  p  yang  lebih bsar  dari  kelompok  normal,  dimana  nilai  p  yang paling  besar  ada  pada  kombinasi  SASN  50:50. Sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  pemberian kombinasi lebih efektif dalam memperbaiki kadar GSH  dibandingkan  dengan  dosis  tunggal  serta dosis  optimal  kombinasi  yang  disarankan  adalah kombinasi 50:50.

## V.  SIMPULAN
Pemberian  kombinasi  ekstrak  etanol  herba sambiloto dan daun sambung nyawa lebih efektif dapat  menurunkan  kadar  glukosa  darah  pada tikus  jantan  galur  wistar  yang  diinduksi  aloksan daripada  pemberian  secara  tunggal.  Dosis optimal  dari  kombinasi  ekstrak  etanol  herba sambiloto dan daun sambung nyawa yang dapat menurunkan  kadar  glukosa  darah  tikus  diabetes melitus  yang  diinduksi  aloksan  yaitu  50%  :  50% setara  dengan  dosis  10,25  mg/KgBB  ekstrak
herba  sambiloto  dan  70  mg/kgBB  ekstrak  daun sambung nyawa.

## DAFTAR PUSTAKA
Akowuah,  G.A.,  Zhari,  I.,  Norhayati,  I.,  Sadikun,
A., dan Khamsah, S.M., 2004. Sinsensetin, euphatorin,
3 ’ -hydroxi-5,6,7,4 ’ - tetramethoxyflavone  and  rosmarintic  acid contents and antioxidative effect of orthosiphon  stamineus  from  Malaysia. J. Food Chem., 87:559-566.
Borhanuddin, M., Shamsuzzoha, M. dan Hussain,  A.  H.  .1994. Hypoglycaemic effects of Andrographis paniculata Nees on non-diabetic rabbits. Bangladesh Med Res Counc Bull, 20, 24-6.
Firmansyah,  D.,Saiful  Bachri,  M.,  Nurkhasanah, 2015, Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Dan  Kloroform  Daun  Sirsak  Terhadap Kolesterol  Total  Dan  Trigliserida  Pada Tikus  Yang  Diinduksi  Aloksan . Jurnal Penelitian. Yogyakarta : UAD
Gong F, Fenglin L, Wanming Z, Jing L, Zhong Z. 2012.  Effects  of  crude  flavonoids  from Tatary  Buckwheat  on  Alloxan  induced oxidative  stress in mice.  Bangladesh Journal of Pharmacology . 7:124 –130.
Kumalaningsih,  S,  2007,  Konsentrasi  Gula  dan Tapioka Terhadap Penerimaan Gel Cincau Hitam  Manis  Dalam  Kemasan, Skripsi , THP-FTP, Malang: Universitas Brawijaya.
Markham,  K.  R.,  1988,  Cara  Mengidentifikasi Flavonoid.  Terjemahan  K.  Padmawinata. Penerbit  ITB  :  Bandung.  Eutuk  EU.  2010. Animals  models  for  studying  Diabetes melitus. Agriculture  and  Biology  Journal  of North America. 1(2):130 – 134.
Moussa  SA.  2008.  Oxidative  stress  in  Diabetes melitus. Romanian  Journal  Biophysic. 18(3):225 –236.
Ohkawa  H,  Ohishi  N,  Yagi  K,  1979,  Assay  for lipid peroxide  in animal tissue by thiobarbituric  acid  reaction. Anal  Biochem . 95: 351-358.
Rosnaeni,  Hana  R,  dan  Sarah  K.  2010.  Effek
Ekstrak Etanol
Daun
Sambiloto
( Andrographis  folium )  Terhadap  Kadar Glukosa Darah Mencit Jantan Galur Swiss Webster  yang  Diinduksi  Aloksan  dan Perbandingannya  Terhadap  Jamu  D. Jurnal Medika Plant. Bandung : Universitas Kristen Maranatha
Sofia, dkk. 2011. Uji in Vivo Ekstrak Etanol Daun Sambung  Nyawa  (Gynura  procumbens) Terhadap  Penurunan  Kadar  Gula  Darah Mencit  (Mus  musculus)  Jantan  Strain Swiss  Webster  Diabetes  melitus .  Aceh  : UNSIYAH
Soegondo,  S,  2007, Diabetes,  The  silent Killer .www.medicastore.com.Tanggal Akses 9 Februari 2010.
Suastuti,  2014. Pengaruh  Ekstrak  Etanol  Buah Ketumbar ( Cor  sativum L.) Terhadap Penurunan  Kadar  Glukosa  Darah  Tikus Putih  yang  Diinduksi  Alloksan .  Manado  : FMIPA UNSTRAT.
Suherman,  K.S,    2007, Adrenokortikotropin, Adrenokortikosteroid,  Analog  Sintetik  dan Antagonisnya,  Dalam  Farmakologi  dan Terapi  Edisi  kelima, Jakarta:  Departemen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Widyawati, T. 2007 "Aspek Farmakologi Sambiloto (Andrographis  paniculata  Nees)
." Majalah  Kedokteran  Nusantara Volume 40 Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. Winarsi  H,  2007, Antioksidan  Alami  dan  Radikal
Bebas . Kanisius : Yogyakarta.
Yasmiwar S, Ahmad Muhtadi, Moelyono Moektiwardoyo,  Putri  Churnia  Arifin  2016. Aktivitas  Antidiabetes  Ektrak  Etanol  Daun Iler  (Plectranhtus  scutellarioide  (L)  )  Pada Tikus  Putih  Galur  Wistar  Dengan  Metode Induksi Aloksan. Jurnal Farmaka Vol 14. 2 Fakultas  Farmasi  Universitas  Padjadjaran.
Sumedang
Zhang,  X.  F.  &  Tan,  B.  K.  2000.  Anti-diabetic property of ethanolic extract of Andrographis  paniculata  in  streptozotocin- diabetic  rats. Acta  Pharmacol  Sin, 21, 1157-64.