Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy) 2018; 4 (1): 68 – 72 ISSN : 2442-8744 (electronic) http://jurnal.untad.ac.id/jurnal/index.php/Galenika/index
DOI : 10.22487/j24428744. 2018.v4.i1.10005

## Pemberian  Citicoline  pada  Tikus  Cedera  Saraf  Mentalis:  Ekspresi  Gen SIRT1 Ganglion Trigeminal
( The  Administration  of  Citicoline  on  Rat  Model  with  Mental  Nerve  Crush  Injury:  Gene Expression of Trigeminal Ganglion SIRT1)

## David Pakaya, InicheTinta, Elfiana Ibrahim, Imtihanah Amri
Fakultas Kedokteran, Universitas Tadulako, Palu,  Indonesia, 94118
Article Info: Received: 12 Desember 2017 in revised form: 12 Januari 2018 Accepted: 30 Maret 2018
Available Online: 30 Maret 2018

## ABSTRACT
Peripheral nerve injuries lead to a decrease in  the number of neurons in the sensory  ganglion.  Citicoline  administration  has  been  reported to  be  able  to improve the functional motoric conditions and prevent neuropathy in model of  peripheral  nerve  injury.  In  sensory  ganglion,  the  increasing  of regeneration  is  associated  with  SIRT1  which  promotes  neuronal  survival. This  study  aimed  to  examine  the  hypothesis  that  citicoline  administration induces SIRT1 gene expression in acute phase of rat model of mental nerve injury.  After  anesthetized,  right  mental  nerve  is  crushed  with  non-serrrated clamp  for 30 seconds. The rats were divided  into 3 groups, sham-operated, control  saline  and  citicoline  group.  Citicoline  is  given  on  i.p.  50  mg/kg BW/day  for  7  days.  The  rats  are  saccrified  at  day  1,  3  and  7  after  injury(3 rats  per  group),  the  right  trigeminal  ganglion  were  disssected  out  and undergo  RNA  extraction,  reverse  transcriptasePCR  and  qPCR  for  SIRT1 gene  expression.  The  results  showed  there  was  increase  level  of  SIRT1  7 days after a mental nerve injury given daily doses of citicoline i.p therapy. In conclusion,  citicolin  administration  immediately  after  injury  increased SIRT1 level 7 days after injury.
Keywords :
Citicoline,
SIRT1,
Peripheral nerves injury, nerve regeneration
Corresponding Author: David Pakaya Fakultas Kedokteran, Universitas Tadulako
Palu, 94118 Indonesia Mobile : 081356377422
Email: davidpakaya@ymail.com
Copyright © 2017 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.
How to cite (APA 6th Style):
Pakaya, D. et al (2018). Pemberian Citicoline pada Tikus Cedera Saraf Mentalis: Ekspresi Gen SIRT1 Ganglion Trigeminal. Jurnal Farmasi Galenika : Galenika Journal of Pharmacy, 4(1), 68-72. doi:10.22487/j24428744.2017.v4.i1.10005

## ABSTRAK
Cedera  saraf  perifer  menyebabkan  jumlah  neuron  menurun  di  ganglion  sensorik,  sehingga regenerasinya  tidak  baik.  Pemberian  Citicoline  telah  dilaporkan  dapat  memperbaiki  kondisi  fungsi motorik dan mencegah nyeri neuropati pada model tikus cedera saraf perifer. Pada ganglion sensorik, peningkatan regenerasi terkait dengan SIRT1 yang mendorong kelangsungan hidup neuron. Penelitian ini bertujuam untuk menguji hipotesis bahwa pemberian citicoline meningkatkan ekspresi gen SIRT1 fase  akut  pada  model  tikus  cedera  saraf  mentalis.  Setelah  dianestesi,  saraf  mentalis  kanan  dijepit dengan klem tanpa gerigi selama 30 detik. Tikus-tikus dibagi menjadi 3 kelompok, kelompok operasi sham,  kelompok  cedera  dan  kelompok  citicoline.  Citicoline  diberikan  secara  i.p.  50  mg/kg  BB/hari selama 7 hari. Tikus dinekropsi pada hari ke-1, 3 dan 7 setelah cedera. Pada hari ke-1,3,7 (3 tikus per kelompok), ganglion  trigeminal kanan dipotong dan diekstraksi RNA,  reverse transcriptase PCR dan qPCR untuk melihat ekspresi gen  SIRT1. Hasil penelitian menunjukkan  peningkatan ekspresi  SIRT1 hari ke-7 setelah cedera saraf mentalis tikus  yang diberikan  terapi citicoline i.p. Sebagai  kesimpulan, pemberian citicolin segera setelah cedera saraf mentalis meningkatkan ekspresi SIRT1 pada hari ke-7.
Kata Kunci : Citicoline, SIRT1, cedera saraf perifer, regenerasi saraf

## PENDAHULUAN
Neuron  yang  mengalami  cedera  dalam system  saraf  perifer,  mampu  secara  spontan beregenerasi (Lu et al , 2014). Namun, setelah cedera saraf  perifer,  sekitar  10-30%  neuron  di  ganglion sensorik  cenderung  mengalami  apoptosis.  Proporsi kematian neuronal bervariasi pada model cedera yang berbeda  dan  dalam  jangka  waktu  yang  berbeda (Groves et  al ,  1999;  Tandrup et  al ,  2000;  McKay Hart et  al ,  2002;  Burland et  al .,  2014.).  Sirtuin1 (SIRT1; silent  information  regulator 1)  merupakan enzim histondeacetilase (HDAC)  kelas  III  yang berperan  dalam  deasetilasi  substrat.  Deasetilasi  oleh SIRT1  ini  akan  mengaktifkan  gen-gen  antiapoptosis. Penghambatan  apoptosis  ini  berefek  penting  dalam neuroproteksi, sehingga dapat meningkatkan survival neuron dan fungsi motoris (Hurtado et al , 2013) . Neuron sensorik membutuhkan faktor neurotropik seperti nerve growth factor (NGF), untuk kelangsungan hidup (Atlasi et al , 2009;. Xiao, 2009). Setelah  mengalami  cedera  saraf  perifer,  terjadi peningkatan    factor  neurotropik  tapi  dengan  respon lambat (Wan et al , 2010;. Saleh et al , 2013; Xu et al , 2013) mulai hari ke-7 setelah cedera (Grumbles et al , 2009; Ziv-Polat et al , 2014). Cytidine-5'-diphosphocholine adalah endogen yang terbentuk selama sintesis phosphatydilcholine. Pemberian cytidine-5'- diphosphocholine  yang  berasal  dari  luar,  (citicoline) dilaporkan  dapat  menginduksi  sintesis  fosfolipid dan menjaga  integritas  membran  (Parisi,  2008).  Pada praktek klinis, citicoline digunakan untuk menginduksi  regenerasi  saraf  di  berbagai  gangguan
system  saraf  pusat  seperti  stroke  iskemik,  gangguan kognitif  dan  glaukoma  (Levin  &  Peeples,  2008; Milani, 2013). Pada model tikus cedera saraf perifer, pemberian  citicoline  telah  terbukti  memiliki  potensi dalam  meningkatkan  fungsi  motorik  (Ozay et  al , 2001;  Aslan et  al .,  2011)  serta  mencegah  nyeri neuropatik  pascacedera  (Emril et  al ,  2015)  dengan dosis  yang  sesuai  (Kaplan et  al ,  2013).  Namun, apakah  citicoline  berpengaruh  dalam  mendorong ekspresi  SIRT1  untuk  mencegah  kematian  neuron  di ganglion sensorik belum diketahui.

## METODE Hewan model
Penelitian  ini  menggunakan  tikus  Wistar jantan Berat badan (BB) ± 250-300 gram, berusia 12 minggu.  Tikus dianestesi dengan campuran ketamin- HCL  dan  ml  Xylazin  dalam  1  ml  saline,  secara intramuskuler.  Daerah  sub  mandibular  kanan  dan saraf  mentalis  kanan  dibersihkan  dengan  etanol70%, dilakukan  insisi,  saraf  mentalis  kanan  dikeluarkan dari  foramen  mandibularis,  saraf  mentalis  dijepit dengan  menggunakan  klem  tanpa  gerigi  berukuran  4 mm selama 30 detik. Tikus dibagi menjadi kelompok operasi  sham,  kelompok  cedera  dan  kelompok citicoline (Dexa Medica) 50 mg/100 gr BB secara i.p setiap hari. Tikus-tikus di nekropsi pada hari hari ke- 1,3 dan 7 setelah cedera (3 tikus per kelompok).

## Analisis ekspresi gen SIRT1
Tikus  dinekropsi  pada  hari  ke-1,  3  dan  7 yang  sebelumnya  dianestesi  dengan  ketamin  i.m. Ganglion  trigeminal  kanan  diambil  untuk  ekstraksi
RNA  menggunakan  RN  easy  minikit  (Qiagen, 74104). Konsentrasi RNA diukur dengan menggunakan  spektrophotometri  dan  integritas  RNA diperiksa  menggunakan  gel  agarosa  2%.  Sintesis cDNA  dilakukan  dengan  menggunakan  2μg  sampel RNA  dan Transcriptor  First  Strand cDNA  sintesis (Roche, 04379012001). Mesin PCR diatur pada suhu 25°C  selama  10  menit;  55°C  selama  30  menit;  85°C selama  5  menit.  cDNA  disimpan  dalam  -20°C  atau langsung  digunakan  untuk  analisis  ekspresi  gen. Primer  untuk  qPCR  dirancang  menggunakan Primer
Blast application di NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), pada  panjang  basa  100-250  dan surpass  esexon mencakup  intron  untuk  mencegah  amplifikasi  DNA yang  tidak  spesifik.  Ekspresi  gen  SIRT1  dianalisis menggunakan cDNA Template 3 µl, Light Cycler FS DNA Master PLUS SYBR Green (Roche,
03515869001)  di Light  Cycler  Carousel (Roche) pada  suhu  95°C  selama  10  detik;  60°  C  selama  5 detik;  72°C  selama  5  detik  dilakukan  dalam  45 siklus.  Data  diperoleh  sebagai  nilai Crossing  point (Cp).  Ekspresi  gen  relatif  dianalisis  dengan menggunakan  referensi  gen  (GAPDH)  berdasarkan persamaan
2 – Cp  target  gene −Cp  reference  gene , dan dianalisis secara kualitatif

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa pemberian  citicolin  secara  i.p.  segera  setelah  terjadi cedera saraf mentalis menghasilkan adanya peningkatan ekspresi SIRT1 (1.18) pada hari ke-7.
Gambar 1. Ekspresi mRNA SIRT1 pada ganglion trigeminal kanan ipsilateral setelah cedera saraf mentalis. Didapatkan peningkatan ekspresi SIRT1 (1.18) setelah pemberian citicoline setiap hari selama 7 hari.
Setelah  terjadi  cedera  saraf,  sel  saraf berespon  dengan  menghasilkan  sinyal  cedera  berupa MAPK  dan  Sirtuin1  (SIRT1)  (Abe  dan  Cavalli, 2008).  Penghambatan  jalur  SIRT1  ini  akan meningkatkan caspase 3 pada jalur apoptosis. Sirtinol merupakan  inhibitor  SIRT1  yang  spesifik,  sehingga fungsi  deasetilasi  yang  dapat  mengaktifkan  gen-gen anti  apoptosis  terhambat.  Pemberian  citicoline membantu  menghambat  peran  sirtinol  tersebut. Citicoline mampu meningkatkan ekspresi SIRT1 dan sel-sel  mononuclear  pada  model  tikus  stroke (Hurtado et al , 2013) .
Cedera  kompresi  pada  akson  saraf  mentalis akan  menyebabkan  kerusakan  selubung  myelin  yang didasari  oleh  proses    degenerasi  Wallerian  pada bagian  distal  dari  segmen  cedera,  demielinisasi segmental dan degenerasi aksonal yang menyebabkan disintegritas membrane saraf (Osbourne, 2007; Truini et  al ,  2015).  Mekanisme  tersebut  dapat  menginduksi apoptosis neuron ganglion (Truini et al , 2015).
Proses degenerasi Wallerian ini membutuhkan  komponen  protein  dan  lipid  termasuk kolin  dan  kolesterol.  Pemberian  citicoline  ini  akan membantu proses regenerasi tersebut. Metabolit kolin dan  sitidin  yang  berasal  dari  citicoline,  merupakan substrat  yang  penting  untuk  sintesis  fosfatidilkolin yang  membantu  perbaikan  membrane  dan  perbaikan neuron. Kolin diperlukan utamanya dalam pertumbuhan  neurit  distal.  Citicoline  membantu mencegah  terjadinya  apoptosis  akson  pascacedera. Selain itu, dapat mencegah terjadinya destruksi akson dan  myelin  melalui  peningkatan  fosfolipid  serta mencegah  respon  peradangan  (Emril et  al, 2015). Efeknya  dapat  mencegah  terjadinya  nyeri  neuropati dan perbaikan fungsi motorik setelah cedera.

## KESIMPULAN
Pemberian  citicolin  segera  setelah  cedera  saraf mentalis  dapat  meningkatkan  ekspresi  SIRT1  pada hari ke-7.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Kami mengucapkan terimakasih kepada dr. RinaSusilowati,  Ph.D  dan  Inna  Armadhari,  M.Sc, Apt.  Departemen  Histologi  dan  Biologi  Sel  FK UGM.

## DAFTARPUSTAKA
Abe,  N.,  &  Cavalli,  V.  (2008).  Nerve  injury signaling. Curr  Opin  Neurobiol ,  18(3):  276–
283.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Cedera Citicoline Hari 1 Hari 3
Hari 7
Aslan, E., Kocaeli, H., Bekar,  A., Tolunay,  S., Ulus, I.  (2011).  CDP-choline  and  its  endogenous metabolites,  cytidine  and  choline,  promote  the nerve  regeneration  and  improve  the  fuctional recovery  of  injured  rat  sciatic  nerves. Neurol. Res . 33: 766-73.
Atlasi,  M.A.,  Mehdizadeh,  M.,  Bahadori,  M.H.,
Joghataei, M.T. (2009). Morphological identification  of  cell  death  in  dorsal  root ganglion  neurons  following  peripheral  nerve injury  and  repair  in  adult  rat. Iran  Biomed  J., 13:65–72.
Burland,  M.,  Paris,  L.,  Quintana,  P.,  Bec,  J.M., Diouloufet,  L.,  Sar,  C.  et  al.  (2014).  Neurite growth  acceleration  of  adult  dorsal  root ganglion  neurons  illuminated  by  low-level  light emitting diode light at 645 nm. J Biophotonics . 9999:9999.
Emril,  D.R.,  Syafruddin,  Wibowo,  S.,  Meliala,  L.,
Susilowati, R. (2015). Cytidine 5'- Dophosphocoline Administration Prevent
Peripheral  Neuropathic  Pain  after  Rat  Sciatic Nerve Crush Injury. J. Pain Res . 9:287-91 Groves,  M.J.,  An,  S.F.,  Giometto,  B.,  Scaravilli,  F.
(1999).  Inhibition  of  sensory  neuron  apoptosis and  prevention  of  loss  by  NT-3  administration following axotomy. Exp. Neurol . 155: 284–94. Grumbles,  RM.,  Sesodia,  S.,  Wood,  P.M.,  Thomas, C.K.  (2009).  Neurotrophic  factors  improve motoneuron  survival  and  function  of  muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68:736–46.
Kaplan, T., Kafa, I.M., Cansev, M., Bekar, A., Karli, N.,  Taskapılıoglu,  M.O.,  Kanar,  F.  (2014). Investigation  of  the  Dose-Dependency  of Citicoline  Effects  on  Nerve  Regeneration  and Functional  Recovery  in  a  Rat  Model  of  Sciatic Nerve Injury. Turkish Neurosurgery . 24; 62-54. Levin,  L.A.,  &  Peeples,  P.  (2008).  History  of Neuroprotection  and Rationale as a Therapy  for Glaucoma. Am J Manag Care , 14:S11-4.
McKay  Hart,  T.,  Brannstrom,  M.,  Wiberg,  G., Terenghi.  (2002).  Primary  sensory  neurons  and satellite  cells  after  peripheral  axotomy  in  the adult  rat:  timecourse  of  cell  death  and elimination. Exp. Brain Res. 142: 308–18.
Milani, M. (2013) Citicoline as coadiuvant treatment of cognitive impairment in chronic degenerative Central  Nervous  System  diseases  and  in ischemic  stroke:  A  review  of  available  data. Online J Med MedSci Res . 18-13.
Osbourne,  A.  (2007).  Peripheral  Nerve  Injury  and Repair. TSMJ. 8:29-33.
Ozay, R., Bekar, A., Kocaeli, H., Karli, N., Filiz, G., Ulus,  H.  (2001).  Citicoline  improves  functional recovery,  promotes  nerve  regeneration,  and reduces  postoperative  scarring  after  peripheral nerve  surgery  in  rats. Surgical  neurology . 68:615-22.
Parisi, V.,  Coppola,  G.,  Centofanti,  M.,  Oddone,  F., Angrisani,  A.M.,  Ziccardi,  L.,  Ricci,  B., Quaranta, L., Manni, G. (2008). Evidence of the neuroprotective  role  of citicoline  in  glaucoma patients . Prog Brain Res. 173:541-54.
Saleh,  A.,  Roy  Chowdhury,  S.K.,  Smith,  D.R., Balakrishnan,  S.,  Tessler,  L.,  Martens,  C.  et  al. (2013). Ciliary neurotrophic factor activates NF- kappa B to enhance mitochondrial bioenergetics and  prevent  neuropathy  in  sensory  neurons  of streptozotocin-induced diabetic rodents.
Neuropharmacology . 65:65–73.
Tandrup,  T.,  Woolf,  C.J.,  Coggeshall,  R.E.  (2000).
Delayed loss of small dorsal root ganglion cells after  transection  of  the  rat  sciatic  nerve. J.
Comp. Neurol. 422: 172–80.
Truini,  A., Haanpaa, M., Provitera, V., Biasiotta, A., Stancanelli,  A.,  Caporaso,G. et  al. (2015). Differential myelinated and unmyelinated sensory  and  autonomic  skin  nerve  fiber involvement  in  patients  with  ophthalmic postherpetic neuralgia. Front. Neuroanat . 9:105. Wan,  L.,  Xia,  R.,  Ding,  W.  (2010).  Short-term  low- frequency electrical stimulation enhanced remyelination  of  injured  peripheral  nerves  by inducing  the  promyelination  effect  of  brain- derived  neurotrophic  factor  on  Schwann  cell polarization. J Neurosci Res . 88: 2578–87.
Xiao, J., Wong, A.W., Willingham, M.M., Kaasinen, S.K.,  Hendry,  I.A,  Howitt,  J.  et  al.  (2009). BDNF  exerts  contrasting  effects  on  peripheral myelination  of  NGF-dependent  and  BDNF- dependent  DRG  neurons. J  Neurosci. 29:4016– 22.
Xu,  P.,  Rosen,  K.M.,  Hedstrom,  K.,  Rey,  O.,  Guha, S.,  Hart,  C.,  Corfas,  G.  (2013).  Nerve  injury induces  glial  cell  line-derived  neurotrophic factor  (GDNF)  expression  in  Schwann  cells through  purinergic  signaling  and  the  PKC-PKD pathway. Glia . 61:1029–40.
Lu,  Y.,  Belin,  S.,  He,  Z.,  (2014).  Signaling regulations  of  neuronal  regenerative  ability, Curr. Opin. Neurobiol . 27: 135–142.
Ziv-Polat,  O.,  Shahar,  A.,  Levy,  I.,  Skaat,  H., Neuman,  S.,  Fregnan,  F.  et  al.  (2014).  The  role of neurotrophic factors conjugated to iron oxide nanoparticles
in peripheral
nerve
regeneration: in vitro studies. Biomed Res Int. 26780
Hurtado,  O.,  Hernandez-Jimenez,  M.,  Zarruk,  J.G.,
Cuartero,  M.I.,  Ballesteros,  I,,  Camarero,  G.  et al.  (2013).  Citicoline  (CDP-Choline)  increase
Sirtuin
expression concomitant to neuroprotection  in  experimental  stroke. J. Neurochem. 126:819-26.