PENGARUH VARIASI WAKTU INKUBASI TERHADAP KADAR HEMOGLOBIN MENGGUNAKAN METODE SAHLI
The Effect of Incubation Time on Hemoglobin Levels using Sahli Method
1 *Rinny Ardina, 2 Yemimasike Putri
1 Universitas Muhammadiyah Palangkaraya , Jl. RTA. Milono Km. 1,5, Palangka Raya, Indonesia
2 Universitas Muhammadiyah Palangkaraya , Jl. RTA. Milono Km. 1,5, Palangka Raya, Indonesia
*e-mail : rinyardina@gmail.com

## ABSTRAK
Beberapa  laboratorium  klinik  kecil  dan  puskesmas  di  kota  Palangka  Raya  masih  menggunakan  cara  sederhana  untuk menentukan  kadar  hemoglobin  yaitu  dengan  menggunakan  metode  Sahli.    Masih  banyak  ditemukan  perbedaan  prosedur terkait waktu inkubasi pada pemeriksaan hemoglobin metode Sahli, dimana ada yang tidak menggunakan inkubasi, inkubasi 3 menit  atau  inkubasi  5  menit.  Tujuan  penelitian  untuk  mengetahui  ada  atau  tidak  adanya  pengaruh  yang  signifikan  antara variasi  waktu  inkubasi  terhadap  kadar  hemoglobin  dengan  menggunakan  metode  Sahli.  Penelitian  ini  merupakan  penelitian eksperimental, dimana kadar hemoglobin diukur dengan metode Sahli dengan variasi waktu inkubasi yaitu 0 menit, 3 menit, 5 menit, 8 menit, dan 10 menit. Sebanyak 21 sampel darah diperoleh dengan teknik Purposive Sampling . Data yang diperoleh dianalisis  secara  statistik  menggunakan  uji One  Way  ANNOVA .  Hasil  penelitian  menunjukkan  adanya  pengaruh  yang signifikan  (p=0,00)  antara  variasi  waktu  inkubasi  (0  menit,  3  menit,  5  menit,  8  menit  dan  10  menit)  terhadap  kadar hemoglobin dengan menggunakan metode Sahli. Tampak peningkatan kadar hemoglobin terjadi seiring dengan penambahan waktu  inkubasi.  Dimana  nilai  terendah  dari  rerata  kadar  hemoglobin  pada  pengukuran  0  menit  yaitu  10,9  g/dl  dan  nilai tertinggi  pada  pengukuran  dengan  waktu  inkubasi  10  menit  yaitu  14,2  g/dl.  Penting  diperhatikan  oleh  petugas  laboratorium untuk melakukan inkubasi pada darah sesuai dengan prosedur yang ditetapkan oleh metode Sahli, sebab kesalahan pada tahap analitik memberikan kontribusi sebesar 25% penyebab kesalahan dalam hasil pemeriksaan laboratorium.
Kata kunci : hemoglobin, waktu inkubasi, metode Sahli

## ABSTRACT
Several clinical laboratory and community health centers in Palangka Raya still use a simple method to determine hemoglobin levels with Sahli method. There are mamy differences in procedures related to incubation time in Sahli method of hemoglobin examination. There are those who don’t use incubation, incubation for 3 minutes or incubation for 5 minutes. This study aimed to  determine  the  effect  of  icubation  time  on  hemoglobin  levels  using  the  Sahli  method.  This  study  was  experimental  study, where hemoglobin levels are measured by Sahli method with incubation time variations of 0 minutes, 3 minutes, 5 minutes, 8 minutes, and 10 minutes. A total of 21 blood samples were obtained by purposive sampling technique. The data obtained were statistically analyzed using the One Way ANNOVA test. The results showed there are significant effect of incubation time (0 minutes,  3  minutes,  5  minutes,  8  minutes  and  10  minutes)  on  hemoglobin  levels  using  Sahli  method  (p  =  0.00).  Increased hemoglobin  levels  occur  with  increasing  incubation  time.  Where  the  lowest  value  of  the  average  hemoglobin  level  at  the measurement  of  0  minutes  was  10.9  g  /  dl  and  the  highest  value  on  the  measurement  of  10  minutes  was  14.2  g  /  dl.  It  is important  to  laboratory  personnel  to  incubate  blood  according  to  the  procedures  established  by  the  Sahli  method,  because errors in the analytical stage contribute 25% to the causes of errors in laboratory result.
Keyword: hemoglobin, incubation time, Sahli method

## PENDAHULUAN
Pemeriksaan hemoglobin merupakan salah satu pemeriksaan darah rutin yang paling sering dilakukan oleh  setiap  laboratorium.  Pemeriksaan  ini  dilakukan terutama  untuk  mendeteksi  kasus  anemia.  Seseorang dapat  dikatakan  anemia  apabila  kadar  hemoglobin <12,0  g/dl  untuk  perempuan  dan  <13,0  g/dl  untuk laki–laki (Bain, et al ., 2017).
Pemeriksaan kadar hemoglobin dapat ditentukan  dengan  cara  manual  atau  otomatis. Beberapa laboratorium klinik kecil dan puskesmas di kota Palangka Raya diketahui masih menggunakan  cara  yang  sederhana  atau  manual untuk menentukan kadar hemoglobin yaitu dengan menggunakan  metode  Sahli.  Dalam  metode  Sahli, hemoglobin dihidrolisis dengan HCl 0,1 N menjadi asam  hematin  yang  berwarna  coklat.  Warna  yang terbentuk dibandingkan dengan warna standard dan perubahan warna asam hematin dibuat dengan cara pengenceran  sehingga  warna  sama  dengan  warna standard.  Pada  pemeriksaan  ini  faktor  kesalahan atau  penyimpangan  mencapai  15-30%.  Asam hematin  adalah  ferroheme  dimana  oleh  oksigen yang  ada  di  udara  akan  dioksidasi  menjadi  ferri heme yang selanjutnya segera bereaksi dengan ion CI  membentuk  ferrihemechlorid  atau  disebut hematin  atau  hemin  yang  berwarna  coklat (Gandasoebrata, 2016).
Dalam pemeriksaan kadar hemoglobin metode Sahli perlu dilakukan proses inkubasi yang bertujuan  untuk  membuat  suatu  larutan  menjadi saling  berikatan  sehingga  menjadi  suatu  larutan yang  homogen.  Berdasarkan  hasil  observasi  pada beberapa pusat layanan kesehatan di kota Palangka Raya, diketahui masih banyak ditemukan perbedaan  prosedur  terkait  waktu  inkubasi  pada pemeriksaan  hemoglobin  metode  Sahli.  Ada  yang tidak menggunakan inkubasi, ada yang menggunakan  inkubasi  selama  3  menit  dan  ada juga  yang  menggunakan  inkubasi  selama  5  menit. Menurut  Gandasoebrata  (2016)  waktu  inkubasi yang dibutuhkan untuk pemeriksaan kadar hemoglobin metode Sahli yaitu 3-5 menit.
Waktu inkubasi yang singkat dapat menyebabkan  asam  hematin  tidak  terbentuk sempurna sehingga menghasilkan kadar hemoglobin  yang  cenderung  rendah.  Sedangkan pada  waktu  inkubasi  yang  terlalu  lama  dapat menyebabkan  eritrosit  menjadi  pecah  atau  lisis sehingga  kadar  hemoglobin  yang  didapatkan cenderung tinggi (Fitri, 2012).
Menurut International Committee for
Standardization  in  Hematology (ICSH), gold standard untuk pemeriksaan  kadar  hemoglobin yaitu menggunakan metode sianmethemoglobin- spektrofotometrik. Pada metode ini, darah diencerkan dengan  larutan  mengandung  potassium  ferricyanide dan  potassium  cyanide.  Potassium  ferricyanide mengoksidasi  besi  yang  ada  di  dalam  heme  untuk mengubah bentuk ferri (Fe 2+ ) menjadi methemoglobin yang dikonversi menjadi sianmethemoglobin oleh potassium cyanide. Sianmethemoglobin  merupakan  produk  berwarna yang  stabil  yang  dapat  diukur  oleh  spektrofotometer dengan  panjang  gelombang  540  nm.  Penentuan konsentrasi  didasarkan  oleh  hukum  Beer-Lambert. Dimana absorbansi sampel setara dengan konsentrasi hemoglobin (Higgins, 2005).
Metode  sianmethemoglobin  pada  masa  kini, telah  dimodifikasi  agar  tidak  berbahaya  dikarenakan penggunaan  bahan  yang  mengandung  sianida. Pemeriksaan  kadar  hemoglobin  dengan Hematology Analyzer mengadaptasi  metode  sianmethemoglobin- spektrofotometrik  tanpa  menggunakan  bahan  sianida dan  ini  jauh  lebih  aman.  Bahan Sodium  Lauryl Suphate (SLS)  merupakan  bahan  yang  digunakan dalam metode ini. SLS dapat melisiskan eritrosit dan secara cepat membentuk kompleks dengan hemoglobin  membentuk  methemoglobin  yang  stabil. Methemoglobin dapat diukur pada panjang gelombang  539  nm  dan  absorbansi  sampel  setara dengan konsentrasi hemoglobin (Higgins, 2005).
Prosedur  inkubasi  pada  pemeriksaan  kadar hemoglobin  metode  Sahli  merupakan  salah  satu prosedur  yang  masuk  dalam  tahap  analitik. Kesalahan  dalam  tahap  pra  analitik  memberikan kontribusi  sebesar  61%  dari  total  kesalahan  dalam
pemeriksaan  di  laboratorium,  disusul  oleh  tahap analitik  sebesar  25%  dan  pasca  analitik  sebesar 14%  (Mengko,  2013).  Oleh  sebab  itu,  sangatlah perlu  ditekankan  kepada  petugas  laboratorium untuk  dapat  memperhatikan  dan  menjalankan prosedur  dengan  benar  terutama  dalam  hal inkubasi sampel darah pada tahap analitik ini untuk mencegah hasil pemeriksaan yang tidak representatif dengan kondisi pasien sebenarnya.

## METODE PENELITIAN
Jenis  dan  metode  penelitian  yang  digunakan adalah  penelitian  eksperimental.  Dimana  kadar hemoglobin  diukur  dengan  metode  Sahli  dengan variasi  waktu  inkubasi  darah  yaitu  0  menit,  3 menit,  5  menit,  8  menit,  dan  10  menit.  Data  yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan menggunakan  uji  normalitas  dan  homogenitas.  Data yang  normal  dan  homogen  selanjutnya  di  uji  secara statistik  dengan  uji One  Way  ANNOVA untuk mengetahui  ada/tidaknya  pengaruh  yang  signifikan dari  variasi  waktu  inkubasi  terhadap  hasil  kadar hemoglobin.
Dalam  penelitian  ini  sampel  yang  diperoleh sebanyak  21  orang  diambil  dengan  teknik purposive  sampling dengan  kriteria:  perempuan, tidak  memiliki  riwayat  anemia,  tidak  sedang menstruasi,  tidak  mengkonsumsi  obat  yang  dapat mempengaruhi  hasil  kadar  hemoglobin,  dan bersedia menjadi responden.
Selanjutnya  dilakukan  pengambilan  sampel darah  vena  pada  responden  berdasarkan  prosedur baku  dari  Departemen  Kesehatan  RI  (2008)  dengan alat  dan  bahan  antara  lain  spuit  3  cc,  tabung  vakum ungu (K 3 EDTA), tourniquet , kapas alkohol 70%, dan plester.  Pemeriksaan  kadar  hemoglobin  dilakukan dengan  menggunakan  metode  Sahli  dengan  variasi waktu  0  menit,  3  menit,  5  menit,  8  menit,  dan  10 menit. Data selanjutnya dianalisis secara statistik.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Perbedaan hasil pemeriksaan kadar hemoglobin dengan waktu inkubasi 0 menit, 3 menit,
5  menit,  8  menit  dan  10  menit  dengan  metode  Sahli dapat dilihat pada grafik berikut:
Gambar 1. Grafik Kadar Hemoglobin Berdasarkan Variasi Waktu Inkubasi (0 menit, 3 menit, 5 menit,
8 menit, dan 10 menit)
Pada  grafik  tampak  hasil  kadar  hemoglobin meningkat  seiring  dengan  bertambahnya  waktu inkubasi. Dimana didapatkan hasil kadar hemoglobin tertinggi  yaitu  pada  waktu  inkubasi  10  menit  dan hasil  kadar  hemoglobin  terendah  pada  0  menit. Sedangkan  hasil  rerata  kadar  hemoglobin  dapat dilihat pada tabel berikut.

## TABEL 1. Rerata Kadar Hemoglobin Berdasarkan Variasi
Waktu Inkubasi No. Perlakuan Kadar Hemoglobin (g/dl) Terendah Tertinggi Rerata±SD 1. 0 menit 10,0 12,0 10,9±0,7 2. 3 menit 11,0 14,0 12,0±0,8 3. 5 menit 12,0 14,6 12,9±0,6 4. 8 menit 12,0 15,4 13,5±0,9 5. 10 menit 12,8 16,8 14,2±0,8
Berdasarkan  tabel  1  didapatkan  hasil  kadar hemoglobin  terendah  pada  0  menit  yaitu  10,0  g/dl, dan  hasil  kadar  hemoglobin  tertinggi  pada  waktu inkubasi  10  menit  yaitu  16,8  g/dl.  Sedangkan berdasarkan rerata kadar hemoglobin  dari 21 sampel pada  waktu  inkubasi  0  menit,  3  menit,  5  menit,  8 menit  dan  10  menit  berturut-turut  adalah  10,9  g/dl, 12,0  g/dl,  12,9  g/dl,  13,5  g/dl, dan  14,2  g/dl.  Dilihat dari  hasil  rerata  kadar  hemoglobin  tampak  semakin lama  waktu  inkubasi  maka  semakin  tinggi  kadar hemoglobin yang diperoleh.
Pengaruh  variasi  waktu  inkubasi  terhadap kadar hemoglobin dengan metode Sahli dapat dilihat pada tabel berikut.
Sumber Varian Jumlah Kuadrat Df Rerata F hitung F tabel Sig. Antar Group 140.004 4 35.001 49.474 3.20 0.00 Dalam Group 70.747 100 0.707 Total 210.750 104
Hasil  uji  statistik  menggunakan One  Way ANNOVA diperoleh  Fhitung  (49,47)  >  Ftabel  (3,20) dan  nilai  sig.  0,00  (<0,05).  Hasil  ini  menunjukkan adanya  pengaruh  yang  signifikan  antara  waktu inkubasi  0  menit,  3  menit,  5  menit,  8  menit  dan  10 menit  terhadap  kadar  hemoglobin  dengan  metode Sahli.  Hasil  penelitian  ini  sejalan  dengan  penelitian Husin (2013) yang menyatakan bahwa ada perbedaan yang  signifikan  terhadap  hasil  kadar  hemoglobin dengan waktu inkubasi yang berbeda.
Selain  itu  Barduagni, et  al. (2003)  yang melakukan  penelitian  untuk  menentukan  status anemia  pada  149  anak  sekolah  di  wilayah  Qena, negara  Mesir  menggunakan  metode  Sahli  untuk mengukur kadar hemoglobin. Inkubasi yang digunakan oleh Barduagni, et al. (2003) yaitu selama 3 menit setelah darah ditambahkan dengan HCl.
Diketahui bahwa pada waktu inkubasi 5 menit kadar  hemoglobin  mencapai  titik  optimum  dimana eritrosit  pecah  atau  terurai  dan  terikat  sempurna. Setelah darah ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 N dan diinkubasi selama 3-5 menit eritrosit akan terikat dan  membentuk  senyawa  hematin  yang  sempurna kemudian  diencerkan  dengan  aquadest  sehingga warna  sama  dengan  warna  standart  (Gandasoebrata, 2016).
Hasil  pemeriksaan  kadar  hemoglobin  yang diperiksa  secara  langsung  tanpa  adanya  inkubasi menunjukkan  kadar  hemoglobin  rendah  yang disebabkan asam hematin belum terbentuk sempurna. Sedangkan  waktu  inkubasi  yang  terlalu  lama  dapat menyebabkan  kadar  hemoglobin  semakin  tinggi dikarenakan semakin banyaknya eritrosit yang pecah atau lisis (Fitri, 2012).
Barduagni, et  al. (2003)  melakukan  penelitian untuk  menentukan  status  anemia  pada  149  anak sekolah  di  wilayah  Qena,  negara  Mesir.  Status anemia  ditentukan  dengan  membandingkan  kadar hemoglobin menggunakan metode Sahli, skala warna Tallquist,  dan  fotometer  hemoglobin  portabel “HemoCue”.  Didapatkan  hasil  17,4%  anak-anak
anemia  dengan  “HemoCue”,  66,4%  anak-anak anemia  dengan  metode  Sahli,  dan  57,7%  anak-anak anemia  dengan  skala  warna  Tallquist.  Baik  Sahli maupun  skala  warna  Tallquist  merupakan  metode yang  sensitif  namun  memiliki  spesifisitas  (39,0%) yang  sangat  rendah,  sehingga  memberikan  hasil positif palsu yang besar.
Metode  Sahli  memiliki  banyak  kelemahan diantaranya bersifat subjektif karena sangat tergantung  pada  cara  membandingkan  warna  secara visual,  membutuhkan  pemipetan  yang  akurat, standard warna yang sudah tidak baik (luntur/buram), sensitivitas  dan  akurasi  yang  buruk,  dan  bukan merupakan  standard  internasional  (Srivastava, et  al. , 2014).

## KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan adanya pengaruh  yang  signifikan  antara  variasi  waktu inkubasi  (0  menit,  3  menit,  5  menit,  8  menit  dan  10 menit) terhadap kadar hemoglobin dengan menggunakan  metode  Sahli.  Tampak  peningkatan kadar hemoglobin terjadi seiring dengan penambahan waktu  inkubasi.  Dimana  nilai  terendah  dari  rerata kadar  hemoglobin  pada  pengukuran  0  menit  yaitu 10,9 g/dl dan nilai tertinggi pada pengukuran dengan waktu  inkubasi  10  menit  yaitu  14,2  g/dl.  Penting diperhatikan  oleh  petugas  laboratorium  untuk melakukan  inkubasi  pada  darah  sesuai  dengan prosedur yang ditetapkan oleh metode Sahli tersebut, sebab  kesalahan  pada  tahap  analitik  memberikan kontribusi  sebesar  25%  penyebab  kesalahan  dalam hasil pemeriksaan laboratorium.

## DAFTAR PUSTAKA
Bain,  B.  J.,  Bates,  I.,  &  Laffan,  M.  A.  (2017).
Dacie  and  Lewis  Practical  Haematology (Twelfth Edition) (Twelfth Ed; M. Emeritus S.  MITCHELL  LEWIS,  BSc  &  F. FRCPath, DCP, eds.). Elsevier B.V.
Barduagni, P., Ahmed, A. S., Curtale, F., Raafat,
M.,  &  Soliman,  L.  (2003).  Performance  of Sahli  and  colour  scale  methods  in diagnosing  anaemia  among  school  children
in  low prevalence  areas. Tropical  Medicine and  International  Health , 8 (7),  615–618. https://doi.org/10.1046/j.1365- 3156.2003.01062.x.
Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia.  2008.
Pedoman  Praktik  Laboratorium  yang  Benar .
Jakarta : Depkes RI.
Fitri, A. 2012 . Pengaruh Warna Standar Terhadap Hasil Pemeriksaan Hemoglobin Metode Sahli. Karya  Tulis  Ilmiah .  Program  Studi  Analis Kesehatan. Fakultas Ilmu Kesehatan.
Universitas  Muhammadiyah  Palangkaraya:
Palangka Raya.
Gandasoebrata  R.  2016. Penuntun  Pemeriksaan
Klinik . PT. Dian Rakyat: Jakarta.
Higgins,  C.  (2005).  Hemoglobin  and  its measurement. Acutecaretesting.Org ,  (July), 1–10. Retrieved from
https://acutecaretesting.org/~/media/acuteca retesting/files/pdf/hemoglobin-and-its-
measurement.pdf.
Husin,  H.Y.  2013.  Pengaruh  Waktu  Inkubasi Pemeriksaan  Hemoglobin  Metode  Sahli. Karya  Tulis  Ilmiah .  Program  Studi  Analis
Kesehatan. Fakultas Ilmu Kesehatan.
Universitas  Muhammadiyah  Palangkaraya:
Palangka Raya.
Mengko,  R.  2013. Instrumentasi  Laboratorium Klinik . Penerbit ITB: Bandung.
Srivastava,  T.,  Negandhi,  H.,  Neogi,  S.  B., Sharma,  J.,  &  Saxena,  R.  (2014).  Methods for Hemoglobin Estimation: A Review of “ What Works .” Journal of Hematology and Transfusion , 2 (3), 2005–2006.
.