## PEMBUATAN MATRIKS KARBOKSIMETIL KITOSAN UNTUK AMOBILISASI ENZIM LIPASE
Anita Herawati Permana * , Eva Yuliana
Program Studi Penjaminan Mutu Industri Pangan, Politeknik AKA Bogor Jl. Pangeran Sogiri No.283, Tanah Baru, Bogor Utara, Kota Bogor, Jawa Barat 16154
Email: anitahera@kemenperin.go.id
(Received : 1 Juni 2020; Accepted: 30 Juni 2020; Published: 1 Juli 2020)

## Abstrak
Kebutuhan  akan  biokatalis  dengan  stabilitas  tinggi  telah  mendorong  penelitian  mengenai  metode  untuk meningkatkan  kinerja  biokatalis.  Amobilisasi  enzim  secara  kovalen  telah  dilaporkan  dapat  menstabilkan  enzim selama proses katalisis. Kitosan banyak digunakan sebagai matriks untuk imobilisasi kovalen. Dalam penelitian ini, kitosan dimodifikasi menjadi karboksimetil kitosan untuk meningkatkan mobilitas enzim. Spektra FTIR dari matriks  yang  dimodifikasi  menunjukkan  adanya  serapan  asam  karboksilat  pada  1724  cm -1 ,  yang  menunjukkan bahwa  kitosan  telah  berhasil  dimodifikasi  menjadi  karboksimetil  kitosan.  Ikatan  enzim  ke  matriks  terbentuk melalui gugus asam karboksilat, ditunjukkan oleh pergeseran serapan dari 1724 cm -1 (asam karboksilat) menjadi 1651 cm -1 (amida). Imobilisasi lipase dalam pelarut isopropanol menunjukkan kapasitas pengikatan yang tinggi, dengan  98%  enzim  terikat  pada  matriks.  Akan  tetapi,  aktivitas  enzim  immobilisasi  yang  tersisa  sebesar  9,08% dibandingkan dengan enzim bebas.
Kata kunci : kitosan; karboksimetil kitosan; amobilisasi; lipase

## Abstract
The  requirement  of  a  high  stability  biocatalyst  has  encouraged  the  research  on  methods  to  increase  the biocatalyst  performance.  Enzyme  immobilization  through  covalent  binding  has  been  reported  to  stabilize  the enzyme during the catalytic processes. Chitosan is widely used as matrices for covalent immobilization. In this research, chitosan was modified into carboxymethyl chitosan to increase enzyme mobility. FTIR spectra of the modified  matrices  showed  a  carboxylic  acid  peak  at  1724  cm -1 ,  thus  suggested  that  chitosan  was  successfully modified into carboxymethyl chitosan. Enzyme linkage  to the matrices was formed through the carboxylic acid group, indicated by a peak shift from 1724 cm -1 (carboxylic acid) to 1651 cm -1 (amide). Lipase immobilization in isopropanol  solvent  showed  high  binding  capacity  since  98%  of  enzyme  was  linked  to  matrices.  However,  the remained activity of immobilized enzyme was only 9,08% compared to the free enzyme.
Keywords : chitosan; carboxymethyl chitosan; immobilization; lipase

## PENDAHULUAN
Amobilisasi merupakan suatu teknik pengikatan atau  penjebakan  enzim  pada  suatu  matriks  sehingga pergerakan enzim menjadi terbatas (Jeganathan et al ., 2008).  Amobilisasi  dilakukan  untuk  meningkatkan performa  enzim  sebagai  biokatalis.  Enzim  amobil mampu  mengkatalisis  reaksi  menghasilkan  produk, dengan  proses  pemisahan  produk  akhir  yang  lebih mudah karena komponen katalisnya tetap terikat pada matriks.  Dengan  kondisinya  yang  terikat  matriks, enzim amobil dapat digunakan secara berulang untuk mengkatalisis  reaksi.  Enzim  amobil  juga  memiliki rentang  ketahanan  pelarut  yang  lebih  tinggi dibandingkan dengan enzim bebasnya.
Penelitian  mengenai  amobilisasi  enzim  masih terus dieksplorasi untuk memperoleh hasil yang lebih baik.  Berdasarkan  jenis  interaksi  enzim-matriks, teknik  amobilisasi  enzim  dapat  dikelompokkan  ke
dalam  metode  interaksi  kimia  dan  interaksi  fisik. Metode  interaksi  kimia  meliputi  adsorpsi,  interaksi ionik,  dan  ikatan  kovalen.  Adapun  metode  interaksi fisik  meliputi  penjebakan  dan  enkapsulasi.  Jenis interaksi  yang  memberikan  hasil  pengikatan  yang lebih  kuat  terjadi  pada  proses  amobilisasi  secara kovalen,  karena  enzim  terikat  secara  permanen terhadap matriks (Tan et al ., 2010).
Amobilisasi  enzim  secara  kovalen  telah dilaporkan  berhasil  pada  beberapa  matriks  seperti poly (gamma-glutamic acid), insoluble yeast betaglucan,  Nylon-6 ,  dan  silika.  Akan  tetapi,  enzim amobil  yang  diperoleh  menunjukkan  pengurangan aktifitas  enzim  yang  cukup  signifikan  (Peng,  2014). Pemilihan  matriks  merupakan  salah  satu  faktor penting dalam perancangan sistem amobilisasi. Salah satu  kandidat  matriks  yang  potensial  digunakan
adalah jenis polimer alami dari golongan polisakarida,  yaitu  kitosan.  Kitosan  merupakan produk  hasil  deasetilasi  kitin,  dengan  keberadaan gugus  hidroksi  dan  gugus  amina  yang  dapat dimanfaatkan  sebagai  sisi  pengikatan.  Kitosan  tidak bersifat  racun  dan  dapat  didegradasi  secara  biologis (Dutta et al ., 2004). Dalam tulisan ini, matriks kitosan yang  digunakan  terlebih  dahulu  dimodifikasi  dengan dengan penambahan gugus karboksimetil. Penambahan  gugus  tersebut  berfungsi  sebagai  spacer yang  memberi  jarak  antara  permukaan  matriks dengan enzim. Dengan demikian, enzim amobil yang terikat  ke  matriks  memiliki  daya  jangkau  dan  ruang gerak yang lebih luas.

## BAHAN DAN METODE
Kitosan  yang  digunakan  sebagai  prekusor merupakan  kitosan  massa  molekular  tinggi  ( Acros Organics ),  yang  dimodifikasi  dengan  penambahan NaOH  dan  asam  monokloroasetat.  Pelarut  organik yang digunakan dalam proses modifikasi matriks dan amobilisasi  enzim  meliputi  isopropanol,  etanol,  dan kloroform.  Larutan  HCl  pekat  digunakan  dalam proses  pengasaman,  dengan  indikator  pH  Acilit ( Merck )  digunakan  untuk  pemantauan  nilai  pH. Enzim  yang  digunakan  untuk  amobilisasi  merupakan enzim  lipase  rekombinan  dari  isolat  Geobacillus thermoleovorans  PPD2,  yang  diperoleh  dari  Grup Riset  Termofilik  dan  Termostabil  Enzim,  Kelompok Keahlian  Biokimia  ITB.  Penentuan  kadar  protein bebas  dan  terikat  menggunakan Bradford  reagen  kit ( Thermo  Scientific ),  dengan Bovine  Serum  Albumine ( Thermo  Scientific )  sebagai  standar.  Pengujian aktivitas  hidrolisis  lipase  menggunakan  p-nitrofenol (Sigma)  sebagai  standar  dan  p-nitrofenil  dekanoat (Sigma) sebagai substrat.

## Sintesis matriks karboksimetil kitosan
Karboksimetil kitosan (KMK) disintesis menggunakan  metode  Chen  dan  Park  (2003)  dengan modifikasi.  Sebanyak  5  gram  kitosan  dicampurkan dengan 6,75 gram NaOH dalam 50 mL isopropanol:air  4:1.  Campuran  direfluks  dalam penangas air (50 o C, 100 rpm) hingga partikel kitosan mengembang. Sebanyak 7,5 gram asam monokloroasetat dilarutkan dalam 10 mL isopropanol,  dan  ditambahkan  tetes  demi  tetes  ke dalam  campuran  kitosan-NaOH.  Campuran  kitosan- asam  monokloroasetat  direaksikan  dalam  penangas air  selama  empat  jam  (50 o C,  100  rpm).  Reaksi dihentikan  dengan  penambahan  100  mL  etanol  70%. Campuran  akhir  disaring  menggunakan  penyaring Buchner dan dibilas dengan etanol 70%.
Sebanyak  1  gram  padatan  dari  pengerjaan sebelumnya  disuspensikan  dalam  100  mL  etanol 70%.  Suspensi  diasamkan  dengan  penambahan  HCl pekat,  kemudian  diinkubasi  selama  30  menit  di  suhu ruang  dengan  kecepatan  pengadukan  150  rpm. Pengecekan  keasaman  dilakukan  secara  berkala menggunakan  indikator Acilit ,  dengan  pH  suspensi
dipastikan berada di kisaran pH 3. Suspensi kemudian disaring menggunakan penyaring Buchner. Karakterisasi KMK dilakukan dengan analisis FTIR.

## Amobilisasi enzim lipase pada matriks
KMK  hasil  sintesis  digunakan  sebagai  matriks amobilisasi  untuk  enzim  lipase.  Padatan  enzim sebanyak 1 mg terlebih dahulu dilarutkan dalam 1 mL bufer  K-fosfat  50  mM  pH  8,  untuk  memperluas  area kontak enzim dengan matriks. Dalam tabung terpisah, sebanyak  10  mg  KMK  disuspensikan  dalam  2  mL pelarut  (isopropanol  atau  kloroform).  Ke  dalam suspensi KMK kemudian ditambahkan larutan enzim. Campuran  matriks-enzim  diaduk  pada  20 o C  selama 12 jam. Setelah reaksi berakhir, larutan disentrifugasi pada 3800 × g selama 30 menit. Enzim terikat matriks terdapat  di  bagian  pelet,  yang  selanjutnya  dibilas dengan  3  ×  5  mL  bufer  K-fosfat  50  mM  pH  8  dan disimpan pada suhu 4 o C. Supernatan dipisahkan dan disimpan pada suhu 4 o C untuk pengujian lebih lanjut.

## Penentuan kapasitas pengikatan matriks
Kadar protein terikat matriks ditentukan melalui pengujian tidak langsung pada supernatan. Supernatan  diuji  kadar  proteinnya  menggunakan metode Bradford ,  yang  dapat  mendeteksi  protein dalam  kisaran  µgram.  Sebanyak  500  µL  sampel direaksikan dengan 500 µL reagen Bradford kit pada suhu  ruang.  Reaksi  dibiarkan  berlangsung  selama sepuluh  menit.  Produk  hasil  reaksi  diukur  pada panjang  gelombang  595  nm.  Absorbansi  sampel kemudian dibandingkan dengan kurva standar Bovine Serum  Albumin  (Bradford,  1976).  Kadar  protein terikat  matriks  ditentukan  dari  selisih  enzim  mula- mula dengan enzim yang terukur di supernatan.

## Penentuan aktivitas enzim amobil
Aktivitas  hidrolisis  enzim  lipase  ditentukan menggunakan  metode yang dilakukan oleh  Lee et al . (1999)  dengan  beberapa  modifikasi.  Campuran substrat  dibuat  dengan  mencampurkan  larutan substrat  p-nitrofenil  dekanoat  10  mM  (dalam asetonitril), etanol, dan bufer glisin-NaOH 50 mM pH 9  dengan  perbandingan  1:4:95  (Lee et  al .,  1999). Campuran  substrat  dibuat  segar  sebelum  dilakukan uji  aktivitas.  Sebanyak  90  µL  campuran  substrat ditempatkan  dalam  tabung  mikro  dan  diinkubasi selama 30 detik. Kedalam tabung mikro ditambahkan 1mg  enzim  amobil  kemudian  campuran  akhir diinkubasi selama 90 detik. Reaksi dihentikan dengan inkubasi  campuran  enzim-substrat  dalam  es.  Uji aktivitas dilakukan pada 50 o C dan pH 9. Produk hasil reaksi  diukur  pada  panjang  gelombang  405  nm. Sebagai  kontrol  digunakan  pengukuran  terhadap campuran  substrat  tanpa  penambahan  enzim.  Selisih dari  absorbansi  sampel  dengan  kontrol  kemudian dibandingkan  dengan  kurva  standar  p-nitrofenol untuk menentukan aktivitas enzim.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Matriks Karboksimetil Kitosan
Sintesis  karboksimetil  kitosan  (KMK), dilakukan melalui pembentukan produk Na- karboksimetil  kitosan  (Na-KMK)  yang  selanjutnya diasamkan  untuk  membentuk  produk  KMK  (Gambar 1).  Analisis  FTIR  terhadap  prekusor  kitosan  yang digunakan  menunjukkan  adanya  serapan  khas  di bilangan  gelombang  3353  cm –1 (vibrasi  ulur  O-H), 2871  cm –1 (vibrasi  ulur  C-H),  1589    cm –1 (vibrasi tekuk  –NH  dari  –NH2),  dan  1024  cm –1 (vibrasi  ulur C-O).
Gambar 1. [a] Kitosan, [b] Na-karboksimetil kitosan, [c] karboksimetil kitosan
Penambahan  gugus  karboksimetil  pada polimer  kitosan  terjadi  melalui  serangkaian  reaksi. Tahap awal dari reaksi ini adalah terjadinya alkalisasi kitosan  melalui  penambahan  NaOH  hingga  polimer mengembang.  Selanjutnya,  proses  protonasi  pada asam  monokloroasetat  menghasilkan  CH2ClCOONa (Na-kloroasetat).  Na-kloroasetat  yang  terbentuk kemudian  berikatan  dengan  kitosan.  Reaksi  tersebut diawali  dengan  penyerangan  gugus      nukleofilik  dari kitosan pada C-α dari Na-kloroasetat (CH2ClCOONa).  Reaksi  terjadi  secara  serentak, diikuti  dengan  lepasnya  gugus      dari  Na-kloroasetat, menghasilkan produk Na-karboksimetil kitosan (Gambar  2).  Terbentuknya  produk  Na-karboksimetil kitosan didukung dengan data FTIR, yang menunjukkan adanya serapan pada bilangan gelombang  3354  cm –1 (vibrasi  ulur  O-H),  1584  cm –1 (vibrasi ulur C=O dari –COONa), 1410 cm –1 (vibrasi tekuk  C-H),  1315  cm –1 (vibrasi  ulur  C-O-C asimetris),  dan  1060  cm –1 (vibrasi  ulur  C-O).  Hasil serupa juga dilaporkan oleh Chen dan Park (2003).
Gambar 2. Mekanisme reaksi pembentukan karboksimetil kitosan
Selanjutnya, produk KMK diperoleh melalui penambahan  asam  pada  Na-KMK.  Padatan  KMK yang  dihasilkan  menunjukkan  serapan  pada  bilangan gelombang  3344  cm –1 (vibrasi  ulur  dari  O-H),  2883 cm –1 (vibrasi ulur C-H), 1724 cm –1 (vibrasi ulur C=O dari –COOH), 1617 dan 1520 cm –1 (vibrasi tekuk N-
H  dari  –NH3+),  1382  cm –1 (vibrasi  ulur  C-O-C asimetris),  dan  1058  cm –1 (vibrasi  ulur  C-O).  Hasil serupa  juga  dilaporkan  oleh  Chen  dan  Park  (2003). Adanya  serapan  C=O  dari  –COOH  pada  panjang gelombang  1724  cm –1 ,  yang  tidak  ditemui  pada kitosan  maupun  Na-KMK (Gambar 3),  menunjukkan bahwa produk KMK telah diperoleh.
Gambar 3. Hasil analisis FTIR untuk kitosan, Na- karboksimetil kitosan (Na-KMK), dan karboksimetil kitosan (KMK)

## Lipase Teramobil Matriks Karboksimetil Kitosan
Amobilisasi  enzim  lipase  dilakukan  dalam dua pelarut organik, yaitu isopropanol dan kloroform. Enzim  lipase  yang  diamobilisasi  dalam  pelarut isopropanol menunjukkan hasil pengikatan yang lebih baik  (98%),  dibandingkan  dengan  pelarut  kloroform (47  %)  (Tabel  1).  Penggunaan  pelarut  isopropanol pada proses amobilisasi memberikan hasil yang lebih baik  karena  sifatnya  yang  protik  sesuai  dengan matriks KMK, dibandingkan dengan pelarut kloroform yang bersifat aprotik.
Pelarut  Enzim mula-mula Enzim tersisa di supernatant Enzim terikat Isopropanol 1 mg 0,02 mg 0,98 mg Kloroform 1 mg 0,53 mg 0,47 mg
Enzim  lipase  yang  diamobilisasi  dalam pelarut  isopropanol  menunjukkan  hasil  pengikatan yang  lebih  baik  (98%),  dibandingkan  dengan  pelarut kloroform  (47  %)  (Tabel  1).  Penggunaan  pelarut isopropanol  pada  proses  amobilisasi  memberikan hasil  yang  lebih  baik  karena  sifatnya  yang  protik sesuai  dengan  matriks  KMK,  dibandingkan  dengan pelarut kloroform yang bersifat aprotik.
Analisis  FTIR  menunjukkan  bahwa  serapan khas gugus –COOH pada matriks KMK tidak ditemui pada  kompleks  enzim  terikat  matriks  (KMK-enzim), digantikan  oleh  serapan  C=O  dari  amida  pada bilangan gelombang 1651 cm –1 (Gambar 4).
Tabel 1. Hasil Pengikatan Enzim pada Matriks KMK
Kompleks KMK-enzim menunjukkan adanya serapan vibrasi  ulur  N-H  dari  –NH2  pada  3363  cm –1 ,  vibrasi ulur  C-H  pada  2936  cm –1 ,  vibrasi  ulur  C=O  dari  – CONH2  pada  1651  cm –1 ,  vibrasi  tekuk  N-H  dari  – NH2  pada  1589  cm –1 ,  vibrasi  ulur  C-O-C  asimetris pada 1324 cm –1 , dan vibrasi ulur C-O pada 1075 cm – 1 .  Hasil  yang  diperoleh  mengindikasikan  adanya pembentukan ikatan kovalen antara gugus karboksimetil  dari  matriks  dengan  gugus  amina  pada protein,  menghasilkan  ikatan  amida  yang  memberi serapan khas di panjang gelombang 1651 cm –1 .
Gambar 4. Hasil analisis FTIR untuk karboksimetil kitosan (KMK) dan KMK terikat enzim

## Aktivitas Enzim Lipase Teramobil KMK
Penentuan aktivitas hidrolisis lipase dilakukan  pada  enzim  bebas  dan  enzim  amobil. Aktivitas  ditentukan  melalui  pengukuran  produk  p- nitrofenol  (pNP)  yang  dihasilkan  oleh  enzim. Aktivitas  hidrolisis  lipase  dinyatakan  dalam  satuan unit aktivitas (µmol pNP yang dilepaskan per menit). Kebolehulangan  enzim  amobil  dinyatakan  dalam persentase  aktivitas  yang  tersisa  relatif  terhadap aktivitas pada penggunaan pertama (aktivitas relatif). Nilai  t1/2  ditentukan  saat  aktivitas  relatif  berkurang sebanyak 50% dari aktivitas awal.
Aktivitas hidrolisis enzim bebas sebesar 3,19 ±  0,225  U/mg  protein,  sedangkan  aktivitas  enzim amobil  sebesar  0,289  U/mg  protein.  Aktivitas hidrolisis  mengalami  penurunan  menjadi  9,08% relatif  terhadap  enzim  bebasnya.  Nilai  t1/2  dicapai pada  penggunaan  kedua  dengan  aktivitas  relatif tersisa  sebesar  33,1%.  Pada  penggunaan  ketiga, aktivitas  hidrolisis  enzim  amobil  masih  tersisa sebesar  23,9%  (Gambar  5).  Padatan  enzim  amobil yang  disimpan  pada  4  oC  masih  mempertahankan 12,7%  aktivitas  setelah  30  hari  penyimpanan  (Tabel
2).  Amobilisasi  lipase  pada  matriks  KMK  dalam pelarut isopropanol menghasilkan enzim amobil yang masih  mempertahankan  9,08%  aktivitas  hidrolisis. Adapun penggunaan pelarut  kloroform  menghasilkan enzim  amobil  yang  inaktif  (kehilangan  aktivitas). Pemilihan  pelarut  merupakan  salah  satu  faktor penting  dalam  proses  amobilisasi,  dan  pelarut isopropanol  memberikan  hasil  yang  lebih  baik  dari segi  pengikatan  protein  maupun  aktivitas  enzim amobil yang dihasilkan.
Gambar 5.Aktivitas hidrolisis enzim bebas dan amobil pada matriks KMK
Penurunan aktivitas pada enzim amobil yang dihasilkan,  menunjukkan  adanya  interferensi  pada kemampuan  katalitik  enzim.  Proses  amobilisasi secara kovalen menghasilkan ikatan yang kuat antara matriks  dan  enzim,  namun  lokasi  pengikatan  yang berada  di  sekitar  sisi  aktif  enzim  dapat  mengganggu aktivitas  enzim.  Interaksi  matriks  KMK  dengan enzim  diduga  berasal  dari  gugus  karboksimetil  yang bersifat  asam  dengan  residu-residu  asam  amino  basa dalam  enzim,  seperti  lisin  dan  arginin.  Hasil pemetaan residu-residu lisin dan arginin dalam enzim lipase Geobacillus thermoleovorans PPD2 menunjukkan adanya residu di bagian lid, yang dapat berakibat fatal jika terikat ke matriks. Lid pada enzim lipase  merupakan  bagian  yang  harus  bebas  bergerak membuka  dan  menutup,  agar  substrat  dapat mengakses  sisi  aktif  enzim  yang  terletak  di  balik  lid (Gambar 6).
Gambar 6. Sebaran residu lisin (merah) dan arginin (hijau) pada lipase G. thermoleovorans PPD2: lid ditunjukkan oleh bagian berwarna kuning dan residu-residu basa ditunjukkan oleh tanda panah
Penurunan  aktivitas  enzim  amobil  juga  dilaporkan terjadi pada lipase C. rugosa yang diamobilisasi pada matriks glioksil agarosa (Perna et al ., 2017). Aktivitas lipase  amobil  yang  diperoleh  mengalami  penurunan
Pelarut Enzim mula-mula Enzim tersisa di supernatant Enzim terikat Isopropanol 1 mg 0,02 mg 0,98 mg Kloroform 1 mg 0,53 mg 0,47 mg
menjadi  35,4%  relatif  terhadap  enzim  bebasnya. Lipase  C.  antartica yang diamobilisasi  pada  matriks kitosan  teraktivasi  glutaraldehid  (Silva et  al .,  2012) dan  lipase C.  rugosa yang  diamobilisasi  pada  manik kitosan  (Yi et  al .,  2009)  juga  mengalami  penurunan aktivitas,  berturut-turut  menjadi  39,9%  dan  10,4% relatif terhadap enzim bebasnya.
Tabel 2. Aktivitas Enzim Amobil setelah 30 Hari
Penyimpanan * Sampel Aktivitas  mula- mula (A 0 ) Aktivitas setelah penyimpanan (A t ) Lipase amobil 0,289 0,0368 (12,7% dari A 0 )
*dinyatakan dalam unit/ mg protein
Lipase amobil dilaporkan memiliki ketahanan  penyimpanan  yang  beragam,  mulai  dari  7 hari  (Hung et  al .,  2003),  30  hari  (Chiou  dan  Wu, 2004;  Huang et  al .,  2007),  60  hari  (Tumturk et  al .,
2007),  hingga  120  hari  (Brady et  al .,  1988).  Lipase Candida  rugosa  yang  diamobilisasi  pada  manik kitosan  (Hung et  al .,  2003)  dan  membran  kitosan nanofiber  (Huang et  al .,  2007)  dilaporkan  memiliki ketahanan penyimpanan selama 7 dan 30 hari, dengan penurunan  aktivitas  berturut-turut  menjadi  sebesar 67%  dan  56,2%.  Lipase  amobil  dengan  ketahanan penyimpanan  hingga  120  hari  dilaporkan  oleh  Brady et  al .  (1988),  pada  lipase  yang  diamobilisasi  dengan serbuk  Accurel.  Lipase  amobil  kehilangan  kurang dari  10%  aktivitasnya  setelah  penyimpanan  selama 120 hari (Brady et al ., 1988).

## KESIMPULAN
Sistem  amobilisasi  menggunakan  matriks karboksimetil  kitosan  (KMK)  berhasil  diterapkan untuk  mengamobilisasi  enzim  lipase.  Matriks  KMK terikat  secara  kovalen  dengan  residu-residu  asam amino  basa  yang  tersebar  di  permukaan  enzim, dengan  beberapa  residu  diantaranya  berada  di  dekat lid  sehingga  terjadi  penurunan  aktivitas  enzim amobil. Amobilisasi lipase pada matriks KMK dalam pelarut isopropanol memberikan hasil yang lebih baik dari  segi  pengikatan  protein  maupun  aktivitas  enzim amobil yang dihasilkan.

## DAFTAR PUSTAKA
Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of micrograms quantities of  protein  utilizing  the  principle  of  protein- dye  binding ,  Analytical  Biochemistry,  72, 248-254.
Brady, C., Metcalfe, L., Slaboszewski, D., Dan Frank, D.  (1988). Lipase  immobilized  on  a hydrophobic,  microporous  support  for  the hydrolysis  of  fats .  Journal  of  the  American Oil Chemists’ Society, 65(6), 917–921.
Chen,  X.  G.,  Park,  H.  J.  (2003). Chemical characteristics of O-carboxymethyl
chitosans related to the preparation conditions . Carbo. Pol , 53, 355-359. Chiou,  S.H.,  Wu,  W.T.  (2004). Immobilization  of Candida  rugosa  lipase  on  chitosan  with activation of the hydroxyl
groups , Biomaterials, 25(2), 197-204. Dutta,  P.  K.,  Dutta,  J.,  Tripathi,  V.  S.  (2004). Chitin and  Chitosan:  Chemistry,  properties,  and applications , J. of  Sci.  &  Ind.  Research , 63, 20-31.
Huang,  X.J.,  Ge,  D.,  Xu,  Z.K.  (2007). Preparation and  characterization  of  stable  chitosan nanofibrous membrane for lipase immobilization .  European  Polymer  Journal, 43(9), 3710-3718.
Hung, T.C., Giridhar, R., Chiou, S.H., Dan Wu, W.T. (2003). Binary  immobilization  of  Candida rugosa  lipase  on  chitosan . Journal  of Molecular  Catalysis  B:  Enzymatic, 26(1), 69-78.
Jegannathan,  K.R.,  Abang,  S.,  Poncelet,  D.,  Chan, E.S.,  Ravindra,  P.  (2008). Production  of biodiesel  using  immobilized  lipase  –  a critical review , Critical Reviews in Biotechnology, 28, 253-264.
Lee,  D.W.,  Koh,  Y.S.,  Kim,  K.J.,  Kim,  B.C.,  Choi, H.J., Kim, D.S., Sujartono, M.T., Dan Pyun, Y.R.  (1999). Isolation  and  characterization of  a  thermophilic  lipase  from  Bacillus thermoleovorans  ID-1 .  FEMS  Microbiology Letters, 179, 393-400.
Peng,  R.  (2014). Recent  progress  in  lipase immobilization, BioTechnology:  An  Indian Journal, 9(1).
Perna, R.F., Tiosso, P.C., Sgobbi, L.M., Vieira, A.M.,
Vieira, M.F., Tardioli, P.W., Soares, C.M.F., Dan Zanin, G.M. (2017). Effects of Triton X- 100 and PEG on the catalytic properties and thermal  stability  of  lipase  from  Candida rugosa  free  and  immobilized  on  glyoxyl- agarose , Open Biochemistry Journal, 11, 66- 76.
Silva, J.A., Macedo, G.P., Rodrigues, D.S., Giordano,
R.L.C., Goncalves, L.R.B. (2012). Immobilization of Candida antarctica lipase B by covalent attachment on chitosan-based hydrogels  using  different  support  activation strategies , Biochemical Engineering Journal, 60, 16-24.
Tan,  T.,  Lu,  J.,  Nie,  K.,  Deng,  L.,  Dan  Wang,  F. (2010). Biodiesel production with immobilized lipase: A review . Biotechnology advances, 28, 628-634.
Tumturk, H., Karaca, N., Demirel, G., Dan  Şahin, F.
(2007). Preparation and  application  of  poly (N,N-dimethylacrylamide-co-acrylamide) and poly (N-isopropylacrylamide-co- acrylamide)/κ-Carrageenan  hydrogels  for immobilization  of  lipase, Int  jour  of biological macromolecules, 40(3), 281-285.
Yi,  S.S.,  Noh,  J.M.,  Lee,  Y.S.  (2009). Amino  acid modified  chitosan  beads:  improved  polymer supports  for  immobilization  of  lipase  from Candida rugosa , Jour of Molecular Catalysis B:  Enzy  of  Molecular  Catalysis  B: Enzymatic , 57(1), 123-129.