STRUKTUR TUBULUS SEMINIFERUS MENCIT ( Mus musculus L.) SETELAH PAPARAN EKSTRAK ETANOL DAUN MIMBA ( Azadirachta Indica A.Juss)
Sarifudin Avycena 1*) , Agung Janika Sitasiwi 2 , Siti Muflcihatun Mardiati 3
1, 2,3 Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro, Semarang * Corresponding author : avycena18@gmail.com

## Abstract
Neem leaves are one of the traditional medicinal plants (Azadirachta indica A Juss). Neem leaves contain an active composition as an antifertility such as azadirachtin, flavonoids, saponins, nembeen and nimbidin. Spermatogenic Index of male mice (Mus musculus L) after being given ethanol extract from the leaves of the mimba (Azadirachta indica  A.  Juss).  This  study  used  a  completely  randomized  design  (CRD)  with  2  control  groups  (aquades)  and treatment (giving the leaves of the mangosteen ethanol extract at a dose of 14 mg / KgBB / day) with 15 replications. The treatment was given orally with a volume of 0.2 ml for 21 days. The 22 days of the testes were isolated, weighed and made histological preparations using a paraffin method with a thickness of 5 μm, and staining of Hematoxylin Eosin (HE). Observation of seminiferous tubule structure and measurement of seminiferous tubule diameter was carried out in 4 fields of view. The Spermatogenic Index values (SI) was determined by the number of phases of each field specified in the seminiferous tubules. Data were analyzed by t test with a confidence level of 95%. The results  of  the  analysis  showed  not  significant  different  on  body  weight,  testicular  weight  and  diameter  of  the seminiferous tubules. Spermatogenic Index observations showed that the control group had a dominant fase of 5 while the treatment group had dominant fase of 4.The research concluded that the administration of mimba leaves ethanol extract was recommended as an antifertility of male animals.
Keywords : Neem; seminiferous Tubules; Spermatogenic Index

## PENDAHULUAN
Pemanfaatan tanaman Mimba terutama  pada  daun  dan  biji  dapat digunakan  sebagai  antifertilitas  baik  pada hewan  jantan  maupun  betina  (Priya et  al ., 2012).  Daun  Mimba  dapat  digunakan sebagai antibacterial, antidiabetic, antioxidant, antidental caries, antihypertensive, antifertility, antimalarial, antitumor, antiulcer dan larvicidal (Hashmat et al., 2012) . Ekstrak mimba juga terbukti  memiliki  kemampuan  menekan pertumbuhan  sel  kanker  (Sharma et  al ., 2013). Mekanisme aksi senyawa antifertilitas  pada  mimba  melalui  2  (dua) cara,  yaitu  melalui  mekanisme  sitotoksik dan hormonal ( Fidan et al. , 2008). Pertama,
penghambatan  spermatogenesis  melalui aksi  senyawa  toksik  yang  menyebabkan kematian  sel  spermatogenik  sehingga terjadi penurunan jumlah sel-sel spermatogenik. Hal tersebut dapat menyebabkan  atrofi  testis.  Senyawa  yang beraksi  secara  sitotoksik  adalah nimbidin , nimbin, azadirachtin, dan salannin (Suryawanshi,  2011).  Senyawa  lain  yang diduga  memiliki  aktivitas  toksik  yang tinggi  adalah  azadirachtin  (Pankaj et  al ., 2011; Hashmat et al ., 2012; Koriem, 2013).
Mekanisme  aksi  secara  hormonal  yaitu terjadinya  penghambatan  sekresi  dan  aksi hormon  reproduksi  yaitu  LH  dan  FSH (Sitasiwi et  al. ,  2017).  Senyawa  yang beraksi secara hormonal adalah
Sarifudin Avycena et al. : Struktur Tubulus Seminiferus Mencit ( Mus musculus ) Setelah Paparan Ekstrak Etanol Daun Mimba ( Azadirachta indica A.Juss)
campesterol, beta-sitosterol,
dan stigmasterol (Suryawanshi, 2011).
Hasil penelitian Mishra (2005) menunjukan  bahwa  pemberian  ekstrak daun mimba dengan dosis 8,4; 11,2; dan 14 mg/kg  BB/hari  mampu  memengaruhi fertilitas mencit betina. Penelitian Hidayah dkk  (2018)  menunjukan  bahwa  dosis optimal yang dapat memengaruhi fertilitas mencit betina adalah 14 mg/kg BB/hari.Pemberian ekstrak etanol 70% biji mimba dengan dosis 10mg/kgBB, 25mg/kgBB,  dan  50mg/kgBB  selama  48 hari  menyebabkan  terjadinya  penurunan berat  testis  (Apolonia,2017).  Penurunan berat  testis  mengidentifikasi  konsentrasi spermatozoa dalam testis berkurang (Adedapo et  al., 2007).  Hasil  penelitian Adebayo et  al. (2008)  menunjukan bahwa ekstrak  etanol  daun  mimba  memengaruhi nilai  GSI  ( Gonadosomatic  Index )  pada tikus  jantan.  Nilai  GSI  pada  hewan  yang diberi perlakuan ekstrak etanol daun mimba dengan dosis 14 mg/kg BB/hari
menunjukan perbedaan bermakna dibandingkan dengan kontrol.
Gonadosomatic  Index merupakan nilai  yang  menunjukkan  perbandingan antara  bobot  testis  dengan  bobot  badan, apabila  nilai  GSI  kecil  maka  bobot  testis rendah.  Testis  adalah  organ  reproduksi yang tersusun atas tubulus seminiferus.Tubulus  seminiferus  tersusun atas  dua  jenis  sel,  yaitu  sel  germinativum
dan  sel  sertoli.Sel  germinativum  sebagian besar  berada  dalam  berbagai  tahap perkembangan spermatogonia (Tash et al. , 2008).  Sel  sertoli  memiliki  ciri  khas berbentuk  piramidal  dengan  dasar  sel melekat  pada  lamina  basalis  dan  ujung apikalnya menjorok ke lumen tubulus. Sel sertoli  ini  terletak  di  antara  sel  sel spermatogenik (Muzakki et al. , 2015).
Proses  spermatogenesis  di  dalam tubulus seminiferus tergantung pada regulasi hormon reproduksi yaitu Luteinzing  hormone (LH)  dan Folicle Stimulating  hormone (FSH).  Sekresi  LH yang  menurun  mengakibatkan  sel  Leydig pada  testis  menghasilkan  lebih  sedikit testosteron. FSH bersamaan dengan testosteron menurunkan rangsangan spermatogenesis  pada  tubulus  seminiferus sehingga sperma yang dihasilkan menurun (Sobti, 2008).
Struktur mikroanatomi tubulus seminiferus testis yang normal menunjukkan kumpulan sel spermatogenik tersusun  berlapis  sesuai  dengan  tingkat perkembangannya dari membran basalis ke arah  lumen  tubulus  yakni  spermatogonia, spermatosit, dan spermatid (Fawcett, 2002). Tash et  al .  (2008)  menyatakan  bahwa senyawa antifertilitas memengaruhi struktur  tubulus  seminiferus  sehingga menyebabkan  perubahan spermatogenic index . Spermatogenic  index adalah  skor yang  menyatakan  keberadaan  berbagai
tingkat  perkembangan  sel  pembentuk spermatozoa.  Ekstrak  etanol  daun  mimba memiliki kemampuan sebagai antifertilitas tetapi  efek  terhadap Spermatogenic  Index testis  mencit  belum  diteliti.  Berdasarkan hal  tersebut  perlu  dilakukan  penelitian mengenai  efek  pemberian  ekstrak  etanol daun mimba terhadap kemampuan reproduksi mencit yang ditunjukkan dengan nilai Spermatogenic Index .

## METODE PENELITIAN
Hewan  uji  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  mencit  ( Mus  musculus L.)  jantan  berusia  3  (tiga)  bulan  dengan rata-rata bobot badan 30-35 g sebanyak 30 ekor.  Sebelum  diberi  perlakuan,  mencit diaklimasi  selama  12  hari  dalam  kondisi laboratorium  yang  terkontrol.  Mencit dipelihara  pada  kandang  terpisah  dengan kepadatan  3  ekor  per  kandang.  Pakan standar HI-PRO-VITE Medicated 594 dan air minum diberikan secara adlibitum.
Pembuatan  ekstrak  etanol  daun mimba dilakukan dengan metode maserasi sesuai  dengan  metode  Fidan et  al. (2008).
Hasil  akhir  ekstraksi  ethanol  daun  nimba berupa serbuk. Ekstrak ethanol daun nimba dibuat  sediaan  bahan  perlakuan  dengan konsentrasi 14mg/kgBB.
Mencit dibagi dalam 2 (dua) kelompok  perlakuan,  yaitu  K  (kelompok kontrol)  dan  P  (kelompok  perlakuan). Kelompok kontrol diberi bahan uji akuades
0,2ml/ekor/hari. Kelompok perlakuan diberi bahan uji esktrak daun mimba dosis 0,2  ml/ekor/hari.  Perlakuan  dilakukan selama 21 hari berturut-turut.
Koleksi  sampel  berupa  organ  testis dilakukan  pada  hari  ke-22  setelah  mencit dipelihara. Mencit dibius dengan kloroform kemudian  dibedah  untuk  diambil  organ testisnya.    Testis  kemudian  dibuatpreparat histologi  dengan  metode  paraffin  dengan ketebalan  sayatan  5  µm  dan  pewarnaan Hematoksilin  dan  Eosin  (H&E)  (Bancroft & Stevens, 1999).
Variabel  yang  diamati  adalah  bobot testis,  diameter  tubulus  seminiferus,  dan Spermatogenic  Index kelompok  kontrol dan kelompok perlakuan. Pengamatan dan pengukuran  diameter  tubulus  seminiferus dan Spermatogenic  Index menggunakan fotomikrograf dengan perbesaran 400x.
Data  yang  diperoleh,  yaitu  rata-rata bobot  testis, diameter tubulus seminiferus, dan Spermatogenic  Index dari  kelompok kontrol  dan  kelompok  perlakuan.  Data dianalisis  dengan  menggunakan  uji  t dengan taraf signifikansi 5%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  mengenai  bobot tubuh,  bobot  testis,  dan  diameter  tubulus seminiferus mencit ( Mus musculus ) jantan setelah  pemberian  ekstrak  etanol  daun mimba disajikan dalam Tabel 4.1.
Sarifudin Avycena et al. : Struktur Tubulus Seminiferus Mencit ( Mus musculus ) Setelah Paparan Ekstrak Etanol Daun Mimba ( Azadirachta indica A.Juss)
Tabel 4.1 Rerata Bobot Tubuh, Bobot Testis, dan Diameter Tubulus Seminiferus Mencit Jantan Setelah Pemberian Ektrak Etanol Daun Mimba
Keterangan: Data disajikan berupa rataan X ± standar deviasi (SD). Rerata yang diikuti superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukan pengaruh tidak nyata (p>0,05) dengan uji t pada taraf kepercayaan 95%. K: kelompok kontrol, P: kelompok perlakuan.
Berdasarkan  uji  t  pada Tabel  4.1 pemberian  ekstrak  etanol  daun  mimba memberi pengaruh tidak signifikan (P>0,05) terhadap bobot tubuh, bobot testis, dan  diameter  tubulus  seminiferus.  Hasil penelitian  ini  menunjukan  pemberian ekstrak etanol daun mimba tidak menyebabkan penambahan maupun penurunan  berat  badan  yang  signifikan. Rata-rata bobot tubuh mencit antara kontrol dan perlakuan tidak berbeda yaitu 35,79 a ±3,28 dan 36,63 a ±3,47. Hasil tersebut  menunjukan  bobot  badan  dalam kisaran  normal.  Penelitan  Kusumawati (2004)  menyatakan  bahwa  bobot  badan mencit normal sekitar 18-36 gram. Sitasiwi et  al. (2017)  menyatakan  bahwa  bobot badan  mencit  jantan  sebesar  30  gram merupakan  bobot  badan  normal  untuk mencit  dewasa.  Penelitian  yangdilakukan oleh  Hasana et  al. (2019)  menyatakan bahwa  pemberian  ekstrak  etanol  daun mimba  dengan  dosis  14  mg/KgBB  tidak mengurangi  bobot  badan  mencit  betina sehingga penelitian ini sekaligus membuktikan  bahwa  efek  ekstrak  etanol
daun  mimba  tidak  tergantung  oleh  hewan uji.
Hasil  uji  t  terhadap  bobot  testis menunjukan  pengaruh  tidak  signifikan (P>0,05). Rerata bobot testis pada kelompok kontrol yaitu 0,85 a ±0,29 sedangkan pada kelompok perlakuan  yaitu 0,83 a ±0,13. Hasil penelitian ini menunjukan bahwa senyawa dalam mimba dengan dosis yang  diberikan  yaitu  14  mg/KgBB  dalam waktu  paparan 21 hari tidak menyebabkan perubahan  bobot  testis.  Hafez  &  Hafez (2009) menyatakan bahwa testis merupakan organ  reproduksi  yang  menghasilkan hormon  testoteron  dan  fungsinya  diatur oleh  hormon  gonadotrophin.  Berdasarkan hal tersebut, bobot testis yang tidak berbeda bermakna diduga disebabkan karena ekstrak etanol daun mimba yang diberikan pada  penelitian  ini  tidak  memengaruhi biosintesa hormon dalam tubuh hewan uji. Hasil  penelitian  tersebut  sesuai  dengan Singh  &  Singh  (2009)  yang  menyatakan bahwa  bobot  testis  tidak  menunjukan perubahan  signifikan  setelah  paparan tanaman yang mengandung senyawa
Variabel
Perlakuan
K P
X ± SD X ± SD Bobot Tubuh (gram) 35,79 a ± 3,28 36,63 a ± 3,47 Bobot Testis (gram) 0,85 a ± 0,29 0,83 a ± 0,13 Diameter Tubulus (µm) 174, 388 a ± 3,28 191,175 a ± 63,34
antifertilitas selama 28 hari. Penelitian Auta &  Hassan  (2016)  juga  menunjukan  bahwa pemberian  ekstrak  daun  mimba  tidak memengaruhi  bobot  testis,  kadar  FSH  dan LH pada dosis 50-100 mg/KgBB.
Penelitian  ini  menunjukan  bahwa senyawa yang terdapat dalam ekstrak daun mimba diduga memengaruhi spermatogenesis  sehingga  memengaruhi nilai  SI.  Fase  dominan  pada  kelompok kontrol  adalah  fase  5  yaitu  fase  dimana terdapat spermatid dengan jumlah 50 buah. Fase  dominan  pada  kelompok  perlakuan yaitu  fase  4  dengan  jumlah  spermatid kurang lebih 25 buah ( Lampiran 1 ).
Tubulus  seminiferus  pada  kelompok kontrol  tidak  ditemukan  fase  1  sedangkan pada kelompok perlakuan ditemukan fase 1. Tash et  al. (2008)  menyatakan  bahwa senyawa  antifertilitas  dapat  menurunkan nilai SI. Hasil penelitian ini pada kelompok kontrol didominasi oleh fase 5, sedangkan
kelompok perlakuan didominasi oleh fase 4 tetapi  ditemukan  2  (dua)  sampel  tubulus seminiferus  dengan  fase  1  sehingga  dapat dikatakan spermatogenesis kelompok perlakuan dalam kondisi abnormal.
Hal  tersebut  sesuai  dengan  pendapat Akbar  (2016)  yang  menyatakan  bahwa tubulus seminiferus yang normal didominasi  oleh  fase  5  atau  6  sedangkan tubulus  seminiferus  abnormal  didominasi fase  1.  Perbandingan  struktur  tubulus seminiferus disajikan pada Gambar 4.1 .
Hasil  uji  t  terhadap  diameter  tubulus seminiferus  menunjukan  pengaruh  tidak signifikan (P>0,05). Rerata diameter tubulus seminiferus kelompok kontrol yaitu 174,388 a ±  3,28  sedangkan  kelompok perlakuan  191,175 a ±  63,34.  Hal  tersebut membuktikan  bahwa  senyawa  antifertilitas dalam ekstrak daun mimba tidak menyebabkan  perubahan  ukuran  diameter tubulus seminiferus.
Gambar 4.1. Fase Spematogenic Index tubulus seminiferus mencit ( Mus musculus ) jantan. Pewarnaan HE dengan perbesaran 400x.
Keterangan: (A) Fase 5, (B) Fase 1, (a) spermatogonia, (b) spermatosit, (c) spermatid, (d) sel sertoli
Sarifudin Avycena et al. : Struktur Tubulus Seminiferus Mencit ( Mus musculus ) Setelah Paparan Ekstrak Etanol Daun Mimba ( Azadirachta indica A.Juss)
Hafez  &  Hafez  (2009)  menyatakan bahwa massa utama penyusun testis adalah tubulus  seminiferus  sehingga  bobot  testis dalam  penelitian  ini  sejalan  dengan diameter  tubulus  seminiferus  ( Tabel  4.1 ).
Hasil penelitian Apolonia (2017) menunjukan  bahwa  ekstrak  etanol  daun mimba  dengan  dosis  100  mg/KgBB berpengaruh signifikan terhadap penurunan diameter tubulus seminiferus mencit jantan. Hasil  penelitian  ini  tidak  menunjukan bedayang  signifikan,  diduga  disebabkan oleh perbedaan konsentrasi bahan uji yang diberikan lebih kecil dari konsentrasi yang diberikan oleh Apolonia (2017).

## KESIMPULAN
Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa ekstrak etanol daun mimba dengan dosis 14 mg/KgBB  dengan  waktu  paparan  21  hari mempengaruhi Spermatogenic Index mencit  jantan  sehingga  dapat  disimpulkan bahwa  ekstrak  tersebut  memiliki  potensi sebagai  senyawa  antifertilitas  pada  hewan jantan.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  Fakultas
Sains dan Matematika Universitas Diponegoro melalui No.1754 I/UN7.5.8/PG/2018 pada tahun 2018.

## DAFTAR PUSTAKA
Adebayo  AO,  BO  Oke  &  AK  Akinloye. 2009. Characterizing the Gonadosomatic Index and its relationship with age in Greater Cane Rat ( Thryonomys swinderianus, Temminck). J. Vet. Anat , 2(2): 53-59. Adedapo AA, Omoloye OA & Ohore OG. 2007.  Studies  on  the  toxicity  of  an aqueous extract of the leaves of abrus precatorius  in  rats.  Onderstepoort J Vet Re, 74:31-36.
Akbar  MA.  2016.  Pengaruh  paparan insektisida  bakar  bentuk  lingkar  dan insektisida cair terhadap
spermatogenesis tiskus sprague dawley  dilihat  secara  histopatologis .
Jurnal Media Medika Muda, 2(1): 4-
8.
Apolonia M & Sukajarti S. 2017. Pengaruh ekstrak  biji  Pepaya  ( Carica  papaya L.) dan ekstrak daun Mimba ( Azadirachta  indica A.Juss) terhadap diameter  tubulus  seminiferus,  sel leydig  dan  bobot  testis  Mencit  ( Mus musculus ). Stigma Journal of Science, 10(1): 5-11.
Auta T & AT Hassan. 2016. Reproductive toxicity  of  aqueous  woodash  extract of  (neem)  a  review. Annals  of Biological Researc, 1(2): 108-113. Bancroft JD & Alan Stevens. 1999. Theory and practice of Histological techniques . London: Pearson
Profesional Limited.
Fawcett  DW.  2002 .  Buku  ajar  Histologi. 12 th ed  Trans  Tambayong  J .  Jakarta:
Penerbit Buku Kedokteran.
Fidan  AF,  Enginar  H,  Cigerci  IH,  Korcan SE  &  Ozdemir  A.  2008.  The radioprotective  potential  of Spinacia oleracia and Aesculuc hippocastanum against  ionizing  radiation  with  their antioxidant and antiomicrobial properties. J Animal Vet Adv , 7 (12): 1528-1536.
Hafez B & ESE Hafez. 2009. Reproduction in  farm  animals.  7th  Edition .  Wiley online  Library.  Published  online  22 Jan 2016.
Hasana  AN,  AJ  Sitasiwi  &  S  Isdadiyanto. 2019.  Hepatosomatik  indeks  dan diameter  hepatosit  Mencit  ( Mus musculus L.)  Betina  setelah  paparan ekstrak etanol daun Mimba ( Azadirachta  indica Juss.). Jurnal Pro-life, 1(6).
Hashmat  I,  H  Azad  &  A  Ahmed.  2012.
Neem ( Azadirachta indica A. Juss)- A Nature's  Drugstore:  An  overview. International  Research  Journal  of Biological Sciences 1(6): 76-79.
Hidayah  N,  AJ  Sitasiwi  &  SM  Mardiati.
2018.  Efek  ekstrak  etanol  daun
Mimba terhadap Gonadosomatic Index  (GSI),  jumlah  dan  ukuran folikel  atresia  pada  Mencit  Betina. Jurnal Pro Life, 5(2).
Koriem KMM. 2013. Review on pharmacological  and  toxicologyical effects of oleum azadirachti oil. Asian Pac J Trop Biomed , 3(10): 834-840.
Kusumawati D, AK Dewi & B. Hermanto. 2004. Pengaruh pemberian triheksifenidil  dosis  bertingkat  per oral terhadap diameter lumen tubulus ginjal Mus musculus . Ejki, 5(3): 151- 154.
Mishra  RK.  2005.Effect  of  Aquaeous  leaf extract  of Azadirachta  indica on  the reproduction  organs  in  male  mice.
Indian J Exp boil, 2005.
Muzakki  LD  &  RB  Witjahyo.  2015.
Pengaruh  pemberian  susu  kambing terhadap gambaran mikroskopis testis dan  kadar  timbal  (PB)  dalam  darah Tikus  Wistar  yang  terpapar  asap kendaraan  bermotor. Media  Medika
Muda , 4 (4). Oktober 2015.
Pankaj  S,  T  Lokeswar,  B  Mukesh  &  B Vishnu.  2011.  Review  on  Neem ( Azadirachta  indica ):  A  thousand problem  one  solution. International Research Journal of Pharmacy , 2(12): 97-102.
Priya  G,  Saravanan  S  &  C  Renuka.  2012. Medinical plants with potential antifertility  activity-A  review  of sixteen  years  of  herbal  medicine research  (1994-2010). Int.J  Pharm tech Res, 4: 485-488.
Sharma RK, AK Goyal  & RA Bhat. 2013.
Antifertility  of  plants  extracts  on female reproduction: A Review. IJBS , 3 (3): 493-514.
Singh  A  &  Shio  Kumar  Singh.  2009.
Evaluation of antifertility potential of Brahmi in male mouse. Contraception,  79  (2009)  71–79: Elsevier. Sitasiwi AJ, S Isdadiyanto & SM Mardiati. 2017.The Estradiol 17-β concentration  in  Mice  after  treated with ethanolic leaf extract of Azadirachta indica (Neem). Proceeding of International
Conference  on  Global  Resource  and Conservation .
Sobti  RC.  2008. Animal  Physiology .  New Delhi: Narosa Publishing House.
Suryawanshi  JAS.  2011.  Neem-natural contraceptive for male and female- an overvier. Int.  Journal  Biomol  dan Biomed, 1: 1-6 .
Tash  JS,  A  Barbara,  AH  Sheri  &  C Ramappa,  2008.    Carboxylic  acid derivative  blocks  spermatogenesis and  is  contraceptive  in  rats  after  a single oral Dose: Biology of Reproduction, 78: 1127–1138.