## Penetapan  Kadar  Tetrasiklin  dalam  Air  Limbah  dengan  High Performance  Liquid  Chromatography-Photodiode  Array  Detector (HPLC-PDA)
(Determination  of  Tetracycline  in  Wastewater  Samples  by  High  Performance  Liquid Chromatography-Photodiode Array Detector (HPLC-PDA))
Sanjayadi 1* , Laurentia Brenda Violita 1 1* Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya, Jakarta, Indonesia. E-mail: sanjayadi@atmajaya.ac.id
Article Info: Received: 23 April 2020 in revised form: 11 Mei 2020 Accepted: 27 Juli 2020
Available  Online:  30  September 2020

## ABSTRACT
Tetracycline  is  an  antibiotic  that  widely  used  for  human  treatment  and veterinary.  Tetracycline  is  also  known  as  one  of  the  persistent  antibiotics in  environment.  This  study  aims  to  develop  and validate  analysis  method for  tetracycline  in  wastewater  samples  and  use  this  method  to  determine tetracycline  concentration  in  wastewater  samples.  The  analysis  is  carried out by extracting samples using SPE C18 and tetracycline was determined by  using  high-performance  liquid  chromatography  equipped  with photodiode  array  (HPLC-PDA)  detector  that  has  been  optimized  and validated. The result of this study revealed that the developed method was valid enough to determine tetracycline in the range of 0.21  – 3.16 µg/mL showed  by  the  correlation  coefficient  of  0.999,  limit  detection  and quantification  of  0.102  µg/mL  and  0.340  µg/mL  respectively,  precision (RSD)  of  5.2  –  5.6%  (intra-day)  and  4.8  –  5.7%  (inter-day)  respectively and  accuracy  (%  recovery)  of  94.6%.  This  study  shows  that  tetracycline was not detected in the analyzed wastewater samples.
Keywords : Tetracycline HPLC-PDA
Environment
Waters
Tropical
Corresponding Author: Sanjayadi Faculty of Medicine and Health
Sciences Atma Jaya Catholic University of Indonesia Jakarta 14440
Indonesia
email: sanjayadi@atmajaya.ac.id
Copyright © 2019 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.
How to cite (APA 6 th Style):
Sanjayadi,  Violita,  L.  B.  (2020).  Penenetapan  Kadar  Tetrasiklin  dalam  Air  Limbah  dengan  High  Performance  Liquid Chromatography-Photodiode  Array  Detector  (HPLC-PDA). Jurnal  Farmasi  Galenika  :Galenika  Journal  of  Pharmacy, 6 (1), 237-242. doi:10.22487/j24428744.2020.v6.i2.15066
Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy) 2020; 6 (2): 237 – 242 ISSN : 2442-8744 (electronic); 2442-7284 (printed) Journal Homepage: https://bestjournal.untad.ac.id/index.php/Galenika DOI: 10.22487/j24428744. 2020.v6.i2.15066

## ABSTRAK
Tetrasiklin merupakan antibiotik yang banyak digunakan baik untuk pengobatan pada manusia maupun veteriner serta  merupakan  salah  satu  antibiotik  yang  persisten  di  lingkungan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengembangkan  dan  memvalidasi  metode  analisis  tetrasiklin  dalam  sampel  air  limbah  dan  menggunakannya untuk menetapkan kadar tetrasiklin dalam sampel air limbah.  Analisis dilakukan dengan mengekstraksi sampel menggunakan  SPE  C18  dan  dilanjutkan  tahap  determinasi  menggunakan  metode High  Performance  Liquid Chromatography yang  dilengkapi  dengan  detektor  foto-dioda ( HPLC-PDA)  yang  sebelumnya  telah  dioptimasi dan  divalidasi.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  metode  analisis  yang  dikembangkan  cukup valid  pada kisaran  konsentrasi  tetrasiklin  0,21  –  3,16  µg/mL  yang  ditunjukkkan  dengan  koefisien  korelasi  sebesar  0,999, batas deteksi dan kuantifikasi berturut-turut 0,102 µg/mL dan 0,340 µg/mL dengan kepresisian ( RSD ) 5,2 - 5,6% dan 4,8 - 5,7% (berturut-turut intra-day dan inter-day ) serta keakuratan (persen perolehan kembali) 94,6%. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa tetrasiklin tidak terdeteksi dalam sampel air limbah yang dianalisis.
Kata kunci: Tetrasiklin; HPLC-PDA; lingkungan; air; tropis

## 1.  PENDAHULUAN
Antibiotik  adalah  obat  antimikroba  yang  membunuh  atau  menghambat  pertumbuhan  bakteri. Antibiotik  telah  digunakan  dalam  jumlah  besar  selama  beberapa  dekade  dan  resistensi  patogen terhadap antibiotik telah lama menjadi titik fokus penelitian klinis dan, dalam beberapa tahun terakhir, dalam  penelitian  lingkungan.  Senyawa  induk  dari  antibiotik,  atau  metabolitnya,  dapat  cukup  stabil sehingga  dapat  lolos  selama  proses  pengolahan  air  dan  masuk  ke  lingkungan  (Kümmerer,  2009). Meskipun telah mengalami pengenceran dengan faktor pengenceran lebih dari satu juta dibandingkan dengan  konsentrasi  dalam  tubuh  manusia  (Jjemba,  2006),  antibiotik  yang  tersebar  di  lingkungan mempunyai konsekuensi penting bagi kesehatan manusia dan ekosistem.
Ada  tiga  jalur  utama  untuk  antibiotik  ke  perairan  air  tawar:  (1)  limbah  dari  IPAL,  (2)  pabrik  kimia serta  (3)  peternakan  dan  akuakultur  (Kümmerer,  2009;  Singer et  al., 2016).  Diperkirakan  konsumsi antibiotik  di  seluruh  dunia  berkisar  antara  100.000  dan  200.000  ton  per  tahun,  dengan  sekitar  50% digunakan  untuk  kedokteran  hewan  dan  sebagai  pemacu  pertumbuhan.  Konsumsi  antibiotik  global oleh manusia meningkat sebesar 36% antara tahun 2000 dan 2010 yang menggambarkan bahwa polusi antibiotik adalah masalah yang terus bertambah (Van Boeckel et al. , 2014).
Residu  antibiotik  yang  mengkontaminasi  air  tanah  mempunyai  resiko  menyebabkan  toksisitas langsung  pada manusia yang  meminum  air  tersebut  (Martinez,  2009).  Residu  antibiotik  yang  berada dalam tanah ditengarai dapat mengganggu kesetimbangan ekosistem mikrobia dalam tanah, terutama mikrobia  fiksasi  nitrogen  yang  menyediakan  unsur  hara  dalam  tanah,  sehingga  mempengaruhi kesuburan  tanah.  Dampak  lain  yang  saat  ini  menjadi  perhatian  adalah  kemungkinan  terjadinya resistensi  mikroba  terhadap  antibiotik  akibat  adanya  residu  antibiotik  di  lingkungan,  khususnya lingkungan  perairan.  Beberapa  gen  resisten  mikroba  patogen  pada  manusia  dan  hewan  berasal  dari bakteri tidak berbahaya di lingkungan (Wellington et al , 2013; Finley et al ., 2013; Gaze et al ., 2013). Keberadaan  residu  di  lingkungan  perairan  telah  banyak  dilaporkan  di  beberapa  negara,  namun demikian  data  adanya  antibitiok  di  lingkungan  perairan  daerah  tropis  masih  sangat  terbatas.  Oleh karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengembangkan  metode  analisis  antibiotik,  khususnya tetrasiklin,  dalam  matriks  air  dan  mengaplikasikannya  untuk  menetapkan  kadar  antibiotik  tersebut dalam  sampel  air  limbah.  Tetrasiklin  dipilih  karena  merupakan  antibiotik  yang  sering  digunakan  di Indonesia  yang  merupakan  daerah  tropis.  PDA  dapat  mendeteksi  pada  rentang  panjang  gelombang tertentu  secara  bersamaan sehingga  mampu menyajikan  kromatogram  dalam  bentuk  3  dimensi.  Oleh karena  itu  detektor  ini  juga  dapat  memberikan  informasi  kemurnian  puncak.  Sementara  itu,  jika menggunakan detektor UV-Vis, maka ketidakmurnian puncak tidak dapat teramati.

## 2.  METODE PENELITIAN

## 2.1.  Alat dan Bahan
HPLC  yang  digunakan  LC-20AD  Prominance  LC  (Shimadzu)  yang  dilengkapi  detektor  foto-dioda (PDA)  SPD-M20A  Prominance  LC  (Shimadzu)  dengan  kolom  Triart-C8  (150,0  x  6,0  mm,  5  uM) (YMC).  Tetrasiklin  kualitas  analisis  (Sigma  Aldrich),  monosodium  fosfat  dan  asam  fosfat  kualitas analisis  (Merck),  asetonitril  kualitas  HPLC  (Merck),  air  bebas  ion  merupakan  air  yang  dimurnikan dengan  menggunakan  Elga  water  deionizer,  SPE  C18  (Waters).  Sampel  air  limbah  merupakan  air selokan yang diperoleh dari selokan yang berada di sekitar Rumah Sakit Atma Jaya, Jakarta.

## 2.2.   Metode

## Pembuatan larutan stok standard tetrasiklin
Stok  larutan  tetrasiklin  dibuat  dengan  konsentrasi  0,75  mg/mL  dalam  air  bebas  ion,  disimpan  dalam lemari  pendingin  pada  suhu  4 o C,  terhindar  dari  cahaya  dan  digunakan  paling  lama  48  jam  setelah dibuat.  Larutan  stok  ini  digunakan  untuk  melakukan  validasi  metode  analisis  yang  digunakan  yang meliputi rentang dan linearitas, batas deteksi dan kuantifikasi, presisi (repeatibilitas, reprodusibilitas) serta akurasi.

## Optimasi HPLC-PDA
Dilakukan pada termperatur ruangan. Fase gerak (A) buffer fosfat dengan konsentrasi 1x10 -2 M dalam air dan (B) asetonitril. Optimasi dilakukan dengan mengubah pH buffer fosfat yaitu 2, 4 dan 6 serta mengatur  perbandingan  buffer  fosfat  dan  asetonitril.  Kecepatan  fase  gerak  1  mL/menit  dan  volume injeksi  20  uL.  Deteksi  dengan  detektor  PDA  pada  panjang  gelombang  antara  290-400  nm  (panjang gelombang maksimum untuk kuantifikasi 350 nm).

## Validasi Metode Analisis
Validasi  metode  analisis  yang  digunakan  yang  meliputi  rentang  dan  linearitas,  batas  deteksi  dan kuantifikasi mengikuti Miller dan Miller (2010), presisi (repeatibilitas, reprodusibilitas) serta akurasi mengikuti Latimer (2016).

## Pengambilan dan Preparasi Sampel
Metode  yang  telah  tervalidasi  digunakan  untuk  mendeterminasi  tetrasiklin  dalam  sampel  air  limbah berupa  air  selokan  yang  berada  dekat  Rumah  Sakit  Atma  Jaya  Jakarta.  Air  dikumpulkan  dengan menggunakan botol kaca coklat. Satu liter sampel disaring dan diekstraksi menggunakan SPE C18 dan menyaring fraksi metanol (5,0 mL) dengan membran filter 0,45 µm. Sebagai kontrol positif, dilakukan juga penambahan larutan stok standard tetrasiklin pada sampel air yang digunakan.

## 3.  HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1.   VALIDITAS METODE ANALISIS
Hasil  optimasi  determinasi  tetrasiklin  dalam  sampel  yang  telah  dilakukan  dalam  penelitian  ini ditunjukkan oleh Tabel 1. Terlihat bahwa kondisi optimal tercapai pada penggunaan fase gerak berupa campuran  buffer  fosfat  dengan  pH  2  (1x10 -2 M)  dalam  air  dan  asetonitril  dengan  perbandingan  75:25 (v/v) yang ditunjukkan oleh nilai efisiensi yang cukup tinggi yaitu sekira 4700 dan bentuk puncak yang simetris  dengan  nilai tailing  factor 1,06.  Kondisi  HPLC  pada pH  yang  sama  dengan  perbandingan  air dan  asetonitril  80:20  (v/v)  juga  memiliki  nilai  efisiensi  yang  cukup  tinggi,  namun  karena  nilai  faktor retensi  yang  lebih  besar  maka  menyebabkan  kurang  simetrisnya  puncak  yang  terbentuk  yang ditunjukkan oleh nilai tailing factor sebesar 1,67.
Tabel 1. Hasil optimasi fase gerak untuk determinasi tetrasiklin dengan HPLC-PDA
pH buffer  Konsentrasi asetonitril (% v/v) Waktu retensi (menit) Faktor retensi Efisiensi Tailing factor tanpa buffer 20 4.2 2.05 6782 2.19 25 2.8 1.05 3836 0 30 2.2 0.59 NA * NA * 2 20 4.7 2.48 4780 1.67 25 3.1 1.32 4706 1.06 30 2.4 0.74 NA * NA * 4 20 4.2 2.08 4301 1.32 25 2.6 0.94 4503 1.09 30 2.1 0.54 NA * NA * 6 20 3.5 1.58 5420 1.11 25 2.3 0.72 NA * NA * 30 2.1 0.57 NA * NA *
Keterangan. NA * : tidak dapat ditentukan
Pada  sistem  HPLC-PDA  yang  digunakan,  waktu  retensi  tetrasiklin  adalah  ±  3,1  menit  seperti  yang ditunjukkan oleh Gambar 1.

## Gambar 1. Kromatogram standar tetrasiklin.
Linearitas  metode  determinasi  tetrasiklin  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa terdapat  hubungan  yang  linear  antara  konsentrasi  tetrasiklin  dan  respon  alat  yaitu  luas  puncak tetrasiklin  pada  rentang  konsentrasi  0,21  –  3,16  µg/mL  yang  mengikuti  persamaan  garis  lurus  Y  = (25162,1±885,4)X + (1483,4±1385,1) dengan nilai koefisien korelasi ( r ) 0,999 pada batas kepercayaan 95%.
Batas determinasi  dan  kuantifikasi  metode  pengukuran  tetrasiklin  dengan menggunakan  HPLC-PDA yang  digunakan  berturut-turut  adalah  0,102  µg/mL  dan  0,340  µg/mL  yang  ditentukan  dengan menggunakan  metode  Miller  and  Miller  (2010)  menunjukan  bahwa  metode  yang  digunakan  cukup sensitif untuk mengukur tetrasiklin dalam sampel.
Presisi  ( RSD )  metode  pengukuran intra-day dan inter-day berturut turut  adalah 5,2  -  5,6%  dan  4,8  - 5,7% yang menunjukkan bahwa metode yang digunakan masih cukup presisi pada rentang kadar yang
diukur. Pada penelitian ini, diperoleh nilai persen perolehan kembali 94,6% yang menunjukkan bahwa metode yang digunakan cukup akurat pada rentang kadar yang diukur (Latimer, 2016).

## 3.2.   ANALISIS SAMPEL AIR LIMBAH
Hasil  pengukuran  tetrasiklin  yang  dilakukan  menunjukkan  bahwa  tetrasiklin  tidak  terdeteksi  dalam sampel air selokan yang dianalisis (Gambar 2).
Gambar 2. Kromatogram sampel air selokan.
Untuk memastikan bahwa metode ini dapat digunakan untuk mendeteksi tetrasiklin dalam sampel air yang digunakan, maka dalam penelitian ini juga dilakukan analsisi sampel air selokan yang ditambah dengan tetrasiklin dan hasilnya ditunjukkan oleh Gambar 3. Hal ini dapat membuktikan bahwa metode ini dapat digunakan untuk menganalisis tetrasiklin dalam sampel dalam air selokan tersebut.
Gambar 1. Kromatogram sampel air dengan penambahan tetrasiklin 0,52 µg/mL.

## 4.  KESIMPULAN
Dari  penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  metode  analisis  tetrasiklin  yang  dikembangkan  dalam penelitian  ini  layak  digunakan  untuk  menetapkan  konsentrasi  tetrasiklin  dalam  matrik  air  yang digunakan.  Penelitian  ini  juga  menunjukkan  bahwa  tetrasiklin  tidak  terdeteksi  dalam  sampel  air selokan yang diamati dengan metode analisis yang digunakan. Selanjutnya perlu untuk dikembangkan metode analisis yang lebih sensitif untuk mendeteksi tetrasiklin di lingkungan perairan.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan anggaran penelitian Unika Atma Jaya melalui Lembaga Penelitian  dan  Pengabdian  kepada  Masyarakat  Unika  Atma  Jaya  (LPPM  Unika  Atma  Jaya).  Penulis mengucakan  terima  kasih  kepada  LPPM  Unika  Atma  Jaya  dan  Pusat  Penelitian  Kesehatan  Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Unika Atma Jaya.

## DAFTAR PUSTAKA
Finley, R. L., Collignon, P., Larsson, D. G. J., McEwen, S. A., Li, X. Z., Gaze, W. H., et al. (2013). The scourge of antibiotic resistance: the important role of the environment. Clinical Infectious Diseases , 57:704–10.
Gaze, W.  H.,  Krone,  S. M.,  Larsson,  D.  G.  J.,  Li,  X. Z.,  Robinson, J.  A.,  Simonet,  P.,  et  al. (2013). Influence  of  humans  on  evolution  and  mobilization  of  environmental  antibiotic  resistome. Emerging Infectious Diseases , 19:7.
Jjemba, P. K., (2006). Excretion and ecotoxicity of pharmaceutical and personal care products in the environment. Ecotoxicology and Enviromental Safety , 63, 113–130.
Kümmerer, K. (2009). Antibiotics in the aquatic environment–a review–part I, Chemosphere , 75, 417– 434.
Latimer, G. W. Jr. (2016). Official Methods of Analysis of AOAC International (20 th ed.). Maryland, USA: AOAC International.
Martinez,  J.  L.  (2009).  The  role  of  natural  environments  in  the  evolution  of  resistance  traits  in pathogenic bacteria. Proceedings  of the Royal Biol Society B: Biologycal Sciences , 276:2521– 30.
Miller,  J.  N.,  Miller,  J.  C.  (2010). Statistics  and  Chemometrics  for  Analytical  Chemistry (6 th ed.).
Gosport, UK: Pearson Education Limited.
Singer,  A.  C.,  Shaw,  H.,  Rhodes,  V.,  Hart,  A..  (2016).  Review  of  antimicrobial  resistance  in  the environment and its relevance to environmental regulators. Frontiers in Microbiology , 7, 1–22.
Van Boeckel, T. P., Gandra, S., Ashok, A., Caudron, Q., Grenfell, B. T., Levin, S. A., Laxminarayan, R. (2014). Global antibiotic consumption 2000 to 2010: an analysis of national pharmaceutical sales data. Lancet Infectious Diseases , 14, 742–750.
Wellington,  E.  M.  H.,  Boxall,  A.  B.  A.,  Cross,  P.,  Feil,  E.  J.,  Gaze,  W.  H.,  Hawkey,  P.  M.,  et  al. (2013). The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram- negative bacteria. Lancet Infectious Diseases , 13:155–65.