Analisa Flow Cytometry pada Subpopulasi Sel T-Limfosit Bursa Fabricius Ayam Pedaging Pasca Infeksi Salmonella typhimurium dan Pemberian Pakan Tambahan

## Polyscias obtusa
Septi Utami Dewi 1 , Mochammad Sasmito Djati 1 , Muhaimin Rifa’i 1
1 Jurusan Biologi, Universitas Brawijaya Malang Alamat korespondensi : septiutamidewi@gmail.com

## ABSTRAK
Tujuan  penelitian    ini  adalah  mengetahui  adanya  aktivitas  imunomodulator  daun  Polyscias  obtusa  pada organ bursa fabricius ayam  pedaging  yang terinfeksi bakteri Salmonella typhimurium, serta mengetahui dosis optimum penambahan daun Polyscias obtusa dalam  mempengaruhi jumlah subpopulasi T-limfosit pada organ bursa fabricius ayam pedaging yang terinfeksi Salmonella typhimurium. Prosedur kerja yang dilakukan  adalah  konfirmasi  isolat  bakteri  Salmonella  typhimurium,  pemberian  daun  Polyscias  obtusa, infeksi bakteri Salmonella typhimurium, pembedahan, isolasi sel, analisis Flow  Cytometri, analisis data. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  Pemberian  pakan  alami  dengan  tambahan  daun  Polyscias  obtusa dengan variasi dosis 0,08%, 0,16%, tidak memberikan pengaruh terhadap jumlah relatif CD8 + dan B220 + pada Bursa fabricius. Sehingga, tidak ada perbedaan yang signifikan antara pakan pabrik dan pakan alami dengan  tambahan  daun  Polyscias  obtusa..  Namun,  pada  dosis  0,26  %  fase  finisher  terlihat  peningkatan jumlah  relatif  sel  CD4 + yang  siginifikan  dibandingkan  fase  starter.  Dapat  disimpulkan  bahwa,  dosis 0,26% merupakan dosis optimum dalam meningkatkan proses proliferasi jumlah sel CD4 + sebagai agen imunomodulator pada bursa fabricius ayam pedaging.
Kata  kunci  :    Ayam  pedaging,  bursa  fabricius,  flow  cytometry,      Polyscias  obtusa,  Salmonella typhimurium typhymurium

## ABSTRACT
This  study  aimed  to  determine  the  development  of  T  lymphocytes  from  bursa  fabricius  of  broiler  that have  been  given  additional  feed  Polyscias  obtusa  after  infected  Salmonella  typhimurium  and  determine the  optimum  dose  of  the  addition  of  leaf  Polyscias  obtusa  in  influencing  the  number  of  T-lymphocyte subpopulations  in  organ  bursa  fabricius  Salmonella  thypimurium  infected  broiler.  The  procedure  is  the confirmation  of  the  Salmonella  typhimurium  isolates,  giving  the  leaves  Polyscias  obtusa,  Salmonella typhimurium  bacterial  infections,  surgery,  cell  isolation,  Flow  Cytometry  analysis,  data  analysis.  The results  showed  that  natural  feeding  with  additional  Polyscias  obtusa  leaves  with  a  dose  variation  of 0.08%, 0.16%, does not give effect to the relative amount, CD8 + and B220 + on the Bursa fabricius. There wasn’t significant between the feed mill and natural food with Polyscias obtusa. Dose of 0.26% proved to increase the relative number of CD4 + cells significantly in organ bursa fabricius. The results of CD4 + T cell activation would play an important role in establishing and maximizing the body's immune system.
Keywords :  broiler, bursa fabricius, flow cytometry, Polyscias obtusa,  Salmonella typhimurium

## PENDAHULUAN
Indonesia  merupakan  negara  dengan sentra  peternakan  hewan  unggas  yang  cukup tinggi, salah satunya adalah sentra peternakan ayam  pedaging  (broiler).  Pakan  ayam pedaging  pada  umumnya  tersusun  atas kebutuhan pertumbuhan, energi, dan membantu sistem metabolisme serta meningkatkan  ketahanan  tubuh  ayam.  Oleh sebab itu, para peternak ayam pedaging selalu memberikan  vaksin  dan  antibiotika  untuk mengurangi penyakit-penyakit tersebut. Namun,  beberapa  vaksin  dan  antibiotika
merupakan  zat  bioaktif  yang  memiliki dampak  negatif  pada  kesehatan  konsumen daging ayam [1]. Sehingga diperlukan adanya alternatif untuk melindungi kesehatan konsumen  dari  efek  samping  penggunaan vaksin dan zat antibiotika.
Pakan  alternatif  ini  diharapkan  dapat meningkatkan  sistem  kekebalan  tubuh  ayam. Pakan alternatif tersebut adalah daun Kedondong  Laut  (Polyscias  obtusa)  yang merupakan  salah  satu  obat  herbal  dengan kandungan senyawa polysciosida [2].
Senyawa  tersebut  memiliki  peran  dalam sistem imunitas dan humoral serta merupakan
senyawa dari kelompok asam oleanic saponin. Saponin adalah senyawa yang berperan dalam proses  mengalirnya  nutrisi  pada  hewan  dan manusia.  Saponin  juga  diketahui  dapat berperan  dalam  permeabilitas  membran, sebagai imunostimulan, agen karsinogen, dan hypocholesterolaemic [3].
Selain  saponin,  terdapat  pula  flavonoid. Senyawa  flavonoid  dikenal  berperan  sebagai agen imunomodulator, antiviral dan antioksidan.  Senyawa  flavonoid  juga  diduga dapat memacu
proliferasi limfosit, meningkatkan jumlah sel T dan meningkatkan aktivitas IL-2 [4] Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan  dengan  menggunakan  hewan  coba mencit dan terinfeksi Salmonella
typhimurium,  khasiat  daun  Polyscias  obtusa dapat  memobilisasi  haematopoetic  stem  cells [5].  Oleh    karena  itu,  penelitian  ini menggunakan  hewan  coba  ayam  pedaging (broiler)  agar  lebih  aplikatif  dan  mengetahui secara spesifik pada organ bursa fabricius.
Pendewasaan  limfosit  B  terjadi  di  bursa fabricius  pada  unggas,  sedangkan  pada mamalia  terjadi  di  hati  fetus,  tonsil,  usus buntu  dan  jaringan  limfoid  dalam  dinding usus. Pendewasaan limfosit T terjadi di organ timus  [6].  Sehingga  diharapkan  dapat diperoleh informasi mengenai aktifitas haematopoetic  stem  cell  (CD4 + ,  CD8 + , B220 + ) dengan
infeksi Salmonella typhimurium  dan  diamati  modulasi  serta perkembangan imunitas seluler.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Percobaan  ini  dilakukan  pada  Maret-
September 2012 di laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Fisiologi Hewan,
Fakultas  MIPA,  Jurusan  Biologi,  serta Laboratorium  Lapang  Sumber  Sekar-DAU Fakultas  Peternakan,  Universitas  Brawijaya, Malang.

## Deskripsi Hewan Coba dan Estimasi Besar Sampel
Hewan  coba  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  DOC  broiler  strain Lohman  varian  platinum. Ayam  akan dipelihara  selama  1  bulan.  Penelitian  ini menggunakan  5  perlakuan  dengan  setiap
perlakuan    3  ulangan,  dan  masing-masing ulangan  di  duplo.  Sehingga  jumlah  seluru seluruh  sampel  ayam  yang  digunakan  adalah 60 ekor.
Deskripsi Perlakuan dan Rancangan Percobaan
Penelitian  ini  menggunakan  rancangan acak  kelompok  yang  terdiri  dari  5  perlakuan dengan  3  ulangan  pada  masing-masing perlakuan seperti pada tabel berikut:
Tabel 3.1. Rancangan Kelompok perlakuan Perlakuan Kelompok Starter  Finisher Pakan Pabrik A1B1 (T0) A1B2 (T0) Pakan Pabrik+ Salmonella thypimurium A2B1 (T1) A2B2 (T1) Polyscias obtusa (0,08%) + Salmonella thypimurium A3B1 (T2) A3B2 (T2) Polyscias obtusa(0,16%) +  Salmonella thypimurium A5B1 (T3) A5B1 (T3) Polyscias obtusa (0,26%) + Salmonella thypimurium A7B1 (T4) A7B2 (T4)

## Pemberian Daun Polyscias obtusa
Bagian  tanaman  Polyscias  obtusa  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  daun dewasa.  Daun  Polyscias  obtusa  kemudian dicuci  dan  dikering  anginkan.  Kemudian dihaluskan  menggunakan  blender  kering. Hasil  tersebut  kemudian  disaring.  Bubuk Polyscias obtusa ditimbang untuk selanjutnya digunakan sebagai campuran pakan tambahan ayam pedaging.

## Infeksi bakteri Salmonella typhimurium
Salmonella  typhimurium  yang  telah dikonfirmasi sebelumnya dan disimpan dalam medium  NA  miring  ditumbuhkan  pada medium cair NB dan diinkubasi selama 1 x 24
jam.  Medium  NB  baru  tersebut  dihitung jumlah  sel  bakteri  tiap  1  jam  untuk mendapatkan  jumlah  sel  bakteri  10 8 sel/ml.
Perhitungan sel dilakukan dengan menggunakan haemocytometer. Biakan bakteri yang telah difiksasi dengan menggunakan    larutan  formalin  4%,  dihitung dengan menggunakan haemocytometer. Berdasarkan  perhitungan  tersebut  diperoleh jumlah  sel  bakteri  sebanyak  727  sel/ml. Selanjutnya  dilakukan  sentrifuse  dengan kecepatan  10.000  rpm  selama  10  menit  pada suhu 25 0 C. Pellet yang diperoleh diresuspensi dengan  larutan  garam  fisiologis  NaCl  0,9%. Suspensi  trsebut  kemudian  diinfeksikan  pada broiler yang digunakan pada percobaan.

## Pembedahan
Kegiatan  ini  dibagi  menjadi  2  yaitu  satu kali  pada  fase  starter  dan  satu  kali  pada  fase finisher.  Pada  fase  starter  pembedahan dilakukan  pada  saat  ayam  berumur  17  hari. Selanjutnya  pada  fase  finisher  ayam  dibedah pada umur 35 hari.
Kegiatan ini dilakukan dengan
menyembelih  ayam  pedaging  fase  stater sejumlah  30  ekor,  dan  pada  fase  finisher sejumlah  30  ekor.  Setelah  disembelih  dan diambil  organ  bursa  fabricius,  organ  tersebut disimpan dalam suhu rendah agar sel-sel pada organ tetap stabil. Selanjutnya, organ tersebut dibawa  ke  Laboratorium  Fisiologi  Hewan, Jurusan  Biologi  Fakultas  MIPA,  Universitas Brawijaya untuk diisolasi sel dari organ bursa fabricius.

## Isolasi Sel
Sel  yang  akan  dihitung  populasinya, diisolasi  dari  organ  bursa  fabricius.  Sel tersebut  digerus  dengan  menggunakan  ujung spuid, dan disuspensi dengan PBS.
Selanjutnya  sel-sel  difilter  menggunakan wire. Kemudian hasil yang diperoleh disentrifugasi  dengan  kecepatan  1500  rpm pada  suhu  20 0 C  selama  5  menit.  Supernatan yang diperoleh dibuang dan pellet diresuspensi  dengan  PBS  1  ml.  Selanjutnya dilakukan pipeting untuk mendapatkan homogenat, dipindahkan pada mikrosentrifuse baru  dan  ditambah  500  µl  lalu  disentrifuse pada  kecepatan  1500  rpm,  suhu  20 0 C  selama 5  menit.  Supernatan  dibuang  dan  pellet
selanjutnya  diinkubasi  dengan  antibodi untuk proses analisis selanjutnya.

## Analisis Flowcytometri
Sel  yang  telah  diisolasi  dan  diperoleh, selanjutnya  dianalisis  Flow  Cytometry  untuk mendeteksi  subpopulasi  T-limfosit  (CD4 + , CD8 + ,  B220 + ).  Analisis  dilakukan  dengan komputer  dan  diatur  pada  keadaan  acquiring serta dilakukan setting sesuai parameter yang akan  dianalisis.  Kemudian  sampel  yang  telah diberi  antibodi  ditambah  1  ml  PBS  dan ditempatkan  pada  kuvet  flowcytometer. Selanjutnya dipilih acquire dan flowcytometer akan menghitung jumlah sel total serta jumlah sel  yang  terdeteksi  oleh  label  antibodi.  Hasil yang  diperoleh  akan  diolah  dengan  program BD cellquest Pro TM .

## Analisis Data
Analisis data dilakukan dengan menggunakan  metode  One  Way  ANOVA pada program SPSS 16 for Windows.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa  flavonoid  yang  terkandung dalam  daun  Polycias  obtusa  adalah  sebagai imunomodulator,  yaitu  dengan  meningkatkan aktivitas  IL-2  dan  proliferasi  limfosit.  Telah diketahui  bahwa  IL-2  adalah  sitokin  yang berfungsi  sebagai  salah  satu  faktor  limfosit berdiferensiasi.  Resistensi  hewan  terhadap infeksi  mikroba  sangat  tergantung  pada aktivasi  dari  sel T-CD4 + yang  berdiferensiasi menjadi  dua  kelompok  berdasarkan  pola sekresi  sitokin,  yaitu  pola  respon  Th1  dan pola respon Th2 [7].
Ayam adalah salah satu sumber penularan  penting  Salmonella  typhimurium. Masalahnya  berawal  dari  peternakan,  dimana anak  ayam  yang  dipelihara  dalam  kondisi komersial  sangat  rentan  terhadap  infeksi Salmonella  typhimurium  karena  mikroflora usus  lambat  berkembang  sehingga  kalah bersaing  jika  ada  serangan  bakteri  pathogen enterik [8].
Perbandingan  Jumlah  Relatif  Sel  CD4 + pada  organ  Bursa  Fabricius  Kelompok Starter dan Finisher
Gambar  1.  Jumlah  Relatif  Sel  T  CD4 + (%) fase Starter dan Finisher   (p>0.05) Berdasarkan gambar 1, dapat disimpulkan  bahwa  semua  perlakuan  dengan menggunakan pakan pabrik maupun
Polyscias obtusa tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata (p>0,05) dalam meningkatkan  jumlah  relatif  sel  CD4 + pada fase  starter  dan  finisher  ayam  pedaging, khususnya  pada  organ  bursa  fabricius. Namun, pada dosis 3 (T4) terlihat peningkatan  jumlah  relatif  sel  CD4 + yang siginifikan.  Hal  ini  berarti  bahwa,  dosis 0,26%  merupakan  dosis  optimum  dalam meningkatkan  proses  proliferasi  jumlah  sel CD4 + pada bursa fabricius ayam pedaging. Hasil yang tidak signifikan ini disebabkkan  karena  waktu  perlakuan  masih dalam  tahap  adaptasi.  Respon  imunologik hewan  muda  masih  berada  pada  tingkatan imunologis paling rendah [9]
Perbandingan  Jumlah  Relatif  Sel  CD8 + pada  organ  Bursa  Fabricius  Kelompok Starter dan Finisher
Gambar 2. Jumlah relatif sel CD8 + (%) bursa fabricius  fase Starter dan Finisher (p>0,05)
Berdasarkan  gambar  diatas,  jumlah relatif sel CD8 + pada fase starter menunjukkan bahwa perbedaan tiap
perlakuan  tidak  signifikan.  Perlakuan  T2 memiliki  jumlah  relatif  sel  CD8 + lebih  tinggi 2,14  %  dari  perlakuan  T1  yang  berjumlah 1,09%. Kemudian pada perlakuan  T3 mengalami  peningkatan  sebesar  1,59%  jika dibandingkan dengan perlakuan T1. Selanjutnya pada perlakuan T4 juga mengalami peningkatan sebesar 1,84%
dibandingkan  dengan  perlakuan  T1.  Namun, dari seluruh perlakuan, dosis 1 (T2) memiliki jumlah relatif sel CD8 + yang lebih tinggi. Hal ini dikarenakan bakteri Salmonella
typhimurium  merupakan  bakteri  intraseluler, sehingga  tubuh  membutuhkan  peran  dari  sel CD8 + yang  merupakan  sel  T  sitotoksik  yang berperan  dalam  membunuh  sel-sel  yang terinfeksi oleh bakteri tersebut. Sehingga pada fase  starter,  dosis  Polyscias  0,08% optimum untuk meningkatkan jumlah relatif sel CD8 + .
Perbandingan  Jumlah  Relatif  Sel  B220 +

## pada  organ  Bursa  Fabricius  Kelompok Starter dan Finisher
Sel  limfosit  B  berasal  dari  sumsum tulang belakang dan mengalami pendewasaan pada  jaringan  ekivalen  bursa.  Jumlah  sel limfosit  B  dalam  keadaan  normal  berkisar antara  10  dan  15%.  Setiap  limfosit  B memiliki  105  B  cell  receptor  (BCR),  dan setiap  BCR  memiliki  dua  tempat  pengikatan yang identik [10].
Gambar 3. Jumlah Relatif sel B220 + pada fase Starter dan Finisher (p>0,05)
Berdasarkan Gambar 3, jumlah relatif sel B220 + pada  fase  starter  di  semua  perlakuan mengalami  perbedaan  yang  tidak  signifikan. Perlakuan  T2  memiliki  jumlah  relatif  sel B220 + sebesar  7,30%  jika  dibandingkan  T3, T1, dan T4 yang bejumlah 4,17%, 5,22%, dan 1,33%.  Hal  ini  berarti  bahwa  masing-masing
perlakuan  tidak  berbeda  nyata  dan  tidak berpengaruh  terhadap  jumlah  relatif  B220 + . Selanjutnya,  pada  fase  finisher  mengalami peningkatan  jumlah  relatif  sel  B220 + yang cenderung  tinggi  dibandingkan  pada  fase starter.  Namun,  perbedaan  jumlah  relatif  sel antar perlakuan pada fase finisher mengalami perbedaan  yang  tidak  siginifikan  tidak memberikan pengaruh terhadap jumlah relatif sel B220 + .

## KESIMPULAN
Pemberian pakan alami dengan tambahan  daun  Polyscias  obtusa  dengan variasi dosis 0,08%, 0,16%, tidak memberikan pengaruh terhadap jumlah relatif, CD8 + dan B220 + pada bursa fabricius. Sehingga, tidak ada perbedaan yang signifikan  antara  pakan  pabrik  dan  pakan alami  dengan  tambahan  daun  Polyscias obtusa. Dosis 0,26% terbukti mampu meningkatkan  jumlah  relatif  sel  CD4 + secara signifikan  pada  organ  bursa  fabricius.  Hasil aktivasi  sel  T  CD4 + akan  memainkan  peran penting dalam mendirikan dan memaksimumkan sistem kekebalan tubuh.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terimakasih diberikan kepada Project  Staff  Research  Grant  IM-HERE 2011/2012.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Lee,  Dhany.  2008.  Vietnamese  Ginseng. (Online),  (http://Vietnam  Overseas  -  A Worldwide  Resource  for  Vietnamese
Culture,Business,andTelecommunicati on/2008/November.mht,
diakses tanggal 15 Juli 2012) [2]  Huan,  V.  D.,Satoshi  Y.,  Kazuhiro  O., Ryoji  K.,  Kazuo  Y.,  Nguyen  T.  N., Hoang M. C. 1998. Oleanane Saponins
From Polyscias Fruticosa.Abstrak
Sciencedirect, 15 Juli 2012)
[3]  Francis,  G.,  Zohar  K.,  Harinder  P.  S.  M.,
Klaus B. 2002. The biological action of saponins  in  animal  systems.  British Journal of Nutrition, 88: 587–605
[4]  Abbas,  A.K.,  dan  A.H.  Lichtman.  2005.
Cellular  and  Molecular  Immunology.
Fifth Edition. W.B. Saunders Company. California [5]Wulan, S. 2012. Mobilisasi  Hematopoietic Stem  Cells  dengan  Menggunakan
Daun  Polyscias  Obtusa  pada  Pakan untuk  Meningkatkan  Imunitas  Seluler Anak  Ayam  Pedaging.  Fakultas  MIPA, Universitas Brwijaya.
[6]  Eerola E, Veromma T, Toivanen P. 1987.
Special  Features  in  The  Structural Organization  of  The  Avian  Lymphoid
System Avian Immunology : Basic and
Practice.  Boca  Raton  :  CRC  Pr.  hlm  :
9-21
[7]  Tizard,  I.R.  2000.  Immunology:  An Introduction  6 th Ed.  New  York:
Saunders  College  Publishing.  pp.98-
161.
[8]  Fenner  J, Fransk. 1995. Virologi Veteriner. Edisi ke-2. Harya P, Penerjemah. Semarang : IKIP
Semarang Press
[9]  Thorns,  C.J.,  I.M.  Mc  Laren,  and  M.G. Sojka.  1994.  The  Use  Of  Latex Agglutination  To  Specifically  Detect Salmonella  typhimurium  Enteritidis. Int. J. Food Microbiol. 21: 47– 49.
[10]  Samuel,  C.E.  2001.  Antiviral  actions  of interferon.  Clinical  Microbiol.  Rev. 14(4): 778-809.