## AKTIVITAS ANTIBAKTERI FORMULA OPTIMUM KRIM ANTIACNE
FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK DAUN TEH HIJAU ( Camelia sinensis L)
Naniek Widyaningrum 1,2) , Achmad Fudholi 1) , Sudarsono 1) dan Erna P. Setyowati 1)
1) Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada
2) Program Studi Farmasi Universitas Islam Sultan Agung
e-mail: naniek.widyaningrum@gmail.com

## ABSTRACT
Green tea ( Camellia sinensis L) contains EGCG, which has antibacterial activity. Stability, optimal concentration and formulation development has been observed before. This study aimed to determine the antibacterial effect stability of the ethyl acetate fractions of green tea leaves extract cream  optimum  formula  and  ethyl  acetate  fraction  of  green  tea  leaves  extract  (EAFGTLE  6%) against  acne-causing  bacteria, S.  epidermidis .  Anti-bacterial  activity  performed  with  diffusion assay  method  on S.  epidermidis ATCC  35984  growths.  The  stability  of  anti-bacterial  activity obtains  during  three  months.  The  result  analyzed  using  paired  sample  t-test  (p:  0.95).  The  result showed there was no significant difference between EAFGTLE 6% inhibition ability (p=0.081) or even  cream  dosage  optimum  formula  (p=0.079)  during  three  months.  It  can  be  concluded  that EAFGTLE 6% and optimum formula cream could inhibit its effectiveness during three months.
Key words: Antibacterial activity, cream, ethyl acetate fraction, green tea leaves extract

## PENDAHULUAN
EGCG merupakan zat yang paling bertanggung jawab terhadap aktivitas antibakteri. Dalam aktivitas antibakterinya, EGCG dapat mengubah polaritas permukaan protein dan secara reversibel menghambat β-ketoasil-(asil protein pembawa) reduktase dari bakteri, memodifikasi enzim protein diikuti  oleh  agregasi  sehingga  menyebabkan  kematian  bakteri  (Bing-Hui  Li  dkk.,  2006).  EGCG juga  memiliki  aktivitas  depigmentasi  sehingga  EGCG  dapat  memulihkan  kondisi  kulit  yang menghitam  akibat  jerawat  (Akhtar  dkk.,  2011;  Mahmood  dkk.,  2010).  EGCG  dalam  teh  hijau dapat  mengurangi sebum  dan  mengurangi  inflamasi pada penderita acne  selama  delapan  minggu (Yoon dkk., 2013). EGCG pada daun teh hijau  merupakan agen bakterisida yang efektif terhadap strain Acinetobacter  baumanii yang  resisten  terhadap  antibiotik  (Osterburg  dkk.,  2009).  Hal  ini menunjukkan bahwa daun teh hijau dapat digunakan sebagai alternatif pengobatan jerawat. Dalam pengembangan  formulasinya  sebagai  antijerawat,  telah  dilakukan  optimasi  dapar  dan  emulgator dengan zat aktif EGCG yang menghasilkan formula optimum sediaan krim dengan stabilitas fisik dan  kimia  yang  baik  (Widyaningrum  dkk.,  2015).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui aktivitas antibakteri formula optimum sediaan krim yang telah diteliti sebelumnya dan FEAEDTH konsentrasi 6% terhadap bakteri penyebab jerawat S.epidermidis .

## METODE PENELITIAN

## Bahan Penelitian
Bahan-bahan  untuk  pembuatan  fraksi  yaitu  simplisia  daun  teh  hijau  yang  berasal  dari PT.Sari  kemuning  di  Karanganyar  -  Jawa  tengah,  aquadest,  es  batu,  asam  fosfat  85%  (Merck), larutan  dapar  pH  4  (asam  sitrat,  HCl, sodium  hydroxide )  (Merck),  etil  asetat  (Teknis).  Bahan- bahan untuk uji mikrobiologi yaitu bakteri S.epidermidis ATCC 35984, media agar darah, media Mueller-Hinton,  larutan  NaCl  0,9%  steril.  Bahan-bahan  yang  digunakan  untuk  pembuatan  krim adalah  asam  sitrat  (Sigma-aldrich),  triethanolamin  (Sigma-aldrich),  asam  askorbat  (Sigma- aldrich),  asam  stearate  (Sigma-aldrich),    tween  80  (Sigma-aldrich),  span  80  (Sigma-aldrich), sorbitol  (Sigma-aldrich),  propilen  glikol  (Sigma-aldrich),  VCO  (Sigma-aldrich:  46949),  metil paraben (Sigma-aldrich), propil paraben (Sigma-aldrich), dan aquadest.

## Alat Penelitian
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  panci stainlesteel , thermometer ,  pH  meter merk  Hanna  HI  98121,  rotari  evaporator  (Heildolph  Jerman), Thermostat  water  bath HH-6, Moisture  balance merek  Shimadzu  EP-90  model  Moc63u,  mortir  dan  stamper,  penangas  air, timbangan  elektrik,    alat-alat  gelas  (pyrex),  aluminium  foil,  pot  krim,  mikropipet,  sengkelit  ose, piring petri, hand scoon , masker.

## Pembuatan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Teh Hijau
Epigallocatechin  gallate (EGCG)  dalam  simplisia  daun  teh  hijau  diekstraksi  dengan mengacu pada hasil metode penelitian Widyaningrum, dkk. (2015 a ). Sebanyak 12 g simplisia the hijau diinfundasi dengan suhu 90 0 C selama 30 menit dengan 1200 mL air suling. Infusa kemudian disaring dan segera diletakkan di atas es  dengan suhu 0 o C selama 30 menit hingga ekstrak bersuhu 5 o C  (ekstrim  dingin),  kemudian  diberi  buffer  solution  hingga  diperoleh  pH  4.  Filtrat  tersebut difraksinasi  dengan  1200  mL  etil  asetat.  Fraksi  etil  asetat  kemudian  dikentalkan  dengan  rotari evaporator  suhu  40 o C.  Setelah  kental  kemudian  diuapkan  diatas  penangas  air  suhu  70 o C  dan diaduk  secara continue sampai  etil  asetatnya  habis  sehingga  diperoleh  serbuk  kering  fraksi  etil asetat ekstrak teh hijau.

## Pembuatan Sediaan Krim
Formula optimum sediaan krim (Widyaningrum dkk., 2015 b ) R/Fraksi etil asetat ekstrak daun teh hijau 6 Propilen glikol 2,1 Span 80 2,2 Tween 80 5,7 Sorbitol 20 Asam stearat 5 VCO 20 Asam Sitrat 0,7 Asam askorbat 0,06 Triethanolamin 2,45 Metil paraben 0,25 Propyl paraben 0,15 Water ad 100
Fase air yaitu propilen glikol, tween 80, sorbitol, asam sitrat, triethanolamin, asam askorbat, metil  paraben,  propyl  paraben  dan  sisa  aquadest  atau water di  panaskan  dalam  cawan  porselin pada  penangas  air/ water  bath suhu  70 o C  selama  dua  menit  atau  hingga  tercampur  merata kemudian ditambahkan fraksi etil asetat ekstrak daun teh hijau selama 1-2 menit. Fase lemak yaitu Asam  stearat,  VCO  dan  span  80  di  panaskan  pada  suhu  70 o C  selama  lima  menit  atau  hingga tercampur  merata.  Kedua  fase  tersebut  dicampur  dalam  mortir  sedikit  demi  sedikit  dengan pengadukan yang continue hingga homogen.

## Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri dilakukan pada fraksi etil asetat ekstrak daun teh hijau dan formula optimum  sediaan  krim  menggunakan  metode  yang  dilakukan  pada  penelitian  Niyomkam  dkk., 2010).  Bakteri S  .epidermidis diinkubasi  dalam  media  agar  darah  selama  24  jam  dalam  kondisi aerob,  kemudian  dibuat  suspensi  bakteri  menggunakan  NaCl  0,9  %  steril.  Kekeruhan  sel disetarakan  dengan  standar  Mc.Farland  0,5  atau  0,05  mL  BaCl 2 1%  dicampur  dengan  9,95  mL H 2 SO 4 1%. Kapas lidi steril dimasukkan ke dalam tabung yang berisi bakteri, kemudian ditekan- tekankan di dinding tabung agar tidak terlalu basah. Kapas tersebut diusapkan pada media Mueller Hinton  yang  sebelumnya  telah  diinkubasi  selama  kurang  lebih  dua  jam  sampai  rata  dan  setipis mungkin, kemudian dibuat sumuran pada media Mueller Hinton dengan menggunakan besi steril pada  media  tersebut.  Pelat  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  24  jam  dengan  kondisi aerob (Niyomkam dkk., 2010).
Pembuatan  standard  0,5  Mc  Farland  yaitu  larutan  BaCl 2 .2H 2 O  1,175%  sebanyak  0,05  mL dicampur  dengan  larutan  H 2 SO 4 1%  sebanyak  9,95  mL.  Larutan  BaCl 2 .2H2O  1,175%  dipipet
sebanyak  0,05  mL  dimasukkan  dalam  labu  takar  10  mL,  ditambah  dengan  larutan  H 2 SO 4 1% sampai 10 mL, dihomogenkan. Suspensi satu ose bakteri yang dilarutkan dalam larutan NaCl 0,9% memiliki  kekeruhan  yang  sama  dengan  standard  0,5  Mc  Farland  sehingga  diperkirakan  suspensi tersebut memiliki kerapatan antara 10 7 -10 8 CFU/mL.

## Analisa Data
Data dianalisa menggunakan Uji T berpasangan dengan taraf kepercayaan 95%. Parameter adanya perbedaan yang bermakna ditunjukkan dengan nilai signifikansi kurang dari 0,05

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Formula optimum sediaan krim dan FEAEDTH 6% diujikan pada bakteri S.epidermidis dari bulan ke-0 hingga bulan ke-3. Hal ini ditujukan untuk mengetahui stabilitas dan efektivitas sediaan krim  dan  FEAEDTH  6%.  Hasil  aktivitas  antibakteri  formula  optimum  sediaan  krim  dan FEAEDTH 6% disajikan pada tabel I dan gambar 1.
Tabel I. Aktivitas Antibakteri Formula Optimum Sediaan Krim dan FEAEDTH 6%
Replikasi Diameter Zona Hambat (cm) Fraksi Etil Asetat Esktrak Daun Teh  Hijau 6% Formula Optimum Sediaan Krim Basis Bulan ke-0 Bulan ke-1 Bulan ke-2 Bulan ke-3 Bulan ke-0 Bulan ke-1 Bulan ke-2 Bulan ke-3 Bulan ke 0-3 Rep 1 25 28 33 33 24 25 25 24 0 Rep 2 26 28 34 33 24 25 26 24 0 Rep 3 26 28 34 33 24 26 26 24 0 Rata-rata 25.67 28 33.67 33 24 25.3 25.67 24 0 SD 0.57 0 0.57 0 0 0.57 0.57 0 0 Sig. (p) 0,081 0,079
Berdasarkan tabel I dan gambar 1, terlihat adanya peningkatan daya hambat FEAEDTH 6% maupun formula optimum sediaan krim terhadap pertumbuhan bakteri S. epidemidis dari bulan ke 0  hingga  bulan  ke  3.  Hasil  statistik  menunjukkan  adanya  perbedaan  yang  signifikan  pada  daya hambat  aktivitas  antibakteri  FEAEDTH  6%  bulan  ke-1,  2  dan  3  terhadap  bulan  ke-0  (p=0,081). Sebaliknya, tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada daya hambat aktivitas antibakteri krim optimum  yang  mengandung  fraksi  etil  asetat  ekstrak  daun  teh  hijau  konsentrasi  6%  (p=0,079). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat stabilitas efektivitas pada FEAEDTH 6% setelah penyimpanan  selama  tiga  bulan  (stabilitas  efektivitas  pada  luas  zona  hambat  sediaan  krim). Dengan kata lain, formula optimum sediaan krim dan FEAEDTH 6% yang disimpan dalam waktu 3 bulan dapat mempertahankan efektivitasnya.
Hasil  penelitian  telah  menunjukkan  bahwa  FEAEDTH  6%  dapat  mempertahankan aktivitasnya  selama  tiga  bulan.  Hal  ini  disebabkan  metode  pembuatan  dan  penyimpanan FEAEDTH  6%  sesuai  dengan  penelitian  sebelumnya  (Widyaningrum,  dkk.,  2015)  yaitu  pada proses penyariannya dilakukan ekstrim dingin dan penurunan pH sampai dengan 4 menggunakan buffer  solution  pH  4  yang  menghasilkan  kadar  EGCG  paling  tinggi  dan  paling  stabil  dibanding dengan  larutan  dapar  lain.  Hal  ini  juga  linier  dengan  penelitian  Hirun  dan  Roach  (2011)  yang menyatakan kadar EGCG pada perlakuan ekstrim dingin dan penambahan asam fosfat lebih tinggi 16% dibanding pelarut  metanol.  Penyimpanan  EGCG juga sangat mempengaruhi stabilitas.  Pada penelitian  ini,  FEAEDTH  6%  disimpan  pada  suhu  2 o C.  Hal  ini  sesuai  penelitian  Widyaningrum dkk.,  (2015)  yang  meneliti  stabilitas  EGCG  yaitu  EGCG  stabil  pada  suhu  2 o C  dan  penelitian Fanguerio dkk., (2014) yang menyatakan EGCG stabil pada suhu 2 o C-20 o C.

## Naniek Widyaningrum
Gambar 1. Aktivitas antibakteri FEAEDTH 6% bulan ke 0 (a1) formula optimum sediaan krim bulan ke 0 (a2),  FEAEDTH  6%  bulan  ke  1  (b1)  formula  optimum  sediaan  krim  bulan  ke  1  (b2), FEAEDTH 6% bulan ke 2 (c1) formula optimum sediaan krim bulan ke 2 (c2), FEAEDTH 6% bulan ke 3 (d1) formula optimum sediaan krim bulan ke 3 (d2)
Formula optimum sediaan krim juga dapat mempertahankan aktivitasnya selama tiga bulan. Hal ini disebabkan terdapatnya komposisi optimum asam askorbat yang dapat melindungi EGCG dari degradasi saat di formulasikan dalam sediaan krim (Widyaningrum, dkk., 2015). Hal ini juga
linier  dengan  penelitian  Sheraz    dkk.,  (2014)  yang  menyatakan  asam  askorbat  dapat  melindungi EGCG dengan cara mereduksi bentuk radikal bebas katekin menjadi bentuk reduksinya dan asam askorbat  mampu  melindungi  EGCG  dan  asam  sitrat  dari  degradasi  akibat  oksigen.  Selain  asam askorbat,  dalam  formulasi  juga  terdapat  komposisi  optimum  emulgator  tween  80,  span  80  dan propilen glikol yang telah diteliti sebelumnya yang menghasilkan stabilitas EGCG pada uji HPLC (Widyaningrum, dkk., 2015).

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Formula optimum sediaan krim dan FEAEDTH 6% mampu mempertahankan efektivitasnya dalam waktu tiga bulan.

## Saran
Perlu  dilakukan  uji  stabilitas  kimia  selama  tiga  bulan  untuk  memastikan  stabilitas  EGCG  dalam formula yang menghasilkan stabilitas efektivitas antibakteri yang baik pada penelitian ini.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terimakasih  saya  sampaikan  kepada  Dirjen  Pendidikan  Tinggi  (DIKTI)  yang  telah memberikan  beasiswa  pendidikan  Doktor,  Prodi  Farmasi  Unissula  yang  telah  memberikan dukungan  dana  publikasi  serta  LaboratoriumMikrobiologi  Fakultas  Kedokteran  UGM  yang  telah memberikan fasilitas penelitian.

## Daftar Pustaka
Akhtar  N.,  Mahmood  T.,  Khan  B.A.,  Khan  H.M.S.  and  Saeed  T.,  2011,  Depigmenting  and  Anti Erythematic Effects of 3% Green Tea Emulsion, HealthMed , 5 (5), 1165–1169
Bing-Hui  Li,  Zhang  R.,  Ya-Tao  Du,  Ying-Hui  Sun,  and  Wei-Xi  Tian,  2006,  Inactivation Mechanism  of  the  β-ketoacyl-[Acyl  Carrier  Protein]  Reductase  of  Bacterial  Type-II  Fatty Acid Synthase by Epigallocatechin Gallate, Biochem. Cell Biol , 84 (5), 755–762
Fangueiro  J.F.,  Parra  A.,  Silva  A.M.,  Egea  M.A.,  Souto,  E.B,,  Garcia  M.L.  and  Calpena  A.C., 2014,  Validation  of  a  High  Performance  Liquid  Chromatography  Method  for  the Stabilization of Epgalloocatechin Gallate, Int. J. Pharm , 475(2)
Hirun  S.  and  Roach  P.D.,  2011,  An  Improved  Solvent  Extraction  Method  for  the  Analysis  of Catechins and Caffeine in Green Tea, J. Food Nutr. Res. , 50 (3), 160–166
Mahmood  T.,  Akhtar  N.,  Khan  B.A.,  Khan  H.M.S.  dan  Saeed  T.,  2010,  Outcomes  of 3%  Green Tea  Emulsion  on  Skin  Sebum  Production  in  Male  Volunteers, Bosn.  J.  Basic  Med.  Sci . Udruženje Basičnih Med. Znan. Assoc. Basic Med. Sci , 10 (3), 260–264
Niyomkam  P.,  Kaewbumrung  S.,  Kaewnpparat  S.,  and  Panichayupakaranant  P.,  2010, Antibacterial  Activity  of  Thai  Herbal  Extracts  on  Acne  Involved  Microorganism. Pharm. Biol , 48 (4), 375–380
Osterburg A., Gardner J., Hyon S.H., Neely A. dan Babcock G., 2009, Highly Antibiotic-Resistant Acinetobacter  Baumannii  Clinical  Isolates  Are  Killed  by  the  Green  Tea  Polyphenol  (–)- Epigallocatechin-3-Gallate (EGCG). Clin. Microbiol. Infect , 15 (4), 341–346
Sheraz  M.A.,  Khan  M.F.,  Ahmed  S.,  Kazi  S.H.,  Khattak  S.R.  dan  Ahmad,  I.,  2014.  Factors Affecting  Formulation  Characteristics  and  Stability  of  Ascorbic  Acid  in  Water-in-Oil Creams. International Journal of Cosmetic Science , 36 , 494–504

## Naniek Widyaningrum
Widyaningrum N., Fuholi A., Sudarsono, Setyowati E.P., 2015 a , The Stability of Epigallocatechin Gallate (EGCG) from Green Tea ( Camellia sinensis ) and its Antibacterial Activity against Staphylococcus  epidermidis ATCC  35984  and Propionibacterium  acnes ATCC  6919, Asian. J. of Biol. Sci , 8 (2), 93-101
Widyaningrum  N.,  Fuholi  A.,  Sudarsono,  Setyowati  E.P,  2015 b ,  Buffer  And  Emulsifier Optimization In Cream With its Antibacterial Activity And Sensitivity, Int. J. of Pharm. Sci and Research, 6 (12), 1000-1006
Widyaningrum  N.,  Fuholi  A.,  Sudarsono,  Setyowati  E.P,  2015 c ,  The  Effect  of  Altitude  Against Total  Phenolic  and Epigallocatechin  Gallate (EGCG)  Content  in  Green  Tea  Leaves, International Converence on Science and Science Education , August 1 st 2015
Yoon  J.Y.,  Kwon  H.H,  Min  S.U.,  Thiboutot  D.M.,  and  Suh  D.H.,  2013,  Epigallocatechin-3- Gallate  Improves  Acne  in  Humans  by  Modulating  Intracellular  Molecular  Targets  and Inhibiting P. acnes , J. Invest. Dermatol , 133 (2), 429–440