## ISSN: 0215-7950
*Alamat penulis korespondensi: Departemen Hama dan Penyakit Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran. Jalan Ir. Sukarno KM 21, Jatinangor, Sumedang- Jawa Barat 45363. Surel: fitri.widiantini@unpad.ac.id
Volume 20, Nomor 1, Januari 2024 Halaman 34–46 DOI: 10.14692/jfi.20.1.32–44
Isolasi Bakteri Filosfer Berpotensi sebagai Penambat Nitrogen dan Deteksi in Vitro Kemampuannya dalam Menghambat Pertumbuhan Colletotrichum
Isolation of Potential Nitrogen-Fixing Phylloplane Bacteria and in Vitro Detection of Their Ability to Inhibit the Growth of Colletotrichum
Fitri Widiantini 1 * , Fitika Syahnur 2 , Yusup Hidayat 1 , Endah Yulia 1 1 Departemen Hama dan Penyakit Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran 2 Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran Jalan Ir. Sukarno KM 21, Jatinangor, Sumedang – Jawa Barat 45363
(diterima Oktober 2023, disetujui Januari 2024)

## ABSTRAK
Antraknosa  merupakan  salah  satu  penyakit  penting  pada  tanaman  cabai  yang  disebabkan  oleh Colletotrichum spp.  dengan  tingkat  kehilangan  hasil  yang  dapat  mencapai  100%.  Dampak  negatif penggunaan  fungisida  menyebabkan  diperlukannya  pencarian  agens  biokontrol  sebagai  bagian  dari pengendalian penyakit yang ramah lingkungan. Salah satu sumber ialah agens biokontrol dari bagian filosfer. Percobaan ini bertujuan mendapatkan bakteri antagonis asal filosfer daun tanaman cabai sehat yang memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai agens biokontrol sekaligus berpotensi meningkatkan perolehan nutrisi bagi tanaman melalui fiksasi nitrogen. Tanaman cabai sehat diperoleh dari pertanaman cabai merah di Desa Cijambu dan Desa Nanggerang, Kabupaten Sumedang, Jawa Barat. Hasil isolasi menggunakan  medium  bebas  nitrogen  dan  hasil  skrining  aktivitas  antagonisme  diperoleh  delapan galur bakteri, yaitu CJB1, CJB2, CJB3, CJB4, CJB5, NGR1, NGR2, dan NGR3. Delapan galur bakteri tersebut  diuji  dengan  beberapa  galur Colletotrichum spp.  asal  beberapa  sentra  pertanaman  cabai  di Garut, Lembang, Sumedang dan Jatinangor. Pengujian dilakukan menggunakan metode biakan ganda yang dilanjutkan dengan pengujian aktivitas senyawa volatil dengan metode double compartment . Hasil percobaan menunjukkan diperolehnya bakteri filosfer NGR1, CJB1, dan CJB5 yang secara konsisten menunjukkan kemampuan yang baik dalam menghambat pertumbuhan empat galur Colletotrichum spp., baik secara langsung melalui uji antagonis maupun berdasarkan uji aktivitas anticendawan senyawa volatil yang dihasilkan galurnya. Malformasi pada miselium Colletotrichum spp. juga terdeteksi ketika patogen dihadapkan secara langsung dengan bakteri filosfer maupun oleh senyawa volatil yang dihasilkannya. Hasil percobaan ini menunjukkan bahwa bakteri filosfer yang berpotensi dapat memfiksasi N ini juga berpotensi untuk dikembangkan sebagai agens biokontrol Colletotrichum spp.
Kata kunci: antraknosa, biokontrol, cabai, senyawa volatil
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Widiantini et al.

## ABSTRACT
Anthracnose is one of the significant diseases in chili plants caused by Colletotrichum spp., with potential yield losses of up to 100%. The negative impact of fungicide use forces the search for biocontrol agents as part of environmentally friendly disease management. One of the sources where these biocontrol agents can be found is in the phyllosphere. This experiment aimed to obtain antagonistic bacteria from the phyllosphere of healthy chili plants that have the potential to be developed as biocontrol agents and potentially increase the nutrition uptake through nitrogen-fixation. Healthy chili plants were obtained from red chili plantations in Cijambu Village and Nanggerang Village, Sumedang Regency, West Java. Isolation using Nitrogen-free media and screening for antagonistic activity resulted in the isolation of eight bacterial strains, namely strains CJB1, CJB2, CJB3, CJB4, CJB5, NGR1, NGR2, and NGR3. The antagonistic tests on these eight bacterial strains were then conducted against various Colletotrichum spp. strains from different chili cultivation centers in Garut, Lembang, Sumedang, and Jatinangor. The testing was carried out using a dual-culture method followed by the examination of volatile compound activity using the double compartment method. The results showed that phyllosphere bacteria NGR1, CJB1, and CJB5 consistently demonstrated abilities to inhibit the growth of four Colletotrichum spp. strains, both directly through antagonistic tests and based on the volatile anticendawan compound activity produced by these bacterial strains. Malformations in the mycelium of Colletotrichum spp. were also detected when the pathogen was directly exposed to phyllosphere bacteria or their volatile compounds. This experiment indicates that phyllosphere bacteria that potentially capable of fixing nitrogen also have the potential to be developed as biocontrol agents for Colletotrichum spp.
Keywords: anthracnose, biocontrol, chili, volatile compounds

## PENDAHULUAN
Suatu  agens  biokontrol  memiliki  dua mekanisme dalam menghambat pertumbuhan patogen penyebab penyakit, yaitu mekanisme penghambatan  langsung  terhadap  patogen, juga mekanisme tidak langsung, yaitu melalui peningkatan kesehatan tanaman. Mekanisme tidak  langsung  tersebut  antara  lain  meliputi peningkatan  pertumbuhan  tanaman  dengan meningkatkan  penyerapan  nutrisi  bagi tanaman. Aktivitas antagonisme dapat terjadi secara alami pada berbagai habitat, misal pada area  filosfer  (Siregar et al. 2020).  Mikrob yang terdapat pada area filosfer sebagian besar dihuni  oleh  golongan  bakteri  (Sobanbabu et al .  2021). Akter et al .  (2014)  melaporkan beberapa  spesies  bakteri Pseudomonas asal filosfer  tanaman  padi  mampu  menghambat pertumbuhan Rhizoctonia solani. Peng- hambatan  terbesar  ditunjukkan  oleh P. aeruginosa secara in vitro ,  yakni  sebesar 68.44%. Bakteri filosfer Arthrobacter sp. dan Bacillus asal tanaman padi dapat menghambat pertumbuhan Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Prabawati et al .  2019) . Selain itu,
bakteri  filosfer  asal  tanaman  milet  jari ( Eleusine coracana ) juga dilaporkan mampu menghambat  penyakit  blas,  dengan  tingkat hambatan  tertinggi  ditunjukkan  oleh  spesies Bacillus cereus sebesar  62.87%  (Sobanbabu et al . 2021). Upaya  mendapatkan  agens  biokontrol yang sekaligus memiliki kemampuan dalam  membantu  penyerapan  unsur  hara bagi  tanaman  memerlukan  strategi  tertentu. Penggunaan medium spesifik seperti medium bebas  nitrogen  (BN)  dapat  meningkatkan kemungkinan perolehan bakteri filosfer yang dapat  memfiksasi  nitrogen  (N)  di  udara. Medium BN merupakan medium yang tidak mengandung nitrogen sehingga hanya golongan  bakteri  diazotrof  saja  yang  dapat tumbuh pada medium tersebut (Kifle dan Laing 2016).  Diazotrof  adalah  bakteri  yang  dapat memfiksasi  nitrogen  yang  ada  di  sekitarnya. Keberadaan  N 2 di udara sangat melimpah, namun tidak dalam bentuk yang dapat diserap langsung  oleh  tanaman.  Bakteri  pemfiksasi N dapat mengubah N 2 di udara menjadi NH 3 yang  merupakan  bentuk  yang  dapat  diserap oleh  tanaman  (Bhattacharjee et al .  2008).
Nitrogen merupakan salah satu unsur hara penting  dalam  menunjang  pertumbuhan tanaman.  Oleh  karena  itu,  agens  biokontrol akan  memiliki  peran  yang  lebih  baik  lagi jika dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan ketersediaan  nutrisi  bagi  tanaman.  Agbavor et al . (2022) menyatakan bahwa konsorsium bakteri  filosfer  yang  disemprotkan  pada tanaman  kedelai  selain  dapat  menghambat efek negatif infeksi Pseudomonas syringae pv. glycine pada tanaman kedelai juga dapat meningkatkan  biomasssa  tanaman  termasuk meningkatkan kandungan klorofil dan nitrogen dalam  tanaman.  Hal  tersebut  disebabkan oleh  kemampuan  bakteri  filosfer—seperti Paenibacillus —yang dapat menfiksasi N dari udara (Agbavor et al . 2022).
Agens biokontrol akan berhasil digunakan dalam upaya pengendalian jika memiliki  aktivitas  penghambatan  yang kuat  sehingga  dapat  digunakan  sebagai alternatif pengendalian, selain fungisida. Dampak negatif dari penggunaan fungisida menyebabkan  timbulnya  populasi  patogen yang resisten terhadap fungisida. Dilaporkan oleh Dewi (2022), bahwa Colletotrichum yang diisolasi  dari  beberapa  daerah  penanaman cabai  merah  di  Jawa  Barat  menunjukkan penurunan sensitivitas terhadap fungisida yang umum digunakan oleh petani, seperti mankozeb,  propineb,  dan  simoksanil.  Oleh karena  itu,  bakteri  filosfer  yang  memiliki aktivitas antagonisme terhadap Colletotrichum diharapkan  dapat  dipertimbangkan  sebagai solusi  pengembangan  agens  biokontrol terhadap  penyakit  antraknosa  pada  cabai merah.

## BAHAN DAN METODE
Isolasi  Bakteri  Pemfiksasi  Nitrogen  dari Filosfer Tanaman Cabai Daun tanaman cabai dipilih dari tanaman cabai  yang  sehat,  berwarna  hijau,  dan  tidak menunjukkan adanya gejala terkena penyakit. Daun  cabai  diambil  dari  pertanaman  cabai di  Desa  Cijambu,  Kecamatan  Tanjungsari dan  Desa  Nanggerang,  Kecamatan  Sukasari, Kabupaten  Sumedang.  Isolasi  bakteri
filosfer  dilakukan  dengan  metode leaf print pada  medium  bebas  nitrogen  (BN)  (20  g mannitol, 0.2 g K 2 HPO 4 ,  0.2  g  NaCl,  0.1  g MgSO 4 , 5 g CaCO 3 , 20 g agar-agar, dan 1 L akuades) (Holland et al . 2000). Koloni bakteri yang  tumbuh  pada  medium  BN  kemudian dipindahkan pada medium agar-agar nutrien (AN) untuk dimurnikan. Koloni bakteri yang tumbuh dikarakterisasi pada medium AN dan diamati morfologi koloninya yang meliputi warna,  bentuk,  elevasi,  tepian,  dan  tekstur. Demikian  juga  pertumbuhnnya  diamati pada medium AN, medium International Streptomyces Project 2  (ISP2)  (4  g  ekstrak khamir , 10 g ekstrak malt, 4 g glukosa,
20 g agar-agar, dan 1 L akuades), dan medium tryptone soya agar (TSA) (40 g TSA dan 1 L akuades). Bakteri filosfer kemudian diuji jenis Gram menggunakan KOH 3%.
Skrining dan Uji Antagonisme Bakteri Filosfer terhadap Colletotrichum Skrining dilakukan untuk memperoleh galur bakteri filosfer yang memiliki aktivitas antagonisme saja. Uji antagonisme dilakukan menggunakan  metode  biakan  ganda.  Uji antagonisme biakan ganda dilakukan dengan menumbuhkan Colletotrichum dan  bakteri filosfer  dalam  cawan  medium  agar-agar dekstrosa  kentang  (ADK).  Bakteri  dan cendawan  ditumbuhkan  berjarak  masing- masing  3  cm  dari  tepi  cawan  (Gambar  1). Uji antagonisme dilakukan terhadap empat galur Colletotrichum dari koleksi
Gambar  1    Ilustrasi  uji  antagonisme  bakteri  filosfer terhadap galur Colletotrichum dengan  metode  biakan ganda.  a,  perlakuan  bakteri  filosfer  dan  b,  perlakuan kontrol.
(Figure 1 Illustration of the antagonism assay of phyllosphere bacteria against Colletotrichum strains using double culture method. a, phyllosphere bacteria treatment and b, control.)
Bakteri filosfer ( phyllosphere bacteria)
Colletotrichum Colletotrichum
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Widiantini et al.

## Laboratorium Bioteknologi, Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran.
Keempatnya  berasal  dari  lokasi  pertanaman cabai  di  Sumedang  ( Colletotrichum galur SMD),  Garut  ( Colletotrichum galur  GRT), Lembang  ( Colletotrichum galur  LMG), dan Jatinangor ( Colletotrichum galur  JTN).
Keempat galur Colletotrichum tersebut dilaporkan mengalami penurunan sensitivitas terhadap fungisida (Dewi 2022). Percobaan dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap dengan bakteri filosfer hasil  seleksi  sebagai  perlakuan,  fungisida berbahan  aktif  mankozeb  sebagai  kontrol positif, dan tanpa perlakuan bakteri/fungisida sebagai kontrol negatif; serta masing-masing diulang sebanyak tiga kali.
Pengamatan dilakukan dengan mengukur jari-jari koloni Colletotrichum yang menuju ke  arah  bakteri.  Pengamatan  pertumbuhan ini dilakukan setiap hari hingga koloni Colletotrichum pada perlakuan kontrol memenuhi  cawan.  Tingkat  hambatan  relatif (THR) dihitung berdasarkan rumus (Chaurasia et al. 2005). THR (%) = × 100%, dengan R1 – R2 R1 THR,  tingkat  hambatan  relatif  (%);  R1, jari-jari koloni Colletotrichum pada  kontrol; dan  R2,  jari-jari  koloni Colletotrichum pada perlakuan. Selain itu, morfologi hifa Colletotrichum diamati  secara  mikroskopi pada setiap perlakuan dan sebagai pembanding hifa normal Colletotrichum diamati pada kontrol.
Aktivitas Senyawa Volatil Bakteri Filosfer terhadap Colletotrichum
Percobaan disusun dalam rancangan acak lengkap terdiri atas 9 perlakuan (kontrol dan 8 galur bakteri) yang diulang sebanyak tiga kali. Deteksi aktivitas anticendawan dari senyawa volatil  yang  dihasilkan  oleh  bakteri  filosfer terhadap masing-masing galur Colletotrichum mengikuti metode double compartment (Widiantini  dan  Hartati  2020).  Metode  ini dilakukan  dengan  menggabungkan  dua cawan  yang  masing-masing  bakteri  filosfer yang  ditumbuhkan  pada  medium  ISP2  dan
galur Colletotrichum yang ditumbuhkan pada medium ADK (Gambar 2). Perlakuan kontrol dilakukan  tanpa  menggunakan  galur  bakteri filosfer.  Pertemuan  kedua  cawan  ditutup dengan plastik wrap untuk menghindari terjadinya kontaminasi. Kemudian, seluruh perlakuan  diinkubasi  pada  suhu  ruang 25–27 ℃ dan diameter koloni Colletotrichum diukur setiap hari hingga memenuhi cawan.
Setelah koloni Colletotrichum kontrol memenuhi  cawan,  dilakukan  perhitungan persentase THR seperti pada uji antagonisme. Perhitungan  tingkat  penghambatan  pert- umbuhan  koloni Colletotrichum dilakukan menggunakan rumus (Widiantini et al . 2016):
THR (%) = × 100%, dengan

## DK – DP
DK THR,  tingkat  hambatan  relatif  (%);  DK, diameter koloni cendawan pada kontrol; dan DP, diameter koloni cendawan pada perlakuan bakteri filosfer. Selanjutnya, secara dilakukan pengamatan mikroskopik untuk mengetahui adanya kerusakan pada hifa cendawan akibat perlakuan.
Analisis Data yang diperoleh diuji normalitas dan homogenesitasnya.  Data  yang  terdistribusi normal dan homogen kemudian dianalisis varians  (ANOVA)  menggunakan  program Statistical  Package  for  the  Social  Science (SPSS) versi 26, yang diikuti dengan uji lanjut Duncan pada taraf 5%.
Gambar  2  Ilustrasi  uji  penghambatan  galur Colletotrichum dengan  perlakuan  volatil  dari  bakteri filosfer .
(Figure 2 Illustration of inhibition assay of Colletotrichum strains treated with volatiles from phyllosphere bacteria.)
Colletotrichum
Bakteri filosfer ( phyllosphere bacteria)

## HASIL
Bakteri  Pemfiksasi  Nitrogen  dari  Filosfer Tanaman Cabai Bakteri  dari  daun  tanaman  cabai  yang diisolasi pada medium BN tidak menghasilkan koloni  bakteri.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa koloni  bakteri  yang  tumbuh  pada  medium isolasi daun leaf print merupakan koloni bakteri  filosfer.  Sebanyak  38  isolat  bakteri filosfer yang diperoleh dan hanya 8 isolat yang menunjukkan  aktivitas  penghambatan,  yaitu isolat  CJB1,  CJB2,  CJB3,  CJB4,  dan  CJB5 dari Desa Cijambu, dan isolat NGR1, NGR2, dan NGR3 dari Desa Nanggerang. Bakteri filosfer yang dapat memfiksasi N memerlukan waktu relatif lama untuk tumbuh pada medium BN. Medium BN merupakan medium selektif sehingga tidak semua bakteri —terutama  bakteri  yang  pertumbuhannya cepat  ( fastidious )—dapat  tumbuh.  Koloni bakteri  filosfer  baru  muncul  di  medium BN  pada  6  HSI.  Galur  bakteri  filosfer terpilih  memiliki  morfologi  koloni  berbeda antarbakteri,  tetapi  seluruhnya  merupakan bakteri  Gram  negatif  (Tabel  1).  Sebanyak delapan  galur  ini  digunakan  untuk  uji  lebih lanjut.
Aktivitas Antagonisme Bakteri Filosfer terhadap Colletotrichum Jari-jari koloni Colletotrichum yang diperlakukan  dengan  bakteri  filosfer  dan fungisida  berbahan  aktif  mankozeb  terlihat secara  nyata  lebih  pendek  dibandingkan dengan  perlakuan  kontrol.  Secara  umum, rata-rata jari-jari koloni Colletotrichum galur  JTN  menunjukkan  pertumbuhan  yang lebih  terhambat  dibandingkan  dengan  galur Colletotrichum lainnya ketika diperlakukan dengan bakteri filosfer yang sama (Tabel 2). Perlakuan  bakteri  filosfer  terhadap Colletotrichum menghasilkan THR bervariasi, yakni  berkisar  antara  14.44%  dan  57.22%, dengan  penghambatan  terbesar  (57.22%) ditunjukkan  oleh  bakteri  filosfer  NGR1 terhadap Colletotrichum galur JTN. Bakteri ini umumnya memberikan efek penghambatan lebih  tinggi  ketika  berhadapan  dengan  galur
Colletotrichum lainnya, yaitu sebesar 38.33% terhadap Colletotrichum galur SMD, 27.78% terhadap Colletotrichum galur  GRT,  dan 50%  terhadap Colletotrichum galur LMG. Bakteri  filosfer  lain  yang  juga  menunjukkan kemampuan  penghambatan  yang  relatif konsisten ialah pada Colletotrichum galur CJB1 dan Colletotrichum galur CJB5. Secara  visual,  bakteri  filosfer  dapat memengaruhi  pertumbuhan  koloni  keempat galur Colletotrichum (Gambar 3). Pertumbuhan koloni Colletotrichum mengalami penipisan ketika mendekati koloni bakteri filosfer.

## Aktivitas Senyawa Volatil Bakteri Filosfer terhadap Colletotrichum
Bakteri  filosfer  yang  diuji  aktivitas senyawa  volatilnya  mampu  menghambat pertumbuhan koloni Colletotrichum (Tabel 3). Nilai tingkat penghambatan relatif umumnya lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  hasil  uji antagonisme.  Sedikit  berbeda  dengan  hasil uji biakan ganda, tidak hanya Colletotrichum galur  JTN  yang  penghambatannya  relatif tinggi, tetapi hal ini terjadi juga pada Colletotrichum galur GRT dengan nilai tingkat penghambatan di atas 30%. Seperti halnya pada uji  antagonisme,  bakteri  filosfer  NGR1  juga menunjukkan  aktivitas  penghambatan  yang konsisten cukup tinggi ketika dihadapkan pada setiap galur Colletotrichum uji, yaitu sebesar 40.19% hingga 53.33%. Tingkat penghambatan paling  tinggi  (61.30%)  ditunjukkan  oleh bakteri filosfer CJB3 terhadap Colletotrichum galur  GRT,  tetapi  tidak  cukup  stabil  ketika diuji terhadap Colletotrichum lainnya. Pada pengujian terhadap Colletotrichum galur LMG,  penghambatan  yang  diberikan  hanya sebesar 28.15%.
Senyawa volatil yang dihasilkan juga memberikan  pengaruh  terhadap  morfologi keempat koloni galur Colletotrichum yang diuji  (Gambar  4).  Secara  visual,  terlihat perbedaan  warna  koloni  antara  perlakuan kontrol  dan  perlakuan  bakteri  filosfer, terutama  pada  bagian  bawah  koloni.  Pada perlakuan kontrol, koloni Colletotrichum cenderung  lebih  berwarna,  warna keunguan pada Colletotrichum galur SMD,

## Tabel 1  Karakteristik koloni bakteri filosfer asal tanaman cabai di Desa Cijambu dan Desa Nanggerang
(Table 1 Colonies characteristics of phyllosphere bacteria from chili plants in Cijambu and Nanggerang villages) Bakteri filosfer (Phyllosphere bacteria) Warna (Color) Bentuk (Shape) Elevasi (Elevation) Tepi (Edge) Tekstur (Texture) Lain-lain (Other) Waktu tumbuh pada medium (jam setelah inokulasi) (growth time on medium (... hours after inoculation)) Reaksi Gram (Gram Reaction) AN ISP2 TSA CJB1 Bening kekuningan (Yellowish transparent) Membulat (Circular) Cembung (Convex) Rapi (Entire) Cair (Liquid) Pusat berwarna kuning (yellow center) 24 24 24 Negatif (Negative) CJB2 Bening keputihan (Whitish transparent) Membulat (Circular) Cembung (Convex) Rapi (Entire) Cair (Liquid) Tidak memiliki pusat (Has no center) 24 24 24 Negatif (Negative) CJB3 Bening (transparent) Agak membulat (Somewhat circular) Tidak cembung (Not convex) Agak rapi (Somewhat Entire) Cair (Liquid) Mengering di medium NA (Dries on NA medium) 24 24 24 Negatif (Negative) CJB4 Bening keputihan (Whitish transparent) Membulat (Circular) Tidak terlalu cembung (Not too convex) Tidak rapi (Undulate) Agak kental, lengket (Slightly viscous, sticky) Tidak memiliki pusat Has no center) 24 24 24 Negatif (Negative) CJB5 Agak bening, Putih kekuningan (Somewhat transparent, white yellowish.) Membulat (Circular) Cembung (Convex) Tidak rapi (Undulate) Cair, agak lengket (Liquid, slightly sticky) Sedikit mengkilap (Slightly shiny) 48 24 24 Negatif (Negative) NGR1 Bening ( transparent ) Menyebar (Irregular) Cembung (Convex) Rapi (Entire) Cair (Liquid) Tidak memiliki pusat (Has no center) 24 24 24 Negatif (Negative) NGR2 Bening keputihan (Whitish transparent) Membulat (Circular) Cembung (Convex) Rapi (Entire) Cair (Liquid Pusat berwarna putih (White center) 24 24 24 Negatif (Negative) NGR3 Bening (Transparent) Membulat (Circular) Cembung (Convex) Agak rapi (Somewhat Entire) Cair (Liquid Mengering di medium NA (Dries on NA medium) 48 24 24 Negatif (Negative) Keterangan (Note): AN=Agar-agar Nutrient (Nutrient agar) ; ISP2= International Streptomyces Project 2 ; TSA= Tryptone Soya Agar
40 Tabel  2    Jari-jari  koloni  dan  tingkat  hambatan  relatif  (THR)  koloni  galur Colletotrichum oleh  bakteri  filosfer  berdasarkan  pada  uji  antagonisme  menggunakan metode biakan ganda (Table 2  Colonies radius and relative inhibition of Colletotrichum strain colonies by phyllosphere bacteria based on antagonism assay using double culture method) Bakteri filosfer (Phyllosphere bacteria) Galur Colletotrichum (Colletotrichum strain) SMD GRT LMG JTN Jari-jari koloni (Radius) (cm) THR (Inhibition) (%) Jari-jari koloni (Radius) (cm) THR (Inhibition) (%) Jari-jari koloni (Radius) (cm) THR (Inhibition) (%) Jari-jari koloni (Radius) (cm) THR (Inhibition) (%) Kontrol (Control) 6.00 d - 6.00 e - 6.00 e - 6.00 c - CJB1 3.63 a 39.44 4.50 c 25.00 3.93 b 34.44 3.90 ab 35.00 CJB2 4.70 bc 21.67 5.10 d 15.00 4.77 cd 20.56 4.10 b 31.67 CJB3 4.50 b 25.00 4.00 bc 33.33 5.03 d 16.11 3.70 ab 38.33 CJB4 4.80 bc 20.00 3.80 ab 36.67 5.10 d 15.00 2.87 ab 52.22 CJB5 3.63 a 39.44 4.27 bc 28.89 4.67 bcd 22.22 2.80 ab 53.33 NGR1 3.70 a 38.33 4.33 bc 27.78 3.00 a 50.00 2.57 a 57.22 NGR2 5.10 c 15.00 5.13 d 14.44 5.10 d 15.00 3.37 ab 43.89 NGR3 4.30 b 28.33 3.37 a 43.89 5.13 d 14.44 3.83 ab 36.11 Mankozeb 5.20 c 13.33 5.10 d 15.00 4.13 bcd 31.11 3.07 ab 48.89
Keterangan: Angka pada kolom yang sama dan diikuti huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan nyata berdasarkan uji Jarak Berganda Duncan pada α 5%.
(Note: values in the same column followed by the same letter are significantly different based on Duncan’s multiple range test at α 5%.)
Tabel 3  Diameter koloni dan tingkat hambatan relatif (THR) koloni galur Colletotrichum pada uji aktivitas anticendawan senyawa volatil oleh bakteri filosfer menggunakan metode double compartment
(Table 3  Colonies diameter and relative inhibition of Colletotrichum strain colonies in the antifungal activity assay of volatile compounds by phyllosphere bacteria using double compartment method)
Bakteri filosfer (Phyllosphere bacteria) Galur Colletotrichum (Colletotrichum strain) SMD GRT LMG JTN Diameter (Diameter) (cm) THR (Inhibition) (%) Diameter (Diameter) (cm) THR (Inhibition) (%) Diameter (Diameter) (cm) THR (Inhibition) (%) Diameter (Diameter) (cm) THR (Inhibition) (%) Kontrol (Control) 9.00 c - 9.00 e - 9.00 e - 9.00 b - CJB1 7.03 b 21.85 5.35 cd 40.56 4.48 a 50.19 4.82 a 46.48 CJB2 5.70 ab 36.67 4.37 ab 51.48 4.62 ab 48.70 5.17 a 42.59 CJB3 5.43 a 39.63 3.48 a 61.30 6.47 d 28.15 4.60 a 48.89 CJB4 5.50 a 38.89 4.75 bc 47.22 4.88 ab 45.74 4.18 a 53.52 CJB5 5.62 ab 37.59 4.67 bc 48.15 5.02 abc 44.26 4.52 a 49.81 NGR1 4.52 a 49.81 4.20 ab 53.33 5.13 abcd 42.96 5.38 a 40.19 NGR2 5.27 a 41.48 6.00 d 33.33 6.28 cd 30.19 5.52 a 38.70 NGR3 4.73 a 47.41 4.42 abc 50.93 5.90 bcd 34.44 4.42 a 55.19
Keterangan: Angka pada kolom yang sama dan diikuti huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan nyata berdasarkan uji Jarak Berganda Duncan pada α 5%.
(Note: values in the same column followed by the same letter are significantly different based on Duncan’s multiple range test at α 5%.)
Gambar 3  Reaksi antagonisme bakteri filosfer terhadap beberapa galur Colletotrichum —galur SMD (13 HSI), GRT  (15  HSI),  LMG,  dan  JTN  (16  HSI)—dengan  metode  biakan ganda. 1, Colletotrichum galur  SMD; 2, Colletotrichum galur GRT; 3, Colletotrichum galur LMG; dan 4, Colletotrichum galur JTN dengan perlakuan A, kontrol; B, CJB1; C, CJB2; D, CJB3; E, CJB4; F, CJB5; G, NGR1; H, NGR2; I, NGR3; dan J, fungisida mankozeb.
(Figure 3  Antagonism reaction of phyllosphere bacteria against several Colletotrichum strains-SMD (13 DAI), GRT (15 DAI), LMG, and JTN (16 DAI)-by double culture method. 1, Colletotrichum strain SMD; 2, Colletotrichum strain GRT; 3, Colletotrichum strain LMG; and 4, Colletotrichum strain JTN with treatments A, control; B, CJB1; C, CJB2; D, CJB3; E, CJB4; F, CJB5; G, NGR1; H, NGR2; I, NGR3; and J, mancozeb fungicide.)
1A 1B 1C 1D 1E 1F 1G 1H 1I 1J 2A 2B 2C 2D 2E 2F 2G 2H 2I 2J 3A 3B 3C 3D 3E 3F 3G 3H 3I 3J 4A 4B 4C 4D 4E 4F 4G 4H 4I 4J
Gambar 4   Koloni cendawan Colletotrichum spp. setelah uji senyawa volatil double compartment : 1, Colletotrichum galur SMD; 2, Colletotrichum galur GRT; 3, Colletotrichum galur LMG; dan 4, Colletotrichum galur JTN dengan A, kontrol; B, Perlakuan CJB1; C, CJB2; D, CJB3; E, CJB4; F, CJB5; G, NGR1; H, NGR2; dan I, NGR3.
(Figure 4   Colonies of Colletotrichum spp. after double compartment volatile compound assay: 1, Colletotrichum strain SMD; 2, Colletotrichum strain GRT; 3, Colletotrichum strain LMG; and 4, Colletotrichum strain JTN with A, control; B, Treatment of CJB1; C, CJB2; D, CJB3; E, CJB4; F, CJB5; G, NGR1; H, NGR2; and I, NGR3).
1A 1B 1C 2A 2B 2C 1D 1E 1F 2D
2E
2F 1G 1H
1I
2G
2H 2I
3A 3B 3C
4A 4B
4C
3D 3E 3F
4D 4E
4F
3G 3H 3I
4G
4H 4I
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Gambar  5    Kerusakan  hifa  cendawan Colletotrichum spp.  pada  perlakuan  bakteri  filosfer;  A,  membengkak; B, menggulung; C, mengeriting; D, mengalami melanisasi; E, mengalami lisis; dan F, hifa normal.
(Figure 5  Damage to hyphae of the fungus Colletotrichum spp. due to the treatment of phyllosphere bacteria; A, swollen; B, coiled; C, curled; D, melanized; E, lysed; and F, , normal hyphae.)
a b c d e
f
keabuan pada Colletotrichum galur GRT, dan warna salem pada Colletotrichum galur LMG dan  JTN.  Sementara  pada  perlakuan  bakteri filosfer,  warna  tersebut  memudar  hingga terpusat  pada  zona  tengah  saja.  Selain  itu, pada pengamatan mikroskopi ditemukan hifa Colletotrichum membengkak,  menggulung, mengeriting, mengalami melanisasi dan lisis banyak dijumpai pada koloni Colletotrichum yang  dihadapkan  pada  bakteri  filosfer,  baik pada uji biakan ganda maupun pada uji double compartment (Gambar 5).

## PEMBAHASAN
Medium BN tidak mengandung nitrogen (N)  yang  merupakan  unsur  penting  yang diperlukan oleh bakteri bagi pertumbuhannya. Hanya bakteri yang dapat memfiksasi N dari udara dapat tumbuh pada medium BN. Hal ini diperkuat oleh penelitian yang dilakukan oleh Haerani et al . (2021) yang menyatakan bahwa kemampuan  bakteri  untuk  memfiksasi  N dapat dikonfirmasi dengan menumbuhkannya pada medium BN. Jika tidak tumbuh, berarti bakteri  tersebut  tidak  dapat  memfiksasi  N. Bakteri  filosfer  yang  mampu  memfiksasi  N memerlukan  waktu  relatif  lebih  lama  untuk
muncul pada medium BN. Pada penelitian ini bakteri pemfikasasi N muncul pada 6 HSI. Hal ini  disebabkan  karena  bakteri  memerlukan energi yang cukup banyak untuk memfiksasi N dari udara. Soumare et al. (2020) melaporkan bahwa untuk dapat memfikasasi satu molekul N 2 diperlukan energi sebanyak 16 ATP. Pada penelitian  ini  potensi  kemampuan  bakteri filosfer  dalam  memfiksasi  N  perlu  diteliti lanjut, terutama kaitannya dengan uji kuantitas kemampuannya dalam memfiksasi N.
Bakteri filosfer yang diperoleh merupakan bakteri  Gram  negatif.  Bakteri  pemfiksasi N  digolongkan  menjadi  bakteri  yang  hidup bebas  ( free - living nitrogen- fixing bacteria ) dan bersimbiosis dengan tanaman ( symbiotic nitrogen- fixing bacteria ).  Bakteri  pemfiksasi N yang hidup bebas kebanyakan termasuk ke dalam golongan bakteri Gram negatif, seperti Azotobacter dan Azospirillum (Vacher et al . 2016; Zhu et al . 2023). Bakteri pemfiksasi N yang ditemukan pada permukaan daun jagung termasuk ke dalam Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria,  dan  Bacteroidetes  dengan Bacillus sebagai  genus  bakteri  yang mendominasi (Abadi et al . 2021). Sementara bakteri  filosfer  yang  diisolasi  dari  daun tanaman hutan dilaporkan didominasi oleh
bakteri  Gram  negatif  Proteobacteria  dan Cyanobacteria (Furnkranz et al . 2008). Permukaan  daun  merupakan  habitat  bagi banyak  mikroorganisme  dengan  diversitas yang  sangat  beragam  dan  memiliki  berbagai fungsi  yang  turut  berkontribusi  terhadap pertumbuhan  serta  kesehatan  tanaman. Bakteri  epifit  pemfiksasi  N  memiliki  ikatan yang erat dengan tanaman inangnya dengan berkontribusi  terhadap  penyediaan  N  yang diperlukan  bagi  pertumbuhan  tanaman  (Zhu et al .  2023),  dan  bakteri  pemfikasi  N  yang juga bersifat antagonis terhadap patogen dapat berkontribusi lebih banyak terhadap kesehatan tanaman inangnya. Pada penelitian ini diperoleh beberapa bakteri filosfer yang selain diduga  dapat  memfiksasi  N  juga  memiliki aktivitas antagonisme terhadap Colletotrichum yang diisolasi dari berbagai lokasi pertanaman cabai.  Setidaknya  terdapat  tiga  galur  bakteri filosfer,  yaitu  NGR1,  CJB1,  dan  CJB5  yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai agens biokontrol.
Agens  biokontrol  dapat  mengendalikan penyakit tanaman melalui dua mekanisme, yaitu  mekanisme  secara  langsung  dengan menghambat pertumbuhan patogen dan mekanisme tidak langsung dengan meningkatkan kesehatan tanaman melalui penyediaan atau peningkatan keterserapan nutrisi  bagi  tanaman  (Legein et al .  2020). Agens  biokontrol  yang  memiliki  berbagai mekanisme  penghambatan  pertumbuhan patogen  akan  lebih  efektif  dalam mengendalikan penyakit tanaman. Bakteri NGR1,  CJB1,  dan  CJB5  secara  konsisten menunjukkan  kemampuan  penghambatan pertumbuhan  koloni Colletotrichum asal beberapa  lokasi  pertanaman. Colletotrichum yang  dikumpulkan  dari  berbagai  lokasi pertanaman dilaporkan memiliki tingkat virulensi dan kepekaan terhadap fungisida yang  berbeda  (Dewi  2022).  Konsistensi suatu  agens  biokontrol  dalam  menghambat pertumbuhan  patogen  dan  mengendalikan penyakit pada tanaman merupakan salah satu faktor penting untuk menilai keefektifannya mengendalikan penyakit tanaman (Bonaterra et al . 2022; Teixido et al . 2022).
Bakteri filosfer yang diuji pada penelitian ini dapat mengakibatkan terjadinya malformasi miselium Colletotrichum seperti membengkak, menggulung, dan mengeriting. Malformasi  dapat  pula  berupa  melanisasi dan lisis. Ketidaknormalan yang terjadi pada miselium Colletotrichum menunjukkan adanya gangguan pada dinding sel cendawan. Hifa  cendawan  yang  mengalami  malformasi dapat disebabkan oleh senyawa antibiosis yang dikeluarkan bakteri antagonis. Hifa cendawan patogen  yang  mengalami  pembengkakan dapat  disebabkan  oleh  enzim  protease  dan amilase yang dihasilkan oleh bakteri antagonis (Anjarsari et al .  2022).  Senyawa  antibiosis tersebut  dapat  menyebabkan  membran  sel pecah sehingga isi sel keluar (Soliman et al . 2022). Selain itu, pada penelitian ini senyawa volatil yang dikeluarkan bakteri filosfer juga menyebabkan warna koloni cendawan menjadi pudar.  Gomez et al. (2021)  melaporkan C. gloeosporioides mengalami pengurangan pigmentasi pada koloninya karena adanya indikasi stres akibat emisi senyawa volatil dari bakteri.  Senyawa  volatil  dari  bakteri  filosfer dapat  menyebabkan  pengurangan  bobot kering koloni cendawan Alternaria alternata , Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, dan F. verticillioides (Azeem et al .  2022).
Beberapa  senyawa  volatil  juga  ditemukan pada Streptomyces sp. yang dapat menghambat pertumbuhan dan menghambat produksi spora cendawan C. gloeosporioides. Hasil analisis bioasai  menunjukkan  keberadaan  senyawa metil  antranilat  bertanggung  jawab  terhadap penghambatan  pertumbuhan  cendawan C. gloeosporioides (Gomez et al . 2021).
Meskipun  aktivitas  penghambatan  yang ditimbulkan  setiap  galur  bakteri  filosfer bervariasi,  setidaknya  terdapat  tiga  galur bakteri  filosfer  (NGR1,  CJB1,  dan  CJB5) yang  memiliki  potensi  untuk  dikembangkan lebih  lanjut  sebagai  agens  biokontrol  karena memiliki aktivitas penghambatan yang relatif stabil  terhadap  semua  galur Colletotrichum yang diuji. Bakteri yang diuji tidak hanya menghambat  secara  langsung  pertumbuhan koloni galur Colletotrichum , tetapi juga dapat menghasilkan senyawa volatil yang
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Widiantini et al. juga  bersifat  anticendawan.  Kemampuan galur  bakteri  filosfer  tersebut  perlu  ditelaah lanjut untuk pengendalian penyakit tanaman, terutama keefektifannya di lapangan serta potensinya  dalam  memfiksasi  nitrogen sehingga  dapat  menjadi  pertimbangan pengendalian alternatif penyakit antraknosa pada cabai.

## DAFTAR PUSTAKA
Abadi  VAJM,  Sepehri  M,  Rahmani  HA, Dolatabad HK, Shamshiripour M, Khatabi B.  2021.  Diversity  and  abundance  of culturable  nitrogen-fixing  bacteria  in  the phyllosphere of maize. Journal of Applied Microbiology.  131(2):898–912.  DOI: https://doi.org/10.1111/jam.14975 . Agbavor  C,  Mirza  BS,  Wait  A.  2022.  The effects  of  phyllosphere  bacteria  on  plant physiology and growth of soybean infected with Pseudomonas syringae . Plants. 11(9):2634.  DOI:  https://doi.org/10.3390/ plants11192634.
Akter S, Kadir J, Jurimi AS, Saud HM, Elmahdi S.  2014.  Isolation  and  identification  of antagonistic  bacteria  from  phylloplane of  rice  as  biocontrol  agents  for  sheath blight. Journal of Environmental Biology. 35(6):1095–1100.
Anjarsari  DT,  Prasetyawati  ET,  Wuryandari Y.  2022.  Pengaruh  Bacillus  sp.  terhadap malformasi hifa patogen Phytophthora palmivora . Jurnal Agrohita. 7(1):67–73. Azeem  S,  Agha  SI,  Jamil  N,  Tabassum  B, Ahmed S, Raheem A, Jahan N, Ali N, Khan A. 2022. Characterization and survival of broad-spectrum  biocontrol  agents  against phytopathogenic fungi. Revista Argentina de  Microbiología.  54(3):233–242.  DOI: https://doi.org/10.1016/j.ram.2021.10.005.
Bhattacharjee  RB,  Singh A,  Mukhopadhyay. 2008.  Use  of  nitrogen-fixing  bacteria  as biofertilizer  for  non-legumes:  Prospect and challenges. Applied Microbiology and Biotechnology. 80:199–209. DOI: https:// doi.org/10.1007/s00253-008-1567-2.
Bonaterra A,  Badosa  E,  Daranas  N,  Frances J,  Rosello  G,  Montesinos  E.  2022.
Bacteria  as  biological  control  agents of  plant  diseases.  Microorganisms. 10(9):1759.  DOI:  https://doi.org/10.3390/ microorganisms10091759.
Chaurasia  B,  Pandey A,  Palni  LMS, Trivedi P,  Kumar  B,  Colvin  N.  2005.  Diffusible and  volatile  compounds  produced by  an  antagonistic Bacillus subtilis strain  cause  structural  deformations  in pathogenic fungi in vitro . Microbiological Research. 160(1):75–81. DOI: https://doi. org/10.1016/j.micres.2004.09.013 . Dewi  APK.  2022.  Status  Resistensi Colletotrichum spp.  asal  cabai  dari Garut, Lembang, dan Sumedang terhadap Fungisida  Berbahan  Aktif  Mankozeb, Propineb,  dan  Simoksanil  [skripsi]. Jatinangor (ID): Universitas Padjadjaran.
Furnkranz M, Wanek W, Richter A, Abell G, Rasche  F,  Sessitsch  A.  2008.  Nitrogen fixation  by  phyllosphere  bacteria associated  with  higher  plants  and  their colonizing  epiphytes  of  tropical  lowland rainforest  of  Costa  Rica.  The  ISME Journal.  2:561–570.  DOI: https://doi. org/10.1038/ismej.2008.14.
Gomez  AG,  Ramos  FA,  Sinuco  DC.  2021. Screening  of  volatile  compounds from  actionobacteria  for  the  control of phytopathogen Colletotrichum gloeosporioides .  Biocontrol  Science  and Technology.  31(10):1067–1079.  DOI: https://doi.org/10.1080/09583157.2021.19 18635.
Haerani N, Syam’un E, Rasyid B, Haring F. 2021.  Isolation  and  characterization  of N-fixing and IAA producing rhizobacteria from  two  rice  field  agro-ecosystems  in South Sulawesi, Indonesia. Biodiversitas -  Journal  of  Biological  Diversity. 22(5):2497–2503. DOI: https://doi. org/10.13057/biodiv/d220506 . Holland MA, Davis R, Moffitt S, O’Laughlin K, Peach D, Sussan S, Wimbrow L, Tayman B. 2000. Using “Leaf Prints” to investigate a  common  bacterium.  The  American Biology  Teacher.  62(2):128–131.  DOI: https://doi.org/10.2307/4450852.
Kifle  MH,  Laing  MD.  2016.  Isolation and  screening  of  bacteria  for  their diazotrophic potential and  their  influence on  growth  promotion  of  maize  seedlings in greenhouses. Frontiers in Plant Science. 6(1225):1–8. DOI: https://doi.org/10.3389/ fpls.2015.01225.
Legein M, Smets W, Vandenheuvel D, Eilers T, Muyshondt B, Prinsen E, Samson R,  Lebeer  S.  2020.  Modes  of  action  of microbial  biocontrol  in  the  phyllosphere. Frontiers in Microbiology. 11:2020. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01619 . Prabawati A,  Susilowati A,  Sugiyarto.  2019. Bakteri filosfer padi sebagai kandidat agen biokontrol  terhadap Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) penyebab penyakit hawar daun bakteri. Prosiding Seminar Nasional Masyarakat Biodiversitas Indonesia. 5(2):256–262.
Siregar BA, KasimNN, N Farida. 2020. Isolasi dan  karakterisasi  biologi  bakteri  endofit, filosfer  dan  rizosfer  dari  tanaman  sagu
( Metroxylon sagu ).  Prosiding  Seminar Nasional  Biotik.  10-11  Juli  2019.  Aceh (ID):  UIN  Ar-Raniry  Darussalam  Banda Aceh. Hlm 335–340.
Sobanbabu G, Theradiman M,
Thiruvudainambi S, Vannirajan C, Rajavel S, Kalpana K, Sindhu S, Brindhadevi
S.  2021.  Evaluation  of  antagonistic activity  of  phylloplane  bacteria  against finger  millet  blast  disease  caused  by Magnaporthe grisea .  Biological  Forum– An International Journal. 13(4):1058–1064 . Soliman  AS,  Khaleil  MM,  Metwally  RA. 2022.  Evaluation  of  the  anticendawan activity of Bacillus amyloliquefaciens and B. velezensis and  characterization  of  the bioactive secondary metabolites produced against plant pathogenic bacteria. Biology. 11(10):1390. DOI: https://doi.org/10.3390/ biology11101390.
Soumare A, Diedhiou AG, Thuita M, Hafidi M, Ouhdouch  Y,  Gopalakrishnan  S,  Kouisni L.  2020.  Exploiting  biological  nitrogen fixation:  a  route  towards  a  sustainable agriculture. Plants. 9(8):1–22. DOI: https:// doi.org/10.3390/plants9081011.
Teixido N, Usall J, Torres R. 2022. Insight into a  successful  development  of  biocontrol agents: Production, formulation, packaging,  and  shelf  life  as  key  aspects. Horticulturae.  8(4):305.  DOI: https://doi. org/10.3390/horticulturae8040305 . Vacher  C,  Hampe  A,  Porte  AJ,  Suer  U, Company  S,  Morris  CE.  2016.  The phyllosphere:  microbial  jungle  at  the plant-climate  interface.  Annual  Review Ecology Evolution Systematics. 47:1–24. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev- ecolsys-121415-032238.
Widiantini  F,  Hartati  F.  2020.  Endophytic Bacteria  origin  of  healthy  rice  plants produce anticendawan volatile compound inhibited the growth of Pyricularia oryzae Cav., the causal agent of rice blast disease. Cropsaver  Journal  of  Plant  Protection. 3(1):31–36. DOI: https://doi.org/10.24198/ cropsaver.v3i1.28121.
Widiantini F, Purnama A, Yulia E, Formanda D.  2016.  Keefektifan  oligochitosan dalam  menekan  pertumbuhan  cendawan patogen Rigidoporus lignosus [(Klotzsch) Imazeki]  penyebab  penyakit  cendawan akar  putih  pada  tanaman  cengkeh  secara in vitro .  Jurnal Agrikultura.  27(1):59–64. DOI: https://doi.org/10.24198/agrikultura. v27i1.8477.
Zhu  YG,  Peng  J,  Chen  C,  Xiong  C,  Li  S, Wang  E,  Liesack  W.  2023.  Harnessing biological nitrogen fixation in plant leaves. Trends  in  Plant  Science.  28(12):1391– 1405. DOI: https://doi.org/10.1016/j. tplants.2023.05.009.