Pengaruh  pemberian  klorofilin  berbagai  dosis  terhadap  indeks  fagositosis makrofag  dan  kadar  nitric  oxide  mencit  BALB/c  yang  diinfeksi  dengan

## Salmonella typhimurium
Puspito Arum 1 , Lisyani B Suromo 2 , Niken Puruhita 3

## ABSTRACT
Background: Immune  responses  to  eliminate  Salmonella  infection  are  by  activating  macrophage  and  by  producing  NO. Chlorophyllin is a chlorophyll derivate that has immunomodulator properties.
Objective: The aim of this study was to prove effect of chlorophyllin in macrophage phagocytosis index and NO level. Methods: A post test only controlled group design  was conducted in 5 groups Balb/c mice (negative control, positive control, dosage  100  µg/200  g  BW,  dosage  200  µg/200  g  BW  and  dosage  380  µg/200  g  BW).  Macrophage  phagocytosis  index  was measured  by  counting  cells  that  phagocyte  latexs  particles.  NO  level  was  measured  by  Griess  method.  Macrophage phagocytosis index difference was analyzed by one way anova and NO level deference was analyzed by Kruskall-Wallis test (α 0,05) . Results: Means  of  macrophage  phagocytosis  index  were  0,7(±0,80),  1,8(±0,80),  2(±0,22),  2,5(±0,43)  and  3,2(±0,68) respectively  in  negative  control,  positive  control,  chlorophyllin  dosage  100  µg/g  BW/day,  200  µg/g  BW/day  and  380  µg/g BW/day.  There  was  a  significant  difference  of  macrophage  phagocytosis  index  between  group  (p  0,000).  Mean  of  NO  level were  0,4  µM(±0,10),  0,6  µM(±0,60),  0,8  µM(±0,64),  0,6  µM(±0,67)  and  0,4  µM(±0,26)  respectively  in  negative  control, positive control, chlorophyllin dosage 100 µg/g BW/day, 200 µg/g BW/day and 380 µg/g BW/day. There was no difference of NO level between group (p 0,813).
Conclusion: There was a significant difference of macrophage phagocytosis index between chlorophyllin administered group and control. The higher chlorophyllin dosage, the higher macrophage phagocytosis index. Therewas no difference of  NO level between chlorophyllin administered group and control.
Keywords: chlorophyllin, macrophage, NO, Salmonella typhimurium

## ABSTRAK
Latar  Belakang :  Respon  imun  tubuh  terhadap  infeksi  Salmonella  diantaranya  mengaktifkan  makrofag  dan    produksi  NO. Klorofilin merupakan turunan dari klorofil yang memiliki sifat sebagai immunomodulator.
Tujuan :  Tujuan  penelitian  ini  membuktikan  pemberian  klorofilin  berbagai  dosis  berpengaruh  terhadap  indeks  fagositosis makrofag dan kadar NO.
Metode :  The  post  test  only  controlled  group  design    pada  mencit  Balb/c  terbagi    dalam  5  kelompok.  Perbedaan  indeks fagositosis  makrofag  dianalisis  menggunakan    uji  one  way  anova.  Perbedaan  kadar  NO  diukur  menggunakan  dianalisis menggunakan uji Kruskall-Wallis.
Hasil : Rerata indeks fagositosis makrofag 0,7(±0,80), 1,8(±0,80), 2(±0,22), 2,5(±0,43) dan 3,2(±0,68) masing -masing pada kelompok kontrol negatif, kontrol positif, klorofilin dosis 100 µg/g BB/hari, 200 µg/g BB/hari dan 380 µg/g BB/hari. Terdapat perbedaan rerata indeks fagositosis makrofag (p 0,000). Rerata kadar NO 0,4 µM(±0,1), 0,6 µM(±0,60), 0,8 µM(±0,64), 0,6 µM(±0,67)  dan  0,4  µM(±0,26)  masing-masing  pada  kelompok  kontrol  negatif,  kontrol  positif  ,  klorofilin  dosis  100  µg/g BB/hari,    dosis  200  µg/g  BB/hari    dan  dosis  380  µg/g  BB/hari.  Tidak  terdapat  perbedaan  bermakna  rerata  kadar  NO  (p 0,813).
Simpulan : Ada perbedaan bermakna pada indeks fagositosis makrofag antara kelompok diberi klorofilin dengan kelompok tanpa klorofilin. Peningkatan dosis klorofilin meningkatkan indeks fagositosis makrofag. Tidak terdapat berbedaan bermakna pada kadar NO antara kelompok diberi klorofilin dengan kelompok tanpa klorofilin.
Kata kunci : klorofilin, makrofag, NO, Salmonella typhimurium

## PENDAHULUAN
Salmonellosis merupakan  kejadian  yang  masih
sering terjadi di seluruh belahan dunia. Demam tifoid menyebabkan  terjadinya  21.650.974  kasus  kesakitan dan  216.510  kasus  kematian  selama  tahun  2000. 1 Diantara negara-negara di Asia, Indonesia merupakan negara dengan insidensi typhoid sedang. 2
Tahap awal infeksi
Salmonella , LPS (Lipopolisakarida)  menginduksi  terjadinya  respon inflamasi  pada  jaringan  disekitarnya  dan  berakibat pada diproduksinya sitokin-sitokin seperti TNF-α, IL-
1 Program  Studi  D-IV  Gizi  Klinik,  Jurusan  Kesehatan, Politeknik Negeri Jember, Indonesia
2 Bagian Patologi Klinik, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro, Semarang, Indonesia
3 Bagian Gizi, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro, Semarang, Indonesia
1,  IL-6,  IL-2  dan  IL-18  dan  berbagai  jenis  kemokin yang  mengundang  sel-sel  sistem  imun  untuk  datang ke tempat tersebut. Selain itu, juga diproduksi sitokin IFN-γ oleh sel NK, makrofag, sel B dan populasi sel T khusus.  Produksi  IFN-γ  akan  mengaktivasi  makrofag untuk  melakukan killing bakteri.  Makrofag  yang teraktivasi  akan  memproduksi reactive  oxigen intermediates (ROIs), seperti superoxide dan reactive nitrogen  intermediates (RNIs),  utamanya nitric  oxide (NO).  Kedua  molekul  tersebut  berperan  dalam membunuh bakteri dalam fagolisosom   makrofag dan menunjukkan  aktifitas  makrofag  dalam  membunuh bakteri. 3 NO  merupakan  molekul  yang  memiliki berbagai peran. Produksi NO berperan penting dalam respon  imun    bawaan,  yaitu  untuk  melakukan  proses killing tumor dan patogen intraseluler. 4 NO merupakan agen mikrobisidal kuat terhadap mikroorganisme intrasel. 3
Klorofilin  merupakan  derivat  dari  klorofil  yang bersifat larut dalam air, dimana ion logam magnesium (Mg)  yang  terkandung  dalam  klorofil  digantikan dengan  ion  logam  tembaga  (Cu),  sehingga  memiliki sifat  yang  lebih  stabil  dibanding  klorofil  itu  sendiri. Klorofilin  telah  dengan  aman  digunakan  dalam pengobatan  selama  beberapa  tahun. 5,6 Klorofilin dianggap sebagai suplemen yang dapat mencegah dan bahkan  menyembuhkan  berbagai  macam  penyakit, khususnya  keganasan,  memberikan  efek  antioksidan, dan  menjaga  dan    memperbaiki  kekebalan  tubuh. Fungsi  klorofilin  dalam  menjaga  dan    memperbaiki kekebalan  tubuh,  klorofilin  dapat  digolongkan menjadi immunomodulator ,    namun  belum  terdapat banyak penelitian yang membuktikan peran klorofilin sebagai immunomodulator, khususnya  pada  respon terhadap  infeksi  bakteri.  Aktifitas  makrofag  dapat dilihat  dengan  meningkatnya  fagositosis  makrofag dan produksi NO.
Infeksi Salmonella  typhimurium pada  mencit menunjukkan gejala penyakit yang sama seperti yang terjadi  pada  manusia  yang  terinfeksi  oleh Salmonella typhi .  Infeksi Salmonella  typhimurium pada  mencit Balb/c kemudian dianggap sebagai model eksperimental  bagi  demam typhoid pada  manusia. 7 Penelitian ini akan menggunakan tiga dosis pemberian klorofilin, yaitu, 100 µg/g berat badan, 200 µg/g berat badan dan 380 mg/kg berat badan.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  membuktikan  adanya pengaruh pemberian klorofilin berbagai dosis terhadap indeks fagositosis makrofag dan kadar nitric oxide pada  mencit  Balb/c  yang  diinfeksi  dengan Salmonella  typhimurium. Hipotesis  penelitian  ini adalah  klorofilin  berbagai  dosis  dapat  meningkatkan indeks  fagositosis  makrofag  dan  kadar  NO  mencit Balb/c  yang  diinfeksi Salmonella  thypimurrium dibandingkan dengan yang tidak diberi klorofilin.

## METODE DAN BAHAN
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental  laboratorik  dengan  menggunakan rancangan the post test only controlled group. Sampel penelitian  adalah  30  ekor  mencit  Balb/c  yang  dibagi dalam  lima  kelompok,  yaitu  dua  kelompok  kontrol negatif,  kontrol  positif,  kelompok  yang  diberi klorofilin  dosis  100  µg/g  BB/hari,  200  µg/g  BB/hari dan  380  µg/g  BB/hari.  Penelitian  dilakukan  di  LPPT (Laboratorium  Penelitian  dan  Pengujian  Terpadu) UGM  (Universitas  Gadjah  Mada).  Indeks  fagositosis dilihat  berdasarkan  prosentase  sel  yang  memfagosit partikel latex yang dihitung pada 200 sel dikali rerata jumlah  partikel  yang  difagosit  pada  sel  yang  positif. Kadar  NO  diukur  dari  konsentrasi  NO  yang  terdapat dalam supernatan kultur makrofag yang diukur denga reagen Griess.
Analisis  deskriptif  digunakan  untuk  menampilkan rerata  dan  simpang  baku  dari  indeks  fagositosis makrofag  dan  kadar  NO.  Uji  normalitas  data menggunakan Saphiro  Wilk .  Uji one  way  anova digunakan  untuk  menganalasis  perbedaan  Indeks fagositosis makrofag antar kelompok, dan dilanjutkan dengan  uji LSD ,  uji Kruskall  Wallis digunakan  untuk menganalisis  perbedaan  kadar  NO  antar  kelompok, dan  dilanjutkan  denganuji Mann-Whitney, dengan  α 0,05.

## HASIL

## Indeks Fagositosis Makrofag
Indeks  fagositosis  makrofag  dihitung  berdasarkan presentase  sel  yang  memfagosit  partikel latex dikali rerata  jumlah  partikel  yang  difagosit  sel  yang  positif. Berdasarkan uji one way ANOVA, terdapat perbedaan bermakna  rerata  indeks  fagositosis  makrofag  antar kelompok perlakuan (p 0,000).
Berdasarkan  uji  LSD  (tabel  1),  diperoleh kesimpulan  bahwa  indeks  fagositosis  makrofag  pada kelompok  yang  diberi  klorofilin  dosis  380  µg/g  BB dan  200  µg/g  BB  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan kelompok  yang tidak diberi klorofilin. Tidak terdapat perbedaan indeks fagositosis makrofag pada kelompok  yang  diberi  klorofilin  dosis  100  µg/g  BB dengan kelompok yang tidak diberi klorofilin (kontrol pisitif).  Indeks  fagositosis  makrofag  pada  kelompok yang  diberi  klorofilin  dosis  380  µg/g  BB  lebih tinggi dibanding kelompok-kelompok lainnya.

## Nitric Oxide
Kadar  NO  diperoleh  dari  menghitung  konsentrasi nitrit  dalam  sampel  berdasarkan  kurva  standar  dari pembacaan  nitrit  standar.Rerata  kadar  NO  pada berbagai kelompok perlakuan tidak terdapat
perbedaan bermakna rerata kadar NO antar kelompok perlakuan (p 0,813).

## PEMBAHASAN
Hasil penelitian ini menunjukkan adanya peningkatan  indeks  fagositosis  makrofag  pada kelompok yang diberi klorofilin  dibanding yang tidak diberi  klorofilin.  Fagositosis  makrofag  semakin meningkat seiring dengan peningkatan dosis klorofilin.  Hasil  penelitian  ini  sejalan  dengan  hasil penelitian  yang  dilakukan  oleh  Sharma et  al 8 yang menunjukkan  pemberian  klorofilin  dosis  100  µg/g BB/hari  dan  200  µg/g  BB/hari  dapat  meningkatkan aktifitas  fagositosis  makrofag  pada  mencit  yang diimunisasi  dengan  SRBC  ( Sheep  Red  Blood  Cells ). Hasil  yang  sama  ini  ditunjukkan  pada  penelitian  ini walaupun  respon  imun  dipicu  oleh  dua  hal  yang berbeda, Salmonella  typhimurium pada  penelitian  ini dan  SRBC  pada  penelitian  yang  dilakukan  oleh Sharma et  al .  Pada  penelitian  ini  indeks  fagositosis makrofag  meningkat  karena  jumlah  makrofag  yang memfagosit  partikel latex dan  jumlah  partikel latex yang  difagosit  semakin  meningkat  seiring  dengan peningkatan dosis klorofilin yang diberikan.
Penelitian ini melihat aktifitas fagositosis makrofag  secara in  vitro dengan  menggunakan latex bead sebagai  partikel  yang  difagosit.  Sinyal transmembran  akan  menyebabkan  polimerisasi actin yang  ada  pada  permukaan  sitoplasma  ketika latex kontak  dengan  reseptor  yang  ada  pada  permukaan makrofag,  sehingga  terjadi  pembentukan  fagosom. 9 Retikulum  endoplasma  bergerak  menuju  permukaan sel  dan  akan  bergabung  dengan  membran  plasma  di bawah  cawan  fagositik  untuk  mensuplai  membran pada pembentukan fagosom. 10
Makrofag,  secara in  vivo ,  teraktifasi  oleh  adanya infeksi Salmonella .  Peningkatan  aktifitas  fagositosis antara  lain  dipengaruhi  keberadaan  reseptor    yang mengenali antigen, seperti TLR ( Tolls Like Receptor ), reseptor  komplemen  dan  reseptor  Fcγ.  Sel  mamalia mengenali  LPS  dari  bakteri  gram  negatif  melalui TLR4  komplek. 11 TLR4  mengikat  rantai acil lipid  A pada  LPS.  Ikatan  antara  LPS  dan  TLR4  yang mengaktifkan  MyD88  berperan  penting  dalam mengontrol  pertumbuhan  exponensial Salmonella typhimurium . 11 Bakteri mengaktifkan sistem komplemen melalui jalur alternatif. Aktifasi komplemen melalui jalur alternatif akan menyebabkan pemecahan  protein  komplemen  C3.  Hasil  pemecahan komplemen C3 akan dikenali oleh reseptor CR1 ( type 1 complement receptor ). 3 CR1 yang berikatan dengan fragmen  komplemen  C3b  dan  memicu  aktifitas fagositosis. 11 Reseptor  Fcγ  mengenali  mikroba  yang telah  diopsonisasi  oleh  antibodi. 3 Interaksi  antara reseptor Fcγ dengan antibodi menginisiasi fagositosis,
kemudian  bakteri  yang  telah  diopsonisasi  oleh antibodi  ditelan  oleh  makrofag  hingga  membran  sel makrofag menutupi keseluruhan bakteri. 12
Klorofilin  memiliki  efek  mampu  meningkatkan pembentukan  komplemen  C3. 17 C3  merupakan  salah satu  faktor  yang  berperan  dalam  meningkatkan fagositosis  makrofag.  Infeksi  bakteri  mengaktifasi terpecahnya  C3  menjadi  fragmen  C3b  yang  berperan sebagai  opsonin  yang  kemudian  dikenali  oleh  CR1, sehingga  memudahkan  fagosit  untuk  melakukan fagositosis bakteri yang diopsonisasi oleh komplemen 11 dan  C3a  yang  berperan  sebagai chemoattractant sel  neutrofil  dan  fagosit. 2 Klorofilin juga  mengandung  logam  Cu  pada  tengah  cincin porfirinnya.  Ion  logam  Cu  memiliki  efek  yang  besar terhadap neutrofil dan makrofag, dimana defisiensi Cu menyebabkan terjadinya keadaan neutrofenia. 13 Penelitian  ini  hanya  melihat  hubungan  klorofilin dengan  aktifitas  fagositosis  makrofag,  namun  tidak meneliti  faktor  lain  yang  mempengaruhi  fagositosis makrofag  seperti  flora  usus.  Pemberian Lactobacillus casei dan Lactobacillus bulgaricus terbukti mengaktifkan  produksi  makrofag  dan  pemberian Lactobacillus  acidophilus mengaktifkan  fagositosis pada  mencit. 14,15 Infeksi Salmonella  typhimurium mempengaruhi keadaan flora usus. Faktor antimikrobial  yang  muncul  akibat  infeksi Salmonella memperlambat  pertumbuhan  mikrobiota  usus  dan mengganggu  jejaring  komensal  antar  mikrobiota saluran  cerna,  sehingga  menyebabkan Salmonella dapat berkembang dengan bebas. 16
Hasil  penelitian ini  menunjukkan  kadar  NO tinggi pada pemberian klorofilin dosis 100 µg/g BB, namun nilai  tersebut  tidak  memiliki  perbedaan  yang bermakna  dibanding  kelompok  lainnya.  Penelitian oleh  Yun, et  al menunjukkan  klorofilin  menurunkan kadar IFN-γ melalui penekanan terhadap produksi IL- 12.  IFN-γ  memiliki  peran  menginduksi  produksi  NO oleh monosit dan makrofag. 19 Penurunan kadar IFN-γ berakibat  pada  penurunan  produksi  NO.  Teori  ini sejalan  dengan  hasil  penelitian  yang  menunjukkan semakin  tinggi  dosis  klorofilin,  semakin  menurunkan kadar NO.
Klorofillin  menunjukkan  aktifitas  antioksidan terhadap  kerusakan  oksidatif 19,20 karena  keberadaan ion  logam  Cu  pada  cincin porphyrin nya. 22 Cu merupakan  komponen  dari superoxide  dismutase , suatu  enzim  antioksidan  yang  penting. 23 Tubuh memiliki  sistem  antioksidan  enzimatis  terdiri  dari superoxide  dismutase , glutathione  peroxidase dan catalase yang bekerja sama dalam eliminasi oksida. 24 Inflamasi yang terjadi akibat adanya infeksi bakteri menyebabkan  diproduksinya  oksidan,  baik    ROS ( reactive oxygen species ) atau RNS ( reactive nitrogen species )  yang  berperan  dalam killing bakteri  namun
juga  dapat  berakibat  pada kerusakan jaringan.  Sistem antioksidan  enzimatis  yang  terdiri  dari superoxide dismutase , glutathione  peroxidase dan catalase berperan  dalam  mencegah  kerusakan  jaringan  akibat oksidan  yang  ditimbulkan  dari  inflamasi. 25 Adanya ion  logam  Cu  pada  klorofilin  meningkatkan  aktifitas superoxide dismutase . 23 Enzim tersebut, pada penelitian  ini,  diduga  mengeliminasi  oksidan  yang diproduksi  oleh  makrofag  akibat  infeksi Samonella typhimurium i.p, sehingga peningkatan dosis klorofilin cenderung menurunkan kadar NO.
Produksi  NO  dikatalisis  oleh  iNOS  di  dalam makrofag  dan sel-sel lain yang berperan dalam respon inflamasi 26 dengan  mengubah  senyawa  L-arginin menjadi L-sitrulin dengan bantuan NADPH, sehingga menghasilkan  gas  NO. 27 Produksi  NO  penting  bagi pertahanan non-spesifik, membantu membunuh tumor dan  patogen  intraseluler. 28 Peningkatan  kadar  NO berhubungan  dengan  aktifitas  anti Salmonella . 29 NO juga  penting  dalam  mencegah  kerusakan  jaringan karena memiliki efek antiapoptosis. Peran NO sebagai antiapoptosis melalui mekanisme pembentukan cGMP, penekanan aktifitas cascapes dan menghambat pelepasan  sitokrom  C. 30 NO  juga  telah  terbukti melindungi  terjadinya  kerusakan    sel  hati  akibat Salmonellosis . 28 Berdasarkan  teori,  semakin  banyak makrofag teraktifasi, maka semakin banyak NO  yang akan diproduksi, namun hasil penelitian ini menunjukkan  kadar  NO  yang  terbentuk  tidak berbanding  lurus  dengan  indeks  fagositosis  makrofag yang  semakin  meningkat  seiring  dengan  peningkatan dosis klorofilin.
Penurunan  kadar  NO  juga  memiliki  efek menguntungkan  bagi host karena  produksi  NO  tinggi akan  memiliki  efek  menguntungkan  bagi  bakteri Salmonella . Efek menguntungkan ini terjadi pada fase infeksi di saluran cerna. Probiotik yang berada dalam saluran  cerna  memiliki  peran  dalam  aktifitas  enzim lysosomal makrofag. 15,32 Enzim lysosomal  elastase berperan  dalam  eliminasi  bakteri  Salmonella, 31 selain killing oleh  NO.  RNS  yang  terbentuk  pada  respon terhadap Salmonella merugikan  mikrobiota  yang hidup  di  saluran  cerna,  sehingga  memungkinkan Salmonella untuk  berkembang  bebas  dalam  saluran cerna. 15,33 Berdasarkan teori tersebut, penurunan kadar NO  akan  menguntungkan  bagi  mirobiota  alami  usus sehingga  mampu  mengaktifasi  enzim lysosomal guna membantu proses killing bakteri.
Penelitian  ini  tidak  meneliti  pengaruh    klorofilin terhadap faktor yang mempengaruhi kadar NO seperti iNOS dan status antioksidan, serta pengaruh klorofilin terhadap jumlah hitung kuman Salmonella.

## SIMPULAN
Peningkatan  dosis  klorofilin  meningkatkan  indeks fagositosis  makrofag  mencit  Balb/c  yang  diinfeksi Salmonella typhimurium . Peningkatan dosis klorofilin menurunkan  kadar  NO  mencit  Balb/c  yang  diinfeksi Salmonella typhimurium

## DAFTAR PUSTAKA
1. Crump  JA,  Luby  SP,  Mintz  ED.  The  global burden  of  typhoid  fever.  Bulletin  of  the  World Health Organization. 2004; 82(5): 346-353.
2. Ochiai  RL,  Acosta  CJ,  Danavaro-Holliday  MC, Baiqing D, Bhattacharya SK, Agtini MD, et al. A study  of  typhoid  fever  in  five  asian  countries  : disease  burden  and  implication  for  control. Bulletin of the World Health Organization. 2008; 86(4): 260-268
3. Abbas AK, Lichtman AH. Cellular and molecular immunology. Philadelphia: Saunders; 2003.
4. Beckman  JS,  Koppenol  WH.  Nitric  oxide, superoxide, and peroxynitrite : the good, the bad, and ugly.  American Journal Physiology Cell and Physiology. 1996; 271: 1424-1437.
5. Young  RW,  et  al.  Use  of  chlorophyllin  in  the case  of  geriatric  patients.  Journal  of  American Geriatri and Society. 1980; 28: 46-47.
6. Egner  PA,  et  al.  Chlorophyllin  intervention reduce  aflatoxin-DNA  adduct  in  individual  at high  risk  for  liver  cancer.  US:  Procceding National  Academy  Science.  1980;  98:  14601- 14606
7. Mittrucker  HW,  Kaufman  SHE. Immune response to infection with salmonella typhimurrium  in  mice.  Journal  of  Leukocyte Biology. 2000; 67: 457-463.
8. Sharma  D,  Kumar  SS,  Sainis  KB.  Antiapoptotic and  immunomodulatory  effect  of  chlorophyllin. Molecular Immunology. 2007; 44: 347-359.
9. Greenberg  S,  Grinstein  S.  Phagocytosis  and innate  immunity.  Current  Opinion  Immunology. 2002; 14: 136-145.
10. Gagnon  E.,  et  al.  Endoplasmic  reticulum- mediated  phagocytosis  is  a  mechanism.  Cellular Immunology. 2002; 110: 119-131
11. Beutler  B,  Du  Xi,  Poltarak  A.  Identification  of toll-like receptor 4 (TLR4) as the sole conduit for LPS signal transduction : genetic and evolutionary  study.  Journal  of  Endotoxin.  2001; 7: 277-9.
12. Baratawidjaja  KG,  Rengganis  I.  Imunologi Dasar. Jakarta: Balai Penerbit FKUI; 2010.
13. Percival  SS.  Copper  and  immunity.  American  J. of Clinical Nutrition. 1999; 67: 1064-8
14. Isolauri  E,  Sutas  Y,  Kankaanpaa  P,  Arvilommi
H,  Salminen  S.  Probiotic  :  effects  on  immunity. American Journal of Clinical Nutrition. 2001:73(suppl); 444S-50S.
15. Perdigon  G,  et  al.  Effect  of  perorally administered lactobacilli on macrophage activation in mice. Infection and Immunity. 1986: 53; 404-410.
16. Stecher B, Robbiani R, Walker AW, Westendorf AM,  Barthel  M,  Kremer  M,  et  al.  Salmonella enteric serivar typhimurium exploit inflammation to  compete  with  the  intestinal  microbiota.  PLoS Biology. 2007: 5; 2177-2189
17. Okada H, Nishioke K, Sindo T. The effect of cu- chlorophyllin on the active site formation of each component of guinea-pig complement. Immunology. 1969; 16: 473-480. 18. Yun, C. H., et al. Chlorophyllin attenuates IFN-γ expression in lipopolysaccharide-stimulated
murine splenic mononuclear cells via suppressing IL-12 production. International
Immunopharmacol. 2005; 5: 1926-1935.
19. Matsuura.,  et  al.  A  pathway  through  interferon- gamma  is  the  main  pathway  for  induction  of nitric  oxide  upon  stimulation  with  bacterial lipopolysaccharide  in  mouse  peritoneal  cell. European  Journal  of  Biochemistry.  2003;  270:
4016-4025.
20. Park  KK,  Park  JH,  Jung  YJ,  Chung  WY. Inhibitor effect of chlorophyllin, henim, tetrakis(4-benzoic  acid0porphyrin  on  oxidative DNA damage ang muose skin inlmataion indused by  12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate  as  a possible anti-tumor promoting mechanism. Mutation. 2003; 542: 89-97.
21. Kumar  SS,  Shankar  B,  Sainis  KB.  Effect  of chlorophyllin  against  oxidative  stress  in  splenic lymphocytes  in  vitro  and  in  vivo.  Biochimica  et Biophysica acta. 2004; 1672: 100-111.
22. Lanfer-Marquez UM, Barros RMC, Sinnecker P. Antioxidant  activity  of  chlorophylls  and  their derivatives.    Food  International.  2005;  38:  885– 891.
23. Evan P, Halliwell B. Micronutrient : oxidant/antioxidant  status.  British  Journal  of Nutrition. 2001; 85: 67-74.
24. Mates  JM,  Perez-Gomez  C,  De  Castro  IN. Antioxidant enzyme and human disease. Clinical Biochemistry. 1999; 32: 1-9.
25. Conner  EM,  Grisham  MB.  Inflammation,  free radical, and antioxidant. Nutrition. 1996; 12: 274- 277.
26. Michel  T,  Feron  O.  Nitric  oxide  synthases  : which, where, how, and why?.Journal of Clinical Investment. 1997; 100(9): 2146-2152.
27. Guzik  TJ,  Korbut  R,  Adamek-Guzik  TA.  Nitric oxide  and  superoxide  ininflammation  and immune  regulation.  Journal  Physiology  and Pharmacology. 2003; 54(4): 469-487.
28. Alam  MS,  et  al.  Role  of  nitric  oxide  in  host defense in  murine  salmonellosis  as  a function  of its  antibacterial  and  antiapoptotic  activities. Infection and Immunity. 2002; 70: 3130-3142.
29. Vazquez-Torres A, Jones-Carson J, Mastroeni P, Ischiropoulos  H,  Fang  FC.  Antimicrobial  action of  the  NADPH  phagocyte  oxidase  and  inducible nitric oxide synthase in experimental salmonellosis.  I.  Effect  on  microbial  killing  by activated  peritoneal  macrophages  in  vitro. Journal of. Experimental and Medical. 2000; 192: 227-236.
30. Kim  YM, et  al. Nitric  oxide  as  a  biofunctional regulator  of  apoptosis.    Infection  and  Immunity. 1999; 84: 253-256.
31. Korkmaz B, Horwitz MS, Jenne DE, Gauthier F. Neutrophil  elastase,  proteinase,  ang  cathepsin  g as therapeutic  target  in human disease. Pharmacology. 2010; 62(4): 726-759.
32. Alderton  WK,  Cooper  CE,  Knowles  RG.  Nitric oxide  synthases  :  structure,  function,  and inhibition. Biochemistry Journal. 2001; 357: 593- 615
33. Henard CA, Vázquez-Torres A. Nitric oxide and salmonella  pathogenesis.  Microbiology.  2011; 2(84): 1-11.