## ALCHEMY , Vol. 2 No. 2 Maret 2013,  hal. 138 - 149

## UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI SENYAWA KATEKIN DARI DAUN TEH
(Cameliasinensis L.var assamica) TERHADAP BAKTERI Micrococcusluteus

## Elly Rustanti, Akyunul Jannah, A. Ghanaim Fasya
Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang Corresponding author : er_ellyrose@yahoo.com

## ABSTRACT
Zat  antibakteri  merupakan  suatu  zat  yang  dapat  mengganggu  pertumbuhan dan  metabolisme  bakteri, sehingga  zat  tersebut  dapat  menghambat  pertumbuhanatau  bahkan  membunuh  bakteri. Penelitian  ini  bertujuan untuk  memanfaatkan bahan  alam  sebagai  antibakteri  alami. Penelitian  ini  ingin  mengetahui  bahwa  daun teh (Camellia  sinensis  L.  var  assamica) yang  efektif  sebagai  antibakteri  alami  dapat  menghambat  bakteri Micrococcus  luteus . Penelitian  ini  meliputi  ekstraksi  yang  dilakukan  dengan  metode  maserasi menggunakansampel daun teh. Pemisahan ekstrak katekin dilakukan dengan KLT Analitik dengan variasi eluen yaitu  etil  asetat:air:asam  format  (18:1:1),  toluena:aseton:asam  format  (3:3:1)  dan  kloroform:metanol:air (6,5:3,5:1),  untuk  mencari  eluen  terbaik  yang  selanjutnya  digunakan  untuk  KLT  Preparatif.  Selanjutnya  hasil dari KLT Preparatif digunakan untuk uji antibakteri.Hasil penelitian  menunjukkan bahwa  hasil ekstrak katekin dari  daun  teh  ±  3,34  gram dari  50  gram  sampel.  Hasil  KLT  Analitik  menunjukkan  bahwa  eluen  terbaik  untuk KLT Preparatif adalah etil asetat:air: asam format. Hasil uji antibakteri menunjukkan bahwa isolat 5 dari ekstrak daun teh memberikan efektivitas terbaik sebagai antibakteri Micrococcus luteus .
Kata Kunci: daun teh, katekin, antibakteri, Micrococcus luteus

## I. PENDAHULUAN
Penambahan  bahan  pengawet  pada makanan  merupakan  salah  satu  cara  yang dapat  digunakan  untuk  mencegah  atau mengurangi  kerusakan  atau  penurunan mutu bahan pangan. Bahan pengawet dapat mencegah kerusakan biologi yang disebabkan  oleh  mikroorganisme  atau disebut dengan antibakteri.
Beberapa bahan pengawet atau komponen antibakteri telah digunakan sejak lama  (Ardiansyah,  2007). Penggunaan pengawet  sintetis  pada  berbagai  makanan cukup  meresahkan,  contoh  jenis  bahan pengawet  sintetis  yang  digunakan  dalam industri  makanan  adalah  formalin,  boraks dan  lain-lain.Fakta  tersebut  tentu  saja sangat meresahkan masyarakat yang senantiasa  ingin  hidup  sehat.Karena  itu, upaya  pencarian  pengawet  alami  sangat perlu dilakukan (Anonymous, 2008).
Bahan  pengawet  dapat  mencegah aktivitas bakteri dan perkembangbiakannya. Dengan  kata  lain,  zat  pengawet  memiliki pengaruh langsung  terhadap  makanan  yang diawetkan.
Sebagian para ahli berpandangan bahwa zat ini tidak
berbahaya  selama  tidak  melebihi  batas. Sementara  yang  lain,  berpendapat  bahwa hal  itu  tetap  dianggap  sebagai  pemicu tumbuhnya  kanker.  Bahan-bahan  pengawet seperti  asam  benzoat,  dan  garamnya  yang paling  berbahaya  adalah  sodium  benzoat, asam  metanol  dan  garamnya,  asam  sulfat dan  garamnya.  Sekalipun  bahan-bahan  ini dianggap  racun  bagi  makhluk-makhluk kecil  seperti  bakteri,  tetapi  bisa  dianggap juga  sebagai  racun  bagi  manusia,  apabila dikonsumsi  secara  berlebihan  (As-Sayyid, 2006).
Makanan  yang  diawetkan  dengan bahan  kimia  seperti  boraks  dan  formalin dalam  berbagai  bahan  makanan  yang beredar di  pasaran seperti  bakso, tahu serta bermacam  produk  ikan  kering  telah meresahkan  masyarakat  sejak  beberapa waktu yang lalu hingga saat ini. Penambahan Bahan pengawet pada makanan  tersebut  dengan  tujuan  supaya produk  lebih  kenyal  dan  tahan  lama (Anonymous, 2008).
Micrococcus termasuk  bakteri  gram positif,  bersifat  aerob,  non  patogen  dan termasuk  family  micrococcaceae.  Sel-sel

## ALCHEMY , Vol. 2 No. 2 Maret 2013,  hal 101 - 149
Micrococcus berukuran  0.5  sampai  3.5  µm dalam  diameter,  suhu  optimum  25 0 C, menghasilkan  pigmen,  dan  koloni  dalam broth dan pada nutrient agar  menghasilkan warna  merah  atau  kuning. Micrococcus dapat  menimbulkan  noda-noda  berwarna merah pada ikan. Kultur bakteri Micrococcus luteus berkembang  sangat lambat  dan  tumbuh  selama  ±  2  minggu (Robert,1957).
Micrococcus
luteus mampu mendegradasi senyawa-senyawa yang mengeluarkan  cairan  dalam  menghasilkan bau  yang  tidak  menyenangkan  (bau busuk). Micrococcus luteus biasanya menyebabkan  kebusukan  pada  produk- produk ikan (Thiagarajan, 2006).
Berkembangnya  ilmu  pengetahuan dan  teknologi  manusia  harus  lebih  selektif dalam memilih makanan. Karena berdasarkan  penelitian  banyak  makanan yang  dicampuri  dengan  bahan  kimia sehingga berakibat pada kesehatan manusia, salah satunya adalah penambahan antibakteri  sintetik  atau  pengawetan  secara kimia.  Penggunaan  antibakteri  sintetik  atau pengawet  sintetik  pada  makanan  seperti penambahan  formalin  sebagai  pengawet makanan,  jika  dikonsumsi  secara  terus menerus  akan  menyebabkan  penyakit. Adanya  fenomena  di  atas  mendorong manusia  untuk  mencari  solusi  yang  terbaik dan tidak memberi mudhorot bagi kesehatan.  Solusi  yang  dilakukan  adalah gerakan back  to  nature atau  kembali  ke alam  untuk  mencari  alternatif  pengganti antibakteri  sintetis.  Salah  satu  sumber antibakteri alami adalah tanaman teh.
Indonesia  merupakan  negara  dengan perkebunan  teh  yang  cukup  luas.  Tanaman teh  yang  tumbuh  di  Indonesia  sebagian besar  merupakan  varietas Assamica yang berasal dari India, berbeda dengan tanaman teh yang tumbuh di Jepang dan China yang merupakan  teh  varietas Sinensis .  Teh varietas Assamica memiliki  kelebihan dalam  hal  kandungan  katekinnya  (zat bioaktif utama dalam teh) yang lebih besar. Oleh  karena  itu,  teh  varietas Assamica ini sangat  potensial  untuk  dikembangkan
menjadi produk olahan pangan dan farmasi yang  sangat  bermanfaat  bagi  kesehatan (Hartoyo, 2003).
Selain  sebagai  obat,  teh  juga  bisa digunakan  sebagai  bahan  aditif    berupa  zat pengawet  pada  ikan,  produk  kosmetik  dan makanan (Anonymous, 2008). Untuk memanfaatkan  komponen  bioaktif  dalam teh dan memperluas aplikasinya diperlukan suatu bentuk produk yang mudah digunakan. Adapun bentuk teh yang praktis tersebut  adalah  ekstrak  teh.  Dalam  ekstrak teh (kering  atau  konsentrat)  terdapat kandungan komponen bioaktif katekin yang tinggi. Produk ekstrak teh ini dimanfaatkan untuk berbagai keperluan (pangan, kosmetik,  dan lain-lain) atau diproses lebih lanjut untuk mendapatkan senyawa bioaktif murni (Hartoyo, 2003).
Allah menciptakan semua yang ada di dunia  ini  tidaklah  sia-sia  dari  yang  kecil hingga yang besar. Makhluk hidup (hewan, tumbuhan  dan  lain-lain)  semuanya  dapat dimanfaatkan oleh manusia jika manusia itu berfikir. Allah menjaga semua yang telah Ia ciptakan agar tetap hidup. Allah membuktikannya  dengan  diturunkan  oleh- Nya  hujan  sebagai  sumber  kehidupan,  dan agar  manusia  dapat  mensyukuri  nikmat yang  telah  Allah  berikan  kepadanya.  Allah telah  menjelaskannya  dalam  surat  Al- An aam  ayat  99  bahwa  Allah  telah menciptakan segala macam tanaman sebagai  tanda-tanda  kekuasaan  Allah  dan sebagai  bahan  untuk  berfikir  agar  tercipta kemaslahatan umat.
Penjelasan  di  atas  didukung  dengan firman  Allah  dalam  surat  Asy-syu ara  ayat 7 bahwa Allah menumbuhkan dari bermacam-macam  tumbuhan  yang  baik yaitu  subur  dan  bermanfaat.  Seperti  halnya teh  yang  di  dalamnya  banyak  memberikan manfaat  jika  dikonsumsi  oleh  manusia sebagai  minuman.  Teh  dalam  kehidupan masyarakat  secara  umum  dikenal  sebagai minuman,  selain  itu  juga  dapat  digunakan sebagai  antibakteri  alami  atau  pengawet alami.
Telah  dilakukan  penelitian  tentang efisiensi  polifenol  daun  teh  melawan

## ALCHEMY , Vol. 2 No. 2 Maret 2013,  hal. 138 - 149
pemudaran  warna  oleh  sinar  UV  pada  ikan berwarna  merah  yaitu  salmon.Karotenoid dalam  sampel  memudar  warnanya  seiring dengan matinya ikan.Namun, dengan penambahan  polifenol  teh,  pemudaran warna  merah  daging  ikan  dapat  dicegah lebih lama (Alamsyah, 2006).
Penelitian  Amarowicz  (2005)  tentang pemisahan Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)  menggunakan  KLT    dengan  fase diam  plat  silika  gel  dan  3 fase  gerak  yang digunakan  untuk  pemisahan    EGCG  dari ekstrak kasar daun teh dengan nilai Rf yang berbeda,  yaitu  etil  asetat:air:asam  format (90:5:5;v/v/v)  dengan  nilai  Rf  0,88,
toluena:aseton:asam format (30:30:10;v/v/v)  dengan  nilai  Rf  0,61  dan kloroform:metanol:air (65:35:10;v/v/v) dengan nilai Rf 0,62.
Berdasarkan  uraian  di  atas,  perlu dilakukan  penelitian  tentang  uji  aktivitas antibakteri  senyawa  katekin  dari  daun  teh ( Camelliasinensis ,  L. var.  Assamica )  yang efektif  sebagai  antibakteri  alami  dalam bentuk  ekstrak  antibakteri  yang  dapat menghambat pertumbuhan
bakteri Micrococcusluteus .  Penelitian  ini merupakan salah satu upaya untuk mengoptimalkan  pemanfaatan  bahan  alam hayati  Indonesia,  dengan  tujuan  untuk pencarian  eluen  terbaik  dalam  pemisahan senyawa  aktif  khususnya  senyawa  katekin sehingga  diketahui  fraksi-fraksi  aktif  yang mempunyai  potensi  sebagai  antibakteri yang terdapat dalam hasil ekstrak daun teh.

## II. METODE PENELITIAN
Alat dan bahan Alat yang digunakan dalam penelitianini  adalah  kertas  saring, neraca analitik,  seperangkat  alat  gelas,  corong pisah, rotary evaporator, sentrifuge, seperangkat alat KLT, lampu UV, spektronik,  cawan  petri,  tabung  reaksi, kapas,  kertas,  jarum  ose,  incubator,pinset, autoklaf, bunsen, dan penggaris.
Bahan  utama  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  pucuk  daun  tehsegar yang diambil dari perkebunan teh
Wonosari, Lawang, Malang. Bahan-
bahankimia yang digunakan dalam penelitian  ini,  antara  lain:  plat  silika gelGF254,  akuades  (H2O),  kloroform (CHCl3)  p.a,  metanol  (CH3OH)  p.a,  etil asetat(CH3COOC2H5)  p.a,  asam  format (CH2O2)  p.a,  aseton  (C3H6O)  p.a,  toluene (C6H5CH3)  p.a,  amoniak  (NH3)  dan larutan FeCl3.
Uji  Antibakteri  digunakan  bahan- bahan sebagai berikut: akuades
steril,alkohol  90  %,  kapas,  kertas  cakram, media  Nutrient  Agar  (NA),  Nutrient Borth(NB),  pinisilin,  streptomycin,  biakan murni Micrococcus luteus .

## Preparasi sampel
Daun  teh  dicuci  terlebih  dahulu, dipotong  kecil-kecil,  kemudian  ditumbuk hingga  halus,  hasil  yang  diperoleh  disebut sebagai sampel daun teh.

## Ekstraksi  Senyawa  Katekin  dengan Metode Maserasi
Sampel  daun  teh  ditimbang  50  gram kemudian  direndam  dalam  pelarut  aquades sebanyak  200  mL  dalam  gelas  beaker selama  2,5  jam  sambil  sesekali  dikocok (Hukmah, 2007). Kemudian larutan ekstrak daun teh disaring dengan kertas saring.Filtrat  ekstrak  daun  teh  dimasukkan dalam corong pisah.
Ditambahkan  kloroform  sebanyak 100 ml dalam corong pisah yang berisi fase air  sambil  dikocok-kocok,  diulang  3 kali.Fase  air  yang  diperoleh  dimasukkan dalam  corong  pisah  dan  ditambahkan  100 ml etil asetat, di ulang 3 kali.Fase etil asetat yang  diperoleh  dipekatkan  dengan  rotary evaporator.Ekstrak  pekat  yang  diperoleh digunakan untuk uji selanjutnya.

## Pemisahan  Ekstrak  Katekin  dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
1. KLT Analitik
Pada pemisahan dengan KLT analitik digunakan plat silika gel GF254 yang sudah diaktifkan  dengan  pemanasan  dalam  oven pada suhu 30-40 C selama 10
menit.Masing-masing  plat  dengan  ukuran 2x10 cm2. Ekstrak daun teh ditotolkan pada
jarak 1 cm dari tepi bawah plat dengan pipa kapiler  kemudian  dikeringkan  dan  dielusi dengan  fase  gerak  etil  asetat:air:asam format  (18:1:1),  toluen:aseton:asam  format (3:3:1), dan kloroform:metanol:air (6,5:3,5:1)  (Amarowicz,  2005).  Setelah gerakan  larutan  pengembang  sampai  pada garis batas,  elusi  dihentikan.  Noda-noda pada  permukaan  plat  diuapkan  dengan  uap amoniak  sambil  diperiksa  di  bawah  sinar UV  pada  panjang  gelombang  maksimum 254  nm  warna  biru  pucat  menunjukkan adanya  katekin  dan  diuji  kimia  dengan menyemprotkan larutan FeCl3 warna hitam kebiruan  menunjukkan  adanya  katekin (Robinson,  1995).  Selanjutnya  dengan memperhatikan  bentuk  noda  pada  berbagai larutan pengembang ditentukan perbandingan  larutan  pengembang  yang paling baik untuk keperluan preparatif.

## KLT Preparatif
Pada pemisahan dengan KLT preparatif  digunakan  plat  silika  gel  GF254 dengan  ukuran  5  x  20  cm.  Ekstrak  pekat hasil  ekstraksi  ditotolkan  sepanjang  plat pada jarak 1 cm dari garis bawah dan 1 cm dari  garis  tepi.  Selanjutnya  dielusi  dengan menggunakan  eluen  yang  memberikan pemisahan  terbaik  pada  KLT  analitik. Noda-noda  pada  permukaan  plat  diuapkan dengan  uap  amoniak  sambil  diperiksa  di bawah  sinar  UV  pada  panjang  gelombang maksimum  254  nm  warna  biru  pucat menunjukkan  adanya  katekin  dan  diuji kimia  dengan  menyemprotkan  larutan FeCl3  warna  hitam  kebiruan  menunjukkan adanya katekin (Robinson, 1995).
Noda yang diperoleh dikerok
kemudian  dilarutkan  dalam  pelarut  air untuk  uji  antibakteri  dan  dilarutkan  dalam pelarut  metanol  untuk  identifikasi  dengan spektrofotometer FTIR, kemudian disentrifuge
untuk mengendapkan silikanya.Berat isolat diketahui dengan cara menghitung  selisih  antara  berat  silika gelsebelum dengan sesudah sentrifuge (Day dan  Underwood,  1986  dalam  Sulami2004), kemudian  isolat  siap  digunakan  untuk analisa berikutnya.

## Uji Antibakteri 1. Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi alat dan bahan dengan cara menutup  alat-alat  yang  akandisterilkan dengan alumunium foil atau kapas, kemudian  dimasukkan  ke  dalamautoklaf pada  suhu  121  0C  dengan  tekanan  15  psi (per square inchi) selama 15menit.

## 2. Pembuatan Media
Media  yang  disiapkan  adalah  media padat  agar  miring  untuk  peremajaanbiakan murni  dan  uji  antibakteri  senyawa  katekin dari ekstrak daun teh padabakteri Micrococcus  luteus .  Pembuatan  media dilakukan  dengan  cara  sebanyak  2  gram nutrien agar dilarutkan dalam 100 mLakuades  dalam  gelas  beaker.  Kemudian dimasukkan  dalam  erlenmeyer  danditutup dengan kapas dan kertas. Suspensi dipanaskan hingga mendidih dan
dimasukkan  ke  dalam  7  tabung  reaksi (masing-masing  10  mL  untuk  5  tabung reaksi dan 5 mL untuk 2 tabung reaksi) dan ditutup dengan kapas. Tabung - tabungtersebut  kemudian  disterilkan  dalam autoklaf suhu 121 0C selama 15
menit,kemudian  diletakkan  dalam  posisi miring selama 24 jam pada suhu kamar.
3. Peremajaan Biakan MurniM. luteus . Biakan murni Micrococcus  luteus diremajakan  pada  media  padat  agar  miring dengan  cara  menggoreskan  jarum  oseyang mengandung bakteri tersebut secara aseptik dan  tabung  media  ditutupdengan  kapas. Selanjutnya biakan Micrococcusluteus diinkubasi  pada  suhu  25  0C  dalam inkubator .
4. Pembuatan Kurva Pertumbuhan bakteri dengan Media NB
Satu tabung subkultur masing-masing bakteri hasil peremajaan ditanamdalam 100 mL  media  pertumbuhan  NB,  kemudian Micrococcus  luteus diinkubasi  pada  suhu 25 0C,  setiap selang  waktu  2 jamdiambil 1 mL  dan  diencerkan  sampai  volume  10  mL sampai tumbuh optimum, kemudian dilakukan pengukuran densitas optik

## ALCHEMY , Vol. 2 No. 2 Maret 2013,  hal. 138 - 149
pertumbuhan  sel  masing-masing bakteri pada panjang gelombang 620 nm menggunakan  spektronik.  Setelah  itudibuat grafik  hubungan  waktu  inkubasi  dengan densitas optik dan diperoleh kurva pertumbuhan bakteri Micrococcus luteus .

## 5. Pembuatan Larutan BakteriM. Luteus
Diambil  1  ose  dari  hasil  peremajaan biakan  murni Micrococcus  luteus dilarutkan dalam 10 mLakuades steril.

## 6. Uji Efektivitas Antibakteri
Media agar berisi 10 mL nutrien agar (tahap  2)  dipanaskan  hingga mencair  dan kemudian  di dinginkan  sampai  suhu  ±  40 0C.  Larutan  nutrien  agardituang  dalam cawan  petri  dan  dicampur  dengan  0,1  mL larutan bakteri Micrococcus luteus , kemudian dihomogenkan  dan  dibiarkan hingga  memadat.  Kertas  cakram  (diameter 5 mm) diresapkan dalam isolat dan kontrol. Proses peresapan dilakukan dengan caramerendam  isolat-isolat  hasil  KLTP dengan variasi sampel dan kontrol. Kontrol positif untuk bakteri M. luteus menggunakan  pinisilin  25  mg/mL,  dan pelarut  Aquades  (sebagai  kontrol  negatif). Kertas cakram tersebut kemudian diletakkan di atas permukaan media bakteri menggunakan  pinset  danditekan  sedikit, kemudian  diinkubasi  pada  suhu  25  oC selama masa pertumbuhan optimum masing-masing  bakteri, kemudian  diukur diameter  zona  hambatnya. Diameter  zona hambatan yang terbentuk diukur menggunakan penggaris untuk  menentukan efektivitas  antibakteri. Pengukuran  zona hambatan  dilakukan dengan  mengukur diameter  daerah  jernih. Diameter  zona hambat adalah diameter yang tidak ditumbuhi  bakteri  di  sekitar  kertas  cakram dikurangi diameter kertascakram.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Preparasi Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  daun  teh  yang  segar. Perlakuan  daun  teh  yang  segar  dilakukan dengan menimbang sebanyak 80 gram daun
teh  segar  dan  dicuci  dengan  air  bersih. Daun yang sudah bersih kemudian dihaluskan  dengan  menggunakan  mortar, perlakuan  ini  bertujuan  untuk  memperluas permukaan sehingga mudah dalam pengekstraksian.  Hasil  yang  diperoleh disebut  sebagai  sampel  daun  teh  berwarna hijau.

## Ekstraksi Senyawa Katekin
Pada  tahap  ini  dilakukan  ekstraksi daun  teh  dengan  tujuan  mendapatkan ekstrak  kasar  senyawa  katekin  dari  daun teh.  Proses  ekstraksi  merupakan  penarikan komponen  aktif  menggunakan  pelarut tertentu.  Komponen  aktif  yang  diambil adalah  senyawa  katekin  dari  daun  teh menggunakan  metode  maserasi.  Pemilihan metode  maserasi  pada  penelitian  ini dikarenakan senyawa katekin rentan terhadap  panas  sehingga  tidak  bagus menggunakan  metode  soxhlet.  Hal  ini didukung  oleh  penelitiannya  Cheong,  et.al (2005)  dalam  Hukmah  (2007)  bahwa dengan  menggunakan  metode  soxhlet konsentrasi  senyawa  katekin  mengalami penurunan  dibandingkan  dengan  metode maserasi.
Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi  adalah  pelarut  aquades.  Aquades sering digunakan untuk mengekstrak senyawa  katekin  karena  senyawa  katekin merupakan  senyawa  yang  mengandung  2 cincin  aromatik  dengan  gugus  hidroksil lebih dari satu. Robinson (2005)
menyatakan semakin banyak gugus
hidroksil  suatu  senyawa  fenol  memiliki tingkat  kelarutan  dalam  air  semakin  besar atau  bersifat  polar  sehingga  dipilih  pelarut polar.
Sampel  daun  teh  ditimbang50  gram kemudian  direndam  dalam  200  mL  pelarut selama  2,5  jam.  Proses  ekstraksi  akan berlangsung  optimal  dengan  tersedianya waktu  kontak  yang  cukup  antara  pelarut dan  sampel.  Selama  proses  perendaman dilakukan  beberapa  kali  pengocokan  untuk menyempurnakan kontak antara pelarut dan sampel.  Larutan  kemudian  disaring  dan diperoleh  filtrat  dari  pelarut  dengan  warna
hijau pada ekstrak daun teh ditentukan oleh adanya klorofil.
Filtrat  hasil  penyaringan  kemudian difraksinasi dengan cara ekstraksi menggunakan corong pisah, filtrat ditambahkan  kloroform  untuk  mengambil senyawa-senyawa  yang  bersifat  nonpolar, diantaranya lemak, klorofil, kafein dan lain- lain.  Penambahan  kloroform  diulang  untuk memaksimalkan proses pengambilan senyawa yang bersifat non polar.
Penambahan kloroform menyebabkan terbentuknya  dua  fase  yaitu  fase  air  dan fase  kloroform.  Fase  kloroform  ditampung dan  fase  air  diambil  untuk  dilakukan  tahap fraksinasi  selanjutnya  menggunakan  etil asetat.  Penambahan  etil  asetat  berfungsi untuk mengambil senyawa katekin. Penambahan  etil  asetat  diulang  untuk memaksimalkan pengambilan senyawa katekin.  Langkah  selanjutnya  fase  air ditampung  dan  diambil  fase  etil  asetat  dari sampel daun teh dengan  warna fase kuning pekat dan berat sampel 3,34 gram.
Ekstrak pekat yang dihasilkan memilikiwarna  kuning  pekatmenunjukkan bahwa klorofil yang terdapat dalam ekstrak daun teh sudah  tidak tampak  karena terikat oleh kloroform, dan ketika ditambahkan etil asetat warna hijau menjadi kuning pekat.
Fase  etil  asetat  kemudian  dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh  ekstrak  pekat.  Proses  evaporasi ini dilakukan untuk menghilangkan pelarutnya.  Pelarut  yang  diuapkan  (etil asetat)  memiliki  titik  didih  antara  77  ºC, sehingga  proses  evaporasi  berlangsung cepat.  Ekstrak  pekat  tersebut  kemudian dipisahkan  dengan  Kromatografi  Lapis Tipis.
Pemisahan  Ekstrak  Katekin  dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
1. KLT Analitik
Pendugaan  secara  kualitatif  senyawa katekin  daun  teh  dari  masing-masing sampel dilakukan dengan metode Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT).  KLT merupakan  metode  pemisahan  senyawa kimia  dengan  menggunakan  fase  diam  dan
fase  gerak.  Pemisahan  katekin  dari ekstrak kasar  dilakukan  menggunakan  plat  silika gel dengan eluen etil asetat:air:asam format (18:1:1), toluen:aseton:asam format (3:3:1), dan kloroform:metanol:air (6,5:3,5:1). Penggunaan  berbagai  macam  eluen  pada pemisahan  ini  untuk  mencari  eluen  terbaik dan  dapat  memisahkan  senyawa  katekin yang terkandung dalam daun teh.
Hasil  elusi  dari  kedua  ekstrak  ini dengan  variasi  bentuk  sampel  dapat ditunjukkan pada Gambar 1. dan Tabel 1.
Tabel 1. Nilai Rf  Pada Kromatogram Hasil KLT Analitik dengan Variasi Eluen
Nilai Rf dari ekstrak daun teh
Etil asetat:air:asa m format (18:1:1) Toluena:ase ton:asam format (3:3:1) Kloroform: metanol: air (6,5:3,5:1) 1. Rf = 0,22 2. Rf = 0,47 3. Rf = 0,64 4. Rf = 0,78 5. Rf = 0,86 6. Rf = 0,95 1. Rf = 0,39 2. Rf = 0,61 3. Rf = 0,74 1. Rf = 0,90
(1) (2)  (3)
Ekstrak daun teh
Keterangan:      Eluen:  (1)  etil  asetat: air: asam  format    (2)  toluen: aseton: asam format (3:3:1) dan  (3) kloroform: metanol: air (6,5:3,5:1)

## Gambar 1. Hasil KLT Analitik
Pada  Gambar  2.  dan  Tabel  3.  dapat dilihat  bahwa  perbedaan  jumlah  noda  pada masing-masing  eluen  tergantung  pada  sifat

## ALCHEMY , Vol. 2 No. 2 Maret 2013,  hal. 138 - 149
kepolaran  noda,  fase  diam  dan  fase geraknya.  Pemisahan  ini  didasarkan  pada sifat  polaritas  senyawa.  Senyawa  yang memiliki polaritas hampir sama dengan fase geraknya  akan  terelusi  terlebih  dulu dibandingkan senyawa dengan sifat polaritas yang berbeda dengan fase geraknya. Hal ini yang mengakibatkan nilai Rf dari masing-masing noda berbeda karena jarak  tempuh  antara  senyawa  dan  fase geraknya tergantung pada sifat polaritasnya.
Hasil  pemisahan  dari  kedua  ekstrak menunjukkan  bahwa  eluen  etil  asetat: air: asam  format  (18:1:1)  mampu  memisahkan ekstrak pekat dengan baik karena menghasilkan  noda  yang  paling  banyak dengan  pemisahan  yang  jelas  yaitu  ekstrak daun  teh  menghasilkan  6  noda,  munculnya 6  noda  ini  tergantung  pada  kelarutan senyawa  dalam  pelarut  yaitu  interaksi antara  molekul-molekul  senyawa  dengan pelarut  dan  melekatnya  senyawa  pada  fase diam yaitu interaksi antara senyawa dengan silika  gel.  Kedua  hal  tersebut  akan mempengaruhi  mudahnya  senyawa  ditarik oleh  fase  gerak  (pelarut)  keluar  dari permukaan  fase  diam  (silika  gel)  sehingga muncul  6  noda  karena  kepolaran  senyawa- senyawa  yang  dipisahkan  mempunyai tingkatan  yang sama  dengan  fase diam  dan fase geraknya.
Eluen dengan
campuran toluen:aseton:asam  format  (3:3:1)  dalam pemisahan  cukup  bagus  yaitu  ekstrak  daun teh  menghasilkan  3  noda,  munculnya  3 noda  ini  karena  senyawa-senyawa  yang dipisahkan  kurang  berinteraksi  dengan  fase gerak (pelarut) karena kepolaran
senyawanya hampir sama dengan fase diam sehingga  yang  dapat  larut  dalam  pelarut hanya sebagian senyawa yang kepolarannya sama.
Sedangkan  eluen  dengan  campuran kloroform:metanol:air  (6,5:3,5:1)  dalam pemisahan kurang bagus yaitu ekstrak daun teh  menghasilkan  1  noda,  munculnya  1 noda  ini  karena  senyawa-senyawa  yang dipisahkan  kurang  berinteraksi  dengan  fase gerak (pelarut) karena kepolaran senyawanya hampir sama dengan fase diam
sehingga  yang  dapat  larut  dalam  pelarut hanya sebagian senyawa yang kepolarannya sama dan senyawa tidak terpisahkan dengan baik  sehingga  perlu  adanya  perubahan eluen.
Eluen yang dapat memisahkan senyawa  katekin  yang  baik  adalah  etil asetat:air:asam  format  (18:1:1),  kemudian toluen:aseton:asam  format  (3:3:1),  dan kloroform:metanol:air  (6,5:3,5:1).  Hal  ini dikarenakan  eluen  etil asetat:air:asam format  (18:1:1)  bersifat  agak  polar  dan kepolarannya  hampir  sama  dengan  ekstrak katekin  yang  dipisahkan  sehingga  noda yang  diperoleh  lebih  banyak.  Menurut Robinson  (2005),  etil  asetat  merupakan pelarut yang baik untuk menangani katekin.
Fase diam juga mempengaruhi pemisahan katekin, fase diam yang digunakan  adalah  silika  gel.  Silika  gel adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom  silikon  dihubungkan  oleh  atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun,  pada  permukaan  silika  gel,  atom silikon  berlekatan  pada  gugus  -OH.    Jadi, pada  permukaan  silika  gel  terdapat  ikatan Si-O-H  selain  Si-O-Si.  Permukaan  silika gel  sangat  polar  dan  karenanya  gugus  -OH dapat  membentuk  ikatan  hidrogen  dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya.
Hasil  KLT  kemudian  dilakukan  uji identifikasi senyawa katekin dengan pereaksi FeCl 3 , pereaksi ini telah digunakan secara luas untuk mengidentifikasi senyawa fenol  terutama  katekin  akan  menghasilkan warna  hitam  kebiruan  (Robinson,  2005). Plat  yang  telah  disemprot  dengan  pereaksi FeCl 3 diangin-anginkan  sampai  kering kemudian diidentifikasi plat tersebut dibawah  sinar  lampu  UV  pada  panjang gelombang  254  nm  (untuk  memperjelas spot yang terbentuk).
Hasil  identifikasi  KLT  ditunjukkan pada gambar di bawah ini:
(a)                       (b)
(c)
Keterangan: Hasil  Identifikasi KLT dengan (a)  tanpa  lampu  UV,  (b)  lampu  UV  + amoniak, dan (c) larutan FeCl 3 .
Gambar  2.    Hasil  Identifikasi  KLT  dengan eluen etil asetat:air:asam format (18:1:1)
Berdasarkan  hasil  dari  KLT  analitik maka  eluen  etil  asetat:air:asam  format (18:1:1)  memberikan  elusi  terbaik,  karena pemisahan  didasarkan  pada  sifat  polaritas senyawa. Senyawa katekin memiliki polaritas  yang  hampir  sama  dengan  eluen etil asetat:air:asam format (18:1:1) sehingga kemampuan  dalam  memisahkan  senyawa tersebut  lebih  baik.  Dan  eluen  tersebut kemudian  digunakan  dalam  pemisahan senyawa katekin dengan KLT preparatif.

## 2. KLT Preparatif
Hasil  pemisahan  kromatografi  lapis tipis  preparatif  hampir  sama  dengan  KLT kualitatif hanya berbeda pada kuantitas dari ekstrak yang digunakan. Dimana pada KLT prepararif  digunakan  plat  KLT  silika  gel dengan  ukuran  yang  lebih  besar  yaitu dengan  ketebalan  ±  1  mm.  Pada  KLTP digunakan  eluen  terbaik  KLTA  yaitu  etil asetat:air:asam  format  (18:1:1),  karena mampu  memisahkan  ekstrak  pekat  dengan baik yaitu ekstrak daun teh menghasilkan 6 noda,  dan  antara  noda  satu  dengan  yang lainnya  terpisah  jelas.  Hasil  noda  pada KLTP ditunjukkan pada gambar berikut:
Gambar 3. Noda hasil KLTP
Pada Gambar 3. Sampel ekstrak daun teh  menghasilkan  6  noda  dengan  nilai  Rf sebagai berikut:
Tabel  2.  Nilai  Rf  dan  Warna  Noda  pada Kromatogram Hasil KLT Preparatif Ekstrak daun teh
Noda Rf Warna Noda Tanpa UV Amoniak UV FeCl 3 1 0,22 Kuning Biru pucat Hitam biru 2 0,47 Kuning Biru pucat Hitam biru 3 0,64 Kuning Biru pucat Hitam biru 4 0,78 Ungu Biru pucat Hitam biru 5 0,86 Ungu Biru pucat Hitam biru 6 0,95 Orange Biru pucat Hitam biru
Warna  biru  pucat  ketika  diuapi amoniak  dan  disinari  lampu  UV  dari  ke-6 noda  tersebut  merupakan  senyawa  katekin, namun  karena  data  kromatogram  tidak menyertakan senyawa standart, maka belum dapat  ditentukan  jenis  komponen  senyawa yang  terekstrak.  Menurut  Robinson  (1995) senyawa  katekin  ketika  diuapi dengan  uap amoniak  sambil  diperiksa  dibawah  sinar ultraviolet (UV) berfluoresensi biru pucat.
Pada  lampu  UV  254  nm,  plat  akan berflouresensi dan penampakan noda terjadi
6
5
4 3 2 1

## ALCHEMY , Vol. 2 No. 2 Maret 2013,  hal. 138 - 149
karena  adanya  daya  interaksi  antara  sinar UV  dengan  indikator  fluoresensi  yang terdapat pada Plat. Fluoresensi cahaya yang tampak  merupakan  emisi  cahaya  yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar  ke  tingkat  energi  yang  lebih  tinggi kemudian  kembali  ke  keadaan  semula sambil melepaskan energi.
Penyemprotan  dengan  larutan  FeCl 3 menunjukkan  warna  hitam  kebiruan  dan diduga merupakan senyawa katekin. Menurut  Robinson  (1995)  suatu  senyawa yang  direaksikan  dengan  FeCl 3 jika  terjadi warna  hitam  kebiruan,  merupakan  bukti adanya  3,4,5-trihidroksi  fenol  (seperti galokatekin).Noda  yang  dihasilkan  pada KLT  preparatif  kemudian  dikerok  dan dilarutkan dalam air untuk uji antibakteri.

## Uji Antibakteri

## 1. Penyiapan  media  dan  peremajaan
biakan murni M. luteus
Media pertumbuhan mengandung nutrisi  dan  zat-zat  yang  diperlukan  oleh bakteri untuk tumbuh. Media cair digunakan  untuk  produksi  atau  pembuatan kurva pertumbuhan, sedangkan media padat digunakan  untuk  peremajaan  biakan  murni bakteri. Peremajaan dilakukan untuk menjaga  ketersediaan  nutrisi,  regenerasi bakteri dan menghindari terjadinya perubahan  karakter  dari  biakan  murni bakteri.
2. Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri dengan media Nutrient Borth Kurva  pertumbuhan  menggambarkan fase-fase  yang  ada  dalam  siklus  hidup Micrococcusluteus yang  meliputi  fase adaptasi, fase logaritmik, fase stasioner, dan fase kematian. Berdasarkan kurva pertumbuhan dapat ditentukan waktu panen yang  ideal  adalah  pada  saat  pertumbuhan bakteri  mendekati  fase  stasioner.  Pada  saat ini, jumlah sel bakteri mendekati maksimum seiring dengan kematian bakteri.
Pembuatan kurva pertumbuhan diawali  dengan  penumbuhan  biakan  murni
bakteri  yang  telah  diremajakan  pada medium cair dan diinkubasi pada inkubator dengan  suhu  25 0 C  sambil  digoyang- goyang.  Hal  ini  dilakukan  untuk  mengatur aerasi  dan  agitasi  yang  menjaga  kondisi fisika  dan  kimia  media  pertumbuhan  serta memperlancar transfer nutrisi ke dalam sel.
Pertumbuhan  bakteri  diamati  dengan mengukur  densitas  optik  (DO)  media pertumbuhan  pada  panjang  gelombang  620 nm  setiap  selang  waktu  2  jam  sampai  nilai DO media konstan dan akhirnya mengalami penurunan.  Nilai  DO  sebanding  dengan massa  sel  yang  terdapat  dalam  media, makin  banyak  massa  sel  makin  besar  DO- nya.  Kemudian  kurva  pertumbuhan  dibuat dengan  membuat  grafik  hubungan  waktu inkubasi  dengan  nilai  DO  media.  Pada penelitian  ini  kurva  pertumbuhan  bakteri Micrococcus luteus pada  penelitian  ini adalah sebagai berikut:
Gambar 4. Kurva Pertumbuhan M. Luteus
Dari  Gambar  4.  diketahui  bahwa pertumbuhan Micrococcusluteus melewati beberapa  fase,  yaitu:  fase  adaptasi  yang terjadi  pada  waktu  inkubasi  0-6  jam,  pada fase  ini  pertumbuhan Micrococcusluteus sangat  lamban  karena  masih  beradaptasi dengan  media.  Fase  logaritmik  pada  waktu inkubasi 6-34 jam, pada fase ini Micrococcusluteus mengalami  pembelahan sel  secara  terus  menerus  yang  ditandai meningkatnya  jumlah  sel  sampai  mencapai jumlah  maksimum.  Fase  stasioner  dicapai waktu  inkubasi  34  jam,  pada  fase  ini pembelahan sel Micrococcus luteus sebanding dengan jumlah kematian sehingga  tidak  terjadi  peningkatan  jumlah sel. Fase kematian terjadi setelah diinkubasi
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 Waktu Inkubasi (Jam) D e n s it a s O p ti k ( A )
selama  46  jam,  pada  fase  ini  terjadi penurunan  jumlah  sel Micrococcusluteus karena kematian  sel  akibat habisnya nutrisi penting  dalam  media.  Oleh  karena  itu, dalam  penelitian  ini  pembuatan  inokulum dilakukan  selama  waktu  inkubasi  14  jam yang merupakan tengah-tengah fase logaritmik  dan  zona  hambat  bakteri Micrococcusluteus dapat  diukur  setelah diinkubasi selama 34 jam.
3. Uji Aktivitas Antibateri Micrococcucluteus Micrococcusluteus merupakan bakteri gram  positif.  Uji  aktivitas  senyawa  katekin sebagai antibakteri Micrococcusluteus dilakukan dengan mengukur zona hambatan yang terbentuk  disekitar  cakram. Perlakuan pada kontrol positif untuk bakteri Micrococcusluteus menggunakan  pinisilin 25 mg/ml dan kontrol negatif air menunjukkan  bahwa  pelarut  air  tidak mampu membunuh bakteri, hal ini ditunjukkan  dengan  pertumbuhan  bakteri yang terus melewati cakram tanpa terhambat pertumbuhannya. Hasil uji aktivitas  6  isolat  hasil  KLTP  dengan konsentrasi 15 mg/ml  dan tiga kali ulangan terhadap  bakteri Micrococcusluteus adalah sebagai berikut:
Tabel 3. Data zona hambat senyawa katekin ekstrak  daun  teh  hasil  KLT  sebagai antibakteri M. Luteus
No. Cakram Diameter zona hambat (mm) Rata- rata (mm) 1 2 3 1. Isolat 1 13,0 12,0 10,0 11,7 2. Isolat 2 14,0 13,0 15,0 14,0 3. Isolat 3 20,0 20,0 18,0 19,3 4. Isolat 4 10,0 10,0 8,00 9,30 5. Isolat 5 22,0 21,0 21,0 21,3 6. Isolat 6 15,0 13,0 15,0 14,3 7. Kontrol + 40,0 37,5 35,0 37,5 8. Kontrol - 0,00 0,00 0,00 0,00
Tabel 3., menunjukkan adanya perbedaan  dari  beberapa  isolat  terhadap zona  hambatan  bakteri Micrococcusluteus . Pada  isolat  1,  2  dan  6  aktivitas  antibakteri mulai  tampak  namun  respon  hambatan
pertumbuhannya  masih  lemah,  dan  pada isolat 3 aktivitas antibakteri juga menunjukkan respon hambatan pertumbuhan yang kurang kuat atau sedang dengan zona hambat sebesar 19,3 mm, pada isolat  4  aktivitas  antibakteri  menunjukkan tidak adanya respon hambatan pertumbuhan.  Sedangkan,  pada  isolat  5 dengan zona hambatan 21,3 mm yang mana respon hambatan pertumbuhannya kuat.
Dari  Tabel  3.  diketahui  bahwa  isolat yang efektif sebagai antibakteri Micrococcus luteus adalah isolat 5. Isolat 5 dari ekstrak daun teh mempunyai efektivitas  antibakteri  yang  paling  kuat yaitu  dengan  memberikan  zona  hambat 21,3  mm  yang  ditunjukan  pada  gambar berikut:

## Gambar 5. Isolat 5 (21,3 mm)

## Mekanisme  Kerja  Senyawa  Katekin Terhadap Pertumbuhan Bakteri
Aktivitas  antibakteri  terbaik  yang menghambat Micrococcusluteus adalah isolat 5 dari ekstrak daun  teh dengan zona hambat 21,3 mm. Micrococcusluteus adalah bakteri gram positif yang susunan komponen  dinding  selnya  lebih  sederhana. Bakteri  gram  positif  90  %  kandungan dinding selnya adalah peptidoglikan, selebihnya  adalah  asam  teikoat  (Fardiaz, 1986 dalam Ardiansyah, 2007).
Senyawa  katekin  termasuk  senyawa polifenol,  yang  mana  senyawa  ini  dapat menghambat  bakteri  dengan  cara  merusak membran  sitoplasma  bakteri  yang  tersusun oleh  60  %  protein  dan  40  %  lipid  yang umumnya  berupa  fosfolipid.  Senyawa katekin  merusak  membran  sitoplasma  yang
Zona hambat

## ALCHEMY , Vol. 2 No. 2 Maret 2013,  hal. 138 - 149
menyebabkan  bocornya  metabolit  penting yang  menginaktifkan  sistem  enzim  bakteri. Kerusakan pada membran  sitoplasma dapat mencegah masuknya bahan-bahan makanan atau  nutrisi  yang  diperlukan  bakteri  untuk menghasilkan energi akibatnya bakteri akan mengalami  hambatan  pertumbuhan  dan bahkan kematian (Volk and Wheller, 1993).
Setiap sel bakteri dikelilingi membran tipis yang disebut membran sitoplasma atau membran  plasma  yang  tersusun  dominan oleh  ergesterol  yang  bersifat  permeabel selektif. Selain itu, fosfolipid juga merupakan  senyawa  yang  penting  dalam pembentukan  membran  sitoplasma  bakteri. Pada  perusakan  membran  sitoplasma, senyawa  katekin  melepaskan  ion  H + yang selanjutnya  menyerang  gugus  hidrofilik (gugus hidroksi dan fosfat) pada permukaan membran sel.
Gugus hidroksi pada molekul ergesterol yang mengadakan ikatan hidrogen  tidak  mampu  mempertahankan ikatan  dan  kedudukannya.  Membran  sel tidak  mampu  menahan  tekanan  dari  dalam, akibatnya  sitoplasma  dalam  sel  akan menembus keluar. Selain  itu, pada molekul fosfolipid ion H + dari senyawa katekin akan menyerang  gugus  polar  (gugus  fosfat) sehingga  molekul  fosfolipid  akan  terurai menjadi  gliserol,  asam  karboksilat,  dan asam  fosfat.  Hal  ini  mengakibatkan fosfolipid  tidak  mampu  mempertahankan bentuk  membran  sitoplasma  akibatnya membran  sitoplasma  akan  bocor  sehingga zat-zat  untuk  metabolisme  sel  bakteri  akan terbuang  keluar  dan  bakteri  akan  mati. Mekanisme  penghambatan  pertumbuhan bakteri  berupa  perusakan  fosfolipid  pada membran  sel  bakteri Micrococcus luteus oleh senyawa katekin.
IV. KESIMPULAN Senyawa katekindari daun teh ( Camelliasinensis ,  L. varassamica )  efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Micrococcusluteus . Senyawa
katekin mempunyai  aktivitas  antibakteri  yang paling kuat yaitu isolat 5 dengan
memberikan  zona hambat  21,3  mm terhadap bakteri Micrococcusluteus.

## V. DAFTAR PUSTAKA
Alamsyah,  N.  A.  ,  2006, Taklukkan Penyakit  dengan  Teh  Hijau ,  Penerbit Agrimedia Pustaka, Jakarta. Al-Jauziyah, I.Q., 2007, Metode Pengobatan  Nabi  SAW ,  Penerbit Griya Ilmu, Jakarta. Amarowicz, R., Maryniak, A., and Shahidi,
F., 2005, TLC Separation of Methylated(-)-Epigallocatechin-3- Gallate ,  Czech  J.  Food  Sci.,  Vol.  23, No.1: 36-39. Anonymous,  2008, Penggunaan  Bahan Pengawet ,http://www.disnaksumbar.o rgDiakses tanggal 15 Maret 2008.
As-Sayyid,  A.,  B.M,  2006, Pola  Makan Rasulullah , Penerbit Almahira,
Jakarta.
Buckle, K. A., Edwards, R. A., Fleet, G. H.,
and  Wotton,  M.,  2007, Ilmu  Pangan , Penerbit  Universitas  Indonesia  (UI-
PRESS), Jakarta. Gritter, R. J., 1991, Pengantar Kromatografi ,  edisi  kedua,  Penerbit ITB, Bandung. Hadiwiyoto, S., 1993, Teknologi Pengolahan Hasil Perikanan , Liberty: Yogyakarta. Harborne  J.B.,  1987, Metode  Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Penerbit ITB, Bandung. Hartoyo,  A.,  2003, Teh  dan  Khasiatnya Bagi  Kesehatan ,  Penerbit  Kanisius, Yogyakarta.
Hukmah,  S., Aktivitas  Antioksidan  Katekin dari  Teh  Hijau  (Camellia  Sinensis O.K.  Var.  Assamica  (mast))  Hasil
Ekstraksi Dengan Variasi Pelarut dan Suhu, Skripsi  Mahasiswa  Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi,UIN, Malang . Imani,  A.K.Q,  2005, Tafsir  Nurul  Quran
Sebuah  Tafsir  Sederhana  Menuju
Cahaya Al-Qur'an , Penerjemah
Salman  Nano,  Penerbit  Al-Huda, Jakarta.
Inglis,  V.,  Robert,  R.,  and  Bromage,  N.,
2001, Bacterial  Diseases  Of  Fish , Blackwell Science company, Australia. Naim,  R.,  2004, Senyawa Anti mikroba Dari Tanaman , IPB, Bogor.
http64.203.71.11kompas- cetak040915sorotan1265264.htm.htm
. Diakses Tanggal 7 April 2008.
Naidu, A.S., 2000, Natural Food Antimicrobial  Systems ,  CRC  Press LLC,  California  State  Polytechnic University, Pomana, California.
Nazaruddin farry B. Paimin, 1993,
Pembudidayaan dan Pengolahan Teh ,
Penebar Swadaya, Jakarta.
Noviana,  L.,  2004, Identifikasi  Senyawa Flavonoid Hasil Isolasi dari Proporlis Lebah Madu (Apis Mellifera) dan Uji Aktivitasnya Sebagai  Antibakteri  (Staphylococcus
Aureus) ,  Skripsi  Mahasiswa  Jurusan Kimia Universitas Brawijaya Malang. Pasya,  A.F.,  2004, Dimensi  Sains  dan  Al- Qur'an  Menggali  Ilmu  Pengetahuan
dari Al-Qur'an, Penerbit Tiga
Serangkai, Solo.
Pelczar,  M.J.  dan  Chan,  E.C.S.,  1986,
Dasar - DasarMikrobiologi ,  UI  Press, Jakarta.
Robert,  S.B.,  E.G.D.  Murray,  and  Nathan
R.  Smith,  1957, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology , Baltimore The Williams  and Walkins Company.
Robinson,  T.,  1995, Kandungan  Senyawa Organik Tumbuhan Tinggi , Diterjemahkan oleh Prof. Dr. Kosasih Padmawinata, ITB, Bandung. Sastrohamidjojo, 2005, Kromatografi ,
UGM Press, Yogyakarta.
Shihab, Q., 2002, Tafsir Al-Mishbah Pesan,
Kesan,  dan  Keserasian  Al-Qur'an Vol.  10 ,  Penerbit  Lentera  Hati,
Jakarta.
Soraya,  N,  2007, Sehat  Dan  Cantik  Berkat
Teh Hijau , Penebar Swadaya, Jakarta. Thiagarajan, S., 2006, Micrococcus , \httpwww.emlab.comssamplingenv- report-12- 2006.html.mht.  Diakses tanggal 18 Juli 2008