Sitotoksisitas in vitro ekstrak etanolik buah parijoto ( Medinilla speciosa , reinw.ex bl.) terhadap sel kanker payudara T47D
Iin Tussanti 1 , Andrew Johan 2 , Kisdjamiatun 3

## ABSTRACT
Background :  Several  studies  focused  on  phytochemical  as  agents  of  cancer  prevention  and  co-chemotherapy.  One  of Indonesian plant which has edible fruit but it hasn’t been completely explored is Medinilla speciosa (Reinw.ex Bl.). Objective : The  aim  of  this  study  is  to  examine  the  cytotoxic  activity  (IC 50 value)  of  Medinilla  speciosa  (Reinw.ex  Bl.)  fruit  ethanolic extract.
Methods :  Medinilla  speciosa  (Reinw.ex  Bl.)  fruit  ethanolic  extract  was  used  in  this  study.  The  cytotoxic  activity  was investigated in vitro on human breast cancer T47D cell-line. The cells viability were assessed using MTT colorimetric assay. Breast cancer T47D cell lines was treated with fruit ethanolic extract (10, 25, 50, 100, 250, 500 and 1000 µg/ml) for 24 hour of incubation. This study also identified phytochemical compound of the fruit with thin layer chromatography (TLC). Results :  The  result  showed  that  ethanolic  extract  of  Medinilla  speciosa  (Reinw.ex  Bl.)  has  moderate  cytotoxicity  on  breast cancer  T47D  cell  line  with  IC 50 value  of  614.50  µg/ml  and  yield  the  decrease  of  cell  viability  at  higher  concentration. Medinilla speciosa fruit can not be used as anticancer agent but chemoprevention agent. Phytochemical test showed that the fruit extract contain flavonoid and saponin compound.
Conclusion :  Ethanolic  extract  of  Medinilla  speciosa  fruit  exhibited  moderate  cytotocicity  on  breast  cancer  T47D  cell  lines with IC 50 value was 614,50 µg/ml thus it can be used as chemopreventioan agent.
Keywords : fruit, Medinilla speciosa (Reinw.ex Bl.), cytotoxixity, MTT assay, breast  cancer, T47D cell line

## ABSTRAK
Latar  belakang  :  Beberapa  penelitian  telah  mengkaji  komponen  fitokimia  tumbuhan  sebagai  agen  kemoprevensi  atau pendamping kemoterapi kanker. Salah satu jenis tumbuhan Indonesia yang dapat dikonsumsi buahnya dan belum dieksplorasi potensinya  terhadap  kanker  adalah  tumbuhan  parijoto  (Medinilla  speciosa).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui sitotoksisitas (nilai IC50) ekstrak etanolik buah parijoto (Medinilla speciosa, Reinw.ex Bl.) secara in vitro.
Metode:  Aktifitas  sitotoksik  ekstrak  etanolik  buah  parijoto  (Medinilla  speciosa,  Reinw.ex  Bl.)  diuji  secara  in  vitro  pada  sel kanker payudara T47D dengan metode MTT. Sel kanker payudara T47D diberi perlakuan dengan seri konsentrasi ekstrak 10, 25,  50,  100,  250,  500  dan  1000  µg/ml  dan  diinkubasikan  selama  24  jam.  Dalam  penelitian  ini  juga  dilakukan  uji  fitokimia terhadap komponen mayor dalam buah dengan metode kromatografi lapis tipis.
Hasil : Ekstrak etanolik buah Medinilla speciosa menyebabkan sitotoksisitas moderat pada sel kanker T47D dengan nilai IC50 sebesar  614,50  µg/ml.  Ini  menunjukkan  bahwa  Medinilla  speciosa  tidak  dapat  digunakan  sebagai  agen  antikanker  tetapi memiliki potensi sebagai agen kemoprevensi dan menyebabkan berkurangnya viabilitas sel. Uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak buah Medinilla speciosa positif mengandung flavonoid dan saponin.
Simpulan : Ekstrak etanolik buah Medinilla speciosa menunjukkan sitotoksisitas moderat pada sel kanker T47D dengan nilai IC50 sebesar 614,50 µg/ml dan berpotensi kemoprevensi.
Kata kunci :  buah, tumbuhan parijoto (Medinilla speciosa, Reinw.ex Bl.), sitotoksisitas, metode MTT, kanker  payudara, sel T47D

## PENDAHULUAN
Kanker payudara merupakan jenis kanker yang paling banyak  diderita    wanita  di  seluruh  dunia. 1 Sebagian besar  penyakit  kanker  (lebih  dari  95%)  disebabkan karena pengaruh epigenetik dimana gen-gen dipengaruhi  oleh  berbagai  faktor  eksternal  seperti makanan  dan  lingkungan. 2,3,4 Kondisi-kondisi  yang
dapat menyebabkan perubahan sel normal menjadi sel kanker  adalah  hyperplasia,  dysplasia  dan  neoplasia. 5 Pertumbuhan  sel  yang  tidak  terkendali  disebabkan karena  kerusakan  DNA  sehingga  menyebabkan mutasi  pada  gen  vital. 6 Mencegah  proliferasi  sel kanker lebih lanjut melalui diet harian dan perubahan gaya hidup perlu dilakukan disamping berbagai upaya kemoterapi  karena  membunuh  satu  sel  target  kanker diantara  jutaan  sel  lain  merupakan  satu  hal  yang sangat sulit dilakukan. 3
Bahan-bahan  alami  tumbuhan  banyak  yang  telah diekstrak  sebagai  obat  antikanker  tetapi  khasiatnya dalam  hal  gizi  diperoleh  dalam  bentuk  nutrisi  harian. Peran  positif    buah  dan  sayur  sebagai  nutrisi  untuk
1 SMA Negeri 2, Kabupaten Pati, Indonesia
2 Bagian  Biokimia,  Fakultas  Kedokteran  Universitas Diponegoro, Indonesia
3 Bagian  Parasitologi,  Fakultas  Kedokteran  Universitas Diponegoro, Indonesia
kesehatan  diindikasikan  oleh  komponen  fitokimia yang  terkandung  didalamnya. 7 Salah  satu  spesies tumbuhan  asli  Indonesia  yang  belum  dieksplorasi sepenuhnya  secara  farmakologi  adalah  tumbuhan parijoto  ( Medinilla  speciosa ,  Reinw.ex  Bl.).  Parijoto merupakan  tumbuhan  endemik  dari  daratan  Asia dengan  pusat  penyebaran  di  Malaysia,  Indonesia  dan Pilipina. 8,9 Di  wilayah  Jawa  Tengah,  buah  parijoto umumnya  dikonsumsi  oleh  wanita  hamil  dan digunakan sebagai obat sariawan. Komponen fitokimia yang terkandung dalam buah parijoto adalah flavonoid, saponin dan kardenolin. 10
Rendahnya  risiko  kanker  kolon,  prostat  dan payudara  pada  masyarakat  Asia  yang  mengkonsumsi sayuran  atau  buah-buahan  dibanding  negara-negara barat menunjukkan adanya peranan fitokimia tumbuhan  sebagai  agen  antikanker.  Sebagian  besar fitokimia  tumbuhan  tergolong  sebagai  senyawa fenol. 11 Salah satu jenis fenol yang paling  melimpah pada  tumbuhan  adalah  flavonoid. 12,13 Beberapa  studi in  vitro  menunjukkan  beragam  efek  antikanker  dari flavonoid  seperti  inhibisi  pertumbuhan  sel  dan aktifitas protein-kinase, induksi apoptosis, berkurangnya  sekresi  matriks  metalloproteinase  dan menghambat  penyebaran  tumor.  Studi  in  vivo  juga menunjukkan  terhambatnya  angiogenesis  akibat konsumsi flavonoid harian. 14,15,16
Saponin  merupakan  komponen  fitokimia  yang memiliki  ciri  dapat  membentuk  busa.  Saponin memiliki  aktifitas  antitumor  dengan  mekanisme sitotoksik  yang  berbeda  tergantung  jenisnya.  Saponin dapat  mengaktifkan  jalur  apoptosis  secara  intrinsik maupun  ekstrinsik,  menahan  siklus  sel,  memicu autofagi,  menghambat  angiogenesis,  disintegrasi sitoskeleton dan menghambat metastatis. 17
Pertumbuhan  dan  viabilitas  sel  dapat  diukur dengan beberapa metode seperti MTT, XTT dan SRB. MTT  adalah  salah  satu  metode  yang  sensitif, kuantitatif  dan  secara  kolorimetri  digunakan  untuk mengukur  viabilitas,  proliferasi  dan  aktivasi  sel. Metode  ini  didasarkan  pada  kapasitas  enzim dehidrogenase  mitokondria  dalam  sel  hidup  untuk mereduksi  garam  MTT  menjadi  formazan  berwarna biru atau ungu yang tidak larut air. 18
Screening  awal  untuk  mengetahui  potensi  suatu senyawa  tumbuhan  dilakukan  untuk  mengetahui adanya  efek  antimikroba,  antioksidan  ataupun antikanker.  Dalam  penelitian  ini  akan  dikaji  potensi buah parijoto terhadap kanker melalui uji sitotoksisitasnya  secara  in  vitro  terhadap  sel  kanker payudara  T47D  dengan  menggunakan  metode MTT.Selain  itudilakukan  pula  uji  fitokimia    buah parijoto  secara  kualitatif  dengan  metode  KLT  untuk
memastikan  adanya  kandungan  flavonoid  dan saponin.

## METODE DAN BAHAN
Bahan  utama  dalam  penelitian  ini  adalah  buah parijoto  ( Medinilla  speciosa, Reinw.ex  Bl.)  yang diambil  dari  Kawasan  Gunung  Muria  Kabupaten Kudus  Jawa  Tengah.  Tumbuhan  diidentifikasi  di Laboratorium  Biologi  Farmasi  Universitas  Gadjah Mada, Yogyakarta. Subjek uji yang digunakan adalah sel kanker payudara T47D koleksi Cancer Chemoprevention  Research  Center (CCRC)  Fakultas Farmasi  UGM.Kultur  sel  ditumbuhkan  dalam  media penumbuh DMEM  (Dulbecco’s  Modified  Eagle Medium) yang  mengandung foetal  bovine  serum (FBS)  10%  (v/v)  (Gibco),  fungizone  0,5  %  (v/v) (Gibco),  dan  antibiotika  penisilin-streptomisin  1  % (v/v)  (Gibco).  Sel  dipanen  dari culture  dish/flask menggunakan  tripsin-EDTA  0,25%untuk  membantu melepaskan sel.
Untuk  preparasi  ekstrak  digunakan  etanol  70% (E.Merck).Uji sitotoksisitas dilakukan dengan metode MTT.  Pereaksi  kerja  dibuat  dengan  mengencerkan pereaksi  stok  10  kali  dengan  medium  DMEM. Pereaksi stopper mengandung  natrium  dodesil  sulfat (SDS,  Merck-Schuchardt)  10%  dalam  0,01  N  HCl (Merck, Darmstadt, Germany). Uji fitokimia dilakukan menggunakan silika gel 60 F254, fase gerak campuran kloroform:metanol:air (64:50:10),fase gerak campuran  etil  asetat:asam  formiat:asam  asetat glassial:air (100:11:11:27), pembanding rutin, pembanding  saponin,  pereaksi  semprot  L-B,  pereaksi semprotsitroborat. Untuk preparasi  larutan uji adalahDMSO (DMSO 99,5% pro GC, Sigma Aldrich Chemie GmBH, Steinheim, Germany).
Penelitian  diawali  dengan  pembuatan  ekstrak etanolik buah parijoto. Larutan uji untuk sitotoksisitas dibuat  dengan  melarutkan  ekstrak  etanolik  parijoto sebesar  5  mg  ke  dalam  50  ml  DMSO.  Larutan  stok diencerkan  dengan  media  pertumbuhan  DMEM hingga  diperoleh  seri  konsentrasi  larutan  uji  dengan konsentrasi  DMSO  tidak  lebih  dari  1%.  Konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah10, 25, 50, 100, 250, 500,  1000  μg/ml.Propagasi  dan  panen  sel  T47D dilakukan  dengan  menumbuhkan  sel  dalam  beberapa tissue  culture  flask atau tissue  culture  dish dan diinkubasi  dalam  inkubator  CO 2 pada  suhu  37  C dengan  aliran  CO 2 5%.  Suspensi  sel  ditambah sejumlah medium   sehingga diperoleh konsentrasi sel sebesar  1 x 10 4 sel/ml, sel siap untuk penelitian.
Uji  sitotoksisitas  dilakukan  dengan  metode  MTT dengan  menempatkan  sel  dalam  sumuran  masing- masing 100 µL. Tahap selanjutnya adalah pembuatan
seri  konsentrasi.  Seri  konsentrasi  sampel  dimasukkan ke  dalam  sumuran  (triplo)  dan  inkubasikan  dalam inkubator  CO 2 .  Lama  inkubasi  tergantung  pada  efek perlakuan  terhadap  sel.  Jika  dalam  waktu  24  jam belum  terlihat  efek  sitotoksik,  sel  diinkubasi  kembali selama 24 jam (total 48 jam).
Setelah  seri  konsentrasi  diberi  perlakuan  dengan reagen  MTT  (0,5  mg/ml)  selanjutnya    diinkubasi selama  2-4  jam  di  dalam  inkubator  CO 2 .  Kondisi  sel diperiksa  dengan  mikroskop  inverted.  Jika  formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper 100 µL SDS 10%  dalam  0,1  N  HCl.  Bungkus  plate  dengan  kertas atau  aluminium  foil  dan  inkubasikan  di  tempat  gelap pada  temperatur  kamar  selama  semalam.  Absorbansi masing-masing sumuran dibaca dengan ELISA reader dengan ƛ =550-600  nm  (595  nm,  tekan  tombol  start). Perhitungan  IC 50 dilakukan  dengan  melihat  apakah absorbansi  yang  didapatkan  dari  ELISA  kontrol pelarut lebih rendah dari kontrol sel atau sama dengan kontrol sel.
Analisis data dilakukan dengan MS Excell dengan cara  membuat  grafik  absorbansi  vs  konsentrasi, kemudian  dihitung  prosentase  sel  hidup  dan  analisis harga  IC 50 dengan  regresi  linear.  Persamaan  regresi linier dicari dari grafik tersebut  dengan menampilkan add trendline-regresi linier kemudian lihat parameter r pada persamaan regresi linier. Jika r lebih besar dari r- tabel maka persamaan regresi linier memenuhi standar untuk  mencari  IC 50 .  Masukkan    y  =  50%  pada persamaan regresi linier dan cari nilai x-nya sehingga diperoleh IC 50 .

## HASIL
Melalui  proses  pengeringan  dan  penyerbukan  1750 gram  buah  parijoto  segar  diperoleh  serbuk  kering sebanyak
179,91 gram. Serbuk kering selanjutnyadimaserasi. Filtrat yang terkumpul selanjutnya  dipekatkan  dengan rotaryevaporator hingga  diperoleh  ekstrak  kental  yang  berwarna  ungu sebanyak 38,19 gram sehingga rendemen ekstrak yang diperoleh sebesar 21,23 %.
Hasil  uji  sitotoksisitas  dengan  perlakuan  7  seri konsentrasi ekstrak etanolik buah parijoto terhadap sel T47D  menunjukkan  adanya  penurunan  viabilitas  sel seiring dengan bertambahnya konsentrasi (Gambar 1).
Pola tersebut  menunjukkan adanya penghambatan proliferase  sel  T47D.  Hasil  perhitungan  IC 50 menunjukkan  nilai  sebesar  614,50  µg/ml  sehingga ekstrak  etanolik  buah  parijoto  tergolong  sitotoksisitas moderat  dan  berpotensi  kemoprevensi.  Hal  ini menunjukkan bahwa ekstrak buah parijoto tidak dapat digunakan  sebagai  agen  antikanker  tetapi  dapat digunakan  untuk  mencegah  pertumbuhan  sel  kanker atau perkembangan sel kanker lebih lanjut.
Hasil  uji  fitokimia  menunjukkan  bahwa  buah parijoto  positif  mengandung  flavonoid  dan  saponin (Tabel 1).
Tabel 1.  Hasil  uji  fitokimia  ekstrak  buah  parijoto secara kualitatif dengan metode KLT
No. Uji Fitokimia Hasil 1. Flavonoid + 2. Saponin +
Keterangan : + = positif y = -0.065x + 90.00 R² = 0.950 0 20 40 60 80 100 120 0 200 400 600 800 1000
1200
V ia b il it a s se l (% )

## Konsentra si (μg/ml)
Gambar 1. Kurva viabilitas sel T47D pada berbagai konsentrasi. Uji  dilakukan dengan menginkubasi 1 x 104 sel T47D  dalam  plate  96  well  selama  24  jam  untuk  beradaptasi,  kemudian    diberi  perlakuan  sampel konsentrasi 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 μg/ml, kemudian diinkubasi lagi selama 24 jam. Setelah 24 jam,  sel  ditambah  reagen  MTT,  dilanjutkan  dengan  pembacaan  ELISA  reader  pada  λ  595  nm.  Profil viabilitas sel disajikan dari  rata-rata ± standard error (SE).
Gambar  2.  Morfologi  sel  T47D  setelah  diinkubasi  selama  24  jam.  Pengamatan  morfologi  sel  pada  perlakuan kontrol (a) dan pada konsentrasi 1000 µg/ml (b) dilakukan pada jam ke-24 dengan inverted microscope perbesaran  100x  dan  difoto  menggunakan  kamera  digital  (Canon,  Japan).Sel  yang  hidup  bentuknya memanjang pada perlakuan (a),sedangkan sel yang mati berbentuk bulat tampak pada perlakuan (b).
Hasil  uji  fitokimia  menunjukkan  bahwa  buah parijoto  positif  mengandung  flavonoid  dan  saponin (Tabel 1).
Tabel 1.  Hasil  uji  fitokimia  ekstrak  buah  parijoto secara kualitatif dengan metode KLT
No. Uji Fitokimia Hasil 1. Flavonoid + 2. Saponin +
Keterangan : + = positif

## PEMBAHASAN
Nilai  IC 50 ekstrak  etanolik  buah  parijoto  terhadap  sel T47D sebesar  614,50  µg/ml  termasuk  dalam  kategori sitotoksisitas moderat. Sitotoksisitas dapat dikelompokkan  menjadi  tiga  yaitu:  (1)  sitotoksik potensial  jika  IC 50 <100µg/ml,  (2)  sitotoksik  moderat jika  100µg/ml<IC 50 <1000µg/ml  dan  tidak  toksik  jika IC 50 >1000  µg/ml.  Kelompok  senyawa  dengan sitotoksisitas  potensial  dapat  digunakan  sebagai  agen antikanker  sedangkan  sitotoksisitas  moderat  dapat dimanfaatkan  untuk  kemoprevensi  yang  dapat mencegah dan menghambat pertumbuhan sel kanker. 19 National Cancer Institute (NCI)
mengelompokkan  suatu  senyawa  tergolong  anti kanker jika IC 50 <20 µg/ml. 20
Deteksi
terhadap kandungan flavonoid menunjukkan  adanya  4  cincin  yang  mengindikasikan adanya  4  komponen  flavonoid.  Beberapa  jenis komponen  fitokimia  yang  terkandung  dalam  ekstrak tumbuhan  dapat  memiliki  pengaruh  sinergis  atau antagonis.  Ini  berarti  bahwa  satu  komponen  dengan komponen  lainnya  akan  berinteraksi  sehingga tumbuhan memiliki pengaruh kumulatif yang berbeda dibandingkan  masing-masing  komponen  tunggalnya. Komponen  aktif  yang  diisolasi  dari  tumbuhan
umumnya lebih toksik daripada ekstrak kasarnya yang mengandung  campuran  beberapa  senyawa. 21 Hal tersebut disebabkan karena komponen-komponen lain memodulasi  toksisitas  senyawa  aktifnya  sehingga ekstrak  akan  bersifat  lebih  netral  secara  in  vitro maupun in vivo.
Flavonoid  bekerja  dengan  meng-aktivasi  protein p53 dan  gen-gen  targetnya.  Pada  penelitian  ini digunakan sel T47D yang merupakan jenis sel kanker yang  mengalami  mutasi  pada  gen p53 sehingga  tidak mampu melakukan pengendalian siklus sel dan terjadi hambatan  dalam  apoptosis  sel.  Sebuah  penelitian membuktikan  adanya  akumulasi  protein  p53  dan terjadinya apoptosis sel pada sel line non-tumor yang diinkubasi  dengan  flavonoid.  Apoptosis  terjadi  pada fase G2/M pada siklus sel. 16
Selain  mengandung  fitokimia  flavonoid,  buah parijoto  juga  positif  mengandung  saponin.  Saponin mempunyai  potensi  antikanker.  Sitotoksisitas  saponin terjadi  melalui  induksi  apoptosis  atau  non-apoptosis. Beberapa  diantaranya  adalah  kematian  sel  akibat autofagosit, hambatan  siklus sel, menurunnya produksi NO atau  disintegrasi  sitoskeleton.  Jalur apoptosis  ekstrinsik  dipicu  melalui  aktifasi  reseptor pro-apoptosis  khusus  di  permukaan  sel  yang distimulasi  oleh  molekul  khusus  yaitu  ligan  pro- apoptosis  ( Apo  2L/TRAIL dan CD95L/FasL ).  Jalur apoptosis  intrinsik  terjadi  dengan  cara  pelepasan sitokrom-c ,  depolimerisasi  membran  mitokondria, downregulasi Bcl-2 ,  stimulasi p53 atau  gangguan homeostasis  Ca 2+ .  Saponinjuga  berperan  untuk menghambat angiogenesis. 22
Pembentukan  tumor  terdiri  dari  tiga  tahapan  yaitu (1)  inisiasi,  (2)  promosi  dan  (3)  progresi.  Agen kemoprevensi  dibagi  menjadi  2  kategori  yaitu:  (1) blocking  agent ,  yang  menghambat  zat-zat  karsinogen menuju  target  dan  (2) suppresing  agent ,  yang
(b)
(a)
menghambat pembentukan malignan dari sel-sel yang ter-inisiasi. 14 Banyak  jenis  obat  antikanker  merupakan senyawa yang diisolasi dari tumbuhan yang umumnya bersifat toksik jika dikonsumsi sebagai bahan pangan. Buah parijoto merupakan buah yang dapat dikonsumsi dan  tidak  toksik.  Efek  buah  parijoto  yang  tergolong sitotoksik  moderat  terhadap  pertumbuhan  sel  kanker dengan  indikasi  adanya  inhibisi  pertumbuhan  dan peningkatan prosentase kematian sel pada konsentrasi bertingkat menunjukkan adanya pengaruh positif buah parijoto untuk menghambat pertumbuhan sel kanker.
Kemampuan  setiap  senyawa  fitokimia  tunggal sebagai  agen  kemoprevensi  untuk  menghambat pertumbuhan kanker harus dipahami sebagai hasil dari kombinasi beberapa proses intraseluler, bukan sebagai respon  biologis  tunggal. 7 Untuk  mengetahui  pengaruh setiap  komponen  aktif  buah  parijoto  maka  perlu dilakukan  isolasi  fitokimia  dan  diuji  sitotoksisitas masing-masing  komponennya  terhadap  sel  kanker. Jenis  sel  kanker  yang  digunakan  dalam  uji sitotoksisitas  juga  berpengaruh  terhadap  hasil  yang diperoleh.  Beberapa  penelitian  membuktikan  bahwa setiap jenis sel kanker memiliki respon yang berbeda- beda  terhadap  senyawa  tertentu.  Efek  kemoprevensi dari  bahan  pangan  hanya  dapat  dicapai  pada konsentrasi  yang  suprafisiologis  dan  konsentrasi seperti ini mungkin tidak dapat diperoleh melalui diet.

## SIMPULAN
Dari hasil uji sitotoksisitas ekstrak buah parijoto pada sel kanker payudara T47D dengan metode MTT dapat disimpulkan  bahwa  ekstrak  buah  parijoto  ( Medinilla speciosa , Reinw.ex Blume)
menunjukkan sitotoksisitas  moderat  terhadap  sel  kanker  payudara T47D  dengan  nilai  IC 50 sebesar  614,50  µg/ml    dan tidak  berpotensi  antikanker  tetapi  dapat  digunakan sebagai  agen  kemoprevensi.  Buah  parijoto  positif mengandung komponen fitokimia golongan flavonoid dan saponin.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didukung sebagian oleh Biro Perencanaan dan Kerjasama Luar Negeri, Kementrian Pendidikan  dan  Kebudayaan  RI  melalui  Program Beasiswa  Unggulan.  Ucapan  terima  kasih  juga disampaikan  kepada    Cancer  Chemoprevention  and Research Center (CCRC) Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

## DAFTAR PUSTAKA
1. WHO. Global status report on noncommunicable diseases.  Publications  of  the  World  Health Organization are available on the WHO web site (www.who.int). 2010.
2. Anand P, Kunnumakara AB, Sundaram C.Cancer is  a  preventable  disease  that  requires  major lifestyle changes. Pharm Res.2008; 25 (9): 2097– 116
3. Goel,  A.  The  Role  of  Phytochemical  as  Anti- Inflammatory  and  Anti-Cancer  Agents.  Baylor University  Medical  Center,  Dallas,  TX.USA. Diunduh dari www.metagenics.com.au
4. Gerhauser C. Cancer cell metabolism, epigenetics and the potential influence of dietary components – A perspective. Biomedical Research .2012; 23.
5. Weinberg  RA.  The  Biology  of  Cancer.  New York: Garland Science. 2007.
6. Ruddon RR. What Makes a Cancer Cell a Cancer Cell?  Holland-Frei  Cancer  medicine  –  edited  by Kufe, DW. RE. Pollock, RR. Weichselbaum, et al (edisi ke-6). Hamilton on BC Decker Inc. 2012.
7. Surh  YJ.  Cancer  Chemoprevention  with  Dietary Phytochemicals. Nature Reviews/ Cancer. Diakses dari www.nature.com
8. Jorim  RY,  Korapel  S,  Legu  W  et  al.  An  ethno botanical  survey  of  medicinal  plants  used  in  the eastern  highlands  of  Papua  New  Guinea. ResearchJEE. 2012; 8:47. Diunduh dari http://www.ethnobiomed.com/
9. Kimura K, Yumoto T, Kikuzawa K, Kitayama K. Flowering  and  fruiting  seasonality  of  eight species  of  Medinilla  (Melastomataceae)  in  a tropical  montane  forest  of  Mount  Kinabalu, Borneo. TROPICS. 2009; 18. 1-8.
10. Depkes  RI.  Inventaris  Tanaman  Obat  Indonesia (V). Balitbang Kesehatan. Departemen
Kesehatan RI. 2009. p: 123-124 11. Maestri DM, Nepote V, Lamarque AL,  Zygadlo JA. Natural products as antioxidants. Phytochemistry:  Advances  in  Research.  2006; 37(2): 661.
12. Wahle  KWJ,  Rotondo  D,  Brown  I,  Heys  SD. Plant  Phenolics  in  the  Prevention  and  Treatment of  Cancer,  Bio-Farms  for  Nutraceuticals: Functional  Food  and  Safety  Control  by Biosensors,    edited  by  Giardi,  MT.,  G.  Rea  and B. Berra. 2009.
13. Kanadaswami C, Lee LT, Lee PH,  Hwang JJ, Ke F, Huang YT, et al. The Antitumor  Activities of Flavonoids. Review In Vivo. 2005; 19: 895-910.
14. Nagarani  B,  Debnath  S,  Kumar  S,  Bhattacharjee C,  Kumar  G.  A  Review:  Herbs  Used  as Anticancer Agents. International research Journal of Pharmacy. 2009. Available at http://www.irjponline.com 15. Ren  W,    Qiao  Z,  Wang  H,  Zhu  L,  Zhang  L. Flavonoids: Promising Anticancer Agents. Medicinal Research Reviews. 2003;  23 (4): 519- 534.
16. Plaumann  B,  Frirsche  M,  Rimpler  H,  Brandner G,  et  al.  Flavonoids  Activate  Wild-type  p53.
Oncogene.  1996;13(8):1605-14.  Diunduh  dari www.ncbi.nlm.nih.gov
17. Man S, Gao W, Zhang F, Liu C. Chemical study and  Medical  Application  of  Saponin  as
Anticancer Agents. 2010. Diunduh dari www.ncbi.nlm.nih.gov
18. Avila  EV,  Pugsley  MK.  An  Overview  of Colorimetric  Assay  Methods  Used  to  Assess Survival  or  Proliferation  of  Mammalian  Cells,
Review Proc West Pharmacol Soc. 2011; 54: 10- 14. Diunduh dari http:// www.mwdicine.nevada.edu 19. Prayong  P,  Barusrux  S,  Weerapreeyakul  N.
Cytotoxic  activity  screening  of  some  indigenous Thai plants. Fitoterapia . 2008; 79 (7): 598-601.
20. National  Cancer  Institute.  Understanding  Cancer series. Diunduh dari http://www.cancer.gov
21. Celik  TA.  Potential  genotoxic  and  Cytotoxic
Effects of Plant Extracts, diunduh dari
http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/26496.pdf 22. Podolak I, Galanty A, Sobolewska D. Saponin as Cytotoxic  Agents:  A  Review.  Phytochem.  Rev. 2010; 9: 425-474. Diakses dari
www.ncbi.nlm.nih.gov