https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.3.162 e - ISSN 2550-0929

## Filogenetik Bulu Babi Tripneustes gratilla menggunakan Gen Sitokrom Oksidase Subunit 1
Philogenetics of Sea Urchin Tripneustes gratilla using Cytochrome Oxidase Subunit 1 Gene
Nurul Abidin 1 , Rina Mogea 2 , Robi Binur 2
1 Program Studi Pendidikan Biologi STKIP Muhammadiyah Manokwari, Manokwari 98315, Indonesia
2 Jurusan Biologi FMIPA UNIPA, Manokwari 98312, Indonesia *Korespondensi: masroel86@gmail.com

## ABSTRAK
Bulu  babi Tripneustes  gratilla merupakan  organisme  multifungsi  yang  dapat dimanfaatkan  sebagai  bahan  pangan  potensial  karena  kandungan  gizinya  yang  cukup tinggi. Organisme ini juga dapat digunakan sebagai bioindikator perairan laut dan sebagai organisme model dalam mempelajari aspek-aspek biologi. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari  filogenetik  (hubungan  kekerabatan)  bulu  babi T.  gratilla dari  perairan Wasior  dan  Serui.  Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium  Bioteknologi  Universitas Negeri  Papua  pada  bulan  November  -  Desember  2009.  Sampel  diekstraksi  dengan menggunakan  Chelex  10  %  dan  diamplifikasi  melalui  teknik  PCR  ( Polymerase  Chain Reaction ).  Perunutan  urutan  nukleotida  ( Sequenching )  fragmen  gen  CO  I  ( Cythocrome oxidase sub  unit  I)  dilakukan  dengan  menggunakan sequencher ABI  377  ( Apllied Biosystem ).  Data  urutan  nukleotida  yang  diperoleh  dianalisis  dengan  menggunakan perangkat  lunak  ( software )  MEGA  4.0.2.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa fragmen  gen  yang  berhasil  diamplifikasi  berukuran  601  pasang  basa  (pb).  Hasil pembacaan  urutan  nukleotida  yang  diperoleh  memperlihatkan  adanya  variasi  nukleotida diantara  individu  dari  kedua  perairan.  Analisis  filogenetik  terhadap  individu  dari  kedua perairan  menghasilkan  dua  kelompok  ( cluster ).  Kelompok  pertama  terdiri  dari  SER  01 dan sub kelompok yang terdiri WSR 02 dan SER 02. Sedangkan kelompok kedua hanya terdiri dari WSR 01. Hasil ini memperlihatkan bahwa individu yang berasal dari Wasior (WSR  02)  memiliki  hubungan  genetik  yang  dekat  dengan  individu  yang  berasal  dari Serui  (SER  02).  Sehingga  menunjukkan  adanya  keterkaitan  genetik  antara  spesies Tripeneustes gratilla dari kedua perairan tersebut.
Kata kunci: Tripneustes gratilla; filogenetik; gen sitokrom oksidase subunit 1

## ABSTRACT
Sea urchin Tripneustes gratilla is multifunction organism that can be used as potential food source because of its high nutrient content. This organism can also be  utilized  bioindicator  of  sea  waters  and  as  a  modal  of  organism  for  studying biology’s  purposes.  The  purposes  of  this  research  is  studying  Filogenetic  of  sea urchin T. gratilla from waters of Wasior and Serui. The research has been doing at the Biotechnology Laboratory of the state of University of Papua on November to December  2009.  The  sample  was  extracted  by  using  Chelex  10  %  and  was amplified  with  PCR  technic  (polymerase  chain  reaction).  Sequencing  of  CO  I gens (cythocrome oxidase subunit I) was done using sequencher ABI 377 (Apllied Biosystem). The result of nucleotid sequence data was analyzed utilizing MEGA 4.0.2.  This  researchs  result  showed  that  the  gen  fragment  that  was  succesfully
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.3.162
amplified  601  bp.  The  sequence  result  of  nucleotid  which  was  analyzed  the variaty  of  nucleotid  between  the  sample  from  two  waters.  Filogenetic  analyzing toward  individu  of  the  two  waters  produce  the  two  clusters.  The  first  cluster consist  of  SER  01  and  sub  cluster  which  is  consisted  of  WSR  02  and  SER  02. While, the second cluster consist of only WSR 01. This result showed that every individu  from  Wasior  (WSR  02)  has  close  genetic  relation  with  other  individu from Serui (SER 02), that proved there is genetic flow between the two waters.
Keywords : Tripneustes gratilla ; Filogenetic; Cythocrome oxidase subunit 1 gene.

## PENDAHULUAN
Bulu  babi Tripneustes  gratilla merupakan  salah  satu  spesies  bulu  babi yang  gonadnya  dimanfaatkan  sebagai sumber pangan potensial  karena gizinya cukup tinggi, dengan kandungan protein 15,43  %  dan  lemak  1,89  %  (Mushtofa, 2007).  Bulu  babi T.  gratilla juga merupakan  salah  satu  organisme  yang banyak  digunakan  sebagai  model  untuk mempelajari aspek-aspek biologi seperti biologi  sel,  biologi  molekul,  regulasi gen,  dan  biokimia  metabolit  (Toha  & Zain,  2006).  Hewan  ini  hidup  bebas, dengan  penyebaran  yang  luas  dan hampir ada di seluruh kawasan perairan. Organisme ini dapat ditemui pada semua laut  dan  lautan,  serta  hidup  menyendiri maupun  berkelompok  (Aziz,  1987). Karena penyebaran yang cukup luas dan di  daerah  dengan  pola  geografi  yang berbeda,  sehingga menimbulkan banyak variasi  pada  bulu  babi T.  gratilla . Adanya  variasi  yang  tampak  secara fenotip  pada  penampilan  fisik  dari  bulu babi  merupakan  perpaduan  antara  sifat genetik dan pengaruh dari lingkungan.
Penelitian tentang
variasi, keanekaragaman  maupun  kekerabatan secara  genetik  banyak  memanfaatkan mtDNA  sebagai  dasar  untuk  melihat adanya  variasi,  hubungan  kekerabatan dalam  spesies  maupun  studi  yang berhubungan  dengan  populasi  genetik (Wandia,  2001).  Pemilihan  mtDNA sebagai dasar untuk mempelajari adanya variasi  genetik  dan  studi  hubungan kekerabatan  suatu  spesies,  dikarenakan gen  ini  banyak  memiliki  kelebihan dibandingkan dengan DNA inti
(nDNA).  mtDNA  diwariskan  secara maternal dan laju evolusinya lebih tinggi dibandingkan DNA inti (Ratnayani et al . 2009).
Fragmen  gen  c ytochrome  oxidase subunit I  (CO  I)  dalam  penelitian  ini digunakan  untuk  melihat  adanya  variasi genetik.  Urutan  Gen  CO  I  merupakan salah  satu  dari  13  gen  penyandi  protein yang  mengkode  enzim  c ytochrome oxidase yang terdapat dalam mtDNA sel eukariot.  Selain  itu  gen  COI  memiliki dua kelebihan, pertama gen COI sebagai primer  universal  yang  kuat  karena mampu mengenali urutan sebagian besar filum  hewan, kedua gen  COI  mapu menunjukkan  jarak  yang  lebih  besar dalam filogenetik mahluk hidup (Hebert et  al.  2003).  Selain  itu,  karena perubahan  urutan  asam  amino  pada  gen COI  lebih  rendah  dibandingkan  gen mitokondria  lainnya,  memungkinkan gen ini untuk mengenali organisme yang belum  teridentifikasi  sehingga  dapat dikelompokkan dalam sistem taksonomi.
Filogenetik atau pohon filogenik merupakan  model  matematika  yang digunakan untuk menggambarkan
hubungan  kekerabatan  dalam  suatu spesies  maupun  populasi  (Holmes,
1998).  Filogenetik  dibedakan  menjadi dua  yaitu,  filogenetik  berdasarkan  data molekuler dan filogenetik yang berdasarkan  data  morfologi.  Dari  kedua filogenetik tersebut, filogenetik molekuler  lebih  akurat  menggambarkan hubungan kekerabatan dibanding
karakter  morfologi  atau  fisiologi  karena berdasarkan  data  urutan  nukleotida. Dimana,  hal  tersebut  sesuai  dengan Moritz  (1996),  yang menyatakan  bahwa
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.3.162 e - ISSN 2550-0929
karakter  molekuler  merupakan  sumber yang  kaya  untuk  analisis  filogenetik spesies. Selain itu juga dengan sistematika  molekuler  dapat  dipahami dengan  baik tentang  sejarah  biogeografi dan proses pembentukan populasi (Avise, 1994).
Filogenetik  suatu  gen  atau organisme  biasanya  digambarkan  dalam bentuk  pohon  dan  akar.  Dimana  yang mempunyai  akar  dikenal  dengan  pohon akar  ( rooted  trees )  dan  yang  tidak mempunyai  akar  dikenal  dengan  pohon tanpa  akar  ( unrooted  trees )  (Holmes, 1998). Untuk merekonstruksi filogenetik dari  data  molekuler  diperlukan  metode pendekatan.  Terdapat  dua  metode  yang umum  digunakan,  yaitu  metode  matriks jarak  ( distance  matrix  methods )  dan metode parsimony maksimum ( maximum parsimony methods ) (Irma et al . 2005).
Metode  matriks  jarak  ( distance matrix  methods ),  merupakan  metode
yang  menggunakan  pendekatan  dengan menggunakan  data  jarak  genetik  atau evolusi  dari  seluruh  pasangan  spesies atau populasi dan rekonstruksi filogenetik dibentuk dengan mempertimbangkan jarak tersebut. Sedangkan  pada  metode  parsimony maksimum ( maximum parsimony methods ), data yang digunakan mengacu pada  urutan  asam  amino  atau  urutan nukleotida  dan  filogenetik  dibentuk dengan meminimalkan jumlah filogenetik (Irma et al . 2005)
Pada  saat  ini  informasi  pada tingkat molekuler mengenai bulu babi T.
gratilla terutama  yang  berasal  dari perairan Papua dan  Papua Barat khususnya  Wasior  dan  Serui  masih sangat terbatas. Oleh karena itu penelitian  merupakan  penelitian  awal yang berguna untuk penelitian selanjutnya.
Gambar 2. Lokasi pengambilan sampel dilakukan di Provinsi Papua (Serui, lingkaran warna kuning) dan Provinsi Papua Barat (Wasior, lingkaran warna merah)
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.3.162

## METODE PENELITIAN

## Pengambilan Sampel
Sampel  Bulu  Babi T.  gratilla dikumpulkan dari perairan pantai Wasior  di  Kabupaten  Teluk  Wondama Provinsi Papua Barat dan perairan Serui Kabuten  Yapen  Waropen  Provinsi Papua.  Dalam  Penelitian  ini  sampel yang  dianalisis  sebanyak  4  sampel, masing-masing  2  sampel  tiap  lokasi. Bagian  jaringan  yang  diambil  adalah duri  utuh  hingga  pangkalnya  dan disimpan dalam etanol 95 %

## Bahan Penelitian
Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  bagian  ujung pangkal  duri  bulu  babi T.gratilla yang berasal dari perairan Wasior (WSR) dan Serui  (SER)  masing-masing  sebanyak  2 individu.  Chelex®  (BIO-RAD), Taq DNA Polimerase, deoksinukleosida trifosfat  (dNTP),  larutan  buffer  PCR (500 mM
KCL,  100  mM  Tris-HCl  pH  8,4 pada  suhu  20 0 C,  15  mM.  MgCl 2 dan 1mg/ml  gelatin),  gel  agarose, Loading dye ,  Bigdye© terminator  chemistry (Perkin  Elmer),  formamida,  etidium bromida (EtBr), Shrimp Alkaline Phospatase (SAP)  dan Exonuclease (EXO) (Amersham Biosciences Corporation, Arlington Heights, Illionis, USA),  Alkohol  95  %  dan  70  %,
isopropanol  40  %,  oligonukleotida primer  (Trip  R  dan  Trip  F),  spiritus, buffer Sequencing , Moleculer  Grade Water , akuades, label, tissu dan alumunium foil.

## Ekstraksi DNA
Ekstraksi  DNA  dilakukan  dengan menggunakan  larutan  Chelex®  (Barber et  al. 2002).  Caranya  yaitu  dengan mengambil  bagian  pangkal  duri T. gratilla kira-kira  1  Mg,  kemudian dimasukkan dalam larutan Chelex 10%.
Gambar 1. T. gratilla (foto: Abidin) Selanjutnya dilakukan pengadukan  dengan  alat  vortex  selama 15  detik  dan  disentrifugasi  selama  10 detik  pada  kecepatan  12000  rpm. Tabung  yang  berisi  jaringan  tubuh  bulu babi T.gratilla tersebut kemudian dipanaskan  selama  25  menit  pada  suhu 95 o C.  Kemudian  setelah  dipanaskan tabung divortex dan  disentrifugasi kembali.  Cairan  yang  berwarna  jernih pada  bagian  atas  tabung  adalah  yang akan digunakan dalam reaksi PCR.

## Amplifikasi DNA dengan PCR
Proses  amplifikasi  dengan  PCR pada  fragmen  gen  COI  menggunakan program Hot-start dan Gold (Saiki et al .,
1988)  mengikuti  protokol  modifikasi Barber  dan  Erdmann  (2000).  Sampel DNA yang diperoleh kemudian dimasukkan  dalam  tabung  eppendorf sebanyak  1  µL  dan  dicampur  dengan reagen  PCR  yang  terdiri  dari  dH 2 O,
larutan buffer PCR, dNTP, oligonukleotida primer COI Trip1R (5’- GGCATTCCAGCTAGTCCTARAA- 3’) dan COI Trip2F (5’- CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC-3’), Taq DNA  polymerase  hingga  volume total  25  µL  kemudian  divortex  hingga tidak  terdapat  gelembung  udara  dalam tabung  dan  kemudian  disentrifugasi selama  10  detik.  Setelah  itu  dilanjutkan dengan amplifikasi menggunakan mesin PCR  ( Thermal  cycler )  pada  suhu  95 0 C selama 7 menit untuk pembukaan rantai polinokleotida ( denaturation ), 52 0 C selama  30  detik  untuk  penempelan ( annealing )  primer  pada  DNA  cetakan ( template ),  dan  72 0 C  selama  1  menit untuk  pemanjangan  rantai  nukleotida
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.3.162 e - ISSN 2550-0929
( elongation )  dan  diulang  hingga  39 siklus.  Setelah  siklus  ke-39,  tabung diinkubasi  pada  suhu  72 0 C  selama  10 menit.

## Elektroforesis DNA
Sampel DNA yang telah diamplifikasi  diambil  3  µL  dimasukkan ke  dalam  sumuran  gel  agarosa  dan ditambahkan  2  µL loading  dye 6x dengan  cara  mencampurkan  kedua bahan  tersebut  terlebih  dahulu  secara merata pada kertas parafilm menggunakan  mikropipet.  Tahap  akhir adalah  memasukkan  ladder  (penanda
DNA) sebanyak 4 µL pada sumuran gel agarosa  yang  pertama.  Selanjutnya  gel dielektroforesis pada arus 200 V selama 25 menit. Kemudian gel direndam dalam larutan  etidium  bromida  selama  15 menit  dicuci  dengan  air  dan  diamati dengan UV transluminator.

## Purifikasi produk PCR (SAP/EXO)
Purifikasi  menggunakan Shrimp Alkaline phosphatase (SAP) dan Exonuclease (EXO).  Tabung  eppendorf strip 200 µL (sama dengan tabung PCR) diberi label,  setelah itu  buat  master mix SAP/EXO dengan mencampur SAP dan EXO dalam tabung eppendorf 250 µL. 5 µL  sampel  produk  PCR  yang  positif dimasukkan  dalam  tabung  eppendorf strip  dan  ditambahkan  1  µL  master mix SAP/EXO. Kemudian disentrifugasi hingga  tidak  ada  gelembung  udara dalam  tabung  tersebut.  Tabung  yang telah disentrifugasi kemudian dimasukkan  dalam  mesin Thermocycler
dan  diinkubasi  dengan  menggunakan program  SAP/EXO  yaitu  pada  suhu 30 o C  selama  30  menit,  suhu  80 o C selama  15  menit  dan  pada  suhu  25 o C selama 1 menit. Setelah tahap SAP/EXO selesai,  hasilnya  dilanjutkan  ke  tahap Cycle sequencing.
Siklus  Pengurutan  nukleotida  (Cycle sequencing)
Produk PCR yang telah dipurifikasi selanjutnya dilanjutkan pada
tahap Cycle  sequencing .  Tahap  ini dilakukan  dengan  membuat master mix, yaitu  dengan  menambahkan  buffer sequence 15  µL,  Primer  COI  Trip1F  3 µL,  Big  Dye©  3  µL  dan  dH 2 O  45  µL. Master  mix  yang  telah  siap,  kemudian diambil  11  µL  dan  dimasukkan  dalam tabung  eppendorf  yang  dibagi  dalam  4 tabung.  Selanjutnya  produk  PCR  yang telah  di  EXO/SAP  diambil  1  µL  dan dimasukkan  dalam  tabung  yang  telah berisi  master  mix,  kemudian  tabung disentrifugasi hingga tidak ada gelembung  udara.  Setelah  itu  tabung dimasukkan  dalam  mesin Thermocycler
dan  diinkubasi  dengan  menggunakan program Cycle sequencing yaitu diinkubasi  pada  suhu  96 o C  selama  10 detik,  suhu  50 o C  selama  5  detik,  suhu 60 o C selama 4 menit dan diulang hingga 24  siklus  dan  pada  siklus  terakhir diinkubasi  pada  suhu  15 o C  selama  3 menit .

## Presipitasi DNA
Produk  yang  telah  selesai  pada tahap cycle  sequencing selanjutnya dipresipitasi dengan menggunakan isopropanol 40 % sebanyak 40 µL untuk tiap  tabung.  Kemudian  disentrifugasi selama  30  menit,  setelah  itu  tutup tabung dibuka dan balik, dengan di alasi tissu  kimtech  untuk  membuang  larutan isopropanol.  Pelet  DNA  yang  telah diberi isopropanol selanjutnya ditambahkan alkohol 70 % sebanyak 46 µL  tiap  tabung  kemudian  disentrifugasi selama  1  menit.  Setelah  itu  tabung dibuka  penutupnya  dan  dibalik  dengan posisi  terbalik  dengan  di  alasi  tissu kimtech  untuk  menyerap  sisa  alkohol. Produk  akhir  dari  DNA  yang  telah dipresipitasi selanjutnya diberi formamida sebanyak 10 µL tiap tabung, setelah  itu  tabung  diberi  penutup, dikemas dengan
menggunakan alumunium foil.

## Perunutan  urutan  nukleotida  (DNA
Sequencing)
Produk  presipitasi  dikirim  ke Cornell University , AS untuk penentuan
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.3.162
urutan  nukleotida  ( sequencing )  dengan menggunakan  mesin Sequencher ABI 377  ( Apllied  Biosystem ).  Hasil  dari perunutan
urutan nukleotida
( sequencing )  diakses  di  website  milik Cornell University
di http://cores.lifesciences.cornell.edu/user dev/index.php.

## Analisis data
Data  hasil  pembacaan  urutan nukleotida  dianalisis  dengan  melakukan penjajaran menggunakan ClustalW pada perangkat lunak ( software ) MEGA 4.0.2 (Tamura et  al .  2007).  Masing-masing individu  disejajarkan  dengan  satu  sama lain  untuk  melihat  adanya  variasi.
ClustalW merupakan program penyepadanan  nukleotida  atau  protein secara  umum,  program  ini  menghitung kesepadanan terbaik dari urutan nukleotida tertentu, sehinggga kesamaan dan perbedaanya dapat diketahui (Mahardika,  2008).  Kemudian  dibuat pohon filogenetiknya berdasarkan metode  Maksimum  Parsimony,  setelah itu  ditentukan indeks perbedaanya
( Disparity  index )  untuk  menentukan seberapa dekat
hubungan kekerabatannya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Urutan Nukleotida Fragmen Gen COI
Hasil  visualisasi  elektroforesis pada  gel  agarose  1  %  menunjukkan ukuran  pasang  basa  (pb)  yang  seragam yaitu  berkisar  600-700  pb.  Ukuran besarnya pasang basa ditentukan berdasarkan  perbandingan  migrasi  pita DNA sampel  yang tervisualisasi dengan Ladder yang  telah  diketahui  besar ukuran pasang basa tiap fragmennya.
Gambar 2 . Hasil elektoforesis fragmen
DNA dengan agarose 1%.
Ukuran  yang  relatif  seragam  dari fragmen  DNA  yang  diamplifikasi, menunjukkan bahwa primer yang digunakan  yaitu  COI  Trip1R  dan  COI Trip2F  bekerja  secara  spesifik  pada ukuran  basa  tertentu.  Menurut  Poerba dan  Yuzammi  (2008),  bahwa  jumlah pita  yang  dihasilkan  setelah  amplifikasi DNA  dengan  PCR  sangat  tergantung dengan  primer  mengenal  homolognya pada  cetakan  DNA  yang  digunakan. Semakin  banyak  daerah  penempelan dari  primer  yang  digunakan  semakin banyak jumlah pita DNA yang dihasilkan. Banyaknya jumlah pita yang berhasil  diamplifikasi  juga  menentukan hasil perunutan urutan nukleotida ( sequencing ), dimana akan diperlihatkan dengan  bentuk  puncak  grafik  yang dihasilkan.
Puncak  grafik  ( peak )  yang  baik ditandai  dengan  tampilannya  yang  tidak berhimpitan  dengan peak yang  lain. Sehingga pada proses sekuensing, sequencher dapat  menerjemahkannya menjadi  nukelotida  yang  benar  tanpa menghasilkan  nukleotida  yang  tidak teridentifikasi  dengan  baik  (ambigu). Tetapi  hal  itu  tergantung  pada  produk amplifikasi  yang  dihasilkan  dari  proses PCR,  sehingga  mempengaruhi  kualitas urutan  nukleotida  yang  berhasil  dibaca pada proses sekuensing. Urutan  nukleotida  dari  keempat individu yang berhasil dibaca mempunyai  ukuran  pasang  basa  sebesar 601  pb,  yang  diawali  dengan  urutan triplet  kodon  AGT  dan  diakhiri  dengan
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.3.162 e - ISSN 2550-0929
CCA. Meskipun urutan diawal dan akhir sama,  tetapi  dijumpai  variasi  urutan nukleotida di sepanjang rantai nukleotida yang berhasil dibaca. Hal ini mengindikasikan  adanya  variasi  dalam individu  tersebut.  Seperti  terlihat  pada Tabel 2 berikut yang memuat persentase komposisi nukleotida dari tiap individu.
Tabel 2.   Persentase  komposisi  nukleo-
tida  masing-masing  individu dari perairan Wasior dan Serui. Individu % A % C % G % T WSR 01 28.2 21.0 19.1 31.7 WSR 02 26.6 22.7 20.3 30.4 SER 01 27.9 21.5 19.3 31.3 SER 02 28.2 21.5 19.1 31.1 Rata-rata 27.7 21.7 19.5 31.2
Tabel  2  memperlihatkan  bahwa terdapat perbedaan persentase komposisi nukleotida dari masing-masing individu. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  komposisi nukleotida  tersebut  tidak  sesuai  atau terdapat  penyimpangan  terhadap  hukum Chargaf.  Hukum  Chargaf  menyatakan bahwa  perbandingan  basa  purin  sama dengan  basa  pirimidin  (Irma et.al , 2005). Menurut  Akhmaloka  (1993),  ada beberapa hal yang menyebabkan terjadinya  penyimpangan  yaitu,  karena guanin  (G)  dan  sitosin  (C)  atau  adenin (A)  dan  timin  (T)  tidak  berada  dalam jumlah  yang  ekimolar.  Tetapi  hal  ini dapat diterangkan dengan adanya penggantian  oleh  5-metilsitosin.  Selain itu  pada  penelitian  ini  yang  digunakan sebagai penanda genetik adalah fragmen gen,  bukan  merupakan  DNA  secara utuh. Sedangkan hukum Chargaf berlaku  untuk  perbandingan  komposisi basa  suatu  DNA  secara  utuh.  Oleh karena  itu,  dimungkinkan  perbandingan komposisi basa yang didapat tidak sama dengan hukum Chargaf.
Perbedaan  persentase  komposisi nukleotida dijumpai pada masing- masing individu ditemukan dalam urutan  nukleotida  suatu  organsime. Seperti  diketahui  bahwa  suatu  produk asam amino dapat dikode oleh lebih dari satu kodon, dimana kodon-kodon
tersebut tersusun triplet. Sehingga
didapatkan kelimpahan kombinasi kodon  yang  mengkode  asam  amino tertentu.  Menurut  Pai  (1992),  dalam suatu  organisme  umumnya  dijumpai kelimpahan kode genetik yang mengkode  satu  asam  amino  tertentu, yang  selanjutnya  kelimpahan  tersebut mengalami degenerasi . Data tersebut memberikan gambaran  bahwa  terdapat  variasi  pada tingkat nukleotida walaupun
perbedaannya  tidak  terlalu  besar,  atau dapat  dikatakan  hampir  seragam.  Tetapi hal  ini  memberikan  bukti  bahwa  antar individu  dalam  spesies  yang  sama  pun memiliki perbedaan.

## Variasi Nukleotida
Hasil penjajaran ( alignment ) dengan menggunakan program ClustalW lebih memperjelas adanya variasi urutan nukleotida antar individu seperti terlihat pada Gambar 3. Variasi itu terlihat pada nukleotida  yang  diperlihatkan.  Urutan nukleotida  yang  sama  diidentifikasikan sebagai  titik  (.)  dan  nukleotida  yang tidak  sama  diidentifikasikan  dengan huruf.  Sedangkan  adanya gap ditandai dengan  (-)  yang  berarti  nukleotida  yang mengalami mutasi.
Variasi antar individu yang terlihat dari hasil penjajaran membuktikan  bahwa  terdapat  variasi pada T.  gratilla dari  kedua  perairan. Variasi  yang  terdapat  pada  suatu organisme  tergantung  beberapa  faktor selain  faktor  genetik  yaitu  kondisi habitatnya. Habitat sebagai tempat hidup dan berkembang biak sangat dipengaruhi  oleh  kondisi  geografis, ketersediaan makanan, arus laut maupun adanya predator. Selain itu juga dipengaruhi  oleh  faktor  demografi,
tingkah  laku  ( behavioral ),  iklim  dan proses  tektonik  (Palumbi,  1995 disitasi Grosberg  dan  Cunningham,  2001). Adanya  faktor-faktor  tersebut  dapat mempengaruhi  kehidupan T.  gratilla yang  dapat  menimbulkan  terjadinya variasi sebagai bentuk adaptasi terhadap kondisi lingkungan di habitatnya.
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.3.162
Gambar 3. Hasil analisis penjajaran ( alignment ) dengan menggunakan program ClustalW.
Tabel 3 Urutan nukleotida T. gratilla yang memperlihatkan variasi.
Wasior 01 Wasior 02 Serui 01 Serui 02 AGTCTCACCT ......T... ......T... ......T... TGATTTCCCG .......... .........A .........A TAACTCACTA .......... A.GG...... C.G-...... TGGATATT ........ .....C.. ........ TTTACATTAG .........C .....G.... .......... TACGTGGTAG C......... .......... .......... ATCAATGGGA ...G...... .......... .......... TTTAGTTATG .....G.... .......... .......... TTAGACTTGG .......C.. .......G.. .......G.. GGAATGCCA ......... .-....... .........
Tabel  3  memperlihatkan  adanya variasi  urutan  nukleotida  dari  hasil penjajaran  dengan  program  ClustalW pada  software  MEGA  4.0.2.  Seperti yang  diungkapkan  oleh  Hidayat et  al (2008), yang menyatakan bahwa adanya gap menunjukkan  proses  mutasi  yang berupa delesi maupun insersi. Selain itu, dengan  penjajaran  ( alignment )  akan menunjukkan  tingkat  homologi  diantara sampel-sampel yang diteliti.
Wasior  02  memiliki  perbedaan yang  cukup  signifikan  dengan  Wasior 01  dibandingkan  dengan  individu  Serui
01  dan  Serui  02,  dimana  hal  itu  juga terlihat  pada  hasil  analisis  filogenetik yang  memperlihatkan  bahwa  Wasior  01 tidak  berada  dalam  satu  kelompok dengan  Wasior  02,  tetapi  berada  dalam satu  kelompok  yang  terpisah  dengan pertama (Wasior 02, Serui 02 dan Serui 01).  Hal  ini  memperlihatkan  bahwa individu  Wasior  02  memiliki  hubungan genetik dengan individu yang terdapat di perairan Serui dan membuktikan adanya aliran  genetik  diantara  perairan  Wasior dan Serui.
Wasior_1  AGTCTCACCT AATTCTACCA GGATTTGGTA TGATTTCCCG TAACTCACTA CTCAGGAAAG CGAGAACCCT TGGATATT Wasior_2  ......T... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........
Serui_1   ......T... .......... .......... .........A A.GG...... .......... .......... .....C.. Serui_2   ......T... .......... .......... .........A C.G-...... .......... .......... ........ GGTATGGTTT ATGCAATGAT TGCTATAGGA ATACTAGGAT TTTTAGTATG AGCTCTCATA TGTTTACAGT AGGAATGG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ ACGTAACACA CGAGCATACT TCCCGCTGCA ACATGATAAT TGCCGTACCA ACAGGAATTA AGGTTTTTAG ATGAATGG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ CAACACTCCG GATCAATCTC AGGAGAAACC CCACTACATG AGCCCTGGGT TTGTTTTCTA TTTACATTAG GAGGACTA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........C ........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....G.... ........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ ACTGGGATTG TCAGCTATTC CTCATTGACG TTGTACTACA CGACACTTAC TACGTGGTAG CTCACTTCCA TTATGTAC .......... .......... .......... .......... .......... C......... .......... ........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ ATCAATGGGA GCCGTCTTTG CATTTTTGCG GATCCCCTGG TTCCTCTTTT CAGGTACAAC CACACCCTCT TGGGAAAG ...G...... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........ GTGCACTTCT TTTAGTTATG GAGTCAATCA ACATTCTTCC CACAACACTT TTAGACTTGG GGAATGCCA .......... .....G.... .......... .......... .......... .......C.. .........
.......... .......... .......... .......... .......... .......G.. .-.......
.......... .......... .......... .......... .......... .......G.. .........
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.3.162 e - ISSN 2550-0929

## Filogenetik T. gratilla
Rekonstruksi filogenetik T. gratilla dengan  menggunakan  metode maksimum  parsimony,  menghasilkan dua kelompok ( cluster ) dengan dukungan  nilai bootstrap sebesar  75. Kedua  kelompok  terdiri  dari  individu yang  berbeda  lokasi  yaitu  kelompok pertama  terdiri  dari  WSR  02,  SER  02 dan SER 01. Sedangkan kelompok yang kedua hanya terdiri dari WSR 01.
Gambar  4  menunjukkan  adanya dua  kelompok  yang  berbeda  walaupun dalam  satu  spesies.  Pada  kelompok pertama terdiri dari SER 01 dan terdapat sub kelompok yang terdiri dari WSR 02 dan  SER  02,  ini  menunjukkan  bahwa terdapat  tiga  individu  dengan  tipe  yang sama. Selain itu pada gambar filogenetik tersebut terlihat bahwa dalam kelompok pertama  terdapat  sub  kelompok  yang terdiri  dari  dua  individu  berbeda  lokasi yaitu  WSR  02  dan  SER  02.  Hal  ini mengindikasikan  keduanya  mempunyai hubungan  genetik  yang  lebih  dekat dibandingkan dengan individu lainya.
Gambar 4.  Filogenetik T. gratilla hasil analisis dengan metode maksimum parsimoni menghasilkan dua kelompok ( cluster ). Tabel  4  menjelaskan  bahwa masing-masing individu memiliki
indeks  perbedaan  yang  beragam.  Indeks perbedaan terbesar yaitu antara WSR 01 terhadap  WSR  02  dan  SER  01  sebesar 0.01273.  Terlihat  pada  pohon  filogeni bahwa WSR 01 tidak berada dalam satu kelompok dengan kedua individu tersebut.  Sedangkan  indeks  perbedaan terkecil  yaitu  antara  WSR  02  dan  SER 02  sebesar  0.003634,  dimana  kedua individu  tersebut  berada  dalam  satu  sub kelompok.
Nilai  jarak  perbedaan  masing-
masing individu menggambarkan seberapa jauh atau dekatnya kekerabatan suatu individu. Berdasarkan hasil tersebut diketahu bahwa jarak perbedaan yang  signifikan  adalah  antara  WSR  01 dengan  WSR  02,  dan  SER  01.  Suatu jarak  perbedaan  dianggap  signifikan apabila  nilainya  ≥  0.01  (Malay et  al , 2000).  Walaupun  terdapat  jarak  yang signifikan  yaitu  sebesar  0.01273  antar individu  dari  kedua  perairan  tersebut,
namun hasil analisis filogenetik membuktikan  bahwa T.  gratilla dari kedua  perairan  memiliki  hubungan khusunya individu WSR 02 dan SER 02. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  tidak adanya  isolasi  terhadap  individu  baik yang  berasal  dari  perairan  Wasior
(WSR)  maupun  dari  perairan  Serui
(SER).  Analisis  filogenetik  memberikan hasil  yang  memperlihatkan  hubungan genetik antara individu yang berasal dari kedua perairan tersebut.
Tabel 4 Indeks perbedaan ( Disparity index ) antar individu T. gratilla. Individu WSR 01 WSR 02 SER 01 SER 02 WSR 01 - 0.01273 0.01273 0.00909 WSR 02 - 0.00545 0.00364 SER 01 - 0.00545 SER 02 -
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2020.Vol.4.No.1.96
Hubungan  genetik  yang  terlihat antara T.  gratilla dari  perairan  Wasior dan  perairan  Serui  dimungkinkan  terjadi karena  penyebaran  individu  pada  saat fase  larva  planktonik  yang  terbawa  oleh arus  laut.  Fase  larva  planktonik T. gratilla mempunyai  waktu  yang  cukup panjang, dimana menurut Shokita (1991) berkisar  lebih  dari  25  hari.  Sedangkan menurut  Juinio-Menez  (1998) disitasi Malay et  al. (2000),  bahwa  fase  hidup larva T.  gratilla berkisar  42-52  hari. Sehinga memungkinkan arus laut menyebarkan  larva  tersebut  ke  kawasan perairan  yang  cukup  jauh  dari  tempat asalnya.  Menurut  Malay et  al. (2000), bahwa  fase  larva T.  gratilla mempunyai waktu yang cukup panjang sehingga arus laut adalah media yang mampu menyebarkan  larva  ke  daerah  yang  lebih jauh.  Adanya  penyebaran  larva  ini memungkinkan  terjadinya  aliran  genetik sehingga  menimbulkan  keanekaragaman pada suatu kawasan tertentu. Bahri, et. al (2017) yang menyatakan bahwa arus laut di kepulauan Yapen Waropen mempunyai  pola  yang  unik  karena dipengaruhi  sejumlah  faktor  seperti faktor fisika  dan  kimia  yang  berasal  dari letak geografis yang berdekatan Samudera  Pasifik.  Selain  itu,  adanya hubungan  genetik  antara  kelompok  bulu babi T.  gratilla dari  perairan  wasior  dan serui karena kedua lokasi spesies tersebut masih  dalam  satu  kawasan  Teluk Cenderawasih. Bahri, dkk (2017) yang menjelaskan  bahwa  pola  arus  laut  di Teluk Cenderawasih
mempunyai karaktersitik  semi  tertutup  sehingga menyebabkan  kecilnya  potensi  aliran variasi  genetik  yang  berasal  dari  luar Teluk  Cenderawasih.  Karena  keragaman genetik  dapat  terjadi  karena  dua  faktor utama yaitu kondisi habitat dan eksploitasi yang berlebihan.
Individu T.  gratilla yang  berasal dari  kedua  perairan  memiliki  hubungan genetik.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa pada  perairan  tersebut  tidak  ada  isolasi yang  membatasi  penyebaran T.  gratilla dari  kedua  perairan.  Adanya  arus  laut  di perairan tersebut bukan merupakan faktor
pembatas  tetapi  merupakan  media  yang berperan  menyebarkan  larva T.  gratilla dari  kedua  perairan,  sehingga  aliran genetik antar kedua perairan dapat terjadi dengan baik.
Gambar 5.  Ilustrasi  yang  menggambar- kan aliran geneti T. gratilla di perairan Wasior dan Serui

## KESIMPULAN
Hasil  perunutan  nukleotida  bulu babi T.  gratilla menunjukkan  adanya variasi  nukleotida  antar  individu  dari perairan Wasior dan Serui. Namun secara umum  urutan  nukleotida  individu  dari kedua perairan memiliki tingakat homologi  yang  seragam  atau  tinggi. Analisis  menunjukkan  variasi  yang terdapat  pada  urutan  nukleotida  dari kedua  individu  tidak  berbeda  nyata  atau dapat  dikatakan  seragam.  Dimana  hasil analisis memberikan nilai indeks
perbedaan (disparity  index )  terbesar adalah  antara  WSR  01  dengan  WSR  02 dan  SER  02  sebesar  0.01273,  sedangkan indeks  perbedaan  terkecil  adalah  antara WSR 02 dan SER 02 yaitu 0.00364. Hasil Analisis filogenetik menunjukkan bahwa bulu babi T. gratilla asal  perairan  Wasior  dan  Serui  memiliki hubungan kekerabatan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terimakasih  disampaikan kepada  bapak  Abdul  Hamid.  A.  Toha, Mr.  Paul  Barber,  Mr.  Craig.  J.  Starger atas  bimbingan  teori,  metode  dan pelatihan  di  laboratorium  dan  atas
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2021.Vol.5.No.3.162 e - ISSN 2550-0929
dukungan  dana  melalui  bapak  sehingga penelitian ini dapat dilaksanakan.

## DAFTAR PUSTAKA
Akhmaloka.  (1993).  Struktur  dan  Fungsi Asam  Nukleat.  Institut  Teknologi
Bandung. Bandung. Avise,  J.C.  (1994).  Why  Employ Molecular  Genetic  Markers?  In Molecular Markers, Natural History  and  Evolution.  Chapman- Hall. 5-14. Aziz,  A.  (1987).  Makanan  dan  Cara Makan  Berbagai  Jenis  Bulu  babi. Oseana. 12(4). 91-100. Bahri,  S.,  Atmadipoera,  A.S.  dan Madduppa,  H.H.  2017.  Genetic Diversity of Olive Ridley Lepidochelys olivaceae Associated with Current Pattern in Cendrawasih  Bay  Papua.  Jurnal Ilmu  dan  Teknologi  kelautan Tropis. 9 (2). 747-760. Barber, P.H, and Erdmann, M.V. (2000). Moleculer  Systematic  of  The Gonodactylidae (Stomatopoda) using  Mitochondrial  Cythochrome oxidase  C  (subunit  1)  DNA Sequence Data. J. Crustacean Biol.
20. 20-36.
Barber,  P.H,  Palumbi  S.R.,  Erdmann,
M.V.,  and  Moosa,  M.K.  (2002). Sharp  Genetic  Breaks  among Populations of Haptosquilla pulchella (Stomatopoda)  Indicate Limits to Larval Transport: Patterns, Causes, and Consequences. Molecular Ecology. 11. 659–674. Folmer, O., Black, M., W. Hoeh, R. Lutz and  R.  Vrijenhoek.  (1994).  DNA Primers for Amplification of Mitochondrial Cytochrome c Oxidase  Subunit  I  from  Diverse Metazoan Invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3(5). 294-299. Grosberg, R., Cunningham, C.W. (2001). Genetic Structure in The Sea: from
Population  to  Communities  in Marine  Ecology.  Sinauer  Press. Sunderland MA. Pp. 61-84. Hebert,  P.D.N.,  Sujeevan.  R,  and deWaard  J.R.  (2003).  Barcoding Animal life: Cytochrome c Oxidase  Subunit  1  Divergences Among  Closely  Related  Species. The Royal Society. Biology Letters. 10. 1-4. Hidayat,  T.,  Kusumawaty,  D.,  Yati K.D.D, Muchtar, A.A., dan Mariana, D. 2008. Analisis Filogenetik Molekuler pada Phyllanthus niruri L. (Euphorbiaceae) Menggunakan Urutan Basa DNA Daerah Internal Transcribed  Spacer (ITS). Jurnal
Matematika dan Sains. 13 (1).
Holmes, E.C. (1998). Trees in Molecular
Evolution. A Phylogenetic Approach. pp. 11-36. Irma,  E.K.,  Jeni  dan  A.  H.  A.  Toha. (2005). Buku Ajar Biologi Molekuler. Jurusan Biologi FMIPA. Universitas Negeri Papua. Manokwari. Malay, M.C.D, M.A.R Juinio-Menez and
C.J  Villanoy.  (2000).  Population Genetic  Structure  of  The  Sea Urchin Tripneustes  gratilla from Selected  Sites  in  Western  Luzon and Eastern Philippines. Proceeding  9 th international  coral reef symposium. Bali, Indonesia.
Mahardika, I.G.N.K, dan Lies Parede, L.
(2008). Analisis Filogenetik Sekuen Nukleotida bagian Hipervariabel  Protein  VP2  Virus Gumboro  Isolat  Indonesia.  Jurnal Veteriner. 9 (2). 60-64. Mushtofa, J. (2007). Bulu Babi ( Tripneustes gratilla ). http://www.ulfana.multiplay.com/d oc. 22 April 2009.
Moritz,  C.  (1996).  Uses  of  molecular phylogenies  for  conservation., In New  Uses  for  New  Phylogenies (Harvey,  Ph.H.,  Leigh  Brown, A.J.,  Maynard  Smith,  J.,  Nee,  S., eds).  Oxford  University  Press.
Oxford. pp 203-216. Pai.  C.A.  (1992).  Dasar-dasar  genetika. Edisi Kedua. Penerjemah; Muchidin Apandi. Erlangga. Jakarta.
https://doi.org/10.46252/jsai-fpik-unipa.2020.Vol.4.No.1.96
Poerba,  Y.S.  dan  Yuzammi.  (2008). Pendugaan  Keragaman  Genetik
Amorphophallus  titanum Becc. Berdasarkan Marka Random Amplified  Polymorphic  DNA. Biodiversitas.9(2).103-107. Radjab,  A.W.  (2001).  Reproduksi  dan Siklus  Bulu  babi  (Echinoidea).
Oseana. 26(3). 25-26. Ratnayani K., Yowani, S.C. dan Liangky,
S.S. (2009). Amplifikasi Fragmen 0,4  kb  Daerah  D-loop  DNA Mitokondria  Lima  Individu  Suku Bali Tanpa Hubungan Kekerabatan dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurusan  Kimia  FMIPA Universitas Udayana. Jurnal Kimia 3 (1): 14-20. Jaafar,  R.B.T.A.  (2008).  Population Genetic  Studies  of  Marble  goby Oxyeleotris  marmoratus (Bleeker, 1852) in Malaysia using Microsatellite  and  Mitochondrial
DNA  Markers.  Thesis.  Universiti
Sains Malaysia.
Sehulz,  M.  and  Riidel,  G.  (1989).
Accumulation  of  The  Cytochrome c  Oxidase  Subunits  I  and  II  in Yeast  Requires  a  Mitochondrial
Membrane-Associated Protein,
Encoded  by  The  Nuclear  SC01 gene. J. Mol. Gen. Genect. 216:37-
43. Shokita. S, Kakazu. K, Tomori. A, and T. Toma.  (1992).  Aquaculture  in Tropical  Areas.  Midori  Shobo Co.Ltd. Solihin,  D.D.  (1994).  Peran  DNA Mitokondria (mtDNA) dalam Studi Keragaman  Genetik  dan  Biologi
Populasi  pada  Hewan.  Jurnal Hayati. 1(1): 1-4.
Tamura,  K.,  Dudley,  J.,  Nei,  M.  and Kumar, S. (2007). MEGA4: Molecular  Evolutionary  Genetics Analysis (MEGA) software version  4.0.2  Molecular  Biology and Evolution 24:1596-1599. Toha, A.H.A, Zain, S. (2006). Bulu Babi : Bioindikator Perairan Laut. Jurnal Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan. Berkala Ilmiah Penelitian Perikanan dan Kelautan. 1 (4). Toha,  A.H.A,  Suhaemi  dan  Binur,  R. (2009).  Usul  Penelitian  Strategis Nasional TA 2009. Analisis Keragaman  Hayati  Bulu  Babi ( Tripneustes gratilla ) dalam Upaya Konservasi dan Menghindari Kepunahan Organisme Model Riset  Biologi.  Universitas  Negeri Papua. Manokwari. Wandia, I.N. (2001). Genom Mitokondria.  Jurnal  Veteriner FKH. Universitas Udayana. 2(4) .