BiosciED: Journal of Biological Science and Education Volume 3 Number 1, 2022, pp 1-8 e-ISSN 2775-6777 p-ISSN 2746-9786 Home page: https://e-journal.upr.ac.id/index.php/bed

## Research Article

## Optimasi  Kit  Zeesan  SARS-COV-2  Test  Kit  untuk  Pengujian Deteksi  DNA  Porcine  pada  Produk  Olahan  Daging  dan  Produk Olahan Kompleks
Optimization of Zeesan SARS-COV-2 Test Kit for Porcine DNA Detection Tests on Processed Meat Products and Complex Processed Product
Tirta Setya Bhakti 1*
1 Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan di Semarang, Jl Sukun Raya 41A Kota Semarang *email: tirta_setya87@yahoo.com
Abstrak. Berbagai  macam  merek  kit  deteksi  RNA  covid  19  banyak digunakan  oleh  laboratorium  pengujian  covid  19.  Salah  satu  kit  tersebut adalah Zeesan SARS COV-2 Test Kit. Kit Zeesan tidak dapat digunakan untuk mendeteksi DNA porcine. Belum ada penelitian resmi penggunaan kit deteksi covid 19 yang dioptimasi untuk deteksi DNA porcine sehingga optimasi  kit  Zeesan  SARS  COV-2  Test  Kit  yang  digunakan  untuk mendeteksi DNA porcine adalah inovasi baru pada pengujian molekuler. Tujuan  penelitian  ini  adalah  mencari  kombinasi  yang  tepat  antara  kit deteksi  Zeesan  SARS  COV-2  Test  Kit  dengan primer-probe  porcine . Kemudian  mencari  setting  suhu  yang  sesuai  untuk  proses  amplifikasi pengujian  DNA  porcine.  Analisis  menggunakan real-time PCR  merek Liferiver  dengan  metode hydrolysis  probe .  Penelitian  dilakukan  dengan running  3  jenis  sampel  positif  porcine  dengan  3  konsentrasi  berbeda. Sampel  penelitian  menggunakan  sosis,  ham,  dan  mie.  Hasil  penelitian menunjukkan kombinasi kit deteksi Zeesan SARS COV-2 Test Kit- primer probe  porcine berhasil  mendeteksi  DNA  porcine  pada  3  sampel  positif porcine konsentrasi 10 ng, dan 5 ng. Sedangkan pada konsentrasi 1 ng, hanya  mampu  dideteksi  pada  2  sampel  positif.Selain  itu,  penelitian  ini menunjukkan  waktu  deteksi  DNA  porcine  yang  relatif  lebih  cepat  dari beberapa penelitian sebelumnya.
Abstract. Various brands of covid 19 RNA detection kits are widely used by  covid  19  testing  laboratories.  One  of  these  kits  is  the  Zeesan  SARS COV-2  Test  Kit.  The  Zeesan  kit  cannot  be  used  to  detect  porcine  DNA. There  has  been  no  official  research  on  the  use  of  optimized  covid  19 detection  kits  for  porcine  DNA  detection,  thus  the  optimization  of  the Zeesan  SARS  COV-2  Test  Kit  used  to  detect  porcine  DNA  is  a  new innovation in molecular testing. The purpose of this study was to find the right combination between the Zeesan SARS COV-2 Test Kit detection kit and the porcine primer-probe. Then look for the appropriate temperature setting  for  the  amplification  process  for  porcine  DNA  testing.  Analysis using  Liferiver  brand  real-time  PCR  with  hydrolysis  probe  method.  The study was conducted by running 3 types of positive porcine samples with
Kata Kunci:
DNA Porcine
Optimasi SARS-COV-2 Test Kit Zeesan

## Keywords:
DNA Porcine Optimization
SARS-COV-2 Test Kit
Zeesan Submitted: 28/04/2022 Revised: 30/05/2022 Accepted: 01/06/2022
3 different concentrations. The research sample used sausage, ham, and noodles. The results showed that the combination detection kit of Zeesan SARS  COV-2  Test  Kit-primary  probe  porcine  successfully  detected porcine DNA in 3 positive samples of porcine with a concentration of 10 ng  and  5  ng.  Meanwhile,  at  a  concentration  of  1  ng,  it  could  only  be detected in 2 positive samples. In addition, this study showed a relatively faster detection time of porcine DNA than several previous studies.
This is an open access article distributed under the Creative Commons 4.0 Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. ©2021 by author.

## 1.  PENDAHULUAN
Pandemi  covid  19  membuat  beberapa instansi  berpartisipasi  melakukan  pengujian covid  19.  Salah  satunya  laboratorium pengujian  di  Badan  POM.  Sebelumnya, pada bidang molekuler Badan POM berperan  mengawasi  kehalalan  produk obat,  suplemen  kesehatan,  kosmetik  dan makanan. Hal ini sesuai dengan visi Badan POM dalam mewujudkan obat, dan makanan  yang  aman,  bermutu,  berdaya saing  untuk  mewujudkan  Indonesia  maju yang berdaulat, mandiri, dan berkepribadian berlandaskan  gotong  royong.  Pengujian untuk  mengawasi  kehalalan  produk  ini menggunakan  metode  analisa  yang  sudah terverifikasi.
Pengawasan kehalalan barang beredar ( post market )
dilakukan sesuai perencanaan
sampling, baik jenis komoditas ataupun kuantitas barang.
Pengawasan berbasis resiko juga dilakukan untuk  mengantisipasi  jika  terjadi  kasus. Penggunaan reagen, alat, dan metode juga dipersiapkan dengan baik untuk menunjang proses pengujian.
Bermacam  metode  dapat  dilakukan untuk menguji adanya kontaminasi kandungan  babi  pada  produk,  antara  lain dengan  identifikasi  protein  dengan  teknik elektroforesis (Kim  dan  Shelef,  1986;
Skarpeidetal,  1998) , liquid  chromatography (Ashoor et  al. ,  1998) dan immunoassays (Jones  and  Paterson,  1985;  Hsieh et  al. ,
1998) . Namun, metode ini memiliki kelemahan, karena protein akan kehilangan aktivitas  biologinya  setelah  hewan  mati, ditambah  sifat  protein  yang  labil  dalam kondisi panas. Metode pendeteksi komponen  babi  dan  turunannya  berbasis DNA  menggunakan  RT-PCR,  memiliki tingkat  sensitivitas  dan  spesifisitas  yang tinggi dibandingkan dengan metode lainnya (Handoyo, et al, 2018) . Pengujian kehalalan produk  oleh  Badan  POM  menggunakan metode  PCR.  Bermacam  metode  PCR digunakan  sesuai  dengan  jenis  sampel. Beberapa  kelebihan  dari  metode  tersebut antara lain sudah terverifikasi, dan menggunakan  reagen,  sampel  dengan volume yang relatif kecil. Adapun kekurangan metode tersebut, yaitu menggunakan komposisi reagen yang relatif banyak  sehingga  berpengaruh  terhadap biaya pengujian. Kemudian waktu pengujian sedikit lebih lama.
Ada  beberapa  protokol  amplifikasi deteksi porcine (babi),  antara  lain  dengan pr ogram  seperti:  pre  denaturasi  suhu  95˚C selama  5  menit;  denaturasi  suhu  95˚C selama  30  detik; annealing suhu  60˚C selama 45 detik; ekstensi suhu 72˚C selama 1  menit  sebanyak  35  siklus  menggunakan thermocycler  Biorad (Sari,  2017) .  Ada  juga protokol amplifikasi dengan program holding 95˚C  selama  2  menit  pre  denaturasi  suhu 95˚C  selama  10  menit;  denaturasi  suhu 95˚C selama 15 detik; annealing suhu 60˚C
selama  60  detik  sebanyak  40  siklus (Widayat, 2019) .
Belum  ada  penelitian  resmi  tentang optimasi kit deteksi covid 19 yang dimanfaatkan untuk mendeteksi DNA
porcine. Banyak laboratorium yang menggunakan  kit  deteksi  covid  19  merk Zeesan  SARS  COV-2.  Kit  ini  berpotensi digunakan  untuk  mendeteksi  DNA  target porcine. Tujuan penelitian adalah menemukan komposisi yang tepat antara kit mastermix  Zeesan  SARS  COV-2  Test  Kit dan  primer-probe  porcine,  dan  mencari siklus  suhu  PCR  yang  sesuai  untuk pengujian DNA porcine. Optimasi kit deteksi covid  19  untuk  mendeteksi  DNA  porcine merupakan  inovasi  baru  dalam  pengujian molekuler.

## 2.  METODE

## 2.1.  Desain Penelitian
Penelitian  ini  merupakan  penelitian kuantitatif  yang  membandingkan  nilai  CT sampel  dengan  nilai  CT  kontrol  positif porcine yang  teramplifikasi.    Sampel menggunakan  3 jenis sampel  positif porcine ; sosis, ham, dan mie. Kontrol positif memakai  daging porcine yang  sudah diekstraksi.  Sampel  negatif  menggunakan sampel  yang  mengandung  DNA  ayam. Reagen  deteksi  yang  digunakan  pada penelitian ini adalah kit master-mix Zeesan®  SARS  COV-2  Test  Kit. Primer- probe  porcine dari Applied  Biosystem ®.  Kit ekstraksi  sampel  menggunakan  Qiagen® DNeasy Mericon Food Kit.

## 2.2.  Prosedur Penelitian

## Preparasi Sampel
Sampel  ditimbang  1  gr,  kemudian  di tambahkan 10 mL Food Lysis Buffer dan 25 μl proteinase K, divortex 1 menit. Kemudian diinkubasi  pada  suhu  65°C  selama  45 menit,  sambil  dihomogenkan  menggunakan
shaker dengan kecepatan 25 rpm. Kemudian  suhu  sampel  diturunkan  dengan cara didiamkan selama 2 menit. Lalu vortex 30 detik dan dimasukkan ke dalam ice block selama 10 menit,
Vortex  kembali  10  detik.  Sampel disentrifugasi  kecepatan  2500xg  selama  5 menit.    Sampel  kemudian akan  terbentuk  2 fase, Pipet 800 µl chloroform ke dalam tube 2 ml yang baru, dengan hati-hati, pindahkan 800  µl  lapisan  bening  tanpa  menyentuh presipitasi  yang  terjadi  didasar  tube. Masukkan ke dalam tube yang berisi 800 µl chloroform dan  di  vortex  15  detik  lalu sentrifuge  kecepatan  14000xg  selama  20 menit.  Ambil  500  µl  lapisan  bening kemudian  dimasukkan  ke  tube  2  ml  yang baru.  Tambahkan  buffer  P B  600  μl,  vortex 15  detik  dan spindown 3  detik.  Sebanyak 650 μl cairan tersebut dipipet ke dalam spin column.  Lalu  sentrifugasi  14000xg  selama 30  detik.  Ulangi  kembali  sampai  cairan sampel habis. Sebanyak 500 μl buffer AW2 ditambahkan ke dalam spin column sebanyak  2  kali.  Selanjutnya  diletakkan pada collection  tube ,  lalu  disentrifugasi kecepatan  14000xg  untuk  mengeringkan membran. Selanjutnya collection tube dibuang dan spin column ditempatkan pada tube 1,5/ 2 ml yang baru. Tambahkan 60 ul buffer  EB,  diamkan  5  menit  untuk  menarik DNA hasil ekstraksi.

## Preparasi  Seri  Kadar  Konsentrasi  Sampel Hasil Ekstraksi
Hasil ekstraksi sampel dibuat menjadi 3  seri  kosentrasi  10  ng,  5  ng,  dan  1  ng. Kontrol  positif  menggunakan  konsentrasi, 10  ng.  Sampel  negatif  menggunakan  DNA ayam. Pengukuran konsentrasi menggunakan alat Implen N50, lalu diencerkan. Penelitian ini juga menggunakan kontrol mastermix , dan kontrol negatif dari NFW.

## Analisis Data
Analisis  menggunakan thermocycler merk  Liferiver®,  metode hydrolysis  probe . Pengukuran  kemurnian  dan  konsentrasi sampel menggunakan nanophotometer NP50  (IMPLEN),  setting  methode;  Nucleid acid,  type  dsDNA,  mode  nano  volume, volume  sampel  2μL, nucleid  acid  factor 50.00, background  correction 320  nm,  air bubble recognition off , manual dilution factor 1.000.  Analisis  data  dilakukan  dengan melihat  hasil  kurva  amplifikasi,  dan  sampel yang naik memotong garis threshold .

## 3.  HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1.  Data Komposisi Kit Deteksi
Data  komposisi  optimasi  kit  deteksi Zeesan  SARS  COV2  Test  Kit  dengan primer-probe  porcine  disajikan  secara  rinci pada Tabel 1 berikut.
Tabel 1. Daftar Komposisi Mastermix
No.  Bahan Merk          Vol 1 RT PCR-Mix Zeesan      9 µl 2 Enzym
Zeesan      2 µl
3 Primer-F 7,5 µM     AB             2 µl 4 5 6 Primer-R 7,5 µM Probe 5 µM Sampel AB             2 µl AB             2 µl 8 µl

## 3.2.  Konfigurasi  Suhu  Siklus  PCR  pada

## Thermocycler Liferiver
Konfigurasi  amplifikasi  pada  mesin thermocycler yang  sesuai  untuk running hasil  optimasi  tersebut  adalah:  Hold  50 0 C selama  2  menit. Hold aktivasi  enzim Taq polymerase 95 0 C selama 7 menit. Dilanjutkan  dengan  45  siklus  pada  kondisi denaturasi 95 0 C selama 15 detik. Penempelan  primer  60 0 C  selama  1  menit.
Reporter dye gen target porcine menggunakan FAM.

## 3.3.  Hasil Amplifikasi Kontrol Positif
Hasil  amplifikasi  DNA porcine pada sampel  kontrol  positif  disajikan  secara  rinci dalam bentuk kurva pada Gambar 1 berikut.
Gambar 1. Kurva hasil amplifikasi kontrol positif konsentrasi 10 ng (3x ulangan)
Analisa hasil amplifikasi kontrol positif berupa  CT  dan  efisiensi  PCR  dapat  dilihat dari  hasil  analisis  mesin thermocycler seperti pada Tabel 2.
Tabel 2. Analisa qPCR kontrol positif No.  Nama CT efisiensi (R 2 ) 1 K1(ulangan 1) 17, 52   0,99851 2 K1(ulangan 2) 17, 85   0,99958 3 K1(ulangan 3) 17, 65   0,99966 3.4.  Hasil Amplifikasi Sampel Positif Hasil amplifikasi sampel positif porcine pada konsentrasi 10 ng, 5 ng, dan 1 ng  disajikan  secara  rinci  dalam  bentuk kurva pada Gambar 2.
Gambar 2. Kurva hasil amplifikasi sampel positif sosis, ham, dan mie konsentrasi 10 ng, 5 ng, dan 1 ng
Analisa hasil amplifikasi sampel positif konsentrasi  10  ng  berupa  CT  dan  efisiensi PCR  dapat  dilihat  dari  hasil  analisis  mesin thermocycler seperti pada Tabel 3.
Tabel 3. Analisa qPCR sampel positif
No.  Nama CT     efisiensi (R 2 ) 1 Sosis (ungu) 18, 85   0,99989 2 Ham (hijau) 15, 02   0,99975 3 Mie (merah) 31, 35   0,99942
Analisa hasil amplifikasi sampel positif konsentrasi  5  ng  dan  1  ng  berupa  CT  dan efisiensi PCR dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Analisa qPCR sampel positif No.  Nama
CT        efisiensi (R 2 ) 1 Sosis 5ng (ungu) 19, 23   0,99962 2 Ham 5ng (hijau) 15, 51   0,99830 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Mie5ng (oranye) Sosis 1ng (biru) Ham1g(cokelat) Sampel  negatif  5 ng(biru muda) Sampel  negatif  5 ng(ungu muda) Kontrol MM (cokelat) Kontrol MM (cokelat muda) Kontrol NFW (ungu) Kontrol NFW (merah muda) 34, 71   0,99942 22, 48   0,99983 - - - -
- -
- -
- - - - - -

## 3.5.  Pembahasan
Nilai CT hasil amplifikasi dari 3 kontrol positif  konsentrasi  10  ng  adalah  17,52; 17,85;  dan  17,65.  Sedangkan  CT  dari sampel  positif  sosis,  ham,  dan  mie konsentrasi 10 ng adalah 18,85; 15,02; dan 31,35.  CT  dari  sampel  positif  konsentrasi  5
ng adalah 19,23; 15,51; dan 34,71. Sampel positif  konsentrasi  1  ng  muncul  pada  CT 22,48  dan  18,63.  Pada  konsentrasi  ini, sampel positif mie 1 ng tidak terdeteksi gen target porcine .  Adanya inhibitor pada sampel  positif  mie  berpengaruh  terhadap konsentrasi  dan  kemurnian  DNA.  Hal  ini juga  terlihat  dari  munculnya  CT  pada sampel  mie  konsentrasi  10  ng,  dan  5  ng yang muncul di atas 30, yaitu 31, 35 dan 34, 71.  Nilai  CT  ˂29  menunjukkan  kadar  asam nukleat  dalam  jumlah  banyak,  sedangkan CT  >30  menunjukkan  kadar  asam  nukleat dalam  jumlah  sedang (Tom,  et  all  2020) . Pemilihan  metode  ekstraksi  dan  jenis  kit ekstraksi  yang  tepat  dapat  menghasilkan konsentrasi dan kemurnian DNA yang lebih baik.  Selain  itu,  pengenceran  sampel  juga bisa dilakukan untuk menghilangkan inhibitor pada  sampel.  Contoh  produk  DNA yang  mengandung  DNA  rendah  antara  lain mie, gelatin, dan marshmallow . Pemanfaatan  kit  deteksi  covid  19  merek zeesan ini terbukti efektif mampu melakukan  amplifikasi  DNA  porcine.  Waktu pengujian  juga  relatif  lebih  cepat  dari beberapa  penelitian  sebelumnya  karena holding time aktivasi enzim yang relatif lebih singkat.
Terdapat 2 parameter verifikasi metode  deteksi  DNA  secara  kualitatif,  yaitu koefisien  regresi  (R2)  dan  efisiensi  PCR, dan Limit  of  Detection (LOD)  (P30MN, Badan  POM  2018).  Tiap  jenis  sampel dihitung efisiensi PCR sesuai Tabel 5 dan 6. Rumus efisiensi dapat dihitung dengan:
𝐸𝑓𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑦 ∶   (10 (− 1 𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒 ) -1) x 100

## Tabel 5. Analisa efisiensi PCR
. Nama Log Dilution factor Sosis 0,5 (20ng ke 10ng) -0,301029996 Sosis 0,25 (20ng ke 5ng) -0,602059991 Sosis 0,05 (20ng ke 1ng) Ham 0,5 (20ng ke 10ng) Ham 0,25 (20ng ke 5ng) Ham 0,05 (20ng ke 1ng) Mie 0,5 (20ng ke 10ng) Mie 0,25 (20ng ke 5ng) -1,301029996 -0,301029996 -0,602059991 -1,301029996 -0,301029996 -0,602059991 Tabel 6. Analisa efisiensi PCR .  Nama Measured CT PCR efficiency Sosis (20ng ke 10ng) 18,85 Sosis (20ng ke 5ng) 19,23 Sosis (20ng ke 1ng) Ham (20ng ke 10ng) Ham (20ng ke 5ng) Ham (20ng ke 1ng) Mie (20ng ke 10ng) Mie ( 20ng ke 5ng) 22,48 15,02 15,51 18,63 31,35 34,71 83,018 86,012 22,91
Kriteria  keberterimaan  efisiensi  PCR untuk  produk  olahan  adalah  75-110  % (JRC,  2015;  JRC,  2016).  Efisiensi  sampel sosis adalah 83,01%, sampel ham 86,012%,  dan  mie  22,910%.  Hal  ini membuktikan  bahwa  komposisi mastermix yang  dipakai  sudah  tepat.  Suhu  denaturasi yang  terlalu  tinggi  akan  menurunkan aktivitas  polimerase  DNA  yang  akan berdampak  pada  efisiensi  PCR,  merusak DNA template , sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi  DNA template tidak  sempurna (Handoyo,  et  al.  2001) .  Efisiensi  PCR produk  sosis  dan  ham  masih  masuk  dalam kriteria  persyaratan.  Namun  pada  produk mie,  nilai  efisiensi  PCR  belum  memenuhi persyaratan.  Rendahnya  efisiensi  sampel mie  dapat  disebabkan  metode  ekstraksi yang  digunakan  kurang  tepat.  Untuk  itu
masih  perlu  dilakukan  optimasi  metode ekstraksi  untuk  mendapatkan  konsentrasi dan  kemurnian  DNA  yang  lebih  baik.  Pada penelitian  selanjutnya,  ekstraksi  sampel yang  telah  mengalami  proses  kompleks dalam pembuatannya sebaiknya menggunakan kit yang penimbangan sampelnya besar atau pengambilan supernatannya lebih banyak. Dengan demikian  peluang  terambilnya  DNA  dalam sampel lebih besar. Seperti sudah dijelaskan  sebelumnya  proses  pembuatan yang  kompleks  berpotensi  merusak  DNA yang  terkandung  di  dalamnya  sehingga jumlahnya  menurun  atau  untaian  DNA menjadi  lebih  pendek  sehingga  lebih  sulit dideteksi.  Pembahasan  koefisien  regresi (R2),  dan  LOD  tidak  dilakukan  karena penelitian ini bersifat kualitatif yang membandingkan  nilai  CT  pada  sampel
dengan nilai  CT  pada  kontrol  positif.  Selain itu diperlukan data yang lebih banyak untuk menghitung analisa regresi dan LOD.
Pada  kontrol mastermix ,  dan  kontrol NFW setelah diamplifikasi tidak menunjukkan  munculnya  kurva  amplifikasi. Hal ini menunjukkan tidak adanya kontaminasi  pada  saat  pengujian.  Pada kontrol sampel negatif juga tidak menunjukkan  munculnya  kurva  amplifikasi. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kombinasi  kit Zeesan  SARS  COV-2  Test  Kit  dengan primer-probe porcine hanya sensitif mendeteksi fragmen DNA porcine.

## 4.  KESIMPULAN
Optimasi kit Zeesan SARS COV-2 Test Kit dengan kombinasi primer-probe porcine, pada  setting siklus  PCR  yang  sesuai  dapat digunakan  untuk  mendeteksi  kandungan DNA  porcine  pada  sampel  produk  olahan daging.  Kadar  DNA  porcine  yang  dapat terdeteksi berada pada konsentrasi 1 ng/ul.

## Daftar Pustaka
Ashoor,  S.,  Monte,  W.,  &  Stiles,  P.  (1998).
Liquid  chromatographic  identification of meats. J Assoc Off Anal Chem. 71, 397-403.
Clspedes,  A.,  Garcia,  T.,  Cerrera,  E.,
Gonzales, I., Fernandez,
A., Hernandez,  P.,  &  Martin,  R.  (1999). Identification  of  sole  (Soleasolca)  and Greenland halibut (Reinhardtiushippoglossoides) by PCR  amplification  of  the  5s  rDNA gene.  J  Agric  Food  Chem.47,  1046-
1050.
European  Network  of  GMO  Laboratories.
(2015). Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical  Methods  of  GMO  Testing, European Commission Joint Research
Centre.  Institute  for  Health  and Consumer Protection.
Handoyo, D., & Rudiretna, A. (2001). Prinsip umum  dan  pelaksanaan  Polymerase Chain  Recation  (PCR).  In  P.  S. Bioteknologi,  General  Principles  and Implementation  of  Polymerase  Chain Reaction  (pp.  Vol.  9,  No.  1  17-29). Unitas.
Jones,  SI.,  &  Paterson,  R.  (1985).  Double antibody  ELISA  for  detection  of  trace amounts  of  pig  meat  in  raw  meat mixtures. Meat Sci.15, 1-13.
Kim,  H.,  &  LA,  S.  (1986).  Characterization and  identification  of  raw  beef,  pork, and chicken and turkey meats by their sarcoplasmis  protein  electrophoretic patterns. J food Set, 51, 731-741.
Sari,  F.  (2017).  Identifikasi  Spesies  Babi pada  Produk  Pangan  Asal  Hewan  di Pasar Tradisional Provinsi Riau dengan  metode  Polymerase  Chain Reaction.  Jurnal  Riau  Biologia  2  (1),
55-60.
The  sub-working  group  "Validation  of  real- time PCR methods". (2016). Guidelines  for  the  single-laboratory validation  of  qualitative  real-time  PCR methods. Bundesamt Verbraucherschutz und
Lebensmittelsicherheit (BVL).
Tom,  M.  R.,  &  Mina,  M.  J.  (2020).  to Interpret  the  SARS  Cov-2  test, consider  the  Cycle  Threshold  Value sample.  Clinical  Infectious  Diseas, ciaa619, DDI:1.0.
Yusuf,  Z.  K.  (2010).  Polymerase  Chain Reaction (PCT). Saintek.5(6).