## Perbedaan Lama Pemberian Minyak Ikan Lemuru terhadap Jumlah Sel Fibroblas Jaringan Ikat pada Tikus Model Reumatoid Artritis
The Difference in Lemuru Fish Oil Duration of Administration on Connective Tissue Fibroblast Cell Count in Rheumatoid Arthritis Rat Model
Asyirah Mujahidah Fillah 1 , Rena Normasari 2 , Dwita Aryadina Rachmawati 3 1 Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Jember
2 Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Jember
3 Laboratorium Ilmu Kesehatan Masyarakat Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jalan Kalimantan No. 37 Kampus Tegalboto, Jember 68121 e-mail korespondensi: asyirafilla@gmail.com

## Abstrak
Reumatoid  artritis  merupakan  proses  inflamasi  kronis  pada  persendian  yang  menyebabkan  destruksi  progresif. Sitokin yang disekresikan akibat inflamasi kronis menyebabkan peningkatan jumlah sel fibroblas yang mensintesis matriks  metallo-proteinase.  Obat  antiinflamasi  non  steroid  yang  diberikan  untuk  mengurangi  gejala  inflamasi memiliki berbagai efek samping sehingga diperlukan antiinflamasi alternatif yang dinilai berefek samping minimal seperti minyak ikan lemuru. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan jumlah sel fibroblas jaringan ikat tikus  model  reumatoid  artritis  akibat  lama  pemberian  minyak  ikan  lemuru.  Jenis  penelitian  ini  adalah  true eksperimental dengan desain the randomized post test only control group design. Sampel yang digunakan adalah tikus galur sebanyak 24 ekor dan dibagi menjadi 6 kelompok. Hasil uji one way anova didapatkan p=0,004.  Hasil analisis data Post Hoc LSD menunjukkan ada perbedaan signifikan pada pemberian minyak ikan lemuru selama 21 hari  dengan  signifikansi  0,038  dibandingkan  dengan  pemberian  selama  7  hari.  Kesimpulan  penelitian  ini  adalah terdapat perbedaan jumlah sel fibroblas jaringan ikat tikus model reumatoid artritis akibat lama pemberian minyak ikan lemuru selama 21 hari .
Kata kunci: reumatoid artritis, sel fibroblas, minyak ikan lemuru

## Abstract
Rheumatoid arthritis is a joint chronic inflammation process leading to progressive distruction.Cytokines secreted from  chronic  inflammation  increases  fibroblast  cell  number  that  synthesize  matrix  metalloproteinase.  Non steroidal anti  inflammation drugs administrated to lighten inflammation symptoms had several side effects that increase the urge to discover an alternative antiinflammation with lower side effect like lemuru fish oil. This  true experimental  study  with  randomized  post  test  only  control  group  design  aimed  to  investigate  the  difference  in lemuru  fish  oil  duration  of  administration  on  connective  tissue  fibroblast  cell  count  in  rheumatoid  arthritis  rat model. The One Way Anova test revealed that there are at least two group means that are statistically significant different  from  each  other  with  a  p  value  of  0,004.  Post  Hoc  LSD  analysis  result  indicate  a  significant  difference after 21 days duration of administration compared to 7 days administration with significance value of 0,038. It can be concluded that there is a significant difference in lemuru fish oil administration after 21 days duration.
Keywords: rheumatoid arthritis, fibroblast cell, lemuru fish oil

## Pendahuluan
Rheumatoid  artritis  adalah  salah  satu  jenis  artritis yang  merupakan  proses  inflamasi  kronis  pada persendian  yang  ditandai  pembengkakan  dan  nyeri sendi  dan  mengakibatkan  destruksi  sendi  progresif yang  menyebabkan  disabilitas  parah  (Aletaha  et  al., 2010).  Untuk  keperluan penelitian, kondisi inflamasi seperti pada rheumatoid artritis ini diinduksi dengan Complete Freund’s Adjuvant (CFA) melalui pembentukan  influks  leukosit  dan  interaksinya dengan antigen. Pelepasan mediator inflamasi dapat menyebabkan  kehilangan  proteoglikan  dan  matriks ekstraselular.  Perubahan  histopatologi  yang  dapat diperhatikan adalah degradasi matriks dan peningkatan jumlah sel fibroblas.
Sel  fibroblas  merupakan  sel  aktif  utama  pada jaringan  ikat  yang  berfungsi  menjaga  integritas struktur  jaringan  ikat  dan  mengatur turnover jaringan ikat dengan memproduksi enzim yang dapat mendegradasi  matriks  ekstraseluler  seperti  MMP (matrix  metalloproteinase) (Pap  et  al.,  2000). Aktivitas  MMP  salah  satunya  diregulasi  oleh mekanisme  post  translasional  yang  terjadi  melalui aktivasi pro-MMP yang dipicu  berbagai faktor, salah satunya prostaglandin E2 (PGE2). Inflamasi berdampak  pada  komponen  membran  sel  yaitu fosfatidilkolin  dan  fosfatidil  inositol  yang  diubah menjadi  asam  arakhidonat  (AA).  Selanjutnya,  AA akan  bercabang  menjadi  dua  jalur,  siklooksigenase (COX)  dan  lipooksigenase  (LOX).  Pada  jalur  COX terbentuk PGE2 dan thromboxane (TXA2), sedangkan  pada  jalur  LOX  akan  terbentuk  leukotrin (LT4)  (Siwik et  al .,  2000).  Tata  laksana  RA  pada dasarnya  bertujuan  untuk  meringankan  gejala  dari inflamasi  yang  terjadi  dan  mencegah  kerusakan sendi  lebih  lanjut,  dengan  kata  lain  hanya  akan mengurangi  dampak  dan  progresivitas  penyakit, tidak  dapat  memulihkan  sepenuhnya.  Salah  satu komponen terapi farmakologis untuk RA adalah obat anti  inflamasi  golongan  non  steroid  (OAINS). Sayangnya, OAINS dapat menimbulkan efek samping gastrointestinal seperti dispepsia, ulserasi, perdarahan atau perforasi (Lelo et al., 2004).
Ikan  lemuru (Sardinella  longiceps) adalah  salah  satu jenis  ikan  pelagik  kecil  yang  banyak  terdapat  di Indonesia dan sering dikonsumsi masyarakat namun pemanfaatannya  masih  kurang  optimal.  Jenis  ikan yang  banyak  dikonsumsi  masyarakat  Indonesia  ini memiliki potensi yang cukup baik untuk pemenuhan gizi  masyarakat  karena  nilai  gizi  dari  jenis  ikan tersebut  tidak  kalah  dibandingkan  dengan  nilai  gizi
jenis  ikan  yang  sering  diekspor  (Irianto,  2007). Minyak  ikan  lemuru  yang  merupakan  hasil  ekstraksi limbah  industri  pengalengan  kaya  asam  lemak  tak jenuh  ganda eicosa  pentaenoic  acid (EPA)  dan docosa  pentaenoic acid (DHA)  yang  berperan  dalam mengganti  prostaglandin  E2  (PGE2)  pada  asam arakhidonat  (AA)  yang  bersifat  inflamasi  dan menyebabkan  nyeri  sendi  menjadi  prostaglandin  E3 (PGE3)  yang  memiliki  efek  anti  inflamasi  (Indahyani et  al.,  2008).  Pemanfaatan  potensi  sumber  daya kelautan  Indonesia  yang  lebih  banyak  terbuang adalah dasar dari penelitian ini.

## Metode Penelitian
Jenis penelitian ini adalah true experimental dengan rancangan randomized  post  test  only  control  group design .  Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium Biomedik  Fakultas  Kedokteran  Gigi  Universitas Jember, Laboratorium Kimia
Dasar FMIPA Universitas  Jember  dan  Laboratorium  Patologi Anantomi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang  pada  bulan  Desember  2015  hingga November  2017.  Penelitian  ini  telah  mendapatkan persetujuan dari komisi etik dari FK Unej.
Sampel penelitian yang digunakan adalah tikus jenis Sprague Dawley jantan usia  3-5 bulan dengan berat badan  200-300  gram . Sampel  dibagi  ke  dalam  6 kelompok  yaitu  kelompok  kontrol  negatif  dengan perbedaan  waktu  dekapitasi  setelah  diinjeksi  CFA yaitu K-1 (hari ke-7), K-2 (hari ke-14), K-3 (hari ke-21) dan  kelompok  perlakuan  dengan  perbedaan  lama pemberian  minyak  ikan  lemuru  yaitu  P1  (7  hari),  P2 (14 hari) dan P3 (21 hari). Metode penentuan besar sampel  menggunakan  rumus  empiris  Federer didapatkan  4  ekor  tikus  untuk  masing-masing kelompok  sehingga  total  sampel  yang  dibutuhkan sebesar  24  ekor  tikus.  Seluruh  sampel  diinjeksi  CFA 0,08  ml  intraartikular  dan  ditunggu  selama  42  hari untuk membuat model inflamasi rheumatoid artritis. Lalu  kelompok  perlakuan  diberi  minyak  ikan  lemuru per oral 1 ml/150-200 gramBB. Sediaan histopatologi yang  diamati  diperoleh  dari  jaringan  ikat  sendi tibiofemoral  kanan.  Data  diperoleh  dengan  cara mengamati  jumlah  sel  fibroblas  pada  enam  lapang pandang  dengan  perbesaran  400x  dan  dihitung jumlah  keenam  lapang  pandang  secara  manual. Penghitungan sel fibroblas dilakukan dengan metode blinding oleh tiga orang kemudian dirata-rata.
Data kelompok perlakuan dianalisis menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk  mengetahui  normalitas  data.  Uji Shapiro-Wilk dipilih  sebagai  uji  normalitas  karena jumlah  sampel  pada  penelitian  ini  kurang  dari  50. Data  juga  diuji  homogenitas Levene untuk  menguji kesamaan varians dari beberapa populasi. Kemudian dilakukan  uji  parametrik  One  Way  Anova  untuk mengetahui  apakah  terdapat  perbedaan  rata-rata antar minimal dua kelompok sampel.

## Hasil Penelitian
Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan  Desember  2015 hingga  November  2016.  Hasil  penghitungan  jumlah sel  fibroblas  masing-masing  kelompok  sampel  dari ketiga  pengamat  dirata-rata  dan  didapatkan  skor yang akan ditampilkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Skor rata-rata jumlah sel fibroblas masing-masing kelompok sampel
Rata-rata Jumlah Fibroblas Rata-rata Jumlah Fibroblas K-1 354.25 P1 214.00 K-2 253.75 P2 192.00 K-3 423.33 P3 107.58
Hasil  penelitian  di  atas  menunjukkan  sel  fibroblas paling  rendah  terdapat  pada  kelompok  P3  yaitu kelompok  yang  diberi  pemberian  minyak  ikan lemuru  selama  21  hari  sedangkan  jumlah  sel fibroblas  paling  tinggi  terdapat  pada  kelompok  K-3 yaitu  kelompok  kontrol  negatif  yang  tidak  diberi minyak ikan lemuru dan didekapitasi pada hari ke-21 hari  setelah  injeksi  CFA.  Sedangkan  pada  kelompok P1  dan  P2    terjadi  penurunan  jumlah  sel  fibroblas seiring  dengan  bertambah  lamanya  pemberian minyak  ikan  lemuru.  Gambaran  histopatologi  dari penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar  1  menunjukkan  bahwa  jumlah  fibroblas pada kelompok kontrol negatif (a), (c), (e) mengalami peningkatan  seiring  dengan  bertambahnya  hari dengan jumlah fibroblas paling tinggi pada kelompok K-3  (e).  Sedangkan  jumlah  fibroblas  paling  rendah pada kelompok perlakuan (b), (d), (f) dengan jumlah fibroblas paling rendah pada kelompok P3 (f).
Gambar 1. Gambaran histopatologi dengan pembesaran 400x pada contoh tiap kelompok sampel
Data  jumlah  fibroblas  yang  telah  terkumpul kemudian  dianalisis  menggunakan  uji Shapiro  Wilk. Berdasarkan  uji  normalitas  didapatkan  data berdistribusi  normal  karena  p>0,05.  Dilanjutkan dengan uji homogenitas Levene didapatkan nilai p = 0,127  menunjukkan  data  berasal  dari  populasi  yang homogen.  Selanjutnya  dilakukan  uji  statistik parametrik One  Way  Anova didapatkan  signifikansi 0,127  yang  artinya  terdapat  minimal  sepasang kelompok  yang  memiliki  perbedaan  jumlah  sel fibroblas  yang  signifikan.  Selanjutnya  dilakukan  uji Post  Hoc  LSD untuk  mengetahui  pada  kelompok mana yang terdapat perbedaan bermakna.  Hasil  uji lanjutan  ini  menunjukkan  bahwa  perbedaan bermakna  terdapat  pada  kelompok  K-3  dan  P3,  P1 dan P3 serta K- 2 dan K-3.

## Pembahasan
Dari  hasil  penelitian,  peningkatan  jumlah  sel fibroblas  antar  kelompok  kontrol  negatif  tidak
signifikan meskipun jumlahnya cenderung meningkat hari ke-21. Hal itu diduga karena pada penelitian ini seluruh  model  tikus  telah  mengalami  inflamasi kronis  seperti  pada  RA.  Pada  inflamasi  kronis, makrofag akan teraktivasi sehingga akan menghasilkan produk-produk termasuk metabolit AA (asam  arakidonat)  dan  sitokin  (IL-1b,  TNFa,  PGE2) yang  memicu  produksi  MMP  oleh  fibroblas  (Cleland et al., 2006). Tidak seperti inflamasi akut dimana ada keseimbangan  MMP  dan  TIMPs  sehingga  produksi jaringan  baru  dapat  dikontrol,  pada  kondisi  kronis penyembuhan  terhenti,  kadar  sitokin  inflamasi  dan MMPs meningkat (Orsted, 2011 ; Diegelmann, 2004).
Nilai  signifikansi  kelompok  P1  terhadap  K-1  sebesar 0,225  dan  kelompok  P2  terhadap  K-2  sebesar  0,393 yang  berarti  tidak  terdapat  perbedaan  yang signifikan  sedangkan  nilai  signifikansi  kelompok  P3 terhadap  K-3  sebesar  0,000  yang  menunjukkan terdapat  perbedaan  yang  signifikan.  Pada  kelompok perlakuan,  jumlah  fibroblas  cenderung  menurun dengan  bertambahnya  hari  perlakuan.  Jumlah fibroblas  pada  kelompok  perlakuan  7  hari  dan  14 hari menurun meskipun hasilnya tidak signifikan. Hal tersebut diduga, pada hari ke-7 belum banyak terjadi penurunan  AA  pada  jaringan  membran  fosfolipid sehingga belum terjadi penurunan PGE2 dan sitokin yang berujung pada belum tampaknya pengurangan jumlah  fibroblas  yang  signifikan.  Hal  ini  selaras dengan hasil penelitian sebelumnya yang menyatakan  bahwa  pada  1  hari  setelah  pemberian minyak  ikan,  penggantian  struktur  AA  dengan  EPA dalam  jaringan  belum  banyak  terjadi  walaupun dosisnya  ditingkatkan.  Pada  hari  ke-14  diduga kandungan  omega-3  PUFA  dalam  minyak  ikan  yang diberikan  sudah  mulai  mengganti  AA  jaringan dengan  EPA  dan  DHA  walaupun  belum  sempurna, mengakibatkan  jumlah  sel  fibroblas  menurun meskipun tidak signifikan.
Perbandingan antar kelompok perlakuan menunjukkan  bahwa  berdasarkan  lama  pemberian, minyak  ikan  lemuru  memberikan  hasil  yang signifikan jika diberikan rutin dan dalam waktu yang lebih  lama  dibuktikan  dengan  semakin  menurunnya jumlah  fibroblas  seiring  lamanya  pemberian. Penelitian  terdahulu  membuktikan  bahwa  konsumsi minyak  ikan  lemuru  selama  10  minggu  secara  terus menerus  menyebabkan  penurunan  produk  sitokin (Indahyani et al., 2011).
Perbandingan  nilai  signifikansi  antara  kelompok  K-3 dengan  P3  yang  signifikan  (0,000)  menunjukkan bahwa semakin lama pemberian minyak ikan lemuru
maka semakin meningkat kadar EPA dan DHA dalam jaringan  ikat  sehingga  daya  hambat  progresivitas inflamasi  semakin  tinggi  dengan  cara  menghambat sintesis  mediator  inflamasi  yang  dapat  memicu sintesis  MMP  oleh  sel  fibroblas.  Pada  keadaan  ini, EPA  dan  DHA  dari  minyak  ikan  lemuru  telah mengganti  struktur  AA  dalam  jaringan.  Eikosanoid yang  berasal  dari  EPA  maupun  DHA  merupakan antagonis  eikosanoid  yang  terbentuk  dari  AA jaringan (Indahyani et al., 2011).
Pemberian  minyak  ikan  lemuru  selama  21  hari ternyata  mampu  menyebabkan  penurunan  jumlah sel  fibroblas  pada  jaringan  ikat  sendi  tikus  yang mengalami  RA.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa pemberian minyak ikan lemuru dengan jangka waktu lama  mampu  mempengaruhi  struktur  AA  jaringan dengan  EPA  dan  DHA  yang  bersifat  anti  inflamasi sehingga  berpengaruh  pada  jumlah  fibroblas  yang memproduksi MMP.

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa  terdapat  perbedaan  jumlah  sel  fibroblas jaringan  ikat  tikus  model  reumatoid  artritis  akibat lama pemberian minyak ikan lemuru.
Perlu  dilakukan  penelitian  selanjutnya  mengenai dosis toksik dan jangka waktu maksimal penggunaan minyak ikan lemuru. Selain itu penelitian selanjutnya bisa  menggunakan  pewarnaa  spesifik  sel  fibroblas sehingga  bisa  diketahui  perbedaan  sel  fibroblas dengan sel lain yang terdapat pada jaringan ikat.

## Ucapan Terima Kasih
Pada  kesempatan  ini  peneliti  mengucapkan  terima kasih  kepada  dr.  Rena  Normasari,  M.Biomed.  serta dr.Dwita  Aryadina  Rachmawati,  M.Kes.  atas bimbingan yang diberikan hingga tersusunnya artikel penelitian ini. Peneliti juga mengucapkan terimakasih kepada Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran  Gigi  Universitas  Jember,  Laboratorium Kimia  Dasar  FMIPA  Universitas  Jember  dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya
Malang yang telah
memberikan izin dan bantuannya dalam pelaksanaan penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Aletaha,  Neogi,  Silman,  Funovits,  Felson,  Bingham, Birnbaum, Burmester, Bykerk, Cohen, Combem Costenbader,  Dougados,  Emery,  Ferraccioli, Hazes, Hobbs, Huizinga, Kavanaugh, Kay, Kvien, Laing,  Pincus,  Smolen,  Stanislawska-Biernat,
Symmons,  Tak,  Upchurch,  Vencovsky,  Wolfe, dan  Hawker.  2010.  Rheumatoid  Arthritis Classification  Criteria:  an  American  College  of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative." Arthritis&Rheumatism 62.9:2569- 2581
Cleland,  L.,  Caughey,  G.,  James,  M.,  dan  Proudman,
S.  2006.  Reduction  of  Cardiovascular  risk factors with longterm fish oil treatment in early rheumatoid arthritis. J. Rheumat . 15: 1471-5
Diegelmann,  R . 2004 . Wound  Healing:  an  Overview of  Acute,  Fibrotic  and  Delayed  Healing.
PubMed.gov  US  National  Library  of  Medicine National Institutes of Health. 1;9:283-9.
Indahyani, D.E., Barid, I., dan Handayani, A.W. 2008. Minyak  Ikan  Lemuru (Sardinella  longiceps)
Meregulasi  Survival  Osteoblas  dan  Osteoklas,
Ekspresi  Integrin  Αvβ3  Tulang  Alveolaris  serta Struktur Gigi pada Tikus yang Mengalami Infeksi
Periodontal  Selama  Masa  Odontogenesis. Dipublikasikan. Laporan Hasil Penelitian . Jember: Universitas Jember.
Indahyani,  D.,  I.  Barid,  dan  A.  Richna.  2011.  Minyak Ikan  Lemuru  Menghambat  Kerusakan  Kolagen pada Tulang Alveolaris. Dipublikasikan. Laporan Hasil Penelitian. Jember: Universitas Jember
Irianto,  H. dan  I.  Soesilo,  2007.  Dukungan  Teknologi
Penyediaan  Produk  Perikanan.  Badan  Riset
Kelautan dan Perikanan. [on line] http://www.doestoc.com/does/19432492/Duk ungan-Tek.perikanan. [8 Juni 2016].
Lelo,  A.,  Z.  Rangkuty,  dan  Y.  Pane.  2004.  Manfaat
AINS Terhadap Nyeri Gangguan
Muskuloskeletal  Pada  Usia  Lanjut.  Fakultas Kedokteran Bagian Farmakologi dan Terapeutik Universitas Sumatera Utara. e-USU Repository.
Orsted,  H.  2011.  Basic  Principles  of  Wound  Healing. Wound Care Canada Volume 2 Nomor 9.
Pap,  Ladner,  Gay,  R.,  dan  Gay,  S.  2000.  Fibroblast biology:  Role  of  Synovial  Fibroblasts  in  the pathogenesis  of  Rheumatoid  Arthritis. Arthritis Research . 2(5): 361-367