## PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PEKTINASE BAKTERI PEKTINOLITIK DARI LIMBAH KULIT JERUK UNTUK KLARIFIKASI JUS LEMON ( Citrus limon)

## PRODUCTION AND CHARACTERIZATION PECTINASE ENZYME PECTINOLITIC BACTERIA FROM CITRUS PEEL WASTED FOR LEMON JUICE (Citrus Limon) CLARIFICATION
Esti Widowati, Rohula Utami, Edhi Nurhartadi, M.A.M Andriani, Ririn Hanifah Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret
Email: esti_widowati@yahoo.com

## ABSTRACT
The  aims  of  this  research  were  to  isolate  and  characterize  the  pectinolytic  bacteria  from  citrus  peel waste,  determine  the  character  of  the  optimum  (pH,  temperature,  K M and  V max )  of  the  pectinase  enzyme  and determine  the  effect  of  the  enzyme  on  the characteristics  of  lemon  juice.  Isolation  and  characterization  of  the pectinolitic bacteria were the first stage of the research. Isolation, presipitation, dyalisis and determination of the  pectinases  enzyme  characters  (optimum  pH  and  temperature,  K m and  V maks )  were  the  second  stage  of  the research. From ten selected bacterial isolates obtained three isolates that produce enzymes that are best in the lemon juice clarification process that isolates 1, 4 and 9. Selection is based on the value of a low viscosity, the value  of  a high  total dissolved solids and  high  transmittance value.  From  the  results  known that  all bacterial isolates were obtained Gram-negative bacteria, negative endospores and positive catalase.  Isolates 1, 4 and 9 optimum at pH 4.0, optimum temperature at 50 0 C stable in the pH range 3.0-4.0, stable at a temperature of 30- 50 0 C. K M value for isolates 1, 4 and 9 in succession is 0.022 mg / ml, 0.009 mg / ml, 0.017 mg / ml, whereas the V max value in succession is 0.041 U / ml, 0,036 U / ml, 0,039 U / ml.
Keywords : Enzyme, Juice Clarification,  Pectin, Pectinases

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri pektinolitik dari limbah kulit jeruk,  mengetahui  karakter optimum (pH, suhu, K M dan V maks ) dari enzim pektinase dan mengetahui pengaruh penambahan enzim terhadap karakteristik jus lemon. Penelitian tahap pertama yaitu dilakukan untuk mengisolasi dan  mengkharakterisasi  bakteri  pektinolitik.  Penelitian  tahap  kedua  dilakukan  isolasi,  presipitasi,  dialisis  dan penentuan karakteristik enzim pektinase (pH dan  suhu optimum, kestabilan pH dan suhu,  K m and  V maks ). Dari sepuluh isolat bakteri dipilih tiga isolat yang menghasilkan enzim yang cocok dalam proses klarifikasi jus lemon yaitu isolat 1, 4 dan 9.  Pemilihan ini berdasarkan pada nilai viskositas yang rendah, nilai total padatan terlarut yang  tinggi  dan  nilai  transmitansi  yang  tinggi.  Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh  semua  isolat  bakteri  yang didapatkan  termasuk  bakteri  Gram  negatif,  endospora  negatif  dan  positif  pada  uji  katalase.  .  Isolat  1,  4  dan 9 optimum pada pH 4,0, optimum pada suhu 50 0 C stabil pada kisaran pH 3,0-4,0 stabil pada suhu 30-50 0 C. Nilai K M isolat 1, 4 dan 9 berturut-turut yaitu 0,022 mg/ml; 0,009 mg/ml; 0,017 mg/ml, sedangkan nilai V maks berturut- turut yaitu 0,041 U/ml; 0,036 U/ml; 0,039 U/ml.
Kata kunci : Pektin, Enzim Pektinase, Klarifikasi Jus

## PENDAHULUAN
Kekeruhan  pada  produk  jus  lemon merupakan  kendala  tersendiri  bagi  produsen jus buah dalam menciptakan jus  yang jernih, selain kekeruhan masalah lain yaitu jus cepat membentuk jelly .  Proses  klarifikasi  pada  jus merupakan salah satu proses untuk mendapatkan  jus  yang  jernih  sehingga  jus yang  dihasilkan  tidak  akan  membentuk  gel. Jeruk lemon ( Citrus limon ) banyak digunakan dalam  pembuatan  jus  atau  sering  juga digunakan  sebagai  penambah  cita  rasa  suatu
masakan, karena rasanya  yang menyegarkan. Kandungan  pektin  yang  tinggi  pada  jeruk lemon menyebabkan jus yang dihasilkan dari jeruk lemon cepat mengalami kekeruhan dan membentuk jelly .
Pektin  adalah  substansi  alami  yang terdapat  pada  sebagian  besar  tanaman pangan.  Disebutkan  dalam  Baker  (1997) bahwa  kadar  pektin  jeruk  lemon  berkisar 2,80-2,99%. Pada industri jus dan konsentrat jus, keberadaan pektin dapat menjadi masalah untuk menghasilkan produksi jus yang jernih. Setiap  produsen  jus  akan  melakukan pengujian  kandungan  pektin,  yang  kemudian
akan  melakukan  depektinasi.  Depektinasi sangat  penting,  terutama  untuk  jus  dalam bentuk  konsentrat  yang  kemudian  akan mengalami proses rekonstitusi untuk diminum.  Jika  tidak  dilakukan  depektinasi, koloid  pektin  dapat  mengendap  pada  produk akhir.  Jus  rekonstitusi  akan  menjadi  keruh dan  berkabut  atau  bahkan  berikatan  dengan partikel  lain  membentuk  partikel  yang  lebih besar, jika pektin tetap berada dalam suspensi (Noer, 2008).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan  oleh  Banik  dan  Ghosh  (2008) menunjukkan  bahwa  pertumbuhan  bakteri
Bacillus sp  dan Streptomyces sp  lebih  tinggi sehingga enzim yang dihasilkan lebih banyak dibandingkan  dengan  jamur Aspergilus sp dan Penicillium sp.  Selain  itu  waktu  yang dibutuhkan  untuk  isolasi  bakteri  pektinolitik lebih  cepat  dibandingkan  dengan  isolasi  dari jamur.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengisolasi  dan  mengkarakterisasi  enzim pektinase dari limbah kulit jeruk; mengetahui karakter  (pH  optimum,  suhu  optimum, kestabilan  pH  dan  suhu,  K M ,  V maks )  enzim pektinase;  mengetahui  pengaruh  enzim pektinase terhadap kekeruhan, viskositas, dan total  padatan  terlarut  dalam  klarifikasi  jus Lemon.

## METODE PENELITIAN
Penelitian Tahap I Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Pektinolitik  (Benson,  2002;  Hadioetomo,
1990)  dan  Penentuan  Isolat  Uji  (Ordonez et  al .,  1998;  Modifikasi  Arthey  and Ashurst, 2001)
Sampel  kulit  jeruk  ditimbang  tepat sebanyak  5  g  kemudian  dihancurkan  dengan mortar steril. Seri pengenceran pada 10 -1 10 -6 dengan  larutan  pengencer  garam  fisiologis (NaCl)  0,85%.  Media  pektin  agar  (Yeast extract 1,0 g; Na 2 HPO 4 0,9 g; KH 2 PO 4 1,0 g; MgSO 4 .7H 2 O 0,5 g; KCl 0,2 g; Pektin Citrus 1,0  g;  Bacteriological  Agar  15  g  dalam  1  L) sebagai  media  selektif  bakteri  pektinolitik. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C dan 50 C selama  24-48  jam.  Morfologi  koloni  bakteri diamati  berdasarkan  bentuk,  tepian,  elevasi, struktur  dalam,  warna  dan  diameter.
Preservasi  isolat  dilakukan  dalam  media pektin agar miring pada suhu 4 C.
Karakterisasi  morfologi  sel  isolat meliputi  pewarnaan  Gram,  pewarnaan endospora  dan  pengukuran  sel.  Uji  biokimia dilakukan  dengan  uji  katalase.  Seleksi  isolat uji  dilakukan  berdasarkan  aktivitas  enzim kasar  (U/ml),  dan  klarifikasi  jus  jeruk (viskositas,  %  T  dan  total  padatan  terlarut (TPT))  dan  depolimerisasi  pektin  cair  1% (viskositas dan % T).

## Penelitian Tahap II
Produksi,  Ekstraksi  dan  Karakterisasi Enzim Pektinase (Fonseca and Said, 1994; Salvador et  al. ,  2002;  Barense dkk ,  2001; Ordonez et al , 1998)
Produksi  enzim  dilakukan  pada  fase logaritmik  masing-masing  isolat  bakteri. Kurva  pertumbuhan  enzim  dihitung  dengan metode turbidimetri yaitu dengan menentukan  nilai  absorbansi  setiap  sampel. Agitasi  dilakukan  sampai  pada  fase logaritmik  sesuai  dengan  kurva  standar  pada kecepatan  144  rpm  sesuai  dengan  suhu masing-masing  isolat.  Aktivitas  enzim dianalisis  dengan  metode  DNS . Kurva pertumbuhan isolat dan kurva aktivitas enzim kemudian  digabungkan  untuk  mengetahui hubungan  antara  jumlah  sel  dengan  aktivitas enzim.
Ekstraksi dilakukan
dengan sentrifugasi  pada  kecepatan  6000  rpm  pada suhu  4 C selama 15  menit  pada kultur isolat pada  fase  logaritmik.  Presipitasi  supernatan menggunakan  fraksinasi  ammonium  sulfat 10%-90%.  Sentrifugasi  dilakukan  pada kecepatan  12.000  rpm  suhu  4 C  selama  10 menit.  Uji  aktivitas  enzim  dilakukan  pada fase supernatan dengan metode DNS.
Fraksi  kejenuhan  dengan  aktivitas enzim  tertinggi  didialisis  dengan  cara memasukkan enzim kedalam kantung membran selofan. Membran selofan direndam  selama  24  jam  dengan  magnetig stirer pada suhu 4 C dalam gelas beaker yang telah  diisi  dengan  buffer  asetat  0,05  M  pH 5,2.
Karakterisasi enzim pektinase (Ordonez et al ., 1998; Barense et al., 2001)
Metode  DNS  yang  digunakan  yaitu enzim sebanyak 0,1 ml dicampur dengan 0,9 ml  media  pereaksi  (campuran  0,7%  pektin citrus  dan  buffer  sodium  asetat  0,025  M  pH 4,8)  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37 C selama  30  menit.  Selanjutnya  sampel ditambahkan  1  ml  larutan  DNS  dan dipanaskan  pada  suhu  90 C  selama  10 menit.setelah  dingin  sampel  ditambahkan dengan  0,5  ml  K-Na-Tartrat  40%  dan dihomogenkan.  Setelah  itu  sampel  ditera absorbansinya  pada  panjang  gelombang  540 nm.  Aktivitas  enzim  ditentukan  dengan mengkonversikan  nilai  absorbansi  asam  D- galakturonat  dengan  persamaan  regresi  linier kurva standar asam D-galakturonat 100 ppm.
1. pH Optimum Enzim
0,1  ml  enzim  dan  ditambahkan  dengan
0,9  ml  media  pereaksi  (0,7%  (w/v)  pektin citrus dan larutan buffer sodium asetat 0,025 M) dengan menggunakan kisaran pH 4,0; 4,5; 5,0;  5,5  dan  6,0.  Selanjutnya  larutan diinkubasi pada suhu 37 C selama 30  menit. Sampel dianalisis dengan metode DNS.
2. Suhu Optimum Enzim
0,1  ml  enzim  dan  ditambahkan  dengan
0,9  ml  media  pereaksi  (0,7%  (w/v)  pektin citrus dan larutan buffer sodium asetat 0,025 M pH 4,8) pada kisaran suhu inkubasi 35; 45; 50;  55  dan  60 o C  selama  30  menit.  Sampel dianalisis dengan metode DNS.
3. [S], nilai K M dan V maks
0,1  ml  enzim  dan  ditambahkan  dengan 0,9  ml  media  pereaksi    (0,7%  (w/v)  pektin citrus,  [S]  sesuai  perlakuan  yaitu  0,05;  0,1; 0,2;  0,4  dan  0,8  mg/ml  dan  larutan  buffer sodium  asetat  0,025  M  pH  4,8).  Larutan diinkubasi pada suhu 37 C selama 30  menit. Sampel dianalisis dengan metode DNS. Nilai  K M dan  V maks ditentukan  dengan  kurva 1/[S]  terhadap  1/aktivitas  enzim  sehingga diperoleh garis linier dengan hubungan 1/v = 1/V maks + K M /V maks . 1/[S] atau   y = a+ bx dengan  Y  =  1/aktivitas  enzim  atau
1/kecepatan enzim (1/v)
X = 1/konsentrasi substrat (1/[S])
Sehingga untuk menentukan V maks dan K M (½ V maks ) adalah a = 1/V maks maka V maks = 1/a b = K M /V maks maka K M = b.V maks
4. 4. Kestabilan Enzim
Enzim  sebanyak  0,1  ml  diinkubasi dalam  0,1  ml  buffer  sodium  asetat  0,025  M pH 3,4,5,6,7,8,9 dan 10 selama 30 menit pada suhu 50 C. Kestabilan suhu enzim dilakukan dengan  enzim  sebanyak  0,1  ml  diinkubasi dalam  0,1  ml  buffer  sodium  asetat  0,025  M pH  7,0  selama  30  menit  pada  suhu 30,40,50,60,70,80,90  dan  100 C.  Aktivitas enzim dianalisis dengan metode DNS.

## Analisis data
Karakter  morfologi  koloni  dan  sel bakteri  dianalisis  secara  kualitatif.  Kurva standar  asam  galakturonat,  kurva  standar isolat,  aktivitas  enzim  pektin  hidrolase ekstraseluler  dan  konstanta  kinetika  enzim K M dan  Vmaks  ditentukan  dengan  regresi linier.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
10  isolat  bakteri  pektinolitik  yang diisolasi  dari  sampel  kulit  jeruk  pontianak dan  campuran  kulit  jeruk  pontianak,  jeruk manis  dan  jeruk  nipis.  6  sampel  didapatkan pada  suhu    37 0 C  dan  4  sampel  pada  suhu 50 0 C inkubasi dilakukan selama 24 jam. Penentuan isolat uji dilakukan dengan dua  tahap.  Tahap  pertama  isolat  uji ditentukan  berdasarkan  uji  aktivitas  enzim kasar  dan  jumlah  sel  bakteri  yang  telah diinkubasi  selama  24  jam.  Aktivitas  enzim mengacu pada kurva standar asam galakturonat.  Seleksi  tahap  kedua  dilakukan berdasarkan  pada  kemampuan  enzim  kasar terhadap klarifikasi jus lemon dan depolimerasi  pektin  cair  1%  maka  diperoleh isolat  1,4  dan  9.  Pemilihan  isolat  untuk klarifikasi  jus  lemon  berdasarkan  pada  nilai viskositas  yang  rendah,  tingkat  kecerahan yang  tinggi  dan  total  padatan  terlarut  yang tinggi.  Isolat  1  dan  4  merupakan  isolat  yang tumbuh  pada  suhu  37 0 C,  sedangkan  isolat  9 merupakan  isolat  bakteri  yang  tumbuh  pada suhu 50 0 C.
Pada fase logaritmik enzim membelah menjadi 2 kali lebih cepat sehingga pada saat fase  logaritmik  aktivitas  enzim  akan meningkat.  Fase  logaritmik  isolat  1  dimulai pada  jam  ke  11  setelah  inokulasi.  Fase logaritmik  Isolat  4  dimulai  pada  jam  ke  10 setelah  inokulasi.  Fase  logaritmik  isolat  9 dimulai pada jam ke 10 setelah inokulasi
Presipitasi isolat 1 dengan menggunakan  fraksi  ammonium  sulfat  80%. Presipitasi  isolat  4  dengan  menggunakan fraksi  ammonium  sulfat  70%.  Presipitasi isolat  9  dengan  menggunakan  fraksi ammonium sulfat 75%.
Konsentrasi  protein  enzim  ditentukan dengan  menggunakan  uji  biuret  dengan menggunakan  kurva  standar  Bovine  Serum Albumin  (BSA).  Konsentrasi  enzim  isolat  1, 4  dan  9  berturut-turut  yaitu  0,23913  mg/ml; 0,108696 mg/ml; 0,086957 mg/ml.
(a) (b)
(c)
Gambar  1.  Hubungan  antara  pH  dengan Aktivitas Enzim Isolat 1 (a), Isolat 4 (b) dan Isolat 9 (c)
Isolat 1, 4 dan 9 optimum pada pH 4,0 pada suhu inkubasi 50 0 C (Gambar 1). Enzim
pektinase  memiliki  kisaran  pH  optimal  3,5- 11(Sieiro et  al., 2012).  Aktivitas  enzim pektinase akan terus menurun seiring dengan semakin  tinggi  pH.  Adanya  perubahan muatan  ion  pada  rantai  samping  residu  asam amino enzim yang terlalu besar menyebabkan menurunnya aktivitas spesifik enzim.
(a) (b)
(c)
Gambar  2.  Hubungan  Antara  Suhu  Dengan Aktivitas Enzim Isolat 1 (a), Isolat 4 (b) dan Isolat 9 (c)
Ketiga  isolat  enzim  optimum  pada suhu  50 0 C  (Gambar  2).  Kisaran  suhu optimum enzim pektinase pada suhu 40-75 0 C (Sieiro et al., 2012). Ini menunjukkan bahwa ketiga  isolat  enzim  mampu  bekerja  optimum pada  suhu  termofilik  yang  dapat  digunakan pada  proses  klarifikasi  jus.  Suhu  yang  tinggi menyebabkan  energi  kinetik  meningkat sehingga  menyebabkan  hilangnya  struktur primer yang berikatan dengan ikatan kovalen sehingga menurunkan aktivitas enzim.
Pada  kisaran  pH  3,0-10  isolat  KJ1, isolat KJ4 dan isolat KJ9 stabil pada pH 3,0-
5,0 dan inaktif pada pH 10. Dengan stabilnya enzim pada kisaran pH 3,0-4,0 menunjukkan bahwa  enzim  dapat  bekerja  pada  klarifikasi jus jeruk  yang memiliki  pH asam  yaitu  pada pH  4,0.  Ketiga isolat  enzim  stabil pada suhu 30-50 0 C  dan  mengalami  penurunan  pada suhu  60 0 C  dan  inaktif  pada  suhu  100 0 C. Enzim  tersebut  juga  dapat  diaplikasikan dalam  klarifikasi  jus  jeruk  skala  industri karena  stabil  pada  suhu  30-50 0 C.  Kestabilan pH  dan  suhu  enzim  dapat  menentukan besarnya  pH  dan  suhu  yang  akan  digunakan dalam  produksi  enzim  dan  dalam  proses klarifikasi jus.
Salah  satu  karakteristik  enzim  yang perlu dipelajari adalah kinetika enzim, berupa parameter  K M dan  V maks .  Salah  satu parameter  kinetika  enzim  yaitu  konstanta Michaelis-Menten, yang lebih dikenal dengan K M . K M merupakan konsentrasi substrat yang separuh dari lokasi aktifnya telah terisi, yaitu bila kecepatan reaksi enzim telah mencapai ½ V maks .  Nilai  K M yang  kecil  menunjukkan bahwa  enzim  memiliki  afinitas  yang  tinggi terhadap  substrat,  dan  nilai  K M yang  besar menunjukkan  kebalikannya.  Harga  V  dari suatu  reaksi  enzimatis  akan  meningkat dengan  bertambahnya  konsentrasi  substrat [S],  akan  tetapi  setelah  [S]  meningkat  lebih lanjut  akan  sampai  pada  kecepatan  yang tetap. Pada konsentrasi enzim tetap (tertentu) harga  V  hampir  linier  dengan  [S].  Pada kondisi dimana V tidak dapat bertambah lagi dengan  bertambahnya  [S]  disebut  kecepatan maksimum  (V maks ).  V maks merupakan  salah satu parameter kinetika enzim (Putra, 2009).
Tabel  1. Nilai  K M (mg/ml)  dan  V maks (U/ml)
Enzim Isolat 1, 4 dan 9 Isolat K M (mg/ml) V maks (U/ml) Isolat 1 0,022 0,041 Isolat 4 0,009 0,036 Isolat 9 0,017 0,039 Berdasarkan  Tabel  1,  Nilai  K M dan V maks isolat  1  masing-masing  yaitu  0,022 mg/ml  dan  0,041  U/ml.  Nilai  K M dan  V maks Isolat  4  masing-masing  yaitu  0,009  mg/ml dan  0,036 U/ml.  Nilai  K M dan  V maks isolat  9 masing-masing  yaitu  0,017  mg/ml dan 0,039
U/ml.  Dari  ketiga  isolat  enzim  dapat diketahui  bahwa  isolat  yang  memiliki  nilai K M dan V maks yang paling kecil adalah isolat 1.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  isolat  1 memiliki  afinitas  terhadap  substrat  yang paling besar dibandingkan dengan dua enzim isolat lainnya.

## KESIMPULAN
1. Bakteri  pektinolitik  diisolasi  dari  limbah kulit  jeruk  Pontianak  dan  limbah  kulit jeruk  campuran  antara  jeruk  nipis  dan jeruk Pontianak.  Inkubasi dilakukan pada suhu  37 0 C  dan  50 0 C.  Pada  suhu  37 0 C diperoleh  6  isolat  yang  tumbuh,  dan  4 isolat yang tumbuh pada suhu 50 0 C.
2. isolat  1,  isolat  4  dan  isolat  9  optimum pada pH 4,0, optimum suhu 50 0 C. Ketiga isolat  stabil  pada  pH  3,0-5,0  dan  pada suhu  30-50 0 C.  Nilai  K m enzim  isolat1, isolat  4  dan  isolat  9  berturut-turut  yaitu 0,022 mg/ml; 0,009 mg/ml; 0,017 mg/ml. Nilai  V maks enzim  isolat  1,  isolat  4  dan isolat  9  berturut-turut  yaitu  0,041  U/ml; 0,036 U/ml; 0,039 U/ml.
3. Ketiga  isolat  enzim  mampu  menurunkan viskositas, meningkatkan nilai tranmitansi atau kecerahan jus lemon dan meningkatkan  nilai  total  padatan  terlarut pada jus lemon dan pektin cair 1%.

## DAFTAR PUSTAKA
Arthey,  D  and  P.R.  Ashurst.  2001. Fruit Processing  Nutritition  Products  and Quality  Management ,  Second  Edition.
AM Aspen Publication. Maryland. p. 86-
148
Baker,R.  A.  1997. Reassessment  of  Some Fruit  and  Vegetable  Pectin  Levels . Journal  Of  Food  Science  Volume  62, No. 2, 1997
Banik,  S  and  S.N.Ghost.  2008. Pectinolytic Activity  of  Microorganisms  in  Piling  of Jute .  Indian  journal  of  Fibre  &  Textile Research Vo.33, June 2008,pp. 151-156.
Barense,  R.I.,  M.A.  Chellegati.,  M.J.V. Fonseca  and  S.  Said.  2001.  Partial Purification  and  Characterization  of Exoplygalacturonase  II  and  III  of
Braz.J.Microbiology . 32 (4) : 5-8
Benson,  H.  J.  2002. Microbiological
Applications  Laboratory  Manual  in General  Microbiology .  Eight  Edition. Mc Graw Hill. Boston.
Fonseca,  M,  J.  V  and  S.  Said.  1994. The Pectinase  Produced  by  Tubercularia vulgaris  in  Submerged  Culture  Using
Pectin  or  Orange  Pulp  Pellets  as
Inducer .  J.  Appl.  Microbiol.  Biotechnol. Brazil.
Hadieotomo, R. S. 1990 . Mikrobiologi Dasar dalam  Praktek  Teknik  Dasar  dan Prosedur  Laboratorium .  PT.  Gramedia. Jakarta.
Noer,  H.  2008. Pectinase:  Small,  but Important. http://foodreview.biz. Diakses pada tanggal 5 Januari 2013 pukul 10.00
WIB.
Ordonez,  R.  G.,  J.  Morlon-Guyot,  S.
Casparian  and  J.  P.  Guyot.  1998. Occurrence  of  a  Thermoacidophilic Cell-bound Exo-Pectinase in Alicyclobacillus  acidocaldarius .  Folia Microbiology. 43 (6). Mexico. Putra, Ganda G.N. 2009. Penentuan Kinetika Enzim Poligalakturonase (PG) Endogenous dari Pulp Biji Kakao . Jurnal Biologi XIII (1) : 21 -24
Salvador,  L.D.,  T.  Singanuma.,  K. Kitahara.,  Y.  Fukusage  and  H.  Tanoue. 2002.  Degradation  of  Cell  Wall Materials  from  Sweet  Potato,  Cassava and Potato by A Bacterial Protopectinase and  Terminal  Sugar  Analysis  of  The Resulting  Solubilized  Products, Journal of Bioscience and Bioengineering . 93 (1) : 64-72
Sierio, C. 2012. Microbial Pectic Enzymes in the  Food  and  Wine  Industry .  Food
Industrial  Processes Methods  and Equipment