## Uji Resistensi Bakteri Endofit Bambu terhadap Logam Merkuri dan Identifikasi Secara Molekuler dengan Analisis Gen 16S rRNA
Resistance Test of Bamboo Endophytic Bacteria to Mercury Metal and Identification of Mercury Resistant Bacteria Using 16S rRNA Gene Analysis
Widiastini Arifuddin  , Maisya Zahra Al Banna Program Studi Pendidikan Biologi STKIP Pembangunan Indonesia Makassar
 Email korespondensi: widiastiniarifuddin88@gmail.com
Abstract. Mercury is one of the heavy metals that are harmful to the environment. The use of bamboo endophyte bacteria  as  mercury  metal  degrading  bacteria  has  not  been  widely  reported  so  it  is  necessary  to  conduct research  to  obtain  mercury  metal  resistant  bamboo  endophyte  bacteria.  This  study  aims  to  determine  the resistance of bamboo endophyte bacteria to mercury metals. Bacterial isolates used are a collection of isolates of Biology Laboratory STKIP Pembangunan Indonesia, were code KL2 A Hitam, KL2 Rehitam, KL2 Blit2, KL2 Rebatik isolates. In the resistance test, 100 µL of HgCl 2 solution was dropped on a paper disk then grown on Nutrient  Agar  as  a  growing  medium  for  bamboo  endophytic  bacteria  for  24  hours  at  37  C.  In  this  test, concentrations of HgCl 2 were used at 10, 20, 30, 40 and 50 ppm, respectively. The results showed that the four bacterial isolates could grow on all media containing HgCl 2 solution as indicated by the formation of a clear zone around the paper disk. Based on clear zone measurements, KL2 Re Batik isolates form a 13 mm clear zone when  grown  on  a  medium  containing  10  ppm  HgCl 2 ,  which  is  the  largest  clear  zone  measured  in  this  study. While the other three isolates, KL2 A Hitam, KL2 Rehitam and   KL2 Blit2 form a 10.66 mm and 7.6 mm clear zone respectively on media containing 10 ppm HgCl 2 . All isolates show a decrease in the size of the clear zone as the concentration of HgCl 2 increased. This shows that bamboo endophytic bacteria are resistant to Hg 2+ ions up  to  a  concentration  of  50  ppm.  The  KL2  Rehitam  isolate  was  chosen  for  identification  using  the  16S  rRNA gene  amplication,  where  the  results  showed  that  the  KL2  Re  Hitam  isolate  had  a  99%  species  similarity  to Bacillus cereus.
Keywords : bamboo, endophytic bacteria, mercury, resistance
Abstrak. Merkuri  merupakan  salah  satu  logam  berat  yang  berbahaya  bagi  lingkungan.  Pemanfaatan  bakteri endofit bambu sebagai bakteri pendegradasi logam merkuri belum banyak dilaporkan sehingga perlu dilakukan penelitian untuk memperoleh isolat bakteri endofit bambu resisten logam merkuri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  resistensi  isolat  bakteri  endofit  bambu  terhadap  logam  merkuri.  Isolat  bakteri  yang  digunakan merupakan  koleksi  isolat  Laboratorium  Biologi  STKIP  Pembangunan  Indonesia,  yang  diberi  kode  KL2  A Hitam, KL2  Rehitam, KL2 Blit2, KL2 Rebatik.  Pada uji resistensi,  sebanyak 100 µL  larutan HgCl 2 diteteskan pada paper  disk yang  ditumbuhkan  pada  media  Nutrient  Agar  sebagai  media  tumbuh  bakteri  endofit  bambu selama  24  jam  pada  suhu  37  C.  Konsentrasi  HgCl 2 yang  digunakan  adalah  10,  20,  30, 40  dan  50  ppm.  Hasil menunjukkan  keempat  isolat  bakteri  dapat  tumbuh  pada  seluruh  media  yang  mengandung  larutan  HgCl 2, yang ditandai  dengan  terbentuknya  zona  bening  di  sekitar paper  disk .  Berdasarkan  pengukuran  zona  bening,  isolat KL2 Rebatik membentuk zona bening sebesar 13 mm pada media mengandung 10 ppm HgCl 2 dan merupakan zona  bening  terbesar.  Tiga  isolat  lainnya,  isolat  KL2  A  Hitam,  KL2  Rehitam  dan  KL2  Blit2  pada  media mengandung  10  ppm  HgCl 2 membentuk  zona  bening  masing-masing  10,66  mm  dan  7,6  mm.  Seluruh  isolat bakteri  menunjukkan  penurunan  ukuran  zona  bening  seiring  dengan  meningkatnya  konsentrasi  HgCl 2 yang digunakan. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri endofit bambu resisten terhadap ion Hg 2+ hingga konsentrasi 50 ppm. Isolat KL2 Rehitam dipilih untuk diindentifikasi menggunakan amplikasi gen 16S rRNA. Hasil identifikasi menunjukkan isolat KL2 Rehitam memiliki tingkat kemiripan sebesar 99% dengan Bacillus cereus . Kata kunci: bakteri endofit, bambu, merkuri, resisten

## PENDAHULUAN
Logam  berat  digolongkan  menjadi logam esensial dan non esensial berdasarkan karakter strukturnya. Logam esensial seperti tembaga (Cu), seng (Zn), mangan (Mn) dan Kobalt (Co), sedangkan  logam  non esensial terdiri  atas  plumbum  (Pb),  merkuri  (Hg), kromium  (Cr)  dan  cadmium  (Cd).  Logan
non  esensial  secara  signifikan  dapat membahayakan  kesehatan  makhluk  hidup karena  dapat  terakumulasi  pada  beberapa bagian  tumbuhan  dan  tanaman  pertanian. Konsumsi  tanaman  yang  telah  terpapar logam berat akan menyebabkan penumpukan  logam  di  dalam  organ  tubuh
yang  dapat  membahayakan  kesehatan, terutama bagi anak-anak (Qing et al ., 2005).
Merkuri  merupakan  jenis  logam  berat beracun  yang  dihasilkan  selama  kegiatan penambangan  maupun  industri  seperti industri  klor  alkali,  industri  pulp  kertas, industri  amalgamasi,  fungisida,  industri  cat (Li et  al .,  2009),  pengolahan  emas  secara tradisional  (Sugianti et  al .,  2014),  peralatan listrik,  dan  pertanian.  Keberadaan  merkuri pada  lingkungan  tanah  memiliki  retensi waktu yang panjang sehingga dapat menimbulkan dampak negatif bagi lingkungan  sekitar.  Bahaya  lain  yang  juga ditimbulkan  oleh  merkuri  yaitu  dapat menyebabkan  gangguan  pada  sistem  saraf, otak  (Azevedo et  al .,  2012),  merusak  hati, ginjal (Sommar et al ., 2013), paru-paru, dan sistem imun. Remediasi lingkungan tercemar  merkuri  merupakan  langkah  yang amat  penting  dilakukan,  karena  merkuri tidak  dapat  terdegradasi  di  alam.  Beberapa langkah  penanggulangan  lahan  tercemar merkuri  dapat  ditempuh  melalui  metode eskavasi,  pembuangan,  elektro-remediasi, pencucian  tanah,  dan  desorpsi  termal, namun metode tersebut membutuhkan biaya pengoperasian  yang  tinggi  (Irawati et  al ., 2012;  Kurniati,  2014).  Beberapa  jenis bakteri  diketahui  sebagai  agen bioremediasi cemaran  merkuri  pada  lingkungan  tanah maupun  perairan.  Pemanfaatan  bakteri dalam  rehabilitasi  lahan  dinilai  sebagai langkah  yang  amat  menjanjikan  karena biaya penanganan  yang relatif lebih rendah, proses  degradasi  merkuri  lebih  efisien,  dan mampu memperbaiki ekosistem yang tercemar  dengan  mengubah  ion  Hg  ke dalam  bentuk  senyawa  yang  tidak  beracun (Kapoor  dan  Kapagunta,  2017).  Namun, dalam  pemanfaatannya  diperlukan  jenis bakteri  yang  resisten  terhadap  logam merkuri.  Bakteri  yang  resisten  terhadap suatu logam berat disebabkan karena proses biosorpsi yang menyerap logam secara pasif sehingga  logam  tidak  merusak  struktur  sel bakteri  dan  proses  bioakumulasi  yang merupakan  proses  secara  aktif  sehingga dapat merusak struktur sel bakteri (Chojnacka, 2010).
Dalam  penelitian  ini  digunakan  isolat bakteri  endofit  dari  akar  beberapa  jenis bambu  asal  Tana  Toraja.  Bakteri  endofit merupakan  bakteri  yang  hidup  di  dalam jaringan tanaman inang tanpa menyebabkan gejala-gejala  penyakit  ( Bhore  dan  Sathisha, 2010 ). Bakteri endofit terdapat hampir pada 300.000  jenis  tumbuhan  di  bumi.  Bakteri endofit  dapat  diperoleh  dengan  cara diisolasi  dari  tanaman  yang  permukaannya telah  disterilkan  ataupun  dapat  diekstrak untuk  memperoleh  bakteri  yang  terdapat pada  jaringan  tanaman  (Ryan et  al .,  2008). Keberadaan  bakteri  endofit  di  dalam jaringan  tanaman  juga  diketahui  dapat memicu pertumbuhan tanaman dan berperan sebagai  agen  pengendali  hayati.  Selain  itu, bakteri endofit mempunyai banyak keuntungan dalam berbagai aspek kehidupan (de Sousa et  a l.,  2017) , senyawa yang  dihasilkan  bakteri  endofit  tertentu berpotensi  dikembangkan  dalam  bidang medis  dalam  bentuk  sediaan  obat-obatan, pertanian  dan  remediasi  lahan  tercemar ( Pulungan,  2015) dan  industri.  Tanaman bambu bagi masyarakat Tana Toraja banyak dimanfaatkan sebagai pengganti kayu untuk konstruksi  bangunan,  kerajinan  tangan,  alat musik,  serta  peralatan  dapur.  Bambu tergolong  pula  sebagai  tanaman  konservasi karena  mampu  menahan  air  lebih  baik dibandingkan  tanaman  lainnya,  meskipun pengetahuan  masyarakat  akan  hal  ini  masih minim.  Negara  Cina  sebagai  penghasil bambu  banyak  memanfaatkan  tanaman  ini dalam  fitoremediasi  logam  berat.  Proses rizofiltrasi  yang  terjadi  pada  akar  bambu dapat  menyerap  kontaminasi  logam  yang berada  di  sekitarnya.  Akar  pada  tanaman bambu  dapat  melepaskan  eksudat  berupa protein pengikat logam berat dan menyimpannya  dalam  struktur  vakuola  sel akar.  Melalui  mekanisme  ini  distribusi molekul  logam  berat  di  dalam  sel  dapat dicegah  (Rascio et  al .,  2011).  Pemanfaatan bakteri endofit akar bambu dalam remediasi merkuri di kawasan Sulawesi belum banyak dilaporkan, sehingga perlu dilakukan penelitian  dasar  yang  bertujuan  untuk memperoleh  isolat  bakteri  endofit  bambu
yang  resisten  terhadap  logam  merkuri  agar pemanfaatannya  sebagai  agen  bioremediasi lebih optimal.

## METODE

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan terdiri dari neraca analitik,  pH  meter,  pipet  mikro, incubator shaker (MAXQ 4000), inkubator (Heraeus), oven (Memmet), autoklaf, sentrifugal,  lemari  pendingin, water  bath , alat Polymerase Chain Reaction (PCR)
Thermal
Cycler , seperangkat alat elektroforesis,  dan  seperangkat  alat-alat gelas  sedangkan  bahan  yang  digunakan terdiri  dari  medium  padat  Nutrient  Agar (NA),  HgCl 2 ,  larutan  buffer  PCR,  buffer lysis, primer B27F, primer U1492R, ddH 2 O, aquades, aquabides, paper disk .

## Determinasi  Resistensi  Bakteri  Endofit Terhadap Merkuri
Isolat  bakteri  endofit  yang  digunakan sebanyak 4 isolat  yang diisolasi  dari bagian rebung  dan  akar  tiga  jenis  bambu  berbeda yakni  jenis  bambu  hitam,  bambu  blit,  dan bambu  batik  asal  Tanah  Toraja  yang merupakan koleksi isolat bakteri Laboratorium Biologi STKIP Pembangunan Indonesia.  Empat  isolat  bakteri  yang digunakan  diberi  kode  KL2  A  Hitam,  KL2 Rehitam, KL2 Blit2, KL2 Rebatik. Keempat isolat  tersebut  ditumbuhkan  pada  medium padat  NA. HgCl 2 yang digunakan sebanyak 100  µL  untuk  masing-masing  konsentrasi 10  ppm,  20  ppm,  30  ppm,  40  ppm,  dan  50 ppm.  Masing-masing  konsentrasi  HgCl 2 tersebut  diteteskan  pada paper  disk dan dikeringkan  selama  10  menit  pada  suhu ruang. Isolat bakteri yang telah ditumbuhkan  pada  medium  Nutrient  Broth diinokulasikan kembali ke media NA secara merata,  selanjutnya paper  disk yang  telah ditetesi  HgCl 2 dimasukkan  secara  aseptik pada  media  NA.  Kemampuan  isolat  bakteri diamati  berdasarkan  pengamatan  zona bening  yang  terbentuk  di  sekitar  koloni bakteri. Jika terbentuk zona bening menunjukkan  bahwa  bakteri  endofit  bambu mampu  mendegradasi  kandungan  merkuri
yang  ada  pada paper  disk yang  diletakkan pada media.
Identifikasi  Molekular  Isolat  Bakteri Endofit
Pada  tahap  ini  dilakukan  isolasi  dan pemurnian
DNA bakteri endofit menggunakan DNA easy mini kit kemudian diamplifikasi  gen  16S  rRNA  menggunakan pasangan  primer  27F  (5’AGA  GTT  TGA TCC  TGG  CTC  AG  3’)  dan  primer  1492R (5’GGT  TAC  CTT  GTT  ACG  ACT  T  3’). Identifikasi  dilakukan  dengan  metode  PCR kemudian hasilnya dianalisis melalui sekuensing  DNA.  Data  sekuens  dianalisis menggunakan  BLAST  dan  dilanjutkan dengan rekonstruksi pohon filogeni menggunakan aplikasi Mega 7.
Tahapan-tahapan pada proses identifikasi  molekular  merupakan  hasil rujukan  dari  Jang-Jih  Lu et  al .,    (2000). Pada  tahapan  isolasi  dan  pemurnian  DNA isolat  bakteri  endofit  digunakan  10  mL kultur  bakteri  kemudian  ditambahkan  1  mL buffer  lysis  yang  mengandung  1  %  Triton X-100,  10  mM  Tris  (pH  8,0),  dan  1  mM EDTA  kemudian  disentrifugasi  dengan kecepatan  13.000  rpm  selama  5  menit. Setiap  pelet  yang  terbentuk  disuspensikan dengan  100  µL  buffer  lysis  dan  dipanaskan pada waterbath selama  30  menit  untuk melepaskan DNA. Puing-puing sel dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan  13.000  rpm  selama  5  menit kemudian supernatan disimpan untuk proses PCR.  Untuk  proses  pemurnian  DNA digunakan QIAamp Tissue Kit .
Pada proses amplifikasi gen 16S rRNA isolat  bakteri  endofit  dilakukan  dengan menggunakan  larutan  buffer  PCR  (10  mM Tris-HCl,  pH  8,3;  50  mM  KCl;  2,5  mM MgCl 2 ;  0,001  %  gelatin),  0,2  µM  primer B27F  (5’AGA  GTT  TGA  TCC  TGG  CTC AG 3’) dan 0,2 µM primer U1492R (5’GGT TAC  CTT  GTT  ACG  ACT  T  3’),  0,2  mM DNA  cetakan,  dan  2,5  U Tag DNA polymerase,  dan  5  µL  ddH 2 O.  Proses amplifikasi diawali dengan kondisi denaturasi pada suhu 94  C selama 10 menit kemudian dilakukan pada kondisi denaturasi
suhu  94  C  selama  1  menit, annealing selama  1  menit  pada  suhu  55  C,  dan extention selama  2  menit  pada  suhu  72  C dengan  jumlah  siklus  35  kali  selanjutnya diinkubasi  selama  10  menit  pada  suhu  72  C.  5  µL  produk  PCR  dielektroforesis menggunakan  1%  gel  agarosa  untuk mengetahui ukuran pasang basanya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Data  Pengujian  Daya  Hambat  Bakteri Endofit Bambu
Berdasarkan  hasil  pengamatan  uji  daya hambat  isolat  bakteri  endofit  pada  hari pertama  setelah  ditumbuhkan  pada  media NA  yang  ditambahkan  dengan  HgCl 2 dan
diinkubasi  selama  1  x  24  jam  menunjukan adanya  zona  bening  di  sekitar paper  disk dengan ukuran penghambatan yang berbeda-beda.  Penggunaan  senyawa  HgCl 2 dalam  penelitian  ini  dikarenakan  ion  Hg 2+ dianggap  sebagai  agen  yang  sangat  toksik. Adanya  zona  bening  yang  terbentuk  di sekitar paper  disk menunjukkan  bahwa isolat  bakteri  endofit  dapat  tumbuh  dan mampu  mendegradasi  kandungan  merkuri atau  resisten  terhadap  merkuri.  Keempat isolat  bakteri  mampu  tumbuh  pada  medium yang  mengandung  HgCl 2 pada  konsentrasi 10-50  ppm.  Hasil  uji  daya  hambat  yang diperoleh  dapat  dilihat  pada  Gambar  1.
Gambar 1 . Zona bening yang terbentuk di sekitar paper disk Pada  hasil  yang  diperoleh  pada  Gambar  1 dapat  dilihat  bahwa  bakteri  endofit  dapat tumbuh  pada  media  yang  mengandung HgCl 2 sehingga  dapat  dikatakan  bahwa bakteri  endofit  resisten  terhadap  logam
merkuri.  Selanjutnya  dilakukan  pengukuran zona bening yang terbentuk di sekitar paper disk sehingga  diperoleh  data  yang  dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil pengukuran zona bening bakteri endofit terhadap logam merkuri
Konsentrasi HgCl 2 (ppm) Hasil  Pengukuran Zona Bening (mm) Isolat  KL2 A Hitam Isolat KL2 Rehitam Isolat KL2 Blit2 Isolat KL2 Rebatik 10 10,6 10,6 7,6 13 20 6,5 2 4,5 6 30 2 2 2 2 40 2,03 2 2 2,06 50 2 3,1 2 2
.
Pada  pengukuran  zona  bening  isolat KL2  A  Hitam  diperoleh  rata-rata  tertinggi 10,6  mm  pada  variasi  konsentrasi  HgCl 2 10 ppm  sedangkan  yang  terendah  pada  variasi konsentrasi  HgCl 2 30  ppm  dan  50  ppm.
Pada pengujian isolat KL2 Rehitam diperoleh  rata-rata  tertinggi  10,6  mm  pada variasi konsentrasi HgCl 2 10 ppm sedangkan yang  terendah  pada  variasi  konsentrasi HgCl 2 20,  30  ppm  dan  40  ppm.  Pada
pengukuran  zona  bening    isolat  KL2  Blit2 diperoleh  rata-rata  tertinggi  7,6  mm  pada variasi konsentrasi HgCl 2 10 ppm sedangkan yang  terendah  pada  variasi  konsentrasi HgCl 2 30,  40  ppm  dan  50  ppm.  Sedangkan pada pengujian isolat KL2 Rebatik diperoleh  rata-rata  tertinggi  13  mm  pada variasi konsentrasi HgCl 2 10 ppm sedangkan yang  terendah  pada  variasi  konsentrasi HgCl 2 30 ppm dan 50 ppm.
Data pada Tabel 1 menunjukkan bahwa kemampuan  bakteri  endofit  mendegradasi kandungan merkuri optimum pada konsentrasi  HgCl 2 10  ppm  sehingga peningkatan  konsentrasi  HgCl 2 tidak  lagi menunjukkan secara signifikan penambahan zona  bening.  Hal  ini  sesuai  dengan  kerja enzim  yang  memiliki  batas  optimum  dalam mendegradasi substrat yang pada kondisi ini menurut  Essa et  al .,  (2002) mekanisme bakteri  dapat  tumbuh  pada  media  yang mengandung  merkuri  atau  bersifat  resisten terhadap merkuri karena adanya enzim yang mereduksi  ion  Hg 2+ menjadi  ion  Hg 0 yakni flavoenzim  merkuri  reduktase  yang  dikode oleh  gen  merkuri  reduktase  ( mer A)  terletak pada  sitoplasma.  Adapun  mekanismenya yaitu  ion  Hg 2+ masuk  ke  dalam  periplasma terikat  pada residu  sistein  pentranspor merkuri  ( mer P)  kemudian  ditransfer  ke residu sistein mer T, mer C, dan mer F masuk ke  dalam  sel.  Di  dalam  sel  tepatnya  di sitoplasma,  ion  Hg 2+ terikat  pada  sisi  aktif enzim  merkuri  reduktase  ( mer A)  yang berupa NADPH sehingga ion Hg 2+ tereduksi menjadi  ion  Hg 0 .  Ion  Hg 0 yang  terbentuk sangat volatil yang kemudian keluar dari sel secara  difusi  lewat  membran  sel.  (Iohara et
al .,  2001;  Sasaki et  al .,  2006;  Dash  &  Das, 2012).
Isolat bakteri endofit bambu menunjukkan tingkat resistensi yang berbeda-beda  jika  dilihat  dari  ukuran  zona bening.  Perbedaan  ini  disebabkan  karena susunan  dan  tingkat  ekspresi  gen mer operon  yang  berbeda-beda  setiap  isolat. Menurut Ranjard et al ., (1997) dan Narita et al .,  (2003),  komponen  gen mer operon setiap spesies tidak sama, terdapat perbedaan  variasi  komposisi  dan  tingkat ekspresi gen-gen penyusunnya.
Hasil Identifikasi Molekuler Isolat Bakteri Endofit Data  identifikasi  yang  diperoleh  hanya isolat dengan kode KL2 Rehitam. Identifikasi  bakteri  endofit  menggunakan metode  PCR  untuk  mengamplifikasi  gen 16S  rRNA.  Penggunaan  gen  16S  rRNA yakni  salah  satu  jenis  gen  yang  telah dikarakterisasi  dengan  baik  dinilai  lebih akurat  dan  membutuhkan  waktu  yang singkat dalam mengidentifikasi suatu mikroorganisme. Hasil amplifikasi selanjutnya disekuensing sehingga diperoleh data  urutan  nukleotida  yang  dapat  dilihat pada Gambar 3.
Hasil  sekuensing  isolat KL2  Rehitam dilacak homolognya dengan mem bandingkan  dengan  data  sekuens  yang ada pada database GenBank melalui aplikasi BLAST secara online pada situs http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi .  Hasil BLAST  yang  diperoleh  dapat  dilihat  pada Tabel 2.
Tabel 2 . Hasil BLAST bakteri endofit isolat KL2 Rehitam Isolat Bakteri GenBank Homologi (%) Jenis Spesies No. Asesi Asal Isolat KL2 Rehitam CP016595.1 Makanan fermentasi Korea, Korea 99 Bacillus cereus strain K8
1       GAAGTAAAAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723076  GAATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACC 723135
61      TGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAAC 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723136  TGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAAC 723195
121     CGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCA 180
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723196  CGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCA 723255
181     TTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGG 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723256  TTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGG 723315
241     TGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723316  TGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA 723375
301     ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCG 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723376  ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCG 723435
361     GGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGA 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723436  GGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGA 723495
421     CGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723496  CGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT  723555
481     GGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723556  GGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGA 723615
541     TGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723616  TGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGA 723675
601     AGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAG 660
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723676  AGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAG 723735
661     TGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAA 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723736  TGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAA 723795
721     CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTT 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723796  CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTT 723855
781     TCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAA 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723856  TCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAA 723915
841     GGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723916  GGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT 723975
901     CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGG 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 723976  CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGG 724035 961     CTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAG 1020 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 724036  CTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAG 724095
1021    ATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTG 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 724096  ATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTG 724155 1081    GGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAT 1140 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
724156  GGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAT 724215
1141    CATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC-CACGTGCTACAATGGACGGTACAA  1188
|||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||
724216  CATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAA  724264
Gambar 2 . Urutan nukleotida hasil sekuensing gen 16S rRNA isolat KL2 Rehitam
Berdasarkan  hasil  BLAST  pada  Tabel  2 diperoleh  bahwa  bakteri  endofit  isolat  KL2 Rehitam  memiliki  kesamaan  dengan  jenis bakteri    yang  terdapat  pada  database GenBank yaitu  bakteri Bacillus  cereus dengan  tingkat  homologi  99% . Hal  ini menunjukkan  bahwa  isolat  KL2  Rehitam
memiliki  tingkat  kesamaan  spesies  99% dengan Bacillus  cereus berdasarkan  urutan nukleotidanya. Selanjutnya dilakukan rekonstruksi  pohon  filogenik  menggunakan aplikasi  Mega 7  yang hasilnya dapat  dilihat pada Gambar 4.

## Gambar3. Pohon filogenik isolat KL2 Rehitam
Pada  desain  pohon  filogenik  Gambar  3 menunjukkan  bahwa  di  semua  cabang terdapat  jenis  bakteri  yang  merupakan keluarga Bacillus .  Pada  Gambar  3  juga menunjukkan  bahwa  bakteri  endofit  isolat KL2  Rehitam  memiliki  hubungan  terdekat dengan bakteri Bacillus  sp strain PJA1.5.

## SIMPULAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa keempat isolat bakteri endofit yang digunakan resisten terhadap terhadap merkuri sehingga selanjutnya dapat digunakan  sebagai  agen  bioremediasi  pada lingkungan  yang  tercemar  limbah  merkuri. Untuk  isolat  KL2  Rebatik  menunjukkan rata-  rata  zona  bening  yang  tertinggi  yaitu 13 mm pada konsentrasi 10 ppm. Pada hasil identifikasi  yang  diamplifikasi  dengan  gen 16S rRNA kemudian dianalisis menggunakan  BLAST,  bakteri  endofit
resisten  merkuri  isolat  KL2  Rehitam merupakan  bakteri  yang  memiliki  tingkat kesamaan  spesies  99%  dengan Bacillus cereus berdasarkan urutan nukleotidanya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  Direktorat  Riset  dan  Pengabdian Masyarakat  (DRPM),  Direktorat  Jenderal Penguatan  Riset  dan  Pengembangan  yang telah  memberikan  dana  hibah  penelitian hingga penelitian ini dapat terlaksana.

## DAFTAR PUSTAKA
Azevedo, B.F., Furieri, L.B., Pecanha, F.M.,
Wiggers,  G.A.,  Vassallo,  P.F.,  Simoes, M.R.  (2012).  Toxic  effects  of  mercury on  the  cardiovascular  and  central nervous systems. J. Biomed. Biotechnol . doi:10.1155/2012/949048.
Bhore SJ, and Sathisha G. (2010). Screening of  endophytic  colonizing  bacteria  for cytokinin  like  compounds:  crude  cell- free  broth  of  endophytic  colonizing bacteria  is  unsuitable  in  cucumber cotyledon bioassay. World J. Agric. Sci , 6(4):345-52.
Chojnacka,  K.  (2010).  Biosorption  and Bioaccumulation  The  Prospect  for Practical  Applications. Environmental International 36: 299-307
Dash, H.R., and Das, S. (2012). Bioremediation  of  Mercury  and  The
Importance  of  Bacterial  mer  Genes.
Inter. Biodeterioration and Biodegradation 75: 207-21. doi:10.1016/j.ibiod.2012.07.023.de Sousa,  C.P.,  Serrano,  N.F.G.  and
Lacava, P.T. (2017). Endophytic Microorganisms of the Tropical Savannah:  A  Promising  Source  of Bioactive  Molecules.  In  Diversity  and Benefits  of  Microorganisms  from  the Tropics. Springer, Cham. pp. 57-70.
Essa,  A M  M., Macaskie,  L E ., Brown, N  L .
Mechanisms  of  mercury  bioremediation. Biochemical  Society  Transactions .  2002. 30: 672-674
Iohara ,  K.,  Liyama,  R.,  Nakamura,  K.
(2001).  The  mer  operon  of  a  mercury resistant Pseudoalteromonas haloplanktis strain isolated from Minamata  Bay,  Japan. Appl  Microbiol
Biotechnol 56, 736-741. doi:10.1007/s002530100734. Irawati,W, Patricia, Y., Soraya, AH Baskoro.  (2012).  A  study  on  mercury- resistant  bacteria  isolated  from  a  gold mine  in  Pongkor  Village,  Bogor, Indonesia. Hayati 19(4): 197-200.
Jang-Jih  Lu,  Cherng-Lih  Perng,  Shih-Yi Lee,  and  Chih-Chieng  Wan.  (2000). J. of  Clin  Microbiol .  38(6):  2076-2080. Kapoor,  Y  and  Kapagunta,  C.  2017. Mercury  Bioremediation  Processes  to Combat Mercury Contamination.
Project Guru. https://www.projectguru.in/publications
/ mercury-bioremediation-processes.
Kurniati,  E.  2014.  Bioremediation  of mercury contaminated soil using Aspergillus flavus strain KRP1 [Disertasi]. Jepang: Yamaguchi University.
Li P., Feng X. B., Qiu G. L., Shang L. H., Li Z.  G.  (2009).  Mercury  pollution  in Asia:  a  review  of  the  contaminated sites. Journal  of  Hazardous  Materials . 168(2-3):591–601. doi:10.1016/j.jhazmat.2009.03.031.
Narita,  M.,  Chiba,  K.,  Nishizawa,  H.,  Ishii,
H.,  Huang,  C.C.,  Kawabata,  Z.,  Silver, S.,  and  Endo,  G.  (2003).  Diversity  of Mercury Resistance Determinants
Among  Bacillus  Strains  Isolated  From Sediment  of  Minamata  Bay. FEMS Microbiology  Letters 223  (1):  73-82. doi:10.1016/S0378-1097(03)00325-2
Pulungan,  A.S.S.  (2015).  Pemanfaatan Mikroorganisme  dalam  Bioremediasi Senyawa  Pencemar. Jurnal  Biosains, 1(1), pp.75-84.
Qing,  X.,  Yuting,  Z.,  Shenggao,  L.  (2015). Assessment  of  heavy  metal  pollution and human health risk in urban soils of steel industrial city (Anshan), Liaoning, Northeast  China. Ecotoxic  Environ Safety ,120: 377-385.
Ranjard, L., Richaume, A., Jocteur- Monrozier,  L.,  and  Nazaret,  S.  (1997). Response  of  Soil  Bacteria  to  Hg(II)  in Relation  to  Soil  Characteristics  and Cell  Location. FEMS  Microbiology
Ecology 24 (4): 321-331.
doi:10.1111/j.1574-
6941.1997.tb00449.x
Rascio  N,  Navari-Izzo  F.  (2011).  Heavy metal  hyperaccumulating  plants:  how and  why  do  they  do  it?  And  what makes  them  so  interesting? Plant  Scie 180: 169-181.
Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ, Dowling  DN.  (2008).  Minireview: Bacterial Endophytes: Recent Development  And  Application. FEMS Microbiol Lett 278: 1-9.
.
Sasaki, Y., Hayakawa, T., Inoue, C. (2006). Generation of Mercury-
Hyperaccumulating Plants through Transgenic  Expression  of  the  Bacterial
Mercury  Membrane  Transport  Protein
MerC. Transgenic  Res 15,  615.
doi:10.1007/s11248-006-9008-4. Sommar, J.N., Svensson, M.K., Bjor, B.M., Elmstahl, S.I., Hallmans, G., Lundh, T., et  al.  (2013).  End-stage  renal  disease and  low  level  exposure  to  lead, cadmium  and  mercury;  a  population- based,  prospective  nested  case-referent study  in  Sweden. Environ.  Health . doi:10.1186/1476-069X-12-9. Sugianti,  T.,  Sudjudi,  dan  Syahri.  2014. Penyebaran  Cemaran  Merkuri  pada Tanah  Sawah  Dampak  Pengolahan Emas  Tradisional  di  Pulau  Lombok
NTB. Prosiding  Seminar  Nasional Lahan  Suboptimal .  Palembang  26-27
September 2014 ISBN : 979-587-529-9 226.