## UNPAD

## Production of Anti-Recombinant Human Insulin Antibody and Validation by Indirect ELISA
Christy Ambarsari 1 , Herman Suryadi 2 *, Arry Yanuar 3
1Department of Pharmaceutical, Medicinal Chemistry, and Bioanalysis, Faculty of Pharmacy, Universitas Indonesia 2Department of Microbiology and Pharmaceutical Biotechnology, Faculty of Pharmacy, Universitas Indonesia 3Department of Biomedical Computation and Drug Design Laboratory, Faculty of Pharmacy, Universitas Indonesia Submitted 11 July 2022; Revised 31 October 2022; Accepted 31 October 2022; Published  30 October 2023 *Corresponding author: hsuryadi@farmasi.ui.ac.id

## Abstract
Human insulin potential has become an interest and is important in maintaining the success of therapy in patients with the availability of chemical-based analytical methods, however, only a few have been using immunoassays. This study aimed to produce IgG polyclonal antibodies from rabbits immunized with 1 mg/mL rhINS subcutaneously and validated by indirect ELISA. Antibody was precipitated and fractioned on a HiTrap® Protein A HP column before being quantified with a UV spectrophotometer at λ 280 nm. The characterization was conducted by Dot Blot test on a BCIP-NBT substrate, as well as SDS-PAGE and Western Blot with polyacrylamide gel concentrations of 7.5% and 17.5%. Validation was performed using solutions containing glycerol and m-cresol as matrices spiked with rhINS. The linearity test in the rhINS concentration range of 80.11-200.28 µg/mL (r = 0.99) showed the linear result. The accuracy and precision obtained an average of 99.11%±5.01 and 3.91%, while the LOD and LOQ were 22.05 µg/mL and 73.51 µg/mL, respectively. Human insulin was stable at 2-8ᵒC for 24 hours (α: 0.05, ANOVA). In conclusion, in-house produced IgG polyclonal antibodies and goat anti- IgG peroxidase conjugate can be used for routine testing of human insulin. Keywords: Indirect ELISA, glycerol and m-cresol, method validation, rabbit IgG polyclonal antibody, recombinant human insulin.
Pembuatan Antibodi Anti-Insulin Human Rekombinan dan Validasi secara ELISA Indirect
Abstrak Potensi insulin human telah menjadi minat dan penting dalam menjaga keberhasilan terapi pada pasien, yaitu dengan tersedianya metode analisis berbasis kimia, namun sedikit dengan immunoassay . Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi antibodi poliklonal IgG dari kelinci yang diimunisasi dengan 1 mg/ mL rhINS secara subkutan dan dilakukan validasi secara ELISA indirect . Antibodi dimurnikan dan fraksinasi dengan kolom HiTrap® Protein A HP, serta dikuantifikasi dengan spektrofotometer UV λ 280 nm. Karakterisasi dilakukan dengan uji Dot Blot menggunakan substrat BCIP-NBT, serta SDS- PAGE dan Western Blot dengan konsentrasi gel poliakrilamid 7,5% dan 17,5%. Validasi dilakukan menggunakan larutan uji yang mengandung gliserol dan m-kresol sebagai matriks yang di- spike dengan rhINS. Uji linearitas pada rentang konsentrasi rhINS 80,11-200,28 µg/mL (r = 0,99) menunjukkan hasil linear. Hasil akurasi dan presisi masing-masing diperoleh rerata 99,11% ±5,01 dan 3,91%, sedangkan LOD dan LOQ masing-masing 22,05 µg/mL dan 73,51 µg/mL. Insulin human menunjukkan stabil pada suhu 2-8ᵒC selama 24 jam (ANOVA, α: 0,05). Kesimpulan, penggunaan antibodi poliklonal IgG yang diproduksi secara in-house dengan anti-IgG konjugat peroksidase dari kambing dapat digunakan untuk pengujian rutin insulin human.
Kata Kunci: ELISA indirect, gliserol dan m-kresol, validasi metode, antibodi poliklonal IgG kelinci, insulin human rekombinan.

## 1.  Pendahuluan
Pada  tahun  2020,  lebih  dari  420  juta orang  di  seluruh  dunia  menderita  Diabetes Melitus  (DM),  yang  mayoritas  tinggal  di negara berpenghasilan menengah dan rendah. Jumlah  ini  diperkirakan  akan  meningkat menjadi  570  juta  pada  tahun  2030  dan menjadi 700 juta pada tahun 20451. Sampai saat ini, terapi insulin tetap menjadi landasan manajemen  DM 2,3 dimana  insulin  eksogen digunakan untuk mengontrol kadar glukosa4. Selain  proses  produksi,  pengangkutan dan  penyimpanan  yang  tidak  tepat  dapat mengganggu  potensi  atau  kualitas  obat biologi 1,5 .  Karena  banyaknya  produk  jenis ini  di  pasaran,  maka  diperlukan  metode analisis  yang  spesifik,  efisien,  dan  cepat untuk  menentukan  potensinya.  Metode  ini digunakan  untuk  memastikan  ketersediaan obat tersebut dengan kualitas, keamanan, dan kemanjuran yang dibutuhkan. Hal ini sejalan dengan salah satu tujuan global World Health Organization (WHO)  yang  disampaikan dalam WHO Stakeholder Workshop pada 21, 23 – 25 September 2020 yaitu meningkatkan ketersediaan dan keterjangkauan insulin yang terjamin kualitasnya 1 . Metode  yang  telah  dikembangkan untuk  insulin  di  antaranya  menggunakan metode  immunoassay  dan  kromatografi4. Dalam  monografi  USP,  insulin  human dapat  dikuantisasi  menggunakan  metode Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi  (KCKT) fase  terbalik.  Beberapa  publikasi  juga melaporkan  baik  secara  KCKT  sistem isokratik  maupun  gradien 6–10 .  Karena  telah tersedia metode secara kimia, maka dilakukan pengembangan  metode  secara immunoassay yang lebih selektif dan peka 11 yaitu enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) 12 . Studi ini membuat salah satu antibodi yaitu antibodi poliklonal  (pAB)  anti-rekombinan  insulin human  dari  kelinci  secara in-house yang disebut imunoglobulin G (IgG), dan dianalisis secara ELISA indirect. Produksi pAB menjadi pilihan dibanding antibodi monoklonal (mAb) karena  tahap  pembuatan  lebih  sederhana, biaya tidak terlalu mahal, keterampilan lebih mudah 13 dan  waktu  produksi  yang  lebih pendek.  Validasi  dilakukan  menggunakan
larutan  uji  mengandung  matriks  berupa gliserol  dan  m-kresol  yang  di- spike dengan insulin human rekombinan  (rhINS)  dalam rentang  konsentrasi  yang  diinvestigasi. Kedua  komponen  matriks  ini  merupakan eksipien  umum  dalam  obat  insulin.  Metode immunoassay ini  hanya  membutuhkan  satu buah microplate 96-well untuk  satu  kali pengujian  dengan  jumlah  sampel  lebih banyak.  Hal  ini  akan  menghemat  waktu, tenaga  dan  biaya  untuk  pekerjaan  rutin  di laboratorium. Selain itu, pAB yang diperoleh juga  dapat  disimpan  sebagai  stok  selama periode tertentu.

## 2.  Metode
2.1.  Alat Reader (BMG  Labtech,  FLUOstar Omega), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), inkubator suhu 37 ᵒ C (Memmert), sentrifuse  suhu  dingin  (Sakuma),  perangkat SDS-PAGE dan Western Blot (Bio-Rad), shaker (Thermo  Scientific), hotplate, dan stirrer (Thermo  Scientific),  mikropipet (Eppendorf), mikroplate Nunc Maxisorb 96- well (Thermo Fisher Scientific), dan visking tubing cut-off 120 kDa (Carolina Biologica).
2.2.  Bahan Sigma  Aldrich  menyediakan  antigen insulin human rekombinan  (rhINS,  Roche),
Freund’s Complete Adjuvant (FCA), Freund’s Adjuvant Incomplete (FIA), 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin (TMB), anti-IgG kelinci  konjugat  peroksidase  dari  kambing, anti-IgG  kelinci  konjugat  alkalin  fosfatase dari  kambing,  X-phosphate  disodium  salt (BCIP),  nitrotetrazolium  blue  chloride (NBT),  natrium  klorida  0,5  M,  natrium hidroksida, dimetil sulfoksida (DMSO) untuk biologi  molekular,  bovine  serum  albumin (BSA),  Laemmli  2X,  magnesium  klorida  1 M untuk biologi molekular, natrium dodesil sulfat  10%  (SDS)  untuk  biologi  molekular, β-merkaptoetanol  untuk  biologi  molekular, asam sitrat monobasa, N,N-dimetilformamida, dan Trizma base . Cytiva menyediakan  AB Buffer  Kit dan  kolom  HiTrap®  Protein  A High-Performance .  Bahan  dari  BioRad meliputi  akrilamid  40%,  bis  akrilamid  2%,
N,N,N,N-tetrametiletilendiamin  (TEMED), amonium  per  sulfat  (APS),  Tris-HCl  1,5  M pH  8,8,  dan  marker  protein  Mini-Protean, Coomassie  Brilliant  Blue    G250,  dan membran  nitroselulosa  0,45  µm  20x20  cm. Merck  mensuplai  amonium  sulfat,  meta- kresol,  gliserol  85%,  natrium  karbonat, natrium hidrogen karbonat anhidrat, natrium klorida,  natrium  hidrogen  fosfat,  natrium dihidrogen  fosfat,  Tween  80,  Tween  20, hidrogen  peroksida  30%,  asam  sulfat,  asam asetat,  metanol,  dan  barium  klorida.  Bahan lainnya  yang  digunakan  adalah  Actrapid® (Novo  Nordisk),  glisin  (Himedia),  natrium klorida  0,9%  (Otsu-NS),  air  untuk  injeksi (WFI,  Otsuka),  air  dari  Milli-Q®,  dan  susu tropikana slim.
2.3.  Prosedur
2.3.1. Pembuatan Larutan
Stok meta-kresol: Stok  dibuat  dari 1,03  kg/L  m-kresol  menjadi  konsentrasi  50 µg/mL dalam air Milli-Q®.
Stok matriks: 1  mL  stok  m-kresol ditambahkan 0,3 mL gliserol 85%, dan di- add 25 mL WFI.
Stok rhINS: Stok  disiapkan  dengan konsentrasi  1001,4  µg/mL  dalam  air Milli-Q®.
Coating buffer: 1,28 g natrium karbonat dan  2,36  g  natrium  hidrogen  karbonat (anhidrat) di-add 1000 mL air Milli-Q®, pH 9,6 diatur dengan NaOH 1 N atau HCl 1 N.
Blocking buffer: 5 g BSA di-add 1000 mL PBS pH 7,2.
Larutan uji validasi: Larutan berbagai konsentrasi  rhINS  disiapkan  dalam coating buffer, sedangkan  pAB  IgG  dan  anti-IgG kelinci  dalam blocking  buffer. Kurva  baku dibuat  dari  7  larutan  yang  di- spike dengan 5,01-300,42 µg/mL rhINS tanpa mengandung matriks.  Persamaan  garis  dari  kurva  baku digunakan untuk perhitungan akurasi, presisi, stabilitas,  dan  penentuan  potensi  produk. Larutan untuk uji linearitas, akurasi, presisi, dan  stabilitas  masing-masing  ditambahkan 0,3  mL  larutan  matriks.  Uji  linearitas dilakukan  terhadap  5  larutan  yang  di- spike dengan 80,11-200,28 µg/mL rhINS, masing- masing dibuat dua seri. Sedangkan uji akurasi
dan presisi dilakukan terhadap larutan spiked 100,14 µg/mL, 140,2 µg/mL, dan 200,28 µg/ mL  rhINS,  masing-masing  dibuat  tiga  seri. Batas  deteksi  (LOD)  dan  batas  kuantitasi (LOQ)  dihitung  menggunakan  perhitungan 3,3  σ/S  dan  10  σ/S.  Uji  stabilitas dilakukan pada larutan spiked 80,11 µg/mL, 140,2 µg/ mL,  dan  200,28  µg/mL  rhINS,  dibuat  dua seri,  dan  disimpan  pada  suhu  2-8ᵒC  selama 24 jam. Pembuatan larutan lain terdapat pada Supplementary File .
2.3.2. Penyiapan Hewan Ethical approval diterbitkan  oleh Kementerian  Kesehatan  Indonesia  dengan nomor  LB.02.01/2/KE.436/2021  tanggal  19 Juli  2021.  Dua  ekor  kelinci  ( Oryctolagus cuniculu ) dengan galur Japanese white jantan diaklimatisasi  selama  2  minggu.  Hewan dipelihara  dalam  kandang  yang  memiliki wadah  yang  berlubang  untuk  membuang kotoran  ke  arah  bawah  dan  berada  di ruangan  bersuhu  22-23ᵒC.  Perlakuan  dan pemeliharaan  hewan  mengikuti  kaidah refinement,  reduction,  replacement (3R) yang  diberi  makanan  dan  minum  secara  ad libitum.  Kriteria  inklusi  pada  penelitian  ini adalah jantan, umur minimal 3 bulan, bobot badan 2,0-2,5 kg, dan sehat. Kriteria kelinci sehat  adalah  struktur  anatomi  normal,  kulit dan bulu halus, mata terang, gerakan lincah, tidak  agresif,  tanpa  luka,  dan  tidak  terdapat tanda abnormal. Sedangkan kriteria eksklusi berupa  kelinci  yang  sakit  atau  mati  selama penelitian.  Kelinci  yang  sudah  dipakai percobaan  diterminasi  oleh  personil  yang terlatih dengan cara disembelih pada bagian leher 14 dengan pisau yang tajam. Hewan mati dimasukkan  ke  dalam  kantong  hitam  dan disimpan dalam freezer suhu -20ᵒC sebelum dimusnahkan dengan insenerator suhu 450ᵒC selama 4 jam. Abu yang dihasilkan dikirim ke perusahaan pengolah limbah.
2.3.3. Penyiapan antigen dan imunisasi hewan Sebanyak 4,0 mg rhINS direkonstitusi dengan  1  mL  WFI  dalam  tabung  steril, diencerkan  dengan  1  mL  NaCl  0,9%,  lalu dicampur  2  mL  FCA  membentuk  emulsi. Homogenisasi dilakukan dengan cara sedot-
semprot  menggunakan  mikropipet  secara perlahan. Kelinci diimunisasi pada hari ke-0, ke-7, ke-10, dan ke-18 15 . Pada hari ke-0, tiap kelinci  disuntik  dengan  1  mL  antigen-FCA secara subkutan pada bagian leher belakang, yang dibagi dalam 2 titik masing-masing 0,5 mL. Penyuntikan booster dengan antigen-FIA dilakukan  pada  hari  ke-7,  ke-10,  dan  ke-18 dengan metode yang sama.
2.3.4. Pengambilan  darah  dan  pembuatan serum
Darah  diambil  pada  hari  ke-0,  ke- 21,  dan  ke-28 15 dimana  volume  yang dikumpulkan  lebih  rendah  dari  kaidah  yang ditetapkan Institutional Animal Care and Use Committee 16,17 .  Hari  ke-0  dilakukan pengambilan darah 2 mL sebelum imunisasi antigen melalui vena marjinalis telinga untuk mendapatkan  serum  pre-imunisasi  sebagai blanko. Darah ditampung dalam tabung tanpa koagulan  dan  dibiarkan  selama  30  menit hingga  mengendap.  Serum  disentrifugasi kecepatan  3000  rpm  pada  suhu  4ᵒC  selama 30  menit  untuk  memisahkan  dari  sel  darah merah. Supernatan disimpan pada suhu -20ᵒC untuk pengujian selanjutnya. Cara yang sama dilakukan pada hari ke-21 dan ke-28 sebanyak 5 mL darah.
2.3.5. Pemurnian pAB IgG
Serum  ditambahkan  larutan  50% (NH4)2SO4  dengan  perbandingan  1:1  setetes demi setetes sambil diaduk dengan stirrer 18 . Larutan  diaduk  selama  3  jam  lagi  dan diinkubasi  pada  suhu  4ᵒC  selama  semalam. Larutan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 30  menit  pada  suhu  4ᵒC,  dan  supernatan dibuang.    Endapan  pAB  IgG  yang  masih mengandung  sisa  (NH4)2SO4  dimasukkan dalam visking tubing yang  sebelumnya telah direndam air selama 2 menit. Kantong direndam dengan PBS pH 7,6 pada suhu 4ᵒC selama  5  hari  yang  diganti  dua  kali  sehari. PBS dicek tiap hari dengan larutan 5% BaCl2 untuk deteksi sisa (NH4)2SO4.
Proses fraksinasi pAB IgG menggunakan kolom HiTrap® Protein A HP yang dirakit dengan jarum suntik 5 mL dan dilakukan  dengan  kecepatan  laju  alir  5  ml/
menit.  Kolom  dicuci  dengan  25  mL  WFI, disetimbangkan  dan  dibilas  masing-masing dengan 50 mL binding buffer 0,02 M natrium fosfat pH 7,0. Sampel pAB IgG ditambahkan binding buffer (1:1, v/v), dimasukkan dalam kolom,  dan  dibilas  kembali  dengan  25  mL binding  buffer. Elusi  dilakukan  dengan  25 mL elution buffer 0,1 M glisin-HCl pH 2,7. Tiap  fraksi  ditampung  sebanyak  1,5  mL dalam microtube yang  telah  berisi  100  µL neutralizing buffer 1 M tris-HCl pH 9.
2.3.6. Kuantitasi pAB IgG Tiap  fraksi  tanpa  pengenceran  diukur absorbansi  menggunakan  spektrofotometer UV  280  nm.  Dari  semua  fraksi  diambil alikot dan disimpan pada suhu -20ᵒC hingga pengujian berikutnya. Konsentrasi IgG (mg/ mL)  dihitung  dengan  rumus:  ( extinction coefficient IgG =1,36).
2.3.7. Karakterisasi pAB IgG
Dot Blot : Dua  lembar  membran nitroselulosa 3,5 x 5 cm diberi titik kendali negatif  dan  positif,  sedangkan  1  lembar ukuran 3,5 x 8,5 cm diberi titik kendali fraksi. Tiap membran diletakkan dalam cawan petri, direndam  dengan  WFI  selama  30  menit, dan dikeringkan pada suhu ruang. Sebanyak 20  µL  rhINS  1  mg/mL  dalam  Laemmli  2X ditotolkan ke semua titik, dibiarkan meresap, lalu dikeringkan. Membran direndam dalam 20 mL larutan 5% blocking blotto , diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam sambil dikocok lembut  menggunakan shaker, dan blocking blotto dibuang. Sebanyak 20 μL fraksi pAB IgG  dan  20  μL  5% blotto masing-masing diteteskan  pada  titik  kendali  fraksi  dan  titik kendali negatif, dibiarkan meresap dan kering. Membran dicuci 3 kali dengan 20 mL PBS-T masing-masing selama 5 menit menggunakan shaker,  dan  sisa  larutan  dibuang.  Sejumlah 20  μL  anti-IgG  kelinci  terkonjugat  alkalin fosfatase  (1:5000)  ditotolkan  pada  semua titik kendali, dan diinkubasi pada suhu ruang hingga kering.  Membran dicuci 3 kali dengan 20 mL PBS-T masing-masing selama 5 menit. PBS-T dibuang dan membran direndam dalam
5  mL  substrat  BCIP-NBT  sambil  dikocok lembut selama 5 menit pada suhu ruang.
SDS-PAGE: Elektroforesis  vertikal dilakukan  dengan  konsentrasi  SDS  dalam separating gel 7,5%  dan  17,5%,  serta stacking gel 4%.  Fraksi pAB IgG diencerkan dengan  Laemmli  2X  (1:1),  ditambah  50  µL β-merkaptoetanol,  dan  dipanaskan  pada suhu  100ᵒC  selama  5  menit.  Fraksi-fraksi dan  Mini-Protean®  masing-masing  di- loading ke dalam sumur stacking gel . Proses elektroforesis dilakukan pada 140 Volt selama 50  menit. Gel diwarnai  dengan  pewarna coomassie brilliant blue G250 selama 2 jam sambil  digoyang  perlahan.  Warna  tersebut dihilangkan  menggunakan destaining  buffer selama 30 menit.
Western  Blot: Sejumlah  20  µL  rhINS 1  mg/mL  dalam buffer Laemmli  2X  di- run dengan gel poliakrilamida  7,5%  dan  17,5% seperti tahap elektroforesis tanpa penambahan coomassie blue . Protein tersebut dipindahkan secara electrotransfer ke membran nitroselulosa  0,45  µm  menggunakan  medan listrik.    Membran  diblok  dengan  5% blotto , ditotolkan  20  µL  fraksi  pAB  IgG,  dan diinkubasi  semalaman  pada  suhu  2–8°C. Membran dicuci 3 kali dengan 20 mL 0,1% PBS-T dan diinkubasi dengan 20 µL anti-IgG kelinci  konjugat  alkalin  fosfatase  (1:5000) selama 1 jam. Membran dicuci kembali 3 kali dengan  0,1%  PBS-T,  dan  diwarnai  dengan substrat BCIP-NBT.
2.3.8. Validasi Metode Validasi  secara  ELISA indirect dilakukan  dengan  mengaplikasikan  100 µL  berbagai  konsentrasi  rhINS  ke  dalam microplate. Coating  buffer dan blocking buffer digunakan  sebagai  kontrol  negatif. Tahap coating ini memerlukan inkubasi pada 2-8°C semalam, Sisa coating buffer dibuang, dicuci dengan 200 µL washing buffer PBS-T sebanyak 3 kali, dan washing buffer dibuang. Pada tahap blocking, 200 µL blocking buffer ditambahkan,  diinkubasi  pada  suhu  37°C selama  1,5  jam,  larutan blocking dibuang, dan  dicuci  dengan  200  µL washing  buffer 2  kali.  Stok  pAB  IgG  dibuat  konsentrasi 20  µg/mL  menggunakan blocking  buffer,
dimasukkan  100  µL  ke  dalam microplate , diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  1,5  jam, sisa pAB IgG dibuang, dan dicuci dengan 200 µL washing  buffer 2  kali.  Anti-IgG  kelinci konjugat peroksidase dari kambing (1:10000) disiapkan dalam blocking buffer, dimasukkan 100  µL  ke  dalam microplate ,  diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam, sisa antibodi dibuang, dan dicuci dengan 200 µL washing buffer 4  kali.    Sejumlah  100  µL  substrat TMB ditambahkan dan diinkubasi pada suhu ruang  selama  15–30  menit  hingga  hingga terbentuk  warna  biru  kehijauan.  Sebanyak 100  µL  H2SO4  2  M  ditambahkan  sebagai stop  solution.  Pembacaan optical density dilakukan pada panjang gelombang 450 nm.
2.3.9. Penentuan sampel di pasaran Sampel  setara  3470  µg/mL  dipipet 0,25  mL  dan  di- add 5  mL coating  buffer . Analisis  secara  ELISA indirect dilakukan dalam rangkap dua pada panjang gelombang 450 nm. Konsentrasi dihitung menggunakan kurva  baku  dan  persentase  potensi  terhadap klaim label dihitung.
3.  Hasil Setelah  penyuntikan  antigen–FCA, timbul  lesi  pada  kedua  kelinci  yang menyebabkan  kelinci  1  gelisah  selama beberapa  hari  namun  tidak  terjadi  pada kelinci 2. Lesi tersebut perlahan hilang hingga minggu ke-2. Booster antigen–FIA dilakukan pada lokasi berbeda dan tidak menimbulkan lesi seperti pada FCA. Kondisi fisik, aktivitas motorik, defekasi, dan urinasi kedua kelinci secara  umum  normal,  yang  ditandai  dengan kenaikan  bobot  badan  selama  penelitian yang  berlangsung  28  hari.  Kedua  kelinci menghasilkan  serum  yang  mengandung pAB  IgG  dengan  total  9  mL.  Pada  proses dialisis, ion sulfat tidak terdeteksi lagi dalam larutan PBS pada hari ke-5 dan menghasilkan pAB  IgG  sebanyak  3  mL.  Tahap  fraksinasi menggunakan  kolom  HiTrap®  Protein  A HP  menghasilkan  15  fraksi  masing-masing bervolume 1,5 mL. Konsentrasi dari 15 fraksi pAB  IgG  ditunjukkan  Gambar  1.  Perolehan pAB  IgG  mulai  meningkat  pada  fraksi  3, mencapai puncaknya pada fraksi 5, dan mulai
menurun pada fraksi 6.  Fraksi 4, 5, 6 memiliki konsentrasi  terbesar  yaitu  masing-masing 0,781 mg/mL, 1,581 mg/mL, dan 0,459 mg/ mL. Konsentrasi fraksi 7–15 cenderung kecil yaitu  rentang  0,009  –  0,03  mg/mL.  Jumlah keseluruhan pAB IgG yang dihasilkan adalah 3,038 mg/mL.
Hasil  karakterisasi  fraksi  3,  4,  11, 13  dengan  uji Dot Blot dan SDS-PAGE ditunjukkan Gambar 2a dan 2b. Titik kontrol negatif dan titik kontrol positif tidak terbentuk warna biru, sedangkan titik kendali keempat fraksi  menghasilkan  warna  biru  (Gambar 2a).  Elektroforesis  empat  fraksi  masing- masing hanya terbentuk dua pita yaitu pada 50 kDa dan 20 – 25 kDa (Gambar 2b). Hasil uji Western Blot dari fraksi 3, 4, 11 masing- masing  membentuk  1  spot  berwarna  gelap sebagai  bukti  terbentuknya  sinyal  adanya reaksi enzimatis antara rhINS, pAB IgG, dan anti-IgG dari kambing (Gambar 2c).
Pada  validasi,  kurva  baku  dari  larutan
5,01–  300,42  µg/mL  rhINS  tanpa  matriks menghasilkan  persamaan  garis  y  =  0,003  + 0,6169 (r = 0,9803). Sedangkan larutan 80,11 –  200,28  µg/mL  rhINS  yang  mengandung matriks membentuk kurva linearitas (Gambar 3) dengan perolehan LOD dan LOQ masing- masing 22,05 µg/mL dan 73,51 µg/mL. Hasil  uji  akurasi  dan  presisi  berupa persentase recovery (%R)  dan  persentase koefisien  variasi  (%KV)  diperoleh  rerata masing-masing  adalah  99,11±5,01%  dan 3,91%  (Tabel  1).  Hasil  pengukuran  larutan rhINS pada uji stabilitas saat 0 ( fresh ) dan 24 jam tertera pada Tabel 2, dan diperoleh nilai p = 0,435 dengan ANOVA (α0,05). Sedangkan persentase potensi sampel tertera pada Tabel 3 dimana persyaratan potensi produk adalah 95–105%.
4.  Pembahasan Antibodi  merupakan  protein  yang diproduksi  oleh  sistem  kekebalan  (sel  B

## Gambar 1. Profil Perolehan pAB IgG Kelinci
Gambar 2. Karakterisasi pAB IgG Kelinci (a) Uji Dot Blot ; (b) Uji SDS-PAGE ; (c) Uji Western Blot
plasma) sebagai respon terhadap antigen 13,15,19 . Perbedaan utama antara mAb dan pAB adalah mAb diproduksi oleh klon sel B plasma yang sama dan mengikat epitop tertentu, sedangkan pAB diproduksi oleh klon sel B plasma yang berbeda  dan  mengikat  epitop  yang  berbeda dalam antigen yang sama 13 . Produksi antibodi berkualitas  tinggi  membutuhkan  imunogen (antigen)  murni  dan  berkualitas  tinggi. Kadar  antigen  yang  disuntikkan  tersebut tergantung  pada  spesies  hewan,  adjuvan, protokol imunisasi dan sifat antigen 15 . Jumlah minimum  antigen  yang  disuntikkan  dengan BM < 18 kDa adalah 200 µg, sedangkan BM > 18 kDa adalah 100 µg per injeksi 15 . Insulin human memiliki BM 5800 Da6 sehingga pada penelitian ini digunakan dengan kadar 1 mg/ mL. Antigen tersebut terkadang tidak cukup untuk memicu respon imun yang memuaskan, sehingga diberikan bersama dengan adjuvan untuk  meningkatkan  respon.  Adjuvan Freund’s umum digunakan dalam penelitian, sangat efektif, tetapi dapat menghasilkan efek samping  inflamasi  yang  menyakitkan  jika tidak  diberikan  dengan  benar.  Adjuvan  ini merupakan emulsi air dalam minyak mineral yang sangat kental dan sulit untuk disuntikkan.
Kandungan minyak ini akan memicu inflamasi dan granuloma di sekitar suntikan 20 . F reund’s Complete Adjuvant (FCA)  mengandung microbacterium  mati  sedangkan Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA) tanpa komponen bakteri. Pada studi ini, FCA digunakan hanya sekali  pada  imunisasi  awal  karena  bersifat sangat iritan dan sering menyebabkan abses jika diberikan berulang. FIA diberikan pada saat booster karena  akan  menstimulasi  sel plasma  untuk  menghasilkan  antibodi  yang berlangsung lebih lama. Pencampuran larutan antigen rhINS dengan adjuvan menghasilkan emulsi  berwarna  putih  yang  kental  seperti santan.  Selain  penggunaan  adjuvan,  respon imun  juga  dapat  ditingkatkan  dengan memperbanyak  tempat  suntikan.  Imunogen akan  terdistribusi  ke  area  permukaan  yang lebih luas dan mencapai jaringan limfoid lebih banyak. Cara ini akan memicu kekebalan dan menghasilkan titer antibodi yang lebih tinggi. Selain  itu  juga  akan  mengurangi  kejadian respon inflamasi lokal yang parah dan abses sehingga meningkatkan keamanan hewan uji. Penyuntikan secara subkutan lebih baik dari intramuskular karena tidak terbentuk lesi dan sedikit rasa sakit. 19
Gambar 3. Kurva Linearitas rhINS (80,11 – 200,28 µ g/mL
Spike (µg/
mL)
OD (450 nm) C % R Rerata a Rerata b SD a % KV a 100,14 0,916 0,912 0,880 100,41 99,07 88,34 100,27 98,93 88,22 95,94 95,81 6,62 6,90 140,20 1,030 1,066 1,045 138,41 150,48 143,66 98,73 107,34 102,47 144,19 102,85 6,05 4,20 200,28 1,207 1,210 1,202 197,76 198,76 196,30 197,76 198,76 196,30 197,61 98,67 1,24 0,63
C: rhINS ( µ g/mL), a : Rerata C (n =3), b : Rerata %R (n =3)
Tabel 1. Hasil Uji Akurasi dan Presisi Insulin Human Rekombinan
Penelitian protein seperti antibodi IgG memiliki tahap kritis pada proses pemurnian, karena masih terdapat banyak cemaran dalam serum.  Penggunaan  50%  (NH4)2SO4  setetes demi setetes pada proses pemurnian bertujuan untuk  membatasi  jumlah  ikatan  hidrogen antara antibodi dan pelarutnya agar pAB IgG mengendap.  Proses  ini  akan  menghilangkan protein lain agar diperoleh bahan yang lebih bersih pada tahap fraksinasi. Namun, cara ini tidak boleh digunakan sebagai pemurnian satu langkah, karena masih mengandung sejumlah besar protein pencemar yang memiliki berat molekul  lebih  kecil.  Dialisis  dilakukan sebagai  tahap  pemurnian  lanjutan  untuk menghilangkan pengotor dan sisa (NH4)2SO4 yang  dapat  mengganggu  aktivitas  antibodi yang diproduksi. pAB IgG kelinci memiliki ukuran  molekul  150–160  kDa  yang  akan tertahan dalam membran dialisis, sedangkan molekul  pengotor  dengan  ukuran  ≤  120 kDa akan keluar melewati membran menuju larutan  PBS.  Pemurnian  antibodi  selektif umumnya  dilakukan  dengan  menggunakan kromatografi  afinitas  atau  kromatografi berbasis  tag-afinitas,  karena  memiliki selektivitas  dan  kemurnian  tinggi 22 .  Kolom HiTrap Protein A HP terbuat dari polipropilen yang tidak berinteraksi dengan biomolekul dan mengandung  protein  A  dari Staphylococcus aureus untuk mengisolasi pAB IgG. Protein A  memiliki  enam  bagian  berbeda,  bersifat kuat dan spesifik, dan akan berikatan dengan area  Fc  dari  antibodi  IgG  target.  Ikatan  ini berupa reaksi hidrofobik yang akan melemah pada  pH  rendah,  sehingga  memungkinkan
elusi IgG 22 . Kemampuan protein A mengikat fragmen  Fc  IgG  menjadikannya  ligan  yang baik  untuk  analisis  antibodi 23 .  Pemakaian visking tubing dan kolom afinitas dalam studi ini  dapat  menahan  protein  target  pAB  IgG secara efektif.
Pada tahap karakterisasi dengan uji Dot Blot, antigen  diimobilisasi  pada  membran nitroselulosa dan dideteksi dengan pAB IgG. Setelah  terikat,  antibodi  divisualisasikan menggunakan  antibodi  sekunder  (anti-IgG konjugat  alkalin  fosfatase)  yang  mengenali domain antibodi pAB IgG. Warna biru yang terbentuk berasal dari reaksi alkalin fosfatase dengan substrat BCIP-NBT. Hasil penelitian menunjukkan  bahwa  keempat  fraksi mengandung pAB IgG target yang diinginkan dan  memberikan  sinyal  reaksi  enzimatis antigen–antibodi. pAB IgG kelinci memiliki struktur yang terdiri dari rantai berat (50 kDa) dan rantai ringan (25 kDa) yang dihubungkan dengan  ikatan  nonkovalen  dan  jembatan disulfida 19,21 . Publikasi lain melaporkan berat molekul  rantai  berat  IgG  kelinci  sekitar  50 kDa, sedangkan rantai ringan 20–30 kDa 20,21 . Karakterisasi 4 fraksi IgG secara elektroforesis dalam studi ini menghasilkan dua pita, hal ini sesuai  dengan  penelitian  sebelumnya. Tidak adanya pita lain yang terdeteksi menunjukkan tidak ada protein lain dalam sampel, sehingga proses  pemurnian  serum  kelinci  berjalan dengan  baik.  Elektroforesis  dengan  SDS- PAGE  memisahkan  protein  berdasarkan bobot  molekul 22 .  Pemanasan  sampel  IgG dan marker dengan  SDS  akan  memutuskan ikatan  disulfida  protein  dan  melingkupi
Spike (µg/mL) 0 jam ( fresh ) 24 jam % R c
% KV % R c % KV 80,11 140,20 200,28 97,65 ± 10,56 103,03 ± 6,09 98,99 ± 0,36 10,81 5,91 0,36 92,35 ± 5,23 92,67 ± 0,68 103,15 ± 5,84 5,66 0,73 5,66
Tabel 2. Hasil Uji Stabilitas Insulin Human Rekombinan Selama 24 Jam
c Data berupa rerata ± SD (n =2)
No OD (450 nm) c C c % Potensi c 1 1,14 ± 0,01 176,47 ± 4,82 101,71 ± 2,78 2 1,13 ± 0,004 171,94 ± 1,26 99,10 ± 0,73 3 1,12 ± 0,01 169,20 ± 3,56 97,52 ± 2,05
c Data berupa rerata ± SD (n =2)
Tabel 3. Hasil Penentuan Produk Insulin Human Rekombinan secara Metode ELISA Indirect
protein  sehingga  bermuatan  negatif.  Buffer Laemmli  2X  mengandung  gliserol  sebagai pemberat  dan  bromfenol  biru  sebagai penanda protein, sementara β-merkaptoetanol untuk  memecah  ikatan  sulfida  pada  protein, sehingga  protein  akan  terurai  dan  mudah dipisahkan.  Penggunaan  gradien  separating gel memisahkan pita-pita protein berdasarkan berat  molekul.  Konsentrasi  7,5%  berada pada  lapisan  atas  karena  memiliki  pori-pori yang  lebih  besar  dan  konsentrasi  17,5% pada lapisan bawah. Ketika diberikan medan elektromagnetik,  sampel  yang  mengandung rantai berat dan rantai ringan akan bermigrasi bersamaan  dari  katoda  (muatan  negatif, atas) menuju anoda (muatan positif, bawah). Rantai berat akan bergerak lambat dan rantai ringan akan menuju anoda lebih cepat karena pengaruh perbedaan pori-pori dari separating gel. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa rantai berat (50 kDa) berada di atas dan rantai ringan (20 – 25 kDa) berada di bawah (Gambar 2.b). Uji Western Blot (WB) merupakan tahap lanjutan  setelah  protein  dielektroforesis dan  dilakukan  transfer  elektroforetik  dari gel  ke  membran  nitroselulosa 25 .  Pada  tahap WB,  antigen  dilakukan  elektroforesis dan  membran  diinkubasi  dengan  antibodi berlabel  yang  sesuai. Spot tunggal  yang terbentuk  menunjukkan  bahwa  ketiga sampel mengandung pAB IgG yang mampu berikatan dengan antigen rhINS dan anti-IgG dari  kambing,  sehingga  memberikan  sinyal adanya  reaksi  enzimatis.  Antibodi  hanya akan mengikat antigen yang sesuai, sehingga hanya terbentuk 1 spot 26 . Antibodi sekunder yang  digunakan  umumnya  dihasilkan  dari spesies  yang  kekerabatannya  jauh  dari penghasil IgG, agar terjadi reaksi penolakan atau  melawan  spesies  antibodi  primer 15 . Spektrofotometer  UV  280  nm  digunakan untuk mengukur absorbansi pAB IgG karena akan menyerap sinar UV dalam larutan pada panjang  gelombang  tersebut.  Metode  ini cukup  sederhana  karena  tidak  memerlukan standar protein atau perlakuan apapun dengan hasil absorbansi setara dengan konsentrasi. Pada  ELISA indirect ,  umumnya digunakan coating  buffer,  washing  buffer, H 2SO4  sebagai stop solution, substrat
tetrametilbenzidin  (TMB),  dan horseradish peroksidase (HRP)  sebagai  enzim  pelabel 19 . Coating  buffer berupa  karbonat  dan washing  buffer berupa  PBS  (campuran KH2PO4,  NaH2PO4,  Na2HPO4,  NaCl,  KCl, 0,05%  Tween-20).  Validasi  dilakukan sesuai  pedoman International Conference on Harmonisation (ICH)  1995  dan  FDA dokumen Q1A(R2).  Menurut ICH, stabilitas obat  harus  dievaluasi  selama  periode  waktu tertentu,  karena  dekomposisi  kimia  dapat terjadi  selama  penyimpanan.  Kurva  baku dan  kurva  linearitas  memperlihatkan  hasil yang  linear  dalam  rentang  konsentrasi yang  dicoba.  Keberterimaan  %R  pada  uji akurasi immunoassay adalah  80-120%, 22,23 sedangkan  uji  presisi  dikatakan  memuaskan jika perolehan %KV ≤ 10% 22 atau ≤ 20% 23 . Mengacu  pada  nilai  ini,  maka  hasil  uji akurasi  dan  presisi  yang  diperoleh  masih berada  dalam  batas  yang  dapat  diterima. Perolehan  %KV  pada  uji  stabilitas  ≤  20% 23 menunjukkan  rhINS  bersifat  stabil  pada suhu 2–8ᵒC selama 24 jam. Ketiga sampel di pasaran yang diuji menunjukkan potensi yang memenuhi persyaratan 95 – 105 % terhadap klaim  label  dan  memiliki  kemanjuran  yang dapat dipercaya.
Imunisasi  kelinci  dengan  1  mg/mL rhINS dan pengambilan darah 5 mL tiap kelinci menghasilkan pAB IgG untuk pengembangan metode hingga tahap validasi. Lebih baik jika pengambilan  darah  ditingkatkan  volumenya hingga  15  mL  agar  diperoleh  konsentrasi pAB  IgG  yang  lebih  pekat  untuk  dilakukan optimasi-optimasi  lain.  Selain  itu,  antigen insulin  human  sebagai  imunogen  dapat ditingkatkan  konsentrasinya  agar  dapat diperoleh  titer  pAB  IgG  yang  lebih  tinggi, namun batas toksisitasnya terhadap hewan uji perlu diketahui. Institutional Animal Care and Use Committee mengizinkan  pengambilan darah 0,5%  dari bobot  badan (Gram)  tiap 7 hari  atau  1%  tiap  14  hari 17 .  Kelinci  dengan bobot 3 kg dapat diambil darah maksimal 30 mL  tiap  14  hari,  namun  diperlukan  metode yang  cukup  efektif  tanpa  menyebabkan penggumpalan  darah  dan  ketidaknyamanan hewan. Walaupun hasil validasi menghasilkan keberterimaan yang baik, sebaiknya antibodi
yang diproduksi dilakukan formulasi terlebih dahulu agar diperoleh sinyal yang lebih stabil. Metode  lain  seperti  ELISA sandwich dapat dikembangkan  agar  ikatan  antigen-antibodi lebih kuat dan spesifik. Dalam studi ini tidak menganalisis  insulin  jenis  lain,  sehingga tidak  dapat  memberikan  gambaran  apakah pAB IgG yang dihasilkan akan memberikan sinyal yang sama jika bereaksi dengan analog insulin.
5.  Kesimpulan Proses  pemurnian,  fraksinasi,  dan karakterisasi telah menghasilkan anti-insulin human rekombinan  yang  memiliki  aktivitas cukup  baik  dalam  memberikan  sinyal  pada panjang gelombang 450 nm. ELISA indirect dapat menjadi metode alternatif selain metode KCKT yang dapat digunakan untuk uji produk insulin human .  Metode immunoassay lain juga dapat dikembangkan untuk sediaan yang mengandung lebih dari satu jenis insulin.
Ucapan Terimakasih Terimakasih  kepada  Badan  Pengawas Obat  dan  Makanan  Nasional  (BPOM), Universitas  Indonesia,  dan  Pusat  Studi Satwa Primata - IPB atas dukungan fasilitas, instrumen,  dan  material.  Penelitian  didanai oleh BPOM, surat KP.07.03.2.82.09.19.2817 Tahun 2019.

## Referensi
1.  World  Health  Organization.  Insulin  and associated devices: access for everybody [diunduh  22  Februari  2021].  Tersedia dari: http://apps.who.int.
2.  Bahendeka  S,  Kaushik  R,  Swai  AB, Otieno  F,  Bajaj  S,  Kalra  S,  et  al. EADSG Guidelines: Insulin storage and optimisation  of  injection  technique  in diabetes  management.  Diabetes  Ther. 2019;10(2):341–66.
3.  Soffe  R,  Nock  V,  Chase  JG.  Towards point-of-care  insulin  detection.  ACS sensors. 2019;4(1):3–193.
4.  Shen Y, Prinyawiwatkul W, Xu Z. Insulin: a review of analytical methods. Analyst. 2019;144(14):4139–48.
5.  Carter AW,  Heinemann  L,  Klonoff  DC,
Fellow  AIMBE.  Quality  control  of insulins  and  biosimilar  insulins:  what do  we  know?  J  Diabetes  Sci  Technol. 2016;10(4):811–5.
6.  Iyire A, Russell C, Dennison T, Rajoli R, Saleem I, Rahman A, et al. Development, optimisation,  validation  and  inter- laboratory  verification  of  a  reversed phase  HPLC  method  for  quantification of  human  recombinant  insulin.  J  Adv Biotechnol. 2018;7(1):984–98.
7.  Arkell  K,  Knutson  H-K,  Frederiksen SS,  Breil  MP,  Nilsson  B.  Pareto- optimal  reversed-phase  chromatography separation  of  three  insulin  variants  with a  solubility  constraint.  J  Chromatogr A. 2018;1532:98–104.
8.  Zuben  E  de  S  Von,  Eloy  JO,  Araujo VHS, Gremião MPD, Chorilli M. Rapid and  sensitive  analytical  method  for  the determination of insulin in liposomes by reversed-phase  HPLC. Acta  Chim  Slov. 2020;67(4):1273–80.
9.  Moses A, Bjerrum J, Hach M, Wæhrens LH,  Toft  AD.  Concentrations  of  intact insulin  concurs  with  FDA  and  EMA standards  when  measured  by  HPLC in  Different  parts  of  the  distribution cold  chain.  J  Diabetes  Sci  Technol. 2019;13(1):55–9.
10. De  Haro  Moreno  A,  Beatriz  Bastos Lucchesi M, Atala Dib S, Regina Nunes Salgado  H.  Development  of  a  new HPLC  method  for  the  determination  of lispro  and  glargine  insulin  analogues in  pharmaceutical  preparations.  J  Anal Pharm Res. 2018;7(1).
11. Sakamoto S, Putalun W, Vimolmangkang S, Phoolcharoen W, Shoyama Y, Tanaka H, et al. Enzyme-linked immunosorbent assay  for  the  quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. J Nat Med. 2018;72(1):32–42.
12. Okita N, Higami Y, Fukai F, Kobayashi M, Mitarai M, Sekiya T, et al. Modified Western  blotting  for  insulin  and  other diabetes-associated  peptide  hormones. Sci Rep. 2017;7(1):6949.
13. Panawala  L.  Difference  between monoclonal  and  polyclonal  antibodies.
Pediaa. 2017.
14. Leary  S,  Underwood  W,  Anthony  R, Cartner S, Grandin T, Greenacre C, et al. AVMA  guidelines  for  the  euthanasia  of animals Edisi 2020 Edition. Schaumburg: The: BRILL; 2020.
15. Delahaut  P.  Immunisation  -  Choice  of host,  adjuvants  and  boosting  schedules with  emphasis  on  polyclonal  antibody production. Methods. 2017;116:4–11.
16. IACUC.  IACUC  Policy :  Blood Collection in Small Laboratory Animals. 2019;1–4.
17. Davis  UC.  Title:  Blood  collection: volumes,  frequency  and  sites.  [diunduh 1 Desember 2021]. Tersedia dari: https:// research.ucdavis.edu/wp-content/ uploads/IACUC-31.
18. Fusvita  A,  Maryam  R,  Pribadi  ES. Karakterisasi antibodi poliklonal terhadap  aflatoksin  M1.  Sain  Veteriner.
2017;34(1):9–15.
19. Wiesner  R,  Scheller  C,  Krebs  F, Wätzig  H,  Oltmann-Norden  I.  A comparative  study  of  CE-SDS,  SDS- PAGE,  and  Simple  Western:  Influences of  sample  preparation  on  molecular weight  determination  of  proteins. Electrophoresis. 2021;42(3):206–18.
20. Bunyamin  M.  Produksi  serum  rabbit anti-catfish  terhadap  penyakit  Motile Aeromonas Septicemia (MAS) pada ikan patin siam (Pangasius hypophthalmus). J MINA SAINS. 2017;1(1):24.
21. Abdel-Rahman EH, El-Jakee JK, Hatem
ME, Ata NS, Fouad EA. Preparation of goat and rabbit anti-camel immunoglobulin G whole molecule labeled with horseradish peroxidase.  Vet  World.  2017;10(1):92–
100.
22. Murphy  C,  Kennedy  RO. ANTI-64762- technology-advancements-in-antibody- purification. Dove Press J. 2016;17–33.
23. Eivazi  S,  Majidi  J,  Maleki  LA, Abdolalizadeh  J,  Yousefi  M,  Ahmadi M,  et  al.  Production  and  purification  of a  polyclonal  antibody  against  purified mouse igg2b in rabbits towards designing mouse  monoclonal  isotyping  kits.  Adv Pharm Bull. 2015;5(1):109–13.
24. Talib  NAA,  Salam  F,  Sulaiman  Y. Development  of  polyclonal  antibody against  clenbuterol  for  immunoassay application. Molecules. 2018;23(4):789.
25. Wangler MF, Bellen HJ. In vivo animal modeling. In: basic science methods for clinical  researchers.  London:  Elsevier; 2017.
26. Iqbal J. Western Blot: proteins separating technique,  protocol,  theory  and  trouble shooting. J Bacteriol Mycol Open Access. 2017;4(2):62–7.
27. Minic  R,  Zivkovic  I.  Optimization, validation and standardization of ELISA. In: Norovirus. IntechOpen; 2021.
28. Andreasson  U,  Perret-Liaudet  A,  van Waalwijk  van  Doorn  LJC,  Blennow  K, Chiasserini  D,  Engelborghs  S,  et  al.  A practical  guide  to  immunoassay  method validation. Front Neurol. 2015 ;6:179.