## ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI TOLERAN LOGAM BERAT Pb (TIMBAL) DAN Cu (TEMBAGA) DARI SEDIMEN MANGROVE DI MANGROVE TAPAK, SEMARANG
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF BACTERIA TOLERANT TO HEAVY METALS Pb (LEAD) AND Cu (COPPER) FROM MANGROVE SEDIMENTS AT MANGROVE TAPAK, SEMARANG
Achmad Baharudin*, Niniek Widyorini, dan Diah Ayuningrum
Program Studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Departemen Sumberdaya Akuatik Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof Soedarto, SH, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah *Corresponden author email: achmadbaharudin84@gmail.com
Submitted: 12 August 2022 / Revised: 01 November 2022 / Accepted: 01 November 2022
http://doi.org/10.21107/juvenil.v3i3.16368

## ABSTRAK
Ekosistem  mangrove  memiliki  fungsi  sebagai  sedimen  trap  yang  sering  kali  mengendapkan  logam berat pada sedimen. Logam berat yang sering ditemukan pada sedimen mangrove yaitu logam Pb dan Cu. Logam ini juga ditemukan di ekosistem mangrove Tapak, Semarang. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui  bakteri  toleran  pada  logam  berat  dengan  mengisolasi  bakteri  dari  sedimen  mangrove, melakukan  uji  logam  berat  dan  melakukan  uji  molekuler.  Sedimen  diambil  dari  ekosistem  mangrove Tapak, pada 3 titik mengunakan metode coring modifikasi. Metode yang digunakan saat pengambilan sedimen adalah metode purpose sampling.  Penanaman bakteri dilakukan dengan metode pour plate dan streak plate. Isolasi dilakukan hingga didapatkan isolat tunggal murni. Isolat bakteri diidentifikasi dengan  gen  16S  rRNA  menggunakan  metode  PCR.  Hasil  yang  didapatkan  18  isolat  bakteri  dan terdapat 2 bakteri paling toleran logam berat, A1-b dan C1-a. Semua isolat bakteri merupakan gram positif dengan bentuk basil. Hasil identifikasi menunjukkan isolat A1.b memiliki kekerabatan terdekat dengan Bacillus tropicus. Hasil yang didapatkan ini selanjutnya dapat dilakukan penelitian untuk masa depan  mengenai  dapat  yang  ada  terhadap  kehidupan  bakteri  pada  sedimen  mangrove  di  kawasan mangrove Tapak.
Kata kunci: Bakteri, Isolasi, Mangrove, Logam Berat.

## ABSTRACT
The mangrove ecosystem has a function as a sediment trap which often deposits heavy metals in the sediment. Heavy metals that are often found in mangrove sediments are Pb and Cu. This metal is also found in the Tapak mangrove ecosystem, Semarang. The purpose of this study was to determine the tolerant  bacteria  to  heavy  metals  by  isolating  bacteria  from  mangrove  sediments,  conducting  heavy metal tests and conducting molecular tests. Sediment was taken from the Tapak mangrove ecosystem, at  3  points  using  the  modified  coring method. The  method  used when  taking  sediment  is  a  purpose sampling method.  Bacterial cultivation was carried out by pour plate and streak plate methods. Isolation was carried out until a single pure isolate was obtained. Bacterial isolates were identified by the 16S rRNA gene using the PCR method. The results obtained were 18 isolates of bacteria and there were 2 bacteria that were the most tolerant of heavy metals, A1-b and C1-a. All bacterial isolates were gram positive with bacilli form. The identification results showed that isolate A1.b had the closest relationship with Bacillus tropicus. The results obtained can then be carried out for future research regarding the presence of bacteria in mangrove sediments in the Tapak mangrove area.
Keywords: Bacteria, Isolation, Mangroves, Heavy Metals.

## PENDAHULUAN
Ekosistem  mangrove  merupakan  ekosistem yang sangat dipengaruhi oleh pasang surut air
laut  dan  aliran  sungai.  Ekosistem  mangrove memiliki  keunikan  sifat  biologi  dan  fisik. Ekosistem mangrove merupakan habitat
penting  bagi  organisme  laut  (Karimah,  2017). Kondisi ekosistem mangrove yang merupakan keunikannya  yaitu  bersalinitas  tinggi,  tanah yang  berlumput,  daerah  pasang  surut  , kelembapan  tinggi  dan  kondisi  anaerobik. Produktivitas  tinggi  pada  ekosistem mangrove dibanding  dengan  ekosistem  lainnya  memiliki kemampuan  dekomposisi  bahan  organik  yang tinggi  dan  mejadikan  mata  rantai  ekologis sangat  penting  bagi  kehidupan makhluk  hidup yang berada pada ekosistem mangrove (Ilham dan Effendi, 2016).
Tempat  hidup  sebagian  besar  komunitas mikroba termasuk bakteri, jamur, dan protozoa yaitu ekosistem mangrove. Ekosistem mangrove  memiliki  keragaman  yang  tinggu dengan  berbagai  hewan,  tanaman  dan mikroorganisme  yang  ada.  Keragaman  yang tinggi  menyebabkan  kebutuhan  nutrien  yang tinggi  sehingga  mikroorganisme  bertanggung jawab terhadap proses degradasi dan pembentukan  senyawa  penting  (Waluyo, 2018).  Mikroorganisme  mangrove  memegang peran penting dalam membantu daur ulang dan transformasi berbagai nutrisi yang mempengaruhi  ekosistem  mangrove  lebih produktif (Ratnakomala et al., 2016).
Logam berat banyak ditemukan pada sedimen mangrove seperti logam berat timbal (Pb) dan tembaga (Cu). Sumber timbal (Pb) yang ada di perairan  berasal  dari  industri  baterai,  industri kimia  dan  akibat  pembakaran  bahan  bakar kendaraan  (Sudarmaji et  al., 2006).  Sumber tembaga  (Cu)  yang  ditemukan  di  perairan berasal  dari  limbah  cairan  pembersih  lantai, galangan kapal dan industri dan sumber alami Cu  yang  ada  dialam  berasal  dari  pengikisan Logam  berat  yang  ada  pada  sedimen mangrove  mengakibatkan  matinya  beberapa jenis-jenis  mikroorganisme  yang  ada  pada sedimen. Mikroorganisme memiliki kemampuan untuk mengasilkan metabolit yang dapat mendegradasi polutan kompleks menjadi senyawa  sederhana,  mikroorganisme  yang tahan terhadap racun logam berat yang ada di lingkungan  karena  sudah  memiliki  sifat resistensi  (Thassitou  dan  Arvanitoyannis, 2001).  Penelitian  ini  akan  dilakukan  uji kemampuan  toleransi  bakteri  dari  sedimen terhadap logam berat Pb dan Cu yang nantinya dapat dimanfaatkan sebagai agen hayati dalam degradasi  logam  berat  dari  ekosistem  yang tercemar.

## MATERI DAN METODE Waktu dan Tempat
Penelitian  ini dilaksanakan pada bulan Desember  2021 –  Juli  2022.  Tempat
pengambilan  sampel  sedimen  mangrove  di kawasan Ekowisata Mangrove Tapak,
Tugurejo,  Semarang  dan  inokulasi  bakteri dilakukan  di  Laboratorium  Fakultas  Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro.

## Bahan Penelitian
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  yaitu akuades,  air  laut  steril,  alkohol,  media  MA ( Marine  Agar ),  peptone,  yeast  extract,  agar, agarose,  primer  universal  meliputi  primer universal 27F (5’- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG- 3’) serta primer 1492R (5’-
GGTTACCTTGTTACGACTT- 3), (Weisburg, et al ., 1991). mix PCR (GoTaq Green Master Mix),
ddH 2 O, TBE buffer, dan EtBr.

## Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel
Sampel  sedimen  mangrove  yang  digunakan diambil  dari  sedimen  mangrove  Tapak, Kecamatan Tugurejo, Semarang. Pengambilan sedimen mangrove menggunakan pipa paralon modifikasi  pada  kedalaman  10  cm  atau  pada lapisan top  soil yang  memiliki  bagian  jumlah koloni bakteri yang lebih banyak (Pattolo et al., 2020). Sampel diambil pada 3 stasiun  dengan masing  masing  stasiun  memiliki  3  titik  yang sudah ditentukan menggunakan teknik purposive sampling yang didasarkan keperluan dan  pertimbangan  tertentu  oleh  peneliti (Rosidanto et al., 2017).
Sampel yang didapatkan selanjutnya dilakukan pengenceran  3  tingkat  dengan  aquades  steril. Dilakukan  dengan  memasukan  9  ml  air  laut sterilisasi  ke  3  tabung  reaksi.  Kemudian ditambahkan  1  mg  sedimen  sampel  pada tabung pertama dan dihomogenisasi. Kemudian  dari  tabung  pertama  diambil  1  ml untuk dilakukan pengenceran ke tabung kedua dan untuk tabung ketiga perlakuan yang sama (Yunita, 2015).

## Isolasi Bakteri
Pembiakan  bakteri  dengan  teknik pour  plate dimana 1 ml sampel dimasukan ke cawan petri steril  yang  kemudian  dituangkan  media peptone  yeast  agar.  Kemudian  diinkubasi selama  1x24  pada  suhu  29 o C.  Bakteri  yang sudah  tumbuh  dilakukan  purifikasi  bakteri berulang  sampai  mendapatkan  koloni  tunggal dengan  teknik  gores  ( streak  plate  method ) (Pamaya et al., 2018)

## Skrining bakteri toleran logam berat
Skrining  bakteri  toleran  logam  berat  dilakukan dengan  menumbuhkan  bakteri  pada  media peptone  yeast  agar  yang  ditambahkan  logam berat  sebanyak  70  ppm  Pb  dan  medium  agar lainnya  dengan  penambahan  30  ppm  Cu. Penentuan konsentrasi logam berat ini didapat dari uji nilai kandungan logam berat Cu dan Pb yang  ada  di  lapangan.  Diamati  setelah terinkubasi  apakah  bakteri masih  bisa  tumbuh di  media  yang  berlogam  berat  bila  masih dilakukan  penanaman  kembali  ke  media dengan konsentrasi 2 kali dari sebelumnya, hal tersebut  terus  dilakukan  sampai  mendapat konsentrasi logam berat tertentu yang mengakibatkan  bakteri  terdegregasi.  Nilai tersebut  nantinya  menjadi  konsetrasi  paling rendah yang dapat menghambat pertumbuhan koloni atau disebut nilai MIC ( Minimal Inhibitory Concentratio ) (Abidin et al., 2019).

## Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri dilakukan dengan menggunakan  identifikasi  molekuler.  Tahap awal  melakukan  ekstraksi  DNA menggunakan metode  Chelex  (Sutrisno et  al., 2013)  . Microtube steril yang telah disiapkan ditambahkan  dengan  2-3  ose  kultur  bakteri berumur  24  jam.  Microtube  yang  sudah  diisi dengan isolate bakteri selanjutnya ditambahkan  chelex  200  µL  dan  divortex selama 20 detik, kemudian disentrifugasi dalam kecepatan  13.000  rpm  selama  20  detik. Microtube  tersebut  selanjutnya  dimasukan  ke heating  block  dengan  suhu  95 o C  selama  45 menit.  Kemudian  divortek  kembali  selama  20 detik. Suspensi bakteri selanjutnya disentrifugasi  dengan  kecepatan  13.000  rpm selama  2  menit.  Tahap terakhir yaitu memisahkan  supernatan  yang  sudah  terpisah dan  dimasukan  microtube  steril  baru  Tahap kedua  yaitu  dilakukannya  amplifikasi  gen  16S rRNA dengan PCR ( Polimerase Chain Reaction ).  Amplifikasi  PCR  dilakukan  dengan volume sebanyak 25µl. Komposisi bahan yang digunakan  yaitu  1  µl downstream primer,  1  µl upstream primer,  2  µl  DNA template ,  12,5  µl GoTaq  Green  Master  Mix  dan  8,5  µl  ddH 2 O. Proses  PCR  dilakukan  dengan  menargetkan gen 16S rRNA, menggunakan primer universal 27F  (5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') serta primer 1492R (5'-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3'))  (Dos  Santos et  al., 2019).  Siklus  dalam  melakukan  PCR yaitu, initial  denaturation pada  suhu  95 ℃ selama 2 menit, 30 kali denaturation pada suhu 95 ℃ selama 1 menit, annealing pada suhu 55 ℃ selama  30  detik, extention pada  suhu  72 ℃
selama 1 menit , final extention pada suhu 72 ℃ selama 5 menit, dengan suhu akhir 4 ℃ . Tahap ketiga  yaitu  melakukan  visualisasi  hasil  PCR dengan  elektroforesis.  Hasil  PCR  sebanyak  3 µl  dicampukan  dengan  2  µl loading  dye kemudian diletakkan dalam sumur gel agarose 1%.  Elektroforesis  dilakukan  dengan  100 voltase  selama  30  menit.  Proses  selanjutnya yaitu  melakukan  perendaman  gel  agarose dalam ethidium bromide selama 30 menit untuk mewarnai  pita  DNA  yang  terperangkap  di dalamnya.  Pita  DNA  kemudian  dapat  dilihat dengan  sinar  UV  pada  Geldoc  (Sutrino et  al ., 2013).

## Analisis Data
Produk  hasil  PCR  yang  telah  didapatkan kemudian  dikirimkan  ke  PT  Genetika  Science (Jakarta, Indonesia) untuk menentukan sekuens  gen  16S  rRNA.  Sekuens  gen  16S rRNA yang telah diperoleh dilakukan pengeditan  dengan  pensejajaran  sekuens dengan  Clustal-W  menggunakan  software MEGA  X.  Sekuens  yang  memiliki  banyak kemiripan dipotong pada ujung 5’, ujung 3’ atau keduanya (Anafarida dan Badruzsaufar, 2020). Sekuens yang telah sejajar, disamakan dengan data  sekuens  yang  terdapat  pada  Gen  Bank menggunakan Basic  Local  Allignment  Search Tool (BLAST) (Benson et al., 1999).

## HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi bakteri dari sedimen mangrove
Isolasi  dilakukan  menggunakan  metode pour plate dengan  media peptone  yeast  agar (peptone 5 g/L, yeast extract 3 g/L, agar 15 g/L agquades 1 L) (De Fretes et al., 2019). Sampel selanjutnya diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruangan  (27 o C)  dan  dilakukan  pengamatan.
Purifikasi dilakukan pada media peptone yeast agar yang berbeda hingga mendapatkan isolat tunggal murni.

## Penapisan Bakteri Toleran Logam Berat
Penapisan bakteri dilakukan dengan menggunakan  media  pepton  yeast  agar  yang ditambahkan  dengan  garam  logam  berat  Pb dan Cu. Penambahan garam logam Pb dimulai dari 70 ppm dan penambahan logam berat Cu dimulai dari 30 ppm. Penambahan dilakukan 2 kali lipat dari sebelumnya jika masih ada bakteri yang  tumbuh  hingga  terdegradasi  didapatkan yang  toleran  pada  logam  berat.  Hasil penapisan  logam  berat  pada Tabel  1 menunjukan  isolat  bakteri  yang  sedimen mangrove  memiliki  batasan  nilai  70-560  ppm untuk Pb dan 30-120 ppm untuk Cu.
Tabel 1 . Nilai Batasan Logam Berat terhadap Isolat
No. Isolat Bakteri Nilai Batasan Logam Berat (ppm) Pb Cu 1 A1.A 280 120 2 A1.B 560 120 3 A2.A 280 60 4 A2.B - - 5 A3.A 70 30 6 A3.B 140 60 7 B1.A 280 30 8 B1.B 280 - 9 B2.A - 30 10 B2.B 280 60 11 B3.A 280 60 12 B3.B 280 30 13 C1.A 560 60 14 C1.B 280 60 15 C2.A 280 30 16 C2.B 280 60 17 C3.A 280 30 18 C3.B 280 60
Hasil  isolasi  bakteri  dari  sampel  sedimen mangrove  yang  diperoleh  sebanyak  18  isolat yang dapat tumbuh pada media peptone yeast agar dengan ditambahkan 280 ppm logam pb.
Gambar 1 . Kemampuan 17 isolat bakteri yang tumbuh pada medium penambahan Pb 280 ppm

## Identiffikasi molekuler bakteri toleran logam berat
Hasil penelitian menunjukkan jika kemampuan mikroba  berbeda-beda  dalam  ketahahana dalam  logam  berat.  Ikhsan et  al., (2020) menjelaskan  bahwa  mikroba  yang  memiliki daya  tahan  terhadap  logam  berat  karena
bakteri tersebut sudah mengalami perkembangan  mekanisme  detoksifikasi  dan respirasi  yang  menggunakan  logam  berat. Mikroba  tersebut  merupakan  mikroba  yang sudahh beradaptasi dengan lingkungan terkontam logam berat dengan menghilangkan efek racun dari logam berat yang ada.
Berdasarkan hasil Identifikasi molekuler bakteri toleran  logam  berat  dimulai  dari  pemilihan sampel  yang  toleran  dengan  logam  berat  Pb dan  Cu.  Sampel  yang  didapatkan  yaitu  A1.B. Uji  molekuler  yang  telah  dilakukan  hingga tahap  analisis  BLAST  ( Basic  Local  Aligment Search  Tools )  pada  GenBank.  Hasil  yang didapatkan  spesies Bacillus  tropicus. Menurut Jamilah  dan  Amri  (2014),  bahwa Bacillus tropicus merupaka  kelompok  yang  mampu melakukan remediasi logam berat, bakteri lain sebagai contoh yaitu Bacillus sp, Pseudomonas sp,  dan Escherichia  coli .
Kapang, contohnya yaitu Penicillium chrysogenum , Rhizopus stolonifer dan
Aspergillus oryzae , sementara khamir, contohnya yaitu Saccharomyces cerevisae .

## KESIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan dapat disimpulkan bahwa jumlah isolat bakteri
terdiri 18 isolat. Isolat bakteri yang toleran pada logam berat memiliki kode isolat A1.B dan C1.A dengan batas nilai konsentrasi logam berat Pb 560  ppm  dan  logam  berat  Cu  120  ppm.  Hasil identifikasi  menunjukkan  bahwa  isolat  A1.B merupakan bakteri Bacillus tropicus.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terimakasih  ditujukan  kepada  LPPM Universitas  Diponegoro  yang  telah membiayai penelitian  ini  dengan  No.  Kontrak  185- 71/UN7.6.1/PP/2021  skema  Riset  Publikasi Internasional (RPI).

## DAFTAR PUSTAKA
Abidin, A. Z., Renjana, E., & Fatimah, N. M. Uji Toleransi Logam Berat Bakteri Hidrokarbonoklastik dan Uji Kemampuan Micrococcus sp. LII61 dalam Menurunkan Kromium (Cr VI), Tembaga (Cu  II),  Seng  (Zn  II)  Heavy  Metal Tolerance Determination of Hydrocarbon-Degrading Bacterial Strains and Reducing Ability of Micrococcus sp. LII61 Strain
toward. Bioedukasi:  Jurnal  Pendidikan Biologi , 12 (1), 66-73. de Fretes, C. E., Sutiknowati, L. I., & Falahudin,
D. (2019). Isolasi dan identifikasi bakteri toleran  logam  berat  dari  sedimen mangrove  di  Pengudang  dan  Tanjung Uban,  Pulau  Bintan,  Indonesia. OLDI
(Oseanologi
dan Limnologi di Indonesia) , 4 (2), 71-77.
Imran,  A.,  &  Efendi,  I.  (2016).  Inventarisasi mangrove  di  pesisir  pantai  cemara Lombok Barat. JUPE: Jurnal Pendidikan Mandala , 1 (1), 105-112.
Jamilah,  J.,  &  Amri,  A.  Analisis  Bakteri Pengakumulasi  Logam  Berat  Timbal (Pb)  di  Tanah  Pembuangan  Limbah
Industri Non-Pangan. Celebes
Biodiversitas , 2 (2), 7-13. Karimah,  K.  (2017).  Peran  Ekosistem  Hutan Mangrove sebagai Habitat untuk Organisme  Laut. Jurnal  Biologi  Tropis , 51-57.
Pamaya,  D.,  Muchlissin,  S.I.,  Maharani,  E.  T. W.,  Darmawati,  S.  dan  Ethica,  S.N.
(2018).  Isolasi  Bakteri  Penghasil  Enzim
Protase Bacillus Amyloliquedaciens Irod2  pada  Oncom  Merah  Pasca Fermentasi 48 Jam. Jurnal Unimus, 1 (1), 40-46. Ratnakomala,  S.,  Apriliana,  P.,  Fahrurrozi,  F., Lisdiyanti,  P.,  &  Kusharyoto, W.  (2016). Aktivitas  Antibakteri  Aktinomisetes  Laut Dari  Pulau  Enggano. Jurnal  Ilmu-ilmu Hayati , 15 (3), 275-283.
Rosdianto, H., Murdani, E. dan Hendra. (2017). The  implementation  of  POE  (Predict Observe  Explain)  model  to  improve student’s  concept  understanding  on Newton’s law. Jurnal  Pendidikan  Fisika,
6 (1), 55-57.
Sutrisno, I. K., Arundina, I., & Sosiawan, A. (2013). Identifikasi bite marks dengan ekstraksi DNA metode Chelex. Dental Jurnal (Majalah Kedokteran Gigi) , 46 (2),
107-112.
Waluyo, L. (2018). Bioremediasi Limbah :
Limbah (Vol. 1). UMMPress. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A.,
& Lane, D. J. (1991). 16S ribosomal DNA amplification
for phylogenetic
study. Journal  of  bacteriology , 173 (2),
697-703.
Yunita.  S.  (2015). Uji  Kemampuan  Bakteri Bacillus  S1  dan  Azotobacter  S8  untuk Meremoval  Logam  Berat  Kromium . (Doctoral  dissertation,  Institut  Teknologi Sepuluh Nopember).