Menara Perkebunan 2014  82(2), 70-80
Respons molekuler Hevea brasiliensis ethylene response factors

## (HbERFs) sebagai marka ekspresi gen terhadap stimulasi ethephon
pada klon-klon tanaman karet
Moleculer response of Hevea brasiliensis ethylene response factors (HbERFs) as expression marker genes in response to ethephon stimulation in rubber tree clones
Riza Arief PUTRANTO 1) , KUSWANHADI 2) & Pascal MONTORO 3)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana No. 1, Bogor 16128, Indonesia
2) Pusat Penelitian Karet, Jl. Salak No. 1, Bogor 16128, Indonesia
3) Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement, Avenue d'Agropolis, Montpellier 34398, Prancis
Diterima tanggal 8 Oktober 2014/disetujui tanggal 30 Desember 2014

## Abstract
Real-Time  quantitative  RT-PCR technique  is  a sensitive  method  for  measuring  the  accumulation  of  gene transcripts. This widely used technique in a variety of plant species;  including  rubber  tree (Hevea  brasiliensis) must meet  basic  criteria  in  order  to  produce  accurate  gene expression  markers.  Gene  expression  markers  associated to the response of ethephon stimulation  such as the Hevea brasiliensis  Ethylene  Response  Factors  (HbERFs) family has  been  characterized  in  a  single  rubber  clone.  It  is known that the effect of genotype on rubber tree clones can give different expression of the same gene. This difference can be converted into a profile that characterizes clones to a certain trait. This study aimed to identify gene expression profile  in  response  to  ethephon  stimulation  using  six HbERFs (HbORA47,  HbRAP2.3,  HbERF12,  HbERF3, HbABR1,  HbRRTF1) in  three  rubber  tree  clones  having contrasted  latex  metabolism  (PB  260,  SP  217,  and  RRIM 600). Total RNA was isolated from 18 samples and used for cDNA  synthesis.  The  quality  of  cDNAs  was  examined  by PCR using HbActin primer. HbRH2b was selected among the  11 housekeeping genes  to  be  used  as  an  internal control  in  gene  expression  analysis.  Gene  expression analysis resulted to an induction and inhibition of HbERFs by ethephon stimulation which are specific to a  particular clone.  Expression  profile  of  three Hevea clones  showed distinct  characteristics.  The  high  latex  metabolism  clone PB 260 was characterized by the upregulated expression of HbRAP2.3 and HbERF12. The low latex metabolism clone SP 217 was characterized by the upregulated expression of HbRAP2.3 and HbRRTF1 .  Meanwhile,  the  profile  of intermediate latex metabolism clone RRIM 600 was shown by  downregulated  expression  of HbORA47 and  up- regulated  expression  of HbABR1. This  study  shows  that HbERFs gene  family  is  an  important  expression  marker because  it  can  inform  physiological  conditions  of  rubber clones associated in response to ethephon .
[ Keywords: Real-Time  quantitative  RT-PCR ,  expression profile,  transcript  accumulation,  genotype effect, internal control ] .

## Abstrak
Teknik Real-Time  quantitative  RT-PCR merupakan metode  sensitif  untuk  mengukur  akumulasi  transkrip  dari gen.  Teknik  yang  telah  banyak  digunakan  pada  berbagai spesies  tanaman,  termasuk  tanaman  karet  ( Hevea brasiliensis ) ini harus  memenuhi kriteria  dasar agar meng- hasilkan  marka  ekspresi  gen  yang  akurat.  Beberapa  marka ekspresi  gen  terkait  respons  terhadap  stimulasi  ethephon seperti  famili  gen Hevea  brasiliensis  Ethylene  Response Factors  (HbERFs) telah  dikarakterisasi  pada  satu  klon tanaman  karet.  Sebagaimana  diketahui,  efek  genotip  pada klon  tanaman  karet  dapat  memberikan  ekspresi  yang berbeda  dari  gen  yang  sama.  Perbedaan  ekspresi  tersebut dapat  dikonversi  menjadi  sebuah  profil  yang  menjadi karakteristik  klon  karet  terhadap  perlakuan  tertentu. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  profil ekspresi  gen HbERFs pada  tiga  klon  tanaman  karet  (PB 260,  SP 217,  dan  RRIM  600)  yang  memiliki  metabolisme lateks  yang  berbeda  terhadap  respons  stimulasi  ethephon dengan  menggunakan  enam  gen HbERFs ( HbORA47, HbRAP2.3,  HbERF12,  HbERF3,  HbABR1,  HbRRTF1 ) . RNA  total  diisolasi  dari  18  sampel  dan  digunakan  untuk sintesis  cDNA.  Kualitas  cDNA  diperiksa  dengan  PCR menggunakan  primer HbActin .  Gen HbRH2b terseleksi diantara  11  gen housekeeping digunakan  sebagai  kontrol internal  pada  analisis  ekspresi  gen.  Hasil  dari  analisis ekspresi  gen  menunjukkan  bahwa  stimulasi  ethephon memiliki efek induksi dan inhibisi gen yang spesifik untuk klon  tertentu.  Profil  ekspresi  dari  tiga  klon  tanaman  karet yang  diuji  memperlihatkan  perbedaan  karakteristik.  Klon metabolisme  tinggi  PB  260  ditunjukkan  dengan  ekspresi positif  dari  gen HbRAP2.3 dan HbERF12 .  Klon  meta- bolisme  rendah  SP  217  ditunjukkan  oleh  ekspresi  positif gen HbRAP2.3 dan HbRRTF1 .  Sedangkan  klon  metabo- lisme  intermedier  RRIM  600  memiliki  profil  ekspresi negatif  dari HbORA47 dan  ekspresi  positif  dari HbABR1 . Penelitian  ini  memperlihatkan  bahwa  famili  gen HbERFs merupakan  marka  ekspresi  yang  penting  karena  dapat menginformasikan  kondisi  fisiologis  klon  tanaman  karet terkait respons terhadap ethephon.
[Kata  kunci : Real-Time  quantitative  RT-PCR ,  profil ekspresi, akumulasi transkrip, efek genotip, kontrol internal].
*) Penulis korespondensi: rizaputranton@gamil.com
Respons molekuler Hevea brasiliensis ethylene response factors (HbERFs) sebagai marka … (Putranto et al .)

## Pendahuluan
Analisis  ekspresi  gen  telah  banyak  digunakan untuk mengeksplorasi proses biologi. Melalui analisis ini,  akumulasi  mRNA  diukur  menggunakan  metode yang  cepat,  sensitif,  dan reliable .  Saat  ini,  teknik PCR  berbasis  fluorescens  seperti Real-Time  quanti- tative  Reverse  Transcriptase  PCR  (Real  Time  qRT- PCR) merupakan  metode  yang  paling  dapat dihandalkan  untuk  mendeteksi  kelimpahan  mRNA bahkan  dalam  jumlah  yang  rendah  (Ginzinger  2002 ; Udvardi et  al., 2008).  Karena  keunggulannya  dalam sensitivitas  dan  penggunaan  untuk  cakupan  luas, Real-Time  quantitative  RT-PCR dapat  digunakan untuk membandingkan mRNA yang berbeda kemelimpahannya  dalam  populasi  sampel  pada waktu  tertentu  (Rieu  &  Powers  2009 ; Skern et  al., 2005).    Akan  tetapi,  keakuratan  teknik  tersebut sangat  tergantung  pada  cara  sampling,  kualitas template dan  efisiensi  amplifikasi  (Bustin et  al ., 2009). Kehandalan  hasil Real-Time PCR juga sangat tergantung pada kontrol internal yang dipilih (Kozera & Rapacz, 2013). Level ekspresi dari kontrol internal harus  tetap  konstan  pada  berbagai  parameter eksperimental  seperti  perlakuan,  organ  atau  jaringan sampel. Teknik analisis ekspresi gen ini telah banyak menghasilkan  marka  ekspresi  gen  yang  penting dalam  proses  fisiologi  terkait  stres  maupun  perkem- bangan  pada  berbagai  spesies  tanaman  (Zhao et  al ., 2014 ; Wang et al ., 2014 ; Xiong et al ., 2013).
Selama  kurun  waktu  lima  tahun  terakhir, analisis ekspresi gen  menggunakan teknik Real-Time qRT-PCR telah banyak dilakukan pada tanaman karet ( Hevea  brasiliensis Müll.  Arg.),  terutama  yang terkait  respon  stres  pada  saat  penyadapan  lateks (Duan et  al .,  2010 ; Piyatrakul et  al .,  2014 ; Putranto et  al .,  Submitted-a,  Putranto et  al .,  Submitted-b, Putranto et  al .,  2012 ; Qin et  al .,  2014,  Xiao et  al ., 2014 ; Aoki et  al .,  2014).  Hingga  saat  ini, H.  brasi- liensis merupakan  satu-satunya  sumber  komersial lateks  alam.  Toleransi  terhadap  stres  berulang  yang diakibatkan  oleh  penyadapan  lateks  merupakan fenomena  khas  pada  tanaman  karet.  Penyadapan lateks sendiri terdiri dari dua proses  yaitu penyadap- an  panel  batang  tanaman  karet  dan  stimulasi  batang karet  menggunakan  bahan  aktif  pelepas  etilen  yang disebut  ethephon.  Beberapa  penelitian  telah  mem- buktikan  akan  peran  hormon  etilen  terkait  aktivasi metabolisme  latisifer  untuk  produksi  lateks  (Lacote et  al .,  2010 ; Zhu  &  Zhang,  2009),  dimana  proses sinyalisasinya melibatkan famili gen yang dinamakan Ethylene  Response  Factors  (ERFs) . Ethylene Response  Factors merupakan  faktor  transkripsi terakhir  yang  diketahui  dalam  jalur  transduksi hormon  etilen  dan  mengatur  gen-gen downstream yang responsif terhadap etilen  (Chen et al ., 2005).
Famili  gen  tersebut  telah  diidentifikasi  pada H.  brasiliensis dan  termasuk  ke  dalam  superfamili AP2/ERF  ( APETALA2/Ethylene  Response  Factors ) (Duan et al ., 2013 ; Piyatrakul et al ., 2014). Sebanyak 87 H.  brasiliensis  Ethylene  Response  Factors (HbERFs) telah  dikarakterisasi  dalam  konteks biologis  yang  berbeda  seperti  proses  embriogenesis somatik (Piyatrakul et al ., 2012), diferensiasi latisifer (Wu et  al .,  2010),  dan  stres  abiotik  (Chen et  al ., 2012 ; Chen et al ., 2011 ; Putranto et al ., Submitted-a, Putranto et al ., Submitted-b).
Hingga  saat  ini,  analisis  ekspresi  gen  yang  telah dilakukan  terhadap  gen-gen HbERFs masih  terbatas pada  satu  klon  karet  (PB  260)  padahal  diketahui bahwa  gen  yang  sama  tidak  selalu  diekspresikan dengan  cara  yang  sama  pada  genotip  yang  berbeda (Bell et al ., 2013). Ekspresi alel dari gen yang berasal dari  tanaman  induk  (jantan  dan  betina)  dapat memberikan  fenotip  yang  berbeda  dan  membedakan genotip  tanaman  satu  dengan  yang  lainnya  (Guo et  al .,  2004 ; Miko,  2008).  Pada  tanaman  karet,  efek genotip  tersebut  sangat  dikenal  pada  kasus  studi penyakit  Kering  Alur Sadap (KAS) dimana toleransi terhadap  KAS  dikendalikan  oleh  genotip  dari  klon- klon  tanaman  karet  sesuai  jenis  metabolisme lateksnya  yang  dikenal  sebagai  tipologi  klonal (Putranto et  al ., Submitted-a).  Sebagai  contoh,   klon karet  dengan  kadar  sukrosa  tinggi  dan  fosfat inorganik  rendah  terindikasi  memiliki  metabolisme latisifer  yang  rendah  dan  potensi  produksi  lateks yang tinggi. Klon semacam ini memerlukan stimulasi ethephon  untuk  menginduksi  metabolisme  di  dalam latisifer  agar  menghasilkan  lateks  seperti  pada  PB 217  (Eliathe et  al .,  2012).  Sebaliknya,  klon  karet dengan  kadar  sukrosa  rendah  dan  fosfat  inorganik tinggi  memiliki  metabolisme  aktif  yang  mengubah sukrosa  menjadi cis-polyisopren (partikel  karet) seperti PB 260 dan PB 235. Klon ini tidak memerlu- kan  stimulasi  ethephon  untuk  menginduksi  meta- bolisme (Eliathe et al ., 2012).
Di sisi  lain, perbedaan ekspresi gen pada genotip yang  berbeda  dapat  digunakan  untuk  identifikasi profil  respons  molekuler  serta  untuk  mengetahui diversifikasi mekanisme metabolik dari genotip yang berbeda.  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan untuk  mengidentifikasi  profil  ekspresi  gen HbERFs pada tiga klon karet dengan metabolisme lateks yang berbeda  terhadap  respons  stimulasi  ethephon. Optimasi  teknik Real-Time  qRT-PCR dilakukan dengan melakukan validasi kualitas RNA dan cDNA, serta  seleksi  kontrol  internal  untuk  normalisasi  data ekspresi. Enam gen HbERFs ( HbORA47, HbRAP2.3, HbERF12, HbERF3, HbABR1, HbRRTF1 ) digunakan dalam  penelitian  ini  sebagai  marka  ekspresi  gen untuk membedakan tiga klon yang diuji (PB 260, SP 217, dan RRIM 600).

## Bahan dan Metode

## Material tanaman
Tamanan karet ( H. brasiliensis ) yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari klon PB 260, SP 217, dan  RRIM  600  berusia  8  tahun  yang  ditanam  di Kebun  Percobaan  Balai  Penelitian  Karet  Sembawa, Palembang.  Klon-klon  tersebut  dipilih  berdasarkan perbedaan  sistem  metabolisme  lateks  yang  telah diuji :  PB  260  (metabolisme  tinggi),  SP  217  (meta- bolisme  rendah),  dan  RRIM  600  (metabolisme intermediate ) (Putranto et al ., Submitted-a). Total 18 pohon  disadap  setiap  dua  hari  (perlakuan  S2). Stimulasi  ethephon  (ET)  dengan  konsentrasi  2,5% diaplikasikan pada kulit batang sebulan sekali selama satu  tahun  (perlakuan  ET  12/y).  Rancangan percobaan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah sebagai berikut : (1) 3 pohon dari klon PB 260 tanpa  stimulasi  ET;  (2)  3  pohon  dari  klon  PB  260 dengan  stimulasi  ET;  (3)  3  pohon  dari  klon  SP  217 tanpa  stimulasi  ET;  (4)  3  pohon  dari  klon  SP  217 dengan  stimulasi  ET;  (5)  3  pohon  dari  klon  RRIM 600 tanpa stimulasi ET; (6) 3 pohon dari klon RRIM 600  dengan  stimulasi  ET.  Saat  pengambilan  sampel, batang karet disadap dengan potongan setengah spiral untuk  melepaskan  lateks.  Dua  puluh  empat  jam setelah  stimulasi  ET,  sampel  lateks  dikumpulkan  di dalam  tabung  berisi  larutan  bufer  standar.  Sampel disimpan  dalam deep  feezer dengan  suhu -80°C hingga isolasi RNA.

## Isolasi RNA dari lateks tanaman karet
Total  RNA  diisolasi  dari  lateks  dengan  meng- gunakan metode cesium chloride cushion (Sambrook et  al., 1989) yang  telah  dimodifikasi  (Duan et  al ., 2010).  Lateks  dipisahkan  dari  larutan  asam  trikloro- asetat  2.5%  dengan  menggunakan  sentrifugasi  pada 10.000  g  selama  15  menit.  Satu  gram  pelet  lateks segar digiling  menggunakan  mortar dan dipindahkan ke  dalam  tabung  berisi  30  mL  bufer  ekstraksi (guanidium  isothiosianat  4  M, sarcosine 1%,  poli- vinilpirolidon  1%,  dan  ß-merkaptoetanol  1%). Setelah  homogenisasi,  tabung  disimpan  di  es  dan kemudian  disentrifugasi  dengan  kecepatan  10.000  g pada  suhu  4°C  selama  30  menit.  Supernatan dipindahkan ke tabung baru  yang berisi 8  mL 5,7 M CsCl. Ultra sentrifugasi dalam rotor tipe swing bucket dilakukan  dengan  kecepatan  89.705  g  pada  20°C selama  20  jam.  Supernatan  dan cesium chloride dibuang  sementara  pelet  RNA  dicuci  dengan  etanol 70%.  Setelah  dikeringanginkan  selama  30  menit, pelet tersebut dilarutkan dalam 200 µL nuclease-free water .  Untuk  menjamin  kemurnian  RNA,  perlakuan DNase dilakukan dengan menggunakan kit TURBO TM DNA-free (Ambion,  USA).  Konsentrasi dan kemurnian (rasio 260/280  nm) dari RNA diukur dengan menggunakan Infinite® 200PRO NanoQuant (Tecan  Group  Ltd,  Swiss).  Integritas  RNA  total
diperiksa  dengan  elektroforesis.  RNA  kemudian disimpan pada -80 ° C freezer.

## Seleksi pasangan primer spesifik
Primer  spesifik  untuk  mengamplifikasi  gen-gen housekeeping dan Ethylene Response Factors ( ERFs ) pada H. brasiliensis ( HbERFs ) diseleksi berdasarkan penelitian-penelitian  yang  telah  dilakukan  sebelum- nya.  Keenam  gen HbERFs dipilih  berdasarkan  hasil induksi  tinggi  terhadap  respon  ethephon  pada  klon PB 260 (Duan et al ., 2013 ; Piyatrakul et al ., 2012 ; Li et al ., 2011a ; Putranto et al ., 2012). Pasangan primer tersebut disajikan pada  Tabel 1.  Perancangan primer telah  mengikuti  parameter  standar  untuk  digunakan pada  eksperimen Real-Time  qPCR (Li et  al .,  2011b) dan  telah  dimodifikasi  untuk  mendapatkan  spesifitas tinggi  (Piyatrakul et  al .,  2012).  Untuk  memvalidasi kapasitas  amplifikasi  nyata  dari  pasangan  primer yang  didesain,  efisiensi  primer  dihitung  mengguna- kan  analisis  kurva  standar  (Putranto et  al .,  2012). Nilai efisiensi tersebut diperhitungkan dalam analisis ekspresi gen.
Sintesis  cDNA  dan  reaksi  untuk  analisis Real-Time qRT-PCR
Sintesis  utas  pertama  cDNA  dilakukan  meng- gunakan  kit RevertAid TM M-MuLV  reverse  trans- criptase sesuai  dengan  protokol  (MBI,  Fermentas, Kanada).  Kualitas  cDNA  diperiksa  untuk  setiap sampel  dengan  amplifikasi  PCR  menggunakan primer  HbActin  (Putranto et  al .,  2012).  Analisis kuantitatif  ekspresi  gen  dilakukan  menggunakan mesin Real-Time  qPCR  Light  Cycler  480 (Roche Applied  Sciences,  Swiss).  Campuran  reaksi  PCR terdiri  dari  2  µL  cDNA,  0.6  µL  masing-masing primer 5 µM, dan 3 µL 2XSYBR Green PCR Master Mix (LightCycler®  480  SYBR  Green  I  Master, Roche  Applied  Sciences)  dalam  volume  total  6  µL. Kondisi reaksi PCR terdiri dari satu siklus denaturasi pada  suhu  95°  C  selama  5  menit,  diikuti  dengan  45 siklus  amplifikasi  (95°  C  selama  20  detik,  60°  C selama  15  detik,  dan  72°  C  selama  20  detik)  dan pendinginan  pada  suhu  4°C  selama  30  detik. Spesifitas  produk  PCR  divalidasi  menggunakan melting curve tunggal.
Penentuan  kontrol  internal  untuk  analisis  ekspresi gen menggunakan Real-Time qRT-PCR
Real-Time  qRT-PCR dilakukan  pada  sebelas gen housekeeping ( HbelF1Aa,  HbUBC4,  HbUBC2b, HbYLS8,  HbRH2b,  HbRH8,  HbUBC2a,  HbαTub, Hb40S,  HbUbi, dan HbActin )  menggunakan  total  18 sampel  cDNA  untuk  memilih  gen  yang  paling  stabil sebagai  kontrol  internal  dalam  analisis  ekspresi  gen. Kesebelas  gen  tersebut  terpilih  berdasarkan  hasil skrining  dari  data  transkriptomik  tanaman  karet  di CIRAD dan  merupakan  sebelas  gen housekeeping
Respons molekuler Hevea brasiliensis ethylene response factors (HbERFs) sebagai marka … (Putranto et al .)
yang  dapat  digunakan  untuk  analisis  ekspresi  gen (Piyatrakul et  al .  2012).  Nilai crossing-point (Cp) yaitu  siklus  dimana  fluorensi  menjadi  terukur  diatas ambang  batas  dari  tiap  gen  ditentukan.  Kontrol internal  yang  ideal  dan  dapat  digunakan  sebagai reference gene dalam analisis Real-Time qPCR pada tanaman  karet  memiliki  nilai  rata-rata Cp  berkisar pada  siklus  ke  20-25.  Hal  tersebut  didasarkan  pada penelitian  pendahulu  yang  menunjukkan  nilai  Cp terbaik  dari  kontrol  internal  yang  dapat  digunakan untuk  normalisasi  data  ekspresi  gen  (Duan et  al ., 2013 ; Piyatrakul et  al .,  2012 ; Li et  al .,  2011a ; Putranto et  al .,  2012).  Koefisien  variasi  yang menandakan  variasi  dalam  populasi  sampel  dihitung dari standar deviasi (SD) tiap gen / rata-rata nilai Cp dari  total  sampel  uji.  Koefisien  variasi  yang mendekati  nol  menunjukkan  rendahnya  perbedaan Cp  antar  sampel  yang  berarti  stabilnya  ekspresi  gen housekeeping tersebut  dalam  berbagai  kondisi sampel. Gen housekeeping dengan koefisiensi variasi terendah akan dipilih sebagai kontrol internal.
Analisis  ekspresi  gen-gen HbERFs menggunakan Real-Time qRT-PCR
Enam  gen ERF yang  digunakan  dalam  peneli- tian ini ( HbORA47, HbRAP2.3, HbERF12, HbERF3, HbABR1, HbRRTF1 ) merupakan marker ekspresi gen dalam penelitian ekspresi famili gen HbERFs spesifik pada  sel  latisifer  penghasil  lateks  dimana  fungsi putatifnya  telah  diprediksi.  Secara  berurutan  gen tersebut  memiliki  nama  lain  yaitu HbERF-IIb2, HbERF-VIIa20,  HbERF-VIIIa13,  HbERF-VIIIa14, HbERF-Xa8,  HbERF-Xb1 (Piyatrakul et  al .  2012). Jumlah  akumulasi    transkrip  untuk  setiap  gen  di- hitung  dengan  normalisasi  menggunakan  akumulasi transkrip  dari  gen  kontrol  internal . Analisis  tersebut juga  memperhitungkan  efisiensi  primer.  Perhitungan rasio  normalisasi  dari  akumulasi  transkrip  dilakukan secara otomatis  menggunakan Light Cycler Software versi  1.5.0  (Roche)  menggunakan  perhitungan sebagai berikut : Rasio normalisasi = Efisiensi primer -Δ(Cp target-Cp kontrol internal terpilih). Data akhir ditampilkan dalam bentuk histogram.

## Analisis statistik untuk data ekspresi gen
Nilai akumulasi transkrip gen merupakan rata-rata dari  tiga  ulangan  biologis  per  perlakuan.  Analisis statistik  dilakukan  setelah  transformasi  logaritmik dilakukan  dari  data  ekspresi  hasil Real-Time  qRT- PCR .  Analisis  tersebut  membandingkan  akumulasi relatif  transkrip  enam  gen HbERFs antara  tanaman perlakuan  (ethephon)  dan  kontrol  (tanpa  ethephon) pada tiga klon  uji (PB 260, SP 217, dan RRIM 600) yang diuji  menggunakan  ANOVA diikuti dengan uji Newman-Keuls. Semua tes statistik dilakukan dengan menggunakan software XL-STAT (Addinsoft, AS).
Konstruksi  profil  marka  ekspresi  gen  untuk  klon karet
Data  dari  akumulasi  transkrip  gen  setelah  per- lakuan  ethephon  ditransformasi  menjadi  kode  warna berdasarkan upregulation atau downregulation dari setiap  gen  menggunakan  program  Cluster  3.0 (Stanford  University,  AS).  Level  ekspresi  dihitung sebagai  rasio  antara  nilai  rata-rata  akumulasi  relatif transkrip  antara  tanaman  perlakukan  dan  kontrol. Sebuah  rasio  ≥  5.0  dinyatakan upregulated dan ditandai  dengan  warna  merah,  sementara  sebuah rasio  ≤  0,2  dinyatakan downregulated dan  ditandai dengan warna hijau.

## Hasil dan Pembahasan

## Validasi integritas RNA dan sintesis cDNA
Validasi integritas RNA merupakan tahapan awal yang  penting  dalam  analisis  ekspresi  gen.  Kualitas dan kuantitas RNA sangat menentukan pula kuantitas dan  kualitas  cDNA  yang  disintesis  (Fleige  &  Pfaffl 2006). Elektroforesis  pada  gel  agarose  menunjukkan bahwa  RNA  total  hasil  isolasi  dari  lateks  tanaman karet bebas dari kontaminasi DNA (Gambar 1). Hasil pengukuran  konsentrasi  RNA  menggunakan Nano- quant menunjukkan bahwa konsentrasi dan kemurnian  seluruh  sampel  sesuai  untuk  analisis akumulasi  transkrip  dengan  teknik Real-Time  qRT- PCR .  Kemurnian  RNA  (rasio  260/280  nm)  yang diperoleh  berkisar  antara  1.71-1.79  (Gambar  1). Sedangkan,  konsentrasi RNA berkisar antara 141.52- 205.36 ng/µl (data tidak ditampilkan). Salah satu cara untuk  melakukan  validasi  integritas  cDNA  hasil reverse  transcriptase adalah  dengan  menggunakan cDNA sebagai templat untuk amplifikasi PCR meng- gunakan  primer  dari  salah  satu  gen housekeeping , seperti  Actin  (Putranto et  al .,  2012).  Elektroforesis pada  gel  agarose  menunjukkan  bahwa  18  sampel cDNA  tersebut  memiliki  kualitas  yang  baik,  terlihat dari  ketebalan band yang  dihasilkan  (Gambar  2). Reaksi PCR terbukti berjalan dengan baik dipastikan dengan  teramplifikasinya  gen HbActin dari  plasmid yang  mengandung  gen HbActin (kontrol  positif). Panjang  produk  PCR  dari  primer HbActin yang digunakan dalam penelitian ini adalah 195 pb.

## Seleksi kontrol internal untuk analisis ekspresi gen
Dalam  menentukan  ekspresi  relatif  sebuah  gen, hasil  dapat  bervariasi  tergantung  pada  kondisi biologis  sampel  (pengaruh  jaringan  spesifik,  atau ekspresi  pada  waktu  tertentu)  (Skern et  al .,  2005). Seleksi  kontrol  internal  sangat  penting  karena  dapat menormalisasi variasi yang terjadi pada ekspresi gen target (Kozera & Rapacz, 2013). Normalisasi tersebut akan memberikan nilai ekspresi yang terukur secara
Tabel 1.   Sekuen primer 11 gen housekeeping dan enam gen Ethylene Response Factors (ERFs) dari Hevea brasiliensis.
Table 1.   Primer sequences of 11 housekeeping and six Ethylene Response Factors (ERFs) genes from Hevea brasiliensis.
Gambar 1. Profil RNA total hasil isolasi dari lateks tiga klon tanaman karet (PB 260, SP 217, RRIM 600). M : 2-Log DNA ladder. Lajur 1-3 : klon PB 260; tanpa stimulasi ET; dengan tingkat kemurnian 1.79, 1.69, dan 1.77. Lajur 4-6 : klon PB 260; dengan stimulasi ET; dengan tingkat kemurnian 1.71, 1.72, dan 1.75. Lajur 7-9 : klon SP 217; tanpa stimulasi ET; dengan tingkat kemurnian 1.73, 1.73, dan 1.75. Lajur 10-12 : klon SP 217; dengan stimulasi  ET, dengan tingkat kemurnian 1.75, 1.76, dan 1.75. Lajur 13-15 : klon RRIM 600; tanpa stimulasi ET; dengan tingkat kemurnian 1.75, 1.72, dan 1.81. Lajur 16-18 : klon RRIM 600; dengan stimulasi ET, dengan tingkat kemurnian 1.76, 1.78, dan 1.74. Konsentrasi RNA dalam tiap sumur adalah 500 ng.
Figure 1.   Profile of total RNA isolated from latex of three rubber tree clones (PB 260, SP 217, RRIM 600). M : 2-Log DNA ladder. Lane 1-3 : clone PB 260; without ET; with purity level of 1.79, 1.69, and 1.77. Lane 4-6 : clone PB 260; with ET stimulation; with purity level of 1.71, 1.72, and 1.75. Lane 7-9 : clone SP 217; without ET; with purity level of  1.73, 1.73, and 1.75. Lane 10-12 : clone SP 217; with ET stimulation, with purity level of 1.75, 1.76, and 1.75.  Lane 13-15  :  clone  RRIM  600;  without  ET,  with purity  level  of  1.75,  1.72,  and 1.81.  Lane 16-18  :  clone RRIM 600; with ET stimulation; with purity level of 1.76, 1.78, and 1.74. RNA concentration of each well was 500 ng.
Gen / Genes Sekuen primer / Primer sequences Produk PCR / PCR product (pb) Efisiensi primer / Primer efficiency (%) Referensi / Reference Forward (5'-3') Reverse (5'-3') 1. Gen housekeeping HbActin AGTGTGATGTGGATATCAGG GGGATGCAAGGATAGATC 195 97.50 Putranto et al., 2012 HbelF1Aa GCGTGACTATCAGGACGACAA CAAGACCTCCAGCAATACCCT 198 97.60 Li et al., 2011 HbUBC4 TCCTTATGAGGGCGGAGTC CAAGAACCGCACTTGAGGAG 221 99.19 Li et al., 2011 HbUBC2b CGACCAAGTTTTCATTTCGGGTG AGTCTCTTCTTTGCTGGGGTTG 219 96.90 Li et al., 2011 HbUBC2a CATTTATGCGGATGGAAGCA CAGGGGAGTTTGGATTTGGA 197 97.90 Li et al., 2011 HbYLS8 CCTCGTCGTCATCCGATTC CAGGCACCTCAGTGATGTC 213 96.90 Li et al., 2011 HbRH2b GAGGTGGATTGGCTAACTGAGAA G GTTGAACATCAAGTCCCCGAG C 215 98.90 Piyatrakul et al ., 2012 HbRH8 TCACAGGGTTGGTAGATCAG CCAAGCTCTTGCTCAATCC 209 95.80 Li et al., 2011 HbαTUB GGTTGGTAGATCAGGCAGGTTTGG  CAACCACAAAAGTGCAATGG 207 95.00 Duan et al ., 2010 Hb40S ACAGGCTCATCACCTCCAAG CAACCACAAAAGTGCAATGG 211 97.00 Duan et al ., 2010 HbUBI TTATCCAATGCGATCCAACC CAAGGTCAAGGCTCACCAAT 214 91.00 Putranto et al. , 2012
2. Gen-gen Ethylene Response Factors (ERFs)
HbORA47 TCAAGGATGATGAGGAGTAGCA GAACAGATGGTTGTGGTGGA 217 100 Piyatrakul et al ., 2012 HbRAP2.3 AACGTTTCTGGGATTGGAG TTGGAACCCTAAACACACCA 208 100 Piyatrakul et al ., 2012 HbERF12 TTCAACGGAGAAGCCTCAG AGCTCATCGTCAGTCGGTAA 197 100 Piyatrakul et al ., 2012 HbERF3 CACGCCAGCTACTGGTCTTT TACCAGCACTAGCACCACCA 203 100 Piyatrakul et al ., 2012 HbABR1 CATTGGTGTTGGATGTTAGTGG ACTCTGACTGGTGGACTCTCCT 196 100 Piyatrakul et al ., 2012 HbRRTF1 CCTATGATAAGGCGGCGATA TCACTTTCCTTCCCCTTTCC 190 97.50 Piyatrakul et al ., 2012
3000 pb 1000 pb 10000 pb 10000 pb 3000 pb 1000 pb 28S rRNA 18S rRNA 28S rRNA 18S rRNA 74 70
Respons molekuler Hevea brasiliensis ethylene response factors (HbERFs) sebagai marka … (Putranto et al .)
Gambar  2.  Profil  cDNA  dari  hasil  amplifikasi  PCR  menggunakan  primer  standar HbActin .  M  :  2-Log  DNA  ladder.  C-  : kontrol  negatif  (air  bebas  nuklease).  C+  :  kontrol  positif  (plasmid  HbActin).  Lajur  1-3  :  klon  PB  260;  tanpa stimulasi ET. Lajur 4-6 : klon PB 260; dengan stimulasi ET. Lajur 7-9 : klon SP 217; tanpa stimulasi ET. Lajur 10-12 : klon SP 217; dengan stimulasi ET. Lajur 13-15 : klon RRIM 600; tanpa stimulasi ET. Lajur 16-18 : klon RRIM 600; dengan stimulasi ET.
Figure  2.    Profile  of  cDNA  resulted  from  PCR  amplification  using  standar  primer HbActin .  M  :  2-Log  DNA  ladder.  C-  : negative  control  (nuclease  free  water).  C+  :  positive  control  (HbActin  plasmid).  Lane  1-3  :  clone  PB  260; without  ET  stimulation.  Lane  4-6  :  clone  PB  260;  with  ET  stimulation.  Lane  7-9  :  clone  SP  217;  without  ET stimulation.  Lane  10-12  :  clone  SP  217;  with  ET  stimulation.  Lane  13-15  :  clone  RRIM  600;  without  ET stimulation. Lane 16-18 : clone RRIM 600; with ET stimulation.
Gambar  3.  Seleksi  kontrol  internal  dari  gen-gen  housekeeping  pada H.  brasiliensis untuk  analisis  ekspresi  menggunakan Real-Time qRT-PCR . Nilai Cp merupakan rata-rata dari 18 sampel cDNA yang digunakan di penelitian ini. Nilai koefisien  variansi  tercantum  di  sebelah  kanan  histogram.  Standar  deviasi  ditunjukkan  dengan  simbol  batang. Batang merah menunjukkan nilai Cp ideal untuk kontrol internal.
Figure 3.  Selection of internal control of housekeeping genes from H. brasiliensis for expression analysis using Real-Time qRT-PCR . Cp values were mean of 18 cDNA samples used in this research. Coefficient of variance values were shown on the right side of histogram. Standard deviation was shown in bars. Red bar showed an ideal threshold of Cp value for internal control.
relatif    terhadap  kontrol  internal  dan  mencegah ekstrapolasi  data  ekspresi  (Udvardi et  al .,  2008). Dengan demikian, gen kandidat untuk marka ekspresi gen dapat ditentukan lebih akurat.
Dari  total  11  gen housekeeping, tiga  gen  yaitu HbRH2b, HbUBC4, dan HbRH8 memiliki  nilai  rata-
rata Cp yang diharapkan yaitu diantara 20-25 (20.98, 21.56, dan 22.06) serta koefisien variasi yang rendah (0.0270,  0.0287,  dan  0.0300)  dari  seluruh  sampel yang  diuji  (Gambar  3).  Hasil  tersebut  menunjukkan bahwa  rendahnya  variasi  Cp  di  dalam  sampel  sesuai dengan  kriteria  yang  diperlukan  untuk  menjadi
0 5 10 15 20 25 30 35 HbActin HbelF1Aa HbUBC4 H bUBC2b HbUBC2a HbYLS8 HbRH2b HbRH8 ? Hb TUB H b40S HbUBI 0.029 0.051 0.055 0.052 0.043 0.041 0.027 0.030 0.041 0.035 0.028
Crossing point (Cp)
500 pb 500 pb 10000 pb 3000 pb 1000 pb 200 pb 195 pb 195 pb 10000 pb 3000 pb 1000 pb 200 pb
kontrol internal dalam analisis ekspresi gen.  Kontrol internal  yang  memiliki  jumlah  transkrip  yang  relatif stabil  sangat  ideal  digunakan  untuk  normalisasi ekspresi  gen.  Terkait  hal  tersebut,  gen HbRH2b dipilih  sebagai reference  gene dalam  penelitian  ini. Dalam  setiap  percobaan  menggunakan  teknik Real- Time  qPCR, kontrol  internal  harus  selalu  divalidasi karena  kondisi  sampel  yang  dipastikan  bervariasi. Terlebih,  reaksi  sel  pada  tingkat  molekuler  dapat terjadi dalam hitungan detik hingga menit.
Pada beberapa penelitian sebelumnya di tanaman karet,  pemilihan  kontrol  internal  yang  secara  rutin dilakukan  untuk  setiap  analisis  ekspresi  gen  meng- gunakan Real-Time  qRT-PCR memberikan  data ekspresi  yang  lebih  akurat  dan reliable (Piyatrakul et  al .,  2012 ; Piyatrakul et  al .,  2014 ; Putranto et  al ., 2012). Dalam setiap penelitian tersebut, gen HbRH2b yang  merupakan  famili  dari RNA  helicases  DEAD- box ,  memperlihatkan  fungsinya  sebagai  kontrol internal yang stabil.
Ekspresi  enam  gen HbERFs terhadap  stimulasi ethephon pada tiga klon tanaman karet
Penelitian-penelitian  sebelumnya  melaporkan bahwa  gen-gen HbERFs telah  digunakan  sebagai marka  ekspresi  gen  dalam  perkembangan  planlet tanaman  karet  melalui  embriogenesis  somatik  dan dalam  respon  terhadap  stres  abiotik  pada  klon tanaman  karet  PB  260  (Piyatrakul et  al .,  2012 ; Piyatrakul et al ., 2014 ; Putranto et al ., Submitted-b). Pada  penelitian  ini,  enam  gen HbERFs terpilih distimulasi  dengan  ethephon  dan  ekspresi  gennya dianalisis  pada  tiga  klon  tanaman  karet  yang memiliki  sistem  metabolisme  lateks  yang  berbeda. Pemilihan  gen-gen  tersebut  didasarkan  pada  tingkat ekspresi  tinggi  yang  diperlihatkan  dalam  respons terhadap berbagai stres abiotik dan stres penyadapan lateks (Putranto et al ., Submitted-b).
Sesuai  dengan  hipotesis,  gen-gen HbERFs tersebut  memperlihatkan  akumulasi  transkrip  yang berbeda  untuk  tiap  klon  (Gambar  4).  Hal  tersebut membuktikan  bahwa  genotip  dari  klon  karet  dapat mempengaruhi  ekspresi  gen-gen  kunci HbERFs . Untuk  gen HbORA47 ,  akumulasi  transkrip  tidak berbeda secara signifikan pada dua klon karet PB 260 dan  SP  217  yang  memiliki  metabolisme  lateks  yang berlawanan.  Namun,  pengaruh  stimulasi  ethephon signifikan pada klon RRIM 600. Akumulasi transkrip gen  tersebut  pada  tanaman  kontrol  klon  RRIM  600 adalah  sebesar  5.06  x  10 -4 .  Sementara  itu,  perlakuan dengan stimulasi ethephon menghambat ekspresi gen HbORA47 menjadi  sebanyak  6.23  x  10 -5 (0,12  kali lebih  kecil).  Gen HbRAP2.3 memperlihatkan tendensi  yang  berbeda.  Stimulasi  ethephon  mening- katkan  secara  signifikan  akumulasi  transkrip  gen tersebut  untuk  klon  PB  260  dan  SP  217  sebanyak 10.55 (dari 1.21 x 10 -2 menjadi 1.28 x 10 -1 ) dan 9.00
kali (dari 3.79  x 10 -3 menjadi  3.41 x 10 -2 ) dibanding tanaman  kontrol,  secara  berurutan.  Pola  ini  tidak diikuti  oleh  klon  RRIM  600  yang  tidak  memper- lihatkan  beda  nyata  ekspresi  gen HbRAP2.3 antara tanaman  yang  diperlakukan  dengan  stimulasi ethephon dan kontrol menurut analisis statistik. Efek stimulasi  ethephon  pada  gen HbERF12 secara signifikan  hanya  terlihat  pada  klon  PB  260  dengan peningkatan akumulasi transkrip sebanyak 26.54 kali (dari  5.77  x  10 -5 menjadi  1.53  x  10 -3 ).  Profil akumulasi  transkrip  yang  sama  untuk  ketiga  klon ditunjukkan oleh gen HbERF3 .
Hasil  tersebut  dikon-firmasi  oleh  analisis statistik  meskipun  akumulasi  transkrip  gen HbERF3 cukup  tinggi  pada  klon  RRIM  600  setelah  stimulasi ethephon.  Variasi  dari  ketiga  ulangan  biologis  yang tinggi  ditunjukkan  oleh  nilai  deviasi  standar  yang tinggi,  sehingga  nilai  ekspresi  gen  menjadi  tidak signifikan.  Sementara  itu,  gen HbABR1 terinduksi sangat  tinggi  dari  1.61  x  10 -7 menjadi  2.55  x  10 -4 (1583.85  kali  dibanding  tanaman  kontrol)  pada  klon RRIM  600.  Hasil  lain  yang  menarik  adalah  bahwa ekspresi  gen HbABR1 dengan  mengesampingkan efek  ethephon  memperlihatkan  gradien  ekspresi  dari tiga  klon  yang  diuji.  Secara  statistik,  klon  PB  260 memiliki  akumulasi  transkrip  gen HbABR1 yang sangat  rendah  dibanding  SP  217  dan  RRIM  600 (Gambar  4).  Sementara  gen HbRRTF1 memperlihat- kan  akumulasi  transkrip  yang  secara  statistik  lebih superior pada klon PB 260 dan RRIM 600 dibanding klon  SP  217.  Akan  tetapi,  efek  stimulasi  ethephon secara  signifikan  terlihat  pada  klon  SP  217  dengan peningkatan  akumulasi  transkrip  sebanyak  500.77 kali (dari 1 x 10 -8 menjadi 5.01 x 10 -6 ).
Profil  tiga  klon  tanaman  karet  terhadap  perlakuan ethephon  dengan  menggunakan  marka  ekspresi  gen dari HbERFs
Karakteristik  ekspresi  gen-gen HbERFs yang berbeda  untuk  tiap  klon  memiliki  potensi  untuk memetakan klon-klon tanaman karet terhadap sebuah sifat  atau  karakter.  Pemetaan  tersebut  dapat diwujudkan  dalam  bentuk  kode  warna  yang  secara visual  dan  cepat  mampu  mengidentifikasi  respon molekuler dari klon tanaman karet. Dalam penelitian ini,  pemetaan  tersebut  dicontohkan  dalam  profil ekspresi  tiga  klon  tanaman  karet  terhadap  respon perlakuan  ethephon  dengan  menggunakan  enam marka  ekspresi  gen  (Gambar  5).  Klon  PB  260 memiliki  dua  marka  ekspresi  gen upregulated yaitu HbRAP2.3 dan HbERF12 dari  total  enam  marker ekspresi.  Sebagaimana  diketahui,  klon  PB  260  yang memiliki metabolisme aktif termasuk dalam klon tipe quick  starter .  Klon  tipe  tersebut  mampu  mem- produksi lateks dalam jumlah tinggi pada tahun-tahun awal  penyadapan.  Pada  klon  dengan  metabolisme lateks yang tinggi, konsumsi sukrosa sebagai sumber karbon diubah secara cepat menjadi cis-polyisopren
Respons molekuler Hevea brasiliensis ethylene response factors (HbERFs) sebagai marka … (Putranto et al .)
(partikel karet) melalui jalur fermentatif piruvat. Hal tersebut menunjukkan bahwa kondisi hipoksik (kadar oksigen  rendah)  di  dalam  sel  latisifer  dapat  terjadi (Piyatrakul et  al .,  2014).  Gen HbRAP2.3 disinyalir berperan  dalam  pengaturan  homeostasis  kadar oksigen di dalam sel latisifer (Piyatrakul et al ., 2014). Ekspresi  positif  dari  gen HbRAP2.3 disinyalir meningkatkan  ketahanan  sel  latisifer  dalam  kondisi hipoksik sehingga mampu terus menghasilkan lateks. Gen  tersebut termasuk  di  dalam  grup  ERF-VII  yang telah  banyak  dipelajari  pada  tanaman  model Arabidopsis ,  dimana  fungsi  spesifik  dalam  respon terhadap  kadar  oksigen  rendah  dalam  sel  telah dibuktikan (Bailey-Serres et al ., 2012 ; Licausi et  al ., 2011). Di sisi lain, ekspresi tinggi dari gen HbERF12 yang  merupakan  ERF  tipe  represor  (Putranto et  al ., Submitted-b),  menunjukkan  adanya  fungsi  represi terhadap  gen-gen  target HbERF12 yang  hingga  saat ini  belum  diketahui  pada H.  brasiliensis .  Dalam literatur,  faktor  transkripsi  bertipe  represor  ini memiliki  peran  besar  di  dalam  induksi  kematian  sel terprogram  ( programmed  cell  death )  (Ogata et  al ., 2013).  Pada  tanaman  karet,  gen  tersebut  dikaitkan dengan kematian sel dalam kasus penyakit  KAS  dan berpotensi  menjadi  marka  ekspresi  saat  tanaman karet terserang  penyakit  fisiologis  tersebut  (Putranto et al ., Submitted-a).
Disisi  lain,  klon  SP  217  memperlihatkan  profil yang berbeda dengan dua marka ekspresi upregulated yaitu HbRAP2.3 dan HbRRTF1 . Klon SP 217 dikenal sebagai  klon slow  starter dan  toleran  terhadap penyakit KAS (Putranto et al ., Submitted-a). Marker ekspresi  gen HbRRTF1 merupakan  hasil  yang menarik  untuk  klon  tersebut.  Pada  tanaman Arabidopsis ,  gen AtRRTF1 berfungi  sebagai master regulator dari  homeostasis  redox  di  dalam  sel  yang telah  dibuktikan  secara  empirik.  Gen  tersebut  men- jaga  sel  dari  stres  oksidatif  yang  disebabkan  dari kondisi  redox  yang  tidak  terkontrol  (Khandelwal et  al .,  2008).  Hipotesis  yang  dapat  ditarik  pada tanaman karet adalah bahwa HbRRTF1 berpotensi
memiliki fungsi yang sama dalam homeostasis redox dan  menjadi  gen  kunci  sifat  toleran  klon  tersebut terhadap penyakit KAS.
Untuk  klon intermediate seperti  RRIM  600, marka  ekspresi  gen  yang  terlihat  adalah  gen HbORA47 dan HbABR1 .  Yang  menarik,  gen HbORA47 tampil  sebagai  marka  negatif  atau down- regulated oleh  perlakuan  ethephon.  Dalam  literatur, gen AtORA47 pada Arabidopsis thaliana berperan penting  dalam  biosintesis  asam  jasmonat  untuk pertahanan  tanaman  (Pauwels et  al .  2008).  Hal tersebut  menunjukkan  adanya  pengaturan  biosintesis asam  jasmonat  yang  secara  potensial  menjadi  faktor kunci dalam  metabolisme dari klon intermediate ini. Perubahan ekspresi HbORA47 saat serangan penyakit KAS  dapat  diasumsikan  dengan  terjadinya  alterasi biosintesis  jasmonat  akibat  sistem  pertahanan tanaman yang lemah. Pengaturan hormon ini rupanya senada  dengan  gen HbABR1 yang  muncul  sebagai marka positif atau upregulated . Mutan dari gen abr1 pada  tanaman Arabidopsis mengakumulasi  asam absisat  (ABA)  yang  membuktikan  bahwa  gen AtABR1 merupakan  represor  dari  sinyal  ABA  (Chao et al . 2014, Pandey et al . 2005). Hingga saat ini, gen HbABR1 belum  dibuktikan  secara  empiris  pada tanaman  karet  namun  diduga  memiliki  fungsi  yang mirip dengan gen ortholognya yaitu AtABR1 . Percobaan  ini  membuktikan  keunggulan  dan kegunaan dari marka ekspresi gen untuk mengungkap proses biologis yang terjadi pada organisme tanaman. Marka  ekspresi  gen  dapat  menjadi  komponen pelengkap  dalam  proses  identifikasi  materi  tanaman menggunakan  marka  genetik,  seperti  DNA  finger- printing.  Dengan  menggunakan  teknologi high  debit seperti Real-Time  qPCR atau RNA  sequencing pada populasi  sampel  yang  besar,  identifikasi  dan  karak- terisasi  marka  ekspresi  gen  menjadi  lebih  cepat  dan akurat. Pada  masa  yang akan datang, profiling klon- klon karet dengan  menggunakan  marka ekspresi  gen diharapkan dapat ditingkatkan dan diaplikasikan pada populasi klon yang lebih besar.

## Marka ekspresi gen/ Expression marker genes

## PB 260
SP 217

## RRIM 600
Gambar 5. Profil ekspresi tiga klon tanaman karet (PB 260, SP 217, dan RRIM 600) menggunakan enam marka ekspresi gen terhadap  respon  perlakuan  ethephon. Upregulated marker  ditampilkan  dengan  warna  merah  sedangkan downregulated marker  ditampilkan  dengan  warna  hijau.    Data  yang  tidak  signifikan  dan  gen  tidak  terekspresi ditampilkan dengan warna hitam.
Figure 5.   Expression profile of three rubber tree clones (PB 260, SP 217 and RRIM 600) using six expression marker genes in response to ethephon treatment. Upregulated marker was shown in red colour, while downregulated marker was in green. Non significant data or unexpressed gene(s) were shown in black.

## Kesimpulan
Dalam  penelitian  ini  telah  ditunjukkan  peng- gunaan  marka  ekspresi  gen  untuk  memetakan karakteristik  klon-klon  karet  terhadap  respons perlakuan  ethephon.  Pemetaan  pada  level  transkripsi tersebut mampu membangun hipotesis tentang proses fisiologis  di  dalam  genotip  serta  membedakan  klon satu  dengan  yang  lainnya..  Kelima  gen  dari  famili gen HbERFs ( HbORA47,  HbRAP2.3,  HbERF12, HbABR1,  HbRRTF1 )  merupakan  marka  ekspresi yang terbukti penting karena dapat digunakan sebagai pembeda  antara  tiga  klon  tanaman  karet  yang  diuji. Gen-gen  tersebut  memiliki  fungsi  potensial  dalam metabolisme  dan  ketahanan  terhadap  cekaman  stres yang  diduga  memiliki  korelasi  langsung  dengan peningkatan produksi lateks.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada Institut  Français  de  Caoutchouc  (IFC),  Michelin, Socfinco  dan  SIPH  yang  telah  mendanai  penelitian ini.  Ucapan  terima  kasih  juga  disampaikan  kepada Maryannick Rio atas bantuan teknisnya.

## Daftar Pustaka
Aoki Y, S Takahashi, D Takayama, Y Ogata,    N Sakurai, H  Suzuki,  K  Asawatreratanakul,  D  Wititsuwannakul, R  Wititsuwannakul,  D  Shibata,  T  Koyama  & T  Nakayama  (2014)  Identification  of  laticifer-specific genes and their promoter regions from a natural rubber producing plant Hevea brasiliensis . Plant Sci 225, 1-8.
Bailey-Serres  J,  T  Fukao,  D  J  Gibbs,  MJ  Holdsworth, SC Lee, F Licausi, P Perata, LA CJ Voesenek & JT van Dongen  (2012)  Making  sense  of  low  oxygen  sensing.
Trends in Plant Sci 17, 129-138.
Bell GDM,  NC  Kane,  LH Rieseberg &  KL  Adams (2013)
RNA-Seq analysis of allele-specific  expression, hybrid effects, and regulatory divergence in hybrids compared with  their  parents  from  natural  populations. Genome Biol & Evolut 5, 1309-1323.
Bustin  SA,  V  Benes,  JA  Garson,  J  Hellemans,  J  Huggett, M  Kubista,  R  Mueller,  T  Nolan,  MW  Pfaffl, GL  Shipley,  J  Vandesompele  &  CT  Wittwer  (2009)
The  MIQE  Guidelines:  minimum  information  for publication of quantitative real-time PCR  experiments.
Clinical Chem 55, 611-622.
Chao  WS,  M  Doğramaci,  JV  Anderson,  ME  Foley  & DP  Horvath  (2014)  The  resemblance  and  disparity  of gene expression in dormant and non-dormant seeds and crown  buds  of  leafy  spurge  ( Euphorbia  esula ). BMC Plant Biol 14, 216.
Chen  YF,  N  Etheridge  &  GE  Schaller  (2005)  Ethylene signal transduction. Ann Bot 95, 901-15.
Chen YY, LF Wang, LJ Dai, SG Yang & WM Tian (2012) Characterization  of  HbEREBP1,  a  wound-responsive
transcription  factor  gene  in  laticifers  of Hevea brasiliensis Muell. Arg. Mol Biol Rep 39, 3713-9.
Chen  YY,  LF  Wang,  SG  Yang  &  WM  Tian  (2011)
Molecular characterization of HbEREBP2 , a jasmonate-  responsive  transcription  factor  from Hevea brasiliensis Muell. Arg. African J Biotechnol 10, 9751- 9759.
Duan  C,  X  Argout,  V  Gébelin,  M  Summo,  JF  Dufayard,
J  Leclercq,  K  Hadi,  P  Piyatrakul,  J  Pirrello,  M  Rio, A Champion & P Montoro (2013) Identification of the Hevea  brasiliensis AP2/ERF  superfamily  by  RNA sequencing. BMC Genomics 14, 30.
Duan  C,  M  Rio,  J  Leclercq,  F  Bonnot,  G  Oliver  &
P Montoro (2010) Gene expression pattern in response to  wounding,  methyl  jasmonate  and  ethylene  in  the bark of Hevea brasiliensis . Tree Physiol 30, 1349-59.
Eliathe  EAA,  KK  Edmond,  OK  Mathurin,  LY  Justin, NAS  Pierre,  D  Kouadio  &  S  Abdourahamane  (2012) Detection  of Hevea  brasiliensis clones  yield  potential and  susceptibility  to  tapping  panel  dryness  in  Côte d’Ivoire  using  the  32  and  35  KDa  lutoidic  proteins.
African J Biotechnol 11, 10200-10206.
Fleige S & MW Pfaffl (2006) RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects of Medicine 27, 126-139.
Ginzinger  DG  (2002)  Gene  quantification  using  real-time quantitative PCR. Experiment Hematol 30, 503-512.
Guo M, MA Rupe, C Zinselmeier, J Habben, BA Bowen & OS Smith (2004) Allelic Variation of Gene Expression in  Maize  Hybrids. The  Plant  Cell  Online 16,  1707- 1716.
Khandelwal  A,  T  Elvitigala,  B  Ghosh  &  RS  Quatrano (2008) Arabidopsis transcriptome  reveals  control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol 148, 2050-8.
Kozera B & M Rapacz (2013) Reference genes in real-time PCR. J Appl Genet 54, 391-406.
Lacote,  R.,  O.  Gabla,  S.  Obouayeba,  J.  M.  Eschbach,  F. Rivano,  K.  Dian  &  E.  Gohet  (2010)  Long-term  effect of  ethylene  stimulation  on  the  yield  of  rubber  trees  is linked  to  latex  cell  biochemistry. Field  Crops Research, 115 , 94-98.
Li,  H.,  Y.  Qin,  X.  Xiao  &  C.  Tang  (2011a)  Screening  of valid  reference  genes  for  real-time  RT-PCR  data normalization  in Hevea  brasiliensis and  expression validation of a sucrose transporter gene HbSUT3. Plant Sci, 181 , 132-9.
Li, L.-Y., Q. Li, Y.-H. Yu, M. Zhong, L. Yang, Q.-H. Wu, Y.-R.  Qiu  &  S.-Q.  Luo  (2011b)  A  primer  design strategy  for  PCR  amplification  of  GC-rich  DNA sequences. Clinical Biochemistry, 44 , 692-698.
Licausi,  F.,  M.  Kosmacz,  D.  A.  Weits,  B.  Giuntoli,  F.  M. Giorgi,  L.  A.  Voesenek,  P.  Perata  &  J.  T.  van Dongen(2011) Oxygen sensing in plants is mediated by an  N-end  rule  pathway  for  protein  destabilization. Nature, 479 , 419-22.
Respons molekuler Hevea brasiliensis ethylene response factors (HbERFs) sebagai marka … (Putranto et al .)
Miko  I  (2008)  Phenotype  variability:  penetrance  and expressivity. Nature Education 1, 137.
Ogata  T,  Y  Kida,  M  Tochigi  &  Y  Matsushita  (2013)
Analysis  of  the  cell  death-inducing  ability  of  the ethylene  response  factors  in  group  VIII  of  the AP2/ERF family. Plant Sci 209, 12-23.
Pandey  GK,  JJ  Grant,  YH  Cheong,  BG  Kim,  L  Li  &
S  Luan  (2005)  ABR1,  an  APETALA2-domain  trans- cription  factor  that  functions  as  a  repressor  of  ABA response in Arabidopsis . Plant Physiol 139, 1185-93.
Pauwels  L,  K  Morreel,  E  De  Witte,  F  Lammertyn,            M Van  Montagu,  W  Boerjan,  D  Inze  &  A  Goossens (2008)  Mapping  methyl  jasmonate-mediated  trans- criptional reprogramming of metabolism and cell cycle progression in cultured Arabidopsis cells. In : Proc Natl Acad Sci U S A, 105, 1380-5.
Piyatrakul  P,  RA  Putranto,  F  Martin,  M  Rio,  F  Dessailly,
J Leclercq, JF Dufayard, L Lardet & P Montoro (2012) Some ethylene biosynthesis and AP2/ERF genes reveal a specific pattern of expression during somatic embryo- genesis in Hevea brasiliensis . BMC Plant Biol 12, 244.
Piyatrakul P, M Yang, RA Putranto, J Pirrello, F Dessailly, S  Hu,  M  Summo,  K  Theeravatanasuk,  J  Leclercq, Kuswanhadi  &  P  Montoro  (2014)  sequence  and expression analyses of ethylene response factors highly expressed in latex cells from Hevea brasiliensis . PLoS ONE, 9, e99367.
Putranto  RA,  E  Herlinawati,  M  Rio,  P  Piyatrakul,  A Clément-Demange,  E  Gohet,  C  Sanier,  J  Pirrello, J  Leclercq,  Kuswanhadi  &  P  Montoro  (Submitted-a)
Regulation  of  ethylene  biosynthesis  and  signalling pathways,  and  ROS-scavenging  systems  in  Tapping Panel Dryness of Hevea brasiliensis . Tree Physiol .
Putranto RA, Kuswanhadi, C Duan, T Chaidamsari, M Rio, P  Piyatrakul,  E  Herlinawati,  J  Pirrello,  F  Dessailly, J  Leclercq,  F.  Bonnot  &  P.  Montoro  (Submitted-b) ERFs  are  controlled  by  multiple  harvesting  stresses  in
Hevea brasiliensis . PLoS ONE .
Putranto  RA,  C  Sanier,  J  Leclercq,  C  Duan,  M  Rio,
C Jourdan, P Thaler, X Sabau, X Argout & P Montoro (2012)  Differential  gene  expression  in  different  types of Hevea brasiliensis roots. Plant Sci 183, 149-58.
Qin Y, Y Huang, Y Fang, J Qi & C Tang (2014) Molecular characterization  and  expression  analysis  of  the  small GTPase  ROP  members  expressed  in  laticifers  of  the rubber  tree  ( Hevea brasiliensis ). Plant  Physiol  & Biochem 74, 193-204.
Rieu  I  &  SJ  Powers  (2009)  Real-Time  quantitative  rt-pcr: design,  calculations,  and  statistics. The  Plant  Cell Online 21, 1031-1033.
Sambrook    J,  EF  Fritsch  &  T  Maniatis  (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual . CHS Press.
Skern  R,  P  Frost  &  F  Nilsen  (2005)  Relative  transcript quantification  by  auantitative  PCR:  Roughly  right  or precisely wrong? BMC Mol Biol 6, 10.
Udvardi MK, T Czechowski & WR Scheible (2008) Eleven golden  rules  of  quantitative  RT-PCR. Plant  Cell 20, 1736-7.
Wang H, Q  Xu, YH Kong, Y Chen, JY Duan, WH Wu & YF  Chen  (2014) Arabidopsis WRKY45  Transcription factor  activates  phosphate  transporter1;1  expression  in response  to  phosphate  starvation. Plant  Physiol 164, 2020-2029.
Xiao  X,  C  Tang,  Y  Fang,  M  Yang,  B  Zhou,  J  Qi  & Y Zhang (2014) Structure and expression profile of the sucrose  synthase  gene  family  in  the  rubber  tree: indicative  of  roles  in  stress  response  and  sucrose utilization in the laticifers. FEBS J 281, 291-305.
Xiong AS, HH Jiang, J  Zhuang, RH Peng, XF Jin, B Zhu,
F  Wang,  J  Zhang  &  QH  Yao  (2013)  Expression  and function  of  a  modified  AP2/ERF  transcription  factor from Brassica napus enhances  cold  tolerance  in transgenic Arabidopsis. Mol Biotechnol 53, 198-206.
Zhao S, QT Jiang, J Ma, XW Zhang, QZ Zhao, XY Wang,
CS  Wang,  X  Cao,  ZX  Lu,  YL  Zheng  &  YM  Wei (2014)  Characterization  and  expression  analysis  of WOX5 genes from  wheat and  its relatives. Gene 537, 63-69.
Zhu  J  &  Z  Zhang  (2009)  Ethylene  stimulation  of  latex production  in Hevea  brasiliensis . Plant  Signaling  & Behavior, 4 , 1072-1074.