Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.7 No.2 Desember 2020 Hal 55 -63 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN:2808-1048 DOI: http://dx.doi.org/10.20473/bikfar.v7i2.29303
Cite this as Chusnul Chatimah, Sugijanto. Achmad Toto Poernomo (2020 Validasi Metode KLT-Densitometri Pada Penetapan Kadar (- )-Epigallocatechin Gallate (EGCG) Dalam Teh Hijau7(2), 35-63
This is an open access article under the CC BY-NC-ND license ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ )

## Validasi Metode KLT-Densitometri Pada Penetapan Kadar (-)-Epigallocatechin Gallate (EGCG) Dalam Teh Hijau
Chusnul Chatimah 1 Sugijanto 1 . Achmad Toto Poernomo*
1 Department of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Universitas Airlangga, Surabaya, East Java, Indonesia
*Corresponding author E - mail: achmad-t-p@ff.unair.ac.id
Article History
Received: 12 juli 2020; Received in Revision: 23 Agustush 2020; Accepted: 1 Oktobr 2020

## ABSTRACT
Background Tea  leaves  (Camellia  sinensis  L.)  has  many  health  benefits.  Green  tea  leaves contain  many  polyphenol  compounds  in  high  levels,  among  others,  catechin  derivates epicatechin  (EC),  epigallocatechin  (EGC),  epicatechin  gallate  (ECG)  and  epigallocatechin gallate  (EGCG).  The  most  dominant  bioactive  component  is  EGCG.  A  simple  TLC- Densitometry methode  has  been  developed  for  the  determination  of  (-)-Epigallocatechin gallate  in  green  tea  product.  Methode uses  silica  gel  F  254  as  a  stationer  phase  and chloroform-acetic  acid-formic  acid-isopropanol  (16:2:2:8)  as  a  mobile  phase . Result  The maximum wavelength was detected at 278 nm. Linearity respon was found (-)-Epigallocatechin gallate between  0,5043 µg–2,5215 µg with regression of equation Y = 5409,8 X – 569,97 (r = 0,9996; Vxo= 3,94%). The methode was validated to determine the imit detection (0,0188 µg), limit  quantitation  (0,0627µg),  accuracy  (91,41%),  precission  for EGCG  standart  (4,47%)  and precission of methode (7,01%). Conclusion these results demonstrate that EGCG in green tea products can be detected by TLC-Densitometry method. By using method, EGCG concentration in green tea products is 3,33%.
Keyword : (-)-Epigallocatechin gallate, EGCG, tea, TLC-Densitometry, validation

## ABSTRAK
Latar Belakang Daun teh (Camellia sinensis L.) memiliki banyak manfaat untuk kesehatan. Daun teh hijau mengandung banyak senyawa polifenol dalam kadar tinggi, antara lain turunan catechin epicatechin  (EC),  epigallocatechin  (EGC),  epicatechin  gallate  (ECG)  dan  epigallocatechin gallate (EGCG). Komponen bioaktif yang paling dominan adalah EGCG. Sebuah metode TLC- Densitometry  sederhana  telah  dikembangkan  untuk  penentuan  (-)-Epigallocatechin  gallate dalam produk teh hijau. Metode ini menggunakan silika gel F 254 sebagai fase diam dan fase gerak  kloroform-asam  asetat-asam  format-isopropanol  (16:2:2:8).  Hasil  Panjang  gelombang maksimum  terdeteksi  pada  278  nm.  Respon  linieritas  ditemukan  (-)-Epigallocatechin  gallate antara 0,5043 g–2,5215 g dengan regresi persamaan Y = 5409,8 X – 569,97 (r = 0,9996; Vxo= 3,94%).  Metode  divalidasi  untuk  menentukan  deteksi  tiruan  (0,0188  g),  kuantisasi  batas (0,0627µg),  akurasi  (91,41%),  presisi  untuk  standar  EGCG (4,47%)  dan  presisi  metode  (7,01 %). Kesimpulan hasil ini menunjukkan bahwa EGCG dalam produk teh hijau dapat  dideteksi dengan  metode  TLC-Densitometry.  Dengan  menggunakan  metode,  konsentrasi  EGCG  pada produk teh hijau adalah 3,33%.
Kata kunci : (-)-Epigallocatechin gallate, EGCG, teh, KLT-Densitometri, validasi

## Research Article
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.7 No.2 Nopember 2020 Hal 1 - 7 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN
Cite this as: Afrilia Diana Fitri, Achmad Toto Poernomo, Muhammad Faris Adrianto (2020),  Pengaruh Sumber Karbon Organik Terhadap Produksi Protease Fibrinolitik Bacillus Sphaericus BM 9.1 Dengan Solid State Fermentation 7(2), 1-7

## Pendahuluan
Teh  merupakan  salah  satu  minuman  yang  sangat populer,  banyak  diminati  masyarakat  didunia.  Teh berasal  dari  tanaman  perdu  Camellia  sinensis  suku ”Theaceae”,  yang  memiliki  rasa  dan  aroma  yang khas.  Dibeberapa  negara  Asia  seperti  Cina  dan Jepang,  teh  merupakan  minuman  sehari-hari  dan banyak  disukai.  Daun  teh  mengandung  tiga komponen  penting  yang  mempengaruhi  mutu minuman  yaitu  kafein  yang  memberikan  efek stimulant,  tannin  yang  memberi  kekuatan  rasa  dan polifenol  yang  memiliki  banyak  khasiat  untuk kesehatan (Hartoyo, 2003).
Senyawa  polifenol  pada  teh  hijau  memiliki  kadar yang  tinggi  antara  lain  :  catechin  (C)  0,08%, epicatechin  (EC)  0,41%,  epigallocatechin  (EGC) 0,39%,  epicatechin  gallate  (ECG)  0,65%  dan epigallocatechin  gallate  (EGCG)  3,28%.  Komponen bioaktif yang paling dominan adalah EGCG. EGCG dalam  teh  hijau  banyak  berkhasiat  bagi  kesehatan salah  satunya  dapat  sebagai  antioksidan  kuat  dan sebagai antikarsinogenik (Hartoyo, 2003).
Polifenol  teh  hijau  juga  dapat  mencegah  terjadinya kanker  dibandingkan  polifenol  teh  hitam  (Fulder, 2004). Teh hijau telah banyak dikonsumsi masyarakat dimana  diketahui  bahwa  kandungan  EGCG  dari  teh hijau  paling  banyak  memberikan  manfaat  bagi kesehatan, oleh sebab itu perlu adanya dikembangkan metode  yang  valid  untuk  menetapkan  kadar  EGCG dalam produk teh hijau.
Dalam produk teh hijau, dijumpai banyak komponen- komponen lain selain golongan katekin. Diantaranya adalah  golongan  alkaloid  yaitu:  xantin,  teophyillin, teobromin,  tearubigin,  kafein,  minyak  atsiri  dan fluorid.  Oleh  karena  itu  dibutuhkan  metode  untuk memisahkan  EGCG  dari  komponen  yang  lainnya. Metode  yang  banyak  digunakan  untuk  pemisahan suatu  campuran  zat  dalam  suatu  sampel  biologis adalah  metode  kromatografi.  Teknik  kromatografi merupakan  suatu  teknik  pemisahan  fisik  suatu campuran zat kimia dalam suatu komponen campuran yang  terpisah  pada  fase  diam  dibawah  pengaruh pergerakan fase gerak.
Pada  penelitian  ini  akan  digunakan  dengan  metode KLT-Densitometri. Sampai saat ini belum ditemukan validasi penetapan kadar EGCG yang terdapat dalam teh  hijau.  Disamping  itu  belum  pernah  ada standarisasi  EGCG dalam produk teh hijau, padahal kandungan EGCG tersebut  memiliki banyak khasiat untuk  kesehatan  masyarakat.  Teknik  kromatografi dengan  KLT-Densitometri  merupakan  suatu  teknik pemisahan yang popular, lebih mudah dilaksanakan,
sederhana  dan  biaya  yang  relatif    lebih  murah daripada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Fried & Sherma, 1994).
Dilihat  dari  strukturnya,  EGCG  dalam  teh  hijau  ini bersifat  polar  dimana  memiliki  gugus  auksokrom yaitu  gugus  OH (hidroksil)  yang  terikat  pada  cincin aromatis  dan  gugus  kromofor  yaitu  ikatan  rangkap terkonyugasi yang akan menyerap radiasi gelombang elektromagnetik  pada  panjang  gelombang  270  nm. Maka dapat dideteksi dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis  (Wu et al., 2000).
Berdasarkan  polaritas  dari  EGCG,  maka  fase  diam yang digunakan adalah silika gel GF 254 yang stabil terhadap  eluen  dengan  kandungan  air  yang  cukup tinggi  (Kantasubrata,  1991).  EGCG  merupakan polifenol, dimana untuk golongan ini pada umumnya fase  gerak  yang  dipakai  adalah  metanol-asam- asetat:air  (19:1:1)  (Heftmann,  1983),  metanol-asam asetat-air (20:5:75) (Sakata et  al., 1991), kloroform- metanol-air (65:35:10) (Amarowicz, 2003), kloroform-asam  asetat-asam  formiat-isopropanol (16:1,5:1,5:8)  (Zulkarnain,  1997)  dan        kloroform- asam  asetat-asam  formiat-isopropanol  (16:2:2:8). Dari  hasil  eluasi  dengan  menggunakan  fase  gerak- fase gerak tersebut, maka akan di cari fase gerak yang sesuai  yang  dapat  memisahlan  EGCG  dari kandungan-kandungan yang lainnya.
Menurut  USP XXIV NF  19 (2000) Validasi  metode dengan  KLT-Densitometri  meliputi  selektivitas, linearitas, batas deteksi (BD),  batas kuantitasi (BK), akurasi dan presisi. Metode ini akan diterapkan untuk menetapkan kadar EGCG dalam salah satu produk teh hijau..

## Material and Methods
Bahan Sampel produk teh hijauBaku/standar EGCG (Sigma),Metanol p.a (E.Merck),Etil asetat (E.Merck), Asam asetat (E.Merck), Kloroform p.a (E.Merck),Asam formiat (E.Merck),Isopropanol (E.Merck),Lempeng KLT silika gel F 254 (E.Merck),Aquades Kertas saring

## Alat
TLC  Densitometer  Shimadzu  CS  930,Bejana kromatografi
Pipa  kapiler,Timbangan  analitik  Sartorius  dengan kepekaan 0,0001 g,Direct reading micro balance L/M Shimadzu,Alat-alat gelas

## Validasi Metode Analisis Selektifitas Pembuatan Larutan Baku Induk EGCG
Ditimbang teliti  dengan neraca mikro analitik 5,000 mg  standar  EGCG  kemudian  dilarutkan  dengan metanol  dalam  labu  ukur  10,0  mL  sehingga didapatkan larutan baku EGCG 500 ppm.

## Penyiapan Fase Diam dan Fase` Gerak
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.7 No.2 Desember 2020 Hal 55 - 63 P-ISSN: 2302-8270

## E-ISSN
Fase  diam  yang  digunakan  adalah  silika  gel  F  254. Fase  gerak  yang  dipakai  adalah  metanol:asam asetat:air  (20:5:75)  (Heftmann,  1983);  kloroform- asam  asetat-asam  formiat-isopropanol  (16:1,5:1,5:8) (Zulkarnain,  1997)  dan  kloroform-asam  asetat-asam formiat-isopropanol  (16:2:2:8).  Untuk  pemeriksaan secara kualitatif dilakukan dengan cara menotolkan 2 macam larutan yaitu :
(1) larutan baku EGCG 150,6 ppm
(2) larutan produk teh hijau yang telah diekstraksi
Kedua  larutan  diatas  ditotolkan  sebanyak  10  µL, dieluasi  dengan  3  macam  fase  gerak  tersebut.  Dari ketiga  macam  fase  gerak  tersebut  akan  dicari  fase gerak  yang  dapat  memisahkan  EGCG  dari komponen-komponen yang lainnya.

## Penentuan Panjang Gelombang Terpilih
Larutan baku 150,6 ppm, ditotolkan pada pelat KLT silika  gel  F  254  sebanyak  10µL,  kemudian  dieluasi dengan  fase  gerak  terpilih.  Noda  yang  diperoleh diamati  spektrum  absorban-reflektannya  dengan Densitometer.         Panjang gelombang terpilih dapat berupa panjang gelombang yang memberikan puncak paling tinggi.

## Ekstraksi EGCG  dalam Produk Teh Hijau
Ditimbang  teliti  sampel  produk  teh  hijau  sebanyak 0,0800 g dengan neraca analitik, dimasukkan dalam 10  ml  air  panas  (±  80-900C)  dalam  beker  gelas, kemudian  didiamkan  selama  30  menit,  setelah  itu disaring dengan kertas saring dan dimasukkan dalam labu ukur 25,0 ml. Kemudian serbuk teh dibilas lagi dengan air panas 10 ml, didinginkan dan dimasukkan dalam  labu  ukur  tersebut  dan  dibilas  lagi  dan ditambah air sampai volume ad 25,0 ml. Dari larutan tersebut  diambil  10,0  ml  dimasukkan  dalam  corong pisah  kemudian  ditambahkan  kloroform  sebanyak  5 ml  dan  dikocok  pelan.  Hal  ini  diulang  sebanyak  2 kali.      Fase  kloroform  dibuang,  kemudian  fase  air ditampung,  kemudian  diekstraksi  lagi  dengan  etil asetat  masing-masing  sebanyak  10,0  ml.  Hal  ini diulang sebanyak 3 kali. Setelah itu fase air dibuang, kemudian  fase  etil  asetat  ditampung  dalam  cawan porselen  dan  diuapkan  dalam  lemari  asam  sampai kering.                     Hasil yang diperoleh dilarutkan dengan metanol, dimasukkan dalam labu ukur sampai volume  ad  10,0  ml.  Larutan  ditotolkan  sebanyak 10 µL,  dieluasi  dengan  fase  gerak  terpilih,  kemudian noda yang diperoleh diamati menggunakan Densitometer (Shirai et al., 1994).
Penentuan Faktor Retardasi (Rf), Faktor Selektifitas (α) dan Derajat Keterpisahan/Resolusi (Rs)
Larutan sampel yang telah diekstraksi ditotolkan pada pelat KLT silika gel F 254 sebanyak 10 µl, kemudian
dihitung nilai Rf, α dan Rs nya. Nilai Rf , α dan Rs dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Rf =  Harga Rf  yang baik umumnya berkisar 0,2-0,8 (Fried & Sherma, 1994).
α =  Dimana:
α =   faktor selektifitas tRA =   waktu tambat komponen A
tRB =   waktu tambat komponen B
Untuk  pemisahan  yang  baik  ditunjukkan  dengan harga α > 1 artinya kedua komponen dapat terpisah, sedangkan  jika  α  =  1,  artinya  komponen  A  tidak terpisah.
Dimana:
tRA =   Jarak yang ditempuh oleh analit A
tRB =   Jarak yang ditempuh oleh analit B W1 =   lebar noda analit A W2 =   lebar noda analit B Rs
=   Resolusi
Resolusi/derajat keterpisahan sebaiknya > 1,5 (Fried & Sherma, 1994).

## Linieritas
Untuk menentukan linieritas, dibuat kurva hubungan antara  konsentrasi  dan  area  EGCG  pada  berbagai macam  konsentrasi.  Ditimbang  teliti  5,000  mg dengan  neraca  mikro  analitik  kemudian  dibuat  5 macam  konsentrasi  50-150%  dari  kadar  analit  yang diperkirakan  (Indrayanto  &  Yuwono,  2002). Konsentrasi yang akan dibuat yaitu 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm dan 250 ppm. Konsentrasi tersebut dibuat  dengan  cara  melarutkan  5,000  mg  EGCG standar  dengan  metanol  sampai  volume  ad  10,0  ml dalam  labu  ukur  sehingga  didapatkan  larutan  baku induk  500 ppm. Dari larutan induk 500 ppm dipipet 0,5  ml;  1,0  ml;  2,0  ml  masing-masing  diencerkan dengan  metanol  sampai  volume  ad  5,0  ml  sehingga didapatkan  konsentrasi  50  ppm;  100  ppm  dan  200 ppm.  Untuk  konsentrasi  250  ppm  dibuat  dengan memipet  5,0  ml  baku  induk,  diencerkan  dengan metanol sampai volume ad 10,0 ml. Dari konsentrasi 250 ppm dipipet 3,0 ml, kemudian diencerkan dengan
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.7 No.2 Desember 2020 Hal 55 - 63 P-ISSN: 2302-8270

## E-ISSN
metanol  sampai  volume  ad  5,0  ml  sehingga  didapat konsentrasi 150 ppm.
Dari larutan yang didapat, masing-masing ditotolkan pada  pelat  KLT  silika  gel  F  254  sebanyak  10  µl kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang  telah  jenuh  oleh  uap  fase  gerak  terpilih  dan dieluasi.  Noda  yang  dihasilkan  diukur  areanya dengan  Densitometer.  Kemudian  didapatkan  area, setelah itu dibuat kurva jumlah EGCG (µg) terhadap area EGCG. Dapat dihitung persamaan regresinya y = bX + a , koefisien korelasi (r) dan koefisien variasi fungsi (Vxo).

## Penentuan  Batas  Deteksi  (BD)  dan  Batas Kuantitasi (BK)
Membuat larutan baku dengan 8 macam konsentrasi yaitu  2  ppm,  4  ppm,  10  ppm,  20  ppm,  30  ppm,  40 ppm, 50 ppm dan 60 ppm dengan cara memipet 1,0 ml dari baku 100 ppm kemudian diencerkan dengan metanol  sampai  volume  ad  10,0  ml,  didapat konsentrasi 10 ppm; memipet 1,0 ml dan 2,0 ml dari baku  150  ppm,  masing-masing    diencerkan  dengan metanol sampai volume ad 5,0 ml didapat konsentrasi 30 ppm dan 60 ppm; dan untuk konsentrasi  20 ppm dan 40 ppm dibuat dengan memipet 1,0 ml sebanyak dua  kali  dari  baku  200  ppm,  masing-masing diencerkan  dengan  metanol  sampai  volume  5,0  ml dan  10,0  ml  Untuk  konsentrasi  yang  50  ppm  dapat dipakai  langsung  dari  konsentrasi  pada  linieritas. Konsentrasi 2 ppm dan 4 ppm dibuat dengan memipet 1,0  ml  dari  baku  10  dan  20  ppm  masing-masing diencerkan  dengan  metanol  sampai  volume  5,0  ml Masing-masing larutan tersebut ditotolkan pada pelat KLT  silika  gel  F  254,  dielusi  dengan  fase  gerak terpilih.  Untuk  menghitung  harga  Sb,  diperoleh dengan  menotolkan  metanol  sebagai  blanko, kemudian dieluasi bersama delapan macam konsentrasi  tersebut,  selanjutnya  analisis  dengan Densitometer,  kemudian  diperoleh  area  puncak pengotor  tertinggi  (Np)  dan  area  puncak  pengotor terendah (p), sehingga Sb=Np-p/5.
Untuk  menghitung  BD  dan  BK  dapat dihitung  dengan  rumus  (Indrayanto  &  Yuwono, 2002) :
C =  K Sl Sb Dimana: C
=   konsentrasi pada BD dan BK Sb =   standar deviasi serapan blanko Sl =   sensitivitas slop K =    konstanta, untuk BD = 3 dan BK = 10

## Penentuan Akurasi dan Presisi Metode
Penentuan  akurasi  pada  tahap  ini  dilakukan  dengan metode  adisi.  Ditimbang  sampel  produk  teh  hijau sebanyak  0,0800  mg  kemudian  ditambahkan  1,0 ml standar EGCG 400 ppm (4,115 mg/10,0 ml metanol),
dimasukkan  dalam  10  ml  air  panas  (±  80 0 C)  dalam beker  gelas,  kemudian  didiamkan  selama  30  menit setelah  itu  disaring  dengan  kertas  saring  dan dimasukkan  dalam  labu  ukur  25,0ml.  Kemudian serbuk  teh  dibilas  lagi  dengan  air  panas  10  ml, didinginkan  dan  dimasukkan  dalam  labu  ukur tersebut  dan  dibilas  lagi  dan  ditambah  air  sampai volume ad 25,0 ml. Dari larutan tersebut diambil 10,0 ml  dimasukkan  dalam  corong  pisah  kemudian ditambahkan  kloroform  sebanyak  5  ml  dan  dikocok pelan.  Hal  ini  diulang  sebanyak  2  kali.  Fase kloroform  dibuang,  kemudian  fase  air  ditampung, kemudian diekstraksi lagi dengan etil asetat sebanyak 10,0 ml. Hal ini diulang sebanyak 3 kali. Setelah itu fase air dibuang, kemudian fase etil asetat ditampung dalam  cawan  porselen  dan  diuapkan  dalam  lemari asam sampai kering. Hasil yang diperoleh dilarutkan dengan metanol, dimasukkan dalam labu ukur sampai volume  10,0  ml.  Proses  ekstraksi  ini  direplikasi sebanyak 5 kali.        Untuk perlakuan sampel saja, tanpa adanya penambahan standar EGCG, diekstraksi dengan  cara  yang  sama  seperti  diatas.  Direplikasi sebanyak  5  kali  juga.  Masing-masing  larutan ditotolkan  sebanyak  10  µL  dan  menotolkan  juga  5 macam  konsentrasi  linieritas  untuk  persamaan regresinya.  Dari  masing-masing  larutan  dieluasi dengan  fase  gerak  terpilih,  kemudian  dilakukan analisis  menggunakan    Densitometer.  Area  yang diperoleh  dimasukkan  kedalam  persamaan  regresi linier  dalam  1  plate  tersebut.  Diperoleh  kadar, kemudian  dihitung  %  perolehan  kembali  (% rekoveri).
% rekoveri =
x 100%
Untuk  presisi  metode  analisis  dihitung berdasarkan harga koefisien variasi dengan rumus :
KV = x SD X 100%
Dimana: KV =   koefisien variasi SD =   standar deviasi X =   rata-rata

## Penetapan  Kadar  EGCG  dalam  Produk  Teh Hijau
Ditimbang  teliti  sampel  produk  teh  hijau  sebanyak 0,0800 g dengan neraca analitik, dimasukkan dalam 10  ml  air  panas  (±  80-90 0 C)  dalam  beker  gelas, kemudian  didiamkan  selama  30  menit,  setelah  itu disaring dengan kertas saring dan dimasukkan dalam labu ukur 25,0 ml. Kemudian serbuk teh dibilas lagi dengan air panas 10 ml, didinginkan dan dimasukkan dalam labu ukur tersebut dibilas lagi dan ditambah air sampai  volume  ad  25,0  ml.  Dari  larutan  tersebut
ahkan yangditam b EGCG banyaknya sam pel EGCG banyaknya total EGCG banyaknya −
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.7 No.2 Desember 2020 Hal 55 - 63 P-ISSN: 2302-8270

## E-ISSN
diambil  10,0  ml  dimasukkan  dalam  corong  pisah kemudian ditambahkan kloroform sebanyak 5 ml dan dikocok pelan. Hal ini diulang sebanyak 2 kali. Fase kloroform  dibuang,  kemudian  fase  air  ditampung, kemudian diekstraksi lagi dengan etil asetat sebanyak 10,0  ml.  Hal  ini  diulang  sebanyak  3  kali. Setelah itu fase air dibuang, kemudian fase etil asetat ditampung  dalam  cawan  porselen  dan  diuapkan dalam  lemari  asam  sampai  kering.  Hasil  yang diperoleh  dilarutkan  dengan  metanol,  dimasukkan dalam  labu  ukur  sampai  volume  10,0  ml.  Hal  ini direplikasi  sebanyak  5  kali  kemudian  dilakukan proses ekstraksi yang sama seperti hal diatas. Masing-masing  larutan  ditotolkan  sebanyak  10  µL, ditotolkan  juga  bersama-sama  5  macam  konsentrasi linieritas.  Noda  yang  diperoleh  diamati  pada Densitometer untuk melihat area (A) EGCG. Setelah diperoleh  area,  dihitung  kadar  analit  dengan memasukkan  harga  (A)  ke  dalam  persamaan  garis regresi linier tersebut.

## Penentuan Panjang Gelombang Terpilih
Hasil pengamatan penentuan panjang gelombang (λ) maksimum EGCG pada standar dan sampel teh hijau pada  rentang  panjang  gelombang  (λ)    200-370  nm adalah sebagai berikut gambaqr 1:
Gambar  1  Spektrum  Absorban-Reflektan  standar EGCG  dan  sampel  teh  hijau  yang  telah  diekstraksi dengan pengukuran  menggunakan Densitometer CS 930.
(Keterangan  : Standar EGCG kadar 150,6 ppm; 2 : sampel produk teh hijau yang telah diekstraksi).
Standar  dan  sampel  memberikan  puncak  absorban- reflektan  yang  sama  yaitu  pada  panjang  gelombang 278  nm,  maka  panjang  gelombang maksimum  yang terpilih adalah 278 nm.

## Linieritas
Dari  larutan  baku  induk  EGCG  500  ppm (5,043mg/10,0  ml),  dibuat  lima  macam  konsentrasi yaitu 50 ppm; 100 ppm; 150 ppm; 200 ppm dan 250 ppm  masing-masing  larutan  ditotolkan  pada  pelat KLT silika gel  F 254 sebanyak       10  μL, dieluasi
dengan  fase  gerak  terpilih.  Noda  yang  diperoleh diamati  pada  Densitometri.  Penentuan  linieritas dilakukan  dengan  menghitung  perbandingan  area EGCG terhadap lima macam konsentrasi EGCG yang diukur  pada  panjang  gelombang  278  nm,  hasil penentuan  ini  dapat  dilihat  pada tabel  1 dan gambar 2
Tabel 1 Hasil pengamatan linieritas EGCG
Persamaan garis regresi Y = 5409,8 X-569,97 r hitung = 0,9996; r tabel (α=0,05) = 0,811 Koefisien variasi fungsi (Vxo) = 3,94%
Harga r hitung > r tabel, Vxo < 5% sehingga ada hubungan yang  linier  antara  konsentrasi  EGCG  terhadap  area EGCG.
Gambar 2 Kurva Hubungan antara banyaknya EGCG (µg) terhadap Area EGCG untuk Linieritas.

## Penentuan  Batas  Deteksi  (BD)  dan  Batas Kuantitasi (BK)
Menotolkan delapan macam konsentrasi yaitu 2 ppm, 4 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm dan 60 ppm sebanyak 10 µL pada pelat KLT silika gel F 254,  dieluasi  dengan  fase  gerak  terpilih.  Untuk menghitung harga Sb, diperoleh dengan menotolkan metanol  sebagai  blanko,  dieluasi  bersama  delapan macam  konsentrasi  tersebut,  Noda  yang  diperoleh diamati  dengan  Densitometer.  kemudian  diperoleh area puncak pengotor tertinggi (Np) dan area puncak pengotor  terendah  (p),  sehingga  Sb=Np-p/5.  Hasil penentuan ini dapat dilihat pada tabel 2 dan gambar 3
2 1
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.7 No.2 Desember 2020 Hal 55 - 63 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.7 No.2 Desember 2020 Hal 55 - 63 P-ISSN: 2302-8270

## E-ISSN
Tabe 2 Hasil penentuan BD dan BK untuk EGCG
Gambar 3  Kurva Hubungan antara banyaknya EGCG (µg) terhadap area  EGCG untuk  Batas Deteksi  dan Batas Kuantitasi.
Y= 9163,3X – 956.41 ; r hitung = 0,9943; r tabel (α=0,01)= 0,754

## Penentuan Presisi
Standar  150,6  ppm  ditotolkan  sebanyak  10  kali berturut-turut  pada  pelat  KLT  silika  gel  F  254, dieluasi dengan fase gerak terpilih, kemudian analisis selanjutnya dengan Densitometer dan diperoleh rata- rata  area.  Dari  data  area  yang  didapat  dihitung koefisien  variasinya  (KV).  Hasil  penentuan  presisi dapat dilihat pada tabel V.5.
Tabel 3. Hasil Penentuan Presisi Standar EGCG
Rata-rata = 11942,798 SD = 533,7183 KV = 4,47 %
Uji presisi untuk standar EGCG dengan Densitometer menunjukkan harga KV 4,47%, memenuhi
persyaratan validasi yaitu KV untuk sampel biologis adalah kurang dari 10 % sehingga harga KV EGCG memenuhi persyaratan (Curniff, 1995).

## Penentuan Akurasi dan Presisi Metode
Hasil  penentuan  akurasi  metode  standar  adisi  yaitu dengan  menambahkan    standar  EGCG  400  ppm (4,115  mg/10,0  mL  metanol)  sebanyak  1,0  ml bersama sampel teh yang telah ditimbang, kemudian diekstraksi  bersama-sama  seperti  pada  butir  4.3.4. Ekstraksi  ini  direplikasi  sebanyak  5  kali.  Untuk sampel saja tanpa adanya penambahan EGCG standar juga diekstraksi kemudian direplikasi sebanyak 5 kali juga. Masing-masing larutan ditotolkan sebanyak 10 μL bersamaan juga ditotolkan 5 macam  konsentrasi linieritas  sebagai  kurva  baku.  Noda  yang  diperoleh diukur  pada  Densitometer.  Area  yang  didapat dimasukkan  pada  persamaan  regresi  linier  didapat kadar, setelah itu dapat dihitung prosen rekoveri dan koefisien variasi (KV).
Harga  prosen  perolehan  kembali,  KV  dan  gambar hasil  eluasi  untuk  akurasi  dan  presisi  metode  dapat dilihat pada tabel 4 , tabel 5 .
Tabel 4 Hasil Penentuan Linieritas untuk Akurasi
Persamaan garis regresi  Y = 7053,2 X – 1560,9 r hitung = 0,9964; r tabel (α=0,05) = 0,811
Tabel 5 Hasil Penentuan Akurasi dan Presisi Metode dalam sampel produk Teh Hijau.
Keterangan (*); data ditolak karena diluar rentang x ± 2,5 SD (Day & Underwood, 1991).
Pada  penentuan  akurasi  didapatkan  rata-rata  prosen perolehan kembali 91,41% dimana syarat penentuan
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.7 No.2 Desember 2020 Hal 55 - 63 P-ISSN: 2302-8270

## E-ISSN
akurasi untuk sampel biologis sebesar 80-120% (Carr & Wahlich, 1990).
Pada  penentuan  presisi  metode  didapatkan harga  KV=  7,01%,  dimana  persyaratan  presisi metode untuk sampel biologis  (KV) < 10%, sehingga presisi metode masih dalam rentang yang dipersyaratkan.

## Penetapan  Jumlah  EGCG  dalam  Produk  Teh Hijau
Pada  penetapan  kadar  dilakukan  preparasi sampel  produk  teh  hijau  seperti  pada  butir  4.3.5, ditotolkan  sebanyak  10  µl  dan  dieluasi  dengan  fase gerak  terpilih.  Area  yang  diperoleh  dimasukkan  ke persamaan  regresi  linier,  kemudian  dihitung  kadar untuk  mengetahui  banyaknya  EGCG  yang  terdapat pada  sampel  teh  hijau.    Penentuan  penetapan  kadar EGCG dapat dilihat pada tabel 6
Tabel 6 Penetapan  jumlah  EGCG  dalam  produk  teh hijau.
Kadar EGCG rata-rata dalam sampel produk teh hijau = 3,33 ± 0,08%.
Pada penelitian ini telah dilakukan uji kualitatif dan kuantitatif  untuk  menetapkan  kadar  EGCG  dalam produk teh hijau dengan metode KLT-Densitometri. Sampel produk teh hijau dilakukan ekstraksi terlebih dahulu agar lebih mudah dalam analisis selanjutnya. Dalam  proses  ekstraksi  meliputi  berbagai  tahap. Tahap  pertama  adalah  menggunkan  air  panas  untuk melarutkan  semua  pengotor  yang  larut  dalam  air panas.  Tahap  kedua  fase  air  kembali  diekstraksi dengan kloroform untuk menarik alkaloid, lemak dan klorofil. Tahap ketiga adalah ekstraksi menggunakan etil  asetat  untuk  menarik  senyawa  katekin  dimana termasuk EGCG didalamnya.
Pada  validasi  metode  analisis  akan  dilakukan selektifitas,  linieritas,  batas  deteksi  (BD),  batas kuantitasi  (BK),  akurasi  dan  presisi.  Pada  uji selektifitas  fase  diam  yang  digunakan  adalah  silika gel F 254. Untuk fase gerak, akan dilakukan optimasi
terlebih  dahulu  terhadap  3  macam  fase  gerak  yaitu metanol-asam  asetat-air  (20:5:75),  kloroform-asam asetat-asam  formiat-isopropanol  (16:1,5:1,5:8)  dan kloroform-asam  asetat-asam  formiat-isopropanol (16:2:2:8). Untuk fase gerak metanol-asam asetat-air (20:5:75)  noda  yang  dihasilkan  tailing.  Untuk  fase gerak kloroform-asam asetat-asam formiat- isopropanol  (16:1,5:1,5:8)  diperoleh  harga  Rf  untuk sampel  dan  standar  0,1625  dan  fase  gerak kloroform-asam  asetat-asam  formiat-isopropanol (16:2:2:8)  diperoleh  harga  Rf    antara  sampel  dan standar  0,21,  Rs  =  2  dan  α  =  1,35.  Harga  Rf  yang memenuhi persyaratan Rf optimum yaitu 0,2-0,8, Rs > 1,5 dan α > 1 (Fried & Sherma, 1994). Berdasarkan harga  persyaratan  tersebut  maka  dipilih  fase  gerak kloroform-asam  asetat-asam  formiat-isopropanol (16:2:2:8) untuk analisis selanjutnya. Hasil pengamatan penentuan fase gerak dapat dilihat pada gambar 5.1.
Beradasarkan  spektrum  yang  diperoleh, maka  panjang  gelombang  yang  terpilih  untuk pengukuran  EGCG  adalah  278  nm.  Dipilih  panjang gelombang  maksimum  dari  EGCG  karena  pada panjang gelombang maksimum, diharapkan kesalahan  pengukuran  yang  diperoleh  lebih  kecil, sehingga  diperoleh    hasil  yang  lebih  teliti.  Hasil pengamatan penentuan panjang gelombang maksimum EGCG dapat dilihat pada gambar 5.2.
Pengujian linieritas EGCG dihasilkan suatu kurva  linieritas  5  konsentrasi  EGCG  dengan persamaan  garis  regresi  Y  =  5409,8  X  –  569,97 dengan harga koefisien korelasi (r)= 0,9996 > r tabel (0,8111)  dan Vxo = 3,94 %, yang mana syarat Vxo adalah  <  10%  dapat  dinyatakan  bahwa  ada  korelasi yang  linier  antara  banyaknya  EGCG  dengan  area yang  didapat.  Oleh  karena  itu  persamaan  linieritas tersebut  dapat  digunakan  untuk  penetapan  kadar EGCG dalam sampel produk teh hijau.
Penentuan  harga  batas  deteksi  (BD)  dan  batas kuantitasi  (BK)  yang  dibuat  dengan  5  macam konsentrasi, didapat persamaan regresi Y= 9163,3X – 956,41  ;  r = 0,9943;  (α=0,01;  n  =  4)  yaitu  0,754. Diperoleh harga BD = 0,0188 µg dan       BK =0,0627 µg.  Hal  ini  berarti  kadar  EGCG  dalam  produk  teh hijau  dapat  dideteksi  dan  dikuantitasi  apabila konsentrasinya  sama  dengan  atau  lebih  besar  dari harga  batas  deteksi  yaitu  0,0188  g  dan  dapat ditentukan kadarnya apabila konsentrasi EGCG lebih besar dari harga batas kuantitasi yaitu 0,0627  g.
Penentuan  akurasi  EGCG  dengan  metode  adisi, EGCG  standar  ditambah  dalam  larutan  daun  teh, kemudian  diekstraksi  bersama-sama.  Hal  ini direplikasi sebanyak 5 kali. Diperoleh persen rekoveri 91,41%  dimana  persyaratan  akurasi  untuk  sampel biologis  mempunyai  rentang  %  rekoveri  antara  80- 120%   (Carr & Wahlich, 1990)  sehingga % rekoveri memenuhi persyaratan.
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.7 No.2 Desember 2020 Hal 55 - 63 P-ISSN: 2302-8270

## E-ISSN
Penetuan  presisi  untuk  standar  EGCG,  dilakukan dengan  menotolkan  standar  EGCG  dengan  jumlah dan  volume  yang  sama  dan  direplikasi  sebanyak sepuluh kali, didapatkan harga KV 4,47%. Harga KV ini  masih  memenuhi  persyaratan  validasi,  karena untuk  sampel  biologis  persyaratan  presisi  adalah kurang  dari  10%  sehingga  dapat  digunakan  untuk analisis selanjutnya  (Curniff, 1995).
Pada  penentuan  presisi  metode  untuk EGCG, harga koefisien variasi (KV) yang diperoleh sebesar 7,01%. Sedangkan persyaratan presisi metode untuk sampel biologis adalah < 10%, sehingga dapat disimpulkan  bahwa  presisi  metode  memenuhi persyaratan.
Setelah  semua  parameter  validasi  terpenuhi  pada penelitian ini, maka dapat disimpulkan bahwa metode yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  telah memenuhi  persyaratan  validasi,  sehingga  dapat dilakukan penetapan kadar EGCG dalam produk teh hijau yang beredar dipasaran. Pada penetapan kadar EGCG  dalam  sampel  produk  teh  hijau  didapatkan kadarnya (3,33 ± 0,08) %.

## Kesimpulan
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa : Fase  gerak  terpilih  untuk  penetapan  kadar  EGCG dalam  produk  teh  hijau  adalah  kloroform-asam asetat-asam  formiat-isopropanol  (16:2:2:8)  dengan harga Rf = 0,21 ; Rs = 2 dan α = 1,35.
Penetapan  kadar  EGCG  dalam  produk  teh  hijau dengan  menggunakan  metode  KLT-Densitometri memenuhi persyaratan validasi metode.
Kadar rata-rata EGCG dalam produk teh hijau adalah (3,33 ± 0,08)%.

## Dafrar Pustaka
Amarowicz, R., Shahidi, F., Wiczkowski, W., 2003. Separation  of  individual  catechins  from  green tea using silica gel column chromatography and HPLC. Journal of Foods Lipids , 10:165-167. Anonim.,  2000. The  United States  Pharmacopeia .
24th edition. Rockville: United States Pharmacopeia, Inc., pp. 2149-2152.
Anonim.,  1970. Remington's  Pharmaceutical Sciences ,  14 th Edition,  Pennsylvania,  Mack Publishing Company. Pp. 1578.
Budavari,  S.,  1996. The  Merck  Index  An Encyclopedia  of  Chemicals,  Drugs  and Biological, 12 th edition,  Merck  &  Co.,  Inc.  pp 595.
Carr,  G.P  and    Wahlich,  J.C.,  1990.  Appractical
Approachto
Method Validation
in
Pharmaceutical  and  Analysis, Journal  of Pharmaceutical  Biomedical  Analysis ,  8:613- 626.
Fried,  B.  and  Sherma,  J.,  1994. Thin  Layer
Chromatography,
Techniques and
Applications . 3 rd edition, revised and expanded,
New York : Marcel Dekker, Inc.
Fulder,  S.,  2004. Khasiat  Teh  Hijau .  Terjemahan,
Jakarta: PT. Prestasi Pustakaraya.
Fessenden, R, J., and Fessenden, J, S., 1986. Kimia Organik. Terjemahan.  Edisi  3,  PT.  Gelora Aksara Pratama. hal. 446-448.
Hartoyo.,  2003. Teh  dan  Khasiatnya  bagi Kesehatan . Yogyakarta, Kanisius. hal 9-22
Hamilton,  R.,  and  Hamilton,  S.,  1987. Thin  Layer Chromatography  Analytical  Chemistry  by Open  Learning .  Chicester  :  John  Wiley  & Sons.
Heftmann,  E.,  1983.  Chromatography  fundamentals
& applications of chromatographic & electrophoretic  methods  part  B  :  applications.,
Journal of Chromatography library , 226 : pp
416-421.
Indrayanto, G., and Yuwono, M., 2003. Encyclopedia  of  Chromatography. New York: Marcel Dekker Inc., pp.1-3.
Kim,  J.I.,  Hong,  S.B.,  Row,  K.H.,  2002 . Effect  of Particle size in preparative reversed-phase high- performance  liquid  chromatography  on  the isolation of epigallocatechin gallate from koren green  tea. Journal  of  Chromatography  A,
949(1-2):275:80
Kantasubrata,  J.,  1991.  Perkembangan  Bahan  untuk Keperluan TLC, Warta Kimia Analitik. No.9. Hal 4-7.
Laszlo,  R.T.,  1987. Quantitative  Thin  Layer
Chromatography and Its
Industrial
Aplications : Marcel Dekker, Inc. pp 17-23
Munson,  J.  W,  1991. Analisis  Farmasi  Metode Modern , Parwa, B ., vol.II, Airlangga
University Press. Hal. 125-134 Mulya,  M  dan  Suharman.,  1995 .  Analysis Instrumental. Surabaya : Airlangga University Press, hal. 143-147, 223-229.
Martin,  A.,  1993. Physical  Pharmacy .  4th  edition, Baltimore: Lippincott Williams, pp. 239-240.
Muljana,  W.,  1993. Petunjuk  praktis  Bercocok Tanam Teh . Semarang, Aneka Ilmu.
Patricia Curniff, 1995, Official Methods of Analysis of  AOAC  International,          16 th ed,  AOAC International, Virginia USA.
Pescok, R. L., Shields, D. L., Cairns, T., and William,
MC, G.I., 1976. Modern Methods of Chemical Analysis .  2  nd  edition,  John  Wiley  and  Sons. Inc. USA, pp. 28-38.
Sakata, I., Ikeuchi, M., Maruyama, I., and Okuda T. Quantitavie aµnalysis of       (-)-epigallocatechin gallate in tea leaves by high-performance liquid chromatography . Yakugaku Zasshi , 1991 Dec ; 111(12) : 790-3
Skoog,  D.  A.  1998, Principles  of  Instrumental Analysis .  5th  ed.,  Harcourt  Bruce  and
Company, USA, pp. 761-765. 42
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.7 No.2 Desember 2020 Hal 55 - 63 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN
Skoog,  D.  A.  1980. Principles  of  Instrumental analysis .  3rd  edition,  New  York,  Secunders College Publishing, pp. 836-897.
Shirai,  T.,  Sato,  A.,  and  Hara,  Y.,  1994. Epigallocatechin  gallate:  the  major  Causative agent of green tea-induced asthma, Chest. 106 :
1801-05
Touchstone, J. C. and Dobbins, M. F. 1983. Practice of Thin Layer Chromatography 2nd ed., John
Wiley & Sons., pp. 256.
Wu, J., Xie, W., and Paliszyn, J., 2000. Automated in- tube Solid Phase Microextraction Coupied with HPLC  ES–MS  for  the  Determination  of Catechins  and  Caffeine  in  tea. The  Analyst ,
125:2216-22.
Zulkarnain,  B.S.  1997,  Standarisasi  Ekstrak  Etanol dari  Teh  Hijau  dengan  Parameter  EGCG ( epigallocatechin gallate ).