## VALIDASI METODE ANALISIS DAN PENURUNAN KADAR INFUS CIPROFLOKSASIN  YANG DIPENGARUHI REAKSI OKSIDASI MENGGUNAKAN HPLC
Submitted : 3 November 2016 Edited : 18 November 2016
Accepted : 30 November 2016
Nugraheni, B.,  Nafi'ah, R., Anggoro, B
Sekolah Tinggi Ilmu Pharmasi "Yayasan Pharmasi" Semarang Email : bn.nugraheni@gmail.com

## ABSTRACT
Validation of analysis methods is conducted on the assay of the antibiotic ciprofloxacin because it is often used in the treatment of urinary tract infections, respiratory tract infections and  gastrointestinal  infections.  This  study  aimed  to  determine  the validity  of  an  analytical method.  Development  of  methods  used  in  this  study  were  the  mobile  phase  of  methanol: aquabidest  :  0.1  M  phosphate  buffer:  acetonitrile  (80:  10:  5:  5).  Then  the  ciprofloxacin validation was performed. After the methods validation were valid, the assay of ciprofloxacin in infusion  was  performed  to  determine  the  decreased  levels  which  affected  by  the  oxidation reaction  of  0,  60,  90, 150  and  180  minutes.  The  validation  parameters  in the research  were selectivity, accuracy, precision, linearity, LOD and LOQ. Samples were standart ciprofloxacin used for the validation and infusion of ciprofloxacin for the assay on the sample application that was affected by the oxidation reaction. The used of HPLC met the requirements such as HPLC devices Waters e2695 Separations, SunFire TM column C18, and PDA detector and a flow rate of 1.0 mL / min. This study showed that the result was selective, stated with no emergence of peaks in the matrix. HPLC analysis methods on ciprofloxacin meet the acceptance criteria of accuracy % recovery value solution concentration of ≥10 mg / mL are 90-107%. Precision test qualifies % RSD for solution concentrations ≥10 mg / mL is <7.3%. Linearity r ≥0,997 then it can be concluded that the result was qualified. LOD value is 0.2707 µg / mL and the LOQ value is 0.9026 µg / mL. The results of the assay infusion of ciprofloxacin were found that there was a significant decrease in the levels of ciprofloxacin due to the influence of the oxidation reaction.
Keywords : Validation, ciprofloxacin, infusion, HPLC, oxidation reaction.

## PENDAHULUAN
Validasi  metode  analisis  merupakan jalan untuk menjamin mutu obat, sedangkan terjaminnya  mutu  obat  adalah  salah  satu prinsip  dalam  Cara  Pembuatan  Obat  yang Baik  (CPOB). Validasi  merupakan  proses pembuktian  bahwa  prosedur,  proses, peralatan, bahan atau sistem yang digunakan secara konsisten memberi hasil sesuai yang diharapkan. Validasi metode analisis sangat penting bagi industri farmasi oleh karena itu
penting  untuk  melakukan  validasi  metode analisis ciprofloksasin.
Ciprofloksasin adalah antibiotik golongan kuinolon kelompok fluorokuinolon yang  bekerja  dengan  menghambat  enzim topoisomerase  II  (DNA  gyrase)  dan topoisomerase IV pada bakteri. Ciprofloksasin  efektif digunakan  dalam terapi infeksi saluran kemih, infeksi saluran napas maupun infeksi saluran pencernaan. Mengenai  validasi  ciprofloksasin dengan fase gerak metanol: buffer (0.025M
asam  Ortofosfat  dengan  penambahan trietilamin  sampai  pH  3,0±0,1)  (40:60v/v), kolom  C-18  (LichroCART®  125x4mm, 5µm),  detektor  UV,  hasil  diperoleh  bentuk peak  yang  tailing.  Penelitian  Dabhi et  al., ( 2013)  mengenai  validasi  levofloxacin menggunakan Ultra  Performance  Liquid Chromatography  (UPLC) (1) . Kondisi  sistem kromatografi pada penelitian ini
menggunakan  fase  gerak  asetonitril  :  bufer (23:77),  (bufer:  20  mM  K2HPO4  +  1  mL trietilamin dalam 1 L aquadest, pH 2,50 dari asam  ortofosfat);  kecepatan  alir  0,400 mL/menit, detektor menggunakan photodiode  array  (PDA). Hasil  diperoleh peak  yang bagus,  dengan  selektivitas  LOD dan  LOQ  yaitu  0,  1  dan  0,5  µg/mL. Penelitian ini adalah pengembangan kondisi kromatografi  dari  penelitian Dabhi et  al.,
(2013) tetapi mengunakan sampel ciprofloksasin,  pengembangan  fase  gerak dan instrumentasi High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (1) .

## METODE PENELITIAN
Alat dan bahan Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  instrumentasi  KCKT merk Waters e2695 Separations ,  kolom C18,  detektor  PDA,  neraca  analitik  digital merk  Ohaus, ultrasonik bath ,  pH meter, filtration unit for HPLC dan alat-alat gelas . Bahan-bahan  yang  digunakan  pada penelitian  ini  antara  lain  baku  pembanding ciprofloksasin yang  diperoleh  dari PT. Zenith  Pharmaceutical  Semarang, infus levofloksasin  yang  diperoleh  dari PT. Quantum Lab, metanol pro HPLC (Merck), Aqua  steril  (PT.  Otsuka), asetonitril  pro HPLC (Merck), dan KH 2 PO 4.

## Prosedur kerja penelitian Uji kesesuaian sistem
Uji  kesesuaian  sistem,  dilakukan dengan membuat larutan baku ciprofloksasin
50 µg/mL. Kemudian dilakukan pengukuran 6  kali  dengan  KCKT  fase  gerak metanol  : aquabidest  :  bufer  fosfat  0,1  N  :  asetonitril (80:10:5:5)  dan  laju  alir  1,0  mL/menit. Kriteria keberterimaan untuk UKS adalah % RSD  waktu  retensi,  lempeng  teoritis,  dan luas area tidak lebih dari 2% (2) .

## Validasi metode analisis Uji selektifitas
Dilakukan  dengan  membandingkan hasil  kromatogram  dan  waktu  retensi  dua larutan ciprofloksasin 50  µg/mL.  Satu larutan  ditambahkan  matriks  sedangkan larutan  yang  lain  tidak  ditambah  matriks. Selektifitas  dinyatakan  dengan  tidak munculnya puncak pada matriks yang dapat mengganggu. Kromatogram yang dihasilkan tunggal  dan  waktu  retensi  kedua  larutan hampir  mirip. Nilai  resolusi  dipersyaratkan untuk  memastikan  komponen-komponen terelusi  dengan  waktu  retensi  berdekatan tersebut terpisah dengan baik dan juga untuk memastikan  efisiensi  pemisahan  sistem (3) . Chan, et  al. (2004)  menyatakan  resolusi memenuhi syarat jika nilai Rs ≥ 1,5 (4) .
Uji akurasi Dilakukan  dengan  membuat  larutan baku dan sampel infus ciprofloksasin 30, 50 dan 70  µg/mL.  Masing-masing  larutan dilakukan replikasi 3 kali dan diukur dengan KCKT.  Nilai  akurasi  dinyatakan  sebagai persen recovery (perolehan  kembali). Menurut  AOAC,  kriteria  keberterimaan untuk akurasi adalah persen recovery untuk larutan konsentrasi ≥10  µg/mL adalah  80- 110%  dan  larutan  konsentrasi ≥100  µg/mL adalah 90-107%.
Uji presisi Dilakukan  dengan  membuat  larutan baku  ciprofloksasin 30, 50  dan 70  µg/mL. Masing-masing larutan dilakukan replikasi 3 kali  dan  diukur  dengan KCKT. Menurut
AOAC,  kriteria  keberterimaan  uji  presisi yaitu % RSD untuk larutan konsentrasi ≥10 µg/mL adalah <7,3% dan larutan konsentrasi ≥100 µg/mL adalah <5,3%.
Uji linieritas
Dilakukan  dengan  membuat  deret baku ciprofloksasin konsentrasi 10,  20,  30, 40 dan 50 µg/mL.  Diukur  dengan  KCKT dan  dibuat  kurva  hubungan  antara konsentrasi  dengan  luas  area  sehingga didapat  persamaan  y  =  bx  +  a. Menurut Chan  (2004),  kriteria  keberterimaan  untuk linieritas  adalah  koefisien  korelasi  (r)  lebih besar atau sama dengan 0,997. Uji LOD dan LOQ
Dilakukan  dengan membuat larutan ciprofloksasin konsentrasi  1,  2,  3,  4  dan  5 µg/mL.  Larutan  diukur  dengan  KCKT  dan dibuat  persamaan  regresi  linier  antara konsentrasi  dengan  luas  area.  Kemudian dihitung  nilai  Y  hitung  dan  slope.  Harga LOD dan LOQ dihitung dengan rumus.

## Aplikasi sampel infus ciprofloksasin
Pengaruh reaksi  oksidasi terhadap penurunan  kadar ciprofloksasin  dalam
sediaan infus dilakukan dengan cara: sampel infus  ciprofloksasin  50  µg/mL  dipanaskan pada suhu 80°C selama 1 jam. Kemudian 1,0 mL  sampel  tersebut  ditambah  H 2 O 2 5% selama 0, 60, 90, 150 dan 180 menit (1) .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji  kesesuaian sistem  KCKT diperoleh  bahwa  perbandingan    fase  gerak adalah metanol : aquabidest: bufer fosfat 0,1 N  : asetonitril  (80:10:5:5)  dengan  laju  alir 1,0  mL/menit.  Hal  ini  ditunjukkan  dengan harga  lempeng  teoritis  (N)  yang  besar, waktu retensi yang tidak bergeser dan tailing factor tidak lebih dari sama dengan 2. Selektifitas adalah kemampuan mengukur analit secara cermat dan seksama dengan  adanya  komponen  lain  dalam sampel.  Pada  penelitian  dilakukan  dengan membandingkan kromatogram larutan ciprofloksasin yang  tidak  ditambahkan matriks  dengan  yang  ditambahkan  matriks. Matriks  yang  digunakan NaCl,  karena sampel  yang  digunakan  dalam bentuk sediaan infus.

## Tabel 1. Hasil uji kesesuaian sistem HPLC
No. RT (menit) Area Tailing N 1. 0,993 2941351 1,6561 1531,2259 2. 0,995 2945043 1,6297 1550,4594 3. 0,996 2982402 1,6293 1581,0055 4. 0,995 2907989 1,6256 1566,9107 5. 0,992 2970978 1,6644 1527,6566 6. 0,994 3018321 1,6547 1534,0645 Χ 0,994 2961014 1,6433 1548,5537 SD 1,4719 x 10 -3 38194,70 0,0169 21,6361 %RSD 0,14% 1,28% 1,03% 1,39%
Au
menit
Gambar 1. Profil kromatogram uji selektivitas pada konsentrasi 50 µg/mL dengan parameter HPLC : Keterangan : Fase diam : SunfireTM C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) Detektor : PDA Fase gerak : metanol : aquabidest : buffer phospat 0,1N : asetonitril (80:10:5:5) Kecepatan alir : 1,0 mL/menit Volume injeksi : 20 µL Hasil  dari  uji  selektifitas  adalah metode analisis dinyatakan selektif ditunjukkan  dengan  kromatogram  yang dihasilkan tunggal tidak terdapat peak lain di sekitar  waktu  retensi ciprofloksasin. Waktu retensi  yang  dihasilkan  mirip  yakni 0,994 menit  untuk  larutan ciprofloksasin tanpa matriks  dan 0,996 menit  untuk  larutan ciprofloksasin yang  ditambahkan  matriks NaCl.
Akurasi adalah ukuran kedekatan nilai terukur  yang  diperoleh  dari  hasil  analisis dengan  nilai  yang  sebenarnya.  Pengujian akurasi  dilakukan  dengan  menghitung  nilai persentase  perolehan  kembali  ( recovery ). Hasil  uji  akurasi sebesar  98,8-104,8  %,  hal ini memenuhi  kriteria  keberterimaan
persentase  perolehan  kembali  untuk  larutan dengan  konsentrasi ≥  10  µg/mL adalah  80- 110% dan untuk larutan dengan konsentrasi ≥ 100 µg/mL adalah 90-107% (5) .
Uji presisi repeatability adalah ukuran kedekatan  nilai  bila  dilakukan  serangkaian pengukuran  yang  sama  di  bawah  kondisi yang  sama,  analis  yang  sama,  laboratorium
yang sama serta dalam waktu interval yang pendek.  Hasil  uji  presisi  repeatability sebesar  2,95%,  hal  ini  memenuhi  syarat keberterimaan untuk persentase baku relatif (RSD)  pada  larutan  yang  mengandung  zat aktif dengan konsentrasi ≥ 10 µg/mL adalah <7,3% dan untuk larutan yang mengandung zat aktif ≥ 100 µg/mL adalah < 5,3% (5) . Linieritas  merupakan    ukuran seberapa  baik  metode  menghasilkan  respon yang  linier dengan  konsentrasi analit.  Hasil pengujian  linieritas memenuhi  syarat keberterimaan  nilai  koefisien  korelasi 0,997 (4) .
Gambar 2. Kurva uji linieritas
Gambar 3. Profil kromatogram ciprofloksasin yang dipengaruhi reaksi oksidasi pada menit ke-180 dengan parameter HPLC: Keterangan : Fase diam : SunfireTM C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) Detektor : PDA Fase gerak : metanol : aquabidest : buffer phospat 0,1N : asetonitril (80:10:5:5) Kecepatan alir : 1,0 mL/menit
Volume injeksi : 20 µL

## Gambar 4. Reaksi degradasi cipofloksasin
Limit  of  detection (LOD)  merupakan konsentrasi terendah dari suatu sampel yang masih dapat terdeteksi oleh  metode analisis namun tidak perlu terkuantisasi sebagai nilai yang  tepat.  Pada  penelitian  diperoleh  nilai LOD  0,2707 µg/mL. Limit  of  quantitation (LOQ) adalah  konsentrasi  sampel  terendah yang masih dapat dideteksi secara kuantitatif dengan  akurasi  dan  presisi  yang  dapat diterima.  Pada  penelitian  diperoleh  nilai LOQ 0,9026 µg/mL.
Aplikasi  penetapan  kadar infus ciprofloksasin  yang  dipengaruhi  reaksi
oksidasi diperoleh  hasil  penurunan  kadar ciprofloksasin infus pada menit ke-0 sebesar 10,55%; menit ke-60 sebesar 18,95%; menit ke-90 sebesar 19,13%; menit ke-150 sebesar 27,39%  dan  menit  ke-180  sebesar  36,01%. Gambar  4 merupakan  reaksi degradasi ciprofloksasin karena reaksi oksidasi (6) .

## SIMPULAN
1. Metode  analisis  penetapan  kadar ciprofloksasin secara HPLC memenuhi syarat  parameter  validasi  yaitu selektivitas, akurasi sebesar 98,8-104%,
ciprofloksasin Ciprofloksasin teroksidasi
Oksidasi berlanjut menjadi CO 2
presisi repeatability sebesar 2,95%, linearitas ≥0,997,  LOD sebesar  0,2707 µg/mL; dan  LOQ sebesar  0,9026 µg/mL.
2. Ada  pengaruh reaksi  oksidasi terhadap penurunan  kadar ciprofloksasin infus yang  dianalisis  menggunakan  metode yang telah divalidasi.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan puji syukur atas berkat  Tuhan dan  menyampaikan  terima kasih  kepada Ketua  Stifar  Semarang,  ketua LPPM,  dan  Nuri  Ardiantika  atas dukungan dan bantuan yang diberikan.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Dabhi, B., Parmar, B., Patel, N., Jadeja,
Y.,  Patel,  M.,  Jebaliya,  H.,  Karia,  D.,
Shah,  A.  K.  A  Stability Indicating UPLC Method for the Determination of Levofloxacin Hemihydrate in Pharmaceutical Dosage Form: Application to Pharmaceutical Analysis.  Chromatography  Research International.
http://dx.doi.org/10.1155/2013/432753, 2013.
2. Gandjar,  IG,  &  Rohman,  A.  Kimia Farmasi  Analisis,  Pustaka  Pelajar, Yogyakarta, 2007: 53&401.
3. DepKes.  Farmakope  Indonesia,  edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, 1995: 558.
4. Chan,  CC.,  Lam,  H.,  Lee., Zang,  XM. Analytical  Method  Validation  and Instrument  Performance  Verification, John Wiley & Sons Inc, Canad a, p 16- 18, 2004.
5. Huber,  L.Validation and  Qualification in  Analytical  Laboratories  Second Edition.  New  York  :  Informa Healthcare USA, 2007
6. An,  T., Yang, H., Li,  G.,  Song,  W., Cooper, W. J., Xiangping. Kinetics and mechanism  of  advanced  oxidation processes  (AOPs)  in  degradation  of ciprofloxacin  in  water. Applied
Catalysis  B:  Environmenta l  94: 288–
294, 2010.