Volume 5, Nomor 1, Juni 2022 e-ISSN: 2598-7453 DOI: https://doi.org/10.31539/bioedusains.v5i1.3160
UJI ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN Theobroma cacao L.
TERHADAP PERTUMBUHAN Escherichia coli DENGAN METODE

## DIFUSI CAKRAM
Annisa Rahmi Hayati 1 , Abdul Rahman Singkam 2 , Dewi Jumiarni 3
Universitas Bengkulu 1,2,3
rahmiannisa764@gmail.com 1

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui daya hambat ekstrak daun T. cacao L. terhadap pertumbuhan bakteri E. coli dan korelasi antara konsentrasi ekstrak daun T. cacao L. dengan zona hambat E. coli yang terbentuk. Metode yang digunakan adalah  eksperimental post-test  only  control  design dengan  menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Zona hambat daun T. cacao L. terhadap E. coli diuji  menggunakan  metode  difusi  cakram  dengan  enam  perlakuan  (konsentrasi 25%,  50%,  75%,  100%,  kontrol  positif  dan  kontrol  negatif)  yang  diulang sebanyak  lima  kali.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  diameter  zona  hambat ekstrak  daun T.  cacao L.  terhadap E.coli berada  pada  interval  5-10  mm  dan termasuk  pada  kategori  hambatan  sedang,  namun  hasil  uji  Duncan memperlihatkan  bahwa  tidak  ada  perbedaan  yang  signifikan  antara  zona  hambat yang terbentuk pada konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100%. Simpulan, daun T. cacao L. kurang efektif dalam menghambat pertumbuhan E. Coli , namun ekstrak daun T. cacao L. berkorelasi positif dengan zona hambat yang terbentuk.
Kata Kunci: Ekstrak  Daun, Escherichia  coli , Theobroma  cacao L,  Uji  Zona Hambat

## ABSTRACT
This  study  aims  to  determine  the  inhibition  of  T.  cacao  L.  leaf  extract  on  the growth  of  E.  coli  bacteria  and  the  correlation  between  the  concentration  of  T. cacao L. leaf extract  and the formed E. coli inhibition  zone. The method  used is experimental post-test  only control  design  using Completely Randomized Design (CRD). The inhibition zone of T. cacao L. leaves against E. coli was tested using the  disc  diffusion  method  with  six  treatments  (concentration  25%,  50%,  75%, 100%,  positive  control  and  negative  control)  repeated  five  times.  The  results showed that the diameter of the inhibition zone of the leaf extract of T. cacao L. against  E.coli  was  at  intervals  of  5-10  mm  and  was  included  in  the  category  of moderate  inhibition,  but  the  results  of  Duncan's  test  showed  that  there  was  no significant difference between the inhibition zones formed at concentrations 25%, 50%, 75%, and 100%. In conclusion, the leaves of T. cacao L. were less effective in  inhibiting  the  growth  of  E.  Coli,  but  the  leaf  extract  of  T.  cacao  L.  was positively correlated with the inhibition zone formed.
Keywords: Leaf  Extract,  Escherichia  coli,  Theobroma  cacao  L.,  Zone  of Inhibition Test

## PENDAHULUAN
Escherichia  coli merupakan  salah  satu  bakteri  penyebab  diare  pada manusia. E. coli adalah pemicu terbanyak kedua terjadinya diare (Fransisca et al.,
2020). Hal  ini diperkuat pula oleh  data bahwa  sebanyak 20 dari 30 sampel feses wisatawan Ubud penderita diare mengandung bakteri E. coli (Rasyid et al., 2020) E.  coli pada  penderita  diare  akan  menyebabkan  gangguan  pencernaan  yang ditandai  dengan rasa nyeri di  bagian perut, frekuensi  buang  air besar meningkat, dan feses  cair.   Penderita diare  akan mengalami  buang  air besar encer lebih  dari tiga  kali  sehari  yang  dapat  disertai  sakit  perut,  mual  dan  muntah  ataupun  tidak (Hardiyanti  et  al.,  2019).  Kasus  diare  di  Indonesia  terbilang  cukup  tinggi.  Data Kemenkes  RI  tahun  2019  menunjukkan  kasus  diare  di  seluruh  Indonesia mencapai  7.265.013  kasus  atau  sebesar  270  per  1000  penduduk  (Kementerian Kesehatan RI, 2019).
Pengobatan  diare  di  Indonesia  umumnya  bertumpu  pada  pengobatan modern  yang  biasanya  menggunakan  bahan  kimia  sintesis  dengan  efek  samping yang lebih besar. Pengobatan diare secara tradisional yang relatif lebih aman dari efek  samping,  belum  banyak  dieksplorasi.  Alternatif  umum  pengobatan  diare yang berkembang di  masyarakat  adalah dengan  mengonsumsi  larutan  garam  dan gula  (Oralit).  Padahal,  pengetahuan  tradisional  Indonesia  menunjukkan  bahwa banyak  tanaman  yang  berpotensi  digunakan  sebagai  alternatif  pengobatan  diare (Mustofa & Rahmawati, 2018).
Salah  satu  tanaman  yang  dapat  digunakan  untuk  pengobatan  diare  adalah tanaman T. cacao L. Daun T. cacao L. mengandung alkaloid, flavonoid, terpenoid dan  saponin  yang  mampu  menjadi  antibakteri  (Parbuntari  et  al.,  2018).  Namun sejauh  ini  belum  ada  penelitian  dengan  langkah  metode  ilmiah  yang  meneliti keefektifan daun T. cacao L. sebagai antibakteri E. coli . Oleh karena itu, peneliti melakukan  kajian  tersebut  guna  mengetahui  tingkat  hambatan  daun T.  cacao L. terhadap  pertumbuhan E.  coli dan  juga  untuk  mengetahui  korelasi  antara konsentrasi  ekstrak  daun T.  cacao L.  dengan  luas  zona  hambat  pertumbuhan E. coli yang terbentuk.

## METODE PENELITIAN
Metode  penelitian  dilakukan  secara  eksperimental  dengan post-test  only control  design menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL).  Alat  dan  bahan yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah Laminar  Air  Flow  Cabinet (ESCO, Singapura),  inkubator  (Memmert,  Jerman), autoclave  ( All  American,  Amerika ) , rotary  evaporator  ( Wincom  Company  Ltd,  China ) ,  spektrofotometer  UV-Vis (Thermo Scientific, Jerman), Jangka sorong digital (ENZO, China), kertas cakram 6 mm (Macherey-Nagel, Jerman), 1 Kg daun T. cacao L. (Bengkulu, Indonesia),
1,4  L  etanol  96%  (Brataco,  Indonesia),  500  mL  alkohol  70%  (PT.  Imfarmind Farmasi  Industri,  Indonesia),  5  g Nutrient  Agar (Merck,  Jerman),  isolat  murni bakteri E.  coli  ( Laboratorium  Biologi  FKIP  Universitas  Bengkulu,  Indonesia ) , Amoxicillin 500  mg  (Hexpharm  Jaya,  Indonesia),  dan  0.9  g  NaCl  (Merck, Jerman).

## Sterilisasi Alat
Sterilisasi dilakukan dengan metode panas lembab dan metode sterilisasi zat kimia.  Alat  yang  tahan  panas  disterilisasi  dengan  metode  panas  lembab
menggunakan autoclave selama 15 menit dengan suhu 121 0 C dan tekanan 1 atm. Alat yang tidak tahan panas disterilisasi dengan cara pengolesan dan perendaman menggunakan alkohol 70% selama 2 menit .

## Pengambilan Sampel dan Pembuatan Simplisia
Sebanyak  1  Kg  sampel  daun T.  cacao L.  diperoleh  dari  Zona  Pertanian Terpadu  Universitas  Bengkulu  dengan  metode purposive  sampling . Purposive sampling adalah  metode  pengambilan  sampel non-probability dimana  sampel diambil berdasarkan standar tertentu. Sampel daun T. cacao L. pada penelitian ini diambil berdasarkan ciri berikut: 1) warna hijau terang 2) panjang daun 10-20 cm, 3)  daun  lembut-tidak  kaku.  Ciri  tersebut  mendeskripsikan  daun  cokelat  stage  3, yaitu  tahap  daun  peralihan  muda  ke  tua.  Kandungan  metabolit  sekunder  pada tanaman muda lebih tinggi dari pada tanaman tua.
Preparasi  sampel  dilakukan  dengan  membersihkan  daun T.  cacao L., dipotong  kecil-kecil  menggunakan  pisau,  dikeringkan  dengan  cara  diangin- anginkan  dalam  suhu  ruang  hingga  rapuh,  dan  kemudian  dihaluskan menggunakan  blender  hingga  membentuk  serbuk  halus.  Serbuk  ini  lalu  diayak menggunakan  ayakan  ukuran  60 mesh .  Simplisia  yang  tidak  lolos  ayakan diblender  kembali  agar  menjadi  lebih  halus  dan  dapat  digunakan.  Pembuatan serbuk  halus  bertujuan  untuk  memaksimalkan  proses  ekstraksi,  semakin  kecil ukuran  serbuk  semakin  besar  luas  permukaannya.  Sehingga,  interaksi  sampel dengan pelarut akan semakin efektif.

## Ekstraksi Sampel
Ekstraksi  sampel  daun T.  cacao L.  dilakukan  dengan  metode  maserasi. Sebanyak 200 g sampel halus daun T. cacao L. dimasukkan ke dalam botol kaca, kemudian  ditambah  1  L  etanol  96%  (perbandingan  1:5).  Etanol  96%  merupakan pelarut  yang  memiliki  kemampuan  ekstraksi  paling  baik  untuk  senyawa  fenolik dan flavonoid. Etanol 96% juga merupakan pelarut paling ideal untuk  flavonoid, tanin,  dan  saponin.  Pelarut  ini  akan  menyebabkan  sel  daun  pecah  dan  zat  yang terkandung di  dalamnya  dapat  keluar, sehingga diperoleh zat  metabolit  sekunder daun secara utuh.
Sampel  direndam  dan  didiamkan  selama  2x24  jam,  terlindung  dari  cahaya matahari dan diaduk setiap hari sebanyak tiga kali sehari. Setelah hari ke-3 sampel disaring  dan  dipisahkan  ampas  dengan  filtratnya  menggunakan  kertas  saring. Ampas  kemudian  direm  maserasi  menggunakan  pelarut  yang  sama  dengan perbandingan  1:2.  Filtrat  yang  diperoleh  dari  dua  kali  maserasi  tersebut dikumpulkan,  dan  kemudian  dipekatkan  dengan  menggunakan  rotary  evaporator pada  suhu  50 0 C  dengan  putaran  60  rpm,  hingga  diperoleh  ekstrak  kasar  ( crude extract )  kental  daun  coklat.  Pemilihan  suhu  dan  putaran  pada  nilai  tersebut dilakukan agar senyawa dalam daun coklat tidak cepat rusak.
Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Daun T. cacao L.
Konsentrasi  ekstrak  yang  akan  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah konsentrasi 25%, 50%, 75% dan 100% (Tabel 1). Berat ekstrak  yang digunakan, dihitung dengan rumus konsentrasi larutan, yaitu massa zat terlarut dibagi dengan volume pelarut. Setelah diketahui massa ekstrak yang diperlukan untuk membuat konsentrasi,  maka  ekstrak  dilarutkan  dengan aquadest steril.  Pembuatan
konsentrasi yang berbeda ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi yang paling efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri E. coli.
Tabel 1 . Perhitungan Konsentrasi Simplisia Daun T. cacao L. pada Uji Antibakteri
E. coli No Konsentrasi Perhitungan 1. Konsentrasi 25% 25%  = 25gr/100 Ml = 0,25 g/mL Simplisia untuk 1 ml larutan = 0,25 g 2. Konsentrasi 50% 50%  = 50 g/100 Ml = 0,50 g/mL Simplisia untuk 1 ml larutan = 0,50 g 3. Konsentrasi 75% 75%  = 75 g/100 mL = 0,75 g/mL Simplisia untuk 1 ml larutan = 0,75 g 4. Konsentrasi 100% 100% = 100 g/100 mL = 1 g/mL Simplisia untuk 1 ml larutan = 1 g

## Pembuatan Larutan Kontrol Positif
Satu  tablet Amoxicillin  Trihydrate 500  mg  digerus  hingga  halus menggunakan  lumpang  alu  porselen.  Serbuk  tablet Amoxicillin tersebut dimasukkan ke dalam gelas beker ukuran 50 mL. Kemudian dituangkan aquadest steril  ke  dalam  gelas  beker  hingga  volume  larutan  menjadi  50  mL,  dan  diaduk hingga homogen. Konsentrasi larutan Amoxicillin sebesar 0,01 g/mL. Konsentrasi hambat minimum Amoxicillin terhadap E. coli adalah konsentrasi 0,01 g/mL.
Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
Serbuk  media  NA  ditimbang  sebanyak  5  g  dan  dilarutkan  dengan  250  mL aquades. Kemudian dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih diatas api bunsen. Setelah mendidih, media NA diangkat dan ditutup menggunakan sumbatan kapas. Setelah  itu,  disterilkan  menggunakan autoclave selama  15  menit . Setelah  steril, digunakan  untuk  membuat  dua  media,  yaitu  media  agar  miring  dan  media pertumbuhan bakteri E. coli. Media agar miring dibuat dengan cara menuangkan 3 mL NA ke dalam 2 buah tabung reaksi steril, lalu ditutup dengan sumbatan kapas. Setelah itu, dibiarkan dalam suhu ruang selama ±30 menit sampai memadat pada kemiringan 30 0 .
Media pertumbuhan bakteri E. coli dibuat dengan menuangkan sebanyak 20 mL NA secara aseptik ke dalam 5 cawan petri steril. Setelah itu, didinginkan dan dibiarkan  dalam  suhu  ruang  sampai  memadat.  Lalu,  diletakkan  dalam  posisi terbalik  di  dalam Laminar  Air  Flow  Cabinet (LAFC).  Sebelum  dituang  media NA, cawan petri tersebut telah dibagi menjadi enam area menggunakan spidol.

## Peremajaan Kultur Murni Bakteri Uji
Satu  koloni  biakan  murni E.  coli diambil  dengan  menggunakan  jarum  ose, dan  inokulasi    pada  media  nutrient  agar  (NA)  miring  dengan  metode  goresan sinambung ( zig-zag ). Kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 1x24 jam.

## Pembuatan Larutan NaCl Fisiologis 0,9% dan Suspensi Larutan Uji
Pembuatan  larutan  NaCl  dilakukan  dengan  menimbang  serbuk  NaCl sebanyak  0,9  g,  lalu  ditambahkan  aquades  hingga  volume  larutan  menjadi  100 mL.  Kemudian  larutan  tersebut  diaduk  hingga  homogen.  Setelah  homogen,
larutan  NaCl  disterilkan  dalam autoclave selama  15  Menit  untuk  meminimalisir kontaminasi.
Suspensi larutan uji dibuat dengan memasukkan 5 mL larutan Nacl 0,9% ke dalam  tabung  reaksi,  lalu  mensuspensikan  hasil  peremajaan  bakteri E.  coli ke dalam  larutan  NaCl  0,9%  tersebut.  Suspensi  tersebut  kemudian  dihomogenkan, setelah  itu  dihitung  absorbansinya  dengan  metode  turbidimetri  menggunakan spektrofotometer  UV-sinar  tampak  pada  panjang  gelombang  625  nm.  Larutan tersebut  dibuat  sedemikian  rupa  hingga  memiliki  nilai  absorbansi  sebesar  0,08- 0,1.  Saat  nilai  absorbansi  larutan  uji  sebesar  0,08-0,1  maka,  suspensi  larutan tersebut setara dengan Mc. Farland 0,5 (1 x 106 – 5 x 106 CFU/mL). Hasil nilai absorbansi suspensi yang diperoleh saat perhitungan dengan alat spektrofotometer adalah 0,089.

## Uji Zona Hambat Bakteri
Uji  zona  hambat  bakteri  dilakukan  dengan  metode  difusi  cakram.  Metode ini  merupakan  metode  uji  diameter  daya  hambat  secara  langsung.  Setelah  media NA  dalam  cawan  petri  memadat,  suspensi  bakteri Escherichia  coli yang  telah dibuat  setara  dengan  standar  Mc.Farland  0,5  diambil  sebanyak  0,1  mL menggunakan  mikropipet.  Kemudian  dituangkan  pada  permukaan  media  dan disebar  secara  merata  menggunakan  batang  spreader.  Selanjutnya  kertas  cakram direndam  ke  dalam  masing-masing  konsentrasi  larutan  ekstrak  kasar  ( crude extract )  daun T.  cacao L.  selama  1-5  menit.  Untuk  kontrol  positif,  direndam kertas  cakram  dalam  larutan Amoxicillin 0,01  g/mL  dan  kontrol  negatif  kertas cakram direndam dalam aquades steril masing-masing selama 1-2 menit.  Setelah itu,  kertas  cakram  diambil  menggunakan  pinset  dan  diletakkan  pada  permukaan area  yang  telah  diberi  tanda.  Lalu  diinkubasi  selama  1x24  jam  pada  suhu  37 0 C. Kemudian diamati zona bening yang terbentuk.
Diameter  zona  bening  diukur  menggunakan  jangka  sorong  dengan  satuan mm. Semua rangkaian perlakuan dilakukan secara aseptis. Pengulangan perlakuan ditentukan  berdasarkan  rumus  Federer.  Adapun  pengamatan  dilakukan  secara langsung  dengan  menggunakan  lembar  observasi.  Perlakuan  diulang  minimal sebanyak empat kali. Metode pengukuran dilakukan menggunakan rumus berikut:

## D =
Keterangan: D   = Diameter Zona Hambat Dv = Diameter Hambat Vertikal Dh = Diameter Hambat Horizontal Dc = Diameter Kertas Cakram
Dv
Dc Dh

## HASIL PENELITIAN
Berdasarkan  uji  normalitas  dan  homogenitas,  data  yang  dianalisis berdistribusi  normal  (p>0.05)  dan  homogen  (p>0.05).  Selanjutnya  data  diuji secara statistik dengan metode One  Way ANOVA menggunakan SPSS 23.  Hasil uji  ANOVA  memperlihatkan  bahwa  ekstrak  daun T.  cacao L.  efektif  dalam menghambat  pertumbuhan  bakteri E.  coli (Gambar  1).  Selain  itu,  terdapat perbedaan zona hambat  yang nyata antara kelompok kontrol positif, negatif, dan perlakuan (F 5,24 = 18,841, p<0.05). Uji lanjutan Duncan menunjukkan bahwa nilai rata-rata zona hambat semua perlakuan berbeda nyata dengan kontrol negatif dan zona hambat pada konsentrasi 25% juga berbeda nyata dengan kontrol positif.
Tabel 2. Diameter Zona Hambat Ekstrak Daun T. cacao L. terhadap E. coli ( mm ) No Kelompok uji Pengulangan ke- Rata 2 1 2 3 4 5 1 Kontrol negatif 0 0 0 0 0 0 a 2 Konsentrasi 25% 7.785 6.71 8.565 6.645 6.925 7.326 b 3 Konsentrasi 50% 7.605 8.77 9.625 7.735 10.15 8.777 bc 4 Konsentrasi 75% 8.63 9.78 11.35 8.05 7.885 9.139 bc 5 Konsentrasi 100% 7.865 14.665 10,48 8.415 8.165 9.918 bc 6 Kontrol positif 13.005 17.885 8.66 9.475 9.675 11.74 c
*Keterangan :  Angka  diikuti  huruf  yang  sama  tiap  kolom  tidak  berbeda  nyata  pada  taraf  uji  5% DMRT
Berdasarkan tabel 2, data memperlihatkan bahwa tidak ada perbedaan yang nyata  antara  zona  hambat  pada  konsentrasi  25%,  50%,  75%,  maupun  100%  dan zona  hambat  pada  konsentrasi  50%,  75%,  100%  tidak  berbeda  nyata  dengan kontrol positif.
Gambar 1 . Zona Hambat Ekstrak Daun T. cacao L.  terhadap E. coli . (a) Pengulangan 1; (b) Pengulangan 2; (c) Pengulangan 3; (d) Pengulangan 4; (e) Pengulangan 5
a b c d e
Gambar  2.  Zona  Hambat  Pertumbuhan E.  coli pada  Beberapa  Perlakuan Ekstrak Daun T. cacao L.
Hasil  pada  gambar  2  menunjukkan  bahwa  peningkatan  konsentrasi  ekstrak daun T. cacao L. berbanding lurus dengan zona hambat (r=0.78, p<0.01). Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun coklat, zona hambat pertumbuhan E.  coli juga  semakin  luas.  Perlakuan  pada  dosis  100%  hanya berbeda 1.82 mm (18%) dengan kontrol positif.

## PEMBAHASAN
Daya Hambat Daun T. cacao L. terhadap Pertumbuhan E. coli
Rata-rata  zona  hambat  ekstrak  daun T.  cacao L.  terhadap E.  coli berada pada  interval  5-10  mm.  Jika  dibandingkan  dengan  kriteria  hasil  zona  hambat Davis  dan  Stout  (1971),  angka  tersebut  masuk  pada  kategori  hambatan  sedang (Trisia  et  al.,  2018).  Hasil  ini  paralel  dengan  penelitian  Permataningrum et  al. yang menemukan bahwa zona hambat ekstrak daun T. cacao L. terhadap Candida albicans tergolong kedalam kriteria sedang (Permataningrum et al., 2019).
Hasil uji ANOVA menunjukkan terdapat perbedaan nyata antara kelompok perlakuan.  Namun,  uji  lanjut  Duncan  menunjukkan  bahwa  tidak  terdapat perbedaan  zona  hambat  yang  signifikan  antar  konsentrasi  ekstrak  yang dipaparkan.  Hal  ini  berarti  tidak  terdapat  perbedaan  efektivitas  ekstrak  daun T. cacao L. pada konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100%. Meskipun, dari luas zona hambat  yang  terbentuk,  terlihat  konsentrasi  ekstrak  100%  adalah  konsentrasi paling  baik  dalam  menghambat  pertumbuhan E.  coli .  Terdapat  keuntungan  dan kerugian  dari  hasil  tersebut.  Keuntungannya  adalah  hanya  dengan  hanya menggunakan  ekstrak  dosis  rendah,  zona  hambat E.  coli yang  terbentuk  sama dengan zona hambat pada dosis yang lebih tinggi. Hal ini memungkinkan sumber daya yang digunakan dalam proses uji lanjutan menjadi semakin sedikit. Namun, kerugiannya  adalah,  hasil  tersebut  mengindikasikan  bahwa  efektivitas  ekstrak daun T. cacao L. dalam menghambat pertumbuhan E. coli tergolong kurang baik. Pertumbuhan E. coli dapat terhambat disebabkan interaksi negatif antara zat antibakteri di dalam ekstrak daun coklat dengan komponen penyusun sel E. coli .
Ekstrak daun T. cacao L. mengandung alkaloid, flavonoid, terpenoid dan saponin (Parbuntari  et  al.,  2018)  yang  secara  berturut-turut  mampu  menyebabkan
0 7,326 8,777 9,139 9,918 11,74 0 7,326 8,777 9,139 9,918 11,74 0 7,326 8,777 9,139 9,918 r= 0,779 0 2 4 6 8 10 12 14 Negatif 25 50 75
100 Positif Dia m et er Z o na H a m ba t/I nh ibi tio n Z o ne ( m m )
Konsentrasi Ekstrak Daun T. cacao L. / The Concentration of T. cacao L. Leaves Extract (%)
kerusakan Deoxyribonucleic Acid (DNA),  protein  sel,  porin,  dan  dinding  sel. Alkaloid dapat merusak DNA karena senyawa ini memiliki gugus basa yang jika berinteraksi  dengan  asam  amino  DNA,  maka  DNA  menjadi  tidak  seimbang  dan rusak.  Flavonoid  merusak  protein  dikarenakan  membentuk  senyawa  kompleks dengan protein ekstraseluler  yang menyebabkan denaturasi protein dan kerusakan membran sel (Hati et al., 2019). Terpenoid bekerja dengan cara membentuk ikatan polimer kuat dengan protein yang mengakibatkan porin menjadi rusak. Sedangkan saponin  bekerja  dengan  cara  memanfaatkan  permukaannya  yang  bersifat  seperti detergen  untuk  menurunkan  tegangan  permukaan  dinding  sel  dan  permeabilitas membrane  (Suryani  et  al.,  2019).  Akibat  serangkaian  reaksi  tersebut,  sel E.  coli tidak  mampu  bertahan  hidup,  sehingga  terbentuklah  zona  bening  yang mengindikasikan bahwa tidak ada E. coli yang hidup di area tersebut. Zona  hambat  ekstrak  daun T.  cacao L.  terhadap E.  coli yang  ditemukan pada  penelitian  ini masih  lebih  kecil  jika  dibandingkan  dengan  tumbuhan  herbal lain  yang  biasa  digunakan  masyarakat  sebagai  obat  diare,  seperti  ubi  kayu ( Manihot  esculenta ),  buah  pinang  ( Areca  catechu L.),  dan  daun  salam  ( Eugenia polyantha ) (Redwik et al., 2019; Utami, 2020). Menurut Mandhaki et al., (2021) diketahui  bahwa  daya  hambat  ekstrak  etanol  daun T.  cacao L.  pada Staphylococcus  aureus lebih baik dari pada hambatannya terhadap E. coli. Hal ini menunjukkan  ekstrak  daun T.  cacao L.  lebih  efektif  menghambat  bakteri  gram positif  daripada  bakteri  gram  negatif.  Hal  ini  dikarenakan  struktur  dinding  sel bakteri  gram  positif  lebih  sederhana  dari  pada  struktur  dinding  sel  bakteri  gram negatif.  Dinding  sel  bakteri  gram  positif  hanya  terdiri  atas  dua  lapis,  sedangkan bakteri gram negatif dinding selnya terdiri atas tiga lapis (Sanuddin et al., 2022). Selain  faktor  tingkat  kompleksitas  dinding  sel  bakteri,  kurangnya  tingkat hambatan ekstrak daun T. cacao L. pada penelitian ini juga kemungkinan karena kadar zat antibakteri di dalam daun T. cacao L. yang tergolong rendah. Mandhaki et  al.,  (2021)  juga  melaporkan  bahwa  rendemen  fraksi  etanol  yang  meliputi saponin,  tanin,  dan  flavonoid  dalam  daun T.  cacao L.  hanya  sebesar  12,52%.
Angka ini menunjukkan bahwa kandungan senyawa antibakteri di dalam daun T. cacao L. cenderung sedikit. Oleh karena itulah pemberian ekstrak pada tingkatan konsentrasi tidak  berpengaruh signifikan terhadap pertumbuhan E. coli. Selain  itu,  ekstrak  daun T.  cacao L.  yang  dipaparkan  pada E.  coli dalam penelitian  ini  hanya  mengandung  terpenoid  dalam  jumlah  yang  sedikit.  Hal  ini karena,  terpenoid  tidak  dapat  larut  secara  sempurna  dalam  etanol  yang  bersifat polar.  Terpenoid  merupakan  senyawa  non-polar  yang  hanya  bisa  larut  sempurna pada  pelarut  non  polar  (Susanto  et  al.,  2018).  Sehingga,  terpenoid  yang  tidak terlarut  sempurna  ini  menyebabkan  efektivitas  ekstrak  daun T.  cacao L.  dalam menghambat E.  coli menjadi  kurang  efektif.  Penyebab  ketiga  yang memungkinkan kecilnya zona hambat yang terbentuk adalah penggunaan metode difusi  cakram  yang  menghasilkan  zona  hambat  lebih  kecil  jika  dibandingkan dengan metode difusi sumuran (Febriawan & Sari, 2021).
Korelasi  Konsentrasi  Ekstrak  Daun T.  cacao L . terhadap  Diameter  Zona Hambat E. coli
Nilai  korelasi  Pearson  antara  konsentrasi  ekstrak  daun T.  cacao L.  dengan zona hambat bakteri E. coli berada pada interval 0,60-0,79. Berdasarkan pedoman derajat korelasi, nilai korelasi pada interval tersebut termasuk dalam kategori kuat.
Hal  ini  menandakan  bahwa  peningkatan  konsentrasi  ekstrak  daun T.  cacao L. memiliki korelasi yang kuat dengan penambahan luas zona hambat E. coli .

## SIMPULAN
Daun T. cacao L. kurang efektif dalam menghambat pertumbuhan E. Coli , meskipun peningkatan konsentrasi ekstrak daun tersebut berbanding lurus dengan pertambahan  diameter  zona  hambat  pertumbuhan E.  coli .  Ekstrak  daun T.  cacao L. berkorelasi positif dengan zona hambat yang terbentuk.

## DAFTAR PUSTAKA
Febriawan, R., & Sari, Z. A. A. (2021). Perbedaan Hasil Uji Aktivitas Antibakteri
Metode  Well  Diffusion  dan  Kirby  Bauer  terhadap  Pertumbuhan  Bakteri. Jurnal Medika Hutama , 2 (4), 1156–1162. https://www.jurnalmedikahutama.com/index.php/JMH/article/view/241 Fransisca,  D.,  Kahanjak,  D.  N.,  &  Frethernety,  A.  (2020).  Uji  Aktivitas Antibakteri  Ekstrak  Etanol  Daun  Sungkai  ( Peronema  canescens Jack) terhadap  Pertumbuhan Escherichia  coli dengan  Metode  Difusi  Cakram Kirby-Bauer. Jurnal  Pengelolaan  Lingkungan  Berkelanjutan , 4 (1),  460– 470. https://doi.org/10.36813/jplb.4.1.460-470
Hardiyanti,  F.,  Tambunan,  H.  S.,  &  Saragih,  I.  S.  (2019).  Penerapan  Metode  K- Medoids  Clustering  pada  Penanganan  Kasus  Diare  di  Indonesia. KOMIK (Konferensi  Nasional  Teknologi  Informasi  dan  Komputer , 3 (1),  598–603. https://doi.org/10.30865/komik.v3i1.1666
Hati,  A.  K.,  Dyahariesti,  N.,  &  Yuswantina,  R.  (2019).  Penetapan  Kadar Flavonoid  dan  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Sereh  ( Cymbopogon nardus )  dan  Temu  Kunci  ( Boesnbergia  pandurata Roxb)  terhadap  Bakteri Streptococcus  mutans . Indonesian  Journal  of  Pharmacy  and  Natural Product , 2 (2), 71–78. https://doi.org/10.35473/ijpnp.v2i2.264
Kementerian  Kesehatan  RI.  (2019).  Profil  Kesehatan  Indonesia  Tahun  2019. https://www.kemkes.go.id/downloads/resources/download/pusdatin/profil- kesehatan-indonesia/Profil-Kesehatan-Indonesia-Tahun-2020.
Mandhaki, N., Huda, C., & Putri, A. E. (2021). Aktivitas Antibakteri Fraksi Daun Kakao  (Theobroma  cacao  L.)  terhadap  Bakteri Staphylococcus  aureus secara  In  Vitro. Jurnal  Saiins  Dan  Kesehatan , 3 (2),  188–193. https://doi.org/10.25026/jsk.v3i2.269
Mustofa, F. I., & Rahmawati, N. (2018). Studi Etnofarmakologi Tumbuhan Obat yang  Digunakan  oleh  Penyehat  Tradisional  untuk  Mengatasi  Diare  di Sulawesi  Selatan. Jurnal  Tumbuhan  Obat  Indonesia , 11 (2),  17–32. https//doi.org/10.22435/jtoi.v11i2.580
Parbuntari,  H.,  Prestica,  Y.,  Gunawan,  R.,  Nurman,  M.  N.,  &  Adella,  F.  (2018).
Preliminary  Phytochemical  Screening  (Qualitative  Analysis)  of Cacao Leaves ( Theobroma cacao L.). Eksakta , 19 (2), 40–45.
https://doi.org/10.24036/eksakta/vol19-iss2/142
Permataningrum,  N.  I.,  Dewi,  L.  R.,  &  Prihanti,  A.  M.  (2019).  Daya  Hambat Ekstrak Daun Kakao ( Theobroma cacao L.) terhadap Pertumbuhan Candida albicans . E-Journal Pustaka Kesehatan , 7 (3), 142–146. https://doi.org/10.19184/pk.v7i3.10824
Rasyid,  B.,  Karta,  I.  W.,  Sari,  N.  L.  P.  E.  K.,  &  Putra,  I.  G.  N.  D.  (2020). Identifikasi  Gen  Penyandi  Protein  Transport  sebagai  Kandidat  Vaksin Subunit terhadap Bakteri Escherichia coli Penyebab Diare Wisatawan. JST (Jurnal  Sains  Dan  Teknologi) , 9 (1),  47–57.  https://doi.org/10.23887/jst- undiksha.v9i1.22774
Redwik, D. U. W., Simbala, H. E., & Edy, H. J. (2019). Identifikasi Fitokimia dan Uji  Daya  Hambat  dari  Ekstrak  Etanol  Tangkai  Buah  Pinang  Yaki  ( Areca vestiaria giseke ) terhadap Bakteri Staphylococcus aureus , Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa . Pharmacon, 8 (4), 936–944.
https://doi.org/10.35799/pha.8.2019.29373
Sanuddin,  M.,  Hadriyati,  A.,  &  Sari,  I.  P.  (2022).  Uji  Aktivitas  Antibakteri
Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli terhadap  Senyawa  Sintesis Difeniltin  (IV)  Metil  Ditiokarbamat. Lumbung  Farmasi , 3 (1),  46–50. https://doi.org/10.31764/lf.v3i1.7030
Suryani,  N.,  Nurjanah,  D.,  &  Indriatmoko,  D.  D.  (2019).  Aktivitas  Antibakteri Ekstrak Batang Kecombrang ( Etlingera elatior (Jack) R. M. Sm.) terhadap Bakteri Plak Gigi Streptococcus mutans . Jurnal Kartika Kimia , 2 (1), 23–29. https://doi.org/10.26874/jkk.v2i1.19
Susanto,  A.,  Ratnaningtyas,  N.  I.,  &  Ekowati,  N.  (2018).  Aktivitas  Antioksidan Ekstrak Tubuh Buah Jamur Paha Ayam ( Coprinus comatus ) dengan Pelarut Berbeda. Majalah Ilmiah Biologi Biosfera : A Scientific Journal , 35 (2), 63– 68. https://doi.org/10.20884/1.mib.2018.35.2.566
Trisia,  A.,  Philyria,  R.,  &  Toemon,  A.  N.  (2018).  Uji  Aktivitas  Antibakteri Ekstrak  Etanol  Daun  Kalanduyung  ( Guazuma  ulmifolia Lam.)  terhadap Pertumbuhan Staphylococcus aureus dengan Metode Difusi Cakram (Kirby- Bauer). Anterior Jurnal , 17 (2), 136–143. https://doi.org/10.33084/anterior.v17i2.12 Utami,  P.  R.,  &  Ramadhani,  R.  (2020).  Uji  Daya  Hambat  Ekstrak  Daun  Salam ( Syzygium  polyanthum [Wight]  Walp)  terhadap  Pertumbuhan  Bakteri Escherichia coli. Jurnal Ilmiah Pannmed , 15 (2).
https://doi.org/10.36911/pannmed.v15i2.726