DAYA HAMBAT AIR PERASAN JERUK NIPIS (Citrus aurantifolia S.) PADA PERTUMBUHAN BAKTERI Edwardsiella tarda DARI BENIH LELE DUMBO (Clarias gariepinus) SECARA IN VITRO
Didik Budiyanto 1 , Sri Oetami Madyowati 2 , Nur Lailiyah 3
123 Jurusan Perikanan, Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Dr. Soetomo Surabaya e-mail: 1 dbudiyanto_unitomo@yahoo.com

## Abstrak
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  seberapa  besar  daya  hambat  air  perasan buah jeruk nipis (Citrus aurantifolia S.) terhadap pertumbuhan bakteri Edwardsiella tarda yang diambil dari  benih  lele  dumbo  (Clarias  gariepinus)  secara  in  vitro.  Metode  penelitian  yang  digunakan  adalah eksperimental  dengan  rancangan  percobaan  menggunakan rancangan acak  lengkap  (RAL)  yang  terdiri dari 4 ulangan, 6 perlakuan dan 2 kontrol. Perlakuan yang digunakan adalah pemberian konsentrasi air perasan buah jeruk nipis yang berbeda yaitu Perlakuan A (15%), B (30%), C (45%), D (60%), E (75%), dan  F  (90%),    kemudian  kontrol  positif  (Chloramphenicol)  dan  kontrol  negatif  (Aquades  steril).  Hasil penelitian  menunjukkan  rata-rata  diameter  zona  hambat  tertinggi  terdapat  pada  perlakuan  F  (dengan nilai rata-rata 17,25 mm) dan rata-rata diameter zona hambat terendah yaitu perlakuan A (dengan nilai rata-rata  1,125  mm).  Hubungan  antara  pemberian  air  perasan  buah  jeruk  nipis  dalam  menghambat pertumbuhan  bakteri  Edwardsiella  tarda  dengan  rata-rata  diameter  zona  hambat  yang  dihasilkan menunjukkan  respon  yang  meningkat  seiring  dengan  bertambahnya  dosis.  Berdasarkan  uji  Anova  dan BNT  menunjukkan  bahwa  air  perasan  buah  jeruk  nipis  (Citrus  aurantifolia  S.)  pada  masing-masing perlakuan berpengaruh nyata terhadap daya hambat pertumbuhan bakteri Edwardsiella tarda dengan F hit > F tabel pada taraf signifikan 5 % (2.77) maupun 1% (4.25).

## Kata Kunci: Air perasan buah jeruk nipis, Edwardsiella tarda, Uji Daya Hambat

## Pendahuluan
Ikan lele merupakan salah satu komoditas  perikanan  yang  pengembangannya diminati  oleh  para  pembudidaya  di  Indonesia. Budidaya  ikan  lele  di  Indonesia  mengalami perkembangan pesat setelah dilakukannya introduksi  ikan  lele  unggul  dari  Taiwan  yang dengan  cepat  berkembang  dan  populer  di kalangan  pembudidaya  dengan  nama  ikan  lele dumbo.  Budidaya  ikan  lele  dumbo  (Clarias gariepinus) adalah sebagai salah alternatif dalam upaya  pemenuhan  protein  hewani.  Prospek pengembangan  budidaya  ikan  lele  dumbo sangatlah  besar, permintaan  pasar  terhadap komoditas  ini  sangatlah  tinggi.  Banyak  petani ikan  yang  mulai  melakukan  kegiatan  budidaya ikan  lele  secara  intensif  untuk  memenuhi permintaan  pasar.  Namun  salah  satu  kendala yang  dihadapi  dalam  budidaya  intensif  adalah penyakit ikan yang dapat menimbulkan kerugian ekonomi bagi para pembudidaya
ikan,antara lain penyakit yang disebabkan oleh bakteri Edwardsiella tarda.
Bakteri Edwardsiella tarda adalah penyebab penyakit Edwardseillosis/ Emphisemathous Putrevactive Desease of Catfish  (EPDC)  atau  Edwardsiella  Septicaemia (ES).  Penyakit  Edwardseillosis  dikenal  sebagai penyakit  utama  pada  budidaya  catfish  akan tetapi  juga  bias  pada  reptile,  burung,  mamalia dan  manusia  yang  dikenal  menyebabkan penyakit  gastrointestinae  dan  extraintestinae. Bakteri  Edwardsiella  tarda  hidup  secara  alamia di  perairan  tawar  dan  laut  khususnya  pada perairan  yang  banyak  mengandung  bahan organik dan juga di lumpur (Plumb, 2002).
Penanganan  penyakit  yang  disebabkan oleh Edwardsiella tarda dapat dilakukan dengan berbagai  cara,  seperti  pemberian  antibiotik. Pemberian  bahan  kimia  ini  memang  dapat mencegah  maupun  mengobati  penyakit  pada
ikan  bila  digunakan  dengan  dosis  yang  tepat, akan tetapi bila digunakan tidak terkontrol maka dapat  menimbulkan    beberapa  efek  negatif. Residu antibiotik dapat menyebabkan timbulnya bakteri  yang  resisten  terhadap  antibiotik,  selain itu  juga  dapat  mencemari  lingkungan  dan  juga dapat  dijumpai  di  tubuh  ikan,  sehingga  ikan tidak  aman  untuk  dikonsumsi  oleh  manusia (Lukistyowati dan Kurniasih, 2011).
Salah  satu  alternatif  dalam  mengobati penyakit bakterial pada ikan adalah menggunakan bahan-bahan alami yang mempunyai  kemampuan  anti  bakteri.  Efek samping yang dihasilkan oleh bahan alami dapat dikatakan  tidak  signifikan  terhadap  kerusakan lingkungan, resistensi bibit penyakit, residu yang tidak terakumulasi di dalam jaringan atau organ dan  aman  baik  komoditas  budidaya  maupun konsumen  (Feriyanto.  2009).    Penanganan penyakit  akibat  Edwardsiella  tarda  dengan menggunakan  bahan  herbal,  berpotensi  sebagai imunostimulan melalui peningkatan sistem imun ikan  untuk  melawan  pertumbuhan  bakteri Edwardsiella tarda (Lukistyowati dan Kurniasih, 2011). Sehingga kematian ikan lele kemungkinan besar dapat teratasi.
Jeruk  nipis  (Citrus  aurantifolia)  adalah jeruk yang  mempunyai  rasa  asam  dan  agak pahit.  Tanaman  ini  adalah  tanaman  tahunan, sudah  sejak  lama  tanaman  jeruk  dibudidayakan di  Indonesia.  Kualitasnya  bukan  dilihat  dari ukuran buahnya, melainkan dari warna, kejernihan, dan tekstur kulit. Semakin tipis kulit jeruk nipis, semakin banyak kandungan airnya.
Jeruk nipis (Citrus aurantifolia) mengandung  unsur-unsur  senyawa  kimia  yang bermanfaat,  seperti  asam  sitrat,  asam  amino (triftopan,  lisin),  minyak  atsiri  (sitral,  limonen, flandren,  lemon  kamfer,  kadinen,  gerani-asetat, linali-asetat,  aktiladehid,  nonildehid),  damar, glikosida,  asam  situn,  lemak,  kalsium,  fosfor, besi, belerang vitamin B1 dan C (Hariana, Arief, 2006).  Menurut  Razak  dkk  (2013),  mengatakan bahwa    senyawa  aktif  antibakteri  dalam  air perasan  buah  jeruk  nipis  yang  diduga  diperoleh dari  kandungan  kimia  yang  terdapat  di dalamnya,  seperti  minyak  atsiri,  diantaranya fenol  yang  bersifat  sebagai  bakterisidal  mampu menghambat pertumbuhan dari bakteri.
Tujuan  dari  penelitian  yang  dilakukan adalah:  Untuk  mengetahui  seberapa  besar  daya
hambat  air  perasan  buah  jeruk  nipis  (Citrus aurantifolia  S.)  terhadap  pertumbuhan  bakteri Edwardsiella  tarda  yang  diambil  dari  benih  lele dumbo (Clarias gariepinus) secara in vitro, serta untuk  mengetahui  konsentrasi  optimal  air perasan  buah jeruk  nipis (Citrus  aurantifolia  S.) yang  menghasilkan  daya  hambat  terbesar terhadap  pertumbuhan  Bakteri  Edwardsiella tarda  yang  diambil  dari  benih  lele  dumbo (Clarias gariepinus) secara in vitro.

## Metodologi

## 2.1. Materi Penelitian
Benih  ikan  lele  dumbo  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  sampel  yang  secara gejala  klinis  di  duga  terinfeksi  bakteri Edwardsiella  tarda,  diperoleh  dari  daerah  Blitar yang  merupakan  sampel  untuk  keperluan sertifikasi  kesehatan  ikan. Air  Perasan  Buah Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia S.)
Isolat  Bakteri  Edwardsiella  tarda  yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari hasil identifikasi  uji  sampel  benih  ikan  lele  yang terinfeksi  Edwardsiella  tarda  di  Laboratorium Balai  Karantina  Ikan,  Pengendalian  Mutu  dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Surabaya I.
Bahan untuk pengujian dalam penelitian ini  adalah  kertas  cakram,  aquades  steril,  tissue, masker, sarung tangan, kertas label, etanol 96%, antibiotik  chloramphenicol  30  mg,  larutan fisiologis,  media  TSA  (Trypthycase  Soy  Agar), media  MIO  (Motility  Indole  Ornitin),  media O/F,  media  MR  (Methyl  Red),  VP  (Voger Prokeur),  Gelatin,  TSIA  (Triple  Sugar  Iron Agar),  MIO  (Motility  Indol  Ornithin),  LIA (Lysine  Iron  Agar),  media  uji  gula  (maltose, laktosa,  arabinosa,  inositol,  manitol,  sukrosa, sorbitol).
2.2. Metode Penelitian
Metode  penelitian  yang  digunakan adalah  metode  eksperimen  (Hanafiah,  1994) yang dilakukan secara in vitro menggunakan uji sensitivitas pada Edwardsiella tarda terhadap air perasan buah jeruk nipis dengan membandingkan  antara  perlakuan  dan  kontrol. Perlakuan  diberikan  yaitu  konsentrasi  air perasan  buah  jeruk  nipis  sebesar  15%,  30%, 45%, 60%, 75%, 90%,  kemudian kontrol positif (Chloramphenicol) dan kontrol negatif (Aquades steril).
2.3 Prosedur Penelitian 2.3.1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi adalah proses penghilang atau membunuh  semua  jenis  mikroorganisme  yang terdapat  pada  suatu  benda  (Vioren,  2011). Sterilisasi media dilakukan menggunakan autoclave  dengan  suhu  1210C  pada  tekanan  1 atm  selama  15  menit.  Sterilisasi  alat  dilakukan dengan  menggunakan  oven  dengan  suhu  1800C selama 2-3 jam.
2.3.2 Pembuatan  Air  Perasan  Buah  Jeruk  Nipis (Citrus aurantifolia S.)
Buah jeruk  nipis  (Citrus aurantifolia  S.) diambil  dari  daerah  Porong,  Sidoarjo.  Buah jeruk  nipis  yang  dipilih  adalah  jeruk  nipis  yang diameter rata-ratanya 3-4 cm, kondisi buah baik, berkulit  halus,  tidak  cacat,  dan  bewarna  hijau. Adapun  proses  pembuatannya  adalah  sebagai berikut :Buah jeruk nipis dicuci bersih, dipotong menjadi  dua  bagian  dan  diperas,  air  perasan buah  jeruk  nipis  murni  tersebut  adalah konsentrasi 100 %, larutan dengan konsentrasi N %  dibuat  dengan  cara  pengenceran  dari  larutan stock  (100  %),  setiap  tahap    konsentrasi  dibuat sebanyak  500  µl  dengan  menggunakan  rumus pengenceran V1.N1 = V2.N2
2.3.3 Penyediaan Bakteri Edwardsiella tarda Bakteri  uji  yang  digunakan  adalah diperoleh  dari  sampel  benih  ikan  lele dumbo yang  terinfeksi  bakteri Edwardsiella  tarda. Sampel jaringan untuk diagnosis dan identifikasi Edwardsiella  tarda  harus diambil  secara  aseptik dari  lesi  pada  ginjal  atau  organ  lainnya,  jika tidak  ada  lesi  maka  ginjal  dan  isi  usus  adalah organ  yang  sesuai  untuk  sampel  (Pusat Karantina  Ikan  :  2007).    Dari  organ  target tersebut  dilakukan  isolasi  dengan  menggunakan ose  pada  media  TSA,  diinkubasi  pada  suhu  26- 30oC selama 24-48 jam dalam inkubator. Untuk mendapatkan biakan murni maka diambil koloni yang tumbuh secara terpisah kemudian diisolasi kembali  ke  dalam  media  TSA  dan  diinkubasi pada  suhu  26-30oC  selama  24-48  jam  dalam inkubator.  Setelah  mendapatkan  biakan  murni, kemudian  dilakukan  uji  pendugaan  awal,  uji biokimia dan di identifikasi.
2.3.4 Identifikasi Bakteri
Identifikasi  bakteri  Edwardsiella  tarda dilakukan  menggunakan  metode  konvensional, yang meliputi pemeriksaan morfologi, pewarnaan  Gram,  dan  uji  biokimiawi  yaitu  uji O/F,  uji  oksidase,  uji  katalase,  uji  motilitas, produksi indol, uji TSIA, uji LIA, uji gelatin, uji MR/VP,  dan  uji  gula  (Pusat  Karantina  Ikan, 2014). Identifikasi bakteri dengan menggunakan uji biokimiawi antara lain:

## 1) Pengamatan Koloni Bakteri
Pengamatan  koloni  bakteri  dilakukan dengan  cara  menumbuhkan  isolat  bakteri  pada agar  cawan  yang  meliputi:  warna,  elevasi,  dan tepi koloni.

## 2) Pengamatan Morfologi Bakteri
Pengamatan morfologi bakteri dilakukan dengan  pewarnaan  Gram.  Pewarnaan  Gram bertujuan  untuk  menentukan  apakah  bakteri tersebut  termasuk  di  dalam  kelompok  bakteri Gram  positif  atau kelompok  bakteri  Gram negatif.  Cara  kerja  dari  pewarnaan  Gram  yaitu kaca  objek  dibersihkan  dengan  alkohol  dan dilewatkan beberapa kali pada nyala api bunsen, kemudian  diambil  isolat  bakteri  dengan  ose secara  aseptik  dan  dioleskan  pada  kaca  objek. Isolat  bakteri  kemudian  ditetesi  karbol  gentian violet dan dibiarkan selama 1 menit, selanjutnya dicuci  dengan  air  mengalir  dan  dianginkan hingga  kering.  Isolat  bakteri  kemudian  ditetesi lagi dengan larutan lugol’s iodine dan dibiarkan selama  1  menit,  kemudian  dicuci  dengan  air mengalir dan dianginkan hingga kering. Selanjutnya  isolat  bakteri  dilunturkan  alkohol 95%  /  alkohol  aseton,  kemudian  dialiri  air  dan dianginkan hingga kering. Isolat bakteri kemudian ditetesi safranin selama          30 detik dan  dicuci  dengan  air  mengalir,  dikeringkan dengan kertas penghisap dan dikering anginkan, kemudian dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop 1000 kali.
Bakteri  Gram  positif  ditandai  dengan warna  ungu  yang  menunjukkan  bahwa  bakteri tersebut  mampu  mengikat  warna  karbol  gentian violet,  sedangkan  bakteri  Gram  negatif  ditandai dengan  warna  merah  muda  yang  menunjukkan bahwa  bakteri  tersebut  tidak  mampu  mengikat warna karbol gentian violet dan hanya terwarnai oleh  safranin  (Hadioetomo,  1993).  Hasil  yang
menunjukkan  Edwardsiella  tarda  adalah    warna merah  muda  yang  merupakan  ciri  dari  gram negative  dan  bentuk  morfologi  bakteri  adalah batang.
3) Uji Katalase Uji katalase bertujuan untuk mengetahui sifat bakteri dalam menghasilkan enzim katalase.  Cara  kerja  dari  uji  katalase  yaitu larutan  H2O2  3%  diteteskan  pada  kaca  objek, kemudian  suspensikan  koloni  bakteri  dengan menggunakan  ose steril.  Perubahan  yang  terjadi jika  terdapat  gelembung-gelembung  oksigen, maka bakteri tersebut positif mengandung enzim katalase,  tetapi  jika  tidak  terdapat  gelembung maka bakteri dikatakan negatif, tidak menghasilkan  enzim  katalase  (Hadioetomo, 1993).  Hasil  yang  menunjukkan  Edwardsiella tarda dari uji katalase adalah positif .
4) Uji Oksidase
Tujuan  uji  oksidase  adalah  mengetahui ada  tidaknya  enzim  oksidase  pada  bakteri.  Cara kerjanya  yaitu  ambil  biakan  bakteri  murni dengan  menggunakan  ose  kemudian  goreskan paa  paper  oksidase.  Hasil  uji  positif  ditandai dengan berubahnya koloni menjadi merah muda, lalu merah tua, merah gelap, dan akhirnya warna hitam,  sebaliknya  apabila  tidak  berubah  warna maka  negatif  (Hadioetomo,  1993).  Hasil  yang menunjukkan  Edwardsiella  tarda  dari  uji oksidase adalah positif.
5) Uji O/F
Uji  O/F  bertujuan  untuk  membedakan sifat  bakteri  oksidatif  dan  bakteri  fermentatif yang  mengandung  oksidasi  atau  fermentasi terhadap  glukosa  dengan  menggunakan  dua tabung media yang salah satunya ditutup dengan paraffin,  sehingga  diharapkan  di  dalam  media tidak  terdapat  udara  yang  dapat  mendukung terjadinya  fermentasi.  Isolat  murni  bakteri diinokulasi pada media O/F dengan cara tusukan kemudian  disimpan  dalam inkubator,  setelah  24 jam  penyimpanan  dilakukan  diamati  perubahan warna  yang  terjadi.  Bakteri  oksidatif  apabila tabung  terbuka  (tidak  berparaffin)  berwarna kuning  dan  tabung  tertutup  (dengan  paraffin) berwarna  biru.    Bakteri  fermentatif    apabila tabung  terbuka  dan  tertutup  berwarna  kuning. Bakteri  non  oksidatif/fermentatif  pada  tabung
terbuka  dan  tertutup  tidak  ada  perubahan (Hadioetomo,  1993).  Hasil  yang  menunjukkan Edwardsiella  tarda  dari uji    O/F  adalah fermentatif.
6) Uji MIO (Motility Indol Ornithin)
Uji  MIO  bertujuan  untuk  mengetahui apakah  bakteri  tersebut  motil  atau  tidak  dan untuk mengetahui produksi indol dari tryptophane.  Cara  kerjanya  yaitu  mengambil bakteri  dengan  menggunakan  ose  steril,  dan ditusukkan kedalam media. Selanjutnya diinkubasi  selama  24  jam.  Pada  pengamatan apabila  bakteri  tumbuh  menyebar  pada  tusukan dikatakan  motility  positif,  jika  media  berubah menjadi kuning maka ornithin positif dan untuk mengetahui  indole,  diteteskan  cairan  konvaks beberapa tetes, lalu didiamkan sebentar kemudian  diamati.  Apabila  terjadi  perubahan yaitu dibagian permukaan menjadi warna merah, maka  dikatakan  indol  positif  (Hadioetomo, 1993).  Hasil  yang  menunjukkan  Edwardsiella tarda  dari  uji  MIO adalah  ornithin  negative, indol positif, dan motilitas positif.
7) Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Uji  TSIA  (Tripel  Sugar  Iron  Agar) bertujuan  untuk  membedakan  jenis  bakteri berdasarkan kemampuan memecahkan glukosa,laktosa, dan sukrosa, selain itu uji TSIA berfungsi  untuk  mengetahui  apakah  bakteri tersebut  menghasilkan  gas  H2S  atau  tidak. Media  yang  digunakan  mempunyai  dua  bagian yaitu  tegak  dan  miring.  Cara  kerjanya  yaitu dengan  mengambil  koloni  bakteri  dnegan menggunakan ose steril dan diinokulasikan pada media  TSIA  dengan  menusuk  tehak  lurus  pada bagian  media  tegak  dan  secara  zig  zag  pada bagiang  media  miring.  Selanjutnya  diingubasi selama  24  jam.  Pengamatan  dilakukan  dengan melihat  warna  media.  Apabila  bagian  media miring  berwarna  merah  dan  media  tegak berwarna kuning maka bakteri mampu memfermentasi  glukosa,  sedangkan  apabila bagian  media  miring  dan  tegak  keduanya berwarna kuning maka bakteri mampu memfermentasi  sukrosa  dan  laktosa.  Apabila terdapat  warna  kehitaman  pada bekas  goresan dan tusukan menunjukkan adanya H2S (Hadioetomo,  1993).  Hasil  yang  menunjukkan
Edwardsiella tarda dari uji TSIA adalah mampu memfermentasi glukosa, dan terdapat H2S.

## 8) Uji LIA  (Lysine Iron Agar)
Uji  LIA  bertujuan  untuk  mengetahui bakteri memproduksi lysine. Cara kerjanya yaitu dengan  mengambil  koloni  bakteri  dengan menggunakan  ose  steril  kemudian  ditusukkan pada  media    tegak  dan  digoreskan  zig  zag  pada media  miring,  selanjutnya  diinkubasi  selama  24 jam.  Pengamatan  dilakukan  dengan  melihat perubahan  warna  pada  media  LIA.  Hasilnya apabila  pada  goresan  berwarna  ungu  dan  pada tusukan berwarna kuning maka lysine decarboxylase  positif,  sedangkan  apabila  tidak terdapat  perubahan  warna  maka  hasil  uji dikatakan  negatif  (Hadioetomo,  1993).  Hasil yang  menunjukkan  Edwardsiella  tarda  dari  uji LIA adalah lysine decarboxylase positif.
9) Uji Gula
Uji  gula  bertujuan  untuk  kemampuan bakteri dalam mendegradasi gula dan menghasilkan  asam  organik  yang  berasal  dari tiap-tiap  jenis  gula,  yaitu  glukosa,  sukrosa, maltosa,  arabinosa,  manitol  dan  inositol.  Isolat murni  bakteri  diinokulasi  pada  masing-masing media dengan cara dicelupkan jarum Ose sampai setengah bagian dari media, kemudian disimpan ke  dalam  inkubator  selama  24  jam.  Setelah  24 jam amati perubahan warna, apabila bakteri pada masing-masing media tersebut mengalami perubahan  warna  menjadi  kuning,  maka  bakteri dikatakan  positif  karena  bakteri  membentuk asam  dari  fermentasi  glukosa  dan  jika  tidak terjadi  perubahan  warna  dikatakan  negatif karena bakteri membentuk asam dari fermentasi glukosa (Hadioetomo, 1993).
2.3.5 Kultur Bakteri Edwardsiella tarda Kultur  Edwardsiella  tarda  didapat  dari hasil pemurnian isolat yang hasil identifikasinya adalah positif isolat bakteri Edwardsiella tarda . Langkah  awal  yang  dilakukan  untuk  kultur bakteri adalah mengambil 1-3 koloni Edwardsiella  tarda  dari  koloni  yang  ada sebelumnya  dengan  menggunakan  jarum  ose, kemudian  di  tanam  kembali  pada  media  buatan yaitu  Trypticase  Soya  Agar  (TSA),  selanjutnya diinkubasi pada suhu 26-30oC selama 24-48 jam
dalam inkubator, Semua proses dilakukan secara aseptis.
2.3.6 Pembuatan Suspensi Bakteri Infeksi bakteri Edwardsiella tarda terhadap  ikan  bersifat  patogen  pada  kepadatan 107 CFU/ml (Wahid, 2006). Sehingga kepadatan bakteri  disesuaikan  dengan  kepadatan  bakteri yang  mampu  menginfeksi  ikan.  Pembuatan suspensi  diawali  dengan  cara  mengambil  2-3 koloni  dengan  menggunakan  jarum  ose  steril, dan  dimasukkan  kedalam  NaCl  Fisiologis  steril 10 ml kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex dan kekeruhannya disetarakan  dengan  standard  Mc  Farland  nomor 0,5.
2.4 Pelaksanaan Penelitian
2.4.1 Pembuatan  Air  Perasan  Buah  Jeruk  Nipis (Citrus  aurantifolia  S.)  Dengan  Berbagai Konsentrasi
Metode  yang  digunakan  pada  penlitian adalah metode difusi dilakukan dengan berbagai konsentrasi.  Microtube  sebanyak  6  buah  diisi larutan  masing-masing  sebanyak  500  µl  dan diberi nomor 1-6. Kemudian microtube nomor 1 adalah konsentrasi 15% (75 µl air perasan buah jeruk nipis dan 425 µl aquades steril), microtube nomor  2  konsentrasi  30%  (150  µl  air  perasan buah  jeruk  nipis  dan  350  µl  aquades  steril), microtube nomor 3 konsentrasi 45% (225 µl air perasan  buah  jeruk  nipis  dan  275  µl  aquades steril), microtube nomor 4 konsentrasi 60% (300 µl  air  perasan  buah jeruk  nipis  dan  200  µl aquades  steril),  microtube  nomor  5  konsentrasi 75%  (375  µl  air  perasan  buah  jeruk  nipis  dan 125  µl  aquades  steril),  microtube  nomor  6 konsentrasi  90% (450  µl  air  perasan  buah jeruk nipis dan 50 µl aquades steril). Berbagai macam konsentrasi tersebut dibandingkan dengan menggunakan  antibiotik  yang  digunakan  oleh penyakit  penyebab  bakteri  Edwardsiella  tarda yaitu Chloramphenicol.
Langkah
selanjutnya adalah mempersiapkan  2  buah  media  TSA  yang sebelumnya telah ditambahkan bakteri sebanyak 200  µl  dan  diratakan  dengan  menggunakan drigalski agar bakteri dapat tersebar pada semua bagian  media  TSA.  selanjutnya  kertas  cakram steril  dimasukkan  kedalam  tabung  reaksi  yang berisikan larutan menggunakan pinset steril, dan
direndam  selama  24  jam  lalu kertas  cakram dipindahkan kedalam cawan petri yang berisikan media  TSA  dan  bakteri  Edwardsiella  tarda. Selanjutnya dilakukan inkubasi selama 24 jam.
2.4.2 Penentuan Zona Hambat Penentuan  zona  hambat  dilakukan dengan mengamati zona terang air perasan buah jeruk  nipis  (Citrus  aurantifolia  S.)  pada  bakteri Edwardsiella  tarda.  Semakin  besar  zona  hambat (zona  terang)  maka  semakin  besar  pula kemampuan  untuk  menghambat  pertumbuhan bakteri  Edwardsiella  tarda.  Zona  hambat  diukur dengan menggunakan penggaris (mm).
Menurut Pratiwi (2008), aktivitas antibakteri  dinyatakan  positif  apabila  terbentuk zona  hambat  berupa  zona  bening  disekeliling kertas cakram.
Diameter  zona  hambat  dideskripsikan dengan Gambar 1 di bawah ini:
Gambar 3. Perhitungan diameter zona hambat antibakteri.
Keterangan: a = Diameter kertas cakram (6 mm) b = Diameter zona hambat yang terbentuk (mm) c = Daerah yang ditumbuhi bakteri
2.4.3 Parameter Penelitian
Parameter yang
diamati dalam penelitian  adalah  adanya  daya  sensitivitas  air perasan  buah jeruk  nipis (Citrus  aurantifolia  S.) terhadap  Edwardsiella  tarda  secara  in  vitro. Hasil konsentrasi terbaik yang dapat menghambat  bakteri  Edwardsiella  tarda  secara in  vitro  yang  dibandingkan  dengan  kontrol positif chloramphenicol dilihat dari zona bening disekitar kertas cakram,
2.5 Analisis Data Dalam  penelitian  ini  menggunakan analisa  data  ANOVA.  Menurut  Furqon  (2009), untuk mengetahui pengaruh perlakuan,
dilaksanakan analisis variasi (ANOVA), kemudian  apabila  terdapat  pengaruh  pada perlakuan  tersebut, maka  dilanjutkan  uji Duncam  dengan  taraf  5  %  dengan  cara membandingkan antara F hitung dengan F tabel :
• Jika  F  hitung  <  F  tabel  5%,  maka  tidak berbeda nyata.
• Jika  F  hitung  >  F  tabel  5%,  maka  perlakuan menyebabkan hasil sangat berbeda nyata.
• Jika  F  tabel  5% <  F  hitung    <  F  tabel  1  % maka  perlakuan  menyebabkan  hasil  berbeda nyata.
Data  hasil  penelitian  disajikan  secara deskriptif  dengan  menampilakan  tabel  dan gambar zona hambat air perasan buah jeruk nipis (Citrus  aurantifolia  S.)  yang  dibandingkan dengan kontrol positif.

## Hasil Penelitian
Hasil  akhir  penelitian  menunjukkan bahwa  perlakuan  F  (90%)  menghasilkan    daya hambat paling tinggi, hal ini seperti dalam tabel 2 dan Gambar 5 di bawah ini:
Perlakuan (Konsentrasi) Diameter Zona Hambat (mm) Rata- rata 1 2 3 4 A (15%) 1 1.5 1 1 1.125 B (30%) 3 3 2.5 3.5 3 C (45%) 6 7 5 6 6 D (60%) 11 9 9 10 9.75 E (75%) 14 14 14 13 13.75 F (90%) 18 16 17 18 17,25
Tabel 2. Hasil rata-rata pengamatan zona hambat setelah pemberian air perasan buah jeruk nipis (Citrus Aurantifolia S.) terhadap bakteri Edwardsiella tarda.
Gambar 5. Grafik Diameter Rata-rata Zona Hambat
Dari  hasil  tersebut  di atas  maka diperlihat  analisis  sidik  ragam  seperti  tabel  3  di bawah ini:

## Tabel 3.  Analisis of Varian (ANOVA)
Dari  hasil perhitungan  diperoleh  bahwa Nilai  F  hitung  >  Nilai  F  tabel  pada  taraf signifikan  5%  dan  1%,  sehingga  dapat disimpulkan  bahwa  perlakuan  air  perasan  buah jeruk  nipis  (Citrus  aurantifolia  S.)  berpengaruh sangat nyata terhadap daya hambat pertumbuhan bakteri Edwardsiella tarda.
Untuk melihat perlakuan mana saja yang memberikan  rata-rata  respon  yang  berbeda dilakukan  uji beda  nyata  terkecil  (BNT). Berdasarkan  hasil  uji,  diperoleh  notasi  yang berbeda dari semua perlakuan, dimana tidak ada perlakuan  yang  terletak dalam  satu  grup. Perlakuan  F  adalah  yang  paling  besar  daya hambatnya yaitu dengan nilai rata-rata mencapai 17,25 mm, disusul perlakuan E yaitu 13,75 mm, perlakuan D yaitu 9,75 mm, Perlakuan C yaitu 6 mm,  perlakuan  B  yaitu  3  mm  dan  perlakuan  A yaitu  1,125. Untuk  lebih  jelasnya  perbedaan selisih  daya  hambat  antar  perlakuan      disajikan dalam tabel 4 dan tabel 5 di bawah ini:
Tabel 4. Uji Lanjut Duncan Diameter Rata-rata Daya Hambat Air Perasan Buah Jeruk Nipis Terhadap Pertumbuhan Bakteri Edwardsiella tarda.
Tabel 5. Selisih Daya Hambat Air Perasan Buah Jeruk Nipis Terhadap Pertumbuhan Bakteri Edwardsiella tarda.
Dari  hasil  identifikasi  bakteri  yang dilakukan  dapat  dilihat  bahwa  morfologi  koloni bakteri  pada  isolat  bakteri  Edwardsiella  tarda yang  diambil  dari  ikan  lele  dumbo    (Clarias gariepinus) dapat dilihat bahwa morfologi koloni pada  media  TSA  berukuran  kecil  (diameter  0.5 mm),  bundar,  permukaan  rata/halus,  sedikit cembung,  tepi  entire  dan  transparan.  Pada  uji KOH 3 % didapat hasil positif (terdapat lendir), hal  ini  menunjukkan  bahwa  bakteri  tersebut adalah  gram  negatif.  Untuk  uji  peneguhan spesies  dilakukan  uji biokimia  yang  hasilnya tertera  pada  lampiran  3,  dimana  hasil  uji biokimawi  dan  morfologi  koloni  menunjukkan bahwa  bakteri  tersebut  merupakan  Edwardsiella tarda yang dibandingkan dengan ciri-ciri bakteri yang  diuraikan  oleh  Woo  dan  Bruno  (1999). Oleh  karena  itu  dapat  disimpulkan  bahwa bakteri  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah bakteri Edwardsiella tarda.
Hasil  perlakuan  pemberian  air  perasan buah  jeruk  nipis  (Citrus  aurantifolia  S.) menggunakan  kertas  cakram  dengan  berbagai kosentrasi  pada  bakteri  Edwardsiella  tarda dengan  metode  sebar  (Pour  plate)  yang  tertera pada lampiran 2. menunjukkan bahwa pengujian daya hambat air perasan buah jeruk nipis (Citrus aurantifolia  S.)  terhadap  bakteri  Edwardsiella tarda  terlihat bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi air perasan  jeruk  nipis  yang  diberikan  maka semakin tinggi pula zona bening yang terbentuk, dengan zona bening terbesar pada konsentrasi 90 %  dengan  rata-rata  zona  bening  sebesar  17.25 mm.  Zona  bening  di  sekitar  kertas  cakram merupakan  petunjuk  kepekaan  mikroorganisme terhadap  senyawa  anti  mikroba.  Menurut  Lay (1994),  terbentuknya  zona  hambat  melalui pengamatan  daerah  jernih  di  sekeliling  cakram kertas  membuktikan  adanya  aktifitas  senyawa antimikroba. Zona lisis yang kecil menunjukkan adanya  aktifitas  antimikroba  yang  rendah, sedangkan zona lisis yang lebih besar menunjukkan  daya  aktifitas  antimikroba  yang besar pula.
Adanya zona bening di sekeliling kertas cakram  membuktikan  bahwa  air  perasan  buah jeruk  nipis  (Citrus  aurantifolia  S.)  dapat menghambat pertumbuhan  bakteri  Edwardsiella tarda.  Tetapi  setelah  didiamkan  selama  5  hari, zona  bening  tersebut  ditumbuhi  oleh  bakteri seperti  yang  terlihat  pada  lampiran  2,  hal  ini
disebabkan  zat  anti  mikrobial pada  zona  bening tersebut telah habis sehingga bakteri di luar zona bening  dapat  masuk  dan  berkembangbiak  pada zona  bening  tersebut.  Hal  ini  diperkuat  oleh pendapat Hasim (2003) yang menyatakan bahwa zona  hambat  (Zona  bening)  yang  ditumbuhi bakteri pada hari ke empat inkubasi menunjukkan  bahwa  zat  antibakteri yang digunakan hanya bersifat bakteriostatik (menghambat  pertumbuhan  bakteri)  bukan bakterisidal (membunuh bakteri).
Menurut Mathur (2009), bahwa ketentuan  kekuatan  antibakteri  adalah  sebagai berikut,  zona  hambat ≤  10  mm  berarti  lemah, 11-14  mm  berarti  kuat,  dan ≥  15  mm  berarti sangat kuat. Hasil uji daya hambat menunjukkan bahwa kontrol positif Chloramphenicol termasuk dalam antibakteri sangat kuat (15 mm). Sedangkan  konsentrasi  air  perasan  buah  jeruk nipis (Citrus aurantifolia S.) 90% jika dibandingkan dengan kontrol positif chloramphenicol maka termasuk dalam antibakteri sangat kuat (17,25 mm). Konsentrasi air perasan buah jeruk nipis 15% dan 30% tidak dapat digunakan sebagai antibakteri karena zona bening terbentuk di sekitar kertas cakram sangat kecil  yaitu ≤  6  mm.  Menurut  Enny  (2005), bahwa  kepekaan  mikroba  terhadap  suatu  bahan obat  adalah  dapat  dinyatakan  peka  apabila  obat tersebut  mampu  memberikan  zona  hambat minimal  6  mm.  Kandungan  senyawa  minyak atsiri  dan  keasaman  yang  terkandung  dalam  air perasan buah  jeruk  nipis  mengakibatkan pertumbuhan  bakteri  terhambat.  Perasan  jeruk nipis  segar  mengandung  asam  sitrat  6,15%, asam  laktat  0,09%,  serta  sejumlah  kecil  asam tartarat.  Aktivitas  antibakteri  dari  buah  jeruk nipis disebabkan oleh kandungan sejumlah asam organik  seperti  asam  sitrat  yang  merupakan komponen  utama,  kemudian  asam  malat,  asam laktat  dan  asam  tartarat.  Penghambatan  sebagai antibakteri  dari  asam  organik  karena  penurunan pH dibawah kisaran pertumbuhan mikroorganisme
dan
penghambatan metabolisme oleh molekul asam yang terkondisosiasi  (Zainal  dkk.,  2002).  Sedangkan menurut  Razak  dkk  (2013)  mengatakan  bahwa senyawa aktif antibakteri dalam air perasan buah jeruk  nipis  yang  diduga  diperoleh  dari kandungan  kimia  yang  terdapat  di  dalamnya, seperti  minyak atsiri,  diantaranya  fenol  yang
bersifat sebagai bakterisidal mampu menghambat pertumbuhan dari bakteri.
Uji  statistik  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  analisa  sidik  ragam  Anova untuk  membandingkan  rata-rata  daya  hambat dari  masing-masing  perlakuan  maupun  dari masing-masing pengulangan dan juga memperhatikan  interaksi  antara  perlakuan  dan pengulangan.  Hasil  yang  memperlihatkan  rata- rata  diameter  zona  hambat  cakram  yang  diberi air perasan buah jeruk nipis menunjukkan bahwa efektifitas  air  perasan  buah  jeruk  nipis  terhadap pertumbuhan bakteri Edwardsiella tarda memiliki  perbedaan  yang  nyata  pada  varian yang  berbeda  dengan  F  hitung  >0.05  (316.72  > 2.27).
Berdasarkan  uji  lanjut  beda  nyata terkecil  terlihat  pada  tabel  dapat  diketahui bahwa perlakuan A (15%) berbeda nyata dengan perlakuan B (30%), C (45%), D (60%), E (75%) dan F (90%). Perlakuan B (30%) berbeda nyata dengan  perlakuan  A  (15%),  C  (45%),  D  (60%), E  (75%)  dan  F  (90%).  Perlakuan  C  (45%) berbeda  nyata  dengan  perlakuan  A  (15%),  B (30%),  D  (60%), E  (75%)  dan  F  (90%). Perlakuan  D  (60%)  berbeda  nyata  dengan perlakuan A (15%), B (30%), C (45%), E (75%) dan  F  (90%).  Perlakuan  E (75%)  berbeda  nyata dengan  perlakuan  A  (15%),  B  (30%),  C  (45%), D  (60%)  dan  F  (90%).  Perlakuan  F  (90%) berbeda  nyata  dengan  perlakuan  A  (15%),  B (30%), C (45%), D (60%) dan  E (75%).
Hasil  penelitian  ini  dapat  dinyatakan bahwa  hipotesis  Ho  ditolak  dan  hipotesis  Hi diterima  yang  menunjukkan  bahawa  uji  potensi air  perasan  buah  jeruk  nipis  mempunyai pengaruh nyata dalam menghambat pertumbuhan  bakteri  Edwardsiella  tarda  secara in vitro.

## Kesimpulan
Hasil  penelitian  uji  daya  hambat  air perasan  buah jeruk  nipis (Citrus  aurantifolia  S.) terhadap  pertumbuhan  bakteri  Edwardsiella tarda  yang  diambil  dari  benih  lele  dumbo (Clarias  gariepinus)  dapat  disimpulkan  sebagai berikut:
1. Pemberian  air  perasan  buah  jeruk  nipis berpengaruh  sangat  nyata  terhadap  daya hambat  pertumbuhan  bakteri  Edwardsiella tarda yang diambil dari benih lele dumbo.
2. Konsentrasi  air  perasan  buah  jeruk  nipis  90 %  (Perlakuan F)    memberikan  hasil  yang paling tinggi dalam menghambat pertumbuhan bakteri Edwardsiella tarda yaitu sebesar  17.25  mm,  kemudian  perlakuan perlakuan  E  (75%)  yaitu  13,75  mm, perlakuan D (60%) yaitu 9,75 mm, Perlakuan
C  (45%)  yaitu  6  mm,  perlakuan  B  (30%) yaitu  3  mm  dan  perlakuan  A  (15%)  yaitu 1,125 mm
3. Perlakuan  A  (15%)  tidak  berpengaruh  nyata jika  dibandingkan  dengan  perlakuan  yang lainya.

## Daftar Pustaka
Abdul  Razak,  Aziz  Djamal  dan  Gusti  Revilla, 2013. Uji Daya Hambat Air Perasan Buah
Jeruk  Nipis  (Citrus aurantifolia  s.) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus  Aureus  Secara  In  Vitro. http://jurnal.fk.unand.ac.id Jurnal. Dikutip
pada tanggal 1 Agustus 2013.
Astuti,  A.  B.  2003.  Interaksi  Pestisida  dan Infeksi  Bakteri  Aeromonas  hydrophila pada  Ikan  Lele Dumbo  (Clarias  sp.).
Skripsi.  Departemen  Budidaya  Perairan. Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan. Institut Pertanian Bogor.
Austin B. dan D.A. Austin, 1999. Bacterial Fish PathogensDesease  in  Farmed  and  wild Fish. John Willey and Sons Ltd. England.
Buller, N.B., 2004. Bacteria From Fish and other
Aquatic Animals : A Practical Identification Manual. CABI Pub. Massachusetts, USA.
Chomnawang,  M.T,  Surassno  S.,  Nukoolkarn,
V.S., and Gristanapan, W. 2005.
Antimicrobia  effects  of  Thai  medicinal plants against    acneinducing  bacteria.
Jethnopharmacol 101. 330-333 hlm.
Coma,  Irena,M.  Edyta,  M.  Grzelak.  2010.
Bioautography  Detection  in  Thin-Layer Chromatography. Jurnal o Chromatography A Chroma-351708.
Enny,  N.  2005.  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Sari Buah  Majapahit  (Crescentia  cujete  L.) Terhadap  Bakteri  Staphylococcus  aureus dan  Escherichia  coli.  Skripsi  Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, hal  16-18.  Universitas  Institut  Teknologi Sepuluh November. Surabaya.
Feriyanto,  N.  2009.  Uji  Aktivitas  Antibakteri
Minyak  atsiri  Kulit  Buah  Jeruk  Keprok (Citrus nobilis L.) terhadap Staphylococcus  dan  Escherichia  coli. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta.
Kadi  Mey,  I.  2014.  Uji  Daya  Hambat  Bakteri Aeromonas hydrophila Setelah Pemberian Ekstrak  Kasar  Daun  Sirsak  (Annona muricata)  Secara  In  Vitro.  Fakultas Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan  Universitas Brawijaya. Malang.
Lukistyowati, I dan Kurniasih. 2011.
Kelangsungan Hidup Ikan  Mas (Cyprinus carpio  L)  yang  diberi  Pakan  Ekstrak Bawang  Putih  (Allium  sativum)  dan  di Infeksi  Aeromonas  hydrophila.  Jurnal Perikanan  dan  Kelautan,  16,1  (2011)  : 144-160.
Mathur,  J.N.  2009.  Detection  Of  Antimikrobal Resistence  in  Common  Gram  Negative and  Gram  Positive  Bacteria  Encountered in  Infectious  Diseasean  Update.  ICMR Bulletin.  Indian  Council  of  Medical Research  Ansari  Nagar.  New  Delhi-110
029. ISSN 0377-4910. India. 7 p.
Nadeak,  A.  2009.  Kawasan  Basis  Sektor
Perikanan dan Kelautan. Jurnal Perencanaan dan Pengembangan Wilayah.
4(3) : 102-110.
Pusat  Karantina  Ikan,  2007.  Metode  Standar Pemeriksaan  HPIK  Golongan  Bakteri Edwardsiella tarda Dokumen 5. Jakarta.
Razak,  A.,  Aziz,  D.,  dan  Gusti,  R.  2013.  Uji Daya  Hambar  Air  Perasan  Buah  Jeruk Nipis  (Citrus  aurantifolia  S.)  Terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus
aureus  Secara  In  Vitro.  Jurnal  kesehatan Andalas
Plumb,  J.A.,  1999.  Edwardsiella  Septicaemias. Dalam : Fish Diseases and Disorder, Vol.
3:  Viral  Bacterial  and  Fungal  Infections,
P.T.K. Woo & D.W. Bruno (ed). pp. 479-
521. CABI Pub. New York.
Vioren,  2011.  Defnisi  Sterlisasi,  Tujuan,  dan Pelaksanaan Sterilisasi. http://viorenshaflody.blogspot.co.id/defini si-sterlisasi-tujuan-caraproses.    html?m=1 . Diakses pada 25 Desember 2016.
Woo  P.T.K.  and  D.W.  Bruno  (editors)  1999. Fish Diseases and Disorder, Vol. 3: Viral Bacterial  and  Fungal  Infections.  CABI Pub. New York. 896 pp.