## Pengujian Kemampuan Larva Ulat Bambu ( Omphisa fuscidentalis ) sebagai Hewan Uji Virulensi Bakteri Klebsiella pneumoniae
1 Maulin Inggraini*, 2 Vega Aulia Romadhona, 3 Noor Andryan Ilsan, 4 Reza Anindita * Coresponding Author: Maulin Inggraini Email Coresponding Author: maulin.inggraini@stikesmitrakeluarga.ac.id 1,2 3,4 STIKes Mitra Keluarga, Bekasi

## Article History
Reviced: 14 October, 2023 Accepted: 19 October, 2023 Published: 24 October,  2023 Corresponding Author* Maulin Inggraini E-mail : maulin.inggraini@stikes mitrakeluarga.ac.id No. HP/WA: 081296473661

## ABSTRAK
Pneumonia dapat menyebabkan inflamasi berlebihan pada paru-paru maupun inflamasi  secara  sistemik  sehingga  bisa  menyebabkan  kematian  pada penderita.  Bakteri  utama  penyebab  pneumonia  diantaranya Staphylococcus aureus,  Pseudomonas  aeruginosa,  Streptococcus  pneumoniae dan Klebsiella pneumoniae . K.  pneumoniae memiliki  faktor-faktor  virulensi  yang  dapat mempengaruhi tingkat keparahan penyakit. Pengujian virulensi suatu bakteri dapat  dilakukan salah satunya dengan  cara in vivo menggunakan  hewan uji. Hewan  uji  yang  umum  digunakan  adalah  tikus  putih  ( Rattus  norvegicus ), mencit  ( Mus  musculus ),  nematoda  transparan  ( Caenorhabditis  elegans ),  ikan zebra ( Danio rerio ), ngengat lilin ( Galleria mellonela ) dan  ulat bambu ( Omphisa fuscidentalis ).  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  menguji  kemampuan Omphisa  fuscidentalis sebagai  hewan  alternatif  untuk  menguji  virulensi Klebsiella  pneumoniae .  Jenis  penelitian  yang  digunakan  adalah  kuantitatif dengan  desain  penelitian  eksperimental.  Perlakuan  yang    dilakukan  berupa penyuntikkan Klebsiella  pneumoniae ke  larva Omphisa  fuscidentallis dengan konsentrasi 10 4 , 10 5 , 10 6 CFU/larva. Semua perlakuan dilakukan sebanyak 10 kali pengulangan. Larva O.fuscidentalis diamati pola kematiannya sampai jam ke  72.  Hasil  yang  didapat  adalah  terdapat  pengaruh  antara  konsentrasi K. pneumoniae dengan jumlah kematian larva ulat O.fuscidentalis. Uji virulensi K. pneumoniae pada konsentrasi 10 6 CFU/larva adalah konsentrasi yang tercepat dalam  membunuh O.fuscidentalis, pada  jam  ke  24  sejumlah  8  larva dengan kategori 2 Mati Putih (MP), 5 Mati Coklat (MC) dan 1 Mati Hitam (MH).
Kata  kunci: Hewan  uji, Klebsiella  pneumoniae, larva  ulat  bambu, Omphisa fuscidentalis, pneumonia.
ISSN: 2623-0321
Doi: 10.56013/bio.v12i2.2317

## ABSTRACT
Pneumonia  can  cause  excessive  inflamation  in  the  lungs  and  systemic  inflamation which  can  can  cause  death  in  sufferers.  The  main  bacteria  that  cause  pneumonia include  Staphylococcus  aureus,  Pseudomonas  aeruginosa,  Streptococcus  pneumoniae and Klebsiella pneumoniae. K. pneumoniae has virulence factors that can influence the severitu of he diseases. Testing the virulence of a bacteria can be done in vivo using test  animals.  Commonly  used  test  animals  are  white  rats  (Rattus  norvegicus),  Mice (Mus  musculus),  transparent  nematodes  (Caenorhabditis  elegans),  zebrafish  (Danio rerio),  wax  moths  (Galleria  mellonela)  and  mealworms  (Omphisa  fuscidentalis).  The aim of  this  researchwas to test the ability of  Omphisa fuscidentalis as an alternative animal  for  testing  Klebsiella  pneumoniae  virulence.  The  type  of  research  used  is quantitative  with  an  experimental  research  design.  The  treatment  consisted  of injecting Klebsiella pneumoniae into Omphisa fuscidentalislarvae with concentrations of  10 4 , 10 5 , 10 6 CFU/larvae. All  treatments were  carried out 10 times in repitition. The death pattern of O. fuscidentalis larvae was observed until 72 hours. The results obtained were that there was an influence between the concentration of K.pneumoniae on the number of deaths of O. fuscidentalis larvae. K. pneumoniae virulence test at a concentration  of    10 6 CFU/larvae  is  the  fastest  concentration  in  killing  O/ fuscidentalis, within 24 hours there were 8 larvae with categories 2 Dead White (MP), 5 Dead Brown (MC) and 1 Dead black (MH).
Keywords:  Test  Animal  ,  Klebsiella  pneumoniae,  mealworm  larvae,  Omphisa fuscidentalis, pneumonia

## I. PENDAHULUAN
Pneumonia merupakan peradangan pada parenkim paru yang disebabkan oleh mikroorganisme. Pneumonia dapat menyebabkan  inflamasi  berlebihan  pada paru-paru  maupun  inflamasi  secara sistemik  sehingga  bisa  menyebabkan kematian  pada  penderita  (Reviono,  2017). Menurut  WHO  tahun  2019  kasus pneumonia  menyumbang  14%  dari  total kematian balita. Angka kejadian pneumonia  tertinggi  dialami  oleh  negara- negara  berkembang  dan  menyerang sekitar  450  juta  orang  setiap  tahunnya. Kematian  akibat  penumonia  di  Indonesia sebesar 34.8%. (Kemenkes, 2019)
Pneumonia  dapat  disebabkan  oleh virus,  bakteri  dan  jamur.  Bakteri  utama penyebab pneumonia
diantaranya
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,  Streptococcus  pneumoniae dan
Klebsiella  pneumoniae (Dahlan,  2014). Menurut  Anderson, et  al. (2007) dalam (Tarina  dan  Kusuma,  2017) K.  pneumoniae merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang pendek, memiliki kapsul dan tidak memiliki spora.
K.  pneumoniae merupakan  bakteri Gram  negatif  terbanyak  yang  ditemukan pada  infeksi  nosokomial. K.  pneumoniae memiliki  faktor-faktor  virulensi  yang dapat  mempengaruhi  tingat  keparahan penyakit. Pengujian virulensi suatu bakteri dapat  dilakukan  salah  satunya  dengan cara in vivo menggunakan hewan uji (Dewi dkk.,  2019).  Hewan  uji  yang  umum digunakan  adalah  tikus  putih  ( Rattus norvegicus ), mencit ( Mus  musculus ), nematoda transparan ( Caenorhabditis elegans ),  ikan  zebra  ( Danio  rerio ),  ngengat lilin  ( Galleria  mellonela )  dan    ulat  bambu ( Omphisa fuscidentalis )  (Ilsan et al., 2023).
Tikus  sudah  umum  digunakan sebagai  hewan  uji  karena  tikus  memiliki fungsi  anatomi  yang  mirip  dengan manusia,  genomenya  dapat  dimanipulasi dan  mudah  dirawat  dan  diternakkan. Kekurangan  tikus  sebagai  hewan  uji adalah  sudah  terlalu  banyak  resisten terhadap patogen manusia, untuk penggunaan  patogen  infeksi  pernafasan dibutuhkan  pembedahan.  Penggunaan ikan  zebra  sebagai  hewan  uji  memiliki keuntungan embrio yang terinfeksi bakteri akan terlihat transparan selama 3 minggu, tetapi ikan dewasa kurang rentan terhadap infeksi bakteri (Ilsan dkk., 2021).
Omphisa fuscidentalis memiliki keuntungan  yang  sama  dengan G. mellonella ,  yaitu  harganya  terjangkau, mudah  ditemukan,  siklus  hidup  mudah untuk  ditentukan,  dapat  diinkubasi  pada suhu  37 o C  seperti  suhu  tubuh  normal manusia  (Tsai  et  al.,  2016).  Uji  virulensi merupakan langkah utama untuk menentukan  tingkat  keparahan  gejala yang  dialami  oleh  inang. O.  Fuscidentalis dapat  digunakan  sebagai  hewan  uji, seperti  ulat  lebah  ( Galleria  mellonella) karena  berasal  dari  ordo  yang  sama  yaitu lepidoptera.  Sistem  imun O.  Fuscidentalis memiliki  kesamaan  dengan G.  Mellonella yaitu  memiliki  enam  jenis  hemosit diantaranya  prohemosit,  sel  granular, koagulosit,  sferulosit  dan  eonositoid (Browne  et  al.,  2013).  Selain  itu  juga terdapat  kesamaan  pada  komponen humoral di antaranya peptida antimikroba, enzim litik dan melanin (Tsai et  al.,  2016).  Berdasarkan  latar  belakang tersebut,  maka  peneliti  ingin  menguji kemampuan Omphisa  fuscidentalis sebagai hewan  alternatif  untuk  menguji  virulensi
Klebsiella pneumoniae pada konsentrasi 10 4 , 10 5 , 10 6 CFU/larva.

## II. METODOLOGI PENELITIAN
Jenis  penelitian  yang  digunakan adalah kuantitatif dengan desain penelitian  eksperimental.  Perlakuan  yang dilakukan  berupa  penyuntikkan Klebsiella pneumoniae ke  larva Omphisa  fuscidentallis dengan konsentrasi 10 4 , 10 5 , 10 6 CFU/larva.  Semua  perlakuan  dilakukan sebanyak  10  kali  pengulangan.  Larva O. fuscidentalis diamati  pola  kematiannya sampai jam ke 72.
Alat yang digunakan pada penelitian  ini  adalah  tabung  reaksi,  pipet ukur,  neraca  analitik  (Adam  PW254), autoklaf  (Hiramaya  HG-50), Hot  plate  and stirer (fka HS  110), shaker incubator (shaker rotator H-SR-200), spektrofotometer (Genesys  10S  UV-VIS)  dan  spuit.  Bahan yang  digunakan  adalah  isolat  bakteri Klebsiella pneumoniae dari  sampel  klinis  RS pendidikan  di  Bekasi,  larva  ulat  bambu Omphisa  fuscidentalis, media  Endo  Agar, media Brain  Heart  Infusion  Broth (BHIB), NaCl 0,9%, alkohol dan aquadest steril.
a. Peremajaan Isolat Bakteri
Isolat Klebsiella pneumoniae
diambil  1  ose  kemudian  di  gores  pada media  Endo  Agar.  Media  diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2x24 jam.

## b. Pembuatan Kultur K. pneumoniae
Isolat K. pneumoniae dimasukkan ke  dalam  3  ml  media Brain  Heart
Infosion Broth (BHIB) kemudian diinkubasi  selama  24  jam  pada incubator shaker dengan kecepatan 100 rpm. Kultur bakteri yang sudah berusia
24  jam,  diambil  1  ml  kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm  selama  2  menit  pada  suhu  20 o C.
Natan  yang  terbentuk  diencerkan dengan  500  µl  NaCl  0,9%.  Suspensi diukur  absorbansinya  menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang  600  nm  dan  OD  1  agar didapatkan  kepadatan  bakteri  10 9
CFU/ml. Suspensi dibuat pengenceran agar  didapatkan  konsentrasi  10 4 ,  10 5 , 10 6 CFU/larva (Ilsan, Lee, et al., 2021).
c. Penyuntikan K.  pneumoniae pada O.
fuscidentalis
O.  fuscidentalis ditimbang  dan dipilih  dengan  bobot  250-350  mg. Setiap  konsentrasi K.  pneumoniae
disuntikkan  pada  10  larva  ulat O. fuscidentalis sebagai ulangan. Kelompok kontrol disuntikkan dengan NaCl 0,9%.
O.  fuscidentalis diletakkan  di  atas  tisu yang  sudah  disemprot  dengan  alkohol 70%,  kemudian  disuntikkan  sebanyak
10  µl  suspensi  bakteri  pada  kaki  kiri terakhir. O.  fuscidentalis diamati  dan dicatat  pola  kematiannya  pada  jam  ke 12, 24, 36, 48, 60 dan 72.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat bakteri K. pneumoniae pada
media  Endo  Agar  akan  menghasilkan koloni  yang  berwarna  merah  muda, karena
K. pneumoniae mampu memfermentasi laktosa yang
terkandung  di  dalam  media  Endo Agar.  Media  Endo  Agar  merupakan media  selektif  untuk  bakteri  Gram negatif, karena kandungan fucshin dan sodium  sulfit  mampu  menghambat
pertumbuhan  bakteri  Gram  positif. Pertumbuhan  bakteri K.  pneumoniae pada  media  Endo  Agar  dapat  dilihat pada gambar 1.
Gambar  1. K.  pneuminae pada media Endo Agar
O.  fuscidentalis yang  sudah disuntik K.  pneumoniae dan  NaCl 0,9%  sebagai  kontrol  kemudian diamati  pertumbuhannya  dan  pola kematiannya  sampai  72  jam. Kategori O.  fuscidentalis dibagi menjadi  4  kategori  seperti  pada gambar 2. Hasil jumlah kematian O. fuscidentalis dapat dilihat pada tabel 1 di bawah ini.
Gambar  2.  A)  Hidup  Putih  (HP),  B) Mati  Putih  (MP),  C)Mati Coklat  (MC),  D)  Mati Hitam (MH)

## Tabel  1.  Kategori  Jumlah  Kematian
Omphisa fuscidentalis
Konsentrasi K. pneumoniae Waktu Kode HP  MP  MC  MH Kontrol 12 10 24 10 36 10 48 10 60 10
72 10 10 4 CFU/larva  12 9 1 24 9 1 36 9 1 48 9 1 60 8 1 1 72 8 1 1 10 5 CFU/larva  12 7 3 24 6 4 36 5 5 48 4 3 3 60 4 1 2 3 72 4 1 2 3 10 6 CFU/larva  12 7 2 1 24 2 2 5 1 36 2 2 3 3 48 2 2 3 3 60 2 2 3 3 72 2 1 3 4 Hasil penyuntikkan K. pneumoniae pada  larva  ulat O. fuscidentalis pada tabel 1
menunjukkan  kontrol  tidak  terjadi kematian  pada  jam  ke  12  sampai jam  ke  72.  Pada  konsentrasi  10 4
CFU/larva  terjadi  kematian  pada jam  ke  12  sebanyak  1  ulat  dengan kategori MP dan kematian
bertambah  pada  jam  ke  60  dengan kategori  1  ulat  MP  dan  1  ulat  MC. Pada  konsentrasi  10 5 CFU/larva larva ulat O. fuscidentalis mengalami kematian dengan kategori MP pada
jam ke 12 sebanyak 3 ulat, jam ke 24 bertambah  menjadi  4  ulat  dan  jam ke  36  sebanyak  5 ulat.  Pada  jam  ke 48  terjadi  perubahan  kategori menjadi  3  ulat  MP  dan  3  ulat  MC. Jam ke 60 dan 72 kategori kematian menjadi 1 ulat MP, 2 ulat MC dan 3 ulat MH.
Konsentrasi
10 6
CFU/larva  mengalami  kematian pada  jam  ke  12  sebanyak  2  ulat dengan  kategori  MP  dan  1  ulat kategori MH. Jam ke 24 sebanyak 2 ulat  mati  dengan  kategori  MP,  5 ulat kategori MC dan 1 ulat kategori MH. Jam ke 36 sampai 60 sebanyak 2  ulat  dengan  kategori  MP,  3  ulat MC dan 3 ulat MH. Pada jam ke 72 sebanyak  1  ulat  dengan  kategori MP, 3 ulat MC dan 4 ulat MH.
Kematian  tercepat  adalah pada  konsentrasi  10 6 CFU/larva, dengan  masa  inkubasi  selama  24 jam  sudah  mampu  membunuh O. fuscidentalis sebanyak 8 ulat.
Semakin  tinggi  konsentrasi K. pneumoniae semakin  banyak  juga larva O.  fuscidentalis yang mengalami melanisasi.
Sistem  imun  leptidoptera atau  serangga  diperantarai  oleh hemosit yang dapat melindunginya dari  bakteri  patogen  dengan  cara fagositosis,  melanisasi  dan  sekresi peptida  antimikroba.  Perubahan warna  pada  larva  menjadi  coklat hingga  hitam  diakibatkan  oleh proses melanisasi. Proses melanisasi adalah respon dasar sistem humoral pada  leptidoptera  yang  akan diaktifkan  ketika  ada  benda  asing
masuk  ke  dalam  tubuh  larva. Sintesis  melanin  yang  disintesis oleh fenoloksidase dapat membatasi penyebaran mikroorganisme (Durieux  MF, et  al ,  2021).  Kurva kelangsungan  hidup Kaplan-Meier pada  larva O.  fuscidentalis dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar  3.  Kurva  Kelangsungan  Hidup Kaplan-Meier pada  Larva O. fuscidentalis yang  Disuntikkan
K.pneumoniae pada Waktu 12, 24, 36, 48, 60 dan 72 jam.
Kelangsungan  hidup  larva O. fuscidentalis dengan konsentrasi 10 4 CFU/larva  pada  waktu  12,  24,  36,  48  jam yaitu 90%, pada waktu 60 dan 72 jam yaitu 80%.  Sedangkan  kelangsungan  hidup O. fuscidentalis pada konsentrasi
10 5
CFU/larva  pada waktu 12 jam yaitu 70%, pada waktu 24 jam yaitu 60%, pada waktu 36 jam yaitu 50%,  pada  waktu  48,  60,  72 jam  yaitu  40%.  Kelangsungan  hidup  ulat bambu  konsentrasi  10 6 CFU/larva  pada waktu  12  jam  yaitu  70%,  pada  waktu  24, 36, 48, 60, 72  jam yaitu 20%. Hal ini sesuai dengan  penelitian  Ilsan  et  al.,  (2023) menyatakan  bahwa  konsentrasi  suspensi bakteri  patogen  yang  lebih  tinggi  akan mengakibatkan  kematian  larva  yang  lebih banyak dan cepat.
Virulensi  bakteri  merupakan  faktor utama  dalam  mempengaruhi  tingkat
keparahan penyakit yang diakibatkan oleh mikroorganisme  (Sarowska, et  al. ,  2019) Faktor  virulensi  yang  paling  berperan dalam  proses  patogenitas K.  pneumoniae adalah  kapsul  lipopolisakarida  dan kemampuannya dalam membentuk biofilm  yang  tebal  (Riwu, et  al., 2022). K. Pneumoniae juga  memiliki  dua  organela fibriae,  yaitu  tipe  1  dan  3.  Proses penempelan  bakteri  pada  permukaan  sel inang  merupakan  langkah  esensial  dalam patogenitas K.  Pneumoniae (Dewi  et  al., 2019).

## IV. KESIMPULAN
Kesimpulan  pada  penelitian  ini adalah  terdapat  pengaruh  antara konsentrasi K.  pneumoniae dengan jumlah  kematian  larva  ulat O. fuscidentalis. Uji virulensi K. pneumoniae pada konsentrasi 10 6 CFU/larva adalah konsentrasi  yang  tercepat  membunuh O.  fuscidentalis, pada  jam  ke  24 sejumlah  8  larva dengan  kategori  2
MP, 5 MC dan 1 MH.

## DAFTAR PUSTAKA
Browne,  N.,  Heelen,  M.,  &  Kavanagh,  K. (2013).  An  analysis  of  the  structural and  functional  similarities  of  insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulance , 4 (7),  597–603. https://doi.org/doi:10.4161/viru.25 906
Dahlan,  Z.  (2014). Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam (M.  Setiati,  Siti  Alwi  Idrus Sudoyo, Aru Simadibrata, B. Stiyohadi, & F. Syam, Ari (eds.); 6th ed.). InternaPublishing.
Dewi,  N.  M.  R.  .,  Tarini,  N.  M.  .,  & Fatmawati,  N.  N.  .  (2019).  Deteksi Gen  fimH  pada  Isolat  Klinis Klebsiella  pneumoniae  di  RSUP
Sanglah  Denpasar. E-Jurnal  Medika ,
8 (4), 1–6.
Durieux MF, Melloul É, Jemel S, Roisin L, Dardé ML, Guillot J, Dannaoui É, B. F.  (2021).  Galleria  mellonella  as  a screening  tool  to  study  virulence factors  of  Aspergillus  fumigatus.
Virulence , 12 (1),
818–834. https://doi.org/10.1080/21505594.2 021.1893945 Ilsan,  N.  .,  Lee,  Y.  .,  Kuo,  S.  .,  Lee,  I.  .,  & Huang,  T.  .  (2021).  Antimicrobial Resistance Mechanisms and Virulence of Colistin-and Carbapenem - Resistant Acinetobacter  baumannii  Isolated from a Teaching Hospital in Taiwan.
Microorganisms , 9 (6), 1295. https://doi.org/https://doi.org/10.
3390/microorganisms9061295 Ilsan,  N.  .,  Nurfajria,  S.,  &  Inggraini,  M. (2021).  HEWAN  SEBAGAI  MODEL PENYAKIT INFEKSI PERNAFASAN YANG DISEBABKAN  OLEH  BAKTERI.
Jurnal Mitra Kesehatan , 4 (1), 48–56. Ilsan, N. ., Yunita, M., Dewi, N. ., Irham, L. M.,  Sipriyadi,  Nurfajriah,  S.,  & Inggraini,  M.  (2023).  Potentially
Virulent Multi ‐ Drug Resistant
Escherichia  fergusonii  Isolated  from Inanimate  Surface  in  a  Medical University: Omphisa fuscidentalis as an Alternative for Bacterial Virulence Determination. DIagnostics , 13 (2),  1–
10.
Kemenkes.
(2019). Profil Kesehatan Indonesia . www.kemenkes.go.id
Reviono.  (2017). Pneumonia (Harsini  (ed.);
1st ed.). UNS Press.
Riwu  KHP,  Effendi  MH,  Rantam  FA,
Khairullah  AR,  W.  A.  (2022).  A review: Virulence factors
of
Klebsiella  pneumonia  as  emerging infection  on  the  food  chain. Vet World , 15 (9), 2172–2179.
https://doi.org/10.14202/vetworld. 2022.2172-2179
Sarowska,  J.,  Futoma-Koloch,  B.,  Jama- Kmiecik,  A.,  Frej-Madrzak,  M., Ksiazczyk, M., Bugla-Ploskonska, G., & Choroszy-Krol, I. (2019). Virulence factors,  prevalence  and  potential transmission of extraintestinal pathogenic  Escherichia  coli  isolated from  different  sources:  recent reports. Gut  Pathogens , 11 (10),  2–6. https://doi.org/https://doi.org/10.
1186/s13099-019- 0290-0
Tarina,  N.  T.  I.  Kusuma,  S.  A.  .  (2017). Deteksi
Bakteri
Klebsiella pneumoniae. Farmaka , 15 (1), 119–126. Tsai, C. J. ., Loh, J. M. ., & Proft, T. (2016).
Galleria  mellonella  infection  models for  the  study  of  bacterial  diseases and  for  antimicrobial  drug  testing.
Virulance ,
7 (3), 214–229. https://doi.org/https://doi.org/10.
1080/21505594.2015.1135289