## EFEKTIVITAS ENKAPSULASI ENZIM PROTEASE DENGAN BEAD HIDROGEL BERBAHAN ALGINAT-KITOSAN

## ENCAPSULATION EFFECTIVITY OF PROTEASE ENZYME WITH ALGINATE-CHITOSAN HYDROGEL BEADS
Christian Joseph Tanuwidjaja 1 , Eko Adi Prasetyanto 2, *
1 Fakultas  Kedokteran  dan  Ilmu  Kesehatan,  Universitas  Katolik  Indonesia  Atma  Jaya, Jl.  Pluit  Raya  No.  2, Jakarta Utara 14440
2 Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya, Jl. Pluit Raya No. 2, Jakarta Utara 14440
* Korespondensi: prasetyanto@atmajaya.ac.id

## ABSTRACT
Introduction: The  addition  of  the  protease  enzyme  from  an  external  source  can  increase  protein absorption  in  the  human  digestive  system.  Protease  enzyme  is  formulated  by  encapsulated  inside alginate-chitosan hydrogel beads to deny immediate proteolysis reaction with the protein consumed and maintain  the  encapsulated  enzyme  in  a  temperature  range  acidity.  This  research  aims  to  know  the encapsulation effectivity of protease enzyme with alginate-chitosan hydrogel beads.
Methods: Experiments were conducted to encapsulate protease enzyme with ionotropic gelation method using alginate and chitosan. Encapsulation yield, bead size, encapsulated enzyme activity, release rate, and stability were analyzed from the hydrogel beads that were obtained. The data is then analyzed using analysis of variance (ANOVA) and Duncan’s Multiple Range Test (DMRT).
Results: From four variants of hydrogel beads that were obtained, this research shows that the volume addition of alginate solution in the encapsulation material will increase the value of encapsulation yield (EY), bead size, and release rate of the encapsulated protease enzyme. Therefore, the volume addition of chitosan solution will increase the value of encapsulation efficiency (EE). Hydrogel beads incubation at 6°C for 24 days maintain 75,55% of encapsulated enzyme activity.
Conclusion: Protease enzyme can be formulated with protein by being encapsulated with alginate-chitosan hydrogel beads.
Key Words: alginate, chitosan, protease enzyme encapsulation

## ABSTRAK
Pendahuluan: Penambahan enzim protease dari sumber lain dapat meningkatkan penyerapan protein oleh organ pencernaan manusia. Enzim protease dari sumber lain diformulasikan dengan cara dienkapsulasi dalam bead hidrogel agar tidak langsung bereaksi dengan protein yang dikonsumsi dan tahan terhadap lingkungan suhu dan keasaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektivitas enkapsulasi enzim protease dengan bead hidrogel berbahan alginat-kitosan.
Metode: Penelitian  ini  dilakukan  secara  eksperimental  untuk  mengenkapsulasi  enzim  protease  dengan metode ionotropic gelation dengan bahan alginat dan kitosan. Bead hidrogel yang terbentuk akan dianalisis yield enkapsulasi,  ukuran bead yang  terbentuk,  aktivitas,  tingkat  pelepasan,  dan  stabilitas  enzim  protease yang dienkapsulasi. Data kemudian akan dianalisis variasinya dengan menggunakan uji analisis keragaman (ANOVA) dan uji beda nyata terkecil Duncan’s Multiple Range Test (DMRT). Hasil: Hasil  dari  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  dari  keempat  variasi bead hidrogel  yang  terbentuk, penambahan volume larutan alginat pada bahan enkapsulasi akan meningkatkan nilai yield enkapsulasi (EY), ukuran bead , dan tingkat pelepasan enzim yang dienkapsulasi (L), sementara penambahan volume larutan kitosan  akan  meningkatkan  nilai  efisiensi  enkapsulasi  (EE).  Inkubasi bead selama  24  hari  pada  suhu  6°C berhasil mempertahankan aktivitas enzim protease yang dienkapsulasi sebesar 75,55%.
Simpulan: Enzim protease dapat diformulasikan dengan dienkapsulasi dalam bead hidrogel berbahan alginat- kitosan.
Kata Kunci: alginat, enkapsulasi enzim protease, kitosan

## ARTIKEL PENELITIAN

## PENDAHULUAN
Manusia  membutuhkan  asupan  protein dalam  konsumsi  hariannya  yang  berguna sebagai  bahan  pembentukan  dan  perbaikan jaringan dalam, seperti otot, kulit, dan jaringan lainnya.  Setiap  harinya,  manusia  membutuh- kan  asupan  protein  1,6g/kgBB 1 .  Proses  pen- cernaan  protein  dalam  tubuh  manusia  ber- langsung  pada  organ  usus  halus,  yang diperantarai  oleh  enzim  protease  seperti pepsin  yang  dihasilkan  oleh  lambung,  dan tripsin yang dihasilkan oleh pankeras. 2 Protein yang dikonsumsi oleh individu akan diabsorpsi oleh tubuh dengan reaksi anabolisme seperti denaturasi  protein  dan  transaminasi  yang dilakukan oleh berbagai enzim protease untuk membentuk  senyawa  asam  amino  agar  bisa melewati  epitel  usus  dan  masuk  ke  dalam pembuluh darah untuk disalurkan ke jaringan target.  Namun  protein  yang  dikonsumsi  tidak bisa  seluruhnya  diserap  oleh  tubuh  karena tergantung  pada  kecepatan  kerja  enzim protease dalam tubuh untuk melakukan reaksi anabolisme dan diubah menjadi asam amino, kecepatan  absorbsi  dari  asam  amino,  dan juga  tipe  aktivitas  yang  dilakukan  oleh individu. 3,4
Gagasan yang muncul dari permasalah- an  tersebut  adalah  penambahan  enzim protease dalam protein yang akan dikonsumsi agar  terjadi  peningkatan  reaksi  anabolisme pada protein yang dikonsumsi sehingga dapat diserap  oleh  tubuh  secara  maksimal.  Pene- litian yang dilakukan oleh Oben, et al. menge- nai  masalah  tersebut  terbukti  dapat  mening- katkan kadar asam amino yang ada di dalam darah,  yang  menandakan  adanya  pening-
katan  penyerapan  protein  yang  dikonsumsi oleh tubuh. 4
Protease  merupakan  enzim  pemecah protein yang mudah ditemukan dan diekstrak dari  bakteri,  kacang-kacangan,  atau  bahkan saluran pencernaan hewan. 5-7 Enzim protease dari  sumber  lain  dapat  diformulasikan  ber- samaan dengan suplemen protein yang akan dikonsumsi,  maka  protease  tersebut  perlu dienkapsulasi  agar  kerja  dari  protease  ter- sebut  dapat  dikontrol  dan  tidak  mudah rusak atau habis ketika dicampurkan dengan suple- men. Proses enkapsulasi dapat menggunakan berbagai  polimer  seperti  dengan  alginat, gelatin,  kitosan,  ataupun  campuran  dua polimer  diantara  seluruh  polimer  tersebut. 8-13
Pada  penelitian  ini,  metode  enkapsulasi ionotropic  gelation akan  dilakukan  untuk mengenkapsulasi  enzim  protease  tersebut dengan  menggunakan  bahan  campuran  dari alginat  dan  kitosan  karena  dinilai  memiliki hasil  yang  baik  dari  penelitian-penelitian  se- belumnya. 13 Protease  yang  sudah  dienkap- sulasi  akan  diuji  karakteristik  kerja  enzimnya dan dibandingkan dengan protease yang tidak dienkapsulasi.

## METODE
Penelitian  ini  menggunakan  desain penelitian  eksperimental  dengan  melakukan enkapsulasi dari enzim tripsin sebagai sumber enzim  protease  dalam bead hidrogel  dari bahan  campuran  alginat  dan  kitosan  dengan menggunakan  metode ionotropic  gelation . Sediaan bead akan  dibuat  dengan  variasi volume larutan bahan yang berbeda, lalu akan dilakukan  analisis  nilai yield enkapsulasi,
ukuran bead ,  efisiensi  enkapsulasi,  tingkat pelepasan  enzim  yang  terenkapsulasi,  dan stabilitas enkapsulasi dari sediaan bead yang terbentuk.
Pembuatan bead hidrogel  terdiri  dari pembuatan  larutan  polimer  kompleks  dan larutan  kationik  untuk  persiapan  enkapsulasi enzim protease dengan menggunakan metode  yang  dipakai  oleh  Anjani, et  al . 13
Preparasi  larutan  alginat  menggunakan  algi- nat  2%  ( w/v )  yang  dilarutkan  dalam  air deionisasi pada suhu 65-75  C selama 1 jam.
Larutan  kitosan  dibuat  dengan  cara  melarut- kan 0,2 g kitosan dalam 10 ml asam asetat 1% ( w/v )  menggunakan magnetic  stirrer .  Air deionisasi ditambahkan hingga volume larutan menjadi 90 ml dan ditambahkan larutan NaOH sampai  mencapai  pH  6,4.  Lalu  tambahkan 0,01  ml  Tween  80  dan  larutan  CaCl 2 0,1M hingga volume larutan menjadi 100 ml. Maka akan  didapat  larutan  akhir  yang  terdiri  dari 0,2% ( w/v ) larutan kitosan dan 9% ( w/v ) larut-
an 0,1 M CaCl2 dan 0,1% Tween 80.
Enkapsulasi  enzim  protease  dilakukan dengan  metode ionotropic  gelation seperti yang  dilakukan  oleh  Anjani, et  al. dengan modifikasi. 13 Sebesar  1  ml  ekstrak  enzim protease  2% (w/v) dicampur  dengan  4  ml larutan alginat yang sudah dipreparasi. Kemu- dian  campurkan  larutan  ke  dalam  10  ml larutan  kitosan  yang  sudah  dipreparasi  se- hingga  membentuk bead hidrogel  pada  suhu ruang.  Campuran  dengan  kombinasi  volume dari  ketiga  larutan  juga  akan  dibuat  seperti pada Tabel 1, bead akan terbentuk selama 30 menit.  Setelah  itu bead dipisahkan  melalui filtrasi  dengan  membilas  menggunakan  air deionisasi, dan kemudian dikeringkan dengan udara  pada  suhu  ruang  selama  30  menit. Bead yang sudah dikeringkan disimpan pada suhu  -20  C.  Enzim  protease  yang  telah dienkapsulasi dalam bead kemudian dianalisis dalam berbagai macam uji.
Tabel 1. Variasi Kombinasi Volume Larutan Bahan Pembuatan Bead Hidrogel Varian Bead Hidrogel Volume Ekstrak Enzim Protease (ml) Volume Larutan Alginat (ml) Volume Larutan Kitosan (ml) X1 1 5 9 X2* 1 4 10 X3 1 3 11 X4 2 4 10 * kombinasi standar
Analisis yield enkapsulasi dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
𝐸𝑌 = 𝑀′ 𝑀 × 100%
dengan M’  = total massa bead (g);  M  =  total massa larutan kopolimer dan larutan enzim (g). Analisis  ukuran bead hidrogel  hasil  enkap-
sulasi  dilakukan  dengan  memilih  80 bead secara  acak  dan  mengukur  diameter bead menggunakan  jangka  sorong,  lalu  dihitung nilai rata-ratanya.
Aktivitas  enzim  protease  dilakukan dengan metode kaseinolitik seperti yang dila- kukan oleh Hidalgo, et al . dengan modifikasi. 7
Uji  aktivitas  enzim  protease  dapat  dilakukan
dengan membuat larutan pada tabung sampel dengan  melarutkan  0,5  ml  kasein  1%  ( w/v ) dalam  0,5  ml buffer fosfat  (Na 2 HPO 4 dan NaH 2 PO 4 )  0,1M  (pH  8,0-9,0)  dan  dicampur dengan 0,25 ml sampel enzim protease, baik yang sudah dienkapsulasi dalam bead hidro- gel  maupun  belum.  Cara  membuat  larutan sampel enzim protease yang sudah dienkap- sulasi  adalah  dengan  melarutkan  1  g bead hidrogel pada 25 ml larutan trisodium sitrat 2%, lalu  diaduk  dengan magnetic  stirrer dengan kecepatan 70 rpm selama 30 menit pada suhu ruang. Campuran sampel diinkubasi selama 1 jam dalam suhu 37  C. Kemudian reaksi pada campuran sampel dihentikan dengan menam- bahkan 0,75 ml asam trikloroastetat (TCA) 8%
( w/v ) pada campuran, lalu diinkubasi kembali pada suhu 6  C selama 1 jam. Larutan kemu- dian  diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  60 menit. Pada tabung blanko diisi dengan cam- puran  antara  0,25  ml  air  deionisasi,  0,5  ml larutan  kasein  1%  ( w/v ),  dan  0,5  ml buffer fosfat 0,1M, lalu ditambahkan 0,75 ml larutan TCA 8%. Pada tabung standar, larutkan 0,5 ml larutan tirosin dengan konsentrasi yang telah diketahui  (25-200  g/ml)  dalam  0,25  ml  air deionisasi  dan  0,5  ml buffer fosfat  0,1M.
Setelah  itu  campuran  pada  tabung  standar ditambahkan 0,75 ml larutan TCA 8%. Semua larutan pada masing-masing tabung kemudian
disentri-fugasi  pada  kecepatan  6000  rpm selama  10  menit.  Supernatan  yang  telah disentrifugasi  dianalisis  absorbansinya  de- ngan  menggunakan  spektrofotometer  pada panjang  gelombang  sebesar  280  nm.  Hasil ukur  1  unit  dari  aktivitas  enzim  bermakna sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk mengkatalisis  reaksi  pemecahan  kasein menjadi 1  g tirosin setiap 1 menit.
Nilai  absorbansi  yang  didapat  akan dilakukan  perhitungan  nilai  aktivitas  enzim protease  dari  samel  dengan  menggunakan rumus berikut: 14
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 = [𝑡𝑖𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛] × 𝑉 (𝑝 × 𝑞) × 𝐹𝑝
dengan  [tirosin]  =  konsentrasi  tirosin  yang terbentuk  (  g/ml);  V  =  volume  total  sampel pada tiap tabung (ml); p = jumlah enzim (ml); q = waktu inkubasi (menit); Fp = faktor peng- enceran. Hasil ukur 1 unit dari aktivitas enzim bermakna  sebagai  jumlah  enzim  yang  dibu- tuhkan untuk mengkatalisis reaksi pemecahan kasein menjadi 1  g tirosin setiap 1 menit. 15
Nilai  aktivitas  enzim  dari  enzim  yang sudah  dienkapsulasi  dibandingkan  dengan nilai aktivitas enzim yang belum dienkapsulasi untuk  menentukan  persentase  efisiensi  en- kapsulasi  (EE).  Persentasi  efisiensi  enkap- sulasi dapat dihitung dengan cara:

## 𝐸𝐸 = 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑒𝑑 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑏𝑒𝑎𝑑
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑡𝑒𝑟𝑒𝑛𝑘𝑎𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎𝑠𝑖 × 100%
Tingkat  pelepasan  enzim  yang  dien- kapsulasi (L) dianalisis dengan melarut-kan 5 g bead hidrogel  dalam  25  ml  air  deionisasi. Lalu dilakukan shaking menggunakan shaker
pada  kecepatan  150  rpm  selama  120  menit. Kemudian, 5 ml sampel dari suspensi tersebut diambil  dengan  interval  waktu  yang  berbeda (0,  30,  60,  90  dan  120  menit).  Sampel  akan
dianalisis  aktivitas  enzim  dari  konsen-trasi enzim  yang  terdapat  pada  sampel.  Aktivitas enzim  protease  dari  sampel  akan  dianalisis
dan  dibandingkan  dengan  aktivitas  enzim pada variasi bead yang diuji.

## 𝐿 = 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑎𝑖𝑟 𝑑𝑒𝑖𝑜𝑛𝑖𝑠𝑎𝑠𝑖
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑏𝑒𝑎𝑑 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑢𝑗𝑖𝑘𝑎𝑛 × 100%
Enzim  yang  telah  dienkapsulasi  dalam bead hidrogel  disimpan  pada  suhu  6  C selama 24 hari. 1 g bead dilarutkan dalam 25 ml  trisodium  sitrat  2%  ( w/v )  dengan  diaduk menggunakan magnetic stirrer dengan kecepatan  100  rpm  pada  suhu  ruang  untuk menginisiasi pelepasan enzim protease yang dienkapsulasi.  Sampel  dianalisis  aktivitas enzimnya  pada  hari  ke-0,  7,  14,  dan  24. Aktivitas enzim dipertahankan selama periode penyimpanan 24 hari.
Penelitian  dilakukan  sebanyak  1  kali ulangan perlakuan, setiap perlakuan dilakukan  3  kali  ulangan  analisis.  Data  yang diperoleh  kemudian  dilakukan  uji  statistik dengan analisis keragaman (ANOVA) dan uji
beda  nyata terkecil Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) dengan tingkat signifikan 95%.

## HASIL
Analisis  dilakukan  dengan  mengukur massa  dari  larutan  kopolimer  dan  larutan enzim  protease  yang  akan  digunakan  untuk melakukan enkapsulasi, dan mengukur massa bead hidrogel yang terbentuk dari enkapsulasi. Kedua nilai massa yang didapat dibuat dalam perbandingan  untuk  mendapatkan  nilai yield enkapsulasi  (EY).  Berdasarkan  hasil  analisis pada data Tabel 2, bead X4 memiliki nilai yield enkapsulasi  tertinggi  (50,96%),  sementara bead X3  memiliki  nilai yield enkapsulasi terendah (29,27%).
Tabel 2. Data Analisis Yield Enkapsulasi Enzim Protease Variasi Bead Hidrogel Total Massa Larutan (g) Massa Bead Hidrogel yang Terbentuk (g) EY (%) X1 14,94 7,17 ± 1,61 47,99 X2 14,47 5,81 ± 0,47 40,15 X3 14,69 4,30 ± 0,47 29,27 X4 15,64 7,97 ± 0,08 50,96
Tabel 3. Data Analisis Ukuran Bead Hidrogel Hasil Enkapsulasi Variasi Bead Hidrogel Diameter (mm) X1 7,285 ± 1,239 X2 5,594 ± 1,299 X3 5,043 ± 0,712 X4 5,887 ± 0,842
Sebanyak  80 bead hasil  enkapsulasi dari  tiap  variasi  diukur  diameternya  secara acak  dengan  menggunakan  jangka  sorong
dengan ketelitian 0,05 mm. Berdasarkan hasil analisis pada data Tabel 3, bead X1 memiliki diameter paling besar (7,285 mm), sementara
bead X3 memiliki diameter paling kecil (5,043 mm).
Analisis  aktivitas  enzim  protease  ditun- jukkan pada Tabel 4, ditemukan bahwa enzim protease  yang  terenkapsulasi  dalam bead hidrogel yang dilarutkan dalam larutan natrium sitrat dengan variasi X4 memiliki nilai aktivitas enzim  tertinggi  (0,875  U/ml),  sedangkan
enzim  protease  yang  terenkapsulasi  dalam bead X1  memiliki  nilai  aktivitas  enzim  yang terendah  (0,297  U/ml).  Hasil  analisis  ini kemudian akan digunakan oleh peneliti untuk melakukan  analisis  efisiensi  enkapsulasi  en- zim  protease,  tingkat  pelepasan  enzim  pro- tease  yang  dienkapsulasi,  dan  stabilitas  en- kapsulasi enzim protease.
Tabel 4. Data Analisis Aktivitas Enzim Protease
Bahan Absorbansi Konsentrasi Tirosin Terlarut (  g/ml) Aktivitas Enzim (U/ml) EP* 2,034 ± 0,035 2,519 ± 0,433 2,687 ± 0,046 X1 0,225 ± 0,004 0,279 ± 0,004 0,297 ± 0,006 X2 0,649 ± 0,003 0,804 ± 0,005 0,858 ± 0,004 X3 0,581 ± 0,008 0,719 ± 0,009 0,767 ± 0,009 X4 0,662 ± 0,030 0,821 ± 0,037 0,875 ± 0,039 EP: enzim protease yang tidak dienkapsulasi
Tabel 5. Data Analisis Efisiensi Enkapsulasi dari Bead Hidrogel yang Terbentuk Variasi Bead Hidrogel Efisiensi Enkapsulasi (%) X1 11,06 ± 0,16 X2 31,93 ± 0,21 X3 28,57 ± 0,37 X4 32,58 ± 1,48
Analisis  efisiensi  enkapsulasi  enzim protease dalam bead hidrogel yang terbentuk dilakukan  dengan  membandingkan  antara nilai aktivitas enzim dari enzim protease yang sudah  terenkapsulasi  dengan  nilai  aktivitas enzim  dari  enzim  protease  yang  tidak  dien- kapsulasi.  Hasil  analisis  data  pada  Tabel  5 memperlihatkan  bahwa  variasi bead hidrogel X4 memiliki nilai efisiensi enkapsulasi tertinggi (32,58%),  dan bead hidrogel  dengan  variasi X1  memiliki  nilai  efisiensi  enkapsulasi  teren- dah (11,06%).
Hasil  analisis  tingkat  pelepasan  enzim protease oleh bead hidrogel pada data Tabel 6  menunjukkan  bahwa  tingkat  pelepasan
enzim protease paling cepat dialami oleh bead X1  dengan  pelepasan  seluruh  konten  enzim (100%)  setelah  dilakukan shaking pada  air deionisasi selama 120 menit, sementara bead X3  dan  X4  memiliki  tingkat  pelepasan  enzim protease  yang  serupa  dan  lebih  lambat dibandingkan dengan tingkat pelepasan bead X2  setelah  dilakukan shaking selama  120 menit.
Berdasarkan  hasil  analisis  data  stabi- litas enkapsulasi enzim protease pada variasi bead X3, tingkat stabilitas enkapsulasi menu- run  sejauh  20,71%  dari  hari  ke-0  sampai  7, dan  tidak  menurun  jauh  pada  hari  ke-14 (3,00%)  dan  hari  ke-24  (0,74%).  Selama
aktivitas enzim dipertahankan selama 24 hari, penurunan keseluruhan tingkat aktivitas enzim yang  dienkapsulasi  terjadi  hanya  sebanyak 24,45%.
Semua data diuji keragamannya dengan
menggunakan  metode  ANOVA  dan  DMRT pada tingkat signifikansi 95% dan menunjukan bahwa  seluruh  data  memilki  perbedaan  atau variasi yang bermakna secara signifikan (p ≤ 0,95).
Grafik 1. Tingkat Stabilitas Enkapsulasi Enzim Protease
Tabel 6. Data Analisis Tingkat Pelepasan Enzim Protease yang Dienkapsulasi
Variasi Bead Hidrogel Tingkat Pelepasan Enzim yang Dienkapsulasi pada Menit ke-0 (%) Tingkat Pelepasan Enzim yang Dienkapsulasi pada Menit ke-30 (%) Tingkat Pelepasan Enzim yang Dienkapsulasi pada Menit ke-60 (%) Tingkat Pelepasan Enzim yang Dienkapsulasi pada Menit ke-90 (%) Tingkat Pelepasan Enzim yang Dienkapsulasi pada Menit ke-120 (%) X1 100% X2 20,43 ± 5,94 26,39 ± 5,01 25,62 ± 2,99 33,78 ± 4,57 33,62 ± 4,02 X3 17,15 ± 5,86 22,38 ± 0,79 20,99 ± 2,48 29,78 ± 4,51 28,14 ± 3,53 X4 9,81 ± 2,22 23,69 ± 2,57 23,84 ± 2,77 29,83 ± 2,03 26,86 ± 1,74

## PEMBAHASAN
Yield enkapsulasi  dari  enzim  protease dalam bead hidrogel yang terbentuk merupa- kan  suatu  faktor  penting  dari  sisi  ekonomis untuk menentukan jumlah bahan polimer dan kopolimer yang dibutuhkan serta menentukan harga  dalam  memproduksi  produk  yang diinginkan. 16 Peneliti  menemukan  bahwa semakin  banyaknya  volume  larutan  alginat dan  larutan  enzim  yang  digunakan,  maka akan meningkatkan nilai yield enkapsulasi dari bead hidrogel yang terbentuk. Pada penelitian yang dilakukan oleh Mong Thu dan Krasaekoopt juga ditemukan hal yang serupa,
bahwa penambahan konsentrasi alginat akan meningkatkan  nilai yield enkapsulasi. 17 Hal tersebut  terjadi  karena  peran  alginat  sebagai struktur  utama  dari bead berperan  besar dalam  menentukan  massa  dan  juga  ukuran dari bead yang dihasilkan, sementara kitosan yang  digunakan  sebagai  kopolimer  dari proses enkapsulasi ini hanya bersifat sebagai pembungkus.
Peneliti  tidak  menemukan  bahwa  pe- nambahan  larutan  kitosan  dapat  mening- katkan  nilai yield enkapsulasi  karena  variasi bead pada  penelitian  yang  menambahkan volume  larutan  kitosan  diikuti  juga  dengan
0 50 100 150 0 10 20 30 Ak ti v ita s En z im y a n g
DIp e rta h a n k a n (% ) Waktu (hari)
pengurangan dari volume larutan alginat yang digunakan,  sehingga  hasil  penelitian  lebih menunjukkan  pengaruh  dari  volume  larutan alginat yang digunakan sebagai bahan dasar dari  struktur bead hidrogel  yang  terbentuk, sedangkan  larutan  kitosan  hanya  sebagai pembungkus dari bead hidrogel yang terben- tuk. Menurut penelitian yang dilakukan  sebe- lumnya,  penambahan  larutan  kitosan  dapat memengaruhi nilai yield enkapsulasi dari bead yang terbentuk. 16,17
Hasil pada analisis ukuran bead hidrogel hasil  enkapsulasi  enzim  protease  menunjuk- kan bahwa penambahan larutan alginat akan mempengaruhi ukuran bead yang dihasilkan.
Semakin banyak larutan alginat yang diguna- kan maka akan menambah bahan yang akan mengalami gelling ketika  larutan  alginat  dite- teskan kedalam larutan kitosan dalam CaCl 2 . Penelitian yang dilakukan oleh Mong Thu dan Krasaekoopt  juga  menunjukkan  bahwa  pe- nambahan  konsentrasi  alginat  pada  bahan enkapsulasi  akan  menambah  diameter bead yang  terbentuk  sebanyak  0,10-0,12  mm.  Hal tersebut terjadi karena alginat sebagai polimer utama  dalam  pembentukan bead memiliki pengaruh  besar  dalam  menentukan  ukuran bead yang terbentuk. 17
Peneliti juga menemukan bahwa sema- kin besar volume larutan alginat yang diguna- kan,  maka  struktur  dari bead hidrogel  yang terbentuk  akan  semakin  lunak  dibandingkan dengan  variasi bead yang  menggunakan volume  larutan  alginat  yang  lebih  sedikit, namun  penambahan  volume  larutan  kitosan akan membuat bead yang terbentuk semakin keras. Hal ini disebabkan oleh matriks alginat
yang  memiliki  pori  cukup  besar  sehingga membuat  struktur bead menjadi  lebih  lunak.
Namun  peran  kitosan  sebagai  kation  mem- bantu CaCl 2 sebagai cross-linker dalam menu- tup  pori  di  antara  matriks  alginat  sehingga dapat  membuat  struktur bead menjadi  lebih kuat. 13,17
Pengujian aktivitas enzim protease yang dienkapsulasi  dilakukan  dengan  melarutkan bead  hidrogel  yang  terbentuk  dalam  larutan natrium  sitrat  2%.  Hasil  dari  pengujian  akti- vitas  enzim  protease  yang  dienkapsulasi  ke- mudian  akan  digunakan  untuk  mendapatkan nilai  efisiensi  enkapsulasi  dari  setiap bead hidrogel yang terbentuk.
Hasil  dari  analisis  nilai  efisiensi  enkap- sulasi dari bead yang terbentuk menunjukkan bahwa  penambahan  volume  larutan  alginat dari kombinasi volume standar dalam melakukan enkapsulasi enzim protease akan menurunkan  nilai  aktivitas  enzim  protease yang dienkapsulasi dan nilai efisiensi enkapsulasi dari bead hidrogel yang terbentuk, sementara  penambahan  larutan  kitosan  dari kombinasi  volume  standar  akan  mening- katkan  nilai  aktivitas  enzim  protease  yang dienkapsulasi  dan  nilai  efisiensi  enkapsulasi. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Anjani, et al. , penambahan konsentrasi kitosan dalam larutan  CaCl 2 sebagai  larutan  kation  akan meningkatkan  efisiensi  enkapsulasi  secara signifikan. Hal ini ditunjukkan dengan peningkatan  nilai  efisiensi  enkapsulasi  seba- nyak  54-76%  dari bead yang  tidak  diberikan bahan  kopolimer  kitosan  bila  dibandingkan dengan bead yang  ditambahkan  larutan kitosan  0,1-0,3%.  Hal  tersebut  terjadi  karena
konsentrasi  kitosan  yang  lebih  banyak  pada proses  enkapsulasi  akan  berikatan  seperti anion  dan  kation,  serta  ukuran  molekul  dari kitosan  yang  besar  dapat  menutup  pori-pori pada  matriks  alginat  sehingga  dapat  mence- gah  keluarnya  larutan  enzim  protease  yang akan dienkapsulasi pada saat terjadinya pro- ses gelling . 13
Pada  analisis  tingkat  pelepasan  enzim protease dari bead hidrogel, peneliti menemu- kan bahwa tingkat pelepasan enzim protease oleh bead X1 langsung mencapai 100% pada saat dilarutkan pada air deionisasi pada menit ke-0.  Temuan  tersebut  dapat  dikaitkan  de- ngan  penggunaan  volume  larutan  kitosan yang  lebih  sedikit  dibandingkan  dengan variasi  lainnya  sehingga  peran  kitosan  yang digunakan  tidak  cukup  dalam  menutupi  pori- pori  pada  matriks  alginat  sehingga  menye- babkan tingkat  pelepasan  yang  sangat tinggi dari  enzim  protease  yang  dienkapsulasi sehingga  seluruh  konten  enzim  langsung dilepaskan oleh bead pada air deionisasi. 13
Penelitian  juga  menunjukkan  bahwa pelepasan  oleh  variasi bead X2-4  memiliki tingkat  pelepasan  yang  bervariasi  di  antara 26,86 –  33,62%  setelah  dilakukan shaking pada  air  deionisasi  selama  120  menit.  Pola pada bead variasi  X2-4  menunjukan  pola pelepasan bead yang  meningkat  setiap  60 menit sekali, terlihat dari pola yang meningkat diantara uji menit ke-0 dan 30 serta menit ke- 60  dan  90,  sementara  di  antara  menit  ke-30 dan  60  serta  menit  ke-90  dan  120  tidak menunjukkan  peningkatan  yang  signifikan. Tingkat  pelepasan  enzim  yang  rendah  pada bead X3 dapat dikaitkan dengan peran kitosan
sebagai kation yang berfungsi untuk menutupi pori-pori yang ada pada molekul alginat yang terbentuk  pada bead yang  disebutkan  pada penelitian  Anjani, et  al. dan  penelitian  Mong Thu  dan  Krasaekoopt,  sehingga  membuat tingkat  pelepasan  dari  enzim  protease  yang dienkapsulasi  menjadi  lebih  rendah  apabila dibandingkan dengan bead X2. 13,17 Pada bead X4,  pemakaian  volume  larutan  enzim  yang lebih  banyak  untuk  dicampurkan  bersama dengan  larutan  alginat  membuat  konsentrasi dari larutan alginat yang dipakai pada proses gelling menjadi  lebih  encer  dan  membuat perbandingan  antara  larutan  alginat  dengan larutan kitosan menjadi lebih rendah, sehing- ga  peran  kitosan  dalam  membungkus bead yang terbentuk lebih terlihat pada variasi bead ini dan menyebabkan tingkat pelepasan enzim protease  yang  lebih  rendah  apabila  diban- dingkan dengan variasi bead X2.
Pada hasil penelitian, ditemukan bahwa stabilitas  enkapsulasi  enzim  protease  pada bead variasi  X3  cukup  tinggi  dengan  masih mempertahankan 75,55% dari aktivitas enzim yang  dapat  diperoleh  dari bead setelah diinkubasi selama 24 hari. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Mong Thu dan Krasaekoopt,  dipaparkan  bahwa bead hidro- gel  yang  memiliki  konsentrasi  kitosan  yang lebih  banyak  memiliki  peran  yang  dominan dalam meningkatkan tingkat stabilitas enkap- sulasi  dan  menurunkan  waktu  paruh  dari pelepasan enzim protease yang dienkapsulasi oleh bead . Hal ini terjadi karena kitosan yang lebih  bermuatan  positif  akan  membentuk suatu  membran  semipermeabel  yang  kuat apabila  berikatan  dengan  polimer  bermuatan
negatif  seperti  alginat.  Membran  yang  ter- bentuk membantu untuk mencegah keluarnya enzim protease yang dienkapsulasi oleh bead yang  terbentuk  serta  meningkatkan  nilai stabilitas enkapsulasi enzim protease. 17
Tindakan pengeringan pada bead dalam penelitian  ini  dilakukan  hanya  pada  udara terbuka  ( air drying ).  Pengeringan  lebih  lanjut dengan  menggunakan freeze  drying dapat meningkatkan nilai stabilitas enkapsulasi dari enzim protease dibandingkan dengan penge- ringan  dengan  udara  terbuka  ( air  drying ). 13
Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan dengan mengeringkan bead yang  dibentuk  dengan freeze  drying guna  mendapatkan bead hidrogel  dengan  stabilitas  enkapsulasi  yang lebih optimal.

## SIMPULAN
Enzim  protease  dapat  diformulasikan dengan  cara  dienkapsulasi  dengan bead hidrogel berbahan alginat-kitosan, ditinjau dari tingkat  efektivitas  yang  tinggi  berdasarkan parameter yang telah diujikan, yaitu nilai yield enkapsulasi,  ukuran bead yang  terbentuk, nilai  efisiensi  enkapsulasi,  tingkat  pelepasan enzim  protease,  dan  stabilitas  enkapsulasi. Karakteristik  kerja  dari  enzim  protease  yang dienkapsulasi  dalam bead hidrogel  yang terbentuk dapat ditinjau dari hasil analisis nilai aktivitas  enzim  protease  yang  dienkapsulasi sebesar  0,297 –  0,897  U/ml.  Perbandingan karakteristik  kerja  dari  enzim  protease  yang dienkapsulasi  dengan  enzim  protease  yang tidak  dienkapulasi  ditinjau  dari  hasil  analisis nilai  efisiensi  enkapsulasi  sebesar  11,06 – 32,58%.

## SARAN
Pembuatan variasi volume yang diguna- kan pada saat pembuatan bead dapat menun- jukkan pengaruh volume larutan yang diguna- kan  pada  karakteristik bead yang  terbentuk. Namun penelitian lebih lanjut dapat dilakukan dengan  membuat  variasi bead dengan penambahan atau pengurangan volume salah satu  larutan  tanpa  melakukan  penambahan atau  pengurangan  volume  larutan  yang  lain. Hal  ini  bertujuan  supaya  pengaruh  dari penambahan  atau  pengurangan  volume  dari suatu  bahan  dapat  terlihat  jelas  tanpa terpengaruh  dari  volume  larutan  bahan  lain yang digunakan pada saat penelitian. Tindakan  lanjutan  berupa  pengeringan  de- ngan freeze  drying atau  pengujian  tingkat pelepasan enzim yang dienkapsulasi dengan stimulasi lingkungan yang mirip dengan organ pencernaan  manusia,  seperti  dengan  larutan simulated  gastric  fluid (SGF)  atau simulated intestinal  fluid (SIF)  juga  dapat  dilakukan untuk  mengetahui  lebih  lanjut  mengenai ketahanan bead secara  lebih  mendetail  dan efektivitasnya  apabila bead yang  diproduksi bertujuan  untuk  dikonsumsi  secara  langsung oleh manusia.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Schoenfeld BJ, Aragon AA. How much protein can the body use in a single meal for muscle-building? Implications for daily protein distribution. Journal of the International Society of Sports Nutrition [internet]. 2018;15(1). https://jissn.biomedcentral.com/ articles/10.1186/s12970-018-0215-1
2.  Sherwood  L. Human  physiology:  from  cells  to systems. Ed  ke-9.  Boston,  MA,  USA:  Cengage Learning; 2016.
3.  Schoenfeld BJ, Aragon AA. How much protein can
the body use in a single meal for muscle-building? Implications for daily protein distribution. Journal of the  International  Society  of  Sports  Nutrition [Internet].  2018  Dec  [cited  2019  Apr  27];15(1). Available from: https://jissn.biomedcentral.com/ articles/10.1186/s12970-018-0215-1
4. Sharawy A. The effects of A pre-and post-exercise
Whey  Protein  Supplement  on  Protein  Metabolism and  muscular  strength  among  elite  wrestlers. Ovidius University Annals, Series Physical Education  &  Sport/Science,  Movement  &  Health [serial online]. 2013 Mar 1;13(1):5-10.
5.  Padmapriya  M,  Williams  BC.  Purification  and characterization  of  neutral  protease  enzyme  from Bacillus  subtilis . Journal  of  Microbiology  and Biotechnology Research . 2012;2(4):612 –18.
6.  Akhtaruzzaman  M,  Mozumder  NHM,  Jamal  R, Rahman  A,  Rahman  T.  Isolation  and  characteri- zation  protease  enzyme  from  leguminous  seeds.
Agricultural Science Research Journals .
2012;2(8):434 –40
7.  Hidalgo MC, Urea E, Sanz A. Comparative study of digestive  enzymes  in  fish  with  different  nutritional habits. Proteolytic and amylase activities.
Aquaculture . 1999;170(3 –4):267–83.
8.  Zhang  S,  Shang  W,  Yang  X,  Zhang  S,  Zhang  X, Chen  J.  Immobilization  of  lipase  using  alginate hydrogel  beads  and  enzymatic  evaluation  in hydrolysis  of  p-nitrophenol  butyrate.  Bulletin  of  the Korean Chemical Society. 2013;34(9):2741-6.
9.  Pichayakorn  W,  Wannaphatchaiyong  S,  Saisin  W. Preparation  process  and  properties  of  crosslinked gelatin beads for drug loading. Advanced Materials Research . 2014;1060:74 –8.
10.  Dimida S, Demitri C, De Benedictis VM, Scalera F,
Gervaso F, Sannino A. Genipin ‐ cross ‐ linked chito-
san ‐ based  hydrogels:  Reaction  kinetics  and structure ‐ related characteristics. Journal of Applied Polymer Science. 2015 Jul 20;132(28).
11.  Campos  EV,  de  Oliveira  JL,  Fraceto  LF,  Singh  B.
Polysaccharides  as  safer  release  systems  for agrochemicals. Agronomy for sustainable
development. 2015 Jan 1;35(1):47-66.
12.  Basu SK, Kavitha K, Rupeshkumar M. Evaluation of ionotropic cross-linked chitosan/gelatin B microspheres  of  tramadol  hydrochloride. AAPS
PharmSciTech . 2011;12(1):28 –34.
13.  Anjani K, Kailasapathy K, Phillips M.
Microencapsulation  of  enzymes  for  potential application  in  acceleration  of  cheese  ripening. International Dairy Journal . 2007;17(1):79 –86.
14.  Noviyanti  T,  Ardiningsih  P,  R  W.  Pengaruh temperature terhadap aktivitas enzim protease dari daun  sansakng  ( Pycnarrhena  cauliflora  Diels ).
Jurnal  Kimia  Khatulistiwa [Internet].  2013;1(1). http://jurnal.untan.ac.id/index.php/jkkmipa/article/vi ew/990
15.  Hanum WM, Susilo U, Priyanto S. Aktivitas protease dan  kadar  protein  tubuh  ikan  lele  dumbo  ( Clarias gariepinus )  pada  kondisi  puasa  dan  pemberian pakan  kembali.  Purwokerto:  Fakultas  Biologi Unsoed; 2013.
16.  Khorshidian N, Mahboubi A, Kalantari N, Hosseini H,
Yousefi M, Arab M, et al. Chitosan-coated alginate microcapsules  loaded  with  galactagogue  herbs extract: formulation optimization and characterization. IJPR [Internet]. 2019;18(3). http://doi.org/10.22037/ijpr.2019.1100776
17.  Mong  Thu  TT,  Krasaekoopt  W.  Encapsulation  of protease  from  Aspergillus  oryzae  and  lipase  from Thermomyces  lanuginoseus  using  alginate  and different  copolymer  types. Agriculture  and  Natural Resources . 2016;50(3):155 –61.