Efektivitas Ozonated Virgin Coconut Oil terhadap Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog

## Tikus Sprague Dawley
Ditinjau dari Ekspresi TGF-ß dan Jumlah Neutrofil
1 2 3 4 5
Nauval Marta Kusuma , Hardian , Najatullah , Renni Yuniati , Neni Susilaningsih
Latar  belakang  : Skin  graft saat  ini  menjadi  salah  satu  terapi  pilihan  pada  proses penyembuhan  luka  yang  selalu  berkembang.  Ekspresi  TGF-ß  dan  jumlah  neutrofil memiliki peran penting dalam penyembuhan luka skin graft . Ozon (O ) memiliki sifat 3 desinfektan  yang  efektif  dalam  penyembuhan  luka.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk membuktikan  efektivitas  pemberian Ozonated VCO  terhadap  penyembuhan  luka Full Thickness Skin Graft dilihat dari Ekspresi TGF-ß dan jumlah neutrofil. Metode : Penelitan ini adalah studi eksperimental dengan group post-test only design terhadap 40 ekor tikus Sprague Dawley dilakukan skin graft autologous pada waktu yang bersamaan. Sampel dibagi secara acak menjadi 8 grup (K1 = tanpa pemberian Ozonated VCO), (A1 = Ozonated VCO 50 mg/ml), (B1 = Ozonated VCO 100 mg/ml), (C1 = Ozonated VCO 200 mg/ml) dan (K2 = tanpa pemberian Ozonated VCO), (A2 = Ozonated VCO 50 mg/ml), (B2 = Ozonated VCO 100 mg/ml), (C2 = Ozonated VCO 200 mg/ml). Penilaian ekspresi TGF-ß dan jumlah neutrofil jaringan dilakukan dengan pengecatan hematoxylin & eosin dan imunohistokimia pada hari ke 6 dan 12 pasca skin graft . Hasil : Terdapat perbedaan yang bermakna ( p < 0,05) ekspresi TGF- dan jumlah neutrofil jaringan antara kelompok kontrol dengan pemberian Ozonated VCO dosis 50 mg/ml, 100 mg/ml, dan 200 mg/ml pada hari ke  6 dan 12 pasca skin graft . Simpulan  : Pemberian Ozonated VCO  efektif  meningkatkan  penyembuhan  luka Full Thickness  Skin  Graft berdasarkan  peningkatan  ekspresi  TGF-ß  dan  penurunan  jumlah neutrofil.
Kata kunci : Ozonated VCO, Full Thickness Skin Graft autologus , ekspresi TGF-ß, jumlah neutrofil.
1 Magister Biomedik dan Bagian Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang
2 Bagian Faal Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang
3 Bagian Bedah Plastik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang
4 Bagian Kulit dan Kelamin Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang
5 Bagian Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang
Abstrak

## Original Article
Med Hosp 2021; vol 8 (3) : 317–325 p-ISSN: 2301-4369 e-ISSN: 2685-7898 https://doi.org/10.36408/mhjcm.v8i3.489
Diajukan: 03 Maret 2021 Diterima: 10 September 2021
Afiliasi Penulis: Magister Biomedik dan Bagian Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang
Korespondensi Penulis: Nauval Marta Kusuma Jalan Dr. Sutomo 16, Jawa Tengah, Semarang 50244, Indonesia
E-mail: emka.nauval@gmail.com
Introduction : Nowadays, skin graft, as one of therapy choices in wound healing, keeps evolving. Expression of TGF-ß and neutrophil count play significant roles in skin graft wound healing. Meanwhile, ozone (O3) also has disinfectant characteristic which is effective in wound healing. This study was aimed to validate the effectiveness of ozonated VCO to full thickness skin graft wound healing shown by expression of TGF-ß and neutrophil count.
Methods : Post-test only experimental study was done to 40 Sprague Dawley mice with autologous skin graft, at the same time. Samples were randomly divided into 8 groups (K1 = without ozonated VCO, A1 = ozonated VCO 50 mg/ml, B1 = ozonated VCO 100 mg/ml, C1 = ozonated VCO 200 mg/ml, K2 = without ozonated VCO, A2 = ozonated VCO 50 mg/ml, B2 = ozonated VCO 100 mg/ml, C2 = ozonated VCO 200 mg/ml). Tissue's expression of TGF-ß and neutrophil count were evaluated by immunohistochemistry test and hematoxylin & eosin(HE) staining on day 6 and 12 after skin graft.
Results : Significant differences were shown on tissue's expression of TGF-ß and neutrophil count between control group and groups that were administered by ozonated VCO with dosage of 50 mg/ml, 100 mg/ml, and 200 mg/ml on day 6 and 12 after skin graft ( p < 0.5). Conclusion : Ozonated VCO was effective in improving full thickness skin graft wound healing, based on increased expression of TGF-and decreased neutrophil count.
Keywords : Ozonated VCO, full thickness autologous skin graft, expression of TGF-ß, neutrophil count.

## Abstract

## Autologous Full Thickness Skin Graft Wound Healing on Sprague Dawley Rats Reviewed from TGF-ß Expression and Neutrophil Count

## PENDAHULUAN
Luka  didefinisikan  sebagai  disrupsi/terganggunya kontinuitas  lapisan  epitel  kulit  ataupun  mukosa  yang disebabkan oleh kerusakan fisik dan/atau termal. Luka merupakan  salah  satu  penyebab  kematian  pada  anak- anak  di  seluruh  dunia  dan  merupakan  penyebab  pada sekitar  950.000  kematian  pada  anak-anak  dan  remaja dibawah 18 tahun pada setiap tahunnya. Penyembuhan dan regenerasi luka adalah proses yang rumit dan terdiri dari  tiga  fase  yaitu  fase  inflamasi,  proliferasi  dan remodeling jaringan. Penyembuhan luka yang bermasalah sering  mengakibatkan  kontraksi  dan  jaringan  parut; kontraksi  yang  berlebihan  menyebabkan  kontraktur yang  dapat  menyebabkan  komplikasi  yang  dapat 1 berdampak negatif pada kualitas hidup pasien.  Proses penyembuhan  luka  melibatkan  interaksi  sitokin,  faktor pertumbuhan (growth  factors) ,  darah  dan  matriks ekstraseluler.  Sitokin  akan  memicu  penyembuhan  luka melalui  produksi  komponen  membrana  basalis, mencegah terjadinya dehidrasi, meningkatkan inflamasi dan pembentukan dari jaringan granulasi. Pathway yang terlibat  dalam  proses  penyembuhan  luka  dipengaruhi oleh  berbagai  faktor  lokal  dan  sistemik,  salah  satunya 2 berupa infeksi.
Skin graft (tandur kulit) saat ini menjadi salah satu model terapi pilihan penyembuhan luka terutama pada luka  yang  tidak  dapat  disembuhkan  menggunakan terapi  agen  topikal  dan/atau  pembalut  luka. Skin  graft adalah  tindakan  memindahkan  sebagian  atau  seluruh ketebalan kulit dari satu tempat ke tempat lainnya dan akan  terjadi  revaskularisasi  untuk  menjamin
3 kelangsungan  hidup  kulit  yang  dipindahkan  tersebut. Berdasarkan ketebalan eksplan, skin graft dibagi menjadi
split–thickness  skin  graft (STSG)  dan  full  thickness  skin 4 graft  (FTSG).   Faktor  yang  berperan  dalam penyembuhan  luka  pada  FTSG  salah  satunya  adalah vaskularisasi  yang  cukup  untuk  dapat  hidup  sebelum dan  setelah  terjalin  hubungan  erat  dengan  jaringan resipien. Nutrisi pada skin graft dimulai dengan proses sirkulasi  plasmatik  dimana  terjadi  proses  inhibisi plasma/serum  dan  oksigen  ke  dalam graft .  Oksigen menjadi  komponen  penting  dalam  penanganan  luka 3,5 serta keberhasilan skin graft . Virgin  coconut  oil merupakan  produk  olahan daging buah kelapa segar pada suhu rendah atau tanpa m e l a l u i   p e m a n a s a n   d e n g a n   t u j u a n   u n t u k mempertahankan  kandungan  penting  dalam  minyak 6 kelapa.   Kandungan  utama  VCO  adalah  asam  lemak jenuh sekitar 90% dan asam lemak tak jenuh sekitar 10%. VCO memiliki kandungan antioksidan seperti tokoferol dan  betakaroten  serta  sifat moisturizer yang  menjaga 7 kelembapan kulit serta meningkatkan hidrasi kulit.  VCO terbukti  meningkatkan  jaringan  granulasi,  penurunan bermakna waktu re-epitelisasi, kadar GAG, total protein, heksosa, asam sialic dan elastin pada luka sehingga dapat meningkatkan  laju  penutupan  luka  pada  luka  yang mengalami delayed  wound  healing serta  meningkatkan berbagai  petanda  luka  pada  luka full-thickness  wound pada tikus. Jumlah total kolagen pada luka yang diterapi dengan  VCO  juga  mengalami  peningkatan  signifikan. Didapatkan pula peningkatan kadar glikohidrolase, beta glukoronidase dan N-asetil-beta-glukosaminidase pada 8,9 luka yang diterapi dengan VCO.
Ozon  diklaim  sebagai  alternatif  yang  potensial untuk  dijadikan  agen  yang  berperan  dalam penyembuhan luka pada kulit selain terapi konvensional
6 yang sudah ada.  Interaksi ozon terhadap jaringan kulit
menyebabkan  inaktivasi  bakteri,  virus  dan  jamur, menstimulasi  produksi  antioksidan,  mengurangi viskositas  darah  dan  plasma,  meningkatkan erythroyte membrane  fluidity ,  pelonggaran  jaringan,  merangsang aktivitas  hemoglobin  dan  meningkatkan  penyerapan sekaligus  pelepasan  oksigen,  memperbaiki  sirkulasi darah ke jaringan, menginduksi pembentukan jaringan kolagen,  aktivasi  jaringan  granulasi,  dan  mempercepat epitelisasi  (pertumbuhan  sel  kulit),  serta  peningkatan 1 0 aktivitas  fagositosis,  dan  aktivasi  fibroblas.
Pembentukan  minyak  ozon,  diperoleh  dengan membuat  ozon  dalam  bentuk  gas  menjadi  minyak dengan  cara cold-press seperti  minyak  zaitun,  minyak bunga  matahari  dan  banyak  asam  lemak  tak  jenuh lainnya.  Keuntungannya  adalah  umur  simpan  2  tahun jika disimpan dalam lemari es berbeda dengan ozonated water yang memiliki waktu paruh 20 menit dengan suhu 11 air 20℃ dan meningkat dengan peningkatan suhu air. TGF-β  berfungsi  kemotaksis  dari  fibroblas  dan otot polos, dan memodulasi pembentukan kolagen dan kolagenase.  Proses  ini  secara  keseluruhan  akan menyebabkan deposisi jaringan ikat baru kedalam lokasi luka  yang  dikenal  sebagai  fase  proliferasi,  dan  setelah semua  proses  epithelialisasi,  granulasi,  dan neovaskularisasi selesai, akan diikuti oleh suatu proses remodelling untuk  mengembalikan  struktur  yang  baru 12 terbentuk mendekat kondisi awalnya.
Full  thickness  skin  graft menjadi  pilihan  untuk menutup  luka  karena  hasil  yang  baik.  Namun  perlu penelitian  lebih  lanjut  mengenai  proses  penyembuhan luka pada FTSG untuk mengurangi penerimaan jaringan yang  tidak  merata  atau  tidak  teratur  yang mengakibatkan  kontraktur  berulang  dan  perbedaan pigmen. Penelitian ini dimaksudkan untuk mengetahui efek pemberian ozon topikal dalam bentuk ozonated VCO pada  penyembuhan  luka  FTSG  autolog  tikus Sprague Dawley ,  yang  ditinjau  dari  kadar  TGF-β  dan  jumlah neutrofil.

## METODE
Design , Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  adalah  penelitian  eksperimental melibatkan dua grup kontrol dan enam grup intervensi dengan group post-test only design dilaksanakan periode Mei–Juni  2019.  Penelitian  ini  telah  mendapatkan persetujuan  dariKomisi  Etik  Penelitian  Kesehatan Fakultas  Kedokteran  Universitas  Diponegoro  dengan No.  54/EC/H/KEPK/FK-UNDIP/V/2019.  Pembuatan ozonated VCO  dilakukan  di Center  Plasma  for  Research Universitas  Diponegoro,  Semarang.  Proses  pembuatan luka  dan  penerapan  FTSG  autologus,  serta  proses pengambilan  jaringan  dilakukan  di  Laboratorium Hewan  Universitas  Brawijaya,  Malang.  Proses pembuatan  preparat,  pewarnaan  HE  serta  pewarnaan imunohistokimia  dilakukan  di  Laboratorium  Patologi
Anatomi  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Brawijaya, Malang.

## Sampel penelitian
Besar sampel menurut WHO tiap kelompok minimal 5 ekor tikus dengan cadangan 10%. Digunakan 48 ekor tikus Sprague  Dawley jantan,  umur  2–3  bulan,  kondisi sehat (bergerak aktif), dengan berat 250±50 gram, tidak ada abnormalitas yang tampak. Tikus dibagi secara acak menjadi  8  kelompok  dengan  masing-masing  kelompok terdiri dari 6 ekor mencit. Tikus dengan kecacatan dan menunjukkan  perubahan  perilaku  selama  aklimatisasi (tampak  sakit  dan  tidak  aktif)  dikeluarkan  dari penelitian.

## Prosedur Penelitian
Ozon  diperoleh  dari  laboratorium Plasma  Research Universitas  Diponegoro,  yang  didapatkan  dari  hasil generator  ozon.  Ozon  yang  dihasilkan  akan dicampurkan  ke  dalam  VCO.  Pengaduk  magnetis digunakan  untuk  memudahkan  pencampuran  ozon dengan  VCO  yang  akan  dijadikan  bahan  aktif  pada ozonated VCO. Ozone dicampurkan ke dalam 100 cc VCO dengan  aliran  oksigen  sebesar  0,1  L/menit  dan konsentrasi  ozon  3360  ppm.  Pengukuran  kadar  ozon dalam Ozonated VCO  diukur  dengan  metode  titrasi kalium iodida
Penelitian dilakukan dengan membuat model full thickness  skin  graft pada  tikus.  Pertama-tama  dilakukan pengambilan area kulit sehat untuk skin graft . Setelah itu, dilakukan pemotongan jaringan lemak dan jaringan ikat yang  berada  dibawah skin  graft .  Setelah  itu,  dapat dilakukan penutupan skin graft pada area kulit yang lesi dengan dilakukan penjahitan skin graft secara interruptus pada  tengah skin  graft ,  keempat  sudut graft dan  dua jahitan  pada  masing-masing  sisi graft dengan  benang T–lene 5.0 .
Setelah  dilakukan  FTSG,  luka  pada  tikus dibersihkan  dengan normal  saline dan  diberi  perlakuan sesuai kelompok. Kelompok kontrol diberikan perlakuan penutupan luka dengan kassa lembab NaCl 0,9% selama 6  (K1)  dan  12  (K2)  hari.  Kelompok  perlakuan  1  (A) dioleskan ozonated VCO 50 mg/ml 1x sehari selama 6 (A1) dan  12  (A2)  hari.  Kelompok  perlakuan  2  dioleskan ozonated VCO 100 mg/ml 1x sehari selama 6 (B1) dan 12 hari (B2). Kelompok perlakuan 3 (C) dioleskan ozonated VCO 200 mg/ml 1x sehari selama 6 (C1)dan 12 (C2) hari.
Euthanasia dilakukan pada tikus dengan bantuan Ketamine-Xylazine  diikuti  dengan  dislokasi  cervical. Pada  tahapan  ini,  dilakukan  penilaian  ukuran graft , perlekatan jaringan, kontraktur, tanda-tanda infeksi akan dinilai. Skin  graft direseksi  sepanjang  0,5–1  cm  dengan jaringan sekitarnya. Fascia (fascia dorsal superfisial) dan otot (latissimus  dorsi) yang  terletak  dibawah graft juga direseksi bersamaan dengan skin graft . Sediaan kemudian dibuat preparat histologisnya dan diberi pewarnaan HE
Efektivitas Ozonated Virgin Coconut Oil terhadap Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog Tikus Sprague Dawley Ditinjau dari Ekspresi TGF-ß dan Jumlah Neutrofil
kemudian  dinilai  dengan  mikroskop  cahaya.  Penilaian dilakukan dengan metode rerata neutrofil pada jaringan skin graft dalam 4 lapangan pandang perbesaran 1000 x dan  pengukuran  rerata  persentase  ekspresi  TGF-β t e r h a d a p s k i n   g r a f t d e n g a n   p e w a r a n a a n immunohistokimia.

## Analisis
Analisis  data  hasil  penelitian  diolah  dengan software SPSS  25.0  for  Windows .  Data  yang  diperoleh  dari pengamatan  penelitian  berupa  ekspresi  TGF-β  dan jumlah  neutrofil  dianalisis  secara  deskriptif  dan dipresentasikan  dalam  bentuk  tabel.  Uji  normalitas dilakukan  menggunakan  uji Shapiro-Wilk .  Data  yang terdistribusi  normal  kemudian  akan  dilakukan  uji hipotesis  menggunakan  uji One-Way  ANOVA diikuti dengan  uji Post  Hoc  Bonferroni untuk  mengetahui perbedaan antar kelompok.

## HASIL
Kondisi Graft
Setelah  dilakukan  perlakuan full  thicknes  skin  graft , dilakukan pengamatan perlakuan terhadap graft secara makroskopis pada hari ke-1, 6, dan 12.
Secara  makroskopis,  dilakukan  pengamatan ukuran graft ,  perlekatan  jaringan,  kontraktur,  tanda- tanda  infeksi  pada  FTSG  dari  setiap  kelompok. Pemberian ozonated VCO dengan berbagai dosis terhadap FTSG menimbulkan efek penyembuhan luka yang secara
makroskopis  lebih  cepat.  Secara  makroskopis, penyembuhan tepi luka FTSG yang diberikan perawatan luka  menggunakan ozonated VCO  memiliki  kerapatan luka  yang  lebih baik  jika  dibandingkan  dengan kelompok  yang  mendapat  perawatan  NaCl  0,9%  pada FTSG.  Proses  penyembuhan  luka  dan  kerapatan  luka pada pemberian ozonated VCO menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan kelompok kontrol.
Transforming Growth Factor Beta (TGF-ß)
Setelah  dilakukan  pengambilan  jaringan,  dilakukan pengecatan  immunohistokimia.  Pembacaan  preparat jaringan dengan pengecatan imunohistokimia dilakukan oleh  ahli  patologi  pada  setiap  kelompok  dengan single blind .  Data  yang  didapatkan  dilakukan  perhitungan rerata presentase TGF-ß terhadap skin graft .
Terdapat  peningkatan  ekspresi  TGF-β  pada kelompok  perlakuan  (A1,  B1,  dan  C1)  terhadap kelompok  kontrol  (K1)  pada  hari  ke-6.  Terdapat peningkatan ekspresi TGF-β pada kelompok perlakuan (A2, B2, dan C2) terhadap kelompok kontrol (K2) pada hari ke-12.
Tabel  1  menunjukkan  rerata  persentase  ekspresi TGF-β pada jaringan FTSG. Data tersebut menunjukkan rerata  ekspresi  TGF-β  pada  kelompok  kontrol  lebih rendah  dibanding  pada  kelompok  yang  mendapat perlakuan. Rerata tertinggi hari ke - 6 dan 12 didapatkan pada  kelompok  C. Median pada  kelompok  K menunjukkan median terendah dibandingkan kelompok lainnya.
Medica Hospitalia | Vol. 8, No. 3, November 2021
Gambar 1. Makroskopis Efek Ozonated VCO pada FTSG
Hari ke-1
Hari ke-6
Hari ke-12
Uji normalitas dan homogenitas data dari masing- masing  kelompok  dilakukan  dengan  menggunakan  uji Shapiro–Wilk karena  sampel  kurang  dari  50. Uji Shapiro–Wilk menunjukkan  nilai p >0,05  pada  masing- masing kelompok sehingga dapat disimpulkan distribusi data ekspresi TGF-β terdistribusi normal dan homogen pada  semua  kelompok.  Selanjutnya  dilakukan  uji One–Way ANOVA untuk menguji hipotesis, yaitu adakah perbedaan bermakna antara lamanya perlakuan hari ke-6 dengan hari ke-12 terhadap ekspresi TGF-β.
Hasil  uji One–Way  ANOVA pada  kelompok perlakuan  hingga  hari  ke-6  didapatkan  nilai p =0,001; karena p <0,05 maka dapat disimpulkan ada perbedaan bermakna  ekspresi  TGF-β  pada  kelompok  perlakuan.
Selanjutnya  digunakan  uji Post  Hoc  Bonferroni untuk mengetahui  perbedaan  antar  kelompok.  Hasil  uji Post Hoc  Bonferroni didapatkan  perbedaan  yang  bermakna antara kelompok K1 dengan B1 ( p =0,023); dan K1 dengan C1 ( p =0,000).
Hasil  uji One–Way  ANOVA pada  kelompok perlakuan  hingga  hari  ke-12  didapatkan  nilai p =0,001, karena p <0,05 maka dapat disimpulkan ada perbedaan bermakna  ekspresi  TGF-β  pada  kelompok  perlakuan. Selanjutnya  digunakan  uji Post  Hoc  Bonferroni untuk mengetahui  perbedaan  antar  kelompok.  Hasil  uji Post Hoc  Bonferroni didapatkan  perbedaan  yang  bermakna antara kelompok K2 dengan A2 ( p =0,042); K2 dengan B2 ( p =0,002); dan K2 dengan C2 ( p =0,000).
Gambar 2. Ekspresi TGF-ß (Pewarnaan IHC dengan pembesaran 1000x)

## TABEL 1
Karakteristik data ekspresi TGF–ß
K (kontrol) Kelompok B (dosis 100 mg/ml) Hari ke – 6 A (dosis 50 mg/ml) C (dosis 200 mg/ml) Rerata ± SD (%) 10,40 ± 1,34
13,80 ± 2,86
8,20 ± 1,30
17,00 ± 2,91
Median (%) 11,00
14,00
8,00
18,00 Hari ke – 12
Rerata ± SD (%)
14,40 ± 1,94 16,40 ± 2,07 9,20 ± 1,30 18,40 ± 4,39
Median (%) 15,00
17,00 9,00 20,00 K2 K1 A1 A2 B2 B1 C1 C2 Hari ke-6 Hari ke-12
Efektivitas Ozonated Virgin Coconut Oil terhadap Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog Tikus Sprague Dawley Ditinjau dari Ekspresi TGF-ß dan Jumlah Neutrofil
Hasil  penelitian  menunjukkan  ekspresi  TGF-β yang ditimbulkan sebagai efek perawatan luka dengan Ozonated VCO  memiliki  rerata  lebih  tinggi  daripada kelompok kontrol yang mendapat perawatan Nacl 0,9% terhadap  luka  FTSG.  Kelompok  yang  dilakukan pemberian Ozonated VCO  dosis  50  mg/ml;  100  mg/ml dan 200 mg/ml menunjukkan ekspresi TGF-β yang lebih tinggi baik pada kelompok hari ke-6 maupun hari ke-12. Pada  penelitian  ini  didapatkan  rerata  ekspresi  TGF-ß kelompok hari ke-12 lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok  hari  ke-6  dengan  rerata  tertinggi  pada  hari ke-12 terdapat pada kelompok perlakuan ozonated VCO dengan  dosis  200  mg/ml  (18,40  ±  4,39)  dan  pada kelompok  hari  ke-6  rerata  ekspresi  TGF-  tertinggi  juga terdapat pada kelompok perlakuan ozonated VCO dosis
200 mg/ml (17,00 ± 2,91). Hasil penelitian menunjukkan adanya peningkatan bermakna terhadap ekspresi TGF-β pada  hari  ke-6  ( p =0,001)  dan  ke-12  ( p =0,001).Hasil  ini menunjukkan bahwa TGF-β akan muncul pada awal fase inflamasi  dan  akan  terus  meningkat  hingga  akhir  fase proliferasi.

## Neutrofil
Jumlah neutrofil didapatkan dari pemeriksaan terhadap jaringan yang telah dicat dengan HE dibawah mikroskop dengan menghitung rerata jumlah neutrofil yang ada di 4  lapangan  pandang  untuk  masing-masing  sampel penelitian.
Presentase  jumlah  neutrofiil  pada  kelompok kontrol  (K1)  lebih  rendah  dibandingkan  kelompok
Medica Hospitalia | Vol. 8, No. 3, November 2021
Gambar 3. Jumlah Neutrofil (Pewarnaan HE dengan pembesaran 1000x)
K2 K1 A1 A2 B2 B1 C1 C2 Hari ke-6 Hari ke-12

## TABEL 2
Karakteristik Data Jumlah Neutrofil K (kontrol) Kelompok B (dosis 100 mg/ml) Hari ke – 6 A (dosis 50 mg/ml) C (dosis 200 mg/ml) Rerata ± SD (%) 8,60 ± 1,14 10,00 ± 1,00 7,40 ± 2,07
11,40 ± 2,30
Median (%) 9,00
10,00
8,00
12,00
Hari ke – 12
Rerata ± SD (%) 5,60 ± 1,14
6,60 ± 1,14
4,60 ± 0,83 7,80 ± 1,64
Median (%)
6,00 7,00 5,00 7,00
perlakuan  (A1,  B1,  dan  C1)  pada  hari  ke-6.  Persentase jumlah  neutrofil  pada  kelompok  kontrol  (K2)  lebih rendah dibandingkan kelompok perlakuan (A2, B2, dan C2) pada hari ke-12.
Tabel  2  menunjukkan  rerata  prosentase  jumlah neutrofil  pada  jaringan  FTSG.  Dari  data  tersebut menunjukkan  rerata  jumlah  neutrofil  pada  kelompok kontrol  lebih  rendah  dibanding  pada  kelompok  yang mendapat  perlakuan.  Rerata  tertinggi  hari  ke-6  dan  12 didapatkan pada kelompok C.
Box  plot seperti  yang  terlihat  pada  gambar  4 menunjukkan  sebaran median jumlah  neutrofil  pada masing-masing  kelompok. Median pada  kelompok  K2 menunjukkan median terendah dibandingkan kelompok lainnya.
Uji normalitas dan homogenitas data dari masing- masing  kelompok  dilakukan  dengan  menggunakan  uji Shapiro–Wilk karena  sampel  kurang  dari  50.  Uji Shapiro–Wilk menunjukkan  nilai p >0,05  pada  masing- masing kelompok sehingga dapat disimpulkan distribusi data jumlah neutrofil terdistribusi normal dan homogen pada  semua  kelompok.  Selanjutnya  dilakukan  uji One–Way ANOVA untuk menguji hipotesis, yaitu adakah perbedaan bermakna antara lamanya perlakuan hari ke-6 dengan hari ke-12 terhadap jumlah neutrofil.
Hasil  uji One–Way  ANOVA pada  kelompok perlakuan  hingga  hari  ke-6  didapatkan  nilai p =0,001, karena p <0,05 maka dapat disimpulkan ada perbedaan bermakna  jumlah  neutrofil  pada  kelompok  perlakuan. Selanjutnya  digunakan  uji Post  Hoc  Bonferroni untuk mengetahui  perbedaan  antar  kelompok.  Hasil  uji Post Hoc  Bonferroni didapatkan  perbedaan  yang  bermakna antara kelompok K1 dengan C1 ( p =0,005).
Hasil  uji One–Way  ANOVA pada  kelompok perlakuan  hingga  hari  ke-12  didapatkan  nilai p =0,001, karena p <0,05 maka dapat disimpulkan ada perbedaan bermakna  jumlah  neutrofil  pada  kelompok  perlakuan. Selanjutnya  digunakan  uji Post  Hoc  Bonferroni untuk mengetahui  perbedaan  antar  kelompok.  Hasil  uji Post Hoc  Bonferroni didapatkan  perbedaan  yang  bermakna antara kelompok K2 dengan B2 ( p =0,009); dan K2 dengan C2 ( p =0,000).
Hasil  penelitian  menunjukkan  jumlah  neutrofil yang ditimbulkan sebagai efek perawatan luka dengan ozonated VCO  memiliki  rerata  lebih  tinggi  daripada kelompok kontrol yang mendapat perawatan NaCl 0,9% terhadap  luka  FTSG.  Kelompok  yang  dilakukan pemberian ozonated VCO  dosis  50  mg/ml;  100  mg/ml dan 200 mg/ml menunjukkan jumlah yang lebih tinggi baik pada kelompok hari ke-6 maupun hari ke-12. Pada penelitian  ini  didapatkan  rerata  jumlah  neutrofil kelompok hari ke-12 lebih rendah dibandingkan dengan kelompok hari ke-6 dengan rerata tertinggi pada hari ke-6 terdapat pada kelompok perlakuan ozonated VCO dengan dosis 200 mg/ml (11,40 ± 2,30) dan pada kelompok hari ke-12 rerata jumlah neutrofil tertinggi juga terdapat pada kelompok perlakuan ozonated VCO dosis 200 mg/ml (7,80 ± 1,64).

## PEMBAHASAN
Efek ozonated VCO  Dosis  Bertingkat  terhadap Makroskopis Full Thickness Skin Graft (FTSG) Proses  FTSG  berjalan  dengan  lancar  tanpa  kendala berarti  dan  dilakukan  dalam  satu  waktu  bersamaan sehingga  meminimalisir  bias.  Pemberian ozonated VCO
K1 Kelompok 4 6 8 10 12 4 Ju m la h N e u tr o fi l A1 B1 C1 K2 A2 B2 C3 p =1,000 p =0,273 p =0,005 p =0,273 p =0,009* p =0,000*
Gambar 4. Grafik box plot data jumlah neutrofil
Efektivitas Ozonated Virgin Coconut Oil terhadap Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog Tikus Sprague Dawley Ditinjau dari Ekspresi TGF-ß dan Jumlah Neutrofil
dengan berbagai dosis terhadap FTSG menimbulkan efek penyembuhan luka yang secara makroskopis lebih cepat. Secara makroskopis, penyembuhan tepi luka FTSG yang diberikan  perawatan  luka  menggunakan ozonated VCO memiliki  kerapatan  luka  yang  lebih  baik  jika dibandingkan  dengan  kelompok  yang  mendapat perawatan NaCl 0,9% pada FTSG.
Takegraft sangat dipengaruhi dari sirkulasi darah yang  adekuat  dan  transport  oksigen  yang  cukup. Putusnya  pembuluh  darah  saat  perlakuan  FTSG  akan
13 membuat graft donor berisiko menjadi daerah iskemik. Pada  penelitian  ini  didapatkan graft tetap  vital  dan tumbuh dengan baik. Take FTSG yang diberi perlakuan ozonated VCO  menunjukkan  hasil  yang  lebih  baik dibandingkan kelompok kontrol. Hal ini sesuai dengan penelitian  yang  membuktikan  bahwa ozonated VCO dapat  meningkatkan  sirkulasi  darah  dan transport 14 oksigen ke jaringan iskemik.
Efek Ozonated VCO  Dosis  Bertingkat  pada  Kadar TGF- β
Peningkatan ekspresi TGF-β yang ditimbulkan oleh ozon sesuai  dengan  teori  yang  mendasari  bahwa  ozon meningkatkan growth  factor secara  endogen  sehingga menstimulasi  pertumbuhan  pembuluh  darah.  Kadar TGF-β ditemukan lebih tinggi pada tepi lesi yang sedang
15-17 mengalami proses re-epitelialisasi dan remodeling . Hal ini  ditemukan  pula  pada  ukuran  luka,  dimana didapatkan  adanya  penurunan  ukuran  luka  yang signifikan pada tikus dengan terapi ozon dibandingkan dengan terapi standar.
Efek Ozonated VCO  Dosis  Bertingkat  pada  Jumlah Neutrofil
Jumlah neutrofil jaringan akan mengalami peningkatan pesat  pada  fase  inflamasi  dan  mengalami  penurunan pada  akhir  fase  inflamasi  karena  proses  apoptosis  dan fagositosis. Setelah fase inflamasi, proses penyembuhan luka  akan  berlanjut  ke  fase  proliferasi,  dimana  jumlah neutrofil   jaringan sudah mengalami penurunan pesat. Jumlah neutrofil yang berlebihan akan memperpanjang fase  inflamasi  yang  dapat  memperpanjang  waktu 17,18 penyembuhan luka dan menimbulkan komplikasi. Pemeriksaan pada hari ke-6 menunjukkan adanya jumlah neutrofil yang tidak terlalu tinggi dan menurun pada  hari  ke-12.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  pada hari  ke-6  proses  penyembuhan  luka  sudah  mulai memasuki  awal  proliferasi,  dimana  jumlah  neutrofil mulai  menurun  karena  sebagian  besar  neutrofil  telah mengalami apoptosis dan difagosit oleh makrofag.
Turunnya  jumlah  neutrofil  mengindikasikan selesainya  fase  inflamasi  dan  dimulainya  fase 19 proliferasi. Ozonated VCO  dosis  200  mg/ml  terbukti efektif  menekan  jumlah  neutrofil  paling  banyak dibandingkan kelompok ozonated VCO dosis 50 mg/ml; 200 mg/ml; dan kelompok kontrol bila dilihat di hari
ke-6. Segera setelah jumlah neutrofil turun maka proses penyembuhan luka memasuki fase proliferasi. Semakin sedikit jumlah neutrofil jaringan, semakin cepat jaringan mengalami  proliferasi  dan  risiko  pemanjangan  fase inflamasi  semakin  rendah.  Seiring  dengan  makin cepatnya  jaringan  masuk  ke  dalam  proses  proliferasi,
20 waktu penyembuhan luka juga akan semakin pendek.

## Keterbatasan
Peneliti  juga  menyadari  masih  banyak  keterbatasan penelitian yang harus diperbaiki untuk melengkapi dan menyempurnakan penelitian ini. Salah satu keterbatasan penelitian ini karena diuji hanya pada beberapa mediator inflamasi. Akan lebih baik penelitian mendatang dapat dilakukan pada beberapa mediator inflamasi lain seperti IL-6, IL-10, TNF-α.
Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  efek terapi ozonated VCO  pada  luka.  Pada  penelitian selanjutnya  diharapkan  dapat  meneliti  efek  dan  dosis toksisitas dari ozonated VCO.
Selain  itu  penelitian  ini  dilakukan  pada  media hewan coba tikus, tidak menutup kemungkinan media penelitian dapat ditingkatkan menjadi uji klinis kepada manusia.

## SIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan, ozonated VCO dosis  bertingkat  efektif  terhadap  proses  penyembuhan luka full thickness skin graft autologus tikus Sprague Dawley ditinjau  dari  makroskopis  luka,  ekspresi  TGF-β  dan jumlah neutrofildan dapat ditarik simpulan: (1) Ozonated VCO efektif dalam meningkatkan respon penyembuhan luka  FTSG  ditinjau  peningkatan  ekspresi  TGF-β  pada hari  ke-12  dibandingkan  hari  ke-6  perawatan.  (2) Ozonated VCO  efektif  dalam  meningkatkan  respon penyembuhan  luka  FTSG  ditinjau  dari  penurunan jumlah neutrofil pada hari ke-12 dibandingkan hari ke-6 perawatan.
Ozonated VCO  dengan  dosis  200  mg/ml  paling efektif  dibandingkan  dengan  dosis  50  mg/ml  dan  100 mg/ml  dalam  proses  penyembuhan  luka full  thickness skin graft .

## DAFTAR PUSTAKA
1. Robson  MC,  Steed  DL,  Franz  MG.  Wound  healing:  Biologic features and approaches to maximize healing trajectories. Curr P r o b l   S u r g .   2 0 0 1   A v a i l a b l e   f r o m : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11452260.
2. Dhivya S, Padma VV, Santhini E. Wound dressings - a review. B i o M e d i c i n e .   2 0 1 5 .   A v a i l a b l e   f r o m : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26615539.
3. Velnar T, Bailey T, Smrkolj V. The wound healing process: an overview of the cellular and molecular mechanisms. J Int Med Res. 2009;37(5): 1528-42
4. Degli AI, Ginelli E, Mazzacane B, et al . Effectiveness of a Short-
Medica Hospitalia | Vol. 8, No. 3, November 2021
Term Treatment of Oxygen–Ozone Therapy into Healing in a Posttraumatic Wound. Case Rep Med. 2016;2016: 9528572
5. Wyatt  J.  Forensic  Medicine.  New  York:  Oxford  University Press; 2011.p 138
6. Valacchi  G,  Lim  Y,  Belmonte  G, et  al .  Ozonated  sesame  oil enhances  cutaneous  wound  healing  in  SKH1  mice.  Wound Repair and Regeneration. 2010;19(1): 107–15
7. Coşkun  S,  Güleç  EG,  Balabanli  B,  Acartürk  F.  Effects  of epidermal growth factor on lipid peroxidation and nitric oxide levels in oral mucosal ulcer healing: a time-course study. Surg Today. 2007. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/17593476.
8. Diegelmann RF. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Front Biosci. 2004;9:283–9
9. Penn JW, Grobbelaar AO, Rolfe KJ. The role of the TGF-β family in  wound  healing,  burns  and  scarring:  a  review.  Int  J  Burn T r a u m a .   2 0 1 2 .   A v a i l a b l e   f r o m : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3415964.
10. Travagli, V., Zanardi, I., Valacchi, G., & Bocci, V. (2010). Ozone and  ozonated  oils  in  skin  diseases:  a  review.  Mediators  of i n f l a m m a t i o n ,   2 0 1 0 ,   6 1 0 4 1 8 .   h t t p s : / / d o i . o r g / 10.1155/2010/610418
11. Pai SA, Gagangras SA, Kulkarni SS, Majumdar AS. Potential of ozonated sesame oil to augment wound healing in rats. Indian J Pharm Sci . 2014;76(1):87–92.
12. Zhang  J,  Guan  M,  Xie  C,  Luo  X,  Zhang  Q,  Xue  Y.  Increased growth factors play a role in wound healing promoted by non invasive oxygen-ozone therapy in diabetic patients with foot ulcers. Oxid Med Cell Longev. 2014;2014:273475
13. Guo S, DiPietro LA. Factors Affecting Wound Healing. J Dent Res. 2010;89(3):219–229.
14. Yuniati R, Subchan P, Riawan W, et al . Topical ozonated virgin coconut  oil  improves  wound  healing  and  increases  HSP90α, VEGF-A, EGF, bFGF and CD34 in diabetic ulcer mouse model of  wound  healing  [version  2;  peer  review:  1  approved  with reservations,  1  not  approved].  F1000Research  2021,  9:580 (https://doi.org/10.12688/f1000research.22525.2)
15. De Monte A, Gori C. Major ozonated autohemotherapy in the treatment  of  limb  ulcers  not  responding  to  conventional therapy.  Vol.  10,  International  Journal  of  Ozone  Therapy. 2011;10:85–98
16. Wilgus  TA,  Roy  S,  McDaniel  JC.  Neutrophils  and  Wound Repair: Positive Actions and Negative Reactions. Adv Wound Care (New Rochelle). 2014;2(7):379–388
17. Borges GÁ, Elias ST, da Silva SMM, et al . In vitro evaluation of wound healing and antimicrobial potential of ozone therapy. J Cranio-Maxillofacial  Surg  [Internet].  2017;45(3):36470. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jcms.2017.01.005.
18. Shaw  TJ,  Martin  P.  Wound  repair  at  a  glance.  J  Cell  Sci. 2009/09/04. 2009;122(Pt 18):3209–13.
19. Orsted Heather L. et al . KDH. Skin: Anatomy, Physiology and Wound  Healing.  canada:  Canadian  Association  of  Wound Care; 2018. p. 7–23.
20. Shah JMY, Omar E, Pai DR. Cellular events and biomarkers of wound healing. Indian J Plast Surg [Internet]. 2012 May [cited 2 0 1 8   D e c   1 7 ] ; 4 5 ( 2 ) : 2 2 0 – 8 .   A v a i l a b l e   f r o m : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23162220.
Efektivitas Ozonated Virgin Coconut Oil terhadap Penyembuhan Luka Full Thickness Skin Graft Autolog Tikus Sprague Dawley Ditinjau dari Ekspresi TGF-ß dan Jumlah Neutrofil