Profil Hormon-hormon Reproduksi Cacing Nipah Namalycastis rhodochorde (Polychaeta: Nereididae)
The Profile of Reproductive Hormones of Nypa Palm Worm Namalycastis rhodochorde (Polychaeta: Neriedidae)
Junardi *) , Tri Rima Setyawati, Ari Hepi Yanti Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Tanjungpura
* E-mail: junardi@fmipa.untan.ac.id

## ABSTRACT
The Nypa palm worm Namalycastis rhodochorde can be cultivated because it has high economic value;  however,  knowledge  of  its  reproductive  biology  is  still  poorly  understood,  especially regarding reproductive hormones for engineering and accelerated maturation. This research aimed to  obtain  profile  data  of  the  three  reproductive  hormones  i.e:  estradiol,  progesterone,  and testosterone of Nypa palm worms. Samples were taken from body coelom fluid containing gametes from three stages of development; immature, submature, and mature. Analysis of progesterone and testosterone  used  the  Radio  Immunoassay  method  while  estradiol  used  the  Enzyme-linked Immunosorbent Assay method. Analysis of variance was used to determine differences in hormone concentrations based on developmental stages. The concentration of the Estradiol hormone increases with maturation, while the concentrations of progesterone and testosterone do not differ at all stages of development.
Keywords: Estradiol, namalycastis , polychaeta, progesterone, reproductive hormone, estosterone.

## PENDAHULUAN
Kajian hormon-hormon reproduksi pada
Polychaeta  awalnya  menggunakan  pendekatan tidak  langsung  dengan  mengetahui  adanya hormon  pertumbuhan Nereidin (Álvarez- Campos et  al .,  2022).    Pendekatan  ini berdasarkan mekanisme kontrol negatif, berkurangnya konsentrasi hormon pertumbuhan akan  menyebabkan  maturasi  individu  dan pemijahan.  Keberadaan  hormon  reproduksi Polychaeta  selanjutnya  dibahas  oleh  beberapa peneliti.  Schenk et  al .,  (2016)  menemukan neurohormon metylfernesoat juga memengaruhi reproduksi pada Annelida termasuk Polychaeta. Informasi tentang hormon reproduksi  secara  umum  juga  telah  dilaporkan pada  beberapa  spesies  dari  famili  Nereididae (Andries, 2001).
Pada satu dasawarsa terakhir ini juga mulai dilaporkan  keberadaan  hormon  steroid  pada berbagai  spesies  anggota  Nereididae,  misalnya estradiol  17-β  pada Nereis  virens (GarcÍa- alonso  &  Rebscher,  2005)  dan  estradiol  17-β, progesteron  dan  testosteron  pada Nereis. diversicolor (Mouneyrac et  al .,  2006);  (Durou &  Mouneyrac,  2007);  (Meunpol et  al .,  2007).
Umumnya,  kajian  hormon  banyak  dilaporkan dari  spesies-spesies  yang  termasuk  dalam subfamili Nereidinae . Informasi hormon reproduksi  lainnya  telah  dikemukakan  oleh Lawrence  &  Soame  (2009)  yang  berpendapat
ada  lebih  banyak  hormon  yang  terlibat  dalam proses  reproduksi  Polychaeta,  namun  sampai saat  ini  pendapat  tersebut  belum  banyak dibuktikan.
Hasil  penelitian  ini  merupakan  informasi awal  tentang  keberadaan  hormon-hormon reproduksi  pada  cacing  nipah Namalycastis rhodochorde (subfamili Namanereidinae) sehingga dapat digunakan sebagai acuan untuk melakukan rekayasa reproduksi seperti induksi hormon untuk mempercepat pematangan gamet. Tujuan penelitian untuk mendapatkan data tiga hormon  reproduksi  estradiol,  progesteron  dan testosteron  pada  cacing  nipah Namalycastis rhodochorde berdasarkan tahap perkembangan.

## METODE
Cacing  nipah  ( N.  rhodochorde )  yang  digunakan dikoleksi  dari  estuari  Sungai  Kapuas,  Kalimantan Barat  dibawa  dalam  keadaan  hidup  ke  laboratorium Zoologi,  Universitas  Tanjungpura  menggunakan kontainer sampel yang diisi dengan lumpur. Sampel cacing  dari  lapangan  dipelihara  dalam  bak  plastik berukuran 50x30x25 cm pada suhu ruang tanpa diberi pakan selama seminggu sebelum digunakan.
Cacing  nipah  yang  digunakan  dalam  penelitian memiliki  karakteristik  warna  tubuh  merah  muda dengan segmen-segmen tubuh dengan ukuran bagian anterior  kecil,  semakin  membesar  ke  arah  median kemudian  semakin  mengecil  kembali  ke  arah posterior  tubuh.  Panjang  tubuh  dewasa  umumnya lebih dari  satu  meter.  Karakter  khas  dari  spesies  ini memiliki ciri tentakel sangat pendek, seta hanya tipe
falciger  (tanpa  seta  spiniger)  pada  parapodia,  seta falciger berukuran pendek terutama pada parapodia di bagian anterior tubuh (Glasby et al ., 2007). Maturasi cacing  ini  dapat  dilihat  secara  visual  dengan perubahan  warna  tubuh.  Warna  merah  muda  pada individu  muda  menjadi  merah  tua  pada  betina  dan menjadi  putih  pucat  kehijauan  pada  jantan  hanya pada individu mature .
Penentuan  tahapan  perkembangan  dilakukan dengan memeriksa gamet. Gamet diambil dari selom tubuh cacing dengan menggunakan pipa kaca kapiler yang  ujungnya  diruncingkan.  Pipa  kaca  kapiler selanjutnya  ditusukkan  pada  bagian  samping  tubuh diantara  dua  segmen  bagian  ventral.  Cairan  selom yang  didapat  kemudian  diteteskan  pada  kaca  obyek dan diamati di bawah mikroskop majemuk (Olympus CX 21) pada perbesaran 100x.
Gamet  betina  (oosit)  diukur  diameternya menggunakan  mikrometer  (Olympus  Cross)  yang dipasang  pada  lensa  okular  mikroskop.  Oosit  yang diukur adalah oosit yang diameternya >30µm karena pada ukuran ini oosit sudah dapat dibedakan dengan eleosit  atau  klaster  sperma  (Junardi et  al .,  2010). Dilakukan pengukuran diameter oosit untuk 30 oosit setiap individu. Tahap perkembangan oosit mengacu pada oogenesis dari Nereididae menurut Eckelbarger (2006)  dan  Junardi et  al .,  (2010).  Perkembangan sperma  juga  mengacu  pada  tahap  spermatogenesis Nereididae menurut Rouse (2006) dan Junardi et al ., (2010).  Data  perkembangan  gamet  ini  kemudian digunakan untuk menentukan jenis kelamin.
Cacing  yang  digunakan  untuk  pengukuran hormon  reproduksi  diambil  sebanyak  tiga  individu yang mewakili masing-masing
tahapan perkembangan. Hormon-hormon yang diukur adalah estradiol  dan  progesteron  dari  cacing  betina, sementara testosteron, sampel diambil dari betina dan jantan.  Total  sebanyak  sembilan  sampel  masing- masing  dari  tiga  tahap  perkembangan,  baik  jantan maupun betina.
Sampel  yang  digunakan  untuk  analisis  hormon diambil  dari  cairan  selom  yang  mengandung  gamet dari  bagian  median  tubuh  dengan  ukuran  segmen yang lebih besar dan lebar dibandingkan bagian tubuh lainnya. Pengambilan cairan selom dilakukan dengan cara  memotong  bagian  posterior  tubuh,  setelah terpotong,  dua  potongan  tubuh  ditekan  pada  cawan petri  berdiameter  6  cm.  Cairan  selom  yang tertampung kemudian disimpan dalam tabung mikro
1 ml. Analisis progesteron dan testosteron
menggunakan  metode Radio  Immunoassay (RIA). Analisis ini dilakukan dengan cara membuat tabung penanda  duplikat  untuk  total  (T), non-specific binding (NSB) standar nol (Standar 1 = B 0 ), standar (S 2-6 ),  kontrol  (C),  dan  sampel  (S x ), Reagent dan sampel  dicampur,  ditambahkan  50μl  pada  masing- masing standar, control, dan sampel ke dalam tabung penanda. Larutan perunut ditambahkan sebanyak 100 μl ke dalam semua tabung. Antiserum sebanyak 100 μl  kemudian  juga  ditambahkan  ke  dalam  semua tabung kecuali tabung T dan NSB. Tabung yang telah
ditambahkan  perunut  dan  antiserum  (kecuali  tabung T)  selama  2-5  detik  yang  ditempatkan  pada  rak holder, selanjutnya rak holder ditempatkan pada plate shaker dan dikocok selama beberapa detik. Inkubasi tabung dilakukan selama 2 jam pada suhu ruang (20- 28°C) dan tabung T ditempatkan pada rak kemudian diaduk bersamaan dengan tabung yang mengandung Magnetic  Immunosorbent (MIS)  sampai  homogen. Sebanyak  500  μl  sampel  ditambahkan  ke  masing- masing  tabung  kecuali  tabung  T.  Semua  tabung diaduk  dan  diinkubasi  selama  15  menit  pada  suhu ruang dan dibagi menjadi beberapa bagian kecil serta disentrifugasi dengan kecepatan 800 rpm selama 15 menit.  Kandungan  radioaktif  pada  semua  tabung kemudian dihitung.
Estradiol dianalisis menggunakan metode Enzyme-linked  Immunosorbent  Assay (ELISA) dengan kit ELISA komersial DRG (R) Germany EIA- 4399. Sebanyak 100 μL dari setiap standar, kontrol, dan  sampel  dengan tips ke  dalam well yang  sesuai. Enzyme  Conjugate diambil  sebanyak  200  μL dimasukkan  ke  dalam  masing-masing well dan diaduk selama 10 detik dan diinkubasi selama 4 jam pada  suhu  ruang.  Isi well kemudian  digoyangkan dengan  cepat,  w ell dibilas  sebanyak  3  kali  dengan Wash  Solution yang  diencerkan  masing-masing sebanyak 400 μL. Sisa tetesan diambil dengan kertas absorbent sampai  hilang  kemudian  ditambahkan sebanyak 200 μL larutan substrat ke setiap well dan selanjutnya  diinkubasi  selama  30  menit  pada  suhu ruang. Stop  solution ditambahkan sebanyak 100 μL yang  dimasukkan  ke  dalam  setiap well .  Pembacaan absorbance menggunakan  ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm setiap 10 menit. Analisis hormon  dilakukan  di  Pusat  Aplikasi  Isotop  dan Radiasi (PAIR) BATAN, Jakarta.
Data  diuji  normalitasnya  menggunakan  uji Kolmogorov-Smirnov  yang  diikuti  dengan  uji homogenitas  varian  (Levene’s  test)  sebelum dilakukan  dianalisis  varian  satu  arah  ( one  way ANOVA).  Uji Post  Hoc dengan Least  Significance Diffe rent  (LSD)  pada  tingkat  kepercayaan  (α=0,05) untuk  membedakan  konsentrasi  hormon  (variabel bebas)  pada  masing-masing  tahap  perkembangan (variabel  terikat).  Analisis  data  menggunakan program Statistika SPSS v21.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hormon-hormon reproduksi cacing nipah yaitu estradiol,  progesteron  dan  testosteron  yang ditemukan  berbeda  konsentrasi  pada  tahap perkembangan. Konsentrasi estradiol menunjukkan peningkatan seiring dengan tahap maturasi  individu  (Gambar  1).    Konsentrasi estradiol  spesies  ini  pada  tahap mature lebih tinggi  dan  hasil  ANOVA  juga  menunjukkan perbedaan signifikan (P=0,06, F=4,48) konsentrasinya pada individu mature dibandingkan  dengan  tahapan  perkembangan lainnya.
Gambar  1.  Konsentrasi  estradiol  rata-rata  pada tiga  tahap  perkembangan.  Angka pada bagian atas batang yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan bahwa tidak berbeda signifikan pada taraf kepercayaan 0,05%.
Konsentrasi  estradiol  ini  berbeda  dengan hasil  penelitian  GarcÍa-alonso  &  Rebscher (2005) yang  mendapatkan  pada N.  virens, estradiol  ditemukan  lebih  tinggi  pada  individu immature sebesar  0,029  ngml -1 dan  0,0129 ngml -1 (betina mature )  dan  0,0135  ngml -1 (jantan mature ).  Hasil  yang  berbeda  juga diperoleh oleh Durou & Mouneyrac (2007) pada N. diversicolor, immature memiliki konsentrasi estradiol  yang  lebih  tinggi  (1,6  ngml -1 ) dibandingkan dengan mature (0,9 ngml -1 ).
Estradiol  dihasilkan  oleh  sel-sel  eleosit untuk  pembentukan  vitellogenin,  banyaknya sel-sel  eleosit  pada  individu immature secara langsung berkorelasi dengan tingginya konsentrasi  estradiol.  Pada  Polychaeta mature pembentukan  vitellogenin  dilakukan  secara heterosintesis  dengan  mengambil  dari  sel-sel eleosit  di  sekitarnya  (Eckelbarger,  1986). Tingginya  konsentrasi  estradiol  pada  betina mature nampaknya  terkait  dengan  masih tingginya  konsentrasi  hormon  ini  pada  cairan selom karena sumber hormon reproduksi selain eleosit juga pada cairan selom tubuh (Álvarez- Campos et al ., 2022).
Pengukuran  kuantitas  vitellogenin  dalam cairan  selom  perlu  dilakukan  untuk  penelitian lebih lanjut sehingga dapat diketahui keselarasannya dengan fluktuasi estradiol yang ditemukan.  Selain  itu,  pada  individu mature Nereididae,  oositnya  memiliki  banyak  kortikal alveoli. Hal ini juga diduga turut menyumbang terhadap  tingginya  konsentrasi  estradiol  hasil
penelitian  ini.  Peran  estradiol  pada  kontrol pembentukan  kortikal  alveoli  telah  dibuktikan pada ikan salmon ( Oncorhynchus kisutch ) oleh Forsgren & Young (2012).
Konsentrasi  progesteron N.  rhodochorde menunjukkan  adanya  peningkatan  (Gambar  2) namun  hasil  analisis  ANOVA  menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan (P=0,47, F=0,85) antartahap perkembangan.
Hasil ini menunjukan  terdapat  dinamika  Progesteron pada tiga tahap perkembangan cacing nipah.
Gambar  2.  Konsentrasi  progesteron  rata-rata pada  tiga  tahap  perkembangan. Angka  pada  bagian  atas  batang yang  diikuti  oleh  huruf  yang  sama menunjukkan bahwa tidak berbeda signifikan  pada  taraf  kepercayaan 0,05%.
Peran  progesteron  penting  dalam  proses vitellogenesis yang disintesis dari sel-sel eleosit untuk  membentuk  protein  yolk  atau  vitellin (GarcÍa-alonso &
Rebscher,
2005).
Pembentukan  vitellin  pada  Nereididae  berasal dari  sel-sel  eleosit  pada  individu immature (Eckelbarger,  1983). Sel-sel  eleosit  akan semakin  berkurang  seiring  dengan  tingkat perkembangan,  namun  pada  penelitian  ini nampaknya  eleosit  masih  belum  sepenuhnya hilang  dari  selom,  sementara  eleosit  lainnya sudah  digunakan  dalam  pembentukan  vitellin, sehigga  konsentrasinya  tidak  berbeda  pada semua tahap perkembangan.
Hasil pengukuran testosteron disajikan pada Gambar 3. Pola fluktuasi hormon pada spesies ini  juga  mirip  dengan  progesteron  yang cenderung  meningkat  pada  individu mature namun  tidak  berbeda  signifikan  (P=0,44, F=0,95) antar tahap perkembangan.
0 0,2 0,4 Immature Submature Mature Ko n se n tras i Estrad io l
(n g m l -1 ) Tahapan perkembangan a,b a c
Gambar 3.  Konsentrasi testosteron rata-rata N. rhodochorde betina pada tiga tahap perkembangan. Angka pada bagian atas batang yang diikuti oleh huruf yang  sama  menunjukkan  bahwa tidak signifikan pada taraf kepercayaan 0,05%.
Konsentrasi testosteron juga dianalisis pada individu  jantan  yang  disajikan  disajikan  pada Gambar 4. Konsentrasi hormon ini pada jantan juga  lebih  tinggi  pada mature, namun  setelah dilakukan analisis
dengan
ANOVA
menunjukkan  tidak  ada  perbedaan  signifikan (P=0,41, F=0,68) pada tiga tahap perkembangan individu  atau  polanya  sama  seperti  pada  hasil testosteron betina.
Gambar  4.  Konsentrasi  testosteron  rata-rata individu  jantan  pada  tiga  tahap perkembangan. Angka pada bagian atas batang yang diikuti oleh huruf yang  sama  menunjukkan  bahwa tidak signifikan pada taraf kepercayaan 0,05%. Fluktuasi konsentrasi testosteron dan progesteron pada spesies cacing nipah memiliki pola yang sama yang berbeda dengan estradiol. Estradiol  ditemukan  cenderung  meningkat sesuai dengan tahap perkembangan, sedangkan progesteron  dan  testosteron  cenderung  sama. Pola  yang  sama  seperti  ini  telah  dilaporkan terjadi  pada  kerang Mya  arenaria, diduga
karena adanya peran progesteron pada gametogenesis (Siah et al ., 2002).
Hubungan  antara  konsentrasi  hormon reproduksi  dengan  perkembangan  oosit  dapat dinyatakan  bahwa  pada immature ditemukan konsentrasi estradiol, progesteron dan testosteron  rendah.    Pada submature juga ditemukan  konsentrasi  tiga  hormon  tersebut lebih  rendah  dari mature namun  tidak  berbeda signifikan.    Pada  saat mature ,  hanya  estradiol yang konsentrasinya tinggi dan berbeda dengan dua  hormon  lainnya  rendah.  Pada  individu jantan,  tahap  spermatosit  klaster  ( immature ) ditemukan  konsentrasi  testosteron  sedang, kemudian  rendah  pada  tahap  pembentukan spermatid  ( submature )  dan  tinggi  lagi  pada tahap  pembentukan  spermatozoa  ( mature ), namun  kondisinya  berfluktuasi  sehingga  hasil analisis  statistikanya  menunjukan  hasil  yang tidak  berbeda  pada  tiga  tahap  spermatogenesis tersebut.
Konsentrasi  hormon  pada  penelitian  ini berbeda dengan konsentrasi hormon reproduksi Nereididae umumnya. Pendekatan untuk mengetahui  hormon  sebelumnya  dilakukan secara  tidak  langsung  menggunakan  fungsi kontrol  negatif  dengan  mengukur  konsentrasi hormon  juvenil.  Konsentrasi  hormon  juvenil tinggi  saat immature dan akan semakin rendah jika  individu  telah mature (Andries,  2001), namun dari hasil penelitian ini dengan hormon- hormon  yang  diukur  pada  berbagai  tingkat perkembangan  tampak  terdapat  dinamikanya sehingga  hormon  reproduksi  akan  lebih  tepat dilakukan dengan mengukurnya secara langsung.
Penelitian  ini  tidak  memisahkan  gamet dengan  cairan  selom  untuk  analisis  sehingga konsentrasi  hormon-hormon  reproduksinya dapat  bertambah  banyak  saat  digabungkan dengan  oosit  yang  matang  karena  telah terbentuk vitellogenin dan kortikal alveoli yang sempurna  dalam  oosit.  Menurut  Forsgren  & Young  (2012),  testosteron  dan  progesteron berperan  dalam  proses  pembentukan  kortikal alveoli pada oosit matang. Pola fluktuasi ketiga hormon  ini  selama  tahap  perkembangan  juga masih  perlu  observasi  lebih  lanjut  terkait fluktuasinya saat proses Gametogenesis dengan memisahkan  sampel  gamet  dari  cairan  selom sehingga  dapat  dengan  tepat  diketahui  kaitan ketiga hormon reproduksi terhadap perkembangan  sel-sel  gamet.  Estrogen  lain seperti  estriol  dan  estron  yang  telah  diketahui reseptornya pada spesies Polychaeta lain (Keay
a a,b a,b,c 0 0,5 1 1,5 immature submature mature Ko n se n tras i T esto ste ro n
(n g m l -1 ) Tahap perkembangan a a,b a,b,c 0 0,5 1 1,5 immature submature mature Ko n se n tras i T esto ste ro n
(n g m l -1 ) Tahap perkembangan
&  Thornton,  2009)  perlu    juga  dipastikan keberadaan  dan  profilnya.  Konsep  multi hormon  yang  berperan  dalam  reproduksi  yang kemukakan  oleh  Lawrence  &  Soame  (2009) perlu juga dianalisis terkait dengan mekanisme kerja dengan hormon pertumbuhan cacing nipah ( N. rhodochorde ).

## KESIMPULAN
Konsentrasi  estradiol  ditemukan  mulai  tahap immature sampai mature dengan  konsentrasi terus  meningkat  seiring  tingkat  maturasi, sementara  untuk  Progesteron  dan  Testosteron konsentrasinya  ditemukan  tidak  berbeda  pada masing-masing tahap perkembangan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Kami  menyampaikan  ucapan  terima  kasih kepada  Ditjen  Dikti  yang  telah  membiayai penelitian ini melalui Skema Penelitian Produk Terapan Tahun 2015. Ucapan terima kasih juga sampaikan  kepada  teknisi,  laboran,  dan mahasiswa yang telah membantu sampling dan preparasi sampel.

## DAFTAR PUSTAKA
Álvarez-Campos  P,  Planques  A,  Bideau  L, Vervoort  M  &  Gazave  E.  2022.  On  the Hormonal Control of Posterior Regeneration in  the  Annelid Platynereis  dumerilii . BioRxiv . 01.21.4772 : 1-44. Andries JC. 2001. Endocrine and Environmental  Control  of  Reproduction  in Polychaeta.  In Canadian  Journal  of
Zoology . 79 (2): 254-270.
Durou C & Mouneyrac C. 2007. Linking Steroid Hormone  Levels  to  Sexual  Maturity  Index and Energy Reserves in Nereis diversicolor from Clean and Polluted Estuaries. General and  Comparative  Endocrinology , 150 (1): 106-113.
Eckelbarger.  1986.  Vitello  Genic  Mechanisms and the Allocation of Energy to Offspring in Polychaetes  Energy. Bulletin  of  Marine Science , 1 (2):165-198.
Eckelbarger.  2006.  Oogenesis.  In  Greg  W Rouse  &  F  Pleijel  (Ed.), Reproductive Biology and Phylogeny of Annelida . pp: 23- 44.
Eckelbarger K. 1983. Evolutionary Radiation in
Polychaete Ovaries and Vitellogenic
Mechanisms:  Their  Possible  Role  in  Life History  Patterns. Canadian  Journal  of Zoology . 61( 3):487-504. Forsgren KL & Young G. 2012. Stage-Specific
Effects  of  Androgens  and  Estradiol-17beta on  the  Development  of  Late  Primary  and Early Secondary Ovarian Follicles of Coho Salmon ( Oncorhynchus kisutch ) In Vitro 1. Biology of Reproduction . 87 (3):64-65.
GarcÍa-alonso J & Rebscher N. 2005. Estradiol
Signalling  in Nereis  virens Reproduction. Invertebrate Reproduction and Development , 48 (1-3): 95-100.
Glasby CJ, Miura T, Nishi  E & Junardi. 2007.
A New Species of Namalycastis
(Polychaeta:  Nereididae:  Namanereidinae) from  the  shores  of  South-east  Asia. The Beagle:  Records  of  the  Museums  and  Art Galleries  of  the  Northern  Territory . 23: 21- 27.
Junardi,  Setyawati  TR  &  Yuwono  E.  2010.
Gametogenesis  of  Nypha  Palm  Worm Namalycastis  rhodochorde (Polychaeta:
Nereididae). Jurnal  ILMU  DASAR . 11 (1): 39-44.
Keay  J  &  Thornton  JW.  2009.  Hormone- Activated  Estrogen  Receptors  in  Annelid Invertebrates:  Implications  for  Evolution and  Endocrine  Disruption. Endocrinology. 150 (4): 1731-1738.
Lawrence  AJ  &  Soame  JM.  2009.  The Endocrine  Control  of  Reproduction  in Nereidae:  A  New  Multi-hormonal  Model with Implications for Their Functional Role in A Changing Environment. Philosophical Transactions  of  the  Royal  Society  B: Biological Sciences. 364 (1534): 3363–3376. Meunpol  O,  Iam-Pai  S,  Suthikrai  W  &
Piyatiratitivorakul S. 2007. Identification of Progesterone and 17α-Hydroxyprogesterone in  Polychaetes  ( Perinereis sp.)  and  The Effects  of  Hormone  Extracts  on  Penaeid Oocyte Development in Vitro. Aquaculture . 270 (1-4): 485-492.
Mouneyrac C, Pellerin J, Moukrim A, Ait Alla A,  Durou  C  &  Viault  N.  2006.  In  Situ Relationship Between Energy Reserves and
Steroid Hormone Levels in Nereis diversicolor (O.F.  Müller)  From  Clean  and Contaminated  Sites. Ecotoxicology  and Environmental Safety . 65 (2): 181-187.
Rouse  GW.  2006.  Annelid  Sperm  and Spermiogenesis.  In  G.  W.  R. and  F.  Pleijel (Ed.), Reproductive Biology and Phylogeny of Annelida . 45-76.
Schenk  S,  Krauditsch  C,  Frühauf  P,  Gerner  C,
& Raible F. 2016. Discovery of Methylfarnesoate  as  The  Annelid  Brain Hormone  Reveals  an  Ancient  Role  of
Sesquiterpenoids  in  Reproduction. ELife , 5 :1-23.
Siah  A,  Pellerin  J,  Benosman  A,  Gagné  JP  &
Amiard JC. 2002. Seasonal Gonad Progesterone Pattern in The Soft-shell Clam Mya  arenaria . Comparative  Biochemistry and  Physiology  -  A  Molecular  and Integrative Physiology . 132 (2):499-511.