Menara Perkebunan 2023, 91(1), 59 – 71
http://dx.doi.org/10.22302/iribb.jur.mp.v91i1.523
p-ISSN: 0125-9318/ e-ISSN: 1858-3768 Accreditation Number: 164/E/KPT/2021
Pemodelan protein dan analisis molecular docking enzim β-glukanase solat

## Bacillus subtilis W3.15
Protein modeling and molecular docking analysis of β-glucanase enzyme isolate of Bacillus subtilis W3.15
Ainia HANIFITRI 1) , Laksmi AMBARSARI 2*) & Nisa Rachmania MUBARIK 3)
1) Prodi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana IPB University, Bogor, 16680, Indonesia
2) Departemen Biokimia, FMIPA, IPB University, Bogor, 16680, Indonesia
3) Departemen Biologi, FMIPA, IPB University, Bogor, 16680, Indonesia
Diterima tgl 9 Jan 2023 / Perbaikan tgl 30 Jan 2023 / Disetujui tgl 23 Apr 2023

## Abstract
The β-glucanase enzyme is an enzyme protein that can hydrolyze β-glucan, one of the main components of  the  fungal  cell  wall.  This  enzyme  protein  is produced  by  several  bacteria,  one  of  which  is B. subtilis .  The  three-dimensional  (3D)  structure  of proteins  is  necessary  to  understand  their  properties and  functions  of  proteins.  Enzyme  proteins  can  be analyzed  for  their  structure  and  function  using  in silico  method.  This  study  aims  to  detect  the  β- glucanase gene from B. subtilis W3.15 and analyze it using  the  in  silico  method.  The  methods  in  this research  are  homology  modeling  and  molecular docking analyses. Modeling was carried out using the SWISS-MODEL server and docking analysis using the PLANTS  1.1  program.  Modeling  the  β-glucanase enzyme  is  based  on  the  template  of  the  β-glucanase enzyme  protein  model  with  PDB  code  3o5s.  The results of sequence alignment and model visualization were quite good as indicated by the model having a Ramachandran  Plot value  in  the  favored  area  of 91.10 %, a MolProbity score of 0.95, and a QMEAN value of 0.90 ± 0.06. The β-glucanase enzyme model was then docked using the PLANTS1.1 program with native ligand B3P, 1,4-β-D-Glucan, D-glucose, β-D- Glucan  from  oats,  and  N-Acetyl  glucosamine.  The results of docking analysis showed that the β-glucan ligand (β-D-glucan from oats) used as a substrate in the cultivation of isolate B. subtilis W3.15 had a better binding energy prediction value compared to the B3P ligand,  which  is  a  natural  ligand  in  the  template proteins.
[Keywords: β-Glucan, β-D-Glucan from oat, ligand, PLANTS  1.1,  3D  structure,  SWISS- MODEL]

## Abstrak
Enzim β-glukanase merupakan protein enzim yang dapat menghidrolisis β-glukan, salah satu komponen utama penyusun dinding sel jamur. Protein enzim ini dihasilkan oleh beberapa bakteri salah satunya adalah B.  subtilis .  Struktur  tiga  dimensi  (3D)  protein diperlukan untuk memahami sifat dan fungsi protein. Protein enzim dapat dianalisis struktur dan fungsinya menggunakan  metode in  silico . Penelitian  ini bertujuan  untuk  mendeteksi  gen  β-glukanase  dari B. subtilis W3.15  dan  menganalisisnya  menggunakan metode in  silico menggunakan homology  modelling dan analisis molecular docking . Pemodelan dilakukan dengan server SWISS-MODEL dan analisis docking menggunakan  program  PLANTS  1.1.  Pemodelan enzim  β-glukanase  berdasarkan  templat  dari  model protein  enzim  β-glukanase  dengan  kode  PDB  3o5s. Hasil  pensejajaran  sekuens  dan  visualisasi  model cukup baik yang ditunjukkan dengan model memiliki nilai Ramachandran  Plot pada  daerah favoured sebesar  91,10  %,  skor MolProbity sebesar  0,95  dan nilai QMEAN 0,90 ± 0,06. Model enzim β-glukanase kemudian di- docking menggunakan program PLANTS1.1 dengan ligan native ligand B3P , 1,4-β-D- Glucan, D-glucose, β-D-Glucan dari oat , dan N-Acetil glucosamine .  Hasil  analisis docking menunjukkan bahwa  ligan  β-glukan  (β-D-glukan  dari  oat)  yang digunakan  sebagai  substrat  dalam  kultivasi  isolat B. subtilis W3.15 memiliki nilai prediksi energi ikat yang lebih  baik  dibandingkan  dengan  ligan  B3P,  yang merupakan ligan alami dalam protein templat.
[Kata  kunci : β-Glucan,  β-D-Glucan dari  oat , ligan, PLANTS  1.1,  struktur  3D,  SWISS- MODEL]
This is an open access article under the CC BY license ( https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ )
Menara Perkebunan is DOAJ indexed Journal and accredited as Sinta 2 Journal ( https://sinta.kemdikbud.go.id/journals/profile/3125 )
How to Cite: Hanifitri, A., Ambarsari, L., & Mubarik, N. R.. (2023). Pemodelan protein dan analisis molecular docking enzim β-glukanase isolat Bacillus subtilis W3.15. Menara Perkebunan, 91 (1), 59 – 71. http://dx.doi.org/10.22302/iribb.jur.mp.v91i1.523
*) Korespondensi penulis: laksmi@apps.ipb.ac.id
Pemodelan protein dan analisis molecular docking enzim β-glukanase isolat Bacillus subtilis………. …… …….......(Hanifitri et al.)

## Pendahuluan
Bakteri  memiliki  berbagai  manfaat  yang  sangat menguntungkan bagi kehidupan manusia di berbagai sektor,  termasuk  sektor  pertanian.  Metabolit  yang dihasilkan oleh bakteri, baik metabolit primer maupun sekunder  dapat  dimanfaatkan  sesuai  kebutuhan  pada sektor  pertanian,  baik  sebagai  pembasmi  hama ataupun  penambah  nutrisi  bagi  komoditas  tanaman tertentu.  Salah  satu  contoh  bakteri  yang  dapat dimanfaatkan  adalah  bakteri  penghasil  enzim  β- glukanase. Enzim β-glukanase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis β-glukan yang merupakan salah satu  komponen  utama  penyusun  dinding  sel cendawan. Enzim β-glukanase bekerja pada ikatan β- glikosidik  dalam  struktur  β-glukan.  Penggolongan enzim ini pun cukup beragam tergantung pada ikatan glikosidik  yang  dihidrolisisnya.  β-glukanase  yang menghidrolisis  ikatan  β-1,3  dikenal  sebagai laminarinase  (EC  3.2.1.39)  (Qin  et  al. , 2017), sedangkan  yang  menghidrolisis  ikatan  β-1,4  lebih dikenal  sebagai  selulase  (EC  3.2.1.4)  (Ejaz  et  al. , 2021).
Enzim β-glukanase dalam bidang industri berperan dalam  proses  degradasi  glukan  untuk  meningkatkan kualitas dan mutu pakan ternak, pendegradasi limbah industri pulp dan kertas hingga biopolimer dan tekstil (Munyaka et al., 2016; Wang et al., 2017; Sharma et al.,  2022).  Selain  itu,  enzim  ini  juga  berpotensi melisiskan  dinding  sel  cendawan  yang  merupakan salah satu patogen bagi tanaman, sehingga fungsi dari enzim  β-glukanase  dapat  dimanfaatkan  sebagai pembasmi  cendawan  fitopatogenik  seperti Fusarium oxysporum (Khan  et  al . ,  2018).  Beberapa  laporan tentang  pengendalian  hayati  terhadap  layu  fusarium pada  tanaman  tomat  mengungkapkan  beberapa  jenis bakteri,  terutama  bakteri  tanah  cukup  efektif  dalam pengendalian  hama F.  oxysporum dan  aktivitasnya telah  diuji  dalam  percobaan  di  rumah  kaca  dan percobaan lapangan skala kecil (Elanchezhiyan et al., 2018). Hasil penelitian Yu et al . (2019) menunjukkan bahwa enzim β-glukanase Paenibacillus terrae dapat melindungi  tanaman  padi  terhadap  serangan cendawan Magnaporthe  oryzae .  Dewi  et  al. (2016) melaporkan bahwa β-glukanase yang diproduksi oleh B.  subtilis memiliki  daya  hambat  kuat  terhadap cendawan Curvularia  affinis dan Colletotrichum gleosporioides . Hasil penelitian Suryadi et al . (2013) menunjukkan produksi β-glukanase oleh B. cereus, B. firmus,  Pseudomonas  aeruginosa, dan Serratia marcescens dapat menghambat pertumbuhan cendawan Rhizoctonia  solani penyebab  penyakit pelepah daun pada tanaman padi .
Selain komoditas pangan dan hortikultura, terdapat pula  komoditas  perkebunan  yaitu  kakao  yang  dapat diserang oleh cendawan patogen. Patogen yang domi-
nan  menyerang  tanaman  kakao  yaitu Phytophthora palmivora penyebab busuk buah kakao. Penyakit ini merupakan  salah  satu  penyakit  penting  kakao  dan dapat  menyebabkan  kehilangan  hasil  hingga  90  % pada  musim  hujan  terutama  pada  lahan  dengan populasi  semut  yang  tinggi  (Hakkar  et  al.,  2014). Komoditas perkebunan lain yang dapat diserang oleh cendawan  patogen  yaitu  tanaman  karet  dan  teh. Cendawan  patogen  yang  umum  menyerang  kedua tanaman itu adalah cendawan Ganoderma philippii yang  menyebabkan penyakit akar  merah. Berdasarkan penelitian dilakukan oleh Budiarti et al. (2011),  Kombinasi  β-1,3-glukanase  dan  kitinase T. harzianum (Sigma)  menunjukkan  adanya  lisis  pada hifa G. philippii .
Enzim  merupakan  salah  satu  jenis  protein  yang dapat  dianalisis  sifat  dan  fungsinya  secara  biokimia molekuler.  Sifat  dan  fungsi  protein  tersebut  dapat dianalisis jika protein tersebut memiliki struktur tiga dimensi  (3D).  Penentuan  struktur  3D  protein  dapat dilakukan dengan menggunakan peralatan laboratorium,  antara  lain  Difraksi  Sinar-X, Nuclear Magmetic  Resonance dan  mikroskop  elektron (Komari et al , 2020). Tiga cara tersebut membutuhkan waktu yang cukup lama dan memerlukan biaya sangat besar untuk penentuan satu struktur protein, sehingga diperlukan penentuan struktur 3D protein yang lebih mudah dan murah yaitu dengan cara in silico (Wijaya et al., 2016).
Metode  pemodelan  struktur  3D  protein  secara in silico terdiri atas 3 metode, yaitu homology modelling, fold  recognition, dan ab  initio (Saudale,  2020). Metode  pemodelan  protein  yang  banyak  digunakan adalah homology modelling , hal ini karena metode ini secara  komputasi  lebih  mudah  dan  lebih  cepat dibandingkan  dua  metode  lainnya.  Metode  ini  juga cukup  baik  dalam  memprediksi  struktur  3  dimensi suatu protein, karena pembuatannya berdasarkan pada pensejajaran  sekuens  asam  amino  protein  target dengan  protein  lain  sebagai  templat  yang  telah diketahui struktur 3D-nya secara instrumentasi.
Studi in  silico selanjutnya  setelah  pemodelan adalah  analisis  penambatan  molekuler  ( docking analysis ). Enzim β-glukanase pada dasarnya memiliki substrat  yaitu  senyawa  karbohidrat  yang  bernama  β- glukan.  Metode  penambatan  molekuler  digunakan untuk  menganalisis  orientasi  ikatan  molekul  ligan (substrat  enzim)  dan  reseptor  (enzim  β-glukanase) secara  spesifik  dengan  mengukur  nilai  afinitasnya (Tumilaar et al., 2021). Penambatan molekuler bekerja dengan algoritma pencarian dimana konformasi ligan dievaluasi secara rekursif hingga tercapai nilai energi minimum.  Pendekatan  molekuler  yang  dapat dilakukan dalam percobaan penambatan ada dua, yaitu rigid body approach yang mana ligan dan reseptor di-
Menara Perkebunan 2023, 91(1), 59 – 71
asumsikan saling mengenal, dan flexible docking yang mempertimbangkan kemungkinan pengenalan konformasi ligan dan reseptor (Prieto-Martinez et al., 2018).
Struktur protein, struktur ligan, dan fungsi scoring yang  diberikan  bertujuan  untuk  menemukan konformasi  ligan  yang  memiliki  energi  rendah  pada sisi  ikatan  protein  yang  berhubungan  dengan  fungsi scoring minimum  secara  umum.  Analisis docking yang  dilakukan  pada  penelitian  ini  adalah menggunakan program PLANTS. Program PLANTS memiliki  algoritma docking berdasarkan  kelas algoritma  optimisasi  stokastik  yang  dinamakan Ant Colony  Optimization (ACO).  ACO  diinisiasi berdasarkan  perilaku  semut  yang  menemukan  jalan terpendek antara sarang dan sumber makanan. Semut menggunakan komunikasi tidak langsung yaitu dalam bentuk  feromon  yang  menandai  jalan  antara  sarang dan sumber makanan. Pada kasus docking senyawa- protein,  “koloni  semut”  diperintahkan  untuk menemukan  konformasi  senyawa  yang  memberikan energi  terendah  pada  sisi  ikatan  protein  (PLANTS) (Korb, 2009).
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  memprediksi struktur  tiga  dimensi  protein  enzim  β-glukanase B. subtilis W3.15 secara in silico menggunakan SWISS- MODEL,  yang  kemudian  dilanjutkan  dengan menganalisis  afinitas  interaksi  ligan-reseptor  dengan metode docking .  Informasi  yang  didapatkan  dari penelitian  ini  diharapkan  dapat  memperluas  kajian molekuler  mengenai  struktur  protein  enzim  β- glukanase B. subtilis W3.15 serta memberikan dasar untuk  mempelajari  mekanisme  interaksi  antar  enzim β-glukanase  dan  substratnya  dalam  pengendalian penyakit layu pada tanaman akibat jamur patogen.

## Bahan dan Metode

## Peremajaan isolat bakteri
Isolat bakteri B. subtilis W3.15 dan B. velezensis yang diperoleh dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi,  Departemen  Biologi,  FMIPA,  IPB University  ditumbuhkan  pada  medium nutrient  agar (NA) yang mengandung 1 % β-glukan selama 24 jam pada suhu 28 °C dan disimpan pada suhu 4 °C.

## Deteksi gen β-glukanase dan sekuensing
Keberadaan  gen  penyandi  β-glukanase  dalam genom  isolat  bakteri  W3.15  dideteksi  berdasarkan metode  Hegazy  et  al . (2018).  Amplifikasi  gen penyandi  β-glukanase  dilakukan  pada  mesin  PCR ( Applied Biosystem 2720 Thermal Cycler, USA), yang di program untuk satu siklus pertama (pre-denaturasi) pada suhu 95 °C selama dua menit, kemudian siklus selanjutnya  dilakukan  dengan  ketentuan  sebagai
berikut: denaturasi pada suhu 95 °C selama satu menit, penempelan  primer  pada  suhu  52  °C  selama  satu menit,  pemanjangan  pada  suhu  72  °C  selama  satu menit dan pasca pemanjangan pada suhu 72 °C selama lima  menit  kemudian  campuran  reaksi  disimpan sementara  pada  suhu  4  °C.  Primer  yang  digunakan dalam  deteksi  gen  β-glukanase  pada  isolat  bakteri terpilih  adalah  primer reverse (5’-ATT  GCA  GCA GGC TCT TTC AC-3’) dan primer forward (5’-AAT GAA AGG GGA ATG CCA AT-3’) (Hegazy et al., 2018). Setelah proses amplifikasi gen bgls pada mesin PCR telah selesai, sebanyak 10 µL amplikon gen bgls dimigrasikan  pada  gel  agarosa  1  %  (b/v)  yang  telah ditambahkan 3 µL pewarna DNA peqgreen (PeqLab, Jerman) dengan cara elektroforesis pada tegangan 70 Volt  selama  35  menit.  Hasil  migrasi  fragmen  DNA dari elektroforesis lalu divisualisasi di bawah sinar UV dalam  mesin gel-doc .  Keberadaan  pita  DNA berukuran  ±  800  bp  yang  berada  pada  daerah  pita sekitar  750  –  1.000  bp  dari  marker  DNA  1  kb menunjukkan  hasil  positif  untuk  keberadaan  gen penyandi β-glukanase pada isolat bakteri W3.15. Hasil amplifikasi  gen bgls tersebut  kemudian  dilakukan sekuensing  melalui  jasa  sekuensing  dengan menggunakan  primer  gen bgls berdasarkan  referensi dari Hegazy et al. (2018), yaitu reverse (5’-ATT GCA GCA GGC TCT TTC AC-3’) dan primer forward (5’- AAT GAA AGG GGA ATG CCA AT-3’).

## Pemodelan protein enzim β-glukanase
Pemodelan  protein  mengikuti  langkah-langkah pada  server  SWISS-MODEL  (Waterhouse  et  al ., 2018).  Tahapan  pemodelan  adalah:  penentuan sekuens  target  protein,  identifikasi  protein  templat, pembuatan  model,  dan  evaluasi  model.  Identifikasi protein templat dilakukan pada server swissmodel.expasy.org/interactive.  Data  sekuens DNA yang diperoleh dari hasil sekuensing, kemudian diterjemahkan ke dalam sekuens asam amino dengan bantuan  BioEdit.  Kemudian,  target  protein  dalam format  FASTA  dikirimkan  pada  server  SWISS- MODEL  tersebut.  Proses  identifikasi  templat  akan menghasilkan  beberapa  protein  templat  dengan parameternya.  Protein  templat  dipilih  sesuai  dengan parameter identity , QMEAN, dan QSQE.
Pembuatan  model  protein  dilakukan  dengan  cara memilih protein templat yang dihasilkan pada server swissmodel.expasy.org/interactive/RGPEKv/template s/.  Pilihan  satu  protein  templat  umumnya menghasilkan  satu  atau  lebih  model.  Model  yang dihasilkan dipilih sesuai parameter GMQE, QMEAN, Oligo State, Ligands, dan Similarity . Evaluasi model dilakukan  dengan  menggunakan  fitur  “ Structure Assessment ”.  Evaluasi  dilakukan  pada  parameter antara lain: Ramachandran Plot, Mol Probity Results,
Pemodelan protein dan analisis molecular docking enzim β-glukanase isolat Bacillus subtilis………. … ……........(Hanifitri et al.)
Quality  Estimate, dan Residu  Quality. Pensejajaran sekuens  protein  model  menggunakan Pairwise Sequence Alignment pada server
https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ .  Visualisasi  protein model dilakukan dengan program BIOVIA Discovery Studio 2021 (Dassault, 2015).

## Persiapan struktur reseptor dan ligan
Tahap  awal  untuk  melakukan  simulasi docking adalah menentukan reseptor dan ligan yang akan diuji. Reseptor  yang  digunakan  berupa  enzim  β-glukanase yag  telah  diperoleh  dari  pemodelan  protein sebelumnya yang kemudian dipreparasi menggunakan program YASARA (Land et al., 2018). Struktur ligan dapat  diperoleh  dengan  mencari  di  database  pada server  PubChem  (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pccompound) kemudian dipreparasi dengan menggunakan MarvinSketch (ChemAxon,  Ltd https://chemaxon.com).
Simulasi docking dan evaluasi hasil docking
Docking dilakukan dengan menggunakan program PLANTS1.1  yaitu  dengan  mengetik  perintah  pada lembar  kerja  cmd,  program  PLANTS1.1  akan membaca  protokol plantsconfig yang  telah  di  set sebelumnya  hingga  diperoleh  nilai best  score dari ligan  senyawa  pembanding  yang  nantinya  akan dibandingkan  dengan  nilai best  score dari  ligan senyawa  uji.  Langkah  selanjutnya  adalah  membuat file hasil docking dari masing-masing ligan senyawa uji dengan program YASARA (tipe file .pdb) (Korb, 2009). File hasil docking inilah yang akan divisualisasi dan  diinterpretasi  untuk  diketahui  interaksi-interaksi yang terjadi menggunakan aplikasi Discovery Studio .

## Hasil dan Pembahasan
Identifikasi  gen  β-glukanase  dari  isolat B.  subtilis W3.15
Produksi  enzim  glukanase  pada  isolat  W3.15 didasarkan  pada  deteksi  gen bgls terhadap  genom isolat bakteri tersebut. Pita untuk amplikon gen bgls berhasil  dideteksi  dengan  elektroforesis  gel  agarosa yang berada pada ukuran yang sesuai dengan literatur primer.  Hasil  ini  telah  sesuai  dengan  laporan sebelumnya  bahwa  ukuran  pita  gen bgls dengan primer bgl F-R  (Loni  et  al., 2014)  sekitar  777  bp (Hegazy et al., 2018). Ukuran pita untuk gen bgls dari isolat W3.15 juga ternyata tidak jauh berbeda dengan yang didapatkan oleh penelitian lainnya yakni sekitar 729  bp  dengan  primer BglsfosD9 (Gonçalves  et  al., 2020).
Amplifikasi  gen bgls pada  genom  hasil  isolasi dilakukan  untuk  mengklarifikasi  keberadaan  gen tersebut pada genom isolate W3.15. Hasil visualisasi gel elektroforesis terhadap hasil PCR untuk gen bgls diperoleh  ukuran  pita  amplikon  sekitar  ±770  bp merujuk pada marker 1 kb yang digunakan (Gambar 1).  Isolat  kontrol  positif B.  velezensis BT2.04 menunjukkan adanya pita pada suhu annealing 50 °C, yakni  pita  pada  ukuran  ±  770  bp  (Gambar  1).  Hasil visualisasi  dari  amplikon  gen bgls tersebut menunjukkan  bahwa  kemungkinan  besar  benar adanya  ekspresi  dan  produksi  enzim  glukanase  pada isolat  W3.15.  Setelah  dilakukan  amplifikasi, kemudian  amplikon  yang  telah  diperoleh  di sekuensing  dan  menghasilkan  sekuens  yang  akan digunakan untuk modelling protein dan menganalisis interaksi  molekulernya  terhadap  substrat  dengan metode komputasi menggunakan program
PLANTS1.1.
Gambar 1.  Visualisasi hasil amplifikasi gen bgls pada gel agarose 1%.  Keterangan: marker 1 kb (M), isolat B. subtilis W3.15 (1 dan 2) dan kontrol positif β-glukanase B. velezensis BT2.04 (3)
Figure 1.  Visualization of bgls gene amplification results on 1% agarose gel. Notes: marker 1 kb (M), B. subtilis W3.15 (1 and 2) and positive control β-glucanase B. velezensis BT2.04 (3)
Menara Perkebunan 2023, 91(1), 59 – 71
Gambar 2. Urutan asam amino enzim β-glukanase B. subtilis W3.15 Figure 2.  The amino acid sequence of the β-glucanase enzyme B. subtilis W3.15
Gambar 3.   Hasil  prediksi  struktur  3D  enzim  β-glukanase B.  subtilis W3.15,  (a)  struktur  3D,  (b)  interaksi  enzim dengan senyawa Ca 2+
Figure 3.  Prediction results of the 3D structure of the β-glucanase B. subtilis W3.15 enzyme, (a) 3D structure, (b) enzyme interaction with Ca 2+

## Pemodelan protein enzim β-glukanase
Pemodelan  struktur  protein  pada  penelitian  ini menggunakan  metode homology  modeling .  Protein target, yaitu protein enzim β-glukanase isolat bakteri B.  subtilis W3.15  dipreparasi  dengan  bantuan perangkat  lunak  BioEdit  sehingga  diperoleh  format file FASTA (Gambar 2). Urutan asam amino tersebut lalu  digunakan  dalam  pencarian  dan  identifikasi templat dengan dibantu web server SWISS-MODEL.
Prediksi  struktur  3D  model  enzim  β-glukanase dengan  menggunakan  Swiss-Model  menghasilkan model  dengan  sisi  aktif  enzim  yang  mempunyai  ion kalsium  (Ca 2+ )  (Gambar  3b).  Pembuatan  model tersebut  tidak  terlepas  dari  peran  SMTL  sebagai penyedia  templat  yang  representatif  sehingga memungkinkan pembangunan struktur protein model yang lengkap dan akurat menyerupai templat aslinya (Gambar 3a).
Model  enzim  β-glukanase  yang  telah  dibuat kemudian  dievaluasi  sifat  stereokimia  dan  sifat ruangnya. Evaluasi sifat stereokimia model dilakukan dengan  menggunakan  web  server  PROCHECK dengan  menganalisis  plot  Ramachandran.  Plot Ramachandran digunakan sebagai parameter analisis
karena  plot  ini  menggambarkan  residu  asam  amino pada struktur enzim secara dua dimensi, dengan sudut φ (phi) sebagai sumbu x dan ψ (psi) sebagai sumbu y yang  dibagi  dalam  empat  kuadran  atau  daerah (Laskowski  et  al.,  1993).  Keempat  daerah  tersebut adalah most  favoured  regions,  additional  allowed regions, generously allowed regions, dan disallowed regions . Penilaian berdasarkan plot ini dengan melihat presentase dari residu asam amino yang berada pada wilayah yang sangat disukai ( most favoured regions ) dan daerah yang tidak diizinkan ( disallowed regions ). Pada penelitian ini, menunjukkan bahwa model enzim β-glukanase B.  subtilis W3.15  memiliki  nilai  plot Ramachandran 91,1 % pada daerah most favoured dan nilai  0,6  %  pada  daerah disallowed .  Hal  ini menunjukkan bahwa model ini baik karena memiliki jumlah  nilai  plot  residu  pada  daerah most  favoured lebih dari 90 %. Sudut φ (phi) sudut ψ (psi) pada plot ini  merupakan  deskripsi  komplit  secara  virtual  dari konformasi backbone plot  Ramachandran  dua dimensi,  sehingga  kombinasi  dari  kedua  sumbu tersebut dapat dijadikan dasar dalam menilai kualitas stereokimia  suatu  model  protein  atau  enzim (Laskowski et al., 1993).
Ca 2+ (a) (b)
Pemodelan protein dan analisis molecular docking enzim β-Glukanase isolat Bacillus subtilis………. … …….......(Hanifitri et al.)
Penilaian menggunakan Verify3D didasarkan pada persen residu skor rata-rata residu 3D-1D ≥ 0,2 yang dimiliki  model.  Suatu  model  dikatakan  memiliki kualitas yang baik apabila nilai persentase residu asam amino  dari  penilaian  Verify3D  untuk  rata-rata  skor residu 3D-1D ≥ 0,2 berada di atas 80 %, yaitu sebesar 99,53 % (Tabel 1). Hasil ini menggambarkan bahwa kompatibilitas  sekuens  dengan  struktur  tiga dimensinya mendekati nilai yang cukup baik. Prediksi model β-glukanase B. subtilis W3.15 pada penelitian ini  menghasilkan  model  yang  cukup  representatif berdasarkan  data  evaluasi  prediksi  model  enzim  β- glukanase  dari  SWISS-MODEL  dengan  pendekatan homology modelling . Skor Molprobity merupakan kombinasi dari clash score ,  presentase Ramachandran  outliers dan persentase rotamer (rantai samping) yang buruk atau lebih  dikenal  dengan poor  rotamer atau rotamer outlier . Clash  score merupakan  nilai  yang  diperoleh dari jumlah tumbukan per 1.000 atom. Penelitian ini memiliki nilai clash score 0,00 dimana nilai ini sesuai dengan  kriteria  nilai clash  score yang  baik  yaitu
memiliki  nilai  <0,45  Å  (Chen  et  al.,  2010).  Kriteria selanjutnya yang dievaluasi pada penelitian ini adalah dengan melihat nilai QMEAN (Struder et al., 2020). Nilai  QMEAN  yang  baik  adalah  berada  di  kisaran nilai 0, sedangkan nilai QMEAN yang kurang dari -4 adalah buruk (Seprianto, 2018). Nilai QMEAN pada penelitian ini berkisar 0,90 (Tabel 4) dan memenuhi syarat sebagai model yang baik. Prediksi model enzim β-glukanase B.  subtilis W3.15  pada  penelitian  ini menghasilkan  model  yang  cukup  representatif berdasarkan  data  evaluasi  prediksi  model  enzim  β- glukanase  dari  SWISS-MODEL  dengan  pendekatan homology modelling .
Hasil docking enzim β-glukanase
Ligan  uji  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini terdiri atas lima ligan yang merupakan senyawa atau molekul  pembentuk  dinding  sel  jamur  patogen  dan ligan  bawaan  dari  struktur  enzim  yang  telah dikristalkan.  Ligan  uji  dan  pembanding  dipreparasi terlebih dahulu dengan menambahkan atom hidrogen.
Gambar 4.   Plot Ramachandran Figure 4.    Ramachandran plot
Tabel 1.   Hasil evaluasi model enzim β-glukanase B. subtilis W3.15 Table 1.   Results of the evaluation of the β-glucanase B. subtilis enzyme model W3.15
Model Model Plot Ramachandran Ramachandran plot 3D-1D ≥ 0,2 QMEAN Nilai Drug Drug Score Nilai MolProbity MolProbity score Nilai Clash Clash score Disukai Favoured Tidak diizinkan Disallowed Enzim β-glukanase 91,1% 0,6% 99,53% 0,9 ± 0,06 0,81 0,95 0,00

## Menara Perkebunan 2023, 91(1), 59 – 71
Penambatan  molekul  dilakukan  dengan  metode targeted  docking yaitu  penambatan  molekul  yang dilakukan  pada  sisi  aktif  dan  ukuran gridbox yang telah  ditentukan  secara  spesifik  (Tambunan  et  al., 2011).  Penentuan  sisi  aktif  dan gridbox tersebut berdasarkan  metode  validitas docking melalui penambatan  kembali  ( redocking )  reseptor  dan  ligan alaminya  sebanyak  10  kali.  Validasi  metode penambatan dikatakan berhasil jika nilai RMSD ( Root
Mean  Square  Deviation )  kurang  dari  2  Å.  RMSD
( Root Mean Square Deviation ) merupakan pengukuran  kuantitatif  yang  menyatakan  kesamaan koordinat  dua  molekul  yang  tumpang  tindih,  antara ligan  alami  dengan  ligan  alami  hasil redocking . Semakin  rendah  nilai  RMSD  yang  dihasilkan,  maka ligan  hasil redocking memiliki  posisi  yang  semakin mendekati hasil kristalografi (Lopez-Comacho et al., 2019).

## Tabel 2.  Senyawa ligan pada uji penambatan molekul enzim β-glukanase
Table 2.  Ligand compounds in the molecular docking of the β-glucanase enzyme
Nama Ligan Ligand name Massa atom relatif (Da) Relative atomic mass (Da) Donor ikatan hidrogen Hydrogen bonds donors Akseptor ikatan hidrogen Hydrogen bonds acceptors Struktur 3D 3D structure Native ligand B3P 312.000 5 6 1,4-β-D-Glukan 536.000 13 18 D-glukosa 180.000 5 6 β-D-Glukan oat 472.000 0 16 N-Asetil glukosamin 221.210 5 7
Gambar 4.  Hasil validasi metode penambatan molekul ligan, ligan awal (merah) dan ligan hasil penambatan ulang (kuning). RMSD = 1,6025 Å
Figure 4.  Results of validation of the ligand molecule docking method, the initial ligand (red) and the ligand re- docking result (yellow). RMSD = 1.6025 Å
Pemodelan protein dan analisis molecular docking enzim β-glukanase isolat Bacillus subtilis………. … ……........(Hanifitri et al.)
Tabel 3.  Hasil docking senyawa ligan uji dengan model enzim β-glukanase B. subtilis W3.15 Table 3.  The result of docking ligand tests with the β-glucanase enzyme from B. subtilis W3.15
Ligan Ligand Skor PLANTSCHEMPLP (kkal/mol) Score of PLANTSCHEMPLP (kkal/mol) Residu asam amino Amino acid residue Jenis ikatan Bonding type Jarak ikatan (Å) Bonding distance (Å) Native ligand B3P -89,82 GLU159 GLU133 GLU137 ASP135 TYR151 TRP212 Hidrogen 2,05 1,98 1,88 1,97 2,56 1,92 1,4-β-D-Glucan -81,83 GLY154 GLU137 GLN147 GLU159
ASN149
ASN157 GLY156 Hidrogen 1,51 2,14 2,11 1,65 2,03 1,97 2,09 TYR151 Hifrofobik 1,25 D-glucose -59,36 GLU137 GLU133 ASP135 Hidrogen 2,10 1,95 2,68 TYR151 Hidrofobik 0,78 β-D-Glucan from oats -97,85 GLU133 GLU137 ASN149 GLN147 GLU159 TRP 220 ASN56 Hidrogen 5,21
5,23 4,32 5,27 4,91 3,45 4,29 N-Acetil glucosamine -71,04 ASN54 ASN210 SER118 TRP212 GLU133 Hidrogen 5,28 4,92 4,25 4,94 4,84
Hasil docking yang  dilakukan  menggunakan program  PLANTS1.1  diurutkan  berdasarkan  fungsi scoring , yaitu suatu metode penilaian kualitas ikatan ligan  dan  reseptor  berdasarkan  fungsi  perhitungan energi  ikat  antara  ligan  dan  reseptor  (Tabel  3). Komponen  yang  berperan  dalam  perhitungan  akhir energi bebas ikatan ialah nilai ΔG Gaussian , nilai ΔG dari  energi  repulsion,  nilai  ΔG  dari  ikatan  hidrogen, nilai ΔG dari interaksi hidrofobik, dan nilai ΔG dari rotating  bond  number  effect .  Dengan  demikian, semakin  banyak  nilai  energi  ikat  yang  berkontribusi terhadap efek ini, maka akan semakin negatif energi ikatnya.
Hasil docking yang diperoleh pada percobaan ini terlihat  pada  Tabel  3.  Terlihat  model  protein  yang diperoleh  setelah  dilakukan  proses docking menggunakan program PLANTS1.1 memiliki energi
ikat yang cukup baik. Hasil penambatan molekul pada 5  ligan  ( native  ligand B3P ,  1,4-  β-D-Glucan,  D- glucose,  β-D-Glucan dari  oat , dan N-Acetil glucosamine ) menunjukkan bahwa ligan β-D-Glucan dari oat memiliki skor PLANTS CHEMPLP paling rendah (Tabel 3), sehingga menunjukkan ikatan yang paling stabil dengan enzim β-glukanase.
Enzim  β-glukanase  yang  telah  di- docking , memberikan  hasil  dimana  enzim  tersebut  mengikat ligan pada beberapa residu asam amino. Native ligand bis-tris-propan (B3P)  yang  telah  di- redocking memiliki  kontak  dengan  enzim  β-glukanase  pada beberapa  residu  asam  amino.  Residu  asam  amino tersebut ialah GLU159, GLU133, GLU137, GLN147, ASP135, TYR151, dan TRP212 (Gambar 5a). Ligan B3P  pada  penelitian  ini  berikatan  secara  hidrogen dengan residu-residu asam amino GLU133, GLU137,
Menara Perkebunan 2023, 91(1), 59 – 71
dan GLN147 yang merupakan celah situs aktif yang terdapat  pada  enzim  β-glukanase  (Furtado  et  al., 2011). Selain itu, pada sisi berlawanan dari situs aktif terdapat satu ion kalsium yang juga terikat pada gugus karbonil dari residu PRO37, GLY73, ASP235, gugus
karboksilat dari ASP235, dan dua molekul air (Furtado et al., 2011). Skor PLANTS CHEMPLP dari ligan bawaan ini  cukup  rendah,  yaitu  -89,8225  (Tabel  3)  yang menunjukkan  ikatan  antara  ligan  dan  reseptor  yang cukup stabil.
(a) (b)
Pemodelan protein dan analisis molecular docking enzim β-glukanase isolat Bacillus subtilis………. … …….......(Hanifitri et al.)
(d) (e)
Gambar 5.   Visualisasi hasil penambatan molekul ligan uji dengan protein enzim β-glukanase. (a) native ligand (B3P), (b) 1,4-β-D-Glukan, (c) D-glukosa, (d) β-D-glukan oat, dan (e) N-asetil glukosamin
Figure 5.  Visualization of the binding of the test ligand molecule with the protein β-glucanase enzyme. (a) native ligand (B3P), (b) 1,4-β-D-Glucan, (c) D-glucose, (d) β-D-glucan from oat, and (e) N-acetyl glucosamine
(d)
(e)
Lanjutan...
Menara Perkebunan 2023, 91(1), 59 – 71
Perbandingan antara ligan native (B3P) dan 4 ligan uji lain terlihat pada skor PLANTS CHEMPLP dan beberapa residu  asam  amino  yang  berikatan  (Lampiran  5), dimana  residu  asam  amino  yang  berikatan  dengan ligan-ligan tersebut memiliki kemiripan dengan B3P dan referensi (Furtado et al ., 2011). Ligan β-D-Glucan oat memiliki  skor  PLANTS CHEMPLP paling  rendah yaitu  -97,85  dengan  adanya  ikatan  hidrogen  dari beberapa residu asam amino (Tabel 5) dan memiliki kemiripan  dengan  B3P  dan  referensi  (Furtado  et  al., 2011),  yaitu  GLU133,  GLU137,  ASN149,  GLN147, dan GLU159.
Hasil yang diperoleh berdasarkan analisis docking ini memberikan pengetahuan mengenai prediksi dari ligan yang dapat digunakan untuk produksi enzim β- glukanase  yang  lebih  optimum.  Informasi  mengenai residu asam amino yang berikatan dengan enzim juga dapat  dijadikan  referensi  dalam  teknologi  rekayasa genetika. Penelitian ini juga dapat dilanjutkan dengan melakukan  molekular  dinamika  untuk  melihat kestabilan  dari  struktur  dan  hasil docking yang diperoleh. Selain itu, data sekuens asam amino yang diperoleh  juga  dapat  digunakan  sebagai  data  untuk melakukan  rekayasa  genetika  untuk  meningkatkan aktivitas dan produksi enzim β-glukanase dari bakteri B. subtilis W3.15.

## Kesimpulan
Isolat B. subtilis W3.15 berhasil disekuensing dan dianalisis  secara in  silico dengan  melakukan pemodelan kemudian dianalisis dengan studi docking . Model protein yang diperoleh didasarkan pada protein templat 3o5s dan memiliki hasil pensejajaran sekuens dan  visualisasi  model  cukup  baik  yang  ditunjukkan dengan  model  memiliki  nilai Ramachandran  Plot pada  daerah favoured sebesar  91,10%,  skor MolProbity sebesar  0,95  dan  nilai  QMEAN  0,90  ± 0,06. Hasil analisis docking menunjukkan bahwa ligan β-glukan  (β-D-Glukan  dari  oat)  yang  digunakan sebagai  substrat  dalam  kultivasi  isolat B.  subtilis W3.15 memiliki nilai prediksi energi ikat yang lebih baik dibandingkan dengan ligan B3P, yang merupakan ligan alami dalam protein templat. Selain itu, ligan β- D-Glucan dari  oat  mengikat  enzim  β-glukanase dengan  jenis  ikatan  hidrogen  dari  beberapa  residu asam  amino  yaitu  GLU133,  GLU137,  ASN149, GLN147, dan GLU159.

## Saran
Penelitian selanjutnya diharapkan dapat dilakukan simulasi dinamika molekuler untuk melihat kestabilan ikatan  antar  ligan  dan  substrat  sehingga  dapat diperoleh  informasi  yang  lebih  mendalam  terkait analisis molekuler enzim β-glukanase dari B. subtilis W3.15.

## Ucapan Terima kasih
Penelitian  ini  menggunakan  dana  mandiri  dan fasilitas  bahan  penelitian  dari  Nisa  Rachmania Mubarik.

## Daftar Pustaka
Budiarti, S. W, & Widyastuti, S. M. (2011). Aktivitas antifungal  β-1,3-glukanase Trichoderma  reesei pada  fungi  akar Ganoderma  philippii . Jurnal Perlindungan Tanaman , 14 (2), 455-460.
Chen, V. B., Arendall, W. B., Jeffrey, J. H., Daniel, A. K., Robert, M. I., Gary, J. K., Laura, W. M., Jane, S. R., & David, C. R. (2009). MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography , 66, 12-21.
https://doi.org/10.1107/S0907444909042073
Dassault Systèmes. (2015). BIOVIA, Discovery studio modeling  environment,  Version  4.5 ,  San  Diego: Dassault Systèmes.
Dewi,  R.  T.,  Mubarik,  N.  R.,  &  Suhartono,  M.  T. (2016).  Medium  optimation  of  β-glucanase production by Bacillus subtilis SAHA 32.6 used as biological control of oil palm pathogen. Emirates Journal  of  Food  &  Agriculture, 28(2),  116-125. https://doi.org/10.9755/ejfa.2015-05-195
Elanchezhiyan,  K.,  Keerthana,  U.,  Nagendran,  K., Prabhukarthikeyan,  S.  R.,  Prabakar,  K., Raguchander,  T.,  &  Karthikeyan,  G.  (2018).
Multifaceted benefits of Bacillus amyloliquefaciens strain FBZ24 in the management of wilt disease in tomato caused by Fusarium oxysporum f . sp. lycopersici.
Physiological  and  Molecular  Plant  Pathology , 103,  92–101.  https://doi.org/10.1016/j.pmpp. 2018.05.008
Pemodelan protein dan analisis molecular docking enzim β-glukanase isolat Bacillus subtilis………. … ………..(Hanifitri et al.)
Ejaz,  U.,  Muhammad  S.,  &  Abdelaz,  G.  (2021).
Cellulases:  From  Bioactivity  to  a  Variety  of Industrial  Applications. Biomimetics  (Basel), 6(3),  44.  https://doi.org/10.3390/biomimetics 6030044
Furtado, G. P., Ribeiro, L. F., Santos, C. R., Tonoli,
C.  C.,  Angelica,  R.  S.,  Oliveira,  R.  R., Murakami,  M.  T.,  &  Ward,  R.  J.  (2011). Biochemical and structural characterization of a β-1,3–1,4-glucanase from Bacillus subtilis 168.
Process  Biochemistry ,  46(5),  1202-1206. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2011.01.037
Gonçalves, A. C., dos S., Rezende, R. P., Marques, E. de L. S., Soares, M. R, Dias, J. C. T., Romano, C. C., Costa, M. S., Dotivo, N. C., de Moura, S. R.,  de  Oliveira,  I.  S, et  al .  (2020). Biotechnological potential of mangrove sediments: Identification and functional attributes of thermostable and salinity-tolerant β- glucanase. International  Journal  of  Biological
Macromolecules , 147, 521–526. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020. 01.078
Hakkar,  A.  A.,  Rosmana,  A.,  &  Rahim,  M.  D.
(2014).  Pengendalian  penyakit  busuk  buah phytophthora  pada  kakao  dengan  cendawan endofit Trichoderma  asperellum . Jurnal Patologi Indonesia , 10(5). 139-144.
https://doi.org/10.14692/jfi.10.5.139
Hegazy, W. K., Abdel-Salam, M. S., Hussain, A. A., Abo-Ghalia,  H.  H.,  &  Hafez,  S.  S.  (2018). Improvement  of  cellulose  degradation  by cloning of endo-β-1,3-1,4 glucanase ( bgls ) gene from Bacillus subtilis BTN7A strain. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 16(2),
281–285. https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2018.06.005
Khan,  N.,  Martínez-Hidalgo,  P.,  Ice,  T.  A., Maymon, M., Humm, E. A., Nejat, N., Sanders, E.  R.,  Kaplan,  D.,  &  Hirsch,  A.  M.  (2018). Antifungal  activity  of bacillus species  against fusarium and  analysis  of  the  potential mechanisms  used  in  biocontrol. Frontiers  in Microbiology ,  9,  1–12.  https://doi.org/10. 3389/fmicb.2018.02363
Komari,  N.,  Hadi,  S.,  &  Suhartono,  E.  (2020). Pemodelan protein dengan homology modelling menggunakan SWISS-MODEL. Jurnal Jejaring
Matematika dan Sains , 2(2), 65-70.
https://doi.org/10.36873/jjms.2020.v2.i2.408
Korb,  O., Stützle,  T., &  Exner,  T.  E.  (2009).
Empirical  scoring  functions  for  advanced protein-ligand  docking  with  PLANTS. Journal of  Chemical  Information  and  Modeling ,  49(1),
84-96. https://doi.org/10.1021/ci800298z
Land, H., & Humble, M. S. (2018). YASARA: a tool to  obtain  structural  guidance  in  biocatalytic investigations. Methods  in  Molecular  Biology , 1685,  43-67.  https://doi.org/10.1007/978-1- 4939-7366-8_4
Laskowski, R. A., MacArthur, M. W., Moss, D. S., &  Thornton,  J.  M.  (1993).  PROCHECK:  a program to check the stereochemical quality of protein  structures. J.  Appl  Cryst ,  26,  283-291. https://doi.org/10.1107/S0021889892009944
Lopez-Camacho, E., Garcia-Godoy, M. J., Garcia- Nieto, J., Nebro, A. J., & Aladana-Montes, J. F. (2019).  Optimizing  ligand  conformations  in flexible  protein  targets:  a  multi-objective strategy. Soft  Computing ,  24,  10705–10719. https://doi.org/10.1007/s00500-019-04575-2
Loni, P. P., Patil, J. U., Phugare, S. S., & Bajekal, S. S.  (2014).  Purification  and  characterization  of alkaline chitinase from Paenibacillus pasadenensis NCIM  5434. Journal  of  Basic Microbiology , 54(10), 1080–1089.
https://doi.org/ 10.1002/jobm.201300533
Munyaka,  P.  M.,  Nandha,  N.  K.,  Kiarie,  E., Nyachoti, C. M., & Khafipour, E. (2016). Impact of combined β-glucanase and xylanase enzymes on growth performance, nutrients utilization and gut  microbiota  in  broiler  chickens  fed  corn  or wheat-based diets. Poultry Science, 95(3), 523 - 540. https://doi.org/10.3382/ps/pev333
Prieto-Martinez,  F.  D.,  Arciniega,  M.,  &  Medina- Franco, J. L. (2018). Molecular docking: current advances  and  challenges. TIP  Revista Especializada en Ciencias Quimico-Biologicas , 21(1),  65-87.  https://doi.org/10.22201/fesz. 23958723e.2018.0.143
Saudale,  F.  Z.  (2020).  Pemodelan  homologi komparatif struktur 3D protein dalam desain dan pengembangan  obat. Al-Kimia ,  8(1),  93-103. https://doi.org/10.24252/al-kimia.v8i1.9463
Schwede, T., Kopp, J., Guex, N., & Peitsch, M. C. (2003). SWISS-MODEL: An automated  protein homology-modeling  server. Nucleic  Acids Research ,  31(13),  3381–3385.  https://doi.org/ 10.1093/nar/gkg520

## Menara Perkebunan 2023, 91(1), 59 – 71
Seprianto.  (2018).  Bioinformatika  untuk  Protein Modelling.  Pusat  Penelitian  Bioteknologi  dan Bioindustri  Indonesia,  Universitas  Esa  Unggul Press.
Sharma, R., Gil, G., & Victoria, H. (2022). A study of different  actions  of  glucanases  to  modulate microfibrillated  cellulose  properties. Cellulose, 29,  2323–2332.  https://doi.org/10.1007/s10570- 022-04451-7
Studer,  G.,  Rempfer,  C.,  Waterhouse,  A.  M., Gumienny,  G.,  Haas,  J.,  &  Schwede,  T.  (2020). QMEANDisCo-distance  constraints  applied  on model  quality  estimation. Bioinformatics ,  36, 1765-1771. https://doi.org/10.1093/bioinformatics /btz828
Suryadi, Y., Priyatno, T. P., I Made, S., Susilowati, D. N.,  Patricia,  &  Irawati,  W.  (2013).  Karakterisasi dan  identifikasi  isolate  bakteri  endofitik penghambat  jamur  patogen  padi. Bul.  Plasma Nutfah ,  19(1),  25-32.  https://doi.org/10.21082 /blpn.v19n1.2013.p%p
Tambunan, U. S. F., Bramantya, N., & Parikesit, A. A. (2011).  In  silico  modification  suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) as potential inhibitor for class  II  histone  deacetylase  (HDAC). BMC Bioinformatics ,  12(13),  1–15.  https://doi.org/ 10.1186/1471-2105-12-S13-S23
Tumilaar, S. G., Siampa, J. P., & Tallei, T. E. (2021).
Penambatan  molekuler  senyawa  bioaktif  dari ekstrak  etanol  daun  pangi  ( Pangium  edule ) terhadap  reseptor  protease  hiv-1. Jurnal  Ilmiah Sains , 21 (1),  6–16.  https://doi.org/10.35799/jis. 21.1.2021.30282
Wang, M., Jian, D., Daolei, Z., Xuezhi, L., & Jian, Z.
(2017).  Modification  of  different  pulps  by homologous overexpression alkali-tolerant endoglucanase in Bacillus subtilis Y106. Scientific Reports , 7,  3321.  https://doi.org/10.1038/s41598- 017-03215-9
Waterhouse, A., Bertoni, M., Bienert, S., Studer, G., Tauriello, G., Gumienny, R., Heer, F. T., de Beer, T. A. P., Rempfer, C., Bordoli, L., Lepore, R., & Schwede, T. (2018). SWISS-MODEL: homology modelling  of  protein  structures  and  complexes.
Nucleic Acids Research , 46(1), 296- 303. https://doi.org/10.1093/nar/gky427
Wijaya H., & Hasanah, F. (2016). Prediksi strukur tiga dimensi  protein  alergen  pangan  dengan  metode homologi  menggunakan  program  SWISS- MODEL. BioPropal Industri , 7(2), 83-94.
Yu, W. Q., Zheng, G. P., Yan, F. C., Liu, W. Z., & Liu, W.  X.  (2019). Paenibacillus  terrae NK3-4:  a potential  biocontrol  agent  that  produces  β-1,3- glucanase. Biological  Control ,  129,  92–101. https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2018.09.019