Majalah Farmaseutik Vol. 18 No. 3 : 241-246 ISSN-p : 1410-590x ISSN-e : 2614-0063

## Aktivitas Antimikroba Ekstrak Etil Asetat Fungi Endofit Eutypa linearis
Antimicrobial Activities of Ethyl Acetate Extract of Endophytic Fungus Eutypa linearis
Baiq Maylinda Gemantari 1,4 , Fitra Romadhonsyah 1,5 , Arief Nurrochmad 2 , Subagus Wahyuono 3 , Puji Astuti 3* 1 Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada
2 Departemen Farmakologi dan Farmasi Klinis, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada
3 Departemen Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada
4 Departemen Farmasi, Fakultas Kesehatan, Universitas Hamzanwadi 5 Departemen Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Islam
Indonesia Corresponding author: Puji Astuti; Email: puji_astuti@ugm.ac.id Submitted: 16-02-2021 Revised: 23-08-2021 Accepted: 30-08-2021

## ABSTRAK
Fungi  endofit  banyak  dilaporkan  mampu  memproduksi  senyawa  metabolit  yang  memiliki beragam  aktivitas  biologis.  Diisolasi  dari  salah  satu  tanaman  berkhasiat  Indonesia  yang  dikenal dengan  nama  tanaman  jinten  ( Coleus  amboinicus Lour.),  pada  penelitian  ini  dilakukan  observasi aktivitas  antimikroba  fungi  endofit Eutypa  linearis .  Ekstrak  etil  asetat  dari  media  fermentasi E.linearis dalam beragam konsentrasi diujikan kepada  beberapa  mikroba  bakteri  dan fungi yakni Staphyloccocus  aureus,  Pseudomonas  aeruginosa,  Bacillus  subtilis, dan Candida  albicans .  Aktivitas antimikroba dievaluasi menggunakan metode mikrodilusi pada media Mueller Hinton Broth untuk kultur bakteri dan Brain Heart Infussion Broth untuk kultur fungi. Nilai optical density pada panjang gelombang 600 nm yang diperoleh dari penggunaan microplate reader digunakan untuk menghitung nilai  IC 50 ekstrak.  Hasil  penelitian  menunjukkan  nilai  IC 50 ekstrak  etil  asetat  media  fermentasi E.linearis pada S.aureus adalah sebesar 260,69 µg/mL; P.aeruginosa 359,32 µg/mL ; B.subtilis 163,74 µg/mL ; dan C.albicans 92,75 µg/mL. Berdasarkan metode bioautografi kontak, diketahui senyawa aktif sebagai antimikroba tersebut merupakan kelompok senyawa yang polar.
Kata kunci: fungi endofit; antibakteri; antifungi; mikrodilusi; bioautografi

## ABSTRACT
Endophytic fungi was known to be one of promising new research object due to its capability to produce various metabolites with broad bioactivity. Focused on its antimicrobial activity of Eutypa linearis, a fungus isolated from medicinal herb Jinten ( Coleus amboinicus Lour.) was the emphasize on this study. Ethyl acetate extract of broth fermentation medium of E.linearis was examined through microdilution  method  against  several  bacterial  and  yeast  such  as Staphyloccocus  aureus, Pseudomonas  aeruginosa,  Bacillus  subtilis, dan Candida  albicans .  Microdilution  method  was performed in Mueller Hinton Broth for bacterial culture and Brain Heart Infussion broth for yeast culture.  Microplate  reader  was  used  to  examine  optical  density  at  600  nm  which  then  used  to calculate IC 50 value of the extract. The results showed that the ethyl acetate extract of E.linearis broth fermentation medium had IC 50 260,69 µg/mL on S.aureus; 359,32 µg/mL on P.aeruginosa; 163,74 µg/mL  on B.subtilis; and 92,75  µg/mL  on C.albicans .  The  active  compound  responsible  for  those activity was polar compounds as confirmed by TLC-bioautography contact.
Keywords : endophytic fungus; antibacterial; antifungi; microdilution; bioautography

## PENDAHULUAN
Tanaman  jinten  ( Coleus  amboinicus Lour.)  adalah  salah  satu  tanaman  herba aromatik  yang  tumbuh  dan  terdistribusi  pada daerah tropis termasuk Indonesia. Bagian daun dari  tanaman  tersebut  dapat  digunakan  untuk mengobati  flu,  asma,  konstipasi,  sakit  kepala,
batuk,  demam  dan  beberapa  penyakit  kulit (Arumugam et  al .,  2016).  Potensi  aktivitas ekstrak  daun  tanaman  jinten  telah  banyak dilaporkan  sebagai  antibakteri,  antifungi (Rodrigues et al ., 2013; Sivaranjani et al ., 2019; Swamy et al ., 2017), antioksidan (Bhatt & Negi, 2012;   Hasibuan et   al .,   2019)   dan    aktivitas
Baiq Maylinda Gemantari, et al
sitotoksik  pada  beberapa  model  sel  kanker (Hasibuan et al ., 2019; Laila et al ., 2020). Endofit  merupakan  mikroorganisme berupa fungi maupun bakteri yang hidup dalam jaringan  intrasel  tanaman  tanpa  menimbulkan penyakit  (Chen et  al .,  2016;  Porras-Alfaro  & Bayman,  2011).  Dengan  inangnya  endofit bersimbiosis memproduksi metabolit sekunder yang  banyak  memiliki  aktivitas  biologis. Beberapa  golongan  metabolit  sekunder  yang dihasilkan oleh endofit yaitu alkaloid, terpenoid dan fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan antikanker,  antifungi  dan  sebagainya  (Porras- Alfaro  &  Bayman,  2011;  Strobel,  2003).  Salah satu  hasil  penelitian  yang  memanfaatkan organisme endofit adalah ditemukannya endofit Aspergillus  fumigatus yang  diisolasi  dari tanaman Taxus  sp. Endofit  tersebut  memiliki kemampuan memproduksi Taxol dalam jumlah yang  tinggi  sebagai  agen  kemoterapi  yang dibutuhkan  dalam  industri  produksi  obat sintesis (Kumar et al ., 2019). Penelitian  terkait  fungi  endofit  yang diisolasi dari daun tanaman jinten melaporkan Athelia rolfsii memiliki fraksi yang aktif sebagai antibakteri. Aktivitas tersebut ditunjukkan pada bakteri  Gram  positif  dan  Gram  negatif Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Escherichia  coli,  Streptococcus  mutans dan Pseudomonas aeruginosa . Dalam fraksi tersebut diketahui  terdapat  senyawa  aktif  antibakteri dengan  kandungan  struktur  aromatis,  gugus metil, hidroksi dan metoksi (Astuti et al ., 2021). Penelitian  sebelumnya  melaporkan  adanya fungi endofit Eutypa linearis pada daun tanaman jinten.  Fungi  endofit  tersebut  dilaporkan memiliki  aktivitas  antioksidan  dan  sitotoksik terhadap  model  sel  kanker  Hela,  T47D, MCF-7,  dan  WiDr  (Gemantari et  al .,  2021). Pada  pengembangannya,  belum  dilaporkan adanya  pengujian  aktivitas  antimikroba  dari fungi  endofit  tersebut.  Pada  penelitian  ini dilakukan  pengujian  antimikroba  fungi  endofit Eutypa linearis yang diisolasi dari daun tanaman jinten.

## METODOLOGI
Bahan Kultur fungi endofit Eutypa linearis koleksi Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi UGM , kultur Pseudomonas  aeruginosa ATCC  27853, Staphylococcus  aureus ATCC  25923, Bacillus subtilis ATCC 6633, fungi Candida albicans ATCC 10231,  Streptomisin,  Nistatin,  media Potato
Dextrose Broth, Mueller Hinton Broth (MHB), Brain Heart Infussion Broth (BHI), Nutrient Agar (NA) dan Saboraud  Dextrose  Agar (SDA),  kloroform, etil  asetat,  dan  plat silica  gel 60 F254  yang masing-masing  diperoleh  dari  Laboratorim Mikrobiologi Fakultas Farmasi UGM.
Alat Alat  gelas,  autoklaf  (Hirayama,  Hiclave HVE-50), incubator  shaker (Stuart  Orbital Incubator), inkubator (Sakura Incubator IF-2B), spektrofotometer  (SP-3000  nano  Optima), LAF cabinet (NUAIRE  NU-126-400E), microplate reader (Corona  Electric  SH-1000Lab), rotary evaporator (Heidolph  Hei-Vap) , bunsen,  ose, Eppendorf steril, mikropipet, yellow tip , blue tip, dan microwell plate.

## Jalannya Penelitian
Fermentasi dan ekstraksi Proses fermentasi dilakukan berdasarkan  modifikasi  metode  Astuti et  al .,
(2021).  Dilakukan  kultur  fungi Eutypa  linearis dalam  media potato  dextrose  broth yang diinkubasi  selama  14  hari  pada  suhu  ruang dengan  rotasi shaker 80  putaran  per  menit. Filtrat  yang  diperoleh  dari  filtrasi  sebagai proses pemisahan terhadap biomassa dipekatkan  menggunakan rotary  evaporator dan  diekstraksi  secara  partisi  cair-cair. Digunakan  pelarut  dengan  perbandingan  etil asetat:  filtrat  pekat  (2:1).  Ekstrak  etil  asetat pekat  diperoleh  dengan  menguapkan  pelarut menggunakan rotary evaporator .
Preparasi inokulum Kultur  bakteri  disiapkan  sesuai  metode preparasi  Farkas et  al .,  (2018).  Koloni  bakteri ditumbuhkan dalam media MHB, dan media BHI untuk  pertumbuhan  koloni  fungi.  Inkubasi dilakukan  semalam  pada  suhu  37℃  hingga diperoleh  jumlah  koloni  yang  setara  dengan standar 0,5 Mc.Farland. Dilakukan pengenceran menggunakan  media  MHB  pada  kultur  bakteri dan  media  BHI  pada  kultur  fungi  untuk memperoleh  jumlah  koloni  akhir  dalam sumuran microplate sebesar 5x10 5 CFU/mL.
Pengujian mikrodilusi Stok ekstrak etil asetat dengan konsentrasi 100  mg/mL  dibuat  dengan  melarutkan  ekstrak pekat  etil  asetat  menggunakan  DMSO  100%. Dilakukan  pengenceran  untuk  membuat  seri konsentrasi  dengan  melarutkan  larutan  stok
dengan  media  MHB  untuk  pengujian  bakteri  dan media BHI untuk pengujian fungi. Seri konsentrasi dibuat dengan
pengenceran bertingkat menghasilkan  konsentrasi  tertinggi  dalam sumuran  sebesar  250  µg/mL.  Pengerjaan dilakukan  secara  aseptis  dalam Laminar  Airflow Cabinet. Dibuat  beberapa  kelompok  perlakuan untuk  memperoleh  model  perhitungan  nilai  IC 50 . Kelompok  uji  berisi  masing-masing  100  µL ekstrak dan 100  µL suspensi mikroba. Dengan perbandingan  volume  yang  sama,  kontrol ekstrak berisi ekstrak dan media, kontrol negatif berisi  suspensi  mikroba  dan  media,  kontrol positif berisi suspensi mikroba dan 500  µg/mL Streptomisin atau 2,5 µg/mL Nistatin serta kontrol media yang berisi 200  µL media MHB atau BHI. Microplate diinkubasi semalam pada suhu 37℃ sebelum  dilakukan  pembacaan  nilai optical density (OD)  menggunakan microplate  reader pada panjang gelombang 600 nm untuk kultur bakteri  dan  530  nm  untuk  kultur  fungi.  Nilai IC 50 diperoleh  sebagai  konsentrasi  ekstrak  uji yang menghasilkan 50% viabilitas sel mikroba dari  perhitungan  nilai optical  density. Prosentase  viabilitas  dihitung  menggunakan formula  Santovito et  al .,  (2018)  dengan modifikasi.
%viabilitas = 𝑂𝐷 𝑘𝑒𝑙𝑜𝑚𝑝𝑜𝑘 𝑢𝑗𝑖−𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓−𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑥 100 %
Pengujian Bioautografi Dilakukan  metode  bioautografi  kontak atau  bioautografi  difusi  agar  sesuai  dengan modifikasi  metode  Sakunpak  dan  Sueree (2018).  Secara  aseptis  dalam Laminar  Airflow Cabinet , sejumlah 5 µL ekstrak etil asetat dalam pelarut  etil  asetat  dielusi  pada  sistem kromatografi lapis     tipis (KLT) menggunakan fase  gerak  kloroform:etil  asetat  (1:1)  dan  fase diam  plat  silika  gel  60  F254.  Nilai  Rf  dihitung berdasarkan  pengukuran  jarak  titik  tengah diameter  zona  spot  senyawa  dari  titik  elusi dibandingkan dengan jarak elusi total fase gerak pada plat KLT yang digunakan. Ke dalam 10 mL media NA dan SDA ditambahkan masing-masing sebanyak  100  µL  suspensi B.subtilis dan C.albicans dengan  teknik pour  plate .  Suspensi bakteri  atau  fungi  yang  setara  dengan  standar kekeruhan  0,5  Mc.Farland.  Plat  KLT  dengan hasil  pita  elusi  dikeringkan  dan  ditempelkan dengan  sisi  silika  menempel  pada  permukaan media  yang  telah  diinokulasikan  kultur mikroba. Plat didiamkan selama 30 menit untuk memastikan kelompok senyawa yang
terpisahkan  berupa  spot  yang  dihasilkan  dari proses  elusi  berdifusi  ke  dalam  media  agar. Cawan  petri  diinkubasi  pada  suhu  37℃ semalam  setelah  melepas  plat  KLT  untuk melihat  pembentukan  zona  inhibisi  dari  spot hasil elusi.
Analisis hasil Respon  viabilitas  mikroba  terhadap konsentrasi  ekstrak  dianalisis  secara  statistik menggunakan  program  SPSS  16  dengan  taraf kepercayaan  95%.  Nilai  signifikansi  dianalisis menggunakan One  way  ANOVA atau Kruskal Wallis sesuai nilai normalitas Shapiro – Wilk .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas antimikroba Hasil  uji  aktivitas  antimikroba  ekstrak etil  asetat  fungi  endofit Eutypa  linearis ditunjukkan  pada  Tabel  I  (Gemantari,  2021). Ekstrak memiliki aktivitas antimikroba sebagai antibakteri  dan  antifungi.  Aktivitas  antibakteri ditentukan  dari  nilai  IC 50 pada  kultur  bakteri S.aureus,  P.aeruginosa, dan B.subtilis .  Aktivitas antifungi  ditentukan  sebagai  nilai  IC 50 ekstrak pada  kultur  fungi C.albicans .  Diperoleh informasi  bahwa  mikroba  fungi Candida albicans lebih  rentan  dibandingkan  bakteri B.subtilis,  P.aeruginosa dan S.aureus terhadap esktrak  etil  asetat E.linearis .  Hal  tersebut ditunjukkan dengan nilai IC 50 yang lebih rendah. Sebagai  korelasi  aktivitas  dengan  tanaman inangnya, Swamy et al ., (2017) dan Sivaranjani et  al .,  (2019)  melaporkan  bahwa Candida albicans merupakan mikroba yang paling rentan terhadap  ekstrak  daun  tanaman  jinten.  Hasil mikrodilusi  menunjukkan  ekstrak  etil  asetat pada penelitian ini memiliki nilai IC 50 terhadap C.albicans sebesar 92,75 µg/mL. Hasil tersebut menunjukkan  potensi  yang  lebih  baik dibandingkan  dengan  minyak  atsiri  tanaman jinten yang tumbuh di Malaysia dengan nilai MIC 12,5  x  10 3 µg/mL  (Erny  Sabrina et  al .,  2014) terhadap C.albicans. Nilai  IC 50 menunjukkan  bahwa  urutan kerentanan  bakteri  uji  terhadap  ekstrak  etil asetat fungi endofit E. linearis adalah B. subtilis, S.  aureus, dan P.  aeruginosa. Hal  ini  dapat dijelaskan  dari  struktur  sel B.  subtilis dan S. aureus yang tergolong bakteri Gram positif, dan P.  aeruginosa sebagai  bakteri  Gram  negatif. Bakteri  Gram  negatif  memiliki  membran  luar yang lebih kompleks dibandingkan Gram positif. Hal ini menyebabkan dinding sel bakteri Gram
Baiq Maylinda Gemantari, et al
negatif  lebih  sulit  tertembus  sehingga kemampuan inhibisi ekstrak akan menunjukkan potensi  yang  lebih  kecil  (Allison  &  Gilbert, 2004).  Sebagai  bakteri  yang  paling  rentan, B. subtilis memiliki nilai IC 50 yang paling rendah dibandingkan S.  aureus dan P.  aeruginosa . Konsentrasi  ekstrak  sebesar  163,74  µg/mL mampu
menghambat sebesar 50% pertumbuhan bakteri
B. subtilis .
Identifikasi komponen aktif Komponen  yang  bertanggungjawab sebagai  antimikroba  dengan  potensi  yang ditunjukkan  secara  mikrodilusi  dianalisis menggunakan  metode  bioautografi  kontak. Bioautografi  kontak  atau  disebut  sebagai bioautografi  difusi  agar  dilakukan  dengan memanfaatkan  proses  difusi  dari  senyawa antimikroba  dari  kromatogram  plat  KLT  ke plate media  agar  yang  telah  diinokulasikan dengan  mikroba  uji.  Setelah  diinkubasi,  zona hambat  akan  muncul  pada  nilai  Rf  dimana komponen aktif antimikroba terelusi pada plat KLT  yang  kontak  dengan  agar  (Balouiri et  al ., 2016; Marston, 2011).
Pada potensi aktivitas antimikroba paling baik,  identifikasi  komponen  aktif  dilakukan
terhadap Candida albicans dan Bacillus subtilis . Hasil  yang  diperoleh  ditunjukkan  pada Gambar 1. Komponen ekstrak etil asetat Eutypa linearis yang aktif sebagai antibakteri B. subtilis adalah  senyawa  yang  terelusi  pada  nilai  Rf  0- 0,37 yang diperoleh dari pengukuran jarak zona jernih yang terbentuk pada media agar dari titik elusi dibandingkan dengan jarak elusi total fase gerak pada plat KLT yang digunakan. Komponen yang  terelusi  pada  nilai  Rf  tersebut  diketahui tidak  memiliki  aktivitas  yang  sama  terhadap kultur  fungi C.  albicans .  Pada  bioautografi dengan  sistem  yang  sama  terhadap  fungi C. albicans , diperoleh hasil bahwa komponen aktif terlusi  pada  nilai  Rf  0-0,1  dari  perhitungan dengan cara yang sama pada perlakuan bakteri B. subtilis . Pada sistem kromatografi lapis tipis menggunakan fase gerak kloroform: etil asetat, komponen  aktif  tersebut  menunjukkan  sifat kepolaran  yang  relatif  tinggi  sehingga  terelusi pada  nilai  Rf  yang  rendah.  Identifikasi komponen aktif tersebut menggunakan pereaksi  semprot  anisaldehid-asam  sulfat menunjukkan  respon  positif.  Hal  tersebut menunjukkan bahwa dimungkinkan komponen aktif  merupakan  senyawa  dengan  golongan fenolik,  steroid,  terpenoid  maupun  senyawa
Atas : B. subtilis; Bawah : C. albicans. A: ekstrak etil asetat E. linearis; B: pelarut etil asetat. Analisis KLT  kiri-kanan :  UV  254  nm,  UV366,  pereaksi  semprot  anisaldehid  asam  sulfat.  Fase  gerak kloroform:etil asetat (1:1), fase diam silica gel 60 F254.
Gambar 1. Hasil bioautografi ekstrak etil asetat E. linearis terhadap mikroba uji Tabel I. Potensi aktivitas antimikroba E. linearis
Organisme IC 50 (µg/mL) Kontrol Viabilitas (%) Streptomisin 500 µg/mL Nistatin 2,5 µg/mL Staphylococcus aureus 260,69 ± 7,09 1,84 ± 0,46 - Pseudomonas aeruginosa 359,32 ± 72,83 29,66 ± 0,68 - Bacillus subtilis 163,74 ± 16,45 2,69 ± 0,52 - Candida albicans 92,75 ± 11,84 - 8,18 ± 1,09
Data ditampilkan sebagai nilai rata-rata ± SD (n=3) P<0,05.
gula  (Jork,  1990).  Hasil  ini  dimungkinkan berkorelasi  dengan  senyawa  aktif  antimikroba yang dihasilkan oleh fungi endofit Athelia rolfsii dari  daun  tanaman  jinten  berupa  komponen dengan  struktur isoprene (Astuti et  al .,  2020) dan  atau  senyawa  yang  memiliki  struktur hidroksil  (Astuti et  al .,  2021).  Senyawa monoterpen fenolik yang dibentuk dari struktur isoprene  dengan  gugus  hidroksil  seperti Carvacrol  dan  Thymol  merupakan  senyawa dengan  aktivitas  antibakteri  serta  antifungi (Bnyan et  al .,  2014;  de  Lira  Mota et  al .,  2012;
Marino et al ., 1999; Pina-Vaz et al ., 2004). Kedua senyawa  tersebut,  dilaporkan  merupakan senyawa  mayor  dalam  minyak  atsiri  tanaman jinten C. amboinicus dengan persentase Thymol mencapai 88% dan 80% Carvacrol (DeBaggio & Tucker, 2009).

## KESIMPULAN
Ekstrak  etil  asetat  fungi  endofit Eutypa linearis memiliki aktivitas antimikroba sebagai antibakteri  dan  antifungi.  Aktivitas  tersebut ditunjukkan  dengan  nilai  IC 50 masing-masing pada S.  aureus (260,69  µg/mL), P.  aeruginosa (359,32 µg/mL), B. subtilis (163,74 µg/mL) dan C.  albicans (92,75  µg/mL).  Komponen  yang bertanggungjawab  pada  aktivitas  antibakteri terhadap B.  subtilis ditunjukkan  pada  hasil bioautografi dengan nilai Rf 0-0,37, dan nilai Rf 0-0,1  untuk  komponen  dengan  aktivitas antifungi terhadap C. albicans. Komponen aktif dengan aktivitas tersebut dikonfirmasi sebagai golongan senyawa polar yang  berespon  positif terhadap  pereaksi  semprot  anisaldehid-asam sulfat.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didukung oleh Kementerian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi melalui program  Penelitian  Dasar  Ungulan  Perguruan Tinggi  (PDUPT)  dengan  nomor  hibah 1764/UN1/DITLIT/DITLIT/PT/2020. Data yang  dipublikasikan  merupakan  bagian  dari tesis Baiq Maylinda Gemantari.
DAFTAR PUSTAKA Allison, D., & Gilbert, P. (2004). Bacteria. In Hugo and Russell’s Pharmaceutical Microbiology (pp.  23 – 43).  John  Wiley  & Sons, Ltd.
Arumugam,  G.,  Swamy,  M.  K.,  &  Sinniah,  U.  R.
(2016). Plectranthus  amboinicus (Lour.)
Spreng: Botanical, Phytochemical, Pharmacological and Nutritional Significance. Molecules (Basel, Switzerland) , 21 (4), 369. Astuti, P., Rollando, R., Pratoko, D. K., Wahyuono, S., & Nurrochmad, A. (2021). Antimicrobial and Cytotoxic Activities of A compound Produced by An Endophytic Fungus  Isolated  from  The  Leaves  of Coleus  amboinicus Lour. International Journal  of  Pharmaceutical  Research , 13 (01), 2632 – 2644. Astuti,  P.,  Rollando,  R.,  Wahyuono,  S.,  & Nurrochmad,  A.  (2020).  Antimicrobial activities  of  isoprene  compounds produced  by  an  endophytic  fungus isolated  from  the  leaves  of Coleus amboinicus Lour. Journal  of  Pharmacy  & Pharmacognosy Research , 8 (4), 280 – 289. Balouiri, M., Sadiki, M., & Ibnsouda, S. K. (2016). Methods  for  in  vitro  evaluating antimicrobial  activity:  A  review. Journal of Pharmaceutical Analysis , 6 (2), 71 – 79. Bhatt,  P.,  &  Negi,  P.  S.  (2012).  Antioxidant  and Antibacterial  Activities  in  the  Leaf Extracts  of  Indian  Borage  ( Plectranthus amboinicus ). Food and Nutrition Sciences , 3 (2), 146 – 152.
Bnyan,  I.  A.,  Abid,  A.  T.,  &  Obied,  H.  N.  (2014). Antibacterial Activity of Carvacrol against Different  Types  of  Bacteria. Journal  of Natural Sciences Research , 4 (9), 13 – 16.
Chen, L., Zhang, Q.-Y., Jia, M., Ming, Q.-L., Yue, W.,
Rahman,  K.,  Qin,  L.-P.,  &  Han,  T.  (2016).
Endophytic fungi with antitumor activities: Their occurrence and anticancer compounds. Critical Reviews in
Microbiology , 42 (3), 454 – 473. de  Lira  Mota,  K.,  de  Oliveira  Pereira,  F.,  de Oliveira, W., Lima, I., & de Oliveira Lima, E. (2012). Antifungal Activity  of Thymus vulgaris L.  Essential  Oil  and  Its Constituent
Phytochemicals against
Rhizopus  oryzae :  Interaction  with Ergosterol. Molecules , 17 (12),  14418 – 14433.
DeBaggio,  T.,  &  Tucker,  A.  O.  (2009). The Encyclopedia  of  Herbs:  A  Comprehensive Reference  to  Herbs  of  Flavor  and Fragrance . Timber Press.
Erny Sabrina, M. N., Razali, M., Mirfat, A. H. S., & Mohd Shukri, M. A. (2014). Antimicrobial activity  and  bioactive  evaluation  of Plectranthus  amboinicus essential  oil.
Baiq Maylinda Gemantari, et al
American Journal of Research Communication , 2 (12), 121 – 127.
Farkas,  A.,  Pap,  B.,  Kondorosi,  É.,  &  Maróti,  G. (2018).  Antimicrobial  Activity  of  NCR Plant  Peptides  Strongly  Depends  on  the Test Assays. Frontiers in Microbiology , 9 . Gemantari,  B.  M.  (2021). Karakterisasi  dan Skrining  Potensi  Akktivitas  Fungi  Endofit Eutypa linearis dari Daun Tanaman Jinten (Coleus  amboinicus  Lour.) [Tesis]. Universitas Gadjah Mada. Gemantari, B. M., Romadhonsyah, F., Nurrochmad, A., Wahyuono, S., & Astuti, P.  (2021).  Bioactivity  Screening  of Endophytic  Fungus Eutypa  linearis isolated  from Coleus  amboinicus (Lour.). Indonesian  Journal  of  Pharmacy , 32 ,  86 – 95.
Hasibuan,  P.  A.  Z.  H.,  Sitorus,  P.,  Satria,  D.,  & Sibuea,  R.  D.  (2019).  Antioxidant Properties and Cytotoxic Activity of Ethyl Acetate Fraction of Plectranthus amboinicus (Lour.)  Spreng.  Leaves  on HeLa  and  T47D  Cell  Lines. Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention , 10 (1),
37 – 45. Jork, H. (Ed.). (1990).
Thin-layer chromatography: Reagents  and detection methods . VCH.
Kumar,  P.,  Singh,  B.,  Thakur,  V.,  Thakur,  A., Thakur,  N.,  Pandey,  D.,  &  Chand,  D.
(2019).  Hyper-production  of  taxol  from Aspergillus  fumigatus ,  an  endophytic fungus  isolated  from Taxus sp.  Of  the Northern Himalayan region. Biotechnology Reports , 24 . Laila, F., Fardiaz, D., Yuliana, N. D., Damanik, M.
R.  M.,  &  Nur  Annisa  Dewi,  F.  (2020).
Methanol  Extract  of Coleus  amboinicus (Lour) Exhibited Antiproliferative Activity  and  Induced  Programmed  Cell Death  in  Colon  Cancer  Cell  WiDr. International  Journal  of  Food  Science , 2020 , e9068326. Marino,  M.,  Bersani,  C.,  &  Comi,  G.  (1999).
Antimicrobial activity of the essential oils of Thymus  vulgaris L.  measured  using  a bioimpedometric method. Journal of Food Protection , 62 (9), 1017 – 1023.
Marston, A. (2011). Thin-layer chromatography with biological detection  in  phytochemistry. Journal  of
Chromatography  A , 1218 (19),  2676 – 2683.
Pina-Vaz,  C.,  Gonçalves Rodrigues,  A.,  Pinto,  E., Costa-de-Oliveira, S., Tavares, C.,
Salgueiro, L., Cavaleiro, C., Gonçalves, M. J.,  &  Martinez-de-Oliveira,  J.  (2004). Antifungal  activity  of  Thymus  oils  and their  major  compounds. Journal  of  the European  Academy  of  Dermatology  and Venereology: JEADV , 18 (1), 73 – 78. Porras-Alfaro, A., & Bayman, P. (2011). Hidden Fungi, Emergent Properties: Endophytes and  Microbiomes. Annual  Review  of Phytopathology , 49 (1), 291 – 315.
Rodrigues, F. F. G., Costa, J. G. M., Rodrigues, F. F. G., & Campos,  A. R. (2013).  Study of  the Interference between Plectranthus Species  Essential  Oils  from  Brazil  and Aminoglycosides. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine ,
2013 , e724161. Sakunpak,  A.,  &  Sueree,  L.  (2018).  Thin-layer chromatography – contact  bioautography as a tool for bioassay-guided isolation of anti- Streptococcus  mutans compounds from Pinus merkusii heartwood. Journal of Planar Chromatography , 31 (5), 355 – 359. Santovito, E., das Neves, J., Greco, D., D’Ascanio, V.,  Sarmento,  B.,  Logrieco,  A.  F.,  & Avantaggiato,  G.  (2018).  Antimicrobial properties of rosin acids-loaded nanoparticles against antibiotic-sensitive and antibiotic-resistant foodborne pathogens.
Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology , 46 (sup3), S414 – S422. Sivaranjani,  D.,  Saranraj,  P.,  Manigandan,  M.,  &
Amala,  K.  (2019).  Antimicrobial  activity of Plectranthus  amboinicus solvent extracts  against  Human  Pathogenic Bacteria  and  Fungi. Journal  of  Drug Delivery and Therapeutics , 9 (3), 36 – 39. Strobel, G. A. (2003). Endophytes as sources of bioactive
products. Microbes and Infection , 5 (6), 535 – 544. Swamy,  M.  K.,  Arumugam,  G.,  Kaur,  R., Ghasemzadeh,  A.,  Yusoff,  M.  Mohd.,  &
Sinniah,  U.  R.  (2017).  GC-MS  Based Metabolite  Profiling,  Antioxidant  and Antimicrobial  Properties  of  Different Solvent Extracts of Malaysian Plectranthus amboinicus Leaves. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine : ECAM , 2017 .