Pengembangan Molecular Imprinted Polymer untuk Pemisahan Vitamin C dalam Sediaan Multivitamin
Development of Molecular Imprinted Polymer for Separation of Vitamin C in Multivitamins
Untung Gunawan*, Eko Adi Prasetyanto, Shannen Ivanka Gunardi
Department of Pharmacy, School of Medicine and Health Sciences, Atma Jaya Catholic University of Indonesia email: untung.gunawan@atmajaya.ac.id
(tanggal diterima: 24-01-2021, tanggal disetujui: 03-03-2021)

## INTISARI
Vitamin C memiliki gugus kromofor dan dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri UV,  namun  apabila  matriks  yang  akan  dianalisis  berupa  multivitamin  yang  kompleks  diperlukan metode  pemisahan  yang  selektif  untuk  mengurangi  interferensi  dari  matriks.  Salah  satu  metode pemisahan yang selektif dalam pemisahan adalah Molecular Imprinted Polymer (MIP) yang belum banyak digunakan dalam sampel multivitamin. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh MIP yang selektif untuk pemisahan vitamin C dalam sediaan multivitamin.
Metode penelitian meliputi  pengamatan  interaksi vitamin C dengan  monomer fungsional menggunakan spektrofotomeri UV. MIP disintesis dengan menggunakan metode ruah selama 24 jam pada suhu 60°C. MIP dikarakterisasi menggunakan menggunakan spektrofotometri inframerah dan scanning electron microscopy . Selektivitas MIP ditentukan dengan pengujian faktor imprinting dan perbandingan perolehan kembalinya terhadap metode ekstraksi cair-cair (ECC) dan SPE C 18 untuk pemisahan  vitamin  C  dalam  sampel  multivitamin  di  pasaran  menggunakan  metode  yang  telah tervalidasi.
Pergeseran hipsokromik menunjukkan adanya interaksi antara vitamin C dengan monomer fungsional di mana ikatan hidrogen berperan dominan dalam sintesis MIP. Faktor imprinting yang lebih  dari  1  dan  nilai  perolehan  kembali  yang  mendekati  100%  menunjukkan  selektivitas  MIP terhadap vitamin C. MIP-1 memiliki selektivitas paling tinggi dibandingkan dengan metode ECC dan SPE C 18 untuk pemisahan vitamin C dalam sampel multivitamin dengan persen perolehan kembali berturut-turut  sebesar  98,17±2,31%,  69,42±3,01%,  dan  93,26±4,24%.  MIP-1  yang  dihasilkan selektif untuk pemisahan vitamin C dalam sediaan multivitamin.
Kata kunci : Vitamin C; Multivitamin; Pemisahan; MIP

## ABSTRACT
Vitamin C has a chromophore group that can be analyzed using UV-Vis spectrophotometry, however, if the complex matrix to be analyzed like multivitamins, a selective separation method is required  to  eliminate  matrix  interferences.  One  of  the  selective  separation  methods  is  Molecular Imprinted Polymer (MIP) which hasn’t been widely used in multivitamin samples. The purpose of this study was to obtain selective MIP for the separation of vitamin C in multivitamins..
Research methods included interaction observation of vitamin C with functional monomers using UV spectrophotometry, MIP was synthesized using a bulk method for 24 hours at 60°C. MIP was  characterized  using  spectrophotometry,  infrared,  and  scanning  electron  microscopy  MIP selectivity was determined by the determination of imprinting factor and its recovery with the liquid- liquid extraction method (LLE) and SPE C18 for separation of vitamin C in multivitamin samples on the market using a validated method.
Hypsochromic shift showed interaction between vitamin C and functional monomers, which hydrogen bonds were taking role in MIP synthesis. Imprinting factor more than 1 and recovery value close to 100% indicated MIP selectivity to vitamin C. MIP-1 had the highest selectivity compared to the ECC and SPE C18 methods for separation of vitamin C in multivitamin samples with the recovery of 98.17 ± 2.31%, 69.42 ± 3.01%, and 93.26±4.24% respectively. Synthesized MIP-1 was selective for the separation of vitamin C in multivitamins.
Keyword: Vitamin C; Multivitamins; Separation; MIP

## 1. PENDAHULUAN
Penggunaan  multivitamin  secara  rutin  pada  masyarakat  di  seluruh  dunia meningkat  secara  signifikan  setiap  tahunnya,  kebanyakan  masyarakat menggunakan  multivitamin  secara  rutin  untuk  pengobatan  atau  pencegahan penyakit kronis [1]. Terjadi peningkatan penggunaan multivitamin di tengah masa pandemi  COVID-19  karena  kemampuannya  untuk  menjaga  sistem  imun  tubuh. Multivitamin  memiliki  efek  imunomodulator  yang  memiliki  peran  penting  dalam pencegahan dan terapi pendukung COVID-19 [2], [3]. Sebagian besar vitamin tidak dapat disintesis dalam tubuh sehingga diperlukan asupan dari luar. Vitamin dapat diklasifikasikan berdasarkan kelarutannya sebagai vitamin larut air (C dan B) dan vitamin larut lemak (A, D, E, dan K) [4].
Salah  satu  komponen  yang  sering  digunakan  dalam  sediaan  multivitamin adalah vitamin C. Vitamin C berfungsi membantu sintesis dan metabolisme tirosin, asam folat dan triptofan, hidroksilasi glisin, prolin, lisin karnitin dan katekolamin. Kekurangan  vitamin  C  sering  dikaitkan  dengan  penyakit  anemia,  infeksi,  gusi berdarah, skorbut, penyembuhan luka yang buruk, perdarahan kapiler, degenerasi otot,  plak  aterosklerotik,  dan  gangguan  sistem  saraf  [5],  [6].  Vitamin  C  dapat digunakan  sebagai  terapi  pendukung  dalam  penanganan  COVID-19  karena kemampuannya  sebagai  antioksidan,  antiinflamasi,  antitrombotik  dan imunodulator. Beberapa penelitian mengindikasikan penggunaan vitamin C untuk pencegahan,  memperpendek  waktu infeksi,  dan  mengurangi  komplikasi  penyakit tanpa adanya efek samping yang dihasilkan [7], [8], [9], [10].
Berbagai  metode  analisis  sudah  banyak  dikembangkan  untuk  analisis vitamin C dalam berbagai matriks, dimana metode yang umum digunakan adalah kromatografi  cair  kinerja  tinggi  (KCKT)  [11],  [12],  [13],  [14],  [15].  Sediaan multivitamin  yang  beredar  di  pasaran  biasanya  mengandung  vitamin  larut  air, vitamin larut lemak, dan mineral lainnya. Vitamin dengan mineral tablet (VMT) yang lengkap mengandung 5 vitamin larut dalam minyak, 9 vitamin yang larut dalam air dan  17  elemen  mineral  dan  merupakan  salah  satu  sediaan  farmasi  yang  banyak digunakan  untuk  suplemen  vitamin  dan  mineral,  penentuan  vitamin  yang  larut dalam  air  (termasuk  vitamin  C)  dalam  VMT  sulit  karena  ketidakstabilan  sampel, polaritas yang tinggi, serta kompleksitas matriks [16].
Berdasarkan  struktur  kimianya,  vitamin  C  memiliki  gugus  kromofor sehingga  dapat  dianalisis  menggunakan  spektrofotometri  UV,  namun  apabila matriks  yang  akan  dianalisis  bersifat  kompleks  seperti  multivitamin  diperlukan metode pemisahan yang selektif sebagai faktor kunci dalam analisisnya [17], oleh
karena itu perlu dilakukan pengembangan metode untuk meningkatkan selektivitas pemisahan serta mereduksi waktu preparasi dan analisis sampel. Berbagai metode pemisahan untuk vitamin C dalam berbagai matriks sudah dikembangkan seperti ekstraksi  cair-cair,  ekstraksi  fasa  padat  (SPE),  dan ultrasound-assisted  extraction [18], [19], [20], [21], [22]. Salah satu metode pemisahan yang banyak dikembangkan saat  ini  adalah Molecular  Imprinted  Polymer (MIP)  karena  metode  ini  bersifat selektif. Penelitian MIP yang ada belum diaplikasikan sebagai metode pemisahan untuk  menggantikan  metode  lain  seperti  ekstraksi  cair-cair  maupun Solid  Phase Extraction (SPE) untuk pemisahan vitamin C dalam sampel multivitamin [23], [24], [25],  [26].  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  memperoleh  MIP  yang  selektif  untuk pemisahan vitamin C dalam sediaan multivitamin.

## 2. METODE PENELITIAN

## 2. 1. ALAT DAN BAHAN
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu  timbangan  digital  Metler Toledo  DRAGON  204 ® ,  hotplate  strirrer  IKA  C-MAG  HS  7 ® ,  mikropipet, Spektrofotometer  ultraviolet  (UV)  UV  Shimadzu  UV-1800 ® ,  spektrofotometer inframerah (IR) Shimadzu IRTracer-100 ® , Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Shimadzu  Prominence ® detektor  Photo  Diode  Array  (PDA),  S canning  Electron Microscope (SEM)-EDX Zeiss EVO MA15 ® , coating sampel Quorum Q150T ES ® dan alat gelas lainnya.
Bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu, vitamin C (Sigma Aldrich), akrilamida  (Sigma  Aldrich),  2-hidroksietilmetakrilat  (HEMA,  Sigma  Aldrich), etilenglikoldimetakrilat  (EGDMA,  Sigma  Aldrich),  azobisisobutironitril  (AIBN, Sigma Aldrich), asetonitril (Merck), metanol (Merck), kloroform (Merck), cartridge SPE kosong, cartridge SPE C 18 (Waters), sampel multivitamin.

## 2. 2. CARA KERJA Sintesis Molecular Imprinted Polymer (MIP)
Sintesis  MIP  diawali  dengan  mengamati  interaksi  antara  molekul  cetakan (vitamin  C)  dan  monomer  fungsional  yaitu  akrilamida  dan  HEMA,  interaksi  yang diamati berupa pembentukan ikatan hidrogen menggunakan spektrofotometer UV Shimadzu  UV-1800 ® .  Dilakukan  penentuan  konstanta  asosiasinya  (Ka)  untuk masing-masing  monomer.  Sintesis  MIP  dilakukan  dengan  metode  ruah,  molekul cetakan,  monomer  fungsional,  pengikat  silang,  dan  inisiator  dilarutkan  dalam pelarut  porogen  dalam  satu  wadah,  digunakan  EGDMA  sebagai  pengikat  silang, AIBN  sebagai  inisiator  reaksi,  dan  pelarut  porogen  berupa  metanol.  Vitamin  C dilarutkan,  kemudian  ditambahkan  monomer  fungsional  ke  dalam  vial  dan disonikasi. Pengikat silang dan inisiator ditambahkan ke dalam vial, disonikasi, dan dialiri  gas  nitrogen,  vial  ditutup  rapat,  dimasukan  dalam oven  24  jam pada  suhu 60  C. Non  Imprinted  Polymer (NIP)  yaitu  MIP  yang  dibuat  tanpa  menggunakan molekul cetakan juga dibuat dengan komposisi dan kondisi reaksi yang sama dengan MIP sebagai pembanding.

## Karakterisasi MIP
MIP dan NIP hasil sintesis dikarakterisasi menggunakan spektrofotometri IR Shimadzu  IRTracer-100 ® ,  dan  SEM-EDX  Zeiss  EVO  MA15 ® .  Pelepasan  molekul cetakan MIP dioptimasi menggunakan sokhlet, refluks, dan sonikasi. Pengamatan pelepasan molekul cetakan dilakukan secara spektrofotometri inframerah. MIP diuji kemampuan  pengikatan  ulangnya  dengan  menginkubasikan  MIP  dengan  larutan vitamin C kemudian diamati perbandingan antara kadar vitamin C awal dan yang sudah  berinteraksi  dengan  MIP.  Kapasitas  adsropsi  dilakukan  dengan membandingakan  kemampuan  MIP  dan  NIP  dalam  mengikat  vitamin  C,  larutan vitamin C dengan dimasukan ke dalam 3 vial, 1 vial berisi 10 mg MIP, 1 vial berisi 10 mg  NIP,  dan  1  vial  tanpa  isi  (blanko),  vial  diinkubasi  selama  24  jam  untuk mengamati terjadinya interaksi antara vitamin C dengan MIP dan NIP, setelah 24 jam  dilakukan  analisis  kadar  vitamin  C  pada  ketiga  vial  tersebut  dan  dilakukan penentuan kapasitas adsorpsi.

## Pembuatan Molecular Imprinted Polymer Solid Phase Extraction (MISPE)
MIP yang telah dikarakterisasi dikemas dalam kemasan seperti Solid Phase Extraction (SPE) untuk mempermudah penggunaan dalam pemisahan. 100 mg MIP dimasukan ke dalam cartridge SPE kosong volume 2 mL kemudian ditutup dengan frit yang akan disebut sebagai MISPE. NIP diperlakukan sama dengan MIP sebagai pembanding  yang  akan  disebut  sebagai Non-Imprinted  Solid  Phase  Extraction (NISPE).

## Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis vitamin C dilakukan menggunakan spektrofometri UV dimana parameter yang diuji adalah linearitas, batas deteksi, batas kuantisasi, akurasi,  dan  presisi.  Linearitas  ditentukan  dengan  cara  membuat  kurva  antara konsentrasi dengan respon Parameter linearitas kurva adalah koefisien korelasi (r) dan koefisien variansi regresi (V x0 ). Batas deteksi dan batas kuantisasi dihitung dari perbandingan signal  to  noise dengan  metode  Miller  dan  Miller  [27].  Akurasi diperoleh dengan cara menghitung rata-rata persen perolehan kembali analit yang ditambahkan. Parameter presisi diperoleh dari pengamatan  koefisien variansi.

## Pengaplikasian MIP
Sebelum  diaplikasikan  untuk  pemisahan  vitamin  C  pada  sampel multivitamin,  dilakukan  optimasi  eluen  untuk  pemisahan  menggunakan  berbagai pelarut  organik  untuk  memperoleh  perolehan  kembali  tertinggi  dari  vitamin  C. Selektivitas  pemisahan  diamati  dengan  menggunakan  sampel  multivitamin  yang mengandung vitamin C yang beredar di pasaran. Pengujian selektivitas dilakukan dengan  membandingan  antara  MIP  yang  telah  dibuat  dengan  dengan  metode ekstraksi  cair-cair  (ECC)  dan  SPE  C 18 untuk  pemisahan  vitamin  C  dalam  sampel multivitamin.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Sintesis MIP
Sintesis  MIP  diawali  dengan  mengamati  interaksi  antara  molekul  cetakan (vitamin  C)  dengan  monomer  fungsional  (akrilamida  dan  HEMA)  dengan menggunakan titrasi UV, 0,0001 mol vitamin C ditambahkan larutan akrilamida dan HEMA masing-masing dengan perbandingan mol vitamin C : monomer (1:1 sampai 1:10)  kemudian  diukur  panjang  gelombang  maksimum  dan  absorbansinya. Kemudian dilakukan penentuan konstanta asosiasi dengan menggunakan rumus:
∆𝜆  = 1 + K [M] 1+K [M] −   ∆𝜆 m𝑎𝑥 ........... persamaan 1
∆ 𝜆 = selisih panjang gelombang K
= konstanta asosiasi
[M] = konsentrasi monomer
∆𝜆𝑚𝑎𝑥 = selisih panjang gelombang maksimum
Tabel 1. Titrasi UV vitamin C-akrilamida dan vitamin C-HEMA Vit C : akrilamida (mol:mol) Panjang gelombang (nm) Absorbansi Vit C : HEMA (mol:mol) Panjang gelombang (nm) Absorbansi 1:0 247,0 0,534 1:0 247,0 0,534 1:1 246,5 0,492 1:1 245,5 0,482 1:2 246,0 0,469 1:2 245,0 0,451 1:3 245,5 0,446 1:3 244,0 0,419 1:4 244,0 0,423 1:4 243,0 0,384 1:5 244,0 0,401 1:5 243,0 0,355 1:6 244,0 0,382 1:6 243,0 0,327 1:7 244,0 0,359 1:7 243,0 0,301 1:8 245,0 0,344 1:8 243,0 0,286 1:9 244,0 0,321 1:9 243,0 0,256 1:10 244,0 0,307 1:10 245,0 0,249
Dari hasil titrasi UV pada tabel 1 terjadi interaksi antara vitamin C dengan akrilamida  dan  HEMA.  Ketika  mulai  ditambahkan  monomer  fungsional  terjadi pergeseran  hipsokromik  yang  menunjukkan  bahwa  ada  interaksi  dimana  terjadi penurunan panjang gelombang seiring dengan peningkatan konsentrasi monomer yang ditambahkan sehingga dapat disimpulkan akrilamida dan HEMA merupakan monomer yang dapat digunakan dalam pembuatan sintesis MIP [28]. Dari tabel 1 diketahui  perbandingan  konsentrasi  optimum  untuk  vitamin  C  berikatan  dengan akrilamida  dan  HEMA  adalah  1:4  (mol:mol),  dimana  setelah  1:4  tidak  terjadi pergeseran  panjang  gelombang  maksimal  lagi.  Nilai  konstanta  asosiasi  antara vitamin C-akrilamida sebesar -2,3965 x 10 4 M -1 dan nilai konstanta asosiasi vitamin C-HEMA sebesar -2,1201 x 10 4 M -1 .
MIP  disintesis  menggunakan  metode  ruah,  molekul  cetakan,  monomer fungsional, pengikat silang dan inisiator reaksi dimasukkan ke dalam satu wadah bersama  pelarut  porogen,  kemudian  diinkubasi  pada  temperatur  60°C  untuk menginisiasi reaksi [29]. Optimasi sintesis dilakukan dengan mencari konsentrasi
ideal  perbandingan  komponen  MIP.  MIP  yang  optimum  diperoleh  dengan perbandingan  molekul  cetakan:  monomer  fungsional:  pengikat  silang  1:4:20 (mol:mol:mol)  dengan waktu sintesis selama 24 jam pada suhu 60°C. Non-Imprinted Polimer (NIP) yaitu MIP tanpa molekul cetakan disintesis dengan metode yang sama sebagai pembanding [30].
Tabel 2. Sintesis MIP&NIP
Kode polimer Perbandingan mol molekul cetakan : monomer : pengikat silang MIP-1 1:4:20 (monomer akrilamida) NIP-1 0:4:20 (monomer akrilamida) MIP-2 1:4:20 (monomer HEMA) NIP-2 0:4:20 (monomer HEMA)

## Karakterisasi MIP
Gambar 1. Spektrum Inframerah MIP-1 (atas) dan NIP-1 (bawah)
MIP dan NIP dikarakterisasi menggunakan spektrofotometri IR dan SEM EDX untk  mengamati  dan  membandingkan  spektrum  MIP  dan  NIP.  Gambar  1  dan  2 menunjukkan  perbedaan  pada  daerah  ikatan  gugus  karbonil  (1650–1800  cm -1 ), terbentuk interaksi berupa ikatan hidrogen pada dan MIP  yang terbentuk antara gugus  karbonil  pada  vitamin  C  dengan  atom  hidrogen  pada  monomer.  Ikatan hidrogen  membuat  vitamin  C  terikat  pada  MIP  yang  ditunjukan  dengan penambahan puncak di daerah gugus karbonil pada spektrum [31]. Citra SEM pada gambar  3  dan  4  menunjukkan  NIP  memiliki  bentuk  yang  lebih  seragam
dibandingkan dengan MIP dan jumlah rongga yang lebih sedikit. Pada NIP ikatan yang terbentuk hanya dihasilkan dari monomer fungsional dan pengikat silang saja, tidak adanya ikatan yang terbentuk antara monomer fungsional dengan vitamin C. Pada MIP citra yang terbentuk lebih tidak seragam diakibatkan pembentukan ikatan antara vitamin C dengan monomer dan  pengikat silang, rongga yang terbentuk juga memungkinkan  sebagai  ruang  dalam  pemisahan  setelah  dilakukan  ekstraksi vitamin C sebagai molekul cetakan [32].
Pelepasan  molekul  cetakan  pada  MIP  bertujuan  pengenalan  kembali  dan memperoleh  pori  yang  selektif  terhadap  vitamin  C.  Proses  pelepasan  molekul cetakan umumnya dilakukan menggunakan pelarut yang digunakan dalam sintesis atau pelarut yang dapat melarutkan molekul cetakan dengan mudah [33]. Optimasi ekstraksi  dilakukan  dengan  soxhlet  menggunakan  metanol.  Optimasi  pelepasan molekul  cetakan  dilakukan  menggunakan  pelarut  metanol:asam  asetat  dengan komposisi  99:1  (volume:volume),  yang  berfungsi  untuk  membantu  pelepasan ikatan molekul cetakan dengan polimer.
Gambar 2. Spektrum Inframerah MIP-2 (atas) dan NIP-2 (bawah)
Kapasitas adsorpsi MIP dilakukan untuk mengamati kemampuannya dalam mengikat kembali vitamin C, kapasitas adsorpsi ditentukan dengan metode batch larutan vitamin C dimasukan ke dalam 3 vial, vial pertama berisi 10 mg MIP, vial kedua berisi 10 mg NIP, dan vial ketiga tanpa isi (blanko), vial diinkubasi selama 24 jam, kemudian diamati penurunan respon hasil interaksi MIP,  NIP, dan blanko [34]. Dari  hasil  penentuan  kapasitas  adsorpsi,  MIP  memiliki  selektivitas  lebih  tinggi dalam mengikat vitamin C dibandingkan dengan NIP.
Gambar 3.Citra SEM MIP-1 (atas) dan NIP- 1 (bawah) Gambar 4.Citra SEM MIP-2 (atas) dan NIP- 2 (bawah) Tabel 3. Kapasitas adsorpsi MIP dan NIP Kode polimer % Pengikatan NIP-1 32,81 NIP-2 28,79 MIP-1 64,35 MIP-2 58,71
Pembuatan Molecular Imprinted Polymer Solid Phase Extraction (MISPE) MISPE dibuat dengan memasukkan 100 mgram MIP ke dalam cartridge SPE kosong volume 2 mL kemudian ditutup dengan frit . Pengujian MISPE diawali dengan melewatkan metanol pada MISPE untuk mengaktivasi gugus-gugus fungsional pada MISPE, kemudian larutan baku vitamin C sebanyak 0,5  mL dengan  konsentrasi 1 µg/mL dilewatkan ke dalam MISPE dan dilakukan optimasi dengan berbagai eluen untuk memperoleh perolehan kembali vitamin C paling besar dari hasil pengujian [35].  Hasil  optimasi  eluen  menunjukkan  bahwa  air:metanol  (30:70)  merupakan eluen yang memberikan perolehan kembali terbesar. Dari hasil pengujian juga dapat diamati faktor imprinting (β) dengan mengamati perbandingan koefisien distribusi antara MIP dan NIP. Nilai β yang lebih besar dari 1 menunjukkan selektivitas MIP terhadap  vitamin  C,  semakin  besar  nilai  β  maka  semakin  selektif  MIP  yang dihasilkan [36].
IF = K D MISPE K D NISPE ........... persamaan 2
IF = faktor Imprinting K D = Koefisien distribusi
Tabel 4. Faktor Imprinting MIP-1 dan MIP-2 Polimer Koefisien Distribusi Faktor Imprinting (β) NIP-1 1,219 4,726 MIP-1 5,761 NIP-2 1,162 2,404 MIP-2 2,793

## Validasi Metode Analisis
Validasi  metode  analisis  dilakukan  untuk  menilai  parameter  tertentu berdasarkan pengujian laboratorium yang dibuktikan untuk memenuhi persyaratan dalam  penggunaannya.  Parameter  yang  divalidasi  antara  lain  linearitas,  batas deteksi, batas kuantisasi, akurasi, dan presisi. [37].
Tabel 5. Pengujian stabilitas larutan vitamin C Menit
Absorbansi Menit Absorbansi 0 0,5380 16 0,5358 1 0,5384 17 0,5355 2 0,5376 18 0,5358 3 0,5378 19 0,5357 4 0,5379 20 0,5352 5 0,5373 21 0,5352 6 0,5377 22 0,5357 7 0,5372 23 0,5348 8 0,5378 24 0,5349 9 0,5370 25 0,5346 10 0,5364 26 0,5347 11 0,5365 27 0,5349 12 0,5364 28 0,5345 13 0,5359 29 0,5343 14 0,5361 30 0,5346 15 0,5361 Rerata 0,5361 Standar deviasi 0,0012 Koefisien variasi (%) 0,23
Sebelum  validasi  metode  analsis,  dilakukan  pengujian  kinetika  untuk mengamati  stabilitas  larutan  vitamin  C  setelah  dipreparasi  sampai  dianalisis. Penelitian yang ada menunjukkan larutan vitamin C stabil pada rentang pH 1,0-8,4 sampai dengan 50 menit untuk analisis kuantitatif [38]. Pengujian stabilitas larutan dilakukan dengan mengamati absorbansi larutan vitamin C selama 30 menit dengan
selang  pengambilan  data  setiap  menitnya.  Dari  tabel  5  diamati  larutan  vitamin C stabil  selama  30  menit  dengan  absorbansi  yang  relatif  stabil  dan  nilai  koefisien variasi (KV) sebesar 0,23%.
Parameter  linearitas  diuji  menggunakan  larutan  vitamin  C  dengan konsentrasi  2,  4,  5,  6,  8,  10  μg/mL,  dilakukan  tiga  kali  replikasi,  dari  gambar  5 diperoleh rentang absorbansi antara 0,2 – 0,8 dengan koefisien variasi (r) sebesar 0,999, dan koefisien variasi fungsi regresi (Vx0) sebesar 1,76% yang menunjukkan bahwa metode memberikan hasil yang linear.

## Gambar 5. Kurva lineritas vitamin C
Batas deteksi dan batas kuantisasi ditentukan untuk mengamati konsentrasi terkecil  vitamin  C  yang  dapat  dianalisis,  tabel  6  menunjukkan  batas  deteksi  dan batas kuantiasi metode berturut-turut sebesar 0,34 μg/mL dan 1,02 μg/mL.
Tabel 6. Perhitungan batas deteksi dan batas kuantisasi
Y Y' Kuadrat (Y-Y') S (Y-Y') Sy/x (Sy/x)/b LOD (ug/mL) LOQ (ug/mL) 0,2330 0,2387 0,000032 0,0001 0,0057 0,1025 0,3382 1,0249 0,3780 0,3757 0,000005 0,4490 0,4442 0,000023 0,5183 0,5127 0,000032 0,6437 0,6497 0,000036 0,7867 0,7867 0,000000
Parameter akurasi dan presisi diuji dengan metode standar adisi, dilakukan perbandingan antara vitamin C yang telah diketahui nilai benarnya sebagai standar dengan  vitamin  C  yang  ditambahkan  ke  dalam  matriks  tablet  multivitamin. Pengujian menggunakan tiga level konsentrasi pada 4, 5, dan 6 μg/mL sebanyak tiga kali  replikasi.  Sampel  multivitamin  di  pasaran  mengandung  vitamin  C  dengan konsentrasi 10-100%. Menurut guideline AOAC 2016, nilai perolehan kembali harus berada pada rentang 98-102% [39], tabel 7 menunjukkan nilai perolehan kembali sebesar 98,8 %; 101,3%, dan 100,8% untuk konsentrasi 4, 5, dan 6 µg/mL berturut- turut    yang menunjukan  metode  memberikan  hasil  yang  akurat.  Terdapat  nilai perolehan  kembali  yang  lebih  dari  100%  dikarenakan  adanya  ketidakpastian
y = 0,0656x + 0,1484 R = 0,999; Vx0 = 1,76%
0 2 4 6 8 10 12 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 Konsentrasi (μg/mL) A b so rb an si Kurva Linearitas Vitamin C
analisis [40]. Parameter presisi diuji dengan menghitung nilai koefisien variasi yang diperoleh,  untuk  sampel  dengan  rentang  konsentrasi  10-100%  nilai  koefisien variasi tidak boleh lebih besar dari 1,9%. Dari tabel 7 diperoleh metode yang presisi dengan nilai koefisien variasi sebesar 1,3%; 1,9%; dan 1,2% untuk   konsentrasi 4, 5, dan 6 µg/mL berturut-turut.
Tabel 7. Perhitungan akurasi dan presisi
Konsentras i Teroritis ( μg/mL) Replikas i Absorbans i Konsentras i terukur ( μg/mL) Peroleha n kembali (%) Rerata peroleha n kembali (%) Standa r deviasi (s) Koefisie n variasi (%) 4 1 0,355 3,953 98,8 100,3 1,32 1,3 2 0,364 4,053 101,3 3 0,362 4,031 100,8 5 1 0,457 5,089 101,8 99,8 1,90 1,9 2 0,447 4,978 99,6 3 0,440 4,900 98,0 6 1 0,533 5,935 98,9 100,2 1,16 1,2 2 0,542 6,036 100,6 3 0,545 6,069 101,2 Pengaplikasian MISPE Pengujian selektivitas MIP-1 dan MIP-2 dilakukan dengan membandingkannya dengan ekstraksi cair-cair (ECC), dan SPE C 18 untuk pemisahan vitamin  C  dalam  tablet  multivitamin  di  pasaran.  Pengujian  dilakukan  sebanyak triplikasi,  sampel  vitamin  C  digerus  hingga  halus,  ditambahkan  metanol  dan disonikasi, kemudian vitamin C dalam larutan dipisahkan menggunaakan ECC, SPE C 18 ,  MIP-1,  dan  MIP-2.  Larutan  yang  telah  dipreparasi  dianalisis  dengan spektrofotometer UV menggunakan metode yang telah divalidasi dan dibandingkan dengan  larutan  vitamin  C  standar.  Perolehan  kembali  dianalisis  dengan membandingkan absorbansi sampel yang telah dipreparasi dengan MIP, ECC, dan SPE C 18 terhadap absorbansi larutan vitamin C standar. Tabel  8  menunjukkan  MIP-1  memiliki  selektivitas  paling  tinggi  dalam pemisahan  dengan  perolehan  kembali  yang  lebih  besar  dibandingkan  dengan metode ECC, SPE C 18 , dan MIP-2.
Tabel 8. Perolehan kembali MIP dengan SPE C 18 dan ECC (n=3)
Metode pemisahan Perolehan kembali (%) ECC 69,42 ± 3,01 SPE C 18 93,26±4,24 MIP-1 98,17±2,31 MIP-2 87,54±3,69

## 4. KESIMPULAN
MIP-1  yang  yang  dihasilkan  selektif  terhadap  vitamin  C  dan  memiliki selektivitas  yang  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  metode  ekstraksi  cair-cair maupun SPE C 18 untuk pemisahan vitamin C dalam sampel multivitamin di pasaran
dengan  persen  perolehan  kembali  berturut-turut  sebesar  98,17±2,31%, 69,42±3,01%, dan 93,26±4,24%.

## 5. DAFTAR PUSTAKA
[1]. Hamishehkar  H,  Ranjdoost  F,  Asgharian  P,  Mahmoodpoor  A,  Sanaie  S. Vitamins,  are  they  safe? Adv  Pharm  Bull .  2016;6(4):467–77. https://doi.org/10.15171/apb.2016.061
[2]. Gombart AF, Pierre A, Maggini S. A review of micronutrients and the immune system–working  in  harmony  to  reduce  the  risk  of  infection. Nutrients . 2020;12(1). https://doi.org/10.3390/nu12010236
[3]. Shakoor H, Feehan J, Al AS, Ali HI, Platat C, Cheikh L, et al. Immune-boosting role of vitamins D , C , E , zinc , selenium and omega-3 fatty acids : Could they help against COVID-19 ? Maturitas . 2021;143:1-9.
https://doi.org/10.1016/j.maturitas.2020.08.003
[4]. Chambial  S,  Dwivedi  S,  Shukla  KK,  John  PJ,  Sharma  P.  Vitamin  C  in  disease prevention and cure: An overview. Indian J Clin Biochem . 2013;28(4):314–28. https://doi.org/10.1007/s12291-013-0375-3
[5]. Schlueter  AK,  Johnston  CS.  Vitamin  C:  Overview  and  update. Complement Health Pract Rev. 2011;16(1):49–57. https://doi.org/10.1177/1533210110392951
[6]. Devaki SJ, Raveendran RL. Vitamin C: Sources, Functions, Sensing and Analysis. Vitam C . 2017;3–20. https://doi.org/10.5772/intechopen.70162
[7]. Abobaker A, Alzwi A, Alraied AHA. Overview of the possible role of vitamin C in  management  of  COVID-19. Pharmacol  Reports .  2020;72(6):1517–28. https://doi.org/10.1007/s43440-020-00176-1
[8]. Carr  AC,  Rowe  S.  The  emerging  role  of  vitamin  c  in  the  prevention  and treatment of covid-19. Nutrients . 2020;12(11):1–8.
https://doi.org/10.3390/nu12113286
[9]. Hoang BX, Shaw G, Fang W, Han B. Possible application of high-dose vitamin C in  the  prevention  and  therapy  of  coronavirus  infection. JGAR .  2020;23:256- 262. http://dx.doi.org/10.1016/j.jgar.2020.09.025
[10]. Holford P, Carr AC, Jovic TH, Ali SR, Whitaker IS, Marik PE, et al. Vitamin C— An  adjunctive  therapy  for  respiratory  infection,  sepsis  and  COVID-19. Nutrients . 2020;12(12):1–17. https://doi.org/10.3390/nu12123760 [11]. Arayne MS, Najma S, Zakia B. Rapid and specific spectrophotometric and RP- HPLC methods for the  determination of ascorbic acid in fruits juices and in human  plasma.  Vol.  31, Journal of  the  Chemical  Society  of  Pakistan .  2009.  p. 402–7.
[12]. Kumar KR, Praveen Kumar P, Mallikarjuna Rao N. Development and validation of RP-HPLC method for the estimation of ascorbic acid in health drinks. J Chem Pharm Res . 2011;3(3):363–74.
[13]. Rojeab  Y,  Hassoun  M,  Hazelet  E,  Myers  D.  HPLC  Method  Development  and Validation  for  Simultaneous  Quantification  of  Vitamins  C  and  K  3  in  Hard
Gelatin  Capsules  for  their  Potential  Benefit  in  Postoperative  Total  Joint Arthroplasty. Ann Clin Res Trials. 2017;1(2):1–7.
[14]. Kachhawah SS, Biswal B, Jain A. Method development and validation for the simultaneous estimation of ascorbic acid and folic acid vitamins by reverse- phase  high-performance  liquid  chromatography  method  in  cyanobacterial metabolites  and  nutraceutical  formulation. Asian  J  Pharm  Clin  Res . 2016;9(3):9–11.
[15]. Mitić  SS,  Kostić  DA,  Nasković-Dokić  DC,  Mitic  MN.  Rapid  and  reliable  HPLC method for the determination of vitamin C in pharmaceutical samples. Trop J Pharm Res . 2011;10(1):105–11. https://doi.org/10.4314/tjpr.v10i1.66549 [16]. Jin P, Xia L, Li Z, Che N, Zou D, Hu X. Rapid determination of thiamine, riboflavin, niacinamide,  pantothenic  acid,  pyridoxine,  folic  acid  and  ascorbic  acid  in Vitamins with Minerals Tablets by high-performance liquid chromatography with  diode  array  detector. J  Pharm  Biomed  Anal. 2012;70:151–7. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2012.06.020
[17]. Tankiewicz  M,  Fenik J, Biziuk  M.  Solventless  and  solvent-minimized  sample preparation  techniques  for  determining  currently  used  pesticides  in  water samples: A review. Talanta. 2011;86(1):8–22.
https://doi.org/10.1016/j.talanta.2011.08.056
[18]. Nells  HJ,  Merchle  G,  Lavens  P,  Sorgeloos  P,  De  Leenheer  AP.  Solid-Phase Extraction of Ascorbic Acid 2-Sulfate from Cysts of the Brine Shrimp Artemia franciscana. Anal Chem . 1994;66(8):1330–3.
https://doi.org/10.1021/ac00080a019
[19]. Tumbas  VT,  Dilas  SM,  Čanadanović-Brunet  JM,  Ćetković  GS,  Savatović  SM. Solid-phase extraction of antioxidant compounds from commercial cranberry extract  and  its  antiradical  activity. Acta  Period  Technol .  2007;38:157–64. https://doi.org/10.2298/APT0738157T
[20]. Said  KAM,  Radzi  Z,  Yakub  I,  Amin  MAM.  Extraction  and  quantitative determination  of  ascorbic  acid  from  banana  peel  Musa  Acuminata  “Kepok.” IIUM Eng J. 2016;17(1):103–14. https://doi.org/10.31436/iiumej.v17i1.576 [21]. Stan  M,  Soran  ML,  Marutoiu  C.  Extraction  and  HPLC  determination  of  the ascorbic  acid  content  of  three  indigenous  spice  plants. J  Anal  Chem. 2014;69(10):998–1002. https://doi.org/10.1134/S106193481410013X
[22]. Legnerová  Z,  Šatínský  D,  Solich  P.  Using  on-line  solid  phase  extraction  for simultaneous  determination  of  ascorbic  acid  and  rutin  trihydrate  by sequential  injection  analysis. Anal  Chim  Acta. 2003;497(1–2):165–74. https://doi.org/10.1016/j.aca.2003.07.007
[23]. Prasad BB, Srivastava S, Tiwari K, Sharma PS. Ascorbic acid sensor based on molecularly  imprinted  polymer-modified  hanging  mercury  drop  electrode. Mater  Sci  Eng  C. 2009;29(4):1082–7.  DOI:  10.1016/j.msec.2008.09.025. https://doi.org/10.1016/j.msec.2008.09.025
[24]. Tiwari MP, Madhuri R, Kumar D, Jauhari D, Prasad BB. Double imprinting in a single molecularly imprinted polymer format for the determination of ascorbic
acid and dopamine. Adv Mater Lett. 2011;2(4):276–80. https://doi.org/10.5185/amlett.indias.202
[25]. Roy AK, Nisha VS, Dhand C, Malhotra BD. Molecularly imprinted polyaniline film  for  ascorbic  acid  detection .  J  Mol  Recognit .  2011;24(4):700–6. https://doi.org/10.1002/jmr.1104
[26]. Prasad BB, Tiwari K, Singh M, Sharma PS, Patel AK, Srivastava S. Molecularly imprinted  polymer-based  solid-phase  microextraction  fiber  coupled  with molecularly  imprinted  polymer-based  sensor  for  ultratrace  analysis  of ascorbic acid. J Chromatogr A. 2008;1198–1199(1–2):59–66. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2008.05.059
[27]. Miller JN, Miller JC. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. 5 th ed. Edinburgh. Pearson Prentice Hall. 2005.
[28]. Damayanti  S,  Gunawan  U,  Ibrahim  S.  Development  of  molecular  imprinted polymer  solid  phase  extraction  for  separation  nitrofurantoin  residue  in chicken eggs.
Asian J Pharm Clin Res. 2017;10(6):108–11. https://doi.org/10.22159/ajpcr.2017.v10i6.17109 [29]. Yan  H,  Kyung  HR.  Characteristic  and  synthetic  approach  of  molecularly imprinted polymer. Int J Mol Sci. 2006;7(5–6):155–78.
https://doi.org/10.3390/i7050155
[30]. Haupt  K.  Molecularly  imprinted  polymers  in  analytical  chemistry. Analyst. 2001;126(6):747–56. https://doi.org/10.1039/b102799a
[31]. Hasanah  AN,  Sari  TN,  Wijaya  N,  Kartasasmita  RE,  Ibrahim  S.  Study  of  the binding ability of molecular imprinted solid phase extraction for glibenclamide by  optimizing  template:  Monomer:  Crosslinker  ratio. Int  J  Chem  Sci . 2014;12(3):863–70.
[32]. Lorenzo  CA,  Concheiro  A.  Handbook  of  Molecularly  Imprinted Polymer. United Kingdom: Smithers Rapra; 2013
[33]. Lorenzo RA, Carro AM, Lorenzo CA, Concheiro A. To remove or not to remove? The  challenge  of  extracting  the  template  to  make  the  cavities  available  in molecularly  imprinted  polymers  (MIPs). Int  J  Mol  Sci. 2011;12(7):4327–47. https://doi.org/10.3390/ijms12074327
[34]. Vasapollo G, Sole R Del, Mergola L, Lazzoi MR, Scardino A, Scorrano S, et al. Molecularly imprinted polymers: Present and future prospective. Int J Mol Sci. 2011;12(9):5908–45. https://doi.org/10.3390/ijms12095908
[35]. Simpson  NJ.  Solid-Phase  Extraction:  Principles,  Techniques,  and Applications. California: Marcel Dekker; 2000. https://doi.org/10.1201/9781420056242
[36]. Zhang  W,  She  X,  Wang  L,  Fan  H,  Zhou  Q,  Huang  X,  et  al.  Preparation, characterization  and  application  of  a  molecularly  imprinted  polymer  for selective recognition of sulpiride. Materials (Basel). 2017;10(5).
[37]. Harmita. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan Cara Perhitungannya  (Guideline  and  practical  approach  of  analytical  method validation). Majalah Ilmu Kefarmasian 2004;
1(3): 117-135.
https://doi.org/10.7454/psr.v1i3.3375
[38]. Golubitskii GB, Budko E V., Basova EM, Kostarnoi A V., Ivanov VM. Stability of ascorbic  acid  in  aqueous  and  aqueous-organic  solutions  for  quantitative determination. J Anal Chem. 2007;62(8):742–7.
https://doi.org/10.1134/S1061934807080096
[39]. AOAC International. Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements. AOAC Off Methods Anal. 2016;9.
[40]. Gustavo  González  A,  Ángeles  Herrador  M.  A  practical  guide  to  analytical method validation, including measurement uncertainty and accuracy profiles.
TrAC - Trends Anal Chem. 2007;26(3):227–38. https://doi.org/10.1016/j.trac.2007.01.009