ISSN 2548-6462 (online), ISSN 2088-8740 (print)
DOI: 10.30644/rik.v8i2.522
Komposisi metabolit sekunder dan uji toksisitas fraksi etil asetat daun leban ( Vitex pinnata Linn)
Sabarudin 1 *, Dewi Kurniasih 2
1 Program Studi D3 Farmasi Jurusan Farmasi, Poltekkes Kemenkes Jambi, Indonesia.
2 Program Studi D3 Teknologi Laboratorium Medik (TLM) Jurusan Analis Kesehatan, Poltekkes Kemenkes Jambi, Indonesia.
*Email korespondensi : sabarudin6kadipan@gmail.com
Accepted: 10 Juni 2021; revision: 15 Juni 2021; published: 30 Juni 2021

## Abstrak
Latar  Belakang: Leban  ( Vitex  Pinnata Linn)  adalah  tumbuhan  tinggi  yang  dikenal  sebagai  salah satu bahan ramuan obat tradisional untuk luka, demam dan sakit perut. (Tujuan) untuk mengetahui komposisi kandungan metabolit sekunder dan potensi toksisitas akut beberapa fraksi dari  ekstrak pucuk leban, sehingga penggunaanya oleh masyarakat memiliki pondasi ilmiah.
Metode: penelitian  diawali  dengan  penyediaan  sampel  yaitu  bagian  pucuk  atau  daun  muda  yang dipanen  dari  pohon  leban  yang  tumbuh  liar  disekitar  perkebunan  penduduk  di  Desa  Pudak. Pengolahan  sampel  melalui  tahapan  seleksi  pucuk  segar,  dicuci  dengan  air  bersih  mengalir, dianginkan untuk pengeringan dan seleksi sampel setelah kering serta dijadikan serbuk simplisia. Sediaan serbuk simplisia  diekstraksi dingin dengan pelarut  n-heksana selama 3 x 24 jam dengan tiga kali pengulangan. Maserat selanjutnya dipisahkan menggunakan corong kaca dan kertas saring, kemudian  diuapkan  dengan  alat vacuum  rotary  evaporator sehingga  diperoleh  ekstrak  kental. Ekstrak  kental  difraksinasi  berdasarkan  tingkat  kepolaran  pelarut  dimulai  dengan  petrolium  eter, kemudian etil asetat selanjutnya dengan metanol. Masing-masing filtrat diuapkan dan dikeringkan untuk memperoleh fraksi petroleum eter, fraksi etil asetat dan fraksi methanol. Setiap fraksi kemudian diidentifikasi  kandungan metabolit sekundernya dan dilakukan uji toksisitas akutnya terhadap larva udang.
Hasil : Hasil  pengamatan  terhadap  perubahan  warna  dalam uji fitokimia dan  berapa jumlah larva udang yang mati setelah 1 x 24 jam diberikan bahan uji untuk setiap perlakuan dicatat. Hasil skrining fitokimia menunjukkan bahwa didalam ekstrak kental terdapat golongan saponin dan flavonoid serta tidak  teridentifikasi  adanya  golongan  alkaloid.  Fraksi  etil  asetat  hanya  mengandung  golongan flavonoid dan golongan saponin. Uji toksisitas menunjukkan hanya fraksi etil asetat yang tergolong toksik akut, analisis probit uji toksisitas memberikan hasil perhitungan dengan nilai  LC 50 = 218 ppm. Kesimpulan :  Pucuk Vitex  pinnata Linn  memiliki  komposisi  metabolit  sekunder  yaitu  golongan triterpenoid, golongan flavonoid dan golongan saponin. Tingkat toksisitas akut dari fraksi etil asetat tergolong sedang.
Kata kunci: Ekstraksi, fraksinasi dan toksisitas, metabolit sekunder, Vitex Pinnata Linn

## Abstract
Background: Leban (Vitex Pinnata Linn) is a tall plant known as one of the ingredients of traditional medicine for wounds, fever and stomach pain. (Purpose) to determine the composition of secondary metabolites and potential acute toxicity of several fractions of leban shoot extract, so that their use by the public has a scientific foundation.
Methods: the  research  begins  with  the  provision  of  samples,  namely  the  shoots  or  young  leaves harvested from the leban tree that grows wild around the plantations of residents in Pudak Village. Processing of samples through the stages of selection of fresh shoots, washed with clean running water, aerated for drying and selection of samples after drying and made into simplicia powder. The simplicia powder preparation was cold extracted with n-hexane solvent for 3 x 24 hours with three repetitions. The macerate was then separated using a glass funnel and filter paper, then evaporated
using  a  vacuum  rotary  evaporator  to  obtain  a  thick  extract.  The  viscous  extract  was  fractionated based on the level of solvent polarity starting with petroleum ether, then ethyl acetate followed by methanol. Each filtrate was evaporated and dried to  obtain petroleum ether fraction, ethyl acetate fraction  and  methanol  fraction.  Each  fraction  was  then  identified  its  secondary  metabolite  content and tested for its acute toxicity to shrimp larvae.
Results: The results of observations of color changes in the phytochemical test and the number of shrimp larvae that died after 1 x 24 hours of being given the test material for each treatment were recorded.  The  results  of  the  phytochemical  screening  showed  that  in  the  thick  extract  there  were groups of saponins and flavonoids and no alkaloids were identified. The ethyl acetate fraction only contains  flavonoids  and  saponins.  Toxicity  test  showed  that  only  the  ethyl  acetate  fraction  was classified as acutely toxic, probit analysis of the toxicity test gave the calculation result with LC 50 = 218 ppm. Conclusion: The shoots of Vitex pinnata Linn have secondary metabolite composition, namely the triterpenoid group, the flavonoid group and the saponin group. The acute toxicity level of the ethyl acetate fraction is moderate.
Key words: Vitex Pinnata Linn; secondary metabolite; extraction; fractionation and toxicity.

## PENDAHULUAN
Vitex  Pinnata Linn  yang  juga  dikenali dengan  nama Vitex  Pubescens Linn(1).  Di pulau  Sumatera  tumbuhan  ini  dikenali dengan  berbagai  nama  antara  lain  leban, halban,  halaban,  kayu  bagak,  dan  akar leban.  Tumbuhan  ini  dijumpai  hampir diseluruh tempat di Asia Tenggara, di tanah rendah, di hutan-hutan lebat, hutan sekunder,  di  pinggiran  sungai,  ditempat terbuka  seperti  di  tepi-tepi  jalan  dan  di  tepi pantai(2). Pohon leban juga dilaporkan lebih banyak tumbuh dan ditemukan pada lahan- lahan bekas ladang atau lahan sekunder(3) dan disekitar perkebunan penduduk(4).
Beberapa  bagian  dari  tumbuhan  ini dapat dimanfaatkan sebagai obat tradisional, daunnya  digunakan  sebagai  obat  demam, peransang  makan,  dan  obat  luka.  Air rebusan  kulit  batang Vitex  Pinnata dapat menghilangkan  sakit  perut,  dan  daunnya digunakan sebagai obat demam dan luka(5). Kulit batang dilaporkan dapat menyembuhkan  sakit  perut,  luka,  dan  juga digunakan sebagai bahan pewarna sedangkan  akar  digunakan  sebagai  obat sakit  perut(6),  penelitian  lain  melaporkan kulit  batang  juga  berkhasiat  sebagai  obat sakit perut, obat masuk angin, dan penyegar badan(3).  Masyarakat  Desa  Jembayan Kabupaten Kutai Kalimantan Timur biji leban digunakan sebagai obat demam, kulit batang
dan  daunnya  digunakan  untuk  mengobati luka, meredakan nyeri dan demam(7).
Sampai saat ini baru terdapat beberapa laporan  ilmiah  yang  telah  mempublikasikan hasil  penelitian  yang  berkaitan  kandungan kimia  dan  aktivitas  biologi  leban  ( Vitex Pinnata Linn). Sebuah ecdisteroid baru yaitu pinnatasterone, bersama
20-
hydroxyecdysone  dan  turkesterone  dari ekstrak  kulit  batang Vitex  pinnata (8). Sementara itu juga dari ekstrak kulit batang Vitex  pinnata,  di  temukan  glukosida  iridoid baru,  pinnatoside  dan  tiga  flavonoid  yang diketahui, viscioside, apigenin, dan luteolin(9). Terbaru  dalam  Prosiding  Seminar
Nasional Kimia 2017, di Universitas
Mulawarman, Samarinda, Kalimantan Timur dilaporkan berhasil diisolasi senyawa turunan fenol dari ekstrak daun Vitex pinnata yaitu 4-hidroksil metil benzoate(10). Bersamaan  dengan  itu  juga  dilaporkan bahwa  uji  antioksidan  terhadap  ekstrak metanol,  etil  asetat  dan  air  memberikan persentase (%) hambatan pada konsentrasi 100  ppm  paling  tinggi  yaitu  masing-masing 95,47;  95,79;  dan  96,22  ppm  dengan  rata- rata aktivitas sebagai antioksidan IC 50 41.08 ppm(11).
Di daerah pedesaan masyarakat Provinsi  Jambi  juga  menggunakan  rebusan kulit  batang  dan  rebusan  kulit  akar  dari
tumbuhan leban ( Vitex Pinnata Linn) sebagai ramuan  untuk  obat  sakit  perut.  Secara entnomedisin diketahui masyarakat pedesaan  menggunakan  air  rebusan  pucuk atau daun muda leban sebagai ramuan obat untuk penderita kencing manis.
Penelusuran  terhadap  pustaka  digital dan  publikasi  ilmiah  melalui  teknologi informasi digital belum ditemukan penelitian lokal  Jambi  tentang  kandungan  komponen kimia dan aktifitas biologi ramuan obat yang terbuat  dari  bagian  tumbuhan  leban.  Untuk itu dilakukan penelitian agar dapat mengetahui komposisi kandungan metabolik sekunder dan aktivitas toksik akut fraksi dari ekstrak  kental  n-heksana  pucuk Vitex Pinnata Linn.
Tujuan Penelitian untuk mengidentifikasi komposisi metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak n-heksana pucuk Vitex  Pinnata Linn  dan  untuk  mengukur potensi  serta  tingkat  toksisitas  akut  fraksi dari ekstrak n-heksana. Diharapkan dengan penelitian ini maka konsumsi rebusan pucuk leban  sebagai  ramuan  obat  tradisional  oleh masyarakat memiliki dukungan kajian ilmiah.

## METODE Jenis Penelitian
Penelitian  ini  tergolong  eksperimen observasi  laboratorium  dengan  metode kualitatif untuk mengetahui golongan metabolit  sekunder  yang  terkandung  dalam masing-masing sampel penelitian dan aktifitas toksik akutnya.

## Alat dan bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain vacuum rotary evaporator (Model : HS 2005S-N), Oven, beker gelas (Iwaki®), gelas  ukur  (Pyrex®),  vial,  spatel,  batang pengaduk,  pisau,  corong  pisah  kaca (Pyrex®),    botol  berwarna  gelap  untuk maserasi,  corong  kaca,  tabung  reaksi,  rak tabung reaksi, labu ukur (Iwaki®), pipet ukur, timbangan  digital  (Durascale  DPB2000), lemari asam (Model FH-1500), kertas saring, waterbath (Faithful Dk-2000), blender (Philips  Tipe  HR  2115),  alumunium  foil,
cawan penguap, freeze dryer (Mini Vacuum Lab  CE),  lampu  UV,  Fortable  5  Watt  (12), kaca pembesar (LUV.100mm).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : daun muda atau pucuk leban ( Vitex  Pinnata Linn),  n-heksana  (Merck), petroleum  eter  (Merck),  etil  asetat,  metanol teknis,  kloroform  (Merck),  amonia  (Merck), asam  klorida  (Merck),  pereaksi  Meyer, pereaksi  Dragendrof,  perekasi  Wagner, serbuk  magnesium  (Mg),  asam  sulfat (Merck),  asam  asetat  anhidrat,  feriklorida, metanol (Merk) asam asetat, reagen DPPH, asam galat, akuades dan larva udang (13).

## Preparasi Sampel
Sampel  yang  diteliti  diperoleh  dari pohon  leban  yang  cukup  tua  dengan ketinggian  pohon  5-7  meter  tumbuh  liar disekitar  perkebunan  masyarakat  Dusun  I Desa Pudak Kumpeh Ulu Kabupaten Muaro Jambi  Provinsi  Jambi.  Sampel  dibersihkan dari  kotoran  yang  melekat,  dicuci  bersih dengan air mengalir, lalu dipotong kecil-kecil. Selanjutnya dikeringkan dengan mengangin- anginkannya didalam ruangan. Sampel yang sudah kering selanjutnya dihaluskan dengan menggunakan  blender  hingga  berbentuk serbuk dan ditimbang (12).

## Ekstraksi
Serbuk  pucuk  atau  daun  muda  leban sebanyak  3000  g,  dimasukkan  kedalam  6 buah  botol  gelap  @  500  g,  lalu  direndam (maserasi)  dengan  masing-masing  500  mL n-heksana. Perendaman dilakukan selama 3 x  24  jam,  setiap  8-12  jam  dilakukan pengadukan menggunakan batang pengaduk  dari  kaca  atau    porselen. Perendaman serbuk dengan pelarut dilakukan pengulangan sampai pelarut tidak berwarna atau sekurang-kurangnya tiga kali pengulangan (12).
Maserat yang dihasilkan disaring dengan  menggunakan  corong  kaca  yang dipasangi  kertas  saring  dipermukaannya untuk  mendapatkan  filtrat.  Selanjutnya masing-masing filtrat yang diperoleh dipisahkan  zat  terlarutnya  dengan  cara
menguapkan pelarutnya dengan
memanfaatkan  perbedaan  titik  didihnya secara  evaporasi  yang  menggunakan  alat vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental  n-heksana (14).

## Fraksinasi
Ekstrak  kental  kemudian  dilarutkan dengan  air  (1:1)  untuk  difraksinasi  dengan berbagai pelarut bedasarkan tingkat kepolarannya.  Sampel  dimasukkan  dalam corong  pisah,  ditambahkan  dengan  pelarut non  polar  yaitu  petrolium  eter  secukupnya. Terbentuk dua lapisan, zat terlarut non polar terperangkap dalam lapisan pelarut petrolium eter yang lain masih berada dalam lapisan  air.  Langkah  ini  dilakukan  tiga  kali pengulangan, sehingga akan di dapat fraksi petrolium  eter  dan  fraksi  air.  Fraksi  air dilanjutkan  dengan  penambahan  pelarut semi  polar  yaitu  etil  asetat  secukupnya dilakukan  3  kali  pengulangan,  sehingga  di dapat fraksi etil asetat dan fraksi air. Fraksi air  dilanjutkan  dengan  penambahan  pelarut polar yaitu metanol sehingga diperoleh fraksi metanol  dan  fraksi  sisa  (residu).  Masing- masing filtrat kemudian dikeringkan menggunakan  metode  evaporator,  untuk dilakukan skrining fitokimia dan uji toksisitas akut.
Rendemen dihitung dengan rumus(15) :
% Rendemen = x100%

## Uji Triterpenoid
Pemeriksaan triterpenoid dilakukan dengan reaksi Liebermann-Burchard. Larutan  uji  sebanyak  2 mL diuapkan  dalam cawan porselin. Residu penguapan dilarutkan  dengan  0,5  mL  kloroform,  dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 0,5 mL asam  asetat  anhidrat.  Asam  sulfat  pekat sebanyak  2  mL  selanjutnya  ditambahkan melalui  dinding  tabung.  Terbentuk  cincin kecoklatan  atau  violet  pada  perbatasan larutan menunjukkan adanya triterpenoid(16).
Uji Flavonoid.
Larutan ekstrak sebanyak 2 mL ditambah  dengan  sedikit  serbuk  Mg  dan  2 mL  HCl  2N.  Senyawa  flavonoid  akan menimbulkan warna jingga sampai merah(16).

## Uji Saponin.
Larutan  ekstrak  ditambahkan  akuades dan  digoncang  dengan  kuat,  adanya senyawa saponin ditandai dengan terbentuknya busa 1-10 cm yang stabil dan busa  bertahan  tidak  kurang  dari  10 menit(16).

## Uji Alkaloid.
Sejumlah larutan ekstrak ditambahkan 3 tetes  H 2 SO 4 ,  2N  kemudian  dipanaskan selanjutnya diuji dengan reagen Dragendroff,  Meyer  dan  Wagner.  Hasil  uji positif  diperoleh  bila  terbentuk  endapan merah  hingga  jingga  pada  penambahan reagen  Dragendroff  dan  endapan  putih kekuningan  pada  penambahan  reagen Mayer. Serta terbentuk endapan kecoklatan pada penambahan reagen Wagner(16) .

## Uji Toksisitas dengan Metode BSLT
Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT) merupakan salah satu metode untuk menguji bahan-bahan  yang  bersifat  toksik  dan digunakan  sebagai  suatu  bioassay  yang pertama  untuk  penelitian  bahan  alam. Metode  ini  menggunakan  larva Artemia salina  Leach sebagai  hewan  coba.  Uji toksisitas dengan metode BSLT ini merupakan  uji  toksisitas  akut  dimana  efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu  singkat,  yaitu  rentang  waktu  selama 24 jam setelah pemberian dosis uji.
Prosedurnya  dengan  menentukan  nilai LC 50 dari  aktivitas  komponen  aktif  tanaman terhadap  larva  anak  udang.  Suatu  ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika  harga  LC 50 <  1000  µg/  mL.  Hasil penelitian    menunjukkan  adanya  hubungan yang konsisten antara toksisitas dan letalitas Brine  shrimp  pada  ekstrak  tanaman(17).
Metode  BSLT  dapat  dipercaya  untuk menguji  aktivitas  farmakologis  dari  bahan- bahan  alami(18).    Suatu  ekstrak  tanaman bersifat  toksik  menurut  harga  LC 50 dengan metode BSLT, maka tanaman tersebut dapat dikembangkan sebagai obat anti kanker(19).
Air laut buatan dengan cara melarutkan 40  g  NaCl  dalam  2000  ml  akuades, kemudian disaring untuk memisahkan kotoran  dan  material  tidak  larut.  Air  laut sebanyak  dimasukkan  ke  dalam  2  wadah yang  berbeda  dan  dibatasi  dengan  sekat yang telah diberi lubang. Salah satu bagian ditutup  dengan  aluminium  foil,  sedangkan bagian  yang  lain  dibiarkan  terbuka  yang pada  bagian  atasnya  dipasangi  lampu  pijar listrik.
1. Penyiapan larva Artemia Salina Leach Penyiapan  larva  dilakukan  dengan mengambil  telur Artemia  Salina  Leach sebanyak  1 g,  dimasukkan  kedalam  wadah yang bertutup. Penetasan dilakukan dengan cara merendam telur tersebut dalam air laut buatan dan diberi penerangan dengan lampu pijar  40-60  watt  serta  diaerasi  selama  48 jam.  Dalam  waktu  48  jam,  telur  akan menetas  menjadi  larva  (nauplis)  dan  siap digunakan untuk penelitian(18).  .
2. Penyiapan Larutan Stok Ditimbang  masing-masing  fraksi  kental sebanyak  0,5  g  dan  dilarutkan  dengan  air laut buatan hingga volumenya mencapai 250 mL untuk membuat konsentrasi sampel 2000 ppm.  Dari larutan uji 2000 ppm, selanjutnya dibuat lagi larutan dengan konsentrasi 1000 ppm,  100  ppm  dan  10  ppm  dengan  cara pengenceran.  Apabila  terdapat  fraksi  yang sukar  larut  dalam  air  laut  buatan,  dapat ditambahkan  DMSO  1%  sebanyak  tiga tetes(18).
3. Pelaksanaan Uji Toksisitas Masing-masing  larutan  fraksi  dengan konsentrasi  masing-masing  10  ppm;  100 ppm; 1000 ppm dipipet 6 mL dimasukkan ke dalam botol vial, kemudian ditambah 4 ml air laut buatan yang berisi 10 ekor nauplis. Satu botol vial digunakan sebagai kontrol 10 ml air
laut  buatan  dan  10  ekor  nauplis.  Setiap perlakuan dibuat sebanyak tiga kali pengulangan.  Jumlah  nauplis  yang  mati dihitung setelah 24 jam dan dianalisa untuk menentukan nilai LC 50 . Selanjutnya dihitung persen kematian larva udang setelah 24 jam perlakuan  menggunakan  rumus  dibawah ini(18).
% Larva = !"
# x 100%

## Analisis Data
Data  mortalitas  pada  uji  utama/definitive merupakan  angka  acuan  untuk menghitung nilai lethal  consentration dengan  analisa probit.  Hubungan  nilai  logaritma  dari konsentrasi bahan uji dengan nilai probit dari persentase mortalitas hewan uji merupakan fungsi  linier  dari  y  =  a  +  bx9.  Nilai  LC 50 didapat  dari  hasil  antilog  nilai  uji  m.  Nilai  m merupakan nilai x pada persamaan dan nilai y merupakan probit mortalitas sebesar 50%. Secara matematis, perhitungan untuk menentukan  nilai  LC 50 adalah  sebagai berikut(20):
$  = % ! ( ∑ ' − )   ∑ * ) ;
)  = ,!.∑ . )/,∑ .∑ ) ,!∑. 0 / ,∑ .)²
Persamaan regeresinya adalah(20):
' = $ + )* , 3  = ,4/ ) 5
Keterangan  :  x=probit  kematian  hewan  uji, y=logaritma  konsentrasi  uji,  a=konsentrasi regresi,  b=slope/kemiringan  regresi,  dan logaritma  konsentrasi  (x)  pada  probit mortalitas (y) 50% (y = 5)(20).

## HASIL Rendemen
Rendemen adalah istilah untuk menyatakan  perbandingan  dalam  persen antara  ekstrak  atau  fraksi  yang  diperoleh dengan  berat  total  simplisia.  Rendemen pucuk Vitex Pinnata Linn dihasilkan sebagaimana disajikan dalam Tabel 1.
Tabel 1. Rendemen Ekstrak Dan Fraksi No Sediaan Berat (g) Rendemen (%) 1 simplisia 3000,0 1.1 ekstrak kental 376,0 12,53 1.2 fraksi p.eter 06,7 0,22 1.3 fraksi e. asetat 21,3 0,71 1.4 fraksi metanol 50,8 1.69 1.5 fraksi air 297,2 9,91 Preparasi Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah pucuk atau daun muda leban  ( Vitex  Pinnata Linn.).  Preparasi sampel melalui serangkaian tahapan berikut yaitu  pengumpulan,  pencucian  dengan  air yang  mengalir,  pengeringan  tanpa  cahaya matahari langsung, dan penghalusan sampel hingga menjadi serbuk.
Ekstraksi adalah suatu teknik pemisahan  zat  atau  komponen  aktif  dari suatu sampel menggunakan pelarut tertentu(21). Ekstrasi dengan metode maserasi adalah metode perendaman bahan dengan pelarut yang sesuai dengan senyawa  aktif  yang  akan  diambil  dengan tanpa  adanya  proses  pemanasan.  Metode maserasi dipilih untuk menghindari terjadinya  kerusakan  terhadap  senyawa kimia  yang  terkandung  dalam  sampel. Pemilihan n-heksana sebagai pelarut pertama dalam ekstraksi karena merupakan pelarut non-polar yang bersifat stabil, mudah menguap  dan  cukup  selektif.  Selain  itu  n- heksana  dinilai  lebih  efektif  mengekstrak pewangi  dalam  jumlah  besar  berbanding pelarut etanol(11).
Ekstrak n-heksana selanjutnya dilarutkan dengan air kemudian dimasukkan kedalam  corong  pisah  dan  difraksinasi berturut-turut menggunakan pelarut petrolium  eter,  etil  asetat  dan  metanol, dengan perolehan rendemen sesuai Tabel 1. Masing-masing fraksi kemudian dilakukan uji skrining fotokimia.

## PEMBAHASAN Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia ekstrak organik sampel  untuk  mengidentifikasi  kehadiran triterpenoid,  saponin, flavonoid  dan  alkaloid telah  dilakukan.  Hasil  uji  triterpenoid menunjukkan  bahwa  fraksi  petrolium  eter dan  fraksi  etil  asetat  adalah  positif. Pengamatan  terhadap  uji  Liebermann- Burchard memperlihatkan perubahan warna menjadi  hijau  kekuning-kuningan  dan  biru, tetapi tidak terjadi  perubahan warna terhadap  fraksi  metanol.  Perubahan  warna mengindikasikan bahwa positif  (++) terdapat golongan triterpenoid.
Uji flavonoid memperlihatkan perubahan positif  terhadap  fraksi  etil  asetat  dan  fraksi metanol,  tetapi  negatif  terhadap  fraksi petrolium  eter.  Fraksi  etil  asetat  dan  fraksi etanol  setelah  ditambah  dengan  sedikit serbuk  Mg  dan  2  ml  HCl  2N  terjadi perubahan  warna  menjadi  kuning  jingga. Perubahan tersebut mengindikasikan adanya golongan flavonoid.
Uji  saponin  menunjukkan  hanya    fraksi petrolium  eter  yang  hasil  positif  (++), kandung golongan saponin ditandai dengan terbentuknya buih yang stabil dan bertahan sampai  60  menit  setelah  ditambahkan akuades  dan  diguncang  searah  kuat-kuat. Perlakuan yang sama untuk fraksi etil asetat dan fraksi metanol tidak terbentuk buih yang stabil.
Dari  seluruh  fraksi  pucuk  leban  ( Vitex Pinnata Linn),  menggunakan  tiga  macam reagent spesifik untuk alkaloid memperlihatkan  tidak  satupun  fraksi  yang diuji  menunjukkan  tanda-tanda  adanya kandungan  alkaloid.  Hasil  pengamatan skrining  uji  fitokimia  terhadap  masing- masing fraksi  diperlihatkan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Nilai Skrining Fitokimia
Fraksi Skrining Fitokimia 1 2 3 4.a  4.b 4.c p. eter ++ - ++ - - - e. asetat ++ ++ - - - - metanol - ++ - - - -
Keterangan : 1    = uji triterpenoid
2    = uji flavonoid 3    = uji saponin 4.a = uji alkaloid (reagen Dragendroff)
4.b = uji alkaloid (reagen Meyer)
4.c = uji alkaloid (reagen Wagner)

## Uji Toksisitas
Preparasi  Hewan  Uji.  Air  laut  buatan dimasukkan  ke  dalam  wadah  yang  telah dibagi  menjadi  dua  bagian,  yaitu  sebagian ditutup dan bagian lainnya dibiarkan terbuka dan  diletakkan  lampu  pijar.  Pemasangan lampu  pijar  dilakukan  untuk  memberikan cahaya  yang  dapat merangsang  penetasan telur Artemia Salina Leach . Selanjutnya telur dimasukkan  kedalam  wadah  yang  telah berisi  air  laut  buatan  pada  bagian  yang tertutup.  Kedalamnya  ditambahkan  oksigen dengan memberikan gelembung-gelembung halus  udara  kedalam  air  menggunakan aerator. Setelah 48 jam telur akan menetas membentuk  naupli  dan  bergerak  ke  bagian yang  terkena  cahaya,  naupli  yang  sehat dengan  anggota  tubuh  lengkap  akan dijadikan hewan coba.
Hasil uji menunjukkan beban konsentrasi  masing-masing  fraksi  dalam media  dapat  membunuh  larva  secara berturut-turut dengan konsentrasi 1000, 100, dan  10  ppm.    Jumlah  larva  tiap  gelas  uji adalah  10  ekor  dan  tiap  konsentrasi dilakukan tiga kali pengulangan. Jumlah total larva  yang  digunakan  adalah  120  ekor. Untuk bantu dalam mengamati pertumbuhan dan  perkembangan  larva  sampai  pada pengujian  toksisitas  akut  digunakan  kaca pembesar.
Hasil uji toksisitas menunjukkan bahwa terdapat  hewan  coba  yang  mengalami kematian  setelah  24  jam  dalam  fraksi  etil asetat, dan tidak didapati hewan coba yang mati  untuk    fraksi  petrolium  eter  dan  fraksi metanol. Analisis probit dengan menggunakan  SPSS  15.0  for  windows menunjukkan  harga  LC 50 dari  seluruh ekstrak  diperoleh  nilai  LC 50 pada  rentang antara 218 ppm sampai dengan > dari 1000
ppm.  Fraksi  etil  asetat  pucuk  leban memberikan  nilai  LC 50 218  ppm,  fraksi petrolium eter dan fraksi metanol menghasilkan  nilai  LC 50 >1000  ppm.  Hasil analisis  nilai  LC 50 masing-masing  fraksi sebagaimana dalam Tabel 3.
Tabel 3 . Perolehan Nilai LC 50 setiap fraksi.
No Fraksi LC 50 (ppm) 1.2  petrolium eter > 1000 1.3  etil asetat 218 1.4  Metanol > 1000

## KESIMPULAN
Skrining fitokimia terhadap fraksi petroleum  eter,  fraksi  etil  asetat  dan  fraksi methanol  dari  ekstrak  n-heksana  pucuk leban ( Vitex Pinnata
Linn) hanya memperlihatkan adanya kandungan
golongan triterpenoid, saponin dan flavonoid,  dan  tidak  terdapat  golongan alkaloid.  Sementara  uji  toksisitas  terhadap semua fraksi menunjukkan  hanya  fraksi  etil asetat  yang  memiliki  tingkat  toksisitas  akut tergolong  sedang.  Analisis  probit  toksisitas akut fraksi etil asetat dari ekstrak n-heksana pucuk leban ( Vitex pinnata Linn) dengan nilai LC 50 = 218 ppm.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Uphof.  Dictionary  of  Economic  Plant. New York: J.Cramer; 1968. 545 p.
2. Keng  H.  Order  And  Families  of Malayan  Seed  Plants.  III.  Singapura: Singapure University Press; 1983.
3. Adelina  K,  Wardenaar  E,  Sisillia  L. Kajian  Etnobotani  dan  Fisiko  Kimia
Kulit  Kayu  Laban  (  Vitex  pubescens Vahl)  di  Desa  Lape  Kecamatan Kapuas Kabupaten Sangau Kalimantan  Barat.  J  Hutan  Lestari. 2014;2(1):92–9. 4. Corner.  Wayside  Tree  of  Malaya.  II. Kuala  Lumpur:  United  Selangor Press; 1988. 754 p.
5. Burkill. A Dictionary of The Economic Product  of  The  Malay  Peninsula.  V. London; 1968. 198–200 p.
6. Mastura,  Barus  T,  Marpaung  L,
Simanjuntak  P.  Aktivitas  Antioksidan Dan Toksisitas Fraksi Etil Asetat Dari Daun Halban (Vitex Pinnata Linn) Asal
Aceh.  Talent  Conf  Ser  Sci  Technol. 2019;2(1):45–51.
7. Setiawati. Utilization Of Laban Wood ( Vitex  Pubescens  Vahl  )  As  Raw Materials  Traditional  Charcoal  By
Communitis  ’ :  A  Case  Study  At Jembayan  Village  East  Kalimantan.
Int J Sci Technol Res. 2017;6(02).
8. Suksamrarn A. ECDYSTEROIDS FROM VIZ ’ EX PINNATA. Phytochemistry. 1993;32(2):303–6.
9. Ataa  A,  Mbonga  N,  Iversona  CD, Samarasekera  R.  Minor  Chemical
Constituents  of  Vitex  pinnata.  Nat
Prod Commun. 2009;4:10–3.
10. Mastura,  Barus  T,  Marpaung  L, Simanjuntak P. SENYAWA FENOLIK
DARI  DAUN  HALBAN  (Vitex  pinnata Linn) SEBAGAI ANTIOKSIDAN. Pros
Semin Nas Kim. 2017;(1966).
11. MASTURA, TONEL  BARUS,  LAMEK MARPAUNG PS. Isolation and Identification  of  Iridoid  from  Water Extract  of  Leaves  of  Vitex  pinnata
Linn.  as  Antioxidant.  Asian  J  Chem. 2018;30(4):814–6.
12. Yulianis,  Hadriyati  A,  Sanuddin  M,
Putriani  N,  Cahyani  IS,  Fitriani  E.  Uji Kadar Polifenol , Uji Aktivitas Antioksidan  Dan  Tabir  Surya  Kulit Buah Pinang. J Ipteks Terap.
2020;14(2):51–9.
13. Faskalia,  Wibowo  MA.  SKRINING FITOKIMIA, UJI AKTIVITAS, ANTIOKSIDAN DAN UJI SITOTOKSIK  EKSTRAK  METANOL PADA  AKAR  DAN  KULIT  BATANG SOMA (Ploiarium alternifolium). J Kim
Khatulistiwa. 2014;3(3):1–6.
14. Julianto  TS.  Fitokimia  -  Tinjauan Metabolit  Sekunder  dan  Skrining
Fitokimia.  Yogyakarta:  UII  Press; 2019.
15. Dewatisari WF, Rumiyanti L, Rakhmawati I. Rendemen dan Skrining Fitokimia pada Ekstrak Daun
Sanseviera  sp.  J  Penelit  Pertan Terap. 2017;17(3):197–202. 16. Harbone. Metode Fitokimia. 1987.
17. Carballo  JL,  Hernández-inda  ZL, Pérez  P,  García-grávalos  MD.  A comparison between two brine shrimp assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural products. BMC Biotechnol. 2002;5:1–5.
18. Meyer  BN,  Ferrigni  NA,  Putnam  JE, Jacobsen LB, Nichols DE, Mclaughlin JL.  Brine  Shrimp :  A  Convenient General  Bioassay  for  Active  Plant Constituents.  J  Med  Plant  Res. 1982;45:31–4.
19. Mclaughlin  JL,  Rogers  LL,  Anderson JE.  THE  USE  OF  BIOLOGICAL ASSAYS TO EVALUATE BOTANICALS. Drug Inf J. 1998; 20. Hendri M, Diansyah G, Tampubolon J. Konsentrasi  Letal  (LC  50  -48  jam) Logam  Tembaga  (Cu)  dan  Logam Kadmium  (Cd)  Terhadap  Tingkat Mortalitas  Juwana  Kuda  Laut  ( Hippocampus  spp).  J  Penelit  Sains. 2008;13(D):26–30.
21. Munawaroh  S,  Astuti  P.  Ekstraksi Minyak  Daun  Jeruk  Purut  (  Citrus hystrix D . C .) Dengan Pelarut Etanol dan  N-Heksana.  J  Kompetensi  Tek. 2010;2(1):73–8.