## PENURUNAN KADAR MATRIKS EKSTRASELULER UTERUS TIKUS DENGAN BERTAMBAHNYA UMUR
(The Decrease of Extracellular Matrix of Rats’ Uterus at Various Level of Ages)
Safrida
Prodi Pendidkan Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Syiah Kuala. Email:idabiologi@yahoo.co.id

## Abstract
This  study  aims  to  determine  the  levels  of  extracellular  matrix  (collagen  content)  at various levels of aged rats and aged rats to acquire suitable for use as an animal model of aging for the  reproductive  system.  Experimental  design  used  was  Complete  Randomized  Design  (CRD), which consists of 5 (five) experimental  groups, each  group  consist of  three (3) rats,  which is the group  one  used      12  months  aged  rats  (K12),  group  2  used  18  months  aged  rats  (K18),  group  3 used 24 months aged rats (K24), a group of 4 using 30 months aged rats (K30), groups of 5 using 36  months  aged  rats  (K36).  The  data  obtained  were  analyzed  using  Analysis  of  Variance (ANOVA)  followed  by  Duncan  test.  Decreased  levels  of  collagen  (extracellular  matrix)  of  the uterus  begin  to  occur  in  rats  aged  24  months.  An  aged  rat  suitable  for  use  as  animal  models  of aging for the reproductive system is a 24-36 months aged rats.
Key words : collagen uterus, age, animal models of aging, female rats.

## PENDAHULUAN
Kolagen merupakan matriks ekstrasel  berupa  protein  struktural,  sebagai pengikat  antarsel  dan  sangat  berhubungan dengan penuaan karena menyangkut perubahan sintesis protein. Penurunan kelarutan  kolagen  dengan  bertambahnya umur terjadi akibat penurunan enzim kolagenase  secara  tajam,  penurunan  ini meningkatkan  ikatan  silang  antara  fibril kolagen  dan  perubahan  daya  regang  kolagen (Kanungo 1994). Fase penuaan menyebabkan penurunan beberapa fungsi tubuh. Penurunan fungsi  organ  tubuh  berbeda  bergantung  pada waktu.  Salah  satu  penuaan  tingkat  seluler dapat dilihat dari penurunan protein struktural seperti kolagen (Rastogi 2007).
Pada  lapisan  endometrium  uterus terdapat  jaringan  ikat  kolagen.  Kolagen adalah  struktur  penunjang  pada  uterus sebagai  indikasi  kepesatan  pertumbuhan kelenjar  yang  akan  berfungsi  sebagai  wadah bagi nutrisi dari embrio  yang disebut dengan susu uterus ( Satyaningtijas 2001). Perubahan struktur  kolagen  uterus  dipengaruhi  oleh estrogen  (Pastore et al. 1992).  Iwahashi  dan Muragaki  (2011)  menyatakan  pada  wanita yang  menderita prolapse uterus  terjadi penurunan kolagen uterus.
Dalam
mengembangkan riset biomedis  peran  hewan  percobaan  dalam penelitian  sangat  diperlukan.  Salah  satu hewan  percobaan  yang  banyak  digunakan dalam  penelitian  di  bidang  kedokteran,
farmasi,  gizi  dan  bidang  ilmu  lainnya  adalah tikus  putih.  Data  mengenai  perubahan  kadar matriks  ekstraseluler  pada  tikus  strain Sprague  Dawley,  dan  umur  tikus  tua    yang cocok  digunakan  sebagai  hewan  model penuaan  untuk  sistem  reproduksi  belum banyak dilaporkan.
Adapun  tujuan  penelitian  ini  untuk mengetahui kadar matriks ekstraseluler (kadar  kolagen)  pada  berbagai  tingkatan umur  tikus,  dan  untuk  memperoleh  umur tikus  yang  cocok  digunakan  sebagai  hewan model  penuaan  untuk  sistem    reproduksi. Manfaat  Penelitian  ini  diharapkan  dapat memberikan informasi mengenai tikus sebagai  hewan  model  penuaan  untuk  sistem reproduksi.  Penelitian  ini  dapat  digunakan untuk  penerapan  dan  pengembangan  dalam Ilmu Kedokteran serta Ilmu Pengetahuan dan Teknologi  (IPTEK)  dan  dalam  bidang farmasi.

## METODE
Penelitian  dilakukan  di  kandang percobaan  FKH  IPB,  dan  Laboratorium Fisiologi dan Farmakologi  FKH IPB. Hewan coba  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  15  ekor  tikus  betina  strain  Sprague Dawley.  Penelitian  ini  menggunakan  metode eksperimental.  Rancangan  percobaan  yang digunakan  adalah  Rancangan  Acak  Lengkap (RAL),  yang  terdiri  atas  5  (lima)  kelompok percobaan, masing-masing terdiri atas tiga (3) ekor,  yaitu  kelompok  1  menggunakan  tikus
umur  12  bulan    (K12),  kelompok  2 menggunakan  tikus  umur  18  bulan  (K18), kelompok  3  menggunakan  tikus  umur  24 bulan (K24), kelompok 4 menggunakan tikus umur 30 bulan (K30), kelompok 5 menggunakan  tikus  umur  36  bulan  (K36). Tikus-tikus  percobaan  tersebut  ditempatkan dalam  kandang  plastik  dengan  tutup  terbuat dari  kawat  ram  dan  dialasi  sekam,  pakan berupa  pelet  dan  air  minum  diberikan ad libitum .  Lingkungan  kandang  dibuat    tidak lembab, ventilasi yang cukup serta penyinaran  yang  cukup  dimana  lamanya terang  14  jam  dan  lama  gelap  10  jam. Masing-masing  tikus  ditempatkan  dalam kandang individu. Semua tikus diadaptasikan di  lingkungan  kandang  percobaan  selama  10 hari,  kemudian  dilakukan  ulas  vagina  untuk kesamaan  fase  siklus  estrus  (pada  fase diestrus  dibedah).  Selanjutnya  semua  tikus dilakukan  penimbangan  bobot  badan  (BB). Sebelum dilakukan pembedahan, tikus terlebih  dahulu  dibius  dengan  eter.  Uterus dipisahkan  dan  dibersihkan  serta  ditimbang bobot  basahnya.  Rancangan  percobaan  yang digunakan  adalah Rancangan  Acak  Lengkap (RAL).  Data  yang  diperoleh  dianalisis dengan  menggunakan Analysis  of  Variance (ANOVA)  dan  dilanjutkan  dengan  Uji Duncan dengan selang kepercayaan  95%  (α =  0.05)  dengan  menggunakan  perangkat lunak SAS (Mattjik dan Sumertajaya 2006).

## Prosedur Penentuan Kadar Kolagen
Penentuan  kadar  kolagen  dilakukan sesuai  dengan  yang  dilakukan  oleh  Manalu
dan  Sumaryadi  (1998).  Pengukuran  kadar kolagen  dilakukan  setelah  uterus  yang  sudah dikeringkan dan dihaluskan diekstraksi dengan  cara  menimbang  seberat  25  mg  ke dalam  tabung  reaksi  dan  menambahkan sebanyak  5 mL HCl 6 N  pada setiap sampel. Semua  tabung  diletakkan  pada  penangas  air 130 o C  selama  3  jam  (air  mendidih  ±  5  jam) sampai  larutan  homogen  kuning  muda.  Jika terjadi penguapan selama pemanasan ditambahkan  lagi  HCl  6  N  sebanyak  5  mL. Isinya  dituangkan  dan  dibaca  pada  pH    6-7 (seragam)  dengan  menambahkan  NaOH  2  N jika  keasaman  atau  HCl  6  N  jika  kebasaan, dan tetap menghitung pelarutannya.
Selanjutnya tabung reaksi disiapkan kemudian  dilabel  untuk  blanko,  standar,  dan sampel  yang  masing-masing  dibuat  duplo. Masing-masing  tabung  diisi  reagen  sehingga akan  berwarna  kuning,  setelah  itu    pada setiap  tabung  ditambahkan  1  ml  Chloramin- T  dan  dikocok  (vorteks).  Larutan  dibiarkan selama  20  menit  pada  suhu  kamar.  Setiap tabung ditambahkan 1 ml PCA (kocok/vortex)  dan  dibiarkan    selama  5 menit. Kemudian  setiap tabung ditambahkan 1 ml p-dimetilaminobenzaldehide dan dikocok  kemudian  diletakkan  pada  penangas air 60 0 C selama 20 menit. Larutan didinginkan  pada  kran  air  mengalir  (tabung direndam  dalam  wadah  berisi  air  dingin) selama  5  menit.  Absorbans  larutan  dibaca dengan  spektrofotometer  dengan  panjang gelombang 557 nm

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Rataan  berat  badan,  berat  uterus, kadar kolagen uterus pada berbagai tingkatan usia  tikus  disajikan  pada  Tabel  1.    Hasil  uji ANOVA  menunjukkan  bahwa  umur  tikus berpengaruh  nyata  (P  <  0.05)  terhadap  berat badan, berat uterus, kadar kolagen uterus. Uji lanjut  Duncan  menunjukkan  bahwa  semakin bertambah  umur  semakin  tinggi  berat badannya.  Kadar  kolagen  uterus  umur  12
bulan,  18  bulan,  24  bulan,  30  bulan,  dan  36 bulan,  masing-masing  sebesar  45.73,    37.74, 24.49,    23.93,  21.88    mg/g  sampel  .  Hasil penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  kadar kolagen  uterus  drastis  menurun  pada  tikus umur  24  bulan.    Kadar  kolagen  uterus  tikus umur  24  bulan  menurun  secara  signifikan sama  dengan    kadar    kolagen  uterus    tikus umur  30  bulan  dan    tikus  umur  36  bulan (Tabel 1, Gambar 1).
Tabel  1.  Rataan  berat  badan,  berat  uterus,  kadar  kolagen  uterus  (rataan±SD)  pada  berbagai tingkatan usia tikus betina. Kelompok Berat badan (g) Berat uterus (g) Rasio berat uterus per berat badan (%) Kadar kolagen uterus (mg/g sampel) K12 230±0.57 e 0.85±0.25 a 0.37± 0.11 a 45.73±2.16 a K18 243±2.64 d 0.60±0.16 ab 0.24±0.07 bc 37.74±3.65 b K24 256±2.00 c 0.59±0.05 ab 0.22±0.02 bc 24.49±2.70 c K30 282±2.00 b 0.60±0.19 ab 0.21±0.07 c 23.93±3.62 c K36 288±1.52 a 0.37±0.02 b 0.13±0.05 c 21.88±4.38 c
Keterangan  :  Angka-angka  yang  diikuti  oleh  huruf    yang  berbeda  pada  kolom  yang  sama  menunjukkan berbeda nyata ( p<0.05). K12 = Tikus umur 12 bulan.  K18 = Tikus umur 18 bulan. K24 = Tikus umur 24 bulan. K30 = Tikus umur 30 bulan. K36 = Tikus umur 36 bulan .
Gambar 1. Rataan kadar kolagen uterus dan kadar kolagen tikus pada berbagai     tingkatan usia
Lebih  lanjut,  semakin  bertambah usia  tikus  maka  semakin  menurun  kadar kolagen  uterus.  Kadar  kolagen  uterus  tikus umur  18  bulan  menurun  sebesar  18,69%, tikus  umur  24  bulan  menurun  sebesar 46,44%, tikus  umur  30  bulan  menurun sebesar  47.67%,    tikus  umur  36  bulan menurun  sebesar  52,15%    dibandingkan dengan  tikus  umur  12  bulan.  Penurunan persentase kadar kolagen uterus secara drastis mulai  terjadi  pada  tikus  umur  24  bulan. Berkurangnya  kadar  kolagen  uterus  pada tikus umur 24 bulan  mengindikasikan bahwa tikus  tidak  reproduktif  lagi.  Tikus  umur  24 bulan    tidak  reproduktif,  apabila  dikawinkan tidak bunting.
Molekul  kolagen  terdiri  atas  5  tipe kolagen yang secara genetik berbeda (Leeson et al. 1996) yaitu Tipe I, jenis ini merupakan tipe  kolagen  yang  paling  banyak  ditemui, yang  meliputi  kurang  lebih  90%  kolagen tubuh; Tipe II, kolagen tipe ini dibentuk oleh kondroblast yang terdiri atas tiga rantai alfa-1 dan  merupakan  unsur  utama  matriks  tulang rawan  serta  serabut-serabutnya  berdiameter kurang  dari  80  nm;  Tipe  III,  pada  tipe  ini terdapat  tiga  rantai  alfa-1  (tipe  III).  Kolagen tipe  ini  ditemukan  pada  awal  perkembangan beberapa  jenis  jaringan  pembangun  yang kemudian  sebagian  besar  digantikan  oleh kolagen tipe I. Pada keadaan dewasa, kolagen ini  terdapat    dalam  jaring-jaring  retikular
yang  berhubungan  dengan  kulit,  pembuluh darah,  uterus,  dan  saluran  cerna.  Pada  kulit, kolagen ini dibentuk oleh fibroblast; Tipe IV, pada  tipe  ini  terdapat  tiga  rantai  alfa-1,  dan ditemukan dalam  lamina basal; Tipe V, pada tipe ini susunannya masih menjadi perdebatan,  membentuk  lamina  tipis  yang tidak bergurat di bawah membran fetus.
Kolagen  merupakan  jaringan  ikat pada  uterus/  struktur  penunjang  pada  uterus sebagai  indikasi  kepesatan  pertumbuhan kelenjar  endometrium.  Penurunan  kadar kolagen uterus tikus seiring dengan bertambahnya  usia.    Penurunan  kolagen mempunyai risiko terjadinya prolapse uterus. Hal  ini  sesuai  dengan  Price et  al. (2010) menyatakan prolapse uterus  terjadi  ketika organ-organ  panggul  wanita  jatuh  dari  posisi normal,  ke  dalam  atau  melalui  vagina. Terjadi  pada  wanita  dari  semua  usia, umumnya pada wanita usia tua. Hal-hal yang dapat meningkatkan risiko terjadinya prolapse adalah  gangguan  jaringan  ikat, merokok, obesitas, gangguan saluran pernapasan  atas,  dan  berulang  cedera regangan.  Menurut  Iwahashi  dan  Muragaki (2011)  bahwa  kelainan  kolagen,  komponen utama matriks ekstraselular dapat mempengaruhi wanita untuk terjadinya prolapse uterus . Lin et al. (2012) menyatakan pemberian  kolagen  yang  berikatan  dengan faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF)
0 10 20 30 40 50 K12 K18 K24 K30 K36 Kelompok K ad ar k o la ge n u te ru s (m g/ g sa m p e l)
pada  uterus  tikus  dapat  menyebabkan regenerasi  endometrium,  sel  otot,  dan vaskularisasi.  Kolagen  dapat  menjadi  solusi pragmatis untuk pengobatan kerusakan uterus.

## SIMPULAN
Penurunan  kadar  kolagen  (matriks ekstraseluler)  uterus  mulai  terjadi  pada  tikus umur  24  bulan.  Umur  tikus  yang  cocok digunakan  sebagai  hewan  model  penuaan untuk  sistem  reproduksi  adalah  tikus  umur 24-36 bulan.

## DAFTAR PUSTAKA
Iwahashi  M,  Yasuteru  Muragaki  Y.  2011.
Decreased type III collagen expression  in  human  uterine  cervix of  prolapse  uteri. Experimental  and Therapeutic  Medicine .  2  (2)  :  271- 274. Kanungo  MS.  1997. Gene  and  Aging . Cambrige University Press. USA. Lesson  CR,  Leeson  TS,  Paparo  AA.  1996. Buku  Teks  Histologi .  Penerbit  EGC. Jakarta.
Lin N, Li X, Song T, Wang J, Meng K, Yang J,  Hou  X,  Dai  J,  Hu  Y.  2012. The effect  of  collagen-binding  vascular endothelial  growth  factor  on  the remodeling  of  scarred  rat  uterus following full-thickness injury. Biomaterials. 33 (6):1801-7.
Manalu  W,  Sumaryadi  MY.  1998.  Maternal
Serum  Progesterone  Concentration
During  Gestation  and  Mammary
Gland  Growth  and  Development  at
Parturition  in  Javanese  Thin-Tail Ewes  with  Carrying  a  Single  or Multiple  Fetuses. Small.  Rum.  Res . 27:131-136. Mattjik AA, Sumertajaya IM. 2006. Perancangan  Percobaan  Dengan
Aplikasi  SAS  dan  MINITAB .  Ed  ke- 3. Bogor: IPB Press.
Pastore  GN,  Dicola  LP,  Dollahon  NR,  dan Gardner  RM.  1992.  Effect  of  estriol on  the  structure  and  organization  of collagen  in  the  lamina  propia  of  the immature  rat  uterus. Biol.  Reprod . 47: 83-91.
Price  N,    Slack  A,  Jackson  S.  2010.
Laparoscopic hysteropexy: the initial results  of  a  uterine  suspension procedure  for  uterovaginal  prolapse. BJOG . 117:62–68.www.bjog.org Rastogi,  SC.  2007. Essential  of  Animal Physiology ,  Fourth  Edition. New Age International (P) Ltd.,
Publishers.  Published  by  New  Age
International  (P)  Ltd.,  Publishers . ISBN : 978-81-224-2429-4. Satyaningtijas AS. 2001. Efektivits pemberian  estradiol  dan  progesteron pada kinerja reproduksi tikus bunting. [ Disertasi ]. Program
Pascasrjana IPB, Bogor.