## ISOLATION, IDENTIFICATION AND SENSITIVITY OF AMILOLITIC BACTERIA FROM MANGROVE ECOSYSTEM SEDIMENT IN PURNAMA MARINE STATION DUMAI ON THE PATHOGENIC BACTERIA
Lamtiur Rotua Silitonga 1* , Nursyirwani 2 , Irwan Effendi 2
1 Student of The Faculty of Fisheries and Marine Science University of Riau, Pekanbaru
2 Lecturer at The Faculty of Fisheries and Marine Science University of Riau, Pekanbaru *lamtiurrotuasilitonga@gmail.com

## ABSTRACT
Litter from the weathering of dead mangrove stems and leaves contains a lot of starch which  has  potential  to  be  degraded  by  amylolytic  bacteria  into  simple  compounds  with  the help  of  the  amylase  enzyme.  Amylolytic  bacteria  are  bacteria  that  hydrolyze  starch  into simpler compounds namely glucose with the help of the amylase enzyme. This study aims to 1) isolate,  identify  and  test  sensitivity  of  amylolytic  bacterial  isolates  found  at  the  Purnama Dumai  Marine  Station, 2) the  ability  of  amylolytic  bacterial  isolates to  inhibit  the growth  of pathogenic  bacteria  ( Escherichia  coli , Pseudomonas  aeruginosa and Vibrio  alginolyticus ) and 3) to determine the of amylolytic bacterial species by 16S rRNA sequence analysis. The results showed 10 bacterial isolates (TR 2, TR 6, TR 7, TR 9, TR 11, TR 13, TR 15, TR 16, TR  18  and  TR  20)  were  able  to  inhibit  the  growth  of  pathogenic  bacteria  ( E.coli , P.aeruginosa and V.alginolyticus ).  The  sensitivity  test  of  isolate  TR  20  against E.coli was categorized into weak with inhibition zone diameter of 4.65 mm. Sensitivity of isolate TR 6 against P.aeruginosa was  categorized  into  medium  with  inhibition  zone  diameter  of  5.22 mm. Then sensitivity of isolate TR 11 against V.algynolyticus was categorized into medium with  inhibition  zone  diameter  of  5.55  mm.  DNA  analysis  using  16S  rRNA  method  and BLAST analysis  showed  similarity  of  each  isolate.  Isolate  TR  6  was  similar  to Bacillus paramycoides strain MCCC 1A04098, isolate TR 11 was in a group of Enterobacter cloacae strain ATCC 13047 and TR 20 was in a group of Vibrio harveyi strains of NBRC 15634.
Keywords: Amylolytic  Bacteria,  Sensitivity  Test,  Amylase  Activity  Test,  16S  rRNA Sequence, Pathogenic Bacteria

## I. PENDAHULUAN
Ekosistem mangrove merupakan
ekosistem produktif. Produksi dan akumulasi  bahan  organik  di  sedimen ekosistem mangrove memungkinkan
daerah  ini  kaya  akan  mikrobia  yang potensial  untuk  dikembangkan  sebagai sumber berbagai macam enzim ekstraseluler. Bakteri diisolasi dari sedimen mangrove  merupakan  sumber  potensial
mikrobia untuk menghasilkan enzim amilase serta dimungkinkan untuk berbagai macam enzim ekstraseluler lainnya
(Subagiyo et al ., 2017).
Keberadaan  bakteri  di  ekosistem mangrove  memiliki  arti  yang  sangat penting  dalam  menguraikan  serasah  daun mangrove  menjadi  bahan  organik  yang digunakan  sebagai  sumber  nutrisi  bagi organisme yang mendiami hutan mangrove.
Hasil  dari  dekomposisi  merupakan mineral dan  unsur  nutrien  yang  sangat  dibutuhkan bagi ekosistem mangrove dan pertumbuhan mangrove itu sendiri (Yahya et al ., 2014).
Mangrove  yang  mati  secara  alami maupun  karena  penebangan  oleh  manusia akan  mengalami  pelapukan.  Dalam  kulit batang  mangrove  terdapat  amilum.  Bakteri amilolitik  dalam  tanah  mangrove  berperan penting  dalam  proses  degradasi  amilum menjadi senyawa yang lebih sederhana dan menjadi nutrisi dalam tanah (Hastuti et al ., 2017).
Bakteri amilolitik
mampu menghidrolisis  amilum  dengan  bantuan enzim  amilase.  Enzim  amilase  memiliki peran  penting  dalam  pengolahan  limbah yang  banyak  mengandung  amilum.  Tanah merupakan  tempat  hidup  yang  paling  ideal bagi  bakteri  dekomposer  karena  tanah mengandung bahan organik, anorganik dan mineral  yang  berlimpah  kemungkinan hidup  berbagai  spesies  bakteri  amilolitik karena  terkandung  amilum.  Amilum  yang terdapat  pada  sedimen  mangrove  akan diuraikan  oleh  bakteri  amilolitik  menjadi menjadi  senyawa  yang  lebih  sederhana yaitu glukosa (Hansen et al ., 2017).
Penyakit  ikan  yang  disebabkan  oleh bakteri patogen sangat mempengaruhi hasil budidaya  karena  penyakit  tersebut  dapat menurunkan hasil ikan budidaya. Penyebaran penyakit  yang disebabkan oleh bakteri  salah  satunya  adalah  melalui  luka ikan.  Bakteri  patogen  merupakan  bakteri yang  menyebabkan  penyakit  dan  kematian pada  ikan.  Jenis  bakteri  patogen  seperti Escherchia  coli , Vibrio  alginolyticus dan Pseudomonas aeruginosa dapat menimbul- kan  penyakit  pada  ikan  budidaya  sehingga perlu  dilakukannya  pencegahan  terhadap bakteri  patogen  dalam  menginfeksi  ikan yang  dibudidayakan  dengan  menggunakan senyawa antimikroba.
Untuk  menentukan  jenis  bakteri amilolitik dari sedimen ekosistem
mangrove  dilakukan  identifikasi.  Metode terbaik menentukan taksonomi suatu
mikroorganisme adalah metode menggunakan  hubungan  kekerabatan  DNA (genotip)  dan  karakterisasi  fenotip  dalam mengklasifikasi  mikroorganisme  adalah menggunakan  analisis  skuensing  gen  16S rRNA.  Teknik  ini  dilakukan  dengan menganalisa  struktur  atau  susunan  basa nukleotida  DNA  yang  terdapat  didaerah 16S rRNA.
Dengan latar tersebut, penulis tertarik untuk  melakukan  penelitian  dengan  judul “Isolasi,  Identifikasi  dan  Uji  Sensitivitas Bakteri Amilolitik dari Sedimen Ekosistem Mangrove  Stasiun  Kelautan  Purnama Dumai terhadap Bakteri Patogen.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi,  mengidentifikasi  dan  uji sensitivitas  isolat  bakteri  amilolitik  yang ditemukan  di  Stasiun  Kelautan  Purnama Dumai, kemampuan isolat bakteri amilolitik dalam menghambat pertumbuhan bakteri  patogen  ( E.coli , P.aeruginosa dan V.alginolyticus )  dan  untuk  mengetahui jenis/spesies  bakteri  amilolitik  dengan analisis sekuen 16S rRNA.

## 2. METODE PENELITIAN Uji Aktivitas Amilase
Visualisasi  zona  bening  dilakukan dengan  larutan  iodin,  pengamatan  zona bening  dan  pengukurun  bakteri  amilolitik adalah  perbandingan  antara  diameter  zona bening dengan diameter koloni (Sudiana et al ., 2002).

## Zona Bening = Diameter Total – Diameter Koloni
Bakteri  amilolitik  ditotol  satu  ose pada  media  Zobell  2216  E  yang  diperkaya dengan  amilum  (1%).  Larutan  lugol  iodine 10%  dituang  ke  atas  kultur  untuk identifikasi aktivitas amilase, adanya aktivitas  enzim  amilase  ditunjukan  oleh terbentuknya  zona  jernih  disekitar  bakteri dengan latar belakang biru gelap.

## Identifikasi Bakteri
Isolat  bakteri  diidentifikasi  secara morfologi dan biokimia. Pengamatan
morfologi  meliputi  bentuk  sel,  warna koloni,  ukuran  koloni,  tepian  dan  elevasi koloni.  Uji  biokimia  meliputi  pewarnaan Gram,  uji  katalase,  uji  motilitas,  uji  indol, uji citrat, uji gula dan uji sulfida (H 2 S).
Uji Sensitivitas Terhadap Bakteri Patogen
Uji  sensitivitas  dilakukan  dengan metode  difusi  agar  ( disc  diffusion  Kirby and  Bauer )  mengacu  pada  prosedur menurut  Wolf  dan  Gibbons et  al .  (1996). Masing-masing  bakteri  patogen E.coli , P.aeruginosa dan V.alginolyticus dikultur dalam  media  Zobell  cair  selama  24  jam. Paper disc steril ukuran 6 mm diletakkan di atas  media  Zobell  agar  yang  telah  terdapat bakteri  patogen.  Selanjutnya  diinkubasi selama  24  jam  dalam  inkubator.  Kontrol positif chloramphenicol dan kontrol negatif Zobell cair 2216 E. Penghambatan terhadap bakteri  patogen  yang  dibuktikan  dengan adanya zona bening disekitar cakram.
Identifikasi  Bakteri  Amilolitik    Secara Molekuler dengan Teknik 16S rRNA
Identifikasi secara molekuler menggunakan  metode  PCR  16S  rRNA, sampel bakteri amilolitik diremajakan pada media  NB  terlebih  dahulu.  Kegiatan identifikasi  secara  molekuler  ini  dimulai dengan proses isolasi DNA bakteri amilolitik, selanjutnya dielektroforesis untuk  melihat  keberadaan  dari  DNA  total bakteri. Setelah pita DNA didapat dilakukan  proses  PCR  berguna  untuk mereplikasi  pita  DNA  hingga  mencapai  ± 1500  bp.  Isolat  DNA  yang  telah  melalui proses  PCR  dikirim  ke  PT.  Genetika Science Indonesia, Jakarta Barat. Purifikasi dan sekuensing dilakukan pihak First Base Malaysia.  Hasil  sekuensing  dilakukan analisis BLAST untuk  melihat  spesies bakteri  yang  didapat  melalui  penelususran pada  situs  Genbank  NCBI  (http://www. ncbi.nih.nlm.gov/.) kemudian dilihat tingkat  homologinya  terhadap sequence
bakteri  yang  terdaftar  pada  situs  tersebut, data  diolah  dengan  aplikasi  Mega  6.0  dan bioedit.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri
Hasil    kultur  dan  pemurniaan diperoleh  10  isolat  bakteri  yang  berbeda berdasarkan  pengamatan  morfologi  yakni  : TR 2, TR 6, TR 7, TR 9, TR 11, TR 13, TR 15,  TR  16,  TR  18  dan  TR  20.  Hasil pengamatan  morfologi  koloni  didapat bentuk  koloni  bulat  dan  tak  beraturan. Tepian  koloni  bakteri  licin,  elevasi  timbul dan  warna  bakteri  bermacam-macam  ada yang  berwarna  kuning,  kuning  pucat, kuning cerah, putih susu dan orange.

## Uji Aktivitas Amilase Bakteri Amilolitik
Isolat  bakteri  yang  menghasilkan amilase  terlihat  dari  pembentukan  zona bening  di  sekitar  koloni  bakteri.  Zona bening 10 isolat bakteri amilolitik menunjukkan bahwa amilum yang di dalam media  dihidrolisis  oleh  amilase  menjadi senyawa  yang  sederhana.  Diameter  zona bening yang dibentuk berkisar antara 3,03 - 10,10  mm.  Diameter  zona  bening  terbesar pada  isolat  TR  20  dengan  diameter  zona bening  10,10  mm.  Diameter  zona  bening terkecil  pada  isolat  TR  2  dengan  diameter zona  bening  3,03  mm.  Bagian  media  yang tetap  berwarna  biru  tua  menandakan  lugol iodin  tidak  terhidrolisis  oleh  bakteri amilolitik (Gambar 1).
Gambar  1. Uji  Aktivitas  Amilase  Bakteri Amilolitik
Aktivitas  amilolitik  adanya  zona jernih  di  sekitar  koloni  bakteri  pada  media agar pati 1% yang dituangkan larutan iodin. Terbentuknya zona bening merupakan hasil aktivitas  enzim  amilase  pada  daerah tersebut.  Zona  bening  yang  terbentuk  di sekeliling  isolat  setelah  ditetesi  larutan lugol  iodin  mengindikasikan  bahwa  enzim amilase  diproduksi  oleh  isolat,  sehingga  di
daerah  tersebut  pati  telah  dihidrolisis menjadi  senyawa  yang  lebih  sederhana. Sedangkan terbentuknya warna biru kehitaman disebabkan karena adanya reaksi antara larutan iodin dengan pati yang tidak terhidrolisis (Irdawati, 2015).
Aktivitas  enzim  amilase  bakteri amilolitik dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Aktivitas Enzim Amilase Bakteri Amilolitik
Kode Isolat Pengulangan Rata-rata (mm) 1 2 3 TR 2 4,50 3,10 1,50 3,03 TR 6 10,30 9,60 7,20 9,03 TR 7 3,30 4,30 4,60 4.07 TR 9 8,70 6,60 6,80 7,37 TR 11 4,20 4,10 2,10 3,47 TR 13 8,50 10,70 8,30 9,17 TR 15 2,80 2,80 6,60 4,07 TR 16 2,70 3,90 3,70 3,43 TR 18 9,20 8,90 9,70 9,27 TR 20 8,60 11,00 10,70 10,10

## Aktivitas Terhadap Bakteri Patogen
Hasil  10  isolat  bakteri  mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen ( E.coli,  P.aeruginosa dan V.alginolyticus ) ditandai terbentuknya zona bening disekitar kertas cakram. Uji sensitivitas pada bakteri E.coli isolat  TR  20  termasuk  kategori lemah  dengan  diameter  zona  hambat  4,65 mm. Uji sensitivitas pada bakteri
P.aeruginosa isolat TR 6 termasuk kategori
sedang  dengan  diameter  zona  hambat  5,22 mm. Uji sensitivitas pada bakteri V.algynolyticus isolat  TR  11  termasuk kategori  sedang  dengan  diameter  zona hambat 5,55 mm. Uji sensitivitas isolat TR 6, TR 11 dan TR 20 memiliki nilai hambat tertinggi  terhadap  ketiga  bakteri  patogen. Daya  hambat  bakteri  amilolitik  terhadap bakteri  patogen  dapat  dilihat  pada  Gambar 2.
Gambar 2 . Uji Sensitivitas Bakteri Amilolitik Terhadap Bakteri Patogen
Menurut  Greenwood dalam Susana (2017),  bahwa  klasifikasi  respon  hambatan pertumbuhan bakteri apabila diameter zona
hambat  lebih  besar  dari  20  mm  maka respon  hambatan  pertumbuhannya  sangat kuat,  apabila  diameter  zona  hambat
berkisar  antara  10-20  mm  maka  respon hambatan  pertumbuhannya  dikatagorikan kuat,  apabila  diameter  zona  hambat berkisar  antara  5-10  mm  maka  respon hambatan  pertumbuhannya  dikatagorikan sedang,  sedangkan  diameter  zona  hambat lebih  kecil  dari  5  mm  maka  respon hambatan  pertumbuhannya  dikatagorikan lemah.
Terbentuknya zona bening
dikarenakan adanya penghambatan senyawa  antimikroba  terhadap  sel-sel mikroba.  Mekanisme  kerja  dari  suatu senyawa  antimikroba  dapat  dilakukan dengan  cara  menganggu  atau  merusak penyusun  dinding  sel,  bereaksi  dengan membran sel yang menyebabkan
peningkatan permeabilitas seluler, inaktifasi enzim-enzim essensial dan destruksi  atau  inaktifasi  fungsi  dan  materi genetik (Sari et al ., 2013).
Noaman et  al .  (2014)  menjelaskan bahwa beberapa faktor yang dapat mempengaruhi  besar  kecilnya  aktivitas penghambatan zat antibakteri antara lain: 1) jenis, umur dari bakteri penghasil bakteriosin  dan  bakteri  uji;  2)  konsentrasi zat  antimikroba  dan  jumlah  inokulum  atau kepadatan  bakteri  uji;  3)  resistensi  dari bakteri  terhadap  substansi  zat  antimikroba terkait  dengan  perbedaan  dinding  sel  dari bakteri uji; dan 4) kadar substansi aktif atau gugus  fungsi  dari  substansi  senyawa antimikroba.
Tabel 2 . Rata-rata Daya Hambat Bakteri Amilolitik terhadap Bakteri Patogen Kode Isolat Diameter Zona Hambat (mm) Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Vibrio alginolyticus (+) R ± SD (+) R ± SD (+) R ± SD TR 2 28,85 2,35 ± 0,95 21,75 1,85 ± 0,17 31,95 2,25 ± 0,46 TR 6 27,95 2,52 ± 0,21 18,45 5,22 ± 1,42 25,15 2,58 ± 0,64 TR 7 25,75 3,42 ± 1,72 19,95 3,55 ± 1,22 27,35 1,95 ± 2,60 TR 9 25,35 2,45 ± 1,78 18,85 3.38 ± 1,37 24,95 2,12 ± 0,57 TR 11 26,25 3,12 ± 0,64 20,55 1,72 ± 0,40 23,45 5,55 ± 1,47 TR 13 29,75 3,32 ± 1,40 18,15 1,92 ± 0,35 25,95 4,35 ± 0,17 TR 15 26,25 2,78 ± 0,91 18,85 2,32 ± 0,15 28,45 3,82 ± 0,15 TR 16 28,85 4,02 ± 0,80 19,25 2,68 ± 0,40 32,95 4,15 ± 0,70 TR 18 25,95 4,48 ± 0,25 24,25 2,22 ± 0,81 26,65 1,72 ± 0,55 TR 20 28,95 4,65 ± 1,08 15,65 3,08 ± 0,40 29,65 4,82 ± 1,21 Hasil Ekstraksi DNA Total Hasil ekstraksi DNA total, dielektroforesis  dengan  1  %  gel  agarose. Hasilnya  ekstraksi  DNA  total  dapat  dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 . Elektroforesis DNA Total Keterangan : M : Fragmen Marker DNA 1 kb ladder TR 6 : Isolat Bakteri TR 11  : Isolat Bakteri TR 20  : Isolat Bakteri
Hasil  sampel  DNA  yang  sudah diamplifikasi  yang  dielektroforesis  dengan
1  %  gel  agarose  dari  ke  3  isolat  bakteri dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 . Hasil uji PCR Keterangan : M : Fragmen marker DNA 1 kb ladder 7 :  Bakteri Isolat TR 11 8 :  Bakteri Isolat TR 20 9 : Bakteri Isolat TR 6
Gambar  4  menunjukkan  besarnya produk  PCR  yang  menghasilkan  pita tunggal  adalah  mendekati  1500  bp  ( base pair ) sesuai dengan perbandingan menggunakan  marker  DNA.  Besarnya ukuran  ini  sesuai  dengan  ukuran  yang diharapkan dari gen-gen 16S rRNA bakteri yaitu 1500-1600 bp.
Analisis BLAST Sistem BLAST ( Basic Local
Alignment  Search  Tool )  merupakan  suatu sistem  untuk  mencari  nama  spesies, presentase  homologi  DNA  hasil  sekuen dengan  basis  data  yang  sudah  ada  di Gen Bank .  Hasil  identifikasi  masing  masing isolat  bakteri  berdasarkan  hasil BLAST dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil sekuen 16S  rRNA isolat bakteri dengan sistem BLAST Isolat Spesies Strain Kode Akses Homologi (%) TR 6 Bacillus paramycoides MCCC 1A04098 NR 157734.1 95 % TR 11 Enterobacter cloacae ATCC 13047 NR_118568.1 99 % TR 20 Vibrio harveyi NBRC 15634 NR 113784.1 96 % Sumber :  BLAST
Dari  hasil  analisis BLAST dibuat pohon  filogenetik  ( Phylogenetic  trees ) percabangan  yang  menghubungkan  titik (nodes),  yang  merupakan  unit  taksonomi, seperti  spesies  atau  gen;  akar  pohon
merupakan  titik  yang  bertindak  sebagai tertua  (nenek  moyang)  untuk  seluruh organisme yang sedang dianilisis (Pramana, 2007).

## Gambar 5 . Pohon Filogenetik

## Analisis Sekuen Bakteri
Berdasarkan  dari  uji  sensitivitas bakteri  amilolitik  terhadap  bakteri  patogen 3 isolat terbaik yaitu isolat TR 6, TR 11 dan TR 20 untuk dianalisis DNA.
Isolat  yang  mempunyai  persamaan  sekuen 16S  rRNA  lebih  dari  97%  dapat  mewakili pada tingkat spesies yang sama. Persamaan sekuen 16S rRNA antara 93% - 97% dapat mewakili identitas pada tingkat genus tetapi berbeda  pada  tingkat  spesies.  Sedangkan jika  dibawah  93%  kemungkinan  spesies baru  yang  urutan  basa  nitrogennya  belum masuk  dalam  data  base  gen  bank (Hagstrom dalam Lusiano, 2007).
i. Bacillus paramycoides
Hasil  homologi  sekuen  16S  rRNA dari  isolat  bakteri  TR  6  mempunyai kemiripan homologi dengan Bacillus paramycoides strain  MCCC  1A04098 dengan  tingkat  homologi  sebesar  95%.  Ini berarti  tingkat  homologinya  sama  sampai tingkat  genus  tetapi  berbeda  pada  tingkat spesies.  Berdasarkan  pohon  filogenetik yang  mengikutsertakan  beberapa  data
sekuen GenBank ,  pohon  UPGMA  berada pada  satu  cabang  maupun  node  (genus) yang sama dengan bakteri Bacillus paramycoides.
Bacillus  paramycoides Gram  positif, anaerob  fakultatif,  nonmotil,  berbentuk batang,  lebar  0,8-1,2  μm  dan  1,8-2,2  μm. Bentuk  koloni  adalah  lilin,  bundar,  tidak tembus  cahaya  dan  berdiameter  2-3  mm setelah inkubasi pada 32 ⁰ C selama 48 jam. Katalase  dan  oksidase  adalah  positif. Pertumbuhan  terjadi  pada  15–39 ⁰ C  (30 ⁰ C optimal),  pada  pH  5–9  (pH  7  optimal)  dan dengan  0–5%  (b/v)  NaCl  (optimum  0,5%). Hidrolisis  pati,  susu  skim  dan  kasein. Dalam  tes  API  20E,  positif  untuk pemanfaatan sitrat, produksi asetoin ( Voges-Proskauer ), gelatinase, dan produksi  asam  dari  glukosa;  negatif  untuk b-galaktosidase,  arginin  dihidrolase,  lisin dekarboksilase, ornitin dekarboksilase, produksi H 2 S, urease, triptofan desaminase, produksi  indole,  dan  produksi  asam  dari mannitol,  inositol,  sorbitol,  rhamnose,
Enterobacter cloacae strain ATCC 13047
Enterobacter hormaechei subsp. xiangfangensis strain 10-17
Klebsiella oxytoca strain JCM 1665
Enterobacter hormaechei strain 0992-77
Citrobacter murliniae strain CDC 2970-59
Isolat TR 11
Vibrio brasiliensis LMG 20546
Vibrio tubiashii ATCC 19109 strain NBRC 15644
Isolat TR 20
Vibrio harveyi strain NBRC 15634
Vibrio alginolyticus strain NBRC 15630
Vibrio natriegens NBRC 15636 ATCC 14048 DSM 759
Isolat TR 6
Bacillus paramycoides strain MCCC 1A04098
Bacillus albus strain MCCC 1A02146
Bacillus cereus strain CCM 2010
Bacillus cereus ATCC 14579
Bacillus cereus strain JCM 2152
sukrosa,  melaminose,  amingdalin  (Liu et al ., 2017).
Bacillus  paramycoides yang  mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen karena  merupakan  bakteri  Gram  positif yang  memiliki  dinding  sel  yang  tebal, menghasilkan enterotoksin membentuk spora  sehingga  mampu  bertahan  hidup ditempat  dengan  kondisi  yang  buruk sekalipun dan menghasilkan enzim amilase dalam menghidrolisis amilum yang digunakan untuk nutrisinya.
ii. Enterobacter cloacae
Hasil  homologi  sekuen  16S  rRNA dari  isolat  TR  11  mempunyai  kemiripan homologi  dengan Enterobacter  cloacae strain  ATCC  13047    dengan  tingkat homologi  sebesar  99%.  Ini  berarti  tingkat homologinya  dapat  mewakili  pada  tingkat spesies  yang  sama.  Berdasarkan  pohon filogenetik yang mengikutsertakan beberapa  data  sekuen GenBank ,  pohon UPGMA  berada  pada  satu  cabang  maupun node  (genus)  yang  sama  dengan  bakteri Enterobacter cloacae.
Enterobacter  cloacae dideskripsikan untuk  pertama  kalinya  pada  tahun  1890 oleh Jordan. Di laboratorium mikrobiologi, E.  cloacae sering  ditanam  pada  suhu  30°C pada agar nutrien atau kaldu atau pada suhu 35°C  dalam  kaldu  kedelai  tryptic.  Ini adalah  bakteri  berbentuk  batang,  Gram- negatif,  secara  fakultatif  anaerob,  dan mengandung flagela peritrichous. Ini adalah oksidase-negatif dan katalase-positif (Streit et al ., 2004).
Bakteri Enterobacter sp yang memiliki  enzim  amilase  yang  berfungsi merombak  amilum  yang  terdapat  dalam pakan. Bakteri Enterobacter cloacea merupakan  satu-satunya  bakteri  yang  tidak patogen  terhadap  ikan  karena  tidak menghasilkan  eksotoksin  dan  endotoksin namun menghasilkan enzim β- galaktosidase yang dapat merombak laktosa menjadi glukosa dan galaktosa yang mudah dicerna  di  dalam  usus  ikan. Enterobacter cloacea dapat  menghambat  pertumbuhan
bakteri patogen dengan aktivitas bakteriosin Enterobacter cloacea memiliki aktivitas  antibakteri.  Senyawa  antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri pada umumnya  merupakan  metabolit  sekunder yang tidak digunakan untuk proses pertumbuhan,  tetapi  untuk  pertahanan  diri dan  kompetisi  dengan  mikroba  lain  dalam mendapatkan  nutrisi,  habitat,  oksigen, cahaya dan lain-lain (Muchlis, 2013).
iii. Vibrio harveyi
Hasil  homologi  sekuen  16S  rRNA dari  isolat  TR  20  mempunyai  kemiripan homologi  dengan Enterobacter  cloacae strain  ATCC  13047    dengan  tingkat homologi  sebesar  99%.  Ini  berarti  tingkat homologinya  dapat  mewakili  pada  tingkat spesies  yang  sama.  Berdasarkan  pohon filogenetik yang mengikutsertakan beberapa  data  sekuen GenBank ,  pohon UPGMA  berada  pada  satu  cabang  maupun node  (genus)  yang  sama  dengan  bakteri Vibrio harveyi .
V.  harveyi merupakan  bakteri  laut Gram negatif berbentuk batang dan bersifat motil  yang  dapat  menjadi  bakteri  patogen bagi  ikan  dan  invertebrata  laut,  salah satunya  pada  Udang  Vannamei. V.  harveyi tumbuh  secara  optimal  pada  suhu  30°C, salinitas  antara  20-30  ppt  dengan  pH  7,0 dan  bersifat  anaerobik  fakultatif,  yaitu dapat  hidup  dengan  oksigen  atau  tanpa adanya  oksigen  (Holt  and  Krieg dalam Yufinta et al ., 2018).
Vibrio  harveyi termasuk  bakteri patogen,  namun  spesioes  bakteri  tersebut dapat  menghasilkan  enzim  amilase  yang digunakan  sebagai  biodegradasi  yaitu penguraian  limbah-limbah  amilum  pada pabrik  serta  pengurai  serasah  mangrove yang  telah  mati. Vibrio  harveyi memiliki metabolit  sekunder  yang  tidak  digunakan untuk  proses  pertumbuhan,  tetapi  untuk pertahanan  diri  dan  kompetisi  dengan mikroba lain.

## 4. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan
Penelitian  ini  berhasil  memperoleh 10 isolat bakteri (TR 2, TR 6, TR 7, TR 9, TR  11,  TR  13,  TR  15,  TR  16,  TR  18  dan TR 20). Didapat 3 isolat bakteri yaitu TR 6, TR  11  dan  TR  20  mampu  menghambat pertumbuhan  bakteri  patogen  ( E.coli , P.aeruginosa dan V.alginolyticus )  dengan diameter zona hambat berturut yaitu TR 20 ( E.  coli ) 4,65  mm  dengan  kategori  lemah, TR  6  ( P.aeruginosa )  5,22  mm  dengan kategori sedang dan TR 11 ( V.alginolyticus ) 5,55  mm  dengan  kategori sedang. Hasil analisis DNA secara molekuler  dengan  16S  rRNA  dan  analisis BLAST menunjukkan hubungan
kekerabatan  masing  –  masing,  yaitu  isolat TR  6  termasuk  kelompok  dari Bacillus paramycoides strain  MCCC  1A04098, isolat  TR  11  termasuk  kelompok  dari Enterobacter  cloacae strain  ATCC  13047 dan  TR  20    termasuk  kelompok Vibrio harveyi strain NBRC 15634.

## Saran
Perlu dilakukan uji lanjut kemampuan memproduksi enzim amilolitik masing-masing isolat bakteri dengan kemampuan bakteri amilolitik dalam biodegradasi limbah-limbah yang mengandung amilum.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Hansen, W.F.E., U.S,  Hastuti., S.P, Makkadafi., P.M.A,  Asna., dan  F.S.A, Nugraheni. (2017). Isolasi dan Identifikasi Bakteri Amilolitik dari Tanah yang Tercampur Limbah Kulit Ubi Kayu di Bondowoso, Jawa Timur. Universitas Muhammadiyah Malang, Kota Malang.
2. Hastuti, U.S., F.S.A, Nugraheni dan M.A, Putri. (2017). Isolasi dan Identifikasi Spesies Bakteri  Amilolitik  yang  Berasal  dari  Tanah  Mangrove  di  Margomulyo,  Balikpapan, Kalimantan Timur. Prosiding Seminar Nasional . Universitas Negeri Malang.
3. Irdawati.,  M,  Fifendy  dan  N,  Yenti.  (2015).  Penapisan  Bakteri  Termofilik  Penghasil Enzim Amilase Dari Sumber Air Panas Sapan Sungai Aro Kabupaten Solok Selatan.
4. Liu,  Yang.,  J,  Du.,  Q,  Lai.,  R,  Zeng.,  D,  Ye.,  J,  Xu  and  Z,  Shao.  (2017).  Proposal  of nine  novel  species  of  the Bacillus  cereus group. Internatoinal  Journal  of  Systematic and Evolutionary Microbiology .
5. Lusiano.  A.  (2007).  Isolasi  dan  Karakterisasi  Bakteri  Hidrokarbon  klastik  dengan Sekuens 16S rDNA dari Sedimen Perairan Dumai. Skripsi . Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Riau. Pekanbaru
6. Muchlis,  A.  R.  F.  (2013).  Skrining  Bakteri  Simbion  Spons  Asal  Perairan  Pulau Polewali  dan  Pulau  Sarappolompo  Sebagai  Penghasil  Antibakteri  terhadap  Bakteri Patogen Pada Manusia dan Ikan. Skripsi . (p. 69). Universitas Hasanuddin. Makassar.
7. Noaman,  N.  H.,  A,  Fattah.,  M,  Khaleata.,  and  S.  H,  Zaky.  (2004).  Factor  Affecting Antimicrob Activity of Synechococus leopoliensis . Journal Microbiol Res.
8. Pramana.  (2007).  Phylogeny  as  a  Central  Principle  in  Taxonomy:  Phylogenetic Definitions of Taxon Names, Volume 39, pages 307-322.
9. Sari, K.  I.  P., Periadnadi., dan N, Nasir.  (2013). Uji  Antimikroba Ekstrak Segar Jahe- Jahean (Zingiberaceae) terhadap Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Candida albicans. Jurnal Biologi Universitas Andalas, Pages 2303-2162 .
10. Subagiyo.,  M.S.R.,  Djarod.,  dan  W.A,  Setyati.  (2017).  Potensi  Ekosistem  Mangrove Sebagai  Sumber  Bakteri  untuk  Produksi  Protease,  Amilase  dan  Selulase.  Jurnal Kelautan , Volume 20(2), pages 106–111.
11. Sudiana, I.M ., A, Kanti., M, Rahmansyah., S, Widawati., Suliasih., R.W, Rahayu., dan H,  Imanuddin.  (2002).  Populasi  dan  Karakterisasi  Bakteri  Selulolitik  yang  Diisolasi Berbagai Ketinggian Lokasi di Taman Nasional Gunung Halimun.
12. Susana.  M.  (2017).  Isolasi  dan  Karakterisasi  Bakteri  Heterotrofik  pada  Perairan  Laut Kawasan Pemukiman dan Perairan Bersalinitas Rendah di Kelurahan Purnama Dumai Provinsi. Skripsi. Fakultas Perikanan dan Kelautan. Universitas Riau. Pekanbaru
13. Streit,  J.M.,  R.N,  Jones.,  H.S,  Sader.,  and  T.R,  Fritsche.  (2004).  Assessment  of Pathogen  Occurrences  and  Resistance  Profiles  Among  Infected  Patients  in  The Intensive  Care  Unit:  Report  from  the  SENTRY  Antimicrobial  Surveillance  Program (North America, 2001). Int. J. Antimicrob. Agents, Volume 24, Pages 111–118.
14. Wolf,  C.E.,  and  W.R,  Gibbons.,  (1996).  Improved  Method  for  Qualification  of Bacteriocins Nicin. Appl Bacterio, Volume l80, Pages 453.
15. Yahya.,  H,  Nursyam.,  Y.  Risjani.,  dan  Soemarno.  (2014).  Karakteristik  Bakteri  di Perairan  Mangrove  Pesisir  Kraton  Pasuruan.  Jurnal    Ilmu  Kelautan,  Volume  19(1) pages 35-42.
16. Yufinta, C.P., G. S. J ,Pande., A. P, Made. (2018). Pengaruh Penambahan Bacillus sp. terhadap Kelulushidupan Pasca  Larva Udang Vannamei ( Litopenaeus vannamei ) yang Terinfeksi Vibriosis. Current Trends in Aquatic Science, Volume 1 (1), pages 89-95.