EISSN: 2407-7690 https://ejournal3.undip.ac.id/index.php/jmr

## Penapisan Aktivitas Antibakteri Dari Bakteri
Asosiasi Spons Terhadap MRSA (Methicilin-resistant Staphylococcus aureus)

## Farrastasya Muflihul Azzami, Agus Trianto*, Agus Sabdono
Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah, 50275, Indonesia *Corresponding author, e-mail: agustrianto.undip@gmail.com
ABSTRAK: Resistensi  bakteri  patogen  tehadap  antibiotik  menjadi  masalah  besar  bagi  dunia kesehatan.  Bakteri  Staphylococcus  aureus  yang  resisten  terhadap  antibiotik  yang  dikenal  dengan MRSA  ( Methicilin-resistant Staphylococcus  aureus ). Bakteri MRSA mengalami resistensi  antibiotik disebabkan oleh mutasi genetik yang disebabkan terapi antibiotik yang bersifat irasional. Penyakit yang  disebabkan  oleh  bakteri  patogen  MRSA  dengan  tingkat  infeksi  yang  bervariasi  dapat  terjadi pada  jaringan  lunak,  tulang,  organ  pernapasan,  serta  jaringan  endovaskuler  yang  menimbulkan indikasi berbagai penyakit seperti bronkitis, pneumonia, meningitis, dan sepsis. Masalah resistensi antibiotik  dapat  diatasi  dengan  pencarian  antibiotik  baru  dengan  eksplorasi  bahan  alam  yang berasal dari laut seperti spons. Spons menyediakan tempat hidup utk bakteri simbion dan simbion membantu spons dlm proses nutrifikasi spons menghasilkan senyawa metabolit untuk perlindungan diri  dari  pathogen  dan  prodatornya,  kompetisi  ekologis.  Metabolit  yang  dihasilkan  oleh  spons merupakan  hasil  biosintesis  sehingga  bakteri  asosiasinya  memiliki  komponen  yang  mirip  dengan spons.  Tujuan  penelitian  untuk  mencari  bakteri  yang  berasosiasi  dengan  spons  yang  memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen MRSA dan mengidentifikasi secara molekuler bakteri asosiasi  spons  tersebut.  Penelitian  ini  menggunakan  metode  eksperimental  laboratoris  dengan melakukan pengujian aktivitas antibakteri dari bakteri yang berasosiasi dengan spons. Metode yang dilakukan  yaitu  purifikasi  bakteri,  penapisan  aktivitas  antibakteri  dengan  metode  agar  plug  dan identifikasi  molekuler  isolat  bakteri.  Hasil  dari  penelitian  ini  didapatkan  2  isolat  yang  berasosiasi dengan  spons  yang  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap  MRSA  yaitu  isolat  RA-S20.4  dan  RA- S20.5. Zona hambat isolat RA-S20.4 sebesar 8,3 mm dan isolat RA-S20.5 sebesar 9,6 mm. Hasil identifikasi  isolat  bakteri  secara  molekuker  didapatkan  bahwa  isolat  RA-S20.4  serta  RA-S20.5 memiliki kekerabatan dekat dengan Vibrio alginolyticus sebesar 99,86% dan 99,65%.
Kata kunci: Antibakteri; Bakteri; MRSA; Spons; V. alginolyticus

## Screening of Antibacterial Activity from Bacteria Associated Sponge Against MRSA (Methicilin-resistant Staphylococcus aureus)
ABSTRACT:  Pathogen  bacteria  resistance  towards  antibiotics  have  been  a  major  problem  in  the medical field. The bacteria Staphylococcus aureus is known to be resistant to antibiotics known as MRSA.  MRSA  bacteria  obtained  their  ability  to  be  resistant  towards  antibiotics  through  gene mutations  caused  by  irrational  antibiotic  application.  MRSA  are  capable  of  causing  diseases  with various  diseases  such  as  bronchitis,  pneumonia,  meningitis,  and  sepsis.  Antibiotic  resistance  can be overcome by discovering new antibiotics through exploration of marine natural products such as sponges.  Marine  sponges  are  hosts  for  various  microbes  such  as  bacteria,  because  they  can protect  microbes  from  predators  by  producing  secondary  metabolite.  The  metabolites  that  are produced by sponges are the result of biosynthesis, in which the bacteria that associated with these sponges have compounds similar to those of sponges. The purpose of this research is to discover bacteria associated with sponges that have antibacterial activity against MRSA  pathogen bacteria, as  well  as  to  molecularly  identify  the  sponge-associated  bacteria.  The  activity  in  this  study  is bacterial  isolation  and  purification,  antibacterial  screening  activity,  and  molecular  identification  of bacterial  isolates.  Result  shows  that  there  are  2  isolates  associated  with  sponges  that  have antibacterial activity against MRSA, namely isolate RA-S20.4 and RA-S20.5. The inhibition zone for isolate  RA-S20.4  was  8,3  mm  and  isolate  RA-S20.5  was  9,6  mm.  The  result  of  molecular
identification of bacterial isolates shows that RA-S20.4 and RA-S20.5 were closely related to Vibrio alginolyticus by 99.86% and 99.65%.

## Keywords: Antibacterial; Bacteria; MRSA; Sponge; V. alginolyticus

## PENDAHULUAN
Resistensi  bakteri  patogen  tehadap  antibiotik  telah  menjadi  masalah  besar  bagi  dunia kesehatan (Negara, 2014). Resistensi suatu bakteri dapat terjadi karena pemberian antibiotik yang tidak  tepat  dosis,  diagnosis  yang  salah,  dan  tidak  tepat  sasaran  terhadap  bakteri  penyebabnya (Sugireng dan Lio, 2020). Staphylococcus aureus yang resisten terhadap antibiotik disebut MRSA ( Methicillin-resistant  Staphylococcus  aureus ).  Bakteri  MRSA  dapat  menyebabkan  resistensi antibiotik  akibat  mutasi  genetik  karena  penggunaan  antibiotik  yang  tidak  wajar  (Sugireng  dan  Lio, 2020).
Staphylococcus aureus adalah flora normal pada kulit, tetapi bersifat patogen terhadap inang yang  memiliki  imun  yang  rentan.  Bakteri  ini  dapat  menyebabkan  berbagai  infeksi  dengan  tingkat keparahan  yang  berbeda  pada  jaringan  lunak,  jaringan  tulang,  organ  pernapasan,  dan  jaringan intravaskular,  yang  mengarah  pada  penyakit,  seperti  bronkitis,  pneumonia,  meningitis  dan  sepsis (Nuryah et al ., 2019).
Menurut  Samirudin et  al .  (2018),  pemecahan  masalah  resistensi  antibiotik  adalah menemukan  antibiotik  baru  dengan  menggali  bahan-bahan  alami  (seperti  spons)  dari  laut.  Spons merupakan  salah  satu  hewan  dari  Filum  Porifera,  yang  menjadi  inang  beberapa  jenis mikroorganisme seperti bakteri. Mikroorganisme tersebut menyumbang 40% dari biomassa spons. Kombinasi mikroorganisme yang beragam dan melimpah diduga dapat dijadikan sumber senyawa yang  aktif  secara  biologis  (Liempepas et  al .,  2019).  Namun,  apabila  senyawa  bioaktif  didapatkan dengan  cara  isolasi  secara  terus-menerus  maka  dikhawatirkan  akan  menimbulkan  permasalahan dalam  ketersediaan  bahan  baku.  Terdapat  beberapa  strategi  untuk  mengatasi  permasalahan tersebut  misalnya  dengan  isolasi  senyawa  bioaktif  dari  mikroba  (Wewengkang et  al .,  2014). Senyawa  yang  dihasilkan  oleh  spons  merupakan  hasil  biosintesis  bakteri  asosiasinya  sehingga bakteri tersebut memiliki sifat yang mirip dengan spons (Taylor et al ., 2011).
Yondelis  adalah  produk  obat  yang  disetujui  beredar  di  Uni  Eropa  pada  Oktober  2007.  Obat tersebut  merupakan  senyawa  aktif  dari  marine  natural  product  pertama  yang  beredar  di  pasaran (Molinski et al ., 2009). Obat tersebut berisi senyawa bioaktifecteinasidinlET-743 yang pada awalnya diisolasi  dari  tunikata  Ecteinascidia  turbinata  atau  dikenal  juga  dengan  trabectedin  yang  memiliki aktivitas  antikanker.  Saat  ini  senyawa  yang  diisolasi  dari  spons  Discodermia  dissoluta  seperti Discodermolide  berada  pada  tahap  uji  klinik  fase  I  dan  sudah  3  dilisensikan  pada  Novartis  oleh Harbor Branch Oceanographic Institution sebagai antikanker (Wibowo, 2014).
Penemuan  senyawa  dari  bahan  alam  untuk  pembuatan  obat  memerlukan  tahapan  yang panjang dari uji aktivitas biologis, ekstraksi, fraksinasi, pemurnian senyawa dan penentuan struktur senyawa.  Setelah  senyawa  aktif  diisiolasi  dan  dielusidasi  strukturnya  maka  dilihat  dari  sisi komersilnya  apakah  dapat  disintesis,  semi  sintesis  atau  tetap  harus  dirpoduksi  dari  bahan  alam. Formulasi  juga  dikembangkan  untuk  mengoptimalkan  profil  farmakokinetik.  Proses  akhir  dari  obat dari  bahan alam adalah uji  pre-klinis, klinis tahap I dan II.  Setelah proses yang panajang ini, obat dari  bahan  alam  akhirnya  bisa  dipasarkan  (Syaifudin,  2014).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mendapatkan  isolat  bakteri  yang  berasosiasi  dengan  spons  yang  mempunyai  aktivitas  antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri MRSA (Methicilin-resistant Staphylococcus aureus) yang merupakan proses uji aktivitas bilogis sebagai awal penemuan senyawa untuk pembuatan obat.

## MATERI DAN METODE
Materi yang digunakan dalam penelitian ini adalah spons nomor RA-S20 yang diperoleh dari Kepulauan  Raja  Ampat,  Papua  koleksi  milik  Agus  Trianto,  S.T.  M.Sc.,  Ph.D  yang  akan  diujikan
aktivitas  bakteri  asosiasinya  terhadap  MRSA  di  Laboratorium Tropical  Marine  Biotechnology, Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,  Universitas  Diponegoro  pada  Juli  2020 –  April  2021. Metode yang dilakukan yaitu purifikasi bakteri, penapisan aktivitas antibakteri dengan metode agar plug dan identifikasi molekuler isolat bakteri.

## Isolasi dan Purifikasi Bakteri Asosiasi Spons
Spons  RA-S20  sebesar  1x1  cm  dihaluskan  dengan  menggunakan  mortal  dan  alu  dan dilakukan pengenceran bertingkat 10 -1 - 10 -4 dengan air laut steril yang bertujuan untuk mengurangi jumlah  mikroba  yang  tersuspensi  dalam  cairan. Hasil pengenceran diinokulasikan sebanyak 10 µl  dengan  teknik pour  plate pada  media  Zobell  Marine  Agar  dan  diinkubasi  selama  1x24  jam (Madigan et  al .,  2011).  Selanjutnya,  diidentifikasi  morfologi  secara  makroskopik  (Marzuki et  al ., 2014).  Purifikasi  dilakukan  dengan  cara  isolat  bakteri  diinokulasikan  ke media  Zobell  Agar  miring dengan metode streak , kemudian diinkubasi pada suhu ruangan selama 1-2x24 jam.

## Penapisan Aktivitas Uji Antibakteri
Penapisan  aktivitas  uji  antibakteri  dilakukan  dengan  metode agar  plug. Isolat  bakteri  RA- S20.1,  RA.S20.2,  RA-S20.4  dan  RA-S20.5  diinokulasikan  dengan  teknik pour  plate pada  media Zobell Marine Agar pada cawan petri yang berisi media Zobell Agar dan diinkubasi selama 1-2x24 jam.  Setelah  inkubasi,  media  Zobell  Agar  yang  telah  berisi  isolat  bakteri  di  cetak  dengan  ukuran diameter  ±  6 mm menggunakan blue  tip .  Cetakan  tersebut  diletakkan terbalik  diatas media MHA yang  telah  berisi  bakteri  uji  yaitu  MRSA.  Kemudian  diamati  pada  1x24  jam.  Indikasi  aktivitas antibakteri  ditandai  dengan  terbentuknya  zona  bening  (Balouiri et  al .,  2016).  Perhitungan  luas zona  pada  media  MHA  dilakukan  untuk  melihat  aktivitas  uji  antibakteri.  Zona  bening  diukur sebanyak tiga kali pengulangan dengan menggunakan sofware ImageJ dengan data yang diinput berupa foto. Zona bening dihitung dengan rumus :  total luas zona = diameter zona yang terbentuk – diameter disk/plug dengan satuan sentimeter.

## Identifikasi Molekuler Bakteri
Kultur  bakteri  seberat  ±  50  µg  dimasukkan  dalam  microtube  yang  berisi  100µl  ddH2O  dan saponin  0,5%  1000µl  (dalam  PBS)  dan  diinkubasi  selama  overnight  pada  suhu  4 o C.  Kemudian disentrifugasi  dengan  kecepatan  12.000  rpm  selama  10  menit.  Isolat  murni  bakteri  ditumbuhkan dalam  media  agar  selama  1-2  hari  untuk  digunakan  dalam  ekstraksi  DNA.  Natan  ditambahkan dengan 1 mL PBS dan divortex hingga homogen. Proses ini dilakukan sebanyak 2-3 kali   dengan tujuan menghilangkan residu saponin. Natan ditambahkan dengan 100µl ddH2O dan Chelex 20% 50µl.  Kemudian  dipanaskan  dalam  heating  block  dengan  suhu  95 o C  selama  5  menit.  Sampel kembali dipanaskan lagi dengan suhu dan waktu yang sama (Trianto et al., 2019).
Amplifikasi DNA dengan PCR menggunakan komposisi bahan yang dimasukkan dalam PCR tube 0,5 μL dari primer 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) sebagai forward primer, 0,5 μL dari  primer  1492R  (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) sebagai reverse primer,  master  mix (GoTaq  Green  Mix)  12  μL,  11  μL  larutan  ddH 2 O  dan  1  μL  DNA template .  Tahapan  dalam  PCR yaitu denaturasi pada 95⁰C selama 3 menit, annealing pada suhu 56.1⁰C selama 1 menit, elongasi pada  suhu  72⁰C  selama  1  menit  dengan  30  siklus  dengan final  extension pada  72⁰C  selama  7 menit (Trianto et al ., 2019).
Pengecekan  kualitas  produk  PCR  dilakukan  menggunakan  elektroforesis  dengan  larutan buffer TAE 1x. Setelah sampel dimasukkan, kemudian dielektroforesis pada tegangan 100 volt dan 400 ampere selama 30 menit. Agarose direndam ethidium bromide selama 15 ‒20 menit. Gel hasil elektroforesis  dapat  dilihat  dengan  alat  UV-Transilluminator  untuk  mengetahui  pita  DNA  yang terbentuk.
Sekuensing  DNA  dilakukan  dengan mengirim sampel  yang telah  di  amplifikasi  ke  Genetika Science.  Sekuens  yang  diperoleh  kemudian  dibandingkan  dengan  basis  data  GenBank  pada National Center for Biotechnology Information (NCBI) menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).  Hasil  BLAST  dibuat  menjadi  pohon  filogenetik  dengan  menggunakan  software MEGA X (Trianto et al ., 2019).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Identifikasi Morfologi Spons
Berdasarkan  hasil  identifikasi  morfologi  secara  makroskopis,  spons  RAS20  termasuk  dalam kelas Demospongiae. Tubuh spons RA-S20 berwarna kuning kehijauan (cerah) karena mengandung pigmen yang terdapat pada amoebosit. Bentuk tubuh spons  RA-S20 tidak  beraturan dengan  ukuran diameter ± 2,5 cm. Habitat Demospongiae umumnya di laut dalam maupun dangkal. Demospongiae merupakan  kelas  terbesar  yang  mencakup  90%  dari  seluruh  jenis  spons  (Marzuki,  2018).  Gambar sampel spons dapat dilihat pada Gambar 1.

## Isolasi Bakteri Asosiasi Spons
Spons nomor RA-S20 menghasilkan 5 isolat dengan kode RA-S20.1, RA-S20.2, RA-S20.3, RA-S20.4 dan RA-S20.5.Isolat kode RA-S20.1 memiliki morfologi berwarna kuning dengan ukuran sedang memiliki bentuk irregular , marginnya undulate serta elevasinya crateriform . Isolat kode RA- S20.2  memiliki  morfologi  berwarna  transparan  dengan  ukuran  sedang,  memiliki  bentuk irregular , marginnya undulate serta  elevasinya raised .  Isolat  kode  RA-S20.3  memiliki  morfologi  berwarna transparan dengan ukuran sedang, memiliki bentuk circular , marginnya entire serta elevasinya flat . Isolat  kode  RA-S20.4  memiliki  morfologi  berwarna cream dengan  ukuran  kecil,  memiliki  bentuk circular ,  marginnya entire serta  elevasinya flat .  Sedangkan  isolat  kode  RA-S20.5  memiliki morfologi berwarna putih pucat dengan ukuran pin point , memiliki bentuk circular , marginnya entire serta elevasinya flat . Penamaan kode isolat dan ciri morfologinya dapat dilihat pada Tabel 6.
Gambar 1 . Spons RA-S20
Tabel 1. Hasil Identifikasi Morfologi Bakteri Asosiasi Spons
Isolat Warna Ukuran Bentuk Margin Elevasi RA-S20.1 Kuning Sedang Irregular Undulate Crateriform RA-S20.2 Transparan Sedang Irregular Undulate Raised RA-S20.3 Transparan Sedang Circular Undulate Crateriform RA-S20.4 Cream Kecil Circular Entire Flat RA-S20.5 Putih Pucat Pin point Circular Entire Flat

## Penapisan Aktivitas Antibakteri
Berdasarkan hasil yang diperoleh pada Tabel 6 didapatkan total 5 isolat bakteri, kemudian dilanjutkan  dengan  penapisan  yang  dilakukan  untuk  mengetahui  potensi  aktivitas  antibakteri terhadap dua bakteri patogen uji yaitu MRSA . Isolat bakteri dengan kode RA-S20.4 dan RA-S20.5
memiliki zona hambat antara 6-10 mm terhadap MRSA dengan yang paling luas zona hambatnya pada isolat RA-S20.5. Hasil penapisan dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Penapisan Aktivitas Antibakteri Terhadap Bakteri MRSA
No Kode Isolat Aktivitas 1 RA-S20.1 - 2 RA-S20.2 - 3 RA-S20.3 - 4 RA-S20.4 + 5 RA-S20.5 +
Keterangan: (+) ada aktivitas, (-) tidak ada aktivitas.
Tabel 3. Hasil Pengukuran Zona Hambat
No Kode Isolat Rata-Rata Zona Hambat (mm) 1 RA-S20.4 8,310 ± 0,051 2 RA-S20.5 9,569 ± 0,105 Keterangan: Hasil zona hambat sudah dikurangi diameter plug sebesar 6 mm.

## Identifikasi Bakteri Secara Molekuler
Isolat  potensial  yang  telah  diamplifikasi  menggunakan  PCR  ditandai  dengan  terbentuknya band tunggal  dari masing-masing  DNA  bakteri. Hasil  amplifikasi  gen  digunakan  untuk  identifikasi lebih  lanjut.  Hasil  amplifikasi  isolat  RA-S20.4  dan  RA-S20.5  menunjukkan  bahwa  adanya  DNA bakteri asosiasi spons yang ditunjukkan dengan pita DNA diukuran ±1500bp. Visualisasi pita DNA bakteri asosiasi spons dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 1. Visualisasi Pita DNA Isolat RA-S20.4 dan RA-S20.5
Identifikasi  bakteri  secara  molekuler  dilakukan  untuk  dua  isolat  aktif  bakteri  asosiasi  spons dengan  kode  isolat  RA-S20.4  dan  RA-S20.5  yang  mampu  membentuk  zona  hambat  pada penapisan aktivitas antibakteri. Berdasarkan hasil dari penelusuran BLAST Homologi  pada Tabel
10,  diketahui  bahwa  isolat  RA-20.4  memiliki  tingkat  kekerabatan  dekat  dengan  bakteri Vibrio alginolyticus dengan  homologi  ( present  identify )  sebesar  99.86%.  Isolat  RA-20.5  memiliki  tingkat kekerabatan dekat dengan bakteri Vibrio alginolyticus dengan homologi ( present identify ) sebesar 99,65%. Berikut hasil penelusuran homologi bakteri asosiasi spons dengan menggunakan sistem BLAST yang disajikan dalam Tabel 4.
Berdasarkan  hasil  analisis  diatas,  dapat  dikatan  baik  karena  presentase  kemiripan  sangat tinggi  yaitu  >97%  dan  nilai  dari  e  value  adalah  0.  Nilai  e  value  merupakan  nilai  dugaan  yang memberikan  ukuran  statistik  yang  signifikan  terhadap  kedua  sekuen  (Sandy et  al .,  2015).  Nilai  e value  yang  semakin  tinggi  menunjukkan  tingkat  homologi  antara  kedua  sekuen  semakin  rendah, sedangkan jika nilai e value semakin rendah maka maka tingkat homologi kedua sekuen semakin tinggi.  Apabila  nilai  e  value  0  (nol),  hal  ini  menunjukkan  bahwa  kedua  sekuen  tersebut  identik (Claverie dan Notredame, 2003).
Hasil  pengolahan  data  pasangan  basa  ( base  pair )  untuk  pembuatan  pohon  filogenetik menunjukkan  adanya  pengelompokkan  ( clustering )  isolat  bakteri  asosiasi  spons  dengan  bakteri lain dalam tingkatan kekerabatan terdekat hingga terjauh. Tingkat kekerabatan pada isolat bakteri RA-S20.4 dan RA-S20.5 menunjukkan kekerabatan yang sangat dekat dengan Vibrio alginolyticus seperti yang terlihat pada Gambar 3.
Tabel 4. Hasil Penelusuran Homologi Menggunakan Sistem BLAST
No Kode Isolat Hasil Identifikasi Query Cover Persent Identify E value Acc Number 1   RA-S20.4 Vibrio alginolyticus 99% 99.86% 0,01 NR_113781.1 2   RA-S20.5 Vibrio alginolyticus 100% 99.65% 0,01 NR_113781.1
Journal of Marine Research Vol 11, No.2 Mei 2022, pp. 208-216
Tingkat kekerabatan pada isolat bakteri dengan kode RA-S20.4 dan RA-S20.5 menunjukkan kekerabatan  yang  sangat  dekat  dengan Vibrio  alginolyticus .  Outgrup  dari  hasil  konstruksi  pohon filogenetik  adalah Halobacillus  alkaphilus karena  spesies  ini  tidak  memiliki  kekerabatan  dengan isolat bakteri asosiasi spons.
Berdasarkan  hasil  identifikasi  morfologi  (Tabel  1),  isolat  RA-S20.4  dan  RA-S20.5  yang diindikasikan  sebagai  Vibrio  alginolitycus  memiliki  warna  koloni  cream  (kuning  agak  kecoklatan), bagian tepi circular serta elevasinya flat sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Dahlia et al . (2017).  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Nursyam  (2017)  juga  menyebutkan  bahwa  Vibrio alginolitycus memiliki warna koloni cream (kuning agak kecoklatan) dan bagian tepinya circular. V. alginolyticus dilaporkan  dapat  beraosiasi  dengan  spons  dan  dapat  memproduksi  senyawa metabolit sekunder yang memiliki aktivitas antibakteri.
Bakteri Vibrio  alginolyticus dilaporkan  dapat  beraosiasi  dengan  spons  dan  dapat memproduksi  senyawa  metabolit  sekunder  yang  memiliki  aktivitas  antibakteri.  Menurut  penelitian Nursyam  (2017)  menyebutkan  bahwa V.  alginolyticus dapat  hidup  berasosiasi  dengan  spons Haliclona sp.  yang  didapatkan  dari  Pulau  Gili,  Probolinggo.  Selain  itu,  penelitian  yang  telah dilakukan  oleh  Trianto et  al .  (2019)  juga  menyebutkan  bahwa  bakteri Vibrio  alginolyticus merupakan  salah  satu  bakteri  simbion  hasil  eksplorasi  dari  spons  yang  berasal  dari  Kepulauan Ternate  dan  bakteri  tersebut  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap  bakteri  patogen  MRSA (Methicilin-resistant  Staphylococcus  aureus) .  Pernyataan  tersebut  mendukung  hasil  penelitian  ini bahwa isolat RA-S20.4 dan RA-S20.5 merupakan bakteri asosiasi hasil eksplorasi dari spons dan dapat  memproduksi  senyawa  metabolit  sekunder  yang  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap bakteri patogen MRSA (Methicilin-resistant Staphylococcus aureus) . Vibrio  alginolyticus memiliki  distribusi  geografis  yang  besar  di  perairan  laut  dan  estuaria. Sebagian besar bakteri fluorescent memiliki sifat halophilic (Nursyam, 2017). V. alginolyticus dapat tumbuh  optimal  pada  20- 40‰  salinitas  air  laut.  Bakteri  tersebut  dianggap  spesies  yang  paling sering hidup bebas dalam air dan sedimen (Harriague et al ., 2008) dan dapat bertahan hidup di air laut  bahkan  dalam  kondisi  stress  dan  kekurangan  nutrisi  sembari  mempertahankan  virulensi  ( Kahla-Nakbi et  al .,  2007).  Anggota  genus  Vibrio  berbahaya  karena  menjadi  penyebab  vibriosis pada kerapu (Nitimulyo et al ., 2005). Menurut Murdjani (2002), salah satu jenis Vibrio yang umum berkaitan  dengan  terjadinya  penyakit  pada  kerapu  tikus,  kakap  putih  dan  kakap  merah  adalah Vibrio  alginolyticus .  Selain  sebagai  bakteri  asosiasi  pada  spons, Vibrio  alginolyticus merupakan jenis  yang  paling  patogen  terhadap  kerapu  tikus  yang  menyebabkan  kematian  sampai  100% dengan nilai LD50 106,65 sel/ikan. Serangan Vibrio alginolyticus pada kerapu tikus menyebabkan gejala penyakit berupa mulut merah, tubuh berbercak merah, pembengkakan rongga perut (akibat pembengkakan  organ  dalam  dan  akumulasi cairan  sisa metabolisme),  serta  putus  sirip  (Taslihan et al . 2000).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  identifikasi  morfologi  secara  makroskopis,  spons  RA-S20  berbentuk  tidak beraturan berwarna kuning kehijauan termasuk dalam kelas Demospongiae. Bakteri asosiasi spons RA-S20  menghasilkan  5    isolat  dengan  kode  RA-S20.1,  RA-S20.2,  RA-S20.3,  RA-S20.4  dan  RA- S20.5. 2. Terdapat dua isolat yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap MRSA, perhitungan zona hambat  isolat  RA-S20.4    sebesar  8,3  mm  dan  isolat  RA-S20.5  sebesar  9,6  mm  dikategorikan memiliki  daya  hambat  sedang  karena  berkisar  antara  6-10  mm.  Berdasarkan  hasil  identifikasi bakteri secara molekuler menunjukkan bahwa isolat RA-S20.4 dan RA-S20.5 memiliki kekerabatan dekat dengan Vibrio alginolyticus .

## DAFTAR PUSTAKA
Claverie,  J.  M.,  &  Notredame,  C.,  2003.  Bioinformatics  for  Dummies . Indianapolis:  Wiley Publishing.
Dahlia,  H.  Suprapto.,  &  Kusdarwati,  R.,  2017.  Isolasi  Dan  Identifikasi  Bakteri  Pada  Benih  Ikan
Kerapu  Cantang  ( Epinephelus sp.)  Dari  Kolam  Pendederan  Balai  Perikanan  Budidaya  Air Payau  (BPBAP)  Situbondo,  Jawa  Timur,  Situbondo,  East  Java. Journal  of  Aquaculture  and Fish Health , 6(2):57-66. DOI: 10.20473/jafh.v6i2.11280 Harriague, A.C., Di Brino, M., Zampini, M., Albertelli, G., Pruzzo, C., & Misic, C., 2008. Vibrios in association with sedimentary crustaceans in three beaches of the northern Adriatic Sea (Italy). Marine Pollution Bulletin , 56: 574-579. DOI: 10.1016/j.marpolbul.2007.12.011 Kahla-Nakbi, A.B., Besbes, A., Chaieb, K., Rouabhia, M. & Bakhrouf, A., 2007. Survival of Vibrio alginolyticus in seawater and retention of virulence of its starved cells. Marine Environmental Research ., 46: 469-478. DOI: 10.1016/j.marenvres.2007.04.002 Madigan, M. T., David, P., Clarck, D. S., John, M., & M. Martinko. 2011.   Brack  Microbiology  of Microorganism. San Fransisco : Benjamin Cummings Publishing.
Marzuki,  I.  2018.  Eksplorasi  Spons  Indonesia:  Seputar  Kepulauan  Spermonde.  Penerbit  Nas Media Pustaka: Makassar. DOI: 10.31219/osf.io/vp369
Marzuki, Noor, I. A., Nafie, N.L., & Djide, M., 2014. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Simbion Spons Penghasil  Enzim  Amilase  Asal  Pantai  Melawai  Balikpapan. Jurnal  Ilmiah  “dr.  Aloei  Saboe” , 2(2):11-18.
Molinski, T.F., Dalisay, D.S., Lievens, S.L.  & Saludes, J.P., 2009. Drug development from marine natural products. Nature reviews Drug discovery , 8(1):69-85. DOI: 10.1038/nrd2487 Murdjani,  M.  2002.  Identifikasi  dan  patologi  bakteri Vibrio  alginolyticus pada  ikan  kerapu  tikus (Cromileptes altivelis). Ringkasan Disertasi. Universitas Brawijaya. Malang: 48 Negara, K.S. 2014. Analisis Implementasi Kebijakan Penggunaan Antibiotika Rasional Mencegah Resistensi  Antibiotika  di    RSUP  Sanglah  Denpasar  :    Studi  Infeksi Methicillin  Resistant Staphylococcus Aureus. Jurnal  ARSI ,  1(1):42-50.
Nitimulyo, K.H., Isnansetyo, A., Triyanto, T., Istiqomah, I. & Murdjani, M., 2005. Patogen Penyebab Vibriosis Pada Kerapu Di Balai Budidaya Air Payau Situbondo. Jurnal Perikanan , Universitas Gadjah Mada , 7(2):80-94. DOI: 10.22146/jfs.9053 Nursyam, H. 2017. Antibacterial activity of metabolites products of Vibrio alginolyticus isolated from sponge Haliclona sp. Against Staphylococcus aureus. Italian Journal of Food Safety , 6(1) :18 – 22. DOI: 10.4081/ijfs.2017.6237
Nuryah, A., Yuniarti, N., & Puspitasari, I., 2019. Prevalensi Dan Evaluasi Kesesuaian Penggunaan Antibiotik Pada Pasien Dengan Infeksi Methicillin Resistant Staphylococcus aureus Di RSUP Dr. Soeradji Tirtonegoro Klaten. Majalah Farmaseutik , 15(2):123-129. DOI: 10.22146/farmaseutik.v15i2.47911
Samirudin, Anwarrudin, S., Layn, A.A., & Yanti, N.A., 2018. Screening Bakteri Yang Bersimbiosis Dengan  Spons  Jenis Petrosia sp.  Sebagai  Penghasil  Antibakteri  dari  Perairan  Taman Nasional Wakatobi. Biowallacea ., 5(1):708-715 .
Sandy,  Y.  A.,  Djauhari,  S.,  &  Sektiono,  A.W.  2015.  Identifikasi  Molekuler  Jamur  Antagonis Trichoderma  harzianum Diisolasi  dari  Tanah  Pertanian  di  Malang,  Jawa Timur. Jurnal  Hama dan Penyakit Tumbuhan , 3(3):1 ‒8.
Sugireng., & Lio, T. M. P., 2020. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Metabolit Anti- Mrsa Yang Bersimbiosis  Dengan  Holothuria  Scabra  Asal  Perairan  Tanjung  Tiram. Jurnal  Biologi Makassar , 5(1):34 –39.
Syaifudin, A. 2014. Senyawa Alam Metabolit Sekunder. Deepublish : Yogyakarta. Taslihan,  A.,  Murdjani,  M.,  Purbomartono,  C.  &  Kusnendar,  E.,  2000.  Bakteri  patogen  penyebab penyakit  mulut  merah  pada  ikan  kerapu  tikus  (Cromileptes  altivelis). Jurnal  Perikanan ,  2(2): 57-62.
Taylor,  M.W.,  Radax,  R.,  Steger,  D.  &  Wagner,  M.,  2007.  Sponge-associated  microorganisms: evolution, ecology, and biotechnological potential. Microbiology and molecular biology reviews, 71(2):295-347. DOI: 10.1128/MMBR.00040-06
Trianto,  A.,  Radjasa,  O.K.,  Sabdono,  A.,  Muchlissin,  S.I.,  Afriyanto,  R.,  Sulistiowati,  S.,  Radjasa, S.K.,  Crews,  P.  & Mccauley,  E.,  2019.  Exploration  culturable  bacterial  symbionts  of  sponges from  Ternate  Islands,  Indonesia. Biodiversitas  Journal  of  Biological  Diversity ,  20(3):776-782. DOI: 10.13057/biodiv/d200323
Wewengkang,  D.S.,  Sumilat,  D.A.  &  Rotinsulu,  H.  2014.  Karakterisasi  Dan  Bioaktif  Antibakteri Senyawa Spons Haliclona Sp. Dari Teluk Manado. Jurnal LPPM Bidang Sains dan Teknologi. , 1(1):71-86.
Wibowo, J. T. 2014. Perkembangan Penemuan Bahan Baku Obat Dari Sumber Daya Hayati Laut. Oseana ., 39(3):41 –49.