KARAKTERISASI ISOLAT Fusicoccum (Crous . S dan Wingf . M . J) PADA KARET ( Hevea brasiliensis )  SECARA MORFOLOGI DAN TEKNIK

## POLYMERASE CHAIN REACTION
Characterization of Fusicoccum (Crous . S and Wingf . M . J) Isolates on Rubber (Hevea brasiliensis) through Morphologically and Polymerase Chain Reaction Technique
1
1
1 Yudiarto SARSONO , Dwi SUGIPRIHATINI , Tuti MURDIATI , 1 2*
Masayun Eka MAYLANDARI , dan Tri Rapani FEBBIYANTI
1 Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian Badan Karantina Pertanian – Kementerian Pertanian Jalan Pemuda Nomor 64 Kav 16-17 Rawamangun Jakarta Timur 13220 DKI Jakarta
2 Pusat Penelitian Karet Sembawa Jalan Raya Palembang – Pangkalan Balai KM 29 Sembawa, Banyuasin 30953, Sumatera Selatan *Email : trifebbi@yahoo.com
Diterima : 24 Juli 2020 / Disetujui : 21 Desember 2020

## Abstract
Fusicoccum is one of the causes of leaf fall (leaf blight) in rubber plants. This disease has  occurred  in  Johor  Peninsular  Malaysia rubber  plantation  in  2010,  caused  by  the fungus  Neofusicoccum  ribis.  Agricultural Quarantine  as  a  Focal  Point  of  the  National Plant Protection Organization has an interest in ensuring the fungus that causes leaf blight on rubber plants and taking action to prevent entry  and/or  spread  of  Neofusicoccum  ribis classified as Plant Pest Organisms (OPTK) A2 Group.  Therefore,  Agricultural  Quarantine Agency  through  Center  for  Diagnostic Standard  of  Agricultural  Quarantine  in collaboration  with  Indonesian  Rubber Research  Institute  Sembawa  and  the Indonesian Institute of Science Bogor tried to develop a test method to identify the fungus that causes Fusicoccum leaf fall disease in the rubber plantation for quarantine purpose. The purpose of this study was to characterize the pathogens  that  cause  Fusicoccum  leaf  fall disease  morphologically.  Morphological examination results directly on the leaves of symptomatic  rubber  leaves  fall,  showed Neofusicoccum  fungi.  PCR  testing  by  using Universal  ITS1/ITS4  Primers  and  continued with Spesific Primer BOT15/BOT16 obtained N e o f u s i c o c c u m   u m d o n i c o l a   a n d Neofusicoccum  parvum,  hereinafter  referred
as  Neofusicoccum  compelex  with  each similarity were 99.66% and 97.08%.
Keywords : Disease;  Fusicoccum;  leaf  fall; morphology;  Neofusicoccum; rubber

## Abstrak
Fusicoccum merupakan  salah  satu penyebab penyakit gugur (hawar) daun pada tanaman karet.   Penyakit ini pernah terjadi di  pertanaman  karet  Johor  Peninsular Malaysia pada tahun 2 0 1 0, yang disebabkan oleh  cendawan Neofusicoccum  ribis . Karantina  Pertanian  sebagai Focal  Point bagian  dari  Organisasi  Perlindungan Tumbuhan    Nasional    berkepentingan untuk  memastikan  cendawan  penyebab penyakit  hawar  daun  pada  tanaman  karet dan  melakukan  tindakan  untuk  mencegah masuk  dan/atau  tersebarnya  cendawan Neofusicoccum  ribis yang  dikelompokan sebagai Organisme Pengganggu Tumbuhan (OPTK)  A2  golongan  I.    Oleh  karena  itu, Karantina Pertanian melalui Balai Besar Uji Standar  Mutu  Karantina  Pertanian  bekerja sama    dengan    Pusat    Penelitian    Karet Sembawa  serta Badan  Pengkajian  dan Penerapan  Teknologi  Lembaga  Ilmu
Jurnal Penelitian Karet, 2020, 38 (1) : 27 - 36 Indonesian  J.  Nat. Rubb. Res. 2020, 38 (1) : 27- 36 https://doi.org/10.22302/ppk.jpk.v38i1.665
Pengetahuan  Indonesia  ( )  -  Bogor LIPI mencoba mengembangkan m etode uji dalam mengidentifikasi  cendawan  penyebab penyakit  gugur  daun Fusicoccum pada tanaman karet untuk keperluan karantina . Tujuan  penelitian  ini  mengkarakterisasi patogen  penyebab  penyakit  gugur  daun Fusicoccum secara  morfologi.  Hasil pemeriksaan  morfologi  secara  langsung terhadap  daun  karet  bergejala  gugur  daun diperoleh jenis cendawan Neofusicoccum dan hasil  pengujian  PCR  dengan  menggunakan primer ITS1/ITS4 universal dan dilanjutkan dengan  Primer  BOT15/BOT16 , diperoleh N e o f u s i c o c c u m   u m d o n i c o l a d a n Neofusicoccum  parvum yang  selanjutnya disebut  sebagai Neofusicoccum  complex dengan masing-masing tingkat kekerabatan 99,66 %  dan 97 ,0 8 % .
Kata kunci : Fusicoccum ; gugur daun; karet; m o r f o l o g i ; N e o f u s i c o c c u m ; penyakit

## PENDAHULUAN
Tanaman  karet  (Hevea  bresiliensis) termasuk  dalam  famili  Euphorbiaceae  dari genus Hevea (Dornelas & Rodriguez, 2005). Terdapat beberapa sentra produksi tanaman karet  di  Indonesia,  antara  lain  Provinsi Sumatra  Selatan,  Sumatra  Utara,  Riau, Jambi dan Kalimantan Barat (Badan Pusat Statistik  [BPS],  2018)  dengan  luas  total 3,11  Juta  Ha.  Diantara  provinsi  tersebut, Sumatera  Selatan  merupakan  penghasil lateks terbesar, yaitu 33,41% (991,000 ribu ton)  dari  total  produksi  Nasional  (BPS, 2018), kemudian produksi lateks Indonesia menduduki  peringkat  ke  lima  sebagai penyumbang devisa terbesar dari sektor non migas  yaitu  sebesar  2,742  ton  atau  setara dengan  USD  3.836,7  juta  (BPS,  2018).  Hal tersebut  menempatkan  Indonesia  sebagai produsen  karet  terbesar  kedua  di  dunia setelah Thailand (BPS, 2018).
Rendahnya  produksi  karet  rakyat d i s e b a b k a n   o l e h   b e r b a g a i   f a k t o r , diantaranya adanya gangguan dari berbagai penyakit (Basuki, 1982). Penyakit tanaman dapat  menimbulkan  hambatan  pada pertumbuhan  dan  kerusakan  pada  bagian
atau  organ  tanaman,  penurunan  hasil secara  langsung  atau  kematian  tanaman secara  tidak  langsung  (Soepadmo,  1980). Penyakit  tanaman  karet  tersebar  di perkebunan  karet  Indonesia  dengan menimbulkan  kerusakan  yang  berbeda menurut  lokasi  kebun  dan  waktu  yang berbeda.
Salah  satu  penyakit  daun  yang keberadaannya  mulai  meningkat  di beberapa  pertanaman  karet  yaitu  penyakit hawar  daun  ( Leaf  Blight ) Fusicoccum (Junaidi et al ., 2 0 18; Febbiyanti et al ., 2 0 18 ) . Penyakit ini dilaporkan pernah terjadi pada awal  1987.  Penyakit  yang  disebut  dengan “menyerupai  antraknos Colletotrichum “ dilaporkan  menyerang  60%  TBM  umur  4 tahun  di  daerah  50  m  di  atas  permukaan tanah di negara bagian Johor, Semenanjung Malaysia.  Jenis  klon    yang  terinfeksi  yaitu klon RRIM 600, PR 261, PB 260, PB 255 dan PB 217 (Radziah & Chee, 1989; Amponsah, 2010). Kemudian tahun 2010, penyakit yang disebabkan  oleh Neofusicoccum sp  ini kembali  dilaporkan  terjadi  di  Penisular Malaysia,  menyerang  tiga  wilayah  yaitu Selangor,  Perak,  dan  Johor  (Ngobisa et  al ., 2012; Ngobisa et a l., 2013).
Di Indonesia, penyakit dengan gejala yang  serupa  pernah  terjadi  di  Kebun Percobaan  Balai  Penelitian  Sungei  Putih, Sumatera  Utara    tahun  2013  yang menyerang  klon  IRR  117,  tetapi  belum menimbulkan  kerugian  yang  berarti. Junaidi et  al .  (2018)    melaporkan  bahwa penyakit  ini  kembali  terjadi  di  Balai Penelitian  Sungei  Putih,  Medan,  Sumatera Utara. Penyakit ini didominasi oleh patogen Colletotrichum dan Fusicoccum .  Pada tanaman karet, patogen Neofusicoccum ribis d i k e l o m p o k a n   s e b a g a i   O r g a n i s m e Pengganggu Tumbuhan (OPTK) A2 golongan I .

## M e n u r u t   P e r a t u r a n   M e n t e r i
P e r t a n i a n   N o m o r   3 1   T a h u n   2 0 1 8 , Neofusicoccum  ribis pada  tanaman  karet keberadaanya  masih  sangat  terbatas  dan diusahakan  untuk  tidak  menyebar  ke wilayah   sentra karet lainnya   di Indonesia . Oleh  karena  itu,  perlu  dipastikan  bahwa patogen  penyebab  kejadian  penyakit  gugur
Sarsono, Sugiprihatini, Murdiati , Maylandari, dan Febbiyanti
daun F usicoccum yang dilaporkan terjadi di wilayah  Sumatera  Utara  dan  Sumatera Selatan.    Untuk  dapat  melaksanakan  hal tersebut,  Badan  Karantina  Pertanian melalui  Balai  Besar  Uji  Standar  Mutu Karantina Pertanian bekerja   sama   dengan Pusat    Penelitian    Karet  Sembawa  serta Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Bogor mencoba mengembangkan metode uji dalam mengidentifikasi cendawan penyebab penyakit  gugur  daun Fusicoccum pada tanaman karet untuk keperluan karantina . Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengkarakterisasi  patogen  penyebab penyakit  gugur  daun Fusicoccum secara morfologi  dan  deteksi  dengan  metode Polymerase Chain Reaction (PCR) .

## BAHAN DAN METODE
Kegiatan  pengembangan  metode  uji deteksi  dan  identifikasi  cendawan  pada tanaman  karet  dilaksanakan  pada  bulan A p r i l   h i n g g a   D e s e m b e r   2 0 1 9   d i Laboratorium  Mikologi  dan  Biomolekuler Karantina  Tumbuhan,  Balai  Besar  Uji Standar  Karantina  Pertanian  (BBUSKP) Jakarta  dan Badan  Pengkajian  dan Penerapan  Teknologi , Lembaga  Ilmu Pengetahuan  Indonesia  ( )  Bogor . Isolat LIPI F u s i c o c c u m d i s e d i a k a n   o l e h P u s a t Penelitian    Karet  Sembawa.    Bahan  yang digunakan yaitu sampel berupa daun karet bergejala  gugur  daun  dan  kultur  murni cendawan  patogen  penyebab  gugur  daun dalam media agar kentang sukrosa . Sampel tersebut  diambil  dari  klon  BPM24  yang diperoleh  dari  Pusat  Penelitian  Karet Sembawa.  Bahan  pendukung  lain  terdiri atas  Primer  ITS1/ITS4 , primer  BOT15/16 Spesifik , marker  1 00 bp  dan  1  kb , Master mix  Green  TAE  1x,  Etidium  bromide , Agar ros, Aquades steril , seire atau lactofenol blue , ch  lorok , objek  dan cover  glass, kertas blotter , tiseu , kutex,  kertas  label , Alkohol 70% , spiritus.  Alat  digunakan  dalam penelitian  meliputi  mikroskop  stereo , mikroskop,  nampan , laminar  air  flow , biosafety  cabinet , heat  block , timbangan , sentrigufe , mesin  PCR , Geldo c, alat elektroforesis , mikropipet , mikro alu , jarum inikulasi , pipet , gunting , cutter , lampu spiritus.
M e t o d e   P e n g u j i a n   M o r f o l o g i (Karakteristik Morfologi dan Kultur)
Pengujian  Secara  Langsung  ( Dirrect Inspection )
Seluruh sampel daun karet bergejala d i p e r i k s a   s e c a r a   l a n g s u n g   d e n g a n menggunakan  mikroskop  stereo  untuk melihat  ada  atau  tidaknya  hifa , konida , tubuh  buah  ( pycnidia )  dan  sorus.  Semua cendawan yang ditemukan dibuat preparat pada objek gelas dengan setetes larutan siere dan  ditutup  dengan cover gelas.  Preparat tersebut  kemudian  diidentifikasi  secara morfologi.  Hasil  identifikasi  selanjutnya didokumentasikan dalam bentuk foto .
Pengujian  Dengan  Menggunakan  Metode Kertas Saring ( Blotter Test )
Seluruh sampel daun karet bergejala hawar  dibilas  air  biasa  yang  mengalir sebanyak  1  kali , dipotong  kecil-kecil , direndam klorok 1% (±1-2 menit) dan dicuci dengan air akuades steril . Sampel kemudian diletakan  dalam  cawan  petri  yang  berisi kertas  saring  yang  telah  dilembabkan dengan  akuades  steril . Selanjutnya diletakan dalam ruang inkubasi pada suhu kamar  selama  ±  7 - 14  hari  di  bawah penyinaran Near  Ultra  Violet (NUV)  12  jam terang - gelap . Setelah  diinkubasi , seluruh sampel  daun  karet  bergejala  hawar  dalam cawan  petri  di  periksa  untuk  melihat  ada atau  tidaknya  hifa , konida , tubuh  buah ( pycnidia ) dan sorus. Semua cendawan yang ditemukan di buat preparat pada objek gelas dengan  setetes  larutan  siere  dan  ditutup cover gelas.  Preparat  tersebut  kemudian  di identifikasi secara morfologi dan morfometri dengan  menggunkan  mikrokop  kompon . H a s i l   i d e n t i f i k a s i   s e l a n j u t n y a didokumentasikan dalam bentuk foto .

## Pengujian  Dengan  Menggunakan  Kultur (Media Agar Kentang Dekstrosa, PDA)
Seluruh sampel daun karet bergejala hawar  dibilas  air  biasa  yang  mengalir , direndam  klorok  1%  (±1-2  menit) , dicuci d e n g a n   a k u a d e s   s t e r i l   d a n dikeringanginkan . Selanjutnya  sampel diperiksa  secara  langsung  menggunakan mikroskop  stereo  untuk  melihat  ada  atau
Karakterisasi Isolat Fusicoccum (Crous . S dan Wingf . M . j) Pada Karet (Hevea Brasiliensis) Secara Morfologi dan Teknik  Polymerase Chain Reaction
tidaknya hifa, konida , tubuh buah ( pycnidia ) dan  sorus . Semua  cendawan  yang ditemukan  (dalam  bentuk  hifa , konida , tubuh  buah  ( pycnidia dan sorus )  dibiakan dalam  media  PDA.  Selanjutnya  diletakan dalam  ruang  inkubasi  pada  temperatur sejuk  selama  ±  7 - 14  hari  di  bawah penyinaran Near  Ultra  Violet (NUV)  12  jam terang - gelap . Hasil  kultur  diperiksa  dan didokumentasikan  dan  dikarakterisasi morfologinya  menggunakan  buku  acuan menurut Rayachhetry et al . (1996), Slippers et al . (2004) , Pavlic et al . (2009), Amponsah (2010),  Begoude et  al . (2 0 1 0 ) , Phillips et  al . (2013), dan Sakalidis et al . (2013).
Metode  Pengujian Polymerase  Chain Reaction (PCR).

## Ekstraksi DNA
Pengujian PCR  dilakukan   terhadap isolat  cendawan  target  yang  diduga Neofusicoccum  ribis. Isolat  diperoleh  dari biakan murni setiap   klon berumur 1 0 hari . Dari  isolat  tersebut  sebanyak  enam  blok m i s e l i u m   y a n g   d i t u m b u h k a n   p a d a 0 temperatur 26 C dipindahkan ke dalam labu erlemeyer berisi 5 0 mL agar Broth Kentang Dekstrosa dan digoyang pada 6 0 rpm dalam suhu  kamar  selama  5  hari . Kemudian miselia disaring menggunakan ketas saring dan  dicuci  dua  kali  dengan  akuades  steril , dibiarkan  mengering  selanjutnya  diambil 25 0 mg dan digerus dengan mikro alu dalam tabung  kerucut  mikro centrifuge 1 , 5  mL dengan  penambahan  nitrogen  cair . Ekstraksi  DNA  dilakukan  menggunakan protokol yang disarankan oleh Sambrook et al ., (1989) dan Birren dan Lai (1994) . Setelah m e m p e r o l e h   D N A   c e n d a w a n   m a k a dilakukan  pengujian  menggunakan  PCR Primer  Universal  ITS - 1  dan  ITS - 4  (White et
al ., 1990)  dan  dilanjutkan  dengan  primer BOT15/BOT16.  Primer  BOT  merupakan p r i m e r   s p e s i f i k   k e l u a r g a Botryosphaeriaceae dan Neofusicoccum ribis termasuk  dalam  golongan  ini.  Dengan mengikuti  komposisi  pencampuran  (dalam satuan  volume)  untuk  reaksi  PCR  sebagai berikut  1  μL  Primer  ITS  1  Forward,  1  μL Primer ITS 4 Reserve, 1 μL Template (DNA), 12,5  μL  Master  Mix,  dan  9,5  μL  Nuclease Free  Water,  sehingga  volume  total pencampuran adalah 25 μL.
Amplifikasi dilakukan menggunakan PCR pada volume total 25 mL dalam siklus. 1
o siklus pada 94 C selam 3 menit terdiri dari o 35  Siklus  Denaturasi  94 C , 1  menit, o penempelan  primer  6 0 C , 1  menit , o pemanjangan primer 72 C , 2 menit. 1 Siklus o pemanjangan akhir 72 C , 1 0 menit, siklus o terakhir   4 C.   Hasil PCR divisualisasi pada gel agaros 1% dalam larutan buffer  TAE 1 × 40 mM Tris, 20 mM asam asetat, dan 1 mM EDTA pada 80 Volt selama 45 menit dalam suhu  ruang. Pembuatan  agaros  mengikuti rumus  1%  x  kapasitas  cetakan  gel  agaros (mL) . Untuk  mempermudah  visualisasi , gel d i b e r i k a n   p e w a r n a a n   d e n g a n   c a r a merendam dalam etidium bromide (± 3 0 -60 menit) , dan  pita  divisualisasikan  di  bawah sinar  UV  dan  difoto  menggunakan  sistem dokumentasi  gel  ( gel  doc ).  Ukuran  fragmen D N A   y a n g   d i p e r k u a t   d i t e n t u k a n menggunakan  penanda  berat  molekul (GeneRuler 1 00 bp DNA Ladder (Fermentas, USA)).

## Sekuensing DNA dan Analisis
Sekuensing  dari  hasil  produk  PCR dilakukan  ke  pihak  ketiga  (First  Base  di Kuala  Lumpur , Malaysia)  menggunakan metode Sanger et al . (1977) . Urutan sekuen
Tabel 1. Susunan basa primer yang digunakan dalam penelitian Table 1. Prime base arrangement which was used in the experiment
Sarsono, Sugiprihatini, Murdiati , Maylandari, dan Febbiyanti
Primer Susunan basa IT S1 5 ’-T C C G TA G G T G A A CC T G C G G -3 ’ IT S 4 5 '-T C C T C C G C T T A T TGA T A T GC -3 ' BO T 15 5 '-C TG A C T TG T G A C G C C GG C T C -3 ' BO T 16 5 '-C A A CC T G C T C A G C A A G C G A C -3' Prime Base arrangement
fragmen  gen  yang  diperoleh  selanjutnya dianalisis  dengan  program  BLAST  pada website  www.ncbi.nlm.nih.gov  dengan menggunakan program MEGA 6 (Tamura et al ., 2 0 13) .

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakter  Morfologi
Deskripsi  morfologi  dari Fusicoccum mengikuti kunci identifikasi menurut Pavlic (2 00 9)  dan  beberapa  referensi  lainnya. Cendawan  ini  memiliki  askostroma erumpent melalui  permukaan  kulit  daun , d i a m e t e r   1 0 0 - 4 0 0 μ m . A s k o m a t a pseudothecial , membentuk  kumpulan botryose hingga  5–5 0, globose dengan lubang  pengeluaran  askospora  di  tengah dengan papillate atau tidak , cokelat sampai k e h i t a m a n , 1 7 5 - 2 5 0 μ m , d i n d i n g pseudothecial terdiri  dari  5–15  lapisan tekstur  angularis,  bagian  luar  sel  cokelat atau cokelat gelap , bagian dalam 2−4 lapisan sel - sel  hialin  yang  melapisi  lokus.  Askus bitunicate , clavate , 8 - askospora , 8 0 –12 0 × 17 - 2 0 μ m . Pseudoparafisis filiform , bersekat, jarang bercabang , lebar 2–4 μ m . Askospora fusoid , sering  membulat  di  ujungnya kemudian  secara  luas  ellips,  hialin , 1  sel , halus  dengan  isi  granular , biseriate pada ascus , (14 –18) - (23–27) × (6 - 8) - 1 0 μ m (rerata dari  8 0 askospora  =  2 0, 5  ×  7 , 1 μ m). Pseudotesium subepidermal , bulat , diameter 23 0 μ m, dinding askokarp dibentuk oleh sel - sel  dari  tekstur angularis , silindris , bertangkai  pendek,  63 - 68  x  13 - 14 u m , askospora ellips sampai ellips tidak teratur , hialin  sampai  kekuningan , 2 0- 25 , 5  x  6 - 8 , 5 μ m . Konidia  yang  diproduksi  dengan  daun pinus pada awalnya hialin dan aseptat dan menjadi cokelat muda dan 1 - atau 2 - septate seiring  bertambahnya  usia . Selain  itu , konidia berbentuk ellipsoidal dengan ujung membulat  bundar  dan  bagian  dasar terpotong  dengan  ukuran  16 , 5 - 24 ,0 ×  3 , 5 - 6 , 5 μ m dan rasio P/L rata-rata 3 , 9 μ m . Tidak ada struktur teleomorph yang terbentuk.
Isolasi  cendawan  tumbuh  cepat dengan  miselium  putih  yang  berubah menjadi abu - abu kehijauan gelap atau abu - abu  dalam  beberapa  hari . Koloni  ditandai oleh  pertumbuhan  koloni  cepat  yaitu  16 , 5 - 17 ,0 mm/hari , yang  menutupi  cawan  petri setelah  5  hari . Selain  itu , miselium  putih berbulu  menjadi  sedikit  kuning  atau kecoklatan di bagian bawah setelah 4 hari . Pada hari ke-5, pusat - pusat menjadi cokelat terang; miselium putih  berbulu hanya pada bagian tepi . Piknidida   muncul dalam 7 - 12 hari pada Potato Dextrosa Agar .

## Karakter  Molekuler  Dengan  Analisa Polymerase Chain Reaction (PCR)
H a s i l   a m p l i f i k a s i   I T S 1 / I T S 4 menunjukkan isolat hasil karakter morfologi Fusicoccum pada  garis  ke-7  memiliki  pita DNA  berkisar  antara  525  hingga  550 basepare (bp)  dalam  marker  penanda  1  kb sebagai  pembanding.  Hasil  analisis  PCR selengkapnya  tersaji  dalam  Gambar  1. Selain menggunakan primer ITS 1 dan ITS 4, pada  isolat  target  juga  dilakukan  analisis PCR  dengan  primer  spesifik  yaitu  primer BOT dengan   tahapan dan cara yang sama pada  primer  sebelumnya.  Hasil  amplifikasi isolat Fusicoccum menggunakan primer BOT memiliki  kisaran  pita  DNA  antara  34 0 bp sampai  dengan  35 0 bp  dalam  marker penanda 1 00 basepare, selengkapnya tersaji pada Gambar 2 .
Pengujian  PCR  dilanjutkan  pada tahapan  skuensing  DNA . Hasil  skuensing produk  PCR  selanjutnya  dibaca  dan diurutkan  menggunakan  program  MEGA versi 6 .0 (Tamura et al ., 2 0 13) . Hasil analisis skuensing  DNA  tersebut  disajikan  pada Tabel 2.
Dari perbandingan di atas diperoleh nama  jenis  cendawan  dari  isolat  uji . Berdasarkan hasil terlihat isolat uji memiliki kekerabatan  lebih  ke  arah Neofusicoccum umdonicola strain  CBS  12365  dengan homolog ikatan basa mencapai 99 , 66% dan
Karakterisasi Isolat Fusicoccum (Crous . S dan Wingf . M . j) Pada Karet (Hevea Brasiliensis) Secara Morfologi dan Teknik  Polymerase Chain Reaction
Gambar 2.   Hasil amplifikasi menggunakan primer spesifik BOT15/BOT16 pada gel agarose 1 , 2 % , 10 0 volt selama 45 menit. Garis 2 : marker 100 bp; garis ke 8 berisi isolat uji, Kontrol positif Fox P , Kontrol positif Fox J; garis 12 berisi kontrol negatif dan garis ke 13 berisi marker 1 0 0 bp Figure 2.   The results of the amplification used BOT15 / BOT16 specific primers on agarose gel 1.2%, 100 volts for 45 minutes. Line 2: 100 bp marker; the 8th line contains target isolate, Fox P positive control, Fox J positive control; line 12 contains negative controls and the 13th line contains 100 bp markers
Gambar 1. Hasil amplifikasi dengan menggunakan primer ITS1/ITS4 pada gel agarose 1 , 2% , 100 volt selama 45 menit . Garis 1 berisi marker 100 bp, garis ke 7   berisi isolat uji, garis ke 10 Kontrol positif Fox P, Kontrol positif,  Fox J; Garis ke 12 Kontrol negatif; dan garis ke 13 berisi marker 1kb
Figure 1. The amplification results used ITS1 / ITS4 primer on 1.2% agarose gel, 100 volts for 45 minutes. Line 1 contains marker 100 bp, line 7 contains target isolate, line 10 Positive control of Fox P, positive control, Fox J; Line 12 Negative control; and the 13 th line contains a 1kb marker
Sarsono, Sugiprihatini, Murdiati , Maylandari, dan Febbiyanti
Isolat Isolate
Nama di NCBI Name in NCBI
Tingkat kekerabatan S imilarity  analysis E2 Neofusicoccum umdonicola strain CBS 12365 99,66 % E2 Neofusicoccum parvum strain CMW 9081 97,08%
Tabel 2.  Hasil penyejajaran DNA yang tersedia dalam data GenBank NCBI Table 2.   Result of DNA sequence alignment available in NCBI GenBank data
Gambar 3. Pohon phylogenetic isolat Neofusicoccum parvum dan Neofusicoccum umdonicola menggunakan analisa Maximum Likelyhood Gambar 3. Phylogenetic tree of Neofusicoccum parvum and Neofusicoccum umdonicola isolates by using Maximum Likelyhood analysis
Karakterisasi Isolat Fusicoccum (Crous . S dan Wingf . M . j) Pada Karet (Hevea Brasiliensis) Secara Morfologi dan Teknik  Polymerase Chain Reaction
Neofusicoccum  parvum dengan  tingkat kekerabatan 97 ,0 8% dan keduanya disebut sebagai Neofusicoccum  complex karena memiliki hasil spesies yang berbeda dengan menggunakan dua primer yang berbeda (ITS dan BOT). Apabila ingin mendapatkan satu nama  spesies  yang  pasti,  maka  harus menggunakan primer jenis beta tubulin atau Primer Elongation  Factor (EF)  yang  dapat memberikan satu nama spesies. Selanjutnya hasil  dari    perbandingan    di  atas divisualisasi   menjadi   pohon phylogenetic dengan  menggunakan  ClustalW2 . Pohon phylogenetic dibuat  untuk  mempermudah penilaian dan analisis  kekerabatan , dengan gabungan  hubungan    kekerabatan    yang berdekatan.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  pengujian  isolat patogen  gugur  daun Fusicoccum yang dilaporkan  terjadi  di  wilayah  Sumatera Utara  dan  Sumatera  Selatan  dengan menggunakan  karakter  morfologi  dan metode Polymerase  Chain  Reaction (PCR) d a p a t   d i k e t a h u i   a d a l a h   p a t o g e n N e o f u s i c o c c u m   u m d o n i c o l a d a n Neofusicoccum  parvum . Kedua  patogen  ini selanjutnya  disebut  sebagai Neofusicoccum complex dengan  masing-masing  tingkat kekerabatan 99,66% dan 97 ,0 8% .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  disampaikan kepada  Kepala  Balai  Besar  Uji  Standar Karantina  Pertanian,  Bapak  drh . Sriyanto , M.Si ., Ph . D  atas  dukungan  penelitian; Kepala  Pusat  Penelitian  Karet  Sembawa Palembang  dan  Peneliti  Proteksi  Pusat Penelitian Karet serta Badan Penelitian dan Pengembangan  Teknologi - Lembaga  Ilmu Pengetahuan  Indonesia,  Bapak  Imam Hidayat Ph . D dan Ibu Dr . Marlina Ardiyanti , serta banyak pihak terkait yang tidak dapat d i s e b u t k a n   s a t u   p e r s a t u   h i n g g a terwujudnya kajian penulisan ini .

## DAFTAR PUSTAKA
Amponsah,  N.T.  (2010). Epidemiology  of b o t r y o s p h a e r i a c e o u s   s p e c i e s associated  with  grapevines  in  New Zealand. [Thesis].  New  Zealand:
Lincoln University-christchurch.
Badan Pusat Statistik. (2018). Statisik Karet Indonesia. Jakarta, Indonesia: BPS.
Basuki.    (1982). Penyakit  dan  Gangguan Pada  Tanaman  Karet. Tanjung Morawa,  Indonesia:  Pusat  Penelitian dan Pengembangan Perkebunan.
Begoude,  B.A.D.,  Slippers,  B.,  Wingfield,
M . J . , & R o u x ,   J .   ( 2 0 1 0 ) .
Botryosphaeriaceae associated  with
Terminalia  catappa  in  Cameroon, South  Africa  and  Madagascar. Mycol. Progress, 9, 101−123. https://doi.org/
10.1007/s11557-009-0622-4
Birren,  B.,  &  Lai,  E.  (1994).    Rapid  pulsed field separation of DNA molecules up to 250 kb. Nucleic Acids Research , 22(4), 5366-5370.  https://dx.doi.org/ 10.1093nar22.24.5366
Dornelas, M.C., & Rodriguez, A.P.M. (2005). The  rubber  tree  ( Hevea  brasiliensis Muell.  Arg.)  homologue  of  the L E A F Y / F L O R I C A U L A   g e n e   i s preferentially  expressed  in  both  male and female floral meristems. Journal of E x p e r i m e n t a l   B o t a n y ,   5 6 ( 4 1 7 ) , 1965−1974.  https://doi.org/10.1093 /jxb/eri194
Febbiyanti,  T.R.,    Alchemi,  P.J.K.,  Fairuza, Z.,  &  Herlinawati,  E.  (2018).  The outbreak of Fusicoccum leaf disease in Indonesia and the potential yield loss. I n t e r n a t i o n a l   P l a n t   P r o t e c t i o n Workshop.    Palembang,  Indonesia: Balai Penelitian Sembawa.
Sarsono, Sugiprihatini, Murdiati , Maylandari, dan Febbiyanti
Junaidi.,  Tistama,  R.,  Atminingsih., Fairuzah, Z., Rachmawan, A., Darojat, M.R.,  &  Andriyanto,  M.  (2018). Fenomena  gugur  daun  sekunder  di W i l a y a h   S u m a t e r a   U t a r a   d a n pengaruhnya terhadap produksi karet. Warta  Perkaretan ,  37(1),  1-16. https://doi.org/10.22302/ppk.wp.v3 7i1.441
Ngobisa.  N.A.I.C.,  Abidin,  M.A.Z.,  Wong, M.Y.,  &  Mahyudian,  M.M.  (2012). C u l t u r a l   a n d   m o r p h o l o g i c a l characterisation of Fusicoccum sp, the causal  agent  of  rubber  ( Hevea brasiliensis )  leaf  blight  in  Malaysia. Journal Rubber Research , 15(1), 64-79.
Ngobisa.  N.A.I.C.,  Abidin,  M.A.Z.,  Wong, M.Y.,  &  Noordin,  M.W.D.W.  (2013). Neofusicoccum  ribis  associated  with l e a f   b l i g h t   o n   r u b b e r   ( H e v e a brasiliensis )  in  Peninsular  Malaysia.
The Plant Phatology Journal , 29(1), 10- 16.  https://dx.doi.org/10.5423 %2FPPJ.OA.07.2012.0110
Pavlic,  D.,  Slippers,  B.,  Coutinho,  T.A.,  & Wingfield, M.J. (2009). Molecular and phenotypic characterization of the tree phylogenetic species discovered within the Neofusicoccum  parvum/N.  ribis complex.  Mycologia, 101(5),  636−647. https://doi.org/10.3852/08-193
Phillips. A.J.L., Alves, A., Abdollahzadeh, J., S l i p p e r s ,   B . ,   W i n g f i e l d ,   M . J . , Groenewald,  J.Z.,  &  Crous,  P.W. (2013). The  Botryosphaeriaceae : genera  and  species  known  from culture. Studies  in  Mycology ,  76(1),
5 1 – 1 6 7 .   h t t p s : / / d o i . o r g / 10.3114/sim0021
Radziah,  N.Z., & Chee,  K.H. (1989).  A new foliar    disease    of    rubber. Plant Pathology ,  38,  293−296.  https:// doi.org/10.1111/j.1365-3059.1989. tb02147.x
Rayachhetry,  M.B.,  Blakeslee,  G.M.,  Webb, R.S.,  &  Kimbrough,  J.W.  (1996). Characteristics  of  the Fusicoccum anamorph  of Botryosphaeria  ribis, a potential  biological  control  agent  for Melaleuca  quinquenervia  in  South Florida. Mycologia, 88(2),  239-248. https://doi.org/10.1080/00275514.1 996.12026649
Sakalidis. M.L., Slippers, B., Wingeld, B.D., Hardy,  G.E.St.J.,  &  Burgess,  T.I. (2013). The challenge of understanding the  origin,  pathways  and  extent  of fungal invasions: Global populations of the Neofusicoccum  parvum  –  N.  ribis species  complex.  Diversity  and D i s t r i b u t i o n s , 1 9 ,   8 7 3 – 8 8 3 . https://doi.org/10.1111/ddi.12030
Sambrook, J., Fritschi, E.F., & Maniatis. T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New  York,  US:  Cold  Spring Harbor Laboratory Press.
Sanger,  F.,  Nicklen,  S.,  &  Coulson,  AR.
(1977).  DNA  sequencing  with  chain- terminating  inhibitors. Proceedings National.  Academic  Science  USA ., 74(12),  54637.  https://dx.doi.org/1 0.1073%2Fpnas.74.12.5463
Slippers,  B.,  Burgess,  T.,  Crous,  P.W., Coutinho,  T.A.,  Wingfield,  B.D.,  & Wingfield, M.J. (2004). Development of SSR  markers  for Botryosphaeria  spp with Fusicoccum anamorphs. Molecular E c o l o g y   N o t e s , 4 ,   6 7 5 − 6 7 7 . https://doi.org/10.1111/j.1471- 8286.2004.00780.x
Soepadmo.  (1980).    Suatu  pemikiran tentang  pengendalian  penyakit  daun p a d a   t a n a m a n   k a r e t . M e n a r a Perkebunan, 48(5), 147-154.
Karakterisasi Isolat Fusicoccum (Crous . S dan Wingf . M . j) Pada Karet (Hevea Brasiliensis) Secara Morfologi dan Teknik  Polymerase Chain Reaction
Tamura,  K.,  Stecher,  G.,  Peterson,  D., Filipski,  A.,  &  Kumar,  S.  (2013). MEGA6:  Molecular  evolutionary g e n e t i c s   a n a l y s i s   v e r s i o n   6 . 0 . Molecular  Biology  and  Evolution , 30(12),  2725-2729.  https://doi.org/ 10.1093/molbev/mst197
White,  T.J.,  Bruns,  T.,  Lee,  S.,  &  Talor,  J.
(1990).  Amplification  and  direct sequencing  of  fungal  ribosomal  RNA genes for phylogenetics. In Innis, M.A., Gelfand, D.H., Snisky, J.J., & White, T. J. PCR  Protocols,  a  Guide  to  Methods and  Applications. New  York,  USA: Academic Press.
Sarsono, Sugiprihatini, Murdiati , Maylandari, dan Febbiyanti