## PEMANFAATAN LIMBAH PENGOLAHAN AGAR SEBAGAI KOMPONEN MEDIUM PRODUKSI SELULASE DARI MIKROBA
The Use of Agar Processing Waste as A Component of Microbial Cellulase Producing Medium
Yusro Nuri Fawzya 1* , Amelia Latifa 2 , dan Nita Noriko 2
1 Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengembangan  Pengolahan  Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan  dan  Perikanan, Jl. K.S. Tubun  Petamburan  VI,  Jakarta Pusat, Indonesia
2 Universitas  Al-Azhar  Indonesia,  Indonesia *  Korespondensi  Penulis:  nurifawzya@gmail.com
Diterima: 9 April 2014;  Disetujui: 21 Mei 2014

## ABSTRAK
Pengolahan  agar  dari  rumput  laut  berkembang  pesat  di  Indonesia.  Hal  ini  berkaitan  dengan produksi  rumput  laut  yang  cenderung  meningkat  dari  tahun  ke  tahun.  Produksi  yang  meningkat ini  diik uti  dengan  meningk atnya  limbah  pengolahan  agar.  Limbah  ini  diketahui  memiliki kandungan  selulosa  yang  tinggi.  Pemanfaatan  limbah  ini  umumnya  untuk  pembuatan  pupuk  dan komponen  pakan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  memanfaatkan  limbah  pengolahan  agar  sebagai komponen medium produksi enzim selulase dari mikroba. Tiga jenis isolat mikroba yaitu PMP1206, Serratia  marcescens  SGS  1609,  dan  isolat  bakteri  PC3,  dikultivasi  dalam  medium  padat  yang mengandung  karboksimetil  selulosa  (CMC).  Isolat  mikroba  yang  menghasilkan  zona  bening paling  besar,  dipilih  dan  enzim  diproduksi  dalam  medium  cair  yang  mengandung  selulosa  dari limbah  agar.  Enzim  yang  dihasilkan  dari  perlakuan  terbaik  dilakukan  karakterisasi.  Medium produksi  enzim  adalah  medium  sintetik  minimal  (MSM)  cair  dengan  penambahan  1%  limbah agar yang telah  diberi perlakuan  dengan NaOH 0, 2, 4, dan 6%. Inkubasi dilakukan  pada suhu  30 o C,  150  rpm.  Pengambilan  sampel  dilakukan  setiap  hari  untuk  diuji  aktivitas  enzimnya.  Hasil seleksi  isolat  menunjukkan  bahwa  S.  marcescens  SGS  1609  menghasilkan  zona  bening  paling besar  dengan  indeks  selulolitik  2,25.  Produksi  enzim  selulase  dari  isolat  ini  pada  medium  limbah agar  menunjukkan  bahwa  waktu  optimal  produksi  enzim  diperoleh  pada  inkubasi  selama  1–3 hari  dari  perlakuan  NaOH  6%.  Enzim  yang  dihasilkan  bekerja  optimum  pada  pH  6  dan  suhu  50 o C.  Enzim  bersifat  stabil  terhadap  panas.  Pada  suhu  40–60 o C  selama  4  jam  penurunan  aktivitas enzim  tidak  lebih dari  30%. Aktivitas  selulase  meningkat  dengan penambahan  ion  Ca 2+, dan  Mg 2+ , dan  menurun  dengan  adanya  10  mM  ion  Zn 2+ .
KATA KUNCI: selulase mikroba, limbah pengolahan agar, perlakuan NaOH

## ABSTRACT
Processing  of agar  from  seaweeds  has  been  growing  rapidly  in  Indonesia.  This  is  related  to the seaweeds production which increases yearly. This production is followed with the increasing of agar processing waste. The waste is known having high cellulose content. It is commonly used for organic fertilizer as well as feed component. This research was purposed to utilize agar processing waste as production medium component of microbial cellulase. Three bacterial isolates, PMP1206, Serratia  marc es c ens   SGS  1609  and  PC3  were  c ultiv ated  in  agar  media  c ontaining carboxymethylcellulose  (CMC).  The  isolate  producing  the  largest  clear  zone,  was  selected  and enzyme  was  produced  in  liquid  medium  containing  cellulose  from  agar  processing  waste.  The enzyme  product  from  the  best  treatment  was  characterized.  The  medium  for  enzyme  production was liquid Minimal Synthetic Media (MSM) added with 1% agar waste which had been treated with NaOH 0, 2, 4 and 6%. Incubation was conducted at 30 o C, 150 rpm. Sampling was carried out daily to  determine  enzyme  activity.  The  result  showed  that  S.  marcescens  SGS  1609  produced  the largest clear zone with the cellulolytic index of  2.25. The production of S. marcescens SGS 1609 cellulase  in  medium containing  cellulose  from  agar processing  waste indicated  that  the  optimum production time was 1–3 days using NaOH 6% treatment. The enzyme worked optimally at 50 o C pH  6 and  was stabil  against heat.  Incubation the  enzyme  at  40–60 o C  for 4  hours decreased  the activity not more than 30%. The cellulase activity increased by the addition of  Ca 2+, and Mg 2+ , and decreased by the addition of 10 mM ion Zn 2+ .
KEYWORDS: microbial cellulase, agar processing waste, NaOH treatment

## PENDAHULUAN
Rumput  laut  merupakan  salah  satu  komoditas unggulan Indonesia yang menghasilkan devisa negara dari hasil ekspornya. Produksi budidaya rumput laut terus meningkat, rata-rata sebesar 29% per tahun; dan pada tahun 2013 mencapai 8,2 juta ton, dengan nilai  total  ekspor  sebesar  US$162,5  juta  (Global Energi, 2014). Salah satu pemanfaatan rumput laut adalah  untuk  pengolahan  agar.  Kim  et  al.  (2007) menyatakan bahwa ekstraksi agar dari rumput laut menghasilkan limbah sekitar 65 – 75%. Limbah agar ini mengandung selulosa cukup tinggi, yaitu 27,38 – 39,45% (Fithriani et al., 2007).
Meningkatnya  produksi  rumput  laut  Indonesia mengakibatkan hasil samping pengolahan rumput laut juga meningkat.  Pemanfaatan limbah  pengolahan rumput laut, termasuk pengolahan agar sampai saat ini terbatas pada penggunaan untuk komponen pakan dan  pupuk.  Limbah  pengolahan  agar  kaya  akan selulosa, sehingga memungkinkan untuk digunakan sebagai substrat bagi mikroba-mikroba pendegradasi selulosa, seperti yang dilaporkan oleh Hariadi (2001) yang  memanfaatkan  limbah  agar  sebagai  media penghasil  produk  biom assa  m ikroorganisme. Tingginya  kadar  selulosa  di  dalam  limbah  agar berpotensi  juga  sebagai  sumber  bioetanol  yang merupakan  energi  terbarukan.  Hidrolisis  selulosa dalam limbah agar dapat dilakukan secara biologi maupun cara kimia. Proses hidrolisis secara biologi m el ibatk an  enzim   selulase  yang  m am pu mendegradasi selulosa.
Enzim selulase merupakan salah satu enzim yang permintaannya  cukup  tinggi.  Enzim  ini  semakin banyak dibutuhkan dengan meningkatnya produksi bioetanol dari bahan berselulosa. Salah satu penghasil enzim selulase adalah mikroorganisme seperti kapang Trichoderma, Humicola, dan Aspergillus (Sukumaran et  al.,  2005,  Kuhad  et  al.,  2011).  Balai  Besar Penelitian dan Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan memiliki koleksi  isolat  bakteri  penghasil  enzim  potensial, diantaranya  adalah  isolat  bakteri  SGS  1609  yang diisolasi dari rumput laut Sargassum sp., PMP1206 dari rumput laut Gracilaria sp. dan PC3 dari sumber air  panas. Isolat  bakteri SGS  1609 dan  PMP1206 diketahui bersifat selulolitik (Munifah et al., 2011), dan isolat bakteri SGS 1609 telah teridentifikasi sebagai Serratia marcescens. Penelitian bertujuan untuk (1) melakukan  seleksi  terhadap  ketiga  isolat  sebagai penghasil enzim selulase, (2) memanfaatkan limbah pengolahan agar, sebagai komponen media produksi enzim selulase dari isolat terpilih, dan (3) melakukan karakterisasi enzim yang dihasilkan dari perlakuan terbaik untuk mengetahui kondisi optimum bekerjanya enzim tersebut.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini meliputi isolat bakteri PMP1206, S. marcescens SGS 1609, dan isolat bakteri PC3, limbah industri pengolahan agar  yang  diperoleh  dari  salah  satu  industri pengolahan agar di Tangerang, Jawa Barat, dan  NaOH untuk  pretreatment  limbah.  Selain  itu  digunakan bahan-bahan kimia untuk pengujian aktivitas enzim dan karakterisasi enzim, serta bahan-bahan media/ mikrobiologi untuk kultivasi bakteri.

## Metode
Penelitian  dilakukan  secara  bertahap,  diawali dengan seleksi isolat bakteri yang didasarkan atas kemampuannya menghasilkan enzim selulase pada media CMC padat, ditunjukkan oleh zona bening yang dihasilk an.  Isolat  bak teri   terpilih  kem udian ditumbuhkan pada medium cair yang mengandung limbah  agar  yang  telah  mengalami  pretreatment. Pretreatment dilakukan menggunakan NaOH dengan 4  variasi  konsentrasi  0,  2,  4,  dan  6%.  Setiap  hari dilakukan  pengambilan  sampel,  sebanyak  3  kali ulangan;  kemudian  sampel  disentrifugasi.  Filtrat sebagai enzim kasar, diuji aktivitas enzimnya. Enzim yang  dihasilkan  dari  kondisi  optimum  kemudian dilakukan karakterisasi, meliputi pengaruh suhu dan pH, ketahanan panas dan pengaruh ion logam. Secara garis besar, penelitian ini dilakukan mengikuti diagram alir yang disajikan pada Gambar 1.
Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah  analisis  deskriptif  dan  analisis  statistik. Analisis deskriptif dilakukan terhadap seleksi isolat bak teri  selulolit ik  dan  kar akter isasi  enz im , berdasarkan pengamatan dan kurva atau histogram hasil  pengolahan  data  aktivitas  enzim.  Analisis statistik  dilakukan  pada  penentuan  perlakuan konsentrasi NaOH terbaik terhadap aktivitas enzim, menggunakan Rancangan Acak Kelompok dengan faktor  konsentrasi  NaOH,  dan  inkubasi  sebagai kelompok. Data diolah menggunakan Program SPSS versi 19. Perlakuan yang berbeda nyata dilanjutnya dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) Duncan.

## Seleksi isolat bakteri selulolitik
Seleksi isolat bakteri selulolitik didasarkan atas uji kualitatif aktivitas selulase melalui pengamatan terhadap zona bening.  Uji kualitatif dilakukan dengan metode pewarnaan merah kongo 0,1% (Ponnambalam et  al.,  2011). Terbentuknya  zona  bening  di  sekitar koloni  bakteri  menunjukkan  bahwa  isolat  bakteri mampu  menghasilkan  enzim  selulase.  Secara
kualitatif, besarnya aktivitas selulase ini dinyatakan sebagai  Indeks  selulolitik  atau  indeks  aktivitas selulase (IAS), diperoleh dengan menggunakan rumus sebagai berikut (Kader & Omar 1998) :
Indeks selulolitik  =
Keterangan/Note: A  =  diameter  zona  bening  (mm) B  =  diameter  koloni  (mm)

## Preparasi limbah pengolahan agar
Preparasi limbah  pengolahan  agar dilakukan 2 tahap,  yaitu menghilangkan sisa  agar yang masih terkandung  dalam  limbah  dan  diberi  pretreatment
Gambar 1. Diagram alir produksi enzim selulase menggunakan medium yang mengandung limbah agar.
Figure 1. Flow chart of cellulase production using medium containing of agar waste.
dengan  penambahan  NaOH.  Menghilangkan  agar dilakukan  dengan  menambahkan  air  mendidih  ke dalam limbah dengan perbandingan 1:20, kemudian didiamkan  selama 1 jam, lalu dicuci hingga pH netral dan disaring. Limbah pengolahan agar selanjutnya dikeringkan  dengan  cara  dijemur.  Limbah  kering kemudian diberi pretreatment/delignifikasi mengikuti metode Gunam et al. (2010) dengan penambahan NaOH dengan konsentrasi 0, 2, 4, dan 6%, kemudian dipanaskan  pada  suhu  121 o C  selama  15  menit. Campuran  kemudian  disaring,  dicuci  dengan  air sampai netral (pH 7) disiapkan untuk komponen media kultur  bakteri  penghasil  enzim  lalu  dikeringkan menggunakan oven pada suhu 105 o C selama 10 jam. Limbah agar siap diaplikasikan sebagai substrat untuk produksi enzim selulase.
Isolat terpilih berdasarkan zona bening/Selected isolate based on clear zone
Seleksi isolat melalui
kultivasi isolat pada medium padat yang mengandung CMC/

## Selection of isolate through
cultivation of bacterial isolate onto solid medium containing of CMC
Isolat S.marcescens SGS 2609, isolat bakteri PMP 1206, dan PC3Isolate
S.marcescens SGS 2609, bacterial isolate PMP 1206 and PC3
Karakterisasi enzim (suhu dan pH optimum, stabilitas panas,
pengaruh ion logam)/enzyme
characterization (optimum temperatures and pHs, heat stability and effect of metal ions)
Preparasi substrat limbah
agar dengan perlakuan
NaOH/Preparation of agar waste substrate by NaOH
treatments Enzim dari perlakuan terbaik/Enzyme from the best treatment
Optimasi produksi selulase/Optimation of cellulase production A - B
B

## Produksi enzim selulase
Produksi enzim selulase dilakukan dengan cara mengkultivasi isolat bakteri terpilih pada media yang mengandung limbah agar yang telah diberi perlakuan NaOH. Starter dibuat dengan cara menginokulasikan kultur segar ke dalam medium cair yang mengandung MgSO 4 .7H 2 O  0,02%; K 2 HPO 4 0,05%; FeSO 4 .7H 2 O 0,002%,  CaCl 2 .2H 2 O  0,004%;  yeast  extract  0,2%, NH 4 NO 3 0,03%,  KH 2 PO 4 0,1%  dan  CMC  1%. Selanjutnya  starter  dipindahkan  ke  dalam    media produksi sebanyak 20% dari volume media produksi dengan komposisi media sama dengan media starter, kecuali CMC diganti dengan limbah pengolahan agar yang telah mengalami perlakuan.  Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 30 o C, 150 rpm selama 6 hari. Setiap  hari  dilakukan  pengam bilan  sam pel, disentrifugasi pada 9000 x g, 4 o C selama 10 menit dan  filtrat  sebagai  enzim  kasar  diuji  aktivitasnya dengan  metode Miller  yang  dimodifikasi (Wood  & Saddler 1988).  Enzim yang dihasilkan dari perlakuan terbaik,  yaitu  yang  memberikan  aktivitas  enzim tertinggi, kemudian dilakukan karakterisasi enzim.

## Karakterisasi enzim
Karakterisasi enzim dilakukan untuk menentukan pH dan suhu optimum enzim serta pengaruh ion-ion
logam terhadap aktivitas enzim. Pengaruh pH terhadap aktivitas  enzim  diuji  dengan  mereaksikan  enzim dengan  substrat  pada  berbagai  pH  (3 – 9),  dengan menggunakan 0,05 M bufer asetat (pH 3, 4, dan 5); 0,05 M bufer sitrat fosfat (pH 5, 6, dan 7); dan 0,05 M bufer  tris-HCl  (pH  7,  8,  dan  9).  Penentuan  suhu optimum  dilakukan  dengan  mereaksikan  enzim dengan substrat pada pH optimum dan berbagai suhu (30 – 90 o C). Pengaruh ion logam diamati terhadap ion- ion logam bivalen (Ca 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ ) dan trivalen (Fe 3+ ) yang  ditambahkan  dalam  bentuk  garam  khlorida dengan konsentrasi 5 dan 10 mM. Aktivitas enzim selulase diukur sesuai dengan prosedur pengujian sebelumnya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Seleksi Isolat Bakteri Selulolitik
Dari 3 isolat bakteri  yang  diuji kemampuannya dalam  menghasilkan  selulase  secara  kualitatif, diperoleh hasil bahwa isolat S.marcescens SGS 1609 menghasilkan indeks selulolitik terbesar (IS = 2,25), dibandingkan 2 isolat lainnya (Tabel 1 dan Gambar 2). Pewarna congo red akan diserap oleh polisakarida yang memiliki ikatan  -D-glukan. Terbentuknya zona bening  menunjukkan  bahwa  polisakarida  telah
Tabel 1. Nilai Indeks Selulolitik dari isolat bakteri PMP1206, S. marcescens SGS 1609, dan isolat bakteri PC3 pada medium CMC
Table 1. Cellulolytic Index Values of bacterial isolates PMP1206, S. marcescens SGS 1609, dan bacterial isolate PC3
Isolat/Isolate Diameter Zona Bening/ Clear Zone Diameter (mm) Diameter Koloni/ Colony Diameter (mm) Indeks Selulolitik/ Cellulolytic index PMP1206 25 9 1.78 S. marcescens  SGS 1609 39 12 2.25 PC3 5 3 0.67
Gambar 2.  Zona bening isolat PMP 1206 (A), S.marcescens SGS 1609 (B), dan PC3 pada medium CMC (C). Figure 2.  Clear zone of isolate PMP 1206 (A), S. marcescens SGS 1609 (B) and PC3 (C).
A B C
terdegradasi menjadi sakarida dengan rantai yang lebih pendek  sehingga  tidak  dapat  menyerap  pewarna congo red  (Zhang  et  al.,  2006).  Dengan  demikian ketiga  isolat  yang  digunakan  memang  memiliki kemampuan mendegradasi selulosa dari limbah agar, yang memiliki ikatan  -D-glukan. Berdasarkan hasil kualitatif ini maka isolat S.marcescens SGS 1609 diteliti lebih lanjut untuk dikultivasi pada medium yang mengandung  limbah  agar,  guna  mendapatkan informasi karakter enzimnya.
Preparasi Limbah Pengolahan Agar
Penghilangan sisa agar dari limbah pengolahan agar menghasilkan rendemen berupa limbah yang lebih bersih dari pengotor sebesar 33,5%. Selanjutnya perlakuan  pemanasan  dengan  larutan  NaOH menghasilkan rendemen yang lebih rendah, berkisar
Tabel 2. Hasil perlakuan NaOH pada limbah pengolahan agar Table 2. Result of NaOH treatment on agar processing waste
antara 23,9-25,5% dan sedikit penurunan kadar abu dari 6,4%  menjadi 6,0%  pada penggunaan  NaOH konsentrasi 6% (Tabel 2).  Kadar abu yang tinggi pada limbah pengolahan agar diduga berasal dari celite yang mengandung silika (Si) yang digunakan dalam proses penyaringan pada pengolahan agar di industri. Semakin tinggi konsentrasi NaOH juga menghasilkan kenampakan limbah yang lebih baik, yaitu lebih pucat (keabu-abuan)  dari  yang  semula  berwarna  coklat kehitaman.  Dengan  demikian  NaOH  berkontribusi terhadap pengurangan mineral dan pigmen.
Produksi Selulase S. mercescens SGS 1609
Aktivitas enzim selulase yang diproduksi dengan menggunakan medium yang mengandung selulosa dari limbah pengolahan agar disajikan pada Gambar 3. Hasil uji statistik (Anova) menunjukkan bahwa baik
Gambar 3. Aktivitas selulase S. marcescens SGS 1609 yang dihasilkan  dari substrat yang mengalami pretreatment dengan berbagai konsentrasi NaOH.
Figure 3. S. marcescens SGS 1609 cellulase activity produced by substrates preatreating with various concentration of NaOH.
0 2 4 6 Warna/Colour Hitam Kecoklatan/ Browny Black Coklat Keabu- abuan/Greyish Brown Abu-abu Kehitaman/ Black y Grey Abu-abu Kehitam an/ Black y Grey Rendemen/Yield  (%) 33.5 24.8 25.5 23.9 Kadar Air/Moisture Content  (%) 5.6 5.6 5.4 5.2 Kadar Abu/Ash Content  (%) 6.4 6.4 6.3 6.0
Parameter Konsentrasi NaOH/NaOH Concentration  (%) Waktu Produksi (hari)/Production Time (days)
NaOH  0%
Akti v ita s Enzim / Enz yme Activity (U/m l) NaOH  2% NaOH  4%
NaOH  6%
Gambar 4. Pengaruh berbagai konsentrasi NaOH terhadap aktivitas enzim selulase.
konsent rasi  NaOH  m aupun  waktu  produksi menghasilkan aktivitas enzim yang berbeda nyata (Gambar 4 dan 5).  Limbah pengolahan agar yang mengalami pretreatment NaOH dengan konsentrasi yang lebih tinggi menghasilkan aktivitas enzim yang lebih tinggi. Aktivitas enzim tertinggi dihasilkan dari perlakuan konsentrasi NaOH 6%. Waktu produksi, meskipun  memberikan  pengaruh  nyata  (p<0,05) namun hasil uji BNT menunjukkan bahwa aktivitas enzim   yang  diproduksi  selam a  1  hari,  yang menghasilkan aktivitas enzim tertinggi, tidak berbeda nyata dengan 2 dan 3 hari.
Menurut Yi-Zheng et al. (2009), perlakuan dengan alkali  pada  dasarnya  adalah  proses  delignifikasi. Dinyatakan bahwa mekanisme proses ini merupakan saponifikasi ikatan ester intermolekuler pada ikatan silang antara xilan hemiselulosa dengan komponen lain  seperti  lignin  dan  hemiselulosa  yang  lain. Perlakuan  alkali  juga  menghilangkan  asetil  dan berbagai substitusi asam uronat  pada hemiselulosa yang  dapat  mengurangi  akses  enzim  terhadap selulosa dan hemiselulosa (Chang et al, 2000). Fan et al. di dalam Yi-Zheng et al. (2009), menyatakan bahwa  perlakuan  alkali  pada  bahan  lignoselulosa m enyebabkan  longgarnya  struktur  selulosa, meningkatkan  luas  permukaan,  rusaknya  struktur lignin dan terpisahnya ikatan struktural antara lignin dengan karbohidrat. Pemisahan/isolasi selulosa dari limbah agar menggunakan NaOH juga dilaporkan oleh Nurhayati  et  al.  (2014)  yang  mempelajari  sintesis selulosa  asetat  dari  limbah  pengolahan  agar. Dil apork an  bahwa  k onsentrasi   NaOH  6% menghasilkan  kadar  selulosa  yang  paling  tinggi dibandingkan dengan konsentrasi 3 dan 9%. Terkait dengan hal ini, maka NaOH dengan konsentrasi 6% telah cukup untuk memberikan perlakuan pada limbah
agar guna menumbuhkan mikroba penghasil enzim selulase.
Rata-rata aktivitas enzim selulase S.marscescens SGS  1609  yang  dihasilkan  dari  perlakuan  NaOH berkisar antara 0,06–0,07 U/ml (Gambar 4). Terjadi peningkatan aktivitas enzim sekitar 16,7% dengan adanya perlakuan NaOH 6% dibandingkan kontrol. Meskipun berbeda nyata, namun nilai ini relatif rendah. Limbah agar yang berasal dari industri mengandung mineral cukup tinggi, mengurangi akses enzim untuk bereaksi  dengan  selulosa.  Fawzya  et  al.  (2013) melakukan  pengujian  aktiv itas  enzim  selulase S.marscescens SGS 1609 pada berbagai substrat, dan mendapatkan bahwa substrat limbah agar dari industri  yang  mendapat  perlakuan  NaOH  6% menghasilkan aktivitas enzim yang lebih rendah (0,087 U/ml) dibanding limbah agar dari pengolah tradisional yang  sama-sama  mendapat  perlakuan  NaOH  6% (0,134). Limbah agar dari pengolah tradisional yang dalam  prosesnya  tidak  menggunakan  celite  lebih mudah dalam proses delignifikasi oleh NaOH, sehingga substrat yang dapat diakses oleh enzim lebih banyak.
Gunam et al. (2010) melaporkan bahwa perlakuan NaOH  6%  pada  jerami  padi  dapat  meningkatkan aktivitas enzim endoglukanase dari 0,0271 menjadi 0,0365 U/ml atau meningkat sekitar 34,6%. Efektivitas perlakuan NaOH untuk delignifikasi dipengaruhi oleh kondisi  substrat  maupun  perlakuannya.  Menurut Bjerre  et  al.  (1996)  dalam  Yi-Zheng  et  al.  (2009), perlakuan alkali lebih efektif untuk delignifikasi bahan berselulosa dari jenis hardwood, tanaman herba dan limbah pertanian yang umumnya mengandung lignin tidak  terlalu  tinggi. Kandungan  lignoselulosa  pada rumput  laut  dilaporkan  sekitar  3-4%  (Santi  et  al., 2012); sedangkan Chasanah et al. (2010) menemukan bahwa kandungan lignin pada rumput laut Gracilaria
a b c d
mencapai sekitar 12%. Menurut Milled et al. (1976) dalam  Yi-Zheng  et  al.  (2009),  kemampuan  enzim mendegradasi kayu keras yang diberi perlakuan NaOH bisa meningkat sekitar 14–55%
Perlakuan  alkali  untuk  delignif ikasi  bahan berselulosa  umumnya  lebih  sering  digunakan dibandingkan dengan perlakuan menggunakan asam kuat seperti asam sulfat atau asam khlorida.  Hal ini disebabkan adanya beberapa kelemahan penggunaan asam  kuat,  seperti  bersifat  korosif,  menghasilkan produk  degradasi  yang  menghambat  fermentasi biomassa alami, diperlukan penanganan/pembuangan garam-garam hasil penetralan terhadap sisa asam dan perlunya penanganan reduksi partikel biomassa (Yi-Zheng et al., 2009).
Waktu optimum produksi selulase S. marcescens SGS  1609  dengan  menggunakan  medium  yang mengandung limbah agar adalah 1–3 hari (Gambar
Gambar 5. Pengaruh  waktu  produksi  terhadap  aktivitas  enzim  selulase  S.  marcescens  SGS  1609 menggunakan medium limbah agar
Figure 5. Effect of production time on the cellulase activity of S. marcescens SGS 1609 in agar waste medium
5). Hasil serupa dilaporkan oleh Sudto et al. (2008) yang menggunakan beberapa jenis limbah pertanian sebagai substrat untuk produksi selulase dari Bacillus subtilis, E.coli dan Rhizobium sp.  Aktivitas selulase tertinggi  dihasilkan pada inkubasi selama 20 jam.
Acharya dan Chaudhary (2011) menemukan bahwa waktu  optimum  produksi  selulase  dari  Bacillus licheniformis WBS1 dan Bacillus sp. WBS3 dalam medium cair yang mengandung jerami padi dan jerami gandum adalah 60 jam. Produksi selulase dari kapang Aspergillus  niger  menggunakan  medium  yang mengandung jerami  padi memerlukan waktu lebih lama yaitu sampai dengan 5 hari (Jadhav et al., 2013).

## Karakterisasi Enzim Selulase
Hasil  karakterisasi  enzim  menunjukkan  bahwa enzim selulase S.  marcescens SGS  1609 bekerja optimal  pada  pH  6  dan  suhu  50 o C  (Gambar  6).
Gambar 6. Pengaruh pH (A) dan suhu (B) terhadap aktivitas enzim selulase S.marcescens SGS 1609. Figure 6. Effect of pH (A) and temperature (B) on the cellulase activity of S.marcescens SGS 1609.
A B ab c bc ab a bc
Dibandingkan dengan hasil penelitian sebelumnya yaitu selulase dari S.marcescens SGS  1609 yang diproduksi dalam  medium cair  mengandung  CMC sebagai substrat (Fawzya et al., 2013) pH optimum enzim sedikit bergeser dari 7 menjadi 6, sedangkan suhu optimum enzim sama, yaitu 50 o C.  Optimasi pada suhu 40–60 o C pada penelitian ini ditinjau dari nilai aktivitas enzim dan standar deviasinya masih berada dalam kisaran yang sama, sehingga dapat dikatakan enzim bekerja optimum pada kisaran suhu 40–60 o C. Beberapa selulase mikroba memiliki pH dan suhu optimum yang hampir sama dengan hasil penelitian ini, seperti selulase Streptomyces ruber yang memiliki  pH  dan suhu  optimum 6  dan  40 o C
(Nermeen et al., 2010), dan selulase Pseudomonas sp. yang bekerja optimum pada suhu 40 o C (Gautam et  al.,  2010).  Selulase  mikroba  lain  yang  bekerja optimal pada pH 6 adalah selulase Bacillus subtilis YJ1 (Yin et al., 2010), dan selulase Bacillus sp. yang diisolasi dari sawah (Vijayaraghavan & Vincent, 2012).
Hasil pengujian stabilitas enzim terhadap panas menunjukkan bahwa enzim selulase S.marcescens SGS 1609 relatif stabil pada suhu 40–60 o C (Gambar 7). Selama 4 jam enzim yang diinkubasi pada kisaran suhu tersebut hanya mengalami penurunan aktivitas enzim tidak lebih dari 30%; bahkan pada suhu 60 o C, aktivitas enzim masih mencapai sekitar 90%. Pola serupa  ditemukan  pada  enzim  dari  mikroba  yang
Gambar 7.  Stabilitas panas enzim selulase S. marcescens SGS 1609.
Figure 7.  Heat stability of S. marcescens SGS 1609 cellulase.
Gambar 8.  Pengaruh ion logam terhadap aktivitas selulase S.marcescens SGS 1609. Figure 8.  Effect of metal ions on the cellulase activity of S.marcescens SGS 1609.
2+ 2+ 3+ 2+ Kontrol/ Control
sama tetapi diproduksi menggunakan medium yang berbeda, yaitu dengan substrat karboksimetil selulosa. Pada substrat ini, penurunan aktivitas enzim tidak lebih dari 20% (Fawzya et al., 2013). Enzim yang stabil terhadap panas sangat diminati oleh berbagai industri. Selulase yang stabil terhadap panas sangat berguna dalam proses sakarifikasi bahan-bahan berserat yang umumnya memerlukan waktu cukup panjang untuk proses hidrolisisnya (Nigam, 2013). Salah satu faktor yang  berperan  terhadap  ketahanan  panas  enzim adalah  banyaknya  ikatan  disulfida  dalam  molekul protein enzim (Pons et al., 1995).
Karakteristik selulase S. marcescens SGS 1609 terkait dengan pengaruhnya terhadap berbagai ion logam menunjukkan bahwa ion kalsium merupakan aktiv ator  sehingga  adanya  ion  kalsium   akan meningkatkan  aktivitas  enzim  cukup  signifikan, demikian juga ion Mg 2+ . Diantara ion-ion logam yang diamati pengaruhnya, hanya ion Zn 2+ pada konsentrasi 10 mM yang bersifat menghambat aktivitas enzim sekitar 40% (Gambar 8).

## KESIMPULAN
Serratia  marcescens  SGS  1609  mempunyai aktivitas selulolitik terbesar berdasarkan pembentukan zona bening dibandingkan dengan isolat PMP1206 dan PC3. Pemanfaatan limbah pengolahan agar untuk media  produksi  enzim  selulase  dari  m ikroba sebaiknya  didahului  dengan  perlakuan  terhadap limbah tersebut. Penggunaan 1% limbah pengolahan agar yang diberi perlakuan NaOH 6% dalam medium MSM  cair  menghasilkan  enzim  selulase  dari  S. marcescens SGS 1609 dengan aktivitas paling tinggi dibandingkan perlakuan NaOH 0; 2; dan 4%. Waktu optimal produksi enzim selulase S. marsescens SGS 1609 dalam medium tersebut adalah 1–3 hari. Enzim selulase yang dihasilkan bekerja optimum pada pH 6, suhu 50 °C, dan stabil pada suhu 40–60 °C selama 4 jam. Enzim dapat ditingkatkan aktivitasnya dengan penambahan  ion  kalsium  dan  magnesium  pada konsentrasi 5–10 mM.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih  penulis  sampaikan  kepada  Ifah Munifah dan Dewi S. Zilda yang telah menyediakan isolat bakteri untuk penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Acharya,  S.  &  Chaudhar, A.  (2011).  Effect  of  nutritional and  environmental  factors  on  cellulases  activity  by thermophilic   bac teria  isolated  from  hot  spring.
Journal of Scientific & Industrial Research. 70: 142– 148.
Chang, V. &  Holtzapple, M. (2000).  Fundamental factors affecting  biomass enzymatic  reactivity.  Appl  Biochem Biotechnol.  84/86:  5–37.
Chasanah,  E.,  Fawzya,  Y.N.,  Poernomo, A.,  Munifah,  I., Dewi, A.S., Pratitis, A. & Patantis, G. (2010). Penelitian Pemanfaatan  Mikroorganisme  dan  Enzim  untuk Pengembangan  Produk  Berbasis  Surimi  Tropical Catfish,  Bioenergi  dari  Limbah  Rumput  Laut,  dan Nutrasetikal  dari  Limbah  Udang.  Laporan  Teknis. Balai  Besar  Riset  Pengolahan  Produk   dan Bioteknologi  Kelautan  dan  Perikanan,  Jakarta. Fawzya, Y.N., Putri, S., Noriko, N. & Patantis, G.  (2013).
Identification of SGS 1609 cellulolytic bacteria isolated from  Sargassum  spec.  and  characterization  of  the cellulase  produced.  Squalen,  Bulletin  Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan  dan Perikanan. 8(2): 57– 68.
Fithriani,  D.,  Rodiah,  N.,  &  Bakti,  B.S.  (2007).  Ekstraksi selulosa  dari  limbah  pembuatan  karaginan.  Jurnal Pasc apanen  dan  Biotek nologi  Kelautan  dan Perikanan.  2(2):  91–97.
Gautam,  S.P.,  Bundela,  P.S.,  Pandey, A.K.,  Jamaluddin, Awasthi,  M.K.,  &  Sarsaiya,  S.  (2010).  Cellulase production  by  Pseudomonas   sp.  isolated  from municipal  solid  waste  compost.  International  Journal of  Ac ademic  Research.  2(6):  330–333.  http:// www.ijar.lit.az
Global  Energi.  (2014).  LPEI  :  Rumput  Laut  :  Produk Ekspor  Unggulan.  http://www.global-energi.com/ index.php?option=com_content&view=article&id= 1 8 2 9 : l p e i — r u m p u t - l a u t - p r o d u k - e k s p o r - unggulan&catid=61:industri&Itemid=87
Gunam, I.B.M, Buda Ketut, & Guna, M.Y.S.I. (2010). Effect of  delignification  with  NaOH  solution  and  rice  straw substrat  concentration  on  production  of  cellulase enzyme from Aspergillus niger NRRL A-II. 264. Jurnal Biologi XIV. (1): 55–61.
Hariadi,  R.  (2001).  Mempelajari  Pemanfaatan  Limbah Pengolahan  Agar-Agar  Kertas   s ebagai  Media Penghas il  Produk   Biomas s a  Mik roorganis me dengan  Menggunakan  Ragi  Roti  dan  Ragi  Tempe. Skripsi.  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,  IPB. 41 pp.
Jadhav, A.R., Girde A.V., More S.M., More S.B., & Saiqua Khan.  (2013).  Cellulase  Produc tion  by  Utilizing Agricultural Wastes. Research  Journal of Agriculture and Forestry Sciences. 1(7): 6–9.
Kader, A.J. & Omar, O. (1998). Isolation of cellulolytic fungi from  Sayap-Kinabalu  Park,  Sabah.  Serawak .  J Biodiversity  Bio-Conserv (ARBEC). p.  1–6.
Kim, G.S., Myung, K.S., Kim, Y.J., Oh, K.K., Kim, J.S., Ryu H.J., & Kim, K.H. (2007). Methode of Producing Biofuel Using  Sea  Algae.  Seoul:  W orld  Intelectual  Property Organization
Kuhad,  R.C.,  Gupta,  R.,  &  Singh,  A.  (2011).  Microbial cellulases  and  their  industrial  applications.  Enzyme Research Volume 2011, Article ID 280696, 10 pages. http://dx.doi.org/10.4061/2011/280696. Diakses pada bulan  November  2013.
Munifah,  I.,Chasanah,  E.,  &  Fawzya,  Y.N.  (2011). Screening  of  cellulolytic  microbes  from  Indonesia’s marine  environment.  Paper  presented  on International  Seminar  of  Indonesian  Society  for Microbiology (ISISM) and IUMS-Outreach Program on Food  Safety at Bali, 22–24 Juni  2011.
Nermeen A.  El-Sersy,  N.A., Abd-Elnaby,  H., Abou-Elela, G.M.,  Ibrahim,  H.A.H.,  &  El-Toukhy,  N.M.K.  (2010). Optimization,  economization  and  characterization  of cellulase  produced  by  marine  Streptomyces  ruber. African  Journal  of  Biotechnology.  9(38):  6355–6364
Nigam,  P.S.  (2013).  Microbial  Enzymes  with  Special Characteristics  for  Biotechnological  Applications. Review.  Biomolecules.  3:  597–611;  doi:10.3390/ biom3030597
Nurhayati &  Rinta Kusumawati.  (2014). Sintesis  selulosa asetat  dari  limbah  pengolahan  agar.  Dalam  proses penerbitan  Jurnal  Pascapanen  dan  Bioteknologi Kelautan  dan  Perikanan.
Pons, J., Planas, A., & Querol, E. (1995). Contribution of a disulfide bridge to the stability of 1,3-1,4-P-D-glucan 4-glucanohydrolase  from  Bacillus   lic heniformis. Protein Eng. 8:  939–945.
Ponnambalam,  A.S.,  Deepthi,  R.S.,  and  Ghosh,  A.R.
(2011).  Qualitative  display  and  measurement  of enzyme  ac tivity  of  isolated  c ellulolytic  bacteria. Research  Article,  Biotechnol.  Bioinf.  Bioeng.  2011. 1(1):  33–37.
Santi,  R.A.,  Sunarti, T.C.,   Santoso, D., & Triwisari, D.A. 2012.  Komposisi  k imia  dan  profil  polisak arida rumput laut  hijau.  J.  Akuatika  III  (2):  105–114.
Sudto, A., Punyathiti, Y., & Pongsilp, N. (2008). The use of agricultural  wastes  as  substrates  for  cell  growth  and carboxymethyl  cellulase  (CMCase)  production  by Bacillus subtilis, Escherichia coli AND Rhizobium sp. KMITL Sci. Tech. J. 8(2): 84
Sukumaran,  R.K.,  Singhania,  R.R.,  &  Pandhey,  A.S.
(2005).  Microbial  cellulases:  Production,  applications and  c hallenges.  J .  of  Scientific   and  Indus trial Research.  64:  832–844.
Vijayaraghavan, P. and Vincent, S.G.P. (2012). Purification and  characterization  of  carboxymethyl  cellulase  of Bacillus sp. isolated from a paddy field. Polish journal of  Microbiology.  61(1):  51–55.
W ood,  T.M.  &  Saddler,  J.N.  (1988).  Increasing  the availability  of  cellulose  in  biomass  materials.  In W ood,  W.A.  and  Kellog,  J.A.  (eds.).  Methode  in Enzymology  Cellulose  and  Hemicellulose.  Volume ke-160. New  York: Academic  press.  p.  3–11.
Yin, Li-Jung, Lin, Hsin-Hung & Xiao, Zheng-Rong. (2010). Purification  and  characterization  of  a  cellulose  from Bacillus  subtilis  YJ1.  Journal  of  Marine  Science  and Technology,  18(3):  466-471.  http://jmst.ntou.  edu.tw/ marine/18-3/466-471.pdf.  Diakses  pada  bulan April 2012.
Yi-Zheng,  Zhongli  Pan,  &  Ruihong  Zhang.  (2009).
Overview  of  biomass  pretreatment  for  cellulosic ethanol  production. Int  J Agric &  Biol Eng. 2(3): 51– 68.  DOI:  10.3965/j.issn.1934-6344.2009.03.051-068
Zhang Y.H.P, Himmel M.E., & Mielenz J.R. (2006). Outlook for  cellulase  improvement:  screening  and  selection strategies.  Biotechnol  Adv.  24:  452–481.