ANALISIS KERAGAMAN GENETIK ISOLAT Corynespora cassiicola (Berk & Curt) WEI. DI INDONESIA MENGGUNAKAN MARKER ISSR ( INTER SIMPLE SEQUENCE REPEAT )
Genetic Variability Analysis of Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei. Isolates in Indonesia using ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) Markers
Misbakhul MUNIR, Heru SURYANINGTYAS, dan KUSWANHADI
Balai Penelitian Sembawa, Pusat Penelitian Karet Jalan Raya Palembang – P. Balai KM 29, PO BOX 1127 Palembang 30001
Diterima tgl 9 Juli 2012 / Disetujui tgl 20 September 2012
Jurnal Penelitian Karet, 2012, 30 (2)  : 86 - 99 Indonesian  J.  Nat. Rubb. Res. 2012, 30 (2) :  86 - 99

## Abstract
Corynespora Leaf Fall Disease caused by Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei is  one  of  most  important  diseases  in  rubber plantation. It is noted that Hevea clones have become more susceptible to the disease and the  susceptibility  to  the  pathogen  varies  in different  geographic  regions.  The  problem may  occur  because  of  the  evolution  of pathogen  that  can  generate  new  races  with more virulent nature. Thus, the information on the  inherent  variability  of  the  pathogen  is really  needed.  A  research  was  done  to  find out  the  genetic  diversity,  and  infection severity  of Corynespora isolates.  The material  used  in  this  research  was Corynespora  cassiicola isolates  from Lampung, Bengkulu, South Sumatera, Jambi, North  Sumatera,  West  Kalimantan,  and Central Java . The procedurs of this researcch were isolates preparation, the DNA extraction performed using modified CTAB method PCR analysis, using ISSR and data analysis made using  UPGMA  in  NTSYS  computer  program . The  results  of  genetic  diversity  analisis  on isolates  of Corynespora  cassiicola  obtained from seven rubber central areas in Indonesia by  using ISSR markers produced four groups (4 races) of C. cassiicola , group A (Race 1) the isolates  from  Bengkulu;  group  B  (Race  2) covering  isolates  from  Lampung  and  North Sumatera; group C (Race 3) covering isolates from West Kalimantan; South Sumatera and Jambi; and group D (Race 4 ) the isolates from Central  Java.  The  detached  leaf  assay's results  showed  that Corynespora isolates residing  in  the  same  group  based  on  the results of genetic analysis also had the same infection  (pathogenicity)  on  rubber  leaves. Isolates from Central Java (CJT) showed the h i g h e s t   a v e r a g e   r a t e   o f   i n f e c t i o n
(pathogenicity)  compared  with  the  other isolates.  The  lowest  infections  rate  of  the seven isolates was found in clones RRIM 712 and IRR 5, whereas the highest one was in BPM 24 and PR 255 clones.
Keywords : Hevea  brasiliensis, genetic variability  analysis, Cory- nespora cassiicola , ISSR

## Abstrak
Penyakit  Gugur  Daun Corynespora yang disebabkan oleh patogen Corynespora cassiicola (Berk  &  Curt)  Wei.,  merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman karet  ( Hevea  brasiliensis ).  Klon-klon  karet yang  semula  bersifat  moderat  terhadap serangan jamur ini, setelah beberapa tahun menjadi  rentan  dan  terserang  hebat.  Hal tersebut  diduga  karena  evolusi  patogen menghasilkan ras baru yang lebih merusak. Oleh  karena  itu,  informasi  yang  berkaitan dengan  variabilitas  patogen  sangat diperlukan.  Suatu  penelitian  dilakukan untuk  mengetahui  keragaman  genetik, kekerabatan  dan  tingkat  infeksi  isolate C. cassiicola. Bahan  yang  dipakai  dalam penelitian  ini  adalah  isolat Corynespora cassiicola dari  tujuh  daerah  sentra perkebunan  karet  Indonesia  yaitu Lampung,  Bengkulu,  Sumatera  Selatan, Jambi, Sumatera Utara, Kalimantan Barat, dan  Jawa  Tengah.  Prosedur  kerja  dalam penelitian  ini  meliputi  penyiapan  kultur isolat,  ekstraksi  DNA Corynespora cassiicola menggunakan metode modifikasi CTAB,    analisis  PCR  dengan  analisis  data menggunakan  UPGMA  dalam  program N T S Y S ,   d a n   u j i   k e l a y u a n   d a u n menggunakan metode Nghia. Hasil analisis
keragaman  genetik  isolat Corynespora cassiicola asal tujuh wilayah sentra karet di Indonesia  menggunakan marker ISSR menghasilkan  empat  kelompok  (4  ras) C . cassiicola ,  kelompok  A  (Ras  1)  yaitu  isolat asal Bengkulu, kelompok B (Ras 2) meliputi isolat  asal  Lampung  dan  Sumatera  Utara, kelompok  C  (Ras  3)  meliputi  isolat  asal Kalimantan  Barat,  Sumatera  Selatan  dan Jambi, dan kelompok D (Ras 4) yaitu isolat asal Jawa Tengah. Hasil uji kelayuan daun m e n u n j u k k a n   b a h w a   i s o l a t - i s o l a t Corynespora yang  berada  pada  kelompok yang  sama  berdasarkan  hasil  analisis genetik,  juga  mempunyai  tingkat  infeksi (patogenitas) yang sama terhadap beberapa daun  karet  yang  diuji.  Isolat  asal  Jawa tengah  (CJT)  mempunyai  rata-rata  tingkat infeksi  (patogenitas)  tertinggi  dibanding isolat yang lainnya. Tingkat infeksi terendah dari tujuh isolat adalah pada klon RRIM 712 dan  IRR  5,  sedangkan  tertinggi  terdapat pada klon BPM 24 dan PR 255.
Kata kunci : Hevea  brasiliensis ,  analisis keragaman  genetik, Cory- nespora cassiicola , ISSR

## PENDAHULUAN
Penyakit  Gugur  Daun Corynespora (PGDC)  yang  disebabkan  oleh  patogen Corynespora  cassiicola (Berk  &  Curt)  Wei., merupakan  salah  satu  penyakit  penting pada  tanaman  karet  ( Hevea  brasiliensis ). Penyakit  ini  semakin  penting  setelah  klon- klon  karet  yang  sebelumnya  bersifat moderat  dilaporkan  menjadi  rentan  dan terserang  hebat  setelah  beberapa  tahun kemudian  (Sinulingga et  al .,  1996).  Selain itu,  klon-klon  karet  juga  menjadi  lebih rentan  terhadap  variasi  patogen  yang berasal  dari  wilayah  geografi  yang  berbeda (Sinulingga et  al .,  1996).  Hal  tersebut, memunculkan  dugaan  adanya  ras  fisiologi C . cassiicola yang berbeda yang menginfeksi tanaman  karet  dan/atau  terjadi  evolusi patogen yang menghasilkan ras baru (Nghia et al ., 2007).
Dewasa  ini marker molekuler  telah luas  dipergunakan  untuk  menentukan karakteristik  gen  dari  berbagai  organisme, termasuk  jamur,  tumbuhan,  dan  hewan. Penemuan Polymerase Chain Reaction (PCR)
mengawali  penemuan marker molekuler generasi kedua yang lebih cepat dan murah yang  diperoleh  dari  teknik  dasar  PCR. Beberapa  keberhasilan  penggunaan  teknik dasar  PCR  telah  dilaporkan  untuk mengidentifikasi jamur patogen pada tingkat taksonomi  yang  lebih  rendah  daripada spesies  (Gil-Lamaignere et  al .,  2003).  Pada penelitian  karet, Randomly  Amplified Polymorphic DNA (RAPD)  telah  banyak digunakan untuk identifikasi dan klasifikasi isolat-isolat C.  cassiicola yang  berbeda (Darmono et  al .,  1996;  Situmorang,  2002), namun  kelemahan  dari  RAPD  adalah  hasil yang tidak sama jika dilakukan perulangan dengan  metode  yang  sama,  baik  antar laboratorium atau dalam laboratorium yang sama  pada  waktu  yang  berbeda  terutama d e n g a n   m e s i n   y a n g   b e r b e d a   ( l o w reproducibility )  (Nghia et  al .,  2007). Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) adalah teknik dasar  PCR  lainnya  yang  hampir  sama dengan  teknik  RAPD,  namun  pada  ISSR sekuen  primer  didisain  dari  daerah microsatelite dan  menggunakan  suhu marker annealing yang lebih tinggi daripada marker RAPD yang mana dapat menghasil- kan  produk  PCR  yang  mempunyai konsistensi  tinggi  (Nghia et  al .,  2007). Beberapa  penelitian  telah  membuktikan bahwa  ISSR  berhasil  diterapkan  dalam identifikasi  jamur  patogen  (Burgess et  al ., 2001).  Oleh  karena  itu,  teknik  ini  dipilih dalam  penelitian  ini  untuk  menganalisis polimorfisme tujuh isolat Corynespora yang berasal dari Lampung, Bengkulu, Sumatera S e l a t a n ,   J a m b i ,   S u m a t e r a   U t a r a , Kalimantan Selatan, dan Jawa Tengah.
Beberapa  ras C.  cassiicola yang menginfeksi tanaman karet telah diidentifi- kasi  dan  kekerabatan  genetik  antar  isolat telah  diketahui  (Darmono et  al .,  1996). Sebagai  hasilnya,  klon-klon  baru  untuk rekomendasi  harus  diseleksi  berdasarkan sifat  ketahanannya  terhadap  serangan C. cassiicola (Ramli et  al .,  1996).  Oleh  karena itu,  informasi  yang  berkaitan  dengan variabilitas  patogen  sangat  diperlukan (Nghia et al ., 1996) dan beberapa penelitian telah  membuktikan  bahwa  ISSR  berhasil diterapkan dalam identifikasi jamur patogen (Burgess et al ., 2001).
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui keragaman genetik, kekerabat- an,  dan  tingkat  infeksi  isolat C.  cassiicola
Analisis keragaman genetik isolat Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei. di Indonesia menggunakan marker ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
yang berasal dari 7 daerah sentra perkebun- an  karet  Indonesia,  yaitu  Lampung, Bengkulu,  Sumatera  Selatan,  Jambi, Sumatera  Utara,  Kalimantan  Selatan,  dan Jawa Tengah berdasarkan pita polimorfisme yang  terbentuk  dari  teknik  dasar  PCR menggunakan marker ISSR.

## BAHAN DAN METODE
Biakan  C. cassiicola yang  digunakan pada  penelitian  ini  adalah  tujuh  isolat C . cassiicola dalam  media  PDA  yang  berasal dari  sentra  perkebunan  karet  Indonesia dalam bentuk kepingan berdiameter 0,5 cm dan  masing-masing  kepingan  dimasukkan ke  dalam  100  ml  media  cair  sari  kentang sukrosa  (500  ml  ekstrak  kentang,  500  ml aquades,  30  g  sukrosa).  Biakan  diinkubasi selama 7 hari pada suhu ≥ 25 C di atas alat pengocok  ( shakker )  dengan  kecepatan  80 rpm. Miselia isolat diambil dan dicuci 2 kali dengan  aquades  steril  dengan  penyaring  2 lapis  kain  kasa  (Modifikasi  Situmorang, 2002).

## Ekstraksi DNA
Ekstraksi  DNA  dilakukan  mengguna- kan  metode  modifikasi  CTAB  yang  diambil dari  Situmorang  (2002)  yaitu,  miselia sebanyak 1 gram dari masing-masing isolat dilumatkan  dengan  N cair  dalam  mortar 2 sampai  halus.  Tepung  miselia  tersebut dimasukkan ke dalam tabung (16 ml) yang berisi buffer [(12,6 ml NaCl 5 M, 2 ml EDTA 0,5 M (pH 8), 5 ml Tris HCl 1 M (pH 8,0), 10 ml CTAB 10 %, 20,4 ml akuabides)]. Campuran d i k o c o k   d e n g a n   v o r t e k s   k e m u d i a n diinkubasi pada 65°C selama 30 menit. Ke dalam  campuran  ditambahkan  lagi (kloroform + isoamil alkohol = 24 : 1) + fenol = 1 : 1 kemudian dikocok dengan vorteks dan disentrifus  11.000  rpm  selama  15  menit. Larutan  bagian  atas  tabung  (supernatan) diambil  dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung sentrifus. Ditambahkan (kloroform + isoamil alkohol = 24 : 1) ke dalam supernatan dan disentrifus lagi 11.000 rpm selama 5 menit. Supernatan  diambil  dan  ditambahkan isopropanol  dingin,  digoyang  pelan kemudian  dimasukkan  ke  dalam freezer selama  30  menit.  Larutan  disentrifus  lagi dalam 11.000 rpm selama 15 menit, cairan dibuang dan pelet diambil. Kemudian pelet
o
dicuci  dengan  etanol  (70%)  dingin,  dan disentrifus lagi dalam 11.000 rpm selama 15 menit kemudian dikeringkan dalam kondisi vakum. Pelet DNA yang diperoleh dilarutkan dalam 1 ml buffer TE [(Tris HCl 10 mM (pH 8,0),  EDTA  1  mM)].  RNA  ( ribonucleic  acid ) dihilangkan  dengan  menambahkan  RNAse (10 μ g/ml)  ke  dalam  0,5  ml  DNA  dan diinkubasi pada suhu 37°C selama satu jam. Ke  dalam  larutan  ditambahkan  etanol absolut  1  ml,  diaduk  perlahan,  diinkubasi lagi  pada  suhu  4°C  selama  0,5  jam, kemudian disentrifus 11.000 rpm selama 2 menit.  Supernatan  dibuang  dan  pelet  DNA dicuci  dengan  etanol  70%  dingin  sebanyak 500 μ l TE dan disimpan pada 4°C. Sebelum disimpan,  kemurnian  dan  total  DNA  tiap contoh  ditentukan  dengan  spektofotometer atau running gel .
Kualitas  DNA  diuji  dengan  elektro- foresis  gel  agarose  0,8%.  Kemurnian  DNA dilihat  dengan  menggunakan  UV  spektro- fotometer pada rasio panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dan konsentrasi DNA pada panjang gelombang 260 nm dengan OD = 1 ekivalen  dengan  sekitar  50 μ g/mL  DNA (Sambrook et al ., 1989).
Analisis  PCR  dengan Inter  Simple Sequence Repeat (ISSR)
Berdasarkan  kestabilan  amplifikasi, dalam  penelitian  ini  digunakan  5  primer ISSR,  yaitu  UBC  826,  UBC  828,  UBC  835, UBC  840,  dan  UBC  850.  Amplifikasi  PCR dilakukan  menurut  metode  William et  al . (1990). Amplifikasi PCR dilakukan dalam 25 μl  vo lum  reaksi  yang  terdiri  1,0 μ L  DNA template (10  ng/ μ l);  1,5 μ L  MgCl2  25  mM; 2,5 μ L buffer 10 x, 0,5 μ L dNTP 10 mM; 0,2 μ L 1 U taq DNA polimerase; 17,3 μ L ddH2O dan masing-masing 1 μ L primer ISSR.
Amplifikasi  dilakukan  dengan  meng- gunakan  mesin  PCR  Biometra,  denaturasi awal  pada  94°C  selama  5  menit,  diikuti dengan  35  siklus  (denaturasi  pada  94°C selama  30  detik, annealing pada  52°C sampai  dengan  55°C  selama  1  menit), extension pada  72°C  selama  2  menit  dan extension akhir pada 72°C selama 10 menit (Nghia et  al .,  2007).  Semua  reaksi  PCR dilakukan  dengan  tiga  ulangan  untuk memastikan  amplifikasinya  konsisten. Untuk  negatif  kontrol,  seluruh  substrat

## Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
diamplifikasi dengan mix tanpa penambah- an DNA.
Produk  amplifikasi  dipisahkan ukurannya pada 1,2% gel agarose dalam 1 x buffer TAE (40mM Tris, 20mM asam asetat dan 1 mM EDTA) pada 70 V selama 45 menit dalam suhu ruangan. Gel diwarnai dengan Ethidium  bromide (Nghia et  al .,  2007). Selanjutnya gel difoto dengan menggunakan Polaroid di bawah UV transiluminator.

## Analisis Data
Fragmen amplifikasi DNA diberi skor 1 jika ada band DNA yang muncul, dan 0 jika tidak  ada band DNA.  Data  matrik  biner digunakan untuk analisis indeks similaritas gen ( Genetic Similarity Index ) dan perbedaan genetik  antara  populasi  patogen.  Analisis cluster dilakukan  berdasarkan  Matriks Similaritas Nei and Li's (Nei dan Li's, 1979) dengan Unweighted  Paired  Group  Method dengan  rata-rata  aritmatik  (UPGMA). Dendogram disusun menggunakan program Numerical  Taxonomy  and  Multivariate Analysis  System (NTSYS-pc)  versi  1.8 (Rhohlf, 1993).
Uji  Kelayuan/Kerusakan  Daun  di Laboratorium
Dari  hasil  analisis cluster ,  3  isolat (isolat  dari  Bengkulu,  Sumatera  Selatan, dan Jawa Tengah) yang mewakili 3 kelompok ras, yaitu Ras I, Ras II, dan Ras III, dipilih untuk  digunakan  dalam  uji  kelayuan/ kerusakan daun 9 klon karet, yaitu klon IRR 107,  RRIM  712,  dan  RRIM  600  untuk mewakili  klon  yang  rentan  terhadap Corynespora ;  klon  PB  260,  RRIC  100,  dan IRR  5  untuk  mewakili  klon  yang  moderat terhadap Corynespora ;  serta  klon  BPM  24, IRR  118,  dan  PR  255  untuk  mewakili  klon yang  resisten  terhadap Corynespora .  Uji kelayuan/kerusakan  daun  dilakukan  kira- kira  10–14  hari  setelah  daun  muda  karet direndam  dalam  air  dalam petri  disk besar dengan  bagian  permukaan  abaksial  daun menghadap  ke  atas.  Inokulasi  dilakukan dengan  meneteskan  10 μ l  suspensi  spora Corynespora cassiicola (2000 spora/ml) dari 3  isolat  terpilih  ke  daun  dengan  8  titik tetesan per daun. Pengamatan kerusakan/ kelayuan  daun  diamati  6  hari  setelah
inokulasi.  Infeksi  terjadi  ketika  jaringan daun pada titik inokulasi menjadi berwarna gelap.  Keparahan  infeksi  diberi  skor  0  jika tidak ada luka/bercak; 1 jika ada perubahan warna  menjadi  gelap  namun  kecil;  2  jika terdapat  bercak  yang  besar  tanpa  meluas melalui  urat-urat  daun;  3  jika  terdapat bercak  yang  besar  dan  meluas  pada  urat- urat daun; 4 jika terdapat bercak yang besar dan  menonjol  dengan  adanya  miselium (Nghia et al ., 2007).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil running elektroforesis  terhadap hasil  amplifikasi  tujuh  DNA Corynespora cassiicola menunjukkan  bahwa  tidak muncul band DNA pada isolat asal Bengkulu (CBK); Lampung (CLP) dan Kalimantan Barat (CKB) pada kelima primer. Sementara pada isolat  asal  Jawa  Tengah  (CJT), band DNA muncul  yaitu  pada  primer  UBC  828,  UBC 835, dan UBC 840. Sementara itu, band DNA juga  muncul  isolat  asal  Sumatera  Selatan (CSS),  Jambi  (CJB)  dan  Sumatera  Utara (CSU) yaitu masing-masing pada primer UBC 828 dan UBC 840.
M e m p e r t i m b a n g k a n   p e r c o b a a n - percobaan hasil running elektroforesis yang telah  dilakukan  sebelumnya,  tampak konsisten bahwa hanya 3 dari 5 primer ISSR yang  menghasilkan  polimorfisme,  yaitu primer  UBC  828,  UBC  835,  dan  UBC  840, maka  dilakukan running elektroforesis terhadap hasil amplifikasi tujuh isolat DNA Corynespora cassiicola CBK, CLP, CKB, CJT, CSS,  dan  CJB  menggunakan  ketiga  primer tersebut.  Hasil  perlakuan  tersebut menunjukkan hasil seperti pada Gambar 1.
Berdasarkan  analisis cluster UPGMA terhadap  hasil running di  atas,  maka didapatkan dendogram kekerabatan genetik dari  ke-7  isolat Corynespora  cassiicola , seperti pada Gambar 2.
Berdasarkan  dendogram  analisis g e n e t i k   m e n g g u n a k a n   p r i m e r   I S S R menunjukkan  bahwa  nilai  koefisien kemiripan  genetik  antar  isolat Corynespora berkisar antara 0,57 - 0,68 (57 - 68%) atau keragaman  genetik  32  -  43%  (Gambar  2). Pada  nilai  koefisien  kemiripan  genetik  57% terbagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok A  berbeda  dengan  kelompok  lainnya  (B,  C,
Analisis keragaman genetik isolat Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei. di Indonesia menggunakan marker ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
Gambar  1. Running  gel elektroforesis hasil amplifikasi DNA C.  cassiicola dari tujuh isolat yang berbeda menggunakan primer UBC 828, UBC 835, dan UBC 840
Figure 1.Running gel electrophoresis of C. cassiicola DNA amplification result of from seven different isolates using primer UBC 828, UBC 835 and UBC 840
Gambar  2. Dendogram  hasil  analisis  cluster  dengan  UPGMA  menunjukkan  hubungan genetik antara tujuh isolat C. cassiicola asal wilayah yang berbeda
Figure 2.  Dendogram by UPGMA cluster analysis shows genetic relationships among the seven isolates of C. cassiicola obtained from the different regions Coefficient of similarity 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90
1.00
CBK CLP CSU CKB CSS CJB CJT A B C D C1 C2
CBK = isolat asal Bengkulu ( isolate from Bengkulu ) CLP = isolat asal Lampung ( isolate from Lampung ) CSU = isolat asal Sumatera Utara ( isolate from North Sumatra ) CKB = isolat asal Kalimantan Barat ( isolate from West Kalimantan ) CSS = isolat asa Sumatera Selatan ( isolate from South Sumatra ) CJB = isolat asal Jambi ( isolate from Jambi ) CJT = isolat asal Jawa Tengah ( isolate from Central Java )

## Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
D),  sehingga  secara  keseluruhan  isolat Corynespora yang dianalisis menghasilkan 4 kelompok  utama.  Kelompok  A  berjumlah  1 isolat  yaitu  CBK.  Kelompok  B  berjumlah  2 isolat  yaitu  CLP  dan  CSU  dengan  koefisien kemiripan  genetik  62,81%  atau  variasi genetik 37,19%.   Kelompok C terdiri dari 3 isolat,  dan  terbagi  dalam  2  sub  kelompok. Sub kelompok C1 yaitu isolat CKB dan sub kelompok C2 terdiri dari isolat CSS dan CJB dengan koefisien kemiripan genetik 68,91% atau  variasi  genetik  31,09%.  Kelompok  D berjumlah 1 isolat yaitu CJT.
Nilai  koefisien  kemiripan  menunjuk- kan  kesamaan  individu  dalam  suatu populasi,  semakin  tinggi  nilai  koefisien kemiripan  antar  individu  menunjukkan kekerabatan  genetik  yang  dekat  antar individu  tersebut.  Isolat  CSS  dan  CJB mempunyai koefisien kemiripan yang paling tinggi yaitu 68,91% (Gambar 2 dan Tabel 1), kedua  isolat  tersebut  menunjukkan  ke- kerabatan genetik yang dekat dibandingkan dengan kekerabatannya dengan isolat yang lain. Hal ini dapat disebabkan oleh wilayah Sumatera  Selatan  dan  Jambi  relatif berdekatan  secara  geografis,  sehingga
memungkinkan  terjadinya  aliran  gen. Menurut  McDonald  (1997),  faktor  yang berperan  dan  menyebabkan  terjadinya perubahan genetika patogen adalah mutasi, rekombinasi,  hibridisasi,  paraseksual, heterokariosis,  migrasi  atau  aliran  gen, besar populasi, dan tekanan seleksi. Matrik kesamaan  genetik  isolat  berdasarkan analisis  dengan  primer  ISSR  tersaji  dalam Tabel 2.
Tingkat Infeksi Tujuh Isolat Corynespora cassiicola pada Uji Penetesan Spora pada Daun  Karet  dari  Berbagai  Klon  (Uji Kelayuan Daun)
Berdasarkan  hasil  uji  kelayuan  daun karet  dari  berbagai  klon  setelah  dilakukan penetesan  suspensi  spora  ke-7  isolat C . cassiicola ,  diketahui bahwa beberapa isolat C . cassiicola mempunyai  tingkat  infeksi (patogenitas) yang berbeda antara satu dan yang  lainnya.  Namun  uji  statistik membuktikan  bahwa  isolat-isolat  yang berada  pada  kelompok  yang  sama  pada analisis genetik menggunakan marker ISSR (Gambar  3  dan  Tabel  1),  menunjukkan
Tabel 2. Matriks kesamaan genetik tujuh isolat Corynespora berdasarkan marka ISSR Table 2. Genetic similarity matrix of seven Corynespora isolate based on ISSR markers

## CBK           CLP         CKB         CJT          CSS         CJB          CSU
CBK 1,0000 CLP 0,5735 1,0000 CKB 0,5890 0,5455 1,0000 CJT 0,5793 0,6107 0,5816 1,0000 CSS 0,5695 0,5109 0,6667 0,5890 1,0000 CJB 0,6207 0,6565 0,6525 0,6286 0,6849 1,0000 CSU 0,5185 0,6281 0,5649 0,5846 0,6471 0,6462 1,0000
Analisis keragaman genetik isolat Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei. di Indonesia menggunakan marker ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
Tabel 1. Pengelompokan tujuh isolat Corynespora berdasarkan dendogram keragaman genetik Table 1. Grouping seven Corynespora isolates  based on genetic diversity dendogram
Kelompok utama Main group Sub kelompok Subgroup Koefisien kemiripan genetik Genetic similarity coefficient % Isolat Isolate A - 57 CBK B - 62,81 CLP, CSU C C1 65 CKB C2 68,91 CSS, CJB D - 59 CJT
tingkat  infeksi  (patogenitas)  yang  tidak berbeda  nyata.  Isolat C . cassiicola CSS mempunyai  rata-rata  tingkat  infeksi  pada daun  uji  yang  tidak  berbeda  nyata  dengan isolat  CJB  (berturut-turut  1,70  dan  1,63) (Tabel  3)  yang  mana  kedua  isolat  tersebut berada pada kelompok yang sama berdasar- kan  analisis  genetik  yang  telah  dilakukan sebelumnya,  yaitu  pada  kelompok  C, khususnya sub-kelompok C . Sementara itu,
2 isolat CSU juga mempunyai rata-rata tingkat infeksi  (patogenitas)  yang  tidak  berbeda nyata  dengan  isolat  CLP  yang  mana mempunyai  rata-rata  tingkat  infeksi berturut-turut 0,63 dan 0,63 (Tabel 3). Pada analisis  genetik  isolat  CSU  berada  pada kelompok  yang  sama  dengan  isolat  CLP, yaitu pada kelompok B (Gambar 2 dan Tabel 1).  Isolat  CKB  berada  pada  satu  kelompok dengan  isolat  CSS  dan  CJB,  namun demikian  isolat  CKB  mempunyai  rata-rata tingkat  infeksi  yang  berbeda  nyata  dengan isolat  CSS  dan  CJB.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  kemungkinan  besar  isolat  CKB berbeda  secara  perilaku  (karakteristik) patogenitasnya dengan isolat CSS dan CJB walaupun secara genetik berdekatan. Hal ini juga  menjadi  dasar  untuk  menempatkan isolat CKB pada sub-kelompok yang berbeda dengan  isolat  CSS  dan  CJB,  yaitu  sub- kelompok C . 1
Isolat  CBK  mempunyai  rata-rata tingkat  infeksi  (patogenitas)  yang  berbeda nyata  dengan  isolat-isolat  yang  lain,  yaitu 3,19.  Hal  ini  selaras  dengan  hasil  analisis genetik,  yang  mana  isolat  CBK  merupakan kelompok  tersendiri  dibanding-kan  dengan kelompok  yang  lain,  yaitu  termasuk  ke dalam kelompok A (Gambar 2 dan Tabel 1). Demikian  juga  dengan  isolat  CJT  yang mempunyai  rata-rata  tingkat  infeksi (patogenitas)  yang  berbeda  nyata  dengan isolat-isolat  yang  lain,  dan  relevan  dengan hasil  analisis  genetik  yang  menempatkan isolat  CJT  pada  kelompok  tersendiri  yaitu kelompok D (Gambar 3 dan Tabel 1). Isolat CJT  mempunyai  rata-rata  tingkat  infeksi tertinggi  dibandingkan  dengan  isolat-isolat yang lain, yaitu 3,70. Hal ini menjadi dasar untuk  menempatkan  isolat  CJT  sebagai kelompok isolat atau ras yang paling virulen.
Penelitian Nghia et al . (2007) mengenai diferensiasi  isolat Corynespora  cassiicola dari  perkebunan  karet  di  Malaysia menggunakan marker ISSR,  melaporkan
bahwa terdapat 3 ras Corynespora cassiicola yang  dihasilkan  dari  analisis  genetik  pada penelitian  tersebut.  Beberapa  daun  yang digunakan  pada  uji  kelayuan  daun  pada penelitian  tersebut,  sama  dengan  yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu daun klon PB 260 dan RRIM 600. Hasil penelitian Nghia et al . (2007) menunjukkan bahwa klon PB  260  mengalami  infeksi  ringan  terhadap isolat Corynespora Ras  1,  terinfeksi  berat terhadap  Ras  2,  dan  terinfeksi  moderat terhadap  Ras  3.  Sementara  itu  pada penelitian  tersebut,  klon  RRIM  600 mengalami  infeksi  ringan  terhadap  Ras  3, infeksi  berat  terhadap  Ras  1  dan  infeksi moderat  terhadap  Ras  2.  Berbeda  pada penelitian ini, dimana hasil analisis genetik isolat Corynespora dari perkebunan karet di Indonesia  menggunakan marker ISSR menghasilkan  empat  ras Corynespora .  Uji kelayuan  daun  pada  klon  PB  260  dalam penelitian ini menunjukkan bahwa daun PB 260  mengalami  infeksi  ringan  terhadap isolat  dari  Lampung  dan  Sumatera  Utara (Ras  2),  serta  Kalimantan  Barat  (Ras  3); mengalami infeksi berat terhadap isolat dari Bengkulu (Ras 1) dan Jawa Tengah (Ras 4); dan  mengalami  infeksi  moderat  terhadap isolat dari Sumatera Selatan dan Jambi (Ras 3).  Sementara  itu  klon  RRIM  600  dalam penelitian  ini  mengalami  infeksi  ringan terhadap isolat dari Lampung dan Sumatera Utara  (Ras  2);  mengalami  infeksi  berat terhadap  isolat  dari  Bengkulu  (Ras  1)  dan Jawa Tengah (Ras 4); dan mengalami infeksi moderat  terhadap  isolat  dari  Jambi, Sumatera  Selatan,  dan  Kalimantan  Barat (Ras  3).  Bervariasinya  hasil  yang  didapat dari  penelitian  ini  dibandingkan  dengan hasil  penelitian  Nghia et  al . (2007) dimungkinkan karena perbedaan asal isolat, dimana  pada  penelitian  Nghia et  al .  (2007) isolat Corynespora diambil  dari  klon  yang sebagian  besar  adalah  klon  RRIM,  sedang- kan  pada  penelitian  ini  seluruh  isolat diambil dari klon GT 1.
Respons  Klon  Karet  terhadap  Infeksi  7 Isolat C . Cassiicola pada  Uji  Kelayuan Daun
Rata-rata  tingkat  infeksi  tujuh  isolat C . cassiicola terhadap  beberapa  klon  karet pada uji kelayuan daun dapat menggambar- kan  respons  klon-klon  karet  tersebut terhadap 7 sampel isolat yang digunakan.

## Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
Hasil uji kelayuan daun menunjukkan bahwa pada umumnya klon-klon karet yang digunakan  dalam  uji  tersebut  mempunyai respons yang hampir sama antara klon yang satu  dengan  klon  yang  lainnya.  Namun demikian  dari  hasil  uji  tersebut  diketahui bahwa  tingkat  infeksi  tujuh  isolat Corynespora pada daun karet klon RRIM 712 dan  IRR  5  berbeda  nyata  dengan  tingkat infeksi  pada  daun  karet  klon  PR  255  dan BPM  24,  yang  mana  tingkat  infeksi Corynespora pada klon RRIM 712 dan IRR 5 lebih  rendah  dibanding  klon  PR  255  dan BPM  24  (Tabel  4).  Penampakan  infeksi Corynespora secara umum pada daun IRR 5 berupa  bercak  yang  berwarna  gelap,  tidak meluas  pada  urat-urat  daun,  dan  tidak terlihat  adanya  miselium.  Sementara  itu
penampakan infeksi Corynespora pada daun PR  255  dan  BPM  24  berupa  bercak  gelap meluas  melalui  urat-urat  daun  dan  tepian daun (Gambar 4).
Tingkat  infeksi  tujuh  isolat Cory- nespora pada  daun  karet  klon  RRIC  100 berbeda  nyata  dengan  tingkat  infeksi  pada daun  karet  klon  RRIM  600,  yang  mana tingkat infeksi Corynespora pada klon RRIC 100  lebih  rendah  dibandingkan  klon  RRIM 600 (Tabel 4). Penampakan daun pada saat terjadinya  infeksi Corynespora pada  daun RRIC  100  tidak  jauh  berbeda  dengan penampakan  daun  IRR  5.  Sementara  itu penampakan  infeksi  pada  daun  RRIM  600 berupa bercak gelap tidak meluas pada urat- urat  daun,  tetapi  bercak-bercak  cukup banyak, dan meluas pada bagian tepi daun (Gambar 4).
Tabel 3.Tingkat infeksi tujuh isolat Corynespora cassiicola pada daun karet dari berbagai klon Table 3. Pathogenicity level of  seven Corynespora isolates on leaves of various rubber clones
Isolat Isolates Rata-rata skor infeksi Corynespora pada daun karet berbagai klon
Average score of Corynespora pathogenicity on leaves of various rubber clones
Rata-rata 1) 1) 1)
Average BPM 24 IRR 5 RRIM 712 RRIC 100 PB 260 IRR 118 RRIM
600 IRR 107 PR 255 CBK 4,00 1,67 1,00 3,67 3,67 3,33 4,00 3,33 4,00 3,19 d CLP 0,67 1,00 0,67 0,67 1,00 0,67 0,33 0,00 0,67 0,63 b CSU 0,67 1,33 1,00 0,67 0,33 0,33 1,00 0,00 0,33 0,63 b CKB 0,33 0,33 0,00 0,33 0,33 0,33 0,00 0,00 0,33 0,22 a CSS 2,00 1,00 2,33 1,33 1,67 1,33 2,00 1,00 2,67 1,70 c CJB 2,67 0,00 0,00 1,67 2,00 0,67 2,33 3,00 2,33 1,63 c CJT 4,00 4,00 4,00 2,00 3,67 4,00 3,67 4,00 4,00 3,70 e Rata-rata Average 2,05 1,33 1,29 1,48 1,81 1,52 1,90 1,62 2,05
Analisis keragaman genetik isolat Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei. di Indonesia menggunakan marker ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan taraf 5% (Figures followed by the same letters at the same coloum are not significantly different based at 5% Duncan test level )
Keparahan infeksi ( pathogenicity severity ): skor 0 :  jika tidak ada luka/bercak; (no injury or spots found) skor 1 :  jika ada perubahan warna menjadi gelap namun kecil; ( if there are changes to a darker color but smaller ) skor 2 :  jika terdapat bercak yang besar tanpa meluas melalui urat-urat daun; (large patches seen but not extending to the  leaf veins )
skor 3  :  jika terdapat bercak yang besar dan meluas pada urat-urat daun; (great spots found  and extending to the leaf veins)
skor 4  :  jika terdapat bercak yang besar dan menonjol dengan adanya miselium; (large and prominent spots found due to  the presence of mycelium)
Gambar 3. Skala bercak daun pada uji kelayuan daun
Figure    3. Scale of  leaf spot in  withered test leaf
Skala ( score ) 0 (a); 1 (b); 2 (c); 3 (d); 4 (e)
(a) (b)
(c) (d) (e)
Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
Tabel 4. Rata-rata tingkat infeksi tujuh  isolat C.cassiicola pada daun klon yang diuji Table 4. Average pathogenicity levels of seven isolates of C. cassicola in leaves test clones
Klon Clone Rata-rata skor infeksi tujuh isolat Corynespora Average of isolates pathogenicity score of seven Corynespora RRIM 712 1,29 a IRR 5 1,33 a RRIC 100 1,48 ab IRR 118 1,52 ab IRR 107 1,62 abc PB 260 1,81 bcd RRIM 600 1,90 cd PR 255 2,05 d BPM 24 2,52 d
Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan taraf 5% (Figures followed by the same letters at the same coloum are not significantly different based on 5% Duncan test level )
Secara umum klon uji yang digunakan dalam  penelitian  ini,  berdasarkan  hasil  uji respons terhadap infeksi Corynespora pada Tabel 4, dapat dikategorikan dalam kategori resisten  sampai  dengan  sedang.  Hasil tersebut  selaras  dengan  hasil  penelitian l a p a n g a n   r e s i s t e n s i   k l o n   t e r h a d a p Corynespora pada  penelitian-penelitian terdahulu.  Meskipun  demikian,  beberapa klon  menunjukkan  respons  yang  berbeda dari  hasil  penelitian  resistensi  di  lapangan seperti  klon  RRIM  712,  RRIM  600,  dan  PR 255 (Tabel 5).
Dalam  penelitian  ini,  klon  RRIM  712 mempunyai  tingkat  infeksi Corynespora paling rendah dibanding klon-klon yang lain, tetapi  berdasarkan  uji  resistensi  klon  di lapangan oleh Situmorang et al. (2005) dan Munir et  al. (2009),  RRIM  712  termasuk dalam  kategori  yang  kurang  resisten terhadap Corynespora .  Demikian  juga dengan  RRIM  600,  dimana  pada  penelitian
ini  mempunyai  tingkat  infeksi Corynespora rendah-sedang, tetapi pada uji resistensi di lapangan  termasuk  dalam  kategori  buruk. Sementara itu, klon PR 255 dalam penelitian ini  mempunyai  tingkat  infeksi Corynespora sedang,  sedangkan  pada  uji  resistensi  di lapangan,  PR  255  mempunyai  resistensi terhadap Corynespora yang  sangat  baik (Tabel 5).
Perbedaan resistensi klon karet seperti RRIM 712, RRIM 600, dan PR 255 terhadap C o r y n e s p o r a d a l a m   p e n e l i t i a n   i n i dibandingkan  dengan  uji  resistensi  yang dilakukan  Situmorang et  al .  (2005)  dan Munir et  al .  (2009)  di  lapangan  adalah dikarenakan pada uji resistensi di lapangan yang dilakukan oleh Situmorang et al , (2005) dan    Munir et  al .  (2009)  menggunakan  1 sumber  patogen  yaitu Corynespora asal Sumatera  Selatan,  karena  penelitian tersebut  dilakukan  di  Sumatera  Selatan. Sementara  itu,  pada  uji  respons  klon
Analisis keragaman genetik isolat Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei. di Indonesia menggunakan marker ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
1) 1)
1)
Keparahan infeksi ( pathogenicity severity ): skor 0 :  jika tidak ada luka/bercak; (no injury or spots) skor 1 :  jika ada perubahan warna menjadi gelap namun kecil; (color changes to a   darker color but smaller)
skor 2 :  jika terdapat bercak yang besar tanpa meluas melalui urat-urat daun; (large patches seen but not extending to the leaf  veins)
skor 3 :  jika terdapat bercak yang besar dan meluas pada urat-urat daun; (great spots  found , extending to  the leaf veins)
skor 4 :  jika terdapat bercak yang besar dan menonjol dengan adanya miselium; (large and prominent spots found due to the presence of mycelium)
(a) (b) (c) (d)
Gambar 4. Bercak infeksi Corynespora pada daun Figure    4. Phatogenicity spot of Corynespora on leaves
Tabel 5. Resistensi klon karet terhadap penyakit Corynespora di lapangan Table 5. Rubber clone resistency to Corynespora disease in the field
Klon Clone Resistensi terhadap Corynespora Resistency to Corynespora RRIM 712 kurang IRR 5 sangat baik RRIC 100 baik IRR 118 sangat baik IRR 107 baik PB 260 baik RRIM 600 buruk PR 255 sangat baik BPM 24 sedang
Sumber ( source ) : diolah dari Situmorang et al. (2005) dan  Munir et al. (2009)
IRR 5 PR 255 BPM 24 RRIM 600 Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
terhadap  infeksi Corynespora dalam penelitian  ini  adalah  menggunakan  tujuh isolat Corynespora asal tujuh wilayah yang berbeda,  sehingga  hasil  penelitian  ini  lebih menggambarkan  respons  klon  terhadap Corynespora secara komprehensif berkaitan dengan asal patogen dan/atau ras patogen, dimana respons klon terhadap Corynespora dapat berbeda-beda antara Corynespora dari suatu daerah/ras dengan Corynespora dari daerah/ras  yang  lain.  Hal  ini  berkaitan dengan  patogenitas Corynespora ,  dimana toksin  yang  disebut  sebagai cassiicolin adalah faktor penentu utama.
Menurut  Breeton et  al .  (2000),  dalam interaksi H.  brasiliensis dan C . cassiicola , antara  klon  resisten  dan  rentan  tidak terdapat  perbedaan  kecepatan  penetrasi cendawan.  Artinya  patogen  yang  sama  (1 ras) memiliki kemampuan untuk menembus lapisan  permukaan  daun,  baik  pada  klon resisten maupun klon rentan dan kemudian masuk  ke  dalam  jaringan  tanaman.  Oleh karena itu, dapat dipahami bahwa ketebalan kutikula,  epidermis  ataupun  pembentukan lapisan  lignin  pada  dinding  sel  bukan merupakan  mekanisme  yang  digunakan klon karet resisten untuk bertahan terhadap serangan patogen tersebut.
Perbedaan nyata antara respons klon resisten  dan  rentan  terlihat  pada  invasi cendawan  dalam  jaringan  tanaman. Serangan  pada  klon  rentan  menyebabkan kerusakan pada sel epidermis, nukleus, dan organel  lainnya,  sehingga  akhirnya menimbulkan kerusakan parah pada daun. Pada  klon  resisten  kolonisasi  cendawan terbatas hanya pada beberapa sel di sekitar hifa. Kondisi tersebut menimbulkan dugaan bahwa klon resisten memiliki suatu molekul yang  disandikan  oleh  suatu  gen  tertentu, sehingga  mampu  mengenal  atau  langsung mengatasi  perkembangan  cendawan (Nurhaimi,  2006).  Hal  ini  diperkuat  oleh kenyataan  bahwa  ketika  menginfeksi tanaman karet, C. cassiicola mengeluarkan toksin ( cassiicolin ) (Onesirosan et al ., 1975; Liyanage  dan  Liyanage  1986;  Purwantara 1987;  Suwarto  1989;  Breton et  al .,  1996; Breton et  al .,  2000).  Toksin  ini  diduga merupakan  faktor  penentu  utama  dalam patogenisitas C.  cassiicola . Cassiicolin
merupakan Host-selective  toxins (HST), termasuk  dalam  kelompok  glikoprotein dengan  bobot  molekul  sekitar  21  kDa (Breton dan d'Auzac, 1999).
M e n u r u t   N u r h a i m i   ( 2 0 0 6 ) , mekanisme resistensi daun karet terhadap C. cassiicola adalah  berkaitan  dengan kemampuan  tanaman  untuk  mengatasi penyebaran  toksin.  Kemampuan  tanaman resisten  mengatasi  penyebaran  toksin melalui aktivasi gen telah dilaporkan pada interaksi  antara  tanaman  jagung  yang memiliki  alel  dominan  pada  lokus Hm1 dengan  cendawan  patogen Cochliobolus carbonum Ras  1.  Gen Hm1 menyandikan karbonil  reduktase,  HC- toxin  reductase (HCTR)  (Johal  dan  Briggs,  1992)  yang menginaktifkan  toksin  yang  diproduksi oleh C. carbonum melalui reduksi enzimatik (Meeley et  al .,  1992;  Meeley  dan  Walton 1991).  Genotipe  homozigot hm1hm1 tidak memiliki  aktivitas  HCTR,  ternyata  rentan terhadap C. carbonum ras 1.
Pada  klon  karet  rentan  yang terinfeksi,  berlanjutnya  gejala  penyakit d i d u g a   b e r h u b u n g a n   d e n g a n ketidakmampuan klon tersebut mengatasi penyebaran  toksin  (Nurhaimi,  2006). Konidia C.  cassiicola biasanya  akan berkecambah  dalam  waktu  4  jam  (Chee, 1988)  dan  penetrasi  fungi  terjadi  12  jam setelah inokulasi (Breton et al ., 2000). Pada klon rentan, pengaruh toksin terjadi dalam waktu  yang  relatif  singkat,  sekitar  24  jam setelah  patogen  diinfeksikan  ke  daun tanaman  (Breton et  al., 1996).  Menurut Nurhaimi  (2006),  hal  tersebut  sejalan dengan pengamatan makroskopis pada hari ke-1  yaitu  24  jam  setelah  inokulasi  tidak menunjukkan adanya gejala, namun secara mikroskopis  melalui  pengamatan  anatomi daun telah terjadi kerusakan pada lapisan kutikula  dan  epidermis  bawah  daun. Kerusakan  tersebut  berlanjut  pada sebagian  parenkima  bunga  karang.  Pada hari  ketiga  kerusakan  lapisan  jaringan daun  semakin  banyak,  dimana  lapisan parenkima  bunga  karang  hancur  dan kerusakan  terjadi  pada  sebagian  lapisan parenkima palisade.
Analisis keragaman genetik isolat Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei. di Indonesia menggunakan marker ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)

## KESIMPULAN
Hasil analisis keragaman genetik iso- lat Corynespora cassiicola asal tujuh wilayah sentra  karet  di  Indonesia  menggunakan marker ISSR menghasilkan empat kelompok (4 ras) C . cassiicola , kelompok A (Ras 1) yaitu isolat  asal  Bengkulu,  kelompok  B  (Ras  2) meliputi isolat asal Lampung dan Sumatera Utara,  kelompok  C  (Ras  3)  meliputi  isolat asal  Kalimantan  Barat,  Sumatera  Selatan dan Jambi, dan   kelompok D (Ras 4) yaitu isolat asal Jawa Tengah. Hasil uji kelayuan daun  menunjukkan  bahwa  isolat-isolat Corynespora yang  berada  pada  kelompok yang  sama  berdasarkan  hasil  analisis genetik,  juga  mempunyai  tingkat  infeksi (patogenitas) yang sama terhadap beberapa daun  karet  yang  diuji.  Isolat  asal  Jawa tengah  (CJT)  mempunyai  rata-rata  tingkat infeksi  (patogenitas)  tertinggi  dibanding isolat  yang  lainnya.  Tingkat  infeksi  tujuh isolat Corynespora terendah  adalah  pada klon RRIM 712 dan IRR 5, sedangkan tingkat infeksi  tujuh  isolat Corynespora tertinggi terdapat pada klon BPM 24 dan PR 255.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  Dr.  Aron  Situmorang,  atas  kerja s a m a n y a   d a l a m   p e n y i a p a n   i s o l a t Corynespora yang  digunakan  dalam penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Breton, F., J. d'Auzac, D. Garcia, C. Sanier, and  J.M.  Esbach.  1996.  Recent research  on Corynespora  cassiicola .
Proc. of Workshop on Corynespora Leaf Fall Disease of Hevea Rubber. Medan, th th December 16 -17  1996. 49-78.
Breton, F. and J. d'Auzac. 1999. Cassiicolin, a  host-selective  toxin  produced  by
Corynespora cassiicola , causal agent of Hevea  leaf  fall  disease. International Rubber  Research  Development  Board Meeting ,  Haicau,  Chinese  People's Republic, 18-22 October 1999.
Breton,  F.,  C.  Sanier,  and  A.  J.  d'Auzac. 2000.  Role  of  cassiicolin,  a  host- selective  toxin,  in  pathogenicity  of Corynespora cassiicola , causal agent of a leaf fall disease of Hevea. J. Rubb.Res .
3(2), 115-128.
Burgess,  T.,  M.  J.  Wingfield  and  B.  W. Wingfield.  2001.  Simple  sequence repeat  markers  distinguish  among morphotypes  of Sphaeroptis  sapinea.
A p p l i e d   a n d   E n v i r o n m e n t a l Microbiology , 67(1), 354-362.
Chee,  K.  H.  1988.  Studies  on  sporulation, pathogenicity  and  epidemiology  of Corynespora cassiicola on Hevea rubber. J.  Nat. Rubb. Res ., 3(1), 21-29.
Darmono,  T.  W,  A.  Darussamin,  and  S. Pawirosoemardjo.  1996.  Variation among  isolates  of Corynespora cassiicola associated  with Hevea brasiliensis in  Indonesia. Proc. Workshop  on  Corynespora  Leaf  Fall th Disease of Hevea Rubber . Medan. 16 - th 17  December 1996. 79-91.
Gil-Lamaignere,  C.  E.,  Roilides,  J.  Hacker and F. M. C. Muller. 2003. Molecular typing for fungi a critical review of the possibilities and limitation of currently and  future  method. Clin  Microbiol. Infect., 9, 172-185.
Johal,  G.  S.  and  S.  P.  Briggs.  1992. Reductase  activity  encoded  by  the Hm1 disease resistance gene in maize. Science. 258, 985-987.
Liyanage, N. I. S., and A. S. Liyanage. 1986.
A study on the production of a toxin in Corynespora  cassiicola.  J.  Rubb.  Res. Inst. Sri Lanka., 65, 51-53.
McDonald,  B.  A.  1997.  The  population genetics of fungi: tool and techniques. Phytophatology., 87, 448-453.
Meeley, R. B., G. S. Johal, S. P. Briggs, and I.
D.  Walton.  1992.  A  biochemical phenotypefor  a  disease  resistance gene of maize. Plant Cell., 4, 71-77.
Meeley,  R.  B.  and  Walton  J.  D.  1991. Enzymatic detoxification of HC-toxin, the  hostselectivecyclic  peptide  from Cochliobolus carbonum. Plant Physiol., 97,1080-1086.

## Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
Munir, M., H. Suryaningtyas, A. Situmorang, dan T. R. Febbyanti. 2009. Resistensi klon  IRR  Seri  100  terhadap  penyakit g u g u r   d a u n C o r y n e s p o r a d a n Colletotrichum . Pros.  Lok.  Nas. Pemuliaan  Tanaman  Karet 2009 . Batam, 4-6 Agustus 2009. 262-268.
Nei,  M.  and  W.  H.  Li.  1979.  Mathematical model for studying genetic variation in terms  of  restriction  endonucleases. Proc.  Nat.  Academy  of  Sciences  of  the United  States  of  America. 76,  5269- 5273.
Nghia,  N.  A.,  J.  Kadir,  A.  Malik,  M.  P. Abdullah, E. Sunderasan and S. Napis.
2007.  Differentiating Corynespora cassiicola isolated  from Hevea plantation  in  Malaysia  using  Inter Simple  Sequence  Repeat  (ISSR) M a r k e r s .   I n t e r n a t i o n a l   R u b b e r Conference  2007,  Natural  Rubber Industry:  R&D  Achievements  & Challenges,  12-13  November  2007, Siem Reap, Cambodia, 435-445.
Nurhaimi. 2006. Ekspresi gen-gen responsif terhadap Corynespora  cassiicola pada tanaman  karet  ( Hevea  brasiliensis , Muell.  Arg.). Disertasi .  Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, www.repository.  ipb.ac.id Diakses tanggal 4 Mei 2012.
Onesirosan, P. T., C. T. Mabuni, R. D. Durbin R. D., R. B. Morin, D. H. Rich, and D. C. Arny.  1975.  Toxin  production  by Corynespora  cassiicola . Physiological Plant Pathology., 5, 289-295.
Purwantara,  A.  1987.  Studi  histologi  daun karet  yang  terserang Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. Menara Perkebunan. 55, 47-49.
Ramli, O., B. Masahuling, S.H. Ong and H.
I s m a i l .   1 9 9 6 .   S t r a t e g i e s   a n d development of resisteant Hevea clones against Corynespora leaf  fall. Proc. Workshop  on  Corynespora  Leaf  Fall th Disease of Hevea Rubber , Medan, 16 - th 17  December 1996. 177-194.
Rohlf,  F.  J.  1993.  NTSYS-pc.  Numerical taxonomy  and  multivariate  analisis system. Exeter software, New York
Sambrook,  J.  E.  F.  Fritsch  and  Maniatis.
1989. Molecular cloning : a laboratory m a n u a l   C o l d .   S p r i n g   H a r b o r Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.
Sinulingga,  W.,  Suwarto  and  H.  Soepena.
1996.  Current  status  of Corynespora leaf  fall  in  Indonesia,  Proc.  workshop on Corynespora Leaf  Fall  Disease  of Hevea Rubber, 16-17 December 1996, Medan, Indonesia,  29-36.
Situmorang,  A.  2002.  Sebaran  penyakit gugur  daun,  virulensi,  dan  genetika Corynespora  cassiicola asal  sentra perkebunan karet Indonesia. Disertasi ,
Program  Pasca  Sarjana,  Institut Pertanian Bogor.
Situmorang,  A.,  M.  Lasminingsih,  dan  T. Wijaya.  2005.  Resistensi  klon  karet anjuran  dan  strategi  penggunaanya dalam  pengendalian  penyakit  penting di  perkebunan  karet. Pros.  Lok.  Nas. Pemuliaan  Tanaman  Karet  2005 , Medan,  22-23  November  2005.  141- 156.
S u w a r t o .   1 9 8 9 .   P a t o g e n i s i t a s   d a n pembentukan  toksin  isolat Cory- nespora cassiicola dari tanaman karet ( Hevea  brasiliensis )  dan  kedelai. Risalah Seminar Latihan/Magang , 55- 59.
William, J. G. K., A. R. Kubelik, K. J. Livak, J. A. Rafalski and S.V. Tingey. 1990. DNA polymorphism  amplified  by  arbitrary primers are useful as genetic markers.
Nucleid Acid Res ., 18.
Analisis keragaman genetik isolat Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei. di Indonesia menggunakan marker ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)