## Sus sp. UJI DETEKSI GEN DNA ENCODING cyt b PADA SAMPEL SOFT GEL CANDY MENGGUNAKAN METODE PCR
Sus sp. DNA ENCODING cyt b GENE DETECTION TEST ON SOFT GEL CANDY SAMPLES USING PCR METHOD
Received: 08/10/2020; Revised: 10/11/2020; Accepted:24/03/2021; Published: 30/05/2021
Latifatoel Chilmi*, Tri Susilowati, Yuanita Rachmawati, Saiku Rokhim, Inggrit Tyautari Program Studi Biologi
Fakultas Sains dan Teknologi, UIN Sunan Ampel Surabaya Jl. Ahmad Yani No.117, Surabaya
*Corresponding author: latifatoelc@gmail.com

## ABSTRAK
Softgel  candy  bertekstur  lunak  yang  diproses  dengan  penambahan  beberapa  komponen  seperti  gum, pektin,  pati  juga  gelatin,  untuk  mendapatkan  suatu  produk  yang  kenyal  dan  dikemas  setelah  melalui perlakuan aging terlebih dahulu. Gelatin adalah salah satu komponen utama dalam pembuatan kembang gula lunak yang berasal dari hidrolisis kolagen jaringan ikat dan tulang binatang yang berfungsi sebagai sifat gelling  agent,  zat  penstabil  ataupun  emulsifier.  Namun  gelatin  yang  digunakan  pada  produk  belum berlabel  halal  Majelis  Ulama  Indonesia  (MUI)  sangat  rentan  berasal  dari gelatin  babi,  mengingat  gelatin babi  lebih  murah  dibanding  sapi.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  menguji  kontaminan  DNA  babi  pada  17 sampel  softgel  candy  tidak  berlabel  halal  MUI.  Penelitian  ini  menggunakan  metode  Polymerase  Chain Reaction  (PCR).  Tujuh  belas  sampel  diisolasi  DNA,  kemudian  dilakukan  spektrofotometri,  dilanjutkan PCR.  Produk  PCR  di  running  menggunakan  elektroforesis.  Visualisasi  DNA  dengan  UV  transluminator. Primer  yang  digunakan  adalah  primer  gen  pengkode  cyt  b  DNA  babi.  Hasil  menunjukkan  bahwa  17 sampel negatif kontaminan, sementara kontrol  positif  daging babi menunjukkan band DNA sebesar  149 bp. Hal ini menunjukkan bahwa Softgel Candy 17 sampel tidak mengandung gelatin babi.
Kata kunci: Softgel Candy, gelatin babi, cyt b babi, PCR

## ABSTRACT
Softgel  candy  is  soft-textured  confectionery  processed  by  the  addition  of  several  components  such  as gum, pectin, starch and gelatin, to obtain a supple product and packed after aging treatment first. Gelatin is one of the main components in the manufacture of soft candy derived from the hydrolysis of collagen connective tissue and animal bone that serves as the nature of gelling agents, stabilizers or emulsifiers. However,  the  gelatin  used  in  products  not  yet  labeled  halal  Indonesian  Council  of  Ulama  (MUI)  is particularly vulnerable to pork gelatin, since pork gelatin is cheaper than cattle. The purpose of this study was  to  test  the  contaminants  of  pig  DNA  on  17  samples  of  soft  candles  not  labeled  halal  MUI.  This research  used  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)  method.  Seventeen  samples  were  isolated  by  DNA, then  spectrophotometry  was  performed,  followed  by  PCR.  The  PCR  product  is  run  electrophoresis. Visualize  the  DNA  with a  UV  gel  documentation.  Primer  used  is  primer  gene  encoding  cyt  b  DNA pork. Results showed that 17 samples were negative contaminants, while the positive control of pork showed a DNA band of 149 bp. This shows that Softgel Candy 17 samples do not contain pork gelatin..
Keywords: Softgel Candy, Pork gelatin, pork bac cyt, PCR
Journal of Halal Product and Research (JHPR) e-ISSN: 2654-9778; p-ISSN: 2654-9409
How to cite: Chilmi L, Susilowati T, Rachmawati Y, Rokhim S, Tyautari I. 2021. Sus sp . DNA Encoding cyt b Gene Detection Test on Soft Gel Candy Samples Using PCR Method. Journal of Halal Product and Research . 4(1), 14-19, https://dx.doi.org/10.20473/jhpr.vol.4-issue.1.14-19.

## PENDAHULUAN
Softgel candy atau kembang gula lunak merupakan makanan yang diproses dengan penambahan hidrokoloid dalam bentuk gum, pati, pectin, gelatin dan lainnya  yang menyebabkan terbentuknya tekstur kenyal  (SNI  3547-2-2008,  BSN  2008).  Pada    proses  pemasaran  produk  softgel  candy  serigkali  terlepas dari  pengawasan  pihak  berwenang,  seperti  ditemukannya  softgel  candy  yang  tidak  berlabel  halal  dan tidak  terdaftar  BPOM.  Menurut  Rachmawati  dkk  (2018)  gelatin  menjadi  titik  kritis  kehalalan  dari  softgel candy  karena  bahan  baku  pembuatan  gelatin  tidak  hanya  berasal  dari  bahan  halal,  namun  bahan  tidak halal juga seperti babi. Persentase gelatin yang beredar di pasar dan sering didapati berasal dari bahan baku  kulit  babi  sebanyak  46%,  tulang  sapi  23,1  %,  kulit  sapi  29,4%,  dan  bahan  produk  perikanan sebanyak  1,5%  (Karim  &  Bath,  2009).  Gelatin  memiliki  sifat  geling  agent,  emulsifier,  dan  penstabil. Gelatin  didapat  dari  protein  hasil  hidrolisis  jaringan  ikat  (kolagen),  tulang,  kulit  melalui  proses  asam ataupun basa.
Sebagai  umat  muslim  wajib  hukumnya  untuk  menjalankan  perintah-Nya  dan  meninggalkan larangan-Nya.  Al- Qur’an  Surat  Al-Baqarah  (2:173)  dijelasakan  larangan  untuk  memakan  daging  babi. “ Sesungguhnya  Allah  hanya  mengharamkan  bagimu  bangkai,  darah,  dagin  babi,  dan  binatang  yang (ketika disembelih) disebut (nama) selain Allah... .” (Q.S. Al-Baqarah : 173).
Allah  mengharamkan  babi  bukan  tanpa  alasan  mendasar,  dijelaskan  lebih  lanjut  pada  surat  Al- An’am:145 “Katakanlah: "Tiadalah aku peroleh dalam wahyu yang diwahyukan kepadaku, sesuatu yang diharamkan bagi orang yang hendak memakannya, kecuali kalau makanan itu bangkai, atau darah yang mengalir atau daging babi -- karena sesungguhnya semua itu kotor -- atau binatang yang disembelih atas nama  selain  Allah.  Barangsiapa  yang  dalam keadaan  terpaksa, sedang  dia  tidak menginginkannya  dan tidak (pula) melampaui batas, maka sesungguhnya Tuhanmu Maha Pengampun lagi Maha Penyayang". Ayat tersebut menerangkan bahwa pelarangan konsumsi babi karena babi termasuk pada sesuatu yang kotor.
Otentifikasi  mengenai  kontaminan  DNA  babi  pada  suatu  makanan  perlu  dilakukan  salah  satunya melalui  teknologi  molekular.  Menurut  Rachmawati  dkk  (2018)  teknologi  molekular  dapat  memastikan suatu  sampel  makanan  tercemar  oleh  unsur  babi  meskipun  dalam  jumlah  yang  sedikit  karena mengidentifikasi  hingga  tingkat  urutan  basa  nukleotidanya.  Teknologi  molekular  yang  sering  digunakan dalam  identifikasi  kontaminan  bai  pada  olahan  makanan  adalah  PCR  konvesional,  multi-plex  PCR,  dan Real-time  PCR.  Menurut  Muladno  (2010)  PCR  ( Polymerase  Chain  Reaction )  merupakan  metode  yang digunakan  untuk  melipatgandakan  DNA  pada  daerah  target.  Proses  pelipatgandaan  ini  dengan mensintests  molekul  DNA  dengan  bantuan  enzim,  dan  dNTPs  yang  terdiri  dari  dATP,  dTTP,  dGTP, dCTP.    Gaffar  (2007)  menjelaskan  bahwa  PCR  melibatkan  banyak  siklus  yang  terdiri  tiga  siklus berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA template, penempelan (annealing) pasangan primer pada  DNA  target  dan  pemanjangan  (extension)    primer  atau  reaksi  polimerase  yang  dikatalisis  oleh enzim DNA polymerase serta terjadi berulang hingga 30-40 siklus.
Cyt b merupakan gen yang ditemukan pada organel mitokondria yang terlibat dalam pengangkutan elektron.  Urutan  sekuens  pada  cyt  b  merupakan  daerah  koserv  sehingga  banyak  penelitian menggunakan  gen  ini  untuk  mengklasifikasikan  dan  menentukan  filogenetik  suatu  spesies  satu  dengan spesies lainnya (Widayanti dkk, 2006). Urutan gen cyt b berasal dari Sus scrofa memiliki panjang urutan 1140  bp. Sus  sp. adalah  spesies  yang  sering  digunakan  untuk  konsumsi  manusia.  Metode  analisis menggunakan  DNA  memiliki  beberapa  keunggulan  yaitu  DNA  dapat  ditemukan  di  semua  sel  baik  pada individu dengan informasi genetik yang identik maupun tidak.
Penelitian ini dilakukan pada sampel beberapa softgel candy yang tidak berlabel halal dari MUI dan berkomposisi  gelatin  babi  bukan  dari  gelatin  sapi.  Adanya  kandungan  gelatin  babi  pada  softgel  candy merupakan  kendala  yang  dihadapi  oleh  umat  muslim  dimana  telah  di  jelaskan  bahwa  haram  untuk mengokonsumsi daging babi menurut Al- Qur’an. Sedangkan pemasaran softgel candy sendiri sangat
Journal of Halal Product and Research (JHPR) e-ISSN: 2654-9778; p-ISSN: 2654-9409
pesat  pada  kalangan  anak  usia  dini.  Oleh  karena  itu  penelitian  ini  bertujuan  untuk  menguji  kontaminan DNA babi pada 17 sampel softgel candy tidak berlabel halal MUI.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  antara  lain  :  minitube,  aluminium  foil,  microtube,  neraca  analitik,  pengaduk kaca,  spatula,  alat  penggerus,  gelas  erlenmayer,  gelas  ukur  100  mL,  gelas  beaker,  corong,  mikropipet, alat  sentrifuge,  UV  transluminator,  thermocycler,  lemari  pendingin,  seperangkat  elektroforesis  dan spektrofotometer.  Sampel  sebanyak  17  buah  diambil  secara  purposive  sampling  dengan  kriteria  lunak, tertera bahan gelatin pada komposisinya, tidak berlabel halal, dan berada di wilayah sekitar kampus UIN Sunan Ampel Surabaya. Bahan lainnya yang digunakan dalam penelitian ini adalah KIT isolasi Promega, ethanol  70%,  buffer  TAE,  DNA  ladder,  Go  taq  green  master  mix,  primer  cyt  b,  pewarna  DNA  Diamond Nuclei Acid, sampel kontrol positif berupa daging babi, darah babi, usus babi, lemak babi, dan hati babi. Urutan sekuens primer cyt b yang digunakan dalam penelitian ini seperti pada tabel 1 berikut ini.
Tabel 1. Sekuens Primer Pork R dan Pork F Target Gen Primer Squence 5’ 3’ Amplicon (bp) Cyt b Pork-R ATG AAA CAT TGG AGT AGT CCT ACT ATT TAC C 149 bp Pork-F CTA CGA GGT CTG TTC CGA  TAT AGG G

## CARA KERJA Isolasi DNA
Di timbang sebanyak 50 mg ditambahkan 600 μL Nucleic Lisis Solution yang dimasukkan kedalam microtube di vortex selama 10 s. Sampel di inkubasi pada suhu 65ºC selama 30 menit. Untuk melisiskan dan mengendapkan proteinnya ditambahkan RNAse Solution 3μL dan di vortek kembali selama 10 s, di inkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  30  menit.  Sampel  di  dinginkan  pada  suhu  ruangan  selama  15  menit, 200  μL  Protein  Precipitation  Solution.  Di  vortex  selama  10  s,  dimasukkan  kulkas  selama  5  menit,  di sentrifuge  pada  15.000  x  g selama  4  menit.  Supernatan  dimasukkan  kedalam  tube  berisi  600  μl isopropanol,  di  inversi  beberapa,  di  sentrifuge  pada  15.000  x  g  1  menit.  Supernatan  yang  dihasilkan dibuang dan ditambahkan 600 μL Etanol 70 %, di fortex selama 1 menit, di sentrifuge pada 15.000 x g selama  1  menit,  etanol  dibuang,  di  kering  anginkann,  ditambahkan  100  μL  DNA  Rehydration  solution untuk  melarutkan  hasil  DNA.  DNA  hasil  isolasi  kemudian  di  ukur  konsentrasinya  menggunakan  alat spektrofotometer, dengan DNA rehydration solution sebagai larutan blanko.

## PCR
Komponen  PCR  terdiri  dari  1  μL  primer  Forward  (F)  dan  1  μL  primer  Reverse  (R).  Ditambahkan GoTaq Green 12,5 μL di suspensi 7x, template DNA 2,5 μL ditambahkan 8 μL Nucleic Free Water dan di fortex selama 10 s. Proses PCR dilakukan pada kondisi Pre Denaturation : 98ºC – 2 min, Denaturation : 95ºC – 30 sec, Annealing : 60ºC – 30 sec, Extention : 72ºC – 40 sec, dan Post Extention : 72ºC – 5 min sebanyak 40 siklus.

## Elektroforesis
Proses  elektroforesis  dilakukan  dengan  menggunakan  agarose  2%  yang  ditambahkan  pewarna Diamond  Nucleic  dye  sebanyak  10  mL.  Proses  elektroforesis  dilakukan  pada  50  volt  selama  75  menit. Digunakan DNA ladder 100 bp sebagai penanda.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Gelatin  merupakan  agen  pengental  yang  sering  digunakan  pada  berbagai  produk  pangan. Seringkali  ditemukan  softgel  candy  yang  tidak  terdaftar  BPOM  dan  tidak  berlabel  halal,    hal  ini disebabkan  karena  distribusi  softgel  candy  yang  lepas  dari  pengawasan  BPOM  maupun  pihak berwenang  lainnya.  Penelitian  ini  diawali  dengan  pengambilan  sampel  di  sekitar  lingkungan  UIN  Sunan Ampel Surabaya dan sekitarnya. Sampel selanjutnya dlakukan isolasi DNA serta diukur konsentrasi dan kemurnian  DNA.  Hasil  isolat  kemudian  diperbanyak  dengan  metode  PCR.    Amplifikasi  DNA  hasil ekstraksi mengikuti prosedur Dooley et al (2004) menggunakan primer cytochrome b (cyt b). Sekuens
Journal of Halal Product and Research (JHPR) e-ISSN: 2654-9778; p-ISSN: 2654-9409
primer kurang dari 16 basa dapat mengakibatkan amplifikasi PCR non spesifik. Pada ukuran primer yang pendek  kemungkinan  dapat  menyebabkan  kurang  spesifiknya  primer  dan  berpengaruh  pada  proses PCR.  Sedangkan  pada  panjang  primer  30  basa  tidak  dapat  meningkatkan  spesifiknya  primer  yang bernilai (Puspitaningrum, 2015).
Setiap  sampel  yang  akan  dilakukan  PCR  dideteksi  konsentrasi  yang  dimiliki  masing-masing sampel.  Spektrofotometri  pada  seluruh  sampel  yang  telah  dilakukan  didapatkan  konsentrasi  yang berbeda- beda. Konsentrasi yang didapatkan dari 17 sampel diantaranya paling rendah 0,0 μg/ml hingga tertinggi 0,4 μg/ml, rinciannya terdapat pada tabel 2 berikut :
Tabel 2. Konsentrasi DNA hasil isolasi sampel Sampel Konsentrasi (ng/μl) 1 0,429 2 0,024 3 0,289 4 0,015 5 0,029 6 0,118 7 0,163 8 0,135 9 0,034 10 0,100 11 0,058 12 0,101 13 0,049 14 1,082 15 -0,208 16 0,473 17 0,015
Hasil isolasi DNA dari tiap sampel menghasilkan  konsentrasi yang berbeda-beda. Menurut Brown (2010)  kemurnian  konsentrasi  DNA  hasil  spektrofotometri  dan  memiliki  konentrasi  berada  dibawah  1,8 menandakan  bahwa  DNA  isolasi  masih  terkontaminasi  oleh  komponen  lain  seperti  protein.  Namun, apabila  nilai  kemurnian  konsentrasi    yang  dimiliki  berada  diatas  2.0  menandakan  bahwa  isolasi  DNA masih terkontaminasi oleh komponen RNA. Hasil PCR kemudian di running menggunakan elektroforesis. Hasil  elelktroforesis  di  visualisasi  menggunakan  alat  UV  transluminator.  Hasil  gambar  ke  17  sampel menggunakan UV transluminator seperti yang ditunjukkan pada gambar 1.
Gambar 1 . Hasil Visualisasi sampel PCR menggunakan Gel Documentation
Sisa primer
Journal of Halal Product and Research (JHPR) e-ISSN: 2654-9778; p-ISSN: 2654-9409
Keterangan:
M
= kontrol positif daging babi (Marker)
1-17
= sampel sofgel candy
Gambar 2 . Hasil Visualisasi PCR babi menggunakan Gel Documentation
(Dok. Pribadi, 2017)
Keterangan: M: Marker atau Ladder 100 bp A: Daging babi B: Darah babi C: Usus Babi D: Lemak babi E: Hati babi
Dari hasil visualisasi UV transluminator tesebut, pada smapel 1 – 17 tidak tampak pita DNA pada daerah  149  bp.  Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  pada  semua  sampel  negatif  DNA  terhadap  babi. Sedangkan pada kontrol positif muncul pita DNA pada daerah 149 bp. Hal demikian menunjukkan bahwa metode  PCR  optimum  digunakan  untutk  pengujian,  akan  tetapi  pada  ke  17  sampel  negatif  terhadap kontaminan  DNA  babi.  Tidak  memungkinkan  suatu  makanan  mutlak  tidak  mengandung  pencemaran keharaman.  Juga  semua  metode  dapat  mendeteksinya.  Metode  PCR  telah  membuktikan  bahwa  tidak adanya  kontaminasi  DNA  babi  pada  seluruh  sampel.  Sehingga  dapat  disimpulkan  penggunaan  gelatin babi tidak terdapat pada sampel yang telah diuji. Namun, kembali kepada individu masing-masing untuk tetap waspada dan berhati-hati dalam memilih makanan softgel candy terutama untuk balita yang masih butuh pengawasan dari orang tua dalam meilih jajanannya.

## KESIMPULAN
Dari  penelitian  yang  telah  dilakukan  pada  sampel  softgel  candy  yang  didapatkan  dari  wilayah sekitar  UIN  Sunan  Ampel  Surabaya  terbukti  tidak  terdapat  kontaminan  DNA  babi.  Walaupun  demikian perlu adanya controling produk dari pemerintah, terkait produk yang bergelatin tidak berlabel halal.

## DAFTAR PUSTAKA
Brown, T.B. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis. Wiley & sons Publisher, Chichester. BSN, Badan Standardisasi Nasional, (2008), SNI (Standar Nasional Indonesia), Jakarta. Dooley,  J.  J.,  Paine,  K.  E.,  Garret,  S.  D.,  and  Hellen  M.  B.    2004.  Detection  of  Meet  Species  using TaqMan  real-time  PCR    assays.  Meat  Science  68  (2004)  431-438.    Edward  Jenner  Institute  for Vaccine  Reearch, Compton, Newbury, Berkshire RG20 7NN, UK.
Gaffar, A. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. FMIPA Universitas Padjadjaran. Handoyono,  D  dan  Ari  Rudiretna.  2000.  Prinsip  Umum  dan  Pelaksanaan  Polymerase  Chain  Reaction (Pcr). Unitas. Vol. 9, No. 1. Pusat Studi Bioteknologi – Universitas Surabaya.
Muladno. (2010). Teknologi Rekayasa Genetik (2nd ed.). Bogor: IPB Press.

## 149 bp

## M         A         B           C         D           E
Journal of Halal Product and Research (JHPR) e-ISSN: 2654-9778; p-ISSN: 2654-9409
Nhari, R. M. H. R, A. Ismail and Y. B Che Man. 2012. Analytical Methods for Gelatin Differentiation from Bovine and Porcine Origins and Food Products, J. Food sci., 71, R42-R46.
Rachmawati,  Y.,  Rokhim,  S.,  Munir,  M.,  &  Agustina,  E.  (2018).  Deteksi  Kontaminan  Fragmen  DNA Pengkode  cyt  b  Babi  Pada  Sampel  SOFTGELLCANDY  Tak  Berlabel  Halal.  Indonesia  Journal  of Halal, 1(1), 25. https://doi.org/10.14710/halal.v1i1.3115.
Standar Nasional Indonesia (SNI) 3547.2-2008. 2008. Kembang Gula - Bagian 2 : Lunak. Jakarta.