## AKTIVITAS ANTITUMOR DAN PREBIOTIK SENYAWA TURUNAN
EPIGLUKAN: (1  3),(1  6)-  -GLUKAN EKSTRASELLULER DARI Epicoccum nigrum EHRENB. EX SCHLECHT
Prebiotic and Antitumor Activities of Extracellular Epiglucan Produced by Epicoccum nigrum Ehrenb. Ex Schlecht
Jayus 1) , Nuriman 2) dan  Sony Suwasono 1)
1) Dosen Fakultas Teknologi Pertanian, Universtas Jember
2) Dosen Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Jember E-mail: jayussanjaya@yahoo.co.uk

## ABSTRACT
Extracellular  epiglucan produced  by Epicoccum  nigrum has  been  examined  by in  vitro analysis to show its potency as an antitumor substance against leucemia cell. The aims of this study were  to  ditermine  the LC 50 value  and  prebiotic  activities  of  native  and  derivated  epiglucan.  The epiglucan was modified by sulfation and carboxymethilation methods. The result showed that LC 50 of  native  epiglucan  occur  at  concentration of 22  g/ml. This  substance  was  chemically  modified through  sulfation and  charboxymethilation  process  in  order  to  increase  its  antitumor  activity. Based  on  the  value  of LC 50 ,  the  sulfated  and  carboxymethylated  epiglucan  have  higher  activity against  leucemia  cell  compare  to  that  of  unmodified  epiglucan. The LC 50 value  of  suphated epiglucan  is 14  µg/L,  while  the  carboxymethylated  one  is 13  µg/L.  Prebiotic  activities  of  both sulfated  and  carboxymethylated  epiglucan  were  also  higher  compare  to  the  unmodified  glucan since these two derivatives are able to elevate the growth rate of probiotic microorganism such as Lactobacillus casei, L. acidophilus and L. rhamnosus.
Key words: antitumor,  extracellular  epiglucan, Epicoccum  nigrum,  charboxymethilation, sulfation

## PENDAHULUAN
Senyawa epiglukan merupakan polisakarida yang dihasilkan oleh Epicoccum  nigrum secara  ektraselluler, memiliki  rantai  utama  dengan  ikatan β - (1 → 3)- dan  memiliki  cabang  berikatan β - (1 → 6)- dengan frekuensi percabangan lebih tinggi dibanding polisakarida lainnya, yaitu 2  kali  untuk  setiap  3  residu  monomer (glukosa)  pada  rantai  utama seperti  terlihat pada Gambar 1 (Schmid et al., 2001).
Epiglukan ini telah terbukti secara in vitro memiliki sifat anti tumor, melawan sel leukemia  dengan  nilai  LC 50 terjadi  pada
konsentrasi  22 µ g/ml  (Jayus,  2007, hasil penelitian belum dipublikasi). Sebagai bahan yang  bersifat  bioaktif,  epiglukan  dapat dijadikan sebagai bahan alternatif untuk obat melawan  tumor,  suatu  penyakit  yang  di Indonesia  cenderung  meningkat  kasusnya dari tahun ke tahun. Sebagai bahan alternatif obat  tumor,  peningkatan  sifat bioaktif epiglukan akan memperbaiki indeks therapeutic dalam aplikasi klinis. Peningkatan  sifat  bioaktif  diduga  dapat dilakukan  dengan  memodifikasi  senyawa induk epiglukan menjadi senyawa turunannya  baik  secara  sulfatasi  maupun karboksimetilasi.
Gambar 1. Struktur epiglukan (Schmid et al., 2001; Smaali et al., 2004)
Senyawa β -glukan sejenis epiglukan telah  diberikan  rekomendasi GRAS  (Generally  Recognized  as  Safe) oleh FDA (Food and Drug
Administration).  Ditemukannya epiglukan yang  memiliki  potensi  sebagai  senyawa antitumor  dan food  additive melahirkan peluang  pemanfaatan  senyawa  ini  sebagai bahan  untuk  bioterapi  penyakit  tumor  dan pengembangannya sebagai senyawa prebiotik  yang  sangat  bermanfaat  bagi industri pangan.
Efektifitas epiglukan sebagai  agen antitumor  dan food  additive sebelum diaplikasikan  perlu  ditingkatkan  untuk mengangkat  nilai  jual,  keunggulan  dan daya  kompetisi  terhadap  produk  sejenis  di pasaran.    Untuk  mencapai  tujuan  ini  perlu ditemukan metode yang mampu memodifikasi epiglukan menjadi  senyawa yang  lebih  potensial.  Demikian  juga dengan keterkaitan antara struktur polisakarida  dan  sifat  bioaktifnya  termasuk penghambatan  tumor  belum  diketahui secara  jelas.  Selama  ini  diduga  ada hubungan  antara  derajat  polimerisasi,  daya larut, frekuensi percabangan, panjang rantai cabang dan konfigurasi molekul polisakarida  dengan  sifat  bioaktifnya  (Bao et  al.,  2001;  Ramesh  and  Tharanatan, 2003). Temuan hasil eksplorasi polisakarida dari  berbagai  sumber  penghasil,  juga menunjukkan  adanya  variasi  sifat  bioaktif dan  reaktivitasnya  ditinjau  dari  struktur polisakarida  yang  dihasilkan.  Modifikasi dari  senyawa  polisakarida  juga  banyak dilaporkan  menghasilkan  produk  turunan yang  lebih  aktif  dibanding  senyawa induknya seperti yang telah dibuktikan oleh
Zang dan Cheung (2002) pada polisakarida (lentinan)  yang  dihasilkan  oleh Lentinus edodes dan  polisakarida  yang  diproduksi oleh Poria  cocos sclerotium  (Wang et  al., 2004).
Studi  terhadap  modifikasi  senyawa polisakarida  masih  terus  digalakkan  oleh para  peneliti  untuk  mendapatkan  gambaran yang  pasti  hubungan  antara  struktur  dan fungsi  polisakarida  itu  sendiri.  Modifikasi semacam  ini  mungkin  dapat  diterapkan untuk meningkatkan fungsionalitas epiglukan,  dan  tidak  menutup  peluang modifikasi  ini  akan  menghasilkan  turunan yang lebih baik dibanding turunan lentinan. Produk  turunan  epiglukan  ini  masih  belum diketahui  seberapa  besar  potensi  dan  sifat bioaktifnya.  Dalam artikel ilmiah ini dikaji metode  substitusi  baik  sulfatasi  maupun karboksimetilasi yang mungkin menghasilkan turunan epiglukan yang lebih unggul.

## METODE PENELITIAN

## Rancangan Penelitian
Penelitian laboratorium (pure experiment)  ini  dilakukan  dalam        tahap  :
1) pemeliharaan kultur Epicoccum  nigrum,
2) produksi Epiglukan  dari Epicoccum nigrum,  3) preparasi  turunan Epiglukan secara  sulfatasi,  4) preparasi turunan epiglucan  secara karboksimetilasi,  5)  uji sifat antitumor  senyawa  turunan epiglukan,
6)  uji prebiotik senyawa  turunan  epiglukan secara sulfatasi, dan 7) pengujian sifat fisik β -glukan. Semua tahapan penelitian dilakukan  di  Laboratorium  Mikrobiologi
Pangan  dan  Hasil  Pertanian,  THP,FTP, Universitas Jember.

## Rancangan Percobaan
Satu  seri  konsentrasi (0,2,4,8,16,32 µg//L) native epiglukan dan  epiglukan termodifikasi    diujikan  untuk  menentukan nilai LC 50 sebagai  indikator  aktivitas  anti kanker. Sementara, untuk uji  prebiotik digunakan  satu  konsentrasi yang  sama untuk    native  dan  epiglukan  dan  epiglukan termodifikasi, yaitu µg/L)

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  meliputi: kultur Epicocum nigrum Ehrenb.  Ex  Schlecht diperoleh dari  Culture  Collection  of  University  of La Trobe (Australia) dalam bentuk kultur tanah, Lactobacillus casei, L. rhamnosus, L. Acidophilus, sel leukemia L1210 yang ditumbuhkan pada medium Eagle’s MEM, Malt Extract Agar (Oxoid),  MRS broth, molase, sodium  nitrat, pelarut etanol, 2  M  HCl, 2  M  NaOH, DMSO, pyridine, isopropanol, dan asam klorosulfonat (HClSO 3 ).
Alat yang digunakan dalam penelitian  ini  meliputi: Fermentor (2  L) dengan pengaduk kontinu (Applikon) dan 2 impeler  Ruston  6-blade,  sentrifuse, freeze drier,  membran  dialisis,  magnetik  stirer, dan viskometer.

## Pemeliharaan Kultur Epicoccum nigrum
Kultur  mikroba E.  nigrum Ehrenb. Ex Schlecht diperoleh dari Culture Collection  of    University  of  La  Trobe (Australia)  dalam  bentuk  kultur  tanah. Fungi  ini  ditumbuhkan  dalam  cawan  petri yang  berisi  media  Malt Extract  Agar (MEA) (Oxoid)  pada suhu 40 o C selama 48 jam.
Produksi Epiglukan  dari Epicoccum nigrum
Fermentasi E.
nigrum akan dilakukan  dalam  fermentor  volume  2  L yang  dilengkapi  dengan  pengaduk  kontinu
(Applikon)  dan  2  impeler  Ruston  6-blade. pH pertumbuhan  dimonitor  menggunakan Ingold  pH  probe  dan  dikontrol  secara otomatis dengan penambahan 2 M HCl atau 2  M  NaOH  menggunakan  pH  controller. Epicoccum  nigrum akan  ditumbuhkan menggunakan  subtrat  molases  sebagai sumber  karbon  dan  sumber  N dari sodium nitrat.
Epiglukan hasil fermentasi diendapkan  menggunakan  pelarut  etanol (2:1) setelah dilakukan pemisahan biomassa dan filtratnya dengan sentrifugasi 8000 rpm . Gumpalan β -glukan kemudian ditempatkan dalam membran dialisis untuk memisahkan sisa-sisa  substrat  yang  terikut  sebelum dilakukan pengeringan pada freeze drier.

## Preparasi Turunan Epiglukan  secara Sulfatasi
Pada dasarnya metode yang digunakan  untuk  mendapatkan  turunan epiglukan  secara  sulfatasi  ini  mengikuti metode yang dikembangkan oleh Zhang et al. (2001). Epiglukan (600  mg)  dilarutkan dalam  50  mL  DMSO  dan  diaduk  dengan magnetik stirer semalam pada suhu kamar. Setelah  itu  ditambahkan  9  mL  pyridine dan  secara  perlahan  diaduk  menggunakan magnetik  stirer  selama  30  menit.  Asam klorosulfonat (HClSO 3 ) (dengan perbandingan  mol  asam  dengan    mol pyridin 1:2) ditambahkan secara tetes demi tetes  ke  dalamnya  dengan  menggunakan pendingin  es  dan  diaduk  menggunakan magnetik  stirer.    Larutan  yang  diperoleh dipanaskan  sampai  80 o C  dan  reaksi dilanjutkan  selama  2  jam.  Setelah  reaksi didinginkan  sampai  suhu  kamar,  larutan NaOH 5% ditambahkan sehingga mencapai  kondisi  netral  (pH  7).  Larutan kemudian  didialisis  dalam  larutan  basa (slightly alkaline water) sehingga mencapai  pH  9  untuk  menghilangkan piridin.  Akhirnya,  epiglukan  tersulfatasi didialisis lagi dalam aquades dan dilakukan  lyophilisis  untuk  memisahkan produk  dari  koloidal  sehingga  diperoleh produk akhir.

## Aktivitas Antitumor dan Prebiotik Senyawa Turunan Epiglukan
Preparasi  Turunan  Epiglucan  secara Karboksimetilasi
Metode  yang  digunakan  untuk mendapatkan  turunan  epiglukan secara karboksimetilasi ini pada dasarnya mengikuti  metode  yang  dikembangkan oleh  Wang, et  al. (2004). Epiglukan (600 mg) disuspensikan dalam campuran 10 mL NaOH 20% dan 25 mL  isopropanol dalam pendingin es dengan diaduk menggunakan magnetik stirer selama 3 jam. Selanjutnya, 5,25  g  asam  kloroasetat,  10  mL  NaOH 20%  dan  25  mL  isopropanol  ditambahkan secara  perlahan  dengan  terus  dilakukan pengadukan.  Reaksi  dilanjutkan  sampai  3 jam pada temperatur kamar dan  kemudian dipanaskan  sampai  suhu  60 o C  selama  1,5 jam.  Setelah  reaksi  didinginkan  sampai temperatur  kamar,  0,5  mol  mol/L  HCl ditambahkan  hingga  mencapai  pH  7. Senyawa turunan polisakarida karboksimetilat  dimurnikan  dengan  proses dialisis  dilanjutkan  lyophilisis  sehingga diperoleh senyawa akhir untuk analisis.

## Uji  Sifat  Antitumor  Senyawa  Turunan Epiglukan
Produk  turunan  epiglukan  secara sulfatasi  dan  karboksimetilasi akan  diuji sifat antitumornya secara in vitro berdasarkan  metode  yang  dikembangkan oleh  Sumatra  (1998),  menggunakan  sel leukemia  L1210  yang  ditumbuhkan  pada medium Eagle’s MEM.
Uji Prebiotik Senyawa Turunan Epiglukan secara Sulfatasi Pengujian  prebiotik  pada  senyawa turunan epiglukan sebelum  dan  sesudah modifikasi  dilakukan  secara in-vitro menggunakan  inokulum Lactobacillus casei, L.  rhamnosus, L.  acidophilus.
Mikroorganisme yang tergolong probiotik ini  ditumbuhkan  selama  72  jam  dalam media MRS broth untuk diukur kecepatan pertumbuhannya dengan atau tanpa adanya senyawa turunan epiglukan. Kecepatan  pertumbuhan spesifik  (μ)
mikroba  dihitung  dengan  menggunakan rumus berikut.
μ = ln X – ln X
∆ dimana : μ = kecepatan pertumbuhan spesifik ( μ g/jam) X 1 = total mikroba jam ke-1 ( μ g) X 2 = total mikroba jam ke- 2 (μg)
Δ t = selisih waktu (t 2 – t 1 ) (jam)
Pengujian Sifat Fisik β -Glukan
Pengujian sifat fisik turunan epiglukan akan  dilakukan  pada  nilai viskositas  dan  kelarutannya  menggunakan alat viskosimeter.
Data dalam penelitian ini merupakan  hasil rata-rata  pengukuran  dari minimal  2  kali  ulangan.  Data  penelitian dianalisis  dengan  membandingkan  rata-rata pengamatan akibat perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pemeliharaan Kultur Epicoccum nigrum
Epicocum nigrum Ehrenb. Ex Schlecht merupakan  jamur  yang  dalam pertumbuhannya  sulit  bersporulasi  dalam jumlah  banyak,  sehingga  dalam  proses peremajaannya perlu menggunakan jaringan  dari  jamur  tersebut  untuk  tumbuh. Jamur  yang  sudah  cukup  tua  sangat  sulit untuk  ditumbuhkan  kembali.  Hal  ini berbeda  dengan  jamur  yang  banyak memproduksi  spora,  peremajaan  jamur yang  mudah  bersporulasi  cukup  dilakukan dengan  mengambil  sebagian  kecil  spora yang  umumnya  berada  pada  permukaan hifa jamur tersebut.
Produksi Epiglukan dari E.nigrum dalam Fermentor Pada fermentasi terendam
(submerged  culture), E.nigrum tumbuh dengan morfologi berbentuk pelet. Pertumbuhan  semacam  ini  sering  terjadi pada banyak jamur yang ditumbuhkan dalam fermentor  berpengaduk  kontinyu. Yield atau rendemen  dari  epiglukan  yang  diproduksi
oleh jamur ini masih tergolong rendah  yang hanya mampu mencapai rata-rata 3 g dalam tiap  liter  media  yang  digunakan.  Jamur- jamur sejenis Epicoccum yang memproduksi polisakarida  secara  ekstraselluler  mampu menghasilkan yield lebih dari 10 g/L seperti pada  produksi  scleroglukan  dari Sclerotium glucanicum (Wang dan  McNeil, 1995; Gibs dan Seviour, 1996).
Sifat  Fungsional  Turunan  Epiglukan secara Sulfatasi
Modifikasi epiglukan secara
sulfatasi dengan metode yang dikembangkan  oleh  Zhang, et  al.  (2001), menghasilkan  turunan  epiglukan  yang memiliki  tingkat  kelarutan  dalam  air  lebih tinggi.  Dengan  perlakuan  dialisis  terhadap hasil modifikasi sulfatasi sebelum dikeringkan mampu menghilangkan sebagian  besar  sisa  garam  mineral  dan senyawa  monosakarida  atau  oligosakarida yang  masih  terikut  pada    senyawa  turunan yang  dihasilkan  selama  proses  preparasi. Senyawa glukan yang berkonfigurasi ikatan α - juga  bisa  mengalami  peningkatan kelarutan  dalam  air  apabila  disulfatasi seperti  yang  dilaporkan  oleh  Bao, et  al. (2001)  pada  produksi  (1 → 3)- α -D-glukan dari  spora Ganoderma  lucidum.  Selain terjadi peningkatan kelarutan pada epiglukan  hasil  sulfatasi,  sifat  aktivitas antitumor  dari  senyawa  turunan  ini  juga sepertinya menunjukkan adanya peningkatan.  Uji  antitumor  secara in  vitro menggunakan  sel  leukemia  L1210  yang ditumbuhkan  pada  medium  Eagle’s  MEM, menunjukkan adanya penurunan nilai LC 50. turunan  epiglukan  secara  sulfatasi.  Nilai LC 50 dari  senyawa  asal,  epiglukan,  adalah 22  µg/L,  sedangkan  nilai  LC 50 dari senyawa  turunannya  adalah  13  µg/L.  Hal ini  berarti  terjadi  peningkatan  kemampuan turunan  epiglukan  dalam  menghambat pertumbuhan  tumor  sel  leukemia.  Kasus peningkatan  sifat  antitumor  dari  senyawa hasil sulfatasi semacam ini pernah dilaporkan  terjadi  pada  sulfatasi  (1 → 3)- α -

## D-glukan  dari Ganoderma  lucidum oleh
Zang, et al. (2000).
Sifat  Fungsional  Turunan  Epiglukan secara Karboksimetilasi
Turunan epiglukan
secara karboksimetilasi  yang  dilakukan berdasar pada  metode  yang  dikembangkan  oleh Wang, et al. (2004) menghasilkan senyawa yang  mengalami  perubahan  kelarutan secara drastis. Epiglukan yang semula sama sekali  tidak  bisa  larut  dalam  air  dingin, setelah dikarboksimetilasi kelarutannya dalam  air  dingin  sangat  tinggi.    Selain terjadi peningkatan kelarutan pada epiglukan  hasil  karboksimetilasi,  sifat aktivitas antitumor dari senyawa turunan ini juga  menunjukkan  adanya  peningkatan berdasarkan  penurunan  nilai LC 50 .  Nilai LC 50 dari  senyawa  asal,  epiglukan,  adalah 22  µg/L,  sedangkan  nilai  LC 50 dari senyawa  turunannya  adalah  14  µg/L.  Hal ini  berarti  terjadi  peningkatan  kemampuan turunan  epiglukan  dalam  menghambat pertumbuhan  tumor sel leukemia. Kasus peningkatan  sifat  antitumor  dari  senyawa hasil  karboksimetilasi  semacam  ini  pernah dilaporkan  terjadi  pada  (1 → 3)- α -D-glukan dari Ganoderma  lucidum oleh  Zhang, et  al. (2000).
Senyawa  glukan  yang  berkonfigurasi ikatan α - juga  bisa  mengalami  peningkatan kelarutan dalam air apabila dikarboksimetilasi  seperti  yang  dilaporkan oleh Bao, et al. (2001) pada produksi (1 → 3)- α -D-glukan dari spora Ganoderma lucidum.
Sifat Antitumor
Senyawa Turunan Epiglukan
Produk  turunan  epiglukan  secara sulfatasi dan karboksimetilasi yang diuji sifat antitumornya  secara in  vitro berdasarkan metode  yang  dikembangkan  oleh  Sumatra (1998),  menggunakan  sel  leukemia  L1210 yang  ditumbuhkan  pada  medium  Eagle’s MEM  menunjukkan  adanya  peningkatan kemampuan  senyawa  turunan  ini  dalam menghambat pertumbuhan sel tumor tersebut. Uji in  vitro terhadap  senyawa  induk  glukan
ini cukup mengalami kesulitan karena tingkat kelarutan  dalam  air  sangat  rendah.  Banyak sekali  senyawa  glukan  yang  dihasilkan  oleh mikroorganisme  memiliki  kelarutan  yang rendah  dalam  air seperti (1 → 3)- α -D-glukan dari Lentinus Edodes (Zhang, et al. 2002).
Kemampuan tingkat kenaikan menghambat  pertumbuhan  tumor  senyawa turunan  epiglukan  hanya  dilihat  dari  nilai LC 50 dari masing-masing senyawa turunan. Melalui proses sulfatasi dan karboksimetilasi epiglukan akan mengalami proses substitusi pada rantai utama maupun rantai  cabang.  Derajat  substitusi  ini  akan mempengaruhi fitur struktur dan konformasi  senyawa  turunan  epiglukan  ini dalam  pelarut  air.  Perbedaan  struktur  dan konformasi  inilah  yang  diduga  berkaitan erat  dengan  aktivitas  biologis  dari  turunan epiglukan  seperti  yang  pernah  ditunjukkan oleh  Bao, et  al. (2001)  yang  membanding kan  aktivitas  immunologi  polisakarida (1  3)- β -D-glukan dan  beberapa  turunan nya yang dihasilkan oleh spora Ganoderma lucidum. Hasil  pengujiannya menunjukkan adanya  dugaan  bahwa derajat  substitusi pada  rantai  utama  dan  panjang  rantai cabang  berkaitan  erat  dengan  bioaktivitas senyawa glukan yang dimaksud.
Uji  antitumor  secara in  vitro terhadap  senyawa  alam  seperti  glukan adalah  pengujian  awal  yang  perlu dilakukan  sebelum  dilakukan  uji in  vivo. Meskipun  sudah  ada  beberapa  turunan glukan  baik  yang  dilakukan  secara sulfatasi  maupun  karboksimetilasi  yang dapat  menghambat  pertumbuhan  sel tumor, bagaimana sebenarnya mekanisme senyawa  ini  melakukan  penghambatan terhadap  sel  tumor  itu  sendiri  masih belum  jelas.  Hamuro  dan  Cihara  (1973) menyatakan  bahwa  polisakarida  mampu mengubah struktur α -heliks serum albumin  bovine.  Dengan  kemampuan  ini polisakarida mungkin  memiliki  pengaruh signifikan  terhadap  struktur  protein  dan karakter  dari  permukaan  sel  tumor seperti  yang  ditunjukkan  oleh  Maeda, et al.  (1974).  Hasil  penelitian  yang  lain menunjukkan terjadinya proses
penetralan  oleh  turunan  dextran  hasil sulfatasi terhadap muatan permukaan sel- sel  tumor  sehingga  terjadi kontak  antar sel  tumor  yang dapat  menyebabkan  sel tumor tersebut berhenti membelah (Ambrose, et al., 1956). Liu, et al. (2000) juga  melaporkan  adanya  penghambatan adhesi  sel-sel  tumor  payudara  carcinoma (MCF-7  dan  MDA-MB231)  menjadi berbagai substrat sel tumor baru. Terjadinya  penghambatan  ini  diduga karena  adanya  gugusan  yang  tersulfatasi, berat molekul dan juga struktur polisakarida yang tersulfatasi tersebut.

## Hasil  Uji Prebiotik Senyawa  Turunan Epiglukan secara Sulfatasi
Probiotik L.  casei, L. acidophilus, dan L. rhamnosus memiliki laju pertumbuhan  yang  berbeda  dalam  media MRS-broth tanpa  adanya  penambahan senyawa  epiglukan.  Profil  pertumbuhan dari  ketiga  probiotik  tersebut  dapat dilihat  pada Gambar  2. Penambahan epiglukan  dan  turunannya  ternyata  dapat mempengaruhi  laju  pertumbuhan  masing- masing mikroorganisme probiotik tersebut.  Meskipun  demikian  besarnya pengaruh senyawa epiglukan dan turunannya terhadap masing-masing bakteri probiotik tidak sama. Penambahan glukan  termodifikasi  tidak  selalu  dapat meningkatkan laju pertumbuhan probiotik dibanding  dengan  laju  pertumbuhannya pada  media  yang  mengandung  glukan yang  tidak  termodifikasi.  Prosentase peningkatan kecepatan pertumbuhan  yang paling  besar  terjadi  pada  mikroorganisme L.  rhamnosus (57,1  %)  dengan laju pertumbuhan  0.024  μg/jam  pada  media tanpa  glukan  menjadi  0.056  μg/jam  pada media  yang ditambahi glukan tersulfatasi. Terjadinya  peningkatan  laju  pertumbuhan mikroorganisme probiotik akibat penambahan senyawa glukan ini mengindikasikan  bahwa  senyawa  tersebut bersifat  prebiotik.  Data  peningkatan  laju pertumbuhan probiotik akibat penambahan senyawa glukan selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 1.
Gambar 2. Profil pertumbuhan mikroorganisme probiotik pada media MRS-Broth yang tidak ditambahi epiglukan
Tabel 1. Kecepatan pertumbuhan probiotik dalam media yang mengandung glukan
Jenis media Jenis Probiotik μ (μg/jam) Persentase peningkatan µ (%) Media MRS-Broth tanpa glukan L. casei 0,066 L. acidophilus 0,076 L. rhamnosus 0,024 MRS-Broth + glukan L. casei 0,075 12,0 L. acidophilus 0,109 30,3 L. rhamnosus 0,055 56,4 MRS-Broth + glukan modifikasi L. casei 0,087 24,1 L. acidophilus 0,078 2,6 L. rhamnosus 0,056 57,1 Data  prosentase  kenaikan  laju pertumbuhan pada Tabel 1 memperlihatkan bahwa kecepatan
pertumbuhan  mikroorganisme  probiotik dalam  media  yang  mengandung  glukan dan  glukan  hasil  modifikasi  hampir  sama dan  bahkan  untuk L.  acidophilus,  laju pertumbuhannya menurun
jika ditumbuhkan pada media yang mengandung  glukan  hasil  modifikasi.  Hal ini  menunjukkan  bahwa  respon  dari masing-
masing  probiotik  berbeda  terhadap keberadaan  prebiotik  dalam  lingkungan pertumbuhannya.
Pengujian Kelarutan β -Glukan Hasil Modifikasi
Pengujian kelarutan terhadap turunan epiglukan baik  yang  dilakukan secara  sulfatasi  maupun  karboksimetilasi menunjukkan  adanya  peningkatan  tingkat kelarutan.  Senyawa  induk  epiglukan  yang semula  sulit  dan  sama  sekali  tidak  larut dalam  air  dingin,  setelah  mengalami modifikasi  baik  secara  sulfatasi  maupun karboksimetilasi  menjadi  larut  dalam  air dingin. Hasil pengukuran viskositas menggunakan  viskosimeter  terhadap  kedua senyawa  turunan  tersebut  menunjukkan adanya  penurunan  viskositas  sebanyak kurang  lebih  2,5x  dibanding  senyawa induknya. Terjadinya peningkatan kelarutan
0.933 0.818 3.352 3.901 2.284 2.394 0 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Waktu Inkubasi (jam) T o ta l M ik r o b a ( m g /m l) L. casei L. acidop hilus
L. rhamnosus
ini  diduga  karena  terjadinya  substitusi gugusan  hidroksil  oleh  karboksimetil  dan sulfat yang lebih bersifat polar. Peningkatan kelarutan  ini  juga  diduga  terjadi  akibat adanya  penurunan  berat  molekul  epiglukan selama proses sulfatasi maupun karboksimetilasi. Terjadinya  peningkatan  kelarutan akibat proses sulfatasi dan karboksimetilasi terhadap epiglukan yang dapat menyebabkan viskositas cairannnya menjadi  sangat  rendah juga  menjadi  salah satu  penyebab  terjadinya  peningkatan  sifat bioaktivitas  senyawa  tersebut. Selama proses  sulfatasi  maupun  karboksimetilasi, sebagian epiglukan dapat mengalami hidrolisis menjadi polisakarida yang panjang  rantainya  lebih  pendek.  Hidrolisis sebagian ini diduga akan meningkat jikalau proses sulfatasi maupun karboksimetilasinya  dilakukan  pada  suhu yang  lebih  tinggi,  seperti  yang  terjadi  pada proses  sulfatasi  (1 → 3)- α -D-glukan  dari Lentinus  Edodes (Zhang, et  al. 2002). Proses  karboksimetilasi  glukan  linier, curdlan, diatas 55 ο C juga dapat menghilangkan  interaksi  hidrofobik  antar gugusan methylen yang terbentuk di karbon
C-6 akibat munculnya
gugusan karboksimetil  yang  hidrofilik  (Jin, et  al., 2006).

## KESIMPULAN
Proses  modifikasi  epiglukan  baik secara  sulfatasi  maupun  karboksimetilasi menghasilkan  turunan  epiglukan  yang memiliki  tingkat  kelarutan  dalam  air  lebih tinggi.  Nilai  LC 50 dari  senyawa  asal, epiglukan,  adalah 22 µg/L, sedangkan nilai LC 50 dari  senyawa  turunannya  secara sulfatasi  adalah 14  µg/L  dan  secara karboksimetilasi nilai LC 50 13 µg/L. Hal ini berarti  terjadi  peningkatan  kemampuan turunan  epiglukan  dalam  menghambat pertumbuhan  sel  tumor  leukemia. Selain itu,  senyawa  glukan  ini  juga  berpotensi sebagai  senyawa  prebiotik  yang  dapat
meningkatkan  laju  pertumbuhan  probiotik L. casei, L. acidophilus, dan L. rhamnosus.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih kepada  Direktorat  Jenderal  Pendidikan Tinggi,  Departemen  Pendidikan  Nasional atas  dukungan  dana  yang  telah  diberikan untuk terlaksananya penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Ambrose  EJ,  James  AM, & Lowick  LBH (1956). Differences  between  the electrical change carried by normal and  homologous  tumor  cells. J.  of E. Nature (177): 576-577.
Bao  X,  Liu  C,  Fang  J, & Li  X  (2001). Structural and immunological studies  of  a  major  polysaccharide from spores of
Ganoderma lucidum (fr.)  KARST. J.  of Carbohydrate  Research (332):  67-
74.
Bao X, Duan JC, Fang X, & Fang J (2001).
Chemical  modifications  of  the (1  3)-  -d-glukan  from  spores  of Ganoderma lucidum and investigation of their physichochemical  properties  and immunological activity. J. of
Carbohydrate Research (336):
127-140.
Hamuro  J & Chihara  G  (1973). Effect  of antitumor  polysaccharides  on  the higher  structure  of  serum  protein. J. of Nature (245): 40-41.
Jin  Y,  Zhang  H,  Yin  Y, & Nishinari  K (2006). Comparison of curdlan and its  carboxymethilated  derivative  by means of rheology, DSC, and AFM.
J. of Carbohydrate Research
(341): 90-99.
Liu  JM,  Haroun-Bouhedja  F, & Boisson- Vidal C  (2000). Analysis  of  the  in vitro inhibition of mammary adenocarcinoma  cell  adhesion  by sulfated    polysaccharides. J.  of Anti  Cancer  Research (20):  3265- 3271.
Maeda  YY,  Chihara  G, & Ishimura  K (1974). Unique  increase  of  serum protein and action antitumor polysaccharides. J.  of  Nature
(252): 250-252.
Ramesh  HP & Tharanathan  RN  (2003). Carbohydrates  the  renewable  raw materials  of  high  biotechnological value. J.  of Critical  Reviews  in Biotechnology (23): 149-173.
Schmid F,  Stone  BA,  McDougall  BM, Bacic A, Martin KL,  Brownlee, RTC, Chai E & Seviour RJ (2001). Structure  of  epiglucan,  a  highly side-chain/branched  (1  3;1  6)-  -glucan  from  the  micro  fungus Epicoccum  nigrum Ehrenb.  Ex Schlecht. Carbohydrate  Research (331): 163-171.
Smaali  MI,  Michaud  N,  Marzouki N, Legoy  MD, &  Maugard  T  (2004). Comparison  of  two  β -glucosidases for the  enzymatic  synthesis  of β -(1- 6)- β -(1-3)-gluco-oligosaccharides. Biotechnology  Letters (26): 675 – 679.
Wang  Y& McNeil  B  (1995). pH  effect  on exopolysaccharide  and  oxalic  acid production in cultures of
Sclerotium glucanicum. J. of
Enzyme and Microbial Technology (17): 124-130.
Wang  Y,  Zhang  L, & Ruan  D  (2004).
Preparation  and  structure  of  five derivatives  of  -(1  3)-d-glucan isolated from poria cocos sclerotium. J.  of Polymer  Science
(22): 137-145.
Zhang  P & Cheung  PCK  (2002).
Evaluation  of  sulfated  lentinus edodes  -(1  3)-D-glucan  as  a potential antitumor agent. J.
Biosience
Biotechnology and Biochemistry (66): 1052-1056.