Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra
# Korespondensi:  Balai  Riset  Perikanan  Budidaya  Air  Payau  dan Penyuluhan  Perikanan.  Jl.  Makmur  Dg.  Sitakka  No.  129, Maros  90512,  Sulawesi  Selatan,  Indonesia Tel.  +  62  411  371545 E-mail:  emirosmiati@yahoo.com
ISOLASI DAN  IDENTIFIKASI SENYAWA  AAPTAMINOID DARI  Aaptos  aaptos DAN  POTENSI  PEMANFAATANNYA  UNTUK  PENCEGAHAN  INFEKSI  BAKTERI  Vibrio  harveyi
Rosmiati # ,  Andi  Tenriulo,  Nurhidayah,  Emma  Suryati,  dan  Andi  Parenrengi
*) Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau dan Penyuluhan Perikanan Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi Selatan
(Naskah diterima: 16 September 2019; Revisi final: 19 November 2019; Disetujui publikasi: 22 November 2019)

## ABSTRAK
Sponge Aaptos aaptos diketahui mengandung senyawa turunan aaptaminoid yang dapat digunakan sebagai sumber  antibakterial  alami  tanpa  efek  samping.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  senyawa bioaktif  dari  ekstrak  butanol  Aaptos  aaptos  yang  efektif  menghambat  pertumbuhan  Vibrio  harveyi  dan mengevaluasi kemampuan senyawa bioaktif dalam pencegahan infeksi V. harveyi. Ekstraksi metabolit sekunder menggunakan metode maserasi, sementara isolasi dan identifikasi senyawa aaptaminoid dengan metode kolom kromatografi dan spektroskopi. Uji aktivitas antibakterial menggunakan metode difusi agar dengan paper  disc.  Evaluasi  kemampuan  senyawa  aktif  dalam  pencegahan  vibriosis  menggunakan  metode eksperimental  dengan  empat  perlakuan  dengan  masing-masing  perlakuan  menggunakan  hewan  uji Litopenaeus vannamei sebanyak 10 ekor/akuarium. Dosis senyawa aktif yang digunakan yaitu; A) 0 µg/g berat badan (bb); B)  0,67 µg/g bb; C) 25  µg/g bb; dan D) 50  µg/g bb. Penyuntikan 100 µL  senyawa aktif pada masing-masing  dosis  tersebut dilakukan  pada  awal  penelitian  dan  setelah 14  hari  pemeliharaan,  udang diuji tantang dengan V. harveyi pada kepadatan 10 7 CFU/mL Pemeliharaan udang dilanjutkan selama tujuh hari.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  perubahan  morfologi  udang  berupa  telson,  rostrum,  tubuh, pereopoda, dan pleopoda memerah sebagai tanda-tanda udang terinfeksi mulai diamati pada 23 jam pasca penginfeksian. Udang pada perlakuan C dan D mulai pulih dari infeksi pada hari keempat yang ditandai oleh  telson,  rostrum,  tubuh,  pereopoda,  dan  pleopoda  yang  normal.  Selain  itu,  perlakuan  D  juga menunjukkan nilai sintasan udang tertinggi (50%), sementara perlakuan C memberikan sintasan sebesar 25%. Sebaliknya pada perlakuan B dan A (kontrol) udang sudah mengalami kematian 100% sebelum 24 jam pasca penginfeksian. Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa senyawa aaptaminoid pada dosis e” 25 µg/g bb dapat dikembangkan sebagai sumber alternatif untuk pencegahan vibriosis.
KATA KUNCI: aaptaminoid; Litopenaeus vannamei; vibriosis
ABSTRACT: Isolation and identification of aaptaminoid from Aaptos aaptos and its potential use for vibriosis prevention. By: Rosmiati, Andi Tenriulo, Nurhidayah, Emma Suryati, and Andi Parenrengi
Aaptos aaptos contains aaptaminoid widely known as a natural antibacterial without any side effect. This recent research aimed to extract bioactive compounds from butanol extract of Aaptos aaptos and determined its efficacy to inhibit the growth and prevent the infection of Vibrio harveyi. The extraction of secondary metabolites used maceration method, while isolation and identification of aaptaminoid used column chromatography and spectroscopy methods. The antibacterial test against V. harveyi used agar diffusion method using paper disc. The evaluation of the active compound during the vibrio challenge test used an experimental method with four treatments. Each treatment used whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei of 10 ind./aquarium. Dosages of the active compound used were A) 0 µg/g bb, B) 0.67 µg/g bb, C) 25 µg/g bb, and D) 50 µg/g bb. The injection of 100 µL of each bioactive compound was carried out at the initial experiment and on day 14 after challenged with V. harveyi at the density of 10 7 CFU/mL. The shrimps was reared for an additional seven days. The findings showed that the infection on shrimps started on 23 hours post- injection of V. harveyi indicated by the reddish color of rostrum, body, pereopods, pleopods, and telson. The shrimps in treatment C and D were able to recover from the infection started on the day-4 post-infection exhibited by the back to
the normal condition of rostrum, body, pereopods, pleopods, and telson. The highest survival rate post-infection was obtained by shrimp in treatment D (50%) followed by treatment C (25 %). In turn, shrimps on treatment A and B had 100% mortality within 24 hours post-infection. This research concludes that aaptaminoid can be developed as an antibacterial agent for vibriosis prevention with an optimal dosage of e” 25 µg/g bb .
KEYWORDS: aaptaminoid; Litopenaeus vannamei; vibriosis

## BAHAN DAN METODE

## Ekstraksi,  Isolasi,  dan  Pemurnian  Senyawa Aaptaminoid
Sponge  Aaptos  aaptos  dikumpulkan  dari  Pulau Barrang  Lompo,  Sulawesi  Selatan.  Sponge ditempatkan dalam plastik klip dan dimasukkan dalam sebuah cool box yang telah diisi es batu dan dibawa ke laboratorium  Bioteknologi  Balai  Riset  Perikanan Budidaya  Air  Payau  dan  Penyuluhan  Perikanan (BRPBAP3),  Maros.
Ekstraksi  dan  isolasi  senyawa  aaptaminoid mengacu pada metode Mohamad et al., 2017. Sekitar 0,5 kg sampel halus kering dimaserasi menggunakan metanol pada suhu ruangan. Partisi ekstrak metanol berdasarkan kepolaran menggunakan pelarut dietil eter, butanol, dan air untuk mendapatkan ekstrak butanol kering  setelah  dievaporasi  (7,0  g).  Ekstrak  butanol kering  difraksionasi  dengan  kolom  kromatografi vakum kering untuk mendapatkan 17 fraksi. Melalui fraksionasi yang diikuti dengan uji bioassay diperoleh bahwa  fraksi  11  dan  12  mampu  menghambat pertumbuhan V.  harveyi.  Fraksi  11  dan  12  digabung (berdasarkan  hasil  kromatografi  lapis  tipis)  dan  di kolom kromatografi silika geL secara berulang untuk mendapatkan  campuran  senyawa  aaptaminoid. Campuran senyawa tersebut dimurnikan dengan kolom kromatografi LH-20 yang dielusi dengan CHCl 3 /MeOH, 1:1 sehingga diperoleh senyawa-1 (75 mg), 2 (50 mg), 3 (2 mg), 4 (6 mg), dan 5 (2,7 mg).

## Uji Aktivitas Antibakterial In Vitro
Uji  aktivitas  antibakterial  menggunakan  Vibrio harveyi (bakteri patogen koleksi BRPBAP3 tahun 2019). Uji  aktivitas  ekstrak,  fraksi,  dan  senyawa  murni terhadap Vibrio harveyi menggunakan  metode difusi agar dengan paper disc (Rosmiati et al., 2011). Seratus µL bakteri Vibrio harveyi dipipet dan diteteskan pada media mueller, diratakan dengan stick. Paper discs (6 mm) diletakkan pada permukaan media lalu diteteskan dengan ekstrak  butanol, fraksi  ekstrak butanol  dan senyawa murni dengan 20 µL dari konsentrasi 10 mg/ mL (100 µg/ disc) untuk ekstrak dan fraksi dan 1 mg/ mL  (10  µg/ disc)  untuk  senyawa  murni.  Paper  discs dikeringkan  dalam  laminar  air  flow  dan  selanjutnya ditempatkan  di  atas  agar  yang  sebelumnya  telah

## PENDAHULUAN
Menurut  Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan (KKP), penyakit vibriosis yang disebabkan oleh bakteri dari jenis Vibrio sp. adalah salah satu jenis penyakit udang yang bisa meningkatkan kematian pada udang saat  masih  berada  di  dalam  tambak  hingga  100% (Ambari, 2018).
Upaya pencegahan penyakit vibriosis tersebut telah dilakukan  melalui  penggunaan  tandon,  biofilter, biokontrol, biosekuriti, imunostimulan, dan skrining benur,  namun  upaya  tersebut  belum  maksimal sehingga dibutuhkan alternatif lain. Pencarian formula untuk menghadang penyakit vibriosis terus digalakkan salah  satunya  dengan  penggunaan  bahan  alam. Organisme yang bersumber dari lingkungan laut kaya akan  senyawa  kimia  dan  aktivitas  biologi.  Senyawa yang diisolasi dari organisme laut memiliki aktivitas spektrum yang luas melawan berbagai macam penyakit tanpa efek samping yang berbahaya (Mayer & Hamman, 2002).
Pencarian senyawa bioaktif  yang bersumber dari lingkungan laut di mulai dengan melakukan skrining antibakterial aktiviti dari enam spesies sponge (Aaptos aaptos,  Aaptos  suberitoides,  Callyspongia  sp., Callyspongia pseudoreticulata, Haliclona sp., and Clathria reinwardti) terhadap Vibrio sp. dan Vibrio harveyi. Dari skrining antibakterial tersebut diperoleh bahwa ekstrak metanol Aptos aaptos dapat menghambat pertumbuhan Vibrio sp. dan V. harveyi secara kuat dengan diameter zona hambatan 45 ± 0,5 mm (Vibrio sp.) dan 34 ± 0,1 mm  (Vibrio  harveyi)  (Rosmiati  et  al.,  2011).  Partisi berdasarkan kepolaran senyawa menggunakan pelarut dietil eter, butanol, dan air dilakukan terhadap ekstrak metanol Aaptos aaptos dilanjutkan dengan uji hayati diperoleh bahwa ekstrak butanol mampu menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi dengan zona hambatan 23 ± 0,1 mm (Rosmiati  & Muliani, 2019). Berdasarkan hasil  tersebut,  perlu  dilakukan  kajian  lebih  lanjut terhadap kandungan senyawa bioaktif ekstrak butanol Aaptos aaptos, serta potensinya dalam penanggulangan penyakit vibriosis. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini  adalah;  (1)  mendapatkan  senyawa  bioaktif  yang efektif menghambat pertumbuhan V. harveyi dan (2) menentukan  aktivitas  antibakterial  senyawa aaptaminoid terhadap V. harveyi.
diinokulasi  dengan  bakteri.  Cawan  petri  diinkubasi pada  suhu  28°C  selama  24  jam  dan  diameter  zona hambatan  yang  diindikasikan  oleh  zona  bening  di sekitar  paper  disc  diukur  dalam  mm.  Streptomicin dengan  konsentrasi  30  µg/ disc  digunakan  sebagai kontrol  positif.
Identifikasi  dan  Elusidasi  Struktur  Senyawa Aaptaminoid
Senyawa  bioaktif  yang  berhasil  diisolasi  dan dimurnikan  diidentifikasi  golongan  senyawanya menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) pada sebuah pelat  dengan Si.gel F 254 (ketebalan  0,2 mm; Merck, Darmstadt, Germany) sebagai fase diam. Pelat KLT yang telah ditetesi senyawa bioaktif  dielusi dengan campuran pelarut (CH 2 Cl 2 : MeOH; 9:1, 5:1, v/ v), (CH 2 Cl 2 : Acetone; 1:1 v/v) dan (CHCl 3 : MeOH; 9:1, 8:2,  7:3,  v/v).  Deteksi  golongan  senyawa  dilakukan menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 344 nm  dengan  bantuan  semprotan  larutan  pendeteksi Dragendorff.  Elusidasi  struktur  senyawa  bioaktif dengan metode spektrometri yaitu gas cromatography mass  spectrometry  (GCMS)  dan  electron  ion  mass spektometry (EIMS) untuk penentuan berat molekul dan formula  senyawa, 1 H-  dan 13 C-nuclear  magnetic  reso- nance  spectroscopy  (NMR)  data  digunakan  untuk menentukan jumlah proton (H) dan karbon (C 13 ). Data correlation  spectroscopy  (COSY)  digunakan  untuk menentukan  pasangan  proton-proton,  data heteronuclear multiple quantum coherence (HMQC) untuk penentuan  ikatan  proton-carbon,  sementara  data heteronuclear  multiple  bond  correlation  (HMBC)  untuk penentuan  hubungan  (konektivitas)  proton-karbon jarak  jauh  dan  untuk  menandai  resonansi  karbon quartenari.  Semua data  spektrometer  dibandingkan dengan data publikasi.

## Evaluasi  Potensi  Senyawa  Aaptaminoid
Sebagai  Antibakterial  Terhadap  Vibrio  harveyi pada  Udang  (L.  vannamei)
Udang  yang digunakan  untuk  uji tantang  adalah udang  vaname  (Litopenaeus  vannamei)  yang dikumpulkan dari tambak Kabupaten Barru, Sulawesis Selatan. Sebelum dilakukan uji tantang terlebih dahulu dilakukan penentuan  konsentrasi  hambat  minimum (KHM)  in  vitro  sebagai  dasar  untuk  penentuan konsentrasi  senyawa-2  (9-demetilaaptamin)  yang digunakan.  Penentuan  KHM  dilakukan  dengan membuat series larutan senyawa-2 pada konsentrasi 1.000, 500, 250, 100, 10, 1, dan 0 mg/L. Penentuan KHM menggunakan metode difusi agar dengan paper disc  seperti  digambarkan  pada  metode  uji  aktivitas antibakterial (Rosmiati et al., 2011).
Dari  pengujian  konsentrasi  yang  dilakukan diperoleh bahwa KHM senyawa-2 (9-demetilaaptamin) adalah 100  mg/L sehingga  dosis 100,  250, dan  500 mg/L dipilih untuk digunakan sebelum dilakukan uji tantang  dengan  V.  harveyi.  Sebelum  dilakukan  uji tantang, udang vaname dengan bobot ± 15 g sebanyak 40  ekor  dipelihara  dalam  empat  akuarium  dengan mengacu pada Sukenda (2007) yaitu sebanyak 10 ekor/ akuarium.  Hewan  uji  diaklimatisasi  selama  14  hari sebelum  diberikan  perlakuan.  Metode  penelitian menggunakan rancangan acak lengkap yang terdiri atas empat perlakuan dengan ulangan individu. Hewan uji diinjeksi dengan 100 µL senyawa-2 pada segmen kedua pada konsentrasi, A) 0 µg/g bb; B) (0,67µg/g bb); C) 25 µg/g bb; dan D) 50 µg/g bb (konsentrasi berdasrkan KHM yaitu 100 mg/L (0,67µg/g bb), 250 mg/L (25 µg/g bb),  dan  500  mg/L  (50  µg/g  bb).  Prosedur  yang dilakukan dalam uji ini adalah setelah udang diinjeksi senyawa  bioaktif  selama  14  hari,  udang  diinfeksi dengan  bakteri  V.  harveyi  dengan  disuntik  dengan kepadatan 10 7 CFU/mL sebanyak 100 µL. Pemeliharaan dilanjutkan  sampai  tujuh  hari  pasca  penginfeksian. Selama pemeliharaan  udang diberi  pakan komersial sebayak 4,5% bobot badan dengan pemberian tiga kali/ hari yaitu pada pukul 06:00, 12:00, dan 18:00. Param- eter yang diamati meliputi respons pakan, gejala klinis, dan tingkat sintasan.

## HASIL DAN BAHASAN

## Identifikasi  dan  Elusidasi  Struktur Aaptaminoid
Semua senyawa yang berhasil diisolasi dari ekstrak butanol Aaptos aaptos berasal dari golongan senyawa alkaloid  yang  diindikasikan  oleh  kehadiran  spot berwarna  orange  setelah disemprot  dengan  larutan Dragendorf. Senyawa-1 telah diisolasi sebagai tepung yang berwarna kuning kehijau-hijauan (75 mg). Hasil kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  menunjukkan  nilai  re- tention of flow (R f ) = 0,16 (diklorometan (DCM)/metanol (MeOH; 8:2)). Data spektrum GCMS menunjukkan m/ z 228 yang sesuai dengan formula molekul C 13 H 12 N 2 O 2 . Data fisik dan NMR, serta perbandingan dengan data literatur yang dipublikasikan oleh Calcul et al. (2003), senyawa-1 diidentifikasi sebagai aaptamin.
Senyawa-2 telah diisolasi sebagai padatan berwarna kuning (11 mg). Hasil KLT menunjukkan nilai R f = 0,2 (Asetonitril/MeOH;  2:8).  Data  electron  ion  mass  spec- trum (EIMS) menunjukkan m/z 214 yang menyarankan formula molekul C 12 H 10 N 2 O 2 . Data fisik dan NMR, serta perbandingan dengan data literatur (Pedpradab, 2005), senyawa-2 identik dengan 9-demetilaaptamine.
Senyawa-3 telah diisolasi sebagai minyak berwarna kuning pucat (6 mg). Hasil KLT menunjukkan nilai R f = 0,2 (DCM/MeOH; 8:2). Data  EIMS menunjukkan m/z 242 yang sesuai dengan formula molekul C 14 H 14 N 2 O 2 . Data fisik dan NMR, serta perbandingan dengan data literatur (Herlt et al., 2004), senyawa-3 sesuai dengan 4-N-metilaaptamin.
Senyawa-4 telah diisolasi seperti getah berwarna coklat (2,7 mg). Hasil KLT menunjukkan nilai R f = 0,26 (DCM/MeOH; 8:2). Data EIMS menunjukkan m/z 258 yang sesuai dengan formula molekul C 14 H 14 N 2 O 3 . Data fisik  dan  NMR,  serta  perbandingan  dengan  data literatur (Calcul et al., 2003), senyawa-4 diidentifikasi sebagai 9-metoksiaaptamin.
Senyawa-5 telah diisolasi sebagai kristal berwarna kuning (2,0 mg). Hasil KLT menunjukkan nilai R f = 0,5 (Klorofom/Aseton; 1:1). Data EIMS menunjukkan m/z 212  yang  menyarankan formula  molekul  C 12 H 8 N 2 O 2 . Data fisik dan NMR, serta perbandingan dengan data literatur (Calcul et al., 2003), senyawa-5 diidentifikasi sebagai  9-demetiloksiaaptamin.  Struktur  kimia  dan data NMR dari senyawa 1-5 disimpulkan dalam Gambar 1 dan Tabel 1, 2, dan 3.

## Aktivitas Antibakterial Senyawa 1-5 Terhadap

## V. harveyi In Vitro
Hasil uji aktivitas antibakterial menunjukkan bahwa senyawa-1-5  mampu  menghambat  pertumbuhan
V.  harveyi  dengan  diameter  zona  hambatan  yang berbeda-beda seperti ditunjukkan dalam Tabel 4.
Dari  Tabel 4  terlihat  bahwa  senyawa-2, 3,  dan  4 menunjukkan diameter zona hambatan e” 20 mm yang mengindikasikan bahwa senyawa tersebut mempunyai daya  hambat  yang  sangat  kuat  terhadap  V.  harveyi berdasarkan  uji  antibiotikmikrobiologi  dengan discplate method yang dilaporkan oleh Davis & Stout (1971) bahwa senyawa murni dengan diameter zona hambat  20-30  mm  tergolong  dalam  kategori  zona hambat sangat kuat, diameter zona hambat 10-20 mm tergolong  dalam  kategori  zona  hambat  kuat.  Bila dibandingkan dengan diameter zona hambatan yang ditunjukkan  oleh  streptomicin,  diameter  zona hambatan  yang  ditunjukkan  oleh  senyawa-2  dan senyawa-4 lebih  kecil. Ini  karena adanya  perbedaan konsentrasi antibiotik streptomicin yang digunakan yaitu lebih besar 35 µg/ disc. Mekanisme kerja senyawa- 1-5 yang merupakan turunan senyawa alkaoid sebagai antibakteri yaitu dengan mengganggu peptidoglikan yang  mengakibatkan  terjadinya  lisis  pada  lapisan dinding sel bakteri (Septiana & Simanjuntak, 2015). Berbeda dengan bakteri Gram positif, V. harveyi yang merupakan  bakteri  Gram  negatif  memiliki  lapisan peptidoglikan yang tipis menyebabkan dinding selnya lebih  rentan  mengalami kerusakan  ketika  diberikan antibakteri (Radji, 2011).
Kemampuan  suatu  senyawa  dalam  menghambat pertumbuhan  mikroba  tergantung  konsentrasi  dari
Gambar 1. Struktur senyawa aaptamin (1), 9-demetilaaptamin (2), 4-N-metilaaptamin (3), 9-demetiloksiaaptamin (4), dan 9-metoksiaaptamin (5).
Figure 1. Chemical structure aaptamine (1), 9-demetylaaptamine (2), 4-N-metylaaptamine
(3), 9-demetyloxyaaptamine (4), and 9-metoxyaaptamine (5).
4                                                           5 1                                                    2                                                      3
Tabel 1. Data spektrum NMR aaptamin (1) dan 9-demetilaaptamin (2) Table 1. NMR spectrum data of aaptamine(1) and 9-demetylaaptamine(2)
Keterangan (Note): C (karbon/carbon), H (proton), N (nitrogen), OCH 3 (metoksi/metoxy), OH (hidroksi/hydroxy)
δ 1 H (m,J  in400 MHz) in CD 3 OD δ 13 C HMBC δ 1 H (m,J  in400 MHz)
in CD 3 OD δ 13 C HMBC 1 NH 2 7.78 (d , 7.2) 141.1 3, 9a,3a 7.71 (d , 6.8) 141.3 2,3,9a,3a 3 6.35 (d , 7.2) 97.7 9b, 2 6.23 (d , 6.8) 96.8 3,2,9b 3a - 150.4 150.6 5 7.27 (d , 7.6) 129.1 6, 6a, 3a 7.11 (d , 7.2) 126.9 5,6,3a,6a 6 6.88 (d , 7.6) 113.0 7,9b,5 6.82 (d , 7.2) 113.3 6,5,7,9b 6a - 132.9 130.4 7 7.07 (s ) 100.8 6, 9b, 9, 8 7.06 (s ) 100.3 7,8,6a,6,9b,9 8 - 157.5 128.7 9 - 132.0 152.3 9a - 133.9 128.5 9b - 116.7 117.0 8-OCH 3 4.06 (s ) 55.6 8 4.06 (s ) 55.7 9 9-OH 3.95 (s ) 59.7 9
-1 -2 Posisi (Position ) C/H
δ 1 H (m,J  in 400 MHz) in CD 3 OD δ 13 C HMBC δ 1 H (m,J  in 400 MHz) in CD 3 OD δ 13 C HMBC 1 NH 2 7.79 (d , 7.2) 141.1 3, 9a,3a 9.09 (d , 5.4) 150.4 3,9a,3a,2 3 6.36 (d , 7.2) 97.7 9b, 2 8.26 (d , 5.4) 128.4 9b,3,2 3a 150.3 150.6 5 7.26 (d , 7.2) 128.9 6, 6a, 3a 9.12 (d , 4.2) 159.3 9b,6,6a,3a,5 6 6.90 (d , 7.2) 113.0 7,9b,5 7.79 (d , 4.2) 124.7 7,9b,6,5 6a 132.8 139.5 7 7.07 (s ) 100.9 6, 9b, 9,8 7.11 (s ) 110.9 7,9b,6,8,9 8 157.5 157.9 9 132.0 180.0 9a 133.8 148.8 9b 116.7 119.9 8-OCH 3 3.95 (s ) 55.6 8 4.02 (s ) 57.6 8 9-OH 4.06 (s ) 59.7 9 4-NCH 3 2.68 (s ) 39.0
Posisi (Position ) C/H 3
Tabel 2. Data spektrum NMR 4-N-metilaaptamin (3) dan 9-demetiloksiaaptamin (4)
Table 2. NMR spectrum data of 4-N-metylaaptamine (3) and 9-demetyloxyaaptamine (4)
senyawa tersebut (Widanarni et al., 2004). Berdasarkan hasil uji pada (Tabel 5) didapatkan bahwa konsentrasi hambat minimum (KHM ) senyawa-2 adalah 100 mg/L atau  setara  dengan  2 µg /disc.  Daya  hambat  yang ditunjukkan oleh senyawa-2 pada konsentrasi 1.000 mg/L  (20 µg /disc)  lebih  besar  dibandingkan  pada konsentrasi 750 mg/L (15 µg /disc), 500 mg/L (10 µg / disc), dan 250 mg/L (5 µg /disc). Hal ini membuktikan bahwa pemberian konsentrasi senyawa yang semakin tinggi akan memberikan zona hambat yang semakin besar. Selain pengaruh konsentrasi, kemampuan suatu senyawa dalam menghambat pertumbuhan bakteri juga ditentukan oleh golongan senyawa tersebut (Ajizah,
2004).  Dalam  golongan  senyawa  aaptaminoid  daya hambat diperngaruhi oleh hubungan aktivitas struktur turunan  aaptaminoid  ke  aktivitas  antibakterial dijumpai  pada  oksidasi  gugus  fungsi  hidroksil  (OH) pada C-9 memberikan gugus fungsional karbonil (C=O) yang  menghasilkan  peningkatan  pada  aktivitas antibakterial (Pettit et al., 2004).

## Potensi  Senyawa  Aaptaminoid  Sebagai
Antibakterial  Terhadap  Vibrio  harveyi  pada Udang  (L.  vannamei)
Udang  vaname  yang  diinjeksi  dengan  senyawa-2 tidak menunjukkan adanya kematian sampai hari ke-
Tabel 3. Data spektrum NMR 9-metoksiaaptamin (5) Tabel 3. NMR spectrum data of 9-metoxyaaptamine (5)
δ 1 H (m,J  in 400 MHz) in CD 3 OD δ 13 C HMBC 2 7.78 (d,  7.2) 141.1 3, 9a,3a 3 6.36 (d , 7.2) 97.6 9b, 2 3a 150.2 5 7.25 (d , 7.2) 128.8 6, 6a, 3a 6 6.87 (d , 7.2) 113.0 7,9b,5 6a 132.8 7 7.04 (s ) 100.9 6, 9b, 9,8 8 157.4 9 131.9 9a 133.7 9b 116.6 8-OCH 3 4.05 (s ) 55.6 8 9-OH 3.95 (s )* 59.7 9
5 Posisi (Position ) C/H
Tabel 4. Aktivitas antibakterial senyawa (1-5) terhadap Vibrio harveyi Table 4. Antibacterial activity of compound (1-5) against Vibrio harveyi
Zona hambatan Inhibition zone  (mm) Vibrio harveyi Aaptamin (1) 12 + 0.3 9- demetilaaptamin (2) 25 + 0.1 4-N -metilaaptamin (3) 20 + 0.1 9-demetiloksiaaptamin (4) 24 + 0.3 9-metoksiaaptamin (5) 13 + 0.1 Streptomycine (kontrol positif/positive control ) 30 + 0.1 Metanol (kontrol negatif/negative control ) -
Senyawa (kode)
Compounds (code)
Keterangan (Note): (-) tidak ada hambatan (no inhibition)
14  pada  semua  perlakuan.  Pada  semua  perlakuan senyawa aktif rata-rata udang telah moulting seperti ditunjukkan oleh kontrol. Selama 14 hari pemeliharaan sebelum  uji  tantang,  udang  terlihat  bergerak  aktif, pola renang aktif, permukaan badan, dan kulit bersih, dan sangat responsif terhadap stimulir. Selain itu, juga tidak didapatkan adanya sisa pakan baik pada kontrol maupun  pada  perlakuan.  Ini  menunjukkan  bahwa senyawa-2 tidak menunjukkan efek toksik terhadap udang bahkan udang tumbuh dengan normal.
Sebaliknya setelah diuji tantang dengan V. harveyi, udang terlihat mengalami perubahan tingkah laku dan morfologi.  Perubahan  tingkah  laku  udang  terlihat berenang dengan badan miring dan tidak lurus, kurang responsif terhadap stimulir, kehilangan nafsu makan yang diindikasikan oleh adanya sisa pakan dan usus yang  kosong.  Perubahan  morfologi  udang  mulai terjadi pada 1,5 jam pasca uji tantang yaitu pereopoda dan  antennal  scale  mulai  memerah.  Setelah  23  jam pascainfeksi  pada  perlakuan  A  dan  B,  seluruh permukaan badan, pleopoda, pereopoda, rostrum, dan telson udang memerah, sementara pada perlakuan C dan D perubahan warna tubuh tidak terlihat, perubahan terjadi  pada  rostrum,  plopoda,  pereopoda,  dan  tel- son namun tidak separah dengan perlakuan A dan B. Berbeda dengan Manopo et al. (2011) dan Sari et al. (2015) yang menyatakan bahwa gejala klinis pada udang vaname yang diinfeksi V. harveyi muncul pada 48 jam. Ini  menunjukkan  bahwa  V.  harveyi  yang  digunakan sangat patogen terhadap udang vaname. Perubahan morfologi udang yang terinfeksi pada semua perlakuan selama penelitian ditunjukkan pada Gambar 2.
Pengamatan sintasan udang setelah 144 jam pasca penginfeksian menunjukkan bahwa rata-rata sintasan tertinggi pada perlakuan D sebesar 50%. Perlakuan C
Tabel 5. Konsentrasi hambat minimum (KHM) senyawa-2 terhadap Vibrio harveyi
Table 5. Minimum inhibitory concentration (MIC) of compound-2 against Vibrio harveyi
rata-rata sintasan sebesar 25%. Sebaliknya perlakuan A  dan  B  semua  udang  sudah  mengalami  kematian sebelum  48  jam  pasca  penginfeksian.  Rata-rata sintasan udang pasca penginfeksian ditunjukkan dalam Gambar 3.
Sintasan udang berkaitan dengan aktivitas senyawa- 2 sebagai antibakterial yang sangat kuat. Hal ini terlihat pada  perubahan  warna  yang  terjadi  pada  udang. Menurut  Ulna  et  al.  (2016),  perubahan  warna merupakan adanya penurunan imunitas tubuh udang, serta hal ini menunjukkan mulai bekerjanya imunitas tubuh untuk melawan benda asing dalam tubuh udang.
Pada penelitian ini perubahan warna udang (badan, telson, pereopoda, plopoda, dan rostrum memerah) pada pelakuan A dan B yang terjadi pada 1,5 jam pasca penginfeksian tidak berkurang dan ketahanan tubuh udang semakin lemah sehingga menyebabkan kematian dan setelah 23 jam pasca penginfeksian, semua udang tidak  ada  yang  bertahan  hidup.  Kematian  udang disebabkan  oleh  patogen  yang  dibuktikan  oleh keberadaan bakteri V. harveyi yang diisolasi dari udang yang maribut sebelum akhirnya mati. Senyawa-2 pada konsentrasi 0,67 µg/g bb belum mampu meningkatkan pertahanan udang terhadap patogen. Berbeda dengan perlakuan C dan D, udang yang sebelumnya terinfeksi berangsur-angsur  pulih  yang  ditandai  dengan perubahan  warna  rostrum,  pereopoda,  dan  telson (Gambar 4) yang terjadi mulai pada hari keempat. Sejak hari keempat pasca penginfeksian, udang mulai terlihat ada nafsu makan yang ditandai dengan usus mulai berisi pakan, sudah responsif terhadap stimulir dan mulai aktif  bergerak  sehingga  sejak hari  ke-4  sampai  hari ke-7 pasca penginfeksian sudah tidak didapatkan udang yang mati. Ini menunjukkan bahwa senyawa-2 pada dosis tersebut berhasil menghambat perkembangan
Zona hambatan
Inhibition zone  (mm)
Vibrio harveyi 1,000 25 ± 0.3 750 21 ± 0.1 500 16 ± 0.1 250 15 ± 0.3 100 14 ± 0.1
10
- 1 - Konsentrasi Concentration (mg/L)
Keterangan (Note): (-) tidak ada hambatan (no inhibition)
V.  harveyi  sehingga  perkembangan  dan  patogenitas dalam tubuh udang menurun. Menurut Saptiani et al. (2013), perlakuan vaksin ataupun adanya uji tantang dapat menstimulir peningkatan pembentukan sel-sel imunitas. Adanya bahan asing atau infeksi yang masuk ke dalam tubuh akan menimbulkan respons kekebalan atau  peradangan  yang  nantinya  akan  diikuti pembentukan zat kebal yang dihasilkan oleh sel-sel radang,  yang  selanjutnya meransang  proliferasi  dan deferensiasi  sel  imunitas  yang  satu  di  antaranya berfungsi  membentuk  bahan  spesifik  yang  disebut antibodi.

## KESIMPULAN
Dari  ekstrak  butanol  aktif  Aaptos  aaptos  telah diisolasi  lima  senyawa  turunan  aaptaminoid  yang diidentifikasi sebagai aaptamin (1), 9-demetilaaptamin (2), 4-N-metilaaptamin (3), 9-demetiloksiaaptami (4), dan 9-metoksiaaptamin (5). Kelima senyawa tersebut mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi in vitro. Uji lanjut terhadap V. harveyi pada udang menunjukkan bahwa 9-demetilaaptamin dapat dikembangkan sebagai antibakterial alami pada udang vaname (L. vannamei) dalam menanggulangi vibriosis.
Gambar 2. Perubahan morfologi udang (L. vannamei) 23 jam pasca penginfeksian V. harveyi. Figure 2.
Morphology change of L. vannamei at 23 hourspost V. harveyi infection. Keterangan: Badan memerah (A), pleopoda memerah (B), rostrum memerah (C), pereopoda memerah (D), dan telson memerah (E)
Note: Reddish on body  (A), pleopoda  (b), rostrum (c), pereopoda (d), and telson (E) B A E D C
Gambar 3. Sintasan udang vaname (L. vannamei) pada jam ke-1,5; 2, 6, 12, 18, 24, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam pasca penginfeksian V. harveyi.
Figure 3. Survival  rate of  L.  vannamei  at  1,5,  2,  6, 12,  18,  24,  48,  72,  96,
120, and 144 hours after V. harveyi infection. Keterangan: A) 0 µg/g bb; B) 0,67 µg/g bb; C) 25 µg/g bb; dan D) 50 µg/g bb Note: A) 0 µg/g bb; B) 0.67 µg/g bb; C) 25 µg/g bb; and D) 50 µg/g bb 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1.5 2 6 12 18 24 48 72 96 120 144 168 Si n ta sa n Su rv iv al r at e (% ) Lama pengamatan (jam) Observation time (hours) A B
C D

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini merupakan lanjutan dari penelitian yang  dibiayai  oleh  Pemerintah  Provinsi  Sulawesi Selatan  dan  Kemenristekdikti  melalui  program INSINAS Tahun 2015; untuk itu, diucapkan terima kasih atas pembiayaannya. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ridwan, S.Pi. (staf Marine Station Unhas) untuk koleksi sampel sponge dan Dr. Ince Ayu Khairana  Kodriah,  S.Pi.,  M.Sc.  atas  koleksi  Vibrio harveyi.

## DAFTAR  ACUAN
Ajizah, A. (2004). Sensitivitas Salmonella typhimurium terhadap  ekstrak  daun  Psidium  guajava  L. Bioscientiae, 1(1), 8-31.
Ambari, M. (2018). Upaya mencari obat penyakit udang dari  tanaman  bakau,  seperti  apa?.  https:// www.mongabay.co.id/2018/08/10/upaya-mencari- obat-penyakit-udang-dari-tanaman-bakau-seperti- apa/. Diakses Tanggal 4 Juli 2019.
Calcul, L., Longeon, A., Mourabit, A.A., Guyot, M., & Bourguet-Kondracki, M.L. (2003). Novel alkaloids of  the  aaptamine  class  from  an  Indonesian  ma- rine sponge of the genus Xetospongia. Tetrahedron, 59, 6539-6544.
Davis, W.W. & Stout,. T.R. (1971). Disc plate method of microbiological antibiotic assay. Appl. Microbiol., 22(4), 659-665.
Gambar 4. Perubahan  morfologi  udang  yang  bertahan  hidup  sampai  144  jam  pasca penginfeksian V.  harveyi  pada  perlakuan  C  dan  D.  Keterangan:  Pereopoda (Ia), rostrum (Ib) dan telson (Ic) yang memerah 23 jam pasca penginfeksian, pereopoda (IIa), rostrum (IIb) dan telson (IIc) yang kembali normal pada 144 jam pasca penginfeksian. Figure 4. Morphological  changes  of  survived  shrimp  during  144  hours  post  V.  harveyi infection in treatment C and D. Note: Reddish of pereopoda (Ia), rostrum (Ib) and telson  (Ic)  at   23  hourspost  infection,  pereopoda  (IIa), rostrum  (IIb)  and  telson (IIc) back to normal at 144 hours post infection.
Herlt,  A.,  Mander,  L.,  Rombang,  W.,  Rumampuk,  R., Soemitro,  S.,  Steglich,  W.,  Tarigan,  P.,  & Nussbaum, F.V. (2004). Alkaloids from marine or- ganisms. Part 8: Isolation of bisdemethylaaptamine and bisdemethylaaptamine-9-O-sulfate from an In- donesian Aaptos sp. marine sponge. Tetrahedron, 60, 6101-6104.
Manopo,  H.  (2011).  Peran  nukleotidase  sebagai immunostimulan terhadap respons imun nonspesifik dan resistensi udang vaname (L. vannamei). Skripsi. Institut Pertanian  Bogor.
Mohamad, H., Rosmiati, Muhammad, T.S.T., Andriani, Y., Bakar, K., Ismail, N., Saidin, J., Latip, J., Musa, N.,  &  Parenrengi, A.  (2017).  Potential  secondary metabolites  from  marine  sponge  Aaptos  aaptos for atherosclerosis and vibriosis treatments. Natu- ral Product Communications, 12(8), 1227-1230.
Mayer, A.M. & Hamman, M.T. (2002). Review marine pharmacology in 1999: Compounds with antibac- terial,  anticoagulant,  antifungal,  anthelmintic, anticardiovascular,  endocrine,  immune  and  ner- vous  systems  and  other  miscellaneous  mecha- nisms of action. Comparative Biochemistry and Physi- ology Part C, 132, 315-339.
Pedpradab, S. (2005). Isolation and structure elucidation of secondary metabolites from marine sponges and a marine-derived  fungus.  Ph.D.  Thesis.  Universität Düsseldorf,  Germany.
Ic Ia IIa Ib IIb IIc
Pettit,  G.R.,  Hoffmann,  H.,  Herald,  D.L.,  Blumberg,
P.M.,  Hamel,  E.,  Schmidt,  J.M.,  Chang,  Y.,  .....,  & Pearce,  L.V.  (2004).  Antineoplastic  agents.  499. Synthesis  of  hystatin  2  and  related  1H- benzo[de][1,6]-naphthyridinium  salts  from aaptamine. J. Med. Chem., 47, 1775-1782.
Radji,  M.  (2011).  Mikrbiologi.  Jakarta:  ECG  Press,
50 hlm.
Rosmiati, Mohamad, H., Muhammad, T.S.T., Musa, N., Ahmad, A.,  Ismail, N.,  & Mohamad,  F. (2011).  In vitro  antagonist  activities  of  Indonesian  marine sponges  Aaptos  aaptos  and  Callyspongia pseudoreticulata extracts and their toxicity against Vibrio spp. Indonesian Aquaculture Journal, 6(1), 173- 182.
Rosmiati & Muliani. (2019). Study on the potential of Aaptos aaptos aqueous extract as an antibacterial agent against Vibrio harveyi in tiger shrimp (Penaeus monodon Fabricius) post larvae. IOP Conf. Ser.: Earth Environ. Sci., 253, 1-7.
Saptiani,  G.,  Prayitno,  S.B.,  &  Anggoro,  S.  (2013).
Potensi antibakteri ekstrak daun jeruju (Acanthus ilcifolius)  terhadap  Vibrio  harveyi  secara  in-vitro. Jurnal Kedokteran Hewan, 7(1), 17-20.
Sari,  R.R.B.,  Sarjito,  &  Haditomo,  A.H.C.  (2015).
Pengaruh  penambahan  serbuk  daun  binahong (Anredera  cordifolia)  dalam  pakan  terhadap kelulushidupan dan histopatologi hepatopankreas udang vaname (L. vannamei) yang diinfeksi bakteri (Vibrio harveyi). J. of Aquaculture Management and Technology, 4(1), 26-32.
Septiana,  E.  &  Simanjuntak,  P.  (2015).  Aktifitas antimikroba  dan  antioksidan  ekstrak  beberapa bagian  tanaman  kunyit  (Curcuma  longa). Fitofarmaka, 5(1), 2087-9164.
Sukenda.  (2007).  Penggunaan  kitosan  untuk pengendalian  infeksi  Vibrio  harveyi  pada  udang putih  (L.  vannamei).  Jurnal  Akuakultur  Indonesia, 6(2), 205-209.
Ulna,  Saptiani,  G.,  &  Hardi,  E.H.  (2016).  Aktivitas antibakterial ekstrak daun Sonneratia alba terhadap Vibrio  harveyi  pada  benur  udang  windu  (Penaeus monodon). J. Aquawarman, 2(2), 35-44.
Widanarni, Meha, D., Nuryati, S., Sukenda, & Suwanto, A. (2004). Uji patogenisitas Vibrio harveyi pada larva udang  windu  menggunakan  resisten  rifampisin sebagai penanda molekuler. Jurnal Akuakultur In- donesia, 3(3), 23-27.