Penyiapan Material Acuan Untuk Penentuan Trigonelline Dalam Biji Kopi Hijau Menggunakan HPTLC
Preparation of Reference Material for Trigonelline Determination Inside of Green Coffee Beans Using HPTLC
Yeni M. Muflihah 1*) dan Buchari 2
1 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Jember
2 Jurusan Kimia, FMIPA, ITB
*) Email: yeni.maulidah@gmail.com

## ABSTRACT
Preliminary study of preparation reference material for trigonelline determination in green coffee beans  have  been  performed  by  HPTLC  method.  Physical  characterization  performed  on  green coffee beans include the determination of moisture content, ash content and metal content. Water content values obtained on average 6.4% (%RSD 4.8) and ash content 3.9% (%RSD 16.2). Metal determination (Cu, Zn, Fe) with atomic absorption spectrometry method found Cu 9.4 (mg/kg), Zn 12,0 (mg/kg) and Fe 64.0 (mg /kg). Sonication as extraction method using methanol solvent for 30 minutes and separation method HPTLC on aluminum plates coated with silica gel 60 F254. Eluent used was  mixture of n-propanol: methanol: water (4:1:4, v/v/v) with elution length 8 cm. Linear regression obtained in concentration range 200-1200 ng spot -1 with R 2 = 0.9857. Detection limits obtained  140.7  ng  and  468.9  ng  for  quantitation  limit.  Repeatability  was  achieved  from  800  ng spot -1 (% RSD 13.8).
Keywords : Reference material, Trigonelline, green coffee, HPTLC

## PENDAHULUAN
Komposisi  senyawa  antioksidan  dalam  kopi akan  bervariasi  tergantung  pada  spesies, varietas,  derajat  pemanggangan,  penyimpanan, geografis,  dan  tingkat  kematangan  buah  kopi ( Casal et  al ,  2000;  Minamisawa et  al ,  2004). Proses roasting atau pemanggangan merupakan salah  satu  tahapan  pengolahan  kopi  dimana terjadi  proses-proses  kimia  secara  simultan seperti  reaksi  Mailard  dan  Stecker,  degradasi protein,  polisakarida,  trigonelline  dan  asam klorogenat ( Bicho et  al ,  2011;  Gomez-ruiz et a l,  2008;  Musatto et  al ,  2000).  Penelitian- penelitian  tersebut  menyimpulkan  bahwa sebagian  senyawa  akan  mengalami  penurunan karena terdegradasi dengan adanya peningkatan  suhu  dan  waktu  pemanggangan. Salah satu senyawa yang mengalami perubahan dengan adanya pemanggangan adalah trigonelline.
Trigonelline  merupakan  hormon  tanaman yang memiliki sifat antara lain anti kanker, anti migrain,
antiseptik, hipokolesteromik, hipoglikemik  dan  antipiretik  (Martin et  al , 1997).
Penelitian  mengenai  trigonelline  telah  banyak dilakukan,  karena  selain  terdapat  dalam  kopi, trigonelline  juga  merupakan  komponen  aktif dari  fenugreek,  Tuang-kua-jen  dan  ubur-ubur (Martin et  al ,  1997).    Namun  demikian, publikasi  mengenai  analisis  trigoneline  dalam kopi  masih  belum  banyak  ditemukan  karena selain kopi merupakan material kompleks yang terdiri dari ratusan senyawa, kadar trigonelline dalam  kopi  sendiri  tidak  terlalu  besar,  yaitu antara  0,3-1,3%  (Bicho et  al ,  2011). Permasalahan-permasalahan  tersebut  dewasa ini  mulai  diatasi  dengan  menggunakan penggunaan material acuan.
Material acuan ( Refference material ) adalah bahan  atau  zat  yang  satu  atau  lebih  sifatnya telah  di  analisa  dan  cukup  homogen  serta cukup stabil untuk digunakan sebagai kalibrasi peralatan,  penilaian  suatu  metode  pengukuran dan  menempatkan  nilai  suatu  material  (IAEA, 2003). Material acuan bisa dalam bentuk murni atau  merupakan  campuran  gas,  cairan  atau padatan. Material acuan banyak dipakai  dalam kimia  analitik  sebagai  kalibrasi  alat,  validasi metode,  penilaian  performance  dari  alat, metode  dan  instrumen  dan  menentukan ketidakpastian suatu hasil pengukuran.
Material  acuan  matriks  adalah  material acuan yang lebih spesifik, suatu senyawa alam yang lebih mewakili sampel-sampel laboratorium  yang  telah  dikarakterisasi  secara kimia  satu  atau  lebih  elemen,  unsur,  dengan suatu ketidakpastian yang diketahui. Metode penelitian untuk penentuan trigonelline yang  sudah dipublikasikan, diantaranya  adalah penggunaan metode HPLC, UV, HPTLC, TLC, juga  penggunaan  kromatografi  ion  kolom tunggal (Martin et al , 1997). HPTLC  merupakan  salah  satu  metode pemisahan  analitik  yang  sangat  berpotensi berdasarkan kemampuan reliability,
reproducibility,  simplicity  dan  kecepatannya. Metode  ini  sangat  ekonomis  karena  hanya membutuhkan bahan dan pelarut dalam jumlah minim.  Waktu  analisis  yang  cukup  cepat  juga menjadi  salah  satu  kelebihan  dari  metode HPTLC ini. HPTLC juga tidak dibatasi dengan pemilihan  fasa  gerak,  penggunaan  pH  tertentu seperti  HPLC  dan  tidak  membutuhkan perlakuan  tambahan  pada  sampel.  Selain  itu dalam  HPTLC  memungkinkan  analisis  secara simultan  dengan  waktu  singkat.  Metode  ini sangat  sesuai  untuk  pemisahan  komponen- komponen dari ektrak tumbuhan yang biasanya terdiri  dari    banyak  senyawa  (Srivastava, 2011).

## METODE

## Bahan Penelitian
Kopi yang digunakan adalah kopi Arabika jenis Ateng  yang  diperoleh  dari  Desa  Pengharapan, Kecamatan  Pangalengan,  Kabupaten  Bandung pada  bulan  Oktober  2011.  Kopi  yang digunakan  adalah  kopi  yang  matang  super. Kopi difermentasi kering, dikeringkan selama 2 minggu  pada  panas  matahari  dan  di  haluskan menggunakan blender.

## Bahan Kimia
Trigonelline  (Flucka,  Switzerland),  metanol (merck),  akuades,  n-propanol,  pelat  silika  gel 60 F 254 , CuSO 4 , ZnSO 4 , FeSO 4, HCL 37%.
Alat-Alat Penelitian Alat-alat  gelas  yang  biasa  digunakan  dalam laboratorium,  blender,  Camag  densitometric scanner  2,  Camag  chamber,  spektrofotometer serapan atom (AAS) Shimadzu,
Spektrofotometer  UV-Vis,  furnace,  oven, neraca  analitik,  pipet  mikro  merk  eppendof, Ultrasonic Batch Branson 3510.

## Karakterisasi Fisik
Penentuan  kadar  air dilakukan  dengan memanaskan  ±  1,00  gram  sampel  kopi  bubuk di  dalam  oven  selama  2  jam  dengan  suhu ±105°C,  dan  dilakukan  dengan  20  kali pengulangan.

## Penentuan kadar abu
Kurang  lebih1,00  gram  sampel  dipanaskan dalam furnace  750°C  selama  4 jam, dilakukan 20 kali pengulangan.

## Penentuan kadar logam
Abu  hasil  pengujian  kadar  abu    didestruksi dengan 10 mL HCl, disaring dan ditandabataskan dengan akuademin sampai 100 mL. Analisa dilakukan
dengan spektrofotometer  serapan  atom  menggunakan kurva  kalibrasi  logam  Cu,  Zn  dan  Fe  masing masing 0,2;0,4;0,6;0,8 dan 1,0 ppm.

## Isolasi  Trigonelline  Dari  Sebuk  Kopi  Hijau
Sejumlah  500  mg  sampel  kopi  hijau dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 mL dan ditambahkan  25  mL  metanol.  Larutan disonikasi  pada  50-60Hz  selama  30  menit. Selanjutnya  disaring  dan  ditandabataskan sampai  50  mL  dengan  metanol.  Perlakuan diulang sebanyak 10 kali.

## Instrumentasi Kromatografi.
Pemisahan  dengan  KLT  kinerja  tinggi dilakukan  menggunakan chamber Camag berukuran  21  cm  x  10  cm  x  20  cm.  Plat  yang digunakan  adalah  plat  KLT  silika  gel  60  F 254 dengan  ukuran  20  cm  x  10  cm.  Panjang  jarak elusi  dari  titik  awal  penotolan  ke  garis  akhir adalah 8 cm, dengan jarak antar spot adalah 1 cm.  Larutan  pengelusi  yang  digunakan  adalah larutan  campuran    n-propanol:metanol:air (40:10:40, v/v/v). Setiap analisis menggunakan 30  mL  larutan  pengelusi  dengan  lama penjenuhan  30  menit.  Volume  sampel  yang ditotolkan  untuk  setiap  spot  adalah  sebanyak 20  µL,  yang  dilakukan  dengan  menggunakan pipet  eppendof  1-10  mikro.  Setiap  penotolan sebanyak  1  µL  dan  langsung  dikeringkan menggunakan pengering rambut ( hair dryer ).

## Pembuatan Kurva Kalibrasi
Kurva  kalibrasi  dibuat  dengan  menyiapkan sederetan larutan standart trigonelline  10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm dan 70 ppm. Larutan selanjutnya di totolkan ke plat KLT  sejumlah  20  µL  untuk  mendapatkan konsentrasi 200, 400, 600, 800, 1000 dan 1200 ng setiap spot.

## Validasi Metode
Keberulangan Pengukuran  keberulangan  dilakukan  dengan menggunakan  larutan  standar  trigonelline  40 ppm  untuk  mendapatkan  800  ng  per  noda. Penotolan  dilakukan  sebanyak  6  titik  dan diekspresikan  dengan  %RSD  (persen  relatif standar deviasi).

## Limit Deteksi Dan Limit Kuantisasi
Limit deteksi dicari dengan menggunakan nilai eror  pada  kurva  kalibrasi  yang  didapatkan menggunakan  program  origin  pro  8.  Limit deteksi  adalah  3  kali  eror  relatif,  sedangkan limit kuantisasi adalah 10 kali eror relatif.
Perolehan Kembali ( Recovery ) Sampel  yang  belum  dianalisis  ditambahkan trigonelline standar 1000 ppm sebanyak 0, 1, 2 dan  3  mL  dan  sampel  dianalisis  kembali menggunakan  metode  yang diusulkan. Metode ini  dilakukan  untuk  mengetahui  perolehan kembali trigonelline pada level yang berbeda.
Pemisahan Trigonelline Dari Ekstrak . Ekstrak  yang  dihasilkan  masing-masing ditotolkan  ke  atas  plat  dengan  jumlah penotolan sebanyak 20 µL dan di elusi dengan cara yang sama seperti standart.

## HASIL dan PEMBAHASAN

## Karakterisasi Serbuk Kopi
Dari  tabel  1  didapatkan  bahwa  kadar  air sebesar 6,4 dengan %RSD 4,2. Kadar air akan menunjukkan  kualitas  suatu  sampel  kopi. Kadar air yang terlalu tinggi akan menurunkan kopi  dan  memperpendek  waktu  penyimpanan. Hasil  pengujian  one  way  ANOVA  (program SPSS  15,0)  menunjukkan  bahwa  sampel  kopi yang  dianalisis    homogen,  dengan  ada perbedaan  antar  pengulangan  pada  taraf signifikansi 0,05.
Kadar abu merupakan sisa-sisa pembakaran  atau  oksidasi,  dan  erat  kaitannya dengan  mineral  dalam  suatu  bahan,  dan dibandingkan  dengan  berat  keringnya.    Kadar abu  menunjukkan  jumlah  mineral  yang terkandung  dalam  suatu  sampel.  Dari pengukuran kadar abu didapatkan nilai rata-rata kadar  abu  3,9%  dengan  %RSD  16,2.  Hasil pengujian dengan one way ANOVA menunjukkan sampel yang digunakan homogen dan tidak ada perbedaan antar pengulangan.
Tabel 1 kadar air dan kadar abu Sampel Rata-rata (%) Standart deviasi % R.S.D Kadar air 6,4 0,7 4,2 Kadar abu 3,9 0,6 16,2
Kadar  logam  Cu,  Zn  dan  Fe  masing-masing adalah  9,4  (mg/Kg),  12,0(  mg/Kg)  dan  64,0
(mg/Kg).
Tabel 2 Kadar logam (mg/kg) Bahan Rerata S.D. %R.S.D Cu 9,4 3,2 34,5 Zn 12,0 1,7 13,9 Fe 64,0 7,6 11,8 Kurva Kalibrasi Pengembangan metode KLT-KT untuk penentuan  trigonelline  menunjukkan  korelasi yang baik pada range konsentrasi 200-1200 ng per  spot  dengan  koefisien  korelasi  sebesar 0,9857 yang diperoleh dari luas areanya. Nilai slope  (Gambar  1)  diperoleh  sebesar  0,8099 (±0,04876) dan intersepnya sebesar 619,686 (± 37,9799)
Gambar  1.  Korelasi  konsentrasi  terhadap dengan koefisien korelasi

## Validasi Metode
Nilai  Rf  untuk  trigonelline  standar  dan trigonelline  dalam  sampel  didapatkan  pada harga  Rf  sebesar  0,45±0,02.  Pengulangan analisis  untuk  konsentrasi  800  ng  per  noda menunjukkan  %RSD  sebesar  13,82  seperti terlihat pada Tabel 3.
Recovery  test  (Tabel  4)  menunjukkan  bahwa untuk  penambahan  trigonelline  semakin  tinggi semakin  sedikit  prosentasi  perolehan  kembali trigonelline.  Dari  data  yang  dihasilkan  terlihat bahwa  persen recovery untuk  sampel  dengan penambahan  trigonelline  100%  dan  200% hasilnya kurang dari 90%. Hal ini
kemungkinan diakibatkan trigonelin dari dalam kopi sendiri masih belum terekstrak sempurna, atau  membutuhkan  waktu  yang  lebih  lama untuk terekstrak.

## Estimasi Kadar Trigonelline Dalam Ekstrak
Kopi Hijau Pengukuran ekstrak kopi menggunakan
HPTLC  memperoleh  kromatogram  dengan puncak  utama    Rf  =  0,45±  0,02  pada pengukuran  panjang  gelombang  265  nm.  Pada kromatogram  sampel  hasil  isolasi,  selain puncak  utama,  juga  muncul  4  puncak  lainnya yaitu pada Rf = 0,76; Rf = 0,88, Rf = 0,92 dan Rf  =  0,97.  Puncak-puncak  ini  belum teridentifikasi  senyawanya  karena  belum  ada literatur  yang  membahas  senyawa  tersebut. Namun 3 puncak di terakhir puncaknya hampir bertumpuk  yang  mengindikasikan  pemisahan yang terjadi belum sempurna
dan membutuhkan  waktu  yang  lebih  lama  atau pelarut  yang  lebih  sesuai  untuk  terpisah sempurna.

## KESIMPULAN
Biji kopi  yang  dipersiapkan  menggunakan prosedur yang disiapkan di atas berpotensi untuk  dapat  digunakan  sebagai  material acuan  dalam  penentuan  trigonelline  biji kopi hijau dengan menggunakan kadar air, kadar  abu  dan  kadar  logam  sebagai  salah satu parameter analisisnya.
Metode HTCLP secara statistik memenuhi beberapa  peryaratan  untuk  digunakan sebagai  metode  analisis,  antara  lain reproducibility, recovery , limit deteksi dan limit kuantisasi.

## Ucapan TerimaKkasih
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada Dirjen  Dikti  melalui  pemberian  dana  BPPS sehingga penelitian ini dapat terlaksana dengan lancar.

## DAFTAR PUSTAKA
Bicho,  N.C.,  Leitao,  A.E.,  Ramalho,  J.C.,  Lidon, F.C., 2011, Identification of Chemical Clusters Discriminators of Roast Degree in Arabica and Robusta  Coffee  Beans, J. Eur.  Food  Res Technol (233) 303-311 Casal, S., Oliveira, M.B.P.P., Alves, M.R., Ferreira, M.A., 2000, Discriminate Analysis of Roasted Coffee  Varieties  for  Trigonelline,  Nicotinic Acid and Caffein Content, J.Agric.Food chem
(48):3420-3424
Gomez-ruiz,  J.A.,  Ames,  J.M.,  Leake,  D.S.,  2008, Antioxidant Activity and Protective Effects of Green  and  Dark  Coffee  Components  Against Human  Low  Density  Lipoprotein  Oxidation, Eur Food Res Technol (227) 1017-1024 International Atomic Energy Agency (IAEA), 2003, Development and Use of Refference Materials and Quality Control Material, IAEA, Austria
Minamisawa,  M.,  Yoshida,  S.,  Takai,  N.,    2004,
Determination of Biologically Active Substances in Roasted Coffee Using a Diode- HPLC system, Anal. Sci ., 20: 325-328.
Musatto,  S.I.,  Machado,  E.M.S.,  Martins,  S., teixeira,  J.A.,  2011, Production, Composition, and  Application  of  Coffee  and  its  Industrial Residues:  Review  Paper, Food  Biopocess technology , (4): 661-672

## Tabel 4. Pengukuran perolehan kembali trigonelline (recovery)
No Jumlah analit ditambahkan (%) Jumlah analit ditambahkan (ng) Nilai teori (ng) Jumlah yg ditemukan (ng) Recovery (%) 1 0 0 570,7 570,7 100 2 50 400 970,7 960 97,3 3 100 800 1370,7 1091,6 65,1 4 200 1200 1770,7 1496,6 77,2 Tabel 3. Pengukuran keberulangan standar trigonelline 800 ng per noda No Sampel Rata-rata Standart Deviasi %RSD Kepercayaan (0,05) 1 Repeatability 849,23 117,35 13,82 93,9
Martin,  M.J.,  pables,  F.,  Belle,  M.A.,  Gonzales, A.G.,  1997,  Determination  of  trigonelline  in green  and  roasted  coffee  from  single  column ionic chromatography, Fresenius J Anal Chem
(357) 357-358 Srivastava,  M.M.,  2011,  High  performance  thin- layer  chromatography  (HPTLC),  springer- verlag Berlin Heidelberg