## Menara Perkebunan 2011 79(2), 57-63

## Pengaruh ventilasi terhadap morfologi, stomata dan kadar klorofil tunas karet yang diperbanyak melalui microcutting
Influence of ventilation on morphology, stomata  and chlorophyll content of Hevea shoots propagated through microcutting
NURHAIMI-HARIS 1*) , Nurul Siti AYUNINGTIAS 2) & Irma Herawati SUPARTO 2)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana No.1, Bogor 16151, Indonesia
2) Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor, Jl Agatis, Kampus Darmaga,  Bogor 16680, Indonesia
Diterima tgl 4 Agustus 2011/Disetujui tgl 11Nopember 2011

## Abstract
In  plant  tissue  culture,  the  culture  vessels  are  usually covered tightly with screw caps, aluminium foils, parafilm, or  plastic  wrap.  This  condition  restricts  the  exchange  of gases  in  culture  vessels  and  will  affect  negatively  the growth of explants. The use of ventilated closure improves the air quality in culture vessels. Microboxes provided with different  types  of  filter  (yellow  filter  with  Kv  value 13.09  Gas  Exchange  (GE)/day,  green  filter  with  Kv  value 81.35  GE/day  and  without  filter)  on  their  closure  were examined as culture vessels for growing rubber explants at multiplication  step.    The  purpose  of  this  research  was  to observe  the  plant  condition  in  different  types  of  microbox corresponding to the morphology, stomata and chlorophyll content  of  the  shoots.  The  results  showed  no  significant difference  of  shoot  height  on  each  microbox.  The  use  of ventilated  closure  increased  significantly  new  leaf formation and decreased leaf fall. Normal size and color of leaves were found on shoots grown in microbox with green filter.  Chlorophyll  analysis  revealed  no  significant differences  on  three  types  of  microbox,  however  visual observation showed that leaves were greener on microbox with  green  filter.    The  stomata  condition  of  shoots  on microbox  with  green  filter  were  similar  with  those  of mother  plants  in  green  house,  while different  condition  of stomata  were  found  on  shoots  grown  in  microbox  with yellow filter or without filter.  In normal environment such as  at  the  field  and  green  house,  most  of  stomata  were closed,  in  microbox  provided  with  filter  on  the  closure, most of stomata were half open, while on microbox without filter most of stomata were wide open.
[ Keywords: Hevea  brasiliensis ,  microcutting,  in  vitro culture]

## Abstrak
Dalam  kultur  jaringan  tanaman,  tabung/botol  kultur ditutup  rapat  dengan  penutup  yang  dilengkapi  ulir, aluminium  foil,  parafilm  atau  plastik wrap .  Kondisi tersebut menghambat pertukaran udara dalam tabung kultur sehingga  sering  memberikan  pengaruh  negatif  terhadap pertumbuhan  eksplan.  Penggunaan  penutup  berventilasi dapat  meningkatkan  kualitas  udara  dalam  lingkungan tabung/botol  kultur.  Oleh  karena  itu  microbox  dengan penutup berfilter diuji sebagai wadah untuk menumbuhkan
eksplan  karet  pada  tahap  multiplikasi,  yaitu  microbox berfilter  kuning  dengan  nilai  Kv  sebesar  13,09  (Gas Exchange  (GE)/hari  dan  berfilter  hijau  dengan  nilai  Kv sebesar  81,35  GE/hari,  sedangkan  sebagai  kontrol  adalah microbox  tanpa  filter  (tertutup  rapat).  Penelitian  bertujuan mengamati  kondisi  tunas  di  dalam  microbox  berfilter, meliputi morfologi, stomata dan kandungan klorofil. Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  tinggi  tunas  tidak  berbeda nyata  pada  masing-masing  microbox.  Jumlah  daun  baru dan daun gugur berbeda nyata, dimana pembentukan daun baru  terbanyak  terdapat  pada  tunas  dalam  microbox berfilter  kuning  maupun  hijau.  Ukuran  dan  warna  daun terlihat  normal  pada  tunas  dalam  microbox  berfilter  hijau. Analisis kandungan klorofil tidak menunjukkan perbedaan nyata, namun pengamatan visual menunjukkan bahwa daun lebih  hijau  pada  microbox  dengan  filter  hijau.  Kondisi stomata  daun  dari  tunas  dalam  microbox  dengan  penutup berfilter  hijau  menyerupai  stomata  tanaman  induk  yang terdapat  di  rumah  kaca  dan  lapangan,  sedangkan  kondisi stomata  berbeda  ditemukan  pada  tunas  dalam  microbox berfilter  kuning  atau  tanpa  filter.  Pada  lingkungan  normal seperti  lapangan  dan  rumah  kaca,  sebagian  besar  stomata menutup,  pada  wadah  dengan  tutup  berfilter  stomata  agak membuka  sedangkan  pada  microbox  tanpa  filter  sebagian besar stomata terbuka lebar.
[Kata  kunci: Hevea  brasiliensis , microcutting, kultur in vitro ]

## Pendahuluan
Hevea brasiliensis adalah spesies penting dalam genus Hevea karena  merupakan  sumber  karet  alam yang  banyak  digunakan  dalam  industri,  terutama industri  otomotif.  Permintaan  bahan  tanam  karet belakangan  ini  meningkat  dengan  tajam,  baik  untuk penanaman  ulang  maupun  penanaman  baru, disebabkan membaiknya harga karet dan meningkat- nya  permintaan  pasar.  Akan  tetapi  pemenuhan terhadap kebutuhan bahan tanam tersebut relatif sulit disebabkan  batang  bawah  yang  berasal  dari  biji sebagai salah satu komponen dalam penyediaan bibit karet  tidak  selalu  tersedia.  Kendala  utama  adalah musim  biji  yang  hanya  berlangsung  sekali  dalam setahun  dan  terbatasnya  klon  karet  yang  dapat digunakan  sebagai  sumber  biji.  Di  samping  itu,
*) Penulis korespondensi: nurhaimi@yahoo.com
Pengaruh ventilasi terhadap morfologi, stomata dan kadar klorofil planlet karet …. ( Nurhaimi-Haris et al.)
terjadinya  pergeseran  musim  juga  mempengaruhi ketersediaan biji.
Untuk penyediaan batang bawah karet, saat ini di Balai  Penelitian  Bioteknologi  Perkebunan  Indonesia sedang  dikembangkan  cara  perbanyakan  klonal dengan  teknologi microcutting ,  yaitu  suatu  teknik mikropropagasi  berbasis  kultur in  vitro dengan menggunakan  eksplan  potongan  batang  muda  yang memiliki  mata  tunas  aksiler  ( axillary  buds ) (Nurhaimi-Haris et  al., 2009a).  Keuntungan  sistem perbanyakan  tersebut  adalah  tersedianya  batang bawah tanpa dipengaruhi musim biji serta tersedianya batang  bawah  dalam  bentuk  klon  yang  selama  ini belum  pernah  bisa  dihasilkan  pada  tanaman  karet. Penggunaan  batang  bawah  klonal  diduga  dapat meningkatkan  keseragaman  tanaman  karet  di lapangan  sehingga  akan  berdampak  positif  terhadap pertumbuhan  tanaman  dan  produksi  lateks.  Di samping  itu,  kemampuan  melakukan  perbanyakan batang bawah secara klonal membuka peluang untuk menghasilkan  batang  bawah  dengan  karakteristik tertentu,  seperti  toleran  terhadap  penyakit  serta kondisi lingkungan yang kering.
Meskipun  perbanyakan  batang  bawah  karet dengan teknologi microcutting telah dapat dilakukan, namun  aplikasinya  dalam  skala  besar  masih  ter- kendala.    Penyebab  utamanya  adalah  banyaknya tanaman  yang  hilang  akibat  kontaminasi,  rendahnya laju  multiplikasi,  terjadinya  kelainan  morfologis  dan fisiologis  dari  tanaman  yang  dihasilkan,  serta banyaknya  tanaman  yang  mati  dalam  proses aklimatisasi.  Semua  kendala  tersebut  menyebabkan biaya produksi per satuan bibit menjadi mahal.
Tanaman  yang  ditumbuhkan  secara in  vitro biasanya  diletakkan  dalam  tabung  atau  botol  kultur dengan  tutup  rapat  untuk  menghindari  kontaminasi bakteri  dan  jamur  serta  untuk  menjaga  kelembaban lingkungan  kultur.  Akan  tetapi  tutup  yang  rapat tersebut  sering  mempengaruhi  komposisi  gas  di dalam  tabung/botol  sehingga  menghambat  pertum- buhan  tanaman  (Kitaya,  2005).  Tutup  tabung/botol seperti  aluminium  foil,  parafilm,  plastik wrap atau tutup  dengan  drat  menyebabkan  pertukaran  gas terhambat  antara  di  dalam  dan  di  luar  tabung/botol. Oleh karena itu udara di dalam tabung/botol berbeda dengan udara ex vitro sehingga sering menyebabkan malfungsi  stomata,  rendahnya  kandungan  klorofil, memanjangnya daun serta hiperhidrasi. Kondisi yang demikian  mengakibatkan  laju  multiplikasi  dan  daya hidup tanaman menjadi rendah.
Untuk  meningkatkan  kualitas  udara  dan meminimalkan perbedaan udara di dalam dan di luar lingkungan  kultur  dapat  digunakan  wadah  kultur yang  dilengkapi  dengan  ventilasi.  Penggunaan ventilasi  biasanya  merupakan  bagian  dari  mikro- propagasi  fotoautropik,  yaitu  suatu  sistem  mikro- propagasi  yang  memanfaatkan  bahan  anorganik endogen untuk memenuhi kebutuhan tanaman dengan menggunakan  cahaya  sebagai  sumber  energi  (Kozai &  Kubota,  2005).  Salah  satu  wadah  kultur  dengan
ventilasi adalah ” the full-gas microbox ” karena tutup box  dilengkapi  dengan  berbagai  ukuran  filter sehingga memungkinkan terjadinya pertukaran udara ( gas exchange ) secara pasif ke dalam maupun ke luar lingkungan  kultur.  Ventilasi  tersedia  dalam  empat macam  nilai  Kv  (koefisien  nilai  pertukaran  gas  per unit waktu) yang ditandai dengan warna filter putih, kuning,  merah  dan  hijau.  Filter  kuning  dan  hijau digunakan  dalam  penelitian  ini  karena  perbedaan nilai  Kv  yang  cukup  signifikan.  Dengan  adanya pertukaran  udara  melalui  filter,  diduga  pertumbuhan tunas karet akan lebih baik.
Tujuan  penelitian  adalah  mengetahui  pengaruh penggunaan  microbox  berventilasi  (tutup  microbox dilengkapi  filter  kuning  dan  hijau)  terhadap pertumbuhan tunas karet dalam proses kultur in vitro , meliputi morfologi tunas, stomata dan kadar klorofil daun.

## Bahan dan Metode

## Wadah kultur dan media tumbuh
Untuk pertumbuhan eksplan digunakan ‘ full-gas microbox ’  dengan  dua  macam  tutup,  masing-masing dengan  filter  kuning  atau  hijau.  Microbox  dengan filter  kuning  mempunyai  koefisien  nilai  pertukaran gas per unit waktu (Kv) sebesar 13,09 (Gas Exchange (GE)/hari  dan  filter  hijau  dengan  nilai  Kv  sebesar 81,35  GE/hari  (Combiness,  nv,  Belgium).  Sebagai kontrol  digunakan  microbox  yang  ditutup  rapat dengan  plastik.  Masing-masing  microbox  diisi dengan  100  mL  media  dasar  MA  yang  dilengkapi dengan  zat  pengatur  tumbuh  BAP  1  mg/L,  IBA 0,25 mg/L serta glukosa dan fruktosa, masing-masing 30 g/L (Carron et al ., 2005). pH media ditepatkan 5,8 dan  sebagai  pemadat  media  digunakan  agar. Sterilisasi  media  dilakukan  menggunakan  autoklaf selama  15  menit  dengan  suhu  121ºC  dan  tekanan 1 atm.

## Eksplan, kondisi kultur dan perlakuan
Eksplan  diambil  dari  kultur  aseptik  karet genotipe  78  pada  tahap  multiplikasi.  Pada  tahap tersebut  eksplan  terdapat  dalam  tiga  macam  bentuk, yaitu stock  explants (SE), shoot  explants (ST)  dan nodal  explants (NE)  yang  diperoleh  melalui pemotongan masing-masing bagian tersebut pada saat akan  dilakukan  subkultur  (Carron et  al .,  2005). Dalam  penelitian  ini  hanya  digunakan  eksplan  tunas (ST).  Eksplan  tunas  tersebut  dikulturkan  dalam microbox,  masing-masing  dengan  tutup  berfilter kuning (nilai Kv: 13,09 GE/day), berfilter hijau (nilai Kv:  81,35  GE/day)  dan  tutup  tanpa  filter  (tertutup rapat).  Setiap  perlakuan  yang  diuji  terdiri  atas  tujuh tunas dengan tiga ulangan.
Eksplan dalam microbox diletakkan di rak dalam ruang  kultur  dengan  suhu  ruang  diatur  pada  kisaran 26-28 ° C,  kelembaban  relatif  60–80  %  dan  pen- cahayaan dengan lampu TL 40 W dengan intensitas
Menara Perkebunan 2011  79(2), 57-63
cahaya ±30 µmol foton/m2/detik, selama 12 jam/hari. Penyimpanan  eksplan  dalam  ruang  kultur  dilakukan selama  empat  minggu  dan  setelah  itu  dilakukan pengamatan  terhadap  tinggi  batang  (tunas),  bobot basah  tunas,  jumlah  daun  baru  dan  daun  gugur. Untuk mengetahui kualitas tunas juga diamati ukuran dan warna daun.

## Ekstraksi dan analisis klorofil daun
Kandungan  klorofil  dari  daun  tunas  karet ditetapkan  melalui  ekstraksi  dengan  menggunakan pelarut  aseton  80%.  Setelah  dikulturkan  selama empat  minggu,  daun  diambil  dan  diiris  tipis, ditimbang sebanyak 1 g, kemudian dihaluskan dalam mortar,  lalu  ditambahkan  10  mL  aseton  80%  ke dalam mortar, digerus kuat dan disaring. Filtrat yang diperoleh  ditampung  dalam  labu  takar  50  mL. Ekstraksi  diulang  kembali  dengan  menambahkan aseton  80%  sebanyak  3  mL,  lalu  disaring.  Filtrat kedua  yang  diperoleh  disatukan  dengan  filtrat pertama.  Perlakuan  ekstraksi  seperti  tersebut  di  atas dilakukan  sebanyak  tiga  kali.  Volume  filtrat ditepatkan  hingga  tanda  tera  dengan  menambah aseton 80%.
Ekstrak pigmen dalam pelarut aseton 80% diukur serapannya  dengan  menggunakan  spektrofotometer UV-VIS  pada  panjang  gelombang  663  nm  untuk klorofil  a  dan  646  nm  untuk  klorofil  b.  Konsentrasi klorofil  a  dan  b  maupun  total  dihitung  dengan menggunakan  rumus  sebagai  berikut  (Wellburn, 1994):
Klorofil total(mg/g) = 17,30.A 646 + 7,18.A 663 Klorofil a     (mg/g) = 12,21.A 663 – 2,81.A 646 Klorofil b     (mg/g) = 20,13.A 646 – 5,03.A 663

## Pengamatan  stomata
Pengamatan stomata menggunakan alat Scanning Electron Microscopy (SEM) dilakukan terhadap daun tunas masing-masing perlakuan kultur serta daun dari tanaman  induk  dari  genotipe  yang  sama  (genotipe 78), yang ditumbuhkan dan dipelihara di rumah kaca dan  di  lapang.  Daun  diambil  pada  posisi  yang  sama dari masing-masing sampel  tanaman.
Persiapan  preparat  untuk  SEM  terdiri  atas  tiga tahap.  Pertama  adalah  tahap  fiksasi,  sampel  daun direndam  dalam caccodylate  buffer ( sodium caccodylate trihydate, HCl, dan H 2 O dengan pH 7,4), selama  kurang  lebih  dua  jam,  lalu  direndam  dalam larutan  glutaraldehida  2,5%  selama  dua  jam  dan direndam  dalam  larutan  asam  tanat  2%  selama semalam. Kedua adalah tahap dehidrasi, yaitu sampel direndam  secara  berurutan  dengan  alkohol  50% selama  empat  kali  lima  menit,  alkohol  70%  selama 20  menit,  dan  alkohol  85%  selama  20  menit  pada suhu  4 ° C.  Kemudian  secara  berturut-turut  sampel direndam  dalam  alkohol  95%  selama  20  menit,
alkohol  absolut  dua  kali  10  menit  dan  t-butanol selama  dua  kali  10  menit  yang  berlangsung  pada suhu  ruang,  lalu  dilakukan  pembekuan  kering. Selanjutnya  sampel  dengan  ukuran  1×1  cm direkatkan pada silinder logam steril yang diletakkan ke  dalam  pelapis  ion  untuk  divakum,  lalu  dilapisi dengan logam Pt-Au menggunakan pelapis ion. Hasil pengamatan dengan SEM difoto pada perbesaran 350 kali dan 1500 kali.

## Analisis data
Analisis  statistik  yang  digunakan  adalah  analisis varian (ANOVA) satu arah untuk parameter respons tinggi batang planlet, bobot basah planlet, dan kadar klorofil daun. Jika berbeda nyata (P<0,05), dilakukan uji  lanjut  Duncan  pada  tingkat  taraf  kepercayaan 95%. Analisis pertumbuhan daun, yaitu pertambahan dan  pengurangan  daun  serta  ukuran  dan  warna  daun dilakukan secara diskriptif.

## Hasil dan Pembahasan

## Morfologi tunas karet
Tunas  karet  yang  ditumbuhkan  dalam  microbox dengan  tutup  berventilasi  terdapat  pada  Gambar  1, sedangkan  morfologi  sebagian  tunas  setelah  di- kulturkan  selama  empat  minggu  dalam  microbox tersebut  terdapat  pada  Gambar  2.  Penggunaan microbox  berventilasi  (Gambar  1)  dimaksudkan untuk  memberikan  peluang  pertukaran  udara  yang lebih  baik  ke  luar  dan  ke  dalam  lingkungan  kultur sehingga  diharapkan  dapat  meminimalkan  penyim- pangan  yang  sering  ditemui  pada  tanaman  yang  di- perbanyak secara in vitro . Di samping itu, pertukaran udara  diperlukan  untuk  meningkatkan  pertumbuhan dan  kualitas  tunas  sehingga  tunas  dapat  menye- suaikan  diri  dengan  mudah  pada  tahap  aklimatisasi (Zobayed, 2005).
Dalam  penelitian  ini  digunakan  tutup  microbox yang  dilengkapi  filter  berwarna  kuning  atau  hijau dengan nilai Kv yang berbeda, serta microbox tanpa filter sebagai kontrol.  Nilai Kv merupakan koefisien pertukaran gas yang terjadi secara difusi melalui filter dan  menggambarkan  banyaknya  pertukaran  gas  di dalam bejana per unit waktu.
Pengamatan secara visual menunjukkan bahwa perkembangan daun tunas yang terlihat normal secara morfologi  (ukuran  dan  warna  daun)  umumnya terdapat pada tunas yang ditumbuhkan dan dipelihara dalam microbox dengan tutup berfilter hijau (Gambar 2c),  sedangkan  pada  tutup  berfilter  kuning  ukuran daun  normal,  namun  warna  daun  agak  kuning (Gambar  2b).  Pada  microbox  yang  ditutup  rapat (tanpa  filter)  sebagian  besar  tunas  mempunyai  daun yang kecil memanjang dan berwarna kuning (Gambar 2a). Pengukuran luas daun menunjukkan bahwa rata- rata luas   daun   tunas  pada microbox dengan tutup
Pengaruh ventilasi terhadap morfologi, stomata dan kadar klorofil planlet karet …. ( Nurhaimi-Haris et al.)
berfilter  hijau  maupun  kuning  adalah  2,0  cm 2 sedangkan  yang  ditumbuhkan  pada  wadah  dengan tutup rapat adalah 1,3 cm 2 . Dalam  perbanyakan in  vitro ,  eksplan  mendapat- kan  kondisi  dan  lingkungan  pertumbuhan  yang berbeda dengan kondisi alami sehingga menyebabkan vitrifikasi  atau  hiperhidrisitas  karena  gangguan fisiologis  yang  akan  berdampak  pada  malformasi daun  dan  batang  (Lucchesini et  al .,  2006). Umumnya, beberapa gejala yang dapat diamati secara morfologi  adalah  batang  mengeras  dan  memendek, daun berbentuk roset, translusen dan mengkerut atau menggulung  serta  ruas  batang  pendek.  Kondisi  ini sering dipicu oleh kondisi kultur yang kurang sesuai, antara lain karena wadah kultur tertutup terlalu rapat. Kejadian vitrifikasi tersebut dapat diminimalkan dan dicegah pada beberapa tanaman dengan memberikan pertukaran gas yang sesuai melalui penggunaan tutup wadah  kultur  selama  proses  kultur  berlangsung  (Lai et al ., 2005; Winarto et al ., 2004). Dalam penelitian ini  penggunaan  microbox  dengan  tutup  dilengkapi filter  hijau  cenderung  menghasilkan  tunas  dengan daun  yang  terlihat  normal  (Gambar  2c).  Diduga pertukaran  udara  yang  terjadi  melalui  filter  tersebut memberikan  lingkungan  mikro  yang  lebih  sesuai untuk pertumbuhan tunas.
Hasil  pengukuran  tinggi  dan  berat  basah  tunas pada  masing-masing  perlakuan  setelah  dikulturkan selama empat minggu dalam microbox menunjukkan tidak  beda  nyata  antara  ketiga  perlakuan  tersebut (Tabel 1).  Nampaknya pemberian udara secara alami melalui  ventilasi  tidak  mempengaruhi  secara langsung  pertambahan  tinggi  maupun  bobot  basah tunas pada tahap multiplikasi. Hal ini sangat berbeda dengan  tahap primary  culture (tahap  sebelum multiplikasi),  dimana  ventilasi  sangat  diperlukan untuk  pertumbuhan  tunas  (Nurhaimi-Haris et  al ., 2009b). Berbeda dengan tinggi dan berat basah tunas,
pertukaran  udara  secara  alami  melalui  filter  pada tutup  microbox  berpengaruh  nyata  terhadap pembentukan  daun  baru  maupun  pengguguran  daun lama  selama  masa  kultur  (Tabel  2).  Pembentukan daun  baru  dalam  microbox  dengan  tutup  berfilter, baik  dengan  filter  kuning  maupun  hijau,  adalah sekitar  empat  kali  lipat  dibandingkan  dengan  yang ditutup  rapat,  sedangkan  jumlah  daun  yang  gugur hanya sekitar sepertiganya.
Lambatnya  perkembangan  tunas  serta  banyak- nya  daun  yang  gugur  dalam  microbox  tanpa  filter dapat  disebabkan  oleh  kondisi  lingkungan  di  dalam microbox  tersebut  seperti  kelembaban  tinggi, kandungan  gas  etilen  meningkat,  kandungan  CO 2 berfluktuasi  dan  sirkulasi  udara  sangat  minim.      Di samping itu, kondisi lingkungan yang demikian akan menghasilkan tunas dengan daun yang kecil (Gambar 2a) sehingga dapat mengurangi kapasitas fotosintesis. Terjadinya  variasi  tunas,  baik  secara  morfologi, anatomi  dan  fisiologi  pada  kondisi  wadah  kultur tertutup rapat telah dilaporkan pada berbagai tanaman lain (Chaum et al ., 2005; Liao et al ., 2007; Nguyen & Kozai, 2001; Zobayed et al ., 2001).

## Kadar klorofil tunas karet
Secara umum terlihat bahwa kandungan klorofil tunas  tertinggi  terdapat  pada  microbox  dengan  tutup berfilter  hijau  (nilai  Kv  81,35  GE/hari),  meskipun dari analisis    statistik    tidak   terdapat   beda nyata pada ketiga perlakuan tersebut (Tabel 3). Namun dari pengamatan  visual  terlihat  bahwa  daun  berwarna lebih  hijau  pada  microbox  dengan  tutup  hijau  (nilai Kv 81,35 GE/hari) dibandingkan daun pada microbox dengan  tutup  kuning  maupun  yang  tertutup  rapat (Gambar 2).
Pertukaran udara yang sangat terbatas dari dalam ke luar tabung kultur menyebabkan lingkungan udara
(a) (b) (c)
Gambar  1.  Tunas  karet  dalam  microbox  dengan  tutup  ber-
ventilasi; filter hijau dengan nilai Kv 81,35 Gas Exchange  (GE)/hari  dan  filter  kuning  13,09 GE/hari.
Figure 1. Hevea shoots in microbox with ventilated closure; green  filter  with  Kv  value  81,35  Gas  Exchange/ day, and yellow filter 13,09 GE/day.
Gambar  2.  Tunas  karet  yang  ditumbuhkan  dalam microbox dengan tutup (a) rapat; (b) filter warna  kuning  (nilai  Kv  13,09  GE/hari); dan (c) filter ukuran warna hijau (nilai Kv 81,35 GE/hari).
Figure 2.   Hevea shoots grown in microbox with closure (a) tight (without filter), (b) yellow filter (Kv value 13,09 GE/day), and (c) green filter (Kv value 81,35 GE/day).
Tabel 1.  Pengaruh ventilasi pada tutup microbox terhadap tinggi dan bobot basah tunas karet.
Table 1. Effect of ventilation on microbox closure on height and fresh weight of Hevea shoots .
Perlakuan ( Treatments ) Tinggi tunas Shoot height (cm) Bobot basah tunas Shoot fresh weight (g) Tanpa filter (tertutup rapat) Without filter (tight closed) 0,89 ± 0,10 6,60 ± 0,43 Filter kuning (13,09GE*/hari) Yellow filter (13,09GE/day) 0,74 ± 0,09 7,00 ± 0,46 Filter hijau (81,35 GE/hari) Green filter (81,35 GE/day) 0,82 ± 0,17 6,10 ± 0,89
*GE: Gas exchange, ANOVA P >0,05 untuk semua data ( for all data )
Tabel 2.  Pengaruh ventilasi pada tutup microbox terhadap jumlah daun baru dan jumlah daun yang gugur pada tunas karet.
Table 2  Effect of ventilation on microbox closure on number of new leaf and leaf fall of Hevea shoots
Perlakuan ( Treatments ) Jumlah daun baru Number of new leaves Jumlah daun yang gugur Number of leaf fall Tanpa filter (tertutup rapat) Without filter (tight closed) 2,00 b* 2,72 a Filter kuning (13,09GE/hari) Yellow filter (13,09GE/day) 8,52 a 1,00 b Filter hijau (81,35 GE/hari) Green filter (81,35 GE/day) 8,38 a 1,05 b
* Angka dalam kolom yang sama yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji jarak ganda Duncan (P=0,05) * Means in the same columns followed by similar letter is not significantly different according to Duncan Multiple Range Test (P=0.05)
di  dalam  tabung  kultur  tidak  normal  dibandingkan dengan  lingkungan  udara  di  luar  tabung.  Kondisi tersebut  dapat  menghambat  proses  fotosintesis, transpirasi, serta serapan air, hara dan CO 2 , sehingga akan  mempengaruhi  kualitas  tanaman.  Dalam penelitian  ini  penggunaan  microbox  dengan  peluang pertukaran  udara  lebih  banyak  (filter  hijau) menghasilkan daun yang lebih baik dilihat dari warna dan  ukuran  daun  (Gambar  2),  namun  belum  dapat meningkatkan jumlah klorofil. Couceiro et al . (2006) mengemukakan  bahwa  kandungan  klorofil  planlet dan  kualitas  tanaman  yang  ditumbuhkan  secara in vitro akan  lebih  baik  dengan  meningkatkan pertukaran udara di dalam tabung kultur. Untuk tunas karet  yang  dikulturkan in  vitro diduga  hal  ini  juga diperlukan, namun banyaknya pertukaran udara yang sesuai masih perlu diuji.

## Stomata pada daun tunas karet
Stomata  tanaman  karet  yang  ditanam  secara normal di lapangan terdapat pada Gambar 3a, dimana stomata terlihat tersebar merata. Penyebaran stomata
yang demikian juga terdapat pada tanaman karet yang ditanam di rumah kaca dan tunas yang ditanam dalam wadah  kultur  dengan  tutup  dilengkapi  filter  hijau (Gambar  3c  &  3i).  Stomata  tanaman  karet  yang ditanam dalam wadah kultur dengan tutup dilengkapi filter  kuning  atau  ditutup  rapat  terlihat  jarang (Gambar  3e  &  3g).  Stomata  dalam  kondisi  menutup terdapat  pada  daun  karet  yang  ditanam  di  lapangan dan  rumah  kaca  (Gambar  3b  &  3d),  agak  membuka pada  tanaman  yang  ditanam  dalam  wadah  yang dilengkapi filter hijau dan kuning (Gambar 3h & 3j), dan  terbuka  lebar  pada  wadah  yang  ditutup  rapat (Gambar  3f).  Membuka  dan  menutupnya  stomata merupakan  mekanisme  menahan  laju  transpirasi. Dalam  penelitian  ini,  diduga  dalam  kondisi  wadah tertutup  rapat  perkembangan  daun  terganggu sehingga  stomata  tidak  berfungsi  secara  normal. Menurut Afreen (2005), membukanya stomata secara terus  menerus  mengindikasikan  abnormalitas  fungsi stomata tersebut.
Berbeda dengan tanaman di lapang yang tumbuh di lingkungan alami dan terbuka, eksplan (dalam hal ini  tunas)  adalah  tanaman  hasil  kultur  jaringan  yang
Pengaruh ventilasi terhadap morfologi, stomata dan kadar klorofil planlet karet …. ( Nurhaimi-Haris et al.)
Tabel 3.   Pengaruh ventilasi pada tutup microbox terhadap kandungan klorofil tunas karet(mg/g) Table 3.  Effect of  ventilation on microbox closure on chlorophyll content of Hevea shoots (mg/g)
Perlakuan ( Treatments ) Klorofil a
Chlorophyll a
Klorofil b Chlorophyll b Klorofil total Total Chlorophyll Tanpa filter (tertutup rapat) Without filter (tight closed) 0,42 0,18 0,60 Filter kuning (13,09GE*/hari) Yellow filter (13,09GE/day) 0,35 0,16 0,50 Filter hijau (81,35 GE/hari) Green filter (81,35 GE/day) 0,50 0,20 0,70
*GE: Gas exchange, ANOVA P >0,05 untuk semua data ( for all data )
Gambar 3.  Stomata dari epidermis bawah daun karet genotipe 78 yang ditumbuhkan di lapang (a dan b), di rumah kaca (c  dan  d),  di  dalam  wadah  dengan  tutup  rapat  (e  dan  f),  di  dalam  wadah  dengan  tutup  berfilter  kuning  (nilai Kv13,09 GE/hari) (g dan h), dan di dalam wadah dengan tutup berfilter hijau (nilai Kv 81,35 GE/hari) (i dan j). Pengamatan dengan perbesaran 350× (a, c, e, g dan i) dan 1500× skala (b, d, f, h, dan j).
Figure 3.    Stomata from lower epidermis of leaves of rubber genotypes 78  grown in the field (a and b), in a greenhouse (c and d), in tightly closed container (e and f), in container with a yellow filtered lid (Kv value 13.09 GE /day) (g  and  h),  and  container  with  green  filtered  lid  (Kv  value  81.35  GE  /day)  (i  and  j).  Observations  with  a magnification of 350 x (a, c, e, g and i) and 1500 x (b, d, f, h, and j).
diperbanyak dan dipelihara dalam lingkungan buatan dan  tertutup  seperti  tabung  atau  botol  kultur. Lingkungan yang demikian sering menyebabkan mal- fungsi stomata, pemanjangan tunas, penurunan kadar klorofil  serta  hiperhidrisitas  (Afreen,  2005).  Mal- fungsi  stomata  umumnya  berhubungan  dengan hilangnya  kemampuan  stomata  untuk  menutup  dan membuka.  Dalam  kondisi  stomata  terbuka  lebar  dan tidak bisa menutup maka laju transpirasi akan sangat tinggi  sehingga  sering  menimbulkan  efek  yang merugikan,  baik  pada  saat  tunas  masih  dalam  tahap pengembangan  di  laboratorium  maupun  pada  saat aklimatisasi.
Menurut  Zobayed et  al .  (2004),  peningkatan kualitas  tanaman  hasil  kultur  jaringan  dapat  dilaku- kan  melalui  pemberian  ventilasi,  pengaturan konsentrasi  CO 2 pada  lingkungan in  vitro dan pemberian  cahaya  yang  cukup.  Dalam  penelitian  ini pemberian  ventilasi  melalui  filter  hijau  pada  tutup wadah  kultur  memungkinkan  terjadinya  pertukaran udara dengan nilai Kv 81,35 GE/hari, sehingga tunas dapat  memiliki  daun  dengan  morfologi  normal (Gambar  2c)  dan  sebaran  stomata  menyerupai tanaman  induknya  yang  dipelihara  di  rumah  kaca maupun lapangan.
(j) (i) (a) (c) (b) (d) (e) (f) (h)
(g)

## Kesimpulan
Tunas  dari  eksplan  karet  yang  ditumbuhkan dalam  microbox  dengan  tutup  dilengkapi  filter  hijau (nilai  Kv  81,35  GE/hari)  memiliki  morfologi, stomata  dan  klorofil  yang  lebih  baik  dibandingkan dengan  tunas  yang  ditumbuhkan  dalam  microbox dengan  filter  kuning  (nilai  Kv  13,09  GE/hari) maupun microbox tanpa filter (tertutup rapat).  Pada microbox  dengan  filter  hijau,  morfologi  dan  warna tunas    normal  serta  kandungan  klorofilnya  lebih tinggi  dibandingkan  tunas  dalam  microbox  lainnya. Di samping itu, sebaran dan pembukaan stomata juga menyerupai  tanaman  induk  yang  ditumbuhkan  di lapang  dan  rumah  kaca.  Penggunaan  microbox dengan  filter  maupun  tanpa  filter  tidak  berpengaruh nyata  terhadap  laju  multiplikasi,  namun  dapat meningkatkan kualitas tunas.

## Daftar Pustaka
Afreen  F  (2005).  Physiological  and  anatomical characteristics  of in  vitro photoautotroph  plants. In : T.  Kozai et  al .  (eds.)  Photoautotrophic (sugar-free medium)  Micropropagation  as  a  New  Micro- propagation    and  Transplant  Production  System. The Netherlands, Springer,  p. 61-90.
Carron  MP,  L  Lardet  &  P    Montoro    (2005).    Hevea microcutting. Technical  Notes  on  The  Process . France, CIRAD.
Couceiro  MA,  F  Afreen,    SMA  Zobayed  &    T  Kozai (2006).  Enhanced  growth  and  quality  of  St.  John’s wort  ( Hypericum  perforatum L.)  under  photo- autotrophic in  vitro conditions. In  Vitro  Cellular Develop Biol-Plant , 42, 278-282.
Chaum  S,    K  Supaibulwatana  &  C  Kirdmanee  (2005). Phenotypic  responses  of  Thai  jasmine  rice  to  salt- stress  under  environmental  control  of in-vitro photoautotrophic system. Asian J  Plant Sci 4, 85-89.
Kitaya  Y  (2005).  Importance  of  air  movement  for promoting  gas  and  leaf  exchange  between  plants  and atmosphere under controlled environment. In : Omassa et  al .  (eds.) Plant  Responses  to  Air  Pollution  and Global Change. Springer-Verlag Tokyo. p. 185-193.
Kozai  T  &  C  Kubota  (2005).  Concepts,  definitions, ventilation  methods,  advantages  and  disadvantages. In :  T.  Kozai et  al .  (eds.) Photoautotrophic  (Sugar- Free  Medium)  Micropropagation  As  a  New  Micro- Propagation  and  Transplant  Production  System . The Netherlands, Springer,  p. 19-29.
Lai  CC,  HM  Lin,  SM  Nalawade,  W  Fang    &  HS  Tsay
(2005).   Hyperhydricity    in    shoot    cultures      of
Scrophularia  yoshimurae  can  be  effectively  reduced by ventilation of culture vessels. J  Plant Physiol 162,
355-361.
Liao  F,  B  Wang,  M  Zhang,  F  Xu  &  F  Lian    (2007). Response  to  sucrose-free  culture  and  diffusive ventilation  of  plantlets in  vitro of Gerbera  jamesonii and photoautotrophic growth potential. Acta Horticult 764, 257-264.
Lucchesini  M,  G  Monteforti,  A  Mensuali-Sodi  &  G  Serra (2006).  Leaf  ultrastructure,  photosynthetic  rate  and growth  of  myrtle  plantlets  under  different in  vitro culture conditions. Biol Plantarum 50, 161-168.
Nguyen QT & T Kozai  (2001). Growth of in vitro banana ( Musa spp.)  shoots  under  photomixotrophic  and photoautotrophic  conditions. In  Vitro  Cellular Develop Biol-Plant 37, 824-829.
Nurhaimi-Haris,  Sumaryono,  Siswanto,  Sumarmadji,
PD  Kasi  &  MP  Carron  (2009a).  Teknologi microcutting untuk  perbanyakan  bahan  tanam  karet. Dalam : Prosiding Lokakarya  Nasional  Pemuliaan Tanaman Karet . Batam, 4-6 Agt 2009 p.188-198.
Nurhaimi-Haris,  Sumaryono,  Carron  MP  (2009b). Pengaruh bahan pra-sterilan, tutup tabung kultur, dan musim  terhadap  tingkat  kontaminasi  eksplan  pada kultur microcutting karet. Menara  Perkebunan 77(2), 89-99.
Wellburn  AR  (1994).  The  spectral  determination  of chlorophylls a and b, as well as total carotenoid, using various  solvent  with  spectrophotometers  of  different resolution. J Plant Physiol 144, 307-313.
Winarto  B,  MA  Aziz,  AA  Rashid    &  MR  Ismail    (2004). Effect  of  permeable  vessel  closure  and  gelling  agent on  reduction  of  hyperhydricity  in  in  vitro  culture  of carnation. Indonesian J Agricult Sci 204, 11-19.
Zobayed    SMA  (2005).  Ventilation  in  micropropagation. In :  T.  Kozai et  al .  (eds.) Photoautotrophic  (Sugar- Free  Medium)  Micropropagation  As  a  New  Micro- Propagation  and  Transplant  Production  System . The Netherlands, Springer,  p. 147-186.
Zobayed  SMA,  F  Afreen,  Y    Xiao  &  T  Kozai    (2004).
Recent  advancement  in  research  on  photoautotrophic micropropagation  using  large  culture  vessels  with forced  ventilation. In  Vitro  Cellular    Develop  Biol- Plant 40, 450-458.
Zobayed SMA, J Armstrong  & W Armstrong  (2001). Leaf anatomy  of  in  vitro  tobacco  and  cauliflower  plantlets as affected by different types of ventilation. Plant Sci 161, 537-548.