## SNP G-1082A GEN IL-10: DISTRIBUSI ALEL DAN GENOTIP PADA PASIEN PERIODONTITIS DI YOGYAKARTA

## (SNP G-1082A IL-10 GENE: ALLELE AND GENOTYPE DISTRIBUTION OF PERIODONTITIS
PATIENT IN YOGYAKARTA)
Rezmelia Sari * , Prayitno * , Alya Nur Fadhilah **
*Departemen Periodonsia Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta Indonesia **Program Studi Pendidikan Dokter Gigi Fakultas Kedokteran Gigi
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta Indonesia
Email: rezmelia_sari@mail.ugm.ac.id

## Abstract
Periodontitis  is  multifactorial  inflamation  process  and  related  to  disproportion  of  cytokine.  IL-10  is  a  dominant noninflammatory cytokines that related to gene polymorphism. Polymorphism G-1082A IL-10 genes has been reported to  increase  the  risk  of  periodontitis  occurs  in  Italian  populations,  apart  from  different  result  found  in  Brazilian.  The purpose  of  this  research  was  to  determine  the  polymorphism  G-1082A  IL-10  in  periodontitis  patients  in  Indonesia, especially among Yogyakarta’s Javanese. This is a case-control research with subjects according to the inclusion criteria. DNA was taken by cotton swab from the epithelial cells of buccal mucosa, and was isolated using a Presto TM (GeneAid) kit. Genotyping  analysis by using the PCR RFLP technique  and descriptive results were  presented. The result showed that  A  allele  frequency  is 100%  and  no G  allele  was  found.  AA genotype  in case group  has  lower  frequency than  in control group and vice versa. From this research, it was concluded that A allele was dominant in Yogyakarta’s Javanese, and AA genotype frequency is lower in individual with periodontitis.
Key Words: periodontitis, Javanese, SNP G-1082A IL-10, Yogyakarta, polymorphism

## Abstrak
Periodontitis  adalah  proses  inflamasi  multifaktorial  dan  terkait  dengan  ketidakseimbangan  sitokin.  IL-10  merupakan sitokin  antiinflamasi  yang  dominan  dan  dihubungkan  dengan  polimorfisme  gen.  Polimorfisme  G-1082A  gen  IL-10 diketahui  meningkatkan  risiko  terjadinya  periodontitis  di  populasi  Italia  namun  memberikan  hasil  yang  berbeda  pada populasi  Brazil.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  polimorfisme  G-1082A  gen  IL-10  pada  pasien periodontitis di Indonesia khususnya suku Jawa di Yogyakarta. Jenis penelitian ini adalah kasus kontrol dengan subjek sesuai kriteria inklusi. DNA diambil dari sel epitel mukosa bukal dengan cotton swab dan diisolasi dengan kit Presto TM (GeneAid). Analisis genotip menggunakan teknik PCR RFLP dan hasil disajikan secara deskriptif.  Hasil menunjukkan bahwa frekuensi alel A pada kelompok kasus dan kontrol adalah 100% dan tidak ditemukan alel G. Genotip AA pada kelompok kasus lebih rendah daripada kelompok kontrol dan sebaliknya. Dari penelitian ini disimpulkan bahwa alel A dominan pada suku Jawa di Yogyakarta dan frekuensi genotip AA lebih rendah pada individu dengan periodontitis.
Kata Kunci: periodontitis, suku Jawa, SNP G-1082A gen IL-10, Yogyakarta, polimorfisme

## PENDAHULUAN
Periodontitis  merupakan  penyakit  infeksi  di  jari- ngan periodontal yang dipengaruhi oleh faktor ling- kungan,  gaya  hidup  dan  faktor  genetik.  Faktor  in- dividual pasien ini sangat menentukan respon host terhadap  bakteri  (faktorinisiasi)  dan  manifesttasi
klinis di rongga mulut. Dengan kata lain, faktor ge- netika  akan  mempengaruhi  kerentanan,  keparahan dan prognosis perawatan 1 sehingga penelitian di bi- dang  genetika  terutama  tentang  variasi  gen  sito- kinin inflamasi penting untuk dilakukan. Telah  di- lakukan beberapa penelitian tentang  hubungan an-
tara variasi genetic sitokin proinflamasi tersebut de- ngan periodontitis, namun hasil yang didapatkan ti- dak  konsisten.  Hal  ini  dipengaruhi  oleh  heteroge- nitas etnik dan kriteria subjek penelitian 2 .
Sitokin  antiinflamasi  yang  berperan  penting  da- lam pertahanan tubuh adalah IL-10 2 .IL-10 berperan sebagai  inhibitor  osteoklastogenesis 3 dan  regulator osteoblas. 4 Pada proses inflamasi, sitokin ini mem- pengaruhi responsel B. Polimorfisme G-1082A gen IL-10 diketahui meningkatkan resiko terjadinya pe- riodontitis  di  populasi  Italia 1 , namun  memberikan hasil yang berbeda pada populasi Brazil. 2 Belum di- temukan  data  mengenai  polimorfisme  G-1082A gen  IL-10  pada  pasien  periodontitis  di  Indonesia khususnya di Yogyakarta.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui keterkaitan  antara  faktor  epidemiologi  klinis,  ge- netika  dan  molekuler  perkembangan  penyakit  pe- riodontitis,  khususnya  mengkaji  bagaimana  distri- busi  alel  dan  genotip  pada  pasien  periodontitis  di Yogyakarta.

## BAHAN DAN METODE
Jenis penelitian ini adalah kasus-kontrol. Kelom- pok kasus adalah subjek sebanyak 29 orang dengan periodontitis  dan  kelompok  control  adalah  subjek yang tampak sehat secara sistemik dan tidak men- derita  periodontitis.  Penelitian  telah  mendapat  ijin dari  komisi  etik  dan  masing-masing  subjek  telah menandatangani informed  consent. Penelitian  ini mengamati polimorfisme G-1082A gen IL-10 yaitu variasi yang terjadipada gen IL-10 dimana basa gu- anin urutan ke-1082 berubah menjadi adenin.
Alat  yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah alat diagnostik, probe periodontal, cotton swab , mi- kropipet, alat sentrifugasi, vortex, mesin PCR, me- sin  elektroforesis,  inkubator,  dan  kulkas.  Bahan yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  mas- ker,  sarung  tangan,  agarose  serbuk,  etidium  bro- mide, primer, kit isolasi DNA, kit PCR, enzim res- triksi (XagI) dan box sampel.
Subjek  diseleksi  berdasarkan  kriteria  yang  telah ditentukan  yaitu  usia di atas 30 tahun, CAL  (jarak antara  CEJ  hingga  dasar  sulkus  gingiva)  ≥3  mm pada  lebih  dari  satu  gigi,  PD  (jarak  antara  margin gingiva  hingga  dasar  sulkus  gingiva)  ≥4mm,  dan memiliki  BOP  (adanya  darah  setelah  dilakukan probing  pada  sulkus  gingiva).  Subjek  diinstruksi- kan  berkumur  terlebih  dahulu  untuk  menghilang- kan  debris  di  rongga  mulut.  Sampel  diambil  dari usapan sel epitel di mukosa bukal. Cotton swab di- gosokkan dengan gerakan memutar di mukosa pipi sebanyak 15-20 kali atau selama 1 menit. Selanjut-
nya dilakukan isolasi DNA menggunakan kit Pres- to TM (GeneAid).
Analisis  genotip  menggunakan  PCR-RFLP  de- ngan primer yaitu 5’-CCA AGA CAA CAC TAC TAA  GGC  TCC  TTT-3’  dan  5’-GCT  TCT  TAT ATG CTA GTC AGG TA-3’.Siklus PCR yaitu de- naturasi  awal  pada  suhu  95 0 C  selama  2  menit,  di- lanjutkan  dengan  35  siklus  PCR  yaitu  denaturesi pada  suhu  95 0 C  selama  40  detik, annealing pada 56 0 C selama 40 detik, extension pada suhu 72 0 C se- lama 40 detik, final extension pada suhu 72 0 C se- lama 7 menit dan cooling pada suhu 4 0 C.
Langkah  kedua  dilakukan  pemotongan  produk PCR dengan  enzim  spesifik.  Sebanyak 0,5  μL en- zim XagI +  1  μL  H 2 O  +  1  μL buffertango +  4  μL DNA dimasukkan kedalam tube . Genotip AA akan terpotong  menjadi  280bp+97bp  dan  GG  menjadi 253bp+27bp.  Distribusi  frekuensi  alel  dan  genotip disajikan secara deskriptif.

## HASIL
Telah dilakukan penelitian  tentang distribusi  alel dan  genotip  pada  SNP  G-1082A  gen  IL-10  pada pasien  periodontitis  di  Yogyakarta.  Karakteristik subjek penelitian disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1.Karakteristik subjek penelitian
SD=Standar  Deviasi;  mm=milimeter;  *Berbeda  makna apabila dibandingkan dengan control (p<0,05)
Tabel  1  menunjukkan  bahwa  rerata  usia  kelom- pok  kasus  lebih  tinggi  daripada  kontrol  (p<0,05) namun masih berada dalam rentang usia sesuai kri- teria  subjek.  Distribusi  frekuensi  jenis  kelamin hampir sama untuk tiap kelompok (p>0,05).  Rera- ta clinical  attachment  loss pada  kelompok  kasus adalah 4,8 mm dan poket 1,1 mm.
Setelah subjek diseleksi sesuai kriteria, dilakukan usap  mukosa  dengan cotton  swab dilanjutkan  de- ngan  isolasi  DNA.  Tahap  selanjutnya  adalah PCR dengan  primer  yang  telah  ditentukan.  Diketahui bahwa  masing-masing  DNA  memiliki  ketebalan
Kasus (n=29) Kontrol (n=29) p value Usia (rata- rata±SD) Jeniskelamin Wanita (%) Laki-laki (%) Suku CAL (mm) PD (mm) 44,66±5,50 96,6 3,4 Jawa 4,8 (3,1-7,5) 1,1 (0,9-5,5) 40,79±5,45 93,1 6,9 Jawa 0 (0-3,5) 1 (0,5-2) 0,01* 0,5 0,00* 0,00*
yang  tidak  sama.  Hasil  polimerisasi  tampak  pada Gambar  3.  Band  yang  dihasilkan  berada  pada  377 bp.
Gambar  1.  Hasil  polimerisasi  DNA  dengan  primer spesifik.
Enzim  yang  digunakan  adalah  XagI  yang  me- motong  pada  sisi  seperti  Gambar  2  dan  hasil  res- triksi  dapat  dilihat  pada  Gambar  3.  Data  hasil  res- triksi dikumpulkan dan disajikan pada Tabel 2.
Gambar 2. Daerah pemotongan enzim XagI. Tampak en- zim  memotong  dan  menghasilkan  daerah  pemotongan tidak simetris.
Gambar  3.  Hasil  restriksi  dengan  enzim  XagI.  Genotip AA  (alel  A  homozigot  terpotong  menjadi  280bp+97bp, Genotip  AG  (alel  A  heterozigot)  terpotong  menjadi 280bp+253bp+97bp+27bp  sedangkan  genotip  GG(alel G) akan terpotong menjadi 253bp+27bp.
Tabel 2. Distribusi frekuensi genotip subjek Genotip Kasus (n=28) Kontrol (n=29) AA (%) AG (%) GG (%) 24 (85,7) 4 (14,3) 0 27 (93,1) 2 (6,9) 0
Tabel 2 menunjukkan bahwa jumlah sampel pada kelompok  kasus  adalah  28  sampel  sedangkan  ke- lompok  kontrol  29  sampel.  Frekuensi  alel  A  pada kelompok  kasus  dan  kelompok  kontrol  adalah 100% sedangkan alel G tidak ditemukan. Alel A ho-
mozigot  (AA)  pada  kelompok  kasus  lebih  rendah daripada  kelompok  kontrol  sebaliknya  ditemukan frekuensi alel A heterozigot (AG) yang lebih tinggi.

## PEMBAHASAN
Periodontitis  merupakan  inflamasi  yang  dipe- ngaruhi  oleh  multifaktor  salah  satunya  faktor  ge- netik. Keseimbangan sitokin inflamasi dan antiinfla- masi  mempengaruhi  risiko  terjadinya  periodontitis. Kadar  sitokin  ini  dapat  dipengaruhi  oleh  polimor- fisme pada gen.
Salah satu sitokin antiinflamasi yang dominan dan dihubungkan  dengan  polimorfisme  gen  adalah  IL- 10.  Penelitian  tentang  hubungan  antara  polimorfis- me  G-1082A  gen  IL-10A  menunjukkan  bahwa polimorfisme  ini berhubungan dengan  risiko perio- dontitis  pada  populasi  di  Italia 1 ,  namun  hasil  pada populasi lain tidak konsisten.
Uji dengan metode PCR RFLP di spot -1082 (dae- rah  promoter)  menunjukkan  bahwa  terjadi  peruba- han basa guanin menjadi adenin. Perubahan basa ini disebutkan akan mempengaruhi kadar protein IL-10 karena  terjadi  pada ETS-like  recognition  site dan mempengaruhi  ikatan  faktor  transkripsi 5 .  Hal  ini mungkin disebabkan oleh mekanisme lain yang me- ngatur pola ekspresi protein IL-10.
Pola  distribusi  frekuensi  alel  A  ditemukan  lebih tinggi  daripada  alel  G.  Bahkan,  pada  suku  Jawa  di Yogyakarta tidak ditemukan individu dengan alel G (Tabel  2).  Hal  yang  hampir  sama  ditemukan  pada populasi  China.  Alel  G  hanya  ditemukan  0,04  dari 213  subjek  sedangkan  alel  A  ditemukan  dominan (0,96) 5 .  Heterogenitas  etnik  dan  perbedaan  subjek penelitian, baik  jumlah  sampel maupun  kriteria  pe- riodontitis  yang  diteliti  akan  mempengaruhi  hasil penelitian 2 . Variasi individual sangat mempengaruhi produksi protein IL-10 sehingga perlu dilakukan pe- nelitian lebih lanjut terkait dengan kadar IL-10 pada masing-masing individu 5 .
Pada  penelitian  ini,  terdapat  beberapa  kesulitan dan  keterbatasan.  Tebal  band  DNA  hasil  isolasi DNA dari usap mukosa sel bukal maupun hasil poli- merisasi dengan PCR tidak sama untuk semua sam- pel. Hal ini dapat terjadi karena sulit untuk menghi- tung jumlah sel epitel yang didapatkan dari mukosa bukal  sehingga  kuantitas  DNA  sangat  bervariasi. Dampaknya, harus dilakukan optimasi beberapa kali baik suhu, waktu maupun jumlah DNA yang digu- nakan untuk menghasilkan produk PCR yang diha- rapkan.
Tahap  RFLP  juga  mengalami  beberapa  kendala antara  lain  beberapa  sampel  tidak  dapat  terpotong secara sempurna. Bahkan terdapat 1 sampel yang ti-
dak  terestriksi    walaupun  telah  dilakukan  beberapa kali  optimasi  baik  waktu  restriksi,  jumlah  produk pcr hingga jenis buffer yang digunakan (Gambar 4). Kendala  ini  menyebabkan  waktu  penelitian  relatif lama dan 1 sampel tidak dapat dilaporkan.
Dari penelitian pendahuluan ini dapat disimpulkan bahwa  alel  A  dominan  pada  suku  Jawa  di  Yogya- karta.  Frekuensi  genotip  AA  lebih  rendah  pada  in- dividu dengan periodontitis.
Gambar 4. Perbandingan hasil restriksi menggunakan buffer tango dan buffer butterfly .

## DAFTAR PUSTAKA
1. Lanni M, Bruzzesi G, Pugliese D, Porcellini E, et al .    Variations  in  inflammatory  genes  are  asso- ciated  with    periodontitis.  Immunity  and  Ageing 2013; 10(39): 1-8.
2. Moreira  PR,  Costa  JE,  Gomez  RS,  Gollob  KJ, Dutra W. TNFA and IL-10 gene polymorphisms are not associated with periodontitis in Brazilians. The Open Dentistry J . 2009; 3: 184-190.
3. Zhang  Q,  Chen  B,  Yan  F,  Guo  J, et  al . Interleukin-10 inhibits bone resorption: a potential therapeutic  strategy  in  periodontitis  and  other bone  loss  disea-ses. Biomed  Res  Intern  2014;
2014: 1-5.
4. Rees  LEN,  Wood NAP,  Gillespie  KM,  Lai  KN, Gaston  K,  Mathieson  PW.    The  Interleukin-10- 108  2G/A  polymorphism:  allele  frequency  in different  populations  and  functions;  significance. Cell.Mol. Life.Sci 2002; 59: 560-9
5. Turner DM, Williams DM, Sankaran D, Lazarus M, Sinnott PJ, Hutchinson IV. An investigation of polymorphism  in  the  interleukin-10  gene promoter. Eur J Immunogenet 1997; 24: 1-8.