## PROFILE PROTEIN Brucella abortus LOCAL ISOLATE  WITH SDS PAGE METHOD
Desty Apritya 1 ,  Didik Handijatno 2 , Ratih Ratnasari 2
1 Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Wijaya Kusuma Surabaya 2 Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga

## ABSTRACT
The aim of this research was to find out the profile protein Brucella abortus local isolate. The samples bacteries were obtained from Balai Besar Veteriner Maros, South Sulawesi.
Whole  protein  was  obtained  from Brucella  abortus local  isolate  by  ultrasonic  homogenizer. The  protein  profile  was  analyzed  by  Sodium  Dodecyl  Sulphate-Polyacrylamide  Gel  Electrophoresis (SDS-PAGE)  with  4%  stacking  gel,  12%  separating  gel  and  standard  of  molecular  weight  was  10  – 200 kDa.
The results of this research showed that the profile protein had seven fractions there were 112 kDa, 72 kDa, 54 kDa, 46 kDa, 41 kDa, 31 kDa and 20 kDa.
Keyword : Protein, Brucella abortus local isolate, SDS - PAGE

## Pendahuluan
Brucellosis  merupakan  penyakit  yang  disebabkan  oleh  mikroorganisme  yang  termasuk  dalam genus Brucella. Brucellosis  disebabkan  oleh B.  abortus,  B.  suis,  B.  melitensis , Brucella  neotomae, Brucella canis, Brucella ovis . Infeksi oleh B. suis dan B. melitensis jarang sekali menunjukkan gejala klinis,  serta  identifikasi  secara  serologis  selalu  mengarah  ke  infeksi B.  abortus (Neta  dkk ., 2009). Berdasarkan sistem pengklasifikasian biovar, B. abortus dikelompokkan menjadi biovar 1, 2, 3, 4, 5, 6 dan 9 (Nicoletti, 1980; Alton dkk.,2002).
Di  Indonesia  kecenderungan  meningkatnya  populasi  dan  lebih  seringnya  mutasi  sapi  perah menjadi penyebab utama meningkatnya kasus Brucellosis. Pada daerah yang mempunyai populasi sapi padat,  cenderung  mempercepat  penularan  penyakit.  Penularan  Brucellosis  dapat  terjadi  melalui makanan  yang tercemar  oleh kotoran  yang positif  Brucellosis, penetrasi  pada luka  abrasi,  pernafasan dan transplasental .  Bakteri  tersebut  dapat  menginfeksi glandula  mamae dan  terdapat  dalam nodus limfaticus sampai beberapa tahun. Brucella dapat ditemukan pada air susu dalam beberapa tahun. Pada sapi  jantan,  bakteri  tersebut  menginfeksi  vesikula  seminalis,  ampula,  testis  dan  epididimis  (Meles, 2007 dan Quinn et al .,2002)
Untuk  mencegah  penyebaran  penyakit  ini  maka  sangatlah  penting  adanya  kerjasama  antara pemerintah  dengan  instansi  terkait  salah  satunya  adalah  dengan  karantina  hewan.  Pengawasan  dapat dilakukan  dengan  membuat  peraturan  yang  melarang  penjualan  sapi  yang  positif,  pemotongan  sapi yang sudah kronis, sanitasi kandang dan vaksinasi sapi (Meles,2007).
Beberapa vaksin yang masih digunakan di Indonesia adalah vaksin B. abortus S19 dan vaksin RB  51.  Kelemahan  dari  penggunaan  vaksin B. abortus S19  antara  lain  dapat  menimbulkan  antibodi yang  persisten,  sehingga  sulit  dibedakan  antara  sapi  yang  telah  divaksinasi  dengan  sapi  yang terinfeksi secara alami, pada sapi  betina bunting dapat menyebabkan abortus dan  pemberian pada pejantan dapat menimbulkan orchitis. Berbeda dengan vaksin B. abortus RB51, penggunaan vaksin RB 51 diketahui tidak menimbulkan gejala klinis pasca vaksinasi, namun vaksin ini juga menggunakan B.
abortus aktif  yang  berisi  kuman  utuh  dan  berasal  dari  isolat  luar  negeri,  yang  belum  tentu  sesuai dengan isolat lokal milik Indonesia (Siadat et al , 2012).
Dilihat dari  kelemahan vaksin Brucella tersebut sehingga perlu pengembangan vaksin yang lebih  efektif  dan    aman  untuk  pengendalian  penyakit  pada  hewan  dan  manusia.  Misalnya menggunakan  vaksin  sub  unit  yang  berisi  protein  tertentu  yang  memiliki  sifat  antigenitas  dan imunogenitas yang baik, sehingga sapi dapat terlindungi dari penyakit dan aman dari efek samping pasca vaksinasi.
Pada  penelitian  ini  merupakan  penelitian  pendahuluan  untuk  menciptakan  vaksin  subunit Brucellosis.    Protein  dari B.  abortus isolat  lokal  yang  berasal  dari  Indonesia  diteliti  antigenitasnya. Diharapkan dengan penggunaan vaksin sub unit tersebut dapat memberikan protektifitas yang baik pada ternak yang ada di wilayah Indonesia.

## Metode Penelitian
Isolasi B. abortus
Kuman B. abortus dibiakkan pada Brucella Agar Media (BAM),dan diinkubasi pada suhu 37°C selama  72  jam..  Pada  penelitian  ini  dipilih  media Brucella Agar  karena  biasa  digunakan  untuk pembiakan B. abortus dan spesfik untuk pertumbuhan kuman tersebut.

## Identifikasi B. abortus
Identifikasi B.abortus dilakukan dengan pemeriksaan secara mikroskopik dengan pewarnaan gram,  uji  urease,  simon  sitrat,  dan Sulfid Indol Motility (SIM).    Pewarnaan  gram  dilakukan  dengan menggunakan  objek  glas  yang  diberi  setetes  aquades  yang  kemudian  dicampur  dengan  koloni kuman menggunakan ose tumpul. Objek glas dipanaskan diatas bunsen, agar kuman melekat pada objek glas. Kemudian, diteteskan kristal violet pada objek glass, tunggu selama 2 menit, selanjutnya cairan  dibuang  dan  dicuci  dengan  air  mengalir.  Berikutnya  diteteskan  lugol,  alcohol  aceton  dan safranin  berurutan  kemudian  dicuci  dengan  air  mengalir.  Setelah  itu  periksa  menggunakan mikroskop perbesaran 1000x.
Pada  uji  urease,  simon  sitrat  dan  SIM  masing-masing  media  ditanamkan  koloni B.  abortus kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 hari. .

## Prosedur Pembuatan Whole Protein B. abortus
Untuk mendapatkan protein dari B. abortus dilakukan sonikasi suspensi kuman  dengan alat ultrasonic homogenizer dengan kecepatan 40 kHz, suhu 4ºC selama 1 menit dengan istirahat 15 detik sebanyak  10  kali.  Setelah  itu  dilakukan  sentrifugasi  dengan  kecepatan  5.000  rpm  selama  20  menit. Supernatan  diambil  kemudian  disentrifus  kembali  dengan  kecepatan  10.000  rpm,  endapan  yang didapat  kemudian dilakukan SDS-Page untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul.

## Analisis Profil Protein dengan SDS – PAGE
Protein tersebut kemudian dianalisis  dengan teknik sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) dengan komposisi separating gel 12% dan stacking gel 4%. Setelah larutan separating  gel 12%  dimasukkan  dalam  gel plate pada  posisi  vertikal  kemudian  di  atasnya  diberi aquadest  sampai  mengeras,  agar  permukaan  gel  menjadi  lurus,  kemudian  aquadest  dibuang. Selanjutnya  ditambahkan stacking  gel 4  %  dan  setelah  itu  dimasukkan comb dan  ditunggu  sampai kering. Plate berisi  gel  kemudian  dipasang  pada  Biorad  dan  dituangkan  electrophoresis  buffer. Sebanyak 10 µg sampel berupa B. abortus yang telah disonikasi ditambah Laemmli buffer sama banyak. Kemudian  sampel  didenaturasi  pada  pemanasan  100ºC  selama  7  menit,  kemudian  dimasukkan  ke dalam sumuran stacking gel . Sebagai marker digunakan protein dengan berat molekul pada kisaran 10–200 kDa produksi Intron TM, Electrophoresis dinyalakan dengan tegangan 100 V dan kuat arus 20 mA selama 100 menit.

## Hasil dan Pembahasan
Isolasi dan Identifikasi B.abortus
Penanaman B. abortus pada BAM memberikan gambaran makroskopik tampak pada gambar 1.1 berupa bentukan koloni yang kecil, halus dengan tepi rata, bulat dan  berwarna krem sesuai dengan pernyataan Sulaiman (2006).
Gambar 1.1 Hasil Penanaman pada Media Brucella Agar. A, media yang sudah ditumbuhi bakteri ; B, media yang belum ditumbuhi bakteri.
B. Abortus strain virulen pada BAM memiliki karakteristik berwarna putih madu, translucent, bertepi halus dan bersifat lembab. Sedangkan penanaman pada media Triptic Soy Broth menunjukkan kekeruhan yang homogen.
Menurut  Quinn et  al (2002)  bahwa  pada  pemeriksaan  mikroskopik  dengan  pewarnaan  Gram negatif  menunjukkan  bahwa B.  abortus berbentuk cocco  bacillus ,  berwarna  merah.  Hal  ini membuktikan bahwa B. abortus tidak tahan terhadap alkohol, karena susunan kimia dinding sel bakteri yang  tipis  sehingga  mampu  dirusak  dan  memudahkan safranin menembus  dinding  sel  sehingga memberikan  warna  merah  pada  sitoplasma.  Sesuai  dengan  pendapat  Volks  (1993)  bahwa  organisme yang  tidak  dapat  menahan  zat  pewarna  setelah  dicuci  dengan  alkohol  95%  disebut  Gram  negatif. Karena terjadi penyingkiran zat lipida dinding sel dengan pencucian alkohol memungkinkan kompleks zat pewarna yodium dapat disingkirkan dari sel.
Penanaman B.  abortus pada  media  urea  agar  menunjukkan  reaksi  positif  (Soebronto,  2003). Hal  tersebut  nampak  pada  perubahan  warna  yang  dihasilkan  menjadi  merah  muda.  Hal  ini membuktikan bahwa B. abortus menghasilkan enzim urease sehingga mampu menguraikan urea yang terdapat dalam media.
Alton et  al (1988)  menyatakan  bahwa  pada  pemeriksaan  uji simmons  citrate menunjukkan reaksi negatif yang dibuktikan dengan tidak merubah warna media sehingga tetap berwarna hijau. Hal ini  membuktikan  bahwa B.  abortus tidak  memanfaatkan  natrium  citrat  sebagai  sumber  karbon  untuk keperluan hidupnya.
Koloni kuman A B
Uji  SIM  menunjukkan hasil bahwa  koloni B. abortus yang di- streak secara injeksi  atau tusuk vertikal  menunjukkan  hasil  bahwa  kuman B.  abortus tidak  bergerak  yang  ditandai  dengan  tidak terbentuknya  gambaran  koloni  bakteri  yang  menyebar.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kuman  tersebut tidak  memiliki  flagela.  Pada  penambahan  reagen kovac menunjukkan  bahwa  kuman  tidak  mampu membentuk indol dari tryptophan , sehingga tidak ditemukan bentukan cincin merah pada lapisan atas media (Alton et al , 1988).

## Analisis Profil Protein B.abortus Isolat Lokal dengan SDS-PAGE
Hasil  analisis  profil  protein B.abortus isolat  lokal  dengan  teknik  SDS-PAGE  menunjukkan adanya 7 macam pita protein, yaitu  112 kDa, 72 kDa, 54 kDa,46 kDa, 41 kDa, 31 kDa dan 20 kDa.
Hasil protein yang didapatkan dari penelitian ini tidak berbeda jauh dengan hasil penelitian Sudibyo dkk, 1995 yaitu 17 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 28 kDa, 33 kDa, 36 kDa, 43 kDa, 58 kDa, 65 kDa, 71 kDa, 84 kDa, dan 94 kDa. Hanya saja pada penelitian ini protein dengan berat molekul rendah yaitu dibawah  20  kDa  tidak  terdeteksi.  Karena  protein  dalam  penelitian  ini  adalah whole protein,  maka berat molekul protein yang didapatkan relatif lebih berat.
Sedangkan hasil analisis profil protein B. abortus S-19 menurut Syamsudin (2008) adalah 55,3 kDa, 44,5 kDa, 38,2 kDa, 30,5 kDa, 24,4 kDa, 21,9kDa, 20,3 kDa dan 14,7 kDa. Hasil protein  yang didapatkan terdapat beberapa persamaan dan perbedaan. Protein dengan berat molekul 55,3 kDa, 30,5 kDa,  dan  20,3  kDa  menunjukkan  berat  molekul  yang  hampir  sama  dengan  protein  dari B.  abortus
Gambar  1.2  Hasil  Analisis  Protein B.abortus isolat  lokal  menggunakan  Teknik  SDS  Page , dengan pewarnaan coommasie brillian blue M, marker;  kolom 1, kontrol negatif; 2-5, Protein B.abortus isolat lokal.
isolat lokal, sedangkan perbedaannya protein dengan berat molekul 112 kDa dan 72 kDa tidak terdapat dalam B. abortus S-19.
Berdasarkan  hasil  pengamatan  terhadap  hasil running SDS-PAGE  menunjukkan  bahwa keberhasilan  running  tersebut  dipengaruhi  beberapa  hal  antara  lain  kebersihan  isolat,  tingkat kemurnian isolat dan kadar protein dalam homogenat. Keberhasilan isolat mempengaruhi kualitas pita protein yang terbentuk pada gel, pita terlihat tajam dengan gel terang, sehingga memudahkan analisis protein  dan  dokumentasi.  Isolat  yang  murni  dan  kadar  protein  homogenat  yang  bagus  akan menghasilkan pita protein yang baik dan jelas sehingga dapat memudahkan analisis berat molekul pada pita yang terbentuk.
Pada penelitian ini, protein  dengan berat  molekul  31 kDa sangat  mencolok dibandingkan pita yang lain Tebal tipisnya pita protein yang tampak pada gel merupakan gambaran ekspresi suatu protein oleh gen penyandi  protein tersebut,  semakin tebal pita protein  yang terlihat  semakin banyak  ekspresi protein oleh sel penyandi (Lastuti dkk, 2001).

## Kesimpulan
Berdasarkan  atas  data  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan,  maka  dapat  ditarik  kesimpulan, profil protein Brucella abortus isolat lokal dengan metode SDS PAGE didapatkan 7 macam pita protein yaitu, 112 kDa, 72 kDa, 54 kDa,46 kDa, 41 kDa, 31 kDa dan 20 kDa.

## Daftar Pustaka
Alton, G.G., L.M. Jones, R.D. Angus, and J.M Veyer. 2002. Technique for the Brucellosis Laboratory. Institude Nasional de la Recherche, Agronomique. Paris
Meles, W. 2007. Penyakit Sapi Perah Disebabkan Faktor Makanan. Laboratorium Kebidanan. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga
Neta,  A.V.C.,  Mol,  J.P.S.,  Xavier,  M.N.,  Paixao,  T.A.,  Lage,  A.P.,  dan  Santos,  R.L.  2009. Pathogenesis of Bovine Brucellosis. The Vet. Journal 184: 146–155.
Nicoletti,  P.  1980.  The  Epidemiology  of  Bovine  Brucellosis.  Advances  in  Veterinary  Science  and Comparative Medicine. Vol : 24, Hal : 69–95.
Quinn,  P.J,  B.K.  Markey,  M.E.  Carter,  W.L.  Donnely  and  F.C.  Leonard.  2002.  Veterinary Microbiology and Microbial Disease. Blackwell Publishing. Hal 163 – 167.
Siadat,  S,D,  Salmani,A,S.  Aghasadeghi,  M,R.  2012.  Brucellosis  Vaccines:  An  Overview,  Zoonosis,
ISBN: 978-953-51-0479-7, InTech, Available from:
http://www.intechopen.com/books/zoonosis/brucellosis-vaccines .
Soebronto. 2003. Ilmu Penyakit Ternak  I. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Hal 464, 465, 474, 475, 483, 484
Sulaiman,  I.  2006.  Bovine  Brucellosis  (Bakteriologi  -  Isolasi  dan  Identifikasi).  Dalam  Pedoman Diagnosa Laboratorium Brucellosis Sapi – BBVet Wates. Hal : 1 – 11.