## ANALISIS SENYAWA METABOLIT SEKUNDER DAN UJI TOKSISITAS
EKSTRAK ETANOL BATANG TANAMAN PATAH TULANG ( Euphorbia tirucalli L.) DENGAN METODE Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Grace S. Baud 1) , Meiske S. Sangi 1) , Harry S. J. Koleangan 1)
1) Program Studi Kimia FMIPA UNSRAT, Manado e-mail: gracebaud1@gmail.com ; meiskesangi@gmail.com ; koleanganharry@yahoo.com

## ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian mengenai analisis senyawa metabolit sekunder dan uji toksisitas pada batang  tanaman  Patah  tulang  ( Euphorbia  tirucalli L.).  Analisis  senyawa  metabolit  sekunder dilakukan  dengan  skrining  fitokimia  yaitu  senyawa  alkaloid,  flavonoid,  triterpenoid,  steroid, saponin  dan  tanin  pada  ekstrak  segar  dan  kering  batang  tanaman  Patah  tulang.  Penentuan toksisitas  ekstrak  etanol  batang  tanaman  Patah  tulang  menggunakan  metode Brine  Shrimp Lethality  Test (BSLT).  Uji  toksisitas  digunakan  hewan  uji Artemia  salina Leach  sebagai bioindikator.  Pada  skrining  fitokimia  diperoleh  positif  flavonoid,  tanin  dan  steroid  sedangkan alkaloid,  saponin  dan  triterpenoid  negatif.  Data  pengujian  toksisitas  diperoleh  dari  analisis Lethality Concentration 50 (LC 50 ) yang dilakukan dengan metode probit menggunakan perangkat lunak SPSS 20.0 (untuk sistem operasi Windows). Hasil uji toksisitas ekstrak etanol batang Patah tulang  menunjukkan  bahwa  ekstrak  segar  maupun  kering  bersifat  sitotoksik  dengan  nilai  LC 50
(7,994ppm) untuk ekstrak etanol batang segar  dan LC 50 (9,940ppm) untuk ekstrak etanol  batang kering.
Kata  kunci  : Euphorbia  tirucalli L.,  Senyawa  metabolit  sekunder,  Toksisitas, Artemia  salina Leach, LC 50 .

## ANALYSIS OF SECONDARY METABOLITE COMPOUNDS AND TOXICITY TEST OF  STEM  PLANT ETHANOL EXTRACTS
OF  PATAH TULANG ( Euphorbia tirucalli L.) BY BRINE

## SHRIMP LETHALITY TEST’S METHOD (BSLT)

## ABSTRACT
A  research  on  the  analysis  of  secondary  metabolite  compounds  contained  in  the  stem  of    patah tulang  ( Euphorbia  tirucalli L.)  and  its  toxicity  had  been  done.  The  analysis  was  performed through  phytochemical  screening  of  alkaloids,  flavonoids,  triterpenoids,  steroids,  saponins  and tannins on extracts of fresh and dried stem of the plant. Toxicity of ethanol extract of the stem was determined  using  Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT)  method  with Artemia  salina Leach  as bioindicator.  Phytochemical  screening  showed  positive  results  for  flavonoids,  tannins,  and steroids  and  negative  one  for  alkaloids,  saponins,  and  triterpenoids.  Toxicity  data  were  obtained from  Lethality  Concentration  50  (LC 50 )  calculation  trhrough  probit  analysis  using  SPSS  20.0 software (for Windows operating systems). Toxicity test showed that ethanol extracts of the fresh and dried stem were cytotoxic with LC 50 value of 7.994 ppm and 9.940 ppm, respectively.
Keywords: Euphorbia  tirucalli L.,  Secondary  metabolite  compounds,  Toxicity, Artemia  salina Leach, LC 50 .

## PENDAHULUAN
Sumber  keanekaragaman  hayati  di Indonesia  merupakan  salah  satu  kekayaan alam  yang  berperan  penting  dalam  berbagai lapisan  masyarakat.  Sebagai  negara  dengan
budaya  yang  masih  kental  akan  pemanfaatan ragam  tanaman  tradisional  untuk  mengobati berbagai  penyakit,  masyarakat  terutama  di daerah pedesaan cenderung memakai tanaman  sebagai  obat  tradisional  untuk menyembuhkan penyakit yang diderita.
Tanaman  menghasilkan  senyawa- senyawa  metabolit  sekunder  yang  bersifat toksik  dan  dapat  digunakan  untuk  mengobati berbagai  jenis  penyakit  pada  manusia. Golongan senyawa metabolit sekunder adalah alkaloid,  flavonoid,  saponin,  tanin,  steroid dan  triterpenoid  (Harborne,  1987).  Senyawa metabolit  sekunder  yang  dihasilkan  oleh tanaman dapat dianalisis kemampuan
sitotoksiknya  melalui  metode Brine  Shrimp Lethality  Test (BSLT).  Metode  BSLT  adalah salah  satu  cara  yang  digunakan  untuk mengetahui  kemampuan  toksik  terhadap  sel (sitotoksik)  dari  suatu  senyawa,  yang dihasilkan  oleh  ekstrak  tanaman  dengan menggunakan  larva  udang Artemia  salina Leach  sebagai  bioindikator  (Kanwar,  2007).
BSLT  lazim  digunakan  karena  lebih  murah, mudah,  cepat  dan  hasilnya  akurat.  Selain  itu, metode ini telah terbukti memiliki  hasil yang berkorelasi  dengan  kemampuan  sitotoksik senyawa anti kanker (Meyer et al ., 1982).
Salah  satu  tanaman  obat  yang digunakan  oleh  masyarakat  adalah  tanaman Patah  tulang  ( Euphorbia  tirucalli L . )  yang merupakan  salah  satu  spesies  dari  famili Euphorbiaceae (Plantamor,  2012) . Menurut informasi  dari  masyarakat  Bitung,  tanaman Patah  tulang  ini  merupakan  tanaman  obat yang  digunakan  secara  empiris  untuk mengobati  patah  tulang  akibat  kecelakaan atau  terjatuh.  Cara  penggunaannya,  batang tanaman  ditumbuk  halus  dan  ditempelkan pada  daerah  yang  sakit.  Tanaman  Patah tulang juga dapat digunakan sebagai antikanker, anti-tumor, anti-inflamasi, penyakit  kulit,  dan  pengobatan  penyakit sifilis (Agral et al. , 2013; Mangan, 2009). Menurut hasil penelitian yang dilakukan  oleh  Absor  (2006),  ranting  Patah tulang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Bacillus  subtilis,  Staphylococcus aureus,  Escherichia  coli dan Pseudomonas aeruginosa. Selain itu, penelitian sebelumnya dari  ekstrak  metanol  dan  kloroform  ranting tanaman  patah  tulang  memiliki  kemampuan toksik berturut-turut sebesar 332,2489 μg/mL dan  240,6432  μg/mL  dan  berpotensi  sebagai pestisida.  Senyawa  yang  terdapat  dalam ekstrak  metanol  adalah  flavonoid,  tanin  dan saponin  sedangkan  ekstrak  kloroform  hanya terdeteksi positif alkaloid (Oratmangun et al .,
2014).  Ekstrak  ranting  tanaman  Patah  tulang memiliki  potensi  sebagai  tanaman  obat  yang terdeteksi memiliki senyawa metabolit
sekunder, serta aktivitas toksik yang berbeda- beda sesuai pada pelarut yang digunakan. Hal ini  merupakan  landasan  pokok  pemikiran untuk  dilakukan  analisis  terhadap  golongan senyawa  metabolit  sekunder  dan  aktivitas toksik  dari  ekstrak  etanol  batang  tanaman Patah tulang.

## METODOLOGI PENELITIAN
Alat  -  alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  evaporator,  desikator, pemanas  listrik,  timbangan  digital,  alat penggiling,  alat-alat  gelas,  kertas  saring, termometer,  aerator,  lampu,  kaca  pembesar (lup),  senter,  wadah  uji,  aluminium  foil  dan ayakan 65 mesh.
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  batang  tanaman  Patah tulang,  telur A.  salina Leach,  dan  akuades. Bahan-bahan  kimia  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  etanol  96%  p.a, merkuri(II)    klorida,  kalium  iodida,  bismut sub  nitrat,  besi(III)  klorida,  asam  klorida pekat, bubuk magnesium, asam asetat glasial, asam sulfat pekat dan garam dapur.

## Preparasi Sampel
Sampel  dibagi  menjadi  dua  kelompok yaitu  sampel  segar  dan  sampel  kering. Sampel  segar  dicuci  bersih,  ditiriskan  lalu dikeringanginkan  kemudian  dipotong  kecil- kecil  dan  dihaluskan.  Sampel  kering,  batang dicuci  bersih  kemudian  ditiriskan  lalu dikeringanginkan  selama  beberapa  hari  dan dipotong  kecil-kecil,  setelah  itu  diblender sampai  halus  dan  disaring  dengan  ayakan  65 mesh.

## Ekstraksi Batang Tanaman Patah tulang
Metode  ekstraksi  yang  digunakan untuk sampel segar dan sampel kering adalah maserasi.  Sebanyak  100  g  sampel  yang  telah dihaluskan  direndam  dalam  500  mL  etanol 96%  p.a  selama  2x24  jam  sambil  sesekali dikocok  kemudian  disaring,  residu  direndam kembali dengan etanol 96% p.a sebanyak 250 mL  lalu  dikocok  dan  disimpan  selama  2x24 jam, kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh  pada  maserasi  pertama  dan  kedua dicampur  dan  dievaporasi,  lalu  dimasukkan dalam  oven  pada  suhu  40-50 0 C  untuk diperoleh ekstrak  kental. Ekstrak  kental yang telah  diperoleh  digunakan  untuk  analisis
senyawa metabolit sekunder dan uji toksisitas.
Skrining Fitokimia
Sampel yang digunakan untuk skrining  fitokimia  adalah  ekstrak  etanol batang  segar  dan  kering  tanaman  Patah tulang.  Masing-masing  pengujian  dibuat duplo.

## Uji Alkaloid
Sebanyak  2  mL  ekstrak  diuapkan  di atas  cawan  porselin.  Residu  yang  dihasilkan kemudian  dilarutkan  dengan  5  mL HCl 2  M. Larutan  yang  diperoleh  dibagi  ke  dalam  3 tabung  reaksi.  Tabung  pertama  berfungsi sebagai  blanko,  ditambahkan  dengan  3  tetes HCl 2 M. Tabung kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi  Dragendorff  dan  tabung  ketiga ditambahkan  3  tetes  pereaksi  Mayer.  Pada pereaksi Dragendorff akan terbentuk endapan berwarna  jingga  sedangkan  pereaksi  Mayer akan terbentuk endapan kuning yang
menandakan positif adanya alkaloid (Farsnworth, 1966).

## Uji Flavonoid
Sebanyak  2  mL  ekstrak  ditambahkan dengan  air  panas  secukupnya,  kemudian dididihkan  selama  5  menit  lalu  disaring. Filtrat  sebanyak  5  mL  ditambahkan  0,05  mg serbuk  Mg  dan  1  mL  HCl  pekat,  kemudian dikocok  kuat-kuat.  Uji  positif  ditunjukkan dengan  terbentuknya  warna  merah,  kuning atau jingga (Harborne, 1987).

## Uji Tanin
Sebanyak  1  mL  ekstrak  ditambahkan dengan beberapa tetes larutan besi(III)klorida 10%.  Jika  terjadi  warna  biru  tua  atau  hitam kehijauan  menunjukkan  adanya  tanin  (Jones dan Kinghorn, 2006; Robinson, 1995).

## Uji Steroid dan Triterpenoid
Sebanyak    2  mL  ekstrak  ditambahkan CH 3 COOH  glasial  sebanyak  10  tetes  dan H 2 SO 4 pekat  sebanyak  2  tetes.  Larutan dikocok  perlahan  dan  dibiarkan  selama beberapa  menit.  Adanya  steroid  ditunjukan oleh  warna  biru  atau  hijau,  sedangkan triterpenoid  memberikan  warna  merah  atau ungu (Harborne, 1987).

## Uji Saponin
Sebanyak 2-3 mL ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian
ditambahkan 10 mL air panas lalu didinginkan,  kemudian  dikocok  kuat-kuat selama 10 detik lalu ditambahkan 1 tetes HCl 2  N.  Uji  positif  ditunjukkan  dengan terbentuknya  buih  yang  stabil  setinggi  1-10 cm  selama  tidak  kurang  dari  10  menit (Depkes RI, 1995).

## Uji  Toksisitas  Menggunakan  Metode BSLT
Sampel  yang  digunakan  untuk  uji toksisitas  adalah  ekstrak  etanol  batang  segar dan  kering  tanaman  Patah  tulang.  Masing- masing pengujian dibuat duplo.
Penyiapan larva A. salina Leach Sebanyak  1  g  telur A.  salina Leach . ditimbang  kemudian  direndam  dalam  1  L  air garam  buatan  untuk  penetasan  dan  diberi penerangan  serta diaerasi  selama  48 jam. Air garam  buatan  dibuat  dengan  cara  melarutkan 20  g  garam  dapur  dalam  1  L  air  kemudian disaring.

## Penyiapan Larutan Stok
Untuk pembuatan larutan stok, ekstrak dari  sampel  segar  ditimbang  sebanyak  200 mg  kemudian  dilarutkan  sampai  100  mL dengan  air  garam  buatan,  selanjutnya  dari larutan  stok  2000  ppm  dibuat  pengenceran 1000  ppm,  500  ppm,  100  ppm,  50  ppm,  25 ppm,  12,5  ppm  dan  0  ppm  sebagai  kontrol tanpa  penambahan  ekstrak.  Perlakuan  yang sama dibuat untuk ekstrak sampel kering.

## Uji Toksisitas dan Analisis Statistik
Disiapkan  6  wadah  pengujian  dan  1 wadah  sebagai  kontrol  untuk  masing-masing konsentrasi  ekstrak  sampel  segar.  Kemudian tiap  konsentrasi  larutan  dimasukan  10  ekor larva  udang A.  salina Leach.  Pengamatan dilakukan selama 1x24 jam terhadap kematian  larva  udang.  Pengamatan  jumlah larva  udang  yang  mati  dihitung  tiap  selang waktu  1  jam  pada  6  jam  pertama  kemudian selang  waktu  6  jam  pada  jam  ke-  12,  18  dan 24.  Perlakuan  yang  sama  dilakukan  untuk ekstrak  sampel  kering.  Data  hasil  penelitian uji  toksisitas  diolah  dengan  analisis  probit menggunakan  SPSS  20.0 for  Windows untuk mengetahui harga LC 50 .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  skrining  fitokimia  menunjukan bahwa ekstrak etanol batang segar dan kering dari tanaman Patah tulang memiliki
kandungan senyawa metabolit sekunder yang sama yaitu positif terdapat senyawa flavonoid,  tanin,  dan  steroid.  Tabel  1 menunjukan hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak etanol batang tanaman Patah tulang.
Tabel 1. Hasil Skrining Fitokimia Batang Tanaman Patah tulang
Uji Hasil BK BS Alkaloid Meyer - - Dragendorff - - Saponin - - Flavonoid + + Steroid + + Triterpenoid - - Tanin + + Keterangan :
BS  =  batang  segar,  BK=  batang  kering,  (-)  =  senyawa  tidak  terdeteksi,  (+)  =  senyawa  terdeteksi
Alkaloid Alkaloid yang diuji dengan menggunakan  pereaksi  Dragendorff  akan menghasilkan  endapan  berwarna  jingga, sedangkan  dengan  pereaksi  Mayer  akan menghasilkan endapan  berwarna  putih kekuningan,  penambahan  asam  klorida bertujuan  untuk  mengekstrak  alkaloid  yang bersifat  basa  dengan  menggunakan  larutan asam (Farnsworth, 1966; Jones dan Kinghorn,  2006).  Hasil  skrining  fitokimia menunjukan  tidak  adanya  endapan,  yang berarti  bahwa  kedua  ekstrak  etanol  batang tanaman Patah tulang tidak terdapat senyawa alkaloid.

## Flavonoid
Flavonoid  dapat  diuji  keberadaannya menggunakan  Mg  dan  HCl  pekat.  Senyawa flavonoid  dapat menghasilkan  warna  merah, kuning  atau  jingga  ketika  tereduksi  dengan Mg  dan  HCl  (Harborne,  1987).  Hasil skrining fitokimia menunjukan kedua ekstrak  etanol  batang  tanaman  Patah  tulang berwarna  kuning  dan  positif  terdapat flavonoid.  Contoh  reaksi  terbentuknya senyawa flavonoid ketika direduksi oleh Mg dan  HCl  ditunjukan  pada  gambar  1. Beragam  warna  yang  dihasilkan  ketika pengujian,  dipengaruhi  oleh  pelarut  dan prosedur  yang  digunakan  (Sangi et  al., 2008).
O O OH HO OH + Mg 2+ +  2HCl O HO OH OH OH +  produk lain (jingga) Tanin
Identifikasi  terhadap  senyawa  tanin dilakukan melalui penambahan FeCl 3. Senyawa tanin adalah senyawa yang bersifat polar  karena  adanya  gugus  OH,  ketika ditambahkan  FeCl 3 10%  akan  terjadi perbahan  warna  seperti  biru  tua  atau  hijau kehitaman yang menandakan adanya senyawa  tanin  (Jones  dan  Kinghorn,  2006; Robinson, 1991).
Menurut  Sangi  et  al.  (2008),  tanin terhidrolisis  akan  menunjukan  warna  biru
kehitaman  sedangkan  tanin  terkondensasi akan  menunjukan  warna  hijau  kehitaman ketika  penambahan  FeCl 3 .  Dari  hasil skrining fitokimia pada kedua ekstrak etanol batang tanaman Patah tulang, diperoleh hasil warna  hijau  kehitaman  yang  berarti  positif terdapat tanin terkondensasi.

## Steroid Dan Triterpenoid
Pengujian  steroid  dan  triterpenoid dalam  CH 3 COOH  glasial  dengan  H 2 SO 4 pekat  didasarkan  pada  kemampuan  senyawa
Gambar 1. Contoh reaksi identifikasi senyawa flavonoid (Harborne, 1987)
steroid  dan  triterpenoid  dalam  membentuk warna  biru  atau  hijau  untuk  steroid,  dan merah  atau  ungu  untuk  triterpenoid.  Steroid dan  triterpenoid  merupakan  senyawa  yang dapat  terekstraksi  dengan  pelarut  non  polar atau  semi  polar  (Harborne,  1987;  Nurjanah, 2011).
Hasil  skrining  fitokimia  menunjukan kedua  ekstrak  etanol  batang  tanaman  Patah tulang  memberikan  warna  hijau  dan  positif terdapat steroid. Warna hijau yang terbentuk disebabkan  oleh  ekstrak  etanol  batang tanaman Patah tulang yang bereaksi terhadap asam (CH 3 COOH glasial dan H 2 SO 4 pekat).
Saponin
Saponin  merupakan  senyawa  aktif permukaan  yang  mudah  terdeteksi  melalui kemampuannya  dalam  membentuk  busa. Komponen  ikatan  glikosida  yang  terdapat didalam  saponin  menyebabkan  senyawa  ini cenderung  bersifat  polar  (Harborne,  1987; Sangi et  al. ,  2008).  Keberadaan  saponin positif  jika  ekstrak  yang  diuji  membentuk busa  setinggi  1-10cm  dengan  selang  waktu ±10  menit  (Depkes  RI,  1995).  Berdasarkan hasil  skrining  fitokimia  menunjukan  ekstrak etanol  batang  tanaman  Patah  tulang  tidak terdapat  saponin  karena  tidak  membentuk busa.
Tabel  2.  Pengaruh  Variasi  Konsentrasi  Ekstrak  Batang  Segar  Tanaman  Patah  Tulang  terhadap Kematian Rata-rata Larva Artemia salina Leach Waktu (Jam) Konsentrasi (ppm) 0 12,5 25 50 100 500 1000 1 0 0 0 0 3.5 7 10 2 0 0 0 1 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 2.5 1.5 3 3 0 12 0 1 4.5 4 1.5 0 0 18 0 0 1.5 1.5 0.5 0 0 24 0 5 0 1.5 1.5 0 0 Total 0 6 8.5 9.5 9.5 10 10 % Kematian Larva 0 60% 85% 95% 95% 100% 100% LC 50 7,994ppm
Tabel  3.  Pengaruh  Variasi  Konsentrasi  Ekstrak  Batang  Kering  Tanaman  Patah  Tulang  terhadap Kematian Rata-rata Larva Artemia salina Leach
Waktu (Jam) Konsentrasi (ppm) 0 12,5 25 50 100 500 1000 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 5.5 3 0 0 0 0 0 4.5 1.5 4 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 0 1 6 0 1 1 3 2.5 1 1 12 0 2.5 3 2.5 3.5 1.5 0 18 0 1 1.5 1.5 1.5 1 0 24 0 1 2 1.5 1.5 2 0 Total 0 5.5 7.5 8.5 9 10 10 % Kematian Larva 0 55% 75% 85% 90% 100% 100% LC 50 9,940 ppm

## Uji Toksisitas
Penelitian  ini  menunjukan  bahwa kedua  ekstrak  etanol  batang  tanaman  Patah tulang masing-masing memiliki kemampuan toksik  yang  dapat  membunuh  larva Artemia salina Leach.  Konsentrasi  yang  diuji  dalam penelitian  ini  untuk  ekstrak  etanol  batang tanaman  Patah  tulang  segar  dan  kering adalah 1000, 500, 100, 50, 25 dan 12,5 ppm. Penelitian ini juga dibuat  konsentrasi 0 ppm sebagai  kontrol,  tanpa  penambahan  ekstrak. Larva  yang  digunakan  berumur  48  jam, karena  menurut  McLaughlin  dan  Roger (1998)  kondisi  larva  yang  tepat  untuk  uji hayati  yaitu  pada  usia  48  jam,  dimana anggota  tubuh  larva  sudah  lengkap  (Muaja, 2013).  Tabel  4  dan  5  menujukan  hasil penelitian  pengaruh  variasi  konsentrasi terhadap  kematian  rata-rata  larva A.  salina Leach.
Dari  tabel  4  dan  5  menunjukan angka  kematian  rata-rata  larva A.salina
Leach  pada  ekstrak  etanol  batang  segar tanaman  Patah  tulang  lebih  besar  daripada ekstrak  etanol  batang  kering  tanaman  Patah tulang. Hasil analisis probit dengan menggunakan SPSS 20.0 for windows untuk ekstrak etanol batang segar menunjukan nilai LC 50 sebesar  7,994ppm  sedangkan,  ekstrak etanol  batang  kering  memiliki  nilai  LC 50 sebesar 9,940ppm.
Menurut  Meyer et  al .  (1982) menuliskan  bahwa  suatu  ekstrak  memiliki aktivitas  toksik  apabila  dapat  membunuh 50%  hewan  uji  pada  konsentrasi  <  1000 µg/mL. Selain itu, McLaughlin et al . (1991) menuliskan  nilai  LC 50 <30µg/mL  bersifat sitotoksik,  30-200µg/mL  berpotensi  sebagai antibakteri    sedangkan  200-1000µg/mL berpotensi  sebagai  pestisida.  Berdasarkan hasil analisis probit LC 50 pada ekstrak etanol batang  segar  dan  kering  tanaman  Patah tulang menunjukan bahwa keduanya memiliki sifat sitotoksik.

## KESIMPULAN
1. Analisis senyawa metabolit sekunder pada ekstrak  etanol  batang  segar  dan  kering tanaman  Patah  tulang  positif  terdapat senyawa flavonoid, steroid dan tanin. 2. Uji  toksisitas  dengan  metode  BSLT terhadap  larva Artemia  salina Leach menunjukan  bahwa  ekstrak  etanol  batang segar  dan  kering  tanaman  Patah  tulang
bersifat  sitotoksik  serta  memiliki  nilai  LC 50 berturut-turut 7,994ppm dan 9,940ppm.

## DAFTAR PUSTAKA
Absor,  U.  2006. Aktivitas  Antibakteri Ranting  Patah  Tulang ( Euphorbia tirucalli.  Linn). [skripsi].  FMIPA IPB, Bogor.
Agral,  O.,  Fatimawali.,  Yamlean,  P.  dan Supriati,  H.S.  2013.  Formulasi  dan Uji  Kelayakan  Sediaan  Krim  Anti Inflamasi  Getah  Tanaman  Patah Tulang  ( Euphorbia  tirucalli L.). Pharmacon Jurnal Ilmiah Farmasi - UNSRAT . 2: 1-3. Depkes  RI.  1995. Farmakope  Indonesia . Departemen  Kesehatan  Republik Indonesia, Jakarta.
Farsnworth,  N.  R.  1966.  Biological  and Phytochemical  Screening  of  Plant.
Journal of Pharmaceutical Sciences . 55: 59.
Harborne,  J.B.  1987. Metode  Fitokimia . Terjemahan:  Padmawinata,  K  dan
Soediro, I. Institut Teknologi Bandung, Bandung. Jones, W.P., Kinghorn, A.D. 2006. Extraction  of Plant  Secondary
Metabolites.  In:  Sharker,  S.D.  Latif Z.,  Gray  A.L,  eds.  Natural  Product Isolation . 2 nd edition. Humana Press. New Jersey.
Mangan,  Y.  2009. Solusi  Sehat  Mencegah dan  Mengatasi  Kanker .  Agromedia pustaka, Jakarta.
McLaughlin, J.L dan Rogers, L.L. 1998. The
Use  Of  Biological  Assays  To Evaluate Botanicals. Drug Information Journal . 32: 513-524.
McLaughlin,  J.L.,  Chang,  C.  J.,  dan  Smith, D. L. 1991. Bench-Top, Bioassay for
The Discovery of Bioactive Naturals Products, An Update, Natural Product Chemistry. Elseiveir. Amsterdam. Meyer,  B.N.,  Ferrigni,  N.R.,  Putnam,  J.E.,
Jacobsen,  L.  B.,  Nichols,  D.  E.  dan McLaughlin, J.L. 1982. Brine Shrimp:  A  Convenient  General Bioassay for Active Plant
Constituents. Journal  of  Medicinal
Plant Research . 45 :31-34.
Muaja,  A.  D.  2013. Uji  Toksisitas  dengan Metode  BSLT  dan  Analisis  Daun Soyogik  (Saurauia  bracteosa  DC) dengan Metode Soxhletasi . [Skripsi]. FMIPA UNSRAT, Manado. Plantamor. 2012. Your plant database : Situs
dunia tumbuhan. http://www.plantamor.com/index.ph p?plant=571 [diakses pada 10
agustus 2014).
Robinson,  T.  1995. Kandungan  Organik
Tumbuhan  Tingkat  Tinggi .  ITB, Bandung. Sangi,  M.,  Runtuwene,  M.R.J.,  Simbala, H.E.I.  dan  Makang,  V.M.A.  2008. Analisis  Fitokimia  Tumbuhan  Obat di  Kabupaten  Minahasa  Utara. Chemistry Progress. 1: 47-53. Sangi,  M.,  L.  Momuat  dan  M.  Kumaunang. 2012.  Uji  Toksisitas  dan  Skrining Fitokimia  Tepung  Gabah  Pelepah Aren  ( Arenga  pinnata ). Jurnal Ilmiah Sains. 12 :128-134.