e-ISSN: 2580-1163 (Online) p-ISSN: 2580-9776 (Print) Widyaningsih, et al | Amerta Nutrition Vol. 6 Issue 1 (March 2022). 53-62

## ABSTRACT
Background: The habit of consuming herbs and high-antioxidant spices in traditional herbal preparations has been widely practiced, but not all people like traditional herbal medicine. One alternative to increase the consumption of high-antioxidant functional drinks is to formulate various herbs with the composition of rosella, sappanwood, cinnamon, and cloves. Apart from being a diversification effort, the choice of this material is also expected to work together to improve sensory characteristics. Objectives: Getting the optimal red rosella-based wedang uwuh formula as a functional drink. Methods: Optimization  of  rosella-based  wedang  uwuh  formula  using  Response  Surface  Methodology  (RSM)  method  with independent  variables,  namely  red  rosella  petal  powder,  sappanwood  powder,  cinnamon  powder,  and  clove  powder.  The responses used were the antioxidant activity of the DPPH method, total phenols, and total flavonoids. The optimal formula was then tested with these three parameters using a spectrophotometer.
Results: The optimal formula obtained based on RSM analysis was red rosella petal powder 1.891 gr, sappan wood powder 1.34, cinnamon powder 0.206, and clove powder 0.063 with a desirability value of 1. The antioxidant activity of the formula after verification was 37.007 ± 0.0466 mg TE/g, total phenol 40.9542 ± 0.0634 mg GAE/g, and total flavonoids 19.842 ± 0.488 mg QE/g.
Conclusions: There is no significant difference between the predicted and verification values of the three responses so the formulation suggested by the mixture design optimization in the design expert is good to be applied.
Keywords: Traditional Drink, Optimization of Formula, Functional Food, Wedang Uwuh, Rosella

## Optimasi Formula Wedang Uwuh Berbasis Rosella Merah sebagai Minuman Fungsional

## Optimization of Red Rosella-based Wedang Uwuh Formula as a Functional Drink
Tri Dewanti Widyaningsih* 1 , Muhammad Fawzul Alif Nugroho 2 , Arya Ulilalbab 3
1 Laboratorium Nutrisi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
2 Program Studi S2 Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
3 Program Studi S1 Gizi, Institut Ilmu Kesehatan Bhakti Wiyata Kediri, Kediri, Indonesia
OPEN ACCESS RESEARCH STUDY ARTICLE INFO
Received: 09-11-2021 Accepted: 24-09-2021 Published online: 18-03-2022
*Correspondent: Tri Dewanti Widyaningsih tridewantiw@ub.ac.id
DOI: 10.20473/amnt.v6i1.2022.53-62
Available online at: https://e- journal.unair.ac.id/AMNT
Keywords: Minuman Tradisional, Optimasi Formula, Makanan Fungsional, Wedang Uwuh, Rosella

## ABSTRACT
Latar  Belakang: Kebiasaan  mengkonsumsi  herbal  dan  rempah-rempah  tinggi antioksidan dalam sediaan jamu tradisional telah dilakukan secara luas, tetapi tidak semua  masyarakat  menyukai  jamu  tradisional.  Salah  satu  alternatif  untuk meningkatkan  konsumsi  minuman  fungsional  tinggi  antioksidan  yaitu  dengan melakukan formulasi aneka herbal dengan komposisi rosella, secang, kayu manis dan cengkeh. Pemilihan bahan tersebut selain sebagai upaya diversifikasi, juga diharapkan dapat bersinergi meningkatkan karakteristik sensori.
Tujuan: Mendapatkan formula optimal wedang uwuh berbasis rosella merah sebagai minuman fungsional.
Metode: Optimasi  formula  wedang  uwuh  berbasis  rosella  menggunakan  metode Response  Surface  Methodology (RSM)  dengan  variabel  bebas  yaitu  serbuk  kelopak rosella merah, serbuk secang, serbuk kayu manis, dan serbuk cengkeh. Respon yang digunakan yaitu aktivitas antioksidan metode DPPH, total fenol dan total flavonoid. Formula optimal  selanjutnya  diuji  dengan  ketiga  parameter  tersebut  menggunakan spektrofotometer.
Hasil: Formula optimal yang diperoleh berdasarkan analisis RSM yaitu serbuk kelopak rosella merah 1,891 gr, serbuk kayu secang 1,34, serbuk kayu manis 0,206 dan serbuk cengkeh  0,063  dengan  nilai  desirability  1.  Aktivitas  antioksidan  formula  tersebut setelah  dilakukan  verifikasi  yaitu  37,007  ±  0,0466  mg  TE/g,  total  fenol  40,9542  ± 0,0634 mg GAE/g dan total flavonoid 19,842 ± 0,488 mg QE/g.
Kesimpulan: Tidak  adanya  perbedaan  yang  signifikan  antara  nilai  prediksi  dan verifikasi terhadap ketiga respon sehingga formulasi  yang disarankan oleh optimasi mixture design pada design expert baik untuk diterapkan.
Widyaningsih,, et al | Amerta Nutrition Vol. 6 Issue 1 (March 2022). 53-62

## PENDAHULUAN
Sangat  ironis,  banyak  masyarakat  yang  tidak menyadari akan dampak negatif rokok. Padahal bahaya- bahaya tersebut sudah tercantum dalam bungkus rokok bahwasanya  merokok  dapat  menyebabkan  kanker, serangan  jantung,  impotensi,  gangguan  kehamilan  dan janin.  Dampak  tersebut  berhubungan  dengan  adanya kandungan  radikal  bebas dalam asap  rokok  seperti  NO, CO,  NOx,  H 2 O 2 ,  aldehid, trace  elements dan nitroso compounds 1 .  Radikal  bebas  dapat  menyebabkan  stres oksidatif  yang  merupakan  muara  dari  penyakit degeneratif.  PP  RI  nomor  109  (2012)  menyebutkan, produk tembakau terutama rokok yang dibakar terdapat lebih dari 4.000 zat kimia antara lain nikotin yang bersifat adiktif dan tar yang bersifat karsinogenik.
Solusi yang bisa dilakukan untuk mengatasi hal tersebut  yaitu  pembuatan  formula  seduhan  wedang uwuh  berbasis  rosella  merah  yang  terdiri  dari  kelopak rosella merah ( Hibiscus sabdariffa ) sebagai bahan tinggi antosianin 2 ,  kayu  manis  ( Cinnamomum  burmannii ), cengkeh ( Syzygium aromaticum ) dan Secang ( Caesalpinia sappan ).  Pelarut  air  cocok  untuk  melarutkan  beberapa senyawa bioaktif yang terkandung dalam bahan tersebut karena mempunyai kepolaran yang mendekati. Selain itu, pelarut  air  dipilih  karena  lebih  aman  dan  mudah diaplikasikan.  Ketersediaan  keempat  bahan  tersebut sangat  melimpah,  harga  murah,  dan  mempunyai kandungan  bioaktif  tinggi  sehingga  sangat  aplikatif apabila  diaplikasikan  dalam  pembuatan  minuman fungsional.  Minuman  fungsional  dapat  meningkatkan sistem  imun  dan  proses  pencegahan  berbagai  penyakit akibat  paparan  berbagai  sumber  radikal  bebas.  Rosella merah  sebagai  basis  dalam  pembuatan  wedang  uwuh fungsional  karena  bahan  tersebut  dapat  mencegah kenaikan  LDL  ( low-density  lipoprotein ) 3 ,  mencegah penurunan  HDL  ( high-density  lipoprotein ) 4 ,  mencegah kenaikan 5 dan mengurangi nilai MDA ( malondialdehyde ) 6 , serta dapat memperbaiki histopatologi  hepar  pada  tikus  yang  dipapar  radikal bebas 7 .
Wedang  uwuh  merupakan  seduhan  minuman hangat  khas  Kecamatan  Imogiri,  Kabupaten  Bantul, Daerah  Istimewa  Yogyakarta  yang  mengandung  aneka rempah  dan  biasanya  disajikan  pada  pagi  ataupun  sore hari.  Komposisi  wedang  uwuh  terdiri  dari  jahe,  daun manisjangan,  daun  pala,  daun  cengkeh,  cengkeh,  daun secang, dan gula batu 8 . Selain itu tidak jarang ditemukan kayu  secang,  kayu  manis  dan  aneka  herbal  lain  pada wedang uwuh. Adanya aneka rempah penyusun wedang uwuh  bisa  mengidentifikasikan  bahwa  wedang  uwuh termasuk minuman fungsional.
Pangan fungsional adalah pangan olahan yang mengandung satu atau lebih komponen fungsional yang berdasarkan  kajian  ilmiah  mempunyai  fungsi  fisiologis tertentu, terbukti tidak berbahaya dan bermanfaat bagi kesehatan 9 .  Fenomena  tren  pangan  fungsional  telah melahirkan paradigma baru bagi perkembangan ilmu dan teknologi  pangan,  yaitu  telah  dilakukannya  berbagai modifikasi  produk  olahan  pangan  yang  mengarah  pada sifat  fungsional.  Saat  ini,  di  Indonesia  telah  banyak dijumpai  produk  pangan  fungsional  baik  di  pasar tradisional  ataupun  pasar  modern.  Keanekaragaman sumber  daya  alam  lokal  di  Indonesia  sangat  berpotensi
untuk dikembangkan sebagai pangan fungsional dengan tujuan  untuk  memperbaiki  fungsi-fungsi  fisiologis,  yaitu agar  dapat  meningkatkan  imunitas  dan  mampu melindungi  tubuh  dari  penyakit,  khususnya  penyakit degeneratif  seperti  hipertensi,  diabetes,  kolesterol  dan kanker.  Tujuan  dari  penelitian  ini  yaitu  mendapatkan formula  optimal  wedang  uwuh  berbasis  rosella  merah sebagai  minuman  fungsional  berdasarkan  respon aktivitas antioksidan, total fenol dan total flavonoid.

## METODE
Optimasi  formula  wedang  uwuh  berbasis rosella  menggunakan  metode Response  Surface Methodology (RSM)  dengan  desain  percobaan mixture experiment .  Desain  percobaan  ini  melibatkan  dua  atau lebih  komponen  dengan  komposisi  tertentu  untuk menghasilkan  produk  akhir  dengan  karakteristik tertentu.  Variabel  bebas  yang  digunakan  yaitu  serbuk kelopak  rosella  merah  (1,85  -  2,82  gr),  serbuk  secang (0,54 - 1,34 gr), serbuk kayu manis (0,09  - 0,25 gr), dan serbuk  cengkeh  (0,05  -  0,06  gr),  yang  ditetapkan  pada penelitian  pendahuluan  berdasarkan  produk  komersial sebagai  pembanding.  Respon  yang  digunakan  yaitu aktivitas antioksidan metode DPPH, total fenol dan total flavonoid.  Ketiga  parameter  tersebut  merupakan senyawa bioaktif yang dapat melindungi sel tubuh akibat stres  oksidatif  yang  ditimbulkan  oleh  radikal  bebas. Formula  optimal  selanjutnya  diuji  dengan  ketiga parameter tersebut menggunakan spektrofotometer.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini  yaitu  kelopak  rosella  merah,  bunga  cengkeh  dan serbuk  kasar  kayu  secang  yang  diperoleh  dari  Desa Selopanggung  Kecamatan  Semen  Kabupaten  Kediri. Serbuk  kayu  manis  diperoleh  dari  Kabupaten  Madiun. Selanjutnya  keempat  bahan  tersebut  diuji  aktivitas antioksidan,  total  fenol  dan  total  flavonoid.  Sebelum dilakukan  pengujian  keti ga  parameter  tersebut,  sampel ditimbang  sebanyak  3,5  gr  lalu  diseduh  dengan menggunakan air  suhu  80ᴼC  selama  5  menit.  Dilakukan penyaringan  menggunakan  kertas  saring  dan  filtrat diletakkan  ke  dalam  botol  gelap  apabila  proses penyeduhan  sudah  selesai.  Selan jutnya  dilakukan pengujian  aktivitas  antioksidan  metode  DPPH  yangb dimodifikasi  dari  Thaipong, et.  al .,  (2006) 10 ,  total  fenol yang  dimodifikasi  dari  Sharma  (2011) 11 dan  total flavonoid yang dimodifikasi dari Li et. al ., (2007).

## Analisa Aktivitas Antioksidan
Pembuatan  kurva  standar  trolox  dimulai dengan  membuat  larutan  trolox  pada  berbagai pengenceran  yaitu  0,  20,  40,  60,  80  dan  100  ppm. Sebanyak  0,5  ml  larutan  trolox  dimasukkan  ke  dalam tabung  reaksi  dan  dicampur  dengan  2,5  ml  Dpph  40 µg/ml  (dilarutkan  dalam  metanol).  Setelah  itu,  tabung reaksi kemudian divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama  30  menit  dalam  ruang  yang  gelap.  Setelah diinkubasi  kemudian  diukur  serapannya  dengan menggunakan  spektrofotometer  pa da  λ  517  nm.  Hasil absorbansi  masing-masing  konsentrasi  trolox  diplotkan ke dalam grafik dan menghitung persamaan linier y = ax + b.
Widyaningsih,, et al | Amerta Nutrition Vol. 6 Issue 1 (March 2022). 53-62

## Analisa Total Fenol
Pembuatan  kurva  standar  asam  galat  dimulai dengan  membuat  larutan  asam  galat  pada  berbagai pengenceran  yaitu  0,  40,  80,  120,  160  dan  200  ppm. Sebanyak  0,5  ml  larutan  asam  galat  diambil  dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu sebanyak 2,5 ml reagen folin ciocalteau 10% dimasukkan ke dalam tabung reaksi  kemudian  diinkubasi  selama 5  menit  dalam  suhu ruang.    Setelah  itu  sebanyak  2  ml  Na2CO3  7,5% dimasukkan  ke dalam tabung reaksi kemudian divortex agar homogen lalu campuran diinkubasi selama 30 menit. Setelah diinkubasi kemudian diukur serapannya dengan menggunakan  spektrofotometer  pada  λ  756  nm.  Hasil absorbansi  masing-masing  konsentrasi  asam  galat diplotkan  ke  dalam  grafik  dan  menghitung  persamaan linear y = ax + b.

## Analisa Total Flavonoid
Pembuatan  kurva  standar  trolox  dimulai dengan  membuat  larutan  quercetin  pada  berbagai pengenceran  yaitu  0,  20,  40,  60,  80  dan  100  ppm. Sebanyak 1 ml larutan quercetin diambil dan dimasukkan ke  dalam  tabung  reaksi  kemudian  ditambahkan  2  ml
Aquadest  dan  reagen  0,3  ml  NaNO2  5%.  Tabung  reaksi divortex kemudian diinkubasi selama 6 menit. Setelah itu ditambahkan  0,3  ml  AlCl3  10%  kemudian  divortex  dan diinkubasi selama 6 menit. Setelah itu ditambahkan 4 ml NaOH  1  M  dan  2,4  ml  aquadest  lalu  divortex  dan diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  15  menit.  Setelah diinkubasi  kemudian  diukur  serapannya  dengan menggunakan  spekt rofotometer  pada  λ  325  nm. Pembuatan  kurva  standar  quercetin  dimulai  dengan membuat  larutan  trolox  pada  berbagai  pengenceran yaitu 0, 20, 40, 60, 80 dan 100 ppm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Analisa bahan baku
Analisa  terhadap  bahan  baku  terdiri  dari aktivitas  antioksidan  DPPH,  total  fenol,  dan  total flavonoid. Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini yakni  serbuk  kayu  secang,  serbuk  kayu  manis,  serbuk bunga cengkeh dan serbuk kelopak rosella. Hasil analisa dari  keempat  bahan  baku  tersebut  dapat  dilihat  pada Tabel 1.
Tabel 1 . Hasil analisa aktivitas antioksidan DPPH, total fenol, dan total flavonoid pada bahan baku
Bahan baku Aktivitas Antioksidan DPPH (mg TE/g) Total Fenol (mg GAE/g) Total Flavonoid (mg QE/g) Kayu Secang 21,16 56,12 22,31 Kayu Manis 21,21 19,05 12,04 Bunga Cengkeh 206,95 219,79 123,86 Kelopak Rosela Merah 3,98 11,56 5,78
Tabel 1. menunjukkan bahwa dari kelima bahan baku  yang  digunakan,  cengkeh  memiliki  aktivitas antioksidan,  total  fenol  dan  total  flavonoid  yang  paling tinggi,  dengan  masing-masing  nilai  206,95  mg  TE/g, 219,79  mg  GAE/g  dan  123,86  mg  QE/g.  Polifenol, flavonoid dan DPPH mempunyai korelasi positif yang kuat dalam  proses  peredaman  dan  penangkalan  radikal 12 . Bunga  cengkeh  mengandung  senyawa  bioaktif  yang cukup  tinggi,  yakni  fenol  118,40  mg  GAE/g,  flavonoid 161,67  mg  QE/g 13 .  Komponen  senyawa  yang  paling banyak  ada  pada  cengkeh  adalah  eugenol,  kemudian eugenil  asetat,  β -caryophyllene,  2-heptanone,  etil heksanoat,  humulenol,  α -humulene,  calacorene  dan calamenene 14 .
Kayu  manis  mempunyai  aktivitas  antioksidan, total fenol dan total flavonoid masing-masing 21,21 mg TE/g,  19,05  mg  GAE/g  dan  12,04  mg  QE/g.  Aktivitas antioksidan,  total  fenol  dan  total  flavonoid  adalah 1058,75  mg  TE/100g,  481  mg  GAE/100g  dan  300mg RE/100g 15 .  Kandungan  senyawa  fenolik  dan  flavonoid dalam  kayu  manis  ini  diantaranya  adalah  epicatechin, catechin,  dan  procyanidin  B2.  Senyawa-senyawa  ini mempunyai  kemampuan  untuk  mengikat  senyawa karbonil  reaktif  seperti  methylglyoxal  (MGO)  dan mempunyai kemampuan sebagai antioksidan 16 . Kayu secang mempunyai aktivitas antioksidan, total fenol dan total flavonoid masing-masing 21,16 mg TE/g, 56,12 mg GAE/g dan 22,31 mg QE/g.  Kayu secang mengandung fenol 30,95 mg GAE/g 17 . Golongan senyawa yang  terkandung  dalam  kayu  secang  yakni  senyawa homoisoflavonoid, pewarna merah saponin, tanin, asam
galat dan brazilin 18 . Senyawa bioaktif lain yang terdapat pada  kayu  secang  seperti  fenol,  flavonoid,  tanin,  4- omethylsappannol,  protosappanin  A,  protosappanin  B, protosappanin  E 19,20 .  Secang  dalam  keadaan  tunggal memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  lebih  rendah dibanding yang lainnya 21 . Bahan  utama  yang  digunakan  pada  penelitian ini  yakni  kelopak  rosella  merah  menunjukkan  aktivitas antioksidan,  total  fenol  dan  total  flavonoid  masing- masing 3,98 mg TE/g, 11,56 mg GAE/g dan 5,78 mg QE/g. kelopak rosella merah mengandung fenol 7,63 mg GAE/g, antioksidan  33,98  mg  TE/100g 22 .  Rosella  merupakan sumber  vitamin,  mineral  maupun  senyawa  bioaktif seperti  asam  organik,  fitosterol  dan  polifenol  yang mempunyai  aktivitas  antioksidan.  Senyawa  fenol terbanyak  pada  rosella  didominasi  oleh  antosianin seperti  delphinidin-3-glucoside,  sambubioside,  dan cyanidin-3-sambubioside;  senyawa  flavonoid  lainnya yakni gossypetin, hibiscetin, dan golongan glikosida yakni asam  protocatechuic,  eugenol,  dan    sterol  seperti β - sitoesterol  dan  ergoesterol 23 .  Ekstrak  rosella  merah merupakan  sumber  antioksidan  yang  baik  yang  berasal dari adanya antosianin 2 . Beberapa penelitian menunjukkan  bahwa  ekstrak  rosella  merah  dapat menghambat  infeksi  bakteri  seperti S.  Aureus dan Klebsiella pneumoniae 24 .
Widyaningsih,, et al | Amerta Nutrition Vol. 6 Issue 1 (March 2022). 53-62
Formulasi Wedang Uwuh Berbasis Rosela Merah dengan Mixture Design
Mixture  design merupakan  perangkat  efisien yang  memberikan  kombinasi  formulasi  bahan  terbaik 25 . Optimalisasi  formula  wedang  uwuh  berbasis  rosela
merah menggunakan desain eksperimen mixture deisgn untuk  mendapatkan  respon  aktivitas  antioksidan  DPPH terbaik,  total  fenol  terbaik  dan  total  flavonoid  terbaik. Nilai  variabel  bebas  dan  respon  dari  desain  ini ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Nilai variabel bebas dan respon Mixture Design
Run Secang (g) Kayu Manis (g) Cengkeh (g) Rosela Merah (g) Aktivitas Antioksidan DPPH (mg TE/g) Total Fenol (mg GAE/g) Total Flavonoid (mg QE/g) 1 0,50 0,05 0,05 2,90 25,38 28,57 15,88 2 0,72 0,05 0,04 2,69 27,52 31,30 16,07 3 0,66 0,26 0,06 2,52 31,88 34,89 17,12 4 0,84 0,26 0,06 2,34 31,91 35,00 17,44 5 1,18 0,05 0,07 2,20 29,02 34,76 17,79 6 1,34 0,26 0,04 1,86 32,76 39,43 20,21 7 1,02 0,26 0,04 2,18 29,04 35,17 17,82 8 1,34 0,05 0,04 2,07 32,90 36,94 18,09 9 0,50 0,26 0,04 2,70 26,90 34,80 17,44 10 1,32 0,26 0,07 1,85 36,40 40,39 20,53 11 0,50 0,19 0,07 2,74 24,17 34,58 16,88 12 0,85 0,14 0,04 2,47 26,06 34,38 16,74 13 1,34 0,05 0,04 2,07 33,88 39,56 18,03 14 0,50 0,05 0,05 2,90 25,45 28,55 15,88 15 0,50 0,26 0,04 2,70 26,94 34,82 17,31 16 0,50 0,19 0,07 2,74 27,08 34,71 16,96 17 1,34 0,13 0,06 1,98 35,98 40,33 19,86 18 1,03 0,05 0,07 2,35 27,78 34,40 16,82 19 1,34 0,13 0,06 1,98 36,68 40,39 20,26 20 1,16 0,26 0,07 2,01 36,26 40,04 19,22
Pada Tabel 2 menunjukkan nilai total aktivitas antioksidan  pada  rentang  24,17  hingga  36,68  mg  TE/g, nilai total fenol berada pada rentang 28,55 hingga 40,39 mg GAE/g, dan nilai total flavonoid berada pada rentang 15,88  hingga  20,53  mg  QE/g.  Data  tersebut  juga menunjukkan adanya sinergisme bahan yang digunakan terhadap total aktivitas antioksidan, total fenol dan total flavonoid  jika  dibandingkan  dengan  data  kandungan bahan  baku  ketika  berada  dalam  formulasi  yang  sama dibandingkan ketika terpisah (Tabel 1).
Permodelan  dan  Analisa  Respon  Aktivitas  Antioksidan DPPH
Hasil  analisa  program  terhadap  aktivitas antioksidan DPPH menunjukkan bahwa model ordo yang disarankan  untuk  digunakan  adalah  model  quadratic. ANOVA  untuk  respon  aktivitas  antioksidan  DPPH  dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. ANOVA pada model quadratic total aktivitas antioksidan DPPH
Source Sum of squares df Mean Square F-value p-value Model 317.81 9 35.31 28.46 < 0.0001 Significant ⁽¹⁾Linear Mixture 255.96 3 85.32 68.76 < 0.0001 AB 2.65 1 2.65 2.14 0.1744 AC 23.56 1 23.56 18.98 0.0014 AD 3.16 1 3.16 2.54 0.1418 BC 26.99 1 26.99 21.75 0.0009 BD 1.56 1 1.56 1.26 0.2879 CD 22.93 1 22.93 18.48 0.0016 Residual 12.41 10 1.24 Lack of Fit 7.44 5 1.49 1.5 0.3347 not significant Pure Error 4.97 5 0.9945 Cor Total 330.22 19 R² 0.9624 Adjusted R² 0.9286 Predicted R² 0.8275
Widyaningsih,, et al | Amerta Nutrition Vol. 6 Issue 1 (March 2022). 53-62
Tabel 3. menunjukkan bahwa model quadratic memiliki nilai R 2 yang mendekati 1 yaitu sebesar 0,9624 yang mengindikasikan korelasi yang baik antara nilai uji dan  yang  diperkirakan  oleh  program.  Pemilihan  model berdasarkan sequential  model  sum  of  square menunjukkan  bahwa  model  quadratic  signifikan  untuk dipilih  karena  memiliki  P<0,05.  Pada  pemilihan  model berdasarkan  uji  simpangan  model  ( lack  of  fit ) menunjukkan  P>0,05  yaitu  sebesar  0,3347  yang  berarti ketidaktepatan  model  berpengaruh  nyata  maka pemilihan  model  dianggap  tepat.  Kesesuaian  model tersebut  mengindikasikan  bahwa  model  matematis terhadap  respon  dapat  digunakan  untuk  menjelaskan pengaruh  dari  variabel  bebas  dalam  percobaan  serta memperkirakan formulasi optimium untuk memperoleh nilai  respon  yang  diinginkan 26 .  Interaksi  antara  AC
(secang dan cengkeh), BC (kayu manis dan cengkeh) dan CD  (cengkeh  dan  rosela  merah)  adalah  signifikan (P<0,05),  sedangkan  AB  (secang  dan  kayu  manis),  AD (secang  dan  rosela  merah),  dan  BD  (kayu  manis  dan rosela merah) tidak signifikan (P>0,05). Persamaan akhir untuk memprediksikan aktivitas antioksidan DPPH pada
formulasi  wedang  uwuh  berbasis  rosela  merah  adalah sebagai berikut:
Y antioksidan = 37,33*A + 98,87*B – 13180,28*C + 24,80*D –
107,58*A*B + 13575,37*A*C – 6,54*A*D + 14511,44*B*C – 79,76*B*D + 13431,55*C*D Berdasarkan
persamaan tersebut menunjukkan bahwa koefisien linear (secang, kayu manis dan  rosela  merah)  dan  koefisien  quadratic  (secang  dan cengkeh atau AC, kayu manis dan cengkeh atau BC, serta cengkeh  dan  rosela  merah  atau  CD)  memberikan  efek positif terhadap respon aktivitas antioksidan. Nilai positif pada  persamaan  regresi  mengindikasikan  efek  yang menguntungkan  terhadap  optimasi  karena  sinergis sedangkan  nilai  negatif  mengindikasikan  efek  antagonis antara  faktor  dan  respon 27 .  Efek  terbesar  dalam peningkatan  nilai  aktivitas  antioksidan  adalah  interaksi antara  kayu  manis  dan  cengkeh.  Peningkatan  nilai aktivitas  antioksidan  yang  tinggi  diduga  berasal  dari senyawa epicatechin, catechin, dan procyanidin B2 pada kayu manis 16 .
Gambar 1. Plot Permukaan 3D bahan secang (A), kayu manis (B), dan rosela merah (D) terhadap nilai aktivitas antioksidan DPPH
Gambar 1. menunjukkan 1 dari 4 variabel bebas telah  ditetapkan  yaitu  cengkeh  sebesar  0,07  g  dan  3 lainnya dapat dibandingkan pengaruh interaksinya. Pada plot  permukaan  terlihat  bahwa  semakin  tinggi  secang maka  nilai  aktivitas  antioksidan  semakin  besar. Penurunan nilai aktivitas antioksidan disebabkan karena efek negatif dari interaksi antara secang, kayu manis dan rosela merah.

## Permodelan dan Analisa Respon Total Fenol
Hasil  analisa  program  terhadap  total  fenol menunjukkan bahwa model ordo yang disarankan untuk digunakan adalah model quadratic. ANOVA untuk respon total fenol dapat dilihat pada Tabel 4.
Widyaningsih,, et al | Amerta Nutrition Vol. 6 Issue 1 (March 2022). 53-62
Tabel 4. ANOVA pada model quadratic total fenol
Source Sum of squares df Mean Square F-value p-value Model 237.34 9 26.37 33.11 < 0.0001 significant ⁽¹⁾Linear Mixture 204.3 3 68.1 85.51 < 0.0001 AB 3.42 1 3.42 4.29 0.0651 AC 1.1 1 1.1 1.39 0.2662 AD 7.14 1 7.14 8.96 0.0135 BC 0.7632 1 0.7632 0.9583 0.3507 BD 6.24 1 6.24 7.84 0.0188 CD 1.14 1 1.14 1.43 0.2587 Residual 7.96 10 0.7964 Lack of Fit 4.52 5 0.9048 1.32 0.3855 not significant Pure Error 3.44 5 0.688 Cor Total 245.3 19 R² 0.9675 Adjusted R² 0.9383 Predicted R² 0.8562
Tabel 4 . menunjukkan bahwa model quadratic memiliki nilai R 2 yang mendekati 1 yaitu sebesar 0,9675 yang mengindikasikan korelasi yang baik antara nilai uji dan  yang  diperkirakan  oleh  program.  Pemilihan  model berdasarkan sequential  model  sum  of  square menunjukkan  bahwa  model  quadratic  signifikan  untuk dipilih  karena  memiliki  P<0,05.  Pada  pemilihan  model berdasarkan  uji  simpangan  model  ( lack  of  fit ) menunjukkan  P>0,05  yaitu  sebesar  0,3855  yang  berarti ketidaktepatan  model  berpengaruh  nyata  maka pemilihan  model  dianggap  tepat.  Kesesuaian  model tersebut  mengindikasikan  bahwa  model  matematis terhadap  respon  dapat  digunakan  untuk  menjelaskan pengaruh  dari  variabel  bebas  dalam  percobaan  serta memperkirakan formulasi optimium untuk memperoleh nilai  respon  yang  diinginkan 26 .  Interaksi  antara  AD (secang dan rosela merah) dan BD (kayu manis dan rosela merah) adalah signifikan (P<0,05), sedangkan AB (secang dan  kayu  manis),  AC  (secang  dan  cengkeh),  BC  (kayu manis dan cengkeh), dan CD (cengkeh dan rosela merah) tidak  signifikan  (P>0,05).  Persamaan  akhir  untuk
memprediksikan  total  fenol  pada  formulasi  wedang uwuh berbasis rosela merah adalah sebagai berikut:
Y Total Fenol = 42,66*A – 73,30*B + 2897,81*C + 29,71*D + 122,11*A*B – 2939,61*A*C – 9,84*A*D – 2440,13*B*C +
159,40*B*D – 2997,27*C*D
Berdasarkan
persamaan tersebut menunjukkan  bahwa  koefisien  linear  (secang,  cengkeh dan  rosela  merah)  dan  koefisien  quadratic  (secang  dan kayu manis atau AB, serta kayu manis dan rosela merah atau BD) memberikan efek positif terhadap respon total fenol.  Menurut  Nilai  positif  pada  persamaan  regresi mengindikasikan  efek  yang  menguntungkan  terhadap optimasi  karena  sinergis  sedangkan  nilai  negatif mengindikasikan  efek  antagonis  antara  faktor  dan respon 27 .  Efek  terbesar  dalam  peningkatan  nilai  total fenol  yaitu  pada  cengkeh.  Peningkatan  nilai  total  fenol yang  tinggi  diduga  berasal  dari  senyawa  eugonol  dan turunannya  seperti  eugenil  asetat,  β -caryophyllene,  2- heptanone,  etil  heksanoat,  humulenol,  α -humulene, calacorene dan calamenene yang banyak pada cengkeh 14 .
Gambar 2. Plot Permukaan 3D bahan secang (A), kayu manis (B), dan rosela merah (D) terhadap nilai total fenol
Widyaningsih,, et al | Amerta Nutrition Vol. 6 Issue 1 (March 2022). 53-62
Gambar 2. menunjukkan 1 dari 4 variabel bebas telah  ditetapkan  yaitu  cengkeh  sebesar  0,07  g  dan  3 lainnya dapat dibandingkan pengaruh interaksinya. Pada plot  permukaan  terlihat  bahwa  semakin  tinggi  secang maka  nilai  total  fenol  semakin  besar.  Penurunan  nilai total fenol disebabkan karena efek negatif dari interaksi antara secang, kayu manis dan rosela merah.

## Permodelan dan Analisa Respon Total Flavonoid
Hasil analisa program terhadap total flavonoid menunjukkan bahwa model ordo yang disarankan untuk digunakan adalah model quadratic. ANOVA untuk respon total flavonoid dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5 . ANOVA pada model quadratic total flavonoid
Source Sum of squares df Mean Square F-value p-value Model 40.25 9 4.47 106.24 < 0.0001 significant ⁽¹⁾Linear Mixture 34.46 3 11.49 272.86 < 0.0001 AB 0.4819 1 0.4819 11.45 0.007 AC 0.0463 1 0.0463 1.1 0.3189 AD 4.07 1 4.07 96.58 < 0.0001 BC 0.0397 1 0.0397 0.9439 0.3542 BD 0.6077 1 0.6077 14.44 0.0035 CD 0.0384 1 0.0384 0.9132 0.3618 Residual 0.4209 10 0.0421 Lack of Fit 0.3275 5 0.0655 3.5 0.0975 not significant Pure Error 0.0935 5 0.0187 Cor Total 40.67 19 R² 0.9896 Adjusted R² 0.9803 Predicted R² 0.9484
Tabel 5. menunjukkan bahwa model quadratic memiliki nilai R 2 yang mendekati 1 yaitu sebesar 0,9896 yang mengindikasikan korelasi yang baik antara nilai uji dan  yang  diperkirakan  oleh  program.  Pemilihan  model berdasarkan sequential  model  sum  of  square menunjukkan  bahwa  model  quadratic  signifikan  untuk dipilih  karena  memiliki  P<0,05.  Pada  pemilihan  model berdasarkan  uji  simpangan  model  ( lack  of  fit ) menunjukkan  P>0,05  yaitu  sebesar  0,0655  yang  berarti ketidaktepatan  model  berpengaruh  nyata  maka pemilihan  model  dianggap  tepat.  Kesesuaian  model tersebut  mengindikasikan  bahwa  model  matematis terhadap  respon  dapat  digunakan  untuk  menjelaskan pengaruh  dari  variabel  bebas  dalam  percobaan  serta memperkirakan formulasi optimium untuk memperoleh nilai  respon  yang  diinginkan 26 .  Interaksi  antara  AB (secang dan kayu manis), AD (secang dan rosela merah), dan  BD  (kayu  manis  dan  rosela  merah)  signifikan (P<0,05), sedangkan AC (secang dan cengkeh), BC (kayu manis dan cengkeh) dan CD (cengkeh dan rosela merah) adalah  tidak signifikan  (P>0,05).  Persamaan akhir  untuk memprediksikan total flavonoid pada formulasi wedang uwuh berbasis rosela merah adalah sebagai berikut:
Y Total Flavonoid = 20,24*A – 17,01*B – 529,02*C + 16,01*D +
45,85*A*B + 601,92*A*C – 7,42*A*D + 556,73*B*C + 49,73*B*D + 549,87*C*D
Berdasarkan persamaan tersebut menunjukkan  bahwa  koefisien  linear  (secang,  cengkeh dan  rosela  merah)  dan  koefisien  quadratic  (secang  dan kayu manis atau AB, serta kayu manis dan rosela merah atau BD) memberikan efek positif terhadap respon total fenol.  Menurut  nilai  positif  pada  persamaan  regresi mengindikasikan  efek  yang  menguntungkan  terhadap optimasi  karena  sinergis  sedangkan  nilai  negatif mengindikasikan  efek  antagonis  antara  faktor  dan respon 27 .  Efek  terbesar  dalam  peningkatan  nilai  total flavonoid  yaitu  pada  interaksi  secang  dan  cengkeh. Peningkatan  nilai  total  flavonoid  diduga  berasal  dari senyawa  bioaktif  pada  kayu  secang  seperti  fenol, flavonoid, tanin, 4-omethylsappannol, protosappanin A, protosappanin  B,  protosappanin  E 19 , 20 dan  senyawa eugenol serta turunannya yang banyak pada cengkeh 14 .
Widyaningsih,, et al | Amerta Nutrition Vol. 6 Issue 1 (March 2022). 53-62
Gambar 3. Plot Permukaan 3D bahan secang (A), kayu manis (B), dan rosela merah (D) terhadap nilai total flavonoid
Gambar 3 . menunjukkan 1 dari 4 variabel bebas telah  ditetapkan  yaitu  cengkeh  sebesar  0,07  g  dan  3 lainnya dapat dibandingkan pengaruh interaksinya. Pada plot  permukaan  terlihat  bahwa  semakin  tinggi  secang maka nilai total flavonoid semakin besar. Penurunan nilai total  flavonoid  disebabkan  karena  efek  negatif  dari interaksi antara secang, kayu manis dan rosela merah.

## Optimasi  Formulasi  Wedang  Uwuh  Berbasis  Rosela Merah
Optimalisasi  bertujuan  untuk  memperoleh variabel input terbaik dan mendapatkan respon maksimal dalam  formulasi  wedang  uwuh  berbasis  rosela  merah. Kriteria  formulasi  dan  respon  target  dapat  dilihat  pada Tabel 6.
Tabel 6. Kriteria formulasi dan respon target
Kriteria Target Batas Bawah Batas Atas Kayu Secang is in range 0,5 1,34 Kayu Manis is in range 0,05 0,26 Bunga Cengkeh is in range 0,04 0,07 Kelopak Rosela Merah is in range 1,85 2,9 Aktivitas Antioksidan DPPH maximize 24,1678 36,6807 Total Fenol maximize 28,5549 40,3864 Total Flavonoid maximize 15,88 20,53
Melalui  analisa  statistik  dan desirability maka diperoleh  formulasi  optimal  yang  disarankan  (prediksi dari design expert), selanjutnya dilakukan konfirmasi dan
dibandingkan  dengan  pengujian  yang  sebenarnya. Perbandingan  nilai  prediksi  dan  hasil  verifikasi pengamatan di laboratorium ditampilkan pada Tabel 7.

## Tabel 7 . Solusi titik optimum dan hasil verifikasi
Variabel bebas Respon Kayu Secang (g) Kayu Manis (g) Bunga Cengkeh (g) Kelopak Rosela Merah (g) Aktivitas Antioksidan DPPH (mg TE/g) Total Fenol (mg GAE/g) Total Flavonoid (mg QE/g) Solusi 1,34 0,206 0,063 1,891 36,966 40,998 20,665 Verifikasi 37,007 ±0,0466 40,9542 ±0,0634 19,842 ±0,488 P-Value 0,267 0,354 0,100
Berdasarkan  verifikasi  laboratorium  yang dilakukan  (Tabel  7.)  dengan  menggunakan  formulasi optimal  yang  disarankan Design  Expert ,  diperoleh aktivitas antioksidan 37,007 ± 0,0466 mg TE/g, total fenol 40,9542 ± 0,0634 mg GAE/g, dan total flavonoid 19,842 ± 0,488  mg  QE/g.  Hasil  verifikasi  kemudian  diuji menggunakan  T-test  pada  Minitab  17  dan  diperoleh  P-
value>0,05  yang  menunjukkan  tidak  adanya  perbedaan yang  signifikan  antara  nilai  prediksi  dan  verifikasi pengujian  sebenarnya  terhadap  ketiga  respon  dan kecukupan model reduksi akhir sesuai dengan RSM 28 . Hal tersebut  menjelaskan  bahwa  dengan  formulasi  kayu secang,  kayu  manis,  bunga  cengkeh  dan  kelopak  rosela merah  yang  disarankan  oleh  optimasi mixture  design
Widyaningsih,, et al | Amerta Nutrition Vol. 6 Issue 1 (March 2022). 53-62
pada Design  Expert baik  untuk  diterapkan  pada pembuatan  wedang  uwuh  untuk  memperoleh  respon
aktivitas antioksidan, total fenol dan total flavonoid yang maksimal.
Gambar 4. Grafik kontur plot desirability
Pada Gambar 4 . menampilkan bahwa formulasi wedang  uwuh  berbasis  rosela  merah  yang  optimum ditentukan dari nilai desirability yang paling maksimum. Nilai  tersebut  menunjukkan  kedekatan  respon  dengan nilai idealnya. Nilai desirability pada rancangan ini adalah 1 yang menunjukkan fungsi optimasi program yang baik dan  mampu  memenuhi  tujuan  berdasarkan  kriteria respon yang diharapkan 29 .

## KESIMPULAN
Diperoleh formula solusi titik optimum dengan komposisi serbuk kelopak rosella merah 1,891 gr, serbuk kayu  secang  1,34  gr,  serbuk  kayu  manis  0,206  gr  dan serbuk  bunga  cengkeh  0,063  gr.  Didapatkan  hasil verifikasi uji aktivitas antioksidan DPPH 37,01 ± 0,05 mg TE/g,  total  fenol  40,95  ±  0,06  mg  GAE/g  dan  total flavonoid 19,84 ± 0,49 mg QE/g. Nilai desirability 1 yang berarti fungsi optimasi program baik.

## ACKNOWLEDGEMENT
Peneliti  berterima  kasih  kepada  Fakultas Teknologi  Pertanian  Universitas  Brawijaya  yang  telah memberikan  dana  penelitian  ini  sebagai  bagian  dari Penelitian Hibah Profesor Tahun 2020.

## KONFLIK KEPENTINGAN DAN PENDANAAN
Penulis  tidak  memiliki  konflik  kepentingan dalam  artikel  ini.  Penelitian  ini  didanai  oleh  Fakultas Teknologi  Pertanian  Universitas  Brawijaya  yang  telah memberikan dana penelitian sesuai dengan Pelaksanaan Keputusan Dekan Fakultas Teknologi Pertanian
Universitas  Brawijaya  Nomor  39  Tahun  2020  tentang Penerima Dana Program Hibah Penelitian untuk Profesor dan  Doktor  Fakultas  Teknologi  Pertanian  Universitas Brawijaya Tahun 2020.

## REFERENSI
1. Valavanidis, A. & Haralambous, E. A comparative study  by  electron  paramagnetic  resonance  of free  radical  species  in  the  mainstream  and sidestream smoke of cigarettes with conventional  acetate  filters  and  ‘bio - filters’. Redox Rep. 6 , 161 – 171 (2001).
2.
Ajiboye,  T.  O. et  al. Antioxidant  and  drug detoxification  potentials  of  Hibiscus  sabdariffa anthocyanin  extract. Drug  Chem.  Toxicol. 34 , 109 – 115 (2011).
3. Ulilalbab, A. & Maskanah, E. Mencegah Kenaikan LDL Serum Sprague dawley yang Dipapar Minyak Jelantah dengan Perlakuan Pemberian Seduhan Kelopak Rosella Merah. J. Kedokt. dan Kesehat. 8 , 2 – 4 (2021).
4. Ulilalbab, A. & Maskanah, E. Pemberian Serbuk Kelopak  Rosella  Merah  yang  Diseduh  Mampu Mencegah Penurunan HDL Pada Sprague dawley yang  Dipapar  Jelantah. J.  Ilmu  Kefarmasian Indones. 19 , 262 – 265 (2021).
5. Ulilalbab,  A.,  Wirjatmadi,  B.  &  Adriani,  M. Ekstrak  Kelopak  Rosella  Merah  Mencegah Kenaikan  Malondialdehid  Tikus  Wistar  yang Dipapar  Asap  Rokok. J.  Ilmu  Kefarmasian Indones. 13 , 215 – 220 (2015).
6. Ulilalbab,  A.  &  Maskanah,  E.  Red  Rosella (Hibiscus sabdariffa Linn.) Petal Brew is Able to Reduce  the  Sprague  Dawley  MDA  Rate  in  Rats Exposed  to  Waste  Cooking  Oil. Folia  Medica Indones. 54 , 167 (2018).
7. Ulilalbab,  A.,  Wirjadmadi,  B.  &  Adriani,  M. Ekstrak  Kelopak  Rosella  Merah  (Hibiscus sabdariffa Linn.) Mampu Memperbaiki Histopatologi  Hepar  Tikus  Wistar  yang  Diberi
Paparan Asap Rokok. J. Kesehat. Andalas 6 , 696 (2018).
8.
Septian Emma Dwi Jatmika, Kintoko, K. I. Inovasi
Widyaningsih,, et al | Amerta Nutrition Vol. 6 Issue 1 (March 2022). 53-62
Wedang  Uwuh  Yang  Memiliki  Khasiat  Untuk Penderita  Hipertensi  Dan  Diabetes  Melitus. J. Ris. Drh. 55 – 71 (2017).
9. BPOM.  Peraturan  Kepala  BPOM  RI  nomor  HK 00.05.52.0685. Peratur. Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indones.
1 – 13 (2005).
10. Thaipong,  K.,  Boonprakob,  U.,  Crosby,  K., Cisneros-Zevallos,  L.  &  Hawkins  Byrne,  D. Comparison  of  ABTS,  DPPH,  FRAP,  and  ORAC assays  for  estimating  antioxidant  activity  from guava  fruit  extracts. J.  Food  Compos.  Anal. 19 , 669 – 675 (2006).
11. Veena  Sharma,  R.  P.  Available  Online  Through Phytochemical  Analysis  and  Evaluation  Of Antioxidant Activities Of Hydro-Ethanolic Extract Of Moringa oleifera Lam. Pods. J. Pharm. Res. 4 ,
2 – 5 (2011).
12. Afroz, R. et al. DNA Damage Inhibition Properties of  Sundarban  Honey  and  its  Phenolic Composition. J.  Food  Biochem. 40 ,  436 – 445 (2016).
13. Adaramola,  B.  &  Onigbinde,  A.  Effect  of Extraction  Solvent  on  the  Phenolic  Content, Flavonoid  Content  and  Antioxidant  Capacity  Of Clove  Bud  Organic  /Analytical  Chemistry  View project  Food  Chemistry  View  project  Effect  of Extraction  Solvent  on  the  Phenolic  Content, Flavonoid  Content  an. IOSR  J.  Pharm.  Biol.  Sci.
11 , 33 – 38 (2016).
14. Chaieb,  K. et  al. Antioxidant  properties  of  the essential  oil  of  Eugenia  caryophyllata  and  its antifungal  activity  against  a  large  number  of clinical  Candida  species. Mycoses 50 ,  403 – 406
(2007).
15. Khristi,  V.,  Elias,  J.,  Dave,  N.  &  Patel,  V.  Gene Expression Analysis of Anti-oxidative Enzymes in Yeast  against  Oxidative  Stress  in  Presence  of Cinnamomum  zeylanicum. Res.  J.  Pharm.  Biol. Chem. Sci. 5 , 1387 – 1396 (2014).
16. Rao, P. V. & Gan, S. H. Cinnamon: A multifaceted medicinal  plant. Evidence-based  Complement. Altern. Med. 2014 , (2014).
17. Neswati, N. & Ismanto, S. D. Ekstraksi Komponen Bioaktif  Serbuk  Kayu  Secang  (Caesalpinia sappan,  L)  dengan  Metode  Ultrasonikasi. J. Teknol. Pertan. Andalas 22 , 187 – 194 (2018).
18. Yemirta.  Identifikasi  Kandungan  Senyawa
Antioksidan  dalam  Kayu  Secang  (Caesalpinia sappan). J. Kim. dan Kemasan 32 , 41 – 46 (2010).
19. Kimestri,  A.  B.,  Indratiningsih  &  Widodo. Microbiological  and  physicochemical  quality  of pasteurized  milk  supplemented  with  sappan wood  extract  (Caesalpinia  sappan  L.). Int.  Food Res. J. 25 , 392 – 398 (2018).
20. Nadu,  T.  in  Vitro  Study  on  Antioxidant  Activity and  Phytochemical  Analysis  of  Caesalpinia Sappan. Int. J. Institutional Pharm. Life Sci. 1 , 31 – 39 (2011).
21. Miksusanti,  Elfita  &  Hotdelina,  S.  Aktivitas Antioksidan  dan  Sifat  Kestabilan  Warna Campuran Ekstrak Etil Asetat Kulit Buah Manggis (Garcinia  mangostana  L.)  dan  Kayu  Secang (Caesalpinia sappan L.). J. Penelit. Sains 15 , 60 – 69 (2012).
22. Wu,  H.,  Yang,  K.  &  Chiang,  P.  Roselle Anthocyanins :  Antioxidant  Properties  and Stability to Heat and pH. 23 , 1 – 15 (2018).
23. Al-hashimi,  A.  G.  Antioxidant  and  antibacterial activities  of  Hibiscus  sabdariffa  L.  extracts. African J. Food Sci. 6 , 506 – 511 (2012).
24. Liu,  K.,  Tsao,  S.  &  Yin,  M.  In Vitro  Antibacterial Activity  of  Roselle  Calyx  and  Protocatechuic Acid. Phyther. Res. 19 , 942 – 945 (2005).
25. Bono,  A.,  Sarbatly,  R.,  Kaluvan,  S.,  Rajin,  M.  & Krishnaiah, D. Effect of mixture components on the properties of MUF resin. Int. J. Phys. Sci. 3 , 045 – 049 (2008).
26. Borhan, F. P., Abd Gani, S. S. & Shamsuddin, R. The  use  of  D-optimal  mixture  design  in optimising  okara  soap  formulation  for  stratum corneum application. Sci. World J. 2014 , (2014).
27. Woitiski, C. B., Veiga, F., Ribeiro, A. & Neufeld, R. Design  for  optimization  of  nanoparticles integrating biomaterials for orally dosed insulin. Eur. J. Pharm. Biopharm. 73 , 25 – 33 (2009).
28. Mirhosseini, H., Tan, C. P., Taherian, A. R. & Boo, H.  C.  Modeling  the  physicochemical  properties of orange beverage emulsion as function of main emulsion  components  using  response  surface methodology. Carbohydr.  Polym. 75 ,  512 – 520 (2009).
29. Raissi,  S.  &  Farsani,  R.  E.  Statistical  process optimization  Through  multi-response  surface methodology. World Acad. Sci. Eng. Technol. 39 , 280 – 284 (2009).