Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 223-231 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
PENGARUH GUGUS FUNGSI CINCIN PIRIDIN, BENZEN, DAN ATOM NITROGEN PADA CINCIN PIRIDIN TERHADAP PENURUNAN KADAR PLASMA PIRIDOKSIN TIKUS WISTAR
Hafrizal Riza 1 *, Jordi Buannata 1
1 Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura
*Email: hafrizal.riza@pharm.untan.ac.id
Artikel diterima: 22 Januari 2022; Disetujui: 1 Oktober 2022 DOI: https://doi.org/10.36387/jiis.v7i2.873

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui peta gugus fungsi isoniazid yang memiliki  afinitas  terhadap  enzim  penyebab  neuropati  pada  gugus  fungsi  cincin piridin. Melalui studi ini akan diketahui apakah ada pengaruh atom N pada cincin piridin,  dan  struktur  cincin  benzen  dari  isoniazid  terhadap  enzim  piridoksal fosfokinase.  Karena  itu  isoniazid  diuji  dalam  bentuk  struktur  senyawa benzohydrazide, butyrohydrazide dan formohydrazide, selain kontrol isoniazid. Uji dilakukan  pada  tikus  coba  untuk  melihat  efek  pengaruh  perubahan  gugus  fungsi terhadap penurunan afinitas pada reseptor enzim piridoksal fosfokinase yang dapat ditunjukkan  dengan  penurunan  kadar  piridoksin  aktif  dalam  darah  tikus.  Ketiga struktur  senyawa  kemudian  dilihat  interaksinya  terhadap  enzim  piridoksal fosfokinase  melalui  pengaruhnya  terhadap  peningkatan  kadar  piridoksal  5  fosfat yang merupakan bentuk aktif dari piridoksin, menggunakan metode Spektroskopi Ultraviolet-Visibel. Hasil uji spektroskopi ultra violet visible menunjukkan kadar piridoksin  aktif  tikus  kelompok  pemberian  isoniazid,  benzohidrazid  (isoniazid tanpa  atom  N  dalam  gugus  fungsi  benzen)  dan  formohidrazid  (isoniazid  tanpa gugus fungsi benzene) dan kelompok kontrol negatif (tanpa pemberian obat) secara berturut - turut adalah 160.259, 120.548, 107.086 dan 104.490. Berdasarkan hasil disimpulkan  atom  N  dalam  gugus  fungsi  benzen  dan  gugus  fungsi  benzen merupakan gugus farmakofor  isoniazid yang berkontribusi pada interaksi dengan enzim piridoksin fosfokinase.
Kata kunci: Piridoksin plasma, Isoniazid, Benzohydrazide, Formohydrazide

## ABSTRACT
This  study  was  purposed  to  determine  the  map  of  functional  groups  of isoniazid that have an affinity for neuropathy-causing enzymes in the pyridine ring functional group. Through this study, it will be known whether there is an effect of the N atom on the pyridine ring, and the structure of the benzene ring. Therefore, Isoniazid  was  tested  in  the  three  structures,  namely  benzohydrazide, butyrohydrazide,  formohydrazide,  and  also  isoniazid  control.  These  Three chemical  structure  were  tested  for  their  effect  on  the  inhibition  of  the  pyridoxal phosphokinase  enzyme  in  experimental  rats  that  showed  the  effect  of  changing functional groups on decreasing affinity for the pyridoxal phosphokinase enzyme
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 223-231 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
receptor which can be indicated by a decrease in active pyridoxine, levels in the blood mouse. The three compound structures were examined for their interactions with the pyridoxal phosphokinase enzyme through their effect on increasing levels of  pyridoxal  5  phosphate  which  is  the  active  form  of  pyridoxine,  using  the Ultraviolet-Visible  Spectroscopy  method.  The  results  of  the  ultraviolet-visible spectroscopy test showed that the active pyridoxine levels of rats in the isoniazid, benzohydrazid,  and  formohydrazid  groups  and  the  negative  control  group  were 160,259, 120,548, 107,086 and 104,490, respectively. Based on the results, it was concluded that benzohydrazide and formohydrazide did not have a pharmacophore group against the pyridoxine phosphokinase enzyme.
Keywords: Plasma pyridoxine , Isoniazid, Benzohydrazide, Formohydrazide

## PENDAHULUAN
Obat isoniazid merupakan
salah satu  obat  antibiotik  yang
menjadi pemilihan terapi TBC
(Kautsar  dan  Intani,  2016).  Di Indonesia,  isoniazid  masih  menjadi standar  terapi  TBC  (Kautsar  dan Intani,  2016) (Suarayasa.,dkk,  2019). Obat ini digunakan secara kombinasi dengan obat golongan lainnya karena mengantisipasi potensi resistensi bakteri  dan  efektivitas  terapi.  Obat isoniazid  merupakan  prodrug  yang memiliki  nekanisme  molekuler  pada penghambatan  dinding  sel  bakteri. Sebagai prodrug, isoniazid diaktivasi oleh  enzim  katalase-  peroksidase bakteri, KatG, menjadi bentuk senyawa radikal asil nikotinat.
Radikal  ini  akan  berikatan  dengan NADH  membentuk  senyawa  NAD nikotinoil  yangs  selanjutnya  berlaku
sebagai analog substrat enzim pembangun  dinding  sel  (Sing, et al.,
2008).
Penggunaan berulang obat isoniazid menimbulkan efek samping neuropati, gangguan saraf. Penggunaan  isoniazid  membutuhkan pemberian  piridoksin,  vitamin  C (Zaoui,  et  al.,  2012).  Penggunaan isoniazid  100  mg  dibutuhkan  10  mg piridoksin  (Mandel,  1957).  Efek samping  ini  terjadi  karena  obat isoniazid  memiliki  afinitas  terhadap enzim  piridoksal  fosfokinase  selain afinitasnya  terhadap  enzim  KatG pada  penghambatan  dinding  sel bakteri. Dalam hal ini, obat isonaizid berlaku  sebagai  multisubstrat  analog seperti yang terjadi pada obat PALA (N-phosphonoacetil-L-aspartate) sebagai antitumor (Silverman, 2004).
Upaya  yang  dapat  dilakukan
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 223-231 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
adalah  memodifikasi  gugus  fungsi
senyawa obat yang dapat menurunkan  afinitas  senyawa  obat terhadap enzim target yang bertanggungjawab pada efek samping seperti  modifikasi  pada  senyawa captopril  pada  gugus  sulfihidril  agar mengurangi  interaksi  gugus  ini dengan ion Zn pada enzim
(Silverman, 2004). Penelitian in silico yang dilakukan oleh Rida pada tahun 2019  menunjukkan  adanya  afinitas dengan energi gibbs yang mendukung dan  interaksi  antara  residu  asam amino  enzim  piridoksal  fosfokinase. Penelitian ini mengidentifikasi gugus-gugus  fungsi  dari  isoniazid yang  memiliki  afinitas  terhadap reseptor  enzim  KatG  dan  reseptor enzim  piridoksal  fosfokinase.  Hasil penelitian  ini  menunjukkan  bahwa pengurangan  struktur  cincin  Piridin akan  menurunkan  afinitas  terbanyak yang signifikan baik isoniazid
terhadap enzim yang bertanggungjawab pada  aktivitas TBC  maupun  pada  enzim  yang bertanggungjawab  pada  neuropati. Hal  ini  disebabkan  interaksi  yang terjadi  didominasi  interaksi  van  der wals  antara  isoniazid  dengan  residu
asam  amino  kedua  enzim.  Beberapa gugus  yang  melekat  kepada  cincin Piridin seperti karboksil tidak memberikan  kontribusi  afinitas  yang siginifikan  kepada  aktivitas  maupun efek  samping  yang  menunjukkan adanya  kontribusi  ikatan  hidrogen aseptor maupun donor.
Melalui  studi  ini  diharapkan dengan  perbedaan  afinitas  maka isoniazid  lebih  kuat  kecenderungan berinteraksi  dengan  enizm  KatG dibanding enzim priridoksal fosfokinase  dan  efek  samping  hanya dapat  tercapai  jika  semua  reseptor KatG  sudah  penuh  ditempati  oleh isoniazid (Silverman, 2004). Penelitian  yang  dilakukan  oleh Hafrizal Riza pada tahun 2021 untuk memastikan  secara in  vivo  pengaruh substituen piridin menunjukkan hasil bahwa  struktur  asam  4  piridin karboksilat, piridin aldehid dan metil piridin tidak memiliki afinitas sekuat isoniazid  terhadap  enzim  piridoksin fosfokinase  sebagai  substrat  analog. Gugus  fungsi  hidrazin  dan  karboksil memiliki peranan afinitas yang besar terhadap  enzim  yang  menentukan efek neuropati perifer (Timmins.,dkk, 2004).
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 223-231 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
Saat  ini  penelitian  modifikasi struktur  kimia  senyawa  isoniazid bertujuan mengatasi resistensi isoniazid dalam terapi TBC.
Penelitian mekanisme isoniazid dilakukan  oleh  Rozswarki  untuk melihat mekanisme aksi pada reseptor Mycobacterium tuberculosis yang  menunjukkan  adanya  ikatan kovalen dan cincin nikotinamid yang bertanggungjawab  pada  aksi  obat (Rozwarski,  et  al.,  1998).  Penelitian yang  dilakukan  Dragostin  mencari modifikasi isoniazid untuk mengatasi efek  samping  hepatotoksik  isoniazid (Dragostin,  et  al.,  2019).  Namun, belum ada peneltiian yang dilakukan untuk mengatasi efek samping neuropati yang juga dapat mempengaruhi kepatuhan pasien.
Pada  penelitian  ini,  peneliti akan  melakukan  studi  lanjut  untuk mengetahui  peta  gugus  fungsi  yang memiliki  afinitas  terhadap  enzim penyebab  neuropati  pada  gugus fungsi cincin piridin setelah
penelitian sebelumnya
pada substituen  cincin  piridin.  Melalui studi  ini  akan  diketahui  apakah  ada pengaruh atom N pada cincin piridin, dan  struktur  cincin  benzen.  Karena
itu ketiga struktur berupa
benzohydrazide, butyrohydrazide dan formohydrazide dan kontrol isoniazid akan diuji pengaruhnya pada penghambatan terhadap enzim piridoksal  fosfokinase  pada  tikus coba  untuk  melihat  efek  pengaruh perubahan  gugus  fungsi  terhadap penurunan  afinitas  pada  reseptor enzim  piridoksal  fosfokinase  yang dapat ditunjukkan dengan penurunan kadar  piridoksin  aktif  dalam  darah tikus (Pedersen and Myers, 2011).

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini menggunakan Pre and  posttest  only  control  group design yaitu  eksperimen  perlakuan dengan  membandingkan  isoniazid sebelum dimodifikasi sebagai kontrol dibandingkan  dengan  isoniazid  yang sudah   dieliminasi   beberapa   gugus fungsi   terhadap   penurunan   kadar piridoksin plasma sehingga diketahui pengaruh gugus fungsi yang menentukan penurunan kadar piridoksin  plasma,  serta  melihat perbedaan pengaruh penurunan piridoksin  dalam  plasma darah sebelum senyawa isoniazid diberikan dan  setelahnya sebagai  kontrol
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 223-231 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
keberhasilan  perlakuan  dan  sebelum dengan sesudah pemberian   senyawa modifikasi   untuk   mengetahui   ada tidaknya      pengaruh  pemberian modifikasi senyawa.
Pengelompokan  dan  perlakuan hewan  uji  menggunakan  Rancangan Acak Lengkap, tikus dibagi menjadi 4 kelompok  dengan  5  ekor  tiap kelompok  uji.  Hewan  uji  sebelum pengujian  di  aklimatisasi  dengan ditempatkan dengan di ruang berventilasi  cukup  dengan  suhu ruangan  25 0 C  dalam  kandang  dan pakan  dan  minum  yang  memenuhi standar  secara  ad  libitum  selama  1 minggu  (Sposito  dan  Santos,  2011). Besar  sampel  pada  penelitian  ini mengacu  pada  rumus  Federer  ( 𝑡 −
1)( 𝑟 − 1) ≥ 15.
Pembagian
kelompok perlakuan sebagai berikut: Kelompok 1  kontrol  positif  (Isoniazid  5,4 mg/200gBB);  Kelompok  2  (asam  4 karboksil  piridin  5,4  mg/200gBB); Kelompok  3  (piridin  aldehid  5,4 mg/200gBB);  Kelompok  4  (metil piridin 5,4mg/200gBB).

## Teknik Pengumpulan Data
Pengumpulan  data  dilakukan dengan mengambil darah dan dibaca
pada  spektroskopi Ultra  Violet dan Visible (Edwards, et al., 1989; Soda, et al., 1969; Bartzatt, et al., 2011) .
Darah  tiap  kelompok  tikus diambil  pada  vena  mata  (sinus orbitalis) dan disentrifugasi (10,000 × g) selama 5 menit untuk mendapatkan eritrosit.  30µl  eritrosit  ditambahkan dengan  30µl  larutan  0.85%  (w/v) NaCl  1.  14  ml  0.025%  (w/v)  larutan saponin.  Larutan  diinkubasi  pada 25°C selama 30 menit dan kemudian disentrifugasi  (1000  ×  g)  untuk memisahkan  sel  debris  sehingga diperoleh  supernatan.  Supernatan disimpan  dengan  sealing  tutup  dan alumunium  foil  pada  suhu  -800C. (Bailey A, et al., 1999).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengujian pengaruh isoniazid, benzohydrazide dan formohydrazide pada penurunan kadar  piridoksin  dalam  tikus  yang dapat menyebabkan neuropati, dilakukan  melalui  uji  spektroskopi
Ultraviolet Visibel. Identifikasi
dilakukan panjang gelombang
maksimal yaitu 220 nm.
Untuk menghitung kadar piridoksin  aktif  dalam  darah  tikus
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 223-231 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
maka  dilakukan  pengukuran  kurva baku  pada larutan  seri  kadar. Melalui kurva baku  diperoleh hubungan  absorban  seri  baku  dari seri kadar.
Tabel 1. Pengukuran Pembuatan Kurva Baku No. Kadar Baku (ppm) Absorban R Persamaan kurva 1. 50 1,579 0,9607 y = 0.0312x - 0.0991 2. 40 1,069 3. 30 0,718 4. 20 0,534
5. 10 0,286
Gambar 1. Hubungan seri kadar pada absorban kurva baku Piridoksin Aktif Tabel  dan  Gambar  di  atas menunjukkan bahwa
terdapat
hubungan  yang  proporsional  dari peningkatan  kadar  baku  terhadap peningkatan  nilai  absorban.  Seri kadar  baku  yang  dibuat  dengan rentang  nilai  yang  sebanding  antar kadar  baku  dapat  menghasilkan rentang  yang  proporsional  dari  nilai absorban.  Ini  menunjukkan  bahwa
metode  pengukuran  yang  meliputi cara  kerja,  langkah  pelaksanaan analis  dan kinerja alat  sudah menunjukkan  kondisi  yang  optimal dalam menghasilkan hasil pengukuran  yang  mendekati  nilai sebenarnya. Hal ini dapat menunjukkan metode memiliki validitas  yang  baik  sehingga  dapat menghasilkan pengukuran  kadar piridoksin  aktif  dalam  darah  tikus mendekati hasil sebenarnya.
Tabel 2. Hasil kadar piridoksin dalam darah Sampel Rerata Absorban Kadar (ppm) piridoksin aktif Isoniazid 2,7 ppm (kontrol positif) 0,581 21,538 Benzohydrazide 2,7 ppm, 0,372 14,840 Formohydrazide 2,7 ppm 0,346 14,006 Tanpa   sampel (kontrol negatif) 0,875 30,962
Gambar 2. Hubungan modifikasi struktur senyawa Isoniazid terhadap piridoksin aktif
Tabel  2  menunjukkan  bahwa kadar  piridoksin  aktif  pada  darah kelompok  tikus  yang  mendapat
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 223-231 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
pemberian  isoniazid  ada  pada  level lebih  rendah  dari  pada  kelompok tikus kontrol negatif tanpa pemberian isoniazid. Sedangkan kadar piridoksin  aktif  pada  darah  tikus kelompok benzohidrazid terlihat lebih  rendah dibanding kontrol negatif. Kadar  piridoksin  aktif  pada kelompok  tikus  dengan  pemberian formohidrazid  ada  pada  kadar  yang lebih  rendah  dari  pada  kelompok tikus  kontrol  negatif.  Hal  ini  dapat disebabkan adanya mekanisme afinitas  isoniazid  terhadap  aktivitas enzim dalam
memproduksi piridoksin  aktif  sehingga  kadar piridoksin  aktif  menurun.  Hal  yang sama berlaku pada benzohidrazid  dan formohidrazid  yang  menunjukkan adanya  afinitas  keduanya  terhadap enzim. Struktur isoniazid dan keduanya  memiliki  afinitas  yang tinggi terhadap enzim sehingga dapat berikatan dengan enzim dalam memproduksi bentuk aktif piridoksin. Melalui  gambar  2  terlihat  kadar piridoksin  aktif  yang  lebih  rendah pada struktur senyawa formohidrazid dan  benzohidrazid  dari  pada  kontrol negatif  yang  menunjukkan  kedua struktur  memiliki  afinitas  terhadap
enzim.  Hal  ini  berarti  cincin  piridin memiliki  pengaruh  pada  afinitas isoniazid  terhadap  enzim.  Cincin piridin  memiliki  gugus  kromofor terhadap efek samping isoniazid.
Hasil  penelitian  ini  sesuai dengan penelitian studi in silico yang dilakukan  oleh  Rida  Resta  Dewi tahun  2019  bahwa  tidak  terdapat penurunan  bermakna  pada  afinitas isoniazid  terhadap  enzim  akibat dimodifikasi  pada  struktur  cincin piridin (Rida, et al ., 2019).
Penelitian  ini  memiliki  kurva baku  dengan  r  =  0,960.  Nilai  ini mendekati angka 1 sehingga menunjukkan  metode  yang  terdiri dari  alat,  penggunaan  bahan  dan kadarnya  serta  cara  kerja  peneliti memberikan  prosedur  yang  sesuai. Hal ini ditunjukkan dengan proporsionalitas ukuran yang semakin  meningkatnya  kadar  baku semakin  tinggi  absorbansinya.  Hasil menunjukkan pengukuran yang benar karena  tikus kelompok kontrol negatif  yang  tidak  diberikan  sampel memiliki kadar piridoksin yang tidak sama  dengan  kelompok  kontrol positif  yang  diberikan  isoniazid. Kontrol positif isoniazid  dapat
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 223-231 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
meningkatkan  kadar piridoksin  tikus karena  isoniazid  terbukti  memiliki afinitas yang kuat terhadap enzim.

## KESIMPULAN
Struktur  cincin  piridin  tidak memiliki  afinitas  sekuat  isoniazid terhadap
enzim
piridoksin fosfokinase.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  ucapkan  kepada
Fakultas Kedokteran Universitas Tanjungpura Pontianak atas dukungan dana yang diberikan untuk
menuntaskan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Bailey  A  L,  Wright  A  J  A  and
Southon S, 1999, High performance liquid chromatography  method  for the determination of pyridoxal-5- phosphate in human plasma: How appropriate  are  cut-off  values for  vitamin  B6  de®ciency?, European  Journal  of  Clinical
Nutrition , Vol. 53, p.448-455.
Bartzatt  R,  Gajmer  P,  Nguyen M  H
C  and  Tran  A  M,  2016, Detection and Assay of
Vitamin B6 (Pyridoxine Hydrochloride) Utilizing Isocratic  High  Performance Liquid Chromatography, Journal  of  Scientific Research & Reports , Vol. 12, No. 3, p. 1-
12.
Dragostin I 1, Dragostin O M, Samal
S K, Dash  S, Tatia R, Dragan M, Confederat L, et al., 2019, New isoniazid derivatives with improved pharmaco- toxicological profile: Obtaining, characterization and  biological evaluation,  Eur J  Pharm  Sci,  Vol.  137, p.104974. Edwards  P,  Liu  P  K  S,  Rose  G  A, 1989, Determination of plasma pyridoxal  phosphate  levels using a modified apotryptophanase  assay,  Ann Clin Biochem, Vol. 26, p. 158-
163.
Mandel W M D, 1959, Pyridoxine and the Isoniazid-Induced Neuropathy, Chest Journal, Vol. 36, Issue 3, p. 293–296. Pedersen F S and Myers M A, 2011, Understanding the principle of organic chemistry, a laboratory  course ,  Balmont;
Brooks Cole, engage learning.
Rida R D, Hafrizal R, Inarah F, 2019, Virtual  Screening  Struktur Modifikasi  Isoniazid  terhadap Enzim  Katalase  Peroxidase menggunakan Metode Docking, Jurnal Untan.
Rozwarski 1 D A, Grant G A, Barton D H, Jacobs  W R, Sacchettini J C, 1998, Modification of the NADH  of  the  isoniazid  target (InhA)  from  Mycobacterium tuberculosis, Science Vol. 279, No. 5347, p98-102.
Silverman  B  R,  2004, The  organic chemistry  of  drug  design  and
drug  action,  second  edition ,
California;  Elsevier,  p.173-
262.
Soda  K,  Yorifuji  T,  Misono  H  and Moriguchi M, 1969, Spectrophotometric determination of pyridoxal and pyridoxal 5’-phosphate with 3- methyl-2-benzothiazolone hydrazine  hydrochloride,  and their selective assay, Biochem.
J, Vol. 114, p. 629-633. Sposito dan Santos, 2011,
Histochemical  Study  of  Early
Embryo  Implantation  in  Rats,
Int. J. Morphol , Vol. 29, No.1, p. 187-192.
Timmins  G  S,  Master  S,  Rusnak  F,
Deretic  V,  2004,  Nitric  oxide generated from isoniazid activation  by  KatG:  source  of nitric oxide and activity against Mycobacterium tuberculosis, Antimicrob. Agents  Chemother ,  Vol.  48,
p.3006-3009.
Zaoui A A, Abdelghani, Salem B H,
Ouanes W,  Hayouni A, Khachnaoui  F., et  al ,  2012,
Early-onset  severe  isoniazid- induced
motordominant neuropathy:  a  case  report , Eastern Mediterranean Health
Journal ,  Vol.18,  No.3,  p.298- 299.