## IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN TOLL-LIKE RECEPTOR-4 PADA AYAM TOLAKI,  AYAM PETELUR KOMERSIAL DAN AYAM BROILER
Niken Ulupi 1* dan Muhammad Amrullah Pagala 2
1) Departemen IPTP, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Jurusan Peternakan, Fakultas Peternakan, Universitas Halu Oleo, Kendari e-mail : niken.ulupi@gmail.com

## ABSTRAK
Gen  Toll-like  Receptor  4  (TLR4)  adalah  salah  satu  gen  yang  mengontrol ketahanan ayam terhadap serangan Salmonella sp, melalui respon  immun non-specific. Gen ini dapat digunakan sebagai marka genetik pada ayam.  Oleh karena itu penelitian ini  bertujuan  mengevaluasi  polimorfisme  genetik  gen  TLR4 pada beberapa  jenis  ayam (Ayam Tolaki, Ayam Ras pedaging dan petelur). Total sampel sebanyak 126. Penelitian ini melalui 3 tahapan  yakni ekstraksi DNA, amplifikasi PCR (dengan ukuran DNA 220 pb  pada  ekson  2),  dan  metode  RFLP  menggunakan    enzim Msc I.    Hasil  penelitian menunjukkan gen TLR4 | Msc I bersifat polimorfik pada semua jenis ayam. Diperoleh 2 alel  (A  dan  G).  Frekuensi  alel  G  (membawa  sfat  resisten)  pada  ayam  Tolaki,  Ras pedaging,  dan  petelur  masing-masing  0.77,  0.87  dan  0.20.  Nilai x 2 menunjukkan genTLR4| Msc I  berada  dalan  keseimbangan  Hardy-Weinberg  dengan  Ho  dan  He  0,31 dan 0,29. Nilai PIC 0,25 termasuk kategori medium. Gen TLR4| Msc I dapat digunakan sebagai marka genetik sifat ketahanan ayam Tolaki terhadap infeksi Salmonellasp.
Kata Kunci : Polimorfik, Gen TLR4, Salmonella sp., Non-Specific Immune Response

## ABSTRACT
Toll-like  Receptor  4  (TLR4)  gene  is  one  ofthe  genesthat  controlresistance  of chickens  against Salmonella  sp .  Through  non-specific  immune  response.  These  gene can be used asgenetic marker sinchickens, if known its diversity.Therefore this research was  aimed  at  evaluating  the  genetic  polymorphism  of  TLR4  gene  in  several  types  of chickens  (Tolaki  chicken,  broiler  chicken  and  commercial  laying  hen).  The  total  of samples were 126. Therewere three stages of identification : extraction of DNA genom, PCR amplification of TLR4 gene (with size 220 bp on exon 2), and RFLP method using restriction enzym ( Msc I).The data were analyzed include frequency of allele, frequency of  genotype,  heterozygosity  values,  and  value  of  Polymorphic  Informative  Content (PIC).  The  results  showed  that  TLR4| Msc I  was  found  polymorphic  in  all  kind  of chickens  that  was  genotyped.  It  were  found  two  alleles    (A  and  G).  Frequency  of  G allele  (carrier  of    resistantcharacter)  on  Tolaki  chickens,  broilers  and  laying  hens  were 0.77, 0.87  and 0.20. The  value of x 2 showed that  TLR4| Msc I  in Tolaki chicken was  in Hardy-Weinberg equilibrium, with Ho and He value were 0. 31 and 0.29. The PIC value of  TLR4  gene  of  Tolaki  chicken  (0.25)  included  in  the  category  of  medium.  These results  declared  that  TLR4| Msc I  gave  hopefor used  as  genetic  marker  sin  resistance  to Salmonella sp . infection in Tolaki chickens.
Keywords : Polimorphism, TLR4 gene, Salmonella sp., non-specific immune response

## PENDAHULUAN
Ayam  lokal  Indonesia  memiliki banyak keragaman, dengan karakteristik morfologis  yang  berbeda.  Ayam  lokal ini merupakan aset yang berharga dalam pembentukan bibit unggul, karena ayam lokal terbukti mampu beradaptasi
dengan baik terhadap lingkungan setempat  (Nataamijaya  2010).  Ayam lokal memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai penghasil daging,  penghasil  telur,  sebagai  hobi, atau  dikembangkan  untuk  memenuhi fungsi  sosial  budaya  yang  berlaku  di berbagai  wilayah di Indonesia.
Ayam  lokal  ini  ada  yang  spesifik dan  yang  tidak  spesifik.  Ayam  lokal yang  tidak  spesifik  adalah  ayam  lokal yang  tidak  mempunyai  ciri  atau karakteristik  yang  khusus  dan  tersebar diseluruh  wilayah  Indonesia.  Adapun ayam  lokal  yang  spesifik  adalah  ayam lokal  yang  mempunyai  ciri  khas  dan hanya  ditemukan  serta  berkembang  di wilayah tertentu.
Salah  satu  ayam  lokal  yang spesifik  adalah  ayam  Tolaki.  Ayam  ini berkembang  di  Kabupaten  Konawe  dan Konawe  Selatan,  Propinsi  Sulawesi Tenggara.  Ciri  khas  yang  dimiliki  oleh ayam  Tolaki  adalah  berbobot  badan kecil,  tangkas  dan  agresif  (Sulandari et al ., 2007). Ayam ini mampu menghasilkan produksi telur diatas rata- rata  ayam  lokal  yang  lain,  yaitu  sekitas 20  butir  per  periode  bertelur  (Pagala, 2014). Daging ayam Tolaki mempunyai rasa  yang  lebih  lezat  dari  pada  ayam lokal  Indonesia  yang  lain.  Oleh  sebab itu  ayam  ini  sangat  diminati  dan  diburu oleh masyarakat.
Telur  ayam  Tolaki,  sebagaimana telur  ayam  lokal  yang  lain,  sebagian besar  dimanfaatkan  oleh  masyarakat setempat  sebagai  jamu,  dan  dikonsumsi secara langsung tanpa melalui pemasakan. Sebesar 44% kasus
salmonellosis  di  dunia  disebabkan karena  mengkonsumsi  telur  yang  tidak matang  secara  sempurna  (Ochiai et  al ., 2008). Hasil isolasi kejadian salmonellosis tersebut ternyata sebagian besar disebabkan oleh bakteri Salmonella  enteritidis (Velge et  al., 2005) .
Dengan demikian masyarakat yang  mengkonsumsi  telur  ayam  Tolaki sebagai  jamu  ini  sangat  berpeluang tertular  salmonellosis.  Oleh  sebab  itu keberadaan  telur  bebas Salmonella menjadi  sangat  penting.  Telur  bebas Salmonella hanya diproduksi oleh ayam yang memiliki ketahanan tinggi
terhadap bakteri tersebut.
Tingginya  tingkat  ketahanan  atau resistensi  ayam  terhadap Salmonella dipengaruhi  oleh  faktor  genetik,  faktor lingkungan  dan  interaksi  kedua  faktor tersebut. Sebagai faktor genetik,
resistensi ayam terhadap Salmonella sp.
dikontrol  oleh  banyak  gen.  Salah satunya  adalah  gen  Toll-like  Receptor 4(TLR4)  (Calenge et  al., 2010). Beberapa  hasil  penelitian  menyatakan bahwa  gen  TLR4  merupakan  salah  satu gen kandidat pada sifat ketahanan ayam terhadap  infeksi  bakteri S.  enteritidis (Kramer et  al., 2003;  Lamont et  al ., 2002).
Gen  TLR4  pada  ayam  berada pada  kromosom  17.  Berdasarkan  data dari GenBank (dengan  nomor  akses  :  A Y064697.1),  gen  TLR4  berukuran 11698  pb.  Struktur  gen  TLR4  diawali oleh  wilayah promoter (2743  pb), exon 1,  2,  dan  3  (105,  167  dan  3260 bp), intron 1  dan  2  (934  dan  984  pb), dan  diakhiri  oleh flankingregion (3505 pb).
Gen TLR4 berperan dalam
mengaktivasi  respon  imun  non  spesifik. Gen  TLR4  mentranskripsi  protein  yang berfungsi  sebagai  reseptor  permukaan sel  fagosit.  Protein  reseptor  ini  mampu mengenali  lipopolisakarida  (LPS)  dari
bakteri gram negatif, termasuk
Salmonella , dengan demikian gen TLR4 ini dapat diaktivasi oleh LPS. (Emertcan et al., 2011; Animura et al., 2008; Akira dan Takeda, 2004; Palsson dan O’Neill, 2004; Akashi et al., 2001). Secara  tidak  langsung  gen  TLR4 juga  mempengaruhi  respons  imun spesifik  yang  diperantarai  oleh  limfosit T  dan  limfosit  B,  seperti  dinyatakan oleh  Kabelitz  (2007),  bahwa  gen  TLR4 juga dapat berekspresi dalam limfosit T. Gen  TLR4  ini  berekspresi  kuat  tidak hanya pada ternak ayam.
Pada  manusia  dan  tikus,  telah dibuktikan  bahwa  terjadinya  mutasi pada  gen  TLR4,  berdampak  terhadap penurunan  kemampuan  individu  dalam mengenali  LPS  dari  bakteri Salmonella sp. Individu  tersebut  menjadi  peka  dan mudah  terinfeksi Salmonella (Lorenz et al., 2002). Adanya mutasi menyebabkan gen TLR4 membentuk beberapa genotipe. Abasht et al. (2009)
menyatakan  bahwa  adanya  variasi genotipe gen TLR4 pada ayam berpengaruh pada ketahanannya terhadap infeksi bakteri Salmonellasp. Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengidentifikasi  keragaman  gen  TLR4 pada  ayam  Tolaki,  ayam  petelur komersial dan ayam broiler, menggunakan metode PCR-RFLP. Hasil penelitian ini diharapkan memperoleh informasi genetik mengenai  keragaman  gen  tersebut  pada ayam  Tolaki  dibandingkan  dengan ayam ras yang beredar di Indonesia.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  dilakukan  dari  awal bulan  April  sampai  akhir  bulan  Mei tahun  2013.  Penelitian  dilaksanakan  di laboratorium  Pemuliaan  dan  Genetika Ternak  Molekuler,  Departemen  Ilmu Produksi  dan  Teknologi  Peternakan, Fakultas  Peternakan,  Institut  Pertanian
Bogor.
Total  sampel  yang  diidentifikasi sebanyak  126,  terdiri  atas  ayam  Tolaki 82 ekor, ayam petelur 20 ekor dan ayam broiler  24  ekor.  Identifikasi  keragaman gen TLR4 beberapa rumpun ayam lokal Indonesia  dilakukan  tiga  tahap,  yaitu ekstraksi DNA genom (Sambrook et al., 1989),  amplifikasi  PCR  gen  TLR4.
Tahap ketiga adalah menentukan genotipe  gen  TLR4  dengan  metode RFLP
( RestrictionFragmentLengthPolymorphi sm ).
Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) Reaksi  PCR  menggunakan  disain primer sebagai berikut : primer forward :  5’-GCT  CAA  ATT  ATT  TTT  CAT CAG  Tgg  CC-3’  dan  primer reverse : 5’-ATC  TGG  ACT  AAA  AGC  TGC AC-3’.  Fragmen  gen  TLR4  yang diamplifikasi  dengan  primer  tersebut berukuran  220  pb.  Primer  tersebut didisain  sendiri  dengan  menggunakan bantuan Primer Designing Tools Program (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/tools /primer-blast). Amplifikasi  DNA  dilakukan  pada total  volume  25  µl,  terdiri  dari  2µl DNA,  15,75  µl  air  bebas  ion  steril,  2,5 µl  10x  buffer  tanpa  Mg 2+ ,  2  µl  MgCl 2 , 0,5  µl  10  mM  dNTP,  0,25  µl  Taq polimerase, 2 µl primer. Tahap pertama dilakukan  satu  siklus,  meliputi  proses denaturasi  awal  pada  94 o C  selama  4 menit. Tahap kedua dilakukan 30 siklus. Setiap  siklusnya  terdiri  dari  denaturasi (94 o C,  selama  10  detik),  annealing (60 o C,  selama  1  menit)  dan  ekstensi (72 o C,  selama  2  menit).  Tahap  ketiga adalah  ekstensi  akhir  (72 o C,  selama  7 menit).  Selanjutnya  diinkubasi  pada suhu  4 o C  hingga  digunakan  untuk analisis  lebih  lanjut.  Proses  amplifikasi
ini  memggunakan  GeneAmp  PCR system 9700 Applied Byosistem
Penentuan  genotipe  menggunakan metode RFLP. Fragmen gen TLR4 yang merupakan  produk  PCR, sebanyak  4  µl dipotong
dengan restriction endonuclease  mix ,  yang  terdiri  dari    2 µl: dH2O (1 µl), buffer (0,7 µl), dan 0,3 µl Msc I selama 16 jam pada suhu 37 o C. Produk  PCR  yang  sudah  dipotong dengan enzim restriksi, kemudian divisualisasikan  dengan  elektroforesis menggunakan  gel  agarose  2%  dengan buffer 0,5 TBE (Tris Borat EDTA) yang dijalankan pada tegangan 100 V selama 40 menit di bawah UV trans iluminator. Enzim  pemotong  ( Msc I),  mengenali situs potong TGG|CCA.

## Analisis Data
Nilai  frekuensi  alel,  frekuensi genotipe,  heterozigositas  pengamatan (Ho),  dan  heterozigositas  harapan  (He), dihitung  berdasarkan  rumus  dari  Nei (1987).  Nilai  keseimbangan  Hardy- Weinberg  dihitung  dengan  rumus  dari
Hartl  dan  Clark  (1997),  dan  nilai Polymorphic  Informative  Content (PIC) dihitung berdasarkan rumus dari
Bostein et al. (1980).
HASIL DAN PEMBAHASAN Genotipe GenTLR4 pada AyamTolaki dan Persilangannya dengan Ayam Broiler
Genotyping gen  TLR4  dilakukan pada exon 2  (basa  ke  3898-4117), dengan  produk  PCR  berukuran  220  pb, seperti  disajikan  pada  Gambar  1. Adapun  visualisasi  hasil  elektroforesis dari  penelitian  ini  disajikan  dalam Gambar 2.
Gambar  1  dan  2  adalah  fragmen gen  TLR4  yang  berukuran  220 pb pada exon 2  yang  merupakan  produk  PCR. Selanjutnya    dipotong  oleh  enzim
restriksi Msc I,  pada  situs  ke  3924 dengan posisi titik potong TGG|CCA.
Gambar 1.Sekuen gen TLR4 yang diamplifikasi ( GenBank A Y064697.1). Posisi primer menempel  pada nukleutida yang bergaris bawah. Gambar 2. Produk PCR-RFLP genTLR4| Msc Ipada exon 2 M : marker 100 pb. N : fragmen gen TLR4 (220 pb). AA,  AG dan GG :  genotipe  gen TLR4 (Ulupi et al., 2013)
Pemotongan  oleh  enzim Msc I menghasilkan alel  A dan alel G. Alel A berukuran 24 pb dan 196 pb, dan alel G berukuran 220 pb. Adapun AA, AG dan GG  adalah  genotipe  gen  TLR4    ayam lokal yang diidentifikasi.
Dari hasil genotyping ini,
terditeksi  adanya  mutasi  pada  situs  ke 3924. Mutasi ini menyebabkan terjadinya  perubahan  basa  dari  guanin (G)  menjadi  Adenin  (A).  Perubahan nukleutida  ini  menyebabkan  terjadinya perubahan  asam  amino,  dari  asam glutamat  (GAA)  menjadi  lisin  (AAA). Hasil  penelitian  ini  serupa  dengan  yang dilaporkan  oleh  Beaumont et  al .  (2003),
Tabel 1.  Nilai frekuensi alel dan frekuensi genotipe gen TLR4 pada ayam Tolaki, ayam petelur dan broiler
Keterangan : A dan G : alel A dan alel G; AA, AG, dan GG : genotipe gen TLR4, (-) : Non genotipe
yang  melakukan genotyping pada  ayam petelur  coklat    komersial  ( commercial
brownlaying hens ).
Frekuensi Alel dan Frekuensi Genetik
Nilai  frekuensi  alel  dan  frekuensi genotipe  gen  TLR4  pada  lokus Msc I pada  ayam  Tolaki  dan  persilangannya dengan  ayam  broiler  disajikan  pada Tabel 1.
Pada  ayam  Tolaki  dan  ayam broiler,  frekuensi  alel  didominasi  oleh alel  G.  Pada  ayam  petelur,  gen  TLR4 didominasi  oleh  alel  A  (80%).  Nilai frekuensi  alel G pada ketiga  jenis ayam tersebut berkisar antara 0.20-0.87. Ulupi (2014)  menyatakan  bahwa  alel  G  pada gen  TLR4  ayam  Kampung  adalah membawa sifat resisten, dengan dihasilkannya  respons  fisiologis  yang lebih  tinggi  dari  pada  alel  A.  Dengan demikian  frekuensi  alel  pembawa  sifat resisten  terhadap Salmonella  sp .  pada ayam  Tolaki  adalah  sangat  tinggi (82%), demikian juga pada ayam broiler (87%).
Pada  penelitian  ini,  gen  TLR4 pada  ayam  Tolaki  teridentifikasi  tiga macam  genotipe,  yaitu  AA,  AG,  dan GG.  Masing-masing  genotipe  tersebut frekuensinya  0.02, 0.31, dan  0.67.  Pada ayam  petelur  dan  ayam  broiler  hanya ditemukan  2  genotipe.  Genotipe  gen TLR4 pada ayam petelur adalah AA dan AG,  yang frekuensinya didominasi oleh
AA (60%). Adapun genotipe gen TLR4 pada  ayam  broiler  adalah  AG  dan  GG. Frekuensi  genotipe  GG  pada  ayam broiler adalah sangat tinggi, yaitu 75%.
Hasil genotyping dalam penelitian ini  dapat  diartikan  bahwa  gen  TLR4 pada  lokus Msc I  bersifat  polimorfik (beragam).  Hal  ini  sesuai  dengan pernyataan  Nei  dan  Kumar  (2000), bahwa  jika  terdapat  sedikitnya  dua  alel atau dua genotipe, dengan nilai frekuensi  relatif  dalam  populasi  lebih dari 0,01 (1%), maka disebut polimorfik.  Keragaman  gen  TLR4  juga telah  dilaporkan  terjadi  pada  beberapa bangsa  ayam  (Ruan et  al., 2012),  pada ayam  ras  petelur(Beaumont et  al., 2003),  pada  ayam  pedaging  atau  ayam broiler  (Malek et  al., 2004), pada  ayam lokal  cina  (Li et  al., 2013;  Liu et  al., 2011), dan pada  ayam Kampung (Ulupi et al., 2013).
Keseimbangan Gen Toll-like Receptor4 dalam Populasi Keseimbangan  gen  TLR4  dalam populasi (keseimbangan Hardy- Wienberg) diuji dengan chi-square  (x) 2 . Hasil  pengujian  terhadap  gen  TLR4 pada  lokus Msc I,  disajikan  pada    Tabel 2. Jenis ayam Jumlah sampel Frekuensi alel Frekuensi genotipe A G AA AG Tolaki 82 0.18 0.82 0.02 0.31 0.67 Petelur komersial 20 0.80 0.20 0.60 0.40 Broiler 24 0.13 0.87 0.75
Tabel  2.  Hasil  uji chi-square  (x 2 ) frekuensi  genotipe  gen  TLR4  ayam  Tolaki,  ayam petelur dan ayam broiler
Jenis ayam Nilai x 2 Tolaki 0.19 tn Petelur komersial 0.06 td Broiler 0.45 td tn : tidak berbeda nyata, x 2 (0.05,1) =3.84 td : tidak dianalisis karena db=0
Nilai x 2 genotipe  gen  TLR4  pada ayam  petelur  komersial  dan  ayam broiler tidak dianalisis. Hal ini disebabkan  karena  jumlah  genotipe  gen
TLR4  ditemukan  dua  macam  yaitu  AA dan  AG  (untuk  ayam  petelur)  dan  AG dan  GG  (untuk  ayam  broiler).  Jumlah alel  yang  ditemukan  juga  dua  yaitu  alel A  dan  alel  G.  Setelah  dihitung berdasarkan  rumus  dari  Allendorf  dan Luikart  (2007), diperoleh  nilai  nol  pada derajat  bebasnya.  Hal  ini  menyebabkan nilai x 2 pada kedua jenis ayam  ini tidak dapat  dianalisis.  Pada  ayam  Tolaki terlihat  bahwa  frekuensi  genotipe  gen TLR4  berada  dalam  keseimbangan Hardy-Wienberg.
Suatu  populasi  dinyatakan  dalam keadaan keseimbangan Hardy- Weinberg,  apabila  frekuensi  genotipe (p 2 , 2pq, q 2 ) dan frekuensi alel (p dan q) adalah konstan dari generasi ke generasi,  akibat  penggabungan  gamet yang terjadi secara acak dalam populasi yang besar (Vasconcellos et al. 2003). Keseimbangan  genotipe  dalam populasi  yang  cukup  besar  terjadi  jika
tidak  ada  seleksi,  mutasi,  migrasi  dan genetic  drift . Genetic  drift adalah perubahan  frekuensi  genotipe  yang diakibatkan  oleh  fluktuasi  acak  akibat adanya peluang dalam pola perkawinan, kesalahan  pengambilan  sampel,  dan perubahan  frekuensi  mendadak  akibat adanya  faktor  lingkungan  (misalnya bencana  alam).  Sebaliknya  jika  terjadi akumulasi  genotipe,  populasi  yang terbagi,  mutasi,  seleksi,  migrasi  dan perkawinan dalam kelompok yang sama (endogami), dapat menimbulkan ketidakseimbangan  frekuensi  genotipe atau  frekuensi  alel  dalam  populasi tersebut. Keseimbangan genotipe gen TLR4 lokus Msc I pada ayam Tolaki ini, memperlihatkan bahwa intersitas kejadian mutasi, endogami, seleksi yang intensif  serta  migrasi  pada  kedua rumpun  ayam  lokal  tersebut  bisa dikatakan  sangat  rendah.  Ayam  Tolaki selama  ini  dipelihara  oleh  masyarakat secara  ekstensif  (dengan  diumbar),  hal ini memungkinkan terjadinya
perkawinan secara acak dari generasi ke generasi.
Tabel  3.    Nilai  heterozigositas  pengamatan  (H o )  dan  heterozigositas  harapan  (H e )  dan nilai Polymorphic Informative Content (PIC) genotipe gen TLR4 Jenis ayam Jumlah sampel  Ho He PIC Tolaki 82 0.31 0.29 0.25 Petelur komersial 20 0.40 0.32 0.27 Broiler 24 0.25 0.23 0.20 Keterangan : Ho   : heterozigositas pengamatan He   : heterozigositas harapan PIC : Polymorphic Informative Content

## Nilai  Heterozigositas  dan  Polymorphic Informative Content
Nilai heterozigositas merupakan rataan persentase  lokus  heterozigot  tiap  individu atau  rataan  persentase  individu  heterozigot dalam  populasi  (Nei  dan  Kumar,  2000). Heterozigositas  yang  tinggi  menunjukkan tingginya  keragaman  genetik  dalam  suatu populasi  dan  sebaliknya.  Adapun  nilai Polymorphic  Informative  Content (PIC) merupakan  salah  satu  parameter  yang menunjukkan  tingkat  informatifnya  suatu penciri ( marker ) (Botstein et al ., 1980). Hasil analisis pendugaan nilai heterozigositas  dan  PIC  gen  TLR4| Msc I pada  ayam  Tolaki,  ayam  petelur  dan  ayam broiler disajikan pada Tabel 3.
Nilaiheterozigositas  pengamatan  gen TLR4| Msc I  pada  ketiga  jenis  ayam  yang dianalisis  berkisar  antara  0.25-0.40.  Nilai heterozigositas  pengamatan  genotipe  gen TLR4  pada  ayam  petelur  dalam  penelitian adalah  tertinggi,  yaitu  0.40.  Ini  berarti bahwa  frekuensi  genotipe  yang  gen  TLR4 yang  homozigot  pada  pada  ayam  petelur adalah  0.6.  Genotipe  gen  TLR4  pada  ayam petelur  komersial  hanya  ditemukan  2 macam,  yaitu  AA  dan  AG.  Oleh  sebab  itu 60%  frekuensi  genotipe  gen  TLR4  yang homozigot,  semuanya  bergenotipe  AA. Genotipe  ini  adalah  pembawa  sifat  peka terhadap  infeksi Salmonella  sp .  Berbeda dengan  genotipe  gen  TLR4  pada  ayam Tolaki  dan  broiler.  Nilai  heterozigositas genotipe  gen  TLR4  pada  kedua  ayam tersebut  lebih  rendah  dari  pada  ayam petelur,  tetapi  genotipe  yang  homozigot didominasi  oleh  GG  yang  merupakan pembawa sifat resisten.
Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He : 0.23-0.32) pada lokus TLR4| Msc I
tidak mengindikasikan  adanya  perbedaan  yang besar.  Nilai  heterozigositas  pengamatan (Ho)  dan  heterozigositas  harapan  (He)  ini
dapat  digunakan  untuk  menduga  nilai inbreeding pada suatu kelompok ternak. Hasil  pendugaan  nilai  PIC  gen  TLR4 lokus Msc I pada ayam Tolaki, ayam petelur dan  ayam  broiler  yang  dianalisis  berkisar antara  0.20-0.27.  Botstein et  al .  (1980) menyatakan  bahwa  kriteria  PIC  termasuk dalam  kelompok  rendah  jika  nilai  PIC ≤ 0.25,  nilai  PIC  termasuk  katagori  sedang adalah  antara  0.25  <  PIC  <  0.5,  dan termasuk kategori tinggi bila nilai PIC ≥ 0.5. Berdasarkan pernyataan tersebut maka nilai PIC gen TLR4| Msc I pada ayam Tolaki dan ayam petelur termasuk kategori sedang. Adapun nilai PIC pada ayam broiler kategori rendah,  hal  ini  disebabkan  karena  ayam broiler merupakan syntheticbreed of chicken yang keseragamannya sangat tinggi.

## SIMPULAN DAN SARAN
Gen  TLR4  bersifat  polimorfik  pada ayam  Tolaki,  petelur  komersial  dan  broiler, dengan  ditemukan  dua  alel  yaitu  A  dan  G. Frekuensi  alel  G  (pembawa  sifat  resisten) pada  ayam  Tolaki  dan  broiler  sangat  tinggi (0.82  dan  0.87).  Genotipe  gen  TLR4| Msc I ayam  Tolaki  berada  dalam  keseimbangan Hardy-Wienberg,  dengan  nilai  informasi genetik sedang. Berdasarkan hasil penelitian ini  gen TLR4| Msc I pada ayam Tolaki dapat digunakan sebagai penciri genetik.
Untuk  memenuhi  permintaan  daging ayam  Tolaki  yang  rasanya  terkenal  lezat, dapat  dicoba  dengan  mengembangkan final stock dari  persilangan  ayam  Tolaki  dan broiler  yang  keduanya  memiliki  alel  G sebagai  pembawa  sifat  tahan  terhadap Salmonella  sp dengan  frekuensi  tinggi. Dengan demikian penurunan populasi ayam Tolaki  bisa  ditekan.  Tidak  dianjurkan melakukan  persilangan  antara  ayam  Tolaki dengan  ayam  petelur  karena  ayam  petelur didominasi  genotipe  gen  TLR4  pembawa sifat  peka    (AA)  terhadap  infeksi  bakteri tersebut.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terimakasih kepada  Ditjen  Dikti  yang  telah  membantu mendanai  penelitian  ini  melalui  Penelitian Unggulan  Strategis  Nasional  Nomor  : 63/IT3.41.2/SPK/2013.
Kepada
Eryk Andreas  SPt,  MSi.  diucapkan  terima  kasih atas  pendampingannya  selama  pelaksanaan penelitian di laboratorium molekuler.

## DAFTAR PUSTAKA
Abasht,  B.,  M.G.  Kaiser,  J.  van  der  Poel, S.J.  Lamont.  (2009).  Genetic  lines differ  in  Toll-like  receptor  gene expression  in  spleens  of  chicks inoculated  with Salmonellaenterica serovar enteritidis. Poult Sci 88: 744– 749.
Akashi,  S.Y.,    H.  Nagai,  M.  Ogata,  K. Oikawa, S. Fukase, K. Kusumoto,  M. Kawasaki,  S.  Nishijima,  M.  Hayashi, Kimoto,  K.  Miyake.  2001.  Human MD-2  confers  on  mouse  Toll-like receptor-4  species-specific  lipopoly- saccharide  recognition. Int.  Immunol. 13:1595-1599.
Akira,  S.,  K.  Takeda.  2004.  TLR  signaling pathways. Nature Reviews Immunology 4: 499-511. Allendorf, F.W., G. Luikart. 2007. Conservation  and  The  Genetic  of Population. Blackwell Publishing.
Animura, N.S.,  F. Saitoh, S. Matsumoto, T. Akashi,  and    K.  Miyake.  2008.  Roles for  LPS-dependent  interaction  and relocation  of  TLR4  and  TRAM  in TRIF-signaling. Biochem.  Biophys. Res. Commun. 368: 94–99.
Beaumont,  C.,  J.  Protais,    F.  Pitel,  G. Leveque,    D.  Malo,  F.  Lantier,  F. Plisson-Petit,  P.  Colin,  M.  Protais, P.L.  Roy,  J.M.  Elsen,  D.  Milan,  I. Lantier,  A.    Neau,  G.  Salvat,  A. Vignal.  2003.  Effect  of  two  candidate
genes  on Salmonella carier  state  in fowl. Poul. Sci. 82: 721-726. Botstein, D., R.L. White, M. Skolnick, R.W.
Davis.  1980.  Construction  of  genetic linkage map in human using restriction fragmen  length  polymorphisms. Amer J Hum Genet. 32 :314-331.
Calenge,  F.,  P.  Kaiser,  A.  Vignal,  C. Beaumont.  2010.  Genetic  control  of resistance  to  salmonellosis  and  to Salmonella carrier-state  in  fowl  :  a review. Genetics  Selection  Evolution 42:1-11.
Emertcan,  A.,  F.  Ozturk,  K.  Gunduz.  2011. Toll-like  receptors  and  skin. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 11:1-7. Hartl, D.L., dan A.G. Clark. 1997. Principle of  Population  Genetic.  Sunderland Sinauer Associates, M.A.
Kabelitz, D. (2007). Expression and function
of Toll-like receptors in T
lymphocytes. Curr  Opin  Immunol 19: 39–45.
Kramer,  J.,  M.  Malek,  S.  Lamont.  2003. Association  of  twelve  candidate  gene polymorphisms and response to challenge  with Salmonella  enteritidis in poultry .  Anim Genet 2003. 34:339- 348.
Lamont,  S.J.,  M.G.  Kaiser,  W.  Liu.  2002. Candidate  genes  for  resistance  to Salmonella  enteritidis colonization  in chickens as detected in a novel genetic cross .  Veterinary  Immunology  and Immunopathology 87, 423–428.
Li,  H.F.,  Y.  Hu,  H.  Hu,  C.  Song,  J.T.  Shu, C.H.  Zhu,  S.J.  Zhang,  H.  Fan,  W.W. Chen.  2013.  Genetic  differ  in  TLR4 gene  polymorphisms  and  expression involved  in Salmonella natural  and artificial  infection  respectively  in Chinese  native  chicken  breeds. Mol.
Biol.  Rep .  DOI:  10.1007/s11033-013- 2601-2608.
Liu, Y., G.B. Chang, W.B. Bao, K.H. Wang,
X.Y.  Zhang,  G.H.  Chen.  2011.
Polymorphism  of  Exon  2  of  TLR4 Gene  and  Its  Correlation  with  Some Commercial Traits in Anka Chicken. African Journal of Biotechnology 10(42):8260-8266.
Lorenz,  E.,  J.P.  Mira,  K.L.  Frees,  D.A.
Schwartz.  2002.    Relevance  of mutations  in  the  TLR4  receptor  in patients  with  gram-negative  septic shock. Arch  Intern  Med. 162:  1028- 1032.
Malek,  M.,  J.R.  Hasenstein,  S.J.  Lamont.
2004.  Analysis  of  chicken  TLR4, CD28, MIF, MD2 and LITAF genes in  a Salmonella  enteritidis Resource Population. Poultry Sci. 83:544-549. Nataamijaya,  A.G.  2010.  Pengembangan potensi  ayam  lokal  untuk  menunjang peningkatan  kesejahteraan  petani. J Litbang Pertanian 29: 131-138.
Nei,  M.,  and  S.  Kumar.  2000.  Molecular Evolutionary  Genetics.  New  York, Columbia University Press.
Nei,  M.  1987.  Molecular  Evolutionary Geneticcs.  New  York,  Columbia University Press.
Ochiai,  R.L.,  C.J.  Acosta,  M.C.  Danovaro-
Holliday.  2008.  A  Study  of  Typhoid Fever  in  Five  Asian  Countries: Disease  Burden  and  Implications  for Controls. Bulletin of the World Health Organization 86:260-268. Pagala,  M.A.  2014.  Identifikasi  Sifat Ketahanan Penyakit Viral Menggunakan Gen Mx sebagai Marka Genetik  Pada  Ayam  Tolaki.  Disertasi. Sekolah Pascasarjana, IPB. Bogor.
Palsson-McDermott, E.M., and L.A.
O’Neill.  2004.  Signal  transduction  by the  lipopolysaccharide  receptor  Toll- like receptor-4. Immunology 113: 153-
162.
Ruan,  W.K.,  J.H.  Wu,  J.  An,  S.J.  Zheng. 2012.  Polymorphisms  of  chicken TLR4,  5,  21  in  different  breeds. Poultry Sci. 91 : 2512-2516. Sambrook,  J.,  E.F.  Fritsch,  T.  Maniatis. 1989. Molecular Cloning : a
Laboratory  Manual.  United  State  of America, CSH Lab Pr.
Sulandari,  S.,  M.S.A.  Zein,  S.  Paryanti,  T. Sartika,  M.  Astuti,  T.  Widjastuti,  E. Sujana,  S.  Darana,  I.  Setiawan,  D.
Garnida.  2007.  Sumberdaya  genetik ayam lokal Indonesia.
Keanekaragaman Sumber Daya Hayati Ayam  Lokal  Indonesia.    Manfaat  dan Potensi.  Pusat  Penelitian  Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor. pp: 45-104.
Ulupi,  N.,  Muladno,  C.  Sumantri,  I.W.T. Wibawan. 2013.  Association of TLR4
Gene Genotype and Resistance Against Salmonella enteritidis Natural Infection in Kampung Chicken . Journal of Poul. Sci . 12(8):445-450. Ulupi,  N.  2014.  Kajian  Ketahanan  Ayam Kampung terhadap Salmonella
enteritidis menggunakan  Gen  TLR4 sebagai  Penciri  Genetik.  Disertasi. Sekolah Pascasarjana, IPB.
Vasconcellos,  L.P.M.K.,  D.T.  Talhari,  A.P.
Pereira, L.L. Coutinho, L.C.A. Regitano. 2003. Genetic characterization  of  aberden  angus cattle  using  moleculer  markers. Genet Mol Biol . 26:133-137.
Velge,  P.,  A.  Cloeckaert,  P.  Barrow.  2005.
Emergence  of Salmonella epidemics  : the problems related to Salmonellaentericaserotype  enteritidis and  multiple    antibiotic  resistance  in other  major  serotypes. Vet.  Res. 36:
267-288.