Sintesis O-(Isoleusil) Parasetamol dan Uji Aktivitas Analgesik terhadap Mencit ( Mus musculus ) dengan Metode Hot Plate
Ida Ayu Andri Parwitha (a)* , Siswandono (b)
(a) Fakultas Farmasi, Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya, Surabaya, Indonesia
(b) Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
Parasetamol merupakan obat analgesik lini pertama yang digunakan dalam tata laksana nyeri. Penggunaan obat tersebut dalam jangka waktu panjang dengan dosis besar berpotensi memunculkan efek samping hepatotoksik. Guna meminimalkan efek samping dan meningkatkan aktivitas analgesik dari Parasetamol maka dilakukan modifikasi struktur –OH pada gugus parasetamol. Tujuan dari penelitian ini adalah mensintesis senyawa O- (isoleusil)  parasetamol melalui reaksi Schotten Baumann antara Parasetamol dan Isoleusil  klorida.  Senyawa sintesis tersebut diuji aktivitas analgesiknya pada Mencit.  Pemurnian senyawa hasil sintesis  melalui proses rekristalisasi menggunakan campuran pelarut etanol:air (1:2) dan diperoleh senyawa berbentuk serbuk berbau menyengat dengan rendemen hasil 32%. Setelah senyawa terbukti murni maka dilanjutkan dengan identifikasi struktur senyawa menggunakan spektrofotometer inframerah dan spektrometer 1 H-NMR. Hasil uji menunjukkan bahwa senyawa hasil síntesis sesuai yang diharapkan. Pengujian aktivitas analgesik senyawa dilaksanakan pada Mencit ( Mus musculus ) dengan metode hot plate . Dosis yang digunakan dalam penelitian ini adalah 12,5; 25; 50; 100; 200 mg/kg BB diberikan  secara intraperitoneal dan parasetamol  dengan dosis sama  sebagai senyawa pembanding. Hasil penelitian menunjukkan  nilai ED 50 O-(isoleusil)  parasetamol  50 mg/kg BB  dan  ED 50 parasetamol adalah 66  mg/kg BB. Berdasarkan nilai ED 50 dapat  disimpulkan bahwa O-(isoleusil)  parasetamol memiliki aktivitas analgesik yang lebih tinggi dibanding parasetamol. Hasil uji statistik Tukey HSD menunjukkan bahwa aktivitas analgesik parasetamol dan O-(isoleusil) parasetamol tidak berbeda bermakna.
Kata Kunci: O-(isoleusil) parasetamol; analgesik; tionil klorida
Synthesis of O-(Isoleucyl) Paracetamol and Analgesic Activity Assay using Hot Plate Method in Mice ( Mus Musculus )
Paracetamol is a first-line analgesic drug used in pain management. The use of these drugs in the long term with larger doses has the potential to cause hepatotoxic side effects. The purpose of this study is to synthesize the O- (isoleucyl)  paracetamol through the Schotten Baumann reaction. Purification of the compound was carried out through the recrystallization process using a mixture of ethanol: water (1: 2) solvent, and a pungent odor-shaped compound with a yield of 32%.  The identification of the structure of the compound was  using an infrared spectrophotometer and a 1 H-NMR spectrometer. The test results showed that the compound synthesized as expected. The analgesic activity of compounds was tested on mice ( Mus musculus ) using the hot plate method. The dose used in this study was 12.5; 25; 50; 100; 200 mg/kg body weight given intraperitoneally, with paracetamol as control positive. The value of ED 50 O- (isoleucyl) paracetamol 50 mg/kg BW and ED 50 paracetamol is 66 mg/kg BW. Based on ED 50 values, it can be concluded that O- (isoleucyl) paracetamol has higher analgesic activity than paracetamol. Tukey HSD statistical test results showed that the analgesic activity of paracetamol and O- (isoleucyl) paracetamol were not significantly different.
Keyword: O-(isoleucyl) paracetamol; analgesic; thionyl chloride
*Corresponding author: Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya, Jl. Raya Kalisari Selatan No. 1 Surabaya, e-mail: idaayu@ukwms.ac.id

## PENDAHULUAN
Analgesik merupakan senyawa yang mampu menekan fungsi sistem saraf pusat maupun perifer secara selektif untuk  mengatasi rasa nyeri tanpa mempengaruhi kesadaran dari pasien. Nyeri sendiri merupakan suatu perasaan sensoris dan subjektif yang umumnya berkaitan dengan kerusakan jaringan pada tubuh dan ber- fungsi sebagai pelindung juga penanda adanya gangguan di jaringan (Marie et al .,  2016). Pa- rasetamol merupakan obat turunan para aminofenol yang luas digunakan oleh masyarakat Indonesia saat ini sebagai obat analgesik dan antipiretik. Dalam tata laksana nyeri seperti pada penyakit Osteoartritis  dan nyeri ringan lainnya merekomendasikan parasetamol sebagai analge- sik pilihan pertama.  Pada beberapa penyakit, terapi  pereda nyeri  dengan  menggunakan obat analgesik dilaksanakan dalam jangka waktu yang panjang  dan  dosis  besar.  Pada dosis normal parasetamol  relatif  aman untuk digunakan, akan tetapi pada dosis lebih dari 4 gram per hari dan secara kronik berpotensi menimbulkan efek samping serius seperti hepatotoksik (Marie et al ., 2016;  Jesse et al . 2017).  Secara normal, parase- tamol akan mengalami konjugasi oleh asam glukoronat dan sulfat membentuk metabolit utama dari parasetamol dan kemudian diekskresikan melalui urin. Sebagian kecil dari parasetamol juga akan mengalami proses oksidasi oleh enzim Cyp2E1 dan Cyp1A2 untuk mem- bentuk metabolit reaktif N-acetyl- p- benzoquinone imine (NAPQI). Metabolit minor ini apabila da- lam jumlah kecil tidak berbahaya bagi tubuh dan diekskresi melalui empedu. Penggunaan Parase- tamol dalam dosis lebih dari 4 gram per hari dan secara kronik  menyebabkan akumulasi NAPQI (Clark et al ., 2012). Mekanisme hepatotoksik dari Parasetamol muncul akibat adanya ikatan kovalen antara makromolekul hati dengan senyawa NAPQI  sehingga  secara  perlahan sel hepatosit menjadi nekrosis  (Ramachandran  dan  Jaeschke, 2017). Modifikasi struktur obat turunan para ami- nofenol telah dilaksanakan sejak lama, salah
satunya adalah Fenetsal yang merupakan hasil esterifikasi asam salisilat dengan parasetamol. Fenetsal terbukti memiliki aktivitas analgesik yang lebih besar dibandingkan parasetamol karena bersifat lebih lipofilik  sehingga penetrasi membran  biologis menjadi meningkat. Selain peningkatan efek analgesik, fenetsal juga memiliki toksisitas yang lebih rendah dikarenakan adanya tambahan gugus ester dapat meminimalkan proses pembentukan ion imidokuinon sehingga efek samping hepatotoksik menjadi lebih rendah (Siswandono, 2016).
Berdasarkan dari penelitian di atas, maka penting untuk dilaksaksanakan sintesis senyawa turunan parasetamol dengan aktivitas lebih op- timal dan efek samping minimal. Tujuan dari penelitian ini adalah mensintesis senyawa O- (isoleusil)  parasetamol melalui reaksi Schotten Baumann antara Parasetamol dan Isoleusil klori- da. Senyawa sintesis tersebut diuji aktivitas anal- gesiknya pada Mencit dan diharapkan memiliki efek analgesik yang lebih tinggi dibandingkan parasetamol. Proses modifikasi struktur parase- tamol menjadi senyawa turunannya yaitu O- (isoleusil)  parasetamol dilaksanakan melalui reaksi Schotten Baumann dengan mereaksikan parasetamol dan isoleusil klorida (Gambar 1). Penambahan gugus isoleusil mengakibatkan se- nyawa turunan parasetamol menjadi lebih lipofilik karena adanya penambahan gugus –CH3 (Siswandono, 2016). Pembentukan ester dengan isoleusil klorida diharapkan dapat meminimalkan proses pembentukan NAPQI karena adanya faktor sterik sehingga senyawa baru tersebut memiliki aktivitas analgesik yang lebih tinggi dengan efek samping lebih rendah. Isoleusin merupakan salah satu asam amino esensial yang dapat membantu regenerasi sel hepatosit yang rusak akibat dari pe- makaian parasetamol dalam dosis tinggi dan jang- ka panjang. Senyawa O-(isoleusil) parasetamol di uji aktivitas analgesik dengan menggunakan me- tode hot plate dan dibandingkan dengan aktivitas analgesik dari Parasetamol.
NH OH O CH 3 NH 2 O OH + S O Cl Cl + + HCl SO 2 + NH O O CH 3 + HCl NH 2 O Cl NH 2 O Cl NH 2 O NH OH O CH 3 NH 2 O OH + S O Cl Cl + + HCl SO 2 + NH O O CH 3 + HCl NH 2 O Cl NH 2 O Cl NH 2 O
Gambar 1. Reaksi Kimia Pembentukan Senyawa O-(isoleusil) parasetamol

## METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah parasetamol pharmaceutical grade (Brata- co, Indonesia), l-isoleusin p.s (Merck, Jerman), Tionil klorida p.s (Merck, Jerman), dan Etanol p.a (Merck, Jerman). Penentuan titik leleh meng- gunakan Electrothermal Melting Point Apparatus Buchi B-540. Penentuan spektra 1H-NMR dengan alat FT-NMR Hitachi R-1900 90 MHz dalam pe- larut CDCl3; sebagai standar internal dipakai tetrametilsilan (TMS). Penentuan spektra infra- merah (IR) dengan alat spektrofotometer IR Shi- madzu FTIR Jasco 5300. Kemurnian senyawa di- uji secara kromatografi lapis tipis (KLT) meng- gunakan beberapa jenis eluen yang berbeda kepolarannya. Pengujian aktivitas analgesik dilak- sanakan dengan menggunakan alat Ugo Basile Plantar Test .
Sintesis Senyawa O-(isoleusil) parasetamol
Proses sintesis senyawa dilaksanakan melalui dua tahapan:
Tahap 1 Senyawa isoleusil klorida disintesis dengan mereaksikan isoleusin dengan tionil klorida (SOCl2). Masukan 4,59  gram isoleusin (0,035 mol) ke dalam labu alas bulat kemudian dilarut- kan dengan 50 ml aseton. Ke dalam campuran tersebut ditambahkan 3 ml tionil klorida dalam lemari asam, dan refluks selama 1 jam  (Zuffanti, 1948; Li dan Sha, 2008).
Tahap 2 Senyawa O-(isoleusil)  parasetamol disin- tesis dengan mereaksikan isoleusil klorida dengan parasetamol berdasarkan reaksi Schotten Bau- mann . Timbang  4,53gram parasetamol (0,030 mol) kemudian larutkan dengan 30 ml aseton dan campurkan dengan hasil refluks  isoleusil klorida. Campuran parasetamol dan isoleusin klorida ke- mudian  direfluks selama 3 jam. Setiap jam cam- puran diuji dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT)  (fase diam: silika gel F254, fase gerak: n -heksana : etil asetat (6:4)). Refluks di- hentikan bila noda parasetamol telah hilang. Tambahkan 40 ml akuadest kedalam hasil refluks hingga  terbentuk endapan. Saring  endapan  de- ngan menggunakan corong Buchner  dan bilas dengan  25 ml akuadest sebanyak 2 kali. Proses rekristalisasi dilakukan untuk pemurnian senyawa hasil sintesis. Endapan yang dihasilkan kemudian dilarutkan dengan menggunakan pelarut cam- puran etanol:air (1:2). Endapan yang terbentuk kemudian disaring dengan menggunakan corong buchner dan dikeringkan pada oven suhu 70 0 C selama 1 jam.
Penyiapan Hewan Coba Digunakan hewan coba mencit ( Mus mus- culus ) galur Swiss Webster, jantan, umur 2-3
bulan, berat badan 20-30 gram, sehat,  dan tidak ada kelainan yang tampak pada bagian tubuh. Sebelum diberi perlakuan pada mencit, dilakukan adaptasi dengan lingkungannya selama 1 minggu dan diberi pakan pellet standar serta minum ad libitum . Kandang mencit diletakan di Labora- torium Hewan Fakultas Farmasi Widya Mandala Surabaya. Ruangan pemeliharaan dijaga pada suhu 22 0 C (± 2 0 C) dengan kelembapan (Rh) 55 – 70%. Penerangan akan disesuaikan mengikuti siklus siang dan malam pada hewan rodent  (12 jam terang dan 12 jam gelap).  Prosedur uji dan pemeliharaan hewan coba telah dinyatakan layak etik oleh Komisi Etik Fakultas Kedokter- an UGM Medical and Health Research Ethics Committe e (MHREC) No. KE/FK/0315/EC/2020. Disiapkan 55 ekor mencit jantan kemudian dibagi secara acak menjadi 3 kelompok. Kelompok pertama atau kelompok uji diberi senyawa uji O- (isoleusil) parasetamol (12,5; 25; 50; 100; 200 mg/kg BB) per dosis 5 ekor mencit. Kelompok kedua atau kelompok pembanding diberi senyawa parasetamol (12,5; 25 ; 50; 100; 200 mg/kgBB) per dosis 5 ekor mencit. Kelompok ketiga atau kontrol diberi larutan water for injection seba- nyak 5 ekor mencit.
Uji Aktivitas Analgesik Mencit  diletakkan dalam wadah hot plate untuk beradaptasi selama 5 menit, setelah terlihat tenang dan tidak banyak bergerak maka sinari telapak kaki Mencit dengan cahaya inframerah. Catat waktu yang diperlukan hingga Mencit me- ngangkat atau menjilat kakinya sebagai waktu respon awal. Ambil Mencit dari hot plate dan berikan sediaan uji melalui rute intraperitoneal . Letakkan kembali ke wadah hot plate lalu sinari dengan cahaya inframerah pada telapak kaki mencit sebelah kiri. Stimulasi panas diberikan pada rentang waktu 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 dan 120 menit. Amati waktu yang dibutuhkan oleh mencit untuk merespon stimulasi panas.
Analisa Data Data pengamatan hasil uji aktivitas analgesik berupa waktu respons Mencit diuji menggunakan ANOVA satu arah pada  α  =  0,05. Analisa data dilanjutkan dengan pengujian Tukey HSD 5% untuk mengetahui kelompok dosis  12,5; 25; 50; 100; 200 mg/kgBB  yang memberikan perbedaan bermakna.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pada uji organoleptis, senyawa hasil sintesis yang didapatkan adalah berbentuk serbuk, ber- warna cokelat, berbau menyengat, tidak larut dalam air, larut dalam aseton maupun etil asetat. Warna cokelat berasal dari reaksi pembentukan halide asam yaitu antara isoleusin dengan tionil klorida. Perbedaan organoleptis antara senyawa hasil sintesis dengan parasetamol menandakan bahwa telah terjadi perubahan struktur dari se-
nyawa asal. Uji kemurnian senyawa hasil sintesis dilaksanakan dengan penentuan  harga Rf ( Retardation Factor ).  Hasil pemeriksaan KLT (Tabel 1  dan Gambar 2) pada 3 fase gerak yang berbeda kepolaran menunjukkan noda tunggal dan harga Rf lebih besar dibandingkan para- setamol pada fase gerak polar, semi polar, dan non polar. Berdasarkan dari hasil uji KLT dapat disimpulkan bahwa senyawa hasil sintesis murni dan layak untuk untuk dilaksanakan identifikasi struktur senyawa menggunakan spektrofotometer inframerah dan resonansi magnet inti. Dari spek- tra inframerah senyawa hasil sintesis (Gambar 3) dapat dibuktikan bahwa senyawa hasil sintesis bukan parasetamol, karena pada spektra infra- merah senyawa hasil sintesis tidak ditemukan puncak OH fenolat pada 3325 cm -1 , gugus –OH pada parasetamol telah tersubtitusi membentuk ester parasetamol  yang dibuktikan dengan munculnya puncak pada 1735 cm -1 yang meru- pakan C-O ester (Silverstein et al ., 2005; Pavia et al .,  2009). Pengujian struktur senyawa yang kedua dengan menggunakan spektrofotometer 1 H- NMR bertujuan untuk mengetahui jumlah atom H yang terdapat pada senyawa uji. Uji identifikasi ini menggunakan pelarut DMSO D 6. Hasil iden- tifikasi menunjukkan senyawa hasil sintesis
memiliki atom H yang lebih banyak dengan jum- lah total atom H adalah 20 (Gambar 4). Hasil analisis spektra 1 H-NMR menunjukkan bahwa puncak  –OH telah hilang dan terdapat penambahan puncak-puncak H dari gugus –NH2 (8,43 ppm), -CH3 (1,23 ppm), dan 2 gugus H (2,16 dan 3,76 ppm)  (Pavia et al .,  2009). Hal ini menunjukkan, bahwa telah terbentuk senyawa ester dengan gugus isoleusil, sebagai hasil reaksi dari parasetamol dan isoleusil klorida.  Ber- dasarkan dari hasil identifikasi struktur senyawa dapat disimpulkan bahwa senyawa hasil sintesis adalah O-(isoleusil) parasetamol (Gambar 5).
Tabel 1. Nilai Rf Hasil Pemeriksaan Kromatografi Lapis Tipis O-(isoleusil) parasetamol dan Parase- tamol
Fase Gerak Nilai Rf Parasetamol O-(isoleusil) parasetamol Etil asetat : aseton (4:6) 0,42 0,54 n-heksana: kloroform: etanol (3:2:5) 0,57 0,60 n-heksana:etil asetat (6:4) 0,58 0,73
Gambar 2. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Keterangan gambar: A. Parasetamol
B. Senyawa Hasil Sintesis
1. Fase diam: Silika Gel F 254, Fase gerak: etil asetat : aseton (4:6).
2. Fase diam: Silika Gel F 254, Fase gerak: n - heksana : kloroform : etanol (3:2:5)
3. Fase diam: Silika Gel F 254, Fase gerak: n - heksana : etil asetat (6:4).
Gambar 3. Spektra Inframerah O-(isoleusil) parasetamol
Gambar 4. Spektra 1 H-NMR O-(isoleusil) parasetamol
Aktivitas analgesik dilaksanakan dengan menggunakan metode hot plate dengan dosis baik untuk senyawa uji maupun pembanding adalah 12,5; 25; 50; 100; 200 mg/kg BB. Berdasarkan data yang didapat, peningkatan dosis parasetamol dan O-(isoleusil)  parasetamol 12,5 –  200 mg/kg BB disertai dengan peningkatan waktu respon mencit terhadap stimulasi panas. Pada senyawa O- (isoleusil)  parasetamol rata-rata waktu respon mencit terhadap stimulasi panas lebih tinggi di semua dosis dibandingkan dengan waktu respon rata-rata kelompok parasetamol, sehingga dapat disimpulkan bahwa aktivitas analgesik O-(iso- leusil)  parasetamol lebih besar dibandingkan parasetamol (Gambar 6). Berdasarkan dari uji Tu- key HSD 5% menunjukkan bahwa aktivitas analgesik antara kedua senyawa tidak memiliki perbedaan yang bermakna di seluruh kelompok dosis. Hal ini disebabkan karena, pembentukan gugus ester pada senyawa O-(isoleusil)  para- setamol memang benar dapat meningkatkan aktivitas analgesik, yang ditunjukkan dengan ada- nya peningkatan waktu respon mencit terhadap stimulasi panas disetiap dosis apabila dibanding- kan dengan parasetamol, tetapi peningkatan aktivitas analgesik tersebut juga diikuti dengan peningkatan efek halangan ruang oleh karena
adanya ester pada gugus –OH parasetamol ter- sebut. Nilai ED 50 senyawa O-(isoleusil)  para- setamol lebih rendah (59 mg/kgBB) dibandingkan dengan  parasetamol  (66 mg/kgBB)  yang dapat disimpulkan bahwa senyawa hasil sintesis me- miliki aktivitas yang lebih tinggi jika dibanding- kan dengan parasetamol. Meskipun nilai ED 50 O- (isoleusil)  parasetamol lebih rendah dibanding parasetamol, tetapi berdasarkan perhitungan statistik dengan uji Tukey HSD 5% menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan bermakna antara aktivitas analgesik O-(isoleusil)  parasetamol de- ngan parasetamol  akibat adanya efek halangan sterik.
Gambar 5. Struktur Senyawa O-(isoleusil) parasetamol

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian di atas maka dapat disimpulkan bahwa senyawa turunan para- setamol yaitu O-(isoleusil)  parasetamol dapat di-
sintesis melalui reaksi asilasi antara parasetamol dan isoleusil klorida. Senyawa turunan tersebut memiliki aktivitas analgesik yang sebanding de- ngan parasetamol.

## DAFTAR PUSTAKA
Clark, R., Fisher, JE., Sketris, IS, Johnston, GM.  2012. Population prevalence of high dose paracetamol in dispensed paracetamol/opioid prescription combinations: an obser- vational study, BMC Clin Pharmacol .  12: 11. Published 2012 Jun 18. doi:10.1186/1472-6904-12-11.
Jesse, C., Victor, N., Steven, H., Jeffrey, R., Paul, A., Simona, R.  2017.  Patterns of Acetaminophen Use Exceeding 4 Grams Daily in a Hospitalized Population at a Tertiary Care Center, Gastroenterlogy and Hepatology . 10(1): 27 – 34.
Li, J. dan Sha Y. 2008. A convenient synthesis of amino acid methyl esters, Molecules .  13(5):1111-1119. doi:10.3390/ molecules13051111.
Marrie, ACB., Terry, LS., Barbara, GW., Patrick, MM., Jill, MK. dan  Joseph, TD.  2016.
Pharmacotherapy Principles &
Practice , 4th ed,  New York: McGraw-Hill Medical.  pp 521 – 522.
Pavia, DL., Lampman, GM., Kriz, GZ., Vyvyan, JR. 2009.
Introduction to Spectroscopy , 4 th ed, America: Bellmont, pp 185 – 190.
Ramachandran, A.  dan  Jaeschke, H. 2017.  Mechanisms of acetaminophen hepatotoxicity and their translation to the human pathophysiology, Journal of Clinical and Translational Research . 3(S1): 157 – 169.
Silverstein, RM., Websrer, FX., Kiemle, DJ. 2005. Spectrometric  Identification of Organic Compounds , 7 th ed, America: John Wiley & Sons, Ltd, pp 198 – 200.
Siswandono, S 2016, Kimia Medisinal ,  2 nd ed. Surabaya: Airlangga University Press, pp 344 – 345.
Zuffanti, S 1948, Preparation of acyl  chloride with thionyl chloride. Journal of Chemical Education. 25(9): 481.