## CAR-T-ICI: KOMBINASI CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T-CELL DENGAN IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR ANTI PD-1 SELAKU PILIHAN TERAPI TERBARU KANKER

## KOLOREKTAL
Eddy Zulfikar 1 , Imam Hermansyah 1
1 Program Studi Profesi Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin, Makassar

## ABSTRAK
Pendahuluan :  Kanker  kolorektal  selaku  keganasan  ketiga  tersering  di dunia  umumnya  ditangani  dengan  operasi,  radioterapi,  maupun kemoterapi  berdasarkan  stadium  penyakitnya.  Namun,  akibat  prosedur invasif  dan  efek  samping  yang  ditimbulkan  oleh  terapi  tersebut, Chimeric Antigen  Receptor  (CAR)  T-cell hadir  sebagai  pilihan  terapi  terbaru  yang bersifat  lebih  spesifik  terhadap  sel  tumor.  Efektivitas CAR  T-cell untuk mengobati  tumor  padat  masih  terbatas  oleh  karena  molekul  imun inhibitorik, Programmed  Cell  Death-1 (PD-1)  yang  memiliki  efek imunosupresif  terhadap  sel  T.  Oleh  karena  itu,  penyusunan literature review ini  bertujuan  untuk  mengkaji  potensi  terapi  kombinasi  imunoterapi CAR-T cell dengan anti PD-1 dalam pengobatan kanker kolorektal stadium lanjut.
Metode: Literature review ini disusun menggunakan metode studi pustaka hingga diperoleh sebanyak  31 jurnal yang memenuhi kriteria . Hasil  dan Pembahasan: Berdasarkan  studi  sebelumnya,  ekspresi EpCAM  dalam  jumlah  tinggi  ditemukan  pada  sel  kanker  kolorektal. Sekresi IFN- γ dan TNF- α dalam  jumlah  yang  tinggi  ditemukan  pada  sel tumor  EpCAM  positif  menunjukkan  bahwa  EpCAM- CAR-T  cell memiliki efek  sitotoksik  spesifik terhadap  sel tumor  target.  Rata-rata  volume tumor kolorektal  pada  kelompok  EpCAM CAR-T  cell lebih  rendah  dibanding kontrol, menunjukkan EpCAM-CAR- T cell mampu menghambat pembentukan  dan  pertumbuhan  sel  tumor.  Di  sisi  lain,  35,8%  pasien kanker  kolorektal  metastasis  diketahui  memiliki objective  response  rate dan  73,6%  diantaranya  tercatat  memiliki disease  control  rate ≥12 minggu setelah  terapi  anti  PD-1  nivolumab,  menunjukkan  efektivitas  nivolumab dalam pengendalian penyakit jangka panjang dengan  masa survival yang lebih lama pada pasien kanker kolorektal metastasis.
Simpulan :  Kombinasi  imunoterapi  EpCAM  CAR- T  cell dengan  anti  PD-1 memiliki  potensi  sebagai  pengobatan  terbaru  yang  efektif  untuk  kanker kolorektal stadium lanjut.
Kata kunci: Anti PD-1, CAR-T cell , imunoterapi, kanker kolorektal
Korespondensi:

## Imam Hermansyah
Email author: imamher5@gmail.com

## Riwayat Artikel
Diterima: 20 Maret 2021 Selesai revisi: 6 Juli 2021
DOI :
10.53366/jimki.v9i1.339

## JIMKI : JURNAL ILMIAH
INDONESIA
CAR-T-ICI: COMBINATION OF CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T-CELL WITH ANTI PD-1 IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR AS A NOVEL TREATMENT FOR COLORECTAL CANCER

## ABSTRACT
Background:  Colorectal  cancer  (CRC)  as  the  third  most  common  malignancy  in  the world is generally treated by surgery, radiotherapy, or chemotherapy based on the stage of the cancer. However, due to the invasive procedures and adverse reactions, scientists are  developing  treatment  advancements  with  immunotherapy,  especially  Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-cell which is considered more specific to tumor cells. However, the effectiveness of CART-T cells to treat solid tumors is still limited by Programmed Cell Death-1  (PD-1)  through  its  immunosuppressive  effect  on  T  cells,  hence  the  addition  of anti  PD-1  to  CAR-T  cells  treatment  is  deemed  necessary  to  increase  its  therapeutic potential.
Objective: To discuss the potential of CAR-T cell in combination with anti PD-1 therapy for treatment of CRC.
Method: The review materials used in this paper were taken from 31 journals that meet the criteria of literature searching.
Results  and  Discussion:  Based  on  previous  studies,  high  level  of  IFN- γ  and  TNF-α secretions were found in Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) tumor cells, showing that EpCAM-CAR-T cells have specific cytotoxic effect on target tumor cells. The average colorectal  tumor  volume  in  the  EpCAM-CAR-T  cell  group  was  lower  than  the  control group,  indicating  that  EpCAM-CAR-T  cells  were  able  to  inhibit  both  the  formation  and growth  of  tumor  cells.  On  the  other  hand,  administration  of  anti  PD-1,  nivolumab  for metastasis  CRC  shows  a  durable  responses  and  disease  control,  as  well  as  long-term survival.
Conclusion:  The  combination  of  EpCAM-CAR-Tcell  immunotherapy  with  anti  PD-1 nivolumab could be an effective potential novel treatment for CRC.
Keywords: anti PD-1, CAR-T cell, colorectal cancer, immunotherapy
1. PENDAHULUAN
Kanker kolorektal merupakan penyakit  keganasan  ketiga  tersering  di dunia  dengan  1,4  juta  kasus  baru  yang terdiagnosis tiap tahunnya [1] . Data epidemiologi kanker kolorektal menunjukkan  bahwa  risiko  mengalami kanker  ini  sebesar  1  dari  20  orang dengan risiko yang lebih rendah ditemukan  pada  wanita  dibandingkan pria.  Di  Indonesia,  pada  tahun  2018 dilaporkan  bahwa  insidensi  kanker kolorektal  ialah  sebesar  12,8  per 100.000 penduduk usia dewasa [2] . Sekitar 9,5% dari seluruh mortalitas kasus  kanker  disebabkan  oleh  kanker kolorektal.  Kanker  kolorektal  adalah penyakit  keganasan  yang  berasal  dari jaringan  usus  besar  yang  terdiri  dari kolon  dan/atau  rektum [2] .  Pengobatan yang  tersedia  untuk  kanker  kolorektal
saat  ini  meliputi  operasi  pada  stadium awal, diikuti dengan kemoterapi dan/atau radioterapi untuk stadium lebih lanjut  yang  diketahui  bahwa  sejumlah penanganan  tersebut  bersifat  invasif dan  memiliki  beberapa  efek  samping yang kurang menguntungkan bagi pasien [3] .  Oleh  karena  itu,  di  samping tatalaksana dengan operasi,
kemoterapi,  dan  radioterapi,  kebutuhan akan  pengobatan  dengan  imunoterapi hadir  untuk  melengkapi  pilar  standar penanganan kanker kolorektal [4] . Diantara  berbagai  macam  pilihan imunoterapi  yang  sedang  berkembang, Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-cell merupakan  jenis  imunoterapi  yang sedang  populer  dalam  beberapa  tahun terakhir  terkait  perkembangan  terapi melawan kanker. CAR merupakan reseptor  imun  yang  dibuat  secara
khusus  di  laboratorium  yang  mampu memodifikasi limfosit untuk menargetkan  dan  mengeliminasi  sel yang  mengekspresikan  antigen  spesifik pada  permukaannya,  sedangkan  sel  T,
baik  yang  diperoleh  dari  darah  pasien sendiri  ( autologous )  maupun  dari  donor yang  sehat  ( allogeneic )  direkayasa secara  genetik  untuk  mengekspresikan CAR yang spesifik. Oleh karena sifatnya itu, CAR-T  cell kini  didesain  secara khusus  untuk  menargetkan  antigen spesifik dari sel tumor, bukan sel normal yang  sehat [5] ,  dan  sejak  tahun  2017, dikarenakan  efektivitasnya, CAR-T  cell telah  disetujui  oleh Food  and  Drug Administration (FDA)  untuk  pengobatan dua  penyakit  keganasan  hematologis yakni acute  lymphoblastic  leukemia dan lymphoma [6] . Walaupun  hasil  yang  menjanjikan berhasil  dicapai  pada  pengobatan  jenis kanker hematologis, efektivitas
imunoterapi CAR-T cell untuk mengobati tumor  padat  masih  terbatas [7] .  Hal  ini dikarenakan  adanya  hambatan  biologis yang terdapat pada Tumor Microenvironments (TME) [8] yang  terdiri atas sel imun, sitokin, dan molekul imun inhibitory beserta faktor inhibitory lainnya,  selain  sel  tumor  itu  sendiri [9] .
Diantara berbagai molekul imun
inhibitory yang  berperan, Programmed Cell Death-1 (PD-1) merupakan molekul immune checkpoint yang mampu menghambat  proliferasi  sel  T  dan Tumor-Infiltrating  Lymphocytes  (TILs) pada jaringan perifer yang menyebabkan  resistensi  imun  pada TME sehingga sering digunakan sebagai  target  terapi [10] .  Terapi  dengan menargetkan PD-1 yang dikenal sebagai Immune  Checkpoint  Inhibitor (ICI) telah terbukti efektif pada pengobatan  melanoma  stadium  lanjut, Merkel  cell  carcinoma,  non-small  cell lung  cancer,  cutaneous  squamous  cell carcinoma,  urothelial  cancer,  renal cancer,  refractory  Hodgkin  lymphoma,
hepatocellular carcinoma, gastric cancer,  triple-negative  breast  cancer, dan microsatellite  instability  (MSI)-high tumors sehingga  kini  dijadikan  sebagai terapi  integrasi  dalam  regimen  standar pengobatan berbagai kanker tersebut [11] .
Yeku, et.  al (2017)  menyatakan bahwa untuk meningkatkan luaran klinis penanganan  tumor  padat  dengan CAR- T  cell ,  perlu  dilakukan  modifikasi  pada CAR-T  cell yakni  menggabungkannya dengan  molekul co-stimulator ,  ligan, terapi target, atau agen imunomodulator [12] . Lebih lanjut, sehubungan dengan efektivitas anti PD-
1,  dalam  penelitian  Cherkassky et.  al (2016)  dijelaskan  bahwa  kombinasi CAR-T  cell dengan  anti  PD-1/PD-L1 diyakini  mampu  meningkatkan  potensi CAR-T  cell dalam  pengobatan  tumor padat [13] .   Berdasarkan  konsep  masalah tersebut,  pada literature  review ini  akan dibahas mengenai potensi terapi
kombinasi  immunoterapi CAR-T  cell dengan Immune  Checkpoint  Inhibitor , khususnya  anti  PD-1/PD-L1  sebagai pilihan  terapi  terbaru  dalam  pengobatan kanker kolorektal.

## 2. METODE
Literature review ini disusun menggunakan  metode  studi  pustaka dengan mengumpulkan dan
menganalisis  berbagai  referensi  yang valid  terkait  potensi  terapi  kombinasi imunoterapi CAR-T cell dengan Immune Checkpoint Inhibitor (ICI) khususnya anti PD-1 sebagai pilihan pengobatan terbaru  kanker  kolorektal.  Data  statistik pada literature review ini bersumber dari laman  resmi  Kemenkes  RI  dan  WHO. Adapun  sebagian  besar  jurnal  diperoleh melalui  database PubMed dengan  kata kunci pencarian berupa CAR-T,
colorectal cancer, dan anti PD-1 sehingga  ditemukan  total  66  jurnal penelitian  publikasi  10  tahun  terakhir yang  relevan  dengan  kata  kunci  dan hanya  31  jurnal  yang  memenuhi  kriteria untuk dikaji lebih lanjut.

## 3. PEMBAHASAN
3.1. Chimeric  Antigen  Receptor

## (CAR) T-cell Therapy
Tujuan  utama  dari  penelitian CAR- T  cell adalah  untuk  menemukan  fungsi aktif  dari  limfosit  T  dalam  menargetkan dan membunuh sel kanker. Terapi CAR- T  cell berkerja  dengan  memanipulasi sistem  imun,  yakni  sel  T  direkayasa secara  genetik  untuk  mengekspresikan imunoreseptor (CAR)  khusus  yang
kemudian memberikan kemampuan bagi  sel  T  tersebut  untuk  menargetkan protein spesifik pada sel kanker. Misalnya,  CD19 CAR-T  cell telah didesain  untuk  mengekspresikan  CAR spesifik  antigen  CD-19  yang  keduanya ditemukan  berperan  dalam  kejadian limfoma  dan  leukimia.  Berbeda  dengan struktur  reseptor  sel  T  klasik  yang memiliki  rantai  alfa  dan  beta  intraseluler ganda yang dihubungkan oleh kompleks CD3  dan  dilengkapi  dengan Major Histocompatibility Complex (MHC), reseptor  pada  CAR  memiliki  domain ekstraseluler  yang  terdiri  atas single ‐ chain variable fragment (scFv) dan tidak memerlukan  MHC  untuk  menargetkan antigen spesifik pada sel kanker [14] .
Terapi CAR-T  cell merupakan metode imunoterapi terpersonalisasi yang  memiliki  langkah-langkah  tertentu untuk  implementasinya  dalam  dunia medis.  Untuk  lebih  jelasnya,  proses keseluruhan  terdiri  dari  ekstraksi  sel  T
normal  dari  darah  perifer  pasien  yang diperoleh melalui leukopheresis , kemudian imunoreseptor khusus  (CAR) diintegrasikan  ke  sel  T  tersebut  di laboratorium,  lalu  diikuti  oleh  proses in vitro untuk pembibitan dan penggandaan CAR-T cell .  Terakhir,
CAR-T  cell yang  telah  diperbanyak kemudian dimasukkan kembali ke tubuh pasien secara intravena sambil memantau efek samping akut pengobatan seperti demam tinggi, kesulitan  bernapas,  mual  muntah  berat, dan  nyeri  otot  serta  nyeri  sendi  yang merupakan  gejala-gejala  dari Cytokine Releases  Syndrome (CRS).  Setelah proses  re-infus, CAR-T  cell yang  telah direkayasa secara khusus akan berproliferasi  dan  membunuh  sel-sel tumor yang mengandung antigen spesifik  yang  menjadi  sasaran  CAR [15] . Untuk alur pembuatan CAR-T cell dapat dilihat pada gambar 1 .
Gambar 1 . Prosedur Pembuatan dan Penggunaan CAR-T cell Selaku Imunoterapi [15]
Berdasarkan  struktur  dan  metode produksinya, telah terdapat empat generasi dari CAR-T cell yang berkembang hingga saat ini. CAR-T cell generasi pertama hanya mengekspresikan  molekul  CD3ζ  untuk penghantaran  sinyal  dan  dibuktikan gagal  dalam  berbagai  penelitian [16] .
CAR-T  cell generasi  kedua  dan  ketiga sela in  mengekspresikan  molekul  CD3ζ juga  diketahui  memiliki  molekul-molekul co-stimulatory seperti  CD28,  4 ‐ 1BB, OX40  dan  CD27  yang  berfungsi  untuk memacu produksi sitokin dan merupakan CAR-T  cell yang  sekarang paling banyak digunakan dalam
penelitian  terkait  pengobatan  tumor.
Sedangkan CAR-T cell generasi keempat yang memiliki tambahan struktur  IL-2  dan  IL-12  masih  dalam
tahap  pengembangan  lebih  lanjut [17] . Struktur  dari  masing-masing  generasi CAR T-cell dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 2 . Struktur CAR-T cell dari Berbagai Generasi [17]
3.2. Programmed Cell Death-1 (PD- 1)  Selaku  Target  Terapi  pada  Tumor Microenvironment (TME) Jaringan tumor padat yang terbentuk  tidak  hanya  mencakup  sel-sel tumor,  tetapi juga  sel-sel  imun inhibitory
(sel T regulator, tumor-associated macrophages, myeloid-derived
suppressor cells ), sitokin inhibitory (IL-4,
IL-6,  Il-10  dan  TGF ‐ β),  molekul  imun inhibitory (PD-1,  CTLA-4,  LAG3,  dan Tim3) dan faktor-faktor inhibitory lainnya (stress  oksidatif,  keterbatasan  nutrisi, pH  yang  terlalu  asam,  dan  hipoksia) yang  keseluruhan  komponen  tersebut membentuk Tumor  Microenvironment (TME) [18] .  TME  inilah  yang  diduga menyebabkan  penurunan  infiltrasi  sel- sel  imun  dan  menghambat  fungsi  sel imun pada jaringan tumor padat sehingga  berujung  pada  terbebasnya sel-sel  tumor  dari  sistem  kekebalan tubuh [19] .
Pada  kondisi  fisiologis,  sel  T bersirkulasi  di  seluruh  tubuh  untuk mengenali  antigen  dari  patogen  yang terdapat pada permukaan Antigen Precenting  Cells (APCs).  Perlekatan antara  reseptor  sel  T  (TCR)  pada  sel  T helper CD4  dan  sel  T  sitotoksik  CD8 dengan  antigen  yang  diikat  oleh  MHC pada permukaan APC merupakan sinyal pertama  untuk  aktivasi  sel  T  selama
respon imun berlangsung. Selain itu, sel T membutuhkan beberapa sinyal sekunder  dari  reseptor co-stimulatory agar  bisa  teraktivasi.  Interaksi  antara reseptor co-stimulatory tersebut  dengan ligannya  pada  APC  mengakibatkan transmisi sinyal aktivasi maupun toleransi pada sel T [18] . Molekul co-stimulatory pada  sel  T meliputi  CD28  dan Inducible  T  Cell  Co- Stimulator (ICOS)  yang  masing-masing berikatan dengan B7-1 (CD80) atau B7- 2  (CD86)  pada  permukaan  APC  dan ligan ICOS (ICOSL). Sebaliknya,
molekul co-inhibitory pada sel T diantaranya Cytotoxic  T  Lymphocyte Antigen  4 (CTLA-4)  dan Programmed Cell Death-1 (PD-1) atau (CD 279). PD- 1  berikatan  dengan  ligannya  yakni  PD- L1  (B7-H1/CD274)  yang  terdapat  pada sel  target,  termasuk  sel  tumor 18 .  Sel tumor  dan  beberapa  sel  stroma  yang terkait  dapat  mengekspresikan  PD-L1 yang  distabilkan  oleh Tumor  Necrosis Factor Alpha (TNF- α) [19] dan
menyebabkan penekanan pada imunitas anti-tumor [20] .    Selama  aktivasi  sel  T, PD-1  terekspresikan  pada  permukaan sel T dan menyebabkan kelelahan pada sel  T.  Ekspresi  PD-1  juga  ditemukan pada  permukaan  limfosit  B  dan  sel Natural  Killer (NK),  namun  secara dominan,  lebih  mempengaruhi  ekspresi
sel  T  CD8  selaku  garis  pertahanan pertama  melawan  sel  tumor [21] .  Pada kondisi  normal,  ekspresi  dari  PD-1 memiliki aktivitas utama berupa transmisi  sinyal  penghambat  ( inhibitory ) selama  respon  imun  sel  T  berlangsung. Hal  ini  terjadi  melalui  mekanisme down- regulation dari Casein  Kinase 2  (CK  2) yang  berperan  dalam  fosforilasi  domain regulatorik dari protein PTEN ( phosphatase  and  tensin  homologue deleted  on  chromosome  10 )  dan menyebabkan terminasi secara bertahap  dari  aktivitas phosphoinositide 3-kinase (PI3K) yang akhirnya menghambat Cyclin-Dependent  Kinase (CDK)  dan  mengontrol  tingkat  ekspresi dari  reseptor  di  permukaan  sel  T [22] . Mekanisme kerja PD-1 dalam menghambat aktivitas sel T dapat dilihat pada gambar 3 .
Gambar 3 . Mekanisme Kerja PD-1
dalam Menghambat Aktivitas Imun Sel T 3 3.3. Potensi Epithelial Cell Adhesion  Molecule - Chimeric  Antigen Receptor –modified  T  cells  (EPCAM- CAR-T  cells)  sebagai  Imunoterapi

## Terbaru Kanker Kolorektal
Seperti  yang  telah  diketahui,  terapi CAR-T  cell bekerja  berdasarkan  hasil rekayasa genetik sel T untuk mengekspresikan imunoreseptor (CAR) khusus yang bertujuan untuk memberikan  kemampuan  bagi  sel  T tersebut  untuk  menargetkan  protein spesifik  pada  sel  tumor.  Pemilihan imunoreseptor (CAR)  khusus  sangat berperan  dalam  tingkat  kesuksesan
terapi CAR-T  cell 14 .  Saat  ini,  salah  satu kandidat  antigen  target  pada  sel  kanker kolorektal  dengan  terapi CAR-T  cell ialah Epithelial  Cell  Adhesion  Molecule (EpCAM) [23] .
Saat  ini  EpCAM  lebih  dikenal sebagai  biomarker  untuk Circulating Tumor  Cells (CTCs)  dan Cancer  Stem Cells (CSCs).  Diketahui  pula  bahwa EpCAM turut berperan dalam proliferasi,
survival dan  metastasis  sel  kanker.
EpCAM merupakan glikoprotein transmembran  yang  dapat  ditemukan pada  sel  kanker  kolorektal [24] .  Zhang et.al (2019) berhasil membuktikan bahwa  ekspresi  EpCAM  yang  lebih tinggi  ditemukan  pada  sel  kanker kolorektal HT29 dan SW480 jika dibandingkan  dengan  sel human  non- small  cell  lung  cancer (NSCLC)  A549
dan  kanker  payudara  MDAMB231  yang tercatat hanya memiliki ekspresi EpCAM moderat  dan  sel  kanker  serviks  hela yang  tidak  memiliki  ekspresi  EpCAM sama  sekali.  Melihat  potensi  tersebut, Zhang et.  al kemudian  melanjutkan penelitian  untuk  menguji  efek  antitumor CAR-T  cell terhadap  perkembangan kanker  kolorektal  dengan menggunakan EpCAM  sebagai  target  reseptor  spesifik dari CAR-T cell . Pada penelitian berbasis in vivo , zhang et al menggunakan CAR-T  cell generasi ketiga yang reseptornya telah dimodifikasi menggunakan EpCAM dengan lentivirus sebagai  vektornya pada  tikus  betina  NOD/SCID  BALB/c (usia  5-8  minggu)  yang  telah  diinduksi dengan  sel  kanker  kolerektal  HT29  dan SW 480 [23] . EpCAM- CAR-T cell generasi ketiga tersebut  kemudian  dikonstruksi  dengan komponen  sinyal  peptida  dari  hIL-2, anti-EpCAM  scFv ,  CD8α- hinge ,  CD8α transmembran (CD8α-TM), co-
stimulatory CD28  dan  4-1BB,  serta human CD3ζ  domain  (gambar  4a  dan 4b). scFv memiliki peran untuk berikatan dengan  antigen  sel  tumor. CD8α- hinge berperan dalam dimerisasi CAR. CD8α- TM  berfungsi  melekatkan  CAR  pada membran  limfosit.  CD28  dan  4-1BB merupakan  molekul co-stimulatory yang dapat  meningkatkan  potensi  aktivitas sitotoksik  dan  kapasitas  proliferasi  sel  T serta  memperpanjang  waktu  masa
hidup  sel  T [25] .  Terakhir, CD3ζ  berperan dalam  transmisi  sinyal  yang  dihasilkan oleh  ikatan  antigen  dengan  scFv.  Gen EpCAM -CAR-T cell yang telah terbentuk kemudian  disisipkan  ke  dalam  vektor lentivirus pWPXLD dengan menggunakan  enzim  BamHI  dan  EcoRI ( gambar 4c ). [23]
Gambar 4 . Konstruksi Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM)- Spesific Chimeric Antigen Receptor (CAR) T- cell (A dan B) dan Penyisipan Gen EPCAM- CAR-T cell pada Vektor Lentiviral (C) [23]
Sehubungan dengan pengujian potensi EpCAM- CAR-T cell dalam mengobati  kanker  kolorektal,  Zhang,  et. al  kemudian  membagi  penelitiannya  ke dalam  dua  aspek  pengujian,  yakni  efek sitotoksik dan antitumor EpCAM- CAR-T cell terhadap  sel  kanker  kolorektal  yang diujikan [23] .
3.3.1.  EpCAM-CAR-T  Meningkatkan
Efek  Sititoksik  Spesifik  terhadap  Sel Target EpCAM Dependen Dalam rangka mengetahui kemampuan  EpCAM- CAR-T  cell dalam mengenali  tumor  spesfik  pengekspresi EpCAM,  maka  Zhang et  al (2019) menginkubasikan EPCAM-CAR-T  cell pada  berbagai  jenis  sel  tumor  dengan tingkat  ekspresi  EpCAM  berbeda-beda
seperti  yang  telah  disebutkan  di  atas ( Effector:Target /E:T ratio =5). Dua puluh jam  setelah  inkubasi,  jumlah  sitokin yag disekresikan  oleh  efektor  yaitu  IFN- γ dan  TNF- α  kemudian  diukur  dengan ELISA. Hasilnya kemudian dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol MOCK T (No-CAR ) cell [23] .
Grafik 1 . Perbandingan EpCAM- CAR-T cell dan No-CAR T-cell dalam Sekresi IFN- γ dan TNF-α pada Berbagai Jenis Sel Tumor dengan Tingkat Ekspresi Reseptor EpCAM yang Berbeda [23]
Dalam  penelitian  tersebut  diperoleh hasil  bahwa CAR-T  cell mampu  secara spesifik mengenali sel-sel tumor dengan ekpresi EpCAM positif (A549, MDA-MB- 231,  SW480  dan  HT29).  Hal  ini diketahui  melalui  sekresi  IFN- γ  dan TNF- α  dalam  jumlah  yang  tinggi  pada EPCAM-CAR-T cell dibandingkan dengan MOCK  T  (No-CAR)  cell pada jenis  sel  kanker  kolorektal  HT29  dan SW480,  sel  NSCLC  A549  serta  sel kanker  payudara  MDA-MB-231  (P<0,05 = A549, MDA-MB-231; P<0,01= SW480, HT29), yang mana diketahui bahwa IFN- γ  dan  TNF-α  merupakan  sitokin  pro- inflamasi  yang  dilepaskan  oleh  sel  T
sebagai  respon  melawan  sel  tumor maupun  patogen.    Sedangkan  pada  sel tumor  dengan  ekspresi  EpCAM  negatif (Hela), tidak ditemukan adanya perbedaan signifikan level sekresi IFN- γ dan  TNF- α  antara  kelompok  EpCAM-
CAR-T  cell dan  kelompok  No-CAR  T. Berdasarkan  temuan  ini,  Zhang et  al (2019)  menegaskan  bahwa EPCAM- CAR-T  cell mampu  bekerja  secara spesifik  dengan  menargetkan  EpCAM pada permukaan sel tumor ( Grafik 1 ) [23] . Selanjutnya, untuk menguji kemampuan  sitotoksik  EpCAM- CAR-T cell terhadap  sel  kanker  kolorektal,
dilakukan  evaluasi  kadar  sitotoksisitas pasca terapi EpCAM- CAR-T cell menggunakan 51 Cr release assay secara in  vitro .  Rasio  jumlah  EpCAM- CAR-T  cell terhadap  sel  tumor direpresentasikan  oleh Effector:Target (E:T)  ratio yang  mana  sampel  dengan
E:T ratio yang lebih besar akan memiliki konsentrasi    EpCAM- CAR-T  cell yang lebih  tinggi  (10:1>5:1>2,5:1).  Hasilnya, tampak  bahwa  efek  sitotoksik  litik  pada EpCAM- CAR-T  cell meningkat  seiring dengan  bertambahnya  jumlah  ekspresi EpCAM  pada  sel  kanker  kolorektal HT29  dan  SW480,  sedangkan  pada  sel tumor  EpCAM  negatif  (Hela),  tidak ditemukan  adanya  aktivitas  sitotoksik yang  signifikan  dari EPCAM-CAR-T  cell (Grafik  2).  Hal  ini  membuktikan  bahwa EpCAM- CAR-T  cell secara  spesifik memiliki efek sitotoksik litik terhadap sel kanker  kolorektal  yang  efektivitasnya bertambah seiring dengan makin banyaknya  efektor  ( CAR-T  cell )  yang bekerja selama respon imun berlangsung [23] .
Grafik 2 . Efek Sitotoksik Litik EpCAM- CAR-T cell pada Berbagai Jenis Sel Tumor dengan Tingkat Ekspresi Reseptor EpCAM yang Berbeda [23] .
3.3.2.  EpCAM-CAR-T Menghambat
Pertumbuhan  Tumor  pada  Tikus dengan Kanker Kolorektal
Untuk  mengetahui  kemampuan EPCAM-CAR-T cell dalam menghambat pertumbuhan  tumor  secara in  vivo ,  dua jenis sel tumor kanker kolorektal dengan ekspresi EpCAM yang tinggi, yaitu HT29 dan SW 480 dipilih sebagai model tumor xenograf . Kemudian sebanyak 5×10 6 sel tumor diinokulasikan pada tikus NOD/SCID  BALB/c.  Hewan  uji  coba tersebut  lalu  dibagi  menjadi  3  kelompok perlakuan dengan
masing-masing diberikan  2×10 7 EpCAM- CAR-T  cell , MOCK  T-cell dan normal  saline (NS group)  secara  bersamaan  ketika  sel tumor diinokulasikan pada tikus. Ukuran volume  tumor  kemudian  diukur  dengan kaliper  pengukur  tiap  3  hari  setelah tumor  mulai  teraba [23] .  Untuk  hasil pengukuran  volume  tumor  dapat  dilihat pada grafik 3 . Berdasarkan grafik 3 , terlihat bahwa pada  hari  ke  26  rata-rata  volume  tumor kolorektal  HT29  pada  kelompok  yang
diberi  EpCAM- CAR-T  cell yaitu  313±92 mm 3 . Hasil ini secara signifikan berbeda dibandingkan  dengan  kelompok  yang diberi MOCK  T-cell dengan  volume mencapai  725±125  mm 3 dan  800±170 mm 3 pada  tikus  yang  diberi normal saline (p<0,05). Hal serupa juga didapatkan  pada  tikus  yang  diinduksi dengan  sel  kanker  kolorektal  SW480. Terlihat pada grafik bahwa pada  hari ke 32  rata-rata  volume  tumor  kolorektal SW480  pada  kelompok  yang  diberi EpCAM- CAR-T  cell yaitu  159±73  mm 3 . Hasil  ini  secara  signifikan  berbeda dibandingkan  dengan  kelompok  yang diberi MOCK  T-cell dengan  volume mencapai  407±75  mm 3 dan  710±108 mm 3 pada  tikus  yang  diberi normal saline (p<0,05). Berdasarkan hasil tersebut, Zhang et al (2019)
menyimpulkan  bahwa  EpCAM- CAR-T cell mampu  menghambat  pembentukan dan  pertumbuhan  kanker  kolorektal HT29  dan  SW480  secara  signifikan pada model xenograf [23] .
Grafik 3 . Kemampuan EPCAM-CAR-T cell dalam Menghambat Pertumbuhan Tumor pada Tikus dengan Kanker Kolorektal. Volume Tumor Diukur Tiap 3 Hari (A dan C).  Rerata Volume Tumor pada Akhir Perlakuan (B dan D) [23]
3.4. Peran  anti  PD-1  (Nivolumab) Sebagai Immune Checkpoint Inhibitor pada Terapi Kanker Kolorektal Metastasis Saat  ini,  standar  perawatan  untuk pasien  kanker  kolorektal  metastasis (mCRC)  yang  tidak  memenuhi  syarat pembedahan ialah dengan terapi paliatif menggunakan regimen kemoterapi berbasis fluorouracil dengan  kombinasi anti-angiogenesis  atau  anti- epidermal growth  factor  receptor [26] .  Meskipun dengan  sejumlah  pilihan  terapi  sistemik mCRC  yang  tersedia,  tingkat survival sampai  5  tahun  hanya  sekitar  13,5% [27] . Hal  ini  erat  kaitannya  dengan  sifat kanker kolorektal yang merupakan salah satu  bentuk  kanker  yang  ditandai  oleh berbagai  macam  kelainan  genetik  dan epigenetik.  Salah  satu  penyebab  utama dari  hipermutasi  pada  kanker  kolorektal adalah  adanya  defisit  dari  sistem Mismatch Repair Deficien t (dMMR) DNA yang mengakibatkan terbentuknya Microsatellite  Instability-High (MSI-H) tumor yang secara kuat mengekspresikan  protein immunological checkpoint ,  termasuk Programmed  cell death-1 (PD-1) [28] .
Bukti  terbaru  menyebutkan  bahwa pasien dengan tipe mCRC DNA dMMR/(MSI-H)  merupakan  kelompok yang  hanya  sedikit  menerima  manfaat dari kemoterapi konvensional dan memiliki overall survival (OS) yang lebih pendek  dibanding  pasien  dengan  tipe mCRC proficient MMR  (pMMR) [29] oleh karena  beban  mutasi  dan  kelebihan neoantigen  tumor  beserta  infiltrasi  sel imun  yang  lebih  padat [30] .  Sehubungan dengan  itu,  dalam  rangka  mengatasi masalah yang ditimbulkan oleh interaksi PD-1/PD-L1 sekaligus mengurangi kasus  rekurensi  pada  kelompok  tumor ini,  pengobatan  berbasis  imunoterapi dengan  menargetkan  PD-1  pada  sel imun dinilai dapat memberikan keuntungan [28] .  Potensi  terapi  anti  PD-1 tersebut kemudian mendorong Overman et.  al untuk  melakukan  penelitian  yang berfokus  pada  analisis  potensi  anti  PD- 1,  yakni  nivolumab  dalam  mengobati kanker kolorektal metastasis tipe dMMR MSI-H [31] . Dalam  penelitian multicenter open- label  nonrandomized yang  dilakukan
oleh Overman et al , sebanyak 53 pasien (umur  ≥18  tahun)  terkonfirmasi  mCRC rekuren  dengan  tipe  dMMR/MSI-H  yang telah  menerima  terapi  sebelumnya diberikan  perlakuan  berupa  pemberian nivolumab  sebanyak  3  mg/kgBB  tiap  2 minggu.  Respon  terapi  kemudian  mulai diukur  pada  28  hari  setelah  dosis pertama,  tiap  6  minggu  selama  24 minggu  dan  tiap  12  minggu  setelahnya menggunakan analisis penilaian RESCIST  v1.1 .  Hasilnya  dapat  dilihat pada tabel di bawah [31] .
Tabel 1 . Respon Pengobatan Nivolumab pada mCRC Tipe
dMMR/MSI-H [31] Patients n (%) dMMR/MSI-H per central assessment (N=53) Objective response rate [95% CI] 19 (35.8) [23.1-50.2] Best overall response Complete response 0 Partial response 19 (35.8) Stable disease 20 (37.0) Progressive disease 11 (20.8) Not determined 3 (5.7) Disease control for ≥12 weeks [95% CI] 39 (73.6) [59.7-84.7] Berdasarkan tabel 1, dari 53 pasien kanker  kolorektal  metastasis/rekuren yang terkonfirmasi MSI-H/dMMR,
diketahui bahwa objective response rate (ORR)  dan disease  control  rate untuk ≥12  minggu  masing-masing  sebesar 35·8%  (95%  CI  23·1% –50·2%)  dan 73,6% (95% CI 59·7 –84·7).
Berdasarkan  hasil  tersebut,  overman et al menyatakan  bahwa  pasca  pemberian nivolumab,  respon  terapi  yang  cukup signifikan ditemukan disertai
pengendalian  penyakit  dalam  jangka panjang  dengan  masa survival bagi pasien  mCRC  tipe  dMMR/MSI-H  yang lebih  lama  sehingga  dapat  dijadikan sebagai  opsi  terbaru  dalam  terapi pasien  mCRC  tipe  dMMR/MSI-H  dan melengkapi terapi lain yang telah ada [31] .

## 4. KESIMPULAN
Kombinasi  imunoterapi CAR-T  cell dengan Immune  Checkpoint  Inhibitor
khususnya  anti  PD-1  memiliki  potensi yang  menjanjikan  sebagai  pilihan  terapi terbaru  pengobatan  kanker  kolorektal. EpCAM merupakan glikoprotein transmembran yang ekspresinya banyak ditemukan  pada  sel  kanker  kolorektal sehingga  tepat  untuk  dijadikan  target pengobatan CAR-T  cell .  Imunoterapi berbasis  EpCAM- CAR-T  cell diketahui terbukti  secara  spesifik  memiliki  efek sitotoksik  litik  terhadap  sel  kanker kolorektal  dan  secara  efektif  mampu menekan pembentukan dan pertumbuhan sel tumor target. Efektivitas CAR-T  cell dapat  dihambat oleh  molekul  imun inhibitory anti  PD-1 pada Tumor  Microenvironment (TME) kanker  kolorektal.    Nivolumab,  selaku agen  anti  PD-1  terbukti  efektif  dalam pengendalian penyakit kanker kolorektal khususnya tipe metastasis sebab mampu  memberikan  masa survival pasien  yang  lebih  panjang.  Melalui kombinasi  EPCAM- CAR-T  cell dengan agen  anti  PD-1  nivolumab  yang  bersifat lebih spesifik dan terpersonalisasi, maka dapat  diperoleh  metode  pengobatan terbaru  kanker  kolorektal  yang  lebih efektif dan minim efek samping.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Arnold  M.,  Sierra  M.  S.,  Laversanne M., Soerjomataram I., Jemal A., Bray F. Global  patterns  and  trends  in colorectal  cancer  incidence  and mortality . Gut . 2016;66(4):683 –691.
2.  Komite Penanggulangan Kanker Nasional Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Pedoman Nasional Pelayanan Kedokteran Tata Laksana  Kanker  Kolorektal .  2018.
http://kanker.kemkes.go.id/guidelines
/PNPKkolorektal.pdf
3.  Neda  Yaghoubia,  Arash  Soltania, Kiarash  Ghazvinib,  Seyed  Mahdi Hassaniana, Seyed Isaac Hashemyc. PD-1/  PD-L1  blockade  as  a  novel treatment for  colorectal cancer.
Biomedicine & Pharmacotherapy 110 (2019) 312 –318.
4.  Tang J, et al. Trial watch: The clinical trial landscape for PD1/PDL1
immune  checkpoint  inhibitors. Nat. Rev. Drug Discov. 2018;17:854 –855. 5.  Sermer, D.; Brentjens, R. CAR T ‐ cell therapy:  Full  speed  ahead .  Hematol.
Oncol.2019, 37 (Suppl. 1), 95 –100 6.  Tomuleasa,  C.;  Fuji,  S.;  Berce,  C.; Onaciu,  A.;  Chira,  S.;  Petrushev,  B.; Micu,  W.T.;  Moisoiu,  V.;  Osan,  C.; Constantinescu,  C.;  et  al. Chimeric
Antigen  Receptor  T ‐ Cells  for  the Treatment of B ‐ Cell Acute Lymphoblastic Leukemia . Front. Immunol.2018, 9, 239
7.  Newick  K,  O'Brien  S,  Moon  E, Albelda  SM. CAR  T  cell  therapy  for solid tumors. Annu Rev Med.
2017;68:139 ‐ 152.  10.1146/annurev- med-062315-120245
8.  Migliorini  D,  Dietrich  P ‐ Y,  Stupp  R, Linette  GP,  Posey  AD,  June  CH. CAR T ‐ cell therapies in glioblastoma:
a  first  look .  Clin  Cancer  Res.
2018;24:535 ‐ 540. 9.  Klemm F, Joyce JA. Microenvironmental regulation of therapeutic  response  in  cancer . Trends Cell Biol. 2015;25:198 ‐ 213. 10. Hamid  O.,  Robert  C.,  Daud  A.,  et  al.
Safety  and  tumor  responses  with lambrolizumab (anti-PD-1) in melanoma .  New  England  Journal  of Medicine . 2013;369(2):134 –144. 11. Y. Xiao, G.J. Freeman. The microsatellite  instable  subset  of colorectal  cancer  is  a  particularly good candidate for checkpoint blockade  immunotherapy. Cancer Discov. 5 (2015) 16 –18.
12. Yeku,  O.;  Li,  X.;  Brentjens,  R.J. Adoptive  T ‐ Cell  Therapy  for  Solid Tumors . Am. Soc. Clin. Oncol. Educ. Book2017, 37, 193 –204,
13. Cherkassky,  L.;  Morello,  A.;  Villena ‐ Vargas,  J.;  Feng,  Y.;  Dimitrov,  D.S.; Jones, D.R.; Sadelain, M.; Adusumilli,  P.S .  Human  CAR  T  cells with  cell ‐ intrinsic  PD ‐ 1  checkpoint blockade resist tumor ‐ mediated inhibition . J. Clin. Investig. 2016, 126, 3130 –3144.
14. June,  C.H.;  Sadelain,  M.  Chimeric Antigen  Receptor  Therapy.  New
Engl.  J.  Med.2018,  379,  64 –73, doi:10.1056/NEJMra1706169.
15. Brudno,  J.N.;  Kochenderfer,  J.N. Chimeric  antigen  receptor  T ‐ cell therapies  for  lymphoma. Nat.  Rev.
Clin. Oncol.2018, 15, 31 –46, doi:10.1038/nrclinonc.2017.128.
16. Thistlethwaite,  F.C.;  Gilham,  D.E.; Guest,  R.D.;  Rothwell,  D.G.;  Pillai, M.;  Burt,  D.J.;  Byatte,  A.J.;  Kirillova, N.;  Valle,  J.W.;  Sharma,  S.K.;  et  al. The clinical efficacy of first ‐ generation  carcinoembryonic  antigen (CEACAM5) ‐ specific  CAR  T  cells  is limited  by  poor  persistence  and transient  pre ‐ conditioning ‐ dependent respiratory  toxicity. Cancer  Immunol.
Immunother.2017,  66,  1425 –1436, doi:10.1007/s00262 ‐ 017 ‐ 2034 ‐ 7.
17. Yeku,  O.O.;  Brentjens,  R.J. Armored CAR  T ‐ cells:  Utilizing  cytokines  and pro ‐ inflammatory  ligands  to  enhance CAR  T ‐ cell  anti ‐ tumour  efficacy. Biochem.  Soc.  Trans.2016,  44,  412 – 418, doi:10.1042/BST20150291. 18. H.  Rezaeeyan,  S.N.  Hassani,  M. Barati,  M.  Shahjahani,  N.  Saki. PD- 1/PD-L1  as  a  prognostic  factor  in leukemia . J.Hematopathol. 10 (2017)
17 –24.
19. Tang H, Qiao J, Fu YX. Immunotherapy and tumor microenvironment . Cancer Lett.
2016;370:85 ‐ 90.
10.1016/j.canlet.2015.10.009
20. S.-O.  Lim,  C.-W.  Li,  W.  Xia,  J.-H. Cha,  L.-C.  Chan,  Y.  Wu,  S.-S.
Chang,  W.-C.  Lin,  J.-  M.  Hsu,  Y.-H. Hsu. Deubiquitination and stabilization  of  PD-L1  by  CSN5 .
Cancer Cell 30 (2016) 925 –939. 21. V.R.  Juneja,  K.A.  McGuire,  R.T. Manguso,  M.W.  LaFleur,  N.  Collins, W.N.  Haining,  G.J.  Freeman,  A.H. Sharpe. PD-L1  on  tumor  cells  is sufficient  for  immune  evasion  in immunogenic  tumors  and  inhibits CD8  T  cell cytotoxicity. J.  Exp.  Med. 214  (Apr.  (4))  (2017)  895 –904  jem. 20160801.
22. A.O.  Kamphorst,  A.  Wieland,  T. Nasti,  S.  Yang,  R.  Zhang,  D.L. Barber,B.T. Konieczny, C.Z.
Daugherty,  L.  Koenig,  K.  Yu,  G.L.
Sica,  A.H.  Sharpe,  G.J.  Freeman, B.R. Blazar, L.A. Turka, T.K.
Owonikoko, R.N. Pillai, S.S. Ramalingam,  K.  Araki,  R.  Ahmed. Rescue of exhausted CD8 T cells by PD-1-  targeted  therapies  is  CD28- dependent .  Science  355  (2017)
1423 –1427.
23. Zhang  BL,  Li  D,  Gong  YL,  Huang  Y, Qin  DY,  Jiang  L,  Liang  X,  Yang  X, Gou  HF,  Wang  YS,  Wei  YQ.
Preclinical  Evaluation  of  Chimeric Antigen  Receptor –Modified  T  Cells Specific  to  Epithelial  Cell  Adhesion Molecule  for  Treating  Colorectal Cancer.  Human  gene  therapy .  2019 Apr 1;30(4):402-12.
24. Nubel  T,  Preobraschenski  J,  Tuncay H,  et  al. Claudin-  7  regulates EpCAM-mediated  functions  in  tumor progression. Mol Cancer Res 2009;7:285 –299 25. Song  DG,  Ye  Q,  Carpenito  C,  et  al. In vivo persistence, tumor localization,  and  antitumor  activity  of CAR-engineered  T  cells  is  enhanced by  costimulatory  signaling  through CD137 (4-1BB). Cancer Res 2011;71:4617 –4627. 26. 26. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. colon cancer V1.2017 (https://www.nccn.org/). 27. National Cancer Institute. Surveillance,  Epidemiology,  and  End Results  Program.  Cancer  stat  facts: colon and rectum cancer http://seer.cancer.gov/statfacts/html/c olorect.html  (accessed  January  13, 2017)
28. Pardoll  D.  M. The  blockade  of immune checkpoints in cancer immunotherapy . Nature Reviews
Cancer .  2012;12(4):252 –264.  doi:
10.1038/nrc3239.
29. Goldstein  J,  Tran  B,  Ensor  J,  et  al. Multicenter  retrospective  analysis  of metastatic  colorectal  cancer  (CRC)
with high-level microsatellite
instability  (MSI-H). Ann  Oncol  2014;
25: 1032 –8. [PubMed: 24585723]
30. Giannakis  M,  Mu  XJ,  Shukla  SA,  et al. Genomic  correlates  of  immune- cell infiltrates in colorectal carcinoma .
Cell Rep 2016; 15: 857 –65.
[PubMed: 27149842]
31. Overman  MJ,  McDermott  R,  Leach JL,  Lonardi  S,  Lenz  HJ,  Morse  MA, Desai J, Hill A, Axelson M, Moss RA,
Goldberg  MV. Nivolumab  in  patients with metastatic DNA mismatch repair-deficient
or microsatellite instability-high colorectal cancer
( CheckMate  142):  an  open-label, multicentre,  phase  2  study .  The Lancet Oncology. 2017 Sep
1;18(9):1182-91