Menara Perkebunan 2014  82(2), 25-31
Penapisan bakteri penghasil bioplastik polihidroksi alkanoat dari tanah tempat pembuangan sampah dan limbah cair pabrik kelapa sawit
Screening of  bioplastics polyhydroxy alkanoic producing bacteria from landfill and palm oil mill effluents
Irma KRESNAWATY *) , Haryo Tejo PRAKOSO, Deden Dewantara ERIS & Agustin Sri MULYATNI
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana No. 1 Bogor 16128, Indonesia
Diterima tanggal 6 Maret 2014/disetujui tanggal 12 Juni 2014

## Abstract
Plastic  wastes  have  become  a  serious  problem  of  the world  because  of  unbiodegradable  property.  There  are many  solutions  to  this  problem  and  one  of  them  is  by replacing  conventional  plastic  base  material  with  the biodegradable  materials.  Bioplastic  material  that  is  quite important  for  industries  and  recently  being  developed  by scientists  is  Polyhydroxyalcanoate  (PHA).  It  is  a  natural polyester  which  can  be  produced  by  several  micro- organisms,  like  bacteria  and  algae.  Bacterial  isolations from  landfills  waste  and  palm  oil  mill  effluents  were conducted on this research. Preliminary screenings of PHA- producing-bacteria  were  examined  qualitatively  using 0.05%  Nile  Red  dye.  The  selection  results  showed    that among 32 bacterial isolates, 10  of  them could  accumulate PHA    which    could  be  detected  qualitatively  through    its fluorescence  in    UV    ray    at  λ  235  nm.  TH-D092  and  LC- S05  isolates  originated  respectively  from  landfill  and palm  oil  mill  effluent  had  ability  to  accumulate  PHA respectively 6.67 and 9.44% dried cell weight. Identification  of  the  microbe  concluded  that  TH-D092  was Pseudomonas  aeroginosa ,  whilst  LC-S05  and  LC-D02 isolates was Bacillus subtilis .
[Keywords: Pseudomonas  aeroginosa,  Bacillus  subtilis , plastic waste, waste treatment].

## Abstrak
Limbah plastik menjadi masalah serius yang dihadapi dunia  karena  sulit  didegradasi  mikroba.  Salah  satu  solusi masalah  adalah  dengan  mengganti  bahan  dasar  plastik konvensional  dengan  plastik biodegradable (bioplastik). Bahan bioplastik yang cukup penting bagi industri dan saat ini  terus  dikembangkan  oleh  peneliti  adalah  Polihidroksial- kanoat  (PHA).  PHA  merupakan  poliester  alami  yang  dapat diproduksi  oleh  mikroorganisme,  seperti  bakteri  dan  alga. Pada  penelitian  dilakukan  isolasi  bakteri  dari  tanah  tempat pembuangan  sampah  (TPS)  dan  limbah  cair  pabrik  kelapa sawit  (LCPKS).  Penapisan  awal  bakteri  penghasil  PHA dilakukan secara kualitatif menggunakan pewarna Nile Red 0.05% . Hasil  penapisan menunjukkan  diantara  ke-32  isolat bakteri  diperoleh  10  isolat  mampu  mengakumulasi  PHA secara  kualitatif,  yaitu  isolat  yang  mampu  menimbulkan pendaran floresen pada sinar UV  pada λ 235 nm. Isolat TH- D092 dari tanah tempat pembuangan sampah dan isolat LC- S05  dari  limbah  cair  pabrik  kelapa  sawit  memiliki kemampuan  mengakumulasi  PHA  berturut-turut  6,67  dan 9,44%  dari  berat  sel  kering.  Hasil  identifikasi  spesies
bakteri  menunjukkan  bahwa  isolat  TH-DO9  termasuk Pseudomonas  aeroginosa ,  LC-SO5  dan  LC-DO2  termasuk Bacillus subtilis .
[Kata  kunci  : Pseudomonas  aeroginosa , Bacillus  subtilis limbah plastik, penganan limbah  ]

## Pendahuluan
Perkembangan industri plastik mempunyai peran- an  yang  sangat  penting  dalam  mememuhi  kebutuhan manusia.  Semakin  meningkatnya  kebutuhan  akan plastik  mendorong  industri  untuk  memproduksi plastik  yang  lebih  banyak.  Meskipun  demikian, limbah  plastik  yang  diproduksi  dari  minyak  bumi tidak  mudah  didegradasi  oleh  mikroorganisme sehingga  berpeluang  mengendap  lama  di  tanah. Limbah  plastik  baru  dapat  terurai  di  alam  dalam waktu  500  -  1.000  tahun,  sehingga  jika  terakumulasi di  tanah  akan  merusak  lingkungan,  menghambat peresapan  air,  menyebabkan  banjir,  dan  merusak kesuburan  tanah.  Salah  satu  solusi  pemecahan masalah  ini  adalah  dengan  mengganti  bahan  dasar plastik  konvensional  tersebut  menjadi  bahan  yang mudah  diuraikan  oleh  mikroorganisme,  yang  disebut dengan plastik biodegradable (bioplastik).
Keuntungan  dari  bioplastik,  yaitu  mengurangi limbah plastik yang semakin lama jumlahnya semakin banyak.  Bioplastik  dirancang  untuk  memudahkan proses  degradasi  terhadap  reaksi  enzimatis  mikro- organisme  seperti  bakteri  dan  jamur  (Avella,  2009). Bahan bioplastik yang cukup penting dan masih terus diteliti  serta  dikembangkan  sampai  saat  ini  adalah Polihidroksialkanoat  (PHA).  Menurut  Van  Wegen et  al .  (1998),  PHA  memiliki  kekuatan  dan  kekerasan yang baik, resisten terhadap kelembaban dan memiliki permeabilitas  O 2 sangat  rendah.  Karena  karakteristik unggul  tersebut,  PHA  merupakan  bahan  campuran paling  banyak  digunakan  sebagai  biopolimer  dalam membuat  plastik  (Wu et  al ,  2000).  PHA  diproduksi secara intraseluler oleh beberapa jenis bakteri sebagai cadangan  karbon  dalam  kondisi  karbon  berlebih dengan  nutrient  (nitrogen  dan  fosfor)  yang  terbatas (Potter et  al .,  2004).  Sampai  saat  ini,  setidaknya terdapat 28 jalur biosintesis PHA yang sudah di pelajari (Chen, 2009). Bakteri yang diketahui dapat *) Penulis korespondensi: irma.kresnawaty@yahoo.com
Penapisan bakteri penghasil bioplastik polihidroksi alkanoat…… (Kresnawaty et al.)
memproduksi  PHA  diantaranya  adalah Ralstonia eutropha (Sudesh et  al ,  2000), Rhizobium (Cicer)  sp. (Chohan  &  Copeland,  1998),  dan Pseudomonas mendocina (Zheng et al , 2005).
Faktor  pembatas  yang  kerap  dijumpai  dalam memproduksi  PHA  dari  bakteri  adalah  ongkos produksi  yang  mahal,  hampir  lima  kali  lipat  ongkos produksi  plastik  secara  konvensional  (Kim,  2000). Mahalnya  ongkos  produksi  terkait  erat  dengan penggunaan sumber karbon. Untuk itu, sumber karbon alternatif  dengan  harga  relatif  murah  mutlak diperlukan.  Salah  satu  sumber  karbon  alternatif  yang tersedia  banyak  di  Indonesia  adalah  limbah  cair pabrik  kelapa  sawit  (LCPKS),  mengingat  Indonesia adalah  produsen  minyak  sawit  nomor  satu  di  dunia (Lubis, 2008).
LCPKS  merupakan  limbah  yang  berasal  dari proses  ekstraksi  minyak  tandan  buah  segar  pada pabrik  kelapa  sawit.  Limbah  ini  mempunyai  kadar BOD  tinggi  (sekitar  20.000  ppm)  dan  kadar  nitrogen rendah  (kurang  dari  200  ppm  dalam  bentuk  nitrogen amoniak dan kurang dari 500 ppm dalam bentuk total nitrogen). Sehingga  LCPKS merupakan substrat yang tepat untuk produksi PHA.
Isolasi  bakteri  untuk  kegiatan  penapisan  dapat dilakukan  dengan  mengambil  contoh  dari  tempat pembuangan  sampah  akhir.  Tempat  pembuangan limbah  rumah  tangga  dan  industri  kecil  merupakan tempat  konsorsium  bakteri  karena  merupakan  tempat penimbunan bermacam-macam sampah, seperti makanan  yang  membusuk  dan  limbah  rumah  tangga yang  kaya  akan  karbon  (Zusfahair,  2008).  Hal  ter- sebut  menjadikan  TPA  sebagai  tempat  yang  tepat untuk  mendapatkan  isolat  bakteri  mampu  menghasil- kan  PHA.  Isolasi  juga  akan  dilakukan  pada  LCPKS untuk mendapatkan bakteri indigenous yang berpotensi menghasilkan PHA

## Bahan dan Metode

## Bahan
Bahan penelitian adalah limbah cair kelapa sawit yang diperoleh dari pabrik kelapa sawit di Palembang, tanah  di  sekitar  pembuangan  sampah,  NaCl, nutrient agar (NA), nutrient broth (NB), glukosa, (NH 4 ) 2 SO4, KH 2 PO 4 ,  MgSO 4 .7H 2 O,  asam  sitrat,  NaOCl,  buffer fosfat, dietil eter, dan H 2 SO 4 .
Isolasi bakteri
Sebanyak 10 g contoh tanah di sekitar pembuang- an  sampah  disuspensikan  ke  dalam  90  mL  larutan garam  fisiologis  (NaCl  0.85%)  steril,  lalu  diinkubasi pada shaker selama satu jam pada suhu 30 °C dengan kecepatan  150  rpm.  Kemudian  dilakukan  seri pengenceran  dengan  larutan  garam  fisiologis  (NaCl 0.85%)  hingga  tingkat  pengenceran  10 -9 .  Lima pengenceran  terakhir  diambil  100  μL  untuk  diinoku- lasikan  secara spread  plate pada  medium  NA  dan diinkubasi  pada  suhu  37  °C  72  jam.  Koloni  bakteri
yang  tumbuh  diisolasi  lalu  diinokulasi  pada  medium NA baru dengan streak kuadran dan diinkubasi pada suhu    37  °C  selama  24    jam.  Selanjutnya  dilakukan pemurnian  isolat  bakteri  yang  ditumbuhkan  pada medium padat NA miring ( agar slant) dan diinkubasi dalam  inkubator  pada  suhu  37  °C  selama  24  jam sebagai  stok  kultur.  Sebanyak  2,5%  (v/v)  LCPKS dicampurkan  dengan  palm  olein  1%  (b/v)  pada medium  NB,  kemudian  disterilisasi.  Campuran tersebut digoyang pada kecepatan 200 rpm pada suhu 30  °C  selama  empat  minggu.  Sebanyak  satu  loop koloni  digores  kuadran  pada  media  NA.  Isolat  yang tumbuh pada agar kemudian dimurnikan.

## Penapisan isolat bakteri yang memproduksi PHA
Penapisan bakteri  yang  memroduksi  PHA dilakukan  menggunakan  medium plate  assays (Spiekerman et  al ,  1999).  Bahan-bahan  yang  diguna- kan  untuk  pembuatan  medium assay  plate adalah glukosa  20  g,  (NH 4 ) 2 SO 4 2  g , KH 2 PO 4 13,3  g, MgSO 4 .7H 2 O  1,2  g,  asam  sitrat  1,7  g,  larutan trace element 10 mL, agar 15 g dan Nile Red 0,05% 5 mL dalam  aseton . Setelah  diinkubasi  selama  24  jam cawan media diamati di bawah sinar UV pada panjang gelombang  λ  235  nm. Determinasi  akumulasi  PHA secara  kualitatif  dilakukan  dengan  pewarnaan Nile red yang  memberikan  hasil  pendaran  pada  koloni bakteri  yang  meng-akumulasi  PHA  (Chaudhry et  al ., 2010; Porwal et al ., 2008; Spiekermann et al ., 1999).

## Produksi PHA
Sebanyak  10  mL  isolat  dipre-kulturkan  pada 100  mL  NB  dan  diinkubasi  di incubator shaker dengan  kecepatan  150  rpm  selama  24  jam  pada  suhu kamar.  Kemudian,  sebanyak  5  mL  inokulum  ditum- buhkan  pada  100  mL  medium  minimal  (Ramsay et al .,  1992)  dengan  sumber  karbon  1%  (b/v)  dan digoyang  di incubator shaker dengan  kecepatan 150 rpm selama 72 jam pada suhu 30 o C

## Kuantifikasi PHA
Kultur  bakteri  yang  telah  diinkubasi  selama  72 jam,  disentrifugasi  pada  4000  rpm  selama  15  menit. Supernatan  kemudian  dibuang  dan  pelet  yang terbentuk  disuspensikan  dalam  5  mL  akuades. Sebanyak  1  mL  suspensi  sel  dianalisis  kadar  PHA dengan  spektrofotometer  UV  pada  panjang  gelom- bang  235  nm  dan  1  mL  suspensi  sel  diambil  untuk mengukur berat kering massa sel.
Kemudian  ke  dalam  suspensi  sel  ditambahkan 3 mL bufer fosfat pH 7,0 dan 1 mL NaOCl 5 %, dan diinkubasi pada suhu 25 o C dengan kecepatan 180 rpm selama  24  jam.  Sisa  pelet  dikumpulkan  dengan sentrifugasi  pada  4.000  rpm  selama  15  menit. Supernatan kemudian disentrifugasi kembali sebanyak tiga  kali  pada  kecepatan  4.000  rpm  selama  15  menit dengan  pelarut masing-masing, yaitu: 5 mL akuades, 3  mL  aseton  dan  3  mL  eter.  Supernatan  dibuang  dan
pelet  dicuci  secara  perlahan  dengan  3  mL  dietil  eter dan  didiamkan  selama    lima  menit,    kemudian    eter dibuang.    Setelah  pelet  kering  ditambahkan  3  mL H 2 SO 4 pekat,  dan  dipanaskan  dalam water  bath dengan  suhu  100 o C  selama  10  menit.  Kadar  PHA dideterminasi  menggunakan  spektrofotometer  UV pada  panjang  gelombang  235  nm  dengan  pelarut H 2 SO 4 pekat.

## Identifikasi bakteri penghasil PHA
Identifikasi  dilakukan  di  Laboratorium  Mikro- biologi Institut Pertanian Bogor menggunakan API-kit test berdasarkan karakterisasi reaksi biokimia mikroba.

## Hasil dan Pembahasan

## Isolasi bakteri
Sebanyak  63  koloni  bakteri  telah  berhasil  di- isolasi  dari  tanah  tempat  pembuangan  sampah  dan limbah  cair  pabrik  kelapa  sawit  (Tabel  1). Pengambilan  sampel  dari  tempat  yang  berbeda diharapkan dapat memberikan variasi mikroorganisme penghasil bioplastik.  Sebanyak 32  isolat bakteri yang dianggap  mewakili  koloni  diseleksi  kembali  untuk mengetahui  kemampuannya  dalam  mengakumulasi- kan PHA dengan pewarna Nile Red .

## Penapisan isolat  yang memproduksi PHA
Hasil  penapisan menunjukkan di antara 63 isolat bakteri  terdapat  10  isolat  mampu  mengakumulasi PHA  secara  kualitatif,    yaitu  kemampuan  menghasil- kan  warna  orange  yang  berpendar.  Isolat  bakteri tersebut  terdiri  dari  lima  isolat  berasal  dari  tanah tempat  pembuangan    sampah  dan  lima  isolat  berasal dari limbah cair pabrik kelapa sawit (Tabel 2).

## Analisis Kuantitatif  PHA
Sebanyak  10  isolat  bakteri  positif  menghasilkan PHA  diinokulasikan  di  medium  minimal.  Kemam- puan  isolat  bakteri  dalam  menghasilkan  PHA  secara kuantitatif  dapat  dilihat  berdasarkan    produksi  PHA pada medium Ramsay (Ramsay et al ., 1992). Medium sintetik ini diperkaya dengan glukosa  sebagai sumber karbon  bagi  isolat  bakteri  yang  diinokulasikan  di dalamnya, sehingga bakteri tersebut dapat membentuk cadangan karbon berupa granula.
Pertumbuhan mikroba biasanya dicirikan dengan waktu  yang  dibutuhkan  untuk  menggandakan  massa sel  atau  jumlah  sel.  Pertumbuhan    mikroorganisme dilakukan  dengan    metode  pengukuran  bobot  sel kering.  Inokulum  media  yang  sudah  diinkubasi selama  72  jam  disentrifugasi  empat  kali  dengan kecepatan  4.000  rpm  selama  15  menit.  Sentrifugasi pertama  bertujuan  untuk  memisahkan  biomassa dengan    fase  cair.  Endapan  yang  diperoleh  pada sentryfugasi  tahap  pertama  disuspensikan  ke  dalam aquades  kemudian  diambil  untuk  pengukuran  berat kering massa sel.
Selama  masa  inkubasi  terjadi  peningkatan  berat kering  massa  sel  semua  isolat  bakteri  (Tabel  3). Peningkatan  berat  kering  massa  sel  yang  ditunjukkan oleh  ke-10  isolat  tersebut  berkisar  antara  6%-50%. Adanya  peningkatan  berat  kering  massa  sel  setelah inkubasi  selama  72  jam  menunjukkan  bahwa  terjadi pertumbuhan  sel bakteri. Bakteri  mampu  memanfaat- kan  nutrisi  yang  tersedia  dan  ketika  kondisi  stres berlangsung  bakteri  “dipaksa”  untuk    mempertahan- kan  hidup  dengan    menghasilkan  sel    baru  yang  ber- tambah  seiring  dengan  pertambahan  waktu  inkubasi (sesuai fase pertumbuhan bakteri) (Kang et al. , 2008). Suspensi  sel  yang  berasal  dari  inokulum  bakteri diuraikan  dengan  NaOH  0,2  N  untuk  mengisolasi PHA.  Pada  proses  penguraian menggunakan  NaOH, biomassa  non-PHA  yang  umumnya  bersifat  polar akan  larut  dalam  NaOH,  sementara  PHA  tidak  larut sehingga  dapat  dipisahkan  (Lee,  1996).  Selama penguraian  akan  terjadi  proses  pemecahan  sel  oleh NaOH  dan  pelarutan    komponen    non-PHA.  Sentri- fugasi  kedua  dilakukan  untuk  memisahkan  endapan (PHA) dan cairan  (larutan NaOH dan biomassa non- PHA).  Endapan  hasil  sentrifugasi  kedua  yang  berisi PHA,  dibilas  dengan  aquades  kemudian  dilakukan sentrifugasi  tahap  ketiga.  Pencucian  ini  dimaksudkan untuk  memperoleh  biomassa  yang  lebih  bersih sehingga  nantinya  dapat    meningkatkan  kemurnian PHA  yang  dihasilkan.  Endapan  hasil  sentrifugasi ketiga  ditambahkan  aseton  kemudian  disentrifugasi tahap  keempat.  Penambahan  aseton  pada  PHA  yang diperoleh  akan  melarutkan  pengotor  yang  mungkin masih  terkandung  dalam  PHA,  seperti  lemak  dan pigmen  yang  berasal  dari  biomassa  sel.  PHA  yang dihasilkan  kemudian  dilarutkan  dengan  asam  sulfat untuk mengetahui jumlah dan kadar PHA.
Jumlah  PHA  dalam  medium  yang  diproduksi oleh ke-10 isolat bakteri terpilih dihitung berdasarkan penentuan  absorbansi  sebelum  dan  setelah  inkubasi (Tabel  3)  selama  72  jam  dengan  panjang  gelombang 235  nm.  Peningkatan  jumlah  PHA  terbesar  berturut- turut ditunjukkan oleh isolat TH-D092 dan isolat LC- S05  (Tabel  3).  Isolat  tersebut  mengalami  perubahan yang  ditandai  dengan  meningkatnya  jumlah  PHA dalam  medium  minimal  setelah  inkubasi  selama  72 jam.  Selain  pertambahan  berat  kering  massa  sel pertumbuhan    sel  bakteri  juga  menentukan  pening- katan jumlah PHA yang diakumulasi oleh bakteri. Ini menunjukkan  kemampuan  bakteri  tersebut  dalam mengubah  glukosa  menjadi  PHA  sebagai  cadangan makanan  bagi  bakteri  tersebut.  Pembentukan  PHA akan  meningkat  setelah  nutrien  nitrogen  dan  oksigen telah  habis,  sedangkan  proses  akumulasi  sumber karbon  berhenti    pada  saat  glukosa    (sumber  karbon) berada  dalam  jumlah  terbatas  dan    saat  kumpulan granula  di  dalam  sel  semakin  rapat  sehingga  jalan masuk  pada  permukaan  sel  menjadi  terbatas  (Jurasek & Marchessault, 2004).
Analisis  kadar  PHA  juga  dihitung  berdasarkan kondisi  sebelum  dan  setelah  inkubasi  selama  72  jam.
Penapisan bakteri penghasil bioplastik polihidroksi alkanoat…… (Kresnawaty et al.)
Tabel 1. Deskripsi morfologi koloni hasil isolasi mikroba tanah TPA dan LCPKS.
Table 1. Morphological description of landfill and  POME  microbial.
No Kode Isolat Isolate code Bentuk  koloni Form of colony Tepian Margin Permukaan Surface Elevasi Elevation Warna Colour 1 LC-S01 Bundar Entire Halus Menonjol Putih 2 LC-S021 Tidak teratur Berombak Halus Menonjol Putih 3 LC-S022 Tidak teratur Berombak Halus Konveks Krem 4 LC-S03 Tidak teratur Berombak Serbuk Datar Krem 5 LC-S04 Punctiform Entire Halus Cembung Putih 6 LC-S051 Tidak teratur Berombak Halus Datar Krem 7 LC-S052 Tidak teratur Berombak Halus Cembung Putih 8 LC-S06 Tidak teratur Berombak Halus Menonjol Kuning 9 LC-S07 Berfilamen Berfilamen Kasar Umbonate Putih 10 LC-S08 - - - - - 11 LC-S091 Tidak teratur Berombak Berserbuk Datar Krem 12 LC-S092 Punctiform Entire Halus Menonjol Kuning 13 LC-D01 Tidak teratur Berombak Berserbuk Datar Krem 14 LC-D02 Tidak teratur Berombak Berserbuk Datar Putih 15 LC-D03 Tidak teratur Berombak Berserbuk Menonjol Putih 16 LC-D041 Tidak teratur Berombak Kasar Menonjol Kuning 17 LC-D042 Tidak teratur Berombak Kasar Menonjol Kuning 18 LC-D05 Tidak teratur Berombak Kasar Cembung Hitam 19 LC-D06 Tidak teratur Berombak Kasar Menonjol Krem 20 LC-D071 Tidak teratur Berombak Kasar Datar Kuning 21 LC-D072 Punctiform Berombak Halus Menonjol Putih 22 LC-D073 - - - - - 23 LC-D08 Bundar Entire Halus Cembung Hitam 24 LC-D091 Tidak teratur Berombak Halus Menonjol Kuning 25 LC-D092 Tidak teratur Entire Berkilau Datar Putih 26 TH-S011 Tidak teratur Berombak Kasar Menonjol Putih 27 TH-S012 Tidak teratur Berombak Halus Datar Krem 28 TH-S021 Tidak teratur Entire Halus Menonjol Krem 29 TH-S022 Tidak teratur Berombak Halus Datar Krem 30 TH-S031 Punctiform Entire Halus Menonjol Kuning 31 TH-S032 Tidak teratur Berombak Halus Datar Krem 32 TH-S033 Berfilamen Filaform Berkilau Halus Kuning 33 TH-S04 Punctiform Entire Halus Cembung Putih 34 TH-S05 Punctiform Entire Halus Menonjol Krem 35 TH-S06 Tidak teratur Berombak Berkilau Datar Krem 36 TH-S071 Rhizzoid Berombak Halus Menonjol Kuning 37 TH-S072 Tidak teratur Berombak Halus Menonjol Putih 38 TH-S081 Tidak teratur Berombak Berkilau Datar Krem 39 TH-S082 Punctiform Entire Halus Menonjol Putih 40 TH-S091 Rhizzoid Berombak Halus Datar Kuning 41 TH-S092 Punctiform Entire Halus Menonjol Kuning 42 TH-S093 Punctiform Entire Halus Menonjol Kuning 43 TH-D01 Tidak teratur Entire Berserbuk Datar Kuning 44 TH-D021 Tidak teratur Berombak Berkilau Datar Putih 45 TH-D022 Tidak teratur Berombak Berkilau Datar Krem 46 TH-D023 Punctiform Entire Halus Umbonate Kuning 47 TH-D031 Reguler Entire Berkilau Datar Putih 48 TH-D032 Reguler Entire Halus Menonjol Kuning 49 TH-D033 Tidak teratur Berombak Berkilau Datar Putih 50 TH-D034 Tidak teratur Berombak Berkilau Menonjol Kuning 51 TH-D041 Punctiform Entire Halus Menonjol Putih 52 TH-D042 Reguler Entire Halus Umbonate Putih 53 TH-D043 Reguler Entire Halus Umbonate Kuning 54 TH-D044 Tidak teratur Berombak Berkilau Datar Putih 55 TH-D051 Punctiform Entire Halus Menonjol Kuning 56 TH-D052 Tidak teratur Berombak Kasar Datar Kuning 57 TH-D061 Tidak teratur Berombak Halus Datar Krem 58 TH-D062 Punctiform Entire Halus Menonjol Kuning 59 TH-D063 Bundar Entire Halus Menonjol Putih 60 TH-D07 Tidak teratur Berombak Berkilau Datar Putih 61 TH-D081 Punctiform Entire Berkilau Menonjol Kuning 62 TH-D091 Tidak teratur Entire Berkilau Datar Putih 63 TH-D092 Punctiform Entire Halus Menonjol Kuning
Tabel 2.  Hasil seleksi bakteri berdasarkan akumulasi PHA secara kualitatif.
Table 2.  Results of  selection  based on the bacteria’s  PHA  accumulation.
No Sumber Isolat Isolates source Kode Isolat Isolates codes Akumulasi PHA PHA accumulation No Sumber Isolat Isolates source Kode Isolat Isolates codes Akumulasi PHA PHA accumulation 1 TTPS TH-S05 - 17 TTPS TH-D092 + 2 TTPS TH-S06 - 18 LCPKS LC-S02 - 3 TTPS TH-S071 - 19 LCPKS LC-S05 + 4 TTPS TH-S072 - 20 LCPKS LC-S052 - 5 TTPS TH-S081 - 21 LCPKS LC-S06 - 6 TTPS TH-S082 - 22 LCPKS LC-S07 - 7 TTPS TH-S091 - 23 LCPKS LC-S091 - 8 TTPS TH-S092 - 24 LCPKS LC-S092 + 9 TTPS TH-S093 - 25 LCPKS LC-D02 - 10 TTPS TH-D051 + 26 LCPKS LC-D05 - 11 TTPS TH-D052 + 27 LCPKS LC-D06 + 12 TTPS TH-D061 + 28 LCPKS LC-D071 + 13 TTPS TH-D062 - 29 LCPKS LC-D072 + 14 TTPS TH-D07 + 30 LCPKS LC-D073 + 15 TTPS TH-D08 - 31 LCPKS LC-D091 - 16 TTPS TH-D091 - 32 LCPKS LC-D092 -
Isolat TH-D051 Isolat TH-D06 Isolat LC-S09 Isolat TH-D092
Gambar 1. Koloni bakteri yang positif mengakumulasi PHA pada media Plate Assay. Figure 1.   Bacterial colony that positively accumulate PHA in plate assay media.
Sama  seperti  perbandingan  jumlah  PHA  dalam medium   minimal,  pada   analisis  kadar  PHA  juga terjadi  peningkatan  setelah  inkubasi  selama  72  jam (Tabel  3). Terdapat dua isolat bakteri yang   memiliki kadar PHA tinggi  dibandingkan  isolat lainnya, yaitu isolat TH-D092 sebelum inkubasi mampu mengakumulasi  sebesar  0,77%,  dan  setelah  inkubasi bertambah  menjadi  6,67%,  serta  isolat  LC-S05 sebelum  inkubasi  mampu  mengakumulasi  sebesar 1,67%,  setelah  inkubasi  bertambah  menjadi    9,44%. Peningkatan  kadar  PHA  berturut-turut  ditunjukkan oleh  isolat  TH-D092  dan  isolat  LC-S05.  Sumber karbon  yang  digunakan  pada  saat  inkubasi  memiliki
pengaruh    terhadap  produksi  PHA,  seperti  pati  sagu yang mengandung karbon (57,72%), molases mengandung  karbon  (37%)  dan  limbah  cair  pabrik kelapa sawit mengandung karbon  (34,4%). Penelitian Haedar et  al .  (2012)  kadar  yang  diproduksi  oleh  tiga isolat  setelah  72  jam  inkubasi  berkisar  antara  5,65%- 14,79%  per  berat  kering  massa  sel  dengan  glukosa sebagai sumber karbon, adapun penelitian Sangkharak dan  Prasertsan    (2012)  kadar  PHA  yang  diproduksi oleh 50 isolat setelah 96 jam inkubasi berkisar antara 10,00%-68,80%  per  berat  kering  massa  sel  dengan sumber  karbon  digunakan  air  limbah  perkotaan, limbah cair pabrik kelapa sawit, gliserol dan molases,
Penapisan bakteri penghasil bioplastik polihidroksi alkanoat…… (Kresnawaty et al.)
Tabel 3. Produksi PHA sebelum dan setelah  inkubasi 72 jam.
Table 3. PHA production  before and  after  72 hours incubation
No Kode Isolat Isolates codes Sebelum inkubasi Before incubation Setelah inkubasi 72 jam After incubation Kenaikan Kadar PHA (kali) Increase of  PHA content  (times ) Jumlah PHA PHA amount (g/L) Kadar PHA PHA content (%) Jumlah PHA PHA amount (g/L) Kadar PHA PHA content (%) 1 TH-D051 0,002 1,11 0,003 1,58 0,5 2 TH-D052 0,002 0,77 0,014 4 6 3 TH-D06 0,001 0,83 0,009 5,63 8 4 TH-D07 0,004 2,35 0,007 3,5 0,75 5 TH-D092 0,001 0,77 0,012 6,67 11 6 LC-S05 0,002 1,67 0,017 9,44 7,5 7 LC-D06 0,002 1,43 0,004 1,9 1 8 LC-D071 0,001 0,45 0,006 2,31 5 9 LC-D072 0,005 2,27 0,006 2,31 0,2 10 LC-D073 0,001 0,56 0,008 3,64 Keterangan ( Notes ): % Kadar  =  jumlah PHA/ berat kering massa sel
Tabel 4. Hasil identifikasi bakteri penghasil PHA. Table 4. Identification  results of  PHA  producing  bacteria.
sedangkan  penelitian  Yanti et  al .  (2009)  kadar  PHA yang dihasilkan  oleh 50 isolat terpilih setelah 72 jam nkubasi  berkisar  antara  0,23%-52,28%  per  berat kering  massa  sel  dimana  dalam  produksinya menggunakan  pati  sagu  sebagai    sumber  karbon. Kadar PHA yang diproduksi oleh ke-10 isolat terpilih sebelum  inkubasi  selama  72  jam  berkisar  antara 0,45%-2,35%  per  berat  kering  massa  sel  sedangkan setelah inkubasi selama 72 jam berkisar antara 1,58%- 9,44% per berat kering massa sel.

## Identifikasi bakteri penghasil PHA
Identifikasi  spesies  mikroba  potensial  penghasil PHA  merupakan  hal  yang  penting  karena  setiap bakteri  memiliki  jalur  biosintesis  yang  spesifik  dan memerlukan kondisi optimum tertentu. Hasil identifikasi  spesies  menggunakan  API-kit  test menunjukkan  bahwa  isolat  TH-DO92  merupakan Pseudomonas  aeroginosa ,  sementara  isolat  LC-SO5 dan  LC-DO6  adalah Bacillus  subtilis (Tabel  4). Pseudomonas aeroginosa merupakan mikroba kosmopolitan  yang  juga  ditemukan  di  tanah.  Seperti halnya mikroba penghasil PHA, spesies Pseudomonas menggunakan PHA sebagai sumber karbon dan energi untuk  bertahan  hidup.  Produksi  PHA  pada  spesies P.  aeruginos a  sangat  dipengaruhi  oleh  oksigen  dan defisiensi  oksigen  akan  menurunkan  produksi  PHA. Selain itu sesuai dengan pembagian kelompok spesies penghasil  PHA  (Wang  &  Lee,  1997),  genus Pseudomonas dikelompokkan  dalam  kelompok  I (bersama Ralstonia  eutropha dan Methylotrophs ), yaitu  kelompok  yang  membutuhkan  keterbatasan unsur nutrisi esensial seperti (N, P, S, Mg, Ca, Fe, dll)
dan  jumlah  karbon  yang  melimpah  untuk  meng- hasilkan PHA yang efisien.
Ohimain et  al. (2012)  melaporkan  adanya spesies Bacilllus sp.  pada  LCPKS. Bacillus  subtilis dapat  tumbuh  di  rentang  suhu  mesofilik  dengan  suhu optimal  25-35 o C. Bacillus  subtilis bisa  beradaptasi pada lingkungan  stres dan  kondisi  kekurangan nutrisi dengan melibatkan strategi untuk bertahan hidup pada kondisi  yang  ekstrim.  Salah  satu  strateginya  adalah pembentukan stress-resistant endospore yang diperoleh dengan mensintesis PHA. Menurut Thirumala et  al .  (2010)  genus Bacillus merupakan kandidat  potensial  karena  merupakan  bakteri  gram positif,  sehingga  kontaminasi  lipopolisakarida  (dari membran bakteri gram negatif) dapat diminimalkan.

## Kesimpulan
Terdapat  10  isolat  bakteri  yang  memberikan reaksi  positif  terhadap  pewarnaan  dengan  Nile  red , yaitu  isolat  TH-D051 , TH-D052 , TH-D06,  TH-D07, dan  TH-D092  dari  tanah  Tempat  Pembuangan Sampah.  Isolat  LC-S05,  LC-D06,  LC-D071 , LC- D072 , dan  LC-D073 dari  limbah  cair  pabrik  kelapa sawit.  Isolat  TH-D092  dan  isolat  LC-S05  menunjuk- kan  kemampuan  mengakumulasi  PHA  berturut-turut sebanyak 6,67% dan 9,44%. Hasil identifikasi spesies bakteri menunjukkan bahwa isolat TH-DO92 Pseudomonas  aeroginosa ,  sedangkan  isolat  LC-SO5 dan LC-DO6 merupakan Bacillus subtilis .

## Daftar Pustaka
Avella  M  (2009).  Eco-challenges  of  bio-based  polymer composites. Materials 2, 911-925.
Chaudry  WN,  N  Jamil,  I  Ali,  MH  Ayaz  &  S  Hasnain (2010).  Screening  for  polyhydroxyalkanoate  (PHA) producing  bacterial  strains  and  comparison  of  PHA production  from  various  inexpensive  carbon  sources. App Microbiol 7p.
Chen  GQ  (2009).  A  polyhydroxyalkanoates  based  bio-  and materials industry. Chem Soc Rev 38, 2434–2446.
No. Kode isolate Isolates codes Hasil identifikasi Identification results 1. TH-DO92 Pseudomonas aeroginosa 2. LC-D06 Bacillus subtilis 3. LC-S05 Bacillus subtilis
Chohan  SN  &  L  Copeland  (1998).  Acetoacetyl  coenzyme A  reductase  and  polyhydroxybutyrate  synthesis  in Rhizobium (Cicer)  sp.  strain  CC  1192. Appl  Environ Microbiol 64, 2859–2863.
Haedar  N,  Fahrudin,  Zenta  &  N  Nurlaela  (2012).  Produksi poli  β-hidroksibutirat  (PHB)  pada  isolate  bakteri  dari molasses dan tanah pabrik gula. Tesis Makasar, Fakultas MIPA, Universitas Hasanudin.
Jurasek  L  &  RH  Marchessault  (2004)  Polyhydroxy - alkanoate  (PHA)  granule  formation  in  Ralstonia eutropha cell : A Computer simulation .
Kim  BS  (2000). Production  of  poly  (3-hydroxybutyrate) from  inexpensive  substrates. Enzyme  Microb  Technol 27, 774-777.
Lee SY (1996). Bacterial polyhydroxyalkanoates.
Biotechnol Bioengin 49, 114.
Lubis AU (2008). Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) di Indonesia . Edisi 2. Medan, Pusat Penelitian Perkebunan Marihat. 348p.
Ohimain EI, C Daokoru-Olukole, C Sylvester, Izah, A Rita AC Eke & J Okonkwo (2012). Microbiology of palm oil mill effluents. Microbiol Biotech Res 2 (6), 852-857.
Porwal  S,  T  Kumar,  S  Lal,  A  Rani,  S  Kumar,  S    Cheema, HJ  Purohit,  R  Sharma,  SKS  Patel  &  VC  Kalia  (2008). Hydrogen  and  polyhydroxybutyrate  producing  abilities of  microbes  from  diverse  habitats  by  dark  fermen- tative  process. Bioresour Technol 99, 5444-5451.
Pötter  M,  H  Müller,  F  Reinecke,  R  Wieczorek,  F  Fricke,
B  Bowien,  B  Friedrich  &  A  Steinbüchel  (2004).  The complex  structure  of  polyhydroxybutyrate  (PHB) granules: four orthologous and paralogous phasins occur in Ralstonia eutropha . Microbiol 150, 2301-2311.
Ramsay  BA,  J  Ramsay,  E  Berger,  C  Chavarie  & G  Barunegg  (1992).  Separation  of  poly-beta-hydrokxy- alkanoic  acid  from  microbial  biomass. United  States Patent 5.110.980.
Sangkharak  K  &  P  Praserstan  (2012).  Screening  and identification  of  polyhydroxyalkanoates  producing
bacteria  and  biochemical  characterization  of  their possible application. J Gen Appl Microbiol 58, 173-182.
Spiekermann  P,  BHM  Rehm,  R  Kalscheuer,  D  Baumeister &  A  Steinbüchel  (1999).  A  sensitive,  viable  colony staining  method  using  Nile  Red  for  direct  screening  of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds. Arch Microbiol 171, 73- 80.
Sudesh K, H Abe & Y Doi (2000). Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Prog Polym Sci 25, 1503–1555.
Thirumala M, SV Reddy & K Mahmood (2010). Production and characterization of PHB from two novel strains of Bacillus spp. isolated from soil and activated sludge. J Ind Microbiol Biotechnol 37, 271–278.
Van  Wegen  RJ,  Y  Ling  &  APJ  Middleberg  (1998). Industrial  production  of  polyhydroxyalkanoates  using Escherichia  coli :  An  economic  analysis. Trans  Chem 76(A), 417-426.
Wang  F  &  SY  Lee  (1997).  Poly  (3-hydroxybutyrates) production  with  high  polymer  content  by  fed-batch culture of alcaligenes  latus under  nitrogen  limitation. Appl Environment Microbiol 63, 3703-3706.
Wu  Q,  SQ  Sun,  PHF  Yu,  AXZ  Chen  &  GQ  Chen  (2000). Environmental  dependence  of  microbial  synthesis  of polyhydroxyalkanoates. Acta Polym Sin 6, 751–756.
Yanti  NA,  L  Sembiring  &  S  Margino  (2009).  Optimasi produksi  poli-β-hikroksibutirat  (PHB)  oleh Bacillus sp., PSA 10. Biota 15(3), 95-99.
Zheng  LZ,  Z  Li,  HL  Tian,  M  Li  &  GQ  Chen  (2005).
Molecular  cloning  and  functional  analysis  of  ( R )-3- hydroxyacyl-acyl  carrier  protein:coenzyme  A  transa- cylase  from Pseudomonas  mendocina LZ. FEMS Microbiol Lett 252, 299–307.
Zusfahair (2008). Isolasi, pemurnian dan karakterisasi lipase hasil  skrining  dari  tanah  tempat  pembuangan  akhir (TPA) Gunung Tugel Banyumas. J Natur Ind 12(2)