## Deteksi Mutasi Gen PBP1A Helicobacter pylori yang Resisten Amoxicillin pada Pasien Dispepsia
Indah Sulistiyawati 1 , I Gede Arinton 2 , Hendro Pramono 1
1 Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman
2 Departemen Penyakit Dalam Fakultas Kedokteran Unsoed email: indahsulistiyawati.s2@gmail.com

## Abstract
Helicobacter pylori infection  is  now  becoming  an  important  factor in dealing  with  cases  both  organic  and  functional dyspepsia.  The  treatment  for  symptomatic  infection  of H.  pylori can  be  carried  out  by  using  a  combination  of  two antibiotics and a proton pump inhibitor or a bismuth component. Amoxicillin is one of the antibiotics commonly used for  treatment H.  pylori infection.  Detection  of H.  pylori infection  is  necessary,  by  using  non-invasive  or  invasive method. This study was aimed to evaluate the presence of H. pylori in patients with dyspepsia by using non-invasive method i.e. H. pylori stool antigen (HPSA) and invasive method i.e. pbp1A gene amplification, and also evaluate the amoxicillin  resistance  of H.  pylori by  assessing  the pbp1A gene  mutations.  The  samples  were    26  faeces  and  26 gastric  biopsies  of  patients  with  dyspepsia  from  the  Internal  Disease  ofProf.  Dr.  MargonoSoekardjo  Hospital  in Purwokerto. The data showed that a negative interpretation of H. pylori infection resulted from all faeces samples by using non-invasive method, HPSA test. pbp1A gene amplification by using PCR obtained 12 positive samples of H. pylori infection. Negative result or no bands appearance from others samples was caused by there was no H. pylori DNA  contain  in  gastric  biopsies,  it  also  reveals  the  results  of  HPSA  test.  DNA  sequencing  analysis  of  12  samples showed  the  presence  of  a  mutations  in pbp1A gene  from  2  samples,  in  the  third  motive  of pbp i.e.  amino  acid changes, Alanine 599 substituted to Threonin and Threonin 592 to Alanine. Those mutations become a dominant risk factor for resistance of H. pylori , toward the bacterial peptidoglycan synthesis. In this research, it was known that the detection of H. pylori infection by using PCR remains more accurate and specific method. The presence of H. pylori mutant strains in this study may becomes the risk factors ofresistance to amoxicillin treatment.
Keywords: dyspepsia, Helicobacter pylori , amoxicillin, resistance, pbp1A genes, mutations

## Abstrak
Infeksi Helicobater  pylori saat  ini  mejadi  salah  satu  faktor  penting  dalam  menangani  kasus  dispepsia  baik  organic maupun  fungsional.  Pengobatan  infeksi H.  pylori dapat  dicapai  dengan    oleh  kombinasi  dua  antibiotik  dan  pompa proton inhibitor atau komponen bismuth salah satu antibiotik tersebut adalah amoxicillin . Terjadinya mutasi gen pbp 1  A pada H.  pylori adalah  penyebab  dominan  resistensi  terhadap  amoxicillin.  Deteksi  infeksi H.  pylori sangat diperlukan,  dapat  menggunakan  teknik  non  invasif  dan  invasif.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengevaluasi keberadaan H. pylori pada pasien dispepsia dengan metode non invasif ( Helicobacter pylori stool antigen ) HpSA dan invasif PCR amplifikasi gen pbp1A , serta mengevaluasi resistensi amoxicillin pada H. pylori dengan mengkaji mutasi gen pbp1A .Dalam penelitian ini telah dilakukan analisis pada 26 sampel feses dan 26 sampel biopsi lambung pasien dispepsia  dari  Bagian  Ilmu  Penyakit  Dalam  RS.  Prof.  Dr.  Margono  Soekardjo  Purwokerto.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  dari  26  sampel  yang  dianalisis  dengan  uji  non  invansif  HPSA  diperoleh  hasil  pemeriksaan negatif H.  pylori .  Pada  sampel  tersebut  juga  dilakukan  PCR  amplifikasi  gen pbp1A dan  mendapatkan  hasil  12 sampel  positif  infeksi H.  pylori, dan  14  sampel  negatif  kemungkinan  terjadi  karena  dalam  sampel  biopsi  tidak terdapat DNA H. pylori ,hal ini mempertegas hasil uji HPSA. Analisis sekuensing DNA dari 12 sampel menunjukkan 2 sampel yang mengalami mutasi gen pbp1A di pbp motif ketiga yaitu perubahan asam amino Alanin599 tersubstitusi menjadi  Threonin,  dan  perubahan  pada  Threonin592  menjadi  Alanin,  yang  terkait  dengan  kemampuan  bakteri H.pylori dalam sintesa peptidoglikan dinding sel bakteri.. Dalam penelitian ini dapat diketahui bahwa metode deteksi H.  pylori dengan  PCR  masih  dinilai  tetap  lebih  akurat  dan  spesifik.  Penemuan  adanya  strain H.  pylori mutan  pada penelitian ini dapat menjadikan faktor resiko resistensi terhadap pengobatan amoxicillin.
Kata kunci : dispepsia, Helicobacter pylori , amoxicillin, resistensi, gen pbp1A , mutasi

## Pendahuluan
Penyakit pencernaan pada konteks kesehatan global umumnya bersifat menular, dan merupakan  infeksi  dari  patogen  yang  melibatkan beberapa bagian dari saluran pencernaan.Adanya gejala  umum  terkait  dengan  infeksi  saluran pencernaan  dikenal  dengan  gejala  dispepsia. Definisi  dispepsia  menurut  Rome  II  tahun  1999 yaitu  keluhan  nyeri  atau  rasa  tidak  enak  yang berpusat  pada  perut  bagian  atas,  terutama  pada
epigastrum atau sekitar linea mediana. Rasa tidak enak  terdiri  dari  rasa  penuh  pada  perut  bagian atas,  cepat  kenyang,  kembung  atau  mual  (Talley et al ., 2000).
Tahun 2004 dalam profil kesehatan dispepsia  menempati  urutan  ke-15  dari  daftar  50 penyakit  dengan  pasien  rawat  inap  terbanyak  di Indonesia  dengan  proporsi  1,3%  dan  menempati urutan  ke-35  yang  menyebabkan  kematian  0,6% (Inri et  al ,  2013).Penyebab  dispepsia  fungsional adalah  “ multi  factorial ”  seperti  keterlambatan
pengosongan  lambung,  dismotiliti,  gangguan akomodasi  lambung  terhadap  makanan  yang masuk, faktor-faktor psikologi dan infeksi Helicobacter Pylori.
Helicobacter  pylori adalah  bakteri  yang menginfeksi lapisan lendir lambung dan duodenum.  Bakteri  ini  adalah  agen  penyebab utama  penyakit  gastritis  superfisial  kronis  dan ulkus  peptikum. H.  pylori dapat  terkait  dengan perkembangan  kanker  lambung  dan  limfoma lambung  (Dunn et  al. ,  1997)..  Namun,  banyak yang  terinfeksi  tetapi  tidak  menunjukkan  gejala penyakit.Bakteri Helicobacter adalah mikroorganisme  yang  hanya  dikenal  dapat berkembang  dalam  lingkungan  lambung  yang sangat  asam.  Bakteri  ini  berbentuk  heliks  (oleh karenanya  dikenal  dengan  nama  helicobacter). Bakteri  ini  diduga    telah  berevolusi  untuk  dapat menembus dan menjelajah lapisan lendir (Bekir et al ., 2009).
Pengobatan  atau  terapi  untuk  pasien dengan  gejala  simptomatik  infeksi H. pylori  dapat dicapai  oleh  kombinasi  dua  antibiotik  ditambah dengan  pompa  proton  inhibitor  atau  komponen bismuth.  Amoxicillin  adalah  salah  satu  agen antimikroba  yang  digunakan  dalam  infeksi H. pylori . Rejimen amoxicillin sering digunakan sebagai  lini  pertama  pengobatan  untuk  infeksi H. pylori .  Penggunaan  antibiotik  di  negara-negara berkembang  pilihannya  sangat  terbatas  dan ekstensif  sehingga  dapat  diperoleh  tanpa  resep dengan  harga  relatif  murah  (obat  generik). Penggunaan antibiotik tersebut dapat menyebabkan  peningkatan  resistensi  terhadap antibiotik. Prevalensi resistensi antibiotik H. pylori menunjukkan  variasi  rasional  per  antibiotik  terapi untuk amoxicillin bervariasi  1%-29%  tergantung konsentrasinya (Mendoca et al ., 2000; Glupczynski et  al .,  2001;  Meyer et  al .,  2002). Meningkatnya  prevalensi  resistensi amoxicillin pada H.  pylori merupakan  masalah  serius  yang dalam  waktu  dekat  dapat  menjadi    penyebab utama kegagalan terapi.
Bakteri H.  pylori memiliki  mekanisme  yang mencakup  penurunan  permeabilitas  membran untuk antibiotik dan penurunan aktivitas antimikroba  dari  sel  bakteri.  PBP  ( Penicillin Binding  Protein )  yang  bertanggung  jawab  untuk perlawanan  amoxicillin  pada H.  pylori yang resisten terhadap amoxicillin mengalami perubahan  struktural.Hasil  analisis  yang  telah dilakukan  oleh  Rimbara et  al .  (2008)  pada  isolat H. pylori asal Jepang,  yang tahan klinik terhadap amoxicillin  menunjukkan  adanya  perlawanan terhadap amoxicillin pada gen pbp1A khusunya di sekitar enzim transpeptidase. Gerrits et al. (2006) juga melaporkan adanya perubahan mutasi di pbp 1A adalah  penyebab  dominan  dari  resitensi amoxicillin.  PBP  adalah  enzim  sintetis  bio peptidoglikan  yang memicu transpeptidase dalam C-erminal  yang  akan  mengi kat  β-laktam  di
wilayah transpeptidase sehingga terjadi perubahan  dan  mungkin  memberikan  resistensi karena menyebabkan berkurangnya afinitas untuk β-laktam.
Beberapa  penelitian  menunjukkan  bahwa terdapat titik  multiple point mutasi di gen pbp1A , merupakan mekanisme utama resistensi amoxicillin  yang  menyebabkan  hilangnya  afinitas antara  amoxicillin  dan  PBP-transpeptidase.  Pada penelitian  tersebut  telah  diamati  terjadinya substitusi  Ser 414 dengan  Arg,  yang  berdekatan dengan  motif SKN pada PBP1 yang bertanggung jawab untuk resistensi amoxicillin secara signifikan  meningkat  dengan  nilai  MIC  (>0,5-1 mg/L)  (Gerrits et  al .,  2006).  Identifikasi  asam amino  disubstitusi  berada  pada  daerah  yang berbeda.  Pada  satu  kelompok  dengan  lima  asam amino  substitusi  termasuk  Ser 414 ---Arg,  Asn 562 --- Tyr,  Thr 593 ---Ala,  Gly 595 ---Ser,  dan  Ala 599 ---Thr berada pada daerah perbatasan dengan PBP.Dalam  spesies H.  pylori substitusi  asam amino didekat motif PBP (SXXK, SXN, dan KTG) hal ini dikaitkan dengan perkembangan resistensi β-laktam  dimana  pengikatan  motif  (SAIK  368- 371),  SLN  (433-435)  dan  KTG  (555-557).Dari penelitian  ini  substitusi  asam  amino  Asn562-  Tyr, mutasi yang terletak dekat KTG (555 untuk 557)  motifnya  identik  ditemukan  pada  semua strain  yang  tahan  amoksisilin  (Gerrits et  al ., 2002),  Substitusi  Ser414-  Arg  yang  terjadi berdekatan  dengan  SLN  (4330435)  motif  juga identik di temukan disemua strain resisten.
Deteksi  infeksi H.  pylori sangat  penting untuk  menilai  status  pasien  dispepsia.Berbagai metode  diagnostik  telah  dimanfaatkan  untuk mendeteksi  infeksi H.  pylori .  Metode  ini  meliputi baik  tes  invasif  (membutuhkan  endoskopi  untuk mendapatkan  spesimen  biopsi  yang  digunakan tes  histologi,  urease  tes  cepat,  kultur,  metode molekuler  “ Polymerase  Chain  Reaction ”  (PCR) atau  tes  non  invasif  (meliputi  tes  serologi,  urea breath  tes,  uji  antigen  feses)  (Choi et  al .,  2011). Menurut  pedoman  eropa    dalam  Malfertheiner et al .  (2002)  menjelaskan  bahwa    “ gold  standar “ (standar  baku  emas)  untuk  mendiagnosis  infeksi H. pylori secara umum harus diwakili setidaknya 2 (dua) tes yang berbeda. Pada penelitian ini untuk pretreatment  mengetahui  infeksi H.  pylori positif pada  pasien  dispepsia  digunakan  tes  noninvasif dengan  sampel  feses  yaitu  tes  feses  antigen (HpSA), HpSA yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan H. pylori aktif, menggunakan Antibodi (Ab) monoklonal (Ricci et al ., 2007).
Pada  penelitian  ini  sampel spesimen yang akan  digunakan  adalah  hasil  biopsi  lambung, yang akan dideteksi resistensi amoxicillin H. pylori dengan  menggunakan  teknik  metode  PCR    dan deteksi  resistensinya  dapat  diketahui  dengan adanya  perubahan  mutasi  gen pbp1A .  Beberapa penelitian  telah  melaporkan  beberapa  subtitusi asam  amino  di pbp1A pada H.  pylori resisten
yang  menunjukkan  transfer  resistensi  fenotipe melalui  transformasi  alami.  Dalam  penelitian  ini kami  menilai  prevalensi H.  pylori yang  resisten terhadap  amoxicillin  pada  pasien  terinfeksi H. pylori dan  meneliti  hubungan  antara  resistensi H. pylori dengan mutasi gen pbp1A .

## Materi dan Metode
Penelitian  ini  merupakan  studi  diskriptif, dengan teknik pengambilan sampling menggunakan metode consecutive sampling yaitu seluruh  penderita  dispepsia  yang  dirawat  di Bangsal  Penyakit Dalam RSU. Prof. Dr. Margono Soekardjo  Purwokerto  yang  telah  didiagnosa melakukan  endoskopi  dan  memenuhi  kriteria sebagai  sampel  sehingga  mencapai  jumlah  yang direncanakan  yaitu  26  sampel.  Kriterian  inklusi penelitian  ini  adalah  (1)  pasien  dengan  keluhan dispepsia, (2) bersedia menandatangani informed consent, (3) subyek penelitian belum mendapatkan  terapi,  (4)  pasien  yang  telah terjadwalkan  atau  terdiagnosis  klinik  untuk endoskopi dan biopsi, sedangkan kriteria eklusinya  adalah  (1)  telah  minum  obat  antibiotik dan  anti  sekresi  penghambat  proton,  (2)  riwayat operasi  lambung,  (3)  peminum  alkohol,  (4) perokok,  (5)  penderita  penyakit  berat.  (6)  subyek penelitian yang merupakan pasien dari tim peneliti tidak akan diikutsertakan dalam penelitian.
Prosedur  awal  penelitian  ini  adalah  peneliti meminta  izin  kepada  Direktur  RSU.  Prof.  Dr. Margono  Soekardjo  Purwokerto  dan  Komite  Etik Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal Soedirman  Purwokerto  (UNSOED).  Penelitian selanjutnya  dilakukan  di  Laboratorium  Biologi Molekuler  UNSOED  dari  bulan  Februari –  Juni 2016. Deteksi  infeksi  H.  pylori  dilakukan  dengan memenuhi gold  standar yaitu  metode  non  invasif HPSA Antigen - (Kit CTK Biotech Catalog number R0192C),  dan  invasif  (amlpifikasi  gen pbp1A dengan PCR).
Pengambilan  spesimen  feses  yang  telah diperoleh  dilanjutkan  dengan  pemeriksaan  rapid tes antigen feses (HpSA). Sampel biopsi  jaringan dari  setiap  subjek  penelitian  diisolasi  dan diekstraksi  untuk  mendapatkan  DNA  bakteri, dengan  menggunakan  metode  ekstraksi  DNA yaitu Phenol  Chloroform (Prabowo,  2008)  yang telah dimodifikasi.
Dilanjutkan
dengan pemeriksaan deteksi resistensi amoxicillin Helicobacter pylori dengan metode PCR menggunakan  master  mix  PCR Phusion  High- Fidelity  kit  Thermo  Scientific dengan  primer  gen pbp1A, primer Forward :
CCACGCAAGCCAAACGG, primer Reverse : CCTTTGGGGACATCAAACTTT.Dari  hasil  test PCR  akan  digunakan  untuk  sekuensing  DNA yang  akan  dilakukan  di  First  BASE  Laboratories Malaysia  urutan    sekuen  yang  dihasilkan  akan dibandingkan pada data Gen Bank
(www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank)  urutan  sekuen H.  pylori strain  51.  Untuk  dievaluasi  perubahan mutasi  gen pbp1A sebagai  penyebab  resitensi amoxicillin menggunakan primer resistensi amoxicillin.  Pengamatan  perubahan  susunan basa  pada  gen pbp1A dengan  parameter resistensi  adanya  perubahan  :  Ser 414 ----  Arg, Asn 562 ---  Tyr,  Thr 593 ---Ala,  Gly 595 ---Ser,  Ala 599 --- Thr.

## Hasil dan Pembahasan
Persebaran penderita dispepsia yang menjadi  subjek  penelitian  terjadi  pada  rentang usia  mulai  dari  20-79  tahun,  berdasarkan pengelompokan  usia  menurut    Depkes  RI  (2009) dijelaskan  bahwa  remaja  akhir  dengan  rentang usia  17-25  tahun,  dewasa  awal  26-35  tahun, dewasa  akhir  36-45  tahun,  lansia  awal  46-55 tahun, lansia akhir 56-65 tahun, dan masa manula 65-sampai atas. Dari 26 subjek penelitian, dengan penderita  dispepsia  diperoleh  data  keluhan dispepsia  sudah  diperoleh  sejak  dini,  hal  ini terlihat  pada  kelompok  remaja  akhir  dengan proporsi  penderita  mencapai  6  orang.  Terjadi peningkatan  pada  kelompok  lansia  (lanjut  usia) awal sejumlah 8 orang, kemudian tidak ditemukan pada  kelompok    lansia  akhir,  akan  tetapi meningkat  pada  kelompok  manula  sejumlah  5 orang.  Penderita  laki-laki  ditemukan  sebanyak  7 orang (26,9%) dan perempuan 19 orang (73,1%).
Deteksi  status H.pylori dalam  subyek manusia  dari  26  orang  dengan  menyajikan pemeriksaan  endoskopi,  dimana  jaringan  biopsi lambung  untuk  tes  PCR  amplifikasi  serta pemeriksaan  feses  dengan  metode  non  invasif dengan  menggunakan  HPSA  diperoleh  hasil H. pylori stool negatif pada 26 orang (0%), dan hasil PCR  amplifikasi  menggunakan  sampel  biopsi lambung  dengan  primer  gen pbp1A didapatkan hasil H.  pylori positif  pada  12  orang  (46,15%). Dengan  rentang  usia  positif  pada  usia  remaja akhir 17-25 tahun 2 orang (16,67%); dewasa awal 26-35  tahun  3  orang  (25%);  dewasa  akhir  36-45 tahun  2  orang  (16,67%);  lansia  awal  46-55  tahun 3  orang  (25%);  lansia  akhir  56-65  tahun  0  orang (0%);  dan  manula  65-atas  tahun  2  orang (16,67%).  Adapun  digambarkan  bahwa  klinisi untuk  pasien  dengan    keluhan    pra    diagnosis dispepsia memiliki hasil post diagnosis endoskopi yaitu gastritis, ulkus ventrikuli, dan LES incompetence ( Lower Esophageal Sfringter ).
Hal  tersebut  sesuai  dengan  penelitian Leonardo et  al .,  (2014)  bahwa  keluhan  dispepsia dengan  indikasi  infeksi H.  pylori dapat  terjadi sejak dini, disebutkan bahwa dalam penelitiannya prevalensi H.  pylori selama  beberapa  dekade terakhir  ini  mengalami  penurunan,  akan  tetapi terjadi  peningkatan  indikasi  infeksi  pada  usia muda.  Beberapa  penelitian  menyebutkan  bahwa faktor  resiko  atau  kendala  untuk  infeksi H.  pylori
pada jenis kelamin dan usia tampaknya tidak ada perbedaan  yang  siginifikan  dari  infeksi H.  pylori pada  laki-laki  maupun  perempuan  ataupun  pada skala  usia  anak-anak,  dewasa  dan  tua  (van Blankenstein et  al .,  2013).  Gradien  usia  tertentu pada  prevalensi H.  pylori dilaporkan  oleh beberapa  penelitian  tampaknya  terkait  dengan adanya  efek Kohort (Lim et  al .,  2013).  Beberapa faktor  subjek  ekonomi  telah  dikaitkan  dengan infeksi H.  pylori secara  khusus  dengan  status sosial  ekonomi  yang  rendah,  mempengaruhi rendahnya  faktor  pendapatan  per  kapita,  serta pendidikan  yang  rendah  juga  berpengaruh  pada pola tatalaksana hidup sehat sehingga
memungkinkan  memicu  faktor  infeksi H.  pylori (Mathewos et al ., 2013).
Pada  penelitian  ini  digunakan  tes  invasif untuk mendeteksi keberadaan H. pylori pada lambung  menggunakan  teknik  endoskopi,  biopsi lambung  yang  digunakan  untuk  sampel  adalah bagian antrum dengan kode A dan corpus dengan kode  B.  Pada  kasus  gastritis  kronis  terkait peradangan  dan  sekresi  asam  maka H.  pylori akan  berkolonisasi  pada  antrum  lambung  dan secara  dominan  akan  berdistribusi  ke  corpus lambung  (Johannes et  al .,  2006)  dapat  dilihat kondisi  sampel  yang  digunakan  hasil  biospi lambung  pada  gambar  1,  sesuai  dengan  kondisi temuan saat endoskopi.
Gambar.1. Post diagnosis temuan endoskopi subyek dengan (A) gastritis kronis (B) LES Incompeten dan (C) ulkus ventrikuli .
Uji hasil HPSA ( H. pylori Stool Antigen )
Analisa  feses  untuk  keberadaan  bakteri H. pylori menggunakan  metode  non  invasif  dengan HPSA  antigen,  diperoleh  hasil  negatif  dari  26 subyek  penelitian,  menurut  Kabir  (2001)  hasil pada  uji  HPSA  seringkali  digunakan  pada tahapan  skrining  awal  dan  memungkinkan  tidak handal  dalam memprediksi  hasil  dari  pengobatan atau  pemberantasan H.  pylori ,  pada  pasien dengan  dispepsia  kronis  akan  sangat  sulit diketemukan  karena  respon  imunoglobin  (Ig  G) yang  tidak  terdeteksi  saat  skrining  awal  dengan antigen  tersebut. Johannes et  al .  (2006) menyatakan  bahwa  infeksi H.  pylori dapat ditandai  dengan adanya gastritis  akut dan kronis. Pada  gastritis  akut,  gejala  awal  yang  muncul adalah  gejala  mual,  muntah,  dengan  peradangan cukup  baik  di  bagian  proximal,  hal  ini  berbeda dengan  kasus  gastritis  kronis  yang  terjadi  secara persisten,  berkaitan  erat  dengan  akumulasi H. pylori pada  bagian  lambung  dan  bersifat menahun,  dapat  terjadi  tanpa  disertai  gejala dispepsia yang spesifik.
Amplifikasi  DNA  pada  gen pbp1A dengan metode PCR
Amplifikasi DNA dari seluruh sampel biopsi lambung dilakukan dengan metode PCR sebanyak  12  sampel  dari  26  sampel  berhasil  di amplifikasi  pada  gen pbp1A yang  memiliki panjang  ~  800 base  pare .    Pengambilan  titik
sampling  dari  26  subyek  penelitian  dari  2  (dua) lokasi  yang  berbeda  pada  lambung  yaitu  bagian antrum  dengan  kode  (A),  dan  bagian  corpus dengan  kode  (B).  Pada  sampel  1A,  2A,  3A muncul band single  tipis;  sampel  24  A  muncul band smear  single ;  sampel  9  B multi  band dan hasil gel  extraction smear , selanjutnya  sampel tersebut  dikirim  untuk  disekuensing  di First  Base Malaysia  Company .  Hasil  agarose  quantification di  First  Base  Malaysia  Company  menunjukkan bahwa hanya 5 sampel dari 6 sampel yang dapat disekuensing  karena  1  sampel  lainnya  yaitu  8B sampel  hasil gel  extraction memiliki  konsentrasi dan volume DNA yang terlalu rendah untuk dapat disekuensing  kelima  sampel  tersebut  yaitu;  5A, 7B, 25B, 10A, 11A (Gambar 2).
Primer yang digunakan dalam penelitian ini mengacu  pada  Byoungrak et  al .  (2014)  dengan primer khusus gen pbp1A yang telah dikonfirmasi dengan NCBI Gen Bank untuk genom Helicobacter  pylori strain  15  CP000012  dengan desain  : pbp1A-F --CCACGCAAGCCAAACGGC — dengan panjang nukleotida 18 nukleotida, dan untuk primer pbp1A-R – CCTTTGGGGACATCAAACTTT —
dengan panjang  nukleotida  21  nukleotida.  Posisi  primer oligonukleotida  tersebut  pada  resistensi  antibiotic yang  menyebabkan  mutasi H.  pylori ,  forward 1076-1093, dan  reverse  1857-1877.   Konsentrasi G+C  pada  primer  tersebut  untuk  primer  forward 66,67%  dan  reverse  42,86%,  panjang  nukleotida
yang digunakan terdiri dari 18-28 nukleotida yang mempunyai  basa  Guanin  (G)  dan  Sitosin  (C) sebesar ± 50-60%.
Gambar 2. Hasil agarose  quantification di First Base  Malaysia Company (1) Gel 1sampel 8B sampel hasil gel  extraction konsentrasi  dan  volume  DNA  yang  terlalu  rendah;  (2)  Gel2:  sampel proses sekuensing (1)5A, (2)7B, (3) 25B, (4) 10A, (5) 11A
Keberhasilan  mengisolasi  DNA  merupakan hal  yang  paling  penting  dalam  metode  PCR. Proses ekstraksi yang cukup panjang prosedurnya  menjadi  kurang tepat  dalam  uji  rutin laboratorium,  seringkali  menyebabkan  hilangnya DNA  selama  prosesnya.  Kemungkinan  hilangnya DNA  saat  ekstrasi  dapat  menjadi  penyebab negatifnya  hasil  deteksi H.  pylori pada  PCR.Hal tersebut  dimungkinkan  terjadi  karena  sampel mengandung  sangat  sedikit  atau  memang  tidak ada bakteri H. pylori dalam biopsi.
Identifikasi  mutasi  gen pbp1A yang  terlibat dalam resistensi Amoxicillin
Hasil sekuensing DNA menunjukkan bahwa pada  sampel  5A,  7B,  25B,  10A,  dan  11  A  untuk gen pbp1A pada H.  pylori terjadi  substitusi  asam amino  pada  sampel  7B  dan  25  B,  dengan subtitusi (tabel 4.9) sampel 7B mengalami mutasi pada gen pbp1A, Alanin 599 (A 599) tersubstitusi menjadi  Threonin  (T)  dan  pada  sampel  25  B perubahan  Threonin  592  (T592)  tersubstitusi menjadi Alanin (A).
Tabel 1.   Tinjauan  perbedaan  asam  amino  dalam  gen pbp1A resisten  amoxicillin  didasarkan  pada sekuensing genetic dari genom H. pylori strain 51 Gen Bank CP000012
H.pylori strain 51 Gen Bank CP000012 S-K-N 414 S K-T-G 562 N 592 T 595 G 599 A 5 A -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 7 B -- -- -- -- -- -- -- L -- -- T 25 B -- -- -- -- -- -- -- L A M H 10 A -- -- -- -- -- -- -- Q Y -- L 11 A -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --
Titik  mutasi  gen  terjadi  sebagai  bentuk perlawanan terhadap amoxicillin terjadinya frameshift  pada  2  sampel  tersebut  menunjukkan adanya  penghapusan  atau  penyisipan.  Analisis urutan  sekuen  DNA  dari  daerah  sekitar  kedua
motif  PBP  SKN  untuk  S  414  tidak  ditemukan adanya  mutasi  tetap  pada  daerah  motif  ketiga KTG  di  urutan  A  599,  tersubstitusi  menjadi Threonin (T) untuk sampel kode 7.
Pada  sampel  positif  infeksi H.  pylori tidak banyak  ditemukan  mutasi  gen pbp1AH.  pylori , sampai  saat  ini  karena  prevalensi  resistensi H. pylori terhadap  amoxicillin  masih  sangat  rendah, maka  amoxicillin  masih  dapat  digunakan  dalam terapi  eradikasi H.  pylori .  Namun  demikian  pada penelitian  ini  resistensi  amoxicillin  muncul  pada sampel    pasien  dengan  hasil  endoskopi  gastritis kronis  untuk  sampel  7  B,  dan  hasil  ulkus  untuk sampel  25  B.  Pada  bakteri  gram  negatif, resistensi  terhadap  antibiotik  jenis  beta  laktam seperti  amoxicillin  sering  terjadi  karena  proses enzimatik β-laktamase yang dapat mendegaradasi antibiotik. Selain adanya mekanisme  seperti  perubahan  struktur    dalam pbp  serta  adanya  penurunan  permeabilitas membrane  untuk  antibiotik.  Meskipun  genom H. pylori mengandung  enzim β-laktamase tetapi tidak  adanya  aktivitas β-laktamase yang signifikan  dapat  menyebabkan  rentan  terhadap amoxicillin,  penelitian  Gerrits et  al .  (2006) menyatakan  bahwa  kemampuan H.  pylori untuk bertahan  terhadap  antibiotik    jenis  beta  laktam khususnya antibiotik amoxicillin sangat
bergantung  pada  perolehan  ekspresi  enzim β- laktamase .

## Simpulan
Hasil  dan  pembahasan  penelitian  ini  dapat diambil  secara  rinci  kesimpulan  sebagai  berikut  : (1).  Keberadaan H.  pylori pada  pasien  dispepsia dengan  metode  non  invasif  HpSA  (uji  antigen feses) dapat dievaluasi menunjukkan hasil negatif dari  26  sampel  feses  pasien  dan  invasif    PCR amplifikasi  gen pbp1A diperoleh  hasil  positf H. pylori sejumlah  12  sampel  dari  26  sampel  biopsi lambung.  Metode  PCR  masih  dinilai  tetap  lebih akurat  dan  spisifik  dalam  penentuan  keberadaan H. pylori . (2). Berdasarkan hasil analisis sekuensing DNA terdapat Mutasi gen pbp1A pada H. pylori diperoleh 2 sampel dari 12 sampel postif. Titik  mutasi  terjadi  pada  pbp  motif  ketiga  yaitu substitusi  pada  Alanin  599  --  Threonin,  dan Threonin 592--Alanin. Strain mutan H. pylori yang ditemukan  dari  sampel  biopsi  dapat  menjadi faktor  resiko  resitensi  amoxicillin  pada  pasien dyspepsia.

## Daftar Referensi
Bekir,  K.,  A.  Avci.,  dan  A.  T.  Yabanigul.  2009. Classification of Helicobacter
pylori According  to  National  Strains  Using Bayesian  Learning. Mathematical  and Computational  Applications .  14(3):  241- 251.
Byoungkrak  An,  B.S  Moon,  H.C.  Lim,  dan  Y.C Lee,  H.  Kim.,  G.  Lee.,  S.  Kim.,  M.  Park., dan  J.B.Kim.  2014.  Analysis  of  Gene Mutations Associated with Antibiotic Resistance  in Helicobacter  pylori Strains Isolated  from  Korean Patients. The  Korean
Journal of Helicobacter and Upper Gastrointestinal Research . 14(2):95-102.
Choi. J, C.H. Kim, D. Kim, S.J. Chung, J.H.Song, J.M. Kang,J. I.  Yang, M. J. Park, Y.S. Kim, J.  Y.  Yim,  S.H.  Lim,  J.S.Kim,  H.C.  Jung, dan I.S. Song . 2011. Prospective Evaluation  of    New  Stool  Aantigen  Test  for The  Detection  of Helicobacter  pylori ,  in Comparison  With  Histology,  Rapid  Urease Test,  C-Urea  Breath  Test,  and  Serology.
Journal Of Gastroenterology and Hepatology . 26:1053-1059. Depkes RI. 2009. Profil Kesehatan Indonesia.Jakarta : Departemen Kesehatan RI.
Dunn,  B.  E.,  H.  Cohen.,  dan  M.  J.  Blaser.  1997. Helicobacter  pylori.  Clin  Microbial  Rev. (10): 720-741.
Gerrits  M.M,  Godoy  A.P,  Kuipers  E.J,  M.  L. Ribeiro,  J.  Stoof,  S.  Mendoca,  A.H.M  Van
Vilet,  J.  Pedrazzoli  Jr,  dan  J.  G.  Kusters. 2006.  Multiple  Mutations  in  or  Adjacent  to the  Conserved  Penicillin-Binding  Protein Motifs  of The  Penicillin-Binding  Protein  1  A
Confer Amoxocillin Resistance in
Helicobacter  pylori . Helicobacter .  11:181- 187.
Glupczynski,  Y.,  Megraud,  F.,  Lopez-Brea,  M., dan  Andersen,  L.P.  2001.  European Multicentre  Survey  of in  vitro Antimicrobial Resistance i n Helicobacter pylori . Eur J Clin Microbial Infect Dis . 20: 820-823.
Inri,  M.S.,  Pangemanan,  D.H.C.,  dan  Untu,  F.M. 2013.  Hubungan  Antara  Pola  Makan dengan  Kejadian  Pada  Siswa-Siswi  kelas XI  di  SMA  Negeri  1  Manado. Ejournal keperawatan (e-Kp) .Vol.1(1)1-6.
Johannes,  G.K.,  Amoud, H.M.,  V.  Uliet.,  dan  E.J.
Kuipers. 2006. Pathogenesis of Helicobacter pylori Infection. Clinical Microbiology Review .p: 449-490.
Kabir, S. 2001. Detection of Helicobacter  pylori in Feces  by  Culture,  PCR,  and  Enzyme Immunoassay. J.  Med  Microbial .  (50)1021- 1029.
Leonardo,  H.E.,    M.  Rocco.,  Zagari  dan  F.
Bazzoli. 2014. Epidemiology of Helicobacter pylori Infection. Review
Article. Helicobacter 19(1):1-5.
Lim,  S.H.,  Kwon,  J.W.,  dan  Kim,  N.  2013.
Prevalance and
Risk Factors of Helicobacter  pylori in  Korea:  Nation  Wide
Multcenter  Study  Over  13  Years. BMC Gastroenterol .13:104.
Malfertheiner.  P,  Megraud.  F,  O’Morain.  C, Bazzoli  F,  El-Omar  E,  Graham  D,  Hunt  R, Rokkas  T,  Vakil  N,  dan  Kuipers  E  J.2002. Current  Concepts  in  The  Management  of H.  pylori  Infection-The  Maastricht  2-2002 Consensus  Report.  Aliment  Pharmacol Ther. 16:167-180.
Mathewos,  B.,  Meges,  B.,  dan  Dagnew,  M. 2013.Seroprevalance and Trend of
Helicobacter  pylori  Infection  in  Gondar University Hospital among Dyspeptic Patients, Gondar North West
Ethiopia.BMC. Res Note; 6:346.
Mendoca  S.,  Ecclissato  C.,  Sartori  M.S.,  Godoy. A.P.,  Gierzoni,  R.A.,  Degger  M.,  dam Pedrazzoli  J.  Jr.  2000.  Prevalence  of Helicobacter pylori
Resistance to Metronidazole,  Clarithromycin,  Amoxicillin, Tetracycline, and Furazolidone in Brazil. Helicobacter 5 : 79-83.
Meyer,  J.M.,  Silliman,  N.P,  Wang  W.,  Siepman, N.Y.,  Sugg  J.  E.,  dan  Morris  D.  2002.  Risk Factors  for  Helicobacter  pylori  Resistance in The United State: The Surveillance of H. pylori  Antimicrobial  Resistance  Partnership (SHARP)  Study,  1993-1999.  Ann  Int  Med. 136: 13-24.
Rimbara,  E.,  N.  Noguchi.,T.  Kawali.,  dan  M. Sasatsu.  2008.  Mutations  in  Penicillin- Binding  Protein  1,2,3  are  Responsible  for Amoxicillin  Resistance  in  Helicobacter pylori. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy. (61); 995-998.
Ricci. C, J. Holton, dan D. Vaira. 2007. Diagnosis of  Helicobacter  pylori:  Invasive  and  Non- Invasive  Test.  Best  Practice  &  Research Clinical Gastroenterology. 21(2) 299-313.
Van Blankenstein, M., van Vuurem, A.J., Looman, C.W.,  Ouwendi,  J.K.M.,  dan  Kuipers,  E.J. 2013.  The  Prevalence  of  Helicobacter pyloriInfection    in  The  Netherlands.  Scan  J Gastroenterol. 48:794-800.