Menara Perkebunan , 2006 74(2),  96-105.
Biokonversi CPO dengan desaturase amobil sistem kontinu pada skala  semipilot untuk produksi minyak

## mengandung GLA
Bioconversion of CPO using immobilized desaturase in continuous system at semipilot scale to produce oil containing GLA
SUHARYANTO 1) , TRI-PANJI 1)*) ,  M. Irfani ABDULLAH 2) & Khaswar SYAMSU 2)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia
2) Jurusan Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16002, Indonesia

## Summary
Gamma  linolenic  acid  (GLA)  is  a polyunsaturated  fatty  acid  having  high economic  value  as  healthy  oil.  Research  at laboratory scale showed that Absidia corymbifera and Rhizopus sp.  fungi  have  the ability  to  increase  unsaturation  level  of  crude palm  oil  (CPO)  and  GLA  formation  through enzymatic  bioconversion.    Stability  of  desatu- rase  enzyme,  especially  ∆ 6 and  ∆ 12 having significant  role  in  this  process  could  be enhanced by applying immobilization technique.  The  current  research  objective  was to  determine  optimum  process  of  CPO  bio- conversion  using  immobilized  desaturase enzyme  using  continuous  system  at  semipilot scale to produce CPO containing GLA.  Crude desaturase  enzyme  of A.  corymbifera biomass was  immobilized  with  zeolite  particles  and used for optimization of CPO bioconversion in continuous system at semipilot scale (15,000  mL  per  day).  Optimization  of  bio- conversion  conditions  included  flow  rate  of substrate,  size  of  zeolite  for  immobilization, and  enzyme  stability  during  process.    The result  showed  that  desaturase  immobilized  in small  size  particles  of  zeolite  (1-3  mm)  gave higher  increase  unsaturation  level  with average  desaturase  activity  of  7.84  U, compared to that immobilized in larger zeolite particles  (8-10  mm),  which  reached  average desaturase  activity  of  4.67  U.    However,  the use  of  small  zeolite  particles  often  caused plugging  substrate  flow.  The  activity  of immobilized  desaturase  in  continuous    system
was  stable  for  9-18  hours.  Optimum  flow  rate of  substrate  using  small  zeolite  particles  (1- 3  mm)  was    850  mL/min,  while  that  of  using larger  zeolite  particles  (8-10  mm)  was 875  mL/min.    The  bioconversion  of  CPO  at optimum  condition  yielding  1.58%  (w/w)  GLA from  initial  concentration  of  linolenic  acid 0.29%.
[ Keyword : Absidia corymbifera, CPO biocon- version, desaturase enzyme, enzyme immobilization,    gamma-linolenic acid ]

## Ringkasan
Asam  γ-linolenat  (GLA)  merupakan asam lemak  takjenuh  majemuk  yang  memiliki  nilai ekonomi  tinggi  sebagai  minyak  kesehatan. Penelitian  pada  skala  laboratorium  me- nunjukkan  bahwa Absidia  corymbifera dan Rhizopus sp.  memiliki  kemampuan  untuk  me- ningkatkan  ketidak-jenuhan  minyak  sawit mentah (CPO) dan menghasilkan GLA melalui biokonversi enzimatis. Stabilitas enzim desaturase , khususnya  ∆ 6 dan  ∆ 12 yang berperan  pada  proses  ini  dapat  ditingkatkan antara lain melalui teknik amobilisasi. Penelitian  lanjutan  ini  bertujuan  menetapkan kondisi  optimum  biokonversi  CPO  untuk menghasilkan  minyak  yang  kaya  akan  asam lemak  takjenuh  majemuk,  khususnya  GLA menggunakan  enzim  desaturase  amobil  sistem kontinu  pada  skala  semipilot.    Ekstrak  kasar enzim desaturase asal biomassa fungi
*) Penulis korespondensi

## Suharyanto et al.
A.  corymbifera diamobilisasi  dengan  butiran zeolit  dan  selanjutnya  digunakan  untuk optimasi  proses  biokonversi  secara  kontinu pada  skala  semipilot  (15.000  mL  per  hari). Optimasi  proses  kontinu  meliputi  laju  alir substrat,  ukuran  butiran  zeolit,  dan  stabilitas enzim  selama  proses.  Hasil  penelitian  menun- jukkan  bahwa  desaturase  yang  diamobilisasi pada  zeolit  berukuran  kecil  (1-3  mm) memberikan  peningkatan  ketidakjenuhan  yang lebih  tinggi  dengan  aktivitas  rata-rata  7,84  U, dibandingkan  dengan  yang  diamobilisasi  pada zeolit  berukuran  besar  (8-10  mm)  dengan aktivitas rata-rata 4,67 U. Namun, penggunaan zeolit  berukuran  kecil  sering  menimbulkan sumbatan  aliran  substrat.  Aktivitas  desaturase amobil  pada  proses  kontinu  dapat  bertahan selama  9-18  jam.  Laju  alir  optimum  substrat pada  penggunaan  zeolit  berukuran  kecil  (1- 3  mm)  adalah  850  mL/menit,  sedangkan  pada penggunaan  zeolit  besar  (8-10  mm)  adalah 875  mL/menit.  Biokonversi  CPO  pada  kondisi optimum  menghasilkan  GLA  1,58%  (b/b)  dari kandungan asam linolenat awal 0,29%.

## Pendahuluan
Asam  gamma  linolenat  (C18:3,  ω-6, atau  GLA)  memiliki  arti  penting  bagi dunia medis dan farmasi, antara lain untuk menurunkan  kolesterol low  density  lipo- protein (LDL)  bagi  penderita  hiper- kolesterolemia  (Ishikawa et  al .,  1989), mengobati  sindroma  prahaid  (Horrobin, 1983),  eksema  atopik  (Biagi et  al .,  1988) dan sebagai anti trombotik (Suzuki, 1991), serta untuk kelancaran metabolisme tubuh (James  &  Carter,  1988).  Di  Jepang,  GLA juga  dipasarkan  sebagai  bahan  baku kosmetika  untuk  menjaga  kelembapan kulit  (Suzuki,  1991).  Asam  lemak  ini dapat  terbentuk  dari  biokonversi  asam linoleat  (LA)  oleh  enzim  ∆ 6 desaturase yang  dihasilkan  oleh  fungi  dari  ordo Mucorales, kelas Zygomycetes.
GLA  memiliki  nilai  ekonomi  yang sangat  tinggi.  GLA  murni  dijual  di  dalam kemasan ampul 100 mg dengan harga US $ 69,7. Dalam  bentuk kasar,  yaitu  dengan
kadar  10%  dalam  campuran  dengan  asam palmitat,  stearat,  oleat  dan  linoleat,  asam lemak  ini  dijual  dengan  harga  US$  160 per  100  g  (Sigma,  2004).  Berbagai penelitian  telah  dilakukan  sebagai  upaya untuk  memproduksi  asam  lemak  jenis  ini dan  asam  lemak  takjenuh  majemuk (PUFA)  lainnya,  mulai  dari  kloning  gen desaturase  asal  tanaman  (Cahoon et  al ., 1998;  Knutzon et  al .,  1998)  hingga optimasi  produksi  menggunakan  mikroba, khususnya fungi (Immelman et al ., 1997). Pada  penelitian  sebelumnya  (Tri-Panji, 1997)  cairan  fermentasi Absidia  corym- bifera terbukti  mampu  meningkatkan angka  iodin  CPO.  Cairan  fermentasi  ini juga  mengubah  asam  oleat  menjadi  lino- leat  (LA)  dan  LA  menjadi  GLA.  Hal  ini berarti  cairan  fermentasi  fungi  tersebut mengandung  enzim  desaturase,  termasuk ∆ 6 dan  ∆ 12 desaturase.  Adanya  enzim  ∆ 6 desaturase    pada  mikroba  penghasil  GLA pernah  dilaporkan  oleh  Suzuki  (1991). Pening-katan  angka  iodin  diduga  tidak hanya berasal dari perubahan  LA menjadi GLA  tetapi  juga  oleh  perubahan  asam lemak  lainnya  yang  mengalami  pening- katan ketidakjenuhan, terutama asam oleat menjadi  linoleat.  Hasil  yang  belum  di- publikasikan  menunjukkan  bahwa  cairan fermentasi Rhizopus oryzae juga memiliki kemampuan  serupa.  Enzim  desaturase dapat  diamobilisasi  dengan  butiran  tulang sapi  dan   zeolit   untuk      meningkatkan kestabilannya  dalam  proses  biokonversi (Tri-Panji et al ., 2002).
Sistem  biokonversi  yang  banyak  di- terapkan di industri adalah sistem kontinu. Sistem  kontinu  adalah  biokonversi  yang memungkinkan  komponen  umpan  dialir- kan dan diproses hingga diperoleh produk secara  terus  menerus.    Sistem  tersebut memiliki  keuntungan  dibanding  dengan sistem batch (curah)  dalam  hal  ke- mudahannya  untuk  otomatisasi  proses, penghematan ruangan produksi dan kecepatan  proses.    Laju  alir  substrat  dan
Biokonversi CPO dengan desaturase amobil sistem kontinu pada skala  semipilot...
stabilitas  desaturase  dalam  sistem  kontinu selama  proses    perlu  diketahui  sehingga biokonversi  dapat  berlangsung  secara optimal.  Tahapan  penelitian  skala  semi- pilot  dan  pilot  perlu  dilakukan  sebelum teknologi  biokonversi  tersebut  dapat  di- terapkan  pada  skala  industri.  Tujuan penelitian  adalah  menetapkan  kondisi optimum  ukuran  butiran  zeolit  yang digunakan  dalam  amobilisasi  desaturase, laju  alir  substrat,  dan  stabilitas  enzim desaturase  amobil  selama  proses  bio- konversi  CPO  dalam  sistem  kontinu  pada skala semipilot.
Bahan dan Metode
Penyiapan kultur A. corymbifera
Fungi A.  corymbifera diperoleh  dari Laboratorium  Mikroba  dan  Bioproses, Balai  Penelitian  Bioteknologi  Perkebunan Indonesia  (BPBPI),  Bogor  dan  dipelihara dalam  medium potato  dextrose  agar (PDA)  miring.  Inokulum  ditumbuhkan dalam   labu   Erlenmeyer 500  mL berisi medium potato  dextrose    broth (PDB) yang  diinokulasi  dengan  dua  loop  spora dan  miselium A.  corymbifera dari  kultur PDA  miring  umur  72  jam.  Kultur  diinku- basi pada suhu ruang (25-30 o C) di atas rak bergoyang  pada  kecepatan  110  rpm selama  72  jam  dan  selanjutnya  miselium dipanen untuk sumber inokulum.
Inokulum  dihaluskan  dengan blender selama  lima  menit,  kemudian  sebanyak 10% (v/v) ditambahkan ke dalam medium fermentasi  Serrano-Carreon et  al. (1993) dengan  komposisi  (g/L)  (NH 4 ) 2 SO 4 0,94;
KH 2 PO 4 7; Na 2 HPO 4 .2H 2 O 2,507; MgSO 4 . 7H 2 O  1,5;  CaCl 2 0,0041;  ZnSO 4 .  7H 2 O 0,0001,  dengan  molase  sebagai  sumber karbon, serta ditambahkan larutan HCl 1:1 sampai  pH  5,0.  Kultur  diinkubasi  selama 120  jam  pada  suhu  ruang  (25-30 o C)  di dalam  fermentor  film  permukaan  volume 60  L  dengan  ketebalan    kultur  1  cm.
Lapisan biomassa miselium dipanen untuk sumber enzim desaturase.

## Isolasi enzim desaturase
Isolasi  enzim  desaturase  (∆ 6 dan  ∆ 12 ) dilakukan  dengan  cara  menghancurkan biomasa A.  corymbifera segar  yang  telah dibersihkan  dari  sisa  medium  dan  dicam- pur dengan PBS ( phosphate buffer saline ) pH  6,8  dengan  nisbah  1:2  (b/v)  dengan blender selama dua kali 15 menit. Pecahan biomassa  miselium  dipisahkan  dari  cairan enzim  menggunakan  sentrifugasi  4.000 rpm selama 15 menit. Ekstrak enzim kasar dipisahkan  dari  pecahan  sel  meng-guna- kan  kertas  saring  pada  corong  Buchner dan dibantu dengan pompa vakum. Super- natan  yang berisi ekstrak kasar desaturase ini digunakan untuk percobaan amobilisasi enzim  dengan  butiran  zeolit  sebagai padatan pendukung atau pengamobil.

## Amobilisasi  desaturase  dan  penentuan aktivitasnya
Butiran  zeolit  berukuran  1-3  mm (ukuran  kecil)  dan  8-10  mm  (ukuran besar)  yang  diperoleh  dari  pasaran sebelum  digunakan  sebagai  padatan  pen- dukung  masing-masing  dicuci  dengan  air mengalir,  kemudian  direndam  dalam larutan  NaCl  1M  selama  12  jam  dengan dua  kali  penggantian  larutan  perendam. Butiran  zeolit  ini  kemudian  diaktivasi dengan  memanaskan  di  dalam  oven  pada suhu 200 o C selama 15 menit. Amobilisasi desaturase dilakukan dengan  cara  merendam  masing-masing 100  g  zeolit  teraktivasi  tersebut  ke  dalam 200  mL  ekstrak  enzim  dan  dikocok dengan  mesin  pengocok  pada  kecepatan 180 rpm selama satu jam pada suhu ruang (25-28 o C),  kemudian  cairan  dipisahkan. Jumlah  enzim  teramobilisasi  ditentukan berdasarkan  pengurangan  kadar  protein cairan enzim sebelum dan setelah
Suharyanto et al.
amobilisasi  menggunakan  metode  Lowry (1951)  dengan  standar  protein  BSA ( bovine  serum  albumin ).  Butiran  zeolit yang telah mengamobilisasi enzim digunakan untuk biokonversi CPO.
Untuk  mengetahui  aktivitas  desatu- rase  amobil  selama  proses  biokonversi, padatan  zeolit  yang  mengandung  enzim amobil  (2  g)  direaksikan  dengan  substrat CPO  (2  mL)  di  dalam  tabung  reaksi. Campuran  tersebut  selanjutnya  divortex selama  2-3  menit  kemudian  diinkubasi selama  30  menit  pada  suhu  ruang  (25- 28 o C). CPO dipisahkan dari padatan zeolit untuk kemudian dianalisis bilangan iodinnya  menggunakan  metode  AOAC (1995). Aktivitas desaturase (unit) didefinisikan  sebagai  besarnya  pening- katan  ketidakjenuhan  CPO  yang  diakibat- kan  reaksi  enzimatis  oleh  1  mg  enzim dalam  padatan  zeolit  selama  satu  menit (g    I 2 /100  g  CPO  per  mg  enzim  per menit). Butiran zeolit yang telah mengamobilisasi  enzim  digunakan  untuk biokonversi CPO.

## Optimasi proses desaturase sistem kontinu
Ekstrak  kasar  desaturase  yang  telah diamobilisasi  dalam  medium  amobilisasi zeolit  (1.000  g),  dengan  dua  ukuran butiran  masing-masing  1-3  mm  dan  8-10 mm  dimasukkan  ke  dalam  kolom  reaktor model  unggun  ( packed  bed )  yang  terbuat dari  kaca  berdiameter  5  cm  dan  tinggi 50  cm  (volume  982  mL).  Secara  sinam- bung  fraksi  CPO  dalam  tangki  timbun dialirkan masuk dari bagian bawah kolom ke  bagian  atas  ( upward  flow )  melewati rongga antarbutiran zeolit dengan bantuan kompresor pada laju alir konstan sedemikian  sehingga  menghasilkan  waktu kontak  enzim-substrat  selama  30  dan  40 menit.  Waktu  kontak  tersebut  didasarkan atas  waktu  optimum  biokonversi  secara batch yang diperoleh  dari  percobaan sebelumnya  (Tri-Panji et  al .,  2003). Zeolit berukuran 1-3 mm (kecil) memiliki
rongga  antar  butiran  sebanyak  47%  total volume, sedangkan zeolit berukuran besar memiliki  volume  rongga  sebesar  49,5%. Pada  penggunaan  enzim  yang  diamobi- lisasi  pada  zeolit  ukuran  kecil,  laju  alir substrat yang digunakan adalah   830 mL/ jam  yang  diperoleh  dari  waktu  kontak enzim-substrat  30  menit  dan  623  mL/jam yang  diperoleh dari waktu  kontak 40  menit.  Pada  penggunaan  medium pengamobil  zeolit  berukuran  besar,  laju alir  substrat  yang  digunakan  adalah 875 mL/jam (waktu kontak 30 menit) dan 656  mL/jam  (waktu  kontak  40  menit). Sampel  CPO  yang  telah  mengalami biokonversi diambil dari botol penampung mulai  dari  jam  ke-0,  1,  2,  4,  6,  9,  12,  18, dan  24,  dan  ditentukan  peningkatan bilangan  iodin  dan  aktivitas  desaturase. Komposisi  asam  lemak  dianalisis  dengan GC  (Tri-Panji et  al .,  1997),  dan  kualitas minyak  (bilangan  iodin,  bilangan  perok- sida,  bilangan  asam,  bilangan  penya- bunan)  sebelum  dan  sesudah  biokonversi pada  kondisi  optimum  diperiksa  dengan metode  AOAC  (1995).  Stabilitas  enzim diuji  untuk  menentukan  sampai  berapa lama enzim amobil dapat digunakan untuk proses kontinu.

## Hasil dan Pembahasan

## Pemilihan ukuran butiran zeolit
Zeolit  berukuran  kecil  memiliki  luas permukaan  per  satuan  bobot  bahan  yang jauh  lebih  besar  dibandingkan  zeolit  ber- ukuran  besar.  Dengan  demikian,  butiran zeolit  yang  lebih  kecil  akan  mampu menjerap  dan  mengamobilisasi  desaturase lebih  banyak  dibandingkan  dengan  yang berukuran  lebih  besar.  Jumlah  desaturase yang  lebih  banyak  akan  mampu  mening- katkan  bilangan  iodin  yang  lebih  banyak juga.  Bilangan  iodin  CPO  blanko,  yaitu 47,95  g  I 2 /100  g  CPO  dapat  ditingkatkan menjadi    4-12 satuan  dengan  desaturase
Biokonversi CPO dengan desaturase amobil sistem kontinu pada skala  semipilot...
teramobilisasi pada zeolit ukuran 1-3 mm, sedangkan  desaturase  yang  diamobilisasi pada  zeolit  berukuran  8-10  mm  hanya meningkatkan  bilangan  iodin  sebesar  2-4 satuan.  Namun, ukuran butiran yang lebih kecil  memiliki  ukuran  rongga  yang  lebih kecil  pula,  yang  berpotensi  menyebabkan terjadinya sumbatan terhadap aliran substrat.  Kendala  teknis  ini  dapat  diatasi dengan  cara  menyaring  substrat  atau memisahkan fraksi padat CPO.

## Optimasi laju alir substrat
Laju  alir  830  mL/jam  (waktu  kontak 30  menit)  untuk    zeolit  ukuran  1-3  mm menghasilkan  aktivitas  desaturase  ter- tinggi  yaitu  13,35  U  pada  jam  ke-9 (Gambar  1  A).    Aktivitas  desaturase  pada laju  alir  tersebut  masih  terdeteksi  sampai jam ke-18 dan tidak terdeteksi lagi setelah 24 jam.  Laju alir 623 mL/jam  dan waktu kontak  40  menit  menghasilkan  aktivitas desaturase  sebesar  2,95  U  (Gambar  1  B). Laju  alir  substrat  yang  lebih  lambat  atau waktu  kontak  yang  lebih  lama  ternyata tidak  menghasilkan  peningkatan  bilangan iodin  yang  lebih  tinggi  untuk  zeolit  ber- ukuran  1-3  mm.  Hal  tersebut  kemung- kinan  disebabkan  waktu  kontak  yang melebihi  optimum  tidak  menghasilkan tambahan pembentukan ikatan C=C, tetapi justru  ikatan  C=C  yang  telah  terbentuk sebagian  rusak  oleh  oksidasi.  Dugaan  ini muncul  berdasarkan  pengamatan  pening- katan  bilangan  peroksida  selama  proses biokonversi  enzimatis  dengan  desaturase (Tabel  1).
Laju  alir  substrat  874  mL/jam  dan 656  mL/jam  untuk  zeolit  berukuran  8- 10  mm  pada  kolom  kaca  (50  cm  x  5  cm i.d.)  berisi  desaturase  amobil  diatur  untuk waktu  kontak  yang  sama  yaitu  masing- masing 30 dan 40 menit. Laju alir substrat 874 mL/jam untuk penggunaan zeolit ber- ukuran  8-10  mm  menghasilkan  aktivitas desaturase  tertinggi  yaitu  4.21  U  yang
dapat dicapai setelah proses berjalan enam jam.  Aktivitas  desaturase  dalam  CPO masih terdeteksi sampai jam ke-9 dan akti- vitas  desaturase  hilang  sama  sekali  pada jam ke-12 (Gambar 2 A). Laju alir substrat 656  mL/jam  untuk  zeolit  berukuran  8- 10  mm  menghasilkan  aktivitas  desaturase tertinggi 7,06 U  yang dicapai pada proses setelah sembilan jam (Gambar  2 B) Aktivitas  desaturase  masih  terdeteksi pada  jam  ke-12  (6,98  U),  dan  perubahan bilangan  iodin  telah  bernilai  negatif  pada jam  ke-18.    Berbeda  dengan  penggunaan zeolit ukuran kecil (1-3 mm), penambahan waktu  kontak  dari  30  menjadi  40  menit untuk  zeolit  berukuran  besar  (8-10  mm) justru  menyebabkan  kenaikan  bilangan iodin.  Hal  tersebut  berarti  bahwa  dengan penambahan  waktu  kontak  laju  desaturasi meningkat lebih besar daripada laju reaksi oksidasi.  Ukuran  rongga  antar  butiran zeolit  yang  lebih  besar  menyebabkan gesekan aliran substrat dengan permukaan zeolit  lebih  kecil  sehingga  oksidasi  juga relatif  lebih rendah.
Stabilitas enzim selama proses biokonversi Secara umum, pola peningkatan aktivitas  desaturase  pada  awal  proses relatif  kecil  bahkan  sebagian  menghasil- kan  nilai  negatif  dan  setelah  waktu tertentu  meningkat  cukup  tajam  dan  pada suatu  saat  kembali  menurun  (Gambar  1 dan  2).  Stabilitas  desaturase  ditetapkan berdasarkan  periode  waktu  yang  mem- berikan  aktivitas  yang  cukup  bermakna (>  1,5  U).    Aktivitas  desaturase  rata-rata selama proses ditetapkan berdasarkan nilai rata-rata  aktivitas  pada  rentang  waktu proses pada saat desaturase dalam keadaan stabil  (Tabel  2).  Pada  proses  kontinu, aktivitas  desaturase  amobil  dapat  diper- tahankan  selama  kurang  lebih  9-18  jam (Gambar  1  dan  2).    Hal  ini  berarti  proses amobilisasi dapat memperpanjang

## Suharyanto et al.
Gambar 1. Peningkatan bilangan iodin CPO dalam biokonversi dengan desaturase amobil menggunakan zeolit kecil (1-3 mm) sistem kontinu skala semipilot pada laju alir 830 mL/jam, waktu kontak 30 menit (A) dan pada laju alir 623 mL/jam, waktu 40 menit (B).
Figure  1.    Increasing  of  iodine  number  in  CPO  bioconverted  by  immobilized  desaturase  using  small zeolite  (1-3mm)  in  continuous    system  at  semipilot  scale  with  flow  rate  of  830    mL/hour, contact time 30 min (A)  and with flow rate of 623  mL/hour, contact time 40 min.
-2 - 1 0 1 2 3 4 5 0 2 4 6 8 10  12  14  16  18  20  22  24
Waktu proses (jam)
Process duration (hours) A k ti v it as d es at u ra se , u n it D es a tu ra se a ct iv it y, u n it - 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10  12  14  16 18 20  22  24
Waktu proses (jam) Process duration (hours) A k ti v it as d es at u ra se , u n it D es a tu ra se a ct iv it y, u n it A B
Biokonversi CPO dengan desaturase amobil sistem kontinu pada skala  semipilot...
Tabel 1. Mutu CPO sebelum dan setelah biokonversi dengan desaturase amobil sistem kontinyu.
Table 1. Quality of CPO before and after bioconversion using  immobilized desaturase  in  continuous systems
Parameter mutu Quality parameter Sebelum biokonversi Before bioconversion Sesudah biokonversi After bioconversion
Bilangan iodin ( Iodine number ),  g I 2 /100 g CPO 47,95 57,65 Bilangan asam ( Acid number ), mg KOH/g CPO 9,0 11,3 Bilangan peroksida (Peroxide number ), mg/kg CPO 12,1 15,7 Bilangan penyabunan ( Soap number ), mg KOH/g CPO 127,4 120,7
aktivitas  desaturase.  Desaturase  di  dalam homogenat  (tanpa  amobilisasi)  hanya bertahan  selama  3-4  jam  (Tri-Panji et  al ., 2002;  Suzuki,  1991),  yang  mungkin disebabkan  antara  lain  oleh  protease (Ozols,  1997).  Perpanjangan  aktivitas desaturase melalui amobilisasi ini mungkin  disebabkan  oleh  pengikatan enzim  desaturase  dan  protease  pada  sisi yang  berbeda  pada  permukaan  zeolit sehingga  frekuensi  kontak  antara  protease dan  desaturase  dapat  dikurangi.    Dengan memilih  laju  alir  optimum  830  mL/jam, jumlah  CPO  yang  dapat  dibiokonversi menggunakan  desaturase  yang  diamobi- lisasi  pada  zeolit  ukuran  1-3  mm  selama satu  siklus  (9-18  jam)  mencapai  7.650- 15.300  mL.  Minyak  hasil  biokonversi dapat  ditingkatkan  bilangan  iodinnya hingga lima satuan (g I 2 / 100 g minyak).
Proses desaturasi sistem kontinu
menggunakan  zeolit  kecil  (1-3  mm) dengan  waktu  kontak  30  menit  memberi- kan  aktivitas  desaturase  rata-rata  terbaik sebesar  7,84    U  CPO  dengan  stabilitas 14  jam.    Dengan  laju  alir  830  mL/jam akan  diperoleh  output  produk  sebanyak 11.620  mL/hari,  dengan  waktu  optimasi selama 14 jam.

## Perubahan  mutu  dan  komposisi  asam lemak
Perubahan  mutu  dan  komposisi  asam lemak CPO hasil biokonversi pada kondisi
optimum dapat dilihat pada Tabel 1 dan 3. Bilangan  iodin  dalam  biokonversi  ini dapat ditingkatkan secara nyata, yaitu dari 47,95  g  I 2 /100  g  CPO  menjadi  57,65  g I 2 /100  g  CPO  yang  terkait  dengan meningkatnya ketidakjenuhan CPO. Selama  proses  desaturasi  sistem  kontinu diduga  terjadi  reaksi  oksidasi  ikatan rangkap membentuk gugus peroksida pada rantai  asam  lemak.    Hal  ini  terlihat  dari peningkatan  bilangan  peroksida  CPO  dari 12,1  mg/kg  menjadi  15,7  mg/kg  atau peningkatan  bilangan  peroksida  sebesar 3,6  satuan.    Reaksi  pembentukan  gugus peroksida  ini  berlawanan  dengan  reaksi desaturasi  karena  bersifat  menurunkan bilangan  iodin  CPO.    Penggunaan  udara bertekanan  tinggi  untuk  pengaliran  CPO dan  terjadinya  kontak  CPO  dengan oksigen terlarut dalam air pada permukaan zeolit  maupun  oksigen  udara  pada  tabung penampung  diduga  ikut  berperan  pada peningkatan bilangan peroksida.  Hal yang sama  juga  terjadi  pada  bilangan   asam yaitu  mengalami  kenaikan  2,3  satuan. Kenaikan  bilangan  asam  terkait  dengan hidrolisis  gliserida  CPO  dengan  bantuan air  yang  sedikit  terkandung  dalam  zeolit sebagai padatan pengamobil enzim. Proses desaturasi kontinu menghasilkan penurun- an bilangan penyabunan yang relatif kecil. Bilangan penyabunan turun dari 127,4 mg KOH/g minyak menjadi 120,7 mg KOH/g minyak.  Penurunan  bilangan  penyabunan ini belum diketahui penyebabnya.
Suharyanto et al.
Tabel 2.  Aktivitas desaturase rata-rata dan stabilitasnya selama biokonversi CPO sistem  kontinu pada skala semipilot.
Table 2.   Average desaturase activity and its stability  during CPO bioconversion in  continuous system at semipilot scale. Ukuran zeolit Zeolite size Laju alir (mL/jam) Flow rate (mL/hour) Waktu kontak Contact time ( min ) Aktivitas desturase rata-rata Average desaturase activity (U) Stabil dalam selang waktu (jam) Stable  at  range time (hour ) Kecil  ( Small) 1-3 mm 830 623 30 40 7,84 2,63 4 - 18 2 - 18 Besar (Large ) 8-10 mm 874 656 30 40 2,63 4,76 2 – 9 1 - 12 -2 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 10  12  14  16  18  20  22  24 Waktu proses (jam) Process duration (hours)
A k ti v it as d es at u ra se , u n it D es a tu ra se a ct iv it y, u n it -2 - 1 0 1 2 3 4 5 0 2 4  6 8  10  12  14  16  18  20  22  24
Waktu proses (jam) Process duration (hours)
A k ti v it as d es at u ra se , u n it D es a tu ra se a ct iv it y, u n it A B
Gambar 2.  Peningkatan bilangan iodin CPO dalam biokonversi dengan desaturase amobil menggunakan zeolit besar (8-10 mm) dalam   sistem  kontinu  skala   semipilot  pada   laju alir 874 mL/jam, waktu kontak 30 menit (A) dan pada laju alir 656 mL/jam, waktu 40 menit (B).
Figure 2.   Increasing   of  iodine  number  in CPO bioconverted by immobilized  desaturase using large zeolite (8-10 mm) in continuous  system  at  semipilot  scale with  flow  rate  of  874 mL/hour, contact time 30 min (A)  and with flow rate of 656 mL/hour, contact time 40 min.
Biokonversi CPO dengan desaturase amobil sistem kontinu pada skala  semipilot...
Tabel 3.  Komposisi asam lemak hasil biokonversi CPO dengan desaturase amobil sistem kontinu skala semipilot pada kondisi optimal.
Table 3.  Fatty  acid  composition  resulted  from CPO  biconversion  using  immobilized  desaturase in continuous system at semipilot scale under optimal condition.
Komposisi asam lemak Fatty acid composition (%, w/w) CPO blanko Blank CPO CPO hasil biokonversi pada kondisi optimum CPO from bioconversion at optimum condition
Asam laurat ( Lauric acid ), C 12:0 Asam miristat  ( Myristic acid ), C 14:0
Asam palmitat ( Palmitic acid ), C 16:0 Asam palmitoleat ( Palmitoleic acid ) C 16:1
Asam stearat ( Stearic acid ), C 18:0
Asam oleat ( Oleic acid ), C 18:1 Asam linoleat ( Linoleic acid ), C 18:2 Asam linolenat ( Linolenic acid ), C 18:3 0,25 1,36 42,59 - 0,13 43,24 12,15 0,29 0,27 1,35 40,13 2,72 0,31 41,89 11,74 1,58
Desaturasi  CPO  sistem  kontinu  menye- babkan  terjadinya  perubahan  komposisi asam  lemak  dalam  CPO.  Asam  lemak takjenuh yang mengalami kenaikan adalah asam  palmitoleat  (C16:1)  sebesar    2,72% dan asam linolenat (C18:3) sebesar 1,29%. Sementara  itu  asam  oleat  (C18:1)  dan asam  linoleat  (C18:2)  mengalami  penu- runan.  Reaksi  desaturasi  asam  lemak merupakan reaksi yang bersifat konsekutif atau  reaksi  berantai.    Menurut  Suzuki (1991)  pembentukan  GLA  berasal  dari asam  linoleat  dikatalisis  oleh  ∆ 6 desa- turase.    Selain  ∆ 6 desaturase,  biokonversi tersebut  diperkirakan melibatkan pula ∆ 12 desaturase yang mengkatalisis pembentuk- an asam linoleat dari asam oleat.  Namun, laju pembentukan asam linolenat mungkin lebih  cepat  daripada  pembentukan  asam linoleat  sehingga  kenaikan  persentase asam  linoleat  tidak  terdeteksi.  Sebagai senyawa  kimia  murni  ( pure  chemical ) asam  linoleat  lebih  murah  dibandingkan GLA  sehingga  peningkatan  GLA  tersebut akan meningkatkan nilai tambah CPO.

## Kesimpulan dan Saran
Kondisi  optimum  untuk  desaturasi CPO  sistem  kontinu  pada  skala  semipilot adalah  dengan  mengamobilisasi  enzim desaturase  pada  zeolit  berukuran  kecil  (1- 3  mm)  yang  telah  diaktifkan.    Laju  alir CPO  optimum  adalah  850  mL/menit  dan waktu  kontak  30  menit.  Aktivitas  desatu- rase  amobil  pada  kondisi  tersebut  dapat bertahan selama 9-18 jam dengan aktivitas rata-rata  7,84  U.  Biokonversi  CPO  pada kondisi  optimum  menghasilkan  GLA 1,58%  (b/b). Namun,  penggunaan  zeolit berukuran  kecil  dapat  menimbulkan sumbatan aliran substrat. Untuk mengatasi hal  tersebut  perlu  digunakan  fraksi  cair CPO  (fraksi olein).

## Ucapan Terimakasih
Tim  peneliti  mengucapkan  terima kasih  atas  bantuan  dana  penelitian  dari Kementerian  Riset  &  Teknologi  melalui Program  Insentif  RUSNAS  Industri  Hilir Minyak  Kelapa  Sawit  TA  2003  yang memungkinkan penelitian ini dapat terlaksana.
Suharyanto et al.

## Daftar Pustaka
AOAC (1995). Official Methods of Analysis of The  Association  of  Official  Analiytical Chemist Vol  II  A.    Washington,  AOAC Int., 4, 17-19.
Biagi,  P.L.,  A.  Bordoni,  M.  Masi,  G.  Ricci, C.    Fanelli,  A.    Patrizi    &    F.  Ceccolini (1988). Evening primose oil (Efanol) in the treatment  of  children  with  atopic  eczema. J. Drug Exptl.  Clin.  Res ., 14, 291-297.
Cahoon,  E.  B.,  S  Shah,  S.,  J  Shanklin  & J.  Browse  (1998).  A  determinant  of
substrate  specificity  predicted  from  the acyl-carrier protein desaturase of developing  cat’s  claw  seed. J.  Plant. Physiol ., 117, 593-598.
Horrobin,  D.F  (1983).  The  role  of  essential fatty  acid  and  prostagladins  in  the premenstrual  syndrome. J.  Reprod.  Med ., 28, 465-468.
Immelman,  M,  J.C.  Du  Preez  &  S.  Killian
(1997).  Effect  of  C:N  ratio  on  gamma- linolenic  acid  production  by Mucor circinelloides grown on acetic acid. System Appl.  Microbiol ., 20, 158-164.
Ishikawa,  T.,  Y.    Fujiyama,  C.    Igarashi, M.    Morino,  N.    Fada,  A.    Kagami, T.  Sakamoto, N.  Nagano & H.  Nakamura (1989).  Clinical feature of familial hypercholesterolemia. J.  Atheroclerosis, 75 , 95.
James,  P.    &  M.    D.    Carter  (1988).  Gamma linolenic  acid  as  a  nutrient. J.  Food Technol ., 42 ,  72-82.
Knutzon,  D.S.,  M.T.  Jennifer,  S.H.  Yung, C.  Sunita,  G.B.  Emil,  M.C.  George, J.  K.  Stephen  &  M.  Pradip  (1997).
Identification of desaturase from Mortierella alpine by heterologous expression  in  Bakers’  Yeast  and  Canola. J. Biol. Chem ., 273, 45 , 29360-29366.
Lowry,  O.H.,  N.J.  Rose  Brough,  A.L.  Farr  & R.J.  Randall  (1951).  Protein  measure-ment with  the  folin  phenol  reagen. J.  Biol.
Chem ., 193 , 265-275.
Ozols, J  (1997)  Degradation of hepatic stearyl CoA ∆ 9 -desaturases. J.  Mol.  Biol.  Cell, 8,
2281-2290.
Serrano-Carreon, L.,Y.Hathout, M. Bensoussan
&    J.M.  Berlin  (1993).  Metabolism  of linolenic acid or mavalo-nate and 6-pentyl- α -pyrone  biosynthesis  by Trichoderma species. J. Appl. Env. Microb ., 59 ,  2945- 2950.
Sigma  Chemical  Company  (2004). Bioche- micals  and  Reagents  for  Life  Science Research. USA, Sigma.
Suzuki, O (1991). Recent trends of oleochemical by biotechnology. In PORIM International Palm Oil Conference
Chemistry  and  Technology  Malaysia . Kuala  Lumpur,  9-14  September  1991,  p 221-230.
Tri-Panji  (1997).  Growth  and  the  content  of polyunsaturated  fatty  acids  of A.    corym- bifera biomass  on  media  containing  crude palm  oil. Menara  Perkebunan, 65 (3),
104-110.
Tri-Panji,  K.  Syamsu  &  Suharyanto  (2003). Produksi  asam  gamma  linolenat  melalui biokonversi  CPO  menggunakan  desatu- rase amobil sistem batch dan kontinu skala semipilot. Laporan  Akhir  Riset  Unggulan Strategis    Nasional  (RUSNAS)  Industri Hilir Kelapa Sawit - Kemeterian Riset dan Teknologi. Bogor,  Balai  Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia,  50p.
Tri-Panji, K. Syamsu, Suharyanto & I.  Fathurachman  (2002).  Amobilisasi desaturase asal Absidia corymbifera menggunakan  butiran  tulang  sapi  dan zeolit .  J.  Tek.  Indst., 11 (3),  101-107 .