## EFEK  PAPARAN  EKSPONENSIAL  DAN SQUARE  WAVE DALAM METODE ELEKTROPORASI TERHADAP MOTILITAS DAN VIABILITAS SPERMA IKAN NILEM ( Osteochilus vittatus )
The effect of exponential and square wave exposures in the electroporation method on the motility and viability of bonylip barb ( Osteochilus vittatu s)
Abdul Rahem Faqih 1* , Septi Anitasari 1 dan Angga Wiratama 2
1 Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Brawijaya, Malang
2 Praktisi Pembenihan Ikan Nilem
* ar.faqih@ub.ac.id

## Abstrak
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh perbedaan metode (Square wave and Exponential) terhadap motilitas) dan (viabilitas) sperma ikan nilem (Osteochilus Vittatus ) . Aspek yang perlu dikaji antara lain penelitian tentang pengaruh medan listrik dengan metode yang berbeda terhadap motilitas dan viabilitas sperma ikan.  Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium  Breeding  (Budidaya  Perairan)  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu Kelautan  serta  di  Laboratorium  Sentral  Ilmu  Hayati  (LSIH)  Universitas Brawijaya  Malang.  Analisa  data  yang digunakan adalah Uji t karena terdiri dari 2 perlakuan dengan 3 kali ulangan. Sebagai perlakuan adalah metode Square wave dan eksponensial juga dilakukan 2 kontrol yaitu pengamatan sperma sebelum dan sesudah perlakuan. Parameter  utama  dalam  penelitian  ini  adalah  motilitas  dan  viabilitas  sperma  ikan  nilem.  Hasil  penelitian menunjukkan bahwa elektroporasi dengan metode Square Wave lebih baik hasilnya jika dibandingkan dengan metode  Eksponensial.  Hal  tersebut  dapat  dilihat  pada  nilai  rata-rata  motilitas  sperma  ikan  nilem  dengan menggunakan metode square wave sebesar 34%, sedangkan dengan metode eksponensial sebesar 11%. Demikian pula hasil nilai rata-rata viabilitas sperma ikan nilem dengan menggunakan metode Square Wave sebesar 56%, sedangkan  dengan  menggunakan  metode  Eksponensial  sebesar  25%.  Hasil  pengamatan  sperma  sebelum elektroporasi diperoleh nilai motilitas sebesar 71,3% dan viiabilitas sebesar 75%, sedangkan sesudah elektroporasi diperoleh nilai motilitas sebesar 46,6% dan viabilitas sebesar 52,6%.
Kata kunci: Elektroporasi, Metode square wave dan exponential wave , Ikan Nilem, Sperma, Motilitas, Viabilitas

## Abstract
The purpose of this study was to determine the effect of different methods (Square wave and Exponential) on the movement (motility) and the ability to live (viability) sperm of bony lip barb ( Osteochilus vittatus ). For this reason, sperm research used as a medium for inserting foreign DNA into eggs needs to be done. One aspect that needs to be studied includes analysis of the effect of electric fields with different methods on the motility and viability  of  fish  sperm.  This  research  was  conducted  at  the  Breeding  Laboratory  of  Aquaculture  and  Marine Sciences and the Central Laboratory of Life Sciences (LSIH) Universitas Brawijaya Malang. The research method used was experimental, while for data analysis, the t-test was used because it consisted of 2 treatments with three replications. The treatment is a Square wave method and 2 exponential controls, namely sperm observation before and after treatment. The main parameters in this study were the motility and viability of sperm of the barb. The results  showed  that  the  electroporation  using  the  Square  Wave  method  was  better  when  compared  to  the Exponential process. This can be seen in the average sperm motility value of bony lip barb fish using the square wave method by 34%, while the exponential process is 11%. Similarly, the average sperm viability of nilem fish using  the  Square  Wave  method  is  56%,  while  the  Exponential  way  by  25%.  Sperm  observations  before electroporation obtained a motility value of 71.3% and viability of 75%, while after electroporation, the motility value is 46.6% and viability is 52.6%.
Keywords : Electroporation, Square wave and exponential wave method, Barb, Sperm, Motility, Viability

## PENDAHULUAN
Elektroporasi  merupakan  proses penerapan medan listrik (pulsa) terhadap sel hidup  dalam  jangka  waktu  yang  singkat. Elektroporasi memungkinkan pembentukan
pori-pori sehingga molekul eksogen seperti DNA  dapat  masuk  ke  dalam  sel. Elektroporasi  merupakan  teknik  yang sangat  efisien  untuk  memasukkan  asam nukleat,  protein,  karbohidrat,  pewarna,
partikel  virus  dan  molekul  lain  ke  dalam berbagai macam sel seperti prokariotik dan eukariotik (Chen et al ., 1994).
Metode  elektroporasi  menggunakan serangkaian  listrik  arus  pendek  untuk melemahkan membran sel guna membantu DNA  rekombinan  masuk  ke  dalam  sel tertentu.
Pada umumnya metode elektroporasi digunakan untuk transfer gen pada  bakteri yeast, tanaman  dan  sel-sel hewan (Chen et al ., 1994). Menurut Weaver (1993),  perubahan  permeabilitas  sel  oleh suatu medan elektrik disebut elektroporasi. Elektroporasi  telah  digunakan  untuk memindahkan  makromolekul  seperti  DNA dan  protein  ke  dalam  sel  tumbuhan,  sel hewan dan sel bakteri.
Metode  elektroporasi  yang  umum digunakan  untuk  menghasilkan  kondisi yang  optimal  terbukti  memakan  waktu. Dengan diperkenalkannya sistem elektroporasi "Gene  Pulser ",  kondisi optimal  dapat  ditentukan  dengan  cepat. Gene  Pulser adalah  sistem  elektroporasi modular,  yang  mencakup  unit  utama, memiliki 2 modul aksesori (modul CE dan modul  PC).  Modul  CE  digunakan  untuk media  yang  memiliki  hambatan  rendah (<1000  Ohm)  dan  tegangan  yang  rendah. Pada  tegangan eksponensial,  modul  CE berfungsi  mengontrol  kapasitan  selama bertambahnya  lama  kejutan  yang  konstan atau  stabil.  Sedangkan  tegangan Square wave memberikan  kebutuhan  kapasitan yang  besar  (3.275  F)  untuk  mengirim kejutan square  wave dalam  media  yang memiliki hambatan rendah.
Modul PC dibutuhkan untuk elektroporasi  tegangan  tinggi.  Modul  PC digunakan untuk hambatan 50 ohm - 1000 ohm dalam setiap kenaikan 50 ohm. Modul ini  efektif  untuk  mengontrol  konstannya waktu  ketika  digunakan  hambatan  tinggi, akan tetapi memiliki efek yang sedikit pada pengontrolan  konstannya  waktu  ketika digunakan pada hambatan rendah.
Modul CE digunakan untuk elektroporasi  sel  eukariotik,  termasuk  sel mamalia  dan  protoplasma  tanaman. Sedangkan  modul  PC  digunakan  untuk
elektroporasi  bakteri  dan  jamur  serta aplikasi lain dimana kejutan tegangan tinggi diterapkan  pada  sampel  volume  kecil  dan ketahanan  tinggi.  Sistem Gene  Pulser menghasilkan
bentuk gelombang eksponensial dan persegi ( square ), memungkinkan  untuk  memilih  gelombang yang  terbaik  untuk  proses  elektroporasi. Baik  secara  eksponensial  maupun  square telah digunakan dengan sangat efektif untuk elektroporasi. Bentuk gelombang elektroporasi dapat memiliki dampak yang signifikan  terhadap  efisiensi  transformasi untuk  tipe  sel  yang  berbeda  (Chen et  al .,
1994).
Transfer  gen  pada  ikan  dengan menggunakan metode elektroporasi dengan sperma  ikan  sebagai  media  transfer  gen masih  belum  dilakukan  di  Indonesia. Padahal  Kang et  al. (1999)  menyatakan bahwa sel sperma dapat digunakan sebagai media  untuk  memasukkan  DNA  asing  ke dalam  sel  telur.  Oleh  karena  itu  perlu dilakukan  penelitian  tentang  pengaruh metode elektroporasi yang berbeda terhadap  motilitas  dan  viabilitas  sperma ikan.
Perpindahan molekul DNA ke dalam sel,  suatu  transfer  gen  dari  sel  yang  berisi DNA  asing  melalui  kejutan  listrik.  Dua jenis  kejutan  listrik  yang  berbeda  yaitu Square  wave dan Exponential  wave telah digunakan dalam mentransfer gen ke dalam sperma  ikan.  Tegangan  dari Square  wave lebih  diarahkan  kepada  amplitudo  yang diperlukan  yang  mana  untuk  menjaga lamanya waktu kejutan, kemudian dikembalikan ke nol. Sedangkan Exponential  wave, tegangan  ditujukan untuk  suatu  amplitudo  yang  diinginkan, kemudian  memberikan  kerusakan  yang bersifat  eksponen  atau  berkelanjutan. Amplitudo  itu  sendiri  adalah  jarak  terjauh simpangan  dari  titik  keseimbangan,  akan tetapi  dalam  gelombang  ini  amplitudo tergantung  pada  tegangan  yang  diberikan (Müller et al., 1992). Sperma  adalah  sel-sel  spermatozoa yang  berada  dalam  larutan  seminal  dan dihasilkan oleh hidrasi testis, atau salah satu
bagian dari alat reproduksi ikan (Wijayanti dan  Simanjuntak,  2006).  Spermatozoa merupakan sel padat dan sangat khas, tidak tumbuh  atau  membagi  diri  serta  tidak mempunyai peranan fisiologis apapun pada hewan yang menghasilkannya, semata-mata hanya  untuk  membuahi  telur  pada  jenis yang sama (Susilawati, 2011).
Media  transfer  gen,  sperma  sangat potensi  dikembangkan  dalam  transgenik ikan karena prosedurnya yang relatif alami dan  lebih  efisien  (Sin et  al., 2000). Kemudian  Lavitrano et  al. (2005) menyatakan  sperma  memiliki  kelebihan sebagai  media  transfer  gen,  karena  dalam proses  transfer  materi  genetik,  sperma sebagai  vektor  yang  relatif  alami.  Sel sperma  telah  digunakan  sebagai  vektor transfer  gen  pada  ikan  mas,  lele  dan  nila (Müller et al., 1992). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh kejutan listrik dengan metode yang berbeda (Square wave dan Eksponensial ) terhadap pergerakan  ( motilitas )  dan  kemampuan hidup  (viabilitas)  sperma  ikan  nilem ( Osteochilus hasselti ) .

## METODOLOGI
Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  di
Laboratorium Breeding (Budidaya
Perairan)  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu Kelautan  serta  di  Laboratorium  Sentral Ilmu Hayati (LSIH) Universitas Brawijaya Malang.

## Materi Penelitian
Pada  penelitian  ini  bahan  dan  alat yang digunakan antara lain meliputi induk jantan  ikan  Nilem  ( Osteochilus  hasselti ), larutan  NaCl  fisiologis,  pewarna  Eosin- nigrosin,  sperma  ikan  Nilem,  akuades, ovaprim,  air,  es  Batu,  satu  set  alat elektroporator (BIO-RAD), cuvette , mikroskop, kolam pemeliharaan induk ikan, bak plastik, object glass , cover glass , pipet volume, mikro pipet, tisu, spuit , blower , dan hand tally counter.

## Rancangan Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  dua perlakuan
yang masing-masing perlakuannya  diulang  sebanyak  tiga  kali dan  kontrol  diberikan  pada  semua perlakuan yang fungsinya untuk membandingkan dengan perlakuan.
Penelitian  ini,  perlakuan  yang digunakan adalah penggunaan metode yang berbeda  pada  pemberian  kejutan  listrik dengan kuat medan listrik 40 V/Cm, yaitu A (pemberian  kejutan  listrik  dengan  metode Square Wave menggunakan parameter ukur tegangan  40  V/cm)  dan  B  (pemberian kejutan listrik dengan metode Eksponensial menggunakan parameter ukur tegangan 40 V/cm). Untuk membedakan atau membandingkan  dua  macam  perlakuan umumnya  dilakukan  dengan  uji  t  (t- test ). Pada prinsipnya berbeda atau tidaknya dua macam  perlakuan  tersebut  dapat  diketahui dari perbandingan t hitung ( calculated ) dan t daftar. Oleh karena itu, sebaiknya dilihat kembali  tentang  uji  t  dan  sebaran  nilai  t (Sastrosupadi, 2000).

## Prosedur Kerja
Setting Alat Elektroporasi Kejutan  listrik  (V/cm)  pada  sperma ikan  nilem  pertama  menyiapkan  alat elektroporasi  dengan  langkah-langkah sebagai berikut : steker alat disambungkan ke  sumber  listrik  yang  sesuai,  tombol "POWER"  di  samping  kanan  alat  ditekan untuk  menyalakan  alat.  Tampilan  awal yaitu "HOME SCREEN" akan muncul .Pada tampilan "HOME  SCREEN" dipilih  no.  3 atau  menggunakan  panah  ke  atas  atau  ke bawah  untuk  memilih "Square  wave protocol / Eksponensial protocoli', 5). Kemudian  muncul  tampilan  detail metode Square wave / Exponential protocol, selanjutnya  masukan  beberapa  parameter yang  ditentukan  seperti  :  Lama  kejutan  + besar kuat medan (V/cm), Lama kejutan + besar  kuat  medan  +  jumlah  kejutan  + interval  tegangan.  Setelah  itu  sisiapkan cuvette yang  akan  dipakai  yaitu cuvette ukuran  0,2  cm.  Setelah  parameter  yang dimasukkan  sesuai  maka  disimpan  dan
diberi  tanda  dengan  abjad,  agar  saat memberikan pulse dapat dilakukan dengan cepat, 8). Kuat medan yang dimasukkan 40 V/cm,.Lama kejutan yang digunakan yaitu 0,5 ms.

## Persiapan Sperma
Persiapan  sampel  dengan  langkah sebagai berikut: 25 ml sperma dimasukkan ke dalam cuvette menggunakan mikro pipet setelah  itu cuvette ditutup  dengan  rapat. Tutup shock  pod dibuka. Cuvette berisi sampel dipasang pada shock pod kemudian shock  pod ditutup  kembali.  Sperma  siap untuk diberi kejutan.
Setelah  itu  besar  kuat  medan  yang diberikan  dipilih  dengan  memilih  tanda,
kemudian "enter" ditekan sehingga tampilan tegangan terbuka, tombol "PULSE" ditekan untuk memulai pemberian  kejutan  pada  sampel.  Akan muncul tampilan yaitu hasil perlakuan yang diberikan pada sampel.
Dicatat hasil dari penurunan tegangan yang  muncul  di  layar  alat  elektroporator. Setelah  sperma  diberi  kejutan  listrik kemudian 25 jl sperma yang ada di dalam cuvette ditambahkan  larutan  Na  Fisiologis sebanyak  275  jl.  Selanjutnya  sperma  hasil elektroporasi diamati motilitas dan viabilitasnya  dan  dilanjutkan  analisa statistiknya.

## Analisis Data
Analisa  data  yang  digunakan  adalah Uji t karena terdiri dari 2 perlakuan dengan 3  kali  ulangan.  Sebagai  perlakuan  adalah
metode Square wave dan eksponensial juga dilakukan  2  kontrol  yaitu  pengamatan sperma sebelum dan sesudah perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Kualitas Sperma Kontrol
Sperma  yang  digunakan  pada penelitian ini mempunyai kualitas baik. Hal tersebut terlihat dari motilitas dan viabilitas spermanya. Selama berlangsungnya penelitian,  motilitas  sperma  yang  didapat adalah  sebesar  71,3%  dan  viabilitas  yang didapat  adalah  sebesar  75%.  Cara pengambilan  sperma  induk  nilem  jantan yaitu  melakukan stripping pada  ikan tersebut.

## Motilitas Spermatozoa
Motilitas  sperma  kontrol  sebelum elektroporasi  (rata-rata  71,3%) lebih  besar dibandingkan  dengan  motilitas  sperma kontrol  sesudah  elektroporasi  (rata-rata 46,6%). Hal ini disebabkan karena sperma kontrol  sebelum  elektroporasi  masih  segar dan  baik,  sedangkan  sperma  kontrol sesudah elektroporasi pengamatan dilakukan  setelah  perlakuan  elektroporasi, sehingga kualitas sperma sudah dipengaruhi oleh  jeda  waktu  perlakuan.  Sehingga pengamatan  motilitas  kontrol  sesudah elektroporasi  baru  diamati  setelah  sperma diberi perlakuan.
Artinya  sperma  kontrol  sebelum  dan sesudah  adalah  sperma  murni  tanpa perlakuan  kejutan  listrik.  Waktu  atau  jeda saat  perlakuan  dapat  dilihat  pada  Tabel  1 berikut ini. Tabel 1. Waktu pemberian perlakuan kejutan listrik. Perlakuan Waktu Perlakuan (WIB) Rata-Rata (menit) 1 2 3 Kontrol Sebelum 08:05 08:10 08:14 3 Square Wave 08:21 08:25 08:29 2,66 Eksponensial Wave 08:40 08:46 08:52 6 Kontrol Sesudah 09:04 09:11 09:20 5,33
Tabel  di  atas  diketahui  jeda  saat pemberian  perlakuan  adalah  1  jam  15 menit,  sehingga  kualitas  sperma  kontrol sesudah menjadi menurun karena dibiarkan
sampai  1  jam  15  menit.  Hasil  persentase motilitas  sperma  ikan  nilem  dapat  dilihat pada Tabel 2 berikut.
Tabel 2. Data nilai motilitas sperma ikan nilem (%). Perlakuan Ulangan Total Rata-rata 1 2 3 Square Wave 35 35 32 102 34 Eksponensial Wave 15 10 8 33 11 K. Sebelum Square Wave 75 74 65 214 71,3 K. Sesudah Square Wave 50 45 45 140 46,6 Diagram tersebut terlihat bahwa nilai rata-rata  persentase  motilitas  perlakuan lebih rendah dibandingkan dengan kontrol, dengan  nilai  rata-rata  34%  untuk square wave ,  11%  untuk  eksponensial  dan  71,3% untuk  kontrol  sebelum  dan  46,6%  untuk kontrol sesudah.
Adanya  perbedaan  nilai  rata-rata motilitas sperma kontrol dengan perlakuan disebabkan  karena  pada  kontrol  sperma tidak  diberi  perlakuan  apapun,  berbeda
dengan perlakuan square dan eksponensial wave  yang  masing-masing  sperma  diberi perlakuan  kejutan  listrik  40  volt.  Menurut Hadie et  al. (2016),  kejutan  listrik  akan berpengaruh terhadap
produksi spermatozoa, sperma yang dikeluarkan dari testis  bisa  menjadi  cacat  dan  dapat menurunkan  tingkat  motilitas  spermatozoa serta  dapat  meningkatkan  nilai  mortalitas dan abnormalitas pada spermatozoa.
Gambar 1.  Nilai motilitas pada masing-masing perlakuan.
Kualitas  sperma  dengan  tingkat motilitas  60  %  dapat  dikatakan  bagus karena menurut Tabares et al. (2007), pada penelitiannya  menggunakan  ikan Brycon henni (ikan air tawar) menunjukkan bahwa pada  sperma  kontrol  memiliki  tingkat motilitas  78  %  karena  di  dalam  cairan seminal  plasma  terdapat  ion  yang  lengkap seperti  KCl,  NaCl,  CaCl 2 ,  dan  MgCl 2 . Fungsi  cairan  seminal  antara  lain mengembangkan  kapasitas  sperma  dalam bergerak  (Mochida et  al., 1999;  Ohta dan Unuma , 2003)  dan  mempertahankan motilitas  sperma  saat  bergerak  dalam  air (Morisawa  dan  Suzuki,  1980;  Scott  dan Baynes ,1980).
Menurut  pendapat  Toelihere  (1981), persentase motilitas spermatozoa di bawah 40%, menunjukkan nilai motilitas spermatozoa  yang  kurang  baik  dalam proses  pembuahan  telur  atau  sering berhubungan  dengan infertilitas. Hasil perhitungan didapatkan hasil t hitung (9,89) lebih  besar  dari  t  tabel  1%  (4,604),  yang berarti  metode  memberikan  pengaruh sangat nyata terhadap motilitas sperma atau dapat  disimpulkan  menerima  H1  dan menolak H0.

## Viabilitas Spermatozoa
Pengamatan  Viabilitas  atau  daya tahan  hidup  spermazoa  pada  penelitian  ini
dilakukan  dengan  menggunakan  bahan pewarna eosin-nigrosin, kemudian diamati viabilitasnya  di  bawah  mikroskop.  Zat pewarna  ini  akan  diserap  oleh  sel spermatozoa yang mati, sedangkan spermatozoa  yang  hidup  tidak  terwarnai atau  sedikit  sekali  menyerap  zat  warna tersebut.
Hal  ini  sesuai  dengan  pendapat
Toelihere (1981) yang menyebutkan bahwa
pada saat spermatozoa dicampur dengan zat warna,  spermatozoa  yang  hidup  tidak menyerap  zat  warna  atau  sedikit  sekali menyerap zat warna. Sedangkan spermatozoa yang mati akan menyerap zat warna  dalam  jumlah  yang  sangat  banyak,
karena permeabilitas dinding sel spermatozoa akan meninggi setelah mati.
Gambar 2.  Gambar sperma (sperma yang hidup warna bening dan yang mati warna gelap atau merah) pada metode Square Wave (pembesaran 400x).
Gambar 3.  Gambar sperma (sperma yang hidup, warna bening dan yang mati) warna merah muda pada metode Eksponensial wave (pembesaran 400x).
Hasil  pengamatan  nilai  viabilitas spermatozoa  dapat  dilihat  pada  tabel  3. Diagram  tersebut  terlihat  bahwa  rata-rata persentase viabilitas perlakuan lebih rendah dari  pada  rata-rata  persentase  viabilitas kontrol.  Sperma  kontrol  tidak  diberi perlakuan  apapun,  sedangkan  sperma square  dan  eksponensial  diberi  perlakuan kejutan  listrik  40  volt.  Inilah  yang menyebabkan rata-rata persentase motilitas sperma kontrol lebih tinggi.
Nilai  persentase  rata-rata  motilitas sperma  kontrol  sebelum  75%,  kontrol sesudah  52,6%, square  wave 56%,  dan eksponensial wave 25%.  Menurut  Weaver (1993),  tegangan  yang  diberikan  terhadap sperma menyebabkan terbukanya pori-pori sel  membran,  akan  tetapi  dapat  juga  sel rusak  atau  pecah  yang  mengakibatkan  sel tersebut mati. Hasil perhitungan didapatkan hasil t hitung (8,68) lebih besar dari t tabel 1% (4,604) yang berarti metode berpengaruh sangat nyata terhadap
viabilitas  sperma  atau  dapat  disimpulkan menerima H1 dan menolak H0.
Tabel 3. Data nilai viabilitas spermatozoa (%). Perlakuan Ulangan Total Rata-rata 1 2 3 Square Wave 60 55 53 168 56 Eksponensial Wave 30 25 20 75 25 K. Sebelum 78 75 72 225 75 K. Sesudah 55 53 50 158 52,6
Gambar 4.  Nilai viabilitas pada masing-masing perlakuan.

## Kualitas Sperma Elektroporasi
Volume  sperma  yang  diberi  kejutan adalah sebesar 25 µ l, kemudian dimasukkan ke  dalam cuvette tipe  0,2  mm,  lalu  diberi perlakuan  kejutan  listrik.  Setelah  sperma diberi  kejutan  listrik,  sperma  ditambahkan larutan  NaCl  fisiologis  sebanyak  275 µ l agar kondisi sperma relatif stabil serta agar dalam  pengambilan  sperma  lebih  mudah. Sperma  yang  keluar  dari  tubuh  ikan  tidak akan  bertahan  lama,  karena  kondisinya berubah.
Oleh  karena  itu  sperma  yang  telah ditampung diusahakan mempunyai kondisi yang  dapat  mendukung  kehidupannya. Salah satu cara untuk tetap menjaga kualitas sperma adalah dengan melakukan penambahan  larutan  fisiologis  (NaCl fisiologis).  Menurut  Hidayaturrahmah (2007)  penggunaan  larutan  fisiologis  yang mengandung  NaCl  dan  urea  dapat mempertahankan  daya  hidup  spermatozoa antara 20-25 menit.

## Metode Square Wave
Elektroporasi sperma dengan
menggunakan  metode Square  Wave
merupakan salah satu metode elektroporasi yang  tegangannya  lebih  diarahkan  kepada amplitudo  yang  diperlukan  untuk menjaga lamanya waktu kejutan (Sin et al. , 2000). Penelitian  diperoleh  hasil  rata-rata nilai  motilitas  sperma  ikan  nilem  setelah diberi  perlakuan  kejutan  listrik  dengan tegangan 40 volt dan lama tegangan 0,5 ms menggunakan metode Square Wave adalah sebesar 34%. Nilai motilitas ini lebih kecil bila  dibandingkan  dengan  nilai  sperma kontrol  sebelum  diberi  perlakuan  kejutan listrik  yaitu  sebesar  71,3%.  Penurunan motilitas  ini  dapat  diakibatkan  karena terjadinya  adaptasi  antara  spermatozoa dengan  tegangan  sehingga  mengakibatkan terjadinya gangguan terhadap permeabilitas membran atau selaput sperma, menurunkan aktivitas  metabolisme,  kerusakan  sel  dan penurunan motilitas.
Hal  ini  sesuai  dengan  pendapat Jeyendran et  al. (1984)  yang  menyatakan bahwa permeabilitas membran spermatozoa erat  kaitannya  dengan  motilitas  dan viabilitas spermatozoa karena seperti yang diketahui  permeabilitas  membran  sangat berkaitan  dengan  transportasi  nutrisi  yang
penting peranannya dalam metabolisme sel. Ditambahkan  oleh  Tsai et  al. (1997)  yang menyatakan  bahwa  motilitas  sperma  yang diperoleh  sangat  tergantung  pada  level tegangan selama elektroporasi.
Nilai  viabilitas  sperma  ikan  nilem setelah diberi kejutan dengan menggunakan metode  yang  sama  diperoleh  rata-rata sebesar 56%. Nilai ini juga lebih kecil bila dibandingkan  dengan  rata-rata  nilai viabilitas  sperma  kontrol  sebelum  diberi perlakuan  yaitu  sebesar  75%.  Adanya penurunan nilai viabilitas sperma ini dapat disebabkan karena pemberian kejutan listrik dengan  tegangan  tinggi  yang  dapat menyebabkan  rusaknya  membran  plasma dan penurunan motilitas sperma.
Sedangkan untuk kontrol sesudah elektroporasi diamati untuk membandingkan  antara  nilai  viabilitas sperma  sebelum  dielektroporasi  dan sesudah dielektroporasi.
Maxwell dan Johnson (1999)
menyatakan  bahwa  kerusakan  membran spermatozoa akan berdampak pada membran  yang  pada  awalnya  mempunyai sifat  permeabel,  tidak  lagi  mampu menyeleksi  keluar  masuknya  zat,  yang akhirnya  pada  saat  dilakukan  uji  warna eosin-nigrosin  zat  tersebut  bisa  masuk  ke dalam plasma. Ditambahkan oleh Tang dan
Affandi (2001) bahwa permukaan spermatozoa dibungkus oleh suatu membran lipoprotein. Apabila spermatozoa tersebut mati maka permeabilitas membrannya meninggi, terutama di daerah pangkal kepala dan hal ini merupakan dasar pewarnaan  sperma  yang  membedakan spermatozoa yang hidup dengan spermatozoa yang mati.
Metode Eksponensial Wave Elektroporasi sperma dengan metode Eksponensial  Wave merupakan  salah  satu metode  elektroporasi  dengan  menaikkan voltase  sampai  pada  amplitudo  yang diinginkan  kemudian  menurun  secara eksponensial  (Sin et  al. ,  2000).  Berarti dalam  hal  ini  faktor  yang  berpengaruh terhadap  metode Eksponensial adalah
tegangan,  waktu  dan  kekuatan  bidang. Eksponensial wave,  tegangan  ditujukan untuk  suatu  amplitudo  yang  diinginkan, kemudian  memberikan  kerusakan  yang bersifat eksponen. Pada metode ini panjang kejutan  memiliki  nilai  yang  sama  dengan lama kejutan.
Penelitian  diperoleh  hasil  rata-rata nilai  motilitas  sperma  ikan  nilem  setelah diberi  perlakuan  kejutan  listrik  dengan tegangan  40  volt  menggunakan  metode Eksponensial Wave adalah  sebesar  11%. Nilai  persentase  motilitas  ini  jauh  lebih kecil bila dibandingkan dengan nilai sperma kontrol  sebelum  diberi  perlakuan  kejutan listrik  sebesar  71,3%.  Begitu  juga  dengan nilai  rata-  rata  viabilitasnya  yaitu  sebesar 25%, juga jauh lebih rendah dibandingkan dengan rata-rata persentase sperma kontrol sebelum diberi kejutan listrik sebesar 75% dengan metode eksponensial.
Sedangkan  untuk  kontrol  sesudah elektroporasi
dilakukan untuk membandingkan  antara  nilai  viabilitas sperma  sebelum  dielektroporasi  dan sesudah dielektroporasi.
Menurut
Nakamura et  al. (2009),  penggunaan tegangan listrik tinggi yang diberikan pada sampel dapat menyebabkan produksi panas oleh  generator  yang  bisa  membunuh sebagian besar sampel yang dielektroporasi.
Perbandingan  Hasil  Metode Square Wave dan Eksponensial Wave
Hasil  yang  didapat  dari  perlakuan pemberian  kejutan  menggunakan  dua metode elektroporasi yang berbeda diperoleh  rata-rata  nilai  motilitas  dan viabilitas  dari  penggunaan  metode Square Wave ternyata  lebih  besar  daripada  nilai motilitas  dan  viabilitas  dari  penggunaan metode  Eksponensial Wave .  Hal  ini kemungkinan karena kerusakan sel spermatozoa  pada  metode Square  Wave lebih  kecil  dibanding  dengan  metode Eksponensial. Chen et al (1994) menyatakan  bahwa  metode Square dapat menghasilkan tegangan yang besar sehingga  efisiensi  pemasukan  DNA  asing lebih  besar  karena  pembukaan  pori  relatif
lebih  besar,  namun  gelombangnya  ( pulse
length ) sangat pendek sehingga mencegah sel rusak dan dapat kembali seperti semula karena panas yang ditimbulkan relatif kecil.
Sehingga  dapat  dikatakan  Metode Square Wave dapat menghantarkan tegangan  tinggi  dalam  gelombang  yang pendek  sehingga  menimbulkan  sedikit panas, sehingga transfer DNA dapat terjadi tanpa  membunuh  sel  atau  embrio.  Hal  ini juga sesuai dengan pendapat Saunders et al.
(1989)  bahwa  penggunaan  dua  metode dalam  elektroporasi (Square/ Eksponensial Wave) akan menimbulkan efek pada suatu sel,  akan  tetapi  pada  penggunaan  metode Square Wave memiliki persentase bertahan hidup  yang  lebih  besar  pada  sel  yang dielektroporasi.
Metode  Square  Wave  dicirikan dengan tegangan (voltase), panjang kejutan (pulse  length), jumlah  kejutan (number  of pulse) dan  jarak  antara  kejutan (pulse interval).
Sedangkan pada metode Eksponensial  Wave  dicirikan  dengan tegangan (voltase), lama kejutan (TC) dan hambatan (resistence). Dari  perlakuan elektroporasi dengan menggunakan tegangan 40 volt pada metode Square Wave menghasilkan  tegangan  akhir  37  volt, panjang gelombang 0,5 ms, jumlah kejutan adalah  1  (satu).  Selanjutnya  pada  metode Eksponensial menghasilkan tegangan akhir 37  volt  dan  waktu  konstan  (TC)  10,4  ms. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa lama  kejutan  atau  panjang  kejutan (pulse length) metode  Eksponensial  Wave  lebih lama  daripada  Metode  Square  Wave, sehingga metode Eksponensial menghasilkan panas yang lebih besar yang mengakibatkan rusaknya sel spermatozoa.
Kedua metode tersebut dapat diketahui  bahwa  penggunaan  metode Square Wave lebih baik dari pada Metode Eksponensial  Wave.  Hasil  ini  terlihat  dari nilai  motilitas  dan  viabilitas  sperma  ikan nilem  yang  lebih  tinggi  dibandingkan dengan metode Eksponensial.

## KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan
Hasil  penelitian  ini  dapat  diperoleh kesimpulan  bahwa  kondisi  sperma  kontrol sebelum dilakukan elektroporasi lebih baik dibandingkan  kondisi  sperma  kontrol setelah dilakukan elektroporasi.
Pemberian  kejutan  listrik  dengan metode  yang  berbeda  berpengaruh  sangat nyata  terhadap  motilitas  dan  viabilitas sperma  ikan  nilem (Osteochilus  hasselti). Lama  kejutan  atau  panjang  kejutan (pulse length) metode  Eksponensial Wave lebih besar  daripada  Metode Square  Wave , sehingga
metode
Eksponensial menghasilkan panas yang lebih besar yang mengakibatkan rusaknya sel spermatozoa.

## Saran
Hasil  penelitian  dapat  disarankan sebagai  berikut:  Sebaiknya  elektroporasi menggunakan  metode  Square  Wave  agar diperoleh  nilai  motilitas  dan  viabilitas sperma yang tinggi.
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang  elektroporasi  dengan  metode Square Wave pada sel telur ikan.

## DAFTAR PUSTAKA
Chen,  T.T.,  Marsh,  A.,  Shamblott,  M., Chan, K.M., Tang, Y.L., Cheng, C.M. dan Yang, B.Y., 1994. 6 structure and evolution of fish growth hormone and insulinlike growth factor genes, Fish Physiology , 13 , pp 179 - 209.
Hadie,  W.,  Kusrini,  E.,  Priyadi,  A.  dan Alimuddin, A., 2016. Penyisipan gen warna pada ikan mas koki Carassius auratus menggunakan metode elektroforasi dalam upaya
meningkatkan  kualitas  ikan  hias. Jurnal Riset Akuakultur , 5 (3), pp.335- 343.
Hidayaturrahmah,  2007.  Waktu  Motilitas dan Viabilitas Spermatozoa Ikan Mas (Cyprinus  carpio L.)  Pada  Beberapa Konsentrasi Larutan Fruktosa. BIOSCIENTIAE, 4 (1), pp.9 - 18.
Jeyendran, R.S., Van der Ven, H.H., Perez- Pelaez,  M.,  Crabo,  B.G.  dan
Zaneveld, L.J.D., 1984. Development of  an  assay  to  assess  the  functional integrity  of  the  human  sperm membrane  and  its  relationship  to other semen characteristics. Reproduction , 70 (1), pp.219-228. Kang,  J.H.,  Yoshizaki,  G.,  Homma,  O., Strusmann,  C.A.  dan  Takashima,  F., 1999. Effect of an osmotic differential on the efficiency of gene transfer by electroporation  of  fish  spermatozoa, Aquaculture, 173 (1-4), pp. 297 - 307. Lavitrano, M., Busnelli, M., Cerrito, M. G., Giovannoni,  R.,  Manzini,  S.  dan Vargiolu, A., 2005. Sperm-Mediated
Gene Transfer,
Reproduction,
Fertility and Development, 18 (2), pp. 19-23.
Maxwell, W.M.C. and Johnson, L.A., 1999. Physiology  of  spermatozoa  at  high dilution  rates:  the  influence  of seminal  plasma. Theriogenology , 52 (8), pp.1353-1362.
Mochida,  K.,  Kondo,  T.,  Matsubara,  T., Adachi,  S.  dan  Yamauchi,  K.,  1999. A high molecular weight glycoprotein in  seminal  plasma  is  a  sperm immobilizing factor in the teleost Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Development, growth & differentiation , 41 (5), pp.619-627. Morisawa,  M.  dan  Suzuki,  K.,  1980. Osmolality  and  potassium  ion:  their roles in initiation of sperm motility in teleosts.
Science , 210 (4474), pp.1145-1147.
Müller, F., Ivics, Z., Erdelyi, F., Papp, T.,
Varadi, L., Horvath, L., Maclean, N. and  Orban,  L.,  1992.  Introducing foreign  genes  into  fish  eggs  with electroporated  sperm  as  a  carrier. Molecular  marine  biology  and biotechnology , 1 (4/5), pp.276-281. Nakamura, K., Shimabukuro, R., Fujiwara, Y., Akiyama, T., Ito, T. dan Freeman,
A.J., 2009. Giant modification of the magnetocrystalline  anisotropy  in transition-metal  monolayers  by  an external  electric  field. Physical review letters , 102 (18), p.187201.
Ohta H. dan Unuma T., 2003. Induction of Sperm  Maturation.  In:  Aida  K., Tsukamoto  K.,  Yamauchi  K.  (eds) Eel  Biology (pp.415-423).  Springer, Tokyo.
Sastrosupadi,
A., 2000. Rancangan percobaan  praktis  bidang  pertanian . Kanisius. Yogyakarta. p.276.
Saunders,  J.A.,  Smith,  C.R.  dan  Kaper, J.M., 1989. Effects of Electroporation Pulse Wave on th e Incorporation of Viral RNA into Tobacco Protoplasts. BioTechniques 7 (10), pp.1124-1131. Scott,  A.P.  dan  Baynes,  S.M.,  1980.  A review  of  the  biology,  handling  and storage  of  salmonid  spermatozoa. Journal  of  Fish  Biology , 17 (6), pp.707-739.
Sin,  F.Y.T.,  Walker,  S.P.,  Symonds,  J.E., Mukherjee,  U.K.,  Khoo,  J.G.I.  dan Sin,  I.L.,  2000.  Electroporation  of salmon  sperm  for  gene  transfer: Efficiency,  reliability,  and  fate  of transgene, Molecular  Reproduction and  Development,  56 (S2),  pp.  285- 288.
Susilawati,  T.,  2011. Spermatology . Universitas Brawijaya Press.
Tabares,  J.,  Ruiz,  T.,  Arboleda,  L.  dan Olivera,  M.,  2007.  Effect  of  some ions  on  sperm  activation  in  Brycon henni (Eigenmann 1913). Colombian Biological Act , 12 (1), pp. 87-98.
Tang, U.M. and Affandi, R., 2001. Biologi reproduksi  ikan. Pusat  Penelitian Kawasan  Pantai  dan  Perairan Universitas Riau, Riau . Toelihere, M.R., 1981. Fisiologi reproduksi pada  ternak .  Penerbit  Angkasa. Bandung.
Tsai, H.J., Lai, C.H. and Yang, H.S., 1997. Sperm  as  a  carrier  to  introduce  an exogenous  DNA  fragment  into  the oocyte of Japanese abalone (Haliotis divorsicolor  suportexta). Transgenic research , 6 (1), pp.85-95. Weaver,  J.C.,  1993.  Electroporation:  a General Phenomenon For
Manipulating  Cells  and  Tissues. J. Cell Biochem, 51 (4), pp. 426435.
Wijayanti,  G.E.  dan  Simanjuntak,  S.B., 2006.  Viabilitas  sperma  Ikan  Nilem (Osteochilus  hasselti  CV)  setelah penyimpanan  jangka  pendek  dalam larutan  ringer. Jurnal  Perikanan Universitas  Gadjah  Mada , 8 (2), pp.207-214.