Injektabel Komposit Hydroksiapatit-Gelatin sebagai Sistem Penghantaran Alendronat
Aniek Setiya Budiatin*, Junaidi Khotib, Didik Hasmono, Samirah Clinical Pharmacy Department, Faculty of Pharmacy Universitas Airlangga *Corresponding author: anieksb@yahoo.co.id

## Abstract
Background: Bisphosphonates,  such  as  alendronate  (ALE),  have  been  known  to  be  effective  in  the treatment  of bone  cancer  and  osteoporosis. However,  it  has  been  reported  that  the  systemic administration of ALE causes a considerable side effect. Thus, the formulation injectable bone substitute (IBS)  for  local  administration  of  ALE,  which  functions  as  drug  delivery  system  (DDS)  as  well  as  filling agent  in  osteoporosis-induced  bone  fracture,  is  needed. Objective: To  establish  the  biodegradable  and biocompatible formulation for ALE in injectable form which supports the drug delivery system and acts as filling  agent  in  bone  fracture. Methods: Hydroxyapatite  (HA)  was  added  to  the  mixture  of  gelatin  and hydroxypropyl  methyl  cellulose  (GEL-HPMC).  ALE  was  added  to  the  mixture  and  semisolid  form  was prepared  for  granulation.  The  dried  granule,  as  injectable  matrix,  was  grinded  and  mixed  with appropriate amount  of  Na 2 HPO 4 . Results: Porosity  of  injectable  form  was  higher  than  those  of granule form. Injectable semisolid form was produced by adding 0.8 mL Na 2 HPO 4 on each gram of granule with 10-12  min  setting  time.  MTT  assay  showed  that  matrix  was  biocompatible  showed  by  more  than  100% viability. In  vitro  dissolution  study  showed  that  ALE  was  slowly  released  in more  than  20  days. Conclusions: The formula of IBS using HA-GEL-HPMC may act as an effective drug delivery system for local administration of ALE in bone fracture.
Keywords: hydroxyapatite, gelatin, HPMC, alendronat, Na 2 HPO 4 , DDS (Drug Delivery System)

## Abstrak
Latar  belakang: Golongan  bisfosfonat  sebagai  obat  kelainan  tulang  sudah  lama  dipergunakan  seperti kanker tulang dan osteoporis. Namun karena efek samping dari obat tersebut  maka dibuat formula lokal dalam  bentuk  injektabel  yang  berfungsi  sebagai  sistem  penghantaran  obat  dan  pengisi  celah  yang terbentuk  dari  fraktur  akibat  osteoporosis. Tujuan: untuk membuat  formula  dari  hidroksiapatit  (HA)  dan gelatin  (GEL)  sebagai  penghantaran/pembawa  obat  (SPO)  maupun  pengisi  tulang.  Formula  injektabel bersifat  biodegradable  dan  biokompatibel  dan  obat  yang  digunakan adalah  alendronat  (ALE).  Hidroksi propil  Metil  Selulosa  (HPMC)  ditambahkan  untuk  memudahkan  pembawa  membentuk  bahan  setengah padat. Metode: HA ditambahkan ke dalam campuran GEL-HPMC diaduk  selajutnya di tambahkan  ALE dan  diaduk  sampai  membentuk  massa  yang  tepat  untuk  dibuat  granul.  Granul  kering  digerus  sebagai matrik injektabel dan diencerkan dengan Na2HPO4. Hasil: porositas (SEM) bentuk granul < bentuk hasil injeksi, repasta dari matrik bentuk serbuk memerlukan Na 2 HPO 4 0,8 ml/gram dan seting dalam waktu 10- 12 menit. Matrik bersifat biokompatibel dengan  viabilitas  >100% (MTT). Dari hasil  uji disolusi in  vitro menunjukkan  bahwa  ALE  dapat  dilepas  secara  perlahan  dalam  waktu  >  20  hari. Kesimpulan: Formula injektabel (IBS) HA-GEL-HPMC dapat berfungsi sebagai penghantaran ALE secara lokal.
Kata kunci: hidroksi apatit, Gelatin, HPMC, alendronat, Na 2 HPO 4, sistem penghantaran obat

## PENDAHULUAN
Komposit  seramik  dan scaffold merupakan material  implan  yang  popular  untuk  gigi,  orthopedik dan  bedah  plastik.  Salah  satu  contoh  seramik  yang sering  digunakan  adalah  hidroksiapatit  (HA)  sebagai bahan dasar dari rekayasa tulang. Bovine hydroxyapatite (BHA), merupakan  seramik  yang sangat sesuai sebagai  matriks implan karena sifatnya mirip  HA  tulang  manusia.  Sebagai scaffold BHA bersifat biokompatibel karena memiliki sifat osteokonduktif yang  tinggi  bila dibanding  HA
sintesis (Aniek et al., 2014). Untuk memperbaiki sifat mekanik  dan  fisik  BHA  dikombinasi  dengan gelatin (GEL) yang bersifat plastis, biodegradabel, biokompatibel. Komposit HA-GEL cocok digunakan sebagai  material  pengganti  tulang  dengan  tingkat biokompatibilitas  yang  tinggi  serta  tidak  toksik setelah  diuji  secara in  vitro selama  24  jam  dengan komposisi  50%  w/w  hidroksiapatit (Askarzadeh, 2004). Azami (2012) juga telah melakukan penelitian bahwa  komposisi  HA-GEL  yang  dapat  digunakan adalah  40:60.  Adanya  penambahan  gelatin  bertujuan
meningkatkan adhesi osteoblast, migrasi dan mineralisasi. Selain itu, komposit HA-GEL memenuhi hampir semua sifat  yang disyaratkan oleh bone substitute, sesuai hasil uji in vitro, in vivo, fisis dan kimiawi (Azami et al., 2012, Aniek et al.,2014).
Pemberian secara lokal Alendronat dalam bentuk injectable  bone  subtitute (IBS) dari  formula BHA- GEL-ALE diharapkan
dapat
meningkatkan efektivitas  alendronat  untuk  menghambat aktivitas osteoklas dalam progresivitas osteoporosis sedangkan BHA-GEL  dapat  berfungsi  sebagai  pengisi  tulang (Aniek et  al., 2014). Penambahan  HPMC  dalam formula ini untuk mempermudah pembasahan serbuk membentuk masa injektabel setengah padat sehingga mudah  mengalir  masuk  ke  dalam  celah-celah  tulang yang  porus  sebagai  pengisi  tulang. Dalam  penelitian ini  dilakukan pembuatan  formula injektabel  dengan komposisi BHA: GEL (20%)= 5:1 sebagai pembawa ALE  10%  dan  HPMC  2%  sebagai suspending  agent serta Na 2 HPO 4 untuk  mempercepat  setting  dari formula.Selanjutnya  dilakukan  evaluasi  karakteristik fisikokimia  dari  formula antara  lain  setting  time, SEM dan disolusi formula.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan yaitu bubuk hidroksiapatit  tulang  sapi (BHA) dari  Bank  Jaringan RSUD Dr.  Soetomo Surabaya,  Gelatin (150  bloom) kulit  sapi didapatkan  dari  Rousselot  (Guangdong, China),  Alendronat  didapatkan  dari  Hetero  Labs (India), Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) didapatkan  dari  Sigma  Aldrich  H7509, bahan-bahan pembuat  buffer  fosfat yaitu NaCl,  Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 (Sigma Aldrich), Aquades, Aquabides.

## Preparasi pembuatan sampel injektabel
HPMC  2%  (w/v)  dibuat  dengan  cara  HPMC dimasukkan  ke  dalam  aquades  bersuhu  90-100°C, masukkan GEL 20% (w/v) diaduk terus hingga suhu aquades 40°C. Perbandingan  BHA  dan  Gelatin (GEL)  adalah 5 :  1  (kering),  lalu  ditambahkan  ALE 10% selanjutnya diaduk  hingga  homogen. Larutan HPMC-GEL ditambahkan pada campuran BHA-ALE sedikit  demi  sedikit  dan  diaduk  terus  sampai
homogen dan  membentuk  formula kalis. Selanjutnya dicetak  menjadi  granul  dengan  mes  berukuran  1,0 mm,  dikeringkan  dalam  oven  40°C selama  24  jam. Untuk  membentuk injectable  bone  substitute (IBS), granul  yang  sudah  kering  digerus  ulang  menjadi serbuk,  selanjutnya  ditambahkan  larutan  Na 2 HPO 4 2,5 %.
Kharakterisasi Fisikokimia Setting  time.  Proses  pengujian  dilakukan  dengan cara menambahkan Na 2 HPO 4 2,5  % pada  1,0  gram IBS sampai  membentuk  kondisi  setengah padat hingga  dapat  diinjeksikan  melalui  spuit  injeksi. Volume Na 2 HPO 4 2,5% yang ditambahkan dan waktu setting dicatat.
Uji SEM digunakan  untuk  melihat  morfologi permukaan BHA-GEL-HPMC-ALE bentuk  granul, hasil  injeksi  yang  sudah  setting sehingga  dapat diketahui  ukuran pori pori  yang  terbentuk  sebelum dan  setelah  adanya  proses  perendaman. The  sample coated with carbon tip to examination.
Uji  kuantitatif  kadar alendronate. Ditimbang serbuk  formula  injektabel  1  gram,  selanjutnya dimasukkan dalam Erlenmeyer 100 ml.
Ditambahkan  aquades  10  ml divortek  selama  10 menit,  tuang  ke  dalam  labu  ukur  100  ml  dan tambahkan campuran CUSO 4. 5H 2 O dan HNO 3 0,1N, amati secara spektrofotometri (Koba et al.,2008)

## Uji toksisitas
Sel  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah fibroblast BHK-21 (Baby Hamster Kidney-21) karena sel  tersebut  memiliki  kecepatan  pertumbuhan  tinggi dan  kemampuan  memperbanyak  diri  serta  integritas sel  tetap  terjaga. Setelah proses  inkubasi  selama  24 jam  dilakukan pengamatan  dengan  Reader  Elisa, menghasilkan  nilai  Optical  Density  (OD)  dan berdasarkan nilai tersebut diperoleh nilai
Viabilitas/pertumbuhan sel
dihitung dengan persamaan sebagai berikut:

## Disolusi Obat.
Formula  injectabel  yang  sudah setting/  kering direndam  dalam  aquades  sekitar 2 ml. Cuplikan aquades  sebanyak  0,5  ml  diambil  setiap  24  jam
OD Perlakuan  +  OD Kontrol Media Viabilitas Sel (%) =                                                                X 100%
OD Kontrol Sel + OD Kontrol Media
hingga  hari  ke-21 untuk  mengetahui  banyaknya alendronat yang terlepas <  dilakukan  penggantian aquades  0,5  ml  dari  setiap  pengambilan.  Hasil cuplikan  disimpan  dalam freezer pada  suhu -40ºC sampai dilakukan analisis (Aniek et al., 2014).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Formula yang  diperoleh  adalah  BHA:GEL:HPMC yaitu 5:1:1  (kering)  dan  ALE  10%. Setting  time secara  in vitro  dilakukan  pengamatan  waktu  formula mengeras  setelah  keluar  dari  spuit  injeksi telihat seperti Tabel 1.

## Tabel 1. Volume cairan dan Setting Time
No Berat formula (g) Larutan Na 2 HPO 4 2,5% (ml) Hasil Setting Time (menit) 1 1,0070 1,0 Hampir Cair 30 menit 2 1,0042 0,9 Lembek 15 menit 3 1,0100 0,8 Lembek 10-12 menit 4 1,0006 0,5 Cepat kering 2-3 menit
Besar porositas sediaan menentukan kecepatan difusi cairan  ke  dalam  sediaan  dan  pelepasan  obat.  Makin besar  porositas,  volume  cairan  yang  berdifusi  ke dalam  matrik  akan  meningkat  dan  obat  yang  terikat matrik semakin cepat terlepas (Gambar 1)
Setting  time dilakukan  untuk  mengetahui  waktu yang dibutuhkan komposit BHA-GEL-HPMC dengan  penambahan alendronat mengalami  proses setting saat aplikasi sebagai injectable bone substitute (IBS). Formula  injektabel  selanjutnya  disebut  IBS berbentuk  setengah  padat sehingga  mudah  mengalir dari  spuit  injeksi  untuk    mengisi  celah  tulang  akibat fraktur osteoporosis.
Gambar 1. Sampel  Bentuk  Granul (A);  Struktur permukaan  sampel  dengan  perbesaran  5.000  X dengan range 10 µ m (B); Perbesaran 30.000X dengan range 5 µ m (C), angka-angka menunjukkan porositas dari sampel
Penambahan Na 2 HPO 4 , 2,5%  ditambahkan sebagai  pengencer  dan  juga  sebagai  larutan  yang mempercepat setting time. Hasil penelitian (Tabel 1) menunjukkan formula yang baik adalah  IBS dengan 0,9  ml Na 2 HPO 4 , 2,5%  memerlukan  waktu  15  menit untuk setting,  waktu  tersebut  cukup  untuk  persiapan injeksi formula pada celah dan penutupan dari bagian yang diinsisi.
Porositas yang  tinggi  menyebabkan  cairan mudah  masuk  ke  dalam  formula  (Gambar  1  dan Gambar 2). Ukuran pori pori dari granul lebih kecil dibanding  hasil  injektabel  hal  ini  disebabkan  kerena kandungan  air  yang  berbeda  saat  pembuatan  dan tekanan saat pencetakan formula. Porositas dari hasil IBS  yang  lebih  besar  sebagai scaffold memudahkan sel  sel  sekitarnya untuk  migrasi,  proliferasi  dan diferensiasi  di  dalamnya. Formula  IBS  yang mengandung  alendronat  bersifat  tidak  toksik/  aman terhadap  sel  di  sekelilingnya  terlihat  dari  hasi  uji
A B
C
MTT
{3-(4,5-dimetil-2-thiazolil)-2,5-diphenil-2- tetrazoliumbromida  Sistem  pembawa  obat  (DDS) yaitu
BHA-GEL maupun BHA-GEL-HPMC menunjukkan  prosen  pertumbuhan  sel fibroblast BHK-21(Baby Hamster Kidney) lebih dari 100%, hal ini berarti bahwa bahan tersebut bersifat biokompatibel  terhadap  lingkungan  (Aniek et al.,2014).
Gambar 2. Sampel setelah keluar dari spuit injeksi dan mengering (A); Struktur permukaan sampel dengan perbesaran 5.000 X dari range 10µ m (B); Perbesaran 30.000X dengan range 5 µ m (C), angka- angka menunjukkan porositas dari sampel
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 160.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Hari ke- k a d a r te rd is o lu s i (u g /m l)

## Gambar 3. Profil pelepasan ALE dari formula BHA-
GEL-ALE-HPMC, bentuk granul
Sedangkan viabilitas bahan aktif Alendronat juga bersifat biokompatibel yang menunjukkan pertumbuhan  >  60%  . Apabila  pertumbuhan  sel  > 60%  maka  dinyatakan  bahwa  formula  bersifat  aman terhadap sel disekelilingnya (Spielmann et al., 2006). Formula BHA-GEL-HPMC-ALE bersifat biokompatibel  dan  biodegradabel,  hasil  degradasi dari  formula  dapat  bersatu  dan  meningkatkan proliferasi sel di sekitarnya.
Uji disolusi obat menunjukkan bahwa alendronat dapat  dihantarkan oleh injectable  bone  substitute (IBS) dalam  waktu  yang  ditentukan. Alendronat (ALE) yang terlepas pada hari pertama menunjukkan bahwa  ALE  yang  teradsorpsi  dipermukaan  akan segera  terlepas  saat  bersinggungan  dengan  fase  cair. Pelepasan  selanjutnya  menurun,  hal  ini  disebabkan adanya proses difusi cairan  masuk ke dalam  formula untuk  melarutkan  ALE  yang  posisinya  terikat/ terdistribusi  lebih  dalam.  Besarnya  ALE  yang terlepas  sesuai  dengan  kecepatan  difusi  cairan, kelarutan ALE dalam pelarut dan difusi ALE ke luar dari formula serta kekuatan GEL untuk mengembang, selanjutnya  formula  akan  mengalami  erosi.  Gelatin (GEL)  mempunyai  kekuatan  untuk  menyerap  cairan sebanyak  10  kali  beratnya  (Hilliq et  al.,  2008), selanjutnya GEL akan mengembang dan terdegradasi.  BHA  merupakan  garam  kalsium  fosfat, ALE  akan  terikat  kuat  oleh  atom  kalsium  dalam jumlah  terbatas,  dengan  penambahan  GEL  maka ALE  yang  dapat  ditambahkan  dalam  formula  dapat mencapai 10% (Panzavolta et al., 2010). Penambahan HPMC  akan  mempercepat  degradasi  dari  formula, karena sifatnya yang hidrofil sangat mudah menyerap cairan  di  sekelilingnya.  Karena  dalam  formula  ini bahan-bahan  yang  digunakan  bersifat  biokompatibel maka  hasil  degradasi  akan  bersatu  dengan  sel-sel disekitarnya  untuk  regenerasi  sel. Sehingga  dari uji disolusi menunjukkan ALE  dapat  dilepas  secara bertahap dalam waktu lama. Hasil uji yang diperoleh selama 21  hari  sampling  digambarkan (Gambar  4) dalam  grafik  waktu vs  jumlah    ALE  yang  terlepas dari  Sistem  Penghantaran  Obat menghasilkan persamaan regresi Y = 0,1299 X + 0,3733 dan R 2 = 0,8146.
A B

## C

## KESIMPULAN
Formula  injektabel (IBS)  dengan  komposisi  BHA- GEL-HPMC dapat  digunakan  sebagai Sistem penhantaran obat dari alendronat.

## UCAPAN TERIMAKASIH:
Prof  Dr  M  Zainuddin  atas  segala  bimbingan  dan pemberi  semangat  serta  Dr  Ferdiansyah,  dr.,Sp.OT (K) atas bimbingan dan pemberian BHA.

## DAFTAR PUSTAKA
Aniek  SB,  M.Zainuddin,  Junaidi  Khotib.  2014.
Biocompatable  Composite  As  Gentamicin Delivery  System  for  Osteomyelitis  and  Bone Regeneration, International Journal of Pharmacy  and Pharmaceutical  Sciencis.  Vol 6, Issue 3, p.223-226
Askarzadeh,  K.,  Orang,  F.,  and  Moztarzadeh,  F., 2004, Fabrication  and  Characterization  of  a Porous  Composite  Scaffold  Based  on  Gelatin and Hydroxyapatite for Bone Tissue Engineering,  Iranian  Polymer  Journal  14  (6), Tehran, Iran: 511-520.
Azami,  M.,  Tavakol,  S.,  Samadikuchaksaraei,  A., Hashjin, M. S., Baheiraei, N., Kamali, M., dan Nourani, M. R., 2012,
A Porous
Hydroxyapatite/Gelatin Nanocomposite
Scaffold for Bone Tissue Repair: In Vitro and In  Vivo  Evaluation,  Journal  of  Biomaterials Science, Tehran, Iran: 1-16.
Bohner, M.,  2010, Design  Of  Ceramic-Based Cements and Putties for Bone Graft Substitution,  Woodhead  Publishing  Limited: Injectable Biomaterial, Switzerland: 1-12.
Catterall,  J.  B.  and  Cawston,  T.  E.,  2002, Drugs  in Development: Bisphosphonate and Metalloproteinase Inhibitors, Arthritis
Research  and  Therapy  Vol.  5  No.  1, Newcastle, United Kingdom: 12-24. Ferraz, M. P., Moteiro F. J. and Manuel, C. M., 2004, Hydroxyapatite  Nanoparticles:
A  Review
Preparation Methodologies, Journal of Applied  Biomaterials  and  Mechanics  2004,  2, Portugal: 74-80.
Hajrawati,  2006, Sifat  Fisik  dan  Kimia  Gelatin Tulang  Sapi  dengan  Perendaman  Asam Klorida pada Konsentrasi dan Lama
Perendaman  yang  Berbeda, Tesis, Sekolah
Pascasarjana Institut  Pertanian  Bogor, Bogor. Kim,  H.  W.,  Knowles,  J.  C.  and  Kim,  H.  E.,  2004,
Hydroxyapatite  and  Gelatin  Composite  Foam Process  via  Novel  Freeze-Drying  and  Cross- linking  for  Use  as  Temporary  Hard  Tissue
Scaffolds, Wiley  Interscience,  Seoul,  South Korea: 136-145.
Koba  M,  Koba  K  and  Przyborowski.  2008. Aplication of Uv-Derivative Spectrophotometry  For  Determination  Of Some Bisphosphonates Drugs In Pharmaceutical  Formulations,  Acta  Poloniae
Pharmaceutica-Drug  Research,  Vol  65  No  3 pp 289-294.
Lui,  P.P.Y.,  Lee,  Y.  W.,  Mok,  T.  Y.,  Cheuk,  Y.  C., and  Chan,  K.  M.,  2013, Alendronate  Reduce
Peri-Tunnel Bone Loss and Enhanced Tendon
Graft  to  Bone  TunnelHealing  in  Anterior Cruciatum Ligament Reconstruction, European  Cells  and  Materials  Vol. 25 (2013), Hongkong: 78-96. Park, J., 2008,
Bioceramics: Properties, Characterization  and  Applications,  Springer Business uand Media, Iowa, USA.
Ratner,  B.  D.,  Hoffman,  A.  S.,  Schoen,  F.  J.  and Lemons,  J.  E.,  2004, Biomaterial  Science:  An Introduction to Materials in Medicine, Second Edition,  Elsevier  Academic  Press,  San  Diego, USA.
Spielmann  Horst,  Andrea  Seiler,  Susanne  Bremer,
Laras  Hareng,  Thomas  Hartung,  Hans  Ahr, Elaine  Faustmen,  Ulla  Hass.  2006. The Application  of  Three  Validated  in  Vitro Embryotoxicity Test. ATLA 34, 527-538.
Warastuti,  Y.  dan  Abbas,  B.,  2011, Sintesis  dan Karakterisasi Pasta Injectable Bone Substitute Iradiasi Berbasis Hidroksiapatit, Jurnal Ilmiah Aplikasi Isotop dan Radiasi, Jakarta: 73-93.
Weiss,  P.,  Gauthier,  O.,  Bouler,  J.  M.,  Grimandi,  G. and  Daculsi,  G.  2007. Injectable  Bone Substitute  Using  a  Hydrophilic  Polymer. Equipe INSERM Materiaux V. 1., France: 1-8