## PENGEMBANGAN TEKNIK DIAGNOSA PARATUBERKULOSIS DENGAN ENZIM LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY
Rahmat Setya Adji 1) dan Adrijanto Hauferson Angi 2)
1) Balai Besar Penelitian Veteriner (BBALITVET) Jl. RE. Martadinata Bogor, Jawa Barat 2) Program Studi Kesehatan Hewan Politeknik Pertanian Negeri Kupang Jl. Adisucipto Penfui, P. O. Box. 1152, Kupang 85011

## ABSTRACT
Diagnosis  Technique  Development  Paratuberkulosis  With  Enzyme  Linked Immunosorbent  Assay .  Paratuberculosis  (Johne’s  Disease)  is  a  chronic granulomatous  enteritis  diseases  of  ruminants  caused  by  Mycobacterium paratuberculosis. The  disease  spreads  by  faeces  with  clinical  signs  of  progressive diarrhoae  and  weight losses.  Diagnostic  kit for  paratuberculosis testing  be  needed for control and monitoring. The aim of  research for develop of  ELISA to diagnosis of paratuberculosis desease. The ELISA  was developed have 0,29 of  a cut  –  off  value with  both  positive  and  negative  control  be  tested  by  using  commercial  ELISA  kit (IDEXX),  showed  good  result.  The  result of  ELISA  80  serum  sample  of  dairy  cattle from  Kaliadem,  Sleman-Daerah  Istimewa  Yogyakarta,  showed  negative paratuberculosis (mean of OD 0,162 ± 0,015).
Keywords: Paratuberculosis, ELISA.

## PENDAHULUAN
Paratuberkulosis  atau  Johne’s  disease  adalah  penyakit  enteritis granulomatik  kronik  pada  ternak  ruminansia  terutama  sapi,  kambing  dan domba  yang  disebabkan  oleh  mycobacterium  paratuberculosis  (OIE  2000)  dan dapat ditularkan melalui pakan yang terkontaminasi feses dari hewan yang sakit dengan  gejala  klinik  diare  progesif  dan  penurunan  berat  badan.   Penyakit  ini dapat  mengakibatkan  kerugian  ekonomi  yang  sangat  besar  karena  terjadi penurunan produksi, penurunan berat badan, meningkatkan hewan yang diafkir dan  menyebabkan  kematian  (Philip  2000).  Paratuberkulosis  ini  dilaporkan sangat  popular  dan  banyak  terjadi  pada  sapi-sapi  di  Australia,  New  Zaeland, Belanda,  Jerman,  Denmark,  Inggris,  Autria,  Belgia  dan  Amerika  Serikat.  Di Amerika  Serikat,  kerugian  akibat  penyakit  ini  diperkirakan  mencapai  US  $  1,5 milyar setiap tahunnya (Colin et al . 1994 ; Floron et al .1999 ; Milner 1990).
Mycobacterium    paratuberculosis merupakan    bakteri    gram    positif, berbentuk   batang   berukuran   kecil   dan   bersifat   tahan   asam.   Kuman   ini umumnya  menempati  saluran  usus,  terutama  pada  pangkal  ileum,  ileocaecal, batas  caecum  dan  limfoglandula  mesentarika  (Yokomizo  1997).    Gejala  klinik penyakit   paratuberculosis   adalah   diare   dan   kurus   dengan   penebalan   dan perlipatan    usus    terutama    pada   pangkal    ileum.    Diagnosa   penyakit    ini berdasarkan gejala klinik dan diteguhkan dengan pemeriksaan laboratorium. Metoda isolasi dan identifikasi ini bagus untuk diagnosa paratuberkulosis pada hewan   hidup   dan   digunakan   untuk   mendapatkan   isolat Mycobacterium paratuberculosis .  Sampel  yang  digunakan untuk isolasi dan identifikasi  dengan faeces   dan   usus   (ileocaecal   dan Limfoglandula   mesentarika ).   Media   yang
digunakan   adalah   Herrold’s    Egg    yolk   Medium   with   Mycobactin   dan diinkubasikan selama 15-20 minggu (OIE 2000).
Uji   serelogi   yang   biasa   digunakan   untuk   diagnosa   paratuberkulosis adalah  Complement  Fixation  Test  (CFT),  Enzyme  Linked  Immunosorbant  Assay (ELISA)   dan   Agar  Gel   Immunodiffusion   (AGID)   untuk    mengukur  imunitas humoral  serta  Gamma  Interferon  untuk  mengukur  imunitas  selular.  ELISA adalah  metode  yang  paling  spesifik  dan  sensitif  untuk  mengukur  titer  antibodi paratuberkulosis (OIE 2000).
Kejadian   penyakit   ini   di   Indonesia   pernah   dilaporkan.     Selain   itu, Indonesia pernah mengimpor sapi dari negara-negara yang tertular oleh penyakit paratuberkulosis.  Pada  penelitian  yang  telah  dilaksanakan  tahun  2003,  telah terisolasi  kuman Mycobacterium  paratuberkulosis ,  sedangkan  dari  hasil  uji serologis serum sapi perah, terdapat 1,67 % sampel yang positif.  Kit ELISA yang digunakan  sekarang  ini  merupakan  produk  import  dengan  harga  yang  sangat mahal  dan  memerlukan  waktu  untuk  mendapatkannya.  Karena  itu,  perlu dilakukan  penelitian  untuk  mengembangkan  dan  membuat  kit  ELISA paratuberculosis  sebagai  perangkat  diagnosa  yang  mudah  dan  murah.  Hal  ini dilakukan  untuk  mempermudah  diagnosa  dan  pengendalian  penyakit paratuberkulosis di Indonesia.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  dilakukan  di  Balai  Besar  Penelitian  Veteriner  yang  ditunjang dengan  pengambilan  sampel  serum  dari  peternakan  sapi  perah  di  Kabupaten Sleman, Daerah Istimewa Yogyakarta.

## Pembuatan Antigen :
Pada penelitian ini dibuat 3 macam antigen untuk coating plate (1 dan 2) dan absorbsi serum (3) yaitu Mycobacterium paratuberkulosis ditumbuhkan pada media cair Watson dan Reid’s serta diinkubasikan pada suhu 37 0 C selama 8 – 10  minggu.  Setelah  tumbuh  baik  dan  banyak,  disentrifuse,  pellet  diambil  dan dicuci  dengan  Phosphate  Buffer  Selina  (PBS)  sebanyak  3  kali.  Selanjutnya dipanaskan  atau  disonikasi  selama  15  menit  .  kemudian  disentrifuse,  sel dibuang  dan  ekstrak  disterilisasi  menggunakan  milipore  0,2  um  (Cox, et  al. 1991),  (2) Mycobacterium  avium ditumbuhkan  pada  media  cair  Dorset  dan Henley  serta  diinkubasikan  pada  suhu  37 0 C  selama  8  –  10  minggu.  Setelah tumbuh  baik  dan  banyak,  disentrifuse  dan  pelet  diambil,  dicuci  dengan  PBS sebanyak  3  kali.  Selanjutnya  dipanaskan  atau  disonikasi  selama  15  menit. Kemudian  disentrifuse,  sel  dibuang  dan  ekstrak  disterilisasi  menggunakan milipore  0,2  um  (Cox, et  al. 1991),  (3) Mycobacterium  phlei ditumbuhkan  pada media  cair  Dorset  dan  Henley  serta  diinkubasikan  pada  suhu  37 0 C  selama  8 minggu. Setelah tumbuh baik dan banyak, disentrifuse dan pelet diambil, dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali, disaring, pellet diambil dan dikeringkan (Milner, et al. 1990).
Conjugate dan Serum Kontrol :
Conjugate  yang  digunakan  adalah  Rabbit  Anti  Bovine  IgG  HRP  serta menggunakan  serum  control  positif yang  didapat  dengan  mengimunisasi  hewan dan serum kontrol negative sebagai pembanding.
Prosedur  Uji  mengikuti  petunjuk  Milner et  al  . 1987;  Waters et  al .  1999; Olsen et al . 2001)
Antigen  dilarutkan  dalam  coating  buffer  (bicarbonat  buffer  pH  9,6) kemudian  masukkan  sebanyak  100  ul  larutan  tersebut  ke  dalam  lubang mikroplat.  Inkubasikan  pada  suhu  4 0 C  selama  satu  malam.  Cuci  mikroplat tersebut  dengan  PBS  Tween  0,05%,  kemudian  masukkan  150  ul  PBS  casein 0,5%   pH   7,4   ke dalam  lubang mikroplat dan diinkubasikan selama satu jam pada suhu kamar. Cuci mikroplat tersebut dengan PBS tween 0,05% , kemudian masukan  100  ul  serum  sampel   (serum  sampel  dilarutkan  dengan  PBS  Tween 0,05%  pH   7,4  dan  diabsorbsi  menggunakan  antigen Mycobacterium  phlei )  ke dalam lubang plate. Kocok/goyang mikroplat  tersebut pada suhu kamar selama satu  jam.  Mikroplate  tersebut  dicuci  kembali.  Larutkan  conjugate  dalam  PBS Tween  0,05%  +  Casein  0,2 %  pH  7,4  sesuai  dengan  enceran  yang  dikehendaki (dari  hasil  titrasi)  dan  masukkan  100ul  ke  dalam  lubang  plate.  Kocok/goyang mikroplat  tersebut  pada  suhu  kamar  selama  satu  jam.  Selanjutnya  mikroplat tersebut  dicuci  kembali  dan  masukkan  100  ul  substrat  (ABTS  dalam  citrate buffer  pH  4,2),  kemudian  kocok  /  goyang  pada  suhu  kamar  selama  satu  jam. Selanjutnya dibaca dengan ELISA Reader pada panjang gelombang 405 atau 414 nm. Intepretasi hasil dengan menggunakan OD. Cut – off yang digunakan adalah rata-rata negatif OD + 3 SD..

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Antigen yang digunakan untuk coating merupakan ekstrak Mycobacterium paratuberkulosis atau Mycobacterium  avium yang  ditumbuhkan  pada  medium cair Watson’s Reid dan Dorset Henley, sedangkan antigen yang digunakan untuk absorbsi  serum  adalah  ekstrak Mycobacterium  phlei yang  ditumbuhkan  pada medium  cair  Dorser  Henley.  Nilai  cut-  off  ELISA  paratuberkulosis  yang  telah dikembangkan adalah rata-rata negate 1,45 dan 0,11. Serum control positif dan negative  juga  diuji  banding  dengan  menggunakan  Kit  ELISA  komersial  (IDEXX) dengan  nilai  rata-rata  Optical  Density  1,38  dan  0,09.  Teknik  diagnosa  ini kemudian digunakan untuk menguji 80 sampel serum sapi perah yang dikoleksi dari  Kecamatan  Cangkringan,  Kabupaten  Sleman  Daerah  Istimewa  Yogyakarta. Hasil ELISA 80 sampel serum tersebut menunjukkan nilai rata-rata OD 0,162 ± 0,015.  Sampel serum ini juga diuji dengan Kit ELISA komersial (IDEXX) dengan rata-rata  OD  0,12.     Dari  hasil  diatas  menunjukkan  bahwa  sampel  serum tersebut adalah negatif (tidak mengandung antibodi terhadap paratuberkulosis). Metode diagnosis paratuberkulosis yang telah dikembangkan merupakan uji  serologi untuk mendeteksi adanya antibodi terhadap paratuberkulosis dalam serum darah sapi. ELISA antibodi ini menggunakan standar cut-off rata-rata OD negatif  +  3  SD,  yaitu  0,29.  untuk  mengurangi  cross  reaksi,  serum  terlebih dahulu  diabsorbsi  dengan  menggunakan  antigen Mycobacterium  phlei .  Hasil ELISA  terhadap  80  sampel  serum  darah  sapi  dari  Sleman  menunjukkan  hasil negatif,  hal  ini  menggambarkan  bahwa  wilayah  Kecamatan  Cangkringan, Kabupaten  Sleman,  Daerah  Istimewa  Yogyakarta  belum  terdapat  penyakit Paratuberkulosis.

## KESIMPULAN
ELISA    antibodi    penyakit    paratuberkulosis    yang    dikembangkan mempunyai  standar  nilai  cutt  –off  0,29.  Kejadian  penyakit  paratuberkulosis  di Kecamatan  Pakem  mungkin  belum  ada,  hal  ini  didasarkan  dari  hasi  uji  ELISA terhadap serum sapi perah menunjukkan hasil negatif..

## DAFTAR PUSTAKA
Collins,  MT,  Socket,  DC,  Gooder,  WJ,  Conrad,  TA.  1994.  Herd  Prevalence  and Geografic  Distribution  of,  and  Risk  Factors  for  Bovine  Paratuberculosis in Wisconsin. J. Am Med. Ass . 2004: 636-641.
Floron  C,  Farries  Jr,  Allen  Jr,  Ellen  J,  Sandra,  RS,  Derry,  DM.  1999. Bovine Paratuberculosis of Dairy Catle . Texas Agricultural Extesion Service, The texas A & M University System, 1-4.
Cox,  JC,  Drane,  DP,  Jones,  SL,  Ridge  S,  Milner,  AR.  1991.  Development  and Evaluatin  of  a  Rapid  Absorbed  Enzyme  Immunoassay  Test  for  The Diagnosis of Johne’s Diseases in Catle. Australian Veterinary Journal , 68
: 157-160.
Jark  U,  Ringena  B,  Franz,  GF,  Gelach  M.  1997.      Development  of  an  ELISA technique  for  Serodiagnosa  of  Bovine  Paratuberculosis. Veterinary Microbiology , 51 : 189 – 198.
Milner,  AR,  Lepper,  AWD.  SYmonds,  WN,  and  Gruner  E.  1987.    Analysis  by ELISA  and  Western  Blotting  of  Antibody  Reactivities  in  Catle  Infected with  Mycobacterium  Paratubeculosis  after  Absorbtion  of  Serum  with Mycobacterium Phlei. Research in Veterinary Science . 42 : 140 – 144. Milner, AR Mack, WN, Coates KJ, Hill J, Gill I, Sheldrick P. 1990. The Sensitivity and Specitivity of a Modified ELISA for The Diagnosis of Johne’s Disease from a Field Trial in Catle. Veterinary Microbiology . 25 : 193 – 198.
[OIE]  Office  International des Epizooties.  2000.  Paratuberculosis.  In  Manual  of Standarts Diagnostic Test and Vaccines . 293-303. Philip  H.  Jones.  2002. Update  on  Bovine  Paratuberculosis  (Johne’s  Disease) . University  of  Liverpool,  Department  of  Veterinary  Clinical  Science  and Animal  Husbandry,  Faculty  of  Veterinary  Science,  Leahurst,  Neston, South Wirral. 1-20.