## PENDAHULUAN
Mikroba laut dapat hidup di semua  kondisi lingkungan  alami.
Bahkan penyebarannya  menjang- kau habitat-habitat  ekstrim yang tidak mendukung kehidupan organisme  lain  pada umumnya, seperti kondisi suhu, pH, tekanan, dan kandungan oksigen yang terlampau  rendah atau tinggi. Keanekaragamannya  sungguh mencengangkan, yaitu sekitar 10.000 spesies yang berbeda untuk tiap gram tanah atau sedimen (Streit et al., 2004). Kelimpahannya  diperkirakan berada  dalam  kisaran 10a sampai 107 sel per mL air. Kandungan karbonnya mencapai 50-100% dari total karbon pada semua tumbuhan darat  (Whitman et al., 1998).  Adanya upaya  pendataan komunitas  mikroba  laut dunia hingga tahun 2020 oleh The lnter- national Census of Marine Mi- crobes  (lCoMM) tentunya akan menambah catatan panjang tentang keanekaragaman  dan kelimpahannya.
Tingginya keanekaragaman dan kelimpahan  mikroba laut menunjukkan  potensinya  sebagai sumber paling  menjanjikan  untuk penemuan produk alami yang bernilai  industri. Di antara  berbagai bentuk produk alami, enzim termasuk paling diminati dalam dunia industri  baik dalam industri kimia, farmasi  maupun  makanan. Hal ini berkenaan dengan peranannya sebagai katalis  yang ramah  lingkungan,  ekonomis  dan bersih  (Wahler&  Reymond,  2001).
Eksplorasi  enzim  dari  mikroba laut biasanya ditempuh dengan cara mengisolasi  dan  menumbuh- kan mikroba dalam  bentuk biakan murni.  Kemudian  dilakukan  seleksi terhadap  mikroba  penghasil  enzim, diikuti dengan optimasi produksi- nya di bioreaktor untuk pelipat- gandaan jumlahnya. Namun sayangnya pendekatan yang dikenal  dengan  sebutan  cultivation- dependent  approach  ini dibatasi oleh kenyataan  bahwa sebagian besar  mikroba  (lebih  dari 99,8% dalam hal keanekaragamannya) tidak dan belum  dapat  dikultur dengan mengunakan teknik{eknik kultivasi  konvensional  yang ada (Riesenfeld et al., 2004).
Kemajuan bioteknologi mo- lekuler yang ditandai dengan lahirnya metagenomika  memung- kinkan untuk mengakses enzim dari  mikroba  laut tanpa perlu mengkulturnya (Arnold, 2001; Handelsman, 2004). Pendekatan metagenomika  ini telah diterapkan untuk  penemuan  sejumlah  enzim dari  mikroba  yang tidak dikultur sepertilipase, esterase  (Henne ef al.,2000), amilase  (Rondon  ef a/.,
2000),  kitinase  (Cottrel et al., 1999) dan alkohol dehidrogenase (Knietsch et  al., 2003). Pendekatan ini juga sedang diterapkan  oleh kelompok  peneliti bioteknologi di Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi  Kelautan dan Perikanan  (BBRP2B)  untuk mem- peroleh  enzim protease  disamping berbagai enzim lainnya dari mikroba laut yang tidak dikultur yang  berasal dari spons.

## ENZM.
ASAL
'  '.  .  . :: .:'. .,.,  '1'  I  '.  : :11  t.:,r r,  r,rr  ri :.t.,; ..  . t.  ..:- .t ,. Agustinus Robert Uria, Dewi Seswita  Zilda dan yusro Nuri Fawzya
Balai Besar Riset Pengolahan  Produk  dan Bioteknotogi
Kelautan  dan  Perikanan Squalen  Vol. 1 No. 1, Desember 2006
Walaupun  penemuan berbagai enzim  unik dan  baru dari  mikroba laut  sangat terbuka lebar,  namun ketika  suatu enzim alami  direkrut untuk aplikasi  industri, seringkali performanya tidak memenuhi selera industr:i.'Dengan kata lain, enzim alami serrngkali mem- pedihatkan  sifat-sifat  yang kurang cocok  untuk proses  industri, seperti labil selama  periode waktu yang lama, tidak aktif  pada  pelarut  yang tidak cair, dan tidak dapat menerima  substrat  spesifik (Van der Oost & de Graaff, 2002). Untuk itu diperlukan suatu sentuhan molekuler guna membuatnya  tampil lebih prima. Sentuhan ini dikenal dengan sebutan  mutagenesis.
Dengan  mutagenesis,  serang- kaian sifat fungsional  enzim  seperti stabilitas  panas, aktivitas  katalisis dan spesifitas substrat  berhasil ditingkatkan (Arnold., 2001). Tulisan ini akan memaoarkan bagaimana  enzim  dari mikroba  laut yang tidak  dapat dikultur  dapat diutak-atik  pada  tingkat  gen untuk membuatnya  tampil  lebih prima,. secara fungsional.

## Dari Metagenomika ke Evolusi Laboratorium
Metagenomika merupakan cabang genetika  yang secara khusus  ditujukan untuk mengumpulkan gen-gen langsung dari  suatu lingkungan, diikuti dengan  rnenguak informasi genetika yang terkandung di dalamnya  (Riesenfeld et al., 2004). Aplikasi pendekatan ini untuk penemuan  enzim  dari mikroba  laut
A.R. Uia, D.S. Zilda dan Y.N. Fawzya
{i} Metagemmika Surnber Mikrnba laut yang tidak  dapat  dilcxrltur iii) Enuhui lahoraturium ffonsfrulcsi,px.rsfaft a nufial Kansfrulcsi p.r st dca met a g*t"**. l-l t} SIrn ningpusJalc a metagetmm,tc- j-l V Enrim alami Gambar 1. Perpaduan  metagenomika  dan  evolusi  laboratorium  untuk meningkatkan  penampilan  enzim dari mikroba  laut  yang tidak  dapat dikultur.
Gen nlaffii Gen rnutrn Eneim  rnutan
yang tidak dapat dikuttur melibatkan (i) konstruksi  pustaka metagenomika, (ii) penapisan pustaka  metagenomika,  dan (iii) analisis  ddn ekspresigen  (Gambar
1).
Konstruksi  pustaka metageno- mika dari suatu lingkungan laut dapat  didasarkan pada teknologi kloning gen shotgun  (Handelsman, 2004). Teknologi ini melibatkan isolasi DNA (deoxyri bon ucteic acifl langsung  dari sampel lingkungan laut, umumnya diikuti dengan pemotongan  DNA tersebut secara parsial. Potongan-potongan  DNA yang relatif besar dikloning ke dalam sel-sel  bakteri, biasanya Escherichia coli. Hasil kloning tersebut  berupa  sekumpulan  klon yang disebut pustaka metageno- mika.
Pustaka metagenomika  kemu- dian diskrining untuk mendeteksi klon-klon  pembawa  enzim yang diinginkan  (Uria et a\.,2006).
Gen  yang  diperoleh  melalui metagenomika  dapat diutak-atik melalui mutagenesis untuk menghasilkan  gen  mutan  unggul. Apabila gen mutan  tersebut diekspresikan,  terbentuklah enzim dengan  sifat unggul.  Mutagenesis biasanya diawali dengan menelusuri  gen yang berperan di balik munculnya  satu atau lebih sifat yang tidak dikehendaki.
Kemudian  informasi  genetik  yang terkandung  dalam  gen bersang- kutan diungkap  dan dianalisis untuk mengetahui faktor penentu sifat. Faktor itu kemudian  dimanipulasi secara  spesifik  pada  urutan  basa nukleotidanya guna menghasilkan gen mutan yang  diinginkan. Gen mutan ini selanjutnya di- ekspresikan untuk membentuk enzim  mutan dengan sifat-sifat yang  diinginkan.  Strategi  seperti ini secara  khusus disebut  disain  pro- tein rasional atau disain rasional. Strategi ini cukup rumit dan memakan waktu lama karena selain membutuhkan  informasi
tentang  struktur enzim juga  tentang hubungan antara urutan,  struktur dan fungsi/mekanisme  kerja enzim (Bornscheuer  & Pohl, 2001).
Akhir-akhir ini telah  berkem- bang  suatu  strategi yang mampu mengubah  performa enzim dalam waktu yang relatif  singkat. Strategi ini cukup  sederhana  karena tidak memerlukan dukungan informasi mengenai  struktur dan hubungan struktur-fungsi  enzim. prinsip kerjanya adalah menghasilkan berbagaigen  mutan  darisuatu  gen alami  dan mengekspresikannya  di inang bakteri yang sesuai. Kemudian  produk  ekspresi, dalam hal ini sekumpulan enzim mutan, diskrining  untuk mendapatkan enzim  mutan dengan sifat-sifat yang diinginkan.  Karena  pringip . kerjanya  menyerupai  teori evolusi Darwin dan berlangsung di laboratorium di bawah  campur- tangan  dan kendalimanusia,  maka strategi ini lebih populer disebut evolusi  laboratorium.  Sejumlah peneliti menyebutnya dengan istilah evolusi  langsung atau evolusi molekuler.  Dengan strategi ini, suatu  molekul  enzim dapat dimanipulasi pada tingkat gen untuk'melahirkan'  turunan unggul. Bahkan dua  atau lebih enzim dengan keunggulan yang berbeda dapat'dikawinsilangkan' untuk melahirkan suatu turunan mutan yang mewarisisemua sifat unggul dari induknya.  Kelebihan-kelebihan ini telah  menempatkannya  sebagai strategi mutagenesis  paling  efektif di abad  milenium ini.,
Evolusi  laboratorium  mencakup sejumlah tahap (Gambar  1). pada tahap pertama yang disebut konstruksi pustaka mutan,  suatu gen dimanipulasisecara  acak untuk menghasilkan  berbagai  mutannya. Gen-gen  mutan itu kemudian dikloning  dan  diekspresikan ke dalam E. coli,  sehingga  mengha- silkan kumpulan klon yang  disebut pustaka  fenotip  mutan. Pada tahap kedua  yang disebut skrining pustaka mutan, pustaka mutan
Squalen  Vol. 1 No. 1, Desember 2006
diskrining  untuk  menyelefsi klon penghasil  enzim mutan dengan fenotip yang diinginkan.  Misalnya, untuk memperoleh  klon penghasil enzim  mutan tahan panas, aktivitas enzim diuji pada  suhu yang tinggi. Kerhudian gen mutan yang diinginkan  dapat disekuens dan- data  sekuens dianalisis untuk mengetahui perubahan informasi genetik yang terjadi.

## Konstruksi  Pustaka Mutan
Konstruksi pustaka mutan dalam  evolusi laboratorium, sebagaimanayang  digambarkan di atas, melibatkan  produksi  berbagai mutan darisuatu gen  alami, diikuti dengan  kloning dan ekspresigen- gen mutan ke dalam  inang E. coli. Hal ini dapat  dilakukan  melalui mutasi  titik  (point  mutation) dan rekombi nasi (reco m b i n atio n). Mutasi titik dan  rekombinasi  yang paling  populer  adalah  error prone PCR  dan DNA shuffling. Kedua teknik ini didasarkan pada penerapan P CR (polyme rase ch ai n reaction)  untuk memodifikasi urutan  nukleotida pada  gen.
Prinsip  Dasar PCR
Teknik PCR pertama kati diusulkan  secara  teoritis  oleh H. Ghobind  Khorana padatahun 1970. Lima belas tahun kemudian  Kary Mullis  dan  rekan-rekannya di Ce- tus Corporation mengimplemen- tasikan  teori itu melalui  eksperi-" mennya tentiang penggandaan  gen- gen mamalia sec€lra i n vitro dengan menggunakan  DNA  polymerase I dari E coll (Sambrook & Russel, 2001). Sejak saat itu penggunaan teknik  PCR berkembang dengan sangat  pesat dan bahkan  sekarang telah  dapat dilakukan secara otomatis dengan menggunakan mesin thermal  cycler atau lebih dikenal  dengan  sebutan  mesin PCR  (Sambrook & Russet, 2001; Karp,2005). Dengan  mesin  pCR, daerah target pada  DNA dapat diperbanyak  sebesar 105 kali
A.R. Uia, D.S. Zilda dan Y.N. FawzYa
melalui 25 siklus dalam waktu paling  kurang 57 menit  (Prescott, et a1.,2002).  Salinan  DNA Yang dihasilkan  dapat  digunakan  untuk tujuan  kloning, sekuensing  dan mu- tagenesis  (Madigan  et a\.,2000).
Dalam prakteknya, reaksi PCR dilakukan dengan cara mencam- purkan  sampel  DNA dengan komponen-komponen  berikut  DNA polimerase,  keempat deoksiribo- nukleotida  (dNTPs),  kofaktor  MgCl, dan sepasang  oligonukleotida  yang disebut  primer. Dalam hal ini, enzim  DNA polimerase Yang digunakan  bersifat  tahan Panas seperti Taq polymerase  dan kedua primer komplemen  dengan  ujung 3' pada  daerah  DNA yang akan digandakan.  Campuran PCR tersebut  ditempatkan  Pada  mesin PCR  dan kondisi siklus  PCR  diset untuk sejumlah siklus Yang dikehendaki. SetiaP siklus mencakup tiga tahap utama.  Pada tahap pertama yang disebut denaturasi,  camPuran PCR
diturunkan  hingga 60"C untuk memungkinkan  primer berikatan atau menempel pada  setiaP untaian tunggal  DNA.  Pada tahaP  ketiga yang disebut elongation,  suhu dinaikkan hingga sekitar 72"C untuk memungkinkan Taq  PolY- merase  menambahkan  dNTPs  ke ujung 3' dari Primer hingga membentuk  untaian tunggal baru pada  untaian  tunggal sebelumnYa. Siklus seperti ini diulangi berkali- kali sehingga hanYa dalam beberapa  jam, miliaran  salinan  dari suatu daerah tertentu Pada DNA dapat dihasilkan (Madigan et al., 2000; Karp,2005).
Dewasa  ini aplikasi  PCR telah menyusup ke hamPirsemua  bidang ilmu dasar  maupun  teraPan.  Dalam bioteknologi, teknik PCR digunakan untuk rekayasa Protein atau mu- tagenesis  dan analisis keaneka- ragaman  mikrorganisme. Dalam dunia  kedokteran, PCR digunakan untuk mendiagnosa berbagai penyakit  manusia baik Yang
digunakan sebagai  bagian dari teknologi  sidik jari DNA untuk membantu  mengungkaP  kasus- kasus  kriminal  (Prescott et al., 2002). Dalam bidang perikanan dan pertanian, PCR diteraPkan  untuk menddteksiparasit Pada ikan  dan tanaman.
Aplikasi PCR untuk Produksi Gen Mutan
PCR  dapat diteraPkan  untuk mengubah  satu atau lebih basa nukleotida pada  salinan darisuatu gen  alami. Aplikasi PCR  untuk tujuan ini disebut mutasi  titik melalui error prone  PCR. Hal ini dapat dilakukan  melalui Penggan- tian kation seperti M92*  dengan Mn2* untuk tujuan mereduksi kondisi  optimal dalam reaksi  PCR.
Cara alternatif  adalah meng- gunakan DNA polymerase Yang tidak mempunyai kemampuan proofreading  (membaca  urutan
*"":ffi::: i;:,trffi;i:::I
diinkubasi  pada 93oC untuk memisahkan  untaian ganda DNA target  menjadi  dua untaian tunggal. Pada tahap selanjutnYa Yang disebut  anealing,  suhu reaksi
disebabkan oleh mikroorganisme patogen, sePerti hePatitis, tuberkulosis, AIDS, mauPun penyakit  genetik  (turunan)  seperti anemia. Dalam  ilmu forensik, PCR
nukleotida yang salah dan memperbaikinya).  Enzim  ini lebih dikenal dengan nama high enor- rate polymerase  (Arnold, 2001;Van der Oost & de  Graff, 2002).
Gambar 2. Error prone  PCR, yang  melibatkan  produksi  berbagai  mutan secara acak dari suatu gen alami (Digambar  kembali dariVan der  Oost & de  Graff, 2002)'
;,
{A} | *  -----------EE-] ^trrcreueru.ri ry a'*lsIa{4'\&*eJ ffi r * | ,f:t!.* un$uhr+r Squalen  Vol. 1 No. 1. tEl tf nF--t m--t *----*tr;F--l L:l D-F-]nT--]---t fl--s-E. rtlr-----l | .Perah?,ag $srrFsij t .p,:g,'rrdlFr+Cgrsnl Desember 2006
tc) tD) re 5sl+,F.rigsnnuiran t] * t  -l tf n3 ff rl
Dalam  proses errorprone  pCR sebagaimana yang  ditunjukkan pada  Gambar 2, suatu  gen  alami dirunakan sebagai cetakan dalam suatu reaksi PCR untuk menghasilkan sekumpulan gen mutan dengan perubahan pada satu atau beberapa nukleotida. Gen-gen  mutan itu kemudian diekspresikan pada strain E coll yang sesuai dan diskrining untuk sifat  atau fenotip  yang dikehendaki.
Jika sifat yang diinginkan belum optimal,  maka  gen mutan target dapat diterapkan lagi dalam sejumlah siklus error prone  pCR hingga  dijumpai  sifat unggutyang diinginkan.
Aplikasi PCR tainnya yang sangat menarik dalam evolusi laboratorium  adalah mengawin- silangkan  dua atau  lebih enzim yang homolog  untuk melahirkan suatu turunan  mutan yang mewarisi semua sifat unggul dari parental- nya. Aplikasi  PCR  yang dikenat dengan  sebutan DNA shuffling ini mula-mula diimplementasikan oleh Stemmer (1994).  Teknik DIVA shuffling  biasanya melibatkan fragmentasi  beberapa gen ho- molog, diikuti dengan perakitan kembali  fragmen-fragmen DNA melalui aplikasi  PCR. Dalam prakteknya  (Gambar  3), sejumlah
Gambar 3. Siklus  DNA shufflrng.
gen  homolog dengan sifat-sifat yang berbeda  dipotong dengan menggunakan enzim DNAse l. Fragmen-fragmen  DNA yang dihasilkan kemudian  diteraokan dalam  suatu  reaksi  PCR. Dalam reaksi PCR,  suatu fragmen dapat berperan sebagai primer  yang menempel pada fragmen homolog lainnya. Dengan demikian, rekombinasi  terjadi ketika  fragmen- fragmen dari suatu gen melakukan  polimerisasi  terhadap salinan gen lainnya (Stemmer, 19e4).
Dengan menggunakan  DNA shuffling, gen-gen  dari strain mikroba yang  berbeda atau bahkan  dari  spesiesyang  berbeda dapat dikawinsilangkan  satu sama lain untuk  menghasilkan  gen  hibrid baru (Arnold , 2001). " Gen mutan ini dapat mewarisi  semua sifat unggul dari gen-gen  induknya. Untuk alasan ini, metode ini dipertimbangkan  sebagai cara yang sangat  ampuh dalam meng- hasilkan enzim mutan yang tidak ditemukan di alam. Keuntungan metode ini dibanding dengan metode-metode mutagenesis lainnya  adalah  tingginya  jumlah siklus evolusi  molekuler yang dilakukannya (Stemmel 1 994).
I f----r
Kloning  dan Ekspresi Gen Mutan
Gen-gen  mutan yang dihasilkan baik melalui  error-prone pCR maupun  DNA shuffling perlu dikloning  dan  diekspresikan  untuk membentuk  perpustakan fenotip mutan. Kloning  dan  eskpresi  gen memerlukan  sistem  mikroba yang sesuai. Di antara sistem mikroba yang ada, E coli masih  merupakan salah satu  inang  yang paling diminati dan digunakan  secara luas. Ada beberapa  alasan  utama untuk hal ini, seperti kemampuan- nya untuk tumbuh dengan cepat pada substrat yang  tidak mahal, genetika dan fisiologinya yang telah diketahui  dengan baik," ketersediaan  sejumlah  vektor kloning yang tepat, dan meninEkatnya jumlah strain mutannya  (Banex,  1999).
Di antara berbagai sistem ekspresi  E. coli, sistem  pET yang dikomersialisasikan  oleh Novagen termasuk  sistem yang paling  baik untuk ekspresi  protein  rekombinan. Sistem ini menawarkan  enam kombinasi  inang-vektor  dan salah satunya adalah vektor  pET24d  dan inang E.  coli BLD21 (DE3) (utvvw. novagen.com).  Kombinasi ini telah  sukses digunakan untuk
I I L
A.R. Uria,  D.S. Zilda dan Y.N. Fawzya
ekspresi  sejumlah enzim rekombinan, seperti alkohol dehidrogenase sebagaimana  yang dilaporkan oleh Machielsen ef a/. (2006)dan Uria ef a/. (2006).  Klon- klon pembawa  gen  mutan yang aktif secara  fungsional dapat diseleksi berdasarkan keberad.aan penanda resisten antibiotik dan gen  /ac I pada  vektor (Gambar4).

## Skrining
Pustaka  Mutan
Pustaka fenotip mutan selanjutnya  perlu  diskrining  untuk mendapatkan  klon-klon  penghasil enzim  mutan dengan sifat-sifat yang  diinginkan.  Ini memerlukan metode-metode yang relatif praktis, tidak mahal dan cepat (Wahler & Reymond, 2001).
Metode yang digunakan  tergantung pada sifat enzim  yang ingin diubah.
Metode-metode skrining yang relatif  sederhana  didasarkan  oada seleksi enzim  terhadap  parameter lingkungan  yang  diinginkan  seperti tahan panas atau dingin,  tahan pH rendah  atau tinggi. Sebagai contoh, protease subtilisin direkayasa melalui evolusi laboratorium  dan  diskrining  untuk sifat tahan atau stabil pada kondisi dingin, sebagaimana  yang dilaporkan oleh Taguchi et al., 1998. Dalam hal ini, pustaka mutan  dibuat replikanya  pada  me- dia yang mengandung  substrat skim milk dan diinkubasi semalaman  pada 37"C untuk membentuk klon-klon. Setelah inkubasi tambahan pada 10"C selama  dua hari,  zona  bening nampak jelas di sekitar  beberapa klon yang  menunjukkan bahwa skim milk dihidrolisis  pada kondisi dingin.
Pustaka  mutan  dapat  ditujukan untuk menyeleksi enzim mutan dengan enansioselektivitas ter- tentu. Sebagai  contoh, deteksi -- enzim  golongan aldolase  terhadap substrat dengan  gugus karbonil sebagaimana  yang dilaporkan  oleh Reymond  (2001).  Ekspresi  enzim
Kaloni-kolani rekambinan dengan antibiotik #
Gambar 4. Seleksi  terhadap  klon-klon  pembawa  gen  mutan  yang  aktif secara  fungsional. Penambahan antibiotik  tertentu ke dalam media  pertumbuhan akan memungkinkan  hanya  klon-klon pembawa  vektortetap  hidup.  Kemudian  adanya  a-galaktosa dalam  media padat memungkinkan  pendeteksian  klon-klon pembawa gen sisipan. Keberadaan  isopropyl-u-D-1- th iog al actopyranoside (l PTG) di dalam  media mengi nduksi ekspresigen-gen  mutan.  Kumpulan klon-klon  pembawa gen mutan  yang  aktif  secara  fungsional ini disebut perpustakaan fenotip mutan.
ini oleh klon dapat dideteksi Teknik sekuensing yang telah karena kemampuannyamengubah digunakan secara luas adalah substratdenganberbagaienansio- pendekatan enzimatis yang selektivitas menjadi umbelliferone. dikemukakan oleh Sanger dan Umbelliferone adalah produk Coulson  dari gRC_CamOriOge, fluoresen  yang  dihasilkan melalui Inggris.  Dewasa  ini, sekuensing eliminasi sen!?w€lu karbonil. teian dilakukan dengan skrining ini dapat juga diterapkan menggunakan mesin sekuensing untuk seleksi alkohol d:!idlg- lseqiinceryyang bekerjaotomatis genase denganstereodanenansio ix"rp, 2005). Untuk sekuensing selektivitas  tertentu.
Gen mutan tarset yans ::ililT:-Tlffi:::3:13i#iT diperofeh selanjutnya dapat dengan sequencerotomatis. disekuens  (ditentukan urutan nukleotidanya) dan  data KESTMPULAN sekuensnya dianalisis untuk mengetahui secara spesifik Tingginya keanekaragaman perubahanyangterjadipadaurutan dan kelimpahan  mikroba laut asam amino yang disandinya. menunjukkan  potensinya  sebagai
Sel dengan veldor pembnr,nm
gen *isipan t*gel $el dengan veldar pembara gen sisipfrn non-hrgEt Media dengan galaktosa Media dengan IPTS
sumber paling  menjanjikan  untuk penemuan produk alami baru yang  bernilai  industri. Enzim termasuk produk alami yang paling dimindti  dalam  dunia  industri karena reputasinya sebagai katalis yang  ramah lingkungan, ekonomis dan  bersih. Dengan menggunakan  pendekatan  meta- genomika,  berbagai enzim unik dan baru  dapat  diakses  dari mikroba laut  yang tidak  dapat dikultur.
Walaupun demikian, enzim alami seringkali tidak me- nunjukkan performa yang sesuai dengan selera  industri, seperti  labil selama  periode waktu  yang  lama, tidak aktif pada  pelarut tertentu, dan tidak  dapat menerima substrat spesifik.  Untuk itu diperlukan suatu sentuhan  molekuler  yang  disebut mutagenesis  guna membuatnya tampil lebih prima untuk  suatu kondisi  reaksi yang diinginkan.
Evolusi laboratorium  dipertim- bangkan sebagai  strategi  mu- tagenesis  paling  efektif  di abad milenium ini. Hal ini karena kemampuannya  mengubah per- forma enzim dalam  waktu yang relatif singkat tanpa memerlukan dukungan informasi mengenai struktur dan hubungan  struktur- fungsi enzim. Ada dua metode yang relatif sederhana dalam evolusi laboratorium, yaitu  error- prone  PCR dan DNA shuffling. Dengan  menggunaka n error-prone PCR khususnya,  suatu molekul enzim  dapat dimanipulasi pada tingkat  gen untuk 'melahirkan' turunan  unggul. Dengan DNA shuf- fling, dua atau lebih enzim ho- molog  dengan  keunggulan yang berbeda dapat'dikawinsilangkan' untuk  melahirkan  suatu turunan mutan yang  mewarisi  semua  sifat unggul dari induknya.

## UCAPAN TERIMA  KASIH
Kami berterima kasih kepada Ariyantiyang  telah membaca  dan memberi  masukan berharga terhadap  isi manuskrip ini.

## DAFTARPUSTAKA
Arnold, F.H. 2001.  Combinatorial  and computational  challenges  for biocatalyst design. Nature  409: 253-258.
Banex,  F. 1999.  Recombinant  protein expression in Escherichia  coli.
Cun. Opin. Biotechnol.  10: 411- 421.
Bornscheuer, U.T. and  Pohl, M. 2001. lmproved  biocatalysts  by directed evolution and  rational orotein design. Curr. Opin.  Chem. Biol. 5: 137-143.
Cottrel,  M.T., Moore, J.A. and Kirchman, D.L. 1999.  Chitinases from uncultured marine microor- ganisms. Appl. Environ. Microbiol.  65(6): 2553-2557. Handelsman, J. 2004. Metageno- mics: Application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68(4)i 669-685.
Henne, A., Schimitz,  R.A.,  Bomeke,
M., Gottschalk,  G. and Daniel, R. 2000.  Screening of environmen- tal DNA  libraries for the  presence of genes  conferring  lipolytic ac- tivity on Escherichia coli. Appl. Environ.  Microbiol. 66: 3113- 3116.
Karp, G. 20O5. Cell and  Molecular Biology:  Concepts  and  Experi- ments.4rh Edition, John Wiley & Sons, Inc.,  NJ. 780 pp. Knietsch, A., Waschkowitz, T., Bowien, S., Henne, A. and Daniel, R. 2003. Construction and  screening of metagenomic libraries  derived from enrichment cultures:  Generation of a gene bank for genes  confferring  alco- hol oxidoreductase activity on Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 69(3):'1408-141  6.
Machielsen R., Uria, A.R., Kengen, S.W. and van der Oost.  J. 2006.
Heterologous production and characterization of a thermo- stable  alcohol dehydrogenase that belongs to aldo-keto re- ductase superfamily. Appl. Environ.  Microbiol.  72(1):  233- 238.
Madigan,  M. T.,  Martinko, J.M. and Parker, J. 2000. Brock  Biology of Mircoorganisms.  Prentice- Hall, Inc. Upper  Saddle River,
Squaten Vot. 1 Aio. 1, Desember 2006
New  Jersey,  USA. 991 pp. ;- Prescott,  L.M.,  Harley,  J.P. and Klein, D.A.  2002. Microbiology.5th edi- tion. The McGraw-Hill Comoa- nies, Inc.,  New York. 1022  pp.
Reymond, J-1.2001. New high- throughput screening  assays for bio-catalysis . Chimia. 55(12): 1049-1052.
Riesenfeld, C.S., Schloss, P.D. and Handelsman. J. 2004. Meta- genomics:  Genomic  analysis  of microbial communities.  Annu.
Rev. Genet. 38: 525-553.
Rondon, M.R., August, P.R:, Betterman, A.D., Brady,S.F., Grossman, T.H., Liles, M.R., Loiacono, K,4., Lynch, B.A., Macneil, 1.A., Minor, C., Tiong, C.L.,  Gilman,  M., Osburne, M.S., Clardy, J., Handelsman, J. and Goodman, R.M. 2000.  Cloning the  soil metagenome: A strategy " .for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms.  Appl. Environ. Microbiol.  66(6): 2541 -2547 . Sambrook, J.E. and Russel, D.W. 2001. Molecular Cloning: A labo- ratory Manual,  2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold  Spring  Harbor, N.Y. Stemmer,  W.P.C.  1994. DNA  shuffling by random  fragmentation  and reassembly:.ln vitro recombina- tion for hiolecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci.91: 10747- 10751.
Streit, W.R., Daniel,  R. and Jaeger, K- E. 2004. Prospecting for biocatalysts and drugs in the ge- nomes of non-cultured microor- ganisms.  Curr. Opin. Biotecnol. 15: 285-290.
Taguchi, S., Ozaki, A. and Momose, H. 1998.  En$ineering of a cold- adapted  protease by sequential random  mutagenesis and a screening system. Appl.  Environ. Microbiol.  64(2): 492-495. Uria,A.R.,  Machielsen, R., Dutilh, B.E.,
Huynen, M.A. and Van der  Oost, J. 2006. Alcohol  dehydrogena- ses from marine  hyperthermo- philic microorganisms  and  their importance to the pharmaceuti- cal industry.  lnternational Semi- nar and Workshop on Marine Biodiversity & their Potential  for Develo pi ng Bio  -P h a rm ace  uti cal
I I L
A.R. Uria, D.8.  Zilda dan Y.N. Fawzya
lndustry in Indonesia, on the 17- 18th of May 2006  at Jakarta.
Van der Oost, J. and de Graaff, L. 2002. Applied Molecular Gene- fics. ff Teaching Module.
Wageningen  University and Re-
search  Centre, the Netherlands. Wahler,  D. and Reymond,J-L.2001.
High-throughput  screening  for biocatalysts. Curr. Opin.
.4
Biotechnol.  12:535-544. i
Whitman,  W.B.,  Coleman,  D.C. and Wiebes, W.J. 1998.  Prokaryotes: The  unseen majority. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6578-6583.
.n'
.,7 ry