## MEKANISME INFEKSI VIBRIO PADA RESEPTOR  IKAN KERAPU TIKUS
Cromileptes altivelis

## THE MECHANISM OF VIBRIO INFECTION TO GROUPER RESEPTOR Cromileptes altivelis

## Uun Yanuhar
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia Jl. Veteran, Malang 65145 Telp. 0341-553512

## Abstract
One of the  most favourite fish that farmer  fish cultivated because  its  high economic  value was gouper  ( C.  altivelis ).  The  obstacle  in  cultivation  system  was  caused  by  Vibrio  algynolitycus.  Vibrio angullarum,  Vibrio  parahaemolyticus.  Vibrio  harveyi  infection.  Many  deseases  that  attacked  to  the grouper was caused by the role of pathogen specific as a ligan and its reseptor.
The aim of these study was to improve and to know the role of reseptor in vibriosis mechanism with tested spesific reseptor protein of grouper Cromileptes altivelis . These study used experimental and descriptive  methode with  identified of grouper reseptor, Hemaglutinin test and observation use electron microscope.
These  study  result  showed  that  reseptor  protein  of C.  altivelis was  found  in  its  eyes.  These showed spesivity and reactivity to the vibriosis specific epitop.
Keywords : reseptor, grouper, vibriosis

## Pendahuluan
Sebagai  komoditas  eksport  kedua setelah  udang,  ikan  kerapu  bebek  atau  kerapu tikus ( C. altivelis ) saat ini merupakan salah satu jenis ikan yang sangat diminati oleh petani ikan untuk  dibudidayakan  karena  mempunyai  nilai ekonomis tinggi, akan tetapi dalam perkembangan  budidaya  ikan  kerapu  ini  masih dihadapkan pada beberapa masalah, diantaranya adalah  penyakit  yang  disebabkan  oleh  mikroba yaitu  bakteri    seperti V.  parahaemolyticus,  V. alginolyticus, V.cholerae, V. anguilarum, V.harveyi dan V.  fulnivicus ).  Pada  juvenil  ikan kerapu  tikus  dengan  rata-rata  berat  9,91  gram- 15,40  gram  dan  panjang  6-10  cm  rentan terhadap infeksi mikroba. Kematian masal yang disebabkan  oleh  penyakit  infeksi  tersebut mencapai 90-100% (rata-rata 93,3%) selama 21 hari.  Kematian  ikan  kerapu  tidak  hanya  terjadi pada  stadia  larva  dan juvenile secara  masal tetapi  juga  pada  induk  kerapu  yang  dipelihara dalam  bak  induk  hingga  mencapai  40% (Mahardika  &  Zafran,  2004).  Baru-baru  ini ditemukan  juga  spesies V.  vluvialis pada  ikan kerapu tikus  (Istiqomah et al ., 2006). Kerugian pada  industri  budidaya  perikanan  air  laut  dan tawar secara serius juga disebabkan oleh spesies Vibrio yang  mengakibatkan  kematian  ikan budidaya  pada  tingkat  benih  mencapai  99% (Wang et  al .,  1998)  dan  (Denkin  &  Nelson, 2004).
Hasil  penelitian  pendahuluan  terhadap infeksi  V.  alginoluticus,  V.  parahaemolyticua, V.  anguilarum  dan  V.  harveyi  dengan  cara infeksi  secara  injeksi  intramuscular  dan  juga secara perendaman menunjukkan bahwa kepadatan  bakteri  hingga 10 8-10 CFU/ml  pada ikan kerapu  pasca infeksi terjadi kematian ikan pada jam ke- 8 dengan imunisasi, dengan  gejala terjadinya luka borok menganga, dan perubahan perilaku, bergerak lamban, keseimbangan terganggu,  yaitu  berputar-putar  ( whirling )  dan nafsu  makan  berkurang,  akan  tetapi  ikan  pada perlakuan perendaman ikan bertahan  hingga 24 jam-96jam.  Imunisasi  secara  intraperitoneal menunjukkan  bahwa  dengan  imunisasi  bakteri V.  alginolyticus 10 10 menunjukkan  kematian hingga  5  jam  pertama  pasca  infeksi  dengan perubahan  warna    morfologi  ikan  menjadi kegelapan,  inflamasi,  sampai abses pada  bekas injeksi, timbul bercak merah pada pangkal sirip, timbul perdarahan pada insang dan mulut, perut menggelembung hingga terjadi kematian. Yanuhar  (  2008)  sebelumnya  juga  menjelaskan dalam penelitiannya  bahwa gejala   infeksi pada ikan  kerapu  dengan  menggunakan  jenis  bakteri lain seperti V. parahaemolyticus, V. anguilarum dan  V.harvey ,  akan  tetapi  tingkat  keganasan berdasarkan  identifikasi  dengan  menggunakan uji  haemaglutinasi,  bakteri V.  alginolyticus merupakan bakteri yang lebih virulen berdasarkan  titer  haemaglutinin  yang  telah
diujikan  dengan  eritrosit  ikan  kerapu  . Berdasarkan  tingkat  serangan  bakteri  telah ditemukan  sebelumnya    bahwa  pathogenesis bakteri V.  alginolyticus diperankan  oleh  peran dan  fungsi  dariprotein  reseptor  dan  protein adhesion dari bakteri V. alginolyticus (Yanuhar, 2006),  yaitu  melibatkan  peran  reseptor  spesifik pada  permukaan  sel  ( specific  cell surface molecule )  yang  disebut  sebagai  reseptor  adesi yang  dapat  digolongkan  menjadi  superfamili yaitu: immunoglobulin,  cadherin,  integrin  dan selectin (Sudhakar & Subramani, 2006).

## Materi dan Metode Penelitian
Material  dalam  penelitian  ini  meliputi, isolat  bakteri V.  alginolyticus  ,  V.  anguilarum,
V.  parahaemolyticus,  V.  harveyi dan  ikan kerapu  tikus  dengan    pemeriksaan  scanning laser mikroskop.
Kultur Vibrio spp. Dalam  penelitian  ini,  bakteri  yang digunakan adalah V.alginolyticus, V.anguilarum, V.harveyi dan V.parahaemolyticus .  Bakteri  ini  diperoleh  dari
BBAP  Jepara  dalam  bentuk  agar  miring. Kemudian  dilakukan  kultur  di  Laboratorium Mikrobiologi  Universitas  Brawijaya.  Kultur  ini menggunakan  media  TCBS  (uji  konfirmasi), media  BHI  (uji  protein)  dan  LB  (uji  DNA). Kultur  dilakukan  diawali  dengan  Vibrio ditanam pada media TCBS selama 24 jam pada suhu  24 o C.  Hasil  dari  biakan  diambil  dengan cara  kerokan  yang  sebelumnya  dituang  PBS steril  pH  7,4  secukupnya.  Suspensi  bakteri kemudian  dimasukkan  dalam  botol  yang  berisi 500  ml  Brain  Heart  Infussion  Broth  (BHI), kemudian  digoyang  kuat  selama  30  menit  pada penangas  air  suhu  37 o C.  selanjutnya  suspensi bakteri  sebanyak  250  ml  dimasukkan  dalam setiap  botol  yang  mengandung  media  LB. Selanjutnya  dilakukan  pengeraman  suhu  37 o C selama 2 x 24 jam.
Test Haemagglutinasi Petunjuk penelitian seperti dilakukan oleh Ehara dengan  modifikasi  (Sumarno et  al .,  1991  dan Winarsih  S., et  al .,  1998).  Hasil  koleksi  pili tersebut  dilakukan  SDS-PAGE.  Gel  dipotong lurus  pada  berat  molekul  yang  diinginkan  dan potongan  pita  tersebut  dikumpulkan  dan dimasukkan  dalam  tabung  membran  dialisa memakai cairan penyangga elektroforesis running buffer . Selanjutnya dilakukan elektroelusi  menggunakan  alat  elektroforesis horisontal aliran 125 mV selama 25 menit. Hasil elektroforesis  dilakukan  dialisa  dengan  cairan penyangga  PBS  2  liter  pH  7,4  selama  1  x  24
jam  dan  2  liter  aquades  selama  1  x  24  jam. Cairan  dialisat  yang  berasal  dari  potongan  pita SDS-Page tersebut dilakukan uji hemaglutinasi.
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gel Electrophoresis (SDS-Page)
Monitoring  berat  molekul  dikerjakan menggunakan  SDS-Page  metode Laemmli (1970).  Sampel  protein  dipanaskan  100 o C selama  5  menit  dalam  larutan  penyangga  yang mengandung  5  mM  Tris  HCL  pH  6,8,  5%  2 - mercapto  ethanol ,  2,5%  w/v sodium  dodecyl sulfate , 10% v/v glycerol dengan warna pelacak bromophenol  blue . Dipilih  12,5%  mini slab gel dengan  tracking  gel  4%.  Voltase  yang digunakan  125  mV.  Sebagai  bahan  warna adalah coomassie  brilliant  blue dan  molekul standar sigma low range marker .
Teknik pemeriksaan Immunokimia Antigen dan protein reseptor dari organ ikan  kerapu C.  altivelis sebanyak  20 l diencerkan  dalam  sodium  azida  (NaN 3 )  1%
(1:4).  Diteteskan  pada  membran  nitroselulosa yang  telah  dibasahi  PBS  yang  terangkai  pada alat  Dot  Blotter.  Didegas  selama  30  menit. Membran  di-blocking  dengan  PBS-Skim  5% selama  1  jam.  Dicuci  dengan  PBS-Tween 0,05%  selama  3x3  menit.  Inkubasi  dengan antibodi  primer  (IgM)  yang  telah  diencerkan dalam  PBS-Skim  5%  (1:200)  selama  2  jam sambil  digoyang.  Dicuci  3x3  menit  dengan PBS-Tween. Diinkubasi dengan antibody sekunder  Anti  IgM  Alkaline  Phospatase  (AP) Conjugated  dalam  TBS  (1:2500)  selama  1  jam sambil  digoyang.  Dicuci  dengan  PBS-Tween 0,05%  selama  3x3  menit,  dilanjutkan  dengan iinkubasi  dalam  substrat  Western  Blue  (dalam ruang  gelap)  selama  30 menit.  Reaksi dihentikan dengan penambahan aquades. Membran dikeringkan dan diamati ada tidaknya noda berwarna biru gelap.

## Hasil dan Pembahasan
Tes Haemaglutinasi Vibrio spp.
Hasil penelitian terhadap tes haemaglutinasi  pada V.  alginolyticus,  V. parahaemolyticus,  V.  anguilarum dan V. harveyi menunjukkan  (Tabel  1)  bahwa  bakteri V. alginolyticus mempunyai titer haemaglutinin yang  lebih  tinggi  konsentrasinya  daripada V. anguilarum,  V.  parahaemolyticus dan V. harveyi .

## Test Haemaglutinasi
Uji  aglutinasi V.  alginolyticus isolat Vibrio spp. ditentukan dari beberapa isolat yang mempunyai titer aglutinasi positif dari
konsentrasi  tertinggi   hingga terendah terhadap eritrosit ikan kerapu tikus C.altivelis . Berdasarkan  hasil  penelitian  terhadap uji  aglutinasi  menunjukkan  bahwa    whole  cell bakteria  memberikan titer positif  haemaglutinin hingga pengenceran 1/512 untuk V.alginolyticus ,    berikutnya V.  anguilarum,  V. parahaemolyticus dan V. harveyi (Tabel 1).
Hasil  uji  haemaglutinin  berdasarkan    titer pengenceran konsentrasi bakteri terhadap eritrosit  ikan  kerapu    menunjukkan  bahwa  titer tertinggi dari masing-masing bakteri mempunyai protein adhesion yakni haemaglutinin yang berarti mampu mengaglutinasi eritrosit ikan kerapu. Elektroforesis  SDS-PAGE  Protein  Reseptor Grouper Tabel . 1 Hasil uji Hemaglutinasi  Vibrio spp.  secara bertingkat  terhadap eritrosit  ikan kerapu tikus C. altivelis Sumur/ materi 1 1/2 2 1/4 3 1/8 4 1/16 5 1/32 6 1/64 7 1/128 8 1/256 9 1/512 10 1/1024 11 1/2048 12 K V. alginolyticus + +
+ + + + + + + - - - V. anguilarum + +
+ + + + + - - - - - V. parahaemolyticus +
+ + + + - - - - - - - V. harveyi + + - - - - - - - - - - Kontrol - - - - - - - - - - - - Keterangan :
V. alginolyticus titer positif haemaglutinin (1/512) V. anguilarum titer positif haemaglutinin (  ) V. parahaemolyticus titer positif haemaglutinin (  ) V. harveyi titer positif haemaglutinin (  )
Gambar  1.  Hasil  elektroforesis  SDS-Page  protein  reseptor  dari  organ  mata C.altivelis dengan pewarnaan commassie brillian blue R-250 Keterangan : Lajur A  :  Protein perunut Low marker merk Sigma Lajur B  :  pita  protein  reseptor    organ  mata C.  altivelis berat  molekul    93,4  kDa  memberikan reaksi silang positif
Lajur C  :  pita protein reseptor berat 93,4 kDa dilakukan uji untuk western blotting
Hasil penelitian terhadap berat molekul reseptor  organ  mata    ikan  kerapu  tikus  C. altivelis dengan SDS-Page adalah  133,7; 115,8 kDa; 105, 3 kda; 93,4 kDa; 86,9 kDa; 79,0 kDa; 68,4 kDa; 59,2 kDa; 52,6 kDA; 48,9 kDa; 41,4 kDa;  33,3  kDa;  26  ,2  kDa  (Gambar  2c).  Hasil pita  protein  reseptor  yang  telah  diuji  adalah berat  molekul  93,4  kDa    yang  sudah  dilakukan uji  reaksi  silang  terhadap  serum  ikan  kerapu tikus C. altivelis , dengan pemeriksaan imunokimia memberikan reaksi silang positif .
Berdasarkan hasil
elektroforesis protein  reseptor  organ  mata  ikan  kerapu C. altivelis yang  diisolasi  dari  organ    sebagai reseptor protein  terhadap adesi V. alginolyticus menunjukkan  gambaran  pita  protein  yang berbeda.  Pada  pengujian  ini  telah  ditentukan bahwa  berat molekul 93,4 kDa  yang digunakan dengan  pengujian  imunokimia  menggunakan teknik  western  blotting    memberikan  reaksi silang  setelah    dilakukan  pengujian  reseptor dengan  protein  adesi V.alginolyticus .  Pengujian lebih  lanjut  perlu  untuk V.  anguilarum,  V. parahaemolyticus, dan V.harveyi.
Pemeriksaan  ekspresi  reseptor  mata    terhadap infeksi Vibrio spp.
Hasil  pengujian  terhadap    ekspresi reseptor  protein  mata  terhadap    perlekatan bakteri  Vibrio  spp.  diantaranya  adalah  V. alginolyticus  terhadap  menunjukkan  bahwa ekspresi  reseptor  protein  pada  organ  mata berbeda  antara  organ  normal  dan  terinfeksi Vibrio.  Gambaran  hasil  ekspresi  reseptor protein      mata    terhadap    perlekatan  bakteri V.alginolyticus   menunjukkan pola   fluorescent yang  kuat  dibandingkan  dengan  yang  normal tidak terinfeksi Vibrio (Gambar 2).
Mekanisme  ekspresi  reseptor  protein mata  ikan kerapu terhadap  infeksi Vibrio spp
(dalam  hal  ini V.  alginolyticus )  ditemukan sementara  bahwa    berat  molekul  93,4  kDa memberikan  reaksi  silang  positif    dengan pemeriksaan imunokimia menggunakan antibodi  primer  poliklonal  antibodi  anti-IgM grouper, dan sekunder anti IgM grouper. Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan  keempat  bakteri V.alginolyticus, V.anguilarum,  V.  parahaemolyticus dan V. harveyi mempunyai titer haemaglutinin, haemaglutinin ini merupakan protein adhesion dari  bakteri  tersebut. Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan pengujian haemagglutinin  bahwa  haemaglutinin  yang ditemukan  merupakan  protein  adhesion  dan juga  merupakan  molekul    glikoprotein,  dimana glikoprotein  juga  ditemukan  pada  organ  usus tepatnya  sel    epitel  usus  ikan  kerapu  tikus (Yanuhar, 2006). Glikoprotein dijelaskan Beachy  (1981)  berfungsi  untuk  migrasi  seluler selama  perkembangan  dan wound  healing , regulasi  pertumbuhan sel dan deferensiasi  yang juga berperan utama dalam trombosis.
Glikoprotein  ini  juga  berperan  pada  perlekatan bakteri  terhadap  permukaan  mukosa  yang merupakan  step  awal  patogenesis  dari  hampir semua  penyakit  infeksi  yang  disebabkan  oleh bakteri  baik  pada  hewan  maupun  manusia. Mekanisme  perlekatan  terdiri  dari  ikatan  adesi molekul  dari  permukaan  bakteri  (adhesin)  dan membran sel host (reseptor).

## Kesimpulan
Kesimpulan  dari  penelitian  ini  adalah bahwa  protein  mata  C.altivelis  dengan  berat molekul  93,4  kDa  memberikan  reaksi  silang terhadap protein adesin hemaglutinin V.alginolyticus.  Reseptor  organ  ikan  kerapu tikus berperan penting dalam mekanisme infeksi Vibrio spp.
Gambar  2.  Ekspresi  Reseptor  Mata  normal  dan  terinfeksi V.  alginolyticus dengan pemeriksaan CLSM
Karena keterbatasan poliklonal antibodi  seperti  reaksi  silang,  kuantitas  yang terbatas,  latar  belakang  reaksi  yang  tidak diinginkan  dan  kemampuan  mendeskriminasi antigen pada tingkat epitop menjadikan penelitian  ini  untuk  dilakukan  lebih  mendalam terhadap peran protein reseptor dan juga protein adhesinnya.

## Ucapan terima kasih
Ucapan  terimakasih  kepada  program    Insentif Riset Dasar Tahun 2008 yang telah memberikan grant  untuk  penelitian  pengembangan  vaksin berbasis  peptida  reseptor  ikan  kerapu  tikus C.altivelis yang  mengenali  antigen  general untuk transgenik antibodi untuk  benih unggul.

## Daftar Pustaka
Mahardika, K .Zafran, 2004. Infeksi  Iridovirus Pada  JuvenilKerapu  Bebek  (Cromileptes altivelis)  Di  Karamba  Jaring  Apung .
Balai  Besar  Riset  Perikanan  Budidaya Laut Gondol. Bali. Prosiding. Pengendalian  Penyakit    Pada  Ikan  Dan Udang berbasis Imunisasi Dan Biosecurity. Istiqomah, I., Isnasetyo, A., Triyanto, Nitimulyo,  K.  H.,  Murjani,  M.,  2006,
Pathogenicity  of Vibrio  fluvialis 24SK  in
Humpback  Grouper. Journal  of  Fisheries Science . Vol III. No. 1. P. 17-24 Wang,  X.H.,  Oon,  H.L.,  Ho,  G.W.P.,  Wong, W.S.F.,  Lim,  T.M.,  Leung,  K.Y.  1998. Internalization and cytotoxicity are importance  virulence  mechanisms  in vibrio-fish  epithelial  cell  interactions. Microbiology , 144, p. 2987-3002 Denkin, S.M., Nelson, D.R. 2004. Regulation of Vibrio  anguilarum  empA  Metalloprotease Expression  and  Its  Role  in  Virulence. Applied  and  Environmental  Microbiology , July. p.4193-4204. Yanuhar,  U.  2008. The  role  of  Haemagglutinin
Protein  as  Adhesin  Molecule  of  Fimbriae Vibrio  alginolyticus  That  Recognized  by Receptor  Membrane  Protein  of  Intestine Cromileptes altivelis Within Pathomechanism  Infection  of  Vibriosis. Pressented on International Seminar Management  Strategy  on  Animal  Health and Production Control in the Anticipation of Global  Warming  for  the  Achievement of  Millennium  Developmental  Goals, Surabaya Yanuhar, U., Sukoso, Sumarno, Widodo, M. A. 2006. Kajian  Molekuler  Faktor  Virulensi Bakteri  Dalam  Patomekanisme  Infeksi Vibrio  alginolyticus  Pada  Cromileptes
altivelis .  Pressented  on  Conference  of Indonesian  Aquaculture  ,  6-8  Juni  2006, Surabaya Sudhakar, P., and Subramani, P., 2006, Review: Mechanism of Bacterial Pathogenesis and Targets  for  Vaccine  Design .  St.  Peters’s Chemical  College,  Tamil  Nadu,  India,  P.
1-16
Sumarno,  Noorhamdani,  A.S.,  Samsul  Islam, Sjoekoer  M.  Dzen,  Ehara,  M,  dan
Ichinose,  Y.  1991. Purifikasi  protein hambatan  aglutinasi  Vibrio  cholerae  El Tor T79-6 . Majalah Kedok. Univ.
Brawijaya.Malang
Winarsih , S.,  Sumarno,  dan  Roekistiningsih. 1998. Fungsi  dan  sifat  immunogenitas protein  haemagglutinin  32  kDa  dan  20 kDa  pada  Helicobacter  Pylori .  Majalah
Kedokteran Universitas Brawijaya Malang
8:11-14
Beachy E.H. 1981.Bacterial adherence: adhesin- receptor  intewractions mediating  the attachment of  bacteria to mucosal  surface. Journal  Infect  Diseases ,  Mar;  143  (3): 325-45.