https://ppnp.e-journal.id/lutjanus_PPNP
Uji Viabilitas Bakteri Aeromonas hydrophila Dengan Metode Penyimpanan Beku Pada Media TSB dan Gliserol
Viability testing of Aeromonas hydrophila by freezing with glycerol in TSB Media
Seniati 1) , Rahmi Mulyani 1) , Syahruddin 1)
1 Jurusan Budidaya Perikanan, Politeknik Pertanian Negeri Pangkep
Article history: received October 5, 2020 Accepted Desember 6, 2020

## Keyword:
Viabilitas,  A.  hydrophila,  sifat  dan karakteristik . *Corresponding Author: seniatipasca@gmail.com
Abstrak: Bakteri A.  hydrophila merupakan  salah  satu  bahan  yang  sering digunakan dalam dunia pendidikan baik sebagai bahan praktikum maupun bahan penelitian, sehingga intensitas kebutuhannya sangat tinggi khususnya di  laboratorium  Kesehatan  Ikan,  Politeknik  Pertanian  Negeri  Pangkep. Oleh  karena  itu  perlu  dilakukan  penelitian  metode  penyimpanan A. hydrophila yang  tepat  sehingga  ketersediaannya  di  laboratorium  selalu berkesinambungan,  sifat  fisika  dan  kimianya  selalu  terjaga  dan kemungkinan  untuk  munculnya  strain  baru  lebih  kecil.  Penelitian  in bertujuan untuk mengetahui komposisi media TSB dan gliserol yang terbaik yang dapat mempertahankan kehidupan A. hydrophila yang disimpan pada pada  suhu  beku dalam  jangka  waktu  tertentu.  Penelitian  ini  berlangsung selama empat bulan di Laboratorium Kesehatan Ikan Politeknik Pertanian Negeri  Pangkep.    Metode  yang  digunakan  adalah  penyimpaan A. hydrophila dengan  menggunakan  media  TSB  dan  gliserol  dengan konsentrasi yang berbeda-beda (80% + 20%,  70% + 30% dan 60% + 40%). Pemantauan perubahan sifat sifat dan karakterisasi A. hydrophila dilakukan pada  awal  penyimpanan,  dua  minggu,  sebulan,  dua  bulan  dan  tiga  bulan umur  penyimpanan.  Hasil  yang  diperoleh  setelah  3  bulan  masa penyimpanan  menunjukkan  bahwa  penyimpanan  bakteri A.  hydrophila pada  media  70  %  TSB  yang  ditambahkan  gliserol  30%  dapat mempertahankan pertumbuhan bakteri dengan penurunan populasi terkecil dibandingkan  perlakuan  lainnya.    Disisi  lain,  bakteri A.  hydrophila dapat mempertahankan sifat dan karakteristiknya, yaitu tipe penggandengan sel, sifat pembentukan koloni dan sifat kimia selama masa penyimpanan.
Abstract: Aeromonas hydrophila bacteria is one of the materials often used in the learning process both as practical and research materials, where the intensity of  the bacteria requirement  is  very  high, particularly  in the  Fish Health Laboratory, Pangkep State Polytechnic of Agriculture. Therefore, it is  necessary  to  conduct  research  on  the  proper  storage  method  of A. hydrophila so that its availability in the laboratory is always sustainable, its physical and chemical properties are always maintained and the possibility of the emergence of new strains is smaller. This study aims to determine the best composition of TSB and glycerol media that can sustain the life of A. hydrophila stored  at  freezing  temperatures  for  a  certain  period.  This research  lasted  for  four  months.    The  method  used  was  the  storage of A. hydrophila using TSB and glycerol media at different concentrations (80% + 20%, 70% + 30% and 60% + 40%). Monitoring of changes in the
properties  and  characterization  of  A.  hydrophila  was  carried  out  at  the beginning of storage, two weeks, a month, two months, and three months of  storage.  The  results  obtained  after  3  months  of  storage  showed  that storage of A. hydrophila on 70% TSB media added with 30% glycerol was able  to  maintain  bacterial  growth  with  the  smallest  population  decline compared  to  other  treatments.  On  the  other  hand, A.  hydrophila can maintain their properties and characteristics, i.e., the type of cell coupling, the nature of colony formation, and chemical properties during the storage period.

## PENDAHULUAN
Bakteri Aeromonas hydrophila merupakan salah satu bakteri paling sering dijumpai dalam dunia perikanan, baik di perikanan air tawar, air payau maupun  air laut.  Bahkan bakteri ini merupakan salah satu bahan yang sering digunakan dalam dunia pendidikan baik sebagai bahan praktikum maupun bahan penelitian, sehingga intensitas kebutuhannya di laboratorium sangat tinggi.  Secara umum, bakteri A. hydrophila sangat mudah mengalami perubahan sifat dan karakteristik sehingga dapat memunculkan strain baru yang berbeda dengan aslinya. Oleh karena itu perlu melakukan koleksi, penyimpanan dan memelihara bakteri dengan tepat, baik untuk  kebutuhan  sehari-hari  di  laboratorium,  untuk  jangka  menengah  maupun  untuk  jangka panjang sehingga ketersediaannya di laboratorium selalu berkesinambungan, ciri-ciri genetik serta  viabilitasnya  akan  selalu  terjaga  dan  kemungkinan  untuk  munculnya  strain  baru  lebih kecil (Machmoed, 2001).
Penyimpanan  bakteri A.  hydrophila dengan  metode  yang  tepat  dapat  menjaga viabilitasnya (daya hidupnya), ciri-ciri genetiknya tetap stabil dan tidak berubah serta hemat biaya dan tenaga pemeliharaan.   Metode yang dipilih sangat tergantung pada sifat mikroba dan tujuan  preservasi.    Sifat  bakteri  secara  umum  dapat  diketahui  melalui  ciri-ciri  morfologi, fisiologi  dan  biokimia  serta  kemampuan  bakteri  dapat  bertahan  hidup  pada  lingkungan alaminya  maupun  pada  lingkungan  buatan.    Untuk  mempelajari  mikroorganisme  diperlukan pengetahuan  yang  komprehensif  tentang  biokimiawi  atau  aktivitas  metabolik  dari  mikrobia tersebut karena menurut Cánovas and Iborra (2003) sifat biokimiawi terkait dengan komposisi kimia, reaksi kimia dan karakteristik khas metabolisme yang terjadi pada jasad hidup tertentu sehingga dengan mengetahuinya dapat dieksplorasi manfaatnya.
Tujuan koleksi dan preservasi bakteri mencakup jangka pendek dan jangka panjang. Preservasi jangka pendek dilakukan untuk kepeluan rutin sehari-hari misalnya untuk kegiatan praktikum  mahasiswa  dan  kegiatan  penelitian.    Preservasi  jangka  panjang  dilakukan  dalam kaitannya  dengan  koleksi  dan  konservasi  jangka  panjang  plasma  nutfah  bakteri,  sehingga apabila  suatu  saat  diperlukan  dapat  diperoleh  kembali  sesuai  dengan  sifat  dan  karakteristik semula.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  komposisi  terbaik  media  TSB  dan  gliserol sebagai  media  penyimpanan  yang  dapat  mempertahankan  sifat  dan  karakteristik  bakteri A. hydrophyla yang  disimpan  pada  suhu  beku  dalam  jangka  waktu  3  bulan.    Hasil  penelitian diharapkan dapat bermanfaat bagi tenaga laboran dalam melakukan penyimpanan stock bakteri A.  hydrophila pada  suhu  beku  sehingga  ketersediaanya  di  laboratorium  selalu  terjaga  dan berkesinambungan.

## METODE
Preparasi dan Furifikasi bakteri A. hydrophila
Preparasi Bakteri A. hydrophila diregeneraikan pada media miring TSA selama 24-48 jam.    Kemudian  isolat  difurifikasi  beberapa  kali  menggunakan  media  TSA.    Pengamatan kemurnian  isolat  dilakukan  dengan  pewarnaan  isolat  bakteri.  Isolat  dikatakan  murni  apabila memiliki reaksi gram dan bentuk sel seragam.  Selanjutnya isolat A. hydrophila dikultur pada media  TSB  selama  24-48  jam.    Sebanyak  1.5  ml  dimasukkan  ke  dalam  mikrotube  lalu disentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 10.000 rpm.  Supernatan dibuang dan pellet ditambah  dengan  media  TSB  plus  gliserol  dengan  perbandingan  80%  TSB  +  20%  gliserol (Media  A),  70%  TSB  +  30%  gliserol  (Media  B)  dan  60%  TSB  +  40%  gliserol  (Media  C). Setiap perlakuan di buat dalam 5 mikrotube lalu kesemua mikrotube disimpan dalam freezer suhu -20 o C  dan secara periodik berawal dari sejak penelitian dimulai, dua minggu, sebulan, dua bulan dan tiga bulan penelitian berjalan  akan dilakukan analisa pembentukan morfologi sel dan koloni, sifat kimia sel, serta daya viabilitasnya.

## Pengamatan pembentukan morfologi sel dan koloni, sifat kimia sel, serta daya viabilitas
Pengamatan morfologi sel dengan melihat bentuk dan tipe penggandengan sel melalui pewarnaan bakteri. Pengamatan morfologi koloni dengan melihat warna, bentuk, penampakan permukaan dan penyebaran sel.  Pengamatan viabilitas dilakukan dengan metode Total Plate Count  (TPC)  melaui  seri  pengenceran  (SNI,  2008).  Pengujian  di  lakukan  dengan  cara mengambil 0.2ml kultur dari freezer selanjutnya di inokulasikan pada media TSB. Inkubasikan selama  24-48  jam  (suhu  37°C).  Selanjutnya  diambil  1ml  kultur  dan  dimasukkan  pada  9  ml akuades  steril  (nilai  pengenceran  10 -1 ),  diambil  1ml  dari  pengenceran  sebelumnya  dan dimasukkan pada 9 ml akuades steril (nilai pengenceran 10 -2 ). Pengenceran dilakukan hingga diperoleh nilai pengenceran 10 -6 . Dari pengenceran 10 -5 -10 -6 masing-masing diambil 1 ml dan diinokulasikan  pada  media  TSA  melalui  metode  pour  plate.  Plate  kemudian  diinkubasikan (suhu 37 °C; 24-48 jam).  Jumlah sel bakteri dihitung dengan rumus :
1 Jumlah koloni bakteri (cfu/ml) =. Jumlah koloni terhitung  x Faktor pengenceran
Kemampuan  bakteri  dalam  mempertahankan  kelulushidupannya  dinyatakan  sebagai viabilitas bakteri.  Pengamatan viabilitas, sifat dan karakter bakteri dilakukan pada 0 hari,  2 minggu, 4 minggu, 8 minggu dan 12 minggu masa penyimpanan.

## Analisis Data
Data morfologi sel, koloni bakteri, sifat kimia sel dan viabilitas bakteri A. hydrophila selama 4 bulan perlakuan dianalisa secara deskriptif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Morfologi sel dan koloni A. hydrophila Pengamatan morfologi sel A. hydrophila selama masa penyimpanan pada suhu  -20 o C menunjukkan bahwa bakteri A. hydrophila termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek  dan  type  penggandengan  selnya  menyebar  secara  haploid.    Pengamatan  morfologi koloni  bakteri A.  hydrophila dengan  komposisi  media  TSB  dan  gliserol  yang  berbeda-beda menunjukkan bahwa penyimpanan hingga bulan kedua tidak menunjukkan perbedaan, namun pada bulan ketiga terjadi perubahan pada penyebaran koloni pada komposisi media A dan C. Koloni terlihat berkumpul atau bergerambol sehingga cenderung terbentuk koloni berukuran besar.    Berbeda  dengan  komposisi  media  B  yang  tetap  sama  dengan  media  kontrol,  dimana koloni tetap menyebar secara  haploid di seluruh permukaan media TSA.  Hasil pengamatan morfologi koloni selama masa penyimpanan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1.  Pengamatan morfologi koloni bakteri A.hydrophila
No. Kode Perlakuan Waktu pengamatan 0 hari 2 minggu 4 minggu 8 minggu 1 A (80% TSB + 20% gliserol) Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Beberapa koloni berkumpul, berwarna krem , bentuk bundar dan permukaan cembung dan mengkilap, 2 B  (70% TSB + 30% gliserol) Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Koloni menyebar secara haploid, berukuran agak besar, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. 3 C  (60% TSB + 40% gliserol) Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Beberapa koloni berkumpul, berwarna krem , bentuk bundar dan permukaan cembung dan mengkilap. 4 Media TSB (kontrol) Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Koloni menyebar secara haploid, berwarna  krem , mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung. Koloni menyebar secara haploid, berukuran agak besar, berwarna  krem ,
mengkilap, bentuk bundar dan permukaan cembung.
Sifat kimia sel A. hydrophila Pengamatan sifat  kimia sel A. hydrophila selama masa penyimpanan dapat terlihat pada Tabel 2.
Tabel 2.  Sifat kimia A. hydrophila selama penyimpanan No . Perlakuan Waktu Pengamatan Reaksi Gram KOH 3% Katalase Oksidase Motil Indol Ornithin O/F 1 A (80% TSB + 20% gliserol) 0    hari Gram - - + + + - + F 2  minggu Gram - - + ++ + - + F 4  minggu Gram - - + ++ + - + F 12  minggu Gram -   - lemah + + + - + F lemah 2 B (70% TSB + 30% gliserol) 0    hari Gram - - + + + - + F 2  minggu Gram - - + + + - + F 4  minggu Gram - - + + + - + F 12  minggu Gram - - + + + - + F lemah 3 C (60% TSB + 40% gliserol) 0    hari Gram - - + + + - + F 2  minggu Gram - - + + + - + F 4  minggu Gram - - + + + - + F 12  minggu Gram -   - lemah + + + - + F lemah 4 TSB (Kontrol) 0    hari Gram - - + + + - + F 2  minggu Gram - - + + + - + F 4  minggu Gram - - + + + - + F 12  minggu Gram - - + + + - + F lemah
Pengamatan  sifat  kimia  selama  penelitian  berlangsung  menunjukkan  bahwa  pada bulan ketiga masa penyimpanan mulai terjadi perubahan sifat kimia khususnya pada uji KOH 3%,  uji  Oksidase  dan  uji  Oksidatif/Fermentatif  (OF).    Pengujian  KOH  3%  menghasilkan sedikit lendir, sangat berbeda dengan jumlah lendir pada uji KOH 3% di bulan pertama dan kedua.  Kurangnya lendir pada uji KOH disebabkan karena berkurangnya lemak pada dinding sel bakteri A. hydrophyla .  Secara teoritis gram (+) memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang  tipis  sedangkan  gram  (-)  berlemak  tebal  dan  berdinding  sel  tipis  yang  berada  di  ruang periplasma. KOH akan menyerang lemak (bilayer lipid) ini dan membuat sel gram (-) pecah. Pecahnya sel melepaskan materi genetik (DNA) yang merupakan substansi melimpah di dalam sel bakteri. Molekul DNA sangat panjang bersifat sticky strings (menyerupai lendir, getah atau dapat  berarti  lengket)  yang  memberikan  hasil  seperti  lendir  saat  diangkat  dengan  jarum inokulum (Edwin, 2011).
Perubahan  kedua  adalah  pada  uji  OF  dengan  menggunakan  media  OF  membentuk warna kuning lemah.  Sangat berbeda dengan warna kuning terang yang terbentuk pada 1 dan 2 bulan masa penyimpanan.   Perubahan media OF menjadi sedikit kuning diasumsikan sebagai F lemah.  Hal ini menunjukkan adanya perubahan sifat kimia A. hydrophila mulai pada bulan ke-3 masa penyimpanan, khususnya pada uji KOH dan uji O/F.
Viabilitas Bakteri A. hydrophila
Viabilitas  bakteri  merupakan  kemampuan  bakteri  untuk  tetap  bertumbuh  dan berkembang.  Menurut Machmoed (2001), tujuan dilakukan preservasi adalah untuk menahan laju  aktivitas  metabolisme  mikroba  sehingga  viabilitas  atau  daya  tumbuhnya  dapat
- 50 100 150 200 250 0 2 4 8 12 A B C Linear (A) Linear (A) Lama penyimpanan P opu la si A. h yd rop h yl a (C P U /ml ) Juta
dipertahankan dan juga untuk memelihara isolat mikroba sehingga mempunyai recovery (daya tumbuh  kembali)  dan  kelangsungan  hidup  yang  tinggi  dengan  perubahan  karakter  yang minimum.  Salah  satu  metode  preservasi  yang  sering  dilakukan  adalah  penambahan  gliserol pada  media  tumbuh  untuk  mempertahankan  viabilitas  bakteri.  Advinda,  dkk.  (2015), menyatakan bahwa dengan penambahan gliserol pada penyimpanan suhu beku mempengaruhi viabilitas Pseudomonas fluorescens dalam bahan pembawa alginat pada 14 hari, 28 hari dan 42 hari masa inkubasi.
Hasil  viabilitas  bakteri A.  hydrophila selama  penyimpanan  memperlihatkan pertumbuhan A. hydrophila semakin menurun.  Penurunan pertumbuhan sel  terendah terjadi pada  perlakuan  B,  kemudian  perlakuan  A  dan  penurunan  pertumbuhan  sel  tertinggi  pada perlakuan C.  Pada suhu kamar, jumlah sel yang optimum sebesar 1,7 x 10 8 cfu/mL sedangkan pada  suhu  -20 o C    jumlah  sel  1,3  x  10 5 cfu/mL  setelah  disimpan  selama  3  bulan.    Hal  ini dikarenakan suhu dapat menyebabkan lambatnya pertumbuhan.  Laju pertumbuhan bakteri A. hydrophila dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Grafik pertumbuhan bakteri A. hydrophila selama penyimpanan pada suhu -20 o C
Penurunan  pertumbuhan  bakteri  terendah  pada  perlakuan  B,  menunjukkan  bahwa  perlakuan tersebut  dapat  mempertahankan  populasi  bakteri  lebih  baik  dibandingkan  perlakuan  lainnya hingga 3 bulan. Penurunan pertumbuhan bakteri yang rendah dapat terjadi apabila kandungan nutrisi  yang  ada  pada  media  terpenuhi.    Komposisi  70%  TSB    pada  perlakuan  B  mampu menyediakan  cadangan  nutrisi  yang  cukup  bagi  bakteri A.  hydrophila selama  penyimpanan beku  berlangsung.    Nutrisi  yang  ada  pada  media  tersebut  digunakan  sebagai  energi  untuk memenuhi  pembentukan  dinding  sel  bakteri  menjadi  lebih  baik,  energi  yang  ada  dalam  sel tersebut  digunakan  untuk  melakukan  metabolisme  (Jarod,  2015).    Media  TSB  mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya  menjadi  media  bernutrisi  untuk  bermacam  mikroorganisme.  Dextrosa  adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik (Anonim, 2014). Perbedaan  pertumbuhan  pada  tiap  media  dimungkinkan  karena  adanya  perbedaan  dari
kemampuan  bakteri  dalam  menyerap  nutrisi  yang  ada  pada  media  tumbuhnya  untuk  proses pertumbuhan dan metabolismenya. Murwantoko (2008), menyatakan bahwa tidak ada teknik penyimpanan  yang  bisa  merecovery  100%  bakteri  yang  disimpan.  Metode  penyimpanan menghasilkan  tingkat  recovery  yang  berbeda-beda,  tergantung  pada  spesies  bakteri  yang disimpan.
Perbedaan  laju  pertumbuhan  disebabkan  oleh  banyak  faktor  antara  lain  tipe  dan  jenis bakteri itu sendiri maupun kemampuan bakteri tersebut dalam menggunakan nutrisi yang ada pada  media  serta  aktivitas  enzim  yang  dihasilkan.  Penyimpanan  yang  dilakukan  masih tergolong jangka pendek dan menengah yaitu 1 minggu hingga 3 bulan.  Untuk penyimpanan jangka  panjang  bisa  mencapai  1  tahun.    Penelitian  lain  menunjukkan  bahwa  untuk penyimpanan jangka panjang memerlukan metode liofilisasi atau kering beku (liophylization atau  freeze  drying)  dan  kriopreservasi  (cryopreservation  atau  cryogenic  preservation) (Badjoeri, 2010; Machmoed, 2001).
Selain  itu,  kemungkinan  komposisi  30  %  gliserol  paling  mampu  mencegah pengumpulan molekul-molekul air dan kristalisasi es pada titik beku larutan. Gliserol juga akan memodifikasi kristal es yang terbentuk di dalam medium pembekuan sehingga menghambat kerusakan  sel  secara  mekanis.    Gliserol  memiliki  daya  larut  yang  tinggi  dengan  media  cair triptic soy broth (TSB) walaupun pada kondisi suhu dingin, memiliki daya penetrasi sampai ke dalam  sel  dan  memiliki  daya  toksisitas  yang  rendah.  Menurut  Herdis  dkk.  (2003),  gliserol mampu mencegah pengumpulan molekul-molekul air dan kristalisasi es pada titik beku larutan. Gliserol  juga  akan  memodifikasi  kristal  es  yang  terbentuk  di  dalam  medium  pembekuan sehingga menghambat kerusakan sel secara mekanis.
Gliserol adalah senyawa bahan kimia dengan rumus kimia HOCH2CH(OH)CH2OH, tidak berwarna, tidak berbau dan berupa cairan kental dengan titik leleh 18ºC dan titik didih 290ºC, sering digunakan pada formula obat-obatan. Gliserol sering juga disebut glycerin atau glicerine,  bermassa  jenis  1,1261,  berasa  manis  dengan  kadar  racun  rendah.  Gliserol  dapat mencegah  pengumpulan  molekul-molekul  air  dan  kristalisasi  es  pada  titik  beku  larutan. Gliserol, seperti banyak zat lain yang memiliki sifat antibeku, benar-benar larut sebagai cairan tetapi  bercampur  dalam  fase  padat.  Bakteri  tertentu  dapat  dibekukan  dengan  penambahan gliserol tanpa mengalami kerusakan (Rojas-Tapias, et. al ., dalam Lela, dkk.,  2016) Gliserol  pada  umumnya  digunakan  sebagai  media  dalam  pengawetan  atau penyimpanan  jangka  panjang  atau  sekedar  sebagai  media  untuk  memindahkan mikroorganisme.    Gliserol  dapat  digunakan  sebagai  media  karena  gliserol  dapat  melindungi aktivitas  antimikroba  dengan  cara  meningkatkan  stabilitas  struktur  protein  asli  dari  mikroba sehingga dapat mencegah protein dari proses termal dan agregasi (Ariwulan, 2013).  Gliserol secara luas telah dikenal dan dimanfaatkan sebagai cryoprotectant sel bakteri melalui meode simpan  beku  ( freezing  storage )  karena  mampu  meminimalisir  efek  larutan  yang  dapat menyebabkan terbentuknya kristal es dalam sel.

## KESIMPULAN
Kesimpulan  yang  dapat  diambil  dari  hasil  penelitian  penyimpanan  bakteri A. hydrophila pada media 60% TSB + 40% Gliserol, 70% TSB + 30% Gliserol  dan 80% TSB + 20% Gliserol adalah sebagai berikut:
1. Sifat  fisika  bakteri A.  hydrophila selama  3  bulan  penyimpanan  pada  suhu  -20 o C  tidak mengalami perubahan fisik.
2. Perubahan sifat kimia terjadi pada bulan ketiga masa penyimpanan,  yaitu hasil uji oksidase menunjukkan  kemampuan  bakteri  untuk  melakukan  oksidase  mulai  melemah  yang ditandai    warna  biru  muda  pada  strip  sitokrom,  dan  hasil  uji  oksidatif/fermentative
menunjukkan  bahwa  sifat  fermentatif  bakteri  sangat  lemah  yang  ditandai  dengan perubahan warna media OF menjadi sedikit kuning (lemah).
3. Viabilitas  bakteri A.  hydrophila dengan  penurunan  terkecil  diperolah  pada  komposisi media 70% TSB + 30% Gliserol pada penyimpanan suhu -20 o C.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim.  2014.  Media  Pertumbuhan  Mikroba.  www.asalkamutahuaja.  bolgspot.com.Diakses tanggal20 Pebruari 2014.
Advinda L., Fifendy, M., In'am, K. 2015.  Penambahan Gliserol Pada Bahan Pembawa Alginat Sebagai  Penstabil  Pertumbuhan  Bakteri  Pseudomonas  Berfluoresen.    Prosiding Semirata 2015 bidang MIPA BKS-PTN Barat Universitas Tanjungpura Pontianak Hal 87 – 94.
Ariwulan,  D.R.  2013.  Metode  Penyimpanan  Mikroba.  http://nightray13-kuro.blog- spot.com/2013/01/boiteknologireviewtugas2.html.Diakses tanggal 4 Nopember 2013 Badjoeri, M. 2010.  Preservasi Mikroba untuk Pelestarian dan Stabilitas Plasma Nutfah.Warta Limnologi Tahun XXIII No. 45: 1-9.
Edwin.  2011 .  Materi  Kuliah  Mikrobiologi .  Universitas  Lambung  Mangkurat,Banjar  baru. Diakses pada tanggal 1 november 2014
Herdis,  KusumaI.,  M.  Surachman,  R.E..2003.    Optimalisasi  Kualitas  Semen  Beku  Domba Garut dengan Pemberian Glyserol.Prosiding SeminarTeknologi untuk Negeri, Vol II. Bogor.
ISO  6887-1:  1999.  Microbiology  of  food  and  animal  feeding  stuffs  –  preparation  of  test samples,  initial  suspension  and  decimal  dilutions  for  microbiological  examination  – Part 1: General rules for the preparationof the initialsuspension and decimal dilution. Jarod S, Johan T.I, Widantari, M. 2015.  Pengaruh Gliserol Pada Media Tryptic Soy Broth (Tsb) Terhadap  Viabilitas  Bakteri Aeromonas  Hydrophila. Jurnal  Dinamika  Pertanian Volume XXX Nomor 1 April 2015 (83 - 91).
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Penerbit Rajawali Press. Jakarta. hlm 75 SNI 2897. 2008. Sisni. Bsn .go. id / index. php / SNI_main / SNI / detail_SNI / 7779 Machmoed, M. 2001. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikrobia.Buletin AgriBio. (4): 24-32.
Murwantoko. 2008. Preservasi Bakteri. Pelatihan Metode Standar Pemeriksaan HPIK. 21-26 April 2008. Yogyakarta.
Lela, S., Purnomo, ES.  2016.  Viabilitas Sel Bakteri Dengan Cryoprotectant Agents Berbeda (Sebagai Acuan Dalam Preservasi Culture Collection di Laboratorium Mikrobiologi). Available online http://journal.uin-alauddin.ac.id/index.php/biogenesis . Vol 4, No. 1, Juni 2016, hal 34-40