Abstrak — Fosfat  tersedia  di  dalam  tanah  diperlukan  oleh tanaman.  Fosfat  terlarut  dapat  disediakan  oleh  mikroorganisme melalui  sekresi  asam  organik  atau  secara  enzimatik  dengan fosfatase. Beberapa anggota genus Azotobacter dapat melarutkan fosfat, namun  belum  diketahui apakah secara  konsorsium  dapat menghasilkan  enzim  fosfatase.  Skrining Azotobacter penghasil fosfatase  dilakukan  dengan  medium  agar  minimal  (MM)  yang dimodifikasi  dengan  penambahan  p-nitrofenol  fosfat  (pNPP) sebagai  sumber  fosfat.  Subkultur  isolat  menggunakan  MM broth.  Konsorsium Azotobacter A1b,  A3,  A6,  A9,  dan  A10 mampu memproduksi enzim fosfatase.
Kata Kunci — Aktivitas Enzim, Fosfatase, Azotobacter , p-NPP.

## I. PENDAHULUAN
OSFOR  (P) merupakan  elemen  penting  yang  tergolong dalam  makronutrien  yang diperlukan oleh tanaman dalam jumlah  banyak  [1].  Ketersediaan  P  dalam  tanah  pada umumnya  rendah.  Hal  ini  disebabkan  P  terikat  menjadi  Fe- fosfat  dan  Al-fosfat  pada  tanah  masam  dan  Ca3(PO)4  pada tanah basa [2]. Tanaman tidak dapat menyerap P dalam bentuk terikat  sehingga  harus  dirubah  menjadi  bentuk  tersedia  bagi tanaman (H 2 PO 4 - , HPO 4 2- , dan PO 4 2- ) [3]. Bakteri tanah dapat berperan  melarutkan  P  terikat,  melalui  sekresi  asam  organik [4] dan produksi enzim fosfatase [5].
Bakteri  tanah  seperti  bakteri  pelarut  fosfat  memiliki kemampuan  melarutkan  P  terikat  menjadi  P  terlarut  yang dibutuhkan  oleh  tanaman.  Bakteri  tanah  yang  diketahui memiliki  kemampuan  tersebut  salah  satunya  adalah  genus Azotobacter [6]. Mikroba tanah menghasilkan enzim fosfatase basa dalam lingkungan basa dan sebaliknya akan menghasilkan  enzim  fosfatase  asam  dalam  lingkungan  asam [7].  Enzim  fosfatase  bertanggung  jawab  dalam  proses hidrolisis  P  terikat  menjadi  P  terlarut  yang  tersedia  bagi tanaman  [2].  Aktivitas  enzim  fosfatase  dapat  ditentukan dengan  penggunaan  fosfat  hasil  mineralisasi  esterfosfat organik  alami  atau  komponen  organik  buatan  seperti  p- nitrofenol fosfat (pNPP) sebagai substrat. Penggunakan pNPP sebagai  substrat  akan  menginduksi  produksi  fosfatase  serta mengindikasikan  kemampuan  hindrolisis  P  terikat  oleh fosfatase [8].
Pada  penelitian  sebelumnya  [9]  telah  didapatkan  potensi Azotobacter A1b, A3, A6, A9, dan A10 dari lahan Eco Urban Farming secara individual dan konsorsium mampu melarutkan fosfat  sebesar  199,2-226,9  ppm.  Namun,  pelarutan  fosfat tersebut belum diteliti potensinya secara sekresi asam organik atau enzimatis.
Berdasarkan  penjelasan  diatas,  diperlukan  penelitian  lanjut apakah  secara  konsorsium  dapat  menghasilkan  enzim fosfatase yang berfungsi melarutkan fosfat.

## II. METODOLOGI PENELITIAN

## A. Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada bulan Januari hingga Juni 2017 di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan Biologi, Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya.

## B. Cara Kerja
Penelitian  ini  terdiri  atas  dua  tahapa  skrining  isolat Azotobacter menghasilkan  fosfatase  dan  kurva  pertumbuhan. Tahapan tersebut dijelaskan sebagai berikut:
1. Skrining Isolat Azotobacter Menghasilkan Fosfatase Isolat Azotobacter diinokulasikan  secara  aseptis  dalam medium  minimal  (MM)  agar  yang  telah  dimodifikasi  sengan komposisi:  potasium  dihidrogen  fosfat  (KH 2 PO4)  0,3  gram, disodium  hidrogen  fosfat  (Na 2 HPO 4 )  0,6  gram,  ammonium klorida  (NH 4 Cl)  0,2  gram,  sodium  klorida  (NaCl)  0,5  gram, magnesium  sulfat  heptahidrat  (MgSO 4 .7H2O),  glukosa,  agar 1,5 gram dan dilarutkan dalam 100 ml akuades [10]. Inokulasi isolat  dilakukan  dengan  menggunakan  jarum  ose  secara aseptis dengan metode streak continue , diinkubasi dalam suhu ruang  selama  24  jam  [11].  Pertumbuhan  isolat  pada  bekas goresan  menunjukkan  indikasi  isolat  mampu  menghasilkan enzim fosfatase.
2. Kurva Pertumbuhan
Medium  yang  digunakan  adalah  medium  minimal  (MM) cair  yang  telah  dimodifikasi  dengan  komposisi:  potasium dihidrogen  fosfat  (KH 2 PO4)  0,3  gram,  disodium  hidrogen fosfat  (Na 2 HPO 4 )  0,6  gram,  ammonium  klorida  (NH 4 Cl)  0,2 gram,  sodium  klorida  (NaCl)  0,5  gram,  magnesium  sulfat heptahidrat  (MgSO 4 .7H2O),  glukosa,  dan  dilarutkan  dalam 100 ml akuades [10]. Selanjutnya 5 ml konsorsium isolat (A3, A9,  dan  A10)  ditambahkan  dalam  medium  minimal  cair sebanyak 585 mL. Semua kultur diinkubasi pada rotary shaker (100  rpm)  selama  48  jam  dan  dilanjutkan  pengamatan kepadatan  sel  dengan  spektrofotometri  panjang  gelombang 600 nm selama 48 jam [11].

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Skrining Isolat Azotobacter Pada Medium Minimal
Kelima  isolat  tunggal Azotobacter A1b,  A3,  A6,  A9,  dan A10  mampu  tumbuh  dalam  medium  minimal  modifikasi (Tabel 1). Kemampuan isolat tumbuh dalam medium minimal mengindikasikan  isolat  mampu  menghasilkan  fosfatase. Selanjutnya isolat A3, A9, dan A10 dikonsorsiumkan. Seleksi terhadap ketiga isolat didasarkan pada pengamatan [9].

## Skrining Konsorsium Azotobacter Penghasil Fosfatase
Rachma Shouma Annisa dan Enny Zulaika Departemen Biologi, Fakultas Ilmu Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS)
e-mail : enny@bio.its.ac.id
F
Tabel 1. Hasil uji positif fosfatase isolat tunggal Azotobacter dalam medium minimal modifikasi No Isolat Azotobacter Tumbuh 1. A1b + 2. A3 +++ 3. A6 + 4. A9 +++
5. A10 +++
Gambar.  1.  Hasil  uji  positif  fosfatase  isolat  tunggal Azotobacter dalam medium minimal modifikasi.
Pengkonsorsiuman dilakukan untuk meningkatkan kemampuan Azotobacter dalam memproduksi enzim fosfatase. Pada penelitian [9], ketiga isolat tunggal Azotobacter A3, A9, dan  A10  bersifat  sinegisme  sehingga  ketiga  isolat  tersebut diharapkan dapat tumbuh bersama untuk menghasilkan enzim fosfatase.

## B. Kurva Pertumbuhan Azotobacter
Pengamatan  kurva  pertumbuhan Azotobacter dilakukan selama  48  jam  untuk  mengetahui  fase  eksponensial. Pengamatan kurva pertumbuhan dilakukan untuk  menentukan umur  starter  bakteri  yang  digunakan  dalam  memproduksi enzim  fosfatase,  fase  yang  digunakan  untuk  umur  starter adalah  rata-rata  dari  eksponensial  awal  dan  akhir.  Kurva pertumbuhan  akhir  yang  dihasilkan,  menunjukkan  adanya  3 fase  pertumbuhan  yaitu  fase  lag,  fase  eksponensial,  dan  fase stasioner.  Pada  jam  ke-0  hingga  jam  ke-2  terlihat  isolat memasuki fase lag. Selanjutnya pada jam ke-4 hingga jam ke- 42  fase  pertumbuhan  yang  terlihat  adalah  eksponensial. Sedangkan, pada jam ke-44 hingga jam ke-48 isolat memasuki fase stasioner.
Pada pengamatan, fase lag terlihat dikarenakan bakteri yang sebelumnya tumbuh dalam medium kaya nutrisi yaitu Nutrient Broth (NB) diinokulasikan kedalam medium yang mengandung  sedikit  nutrisi  yaitu  medium  minimal  (MM). Perbedaan lingkungan hidup menyebabkan bakteri membutuhkan  waktu  lebih  untuk  beradaptasi  dengan lingkungan  yang  baru.  Pada  fase  lag,  bakteri  akan  memulai sintesis protein, ko-enzim, dan vitamin yang dibutuhkan untuk pertumbuhannya [12].
Selanjutnya pertumbuhan bakteri memasuki fase eksponensial  yaitu  fase  pembelahan  sel  yang  berlangsung secara  cepat  karena  adanya  peningkatan  aktivitas  metabolism dan  replikasi  DNA  [12].  Pasa  fase  eksponensial  sel berkembang  secara  optimum.  Fase  salanjutnya  merupakan fase  stasioner  yaitu  fase  dimana  metabolisme  bakteri  mulai melambat  dan  diikuti  dengan  melambatnya  pembelahan  sel. Perubahan dalam fase ini terjadi akibat perubahan lingkungan yang disebabkan kepadatan sel yang tinggi [13].
Pada  fase  stasioner  terjadi  akumulasi waste  materials , senyawa metabolit yang bersifat toksik, dan senyawa inhibitor
seperti  antibiotik  di  dalam  medium  [12].  Pada  pengamatan tidak terlihat adanya fase kematian, karena pengamatan hanya dilakukan  sampai  dengan  48  jam,  sehingga  fase  kematian tidak  didapatkan.  Selain  itu,  kemampuan Azotobacter dalam memfiksasi  nitrogen  bebas  menyebabkan  kebutuhan  nitrogen tidak terbatas dalam medium sehingga isolat dapat tetap hidup dengan  cara  memperpanjang  fase  stasioner  meskipun  sumber nitrogen dalam medium sudah habis [9].
Fase  pertumbuhan  yang  didapat,  dijadikan  landasan  dalam menentukan starter untuk produksi enzim fosfatase. Penentuan starter  diambil  dari  kultur  pada  fase  eksponensial,  yaitu  pada jam  ke  20.  Starter  yang  berada  pada  fase  eksponensial dianggap  paling  optimal  untuk  produksi  enzim  fosfatase, karena selama fase eksponensial terjadi peningkatan massa sel dan  massa  sitoplasma,  pertumbuhan  dan  pembelahan  sel bakteri  juga  mengalami  peningkatan  yang  cepat  dengan doubling time kurang dari 20 menit [13].

## IV. KESIMPULAN
Isolat Azotobacter A1b,  A3,  A6,  A9,  dan  A10  mampu menghasilkan fosfatase. Kemampuan tumbuh isolat menghasilkan  fosfatase  tertinggi  adalah  A3,  A9,  dan  A10. Konsorsium Azotobacter A3,  A9,  dan  A10  mampu menghasilkan enzim fosfatase.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  I.  Mardad,  S.  Aurelio,  and  S.  Abdelaziz, “ Solubilization  of  Inorganic Phosphate and Production of Organic Acids By Bacteria Isolated from A Moroccan Mineral Phosphate Deposit, ” African J. Microbiol. Res. , vol. 7, no. 8, pp. 626 – 635, 2013.
[2]  L. Lal, Phosphate Biofertilizers . Agrotech Publication Academy, 2002.
[3]  Suliasih  and  Rahmat, “ Aktivitas  Fosfatase  dan  Pelarut  Kalsium  Fosfat oleh beberapa Bakteri Pelarut Fosfat, ” J. Biodiversitas , vol. 8, no. 1, pp. 23 – 26, 2006.
[4]  J.  Cunningham  and  C.  Kuiack, “ Production  Of  Citric  And  Oxalic  Acid And  Solubilization  Of  Calsium  Phosphate  By  Penicillium  bilail, ” Appl. Environ. Microb. , vol. 58, pp. 1451 – 1458, 1992.
[5]  P.  Ponmurugan  and  C.  Gopi, “ Distribution  Pattern  and  Screening  of Phosphate Solubilizing Bacteria Isolated from Different Food and Forage Crops, ” J. Agron. Asian Netw. Sci. Inf. , vol. 5, no. 4, pp. 600 – 604, 2006. [6]  D.  J.  Jimenez,  J.  S.  Montana,  and M.  M.  Martinez, “ Characterization  of Free  Nitrogen  Fixing  Bacteria  Of  The  Genus  Azotobacter  In  Organic Vegetable  Grown  Colombian  Soil, ” Brazilian  J.  Microbiol. ,  vol.  42,  pp. 846 – 858, 2011.
[7]  N.  Widawati  and  S.  S.  Arif,  I  Made, “ Aktivitas  Pelarut  Fosfat  oleh Aktinomisetes  yang  Diisolasi  dari  Waigeo,  Kepulauan  Raja  Ampat, Papua Barat, ” J. Biodiversitas , vol. 9, no. 2, pp. 87 – 90, 2008.
[8]  M.  A.  Tabatabai, Methods  of  Soil  Analysis:  Soil  Enzyme .  USA: Wisconsin, 1982.
[9]  R.  Irawan  and  E.  Zulaika, “ Potensi  Konsorsium  Azotobacter  untuk Meningkatkan  Ketersediaan  Fosfat  di  Dalam  Tanah, ” Institut  Teknologi Sepuluh Nopember, 2016.
[10] M.  Mahesh,  R.  Somashekhar,  B.  Preenon,  and  E.  T.  Puttaiah, “ Optimization  for  the  Production  of  Extracellular  Alkaline  Phosphatase from  Proteus  mirabilis, ” J.  Bioproces  Biotech ,  vol.  5,  no.  3,  pp.  1 – 5, 2015.
[11] J.  P.  Harley  and  L.  M.  Prescott, Laboratory  Exercises  in  Microbiology . USA: Mc Graw Hill, 2002.
[12] M. D. Rolfe et al. , “ Lag Phase Is a Distinct Growth Phase That Prepares Bacteria  for  Exponential  Growth  and  Involves  Transient  Metal Accumulation, ” Int. J. Bacteriol. , vol. 194, no. 3, pp. 686 – 701, 2012. [13] P. Bhattacharya and R. K. Jain, “ Phosphorus Solubilizing Biofertilizers In Whirlpool of Rock Phosphate Challenges & Opportunities, ” J. Plant , vol. 45, no. 10, pp. 45 – 72, 2000.