Menara Perkebunan , 2006 74(2), 52-61.
Identifikasi homolog TcAGL-15 untuk penanda embriogenesis tanaman kakao
Identification of TcAGL-15 homolog  for embryogenesis marker of cacao plant
Oktaviany Ferry TRIASTANTO 1 ,  Muhammad JUSUF 1 & Djoko SANTOSO 2*)
1) Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor, Indonesia
2) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia

## Summary
One of the major problems encountered in micropropagation  of  cacao  through  tissue culture  is  very  low  frequency  of  embryo formation.  Embryogenesis  is  believed  to  have key  regulatory  gene  determining  the  process. Understanding  such  gene  may  help  to  solve problems  in  the  regeneration  process.  One  of the  genes  reported  to  involve  in  the embryogenesis  is AGAMOUS-like  15 ( AGL- 15 ).  This  gene  has  an  important  role  in  the regulation  of  early  embryogenesis  in  several plants. This experiment aimed to identify AGL- 15 homolog  in  cacao  through  bioinformatics approach. The first step of this experiment is to identify  the AGL-15 homolog  using  hetero- logous  primers  from  DNA  genomic  isolated from  leaves  of  cacao  plants.  The  sequence  of the AGL-15 fragment  was  used  in  designing specific  primers  for  longer AGL-15 fragment. These primers were then used to identify AGL- 15 gene using total RNA isolated from cultured zygotic  embryos.  Differential  pattern  of AGL- 15 gene  expression  was  observed  in  zygotic embryos  cultured  for  five  weeks. AGL-15 heterologous  primers  designed  from  several plants could be used to identify cacao AGL-15 homolog.  The  putative  cacao AGL-15 gene could  be  identified  from  zygotic  embryos.  The differential  pattern  of  the AGL-15 gene expression  up  to  five  weeks    is  a  strong indication  that AGL-15 can  be  used  as  an embryogenesis marker in cacao plants.
[ Keywords: Theobroma cacao, embryogenesis, AGAMOUS  -  LIKE gene,      bio- informatics]

## Ringkasan
Salah  satu  kendala  perbanyakan  kakao melalui  kultur  jaringan  adalah  rendahnya frekuensi  pembentukan    embrio,  yang  diduga melibatkan  satu  atau  lebih  gen  kunci  yang menentukan  proses  tersebut.  Keberhasilan mengidentifikasi  gen-gen  kunci  akan  mem- bantu menyelesaikan masalah dalam regenerasi embrio  kakao.  Salah  satu  gen  yang  diduga terlibat  dalam  proses  ini  adalah AGAMOUS- like  15 ( AGL-15 ).  Gen  ini  berperan  pada regulasi  selama  masa  awal  perkembangan embrio  beberapa  tanaman.  Penelitian  ini  ber- tujuan  untuk  mengidentifikasi  homolog AGL- 15 pada  kakao  melalui  pendekatan  bioinfor- matika dan RT-PCR. Penelitian diawali dengan identifikasi  homolog AGL-15 dari  DNA genomik  daun  kakao  menggunakan  primer heterologus. Sekuen fragmen homolog AGL-15 yang  diperoleh,  kemudian  digunakan  untuk merancang  primer  spesifik AGL-15 yang berukuran lebih panjang. Primer ini selanjutnya digunakan untuk mengidentifikasi gen AGL-15 dari  RNA  total  embrio  zigotik.  Pengamatan pola pita gen AGL-15 dilakukan pada kultur in vitro embrio  zigotik  yang  berumur  lima minggu.  Primer  heterologus  gen AGL-15 yang berasal  dari  berbagai  tanaman,  mampu  meng- identifikasi keberadaan homolog  gen  tersebut pada tanaman   kakao. Fragmen homolog AGL- 15 putatif  tanaman  kakao  teridentifikasi  pada tingkat  RNA  embrio.  Dengan  adanya  pola diferensial  dari  ekspresi  gen AGL-15 hingga lima  minggu  pertama  perkembangan  embrio, ada  indikasi  kuat  bahwa  fragmen  homolog AGL-15 dapat  menjadi  penanda embriogenesis pada tanaman kakao.
*) Penulis korespondensi
Triastanto et al .

## Pendahuluan
Kakao  ( Theobroma  cacao L)  me- rupakan  salah  satu  komoditas  perkebunan dan perdagangan serta sumber penerimaan devisa  negara  yang  cukup  penting.  Data pada  tahun  2003,  devisa  yang  dihasilkan dari komoditas ini mencapai US$ 701 juta. Dengan total produksi sekitar 572.640 ton dari  total  area  917.000  Ha,  Indonesia termasuk dalam tiga besar produsen kakao dunia  bersama  Ghana  dan  Pantai  Gading (Direktorat Jenderal Bina Produksi Perkebunan, 2004).
Berbagai permasalahan yang dihadapi dalam  budidaya  kakao  antara  lain  adalah hama  penggerek  buah  kakao,  layu  pentil, kualitas  biji  yang  rendah  dan  regenerasi embrio  melalui  kultur  jaringan.  Usaha perbanyakan kakao melalui kultur jaringan untuk  memperoleh  tanaman  klonal  telah dilakukan  namun  masih  menemui  banyak kendala.  Berbagai  macam  eksplan  seperti kelopak  bunga,  staminode  dan  daun  telah diuji  namun  belum  berhasil  dengan  baik. Kendala  yang  sering  dijumpai  antara  lain inisiasi kalus dan  embryogenesis.  Terben- tuknya  senyawa  fenolik  teroksidasi  dan lendir  yang  sangat  cepat,  menghambat proses  diferensiasi.  Demikian  juga  repro- dusibilitas prosedur dan kondisi regenerasi tergolong  sangat  rendah  (Tahardi  & Mardiana,  1995).  Embriogenesis  somatik dapat  diperoleh  tetapi  hanya  dengan menggunakan  eksplan   tertentu      yaitu embrio  zigotik  muda  dan  organ  bunga dengan  frekuensi  yang  sangat  rendah (Lopez-Baez et al. , 1993).
Proses embriogenesis diduga melibat- kan  satu  atau  lebih  gen  kunci  yang  me- nentukan  proses  tersebut.  Keberhasilan mengidentifikasi  gen-gen  kunci  diharap- kan  dapat  membantu  menyelesaikan masalah  dalam  regenerasi  embrio  kakao. Salah satu gen yang diduga terlibat dalam
proses  ini  adalah AGAMOUS-like  15 ( AGL-15 ). AGL-15 merupakan  gen  yang berperan  pada  regulasi  selama  masa  awal perkembangan  embrio  beberapa  tanaman. Gen  ini  adalah  anggota  dari  keluarga MADS-domain  yang  berfungsi  sebagai regulator,  biasanya  terakumulasi  pada organ  dan  jaringan  yang  diturunkan  dari proses  fertilisasi  ganda  pada  pembungaan tanaman,  seperti  pada  embrio,  suspensor dan endosperma (Perry, 1999).
Arabidopsis AGAMOUS  (AG) diper- lukan  untuk  perkembangan  bunga  ter- utama  pada  bagian  stamen  dan  karpel (Bowman et  al. ,  1989;  Yanofsky et  al. , 1990).  Karpel  merupakan  bagian  penting dari  bunga  terutama  untuk  reproduksi seksual  tanaman  karena  menjadi  wadah dari  ovul  yang  kemudian  berkembang menjadi  buah  yang  berfungsi  untuk melindungi dan memberi nutrisi pada biji. (Pinyopich,  2003).  Overekspresi AGL-15 berpengaruh  pada  proses  penuaan  bunga dan pemasakan buah (Fang &  Fernandez, 2002),  mengawali  pembentukan  embrio somatik  setelah  tahap  perkecambahan (Alvarez-Buyla,  2000)  serta  berkaitan langsung dengan regulasi ekspresi dari gen lainnya  yang  mengkode  enzim  yang terlibat dalam proses metabolisme gibberellin (Wang, 2004). Potensi ekspresi embriogenesis  pada  kultur in  vitro dapat ditingkatkan  melalui  ekspresi  konstitutif gen AGL-15 (Harding et al. , 2003).
Transisi  dari  fase  vegetatif  ke  gene- ratif  pada  kakao  diatur  di  tingkat  ekspresi gen  sebagaimana  pada  tanaman  lainnya. Gen-gen  yang  berkaitan  dengan  fase generatif  seperti  pembungaan  dan  regene- rasi  memiliki  daerah  yang  terkonservasi ( conserved  regions )  dengan  homologi yang  signifikan  terhadap  gen  yang berfungsi sama pada spesies lainnya. Pada tingkat  tertentu,  diduga  ada  persamaan antara  gen-gen  pembungaan  dan  regene-
Identifikasi homolog AGL-15 untuk penanda embriogenesis….
rasi  pada  kakao  dengan Arabidopsis . Berdasarkan  kelengkapan  informasi  ten- tang alur  pembungaan dan regenerasi dari Arabidopsis (Blasquez, 2000), bisa dilaku- kan  suatu  ekstrapolasi  untuk  menduga proses yang sama pada tanaman kakao.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  meran- cang  primer  heterologus  berdasarkan informasi  gen AGL-15 pada  berbagai tanaman  kemudian  mengidentifikasi  gen AGL-15 pada  kakao.  Hipotesis  yang dikemukakan  adalah  (1) AGL-15 terdapat juga  pada  tanaman  kakao  sebagaimana pada  spesies  tanaman  lainnya  dan  (2)
AGL-15 diekspresikan pada proses embriogenesis  tanaman  kakao  secara in vitro ,  yang  dapat  dideteksi  dengan  teknik PCR spesifik.

## Bahan dan Metode
Perancangan primer degenerasi untuk gen AGL-15
Pengumpulan  data  sekuen  nukleotida gen AGL-15 berbagai  tanaman  diperoleh dari  database  di  internet  ( www.ebi.ac.uk ). Sekuen  nukleotida  tersebut  dikonversi  ke sekuen  asam  amino  menggunakan  pro- gram  Bioedit  7.0  dengan  memperhatikan adanya  mekanisme splicing (penghilang- an  intron).  Pencarian  daerah  konservatif (homologi  tinggi)  berdasarkan  sekuen asam  amino,  dilakukan  menggunakan algoritma  Clustal-W.  Setelah  diperoleh output dari  program  Clustal-W,  maka sekuen  asam  amino  kembali  dikonversi menjadi sekuen nukleotida. Dengan demi- kian  daerah  konservatif  dapat  diperoleh berdasarkan  sekuen  nukleotida  tersebut. Sekuen  yang  mengandung  daerah  konser- vatif,  diproses  dengan  program  Primer3, untuk  perancangan  primer.  Dari  program Primer3 diperoleh beberapa pasang primer
yang  siap  untuk  digunakan.  Program Primer3  tersebut  telah  mengantisipasi adanya  kondisi  tidak  optimal  antara  lain, selisih  Tm  yang  terlalu  besar,  struktur sekunder  yang  mungkin  terbentuk  serta primer dimer.

## Isolasi DNA genomik daun kakao
Isolasi  DNA  dilakukan  berdasarkan metode Orozco-Castillo et al . (1994) yang dimodifikasi.  Sebanyak  1  g    daun  kakao digerus  dengan  N 2 cair  di  dalam  mortar sampai  halus  dan  ditambah  dengan  8– 12  mL  bufer  MPIS  pH  6  (100  mM Natrium  sitrat;  0,35  M  Glukosa;    5  mM EDTA;  1  %  BSA;  2  %  PVP;  1  % β -Merkaptoetanol),  kemudian  disaring dengan  kain  kasa  steril  dan  ditampung  di dalam  botol.  Filtratnya  ditambah  dengan 2 sampai 3 mL bufer BED (100 mM Tris– HCl  pH  8;  250  mM  EDTA;  1,5  NaCl; 2,5 % CTAB; 1 % PVP; 0,2 % β -Merkap- toetanol),  dibolak-balik  dan  dipindahkan ke  tabung  Eppendorf.  Sampel  dalam tabung  diinkubasi  pada  suhu  60 o C  selama satu  jam.  Setelah  dingin,  suspensi  dieks- traksi  dengan  kloroform:isoamil  alkohol (24:1) sebanyak satu volume dan dibolak- balik  selama  5-10  menit  pada  suhu  4 o C. Sampel  disentrifugasi  pada  12.000  g,  de- ngan  suhu  4 o C  selama  10  menit.  Lapisan atas   dipindahkan  ke    tabung  Eppendorf baru  dan  suspensi  DNA  dipresipitasi dengan    menambah  0,5  V  NaCl  5  M  dan 0,6 V isopropanol kemudian dibolak-balik 15-30 kali sebelum didiamkan di dalam es selama  satu  jam.  Tabung  Eppendorf disentrifugasi  pada  suhu  4 o C  dengan kecepatan  12.000  g  selama  10  menit. Setelah  filtratnya  dibuang,  pelet  dibilas dengan  etanol  70%.  Pelet  dikeringkan dengan speed  vac kemudian  dilarutkan dalam 100 µ L ddH2O.
Triastanto et al .
Kualitas  DNA  diuji  melalui  elektro- foresis  menggunakan  gel  agarosa  0,8% dalam  bufer  TBE  0,5X.  Disamping  itu kuantitas  dan  kemurnian  DNA  ditentukan dengan  membandingkan  absorbansinya pada  panjang  gelombang  260  nm  dan 280  nm  (A 260 dan  A 280 )    menggunakan spektrofotometer.

## Embriogenesis  somatik  dari  eksplan embrio zigotik
Buah  kakao  berumur  90-120  hari dipetik  kemudian  didesinfeksi  dengan alkohol  70%  selama  10  menit.  Embrio zigotik  diisolasi  dari  bakal  biji,  dipilih yang berukuran sekitar 2-4 mm kemudian ditanam  pada  medium.  Medium  dasar yang  digunakan  adalah  medium  B5  yang dimodifikasi  dengan  menambahkan  zat pengatur  tumbuh indole  butyric  acid (IBA)  2  mg/L,  air  kelapa  100  mL/L, sukrosa  30  g/L  dan  phytagel  2  g/L. Medium  diatur  pH-nya  5,8  kemudian diautoklaf  pada  suhu  121°C  selama 20  menit.  Medium  dituang  ke  dalam cawan Petri diameter 10  mm.  Setiap  Petri diisi  30  mL  medium  dan  ditanami  10 eksplan. Kultur disimpan pada ruang gelap suhu  26°C.  Pengamatan  yang  dilanjutkan ke  isolasi  RNA  dilakukan  pada  jangka waktu 0 sampai 5 minggu.

## Isolasi RNA total dari jaringan  embrio zigotik
RNA  total  diisolasi  dari  jaringan embrio zigotik  pada berbagai umur kultur dengan  metode  yang  dimodifikasi  oleh Santoso & Maagd (2003). Sebanyak 5 µ L β -merkaptoetanol  ditambahkan  ke  dalam setiap mL bufer ekstrak. Selain itu, PVPP ditambahkan  ke  dalam  ekstrak  sebagai antioksidan.  Penambahan  kedua  anti-
oksidan tersebut dilakukan sesaat sebelum bufer  ekstraksi  digunakan.  Ekstraksi  de- ngan  pelarut  dilakukan  tiga  kali    masing- masing  dengan  kloroform:isoamilalkohol (24:1),  fenol:    kloroform:isoamilalkohol (25:24:1) dan dengan  kloroform: isoamil- alkohol  (24:1).  Ekstraksi  pertama  dilaku- kan  bersamaan  dengan  tahapan  inkubasi pada  suhu  65 o C  selama  satu  jam.  Sentri- fugasi dilakukan pada 12.000 g selama 20 menit.  Sampel  ditambah  dengan  LiCl kemudian  diendapkan  selama  semalam untuk memisahkan RNA dari DNA.

## Analisis PCR
Analisis  PCR  dilakukan  dengan  total reaksi 20 µ L, mengandung DNA genomik 30-40 ng, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) 0,1 µ M, primer heterologus, enzim Taq  DNA  polymerase 1  unit  dalam larutan  bufer  1X.  Program  PCR  terdiri dari predenaturasi  pada  suhu  94 o C selama lima  menit,  dilanjutkan  dengan  30  siklus yang  terdiri  dari  denaturasi  pada  suhu 94 o C selama satu menit, penempelan  pada suhu  46 o C  selama  30  detik  dan  ekstensi pada  suhu  72 o C  selama  90  detik.  Pada tahap  terakhir  proses  PCR  dilakukan ekstensi akhir  pada suhu 72 o C selama 15 menit. Sebanyak 10 µ L produk PCR hasil amplifikasi  dianalisis  dengan  elektro- foresis pada gel agarosa 1% (w/v).

## Reamplifikasi PCR
Hasil  PCR  sebelumnya  diencerkan dengan tingkat pengenceran satu, lima dan sepuluh  kali  untuk  digunakan  sebagai templat pada proses PCR berikutnya. PCR terdiri  dari  predenaturasi  pada  suhu  94 o C selama  lima  menit,  dilanjutkan  dengan 30 siklus  yang  terdiri  dari  denaturasi  pada
Identifikasi homolog AGL-15 untuk penanda embriogenesis….
suhu 94 o C selama satu menit, penempelan pada  suhu  53 ° C  (untuk  penempelan  situs spesifik)  dan  ekstensi  72 o C  selama    90 detik.  Pada  tahap  terakhir  proses  PCR dilakukan  ekstensi  akhir  pada  suhu  72 o C selama 15 menit. Sebanyak  10 µ L produk PCR  hasil  amplifikasi  dianalisis  dengan elektroforesis pada gel agarosa 1% (w/v).

## Sekuensing dan analisis BLAST
Hasil  PCR  yang  sudah    direampli- fikasi  kemudian  disekuen  di  Lembaga Biologi  Molekuler  Eijkman  di  Jakarta. Hasilnya  dianalisis  BLAST  pada  situs NCBI    http://www.ncbi.nlm.nih.  gov/ BLAST
Analisis RT-PCR dan perancangan primer spesifik
RNA total yang digunakan dalam RT- PCR  harus  memiliki  kualitas  bagus,  yaitu mempunyai  kemurnian  tinggi,  rasio  λ 260 / λ 280 ≥ 1,6 dan λ 260 / λ 230 ≥ 1,0. Reaksi RT- PCR  dilakukan  melalui  dua  proses,  yaitu pembuatan first  strand cDNA  dan  reaksi PCR biasa yang menggunakan first strand cDNA sebagai cetakan. Untuk pembuatan first strand cDNA, cetakan yang digunakan adalah RNA total yang  diisolasi  dari  jaringan  hasil  kultur embriogenesis  pada  umur  0  sampai  5 minggu.  Primer  yang  digunakan  adalah oligo dT(18) dari  kit  Invitrogen.  Sedang- kan untuk reaksi PCR selanjutnya,  primer yang  digunakan  adalah  primer  spesifik yang  dirancang  ulang  dari  hasil  sekuen- sing.  Amplikon  dielektroforesis  meng- gunakan  gel  agarosa  1,4%.  Pengamatan dilakukan  terhadap  pola  pita  yang  ter- bentuk  dari  hasil  PCR.  Intensitas  pita DNA  hasil  RT-PCR  digunakan  untuk
mengestimasi  tingkat  ekspresi  gen  ter- lacak.

## Hasil dan Pembahasan
Setelah  RNA  yang  terikut  pada  hasil dihilangkan  dengan  RNAse,  DNA  geno- mik  kakao  diperiksa  baik  dengan  elektro- foresis gel agarosa (0,8%) maupun dengan spektrofotometer untuk menetapkan kualitas  dan  kuantitasnya.  Pengujian  me- nunjukkan  bahwa  DNA  genomik  yang dihasilkan  memiliki  kualitas  yang  cukup baik,  tidak  terdegradasi  dan  relatif  murni (data  tidak  ditunjukkan).  Selanjutnya, DNA  ini  yang  digunakan  dalam  reaksi PCR.
Untuk  mendeteksi  keberadaan  gen AGL-15 ,  dilakukan  PCR  menggunakan primer  spesifik.  Primer  heterologus  spe- sifik AGL-15 dirancang  berdasarkan  situs homologi AGAMOUS dan AGAMOUS- like pada  berbagai  tanaman  antara  lain apel,  poplar, Arabidopsis dan  kapas. Dengan  metode  primer  degenerasi  seperti yang  dijelaskan  pada  Metode  Penelitian, diperoleh  primer  dengan  sekuen  dan karakteristik sebagai berikut :
EMF1: 5’-GAGATTAAGAGGATCGA  - 3’ Tm = 49 ° C EMR2: 5’-GAGAAGACGATGAGAGC - 3’ Tm = 52 ° C
Amplifikasi  fragmen  DNA  spesifik kakao dengan PCR menggunakan pasangan  primer  EMF1  dan  EMR2  dan suhu penempelan 46 ° C menghasilkan pita dengan  ukuran  150  bp.  Karena  intensitas pita DNA hasil amplifikasi ini tidak cukup kuat  (Gambar  1  lajur  1),  maka  dilakukan reamplifikasi.  Templat  yang  digunakan dalam reamplifikasi adalah hasil purifikasi pita  tersebut  dari  gel  agarosa.  Dengan optimasi  pengenceran  satu,  lima  dan sepuluh  kali  serta  dengan  peningkatan suhu  penempelan  menjadi  53 ° C    untuk
Triastanto et al .
peningkatan  spesifitas,  diperoleh  bahwa pengenceran 10 kali mampu menghasilkan amplikon  yang  terbaik.  Sedangkan  untuk pengenceran    satu  dan  lima  kali,  diduga kuantitas  amplikon  masih  tinggi  sehingga menghasilkan pita yang smear (Gambar 1 lajur  2  dan  3).  Untuk  keperluan  sekuen- sing,  fragmen  DNA  murni  dalam  jumlah yang  lebih  banyak  didapat  dari  gel preparatif (Gambar 1 lajur 6) Sekuensing dilakukan di Laboratorium Eijkman  menggunakan  alat  Sequencer ABI  Prism  371.  Prinsip  kerja  sekuensing ini  didasarkan  pada  metode  penyetopan dideoksi yang dikembangkan oleh Sanger. Dari  hasil  sekuensing  diperoleh  sekuen DNA dengan ukuran 100 bp (sekuen tidak
ditampilkan).  Sekuen  putatif AGL-15 kakao  digunakan  sebagai input pada analisis  BLAST-N  dan  menghasilkan output seperti Gambar 2.
Hasil  analisis  Blast-N  menunjukkan bahwa  input  ( entry )  sekuen  produk  PCR spesifik  150  pb  tersebut  mempunyai homologi yang tinggi dengan AGAMOUS- like dari  berbagai  spesies  tanaman (Gambar  2)  antara  lain  dengan: Clematis integrifolia , Magnolia praecocissima , Malus  x  domestica,  Vitis  vinifera , Rosa rugosa,  dan  Populus  tomentosa dengan E-value di  bawah  1.10 -7 .  Nilai  ini  me- nunjukkan  adanya  indikasi  kuat  bahwa sekuen  tersebut  merupakan  varian  dari AGAMOUS- like .
Gambar 1. Hasil  PCR  pada  suhu  penempelan (SA) 46 ° C  dan reamplifikasi pada  suhu 53 ° C. Lajur 1-6 masing-masing  adalah      produk  PCR  standar  (lajur  1),  reamplifikasi  dengan  pengenceran templat 5x (lajur 2), 1x (lajur 3), 10x (lajur 4-5), ekstrak dari gel templat yang diencerkan 10x, gel  preparatif (lajur 6), dan M penanda bobot molekul.
Figure 1.  PCR  products at  annealing  temperature  46 ° C  and  reamplification  at  53 ° C. Lanes 1-6 are Standrd PCR product (lane 1)  reamplification  products  with 5x (lane2), 1x (lane3), 10x (lane 405), gel  extract  of  diluted  templates 10x, preparative   gel (lane 6) and  M  is  DNA molecular weight marker respectiviely.
150 pb 1      M     2      3       4           5              M        M         6
Identifikasi homolog AGL-15 untuk penanda embriogenesis….
Spesies tanaman Plant species Skor ( Score ), Bites Nilai E E Value C. integrifolia 105 2 e - 21 M. praecocissima 103 1 e - 20 Malus x domestica 96 2 e - 18 V. vinifera 90 1 e - 16 R. rugosa 88 6 e - 16 P. tomentosa 72 3 e - 11
Gambar 2. Hasil Blast-N dari sekuen fragmen 150 pb homolog AGL-15 kakao.
Figure 2.  Blast-N output of the 150 bp fragment of cacao AGL-15 homolog .
Dengan  menggunakan contig antara sekuen AGL-15  putative dan AGAMOUS- like buah kakao  dari klon  Indonesia,  serta menggunakan  software  Primer3,  didapat- kan  primer  spesifik  dengan  karakteristik sebagai berikut :
Forward:5’-GCCTATGAACTGTCTGTGCT-3’Tm= 62 ° C Reverse: 5’- CAGCAGTCATTCTTTTTGG – 3’Tm = 59 ° C
Pasangan  primer  tersebut  selanjutnya digunakan  dalam  RT - PCR  untuk  meng- analisis  ekspresi TcAGL-15 pada berbagai umur kultur embrio zigotik kakao.
Kultur embrio zigotik (EZ) dari umur 0  hingga  5  minggu  adalah  seperti  pada Gambar  3.  Data  ini  menunjukkan  bahwa eksplan  tersebut  mengalami  perkembang- an  embryogenesis,  dan  terlihat  jelas  pada umur 4 – 5 minggu. Pada umur kultur lima minggu  embrio  somatik  fase  globular yang  berkembang  dari  eksplan  EZ  jelas terlihat  di  bawah  mikroskop  dengan pembesaran 10 hingga 40 kali (Gambar 3. 5Z).  Pada subkultur     2 – 3, fase  globuler akan  berkembang  menjadi  fase  torpedo atau  hati.  Selanjutnya  embrio  kultur tersebut  digunakan  sebagai  sumber  RNA total.  Larutan  asam  nukleat  dianggap
murni  dari  karbohidrat  kompleks  ataupun senyawa  polifenolik  apabila  rasio  antara serapan  pada    λ 260 nm  dengan  λ 260 nm (λ 260/ λ 230 )  sama  dengan  satu  atau  lebih (Lewinsohn et al. , 1994).
Kandungan kedua senyawa tersebut di dalam jaringan kakao relatif sangat tinggi. RNA  total  hasil  isolasi  dari kultur  embrio zigotik  ditampilkan  pada  Gambar  4. Visualisasi elektroforesis ini menunjukkan bahwa kualitas RNA total relatif baik dan masih  utuh.  Hal  tersebut  ditunjukkan dengan adanya dua pita diskrit RNA ribo- somal.  Data  spektrofotometer  di  sebelah kanan juga menunjukkan bahwa kemurni- an RNA total relatif baik.
Berdasarkan gambar dan data tersebut diduga  bahwa  RNA  hasil  isolasi  dapat digunakan  untuk  analisis  ekspresi  gennya dengan  metode  RT-PCR.  Pada  percobaan ini  digunakan  RT-PCR  melalui  pemben- tukan first  strand cDNA  terlebih  dahulu baru  kemudian  diteruskan  dengan  proses PCR.  Dari  dua  kali  proses    PCR  dengan menggunakan suhu penempelan yang ber- beda  (60  dan    64 ° C)  dengan  cetakan first strand dari RNA pada M 0 , M 1 M 2 M 4 dan M 5 ,  diperoleh  pola  yang  mirip  yaitu  pita
Triastanto et al .
Gambar 4. Hasil isolasi RNA total eksplan kakao dari kultur minggu ke 0 - 5 beserta serapan spektro- fotometri.
Figure 4. Electrophoretic profile and spectrophotometrics of total RNA isolated from ZE cultured for 0 to 5 weeks.
λ 260 λ 280 λ 230 λ 260 / λ 280 λ 260 / λ 230 [ng/µL] M 0 M 1 M 2 M 4 M 5 0,087 0,041 0,157 0,066 0,126 0,04 0,011 0,113 0,043 0,076 0,053 0,019 0,097 0,033 0,095 2,175 3,727 1,389 1,535 1,658 1,642 2,158 1,619 2 1,326 348 164 628 264 504
Gambar 3.  Kultur embrio zigotik secara in vitro pada minggu ke 0, 1, 3, 5. 5Z adalah  kultur pada minggu ke  lima dilihat di bawah mikroskop.
Figure 3.    Zygotic embyos cultured for 0, 1, 3, 5 weeks. 5Z is a microscopic view of the five- week culture.
5 5Z 1 0 3
Identifikasi homolog AGL-15 untuk penanda embriogenesis….
Gambar 5.  Hasil RT-PCR  pada suhu  penempelan 60 ° C  menunjukkan  pola pita  diferensial (lajur 0 hingga 5).
Figure 5.   RT-PCR products at annealing temperature 60 ° C indicates a differential banding patern (lanes 0 to 5).
tebal  pada  minggu  ke-0,  berangsur menipis  pada    minggu  ke-2,  hilang  pada minggu  ke-4  dan  muncul  lagi  pada minggu  ke-5  (Gambar  5).  Hal  itu menunjukkan  adanya  indikasi  kuat  bahwa sekuen AGL-15 tersebut  berperan  pada proses  embriogenesis.  Di  awal  kultur, eksplan  diduga  masih  memiliki  identitas embrio.  Pada  minggu  kedua  sel  embrio- genik mulai  berubah menjadi sel  somatik. Pada  minggu  ke-4  identitas  embriogenik hilang dan pada minggu ke-5 karakteristik embriogenik  muncul  kembali  sejalan dengan  proses  embriogenesis  somatik. Peranan gen MADSBOX jenis AGAMOUS dalam  embriogenesis  sejalan  dengan  ting- kat  ekspresinya  pada  organ  reproduktif. Chaidamsari et  al. (2006)  melaporkan bahwa  selain  menunjukkan  peran  sebagai gen identitas pembungaan, gen sejenisnya, TcAG juga  diekspresikan  relatif  tinggi pada  jaringan  tanaman  kakao  ovari  dan buah yang sedang berkembang yang dapat diasosiasikan dengan perkembangan embrio biji buah kakao tersebut.

## Kesimpulan
1.  Primer  heterologus  untuk  gen AGL-15 yang  berasal  dari  berbagai  tanaman,
mampu  mendeteksi  keberadaan  homo- log gen tersebut pada tanaman kakao.
2. Fragmen homolog AGL-15 putatif tana- man  kakao  terdeteksi  pada  tingkat RNA embrio.
3. Pola ekspresi differensial mengindikasi- kan  bahwa  fragmen  homolog AGL-15 dapat  digunakan  sebagai  penanda embriogenesis pada tanaman kakao.

## Daftar Pustaka
Alvarez-Buylla,  E.  (2000).  An  cancestral MADS-box  gene  duplication  occurred before  the  divergence  of  plants  and animals. PNAS, 97 ( 10),5328-5333.
Chaidamsari,  T.,  Samanhudi,  H.  Sugiarti, D. Santoso, G. C. Angenent &
R.A. de Maagd (2006). Isolation and charac- terization of an AGAMOUS homologue from cocoa. Plant Science 170, 968-975.
Direktorat  Jenderal  Bina  Produksi  Perkebunan (2004). Statistik  Perkebunan  Indonesia 2001-2003,  Kakao. Jakarta,  Dirjenbun. p. 47.
Blasquez, M. A. (2000). Flower developmental pathways. Cell  Science  at  a  Glance, 354 , 6-7.
0        1      2       4         5        +    M 350 pb
Triastanto et al .
Bowman,  J.  L.,  D.  R.  Smyth  &  E.  M Meyerowitz  (1989).  Genes  directing flower development in Arabidopsis. Plant Cell , 1, 37-52.
Fang, S.C. & D.E. Fernandez (2002). Effect of regulated  overexpression  of  the  MADS domain factor AGL-15 on flower senescence  and  fruit  maturation. Plant Physiol., 130 ,78-89.
Harding,  E.W.,  W.  Tang,  K.  W.  Nichols, D.  E.  Fernandez  &  S.  E.  Perry  (2003). Expression  and  maintenance  of  embryo- genic  potential  is  enhanced  through constitutive expression of AGAMOUS-like 15. Plant Physiol., 13, 653-663.
Lewinsohn E., C.L. Steele & R. Croteau (1994) Simple  isolation  of  functional  RNA  from woody  stems  of  Gymnosperms. Plant Mol. Biol. Rep., 12, 20-25.
Lopez-Baez,  O.,  H.  Bollon,  A.  Eskes  & V. Petiard (1993). Embyogenese somatique  de  cacaoyer Theobroma  cacao La  partir  de  pieces  florales. Comptes Rendus  de  l’Academie  des  Sciences  Serie III – Sciences de la Vie. 316,  579-584 .
Orozco-Castillo, K.T. Chalmena, B. Wough & W. Powell  (1994).  Detection  of  genetic diversity  and  selective  gene  intro- genession  in  coffee  using  RAPD  marker.
Theor. Appl. Genet. , 87, 934-935.
Perry, S.E. (1999). The MADS-domain protein AGAMOUS-Like  15  accumulates  in embryonic  tissues  with  diverse  origin. Plant Physiol., 120 , 121-129.
Pinyopich, A. (2003). Assessing the redundancy  of  MADS-box  genes  during carpel  and  ovule  development. Nature,
424, 85-88.
Santoso,  D.  &  R.A  Maagd  (2003).  Molecular and  genetic  engineering  studies  toward improvement  of  cocoa  beran  production, Internal Report of RUTi .
Tahardi,  J.  S.  &  N.  Mardiana  (1995).  Tissue culture  of Theobroma  cacao  L. Menara Perkebunan, 52 , (3), 174-178.
Thiessen,  G.  (2001).  Development  of  floral organ  identity:  Stories  from  the  MADS house. Curr. Opin. Plant Biol., 4, 75-85.
Wang, H. (2004). The Embyro MADS domain protein  AGAMOUS-like  15  directly regulates  expression  of  a  gene  encoding an  enzyme  involved  in  gibberellin metabolism. Plant Cell, 16 , 1206-1219.
Yanofsky,  M.  F.  (1990).  The  protein  encoded by  the  Arabidopsis  hemoetic  gene agamous  resembles  transcription  factors.
Nature, 346 , 35-39.