## Sintesis Tetrapeptida Linear Phe-Leu-Ala-Pro (FLAP) sebagai
Kandidat Antioksidan dengan Metode Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS)
Eka Nurjanah * , Nety Kurniaty
Prodi  Farmasi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas Islam Bandung, Indonesia.
* eka.nurzannah12@gmail.com, netykurniaty@yahoo.com
Abstract . Antioxidants are compounds that can prevent or inhibit oxidation in a cell caused by free radicals. Based on previous study, one of the natural antioxidant peptides is a tetrapeptide (Phe-Leu- Ala-Pro),  which  was  isolated  from  Sea  Cucumber  Collagen  (Acaudina  Molpadiodes)  in  Zheijing
Province, China. In this study, a tetrapeptide (Phe-Leu-Ala-Pro) has been successfully synthesized using the solid phase peptide synthesis method (SPPS) with the strategy by using a protective group Fmoc, 2-chlorotrityl  chloride  resin as  a buffer and coupling  reagents including  HBTU,  HOBt and DIPEA.  FLAP  tetrapeptide  compound  has  been  formed  which  is  characterized  by  mass spectrophotometer with an m/z value of 447.2608 for peak of [M+H]+ ion. The results of the RP-
HPLC analysis showed that the FLAP tetrapeptide compound was not pure because there were still minor peaks, the target compound retention time was 2 minute. The FLAP tetrapeptide compound has antioxidant activity with an IC50 value of 9376.6 ppm based on DPPH test.
Keywords: Tetrapeptide FLAP, Antioxidant, Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS).
Abstrak. Antioksidan adalah suatu senyawa yang dapat mencegah atau menghambat oksidasi pada suatu sel yang disebabkan oleh radikal bebas. Salah satu peptida antioksidan alami yang ditemukan pada  penelitian  sebelumnya  adalah  tetrapeptida  (Phe-Leu-Ala-Pro)  yang  diisolasi  dari  Kolagen Teripang  (Acaudina  Molpadiodes)  di  Provinsi  Zheijing  Cina  yang  memiliki  aktivitas  antioksidan. Pada  penelitian  ini  tetrapeptida  (Phe-Leu-Ala-Pro)  telah  berhasil  disintesis  menggunakan  metode sintesis  peptida  fase  padat  (SPPS)  dengan  strategi  pemakaian  gugus  pelindung  Fmoc,  penyangga yaitu resin 2-klorotritil klorida dan reagen pengkopling diantaranya yaitu HBTU, HOBt dan DIPEA. Senyawa tetrapeptida FLAP telah terbentuk yang ditandai dengan hasil karakterisasi menggunakan spektrofotometer  massa  dengan  nilai  m/z  447,2608  pada  puncak  ion  [M+H]+.  Pada  hasil  analisis RP-HPLC  menunjukkan  bahwa  senyawa  tetrapeptida  FLAP  belum  murni  karena  masih  adanya puncak-puncak minor, senyawa target berada pada waktu retensi menit ke-2. Senyawa tetrapeptida FLAP memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 9376,6 ppm pada uji DPPH.
Kata Kunci: Tetrapeptida FLAP, Antioksidan, Sintesis peptida fase padat (SPPS).

## A. Pendahuluan
Peptida bioaktif yang telah menarik banyak perhatian para ilmiah memiliki efek potensial untuk kesehatan  dan  mengurangi  resiko  penyakit  seperti  yang  diketahui  yang  memiliki  aktivitas antioksidan,  antikanker  hingga  antimikroba  (Sumiarsa,  2019).  Selain  itu  peptida  merupakan bahan  yang  tersusun  dari  asam  amino  sehingga  lebih  selektif  sekaligus  relatif  lebih  aman ditoleransi oleh tubuh (Fosgerau dan Hoffmann, 2015).
Menurut  Jin,  et.  al,.  (2019)  menyatakan  bahwa  telah  dilakukan  isolasi  salah  satu peptida antioksidan yang diperoleh dari Kolagen Teripang Acaudina Molpadiodes di Provinsi Zheijing di Cina merupakan salah satu derivat tetrapeptida dengan urutan FLAP (Phe-Leu- Ala- Pro) dengan IC50 pada uji DPPH 0,385 mg/mL. Dari hasil penelitian sebelumnya, tetrapeptida hasil isolasi dengan urutan asam amino FLAP menunjukkan aktivitas antioksidan yang kurang baik.
Pada  penelitian  sintesis  tetrapeptida  dengan  urutan  asam  amino  FLAP  (Phe-Leu-Ala- Pro)  sebagai  kandidat  antioksidan.  Dilakukan  sintesis  secara  kimia  sebagai  metode  alternatif dari ekstraksi bahan alam yang membutuhkan waktu cukup lama untuk mendapatkan senyawa target,  maka  dilakukan  sintesis  peptida  agar  memudahkan  mendapatkan  senyawa  target  yang memiliki  aktivitas  farmakologi  yang  sama.  Selain  itu  sintesis  peptida  memiliki  keuntungan yaitu pelarut yang digunakan nya sedikit dan bahan yang digunakan diperoleh dari asam amino sehingga  tidak  dianggap  benda  asing  oleh  tubuh.  Metode  sintesis  kimia  senyawa  tetrapeptida urutan  asam  amino  FLAP  menggunakan  metode  sintesis  peptida  fase  padat  (SPPS),  dimana metode SPPS merupakan suatu metode sintesis peptida yang efektif dan sederhana (Irwansyah, 2010).
Maka  rumusan  masalah  pada  penelitian  ini  adalah  bagaimana  cara  mensintesis tetrapeptida FLAP (Phe-Leu- Ala-Pro) menggunakan metode SPPS agar didapat urutan seperti hasil isolasi. Selain itu apakah senyawa tetrapeptida (Phe-Leu-Ala-Pro) hasil sintesis memiliki aktivitas antioksidan terhadap radikal DPPH seperti yang dimiliki oleh peptida hasil isolasi dari Teripang  Acaudina  Molpadiode.  Tujuan  dari  penelitian  ini  yaitu  untuk  mensintesis  senyawa tetrapeptida FLAP dengan metode SPPS dan menguji aktivitas antioksidan tetrapeptida FLAP hasil  sintesis  menggunakan  metode  peredaman  DPPH  (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil).  Manfaat penelitian  ini  yaitu  dapat  mengembangkan  metode  alternatif  sintesis  tetrapeptida  FLAP  yang dapat menghasilkan senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan.

## B. Metodologi Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  metode  sintesis  peptida  fase  padat  (SPPS)  yang  terdiri  dari beberapa tahap  yaitu  melakukan  pengkondisian  tabung  agar  bebas  dari  pengotor  supaya  tidak menggangu proses sintesis, pengembangan resin dilakukan untuk membuka sisi aktif resin agar memudahkan asam amino masuk kedalam resin. Selanjutnya kopling asam amino pertama pada resin  untuk  penyangga  fasa  padat,  kemudian  untuk  mengetahui  keberhasilan  proses pengkoplingan maka dilakukan uji kloranil, lalu capping resin agar dapat menutupi gugus aktif resin  maka  resin  tidak  berikatan  dengan  asam  amino  lain.  Setelah  itu  pelepasan  gugus pelindung  Fmoc  agar  terjadi  pengikatan  antara  asam  amino  dengan  asam  amino  lainnya. Selanjutnya  penyusunan  asam  amino  dengan  melakukan  prosedur  yang  sama  untuk  proses pengkoplingan  asam  amino  hingga  terbentuk  senyawa  tetrapeptida  yang  diinginkan.  Setelah terbentuk fragmen tetrapeptida selanjutnya dilakukan pelepasan tetrapeptida dari resin, setelah terlepas  kemudian  dilakukan  proses  pengeringan  dan  pemekatan  menggunakan  rotary evaporator.  Kemudian  proses  karakterisasi  menggunakan  spektrofotometer  massa  untuk memastikan  terbentuknya  senyawa  tetrapeptida,  lalu  dilakukan  uji  kemurnian  dengan  melihat kromatogram  menggunakan  RP-HPLC.  Lalu  uji  aktivitas  antioksidan  menggunakan  metode peredaman  DPPH  dengan  Spektrofotometer  UV-Vis  untuk  mengetahui  nilai  aktivitas peredaman radikal bebas dengan nilai IC50.

## C. Hasil Penelitian dan Pembahasan
Sintesis senyawa FLAP menggunakan metode sintesis peptida fase padat . Keuntungan metode ini diantaranya yaitu lebih sederhana dan dapat memproduksi senyawa yang diinginkan dengan
cepat  (Kim  &  McAlpine,  2013).  Resin  2-  klorotiril  klorida  adalah  resin  fase  padat  yang digunakan  pada  metode sintesis,  resin  dikembangkan  terlebih  dahulu  agar sisi aktif  pada resin terbuka  sehingga  asam  amino  pertama  dapat  lebih  mudah  terikat  pada  sisi  aktif  resin.  Pelarut yang digunakan yaitu diklorometana (DCM) dan dimetilformamida (DMF).

## Pengkoplingan Asam Amino
Pada  sintesis  asam  amino  pertama  pada  tetrapeptida  FLAP  yaitu  asam  amino  Prolin  (Pro). Asam  amino  pada  terminal  n  sudah  terlindungi  dengan  gugus  pelindung  Fmoc  agar  tidak mengganggu  reaksi,  proses  reaksi  yang  terjadi  adalah  asam  amino  pertama  Fmoc-Pro-OH dengan  DIPEA  sebagai  reagen  yang  bersifat  basa.  Reaksi  asam  basa  hanya  mengambil hidrogen  dari  gugus  karboksil  pada  asam  amino  Fmoc-Pro-OH  membentuk  nukleofil, kemudian  nukleofil  tersebut  yang  terbentuk  akan  menggantikan  atom  klorida  pada  karbon kuartener  yang  ada  pada  resin  2-klorotritil  klorida.  Sehingga  asam  amino  dapat  membentuk ikatan dengan resin (Maharani, et. al., 2016).
Reaksi dilakukan selama 4 jam untuk sintesis peptida FLAP, untuk  memastikan asam amino pertama yang masuk kedalam resin. Nilai loading resin menentukan jumlah asam amino yang  dapat  ditambahkan  selanjutnya  (Chan  dan  White,  2000).  Penentuan  nilai  loading  resin dilakukan  dengan  menggunakan  spektrofotometer  UV  dan  telah  diketahui  nilai  loading  resin peptida  FLAP  yaitu  0,3626  mmol/g  dimana  hasil  dari  loading  resin  menandakan  bahwa  resin dapat  mengikat  asam  amino  dengan  baik  karena  berada  pada  rentang  rata-rata  loading  resin yaitu  0,1-1,3  mmol/mg  (Maharani,  et.  al.,  2016).  Dilakukan capping resin  untuk  menutupi gugus aktif resin agar tidak bereaksi dengan gugus metoksi untuk menghindari asam amino lain bereaksi  dengan  gugus  aktif  resin  yang  tersisa.  Proses capping resin  menggunakan  campuran metanol  :  DCM  :  DIPEA  (2  :  7  :  1),  dimana  metanol  berperan  yang  menutupi  sisi  aktif  pada gugus  klorida,  kemudian  DCM  sebagai  pelarut  yang  bersifat  volatil  dan  DIPEA  sebagai  basa yang menarik OH dari metanol agar lebih nukleofil yang menyerang karbon tersier dari resin.
Gambar 1. Reaksi Capping Resin dengan Reagen Methanol dan DIPEA.

## Deproteksi Fmoc
Pelepasan gugus pelindung Fmoc dilakukan setelah capping resin. Deproteksi dilakukan untuk menyediakan  sisi  aktif  asam  amino  pertama  yang  akan  bereaksi  dengan  asam  amino selanjutnya,  dimana  gugus  pelindung  Fmoc  yaitu  bersifat  labil  dalam  kondisi  basa  sehingga dapat  dilepaskan  dengan  menggunakan  basa  (Sumiarsa,  2019).  Dengan  menggunakan  larutan piperidin  20%  dalam  DMF,  dipilih  DMF  karena  memiliki  sifat  yang  tidak  volatil.  Hidrogen pada  cincin  fluorena  dalam  gugus  Fmoc  diikat  oleh  piperidin  yang  membentuk  gugus  asam amino  bebas  (Chan  dan  White,  2000).  Untuk  mengetahui  keberhasilan  deproteksi  Fmoc dilakukan uji kloranil yang ditandai dengan adanya perubahan warna pada butiran resin karena adanya  gugus  NH 2 bebas  yang  berikatan  dengan  kloranil  yang  menyebabkan  berubah  warna (Sumiarsa, 2019).

## Penyusunan Tetrapeptida
Tahap  selanjutnya  adalah  reaksi  kopling  dengan  asam  amino  kedua,  Fmoc-Ala-OH  dengan menambahkan HBTU dan HOBt dimana kedua reagen tersebut merupakan reagen yang sering digunakan  untuk  proses  pengkoplingan  asam  amino,  karena  dapat  menjadikan  gugus  amina pada  asam  amino  menjadi  lebih  reaktif  dan  terjadinya  proses  reaksi  yang  cepat.  HBTU dianggap sebagai reagen kopling yang biasanya dapat menunjukkan performa yang sangat baik sedangkan HOBt dapat meningkatkan rendemen (Valeur dan Bradley, 2009).
Tahap  pelepasan  gugus  pelindung  Fmoc  dilakukan  kembali  dengan  penambahan piperidin  20%  dalam  DMF.  Dan  diuji  keberhasilan  kopling  dengan  uji  kloranil  yang menunjukkan  tidak  adanya  perubahan  warna  pada  resin  karena  masih  ada  gugus  pelindung Fmoc  yang  membuat  gugus  amina  belum  bebas.  Lakukan  tahap  pengulangan  reaksi  kopling dan  deproteksi  Fmoc  untuk  asam  amino  ketiga  (Fmoc-Leu-OH)  dan  asam  amino  keempat (Fmoc-Phe-OH) secara berurutan sampai terbentuk tetrapeptida.
Gambar 2. Reaksi Pengikatan Tetrapeptida Menggunakan HBTU dan HOBt.

## Pelepasan Peptida dari Resin
Tetrapeptida  yang  telah  disintesis  kemudian  dilepaskan  dari  resin.  Pelepasan tetrapeptida  dari  resin  dengan  menggunakan  TFA  20%  dalam  DCM.  Dimana  TFA  memiliki gugus  amino  yang  bermuatan  positif,  gugus  amino  ini  dapat  memotong  ikatan  resin  pada tetrapeptida, dimana TFA yang bersifat asam sedangkan resin 2-klorotritil klorida bersifat basa sehingga proses lepasnya resin yaitu dengan membentuk garam TFA yang memiliki kelarutan rendah  sehingga  TFA  dapat  terhambat  pada  tabung  sintesis  dan  dapat  terpisah  dengan tetrapeptida  (Chan  dan  White,  2000).  Keberhasilan  proses  pelepasan  resin  ditandai  dengan berubahnya warna resin menjadi merah yang menunjukkan bahwa resin sudah terlepas. Setelah dipekatkan dengan rotary evaporator , krud peptida diperoleh sebanyak 204,6 mg sebagai selai warna kuning kecoklatan.
Reaksi  yang  terjadi  pada  pelepasan  resin  dimulai  dari  protonasi  atom  oksigen  pada rantai peptida oleh TFA maka dapat menghasikan rantai peptida (Chan dan White, 2000).
Gambar 3 . Reaksi Pemutusan Resin
Dalam  sintesis  tetrapeptida  FLAP  urutan  asam  amino  yang  terdapat  dalam  peptida sudah diketahui secara pasti sehingga untuk karakterisasi dapat digunakan metode spektroskopi massa  untuk  mengetahui  bobot  molekul  dari  produk  sintesis.  Pada  penelitian  digunakan Spektrometer  Massa.  Hasil  karakterisasi  menunjukkan  adanya  puncak  ion  molekul  untuk senyawa FLAP dengan nilai m/z 447,2608.
Gambar 4. Hasil Spektrofotometer Massa Tetrapeptida (Phe- Leu-Ala-Pro).
Peptida  FLAP  yang  didapat  yaitu  204,6  mg  kemudian  diambil  sebanyak  1  mg dilarutkan  dalam  aquadest  :  acetonitril  (1:1).  Untuk  pengujian  dengan  RP-  HPLC  dilakukan menggunakan fase balik C18 menggunakan eluen gradien air : acetonitril, dengan detektor PDA dan UV pada panjang gelombang 210 nm dan 240 nm. Deteksi peptida dalam RP-HPLC antara panjang  gelombang  210  nm  sampai  254  nm,  dimana  panjang  gelombang  tersebut  panjang gelombang spesifik untuk ikatan peptida.
Gambar 5. Hasil RP-HPLC tetrapeptida FLAP pada panjang gelombang 240 nm
Berdasarkan  hasil  tersebut  dapat  menunjukkan  bahwa  hasil  kromatogram  tetrapeptida yang didapat waktu retensi pada menit ke 2,061 dan membentuk beberapa puncak. Hal tersebut menandakan bahwa peptida belum murni sehingga memerlukan pemurnian lagi.

## Uji Aktivitas Antioksidan metode DPPH
Pengujian  antioksidan  tetrapeptida  FLAP  menggunakan  metode  peredaman  DPPH,  metode peredaman  DPPH  adalah  metode  yang  mudah  dan  cepat  untuk  mengevaluasi  senyawa antioksidan  secara  spektrofotometri,  metode  ini  juga  merupakan  metode  yang  sensitif  dan sederhana (Molyneux, 2004). Prinsip pengujian ini adalah atom hidrogen senyawa antioksidan akan  berikatan  dengan  elektron  bebas  senyawa  radikal  yang  menyebabkan  perubahan  radikal menjadi non radikal ditandai dengan perubahan warna ungu menjadi kuning.
Pengujian  aktivitas  antioksidan  dibuat  dalam  20460  ppm  dengan  menggunakan konsentrasi yaitu 0 ppm, 1600 ppm, 8000 ppm, 10000 ppm, dan 15000 ppm untuk mengetahui tingkat peredaman warna sebagai akibat adanya senyawa antioksidan yang mampu mengurangi intensitas  warna  ungu  dari  DPPH  karena  semakin  banyaknya  senyawa  antioksidan  akan menyebabkan semakin besar peredaman warna ungu dari DPPH sehingga nilai absoransi yang diperoleh  semakin  kecil.  Kemudian  larutan  didiamkan  selama  30  menit  agar  terjadi  reaksi antara  radikal  DPPH  dan  sampel  uji  selanjutnya  ukur  absorbansinya  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombangnn  517  nm  dimana  panjang  gelombang tersebut  merupakan  panjang  gelombang  maksimum  dari  DPPH.  Hasil  yang  diperoleh menunjukkan  uji  aktivitas  yang  lemah  karena  nilai  absorbansi  yang  besar,  dimana  semakin besar nilai absorbansi maka nilai IC 50 semakin lemah (Erawati, 2012).
Melalui hasil uji DPPH didapatkan nilai IC50 adalah 9376,6 µg/mL, Berdasarkan nilai IC50  yang  didapat  bahwa  senyawa  tetrapeptida  FLAP  memiliki  aktivitas  antioksidan  yang lemah,  bahwa  tingkat  kekuatan  senyawa  yang  memiliki  aktivitas  antioksidan  terhadap  DPPH yaitu aktivitasnya lemah jika memiliki nilai IC50 > 150 µg/mL (Armala, 2009).
Tabel 1 . Hasil Uji Aktivitas Senyawa Tetrapeptida FLAP
Pada  pengujian  aktivitas  antioksidan  digunakan  pembanding  yaitu  vitamin  C,  Tujuan dilakukan  pembanding  vitamin  C  untuk  melihat  tingkat  aktivitas  antioksidan  dari  senyawa tetrapeptida linier FLAP. Berdasarkan hasil  yang diperoleh bahwa nilai IC50 Vitamin C yaitu 6,6057 ppm, dimana hasil yang diperoleh bahwa aktivitas antioksidan sampel lebih lemah dari
pembanding.
Tabel 2 . Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Vitamin C Konsentrasi (ppm) ABS % inhibisi IC 50 (ppm) 0 0,8517 0 1 0,7472 12,2695 10 0,2198 74,1927 6,6057

## D. Kesimpulan
Berdasarkan  penelitian  ini  dapat  diambil  kesimpulan  bahwa  tetrapeptida  Phe-Leu-Ala-Pro dapat disintesis dengan menggunakan  metode  sintesis peptida fase padat (SPPS) dengan hasil karakterisasi  menggunakan  spektrofotometer  telah  menunjukkan  adanya  puncak  ion  molekul [M+H]  pada  m/z  447,2608  dan  hasil  yang  diperoleh  dari  uji  aktivitas  antioksidan  dan  pada tetrapeptida FLAP didapatkan nilai IC50 sebesar 9376,6 µg/mL sehingga aktivitas antioksidan dari senyawa tersebut lemah.

## Acknowledge
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Universitas  Islam  Bandung  dan  Lab  Sentral Universitas Padjadjaran yang telah memberikan fasilitas untuk melakukan penelitian.

## Daftar Pustaka
[1] Armala,  M.  M.  2009.  Daya  Antioksidan  Fraksi  Air  Ekstrak  Herba  Kenikir  (Cosmos caudatus  H.B.  K)  dan  profil  KLT.  Skripsi,  39.  Yogyakarta:  Fakultas  Farmasi  Universitas Islam Indonesia
[2] Chan,  W.  C.,  2000.  Fmoc  Solide  Phase  Peptide  Synthesis  A  Practical  Approach.  New York: Oxford University press.
[3] Erawati.  2012.  Uji  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Daun  Garciniadaedalanthera  Pierre dengan Metode DPPH (1.1 difenil pikrihidrazil) dan Identifikasi Golongan Senyawa Kimia dari Fraksi Paling Aktif, Skripsi. Depok: FMIPA, Universitas Indonesia.
[4] Fosgerau, K. Hoffman. T., 2015. Peptide therapeutics currents status and future direction. Denmark.
[5] Irwansyah,  2010.  Studi  Struktur  Self-Asembly  Peptida  Ampifil.  Jakarta:Universitas Indonesia Khopkar,S.M. (1990). Konsep Dasar KImia Analitik: Jakarta UI Press.
[6] Jin,  H.  X.  Xu.  H.  P.  Li.  Y.  Zhang.  Q.  W.  &.  Xie.,  H.  2019.  Preparation  and  evalution of peptides with potentional antioxidant activity by microwave assisted enzymatic hydrolysis of collagen from sea cucumber acaudina molpadioides obtained from Zheijiang Province in China, Marine drugs, 17 (3), 169.
[7] Kim,  S.  McAlpine.  S.,  R.  2013.  Solid  Phase  versus  Solution  Phase  Synthesis  of Heterocyclic Macrocycles. J. Molecules, Vol 8: 1111-1121.
[8] Maharani,  R.  Yanti.  E.  F.,  2016.  Sintesis  Heptapeptida  Linear  (H-Tyr-Asp-Pro-Ala- ProPro-Pro-OH) dengan menggunakan Dic/Oksima sebagai reagen pengkopling. Bandung: Departemen  Kimia  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam  Universitas Padjadjaran Bandung.
[9] Molyneux, P. 2004. The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol, 212-217
[10] Sumiarsa,  D.  Marpaung.  C.,  Zainuddin.  A.,  Hidayat.  T.A.,  Harneti.  Maharani.,  R.  dkk. 2019.  Sintesis  Tetrapeptida  PADY  menggunakan  Metode  Fasa  Padat  dan  Aktivitas Antioksidannya.  Departemen  Kimia  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam Universitas Padjadjaran Bandung: Jurnal Kimia Valensi.
[11] Valeur E, Bradley M. 2009. Amide bond formation: beyond the myth of copling reagents. 8 | Eka Nurjanah, et al. Volume 1, No. 2, Tahun 2021, Hal: 1-4 ISSN: 2798-6292 Chem. Soc.
96 | Eka Nurjanah, et al.
Rev. 38: 606-631.