Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology Journal Homepage : http://jurnal.unpad.ac.id/ijpst/ UNPAD

## Antiviral Activity and Toxicity Prediction of Compounds Contained in Figs

## ( Ficus carica L.) by In Silico Method
Sophi Damayanti 1,2 *, Khonsa Khonsa 1 , Tasia Amelia 1
1 Department of Pharmacochemistry, School of Pharmacy, Bandung Institute of Technology, Bandung, Indonesia
2 University Center of Excellence on Artificial Intelligence for Vision, Natural Language Processing & Big Data Analytics (U-CoE AI-VLB)-ITB
Submitted 4 August 2020; Revised 6 September 2020; Accepted 20 October 2020; Published 5 February 202 1 *Corresponding author: sophi.damayanti@fa.itb.ac.id

## Abstract
Viral infection is a global health problem that can cause endemic to a pandemic. Compounds delivered from plants has been developed as an alternative antiviral agent. One of the plants that can be used as antiviral therapy is Ficus carica L. (figs). This research aims to predict the inhibitory activity and toxicity of compounds in figs as an antiviral for HIV-1 using the in silico method. Compounds were docked to the HIV-1 Reverse Transcriptase protein (PDB ID: 3LAL). Three-dimensional structures were modelled using GaussView and optimized using Gaussian 09W. Optimized compounds were docked to the target protein using AutoDock Tools and the interaction to protein binding side was analyzed compared to the standard compounds, namely nevirapine, efavirenz, and doravirine. The compound toxicity was analyzed using ECOSAR and Toxtree. Based on the results, the compounds that have similar interaction to the standard compounds were campesterol which has four similar hydrophobic interactions. Based on the classification of Cramer Rules for toxicity test, campesterol is classified in Class 3 (high toxicity), and according to the Benigni/Bossa Rulebase classification, campesterol is negative for genotoxic and nongenotoxic carcinogenicity.
Keywords: Antivirus, HIV, figs, molecular docking, toxicity.
Prediksi Aktivitas Inhibisi dan Toksisitas Beberapa Senyawa dalam Buah Tin ( Ficus carica L.) Sebagai Antivirus secara In Silico

## Abstrak
Infeksi virus merupakan masalah kesehatan global yang dapat menyebabkan endemi hingga pandemi. Senyawa-senyawa yang berasal dari tumbuhan telah dikembangkan sebagai alternatif terapi antivirus. Salah satu tumbuhan yang dapat digunakan sebagai antivirus adalah Ficus carica L. (Buah Tin). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memprediksi aktivitas inhibisi dan toksisitas beberapa senyawa yang terkandung dalam buah tin (Ficus carica L.) sebagai antivirus untuk HIV-1 menggunakan metode in silico. Senyawa uji dan pembanding ditambatkan ke protein HIV-1 reverse transcriptase (PDB ID: 3LAL).  Struktur  tiga  dimensi  senyawa  uji  dan  pembanding  dimodelkan  menggunakan  GaussView dan dioptimasi menggunakan Gaussian 09W. Senyawa-senyawa yang telah dioptimasi ditambatkan ke protein target menggunakan Autodock Tools dan dianalisis interaksinya pada situs pengikatan protein dengan  membandingkan  terhadap  senyawa  pembanding,  yaitu  nevirapin,  efavirenz,  dan  doravirin. Toksisitas senyawa dianalisis menggunakan ECOSAR dan Toxtree. Berdasarkan hasil analisis, senyawa yang memiliki interaksi paling mirip dengan senyawa pembanding adalah kampesterol dengan 4 interaksi hidrofobik yang sama. Berdasarkan klasifikasi Cramer Rules untuk uji toksisitas, senyawa kampesterol  diklasifikasikan d alam k elas 3  ( toksisitas t inggi) d an b erdasarkan k lasifikasi Benigni/ Bossa Rulebase , senyawa kampesterol tidak bersifat karsinogen genotoksik dan nongenotoksik.
Kata Kunci: Antivirus, buah tin, penambatan molekul, toksisitas.

## 1.  Pendahuluan
Infeksi virus merupakan masalah kesehatan global yang dapat menyebabkan endemi hingga pandemi. Beberapa virus masih belum memiliki pengobatan yang efektif. Pengembangan beberapa obat konvensional mengalami kegagalan dalam melawan infeksi virus dan dapat menimbulkan resistensi virus. Oleh karena itu, salah satu alternatif terapi antivirus yang banyak dikembangkan adalah menggunakan senyawa yang berasal dari tumbuhan. 1 Ficus carica L. (buah tin) merupakan salah satu buah yang banyak dikonsumsi baik dalam bentuk kering maupun segar. Secara in vitro , buah tin memiliki aktivitas antivirus terhadap virus herpes simplex, echovirus, dan adenovirus. 2 Namun penelitian aktivitas antivirus buah tin tersebut belum dikembangkan lebih lanjut dan belum banyak penelitian aktivitas antivirus buah tin terhadap jenis  virus  lainnya.  Berdasarkan  penelitian fitokimia  yang  telah  dilakukan,  buah  tin mengandung senyawa bioaktif seperti senyawa  fenolik,  fitosterol,  asam  organik, antosianin, triterpenoid, kumarin, dan senyawa volatil seperti hidrokarbon, alkohol alifatik, serta beberapa golongan metabolit sekunder lainnya. 3 Beberapa metabolit sekunder yang terkandung dalam buah tin adalah psoralen, angelisin, bergapten, rutaretin, pimpinellin, seselin,  β-sitosterol,  kampesterol,  β-amirin, sianidin-3-O-glikosida, aristolon, dll. 4,5
Di antara antivirus yang berpeluang besar untuk dikembangkan adalah antivirus untuk Human  Immunodeficiency  Virus (HIV).  HIV  merupakan  spesies  lentivirus yang menyerang sel-sel CD4 di dalam sistem kekebalan tubuh. 6 HIV  tipe  1  adalah  virus HIV yang dominan menginfeksi manusia dan menyebabkan epidemi. 7 Berdasarkan data WHO tahun 2018, terdapat 37,9 juta orang di dunia  dan  327.000  orang  di  Indonesia  yang hidup  menderita  HIV.  Obat  yang  digunakan untuk  terapi  HIV  diantaranya  adalah  anti- retroviral dengan mekanisme inhibisi protein nucleoside analogue reverse transcriptase (NRTI), non-nucleoside reverse transcriptase (NNRTI), dan protease (PI).
Tahap awal dalam penemuan obat
baru  yang  saat  ini  banyak  dikaji  adalah studi interaksi secara in silico yang diawali dengan penambatan molekul, yaitu prediksi konformasi dan orientasi ligan di dalam situs pengikatan pada protein target menggunakan suatu perangkat lunak untuk memprediksi aktivitasnya. 8 Keuntungan dari metode in silico adalah lebih ekonomis, efisiensi waktu, dan  pengerjaannya  lebih  mudah.  Hasil  dari studi in silico diuji lebih lanjut secara in vitro dan in vivo . Studi in silico aktivitas senyawa yang terkandung dalam buah tin belum banyak dilaporkan sehingga dilakukan penelitian ini  yang  bertujuan  untuk  memprediksi aktivitas inhibisi dan toksisitas senyawa yang terkandung dalam buah tin ( Ficus carica L.) sebagai antivirus HIV secara in silico .

## 2.  Metode
2.1.  Alat Laptop  Acer  Z476  31TB  Intel(R) Core(TM)  i3-6006U  CPU  @2,20  GHz RAM 4GB, Program AutoDock 4.2.6, AutoDockTools v.1.5.6 (The Scripps Research Institute,  US),  Discovery  Studio  v.4.0 (BIOVIA,  US),  Gaussian  09W  (Gaussian, Inc.,  US),  GaussView  5.0,  ECOSAR  v2.0 (EPA, US), dan Toxtree v3.1.0 (IDEAconsult Ltd, Bulgaria).

## 2.2.  Prosedur Penelitian

## 2.2.1 Penyiapan Senyawa Uji dan Senyawa Pembanding
Struktur 3D senyawa uji dan senyawa pembanding dimodelkan menggunakan program  GaussView  5.0.  Senyawa  uji yang  dimodelkan  adalah  18  senyawa  yang terkandung dalam buah tin, yaitu angelisin, aristolon, asam klorogenat, bergapten, β-amirin, β-sitosterol, kampesterol, metoksalen, nikotiflorin, pimpinellin, psoralen, rutaretin, rutin, seselin, sianidin 3-O-rutinosida,  stigmasterol,  (-)-epikatekin, dan (+)-katekin. Adapun senyawa pembanding yang digunakan adalah nevirapine, efavirenz, dan doravirin.
Optimasi geometri struktur 3D senyawa uji  dan  senyawa  pembanding  yang  telah dibuat dilakukan dengan program Gaussian
09W. Teori yang digunakan    adalah Density Functional Theory (DFT) dan B3LYP dengan basis  set  6-31G.  Hasil  dari  proses  optimasi geometri  berupa  file  dengan  ekstensi  .log yang  selanjutnya  dikonversi  menjadi  format .mol2.
2.2.2 Struktur Tiga Dimensi Protein Target Struktur  kristal  protein  target  HIV-1 RT (PDB ID: 3LAL) diunduh melalui RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org).
2.2.3 Preparasi Protein Target
Protein target dipreparasi terlebih dahulu menggunakan program Discovery Studio v.4.0. Preparasi dilakukan dengan cara memisahkan ligan   alami dan protein target, menghilangkan molekul air dari protein target, menghilangkan molekul lain yang tidak digunakan, dan memilih daerah protein yang akan dijadikan target untuk penambatan molekul.
2.2.4 Validasi Penambatan Molekul
Dilakukan validasi penambatan molekul dengan menambatkan ulang ( redocking ) molekul ligan alami 3-{[3-ethyl- 5-(1-methylethyl)-2,6-dioxo-1,2,3,6- tetrahydropyrimidin-4-yl]carbonyl}-5- methylbenzonitrile (KRV)  kepada  protein target menggunakan program AutoDock v.4.2.6.  Hasilnya  diperoleh  nilai root mean square deviation (RMSD)  yang  dapat digunakan sebagai parameter validasi. Proses validasi dinyatakan berhasil apabila diperoleh nilai RMSD <2 Å pada cluster dengan anggota terbanyak.
2.2.5 Studi Interaksi secara In Silico dengan Penambatan Molekul Studi interaksi secara in silico dilakukan dengan  menambatkan  senyawa  uji  dan senyawa pembanding yang telah dioptimasi ke  protein  target  HIV-1  RT  menggunakan program AutoDock v.4.2.6. Pengaturan ukuran gridbox , grid spacing , dan koordinat yang digunakan sama dengan pengaturan pada validasi penambatan molekul. Digunakan ukuran gridbox x = 50, y = 50, dan z = 50, koordinat  x  =  9,429,  y  =  13,086,  dan  z  =
18,186, serta grid spacing = 0,475 Å.
2.3.1. Analisis Hasil Penambatan Molekul Analisis hasil penambatan molekul dilakukan menggunakan konformasi terbaik ligan hasil penambatan molekul yang dipilih dengan cara menentukan konformasi ligan yang memiliki energi bebas ikatan paling rendah pada kluster terbanyak. Setelah itu dilakukan analisis dengan membandingkan interaksi  senyawa  uji  dengan  protein  target terhadap interaksi senyawa pembanding dengan protein target. Senyawa yang interaksinya paling menyerupai senyawa pembanding pada masing-masing protein ditentukan.
2.2.6 Prediksi Toksisitas secara In Silico dengan ECOSAR Prediksi  toksisitas  senyawa  uji dan senyawa pembanding dilakukan menggunakan program ECOSAR v2.0. Kode  SMILES  ( Simplified  Molecular Input  Line  Entry  System )  atau  nomor  CAS ( Chemical Abstracts Service )  senyawa  uji serta pembanding yang diperoleh dari situs Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/)  dimasukkan  pada  mesin  pencari  di program ECOSAR. Program ECOSAR akan  menampilkan  nilai  LC50  (50% lethal concentration )  untuk  toksisitas  akut  pada organisme ikan dan daphnid serta nilai EC50 (50% effective concentration ) untuk toksisitas akut  pada  organisme  alga  hijau  serta  nilai ChV  ( chronic value )  toksisitas  kronis  pada organisme ikan, daphnid, dan alga hijau.
2.2.7 Prediksi Toksisitas secara In Silico dengan Toxtree Prediksi  toksisitas  senyawa  uji dan senyawa pembanding dilakukan menggunakan  program  Toxtree  v3.1.0. Kode  SMILES  atau  nomor  CAS  senyawa uji  serta  pembanding  yang  diperoleh  dari situs Pubchem, dibuat tabel pada Ms Excel, kemudian  disimpan  dengan  ekstensi  file .txt. File tersebut dibuka pada program Toxtree kemudian dipilih metode yang akan digunakan. Metode analisis toksisitas pada program Toxtree yang digunakan adalah
Cramer rules , START Biodegradability , Skin irritation/ skin corrotion , Carcinogenicity ( genotoxic and nongenotoxic ) and mutagenicity  rulebase by ISS. Masing- masing senyawa akan dikategorikan ke dalam beberapa kelas berdasarkan parameter dari metode yang digunakan.
3.  Hasil
3.1.  Hasil Validasi Penambatan Molekul Dari proses validasi penambatan molekul yang dilakukan, diperoleh nilai energi  bebas  ikatan  -10,70  kkal/mol, konstanta inhibisi 14,26 nM, dan RMSD 1,447 Å. Hasil penambatan molekul senyawa uji  dan  senyawa  pembanding  tertera  pada Tabel 1. Berdasarkan data tersebut, senyawa uji yang memiliki energi bebas ikatan paling rendah  adalah  senyawa  β-sitosterol  sebesar -12,35     kkal/mol.     Interaksi senyawa uji
dan senyawa pembanding hasil penambatan molekul divisualisaikan menggunakan program Discovery Studio.

## 3.2.  Hasil  Penambatan  Molekul  dan Analisisnya
Interaksi senyawa pembanding nevirapin,  efavirenz,  dan  doravirin  dengan protein  HIV-1  RT  dapat  dilihat  pada  Tabel 2 beserta visualisasinya pada Gambar 1. Interaksi yang sama pada ketiga pembanding tersebut adalah VAL106, LYS103, LEU100, dan  LEU234  pada  interaksi  hidrofobik, serta  HIS235  pada  interaksi  van  der  waals. Interaksi senyawa uji dibandingkan terhadap interaksi tersebut, diperoleh hasil pada Tabel 3.  Berdasarkan  data  tersebut,  senyawa  uji yang memiliki interaksi paling mirip dengan interaksi  pembanding  pada  protein  HIV-RT adalah senyawa kampesterol.
Senyawa Energi Bebas Ikatan (kkal/mol) Konstanta Inhibisi (nM) Ligan KRV -10,70 0,01 x 105 (-)-Epikatekin -7,97 0,01 x 105 (+)-Katekin -7,40 0,04 x 105 Angelisin -6,85 0,09 x 105 Aristolon -8,68 430,90 Asam Klorogenat -6,65 0,13 x 105 Bergapten -7,12 0,06 x 105 β-Amirin -7,33 0,04 x 105 β-Sitosterol -12,35 0,88 Kampesterol -11,60 3,13 Metoksalen -7,30 0,04 x 105 Nikotiflorin -6,72 0,12 x 105 Pimpinellin -7,31 0,04 x 105 Psoralen -6,88 0,09 x 105 Rutaretin -7,12 0,06 x 105 Rutin -6,98 0,08 x 105 Seselin -8,83 338,83 Sianidin 3-O-rutinosida -6,94 0,08 x 105 Stigmasterol -8,08 0,01 x 105 Nevirapin -8,20 970,37 Efavirenz -8,59 502,94 Doravirin -10,68 14,77

## Tabel 1. Hasil Penambatan Molekul Senyawa Uji dan Pembanding pada Protein HIV-1 RT
Berdasarkan visualisasi hasil penambatan  molekul  (Gambar  2),  senyawa kampesterol memiliki 4 interaksi hidrofobik yang sama dengan pembanding pada LEU234 (1 interaksi), LYS103 (2 interaksi), LEU100  (2  interaksi),  dan  VAL106  (5 interaksi).  Sedangkan  senyawa  β-Sitosterol hanya  memiliki  3  interaksi  hidrofobik  yang sama  dengan  pembanding  pada  VAL106  (4 interaksi), LEU234 (2 interaksi), dan LEU100 (3 interaksi).
3.3.  Hasil  Uji  Toksisitas  ECOSAR  dan Toxtree Berdasarkan  uji  toksisitas  akuatik menggunakan program ECOSAR, senyawa kampesterol dan β-Sitosterol diklasifikasikan dalam toksisitas rendah, pembanding nevirapin  dan  efavirenz  termasuk  toksisitas tinggi, sedangkan pembanding doravirin termasuk toksisitas sedang.
Pada  uji  toksisitas  menggunakan program Toxtree, Cramer Rules mengklasifikasikan senyawa-senyawa tersebut ke dalam toksisitas tinggi. Menurut Benigni/Bossa rulebase , senyawa-senyawa
tersebut diprediksi tidak bersifat karsinogen genotoksik dan nongenotoksik, kecuali pembanding doravirin diprediksi bersifat karsinogen nongenotoksik. Berdasarkan klasifikasi START Biodegradability dan Skin irritation/skin corrotion , senyawa-senyawa tersebut diprediksi merupakan senyawa yang sulit mengalami biodegradasi dan tidak korosif.
4.  Pembahasan Pada penelitian ini, dilakukan studi interaksi dengan menambatkan beberapa senyawa bahan alam yang terkandung dalam buah tin ( Ficus carica L.)  dengan  protein target HIV-1 reverse transcriptase (PDB ID: 3LAL) karena protein tersebut berperan untuk mengubah genom RNA untai tunggal menjadi salinan DNA untai ganda dengan mengatalisis polimerisasi DNA dan pembelahan RNase H. 9 Apabila protein tersebut dihambat, HIV tidak dapat  mengubah  RNA  virus  menjadi  DNA dan tidak dapat mengintegrasikan materi genetiknya ke dalam sel inang sehingga replikasi virus tidak terjadi.
Penambatan molekul dilakukan untuk
Gambar 1. Interaksi  pembanding  doravirin  (a),  interaksi  pembanding  nevirapin  (b),  interaksi pembanding efavirenz (c) dengan HIV-1 RT.

## memodelkan interaksi antara molekul kecil
(ligan)  dengan  protein  pada  tingkat  atom dan mengarakterisasi perilaku ligan di situs pengikatan protein target. Proses penambatan molekul melibatkan dua langkah dasar, yaitu prediksi konformasi, posisi, dan orientasi ligan di dalam situs-situs pengikatan protein target (pose ligan) serta prediksi nilai afinitas pengikatan. 10 Pada proses penambatan molekul, biasanya protein dianggap rigid/kaku sedangkan  ligan  dianggap  fleksibel  (bebas bergerak).  Selain  itu,  proses  penambatan molekul dilakukan dalam kondisi tanpa air dan tidak sesuai dengan kondisi lingkungan tubuh. 11 Tahapan dalam proses penambatan molekul meliputi penentuan dan pemodelan senyawa kandidat, penentuan dan preparasi protein target, validasi proses penambatan molekul, penambatan molekul senyawa kandidat dan pembanding, penentuan pose ligan terbaik, visualisasi hasil penambatan molekul, dan analisis hasil penambatan molekul. Di antara program yang dapat digunakan untuk penambatan molekul adalah Autodock, cDocker,  FLIPdock,  GOLD,  Glide,  iDock,
SwissDock, Pyrx, dll. Program Autodock banyak digunakan untuk penambatan molekul karena merupakan program yang mudah diperoleh secara gratis.
Algoritma pencarian konformasi terbaik ligan pada sisi aktif target pada program Autodock menggunakan algoritma genetik yang mensimulasikan teori evolusi Darwin. Parameter model yang mewakili derajat  kebebasan  ligan  dikode  dalam  gen. Gen-gen tersebut menyusun suatu kromosom yang mewakili pose ligan. Kromosom diubah secara acak dengan algoritma mutasi dan persilangan. Perubahan acak dan pertukaran gen menghasilkan pose ligan baru. 12

## 4.1. Hasil Validasi Penambatan Molekul
Sebelum dilakukan penambatan senyawa  uji  dan  pembanding  ke  protein target, dilakukan proses validasi penambatan molekul terlebih dahulu dengan cara menambatkan kembali ligan alami ke protein target. Validasi penambatan molekul dilakukan untuk mengukur tingkat kesahihan metode penambatan molekul yang digunakan. Parameter validasi penambatan molekul adalah nilai RMSD ( Root  Mean  Square
Gambar 2. Interaksi pembanding doravirin (a), senyawa kampesterol (b), dan senyawa β-Sitosterol dengan HIV-1 RT.
Deviation )  yang  menunjukkan  perbedaan jarak  pose  ligan  alami  sebelum  dan  setelah redocking. Proses validasi dinyatakan berhasil apabila program mampu mengembalikan pose ligan hasil redocking ke pose semula dengan nilai RMSD < 2 Å. 13 Proses validasi yang dilakukan dinyatakan telah valid karena diperoleh nilai RMSD sebesar 1,447 Å.
4.2. Analisis Hasil Penambatan Molekul Setelah metode penambatan molekul tervalidasi, dilakukan studi interaksi senyawa
uji  yang  terkandung  dalam  buah  tin  dengan masing-masing protein target.  Senyawa uji  dan  senyawa  pembanding  ditambatkan pada protein target kemudian hasilnya dianalisis. Analisis hasil penambatan molekul yang dilakukan berupa perbandingan interaksi  senyawa  uji  dengan  protein  target terhadap interaksi senyawa pembanding dengan protein target. Digunakan senyawa pembanding berupa obat yang secara klinis atau secara in vivo atau secara in vitro memiliki  efek  antivirus  yang  bekerja  secara
Senyawa Interaksi hidrofobik Interaksi van der waals Asam amino Jumlah Asam amino Jumlah (-)-Epikatekin LEU100 3 - 0 LYS103 VAL106 (+)-Katekin LEU100 3 HIS235 1 LYS103 VAL106 Angelisin VAL106 1 - 0 Aristolon LEU100 3 - 0 VAL106 LEU234 Asam Klorogenat - 0 - 0 Bergapten VAL106 1 - 0 β-Amirin - 0 - 0 β-Sitosterol LEU100 3 - 0 VAL106 LEU234 Kampesterol LEU100 4 - 0 LYS103 VAL106 LEU234 Metoksalen VAL106 1 - 0 Nikotiflorin - 0 - 0 Pimpinellin VAL106 1 - 0 Psoralen VAL106 1 - 0 Rutaretin VAL106 1 - 0 Rutin - 0 - 0 Seselin VAL106 2 - 0 LEU234 Sianidin3-O-rutinosida LEU100 3 HIS235 1 VAL106 LEU234 Stigmasterol LEU100 1 - 0

## Table 2. Hasil Perbandingan Interaksi Senyawa Uji terhadap Senyawa Pembanding
spesifik pada protein target.  Pada penelitian ini, digunakan senyawa pembanding berupa obat antiretrovirus dengan mekanisme inhibisi protein reverse transcriptase yang telah disetujui Food and Drug Administration (FDA),  yaitu  nevirapin,  efavirenz,  dan doravirin.
Hasil  penambatan  molekul  akan memberikan konformasi-konformasi ligan di situs aktif protein yang berada dalam gridbox kemudian memberi peringkat konformasi tersebut melalui scoring function .  Tujuan dari scoring function adalah untuk mencari pose ligan yang benar di antara pose ligan yang salah. Program Autodock menggunakan fungsi skoring berbasis medan gaya, yaitu fungsi yang menyatakan energi sistem dihasilkan  dari  jumlah  energi  penyusunnya seperti ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, interaksi van der waals, interaksi elektrostatik, gaya torsi, dll berdasarkan prinsip-prinsip fisika.  Kelemahan  fungsi  tersebut  adalah tidak mempertimbangkan adanya pelarut yang dapat mempengaruhi interaksi ligan
Senyawa Ikatan hidrogen Interaksi hidrofobik Interaksi van der waals Interaksi lain Pi-sigma Pi-alkil/ Alkil Pi-Pi Halogen Pi- lone pair Nevirapin LYS101
VAL106 LEU100 TYR318 LYS102
PHE227 HIS235
PRO236
- -
LYS103
VAL179 TYR188
LEU234 Efavirenz LYS100 LEU100 PRO95 - VAL179
VAL189 HIS235 TYR318 TYR188 - LYS103
VAL106
TYR181 PHE227
TRP229
LEU234 Doravirin LYS103 LEU100 VAL106 PRO95
TYR188 TRP229 TYR318 LYS102 VAL189 GLY190 HIS235 TYR188 PRO236
LEU100
LYS103 VAL106 VAL179 TYR181 TYR188 PHE227

## TRP229

## LEU234
Table 3. Interaksi Senyawa Pembanding dengan Protein HIV-1 RT
dengan target. 14
Hasil  penambatan  molekul  senyawa uji dan senyawa pembanding tertera pada tabel 1. Dari hasil penambatan molekul, diperoleh nilai energi bebas ikatan pembanding nevirapin,  efavirenz,  dan  doravirin  sebesar -8,20, -8,59, dan -10,68 kkal/mol. Nilai energi bebas ikatan senyawa uji yang paling rendah adalah  senyawa  β-Sitosterol  sebesar  -12,35 kkal/mol. Senyawa uji β-Sitosterol memiliki nilai energi bebas ikatan yang lebih rendah dari ketiga pembanding. Untuk mengatahui senyawa yang memiliki aktivitas inhibisi protein terbaik, diperlukan analisis interaksi hasil penambatan molekul.
Interaksi  senyawa  uji  dan  senyawa pembanding hasil penambatan molekul dengan protein divisualisaikan menggunakan program Discovery Studio. Interaksi yang terjadi antara ligan dan protein dapat berupa ikatan hidrogen, seperti ikatan hidrogen konvensional,   ikatan karbon   hidrogen,   dan ikatan  pi-donor, interaksi hidrofobik seperti pi-alkil, alkil, pi-sigma, pi-pi T-shaped , dan pi-pi stacked , interaksi elektrostatik, seperti jembatan garam, pi-kation, dan pi-anion, serta interaksi lainnya, seperti interaksi halogen dan pi-lone pair . Dibandingkan hasil visualisasi senyawa  uji  dan  senyawa  pembanding dengan melihat interaksi yang sama pada residu asam amino yang sama. Apabila digunakan pembanding >1 maka dianalisis terlebih dahulu interaksi yang sama pada seluruh senyawa pembanding kemudian hasilnya dibandingkan dengan interaksi senyawa uji. Interaksi yang sama pada seluruh pembanding  dapat  menunjukkan  interaksi yang memberikan efek karena interaksi yang memberikan efek terdapat pada semua obat. Pada Gambar 1, senyawa pembanding doravirin memiliki 1 ikatan hidrogen konvensional  pada  LYS103,  13  interaksi pi-alkil/alkil  pada  VAL179  (1  interaksi), TYR181 (2 interaksi), LEU234 (1 interaksi), PRO95  (1  interaksi),  PHE227  (1  interaksi), LEU100 (1 interaksi), VAL106 (2 interaksi), TYR188 (1 interaksi), LYS103 (2 interaksi), dan  TRP229  (1  interaksi),  1  ikatan  halogen pada TYR188, 2 interaksi pi-pi stacked pada
TYR188  dan  TYR318,  2  interaksi  pi-pi T-shaped pada  TRP229,  1  interaksi pi-lone pair pada PRO236, serta 3 interaksi van der waals pada TYR318, TRP229, dan TYR188. Senyawa pembanding nevirapin memiliki 1 ikatan hidrogen konvensional pada LYS101, 1 ikatan pi-sigma pada VAL106, 8 ikatan  pi-alkil/alkil  pada  TYR188,  LYS103 (2 interaksi), VAL179, LEU100 (2 interaksi), LEU234, dan VAL106, serta 4 interaksi van der  waals  pada  PHE227,  HIS235,  PRO236, dan LYS102.
Sedangkan senyawa pembanding efavirenz  memiliki  1  ikatan  hidrogen konvensional  pada  LYS100  (1,91843  Å), 10  ikatan  pi-alkil/alkil  pada  VAL106  (2 interaksi),  VAL100,  TYR188,  LYS103, LEU234,  PHE227,  TYR181,  TRP229,  dan PRO95,  2  ikatan  halogen  pada  TYR188, dan 5 interaksi van der waals pada VAL179, GLY190, VAL189, HIS235, dan TYR318. Interaksi yang sama pada ketiga pembanding  tersebut  adalah  VAL106, LYS103, LEU100, dan LEU234 pada interaksi hidrofobik  dan  HIS235  pada  interaksi  van der waals seperti yang tertera pada Tabel 2. Pembanding doravirin memiliki energi bebas ikatan  sebesar  -10,68  kkal/mol  yang  lebih rendah  dari  nevirapin  dan  efavirenz  dengan energi  bebas  ikatan  -8,20  dan  -8,59  kkal/ mol.  Hal  tersebut  disebabkan  oleh  interaksi hidrofobik pada pembanding doravirin lebih banyak dengan jumlah 17 interaksi. Pada  Tabel  3,  senyawa  uji  yang memiliki interaksi paling mirip dengan interaksi ketiga pembanding (nevirapin, efavirenz,  dan  doravirin)  pada  protein  HIV- RT adalah senyawa kampesterol dengan 4 interaksi  hidrofobik  pada  LEU234,  LYS103 (2  interaksi),  LEU100  (2  interaksi),  dan VAL106  (5  interaksi).  Interaksi  yang  sama pada  senyawa  uji  kampesterol  dan  ketiga pembanding menunjukkan interaksi senyawa- senyawa tersebut berada di situs yang sama pada  protein  HIV-1  RT  dengan  kekuatan interaksi yang serupa sehingga dapat diprediksi senyawa uji kampesterol memiliki aktivitas inhibisi terhadap protein HIV-1 RT.
Pembanding doravirin memiliki energi bebas ikatan sebesar -10,68 kkal/mol,
sedangkan senyawa kampesterol memiliki energi bebas ikatan yang lebih rendah yaitu sebesar -11,60 kkal/mol. Hal tersebut sesuai dengan hasil yang ditunjukkan pada Gambar 2, dimana senyawa kampesterol memiliki memiliki interaksi hidrofobik lebih banyak dari pembanding doravirin.
Adapun senyawa β-Sitosterol memiliki nilai energi bebas ikatan yang paling rendah,  yaitu  sebesar  -12,35  kkal/mol karena   memiliki   interaksi   hidrofobik yang lebih banyak sejumlah 27 interaksi. 27 interaksi tersebut adalah 26 interaksi pi-alkil/ alkil pada VAL179 (2 interaksi), VAL108 (2 interaksi), LYS223 (1 interaksi), TRP229 (2 interaksi),  TYR188  (4  interaksi),  VAL106 (4 interaksi), LEU234 (2 interaksi), LEU100 (3 interaksi), serta 1 interaksi pi-sigma pada PHE227.  Namun  senyawa  β-Sitosterol memiliki kemiripan interaksi dengan pembanding yang lebih sedikit dari senyawa kampesterol, yaitu 3 interaksi hidrofobik pada VAL106, LEU234, dan LEU100.
4.3. Analisis Toksisitas Toksisitas adalah ukuran dari kumpulan efek bahan kimia yang tidak diinginkan     atau merugikan.   Derajat toksisitas suatu senyawa dapat  bersifat  kuantitatif  (seperti  LD50, EC50,  ChV,  dll)  dan  kualitatif  baik  secara binary (seperti toksik atau tidak toksik) atau secara ordinary (seperti toksisitas rendah, sedang, atau tinggi). Uji toksisitas bertujuan untuk mengidentifikasi efek berbahaya suatu senyawa pada manusia, hewan, tanaman, atau lingkungan melalui paparan akut atau paparan kronis. Adapun prediksi toksisitas secara in silico bertujuan untuk melengkapi uji toksisitas secara in vitro dan in vivo dengan keuntungan dapat  mengurangi  kebutuhan  hewan  uji, mengurangi biaya dan waktu, meningkatkan prediksi toksisitas dan penilaian keamanan, serta  dapat  memperkirakan  toksisitas  zat kimia sebelum disintesis. 15 Prediksi toksisitas menggunakan ECOSAR v2.0 dilakukan untuk memprediksi toksisitas akut dan kronis pada komunitas perairan umum. Environmental Protection Agency (EPA)  telah  memfokuskan  model toksisitas perairan untuk organisme air tawar
karena sebagian besar pelepasan bahan kimia industri masuk ke dalam air tawar. Toksisitas akut merupakan efek toksik organisme air tawar  setelah  paparan  jangka  pendek  suatu senyawa yang dapat dianalisis dari nilai LC50 ( Lethal Concentration ) organisme ikan selama 96 jam, LC50 organisme daphnid 48 jam, dan EC50 ( Effect Concentration ) organisme alga hijau  selama  96  jam.  Sedangkan  toksisitas kronik merupakan efek toksik organisme air tawar  setelah  paparan  jangka  panjang  suatu senyawa yang dapat dianalisis dari nilai ChV  ( Chronic  Value )  pada  organisme  ikan, daphnid, dan alga hijau. Parameter yang harus diperhatikan dalam analisis toksisitas dengan program ECOSAR adalah berat molekul, nilai logKow, dan kelarutan dalam air. ECOSAR memiliki batas maksimum nilai logKow untuk setiap QSAR yang digunakan. Jika log Kow melebihi batas, terjadi “ no effect at saturation ” (tidak ada efek saat jenuh) selama durasi paparan yaitu tidak teramati adanya efek toksisitas karena telah terjadi kejenuhan. Kelarutan dalam air suatu senyawa harus dibandingkan dengan nilai toksisitas yang diperoleh, apabila nilai toksisitas secara signifikan lebih besar dari kelarutan dalam air maka  terjadi no  effect  at  saturation (NES). Apabila efek konsentrasi di bawah kelarutan dalam air maka hasil prediksi toksisitas diklasifikasikan berdasarkan nilai LC50 atau EC50 pada toksisitas akut dan nilai ChV pada toksisitas kronik. Jika efek konsentrasi ≥ 10x di atas kelarutan dalam air maka tidak ada efek saat jenuh ( low concern ) dan jika efek konsentrasi < 10x di atas kelarutan dalam air maka  tidak  ada  efek  saat  jenuh  atau  dapat terjadi efek. 16
Berdasarkan  data  hasil  uji  toksisitas akuatik  menggunakan  ECOSAR  (Tabel  4), diperoleh bahwa senyawa kampesterol dan β-Sitosterol memiliki nilai logKow melebihi batas  maksimum  logKow  sehingga  terjadi “ no  effect  at  saturation ” di mana senyawa- senyawa tersebut tidak cukup larut dalam air sehingga efek toksisitasnya tidak teramati. Oleh karena itu, kedua senyawa tersebut termasuk dalam kategori low concern atau memiliki  toksisitas  rendah  (cukup  aman)
pada organisme air.
Senyawa pembanding nevirapin dan efavirenz termasuk dalam klasifikasi toksisitas high concern karena  memiliki  nilai  LC50 atau EC50 pada toksisitas akut  < 1 mg/L atau memiliki nilai  ChV  pada toksisitas kronik < 0,1 mg/L. Kedua senyawa tersebut memiliki toksisitas yang tinggi pada organisme air sehingga pembuangan limbah kimia ke perairan  perlu  diperhatikan.  Diperlukan  uji toksisitas  lebih  lanjut  untuk  mengetahui apakah keempat senyawa tersebut memiliki toksisitas  yang  tinggi  juga  pada  manusia. Adapun senyawa doravirin dikategorikan dalam moderate concern karena memiliki nilai LC50 atau EC50 pada toksisitas akut > 1 dan < 100 mg/L  atau memiliki nilai ChV pada toksisitas kronik > 0,1 dan < 10 mg/L. Prediksi  toksisitas  juga  dilakukan  pada senyawa uji menggunakan program Toxtree.
Parameter    yang    digunakan    untuk prediksi toksisitas tersebut adalah Cramer rules , START  Biodegradability , Skin irritation/skin corrosion , Carcinogenicity
( genotox  and  nongenotox )  dan mutagenicity rulebase by ISS. Hasil uji analisis toksisitas dengan program Toxtree tertera pada Tabel 4. Berdasarkan Cramer rules , toksisitas
suatu senyawa dikategorikan menjadi 3 kelas yaitu  toksisitas  rendah  (kelas  1),  toksisitas sedang (kelas 2) dan toksisitas tinggi (kelas 3). Senyawa yang diuji termasuk dalam kelas 3  karena  pada  nevirapin  cincin  heterosiklik dengan substituen kompleks, pada efavirenz terdapat  elemen  selain  C,  H,  O,  N,  dan  S divalent, dan pada doravirin memiliki gugus fungsi yang dapat meningkatkan toksisitas. Senyawa  kampesterol  dan  β-Sitosterol termasuk dalam kelas 3 namun pada program Toxtree  tidak  teridentifikasi  adanya  struktur yang mengkategorikan kedua senyawa tersebut ke dalam kelas 3.
Berdasarkan parameter START Biodegradability , senyawa dalam kelas 1 merupakan senyawa yang mudah dibiodegradasi, kelas 2 merupakan senyawa persistent ,  dan  kelas  3  merupakan  senyawa yang belum diketahui biodegradabilitasnya. Diketahui  senyawa  yang  diuji  merupakan senyawa persistent yaitu senyawa yang relatif bertahan lama di lingkungan karena memiliki 2 atau lebih cincin.
Menurut parameter Skin irritation/ skin corrosion ,  senyawa  uji  dikategorikan menjadi  7  kelas,  yaitu  tidak  korosif  pada kulit (kelas 1), tidak mengiritasi atau korosif
Senyawa Toksisitas akuatik Cramer rules Skin irritation START biodegradabilty Benign/Bossa rulebase Genotoxic carcinogenicity Nongenotoxic carcinogenicity Kampesterol Low concern Kelas 3 Tidak korosif Persistent Negatif Negatif β-Sitosterol Low concern Kelas 3 Tidak korosif Persistent Negatif Negatif Nevirapin High concern Kelas 3 Tidak korosif Persistent Negatif Negatif Efavirenz High concern Kelas 3 Tidak korosif Persistent Negatif Negatif Doravirin Moderate concern Kelas 3 Tidak korosif Persistent Negatif Structural alert
Table 4. Hasil Analisis Uji Toksisitas dengan Program ECOSAR dan Toxtree
pada kulit (kelas 2), tidak mengiritasi (kelas 3),  mengiritasi  kulit  (kelas  4),  korosif  pada kulit (kelas 5), mengiritasi atau korosif pada kulit (kelas 6), dan tidak diketahui sifat iritasi atau korosifnya pada kulit (kelas 7). Senyawa yang diuji temasuk dalam kelas 1, yaitu tidak korosif karena memiliki berat molekul > 350 g/mol. Berdasarkan carcinogenicity ( genotox and  nongenotox )  dan mutagenicity  rulebase by  ISS ,  senyawa  uji  diklasifikasikan  ke dalam 10 kelas yaitu struktur alert untuk karsinogen genotoksik (kelas 1), struktur alert untuk  karsinogen  nongenotoksik  (kelas  2), berpotensi mutagen Salmonella typhimurium TA100 berdasarkan QSAR ( Quantitative Structure  Activity  Relationship )  (kelas 3),  tidak  berpotensi  mutagen Salmonella typhimurium TA100 berdasarkan QSAR (kelas 4), berpotensi karsinogen berdasarkan QSAR (kelas 5), tidak berpotensi karsinogen berdasarkan QSAR (kelas 6), untuk penilaian lebih baik dapat diterapkan perhitungan QSAR (kelas  7),  negatif  karsinogen  genotoksik (kelas  8),  negatif  karsinogen  nongenotoksik (kelas  9), error ketika diterapkan decision tree (kelas 10). Senyawa doravirin termasuk dalam kelas 2 dan 8 karena memiliki gugus benzen terhalogenasi, sementara senyawa lainnya termasuk  dalam  kelas  8  dan  9  karena  tidak memiliki struktur yang dapat meningkatkan potensi karsinogen genotoksik dan nongenotoksik.
5.  Simpulan Hasil  studi  interaksi  senyawa  yang terkandung dalam buah tin dan protein target  HIV-1  RT  menggunakan  program Autodock  menunjukkan  bahwa  senyawa yang interaksinya paling menyerupai senyawa pembanding adalah kampesterol dengan 4 interaksi hidrofobik pada LEU234, LYS103, LEU100, dan VAL106. Berdasarkan klasifikasi Cramer Rules untuk uji toksisitas, senyawa kampesterol diklasifikasikan dalam kelas  3  (toksisitas  tinggi)  dan  berdasarkan klasifikasi Benigni/Bossa Rulebase , senyawa kampesterol tidak bersifat karsinogen genotoksik dan nongenotoksik. Senyawa
kampesterol  menunjukkan  toksisitas  yang rendah pada organisme air. Senyawa tersebut berpotensi baik untuk menjadi dasar pengembangan obat anti HIV.

## Daftar Pustaka
1.  Denaro M, Smeriglio A, Barreca D, Francesco CD, Occhiuto C, Milano G, Trombetta D. Antiviral activity of plants and their isolated bioactive compounds: an update.  Phytother  Res.  2020;34(4):742- 768.
2. Badgujar SB, Patel VV, Bandivdekar AH, Mahajan RT, Bandivdekar AH, Mahajan RT. Traditional uses, phytochemistry and pharmacology of Ficus carica: a review. Pharm Biol. 2014;52(11):1487-1503.
3.  Mawa  S,  Husain  K,  Jantan  I.  Ficus carica  L.  (moraceae):  phytochemistry, traditional uses and biological activities. Evidence-based Complement Altern Med. 2013;2013:1-8.
4.  Marrelli M, Menichini F, Statti GA, Bonesi M, Duez P, Menichini F, Conforti F. Changes in the phenolic and lipophilic composition, in the enzyme inhibition and antiproliferative activity of Ficus carica L. cultivar Dottato fruits during maturation. Food  Chem  Toxicol.  2012;50(3-4):726- 733.
5. Loizzo  MR,  Bonesi  M,  Pugliese  A, Menichini F, Tundis R. Chemical composition and bioactivity of dried fruits and honey of Ficus carica cultivars Dottato, San Francesco and Citrullara. J Sci Food Agric. 2014;94(11):2179-2186.
6. Yuliandra  Y,  Nosa  US,  Raveinal  R, Almasdy D. Terapi antiretrovirus pada pasien  HIV/AIDS  di  RSUP.  Dr.  D. Djamil  Padang:  kajian  sosiodemografi dan evaluasi obat. J Sains Farm Klin. 2017;4(1):1-8.
7.  Magiorkinis G, Angelis K, Mamais I. The  global  spread  of  HIV-1  subtype B epidemic. Infect Genet Evol. 2016;46:169-179.
8.  Pinzi  L,  Rastelli  G.  Molecular  docking: shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 2019;20(18):1-23.
9. Seal A, Aykkal R, Babu RO, Ghosh
MG.  Docking  Study  of  HIV-1  Reverse Transcriptase         with Phytochemicals. Bioinformation. 2011;5(10):430-439.
10. Meng XY, Zhang HX, Mezei M, Cui M. Molecular docking: a powerful approach for structure-based drug discovery. Current Computer-Aided Drug Design. 2010;7(2):146-157.
11. Pantsar  T,  Poso  A.  Binding  affinity  via docking:  fact  and  fiction.  Molecules. 2018;23(8):1-11.
12. Guan  B,  Zhang  C,  Ning  J.  Genetic Algorithm with a crossover elitist preservation mechanism for protein– ligand docking. AMB Express. 2017;7(1):174.
13. Bursulaya BD, Totrov M, Abagyan R,  Brooks  CL.  Comparative  study  of
several  algorithms  for  flexible  ligand docking. J Comput Aided Mol Des. 2003;17(11):755–763.
14. Huang  SY,  Grinter  SZ,  Zou  X.  Scoring functions and their evaluation methods for protein-ligand docking: recent advances and future directions. Phys Chem Chem Phys. 2010;12(40): 12899–12908.
15. Raies AB, Bajic VB. In silico toxicology: computational methods for the prediction of  chemical  toxicity.  Wiley  Interdiscip Rev Comput Mol Sci. 2016;6:147-172.
16. Mayo-Bean K, Moran K, Meylan B, Ranslow P. Methodology document for the ecological structure-activity relationship model  (ECOSAR)  class  program.  New York: US Environ Prot Agency; 2012.