Ekplorasi Bakteri dari Air Laut yang Resisten Terhadap Pestisida Organofospat Khlorpirifos di Perairan Pantai Utara Jawa Tengah
Chrisna Adhi Suryono 1 , Agus Indarjo 1 *, Baskoro Rochaddi 2 , Wilis Ari Setyati 1
1 Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro
2 Departemen Oseanografi, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof Soedarto, SH. Kampus UNDIP Tembalang Semarang 50275 Indonesia
Email: indarjoa@yahoo.com
A bstract

## Bacteria Resistant to Chlorpyrifos Organophosphate Pesticides Isolated from Marin Water of North Coastal Waters of Central Java
Chlorpyrifos from agricultural activities eventually will flow to marine waters through rivers. This research was conducted to determine the resistance of bacteria from seawater of 100ppm Chlorpyrifos.  Three of the five bacterial strains was isolated from seawater from Brebes and Pati, Central Java were selected because they were resistant to the pesticide chlorpyrifos. Analysis of 16S rRNA gene sequences showed that the isolates belonged to the genus Virgibacillus spp. (2 strains) and Bacillus sp (1 strains). This bacterial strain has great potential ability to bioremediation of coastal waters of Brebes and Pati, Central Java from chlorpyrifos pesticide residues.
Keywords: Resistant, Chlorpyrifos, Bacillus albus, Virgibacillus salaries

## Abstrak
Khlorpifos  dari  hasil  kegiatan  pertanian  lama  kelamaan  akan  menuju  ke  perairan  laut  melalui  aliran  sungai.    Penelitian dilakukan  untuk mengetahui  resistensi baktrei  dari air laut  yang  tahan  terhadap  100ppm  Khlorpirifos.    Tiga  dari lima strain bakteri  yang  diisolasi dari air laut  dari  Brebes dan  Pati  Jawa  Tengah dipilih karena  resisten  terhadap  pestisida khlorpirifos. Analisis sekuens gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat termasuk dalam genus Virgibacillus sp. (2 strain) dan Bacillus sp (1 strain). Strain bakteri ini memiliki potensi penggunaan yang besar untuk bioremediasi perairan pesisir Brebes dan Pati Jawa Tengah dari residu pestisida klorpirifos.
Kata Kunci : Resisten, Khlorpirifos, Bacillus albus, Virgibacillus salaries

## PENDAHULUAN
Pesisir  Utara  Pulau  Jawa  merupakan  daerah  pertanian  yang  sangat  luas  dan  untuk mendukung keberhasilan pertanian dibutuhkan pestisida.  Pestisida yang saat ini banyak digunakan adalah  dari  jenis  Organofospat  seperti  Khlorpirifos.    Senyawa  pestisida  Klorpirifos  memiliki  struktur kimia [O, O-diethyl O-(3,5,6-trichloro-2-pyridyl) phosphorothioate] banyak digunakan di pertanian, perkebunan dan rumah tangga (Wang et al., 2013).
Pestisida  klorpirifos  paling  banyak  digunakan  sebagai  pengendali  hama  di  Indonesia  sejak revolusi hijau yang dicanangkan pemerintah pada tahun 1965.  Meluasnya penggunaan pestisida ini telah menyebabkan pencemaran lingkungan yang luas, seperti di tanah, danau dan air (Isworo et al ., 2015).  Relyea (2009) melaporkan bahwa beberapa ekosistem darat dan air terkontaminasi oleh  pestisida  Khlorpirifos.    Penggunaan  Khlorpirifos  dapat  berdampak  pada  komunitas  perairan seperti  plankton,  katak  dan  hewan  lainnya  (Bendis  dan  Relyea  2016).    Beberapa  jenis  karang  di perairan Laut Jawa mendeteksi adanya senyawa Khlorpirifos pada jaringan karang.  (Sabdono et al .,  2007).    Beberapa  pestisida  organofosfat  seperti  Khlorpirifos,  Fenitrotion  dan  Profenofos  telah mencemari  organisme  benthik  ( Anadara  inaequivalvis , Perna  viridis dan Atrina  pectinata )  di Surabaya, Semarang, Demak dan Brebes (Suryono et al. , 2019a; Suryono et al. , 2019a; Suryono et al. , 2021).  Meskipun pestisida organoposfat seperti Khlorpirifos lebih cepat rusak, memiliki dampak yang lebih  ringan,  dan  lebih  aman  serta  tidak  terlalu  beracun  dibandingkan  organoklorin.    Namun
pestisida  organoposfat  merupakan  pestisida  paling  populer  dan  penggunaannya  terus berkembang karena murah, keampuhan, spektrum aplikasi yang luas, kemampuan pengendalian multi-hama dan kurangnya bertahan lama di alam ( Dujaković et al. , 2010; Li et al. , 2010; Sapbamrer dan Hongsibsong, 2014).  Namun dengan penggunaan yang tanpa henti dan tanpa protokol yang benar lama kelamaan akan menimbulkan pemasalahan dilingkungan baik darat maupun perairan. Upaya remidiasi residu pestisida tersebut salah satunya dengan menggunakan bakteri yang mampu mendegradasi  pestisida  tersebut  baik  yang  berasal  dari  lingkungan  darat  maupu  perairan. Beberapa penelitian di Indonesia telah menunjuk bahwa bakteri mampu mendegradasi pestisida jenis Khlorpirifos dari berbagai sember seperti air dan sedimen danau air tawar (Isworo et al ., 2015), tanah pertanian (Sulaeman et al ., 2016), air tanah (Rochaddi et al. , 2019), kerang laut (Suryono et al .,  2021).  Salah  satu  cara  yang  paling  baik  saat  ini  untuk  mencari  bakteri  yang  mampu mendegradasi atau resisten terhadap bakteri adalah secara molekuler.  Beberapa penelitian telah dilakukan  mengenai  identifikasi  bakteri  pada  tingkat  molekuler  yang  dapat  mendegradasi kelompok pestisida organofosfat tertentu. Beberapa gen pendegradasi pestisida  Khlorpirifos (gen mpd  dan  opd)  ditemukan  pada  beberapa  bakteri  (Yang et  al .,  2006).    Sebagian  besar  gen degradasi ini dikodekan dalam plasmid mereka dalam urutan DNA yang sama.  Berbeda dengan hasil  penelitian  Horne et  al .  (2002)  bahwa  gen  pendegradasi  pestisida  Khlorpirifos  pada  bakteri Agrobacterium radiobacter dikodekan dalam kromosomnya, tetapi mempertahankan urutan DNA yang  mirip  dengan  gen  opd  pada  spesies  bakteri  lainnya.    Tujuan  penelitian  ini  dilakukan  untuk mencari  bakteri  yang  resisten  terhadap  klorpirifos  pada  air  laut  dengan  mengidentifikasi  secara molekuler.

## MATERI DAN METODE
Sampel  bakteri  diperoleh  dari  isolasi  bakteri  dari  sampel  air  laut  dengan  menggunakan metode  seri  pengenceran  - spread  plate dengan  media  Nutrien  Agar  (NA).  Purifikasi  ke  dalam tabung reaksi dengan metode streak (media miring Nutrien  Agar) sebagai stok (Laili dan Hartati, 2011).  Inokulasi bakteri resisten Khlorpirifos dilakukan menggunakan media cair zobell 2216E yang diperkaya Khlorpirifos 100 ppm.  Kultur uji dishaker dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruangan selama 3 x 24 jam (Laili dan Hartati, 2011).  Uji isolate bakteri resitensi terhadap penambahan 100 ppm Khlorpirifos dapat dilihat dalam (Gambar 1).
Gambar 1. Hasil Uji Resistensi Bakteri pada Media dengan Penambahan Khlorpirifos 100 ppm. (A) Kontrol Media Bakteri dengan Khlorpirifos 100 ppm, (B) Bakteri Resisten diketahui dengan adanya  Bakteri  yang  Tumbuh,  (C)  Bakteri  yang  tidak  dapat  Tumbuh  pada  media Khlorpirifos 100 ppm
Isolat bakteri hasil inokulasi diidentifikasi secara molecular berdasarkan sekuens gen 16 S rRNA. DNA  bakteri  diekstraksi  menggunakan  saponin  dan  chelex  resin.  DNA  genom  yang  diperoleh selanjutnya diamplifikasi menggunakan primer primer depan (Forward) 27F (5'-
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG- 3') dan primer belakang (Reverse) HCO2198: 3’ - TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA - 5’. Proses amplifikasi di lakukan sebanyak 30 siklus, yang terdiri dari denaturasi pada  suhu  96  °C  selama  10  detik,  annealing  pada  suhu  50  °C  selama  60  detik,  dan  suhu pemanjangan 72 °C selama 90 detik. Proses PCR diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 °C selama 4 menit. Hasil amplifikasi selanjutnya dilakukan sekuensing urutan basa nitrogennya. Proses sekuensing  dilakukan  oleh  PT.  Genetika  Science,  TangerangData  sekuen forward dan reverse selanjutnya dilakukan editing menggunakan program MEGA 7 (Sabdono et al. , 2007).
Identifikasi  spesies  dilakukan  dengan  membandingkan  data  fasta  sekuen  masing-masing bakteri  dengan  database  yang  ada  di  gene  bank  menggunakan  fasilitas  BLAST  (Basic  Local Alignment Search Tool) pada National Center for Biotechnology Information, National Institute for Health, USA  (www.ncbi.nlm.nih.gov;  NCBI).    Analisis kemungkinan maksimum  (maximum likehood) digunakan untuk membangun pohon filogenetik.   Multiple alignment / berpasangan urutan DNA dianalisis  oleh  Clustal  X  (Thompson et  al .,  1997).    Perangkat  lunak  PAUP  *  4.0  digunakan  untuk membangun pohon filogenetik (Swofford, 1998). Nomor aksesi urutan nukleotida Urutan nukleotida gen 16S rDNA parsial dari strain yang dipilih disimpan dalam database Genbank (Sabdono et al., 2007).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian menunjukan bahwa petani di pesisir Pantai Utara Jawa Tengah menggunakan pestisida  berbagai  merek  untuk  membasmi  hama  tanaman  seperti  Dursban,  Hardtop,  Arjuna, DuPont Prevathon, Ares, Amistar, Diazinon, Virtako, Dimmer, DuPont Ally Plus, Orthene 75 SP, Bentan, Besvidan, Pyrinex – C dan Prima Strike.  Pestisida pestisida tersebut sebagian besar berbahan aktip khlorpirifos yang bervariasi konsentrasinya.  Hasil isolasi baktetiri dari air laut yang resisten terhadap khlorpirifos 100 ppm ditemukan 3 isolat yaitu BPAL 1.2 (1 isolat) berasal dari perairan Brebes dan PJAL 1 (1 isolat) dan PJAL 3 (3 isolat) berasal dari perairan Pati untuk lebih jelasnya datap dilihat dalam Tabel 1.
Tabel 1. Bakteri yang resisten terhadap 100 ppm Klorpirifos
Kode Sampel Klorpirifos (100 ppm) Panjang Sekuens (bp) Nama Bakteri Homologi (%) Accesion Number BPAL 1.2 + 1440 Virgibacillus salarius 99,33 MT299656 PJAL 1 + 1102 Bacillus albus 99,55 MT299705 PJAL 3 + 1445 Virgibacillus salarius 99,86 MT299655
Beberapa penelitian menunjukan bahwa khlorpirifos dapat terdegradasi oleh bakteri seperti bakteri yang bersal dari tanah (Rayu et al. , 2017) dan air tanah (Rochaddi et al. , 2019).  Beberapa bakteri dari  tanah  pertanian  yang  memiliki  kemampuan  mendegrasi  pestisida  khlorpirifos  seperti Pseudomonas sp (Farhan et al. , 2013), Klebsiella sp. (Farhan et al., 2013), dan Stenotrophomonas sp. (Deng et al. , 2015), Pseudomonas monteilii, Bacillus cereus dan Pseudomonas sp (Sulaeman et al. , 2016).  Lebih lanjut Rochaddi et al. (2019) menginformasikan beberapa bakteri yang berasal dari airtanah yang diambil di sekitar Surabaya, Sidoarjo, Gresik dan Lamongan mampu mendegradasi khlorpirifos seperti Bacillus cereus, Bacillus paramycoides, Bacillus thuringiensis, dan Bacillus subtilis. Sebagian  besar  peneli  mencari  bakteri  pendegradasi  khlorpirifos  berasal  dari  tanah  yang  terkait dengan  pertanian  maupun  air  yang  ada  di  daratan  dan  masih  jarang  terhadap  material  yang berasal dari lingkungan laut.   Hasil penelitian saat ini menggukan materi yang berasal dari air laut untuk mencari bakteri yang resisten atau mampu mendegradasi khorpirifos didapatkan dua jenis bakteri yaitu Virgibacillus salaries berasal dari air laut Brebes dan Pati dan Bacillus albus yang berasal dari  Pati.    Peneltian  penelitian  sebelumnya  yang  menggunakan  materi  dari  lingkungan  laut  juga
mendapatkan bakteri yang mampu mendegradasi khorpirifos seperti yang dilakukan  Zhang et al (2006)  mendapatkan  bakteri Virgibacillus flavescens dari  sedimen  laut;  Essghaier et  al. (2012) menemukan Virgibacillus marismortui yang ditemukan dari danau garam; Montriwong et al. (2012) menemukan Virgibacillus halodenitrificans .  Lebih lanjut   Suryono et al. (2021) menemukan beberapa jenis  bakteri  yang  bersimbion  dengan  kerang  kerangan  laut  yang  diambil  disekitar  perairan Surabaya  dan  Sidoarjo  ditemukan  bakteri  yang  mampu  mendegradasi  khlorpirifos  seperti Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, Virgibacillus marismortui, Virgibacillus salaries, Bacillus tropicus .  Bila dilihat bakteri dari penelitian sebelumnya dan bakteri yang didapat pada saat penelitian saat ini yang menggukan sumber dari laut mengindikasikan bahwa bakreri Virgibacillus sp dan Bacillus sp yang selalu ada dalam lingkungan laut dan beberapa jenis menunjukan kemampuan mendegradasi atau resisten terhadap pestisida jenis khlorpirifos.
Gambar 2. Pohon filogenetik bakteri dari air laut yang resisten terhadap khlorpirifos menggunakan metode Neighbor-Joining dengan model Kimura 2-parameter dan 1.000 bootstrap
Dalam penelitian ini diperoleh 3 strain bakteri yang resisten terhadap 100 ppm klorpirifos dari sampel  air  laut  Pesisir  Utara  Pulau  Jawa  (Berebes  dan  Pati).  Gen  16S  rDNA  diurutkan  untuk mengetahui korelasi filogenetik dan evolusi di antara strain bakteri.  Urutan DNA dari 3 strain bakteri berhasil diamplifikasi menggunakan PCR, dan diidentifikasi dengan menggunakan nukleotida BLAST berdasarkan  database  GenBank.    Analisis  urutan  DNA  menunjukkan  bahwa  identitas  nukleotida yang  bervariasi  dari  99,33%  hingga  99,86%  didasarkan  pada  urutan  konsensus  3  bakteri  yaitu V. salaries dan B. albus (Tabel 1).  Isolat terbaik, PJAL 3, diidentifikasi sebagai V. salarius dan disimpan di GenBank dengan Acc. Nomor MT299655. Analisis filogenetik mengelompokkan isolat menjadi dua klad, yaitu yaitu V. salaries dan B. albus . (Gambar 2).  Selanjutnya dalam Gambar 2 menunjukkan bahwa  isolat  PJAL  3  mengelompok  ke  dalam  kelompok Virgibacillus sp.    Beberapa  penelitian sebelumnya  menginformasikan  bahwa Virgibacillus sp  memiliki  potensi  untuk  degradasi  substrat, seperti V.  flavescens diisolasi  dari  sedimen  laut,  dapat  mendegradasi  kasein,  pati,  pektin,  asam poligalakturonat, karboksimetil-selulosa, asam alginat, dan agar (Zhang et al., 2016).  Essghaier et al. (2012) melaporkan bahwa V. marismortui yang diisolasi dari danau garam dangkal di Tunisia dapat mendegradasi  kitin.    Montriwong et  al. (2012)  menginformasikan  bahwa V.  halodenitrificans menghasilkan  proteinase  tinggi.    Beberapa  genus  Bacillus  juga  dilaporkan  dapat  mendegradasi pestisida klorpirifos.  Namun, sebagian besar diisolasi dari tanah, seperti B. cereus (Liu et al., 2012; Jiang et al., 2019), B. megaterium (Zhu et al., 2019), dan B. subtilis (El-Helow et al., 2013).  Dari hasil penelitian  saat ini  dan beberapa penelitian sebelumnya menunjukan bahwa bakteri Virgibacillus salaries dan Bacillus  albus merupakan  kelompok  bakteri  dari  lingkungan  laut  yang  resisten  atau memiliki kemampuan mendegradasi pestisida.

## KESIMPULAN
Hasil penelitian ditemukan 2 spesies bakteri yang resisten terhadap  Khlorpirifos 100ppm dari perairan  Brebes Virgibacillus  salaries MT299656  dan  perairan  Pati Virgibacillus  salaries MT299705, Bacillus albus MT299655.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Artikel  ini  merupakan  luaran  dari  penelitian  hibah  dari  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan Universitas Diponegoro Tahun Anggaran 2021 dengan nomor kontrak 77/UN7.5.10.2/PP/2021.

## DAFTAR PUSTAKA
Bendis,  R.J.,  &  Relyea,  R.A.,  (2016).  Wetland  defense:  naturally  occurring  pesticide  resistance  in zooplankton populations protects the stability of aquatic communities. Oecologia, 181(2), 487- 498
Deng, S., Chen, Y., Wang, D., Shi, T., Wu, X., Ma, X., Li, X., Hua, R., Tang, X., & Li, Q. X.,  (2015). Rapid biodegradation  of  organophosphorus  pesticides  by Stenotrophomonas sp.  G1. Journal  of Hazardous Materials, 297, 17-24 Dujaković, N., Grujić, S., Radisić, M., Vasiljević, T., & Lausević, M., (2010). Determination of pesticides in  surface  and  ground  waters  by  liquid  chromatography-electrospray-tandem  mass spectrometry. Anal. Chim. Acta, 678 (1), 63 – 72. doi: 10.1016/j.aca. 2010.08.016.
El-Helow,  E.R.,  Badawy,  M.E.I.,  Mobrouk,  M.E.M.,  Mohamed,  E.A.H.,  &  El-Beshlawy,  Y.M.,  (2013).
Biodegradation of chlorpyrifos by a newly isolated Bacillus subtilis strain, Y242. Bioremediation Journal, 17(2), 113-123 Essghaier, B., Rouaissi, M., Boudabous, A., Jijakli, H. & Sadfi-Zouaoui, N., (2012). Characterization of a novel chitinase from a moderately halophilic bacterium, Virgibacillus marismortui strain M3-23. Ann. Microbiology, 62, 835 – 841
Farhan, M., Wahid, A., Khan, A. U., Ali, A.S., & Ahmed, F., (2013). Potential of indigenous Klebsiella sp. for chlorpyrifos biodegradation. Pakistan Journal of Science, 65(1), 133-137.
Horne, I., Sutherland, T. D., Harcourt, R. L., Russell, R.J., & Oakeshott, J.G., (2002). Identification of an opd (organophosphate  degradation)  gene  in  an Agrobacterium isolate .  Applied  and Environmental Microbiology, 68(1), 3371-3376
Isworo, S., Purwanto, I., & Sabdono, A.,  (2015). Impact of Pesticide Use on Organophosphorus and Organochlorine  Concentration  in  Water  and  Sediment  of  Rawa  Pening  Lake,  Indonesia. Research Journal of Environmental Sciences, 9(5), 233-240.
Jiang, J.,  Tang, M.,  Chen,  J., & Yang, Y.,  (2019). Identification and degradation characteristics of Bacillus cereus strain WD-2 isolated from prochloraz-manganese-contaminated soils. PLoS ONE 14(8), e0220975, 13 p.
Laili,  N.  &  I.  Hartati.  (2011).  Isolasi  dan  karakterisasi  bakteri  pendegradasi  herbisida  diuron  dan bromacil dari area perkebunan di Lampung. Journal of Biological Researches, 17, 57-61
Li, X., Gan, P., Peng, R., Huang, C., & Yu, H., (2010). Determination of 23 organophosphorous pesticides in surface water using SPME followed by GC – MS. Journal of Chromatographic Science, 480(3), 183 – 187. Liu Z. Y., Chen X., Shi Y., & Su Z. C., (2012). Bacterial degradation of chlorpyrifos by Bacillus cereus . Advanced Materials Research 356-360, 676-680.
Montriwong,  A.,  Kaewphuak,  S.,  Rodtong,  S.,  Roytrakul,  S.,  &  Yongsawatdigul  J.,  (2012).  Novel fibrinolytic  enzymes  from Virgibacillus  halodenitrificans SK1-3-7  isolated  from  fish  sauce fermentation. Process Biochemistry, 47(12), 2379-2387.
Rayu, S., Nielsen, U.N., Nazaries, L., & Singh B.K., (2017). Isolation and molecular characterization of novel chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol-degrading bacteria from sugarcane farm soils. Frontier in Microbiology 8:518, 16 p.
Relyea, R.A., (2009). A cocktail of contaminants: how mixtures of pesticides at low concentrations affect aquatic communities. Oecologia, 159(2), 363-376
Rochaddi, B., Zainuri, M., & Sabdono, A., (2019). Diversity of Chlorpyrifos-degrading bacteria isolated from shallow aquifer of East Java Coastal Settlements, Indonesia. Biodiversitas, 20(12), 3662-3666 doi: 10.13057/biodiv/d201227
Sabdono, A., Kang, S., Hur, H.G., Grossart, H.P., Simon, M., & Radjasa, O.K., (2007). Organophosphate pesticide concentration in coral tissues of indonesian coastal waters Pakistan Journal of Science 10(11), 1926-1929
Sapbamrer, R., & Hongsibsong, S., (2014). Organophosphorus pesticide residues in vegetables from farms, markets, and a supermarket around Kwan Phayao Lake of northern Thailand. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 67 (1), 60 – 67. doi: 10.1007/ s00244-014-0014-x. Sulaeman, E., Ardiwinata, A.S., & Yani, M., (2016). Eksplorasi Bakteri Pendegradasi Insektisida Klorpirifos di Tanah Sayuran Kubis di Jawa Barat. Jurnal Tanah dan Iklim 40(2), 103-112
Suryono, C.A., Irwani., Rochaddi, B.,  Setyati, W.A., & Indardjo, A.,  (2021). Kontaminasi Kerang Filter Feeder Perna viridis Linnaeus, 1758 (Bivalvia: Mytilidae) oleh Pestisida Organofosfat di Perairan Laut  Brebes  Jawa  Tengah  Indonesia. Jurnal  Kelautan  Tropis, 24(2),  205-21. doi: 10.14710/jkt.v24i2.11013
Suryono,  C.A.,  Sabdono,  A  &  Subagiyo.  (2019ª).  Kontaminasi  pestisida  organoposfat:  Klorpirifor, Fenitrotion dan Profenofos dalam bivalvia yang ditangkap di pesisir utara pulau Jawa. Jurnal Kelautan Tropis, 22(2), 103 – 108. doi: 10.14710/jkt.v22i2.6274
Suryono,  C.A.,  Sabdono,  A.,  Subagiyo,  &  Setyati,  W.A.  (2019b).  The  preliminary  investigation  of organophosphate pesticide residues on green mussel Perna viridis (bivalvia: Mytilidae, linnaeus , 1758)  at  Demak  coastal  waters  central  Java  Indonesia. IOP  Conference  Series:  Earth  and Environmental Science, 246, 012071. doi: 10.1088/1755-1315/246/1/012071
Suryono, C.A., Subagiyo., & Sabdono, A., (2021). Chlorpyrifos pesticide-degrading bacteria isolated from bivalves of Surabaya coastal waters, East Java, Indonesia., AACL Bioflux , 14(3), 1665-1674. Swofford, D.L., (1998). PAUP: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and other methods) version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts
Thompson  J.D.,  Gibson  T.  J.,  Plewniak  F.,  Jeanmougi  F.,  &  Higgins  D.  G.,  (1997).  The  CLUSTAL_X windows interface: Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research , 25, 4876-4882
Wang, S., Zhang, C., Li, K., Qu J, Shi, Y., & Yan, Y., (2013). Chlorpyrifos-induced stress response in the Chlorpyrifos-degrader Klebsiella sp. International Biodeterioration and Biodegradation , 82, 17-23. Yang, C., Liu, N., Guo, X., &  Qiao  C.,  (2006).  Cloning of mpd gene from  a chlorpyrifos-degrading bacterium  and  use  of  this  strain  in  bioremediation  of  contaminated  soil. FEMS  Microbiology Letters, 265(1), 118-125.
Zhang,  D.C.,  Schumann,  P.,  Wu,  J.,  Franca,  L.,  Neuner  K . ,  &  Margesin,  R.,  (2016). Virgibacillus flavescens sp.  nov.  isolated  from  marine  sediment.  International Journal  os  Systematic  and Evolutionary Microbiology, 66(3), 1138-1143.
Zhang,  Z.,  Hong,  Q.,  Xu,  J.,  Zhang,  X.,  &  Li,  S.,  (2006).  Isolation  of  fenitrothion-degrading  strain Burkholderia  sp.  FDS-1  and  cloning  of  mpd  gene. Biodegradation, 17,  275 – 283.  doi: 10.1007/s10532-005-7130-2
Zhu, J., Zhao, Y., & Ruan, H., (2019). Comparative study on the biodegradation of chlorpyrifos methyl by Bacillus  megaterium CM-Z19  and Pseudomonas  syringae CM-Z6. Anais  da  Academica Brasileira de Ciencias, 91(3), e20180694, 10 p.