Menara Perkebunan , 2006, 74 (1), 10-22
Pengaruh elisitasi terhadap pertumbuhan dan produksi alkaloida kinolin dari akar rambut  tanaman kina ( Cinchona succirubra Pavon ex Klotzsch)
Effect of elicitation on growth and alkaloid quinoline production in  hairy root of cinchona plant (Cinchona succirubra Pavon ex Klotzsch )
Nurita TORUAN-MATHIUS 1) , NURHAIMI-HARIS 2) ,
Joko-SANTOSO 3) & ADE-HERI 4)
1) SEAMEO-BIOTROP,  Bogor, Indonesia
2) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia
3) Pusat Penelitian Teh dan Kina, Gambung, Indonesia
4) Jurusan  Kimia, Universitas Pakuan, Bogor, Indonesia

## Summary
Manipulation to increase alkaloid producti- vity in hairy root  can be done by elicitation with the addition of certain  enzymes. The objective of this research is to find out the effect of elicitation by  cellulase  and  pectyoliase  enzymes  on  the productivity of Cinchona succirubra hairy root culture. Hairy root was  cultured on ½ MS macro nutrient  with  the  addition  of  40  g/L  sucrose  and 7  g/L  agar.  Elicitation  was  done  by  the  addition of cellulase and pectiolyase at the concentrations of  0;  0.05;  0.10;  0.50;  1.00;  3.00;  5.00;  10.00; 15.00;  20.00  and  25.00  mg/L,  respectively.The effect of elicitation was  analyzed by fresh weight of hairy root, and alkaloid content in four-month- old  culture.The  result  showed  that  the  best growth  was  obtained  by  the  addition  of  15  mg/L cellulase, with fresh weight as much as  920 mg . The  addition  of  10  mg/L  pectyoliase  increased hairy root fresh weight as much as  880 mg. The highest  quinoline  alkaloid  production  was obtained  by  the  addition  of  25  mg/L  celluase (Quinine  580,  quinidine  492,  cinchonine  234, dihydroxyn-chonine  195  and  cinchonidine  165 µg/g  fresh  weight)  and  1  mg/L  pectyoliase (Quinine  2363,  quinidine  238,  cinchonine  104, dihydroxyn-chonidine 138 and cinchonidine 1558 µg/g fresh weight).
[ Key  words :  Hairy  root-culture, Cinchona succirubra, enzyme elicitation, pectyoliase, cellulase, quinoline alkaloid.]

## Ringkasan
Manipulasi  untuk  meningkatkan  produk- tivitas  akar rambut  dapat dilakukan di antaranya dengan  elisitasi  melalui  penambahan  enzim tertentu  ke  dalam  medium.  Tujuan  penelitian  ini adalah  untuk  menetapkan  pengaruh  elisitasi dengan  penambahan  selulase  dan  pektioliase terhadap  produktivitas  akar  rambut  tanaman Cinchona  succirubra .  Akar  rambut  tanaman Cinchona succirubra dikulturkan dalam medium  MS  ½  hara  makro  dengan  penambahan sukrose 40 g/L dan agar 7 g/L. Elisitasi dilakukan dengan  penambahan  selulase  dan  pektioliase masing-masing  pada  konsentrasi  0;  0,05;  0,10; 0,50;  1,00;  3,00;  5,00;  10,00;  15,00;  20,00  dan 25,00  mg/L.  Peubah  yang  diukur  adalah  bobot basah  akar  rambut  dan  kandungan  alkaloida kinolin  pada  kultur  berumur  empat  bulan.  Hasil yang  diperoleh  menunjukkan  bahwa  pertumbuh- an  terbaik  terjadi  pada    penambahan  konsentrasi selulase  15  mg/L    dengan  bobot  basah  920  mg dan  pektioliase    10  mg/L  dengan  bobot  basah 880  mg.  Produksi  alkaloida  kinolin  tertinggi
Toruan-Mathius et al.
diperoleh   pada   konsentrasi   selulase  25 mg/L (kinin  580,  kinidin  492,  sinkonin  234,  dihidrok- sinkonin  195  dan  sinkonidin  165  µg/g  bobot basah)  dan  pektioliase  1  mg/L  (kinin  2363, kinidin  238,  sinkonin  104,  dihidroksinkonin  138 dan sinkonidin 1558 µg/g bobot basah).

## Pendahuluan
C.  succirubra memiliki  kadar  kinin yang  sangat  rendah  (0,8  -  1,4  %).  Akan tetapi kadar sinkonidinnya lebih tinggi yaitu 3,2  -  5,1  %  dari  pada C.  ledgeriana yang hanya  mengandung    0  -  3,4  %  (Astika, 1975).  Alkaloid  di  dalam  kulit  batang  kina mempunyai  nilai  penting  dan  digunakan dalam  bidang  industri  farmasi  (Hay et  al., 1986;  Raintree  Nutrition,  2003),  serta industri  makanan  dan  minuman    (Widayat, 2000; PT SIL, 2002).  Empat jenis alkaloida utama yang mempunyai nilai ekonomi tinggi adalah  kinin,  sinkonin,  kinidin    dan sinkonidin  (Brotosisworo,  1993).  Selain untuk  obat  malaria  kinin  digunakan  sebagai obat  aritmia  jantung  dan  hampir  50  % produksi  kinin  digunakan  sebagai  bahan tonik,  yaitu tonik  water , bitter  lemon ,  dan penambah  nafsu  makan  (Raintree  Nutrition, 2003).  Pada  industri  minuman  ringan,  kinin biasanya  digunakan  sebagai  pemberi  cita rasa  karena  rasanya  pahit  dan  juga  sebagai obat anti kejang otot (Wahyudi, 2006).
Pada  dekade  terakhir  ini  perhatian memproduksi  metabolit  sekunder  beralih pada  pemanfaatan  teknologi  kultur  akar rambut,  yang  diperoleh  sebagai  hasil  trans- formasi  sel  tanaman  dengan Agrobacterium rhizogenes. Agrobacterium merupakan bakteri  tanah  yang  mempunyai  kemampuan untuk  mentransfer  T-DNA  dari  plasmid yang  dikenal  dengan  Ri  plasmid  ( root inducing  plasmid )  ke  dalam  sel  tanaman melalui  pelukaan  (Nilson  &  Olsson,  1997). T-DNA  akan  terintegrasi  pada  kromosom
tanaman dan akan mengekspresikan gen-gen untuk mensintesis senyawa opin, di samping itu T-DNA juga mengandung onkogen yaitu gen-gen  yang  berperan  untuk  menyandi hormon  pertumbuhan  auksin  dan  sitokinin. Ekspresi  onkogen  pada  plasmid  Ri  menciri- kan pembentukan akar adventif secara besar- besaran  pada  tempat  yang  diinfeksi  dan dikenal  dengan  ‘ hairy  root’ (Nilson    & Olsson,  1997). Keuntungan  menggunakan kultur hairy root (akar rambut) di antaranya relatif  seragam,  memiliki  kestabilan  genetik yang  tinggi,  dan  dapat  menggunakan  me- dium  tanpa  penambahan  zat    pengatur  tum- buh,  di  samping  itu  mudah  dimanipulasi untuk meningkatkan produktivitasnya. Salah satu di antaranya dengan cara elisitasi meng- gunakan  elisitor  pada  sel  tumbuhan  dengan tujuan  untuk  menginduksi  dan  meningkat- kan pembentukan metabolit sekunder.
Produksi  ginsenosid  pada  kultur  akar rambut Panax  ginseng meningkat  secara nyata  setelah  dielisitasi  dengan  asam jasmonat  dan  elisitor  lain  (Yu et  al., 2000). Alvares et  al. (2003)  menemukan    bahwa elisitasi  kultur  akar  rambut Brugmansia candida meningkatkan  hiosiamin  intra- seluler sebesar 200 – 300% dan melepaskan sampai  1500%  (skopolamin)  dan  1100% (hiosiamin).  Messner  &  Boll  (1999) melaporkan  bahwa  penambahan  elisitor berupa  sediaan  dinding  sel Rhizosphaera kalkhoffii yang  diautoklaf,  mampu  mening- katkan  aktivitas  beberapa  enzim  yang berperan  dalam  biosintesis  lignin  di  antara- nya  L-fenilalanin  amonia  liase  (PAL) sebanyak  sepuluh  kali,  feruloil  CoA reduktase  (FCR)  sebanyak  empat    kali, sinamil alkohol dehidrogenase sebanyak dua kali, dan peroksidase sebanyak 1,5 kali yang terjadi  tiga  hari  setelah  dielisitasi.  Carvalho & Curtis (2002) melaporkan  bahwa elisitasi akar  dan  kultur  suspensi  sel  dengan  elisitor dari Rhizoctonia solani menyebabkan
Pengaruh elisitasi terhadap pertumbuhan dan produksi alkaloida kinolin ...
perubahan  pernafasan,  asupan    hara  oleh akar, dan pertumbuhan  yang dramatis.
Tujuan  penelitian  ini    untuk  menetap- kan  pengaruh  perlakuan  elisitasi  dengan enzim  selulase  dan  pektioliase  sebagai elisitor  terhadap  pertumbuhan  dan  produksi alkaloida  kinolina  dalam  akar  rambut tanaman C. Succirubra .

## Bahan dan Metode
Konfirmasi  integrasi  T-DNA A.  rhizogenes pada akar rambut
Konfirmasi  adanya  integrasi  T-DNA, yaitu  daerah  TL  dan  TR-DNA  dari A.  rhizogenes galur  LBA  9457b  ke  dalam akar rambut tanaman kina dilakukan dengan teknik PCR. Sebagai kontrol positif  diguna- kan  DNA   plasmid A.  Rhizogenes, sedang DNA  daun  dari  planlet C.  succirubra in vitro digunakan  sebagai  kontrol  negatif. Sebagai  DNA  uji  adalah  DNA  dari  akar rambut  tanpa    perlakuan  dan  perlakuan elisitasi dengan selulase dan pektioliase.
Isolasi  DNA  plasmid  dilakukan  meng- gunakan modifikasi metode Sambrook et al. (1989). Sebagai sumber DNA A. rhizogenes digunakan  kultur  berumur  48  jam.  Sedang isolasi  DNA  planlet  akar  rambut  dilakukan dengan  menggunakan  modifikasi  metode Orozco-Castillo et  al. (1994).  Sebagai sumber  DNA  digunakan  daun  planlet C.  succirubra dan  akar  rambut  dari  setiap perlakuan,    masing-masing  sebanyak  0,2  g. Amplifikasi  DNA  dilakukan  dengan  teknik PCR menggunakan modifikasi metode Aoki et  al. (1997).  Untuk  deteksi  TL-DNA digunakan  pasangan  primer rol B 1 (5'ATG GAT  CCA  AAT  TGC  TAT  TCC  CCA CGA3')  dan rol B 2 (5'TTA  GGC TTT  CAT TCG GGT TTC CTG CAG C3'). Sedangkan untuk deteksi TR-DNA digunakan pasangan
primer  TR1  (5'GGA  AAT  TGT  GGC  GTT GTT  GTG  GAC3')  dan  TR 2 (5'AAT  CGT TCA  GAG  AGC  GTC  CGA  AGT  T  3') (Ermayanti et al ., 2000).
Amplifikasi  DNA  contoh  dilakukan menggunakan alat Thermal Cycler
(Thermolyne  II),  dengan  siklus  amplifikasi sebagai berikut : denaturasi pada  suhu 94 o C selama  satu  menit, annealing pada  suhu 55 o C  selama  satu  menit  dan  ekstensi  pada suhu  72 o C selama 2,5 menit. Seluruh reaksi dilakukan  sebanyak  35  siklus  reaksi.  Hasil PCR difraksinasi dengan elektroforesis 0,8% (b/v)  gel  agarose  yang  mengandung  2,5 µ L etidium  bromida  1%  dengan  kondisi  arus konstan  36  mA  dan  50  volt  selama  kurang lebih  satu  jam.  Sebagai  marker  digunakan DNA  1  Kb  Ladder.  Gel  hasil  elektroforesis divisualisasikan  di  atas  UV  transluminator dan untuk dokumentasi dilakukan pemotret- an  dengan  menggunakan  film  polaroid  665. Pengamatan  dilakukan  dengan  melihat adanya  pita  DNA  dari  akar  rambut    yang mempunyai  berat  molekul  yang  sama dengan TR dan TL-DNA plasmid A. rhizogenes.

## Elisitasi terhadap pertumbuhan akar rambut dan produksi alkaloid kinolin
Bahan  yang  digunakan  yaitu  akar rambut    tanaman C.  succirubra hasil  ino- kulasi dengan A. rhizogenes galur LBA 9457 (Reflini,  2002)  yang  dikulturkan  dalam medium  MS  ½  hara  makro  dengan penambahan 40 g/L sukrosa dan  7 g/L agar (Aneloi, 2004). Larutan selulase dan pektio- liase  melalui  milipore  membran  (0,22  µm) ditambahkan  ke  dalam  medium  MS  ½  hara makro  secara  aseptik.  Sebanyak  empat potong  akar  rambut  dengan  ukuran  ±  2  cm dikulturkan  dalam  setiap  botol  yang  berisi medium  dengan  penambahan  selulase  dan pektioliase, masing-masing  dengan konsen-
Toruan-Mathius et al.
trasi  0;  0,05;  0,10;  0,50;  1,00;    3,00;  5,00; 10,00;  15,00;  20,00,  dan  25,00  mg/L  yang diulang  sebanyak  sepuluh  kali.  Percobaan dilaksanakan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan pola faktorial. Pengamatan  dilakukan  terhadap  per- tumbuhan dan kandungan    alkaloida kinolin akar rambut pada umur empat bulan. Peubah yang  diukur  untuk  pertumbuhan  meliputi waktu inisiasi, bobot basah akar rambut pada setiap  perlakuan  sebagai  variabel  respons. Produksi  alkaloida  kinolin  meliputi  kadar kinin,  kinidin,  sinkonin,  dan  sinkonidin. Waktu  inisiasi  ditentukan  dengan  meng- hitung  saat  (hari)  terbentuknya  akar  rambut yang  pertama.  Bobot  basah  ditentukan dengan  menimbang  akar  rambut  yang  telah dibersihkan  dari  medium.  Sedang  kadar alkaloida kinolin ditentukan dengan HPLC.
Uji  statistik  untuk  mengetahui  penga- ruh  penambahan  elisitor  terhadap  pertum- buhan  dan  produksi  alkaloida  kinolin  pada akar rambut tanaman kina dilakukan dengan Analisis  Varian  (ANOVA).  Apabila  terlihat ada  perbedaan    nyata,  analisis  dilanjutkan dengan Duncan  New’s  Multiple  Range  Test (DNMRT).
Analisis kandungan alkaloida kinolin dengan HPLC
Sebanyak  50  mg  contoh  akar  rambut dari  masing-masing  perlakuan  digerus  sam- pai halus dengan  Nitrogen cair, selanjutnya diekstrak  dengan  1  mL  MeOH:  0,1  M  HCl (1:1)  dan  divorteks,  lalu  disentrifugasi selama  15  menit  pada  14.000  rpm.  Super- natan  diliopilasi  dan  diresuspensi  dengan 1  mL  eluen  HPLC  (larutan  yang  mengan- dung  6,8  g  KH 2 PO4,  1,95  g  heksilamina; 50  mL  H 3 PO4  1M  dan  60  mL  asetonitril dalam  1  L  larutan    dengan  pH  2,8).
Selanjutnya disaring dengan milleks 0,45 µ m  dan  disuntikkan  ke  dalam  HPLC, Shimadzu tipe  C-R4A  dengan  kondisi
sebagai  berikut  :  panjang  gelombang/ λ 245 nm,  sensitivitas 0,001 AUFS, flow rate 2  mL/menit, chart  speed 5  cm/menit, volume  suntik  sebanyak  2 µ L,    kolom µ Bondapak  C.18  (Geerlings et  al .,  1999). Peubah  yang  diamati  adalah  kandungan alkaloida  kinolin  meliputi  kadar  kinin, kinidin, sinkonin, dan sinkonidin pada setiap perlakuan dengan membandingkan luas area puncak contoh dengan luas area puncak dari kinin,  kinidin,  sinkonin  dan  sinkonidin standar dari SIGMA.

## Hasil dan Pembahasan
Uji
konfirmasi integrasi T-DNA A. rhizogenes
Hasil  PCR  DNA  menunjukkan  adanya dua pita DNA pada ukuran basa 780 pb dan 1600  pb  pada  akar  rambut  kontrol  maupun akar  rambut  dengan  perlakuan  elisitasi dengan  selulase  dan  pektioliase,  kecuali pada  DNA  planlet C.  succirubra yang berfungsi  sebagai  kontrol  negatif  (Gambar 1).  Hal  ini  menunjukan  bahwa  gen  TL  dan TR  dari A.  rhizogenes tetap  terintegrasi secara  stabil  pada  akar  rambut  kontrol maupun  akar  rambut  yang  diberi  perlakuan elisitasi. Adanya dua pita DNA pada ukuran basa    780  pb  dan  1600  pb  tersebut  juga dilaporkan  oleh  Reflini  (2002)  dan  Aneloi (2004)  bahwa  DNA  pada  ukuran  basa tersebut  adalah  gen  TL  dan  TR  yang merupakan    bagian  dari  plasmid  Ri A.  rhizogenes yang  telah  terintegrasi  ke dalam genom tanaman C. Succirubra . Ermayanti et  al. 2000)  menyatakan bahwa  gen  TL  merupakan  T-DNA  dengan ukuran 780 pb yang mengandung gen iaa M dan iaa  H untuk  biosintesis  auksin  dan sintesis  senyawa  opin.  Gen  TR,  yaitu  gen yang berukuran 1600 pb merupakan T-DNA yang  mengandung  gen rol penginduksi pembentukan  akar.  Pita  DNA  yang    ber-
Pengaruh elisitasi terhadap pertumbuhan dan produksi alkaloida kinolin ...
Gambar  1.  Konfirmasi  integrasi  T-DNA  dengan PCR  pada  akar  rambut  tanaman  kina C.  succirubra dengan  perlakuan elisitasi  (1)  Marker  1  kb  DNA Ladder;    (2)  Plasmid A.  rhizogenes - primer  TL  &  (3).  TR;  (4).  Akar rambut  kontrol-  primer  TL;  (5).  TR; (6).  Akar  rambut  vs  selulase-  primer TL,  &  (7)  TR,  (8).  Akar  rambut vs pektioliase-primer  TL,  (9).  TR,  (10). Daun C.  succirubra- primer  TL , & (11). TR.
Figure 1.  Confirmation the integration of T-DNA by  PCR  on C.  succirubra hairy  root with elicitation treatment. (1). Marker 1  kb  ladder  DNA ,  (2).  A.  rhizogenes plasmid  -TL  primer &  (3). TR ,  (4). Control  hairy  root,  TL  primer ,  & (5). TR ,  (6). Hairy  root  vs  cellulase- TL primer , & (7). TR , (8). Hairy root vs  pectyoliase-TL  primer ,  (9). TR , (10). C . succirubra leaf-TL primer, & (11). TR.
ukuran  780  pb  relatif  lebih  tebal  daripada pita  DNA  yang  berukuran  1600pb.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  kandungan  gen  TL dalam  akar  rambut    lebih  besar  dibanding- kan dengan kandungan gen TR-nya.
Menurut Gelvin (2000) proses
pembentukan  akar  rambut    terjadi  karena  di dalam  T-DNA  terdapat  berbagai  gen penyandi  protein  yang  berperan  dalam proses biosintesis zat pengatur tumbuh yaitu auksin  dan  sitokinin  di  dalam  sel  tanaman. Zayedb    &    Winka  (2004)  melaporkan
bahwa  kultur  akar  rambut B.  suaveolens dilakukan  dengan  menginfeksi  ujung  akar dengan A.  rhizogenes. Hasil analisis dengan PCR    menunjukkan  bahwa  telah  terjadi transformasi gen rol C dan vir C.

## Pertumbuhan akar rambut
Akar  rambut  yang  ditumbuhkan  dalam medium dengan berbagai konsentrasi selulase  memiliki  waktu  inisiasi,  bobot basah,  dan  penampakan  akar  baru  yang berbeda  nyata  dibandingkan  dengan  kontrol (Gambar  2).  Tampak  bahwa  semakin  tinggi konsentrasi  selulase  semakin  lama  waktu inisiasi  dan  semakin  rendah  bobot  basah akar rambut, pada umur empat bulan. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh adanya pengaruh feedback  inhibition dari  kon- sentrasi enzim yang terlalu tinggi (Tabel 1). Di  samping  itu  penambahan  selulase menghasilkan  akar  rambut  yang  memiliki bentuk  serabut  tipis,  kompak  dan  banyak (Gambar  2).  Hal  tersebut  menyebabkan bobot  basah  akar  rambut  cukup  tinggi. Sedangkan  akar  rambut  yang  ditumbuhkan dalam  medium  kontrol  memiliki  bentuk lebih besar, tidak terlalu kompak (lepas satu dengan  lainnya)  dan  berukuran  agak panjang.  Struktur  akar  tersebut  menghasil- kan bobot basah agak rendah.  Pertumbuhan akar rambut  terbaik diperoleh  pada konsen- trasi selulase 15 mg/L yang memiliki  bobot basah tertinggi, yaitu 920 mg (Tabel 1).
Akar  rambut  yang  ditumbuhkan  dalam berbagai  konsentrasi  pektioliase  memiliki pertumbuhan  yang  berbeda  nyata  di- bandingkan dengan kontrol dalam hal waktu inisiasi,  dan  bobot  basah  (Tabel  2)  serta morfologi  akar  rambut    (Gambar  3). Semakin  tinggi  pektioliase  semakin  lama waktu  inisiasi  dan  semakin  rendah  bobot basah  akar  rambut.  (Tabel  2).    Bobot  basah tertinggi,  yaitu    880  mg  diperoleh  dari
760  -
160 0-

## pb     1   2    3   4    5    6   7    8   9  10  11
Toruan-Mathius et al.
Tabel 1. Pengaruh enzim selulose terhadap pertumbuhan akar rambut setelah berumur empat  bulan.
Table 1. Effect of   cellulase on hairy root growth after four-month old.
No. Konsentrasi selulase Cellulase concentration mg/L Waktu Inisiasi Initiation time Hari (Day) Bobot basah Fresh weight mg 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
9. 10. 11. 0,00 0,05 0,10 0,50 1,00 3,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 11,6    b*) 5,8    a 6,0    a 6,1    a 6,6    a 5,7    a 13,8    b 14,1    b 17,8    c 19,4    c 20,2    d 290 a 390 a 490 b 630 c 640 c 680 c 700 c 790 d 920 e 570 b 540 b
*)   Angka yang diikuti dengan huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan     pada (P< 0,05).
*) Figures in the same columm of each group followed by similar letter are not significantly different   according to Duncan MRT (P<0.05).
Gambar  2.  Penampakan  akar  rambut    dengan  perlakuan  elisitasi  selulase  (a)  kontrol,  (b)  5  mg/L; (c)  10  mg/L;  (d)  15  mg/L;  (e)  20  mg/L  dan  (f)  25  mg/L,  berumur  empat  bulan    setelah dikulturkan.
Figure 2.   Hairy   root    performance   with  enzyme   cellulase   elicitation ( a) control,   (b) 5  mg/L; (c) 10 mg/L; (d) 15 mg/L; (e)20 mg/L and (f) 25 mg/L,  four-month-old after culture.
a b c e d f
Pengaruh elisitasi terhadap pertumbuhan dan produksi alkaloida kinolin ..
Tabel 2. Pengaruh enzim pektioliase terhadap pertumbuhan akar rambut  setelah berumur empat bulan.
Table 2. Effect of pectyoliase enzyme on hairy root growth after four- month- old.
No. Konsentrasi pektioliase Cellulase concentration mg/L Waktu Inisiasi Initiation time Hari (Day) Bobot basah Fresh weight mg 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
9. 10. 11. 0,00 0,05 0,10 0,50 1,00 3,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 11,6  b*) 6,2  a 8,4  a 5,8  a 6,7  a 9,5  b 12,7  c 15,6  c 22,7  e 30,9  f 40,6  g 400 c 490  c 550 d 560 d 570 d 620 e 630 e 880 f 230 b 160 a 120 a
*) Angka yang  diikuti  dengan huruf yang  sama  menunjukkan  tidak  berbeda nyata  pada uji Duncan pada P< 0,05.
*) Figures in the same columm of  each  group  followed by similar letter are not significantly different  according    to Duncan MRT (P<0.05)
Gambar 3. Penampakan  akar   rambut  dengan   perlakuan  elisitasi pektioliase  (a) kontrol, (b) 5 mg/L;
(c)10 mg/L; (d) 15 mg/L; (e) 20 mg/L dan (f) 25 mg/L, berumur empat bulan setelah dikulturkan.
Figure 3. Hairy root performance with enzyme pectyoliase elicitation (a)  control, (b) 5 mg/L; (c) 10 mg/L; (d) 15 mg/L; (e) 20 mg/L and   (f) 25 mg/L, four-month-old after culture. c b a d e f
Toruan-Mathius et al.
penambahan  10  mg/L    pektioliase.    Bentuk akar  rambut  yang  berupa  serabut  tipis  yang jarang,  tidak  kompak    sehingga  memiliki bobot basah yang rendah. Pada awal pertum- buhan  eksplan  mengalami  pencokelatan, yang  tampaknya  menghambat  inisiasi  dan pertumbuhan akar rambut
Selulase  adalah  enzim  penghidrolisis selulosa  yang  merupakan  unsur  penyusun dinding  sel  tanaman.  Sedang  pektioliase adalah enzim penghidrolisis asam poligalak- touronat  menjadi  monomernya  yaitu  asam galaktouronat. Asam poligalaktouronat adalah  salah  satu  polimer  penyusun  dinding sel  tanaman.  Dengan  penambahan  enzim selulase  dan  pektioliase    ke  dalam  medium yang  digunakan  untuk  pertumbuhan  akar rambut    tanaman  kina,  maka  diharapkan asupan hara ke dalam sel lebih tinggi sehing- ga  pertumbuhannya  lebih  baik  dan  sel tanaman tersebut akan memproduksi alkaloida  kinolin  yang  lebih  tinggi  sebagai respons  pertahanan  sel.  Semakin  tinggi konsentrasi  selulase  pektioliase  semakin tinggi  cekaman  yang  terjadi  sehingga pertumbuhan  akar  rambut  semakin  terham- bat.
Menurut  Vazques-Flota et  al. (1994) perubahan  konsentrasi  komponen  medium seperti  penambahan  enzim  hidrolitik  dan elisitor  biotik  lainnya  dapat  digunakan sebagai  strategi  untuk  meningkatkan  hasil alkaloida. Verpoorte et al. (1998) menemu- kan bahwa pada kultur Catharanthus roseus pembentukan  alkaloida  seringkali  berhu- bungan  dengan  diferensiasi  dalam    mem- bentuk  organ  tertentu,  seperti  akar  atau pucuk.
Zayedb   &   Winka  (2004)  melaporkan bahwa pada kultur akar rambut B.suaveolens yang  diberi  perlakuan  elisitasi  dengan menambahkan  elisitor  metiljasmonat,  kuer- sitin,  dan  asam  salisilat  untuk  mempelajari pembentukan  alkaloida  tropan  di  antaranya hiosiamin. Perlakuan dengan elisitasi
200  µm  metiljasmonat    meningkatkan  aku- mulasi    hiosiamin  sebanyak  25  kali,  yaitu 1  mg/g  bobot  basah  dibandingkan  dengan kontrol.  Kuersetin  meningkatkan  produksi alkaloida  sebanyak  sepuluh  kali  (400  mg/g bobot  basah)  selama  24  jam.  Sedang penambahan elisitasi sebanyak 100 µm asam salisilat  menurunkan  produksi  alkaloida sampai pada tingkat 1 µg/g bobot basah. Sim et  al .  (1994)  melaporkan  bahwa  tidak  ada pengaruh  yang  nyata  dari  elisitasi  fungi terhadap  produksi  sikonin  dalam  akar  ram- but  dan  kultur  suspensi  sel Lithospermum erythrorhizon. Alvarez et  al .  (2003)  mene- mukan  bahwa  akar  rambut Brugmansia candida yang  dielisitasi  dengan  pektinase menyebabkan  peningkatan  (200  –  300%) kandungan  hiosiamin  intraselular,  1500% (skopolamin)  dan  1100%  (hisosiamin). Sedang  elisitasi  dengan  homogenasi  akar B.  candida meningkatkan  akumulasi  kedua alkaloid tersebut sebesar (50 – 600%).

## Produktivitas kinolin pada akar rambut
Peningkatan  alkaloida  kinolin  melalui elisitasi  dengan  selulase  dan  pektoliase sebagai elisitor terbaik terjadi pada konsentrasi  selulase  tertinggi  yaitu  25  mg/L yang memiliki pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan  dengan  kontrol,  sedangkan dengan  pektioliase  terjadi  pada  konsentrasi 1  mg/L  yang  memiliki  pertumbuhan  yang lebih rendah dibandingkan dengan kontrol.
Tampak bahwa semakin tinggi konsen- trasi  enzim  yang  digunakan  menyebabkan pertumbuhan  akar  rambut  semakin  terham- bat yang menyebabkan semakin rendah pula kandungan  alkaloida  kinolin  yang  dihasil- kannya.  Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan bahwa  produksi  alkaloida  kinolin  tertinggi untuk  jenis  alkaloida  yang  berbeda  terjadi pada konsentrasi enzim yang berbeda. Kinin dan  sinkonidin  tertinggi  pada  konsentrasi selulase  25,0  mg/L,  kinidin  pada  penam-
Pengaruh elisitasi terhadap pertumbuhan dan produksi alkaloida kinolin ...
bahan  selulase  0,5  mg/L,  sinkonin  pada selulase  0,1  mg/L,  dihidrosinkonin  pada selulase 3,0  mg/L  (Gambar  5).  Penambahan selulase  dengan  konsentrasi  optimum,  yaitu 25,0  mg/L  yang  memproduksi  semua  jenis alkaloida  kinolin  dengan  konsentrasi  yang cukup  tinggi  (kinin  580;  kinidin  492; sinkonin  234;  dihidrosinkonin  195  dan sinkonidin  165  µg/g  bobot  basah)  serta memiliki pertumbuhan yang cukup baik.
Pada  perlakuan  pektioliase,  pertum- buhan  yang  terbaik  diperoleh  dari  konsen- trasi      0,05  mg/L  dengan  bobot  basah  yang lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  kontrol. Peningkatan  kandungan  alkaloida  kinolin tertinggi  terjadi  pada  konsentrasi  1,0  mg/L. Kinin  tertinggi  pada  konsentrasi  enzim pektioliase  1,0  mg/L,  kinidin  pada  pektio- liase  0,1  mg/L,  sinkonin  pada  pektioliase 0,1 mg/L, dihidroksinkonin pada pektioliase 10,0  mg/L,  dan  sinkonidin  pada  pektioliase 1,0  mg/L  (Gambar  2).  Pada  pemberian pektioliase  1,0  mg/L  menyebabkan  akar rambut  mampu  memproduksi  semua  jenis kinolin  dengan  konsentrasi  yang  tertinggi untuk  kinin  dan  sinkonidin  (kinin  2363; kinidin  238,  sinkonin  104;  dihidrosinkonin 138, dan sinkonidin 1558 µg/g bobot basah). Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pektioliase sangat  baik  digunakan  sebagai  elisitor  pada konsentrasi  rendah  karena  pada  konsentrasi tinggi,  menyebabkan  cekaman  pada  sel. Penambahan  selulase  dan  pektioliase  ke dalam  medium  pertumbuhan  akar  rambut tanaman C.  succirubra ,  dapat  menyebabkan terjadinya  hidrolisis  unsur-unsur  penyusun dinding  sel  yaitu  selulosa  dan  asam  poli- galaktouronat menjadi monomernya. Hal ini akan  menyebabkan  perubahan  prilaku  dari membran dinding penghalang pada cekaman dengan penambahan elisitor.
Menurut Aprianita et al. (2003) bahwa faktor  yang  menentukan  keberhasilan  elisi- tasi  di  antaranya  adalah  konsentrasi  elisitor
dan waktu kontak antara sel dengan elisitor. Contin et  al. (1999)  menjelaskan  bahwa elisitor  dapat  meningkatkan    kandungan metabolit  sekunder  dengan  dua  cara,  yaitu meningkatkan  aktivitas  enzim  dan  mening- katkan  sintesis  enzim  yang  terlibat  dalam jalur  biosintesis  metabolit  tertentu.  Pada penelitian  ini,  peningkatan  alkaloida  kinolin diduga  terjadi  melalui  peningkatan    sintesis enzim.
Endress  (1994)  menemukan  pada  kul- tur  sel C.  roseus yang  dielisitasi  terjadi induksi  enzim  triptofan  dekarboksilase (TDC)  dan  striktosidin  sintetase    (SS)  yang didahului  dengan  sintesis  mRNA  kedua enzim tersebut. Enzim TDC berfungsi untuk mengkatalisis  pembentukan  triptamin  se- bagai  prekursor  alkaloida  kinolin,  sedang- kan  SS  berperan  dalam  kondensasi  antara triptamin dan sekologanin sebagai prekursor alkaloida kinolin.
Menurut  Yu et  al .(2000)  pendekatan umum  yang  dapat  digunakan  untuk  mem- peroleh  hasil  yang  lebih  tinggi  adalah menggunakan  sistem  kultur  dengan  dua tahap  proses.  Tahap  pertama  dengan medium  pertumbuhan  tanpa  elisitor  untuk biomassa maksimum, sedangkan pada tahap kedua  jaringan  akar  rambut  yang  terakumu- lasi  ditransfer  ke  dalam  medium  yang  me- ngandung  elisitor  sebagai  medium  produksi yang  membatasi  pertumbuhan  tetapi  me- rangsang  biosintesis  alkaloida.  Kandungan fitoaleksin kapsidiol pada kultur sel Capsicum annuum dapat ditingkatkan setelah diberi penambahan ekstrak dari spora dan  miselium Gliocladium  deliques Cens. Antosianin  pada  kultur  sel Daucus  carota dapat ditingkatkan setelah diberi penambah- an filtrat sel dan homogenat dari Escherichia coli,  Staphyllococcus  aureus , Saccharo- myces  cereviseae, dan Candida  albicans (Survanalatha et  al., 1994)  terhadap  keru- sakan yang terjadi pada dinding sel tanaman.
Gambar 4. Kandungan  alkaloida kinolin pada akar rambut C. succirubra dengan perlakuan selulase pada umur empat bulan.
Figure  4.  Quinoline alkaloid content on hairy root C. succirubra with cellulase  treatment on four-month- old.
Gambar 5. Kandungan alkaloida kinolin pada akar rambut dengan perlakuan  enzim pektioliase pada kultur umur empat bulan.
Figure 5.   Alkaloid quinoline content on hairy root with pectyoliase    treatment in  four-month-old culture.
Produksi  ginsenosida  pada  kultur  akar rambut Panax  ginseng meningkat  secara nyata  setelah  dielisitasi  dengan  asam jasmonat  dan  elisitor  lain  (Yu et  al ,  2000). Elisitasi dengan selulase dan pektinase pada
kultur C.  roseus menunjukkan  adanya  akti- vasi enzim pendegradasi sekologanin sehingga  menurunkan  kandungan  sekolo- ganin dan striktosidin seluler tetapi meningkatkan kandungan  triptamin  seluler,
0 200 400 600 800 1000 1200 0 0,05  0,1  0,5 1 3 5 10 15 20 25 Konsentrasi Selulase (mg/L)
Cellulose concentration (mg/L)
Kinin ( Quinine ) Kinidin ( Quinidine) Sinkonin ( Cinchonine ) Dihidrosinkonin Dihydroxynchonidine ) Sinkonidin ( Cinchonidine ) K a n d u n g a n al k a lo id a k in o li n a (u g /g b er a t b as a h ) Q u in o li n e a lk a lo id c o n te n t (u g /g f re sh w ei g h t) 0 500 1000 150 2000 2500 0 0,05  0,1  0,5 1 3 5 10 15 20 25 Konsentrasi Pektoliase (mg/L) Pectyoliase consentration (mg/L ) K a n d u n g an a lk al o id a k in o li n a (u g /g b er at b a sa h ) Q u in o li n e a lk a lo id c o n te n t (u g /g f re sh w ei g h t) Sinkonidin ( Cinchonidine ) Kinin( Quinine ) Kinidin( Quinidine ) Sinkonin( Cinc ho nin e) Dihidrosinkonin Dihydroxynchonidine Toruan-Mathius et al.
Pengaruh elisitasi terhadap pertumbuhan dan produksi alkaloida kinolin ...
serta  menghalangi  pengambilan  loganin dalam  sel  yang  dielisitasi.  Zabetakis et  al. (1999)  melaporkan  terjadinya  peningkatan biosintesis  alkaloida  tropan  pada  akar rambut Datura stramonium yang dielisitasi.

## Kesimpulan
1. Adanya  dua  pita  DNA  pada  ukuran basa  780  pb  dan  1600  pb  pada  DNA hairy  root yang  diberi  perlakuan elisitasi menunjukan bahwa gen TL dan TR dari A. rhizogenes tetap terintegrasi secara stabil pada akar rambut .
2. Pertumbuhan  akar  rambut C.  Succi- rubra terbaik diperoleh dari penambah- an  selulase  15  mg/L  (pertambahan bobot  basah  920  mg)  dan  pektioliase 10  mg/L  (pertambahan  bobot  basah 880  mg).  Produksi  alkaloida  kinolin tertinggi  diperoleh  dari  penambahan selulase    25  mg/L  (kinin  580,  kinidin 492, sinkonin 234, dihidrosinkonin 195 dan sinkonidin   165 µg/g bobot basah) dan  pektioliase    1  mg/L  (kinin  2363, kinidin  238,  sinkonin  104,  dihidro- sinkonin 138 dan sinkonidin 1558 µg/g bobot basah).

## Ucapan Terimakasih
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  (i)  Penanggungjawab  Proyek  RUT XI, DRN-LIPI yang telah mendanai penelitian  ini  dari  tahun  2004-2005,  dan kepada  (ii)  Kepala    Balai  Penelitian Bioteknologi  Perkebunan  Indonesia,  atas fasilitas  yang  digunakan  untuk  pelaksanaan penelitian.

## Daftar Pustaka
Alvarez,  S.P.,  P.L.  Marconi  &  A.  Giulietti (2003).  The influence of different elicitors on hyosyamine and scopolamine content in hairy root cultures of Brugmansia candida. In  Vitro  Cell  &  Dev.  Biol.  Plant, 39 (6),
640-644.
Aneloi,  Z.  (2004) . Pertumbuhan  dan  produksi alkaloid  kinolina  pada  kultur  akar  rambut kina  ( Cinchona  ledgeriana Moens  dan C.  succirubra Pavon  ex  Klotzsc)  hasil transformasi  Agrobacterium  rhizogenes galur  LBA  9457. Disertasi. Program Pascasarjana Universitas Pajajaran, Bandung. 117p.
Aprianita,  R.R.Esyanti  &  A.H.  Siregar  (2003). Pengaruh pemberian elisitor jamur Phytium aphanidermatum (Edson)  Fitzp.  terhadap kandungan  ajmalisin  pada  kultur  kalus berakar C.  roseus (L.)  G.  Don. Berita Biologi, 6 (7), 43-547.
Astika,  W.  (1975).    Klon  QRC,  Asal-usul  dan daya  produksinya. Warta  BPTK , 1 (2,3),
175 - 192.
Aoki, T., H. Matsumoto, Y.Asako , Y. Matsunaga &  K.  Shimomura  (1997).  Variation  of alkaloid  productivity  among  several  clones of  hairy  roots  and  regenerated  plants  of Atropa belladonna transformed with
Agrobacterium  rhizogenes 15834. Plant Cell Rep., 16, 282-286. Brotosisworo,  S.  (1993).  Efek  garam  anorganik tertentu terhadap pertumbuhan dan kandungan alkaloid kultur jaringan tanaman Cinchona. Ringkasan Disertasi .
Yogyakarta,  Universitas  Gadjah  Mada. (Tidak dipublikasikan).
Contin,  A.,  R.  van  der    Heijden  &  R.  Verpoorte (1999). Effects of alkaloid precusor feeding and  elicitation  on  the  accumulation  of secologanin  in  a Catharanthus  roseus Dell suspension culture. Plant Cell Tiss. & Org. Cult., 56, 111-119.
Toruan-Mathius et al.
Carvalho, E. B. & W. R. Curtis (2002). Effect of elicitation  on  growth,  respiration,  and nutrient  uptake  of  root  and  cell  suspension cultures of Hyoscyamus muticus. Biotechnol. Prog., 18 (2), 282 -289.
Endress,  R.  (1994). Plant  Cell  Biotechnology . Berlin, Springer-Verlag. p.122-128.
Ermayanti,  T.M.,  L.  Sari,  E.M.R.  Siregar  & D.  Sudradjat  (2000).  Transformasi  mimba ( Azadirachta  indica A.  Juss)  dengan Agrobacterium  rhizogenes galur  ATCC- 15834. Dalam Pros.  Semimar  Nasional Bioteknologi  Pertanian .  Yogyakarta,  7-9 Nopember, 2000.
Geerlings,  A.,  D.  Hallard,  A.M.  Cabbalero, I.L.  Cardoso,  R.van  der  Heijden  & R.  Verpoorte  (1999).  Alkaloid  production by Cinchona  officinalis  'ledgeriana' hairy root culture containing constitutive expression construct of Tryptophan
Decarboxylase  and  Strictosidine  Synthase cDNAs  from Cantharanthus  roseus . Plant Cell Rep., 19, 191-196.
Gelvin,  S.B.  (2000).  Agrobacterium  and  plant genes  involved  in  T-DNA  transfer  and integration. Ann. Rev. Plant. Mol. Biol ., 51 , 223-256.
Hay,  C.A.,  L.A.  Anderson,  M.F.  Roberts  & J.D.  Phllipson.  (1986). In  Vitro culture  of Cinchona species  precursor  feeding  of C.  ledgeriana root  organ  suspension cultures  with  L-Tryphtophan Plant  Cell Rep ., 5 , 1-4.
Messner, B. & M. Boll (1993). Elicitor-mediated induction of enzymes of lignin biosynthesis  and  formation  of  lignin-like material  in  a  cell  suspension  culture  of spruce ( Pice abis ). Plant Cell Tiss. & Org. Cult ., 34 , 261-264.
Nillson, O. & O. Olsson (1997). Geeting to the root  :  the  role  of  The Agrobacterium rhizogenes rol  genes  in  the  formation  of hairy  roots. Physiol.  Plant., 100 ,    463- 473.
Orozco-Castillo,  K.J.  Chalmers,  R.  Waugh  & W.  Powell.  (1994).  Detection  of  genetic diversity  and  selective  gene  introgression in  coffee  using  RAPD  marker. Theor. Appl. Genet ., 87, 934-938.
PT.  SIL.  (2002). Kebijakan  Pemasaran  dan Pengembangan  Kina  Dunia. Bandung,
Pusat  Penelitian Teh dan Kina  Gambung. Rapat  Kina Indonesia.
Raintree  Nutrition.  (2003). Tropical  plant database . Database  File  For:  Quinine
(Cinchona  offinalis).  Raintree  Nutrition Inc.,  Austin,  Texas  78758.  All  right reversed. File://C:\My Documens\
Quinine  Bark-Cinchona-Database  entry for-Quinine  Bark  -  Cinchona  –quinine Bark. Htm.
Reflini  (2002). Kajian  Pertumbuhan  Akar
Rambut Cinchona sp  dari  Inokulasi Beberapa Galur Agrobacterium rhizogenes . Bogor, Program Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor, 60p.
Sambrook, J., E.F. Fritsch & T Maniatis (1989). Molecular  Cloning .  New  York,  Cold Spring Harbour Laboratory Press. p. 468 - 500.
Sim,  S.J.,  J.D  Kim  &  H.N.  Chang  (1994).
Shikonin production by extractive cultivation  in  transformed-suspension  and hairy  root  cultures  of Lithospermum erythrorhizon.  Ann.  N.Y.  AcadSci .,  30
(745), 442-454.
Survanalatha, G. L. Rajendran, G.A. Ravishankar & L.V. Venkataraman (1994). Elicitation of anthocyanin  production  in  cell  cultures  of carrot ( Daucus carota L.) by using elicitors and  abiotic  stress. Biotechnol.  Lett. ,  16
(12), 1275-1280.
Vazques-Flota,  F.  O.,  M.  Moreno-Valezuela, L.  Miranda-Ham,  J.  Coello-Coello,  & V.M.  Vargas  (1994).    Catharanthine  and ajmalicine  synthesis  in Catharantus  roseus hairy root culture. Plant Cell Tiss.  & Org. Cult ., 38 , 273-279.

## Pengaruh elisitasi terhadap pertumbuhan dan produksi alkaloida kinolin
...
Verpoorte.  R.,  R.  Van  der  Heijden,  H.J.G.ten Hoopen  &  J.  Memelink  (1998).  Metabolic engeneering  for  the  improvement  of  plant secondary  metabolite  production. Plant Tiss. Cult. &  Biotechnol ., 4 (1),3-20.
Widayat,  W.  (2000).  Peluang  pasar  dan perkembangan kina dunia . Dalam Prosiding  Pengembangan  Kina  Nasional . Bogor,  Asosiasi  Penelitian  Perkebunan Indonesia. p. 4-10.
Wahyudi, H.I. (2006). Pasar kina dan prospeknya. Dalam Lokakarya Kina Nasional.  Pusat  Penelitian  Teh  dan  Kina Gambung . Bandung, 9 Mei 2006. Yu  Kee-Won,  Wen-Yuan  Gao,  Sung-Ho  Son  &
Kee-Yoeup  Paek  (2000).  Improvement  of ginsenoside  production  by  jasmonic  and some  other  elicitor  in  hairy  root  culture  of ginseng  ( Panax  ginseng C.A.  Meyer). In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant., 36 ,124-128.
Zabetakis, I., R. Edwards & M.  J. Leech (2000).
Elicitation  of  tropane  alkaloid  biosynthesis in  transformed  root  cultures  of Datura stramonium. Phytochemistry 50 , 53-56.
Zayedb,  R.    &    M.  Winka  (2004).    Induction  of tropane  alkaloid  formation  in  transformed root  cultures  of Brugmansia  suaveolens (Solanaceae). Z.  Naturforsch., 59c ,  863- 867.