## Skrining Inhibitor NF- κB Combretum indicum dengan Metode Docking

## Screening Of Inhibitor NF- κB Combretum indicum with Docking Method
Samsul Hadi*, Amalia Khairunnisa, Sefa Nur Khalifah, Sintya Oktaviani, Sri Oktaviana Sari, Umi Nur Hapifah
Prodi Farmasi, FMIPA, Universitas Lambung Mangkurat , Jl. Brigjen. H. Hasan Basry Kayu Tangi, Banjarmasin, Kalimantan Selatan *E-mail: samsul.hadi@ulm.ac.id
Received: 17 September 2021; Accepted: 25 Desember 2021; Published: 31 Desember 2021

## Abstrak
Nuclear factor kappa B (NF-κB) adalah faktor transkripsi yang mengatur ekspresi gen yang penting untuk respon imun bawaan dan adaptif.  Aktivasi berlebih NF-κB berkaitan dengan penyakit inflamasi contohnya autoimun,  lupus  eritematosus  sistemik  (SLE)  dan  rheumatoid  arthritis  (RA).  Penelitian  ini  bertujuan melakukan  skrining  kandungan  kimia  Combretum  indicum  terhadap  inhibitor  NF-κB-inducing  kinase. Metode yang digunakan dalam penelitian ini dua yaitu melalui PASSonline dan docking. Metode docking yang dipergunakan  adalah  PLANTS. Hasil dari  PASSonline  senyawa yang memiliki nilai  P.a diatas  0,7 adalah  arachidonic  acid,  linoleic  acid,  rutin,  methyl  urasolate,  sedangkan  skor  docking    yang  diperoleh adalah asquisqualic acid: -60,0382; arachidonic acid : -100,9410; linoleic acid: -93,8730; rutin : -102,9320; methyl urasolate: -47,9166. Nilai skor docking yang negatif ini mengindikasikan adanya reaksi yang terjadi antara  senyawa  dan  target  terjadi  dengan  mudah.  Berdasarkan  hasil  tersebut  senyawa  yang  diprediksi berpotensi sebagai inhibitor NF-κB adalah Rutin.
Kata Kunci : NF-κB, C.indicum, Docking

## Abstract
Nuclear factor kappa B (NF-κB) is a transcription factor that regulates the expression of genes important for innate and adaptive immune responses. NF-κB overactivation is associated with inflammatory diseases such as autoimmune, systemic lupus erythematosus (SLE) and rheumatoid arthritis (RA). This study aims to  screen  the  chemical  content  of  C.indicum  against  NF-κB-inducing  kinase  inhibitors.  There  are  two methods  used  in  this  study,  namely  through  PASSonline  and  docking.  The  docking  method  used  was PLANTS. The results of PASSonline compounds that have P.a values above 0.7 weree  arachidonic acid, linoleic acid, rutin, methyl urasolate, while the docking scores obtained were asquisqualic acid: -60.0382; arachidonic acid :  -100,9410;  linoleic acid:  -93.8730;  routine  :  -102,9320; methyl urasolate:  -47,9166. This negative docking score indicates that the reaction between the compound and the target occurs easily. In conclusion, the compound predicted to have a potential as an inhibitor of NF-κB is Rutin.
Keywords: NF-κB, C.indicum, Docking

## PENDAHULUAN
Nuclear  factor  kappa  B  (NF-κB)  adalah faktor transkripsi yang mengatur ekspresi gen yang penting untuk respon imun bawaan dan adaptif.    Aktivasi  NF-κB  berperan  dalam respon  pertahanan,  proliferasi  limfosit  dan inflamasi.  NF-κB  termasuk  dalam    keluarga mitogen-activated  protein  kinase  kinase kinase (MAP3K) (Malinin et al., 1997). NF-
κB-inducing kinase (NIK) merupakan protein serin/treonin  kinase  penting  untuk  aktivasi NF-κB  (NF-κjB2).  NIK    mengatur  NF-κjB2 dengan  memfosforilasi  proteolitik  prekursor p100  ke  bentuk  aktif  p524,  yang  mengikat DNA dan mengaktifkan transkripsi gen yang di targetkan (Smith et al., 2001).
Aktivasi  NF-κB  tergantung  pada  NIK dalam  memperoleh  signal  aktivitas  biologis
dari jalur BAFF/BAFF-R  dan (LTα/β2)/LTβ- R  (Kohno  et  al.,  2008).  Signal    BAFF-R berperan  penting  dalam  perkembangan  dan pematangan sel B perifer. Aktivitas abnormal sel B yang disebabkan  oleh kelebihan BAFF dapat  menyebabkan  penyakit  autoimun  dan limfoma sel B. Signal LTβ-R berfungsi dalam memperbaiki organogenesis limfoid sekunder, yang sering menjadi ciri khas untuk perkembangan peradangan kronis dan autoimun (Remouchamps et al., 2011).  NIK juga  menerima  signal  dari  keluarga  sitokin TNF,  contohnya    CD27L,CD40L,  TWEAK, and  RANKL  (akivator  reseptor  NF-κB)  hal ini  berkaitan  dengan  penyakit  autoimun, osteoporosis  dan  kanker  yang  disebabkan oleh Sel  B (Bossen et al., 2006).  Pengobatan dengan target  reseptor  BAFF/LTb/TWEAK secara  signifikan  mengurangi  dan  bahkan mencegah  penyakit    lupus  eritematosus sistemik (LES) dan rheumatoid arthritis (RA) (Jackson  &  Davidson,  2019).  Dengan demikian,  inhibitor  molekul  kecil  khusus untuk  NIK  dapat  memberikan  pendekatan baru  dalam  intervensi  signal    dan  modulasi NF-κB  (Ren  et  al.,  2017).  Inhibisi  terhadap protein ini membantu apoptosis dan meningkatkan  respon  sel  kanker  ketika menjalani  terapi  kanker,  sehingga  proses aktivasi protein dan produksi NF-κB menjadi salah  satu  target  obat  antiiflamasi.  Molekul kecil yang mempunyai akivitas ini mendorong  peneliti  melakukan  skrining komputasi dengan metode docking dari salah satu tumbuhan yaitu Combretum indicum.
C.  indicum  merupakan  tanaman  dengan bunga  berwarna  pink,  putih  tergantung varietasnya.  Tanaman  ini  memiliki  beberapa khasiat  diantaranya  bagian  akar  digunakan untuk  rematik,  biji    atau  buah  dipergunakan sebagai obat cacing, Rebusan buah juga bisa digunakan untuk berkumur dan juga digunakan untuk faringitis.
Daun
dipergunakan  menurunkan  rasa  sakit  karena demam.  Jus  dari  daunnya  digunakan  untuk menyembuhkan  bisul  dan  untuk  mengobati koreng.  Tanaman  ini  digunakan  untuk mengobati  hiperlipidemia,  asma  bronkial,
keram  perut  (Bekele  &  Lemma,  2021). Kandungan  senyawa  dari  tanaman  ini  yaitu asquisqualic  acid,  arachidonic  acid,  linoleic acid,  rutin  dan  methyl  urasolate,  dari kandungan ini yang mempunyai kemampuan dalam pengobatan cacingan adalah quisqualic acid  (Pooja,  2016).  Bunga  dari  C.indicum mepunyai  kemampuan  anti  bakteri  terhadap Staphylococcus aureus (Zuraida et al., 2017)

## METODE PENELITIAN Bahan  dan peralatan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah  senyawa  yang  ditemukan  dari  C. indicum.  Peralatan  yang  digunakan  adalah laptop    Aspire    ES  14.  Software  yang dipergunakaan adalah PLANTS (Korb et al., 2009),  Marvin  bean  (ChemAxon,  2016)  dan discovery studio (Systèmes, 2020). Webserver  yang  dipergunakan  adalah  PASS online.

## Cara kerja
Skrining  virtual  terhadap  inhibitor  NF- κB dilakukan menggunakan metode docking. Tahap  pertama  dalam  penelitian  ini  adalah preparasi NF-κB dengan kode PDB ID: 4IDV menggunakan  yasara  yaitu  memilih  rantai yang  ditargetkan.  Tahap  selanjutnya  adalah preparasi ligand dan senyawa aktif menggunakan Marvin bean. Tahap berikutnya  penelitian  ini  adalah redocking untuk  memvalidasi  metode,  koordinat  yang dipergunakan adalah X:16,8342; Y: 13,8496; Z:  87,2754  dan  radius  yang  dipergunakan adalah  12,1842.    Setelah  metode docking valid maka skrining virtual dapat dilaksanakan.  Tahap  akhir  dalam  penelitian ini  adalah  visualisasi  residu  dan  jarak ikatannya.

## Analisis data
Analisis  dengan  melihat  skor docking yang di atas 80 % dari ligand referensi
Skor docking = Skor docking ligand Skor docking referensi x100% (1)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Skrining virtual inhibitor NF-κB dimulai dengan  mencari  kandungan  kimia  dari  C. indicum.  Dari  penelusuran  daftar  pustaka didapatkan 5 senyawa yaitu asquisqualic acid, arachidonic  acid,  linoleic  acid,  rutin  dan methyl  urasolate  (Bekele  &  Lemma,  2021). Setelah  mendapatkan  senyawa,  selanjutnya adalah  membuat  struktur  dengan  bantuan Marvin  bean  dan  disimpan  dalam  format smile.  Format  smile  ini  yang  dipakai  dalam PASS  online  untuk  memprediksi  aktivitas antiinflamasi.  Hasil  prediksi  online  dapat dilihat  pada Tabel 1.  Dari Tabel 1  nilai tertinggi yang mempunyai aktivitas antiinflamasi  adalah  rutin  dan  nilai  terendah adalah  asquisqualic  acid.  Dan  nilai  Pa ( Probability to be active ) dari semua senyawa yang di skrining menunjukkan nilai Pa lebih besar dari Pi ( probability to be in active ), hal ini menunjukkan senyawa ini berpotensi aktif dari  pada  in  aktif.    Dari Tabel ini  juga diperoleh  4  senyawa  nilai  Pa>0,7  yaitu arachidonic acid, linoleic acid , rutin, methyl urasolate sehingga  empat  senyawa  ini berpotensi  tinggi  secara  komputasi  dan  uji laboratorium sebagai antiinflamasi. Sementara asquisqualic acid nilai  Pa < 0,3, sehingga  senyawa  ini  mempunyai  potensi rendah  sebagai  antiiflamasi  baik  secara komputasi maupun uji laboratorium (Filimonov  et  al.,  2014;  Primadhanty  et  al., 2020).
Tabel 1. Skrining PASS online
Senyawa Pa Pi asquisqualic acid 0,222  0,156 arachidonic acid 0,73 0,012 linoleic acid 0,73 0,012 rutin 0,99 0 methyl urasolate 0,859  0,005
Setelah dilakukan skrining melalui PASS online  untuk  melihat  prediksi  aktivitas antiinflamasi  selanjutnya  adalah docking untuk melihat stabilitas interaksi antara ligand dengan NF-κB. Sebelum melakukan docking terhadap  senyawa  dari Combretum  indicum
terlebih  dahulu  dilakukan  validasi docking menggunakan  struktur  co-crystal  yaitu  4-{3- [2-amino-5-(2-methoxyethoxy)pyrimidin-4- yl]-1H-indol-5-yl}-2-methylbut-3-yn-2-ol. Hasil  dari  validasi docking memperlihatkan nilai RMSD sebesar 0,2393 Å seperti terlihat pada Gambar  1 .  Nilai  ini  di  bawah  2  Å, sehingga  metode  ini  dapat  dikatakan  valid (Rodríguez et al., 1989).
Gambar 1 . Visualisasi redocking

## Merah adalah ligand referensi, kuning adalah ligand redocking
Stabilitas  interaksi  antara  ligand  dengan protein  dapat  dilihat  dari  skor docking .  Skor docking negatif menunjukkan semakin stabil dan reaksi  yang terjadi semakin mudah  dan spontan (Cournia et al., 2017). Skor docking dan tipe residu yang terlibat dapat lihat pada Tabel 1.  Skor docking relatif  di  atas  80  % adalah arachidonic acid dan methyl urasolate . Skor docking dari arachidonic acid disebabkan  oleh  interaksi  hidrofobik  tipe alkil-alkil  antara  ligand  dengan  ALA443 dengan  jarak  ikatan  4,99992  Å  dan  3,62564 Å; Residu LYS517 jarak 4,60602 Å, VAL521 jarak  5,21415  Å,  ALA  538  jarak  3,6057  Å, LEU522  jarak  4,93024  Å.  Ikatan  Hidrofob dengan  tipe  pi-alkil  terjadi  pada  HIS513 dengan jarak 4,74373 Å dan  4,74373 Å serta 4,21303  Å;  PHE535  jarak  4,01061  Å  dan 4,96785  Å.  Jika  dikomparatifkan  dengan ligand  referensi  maka  memiliki  persamaan residu  yang  berinteraksi  yaitu  LYS517, ALA538, PHE535. Yang menarik dari ligand ini    jika  dibandingkan  dengan linoleic  acid
adalah  terdapat  ikatan  rangkap  pada  nomer 5,8,11,  14  sedangkan linoleic  acid hanya memiliki ikatan rangkap pada 9 dan 12, hal ini berpengaruh pada tipe interaksi yang terjadi, walaupun  memiliki  kesamaan  residu  yang berikatan akan tetapi terdapat perbedaan pada ALA443, HIS513, PHE535, karena arachidonic acid mampu membentuk interaksi lebih dari 1( Tabel 2 ).
Rutin memiliki skor docking yang bagus karena memiliki ikatan hidrogen yang berasal dari  CYS533    atom  H    dengan  atom  O  dari ligand  dengan  jarak  ikatan  2,10764  Å, ASN520 (2,49083 Å), ALA531  (2,83007 Å),
LYS517 (2,18111 Å), PHE535 (3,07222 Å), HIS513 (2,1895 Å), ASP534 (2,73761 Å). Ikatan hidrogen terjadi antara pi ligand- alkil dari  protein  yaitu  LYS517  jarak  ikatan 4,59707  Å,  ILE452  (5,36648  Å),  CYS533 (4,82897  Å),  ILE452  (5,36648  Å),  CYS533 (4,82897 Å), VAL 453 (4,47419 Å), ALA531 (4,53039 Å), LEU506 (4,10214 Å), ALA538 (4,91563  Å).  Jika  dikomparatifkan  dengan ligand  referensi  maka  memiliki  persamaan residu  yang  berinteraksi  yaitu  CYS533, ALA531, LYS517, PHE535, ASP534, LEU506, ALA538. Tabel 2. Skor docking dan residu yang berinteraksi Senyawa Skor docking Tipe ikatan Hidrogen Hidrofob Pi-lone pair ligand referensi -118,2650 ALA531, LYS517, ALA518, ASP519 PHE535, ALA443, ALA538, LEU506, ILE511, HIS513, LEU532, CYS533 ASP534 asquisqualic acid -60,0382 ASP534, VAL516, ASN520, ASP515, ASP534 LEU532, CYS533, VAL516, LEU532 ASP534 arachidonic acid -100,9410 ALA443, LYS517, VAL521, ALA538, LEU522, HIS513, PHE535 linoleic acid -93,8730 ALA443, LYS517, VAL521, ALA538, LEU522, HIS513, PHE535 rutin -102,9320 CYS533, ASN520, ALA531, LYS517, PHE535, HIS513, ASP534 LYS517, ILE452, CYS533, VAL453, ALA531, CYS533, LEU506, ALA538 methyl urasolate -47,9166 HIS537 VAL516, VAL521, LEU522,
CYS533, ALA538, LEU522, LEU532, LEU477, LEU522, HIS513, PHE535 (A) (B)
Gambar 2. Visualisasi 3D Kuning adalah ligand ; (A) interaksi Arachidonic acid dengan NF-κB; (B) interaksi rutin dengan NF-κb
Arachidonic  acid walaupun  mempunyai nilai  Pa  tinggi  dan  mempunyai  stabilitas interaksi  yang  baik,  tetapi  senyawa  ini merupakan asam lemak tak jenuh ganda yang terikat secara kovalen dalam bentuk esterifikasi  di  membran  sel  tubuh.  Setelah iritasi atau cedera, asam arakidonat dilepaskan  dan  dioksigenasi  oleh  sistem enzim  yang  mengarah  pada  pembentukan kelompok mediator inflamasi yaitu eikosanoid. Eikosanoid merupakan dasar dari proses inflamasi (Higgins & Lees, 1984) yang dengan adanya enzim lipooksigenase, eikosanoid  dikatalisis  menjadi  prostaglandin E2  dan  prostanoid  lainnya.  Salah  satu mekanisme  obat  antiinflamasi  nonsteroid menghasilkan penghambatan sintesis prostaglandin dengan menginhibisi siklooksigenase,  sehingga  saat  ini  salah  satu pendekatan antiinflamasi adalah mengganggu metabolisme arachidonic  acid khususnya inflamasi  kronis  karena  senyawa  ini  bekerja di daerah jalur utama inflamasi (Sugimoto et al., 2016). Sehingga arachidonic acid bekerja sebagai agonis dari inflamasi. Sedangkan skor docking dari rutin yang bagus ini, berkolerasi dengan aksi antinflamasi melalui mekanisme penurunan  produksi  nitrit  oxide  (NO)  dan
TNFα  pada  neutrophil  dengan  konsentrasi 100 μM (Nikfarjam et al., 2017).
Active  site NF-κB  memiliki  pengaruh yang  besar  karena  adanya  residu    SER177, CYS179  dan  SER  188  (Gilmore  & Herscovitch,  2006)  merupakan  bagian  dari loop  aktivasi  kinase  dan  diperlukan  untuk aktivasi IKK β dalam merespon signal  TNF dan  LPS  ketika  terjadi  inisiasi  inflamasi (Perkins,  2006)  namun  karena  berbeda koordinat  dengan  situs  pengikatan  co-cystal yaitu
4-{3-[2-amino-5-(2-
methoxyethoxy)pyrimidin-4-yl]-1H-indol-5- yl}-2-methylbut-3-yn-2-ol maka interaksi ini tidak terlihat  pada interaksi  arachidonic acid atau rutin (Gambar 2). . Sehingga berdasarkan data diatas dan informasi tentang arachidonic acid maka  senyawa  yang  berpotensi  sebagai inhibitor  NF-κB  secara  komputasi  adalah rutin.

## KESIMPULAN
Senyawa yang berpotensi sebagai inhibitor  NF-  κB  secara  komputasi  adalah rutin

## Daftar Pustaka
Bekele,  B.,  &  Lemma,  B.,  2021. Bioactive  compounds  from  ten  species  of  the  genus Combretum : Review . 5 (1), 18–30.
Bossen,  C.,  Ingold,  K.,  Tardivel,  A.,  Bodmer,  J.-L.,  Gaide,  O.,  Hertig,  S.,  Ambrose,  C., Tschopp, J., & Schneider, P., 2006. Interactions of tumor necrosis factor (TNF) and TNF receptor family members in the  mouse and human. The Journal of Biological Chemistry , 281 (20), 13964–13971.
ChemAxon., 2016. ChemAxon - Software Solutions and Services for Chemistry and Biology. In MarvinSketch, Version 16.10.31 . https://chemaxon.com/
Cournia, Z., Allen, B., & Sherman, W., 2017. Relative Binding Free Energy Calculations in Drug  Discovery:  Recent  Advances  and  Practical  Considerations. Journal  of  Chemical Information and Modeling , 57 (12), 2911–2937.
Filimonov,  D.  A.,  Lagunin,  A.  A.,  Gloriozova,  T.  A.,  Rudik,  A.  V,  Druzhilovskii,  D.  S., Pogodin, P. V, & Poroikov, V. V., 2014. Prediction of the Biological Activity Spectra of
Organic  Compounds  Using  the  Pass  Online  Web  Resource. Chemistry  of  Heterocyclic Compounds , 50 (3), 444–457
Gilmore, T. D., & Herscovitch, M., 2006. Inhibitors of NF-κB signaling:  785 and counting. Oncogene , 25 (51), 6887–6899.
Higgins, A. J., & Lees, P., 1984. The acute inflammatory process, arachidonic acid metabolism and the mode of action  of anti-inflammatory drugs. Equine Veterinary Journal , 16 (3), 163–175.
Jackson,  S.  W.,  &  Davidson,  A.,  2019.  BAFF  inhibition  in  SLE-Is  tolerance  restored? Immunological Reviews , 292 (1), 102–119.
Kohno, T., Daa, T., Otani, H., Shimokawa, I., Yokoyama, S., & Matsuyama, T., 2008. Aberrant expression of BAFF receptor, a member of the tumor necrosis factor receptor  family, in malignant  cells  of  nonhematopoietic  origins. Genes to Cells : Devoted to Molecular & Cellular Mechanisms , 13 (10), 1061–1073.
Korb, O., Stützle, T., & Exner, T. E., 2009. Empirical scoring functions for advanced Protein- Ligand docking with PLANTS. Journal of Chemical Information and Modeling , 49 (1), 84–96.
Malinin, N. L., Boldin, M. P., Kovalenko, A. V, & Wallach, D., 1997. MAP3K-related kinase involved in NF-kappaB induction by TNF, CD95 and IL-1. Nature , 385 (6616), 540–544.
Nikfarjam, B. A., Adineh, M., Hajiali, F., & Nassiri-Asl, M., 2017. Treatment with Rutin - A Therapeutic Strategy for Neutrophil-Mediated Inflammatory  and Autoimmune Diseases: -  Anti-inflammatory  Effects  of  Rutin  on  Neutrophils. Journal  of  Pharmacopuncture , 20 (1), 52–56.
Perkins, N. D., 2006. Post-translational modifications regulating the activity and function of the nuclear factor kappa B pathway. Oncogene , 25 (51), 6717–6730.
Pooja,  S.  S.,  2016.  A  brief  review  on  pharmacological  studies  of  Combretum  indicum  in development of pharmaceutical formulation for challenging. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences , 5 (6), 500–507.
Primadhanty, B., Adniana, N., Pk, H., Utomo, D. H., & Yustin, E., 2020. Analisis In Silico Pada Virgin Coconut Oil ( VCO ) Untuk Terapi Dermatitis Atopik. Medicinus , 33 (3), 32– 37.
Remouchamps,  C.,  Boutaffala,  L.,  Ganeff,  C.,  &  Dejardin,  E.,  2011.  Biology  and  signal transduction pathways of the Lymphotoxin-αβ/LTβR system. Cytokine & Growth Factor Reviews , 22 (5–6), 301–310.
Ren,  X.,  Li,  X.,  Jia,  L.,  Chen,  D.,  Hou,  H.,  Rui,  L.,  Zhao,  Y.,  &  Chen,  Z.,  2017.  A  small- molecule  inhibitor  of  NF-κB-inducing  kinase  (NIK)  protects  liver  from    toxin-induced inflammation, oxidative stress,  and injury. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for  Experimental Biology , 31 (2), 711–718.
Rodríguez, E., Arqués, J. L., Rodríguez, R., Nuñez, M., Medina, M., Talarico, T. L., Casas, I. A.,  Chung,  T.  C.,  Dobrogosz,  W.  J.,  Axelsson,  L.,  Lindgren,  S.  E.,  Dobrogosz,  W.  J., Kerkeni, L., Ruano, P., Delgado, L. L., Picco, S., Villegas, L., Tonelli, F., Merlo, M., … Masuelli,  M.,  1989.  Protein-Protein  and  Protein-Ligand  Docking. Intech , 32 (tourism), 137–144.
Smith, C., Andreakos, E., Crawley, J. B., Brennan, F. M., Feldmann, M., & Foxwell, B. M., 2001.  NF-kappaB-inducing  kinase  is  dispensable  for  activation  of  NF-kappaB  in inflammatory    settings  but  essential  for  lymphotoxin  beta  receptor  activation  of  NF- kappaB in primary human fibroblasts. Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950) , 167 (10), 5895–5903.
Sugimoto, M. A., Sousa, L. P., Pinho, V., Perretti, M., & Teixeira, M. M., 2016. Resolution of Inflammation: What Controls Its Onset?   . In Frontiers in Immunology (Vol. 7, p. 160).
Systèmes, D., 2020. Free Download: BIOVIA Discovery Studio Visualizer - Dassault Systèmes . https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer- download#_ga=2.4935860.685747970.1587999055-a5d1c1c0-3176-11e9-a86f- e302515d21c8
Zuraida,  Riniwasih,  L.,  &  Hartanti,  D.,  2017.  Uji  efektifitas  ekstrak  etanol  bunga  ceguk (Combretum  indicum  L.)  dalam  bentuk  sedian  gel  antiseptic  tangan  dengan  metode replika. Indonesia Natural Research Pharmaceutical Journal , 2 (1), 64–72.