Sintesis Antigen AFB1-BSA dan Konjugasi Antibodi Anti AFB1- BSA dengan Nanopartikel Emas sebagai Pereaksi Imunostrip †
Ita Krissanti 1,2 *, Agustin Indrawati 3 , Romsyah Maryam 4
1 Program Studi Kedokteran Hewan, Fakultas Kedokteran, Universitas Padjadjaran, Bandung
2 Departemen Ilmu Kedokteran Dasar, Fakultas Kedokteran, Universitas Padjadjaran, Bandung
3 Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Per- tanian Bogor, Bogor
4 Balai Besar Penelitian Veteriner, Bogor
ABSTRACT: Aflatoxin B1 (AFB1) often contaminates a great variety of foods and animal feeds that will be dangerous if con- sumed by humans or animals.  Rapid detection techniques that can be used in the field is really needed to monitor AFB1 con- tamination.  The aims of this study were to perform synthesis of AFB1-BSA antigen and conjugation of antibody against AFB1- BSA to gold nanoparticle as immunostrip test reagents. The AFB1-CMO was identified on TLC and AFB1-BSA was charac- terized using SDS PAGE. The AFB1-CMO formation indicated as a blue spot at 0.45 retention factor (Rf) on TLC and the AFB1-BSA antigen revealed as a single band protein at about 72 kDa molecular weight on the SDS PAGE. Conjugation of antibody against AFB1-BSA to gold nanoparticle resulted in the formation of red-dish purple compound which can be used for the detection of AFB1 on immunostrip. The optimum composition achieved in concentration of AFB1-BSA 1-1.5 mg/ml, IgG anti rabbit 0.1 mg/ml, and antibody against AFB1-BSA-gold nanoparticle conjugate in 0.5x0.5 cm² area characterized by the establishment of two reddish purple lines in the test and control zone.

## Keywords:
AFB1, antibody against AFB1, gold nanoparticle, immunostrip.

## ■ PENDAHULUAN
Toksin AFB1 dari kapang Aspergillus flavus dan Aspergillus parasiticus sebagai karsinogen grup IA (IARC 2002) meru- pakan  agen  teratogen  dan  imunosupresif bagi  manusia  dan hewan.  Pakan  ternak  dapat  membawa  aflatoksin  yang beracun sehingga berbahaya bagi hewan dan manusia yang mengkonsumsinya (Maciorowskia et  al .  2007). Teknik de- teksi keamanan bahan pangan dan pakan sangat diperlukan. Saat ini metode uji untuk mendeteksi AFB1 antara lain TLC, HPLC, dan ELISA yang hanya dapat dilakukan di laborato- rium, membutuhkan waktu lama dan tenaga berketerampilan khusus (Zheng et al . 2006; Saini &  Kaur 2012).  Pengem- bangan  uji  imunostrip  dapat  digunakan  untuk  mendeteksi AFB1 secara sensitif,  mudah, efisien,  serta  tanpa  peralatan dan  keterampilan  khusus  (Liu et  al .  2013).    Penelitian  ini mensintesis antigen AFB1-BSA dan memproduksi konjugat antibodi anti AFB1-BSA dengan nanopartikel emas sebagai bahan pereaksi imunostrip untuk mendeteksi AFB1.

## ■ BAHAN DAN METODE
Sintesis dan Karakterisasi Antigen AFB1-Bovine Serum Albumine  (BSA): Sintesis  antigen  dilakukan  dengan merubah AFB1 menjadi AFB1- carboxymethyl oxime (CMO) untuk  kemudian  dikonjugasikan  dengan  BSA  (Liu et  al . 2013).
Konjugasi  Antibodi  Anti  AFB1-BSA  dengan  Nano- partikel  Emas: Antibodi  Anti  AFB1  diproduksi  dan  di- purifikasi  di  Laboratorium  Toksikologi  Balai  Besar Penelitian  Veteriner  (BBLitVet)  dikonjugasi  dengan nanopartikel emas sesuai metode Liu et al . (2013). Perakitan imunostrip  terdiri  dari  lapisan  komponen  disajikan  pada Gambar  1.  Sistem  imunostrip  dengan  format  kompetitif dapat berjalan dengan terbentuk 2 garis berwarna ungu untuk hasil uji negatif yaitu pada daerah uji dan daerah kontrol.
Gambar 1. Susunan imunostrip (A); hasil negatif imunostrip (B); hasil positif imunostrip (C)
ISSN 2581-2416 DOI: http://dx.doi.org/10.29244/avl.4.4.77-78 http://journal.ipb.ac.id/index.php/arshivetlett
Diterima: 21-10-2020 | Direvisi: 12-11-2020 | Disetujui: 21-11-2020 © 2020 CC-BY-SA. Ini adalah artikel Open Access yang didistribusikan ber- dasarkan ketentuan dari Creative Commons Attribution ShareAlike 4.0 Interna- tional License ( https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/ ).

## ■ HASIL DAN PEMBAHASAN

## Sintesis dan Karakterisasi Antigen AFB1-BSA
Toksin  AFB1  memiliki  ciri  penampakan  fluorosensi berwarna biru dibawah sinar ultraviolet (UV) panjang gelom- bang 365 nm. Bercak AFB1-CMO memiliki Rf = 0,45, se- dangkan  AFB1  baku  memiliki  Rf  =  0,9.  Nilai  Rf  AFB1 bervariasi tergantung pada jenis pelat dan sistem pelarut yang digunakan. Pada sistem pelarut kloroform dan aseton (9:1), nilai  Rf  dari  AFB1-CMO  berkisar  0,4–0,7  (AOAC  1995). Toksin AFB1 dikonjugasikan dengan protein pembawa yaitu BSA karena toksin ini memiliki bobot molekul yang terlalu kecil  untuk  digunakan  sebagai  imunogen.  Toksin  ini  tidak memiliki gugus reaktif untuk berikatan dengan BSA. Taha- pan sintesis antigen AFB1-BSA diawali dengan sintesis hap- ten AFB1-CMO terlebih dahulu seperti dilaporkan oleh Chu et al . (1977) dan Liu et al . (2013).
Berdasarkan perhitungan, hasil SDS PAGE antigen AFB1- BSA yang disintesis menunjukan pita protein tunggal dengan bobot molekul sekitar 72 kDa, sedangkan BSA menunjukan pita protein tunggal berukuran sekitar 66,9 kDa. Analisis an- tigen  AFB1-BSA  diperoleh  migrasi  protein  penanda  dari awal resolving gel sampai tracking dye berjarak 6,6 cm (Rf). Ukuran molekul pita protein dihitung berdasarkan rumus re- gresi dari nilai logaritma berat molekul pita protein penanda (sumbu  y)  terhadap  mobilitas  relatif  atau  Rf  (sumbu  x) (Hames 1998). Kurva regresi linear diperoleh dengan persa- maan  y  =  -1,023x +  2,276;  R2  = 0,949.  Hasil  SDS  PAGE menunjukkan antigen AFB1-BSA yang disintesis lebih besar bobot molekulnya dibandingkan dengan BSA. Hal ini terjadi karena penambahan AFB1-CMO berikatan dengan BSA.

## Konjugasi  Antibodi  Anti  AFB1-BSA  dengan  Nano- partikel Emas
Terdapat  perbedaan  warna  nanopartikel  emas  sebelum dikonjugasi  yang  berwarna  merah  sedangkan  sesudah dikonjugasi dengan antibodi anti AFB1-BSA menjadi warna merah  keunguan.  Pengujian  sistem  imunostrip  diperoleh konsentrasi  optimum  dari  antigen  AFB1-BSA  yaitu  1,5 mg/ml sebanyak 1 µL dan IgG anti rabbit dengan konsentrasi 0,1  mg/ml  sebanyak  1  µL  dari  terbentuknya  garis  merah keunguan  pada  daerah  uji  dan  daerah  kontrol  (Gambar  2). Jumlah  antigen  AFB1-BSA  pada  membran  nitroselulosa serta jumlah konjugat antibodi anti AFB1-BSA dengan na- nopartikel  emas  pada  lapisan  konjugat  akan  menentukan limit deteksi visual dari imunostrip (Li et al . 2009).
Imunostrip  dengan  menggunakan  antibodi  yang  dilabel oleh  nanopartikel  emas  lebih  menjanjikan  karena  ukuran partikelnya  yang  kecil.  Menurut  Chiao et  al .  (2004), penggunaan nanopartikel emas sebagai reagen detektor pada uji  imunokromatografi  cepat  memiliki  kelebihan  yaitu mempunyai mobilitas yang baik pada membran berpori, dan kecenderungan  rendah  untuk  beragregasi  selama  preparasi imunostrip  sehingga  akan  mempunyai  sensitivitas  yang tinggi untuk digunakan sebagai komponen reagen.
Gambar 2. Komposisi optimum antigen AFB1-BSA dan IgG anti rabbit pada pengujian sistem imunostrip

## ■ SIMPULAN
Sistem imunostrip yang dikembangkan dapat digunakan un- tuk mendeteksi AFB1 pada sampel.

## ■ INFORMASI PENDUKUNG
†  Preparasi  sistem  imunostrip  yang  dikembangkan  untuk mendeteksi AFB1 tersedia sebagai informasi pendukung.

## ■ INFORMASI PENULIS

## Penulis Korespondensi
*IK: itakrissanti@gmail.com
Program Studi Kedokteran Hewan, Fakultas Kedokteran, Universi- tas Padjadjaran, Bandung

## ■ UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  diucapkan  kepada  Balai  Besar  Penelitian Veteriner Bogor (BBLitVet) yang telah mendukung dan membantu hingga terselesaikannya penelitian ini.

## ■ PUSTAKA ACUAN
AOAC.  1995.  Official  Methods  of  Analysis  of  AOAC  International. Maryland: AOAC International.
Chiao DJ, Shyu RH, Hu Cs, Chiang HY, Tang SS.  2004.  Colloidal gold based  immunochromatographic  assay  for  detection  of  botulinum neurotoxin type B. Journal of Chromatography B. 809(1): 37-41.
Chu FS, Hsia SMT, Sun PS.  1977.  Preparation and characterization of AFB1-oxime. Association Official Analytical Chemistry. 60:791-794. Hames  BD.  1998.  Gel  Electrophoresis  of  Protein  3 rd ed.  New  York.
Oxford University Press.
[IARC]  International  Agency  of  Research  on  Cancer.  2002.  Some traditional  herbal  medicines,  some  mycotoxins,  naphthalene  and styrene.  IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 82: 1-556.
Laemmli UK. 1970. Cleavage of Structural Protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227(5259): 680-685.
Li P, Zhang Q, Zhang W.  2009.  Immunoassays for aflatoxins.  Trends in Analitical Chemistry. 28(9): 1115-1126.
Liu BH, Yu-Tien Hsu, Chuan-Chen Lu, Feng-Yih Yu.  2013.  Detecting AFB1  in  foods  and  feeds  by  using  sensitive  rapid  enzyme-linked immunosorbent assay and gold nanoparticle immunochromatographic strip. Food Control. 30(1):184-189.
Maciorowskia KG, Herreraa P, Jonesb FT, Pillaia SD, Rickea SC.  2007.
Effects on poultry and livestock of feed contamination with bacteria and fungi. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2): 109–136. Saini  SS,  Kaur  A.  2012.  Aflatoxin  B1:  Toxicity,  characteristics  and analysis:  Mini  review.  Global  Advanced  Research  Journal  of Chemistry and Material Science. 1(4): 63-70.
Zheng MZ, Richard JL, Binder J.  2006.  A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopatologia  161(5): 261-273.