## OPTIMASI  WAKTU  PROSES  HIDROLISIS  DAN  FERMENTASI DALAM  PRODUKSI  BIOETANOL  DARI  LIMBAH  PENGOLAHAN
AGAR  ( Gracilaria sp.)  INDUSTRI
Optimization of Hydrolysis and Fermentation in The Bioethanol Production from Waste of Industrial Agar (Gracilaria sp.) Processing
Rodiah Nurbaya Sari 1* , Sugiyono 1 , dan Luthfi Assadad 2
1 Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengembangan  Pengolahan Produk  dan  Bioetknologi  Kelautan  dan  Perikanan,  KKP. Jl. K.S. Tubun Petamburan  VI, Jakarta  Pusat 10260
2 Loka  Penelitian  dan Pengembangan  Mekanisasi  Pengolahan Hasil  Perikanan,  KKP. Jl. Imogiri  Barat  KM  11.5 Jetis,  Bantul–DI. Yogyakarta  55781 *Korespondensi  Penulis:  rodiah_ns@kkp.go.id/rodiah_ns@yahoo.com
Diterima:  24  Februari  2012;  Disetujui  12  November  2013

## ABSTRAK
Produksi  bioetanol  sebagai  sumber  energi  dari  biomassa  lignoselulosa  merupakan  salah satu  alternatif  untuk  mengurangi  penggunaan  bahan  bakar  fosil  dan  kerusakan  lingkungan. Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  mendapatkan  waktu  hidrolisis  dan  fermentasi  yang  optimal untuk  memproduksi  bioetanol  dari  limbah  pengolahan  agar  ( Gracilaria  sp .)  industri  dengan menggunakan  kapang Trichoderma  viride dan  khamir Saccharomyces  cerevisiae .  Penelitian yang  dilakukan  terdiri  dari  beberapa  tahap  yaitu  karakterisasi  limbah  agar  industri,  hidrolisis enzimatis  menggunakan  kapang Trichoderma  viride penghasil  selulase,  dan  fermentasi  dengan khamir Saccharomyces  cerevisiae .  Hasilnya  menunjukkan  bahwa  waktu  optimal  untuk  hidrolisis enzimatis  adalah  4  hari  pada  suhu  28 o C  dan  pH  3,91;  aktivitas  CMC ase 210,48  IU/ml  dan menghasilkan  total  gula  pereduksi  6,74  mg/ml.  Sedangkan  untuk  waktu  fermentasi  yang  optimal adalah 2 hari pada  suhu 32 o C dan pH  4,66 dengan nilai OD 600 nm 0,0181 menghasilkan  etanol kasar  dengan  kadar  0,47%  (b/b).
KATA KUNCI: bioetanol,  limbah  pengolahan  agar  ( Gracilaria sp.), Trichoderma  viride , selulase, Saccharomyces  cerevisiae

## ABSTRACT
Production of bioethanol as a  source of energy from lignocellulosic biomass has become one alternative  for  reducing  fossil  fuel  usage  and  environmental  damage.  The  purpose  of  this  study was  to find  out optimum  time  of  hydrolysis  and fermentation  process to  produce  bioethanol  from solid  waste  of  industrial  agar  ( Gracilaria sp.) processing  using Trichoderma  viride fungus  and Saccharomyces  cerevisiae yeast.  The  research  cons isted  of  sev eral  stages ,  i.e.  the characterization  of  industrial  agar  waste,  enzymatic  hydrolysis  using  cellulase  producing Trichoderma viride and the fermentation using Saccharomyces cerevisiae . The results showed that the optimum time of enzymatic hydrolysis was 4 days at the temperature of 28 °C, pH of 3.91, and  CMCase  activity  of  210.48  IU/ml  resulting  in  total  reducing  sugar  of  6.74  mg/ml.  While  the optimum time of fermentation was 2 days at the temperature of 32 °C and pH of 4.66 with OD 600 nm value  of 0.0181, resulting crude  ethanol with  concentration of  0.47% (w/w).
KEYWORDS: bioethanol,  industrial  agar  ( Gracilaria sp.)  processing  waste, Trichoderma viride ,  cellulase, Saccharomyces  cerevisiae

## PENDAHULUAN
Minyak bumi Indonesia saat ini diperkirakan hanya tersedia untuk jangka waktu sekitar 15 tahun dengan asumsi tingkat pertumbuhan konsumsi berada pada kisaran 5-6% setahun (Anon., 2009). Untuk mengatasi
kebutuhan akan energi, diperlukan energi alternatif. Salah  satu  upaya  adalah  dengan  mengkonversi biomassa menjadi bioetanol. Di sisi lain, kekayaan Indonesia yang berlimpah akan sumber daya hayati termasuk mikroorganisme,  sangat  memungkinkan untuk pemanfaatan biomasa/lignoselulosa menjadi
bioetanol, yang sampai saat ini belum dikembangkan secara optimal (Anindyawati, 2009).
Lignoselulosa adalah komponen organik di alam yang melimpah dan terdiri dari tiga tipe polimer, yaitu selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Lignoselulosa bisa diperoleh dari bahan kayu, jerami, rumput-rumputan, limbah pertanian/hutan, limbah industri (kayu, kertas), dan bahan berserat lainnya. Kandungan dari ketiga komponen lignoselulosa bervariasi tergantung dari jenis bahannya (Anindyawati, 2009). Teknologi yang mengkonv ersi  biomasa/lignoselulosa  menjadi bioetanol merupakan teknologi yang mempunyai nilai ekonomi tinggi karena dapat memanfaatkan bahan limbah  sebagai  bahan  baku.  Melalui  penerapan bioteknologi, dengan penggunaan mikroba sebagai penghasil enzim, diharapkan dapat diperoleh teknologi yang ramah lingkungan dibandingkan dengan proses kim iawi  yang  selam a  ini  banyak  dilakukan (Anindyawati, 2009).
Bahan  baku  untuk  proses  produksi  bioetanol diklasifikasikan menjadi tiga kelompok, yaitu gula, pati,  dan  selulosa  (Ge et  al., 2011).  Sumber  gula berasal dari gula  tebu, gula bit, molase dan buah- buahan, dapat langsung dikonversi menjadi etanol. Sumber dari bahan berpati seperti jagung, singkong, kentang dan akar tanaman harus dihidrolisis terlebih dahulu menjadi gula. Sumber lainnya yaitu selulosa berasal dari kayu, limbah pertanian, limbah pabrik pulp dan kertas, semuanya harus dikonversi menjadi gula. Namun  sumber  gula  dan  bahan  berpati  dapat menimbulkan permasalahan baru jika dikonversi terus menerus  menjadi  bioetanol  karena  bahan-bahan tersebut berpotensi juga sebagai bahan pangan (Lin et al., 2006).
Limbah agar ( Gracilaria sp.) industri berpotensi untuk  dijadikan  bahan  baku  produksi  bioetanol dikarenakan  dua alasan yaitu kandungan selulosa yang cukup tinggi mencapai 16,00-59,69% (Harvey, 2008; Sedayu et al ., 2008, Triwisari, 2010) dan jumlah limbah industri agar yang tinggi merupakan potensi besar  dalam  menjamin  ketersediaan  bahan  baku. Menurut Kim (2007) perusahaan pengolah rumput laut menghasilkan limbah padat sebanyak 65-75% dari bahan baku setiap harinya dan jika suatu pabrik besar pengolah agar memiliki kapasitas produksi sebesar 80  ton  per  bulan  m aka  m enghasilkan  lim bah berselulosa sebanyak 56 ton (Ujiani, 2007).
Penelitian  pembuatan  bioetanol  telah  lama dilakukan, namun pemanfaatan limbah pengolahan agar  ( Gracilaria sp.)  industri  sebagai  bahan  baku produksi bioetanol masih belum banyak dilakukan. Salah  satu  penelitian  yang  mengkaji  produksi bioetanol dari Sargassum sp., Sari (2010) menyatakan hasil bioetanol yang diperoleh masih sangat rendah
yaitu 0,045 % (b/b). Kesulitan yang dialami adalah karena  adanya  beberapa  f aktor  yang  sangat mempengaruhi proses produksi bioetanol di setiap tahapan yang harus dilewati. Tahapan proses tersebut yaitu proses hidrolisis (secara asam dan enzimatik) dan fermentasi. Faktor-faktor yang berpengaruh pada proses hidrolisis adalah kandungan karbohidrat bahan baku, waktu,  pH, dan suhu (Osvaldo et al., 2012). Sedangkan  pada  proses  fermentasi  adalah  jenis mikroorganisme,  kadar  gula  yang  dihasilkan  dari proses hidrolisis, waktu, pH, dan suhu (Azizah et al., 2012; Osvaldo et al., 2012).
Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan  untuk mendapatkan waktu optimum hidrolisis enzimatis dan fermentasi untuk memproduksi bioetanol dari limbah pengolahan  agar  ( Gracilaria sp.) industri  dengan menggunakan kapang Trichoderma viride dan khamir Saccharomyces cerevisiae .

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah limbah  padat  yang  dikum pulkan  dari  industri pengolahan  agar  ( Gracilaria  sp. )  PT.  Agarindo Bogatam a.  Limbah  tersebut  m erupakan  hasil penyaringan pada tahap akhir proses pengolahan. Limbah dikeringkan dengan sinar matahari sampai kadar  air  mencapai  sekitar 10%.  Bahan lain  yang digunakan  adalah  kapang T.  viride dan  khamir S. cerevisiae dari Laboratorium Mikrobiologi, ITP, IPB; PDB ( potato dextrose broth ), YGMP ( yeast extract, glucose, malt extract, dan pepton ), media Andreoti, pepton, tween 80, dan yeast extract . Bahan kimia yang digunakan untuk analisis adalah glukosa standard dan asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS).
Alat yang digunakan meliputi:  bioreaktor batch stainless stee l sistem double jacket hasil rakitan Balai Besar Penelitian  dan  Pengembangan Pengolahan Produk  dan  Boteknologi  Kelautan  dan  Perikanan dengan kapasitas 5 liter dilengkapi dengan pengaduk dan heater . Alat lain yang digunakan adalah pH meter. Sedangkan alat-alat analisa: Spectrophotometer UV/ VIS (Perkin Elmer lamda 25 ) dan Gas Chromatography (Agilent).

## Metode
Tahapan penelitian produksi bioetanol dari limbah pengolahan agar ( Gracilaria sp.) industri dapat dilihat pada  Gambar  1.  Penelitian  ini  diawali  dengan melakukan  karakterisasi  limbah  yaitu  kadar  air (AOAC, 2005) dan kadar  selulosa dengan metode TAPPI T17 wd-70 (Irawati, 2006) yang dilakukan di Laboratorium Kimia Hasil Hutan-THH, IPB.
Gambar 1. Produksi bioetanol dari limbah pengolahan agar industri. Figure 1. Bioethanol production from waste of industrial agar processing.

## Limbah pengolahan agar
(Gracilaria sp. ) industri/ Waste of industrial agar (Gracilaria sp. )
processing
Kultivasi kapang T. viride / Cultivation of T. viride
Hidrolisis enzimatis dengan T. viridie suhu 25-28 o C, pH 4,8, 1-9 hari/ Enzymatic hydrolysis using T. viride Temperature 25-28 o C, pH 4,8, 1-9 days Kultivasi khamir S. cerevisiae / Cultivation of
S. cerevisiae
Kapang T. viride / T. viride
Fermentasi dengan S. cerevisiae suhu 25-30 o C, pH 4,5, 1-4 hari/
Fermentation using S. cerevisiae temperature 25-30 o C, pH 4.5, 1-4 days
Khamir S. cerevisiae/
S. cerevisiae
Bioetanol kasar/
Crude bioethanol
Hidrolisis enzimatis dengan T. viride
Hidrolisis enzimatis dimaksudkan untuk mengubah selulosa menjadi gula pereduksi dengan bantuan T. viride sebagai penghasil selulase. Dalam tahap ini akan dit entuk an  waktu  optim al  (1- 9  har i)  untuk menghasilkan gula pereduksi tertinggi. Berdasarkan aktivitas enzim yang tertinggi.
Sebelum  proses  hidrolisis  enzimatis  dimulai, dilakukan  lebih  dahulu  proses  kultivasi  kapang T. viride dengan media PDB pada suhu 25-28 o C (Arnata, 2009) selama empat belas hari. Setelah itu dilakukan persiapan substrat dengan memasukkan limbah agar sebanyak 375 g dalam ke bioreaktor dan ditambahkan 3 liter akuades sambil diaduk sampai menjadi bentuk bubur.
Ke dalam substrat ditambahkan media Andreoti (Subekti,  2006),  pepton  2%,  dan  tween  80  0,1% dengan  tetap  dilakukan  pengadukan.  Derajad keasaman (pH) diatur menjadi 4,8  (Irawati, 2006; Arnata,  2009)  dengan  penambahan  HCl  3  N  atau NaOH 3 N. Penggunaan normalitas yang tinggi ini dimaksudkan  agar  saat  mengatur  pH  tidak  terjadi penam bahan  v olum e  substrat  yang  banyak. Selanjutnya pH dijaga dengan penambahan buffer sitrat 0,2 M dan substrat disterilisasi dengan pemanasan
pada 100 o C selama 30 menit (Hogg, 2005). Setelah itu substrat didinginkan hingga suhu 25-28 o C (Irawati, 2006; Arnata, 2009). Substrat yang telah disiapkan kemudian ditambahkan suspensi T.  viride sebanyak 10% (v/v) dari substrat.
Waktu  terbaik  hidrolisis  enzimatis  ditentukan berdasarkan aktivitas enzim CMC ase dan total gula pereduksi  tertinggi.  Berdasarkan  waktu  hidrolisis terbaik  tersebut  kem udian  dilanjutkan  tahap fermentasi.
Fermentasi dengan S. cerevisiae
Fermentasi dimaksudkan untuk mengubah gula pereduksi menjadi etanol. Pada awal proses terjadi penguraian glukosa yang ditandai dengan menurunnya kadar gula pereduksi sehingga besarnya total gula pereduksi  yang  hilang  menjadi  indikator  besarnya kadar etanol yang diperoleh. Dalam tahap ini akan dit entuk an  waktu  optim al  (1- 4  har i)  untuk menghasilkan kadar etanol kasar tertinggi.
Fermentasi diawali dengan melakukan kultivasi S. cerevisiae pada  media  YGMP  selama  dua  hari. Substrat awal disiapkan kembali dan dilakukan proses hidrolisis enzimatis berdasarkan waktu terbaik. Untuk proses inaktivasi T. viride , substrat dipanaskan pada
suhu  65 o C  selama  30  menit  (Prihatini,  2008). Selanjutnya substrat didinginkan hingga suhu 25-30 o C. Pada substrat ditambahkan juga pepton 2% dan yeast extract 1% dengan tetap dilakukan pengadukan. Nilai pH  diatur menjadi 4,5  (Elevri &  Putra, 2006) dengan penambahan HCl 3 N atau NaOH 3 N (Horn, 2000).  Kemudian  pH  substrat  dijaga  dengan penambahan  buffer  sitrat  0,2  M  dan  substrat disterilisasi dengan pemanasan pada 100 o C selama 30  m enit  (Hogg,  2005).  Setelah  itu  substrat didinginkan hingga suhu 25-30 o C (Elevri & Putra, 2006).  Substrat  yang  telah  disiapkan  kemudian ditambahkan suspensi S. cerevisiae sebanyak 10% (v /v )  dari  substrat.  Selama  proses  fermentasi berlangsung dilakukan pengadukan secara kontinyu dengan kecepatan 12 rpm (Irawati, 2006; Subekti, 2006; dan Arnata, 2009) .
Waktu terbaik fermentasi ditentukan berdasarkan hasil  analisis  etanol  kasar  tertinggi.  Berdasarkan waktu  terbaik  hidrolisis  enzimatik  dan  fermentasi dilanjutkan dengan produksi bioetanol.

## Produksi bioetanol
Produksi bioetanol secara keseluruhan dilakukan berdasarkan waktu terbaik hidrolisis enzimatis dan fermentasi. Setiap tahap proses dilakukan dengan dua kali ulangan.

## Analisis dan Pengamatan
Hidrolisis enzimatis dengan T. viride
Selama hidrolisis enzimatis berlangsung sembilan hari  dilakukan  pengambilan  sampel  setiap  1  hari dengan  ulangan  sebanyak  dua  kali. Analisis  yang dilakukan  adalah:  aktiv itas CMCase ( Endo-ß- glukanase ) dengan metode Mandels et al. (1976) dan total gula pereduksi dengan metode DNS (Miller, 1959) serta dilakukan pengamatan suhu dan pengukuran pH.  Hasil  analisis  total  gula  pereduksi  dinyatakan dalam mg/ml.
Fermentasi dengan S. cerevisiae
Selama  fermentasi  berlangsung  empat  hari dilakukan pengambilan sampel setiap hari dengan ulangan sebanyak dua kali untuk dianalisis tingkat pertumbuhan  khamir  dengan  menentukan Optical Dens ity pada  panjang  gel om bang  600  nm menggunakan Spectrophotometer (Bergman, 2001; Ly et al ., 2005) dan kadar etanol kasar menggunakan alat Gas Chromatography di Laboratorium Forensik- Mabes  Polri,  Jakarta.  Hasil  analisis  kadar  etanol kasar dinyatakan dalam %  terhadap bobot bahan baku  limbah  (b/b).  Selama  proses  juga  dilakukan pengamatan suhu dan pengukuran pH.

## HASIL DAN BAHASAN
Karakterisasi limbah pengolahan agar ( Gracilaria sp .) industri
Karakterisasi limbah pengolahan agar ( Gracilaria sp.) industri sebagai bahan baku meliputi kadar air dan selulosa. Limbah pengolahan agar ( Gracilaria sp.) PT.  Agarindo  Bogatama  memiliki  kadar  air  awal 19,63±1,60% (bb). Setelah  dilakukan pengeringan dengan sinar matahari kadar air limbah 10,04±0,19% (bb). Kadar air ini disesuaikan dengan kondisi bahan baku pada penelitian produksi bioetanol berbahan baku selulosa  yang  telah  dilakukan  sebelumnya  yaitu berkisar  antara  7,04-11,16%  (Subekti,  2006; Shofiyanto,  2008;  Borines et  al., 2013).  Kadar  air bahan baku dijaga untuk tidak tinggi agar tidak terjadi penurunan porositas dan laju difusi oksigen yang dapat menyebabkan  perpindahan  panas  dan  massa berlangsung  kurang  baik  sehingga  menghambat pertumbuhan miselium kapang (Loebis, 2008).
Kadar selulosa limbah pengolahan agar ( Gracilaria sp.)  sebesar 20,17±0,03%.  Kadar selulosa  limbah agar  tersebut berada  pada  kisaran kadar  selulosa limbah pengolahan agar dari beberapa hasil penelitian sebelumnya yaitu antara 16,00-59,69% (Harvey, 2008; Sedayu et al ., 2008; Triwisari, 2010; Borines, Leon & Cuello, 2013) sehingga limbah agar ( Gracilaria sp.) PT. Agarindo Bogatama ini berpotensi sebagai bahan baku untuk produksi bioetanol.

## Proses hidrolisis enzimatis
Aktivitas CMC ase (IU/ml)
Hasil analisis aktivitas CMC ase dapat dilihat pada Gambar 2. Aktivitas CMC ase mencapai maksimum pada hari ke-4 yaitu 210,48 IU/ml substrat. Aktivitas CMC ase yang dihasilkan dari penelitian ini lebih tinggi dibandingkan hasil penelitian Zhou et al . (2008), Arnata (2009), dan Nethu et al . (2012). Hal ini diduga kondisi optimum T.  viride memproduksi  CMC ase dengan media  limbah  agar  ( Gracilaria sp.)  industri  sudah tercapai yaitu pada suhu 28±1 o C dan pH 3,91±0,02. Namun perbedaan jenis substrat juga mempengaruhi aktivitas CMCase dari T. viride ini. Penelitian Zhou et al .  (2008)  menggunakan T.  viride strain T  100-14 dengan  media  cair  yang  ditambahkan  1% Avicel (sebagai  sumber  karbon) menghasilkan  aktivitas CMC ase maksimum pada hari ke-4 sebesar 13,83 IU/ml substrat. Penelitian Arnata (2009) dengan bahan baku  ubi  kayu  menghasilkan  aktivitas  CMC ase maksimum pada hari ke-7 yaitu 5,05 IU/ml substrat dengan kondisi suhu 25-28 o C dan pH 3,28. Sedangkan penelitian Neethu et al . (2012) dengan bahan baku Basal Mineral Salt Medium (BSM) yang ditambahkan
Gambar 2.  Aktivitas enzim CMC ase dari T. viride
Figure 2. CMCase enzyme activity of T. viride Ak ti v ita s en zi m CM C a se / CM Ca s e e nz y me acti vit y (U/m l)
Hari  ke-/ Days
CMC  1,25%  menghasilkan  aktiv itas  selulase mencapai 173 IU/ml pada hari ke-6 dengan kondisi optimum pada suhu 28 o C dan pH 4. Dibandingkan hasil penelitian tersebut,  penggunaan substrat limbah agar ( Gracilaria sp.) industri yang difermentasi dengan T. viride ini dapat menghasilkan aktivitas CMC ase yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih pendek.
Kesesuaian substrat dan kondisi yang optimum dapat mendukung kapang memproduksi enzim endo- ß-glukanase yang mendegradasi fraksi selulosa dalam media menjadi glukosa dan selo-oligosakarida. Fraksi selulosa berperan sebagai penginduksi selulase yang menjadi sumber karbon dan energi untuk pertumbuhan kapang.  Selulase  tersebut  m erupakan  suatu kompleks  enzim yang  terdiri  dari beberapa  enzim yang  bek erja  bert ahap  atau  bersam a-sam a menguraikan selulosa menjadi glukosa dengan cara menghidrolisis ikatan  -1,4 pada selulosa (Gunam, Aryanta & Darma, 2011).
Menurunnya  aktivitas  CMC ase pada  hari  ke-5 sampai hari ke-8 diduga karena kadar glukosa berlebih telah menghambat  aktivitas selulase  dengan cara membentuk  kompleks  dengan  selulase.  Menurut Holtzapple et al . (1990) selulase dari T. viride dapat dihambat oleh glukosa,  -glukonolakton, selebiosa, dan pelarut organik seperti etanol, butanol, dan aseton. Menurut Izzati et al . (2010), jika kadar glukosa berlebih maka  pembentukan  glukosa  juga  akan  berkurang ( feedback inhibition).
Pada  hari  ke-5  sampai  hari  ke-8  juga  terjadi kecenderungan penurunan nilai pH. Hal ini diduga karena terjadi akumulasi produk berupa gula reduksi sederhana  yang  dihasilkan  dari  hidrolisis  selulosa secara acak pada ikatan 1,4-D-glycosidic . Perubahan pH tersebut dapat mempengaruhi kerja enzim karena terjadi perubahan pada daerah katalitik dan konformasi sifat ionik dari gugus karboksil dan gugus amino enzim
tersebut (Pelczar & Chan, 1986). Dick, Cheng & Wang (2000) juga  menyatakan  jika  perubahan  pH  dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi sehingga menurunkan aktivitas enzim.

## Total gula pereduksi
Total  gula  pereduksi  yang  dihasilkan  selama hidrolisis  enzimatis  dapat  dilihat  pada  Gambar  3 dengan  kisaran  4,65-10,77  mg/ml.  Hasil  ini  lebih rendah  dibandingkan  dengan  hasil  penelitian Saparianti, Dewanti & Dhoni (2012) yaitu 13,44 mg/ ml. Penelitian Saparianti et al. (2012) menggunakan ampas  tebu  sebanyak  8%  dengan  kadar  selulosa 47,59%. Perbedaan hasil tersebut diduga karena ada perbedaan  kadar  selulosa  dari  bahan  baku  yang digunakan. Bahan baku pada penelitian ini adalah limbah pengolahan agar ( Gracilaria sp.) industri yang mem iliki  kadar  selulosa  sebesar  20,17%  dan digunakan sebanyak 12,5%. Menurut Saparianti et al. (2012) semakin banyak substrat selulosa yang bisa dihidrolisis oleh selulase menjadi monomernya maka semakin meningkat kadar glukosanya. Namun jika dilihat dari jumlah selulosa yang digunakan, penelitian ini menggunakan  selulosa yang lebih  sedikit yaitu 2,52% dibandingkan penelitian Saparianti et al. (2012) yaitu 3,81%. Dengan penggunaan selulosa yang lebih sedikit, total gula pereduksi yang dihasilkan pun akan lebih rendah.
Dari Gambar 3 tampak bahwa total gula pereduksi tertinggi dihasilkan pada hari ke tiga. Peningkatan nilai ini diduga disebabkan adanya aktivitas selulase secara sinergis antara endo-ß-glukanase (CMC ase ), ekso- ß-glukanase, dan ß-glukosidase (Belitz et al., 2008). Tingginya kadar glukosa pada hari ke-3, ke-5, dan ke-7  diduga  telah  menghambat  aktivitas  selulase sehingga pembentukan glukosa menjadi terhambat. Hal tersebut diduga telah terjadi feedback inhibition
Gambar 3. Total gula pereduksi yang dihasilkan dari proses hidrolisis enzimatis. Figure 3. Total sugar reducing resulted from enzymatic hydrolysis process.
T ot al G ula Pere du ks i (% b/b)/ T o tal s ug a r red uci ng (% w /w )
Hari  ke-/ Days
Gambar 4. Tingkat pertumbuhan (nilai OD 600 nm) S. cerevisiae . Figure 4. Growth rate ( OD 600 nm value ) of S. cerevisiae
nOD 60 0 nm S. cere vi sia e
Hari  ke-/ Days
pada hari ke-4, ke-6, ke-8 sampai ke sembilan yang mengakibatkan menurunnya nilai total gula pereduksi . Pada hidrolisis enzimatis ini terjadi penghambatan reversibel kompetitif. Kadar glukosa yang berlebih m engham bat  aktiv itas  selulase  dengan  cara membentuk  kompleks  dengan  enzim  tersebut sehingga  terjadi  persaingan  antara  glukosa  dan substrat untuk membentuk kompleks dengan selulase. Jika  kadar  glukosa  berlebih  maka  pembentukan glukosa juga menjadi berkurang (Izzati et al ., 2010).
Waktu hidrolisis enzimatis terbaik pada limbah pengolahan  agar  ( Gracilaria sp.)  PT.  Agarindo Bogatama  menggunakan T.  viride adalah  selama empat hari dengan aktivitas enzim CMC ase 210,48 IU/ml menghasilkan total gula pereduksi 6,74±0,29 mg/ml pada suhu 28±1 o C dan pH 3,91±0,02.
Fermentasi dengan S. cerevisiae
Fermentasi dilakukan menggunakan S. cerevisiae yang memanfaatkan gula pereduksi yang dihasilkan
dari  hidrolisis  enzimatis  menggunakan T.  viride selama 4 hari yang besarnya 6,74±0,29 mg/ml.
Nilai OD 600 nm S. cerevisiae
Nilai OD 600 nm S. cerevisiae selama empat hari inkubasi dapat dilihat pada Gambar 4. Nilai OD 600 nm S. cerevisiae tertinggi yaitu 0,0181 dicapai pada hari ke-2. Nilai ini lebih rendah dibandingkan hasil penelitian Ly et al. (2005) dengan media yeast peptone dextrose (YPD) pada suhu 30 °C yaitu1,5-1,7. Hal ini diduga karena glukosa yang dihasilkan pada hidrolisis enzimatis  ini  sedikit  sehingga  mempengaruhi pertumbuhan S. cerevisiae . Selama fermentasi terjadi konsumsi  glukosa  oleh S.  cerevisiae sehingga kemungkinan kadar glukosa berkurang sesuai dengan ber tam bahnya  wak tu  f erm entasi.   Aki bat bertambahnya waktu fermentasi maka aktivitas S. cerevisiae menurun  sesuai  dengan  berkurangnya substrat dan nutrien yang tersedia.
Kad ar Cr ud e E tano l (% b/ b)/
C ru de E tha no l C on te nt (% w/w)
Hari  ke-/ Days
Gambar 5. Kadar etanol kasar yang dihasilkan selama proses fermentasi. Figure 5. Crude ethanol content resulted during fermentation process.
Menurut Belloch et al . (2008) khamir memerlukan substrat   dan  lingk ungan  yang  sesuai  untuk pertumbuhan dan perkembangbiakannya. Salah satu unsur dasar yang dibutuhkan dalam substrat adalah karbon  dan  karbon  tersebut  berasal  dari  gula pereduksi. Wignyanto et al. (2001) juga menyatakan konsentrasi gula pereduksi 10% merupakan media yang paling sesuai bagi S. cerevisiae untuk tumbuh.
Tingginya nilai OD-600 nm S. cerevisiae pada hari ke-2 diduga karena kondisi substrat telah optimum untuk  mendukung  khamir  memanfaatkan  gula pereduksi sebagai nutrisi untuk tumbuh. Tercatat pH dan  suhu  pada  hari  ke-2  masing-masing  adalah 4,66±0,16 dan 32±4 o C. Menurut Arroyo-López et al . (2009) S. cerevisiae dapat melakukan fermentasi lebih cepat  pada  suhu  kisaran  34,1 o C  dan  pH  4,76. Sedangkan pada hari ke-3 dan ke-4 nilai  OD-600 nm S. cerevisiae mengalami penurunan. Hal ini diduga karena gula reduksi sebagai sumber unsur karbon sudah  t idak  m enc ukupi   unt uk  m enunj ang pertumbuhan S. cerevisiae .

## Kadar etanol kasar
Kadar etanol kasar yang dihasilkan dari fermentasi oleh S. cerevisiae dapat dilihat pada Gambar 5. Kadar etanol kasar berkisar antara 0,22-0,47% (b/b). Kondisi tersebut  dihasilkan  dengan  substrat  gula  reduksi sebanyak 6,74±0,29 mg/ml. Kadar tertinggi dicapai pada hari ke-2. Hasil ini lebih rendah dibandingkan dengan hasil penelitian Azizah, Al-Baari & Mulyani (2012) yaitu kadar etanol berkisar 1,21-2,25% dengan lama  fermentasi  selama  60  jam.  Pada  penelitian Azizah et al. (2012) digunakan substrat kulit nanas. Rendahnya kadar etanol kasar yang dihasilkan pada penelitian ini diduga karena pertumbuhan S. cerevisiae yang rendah akibat gula reduksi dalam substrat tidak tersedia dalam jumlah yang cukup. Kemungkinan lain
yang  dapat  terjadi  adalah  karena  terjadinya pembentukan  senyawa  lain  selain  etanol  yang menyebabkan  efisiensi  produksi  etanol  rendah (Gokarn et al ., 1997).
Menurunnya kadar etanol kasar pada hari ke-2 dan ke-3 diduga karena pertumbuhan S. cerevisiae telah mengalami penurunan dan kondisi substrat yang tidak optimum mendukung khamir menghasilkan etanol. Nilai pH dan suhu yang tercatat pada hari ke tiga dan ke empat berturut-turut adalah 4,76±0,09; 4,79±0,05; 30±0 o C; dan 30±0 o C. Kenaikan pH substrat diduga terjadi  karena  penurunan  aktivitas S.  cerevisiae sehingga  mengurangi  jumlah  asam  organik  yang terbentuk sebagai hasil samping dalam pembuatan bioetanol. Menurut Reibstein et al . (1986) nilai pH awal media fermentasi sangat mempengaruhi kadar etanol yang  dihasilkan.  Hal  ini  disebabkan proton-proton mempengaruhi  kinerja  enzim-enzim  dalam  jalur Emden Meyerhof Parnas (EMP). Dengan pH substrat mengarah  ke  kondisi  alkali,  terdapat  perubahan komposisi  produk.  Glukosa  akan  diubah  menjadi gliserol,  etanol,  asetat,  dan  CO 2 .  Sedangkan asetaldehid  akan  dioksidasi  menjadi  asetat  dan NADH. NADH dipakai untuk mereduksi asetaldehid lainnya menjadi etanol. NADH hasil oksidasi glukosa menjadi 2 asetaldehid digunakan untuk mereduksi dihidroksiaseton  fosfat  menjadi  gliserol  fosfat kemudian menjadi gliserol.
Dari hasil fermentasi di atas maka penggunaan bioreaktor  sistem batch pada  penelitian  ini  belum tepat. Pada fermentasi hari ke-2 apabila ditambahkan gula reduksi dengan konsentrasi yang sesuai untuk mendukung pertumbuhan S. cerevisiae maka kadar etanol kasar dapat ditingkatkan.
Berdasarkan kadar etanol kasar yang diperoleh maka waktu terbaik fermentasi limbah pengolahan agar ( Gracilaria sp.) industri ini adalah 2 hari dengan nil ai  OD- 600  nm S.  cerev isiae 0,018  dan
menghasilkan etanol kasar dengan kadar 0,47±0,08% (b/b) pada suhu 32±4 o C dan pH 4,66±0,16. Menurut Sebayang  (2006)  kadar  etanol  tertinggi  diperoleh sebesar 12,94% dengan waktu inkubasi S. cerevisiae selama 36 jam pada substrat molase. Sedangkan Sari et  al.  (2008)  menyatakan  lama  fermentasi  untuk memproduksi  etanol  paling  tinggi  sebesar  0,77% adalah  3  hari  menggunakan  substrat  jerami  padi dengan T. viride dan S. cerevisiae .

## KESIMPULAN
Produksi bioetanol dari limbah pengolahan agar ( Gracilaria sp .) industri menghasilkan kadar etanol kasar tertinggi dengan waktu optimum sebagai berikut:
1. Hidrolisis enzimatis menggunakan T. viride adalah selama empat hari yang menghasilkan total gula pereduksi 6,74 mg/ml dengan aktivitas CMC ase 210,48 IU/ml pada suhu 28 o C dan pH 3,91;
2.  Fermentasi  menggunakan S.  cerevisiae adalah selama dua hari dengan tingkat pertumbuhan (OD 600 nm) 0,0181 dan menghasilkan kadar etanol kasar 0,47% (b/b) pada suhu 32 o C dan pH 4,66.

## DAFTAR PUSTAKA
Anon. 2009. Sisa Cadangan Minyak Indonesia 15 Tahun. http://www.indomigas.com/sisa-cadangan-minyak- indones ia-15-tahun/. Diak ses  pada  tanggal  22 Pebruari  2013.
Anindyawati,  T.  2009. Prospek  Enzim  dan  Limbah Lignoselulosa  untuk  Produksi  Bioetanol. BS 44(1): 49- 56.
AOAC.  2005. Official  Methods   of  Analy s is   of  the Association  of  Analytical  Chemist .  Washington.
Arnata,  I.  W. 2009. Pengembangan  Alternatif  Teknologi Bioproses  Pembuatan  Bioetanol  dari  Ubi  Kayu Menggunakan Trichoderma viride , Aspergilus niger dan Saccharomyces  cerevisiae . Tesis.  Bogor: Program  Pascasarjana  Institut  Pertanian  Bogor.
Arroyo-López,  F.  N.,  Orlic, S.,  Querol, A.,  and  Barrio,  E.
2009.  Effec ts  of  Temperature,  pH  and  Sugar Conc entration  on  the  Growth  Parameters  of Saccharomyces cerevisiae , S. kudriavzevii and Their Interspeciûc  Hybrid. International  Journal  of  Food Microbiology .  131:  120–127.
Azizah,  N.,  Al-Baari, A.  N.,  Mulyani,  S.  2012.  Pengaruh
Lama  Fermentasi  terhadap  Kadar Alkohol,  pH,  dan Produksi Gas pada Proses Fermentasi Bioetanol dari Whey  dengan  Subsitusi  Kulit  Nanas. Jurnal  Aplikasi Teknologi  Pangan. 1(2):  72-77.
Belitz, H. D., Grosch, W., and Schieberle, P. 2008. Food Chemistry, 4 th ed. Berlin: Springer-Verlag. p. 327-337. Belloch,  C.,  Orlic,  S.,  Barrio,  E.,  and  Querol,  A.  2008. Fermentative  stress  adaption  of  hybrids  within  the Saccharomyces sensu  stricto  complex. International Journal of Food  Microbiology . 122:  188-195.
Bergman, L. W. 2001. Growth and Maintenance of Yeast .
Methods  in  Molecular  Biology  Vol.  177.  Two-Hybrid Systems:  Methods  and  Protocols  Edited  by:  P.  N. MacDonald © Humana  Press Inc., Totowa, NJ. 9-14.
Borines,  M.G.,  Leon,  R.L.D,  and  Cuello,  J.L.  2013.
Bieothanol  produc tion  from  the  mac roalgae Sargassum  spp . Bioresource  Technology .  138:  22-
29.
Dick, W. A., L. Cheng  and P. Wang. 2000. Soil acid and alkaline  phosphatase  ac tivity  as  pH  adj ustment indicators. Journal  of  Soil  Biology  &  Biochemistry 32:  1915-1919.
Elevri,  P.A.  and  Putra,  S.R.  2006.  Produk si  etanol menggunakan Saccharomyces   cerev isiae yang diamobilisasi  dengan  agar  batang. Ak ta  Kimia Indonesia .  1(2):  105-114.
Ge,  L.,  Peng,  W .,  and  Haij in,  M.  2011 .  Study  on Saccharification techniques  of  seaweed  wastes  for the  transformation  of  ethanol. Renewable  Energy . 36: 84-89.
Gok arn,  R.R.,  Eitman,  M.A.,  and  Sridhar,  J.  1997.
Produc tion of suc cinate by anaerobic microorganisms  in  fuels  and  chemicals  from biomass. In B.C.  Saha  and J .  W oodward  (eds.). American Chemical Society . Washington - DC . p. 237- 263.
Gunam, I. B. W., Aryanta, W. R.,   dan Darma, I. B. N. S. 2011.  Produk si  Selulase  Kasar  dari  Kapang Trichoderma  viride dengan  Perlakuan  Konsentrasi Substrat Ampas  Tebu  dan  Lama  Fermentasi. Jurnal Biologi XV(2): 29 – 33.
Harvey,  F.  2008. Bioetanol  Berbahan  Dasar  Ampas Rumput  Laut.  Under  Graduate. [Thesis].  Bogor Agricultural  University.
Hogg, S. 2005. Essential Microbiology. John Wiley & Sons Ltd:  England.  454pp.
Holtzapple,  M.,  Cognata,  M.,  Shu,  Y.,  and  Hendrickson,
C.  1990.  Inhibition  of Trichoderma  reesei Cellulase by  Sugars  and  Solvents. Biotec hnology   and Bioengineering .  36:  275-287.
Horn,  S.J.  2000.  Bioenergy  from  Brown  Seaweeds.
[Thesis].  Department  of  Bioetechnology.  Norwegian University of Science and Technology. 18  September 2 0 0 8 . h t t p : / / w w w . d i v a - p o r t a l . o r g / d i v a / g e t D o c u me n t ? u r n _ n b n _ n o _ n t n u _ d i v a - 5 4 7 - 1__fulltext.pdf. Diakses  pada  tanggal 14  Januari 2009.
Irawati,  D.    2006. Pemanfaatan  Serbuk  Kayu  untuk Produks i  Etanol [Tesis].  Bogor: Program Pascasarjana,  Institut  Pertanian  Bogor.
Izzati, N., Yusnidar, R., Rahmawati  F. D., dan Hidayat,  F. 2010. Pengaruh Perlakuan Awal Autoklaf dan Autoklaf- Impregnasi  terhadap  Persen  Sakarafikasi  Ampas Tebu  secara  Eznimatis  menjadi  Bioetanol  sebagai Bahan  Bak ar  Alternatif. Program  Kreativ itas Mahasiswa .  Universitas  Negeri  Malang.  Malang.
Kim, G. S., Myung, K. S., Kim, Y. J., Oh, K. K., Kim, J. S., Ryu, H. J., and Kim, K. H. 2007. Methode of Producing Biofuel  Using  Sea  Algae .  Seoul:  W orld  Intelectual Property  Organization.
Lin,  Yan,  and  S.  Tanaka.  2006.  Ethanol  Fermentation from  Biomass  Reseourc es:  Current  State  and Prospects. Appl.  Microbiol.  Biotechnol .  69:  627-642. Loebis,  E.  H.  2008. Optimasi  Proses  Hidrolisis  Kimiawi dan Enzimatis Tandan Kosong Kelapa sawit menjadi Gluk os a  untuk  Produk si  Etanol [Tesis].  Bogor: Program  Pascasarjana,  Institut  Pertanian  Bogor.
Ly, D.  Yu, D., Girten,  B.,  and  Cohen  J.  2005.  Testing  of Saccharomyces  cerevisiae Morphological  Fixatives and Fixed  Samples  Stored  at Ambient  Temperature.
Gravitational  and  Space  Biology .  18(2):  105-106. Mandels,  M.,  Andreotti,  R.,  and  Roc he,  C.  1976. Measurement  of  Saccharifying  Cellulase. Biotechnol. Bioeng.  Symp . 6:  21-23.
Miller, G. L. 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem . 31(3): 426–428.
Neethu, K., Rubeena, M., Sajith, S., Sreededi, S., Priji, P., Unni, K. N., Sarath Josh, M. K., Jisha, V. N. Pradeep, S.,  and  Benj amin,  S.  2012.  A  Novel  Strain  of Trichoderma  viride  Shows  Complete  Lignocellulolytic Activities. Advances in Bioscience and Biotechnology . 3:  1160-1166.
Osvaldo, Z. S., Putra, S. P., dan Faizal, M. 2012. Pengaruh Konsentrasi  Asam  dan  W aktu  pada  Proses Hidrolisis  dan  Fermentasi  Pembuatan  Bioetanol  dari Alang-Alang. Jurnal  Teknik  Kimia .    2(18):  52-62.
Pelczar,  M.  J.  and  E.  C.  S.  Chan.  1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerjemah:  Hadi,  R.  S.  Jakarta:  UI Press.  443  pp.
Prihatini,  R.  I.  2008.  Analisa  Kecukupan  Panas  pada Proses  Pasteurisasi  Santan  [Skripsi].  Bogor: Departemen  Teknologi  Industri  Pertanian.  Fakultas Teknologi  Pertanian.  Institut  Pertanian  Bogor.
Reibstein, D., Hollander, J. A., Pilkis, S. J. and Shulman, R.  G.  1986.  Studies  on  The  Regulation  of  Yeast Phosphofructo-1-kinase :  Its  Role  in  Aerobic  and Anaerobic  Glycolysis. Biochemistry .  25:  219-227.
Saparianti,  E.,  Dewanti,  T.,  dan  Dhoni,  S.  K.  2012. Hidrolisis  Ampas  Tebu  menjadi  Glukosa  Cair  oleh Kapang Trichoderma  viride (Kaj ian  Konsentrasi Ampas  Tebu  ( Saccharum  officinarum )  dan  Lama Fermentasi). J. Tek. Pert . 5(1): 1 – 10.
Sari, I. M., Noverita dan Yulneriwarni. 2008. Pemanfaatan Jerami  Padi  dan  Alang-alang  dalam  Fermentasi Etanol Menggunakan kapang Trichoderma viride dan Khamir Saccharomyces cerevisiae . Vis. Vitalis . 5(2):
55-62.
Sari,  R.  N.  2010.  Kajian  Proses  Produksi  Bioetanol  dari Rumput  Laut  Cok lat  ( Sargas s um  duplic atum ). [Tesis].  Bogor:Program  Pasc asarj ana  Institut Pertanian  Bogor.
Sebayang,  F.  2006.  Pembuatan  Etanol  dari  Molase secara fermentasi Menggunak an Sel Saccharomyces  cerevisiae  yang  Terimobilisasi  pada Kalsium Alginat. Jurnal  Teknologi  Proses .  5(2):    68- 74.
Sedayu, B. B., Widianto, T. N., Basmal, J., dan Utomo, B. S. B. 2008.  Pemanfaatan Limbah Padat Pengolahan Rumput Laut  Gracilaria sp.  untuk Pembuatan  Papan partik el. J urnal  Pas c apanen  dan  Biotek nologi Kelautan  dan  Perikanan .  3(1):  1-9.
Shofiyanto,  M.  E.  2008.  Hidrolisis  Tongkol  Jagung  oleh Bakteri  Selulotik  untuk  Produksi  Bioetanol  dalam Kultur Campuran  [Skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian,  Institut  Pertanian  Bogor.
Subekti,  H.  2006.  Produksi  Etanol  dari  Hidrolisat  Fraksi Selulosa  Tongkol  Jagung  oleh Sac charomy ces cerevisiae [Skripsi].  Bogor:  Fakultas  Tek nologi Pertanian,  Institut  Pertanian  Bogor.
Triwisari,  D. A.  2010. Fraksinasi  Polisakarida  beberapa Jenis  Rumput  Laut .  [skripsi].  IPB.
Ujiani,  N.  2007. Pengaruh  Konsentrasi  Polyprophylene dan  Uk uran  Partik el  Limbah  Padat  Agar-agar Terhadap  Kualitas  Papan  Partikel .  [skripsi].  Bogor: Departemen  THH,  IPB.
W ignyanto,    Suharjono,    dan  Novita.  2001.  Pengaruh Konsentrasi  Gula  Reduksi  Sari    Hati  Nanas    dan Inok ulum Sacc haromy c es    c erev is iae pada Fermentasi  Etanol. Jurnal Teknologi Pertanian . 2(1): 68-77.
Zhou, J., Y. H. Wang, J. Chu,  Y. P. Zhuang, S. L. Zhang, and P. Yin. 2008. Identification and  Purification of the Main  Components of Cellulases from  a Mutant Strain of Trichoderma  viride T  100-14. Bioresour.  Technol . 99:  6826-6833.