## TEKNIK ISOLASI SENYAWA BIOAKTIF DARI KAPANG YANG BERASAL DARI LINGKUNGAN LAUT
Dedi Noviendri *)

## ABSTRAK
Pada  prinsipnya,  teknik  isolasi  senyawa  bioaktif  dari  kapang  yang  berasal  dari  laut  mirip dengan  teknik  isolasi  senyawa  bioaktif  dari  invetebrata  laut  dan  juga  biota-biota  yang  ada  di lingkungan  darat.  Namun  ada  beberapa  hal  yang  berbeda,  diantaranya  c ara  isolasi  dan pengkulturan  terutama  pada  komposisi  media  pertumbuhannya,  serta  cara-cara  pemanenannya. Sedangkan  cara  ekstraksi,  fraksinasi,  dan  purifikasinya  sampai  mendapatkan  suatu  senyawa bioaktif  yang  murni  adalah  relatif  sama.  Untuk  proses  pemisahan  dan  purifikasi  dapat  digunakan alat  Kromatografi  Cair  Kinerja      Medium  (KCKM)  dan  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi  (KCKT), serta  disertai  pengujian  kemurnian  dengan  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT).    Jika  dari  hasil  analisis dengan  KCKM  atau  KCKT  memberikan  hasil  satu  puncak  ( peak )  yang  tunggal,  maka  terhadap sampel  tersebut    dapat  dilakukan  analisis  dengan  alat  MS,  dan  hasilnya  dibandingkan  dengan database untuk menguji apakah  senyawa murni  yang diperoleh adalah senyawa  baru atau  bukan. Selanjutnya  dengan  semua  data  analisis    yang  diperoleh  dari  sampel  murni  tersebut,  yaitu  data fisika  dan  hasil  spektrofotometer  UV,  hasil  IR  (KBr),  MS,  NMR  1  dimensi  (proton,  karbon,  dan DEPT),  dan  NMR  2  dimensi  (1H-1H  COSY,  13C-1H  COSY,  HMBC,  HMQC,  dan  NOESY),  maka dilanjutkan  dengan  penentuan  struktur  molekul  (dikenal  dengan  elusidasi  struktur).
KATA KUNCI:  isolasi senyawa bioaktif, kapang, marine fungus

## PENDAHULUAN
Makroinvertebrata laut yang bersifat sesil seperti spons dan  hewan karang  dikenal memiliki kandungan senyawa bioaktif yang potensial untuk dikembangkan dalam bidang farmasi. Namun masalah yang muncul dalam eksplorasi  senyawa bioaktif  dari spons  dan hewan karang adalah masalah suplai dan dampak ekologis yang ditimbulkan. Masalah suplai muncul karena rendemen senyawa aktif yang dihasilkan dari spons,  misalnya  dari  berat  basah  spons  Kaliapsis 2109,2 g hanya memperoleh 6,04 g ekstrak kering spons (Setyowati et al ., 2007) dan ekstraksi karang sekitar  100  g  berat  basah Sarcophyton  glaucum hanya  menghasilkan  puluhan  mg  senyawa  aktif (Wikanta et al., 2007), padahal  spons atau hewan karang membutuhkan waktu bertahun-tahun bahkan puluhan tahun untuk mencapai 1 kg bobot basahnya. Secara ekologis hal ini kurang menguntungkan. Salah satu strategi untuk mengatasi masalah di atas adalah dengan mengisolasi mikroba yang bersimbion dengan spons dan hewan karang kem udian menumbuhkannya  di  laboratorium.  Mikroba  yang bersimbiosis  dengan  spons  dan  hewan  karang menyumbang 60–80% dari bobot basah inangnya. Salah satu mikroba simbion yang memiliki keragaman tinggi  dan  mampu   tumbuh cepat adalah kapang ( marine fungus ).
Khusus  tentang  biodivesitas  laut  di  Indonesia, terdapat  782  spesies  alga,  12  spesies  lamun,  38 spesies mangrove , 850 spesies spons, 210 spesies karang  lunak,  serta  ribuan  spesies  berbagai  biota lainnya (Dahuri, 2003). Walaupun demikian, kekayaan alam  Indonesia  yang  terkenal  ini  belum  banyak dieksplorasi. Eksplorasi senyawa bioaktif laut, atau sering dikenal sebagai senyawa bioaktif dari laut, baru dilakukan terutama pada invertebrata laut,  misalnya spons (Astuti et al ., 2005; Li et al ., 2005) dan rumput laut (Zhang & Son, 2006; Zhang & Son, 2007a; Zhang & Son, 2007b; Rusman et al., 2007; Kim & Son, 2007; Ngunyen  &  Son,  2007).  Sedangkan  eksplorasi senyawa bioaktif dari kapang yang  berasal dari laut masih jarang dilakukan, sehingga teknik-teknik isolasi seny awa  bioaktif   dari  m i kroorganism e  yang berasosiasi dengan biota laut tersebut, dalam hal ini kapang, jikapun ada belum begitu berkembang.
Dalam beberapa tahun terakhir ini, orang sudah banyak  meneliti  potensi  mikroorganisme  yang berasosiasi  dengan  biota  laut  untuk  mengisolasi senyawa bioaktif atau senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme tersebut. Kapang yang berasosiasi dengan biota laut atau diisolasi dari lingkungan  laut,  sangat   potensial   sebagai mikroorganisme penghasil senyawa bioaktif. Teknik untuk isolasi senyawa bioaktif dari lingkungan yang sering digunakan oleh ahli-ahli kimia bahan alam pada
*) Peneliti  pada Balai  Besar  Riset Pengolahan  Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan dan  Perikanan
Gambar  1.  Beberapa    jenis    kapang    yang    telah  berhasil  diisolasi  dari  lingkungan  laut  pada  media  padat  YPG  dan media cair  SWS;  (a) Streptomyces sp. (Rahman et al ., 2006), (b) Pseudallescheria sp. (Zhang & Son,
2006), (c) Myrothecium sp. (Li et al ., 2005), dan (d) Aspergillus sp. (Li et al ., 2005).
(b) (a) (c) (d)
dasarnya  semuanya  hampir  sama.  Di  Indonesia, teknik-teknik ini sudah biasa dilakukan untuk isolasi senyawa bioaktif dari lingkungan terestrial tanaman tropika yang berpotensi sebagai obat misalnya pada herba meniran ( Phyllanthus niruri Linn) (Gunawan et al ., 2008), batang Garcinia Balica Miq (Mudjirahmini dan Ersam, 2006), daun pandan wangi ( Pandanus amaryllifolius Roxb) (Sukandar et al .,  2008a), kulit batang Aglaia disoxylum (Meliaceae) (Sukandar et al ., 2008b), buah mahkota dewa [ Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl.] (Tambunan dan Simanjuntak, 2006), dan mikroorganisme  yang berasal  dari lingkungan darat.  Pada  tulisan  ini  akan  dijelaskan  salah  satu teknik  isolasi  senyawa  bioaktif  dari  kapang  yang berasal dari lingkungan laut ( marine fungus ).

## KAPANG
Kapang  adalah  kelompok  mikroba yang tergolong dalam  fungi multiseluler yang mempunyai filamen dan pertumbuhannya pada makanan mudah dilihat karena penampakannya  yang  berserabut  seperti  kapas. Pertumbuhannya mula-mula akan  berwarna putih, tetapi  jika  sporanya  telah  timbul  akan  terbentuk berbagai    warna    tergantung    dari    jenis  kapang (Gambar 1). Ilmu yang mempelajari mengenai fungi disebut mikologi. Selain kapang, organisme lainnya yang  tergolong  fungi   adalah   khamir  dan jamur ( mushroom ).  Fungi  (jamak)  atau  fungus  (tunggal) adalah suatu organisme eukariotik yang mempunyai ciri-ciri spesifik sebagai berikut: (1) mempunyai inti sel,  (2)  memproduksi  spora,  (3)  tidak  mempunyai klorofil sehingga  tidak  dapat  melakukan  fotosintesis, (4) dapat berkembang biak secara seksual maupun aseksual, dan (5) beberapa mempunyai bagian-bagian tubuh  berbentuk  filamen  dengan  dinding  sel  yang mengandung  selulosa  atau  kitin,  atau  keduanya. Perbedaan utama antara organisme yang tergolong fungi,  misalnya  antara  kapang  dan  khamir,  yaitu kapang  adalah  fungi  yang  mempunyai  filamen (miselium), sedangkan khamir merupakan fungi sel tunggal tanpa filamen (Fardiaz, 1992).
Pada  umum nya,  kapang  membutuhkan  A w minimal lebih rendah dibandingkan dengan khamir dan bakteri untuk pertumbuhannya. Kebanyakan kapang bersifat mesofilik, yaitu tumbuh baik pada suhu kamar. Suhu  optimum  pertumbuhan  untuk  kebanyakan kapang  adalah  sekitar  25–30 o C,  tetapi  beberapa kapang dapat tumbuh pada suhu 35–37 o C atau lebih tinggi, misalnya Aspergillus . Beberapa kapang yang telah berhasil diisolasi dari biota laut memiliki suhu optimum sekitar 29 o C, kapang tersebut adalah Strep- tomyces sp. (Rahman et al ., 2006), Pseudallescheria sp. (Zhang & Son, 2006), Myrothecium sp.(Li et al ., 2005), Aspergillus sp. (Li et  al .,  2005), Penicillium citreonigrum (Rusman et al ., 2007), Exophiala (Zhang et al ., 2008), dan kapang laut kode B.24 yang telah berhasil diisolasi dari sedimen perairan laut Kepulauan Seribu (Supriyono et al., 2007).
Kemudian semua kapang bersifat aerobik, yaitu membutuhkan  oksigen  untuk  pertumbuhannya. Kebanyakan kapang dapat tumbuh pada kisaran pH yang  luas,  yaitu  pH  2,0–8,5,  tetapi  biasanya pertumbuhannya akan lebih baik pada kondisi asam atau pH rendah (Fardiaz, 1992).

## ISOLASI KAPANG
Kapang  diisolasi  dari  sampel  lingkungan  laut diantaranya dari sedimen, kerang, bulu babi, alga hijau Ulva pertusa (Zhang & Son, 2007a), Enteromorpha compressa (Li et al ., 2005; Kim & Son, 2007), Agarum cribrosum (Zhang  &  Son,  2006;  Ngunyen  &  Son, 2007), alga merah Hyalosiphonia caespitosa (Zhang & Son, 2007b), Lomentaria catenata (Li et al ., 2005), alga  coklat Sargassum  horneri (Ngunyen  &  Son, 2007), spons Halichondria panacea (Zhang & Son, 2007b), Pseudoceratina  purpurea (Rusman et  al., 2007), dan Petrosia sp. (Astuti et al ., 2005). Saat ini kelompok  peneliti  Bioteknologi  Balai  Besar  Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan sedang melakukan riset isolasi senyawa bioaktif  dari kapang yang bersimbiosis dengan spons, namun spons yang digunakan belum teridentifikasi.
Isolasi kapang dilakukan dengan menempatkan sampel pada media selektif untuk kapang. Media yang dapat digunakan untuk isolasi kapang ada  berbagai jenis yaitu potato dextrose agar (PDA) (Suryono et al .,  2002;  Nugroho et  al .,  2003), peptone  glucose fluconazole  agar (PGFA) (Randhawa et al ., 2005), potato carot agar, pentachloronitrobenzene agar, rose bengal medium, yeast malt agar (Demain & Solomon, 2986), yeast peptone glucose (YPG) (Li et al ., 2005; Li et al ., 2006;  Rahman et  al ., 2006 dan Zhang & Son, 2006; Ngunyen & Son, 2007; Zhang et al ., 2008), dan media lainnya. Namun dari sekian banyak media yang  dapat  digunakan  untuk  isolasi  kapang,  yang akan dijelaskan di sini hanya media YPG.
Mula-mula sampel ditempatkan pada media YPG, lalu media ditempatkan di dalam inkubator (untuk skala kecil) atau di dalam suatu ruangan khusus (untuk skala besar) yang dijaga kondisi suhu dan kelembabannya, dan  setelah  itu  dibiarkan  beberapa  hari.  Setelah beberapa hari, berbagai kapang akan tumbuh pada media YPG tersebut, lalu dilakukan pemurnian secara berulang-ulang dengan cara menumbuhkan kembali dengan media yang sama sampai didapatkan kultur kapang yang tunggal. Kultur tunggal kapang ini dapat langsung digunakan dan sebagian yang lain dapat disim pan  pada  gliserol  dengan  kondisi  suhu penyimpanan  –80 o C.  Kultur  tunggal  ini  kemudian ditumbuhkan ke dalam media cair YPM yang terdiri atas yeast  extract ,  pepton,  dan  manitol  dengan volume kerja 10 ml, lalu diinkubasi pada suhu tertentu, biasanya  28–29 o C  (Li et  al .,  2005;  Li et  al .,  2006; Rahman et al ., 2006 dan Zhang & Son, 2006; Ngunyen & Son, 2007; Zhang et al ., 2008) selama 3 sampai 4 hari dalam kondisi statis. Setelah beberapa hari (3 sampai  4  hari),  kultur  kapang  dipindahkan  secara aseptik ke dalam media cair SWS yang terdiri atas soytone, water (dalam hal ini air laut), dan s oluble starch dengan volume kerja 1 L, lalu diinkubasi pada suhu 28–29 o C selama 25–30 hari dalam kondisi statis (Zhang & Son, 2007a). Pertumbuhan kapang biasanya berjalan lambat bila dibandingkan dengan pertumbuhan khamir  dan  bakteri.  Oleh  karena  itu,  jika  kondisi pertumbuhan memungkinkan semua mikroorganisme untuk tumbuh, kapang biasanya kalah dalam kompetisi dengan khamir dan bakteri. Tetapi jika kapang dapat tumbuh,  pertumbuhannya  yang  ditandai  dengan pembentukan miselium dapat  berlangsung dengan cepat (Fardiaz, 1992).

## ISOLASI BAHAN AKTIF

## Panen dan Ekstraksi
Setelah  kapang  ditumbuhkan  pada  media  cair SWS selama 25–30 hari dalam kondisi statis, maka kapang telah tumbuh dengan pesatnya, yang ditandai
dengan t erbentukny a m i selium , m edia pertumbuhannya telah berubah warna, dan warna yang terbentuk  tergantung  dari  jenis  kapang  yang ditum buhkan  (Gam bar  1).  Beberapa  kapang mengeluarkan  suatu senyawa metabolit sekunder. Senyawa ini biasanya dikeluarkan oleh suatu kapang untuk  pertahanan  diri  dan  dapat  menghambat pertumbuhan organisme lain (Fardiaz, 1992). Senyawa metabolit sekunder dari kapang misalnya Penisilin yang diproduksi oleh Penicillium chrysogenum dan Clavasin yang diproduksi oleh Aspergillus clavatus (Fardiaz,  1992).  Sedangkan  senyawa  metabolit sekunder yang telah berhasil diisolasi dari kapang yang bersimbiosis dengan biota laut diantaranya adalah sebagai  berikut:  Redoksitrinin  dari Penicillium sp. (Zhang et al ., 2007a),  Fusrielin A dari Aspergillus sp. (Ngunyen & Son, 2007), Botrititon dari Botrytis sp. (Zhang  &  Son,  2007),  Dihidroksifumitremorgin  C, Fumitremorgin C, Brevianamid F dari Pseudallescheria sp. (Zhang et al. , 2007b), dan  Benzodiazepin dari Exophiala (Zhang et al., 2008).
Setelah  kapang  tumbuh  dengan baik selama 25–30 hari tersebut, maka dapat dilakukan proses pemanenan. Proses ini akan memperoleh dua bagian penting yang akan digunakan untuk isolasi senyawa organik, atau senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh kapang,  yaitu  bagian broth dan  miselium.  Cara pemanenan sebagai berikut, pertama sampel kapang yang terdiri atas broth dan miselium disaring dengan menggunakan  kain  kasa.  Filtrat  ( broth )  langsung ditampung  di  dalam  corong  pisah,  sedangkan miseliumnya  tertinggal  di  kain  kasa.  Miselium  ini segera disimpan di dalam aluminium foil tertutup dan disimpan di dalam freezer untuk digunakan pada uji selanjutnya. Setelah disimpan dalam freezer selama 1  m alam ,  kem udian  dil akuk an  ek straksi m enggunakan  pelar ut  (M eOH: CH 2 Cl 2 =1:1). Sedangkan broth diekstrak  dengan  menggunakan pelarut etil asetat (EtOAc), (Li et al ., 2005; Li et al ., 2006;  Rahman et al ., 2006 dan Zhang & Son, 2006; Ngunyen & Son, 2007; Son, 2007; Zhang et al ., 2008), yang tujuannya adalah untuk mendapatkan senyawa non-polar (senyawa target yang baru) yang biasanya banyak  terdapat pada kapang. Broth ini ditambahkan etil asetat (EtOAc) dengan perbandingan (1 : 1) dalam corong pisah, lalu dikocok kuat-kuat, dan dilakukan berulang, kurang lebih tiga kali. Setelah itu, corong pisah didiamkan beberapa waktu sampai benar-benar memisah  membentuk  dua  lapisan  yang  akan dipisahkan. Lapisan atas  adalah broth dalam EtOAc yang di dalamnya terdapat metabolit sekunder serta lapisan bawah adalah air bersama media dan kotoran lainnya. Fase atasnya diambil dan digunakan untuk tahap selanjutnya, sedang fase bawahnya dibuang karena merupakan kontaminan yang tidak diharapkan. Lapisan  atas  ( broth )  ini  selanjutnya  ditambahkan
Gambar  2.  Diagram alir tahap  pemanenan  dan  ekstraksi  miselium  dan broth dari  kapang  laut  pada Li et  al .,  2005;  Li et al ., 2006; Rahman et al ., 2006; Zhang & Son, 2006; Ngunyen & Son, 2007; Son, 2007; dan Zhang et al ., 2008. (Keterangan: M:C=Metanol:CH 2 Cl 2 )
Strain kapang yang
berasal dari lingkugan laut
Proses pemanenan dengan filtrasi pakai kasa
Miselium
Broth
1. Ekstraksi
(a). Sonikasi 30’ dalam M:C=1:1 (b). Kocok, 170 rpm, 29 o C, 3 jam
2. Filtrasi
3. Evaporasi
4. Proses 2~4 dilakukan 2x Ekstrak Miselium (xxx g) Ekstraksi 2x, (EtOAc: Broth =1:1) Fase EtOAc Fase Air 1. Dehidrasi dengan Na 2 SO 4 2. Evaporasi
Ekstrak Broth (yyy g)
dengan  sodium  sulfat  anhidrat  2%  (b/v )  untuk menghilangkan sisa air yang masih terdapat pada broth . Setelah benar-benar bebas air yang ditandai dengan menggumpalnya sodium sulfat anhidrat, maka broth selanjutnya   dipindahkan   ke   dalam   labu evaporator  untuk  proses  pengeringan,  dengan evaporasi.  Proses  evaporasi  dihentikan  sampai diperoleh broth yang  benar-benar  kering,  lalu ditimbang dan siap untuk uji selanjutnya (Gambar 2).
Terhadap kedua ekstrak (ekstrak  miselium  dan broth ) yang diperoleh, selanjutnya dilakukan pengujian ( assay ) terlebih dahulu  untuk menentukan apakah ekstrak yang diperoleh tersebut aktif atau tidak. Jika seandainya ekstrak yang diperoleh tidak aktif, maka pengujian tidak dilanjutkan. Namun, jika ekstrak yang diperoleh tersebut  bersifat aktif (merupakan suatu senyawa  bioaktif),  maka  tahap  selanjutnya  yang dilakukan adalah fraksinasi ekstrak tersebut dengan menggunakan  kromatografi  kolom SiO 2 (Li et al ., 2005; Li et al ., 2006;  Rahman et al ., 2006 dan Zhang &  Son,  2006;  Ngunyen  &  Son,  2007;  Son,  2007; Zhang et  al .,   2008).   Kolom  SiO 2 (bersifat  fase normal) ini dipilih karena beberapa hal, diantaranya harganya relatif murah. Kemudian dengan kolom SiO 2 ini  bisa  lebih  banyak  memisahkan/mendapatkan senyawa  (mulai  dari  senyawa non-polar sampai polar). Senyawa dapat dipisahkan menurut derajat kepolarannya dengan menggunakan pelarut (sebagai fase geraknya) mulai dari n-heksana (bersifat non-
polar) sampai  metanol  (bersifat polar).  Sehingga, senyawa non-polar (senyawa target yang baru) juga dapat dipisahkan dan diperoleh dengan baik. Adapun jenis assay yang  digunakan  dalam  pengujian  ini adalah bermacam-macam, tergantung dengan yang diinginkan dan target dari peneliti yang akan bekerja untuk  menemukan  suatu  senyawa  bioaktif  baru tersebut.

## Fraksinasi
Pada  tahap  fraksinasi  ini  akan  dijelaskan kromatografi kolom SiO 2 dan kromatografi lapis tipis sebagai pemandu isolasi.
Kromatografi kolom SiO 2
Setelah  dilakukan  proses  pemanenan dan ekstraksi broth dengan pelarut EtOAc dan miselium dengan  pelarut  (m etanol:CH 2 Cl 2 =1:1),  m aka selanjutnya  dilakukan  pemisahan/fraksinasi  dengan menggunakan  kolom  silika Column  Chromatogra- phy ( open column ) atau yang dikenal dengan SiO 2 - CC (Li et al ., 2005; Li et al ., 2006;  Rahman et al ., 2006; Zhang & Son, 2006; Ngunyen & Son, 2007; Son, 2007; Zhang et al ., 2008) terhadap kedua sampel tersebut. Khusus untuk miselium, sebelum dilakukan tahap  selanjutnya  harus  dilakukan  terlebih  dahulu proses desalting untuk menghilangkan garam-garam yang dikandungnya.
Gambar 3.     Kromatogram   dari   hasil   suatu  sampel   senyawa  organik  menggunakan KLT; (a) contoh  sampel yang belum murni dan (b) contoh sampel  yang sudah murni.
Adapun cara-cara preparasi kolom dan fraksinasi menggunakan kolom Si terhadap sampel broth dan miselium adalah sebagai berikut (Son, 2007):
1. Disiapkan  tabung  kolom yang kering dan bersih (jangan  sampai  ada  air  sedikitpun,  karena hal tersebut   dapat  menimbulkan  gelembung  pada kolom Si).
2. Dimasukkan  kapas  bersih, lalu dimasukan silika gel  juga  ke dalam  kolom  dengan  rasio  antara sampel  yang   akan   dielusi   dengan  silika  gel adalah 1: 50~70, biasanya 1:50, atau tergantung ukuran panjang kolom yang digunakan.
3. Silika    gel   dicampur  dengan    n-heksana,  lalu campuran tersebut dimasukkan perlahan-lahan ke dalam kolom (jangan sampai ada gelembung).
4. Dibiarkan beberapa saat sampai silika gel memadat di  dalam  tabung,  bila perlu dibantu dengan cara memukul-mukul  bagian  luar kolom dengan karet untuk mempercepat proses pemadatan.
5. Setelah    padat,    ke dalam   kolom  dimasukkan kapas    bersih    lagi    secukupnya , lalu dibilas/ dibasahi  dengan   n-heksana  (ini dilakukan untuk mencegah   percampuran  antara  silika  gel  dengan sampel       secara     langsung     saat     sampel dimasukkan).
6. Sampel   siap   dimasukkan,  dielusi mulai dengan pelarut    non-polar   (n-heksana)   sampai pelarut polar (Metanol).

## KROMATOGRAFI  LAPIS  TIPIS  (KLT)  SEBAGAI PEMANDU ISOLASI
Setelah selesai fraksinasi menggunakan kolom silika  terbuka,  maka  dilanjutkan  dengan  proses evaporasi untuk pengeringan terhadap semua fraksi yang diperoleh (baik dari sampel miselium maupun sampel broth ), lalu semua fraksi ditimbang. Kemudian terhadap semua fraksi ini dilakukan uji lebih lanjut untuk mendapatkan suatu senyawa yang benar-benar murni ( pure ). Untuk memudahkan tahap isolasi dan
arah  pekerjaan  selanjutnya  maka  perlu  mengikuti suatu panduan isolasi dalam  mendapatkan senyawa bioaktif target.  Panduan isolasi ini tergantung dari tujuan peneliti yang akan melakukan pekerjaan isolasi senyawa bioaktif tersebut.
Biasanya  ada  dua  cara  yang  digunakan  untuk panduan  tahap  isolasi.  Pertama, assay  guide isolation ,  yaitu  tahap  isolasi  yang  dilakukan berdasarkan atau dipandu oleh uji-uji yang dilakukan. Isolasi suatu senyawa bioaktif akan mengacu pada suatu assay (uji) sesuai dengan  target  senyawa yang  diinginkan, misalnya uji anti bakteri (Rusman et al ., 2007; Gunawan et al .,  2008), anti penuaan, anti  ultraviolet A  (Zhang et  al .,  2008),  anti  kanker dengan metode uji MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5- difeniltetrazolium  bromida]  (Astuti et  al .,  2005; Setyowati et  al. ,  2007),  uji  DPPH  (1,1-  difenil-2- pikrilhidrazil)  (Li et  al .,  2006a;  Li et  al .,  2006b; Mudjirahmini  &  Ersam,  2006),  atau  uji-uji  yang lainnya. Jadi disetiap tahap fraksinasi yang dilakukan, sampelnya selalu diuji sesuai target senyawa yang diinginkan. Pekerjaan ini dilakukan kontinyu, sampai diperoleh suatu target senyawa yang  diinginkan  murni ( pure ). Kedua, TLC guide isolation , yaitu tahap isolasi yang  dilakukan  berdasarkan  hasil  TLC  atau kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  (Gambar  3).  Ini berdasarkan  target spot KLT  yang  diperoleh  dan pekerjaanya juga dilakukan secara kontinyu sampai diperoleh  suatu spot dari  target  senyawa  yang diinginkan benar-benar murni (Ritmaleni & Nurcahyani, 2006; Setyowati et al ., 2007). Namun hasil KLT yang telah memberikan satu spot ini perlu juga dilakukan pengujian kemurnian dengan KCKT (Swantara et al ., 2007) atau dengan GC-MS (Gunawan et al ., 2008). Hal ini disebabkan oleh satu spot hasil KLT tersebut dapat  memberikan  dua  puncak (peak) atau  lebih (Gunawan et al ., 2008).
Pada KLT ini, fase diam (fase stasioner) berupa lapisan  yang  seragam  pada  bidang  datar  yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau
Gambar 4. Cara menentukan nilai Rf dari suatu hasil KLT (Anon., 2008).
pelat plastik, berbeda dengan kromatografi kolom yang fase diamnya diisikan atau dikemas di dalam kolom. Meskipun demikian, KLT ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom. Fase diam yang  digunakan  dalam  KLT  merupakan  penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10- 30 µm. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa (Rohman, 2007).
Menurut Rohman (2007), fase gerak (eluen) pada KLT dapat dipilih dari pustaka, namun lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana adalah campuran  dua  pelarut  organik  karena  daya  elusi campuran  kedua  pelarut  ini  dapat  dengan  mudah diatur sedemikian rupa, sehingga pemisahan dapat terjadi  secara  optimal.  Beberapa  petunjuk  dalam memilih  dan  mengoptimasi  fase  gerak  adalah (Rohman, 2007):
1. Fase   gerak  harus  mempunyai kemurnian yang sangat tinggi, karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga   nilai   Rf   (Gambar 4)  terletak  antara 0,2–0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
3. Untuk  pemisahan  dengan   menggunakan   fase diamnya   polar  seperti  silika gel, maka polaritas fase  gerak  akan menentukan kecepatan migrasi solut  (zat terlarut), yang berarti juga menentukan nilai  Rf.  Penambahan  pelarut  yang sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzena akan meningkatkan nilai Rf secara signifikan.
4. Solut-solut     polar    lebih    baik   menggunakan campuran  pelarut  sebagai fase geraknya, seperti campuran  air  dan  metanol  dengan  perbandingan tertentu.
Reagen  (pereaksi)  yang  digunak an  sebagai penampak bercak ( spot ) dalam KLT dapat dibedakan menjadi 2, yaitu pereaksi umum yang berlaku untuk hampir semua senyawa organik (Tabel 1) dan pereaksi
selektif yang hanya mendeteksi jenis atau golongan senyawa tertentu (Tabel 2).
Untuk mendapatkan senyawa murni, diperlukan tahap  pem isahan  dan  pem urnian  dengan menggunakan  HPLC  atau  lebih  dikenal  dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan juga MPLC atau lebih dikenal dengan kromatografi cair kinerja medium (KCKM). Kemudian dari sampel yang telah diperoleh  berupa  senyawa  murni,  yang  ditandai dengan  hasil  KLT  memberikan  hasil  satu spot (Ritmaleni  &  Nurcahyani,  2006;  Setyowati et  al ., 2007), dan hasil analisis dengan KCKM atau KCKT memberikan hasil satu puncak ( peak ) yang tunggal. Selanjutnya  terhadap  sampel  tersebut  dilakukan analisis dengan alat MS atau yang dikenal dengan spektroskopi massa (SM) untuk mengetahui bobot molekul (BM) dan ion fragmen dari hasil fragmentasi senyawa (Ritmaleni & Nurcahyani, 2006). Hasil MS dibandingkan  dengan database /pustaka,  untuk menguji apakah senyawa murni yang diperoleh adalah senyawa baru atau tidak. Hal ini penting, karena bagi peneliti di bidang kimia bahan alam, mendapatkan suatu senyawa baru adalah sesuatu hal yang menjadi prioritas. Ada empat prioritas yang digunakan oleh peneliti  di   bidang  kim ia  bahan  alam   dalam mendapatkan senyawa bioaktif. Menurut Son (2007) keempat prioritas tersebut adalah (1) senyawa baru dan bersifat aktif, (2) senyawa baru namun tidak aktif, (3)  senyawa  sudah  dikenal  namun  aktif,  dan  (4) senyawa  sudah  dikenal  dan  tidak  aktif.  Prioritas terakhir inilah yang paling tidak disukai oleh ahli-ahli kimia bahan alam dalam proses pencarian dan isolasi senyawa bioaktif.
Jika sampel murni yang diperoleh diduga adalah suatu  senyawa  baru,  maka  proses  analisisnya dilanjutkan    dengan  menggunakan  FTIR  ( Fourier Transform-Infra Red ) untuk menentukan gugus fungsi (Januar et al ., 2007) yang menyusun senyawa baru tersebut dan  juga jumlah atom  karbon  dan proton penyusun  senyawa  baru  ter sebut   dengan menggunakan  NMR  ( Nucleus Magnetic Resonance ).
Sumber: Rohman (2007).
Tabel  1.  Beberapa  pereaksi  umum  yang  digunakan  pada  KLT
Sumber:  Rohman  (2007).
Tabel  2.  Beberapa  pereaksi  spesifik  yang  digunakan  pada  KLT Metode deteksi Warna bercak solut Penggunaan Asam fosfomolibdat + pemanasan Biru gelap Beberapa senyawa organik Asam sulfat pekat + pemanasan Hitam kecoklatan Semua senyawa organik Uap iodium Coklat Beberapa senyawa organik Metode deteksi Warna bercak solut Penggunaan Ninhidrin Pink ke ungu Asam-asam amino dan amina 2,4-dinitrofenil hidrazon Oranye/merah Senyawa-senyawa karbonil Bromokresol hijau/biru Kuning Asam-asam organik 2,7-fluoresein Kuning kehijauan Senyawa organik Vanilin/asam sulfat Merah/hijau/pink Alkohol/keton Rhodamin-B Berfluoresensi merah Lemak Anisaldehida/antimon kloida Berbagai macam Steroid Difenilamina/seng Berbagai macam Pestisida
Jumlah  atom karbon ditentukan dengan 13 C-NMR dan jumlah  atom  proton  dengan 1 H-NMR.  Selanjutnya dengan  semua  data  analisis    yang  diperoleh  dari sampel  murni  tersebut,  yaitu  data  fisika  dan  hasil spektrofotometer  UV,  hasil  IR  (KBr),  MS,  NMR  1 dimensi (proton, karbon, dan DEPT) (Mudjirahmini & Ersam, 2006), serta NMR 2 dimensi seperti 1H-1H COSY,  13C-1H  COSY,  HMBC  (Tambunan  dan Simanjuntak, 2006), HMQC (Sukandar et al ., 2007), dan  NOESY  (Rusman et  al. ,  2007).  Setelah  data didapatkan,  m aka  dapat  dilanjutkan  dengan penentuan struktur molekul (dikenal dengan elusidasi struktur). Tahap ini merupakan tahap yang paling sulit dan menentukan dari semua tahap yang dilakukan untuk  m endapatkan  dan  menentukan  struktur senyawa baru.

## PENUTUP
Teknik isolasi senyawa bioaktif dari kapang yang berasal dari lingkungan laut ini bisa digunakan dan
dikembangkan di Indonesia, mengingat semua bahan dan peralatan yang digunakan sudah banyak tersedia. Namun,  untuk  mendapatkan  hasil  terbaik  perlu dilakukan  penyempurnaan  metode-metode  yang digunakan,  selain  itu  yang  tidak  kalah  pentingnya kemampuan para penggunanya dalam menggunakan alat-alat  yang  relatif  canggih  perlu  diasah  dan ditingkatkan  terus.  Kemudian  untuk  mendapatkan kondisi terbaik isolasi senyawa bioaktif dari kapang tersebut, para pengguna dapat melakukan modifikasi- modifikasi  dalam  setiap  tahap  yang  digunakan. Modif ikasi  ini  dapat  di lakuk an  pada  m edia pengkulturan terutama jenis dan komposisi media, cara  pemanenan,  jenis  pelarut,  dan  kolom  yang digunakan untuk fraksinasi.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  diucapkan  kepada  Muhammad Nursid, M.Si  yang telah meluangkan waktunya diawal
penulisan ini untuk memberikan kritikan dan masukan demi kesempurnaan tulisan ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Astuti,  P.,  G.,    Alam.,  M.S.Hartati.,  D.  Sari.,  dan  S. Wahyuono. 2005. Uji Sitotoksik Senyawa Alkaloid dari Spons Petrosia  sp :  Potensial  Pengembangan Sebagai Antikanker. Maj Farm  Indo .  16(1):  58–62. Dahuri,  R.  2003. Keanekaragaman  Hayati  Laut .  PT. Gramedia.  Pustaka  Utama.  412  pp. Demain,  A.L.  and  Solomon,  N.A.  1986. Manual  of Indus trial  Mic robiology   and  Biotechnology. American  Society for Microbiology, Washington, D.C. 466  pp.
Fardiaz,  S.  1992. Mikrobiologi  Pangan  1 .  Gramedia Pustaka  Utama,  Jakarta.  308  pp.
Gunawan, I.W.G., I.G.A.G. Bawa., dan N.L. Sutrisnayanti.
2008.  Isolasi  dan  Identifikasi  Senyawa  Terpenoid yang Aktif Antibakteri pada Herba Meniran ( Phyllanthus niruri Linn). J.  Kimia .  2(1):  31–39.
Januar, H. I., Patmaesari, L., W ikanta, T., dan Chasanah, E.  2007.  Analisis  Dereplikasi  Substansi  Bioaktif Fraksi  Polar Petrosia sp.  Dari  Perairan  Kepulauan Seribu. JPB,  Perikanan .  2(2):  129–136.
Khong, T  and Son, B.W. 2006. Diketopiperazine Alkaloid from  the  Marine-Derived  Fungus Pseudallescheria sp. Prensented  at  Lab  meeting  in  Natural  Product Chemistry  Laboratory .  Department  of  Chemistry, Pukyong  National  University,  Busan.  Korea.  8  pp.
Kim,  Y.  H  and  Son,  B.W.  2007.  Biological  Synthesis  of Polyk etides  from    6- n -pentyl- á -pyrone  by Streptomyces sp. Prensented  at  Lab  meeting  in Natural  Product  Chemistry  Laboratory .  Department of  Chemistry,  Pukyong  National  University,  Busan. Korea. 24 pp.
Li,  X.,  Choi,  H.  D.,  and  Son,  B.  W.  2005.  Bioactive Polyketides  from  a  Marine  Isolate  of  the  Fungus Myrothecium . Prensented  at  Lab  meeting  in  Natural Produc t  Chemistry   Laboratory .  Department    of Chemistry,  Pukyo ng  National  University,  Busan. Korea. 15 pp.
Li,  X., S.K.  Kim.,  J.S.  Kang.,  H.D.  Choi,  and  B.W.  Son. 2006.  Radical  Scaving  Hydroxyphenyl  Ethanoic Acid Derivative  from  a  Marine-Derivative  Fungus. J . Microbiol.  Biotechnol .  16(4):  637-638.
Li,  Y.,  Li,  X.,  and  Son,  B.  W.  2005.  Diketopiperazine Alkaloid  from  the  Marine-Derived  Fungus Aspergillus sp. Prens ented  at  Lab  meeting  in Natural  Product  Chemistry  Laboratory .  Department of  Chemistry,  Pukyong  National  University,  Busan. Korea. 18 pp.
Mudjirahmini,  D  dan  T.  Ersam.  2006.  4-Fenilkumarin pada  Fraksi  Polar  Ekstrak  Etil  Asetat  dari  Batang Garcinia  balica Miq. Seminar  Nasional  Kimia  VII di Surabaya. 8 Agustus 2006. 9 pp.
Ngunyen, P. H and Son,  B.  W. 2006.  Two Antimicrobial Polyk etides  from  a  Marine-Derived  Fungus. Prensented  at  Lab  meeting  in  Natural  Product Chemistry  Laboratory .  Department  of  Chemistry,
Pukyong  National  University,  Busan.  Korea.  14  pp.
Nugroho,  T.T.,  M.  Ali.,  C.  Ginting.,  Wahyuningsih.,  A.
Dahliaty.,  S.  Devi,  dan  Y.  Sukmarisa.  2003.  Isolasi dan  Karakterisasi  sebagian  Kitinase Trichoderma viride TNJ63. J. Nat.  Indo . 5(2): 101–106.
Rahman,  A.,  Li,  X.,  and  Son,  B.  W.  2006.  Biological Synthesis  of  the  Oxidized  Terreusinone  by Streptomyces sp. Prensented  at  Lab  meeting  in Natural  Product    Chemistry  Laboratory .  Department of  Chemistry,  Pukyong  National  University,  Busan. Korea. 10 pp.
Randhawa, H.S., T. Kowshik., K.P. Sinha.,  R.S. Sandhu, and  A.  Chowdhary.  2005.  Peptone  glucose fluconazole  agar,  a  selective  medium  for  rapid  and enchanced  isolation  of Aspergillus  fumigatus from aqueous  suspensions  and  sputum  seeded  with Candida  albicans . Current  Sci .  88(3):  449–454. Ritmaleni  dan  W.  Nurchayani. 2006.  Sintesis  4-fenil-3,4- tetrahidro-indeno  [2,1]-pirimidin-2-on  (LR-1). Maj. Farm  Indo .  17(3):  149–155.
Rohman,  A.  2007. Kimia  Farmasi  Analisis .  Pustaka Pelajar, Yogyakarta.  485  pp.
Rusman, Y.,  P. Proksch.,  and  R.  Ebel. 2007.  Isolasi  dan Aktivitas Biologi Senyawa Meroterpen dari Jamur Laut Penicillium  citronigrum .  Prosiding  Seminar  Nasional Kimia  2007.  Departemen  Kimia  FMIPA-UI  (Program Hibah  Kompetisi-A3).  Himpunan  Kimia  Indonesia (HKI).
Suryono,  A.,  Martina, dan  A.M. Chainulfifah. 2002. Isolasi dan  Karakterisasi  Jamur  Penghasil  Inulinase  yang Tumbuh pada Umbi Dahlia ( Dahlia variabilis ). J. Nat. Indo. 4(2):  171–177.
Setyowati, E.P., U.A. Jenie., Sudarsono., B. Kardono., R.
Rahmat,  dan  E.  Meiyanto.  2007.  Isolasi  Senyawa Sitotoksik  Spons  Kaliapsis. Maj  Farm  Indo .  18(4): 183–189.
Son, B. W. 2007. A short communication.
Suk andar,  D.,  S.  M.  Chairul,  dan  Nurlaela.  2007.
Elusidasi  Struk tur  Kimia  Senyawa  Bioaktif Pengendali  Serangga  Ulat  Kubis  Dari  Kulit  Batang Aglaia Disoxylum (Meliaceae). J. Valensi . 1(1):7–13. Sukandar,  D.,  S.  Hermanto,  dan  E.  Lestari.  2008.  Uji Toksisitas  Ekstrak  Daun  Pandan  Wangi  ( Pandanus amaryllifolius Roxb.)  dengan  Metode Brine  Shrimp Lethality Test (BSLT). J. Valensi . 1(2): 63–70. Supriyono, A.,  Y.  Rusman.,  S.  Kusumaningrum,  dan  E. Rofaani.  2007.  Isolasi  Senyawa  aktif  Meleagrine  dari Kapang  Laut  kode  B.24  yang  Diisolasi  dari  Redimen Perairan  Laut  Kepulauan  Seribu. Prosiding  Seminar Nasional  Kimia  2007. Departemen  Kimia  FMIPA-UI (Program  Hibah  Kompetisi-A3).  Himpunan  Kimia  In- donesia  (HKI).
Swantara, I.M.D., A. Supriyono, dan M. Trinoviani. 2007. Isolasi  dan  Identifikasi  Senyawa  Toksik  pada  Spons dari  Perairan  Pili  Sulat-Lombok. J.  Kimia .  1(2):  67– 69.
Tambunan,  R.M  dan  P.  Simanjuntak.  2006.  Penentuan Struktur  Kimia Antioksidan  Benzofenon glikosida  dari Ekstrak  n-Butanol  Buah  Mahkota  Dewa  [ Phaleria macrocarpa (Scheff)  Boerl.]. Maj  Farm  Indo .  17(4): 184–189.
W ikanta,  T.,  Y. A.  Zakaria,  D.  Ratih,  dan  M.  Nursid.  Uji Ak tivitas Sitotok sik   ekstrak k arang lunak Sarcophytonglaucum  (Quoy  &  Gaimard)  Terhadap Sel Lestari Tumor Hela. JPB. KP . 2(1): 69–80.
Zhang, D & Son, B. W. 2006. Antibacterial Dioxopiperazine Alkaloids  from  the  Marine-derived  Fungus Pseudallescheria. Prensented  at  Lab  meeting  in Natural  Product  Chemistry  Laboratory .  Department of  Chemistry,  Pukyong  National  University,  Busan. Korea. 12 pp.
Zhang,  D  &  Son,  B.  W.  2006.  The  metabolites  from  a Marine-Derived  Fungus Aspergillus sp. Prensented at  Lab  meeting  in  Natural  Produc t  Chemistry Laboratory .  Department  of  Chemistry,  Puk yong National  University,  Busan.  Korea.  28  pp.
Zhang,  D  &  Son,  B.  W .  2007a.  Citrinin  from  a Marine-Derived  Fungus Aspergillus  sp. Prensented at  Lab  meeting  in  Natural  Produc t  Chemistry Laboratory .  Department  of  Chemistry,  Puk yong National  University,  Busan.  Korea.  9  pp.
Zhang, D & Son, B. W. 2007b.  Chemical Studies on the Bioactive  Metabolites  from  Marine-Derived  Fungi MFB604  &  MFC353. Prensented  at  Lab  meeting  in Natural  Product  Chemistry  Laboratory .  Department of  Chemistry,  Pukyong  National  University,  Busan. Korea. 46 pp.
Zhang, D., Li, X., Kang, J. S.,  Choi, H.D., Jung, J. H., and Son,  B.W .  2007a  Redoxc itrinin,  a  biogenetic precursor  of  citrinin  from  marine  isolate  of  fungus Penicillium sp. J.Microbiol.  Biotechnol. 17, 865–867. Zhang, D., Noviendri, D., Nursid., M. Dong, X., and Son, B.W.  2007b.  12,13-Dihydroxyfumitremorgin  C, Fumitremorgin  C,  and  Brevianamide  F,  Antibacterial Diketopiperazine  Alkaloids  from  the  Marine-Derived Fungus Ps eudallescheria sp. J.  Nat  Prod.  Sc i . 13(3):251–254.
Zhang, D., X. Yang., J.S. Kang., H.D. Choi., and B.W. Son. 2008.  Circumdatin  I,  a  New  Ultraviolet-A  Protecting Benzodiazepine Alkaloid from  a  Marine  Isolate of  the Fungus Exophiala . J.  Antibiot .  61(1):  40–42.