## OPTIMASI KONSENTRASI MgCl

## 2 DAN SUHU ANNEALING PADA PROSES AMPLIFIKASI MULTIFRAGMENS mtDNA DENGAN METODA PCR
Mukhammad Asy’ari 1) dan A. Saifuddin Noer 2)
1) Laboratorium Biokimia jurusan Kimia FMIPA UNDIP Semarang
2) Laboratorium Rekayasa Genetika PAU Bioteknologi ITB Bandung

## ABSTRAK
Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)  merupakan  metode  amplifikasi  Deoxyribonucleic  acid (DNA) secara in vitro. Hingga saat ini para peneliti baru berhasil mengamplifikasi secara in vitro DNA mitokondria (mtDNA) manusia Indonesia sampai ukuran fragmen maksimal 1,6 kilobasa (kb) dan belum dilakukan untuk “banyak fragmen” (multifragments). Pada penelitian ini telah berhasil diamplifikasi multifragments DNA mitokondria manusia Indonesia berukuran 5,4 kb; 4,2 kb; 3,5 kb; 2,1 kb; 1,6 kb dengan  metode  PCR  standar  melalui  optimasi  konsentrasi  MgCl 2 dan  suhu  annealing.  Proses berlangsung  dalam  satu  reaksi  PCR  menggunakan  enzim  taq  polimerase, lima  primer yaitu  dmt-2L, dmt-1H, FL, FH dan MH pada kondisi bufer standar dengan konsentrasi MgCl 2 2,5 mM, selama 30 siklus pada suhu denaturasi 94°C (15 detik), annealing 65°C (30 detik) dan extension 72°C (180 detik). Keberhasilan metode amplifikasi in vitro multifragments yang mengandung fragmen panjang tersebut diharapkan bisa membuat proses amplifikasi beberapa gen dalam satu genom menjadi lebih cepat dan efisien.
Kata kunci: PCR multifragments, mtDNA manusia Indonesia, optimasi PCR, MgCl 2
OPTIMIZING OF MgCl 2 CONCENTRATION AND ANNEALING TEMPERATURE ON AMPLIFICATIONS PR°CESS OF mtDNA MULTIFRAGMENTS USING PCR METHODS

## ABSTRACT
Polymerase Chain Reaction (PCR) is an in vitro amplification Deoxyribonucleic acid (DNA) method. Recently, researchers have successed in vitro amplification Indonesian human mit°Chondrial DNA (mtDNA). Size mtDNA fragment can be amplified up to 1,6 kb and multifragments amplified is rarely. In this research multifragments 5,4 kb; 4,2 kb; 3,5 kb; 2,1 kb and 1,6 kb of Indonesian mtDNA can  be  in  vitro  amplified  trough  optimazing  of  MgCl 2 concentrations  and  annealing  temperature. Multifragments were amplified in one PCR reaction using taq polimerase enzyme and five primers: dmt- 2L,  dmt-1H,  FL,  FH  and  MH,  on  standard  conditions  buffers  with  modifications  of  MgCl 2 concentrations  become  2,5  mM.  Perform  30  cycles  of  PCR  using  the  following  temperature  profile: denaturation 94 °C (15 seconds), annealing 65°C (30 seconds) and extension 72°C (180 seconds). The result  of  in  vitro  multifragments  ampfications  methods  included  could  amplified  the  long  fragments mtDNA can contribute in amplifications of some gene in genome more quickly and efficient. Keyword: Multifragments PCR, Indonesian human mtDNA, PCR optimizing, MgCl 2

## PENDAHULUAN
Metode  PCR  multifragmen  adalah  teknik amplifikasi in vitro dari beberapa fragmen DNA pada lokus yang berbeda dalam satu reaksi PCR. Metoda  ini  pertama  kali  dikembangkan  oleh Chamberlain dan telah berhasil digunakan dalam berbagai  analisis  DNA  seperti  delesi,  mutasi, dan polimorfisme [Chamberlain et al., 1988].
Optimasi metode PCR multifragmen masih terus dilakukan,  hal  ini  dikarenakan  kondisi  optimal
reaksi  polimerisasi  masing-masing  fragmen DNA adalah berbeda. Variasi komponen reaksi PCR seperti: konsentrasi primer, templat DNA, dNTP,  garam-garam  dalam  bufer  (MgCl 2 dan KCl),  unit  DNA  polimerase  dan  profil temperatur  siklus  PCR  dilakukan  untuk mencapai  kondisi  reaksi  yang  optimal  bagi semua  fragmen  yang  diamplifikasi  [Innis  & Gelfand,  1990;  Becks,  1998;  Cheng  &
Kolmodin,  1997;  Cheng  et  al.,  1994;  Barnes,
1994].
Konsentrasi  ion  Mg 2+ (bentuk  garam  MgCl 2 ) dalam  reaksi  PCR  bisa  divariasi  antara  0,5-5,0 mM.  Ion  Mg 2+ berperan  dalam  membentuk kompleks dengan dNTP sehingga dNTP menjadi semakin  larut,  meningkatkan  aktivitas  enzim DNA  polimerase  dan  menaikan  harga  Tm (melting  temperature)  dari  untai  ganda  templat DNA maupun interaksi primer–templat.
Konsentrasi  MgCl 2 juga  berpengaruh  besar terhadap  spesifisitas  dan  yield  (jumlah  produk) PCR. Pada umumnya jika ion Mg 2+ kurang akan menurunkan  yield,  sedangkan  jika  ion  Mg 2+ berlebih  akan  menurunkan  spesifisitas  dan menghasilkan produk non spesifik [Newton dan Graham, 1997; Innis dan Gelfand, 1990].
Suhu annealing adalah suhu di mana primer akan menempel  pada  templat  DNA,  besarnya  suhu dapat  dihitung  berdasarkan  nilai  melting temperature  (Tm)  dari  masing-masing  primer. Pencarian  kondisi  optimal  dari  suhu  annealing sangat  penting,  karena  berkaitan  dengan spesifitas dan sensitifitas produk PCR.
Berdasarkan beberapa hasil penelitian kelompok DNA  mitokondria  di  Institut  Teknologi Bandung,  telah  berhasil  diamplifikasi  secara  in vitro  DNA  mitokondria  manusia  Indonesia dengan ukuran fragmen maksimal sebesar 1,6 kb menggunakan  metode  PCR  fragmen  tunggal [Puspasari,  1998;  Ratnayani,  2000].  Penelitian ini  bertujuan  untuk  melakukan  amplifikasi  in vitro beberapa fragmen mtDNA pada lokus yang berbeda  dan  mengandung  fragmen  lebih  besar dari  1,6  kb  menggunakan  metode  PCR multifragmen melalui optimasi komponen reaksi PCR  yaitu  konsentrasi  MgCl 2 dan  suhu annealing.

## METODA PENELITIAN
Dalam  penelitian  ini  dilakukan  serangkaian percobaan yang meliputi:

## Preparasi Templat mtDNA
Templat  mtDNA  diambil  dari  sel-sel  epitel rongga  mulut,  dengan  metoda  pengambilan sampel air kumur. Lisis sel epitel menggunakan bufer lisis 10X ( 500 mM Tris–HCl pH 8,5; 10 mM  EDTA  pH  8,5  dan  5%  Tween20  )  dan proteinase K 10 mg/mL [Noer et al, 1994].

## Amplifikasi in vitro mtDNA dengan Metoda PCR Multifragmens
Pada  penelitian  ini  amplifikasi  in  vitro  multi- fragmens  mtDNA  menggunakan  lima  macam primer yaitu: dL , dH , FL , FH dan MH (Genset Oligos, Singapore) masing-masing 0,4  M, 1,25 unit  enzim  Taq  DNA  polimerase  (Amersham Pharmacia  Biotech,  USA),  dNTP  (Amersham Pharmacia  Biotech,  USA)  masing-masing  0,2 mM dan bufer PCR 10X (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl  ,  15  mM  MgCl 2 ,pH  9,0  pada  suhu kamar)  penambahan  ddH2O  steril  hingga volume  25  L.  Proses  PCR  dilakukan  sebanyak 30  siklus.  Tahap  awal  dari  proses  PCR  adalah tahap denaturasi awal (94°C, 2 menit), kemudian masuk ke program siklus PCR di mana masing- masing siklus terdiri atas tiga tahap yaitu tahap denaturasi (94°C, 15 detik), annealing (65°C, 30 detik)  dan  polimerisasi  (72°C,  5  menit).  Pada akhir  siklus  dilakukan  tambahan  proses polimerisasi pada suhu 72  C selama 10 menit.
DNA hasil PCR disimpan pada suhu –20  C.

## Konsentrasi Garam MgCl 2
Bufer  PCR  1X  yang  digunakan  sudah mengandung  MgCl 2 1,5  mM,  sehingga  variasi konsentrasi  dilakukan  dengan  penambahan garam Mg yang sama dengan bufer yaitu MgCl 2 .

## Analisis Hasil PCR
Hasil  amplifikasi  PCR  selanjutnya  dianalisis melalui  elektroforesis  gel  agarosa  1  %  (b/v) komposisi  gel  agarosa  dapat  dibuat  dengan melarutkan agarosa dalam bufer TAE 1 x (Tris- asetat 0,04 M, EDTA 0,001 M pH 8,0). Proses elektroforesis  ini  dilakukan  dengan  meng- gunakan  submarine  elektroforesis  yang  diisi dengan  bufer  TAE  1  x  sebagai  media  peng- hantar  arus  pada  tegangan  80  volt  selama  45
menit.  Penampakan  fragmen  DNA  yang  ber- interaksi  dengan  etidium  bromida  10  g/mL (sigma) pada gel agarosa dilakukan  di ata sinar UV pada 254 nm. Marker atau penanda standar yang digunakan adalah  /HindIII yang memiliki 8 pita (masing-masing ber-ukuran 23 kb; 9,4 kb; 6,6 kb; 4,4 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 564 pb; 125 pb). Prediksi  konsentrasi  DNA  dapat  dilakukan dengan  memban-dingkan  ketebalan  pita  yang dianalisis  terdapat  pita-pita  dari  marker  yang konsentrasinya telah ditentukan sebelumnya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pengaruh suhu annealing
Pengaruh suhu annealing terhadap keberhasilan proses  PCR  dapat  dilihat  pada  hasil  percobaan (gambar 1).
Gambar 1.  Pengaruh  suhu  Annealing  terhadap produk PCR
Percobaan  di  ata  dilakukan  pada  kondisi  PCR standar  selama  30  siklus  pada  suhu  denaturasi 94°C  (1’),  annealing  57°C(1’),  dan  ekstensi 72°C  (5’).  Hasil  elektroforesis  menunjukkan kolom  1  adalah  fragmen  1,6  kb  (FL  dan  FH), kolom  2  adalah  fragmen  2,1  kb  (FL  dan  dH), kolom 3 adalah negatip, seharusnya fragmen 4,8 kb  (FL  dan  MH),  kolom  4  negatip,  seharusnya fragmen  5,4  kb  (dL  dan  dH),  dan  kolom  M adalah  DNA  marker  yaitu  /Hind  III.
Berdasarkan perhitungan nilai Tm dari masing- masing  primer  maka  kondisi  suhu  annealing 57°C sangat tepat untuk pasangan primer FL/FH dengan Tm = 65°C (kolom 1) dan FL/dH dengan Tm = 64°C (kolom 2), sedangkan FL/M (kolom
3)  dan  dL/dH  (kolom  4)  memiliki  Tm  lebih rendah lagi yaitu rata-rata 60°C. Suhu annealing biasanya digunakan suhu 5°C lebih rendah dari nilai Tm nya, karena jika suhu annealing terlalu tinggi  maka  penempelan  primer  pada  templat DNA akan lepas kembali sehingga produk PCR tidak terbentuk (kolom 3 dan 4), sebaliknya jika suhu annealing terlalu rendah maka akan terjadi penempelan  primer  pada  templat  DNA  tidak spesifik  sehingga  bisa  ter-bentuk  produk  PCR non  spesifik.  Ketidak-berhasilan  amplifikasi fragmen 4,8 kb dan 5,4 kb pada suhu annealing 57°C juga dikarenakan lebih panjangnya produk tersebut,  di  mana  kondisi  amplifikasi  fragmen- fragmen  panjang  perlu  kondisi  yang  khusus. Beberapa  kondisi  PCR  optimal  telah  berhasil dilakukan  untuk  beberapa  produk  dengan panjang fragmen yang berbeda diringkas dalam tabel 1.
Tabel 1.  Kondisi  optimal  beberapa  fragmen
hasil PCR Sampel Primer Suhu Anealing (°C) [Mg 2+ ] (mM) Produk PCR Epitel ML 50 1,5 * 0,4 kb Epitel MH 55 1,5 * 1,3 kb
Epitel XL XH 60 1,5 * 1,6 kb Epitel FL FH 57 1,5 * 2,1 kb Epitel FL dH 65 2,5 ** 4,8 kb
Epitel FL MH 65 2,5 ** 5,4 kb
Epitel dL dH dL dH FL FH MH 65 2,5 ** 5,4;4,2;3,5;2,1;1,6 kb
(Keterangan:  *  =  konsentrasi  ion  Mg 2+ pada bufer PCR standar, ** = hasil optimasi ion Mg 2+ )
Hasil  percobaan  (seperti tercantum  dalam  tabel 1) menunjukkan bahwa produk PCR berukuran ≤  2,1  kb  dapat  dihasilkan  pada  kondisi  PCR standar,  dengan  melakukan  optimasi  suhu annealing  dan  waktu  ekstensinya,  sedangkan produk  PCR  lebih  dari  2,1  kb  memerlukan optimasi  variabel  lainnya,  terutama  konsentrasi ion Mg 2+ . Produk PCR berukuran 4,8 kb; 5,4 kb dan  multifragmen  berhasil  diamplifikasi  pada konsentrasi  ion  Mg 2+ 2,5  mM  dan  suhu annealing 65°C.

## Optimasi konsentrasi ion Mg 2+
Konsentrasi  ion  Mg 2+ berpengaruh  besar terhadap  spesifisitas  dan  jumlah  produk  (yield) PCR. Pada umumnya jika ion Mg 2+ kurang akan menurunkan  yield,  sedangkan  jika  ion  Mg 2+
berlebih  akan  menghasilkan  produk  non spesifik, seperti pada gambar 2.
Gambar 2.  Pengaruh  konsentrasi  ion  Mg 2+ terhadap produk PCR
Percobaan  di  atas  dilakukan  pada  kondisi  PCR dengan  variasi  konsentrasi  ion  Mg 2+ (2,0-5,0 mM)  selama  30  siklus  pada  suhu  denaturasi 94°C (15’’), annealing 65°C(30’’), dan ekstensi 72°C  (5’).  Hasil  elektroforesis  menunjukkan bahwa  kolom  1-5  adalah  hasil  negatip (seharusnya  fragmen  5,4  kb  dengan  primer  dL dan dH ), kolom 6 adalah kontrol positip, kolom 7-8 adalah fragmen 5,4 kb dengan primer dL dan dH, kolom 9-10 adalah fragmen 4,8  kb dengan primer FL dan MH dan kolom M adalah marker DNA  /Hind III.
Kondisi optimal PCR untuk fragmen 4,8 kb dan 5,4 kb yaitu pada konsentrasi ion Mg 2+ 2,5 mM.
Jumlah produk  amplifikasi  fragmen  5,4  kb  dan 4,8 kb pada konsentrasi ion Mg 2+ 2,5 mM lebih besar  (pita  tebal)  daripada  2,0  mM  (pita  tipis). Sedangkan pada konsentrasi lebih besar dari 2,5 mM hasil amplifikasi fragmen 5,4 kb (kolom 1- 5) menunjukan negatip, dan terlihat pola smear yang  menunjukan  adanya  produk  non  spesifik. Konsentrasi  ion  Mg 2+ yang  terlalu  besar menyebabkan  meruahnya  dNTP  disekitar  Taq polimerase  sehingga  bisa  terjadi  kesalahan dalam  sintesis  DNA  baru  yaitu  membentuk produk yang non spesifik.

## Amplifikasi in vitro ”Multifragmens” mtDNA dengan metoda PCR
Amplifikasi  in  vitro  multifragmens  DNA mitokon-dria  berukuran  5,4  kb;  4,2  kb;  3,5  kb; 2,1  kb;1,6  kb  telah  berhasil  dilakukan  dengan metoda  PCR  (gambar  3).  Proses  berlangsung dalam  satu  reaksi  PCR  dengan  menggunakan enzim  Taq  polimerase,  lima  primer  yaitu  dmt- 2L, dmt-1H, FL, FH dan MH pada kondisi bufer standar dan konsentrasi ion Mg 2+ 2,5 mM selama 30  siklus  pada  suhu  denaturasi  94°C  (15’’), annealing 65°C (30’’) dan ekstensi 72°C (5’).
Gambar 3. Hasil PCR Multifragmens mtDNA Keterangan  (S):  hasil  “multifragmens”  5,4  kb; 4,2 kb; 3,5 kb; 2,1 kb dan 1,6 kb, dengan primer dL, dH, FL, FH, MH , (M): marker DNA  /Hind III,  sampel  yang  digunakan  adalah  sel  epitel pada  kondisi  PCR  teroptimasi  dan  siklus 94°C(15’’), 65°C(30’’),  72°C(5’)  dengan konsentrasi ion Mg 2+ 2,5 mM.

## KESIMPULAN
Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa:
1. Konsentrasi MgCl 2 mempengaruhi keberhasilan amplifikasi in vitro mtDNA.
2. Amplifikasi  mtDNA  berukuran  ≥  2,1  kb membutuhkan konsentrasi MgCl 2 2,5 mM.
3. Suhu annealing tergantung pada jenis primer yang  digunakan  dan  ukuran  fragmen  yang diamplifikasi.
4. Amplifikasi  mtDNA  berukuran  ≥  2,1  kb berhasil  dilakukan  pada  suhu  annealing  65 °C.
5. Telah  berhasil  diamplifikasi  secara  in  vitro
multifragments mtDNA manusia berukuran
5,4 kb; 4,2 kb; 3,5 kb; 2,1 kb; 1,6 kb melalui optimasi metoda PCR standar pada konsentrasi  MgCl 2 2,5  mM  dan  suhu annealing 65 °C.

## DAFTAR PUSTAKA
Barnes,  M.,  Wayne.  1994,  “PCR  amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from  bacteriophage templates”,
Pr°C. of the Natl. Acad. of Sci. of the USA
91: 2216-2220.
Beck, S., 1998, “High Fidelity PCR: Enhancing the Accuracy of DNA Amplification”, The Scientist 12[1]: 17.
Chamberlain, J.S., R.A. Gibbs, J.E. Ranier, P.N.
Nguyen  and  C.T.  Caskey.,  1988,  “Deletion screening  of  Duchenne  muscular  dystropy l°Cus  via  multiplex  DNA  amplification”, Nucleic Acids Res.16: 11141-11156.
Cheng, S., and Kolmodin, L.A., 1997, XL PCR amplification of long targets from genomic DNA, Methods in Molecular Biology: PCR Cloning  Prot°Cols,  edited  by  Bruce  A. White,  67,  Humana  Press,  Totowa,  New Jersey, page 17 – 29.
Cheng,  S.,  F°Ckler,  C.,  Barnes,  M.W.,  and Higuchi, R., 1994, “Effective amplification of long target from cloned inserts and human genomic DNA”, Pr°C. of the Natl. Acad. of Sci. of the USA 91: 5695-5699.
Innis,  A.M.,  and  Gelfand,  H.D.,  1990, “Optimization of PCRs”, PCR Prot°Cols: A
Guide to Methods and Applications.
Newton, C.R., and Graham,A., 1997, PCR, 2nd edition, BIOS Scientific Publisher Limited, UK.
Noer,  A.S.,  Martasih,  F.,  Mulyani,  S., Muktiningsih,  dan  Wirahadi-kusumah,  M., 1994,  Analisis  varian  urutan  nukleotida  D- loop mtDNA  manusia dari berbagai daerah di  Indonesia,  Proseeding  Seminar  Bersama
UKM-ITB I, halaman 201-214.
Puspasari,  F.,  1998,  “Substitusi  Enam
Nukleotida  Daerah  Gen  ND4,  ND5  DNA Mitokondria  Manusia  Indonesia”  ,  Tesis, Bidang  Studi  Magister  Kimia  Kimia Program Pascasarjana, ITB, Bandung.
Ratnayani, K., 2000, Varian normal fragmen 1,6 kb  daerah  gen  ND4  dan  ND5  DNA
mitokondria  10  individu  Indonesia,  Tesis, Bidang  Khusus  Biokimia,  Program  Studi Kimia, Program Pascasarjana, ITB, Bandung.