Perbedaan Jumlah Trombosit, Leukosit dan Eritrosit dengan Kecepatan Sentrifugasi yang Berbeda pada Pembuatan Platelet Rich Plasma
Dwi Fajaryani, Muji Rahayu, Edward Kurnia Setiawan Limijadi
Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro / RSUP Dr. Kariadi Semarang

## Original Article

## Abstrak
p-ISSN: 2301-4369 e-ISSN: 2685-7898 https://doi.org/10.36408/mhjcm.v7i1.421
Diajukan: 5 Juli 2019 Diterima: 7 Oktober 2019
Afiliasi Penulis: Bagian Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro/ RSUP Dr. Kariadi Semarang
Korespondensi Penulis: Dwi Fajaryani Jl. Dr. Sutomo No. 16, Semarang, Jawa Tengah 50244, Indonesia
E-mail: dwifajaryani@yahoo.com
Latar belakang : Platelet Rich Plasma (PRP) adalah plasma dalam jumlah sedikit dengan jumlah trombosit banyak, didapatkan melalui sentrifugasi. Trombosit dalam PRP penting untuk  penyembuhan  luka  dan  memperbaiki  jaringan  rusak.  Kecepatan  sentrifugasi berperan penting dalam memisahkan sel darah merah dengan plasma dan menghasilkan platelet  konsentrat.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  perbedaanjumlah trombosit,  leukosit  dan  eritrosit  dengan  kecepatan  sentrifugasi  yang    berbeda  pada pembuatan platelet rich plasma . Metode : Penelitian belah lintang  pada  orang  sehat di  laboratorium RSUP Dr. Kariadi Semarang   bulan Juli 2018. Darah vena ditampung dalam   tabung sitras   dan Ethylene diamine  tetra  acetic  acid (EDTA).  Darah  EDTA  untuk  pemeriksaan  hematologi  rutin dengan hematology analyzer , hasil normal dilanjutkan pembuatan PRP dari darah sitras 3,2% dengan dua metode sentrifugasi, dengan kecepatan 100xg – 400x selama 10 menit (metode PRP1) dan kecepatan 540xg – 2270xg selama 10 menit (metode PRP2). Kedua produk  PRP  dilakukan  pemeriksaan    jumlah  trombosit,  leukosit  dan  eritrosit.  Data dianalisis dengan uji Kruskall Wallis dan Mann Whitney , signifikan bila p < 0,05. Hasil : Sampel terdiri dari 35 orang responden. Terdapat perbedaan bermakna jumlah trombosit, leukositdan eritrositpada pembuatanPRP–1 dan PRP-2  ( p <0,001) Simpulan : Terdapat perbedaan jumlah trombosit, leukosit dan eritrosit pada kecepatan sentrifugasi  yang  berbeda.  Kecepatan  sentrifugasi  pada  metode  pembuatan  PRP–1 disarankan dalam pembuatan PRP.
Kata kunci : PRP, trombosit, leukosit, eritrosit

## PENDAHULUAN
Platelet  Rich  Plasma (PRP)    adalah  produk  darah  yang terdiri  dari  sejumlah  plasma  dalam  jumlah  sedikit dengan  jumlah  trombosit  yang  banyak,  didapatkan 1 melalui  proses  sentrifugasi  dari  sediaan whole  blood . Konsentrasi  trombosit  yang  berada  dalam  PRP dilaporkan sangat penting dalam proses penyembuhan 3 luka.  PRP di RSUP Dr. Kariadi pada saat ini digunakan untuk  kepentingan  klinis  pasien  dengan  osteoarthritis. Pembuatan PRP di RSUP Dr. Kariadi dengan kecepatan sentrifugasi 540 xg   selama 10 menit   pada sentrifugasi pertama dilanjutkan dengan kecepatan sentrifugasi 2270
4 xg  selama 10 menit pada sentrifugasi kedua.  Kecepatan sentrifugasi yang digunakan di laboratorium RS. Kariadi saat ini digunakan di bagian Ilmu/SMF Kesehatan kulit dan kelamin  FK  UGM/ RSUP Dr.  Sardjito Yogyakarta, namun belum didapatkan data tentang jumlah trombosit yang  dihasilkan  dari  sediaan  PRP  tersebut.    Penelitian 5 Perez, et al ,  mendapatkan kenaikan jumlah trombosit 5x dari jumlah trombosit sebelum preparasi  melalui proses sentrifugasi 100 xg selama 10 menit dilanjutkan dengan sentrifugasi  kedua  400  xg  selama  10  menit.  Kontrol kualitas  dari  sediaan  trombosit  menurut American Association  of  Blood  Banks dinilai  dari  jumlah  volume sediaan,  jumlah  trombosit,  fenomena swirling pada sediaan  trombosit,  pH,  jumlah  eritrosit  yang  tersisa,
6 leukosit, dan sterilitas,  pada penelitian ini jumlah lekosit dan  eritrosit  (yang  tersisa)  pada  sediaan  PRP  menjadi salah satu kontrol kualitas dari sediaan PRP.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah terdapat  perbedaan    jumlah  trombosit,  leukosit  dan
eritrosit  dengan  kecepatan  sentrifugasi  yang    berbeda pada  pembuatan platelet  rich  plasma .  Penelitian diharapkan dapat menjadi masukan dalam penyusunan metode  pembuatan  PRP  dalam  menghasilkan  jumlah trombosit  yang  optimal  dengan  jumlah  leukosit  dan eritrosit yang minimal.

## METODE
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  dengan  metode belah  lintang (cross  sectional) yang  dilakukan  selama 2–6 Juli 2018 di RSUP Dr. Kariadi Semarang. Penelitian melibatkan 35 orang sehat yaitu residen dan analis yang berdinas di Laboratorium RSUP Dr. Kariadi Semarang, berusia 25-45 tahun, terdiri dari 12 orang laki-laki dan 23  orang  perempuan,  tidak  ada  keluhan  sewaktu penelitian,  dari  pemeriksaan  tanda-tanda  vital  dan pemeriksaan fisik didapatkan hasil dalam batas normal dan  pemeriksaan  hematologi  rutin  dalam  rentang
3 normal dengan nilai trombosit 150–400 x10  /uL, leukosit
3
6 3,6–11  x10   /uL,  eritrosit  4,4–5,9  x10 /uL,  dan  Hb 12–17  g/dl.  Sampel  dengan  riwayat  kelainan  sistem hematologi  dan  koagulasi,  riwayat  penyakit  berat  dan kronis,  mengkonsumsi  obat  antikoagulan  dalam  7  hari terakhir  dikeluarkan  dari  penelitian  ini. Sampling dilakukan  dengan  teknik consecutive pada  residen  dan analis laboratorium RSUP Dr. Kariadi yang bersedia ikut serta  dalam  penelitian  ini  dengan  persetujuan informed consent . Ethical  clearance diperoleh  dari  institusi  Komite Etik  Penelitian  Kedokteran  dan  Kesehatan,  Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang nomor : 439/EC/FK–RSDK/VII/2018
Background : Platelet Rich Plasma (PRP) consisting of small amounts plasma with many platelet, which was obtained by centrifugation process. The plateletin PRP are essential for wound healing and repair of damaged tissue. The centrifugation velocity plays an important role in separating red blood cells by plasma and producing concentrated–platelets. This study aims to determine differences the number of platelets, leukocytes and erythrocytes with different centrifugation rates on platelet rich plasma production.
Methods:This cross sectional study was conducted on 35 healthy people in the laboratory of Kariadi Hospital Semarang in July 2018.  The blood vein were collected in Citrate 3.2 % and Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) tubes. Sample EDTA for complete blood counts, ifthe results were normal then continued with PRP preparation in 2 different methods centrifugation (PRP 1 at 100xg-400xg for 10 minutes and PRP 2 at 540xg – 2270 xg for 10 minutes). Both of the PRP products were calculated the amounts of platelet, leukocytes, and erythrocytes. The data were analyzed by Kruskall Wallis and Mann Whitney , p < 0.05 was considered as significant. Results : There wasa significant difference between PRP-1 and PRP-2 method in platelet counts, leukocytes count and erythrocytescount ( p <0.001). Conclusion  : There  was  differences  in  platelet  count,  leukocytes  count  and  erythrocytes  count  with  different  centrifugation  rate. Centrigugation rate on PRP–1 method is recommended in the production of PRP.
Keywords : PRP, platelets, leukocytes, erythrocytes

## Abstract

## The differences of platelets, leukocytes and erythrocytes count with different centrifugation rate on platelet rich plasma production
Perbedaan Jumlah Trombosit, Leukosit dan Eritrosit dengan Kecepatan Sentrifugasi yang Berbeda pada Pembuatan Platelet Rich Plasma
Sampel darah whole blood diambil sebanyak 12 ml dari  responden,  2  ml  di  masukan  ke  dalam  tabung dengan  antokoagulan  EDTA  dan  2,5  ml  dimasukan kedalam empat buah tabung dengan antikoagulan sitras 3,2%.  Sampel  dengan  antikoagulan  EDTA  dilakukan pemeriksaan  hematologi  rutin  menggunakan  alat hematology analyzer Sysmex XP–100 (Sysmex Corporation, Kobe,  Jepang)  dengan  metode  impedansi,  selanjutnya sampel  dengan  hasil  hematologi  yang  normal dilanjutkan  dengan  preparasi  pembuatan  PRP  dari sampel  dengan  antikoagulan  sitras  3,2%  meliputi pembuatan PRP 1 dengan kecepatan sentrifugasi 100xg dilanjutkan 400xg selama 10 menit dan pembuatan PRP 2 dengan kecepatan sentrifugasi 540xg dilanjutkan 2300xg selama  10  menit  dengan  alat  KUBOTA  4000  (Tokyo, Jepang).  Sampel  dari  pembuatan  PRP  1  dan  PRP  2 selanjutnya  di  hitung  jumlah  trombosit,  leukosit  dan eritrosit yang tersisa, kemudian hasilnya dibandingkan dengan  nilai  trombosit,  lekosit,  dan  eritrosit  sebelum
pembuatan PRP (sampel EDTA).
Data  jumlah  trombosit,  leukosit  dan  eritrosit dengan distribusi tidak normal disajikan dalam bentuk median (nilai terendah – nilai tertinggi). Analisis statistik menggunakan  uji  komparatif  numerik  tidak berpasangan dengan Kruskall Wallis untuk lebih dari dua kelompok,  satu  kali  pengukuran  dan Mann  Whitney untuk dua kelompok, satu kali pengukuran. Analisis data penelitian menggunakan SPSS 15.0.

## HASIL
Penelitian  ini  merekrut  sejumlah  41sampel  orang sehat,dari  hasil  hematologi  rutin,  terdapat  nilai  yang tidak  memenuhi  kriteria  nilai  normal  sehingga  yang memenuhi  kriteria  inklusi  dan  eksklusi  sejumlah  35 sampel terdiri dari 12 laki-laki (34,3%) dan 23 perempuan (65,7%) dengan rata-rata rentang usia 33,00 ± 4,71. Data karakteristik subjek pada tabel 1 disajikan dalam bentuk

## TABEL 1
Data deskriptif sampel
Variabel
Jenis kelamin Laki-laki Umur (tahun) F 10 23 25 12 Hematologi 6 Eritrosit(x10 /µL) Median (Min – Maks) 6,7 (4,49 – 9,7) 299 (165 – 403) 4,79 (4,05 – 10,9) Pekerjaan Residen Analis Perempuan Hb (mg/dl) 3 Trombosit (x10 /µL) 3 Leukosit (x10 /µL) Hb : hemoglobin % 28,6 65,7 71,4 34,3 Mean ± SD
33,00 ± 4,71
13,60 ± 1,23

## TABEL 2
Perbedaan Jumlah trombosit, leukosit dan eritrosit pada sampel EDTA, PRP 1 dan PRP 2
Variabel
3 Trombosit (x10 /µL)
Median
p Leukosit (x10 3 /µL) <0,001*
<0,001*
6 Eritrosit(x10 /µL) <0,001* 299 (165 – 403) 6,7 (4,49 – 9,7) EDTA 4,79 (4,05 – 10,9) 593 (246 – 1311) 0,1 (0 – 0,8) PRP 1 0,02 (0 – 0,1)
133 (53 – 621)
0,1 (0 – 0,3)
PRP 2 0 (0 – 0,01)
* Kruskal Wallis

## Medica Hospitalia
| Vol. 7, No. 1, Mei 2020

## TABEL 3
Uji beda nilai trombosit pada kelompok EDTA,
PRP 1 dan PRP 2 Trombosit EDTA PRP 1 PRP 1 – Mann Whitney
<0,001 PRP 2
<0,001 <0,001

## TABEL 4
Uji beda nilai leukosit pada kelompok EDTA,
PRP 1 dan PRP 2 Leukosit EDTA PRP 1
PRP 1 – Mann Whitney <0,001 PRP 2
0,872
<0,001

## TABEL 5
Uji beda nilai eritrosit pada kelompok EDTA,
PRP 1 dan PRP 2 Eritrosit EDTA PRP 1 PRP 1
– Mann Whitney <0,001 PRP 2 <0,001
<0,001
rerata simpang baku untuk data berdistribusi normal dan disajikan dalam bentuk median untuk data berdistribusi tidak normal.
Uji Kruskall  Wallis pada  Tabel  2  menunjukkan terdapat  perbedaan  jumlah  trombosit  pada  EDTA, PRP    1,  PRP  2  dengan p <0,001.  Terdapat    perbedaan jumlah leukosit pada EDTA, PRP 1, PRP 2 dengan p <0,001 . Terdapat perbedaan antara jumlah eritrosit pada EDTA, PRP  1,  PRP  2  dengan p <0,001.  Uji Mann  Whitney menunjukan  perbedaan  antara  jumlah  trombosit  dan eritrosit  (tabel  3  dan  tabel  5)  antara  EDTA  dan  PRP  1, EDTA dan PRP  2, PRP  1 dan PRP  2 dengan p < 0,001.

## PEMBAHASAN
Sentrifugasi  berperanan  penting  dalam  menghasilkan konsentrat trombosit dapat kita lihat di tabel 2 dengan kecepatan sentrifugasi 100xg selama 10 menit dilanjutkan dengan  kecepatan  400xg  selama  10  menit  jumlah trombosit pada PRP 1 mengalami peningkatan. Jumlah trombosit pada PRP 2 berbeda jika dibandingkan dengan EDTA  namun  jumlahnya  bervariasi  setelah  dilakukan
sentrifugasi  dengan  kecepatan  540xg  selama  10  menit dilanjutkan dengan 2300xg selama 10 menit. Pergerakan partikel  sel  darah  terhadap  gaya  sentrifugasi  dan diameter  rotor  sangat  berpengaruh  selama  proses sentrifugasi  begitu  juga  friksi  dari  partikel  terhadap velocity partikel dan viskositas cairan, pada sediaan whole blood gaya  sentrifugasi  dan  waktu  sentrifugasi  akan membuat eritrosit mengendap di bawah, lapisan plasma beserta  platelet  berada  diatasnya,  sedangkan  pada sentrifugasi  yang  kedua  konsentrasi  gradien  menjadi
7 lebih  konsisten.   Trombosit  berada  di  lapisan  atas eritrosit oleh karena itu terkadang eritrosit terbawa pada proses  pipetasi  menjadi  hal  yang  sulit  di  hindari. Kecepatan sentrifugasi yang tinggi dapat mengaktivasi trombosit,  merangsang  pelepasan  ADP  dan  ATP  yang
8 selanjutnya  dapat  merangsang  terjadinya  agregasi. Bervariasinya  jumlah  trombosit  pada  PRP  2  bisa diakibatkan terdapatnya pellet, yaitu jendalan trombosit dan  eritrosit  di  bagian  bawah  PRP  yang  akan mempengaruhi jumlah trombosit.
9 Hasil  penelitian  Bausset, et  al ,   menyebutkan trombosit  konsentrat  dihasilkan  maksimal  dari kecepatan  sentrifugasi  130xg  dilanjutkan  dengan kecepatan  250xg  selama  15  menit,  bila  di  bandingkan dengan jumlah trombosit whoole blood hasilnya bermakna dengan  nilai p =0,02,  jika  dibandingkan  dengan kecepatan  1000xg  didapatkan p =0,14.  Peneliti  juga mengalami  kesulitan  sewaktu  melakukan  resuspensi pelet  trombosit  pada  kecepatan  tersebut,  ini berhubungan  dengan  agregasi  trombosit  yang menunjukan  dengan  kecepatan  sentrifugasi  yang  lebih tinggi  dapat  mengurangi  fungsi  trombosit  dan berkurangnya pelepasan growth factor .
Bertolak belakang dengan penelitian Nugraha, 10 et al ,  pada 30 sampel darah dari kantong donor darah yang berada di PMI Surabaya menggunakan sentrifugasi dengan  kecepatan  antara  200–2300xg  dengan double sentrifugasi  selama  5–15  menit.  Terjadi  peningkatan jumlah  trombosit  tertinggi  pada  sediaan  pada  proses sentrifugasi pertama sebesar 1300xg selama 5 menit dan 2300 xg selama 7 menit untuk sentrifugasi kedua dengan menggunakan Tube–Shaped “I”,  kenaikan  jumlah trombosit  mencapai  4,11  kali  dari  jumlah  sebelum preparasi.
Tabel  4  menunjukan  perbedaan  antara  jumlah leukosit  antara  EDTA  dan  PRP  1,  EDTA  dan  PRP  2 dengan p <0,001,  Tidak  menunjukan  perbedaan  antara PRP  1  dan  PRP  2  dengan p =0,872.  Hal  ini menggambarkan bahwa kualitas PRP 1 dan PRP 2 dinilai dari jumlah leukosit yang tersisa sudah cukup baik, dan dengan  kecepatan  sentrifugasi  yang  berbeda  tidak mempengaruhi  jumlah  leukosit  yang  tersisa  dalam sediaan  PRP.  Leukosit  yang  tersisa  dalam  sediaan trombosit  konsentrat  membawa  dampak  yang merugikan, dapat menurunkan nilai pH, meningkatkan konsumsi  glukosa,  meningkatkan  produksi  laktat  dan
Perbedaan Jumlah Trombosit, Leukosit dan Eritrosit dengan Kecepatan Sentrifugasi yang Berbeda pada Pembuatan Platelet Rich Plasma
11 pelepasan LDH selama masa penyimpanan,  selain itu dapat juga meningkatkan reaksi inflamasi, menyebabkan rasa nyeri pada lokasi injeksi PRP, namun ada beberapa pendapat  yang  mengungkapkan  bahwa  VEGF  dari leukosit  dapat  sebagai  antimikroba  dan  memicu
12 perbaikan jaringan.
Tabel  5  menunjukan  perbedaan  jumlah  eritrosit antara EDTA dan PRP 1, EDTA dan PRP 2, PRP 1 dan PRP 2  dengan p <0,001.  Sisa  jumlah  eritrosit  pada  kedua sediaan  menunjukan  perbedaan,  dengan  kecepatan sentrifugasi yang lebih rendah sisa jumlah eritrosit lebih banyak  dibanding  dengan  kecepatan  sentrifugasi  yang lebih  tinggi,  hal  ini  terjadi  karena  dengan  gaya sentrifugasi  yang  lebih  tinggi  eritrosit  akan  lebih  cepat 11 mengendap.  Penelitian  Raturi et  al ,   mendapatkan jumlah   kontaminasi eritrosit dalam sediaan PRP 0,29 ± 0,20  ml.  Kontaminasi  eritrosit  pada  sediaan  konsentrat trombosit  dapat  membentuk  granul  di  bagian  bawah botol  penampung,  dimana  granul  tersebut  akan menyebabkan  menempelnya  trombosit  dan  leukosit dipermukaan granul tersebut dan dapat mempengaruhi 10 jumlah dan kualitas trombosit konsentrat.
Kelemahan  dari  penelitian  ini  adalah  menilai kualitas  PRP  belum  dari  semua  parameter  indikator mutu,  perlu  dilakukan  penelitian  lanjutan  dengan variabel yang yang lebih lengkap terutama yang menilai fungsi trombosit, kandungan growth factor dan indikator mutu pada pembuatan PRP.

## SIMPULAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan jumlah  trombosit lekosit dan eritrosit dengan kecepatan  sentrifugasi  yang  berbeda  pada  pembuatan platelet  rich  plasma .  Kecepatan  sentrifugasi  yang  rendah (100xg – 400xg selama 10 menit) dapat disarankan dalam pembuatan PRP karena menghasilkan jumlah trombosit yang  lebih  tinggi  dengan,  jumlah  leukosit  yang  sama antara PRP 1 dan PRP 2 sebagai salah satu indikator mutu PRP.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Marx RE, Carlson ER, Eichstaedt RM, Schimmele SR, Strauss JE, Georgeff KR. Platelet–rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 1998;85:638–46.
2. Lee JW, Kwon OH,  Kim TK, Cho YK,  Choi KY, Chung HY, et al . Platelet–Rich Plasma: Quantitative Assessment of Growth Factor  Levels  and  Comparative  Analysis  of  Activated  and Inactivated Groups. Arch Plast Surg. 2013;40:530-5.
3. Khalafi RS, Bradford DW, Wilson MG. Topical application of autologous blood product during surgical closure, folowing a coronary  artery  bypass  graft.  Eur  J  Cardiothorac  Surg. 2008;34:360–4.
4. Budiyanto  A.  Penggunaan  PRP  di  bidang  dermatologi. Bagian/SMF  Ilmu  kesehatan  Kulit  dan  kelamin.  FK UGM/RSUP  Dr.  Sardjito  Yogyakarta.  Available  from  : http://andinanendra.wordpress.com/2011/prp-for-skin- rejuvent
5. Perez AGM, Lana JFSD, Rodrigues AA, Luzo ACM, Belangero WD, Santana MHA. Relevant aspects of centrifugation step in the  preparation  of  platelet  rich  plasma.  Hindawi.  ISRN Hematology. 2014.
6. Kamruzzaman BM, Hasan A , Dhingra N.  Standard Operating Procedures for blood tranfusion, Directorate general of health services  (BANBCT),  Mokhali  Technical  Assistance  by  WHO and  Supported  by  The  OPEC  Fondation  for  International D e v e l o p m e n t ,   2 0 1 3 .   A v a i l a b l e   f r o m www.who.int/bloodsafety/tranfusion_service/sop- bts_bangladesh
7. Plao L, Park H, Jo CH. Theoritical prediction and validation of cell recovery rates in preparing platelet rich plasma through a centrifugation. PLOS ONE. 2017;12(11): 1–25.
8. Kaushansky K, Lichtman MA, Kipps TJ, Prchal JT, Levi MM. Williams Hematology eight edition, 2010.
9. Bausset  O,  Giraudo  L,  Veran  J,  Magalon  J,  Coudreuse  JM, Magalon  G, et  al .  Formulation  and  storage  of  platelet  rich plasma homemade product. BioResearch Open Access, Mary Ann Liebert, Inc. 2012;1(3):115–23.
10. Nugraha HK, Muljanti M, Hernaningsih Y, Nugraha J. Platelet rich plasma protocols : A Preliminary Study. Indonesia journal of tropical and infectious disease. 2012;3(2):104–7
11. Raturi M, Shastry S, Raj P. Cumulative quality asessment for whole Blood–derived platelets : a complience review. Global Journal of Transfusion Medicine. 2017;2:38-43.
12. Satyam  A.  Preparation  and  quality  control  of  autologous platelets  for  therapeutic  applications.  Clinical  Association Departement  of  Tranfusion  Medicine.  BLK  Super  Speciality H o s p i t a l ,   N e w D e l h i .   2 0 1 5 .   A v a i l a b l e   f r o m   : https://www.researchgate.net
Medica Hospitalia | Vol. 7, No. 1, Mei 2020