## CURRENT BIOCHEMISTRY
ISSN: 2355-7877 e-ISSN: 2355-7931 Journal homepage: http://journal.ipb.ac.id/index.php/cbj Journal E-mail: current.biochemistry@gmail.com
Ekstrak dan Fraksi N-heksana Teh Hijau sebagai Antiproliferasi Sel Kanker Payudara MCM-B2 In Vitro
(N-hexane Extract and Fraction of Green Tea as Antiproliferation of MCM-B2 Breast Cancer Cells In Vitro)
Lisni Noraida W 1 , Maria Bintang 1* , Bambang Pontjo P 2
1 Department of Biochemistry, IPB University, Bogor, 16680, Indonesia 2 Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680, Indonesia
Received: 16 October 2018    ; Accepted: 1 July 2019
Corresponding author : Prof. Dr. Drh. Maria Bintang, MS; Departemen Biokimia, Jl. Agatis, Gd. Fapet, Lt. 5, Wing 5, Bogor 16680; Email: maria_bintang@yahoo.com

## ABSTRACT
Green  tea  (Camellia  sinensis)  is  one  of  tradisional  plants  that  have  potential  as  anticancer.  The sample  used  in  this  research  was  commercial  green  tea  extract.  The  purpose  of  this  study  was  to  test  the antiproliferation activity of green tea extract on breast cancer cell MCM-B2 in vitro. Green tea extract was fractionated using three solvents, ie water, ethanol 70%, and n-hexane. Extract and water fraction of green tea have Lethality Concentration 50 (LC 50 ) value of more than 1000 ppm. Fractions of ethanol 70% and n- hexane  had  an  LC 50 value  of  883.48  ppm  and  600.56  ppm,  respectively.  The  results  of  phytochemical screening  of  green  tea  extract  are  flavonoids,  tannins,  and  saponins,  while  the  phytochemical  screening results of n-hexane fraction are flavonoids and tannins. Antiproliferation activity was tested on breast cancer cells MCM-B2 and normal cells Vero by tripan blue staining method. The highest MCM-B2 cell inhibitory activity was achieved at a concentration of 13000 ppm green tea extract and 1000 ppm of n-hexane fraction, 59%  and  59%,  respectively.  The  extract  and  n-hexane  fraction  of  green  tea  are  not  toxic  to  normal  Vero cells characterized by not inhibiting normal cell proliferation.
Keywords: Antiproliferative, Cancer cell MCM-B2, Commercial green tea, Cytotoxicity

## ABSTRAK
Teh  hijau  (Camellia  sinensis)  merupakan  salah  satu  tanaman  tradisional  yang  berpotensi  sebagai antikanker.  Sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  ekstrak  teh  hijau  komersil.  Tujuan penelitian ini adalah menguji aktivitas antiproliferasi ekstrak teh hijau terhadap sel kanker payudara MCM- B2 secara in vitro. Ekstrak teh hijau difraksinasi menggunakan tiga pelarut, yaitu air, etanol 70%, dan n- heksana.  Ekstrak  dan  fraksi  air  teh  hijau  memiliki nilai  Lethality  Concentration 50  (LC 50 )  lebih  dari 1000 ppm. Fraksi etanol 70% dan fraksi n-heksana teh hijau memiliki nilai LC 50 , masing-masing sebesar 883.48 ppm  dan  600.56  ppm.  Hasil  penapisan  fitokimia  ekstrak  teh  hijau  adalah  flavonoid,  tanin,  dan  saponin, sedangkan  hasil  penapisan  fitokimia  fraksi  n-heksana  adalah  flavonoid  dan  tanin.  Aktivitas  antiproliferasi diuji  pada  sel  kanker  payudara  MCM-B2  dan  sel  normal  Vero  dengan  metode  pewarnaan  tripan  biru. Aktivitas  penghambatan sel  MCM-B2 tertinggi  dicapai  pada konsentrasi  13000  ppm  ekstrak teh hijau  dan
1000  ppm  fraksi  n-heksana,  berturut-turut  sebesar  59%  dan  59%.  Ekstrak  dan  fraksi  n-heksana  teh  hijau tidak  bersifat  toksik  terhadap  sel  normal  Vero  yang  ditandai  dengan  tidak  menghambat  proliferasi  sel normal.
Kata kunci : Antiproliferasi, Sel kanker MCM-B2, Sitotoksisitas, Teh hijau komersil

## 1. PENDAHULUAN
Kanker  merupakan  masalah  dalam bidang  kedokteran  yang  ditandai  dengan pembelahan  sel  yang  tidak  terkendali  dan abnormalitas sel akibat mutasi DNA (Setiawan  2015).  Penyakit  kanker  dapat dikatakan  sebagai  salah  satu  penyebab kematian  kedua  setelah  penyakit  jantung koroner  diseluruh  dunia.  Berdasarkan  data WHO  (2015),  diketahui  bahwa  pada  tahun 2012, terdapat sekitar 8.2 juta kematian akibat kanker  diseluruh  dunia.  Jumlah  penderita kanker  di  Indonesia  seiring  bertambahnya waktu menjadi semakin bertambah.
Berdasarkan  hasil  dari  rekapitulasi  deteksi dini pemeriksaan penderita kanker di Indonesia  dari  tahun  2006  sampai  2016 menunjukkan  jumlah  penderita  sebesar  1.9 juta  jiwa  (Kemenkes  RI  2016).  Jenis  kanker yang menyebabkan kematian terbesar disetiap tahunnya  adalah  kanker  payudara,  kanker hati,  kanker  perut,  dan  kanker  kolorektal (Kemenkes RI 2015).
Salah  satu  jenis  kanker  yang  paling ditakuti  terutama  bagi  kaum  wanita,  yaitu kanker payudara. Kanker payudara merupakan tumbuhnya sel-sel  abnormal  yang bersifat proliferatif secara terus-menerus pada jaringan payudara (Wahyuni 2015).
Berdasarkan  rekapitulasi  deteksi  dini  di Indonesia  dari  tahun  2006  sampai  2016, jumlah  penderita  kanker  payudara  adalah sebesar  4  ribu  jiwa  (Kemenkes  RI  2016). Pengobatan  kanker  payudara  yang  dikenal saat ini, yaitu operasi (pembedahan), radioterapi,  dan  kemoterapi.  Pengobatan kanker  dengan  cara  tersebut  memiliki beberapa  kelemahan.  Operasi  pada  umumnya tidak  efektif  untuk  sel  yang  telah  mengalami
metastasis,  radiasi  tidak  efektif  dan  tidak aman  untuk  sel-sel  normal,  sedangkan kemoterapi  belum  memberikan  hasil  yang optimal  karena  kerja  obat  tidak  spesifik  dan relatif mahal (Fadhli et al. 2012).
Obat  kanker  yang  umumnya  digunakan oleh  penderita  kanker  adalah  doksorubisin. Obat  kanker  tersebut  menimbulkan  efek samping  bagi  pemakainya,  seperti  rambut rontok,  bibir  menjadi  kering,  mual,  muntah, dan  gangguan  pada  jantung.  Selain  itu, doksorubisin tergolong obat  hasil sintetis  dan relatif mahal. Berdasarkan hal itu, penggunaan herbal sebagai pengobatan alternatif kanker menjadi semakin meningkat. Bahan  baku  obat-obatan  tradisional  mudah didapat,  aman,  relatif  murah,  dan  efek sampingnya  relatif  lebih  kecil  dibandingkan obat sintesis (Atiqoh et al. 2011).
Salah  satu  tanaman  tradisional  yang memiliki khasiat sebagai antikanker, yaitu teh hijau.  Teh  hijau  adalah  jenis  teh  yang  proses pembuatannya tidak melalui proses fermentasi,  sehingga  warnanya  masih  hijau. Teh  hijau  mengandung  berbagai  komponen kimia,  diantaranya  polifenol,  florida,  vitamin K,  kafein,  dan  mineral.  Senyawa  bioaktif yang  banyak  terdapat  pada  teh  hijau  adalah katekin  (Tohawa  2013).  Katekin  merupakan senyawa golongan flavonoid. Senyawa katekin  yang  tersusun  dalam  teh  hijau, diantaranya  epikatekin  (EC),  epikatekin-3- galat (ECG), epigalokatekin (EGC), epigalokatekin-3-galat
(EGCG), dan galokatekin (GC) (Yuan et al. 2013). Katekin terutama epigalokatekin-3-galat yang terkandung  dalam  teh  hijau  lebih  tinggi  dari pada  jenis  teh  lainnya  (Tohawa  2013). Menurut  Pratiwi  (2017),  melaporkan  bahwa
teh  hijau  memiliki  kandungan  total  fenol tertinggi  sebesar  88.3170  mg  GAE/g  sampel dibandingkan  dengan  teh  hitam  dan  teh rosela,  sehingga  mempunyai  kemampuan bioaktif yang semakin baik.
Teh  hijau  tidak  hanya  berperan  sebagai minuman, melainkan terdapat berbagai penelitian  yang  menyatakan  bahwa  teh  hijau juga mampu meningkatkan kesehatan seseorang (Tohawa 2013). Menurut Purwanto (2011);  Tabaga et  al. (2015),  epigalokatekin- 3-galat  tergolong  jenis  katekin  yang  paling banyak  ditemukan  pada  teh  hijau  dan  dapat menyebabkan  apoptosis  serta  menghentikan siklus  sel  yang  telah  mengalami  kerusakan DNA. Penelitian yang dilakukan Kusmiyati et al. (2015)  dijelaskan  bahwa  teh  hijau mempunyai  aktivitas  antioksidan  tertinggi yang  ditandai  dengan  rendahnya  nilai  IC 50 , yaitu  21.44  µg/mL.  Nilai  IC 50 ( inhibition concentration ) adalah bilangan yang menunjukkan konsentrasi ekstrak yang mampu  menghambat  aktivitas  radikal  bebas sebesar 50% (Tohawa 2012). Nilai  IC 50 yang semakin  kecil  menunjukkan  bahwa  aktivitas antioksidannya  semakin  besar.  Menurut Elsyana  (2015),  adanya  aktivitas  antioksidan diduga  dapat  berperan  dalam  mencegah terjadinya kanker.

## 2. METODOLOGI
Fraksinasi  Ekstrak  Teh  Hijau  Komesil (Firdausi et al. 2015 yang dimodifikasi)
Fraksinasi  ekstrak  teh  hijau  dilakukan dengan  melarutkan  2  gram  ekstrak  teh  hijau komersil  dalam  150  mL  pelarut.  Fraksinasi dilakukan menggunakan tiga pelarut berdasarkan  perbedaan  tingkat  kepolarannya, yaitu air (polar), etanol 70% (semi polar), dan n-heksana (non polar). Pembuatan fraksi  air : n-heksana  dilakukan  dengan  cara,  yaitu sebanyak  2  gram  ekstrak  teh  hijau  dilarutkan dalam  150  mL  akuades  dan  dimasukkan  ke dalam corong pisah 500 mL. Setelah itu, 150
mL  n-heksana  ditambahkan  dan  dicampur sampai homogen. Campuran dikocok perlahan  dan  didiamkan  selama  30  menit hingga terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan air dan  lapisan  n-heksana.  Campuran  dikocok dengan  cara  diputar-putar  secara  horizontal dan sesekali keran corong pisah harus dibuka, sehingga  udara  yang  terperangkap  dapat keluar dan tekanan udara menurun. Fraksi air dan  fraksi  n-heksana  dipisahkan  dan  masing- masing  disimpan  dalam  lemari  pendingin untuk pengujian  selanjutnya.  Fraksinasi ekstrak  teh  hijau  komersil  dalam  air  :  n- heksana  diulang  sebanyak  3  kali.  Pembuatan fraksi etanol 70% : n-heksana dan n-heksana : air  dilakukan  dengan  prosedur  yang  sama seperti  di  atas.  Ketiga  fraksi  yang  diperoleh, yaitu  fraksi  air,  fraksi  etanol  70%,  dan  fraksi n-heksana,  masing-masing  dikumpulkan  dan diuapkan  pelarutnya  dengan  vakum  pan evaporator pada suhu 60 sampai kering.
Uji Sitotoksitas LC 50 Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT) (Meyer et al. 1982) Penetasan Larva Udang.
Larva  udang Artemia  salina Leach sebanyak  10  mg  ditetaskan  terlebih  dahulu dalam  500  mL  air  laut  yang  telah  disaring. Penetesan dilakukan pada suhu kamar dengan diterangi sinar lampu TL 14 watt dan diaerasi selama 48 jam.

## Persiapan Larutan Uji
Larutan  uji  terdiri  atas  ekstrak  teh hijau  komersil,  fraksi  air,  fraksi  etanol  70%, dan  fraksi  n-heksana.  Larutan  stok  masing- masing  fraksi  dibuat  dalam  konsentrasi  2000 ppm,  yaitu  dengan  sebanyak  0.02  g  fraksi dilarutkan  dengan  10  mL  air  laut.  Pengujian fraksi  dilakukan  dengan  konsentrasi  1000, 800, 600, 400, 200, 100, dan 0 ppm.  Larutan stok ekstrak teh hijau dibuat dalam konsentrasi  sesuai  dengan  aturan  pakai  yang tertera  dikemasan  produk  teh  hijau  komersil,
yaitu 13000 ppm. Larutan stok ekstrak 13000 ppm  dibuat  dengan  sebanyak  1.95  g  ekstrak dilarutkan dalam 150 mL air laut. Fraksi yang tidak  larut  dalam  air  ditambahkan  dengan  50 µL  Tween80.  Pengujian  ekstrak  dilakukan dengan  konsentrasi  13000,  10000,  8000, 6000, 4000, 2000, 1000, 500, dan 0 ppm.

## Uji Sitoksisitas
Air  laut  sebanyak  1  mL  yang mengandung larva udang 10 ekor dimasukkan ke  dalam  mikroplat  12  sumuran  dan ditambahkan  1000,  800,  600,  400,  200,  dan 100  µL  larutan  stok  fraksi  (2000  ppm), sedangkan untuk perlakuan ekstrak, ditambahkan 1000 µL dari larutan stok 13000 ppm  dan  diencerin  menjadi  10000,  8000, 6000,  4000,  2000,  1000,  dan  500  ppm. Volume setiap sumuran  dicukupkan hingga 2 mL  dengan  penambahan  air  laut.  Setiap konsentrasi  ekstrak  dan  fraksi  teh  hijau  diuji sebanyak tiga kali ulangan. Inkubasi dilakukan  pada  suhu  kamar  di  bawah  sinar lampu  TL  14  watt.  Setelah  24  jam,  jumlah larva  udang  yang  mati  untuk  tiap-tiap konsentrasi  dihitung  dan  dicatat.  Kontrol  (0 ppm)  dilakukan  dengan  prosedur  yang  sama tanpa  penambahan  ekstrak  dan  fraksi  teh hijau. Nilai LC 50 ditentukan dengan menggunakan analisis probit program SPSS. Uji Fitokimia (Harbone 2007 yang dimodifikasi) Uji Flavonoid
Ekstrak dan fraksi n-heksana teh hijau komersil  ditimbang  sebanyak  0.1  g  ditambah 5  mL  metanol,  lalu  dipanaskan  pada  suhu 50 .  Filtrat  dipisahkan  dan  ditambahkan H 2 SO 4 pekat.  Terbentuknya  warna  merah yang  terbentuk  akibat  penambahan  H 2 SO 4 pekat menunjukkan adanya senyawa flavonoid.

## Uji Alkaloid
Ekstrak dan fraksi n-heksana teh hijau komersil  sebanyak  0.1  g  dimasukkan  ke dalam  tabung  reaksi,  lalu  ditambahkan  5  mL kloroform  dan  5  tetes  amoniak.  Fraksi kloroform dipisahkan lalu ditambahkan dengan  H 2 SO 4 2  M  sebanyak  1.5  mL. Kemudian,  fraksi  H 2 SO 4 diambil,  lalu  dibagi ke  dalam  tiga  tabung.  Tabung  pertama ditambahkan  dengan  pereaksi  Dragendrof, tabung  kedua  dengan  pereaksi  Meyer,  dan tabung  ketiga  dengan  pereaksi  Wagner. Alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan  putih  pada  pereaksi  Meyer,  endapan merah  pada  pereaksi  Dragendrof,  dan endapan coklat pada pereaksi Wagner.
Uji  Tanin. Ekstrak  dan  fraksi  n-heksana  teh hijau  komersil  sebanyak  0.05  gram  ditambah dengan  air  sebanyak  2.5  mL,  kemudian didihkan  pada  suhu  100 selama  5  menit. Larutan  tersebut  ditambah  dengan  1  tetes FeCl 3 . Tanin ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru atau hijau kehitaman.
Uji  Saponin. Ekstrak  dan  fraksi  n-heksana teh hijau sebanyak 0.05  gram  dimasukkan ke dalam  tabung  reaksi,  lalu  ditambahkan  2.5 mL akuades. Kemudian, didihkan pada 100 selama  5  menit  dan  kocok  hingga  berbusa. Saponin  ditandai  dengan  terbentuknya  busa yang stabil selama 15 menit.

## Uji Steroid dan Triterpenoid
Ekstrak dan fraksi n-heksana teh hijau komersil sebanyak 0.1 gram ditambah dengan 5 mL etanol 70%, kemudian dipanaskan, lalu disaring.  Filtrat  diuapkan  dan  ditambahkan dengan  dietileter  hingga  larut.  Fraksi  dietil eter  diambil  dan  ditambahkan  dengan pereaksi  Lieberman-Burchard  (3  tetes  asam asetat  anhidrat  dan  1  tetes  H 2 SO 4 pekat). Steroid  ditunjukkan  dengan  terbentuknya
warna biru  atau hijau, sedangkan triterpenoid ditunjukkan  dengan  terbentuknya  warna merah atau ungu.
Pengujian  Aktivitas  Ekstrak  dan  Fraksi Teh  Hijau  Komersil  pada  Sel  Kanker In Vitro (Priosoeryanto et al. 1995).

## Persiapan Media Sel Kanker
Sel  lestari  kanker  MCM-B2  dan  sel normal  Vero  dikultur  menggunakan  media pertumbuhan DMEM sebanyak 800 µL dalam mikroplat  24  sumuran.  Media  disetiap sumuran  ditambahkan  antibiotik  (penisilin- streptomisin)  50  µL,  fungizon  50  µL,  dan serum  (FCS)  50  µL,  serta  ekstrak  dan  fraksi teh  hijau  komersil  sebanyak  50  µL.  Fraksi yang  digunakan  adalah  fraksi  yang  bersifat toksik  berdasarkan  uji  toksisitas  dengan BSLT,  yaitu  fraksi  n-heksana.  Sampel  lain yang  diuji  antiproliferasinya  adalah  ekstrak teh hijau komersil.
Perlakuan  Ekstrak. Sel  kanker  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  sel MCM-B2,  sedangkan  sel  normal  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  sel Vero.  Suspensi  sel  kanker  dan  sel  normal dalam  ampul  ( cryovial )  dicairkan  ( thawing ), lalu  dihomogenkan  dengan  vorteks.  Suspensi sel  (7×10 6 sel/mL)  dimasukkan  ke  dalam sumur-sumur  mikroplat sebanyak  50  µL. Tiap-tiap sumur telah berisi media bersuplemen,  ekstrak,  dan  fraksi  n-heksana dari  teh  hijau  komersil.  Kontrol  positif  yang digunakan  adalah  doksorubisin  100  µg/mL, sedangkan  kontrol  negatif  hanya  berisi suspensi sel dan media dengan prosedur yang sama.  Volume  total  setiap  sumuran  adalah  1 mL.  Semua  perlakuan  dilakukan  dalam  tiga kali  ulangan.  Kultur  sel  kanker  diinkubasi pada inkubator dengan kondisi 5% CO 2 , 37 selama 3 hari.

## Pemanenan dan Penghitungan Sel
Sel dipanen setelah 3 hari, yaitu ketika pertumbuhan  sel  dikontrol  negatif  telah menutupi  sekitar  70%  permukaan  sumuran (konfluen).  Sel  kanker  dan  sel  normal sebanyak  80  µL  dimasukkan  ke  dalam sumuran  mikroplat  yang  telah  berisi  20  µL pewarna tripan biru , kemudian dihomogenkan.  Sel  dipipet  sebanyak  80  µL dan  diteteskan  pada chamber hemasitometer ditutup  dengan cover  slip .  Sel  dihitung menggunakan  mikroskop  cahaya  dengan perbesaran 100x. Sel yang dihitung adalah sel yang  berada  pada  kotak  tengah  kamar  dan dihitung baik sel yang mati (biru) maupun sel hidup  (bening),  yang  disebut  total  sel.    Hasil perhitungan  sel  dikonversikan  ke  dalam jumlah  sel  per  mL  suspensi  dan  persentase dari  data  yang  diperoleh  dengan  menghitung jumlah  sel  yang  hidup  dan  mati,  dihitung dengan persamaan berikut.
Proliferasi (%)
Aktivitas penghambatan (%) = 100% - (% Proliferasi)

## 3. HASIL

## Rendemen Fraksi dari Ekstrak Teh Hijau Komersil
Fraksinasi  sampel  dengan  pelarut  air menghasilkan  rendemen  fraksi  yang  paling tinggi  dibandingkan  dengan  pelarut  etanol 70%  dan  n-heksana,  yaitu  sebesar  93.74% (Tabel  1).  Fraksinasi  ekstrak  teh  hijau komersil  dengan  air,  etanol  70%,  dan  n- heksana, masing-masing menghasilkan rendemen secara berturut-turut adalah 93.74%, 5.91%, dan 3.47% (Tabel 1).
Tabel 1. Rendemen hasil fraksinasi teh hijau komersil Sampel Rendemen (%) Fraksi air 93.74 Fraksi etanol 70% 5.91 Fraksi n-heksana 3.47

## Sitotoksisitas  Ekstrak dan Fraksi  dari  Teh Hijau Komersil
Larutan  uji  yang  digunakan  dalam  uji sitotoksisitas  terhadap  larva  udang  adalah ekstrak  teh  hijau  komersil,  fraksi  air,  fraksi etanol 70%, dan fraksi n-heksana. Ekstrak teh hijau  komersil  dan  fraksi  air  memiliki  nilai Lethal  Concentration 50  (LC 50 )  lebih  besar dari  1000  ppm,  masing-masing  adalah 14330.31  ppm  dan  1415.60  ppm  (Tabel    2). Ekstrak teh hijau komersil dan fraksi air tidak bersifat  toksik.  Fraksi  n-heksana  dan  fraksi etanol  70%  mampu  mematikan  larva  udang ditandai  dengan  memiliki  nilai  LC 50 lebih kecil  dari  1000  ppm,  masing-masing  adalah 600.53 ppm dan 883.48 ppm (Tabel 2). Fraksi n-heksana  memiliki  nilai  LC 50 yang  lebih kecil dibandingkan dengan fraksi etanol 70%, sehingga  fraksi  n-heksana  tergolong  lebih toksik  dibandingkan  dengan  fraksi  etanol 70%. Nilai LC 50 ditentukan dengan menggunakan analisis probit program SPSS. Tabel 2. Nilai LC 50 ekstrak dan fraksi teh hijau komersil
Sampel LC 50 Ekstrak teh hijau komersil 14330.31 Fraksi air 1415.60 Fraksi etanol 70% 883.48 Fraksi n-heksana 600.53
Komponen  Fitokimia  Ekstrak  dan  Fraksi n-heksana Teh Hijau Komersil
Sampel  yang  akan  diuji  komponen fitokimia adalah sampel yang tergolong toksik berdasarkan  uji  sitotoksisitas  dengan  BSLT. Sampel yang tergolong toksik, yaitu fraksi n- heksana.  Fraksi  n-heksana  memiliki  tingkat toksisitas yang lebih baik dibandingkan fraksi air  dan  fraksi  etanol  70%.  Ekstrak  teh  hijau komersil  tergolong  tidak  toksik  berdasarkan metode BSLT, namun dilakukan uji fitokimianya  karena  secara  empiris  tergolong minuman kesehatan antikanker yang umumnya  diminum  oleh  konsumen.  Ekstrak teh  hijau  komersil  menunjukkan  hasil  positif
terhadap  flavonoid,  saponin,  dan  tanin  serta negatif  terhadap  alkaloid,  steroid,  dan triterpenoid.  Fraksi  n-heksana  menunjukkan hasil positif terhadap flavonoid dan tanin serta negatif  terhadap  saponin, steroid, dan triterpenoid.  Hasil  uji  kualitatif  kandungan fitokimia  ekstrak  dan  fraksi  n-heksana  dari teh hijau dapat dilihat pada Tabel 3.

## Aktivitas  Antiproliferasi  Ekstrak  dan Fraksi n-heksana Teh Hijau Komersil
Pengujian  aktivitas  antiproliferasi  dilakukan dengan  menggunakan  sampel  yang  bersifat toksik  berdasarkan  uji  sitotoksisitas  dengan BSLT.
Tabel 3. Hasil uji kualitatif komponen fitokimia ekstrak dan fraksi n-heksana teh hijau
komersil Komponen fitokimia Ekstrak teh hijau komersil Fraksi n- heksana Flavonoid + + Alkaloid - - Saponin + - Tanin + + Steroid - - triterpenoid - - Keterangan : (+) : Mengandung metabolit sekunder (-)  : Tidak mengandung metabolit sekunder Sampel yang bersifat toksik berdasarkan  metode  BSLT,  yaitu  fraksi  n- heksana.  Selain  itu,  sampel  yang  akan  diuji aktivitas  antiproliferasinya  adalah  ekstrak  teh hijau  komersil  sebagai  minuman  kesehatan antikanker.  Hasil  penelitian  secara  umum menunjukkan  bahwa  ekstrak  dan  fraksi  n- heksana  teh  hijau  komersil  secara  nyata (p<0.05)  mampu  menurunkan  pertumbuhan sel  kanker  MCM-B2.  Pengaruh  pemberian ekstrak  dan  fraksi  n-heksana  teh  hijau komersil  terhadap  pertumbuhan  sel  kanker MCM-B2 ditunjukkan pada Gambar 3.
Aktivitas  penghambatan  pada  sel kanker  MCM-B2  dengan  pemberian  ekstrak teh  hijau  komersil  konsentrasi  13000,  10000, 8000,  6000,  4000,  dan  2000  ppm  tampak
tidak  berbeda  nyata.  Demikian  juga  aktivitas penghambatan  pada  sel  kanker  MCM-B2 dengan pemberian fraksi n-heksana konsentrasi 1000, 800, 600, 400, dan 200 ppm tampak  tidak  berbeda  nyata.  Aktivitas penghambatan  sel  kanker  MCM-B2  dengan pemberian  ekstrak  dan  fraksi  n-heksana  teh hijau  komersil  tampak  berbeda  nyata  dengan kontrol negatif.
Aktivitas  penghambatan  terhadap  sel kanker  MCM-B2  meningkat  seiring  dengan peningkatan konsentrasi  ekstrak dan fraksi  n- heksana  yang  digunakan.  Ekstrak  teh  hijau komersil  dengan  konsentrasi  13000  ppm mampu menghambat pertumbuhan sel kanker MCM-B2  paling  tinggi  dibandingkan  dengan konsentrasi  lainnya,  yaitu  sebesar  58.64% (Gambar 1). Konsentrasi 13000 ppm merupakan
perhitungan konsentrasi berdasarkan  aturan  pakai  dari  minuman kesehatan  antikanker  ekstrak  teh  hijau komersil.  Fraksi  n-heksana  teh  hijau  juga mampu  menghambat  sel  kanker  MCM-B2 paling  tinggi,  yaitu  dengan  konsentrasi  1000
ppm  sebesar  59.01%  (Gambar  1).  Aktivitas penghambatan  ekstrak  dan  fraksi  n-heksana terhadap  sel  kanker  MCM-B2  lebih  baik dibandingkan dengan kontrol positif (doksorubisin).

## 4. PEMBAHASAN

## Rendemen Fraksi dari Ekstrak Teh Hijau Komersil
Fraksinasi  ekstrak  teh  hijau  komersil dilakukan  dengan  menggunakan  tiga  pelarut yang berbeda tingkat kepolarannya, diantaranya  air,  etanol  70%,  dan  n-heksana. Fraksinasi  bertujuan  memisahkan  senyawa berdasarkan  perbedaan  kepolarannya  (Kantor et  al. 2015).  Fraksinasi  ekstrak  teh  hijau komersil  dengan  air,  etanol  70%,  dan  n- heksana, masing-masing menghasilkan rendemen secara berturut-turut adalah 93.74%, 5.91%, dan 3.47% (Tabel 1).
Fraksi  air  menghasilkan  rendemen paling  tinggi,  diikuti  fraksi  etanol  70%  dan fraksi n-heksana (Tabel 1).
Gambar 1. Aktivitas penghambatan sel kanker MCM-B2 setelah pemberian ekstrak dan fraksi n- heksana teh hijau komersil
Keterangan : Huruf superscript yang sama menunjukkan perbedaan tidak nyata pada taraf uji 5%  uji Duncan
Tabel 4. Aktivitas penghambatan sel normal Vero setelah pemberian ekstrak dan fraksi n-heksana teh hijau
Ekstrak teh hijau Fraksi n-heksana Konsentrasi (ppm) Aktivitas penghambatan (%) Konsentrasi (ppm) Aktivitas penghambatan (%) Kontrol negatif 0 a Kontrol negatif 0 a Dox (100 ppm) 35.38 b Dox (100 ppm) 35.38 b 2000 0.64 a 400 1.21 a 13000 1.82 a 600 2.42 a 800 3.64 a 1000 6.06 a
Keterangan : Huruf superscript yang sama menunjukkan perbedaan tidak nyata pada taraf uji 5% uji Duncan
Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kandungan fitokimia  dalam  ekstrak  teh  hijau  bersifat polar  (Elsyana  2015).  Berdasarkan  penelitian Wijayanto  (2013),  nilai  rendemen  fraksi paling  yang  tinggi  menunjukkan  semakin banyak senyawa yang terfraksi dalam sampel. Menurut  Brown et  al. (2015),  semakin  tinggi indeks kepolaran suatu pelarut, maka sifatnya semakin  polar.  Berdasarkan  literatur,  indeks kepolaran  air,  etanol  70%,  dan  n-heksana berturut-turut adalah 9.0, 5.2, dan 0.1 (Brown et  al. 2015;  Padmasari et  al. 2013).  Tinggi rendahnya persentase rendemen fraksi disebabkan  oleh  perbedaan  tingkat  kepolaran pelarut.  Air  tergolong  pelarut  dengan  tingkat kepolaran yang tinggi, sehingga menghasilkan rendemen fraksi yang paling tinggi. Rendemen  pada  etanol  70%  lebih  kecil dibandingkan  air,  namun  lebih  besar  dari pelarut  n-heksana,  hal  ini  diduga  sifat kepolaran    etanol  70%  yang  terdiri  atas  30% air,  sehingga  tidak  dapat  memfraksi  senyawa yang  terkandung  dalam  ekstrak  teh  hijau komersil  dalam  jumlah  yang  banyak.  Nilai rendemen  yang  terkecil  terdapat  pada  fraksi n-heksana,  hal  ini  menunjukkan  bahwa senyawa bioaktif yang bersifat non polar pada sampel  ekstrak  teh  hijau  komersil  jumlahnya sedikit (Brown et al. 2015).
Sitotoksisitas Ekstrak dan Fraksi n- heksana Teh Hijau Komersil
Metode  BSLT  ( brine  shrimp  lethality test )  merupakan  uji  pendahuluan  untuk menentukan  kadar  toksisitas  dan  aktivitas farmakologis suatu bahan alam serta praskrining  terhadap  senyawa-senyawa  yang berpotensi  sebagai  antikanker.  Kelebihan metode  BSLT,  yaitu  waktu  ujinya  cepat, pengerjaannya  mudah  dan  sederhana,  biaya relatif  murah,  tidak  memerlukan  teknik aseptik,  dan  memerlukan  sedikit  sampel (Agustini 2017).
Hewan  uji  yang  digunakan  dalam metode  BSLT  adalah  larva  udang Artemia salina Leach. Artemia salina Leach digunakan  sebagai  hewan  uji  karena  dapat bertahan pada kondisi kering, dapat disimpan dalam  waktu  yang  lama,  memiliki  membran yang  tipis  dan  analogi  dengan  membran  sel tipis  untuk  mengukur  efek  toksisitas  suatu bahan, serta proses penetasan larva berlangsung dalam waktu yang cepat, yaitu 48 jam. Proses penetasan udang dipengaruhi oleh beberapa  faktor,  diantaranya  suhu,  aerasi, cahaya,  dan  kadar  garam  (Agustini  2012). Menurut Agustini (2017), penggunaan Artemia  salina L.  sebagai  hewan  uji  karena identik  dengan  sel  kanker,  sehingga  apabila suatu  ekstrak  yang  digunakan  memiliki aktivitas  yang  tinggi,  maka  ekstrak  tersebut dapat  berpotensi  sebagai  obat  di  masa  yang akan  datang.  Hewan  uji  yang  digunakan dalam  penelitian  berumur  2  hari  (48  jam) karena  larva  berada  dalam  keadaan  yang
mana  dinding  selnya  masih  kondisi  lunak, sehingga ekstrak yang diujikan dapat menimbulkan efek yang diinginkan (Rizqiyah 2014).
Pengujian sitotoksisitas dilakukan untuk mendapatkan  persen  data  kematian  yang dinyatakan  dalam Lethality  concentration 50 (LC 50 ).  LC 50 merupakan  konsentrasi  yang dapat  mematikan  50%  populasi  larva  udang. Nilai LC 50 yang semakin rendah mengindikasikan bahwa suatu ekstrak tersebut  semakin  tinggi  toksisitasnya  dan berpotensi  membunuh  sel  kanker  (Elsyana 2015). Berdasarkan indeks toksisitas Meyer et al. (1982),  suatu  ekstrak  menunjukkan aktivitas ketoksikannya apabila dapat menyebabkan  kematian  50%  hewan  uji dengan  nilai  LC 50 <  1000  ppm,  sedangkan ekstrak dengan nilai LC 50 > 1000 ppm disebut tidak  toksik.  Menurut  Mentor et  al. (2014), ekstrak  dengan  nilai  LC 50 500  >  1000  ppm, disebut toksisitas rendah, ekstrak dengan nilai LC 50 100  >  500,  disebut  toksisitas  menengah, dan  ekstrak  dengan  nilai  LC 50 0  <  100  ppm, disebut sangat toksik.
Berdasarkan  analisis  probit,  ekstrak  teh hijau  komersil  dan  fraksi  air  tidak  bersifat toksik  dengan  nilai  LC 50 di  atas  1000  ppm (Tabel 2). Hal ini mengindikasikan kemampuan  bioaktivitas  ekstrak  teh  hijau komersil  dan  fraksi  air  rendah  dan  diduga tidak  adanya  kerja  sama  yang  sinergis  antara metabolit  sekunder  yang  terdapat  dalam ekstrak  dan  fraksi  air  teh  hijau  komersil, sehingga  toksisitasnya  sangat  kecil  (Pasilala et  al .  2016).  Fraksi  etanol  70%  dan  fraksi  n- heksana memiliki tingkat toksisitas yang baik dibandingkan  ekstrak  dan  fraksi  air  teh  hijau (Tabel  2).  Hal  ini  ditandai  dengan  nilai  LC 50 dibawah  1000  ppm,  sehingga  mampu mematikan  setengah  populasi  larva.  Namun, fraksi  n-heksana  memiliki  nilai  LC 50 yang lebih  kecil  dari  fraksi  etanol  70%,  sehingga dapat  dikatakan  bioaktivitas  fraksi  n-heksana
lebih  aktif  dibandingkan  fraksi  etanol  70%. Indeks toksisitas fraksi n-heksana berdasarkan Mentor et  al. (2014)  tergolong  toksisitas rendah,  namun  mampu  membunuh  setengah populasi  larva  dibawah  konsentrasi  1000 ppm,  sehingga  dapat  dikatakan  berpotensi sebagai antikanker.
Kematian larva udang tersebut berkaitan  dengan  kandungan  fitokimia  yang dimilikinya.  Flavonoid  yang  terkandung dalam  fraksi  teh  hijau  berpotensi  sebagai penyebab  kematian Artemia  salina L. Senyawa  flavonoid  dapat  bertindak  sebagai racun  perut  yang  akan  mengganggu  alat pencernaan  larva  dan  juga  menghambat reseptor perasa pada daerah mulut larva. Oleh karena itu, larva  gagal  mendapatkan stimulus rasa yang membuatnya tidak mampu mengenali  makanannya,  sehingga  larva  mati kelaparan (Dapas et al. 2014).

## Komponen Fitokimia Ekstrak dan Fraksi n-heksana Teh Hijau Komersil
Sampel  yang  diuji  fitokimianya  pada penelitian ini, yaitu berdasarkan uji sitotoksisitas  dengan  BSLT.  Sampel  yang tergolong lebih toksik, yaitu fraksi n-heksana. Ekstrak  teh  hijau  komersil  bersifat  tidak toksik,  namun  dilakukan  uji  fitokimianya karena secara empiris tergolong produk herbal antikanker  yang  dikonsumsi  saat  ini  oleh penderita kanker maupun yang tidak menderita  kanker.  Uji  fitokimia  bertujuan mendeteksi senyawa-senyawa metabolit sekunder yang akan berperan dalam pengujian aktivitas  antikanker.  Hasil  uji  fitokimia  dari ekstrak  teh  hijau  komersil  memberikan  hasil uji  positif  terhadap  flavonoid,  tanin,  dan saponin  (Tabel  3).  Hal  ini  menunjukkan bahwa  ekstrak  teh  hijau  komersil  yang digunakan dalam penelitian ini tidak mengandung  senyawa  alkaloid,  steroid,  dan triterpenoid.  Hasil  uji  fitokimia  dari  fraksi  n-
heksana  teh  hijau  memberikan  hasil  positif terhadap flavonoid dan tanin (Tabel 3).
Penelitian  Andaryekti et  al. (2015), melaporkan  bahwa  ekstrak  teh  hijau  etanol 70%  memberikan  hasil  positif  terhadap flavonoid,  alkaloid,  saponin,  dan  tanin.  Hasil berbeda  juga  dilaporkan  oleh  Ardiansyah et al. (2015),  melaporkan  bahwa  ekstrak  air daun  teh  hijau  memberikan  hasil  positif terhadap  flavonoid  dan  tanin,  sedangkan fraksi  n-heksana  memberikan  hasil  positif terhadap  flavonoid.  Hasil  uji  fitokimia  dari fraksi  n-heksana  teh  hijau  memberikan  hasil positif terhadap flavonoid dan tanin. Menurut Marvibaigi et  al. (2014),  tanaman  dengan spesies sama mengandung metabolit sekunder yang  bervariasi  karena  tergantung  dari  jenis tanaman inang dan lokasi tempat tumbuhnya. Artanti et  al. (2012),  menunjukkan  bahwa kandungan fitokimia teh hijau dapat ditentukan berdasarkan pelarut yang digunakan  pada  saat  ekstraksi.  Berdasarkan penelitian  Elsyana  (2015),  juga  melaporkan bahwa  kandungan  fitokimia  yang  terdapat pada  masing-masing  sampel  tergantung  dari kepolaran pelarut yang digunakan.

## Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak dan Fraksi n-heksana Teh Hijau Komersil
Aktivitas  antiproliferasi  ekstrak  dan fraksi n-heksana teh hijau komersil diuji pada sel  kanker  payudara  (MCM-B2)  dan  sel normal  (sel  Vero).  Sel  MCM-B2  merupakan sel kanker yang diisolasi dari payudara anjing. Sel  Vero  sering  digunakan  dalam  berbagai penelitian  untuk  mempelajari  pertumbuhan sel,  diferensiasi  sel,  sitotoksisitas,  dan transformasi sel  yang diinduksi oleh berbagai senyawa  kimia.  Selain  itu,  sel  ini  juga direkomendasikan  sebagai  sel  model  dalam mempelajari  karsinogenesis  secara in  vitro (Senthilraja dan Kathiresan 2015).
Aktivitas  antiproliferasi  ekstrak  dan fraksi  n-heksana  teh  hijau  diuji  dengan
pewarnaan  tripan  biru.  Prinsip  pewarnaan dengan tripan biru adalah sel  yang telah mati akan  terlihat  berwarna  biru  akibat  terjadinya lisis,  sehingga  protein  dalam  plasmanya berikatan dengan tripan biru. Metode pewarnaan  tripan  biru  dapat  membedakan antara sel hidup dan sel  mati. Sel  yang hidup akan tampak membulat, berwarna bening, dan bentuknya  masih  utuh,  sehingga  tripan  biru tidak dapat masuk ke dalam sel. Sel yang mati memiliki  bentuk  yang  sudah  tidak  beraturan akibat  telah  mengalami  lisis  dan  nekrosis, berwarna biru tua, dan ukurannya lebih besar dari pada sel hidup. Perhitungan sel dilakukan dengan  menghitung  jumlah  yang  masih  ada baik  sel  hidup  maupun  sel  mati  ketika  diberi ekstrak  dan  dibandingkan  dengan  kontrol negatif  yang  tidak  diberi  ekstrak.  Sel  hidup dan  sel  mati  diamati  di  bawah  mikroskop menggunakan  hemasitometer  (Djajanegara dan Wahyudi 2009).
Ekstrak teh hijau komersil tidak bersifat toksik terhadap Artemia salina namun mampu menghambat  proliferasi  sel  kanker.  Menurut Priosoeryanto et al. (1995), sel kanker MCM- B2 tergolong tipe sel yang belum terdiferensiasi  karena  berasal  dari  sel  induk atau sel atipikal, sehingga apabila pertumbuhan selnya diganggu dengan pemberian  ekstrak  teh  hijau  komersil,  maka menyebabkan  banyak  sel  terhambat  aktivitas proliferasinya. Artemia salina yang digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  berumur  48  jam, pada  umur  ini  anggota  tubuh  larva  sudah lengkap dan telah memiliki saluran pencernaan  yang  sempurna,  sehingga  dengan penambahan  ekstrak  teh  hijau  komersil  tidak mampu  membunuh  setengah  populasi  larva, melainkan hanya mampu membunuh beberapa ekor larva saja (Muaja et al. 2013). Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa pemberian  ekstrak  teh  hijau  dan  fraksi  n- heksana  secara  nyata  (p<0.05)  mampu menurunkan pertumbuhan sel kanker
payudara  (MCM-B2)  dan  tidak  membunuh sel normal (sel Vero). Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan  bahwa  aktivitas  penghambatan pada  sel  kanker  MCM-B2  dengan  pemberian ekstrak  teh  hijau  konsentrasi  13000,  10000, 8000,  6000,  4000,  dan  2000  ppm  tampak tidak  berbeda  nyata  (Gambar  1).  Aktivitas penghambatan  yang  tidak  berbeda  nyata  juga ditunjukkan  oleh  pemberian  fraksi  n-heksana konsentrasi 1000, 800, 600, 400, dan 200 ppm (Gambar  1).  Hasil  tersebut  menunjukkan bahwa  ekstrak  dan  fraksi  n-heksana  teh  hijau memiliki  aktivitas  penghambatan  sel  kanker yang  hampir  sama  pada  setiap  konsentrasi yang  digunakan.  Aktivitas  penghambatan ekstrak  dan  fraksi  n-heksana  teh  hijau semakin meningkat seiring dengan konsentrasi yang digunakan.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak dan fraksi n-heksana teh hijau dengan konsentrasi  masing-masing,  yaitu  13000  ppm dan  1000  ppm  dapat  menekan  pertumbuhan sel  kanker  tertinggi  secara  berturut-turut, yaitu 58.64% dan 59.01% (Gambar 1). Fraksi n-heksana  mencapai  aktivitas  penghambatan sel  kanker  yang  tinggi  dengan  konsentrasi yang  lebih  rendah  dibandingkan  dengan ekstrak  teh  hijau  komersil.  Rismana et  al. (2013)  menjelaskan  bahwa  fraksi  memiliki kualitas lebih murni dan penggunaannya lebih mudah  karena  telah  dilakukan  pemisahan senyawa  berdasarkan  tingkat  kepolarannya, sehingga  meningkatkan  kandungan  senyawa yang diinginkan dan menghilangkan senyawa yang  tidak  diinginkan.  Ekstrak  memiliki senyawa  aktif  yang  masih  tergolong  kasar karena bercampur dengan senyawa lain akibat tidak melalui proses pemisahan senyawa.
Ekstrak  dan  fraksi  n-heksana  teh  hijau komersil dapat menghambat proliferasi kanker  karena  adanya  katekin  terutama epigalokatekin-3-galat.  Katekin  merupakan golongan flavonoid yang memodulasi berbagai gen yang terlibat dalam
perkembangan  dan  proses  terjadinya  kanker. Komponen fenolik di dalam teh hijau terdapat sekitar  30-42%  dari  berat  kering  dan epigalokatekin-3-galat (EGCG) tergolong senyawa  katekin  yang  melimpah  sekitar  50- 80% dari total katekin (Rahmani et al. 2015).
Ekstrak  dan  fraksi  n-heksana  teh  hijau juga  diuji  antiproliferasinya  pada  sel  normal Vero.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa aktivitas  penghambatan  ekstrak  teh  hijau komersil  terhadap  sel  Vero  menurun  pada konsentrasi  13000  ppm  dan  2000  ppm, masing-masing  sebesar  1.82%  dan  0.64% (Tabel 4). Fraksi n-heksana juga menunjukkan bahwa aktivitas
penghambatannya terhadap sel Vero menurun pada  konsentrasi  1000  ppm  dan  200  ppm, masing-masing  sebesar  6.06%  dan  1.21% (Tabel 4). Hasil penelitian tersebut mengindikasikan bahwa  ekstrak dan fraksi  n- heksana tidak memiliki efek toksik dan relatif aman  terhadap  sel  normal  karena  senyawa flavonoid yang terkandung didalamnya.
Berdasarkan penelitian Mustariani (2011), melaporkan bahwa suatu ekstrak atau fraksi tidak memiliki efek toksik terhadap sel normal apabila hanya menghambat proliferasi sel  sebesar  19.77%.  Selain  itu,  Ren et  al. (2003),  menjelaskan  bahwa  flavonoid  dapat menginduksi  apoptosis  pada  beberapa  jenis sel  kanker  tanpa  mengganggu  aktivitas proliferasi  sel  normal  karena  bekerja  secara selektif hanya pada kanker saja. Doksorubisin sebagai  obat  sintetis  kanker  menghambat aktivitas  sel  normal  Vero  sebesar  35.38%, melebihi  batas  hambat  proliferasi  sel  normal. Hal  ini  disebabkan  oleh  gugus  kuinon  yang mampu menghasilkan radikal bebas baik pada sel  normal  maupun  pada  sel  kanker  (Hatim 2012).
Mekanisme teh hijau dalam menghambat  pertumbuhan  kanker  terdiri  atas 4  tahapan.  Tahap  pertama,  yaitu  teh  hijau bertindak  sebagai  inhibitor  siklooksigenase,
lipoksigenase, faktor nekrosis tumor, dan jalur interleukin  yang  pada  akhirnya  mengontrol perkembangan  dan  proses  pembentukan kanker.  Tahap  kedua,  yaitu  teh  hijau menunjukkan  efek  kemopreventif  melalui aktivasi  gen  penekan  tumor,  seperti  p53  dan PTEN/p21, regulasi apoptosis (bcl2/Bax), dan menghambat angiogenesis serta faktor transkripsi  lainnya  yang  terlibat  dalam perkembangan kanker. Tahap ketiga, yaitu teh hijau berperan menetralisasi radikal bebas dan perusakan  makromolekul  yang  dinetralisir oleh  kapasitas  antioksidan  yang  tinggi  yang pada  akhirnya  mencegah  patogenesis  tumor. Tahap  keempat,  yaitu  mekanisme  yang  lain dari teh hijau dalam mencegah kanker melalui modulasi  gen  yang  terlibat  dalam  inisiasi, promosi, dan perkembangan kanker (Rahmani et al. 2015).
Ekstrak dan fraksi n-heksana teh hijau komersil mengandung flavonoid yang dapat menghambat  proliferasi  sel  kanker  payudara dan  tidak  memiliki  efek  toksik  terhadap  sel normal  secara in  vitro . Penelitian lebih lanjut mengenai pengujian antiproliferasi ekstrak teh hijau  secara in  vivo ,  identifikasi  senyawa antikanker, dan pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak teh hijau komersil sebagai obat  antikanker  komersil  perlu  dilakukan untuk menambahkan informasi tentang kemampuan bioaktivitas ekstrak teh hijau.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  Pembimbing  Skripsi  saya  Prof.  Dr. Drh.  Maria  Bintang,  MS  dan  Prof.  Drh. Bambang  Pontjo  P,  MS,  PhD,  APVet, DACCM,  yang  telah  membantu  dalam mendanai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[WHO]  World  Health  Organization.  2015. Prevalence of cancer worldwide [Internet].  [diunduh  25  Januari  2018].
Tersedia
pada
http://www.who.int/mediacentre/factshe ets/fs297/en/.
Agustini  NWS.  2012.  Aktivitas  antioksidan dan  uji  toksisitas  hayati  pigmen fikobiliprotein  dari  ekstrak Spirulina platensis . Proceeding Biology
Education Conference. 9(1):2528-5742.
Agustini  NWS.  2017.  Identifikasi  senyawa aktif  dan  toksisitas  hayati  ekstrak  n- heksana, etil asetat, dan etanol mikroalga Tetraselmis  chuii secara brine  shrimp  lethality  test  (BSLT).
Warta IHP . 34(1):8-17.
Andaryekti  R,  Mufrod,  Munisih  S.  2015. Pengaruh  basis  gel  sediaan  masker ekstrak  daun  teh  hijau  ( Camellia sinensis Linn)  pada  karakteristik  fisik dan aktivitas antibakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923. Majalah Farmaseutik . 11(2):294-299.
Ardiansyah  SA,  Adirestuti  P,  Desmiaty  Y. 2015.  Pengujian  ekstrak  air  dan  fraksi- fraksi daun teh hijau ( Camellia sinensis (L.)  Kuntze)  terhadap  aktivitas  bakteri penyebab  jerawat  ( Propionibacterium acnes dan Staphylococcus  aureus ). JSTFI . 4(1):28-35.
Artanti N, Firmansyah T, Darmawan A. 2012. Bioactivities  evaluation  of  indonesian mistletoes ( Dendrophtoe pentandra (L.) Miq.) leaves extracts. JAPS . 2(1):24-27.
Atiqoh  H,  Wardani  RS,  Meikawati  W.  2011. Uji  antidiabetik  infusa  kelopak  bunga rosela  ( Hibiscus  sabdariffa Linn.)  pada tikus  putih  jantan  galur  wistar  yang diinduksi  glukosa. J  kesehat  Masy Indones . 7(1):43-50.
Brown ET, Leemay E, Bursten B, Murphy C, Woodwark  P.  2015. The  Central Chemistry  13th  Edition .  USA  (US): Pearson Education Inc.
Dapas  CC,  Koleangan  HSJ,  Sangi  M.  2014.
Analisis  senyawa  matabolit  sekunder dan uji toksisitas ekstrak batang bawang laut  ( Proiphys  amboinensis L). Jurnal MIPA UNSRAT Online . 3(2):144-148.
Djajanegara, Wahyudi P. 2009. Pemakaian sel
HeLa dalam uji sitotoksitas fraksi etanol biji mimba ( Azadirachta indica ). Biosfera. 26(2):59-64.
Elsyana  V.  2015.  Identifikasi  senyawa antikanker dan uji aktivitas antiproliferasi  ekstrak  daun  benalu cengkih  ( Dendrophthoe  pentandra (L.) Miq.)  [tesis].  Bogor  (ID):  Sekolah Pascasarjana IPB.
Fadhli  H,  Teruna  HY,  Jose  C.  2012.  Uji toksisitas  ekstrak  kulit  batang  pulai basung  ( Alstonia  spatulata BL)  dengan metode brine shrimp lethality test. J Ind Che Acta . 3(1):10-15.
Faramayuda  F,  Alatas  F,  Desmiaty  Y.  2010. Formulasi  sediaan  losion  antioksidan ekstrak  air  daun  teh  hijau  ( Camellia sinensis L.). Majalah Obat Tradisional . 15(3):105-111.
Firdausi  I,  Retnowati  R,  Sutrisno.  2015. Fraksinasi ekstrak metanol daun mangga  kasturi  ( Mangifera  casturi Kosterm ) dengan pelarut n-butanol. Kim Stud Jour . 1(1):785-790.
Hatim NB. 2012. Aktivitas antikanker ekstrak etanol  daun  surian  ( Toona  sinensis )
pada  tikus  betina Sparague-Dawley yang diinduksi 7,12- Dimetilbenz(α)antrasena [skripsi].
Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Harborne JB. 2007. Phytochemical Methods :
A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis. London  (EN):  Chapman  and Hall.
Kantor MNN, Wewengkang DS,  Wullur AC. 2015.  Aktivitas  antibakteri  ekstrak karang  lunak Xenia sp.  yang  diperoleh dari  Teluk  Manado. Jurnal  Ilmiah Farmasi . 4(3):2302-2493.
Kementrian  Kesehatan  Republik  Indonesia. 2015. Situasi  Penyakit  Kanker .  Jakarta (ID): Kepala Pusat Data dan Informasi.
Kementrian  Kesehatan  Republik  Indonesia.
2016. Data  dan  Informasi  Profil Kesehatan  Indonesia. Jakarta  (ID):
Kepala Pusat Data dan Informasi.
Kusmiyati  M,  Sudaryat  Y,  Lutfiah  IA, Rustamsyah  A,  Rohdiana  D.  2015. Aktivitas  antioksidan,  kadar  fenol  total, dan  flavonoid  total  dalam  teh  hijau ( Camellia  sinensis (L.)  O.  Kuntze)  asal tiga  perkebunan  Jawa  Barat. Jurnal Penelitian  Teh  dan  Kina .  18(2):101- 106.
Mentor  RH,  Blagica  J,  Tatjana  KP.  2014. Toxicological  evaluation  of  the  plant product  using  brine  shrimp  ( Artemia salina L) model.
Macedonian
Pharmaceutical Bulletin . 60(1):9-18.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL. 1982. Brine  shrimp:  a  convenient  general bioassay  for  active  plant  constituents. Journal  Medicinal  Plant  Research . 45:31-34.
Muaja AD, Koleangan HSJ, Runtuwene MRJ. 2013.  Uji  toksisitas  dengan  metode BSLT dan analisis kandungan fitokimia ekstrak daun soyogik ( Saurauia bracteosa DC) dengan metode soxhletasi. Jurnal  MIPA  UNSRAT
Online . 2(2):115-118.
Mustariani  BAA.  2011.  Potensi  kaempferol daun sirsak sebagai penghambat proliferasi sel kanker ragi [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Padmasari  PD,  Astuti  KW,  Warditiani  NK. 2013.  Skrining  fitokimia  ekstrak  etanol 70% rimpang bangle ( Zingiber purpureum Roxb.). Farmasi  Udayana . 2(4):2301-7716.
Pasilala  FB,  Daniel,  Saleh  C.  2016.  Uji toksisitas  (brine  shrimp  lethality  test) dan aktivitas  antioksidan  dari  daun  sintrong ( Crassocephalum  crepidioides )  dengan metode 2,2- diphenyl-1-picrylhidrazil (DPPH). Jurnal  Kimia  Mulawarman . 14(1):13-17.
Pratiwi  G.  2017.  Perfomance  kapasitas antioksidan  teh  kulit  manggis,  teh hitam, teh hijau, dan teh rosela [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Priosoeryanto BP, Tateyama S, Yamaguchi R, Uchida  K.  1995.  Establishment  of  cell line  (MCM-B2)  from  a  benign  mixed tumour  of  canine  mammary  gland. Research in Veterinery Science. 58:272- 276.
Purwanto  DA.  2011.  Analisis  kadar  o 6 - [H 3 ]metilguanin-DNA pada kultur hepatosit  tikus  menggunakan  liquid scintillation  counter  setelah  pemberian epigalokatekin-galat  dari  teh  hijau. Jurnal  Kedokteran  Indonesia .  2(1):5- 10.
Rahmani  AH,  Shabrmi  FM,  Allemailem  KS, Aly  SM,  Khan  MA.  2015.  Review articel: implications of green tea and its constituens  in  the  prevention  of  cancer via  the  modulation  of  cell  signalling pathway. BioMed Research International . 10:1-12.
doi:dx.doi.org/10.1155/2015/925640.
Ren  W,  Qiao  Z,  Wang  H,  Zhu  L,  Zhang  L. 2003.  Flavonoids:  promising  anticancer agents. Medicinal  Research  Reviews . 23(4):519-534.
Rismana E, Rosidah I, Prasetyawan Y, Bunga O,  Erna  Y.  2013.  Efektivitas  khasiat pengobatan  luka  bakar  sediaan  gel mengandung  fraksi  ekstrak  pegagan berdasarkan  analisis  hidroksiprolin  dan histopatologi pada kulit kelinci.
Bul.Penelit.Kesehat . 41(1):45-60.
Rizqiyah  AH.  2014.  Uji  sitotoksik  akar rumput  bambu  ( Lophatherum  gracile
B.)  dengan  variasi  pelarut  melalui metode BSLT dan identifikasi golongan senyawa  aktifnya  [skripsi].  Malang (ID): Universitas Islam Negeri.
Setiawan SD. 2015. The effect of chemotherapy  in  cancer  patient  to anxiety. Journal Majority . 4(4): 96-99.
Senthilraja  P,  Kathiresan  K.  2015.  In  vitro cytotoxicity  MTT  assay  in  Vero, HepG2  and  MCF-7  cell  lines  study  of marine  yeast. Journal  of  Applied Pharmaceutical Science . 5(3):80-84.
Tabaga  KD,  Durry  FM,  Kairupan  C.  2015. Efek  seduhan  teh  hijau  ( Camellia sinensis ) terhadap gambaran histopatologi  payudara  mencit  yang diinduksi     z (α)p     . e-  Biomedik. 3(2):544-548.
Tohawa  J.  2012.  Manfaat  Eugenol  cengkeh pada  berbagai  industri  di  Indonesia.
Perspektif . 11(3):91-101.
Tohawa  J.  2013.  Kandungan  senyawa  kimia pada  daun  teh  ( Camellia  sinensis ).
Warta  Pertanian  dan  Pengembangan Tanaman Industri . 19(3):12-16.
Wahyuni T. 2015. Hubungan antara frekuensi kemoterapi dengan  kualitas  hidup
perempuan  dengan  kanker  payudara yang  menjalani  kemoterapi  di  ruang kemoterapi RSUD A.M parikesit tenggarong. Jurnal  Ilmu  Kesehatan . 3(2):1-13.
Wang P, Vadgama JV, Said JW, Magyar CE, Doan  N,  Heber  D,  Henning  SM.  2014. Enhanced  inhibition  of  prostate  cancer xenograft  tumor  growth  by  combining quercetin  and  green  tea. J  Nutr Biochem . 25(1):1-17.
Yuan  JM.  2013.  Cancer  prevention  by  green tea: evidence from epidemiologic studies. Am J Clin Nutr . 98:1676S-81S. doi:10.3945/ajcn.113.058271.