## Ekspresi Relatif mRNA BRLF1 Epstein-Barr Virus dari Biopsi Jaringan Tumor dalam Blok Parafin sebagai Petanda Biologi Patogenesis Karsinoma Nasofaring
Andreanne Poppy Estania 1 , Hidayat Sulistyo 2 , Daniel Joko Wahyono 1
1 Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman
2 Fakultas Kedokteran, Universitas Jenderal Soedirman Email: danieljokowahyono@yahoo.com.

## Abstract
Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is a malignant tumor of epithelial cells of the nasopharynx and is a multifactorial disease that is geographically endemic in the world. The undifferentiated carcinoma is the most common type of NPC and  strongly  associated  with  Epstein-Barr  virus  (EBV)  infection.  BRLF1  lytic  gene  is  required  for  the  switch  from latent to lytic infection. The pathogenesis of NPC is more directly reflected by carcinoma-specific viral transcriptional activity at the site of primary tumor. The aim of this study was to determine the relative expression of mRNA BRLF1 EBV in NPC WHO-3 patient as a potential biomarker of NPC pathogenesis, particularly in tumor progressivity in NPC. This research designed by an analytical observasional research with a cross sectional study. The samples were the tissue  biopsies  formalin-fixed  embedded  paraffin  (FFPE)  of  24  NPC  patients  at  Pathology  Anatomy  Departement, RSUD.  Prof.  dr.  Margono  Soekarjo,  Purwokerto.  The  relative  expression  of  mRNA  BRLF1  EBV  was  determined by RT-qPCR technique and  calculated by Livak & Schmittgen formula (2 - ΔCt ).  The relative expression of mRNA BRLF1 EBV  in  NPC WHO-3  patients on  advanced staging  was  approximately    start  from  99.04415959  to 1097.496026.  In NPC WHO-3 patients, the relative expression of mRNA BRLF1 EBV  in early stage (n = 5; 544,72420 + 142,614733) increased  of  1.8  times  compared  to  late  stage  (n  =  17;  395,68612  +  293,172201),  however  it  was  no  significance differences statistically (n = 17; df =1; p=0,13). Therefore, the relative expression of mRNA BRLF1 EBV from tissue biopsies    FFPE  are  not  potensial  biomarker  of  NPC  pathogenesis,  particularly  in  tumor  progressivity  on  advanced staging.
Key Words : Biomarker pathogenesis, NPC, Relative expression of mRNA BRLF1 EBV BRLF1

## Abstrak
Karsinoma nasofaring (KNF) merupakan tumor ganas pada sel epitel nasofaring dan merupakan penyakit multifaktor  yang  bersifat  endemik. Tipe  KNF  tidak  berdiferensiasi  (KNF WHO-3) telah  terbukti  konsisten dengan  infeksi  EBV.  Gen  litik  BRLF1  berperan  sebagai  mediator  transisi  dari  fase  laten  menjadi  litik. Pengukuran  aktivitas  mRNA  EBV  di  lokasi  tumor  primer  perlu  dilakukan  karena  lebih  mencerminkan patogenesis  KNF  yang    sesungguhnya  dari  pada  diagnosis  serologi  dan  pengukuran  DNA  EBV  di sirkulasi darah. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui nilai ekspresi relatif mRNA BRLF1 Epstein-Barr Virus pada  beberapa  tingkat  stadium  tumor  penderita  KNF  sebagai    petanda  biologi  potensial  dalam patogenesis  KNF.  Metode  penelitian  yang  digunakan  adalah  metode  deskriptif  yang  berbentuk  studi seran  lintang.  Sampel  penelitian  ini  adalah  biopsi  jaringan  tumor  dalam  blok  parafin  penderita  KNF sebanyak  24  sampel.  Sampel  tersebut  telah  didiagnosis  pasti  sebagai  KNF  WHO-3  dari  hasil pemeriksaan  Patologi  Anatomi  pada  Poli  Patologi  Anatomi,  RSUD  Prof.  Dr.  Margono  Soekarjo, Purwokerto  serta  memenuhi  kriteria  inklusi  sampel.  Analisis  statistik  dilakukan  untuk  membandingkan ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1  stadium  yang  berbeda.  Nilai  ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1  EBV  pada  24 sampel KNF berkisar 99,04415959-1097,496026. Hasil analisis statistik menunjukkan nilai ekspresi relatif mRNA  BRLF1  EBV  pada  stadium  awal  (n  =  5;  544,72420  +  142,614733)  lebih  tinggi  1,8  kali dibandingkan  dengan  stadium  lanjut  (n  =  17;  395,68612  +  293,172201),  namun  peningkatan    ekspresi relatif mRNA BRLF1 EBV tidak bermakna secara statistik karena didapatkan nilai p=0,130 (p>0,05). Oleh karena  itu,  ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1  EBV  dari  biopsi  jaringan  tumor  dalam  blok  parafin  tidak berpotensi  sebagai  petanda  biologi  molekul  patogenesis  KNF,  khususnya  progresivitas  tumor  pada stadium lanjut KNF.
Kata kunci : Ekspresi relatif mRNA BRLF1 EBV, KNF, Petanda biologi patogenesis

## Pendahuluan
Karsinoma  nasofaring  adalah  salah  satu jenis kanker  yang sulit dideteksi secara dini.  KNF merupakan  kanker  yang  mempunyai  keunikan dan  berbeda  dari  tumor  ganas  di  daerah  kepala dan  leher  lainnya  dalam  hal  epidemiologi, spektrum  gambaran  histopatologi,  karakteristik
klinik  dan  sifat  biologi.  Kejadian  KNF    bersifat endemik di wilayah Asia  (Chang & Adami, 2006). Prevalensi  KNF  di  Indonesia  adalah  6,2  per 100.000  penduduk  per  tahun  dengan  13.000 kasus  KNF  baru  setiap  tahun  (Adham  et  al., 2012). Berdasarkan rekam medis RSUD Prof. Dr. Margono  Soekarjo  jumlah  kunjungan  pasien  KNF pada  tahun  2013  sebesar  371  pasien  dengan  74
pasien berasal dari wilayah Kabupaten Banyumas,  sedangkan  pada  tahun  2014  jumlah kunjungan  pasien  KNF  sebanyak  332  pasien dengan 73 pasien berasal dari wilayah Kabupaten Banyumas (Dinas Kesehatan Banyumas, 2014).
KNF  bersifat  multifaktor  karena  merupakan interaksi  antara  faktor  kerentanan  genetik, lingkungan  yang  bersifat  karsinogen,  dan  infeksi EBV  yang  dapat  menginduksi  terbentuknya  sel tumor  (Rubin  et  al.,  2005).  Peningkatan  insidensi KNF juga dilaporkan berkaitan erat dengan faktor makanan  seperti  makanan  yang  diawetkan  (ikan asin),  difermentasi,  dan  diasapi.  Makanan- makanan tersebut dapat meningkatkan kandungan  nitrosamin  yang  dapat  mengaktivasi Epstein-Barr  virus  (EBV)  dan  menginduksi perkembangan  tumor  pada  KNF.  Selain  itu, konsumsi minuman beralkohol juga dapat meningkatkan  risiko  terkena  KNF  (Susworo, 2004).
WHO  membagi  KNF  atas  tiga  tipe berdasarkan  gambaran  histopatologi  yaitu  KNF WHO-1,  KNF  WHO-2  dan  KNF  WHO-3.  WHO KNF  WHO-1  ditemukan  sekitar  10%  kasus,  KNF WHO-2  ditemukan    sekitar  15%  kasus  dan  KNF WHO-3  adalah  tipe  yang  paling  sering  ditemukan sekitar  75%  kasus  (Hendrawan,  2013).  Tipe  KNF tidak  berdiferensiasi  (KNF  WHO-3)  sangat konsisten konsisten terhadap infeksi EBV (Wahyono et al., 2010).
Gejala  klinis  KNF  baru  bermanifestasi setelah  tumor  bermetastasis  ke  kelenjar  getah bening  daerah  leher  (Faiza,  2016).  Mayoritas penderita  KNF  pada  saat  didiagnosis  sudah dalam  stadium  lanjut  (stadium  III  dan  IV).  Hal  ini memberikan  gambaran  bahwa  pengetahuan  dan kesadaran  terhadap  gejala  klinis  awal  KNF  yang rendah  dari  penderita  KNF  (Fles  et  al.,  2010). Diagnosis klinis berdasarkan gejala yang ditimbulkan sejauh ini memiliki tingkat keakurasian  yang  masih  rendah,  terutama  pada saat  pasien  berada  pada  stadium  awal  yang berakibat  pada  terjadinya  kesalahan  diagnosis (Radji, 2010).
Pengukuran  aktivitas  mRNA  (transkrip) EBV di lokasi tumor primer secara langsung pada daerah  nasofaring  perlu  dilakukan,  karena aktivitas mRNA EBV lebih mencerminkan patogenesis  KNF  yang    sesungguhnya  daripada diagnosis  serologi  dan  pengukuran  DNA  EBV  di sirkulasi  darah  (Feng  et  al.,  2000).  Metode real- time RT-PCR  (RT-qPCR)  telah  digunakan  untuk mengukur ekspresi relatif mRNA BRLF1 EBV dan mRNA  BZLF1  EBV  secara in  vitro (Chia  et  al., 2008). Ekspresi mRNA BRLF1 Epstein Barr-Virus merupakan  petanda  sensitif  dan  spesifik  untuk diagnosis  kanker  karsinoma  nasofaring  dan memberikan  bukti  yang  cukup  menjanjikan sebagai  petanda  molekuler  untuk  deteksi  dini, staging , prognosis, dan pemantauan kekambuhan kanker karsinoma nasofaring (Cacais, 2008). Oleh
karena  stadium lanjut KNF mencerminkan terjadinya  progresivitas  tumor  pada  KNF,  maka ekspresi  re latif  mRNA  BRLF1  EBV  berpotensi sebagai petanda biologi patogenesis KNF terutama  progresivitas  tumor  KNF.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  nilai  ekspresi  relatif mRNA  BRLF1  Epstein-Barr  Virus  pada  beberapa tingkat  stadium  tumor  penderita  KNF  sebagai petanda biologi potensial dalam patogenesis KNF. Hasil  penelitian  ini  diharapkan  dapat  memberikan informasi ilmiah mengenai peran biologi molekuler dalam memahami aspek biologi tumor pada KNF.

## Metode
Sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah  bahan  biologi  berupa  biopsi  jaringan tumor    penderita  KNF    dalam  blok  parafin  yang telah didiagnosis pasti di Bagian Patologi Anatomi RSUD  Prof.  dr.  Margono  Soekarjo,  Purwokerto. Berdasarkan proporsi jumlah pasien KNF dibandingkan  dengan  kanker  lain  adalah  5,46 persen  (Incidency  Primary  Cancer  in  Indonesia Pathology  Base,  1990),  maka  besar  sampel minimal  yang  diperlukan  dalam  penelitian  ini adalah    22  orang.  Sampel  penelitian  yang digunakan adalah sampel yang memenuhi kriteria inklusi  dan  eksklusi.  Kriteria  inklusi  subyek penelitian  adalah  1)  Penderita  KNF  dengan diagnosis  pasti  dari  hasil  pemeriksaan  Patologi Anatomi  sebelum  terapi  yang  berusia  >15  tahun; 2)  Sampel  penelitian  yang  dapat  ditentukan  tipe KNF  nya,  yaitu  tipe  KNF  WHO-3;  3)  pasien  yang melakukan  biopsi  jaringan  tumor  KNF  di  RSUD Prof.  dr.  Margono  Soekarjo  Purwokerto.  Kriteria eksklusi  subyek  penelitian  adalah  :  1)  Penderita yang  didiagnosis  bukan  KNF,  misal  tumor  hidung dan sinonasal, tumor laring, angiofirboma nasofaring  belia  dan  limfoma  malignum;  2) Penderita  KNF  pasca  terapi  dan  mengalami kekambuhan  (relaps).  Rancangan  penelitian  ini berupa  analitik  observasional  yang  berbentuk studi seran lintang ( cross sectional ).

## Isolasi  RNA  EBV  dari  Jaringan  Tumor  dalam Blok Parafin
Sebanyak  8  irisan  dari  sampel  biopsi jaringan  tumor  penderita  KNF  diambil  dan ditambahkan  300µm  larutan melting  buffer . Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000  rpm  selama  20  detik  dan  diinkubasi  pada suhu 72°C selama 10 menit. Lysate ditambahkan 20µl Proteinase K dan diinkubasi pada suhu 60°C selama  60  menit.  Setelah  itu  disentrifugasi dengan  kecepatan  13.000  rpm  selama  1  menit. Lysate dipindahkan  ke  dalam  tabung  1,5mL  baru (RNAse clean  tube )  dan  ditambahkan  400  µl binding  buffer ,  kemudian  ditambahkan  800  µl 100% ethanol . Sebanyak 700 µl lysate dimasukkan  ke  dalam spin  cartridge dengan tabung  koleksi  (Tahap  1)  dan  disentrifugasi
dengan  kecepatan  2900  rpm  selama  1  menit. Kemudian  larutan  dibuang  melalui spin  cartridge ditampung di dalam tabung koleksi, spin cartridge dipasangkan  kembali  pada  tabung  koleksi. Setelah  itu  Tahap  I  diulangi  dan  disentrifugasi dengan  kecepatan  2900  rpm  selama  1  menit. Kemudian dicuci dengan wash buffer dan diulang sebanyak  2-3  kali  perlakuan,  sentrifugasi  pada kecepatan  13.000  rpm  selama  1  menit.  50  µl RNA-se free  water dipanaskan  pada  suhu  65°C, kemudian  dimasukkan  ke  dalam spin  cartridge dengan  tabung recovery ,  diinkubasi  selama  1 menit,  disentrifugasi  dengan  kecepatan  13.000 rpm selama 1 menit, kemudian larutan ditampung melalui spin  cartridge dalam  tabung recovery sehingga  akan  diperoleh  larutan  RNA  kualitas  I dengan  volume  50  µl.  Prosedur  elusi  sekali  lagi diulang, diperoleh larutan RNA kualitas II. Larutan RNA  bisa  digunakan  untuk  analisis  RT-PCR dengan  diletakkan  di  atas  es.  Larutan  RNA  bisa disimpan  pada  suhu  -80°C  (dalam  jangka  waktu lama).

## Sintesis cDNA
Annealed RNA mix dibuat dalam volume 10 µL  dengan    mencampurkan  1,0  µL  50  µM  Oligo d(T)  20  primer,1,0  µL  10  mM  dNTP  mix,  7,0  µL Template  RNA,  1,0  µL  DEPC- treated  water . Campuran  diinkubasi  di waterbath pada  suhu 65°C  selama  5  menit  dan  diletakkan  di  atas  es selama 2-3 menit. Kemudian cDNA synthesis mix dibuat pada volume 10 µL dengan mencampurkan 2,0  µL  10  X  RT  Buffer,  4,0  µL  25  Mm  MgCl 2 ,  2,0 µL  0,1  DTT,  1,0  µL  RNaseOUT  (140  U/  µL),  1,0 µL Superscript III RT (200 U/ µL). Annealed RNA Mix dan  cDNA synthesis  mix dicampurkan  dan diinkubasi  di waterbath pada  suhu  50°C,  selama 50  menit  kemudian  diinkubasi  di waterbath pada suhu  85°C,  selama  5  menit.  Sebanyak  1  µL Rnase  H  dicampurkan,  selanjutnya  diinkubasi  di waterbath pada  suhu  37°C,  selama  20  menit. Pengukuran konsentrasi cDNA sampel  dilakukan dengan  nanodrop  spektrofotometer  (NanoOne version  4262  V1.7.3)  dan  konsenterasi  dibuat  50 ng.

## RT-qPCR Mix
Campuran qPCR (q PCR mix ) dibuat  dalam volume  20 μL  (DyNAmo  Flash  SYBR  Green qPCR  Kit –  Thermo  Scientific)  dengan  komposisi yaitu  2X  Master  mix,  1 μl  0,5  μM  primer  forward 10 μl, 1 μl 0,5 μM primer reverse, 6 μl ddH 2 O, dan 2 μl  50  ng  cetakan  cDNA.  Amplifikasi  dilakukan pada  mesin  real-time  PCR  (Bioer –  LineGene  K FQD  48A)  sebanyak  40  siklus  dengan  kondisi PCR  sebagai  berikut:  denaturasi  awal  95  °C selama  7  menit,  denaturasi  95  °C  selama  15 detik,    penempelan  primer  dan  pemanjangan  60 °C selama 30 detik. Primer yang digunakan dalam amplifikasi mRNA BRLF1 EBV akan menghasilkan amplikon fragmen cDNA berukuran
142 pb dengan forward primer 5’- GGAGATTCTCTGGCGACTTG- 3’  dan reverse
primer 5’-GAGCCAAAGGAGATCAACCA-3’. Primer  gen  GAPDH  ( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ) sebagai gen house-keeping yang berfungsi  untuk  normalisasi  nilai  Ct  akan menghasilkan  amplikon  cDNA  berukuran  226  pb. Primer  sisi  kiri  ( forward/left  primer )  adalah  5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGT- 3’dan  primer  sisi kanan
(reverse/ right primer ) adalah 5’- GAAGATGGTGATGGGATTTC- 3’  (Chia  et  al., 2008).
Ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1  dihitung berdasarkan atas rumus 2 - ΔCt = 2 -[Ct(BRLF1) – Ct(GAPDH)]
(Livak & Schimttgen, 2001). House keeping genes adalah  gen  yang  ekspresinya  tidak  berubah dalam kondisi eksperimen. Gen GAPDH (Glyceraldeyde-3-phosphat dehydrogenase) merupakan house keeping gene yang ekspresinya  paling  stabil,  sehingga    digunakan sebagai  kontrol  internal  dalam  RT-qPCR  (Barber et  al.,  2005).  Analisis  statistik  dilakukan  untuk menyajikan analisis Box Plot nilai median ekspresi relatif mRNA BRLF1 EBV dengan program SPSS berdasarkan atas pengelompokan stadium KNF.

## Hasil dan Pembahasan
Penelitian  ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1 Epstein-  Barr  Virus dari  biopsi  jaringan  tumor dalam  blok  parafin  sebagai  petanda  biologi patogenesis karsinoma nasofaring (KNF) menggunakan  24  sampel  berupa  biopsi  jaringan tumor  KNF  tipe  WHO-3.  Sampel  penelitian  yang diambil  adalah  sampel  yang  memenuhi  kriteria inklusi  dan  eksklusi  dengan  teknik consecutive sampling yaitu  semua  subjek  yang  datang  dan memenuhi  kriteria  inklusi  dimasukkan  dalam penelitian  sampai  jumlah  subjek  yang  diperlukan terpenuhi. Data  pasien  didapatkan  dari  rekam medis  diagnosa  pasti  Poli  Patologi  Anatomi kemudian  dicocokkan  dengan  diagnosis  stadium dari Poli Radioterapi.
Pengukuran mRNA BRLF1 dilakukan menggunakan  teknik Reverse  Transcriptase- quantitative  Polymerase  Chain  Reaction (RT- qPCR).  Konsentrasi  dan  kemurnian  cDNA  pada sampel penelitian ini diukur lebih  dahulu menggunakan  nanodrop  sebelum  diamplifikasi. Konsenterasi  cDNA  dari  sampel  penelitian  ini memiliki  kisaran  nilai  452-1244  ng/µL,  sehingga menunjukkan  konsentrasi  yang  tinggi.  DNA dengan  rasio  λ260/280  nm  pada  kisaran  antara 1,8-2,0  memiliki  kemurnian  sesuai  persyaratan kemurnian dalam analisis molekuler. DNA dikatakan murni apabila mempunyai nilai perbandingan  absorbansi  λ  260/280  nm  berkisar 1,8 - 2,0. DNA yang memiliki nilai absorbansi lebih rendah  dari  1,8  menunjukkan  sampel  DNA terkontaminasi oleh protein, sedangkan kemurnian DNA yang nilainya lebih tinggi dari 2,0
artinya  sampel  DNA  terkontaminasi  oleh  RNA (Sambrook & Russel, 1989).
Kemurnian  cDNA  dari  24  sampel  yang digunakan berkisar 1,000-1,707, sehingga kemurnian cDNA <1,8 yang menunjukkan sampel masih  terkontaminasi  protein.  Kuantitas  RNA yang  baik  dibutuhkan  untuk  melakukan reverse transcription yang  optimal,  sehingga  diperoleh cDNA dengan kuantitas yang baik (Godfrey et al., 2000).  Kemurnian  cDNA  ditentukan  dengan perbandingan  hasil  absorbansi  pada  λ  260/280. Rendahnya  kemurnian  cDNA  ini  dapat  berasal dari  rendahnya  kemurnian  RNA  yang  didapatkan dari isolasi jaringan tumor pada parafin. Kemurnian  RNA  dalam  penelitian  ini  pada  λ 260/280 adalah 1,4333 - 2,333.
Sampel  penelitian  yang  digunakan  dibagi menjadi  2  kelompok  yaitu  stadium  awal  (I-II)  dan
stadium  lanjut  (III-IV).  Tabel  1  menunjukkan  nilai ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1  dan  data  stadium setiap  sampel.  Jumlah  sampel  stadium  awal sebanyak 5 sampel, jumlah sampel stadium lanjut sebanyak  17  sampel,  dan  2  sampel  tidak diketahui stadiumnya. Sampel yang tidak diketahui  stadiumnya  tidak  diikutsertakan  dalam analisis  statistik.  Nilai  ekspresi  relatif  mRNA BRLF1  EBV  pada  24  sampel  KNF  berkisar 99.04415959-1097.496026.  Nilai  ekspresi  relatif mRNA  BRLF1  EBV  pada  stadium  awal  memiliki nilai median
533.7424696
(418.765854- 765.3628153),  sedangkan  nilai  ekspresi  relatif mRNA  BRLF1  EBV  pada  stadium  lanjut  memiliki nilai median 306.5545484 (99.04415959-
1097.496026).

## Tabel 1. Nilai ekspresi relatif mRNA BRLF1 dan stadium KNF
No Kode Sampel Ct BRLF1 ∆Ct 2 - ∆Ct Stadium 1. 3738 24.95 -8.92 484.38152 IV 2. 2309 25.14 -8.73 424.61161 IV A 3. 2558 24.8 -9.07 537.45494 - 4. 2142 25.15 -8.72 421.6786 II 5. 2822 24.68 -9.19 584.07102 II 6. 2721 24.81 -9.06 533.74247 II 7. 4090 25.7 -8.17 288.01497 IV C 8. 2465 24.66 -9.21 592.22435 III 9. 3208 23.92 -9.95 989.1188 IV A 10. 1810 24.59 -9.28 621.66778 III 11. 1808 24.9 -8.97 501.46319 - 12. 1784 25.7 -8.17 288.01497 III 13. 840 25.16 -8.71 418.76585 II 14. 1965 23.77 -10.1 1097.496 IV A 15. 2487 24.94 -8.93 487.75065 III 16. 2439 24.29 -9.58 765.36282 II 17. 1640 26.4 -7.47 177.29401 III 18. 2070 25.61 -8.26 306.55455 III 19. 3709 26.22 -7.65 200.85353 IV A 20. 3274 25.94 -7.93 243.87533 IV A 21. 309 26.97 -6.9 119.42822 III 22. 713 26.35 -7.52 183.54627 IV A 23. 3377 26.93 -6.94 122.78581 IV B 24. 435 27.24 -6.63 99.04416 III
Data  yang  didapatkan  pada  penelitian  ini menunjukkan  stadium  awal  memiliki  ekspresi
relatif mRNA BRLF1 yang lebih tinggi dibandingkan dengan stadium lanjut. Steven et al. (2006),  menyatakan  bahwa  pengukuran  aktivitas
mRNA  EBV pada  lokasi  tumor  primer  perlu dilakukan,  karena  aktivitas  mRNA  EBV lebih mencerminkan  pathogenesis  KNF  dibandingkan diagnosis  serologi  dan  pengukuran  DNA  EBV di sirkulasi.  Menurut  Chia  et  al.  (2008),  ekspresi relatif  mRNA  BRLF1  lebih  tinggi  dibandingkan dengan ekspresi BZLF sehingga BRLF1 dianggap memiliki  peran  lebih  dominan  pada  aktivasi  EBV pada karsinoma nasofaring.
Ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1  EBV  pada biopsi  jaringan  segar  tumor  KNF  ( fresh  biopsy ) meningkat secara sangat bermakna pada stadium lanjut KNF, terutama antara status M 1 (metastasis jauh)  dibandingkan  dengan  status  M 0 (sebelum metastasis  jauh)  (Wahyono  et  al.,  2016). Berdasarkan penelitian tersebut didapatkan terjadi peningkatan  signifikan  ekspresi  relatif  mRNA BRLF1  pada stadium lanjut dibandingkan dengan stadium  awal.  Hal  ini  berbeda  dengan  hasil  yang didapatkan  pada  penelitian  ini.  Perbedaan  ini diduga  karena  perbedaan  keadaan  sampel jaringan.  Jaringan  segar  tumor  lebih  bisa menggambarkan  progresivitas  tumor  karena materi  genetik  yang  diisolasi  dari  jaringan  tumor segar memiliki kualitas yang baik.
Sampel penelitian ini berupa biopsi jaringan dalam  blok  parafin  atau formalin-fixed  parafin- embedded (FFPE).  Penggunaan  sampel  jaringan tumor  dalam  blok  parafin  menghasilkan  kualitas
materi genetik yang kurang baik karena terjadinya degradasi  akibat  penggunaan  formalin  sebagai larutan  fiksatif.  Hal  ini  sesuai  dengan  pendapat Lehman  &  Kreipe  (2001),  fiksasi  sampel  jaringan menggunakan  larutan  formalin  menyebabkan terjadinya crosslinking pada  seluruh  komponen jaringan  sehingga  asam  nukleat  (DNA  dan  RNA) mengalami  fragmentasi.  Berdasarkan  penelitian Rezeki  et  al.  (2014),  juga  menyatakan  bahwa proses  fiksasi  dan  pembuatan  blok  parafin mampu  mengubah  struktur  DNA  sewaktu  proses fiksasi formalin. Fiksasi jaringan dengan menggunakan formalin dan disimpan dalam waktu lama dapat menyebabkan perubahan struktur dan degradasi DNA.
Gambar 4.1 menampilkan hasil analisis box plot  ekspresi  relatif  mRNA  BRLF.  Data    nilai median  pada  stadium  awal  dan  lanjut  tidak simetris. Hal ini dapat dilihat dari jarak median ke kuartil  1  dan  jarak  median  ke  kuartil  3  yang  tidak sama  panjang  pada  stadium  awal  maupun stadium  lanjut.  Distribusi  data  pada  kedua kelompok juga tidak simetris. Distribusi data dapat dilihat  melalui  letak  garis  median  dan  panjang whisker  yang  tidak  simetris.  Nilai  median  pada stadium  awal  yaitu  533.7424696  (418.765854- 765.3628153)  dan  nilai  median  stadium  lanjut 288.015 (99.04415959-1097.496026).
Gambar 1. Analisis  Box-Plot  ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1  EBV  pada  penderita  stadium  awal  dan stadium lanjut.
Menurut  data  yang  ditampilkan  dalam boxplot  tersebut  distribusi  data  tidak  normal,  hal ini  dibuktikan  dengan  adanya  nilai  ekstrem.  Data dikatakan  berdistribusi  normal  bila  nilai  median ada  di  tengah-tengah  kotak,  nilai  whisker  terbagi secara  simetris  ke  atas  dan  ke  bawah,  dan  tidak
ada  nilai  ekstrem  atau outlier (Dahlan,  2014). Tabel  2  memperlihatkan  hasil  analisis  statistic dengan  uji  T  independen  (SPSS version 15) menunjukkan  nilai  ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1 EBV  pada  stadium  awal  (n  =  5;  544.72420  + 142.614733)  lebih  tinggi  1,8  kali  dibandingkan
dengan  stadium  lanjut  (n  =  17;  395.68612  + 293.172201), namun peningkatan  ekspresi relatif
mRNA  BRLF1  EBV  tidak  bermakna  secara statistik.

## Tabel 2. Hasil Uji T independen
Nilai  ekspresi  relatif  BRLF1  mengalami lebih  tinggi  1,8  kali pada  stadium awal dibandingkan  dengan  stadium  lanjut.  Hal  ini diduga  karena  gen  litik  EBV  yang  diisolasi  dari tumor primer kurang menggambarkan progresivitas  tumor.  Rangkaian  fase  litik  EBV ditandai  dengan  adanya  lisis  sel  dan  pelepasan virion.  Virion  akan  menyebar  dari  tumor  primer menuju  sirkulasi,  sehingga  isolasi  DNA  EBVdari tumor  primer  untuk  analisis  ekspresi  gen  litik seperti  BRLF1  menjadi  kurang  efektif.  Ekspresi mRNA  BRLF1  EBV  dari  biopsi  jaringan  tumor dalam  blok  parafin  dapat  digunakan  untuk diagnosis  KNF  karena  menunjukkan  ekspresi yang  tinggi  pada  stadium  awal  tetapi  tidak  dapat digunakan untuk prognosis KNF.
Menurut  penelitian  yang  dilakukan  oleh Feng  et  al.  (2000),  ekspresi  BRLF1  pada penderita KNF dapat digunakan sebagai parameter  untuk  menentukan  diagnosis  KNF. Antibodi  IgG  digunakan  sebagai  parameter serologi  karena  keterkaitannya  dengan  Rta (protein  yang  dihasilkan  oleh  gen  BRLF1). Keberadaan  kompleks  IgG  dan  Rta  akan menentukan  diagnosis  dan  dapat  digunakan untuk screening pasien  terduga  KNF.  Parameter ini  memiliki  tingkat  spesifitas  yang  cukup  tinggi dan  untuk  meningkatkan  sensitivitas  dapat dilakukan  dengan  menggunakan  serum  dalam jumlah yang lebih banyak. Berdasarkan penelitian tersebut ekspresi BRLF1 yang didapatkan melalui isolasi  DNA  EBV  di  sirkulasi  darah  diketahui cukup spesifik dan sensitif. Hal  ini sesuai dengan pendapat  Chia  et  al.  (2008),  yang  menyatakan tingkat  DNA  EBV  di  sirkulasi  darah  merupakan biomarka yang efektif digunakan untuk memantau respon KNF terhadap terapi.
Berdasarkan  penelitian  terdahulu  yang dilakukan  oleh  Notoputro  et  al.  (2008),  dari  25 penderita  karsinoma  nasofaring  dengan  kisaran umur 20-60 tahun, 7 orang diantaranya perempuan  dan  18  orang  lainnya  laki-laki. Perbandingan penderita laki-laki dengan perempuan  adalah  1,2  :  1.  Penelitian  yang dilakukan oleh Poida et al (2015) juga menunjukkan  distribusi  KNF  lebih  tinggi  laki-laki yaitu  sebanyak  21  kasus  (61,8%),  sedangkan penderita perempuan sebanyak 13 kasus (28,2%).  Perbedaan  distribusi  KNF  berdasarkan
jenis  kelamin  berbeda  signifikan  antara  laki-laki dan  perempuan  yaitu  penderita  laki-laki  sejumlah 23 (76,67%) dan penderita perempuan sejumlah 7 (23,33%) (Murdiyo et al., 2013).
KNF selalu lebih tinggi ditemukan pada laki- laki  (Faiza  et  al.,  2016).  Tabel  1  menunjukkan jumlah  penderita  KNF  tipe  WHO-3  lebih  banyak pada  laki-laki.  Sebanyak  17  penderita  KNF (70,8%)  dari  24  total  sampel  yang  digunakan dalam penelitian ini adalah laki-laki, dan 7 lainnya (29,2%).  Rasio  antara  penderita  laki-laki  dan perempuan  adalah  2,4  :  1.  Data  yang  didapatkan sesuai dengan penelitian terdahulu yang menyatakan bahwa penderita  KNF lebih dominan pada laki-laki. Hal ini dikarenakan pola hidup laki- laki  yang  lebih  buruk  dari  perempuan  dan perbedaan  intensitas  terpapar  zat  karsinogen, laki-laki  cenderung  lebih  sering  terpapar  zat karsinogen  dibandingkan  perempuan  sehingga resiko terkena KNF lebih besar.
Tabel 3. Karakteristik berdasarkan jenis kelamin
Jenis kelamin Jumlah (n) Persentase (%) Laki-laki 17 70,8 Perempuan 7 29,2 Jumlah 24 100
KNF  dapat terjadi  pada  setiap  usia,  namun sangat jarang dijumpai penderita di bawah usia 20 tahun  dan  usia  terbanyak  antara  45-54  tahun (Tham  et  al.,  2009).  Menurut  Guo  et  al.  (2009), insiden  kanker  nasofaring  mulai  meningkat setelah  usia  30  tahun,  93%  terjadi  setelah melewati  usia  30  tahun  dengan  puncak  tertinggi saat  usia  45-55  tahun.  Berdasarkan  penelitian yang  dilakukan  oleh  Faiza  et  al.  (2016), didapatkan hasil yaitu secara keseluruhan kisaran umur  penderita  pasien  KNF  antara  17-75  tahun dengan  angka  kejadian  terbanyak  ditemukan pada  dewasa  tua  dengan  kisaran  umur  41-65 tahun sebesar 68,18%,  diikuti oleh  dewasa muda dengan  kisaran  umur  21-  <  41  tahun  sebesar 24,99%,  kemudian  remaja  dengan  kisaran  umur 13- < 21 tahun sebesar 4.54%, dan kisaran umur yang  paling  sedikit  ditemukan  pada  manula dengan umur > 65 tahun sebesar 2,27%.
Distribusi  penderita  KNF  berdasarkan  usia digambarkan pada Tabel 4.2. Penderita KNF yang
digunakan sebagai subjek penelitian ini mayoritas berumur  37-47  tahun  yaitu  didapatkan  sebanyak 10  orang  (41,7%)  dari  total  sampel  penelitian. Kedua  terbanyak  memiliki  kisaran  umur  48-58 tahun (33,3%), diikuti oleh pasien dengan kisaran umur  59-69  tahun  (12,5%),  kemudian  kisaran umur  26-36  tahun  (8,3%),  dan  pasien  paling sedikit memiliki kisaran umur 15-25 tahun (4,2%).
Penelitian  Midoen  (2010),  menunjukkan dari  segi  faktor  umur,  jumlah  pasien  terbanyak adalah  pada  umur  41-50  tahun  (29,41%),  diikuti umur  51-60  tahun  (24,51%),  dan  umur  31-40 tahun  (23,53%)  dengan  sebaran  umur  berkisar antara  umur  15  sampai  dengan  69  tahun.  Hal  ini sesuai  dengan  pendapat  Savitri  &  Haryana (2014),  yang  menyatakan  karsinoma  nasofaring banyak  terjadi  pada  usia  produktif  antara  35-50 tahun.  Pendapat  ini  diperkuat  dengan  hasil penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan  di  RSCM, yaitu pasien  KNF  terbanyak  ditemukan  pada  usia 41-50 tahun.
Tabel 4. Karakteristik berdasarkan usia Kelompok usia pasien Jumlah (n) Persentase (%) 15-25 tahun 1 4,2 26-36 tahun 2 8,3 37-47 tahun 10 41,7 48-58 tahun 8 33,3 59-69 tahun 3 12,5 Jumlah 24 100
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Faiza  et  al.  (2016),  menunjukkan  bahwa mayoritas  penderita  KNF  datang  dengan  stadium lanjut  yaitu  sebesar  86,36%,  yang  terdiri  atas stadium  III  dan  IV,  diikuti  stadium  awal  yaitu stadium  II  sebesar  13,64%,  sedangkan  stadium  I tidak  ditemukan.  Hal  ini  memperlihatkan  bahwa penderita  biasanya  telah  datang  dalam  keadaan stadium lanjut dengan gejala berupa massa tumor yang  telah  menginvasi  intrakranial  dengan melibatkan  nervus  kranial,  fossa  infratemporal, hipofaring,  orbit,  atau  ruang  mastikator  yang dapat dilihat pada hasil pemeriksaan CT Scan.
Hasil pada Tabel 4.5 menunjukkan karakteristik  sampel  pasien  KNF  berdasarkan
stadium.  Data  tersebut  menunjukkan  bahwa pasien  yang  memiliki  stadium  lanjut  (III-IV)  lebih banyak  ditemukan  daripada  pasien  dengan stadium  awal  (I-II).  Pasien  dengan  stadium  lanjut didapatkan  sejumlah  17  orang  (77,27%)  dan pasien dengan stadium awal didapatkan sejumlah 5  orang  (22,73%).  Perbandingan  antara  pasien stadium  lanjut  dan  stadium  awal  adalah  sebesar 3,4  :  1.  Tingginya  angka  penderita  KNF  pada stadium  lanjut  dikarenakan  terlambatnya  pasien untuk  datang  berobat.  Mayoritas  pasien  datang dalam  keadaan  sudah  memasuki  stadium  lanjut karena KNF tidak memiliki gejala awal yang khas, sehingga sering diabaikan oleh penderita. Diagnosis  dini  KNF  cukup  sulit  karena  letak  awal keganasannya yang tersembunyi.
Tabel 5. Karakteristik berdasarkan stadium
Stadium KNF Jumlah (n) Persentase (%) I-II (Awal) 5 22,7 III-IV (Lanjut) 17 77,3 Jumlah 22 100
Keterbatasan  pada  penelitian  ini  adalah jumlah  sampel  yang  terbatas  untuk  analisis statistik.  Kondisi  spesimen  kurang  baik  karena perlakuan  fiksasi  sampel  dalam  larutan  formalin sebelum  sampel  ditanam  dalam  blok  parafin. Selain  itu,  kontaminasi  dalam  sampel  biopsi parafin pada saat isolasi RNA yang sulit dihindari.

## Simpulan
Nilai  ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1  dari biopsi  jaringan  tumor  dalam  blok  parafin  berkisar antara 99,04-1097,49. Stadium awal memiliki nilai median 533,74 (418,76-765,36), sedangkan stadium  lanjut  memiliki  nilai  median  288,015 (99,04-1097,50).  Perbedaan  ekspresi  antara stadium  awal  dan  stadium  lanjut  tidak  bermakna secara  statistik.  Oleh  karena  itu,  ekspresi  relatif mRNA  BRLF1  EBV  dari  biopsi  jaringan  tumor dalam  blok  parafin  tidak  berpotensi  sebagai petanda  biologi  molekul  patogenesis,  khususnya progresivitas tumor KNF.

## Daftar  Referensi
Adham  M,  Kurniawan  AN,  Muhtadi  AI,  Roezin  A, Hermani  B,  Gondhowiardjo  S,  Tan  IB, Middeldorp  JM.  2012.  Nasopharyngeal carcinoma  in  Indonesia:  epidemiology, incidence,  signs,  and  symptoms  at presentation. Chin  J  Cancer ,  31(4),  pp. 185-96.
Boyer, R. 2005. Modern Experimental Biochemistry Third Edition . India: Pearson Education Inc. Cacais, A. O. G. 2008. Immunological Consequences  of  Epstein-Barr  Virus Replication. Dissertation. Stockholm, Sweden:  Department  of  Microbiology, Tumor  and  Cell  Biology,  Karolinska Institute.
Chang,  E.T.  &  Adami.  2006.  The  enigmatic epidemiology of nasoparhyngeal carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev , 15, pp. 1765-1777.
Chia,  M.C.,  Leung,  A.,  Krushel,  T.,  Alajez,  N.M., Lo,  K.W.,  Busson,  P.,  Klamut,  H., Bastianutto, C. & Liu, F-F. 2008. Nuclear
Factor-Y  and  Epstein  Barr  Virus  in Nasopharyngeal  Cancer. Clin  Cancer Res , 14, pp. 984-994. Dahlan,  M.S.  2014. Statistik  untuk  Kedokteran dan  Kesehatan:  Deskriptif,  Bivariat,  dan Multivariat, Dilengkapi Aplikasi Menggunakan  SPSS ,  6 th ed.  Jakarta: Epidemiologi Indonesia.
Faiza,  S.,  Sukri,  R.  &  Aswiyanti,  A.    2016. Karakteristik Klinis dan Patologis KNF di Bagian  THT-KL  RSUP  Dr.M.Djamil Padang. Jurnal Kesehatan Andalas , 5(1), pp. 90-96.
Feng, F., Ren, E. C.,  Liu, D., Chan,  S.  & Hhu, H. 2000.  Expression  of  Epstein-Barr  Virus lytic  gene  BRLF1  in  nasopharyngeal carcinoma : potensial use in diagnosis. J Gen Virol , 81, pp. 2417-2423.
Fles, R., Wilderman M. A., Sulistiono B., Haryana
S.  M.  &  Tan  I.  B.  2010.  Knowledge  of General Practioners about Nasopharyngeal  Cancer  at  Puskesmas in  Yogyakarta,  Indonesia. BMC  Medical Education , 10(81), pp. 1- 6.
Guo, X., Johnson, R.C., Deng, H., Liao, J., Guan, L.,  Nelson,  G.W.,  Tang,  M.,  Yumin,  Z., Guy,  D.,  Stephen,  J.O.,  Cheryl,  A.W.  & Yi,  Z.  2009.  Evaluation  of  Nonviral  Risk Factors  for  Nasopharyngeal  Carcinoma in  a  High-Risk  Population  of  Southern China. Int.J.Cancer ,  124,  pp.  2942- 2947.
Hendrawan,  A.  2013.  Faktor  Risiko  KNF. CDK- 204 , 40(5), 348-351.
Lehmann,  U.  &  Kreipe,  H.  2001.  Real-Time  PCR
Analysis  of  DNA  and  RNA  Extracted from Formalin-Fixed and Paraffin- Embedded  Biopsies. Methods ,  25,  pp. 409-418.
Livak,  K.J.  &  Schimttgen,  T.D.    2001.  Analysis  of
Relative Gene Expression Data UsingReal-Time  Quantitative  PCR  and the 2 - ΔΔCt Method. Methods , 25,8-402.
Midoen,  Y.H.,  Suryandari,  D.A.,  Purnomo,  S., Moeloek,  N.  &  Susworo,  R.  2010.  Pola
Distribusi Alotip Gen
Polymeric Immunoglobulin  Receptor (PIGR)  pada
Penderita  Karsinoma  Nasofaring  (KNF) di Indonesia, MKI, 60(11), pp. 489-495. Murdiyo,  M.D.,  Cici  S.,  Pudji,  R.,  Endang,  R.  & Johanes,  B.S.  2013.  Hubungan  mutasi gen ras dan p53 pada  penderita karsinoma  nasofaring  dengan  riwayat merokok, ORLI, 43(1), pp. 26-37.
Notopuro,  H.,  Kentjono,  W.A.  &  Handajani,  R. 2008.  Karsinoma  Nasopharynx  dan Infeksi EBV di Indonesia; Analisis Aspek Klinis, Patologi dan Biomolekular.
Jurnal Yarsi ISSN , 16 (2).
Gurning,  P.P.B.,  Lubis,  M.N.D.  &    Delyuzar,  M. 2015.  Ekspresi  LMP1  pada  Sel  Tumor Sediaan Sitologi Biopsi Aspirasi Kelenjar Getah  Bening  Leher  pada  Metastasis Karsinoma Nasofaring. Majalah Patologi , 24(2), pp. 39-46.
Radji.  2010. Imunologi  dan  Virologi .  Jakarta.  PT. ISFI.
Rentoft,  M.  2012.  The  Use  of  Formalin  Fixed Paraffin  Embedded  Tissue  and  Global Gene  Expression  Profiling  for  Increased Understanding of Squamous Cell Carcinoma  of  The  Tongue. University Medical Dissertations , New Series.
Rubin, E.,  Gorstein,  F.,  Rubin, R.,  Schwarting, R.
&  Strayer,  D.    2005. Rubin’s  pathology: Clinicopathologic foundations of medicine.  4th  ed.  In:  The  head  and neck:  Tumors  of  the  nasopharynx. Baltimore: Lippincott, pp. 5-1294.
Sambrook,    J.,    &    Russel,    D.W.,    2001.
Molecular    Cloning:    A    Laboratory Manual (Third Edition).  New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Savitri E. & Haryana S.M. 2014. Hubungan Kadar
IL-8  dan  IL-10  yang  Berpengaruh Terhadap Progresifitas Karsinoma Nasofaring. ORLI , 44(1), pp. 44-51. Susworo, R. 2004. Kanker Nasofaring: Epidemiologi  dan  Pengobatan  Mutakhir. Cermin  Dunia  Kedokteran. 144,  pp.  9- 16.
Tham, I.W.K., Hee, S.W., Yeo, R.M., Salleh, P.B.,
Lee,  J.,  Tan,  T.  W.,  Fong,  K.W.,  Chua, E.T.  &  Wee,  J.T.  2009.  Treatment  of Nasopharyngeal Carcinoma Using Intensity-Modulated  Radiotherapy.  The National Cancer Centre  Singapore
Experience .  J.  Radiation  Oncology  Biol , 75 (25), pp. 1481-1486.
Wahyono,  D.J.,  Bambang,  H.  &  Purnomo,  S. 2010.  Ekpresi  gen  litik  virus  Epstein- Barr:  mnafaatnya  untuk  penegakan diagnosis  karsinoma  nasofaring. Tesis . Jakarta, Program Doktor Ilmu Biomedik- Program Pascasarjana FKUI.
Wahyono,  D.J.,  Musa,  Z.,  Lisnawati,  Suryandar,
D.A.,  Hermani,  B.  &  Soeharso,  P. Penjamu-patogen  study  :  The  relative expression  of  mRNA  BRLF1  Epstein- Barr virus : a potensial use for biomarker of  tumor  progresivity  &  polymorphisms of TCRBC and TCRGC2 penjamu genes related  to  genetic  susceptibility  on nasopharyngeal carcinoma. BMC Proceeding 2016 : 7th Biannual International Symposium on Nasopharyngeal Carcinoma 2015, Yogyakarta, Ind onesi.