## IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT DARI HASIL
FERMENTASI SELADA ROMAIN ( Lactuca sativa var. longifolia Lam.) MENGGUNAKAN GEN 16S rRNA
Maria A. Gani 1) , Trina E. Tallei 2) , Fatimawali 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
2) Jurusan Biologi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Lactic  acid  bacteria  (LAB)  is  a  group  of  bacteria  that  produce  lactic  acid  as  the  major metabolic  end  product  of  carbohydrate  fermentation.  LAB  are  highly  beneficial  because  of  their probiotic potential properties and as functional starter cultures in food fermentation. This study  was aimed to identify the LAB species isolated from romaine lettuce fermented product by using molecular identification  method  with  16S  rRNA  gene  marker.  The  fermented  product  was  diluted  and  spread onto  MRS  agar  supplemented  with  1%  of  CaCO 3 and  then  purified  by  using  streak  method.  Both isolates  were  positive  Gram  bacteria  and  gave  negative  results  from  catalase  test.  The  result  of molecular identification showed that LAB from romaine lettuce fermented product have each 99 and 100%  similarity  to  Enterococcus  faecium  that  known  have  properties  as  probiotic  potential  and functional culture starter.
Key  words :  lactic  acid  bacteria,  fermentation, probiotic,  Enterococcus  faecium, Lactuca  sativa  var. Longifolia Lam.

## ABSTRAK
Bakteri  asam  laktat  (BAL)  merupakan  bakteri  yang  menghasilkan  asam  laktat  sebagai metabolit  utamanya  dalam  fermentasi  karbohidrat.  BAL  merupakan  bakteri  yang  menguntungkan karena  memiliki  aktivitas  probiotik  potensial  dan  dapat  berguna  sebagai  starter  dalam  proses fermentasi makanan. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi spesies BAL yang diisolasi dari hasil fermentasi selada romain menggunakan metode identifikasi molekuler dengan gen penanda 16S rRNA.  Cairan  hasil  fermentasi  diencerkan  dan  ditebar  pada  media  MRS  agar  yang  telah  dicampur dengan  CaCO 3 1%  dan  kemudian  dimurnikan  menggunakan  metode streak  plate .  Kedua  isolat merupakan  bakteri  Gram  positif  dan  menunjukkan  hasil  negatif  pada  uji  katalase.  Hasil  identifikasi molekuler  menunjukkan  bahwa    kedua  BAL  hasil  fermentasi  selada  romain  memiliki  kemiripan masing-masing  99  dan  100  %  dengan Enterococcus  faecium yang  diketahui  memiliki  aktivitas probiotik.
Kata  Kunci :  bakteri  asam  laktat,  fermentasi,  probiotik, Enterococcus  faecium , Lactuca  sativa var. longifolia Lam.

## PENDAHULUAN
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan  bakteri  yang  menghasilkan asam  laktat  sebagai  metabolit  utamanya. BAL merupakan bakteri yang menguntungkan  karena  terbukti  dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti Escherichia coli serta jamur seperti Aspergillus  fumigatus (Dow et  al., 2010; Lahtinen et al. , 2012).
Bakteri asam laktat dapat
ditemukan  dalam  makanan  fermentasi (Lahtinen et  al. ,  2012).  Fermentasi merupakan  teknik  yang  digunakan  untuk mengawetkan suatu makanan (Fleck et al ., 2012).
Bakteri  asam  laktat  telah  diteliti dapat  memberikan  manfaat  baik  bagi kesehatan  yang  membuatnya  disebut sebagai  probiotik  potensial.  Keuntungan mengomsumsi  probiotik  antara  lain;  dapat meningkatkan  kekebalan  tubuh  untuk melawan infeksi, menekan bakteri patogen dan  menyeimbangkan  kondisi  mikrobiota di usus serta menurunkan serum kolesterol,  (Kaur et  al. ,  2014;  Lahtinen et al. , 2012).
Sampai  saat  ini  BAL  telah  banyak diidentifikasi  berdasarkan  karakterisitik fenotipnya,  namun  identifikasi  ini  tidak sepenuhnya  akurat  serta  membutuhkan waktu  yang  relatif  lama  (Khalid,  2011). Maka  dari  itu,  saat  ini  identifikasi  BAL telah  beralih  ke  arah  molekuler,  salah satunya  menggunakan  gen  16S  rRNA (Khalid, 2011).
Gen  16S  rRNA  merupakan  gen yang  terletak  pada  ribosom  sub  unit  kecil dan  memiliki  sekitar  1500  pasang  basa yang  dapat  digunakan  untuk  identifikasi suatu  bakteri  (Das et  al. ,  2014;  Senthilraj et al. , 2016).

## METODE PENELITIAN

## Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian telah dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi Program Studi Farmasi,  Laboratorium  Mikrobiologi  dan
Laboratorium
Bioteknologi
Jurusan Biologi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan  Alam  Universitas    Sam Ratulangi.  Penelitian  ini  terlaksana pada bulan Oktober 2018 – November 2018.
Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  antara  lain; alat ekstraksi  DNA  ( Presto™ Mini gDNA Bacteria) ,  alat  PCR  (TOYOBO  KOD  FX Neo Catalog No. KFX-201) alat elektroforesis  dan  alat  purifikasi  gel  DNA (Zymoclean ™ Gel DNA Recovery).
Bahan  yang  digunakan  antara  lain;  selada romain,  MRS  (de  Man,  Rogosa  and Sharpe)  agar,  Geneaid  Presto ™ Mini gDNA Bacteria Kit (GBB100),
Zymoclean ™ Gel  DNA  Recovery  Kit (Zymo  Research),  PCR  Buffer  KOD  FX neo,  dNTPs,  Primer  27F,  Primer  1492R, KOD FX Neo, bubuk agarose, buffer TBE (Tris-Boric  EDTA)  1X,  DNA ladder , bakteri Escherichia coli (Migula)
Castellani and Chalmers (ATCC ® 25922).

## Cara  Kerja Fermentasi
Daun selada romain dimasukkan ke dalam  wadah  fermentasi,  diberi  pemberat dan  ditambahkan  larutan  garam  10%. Proses  fermentasi  dilakukan  pada  suhu ruang selama 4 hari tanpa cahaya di dalam wadah fermentasi yang ditutup rapat.

## Isolasi Bakteri
Sebanyak  100  µL  cairan  hasil fermentasi  dipipet  dan  diencerkan  dengan pengenceran  berseri  sampai  10 -5 .  Setelah itu  cairan  hasil  fermentasi  yang  telah diencerkan  ditebar  pada  media  MRS  agar
yang  mengandung  CaCO 3 dan  diinkubasi selama  48  jam  pada  suhu  37 o C  (Lawalata et  al .,  2011).  Setelah  bakteri  tumbuh, masing-masing koloni dengan zona bening disekitarnya  dimurnikan  pada  MRS  agar yang  baru  menggunakan  metode streak plate .

## Pewarnaan Gram
Satu  Ose  bakteri  diambil  dan digoreskan  pada  kaca  preparat,  ditetesi akuades  dan  difiksasi  di  atas  pembakar Bunsen dan kemudian diwarnai menggunakan metode (Reynolds, 2011).

## Uji Katalase
Masing-masing  isolat  dan  bakteri pembanding ( E. Coli) yang telah dibiakkan diambil  terlebih  dahulu  menggunakan jarum Ose dan diletakkan di kaca preparat yang  sama.  Setelah  itu  ditetesi  2  tetes larutan  H 2 O 2 5%  lalu  diamati  dan dibandingkan  reaksi  pada  isolat  dengan bakteri  pembanding  (Tallei,  komunikasi pribadi).

## Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA
dilakukan menggunakan kit  Presto™  Mini  gDNA
Bacteria.

## Amplifikasi DNA
Fragmen DNA diamplifikasi menggunakan  kit  PCR  KOD  FX  Neo Catalog
No. KFX-201 (Toyobo).
Komponen master  mix PCR  yaitu;  5  μl ddH 2 O, 12.5 μl PCR Buffer KOD FX neo,
5  μl  dNTPs,  0.5  μl  KOD  FX  Neo,  1  μl
DNA  template ,  0.5  μl primer 27F
(forward) dan  0.5  μl primer 1492R (reverse ).  Tahap  pertama  yaitu  denaturasi awal  pada  suhu  95 o C  selama  3  menit  (1 siklus). Tahap kedua yaitu denaturasi pada suhu  98 o C  selama  15  detik,  penempelan primer pada  suhu  52 o C  selama  30  detik dan  elongasi  pada  suhu  68 o C  selama  45 detik. Tahap kedua dilakukan sebanyak 35
siklus.  Tahap  terakhir  yaitu holding dilakukan  pada  suhu  4 o C  (Genetika Science Indonesia, komunikasi pribadi).
Elektroforesis
Sebanyak  5  μl DNA ladder dimasukan ke dalam gel agarosa 1% untuk menghasilkan ukuran pita DNA. Selanjutnya produk PCR yang mengandung loading  dye dimasukkan  ke dalam  sumur-sumur  gel  agarosa  lalu dialirkan listrik dengan tegangan 100 Volt selama 30 menit. Fragmen DNA divisualisasi menggunakan UV- transluminator dan didokumentasi menggunakan  kamera  digital  (Genetika Science Indonesia, komunikasi pribadi).

## Purifikasi Gel DNA
Gel DNA hasil elektroforesis dipurifikasi menggunakan kit Zymoclean ™ Gel DNA Recovery.

## Sekuensing
Fragmen DNA yang telah diamplifikasi  beserta  dengan  primernya dikirim  ke  1Base  C.O  Malaysia  untuk dilakukan  proses  sekuensing.  Sekuensing dilakukan untuk menentukan urutan fragmen DNA.

## Analisis Data
Kromatogram
disunting menggunakan  Geneious  11.1.5.  Sebanyak 50  nukleotida  di  bagian  awal  dan  akhir dari  sekuens  yang  mengandung  primer dihilangkan.  Konsensus  sekuens  diperoleh dengan  cara pairwise  alignment dari sekuens forward dan reverse .  Setelah  itu sekuens  DNA  dianalisis  menggunakan Basic  Local  Alignment  Search  Tool (BLAST)  untuk  mencari  sekuens  yang serupa yang tersedia di GenBank.
Kemudian  Sekuens  16S  rRNA  dijajarkan menggunakan  Multalin  5.4.1  (Tallei  dan Kolondam,  2015).  Setelah  itu,  pohon filogenetik  dibuat  menggunakan  piranti
MEGA  7.0.26  dengan  metode  UPGMA.
Jarak genetik diperoleh berdasarkan Kimura-2 parameter method yang terintegrasi pada MEGA 7.0.26 (Linelejan, 2018; Rambitan, 2018).

## HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri Asam Laktat
Hasil fermentasi merupakan sumber isolat  bakteri  asam  laktat  (BAL).  Cairan hasil  fermentasi  selama  4  hari  pada  suhu ruang  dan  dalam  keadaan  gelap  ditebar  di media  MRS  agar  yang  mengandung CaCO 3 1%  dan  diinkubasi.  Hasil  inkubasi menunjukkan  adanya  pertumbuhan  koloni bakteri,  sehingga  dapat  dinyatakan  bahwa bakteri  yang  tumbuh  merupakan  bakteri yang  tahan  terhadap  konsentrasi  garam 10%,  sesuai  dengan  karakteristik  BAL (Gomes et  al. , 2010). Koloni bakteri  yang tumbuh  terlihat  memiliki  zona  bening  di sekitarnya.  Zona  bening  ini  yaitu  endapan kalsium  laktat  yang  merupakan  produk dari  reaksi  antara  asam  laktat  yang diproduksi oleh bakteri dengan CaCO 3 1% yang ada pada media.
Terdapat  perbedaan  jumlah  koloni yang  tumbuh  pada  setiap  pengenceran. Pada  pengenceran  10 -5 terdapat  5  koloni bakteri, pada pengenceran 10 -4 terdapat 26 koloni bakteri sedangkan pada pengenceran  10 -3 ,  10 -2 ,  10 -1 serta  cairan fermentasi  tanpa  pengenceran  koloni bakteri  tidak  dapat  dihitung.  Sehingga dapat  dinyatakan  bahwa  semakin  banyak pengenceran  yang  dilakukan  maka  jumlah koloni bakteri akan semakin berkurang.
Dari  pengenceran  10 -4 dan  10 -5 diperoleh  dua  koloni  dengan  morfologi yang  berbeda  serta  memiliki  zona  bening di sekitarnya.
Koloni-koloni
ini dimurnikan  menggunakan  metode streak plate sehingga didapat 2 isolat murni yang diberi  nama  MG1  dan  MG2.  MG1
memiliki  warna  putih  susu,  tepian  yang tidak beraturan, berbentuk bulat, berukuran  kecil  dan  berelevasi  cembung. MG2  memiliki  warna  putih,  tepian  rata, berbentuk  bulat,  berukuran  sedang  dan berelevasi cembung.

## Pewarnaan Gram
Hasil
pewarnaan Gram menunjukkan  bahwa  kedua  isolat  baik MG1  maupun  MG2  berwarna  ungu, sehingga  dapat  dinyatakan  bahwa  kedua isolat  merupakan  bakteri  Gram  positif  . Hasil  pengamatan  di  bawah  mikroskop dengan  perbesaran  100  kali  menunjukkan bahwa isolat MG1 maupun MG2 memiliki bentuk sel kokus. Berdasarkan hal tersebut maka  dapat  dinyatakan  isolat  MG1  dan MG2  memiliki  karakteristik  bakteri  asam laktat (BAL) yang mana menurut Lahtinen et  al. (2012)  BAL  merupakan  bakteri Gram  positif  yang  berbentuk  batang  atau kokus.

## Uji Katalase
Hasil  uji  katalase  menunjukkan bahwa  kedua  isolat  baik  MG1  maupun MG2  memiliki  katalase  negatif.  Hal  ini dikarenakan kedua isolat tidak menghasilkan  gelembung  ketika  ditetesi larutan  H 2 O 2 5%.  Hasil  ini  dibandingkan dengan  bakteri  pembanding  ( Escherichia coli )  yang  diketahui  memiliki  katalase positif  serta  menghasilkan  gelembung ketika ditetesi dengan larutan H 2 O 2 5%. Ini menandakan  bahwa  kedua  isolat  tidak menghasilkan  enzim  katalase  yang  dapat mengkatalisis H 2 O 2 menjadi 2H 2 O dan O 2 , dimana  O 2 merupakan  gelembung  yang terlihat  pada  pengujian  katalase  dari E. coli .
Identifikasi Molekuler Menggunakan Gen 16S rRNA
Gambar 1. Hasil elektroforesis
Berdasarkan  hasil  elektroforesis
(Gambar  1)  dapat  diketahui  bahwa fragmen DNA yang diamplifikasi memiliki panjang sekitar 1400 bp. Setelah dilihat  menggunakan  Geneious  11.1.5, diketahui  bahwa  MG1  memiliki  panjang 1400  bp  sedangkan  MG2  memiliki panjang  1411  bp.  Fragmen  DNA  ini merupakan  daerah  yang  mengkode  16S rRNA.  Fragmen  ini  memiliki  daerah variabel,  dimana  pada  daerah  ini  urutan basa  nitrogen  pada  setiap  spesies  bakteri berbeda-beda  sehingga  dapat  menentukan spesies dari MG1 dan MG2.
Hasil identifikasi menunjukkan bahwa MG1 memiliki kemiripan 99% dan MG2  memiliki  kemiripan  100%  dengan kebanyakan  spesies Enterococcus  faecium yang diteliti, kecuali E. faecium strain JE1.
Hal  ini  menyatakan  bahwa  kedua  isolat merupakan  spesies  yang  sama  meskipun memperlihatkan  morfologi  yang  berbeda. Hal ini dikarenakan karakteristik morfologi  yang  ditunjukkan  oleh  MG1 maupun  MG2  sangat  dipengaruhi  oleh kondisi  lingkungan,  seperti  suhu  dan  pH, sehingga identifikasi berdasarkan karakteristik  morfologinya  saja  bisa  tidak akurat.
Gambar 2. Rekonstruksi filogenetik Hasil rekonstruksi pohon filogenetik dapat dilihat  pada    Gambar  2,  dimana  isolat MG1 dan MG2 berada dalam spesies yang sama dengan Enterococcus faecium , dibandingkan dengan pembandingnya yaitu E. faecalis . Jarak genetik antar taksa dihitung  menggunakan  metode  Kimura  2- parameter (Tabel 1) (Kimura, 1980). Jarak genetik  antara  isolat  MG1  dengan  MG2 dan E. faecium lainnya yaitu 0.002 (0.2%), kecuali strain JEI  yaitu  0,004  (0,4%). Jarak  genetik  antara  MG2  dengan E. faecium lainnya  yaitu  0.000,  kecuali dengan strain JEI  yaitu  0,001  (0,1%). Menurut Konstantinidis dan Tiedje (2005), berdasarkan  identitas  sekuens  gen  16S rRNA,  bakteri  dapat  dinyatakan  spesies yang  sama  apabila  kemiripannya  lebih besar  dari  97%.  Meskipun  demikian, Edgar  (2018)  menyatakan  bahwa  ambang identitas  optimal  spesies  bakteri  yaitu ~99% untuk  sekuens 16S rRNA utuh,  dan ~100% untuk daerah V4 yang hypervariable.

## Tabel 1. Jarak genetic antar taksa menggunakan metode Kimura 2 parameter
Genus Enterococcus termasuk  ke dalam  bakteri  penghasil  asam  laktat dengan  ciri-ciri  Gram  positif,  katalase negatif,  tidak  membentuk  spora,  fakultatif anaerob  serta  berbentuk  kokus.  Secara filogenetik, Enterococcus termasuk  ke dalam filum Firmicutes , kelas Bacilli , ordo Lactobacillales dan famili Enterococcacae (Gomes et  al., 2010;  Lahtinen et  al. ,
2012).
Enterococcus  faecium memiliki banyak  manfaat  menguntungkan  bagi kesehatan, antara lain;
dapat mengasimilasi  kolestrol  (El-Jeni et  al. , 2015),  dapat  menurunkan  angka  kejadian diare (Jatkauskas dan Vrotniakienė, 2014), dapat meningkatkan sistem imun (Scharek et  al. ,  2005),  dapat  meningkatkan  berat badan  (Simonova et  al. ,  2009)  serta memiliki aktivitas antibakteri dari bermacam-macam bakteriosin yang diproduksinya (Cintas et al. , 1997; El-Jeni et al. , 2015)
Enterococcus faecium dapat
dijadikan starter dalam  proses  fermentasi makanan  (Gomes et  al., 2010)  yang membuatnya dapat  mencegah kontaminasi dari  makanan  yang  difermentasi.  Selain itu,  asam  laktat  yang  diproduksinya  dapat memberikan  cita  rasa  unik  pada  makanan yang  membuatnya  disukai  banyak  orang (Lahtinen et al. , 2012).
KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa isolat  bakteri  asam  laktat  MG1  dan  MG2 hasil  fermentasi  selada  romain  merupakan Enterococcus faecium .

## SARAN
Perlu  diadakan  penelitian  lebih lanjut  tentang  probiotik  potensial  yang mencakup  aktivitas  antibakteri,  enzim BSH ( bile salt hydrolase ) dan kemampuan tahan asam dari Enterococcus faecium.

## DAFTAR PUSTAKA
Cintas  L.  M., Casaus,  P., Håvarstein,  L.
S., Hernández,  P.  E., Nes  I.  F.
1997.   Biochemical   and genetic characterization  of enterocin P,  a novel  sec-dependent  bacteriocin from   Enterococcus  faecium  P13 with a broad   antimicrobial spectrum. Appl Environ  Microbiol .
63(11) : 4321–4330.
Das,  S.,  Dash,  H.  R.,  Mangwani,  N., Chakraborty,  J.,  Kumari,  S.  2014. Understanding Molecular Identification and Polyphasic Taxonomic Approaches for Genetic Relatedness and Phylogenetic Relationships of Microorganisms. Journal of Microbiological Methods . 103 : 84. Dow.  A.,  C.  Alvarado.,  M.  Brashears. 2010.   Reduction  of  inoculated
Salmonella cocktail  in    ground
No. Strain 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 MG1 2 MG2
0,002
3 CP033041.1 E. faecium JE1 0,004 0,001 4 MH900221.1 E. faecium E1 0,002 0,000 0,001 5 MH819597.1 E. faecium HBUAS54363 0,002 0,000 0,001 0,000 6 MH817719.1 E. faecium HBUAS54268 0,002 0,000 0,001 0,000 0,000 7 MH733939.1 E. faecium LM5.10 0,002 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 8 MG976843.1 E. faecium E6 0,002 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000 9 MG911720.1 E. faecium WR1 0,002 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 10 MH588228.1 E. faecium ACD44-2 0,002 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 11 MH569604.1 E. faecium MZF2 0,002 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 12 CP014949.1 E. faecalis LD33 0,030 0,028 0,028 0,028 0,028 0,028 0,028 0,028 0,028 0,028 0,028
turkey and turkey breasts  using
Lactobacillus -based   intervention.
Poultry Science. 90 :   876.
Edgar,  R.  C.  2018.  Updating  the  97%
Identity Threshold for 16S Ribosomal RNA OTUs. Bioinformatics . 34(14) : 2371-2375. El-Jeni,  R.,  El  Bour,  M.,  Calo-Mata,  P.,
Bohme,  K.,  Fernandez-No,  I.  C., Barros-Velazquez,  J.,  Bouhaouala-
Zahar,  B.  2015.  In-vitro  probiotic profiling of novel  Enterococcus faecium and Leuconostoc mesenteroides Lactic Acid Bacteria  strains  from  Tunisian freshwater fishes. Canadian Journal of Microbiology. 62(1) : 60-71.
Fleck.  C.  Z.,  Savić,  V.,  Kozačinski,  L., Njari,  B.,  Zdolec,  N.,  Filipović,  I. 2012.   Identification   of lactic acid
bacteria isolated from dry fermented sausages. Veterinarski Arhiv . 82(3) : 265.
Gomes,  B.  C.,  Franco,  B.  D.  G.  M.,
Martinis,  E.  C.  P.  D.  2010. Dualistic aspects of Enterococcus spp. in   foods. A.
Mandez-Vilaz . 1119-1122.
Jatkauskas, J., dan V. Vrotniakienė. 2014.
Effect  of  Encapsulated  Probiotic Enterococcus   faecium  Strain  on Diarrhoea Patterns and Performance   of  Early  Weaned Calves. Vet Med   Zoot. 67(89) : 47.
Khalid.  K.  2011.  An  Oerview  of  Lactic
Acid Bacteria. International Journal of Biosciences. 1(3) :
2.
Kimura,  M.  1980.  A  simple  method  for estimating evolutionary rate of base substitutions   through comparative studies  of  nucleotide  sequences.
Journal of Molecular   Evolution .
16 : 111-120.
Konstantinidis,  K.  T.  dan  Tiedje  J.  M.
2005.   Genomic Insights that advance the species definition for prokaryotes . Proc.  Natl. Acad. Sci. USA . 102(7) :
2567-  2572. Lahtinen, S., Ouwehand, A. C., Salminen,
S., Wright, A. V. 2012. Lactic Acid Bacteria Microbiological and
Functional  Aspects. Edisi  keempat. CRC Press, London.
Lawalata,  H.J.,  Sembiring,  L.,  Rahayu,  E.
S. 2011. Molecular identification of Lactic  Acid Bacteria  producing  antimicrobial agents from bakasang, an Indonesian  traditional  fermented fish product. Indonesian J. Biotech . 16(2) :  93-99.
Linelejan,  Y.  T.,  Umboh,  S.  D.,  Tallei,  T. E. 2018.  Identifikasi  Bakteri Endofit Daun Ficus Minahassae (Teijsm.  & De Vriese)  Miq.  Berdasarkan  Gen  16s
rRNA. Jurnal MIPA   UNSRAT.
7(2) : 17.
Meremae,  K.,  Elias,  P.,  Tamme,  P.  T.,
Kramarenko,  T.,  Lillenberg,  M., Karus,  A.,  Hanninen,  M.  L., Roasto, M. 2010. The occurrence of Campylobacter spp.
in Estonian broiler chicken
production in 2002–  2007. Food Control. 21 : 272– 275. Rambitan, G. 2017. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Hasil Fermentasi Kol Merah ( Brassica oleracea L.) sebagai probiotik potensial  [skripsi]. FMIPA UNSRAT, Manado.
Reynolds,  J.  2011. The  Gram  Strain .
Richard Collage, Bournemounth.
Scharek,  L.,  Guth,  J.,  Reiter,  K.,
Weyrauch, D.  K.,  Taras,  D.,
Schwerk, P.,   Schierack,  M.  F.,
Schmidt, L.,   Wieler,  H.,  Tedin, K. 2005. Influence of a probiotic Enterococcus faecium strain on development of the immune system of
sows and piglets. Vet.  Immunol.
Immunopathol. 105 : 151- 161.
Senthilraj,  R.,  Prasad,  G.  S.,  Janakiraman,
K. 2016. Sequence-based
identification   of microbial
contaminants in non-parenteral products. Brazilian  Journal  of Pharmaceutical  Sciences. 52(2) :
330.
Simonova, P. M., Laukova, A.,
Chrastinova,  L.,  Strompfova,  V.,
Faix, Š., Vasilkova, Z., Ondruška, Ľ.,  Jurčik,  R.,  Rafay,  J.  2009a. Enterococcus faecium CCM 7420,   bacteriocin PPB CCM 7420 and their effect in  the  digestive  tract  of  rabbits. Czech J. Anim. Sci. 54 : 376- 386.