Majalah Farmasi, Sains, dan Kesehatan ISSN 2442-9791
Penentuan  Aktivitas  Siklisasi-β  Siklodekstrin  Glukosiltransferase Wild Type , H43K, P84Y, Y93F, Y188L, dan S468F dari Bacillus sp.
A2-5a terhadap Pati Terlarut
Tina Rostinawati *1 , Yeyet Cahyati Sumirtapura 2 , Elfahmi 2 , Debbie Sofie Retnoningrum 2
1 Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran, Jl. Raya Bandung-Sumedang KM 21 Jatinangor 45363
2 Sekolah Farmasi Institut teknologi Bandung, Jl. Ganesha No. 10 Bandung 40132

## Abstrak
Siklodekstrin (CD) merupakan oligosakarida yang terdiri atas enam sampai delapan glukosa yang dihubungkan dengan ikatan 1,4 glikosida (CD-α, -β dan -γ). Molekul ini memiliki kemampuan membentuk kompleks inklusi dengan suatu molekul ”tamu” ( guest) yang  bersifat  hidrofobik.  CD  membentuk  cincin  yang  rongganya  bersifat  hidrofob  namun  permukaan  luarnya  bersifat  hidrofil sehingga  memungkinkan molekul tamu  yang tidak larut air untuk berkompleks di dalam rongganya. Senyawa ini diaplikasikan secara  luas  pada  berbagai  industri  farmasi,  bioteknologi,  makanan,  kimia,  tekstil,    pertanian  dan  juga  untuk  perlindungan lingkungan.  CD  dihasilkan  melalui  reaksi  enzimatis  siklodekstrin  glikosiltransferase  (CGTase)  terhadap  pati  sebagai  substrat. CGTase yang berasal dari Bacillus sp. A2-5a (BA2-5a) merupakan CGTase-β yang menghasilkan CD-β sebagai produk utamanya dengan sebagian kecil CD-α dan selebihnya CD-γ. Pada penelitian sebelumnya telah dihasilkan CGTase BA2-5a mutan melalui substitusi asam amino pada posisi 43, 84, 93, 188 dan 468 yang menghasilkan CGTase BA2-5a H43K, P84Y, Y93F, Y188L dan S468F.  Pada  penelitian  ini  ditentukan  aktivitas  siklisasi-β  CGTase  BA2-5a  wild  type  dan  CGTase  mutan  H43K,  P84Y,  Y93F, Y188L dan S468F. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas siklisasi-β CGTase wild type dan pengaruh substitusi asam amino pada posisi 43, 84, 93, 188 dan 468 terhadap aktivitas tersebut. Hasil penelitian menunjukkan aktivitas siklisasi-β CGTase wild type, CGTase H43K, CGTase P84Y, CGTase Y93F, CGTase Y188L dan CGTase S468F adalah 5,01; 2,14; 2,78; 1,77; 0,62; dan 3,37 unit/ml. Pada penelitian ini juga ditentukan aktivitas spesifik CGTase wild type, CGTase H43K, CGTase P84Y, CGTase Y93F, CGTase Y188L dan CGTase S468F sebagai berikut : 65,6; 41,2; 53,8 29,1; 11,0; dan 57,6 (unit/mg). Substitusi asam amino pada CGTase BA2-5a menunjukkan penurunan aktivitas siklisasi-β.
Kata kunci: BA2-5a, CGTase wild type , substitusi, CGTase mutan, aktivitas siklisasi-β

## 1. Pendahuluan
Siklodekstrin  (CD)  merupakan  suatu  molekul siklik yang dihasilkan dari pati yang dimodifikasi secara enzimatik yang diaplikasikan secara luas dalam industri makanan,  farmasi,  kimia  dan  pertanian.  Molekul  ini memiliki  kemampuan  membentuk  kompleks  inklusi dengan  suatu  molekul  ”tamu”  ( guest) yang  bersifat hidrofobik.  CD  membentuk  cincin  yang  rongganya bersifat  hidrofob  namun  permukaan  luarnya  bersifat hidrofil,  sehingga  memungkinkan  molekul  tamu  yang tidak  larut  air  untuk  berkompleks  di  dalam  rongganya. Dalam  bidang  farmasi,  CD  mempunyai  peranan  yang luas  diantaranya  untuk  memperbaiki  kelarutan  obat dalam air sehingga meningkatkan bioavaibilitas senyawa obat,  meningkatkan  stabilitas  senyawa  obat  (pengaruh
* Departemen Biologi Farmasi Email: tinarostinawati@gmail.com
kimia  fisika:  pemanasan,  proses  beku  kering, penyimpanan  atau  keberadaan  senyawa  pengoksidasi) dan agregasi [1].
CGTase dari Bacillus sp. galur A2-5a (nomer akses BAA31539)  terutama  menghasilkan  CD-β  (CGTase-β) dengan aktivitas siklisasi jauh lebih tinggi dari aktivitas hidrolisis  (rasio  313,  tertinggi  dari  CGTase  yang dilaporkan [2]). CGTase ini menghasilkan CD-α, -β, -γ dengan  rasio  5:77:18,  mempunyai  aktivitas  hidrolisis paling rendah diantara CGTase-β  yang dilaporkan [2]). Telah  dilaporkan  pula  CGTase  BA2-5a  memproduksi sikloamilosa dengan derajat polimerisasi besar (9 gugus glikosil  atau  lebih  besar)  pada  tahap  awal  yang selanjutnya,  dengan  merubah  sikloamilosa  besar
Rostinawati, dkk: Penentuan Aktivitas Siklisasi-β Siklodekstrin Glukosiltransferase Wild Type, H43K, P84Y,
Y93F, Y188L, dan S468F dari Bacillus sp. A2-5a Terhadap Pati Terlarut
menjadi  lebih  kecil  dan  akhirnya  menjadi  CD  tujuh gugus  glikosil  atau  CD-β  dibandingkan  CGTase  yang berasal dari Bacillus macerans dan Bacillus stearothermophilus yang    memproduksi  sikloamilase spesifik untuk CD-α [3].
Pada  penelitian  sebelumnya  telah  dilakukan mutagenesis  terarah  dan  mutasi  secara  acak  pada  gen sintetik  pengkode  CGTase  BA2-5a.  Mutagenesis  pada kodon  93  yang  mengubah  tirosin  menjadi  fenilalanin telah  yang  dilakukan  pada  gen cgtase sintetik  [4,5]. Pemilihan  residu-residu  asam  amino  yang  disubstitusi berdasarkan  pada  analisa  urutan  asam  amino  dan penelitian  yang  sudah  ada  sebelumnya  karena  tidak adanya  ketersediaan  data  struktur  CGTase  BA2-5a. Untuk  substitusi  dipilih  residu  pada  posisi  47,  89,  100 dan  195  (43,  84,  93  dan  188  pada  CGTase  BA2-5a). Substitusi  Y93F  CGTase  terhadap  spesifisitas  produk telah  dilaporkan  [4].  CGTase Bacillus sp.  A2-5a  ini memiliki beberapa kelebihan dibandingkan CGTase dari bakteri  lain.  Telah  dilaporkan  studi  komparasi  tiga CGTase  dari  bakteri  penghasil  CGTase  yaitu  dari Bacillus sp. A2-5a (CGTase A2-5a), Bacillus macerans (CGTase  Bmac)  dan Bacillus  stearothermophilus (CGTase Bste). Hasilnya  menunjukkan bahwa CGTase A2-5a  memproduksi  sikloamilosa  dengan  derajat polimerisasi  besar  (9  gugus  glikosil  atau  lebih  besar) pada  tahap  awal  pertumbuhan  bakteri.  Spesifikasi produksi  sikloamilosa  terjadi  pada  tahap  selanjutnya, dengan merubah sikloamilosa besar menjadi lebih kecil dan akhirnya menjadi CD tujuh gugus glikosil atau CD- β.  CGTase  Bmac  dan  CGTase  Bste  memproduksi sikloamilase spesifik untuk CD-α.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui pengaruh  substitusi  asam  amino  CGTase  BA2-5a  pada posis  43(H K),  84(P Y),  93(Y F)  dan  188(S F) terhadap  aktivitas  siklisasi-β  dan  aktivitas  spesifiknya sehingga  dapat  mengetahui  peranan  dari  residu-residu asam amino tersebut pada CGTase BA2-5a.

## 2. Metode

## 2.1 Overproduksi dan Pemurnian CGTase Rekombinan
Koloni  tunggal  yang  berasal  dari E.  coli BL21(DE3)  diambil  dengan  bantuan  kawat  ose  dan dikultivasi  dalam  medium  LB  cair  10  mL  yang mengandung antibiotik kanamisin  pada suhu 37 °C dan 150  rpm  selama  18  jam.  Sebanyak  2%  kultur ditambahkan ke dalam labu yang berisi medium LB 500 mL  untuk  overproduksi  skala  besar.  Kultur  diinkubasi lagi selama 3 jam pada suhu 37 °C dan 200 rpm untuk mencapai  OD  (Optical  density=0,6).  Konsentrasi optimum IPTG yang digunakan untuk produksi rCGTase pada E. coli BL21(DE3) adalah 0,1 mM [5]. Selanjutnya kultur diinkubasikan lagi selama 6 jam pada kondisi suhu
25  °C  dan  200  rpm  [6].  CGTase  rekombinan  yang mengandung  pJexpress401  _cgtase_optEc  diturunkan suhu  pasca  induksi  menjadi  25 ° C  menunjukkan  hasil pembentukan  Badan  Inklusi  (BI)  yang  terbentuk  18% dan protein terlarut sebesar 82% dari total CGTase [6]. Sel  dipanen  dengan  sentrifugasi  dingin  pada  3400  x  g selama 20 menit dan ditambah dapar lisis pH 8,0 (50 mM NaH 2 PO 4 ,  300  mM  NaCl)  yang  mengandung  1  mM fenilmetil sulfonil fluoride. Sel dipecah dalam es selama 2  menit  dengan  selang  waktu  5  detik  menggunakan sonikator dengan amplitude 25%.
Pemurnian  CGTase  dari  protein-protein  lain dilakukan  menggunakan  resin  Ni-NTA  Agarose (Qiagen®). CGTase Bacillus sp. A2-5a mutan dan wild type dioptimasi pemurniannya pada tahap elusi dengan menggunakan konsentrasi imidazol bertingkat yaitu 15, 50,  100,  200  dan  250  mM.  Selanjutnya  CGTase  murni ditentukan bobot molekulnya menggunakan SDS-PAGE 10% (b/v). Konsentrasi CGTase ditentukan dengan cara membandingkan  dengan  konsentrasi  protein  BSA dengan  metode  Bradford  menggunakan  pereaksi Bradford (Bio-Rad®). Kurva standar dibuat menggunakan  protein  BSA  murni  dengan  berbagai konsentrasi yang direaksikan dengan pereaksi Bradford dan  diukur  absorbannya  pada  λ  595  nm.  CGTase  hasil pemurnian  direaksikan  dengan  pereaksi  Bradford, diukur  absorbannya  dan  ditentukan  konsentrasinya berdasarkan kurva standar (Bio-Rad protocol).

## 2.2 Uji aktivitas CGTase Mutan dan wild type dengan metode Zymografi
Uji aktivitas CGTase BA2-5a mutan dan wild type dilakukan  pada  PAGE-natif  yang  diwarnai  dengan indikator  fenolftalein.  CGTase  dielektroforesis  dalam bentuk  natifnya  menggunakan  PAGE-natif.  CGTase dielektroforesis pada satu gel dan kemudian gel tersebut dipotong  sama  bagian.  Hasil  elektroforesis  pertama diwarnai dengan coomassie blue sedangkan yang kedua dengan gel indikator fenolftalein. Pada metode ini dibuat gel  indikator  segar  dengan  mencampurkan  pati  terlarut 0,24 g dan agarosa 0,14 g dalam dapar fosfat 16 mL (pH 8,  0,2  M)  lalu  dipanaskan  hingga  pati  terlarut.  Setelah larutan terbentuk ditambahkan larutan fenolftalein 0,4% (b/v) sebanyak 0,5 mL dan didinginkan sampai suhu 50 °C. Gel indikator dituang secara merata di atas PAGE- natif  dan  dibiarkan  memadat,  kemudian  diinkubasi selama  lima  menit  pada  suhu  37  °C.  Setelah  itu,  gel dituang  dengan  Na 2 CO3  10%,  daerah  bening  yang muncul menunjukkan aktivitas pembentukan CD-β [7].
2.3 Aktivitas  Siklisasi-β  CGTase  wild  type  dan  mutan (Penentuan aktivitas dan aktivitas spesifik)
Rostinawati, dkk: Penentuan Aktivitas Siklisasi-β Siklodekstrin Glukosiltransferase Wild Type, H43K, P84Y,
Y93F, Y188L, dan S468F dari Bacillus sp. A2-5a Terhadap Pati Terlarut
Aktivitas siklisasi CGTase ditentukan seperti yang dinyatakan  di  dalam  Moriwaki  dkk.  (2009)  dengan sedikit  modifikasi  [8].  Reaksi  terdiri  dari  0,9  ml  pati terlarut  yang  terpegelatinasi  (10  %)  di  dalam  50  mM dapar Tris-HCl (pH 7) dan ditambahkan 0,1 ml larutan enzim. Reaksi berjalan pada kondisi suhu inkubasi 60 °C (suhu  optimum)  selama  30  menit.  Reaksi  dihentikan dengan  pemanasan  dalam  air  yang  mendidih  selama  5 menit.  CD-β  yang  terbentuk  diukur  dengan  metode kolorimetri  berdasarkan  mekanisme  pembentukan kompleks  inklusi  fenoftalein  di  dalam  CD-β  [9].  Satu unit  aktivitas  didefinisikan  sebagai  sejumlah  enzim menghasilkan 1 µmol CD-β per menit.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1 Overproduksi dan pemurnian CGTase
E. coli transforman  yang telah  membawa plasmid pJx_cgtase_optEc kemudian digunakan untuk mengoverekspresikan  protein  CGTase.  Pada  proses overproduksi protein CGTase dilakukan penambahan 10 mM CaCl 2 yang bertujuan untuk meningkatkan aktivitas CGTase.  Penambahan  10  mM  CaCl 2 mampu meningkatkan  aktivitas  enzim  CGTase  sebesar  40% dibandingkan tanpa penambahan CaCl 2 [10].
Gambar  1. Hasil  Purifikasi  dengan  resin  Ni-NTA menggunakan  konsentrasi  imidazole  bertingkat  :  Lajur  1) protein crude, lajur 2) Flow Thrrough, lajur 3-4) Washing 1-2 (tanpa imidazol), lajur 5-6) Elusi (imidazol 50 mM), lajur 7-8) Elusi (imidazol 100 mM), lajur 9-10) Elusi (imidazol 150 mM), lajur  11-12)  Elusi  (imidazol  200  mM),  lajur  13-14)  Elusi (imidazol (250 mM) dan lajur 15) BSA
Keberadaan  ion  Ca 2+ membantu  pelipatan  enzim CGTase  menjadi  bentuk  aktif.  Berdasarkan  data  blast dari  NCBI,  urutan  asam  amino  CGTase  BA2-5a  99% homolog  dengan  urutan  asam  amino  CGTase  yang berasal dari Bacillus ohbensis (Bacoh). Berdasarkan data uniprot www.uniprot.org , Bacoh membutuhkan dua ion Ca 2+ untuk  membantu  folding  proteinnya  dan berdasarkan  hasil  data alignment, kedua  CGTase  ini memiliki  jenis  residu  asam  amino  yang  sama  yang berperan dalam pengikatan dengan ion kalsium.
Pemurnian  protein  CGTase  dilakukan  dengan menggunakan resin Ni-NTA menggunakan pereaksi dan prosedur yang berasal dari kit Protino® Ni-TED dengan
optimasi  pada  tahap  elusi  dengan  menggunakan konsentrasi  imidazol  bertingkat  yaitu  15,  50,  100,  200 dan  250  mM.  Dengan  cara  elusi  bertahap,  didapatkan protein CGTase yang bebas dari protein lain yang tidak diinginkan.  Salah  satu  protein  pengotor  ini  adalah monomer protein Lac repressor yang berukuran sekitar 45 kDa. Protein ini memiliki histidin pada posisi ke 163, 173,  and  202  di  tiap  monomernya  sehingga  mampu berikatan pada kolom nikel [11]. Protein pengotor dapat terpisah  dengan  protein  target  berdasarkan  perbedaan afinitasnya  dengan  Nikel  dan  pengotor  terlihat  terelusi secara  bertahap  pada  larutan  elusi  dengan  konsentrasi imidazol yang lebih rendah. Pada elusi dengan imidazol 100, 200 mM terlihat pita tunggal dengan ukuran teoritis 76,39  kDa  yang  pada  elektroforegram  terletak  di  atas protein  BSA  yang  berukuran  65  kDa,  sedangkan  pada elusi 250 mM sudah tidak ada lagi protein yang terelusi (Gambar  1).  Hasil  elusi  dengan  imidazol  100  dan  200 mM  dikumpulkan  kemudian  dipekatkan  dengan nanoshep  10K.  Hasil  pemekatan  dapat  dilihat  pada (Gambar 2).
Gambar  2. Hasil  Pemekatan  Protein  CGTase  wild  type  dan mutan meggunakan Nanoshep 10K. M = marka protein, lajur 1: CGTase wild type, lajur 2: CGTase H43K, lajur 3: CGTase P84Y, lajur 4: CGTase Y93F, lajur 5: CGTase Y188L dan lajur 6: CGTase S468F

## 3.2 Uji  aktivitas  CGTase  wild  type  dan  mutan  dengan metode Zymografi
Penelitian  ini  menggunakan  PAGE-natif  yang bertujuan  protein  yang  bermigrasi  dalam  akrilamid merupakan protein dalam bentuk natif sehingga mampu melakukan  aktivitas  enzimatis  dalam  gel.  Metode Zymografi  digunakan  untuk  mendeteksi  aktivitas CGTase  untuk  menghidrolisis  pati  dan  aktivitas siklisasi-β [7].
Pengujian  hidrolisis  pati  menggunakan  pewarna iodin (KI/I 2 ) yang memberi warna hitam kebiruan ketika I 3 ¯ membentuk kompleks dengan struktur kumparan pati [12].  Pada  pati  yang  terhidrolisis,  struktur  kumparan terputus  menjadi gula dengan rantai  yang lebih pendek sehingga  I 3 ¯ tidak  dapat  membentuk  kompleks  dengan pati  yang  telah  terurai  sehingga  warna  hitam  tidak
Rostinawati, dkk: Penentuan Aktivitas Siklisasi-β Siklodekstrin Glukosiltransferase Wild Type, H43K, P84Y,
Y93F, Y188L, dan S468F dari Bacillus sp. A2-5a Terhadap Pati Terlarut
terbentuk. Hasil uji hidrolisis pati pada PAGE natif yang telah  ditambahkan  peraksi  iodin  terbentuk  zona  bening di  pita  protein  CGTase  yang  menunjukkan  protein CGTase  memiliki  aktivitas  hidrolisis  terhadap  pati (Gambar  3).  CGTase  merupakan  enzim  yang  termasuk keluarga  glikosil  hydrolase  13  yang  mempunyai aktivitas  umum  dalam  menghidrolisis  pati.  CGTase dapat  memutus  ikatan  α-(1,4)  antar  unit  gula  dari  pati juga  mentransfer  oligosakarida  yang  terikat  kovalen kepada  molekul  air  (reaksi  hidrolisis)  melalui pembentukan ikatan hidrogen. Dengan adanya aktivitas hidrolisis,  memberikan  kemudahan  dalam  ketersediaan substrat  dengan  rantai  gula  yang  lebih  pendek  untuk inisiasi reaksi siklisasi pada pembentukan CD [13].
Gambar  3 .  Hasil  uji hidrolisis  CGTase  wild  type  dan  mutan dengan metode Zimografi. Lajur 1) CGTase wild type, lajur 2) CGTase H43K, lajur 3) CGTase P84Y, lajur 4) CGTase Y93F, lajur 5) CGTase Y188L dan lajur 6) CGTase S468F
Pengujian aktivitas siklisasi-β dilakukan menggunakan  indikator  fenolftalein  untuk  mengetahui adanya  pembentukan  CD-β  oleh  CGTase  yang dipisahkan pada PAGE-natif. Pengujian ini memberikan hasil  positif  dengan  terjadinya  perubahan  warna  dari merah  muda  menjadi  tidak  berwarna  pada  reaksi siklisasi-β yang diamati. Pada metode zymografi ini, gel yang telah diselimuti larutan pati yang mengandung agar dan  fenolftalein  dalam  kondisi  basa  berwarna  merah muda  dan  setelah  tahap  inkubasi  terlihat  zona  putih  di sekitar  protein  CGTase.  Proses  ini  menunjukkan  telah terbentuknya  CD-β  dan  kompleks  inklusi  dengan masuknya fenoftalein ke dalam rongga CD-β [7]. Hasil reaksi siklisasi-β dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Hasil uji siklisasi-β CGTase wild type dan mutan dengan metode Zimografi. Lajur 1) CGTase wild type, lajur 2) CGTase H43K, lajur 3) CGTase P84Y, lajur 4) CGTase Y93F (Rostinawati,  2015),  lajur  5)  CGTase  Y188L  dan  lajur  6) CGTase S468F
3.3 Aktivitas siklisasi-β CGTase wild type dan mutan Reaksi siklisasi CGTase diawali dengan perlakukan pati terlebih dahulu dengan proses gelatinasi. Gelatinasi  pati  merupakan  suatu  proses  pemutusan ikatan  intermolekul  suatu  molekul  pati  dengan  adanya air  dan  panas  sehingga  menyiapkansitus  pengikatan hidrogen  dengan  keberadaan  air.    Dengan  pati  yang sudah  digelatinasi,  maka  proses  siklisasi  dapat berlangsung  lebih  cepat  karena  proses  ini  akan menyiapkan molekul gula rantai pendek. Pada penelitian ini uji aktivitas β-siklisasi dilakukan dengan memberikan  perlakuan  awal  terhadap  substrat  yaitu dengan gelatinasi. Gelatinasi merupakan perlakuan awal untuk mendapatkan molekul gula rantai pendek. Proses ini  sama  dengan  proses jet-cooked  starch yang  umum digunakan  dalam  industri  [14].  Berdasarkan  aktivitas siklisasi-β pada suhu dan pH optimum selama 30 menit didapatkan  data  unit  aktivitas  CGTase  wild  type  dan mutan  (Tabel 1 ).  Pati  yang  tergelatinasi  membentuk gula-gula  rantai  pendek  yang  memudahkan  proses siklisasi.
Tabel 1. Unit aktivitas, aktivitas spesifik dan persen perolehan kembali CGTase wild type dan mutan
Rostinawati, dkk: Penentuan Aktivitas Siklisasi-β Siklodekstrin Glukosiltransferase Wild Type, H43K, P84Y,
Y93F, Y188L, dan S468F dari Bacillus sp. A2-5a Terhadap Pati Terlarut
Parameter aktivitas spesifik suatu enzim mempunyai makna sebagai nilai yang digunakan untuk mengukur kinetik enzim (kecepatan reaksi enzim dengan substrat tertentu). Selain itu aktivitas spesifik enzim juga digunakan  untuk  mengukur  kemurnian  suatu  enzim. Nilai  aktivitas  spesifik  menjadi  lebih  besar  nilainya untuk  enzim  yang  lebih  murni.  Pada  penelitian  ini, aktivitas  spesifik  enzim  berkorelasi  dengan  kinetika enzim karena enzim CGTase wild typ e dan mutan yang digunakan  dimurnikan  dengan  prosedur  dan  resin  Ni- NTA  yang  sama.  Pada  Tabel  1  aktivitas  spesifik  yang terbesar  dimiliki  oleh  CGTase  wild  type  diikuti  oleh CGTase  S468F,  CGTase  P84Y,    CGTase  H43K, CGTase  Y93F  dan  CGTase  Y188L.  Untuk  nilai  (% yield ) diperoleh berdasarkan aktivitas enzim total per ml setelah dimurnikan dibandingkan dengan aktivitas total per ml crude lysat enzim sebelum dimurnikan. Nilai (% yield ) untuk keenam enzim memliki rentang nilai 70-80 % yield artinya perolehan kembali nilai aktivitas keenam enzim tersebut tidak jauh berbeda satu sama lainnya.

## 4. Kesimpulan
Residu  His43,  Pro84,  Tyr93,  Tyr188  dan  Ser468 pada CGTase BA2-5a berperan pada aktivitas siklisasi-β enzim.

## Daftar Pustaka
1. Qingsheng  Q,  dan  W.  Cyclodextrin  Glucanotransferase: from Gene to Applications. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005, 66 ; 475–485.
2. Kelly RM, Dijkhuizen L, dan Leemhuis H. The evolution of  cyclodextrin  glucanotransferase  product  specificity. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009, 84(1) : 119–133.
3. Terada Y, Sanbe H, Takaha T, Kitahata S, Koizumi K, dan Okada S. Comparative study of the cyclization reactions
of three bacterial cyclomaltodextrin glucanotransferases. Appl. Envi. Microbiol., 2001, 67 : 1453–1460.
4. Rostinawati  T,  Riani  C,  Elfahmi,  Sumirtapura  YC,  dan Retnoningrum  DS.  Y93F  Substitution  of  Cyclodextrin Glucanotransferase  from Bacillus sp.  A2-5a  and  its Enzyme Characterization. Biotechnology , 14(4) : 181-187.
5. Muchlisin A. Konstruksi Gen cgtase Sintetik dari Bacillus sp.  A2-5a  untuk  Overekspresi  di  Escherichia  coli BL21(DE3)  serta  uji  aktivitas  produk  gennya. Skripsi. Sekolah Farmasi ITB: Bandung. 2010.
6. Yustiantara  P.  Karakterisasi  Enzim  Cyclodextrin Glucanotransferase  Hasil  Ekspresi  Gen  Sintetis  cgtase dari  Bacillus  sp.  A2-5A  pada    Escherichia  coli  .Tesis. Sekolah Farmasi ITB: Bandung. 2011.
7. Pakzad, SR, Ajdary S, Moazami N, Haghighi S. A Novel Method  to  Detect  β-Cyclodextrin  Glucosyl  Transferase (β-CGTase) Activity on Polyacrylamide Gels, 2005, Iran. Biomed. J. , 9 ; 87-90.
8. Moriwaki  C,  Ferreira  LR,  Rodella  JRT,  Matioli  G.  A novel  cyclodextrin  glycosyltransferase  from  Bacillus sphaericus  strain  41:  Production,  characterization  and catalytic properties. 2009, Biochem. Eng. J. , 48 ; 124-131.
9. Goel  A, Nene  SN.  Modifications  in the phenolphthalein method  for  spectrophotometric  estimation  of  beta cyclodextrin. Starch, 1995, 47(10) ; 399–400
10. Han NS dan Tao BY.  A simple method to express soluble, highly  active  cyclodextrin  glycosyltransferase  in recombinant E. Coli. 1999, Biotechnol. Technol. 13 ; 631- 635.
11. Owens MJ, Knight DL, Nemeroff CB. Second-Generation SSRIs:  Human  Monoamine  Transporter  Binding  Profile of Escitalopram and R-Fluoxetine. Biol. Psychiatry. 2001, 50 ; 345–350.
12. Fuwa  H.  A  New  Method  for  Microdetermination  of Amylase  Activity  by  The  Use  of  Amylose  as  The Substrate. 1954, 41 ; 583-603.
13. Pishtiyski I, Zhekova B. Effect of Different Substrates and Their Preliminary Treatment on Cyclodextrin Production. World J. Microbiol. Biotechnol. , 2006, 22 ; 109–114.
14. Szejtli  J.  Utilization  of  cyclodextrins  in  industrial products and processes. J. Mater. Chem , 1997, 7 ; 575–587