PENGARUH ANTOSIANIN UBI UNGU ( Ipomoea batatas L.) KULTIVAR GUNUNG KAWI TERHADAP EKSPRESI CASPASE-3 PADA JARINGAN OTAK TIKUS MODEL DM TIPE 2
Ardani Galih Prakosa *  ,Retty Ratnawati * , Risma Karlina Prabawati**

## Abstrak
Diabetes  melitus  (DM)  merupakangangguan  metabolism  yang  menyebabkan  kondisi  hiperglikemia. Hiperglikemia  akan  memicu  pembentukan  radikal  bebas.  Radikal  bebas  yang  berlebihan  dapat  merusak sistem membran sel dan kematian sel di berbagai jaringan tubuh. Salah satu penanda terjadinya kematian sel  pada  suatu  jaringan  adalah  caspase - 3.  Ubi  ungu  merupakan  tanaman  tradisional  yang  mengandung antosianin yang bermanfaat sebagai antiinflamasi, antioksidan, neuroprotektan, dan antidiabetik. Penelitian ini  dilakukan  untuk  mengetahui  pengaruh  pemberian  antosianin  ubi  ungu  terhadap  ekspresi  caspase-3 pada jaringan otak tikus Wistar yang diinduksi DM tipe 2. Penelitian ini menggunakan desain eksperimental post-test only control group. Sampel penelitian terbagi menjadi  5 kelompok  yaitu kontrol negatif, kontrol positif, antosianin dosis 10 mg/kgBB, dosis 20 mg/kgBB, dan dosis 80 mg/kgBB selama 5 minggu. Kontrol positif adalah tikus yang dibuat DM tipe 2, sedangkan kontrol negatif adalah tikus sehat. Ekspresi caspase- 3  diukur  dengan  metode  imunohistokimia.  Analisis  statistik  menunjukkan  bahwa  ekspresi  caspase-3 berbeda secara bermakna pada semua kelompok perlakuan (ANOVA, p<0,05). Pemberian antosianin dosis 10  dan  20  mg/kgBB  menurunkan  ekspresi  caspase-3  secara  bermakna  dibandingkan  kontrol  positif, sedangkan  pemberian  antosianindosis  80  mg/kgBB  justru  meningkatkan  ekspresi  caspase-3.  Dapat disimpulkan bahwa pemberian antosianin dosis 10 dan 20 mg/kgBB menurunkan ekspresi caspase -3 pada jaringan otak tikus wistar model DM tipe 2.
Kata kunci: antosianin, ekspresi caspase-3, hiperglikemia, jaringan otak
THE EFFECT OF PURPLE SWEET POTATO ( Ipomoea batatas L .) ANTHOCYANIN ON THE EXPRESSION OF CASPASE-3 IN BRAIN TISSUE OF DIABETES MELLITUS TYPE 2-

## INDUCED RATS

## Abstract
Diabetes  mellitus  (DM)  is  a  metabolic  disorder  that  leads  to  the  condition  of  hyperglycemia. Hyperglycemia  will  trigger  the  formation  of  free  radicals.  Excessive  free  radicals  can  damage  the  cell membrane system and cell death in various tissues. Caspase-3 is a marker of cell death in a tissue. Purple sweet potato is a traditional crop that contain anthocyanins that are useful as antiinflammatory, antioxidant, neuroprotectant, and antidiabetic. This study was conducted to determine the effect of purple sweet potato anthocyanin on the expression of caspase-3 in brain tissue of diabetes mellitus type 2-induced Wistar rats. This study used an experimental post-test only control group design. The research sample was divided into 5 groups: negative control, positive control, anthocyanin dose of 10 mg/kg, dose of 20 mg/kg, and dose of 80 mg/kg for 6 weeks. Positive control contained of rats with DM type 2, whereas negative control contained of  the  healthy  rats.  The  expression  of  caspase-3  was  measured  by  immunohistochemistry  methods. Statistic  analysis  result  showed  that  the  expression  of  caspase-3  increased  significantly  in  all  treatment groups (ANOVA, p < 0,05). Anthocyanin dose of 10 and 20mg/kg treatment decreased the expression of caspase-3 significantly more than the positive control. While the treatment of anthocyanin dose of 80mg/kg body weight actually increase the expression of caspase-3. It can be concluded that the administration of anthocyanin  doses  10  and  20  mg/kg  decreased  the  expression  of  caspase-3  in  brain  tissue  Wistar  rat model of type 2 diabetes.
Keywords: anthocyanin, brain tissue, caspase-3 expression, hyperglycemia
* Lab Fisiologi, FK UB
** Program Studi Pendidikan Dokter Spesialis Neurologi, FK UB-RSSA
 E-mail: ardanigalih@gmail.com

## Pendahuluan
Diabetes  melitus  (DM)  tipe  2 merupakan  gangguan  metabolisme  yang ditandai  dengan  gangguan  sekresi  insulin, resistensi  insulin,  produksi  glukosa  hepatik berlebihan,  dan  gangguan  metabolisme lemak,  yang  pada  akhirnya  akan menimbulkan kondisi hiperglikemia. 1
Jumlah  penderita  DM  selama  tiga dekade  terakhir  telah  mencapai  lebih  dari dua  kali  lipat  secara  global,  menjadikan salah satu tantangan kesehatan masyarakat yang  paling  penting  untuk  semua  bangsa. DM tipe 2 dan prediabetes semakin banyak terjadi pada anak-anak, remaja, dan dewasa muda.  Penyebab  diabetes  melitus  tipe  2 sangat  kompleks  mulai  dari  sistem  genetik yang  berinteraksi  dengan  perilaku  dan pengaruh  lingkungan. 2 Menurut  data RISKESDAS  2013,  prevalensi  DM  di Indonesia  berdasarkan  yang  terdiagnosis dokter  atau  gejala  sebesar  2,1%,  untuk Jawa  Timur  sendiri  menempati  peringkat  4 sebesar 2,1%. 3 Gangguan  metabolisme  yang  terjadi pada  tubuh  penderita  DM  menyebabkan perubahan  fungsional  dan  struktural  dalam sistem  saraf  pusat.  Atrofi  serebral  moderat dan peningkatan lesi subkortikal dan batang otak  telah  dilaporkan  pada  pasien  diabetes yang tidak terkontrol. Penelitian sebelumnya telah  menyatakan  bahwa  memori,  belajar, dan  gangguan  kognitif  lebih  umum  pada penderita diabetes dibandingkan pasien non diabetes. 4
Hiperglikemia  pada  DM  menyebabkan kenaikan  kadar  radikal  bebas.  Proses autooksidasi  pada  hiperglikemi  memicu pembentukan  radikal  bebas.  Radikal  bebas dapat  merusak  membran  sel,  menjadi  lipid peroksida atau malondialdehyde (MDA), bila berlanjut  mengakibatkan  kerusakan  sistem membran  sel  dan  kematian  sel.
4 Penelitian lain menunjukkan diabetes melitus mengurangi fungsi belajar dan memori tikus, merusak  struktur  neuron  hipokampus  dan sinapsis,  dan  menginduksi  apoptosis neuronal yang ditunjukkan dengan meningkatnya aktivitas caspase-3 . 5 Caspase adalah  keluarga  sisteinil  protease  spesifik aspartat  yang  terdapat  pada  organisme multiselular dan berfungsi sebagai regulator sentral  apoptosis.  Salah  satu  anggotanya, caspase-3,  telah  diidentifikasi  sebagai mediator  apoptosis  dalam  sel  neuron. 6 Antosianin  termasuk  dalam  kelompok flavonoid,  yang  memiliki  kelompok  fenolik pada  struktur  kimiawinya  dan  memberikan warna  pada  beberapa  bunga  dan  buah. 7 Antosianin  juga  memiliki  peran  sebagai antiinflamasi dan neuroprotektan. 8 Studi  untuk  meneliti  efek  antioksidan dan  antiinflamasi  antosianin  pada  tikus model  Alzheimer  menunjukkan  bahwa antosianin  memberikan  efek  positif  pada fungsi kognitif tikus model tersebut. 9 Namun, belum  banyak  penelitian  yang  mengamati efek  antosianin  terhadap  kematian  sel  otak tikus  model  diabetes.  Berdasarkan  hal tersebut  maka  dilakukan  penelitian  untuk mengetahui pengaruh pemberian antosianin terhadap  ekspresi caspase -3  sebagai penanda  kematian  sel  pada  jaringan  otak tikus model DM tipe 2.

## Bahan dan Metode
Desain Penelitian: Penelitian  ini  menggunakan  desain eksperimental  laboratorik, post-test  only control  group dengan  menggunakan  tikus Wistar yang diinduksi DM tipe 2 . Perlakuan dibagi menjadi 5 kelompok, yaitu: kelompok kontrol  negatif  yaitu  tikus  Wistar  yang  tidak diberi  diet  tinggi  lemak  maupun  injeksi streptozotocin, kelompok kontrol positif yaitu tikus Wistar yang diberi diet tinggi lemak dan injeksi  streptozotocin  tanpa  antosianin, kelompok  P1  yaitu  tikus  Wistar  yang  diberi diet  tinggi  lemak  dan  injeksi  streptozotocin dan  diberi  ekstrak  antosianin  10  mg/kgBB, kelompok  P2  yaitu  tikus  Wistar  yang  diberi diet  tinggi  lemak  dan  injeksi  streptozotocin dan  diberi  ekstrak  antosianin  20  mg/kgBB, dan  kelompok  P3  yaitu  tikus  Wistar  yang
diberi  diet  tinggi  lemak  dan  injeksi streptozotocin  dan  diberi  ekstrak  antosianin 80  mg/kgBB.  Penelitian  dilakukan  di Laboratorium  Farmakologi,  Laboratorium Patologi Anatomi dan Laboratorium Fisiologi, Fakultas  Kedokteran  Universitas  Brawijaya Malang.  Sampel  penelitian  adalah  tikus Wistar jantan, berat 125-175 gram, umur 6-8 minggu,  berasal  dari  Eijkman  Institute Jakarta.  Penelitian    telah  disetujui  oleh Komisi Etik  Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
Induksi Diabetes: Tikus  Wistar  diberi  diet  tinggi  lemak selama  6  minggu  dan  injeksi  streptozotocin intraperitonial  dengan  dosis  35  mg/kg  pada akhir minggu keenam dan 35 mg/kg 24 jam setelah  injeksi  pertama,  jika  belum  terjadi hiperglikemia.  Diet  tinggi  lemak  terdiridari PARS  50%,  tepung  terigu  25%,  kolesterol 1%,  asam  cholat  0,1%,  minyak  babi  2,5%, dan  air  21,4%.  Diet  tinggi  lemak  diberikan pada minggu ke-1 hingga ke-6.
Pemberian Antosianin Ubi Ungu: Antosianin  yang  digunakan  pada penelitian  ini  telah  melalui  proses  purifikasi yaitu  berasal  dari  ubi  jalar  ungu  kultivar Gunung  Kawi  yang  dilakukan  oleh  Dr. Ciptati,  MS.,  di  Laboratorium  Kimia  FMIPA ITB  Bandung  dengan  menggunakan kromatografi  kolom  flash  termodifikasi dengan  fasa  diam  poliamida  C-6  dan  fasa gerak  air  dan  etanol.  Pemberian  ekstrak antosianin diberikan secara per oral satu kali setiap  hari  selama  5  minggu  dengan  dosis 10, 20 dan 80 mg/kgBB. 11
Preparasi Sampel Otak: Pembedahan  dilakukan  pada  minggu ke-7  setelah  pemberian  diet  tinggi  lemak. Tikus    dimatikan  dengan  pemberian  eter perinhalasi.  Setelah  tikus  dipastikan  tidak sadar (tidak menunjukkan gerakan spontan), dilakukan  pembedahan  untuk  mengambil jaringan  otak  tikus.  Pembedahan  tersebut dilakukan  dengan  cara  menggunting
kranium  dengan  arah  sagital  dari  kaudal (oksipital) menuju ke rostral (frontal), tepat di antara  kedua  hemisfer  otak  tikus. Selanjutnya  dilakukan  pembebasan  otak tikus  pada  regio  basal  dari  jaringan  ikat sekitarnya.  Botol  yang  berisi  jaringan  otak dan  larutan  formalin  tersebut  ditutup  rapat. Selanjutnya  dilakukan  pengirisan  jaringan otak  dan  pembuatan slide dengan paraffin block.
Pembuatan Preparat Jaringan Otak: Jaringan  otak  dimasukkan  tabung formalin  10%  dipotong  dengan rotary microtom setebal  4  mikron  dan  diletakkan dalam poly-L-lysine  object  glass dan dibiarkan  dalam  suhu  kamar.  Selanjutnya dilakukan  deparafinisasi,  tetapi  sebelumnya slide dipanaskan  dahulu  pada  suhu  60˚C selama  60  menit.  Kemudian  ditambahkan dengan  larutan  berikut  ini  secara  berurutan yaitu:  xylol  (2x10  menit),  etanol  absolut (2x10 menit), etanol 90% (1x5 menit), etanol 80%  (1x5  menit),  etanol  70%  (1x5  menit), aquades steril (3x5 menit).
Pengukuran  Caspase-3  dengan  Metode Imunohistokimia:
Langkah  awal  adalah  proses antigen retrieval dengan buffer sitrat. Slide direndam dalam chamber berisi  buffer  sitrat  pH  6,0, kemudian dipanaskan dalam waterbath suhu 95˚C selama 20 menit. Slide dikeluarkan dari waterbath ,  ditunggu  sampai  suhu  ruang (±20  menit)  kemudian  dicuci  dengan  PBS (3x2  menit).  Selanjutnya  dilakukan  proses pengecatan secara immunohistokimia sebagai  berikut: slide ditetesi  dengan  3% H 2 O 2 dalam  metanol  dan  diinkubasi  selama 15  menit,  kemudian  dicuci  dengan  PBS selama 2 menit sebanyak 3 kali. Setelah itu, dilakukan blocking unspecific protein dengan diteteskan background sniper , diinkubasi 15 menit  pada  suhu  ruang,  kemudian  dicuci dengan  PBS  selama  2  menit  sebanyak  3 kali. Diteteskan antibodi primer (anticaspase-3  yang dilarutkan dalam buffer PBS  dengan  perbandingan  1:50  dan  5%
FBS) selama semalam pada suhu 4˚C. Slide kemudian  diinkubasi  dengan  antibodi sekunder  30  menit  pada  suhu  ruang kemudian  dicuci  dengan  PBS  selama  2 menit sebanyak 3 kali. Setelah itu, diinkubasi enzim SA-HRP selama 20 menit pada suhu ruang, kemudian dicuci dengan PBS selama 2 menit sebanyak 3 kali dan dibilas dengan aquades.  Diteteskan  DAB  dan  DAB  buffer dengan perbandingan 1:50 dan diinkubasi 3- 10 menit pada suhu ruang, kemudian dicuci dengan PBS selama 2 menit sebanyak 3 kali dan dicuci dengan aquadest selama 2 menit sebanyak  3  kali.  Selanjutnya  diteteskan Mayer  dan tap  water dengan  perbandingan 1:10  dan  diinkubasi  5-10  menit  pada  suhu ruang,  kemudian  dibilas  dengan tap  water , dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali.
Analisis Statistik:
Data  yang  diperoleh  dalam  penelitian dianalisissecara statistik dengan uji oneway ANOVA untuk mengetahui adanya perbedaan  ekspresi  caspase-3,  pada kelompok  perlakuan.  Hasil  uji  statistik bernilai  signifikan  jika  p  <  0,05.  Kemudian, dilanjutkan  uji  Tukey  untuk  mencari  letak perbedaan  yang  signifikan  pada  kelompok perlakuan.  Uji  korelasi  Pearson  digunakan untuk  mengetahui  korelasi  antara  dosis antosianin dengan ekspresi caspase-3.

## Hasil
Ekspresi Caspase-3: Ekspresi caspase-3 diamati dan diukur melalui  pemeriksaan  imunohistokimia  pada sampel  otak  tikus  menggunakan  mikroskop pada  perbesaran  400x.  Sel  yang mengekspresikan  caspase-3  menunjukkan sitoplasma  yang  berwarna  berwarna  coklat pada semua jenis sel. Pengukuran dilakukan dengan  cara  menghitung  rerata  sel  yang mengekspresikan  caspase-3  dari  10  lapang pandang (Gambar 1).
Gambar  1.  Ekspresi  caspase-3  otak  tikus  pada  hari  ke-50  dengan  metode  imunohistokimia (perbesaran  400x).  Sel  yang  mengekspresikan  caspase-3  tampak  berwarna kecoklatan  (tanda  panah). Keterangan: A .  Ekspresi  caspase-3  pada  kelompok  kontrol negatif; B .  Ekspresi  caspase-3  pada  kelompok  kontrol  positif; C .  Ekspresi  caspase-3  pada kelompok P1; D . Ekspresi caspase-3 pada kelompok P2; E . Ekspresi caspase-3 pada kelompok P3.
Grafik  rata-rata  ekspresi  caspase-3 pada  otak  tikus  Wistar  pada  tiap-tiap kelompok  di  hari  ke-50  dapat  dilihat  pada Gambar  2.  Analisis  perbandingan  ekspresi caspase-3  menunjukkan  adanya  perbedaan
yang  signifikan  pada  kelima  kelompok  (p  < 0,05).  Ekspresi  caspase-3  pada  kelompok kontrol  negatif  berbeda  signifikan  dengan kelompok  kontrol  positif,  P1,  P2,  dan  P3. Ekspresi  caspase-3  pada  kelompok  kontrol
A E D C B
positif  berbeda  signifikan  dengan  kelompok kontrol  negatif,    P1,  P2,  dan  P3.  Ekspresi caspase-3  pada  kelompok  P3  berbeda signifikan dengan kelompok kontrol negatif, kelompok  kontrol  positif,  P1  dan  P2. Ekspresi caspase-3 tertinggi pada kelompok kontrol  positif  dan  terendah  pada  kelompok kontrol negatif.
Gambar 2. Rerata ekspresi caspase-3 otak tikus Wistar antar perlakuan.Keterangan: K(-): kontrol negatif; K(+): kontrol positif; P1: antosianin dosis 10 mg/kgBB; P2: antosianin dosis 20 mg/kgBB; P3: antosianin dosis 80 mg/kgBB.
Berdasarkan  hasil  uji  korelasi  menunjukkan nilai  koefisien  korelasi  antara  ekspresi caspase-3 pada otak tikus Wistar dan dosis ekstrak  antosianin  sebesar    0,207  dengan nilai  signifikansi  sebesar  0,381  (p  >  0,05), sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  tidak terdapat  hubungan  yang  signifikan  antara ekspresi  caspase-3  pada  otak  tikus  Wistar dan dosis ekstrak antosianin.

## Pembahasan
Pada  penelitian  ini  didapatkan  adanya peningkatan  ekspresi  caspase-3  pada kelompok  tikus  yang  diinduksi  DM  tipe  2. Hasil  ini  sesuai  dengan  penelitian sebelumnya yang menunjukkan peningkatan ekspresi  caspase-3  pada  hipokampus  tikus yang  diinduksi  streptozotocin  dibanding dengan  tikus  yang  tidak  diinduksi  diabetes dengan menggunakan streptozotocin. 10
Enzim  caspase-3  merupakan  efektor proses  apoptosis  yang  memegang  peranan penting  dalam  proses  degradasi  sel. Hiperglikemia  yang  terjadi  pada  pasien
diabetes  mellitus  dihubungkan  dengan proses  stres  oksidatif  yang  akan  memicu kematian  sel  neuron  dansel  Schwann melalui peningkatan aktivitas caspase-3. 10 Berdasarkan  data  penelitian  di  atas diketahui  bahwa  terjadi  penurunan  ekspresi caspase-3  yang  signifikan  pada  kelompok perlakuan  dosis  10  mg/kgBB  dan  20 mg/kgBB  dibandingkan  dengan  kelompok perlakuan kontrol positif dan perlakuan dosis 80  mg/kgBB.  Hal  ini  berarti  pemberian antosianin  pada  dosis  10  mg/kgBB  dan  20 mg/kgBB  dapat  menghambat  peningkatan ekspresi  caspase-3,  namun  pada  dosis  80 mg/kgBB  justru  meningkatkan  ekspresi caspase-3.
Hasil penelitian ini sesuai dengan hasil penelitian  lain,  bahwa  antosianin  sebagai antioksidan  akan  melindungi  sel  endotel terhadap stress oksidatif dengan menghambat  apoptosis  sel  melalui  proteksi membran  mitokondria  dan down  regulation aktivasi  caspase-3. 11 Pada  penelitian  lain yang  dilakukan  pada  retina,  antosianin terbukti  menghambat  degenerasi  retina
*
Prakosa AG, et al .                                                      Pengaruh Antosianin Ubi Ungu ( Ipomoea batatas L.)…..
melalui  peningkatan  produksi  enzim antioksidan,  penurunan  jumlah  peroksidasi lipid  (MDA),  dan  hambatan  apoptosis  yang ditunjukkan  dengan  penurunan  ekspresi caspase-3. 12
Antosianin  dapat  mencapai  otak  yang normal  melalui  mekanisme  yang  masih belum  dapat  dijelaskan  dengan  baik. Sebelum masuk ke otak, antosianin sebagai salah  satu  jenis  flavonoid,  harus  melewati sawar  darah  otak  terlebih  dahulu  ( blood brain  barrier ).  Derajat  penetrasi  golongan flavonoid  ini  bergantung  pada  tingkat lipofilisitas  (senyawa  yang  tidak  polar  lebih besar penetrasinya dibanding senyawa yang polar (terglukoronidasi)). Antosianin sebagai salah satu senyawa yang mengalami proses glukoronidasi  kemungkinan  masuk  ke  otak melalui  mekanisme  yang  lain  (selain  difusi langsung). Antosianin diduga masuk melalui transporter  spesifik  yang  diekspresikan  di endotel  sawar  darah  otak,  yaitu  P- glycoprotein.  Antosianin  juga  ditemukan lebih  banyak  terdapat  pada  daerah hipokampus dan korteks serebri. 10
Lebih  lanjut,  hasil  penelitian  ini menunjukkan  bahwa  pemberian  antosianin dosis  80mg/kgBB  meningkatkan  ekspresi caspase-3 otak  tikus  dan  mendekati  kontrol positif.  Hasil  pada  penelitian  lain  pada  sel kanker  kolon,  antosianin  justru  memicu terjadinya  stress  oksidatif  dan  memicu apoptosis  sel  kanker  melalui  aktivasi caspase -3  pada  dosis  tertentu. 13 Hal  ini menunjukkan  bahwa  pada  dosis  tertentu, antosianin  memiliki  efek  pro-oksidan  dan pro-apoptosis,  yang  sesuai  dengan  hasil pada penelitian ini.
Teori  yang  dikemukakan  oleh  Gordon et al. menjelaskan bahwa besar konsentrasi antioksidan  yang  ditambahkan  dapat berpengaruh  pada  laju  oksidasi. 14 Pada konsentrasi  tinggi,  aktivitas  antioksidan kelompok  fenolik  sering  lenyap  bahkan antioksidan  tersebut  menjadi  pro-oksidan. Pengaruh  jumlah  konsentrasi  pada  laju oksidasi tergantung pada struktur
antioksidan,  kondisi  dan  sampel  yang  akan
diuji. Hal ini yang kemungkinan menyebabkan  pada  dosis  tertentu  maka efek  antioksidan  akan  hilang  pada  suatu senyawaherbal. 14 Teori ini dapat menjelaskan mengapa pada dosis 80mg/kgBB,  pemberian  antosianin  malah meningkatkan jumlah caspase-3.
Dari  uraian  di  atas  dapat  disimpulkan bahwa  pemberian  ekstrak  antosianin  ubi jalar ungu dosis 10mg/kgBB dan 20mg/kgBB dapat menurunkan ekspresi caspase-3 pada jaringan otak tikus Wistar yang diinduksi DM tipe2.  Keterbatasan  studi  ini  adalah  dosis antosianin  yang  digunakan  terlampau  jauh jarak  antar  dosisnya,  sehingga  seolah-olah kenaikan  dosis  tidak  memberikan  efek penghambatan.  Maka,  diperlukan  penelitian lanjutan yang menggunakan dosis antosianin  di  antara  dosis  20  dan
80mg/kgBB.  Juga  seharusnya  dilihat  efek pemberian  antosianin  dengan  dosis  yang lebih  besar  dari  80mg/kgBB,  sehingga dapat  diketahui  dengan  pasti  bahwa  efek pro-oksidan  dan  pro-apoptosis  ini  hanya terjadi  pada  dosis  tersebut  atau  memang terjadi  toksisitas  yang  sifatnya  subkronis. Dosis  yang  efektif  belum  dapat  ditentukan pada  penelitian  ini,  dikarenakan  dosis  yang terbukti berbeda bermakna hanya dua dosis, sedangkan  untuk  uji  efektifitas  dosis  suatu bahan  dibutuhkan  setidaknya  11  tingkatan dosis.  Pada  penelitian  ini  juga  tidak dilakukan  pemeriksaan  kadar  HbA1c  dan kadar  insulin  sebagai  konfirmasi  yang menunjukkan
terjadinya kerusakan pankreas,dan pemeriksaan  perbaikan  kadar glukosa darah.

## Daftar Pustaka
1. Jameson LJ, Kasper LD, Longo DL et al . Harrison's Principles of Internal Medicine. 18 th Edition.  US:  The  McGraw-Hill Companies Inc. 2012.
2. Chen  L,  Magliano  DJ,  Zimmet  ZP.  The Worldwide  Epidemiology  of  Type  2
Diabetes  Mellitus—Present  and  Future
Perspectives. Nature Reviews Endocrinology . 2012; (8):228-236. 3. RISKESDAS.  Badan  Penelitian  dan
Pengembangan Kesehatan. Kementerian
Kesehatan  Republik  Indonesia.  Jakarta. 2013. 4. YongucNG,Dodurga Y,Adiguzel E, Gundogdu  G,Kucukatay  V et  al .  Grape Seed  Extract  has  Superior  Beneficial Effects  than  Vitamin  E  on  Oxidative Stress and Apoptosis in the Hippocampus  of  Streptozotocin  Induced Diabetic  Rats. Gene .  2014;  555(2015): 119—126.
5. Zhang  Y,  Xu  L,  He  D,  and  Ling  S. Endoplasmic Stress-Mediated Hippocampal Neuron Apoptosis Involved in Diabetic Cognitive Impairment. BioMed Research  International .  (Online)  . 2013.https://www.hindawi.com/journals/b mri/2013/924327/.
6. D'Amelio  M,  Cavallucci  V,  Middei  S, Marchetti  C,  Pacioni  S,  Ferri  A, Diamantini  A,  De  Zio  D,  Carrara  P, Battistini  L,  Moreno  S,  Bacci  A, Ammassari-Teule M, Marie H, Cecconi F. Caspase-3  Triggers  Early  Synaptic Dysfunction  in  a  Mouse  Model  of Alzheimer's  Disease. Nat  Neurosci .
2011; 14(1):69-76. doi: 10.1038/nn.2709.
7. Yoshida K, Mori M,Kondo T. Blue Flower Color  Development  by  Anthocyanins: from  Chemical  Structure  to  Cell Physiology. Nat  Prod  Rep .  2009;
26(7):884-915.
8. Min  B,  McClung  AM,  Chen  MH. Phytochemicals and Antioxidant Capacities  in  Rice  Brans  of  Different Color. J Food Sci . 2011; 76(1):C117-26.
9. Jessie  M,  Gutierres  FB,  Carvalho  MRC,
Schetinger  PM.  Anthocyanins  Restore Behavioral  and  Biochemical  Changes Caused by Streptozotocin-Induced Sporadic Dementia of Alzheimer’s Type. Life Sciences . 2013; S0024- 3205(13)00713-3. 10. VauzourD.  Dietary  Polyphenols  as Modulators of Brain Functions: Biological
Actions  and  Molecular  Mechanisms Underpinning  Their  Beneficial  Effects. Hindawi Publishing Corporattion . 2012. 11. Speciale  A et  al .  Bioavailability  and Molecular  Activities  of  Anthocyanins  as Modulators  of  Endothelial  Function. Genes Nutr . 2014; 9:404.
12. Wang Y et al . Retinoprotective Effects of Bilberry  Anthocyanins  via  Antioxidant,
Antiinflammatory,  and  Anti-Apoptotic Mechanism  in  a  Visible  LightInduced Retinal Degeneration Model in Pigmented  Rabbits. Journal  Molecules . 2015; 20:22395-22410.
13. Anwar  S et  al .  Berry  Anthocyanins Reduce Proliferation of Human Colorectal  Carcinoma  Cells  by  Inducing Caspase-3 Activation and P21 Upregulation. Mol  Med  Rep .  2016;
14(2):1397-1403.
14. Gordon  MH. Food  Antioxidants. In:  The Mechanism of Antioxidant Action In Vitro. Elsevier. 1990. P 1-18.