## Pengembangan dan Validasi Metode Analisis Amlodipin Besilat dan Identifikasi Cemarannya dalam Sediaan Tablet
Analytical Method Development and Validation Of Amlodipine Besylate and Identification Its Impurities in Tablets Dosage Form
Muhammad Haqqi Hidayatullah 1* , Slamet Ibrahim 2, Benny Permana 2
1 Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Jl. A. Yani Tromol Pos 1, Sukoharjo, Indonesia
2 KK Farmakokimia, Sekolah Farmasi, Institut Teknologi Bandung, Jalan Ganesha 10, Bandung, Indonesia *E-mail: mhh996@ums.ac.id
Received: 20 Oktober 2022; Accepted: 17 Desember 2022; Published: 31 Desember 2022

## Abstrak
Amlodipin besilat merupakan salah satu contoh obat oral untuk pengobatan hipertensi yang termasuk kelas penghambat  saluran  kalsium  dihidropiridin.  Amlodipin  tablet  termasuk  sediaan  farmasi  sehingga  syarat sediaan  farmasi  yang  baik  harus  terpenuhi,  yaitu  berkhasiat,  berkualitas  dan  aman.  Keamanan  sediaan farmasi  dapat  dipengaruhi  oleh  keberadaan  cemaran  organik.  Oleh  karena  itu  perlu  dilakukan pengembangan metode analisis cemaran dengan metode  degradasi paksa karena  sulit untuk memperoleh baku pembanding cemaran. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) yang digunakan adalah fase diam kolom  Eclipse  Plus  C18  (150  x  4,6 mm, 5 μm), fase gerak  campuran  trietilamin (TEA)  : metanol (40:60 %v/v) dengan kecepatan alir 1 mL/menit, detektor UV 237 nm dan volume injeksi 10 μL. Validasi metode  analisis  memberikan hasil linieritas dengan nilai  R2   sebesar 0,9996,  batas deteksi  adalah 18,46 μg/mL dan nilai batas kuantitasi adalah 61,54 μg/mL. Parameter presisi memberikan nilai koefisien variasi sebesar  1,18-1,26%.  Persen  perolehan  kembali  sebesar  98,07-102,44%  +  0,47-1,14  dan  nilai  rentang proporsional (R 2 = 0,9993) pada rentang uji. Sistem KCKT memenuhi syarat uji kesesuaian sistem. Terdapat 2 dari 5 puncak produk degradasi yang  terdeteksi pada degradasi paksa kondisi asam dan basa. Aplikasi metode  analisis  pada  sampel  komersial  memberi  kan  hasil  kadar  Amlodipin  90,79-95,68%  dan  tidak terdeteksi adanya cemaran.
Kata Kunci: Amlodipin, metode analisis, degradasi paksa, validasi metode, cemaran

## Abstract
Amlodipine besylate is one of the oral drugs for the treatment of hypertension which belongs to the class of dihydropyridine calcium channel blockers. Amlodipine tablets are a part of pharmaceutical preparations so the requirements for good pharmaceutical preparations must be met, they were efficacious, quality, and safe. The  safety  of pharmaceutical preparations  can  be affected by  the presence  of organic  impurities. So,  it  is necessary to develop an analytical method for impurities with a stress test method because it is difficult to obtain a reference standard for the comparison of impurities. The High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)  system used  was Eclipse Plus  C18  column (150 x 4.6  mm,  5 μm)  as  stationary phase, the  mobile phase was a mixture of triethylamine (TEA): methanol (40:60  %v/v) with flow rate 1 mL/min, UV detector 237 nm and injection volume 10 μL. The validation of the analytical method had linearity results with an R 2 value of 0.9996, the limit of detection was 18.46 μg/mL and the limit of quantitation limit value was 61.54 μg/mL. The precision parameter gave a coefficient of variation of 1.18-1.26%. The percent recovery is 98,07- 102,44% + 0,47-1,14 and the value of the range was proportional (R 2 = 0.9993) in the range parameter. The selected  HPLC  system  complied  with  the  system  suitability  test  requirements.  There  are  2  of  5  peaks  of degradation  products  detected  at  stress  test  in  acid  and  base  stressors.  The  application  of  the  analytical method on commercial samples gave the results of Amlodipine levels of 90.79-95.68% and no impurities were detected.
Keywords: Amlodipine, analytical method, force degradation, method validation, impurity

## PENDAHULUAN
Amlodipin ( Gambar 1 ) dengan penamaan kimia 2-[(2 aminoetoksi) metil]-4- (2-klorofenil)-1,4-dihidro-6-metil-3,5 asam piridindikarboksilat  3-etil  5-metil  ester. Amlodipin  berperan  sebagai  penghambat kanal  kalsium  sehingga  memiliki  manfaat sebagai  antihipertensi  untuk  pengobatan angina    (Tiwari  dkk.,  2015).  Amlodipin termasuk dalam golongan penghambat saluran kalsium dihidropiridin oral. Amlodipin memiliki  waktu  paruh  yang  paling  panjang dibandingkan  obat  penghambat  saluran kalsium  dihidropiridin  oral  lain.  Amlodipin tersedia  sebagai  Amlodipin  besilat,  yang awalnya disetujui pada tahun 1987 oleh FDA (Bulsara  dan  Cassagnol,  2021).  Amlodipin besilat  berperan  sebagai  penghambat  saluran kalsium  dengan  mekanisme  menghambat masuknya awal kalsium sehingga menyebabkan penurunan tekanan darah (Tang dkk., 2016). Selain berperan sebagai antihipertensi, Amlodipin besilat dapat digunakan  dalam  terapi  angina  dengan mekanisme  menghambat  masuknya  ion kalsium  transmembran  ke  dalam  otot  polos pembuluh darah dan otot jantung (Tiwari dkk.,
2015).
Amlodipin  merupakan  sediaan  farmasi harus memenuhi kriteria sediaan farmasi yang baik, yaitu keamanan, efikasi dan farmasetis. Adanya cemaran organik pada produk farmasi dapat  mempengaruhi  keamanan  dari  produk
obat.  Keberadaan  cemaran  organik  pada produk  obat  harus  ditetapkan  untuk  menjaga kualitas  produk  obat  (WHO,  2003).  Aspek keamanan  dilakukan  dengan  pengujian  rutin sebelum produk dirilis (Basak et al., 2007).
Metode analisis diperlukan untuk mengidentifikasi  keberadaan  cemaran  pada sediaan  Amlodipin.  Pengujian  stabilitas  obat di bawah kondisi stres dapat dilakukan untuk menguji  cemaran  pada  produk  obat  karena jumlah  hasil  degradasi  yang  timbul  selama penyimpanan jumlahnya  sangat rendah (Blessy dkk., 2014). Induksi dilakukan dengan beberapa  kondisi  stres  untuk  meningkatkan jumlah  hasil  degradasi  yang  terbentuk sehingga  mempermudah  untuk  menganalisis hasil  degradasi  yang  terbentuk  (Bakshi  dan Singh, 2002).
Metode  analisis  kemudian  dilakukan validasi  berdasarkan  pedoman  ICH  (ICH, 2005).  Tahapan  yang  perlu  dilakukan  adalah mengisolasi, mengidentifikasi dan menetapkan kadar degradasi (Ali et al., 2012). Modifikasi  metode  dilakukan  jika  metode yang ada tidak memenuhi kriteria keberterimaan  validasi  kemudian  lakukan validasi kembali (Shah et al., 2012).
Amlodipin  merupakan  salah  satu  obat antihipertensi  yang  banyak  digunakan  di Indonesia  (Tutoli  et  al.,  2021;  Udayani  and Riastini,  2018;  Fatimah  dan  Mutmainah, 2022;  Yulianti  dan  Chiburdanidze,  2018). Tablet  Amlodipin sebagai  sediaan  obat  perlu dijaga keamanannya dari keberadaan cemaran.  Cemaran organik merupakan salah satu  unsur  yang  dapat  memengaruhi  kualitas obat (ICH, 2003). Cemaran yang muncul pada saat  penyimpanan  produk  sediaan  farmasi harus  dapat  diidentifikasi  untuk  memastikan kualitas  dari  sediaan  obat.  Metode  analisis diperlukan untuk mengidentifikasi keberadaan cemaran pada sediaan Amlodipin.
Gambar 1. Struktur kimia Amlodipin Besilat
Pengembangan  metode  analisis  cemaran memerlukan  waktu  yang  lama  karena  untuk melihat adanya cemaran membutuhkan waktu penyimpanan  yang  lama.  Degradasi  paksa dilakukan untuk mengefisienkan waktu dalam pengembangan  metode  analisis  cemaran dalam  sediaan  farmasi  (Blessy  dkk.,  2014). Degradasi paksa dilakukan dengan memberikan  kondisi  paparan  yang  ekstrem. Setelah  diberkan  paparan  kondsis  ekstrem, kemudian  dilakukan  pengembangan  metode analisis untuk mengidentifikasi cemaran.
Metode  analisis  untuk  mengidentifikasi cemaran dari tablet Amlodipin dengan KCKT sistem  kromatografi  gradien  (Tiwari  dkk., 2015). Sistem gradien tidak bisa diaplikasikan pada  semua  instrument  KCKT  karena  tidak semua  KCKT  memiliki  sistem  gradien sehingga  perlu  dilakukan  pengembangan metode  yang  lebih  sederhana  yaitu  sistem isokratik.  Metode  kromatografi  menjadi pilihan karena kemampuan pemisahan senyawa secara simultan, identifikasi, penentuan  senyawa  kimia  dan  penetapan kadar  (Hanwar  et  al.,  2020;  Moffat  et  al., 2011; Skoog et al., 2013).
Jumlah  cemaran  berupa  hasil  degradasi pada  umumnya  sangat  kecil  sehingga dibutuhkan  metode  analisis  yang  sensitif, selektif, akurat dan presisi (ICH, 2005). Baku pembanding cemaran sulit diperoleh sehingga untuk pengembangan metode analisis dilakukan  dengan  cara  degradasi  paksa dengan berbagai kondisi.

## METODE PENELITIAN Instrumen
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi (KCKT)  Agilent  Technologies  1220  Infinity LC, kolom kromatografi cair Eclipse Plus C18 5 μm (150 x 4,6 mm), perangkat lunak Agilent
OpenLAB CDS ChemStation, Ultrasonikator AE,  timbangan  analitik  Mettler  Toledo AG104.

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  adalah  baku pembanding Amlodipin Besilat dari PT Kimia Farma, Metanol Pro KCKT ( Merck; Darmstadt,  Jerman ),  Trietilamin  (TEA) ( Merck;  Darmstadt,  Jerman) ,  Asam  Sulfat (H 2 SO 4 ) ( Merck; Darmstadt, Jerman) , Natrium Hidroksida (NaOH) ( Merck; Darmstadt,  Jerman) ,  Hidrogen  Peroksida (H 2 O 2 )  ( Merck;  Darmstadt,  Jerman) ,  Akua
Bidestilata
(Ikapharmindo;
Jakarta, Indonesia).
Sistem Kromatografi
Sistem yang digunakan adalah fase diam berupa kolom kromatografi cair Eclipse Plus C18 5 μm (150 x 4,6 mm),  fase gerak TEA (pH  3,0)  :  metanol  dengan  perbandingan 40:60  dengan  elusi  isokratik  dan  laju  alir  1 mL/menit.  Panjang  gelombang  237  nm  dan volume injeksi 10 μL.
Larutan  trietilamina  dibuat  dengan melarutkan 7,0 mL trietilamina P dalam 800 mL  air  kemudian  atur  pH  hingga  3,0  ±  0,1 dengan penambahan asam fosfat P, encerkan dengan air hingga 1000,0 mL
Preparasi  fase  gerak  dilakukan  dengan mencampurkan  trietilamin  pH  3,0  dan metanol  pro  KCKT  dengan  perbandingan 40:60 kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman No 41 lalu dilakukan diawaudarakan dengan sonikasi selama 15 menit.

## Preparasi Larutan Induk
Larutan  induk  Amlodipin  Besilat  dibuat dengan  konsentrasi  600 µ g/mL  dalam  fase gerak.  Sebanyak  15  mg  baku  Amlodipin Besilat dilarutkan dalam labu takar 25,0 mL.

## Uji Kesesuaian Sistem KCKT
Uji Kesesuaian Sistem KCKT dilakukan pada standar kerja 60 μg/mL sebanyak 6 kali dan  dievaluasi  nilai  simpangan  baku  relatif luas  area  dan  waktu  retensi,  resolusi,  faktor ikutan,  faktor  kapasitas  dan  angka  pelat teoritis.
Metode Stres (Sahu et al., 2010)
a. Hidrolisis Asam Sejumlah 1,0 mL larutan standar Amlodipin Besilat 600 μg/mL ditambahkan 1 mL  HCl 0,1 M diinkubasi pada suhu 80°C selama 24 jam.
b. Hidrolisis Basa
Sejumlah 1,0 mL larutan standar Amlodipin Besilat 600 μg/mL
ditambahkan  1  mL  NaOH  0,1  M diinkubasi pada suhu 80°C selama 24 jam.
c. Hidrolisis Netral Sejumlah 1,0 mL larutan standar Amlodipin Besilat 600 μg/mL ditambahkan  1  mL  aquades  diinkubasi pada suhu 80°C selama 24 jam.
d. Fotolisis Sejumlah 1,0 mL larutan standar
Amlodipin  Besilat  600  μg/mL  diberi paparan sinar matahari selama 2 hari durasi 2 jam per hari pada vial bening tertutup.
e. Oksidatif Sejumlah 1,0 mL larutan standar Amlodipin Besilat 600 μg/mL
ditambahkan  1  mL  H 2 O 2 30%,  disimpan pada  suhu  ruang  selama  5  hari.  Larutan diencerkan hingga konsentrasi 60 μg/mL.
f. Panas Sampel padat dipanaskan pada suhu 50°C selama  60  hari  dalam  oven.  Kemudian dilarutkan hingga konsentrasi 60 μg/mL.
Validasi Metode Analisis
a. Selektivitas
Selektivitas dilakukan dengan melakukan  analisis  terhadap  larutan  baku, pelarut  dan  sampel  hasil  degradasi  paksa.
Kriteria keberterimaan dinilai dengan melihat adanya  puncak  lain  dengan  resolusi  yang cukup.
b. Linearitas
Seri  konsentrasi  larutan  uji  Amlodipin Besilat  dibuat  sebanyak  6  konsentrasi.  Seri konsentrasi  yang  dibuat  24  –  84  μg/mL. Dibuat kurva kalibrasi antara respon terhadap konsentrasi  kemudian  dihitung  persamaan regresi,  koefisien  korelasi,  koefisien  variasi regresi  linear,  batas  deteksi,  dan  batas kuantitasi.
c. Presisi
Sebanyak  6  larutan  sampel  60  μg/mL dibuat dengan menimbang sampel yang setara dengan  15  mg  Amlodipin  Besilat  dilarutkan pada  labu  takar  25,0  mL.  Dihitung  nilai simpangan baku relatif untuk presisi pada hari yang  sama  ( intraday )  dan  presisi  pada  hari yang berlainan ( interday ).
d. Akurasi
Uji  akurasi  dilakukan  dengan  metode sampel  adisi  standar  Amlodipin  Besilat. Sampel  adisi  dibuat  dengan  penambahan standar  Amlodipin  Besilat  80-120  %  pada larutan sampel 60 μg/mL. Ditentukan persen perolehan  kembali  dari  masing-masing penambahan standar.
e. Rentang
Uji  rentang  dilakukan  dengan  seri penimbangan sampel yang berbeda sehingga diperoleh konsentrasi 24 – 84 μg/mL.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Studi Degradasi Paksa
Degradasi  paksa  yang  dilakukan  pada Amlodipin  menunjukkan  tidak  terdegradasi pada  kondisi  hidrolisis  netral,  oksidatif (H 2 O 2 ),  panas  dan  fotolisis.  Degradasi  paksa pada  suasana  hidrolisis  asam  dan  basa menunjukkan Amlodipin Besilat terdegradasi.
Studi  degradasi  paksa  pada  kondisi  asam membentuk  tiga  produk  degradasi  dan  dua produk degradas pada kondisi basa. Spesifisitas  dievaluasi  dengan  parameter waktu  retensi  dan  waktu  retensi  relatif. Konsentrasi untuk melakukan degradasi paksa adalah  600  µg/mL.  Waktu  retensi  ( Retention Time /RT)  dan  waktu  retensi  relatif  ( Relative Retention  Time /RRT)  hasil  degradasi  paksa asam ditunjukkan pada Tabel 1 .
Kromatogram  hasil  studi  degradasi  paksa asam  menunjukkan  terdapat  3  puncak  baru yang  terbentuk.  Produk  hasil  degradasi memiliki  RRT  0,45;  0,68 dan 0,72 terhadap puncak  Amlodipin  yang  memilki  RT  7,291. Sampel  terdegradasi  sebesar  32,3%.  Pada kondisi  degradasi  paksa  pada  kondisi  basa dengan penambahan 0,1 M NaOH selama 24 jam  pada suhu  80°C menghasilkan 2 puncak hasil  degradasi  baru.  Puncak  baru  yang terbentuk muncul dengan RRT 0,35 dan 0,64 terhadap puncak utama Amlodipin dengan RT 7,213 ( Tabel 2 ).
Produk  degradasi  tidak  terbentuk  pada kondisi  degradasi  paksa  dengan  metode hidrolisis  netral  dengan  penambahan  air. Produk  degradasi  juga  tidak  terbentuk  pada degradasi  paksa  pada  metode  degradasi oksidatif  dengan  paparan  H 2 O 2 selama  lima hari. Hal ini menunjukkan bahwa  Amlodipin stabil terhadap stres oksidatif. Amlodipin juga stabil  terhadap  paparan  sinar  matahari langsung  selama  dua  hari.  Pada  kondisi paparan suhu 50°C selama 2 bulan, Amlodipin tidak  terdegradasi.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  Amlodipin  tahan  terhadap  paparan panas.

## Identifikasi Cemaran
Cemaran  yang  terbentuk  dari  degradasi paksa  dilakukan  identifikasi.  Identifikasi cemaran  dilakukan  dengan  membandingkan RRT  hasil  penelitian  dengan  RRT  pada penelitian.Tiwari dkk., 2015. RRT diperoleh dari perbandingan antara RT puncak cemaran terhadap  RT  puncak  Amlodipin.  Ketika terdapat puncak dengan nilai RRT yang sama, maka  dapat  diperkirakan  bahwa  senyawa yang  terbentuk  juga  sama.  Pembandingan RRT dilakukan karena standar cemaran sulit diperoleh.
Tabel 1. Nilai RT dan RRT Sampel Hasil
Degradasi Paksa Asam Puncak RT RRT a) 1 3,300 0,45 2 4,922 0,68 3 5,222 0,72 4 7,291 1,00 b) Keterangan : a) perbandingan antara RT puncak cemaran dengan RT puncak Amlodipin, b) puncak Amlodipin
Tabel 2. Nilai RT dan RRT Sampel Hasil
Degradasi Paksa Basa Puncak RT RRT a) 1 2,492 0,35 2 4,642 0,64 3 7,213 1,00 b)
a) perbandingan antara RT puncak cemaran dengan RT puncak Amlodipin,b) puncak Amlodipin
Tabel 3. Perbandingan nilai RRT puncak hasil degradasi metode asam dan referensi Urutan Puncak Hasil Degradasi Referensi *) 1 0,45 0,17 2 0,68 0,67 3 0,72 0,89 4 1,00 1,00 5 1,54 *)Tiwari et al., 2015
Pada degradasi paksa metode asam dengan penambahan  HCl  0,1  M  pada  suhu  80°C memberikan 3 puncak baru dengan nilai RRT 0,45;  0,68  dan  0,72.  Sedangkan  pada penelitian  referensi  (Tiwari  dkk.,  2015) muncul  4  puncak  baru  selain  puncak  utama Amlodipin.  Hasil  pembandingan  nilai  RRT menunjukkan  terdapat  satu  puncak  yang memiliki  nilai  RRT  yang  mirip  antara  hasil penelitian  dan  referensi  yaitu  puncak  2  hasil penelitian  dengan  nilai  RRT  0,68  dengan puncak  2  pada  referensi  dengan  nilai  RRT 0,67  ( Tabel 3 , Gambar  3a ).  Berdasarkan pembandingan  RRT  menunjukkan  bahwa kedua  puncak  tersebut  merupakan  senyawa yang  identik.  Pada  penelitian  Tiwari  dkk., 2015,  hasil  analisis  Spektroskopi  Massa menunjukkan  bahwa  rumus  molekul  yang mungkin untuk RRT 0,68 adalah (C 19 H 22 N 2 O 5 Cl) + (cemaran  1)  dengan  massa m/z 393,0  ( Gambar  2b ).  Cemaran  1 merupakan  hasil  degradasi  dari  Amlodipin yang kehilangan gugus metil pada cincin 1,4- dihidropiridin dan muatan pada gugus amina
terminal berpindah ke atom karbon kelima di 1,4-dihidropiridin.
Terdapat  2  puncak  baru  yang  terbentuk pada  degradasi  paksa  metode  basa  dengan paparan NaOH 0,1 M pada suhu 80°C Puncak baru yang terbentuk memiliki nilai RRT 0.35 dan  0.64  terhadap  puncak  Amlodipin.  Pada penelitian  (Tiwari  dkk.,  2015)  terdapat  9 puncak baru yang muncul.
Puncak  yang  memiliki  RRT  yang  mirip antara  hasil  penelitian  dan  referensi  yaitu puncak  2  hasil  penelitian  dengan  nilai  RRT 0,64  dan  puncak  5  dari  referensi  yang memiliki  RRT  0,63  ( Tabel  4,  Gambar  3b ). Pembandingan  nilai  RRT  dapat  disimpulkan bahwa  kedua  puncak  tersebut  merupakan senyawa yang identik.
Hasil  analisis  Spektroskopi  Massa  pada penelitian  Tiwari  dkk.,  2015  menunjukkan bahwa puncak dengan nilai RRT 0,64 adalah (C 19 H 23 NO 5 Cl) + (cemaran  2)  yang  memiliki massa m/z 380.83  ( Gambar  2c ).  Cemaran  2 terbentuk  dari  terputus  gugus  metamin  pada gugus samping di posisi karbon 2 pada cincin 1,4-dihidropiridin.
Gambar 2. Struktur kimia (a) Amlodipin, (b) Struktur Cemaran 1 dan (c) Struktur Cemaran 2 Tabel 4. Perbandingan nilai RRT puncak hasil degradasi metode basa dan referensi Urutan Puncak Hasil Degradasi Referensi *) 1 0,35 0,17 2 0,64 0,45 3 1,00 0,52 4 0,59 5 0,63 6 0,67 7 1,00 8 1,47 9 1,54 *)Tiwari et al., 2015
Konsentrasi  cemaran  dihitung  dengan metode  Normalisasi  Area.  Normalisasi  area merupakan  metode  untuk  menghitung  kadar dengan membandingkan luas area bawah kurva  dari  puncak  yang  akan  dihitung dengan  total  luas  area  bawah  kurva  pada kromatogram. Metode normalisasi area dapat dilakukan  jika  tidak  terdapat  standar  dari senyawa yang akan ditetapkan kadarnya.
Konsentrasi  masing-masing  puncak  yang terbentuk  pada  degradasi  paksa  asam  adalah puncak  1  :  0,51%,  puncak  2  :  0,84%  dan puncak 3 : 2,9%. Sedangkan konsentrasi untuk puncak  pada  degradasi  paksa  basa  adalah puncak 1 : 0,34% dan puncak 2 : 1,79%. Optimasi Sistem KCKT
Analisis  yang  dilakukan  menggunakan sistem  kromatografi  fase  terbalik.  Sistem kromatografi  fase  terbalik  adalah  jenis analisis kromatografi dimana fase gerak yang digunakan lebih polar daripada fase diamnya. Pada penelitian ini, fase diam yang digunakan adalah kolom oktadesil silika atau C18 yang tersusun dari rantai hidrokarbon sebanyak 18 yang  terikat  pada  satu  atom  Silika  (Si) sehingga  memberikan  sifat  non  polar  pada fase diam. Penggunaan fase diam C18 paling banyak  dipilih  pada  analisis  Amlodipin karena sifat fisikokimia dari Amlodipin yang merupakan senyawa non polar.
Jenis  elusi  yang  digunakan  pada
penelitian  ini  adalah  elusi  isokratik.  Elusi isokratik  merupakan  jenis  elusi  dengan menggunakan fase gerak yang tetap perbandingannya  selama  analisis.  Elusi isokratik ini dipilih karena kemudahan dalam analsis dan hanya membutuhkan satu pompa. Elusi isokratik memiliki beberapa keunggulan diantaranya sederhana, biaya lebih rendah dan tidak  memerlukan  ekuilibrasi  ulang  kolom
Gambar 3. Kromatogram hasil degradasi paksa (a) asam dan (b) basa
Tabel 5. Hasil Optimasi Komposisi Fase Gerak dan Laju Alir Sistem KCKT Perbandingan Fase Gerak Laju alir (mL/menit) Waktu retensi (menit) TEA  Metanol 0 100 0,8 1,802 0,9 1,599 1,0 1,435 5 95 0,8 1,824 0,9 1,623 1,0 1,486 10 90 0,8 1,903 0,9 1,757 1,0 1,611 15 85 0,8 2,143 0,9 1,906 1,0 1,775 40 60 0,8 7,062 0,9 6,298 1,0 5,627
pada  injeksi  berturutan  (García-Álvarez- Coque dkk., 2006).
Fase  gerak  yang  digunakan  adalah kombinasi  TEA  dan  metanol.  Trietilamin digunakan  sebagai  larutan  penyangga  untuk mempertahankan pH fase gerak. Penggunaan buffer  pada  fase  gerak  digunakan  untuk menjaga  kestabilan  pH  fase  gerak  dan mengoptimalkan bentuk puncak yang terbentuk.  Pemilihan  pH  pada  fase  gerak mempertimbangkan  pKa  dari  analit.  Selain itu, konsentrasi buffer yang rendah memberikan reprodusibilitas yang baik (Dolan,  2018).    Metanol  merupakan  pelarut polar  protik  dan  banyak  digunakan  sebagai fase gerak. Metanol banyak digunakan karena memiliki  kelebihan  yaitu  dapat  mendeteksi ghost peak dan tahan terhadap presipitasi pada pencampuran  dengan  beberapa  jenis  larutan penyangga  (Shimadzu,  2019).  Sehingga dipilih  campuran  trietilamin  dan  metanol sebagai fase gerak pada penelitian ini.
Optimasi sistem KCKT dilakukan berdasarkan  komposisi  fase  gerak  dan  laju
alir.  Variasi  laju  alir  yang  digunakan  pada rentang 0,8-1 mL/menit. Percobaan dilakukan dengan berbagai variasi komposisi fase gerak dan  dimulai  dari  fase  gerak  tunggal  yaitu metanol.
Dari  hasil  optimasi,  jumlah  TEA  pada perbandingan  fase  gerak  meningkatkan retensi  Amlodipin.  Pada  waktu  analisis  2 menit,  terdapat  puncak dari pelarut  sehingga diperlukan  penyesuaian  untuk  meretensi Amlodipin  lebih  lama.  Laju  alir  yang  lebih besar  mempercepat  waktu  retensi  pada keseluruhan komposisi fase gerak. Berdasarkan  hasil  optimasi  sistem  KCKT, maka sistem yang digunakan adalah fase diam berupa kolom kromatografi cair Eclipse Plus C18 5 μm (150 x 4,6 mm), fase gerak terpilih TEA:metanol  dengan  perbandingan  40:60 dengan  elusi  isokratik  dan  laju  alir  1 mL/menit,  panjang  gelombang  237  nm,  dan volume injeksi 10 μL ( Tabel 5 ).

## Uji Kesesuaian Sistem
Uji  kesesuaian  sistem  dilakukan  untuk memastikan  bahwa sistem  KCKT yang  telah teroptimasi  sesuai  untuk  tujuan  analisis.  Uji kesesuaian  sistem  dilakukan  menyuntikkan standar  Amlodipin  Besylate  sebanyak  enam kali  berturut-turut  dengan  konsenstrasi  60 μg/mL. Parameter uji kesesuaian sistem yang dilakukan adalah  penyuntikan ulang larutan, resolusi  (Rs),  angka  lempeng  teoritis  (N), faktor  kapasitas  (k')  dan  faktor  ikutan  (τ).
Kriteria keberterimaan masing-masing parameter uji telah ditetapkan (USP, 2017).
Penyuntikan ulang larutan baku dilakukan untuk  memastikan  persyaratan  presisi  telah terpenuhi.  Resolusi  merupakan  kemampuan kolom untuk melakukan pemisahan antara dua komponen pada saat analisis. Angka lempeng teoritis  menunjukkan  bahwa  pemisahan saksama senyawa satu dan lainnya atau biasa disebut efisiensi kolom. Faktor kapasitas atau
(a)
(b) Gambar 4. Perbandingan kromatogram (a) pelarut dan (b) standar Amlodipin 600 µg/ml
yang  dapat  disebut  faktor  retensi  dapat diperoleh  dari  waktu  retensi  masing-masing yang  berdekatan.  Hasil  uji  kesesuaian parameter  pada  sistem  yang  teroptimasi memenuhi  syarat  keberterimaan  sesuai  pada Tabel 6 .

## Validasi Metode Analisis
Validasi  metode  analisis  merupakan suatu  prosedur  sistematis  untuk  memastikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan dan  sesuai  dengan  tujuan  penggunaan. Parameter validasi metode analisis antara lain spesifisitas, linieritas, akurasi, presisi, presisi antara dan rentang (ICH, 2005).
a. Spesifisitas
Uji spesifisitas dilakukan dengan membandingkan kromatogram baku pembanding Amlodipin Besilat dan kromatogram  pelarut.  Hasil  kromatogram menunjukkan  bahwa  tidak  terdapat  puncak lain  yang  mengganggu  puncak  Amlodipin Besilat  ( Gambar 4 ).  Oleh  karena  itu,  dapat disimpulkan  bahwa  metode  analisis  KCKT telah memenuhi syarat spesifisitas.
b. Linieritas
Syarat  kriteria  keberterimaan  linieritas adalah  nilai  koefisien  korelasi  (R)  >  0,999 (AOAC,  2002).  Seri  larutan  baku  pada konsentrasi 24-84 μg/mL kemudian diinjeksikan sebanyak tiga replikasi. Hasil uji linearitas  menunjukkan  nilai  R 2 sebesar 0,9996 ( Tabel 7 ) sehingga memenuhi kriteria keberterimaan.
c. Batas Deteksi dan Batas Kuantisasi
Perhitungan  batas  deteksi  dan  batas kuantitasi  diperoleh  dari  kurva  linieritas dengan  menggunakan  nilai  standar  deviasi. Nilai  batas  deteksi  dan  batas  kuantisasi ditentukan  dengan  rumus  berikut  (Lister, 2005):
𝐵𝑎𝑡𝑎𝑠 𝐷𝑒𝑡𝑒𝑘𝑠𝑖  = 3,3 𝑥 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑖𝑒𝑛 𝑘𝑢𝑟𝑣𝑎 𝑙𝑖𝑛𝑖𝑒𝑟𝑖𝑡𝑎𝑠
𝐵𝑎𝑡𝑎𝑠 𝐾𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑠𝑎𝑠𝑖  = 10 𝑥 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑖𝑒𝑛 𝑘𝑢𝑟𝑣𝑎 𝑙𝑖𝑛𝑖𝑒𝑟𝑖𝑡𝑎𝑠
Perhitungan  batas  deteksi  dan  batas kuantitasi  menggunakan  standar  deviasi residual dan gradien kurva linieritas ( Tabel 7 ).

## d. Presisi
Nilai  yang  diuji  pada  parameter  presisi adalah koefisien variasi (KV) atau simpangan baku relatif (SBR). Nilai syarat keberterimaan untuk sediaan obat berdasarkan FDA adalah < 2%  sedangkan  berdasarkan Tabel 7 yang diperoleh dari persamaan Horwitz, nilai syarat keberterimaan  bergantung  pada  konsentrasi analit  yang  akan  dianalisis.  Semakin  kecil konsentrasi  analit  yang  akan  dianalisis  maka syarat  keberterimaan  semakin  ketat.  Syarat keberterimaan untuk presisi analisis Amlodipin  adalah  RSD  <  2,7  %  karena konsentrasi  analit  pada  sampel  berada  pada rentang  1-10%  (AOAC,  2019).  Konsentrasi analit pada sampel maka syarat keberterimaan untuk presisi analisis Amlodipin adalah < 2,7 %  (Rivera  dan  Rodríguez,  2011).  Nilai  RSD untuk  parameter  presisi intraday adalah  1,24
Tabel 6. Hasil Uji Kesesuaian Sistem KCKT
Penetapan Amlodipin Parameter Uji Kriteria Keberterimaan *) Hasil Uji SBR Penyuntikan Berulang SD < 2% Luas area : 1,613% Waktu retensi : 0,045% Resolusi > 1,5 7,74 Angka Pelat Teoritis > 2000 3346 Faktor Kapasitas 1 < k’ <10 2,91 Faktor Ikutan ≤ 2 1,56
*) USP, 2017
% dan pada uji presisi interday adalah 1,21 %
( Tabel 7 ). Nilai Horwitz Ratio (Horrat) pada uji  presisi intraday adalah  0,45  dan  pada  uji presisi interday adalah 0,42.

## e. Akurasi
Nilai  persen  perolehan  kembali  dihitung untuk  masing-masing  konsentrasi.  Nilai keberterimaan  persen  perolehan  kembali untuk  konsentrasi  analit  1-10%  adalah  97- 103% (AOAC, 2019).
Nilai  persen  perolehan  kembali  pada pengujian  akurasi  ini  adalah  98,07-101,44% ( Tabel 7 )  sehingga  metode  analisis  ini  telah memenuhi syarat keberterimaan akurasi.

## f. Rentang
Pengujian rentang dilakukan pada rentang konsentrasi  24-84 μ g/mL.  Pengujian  rentang proporsional  pada  rentang  konsentrasi  uji dengan nilai R 2 adalah 0,9993 ( Tabel 7 ).

## Aplikasi  Metode  Analisis  pada  Sampel Komersial
Metode  analisis  yang  telah  divalidasi kemudian  diaplikasikan  pada  sampel  Tablet Amlodipin  yang  terdapat  di  pasaran  untuk menganalisis  Amlodipin  dan  cemarannya. Analisis  dilakukan  terhadap  5  merk  Tablet Amlodipin  yang  terdiri  dari  3  Tablet Amlodipin  Generik  dan  2  Tablet  Amlodipin Branded . Dibuat konsentrasi larutan sampel dengan  konsentrasi  600  µg/mL  untuk masing-masing sampel lalu dianalisis dengan sistem  KCKT  yang  telah  divalidasi.  Hasil analisis sampel menunjukkan kadar Amlodipin  antara  90,79-95,68%  ( Tabel 8 ) dan  tidak  terdapat  adanya  cemaran  pada sediaan ( Gambar 5 ). Kadar Amlodipin pada sampel  memenuhi  syarat  pada  Farmakope Indonesia yaitu 90-110%.

## KESIMPULAN
Pengembangan  metode  analisis  untuk Amlodipin dan cemaran pada Tablet Amlodipin  menggunakan  kromatografi  cair kinerja  tinggi  (KCKT)  dengan  fase  diam berupa kolom Eclipse Plus C18 5 μm (150 x 4,6  mm),  fase  gerak  TEA:methanol  (40:60 v/v)  237  nm,  laju  alir  1,0  mL/menit  dan volume injeksi 10 μL memenuhi persyaratan
Tabel 7. Hasil Validasi Metode Penetapan Amlodipin dengan KCKT Parameter Hasil Uji Spesifisitas Tidak ada puncak yang mengganggu puncak Amlodipin Linieritas r 2 = 0.9996 Batas Deteksi 18,46 μg/mL Batas Kuantitasi 61,54 μg/mL Presisi Intraday 1,24 % Presisi Interday 1,21 % Akurasi (% recovery + RSD) 98,07-102,44% + 0.47-1.14 Rentang r 2 = 0,9993 (a) (b) Gambar 5. Hasil Analisis pada sampel Tablet
Amlodipin komersial (a) Tablet Generik A,
(b) Tablet Branded D
Tabel 8. Konsentrasi Amlodipin dalam Tablet Amlodipin Komersial Sampel Persen klaim (%) Kandungan (mg/tablet) Tablet Generik A 94,19 9.42 Tablet Generik B 90,79 9.08 Tablet Generik C 91,99 9.20 Tablet Branded D 92,64 9.26 Tablet Branded E 95,68 9.57 *) klaim kandungan per tablet 10 mg
uji  kesesuaian  sistem  dan  parameter  validasi berupa  spesifisitas,  linearitas,  batas  deteksi, batas kuantisasi, akurasi, presisi dan rentang.
Sistem kromatografi dapat mengidentifikasi keberadaan 5 puncak produk degradasi dimana 2 puncak diantaranya sudah
dikarakterisasi  struktur  kimianya.  Kadar Amlodipin  pada  produk  komersial  yang dianalisis  antara  90,79-95,68%  dan  tidak terdapat puncak cemaran pada sampel produk komersial.

## Daftar Pustaka
Ali, N.W., Abbas, S.S., Zaazaa, H.E.-S., Abdelrahman, M.M., Abdelkawy, M., 2012. Validated stability  indicating  methods  for  determination  of  nitazoxanide  in  presence  of  its degradation products. Journal of Pharmaceutical Analysis 2, 105–116.
AOAC,  2019.  Official  methods  of  analysis  of  the  Association  of  Analytical  Chemist. Association of Official Analytical Chemist, Inc. Virginia USA.
Bakshi, M., Singh, S., 2002. Development of validated stability-indicating assay methods— critical review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 28, 1011–1040.
Basak, A.K., Raw, A.S., Al Hakim, A.H., Furness, S., Samaan, N.I., Gill, D.S., Patel, H.B., Powers,  R.F.,  Yu,  L.,  2007.  Pharmaceutical  impurities:  Regulatory  perspective  for Abbreviated New Drug Applications. Advanced Drug Delivery Reviews 59, 64–72.
Blessy,  M.,  Patel,  R.D.,  Prajapati,  P.N.,  Agrawal,  Y.K.,  2014.  Development  of  forced degradation  and  stability  indicating  studies  of  drugs—A  review.  Journal  of Pharmaceutical Analysis 4, 159–165.
Bulsara, K.G., Cassagnol, M., 2021. Amlodipine. StatPearls Publishing.
Dolan, John. 2018. A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection.  ACE-HPLC :  Aberdeen,
Scotland
Fatimah,  U.  Mutaminah,  N.,  2022,  Evaluasi  Rasionalitas  Pengobatan  Pada  Pasien  Diabetes Melitus Tipe 2 Di Puskesmas Tawangsari Sukoharjo Tahun 2021, Naskah Publikasi. Universitas Muhammadiyah Surakarta
García-Álvarez-Coque,  M.C.,  Torres-Lapasió,  J.R.,  Baeza-Baeza,  J.J.,  2006.  Models  and objective  functions  for  the  optimisation  of  selectivity  in  reversed-phase  liquid chromatography. Analytica Chimica Acta 579, 125–145.
Hanwar,  D.,  Handayani,  V.R.,  Suhendi,  A.,  2020.  Validasi  Metode  HPLC  untuk  Analisis Kurkumin pada Ekstrak Rimpang Temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.). The 12th University Research Colloqium 2020, 371-378.
ICH, 2003,  Q1A (R2) : Stability Testing Of New Drug Substances And Products, Stability Testing of New Drug Substances and Products , ICH : EU.
ICH, 2005. Q2 (R1) : Validation Of Analytical Procedures: Text And Methodology. ICH : EU
Kemenkes RI, 2020, Farmakope Indonesia Edisi VI. Kemenkes RI : Jakarta
Lister, A.S., 2005. 7 Validation of HPLC methods in pharmaceutical analysis, in: Separation Science and Technology. Elsevier, pp. 191–217.
Moffat, A.C., Osselton, M.D., Widdop, B., Watts, J. (Eds.), 2011. Clarke’s analysis of drugs and poisons: in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material, Fourth edition. ed. Pharmaceutical Press, London ; Chicago.
Rivera, C., Rodríguez, R., 2011. Horwitz Equation as Quality Benchmark In ISO/IEC 17025 Testing Laboratory. Firm of industrial engineers, S.C. : Mexico.
Sahu, K., Patel, P., Karthikeyan, C., Trivedi, P., 2010. The ICH guidance in practice: Stress degradation studies  on irbesartan  and development  of a validated stability-indicating UPLC assay. Acta Chromatographica 22, 189–205.
Shah, B.P., Jain, S., Prajapati, K.K., Mansuri, N.Y., 2012. Stability Indicating Hplc Method Development. IJPSR, 2012; Vol. 3(9): 2978-2988.
Shimadzu,  2019.  7  Key  Differences  in  the  Use  of  Methanol  and  Acetonitrile. https://www.shimadzu.com/an/service-support/technical-support/lib/methanol- acetonitrile.html (accessed on September 17th 2021)
Skoog,  D.A.,  West,  D.M.,  Holler,  F.J.,  Crouch,  S.R.,  2013.  Fundamentals  of  Analytical Chemistry. Cengage Learning: Boston, Massachusetts, USA .
Tang, L., Gamal El-Din, T.M., Swanson, T.M., Pryde, D.C., Scheuer, T., Zheng, N., Catterall, W.A., 2016. Structural basis for inhibition of a voltage-gated Ca2+ channel by Ca2+ antagonist drugs. Nature 537, 117–121.
Tiwari, R.N., Shah, N., Bhalani, V., Mahajan, A., 2015a. LC, MS n and LC–MS/MS studies for  the  characterization  of  degradation  products  of  Amlodipine.  Journal  of Pharmaceutical Analysis 5, 33–42.
Tutoli, T.S., Rasdiana, N., Tahala, F., 2021. Pola Penggunaan Obat Antihipertensi Pada Pasien Hipertensi. Tipe 1, 127–135.
Udayani, N.N.W., Riastini, N.W., 2018. Perbedaan Efektivitas Penggunaan Obat Amlodipin Tunggal Dengan Kombinasi Amlodipin Dan Lisinopril Pada Pasien Hipertensi Rawat Inap Di RS "X" Tabanan Tahun 2017. Jurnal Ilmiah Medicamento (4) No.2
USP,  2017.  United  States  Pharmacopeia,  ed  40.  United  States  Pharmacopeia  Convention, Rockville.
WHO  (2003):  Effective  medicines  regulation :  ensuring  safety  ,  efficacy  and  quality, WHO Policy Perspectives on Medicines , WHO. 1–6.
Yulianti, T., Chiburdanidze, A., 2018, Ketepatan Pemilihan Obat Antihipertensi Pada Pasien Hipertensi Rawat Jalan di Surakarta, The 7th University Research Colloqium, 663-668