Journal of Aquaculture and Fish Health Vol. 9(3) - September 2020 DOI : 10.20473/jafh.v9i3.18855

## Analisis Keanekaragaman Genus Vibrio pada Udang Terinfeksi Enterocytozoon Hepatopenaei (EHP) dengan Metode

## Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Polymerase Chain Reaction (ERIC PCR)
Diversity Analysis of Genus Vibrio in Enterocytozoon Hepatopenaei (EHP) Infected Shrimp with Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Polymerase Chain Reaction (ERIC PCR) Method
Fenny Amelia 1 , Beni Halalludin 2 , Sidrotun Naim 1,3 dan Rega Permana 4*
1 Program Studi Biologi, Fakultas Ilmu Hayati, Universitas Surya, Jl. M.H. Thamrin Km 2.7, Kota Tangerang 15143, Indonesia
2 Animal Health Service Laboratory, PT. Central Proteina Prima, Jl. Anggerek 3 Blok EA No.11, Kota Tangerang 15560, Indonesia
3 Program Studi Teknik Lingkungan, Fakultas Teknik, Universitas Surya, Jl. M.H. Thamrin Km 2.7, Kota Tangerang 15143, Indonesia
4 Departemen Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Padjadjaran, Jalan Raya Bandung-Sumedang KM.21 Jatinangor, Kabupaten Sumedang 45363, Indonesia

## Abstrak
Udang merupakan salah satu komoditas unggulan nasional dan  memiliki  nilai  ekonomi  yang  tinggi.  Produksi  udang budidaya di Indonesia tahun 2012-2017 mengalami kenaikan secara signifikan. Meski mengalami kenaikan, masih terdapat masalah  yang  harus  diatasi,  salah  satunya  adalah  penyakit yang  disebabkan  oleh  parasit Enterocytozoon  Hepatopenaei (EHP). Infeksi EHP mengganggu sel tubulus hepatopankreas. Lesi  yang  disebabkan  oleh  EHP  dapat  menjadi  tempat pertumbuhan  koloni Vibrio sehingga  meningkatkan kemungkinan  munculnya  penyakit  lain.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  keanekaragaman Vibrio pada udang  terinfeksi  EHP  yang  dianalisis dengan Enterobacterial Repetitive  Intergenic  Consensus  Polymerase  Chain  Reaction (ERIC PCR). ERIC PCR dapat membedakan strain bakteri yang berkerabat dekat, prosedur kerja yang sederhana, cepat dan murah. Bakteri Vibrio diisolasi dari hepatopankreas, feses dan air  udang  terinfeksi  EHP  dan  udang  sehat  (kontrol), dilanjutkan dengan ekstraksi  DNA,  ERIC PCR, elektroforesis dan  konstruksi  pohon  filogenetik.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  jumlah  bakteri Vibrio pada hepatopankreas,  air  dan  feses  udang  terinfeksi  EHP  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  udang  sehat.  Udang  terinfeksi EHP memiliki keanekaragaman Vibrio yang lebih rendah dari pada udang sehat. Hal ini menunjukkan adanya spesies Vibrio spesifik yang mendominasi pada udang terinfeksi EHP.
*Correspondence : rega.permana@unpad.ac.id
Received : 2020-04-29 Accepted : 2020-07-06
Kata Kunci : Enterocytozoon Hepatopenaei, ERIC PCR, Udang  vaname, Vibrio
Keywords : Enterocytozoon Hepatopenaei, ERIC PCR , Vannamei shrimp, Vibrio

## Abstract
Indonesian  cultivation  of  shrimp  production  increased significantly  in  2012-2017.  Despite  this,  there  are  still problems that need to be solved, and one of them is the disease caused  by Enterocytozoon  Hepatopeneaei (EHP).  Infection  of EHP  disturbed  hepatopancreatic  tubular  cells.  The  lesion caused  by  EHP  allows Vibrio to  form  colonies  in  the  cell, increasing shrimps' susceptibility to other diseases. This study aimed to determine the number of Vibrio colonies and Vibrio diversity in EHP-infected shrimp analyzed by Enterobacterial Repetitive  Intergenic  Consensus  Polymerase  Chain  Reaction (ERIC  PCR).  This  method  can  differentiate  closely  related bacteria strain with simple, fast, and cheap procedure. Vibrio bacteria were isolated from hepatopancreas, feces, and water of EHP infected shrimp and healthy shrimp (control), followed by  genome  extraction,  ERIC  PCR,  electrophoresis,  and phylogenetic  tree  construction.  The  results  showed  that  the number of Vibrio bacteria in hepatopancreas, water, and feces of  EHP-infected  shrimp  were  higher  than  healthy  shrimp. Infected shrimp with EHP have lower Vibrio diversity than the healthy  shrimp.  This  indicating  that  some  specific Vibrio species dominated the infected shrimp.

## PENDAHULUAN
Udang  merupakan  salah  satu komoditas  unggulan  nasional  dan memiliki  nilai  ekonomi  yang  tinggi.
Berdasarkan Pusat Data Statistik, Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan
(2018),  produksi  udang  budidaya  pada tahun  2012  hingga  2017  secara keseluruhan  mengalami  kenaikan.  Meski produksi  budidaya  udang  mengalami kenaikan,  penyakit  pada  udang  menjadi penghambat utama untuk pengembangan budidaya  udang  (Selvin et  al .,  2015). Salah  satu  penyakit  yang  muncul  pada udang disebabkan oleh parasit Enterocytozoon Hepatopenaei (EHP). EHP merupakan parasit mikrosporidian  pada  udang  windu  dan vaname.  Parasit  EHP  pertama  kali diidentifikasi  dan  dikarakterisasi  pada udang  windu  ( Penaeus  monodon )  di Thailand  pada  tahun  2009.  EHP menginfeksi  sitoplasma  dari  sel  tubulus epitelial  dari  hepatopankreas  udang (Tourtip et  al .,  2009).  Pada  uji laboratorium,  udang  vaname  yang terinfeksi  EHP  meningkatkan  kerentanan akan  infeksi Vibrio yang  berasosiasi dengan Acute  Hepatopancreatic  Necrosis
Diseases (AHPND). Infeksi EHP
mengganggu  sel  tubulus  hepatopankreas dan Vibrio yang  sudah  ada  membentuk koloni pada sel tersebut (Aranguren et al ., 2017).
Terdapat  beberapa  metode  yang digunakan  untuk  identifikasi Vibrio , antara lain Ribotyping, Amplified Fragment Length  Polymorphism (AFLP), Repetitive Extragenic  Palindromes (REP),  dan Pulse Feld  Gel  Electrophoresis (PFGE).  Metode- metode  tersebut  memberikan  informasi dan  wawasan  baru  mengenai  struktur populasi  dan  identifikasi  organisme  dari famili  Vibrionaceae.  Metode  yang  paling sering digunakan adalah rep-PCR terutama Enterobacterial Repetitive
Intergenic  Consesus  Polymerase  Chain Reaction (ERIC  PCR)  karena  dapat menunjukkan perbedaan yang sangat jelas dan  memberikan  reproduksibilitas  yang lebih baik (Wong dan Lin, 2001; Gomez- Gil et al ., 2014). ERIC-PCR merupakan metode penapisan  DNA  (DNA fingerprinting ) berdasarkan sekuen yang repetitif (ERIC) pada genom bakteri. Elemen ERIC sangat lestari dan sangat bervariasi antar spesies,
memiliki  panjang  127  pasang  basa (Sharples dan Lloyd, 1990). Teknik ERIC- PCR  sering  digunakan  karena  ERIC-PCR dapat  membedakan  strain  bakteri  yang berkerabat dekat, prosedur kerja sederhana,  cepat,  dan  murah  (Bilung et al. , 2018; Asgarani et al. , 2015). ERIC PCR telah berhasil digunakan untuk
menganalisis  keanekaragaman  strain Mycobacterium  tuberculosis (Sechi et  al. , 1998), Vibrio  parahaemolyticus yang diisolasi dari kerang di Padang, Indonesia (Zulkifli et al. , 2009), Vibrio cholerae dari es batu di Jakarta, Indonesia (Waturangi et al. , 2012), dan Vibrio parahaemolyticus yang berasosiasi dengan AHPND (Feng et al .,  2017).  Penggunaan  ERIC  PCR  untuk menganalisis  keanekaragaman  spesies Vibrio pada  udang  yang  terinfeksi  EHP masih belum banyak dilaporkan. Penelitian ini dilakukan untuk menganalisis  keanekaragaman Vibrio
pada  udang  yang  terinfeksi  EHP  dengan ERIC PCR.

## METODOLOGI Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan di laboratorium Animal  Health  Service dan laboratorium Disease  Research  Center PT. Central  Proteina  Prima  Tbk,  Tangerang, Banten  15560.  Penelitian  dilaksanakan pada bulan Februari-Juni 2019.

## Materi Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  akuarium  volume 150  L,  neraca  analitik  (AL204,  Mettler Toledo,  USA),  keramba  kain, shaking incubator (VS-8480SL,  Bionex  Vision Scientific,  Co.  Ltd.,  Korea),  cawan  petri (3160-102,  Pyrex,  Prancis),  Erlenmeyer (Iwaki,  Indonesia), hotplate (SP18425Q Nuova Stirplate, Thermo Scientific, USA), Laminar  Clean  Bench (Airstream  Gen  3 Laminar  Flow  Clean  Benches,  Esco, Singapura),  gelas  ukur  (Graduated Cylinders,  PP,  Class  B,  with  raised  blue scale  Plasti  Brand,  VitLab,  Jerman), magnetic  sitrrer  bar ,  spatula,  autoklaf (Tomy  SX-700,  Tomy  Digital  Biology,
Jepang), tabung reaksi (Iwaki, Indonesia), botol  Schott  (laboratory  bottle  with  din thread,  Duran,  Jepang),  oven  (UN  450, Memmert, Jerman), botol vial, mikropipet (P2L, P10L, P20L, P100L, Gilson, USA dan Eppendorf, Jerman), tips (D10, Pipetman Diamond  Tips  D10,  Gilson,  USA), spreader ,  inkubator  (IN  750  plus, Memmert, Jerman), colony counter , kulkas (GN-B422SQCL,  LG,  Korea), microtube (1.5 ml, Axygen, USA), bunsen, korek api,
micropesstle
(SIAL501ZZ0, Merck, Jerman),  kulkas  -80 o C  (New  Brunswick Scientific  U360  Innova,  Eppendorf, Jerman),  pipet  tetes  (plastik  5  ml, Onemed,  Indonesia), stopwatch (H-2017, Hoseki,  Jepang),  gelas beaker (Pyrex, Prancis),  pH  meter  (S20  SevenEasy, Mettler  Toledo,  USA),  lup  inokulasi, microwave  (R21DOSIN,  Sharp,  Jepang), DNA column (Axygen,  USA),  mesin thermocycler (Veriti  96-well  Applied Biosystems,  Thermo  Fisher  Scientifics, USA), chamber  electrophoresis (Owl EasyCast  B2,  Thermo  Fisher  Scientifics, USA) , dan gel  documentation (UVITEC UVIdoc HD2, Cambridge, UK).
Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah juvenil udang sehat dan udang terinfeksi EHP yang didapatkan dari PT. CP Prima, air laut (asli dari pesisir laut  Tangerang),  pakan  udang  komersial (Feng  Li  Gold,  PT.  Matahari  Sakti, Indonesia),  aluminium  foil  ( Total  Wrap ), media  TCBS  (Difco,  Thermo  Fisher Scientific,  USA),  media  TSA  (Difco), media  TSB  (Difco),  akuades  steril, natrium  klorida  (Merck,  Jerman),  jarum suntik,  larutan  etanol  absolut  (Merck, Thermo  Fisher  Scientific,  USA),  larutan KOH 3% (Emsure, Merck, Thermo Fisher Scientific,
USA), reagen oksidase (N,N,N’,N’-,Tetramethyl-p-phen ylene- diaminedihydrochloride,  Sigma-Aldrich, Jerman),  medium  OF  Basal  (Difco, Thermo  Fisher  Scientific,  USA),  glukosa (Merck,  Jerman),  reagen  katalase  H 2 O 2 (OneMed,  Indonesia),  0,25%  SDS (Thermo Fisher Scientific, USA), buffer LB (Thermo  Fisher  Scientific,  USA),  etanol 75%  (Thermo  Fisher  Scientific,  USA), nuclease  free  water (Thermo  Fisher
Scientific, USA), master mix GoTaq Green 2x (Promega, USA), primer ERIC 1R dan 2F  dari  PT.  CP  Prima  (confidential  PT. CPP), Agarosa (Bioron, Jerman), boric acid (Emsure, Merck, Thermo Fisher Scientific, USA) , trisbase  (Himedia,  USA),  EDTA (Emsure, Merck, Thermo Fisher Scientific, USA), loading  dye HydraGreen  (Thermo Fisher Scientific, USA), marker 10 kb (log 2,  Biolabs  Inc,  USA),  masker  (Sensi,  PT. Media  Mitra  Pratama,  Indonesia),  dan sarung tangan (Sempermed, Singapura).

## Rancangan Penelitian
Penelitian dilakukan
secara eksperimental  meliputi bioassay EHP, isolasi  dan  kuantifikasi  bakteri  dari hepatopankreas,  feses  dan  air  serta analisis  keanekaragaman  menggunakan ERIC  PCR.  Rangkaian  eksperimen  akan dilakukan  pada  kelompok  udang  sehat dan kelompok udang yang terinfeksi EHP sehingga  gambaran  mengenai  perbedaan kelimpahan  bakteri  pada  dua  kelompok ini akan terlihat dengan jelas.

## Prosedur Kerja Bioassay EHP
Sebelum  bioassay  EHP  dilakukan, udang  sehat  dan  udang  EHP  diambil untuk  mengkonfirmasi  infeksi  dengan metode nested PCR. Nested PCR  EHP menargetkan  gen  pengkode  protein dinding  spora  ( spore  wall  protein atau SWP)  dari  EHP.  Panjang  amplikon  yang dihasilkan  sebesar  148  pasang  basa (Itsathitphaisarn et  al .,  2017).  Metode bioassay EHP  yang  dilakukan  adalah kohabitasi, mengikuti protokol dari PT. CP Prima (unpublished).
Sebanyak  enam  akuarium  150  L diisi  dengan  air  laut  (salinitas  20  ppt). Tiga  akuarium  diisi  dengan  10  udang sehat (31-33 gram) dan 3 udang terinfeksi EHP  secara  alami  (8-9  gram).  Tiga akuarium  lainnya  diisi  dengan  10  udang sehat (31-33 gram) dan 3 udang sehat (8- 9  gram)  sebagai  kontrol.  Penggunaan kedua  ukuran  udang  yang  berbeda berdasarkan pada hasil penelitian PT. CP Prima,  dimana  pada  jumlah  dan  berat udang tersebut infeksi EHP lebih optimal (unpublished). Udang terinfeksi EHP dan udang sehat dipisahkan dengan keramba untuk mencegah kontak kedua kelompok.
Tiga  hari  setelah  infeksi  dilakukan, udang  di  dalam  keramba  diangkat. Persentase  pakan  harian  ( feeding  rate ) udang dengan massa ± 3 gram adalah 5%. Berat  pakan  udang  harian  udang  di  luar keramba  sebesar  0.8  gram,  diberikan empat  kali  sehari  hingga  eksperimen selesai dilakukan. Sedangkan berat pakan udang  dalam  keramba  setengah  dari feeding rate, sebesar 0.4 gram.
Pengamatan dilakukan sampai 14-31 hari setelah  udang  sakit  dalam  keramba diangkat. Setelah pengamatan sampai hari ke-31,  semua  udang  kemudian  diambil dari  akuarium  dan  dipisahkan  menjadi dua  kelompok,  yaitu  udang  sehat  dan udang terinfeksi EHP berdasarkan hasil uji PCR dan pengamatan morfologi hepatopankreas.  Setelah  dikelompokkan, diambil  untuk  menghitung  total  bakteri (TVC) dan Vibrio (PVC) pada hepatopankreas. Kelimpahan bakteri total dan  bakteri Vibrio pada  air  dan  feses dihitung setiap satu minggu sekali.
Gambar 1.  Desain eksperimen bioassay .

## Menghitung  Bakteri  Total  dan Terduga Vibrio
Jumlah  bakteri  total  dan  terduga Vibrio pada  hepatopankreas  udang  sehat dan  udang  terinfeksi  EHP  dihitung  pada hari  ke-0  dan  31  menggunakan  metode Total  Viable  Count (TVC)  dan  metode Planctobacteria  Viable  Count (PVC). Bakteri  juga  diisolasi  menggunakan metode spread plate untuk dikarakterisasi secara  biokimia  dan  dilanjutkan  dengan ERIC PCR.
Karakterisasi Isolat Vibrio Karakterisasi isolat Vibrio dilakukan dengan pengamatan morfologi koloni dan uji  biokimia.  Morfologi  koloni  diamati dengan mengisolasi bakteri menggunakan media  TCBS  dan  TSA+  kemudian diinkubasi pada suhu 30 ° C selama 18-24 jam. Uji biokimia yang dilakukan meliputi uji salinitas pada media TSA dengan NaCl 2%, uji gram dengan KOH 3%, uji oksidase menggunakan tetrametil-p-fenilendiamin- dihidroklorida, uji katalase dengan H 2 O 2 , dan  uji  oksidasi  glukosa  pada  media  OF Basal (DIFCO).

## Prosedur ERIC PCR
Primer yang digunakan untuk ERIC PCR yaitu ERIC F(5’ à 3’): AAGTAA-GTGA CTGGGGTGAGCG  dan  ERIC  R’  (3’ à 5’):
ATGTAAGCTCCTGGGGATT-CAC.
DNA dari isolat Vibrio diekstraksi menggunakan metode dari PT. CP Prima (unpublished). Total campuran reaksi  ( reaction mixture ) adalah  25  µl,  terdiri  dari  12.5  µL master mix  GoTaq  Green  2x,  6  µL nuclease  free water, 2,5 µL primer F, 2,5 µL primer R, dan  1,5  µL  DNA template .  Amplifikasi dilakukan  dengan  mengikuti  parameter sebagai berikut: initial denaturation pada 95 o C  selama  5  menit  1  kali,  diikuti  30 siklus  predenaturasi  90 o C  selama  30 detik, annealing 50 o C  selama  30  detik, ektensi ( extension ) 52 o C selama 1 menit, 72 o C  selama  1  menit,  kemudian  ekstensi akhir  ( final  extension )  72 o C  selama  8 menit 1 kali.

## Elektroforesis Gel Agarosa
Prosedur  elektroforesis  gel  agarosa mengikuti  protokol  PT.  CP  Prima (unpublished). Hasil amplifikasi ERIC PCR dilakukan elektroforesis pada gel agarosa 1.2%  dalam  1x  Tris-Borate-EDTA  (TBE) dan  3  µl loading  dye HydraGreen. Sebanyak 8  µl  produk  PCR  masukkan  ke dalam  sumuran.  Pada  sumuran  lain ditambahkan marker 10 kb. Elektroforesis dilakukan  dengan  waktu  100  menit,  80 volt,  400  ampere.  Hasil  elektroforesis tidak  ditambahkan  dengan  reagen pewarnaan  asam  nukleat  karena  saat pembuatan  agarosa  sudah  ditambahkan dengan pewarna Hydra
Green, divisualisasi dengan Gel documentation.

## Analisis Data
Data yang diperoleh dari penelitian dianalisis  dengan  mengonstruksi  pohon filogenetik Vibrio dari  udang  sehat  dan udang yang terinfeksi EHP hasil ERIC-PCR yang  sudah  divisualisasi.  Konstruksi pohon  filogenetik  dilakukan  dengan menggunakan perangkat lunak
Paleontological  Statistics versi  3  (Past3). Kemudian  hasil  akan  dianalisis  secara deskriptif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Bioassay EHP
Hasil  PCR  menunjukkan  bahwa udang sehat tidak terinfeksi EHP (negatif) dan  udang  EHP  positif  terinfeksi  EHP. Udang terinfeksi EHP menunjukkan warna hepatopankreas  yang  lebih  pucat  dan memiliki  ukuran  yang  lebih  beragam karena  pertumbuhan  yang  terhambat. Udang  sehat  (kontrol)  memiliki  ukuran yang  tidak  jauh  berbeda.  Udang  kontrol terbesar memiliki berat 9,44 gram, terkecil memiliki  berat  6,16  gram.  Sedangkan udang  terinfeksi  EHP  terbesar  memiliki berat  9,01  gram,  dan  terkecil  memiliki berat  2,91  gram.  Ukuran  udang  EHP bervariasi  sesuai  dengan  penelitian  yang dilakukan oleh Rajendran et al . (2016).
Tabel 1.
Massa udang setelah bioassay kohabitasi hari ke-31. Kontrol (Gram) EHP (Gram) I 78,06 76,69 (Negatif EHP) II 70,93 57,81 III 70,17 55,86 Rata-rata 73,05 ± 3,55 56,83 ± 9,35
Pada akuarium EHP I menunjukkan udang  tidak  terinfeksi  EHP.  Hal  ini disebabkan  karena  pada  fase  kohabitasi dari  tiga  udang  terinfeksi  EHP  yang  di- gunakan,  dua  diantaranya  mati  sehingga proses  infeksi  EHP  terhadap  udang  lain kurang kuat. EHP menginfeksi sitoplasma dari sel tubulus epitelial dari hepatopankreas udang, sehingga merusak kemampuan hepatopankreas untuk menyerap  nutrisi  dari  makanan  dan menyebabkan pertumbuhan udang terhambat (Tourtip et al., 2009; Newman, 2015). Terhambatnya pertumbuhan udang terinfeksi EHP menyebabkan berat udang  menjadi  lebih  ringan  dari  pada udang sehat.

## Jumlah  Bakteri  Total  dan  Terduga Vibrio
Jumlah bakteri total pada hepatopankreas  udang  sehat  mengalami kenaikan  setelah  31  hari  kultur.
Sedangkan  pada  udang  terinfeksi  EHP jumlah
bakteri total mengalami penurunan.  Jumlah  bakteri Vibrio pada hepatopankreas  udang  sehat  dan  udang terinfeksi  EHP  mengalami  penurunan (Gambar  2).  Perkembangan  infeksi  EHP yang  lambat  (kronis)  dan  kondisi
lingkungan  yang  lebih  baik  daripada tempat pemeliharaan sebelumnya menyebabkan  mikroflora  pada  udang mengalami  perbaikan  (Rajendran et  al ., 2016).  Lingkungan  dan  sistem  imun udang  yang  baik  menyebabkan  jumlah Vibrio pada  hepatopankreas  cenderung menurun.  Infeksi  EHP  tidak  berlangsung cepat, sehingga jumlah Vibrio pada udang terinfeksi EHP cenderung mengalami pola yang sama dengan udang kontrol.
Dibandingkan  dengan  udang  sehat, jumlah Vibrio pada udang EHP lebih tinggi (Gambar 2). Meningkatnya jumlah Vibrio pada  udang  terinfeksi  EHP kemungkinan disebabkan oleh sistem imun udang yang menurun  akibat  infeksi  EHP.  Meski hepatopankreas  tidak  secara  langsung terlibat  dalam  sistem  imun,  penurunan nutrisi  dan  energi  akibat  infeksi  EHP menurunkan  sistem  pertahanan  tubuh udang (Pascual et al ., 2006). Hepatopankreas ditutup oleh selaput  membran  tipis,  tersusun  dari tubulus  yang  dihubungkan  oleh  jaringan ikat  basofilik  yang  meningkatkan  luas permukaan  untuk  pencernaan  dan penyerapan.  Setiap  tubulus  memiliki lumen  pada  bagian  tengahnya  dan dibatasi  oleh  epitel  (Reantaso et  al .,
2013).
Gambar 2.  Jumlah bakteri total dan terduga Vibrio dari hepatopankreas yang tumbuh pada media TSA+ dan TCBS.
EHP  merupakan  parasit  obligat intraseluler yang menyerang hepatopankreas  udang  (Tourtip et  al ., 2009). Dengan nutrisi dari sel hepatopankreas, spora EHP berproliferasi, menyebabkan  sel  inang  membesar  dan pecah. Sel inang yang pecah (lesi) sudah tidak  terdapat  pertahanan  tubuh  udang, sehingga menjadi tempat yang baik untuk Vibrio tumbuh (Tang et al ., 2017).
Umumnya,  udang  positif  terinfeksi EHP setelah hari ke-20 bioassay kohabitasi
dilakukan  (Jaroenlak et  al., 2018).  Pada penelitian  ini,  infeksi  EHP  telah  terjadi pada hari ke-21. Hal ini diperkuat dengan jumlah Vibrio pada  air  dan  feses  udang EHP  yang  mengalami  perubahan  pada hari  ke-21  (Gambar  3).  Hasil  ini  sesuai dengan  penelitian  sebelumnya  bahwa jumlah Vibrio pada  air  dan  feses menunjukkan  kondisi  yang  terjadi  pada udang,  jumlah  bakteri Gammaproteo- bacteria meningkat  pada  air  udang  sakit (Zheng et al ., 2017).
Gambar 3.  (A) Jumlah bakteri total dan terduga Vibrio yang tubuh di air; (B) Jumlah bakteri total dan terduga Vibrio di feses yang tumbuh pada media TSA+ dan TCBS.
Jumlah Vibrio
juga dihitung berdasarkan  warna  koloni.  Pada  media TCBS,  terdapat  dua  warna  koloni Vibrio yang  muncul,  yaitu  hijau  dan  kuning. Perubahan warna dan jumlah koloni pada udang terinfeksi EHP terjadi pada air dan feses  udang  EHP.  Air  pada  akuarium udang  sehat  memiliki  jumlah  koloni kuning lebih tinggi dari pada koloni hijau (Gambar 4A).
Air pada akuarium udang terinfeksi EHP  memiliki  jumlah  koloni  hijau  yang
lebih  tinggi  dari  pada  koloni  kuning (Gambar 4C). Feses udang sehat (kontrol) memiliki jumlah koloni kuning yang lebih tinggi dari pada koloni hijau (Gambar 4B). Berbeda dengan udang sehat, feses udang EHP  memiliki  jumlah  koloni  hijau  yang lebih  tinggi  dari  pada  koloni  kuning. Tetapi  pada  hari  ke-28  jumlah  koloni kuning lebih tinggi dari pada koloni hijau (Gambar 4D).
A B
Gambar 4.  Jumlah terduga Vibrio dari (A) air udang sehat; (B) feses udang sehat; (C) air udang EHP, dan (D) feses udang EHP pada media TCBS.
Bakteri Vibrio yang  menyebabkan penyakit  pada  udang  umumnya  tidak dapat  melakukan  fermentasi  sukrosa, sehingga menghasilkan warna hijau pada media  TCBS  (Lavilla-Pitogo  dan  Pena, 1998),  seperti Vibrio  parahaemolyticus, Vibrio  campbelii,  Vibrio  tapetis,  Vibrio harveyi . Vibrio  parahaemolyticus strain virulen dan Vibrio campbelii yang memiliki gen  pir VP dan  menghasilkan  toksin  pirA dan  pirB  menyebabkan  penyakit  AHPND pada  udang  (Dong et  al .,  2017). Vibrio tapetis menyebabkan Brown  Ring  Disease (Balboa et al., 2012). Vibrio harveyi yang tidak  berpendar  ( non  luminescence ) berasosiasi  dengan  penyakit White  Tail Disease (Zhou et al ., 2012).

## Karakterisasi Isolat Vibrio
Pada  media  TCBS,  koloni Vibrio berwarna  hijau  dan  kuning,  diameter koloni 1-4 mm, berbentuk bulat dan tidak beraturan, elevasi cembung dan pinggiran halus.  Pada  media  TSA+,  koloni Vibrio berwarna putih kekuningan, dan pinggiran  koloni  yang  halus.  Morfologi dan  warna  koloni Vibrio pada  penelitian
ini  sesuai  dengan  ciri  koloni Vibrio pada penelitian  sebelumnya  (Gomez-Gil et  al .,
2014).  Uji  katalase  pada  isolat Vibrio memberikan  hasil  positif  pada  83  isolat dan 26 isolat Vibrio lainnya menunjukkan hasil  negatif.  Uji  positif  katalase ditunjukkan  dengan  adanya  gelembung. Gelembung  yang  dihasilkan  adalah  hasil konversi  enzim  katalase  dari  hidrogen peroksida  menjadi  oksigen  (Barton  dan McLean,  2019).  Uji  gram  menggunakan KOH 3% menunjukkan bahwa isolat Vibrio merupakan  bakteri  gram  negatif. Setelah ditambahkan KOH 3%, semua isolat (109 isolat) menunjukkan adanya benang yang kental.  Benang  kental  dapat  terbentuk karena  dinding  sel  bakteri  gram  negatif yang  lisis  dan  keluarnya  DNA  bakteri (Clontz, 2009).
Seluruh  isolat Vibrio menunjukkan hasil positif pada uji oksidase. Isolat Vibrio memiliki  enzim  sitokrom  oksidase  yang dapat  mengoksidasi  reagen  oksidase, tetrametil-p-fenilendiamin-dihidroklorida dan  membentuk  produk  indofenol  yang berwarna  ungu  (Csuros  dan  Csuros, 1999).  Selain  uji  gram  dan  oksidase,
A
B C
D
seluruh  isolat Vibrio menunjukkan  hasil positif  pada  uji  oksidatif  glukosa.  Media oksidatif  glukosa  berwarna  hijau  karena terdapat  indikator  pH  bromotimol  biru. Setelah  diinokulasikan  dengan  isolat Vibrio dan  diinkubasi  selama  18-24  jam, media  menjadi  berwarna  kuning.  Isolat Vibrio menghasilkan  asam  sehingga  pH media  menjadi  turun.  Pada  pH  asam bromotimol biru berubah warna dari hijau menjadi  kuning  (Ramakrishnan  dan Sulochana,  2012).  Seluruh  isolat Vibrio menunjukkan  hasil  positif  pada  uji  gram dengan KOH 3%, uji oksidase dan oksidasi glukosa,  sesuai  dengan  literatur  yang ditulis  oleh  Holt et  al. (1994)  dan Parija (2012).
Analisis  Hasil  ERIC  CR  dan Konstruksi Pohon Filogenetik
Isolat Vibrio yang berhasil
diekstraksi  dan  dilanjutkan  dengan  ERIC PCR sebanyak 109 isolat, dengan jumlah koloni  dari  hepatopankreas  udang  sehat sebanyak  11  isolat,  air  udang  sehat
sebanyak 22 isolat, dan feses udang sehat sebanyak  31  isolat.  Hepatopankreas udang EHP yang berhasil dilakukan ERIC PCR sebanyak 6 isolat, air udang EHP 15 isolat  dan  feses  udang  EHP  sebanyak  24 isolat.
Sebanyak 109 isolat Vibrio berhasil diamplifikasi dengan primer ERIC 1R dan 2F. Fragmen DNA bakteri Vibrio hasil ERIC PCR  berkisar  antara  3-8  pita.  Fragmen DNA  hasil  ERIC-PCR  memiliki  ukuran yang bervariasi antara 3 kb sampai dengan 0.2  kb.  ERIC  PCR  dapat  menghasilkan pita/ band sebanyak  3-15  dengan  ukuran dari  0.1-5  kb  (Zulkifli et  al .,  2009). Fragmen  ERIC  yang  sering  ditemukan pada  isolat Vibrio sebanyak  satu  pita/ band ,  pada  3  kb.  Pada  hepatopankreas udang  sehat  dan  EHP,  fragmen  ERIC sering  ditemukan  pada  band  1.2-1.5  kb. Fragmen  ERIC  yang  sering  ditemukan pada isolat Vibrio dari air udang sehat dan EHP  adalah  3  kb.  Sedangkan  pada  feses udang  sehat  dan  EHP  pada  pita/ band ukuran 1.2-1.5 dan 3 kb.
Tabel 2.   Sumber dan jumlah koloni Vibrio yang dilakukan ERIC PCR.
Sumber isolat Jumlah koloni kuning Jumlah koloni hijau Total koloni Hepatopankreas udang sehat (HS) 6 5 11 Air udang sehat (AS) 14 8 22 Feses udang sehat (FS) 20 11 31 Hepatopankreas udang EHP (HE) 3 3 6 Air udang EHP (AE) 5 10 15 Feses udang EHP (FE) 12 12 24 Jumlah keseluruhan 109 Visualisasi hasil ERIC PCR menunjukkan  bahwa  isolat Vibrio baik dari udang sehat maupun udang terinfeksi EHP memiliki profil ERIC yang beragam. Pohon filogenetik hasil ERIC PCR berhasil dikonstruksi  berdasarkan  sumber  bakteri Vibrio ,  hepatopankreas,  air  dan  feses.
Konstruksi pohon filogenetik menggunakan  program  Past3,  dengan koefisien Dice  Similarity dan  UPGMA (Maluping et al ., 2005). Perbedaan  jumlah  dan  ukuran  dari hasil ERIC PCR menunjukkan
keanekaragaman  genetik  dari  isolat bakteri  (Meacham et  al., 2003).  Pohon filogenetik  hasil  ERIC  PCR  menunjukkan kekerabatan  isolat Vibrio dari  air,  feses, hepatopankreas,  udang  sehat  dan  udang EHP. Clustering pada  pohon  filogenetik dilakukan  berdasarkan  tingkat  kemiripan 50%  (0.5 similarity )  (Pusparini et  al ., 2018).
Gambar 5.  Visualisasi  gel  agarosa  1.2%  hasil  ERIC  PCR  dari  (A)  hepatopankreas  udang sehat, (B) air udang sehat, (C) feses udang sehat, (D) hepatopankreas udang EHP, (E) air udang EHP, (F) feses udang EHP.
Gambar 6.  Konstruksi pohon filogenetik (A) Vibrio udang sehat dan (B) Vibrio udang EHP.
Koloni Kuning
Koloni Kuning
Koloni Hijau Koloni Hijau Koloni Kuning Koloni Hijau Koloni Kuning Koloni Kuning Koloni Hijau Koloni Hijau Koloni Hijau Koloni Hijau
Koloni Kuning
Koloni Hijau
Pada udang sehat terdapat 64 isolat yang  berhasil  dilakukan  ERIC  PCR.  Dari 64 isolat, terbagi menjadi 13 kluster dan 41  pola  yang  berbeda  (Gambar  6A). Bakteri Vibrio pada  udang  EHP  berhasil diisolasi  sebanyak  45  isolat.  Pohon filogenetik  berhasil  dikonstruksi  dengan 14  kluster  dan  27  pola  yang  berbeda (Gambar 6B). Berdasarkan hasil konstruksi pohon filo-genetik, isolat Vibrio ditemukan    menge-lompok  berdasarkan warna  koloni.  Pada  udang  sehat  dan udang  EHP,  terdapat  7  kelompok Vibrio berdasarkan  warna  koloni  hijau  dan kuning. Penambahan kluster pada udang yang  terinfeksi  EHP  disebabkan  karena terjadinya dominansi Vibrio yang patogen.
Vibrio merupakan  bakteri  patogen oportunistis  pada  udang. Vibrio dapat menjadi  patogen  ketika  udang  sedang tidak sehat, seperti adanya luka, terinfeksi penyakit  atau  terjadi  infeksi  sebelumnya (Brown et  al .,  2012).  Pada  udang  yang tidak  sehat,  keberadaan Vibrio yang patogen dapat menjadi lebih banyak dan lebih  dominan.  Umumnya Vibrio yang patogen tidak dapat melakukan
fermentasi  sukrosa,  pada  media  TCBS menunjukkan  koloni  berwarna  hijau (Lavilla-Pitogo  dan  de  la  Peña,  1998). Vibrio dapat bersifat dominan disebabkan oleh kemampuan Vibrio dalam melakukan quorum  sensing ,  adhesi,  kolonisasi,  dan infeksi terhadap host (Austin dan Zhang, 2006).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  yang  telah disampaikan  dapat  disimpulkan  bahwa metode  ERIC  PCR  cukup  efektif  untuk menganalisis  keanekaragaman  bakteri Vibrio secara cepat. Jumlah bakteri Vibrio pada  udang  terinfeksi  EHP  lebih  tinggi dibandingkan udang sehat namun keanekaragamannya lebih
rendah dibandingkan  udang  sehat.  Hal  ini menunjukkan  adanya  dominansi  spesies tertentu.  Penelitian  lebih  lanjut  terhadap jenis  spesies  tiap  isolat  bakteri  dapat dilakukan  dengan  metode  sekuensing untuk mendapatkan gambaran lebih jelas
dan  ciri  isolat  yang  lebih  detail.  Namun penggunaan  ERIC  PCR  dapat  dijadikan salah  satu  metode  alternatif  yang  cepat dan murah pada diagnosa penyakit infeksi EHP.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih kepada  seluruh  pihak  yang  mendukung kelancaran penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Aranguren,  L.F.,  Han,  J.E.  dan  Tang, K.F.J., 2017. Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis  disease  (AHPND)  and septic  hepatopancreatic  necrosis (SHPN) in the Pacific white shrimp Penaeus  vannamei . Aquaculture,
471 , pp.37-42. https://doi.org/10.
1016/j.aquaculture.2016.12.038. Asgarani, E., Ghashghaei, T., Soudi, M. R. dan Alimadadi, N., 2015. Enterobacterial repetitive intergenic  consensus  (ERIC)  PCR based genetic diversity of Xanthomonas spp. and its relation to  xanthan  production. Iranian Journal  of  Microbiology , 7 (1),  pp. 38-44.  https://www.ncbi.nlm.nih. gov/pmc/articles/PMC4670466/ Austin,  B.  dan  Zhang,  X.H., 2006. Vibrio harveyi :  a  significant  pathogen  of marine vertebrates and invertebrates. Letters  in  Applied Microbiology ,  43(2),  pp.119-124. https://doi.org/10.1111/j.1472- 765X.2006.01989.x.
Balboa, S., Dieguez, A.L., Doce, A., Barja, J.L.  dan  Romalde,  J.L.,  2012. Evaluation  of  different  culture media for the isolation and growth of the fastidious Vibrio tapetis, the causative  agent  of  brown  ring disease. Journal  of  invertebrate pathology , 111 (1), pp.74-81. https://doi.org/10.1016/j.jip.201 2.06.007.
Barton,  L.L.  dan  McLean,  R.J.C.,  2019. Environmental  Microbiology  and
Microbial  Ecology .  John  Wiley  & Sons, Inc. USA. p.445. Bilung, L.M., Pui, C.F., Su’ut, L. dan Apun, K.,  2018.  Evaluation  of  BOX-PCR and ERIC-PCR as molecular typing tools  for  pathogenic Leptospira . Disease  Markers , 2018 ,  pp.1-10. https://doi.org/10.1155/2018/13 51634. Brown, S.P., Cornforth, D.M. dan Mideo,
N., 2012. Evolution of virulence in opportunistic pathogens: generalism, plasticity, and control. Trends  in  microbiology , 20 (7),
pp.336-342. https://doi.org/10.10 16/j.tim.2012.04.005. Clontz,  L.,  2009. Microbial  Limit  and Bioburden Test Validation Approaches and Global Requirements  Second  Edition .  CRC Press. USA. p.326. Csuros, M. dan Csuros, C., 1999. Microbial Examination of Water and Wastewater .  CRC  Press.  USA.
p.364.
Dong, X., Wang, H., Xie, G., Zou, P., Guo,
C., Liang, Y. dan Huang, J., 2017. An  isolate  of Vibrio  campbellii carrying the pir VP gen causes acute hepatopancreatic necrosis disease. Emerging  Microbes  &  Infections, 6(1),  pp.1-3.  https://doi.org/10. 1038/emi.2016.131.
Feng, B., Liu, H., Wang, M., Sun, X., Pan, Y.  dan  Zhao,  Y.,  2017.  Diversity analysis of acute hepatopancreatic necrosis  disease-positive Vibrio parahaemolyticus strains. Aquaculture  and  Fisheries , 2 (6),
pp.278-285. https://doi.org/10.10
16/j.aaf.2017.10.001.
Gomez-Gil, B., Thompson, C., Matsumura,
Y.,  Sawabe,  T.,  Iida,  T.,  Christen, R.  dan  Thompson,  F.,  2014. The Family Vibrionaceae, The prokaryotes .  Springer,  Berlin: Heidelberg. pp.659-747. Holt,  J.G.,  Krieg,  N.R.,  Sneath,  P.H.A.,
Staley,  J.T.  dan  Williams,  S.T.,
1994. Bergey’s Manual of Determinate  Bacteriology  Ninth
Edition .  Lippincott  Williams  &
Wilkins. USA. p.787.
Itsathitphaisarn,  O.,  Thitamadee,  S.,
Weerachatyanukul, W. dan Sritunyalucksana, K., 2017. Potential  of  RNAi  applications  to control  viral  diseases  of  farmed shrimp. Journal  of  invertebrate pathology , 147 , pp.76-85. https:// doi.org/10.1016/j.jip.2016.11.00 6 Jaroenlak, P., Boakye, D.M., Vanichviriyakit,  R.,  Williams, B.A.P.,  Sritunyalucksana,  K.  dan Itsathitphaisam, P., 2018. Identification, characterization and heparin binding capacity of a spora-wall, virulence protein from the shrimp microsporidian, Enterocytozoon hepatopenaei
(EHP). Parasites  &  Vectors , 11
(177),  pp.2-15.  https://doi.org/ 10.1186/s13071-018-2758-z. Lavilla-Pitogo, C.R. dan de la Peña, L.D.,
1998.  Bacterial  diseases  in  tiger shrimp  culture  in  the  Philippines. SEAFDEC Asian Aquaculture ,
20 (5),  pp.6-7,  10,  32-33.  http://
repository.seafdec.org.ph/handle/
10862/2883.
Maluping, R.P., Ravelo, C., Lavilla - Pitogo, C.R.,  Krovacek,  K.  dan  Romalde, J.L.,  2005.  Molecular  typing  of Vibrio  parahaemolyticus  strains isolated  from  the  Philippines  by PCR - based  methods. Journal  of applied microbiology , 99 (2), pp.383-391. https://doi.org/10.11 11/j.1365-2672.2005.02571.x.
Meacham,  K.J.,  Zhang,  L.,  Foxman,  B., Bauer, R.J. dan Marrs, C.F., 2003. Evaluation  of  genotyping  large numbers  of  Escherichia  coli isolates by enterobacterial repetitive  intergenic  consensus- PCR. Journal of clinical microbiology , 41 (11),  pp.5224- 5226.  https://doi.org/10.1128/ jcm.41.11.5224-5226.2003. Newman,  S.G.,  2015.  Microsporidian impacts shrimp production- industry  efforts  address  control,
not eradication. Global Aquaculture Advocate , pp.33-35. Parija, S.C., 2012. Textbook of Microbiology and Immunology 2nd
Edition . Elsevier. Manesar. p.684.
Pascual, C., Ariadna, S., Edgar, Z., Gerard, C.,  Gaxiola,  G.,  Roberto,  B., Rolando,  G.,  Enrique,  H.  dan Carlos,  R.,  2006.  Biochemical, physiological,  and  immunological changes  during  starvation  in juveniles of Litopenaeus vannamei . Aquaculture, 25(1),  pp.416-429.
https://doi.org/10.1016/j.aquacu lture.2005.06.001. Pusat Data Statistik, Kementerian Kelautan dan Perikanan (Sidatik), 2018. Dashboard Produksi Perikanan dan Kelautan Satu Data –  Kementerian  Kelautan  dan Perikanan . Website https:// satudata.kkp.go.id/dashboard_pro duksi.
Pusparini,  N.,  Waturangi,  D.E.,  Usia,  T. dan  Nikastri,  E.,  2018.  Genetic diversity  of  Escherichia  coli isolated from ice cube production sites. BMC  research  notes , 11 (1), pp.1-8.  https://doi.org/10.1186/ s13104-018-3737-3.
Rajendran,  K.V.,  Shivam,  S.,  Praveena, P.E.,  Rajan,  J.J.S.,  Kumar,  T.S., Avunje,  S.,  Jagadeesan,  V.,  Babu,
S.P., Pande, A., Krishnan, A.N. dan Alavandi,  S.V.,  2016.  Emergence of  Enterocytozoon  hepatopenaei (EHP) in farmed Penaeus (Litopenaeus)  vannamei  in  India.
Aquaculture , 454 ,  pp.272-280.
https://doi.org/10.1016/j.aquacu lture.2015.12.034.
Ramakrishnan,  S.  dan  Sulochana,  K.N.,
2012. Manual of Medical Laboratory  Techniques .  Jaypee
Brothers  Medical Publishers.  New
Delhi. p.453.
Reantaso, M.B., Tran, L. dan Hue, D.T.T., 2013.  What  happens  when hepatopancreas  –  shrimp’s  main organ  for  food  absorption, digestion  and  storage  –  becomes infected  by  a  pathogen?. FAO
Aquaculture  Newsletter ,  51,  p.37-
39. Sechi, L.A., Zanetti, S., Dupré, I., Delogu,
G.,  dan  Fadda,  G.,  1998.
Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequences as molecular  targets  for  typing  of Mycobacterium tuberculosis strains. Journal  Of  Clinical  Microbiology ,
36 (1), p.128-132. https://doi.org/ 10.1128/JCM.36.1.128-132.1998 Selvin, J., Ninawe, A.S., Meenatchi, R. dan Kiran,  G.S.,  2015.  Control  of pathogenic  Vibrios  in  shrimp aquaculture  using  antiinfectives from  marine  natural  products. Nutrición  Acuícola: Investigación  y Desarrollo , p.102-141. http://nutri cionacuicola.uanl.mx/index.php/a cu/article/view/37.
Sharples,  G.J.  dan  Lloyd,  R.G.,  1990.  A novel  repeated  DNA  sequence located in the intergenic regions of bacterial  chromosomes. Nucleic acids  research , 18 (22),  pp.6503- 6508.https://doi.org/10.1093/na r/18.22.6503. Tang, K.F., Aranguren, L.F., Piamsomboon,  P.,  Han,  J.E., Maskaykina,  I.Y.  dan  Schmidt,
M.M.,  2017.  Detection  of  the microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei  (EHP)  and  Taura syndrome  virus  in  Penaeus vannamei  cultured  in  Venezuela. Aquaculture , 480 , pp.17-21. https: //doi.org/10.1016/j.aquaculture. 2017.07.043.
Tourtip,  S.,  Wongtripop,  S.,  Stentiford, G.D., Bateman, K.S., Sriurairatana, S., Chavadej, J., Sritunyalucksana, K.  dan  Withyachumnarnkul,  B., 2009.  Enterocytozoon  hepato- penaei  sp.  nov.  (Microsporida: Enterocytozoonidae), a parasite of the  black  tiger  shrimp  Penaeus monodon (Decapoda: Penaeidae): Fine  structure  and  phylogenetic relationships.
Journal of
invertebrate  pathology , 102 (1), pp.21-29. https://doi.org/10.1016 /j.jip.2009.06.004.
Waturangi, D.E., Joanito, I., Yogi, Y. dan Thomas, S., 2012. Use of REP- and ERIC-PCR  to  reveal  genetic heterogeneity  of Vibrio  cholerae from  edible  ice  in  Jakarta, Indonesia. Gut  Pathogens , 4 (1), pp.1-9.  https://doi.org/10.1186/ 1757-4749-4-2. Wong,  H.C.  dan  Lin,  C.H.,  2001. Evaluation  of  typing  of  Vibrio parahaemolyticus  by  three  PCR methods  using  specific  primers. Journal  of  Clinical  Microbiology ,
39 (12),  pp.4233-4240.  https:// doi.org/10.1128/JCM.39.12.4233 -4240.2001. Zheng, Y., Yu, M., Liu, J., Qiao, Y., Wang,
L., Li, Z., Zhang, X.H. dan Yu, M., 2017. Bacterial
community associated  with  healthy  and diseased  Pacific  white  shrimp (Litopenaeus  vannamei)  larvae and rearing water across different growth  stages. Frontiers  in
microbiology , 8 (1362),  pp.1-11. https://doi.org/10.3389/fmicb.20 17.01362. Zhou, J., Fang, W., Yang, X., Zhou, S., Hu, L., Li, X., Qi, X., Su, H., dan Xie, L., 2012.  A  nonluminescent  and highly  virulent Vibrio  harveyi strains is associated with “Bacterial White Tail Disease” of Litopenaeus vannamei Shrimp. Plos One , 7 (2), pp.1-6.  https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0029961. Zulkifli, Y., Alitheen, N.B., Son, R., Raha, A.R.,  Samuel,  L.,  Yeap,  S.K.  dan Nishibuchi,  M.,  2009.  Random amplified  polymorphic  DNA-PCR and  ERIC  PCR  analysis  on Vibrio parahaemolyticus isolated  from cockles  in  Padang,  Indonesia. International Food Research Journal, 16 (2), pp.141-150. http://www.ifrj. upm.edu.my/volume-16-2009.html.