ANALISIS RESPONS IMUN IKAN KOI ( Cyprinus carpio koi) YANG DIVAKSIN DENGAN WHOLE PROTEIN SPORA Myxobolus koi SEBAGAI KANDIDAT VAKSIN MYXOBOLUSIS
IMMUNE RESPONSE ANALYSIS OF FISH KOI ( Cyprinus carpio koi) VACCINATED Myxobolus koi SPORES WHOLE PROTEIN AS A VACCINE CANDIDATE MYXOBOLUSIS
Mohamad Yusuf 1 , Gunanti Mahasri 2 dan Mufasirin 3
1 Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga Kampus B Jl. Airlangga 4-6 Surabaya, 60286 Telp. 031-5041566
2 Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo – Surabaya, 60115 Telp. 031-5033710
3 Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya 60115

## Abstract
Myxobolus is one of parasites on koi fish that belongs to a class myxosporea that can infect and systemic and can cause  harm  to the fish  farming. Vaccination is an attempt to cause-specific endurance through vaccination. Observations differential leukocytes and increased optical density values can be used to determine the effectiveness of the vaccine is given.
This study aims to analyze the immune response koi fish vaccinated with Myxobolus koi spores whole  protein for  vaccine  development  myxobolusis  in  koi  fish.  The  method  used  in  this  study  is Completely Randomized Design with 4 treatments and 5 replications.
The results showed that a change in the total number and types of leukocytes that can be used as indicators  of  the  presence  of  certain  infectious  diseases  that  occure  in  fish.  The  highest  value  of lymphocytes in treatment B, monocytes  highest in treatment D,  neutrophils on treatment D, eosinophils on treatment A and basophils highest in treatment A. The observation of the highest optical density value in treatment B (fish vaccinated and infected 80 M. koi spores / tail) of 0.593 at day 30, while the lowest in treatment D (fish are not vaccinated but diinveksi 80 M. koi spores / tail) of 0,064 in 30 days.
Keywords : vaccination Myxobolus koi spore whole protein , differential  leukocyte, the  value of optical density, immune response

## Pendahuluan
Ikan  koi  merupakan  salah  satu  ikan hias  air  tawar  yang  menjadi  komoditas perikanan  yang  saat  ini  sedang  mendapatkan perhatian  pemerintah  untuk  pengembangan budidaya  (Anshary,  2008).  Masalah  utama dalam  budidaya  ikan  hias  di  Indonesia  hingga saat  ini  adalah  penyakit. Myxobolus merupakan salah  satu  parasit  pada  ikan  koi  yang  termasuk dalam  kelas  myxosporea  (Lom and Dykova, 1992)  yang  dapat  menginfeksi  dan  bersifat sistemik serta dapat menimbulkan kerugian bagi usaha budidaya ikan (Helmiati dkk., 2005).
Hadiroseyani (2003) mengemukakan bahwa  myxosporea  merupakan  protozoa  yang mampu  menurunkan  produksi  ikan  koi  di Indonesia  terutama  pada  benih  dan  dapat menyebabkan  kematian    pada  populasi  ikan yang  terinfeksi.  Rukyani  (1990)  menyatakan bahwa  infestasi Myxobolus  koi menyebabkan kematian ikan sebanyak 50% dari populasi pada beberapa kolam budidaya.
Upaya pengobatan dengan menggunakan perendaman air laut maupun penggunaan bahan kimia seperti formalin , methylen blue , pottasium permanganate , glacial  acetic  acid atau phenol tidak  efektif  untuk  mengobati  penyakit  ini (Hoshina, 1952 dalam Dwijayanti, 2011). Salah satu  metode  penanggulangan  penyakit  yang dinilai aman adalah vaksinasi (Poobalane et al ., 2010). Berdasarkan latar belakang yang dikemukakan di atas maka perlu dikembangkan cara  pencegahan  yang  tepat  dan  akurat  melalui penelitian  dengan  menganalisis  respons  imun ikan  koi  yang  divaksin  dengan whole  protein spora Myxobolus  koi sebagai  bahan  kandidat vaksin sehingga diharapkan terjadi proteksi atau terbentuk  respons  imun  pada  ikan  koi  terhadap infeksi Myxobolus .
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah menganalisis  respons  imun  ikan  koi  yang divaksin dengan whole protein spora Myxobolus koi untuk  pengembangan  vaksin  myxobolusis pada  ikan  koi,  mengamati  differensial  leukosit
darah  ikan,  menentukan  nilai optical  density (IgM)  pada  darah  ikan  dan  menentukan  tingkat kelangsungan hidup atau survival rate (SR).
Manfaat  dari  penelitian  ini  adalah memberikan  informasi  ilmiah  mengenai whole protein spora Myxobolus  koi sebagai  bahan pengembangan  vaksin  pada  ikan  koi  untuk mencegah  myxobolusis  dan  dapat  digunakan sebagai  acuan  dalam  pengembangan  bahan vaksin  dan  dapat  diterapkan  dalam  mencegah myxobolusis pada ikan koi.

## Materi dan Metode
Materi  penelitian  terdiri  dari  alat  dan bahan  penelitian.  Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  ikan  koi  yang  terinfeksi Myxobolus  koi .  Bahan  yang  digunakan  untuk isolasi  nodul  yang  berisi  spora Myxobolus  koi yaitu aquadest ,  larutan Phosphate  Buffered Saline (PBS), Ethanol absolute dan Buffer Tris- HCL.  Bahan  untuk  isolasi  protein  adalah Larutan Phosphate buffer salin / PBS (bio-Rad), protease  inhibitor yang  terdiri  dari  :  100  ml PBS, 100 µl 40 mM PMSF, 7,3 mg TLCK dan 7,5 mg EDTA (Sigma-USA), nonidet P40 0,5%
(Sigma-USA).  Bahan  yang  digunakan  untuk analisis  protein  dengan  metode  SDS-PAGE adalah separating  gel dan stacking  gel ( lower gel  buffer , upper  gel  buffer ,  Larutan  PBS,  T- Akril, ddH2O, Tetra Methyl Diamine (TEMED) (Bio-Rad), ammonium persulphate , Tris ( hydroxymethyl ), HCL (Merck) pH=8.8 dan 6.5, deterjen Sodium  Dodecyl  Sulphate (SDS), aquadest dan pewarna Comassie Brilliant Blue . Bahan  yang  digunakan  untuk  pengukuran  titer antibodi  menggunakan  ELISA  adalah  cairan pencuci  (PBS-tween  20  +  preservatif  proclin 300 0,005%), larutan konjugat ( phosphat buffer saline , BSA dan stabilizer), substrat ( tetramethyl-benzidine dengan citrate- phosphate  buffer mengandung  H 2 O 2 , coating buffer , PBS-T Casein 1%, stopping solution dan aquadest .  Peralatan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  nampan  bedah,  mikroskop cahaya, pinset, cawan petri, pipet, tabung reaksi, micropipet , object  glass , cover  glass , Beaker glass , tubes dan microtubes , sentrifus, peralatan elektroforesis (Bio-Rad), chamber untuk running SDS-PAGE  (Bio-Rad), deep  freezer (4 o C), waterbath  shaker .  Peralatan  untuk ELISA  meliputi polystyrene 96 well  microtiter plate (microplate), micropipet (100-200  µL), microplate  shaker , microtube (1-1,5  mL), microplate  washer , Baker  glass dan  ELISA reader (elektrofotometer).
Metode  penelitian  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  Rancangan  Acak Lengkap  (RAL)  dengan  4  perlakuan  dan  5
ulangan.  Adapun  perlakuan  adalah  sebagai berikut : A = Ikan  koi  sebanyak  5  ekor  disuntik  larutan PBS  dan  tanpa  diinfeksi  spora M.  Koi (kontrol).
B  =  Ikan  koi sebanyak 5 ekor divaksin dengan whole  protein spora M.  koi dan  diinfeksi dengan 80 spora/ekor M. koi .
C  =  Ikan  koi sebanyak 5 ekor divaksin dengan whole protein spora M. koi tanpa diinfeksi spora M. koi .
D =  Ikan  koi  sebanyak  5  ekor  tanpa  divaksin whole  protein spora M.  koi dan  diinfeksi dengan 80 spora/ekor M. koi .

## Prosedur Kerja
Preparasi sampel spora Myxobolus koi
Ikan  yang  terserang  myxobolusis dicuci  dengan  akuades  agar  kotoran  yang menempel  pada  tubuh  ikan  hilang,  kemudian nodul  myxobolus  yang  menempel  diinsang diambil  dengan  menggunakan  pinset  dan scalpel secara  perlahan  agar  nodul  yang  berisi spora  tidak  hancur.  Nodul  yang  telah  diambil kemudian  diletakkan  di Petri  disc dan  diberi PBS  secukupnya.  Nodul  dipotong  beberapa bagian  untuk  mengeluarkan  spora  dengan menggunakan scalpel kemudian  ditambahkan akuades,  dimasukkan  dalam  tabung  reaksi  dan disentrifugasi  dengan  kecepatan  2500  rpm selama  15  menit  untuk  memisahkan  sel Myxobolus . Supernatan yang terbentuk kemudian  dibuang  dan  endapan  ditambah akuades, disentrifugasi kembali hingga memadat dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit.  Selanjutnya  pelet  dihitung  dengan haemocytometer .
Perhitungan spora Myxobolus koi
Perhitungan  spora  dilakukan  dengan menggunakan haemocytometer dan untuk memudahkan  perhitungan  digunakan hand counter .  Perhitungan  spora  pada  blok  A,  B,  C dan D dimulai dari sisi  kiri kotak kearah kanan dan  menghitung  spora  yang  berada  dalam  garis atau  yang  mendekati  garis  batas  bagian  dalam kotak.  Langkah  selanjutnya  menjumlahkan perhitungan  pada  blok  A,  B,  C  dan  D  pada bidang  perhitungan  bagian  atas  dan  bagian bawah haemocytometer kemudian  menghitung kepadatan
spora (spora/ml)
dengan menggunakan  rumus  perhitungan Big  Block (Satyantini dkk., 2012).
Kepadatan spora (spora/ml) = nA + nB +nC +nD
Keterangan :
nA, nB, nC, nD = Jumlah spora pada blok A, B, C dan D 4 = Jumlah blok yang dihitung 10 -4 = Volume masing-masing blok
Isolasi whole protein spora Myxobolus koi
Spora  yang  telah  dihitung  diberi  PBS secukupnya  kemudian  disentrifugasi  dengan kecepatan  5000  rpm  selama  10  menit.  Pellet ditambah  buffer  lisis  500  µl  kemudian disonikasi  dalam  es  (1  menit  sonikasi  ½  menit istirahat),  dilakukan  berulang  10  kali.  Hasil sonikasi  lalu  divortex  (½  menit  vortex  I  menit istirahat)  dalam  es,  dilakukan  berulang  15  kali. Hasil  vortex  disentrifugasi  dengan  kecepatan 12000  rpm  selama  5  menit,  supernatan  yang terbentuk dikoleksi kemudian dilakukan analisis SDS-PAGE.
Penentuan  konsentrasi whole  protein spora Myxobolus koi Penentuan  konsentrasi whole  protein spora Myxobolus menggunakan metode Bio-Rad Protein  Assay dan  dibaca  menggunakan Spectrophotometer  UV-Visible dengan  panjang gelombang 600 nm.
Analisis whole  protein spora Myxobolus  koi dengan SDS-PAGE
Analisis  terhadap  protein  dilakukan dengan metode  elektroforesis  SDS-PAGE dengan  komposisi separating  gel 12,5  %  dan stacking gel 5 %. Sebanyak 10 µg sampel yang ditambahkan
Laemly
buffers dengan perbandingan  2:1  dilakukan  perebusan  pada 100 o C  selama  5  menit,  dimasukkan  ke  dalam sumuran  yang  terletak  pada stacking  gel . Sebagai marker digunakan protein dengan berat molekul  pada  kisaran  10  -  180  kDa  ( New England
Bio-Labs ). Kemudian dilakukan running pada chamber yang  telah  diisi Electrode  Buffers 1X  dengan  100  volt,  40  mA. Proses running dihentikan  setelah  warna  biru penanda  mencapai  batas  bawah plate gel. Selanjutnya  gel  dimasukkan  ke  dalam  larutan pencuci  yang terdiri dari methanol 25  ml, asam asetat 3,7 ml dan Aquades 100 ml. Digoyang di atas  shaker  selama  30  menit.  Pencucian  ulang dilakukan  dengan  larutan  yang  sama  dengan pengurangan komposisi ethanol dan penambahan asam asetat setengah dari sebelumnya  selama  30  menit.  Pencucian berikutnya  dengan  larutan  glutaraldehid  10% dan akuades selama 30 menit. Setelah dicuci gel diwarnai  dengan  perak  nitrat  (AgNO 3 )  selama 15  menit,  kemudian  dilakukan  pencucian
dengan aquades dua kali masing-masing selama 2  menit.  Diberikan  larutan  pengembangan warna  yang  terdiri  dari  formaldehid  3,7  %, zitronsauce  5  %  dan  aquades.  Setelah  pita terlihat maka reaksi dihentikan dengan menambahkan  asam  asetat  10  %.  Hasil elektroforesis  SDS-PAGE  yang  berupa  pita dapat  dilakukan  penentuan  berat  molekul dengan  menghitung  nilai  Rf  ( Retardation Factor )  dari  masing-masing  pita  dengan  rumus (Rantam, 2003) :
awal tempat dari warna pergerakan jarak awal tempat dari protein pergerakan jarak Rf
Kemudian nilai Rf dimasukkan dalam persamaan regresi linear dengan rumus :
Y = a + bX
Keterangan :  Y = berat molekul X = nilai Rf sampel
Vaksinasi whole protein spora Myxobolus koi Ikan  koi  diuji  dengan  menggunakan  4 akuarium  dengan  kapasitas  5  lt  air.  Padat  tebar ikan  adalah  5  ekor/akuarium  dengan  ukuran ikan  7-10  cm.  Ikan  yang  digunakan  untuk perlakuan  adalah  ikan  sehat  yang  telah direndam  dahulu  dalam Methylene  blue 3-5 g/m 3 air  selama  5  menit  untuk  membersihkan organisme yang menempel pada tubuh ikan.

## Differensial leukosit
Gambaran  darah  yang  diamati  adalah hitung  jenis  (differensial)  leukosit.  Darah diambil  dari  vena  caudal  dengan  menggunakan spuit  1  ml  sebanyak  ±  1ml.    Jarum  suntik ( syringe ) yang sebelumnya sudah diberi dengan EDTA  (sebagai  antikoagulan).  Darah  dibuat preparat  ulas  dengan  cara  menempatkan  setetes darah  segar  pada  gelas  objek  pertama,  gelas objek  kedua  diletakan  dengan  suduk  45 o terhadap  gelas  objek  pertama,  kemudian  ditarik sampai  menyentuh  darah,  darah  dibiarkan menyebar sepanjang tepi gelas objek kedua, lalu gelas objek kedua didorong sepanjang permukaan  gelas  objek  pertama  sehingga membentuk  lapisan  darah  tipis  dan  merata. Preparat  dikeringkan  di  suhu  ruang  kemudian difiksasi  dengan  metanol  absolute  selama  3 menit  dan  dikeringkan  di  suhu  ruang  kembali sebelum diwarnai dengan pewarna Giemsa 10% selama  15  menit,  lalu  preparat  dicuci  kembali dengan  akuades  untuk  mengurangi  kelebihan warna  dan  dikeringkan  di  suhu  ruang.  Preparat diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran
1000x  dan  dihitung  setiap  jenis  leukosit  hingga jumlah 100 sel.
Penentuan  nilai optical  density dengan indirect ELISA Nilai optical  density yang  berasal  dari serum  darah  ikan  yang  telah  divaksinasi ditentukan  dengan  metode indirect ELISA. Cawan mikrotiter yang digunakan adalah cawan mikrotiter  96  sumuran.  Setiap  sumuran  diisi dengan  100  µl  larutan  antigen  dengan konsentrasi  10  µg/ml  dalam  buffer  pelapis  dan diinkubasi  pada  suhu  40 o C  selama  satu  malam. Cawan mikrotiter dicuci satu kali dengan buffer pencuci kemudian dalam tiap sumuran ditambahkan  100  µl  serum  darah  ikan  yang telah  divaksinasi  dan  diencerkan  dengan  PBS. Serum darah ikan diencerkan berseri, plat mikro diinkubasi pada suhu 37 o C selama satu jam dan dilanjutkan  dengan  pencucian  tiga  kali  dengan buffer pencuci. Setiap sumuran diisi dengan 150 µl  larutan  konjugat IgM  anti  rabbit  alkali fosfatase .  Konjugat  diencerkan  dengan  PBS dengan  perbandingan  1  :  4000.  Plat  mikrotiter diinkubasikan  pada  suhu  37 o C  selama  satu  jam dan  selanjutnya  dicuci  tiga  kali  dengan  buffer pencuci.  Setiap  sumuran  ditambahkan  substrat larutan  pNPP  sebanyak  150  µl.  Plat  mikrotiter diinkubasikan dalam temperatur ruangan selama 5  menit.  Titer  antibodi  dibaca  dengan  alat spektrofotometer  untuk  ELISA  pada  panjang gelombang 405 nm.
Penentuan kelulushidupan (SR) Tingkat  kelulushidupan  dinyatakan berupa  persentase  jumlah  ikan  koi  yang  hidup sampai  dengan  hari  ke-30  pasca  perlakuan
percobaan  terhadap  jumlah  keseluruhan  ikan yang  dipelihara.  Kelangsungan  hidup  ikan dihitung dengan menggunakan rumus:
SR = % 100
No Nt x
Keterangan : SR =   Kelangsungan hidup Nt  =  Jumlah  ikan  yang  hidup  pada  akhir pengamatan (ekor)
No =   Jumlah  ikan  yang  hidup  pada  awal  uji tantang (ekor)
Pengumpulan dan Analisis Data
Data  yang  diperoleh  terdiri  dari  data kualitatif  dan  kuantitatif.  Data  kualitatif  adalah data hasil pengamatan differensial leukosit pada analisis  respons  imun  ikan  koi  yang  divaksin dengan whole  protein spora Myxobolus  koi sebagai  kandidat  bahan  pengembangan  vaksin myxobolusis,  sedangkan  data  kuantitatif  yaitu data  hasil  penentuan  kelangsungan  hidup  (SR) dan nilai OD dalam darah.

## Hasil dan Pembahasan
Perhitungan spora Myxobolus koi Hasil perhitungan spora Myxobolus koi menggunakan
Haemocytometer
diperoleh jumlah spora sebanyak 490.000 spora/ml. Konsentrasi whole protein spora Myxobolus koi Hasil  penentuan  konsentrasi whole protein spora Myxobolus menggunakan  metode Bio-Rad Protein Assay
dan dibaca menggunakan Spectrophotometer  UV-Visible dengan  panjang  gelombang  600  nm  diperoleh kadar protein sebesar 16,332mg/ml.
Gambar 1.  Hasil  karakterisasi whole  protein spora Myxobolus  koi dengan  SDS-PAGE  menggunakan pewarnaan perak nitrat.
Keterangan : Lajur (M): Marker dan lajur (S): whole protein sampel
Analisis whole  protein spora Myxobolus  koi dengan SDS-PAGE Hasil  analisis whole  protein spora
Myxobolus koi menggunakan SDS-PAGE dengan  komposisi separating  gel 12,5  %  dan stacking  gel 5  %  dapat  dilihat  pada  Gambar  1. yang menunjukkan adanya protein digambarkan dalam bentuk pita-pita pada gel SDS-PAGE dan ditemukan  6  pita  (band)  protein  yaitu  X 1 ,  X 2 , X 3 , X 4, X 5 dan X 6 . Perhitungan  berat  molekul whole protein spora Myxobolus  koi diperoleh  enam pita  molekul  dengan  berat  molekul  68.1  kDa, 38.5 kDa, 25.6 kDa, 23 kDa, 21.7 kDa dan 18.9 kDa.
Differensial leukosit ikan koi
Pengamatan differensial leukosit meliputi  hitung  jenis  sel  limfosit,  monosit, heterofil,  eosinofil  dan  basofil  dalam  100  sel darah  putih  yang  diamati  dibawah  mikroskop dengan perbesaran 1000x.
Hasil pengamatan limfosit dalam darah ikan koi menunjukkan persentase tertinggi pada perlakuan  B  sebesar  61%  yang  tidak  berbeda nyata  dengan  perlakuan  D  yaitu  sebesar 59,33%. Pengamatan monosit dalam darah ikan koi  pada  masing-masing  perlakuan  diperoleh persentase  tertinggi  pada  perlakuan  B  sebesar 21% yang tidak berbeda nyata dengan perlakuan D  dan  C.  Pengamatan  neutrofil  dalam  darah ikan koi menunjukkan persentase tertinggi pada perlakuan  A  (kontrol)  sebesar  20,20%  dan terendah  pada  perlakuan  B  sebesar  6%  yang tidak  berbeda  nyata  dengan  perlakuan  D. Pengamatan  jumlah  eosinofil  menunjukkan
persentase  tertinggi  pada  perlakuan  D  sebesar 14%  dan  terendah  pada  perlakuan  A  (kontrol) sebesar  9%  yang  tidak  berbeda  nyata  dengan perlakuan  C.  Pengamatan  terhadap  jumlah basofil  menunjukkan  persentase  tertinggi  pada perlakuan  A  (kontrol)  sebesar  1,4%  dan terendah  pada  perlakuan  D  yang  tidak  berbeda nyata dengan perlakuan B dan C.
Nilai optical density dengan indirect ELISA Hasil pengujian sampel dengan menggunakan
indirect ELISA untuk mengetahui  nilai  OD  yang  terbentuk  dapat dilihat pada Tabel 2.
Hari ke 1 pada Tabel 2 merupakan nilai OD  pada  saat  ikan  koi  belum  divaksin  dengan whole  protein spora Myxobolus  koi .  Tabel  2 menunjukkan nilai OD tertinggi pada perlakuan B (ikan divaksin dan diinfeksi 80 spora/ekor M. koi ) sebesar 0,593 di hari ke 30, sedangkan yang terendah pada perlakuan D (ikan  tidak divaksin tetapi  diinveksi  80  spora/ekor M.  koi )  sebesar 0,064  di  hari  ke  30.  Gambar  5.8  menunjukkan grafik nilai OD pada masing-masing perlakuan.

## Penentuan kelulushidupan (SR)
Hasil  perhitungan  SR  menunjukkan tingkat kelulushidupan tertinggi pada perlakuan C  (ikan  divaksin  tanpa  diinfeksi  spora M.  koi ) dan  perlakuan  A  (kontrol)  sebesar  100%, sedangkan  yang  terendah  pada  perlakuan  D (ikan  tidak  divaksin  dan  diinfeksi  dengan  80 spora/ekor M.  koi )  dengan  nilai  SR  sebesar 60%.
Hasil  analisis whole  protein spora M. koi dengan  SDS-PAGE  menunjukkan  adanya protein  yang  digambarkan  dalam  bentuk  pita-
Tabel 1. Persentase jenis leukosit pada ikan koi.
PERLAKUAN JENIS LEUKOSIT (%) Rata-rata ± SD LIMFOSIT MONOSIT NEUTROFIL EOSINOFIL BASOFIL A 52,20 c ± 1,30 17,20 b ± 1,30 20,20 a ± 0,84 9,00 c ± 1,00 1,40 a ± 0,55 B 61,00 a ± 0,82 21,00 a ± 0,82 6,00 c ± 0,82 11,75 b ± 0,96 0,25 b ± 0,50 C 58,20 b ± 1,64 19,80 a ± 0,84 12,20 b ± 1,30 9,40 c ± 0,55 0,40 b ± 0,55 D 59,33 ab ± 0,58 20,33 a ± 0,58 6,33 c ± 0,58 14,00 a ± 1,00 0,00 b ± 0,00 NORMAL 52 18 20 8 2
Tabel 2.  Nilai Optical  Density (OD)  antibodi  poliklonal whole  protein spora Myxobolus  koi dengan Indirect ELISA. Hari ke Nilai OD Perlakuan A (kontrol) Perlakuan B Perlakuan C Perlakuan D 1 0,265 0,264 0,267 0,265 14 0,263 0,465 0,463 0,264 21 0,266 0,576 0,465 0,127 30 0,264 0,593 0,412 0,094
pita  pada  gel  SDS-PAGE.  Ditemukan  6  pita (band) pada gel SDS-PAGE  yang tampak jelas, yaitu  protein  dengan  berat  molekul  (BM)  68.1 kDa, 38.5 kDa, 25.6 kDa, 23 kDa, 21.7 kDa dan 18.9  kDa.  Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa protein yang ditemukan memiliki berat molekul yang  tinggi.  Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian Chavda et  al (2010)  yang  mengemukakan  hasil analisa  elektroforesis  SDS-PAGE  dari  spora Myxobolus  cerebralis diperoleh  ekspresi  pita protein  dengan  berat  molekul  130  kDA  dan  60 kDa. Abbas et al (2000) mengemukakan bahwa suatu  molekul  memiliki  sifat  imunogen  apabila berat molekulnya lebih dari 5 kDa.
Perubahan  jumlah  total  dan  jenis leukosit  dapat  dijadikan  indikator  adanya penyakit infeksi tertentu yang terjadi pada ikan. Leukosit merupakan salah satu komponen darah yang  berfungsi  sebagai  pertahanan  tubuh spesifik yang akan menetralisir dan memusnahkan patogen
melalui proses fagositosis.  Limfosit  merupakan  salah  satu bentuk  leukosit.    Tabel  1  menunjukkan persentase limfosit pada masing-masing perlakuan. Hasil pengamatan limfosit menunjukkan  persentase  tertinggi  sebesar  61% pada  perlakuan  B  (divaksin  dan  diinfeksi dengan  80  spora/ekor M.  koi )  yang  tidak berbeda  nyata  dengan  perlakuan  D  (tidak divaksin  tetapi diinfeksi  80 spora/ekor M. Koi ). Peningkatan  jumlah  limfosit  pada  ikan  yang diinfeksi  dengan  spora M . koi merupakan tanggapan  sistem  pertahanan  tubuh  ikan  atas masuknya  patogen.  Hal  ini  sesuai  dengan pendapat  Bastiawan  dkk  (2001),  limfosit berfungsi  sebagai  penghasil  antibodi  untuk kekebalan tubuh dari gangguan penyakit.
Pada  dasarnya  sel  limfosit  terdiri  dari dua  populasi  yaitu  sel  B  dan  sel  T.  Sel  B mempunyai  kemampuan  untuk  bertransformasi menjadi sel plasma yaitu sel yang memproduksi antibodi.  Sel  T  sangat  berperan  dalam kekebalan berperantara sel (sel T sitotoksik) dan mengontrol  respons  imun  (sel  T  supresor) (Kresno,  2001).  Setelah  terjadi  pengikatan antigen  dengan  reseptor  antigen  sel  limfosit, maka  sel  limfosit  akan  membelah  dan berdiferensiasi  menjadi  sel  efektor  dan  sel memori (Tizard, 1988).
Persentase monosit masing-masing perlakuan ditunjukkan pada Tabel 1. Persentase monosit  tertinggi  pada  perlakuan  B  yang  tidak berbeda  nyata  dengan  perlakuan  D  dan  C. Peningkatan  jumlah  monosit  bila  dibandingkan dengan  kontrol  disebabkan  karena  monosit memfagositosis spora M. koi yang masuk dalam tubuh  ikan.  Hal  ini  sesuai  dengan  pendapat bahwa  monosit bersama dengan  makrofag akan
memfagosit  agen  penyebab  penyakit  yang masuk  dalam  tubuh.  Bastiawan  dkk  (2001) menjelaskan,  monosit  berfungsi  sebagai  fagosit terhadap  benda-benda  asing  yang  berperan sebagai agen penyakit.
Jumlah  neutrofil  pada  perlakuan  B,  C dan D  mengalami penurunan  bila dibandingkan dengan perlakuan A (kontrol) seperti ditunjukkan  pada  Tabel  1.  Hal  ini  disebabkan adanya  kenaikan  pada  limfosit  dan  monosit sehingga  neutrofil  menurun. Selain itu neutrofil tidak  terlalu  berperan  dalam  merespon  infeksi yang  diakibatkan  oleh  parasit.  Heterofil  lebih banyak  berperan  pada  infeksi  yang  diakibatkan oleh bakteri.
Pengamatan  terhadap  jumlah  eosinofil menunjukkan persentase tertinggi pada perlakuan  D  sebesar  14%  bila  dibandingkan dengan  perlakuan  A  (kontrol)  sebesar  9%. Infeksi  spora M.  koi meningkatkan  jumlah eosinofil pada darah ikan. Hal ini sesuai dengan pendapat  Tizard  (1988)  yang  menyatakan bahwa  eosinofil  merupakan  salah  satu  sel pertahanan tubuh yang dominan di dalam darah dan  akan  meningkat  tajam  jumlahnya  bila terjadi infeksi penyakit parasiter.
Pengamatan  basofil  pada  perlakuan menunjukkan  persentase  yang  kecil  yaitu  1,4% pada  kontrol,  basofil  bahkan  tidak  ditemukan pada  perlakuan  D.  Affandi  dan  Tang  (2002) menyatakan  bahwa  persentase  basofil  di  dalam darah  ikan  berkisar  antara  0.17  -  0.194  %  dan berukuran  8-12  μm.  Feldman et  al (2000) menerangkan  bahwa  keberadaan  basofil  di dalam  sirkulasi  darah  telah  diamati  hanya  pada sejumlah  kecil  dari  spesies  ikan  yang  ada. Bahkan  basofil  lebih  jarang  ditemukan  pada pemeriksaan darah dibandingkan dengan eosinofil. Hasil pengamatan uji ELISA
menunjukkan bahwa vaksin whole protein spora Myxobolus koi dapat menginduksi terbentuknya antibodi  pada  ikan  koi.  Tabel  2  menunjukkan nilai optical  density tertinggi  pada  ikan  yang divaksin  kemudian  diinfeksi  dengan  spora M. koi (perlakuan B) sebesar 0,593 pada hari ke 30 bila dibandingkan dengan perlakuan A (kontrol). Peningkatan nilai OD pada ikan yang divaksin  kemudian  diinveksi  dengan whole protein spora M.  koi menunjukkan  kemampuan proteksi  vaksin  tersebut  terhadap  infeksi myxobolusis.  Hal  ini  diperkuat  oleh  pendapat Baratawidjaja (1996) tentang mekanisme respon imun  pada  ikan,  ketika  antigen  (vaksin)  masuk dalam  tubuh  ikan  maka  antigen  tersebut  akan dipresentasikan  oleh  MHC,  antigen  akan ditangkap  oleh  reseptor  pada  sel  T  helper  (2), dan sel T helper (2) akan mensekresikan sitokin
yaitu IL-2, IL- 4, dan IL-6 yang bertujuan untuk diferensiasi dan proliferasi sel B, diferensiasi sel B  akan  menghasilkan  sel  plasma  dan  sel memori. Selanjutnya sel plasma akan mensintesis  antibodi  yang  spesifik  yang  akan mengikat antigen
sehingga mencegah pergerakan  antigen  dan  memudahkan  proses fagositosis.
Hari ke 1 pada Tabel 2 merupakan nilai OD  dimana  serum  darah  ikan  diambil  sebelum diinjeksi whole  protein spora M.  koi sehingga nilai  OD  pada  hari  ke  1  masing-masing perlakuan  hampir  sama  yaitu  berkisar  antara 0,264 - 0,267. Hari ke 14 nilai OD perlakuan B dan  C  mengalami  peningkatan  hampir  50% karena  adanya  pemberian  vaksin whole  protein spora M. koi yang diinjeksi setelah pengambilan serum  hari  pertama.  Hal  ini  sesuai  dengan pendapat  Tizard  (1988)  bahwa  hewan  yang diberikan vaksin akan merangsang terbentuknya antibodi yang lebih banyak. Hari ke 21 nilai OD perlakuan B mengalami peningkatan sedangkan pada  perlakuan  D  (tidak  divaksin)  justru mengalami  penurunan.  Hal  ini  disebabkan  oleh infeksi  spora Myxobolus dengan  dosis  80 spora/ikan  yang  diberikan  setelah  pengambilan serum  pada  hari  ke  14.  Nilai  OD  perlakuan  B meningkat  karena  vaksin  yang  diberikan sebelumnya  memberikan  respon  tanggap  kebal terhadap  infeksi Myxobolus .  Rizkiani  (2006) mengemukakan  bahwa  antibodi  merupakan suatu  protein  globulin  yang  dibentuk  selama adanya  rangsangan  imunitas.  Antigen  yang masuk  akan  dikenali  sebagai  benda  asing  oleh antibodi  sehingga  merangsang  terbentuknya protein  (immunoglobulin)  yang  meningkatkan nilai OD dalam darah ikan.

## Kesimpulan
Kesimpulan  yang  dapat  diambil  dari penelitian  ini  adalah  vaksinasi  dengan whole protein spora M.  koi dapat  meningkatkan respons  imun  ikan  yang  ditandai  dengan meningkatnya jumlah limfosit. Vaksinasi dengan whole  protein spora M.  koi dapat meningkatkan nilai OD (IgM) dalam darah ikan. Vaksinasi  dengan whole  protein spora M.  koi dapat meningkatkan kelulushidupan (SR) ikan.
Saran  yang  dapat  diajukan  dari  hasil penelitian  ini  adalah  vaksinasi whole  protein spora Myxobolus  koi dengan  metode  injeksi kurang  efektif  bila  dilakukan  pada  benih  ikan dengan  jumlah  yang  banyak.  Vaksinasi  dengan metode  ini  lebih  cocok  dilakukan  terhadap induk koi dengan jumlah yang lebih sedikit dan diharapkan  terbentuk  imunitas  pada  anak  koi yang  dihasilkan,  akan  tetapi  perlu  dilakukan penelitian  lebih  lanjut  mengenai  dosis  vaksin
pada  induk  dan  respons  imun  baik  pada  induk maupun anakan koi.

## Daftar Pustaka
Abbas, S. A., J. J Glazier., A. H. Lightman and Pober,  J.  S.  2000.  Celluler  and Molecular  Immunology.  J  of  Immun. 36: 959-969p.
Affandi  R  dan  Tang  UM.  2002. Fisiologi Hewan Air . Unri Press. Pekanbaru. 38 - 40.
Anshary,  H.  2008.  Modul  Pembelajaran Berbasis  Student  Center  Learning (SCL)  Mata  Kuliah  Parasitologi  Ikan.
Jurusan  Perikanan  Fakultas  Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Hassanudin. Makasar. Hal 126. Bastiawan  D,  A.  Wahid,  M.  Alifudin  dan  I. Agustiawan.  2001.  Gambaran  Darah
Lele  dumbo (Clarias  spp )  yang Diinfeksi  Cendawan Aphanomyces sp pada pH yang Berbeda. Jurnal
Penelitian
Indonesia 7(3) : 44-
47.Chavda,  D.  2010.  Pathogenicity  of Myxobolus Infection  and  its  Effect  on Protein  Expression  in Catla  catla Central  Gujarat  Region.  J.  Cell  Tiss Research. 8: 258-261p.
Dwijayanti,  A.  A.  2011.  Karakterisasi  protein nodul  pada  insang  ikan  mas  ( Cyprinus carpio )  akibat  infestasi Myxobolus  sp dengan  metode  SDS-PAGE.  Skripsi. Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga. Hal 2. Hadiroseyani,  Y.  2003.  Potensi  Oligochaeta Sebagai Inang Antara Parasit Myxosporea  pada  Ikan  Mas  ( Cyprinus carpio L). Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Hal 37-39. Helmiati, S., Triyanto dan H. N. Kamiso. 2005. Prevalensi dan Derajat Infeksi
Myxobolus sp  Pada  Insang  Benih Karper ( Cyprinus carpio ) di Kabupaten Sleman. Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Hal 7. Lom,  J  and  I.  Dykova.  1992.  Protozoan
Parasites  of  Fishes.  Developments  in Aquaculture and Fisheries Science. 26: 315 p.
Poobalane,  S.,  K.  D.  Thompson,  L.  Ardo,  N.
Verjan, H. J. Han, G. Jeney, I. Hirono, T.  Aoki  and  A.  Adams.  2010. Production and efficacy of an Aeromonas  hydrophila recombinant  S- layer protein vaccine for fish. Elsevier. Japan. 3540-3541 p.
Rizkiani, F. 2006. Produksi Antibodi Poliklonal oleh  Toksin  Insektisida Photorhabdus spp  dan  Deteksinya  dengan  Teknik NCM-ELISA. Program Studi Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan  Alam.  Institut  Pertanian Bogor. Hal 4-5. Rukyani, A. 1990. Histopathological Changes in
The  Gill  of  Common  Carp  ( Cyprinus carpio L. ) Infected with the Myxosporean  Parasite Myxobolus Koi Kudo . 1920: 337-341.
Tizard I. 1988. Pengantar Imunologi Veteriner . Ed  ke-2.  Partodirejo  M,  Hardjosworo S,  penerjemah;  Surabaya:  Airlangga
University  Press.  Terjemahan  dari: An Introduction to Veterinary Immunology .