## VALIDASI METODE ANALISIS KADAR AMBROKSOL HIDROKLORIDA DALAM SEDIAAN TABLET CYSTELIS 

## SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Ade Heri Mulyati 1) , Sutanto 2) dan Dewi Apriyani 3)
1,2,3) Program Studi  Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan Bogor

## ABSTRACT
Cystelis ® tablet  is  an  expectorant  medicine  which  contain  30  mg/tablet  of  Ambroxol Hydrochloride. To ensure the safety and effectiveness of the medicine must be well controlled especially  the  analytical  methode  which  used  to  determined  the  actived  ingredient  in  the medicine.  This  analytical  methode  must  resulting  the  amount  of  Ambroxol  Hydrochloride which  can  be  trusted.  The  purpose  of  this  research  are  to  test  and  proof  the  result  of determination  Ambroxol  Hydrochloride  in  Cystelis ® tablet  could  be  trusted  in  daily  test  in laboratorium. Analytical methode  validation is a effort to get and documented proof that the result  of  test  methode  can  be  trusted  with  some  specification.  The  Parameters  of  analytical methode  validation  are  precision,    linearity,  accuracy,  range,  selectivity,  and  stability  test (robustness). Analytical methode that used in pharmacy specially High Performance Liquid Chromatography  (HPLC),  using  mobile  phase  metanol  :  buffer  potassium  dyhidrogen phosphate  0,01  M  (70:30)  pH  6,0  and  stationary  phase  C18  Symmetry  (150  mm  x  4,6  mm) with  particle  size  5  m,  flow  rate  1,0  mL/minute,  injection  volume  10,0  L  and  measured  at wavelength  247  nm.  Analytical  results  showed  that  the  placebo  did  not  gived  any  analytical respons  in  selectivity  test.  Accuracy  which  know  as    %  recovery  showed  the  average  of  % recovery  99,31%  (98,70  –  100,44%),  range  between  80%-120%.  Linearity  at  consentration range  70%  -  130%  with  coefficient  correlacy  (r)    0,99924.  The  result  of  precision  which  is repeatability  with average of % RSD 0,25%.  Based on t value and F value on intermediate precision  showed  that  there  is  no  differently  result  gived  by  the  analytical  methode  with different analyst and time. Stability test solution and mobile phase composition with % bias   2% and %RSD  2%. Based on the analytical methode validation result the determination of Ambroxol Hydrochloride in Cystelis ® tablet with high performace liquid chromatography we  can  conclude  that  this  analytical  methode  is  valid  to  implemented  in  daily  inspection  at Quality Control laboratory PT. Armoxindo Farma
Kata kunci : Validation, Analytical methode, Ambroxol Hydrochloride, HPLC

## PENDAHULUAN
Cystelis  Tablet  merupakan  obat  yang mengandung Ambroksol Hidroklorida sebagai  zat  aktifnya  yang  berfungsi  untuk mengobati  gangguan  saluran  napas  akut dan  sebagai  ekspektoran.  Sediaan  obat mutlak  ditetapkan  secara  memadai  untuk menjamin keamanan dan khasiatnya. Khasiat dan keamanan obat tersebut hanya dapat  dijamin  melalui  pemantauan  mutu mulai dari proses pembuatan, penyimpanan,  distribusi  hingga  tahap penggunaannya.  Salah  satu  pemantauan
mutu  yang  dilakukan adalah  analisis  kadar zat  aktif  dalam  sediaan  obat  untuk memastikan  kandungannya  sesuai  dengan yang  dikehendaki.  Industri  farmasi  dalam memproduksi obat dituntut untuk memenuhi persyaratan Good
Manufacturing  Practice (GMP)  atau  Cara Pembuatan  Obat  yang  Baik  (CPOB)  yang sifatnya dinamis, mengikuti perkembangan ilmu dan teknologi. CPOB adalah pedoman yang  bertujuan  untuk  memastikan  agar sifat  dan  mutu  obat  yang  dihasilkan  sesuai dengan  yang  dikehendaki,  sehingga  obat-
obat yang diproduksi aman untuk dikonsumsi.
Untuk menjamin khasiat dan keamanan obat  tersebut  maka  industri  farmasi  sesuai dengan  persyaratan  CPOB  melakukan validasi  pada  semua  hal  yang  berkaitan dengan  proses  pembuatan  obat,  salah  satu validasi  yang  harus  dilakukan  untuk menjamin  kualitas  dan  keamanan  obat adalah  validasi  metode  analisis  kadar  zat aktif  dalam  sediaan  obat.  Validasi  metode analisis  adalah  upaya  yang  dilakukan melalui  penelitian  laboratorium  untuk membuktikan  karakteristik  kinerja  metode memenuhi aplikasi analisis yang dimaksud (BPOM,  2001).  Validasi  dilakukan  untuk melihat  pengaruh  dari  kondisi  peralatan- peralatan  yang  digunakan,  pereaksi  dan personil yang melakukan pemeriksaan.
Metode  analisis  kadar  Ambroksol Hidroklorida  untuk  bahan  baku  yang dilakukan  selama  ini  menurut  European Pharmacopoeia  adalah  metode  titrasi  asam basa,  kemudian  dilakukan  pengembangan metode analisis kadar Ambroksol Hidroklorida dalam sediaan tablet menggunakan  metode  kromatografi  cair kinerja  tinggi.  Metode  analisis  yang digunakan  harus  menghasilkan  kadar Ambroksol  Hidroklorida  yang  akurat  dan dapat dipertanggungjawabkan. Untuk mengetahui  keabsahan  hasil  uji,  maka metode analisis yang akan digunakan harus divalidasi.  Berdasarkan  pedoman  Cara Pembuatan  Obat  yang  Baik  (CPOB)  tahun 2001,  parameter  validasi  metode  analisis yang ditentukan adalah selektifitas, akurasi, linieritas,  rentang,  batas  deteksi,  batas kuantitasi  dan  ketegaran,  namun  untuk analisis  kadar  zat  aktif  dalam  sediaan farmasi  batas  deteksi  dan  batas  kuantitasi tidak perlu dilakukan.
Selektifitas suatu metode adalah kemampuan  suatu  metode  analisis  yang hanya  mengukur  zat  tertentu  saja  secara cermat  dan  seksama  dengan  adanya komponen  lain  yang  mungkin  ada  dalam matriks sampel (Harmita, 2004).
Selektifitas  seringkali  dapat  dinyatakan sebagai  derajat  penyimpangan  ( degree bias )  metode  yang  dilakukan  terhadap sampel  yang  mengandung  bahan  yang ditambahkan  berupa  cemaran,  hasil  urai, senyawa  sejenis,  senyawa  asing  lainnya, dan  dibandingkan  terhadap  hasil  analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang  ditambahkan  (Harmita,  2004),  untuk metode  kromatografi  selektifitas  dilihat dari  nilai  resolusi  antara  dua  peak  analit dengan  peak  lain  yang  mungkin  timbul. Syarat  resolusi  menurut  BPOM  2001 adalah  1,5.
Akurasi atau kecermatan adalah ukuran yang  menunjukkan  derajat  kedekatan  hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya.  Akurasi  sering  dinyatakan sebagai  persen  perolehan  kembali  (% recovery )  dari  suatu  pengujian  terhadap penambahan sejumlah analit dengan jumlah  yang  diketahui.  Uji  akurasi  ini dilakukan untuk melihat  ketelitian alat dan analisis dalam membuat konsentrasi larutan yang sesuai dengan kadar yang sebenarnya. Uji akurasi dilakukan dengan menggunakan tiga level konsentrasi dengan tiga replikasi untuk setiap level konsentrasi.  Kriteria  penerimaan  akurasi adalah %recovery 98%-102%.
Presisi  merupakan  kedekatan  antara hasil pengujian individu dalam serangkaian pengukuran terhadap suatu sampel homogen. Presisi dinyatakan sebagai standar deviasi atau Relatif Standar Deviasi (%  RSD).  Syarat  %  RSD  yang  ditentukan oleh BPOM adalah  2%.
Nilai  presisi  dihitung  secara  statistik pada tiga tingkatan :
1.Ripitabilitas  atau  presisi  intra  penetapan kadar menyatakan presisi yang dilakukan pada  kondisi  yang  telah  ditentukan  di laboratorium  yang  sama  dalam  interval waktu  yang  pendek  oleh  analis  yang sama dengan menggunakan peralatan dan pereaksi yang sama.
2.Presisi antara atau presisi antar penetapan kadar menyatakan presisi yang dilakukan
pada  kondisi  yang  telah  ditentukan  di laboratorium yang sama dengan alat yang berbeda,  analis  yang  berbeda,  atau  pada hari yang berbeda.
3.Reprodusibilitas menyatakan presisi yang dilakukan  pada  kondisi  yang  telah ditentukan  di  laboratorium  yang  berbeda pada  hari  yang  berbeda  oleh  analis  yang berbeda  dengan  menggunakan  peralatan dan pereaksi yang berbeda.
Pada  presisi  antara  dihitung  dengan melakukan  uji  t  dan  uji  F.Uji  t  merupakan uji  signifikasi  untuk  menguji  perbedaan nilai  antara  dua  hasil  (Susanto,  2006). Presisi dilakukan. Presisi dilakukan dengan minimal 6 replikasi sampel.
Linieritas adalah kemampuan dari suatu metode  uji  untuk  menghasilkan  hasil  uji yang  proporsional  terhadap  kepekatan analit  sampel  dalam  jangkauan  kepekatan yang  ada.  Linieritas  suatu  metode  yang diuji  untuk  memastikan  adanya  hubungan linier  antara  konsentrasi  analit  dan  respon detektor.  Untuk  mengetahui  hubungan linieritas, digunakan koefisien korelasi ( r ) pada  analisis  regresi  linier  minimum  0,98 untuk  syarat  sesuai  dengan  BPOM  tahun 2001 atau minimum 0,999 untuk rekomendasi  CDER  ( Center  for  Drug Evaluation  and  Research )  .  Linieritas  ini dilakukan  dengan  menggunakan  7  level konsentrasi  yaitu  70%  sampai  130%  dari konsentrasi kerja 100%.
Rentang  atau  jangkauan  merupakan interval  di  antara  konsentrasi  analit tertinggi  dan  terendah  dalam  sampel  yang dapat  ditetapkan  dengan  akurasi,  presisi dan linieritas yang dapat diterima menggunakan  metode  analisis  tersebut. Rentang  dinyatakan  dalam  satuan  yang sama  seperti  hasil  uji  misalnya  persen, untuk penetapan kadar zat aktif syarat yang ditentukan BPOM adalah 80%-120%.
Ketegaran  ( Robustness )  adalah  ukuran kemampuan  metode  untuk  tetap  tak berpengaruh dan bertahan terhadap pengaruh  kecil,  tapi  dilakukan  dengan sengaja  dengan  membuat  variasi  dalam
faktor  metode  yang  memberikan  indikasi reliabilitas  metode  normal  pada  pengujian. Beberapa  contoh  variasi  yang  dilakukan adalah  kestabilan  larutan  terhadap  waktu, waktu  ekstraksi,  untuk  kromatografi  cair dapat  dilakukan  beberapa  variasi  seperti perubahan  pH  fase  gerak,  perubahan komposisi  fase  gerak,  suhu  kolom, kecepatan alir, dll (ICH, 1994).
Kurva  kalibrasi  merupakan  hubungan antara respon instrumen dengan konsentrasi  analit  yang  telah  diketahui. Kurva  kalibrasi  terdiri  dari  sampel  blanko (matrik  kosong  tanpa  standar  internal), sampel zero (matrik kosong dengan standar internal)  dan  6-8  konsentrasi  sampel standar termasuk batas kuantitasi konsentrasi  rendah  (LoQ)  (FDA,  2001). Kriteria penerimaan kurva kalibrasi sedikitnya  4  titik  dari  8  titik  (termasuk LoQ  dan  konsentrasi  standar  tertinggi) memenuhi  kriteria  akurasi  dan  presisi (FDA, 2001).
Batas  Kuantitasi  (LoQ)  merupakan konsentrasi  analit  terendah  dalam  sampel yang dapat diukur secara kuantitatif dengan akurasi  dan  presisi  yang  dapat  diterima. Batas  kuantitasi  dilakukan  minimal  5 replikasi.  Kriteria  penerimaan  presisi  dan akurasi  untuk  batas  kuantitasi  adalah koefisien  variasi  (CV)  <  20%  dan  bias  < ±20% (FDA, 2001).
Selektifitas  merupakan  kemampuan metode  analisis  untuk  membedakan  dan mengukur analit dengan adanya komponen-komponen lain di dalam sampel. Uji selektifitas dilakukan di dalam sampel  blanko  (matrik  biologi  kosong) dengan  menggunakan  minimal  6  sampel blanko dan dilakukan pada batas kuantitasi konsentrasi rendah (LoQ) (FDA, 2001).
Presisi, akurasi dan recovery menggunakan  tiga  konsentrasi  sampel (rendah,  sedang  dan  tinggi)  digunakan sebagai  kontrol  sampel    yang  ditetapkan sebagai berikut: (FDA, 2001) QCL  = 3 x LoQ QCM = terdapat diantara QCL dan QCH
QCH  =  75%-90%  dari  standar  kalibrasi tertinggi
Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil  uji  individual  dengan  hasil  rata-rata pengukuran yang dilakukan, meliputi: a. Within day variation (Intra-day )
b. Day-to-day variation (Inter-day)
Kriteria  penerimaan  untuk  presisi  adalah koefisien  variasi  (CV)  <  15%  (FDA, 2001).
Akurasi menunjukkan kedekatan antara hasil  yang  diperoleh  dari  metode  yang digunakan  dengan  nilai  konsentrasi  analit yang sebenarnya yang meliputi:
a. Within  day  variation  (Intra-day) dan Recovery
b. Day-to-day variation (Inter-day)
Kriteria  penerimaan  untuk  akurasi intra- day dan inter-day adalah bias < ±15% dan untuk recovery adalah  85  –  115  %  (FDA,
2001). Linieritas ditunjukkan berdasarkan koefisien  korelasi    (r)  selama  validasi metode  pada  saat  melakukan  presisi  dan akurasi  selama  5  hari.  Kurva  linieritas dapat  dilihat  dari  hasil  koefisien  korelasi (r)    kurva  kalibrasi    ≥  0.99  (Riley  dan Rosanske,  1996)  dan  koefisien  variasi (CV)  dari  masing-masing  konsentrasi kurang dari 15% (FDA, 2001).

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Carbamazepine  (R.  L.  Fine  Chem)  dan standar internal Estazolam (Hubei Zhongtian Aibaike Pharmaceutical),
Kalium dihidrogen fosfat, Metanol,
Natrium  hidroksida,  Asam  fosfat  85% (Merck analytical  grade ),  Asetonitril
(Merck Lichrosolv. HPLC grade ).
Preparasi Larutan Standar
Larutan  stok  standar  kalibrasi  ( Stock Solution /SS1)  dan  larutan  stok  standar sampel  (SS2)  dibuat  dengan  melarutkan Carbamazepine  dengan  penimbangan  yang berbeda dalam metanol, sehingga didapatkan  konsentrasi  1000  ppm.  Larutan
kerja standar kalibrasi ( Working Solution /WS1) dibuat dengan
mengencerkan  larutan  SS1  dalam  larutan metanol  :  aquabides            (1  :  1),  sehingga konsentrasi  larutan  menjadi  0,5;  1;  2,5;  5; 10;  25  dan  50  ppm.  Larutan  kerja  standar sampel  (WS2)  dan  standar  LoQ  dibuat dengan  mengencerkan  larutan  SS2  dalam larutan  metanol  :  aquabides  (1  :1), sehingga  konsentrasi  larutan  menjadi  1,5; 8; 40 ppm (WS2) dan 0,25; 0,5 ppm (LoQ). Larutan kerja Estazolam dibuat dengan melarutkan  Estazolam  dalam  metanol (1000  ppm),  kemudian  diencerkan  dalam aquabides menjadi konsentrasi 50 ppm.

## Kromatografi
Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi (Shimadzu, Japan) yang terdiri atas Pompa (LC-10ATVp), degasser (DGU-14A), auto injector (SIL-10ADvp), system  controller (SCL-10Avp),  suhu  diatur                  60  ˚C menggunakan oven kolom (CTO-10ASvp), λ  =  220  nm  dengan  detektor  UV  (SPD- 10Avp), kolom analitik Lichrospher RP-18, 5  μm  125  mm  x  4  mm  i.d  (L.  Merck, Darmastadt,  Germany),  guard  kolom  RP- 18 (L. Merck, Darmastadt, Germany).
Fase  gerak  yang  digunakan  adalah Kalium  dihidrogen  fosfat  10  mM  pH  7,4 (disaring  dengan  kertas  saring  0,45  μm (Sartorius,  Germany))  dan  asetonitril  (65  : 35,  v/v).  Fase  gerak  kemudian  di- degass dan  dialirkan  pada  KCKT  dengan  laju  alir 1 mL/menit.

## Preparasi Sampel
Sebanyak  500  μL  plasma  dimasukkan ke  dalam  tabung  mikro,  lalu  ditambahkan 30 μL standar internal (Estazolam 50 ppm) dan  500  μL  asetonitril.  Larutan  tersebut divorteks selama 30 detik dan disentrifugasi  pada  3000  rpm  selama  10 menit.  Selanjutnya  supernatan  dimasukkan ke  dalam  vial  dan  diinjeksikan  25  μL  ke dalam KCKT.

## Kurva Kalibrasi dan Validasi Metode
Deret  standar  Carbamazepine  dibuat dengan  mengencerkan  larutan  WS1  ke
dalam plasma untuk mendapatkan konsentrasi  Carbamazepine  50;  100;  250; 500;  1000;  2500  dan  5000  ng/mL. Kemudian  dilakukan  preparasi  sampel  dan diinjeksikan  ke  dalam  KCKT.  Kurva kalibrasi dibuat dengan memplot hubungan antara  konsentrasi  standar  dengan  rasio area (Carbamazepine/Estazolam).
Uji  LoQ  dibuat  dengan  mengencerkan larutan kerja standar LoQ ke dalam plasma untuk mendapatkan konsentrasi Carbamazepine  25  dan    50  ng/mL. Selanjutnya  dilakukan  preparasi  sampel dengan 5 replikasi tiap konsentrasi. Setelah diinjeksikan  ke  dalam  KCKT  dihitung  % CV dan   % bias.
Uji selektifitas dibuat dengan mengencerkan  larutan  kerja  standar  LoQ konsentrasi  0,5  ppm  ke  dalam  plasma untuk mendapatkan konsentrasi Carbamazepine  50  ng/mL.  Dilakukan  dua replikasi  beserta  satu  blanko  plasmanya. Uji  selektifitas  dilakukan  pada  6  plasma dari  individu  yang  berbeda.  Setelah dilakukan preparasi sampel dan
diinjeksikan  ke  dalam  KCKT  kemudian diamati  gangguan  analit  dari  6  blanko plasma tersebut.
Presisi ( intra-day dan inter-day ), akurasi  ( intra-day dan recovery )  serta akurasi inter-day terdiri  atas  sampel  QC ( Quality Control ) konsentrasi 150; 800 dan
4000 ng/mL yang dibuat dengan mengencerkan  larutan  WS2  ke  dalam plasma  untuk  mendapatkan  konsentrasi Carbamazepine  150  (QCL),  800  (QCM) dan  4000  (QCH)  ng/mL.  Presisi  akurasi intra-day dan recovery dibuat  5  replikasi tiap  konsentrasi  dalam  hari  yang  sama, sedangkan  presisi  akurasi inter-day dibuat 5  replikasi  tiap  konsentrasi  pada  5  hari yang  berbeda.  Setelah  dilakukan  preparasi sampel  dan  diinjeksikan  ke  dalam  KCKT, kemudian  dihitung  %  CV  (untuk  presisi),
%  bias  (untuk  akurasi)  dan    % recovery (untuk uji recovery ).
Linieritas  kurva  kalibrasi  didapat dengan  menghitung  koefisien  korelasi  dan
koefisien  variasi  (CV)    tiap  konsentrasi deret  standar  kalibrasi  dan  yang  didapat selama validasi inter-day variation.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji  pendahuluan  dari  penelitian  ini yaitu  pemilihan  standar  internal  dan penentuan  komposisi  fase  gerak.  Standar internal  yang  terdiri  dari  Estazolam, Cetirizine  dihidroklorida  dan  Diazepam yang  dilarutkan  dalam  metanol  dengan komposisi  fase  gerak  dapar  fosfat  10  mM pH  7,4  :  asetonitril  (70  :  30).  Bila  dilihat pada  kromatogram  (Gambar  1),  Estazolam memiliki  resolusi  yang  baik  terhadap Carbamazepine sedangkan Cetirizine dihidroklorida  memiliki  resolusi  kurang baik  terhadap  Carbamazepine  yang  dapat mempengaruhi  puncak  Carbamazepine, terutama pada konsentrasi tinggi. Sedangkan  Diazepam  memiliki  resolusi yang  lebih  besar  terhadap  Carbamazepine, yang mengakibatkan waktu analisis semakin lama.
Minutes 0 5 10 15 20 25 Vo lt s 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Vo lt s 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 5.950 Carb amazepine 6.858 Cetirizine dihidroklorida 9.275 Est azolam Diazepam 23 .892 Detector A (220nm) Carbamazepine-Cetirizine-Estazolam.dat Retention Time Name Detector A (220nm) Diazepam 10ppm 7030 Name Retention Time
Gambar  1. Kromatogram  larutan  standar Carbamazepine dan standar internal (Cetirizine dihidroklorida, Estazolam,
Diazepam),  kondisi  percobaan  :  kolom Lichrospher  RP-18  (125  x  4mm,  5  μm), fase gerak dapar fosfat 10 mM pH 7,4 dan asetonitril  (70:30),  laju  alir  1  mL/menit, detektor UV (λ = 220 nm).
Penentuan  komposisi  fase  gerak dilakukan setelah pemilihan standar internal,  hal  ini  dimaksudkan  untuk
mendapatkan  waktu  analisis  yang  cepat tapi masih menghasilkan resolusi (R) yang baik  (R  >  1,5).  Pada  kromatogram (Gambar  2)  dapat  dilihat  bahwa  ketiga komposisi  fase  gerak  dapar  fosfat  10  mM pH  7,4  dan  asetonitril  masih  memberikan resolusi  lebih  besar  dari  1,5.  Karena banyaknya  sampel  yang  dianalisis  dalam uji  bioekivalensi,  maka  dibutuhkan  waktu analisis  yang  singkat.  Waktu  analisis  yang paling  singkat  yaitu  pada  komposisi  60  : 40,  namun  pada  kondisi  ini  terdapat gangguan  blanko  plasma  pada  puncak Carbamazepine dan Estazolam. Oleh karena  itu,  dipilih  komposisi  fase  gerak 65 : 35.
Terdapat  perbedaan  antara  metode modifikasi  dengan  metode  acuan.  Pada metode  acuan  (Martinez  de  Munoz et  all , 1996)  digunakan  fase  gerak  asetonitril  : metanol  :  dapar  fosfat  10  mM  pH  7,4  (15: 35  :  50),  tetapi  pada  penelitian  ini  tidak menggunakan  metanol  melainkan  hanya menggunakan  dapar  fosfat  10  mM  pH  7,4 dan  asetonitril  (65  :  35).  Penggunaan metanol  dihindari  pemakaiannya  karena dapat  meningkatkan  viskositas  fase  gerak, sehingga dapat meningkatkan tekanan pada KCKT  yang  menyebabkan  kerusakan kolom  dan  kebocoran  pada  sambungan- sambungan  alat  KCKT.  Suhu  kolom  yang digunakan  pada  penelitian  ini  adalah    40 ˚C,  sedangkan  pada  metode  acuan  adalah 25  ˚C.  Hal  ini  dimaksudkan  untuk mempercepat  proses  pemisahan  dan  dapat menurunkan  viskositas.  Standar  internal digunakan untuk mengurangi variasi dalam respon  alat,  volume  injeksi,  dan  proses pengendapan protein. Standar internal yang digunakan  pada  penelitian  ini  adalah Estazolam, sedangkan pada metode acuan adalah 2-hidroksi-2-etil-2-
fenilasetamida.  Pemilihan  standar  internal ini dipilih berdasarkan kemudahan diperolehnya  dengan  kemurnian  tinggi, harus  terpisah  sempurna  dari  dari  senyawa pada  pemisahan,  stabil  dan  tidak  bereaksi dengan  sampel  atau  fase  gerak,  memiliki
respon  terhadap  detektor  serupa  dengan respon  analit  pada  konsentrasi  yang digunakan,  memiliki  polaritas  dan  struktur yang mirip dengan analit.
Limit  of  Quantitation (LoQ)  yang didapat  adalah  50,30  ng/mL.  Pada      Tabel 1,  konsentrasi  50,30  ng/mL  diterima sebagai  batas  kuantitasi  karena  memenuhi presisi  (CV  <  20%)  dan  akurasi  (bias  < ±20%),  sedangkan  pada  konsentrasi  25,15 ng/mL  sudah  tidak  terdeteksi.  Contoh kromatogram dapat dilihat pada Gambar 3.
Uji  selektifitas  pada  Tabel  2 memenuhi  persyaratan,  karena  tidak  ada pengaruh respon puncak dari 6 jenis blanko plasma dari individu berbeda yang dibandingkan  dengan  area  analit  pada konsentrasi  LoQ.  Contoh  kromatogram dapat dilihat pada Gambar 3.
Presisi dan akurasi Intra-day merupakan  presisi  dan  akurasi  yang pengukurannya dilakukan dengan menganalisis  tiga  konsentrasi  (rendah, sedang  dan  tinggi)  dengan  minimum  5 replikasi tiap konsentrasi yang diukur pada hari yang sama. Presisi Intra-day dilakukan untuk  mengetahui  kesalahan  acak  dan ketidakseragaman  hasil  analisis  yang dihasilkan  dari  suatu  pengujian  dengan kondisi  yang  sama.  Berdasarkan  Tabel  3, hasil  uji  presisi Intra-day pada  tiga konsentrasi  diperoleh  CV  sebesar  0,72  – 2.84%, dimana hasil ini memenuhi kriteria penerimaan  presisi  yaitu  CV            <  15%. Hasil  uji  akurasi Intra-day pada  tiga konsentrasi  menghasilkan  bias  -11,68  – 1,14%, dimana hasil uji tersebut memenuhi kriteria  penerimaan  akurasi  yaitu  bias  < ±15%.  Dengan  demikian,  metode  uji  yang digunakan  memiliki  akurasi  yang  baik selama jalannya satu kali analisis.
Keterangan : ND = Not Detection (tidak terdeteksi) Minutes 0 5 10 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 5.9 42 C arb am az ep in e 0.0 0 9.3 00 E sta zo la m 6.6 1 Detector A (220nm) kk5000-7030 Retention Time Name Resolution Minutes 0 5 10 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 4.0 00 C arb am az ep in e 0.0 0 5.7 17 E sta zo la m 4.6 5 Detector A (220nm) kk 5000ppm-6535 Retention Time Name Resolution Minutes 0 5 10 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 3.0 33 C arb am az ep in e 0.0 0 4 .0 50 E sta zo la m 3.4 0 Detector A (220nm) kk 5000ppm-6040 Retention Time Name Resolution A B C
Gambar  2. Kromatogram  Carbamazepine  5066  ng/mL  dan  Estazolam  dalam  plasma,  kondisi percobaan : kolom Lichrospher RP-18 (125 x 4mm, 5 μm), laju alir 1 mL/menit, detektor UV (λ = 220 nm), fase gerak dapar fosfat 10 mM pH 7,4 dan asetonitril.(A) Komposisi fase gerak 70:30, Resolusi 6,61, (B) Komposisi fase  gerak 65:35, Resolusi 4,65, (C) Komposisi fase  gerak  60:40, Resolusi 3,40.
Tabel 1. Data Hasil Uji (LoQ)
Tabel 2. Data Hasil Uji Selektifitas
Minutes 4 6 8 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 (Car bam azepi ne) (E stazol am ) Detector A (220nm) Blank'.dat Retention Time Name Minutes 4 6 8 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 3.992 Carb am azepi ne 5.500 Es tazol am Detector A (220nm) 503'.dat Retention Time Name Minutes 4 6 8 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 V olt s 0.00 0.01 0.02 0.03 (Car bam azepi ne) 5.500 Es tazol am Detector A (220nm) 255'.dat Retention Time Name A B C
Gambar  3 .  (A)  Plasma  blanko;  (B)  Carbamazepine  50,30 ng/mL dan Estazolam dalam plasma; (C)  Carbamazepine  25,15  ng/mL  dan  Estazolam  dalam  plasma  Kondisi  percobaan  :  kolom Lichrospher  RP-18  (125 x  4  mm,  5  μm),  laju  alir  1  mL/menit,  detektor  UV  (λ  =  220  nm),  fase gerak dapar fosfat 10 mM pH 7,4 dan asetonitril (65 : 35).
Konsentrasi Sebenarnya Konsentrasi Terukur Konsentrasi rata – rata SD CV (%) % Bias (ng/mL) (ng/mL) 50,30 51,37 52,71 1,82 3,46 2,13
54,38 8,11 54,00 7,36 53,59 6,53 50,21 -0,18
25,15 ND
- - -
- ND - ND
-
ND
-
ND
- Plasma Area Carbamazepine Blank LoQ 1 0 2476 2707 2 0 2996 3308 3 0 2949 2950 4
0 2926 2800 5
0 2734 2651 6 0
3193 3138
Tabel 4 . Data Hasil Uji Recovery Konsentrasi Sebenarnya (ng/mL) Konsentrasi Terukur (ng/mL) Recovery (%) Rata-rata Recovery
150,90
139,56 92,48 95,57 147,37 97,66
149,46 99,04 143,02 94,78 141,70 93,90
804,80 724,75 90,05 89,15
719,30 89,38
710,81 88,32 715,23 88,87 717,29 89,13
4024,00 3914,09 97,27 98,67
3917,84 97,36 4069,89 101,14 3994,66 99,27 3956,43 98,32 Recovery termasuk dalam uji akurasi. Tujuan uji recovery untuk
mengetahui pengaruh
pengendapan
protein      plasma  terhadap  konsentrasi analit. Persentase recovery diperoleh dengan  membandingkan  konsentrasi  analit dengan proses pengendapan protein plasma terhadap  konsentrasi  sebenarnya  tanpa pengendapan protein plasma lalu dikalikan 100%.  Berdasarkan  tabel  4,  hasil  uji recovery pada  tiga  konsentrasi  didapatkan 89,15  -  98,67%.  Persyaratan  uji  recovery adalah  85  -  115%  (FDA,  2001).  Dengan demikian,  metode  ini  akurat  karena konsentrasi analit dengan proses pengendapan protein plasma masih memberikan hasil sesuai dengan konsentrasi analit sebenarnya tanpa pengendapan protein plasma.
Tabel 5. Data Hasil Uji Presisi dan Akurasi Inter-day
Konsentrasi Sebenarnya Hari Konsentrasi Terukur (ng/mL) Rata-rata
Inter-day Bias (%) (ng/mL) Simplo Duplo Perhari Rata-rata SD CV(%) 150,90 1 139,56 147,37 143,46 148,98 7,49 5,03 -4,93 2 154,17 162,61 158,39 4,96 3 153,27 154,59 153,93 2,01 4 144,42 153,83 149,12 -1,18 5 138,96 141,02 139,99 -7,23 804,80 1 724,75 719,30
722,02
745,44 35,54 4,77 -10,29 2 796,80 801,35 799,07 -0,71 3 739,28 765,68 752,48 -6,50 4 755,49 740,18 747,83 -7,08 5 691,83 719,73 705,78 -12,30 4024,00 1 3914,09 3917,84 3915,96 3884,45 173,80 4,47 -2,68 2 3786,02 4154,77 3970,40 -1,33 3 4202,19 4022,35 4112,27 2,19 4 3768,32 3698,96 3733,64 -7,22 5 3686,69 3693,33 3690,01 -8,30

## Tabel 6. Data Hasil Uji Linieritas
Ha ri Perhitungan Konsentrasi Deret Standar
Slope Intersep R Konsentrasi Sebenarnya (ng/mL) 0 50,66 101,32 253,30 506,60 1013,20 2533,00 5066,00 1 0 58,87 110,59 247,39 472,77 965,78 2591,90 5049,45 0,0003 -0,0085 0,9998 2 0 50,83 90,72 250,89 515,79 992,35 2551,55 5060,31 0,0003 -0,0035 1,0000 3 0 49,77 98,04 237,45 485,77 1017,56 2582,26 5043,45 0,0003 -0,0031 0,9999 4 0 54,60 93,45 244,46 462,30 969,90 2662,43 5014,94 0,0003 -0,0070 0,9995 5 0 56,66 114,85 255,76 489,32 1029,82 2453,22 5103,84 0,0003 -0,0062 0,9998
Rat a- rata 0 54,15 101,53 247,19 485,19 995,08 2568,27 5054,40 SD 0 3,8433 10,6539 6,8831 20,1970 28,3361 76,0540 32,3318 CV 7,10 10,49 2,78 4,16 2,85
2,96 0,64
Presisi dan akurasi Inter-day bertujuan untuk mengetahui ketidakseragaman  dan  keakuratan  hasil yang diperoleh pada waktu yang berbeda.
Pada Tabel 5, hasil uji presisi Inter- day pada  tiga  konsentrasi  diperoleh  CV sebesar  4,47  –  5,03%.  Hasil  menyatakan uji  presisi Inter-day memenuhi  kriteria penerimaan  yaitu  CV  <  15%.  Hasil  uji akurasi Inter-day pada  tiga  konsentrasi diperoleh  bias  -12,30  –  4,96%.  Hasil  uji tersebut  memenuhi  kriteria  penerimaan yaitu  bias  <  ±15%.  Dengan  demikian, metode uji yang digunakan masih memberikan hasil uji yang relatif sama dan akurat pada waktu yang berbeda.
Berdasarkan  Tabel  6,  linieritas kurva  kalibrasi  standar  pada  presisi  dan akurasi  selama  5  hari  yang  berbeda  pada konsentrasi  50,66  -  5066.00  ng/mL menghasilkan  r  ≥  0.99  dan  CV  <  15%. Kofisien variasi disini menunjukkan bahwa kurva  kalibrasi  standar  dalam  waktu  yang berbeda  masih  memberikan  hasil  yang relatif  sama.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa kurva kalibrasi tersebut mempunyai linieritas  yang  cukup  baik,  sehingga  hasil interpolasi pada penetapan kadar Carbamazepine dalam plasma dapat terjamin kebenarannya.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
1. Batas kuantitasi sebesar 50,30 ng/mL.
2. Pada uji selektifitas tidak ada pengaruh respon  puncak  dari  6  jenis  blanko plasma dari individu berbeda.
3. Presisi intra-day dan inter-day menghasilkan  CV  0,72  –  2,84%  dan 4,47 – 5,03%.
4. Akurasi intra-day dan inter-day menghasilkan  bias  -11,68  –  1,14%  dan -12,30  –  4,96%, recovery 89,15  – 98,67%.
5. Kurva kalibrasi linier pada range 50,66 – 5066 ng/mL dengan r ≥ 0,99.
6. Metode  analisis  ini  memenuhi  kriteria penerimaan  validasi  metode,  sehingga dapat  digunakan  pada  laboratorium pengujian bioekivalensi.

## Saran
1. Perlu dilakukan validasi metode analisis secara berkala untuk menjamin validitas metode analisis yang digunakan.  Jika  tidak  ada  perubahan metode analisis maka dilakukan validasi  sebagian,  jika  ada  perubahan metode analisis maka dilakukan validasi penuh.
2. Sebaiknya  dilakukan  pengujian  secara in  vivo  untuk  memastikan  metode dapat digunakan pada pengujian bioekivalensi.

## DAFTAR PUSTAKA
Badan  Pengawas  Obat  dan  Makanan.  2002. Petunjuk  Operasional  Cara  Pengolahan Obat yang Baik . Jakarta.
.  2004. Pedoman  Uji  Bioekivalensi . Cetakan I. Jakarta.
BP  (British  Pharmacopoeia).  2003. British Pharmacopoeia .  Vol.  I.  London:  The Stationary Office.
FDA  (Food  and  Drug  Administration).  2001. Guidance  for  Industry  Bioanalytical Method  Validation .  Center  for  Drug Evaluation  and  Research,  Rockville, MD, USA.
Gritter, R. J., M. Bobbitt dan A. E. Schwarting. 1991. Pengantar  Kromatografi .  Edisi  II. Kosasih Padmawinata, penerjemah.
Bandung: ITB. Terjemahan dari:
Introduction to Chromatography . ICH (International Conference Harmonization). 1994. Note for Guidance  on  Validation  of  Analytical Procedurs: Definitions and Terminology,
ICH  Topic  Q2A.  The  European  Agency for the Evaluation of Medicinal Products.
ICH (International Conference Harmonization). 1994. Note for
Guidance  on  Validation  of  Analytical Procedurs, ICH  Topic  Q2B.  The European  Agency  for  the  Evaluation  of Medicinal Products.
Riley,  C.  M.  and  Rosanske  T.  W.  1996.
Development and Validation of Analytical  Methods .  Vol.    3.  USA:
Elsevier Science Ltd. Synder,  L.  R.,  J.  J.  Kirkland  and  J.  L.  Glajch. 1997. Practical HPLC Method
Development. Second  Edition.  New York: John Willey & Sons Inc.