## Sitotoksisitas Fraksi Nonpolar Brucea javanica (L.) Merr. Terhadap Sel Kanker Payudara T47D
Arum Setiawan 1) , Elvi Rusmiyanro Pancaning Wardoyo 2) , dan Ary Kusmawati 3)
1) Jurusan Biologi,Fakultas MIPA, Universitas Sriwijaya, Indonesia. 2) Fakultas MIPA, Universitas Tanjungpura, Indonesia.
3) SMA Negeri 9 Pontianak, Indonesia
Intisari: Buah  Brucea  javanica  (L.)  Merr  (Buah  Makasar)  telah  banyak  dimanfaatkan  oleh  masyarakat pedalaman  Kalimantan  untuk  mengatasi  berbagai  macam  penyakit,  seperti  diare,  panas  badan  dan  tumor. Informasi tentang aktivitas fraksi polar buah B. javanica asal Kalimantan Barat masih sangat terbatas. Tujuan penelitian ini ialah mengetahui aktivitas sitotoksik fraksi non polar B.  javanica asala Kalimantan Barat terhadap sel  kanker  payudara  T47D.  Buah  Brucea  javanica  (L.)  Merr.  yang  diambil  dari  Taman  Nasional  Betung Karihun, Kalimantan Barat digunakan dalam penelitian ini. Sel kanker payudara yang digunakan ialah cell line T47D.  Ekstrak  kloroform  buah  B.  javanica  difraksinasi  dengan  menggunakan  metode  Kromatografi  Vakum Cair  (KVC).  Fraksi  non  polar  yang  diperoleh  dilakukan  uji  sitotoksistas  dengan  metode  MTT  assay.  Sebagai pembanding digunakan obat standar Doksorubicin. Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa fraksi non polar buah B. javanica memiliki aktivitas sitotoksik  sebesar 63,32±2,35 µg/mL, lebih rendah dibandingkan dengan doxorubicin  sebesar 38,29 µg/mL. Golongan senyawa yang terdapat pada fraksi non polar buah B. javanica adalah terpenoid.
Kata kunci: Brucea javanica , kanker payudara, T47D, sitotoksisitas, terpenoid
Abstract: Fruit Brucea javanica (L.) Merr (fruit Makasar) has been widely used by Borneo people to various diseases, such as diarrhea, body heat and tumors. The activities of polar fraction B. javanica fruit from West Kalimantan  is  still  very  limited.  The  aim  of  this  study  is  to  determine  the  cytotoxic  activity  of  the  non-polar fraction B. javanica from West Kalimantan on breast cancer cells T47D. Fruit Brucea javanica (L.) Merr. taken from Karihun Betung National Park, West Kalimantan used in this study. Breast cancer cells used is cell line T47D.  B.  javanica  fruit  chloroform  extract  was  fractionated  using  Vacuum  Liquid  Chromatography  (KVC). Non-polar  fraction  obtained  cytotoxicity  test  performed  with  MTT  assay  method.  Used  as  the  standard  drug doxorubicin. The results showed that the fraction of non-polar of B. javanica cytotoxic activity of 63.32 ± 2.35 pg  /  mL,  lower  than  with  doxorubicin  at  38.29  mg  /  mL.  Group  of  compounds  contained  in  the  non-polar fraction B. javanica fruit is terpenoids.
Email: arum.setiawan@unsri.ac.id

## 1 PENDAHULUAN
anker  merupakan  penyebab  kematian  kedua setelah  penyakit  kardiovaskuler.  Kanker  meru- pakan  penyakit  yang  disebabkan  kegagalan  meka- nisme  pengaturan  multiplikasi  dan  fungsi  homeo- statis pada manusia (Nafrialdi & Gan, 2007). Kedua jenis  kanker  ini  merupakan  penyebab  kematian utama bagi kaum perempuan.
Pengobatan  kanker  dapat  dilakukan  secara  me- dis  dan  non  medis.  Pengobatan  kanker  secara  non medis  dilakukan  melalui  pemanfaatan  tumbuhan yang secara etnobotani dan etnoformakologi sudah diketahui sebagai tumbuhan obat. Pengobatan her- bal  dianggap  sebagai  alternatif  pengobatan  kanker yang  murah  dan  dapat  mengurangi  efek  samping yang ditimbulkan.
Obat  herbal  antikanker  memiliki  tingkat  keman- juran  tinggi,  bersifat  selektif  dan  dapat  bekerja  se- cara spesifik terhadap sel target, serta tidak merusak
sel normal. Penemuan obat herbal dapat dilakukan dengan  mengeksplorasi  senyawa  aktif  yang  berasal dari tumbuhan. Sampai saat ini dari sekitar 250.000 spesies  tumbuhan  tinggi  yang  telah  diteliti,  hanya 5%  yang  telah  diketahui  aktivitas  biologinya (Nugroho  &  Verpoorte,  2002)  dan  hanya  sekitar 100  senyawa  yang  bersifat  sitotoksik  telah  dite- mukan.
Penggunaan  sel  lestari  kanker  dalam  pencarian senyawa  antikanker  memiliki  keuntungan  seperti mudah penanganannya, memiliki kemampuan rep- likasi yang tidak terbatas, bersifat repeatable , homo- genitas  yang  tinggi  dan  mudah  diganti  dengan frozen stock jika terjadi kontaminasi, serta secara in vitro dapat diketahui mekanisme molekular senyawa antikanker  yang  sedang  dipelajari  (Burdal et  al ., 2003;  Felth,  2011).  Salah  satu  sel  kanker  yang banyak  digunakan  adalah  sel  kanker  payudara T47D ( human ductal breast epithelial tumor cell line ). Sel kanker T47D pertama kali disiolasi dari jaringan
K
tumor  duktal  payudara  seorang  wanita  berusia  54 tahun (Anonim, 2007).
Salah satu tumbuhan yang secara empiris diman- faatkan  sebagai  obat  tradisional  oleh  masyarakat pedalaman  etnis  Dayak,  Cina  dan  Melayu  adalah tumbuhan Brucea  javanica (L.)  Merr.  (buah  maka- sar).  Secara  umum,  organ  tumbuhan Brucea  java- nica (L.)  Merr.  yang  digunakan  adalah  buah  yang sudah  tua  dan  berwarna  hitam  serta  dikonsumsi langsung atau direbus.
Berdasarkan jurnal yang meneliti tentang Brucea javanica (L.) Merr.  diketahui bahwa  senyawa kimia yang  telah  diisolasi  dari  tumbuhan Brucea  javanica (L.)  Merr.  sebanyak  78  buah  senyawa.  Senyawa kimia tersebut sebagian besar merupakan golongan terpenoid  (Wardoyo et  al .,  2009).  Golongan  senya- wa  kimia  terpenoid  diketahui  memiliki  potensi  se- bagai antikanker.
Beberapa penelitian tentang Brucea javanica (L.) Merr.  pernah  dilakukan  oleh  Sakaki et  al .,  (1985); Sakaki et  al .  (1986);  Sakaki et  al .,  (1984);  Khoyaik- lang et  al .,  (2005);  Greenwood et  al .,  (2002);  Lau (2005); Sonlimar et al ., (2002) dan  Wardoyo et al ., (2009), tetapi hanya fokus pada identifikasi senyawa dan  aktivitas biologiknya saja, sehingga tidak  dapat diketahui  potensi  tumbuhan Brucea  javanica (L.) Merr.  secara  menyeluruh.  Penelitian  untuk  melihat potensi  fraksi  non  polar Brucea  javanica (L.)  Merr. masih sangat sedikit.

## 2 METODE PENELITIAN

## Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian  ini adalah buah Brucea javanica L. (Merr.) (nama lokal : Buah Makasar)  yang  diambil  dari  Hutan  Penyangga  Ta- man  Nasional  Gunung  Palung,  Kabupaten  Kayong Utara Provinsi Kalimantan Barat.
Subyek uji dalam penelitian ini adalah sel kanker payudara  T47D  dan  sebagai  pembanding  diguna- kan  sel  normal  (sel  Vero)  yang  diperoleh  dari Laboratorium  Parasitologi  Bagian  Kedokteran  Tro- pis  Fakultas  Kedokteran  UGM  Yogyakarta.  Bahan yang digunakan untuk kultur sel dan uji sitotoksisitas sel  kanker  adalah  media  kultur Dulbecco’s  Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma), antibiotik penisilin- streptomisin  (Sigma), Fetal  Bovine  Serume (FBS) 10%  v/v  (Gibco), Phosphate  Buffer  Saline (PBS)  1  x (Sigma),  Trypsin  0,25%  (Sigma),  reagen (3-(4,5- dimethylthiazol-2-il)-2,5-diphenyl tetra zolium bromide (MTT), reagen stopper SDS 10% (Sigma) dalam HCl
0,1  N  (Merck), Dimethyl  Sulfoxide (DMSO)  (Merck) dan alkohol 70%.
Bahan yang digunakan untuk ekstraksi, fraksinasi dan kromatografi adalah kloroform (pa, Merck), etil asetat  (pa,  Merck),  metanol  (pa,  Merck),  n-Heksan (pa, Merck),  dikloromethan (pa Merck),  aseton (pa Merck),  asam  asetat  glasial  (pa  Merck),  akuades, lempeng silika gel GF 254 (Merck), serbuk silika gel 60 PF 254 (Merck), perekasi semprot serium (IV) sulfat.

## Alat Penelitian
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  ada- lah  seperangkat  alat-alat  gelas  (Pyrex),  kamera digital  (Sony),  timbangan  analitik  (Sartorius), seperangkat soxhlet (Pyrex),  oven  (Memmert), freezer (Electrolux), magnetic  stirer (Nouva  II), pompa  vakum  (Gast-USA),  mikroskop  inverted (Olympus  CH-2),  mikroskop  binokuler  (olympus), deep  freezer -80 o C  (Shel  Lab),  Mikropipet  (Eppen- dorf), blue  tips , yellow  tips , white  tips ,  kertas  saring biasa,  hemositometer  (Neubauer  assistant), Thin Layer  Chromatography  (TLC)    chamber ,  kompor listrik  (Maspion),  pelat  kaca  20  x  20  cm,  desikator, lampu  UV λ =  254  nm  dan  366  nm, autoclave (Hirayama HICLAV HV-25), refrigerator suhu dingin (Sanyo- Ultra  Low ),  inkubator  CO 2 (Hiraeus), sentrifuge  (Sarvall  MT  12V), tissue  culture  flask (Nunclon), tissue  culture  test  plate  96  well (Iwaki), Laminar  air  flow  cabinet (Labconco  Purifier  Class  II Biosafety Cabinet), ELISA reader (BioRad-Mikroplate Reader  Benchmark), hand  counter ,  lemari  es (Sharp).

## Cara Kerja Penelitian
Tumbuhan  yang  diperoleh  diidentifikasi  mengacu pada buku kunci determinasi tumbuhan Suryo et al . (1981)  dan  Steenis  (1992).  Keakuratan  spesies tumbuhan  dideterminasi  di  Laboratorium  Taksono- mi Tumbuhan Fakultas Biologi UGM dan Herbarium Bogoriense Bogor.

## Fraksinasi Ekstrak Potensial
Prosedur  fraksinasi  mengikuti  cara  yang  dilakukan oleh  Coll  &  Bowden  (1986)  yang  menggunakan metode  kromatografi  vakum  ciar  (KVC).  Fraksinasi dengan menggunakan kolom vakum SiO 2 2 x 4 cm dengan menggunakan pelarut seperti pada tabel  1. Sampel  ekstrak  potensial  sebanyak  3  g  ditambah dengan  serbuk  silika  gel  60  GF 254 sebanyak  5  g, sedikit  demi  sedikit  sambil  diaduk  dalam  cawan porselen  hingga  diperoleh  campuran  yang  homo- gen  dan  kering.  Pembuatan  kolom  SiO 2 dilakukan dengan  memasukkan  silika  gel  sedikit  demi  sedikit
ke  dalam sintered  glass sambil  divakum  untuk memperoleh  massa  fase  diam  yang  kompak  dan padat. Sampel yang sudah dikeringkan dengan silika gel hingga menjadi serbuk free flowing dipindahkan sedikit  demi  sedikit  ke  dalam sintered  glass di  atas fase  diam  dengan  permukaan  atas  diusahakan  rata sambil divakum.
Fraksinasi  dilakukan  dengan    menuang  pelarut secara  perlahan-lahan  pada  permukaan  kertas saring yang diletakkan diatas fase diam dan sampel dalam sintered  glass sambil  divakum.  Pelarut  yang digunakan  dimulai  dari  yang  paling  non  polar  dan selanjutnya dengan pelarut yang lebih polar secara bertahap.  Pelarut  yang  digunakan  dalam  fraksinasi ekstrak potensial dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Pelarut yang digunakan dalam fraksinasi ekstrak
potensial Fraksi ke- Pelarut Volume (ml) 1 n-Heksan 100% 100 2 Kloroform 100% 100 3 Kloroform : etil asetat = 30 : 1 (v/v) 100 4 Kloroform : etil asetat = 20 : 1 (v/v) 100 5 Kloroform : etil asetat = 10 : 1 (v/v) 100 6 Kloroform : etil asetat = 3 : 1 (v/v) 100 7 Etil asetat 100% 100 8 Etil asetat : metanol = 20 : 1 (v/v) 100 9 Etil asetat : metanol = 10 : 1 (v/v) 100 10 Etil asetat : metanol = 5 : 1 (v/v) 100 11 Etil asetat : metanol = 3 : 1 (v/v) 100 12 Metanol 100% 100
Hasil  fraksinasi  kemudian  ditampung  dalam  ca- wan  porselen  dan  dikeringanginkan  dengan  ban- tuan kipas angin. Berat masing-masing fraksi kemu- dian ditimbang.

## Kromatograf Lapis Tipis (KLT) Fraksi dari Ekstrak Potensial
Kandungan  bioaktif  masing-masing  fraksi  hasil fraksinasi ekstrak potensial  di monitor  dengan KLT. KLT menggunakan fase diam berupa silika gel GF 254 dengan  menggunakan  pelarut  tertentu.  Orientasi dan  pengembangan  fase  gerak  dimulai  dengan menggunakan pelarut yang non polar yaitu n-heksan dan  kloroform  serta  selanjutnya  dengan  pelarut yang polar yaitu air dan aseton secara bertahap.
Lempeng KLT diaktifkan terlebih dahulu dengan menggunakan hair  dryer selama  10  menit.  Semua hasil  fraksi  yang  diperoleh  dan  satu  fraksi  metanol potensial  yang  belum  difraksinasi  (sebagai pembanding)  ditotolkan  pada  bagian  bawah lempeng dengan jarak antar totolan 1 cm, diameter 2-3  mm,  dikeringanginkan  dan  ditotol  kembali.
Berdasarkan hasil orientasi dan pengembangan fase gerak, pelarut yang digunakan untuk KLT hasil hasil fraksinasi adalah kloroform : etil asetat = 10:1.
Profil kromatogram divisualisasi dengan menggunakan  sinar  tampak,  sinar  UV λ =  254  nm dan  sinar  UV λ =  366  nm,  disemprot  dengan dengan serium (IV) sulfat, dipanasi dalam oven 100 o C.  Fraksi  dengan  pola  kromatogram  mirip digabungkan  dan  ditimbang  beratnya.  Senyawa bioaktif yang terdapat dalam fraksi gabungan dimo- nitor dengan menggunakan KLT.

## Uji Sitotoksisitas Fraksi (MTT Assay)
Perbanyakan Cell Line T47D
Kultur cell  line T47D  mengacu  protokol  yang dilakukan  oleh  CCRC  (2009).  Kultur  stok cell  line T47D  dalam cryogenic  tube dikeluarkan  dari refrigerator  dan  dibiarkan  mencair  pada  suhu kamar. Cryogenic tube kemudian dibawa ke laminar air  flow  cabinet,  cell  line T47D  dipipet  dengan mikropipet steril dan dipindahkan ke dalam conical tube ukuran  15  ml  steril,  ditambahkan  medium DMEM  sebanyak  10  ml,  dipasang  dalam  alat sentrifuge dan disentrifugasi dengan kecepatan 700 rpm  selama  10  menit  hingga  sel  mengendap. Setelah  itu,  supernatan  dibuang,  pelet  ditambah dengan medium kultur sebanyak 5 ml, diresuspensi dengan  pipet  pasteur  steril,  dan  sel  terlarut dipindahkan  ke  dalam  2  buah cultur  flask steril. Medium kultur dapat ditambahkan bila dasar culture flask belum tergenang oleh medium.  Sel kemudian diinkubasi  dalam  inkubator  CO 2 pada  suhu  37  ºC, 5%  CO 2 dan  diamati  setiap  hari.  Penggantian medium  dilakukan  apabila  medium  dalam culture flask sudah  berubah  warna  dari  merah  muda menjadi  jingga  atau  kuning.  Jika  sel  sudah  kofluen (menutupi  90%  dasar culture  flask )  maka  sel  siap untuk dipanen.

## Panen Sel
Kultur   sel dikeluarkan dari inkubator CO 2 , dibawa ke laminar air flow cabinet , dibuang media kulturnya dengan  pipet  pasteur  steril  dan  dicuci  dengan menggunakan  PBS,  ditambahkan  500  µl  tripsin 0,05%  lalu  diinkubasikan  selama  3-5  menit  dalam inkubator  CO 2 (37  ºC,  5%  CO 2 )  hingga  sel  terlepas dari dasar flask, lalu ditambahkan 3 ml media kultur dan  diresuspensi  dengan  pipet  pasteur  steril.  Sel terlarut  dipindahkan  dalam conical  tube steril ukuran  15  ml.  Selanjutnya  diambil  10  µl  dengan mikropipet  untuk  dihitung  dengan  hemositometer dibawah  mikroskop inverted. Sel  diamati  dan dihitung. Volume yang diperlukan sebanyak 100 μ l x 100 well = 10 ml.

## Uji MTT Assay
Penentuan  kadar  yang  digunakan  untuk  uji sitotoksik mengacu protokol CCRC (Anonim, 2009). Seratus mikroliter suspensi yang berisi c ell line T47D dalam  media  kultur  yang  mengandung  1,5x10 4 sel dimasukkan  ke  dalam  masing-masing  sumuran microplate 96 well .  Mikroplate  diinkubasi  dalam inkubator  CO 2 selama  12  jam  pada  suhu  37ºC,  5% CO 2 .  Setelah  12  jam,  morfologi  sel  diamati  dengan inverted  microscope untuk  dilihat  apakah  sel  dalam kondisi  baik  dan  tidak  terjadi  kontaminasi.  Setelah sel  melekat  dengan  baik  pada  dasar  mikroplat, media  sel  di  dalam  setiap  sumuran  dibuang, kemudian  ke  dalam  setiap  sumuran  tersebut ditambahkan  100  µl  media  baru  yang  sudah mengandung  ekstrak  dengan  kadar  tertentu. Mikroplate  diinkubasi  dalam  inkubator  selama  24 jam  pada  suhu  37ºC,  5%  CO 2 .  Setelah  24  jam, morfologi  sel  diamati,  media  dan  ekstrak  dibuang dari  dalam  mikroplat  dan  dicuci  dengan  PBS.  Ke dalam setiap well  plate ditambahkan 110 µl  larutan MTT  (konsentrasi  MTT  0,5  mg/ml)  dan microplate diinkubasikan  pada  suhu  37ºC,  5%  CO 2 .  Setelah  4 jam  ditambahkan  100  µl  reagen stopper SDS  10% dalam  HCl  0,1N  ke  dalam  setiap well (untuk melarutkan  kristal purple  formazan ).  Mikroplat diinkubasi kembail selama 12 jam pada suhu kamar. Absorbansi  dibaca  dengan  menggunakan  ELISA reader pada λ = 595 nm (Wilson et al ., 2004).
Menurut  Anonim  (2009),  persentase  kematian sel dihitung dengan rumus sebagai berikut :
(a – b) – (c – b)
% kematian sel  = × 100%
(a – b)
Keterangan: a = absorbansi kontrol sel b = absorbansi kontrol media c = absorbansi sampel

## Analisis Data
Data hasil perhitungan nilai IC 50 fraksi aktif dianalisis dengan  analisis  variansi  untuk  mengetahui  beda nyata perlakuan dan dilanjutkan dengan uji analisis duncan  multiple  range  test (DMRT)  untuk  mengeta- hui beda nyata antar perlakuan.

## 3 HASIL DAN PEMBAHASAN

## Fraksinasi dan Profil KLT Senyawa Bioaktif dari Ekstrak Aktif
Pencampuran  ekstrak  potensial  dengan  silika  gel bertujuan  untuk  memperluas  permukaan  kontak
ekstrak  dengan  fase  diam  dan  fase  gerak  yang digunakan,  sehingga  proses  pemisahan  dan penarikan senyawa dalam ekstrak dapat berlangsung maksimal.
Pengaliran  pelarut  dilakukan  secara  berurutan dan bergantian dimulai dari pelarut yang non polar (n-heksan)  menuju  ke  pelarut  yang  paling  polar (metanol).  Senyawa-senyawa  yang  terkandung dalam  ekstrak  akan  terpisah  berdasarkan  tingkat kepolarannya. Senyawa yang non polar akan keluar dari  kolom  terlebih  dahulu,  kemudian  diikuti senyawa  yang  lebih  polar  (Sherma,  2003;  Nyiredy, 2003).
Analisis  KLT  dilakukan  untuk monitoring senyawa yang terkandung  dalam setiap fraksi yang dihasilkan.  Visualisasi  bercak  pada  plat  KLT menggunakan  sinar  tampak,  sinar  UV  dengan λ =254 nm dan λ =366 nm. Profil kromatogram akan nampak nyata setelah disemprot dengan serium (IV) sulfat. Berdasarkan monitoring KLT fraksi-fraksi yang dihasilkan,  dapat  ditunjukkan  bahwa  proses pemisahan  yang  dilakukan  dengan  metode  KCV dapat  memisahkan  kelompok  senyawa  yang terkandung  dalam  ekstrak  potensial  menjadi beberapa kelompok senyawa yang lebih sederhana.
Profil kromatogram fraksi hasil fraksinasi pereaksi semprot serium (IV) sulfat dapat lihat pada Gambar 1.  Berdasarkan  profil  kromatogram  12  fraksi  dari ekstrak potensial, tampak ada kesamaan profil bebe- rapa fraksi. Profil kromatogram fraksi 1 dan 2 mirip, fraksi 3,4 dan 5 mirip dan fraksi 6 sampai 12 mirip, sehingga  dilakukan  penggabungan  fraksi-fraksi  ter- sebut.  Penggabungan  fraksi  dilakukan  dengan  tu- juan  untuk  menyederhanakan  fraksi  yang  dipero- leh.  Penggabungan  fraksi  menghasilkan  3  fraksi  ga- bungan,  yaitu  fraksi  gabungan  1  (F1),  fraksi  gabu- ngan  2  (F2)  dan  fraksi  gabungan  3  (F3).  Pengga- bungan  fraksi-fraksi  yang  memiliki  kesamaan  profil dan berat fraksi gabungan dapat dilihat pada Tabel 2.
Fraksi  1  dan  2  (fraksi  gabungan  F1)  mengguna- kan  pelarut  n-heksan  dan  kloroform  yang  bersifat non  polar memiliki  berat  ekstrak  yang  paling  besar (2,20  g).  Senyawa  yang  larut  dalam  pelarut non polar merupakan  senyawa non  polar .  Pelarut  n- heksan  dan  kloroform  dapat  mengelusi  senyawa- senyawa  yang  bersifat non  polar ,  seperti  terpenoid, quasinoid  termasuk  asam  lemak  yang  banyak terdapat dalam biji Brucea javanica (L.) Merr. Berat masing-masing  fraksi  dan  fraksi  gabungan  yang dihasilkan dapat dilihat pada tabel 2.
Gambar 1. KLT fraksi hasil fraksinasi (fase diam silika gel GF 254 ; fase gerak kloroform : etil asetat = 10 : 1, pereaksi semprot Serium (IV) sulfat) Tabel 2. Berat masing-masing fraksi dan fraksi gabungan yang dihasilkan No. Fraksi Kode fraksi gabungan Berat fraksi gabungan (g) 1 Fraksi 1 F1 2,20 2 Fraksi 2 3 Fraksi 3 F2 0,65 4 Fraksi 4 5 Fraksi 5 6 Fraksi 6 F3 0,13 7 Fraksi 7 8 Fraksi 8 9 Fraksi 9 10 Fraksi 10 11 Fraksi 11 12 Fraksi 12
Kromatogram  KLT  fraksi  F1  menghasilkan bercak  dengan  nilai  Rf  sebesar  0,53;  0,76  dan  0,83 dan  fraksi  F2  menghasilkan  bercak  dengan  nilai  Rf sebesar  0,23;  0,33  dan  0,73,  sedangkan  fraksi  F3 menghasilkan  bercak  dengan  nilai  Rf  sebesar  0,37 dan  0,47.  Berdasarkan  nilai  Rf  fraksi  gabungan menunjukkan  bahwa  penggabungan  fraksi  yang dilakukan  tidak  menghasilkan  profil  yang  berbeda dengan  profil  kromatogram  fraksi-fraksi  hasil  KVC. Kromatogram fraksi 1, F2 dan F3 dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. KLT fraksi F1, F2 dan F3 (fase diam = silika gel GF 254 ; fase gerak kloroform : etil asetat = 10 : 1, Pereaksi semprot Serium (IV) sulfat

## Aktivitas Sitotoksik Fraksi Gabungan dari Ekstrak Potensial
Penggabungan  fraksi  hasil  fraksinasi  EKBT  untuk menyederhanakan jumlah fraksi yang diuji sitotoksi- sitasnya.  Uji  sitotoksisitas  dilakukan  dengan  meng- gunakan sel kanker payudara T47D. Kadar konsen- trasi  yang  digunakan  adalah  400,  200,  100,  50  dan 25 µg/mL. Hasil uji sitotoksik ketiga fraksi gabungan dapat dilihat pada Tabel 3.
Efek  sitotoksik  fraksi  F1  dan  F2  terhadap  sel kanker  payudara  T47D  terlihat  lebih  nyata  diban- ding dengan efek ekstrak Brucea javanica (L.) Merr. Analisis  variansi  yang  dilanjutkan  dengan  analisis DMRT terhadap ke-3 fraksi gabungan menunjukkan perbedaan  yang  signifikan  (p<0,05)  antar  fraksi gabungan.
Tabel 3. Nilai IC 50 fraksi gabungan dari ekstrak potensial
Brucea javanica (L.) Merr. terhadap sel T47D (µg/mL) No. Bahan Kode Nilai IC 50 (µg/mL) 1.  Fraksi gabungan 1 F1 63,32±2,35 a 2.  Fraksi gabungan 2 F2 69,95±0,36 b 3.  Fraksi gabungan 3 F3 356,75±0,95 c
Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang sama pada setiap kolom tidak berbeda nyata (N=3, p<0,05)
Berdasarkan  Tabel  3,  dapat  memperlihatkan, fraksi  F1  memiliki  nilai  IC 50 terkecil,  yaitu  sebesar 63,32 µg/mL dibandingkan nilai IC 50 fraksi gabungan F2  (69,95  µg/mL)  dan  F3  (356,75  µg/mL).  Hal  ini sesuai  dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh Moeljopawiro et al . (2007) yang menggunakan me- tode  KVC  untuk  fraksinasi  buah  merah  ( Pandanus sp)  dan  ternyata  dapat  meningkatkan  efek  sitotok- siknya.
Fraksi  F1  merupakan  fraksi  gabungan  yang mengadung senyawa bersifat non polar . Dibanding- kan  dengan  doxorubicin  (nilai  IC 50 sebesar  38,29 µg/mL), nilai IC 50 ketiga fraksi gabungan masih lebih tinggi.  Meskipun  fraksi  gabungan  memiliki  aktivitas sitotoksik  yang  lebih  rendah  jika  dibandingkan dengan  obat  standar  doxoribicin,  tetapi  senyawa metabolit  yang  terkandung  dalam  fraksi  gabungan tersebut  dapat  dikembangkan  sebagai  agen  anti- kanker  (Wahyuningsih et  al .,  2003).  Hubungan  an- tara konsentrasi fraksi gabungan  dengan persentase viabilitas  sel  kanker  payudara  T47D  terdapat  pada Gambar 3.
Penelitian  dilanjutkan  dengan  menggunakan fraksi  F1  dengan  2  dasar,  pertama,  fraksi  F1  meru- pakan  fraksi  yang  paling  toksik  (IC 50 63,32  µg/mL) (lihat Gambar 15) dan kedua, memiliki berat ekstrak yang  paling  besar  (2,20  g).  Penelitian  dilanjutkan
dengan  analisis  KLTP.  Selanjutnya  fraksi  gabungan F1 disebut sebagai fraksi gabungan aktif.
Gambar 3. Sitotoksistas fraksi F1, F2 dan F3 terhadap sel T47D. (F1=fraksi gabungan pertama; F2=fraksi gabungan kedua; F3=fraklsi gabungan ketiga)
Pengujian  efek  sitotoksik  senyawa  yang terkandung  dalam  tumbuhan Brucea  javanica (L.) Merr. dilakukan dengan menggunakan reagen MTT. Senyawa  bahan  alam  diperlakukan  pada  kultur  sel kanker  T47D  secara in  vitro .  Dasar  pengujian  ini adalah reaksi reduksi MTT yang terjadi karena akti- vitas  sel  hidup  membentuk  kristal  formazan.  Pem- bentukan  formazan  terjadi  karena  berkaitan  lang- sung dengan aktivitas metabolisme sel hidup dalam kultur yang secara langsung dapat diukur absorban- sinya menggunakan ELISA reader pada λ = 595 nm (Wilson et al ., 2004; Gonzalves et al ., 2010). Ekstrak potensial  yang  dapat  digunakan  sebagai  agen  ke- moterapi  kanker  apabila  memiliki  nilai  IC 50 kurang dari 1000 µg/mL (Doyle & Griffiths, 2000).
Studi  yang  dilakukan  sebelumnya,  telah  dike- tahui  bahwa  tumbuhan Brucea  javanica (L.)  Merr. mengandung  senyawa  golongan  alkaloid,  quasi- noid,  terpenoid  dan  lipid.  Pada  penelitian  ini,  sen- yawa aktif dalam buah dan biji Brucea javanica (L.) Merr.  larut  dalam  pelarut non  polar dan polar (Wardoyo et al ., 2011).
Biji  merupakan  organ sink bagi  tumbuhan  yang berperan  untuk  regenerasinya.  Senyawa  yang  ber- kaitan  dengan  proses  regenerasi  tumbuhan  akan ditransport  ke  dalam  biji.  Biji  juga  mampu  mensin- tesis  senyawa  ( source )  yang  diperlukan  untuk  rege- nerasi. Oleh karena itu, buah dan biji mengandung senyawa  metabolit  sekunder  yang  lebih  kompleks bila  dibandingkan  dengan  organ  yang  lain.  Meta- bolit  sekunder  akan  disimpan  pada  buah  dan  biji sebagai  cadangan  makanan,  sumber  energi  dan pertahanan  diri  ( sel-defense ).  Jenis  dan  konsentrasi senyawa  metabolit  sekunder  yang  lebih  lebih kompleks  menyebabkan  buah  dan  biji  berpotensi
memiliki aktivitas biologi yang lebih luas (Robinson, 1991;  Campbell et  al .,  2008).  Menurut  Campbell et al .  (2008),  berkaitan  dengan  fungsinya,  buah  dan biji  merupakan  salah  satu  organ  yang  dijadikan  se- bagai lokasi akumulasi senyawa metabolit sekunder. Biji yang sudah tua diprediksi mengandung senyawa metabolit sekunder yang lebih kompleks.
Ekstraksi  secara  sokletasi  menggunakan  pelarut kloroform  akan  melarutkan  senyawa  metabolit  se- kunder yang bersifat non polar . Senyawa non polar yang  telah  diketahui  bersifat  sitotoksik,  antara  lain berasal dari golongan terpenoid, quasinoid  dan se- bagian  asam  lemak  (Alexandrova et  al .,  2000).  Ke- mampuan ekstrak EKBT menghambat proliferasi sel kanker  disebabkan  karena  buah  dan  biji  memiliki senyawa bioaktif anti kanker yang bersifat non polar . Metode  KVC  dapat  digunakan  untuk  memisah- kan  senyawa  kompleks  terpenoid  menjadi  fraksi yang  lebih  sederhana  (Coll  &  Bowden,  1986);  Pel- letier et  al .,  1986).  Fraksinasi  secara  KVC  mampu memisahkan  ekstrak  EKBT  menjadi  12  fraksi  yang memiliki  komposisi  kandungan  senyawa  yang  lebih sederhana. Fraksi yang memiliki profil kromatogram yang  sama  digabungkan  untuk  menyederhanakan fraksi, dan didapatkan 3 fraksi gabungan. Fraksi ga- bungan  pertama  (F1)  merupakan  gabungan  fraksi n-heksan  dan  kloroform.  Fraksi  gabungan  F1  ini mengandung    senyawa  yang  bersifat non  polar . Fraksi  gabungan    F1  memiliki  efek  sitotoksik terhadap  sel  kanker  T47D  (nilai  IC 50 63,32  µg/mL) yang  lebih  tinggi  dibandingkan  ekstrak  EKBT  (nilai IC 50 95,59 µg/mL).
Uji sitotoksisitas fraksi gabungan F1 menunjukkan adanya  penurunan  nilai  IC 50 dan  peningkatan  akti- vitas  sitotoksik  terhadap  sel  kanker  T47D.  Pening- katan  efek  sitotoksistas  ini  diprediksi  oleh  mening- katnya  efek  sinergisme  senyawa  yang  terkandung dalam  fraksi  gabungsn  F1.  Aktivitas  sitotoksik  yang ditimbulkan  oleh  suatu  komponen  senyawa  kimia juga  dapat  berasal  dari  efek  kombinasi  antara senyawa  yang  tidak  atau  kurang  aktif  dan  senyawa yang  aktif.  Sifat  aktif  suatu  senyawa  akan  saling meningkatkan  dan  menghasilkan  aktivitas  yang lebih tinggi (Moeljopawiro et al ., 2007).

## 4 KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  pembahasan  dan  analisis  data dapat disimpulkan bahwa fraksi gabungan n-heksan dan  kloroform  100%  memiliki  aktivitas  sitotoksik paling  tinggi  terhadap  sel  kanker  payudara  T47D dengan nilai IC 50 sebesar 63,32 µg/ml.

## REFERENSI _____________________________
Alexandrova, R., I. Alexandrov, M. Velcheva , T. and Va- radinova 2000. Phytoproducts and Cancer. J. Exp. Path.  and Par. 4: 15-26.
Anonim. 2007. T47D. Human ductal breast epithelial tumor cell line. Whole Cell Lysate datasheet. http://www. abcam.com/index.html?datasheet =14899. diakses Oktober 2011.
Anonim. 2009. In Vitro Test Protocol, Cancer Chemopre- vention Research Center http://ccrc.farmasi.ugm.ac. id/en/. diakses tanggal 10 Juli 2013.
Burdall, E.S., Hanby M.A., Landsdown, R.J.M., and Speirs, V. 2003. Breast Cancer Cell Line. Breast Can- cer Res ., 5 (2): 89-95.
Campbell, N.A., Jane B. Reece, Lisa A. Urry, Michael L. Cain, Steven A. Wasserman, Peter V. Minorsky, and Robert B. Jackson. 2008. Biology . 8 nd edition. Pearson Education, Inc. San Francisco. pp. 738-821.
Coll, J. C. and B. F. Bowden. 1986. The Aplication of Vaccum Liquid Chromatography to The Separation of Terpene Mixtures. J. Nat. Prod . 49 (5):934-936. Dewick, P. M. 2009. Medical Natural Products : A Biosyn- thesis Approach , John Wiley and Sons Ltd. Chichester. pp. 7-48.
Felth, J. 2011. Studies of Cytotoxic Compounds of Natural Origin and Their Mechanism of Action . Dissertations. University of Uppsala.
Gonzales, A.D., P.G. Lopez, L.A. Herrera, J.L. Medina- Franco, A. Gonzales-Fierro, N. Candelaria. 2008. The Prince and The Pauper: A Tale of Anticancer Targeted Agents. Mol. Cancer . 7: 82
Greenwood E. M., M. Cuendet, D. Sher, D. Gustin, W. Stock and J. M. Pezzuto. 2002. Brusatol-Mediated In- duction of Leukemic Cell Differentiation and G1 Arrset is Associated With Down-Regulation Of C-Myc. Leu- kimia . 16 : 2275-2284.
Kim, I. H., Y. Hitotsuyanagi and K. Takeya, 2004, Quassi- noid Glycosides from seeds of Brucea amarissima .
Phytochem. 65 : 3167-3173.
Kim, I.H. Satoru Takashima, Yukio Hitotsuyanagi, Tomoyo Hasuda, and Koichi Takeya.. 2004. New Quassinoids, Javanicolides C and D and Javanicosides B-F, from Seeds of Brucea javanica. J. Nat. Prod.. 67, 863-868 Kitagawa, I., T. Mahmud, P. Simanjuntak, K. Hori, T. Uji and H. Shibuya. 1994. Indonesian Medicinal Plants. VIII. Chemical Structures of Three New Triterpenoids, Bruceajavanin A, Dihydrobruceajavanin A, and Bru- ceajavnin B, and a New Alkaloid Glycoside, Brucea- canthinoside from the Stem of Brucea javanica (Sima- roubacae). Chem. Pharm. Bull . 42 (7) :  1416-1421. Khoyaiklang, P., C. Hahnvajanawong, P. Laupatarakasem, B. Sripa, S. Ubol and V. Lulitanond. 2005. Cytotoxicity of Brucea javanica (L.) Merr. on Human Cholangcarci- noma Cell Lines . http://www. scholar.com/scholar. Di- akses Juli 2010.
Lau, F. Y. 2005. Antiproliferative and apoptosis-inducing activity of Brucea javanica extrat on human carcinoma cells, Intl J Mol. Med. 16 : 1157-1162.
Moejopawiro, S, TR. Nuringtyas, R. Noveriza, dan O. Tri- silawati. 2007. Kajian bioaktif anti kanker 3 varietas buah merah: Identifikasi fraksi bioaktif antikanker payu- dara dan kaner rahim dan mikrobia kontaminan pada 3 varietas buah merah ( Pandanus conoideus Lamk). Laporan hasil penelitian kerjasama UGM dengan Sekretariat Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian.
Nafrialdi dan S. Gan. 2007. Antikanker dalam Farmakologi dan Terapi . Edisi 5. Departemen Farmakologi dan Terapeutik. Jakarta.
Nugroho, L. H. and R. Verpoorte. 2002. Secondary Meta- bolism in Tobacco. Plant Cell, Tissue and Organ Cul- ture . 68 : 105-125.
Nyiredy, S. 2003. Thin Layer Chromatography. In Hand- book of Thin-Layer Chromatography . Third Edition, Re- vised and Expanded edited by Joseph Sherma and Bernard Fried. Marcel Dekker. New York. pp. 302- 323.
Pelletier, S.W., Hitesh P. Choksi and Haridutt K. Desai. 1986. Separation of Diterpenoid Alkaloid Mixtures Using Vacuum Liquid Chromatographi. J of Nat Prod . 49 (5): 892-900.
Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi . Edisi Keenam. Terjemahan oleh Kosasih Padmawi- nata. ITB Press. Bandung. pp. 90-105.
Sakaki, T., S. Yoshimura, M. Ishibashi, T, Tsuyuki T. Taka- hashi, T. Honda and T. Nakanishi. 1984. New Quassi- noid Glycosides, Yadaziosides A-H, from Brucea java- nica , Chem. Pharm. Bull . 32 (11) : 4702-4705.
Sakaki, T., S. Yoshimura, M. Ishibashi, T. Tsuyuki, T. Ta- kahashi, T. Honda and T. Nakanishi. 1985. Structures of New Quassinoid Glycosides, Yadanziosides A, B, C, D, E, G, H, and New Quassinoid, Dehidrobrusatol and Dehydrobruceantinol from Brucea javanica (L.) Merr. Bull. Chem. Soc. Jpn . 58 (9): 2680-2686.
Sakaki, T., S. Yashimura, T. Tsuyuki, T. Takahashi, T. Honda and T. Nakanishi. 1986. Structures of Yadanzi- osides K, M, N, and O, New Quassinoid Glycosides from Brucea javanica . Bull.Chem. Soc. Jpn . 59 (11) : 3541-3546.
Sherma, J. 2003. Basic TLC Techniques, Materials, and Apparatus. In Handbook of Thin-Layer Chromatogra- phy . Third Edition. edited by Joseph Sherma and Ber- nard Fried. Marcel Dekker, Inc.  New York. pp. 1-46 Sonlimar, M., Sismindari dan Mustofa. 2002. Uji Sitotoksik In Vitro Ekstrak Klororform Brucea javanica (L.) Merr,
Ipomoea batatas Poir, Mussaenda pubescens Ait. F., dan Portulaca oleracea L. Tehadap Sel HeLa. Majalah Farmasi Indonesia . 13 (4) : 215-222.
Subeki, H. Matsuura, K. Takahashi, K. Nabeta, M. Yamasaki, Y. Maede, and K. Katakura. 2007. Screening of Indonesian Medicinal Plant Extracts for Antibabesal Activity and Isolation of New Quassionoid from Brucea javanica . J. Nat. Prod . 70 (10) : 1654-1657.
Wardoyo, E. R. P., L. H. Nugroho, and Y.I. Yanti, 2009. Cytotoxic Assay of Chloroform and Methanol Extract of Brucea javaniva (L.) Merr. On Cervix Cancer (HeLa), International Confernce on Biological Science, Faculty of Biology, Gadjah Mada University. Yogyakarta.
Wardoyo E. R. P., L.H. Nugroho, Santosa dan S. Moeljopawiro. Efek Sitotoksik Ekstrak Kloroform, Metanol dan Air Buah Brucea javanica (L.) Merr.
terhadap Sel Kanker Pyudara T47D. Berkala Penelitian Hayati . 4D : 13-16.
Wilson, V.S, Bobseine, K. and Gray EL. 2004. Develop- ment and Characterization of a Cell Line That Stably Expresses an Estrogen-Responsive Luciferase Reporter for the Detection of Estrogen Receptor Agonist and Antagonists. Toxicol Sci . 81(1): 69-77.  ______________