Jurnal EduMatSains, 3 (2) Januari 2019, 119-132
Induksi Kalus Krisan ( Chrysanthemum morifolium Ramat.) dengan Penambahan Berbagai Kombinasi Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)
Tia Setiawati*, Alma Ayalla, Anandira Witri
Program Studi Biologi Fakultas MIPA Universitas Padjadjaran Jl. Raya Bandung-Sumedang Km.21 Jatinangor
*e-mail : tia@unpad.ac.id

## Abstract
Chrysanthemum is an ornamental plant that contains many secondary metabolites such as flavonoids and  various  volatile  compounds  that  have  the  potential  as  medicinal  ingredients.  Production  of secondary metabolites from plants can be carried out in vitro through callus culture. The purpose of this  study  was  to  determine  the  effect  of  Plant  Growth  Regulators  (PGR)  combination  on  callus formation from explants of leaves and stems of Chrysanthemum plantlets in Murashige & Skoog (MS) media. The study was conducted using a Completely Randomized Design (CRD) with a single factor in the  form  of  10  combinations  of  2,4-D  +  kinetin    for  callus  induction  from  stem  explants  and  12 combinations of NAA + BAP  for callus induction from leaf explants. Observations were conducted on two  months  after  planting.  Observation  data  were  analyzed  descriptively.  The  results  showed  that callus formation occurred both from stem and leaf explants in all treatment combinations.In the group of  stem  explant,  a  combination  of  3  `ppm  2,4-D  +  2  ppm  kinetin  resulted  in  the  highest  average  of callus size,  wet  weight,  and  dry  weight,  ie  13  (clay models); 1.186  grams;  0.316  grams respectively with a compact texture and light green, brownish dark green.Pada kelompok ekpslan daun, kombinasi 1 ppm NAA + 1 ppm BAP  rata-rata ukuran, berat  basah dan berat  kering kalus tertinggi   berturut- turut  sebesar  17  (skala  clay  models);  1,3921  gram  dan  0,1024  gram  dengan  tekstur  kompak  dan berwarna  hijau  muda.In  the  leaf  explant  group,  a  combination  of  1  ppm  NAA  +  1  ppm  BAP,  the highest average of size, fresh weight and dry weight of callus at 17 (clay models); 1,3921 grams and 0.1024 grams with compact texture and light green color.
Keywords : Chrysanthemum morifolium, calli, NAA, BAP, kinetin

## PENDAHULUAN
Chrysanthemum morifolium atau yang lebih dikenal dengan krisan, merupakan  salah  satu  tanaman  hias  berasal dari  famili  Asteraceae  yang  memiliki banyak  manfaat.  Krisan  sudah  banyak digunakan  sebagai  bahan  obat-obatan tradisional,  termasuk  dijadikan  minuman seperti teh. Menurut Mustakim et al. (2015), bunga  krisan  mengandung  zat  antioksidan
yang bermanfaat bagi detoksifikasi racun di dalam  tubuh  dan  membantu  melancarkan peredaran  darah.  Selain  itu,  krisan  biasa digunakan  untuk  mengobati  flu,  bahan dasar  obat  antibiotik,  dan  meningkatkan sistem penglihatan (Mani and Senthil 2011; Lin & Harnly, 2010).
Sun  et  al.  (2010)  melaporkan  bahwa tanaman C.  morifolium mengandung  12 jenis  flavonoid  dan  58  senyawa  volatil  di
antaranya  quercetin-3-galactoside,  luteolin- 7-glucoside, quercetin-3- glucoside, quercitrin,  myricetin,  luteolin,  apigenin, kaempferol.  Flavonoid  menjadi  perhatian karena  peranannya  bersifat  obat  dalam pencegahan kanker dan penyakit kardiovaskular (Neldawati et al. 2013).
Produksi senyawa aktif dari tumbuhan  dapat  dilakukan  secara in  vitro melalui  kultur  kalus.  Kalus  merupakan massa  sel  yang  tidak  terdeferensiasi,  serta dapat dimanfaatkan sebagai sumber alternatif produksi metabolit sekunder pada tumbuhan (Razavi et al. 2016; Ikeuchi et al. 2013). Menurut Swarna et al. (2016), kultur kalus  sangat  efektif  untuk  memperoleh metabolit  sekunder  dan  menjadi  alternatif untuk  membantu  konservasi  keberadaan tumbuhan di alam.
Salah  satu  faktor  yang  menentukan keberhasilan  dalam  menginduksi  kalus dalam  teknik in  vitro adalah  pemilihan bahan  eksplan.    Eksplan  merupakan potongan  atau  bagian  jaringan  yang diisolasi  dari  tanaman  yang  digunakan untuk  inisiasi  suatu  kultur in  vitro (Hendaryono & Wijayani 1994).
Pembentukan  kalus  pada  eksplan  sangat dipengaruhi  zat  pengatur  tumbuh  (ZPT) yang  ditambahkan  pada  media  terutama ZPT  golongan  auksin  dan  sitokinin.  Salah satu  ZPT  golongan  auksin  yang  sering
digunakan  untuk  menginduksi  kalus  adalah Asam  2,4-Diklorofenoksiasetat  (2,4-D). Jika  dibandingkan  dengan  jenis  auksin lainnya, 2,4-D secara efektif dapat merangsang  pembentukan  kalus  karena aktivitas  yang  kuat  untuk  memacu  proses diferensiasi sel, organogenesis dan menjaga pertumbuhan  kalus  (Rivai  &  Helmanto 2015).
Dalam menginduksi kalus penambahan  auksin  sering  dikombinasikan dengan  sitokinin  di  antaranya  kinetin  dan Benzyl  Amino  Purin  (BAP).  Penambahan auksin atau sitokinin ke dalam media kultur dapat meningkatkan konsentrasi ZPT endogen  di  dalam  sel,  sehingga  menjadi faktor  pemicu  dalam  proses  pertumbuhan dan  perkembangan  jaringan  (Lestari  2011). Kombinasi  antara  auksin  dan  sitokinin dapat  menunjukkan  hasil  morfologi  dan tekstur  kalus  yang  berbeda  setelah  dua minggu  masa  tanam  (Mastuti  et  al.    2017). Pemberian  kombinasi  zat  pengatur  tumbuh (ZPT)  asam  2,4-Diklorofenoksiasetat  (2,4- D)  dan  kinetin  pada  media  MS  berhasil menginduksi pembentukan kalus dari eksplan batang Telfairia occidentalis (Sakpere et al. 2014).
Tujuan dari penelitian adalah mengetahui pengaruh pemberian kombinasi konsentrasi  2,4-D  +  kinetin  dan  NAA  + BAP  terhadap  induksi  kalus  dari  eksplan
batang dan daun planlet krisan ( Chrysanthemum  morifolium Ramat  cv. Yulimar).

## METODE PENELITIAN
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  NAA,  BAP,  kinetin, 2,4-D, agar pemadat, alkohol  70%, alkohol 95%,  aquades,  medium  Murashige  & Skoog,  spirtus,  sukrosa,  planlet  krisan  ( C. morifolium Ramat.) cv. Yulimar.
Penelitian  dilakukan  menggunakan metode  eksperimental  dengan  Rancangan Acak Lengkap (RAL).
a.  Untuk  induksi  kalus  eksplan  batang perlakuan terdiri
dari 10
kombinasikonsentrasi  2,4-D  dan  kinetin meliputi 1 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin; 1 ppm 2,4-D + 1,5 ppm kinetin; 2 ppm 2,4-D +  0,5  ppm  kinetin;  2  ppm  2,4-D  +  1  ppm kinetin;  2  ppm  2,4-D  +  1,5  ppm  kinetin;  2 ppm 2,4-D + 2 ppm kinetin; 3 ppm 2,4-D + 0,5  ppm  kinetin;  3  ppm  2,4-D  +  1  ppm kinetin;  3  ppm  2,4-D  +  1,5  ppm  kinetin;  3 ppm 2,4-D + 2 ppm kinetin.
b.  Untuk  induksi  kalus  eksplan  daun, perlakuan  terdiri  dari  12  kombinasi konsentrasi  NAA  dan  BAP,  yaitu  1  ppm NAA  +  0,5  ppm  BAP  ;  1  ppm  NAA  +  1 ppm BAP ; 1 ppm NAA + 1,5 ppm kinetin; 1 ppm NAA + 2 ppm BAP; 2 ppm NAA +
0,5 ppm BAP ; 2 ppm NAA + 1 ppm BAP ; 2 ppm NAA + 1,5 ppm BAP ; 2 ppm NAA +  2  ppm  BAP  ;  3  ppm  NAA  +  0,5  ppm BAP;  3  ppm  NAA  +  1  ppm  BAP  ;  3  ppm NAA  +  1,5  ppm  BAP  ;  3  ppm  NAA  +  2 ppm BAP.
Pengamatan  dilakukan  setiap  hari untuk  mengetahui  waktu  muncul  kalus pertama  kali,  sedangkan  parameter  tekstur dan  warna  kalus,  ukuran,  berat  basah  dan berat  kering  kalus  diamati  pada  60  hari setelah tanam (HST)

## Tata Kerja Penelitian
Sterilisasi Alat
Peralatan yang akan digunakan disterilkan  menggunakan  autoklaf  pada temperatur  121  °C  dengan  tekanan  17,5  - 20  psi  ( pounds  per  square  inch )  selama  1 jam. Laminar  air  flow disterilisasi  sebelum digunakan  untuk  penanaman  dengan  cara dibersihkan  menggunakan  alkohol  70%, lampu  ultraviolet  (UV)  diaktifkan  selama 60 menit.

## Pembuatan  Larutan  Stok  ZPT  dan  Media Perlakuan
Larutan  stok  ZPT  dibuat  dengan konsentrasi masing-masing 100 ppm, sebelumnya  dilarutkan  terlebih  dahulu dengan beberapa tetes NaOH  untuk auksin dan HCl untuk golongan sitokinin. Penambahan  aquades  steril  pada  larutan
stok  ZPT  disesuaikan  dengan  konsentrasi yang akan dibuat.
Pembuatan media perlakuan dilakukan  dengan  cara  menimbang  media MS  sebanyak  4,43  g/L,  30  g/L  sukrosa,  7 g/L  bubuk  agar  dan  dimasukkan  ke  dalam gelas  kimia  yang  telah  berisi  akuades. Selanjutnya ditambahkan ZPT sesuai konsentrasi yang telah ditentukan.
Banyaknya bahan-bahan yang ditambahkan disesuaikan  dengan  volume  medium  yang akan  dibuat.  Media  dihomogenkan  dan  pH media diukur dengan pH meter hingga 5,6 - 5,8.  Media  dipanaskan  hingga  mendidih dan  dimasukkan  ke  setiap  botol  kultur sebanyak  ±  15  ml  lalu  disterilisasi  dengan autoklaf pada suhu 121 °C selama 20 menit pada tekanan 17,5 psi.

## Penanaman Eksplan dan Pengamatan
Eksplan  batang  planlet  dipotong dengan  ukuran  1  cm,  sedangkan  eksplan daun  0,5  cm 2 lalu  ditanam  dalam  media perlakuan.  Kultur  diinkubasi  dengan  suhu 18 o C-27 o C  dan  intensitas  cahaya  600-1000 lux. Pengamatan  dilakukan  setiap  hari untuk  mengetahui  waktu  muncul  kalus  dan pada  60  HST  dilakukan  pengamatan terhadap  tekstur  dan  warna  kalus,  ukuran kalus, berat basah, dan berat kering. Ukuran kalus  diukur  menggunakan  skala clay models . Data dianalisis secara deskriptif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Morfologi  Kalus  (Tekstur,  Warna,  dan Respon Lain)
Pengamatan  morfologi  kalus  yang terbentuk  dapat  dilihat pada Tabel  1 dan 2, Gambar  1  dan  2.  Kalus  terbentuk  ditandai dengan  pembengkakan  jaringan  (elongasi) pada  hari  ke  -  3  yang  diikuti  dengan terbentuknya  bulir-bulir  kecil  berwarna bening pada luka bekas irisan eksplan. Pada eksplan  batang  terjadi  di  kedua  ujung batang  atau  salah  satunya,  sedangkan  pada eksplan  daun  terjadi  pada  permukaan  daun yang  dilukai.  Hariyati  et  al.  (2016) menuturkan  bahwa  pertumbuhan  kalus ditandai  dengan  adanya  pembengkakan berwarna  kuning  keputihan/  bening  di sekitar  luka  irisan  eksplan  dan  akhirnya menutupi  seluruh  permukaan.  Menurut Hendaryono & Wijayani (1994), terbentuknya  massa  sel  atau  kalus  pada seluruh  permukaan  irisan  eksplan  ditandai sebagai  respon  terhadap  hormon  bbaik secara  eksogen  maupun  endogen.  Tekstur dan  warna  kalus  yang  berasal  dari  eksplan batang  planlet  krisan  dapat  dilihat  pada Tabel 1 dan Gambar 1.
Pada Tabel  1 terlihat bahwa sebagian besar  kalus  yang  terbentuk  dari  eksplan batang  memiliki  tekstur  kompak  dan  pada beberapa  perlakuan  bertekstur  kombinasi kompak  dan  remah.  Demikian  juga  kalus
asal  eskplan  daun    memiliki  tekstur  kalus yang  bervariasi,  namun  secara  umum bertekstur  kompak  (Tabel  2).Tekstur  kalus dapat dibedakan menjadi tiga macam, yaitu kompak,  remah,  dan  campuran  keduanya. Kalus  remah  memiliki  struktur  sel-selnya renggang  dan  mudah  rapuh  sedangkan kalus  bertekstur  kompak  memiliki  ciri-ciri susunan  sel  yang  rapat  dan  membentuk tonjolan  padat  (Santoso  &  Nursandi  2003). Menurut Mahadi  et al. (2016) tekstur kalus
yang  remah  mengalami  pembelahan  sel yang  cepat  daripada  tekstur  kalus  yang kompak.
Dominansi  tekstur  kompak  pada penelitian  ini  dapat  disebabkan  oleh  efek pemberian  sitokinin  pada  media  kultur. Sesuai dengan pernyataan Purwianingsih  et al.  (2007)  bahwa  tekstur  kalus  kompak merupakan  efek  dari  sitokinin  yang berperan dalam transport zat hara.
Tabel 1. Tekstur dan warna kalus, serta respon lain eksplan batang krisan
( C. morifolium Ramat cv. Yulimar) No  Perlakuan Tekstur Kalus Warna Kalus Respon lain 1 1 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin Kompak & Remah Hijau muda- hijau tua - 2 1 ppm 2,4-D + 1,5 ppm kinetin Kompak Hijau muda Tumbuh  akar 3 2 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin Kompak Hijau muda- hijau tua Tumbuh akar dan tunas 4 2 ppm 2,4-D + 1 ppm kinetin Kompak Hijau tua Tumbuh akar 5 2 ppm 2,4-D + 1,5 ppm kinetin Kompak Hijau muda- hijau tua - 6 2 ppm 2,4-D + 2 ppm kinetin Kompak Hijau tua Tumbuh akar dan daun 7 3 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin Kompak Hijau muda Tumbuh akar 8 3 ppm 2,4-D + 1 ppm kinetin Kompak Hijau muda- hijau tua Tumbuh akar dan tunas 9 3 ppm 2,4-D + 1,5 ppm kinetin Kompak &
Remah Hijau muda- hijau tua Tumbuh akar 10 3 ppm 2,4-D + 2  ppm kinetin Kompak Hijau tua kecoklatan Tumbuh akar dan tunas
1 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin (a) 1 ppm 2,4-D + 1,5 ppm kinetin (b) 2 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin (c) 2 ppm 2,4-D + 1 ppm kinetin (d) 2 ppm 2,4-D + 1,5 ppm kinetin (e) 2 ppm 2,4-D + 2 ppm kinetin (f) 3 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin (g) 3 ppm 2,4-D + 1 ppm kinetin (h) 3 ppm 2,4-D + 1,5 ppm kinetin (i) 3 ppm 2,4-D + 2 ppm kinetin (j)
Gambar  1.  Morfologi  kalus  asal  eksplan  batang  planlet  krisan  ( C.  morifolium Ramat cv. Yulimar)
Tabel 2. Tekstur dan warna kalus, serta respon lain eksplan daun krisan
( C. morifolium Ramat cv. Yulimar)
No  Perlakuan Tekstur Kalus Warna Kalus Respon lain 1 1 ppm NAA + 0,5 ppm BAP Kompak hijau kecoklatan akar 2 2 ppm NAA + 0,5 ppm BAP Remah
hijau kecoklatan Akar dan tunas 3 3 ppm NAA + 0,5 ppm BAP Remah hijau bening Akar dan tunas 4 1 ppm NAA + 1 ppm BAP Kompak Hijau muda Tunas 5 2 ppm NAA + 1 ppm BAP Remah Hijau Muda Tunas
6 3 ppm NAA + 1 ppm BAP Kompak Hijau kecoklatan Tunas 7 1 ppm NAA + 1,5 ppm BAP Kompak Hijau muda Tunas 8 2 ppm NAA + 1,5 ppm BAP Remah Hijau muda Tunas 9 3 ppm NAA + 1,5 ppm BAP Remah Hijau muda Tunas 10 1 ppm NAA + 2 ppm BAP Kompak Hijau tua Tunas 11 2 ppm NAA + 2 ppm BAP Remah Hijau muda Tunas 12 3 ppm NAA + 2 ppm BAP Kompak Hijau tua kecoklatan Tunas 1 ppm NAA + 0,5 ppm BAP (a) 2 ppm NAA + 0,5 ppm BAP (b) 3 ppm NAA + 0,5 ppm BAP (c) 1 ppm NAA + 1 ppm BAP (d) 2 ppm NAA + 1 ppm BAP (e) 3 ppm NAA + 1 ppm BAP (f) 1 ppm NAA + 1,5 ppm BAP (g) 2 ppm NAA + 1,5 ppm BAP (h) 3 ppm NAA  + 1,5 ppm BAP (i) 1 ppm NAA + 2 ppm BAP (j) 2 ppm NAA + 2 ppm BAP (k) 3 pmm NAA + 2 ppm BAP (l)
Gambar 2. Morfologi kalus asal eksplan daun planlet krisan ( C. morifolium Ramat cv. Yulimar)
Sitokinin  berperan  dalam  transport  air  dan zat  hara  melalui  pembuluh  angkut  dan mempengaruhi potensial osmotik sel.
Sukrosa  yang  terkandung  dalam  media kultur  akan  menimbulkan  tekanan  turgor. Tekanan  tersebut  muncul  akibat  adanya perbedaan  konsentrasi  larutan,  sehingga  air dan  zat  hara  dari  media  akan  masuk  ke dalam sel melalui osmosis dan menyebabkan  dinding-dinding  sel  menjadi kaku, dan membuat kalus menjadi kompak. Demikian  pula  menurut  Mahadi  et  al. (2016)  bahwa  tekstur  kompak  disebabkan kalus mengalami lignifikasi sehingga mempunyai  tekstur  yang  keras.  Dwi  et  al. (2012)  menyatakan  bahwa  tekstur  kompak merupakan  efek  dari  sitokinin  dan  auksin yang mempengaruhi potensial air dalam sel. Hal  ini  menyebabkan  penyerapan  air  dari medium  ke  dalam  sel  meningkat,  sehingga sel  menjadi  lebih  kaku.  Pada  beberapa kombinasi  perlakuan  menunjukkan  bahwa kalus asal daun bertekstur remah (Tabel 2). Tekstur  kalus  yang  remah  dianggap  baik karena  memudahkan  dalam  pemisahan menjadi sel-sel tunggal pada kultur suspensi, di samping itu akan meningkatkan aerasi oksigen antar sel (Rosmaina 2015).
Pemberian berbagai
kombinasi konsentrasi
2,4-D
dan kinetin
mengakibatkan  warna  yang  berbeda-beda pada  kalus  eksplan  batang    (Tabel    1  dan
Gambar  1)  dan  eskplan  daun  (Tabel  2  dan Gambar 2).
Sebagian  besar  kalus  asal  eksplan batang  pada  awalnya  berwarna  hijau  muda dan  pada  akhir  pengamatan  berubah menjadi  lebih  gelap  (hijau  tua).  Sesuai dengan pernyataan Roy et al. (2008), bahwa pemberian  kombinasi  2,4-D  dan  kinetin pada  kalus  batang Gymnema  sylvestris menghasilkan  warna  kalus  hijau  muda hingga hijau tua. Begitu pula dengan warna kalus  asal  eksplan  daun  sebagian  besar berwarna  hijau.  Warna  hijau  pada  kalus mengidentifikasi  kandungan  klorofil  dalam jaringan,  semakin  banyak  klorofil  pada tanaman.
Pada  beberapa  perlakuan,  kalus  yang terbentuk berwarna hijau kecoklatan (Tabel 1  dan  2;  Gambar  1  dan  2).  Warna kecoklatan ini dapat terjadi karena beberapa faktor,  seperti  adanya  proses  metabolisme senyawa  fenol  yang  berlebih  (Dwi  et  al. 2012)  atau  proses  perubahan  adaptif tanaman  terhadap  pengaruh  fisik  (Rohmah 2007).  Senyawa  fenol  yang  terbentuk  pada kalus  dalam  penelitian  ini  merupakan bentuk respon eksplan terhadap luka karena pengirisan.    Jika  fenol  yang  terbentuk mengalami oksidasi maka dapat menyebabkan  warna  coklat  pada  kalus. Purnamaningsih & Ashrina (2011) menyatakan bahwa perubahan kalus
menjadi  coklat  menunjukkan  pertumbuhan dan  perkembangan  kalus  memasuki  fase stasioner  (penuaan)  yang  selanjutnya  kalus menjadi mati.
Respon  eksplan  terhadap  ZPT  selain membentuk kalus, pada beberapa kombinasi  perlakuan  muncul  akar,  tunas, dan daun (Tabel 1 dan 2; Gambar 1 dan 2). Menurut  George  &  Sherrington  (1984), penambahan konsentrasi auksin dan sitokinin dalam perbandingan tertentu dapat memacu pertumbuhan eksplan beregenerasi membentuk  organ.  Banyaknya  akar  yang tumbuh  pada  kalus  asal  eksplan  batang pada kombinasi konsentrasi 3 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin dapat disebabkan
perbandingan  konsentrasi  2,4-D  yang  lebih tinggi daripada konsentrasi kinetin (Gambar 4h).  Hendaryono  &  Wijayani  (1994) menuturkan apabila auksin yang ditambahkan  dosisnya  lebih  tinggi,  maka akan memacu pembentukan akar, sedangkan jika kadar sitokinin  lebih tinggi, maka akan memacu pembentukan tunas.

## Ukuran,  berat  basah  dan  berat  kering kalus
Pengamatan  terhadap  ukuran,  berat basah  dan  berat  kering  kalus  asal  eksplan batang dan daun planlet krisan dapat dilihat pada Tabel 3 dan 4.
Tabel 3. Ukuran, berat basah dan berat kering kalus asal eksplan batang krisan ( C. morifolium Ramat cv. Yulimar) No Kombinasi Kinetin dan 2,4-D Ukuran (skala clay models) Berat Basah (g) Berat Kering (g) 1 1 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin 10 0,375 0,032 2 1 ppm 2,4-D + 1,5 ppm kinetin 10 0,407 0,032 3 2 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin 11 0,836 0,061 4 2 ppm 2,4-D + 1 ppm kinetin 10 0,356 0,030 5 2 ppm 2,4-D + 1,5 ppm kinetin 12 0,401 0,031 6 2 ppm 2,4-D + 2 ppm kinetin 12 0,493 0,039 7 3 ppm 2,4-D + 0,5 ppm kinetin 12 0,481 0,035 8 3 ppm 2,4-D + 1 ppm kinetin 10 0,245 0,026 9 3 ppm 2,4-D + 1,5 ppm kinetin 11 0,596 0,059 10 3 ppm 2,4-D + 2  ppm kinetin 13 1,186 0,316
Tabel 4.Ukuran, berat basah dan berat kering kalus asal eksplan daun krisan
( C. morifolium Ramat cv. Yulimar) No Kombinasi Kinetin dan 2,4-D Ukuran (skala clay models) Berat Basah (g) Berat Kering (g) 1 1 ppm NAA + 0,5 ppm BAP 9 0,3143 0,0293 2 2 ppm NAA + 0,5 ppm BAP 12 1,2472 0,0865 3 3 ppm NAA + 0,5 ppm BAP 13 0,9778 0,0632 4 1 ppm NAA + 1 ppm BAP 17 1,3921 0,1024 5 2 ppm NAA + 1 ppm BAP 11 0,8583 0,0662 6 3 ppm NAA + 1 ppm BAP 13 1,0985 0,0613 7 1 ppm NAA + 1,5 ppm BAP 14 1,5621 0,1906 8 2 ppm NAA + 1,5 ppm BAP 5 0,399 0,0378 9 3 ppm NAA + 1,5 ppm BAP 8 0,4213 0,0861 10 1 ppm NAA + 2 ppm BAP 12 1,4831 0,0471 11 2 ppm NAA + 2 ppm BAP 6 0,3495 0,0347 12 3 ppm NAA + 2 ppm BAP 15 1,5318 0,1047
Pertumbuhan  kalus  dalam  penelitian ini  ditentukan  dengan  mengukur  ukuran, berat  basah  dan  berat  kering  kalus. Pertumbuhan kalus asal eksplan batang dan daun    krisan  yang  terbaik  berturut-turut terdapat  pada  perlakuan  3  ppm  2,4-D  +  2 ppm  kinetin  dan  1  ppm  NAA  +  1  ppm BAP.   Hal  ini  ditunjukkan dengan rata-rata ukuran  kalus,  berat  basah  dan  berat  kering kalus  tertinggi  yang  terjadi  pada  kedua kombinasi  tersebut.    Tabel  3  menunjukkan bahwa  pada  kombinasi  3  ppm  2,4-D  +  2 ppm,  kalus  dari  eksplan  batang  memiliki ukuran,  berat  basah  dan  berat  kering tertinggi  berturut-turut  sebesar  13  (skala clay  models );  1,186  gram  dan  0,316  gram.
Rata-rata  ukuran,  berat  basah  dan  berat
kering  kalus  tertinggi  asal  eksplan  daun yang terdapat  pada kombinasi  1 ppm  NAA +  1  ppm  BAP  berturut-turut  sebesar  17 (skala clay  models );  1,3921  gram  dan 0,1024 gram (Tabel 4).
Berat  basah  secara  fisiologis  terdiri dari  dua  kandungan  materi  yaitu  air  dan karbohidrat.  Berat  basah  kalus  yang  besar disebabkan  oleh  kandungan  airnya  yang tinggi.  Berat  basah  yang  dihasilkan  sangat tergantung  pada  kecepatan  sel-sel  tersebut membelah  diri,  memperbanyak  diri  dan dilanjutkan  dengan  membesarnya  kalus (Andaryani  2010).  Pertumbuhan  kalus dipengaruhi  oleh  perimbangan  ZPT  auksin dan  sitokinin  yang  ditambahkan  dalam media  serta  interaksinya  dengan  ZPT
endogen  yang  dihasilkan  secara  alami  oleh jaringan  eksplan.  George  &  Sherington (1984)  menyatakan  bahwa  auksin  dan sitokinin  adalah  dua  senyawa  penting  yang dapat  mempengaruhi  pertumbuhan  dan morfogenesis kultur sel, jaringan, dan organ tanaman. Interaksi perimbangan antara ZPT yang  diberikan  dalam  media  dan  yang diproduksi  sel  secara  endogen  menentukan arah  perkembangan  suatu  kultur.  Menurut Rahayu  (2003),  proses  pembentukan  kalus tidak terlepas dari pembelahan, pembesaran,  dan  perpanjangan  sel.  Auksin berperan dalam pembentukan kalus tersebut, sehingga auksin dapat meningkatkan  permeabilitas  dinding  sel, sehingga  air,  ion-ion  organik  dan  molekul- molekul  anorganik  masuk  ke  dalam  sel. Hal  ini  ditunjukkan  dengan  terjadinya pertambahan ukuran dan berat kering kalus yang  tidak  dapat  balik.  Pertumbuhan berkaitan  dengan  pertambahan  volume  dan jumlah sel, pembentukan protoplasma baru, pertambahan berat dan selanjutnya meningkatkan berat keringnya.
Kombinasi  2,4-D + kinetin  dan NAA + BAP yang digunakan untuk  menginduksi kalus dalam penelitian ini dengan perbandingan yang tepat dapat mempengaruhi  cepatnya  pertumbuhan  sel kalus  dan  pertambahan  massa  kalus.  Hasil serupa  dilaporkan  Karimian et  al. (2014)
bahwa  kombinasi  antara  2,4-D  dan  kinetin efektif dalam meningkatkan berat basah dan berat  kering  pada  kalus  batang Taxus brevifolia . Pemberian kinetin tunggal dengan  konsentrasi  yang  cukup  banyak memiliki efek hambatan pada pertumbuhan kalus  dan  berat  basah  kalus,  sedangkan penambahan  2,4-D  memiliki  efek  stimulasi linear pada penambahan massa kalus.

## KESIMPULAN
Pembentukan  kalus  yang  diinduksi dari eskplan batang dan daun planlet krisan terjadi  pada  seluruh  perlakuan  kombinasi 2,4-D + kinetin dan NAA + BAP. Sebagian besar kalus yang terbentuk memiliki tekstur kompak  dengan  warna  kehijauan.  Ukuran kalus,  berat  basah  dan  berat  kalus  tertinggi yang  diinduksi  dari  eksplan  batang  dan daun  krisan  berturut-turut  terdapat  pada kombinasi  3  ppm  2,4-D  +  2  ppm  kinetin dan  1  ppm  NAA  +  1  ppm  BAP.  Hasil penelitian  diharapkan  dapat  memberikan informasi dan rujukan dasar untuk menginduksi  kalus  krisan  yang  bermanfaat sebagai  sumber  metabolit  sekunder  dan bahan  perbanyakan  tanaman  krisan  secara in vitro .

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian  ini  terselenggara  atas  dana Hibah  Internal  Universitas  Padjadjaran Skema  Riset  Fundamental  Unpad.  Ucapan terimakasih  disampaikan  kepada  Rektor Universitas  Padjadjaran  dan  Departemen Biologi FMIPA Unpad.

## DAFTAR PUSTAKA
Andaryani  S.  2010.  Kajian  penggunaan berbagai  konsentrasi  BAP  dan  2,4-D terhadap  induksi  kalus  Jarak  Pagar (Jatropha  curcas  L.). Skripsi .  Fakultas
Pertanian.  Universitas  Sebelas  Maret Surakarta.
Dwi,  N.M.,  Waenati,  Muslimin  &  I.N.
Suwastika. 2012. Pengaruh penambahan  air  kelapa  dan  berbagai konsentrasi hormon 2,4-D pada medium  MS  dalam  menginduksi  kalus tanaman anggur hijau (Vitis vinifera L.)
Jurnal Natural Science 1(1): 53-62.
George,  E.F.,  &  T.D.  Sherrington.  1984.
Plant  Propagation  by  Tissue  Culture .
Handbook and Directionary of
Commercial Laboratories. England.
Hariyati,  M.,  I.  Bachtiar,  &  P.  Sedijani.
2016.  Induksi  kalus  tanaman  krisan (Chrysanthemum  morifolium) dengan pemberian  benzil  amino  purin  (BAP) dan Dichlorofenoksi acetil acid (2,4-D). Jurnal Penelitian Pendidikan IPA 2 (1).
Hendaryono  D.P.S.,  &  A.  Wijayani.  1994.
Teknik  Kultur  Jaringan:  Pengenalan dan  Petunjuk  Perbanyakan  Tanaman Secara Vegetatif Moder n. Yogyakarta : Kanisius.
Ikeuchi,  M.,  K.  Sugimoto,  &  A.  Iwase.
2013.  Plant  callus:  Mechanism  of induction  and  repression. The  Plant Cell 25: 3159-3173
Karimian, R., M. Lahouti, & S.J.
Davarpanah.  2014.  Effects  of  different concentrations  of  2,  4-D  and  bTaxus Brevifolia  Nutt . Journal  of  Applied Biotechnology Reports 1(4):167-170.
Lestari,  E.G.  2011.  Peranan  zat  pengatur tumbuh  dalam  perbanyakan  tanaman melalui kultur jaringan . Jurnal AgroBiogen 7 (1): 63-68.
Lin, L.Z., & J.M. Harnly. 2010.
Identification of the phenolic components  of  chrysanthemum  flower (Chrysanthemum  morifolium  Ramat). Food Chemistry 120: 319–326.
Mahadi,  I.,  I.W.  Syafi’,  &  Y.  Sari.  2016. Induksi  kalus  jeruk  kasturi  ( Citrus microcarpa )  jenggunakan  hormon  2,4- D  dan  BAP  dengan  metode  in  vitro . Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia (JIPI) 21 (2): 84-89.
Mani, T., & K. Senthil. 2011. Multiplication of Chrysanthemum through  somatic  embryogenesis .  Asian
Journal Pharma Technology 1 (1) :13- 16.
Mustakim, B., F. Wahidah, & A. Al-Fauzy.
2015. Pengaruh penambahan air kelapa terhadap  pertumbuhan  stek  mikro tanaman krisan (Chrysanthemum indicum) secara  in  vitro .  Prosiding Seminar Nasional Mikrobiologi Kesehatan dan Lingkungan .
Neldawati, Ratnawulan, dan Gusnedi. 2013.
Analisis nilai absorbansi dalam penentuan kadar flavonoid untuk berbagai  jenis  daun  tanaman  obat .
Pillar of Physics 2: 76-83.
Purnamaningsih  R.,  &  M.  Ashrina.  2011.
The effect  of  BAP  and  NAA on callus inductionand artemisinin content ofArtemisia  annual. Berita  Biologi
10(4).
Purwaningsih,  W.,  S.  Febri,  &  Kusdianti. 2016.  Formation  flavonoid  secondary metabolites  in  callus  culture  of Chrysanthemum cinerariefolium as
alternative provision medicine.
Proceedings  of  International  Seminar on Mathematics, Science, and Computer Science Education (MSCEIS 2015) .
Rahayu,  W.P.  2003. Klasifikasi  Bahan
Pangan  dan  Resiko  Keamanannya . Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Utama.
Razavi,  S.M.,  H.  Arshneshin,  &  A. Ghasemian.  2016.  In  vitro  callus induction  and  isolation  of  volatile compounds in callus culture Lallemantia iberica ( M. Beib. ) Fisch. &
C.A. Mey .  Journal  of  Plant  Process and Function 5(18).
Rivai,  R.R.  &  H.  Helmanto.  2015.  Induksi kalus  Crhysanthemum  indicum  untuk meningkatkan  keragaman  genetic  dari sel  somatic. PROS  SEM  NAS  MASY BIODIV INDON 1(1): 167-170.
Rohmah,  S.N.  2007.  Penggunaan  BAP  dan 2,4-D  dalam  Kultur  In  Vitro  Iles-iles (Amorphophallus muelleri Blume).
Tugas Akhir .  Bogor : ITP
Rosmaina,  Z.,  P.  Sutejo,  Ulfiatun,  & Maisupratina.  2015.  Induksi  kalus pasak bumi (Eurycoma longifolia Jack) melalui  eksplan  daun  dan  petiol. J. Agroteknologi 6(1): 33-40.
Roy,  A.,  S.  Ghosh,  M.  Chaudhuri,  &  P.K.
Saha.  2008.  Effect  of  different  plant hormones  on  callus  induction  in Gymnema sylvestris R.Br. ( Asclepiadaceae ).  African  Journal  of Biotechnology 7(13):  2209-2211.
Sakpere,  A.M.A.,  S.A.  Ajayi,  &  A.A.
Adelusi. 2014. Effect growth regulators and explant types on callus induction in Telfairi  occidentalis  Hook  F. Afr.  J. Biothecnol 13(20): 2015 – 2021.
Santoso,  U.,  &  F.  Nursandi.  2003. Kultur
Jaringan  Tanaman .  Malang:  Pusbitan
UMM.
Sari,  I.A.,  Sukarsa  &  S.  Samiyarsih.  2016.
Analisis fenetik kultivar krisan
( Chrysanthemum  morifolium Ramat).
Biosfera 33(2): 52-59.
Sun, Q.L., S. Hua, S., Ye, J.H., Zheng, X.Q.,
&  Liang,  Y.R.  2010.  Flavonoids  and
volatiles in Chrysanthemum morifolium
Ramat  flower  from  Tongxiang  County in China . African Journal of Biotechnology 9(25):3817-3821.
Swarna,  S.J.,  Y.  Dilruba,  Md.  Mostafizur, & A. Firoz. 2016. Callus induction and indirect organogenesis in
Chrysanthemum morifolium Ramat. Int.
J. Biosci 9(3): 139-149.