p- ISSN 2354-6565 / e- ISSN 2502-3438

## PRESISI UJI ANTIHIPERURISEMIA IN VITRO BERDASARKAN PENGUKURAN SERAPAN PADA DUA PANJANG GELOMBANG
Liliek Nurhidayati, Dian Ratih Laksmitawati, Riska Eka Putri Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila, Srengseng Sawah, Jagakarsa, Jakarta Selatan Corresponding author email: liliek_nurhidayati@yahoo.com

## ABSTRAK
Metode  yang  digunakan  dalam  skrining  obat  antihiperurisemia in  vitro berdasarkan  pada kemampuan suatu bahan  menghambat  enzim xantin  oksidase  dalam  mengubah substrat xantin menjadi  asam  urat.  Para  peneliti  mengukur  aktivitas  antihiperurisemia  berdasarkan  asam  urat yang terbentuk atau xantin yang tersisa. Untuk  mengetahui presisi kedua pengukuran tersebut, telah  dilakukan  pengujian  aktivitas  antihiperurisemia  alopurinol  berdasarkan  pengukuran serapan  pada  panjang  gelombang  291  nm  dan  268  nm.  Pada  kondisi  optimum  diperoleh simpangan  baku  relatif  persen  penghambatan  berdasarkan  jumlah  asam  urat  yang  terbentuk 0,24-1,30%, sedangkan berdasarkan sisa xantin adalah 0,25-2,39%.
Kata kunci :  pengambatan, xantin oksidase, in vitro , alopurinol, presisi

## ABSTRACT
The  method  used  in  in  vitro  antihiperurisemia  drug  screening  based  on  the  ability  of  a substance  to inhibit the xanthine oxidase enzyme in converting the substrate xanthine to uric acid. The researchers measured the hyperuricemia treatment activity based on the formation of uric  acid  or  the  remaining  xanthine.  To  determine  the  precision  of  the  measurements, antihiperurisemia  activity  of  allopurinol  was  conducted  by  measuring  absorption  at  a wavelength of 291 nm and 268 nm. At the optimum conditions, the  relative standard deviation of percent inhibition based on the amount of uric acid was 0.24 to 1.30%, while based on the rest of the xanthine was 0.257 to 2.39%.
Keywords : inhibition, xanthine oxidase, in vitro, allopurinol, precision

## PENDAHULUAN
Prevalensi penyakit hiperurisemia semakin meningkat  dari  tahun  ke  tahun.  Penyakit  ini memang tidak menyebabkan kematian namun dapat  menurunkan  produktivitas  kerja  akibat penderitanya  tidak  dapat  beraktivitas  secara maksimal.  Prinsip  pengobatan  arthritis  gout adalah  menghilangkan  gejala  inflamasi  dan mengurangi  kekambuhan.  Karena  penyebab utamanya adalah kadar asam urat yang tinggi di  dalam  darah  maka  untuk  mengurangi kekambuhan diperlukan urate lowering agent . Alopurinol merupakan satu-satunya obat yang bersifat urikostatik yaitu menghambat terbentuknya  asam  urat  dengan  jalan menghambat  aktivitas  enzim  xantin  oksidase (XO) (Gunawan, 2007).
Ketersediaan
alopurinol masih bergantung  pada  pasokan  impor  sehingga
diperlukan  bahan  obat  alternatif  yang  bekerja sebagai  penghambat  asam  urat.  Untuk melakukan pencarian obat tersebut diperlukan serangkaian penelitian baik in vitro maupun in vivo .  Secara in  vitro ,  metode  yang  banyak digunakan  adalah  metode  penghambatan xantin oksidase. Xantin oksidase adalah enzim yang  terdapat  di  semua  sel  terutama  di  hati. Metode  penetapan  aktivitas  enzim  ini dilakukan dengan penambahan substrat xantin sehingga  terbentuk  asam  urat.  Penetapan aktivitas  enzim  xantin  oksidase  dapat dilakukan  dengan  cara  langsung  mengukur produk  ataupun  secara  tidak  langsung  yaitu dengan  mengukur  sisa  substrat.  Dengan menggunakan  prinsip  penentuan  aktivitas xantin  oksidase  maka  dapat  pula  ditentukan persentase  penghambatan  aktivitas  xantin oksidase  yang  ada  dalam  bahan  yang  akan diteliti sebagai urikostatik. Beberapa
penelitian  menggunakan  cara  langsung (Umamaheswari,  2009  dan  Saputra,  2012) namun beberapa penelitian lain menggunakan cara  tidak  langsung  (Yulianto,  2009; Iswantini,  2012  dan  Santi  2014).  Oleh  sebab itu  ingin  dibandingkan  presisi  metode langsung  dengan  mengukur  serapan  pada panjang  gelombang  serapan  maksimum  asam urat  dan  tidak  langsung  dengan  mengukur serapan  pada  panjang  gelombang  serapan maksimum xantin.

## METODE
Bahan  dan  Alat. Bahan  penelitian  yang digunakan  adalah  xantin  oksidase  bentuk suspensi  dalam  ammonium  sulfat  (Sigma), xantin (Sigma), asam urat (Merck), dan bahan kimia  lain  dengan  kualitas  proanalisis. Pengukuran  serapan  dilakukan  menggunakan spektrofotometer Shimadzu UV 1800).
Penentuan  panjang  gelombang  serapan maksimum. Dibuat  spektrum  serapan  xantin dan asam urat dalam  dapar fosfat 50 mM pH 7,5  dengan  penambahan  HCl  I  N  pada panjang  gelombang  200-300  nm.  Masing- masing  dikerjakan pada tiga konsentrasi yang berbeda.
Penentuan  kondisi  optimum  reaksi enzimatis. Pemilihan  kondisi  optimum dilakukan  melalui  reaksi  enzimatis  dengan variasi  konsentrasi  xantin  (0,1  mM,  0,2  mM dan  0,3  mM),  konsentrasi  enzim  (0,1  U/mL, 0,2 U/mL dan 0,3 U/mL), waktu inkubasi (30 dan 45 menit), dan suhu (25 o C dan 37 o C) Pengujian metode penetapan penghambatan aktivitas XO secara langsung dan tidak langsung. Digunakan zat penghambat  xantin  oksidase  yaitu  alopurinol 0,5 mL dengan konsentrasi 0,1; 0,25; 0,5; 1,0, 2,0,  dan  5,0  ppm  dan  ditambah  larutan  dapar fosfat  50  mM  pH  7,5  sebanyak  1,45  mL. Campuran  kemudian  ditambah  1  mL  larutan substrat xantin 0,3 mM dalam dapar fosfat pH 7,5. Setelah  dilakukan  prainkubasi  pada  suhu 25ºC selama 15  menit, reaksi  dimulai  dengan penambahan  xantin  oksidase  0,3  U/mL sebanyak  0,05  mL  lalu diinkubasi  pada  suhu 25ºC  selama  45  menit.  Setelah  diinkubasi, campuran  segera  ditambahkan  HCl  1  N sebanyak  0,5  mL  untuk  menghentikan reaksinya.  Sisa  substrat  xantin  dan  asam  urat yang terbentuk diukur serapannya
menggunakan  spektrofotometer  UV  pada panjang  gelombang  maksimum.  Dilakukan juga  pengujian  terhadap  blangko  dan  kontrol blangko.  Blangko  yang  dimaksud  dalam penelitian ini adalah substrat xantin dan enzim xantin  oksidase  tanpa  penambahan  inhibitor enzim. Kontrol blangko yang dimaksud dalam penelitian  ini  adalah  substrat  xantin  tanpa penambahan  enzim  xantin  oksidase  dan inhibitor  enzim.  Konsentrasi  xantin  yang tersisa  dan  asam  urat  yang  terbentuk ditentukan  menggunakan  kurva  baku.  Setiap konsentrasi alopurinol dikerjakan lima kali.
Aktivitas  xantin  oksidase  dihitung  dengan persamaan berikut: aktivitas XO= xantin yang bereaksi (mM)
volume enzim (L) x waktu inkubasi (menit)
atau aktivitas XO=
asam urat yang terbentuk (mM) volume enzim (L) x waktu inkubasi (menit)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Asam urat merupakan hasil oksidasi xantin oleh  enzim  xantin  oksidase.  Aktivitas  enzim bisa  dihitung  berdasarkan  jumlah  asam  urat yang terbentuk (langsung) maupun berdasarkan  sisa  substrat  xantin  (tidak langsung).
Dari  spektrum  serapan  ditemukan  bahwa panjang gelombang serapan maksimum untuk asam urat dan xantin berturut-turut adalah 291 nm  dan  268  nm.  Menurut  Umamaheswari (2009),  asam  urat  memiliki  panjang gelombang  maksimum  290  nm  sedangkan menurut  Saputra  (2012)  281,5  nm.  Panjang gelombang serapan maksimum yang diperoleh dari penelitian ini sama dengan Umamaheswari  (2009).  Panjang  gelombang serapan  maksimum  xantin  yang  diperoleh berbeda  dengan  hasil  penelitian  sebelumnya yakni  265  nm  (Santi,  2014),  264  nm (Yulianto,  2012).  Untuk  mengetahui  ada tidaknya  pengaruh  serapan  satu  sama  lain dibuat spektrum serapan xantin dan asam urat yang  ditumpangtindihkan  yang  hasilnya disajikan pada Gambar 1.
x100% blangko XO aktivitas uji) zat XO aktivitas blangko XO (aktivitas inhibisi persen  
Gambar  1. Spektrum  serapan  asam  urat  dalam dapar fosfat pH 7,5 (a) dan xantin (b) yang ditumpang tindihkan.
Spektrum  serapan  xantin  tunggal  dengan konsentrasi  yang  berbeda-beda  menunjukkan maksimum  pada  panjang  gelombang  yang sama  yakni  268  nm,  begitu  pula  asam  urat dengan panjang gelombang serapan maksimum  291  nm.  Gambar  1  menunjukkan bahwa  pada  panjang  gelombang  serapan maksimum  xantin,  yakni  268  nm,  asam  urat juga  memberikan  serapan.  Ada  kemungkinan pada  pengujian  aktivitas  antihiperurisemia serapan  pada  268  nm  bukan  hanya  serapan dari  xantin  tetapi  juga  ada  tambahan  serapan dari  asam  urat  produk  reaksi  enzimatis.  Pada panjang  gelombang  serapan  maksimum  asam urat  yakni  291  nm,  gangguan  serapan  dari xantin relatif sedikit.
Untuk  membandingkan  presisi  penentuan aktivitas  penghambatan  xantin  oksidase berdasarkan pengukuran serapan pada panjang gelombang  268  nm  dan  291  nm,  dilakukan penentuan  aktivitas  penghambatan  xantin oksidase  menggunakan  alopurinol  enam konsentrasi.  Setiap  konsentrasi  dikerjakan lima  kali.  Pengujian  dilakukan  pada  kondisi optimum  yakni  menggunakan  xantin  dengan konsentrasi  0,3  mM,  konsentrasi    enzim  0,3 U/mL,  suhu  inkubasi  25 o C  selama  45  menit. Aktivitas  enzim  yang  dihitung  berdasarkan jumlah  asam  urat  yang  terbentuk  ditentukan pada panjang gelombang 291 nm. Jumlah mol asam  urat  akan  sama  dengan  xantin  yang bereaksi,  sehingga  bila  berdasarkan  jumlah mol  xantin  yang  bereaksi  bisa  dicari  dengan menghitung  selisih  xantin  mula-mula  dengan sisa  xantin.  Jumlah  xantin  yang  tersisa  bisa ditentukan pada panjang gelombang 268 nm Hasil  pengukuran  aktivitas  penghambatan yang ditetapkan pada panjang gelombang 268 nm  dan  291  nm  disajikan  pada  Tabel  1.
Rentang  standar  baku  reatif  (SBR)  pada pengukuran  berdasarkan  serapan  sisa  xantin (tidak  langsung)  adalah  0,25-2,39  % sedangkan  pada  pengukuran  berdasarkan asam  urat  yang  terbentuk  (langsung)  sebesar 0,24-1,18%. Dengan membandingkan rentang SBR  bisa  diketahui  bahwa  presisi  kedua metode  hampir  sama.  Rentang  SBR  yang lebih  besar  pada  penentuan  berdasarkan pengukuran sisa xantin kemungkinan disebabkan  oleh  asam  urat  yang  juga memberikan serapan pada panjang gelombang 268 nm.
Tabel 1. Hasil uji penghambatan xantin oksidase berdasarkan pengukuran serapan Kons. alopurinol (bpj) λ 268m λ 291nm Pengham- batan rata-rata (%) SBR (%) Pengham- batan rata-rata (%) SBR (%) 0,1 19,12 2,39 19,01 1,18 0,25 26,28 1,58 27,05 0,62 0,50 40,38 1,89 35,96 0,97 1,00 51,03 0,25 46,29 1,30 2,00 61,08 0,35 61,62 0,36 5,00 94,86 0,36 91,69 0,24

## KESIMPULAN
Presisi  penentuan  persen  penghambatan berdasarkan pengukuran serapan pada 268 nm dan  291  nm  hampir  sama  dengan  rentang standar baku relatif berturut-turut 0,25-2,39% dan 0,24-1,30%

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan terima  kasih  kepada Pimpinan  Fakultas  Farmasi  Universitas Pancasila  atas  dana  yang  diberikan  melalui penelitian insentif tahun anggaran 2015.

## DAFTAR PUSTAKA
Gunawan SG. 2007: Farmakologi dan terapi . Edisi  V.  Jakarta:  Balai  Penerbit  FKUI, 243-44. Iswantini,D,  Ramdhani  TH,  Darusman LK,.2012:In  vitro  inhibition  of  celery (Apium  graviolens  L.)  extract  on  the activity of xanthine oxidase and determination  of  its  compound. Indo.  J. Chem. 12(3) 247-254
a b
Santi.  2014:  Aktivitas  penghambatan  xantin oksidase  dari  lima  fase  ekstrak  daun  sirih merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav) secara in  vitro. Skripsi .  Fakultas  Farmasi Universitas Pancasila
Saputra  KA,  2012:  Uji  penghambatan Aktivitas  Xantin  Oksidase  secara  InVitro pada  The  Celup  Kombinasi  Daun Gandarusa (Justicia gendarussa Burm) dan Kaliks Rosela ( Hibiscus sabdariffa Linn). Skripsi . FMIPA Prodi Farmasi UI Umamaheswari,M, Asokkumar K, Subhadradevi  V,  Shivashanmugam  AT,
2009: In  vitro  Xantine  Oxidase  Inhibitory Activity of The Fraction of Erytrina stricta Roxb ,  India:  Departemen  Farmakologi Institut Ilmu Paramedikal Sri Ramakrishna.
Yulianto  D.  2009:  Inhibisi  xantin  oksidase secara  in  vitro  oleh  ekstrak  rosela ( Hibiscus sabdariffa ) dan ciplukan ( Physalis  angulata ). Skripsi .  Bogor: Departemen  Kimia  Fakultas  Matematika dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam  Institut Pertanian Bogor; h. 3-4, 37-41.
Yumita A, Suganda AG, Sukandar EY. 2013: Xanthine  oxidase  inhibitory  activity  of some  Indonesian  medicinal  plants  and active  fraction  of  selected  plants. Int  J Pharm Pharm Sci ;5(2):293-96.