How to cite: Santika.  I.W.M.,  Putu  Eka  Arimbawa  (2022)  Amplifikasi  Gen  Bla  dan  Ori  Untuk  Konstruksi  Vektor Ekspresi  Vaksin  Rekombinan  dengan  Metode  PCR. Syntax  Literate:  Jurnal  Ilmiah  Indonesia,  7 (1). http://dx.doi.org/10.36418/ Syntax-Literate.v7i1.6054
E-ISSN: 2548-1398 Published by: Ridwan Institute
Syntax  Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia p–ISSN: 2541-0849 e-ISSN: 2548-1398 Vol. 7, No. 1, Januari 2022

## AMPLIFIKASI  GEN  BLA  DAN  ORI  UNTUK  KONSTRUKSI  VEKTOR EKSPRESI VAKSIN REKOMBINAN DENGAN METODE PCR
I Wayan Martadi Santika, Putu Eka Arimbawa Udayana University 1 , Bali International 2
Email: wayanmartadi@gmail.com, eka_apoteker@yahoo.co.id

## Abstrak
Vaksin  rekombinan  subunit  protein  memiliki  tingkat  keamanan  yang  lebih  baik dibandingkan  vaksin  yang  dilemahkan  atau  dimatikan  sehingga  terdapat peningkatan  kebutuhan  vaksin  tersebut.  Peningkatan  kebutuhan  ini  harus diantisipasi dengan peningkatan kapasitas produksi. Vektor ekspresi yang memiliki efisiensi transkripsi  yang  tinggi  dan  membawa ori dengan  jumlah  salinan  rendah- sedang dapat meningkatkan kapasitas produksi vaksin rekombinan subunit protein. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengamplifikasi  gen bla dan ori dari  plasmid pBR322  dengan  jumlah  salinan  rendah-sedang  dengan  metode  PCR.  Gen bla dan fragmen ori pBR322  diamplifikasi  dengan  metode  PCR  mengunakan  pasangan primer F bla , R bla ,  F ori dan R ori . Ukuran masing-masing pita atau fragmen DNA dikonfirmasi  dengan  analisa  migrasi  mengunakan  metode  elektroforesis  gel  untuk memastikan ukuran gen bla dan ori yang telah teramplifikasi memiliki ukuran yang tepat.    fragmen bla dan ori telah  telah  diamplifikasi  dengan  metode  PCR. Konfirmasi  ukuran  produk  PCR  dengan  metode  elektroforesis  gel  telah menunjukan  terbentuknya  pita  atau  fragmen  DNA  dengan  ukuran  eksperimental yang  mendekati  ukuran  gen bla sebesasar  1013  bp  dan  fragmen ori sebesar  1380 bp.  Penelitian  menujukan  bahwa  gen bla dan  fragmen ori dari  plasmid  pBR322 telah  berhasil  diamplifikasi  dengan  metode  PCR.  Kedua  fragmen  DNA  ini  dapat dikosntruksi  menjadi  plasmid  baru  dengan  jumlah  salinan  sedang-rendah  sebagai vektor ekspresi untuk produksi vaksin rekombinan subunit protein
Kata Kunci: bla ; ori ; pBR322; vaksin rekombinan

## Abstract
Recombinant protein subunit vaccines have a better safety level than attenuated or killed vaccines,  so  there is  an  increased need  for  these  vaccines.  This  increase  in demand must be anticipated by increasing production capacity. Expression vectors that  have  high  transcriptional  efficiency  and  carry  ori  with  low-moderate  copy number  can  increase  the  production  capacity  of  protein  subunit  recombinant vaccines. The aim of this study was to amplify the bla and ori genes from the low- medium  copy  number  plasmid  pBR322  by  PCR  method.  The  bla  gene  and  the  ori pBR322  fragment  were  amplified  by  PCR  method  using  primer  pairs  Fbla,  Rbla, Fori and Rori. The size of each DNA band or fragment was confirmed by migration analysis using the gel electrophoresis method to ensure that the amplified bla and
ori gene sizes were of the right size. Bla and ori fragments have been amplified by PCR  method.  Confirmation  of  the  size  of  the  PCR  product  by  the  gel electrophoresis method has shown the formation of DNA bands or fragments with experimental  sizes  close  to  the  size  of  the  bla  gene  of  1013  bp  and  the  original fragment of 1380 bp. The  study showed that the bla gene and the ori fragment of the  pBR322  plasmid  had  been  successfully  amplified  by  the  PCR  method.  These two  DNA  fragments can  be  constructed  into  new  plasmids  with  medium-low  copy number as expression vectors for protein subunit recombinant vaccine production.
Keywords: bla; ori; pBR322; recombinant vaccine
Received: 2021-12-20; Accepted: 2022-01-05; Published: 2022-01-15

## Pendahuluan
Kebutuhan protein rekombinan dimasa depan diperkirakan akan terus meningkat. Sekitar  200  protein  terapeutik  tersedia  secara  komersial  untuk  terapi  kanker, autoimunitas, peradangan, penyakit menular, dan penyakit genetic (LagasséLagassé, H. A.  Daniel,  Alexaki,  Aikaterini,  Simhadri,  2017) .  Vaksin  konvensional  baik  vaksin generasi  pertama  dan  vaksin  generasi  kedua  dalam  penggunaannya  masih  memiliki beberapa  kelemahan.  Untuk  mengatasi  berbagai  kelemahan  tersebut  telah dikembangkan vaksin generasi yang ketiga yaitu vaksin rekombinan yang juga dikenal dengan  vaksin  subunit (Radji,  2009) .  Peningkatan  kebutuhan  ini  harus  diikuti  dengan peningkatan kapasitas produksi protein rekombinan. Salah satu tantangan yang muncul adalah  mengoptimalkan  sistem  ekspresi  yang  digunakan  untuk  produksi  protein  skala industri.
Optimasi  sistem  ekspresi  melibatkan  pemilihan  kombinasi  yang  tepat  dari  sel inang  dan  vektor  ekspresi (Huang,  Lin,  &  Yang,  2012) .  Untuk  sel  inang,  bakteri Escherichia  coli merupakan  pilihan  utama  karena  beberapa  kelebihan  seperti  sistem genetikanya  yang  telah  dipelajari  secara  mendalam  dan  ketersedian  berbagai  metode molekular untuk kloning dan ekspresi (Rosano & Ceccarelli, 2014) . Plasmid merupakan vektor  ekspresi  yang  sering  digunakan  untuk  produksi  protein  terapeutik  rekombinan dalam skala industri di sel inang E. coli .
Pemilihan  plasmid  yang  tepat  sangat  tergantung  pada  efisiensi  transkripsi  dan efisiensi  translasi  yang  dimiliki  oleh  plasmid  tersebut.  Efisiensi  transkripsi  bergantung pada jumlah salinan gen dan karakteristik promotor (Huang et al., 2012) . Jumlah salinan gen  ditentukan  oleh  jumlah  salinan  plasmid  dimana  semakin  banyak  jumlah  salinan plasmid  maka  semakin  banyak  juga  gen  yang  tersedia  untuk  proses  transkripsi. Pengunaan  plasmid  dengan  jumlah  salinan  tinggi  menyebabkan  peningkatan  beban energi yang dibutuhkan oleh sel untuk pemeliharaan jumlah salinan plasmid (Ningsih et al.,  2021) .  Hal  ini  akhirnya  meningkatkan  beban  metabolism  sel  dan  pada  akhirnya dapat  menurunkan  produksi  protein (Jana  &  Deb,  2005) .  Ukuran  plasmid  juga  dapat meningkatkan  beban  metabolisme  sel.  Semakin  besar  ukuran  plasmid  maka  semakin besar  juga  energi  yang  dikeluarkan  sel  untuk  mereplikasi  plasmid  tersebut.  Plasmid
dengan  ukuran  kecil  (<3  kb)  biasanya  lebih  sering  digunakan  untuk  ekspresi  protein rekombinan (Huang et al., 2012) .
Diperlukan  rancangan  plasmid  ekspresi  baru  yang  memiliki  jumlah  salinan rendah-sedang  yangsangat  ditentukan  oleh Origin  of  Replication  (ori) yang  dimiliki oleh  plasmid  tersebut (Dao  et  al.,  2019) .  Salah  satu  plasmid  yang  memiliki  jumlah salinan rendah-sedang adalah plasmid pBR322 dengan jumlah salinan 15-20 salinan/sel. Plasmid  pBR322  membawa  membawa ori pMB1  dan  memiliki  2  gen  resistensi antibiotik yaitu gen bla dan tetR . Plasmid ini dapat digunakan sebagai tulang punggung untuk  merekonstruksi  plasmid  baru  yang  membawa  jumlah  salinan  rendah-sedang  dan memiliki  ukuran  yang  lebih  kecil.  Strategi  yang  digunakan  adalah  dengan merekonstruksi plasmid yang membawa ori pMB1 dari plasmid pBR322 dan membawa hanya satu gen resistensi antibiotik bla sehingga ukuran plasmid menjadi lebih kecil.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengamplifikasi  gen bla dan ori pMB1  dari plasmid  pBR322  dengan  metode  PCR.  Hasil  amplifikasi  ini  nantinya  dapat dimanfaatkan untuk merekonstruksi plasmid ekspresi baru dengan ukuran dibawah 3 kb dan membawa ori dengan jumlah salinan rendah-sedang.

## Metode Penelitian
Desain Primer Untuk Amplifikasi gen bla dan ori: Gen (bla) diamplifikasi dengan PCR  mengunakan  primer  FPsiI  bla  yang  membawa  situs  restriksi  PsiI  dan  RHpaI  bla yang  membawa  situs  restriksi  HpaI  dan  NotI.    Fragmen  DNA  yang  membawa  ori pBR322  akan  diamplifikasi  mengunakan  primer  FHpaI  ori  yang  membawa  situs restriksi HpaI dan NotI serta RPsiI ori yang membawa situs restriksi PsiI. Semua primer dirancang  dengan  softyware  Primer  Select  agar  memenuhi  syarat  syarat  primer  yang spesifik dengan mempertimbangkan beberapa parameter seperti panjang primer, %GC, melting  temperature,  suhu  annealing,  GC  clamp,  secondary  structure  seperti  hairpin, selfdimer dan pair dimer, serta runs dan repeat basa.
Karakterisasi  templat  PCR  Plasmid  pBR322:  Analisa  migrasi  dilakukan  untuk mengetahui profil dari plasmid pBR322.  Sebanyak 5 µL plasmid pBR322 hasil isolasi dicampur  dengan  1  µL  DNA  loading  dye.  Elektroforesis  dilakukan  mengunakan  gel agarosa 1% dalam dapar TAE 1X pada tegangan 80 volt, kekuatan arus 400 mA selama 60  menit.  Sedangkan  analisa  pemotongan  dilakukan  untuk  mengkonfirmasi  ukuran plasmid  pBR322  (4361  bp).  Komposisi  reaksi  pada analisa  pemotongan  yaitu  plasmid pBR322  500  ng,  enzim  restriksi  BamHI  10  U,  Dapar  BamHI  10X  dan  ddH2O  steril sampai volume akhir 20 µL. Reaksi dilakukan pada suhu 37 °C semalam. Elektroforesis dilakukan  mengunakan  gel  agarosa  1%  dalam  dapar  TAE  1X  pada  tegangan  80  volt, kekuatan arus 400 mA selama 60 menit dan ladder 1 kb.
Amplifikasi gen bla dan ori dengan metode PCR: Optimasi PCR dilakukan untuk mendapatkan  komposisi  dan  kondisi  PCR  untuk  amplifikasi  gen  bla  dan  ori.  Templat yang digunakan adalah plasmid pBR322dengan komposisi PCR dengan total volume 25 µL  dibuat  dengan  mereaksikan  3  µL  plasmid  pBR322  (60  ng),  5  µL  dapar  PCR  5X yang sudah mengandung MgCl2 dengan konsentrasi 1X sebesar 2 mM, masing-masing
sebanyak  0,15 µL pasangan primer (0, 6 µM), 0,5 µL MyFi DNA Polymerase 5U/µL, 1 µL dNTPs 10 mM dan digenapkan sampai 25 µL dengan ddH2O steril. PCR dilakukan pada kondisi: tahap denaturasi awal 95 °C, 2 menit; tahap amplifikasi 30 siklus dimana setiap siklus terdiri dari denaturasi pada suhu 92 °C selama 30 detik, penempelan primer pada  suhu  63  °C  selama  30  detik  dan  pemanjangan  fragmen  DNA  pada  suhu  72  °C selama 3 menit; tahap pemanjangan akhir pada suhu 72 °C selama 10 menit.
Karakterisasi produk PCR:  Karakterisasi dilakukan dengan analisa migrasi untuk mengetahui ukuran dari masing-masing produk PCR gen bla dan ori. Sebanyak masing- masing  5  µL  produk  hasil  hasil  isolasi  dicampur  dengan  1  µL  DNA  loading  dye. Elektroforesis  dilakukan  mengunakan  gel  agarosa  1%  dalam  dapar  TAE  1X  pada tegangan  80  volt,  kekuatan  arus  400  mA  selama  60  menit  dan  ladder  1  kb.  Setelah selesai  fragmen  ori  dan  bla  dimurnikan  dengan  mengunakan  Gel/PCR  purification  kit dan disimpan pada freezer.

## Hasil Dan Pembahasan
A. Hasil
Desain  pasangan  primer  dilakukan  dengan  mempertimbangkan  beberapa karakteristik  primer  seperti  panjang  primer,  %GC,  melting  temperature  (Tm),  GC clamp, struktur seperti hairpin, self dimer dan pair dimer, serta runs basa dan repeat basa. Hasil ditampilkan dalam tabel 1.

## Tabel 1

## Karakteristik pasangan primer untuk amplifikasi gen bla dan ori plasmid pBR322
Karakteristik Primer Primer Keterangan Fbla Rbla Fori Rori Panjang Primer 32 36 32 37 Primer merupakan overhang primer dimana  Panjang  primer  yang  berikatan langsud  dengan  templat  sudah  dibawah  30 bp %GC 46%  49% 49% 40% Persen GC memenuhi rentang 40-60% Tm 58 0 C  61.7 0 C  59.3 0 C  58.3 0 C  Tm memenuhi rentang 50-65 0 C GC Clamp - - - - Tidak ditemui GC clamp pada ujung 3’ Hairpin 1.1 1 -2.4 -1.2 Memenuhi  syarat  hairpin  (dG  ≤  -3 kcal/mol) Dimer Memenuhi syarat (dG 3’≤  -5 kcal/mol dan dG internal ≤ -6 kcal/mol) Runs 3 2 2 3 Run ≤  3 basa pada ujung 3’ Repeat - - - - Tidak  ditemukan  Repeat  ≤  3  basa  pada ujung 3’
Karakterisasi  templat  pBR322  dilakukan  dengan  analisa  migrasi  dan  analisa pemotongan.  Analisa  migrasi  dilakukan  untuk  mengetahui  profil  dari  plasmid pBR322  Sedangkan  analisa  pemotongan  dilakukan  untuk  mengkonfirmasi  ukuran
plasmid  pBR322  (4361  bp).  Hasil  Analisa  migrasi  dan  Analisa  pemotongan  dapat dilihat pada gambar 1.
a.                                                                     b.
Gambar 1
aAnalisa migrasi plasmid pBR322; anak panah menunjukan pita DNA plasmid pBR322 berbentuk supercoil. b. Analisa pemotongan dengan BamHI; anak panah menunjukan plasmid dalam bentuk linear dengan ukuran diantara marka 4000 bp dan 5000 bp.
Templat  pBR322  digunakan  sebagai  cetakan  untuk  amplifikasi  gen  bla  dan fragmen  ori.  Produk  PCR  selanjutkan  dianalisa  migrasi  dengan  metode elektroforesis gel. Hasilnya ditunjukan pada gambar 2.
Gambar 2
Analisa migrasi produk PCR menunjukan terbentuknya pita band fragmen ori (1380 bp) dan gen bla (1013 bp)

## B. Pembahasan
Hasil  analisis  primer  maka  urutan  primer  yang  akan  digunakan  untuk amplifikasi fragmen gen bla adalah primer F bla (5’-GGCCGCGGT TATAATCTTCACCTAGATCCTTT-3’)  dan  primer  R bla (5’-TAATTTGCG GCCGCGTTAACCCGCTCATGAGACAAT-3’). Sedangkan primer yang
digunakan  untuk  mengamplifikasi ori pMB1  adalah  primer  Fori  (5’- GAAAATCCGCGGCCGCTTCATCGGTATCATTA-3’)  dan  primer  Rori  (5’- CCCCGCTTATAATTGATAATCTCATGACCAAAATCCC-3’).    Seluruh  primer yang  digunakan  telah  memiliki  karakteristik  primer  yang  sesuai  dan  mampu memberikan  efisiensi  dan  spesifisitas  primer  yang  baik.  Efisiensi  dan  spesifisitas primer menentukan keberhasilan dari proses amplifikasi dengan metode PCR (Jana and Deb, 2005) .
Kondisi  templat  PCR  sangan  menentukan  keberhasilan  proses  PCR.  Hasil analisa  migrasi  plasmid  pbR322  menunjukan  bahwa  terdapat  pita  DNA  dengan ukuran  sekitar  3000  bp.  Pita  ini  menunjukan  keberadaan  plasmid  pBR322  dalam bentuk supercoild. Analisa migrasi menunjukan plasmid berada dalam struktur yang utuh  tanpa  terpotong  atau  mengalami  nick.  Plasmid  dalam  bentuk  supercoiled berukuran lebih mampat sehingga akan bermigrasi lebih cepat pada gel agarose (Bo et  al.,  2013) .  Analisa  pemotongan  dilakukan  dengan  memotong  plasmid mengunakan  enzim  retriksi  BamHI.  Enzim  ini  akan  memotong  plasmid  pBR322 pada situs restriksi BamHI yang terletak pada gen tetR (gambar 1). Pemotongan ini kan menyebabkan plasmid pBR322 mengalami relaksasi dari bentuk supercoiled ke bentuk  linear.  Hasil  Analisa  pemotongan  menunjukan  terbentuknya  pita  DNA dengan  ukuran  diantara  4000  bp  dan  5000  bp.  Hasil  mengkonfirmasi  bahwa  pita DNA  tersebut  merupakan  plasmid  pBR322  dalam  bentuk  linear  yang  memiliki ukuran 4361 bp.
Fragmen ori dan  gen bla dari  plasmid  pBR322  selanjtunya  diamplifikasi dengan  primer  dengan  metode  PCR.  Produk  hasil  amplifikasi  ini  dianalisa  dengan analisis migrasi. Hasil analisa migrasi menunjukan bahwa fragmen ori telah berhasil diamplifikasi  dengan  metode  PCR  yang  ditandai  dengan  terbentuknya  pita  DNA dibawah  marka  1500  bp  yang  berukuran  1380  bp.  Hasil  analisa  migrasi  juga menunjukan  bahwa  gen bla telah  berhasil  diamplifikasi  yang  ditandai  dengan terbentuknya  pita  DNA  disekitar  marka  1000  bp  yang  berukuran  1013  bp.  Kedua pita  DNA  tampak  dengan  jelas  namun  smear  yang  menunjukan  bahwa  proses amplifikasi telah berjalan dengan efisien namun belum berjalan dengan spesifik. Hal ini  menunjukan  bahwa  masih  diperlukan  proses  optimasi  metode  amplifikasi fragmen ori dan  gen bla dari  plasmid  pBR322.  Optimasi  cara  meliputi  amplifikasi jumlah templat pBR322, optimasi kadar primer dan optimasi suhu annealing untuk mencegah  terbentuknya  pita  yang  smear  yang  menunjukan  terbentuknya  produk nonspesifik.
Fragmen ori nantinya  akan  menentukan  jumlah  salinan  dari  plasmid.  Sistem replikasi  pada  plasmid  pBR322  tergantung  pada  situs ori yang  berisi  elemen  yang
mengontrol copy  number seperti  RNAI,  RNAII,  dan  rop (repression  of  primer) . Replikasi pada plasmid biasanya diinisiasi oleh RNAII, sedangkan RNAI menekan replikasi  plasmid.  Plasmid  dengan copy  number tinggi  akan  memperlambat replikasi. ori juga  mengkodekan protein  rop yang  mengatur copy  number pada plasmid.  Bekerja  dengan  menstabilkan  interaksi  antara  RNAI  dan  RNAII.  rop memiliki  peran  penting  untuk  mencegah  terjadinya  replikasi  yang  tidak  terkendali dengan meningkatkan afinitas RNAI untuk menekan RNAII sehingga menekan laju inisiasi dari RNAII (Klumpp, 2011) . Penelitian ini telah menghasilkan gen bla yang membawa marka seleksi antibioti dan fragmen ori yang menentukan jumlah salinan rendah-sedang  dari  plasmid.  Pada  tahap  selanjutnya  gen bla dan  fragmen  oridapat digunakan  sebagai  tulang  punggung  untuk  mengkonstruksi  plasmid  sebagai  vector ekspresi untuk produksi vaksin rekombinan.

## Kesimpulan
Gen bla telah  berhasil  diamplifikasi  dengan  metode  PCR  yang  ditandai  dengan terbentuknya  pita  DNA  berukuran  1013  pb  (bp).  Fragmen ori telah  berhasil diamplifikasi  dengan  metode  PCR  yang  ditandai  dengan  terbentuknya  pita  DNA berukuran 1380 pb (bp).

## BIBLIOGRAFI
Bo, Huaben, Wang, Jinquan, Chen, Qizhu, Shen, Han, Wu, Fenglin, Shao, Hongwei, & Huang, Shulin. (2013). Using a single hydrophobic-interaction chromatography to purify  pharmaceutical-grade  supercoiled  plasmid  DNA  from  other  isoforms. Pharmaceutical Biology , 51 (1), 42–48. Google Scholar
Dao,  Fu  Ying,  Lv,  Hao,  Wang,  Fang,  Feng,  Chao  Qin,  Ding,  Hui,  Chen,  Wei,  &  Lin, Hao. (2019). Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two- step  feature  selection  technique. Bioinformatics , 35 (12),  2075–2083. Google Scholar
Huang,  Chung  Jr,  Lin,  Henry,  &  Yang,  Xiaoming.  (2012).  Industrial  production  of recombinant therapeutics in Escherichia coli and its recent advancements. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology , 39 (3), 383–399. Google Scholar
Jana,  S.,  &  Deb,  J.  K.  (2005).  Retracted  Article:  strategies  for  efficient  production  of heterologous  proteins  in  Escherichia  coli. Applied  Microbiology  and Biotechnology , 67 (3), 289–298. Google Scholar
Klumpp,  Stefan.  (2011).  Growth-rate  dependence  reveals  design  principles  of  plasmid copy number control. PloS One , 6 (5), e20403. Google Scholar
LagasséLagassé, H. A. Daniel, Alexaki, Aikaterini, Simhadri, Vijaya L. (2017). Recent advances  in  (therapeutic  protein)  drug  development. F1000Research , 6 . Google Scholar
Ningsih, Hardian, Ramdan, Evan Purnama, Septariani, Dwiwiyati Nurul, Sari, Miranda Ferwita,  Fajarfika,  Resti,  Lestari,  Widya,  Junaedi,  Abdus  Salam,  Putri,  Ria,  & Joeniarti,  Elika.  (2021). Pengantar  Bioteknologi .  Yayasan  Kita  Menulis. Google Scholar
Radji,  Maksum.  (2009).  Vaksin  DNA:  Vaksin  generasi  keempat. Majalah  Ilmu Kefarmasian , 6 (1), 4. Google Scholar
Rosano, Germán L., & Ceccarelli, Eduardo A. (2014). Recombinant protein expression in  Escherichia  coli:  advances  and  challenges. Frontiers  in  Microbiology , 5 ,  172. Google Scholar

## Copyright holder:
I Wayan Martadi Santika, Putu Eka Arimbawa (2022)

## First publication right:
Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia
This article is licensed under: