How to cite: Wiyani.  S.,  Charil  Anwar,  Dwi  Handayani  &  Ahmad  Ghiffari  (2021)  Identifikasi  Mutasi  Gen  Pvk12  Penanda Resistensi  Plasmodium  Vivax  Terhadap  Artemisin  Pada  Penderita  Malaria  Suku  Anak  Dalam  Di  Kabupaten Batang Hari Provinsi Jambi. Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia, 6 (12). http://dx.doi.org/10.36418/ Syntax- Literate.v6i12.5170 E-ISSN:
2548-1398 Published by: Ridwan Institute
Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia p–ISSN: 2541-0849 e-ISSN: 2548-1398
Vol. 6, No. 12, Desember 2021 IDENTIFIKASI MUTASI GEN PVK12

## PENANDA RESISTENSI

## PLASMODIUM  VIVAX  TERHADAP  ARTEMISIN  PADA  PENDERITA MALARIA  SUKU  ANAK  DALAM  DI  KABUPATEN  BATANG  HARI PROVINSI JAMBI

## Sri Wiyani, Charil Anwar, Dwi Handayani, Ahmad Ghiffari
Program  Studi  Ilmu  Biomedik  FK  Universitas  Sriwijaya  (UNSRI),  Departemen Biomedik  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Sriwijaya  (UNSRI),  Universitas Muhammadiyah Palembang, Indonesia Email: sriwiyani76@gmail.com, chairil53@fk.unsri.ac.id, dwih.dr@gmail.com, dokter.ghi@gmail.com

## Abstrak
Penyakit malaria  disebabkan oleh parasit famili Plasmodium yang ditularkan oleh nyamuk  Anopheles  betina.  Enam    spesies  Plasmodium  pada  manusia  adalah  P. vivax,  P.  falciparum,  P.  malariae,  P.  ovale,  P.  knowlesi  dan  P.cynomolgi  (WHO, 2016).    Suku  anak  dalam  (SAD)  atau  orang  rimba  yang  hidup  di  pedalam  hutan Jambi secara geografik menempati wilayah utara sekitar Taman Nasional Bukit 30 selain  itu  menempati  wilayah  selatan  Provinsi  Jambi  di  daerah  Taman  Nasional Bukit  12.  Wilayah  tinggal  SAD  berada  di  dalam  hutan  sehingga  mereka  sangat rentan  terhadap  penyakit  malaria  (Dinas  Kesehatan  Provinsi  Jambi  Tahun  2015). Tujuan  penelitian  ini  mengetahui  adanya  mutasi  gen  Pvk12  pada  sampel  darah yang diambil dari penderita Suku Anak Dalam  yang positif  P. vivax di kabupaten Batang  Hari  Provinsi  Jambi.  Jenis  penelitian  ini  adalah  deskriptif  obeservasional dengan  desain  survei.  Dari  hasil  pemeriksaan  Nested  PCR  dari  35  sampel  yang positif  malaria  P.  vivax  didapat  dua  positif  ada  pita  di  792  bp  yang  selanjutnya disekuensing  hasilnya  hanya  ada  satu  sampel  saja  yang  dapat  diidentifikasi  dan yang lainnya tidak dapat didentifikasi. Hasil sekuensing menunjukan  mutasi pada titik 1253 ,  mutasi yang terjadi pada titik bukan penanda resistensi artemisin.  Dari hasil  diatas  dapat  ditarik  kesimpulan  bahwa  belum  terjadi  resistensi  P.vivax  pada SAD Kabupaten Batang Hari Jambi terhadap artemisin.
Kata Kunci : P. vivax; Gen PvK12; SAD; resistensi; artemisin

## Abstract
Malaria is caused by parasites of the Plasmodium family, which is transmitted by the  female  Anopheles  mosquito.  The  six  Plasmodium  species  in  humans  are  P. vivax,  P.  falciparum,  P.  malariae,  P.  ovale,  P.  knowlesi  and  P.cynomolgi  (WHO, 2016). The tribe of anak dalam (SAD) or jungle people who live in the interior of Jambi  forest  geographically  occupies  the  northern  area  around  the  Bukit  30 National  Park  besides  occupying  the  southern  region  of  Jambi  Province  in  the Bukit  National  Park  area  12.  SAD's  living  area  is  in  the  forest  so  they  are  very
vulnerable against malaria (Jambi Provincial Health Office 2015). The purpose of this  researchKnowing  the  presence  of  Pvk12  gene  mutations  in  blood  samples taken from patients with P.vivax in Batang Hari district, Jambi Province. This type of  research  was  a  descriptive  observation  survey  design.  From  the  results  of  the Nested  PCR  examination  of  35  positive  samples  of  Plasmodium  vivax  malaria,  it was found that two were positive, there was a band at 792 bp, then the results were sequenced,  only  one  sample  could  be  identified  and  the  others  could  not  be identified. The results of the screening showed mutation points at 1253 and 1958 at codons  448,  517,  568  and  576.  From  the  results  above,  it  can  be  concluded  that there  was  a  mutation  of  the  PvK12  gene  in  the  tribal  children  in  Batang  Hari Regency, Jambi Province but did not show artemisin resistance.
Keywords: P. vivax; Gen PVK12; SAD; resistance; artemisin
Received: 2021-11-20; Accepted: 2021-12-05; Published: 2021-12-20

## Pendahuluan
Penyakit malaria disebabkan oleh parasit famili Plasmodium yang ditularkan oleh nyamuk Anopheles betina . Enam  spesies Plasmodium pada manusia adalah P. vivax, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. knowlesi dan P. Cynomolgi ( WHO,2016 ). P. vivax merupakan  spesies  yang  paling  banyak menginfeksi  manusia  dari  plasmodium  lainnya sekitar 40 % penderita malaria ditemukan P. vivax . P. vivax bertanggung jawab hingga 400 juta infeksi setiap tahun, mewakili spesies plasmodium paling luas bahkan P. vivax bertanggung  jawab  atas  morbiditas  yang  signifikan  bahkan  penyakit  parah  yang menyebabkan kematian (Deida et al ., 2018) .
Sejak lima dasawarsa upaya pengendalian malaria di Indonesia telah membuahkan hasil.  Hal  ini  ditandai  dengan  menurunnya  angka  kejadian  malaria  ( Annual  Parasite Incidence -API)  dari  1,75  pada  tahun  2011  menjadi  0,85  pada  tahun  2015 (Infodatin Kemenkes  RI,  2016) .  Pada  tahun  2017  sebesar  0.99  per  1000  penduduk  tahun  2018 menjadi  0,68  per  1000  penduduk  dengan  total  positif  malaria  adalah  180.205  orang. Propinsi  Jambi  tahun  2018  adalah  0,03  per  1000  penduduk  dengan  jumlah  total  121 orang  positif  malaria,  Dikabupaten  Batang  Hari  API  yaitu  0,042  per  1000  penduduk (Dinas Kesehatan Provinsi Jambi, 2017) .
Resistensi  artemisinin  beserta  derivatnya  pada P.  vivax diketahui  salah  satunya berkaitan dengan single nucleotide polymorfisme (SNP) multiple pada kromosom 12 P. vivax yaitu kelch12 ( K12) (Tresnawati,  Kusuma,  Wijaya,  &  Hasibuan,  2019) .  Mutasi pada  domain propeller dari  gen Plasmodium  vivax  Kelch12 ( PvK12 )  erat  kaitannya dengan  resistensi  artemisin.  Adanya  mutasi  gen  ini  akan  mengubah  respon P.  vivax terhadap  stress  oksidatif  yang  ditimbulkan  oleh  artemisin  dengan  melibatkan  jalur proteasome-ubiquintin .  Mutasi  pada  gen  ini  terletak  pada  baling-baling  domain propeller  bilah  ketiga.  Protein  K12  terdiri  dari  3  domain  spesifik Plasmodium yaitu domain  Tho2  super  family,  BTB-POZ,  dan  sebuah  domain propeller dengan  6- blade , dimana  kejadian  mutasi  terkait  resistensi  artemisin  mayoritas  terletak  pada  domain propeller dari protein tersebut (Tripura et al., 2017) .
Suku Anak Dalam (SAD) atau orang rimba yang hidup di pedalaman hutan Jambi secara  geografik  menempati  wilayah  utara  sekitar  Taman  Nasional  Bukit  30  selain  itu menempati  wilayah  selatan  Provinsi  Jambi  di  daerah  Taman  Nasional  Bukit  12, populasi SAD ditahun 2010 berjumlah 3205 orang yang hidup di wilayah administrasi Kabupaten Merangin, Kabupaten Sarolangun, Batang Hari, Tanjung Jabung Barat, Tebo dan Muaro Bungo. Wilayah tinggal SAD berada di dalam hutan sehingga mereka sangat rentan terhadap penyakit malaria (Dinas Kesehatan Provinsi Jambi Tahun 2015) .

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  adalah  penelitian  deskriptif  observasional  dengan  desain  survey Penelitian ini dilakukan di daerah Suku Anak Dalam di Kabupaten Batang Hari Provinsi Jambi (Andini,  2013) .  Penelitian  dilakukan  mulai  bulan  Oktober  2019  sampai  dengan bulan Oktober 2020. Sampel isolate DNA SAD diperiksa di Laboratorium Bioteknologi Fakultas  Kedokteran  UnsriGen  kelch  pada Plasmodium  vivax diamplifikasi menggunakan  nested  PCR.  Primer  spesifik  yang  digunakan  untuk  amplifikasi  domain baling-baling kelch merujuk jurnal Plos One sebagai berikut:
P.vivax K13_Pvx_F1  5’CATTTCCAACTTCTCCGTC-3’ K13_Pvx_R1   5’ TATCTGCCACTCATTCGTG-3’K13_Pvx_F2    5’
CGAAAGTGAGGCTTTACTA-3’ K13_Pvx_R2    5’ CCACCAGTGATGATGTAC -3’
Spesifik primer ini dirancang oleh Talundzic et al., 2015,  spesifik primer ini muncul pita pada  792 bp.
A. Nested PCR
Komposisi campuran yang digunakan sebanyak volume total 25 μL PCR Mix Go Taq (Promega USA) terdiri dari:  9μL ddH2O, 10 μL Green Go Taq dan 5 μL DNA  cetakan  ( template )  serta  primer  oligonukleotida reverse (R)  dan forward (F) masing-masing    0,5  μL.  Melalui  teknik  ini,  fragmen  DNA  target  yang  spesifik diperbanyak secara in vitro dengan menggunakan pasangan primer oligonukleotida sintetik  yang  membatasi  daerah  yang  akan  diperbanyak.  Amplifikasi  DNA dilakukan 2 tahap ( nested ), yaitu:
a. PCR  pertama,  untuk  amplifikasi  gen pvk12 parasit P.  vivax dengan menggunakan sepasang primer spesifik. Tiap campuran mengandung 5 μL DNA hasil  ekstraksi  sebagai  cetakan (template). Ditambahkan  kedalam  20  μL  reaksi PCR yang terdiri dari: 9 μL ddH2O, 10 μL Green Go Taq , dan 1μL primer (0,5 μL  primer  R1  dan  0,5  μL  primer  F1).  Amplikasi  dilakukan  dengan menggunakan mesin PCR Thermal Cycler . Campuran diamplifikasi sebanyak 34 siklus dengan kondisi sebagai berikut: predenaturasi pada 94 0 C selama 5 menit, denaturasi  94 0 C  selama  30  detik,  annealing    59 0 C,  ekstensi  72 0 C  selama  6 menit dan diakhiri dengan 12 0 C selama 12 menit (Talundzic et al ., 2015) .
b. PCR kedua ( nested PCR), untuk memperbanyak DNA yang sudah diamplifikasi pada PCR yang pertama agar dapat divisualisasi. Produk DNA hasil amplifikasi
pada  PCR  pertama,  diamplifikasikan  kembali  menggunakan  internal  primer untuk  gen pvkelch12  P.vivax .  Untuk  reaksi  yang  kedua  digunakan  ddH2O  12 μL, 10 μL Green Go Taq , dan 1μL primer (0,5 μL primer R2 dan 0,5 μL primer
F2)  kemudian  amplikon  dimasukan  kedalam  mesin  thermal  cycle  lalu  diulang pada 94 0 C selama 5 menit, denaturasi 94 0 C selama 30 detik, annealing  58,2 0 C sebnyak  34  siklus,  ekstensi  72 0 C  selama  6  menit  dan  diakhiri  dengan  12 0 C selama 7 menit (Talundzic et al ., 2015) .

## B. Deteksi Hasil PCR
Kualitas  hasil  amplifikasi  dengan  teknik  PCR  dilihat  dengan  menggunakan teknis elektroforesis gel agarose (konsentrasi 2%). Elektroforesis dilakukan di dalam appartus elektroforesis ( Horizontal MiniSub DNA Biorad ) yang berisi TBE 1x (Tris- Boric acid-EDTA: 10,8 g/L. Tris pH 8,0 yang mengandung 5.5 g/L Boric Acid dan 0,5 M EDTA pH 8,0) dan ditambahkan zat interkalator Ethidium Bromide 0,1%.
DNA  hasil  PCR  sebanyak  5  μL  dimasukkan  dalam  sumuran  yang  terdapat pada  gel  agarose  2  %.  Sebagai  penanda  ukuran  pita-pita  DNA  hasil  elektroforesis pada  gel  Marker  (100bp  DNA  ladder  Cat  no:  15628-019  LOT  NO.  1289697 sebanyak 3μg/μL; Promega) yang di campur 2 μL loading dye dan 4,5 μL 1x TBE buffer.
Gel  dielektroforesis  pada  tegangan  listrik  100  volt,400  mA  selama  30  menit. Selanjutnya  dideteksi  dengan  menggunakan Gel  Doc  1000 (Biorad USA)  untuk divisualisasi dengan sinar ultraviolet pada panjang gelombang 300 nm dan direkam.

## Hasil dan Pembahasan
A. Hasil Penelitian
Sampel  penelitian  yang  positif P.  vivax berjumlah  35  sampel  kemudian  di amplifikasi dengan nested PCR lalu di elektroforesis dengan menggunakan agarrose 2% kemudian dibaca dengan geldoc dengan hasil sebagai berikut.

## Gambar 1

## 1. Sekuensing
Dari hasil yang didapat ada 2 sampel positif menunjukkan pita pada 792 bp  yaitu  sampel  no.8  dan  33,  Setelah  sampel  didapat  langkah  selanjutnya dilakukan  sekuensing  untuk  memperoleh  urutan  basa.  Untuk  persiapan sekuensing  sampel  terlebih  dahulu  dilakukan  pretreatmen  yaitu  dengan melakukan nested PCR kembali. Kemudian 2 sampel positif yang muncul pita dan  sudah  di  pretreatmen  dikirim  ke  PT.  Genetica  Science  di  Jakarta selanjutnya sampel dikirim ke Apical 1st Base Malaysia. Hasil yang didapat ternyata hanya satu sampel yang dapat dibaca yaitu sampel no.8, satu sampel lagi tidak bisa dibacaBerikut hasil sekuensing.

## Gambar 2 Hasil sekuensing dengan titik mutasi1253

## B. Pembahasan
Dari  hasil  amplifikasi  35  sampel  yang  positif  malaria P.  vivax pada  SAD  di kabupaten Batang Hari hanya muncul 2 sampel yang menunjukan hasil positif atau pita  pada  792  bp,  yang  menandai  adanya  alel  mutan  gen Pvk12 sebagai  penanda resistensi  artemisin,  Selebihnya  33  sampel  negatif  atau  tidak  muncul  pita.  Pada sampel no.8 hasil sekuensing menunjukkan adanya mutasi pada dititik 1253, mutasi tersebut tidak terjadi pada titik penanda resistensi P. vivax terhadap artemisin.
Mutasi  lain  telah  terjadi  pada  sampel P. vivax Jambi,  namun tidak  pada titik penanda.  Mutasi  ini  tidak  dapat  disimpulkan  sebagai  penanda  resistensi  obat malaria pada pasien Jambi, karena diambil bukan dari isolat pasien yang mengalami resistensi melainkan dari hasil surveilans. Hal ini menunjukkan bahwa belum terjadi resistensi P.  vivax terhadap  artemisin  pada  SAD,  sehingga  obat  artemisin  masih dapat digunakan pada SAD dikabupaten Batang hari jambi.
Resistensi  artemisin  memiliki  pola  posisi  mutasi  yang  berbeda  di  setiap wilayah  endemis  malaria.  Mutasi  pada  gen  ini  akan  menyebabkan  respon  stress oksidatif  sehingga  sel  tidak  terdegradasi  walaupun  telah  diberikan  artemisin.
Resistensi  terhadap  artemisin  dapat  ditanggulangi  dengan  memperpanjang  durasi pengobatan (Tantiamornkul,  Pumpaibool,  Piriyapongsa,  Culleton,  &  Lek-Uthai, 2018) .
Resitensi P.  vivax terhadap  artemisin  disebabkan  oleh  mutasi  gen  PvK12 dengan cara yaitu artemisin yang masuk kedalam tubuh dalam bentuk inaktif yang akan diaktivasi oleh Fe+2 (hasil degradasi hemoglobin) untuk menghasilkan radikal bebas  yang  sangat  reaktif  dan  akan  bereaksi  dengan  protein  parasit  menyebabkan alkilasi  protein.  Alkilasi  dapat  menyebabkan  kematian  sel  dan  kematian  parasit. Tetapi  pada P.vivax dengan  mutasi  K12  terjadi  peningkatan  respon  stress  akibat keterlibatan  jalur proteasome-ubiquintin, sehingga  sel  tetap  bertahan  hidup (Popovici  &  Ménard,  2015) .  Protein  K12  Pada  parasit yang  sensitive  terhadap artemisin akan berikatan dengan sebuah factor transkripsi dan mengatur terjadinya degradasi  sedangkan  parasit  yang  resistensi  terhadap  artemisin,  K12  tidak  dapat berikatan dengan faktor transkripsi tersebut sehingga menyebabkan upregulasi dari gen  yang  terkait  respon  anti  oksidan.  Dalam  kondisi  ini  parasit  mampu  mengatasi stress oksidatif dari artemisin secara lebih baik.
Menurut (Popovici  &  Ménard,  2015) Polimerfisme  PvK12 P.  vivax di Kamboja  sangat  terbatas  dibandingkan  dengan  polimorfisme P.  falciparum gen PfK13.  Hanya  2  dari  284  sampel  yang  memiliki  mutasi  pada  kodon  552  (V552I) pada  sampel  yang  dikumpulkan  dari  tahun  2013,  begitu  juga  di  Indonesia polimorfisme pvk12 p. vivax masih jarang dilakukan penelitian. Mutasi yang terjadi pada SAD di Kabupaten Batang Hari jambi yaitu pada titik G1253A.

## Kesimpulan
Terjadi  mutasi  gen  Pvk12  pada  Suku  Anak  Dalam  di  kabupaten  Batang  Hari Provinsi Jambi, ditemukan pada titik mutasi 1253. Mutasi yang terjadi di titik 1253, CAG  menjadi  GCA  glutamin  menjadi  arginine.  Meskipun  telah  terjadi  mutasi  gen PvK12, namun hasil analisa menunjukan tidak terjadi resistensi artemisin pada Suku Anak  Dalam  tersebut  karena  mutasi  tidak  pada  titik  penanda  resistensi  artemisin. Untuk pengobatan malaria yang positif pada Suku Anak Dalam di Kabupaten Batang Hari Propinsi Jambi masih dapat menggunakan artemisin.

## BIBLIOGRAFI
Andini,  Restian  Febi.  (2013). Mikrostruktur  Enamel  Gigi  Bovine  Setelah  Perendaman Dalam  Ekstrak  Teh  Hijau  Dan  Casein  Phosphopeptide-Amorphous  Calcium Phosphate  (Penelitian  Deskriptif  Observasional) .  Universitas  Airlangga. Google Scholar
Dinas kesehatan Provinsi Jambi . (2017). 7 (2), 1–16.
Global  Technical  Strategy  for  Malaria  2016-2030  -  World  Health  Organization  - Google Books . (n.d.). Google Scholar
Jambi, Dinas Kesehatan Provinsi. (2015). Dinas Kesehatan Provinsi Jambi Tahun 2015.
In Dinas Kesehatan Provinsi Jambi 2014 .
Mint Deida, Jemila, Ould Khalef, Yacoub, Mint Semane, Emal, Ould Ahmedou Salem, Mohamed  Salem,  Bogreau,  Hervé,  Basco,  Leonardo,  Ould  Mohamed  Salem Boukhary,  Ali,  &  Tahar,  Rachida.  (2018).  Assessment  of  drug  resistance associated  genetic  diversity  in  Mauritanian  isolates  of  Plasmodium  vivax  reveals limited polymorphism. Malaria Journal , 17 (1), 1–7. Google Scholar
Popovici, Jean, & Ménard, Didier. (2015). Challenges in Antimalarial Drug Treatment for  Vivax  Malaria  Control. Trends  in  Molecular  Medicine , 21 (12),  776–788. Google Scholar
Talundzic, Eldin, Chenet, Stella M., Goldman, Ira F., Patel, Dhruviben S., Nelson, Julia A., Plucinski, Mateusz M., Barnwell, John W., & Udhayakumar, Venkatachalam. (2015).  Genetic  analysis  and  species  specific  amplification  of  the  artemisinin resistance-associated  kelch  propeller  domain  in  P.  falciparum  and  P.  vivax. PLoS ONE , 10 (8), 1–11. Google Scholar
Tantiamornkul,  Kritpaphat,  Pumpaibool,  Tepanata,  Piriyapongsa,  Jittima,  Culleton, Richard, & Lek-Uthai, Usa. (2018). The prevalence of molecular markers of drug resistance  in  Plasmodium  vivax  from the  border  regions  of  Thailand  in  2008 and 2014. International  Journal  for  Parasitology:  Drugs  and  Drug  Resistance , 8 (2), 229–237. Google Scholar
Tresnawati, Lina Herlina, Kusuma, Wisnu Ananta, Wijaya, Sony Hartono, & Hasibuan, Lailan  Sahrina.  (2019).  Asosiasi  Single  Nucleotide  Polymorphism  pada  Diabetes Mellitus Tipe 2 Menggunakan Random Forest Regression. Jurnal Nasional Teknik Elektro Dan Teknologi Informasi (JNTETI) , 8 (4), 320–326. Google Scholar
Tripura,  Rupam,  Peto,  Thomas  J.,  Veugen,  Christianne  C.,  Nguon,  Chea,  Davoeung, Chan,  James,  Nicola,  Dhorda,  Mehul,  Maude,  Richard  J.,  Duanguppama, Jureeporn,  &  Patumrat,  Krittaya.  (2017). Submicroscopic  Plasmodium  prevalence in  relation  to  malaria  incidence  in  20  villages  in  western  Cambodia. Malaria Journal , 16 (1), 1–12. Google Scholar

## Copyright holder:
Sri Wiyani, Charil Anwar, Dwi Handayani, Ahmad Ghifari (2021)

## First publication right:
Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia
This article is licensed under: