Wihanto L, Ilmi H, Tumewu L, Widyawaruwati A, Zaini AF, Tantular I

## ANALISIS HAMBATAN  PERKEMBANGAN STADIUM PLASMODIUM
FALCIPARUM TERHADAP PEMBERIAN EKSTRAK DAUN SALAM BADAK

## (ACMENA ACUMINATISSIMA) IN VITRO
Laura Wihanto 1) , Hilkatul Ilmi 2) , Lidya Tumewu 2) , Aty Widyawaruyanti 2), 3) , Achmad Fuad Hafid 2), 3) , Indah Tantular 2), 4)

## ABSTRACT
Background:  The  urgency  generated  by  drug-resistant  strains  of  malaria  parasites  has accelerated the need to find  a new anti-malarial drug. Recent studies have  shown that 80% ethanol extract Acmena acuminatissima has suitable antimalarial activities. Aim: To analyze the inhibitory effect of A. acuminatissima extract at the developmental stage of P. falciparum in  infected  erythrocytes  in  vitro.  Methods:  the  synchronized  culture  of  P.  falciparum  was incubated  along  with  A.  acuminatissima extract,  and compared  with  negative  controls.  The effect  on  parasite  growth  was  determined  by  observing  the  level  of  parasitemia  and accumulation of various infective stages seen on thin blood smears after the incubation period of 12, 24, 36, and 48 hours using a light microscope with 1000 times magnification. Results: Within 48 hours of observation the difference was mainly in the proportion of ring-stage which was 2.75% in culture with the test compound and 41.41% in the negative control which showed that ethanol extract of A. acuminatissima inhibited the growth of parasites at the schizont stage into  the  ring  stage.  In  trophozoite  and  schizonts  stages  of  culture  with  test  compounds, enlargement of digestive vacuole and vesiculation is obtained. Conclusion: A. acuminatissima inhibits  the  development  of  intraerythrocyt parasites  at  the  schizonts  stage  and  induced morphological changes.
Keyword: Malaria, Acmena Acuminatissima, Plasmodium Falciparum, Stage Development

## ABSTRAK
Pendahuluan :  Kejadian  resistensi  strain  parasit  malaria  terhadap  obat  mengindikasikan semakin terdesaknya kebutuhan untuk menemukan obat anti malaria yang baru. Studi terakhir menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  80% Acmena  acuminatissima memiliki  aktivitas antimalaria  yang  tergolong  baik. Tujuan :  Menganalisis  efek  penghambatan  ekstrak A. acuminatissima terhadap tahapan perkembangan P. falciparum pada eritrosit terinfeksi secara in vitro . Metode : Biakan P. falciparum yang telah disinkronisasi diinkubasi bersama dengan ekstrak A. acuminatissima , dan dibandingkan dengan kontrol negatif. Efek pada pertumbuhan
parasit  ditentukan  dengan  mengamati  tingkat  parasitemia  dan  akumulasi  berbagai  stadium infektif yang berbeda yang dilihat pada hapusan darah tipis setelah masa inkubasi 12, 24, 36, dan 48 jam menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 1000 kali. Hasil : Dalam 48 jam pengamatan perbedaan terutama pada proporsi stadium cincin yaitu 2,75% pada kultur dengan senyawa uji dan 41,41% pada kontrol negatif yang menunjukkan bahwa ekstrak etanol A.  acuminatissima menghambat pertumbuhan parasit pada stadium skizon menjadi stadium cincin.  Pada  parasit  stadium  trofozoit  dan  skizon  kultur  dengan  senyawa  uji  didapatkan pembesaran  vakuola  digestif  dan  gambaran  vesikulasi. Kesimpulan : A.  acuminatissima menghambat  perkembangan  parasit  intraeritrositik  pada  stadium  skizon  dan  menyebabkan terjadinya perubahan morfologi.
Kata  Kunci :  Malaria, Acmena  Acuminatissima, Plasmodium  Falciparum, Tahapan Perkembangan Stadium
1) Departemen Mikrobiologi dan Parasitologi, Fakultas Kedokteran Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya, Jl. Raya Kalisari Selatan No.1 Tower A Lt.6 Pakuwon City Surabaya, Email korespondensi: laura_wihanto@hotmail.com , 2) Institute of Tropical Disease, Universitas Airlangga, Surabaya, 3) Departemen Farmakognosi dan Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya, 4) Departemen Parasitologi, Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Surabaya

## PENDAHULUAN
Malaria  merupakan  salah  satu ancaman  patogen  terbesar  yang  mendapat prioritas  kesehatan  internasional  di  abad 21(1).  Insiden  malaria  di  dunia    menurut
World  Health  Organization diperkirakan mencapai  214  juta  kejadian  dengan kematian mencapai 438.000 orang di tahun 2015. Kematian akibat malaria ini terutama terjadi pada bayi dan anak di bawah usia 5 tahun  yaitu  sebesar  306.000  kematian (70%)  dan  292.000  di  antaranya  (89%) terjadi  di  sub-Sahara  Afrika  atau  dengan kata lain terjadi satu kematian anak setiap dua menit di Afrika (2).
Di  Indonesia  angka  kejadian malaria  masih  relatif  tinggi  dan  80%
berasal  dari  5  provinsi  di  wilayah  timur Indonesia  yaitu Papua, Papua Barat, Nusa Tenggara  Timur,  Maluku,  dan  Maluku Utara (3) .
Berbagai  upaya  telah  dilakukan untuk  menekan  angka  kesakitan  dan kematian  akibat  malaria  yang  meliputi diagnosis dini, pengobatan cepat dan tepat, kemoprevensi  (pemberian  profilaksis), surveilans  dan  pengendalian  vektor  yang kesemuanya  ditujukan  untuk  memutus mata  rantai  penularan  malaria.  Angka kejadian  malaria  dilaporkan  menurun hingga  lebih  dari  separuh  pada  dekade terakhir namun kendala untuk pemberantasan  malaria  juga  semakin bertambah.  Salah  satu  yang  harus
Wihanto L, Ilmi H, Tumewu L, Widyawaruwati A, Zaini AF, Tantular I

## diwaspadai  adalah  ancaman  resistensi
Plasmodium terhadap pengobatan.  Indikasi resistensi  terhadap  artemisinin  telah terdeteksi  di  lima  negara  di  area  Mekong Besar  yaitu  Kambodia, Lao  People’s
Democratic Republic , Myanmar, Thailand, dan Vietnam (2,4).
Kebutuhan  untuk  mencari  senyawa lain  yang  berpotensi  dalam  pemberantasan malaria adalah masalah mendesak yang harus senantiasa diselidiki. Keanekaragaman hayati Indonesia yang merupakan  terbesar kedua di dunia setelah Brazil,  sangat berpotensi untuk digali, diteliti dan dikembangkan dalam upaya menemukan komponen antimalaria baru yang poten (5).
Acmena acuminatissima atau salam badak  adalah  tanaman  yang  banyak ditemukan di berbagai wilayah di Indonesia. Pada  penelitian  terdahulu,  didapatkan bahwa  dalam  ekstrak  etanol  80%  daun
Acmena  acuminatissima terkandung bahan kimia terpenoid, antrakinon, flavonoid, dan polifenol  serta  dalam  pengujian  sebagai antimalaria  didapatkan  nilai  IC50  yang tergolong dalam kriteria moderat sehingga cukup prospektif dalam rangka pengembangan  bahan  alam  Indonesia menjadi  obat  herbal  terstandar  dan fitofarmaka  antimalaria (6-8).
Pada  penelitian  ini  akan  dilakukan  uji ekstrak  etanol  80%  daun Acmena acuminatissima terhadap parasit P. falciparum strain 3D7 secara in vitro untuk
mengevaluasi  aktivitas  antimalaria  dan pengaruhnya terhadap tahapan perkembangan  stadium P.  falciparum di dalam  darah.  Daya  kerja  selektif  terhadap stadium  tertentu  pada  siklus  hidup  parasit diharapkan  memberi  petunjuk  mengenai mekanisme kerja senyawa aktif antimalaria yang  sesungguhnya  yang  terkandung  di dalam ekstrak (9).

## METODE PENELITIAN

## Bahan Penelitian
Sampel  yang  digunakan  adalah kultur Plasmodium  falciparum strain  3D7 (sensitif klorokuin)  dalam bentuk simpanan beku dan ekstrak etanol 80% daun Acmena acuminatissima yang  diperoleh  dari laboratorium Science  and  Technology Research  Partnership  for  Sustainable Development (SATREPS) Institute  of Tropical  Disease (ITD)  -  Universitas Airlangga,  Surabaya.  Bahan-bahan  lain adalah  RPMI 1640, HEPES buffer , natrium bikarbonat (NaHCO3), hipoksantin,
gentamisin, serum dan eritrosit golongan O, natrium  klorida  (NaCl), aquadest steril,
dimetilsulfosida (DMSO), pewarna giemsa, minyak emersi, dan sorbitol.
Uji ekstrak terhadap tahapan

## perkembangan stadium
Dalam  pengujian  ekstrak  terhadap tahapan  perkembangan  stadium P.
falciparum ,  tingkat  parasitemia  awal  yang diperlukan  adalah  1%  dengan  5%
hematokrit.  Suspensi  parasit  dibuat  dari kultur P.  falciparum yang  dibiakkan menurut metode Trager dan Jansen (1976) (10-12)  kemudian  disinkronisasi  sehingga semua  parasit  berada  pada  stadium  cincin menggunakan sorbitol 5% (13).
Bahan  uji  yang  digunakan  adalah ekstrak  etanol  80%  daun Acmena
acuminatissima dengan konsentrasi 1 μg/ml yang  mampu  menghambat  sekitar  70-80% pertumbuhan  parasit  secara in  vitro
berdasarkan  hasil  uji  aktivitas  antimalaria (7).  Suspensi  parasit  diinkubasi  bersama bahan  uji  dan  kontrol  menggunakan lempeng sumur mikro dengan 24 lubang.
Pengamatan dilakukan setiap 12 jam dengan membuat hapusan darah tipis pada jam  ke-0,  12,  24,  36,  dan  48.  Hapusan difiksasi menggunakan metanol absolut dan dikeringkan.  Pewarnaan  memakai    giemsa konsentrasi  20%  kemudian  diamati  di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran  1000X  menggunakan  minyak emersi.
Pada  kondisi  normal,  apabila  tidak terjadi  hambatan  pertumbuhan  dan perkembangan, maka stadium parasit akan berkembang  dari  stadium  cincin  menjadi trofozoit,  dan  dilanjutkan  dengan  stadium skizon dalam waktu 48 jam sesuai dengan siklus hidup normal parasit P. falciparum .
Penghitungan parasitemia dilakukan pada masing-masing stadium pada jam-jam
tersebut di atas per 5000 eritrosit.  Kriteria stadium parasit ditetapkan sebagai berikut: stadium  cincin  memiliki  bentukan  seperti cincin  dengan  inti  1-2,  stadium  trofozoit memiliki  komponen  sitosol  dan  pigmen serta  inti  tunggal,  dan  stadium  skizon memiliki bentukan post mitosis dengan inti dua atau lebih (14,15).
Hasil parasitemia yang didapat pada masing-masing  stadium  dibandingkan antara  senyawa  uji  dan  kontrol. Pengamatan  dievaluasi  menggunakan rumus berikut(6) :
Keterangan : Xp  = Parasitemia uji Xkn = Parasitemia kontrol negatif

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  pengamatan  setelah  12  jam masa  inkubasi  kultur  yang  diberi  ekstrak memiliki stadium cincin yang lebih sedikit dibandingkan  kontrol  negatif  sedangkan stadium  trofozoit  dan  skizon  relatif  sama. Hal  ini  berarti  jumlah  merozoit  yang menginvasi  eritrosit  baru  untuk  menjadi stadium  cincin  dari  stadium  skizon sebelumnya  berkurang  dibandingkan kontrol negatif.
Wihanto L, Ilmi H, Tumewu L, Widyawaruwati A, Zaini AF, Tantular I
Pada  jam  berikutnya  kultur  yang  diberi ekstrak tetap memiliki stadium cincin yang lebih  sedikit  dibandingkan  kontrol  negatif dan  selisihnya  menjadi  semakin  besar. Stadium trofozoit dan skizon juga menjadi lebih  kecil  dibandingkan  kontrol  negatif namun kondisi ini kemungkinan disebabkan proporsi  stadium  sebelumnya  memang lebih rendah, dalam artian stadium trofozoit dan skizon lebih rendah pada kultur dengan perlakuan  ekstrak  dibandingkan  kontrol negatif  karena  pada  pengamatan  waktu sebelumnya  stadium  cincin  dan  trofozoit pada kultur dengan perlakuan ekstrak sudah lebih rendah dibandingkan kontrol negatif.
Pada  pengamatan  setelah  48  jam masa  inkubasi,  nampak  perbedaan  pada ketiga  jumlah  stadium  baik  cincin,
trofozoit, maupun skizon yang ditunjukkan pada Tabel 1.
Ketiganya lebih sedikit pada kultur yang  diberi  ekstrak  dibandingkan  kondisi normal tanpa bahan uji. Perbedaan terutama pada  proporsi  stadium  cincin  yaitu  2,75% pada kultur dengan senyawa uji dan 41,41% pada  kontrol  negatif.  Hasil  tersebut menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol A. acuminatissima menghambat  pertumbuhan parasit  pada  stadium  skizon  menjadi stadium cincin.
Pada pengamatan morfologi menggunakan  mikroskop  cahaya  (Nikon) dengan pembesaran 1000x terhadap biakan yang  diinkubasi  ekstrak,  bentukan  cincin relatif  normal  dan  tidak  berbeda  dengan bentukan cincin pada biakan kontrol negatif pada semua waktu pengamatan.
Gambar  1. Morfologi P.  falciparum setelah  diinkubasi  bersama  ekstrak  etanol A. Acuminatissima . Bentuk cincin (e) nampak tidak ada perbedaan dibandingkan kontrol. Bentuk trofozoit  dan  skizon  nampak  vakuola  digestif  membesar  berwarna  jernih  hampir  memenuhi sitosol  (f,  g)  dan  terjadi  vesikulasi  yaitu  sitoplasma  mengalami  vakuolisasi  dengan  bentukan vesikel-vesikel (h). Pigmen hemozoin nampak berwarna lebih gelap (f, g, h)
Perubahan morfologi parasit didapatkan terutama pada bentuk trofozoit dan skizon yaitu sitosol parasit menipis dan jernih di bagian tengah dan vakuola digestif membesar  berbentuk  bulat  dengan  batas tegas  pada  sitoplasma  parasit,  yang beberapa  membesar  hampir  memenuhi seluruh sitoplasma.
Vakuola  digestif  diperkirakan merupakan vesikel yang khusus diperuntukkan  untuk  proses  degradasi hemoglobin  parasit.  Proses  degradasi hemoglobin terutama terjadi pada stadium trofozoit  dan  skizon  yang  menunjukkan aktivitas  metabolik  terbesar.  Proses  ini memiliki peran vital sebagai sumber utama asam  amino  yang  diperlukan  untuk pertumbuhan  dan  perkembangan  parasit
(16). Parasit di samping fungsi nutrisi, juga perlu  mendegradasi  hemoglobin  untuk mengurangi  volume  dan  mencegah  lisis prematur  dari  eritrosit  yang  akan  terjadi seiring perkembangan volume parasit (17).
Pembesaran vakuola digestif merupakan  tanda  patologis  (18)  yang mengindikasikan  adanya  kemungkinan ekstrak A. acuminatissima memiliki aktivitas  antimalaria  dengan  menghambat proses  degradasi  hemoglobin  dan  atau akibat  terhambatnya  proses  detoksifikasi
heme sehingga  terjadi  penumpukan  di dalam  vakuola  digestif.  Gambaran vesikulasi  parasit  yaitu  gambaran  vesikel kecil  multipel  pada  sitoplasma  parasit. menandakan terjadinya degenerasi parasit.
Wihanto L, Ilmi H, Tumewu L, Widyawaruwati A, Zaini AF, Tantular I
Ekstrak A.
acuminatissima
berdasarkan pengamatan terhadap tahapan perkembangan  parasit  mempengaruhi proses  maturasi  stadium  trofozoit  dan skizon  menjadi  bentuk  yang  tidak  normal dan berakibat pada terhambatnya pembentukan merozoit baru dan pecahnya skizon.

## KESIMPULAN
A.  acuminatissima menghambat perkembangan  parasit  intraeritrositik  pada stadium skizon. Perubahan morfologi yang tampak  menyolok  terutama  terjadi  pada stadium  trofozoit  dan  skizon  berupa pembesaran vakula digestif dan vesikulasi pada sitoplasma parasit.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Riley  EM,  Stewart  VA.  Immune mechanisms in malaria: new insights in vaccine  development.  Nat  Med.  2013 Feb;19(2):168–78.
2. WHO.  World  Malaria  Report  2015. World Health Organization. 2015;238.
3. Pusat  Data  dan  Informasi  Kementrian Kesehatan  RI.  InfoDatin-Malaria. Kementrian Kesehatan RI; 2016. 1–7 .
4. Klein EY. Antimalarial drug resistance: A review of the biology and strategies to  delay  emergence  and  spread.  Int  J Antimicrob Agents. 2013;41(4):311–7.
5. Dewoto  HR.  Pengembangan  Obat Tradisional Indonesia Menjadi
Fitofarmaka  .  Maj  Kedokt  Indones.
2007;57(7):205–11.
6. Hafid  AF,  Puliansari  N,  Lestari  NS, Tumewu L, Rahman A, Widyawaruyanti A. Skrining Aktivitas Antimalaria Beberapa Tanaman Indonesia  Hasil  Eksplorasi  dari  Hutan Raya  Cangar,  Batu-Malang,  Jawa Timur.  J  Farm  dan  Ilmu  Kefarmasian Indones. 2019;3(1):6-11.
7. Cahyaningsih,  E. 'Kajian  bahan  aktif antimalaria  dari  daun  Salam  Badak (Acmena  acuminatissima)  terhadap
Plasmodium falciparum in vitro', Tesis,
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Surabaya, 2015
8. Wilcox  M,  Bodeker  G,  Rasoanaivo  P. Traditional  Medicinal  Plants  and Malaria: Guidelines for the Nonclinical Evaluation  of  the  Efficacy  of Traditional  Antimalarials.  Wilcox  M, Bodeker  G,  Rasoanaivo  P,  editors.
Florida: CRC Press, LLC, 2004. 266-67
9. Bhat  GP,  Surolia  N.  In  vitro antimalarial activity of extracts of three plants used in the traditional medicine of  India.  Am  J  Trop  Med  Hyg. 2001;65(4):304–8.
10. Trager  W,  Jensen  JB.  Human  Malaria Parasites in Continous Culture. Science. 1976;193(August):673–5.
11. Kunwittaya  S,  Treeratanapiboon  L, Srisarin A, Isarankura-Na-Ayudhya C, Prachayasittikul  V.  In  vitro  study  of
parasite  elimination  and  endothelial protection  by  curcumin:  Adjunctive therapy for cerebral malaria. EXCLI J. 2014;13(Cm):287–99.
12. Gamo F-J, Sanz LM, Vidal J, de Cozar C,  Alvarez  E,  Lavandera  J-L,  et  al.
Thousands  of  chemical  starting  points for  antimalarial  lead  identification.
Nature. 2010;465(7296):305–10.
13. Lambros C, Vanderberg JP.
Synchronization of Plasmodium falciparum  erythrocytic  stages  in culture. J Parasitol. 1979;65(3):418–20.
14. Bogitsh,  B.,  Carter,  C.  and  Oeltmann, T.  Human  parasitology.  Burlington,
MA:  Elsevier  Academic  Press,
2013.116-25.
15. Farrar, J., Hotez, P., Junghanss, T., Kang, G., Lalloo, D. and White, N.
Manson's tropical diseases. 3rd ed.,
Philadelphia: Elsevier Saunders, 2014.
532-66
16. Ihekwereme  CP,  Esimone  CO, Nwanegbo  EC.  Hemozoin  inhibition and  control  of  clinical  malaria.  Adv Pharmacol Sci, 2014(45):1-7.
17. Coronado LM, Nadovich CT,
Spadafora C. Malarial hemozoin: From target to tool. Biochim Biophys Acta - Gen Subj, 2014;1840(6):2032–41.
18. Rosenthal PJ. Plasmodium falciparum: Effects  of  Proteinase  Inhibitors  on
Globin Hydrolysis by Cultured Malaria
Parasites.  Exp  Parasitol.  1995  Mar 1;80(2):272–81.