Isolasi Gen Pengkode Arthropod Odorant Binding Protein D7 dari Kelenjar Saliva Vektor Malaria
Anopheles sundaicus
Isolation of Genes Encoding Arthropod Odorant Binding Proteins (OBP), D7 from Salivary Gland Vectors of Malaria: Anopheles sundaicus
Nuryatmaja Gora Pawana 1 , Kahar Muzakar 2 dan Kartika Senjarini 3*)
Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Jember University, Jember
*) E-mail : Kartika_senjarini@yahoo.com

## ABSTRACT
The isolation of Arthropod Odorant Binding, D7 protein, encoding genes from Anopheles sundaicus and An.  maculatus  mosquitos  as  the  malaria  vectors  in  Indonesia  is  necessary  to  recognize  their characteristic.  The  isolated  genes  can  be  used  to  develop  the  Transmission  Blocking  Vaccine  (TBV). This research aims to characterize the D7 protein encoding genes from An. sundaicus and An. maculatus through the synthesis of complementary DNA (cDNA) of D7 protein by using D7 protein primer that has  been  used  for  the  other  species  of  Anopheles.  The  mosquitos  were  taken  from  Dusun  Parasputih, Bangsring,  Wongsorejo,  Banyuwangi,  Jawa  Timur.  Isolation  of  the  salivary  gland  was  done  by performing  microdisection  method  and  the  isolation  of  the  total  RNA  was  done  by  performing  High Pure RNA Isolation Kit (Roche-Germany). Synthesis of cDNA D7 encoding gene and its amplification were performed by using Maxime RT-PCR Premix Kit (iNtRon Biotechnology). The result of the total RNA and RT-PCR were run  in agarose gel and visualized under the UV transiluminator. Based on the visualization,  we  found  that  the  salivary  gland  total  RNA  of  female  An.  sundaicus  was  500-750  base pair (bp). The RT-PCR visualization showed a band sized below 100 bp and it was concluded not to be the  size  of  the  D7  protein  encoding  gene.  An  incompatibility  of  D7  primer  from  An.  gambiae  with cDNA template from An. sundaicus was suspected to be the reason of the gene isolation failure.
Keywords : gene isolation, D7 protein, salivary gland, Anopheles sundaicus

## PENDAHULUAN
Teknologi  transkriptomik  adalah  teknoogi  yang menganalisa dan mengidentifikasi sekuen nuklotida  RNA  yang  mengkode  gen  (DNA) fungsional  tertentu  secara  kuantitatif  maupun kualitatif  berkaitan  dengan  fungsinya  secara seluler  (Valenzuela et  al .,  2003).  Salah  satu contoh  hasil  teknologi  transkriptomik  yaitu penelitian pada kelenjar saliva Anopheles gambiae sebagai  vektor  malaria  di  Afrika.  Penelitian  ini memberikan  informasi  tentang  sejumlah  protein yang  mampu  mendukung  patogenesis  parasit  dan dapat  memicu  sistem  imun  pada  inang  (antigen) serta  sekuen  asam  amino  penyusunnya  (Calvo et al. , 2005; Choumet, 2010). Kelenjar  saliva An.  gambiae mengandung protein D7 yang terdiri atas lima kelompok (D7r1, D7r2,  D7r3,  D7r4  dan  D7r5)  yang  mengganggu pelbagai aspek fisiologi inang.  D7r1 – D7r4 dapat mengikat  serotonin,  norepinefrin,  dan    histamin yang berperan dalam respon imun lokal sehingga mendukung kesuksesan transmisi parasit ke tubuh inang.    Kelompok  protein  ini  telah  terbukti berperan sebagai imunomodulator, imunosupresor dan vasodilator yang menurunkan kepekaan imun inang  dan  membantu  proses  makan  darah  ( blood feeding ) (Calvo et al. , 2005).
Spesies  nyamuk  yang  telah  dikonfirmasi menjadi  vektor  penularan  malaria  di  Indonesia antara  lain An.  aconitus Donitz, An.  supictus Grassi, An.  sundaicus Rodenwaldt  (Soekirno, et al .,  2006). An.  sundaicus dipilih  sebagai  obyek dalam  penelitian  ini  karena  berperan  sebagai vektor  malaria  di  Jawa.    Nyamuk  jenis  ini  dapat diperoleh  salah  satunya  di  daerah  Bangsring, Wongsorejo,  Banyuwangi,  Jawa  Timur  sebagai daerah  endemik  malaria  (Mardiana et al. ,  2003). Habitat    spesifiknya    di  daerah  pesisir  pantai dengan  tingkat  salinitas  mulai  dari  rendah, genangan  air  payau  terlantar,  bahkan  beberapa adaptif  terhadap  air  tawar.    Kolam  penduduk sekitar pantai, rawa, lagun, bakau terbuka, tambak udang  dan  ikan  di  pesisir  menjadi  habitat perindukannya.    Vektor  ini  dikonfirmasi  juga memberi  kontribusi  penyebaran  malaria  di Sumatera  bahkan  di  Malaysia  dan  Thailand  serta beberapa daerah Indo-cina (Sinka et al. , 2011). Karena An.  sundaicus telah  diketahui sebagai  vektor  penting  malaria,  maka  perlu dilakukan  karakterisasi  gen  pengkode  D7  dari kelenjar  saliva  vektor  tersebut.    Gen  pengkode tersebut didapatkan dari sintesis cDNA menggunakan  primer  D7  hasil  konservasi  dan RNA  total  hasil  isolasi  dari  kelenjar  saliva nyamuk yang digunakan sebagai template .  Hasil
penelitian  ini  selanjutnya  dapat  digunakan  dalam pengembangan Transmission  Blocking  Vaccines (TBV)  malaria di Indonesia.

## METODE
Metode  penelitian  terdiri  atas  empat  tahap,  tahap pertama  yaitu  koleksi  nyamuk An.  sundaicus dengan landing  collection ke  daerah  endemik, tahap  kedua  melakukan  isolasi  kelenjar  saliva nyamuk  betina,  tahap  ketiga  adalah  isolasi  RNA total,  tahap  keempat  yaitu  isolasi  gen  pengkode D7.  Nyamuk  diambil  dari  Desa  Bangsring, Wongsorejo,  Banyuwangi,  Jawa  Timur  sebagai daerah  endemik  malaria.    Jenis  kelamin  betina dipilih  karena  kompetensinya  dalam  penyebaran parasit malaria melalui aktivitas blood feeding . Isolasi  kelenjar  ludah  dilakukan  dengan metode microdisection dan  tahap  ketiga  adalah isolasi  RNA  total  dilakukan  dengan High  Pure RNA  Isolation  Kit (Roche-Germany).  Tahap keempat  yaitu  menyusun complementary  DNA (cDNA) dan diamplifikasi dengan primer D7 dari An.  gambaie (hasil  konservasi)  dengan  fragmen sebagai berikut: D7rpl forward 5’ AACACGGTTAAGAAGTGTGA GAAG 3’ dan reverse 5’ TTAGTTGCAAATCTT GTCATCGATTT 3’; D7rp2 forward 5’ CGAAAGG AGTCAACGGTGGAGG 3’ dan reverse 5’ CTAGC ACAAACCATCATCGATTTCC; 3’ D7rp3 forward 5’ AGACAAGAGGAAACGGTTGAAGAATGC 3’ dan reverse 5’ TCAGTTACACAGCCCATCATCA A 3’; D7rp4 forward 5’ GAGACTGTGCAAGATT GTGAGAAT 3’ dan reverse 5’ TCAGCAGTTTA ATGCCTTATCATAATC 3’; D7rp5 forward 5’ GT GAGTGATTGTGTGAGGCATG 3’ dan reverse 5’ TTAGCACCGTAACTGACTGTTCAAC 3’ (Calvo et al. , 2005).
Sintesis  cDNA  dan  amplifikasinya  dilakukan dengan  menggunakan Maxime  RT-PCR  Premix Kit ( iNtRon  Biotechnology ).    Hasil  isolasi  RNA total  dan  RT-PCR  di- running dalam  gel  agarose dan divisualisasi di bawah transiluminator UV .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
RNA  Total  Kelenjar  Saliva An.  sundaicus Betina
Visualisasi  hasil  isolasi  RNA  total  dari kelenjar  saliva An. sundaicus menggunakan High Pure  RNA  Isolation  KIT ( Roche–Germany ) menunjukkan  kemunculan  dua  pita  tipis  yang menandakan  sub  unit  ribosomal  28S  dan  18S antara  500  –  750  bp  pada  marker  DNA  1  kb (Gambar  1).    Pita  28S  rRNA  pada  hasil  isolasi RNA  kelenjar  ludah An. sundaicus tampak  lebih
tebal  dibandingkan  pita  18S,  kira-kira  dua  kali lebih  kuat  (rasio  2  :  1).    Penggunaan heat block dan  tanpa heat  block tidak  mempengaruhi ketebalan band RNA  total  hasil  isolasi.    Data  ini mengindikasikan bahwa RNA dapat diisolasi dari jaringan  secara  utuh  dan  dapat  digunakan  untuk tahap sintesis cDNA dengan menggunakan primer tertentu (White, 2004).
Gambar 1. Visualisasi Isolasi RNA Total Kelenjar Saliva An. sundaicus; M : marker 1 kb , RNA 1: RNA kelenjar saliva dengan heat block , RNA 2 : RNA  kelenjar  saliva  tanpa heat  block; menggunakan High  Pure  RNA  Isolation  Kit ( Roche - Germany );  n  =  13  (kelenjar  saliva  yang digunakan); agarose 1,5%, 90 menit, 80 Volt.

## Gen Pengkode Protein D7 dari Kelenjar Saliva
An. sundaicus Betina Maxime  Reverse  Transcription-Poly  Chain Reaction  (RT-PCR)  PreMix  Kit (iNtRon Biotechnology )  digunakan  untuk  mengisolasi DNA pengkode  protein D7 menggunakan primer d7rp1  –  d7rp5  dari  sampel  RNA  total.    Langkah RT-PCR dapat dilakukan baik dalam tabung yang sama  dengan  PCR  ( one  step  PCR )  atau  dengan memisahkan  satu  tabung  dilanjutkan  ke  tabung berikutnya    ( two  step  PCR )  menggunakan  suhu antara 40 °C dan 50 °C, tergantung pada sifat-sifat reverse  transcriptase (enzim  yang  dapat menyusun  DNA  dari  RNA)  yang  digunakan. Langkah  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah two  step RT-PCR  karena  mempunyai beberapa  kelebihan  daripada one  step RT-PCR yaitu  lebih  sensitif  dan    penggunaan  cDNA sebagai  cetakan  dalam  PCR  bersifat  lebih  stabil daripada  RNA  karena  kandungan  ikatan  CH (stabil pada kondisi basa) (O’Connell, 2002).
Band  cDNA  hasil  tahap  RT  tidak  muncul pada  visualisasi  hasil  running gel  agarose . Diduga ketidakmunculan cDNA karena konsentrasinya  yang  sangat  kecil.  Tahap  PCR dilakukan  untuk  meng-amplifikasi  cDNA  dan ternyata tampak beberapa band pada gel agaraosa, yaitu  pada  sumuran  drp2  (D7rp2),  drp  4  (D7rp4) dan  drp5  (D7rp5,  sedangkan Band D7rp1  dan D7rp3 pada sumuran drp1 dan drp3 tidak tampak pada visualisasi (Gambar 2).
Gambar 2. Visualisasi cDNA Gen D7 (D7rp1 – 5) dari Kelenjar Saliva An. sundaicus ; agarose 1,5%, 30 menit, 100 volt; M : marker 10 kb, sumur drp1 : sampel dengan primer D7rp1, sumur drp2 : sampel dengan primer D7rp2, drp3 : sampel dengan primer D7rp3, sumur drp4 : sampel dengan primer D7rp4 dan sumur drp5 : sampel dengan primer D7rp5 .
Perbedaan  urutan  nukleotida  pada  cDNA bisa menyebabkan kegagalan primer melekat pada sekuen targetnya, seperti halnya yang terjadi pada D7rp1  dan  D7rp3.    Primer  D7rp3 An.  gambiae mempunyai
urutan nukleotida forward 5’AGACAAGAGGAA  ACGGTTGAAGAATGC 3’ dan reverse 5’ TCAGT
TACACAGCCCATCATCAA  3’  (Calvo et  al. ,
2005).  Pada  saat annealing PCR, forward menempel  pada  sekuen  DNA  dengan  urutan  3’ TCTGTTCTC  ….  5’  selanjutnya reverse menempel  pada  3’  AGTCAATGT  …  5’,  cDNA double-strand terbentuk  dari  hasil  penenmpelan tersebut.    Hasil  ini  dapat  dicek  ukurannya  dalam satuan base  pair dengan  cara  elektroforesis. Apabila  primer  tidak  menemukan  nukleotida target/residu  pada  ujung  3’  yang  komplementer dengan  dirinya  maka  DNA  tidak  akan  terbentuk dan  tidak  terlihat band pada  gel  agarose  ( non- amplicon )(Han  &  Kim,  2006;  Barlet  &  Stirling, 2010). Berdasarkan  marker, band drp2,  drp4  dan drp5  berukuran  kurang  dari  100  bp.    Apabila dibandingkan  dengan  ukuran  protein  pelbagai Diptera,  ukuran  gen  pengkode  protein  ini  sangat berbeda (Tabel 1).
Tabel 1. Ukuran Gen Pengkode Protein D7 Diptera No Jenis Diptera Ukuran D7 (bp) Referensi 1 An. gambiae
D7rp1 = 400 Arca et al. , 1999 D7rp2 = 479 D7rp3 = 500 2 An. stephensi
179 - 538 Dixit et al. , 2009 3 Ae. aegypti 1000 Peng, et a.l , 1999 4 Plhebotomus thobbi 684 – 732* Rohousova et al. ,
2012 5 P. sergenti
722 – 724 *
* : konversi dari KDa ke base pair (DNA size to Protein Size Tool)
Protein  D7  terdapat  pada  Diptera  dan menempatkannya pada kelompok super famili D7. Kelompok  ini  terbagi  menjadi  dua sub-family protein  D7  dengan  berat  protein  berbeda,  yaitu protein  pendek  (D7 short  family )  dan  protein panjang  (D7 long  family ).    Protein  D7  pendek mempunyai berat antara 15 – 20 kDa dan protein panjang beratnya 27 – 30 kDa (Dixit, et al., 2009; Drame  et  al.,  2013).    Berat  dalam  kDa  dapat dikonversi  dengan DNA  size  to  Protein  Size Convertion  Tool (http://www.molbiol.ru/eng/ scripts/01_06.html)  menjadi base  pair dengan acuan  umum  37  kDa  mengandung  1000  bp/1  kb, sehingga ukuran protein pendek D7 berkisar 405 – 541 bp, sedangkan protein panjang 730 – 811 bp.
Berdasarkan  tabel  1  dapat  disimpulkan bahwa band yang  muncul  pada  visualisasi  hasil RT-PCR  bukan  gen  pengkode  protein  D7. Band yang  terbentuk  diduga  sebagai  hasil  amplifikasi dari  primer  D7rp2,  D7rp4  dan  D7rp5  yang berpasangan  dengan  sisa-sisa  dNTPs  pada  saat PCR.  Primer D7rp1 hingga D7rp5 kemungkinan tidak sesuai dengan urutan nukleotida cDNA yang disintesis  dari  RNA  total,  hal  ini  karena  primer yang digunakan dalam penelitian ini dikreasi dari An.  gambie sebagai  vektor  malaria  di  Afrika ( afrotropical ) (Calvo et  al. ,  2005;  Garros  & Dujardin,  2013),  sedangkan  mRNA  total  dan cDNA  dengan  kode  nukleotidanya  berasal  dari kelenjar  saliva An.  sundaicus sebagai  vektor malaria  di  Asia  (oriental).    Perbedaan  jenis Anopheles diduga menjadi penyebab ketidaksesuaian primer dan tidak terisolasinya gen pengkode D7 pada An. sundaicus . Self-annealing bisa  terjadi  pula  pada  saat PCR  karena  ketidaksesuain  primer  dengan template sehingga terbentuk band kurang dari 100 bp  pada  D7rp2,  D7rp4  dan  D7rp5.    Primer    D7 tidak  menemukan  cetakannya  sehingga  terjadi penempelan  dengan  dirinya  sendiri  dan  hasil penempelan  itu  teramplifikasi. Olygo  Analyzer software dapat  digunakan  untuk  mengetahui kemungkinan  pasangan  nukleotida  dalam  satu pimer  dapat  terjadi.    Di  bawah  ini  adalah  salah satu  model  keluaran Self-annealing yang kemungkinan  terjadi  pada  primer  forward  D7rp5 dengan  urutan  nukleotida  5’  GTGAGTGAT TGTGTGAGGCATG 3’.

## Hasil analisis Program Oligo Analyzer -
1.0.2

## Primer D7rp5 forward
Name          : Primer 1 (forward) Primer        : 5´- GTGAGTGATTGTGTGAGGCATG- 3´ Reverse       : 3´- GTACGGAGTGTGTTAGTGAGTG- 5´ Length        : 22 nt
Tm (basic)    : 66.0 ºC GC %          : 50.0 % dG            : -38.1 kCal/mol Molecular weight : 6963.5 g/mol
Primer 1 self annealing:
5'-GTGAGTGATTGTGTGAGGCATG-3' |||| 3'-GTACGGAGTGTGTTAGTGA GTG-5' dG: -2.17 kcal/mol
Primer 1 loops: None!
Data  analisis  menunjukkan  bahwa  primer D7rp5  tersusun  atas  22  basa  nukleotida  dan mempunyai melting  Temperature 66 0 C  ( Tm basic ).  Tm    merupakan  temperatur  yang diperlukan oleh separoh primer dupleks mengalami disosiasi/lepas ikatan.  Primer dengan Tm  berkisar  antara  52  –  58 0 C  sangat  ideal, sedangkanTm  di  atas  65 0 C  akan  mengurangi efektifitas annealing sehingga  proses  amplifikasi DNA kurang berjalan dengan baik.  Tm ini sangat ditentukan  oleh  jumlah  basa  GC  (GC contains ). Prosentase  kandungan  basa  Guanin  dan  Cytosin sebesar  50%  (GC%)  dengan  nilai  energi pengikatan delta  G (dG) sebesar -38,1 kCal/mol. Berat molekul D7rp5 sebesar 6963,5 g/mol. Self- annealing ( self  dimer )  terjadi  karena  urutan nukleotida  5’  GTGA  ….  CATG-3’  ( primer forward )  berpasangan  dengan  urutan  nukleotida kebalikannya 3’ GTAC …. AGTG  5’, dengan dG sebesar  -2,17  kCal/mol.      Hasil  analisis menunjukkan tidak ada kemungkinan pembentukan loops pada primer D7rp5. Primer reverse pun  dapat  mengalami self- annealing dengan  dirinya  sendiri,  dengan  model keluaran Olygo Analyzer sebagai berikut:
Hasil analisis Program Oligo Analyzer - 1.0.2

## Primer D7rp5 reverse
Name          : Primer 2 (reverse) Primer        : 5´- TTAGCACCGTAACTGACTGTTCAAC-3´ Reverse       : 3´- CAACTTGTCAGTCAATGCCACGATT-5´ Length        : 25 nt
Tm (basic)    : 72.0 ºC GC %          : 44.0 % dG            : -43.4 kCal/mol Molecular weight : 7663.0 g/mol

## Primer 2 self annealing:
5'-TTAGCACCGTAACTGACTGTTCAAC-3' |||    ::: 3'-CAACTTGTCAGTCAATGCCACGATT-5' dG: -0.31 kcal/mol
5'-TTAGCACCGTAACTGACTGTTCAAC-3' ||| : : :::
3'-CAACTTGTCAGTCAATGCCACGATT-5' dG: -0.07 kcal/mol
5'-TTAGCACCGTAACTGACTGTTCAAC-3' ||| :::
3'-CAACTTGTCAGTCAATG
CCACGATT-5' dG: -0.07 kcal/mol
5'-TTAGCACCGTAACTGACTGTTCAAC-
3' |||      ::: 3'-CAACTTGTCAGTCAATGCCACGATT-5' dG: 0.31 kcal/mol

## Primer D7rp5 reverse loops:
5'-TTAGCACCGTAACTGACT |||  ) 3'-CAACTTG dG: -0.20 kcal/mol
5'-TTAGCACCGTAACTG |||  A 3'-CAACTTGTC dG: 0.04 kcal/mol
5'-TTAGCA |||   ) 3'-CAACTTGTCAGTCAATGCC dG: 0.43 kcal/mol
Primer reverse D7rp5  dengan  urutan  5’ TTAG …. CAAC 3’ dapat berpasangan dengan 3’ CAAC  ….  GATT  5’  sebagai  kebalikan  urutan nukleotida  primer reverse itu  sendiri.    Analisa menunjukkan  bahwa  ada  empat  kemungkinan self-annealing yang  bisa  terjadi  pada  primer D7rp5 reverse dan  terbentuk  tiga  kemungkinan pembentukan loops .
Penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa perbedaan  urutan  beberapa  sekuen  asam  amino penyusun  protein  D7/OBP  pada  beberapa  genus Anopheles  yang  berbeda  spesies  ( An.  stephensi , An.  darlingi , An.  funetus , An.  gambiae )  dan Ae. aegypti, dapat  saja  terjadi  karena  evolusi  protein (Gambar  3)  dan  adaptasi  isolasi  geografi  suatu populasi. Teknologi proteomik dan transkriptomik  dapat  menganalisa  perubahan sekuen asam amino ( Amino Acid Sequencing) dan urutan  nukleotida  gen  pengkodenya.  Perbedaan urutan asam amino ini menimbulkan konsekuensi fisiologis  perbedaan  kemampuan  D7  sebagai protein imunomodulator dalam mengikat komponen asam amino biogenik dan anti-platelet cysteinyl leukotrienes (CysLTs) dan thromboxane A2  (TXA2))  dalam  respon  imun,  khususnya antara kelompok Anopheles sp dan Aedes aegypti (Alvarenga et  al. ,  2010).    Hal  ini  tentu  saja berkaitan  dengan  perubahan  beberapa  struktur asam amino pada protein D7.
Protein  panjang  D7  pada ancestral mengalami  duplikasi  yang  menurunkan  protein- protein  pendek  D7  dengan  kemampuan  lebih spesifik sebagai imunomodulator dalam mengikat amino  biogenik.      Protein  D7rp1  dan  D7rp2 memiliki  kemampuan  mirip  seperti  nenek
moyangnya  yaitu  kompeten  dalam  pengikatan serotonin,  norepinefrin  dan  epinefrin,  sedangkan D7rp3 dan D7rp4 lebih spesifik dalam pengikatan serotonin  dan  histamin.    D7rp5  mengalami kehilangan  kemampuan  mengikat  asam  amino biogenik  dan  sampai  sekarang  belum  diketahu fungsinya  (pseudogen).  Kehilangan  kemampuan D7rp5  tidak  terjadi  pada Ae.  agypti dalam mengikat  serotonin,  histamin,  norepinefrin  dan epinefrin (Calvo et al. , 2005).
Gambar 3.  Model Evolusi Fungsi Protein D7 dari An. gambie dalam Kemampuannya Mengikat Amino Biogenik; 5-HT : serotonin, EP : epinefrin, NE : norepinefrin, H : histamine (Calvo et al ., 2005).
Vektor  malaria  yang  berbeda  wilayah geografi  diduga  pula  menjadi  pemicu  perbedaan urutan nukleotida penyusun substansi genetiknya. Delesi  suatu  atau  beberapa  basa  nukleotida menyebabkan  jumlah  basa  penyusun  suatu  gen berubah  dan  menyebabkan  suatu  spesies mengalami  spesiasi  divergensi  menjadi  dua  sub spesies  ( sublink )  yang  berbeda.    Penelitian  pada An.  sundaicus di  India  (Andaman  dan  Nicobar) yang  hidup  di  air  payau  dan  air  tawar menunjukkan  pebedaan  sekuen  ribosomal  DNA (rDNA) internal  transcribed  spacer  2 (ITS  2) antara An.  sundaicus  A dari  Vietnam  dan An. sundaicus  s.  s. dari  Malaysia.    Basa  nukleotida nomor  431  dan  490  mengalami  substitusi  dari  C ( Cytosin )  menjadi  T  ( Tymin )  dan  G  ( Guanin ) menjadi  T,  sedangkan  delesi  basa  C  terjadi  pada basa  nomor  555.  Tidak  disebutkan  konsekuensi fisiologis  yang  terjadi  dari  perbedaan  sekuen tersebut,  hanya  diprediksi  pemicu  perbedaan adalah  isolasi  geografis  antara An.  sundaicus Andaman  dan  Nicobar  dengan  Vietnam  dan Malaysia  menjadi  sub  spesies  berbeda  dari kelompok  Anopheles  kompleks.    Perbedaan  ini semakin  nyata  pada  pem band ingan  sekuen domain-D3  28S  rRNA  pada An.  sundaicus Andaman  dan  Nicobar  dengan Anopheles sp MYJ-1, An. minimus yang berbeda spesies dengan kesamaan sekuen 95% dan tingkat divergensi 3%. Pembadingan  dengan An.  dirus D  dari  Cina  dan An.  dirus A  dari  Kamboja  dengan  penurunan kesamaan  sekuen  sebesar  63,7%  dan  60,8% (Alam et al. , 2006).
Perubahan  urutan  nukleotida  kemungkinan terjadi pula pada gen pengkode D7 An. sundaicus. Perbedaan jenis asam amino penyusun D7 protein pada beberapa region dapat membawa konsekuensi  perbedaan  beberapa  urutan  basa nukleotida DNA pengkode protein, sesuai konsep
dogma biologi transkripsi dan translasi. Kemungkinan  hal  inilah  yang  mengakibatkan primer  D7  dari An.  gambiae tidak  menemukan template dari cDNA kelenjar saliva An. sundaicus pada saat PCR dan meyebabkan gen pengkode D7 dari  kelenjar  saliva An.  sundaicus betina  tidak terisolasi.

## KESIMPULAN
Ukuran  RNA  total  yang  telah  berhasil  diisolasi dari  kelenjar  saliva An. sundaicus betina  sebagai vektor  malaria  di  Desa  Bangsring,  Wongsorejo, Banyuwangi, Jawa Timur kurang lebih 500 – 750 bp.   Gen pengkode protein D7 dari kelenjar saliva An. sundaicus belum berhasil diisolasi, visualisasi hasil  RT-PCR  menunjukkan  adanya  band berukuran  di  bawah  100  bp  dan  disimpulkan bukan  merupakan  ukuran  gen  pengkode  protein D7.
Untuk penelitian selanjutnya,  primer D7 yang digunakan  sebaiknya  hasil  eksplorasi  dari Anopheles  yang  berperan  sebagai  vektor  malaria di daerah oriental sehingga meminimalkan resiko perbedaan  urutan  nukloetida  yang  terlalu  besar dan  kemungkinan  menyebabkan  primer  tidak menemukan template yang komplementer.  Untuk memastikan  bahwa  hasil  RT-PCR  adalah  gen pengkode protein D7, perlu dilakukan sequencing DNA  dan  dikonfirmasi  dengan  data Gene  Bank (http: //www.ncbi. nlm.nih.gov/nucleotide). Apabila  sesuai  dengan  data  acuan  dan  diketahui bahwa  sekuen  tersebut  adalah  pengkode  protein D7,  tahap  kloning  dan  produksi  protein  dapat dilakukan  untuk  keperluan  tahap  penelitian selanjutnya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Proyek Penelitian  Hibah  Pascasarjana  sesuai  SPK  Dikti Nomor  358/UN25.3.1/LT.6/2013  yang  telah membiayai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Alam,  M.  T.,  M.  K.  Das,  M.  A.  Ansari,  Y.  D. Sharma.  2006.  Molecular  identification  of Anopheles  (Cellia)  sundaicus from  the Andaman and Nicobar islands of India. Acta Tropica Vol. 97 : 10 – 18.
Alvarenga, P. H., I. M. B. Franchiscetti, E. Calvo,
A.  Sa-Nunes,  J.  M.  C.  Ribeiro,  J.  F. Andersen.  2010. PLos Biology Vol.  8  (11)  :
1 – 15.
Arca,  Lombardo,  Cappuro,  Torre,  Dimopoulos, James  &  Coluzzi.  1999.  Traping  cDNA Encoding  Secreted  Proteins  from  The Salivary  Glands  of  The  Malaria  Vector
Anopheles gambiae . PNAS Vol.  96:  1516  – 1521.
Barlet,  J.  M.  S.,  D.  Stirling.  2010. Method  in Molecular  biology  :  PCR  Protocol  Second Edition . Totowa, NJ : Humana Press, inc.
Calvo  E.,  Mans  B.  J.,  Andersen  J.  F.,  Ribeiro  J.
M.  2005.  Function  and  Evolution  of  a Mosquito  Salivary  Protein  Family. J  Biol Chem . Vol. 281:1935–1942.
Choumet,  V.  2010.  Proteomics  of Anopheles gambiae . Malariae Parasites Journal Vol. 1 : 40 – 49.
Dixit, R., A. Sharma, D. T. Mourya, R. Kamaraju, m. S. Patole, Y. S. Shouche. 2009. Salivary gland transcriptome analysis during
Plasmodium  infection  in  malaria  vector Anopheles  stephensi . International  Journal of Infectius Diseases Vol. 13 : 636 – 646.
Drame,  P.  M.,  A.  Poinsignon,  A.  Marie,  H.
Noukpo,  S.  Doucoure,  S.  Cornelie,  F. Remoue.  2013. New Salivary Biomarkers of Human  Exposure  to  Malaria  Vector  Bites . InTech : Croasia.
Han S., D. Kim. 2006. AtRTPrimer: database for Arabidopsis genome-wide homogeneous and specific  RT-PCR  primer-pairs. BioMed
Central Vol. 7 : 1 - 9
Mardiana, Wigati, T. Suwaryono. 2003. Aktivitas Menggigit Anopheles sundaicus di Kecamatan Wongsorejo, Kabupaten
Banyuwangi,  Jawa  Timur. Media  Litbang
Kesehatan Vol. 13 (2) : 26 – 30.
O’Connell,  J.  2002. Methods  in  Molecular Biology:  RT-PCR  Protocols Vol.  193.  New
Jersey : Humana Press, Inc. Peng  Z,  Yang  J,  Wang  H,  Simons  FE.  1999. Production and characterization of monoclonal antibodies to two new mosquito
Aedes  aegypti  salivary  proteins. Insect Biochem Mol Biol Vol. 29(10): 909-914.
Rohousova, I., S. Subhrahmanyam, V. Volfova, J. Mu, P. Volf, J. G. Valenzuela, R. C. Jochim.
2012.  Salivary  Gland  Transcriptomes  and Proteomes  of  Phlebotomus  tobbi  and Phlebotomus sergenti, Vectors of
Leishmaniasis.  PlOs    Neglected  topical Disease Vol. 6 (5) : 1 – 27.
Sinka,  M.  E.,  M.  J.  Bangs,  S.  Manguin,  T. Chareonviriyaphap,  A.  P.  Patil,  W.  H. Temperley,  P.  W.  Getting,  I.  R.  Elyazar,  C. W. Kabaria, R. E. Harbach, S. I. Hay. 2011. The  dominant  Anopheles  vectors  of  human malaria in the Asia-Pacific region:
occurrence  data,  distribution  maps  and bionomic précis. Parasites and Vector Vol 4
: 1 – 46.
Soekirno,  M.  M.  Sudomo,  A.  Munif.  2006.
Ketahanan  Hidup  di  Alam  Tiga  Spesies Nyamuk Anopheles di  Indonesia. Jurnal Ekologi Kesehatan Vol. 5 (2): 404 – 408.
Valenzuela,  J.  G.,  I.  M.  B.  Francischetti,  V.  M. Pham,M. K. Garfield.J. M. C. Riebeiro. 2003. Exploring    the  salivary  gland  transcriptome and  proteome  of  the Anopheles  stephensi mosquito. Insect  Biochemistry  and  Molecular Biology Vol. 33: 717 – 732.
White,  P.  2004. Evaluating  Concentration  and Purity  of  RNA  Functional  Genomic  Core .
University of Pennsylvania.

## Sumber online :
http: //www.ncbi. nlm.nih.gov/nucleotide [diakses 5 Mei 2014]