PENGARUH  SUSU  IBU  HAMIL  TERHADAP  EKSPRESI KALLIKREIN-RELATED  PEPTIDASE-4 (KLK-4) PADA SEL AMELOBLAS DALAM TUMBUH KEMBANG GIGI (Studi terhadap Gigi Janin Mencit Mus Musculus L.)
Salma Samia*, Sandy Christiono**, Rina Kartika Sari***

## ABSTRACT
Background: Tooth development during the embryonic period is a complex process  that  needs  enough  nutrition  for  the  formation  of  healthy  dental tissue.  Kallikrein-related  peptidase-4  (KLK-4)  is  a  serine  proteinase secreted  by  ameloblast  during  transition  and  maturation  stages  in  the amelogenesis  process  which  functions  to  degrade  protein  matrices  so enamel  could  reach  the  final  hardness.  Pregnancy  milk  contains  various nutrients that can increase KLK-4 expression of ameloblast cells in the tooth development. This study aims to determine the impact of pregnancy milk against the KLK-4 expression of ameloblast cell in the tooth development process.
Method: 12 pregnant female mice (Mus Musculus L.)  divided  into control group (given sterile aquadest) and treatment group (given pregnancy milk + sterile aquadest) for 18 days then the tooth germ was taken. Samples were stained  to  see  the  KLK-4  expression.  Data  were  analyzed  using  an Independent sample t-test.
Result: Our study showed that the average amounts of KLK-4 expression in the  treatment  group  are  higher  than  the  control  group.  Based  on  the Independent sample t-test statistic methods, there is a significant difference with the value of p=0,017.
Conclusion: The  pregnancy  milk  could  influence  the  Kallikrein-related peptidase-4 (KLK-4) expression of ameloblast cell in the mice fetus’s tooth development.

## PENDAHULUAN
Pertumbuhan  dan  perkembangan  gigi pada  masa  embrio  merupakan  fase  yang sangat  penting  untuk mendapatkan  benih  gigi yang  dapat  berkembang  sesuai  bentuk  dan fungsi  normalnya 1 .  Perkembangan  gigi  atau odontogenesis  merupakan  proses  kompleks terbentuknya  jaringan  gigi  yang  dimulai  sejak dalam kandungan sekitar 28 hari intra uterin 2 . Salah  satu  proteinase  yang  berperan  dalam tahap pembentukan enamel  adalah Kallikrein- related peptidase-4 (KLK-4). KLK-4 merupakan serine proteinase yang disekresikan ameloblas selama  tahap  transisi  dan  maturasi  dalam
proses amelogenesis yang berfungsi mendegradasi protein matriks sehingga enamel mencapai kekerasan akhir 3 .
Susu ibu hamil mengandung berbagai nutrisi yang diperlukan dalam proses pembentukan  dan  perkembangan  gigi  seperti protein,  kalsium,  fosfor,  vitamin  A,  vitamin  C dan  vitamin    D 4 .  Peningkatan  asupan  kalsium selama  masa  kehamilan  akan  menyebabkan meningkatnya  penyerapan  kalsium  dalam darah  yang  akan  merangsang  ekspresi kalsitonin yang berperan dalam meningkatkan aktifitas  odontoblas  dan  ameloblas 5 .  Pada penelitian  Wahluyo  (2013)  menunjukkan
* Program Pendidikan Sarjana Kedokteran Gigi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Islam Sultan Agung ** Departemen Kedokteran Gigi Anak Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Islam Sultan Agung,
*** Departemen Ilmu Penyakit Mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Islam Sultan Agung Korespondensi: sandy@unissula.ac.id

## Keywords:
Kallikrein-related peptidase-4 (KLK-4), Pregnancy milk, Tooth development
pemberian kalsium bertujuan untuk
meningkatkan mineralisasi dan berperan dalam pembentukan  kristal  matriks  enamel 6 .  Vitamin D  berfungsi  untuk  membantu  metabolisme fosfor dan kalsium.. Vitamin A dan C berperan dalam  menjaga  diferensiasi  sel  ameloblas dalam  perkembangan  gigi 7 .  Asupan  nutrisi yang  kurang  pada  masa  kehamilan  akan berdampak pada ukuran gigi, waktu erupsi gigi, dan  defek  pada  mineralisasi  gigi  yang  dapat meningkatkan  resiko  karies 4 .  Susu  ibu  hamil yang  mengandung  berbagai  nutrisi  tersebut diharapkan dapat meningkatkan ekspresi KLK-
4 pada  sel  ameloblas  dalam  proses perkembangan  gigi.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengetahui  pengaruh  susu  ibu  hamil terhadap ekspresi Kallikrein-related peptidase- 4 (KLK-4) pada sel ameloblas gigi janin mencit .

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini telah mendapat persetujuan  dari    Komite    Etik    Fakultas Kedokteran  Gigi  Universitas  Islam  Sultan Agung  Semarang  dengan  No.  178/B.1- KEPK/SA-FKG/I/2020.  Penelitian  dilakukan  di Laboratorium Biomedik Terintegrasi FK UNISSULA,  Unit  Mikroskop  Elektron  dan Laboratorium  Terpadu  FK  UNAIR,  dan Laboratorium  Patologi  Anatomi  Rumah  Sakit Islam Sultan Agung Semarang.
Jenis  penelitian  ini  adalah True Experimental  Laboratories dengan Post  test only  control  group  design .  Sampel  penelitian yang  digunakan  berjumlah  12  ekor  mencit betina (Mus  Musculus  L) yang  dibagi  dua kelompok,  yaitu  kelompok  kontrol  dimana  6 ekor mencit  betina  bunting  diberikan  aquades steril selama 18 hari, dan kelompok perlakuan dimana  6  ekor  mencit  betina  yang  sedang bunting diberikan susu ibu hamil dengan dosis
117 mg yang dilarutkan dalam 0,5 ml aquades steril selama 18 hari.
Penelitian  ini  menggunakan  beberapa instrumen  yaitu  kandang  mencit  berukuran 40cm x 30cm, tempat makanan dan minuman, pot  plastik, cotton  bud, sonde,  neraca timbangan  analitik,  pinset  anatomis,  gunting bedah,  spuit  volume  1ml,  blade  dan  scalpel, wadah dengan kapasitas 20cc, mikrotom, gelas objek,  gelas  penutup, staining  jar,  clearing xylol,  water  bath, dan  mikroskoskop  cahaya. Bahan yang digunakan adalah susu Prenagen ® mommy moka, bahan marker KLK-
4 dari  HRP-Linked  Polyclonal  Antibody  anti KLK-4: MBS2042557-HRP, MyBioSource, Inc.
USA, methylene  blue  1%, aquades  steril, kapas, alkohol 70%, larutan formalin 10%, dan kloroform,
Hewan  uji  dikawinkan  dengan  cara menggabungkan  tiga  ekor  mencit  betina dengan  dua  ekor  mencit  jantan  dalam  satu kandang.  Penggabungan  mencit  jantan  dan betina  dilakukan  saat  mencit  betina  sedang mengalami fase estrus. Penentuan fase estrus dilakukan  dengan  mengamati  hasil  apusan vagina (vaginal  swab) dibawah  mikroskop pembesaran  400x  yang  ditandai  dengan menghilangnya  leukosit  dan  epitel  berinti, digantikan  dengan  sel  epitel  bertanduk  atau kornifikasi. Pengamatan vaginal plug dilakukan keesokan  paginya  dan  apabila  ditemukan vaginal plug / sumbat vagina maka menandakan  mencit  telah  berkopulasi  dan memasuki hari ke-0 kebuntingan.
Pemberian  dosis  susu  ibu  hamil menggunakan  perhitungan  dosis  berdasarkan konversi  (Laurense  &  Bacharach  1964), konversi dosis manusia (70 kg) ke mencit (20 gr)  =  0,0026.  Dosis  susu  ibu  hamil  yang dianjurkan  pada  ibu  hamil  adalah  45000  mg perhari. Dosis susu ibu hamil pada mencit hamil
(20 gr) = (45000 x 0,0026) mg = 117 mg. Pada penelitian  ini  menggunakan  dosis  susu  ibu hamil  sebesar  117  mg  yang  dilarutkan  dalam 0,5 ml aquades steril.
Seluruh  mencit  betina  yang  telah bunting  dibagi  menjadi  dua  kelompok,  yaitu kelompok kontrol dimana 6 ekor mencit betina bunting  diberikan  aquades  steril  sedangkan kelompok  perlakuan  dimana  6  ekor  mencit betina yang sedang bunting diberikan susu ibu hamil  dengan  dosis  117  mg  yang  dilarutkan dalam  0,5  ml  aquades  steril.  Pemberian  susu ibu  hamil  dilakukan  pada  pagi  (jam    ±09.00 WIB)  dan  sore  hari  (jam  ±16.00WIB)  secara oral  menggunakan  sonde.  Pada  kebuntingan hari  ke-18,  seluruh  induk  mencit  dibedah  dan diambil  benih  gigi  janin.  Tahap  selanjutnya dilakukan  pembuatan  sediaan  histopatologis (preparat  IHC)  dengan  menggunakan  metode mikroteknik  jaringan.  Kemudian  dilakukan pengamatan  mikroskopis  untuk  menghitung jumlah ekspresi KLK-4 menggunakan mikroskop  cahaya  yang  dilengkapi  kamera Sigma dengan  perbesaran  100x  &  400x.
Perhitungan
jumlah ekspresi
KLK-4
menggunakan metode Allred Score kombinasi Hotspot .
Analisis  data  dilakukan  menggunakan uji  normalitas  dengan shapiro-wilk dan  uji homogenitas  dengan levene  test .  Hasil  yang didapatkan adalah data terdistribusi normal dan homogen  sehingga  dilakukan  uji Independent sample t-test .

## HASIL PENELITIAN
Pengamatan terhadap ekspresi KLK-4 dilakukan  melalui  preparat  histologi  pada bagian  benih  gigi  janin  mencit  yang  telah  di warnai menggunakan pengecatan Immunohistochemistry (IHC).  Ekspresi KLK-4
diamati  dibawah  mikroskop  cahaya  yang dilengkapi  kamera Sigma dengan  perbesaran mikroskop  100x  dan  400x,  kemudian  dihitung menggunakan  metode allred  score kombinasi hotspot yang  memberikan  reaksi  positif berwarna kecoklatan pada sitoplasma terhadap antibodi polyclonal anti KLK-4 sebagai berikut:
Gambar 1. Pewarnaan IHC KLK-4. A,B pada kelompok kontrol. C,D pada kelompok perlakuan. A,C pembesaran 100x, B,D pembesaran 400x. Tanda panah menunjukkan gambaran ekspresi
KLK-4 pada kebuntingan hari ke-18.
Data  jumlah  rata-rata  ekspresi KLK-4 tersebut disajikan dalam tabel 1.
Tabel 1. Rerata dan standar deviasi kelompok kontrol dan kelompok perlakuan terhadap jumlah
ekspresi KLK-4. Kelompok   Jumlah sampel Rerata Standar deviasi Diberi aquades steril 6 21,1667 11,3915 2 Diberi susu ibu hamil + aquades steril 6 61,6667 32,8613 2
Pada kelompok kontrol yang hanya diberi aquades  steril  memiliki  nilai  rata-rata  sebesar 21,1667  dengan  standar  deviasi  11,39152 sedangkan  kelompok  perlakuan  yang  diberi susu  ibu  hamil  +  aquades  steril  memiliki  nilai rata-rata  61,6667  dan  standar  deviasi 32,86132.
Selanjutnya  data  pengamatan  jumlah ekspresi KLK-4 dilakukan  menggunakan  uji normalitas  dengan  uji Shapiro-Wilk dan  uji homogenitas dengan levene statistic.
Tabel 2. Uji Normalitas data jumlah ekspresi KLK-4 Kelompok Sig. Diberi aquades steril 0,153 Diberi  susu  ibu hamil  +  aquades steril 0,812 Hasil analisa menunjukkan bahwa nilai
Saphiro-Wilk pada  kelompok  yang  diberi aquades steril dan kelompok yang diberi susu ibu  hamil  +  aquades  steril  memiliki  nilai signifikansi  p>0,05  yang  menunjukkan  data tersebut terdistribusi  normal. Selanjutnya data dilakukan uji homogenitas.
Tabel 3. Uji Homogenitas data jumlah ekspresi KLK-4 Levene Statistic Sig. 3,049 0,111
Hasil  uji  homogenitas  menunjukkan angka 0,111 (p>0,05) yang berarti bahwa data tersebut homogen sehingga dilanjutkan dengan uji parametric menggunakan Independent sampel t-test.
Tabel 4. Uji Independent sample t-test. Sig. (2- tailed) Equal variances assumed 0,017
Keterangan : signifikansi p<0,05
Hasil  analisa  data  menggunakan  uji Independent  sample  t-test didapatkan  nilai  p (Sig. 2-tailed) = 0,017 yang berarti nilai p<0,05. Dari hasil tersebut didapatkan kesimpulan yaitu terdapat  perbedaan  yang  signifikan  jumlah ekspresi KLK-4 pada  kelompok  yang  hanya
diberikan  aquades  steril  dan  kelompok  yang diberikan susu ibu hamil dan aquades steril.

## DISKUSI
Hasil akhir dari penelitian ini adalah susu ibu hamil dapat memberikan perbedaan jumlah ekspresi KLK-4 pada  sel  ameloblas  dalam proses  amelogenesis  dimana  penggunaan susu  ibu  hamil  sebagai  asupan  nutrisi didapatkan hasil yang lebih tinggi dibandingkan yang  tidak  diberikan  susu  ibu  hamil. Berdasarkan pengamatan ekspresi KLK-4 pada Gambar  1  didapatkan  bahwa  terdapat perbedaan  gambaran  kepekatan  antara kelompok  kontrol  dan  kelompok  perlakuan. Pada  kelompok  kontrol  terlihat  lebih  sedikit jumlah KLK-4 atau  lebih  pudar,  sedangkan pada  kelompok  perlakuan  terlihat  gambaran KLK-4 yang lebih pekat dengan jumlah KLK-4 yang terlihat lebih banyak.
Hasil  ini  sesuai  dengan  penelitian Christiono (2019) menunjukan bahwa terdapat peningkatan  ekspresi KLK-4 pada  sel ameloblas dengan pemberian serbuk ikan laut dalam  proses  amelogenesis 8 .  Ikan  laut mengandung  berbagai  nutrisi  seperti  protein, lemak, kalsium, dan vitamin. Kandungan nutrisi pada ikan laut tersebut hampir serupa dengan susu ibu hamil  yang berpotensi meningkatkan ekspresi KLK-4. Amelogenesis  merupakan proses pembentukan enamel yang melibatkan sel ameloblas dan terdiri  dari lima tahap  yaitu presecretory,  secretory,  transition,  maturation dan post-maturation. Pada maturation, ameloblas  akan  mensekresikan Kallikrein- related  peptidase-4  (KLK-4) yang  berperan penting dalam biomineralisasi enamel gigi 3 . KLK-4 berasal  dari  gen  cluster  kallikrein yang  berfungsi  untuk  mendegradasi  protein amelogenin  dari  jaringan  bersamaan  dengan

## 102 PENGARUH SUSU IBU HAMIL TERHADAP EKSPRESI KALLIKREIN-RELATED PEPTIDASE-4
(KLK-4) PADA SEL AMELOBLAS DALAM TUMBUH KEMBANG GIGI
sebagian besar protein matriks enamel lainnya dan  menggantikannya  dengan  ion  mineral seperti kalsium dan fosfor sehingga menghasilkan enamel dengan tingkat mineralisasi  yang  keras  dan mature 3 .  Pada penelitian ini pengukuran ekspresi KLK-4 pada janin usia kebuntingan hari ke 18, dimana pada tahap  tersebut  sudah  terjadi  proses  maturasi enamel  dalam  pembentukan  matriks  enamel. Hal  ini  dapat  dilihat  secara  imunohistokimia, pada  tahap bell  stage yang  sudah  terdapat ameloblas  yang  akan  berdiferensiasi 9 .  Pada penelitian  yang  dilakukan  Simmer  (2011) menunjukkan adanya gangguan pada ekspresi KLK-4 menyebabkan hypomaturation amelogenesis  imperfecta ditandai  dengan ketebalan  enamel  yang  normal  tetapi  enamel mengalami  hipomineralisasi  dan  cenderung rapuh 10 .
Susu  ibu  hamil  mengandung  berbagai nutrisi  yang  berperan  penting  dalam  proses pembentukan  gigi  seperti  kalsium,  vitamin, fosfor,  dan  protein.  Kalsium  berfungsi  untuk diferensiasi  sel  ameloblas  dan  proses mineralisasi yang nantinya akan mempengaruhi  kepadatan  matriks  enamel 6 .
Vitamin  A  dan  C  berperan  dalam  menjaga diferensiasi sel ameloblas dalam perkembangan  gigi 7 .  Vitamin  D  berfungsi sebagai  mineralisasi  gigi  dan  membantu metabolisme  fosfor  dan  kalsium 11 .  Fosfor dibutuhkan  dalam  pembentukan  mineral  gigi sehingga kekurangan fosfor dapat menyebabkan  gangguan  kalsifikasi  pada  saat perkembangan gigi 4 . Protein berfungsi sebagai pembentuk  matriks  organik  tulang  dan  gigi yang  berfungsi  sebagai  tempat  deposisi  ion mineral  pada  proses  kalsifikasi  gigi,  yaitu  ion kalsium dan fosfor 1 .
Pada  masa  kehamilan  asupan  kalsium sebanyak  30  gram  ditransmisikan  dari  ibu  ke janin. Absorpsi kalsium akan meningkat selama masa  kehamilan  terutama  saat  memasuki trimester  III,  yang  disebabkan  oleh  proses mineralisasi yang cepat 12 . Susu ibu hamil yang mengandung  kalsium  dan  berbagai  macam nutrisi  lainnya  akan  menginduksi  mencit  yang bunting 8 .  Kalsium  dapat  menembus  plasenta berikatan  dengan  TRPV6  yang  merupakan suatu membran kanal kalsium yang mempengaruhi  absorbsi  kalsium  di  usus, selanjutnya  akan  di  transporter  oleh  Ca 2+ binding  protein  ke  janin  mencit 8 .  Ca 2+ akan ditangkap  oleh  sel  ameloblas  melalui  Ca 2+ Sensing  reseptor. FATPs  meningkat  dengan adanya  signaling  dari Insulin  Growth  Factor (IGF) yang nantinya membantu migrasi sel dari protein  yang  disekresikan  oleh  sel  ameloblas dalam  tahap secretory seperti  protein amelogenin,  ameloblastin,  dan  MMP-20 8 . Selanjutnya sel ameloblas akan mensekresikan KLK-4 pada tahap maturation untuk mendegradasi protein amelogenin dan sekresi calbindin D28 sebagai deposisi Ca 2+ sehingga membentuk  mineralisasi  dari  hidroksiapatit 8 .
Kecukupan mineral, vitamin, protein dan zat-zat gizi  yang  lain  secara  seimbang  bukan  hanya berpengaruh  pada  kesehatan  ibu  hamil  tetapi juga  berpengaruh  untuk  perkembangan  gigi termasuk dalam meningkatkan ekspresi KLK-4 dalam proses amelogenesis 8 .
Keterbatasan penelitian ini yaitu penelitian ini  menerapkan  pendekatan in  vivo sehingga tidak  dapat  menggambarkan  semua  tahap pembentukan gigi secara lengkap, karena pada penelitian  ini  hanya  dilihat  pada  1  tahap  yaitu bell  stage. Pembentukan  gigi  pada  mencit dimulai pada hari ke-13 bud stage, hari ke-14 cap stage dan hari ke-18 bell stage 9 . Selain itu,
penelitian  mengenai  perkembangan  gigi  pada masa  prenatal  belum  terlalu  banyak  sehingga menimbulkan sedikit kesulitan untuk menemukan referensi.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh kesimpulan  yaitu  pemberian  susu  ibu  hamil memberikan  pengaruh  yang  siginifikan  dalam meningkatkan ekspresi Kallikrein-related peptidase-4 (KLK-4) pada sel ameloblas dalam proses tumbuh kembang gigi janin mencit.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Aryati E, Dharmayanti AWS. Manfaat Ikan Teri  Segar  (Stolephorus  Sp)  Terhadap Pertumbuhan  Tulang  Dan  Gigi. ODONTO
Dent J . 2014;1(2):52–6.
2.  Shita  ADP,  Sulistiyani.  Pengaruh  Kalsium Terhadap  Tumbuh  Kembang  Gigi  Anak. Stomatognatic (J.K.G Unej) . 2010;7(3): 40– 44.
3.  Bartlett  JD.  Dental  Enamel  Development: Proteinases  and  Their  Enamel  Matrix Substrates .  ISRN  Dentistry .  2013;5(2):1–
24.
4.  Andriany P. Nutrisi Pada Pertumbuhan Gigi Pra  Erupsi. J  Kedokteran  Syiah  Kuala . 2008;(1): 57–60.
5.  Sari  RP,  Revianti  S,  Prabowo  PB.  Diet bubuk  cangkang  Anadara  granosa  dan susu  kedelai  meningkatkan  kekerasan permukaan  gigi. J  Material  Kedokteran
Gigi. 2012;1(1): 41–49.
6.  Wahluyo  S.  Peran  Kalsium  Sebagai Prevensi  Terjadinya  Hipoplasia  Enamel (The  Role  of  Calcium  On  Enamel Hypoplasia  Prevention). Dental  Journal
(Majalah  Kedokteran  Gigi) .  2013;46(3):
113-118.
7.  Almatsier  S.  Prinsip  Dasar  Ilmu  Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama; 2011.
8.  Christiono  S.  Mekanisme  Peningkatan Densitas  Pada  Amelogenesis  Gigi  Janin Mencit  Dari  Induk  Mencit  Yang  Diberi Serbuk Ikan Laut (Penelitian Eksperimental Secara  Invivo)  [Disertai].  Surabaya:
Universitas Airlangga; 2019.
9.  Ida YH, Nakatomi M, Harada H, Takata H, Baba  O,  Ohshima  H.  Glucose  Uptake Mediated  by  Glucose  transporter  1  is Essential  For  Early  Tooth  Morphogenesis
and  Size  Determination  of  Murine  Molars. Developmental  Biology .  Elsevier  Inc. 2012;363(1): 52–61.
10.  Simmer  JP,  Richardson  AS,  Smith  CE, Bartlett JD, Hu JC, Hu Y. Effect of Kallikrein 4  Loss    On  Enamel  Mineralization: Comparison  To  Mice  Lacking  Matrix Metalloproteinase 20. Journal of Biological Chemistry. 2011;286(20): 18149-18160.
11.  Ghosh  A,  Nagpal  B,  Hegde  U,  Nagpal  J. Role of Vitamins in Oral Health & Disease : An  Overview  Role  of  Vitamins  in  Oral Health  &  Disease :  an  Overview. Indian Journal  Of  Applied  Research .  2015;5(12): 292-295.
12.  Purnasari  G,  Briawan  D,  Dwiriani  CM. Calcium  Intake  and  Calcium  Adequacy among  Pregnant  Women  in  Jember Regency. Jurnal  MKMI .  2016;12(4):  261– 268.