Pengaruh Penambahan Ekstrak Teh Hijau ( Camellia sinensis ) dalam Diluter Tris Kuning Telur Terhadap Kualitas Spermatozoa Sapi Bali ( Bos sondaicus ) Setelah Pembekuan
Effect of Addition of Green Tea Extract (Camellia sinensis) in Egg Yolk Tris Diluter on Spermatozoa Quality in Bali Cattle (Bos sondaicus) After Freezing
Ani Wijayanti 1 , Tri Wahyu Suprayogi 2 , Ragil Angga Prastiya 2 *, Tatik Hernawati 2 , Trilas Sardjito 2 , Amung Logam Saputro 3 , Anny Amaliya 1 , Deny Sulistyowati 1
1 Profesi Dokter Hewan, 2 Divisi Reproduksi Veteriner, 3 Divisi Klinik Veteriner, SIKIA Banyuwangi, Universitas Airlangga, Jl. Wijaya Kusuma No. 113, Mojopanggung, Giri, Banyuwangi.
* Corresponding author : ragilap@fkh.unair.ac.id

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  penambahan  ekstrak  etanol  96%  teh  hijau ( Camellia  sinensis )  dalam  diluter  tris  kuning  telur  terhadap  kualitas  spermatozoa  sapi  Bali  ( Bos  sondaicus ) setelah  pembekuan.  Sampel  dibagi  menjadi  empat  kelompok  perlakuan  yang  berbeda,  yakni  berisi  sampel semen + gliserol 13% + masing-masing diluter tris kuning telur ditambah ekstrak teh hijau (P0) 0 mg/100 ml, (P1) 0,05 mg/100 ml, (P2) 0,10 mg/100 ml, dan (P3) 0,15 mg/100 ml. Variabel yang diamati meliputi motilitas, viabilitas,  dan  abnormalitas  spermatozoa.  Data  dianalisis  menggunakan OneWay ANOVA  dan  dilanjutkan dengan uji Duncan (p<0,05). Hasil menunjukkan pada kelompok P3 dengan  motilitas 49,00±2,15, viabilitas 61,92±1,70, dan abnormalitas 4,24±2,16 berbanding signifikan dengan kelompok yang lain. Kesimpulannya, kelompok  P3  dengan  penambahan  teh  hijau  0,15  mg/100  ml  dapat  meningkatkan  motilitas,  viabilitas,  dan abnormalitas spermatozoa sapi Bali.
Kata kunci: kesehatan dan kesejahteraan yang baik, setelah pembekuan, sapi bali, ekstrak teh hijau, kualitas spermatozoa

## Abstract
This study aimed to determine the effect of adding 96% ethanol extract of green tea (Camellia sinensis) in egg yolk tris diluter on the quality of spermatozoa of Bali cattle (Bos sondaicus) after freezing. The samples were divided into four different treatment groups, which contained semen sample + 13% glycerol + each egg yolk tris diluter + green tea extract (P0) 0 mg/100 ml, (P1) 0,05 mg/100 ml, ( P2) 0,10 mg/100 ml, and (P3) 0,15 mg/100 ml. The variables observed included motility, viability, and spermatozoa abnormalities. Data were analyzed using OneWay ANOVA and continued with Duncan's test (p<0,05). The results showed that the P3 group  had  motility  of  49,00  ±  2,15,  viability  of  61,92  ±  1,70,  and  abnormality  of  4,24  ±  2,16  significantly compared to the other groups. In conclusion, the P3 group with the addition of 0,15 mg/100 ml of green tea could increase the motility, viability, and abnormal spermatozoa of Bali cattle.
Keywords: good health and well-being, after freezing, bali cattle, green tea extract, spermatozoa quality
Received: 30 April 2022
Revised: 14 September 2022 Accepted: 24 October 2022

## PENDAHULUAN
Sapi  Bali  merupakan  hasil  domestikasi banteng liar di daerah Bali dan Blambangan, Jawa
Timur
(Martojo, 2012). Berhasilnya pengembangan  sapi  Bali  akan  menunjukkan potensi  Indonesia  sebagai  negara  yang  mandiri
dan  berdaulat  pangan  (Sutarno  dan  Setyawan, 2015). Sapi Bali menjadi plasma nuftah sapi lokal Indonesia yang tersebar hampir seluruh provinsi di Indonesia dan memiliki perkembangan cukup pesat karena memiliki keunggulan daya adaptasi yang  baik  terhadap  lingkungan  dan  memiliki fertilitas  baik  83%,  sehingga  dapat  digunakan
untuk  usaha  sapi  potong  (Ashari et  al .,  2019). Keunggulan  pada  sapi  Bali  tersebut  harus didorong dengan kemajuan teknologi khususnya teknologi reproduksi untuk meningkatkan efisiensi reproduksi ternak.
Hanifah et  al .  (2020)  menyatakan  bahwa inseminasi  buatan  (IB)  sebagai  teknologi alternatif  yang  saat  ini  banyak  digunakan  untuk meningkatkan produktivitas dan populasi ternak. Teknik IB dilakukan dengan memasukkan semen menggunakan alat khusus yang disebut insemination  gun ke  dalam  saluran  reproduksi betina  (Feradis,  2014).  Program  inseminasi buatan sebagai teknologi reproduksi dalam proses sebelumnya meliputi penampungan semen segar, proses pengolahan berupa pengenceran, ekuilibrasi atau penyesuaian suhu dan pembekuan semen  mempengaruhi kualitas semen yang akan diaplikasikan pada ternak (Prastowo et al ., 2017). Proses pembuatan semen beku membutuhkan  waktu  yang  panjang  dan  dapat menyebabkan  stres  berat  bagi  kehidupan spermatozoa.  Proses  pengolahan  semen  beku banyak  berhubungan  dengan  udara  luar  yang mengandung  banyak  oksigen,  sehingga  hal tersebut  akan  mempercepat  metabolisme  serta dapat menimbulkan reaksi peroksidasi lipid yang menyebabkan rusaknya membran plasma spermatozoa.  Kerusakan  seperti  ini  biasanya disebabkan oleh terbentuknya radikal bebas yang merupakan produk dari metabolisme spermatozoa itu sendiri (Gunawan et al ., 2012). Radikal bebas bersifat sangat reaktif, jika bereaksi dengan lipida terutama  asam  lemak  tak  jenuh  yang  dominan menyusun  membran  plasma  spermatozoa  akan menyebabkan  peroksidasi  lipid  (Feradis,  2009). Reaksi  awal  dari  radikal  bebas  apabila  tidak dikendalikan  akan  terjadi  reaksi  secara  terus- menerus  yang  akhirnya  dapat  merusak  sebagian besar atau seluruh membran plasma spermatozoa.
Penurunan kualitas spermatozoa pada semen beku  dapat  terjadi  akibat  stress  oksidatif  yang meningkatkan  jumlah  radikal  bebas  dan  dapat membahayakan  motilitas  spermatozoa  untuk bergerak,  sehingga  tidak  dapat  membuahi  sel telur  (Sabile et  al .,  2016).  Kualitas  semen  beku untuk IB setidaknya harus memenuhi standar post thawing  motility (PTM)  sebesar  40%  (BSN,
2021).  Noori  (2012)  menyatakan  kadar reactive oxygen spesies (ROS) yang tinggi dalam sel dapat mengoksidasi  lipid,  protein  dan  DNA,  sehingga diperlukan  adanya  antioksidan  yang  bertindak sebagai penangkal radikal bebas untuk melindungi spermatozoa. Penambahan zat antioksidan  pada  pengencer  dapat  mencegah aktivitas  radikal  bebas  terhadap  kerusakan membran  sel  spermatozoa  yang  berpengaruh terhadap  viabilitas  dan  fertilitas,  serta  berperan sebagai  sumber  energi  untuk  mempertahankan motilitas spermatozoa.
Teh  hijau  ( Camellia  sinensis )  sebagai tanaman herbal dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan  aktivitas  antioksidan  alami  dengan cukup  kuat,  diperoleh  dari  proses  pengolahan daun. Senyawa utama yang berpengaruh terhadap mutu  daun  teh  hijau  yaitu  katekin  (Anjarsari, 2016).  Katekin  pada  teh  hijau  memiliki kemampuan  100  kali  lebih  efektif  untuk menetralisir radikal bebas daripada vitamin C dan 25  kali  lebih  kuat  dari  vitamin  E  (Towaha  dan Balittri, 2013). Aktivitas antioksidan turunan dari katekin  adalah  epigalokatekin  galat  (EGCG) dianggap  sebagai  senyawa  bioaktif  paling menjanjikan  dalam  teh  hijau  karena  aktivitas antioksidannya  yang  kuat  (Silva et  al .,  2019). Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui pengaruh  penambahan  ekstrak  etanol  96%  teh hijau  dalam  diluter  tris  kuning  telur  terhadap motilitas, viabilitas, dan abnormalitas spermatozoa sapi Bali setelah pembekuan.

## METODE PENELITIAN

## Sampel Semen
Penelitian  dilaksanakan  di  Balai  Besar Inseminasi  Buatan  (BBIB)  Singosari,  Malang. Sampel  penelitian  yang  digunakan  yaitu  semen sapi  Bali  jantan  bernama  Jimbara  berumur  12 tahun  dengan  nomor  kode  bull  10980  yang diperoleh dari BBIB Singosari, Malang. Pembuatan  ekstrak  teh  hijau  dilakukan  di  UPT Laboratorium  Herbal  Materia  Medica  Batu  dan proses freeze  dry dilakukan  di  Laboratorium Biomol, Universitas Airlangga, Surabaya.
Semen  dikoleksi  menggunakan  vagina buatan  dan  selanjutnya  dievaluasi  kualitasnya
secara makroskopis dan mikroskopis. Pemeriksaan  makroskopis  meliputi  volume, warna,  pH,  bau  dan  konsistensi,  sedangkan pemeriksaan  mikroskopis  meliputi  gerakan massa,  motilitas,  viabilitas,  abnormalitas  dan konsentrasi.

## Perlakuan
Semen  yang  memenuhi  syarat  langsung diencerkan menggunakan tris kuning telur dengan penambahan  ekstrak  teh  hijau  dan  selanjutnya dilakukan proses menuju semen beku. Penelitian ini  menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap (RAL)  dengan  empat  perlakuan  dan  lima  kali pengambilan,  yakni  berisi  sampel  semen  + gliserol 13% + masing-masing diluter tris kuning telur ditambah ekstrak teh hijau (P0) 0 mg/100 ml, (P1) 0,05 mg/100 ml, (P2) 0,10 mg/100 ml, dan (P3)  0,15  mg/100  ml.  Pengumpulan  data dilakukan  setiap  tahap  evaluasi  kualitas  setelah pembekuan spermatozoa.

## Pengambilan Data
Pemeriksaan  motilitas  pada  spermatozoa dilakukan  dengan  cara  meneteskan  spermatozoa sebanyak  satu tetes  pada  obyek  glass,  kemudian tutup  menggunakan  cover  glass  dan  lakukan pengamatan  di  bawah  mikroskop  dengan perbesaran 100× atau 400× untuk melihat adanya gerakan maju pada spermatozoa. Hitung dan beri nilai  dari  jumlah  keseluruhan  spermatozoa  yang diamati  dalam  persen  (%)  (Susilowati et  al ., 2010).
Pemeriksaan  viabilitas  pada  spermatozoa dengan menggunakan perwarnaan Eosin- Negrosin  akan  mewarnai  kepala  spermatozoa yang mati karena lapisan lipid pada spermatozoa telah  rusak,  sedangkan  pada  spermatozoa  yang masih hidup tidak akan terwarnai atau transparan. Pemeriksaan  dilakukan  dengan  cara  meneteskan zat  warna  dan  semen  masing-masing  sebanyak satu  tetes  pada  obyek  glass,  lalu  campurkan keduanya  sampai  homogen,  kemudian  ulas  dan keringkan  preparat  di  atas  nyala  api,  lakukan pengamatan  dibawah  mikroskop.  Spermatozoa yang  diamati  dinyatakan  dalam  persen  (%). Waktu  yang  digunakan  dalam  melakukan
penghitungan  persentase  spermatozoa  maksimal adalah 15 detik (Susilowati et al ., 2010).
Pemeriksaan abnormalitas pada spermatozoa menggunakan  preparat  ulas  yang  telah  dibuat menggunakan pewarnaan Eosin-Negrosin, kemudian dilakukan pengamatan dibawah mikroskop  dengan  perbesaran  100×  atau  400×. Hitung  berapa  spermatozoa  yang  abnormal  dan jumlah  dari  spermatozoa  lalu  dinyatakan  dalam persen (%) (Susilowati et al ., 2010).

## Analisis Data
Data dianalisis menggunakan analisis statistika  dengan  uji OneWay ANOVA.  Jika terdapat  perbedaan  yang  signifikan  (p<0,05), maka dilanjutkan uji Duncan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil rata-rata volume semen sapi Bali yang diperoleh  pada  penelitian  ini  sebesar  6,28±0,92 (Tabel 1), lebih tinggi dibanding sapi Aceh umur 10  tahun  dengan  rata-rata  volume  3,85  ml (Azzahra,  2021),  pada  Peranakan  Ongole  (PO) yang berumur 12 tahun dengan rata-rata volume 4,22 ml (Kristanto, 2019). Perbedaan volume ini mungkin  dapat  disebabkan  oleh  perbedaan spesies, umur dan juga dipengaruhi oleh masing- masing  individu  seperti  keadaan  ternak,  metode koleksi  dan  seberapa  sering  sapi  dikoleksi semennya (Muzakkir, 2017).
Warna semen segar sapi Bali yang diperoleh pada penelitian ini berwarna putih susu (Tabel 1). Hasil  ini  sesuai  dengan  warna  semen  segar  sapi Aceh berkisar warna putih susu sampai krem atau kekuning-kuningan (Mukhlis et al ., 2017). Hasil warna putih susu semen segar sapi Bali juga dapat ditunjang  oleh  pengamatan  dari  narasumber Laboratorium BBIB Singosari.
Bau  semen  yang  diperoleh  pada  penelitian ini adalah khas sapi, tidak terdapat bau patologis seperti bau urine, bau feses dan anyir (Tabel 1). Hasil  bau  tersebut  sesuai  dengan  pendapat Susilowati et  al .,  (2010)  menyatakan  bahwa semen  sapi  memiliki  bau  khas  sapi  atau  seperti bau susu, selain itu juga hasil bau khas semen sapi Bali  dapat  ditunjang  oleh  pernyataan  dari narasumber  Laboratorium  BBIB  Singosari.  Bau
khas  semen  sapi  Bali  relatif  sama  dengan  bau semen sapi Rambon berbau khas (Setyawan et al ., 2019)  dan  bau  semen  sapi  PO  berbau  khas  sapi (Sholikah et  al .,  2016).  Rizal  dan  Herdis (2008) menyatakan  bahwa  pada  umumnya  bau  semen dikategorikan sebagai bau khas.
Konsistensi semen sapi Bali yang diperoleh pada  penelitian  ini  adalah  sedang  sampai  kental (Tabel 1). Hasil ini sesuai dengan penelitian sapi Rambon dengan konsistensi kental (Safitri et al ., 2018).  Penelitian  pada  sapi  Madura  dengan konsistensi  sedang  sampai  kental  (Ratnawati et al ., 2017). Hasil konsitensi sedang sampai kental semen  segar  sapi  Bali juga  dapat  ditunjang  oleh pengamatan dari narasumber Laboratorium BBIB Singosari. Semen dengan konsistensi sedang dan kental  merupakan  kriteria  standar  semen  untuk dijadikan semen beku. Semen yang baik memiliki derajat konsistensi yang kental melebihi kekentalan  susu,  sedangkan  semen  yang  buruk derajat konsistensi hampir sama dengan air kelapa (Garner dan Hafez, 2000).
Derajat  keasaman  semen  segar  sapi  Bali pada penelitian ini dengan rata-rata 6,4 (Tabel 1) sesuai  dengan  penelitian  sebelumnya  bahwa  pH semen segar sapi Bali berkisar 6,4-6,5 (Tethol et al .,  2020).  Menurut  Susilowati et  al .,  (2010) derajat keasaman normal pada semen sapi adalah 6,4-6,8,  apabila  derajat  keasaman  rendah disebabkan  oleh  faktor  asam  laktat  hasil metabolisme  spermatozoa.  Derajat  keasaman sangat menentukan hidup atau matinya spermatozoa  dalam  semen  (Zulyazaini et  al ., 2016).
Pemeriksaan  mikroskopis  semen  meliputi pemeriksaan  konsentrasi,  motilitas,  gerakan massa,  viabilitas  dan  abnormalitas  semen. Konsentrasi semen segar sapi Bali pada penelitian ini  dengan  rata-rata  1.646,60±384,41  juta/ml (Tabel  1),  masih  lebih  tinggi  dibandingkan dengan konsentrasi pada sapi Aceh 1.194 ± 4,80 juta/ml  (Zulyazaini et  al .,  2016).  Hasil  tersebut sudah  sesuai  dengan  standar  konsentrasi  semen sapi  segar  yaitu  diatas  1000  juta/ml  (Susilawati, 2000).  Menurut  Komariah et  al .,  (2020) konsentrasi  spermatozoa  semen  sapi  pejantan dipengaruhi  oleh  besar  testis  dan  frekuensi penampungan semen yang dilakukan.
Gerakan massa spermatozoa sapi Bali yang diperoleh  pada  penelitian  ini  rata-rata  adalah (+++) (Tabel 1),  yang menandakan spermatozoa bergerak  membentuk  gelombang  besar  dan progresif.  Menurut  Muzakkir et  al .,  (2017) spermatozoa  yang  baik  memiliki  gerakan  massa dan motilitas dengan daya gerak yang progresif. Susilawati  (2011)  menyatakan  bahwa  gerakan massa  spermatozoa  yang  baik  apabila  terlihat membentuk gelombang yang besar, banyak, gelap dan aktif seperti awan hitam.
Persentase  motilitas  spermatozoa  sapi  Bali berkisar 79,80-85,70 dengan rata-rata 82,62±2,40 (Tabel 1). Hasil ini lebih tinggi bila dibandingkan dengan rata-rata persentase motilitas spermatozoa sapi Aceh 65,83±14,65 (Rahmawati et al ., 2015). Persentase  rata-rata  motilitas  spermatozoa  sapi Madura  70,00±0,00  (Yekti et  al .,  2018). Perbedaan  ini  kemungkinan  disebabkan  oleh umur,  spesies,  cara  penampungan  dan  frekuensi penampungan  (Hafez,  2000).  Menurut  BSN (2021)  persyaratan  mutu  motilitas  semen  segar yang  digunakan  untuk  proses  menjadi  semen beku yaitu dengan minimum 70%.
Persentase  viabilitas  spermatozoa  sapi  Bali pada  penelitian  ini  berkisar  81,10-86,70  dengan rata-rata  84,06±2,25  (Tabel  1).  Hasil  ini  lebih tinggi  dari  persentase  viabilitas  sapi  Pasundan dengan rata-rata 63,93±15,17. Persentase viabilitas  sapi  Madura  rata-rata  73,00±2,58 (Romadhoni et  al .,  2014).  Menurut  Muzakkir et al ., (2017) bahwa nilai viabilitas lebih tinggi dari motilitas,  dikarenakan  spermatozoa  yang  motil tidak bergerak progresif akan tetapi masih hidup sehingga  tidak  terpapar  saat  fiksasi.  Persentase abnormalitas sapi Bali pada penelitian ini berkisar 1,6-4,7  dengan  rata-rata  2,25±1,09  (Tabel  1). Hasil  ini  lebih  rendah  dari  sapi  Pesisir  dengan rata-rata 10,375±0,85. Abnormalitas spermatozoa Sapi Bali pada penelitian ini masih sesuai standar abnormalitas  kurang  dari  20%,  sehingga  masih sesuai  untuk  dilakukan  perlakuan  (Susilowati et al ., 2010).
Selama  pembekuan  terjadi  perubahan  suhu dan  osmolaritas  yang  ekstrim  memicu  produksi ROS  sehingga  akan  merusak  komposisi  lipid membran  plasma  berdampak  pada  penurunan motilitas spermatozoa. Zat Epigalokatekin galat
Tabel 1. Kualitas semen segar sapi Bali
Parameter Replikasi I II III IV V Rata-rata±SD Makros k opis Volume (ml) 5,8 7,4 6,4 5 6,8 6,28±0,92 Bau Khas sapi  Khas sapi  Khas sapi  Khas sapi  Khas sapi Khas sapi Warna Putih susu  Putih susu  Putih susu  Putih susu  Putih susu Putih susu pH 6,4 6,4 6,4 6,6 6,4 6,4±0,08 Konsistensi Kental Kental Kental Sedang Kental Kental Mi kro skop is Motilitas (%) 80,7 84 82,9 79,8 85,7 82,62±2,40 Konsentrasi (juta/ml) 1.587 2.035 1.670 1.038 1.903 1.646,60±384,41 Viabilitas (%) 82,7 85,7 84,1 81,1 86,7 84,06±2,25 Gerakan massa +++ +++ +++ +++ +++ +++ Abnormalitas sekunder (%) 2 1,6 1,7 3,2 4,1 2,25±1,09
Tabel 2. Rata-rata dan standard deviasi motilitas, viabilitas, dan abnormalitas spermatozoa sapi Bali Perlakuan Motilitas Viabilitas Abnormalitas P0 41,18 a ±0,94 51,66 a ±2,24 6,60 a ±2,02 P1 43,60 ab ±1,90 55,30 b ±2,25 6,48 a ±2,33 P2 44,84 b ±2,29 57,52 b ±1,61 4,72 a ±1,24 P3 49,00 c ±2,15 61,92 c ±1,70 4,24 a ±2,16
Superskrip berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (p<0,05).
Gambar 1. Viabilitas spermatozoa sapi Bali (Pewarnaan Eosin-Negrosin, perbesaran 400x, Mikroskop Nikon Eclipse E200). (A) spermatozoa hidup kepalanya tidak terwarnai atau transparan, (B) spermatozoa mati kepalanya berwarna merah keunguan.
Gambar 2. Abnormalitas spermatozoa sapi Bali (Pewarnaan Eosin-Negrosin, perbesaran 400x,
Mikroskop Nikon Eclipse E200). (A) ekor tergulung, (B) ekor terputus, dan (C) kepala tanpa ekor.
(EGCG)  sebagai  akivitas  antioksidan  dari kelompok polifenol katekin diperoleh dari ekstrak teh hijau mampu mengatasi masalah radikal bebas berupa ROS (Susilowati et al ., 2021). Mekanisme
dari EGCG mampu mengurangi peroksidasi lipid, karbonilasi  protein  dan  kerusakan  DNA, memulihkan glutathion peroksidase dan aktivitas transferase  glutathione  (Roychoudhury et  al ., 2017).
Kebutuhan  jumlah  antioksidan  dari  ekstrak teh hijau dengan konsentrasi yang sesuai agar bisa menstabilkan  radikal  bebas  hasil  metabolisme yang  tidak  stabil.  Penelitian  ini  semakin  tinggi konsentrasi  penambahan  ekstrak  teh  hijau,  hasil persentase  motilitas  spermatozoa  sapi  Bali  yang dipertahankan  juga  semakin  tinggi.  P1  dengan penambahan  ekstrak  teh  hijau  0,05  mg/100  ml diluter  tris  kuning  telur,  terjadi  peningkatan motilitas walaupun tidak berbeda nyata (p>0,05) dengan  P0  yang  sebagai  kontrol  (Tabel  2). Konsentrasi  ekstrak  teh  hijau  0,05  mg  belum mampu  menetralisir  senyawa  radikal  bebas, sedangkan  dalam  konsentrasi  ekstrak  teh  hijau yang  sesuai  pada  P2  dengan  penambahan konsentrasi  ekstrak  teh  hijau  0,10  mg/100  ml diluter  tris  kuning  telur  terjadi  peningkatan motilitas  spermatozoa,  namun  peningkatan motilitas  tertinggi  ditunjukkan  pada  P3  dengan penambahan  konsentrasi  ekstrak  teh  hijau  0,15 mg/100 ml diluter tris kuning telur.
Perlakuan  kelompok  P3  memberikan  efek motilitas  paling  signifikan  dibanding  perlakuan kelompok yang lain. Konsentrasi ekstrak teh hijau 0,15  mg/100  ml  diluter  tris  kuning  telur  sesuai untuk menetralisir radikal bebas yang dihasilkan oleh metabolisme spermatozoa.
Antioksidan  yang  ditambahkan  ke  dalam pengencer  dapat  mempertahankan  viabilitas spermatozoa dan mengurangi efek berbahaya dari stres oksidatif yang disebabkan oleh ROS selama pembekuan. Kandungan EGCG dapat menghambat  peroksidasi  lipid  dan  memberikan perlindungan  sel  terhadap  kerusakan  okidatif dengan  menembus  scavenging  langsung  dari ROS.  Penelitian  ini  semakin  tinggi  konsentrasi penambahan  ekstrak  teh  hijau,  hasil  persentase viabilitas spermatozoa sapi Bali yang dipertahankan juga semakin tinggi. Hal ini sesuai dengan  pernyataan  Aslam et  al .,  (2014) menyebutkan bahwa penambahan zat antioksidan pada  pengencer  memiliki  manfaat  yang  cukup baik  diantaranya  mencegah  aktivitas  radikal
bebas terhadap kerusakan membran sel spermatozoa yang berpengaruh terhadap viabilitas  dan  fertilitas  spermatozoa.  P1  dengan penambahan  ekstrak  teh  hijau  0,05  mg/100  ml diluter tris kuning telur dengan terjadi peningkatan  viabilitas,  P2  dengan  penambahan ekstrak  teh  hijau  0,10  mg/100  ml  diluter  tris kuning  telur  juga  terjadi  peningkatan  viabilitas, namun peningkatan viabilitas tertinggi ditunjukkan pada P3 dengan penambahan ekstrak teh hijau 0,15 mg/100 ml diluter tris kuning telur. Perlakuan  kelompok  P3  memberikan  efek viabilitas  paling  signifikan  dibanding  perlakuan kelompok  yang  lain  (Tabel  2).  Hasil  perlakuan tersebut  membuktikan bahwa  penambahan ekstrak  teh  hijau  0,15  mg/100  ml  diluter  tris kuning  telur  mampu  menghambat  senyawa radikal bebas, sehingga mampu mempertahankan viabilitas spermatozoa sapi Bali.
Semen  untuk  keperluan  Inseminasi  Buatan sebaiknya  tidak  mengandung  sperma  abnormal yang  lebih  dari  20%  (Sekosi et  al .,  2016). Konsentrasi penambahan ekstrak teh hijau 0 mg, 0,05  mg,  0,10  mg,  dan  0,15  mg  dalam  100  ml diluter tris kuning telur sama-sama tidak merubah abnormalitas pada spermatozoa (Tabel 2).
Abnormalitas yang ditemukan pada penelitian  ini  yaitu  abnormalitas  ekor  tergulung, ekor  terputus  dan  kepala  tanpa  ekor  (Gambar  1 dan 2). Seperti pada penelitian Rizal dan Herdis (2005)  menyatakan  bahwa  abnormalitas  terjadi saat  pembuatan  preparat  sebelum  dilakukan pengamatan  berupa  terpisahnya  ekor  dengan kepala  akibat  terputus.  Abnormalitas  selama proses  menuju  semen  beku  yang  meningkat adalah  abnormalitas  sekunder  yaitu  ekor  yang melingkar atau  terputus disebabkan oleh perbedaan osmosis saat melakukan pengenceran, cold  shock  pada  saat  pendinginan  dan  putusnya ekor  spermatozoa  disebabkan  oleh  preparasi sampel  pada  saat  membuat  ulasan.  Peningkatan abnormalitas  selama  proses  pendinginan  dan pembekuan dapat diakibatkan oleh pengenceran, perubahan  suhu,  adanya  cekaman,  kecepatan pendinginan  sebagai  akibat  adanya  perubahan tekanan osmosis karena adanya pengeluaran ion- ion,  dehidrasi  yang  hebat  menyebabkan  sel mengkerut dan merusak membran sel.
Pencampuran  dengan  pengencer  atau  saat pembuatan preparat yang kasar akan meningkatkan
kerusakan pada kepala spermatozoa (Ihsan, 2009).

## KESIMPULAN
Dapat  disimpulkan  pengaruh  penambahan ekstrak  teh  hijau  konsentrasi  0,15  mg/100  ml diluter tris kuning telur menghasilkan persentase motilitas  dan  viabilitas  spermatozoa  sapi  Bali paling  tinggi  dibandingkan  dengan  perlakuan kontrol maupun konsentrasi 0,05 mg dan 0,10 mg. Selain  itu,  juga  tidak  berpengaruh  terhadap abnormalitas  spermatozoa  sapi  Bali  setelah pembekuan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih  kepada BBIB  Singosari  dan  SIKIA  Banyuwangi  atas fasilitas selama penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Anjarsari, I. R. D. (2016). Katekin Teh Indonesia:
Prospek  dan  Manfaatnya. Jurnal  Kultivasi , 15(2), 99-106.
Ashari,  L.,  Mustofa,  I.,  Yunita,  M.  N.,  Sardjito, T., Saputo, A. L., & Prastiya, R. A. (2019). Pengaruh  Durasi  Waktu  pada  Sexing Spermatozoa  Sapi  Bali  Terhadap  Kualitas dan Efektovitas Sexing Spermatozoa dengan Menggunakan  Alat Electric  Separating Sperm (ESS). Jurnal Medik Veteriner , 2(1), 24-29.
Aslam,  H.  A.,  Dasrul,  &  Rosmaidar.  (2014).
Pengaruh  Penambahan  Vitamin  C  dalam Pengencer  Andromed  terhadap  Persentase
Motilitas  dan  Membran  Plasma  Utuh Spermatozoa Sapi Aceh Setelah Pembekuan. Jurnal Medika Veterinaria , 8(1), 20-26.
Azzahra, F. (2021). Identifikasi Produksi Semen
Sapi Aceh pada Umur 6, 7, 8, 9 dan 10 Tahun di  Balai  Inseminasi  Buatan  Lembang
[Skripsi].  Fakultas  Peternakan.  Universitas Brawijaya.
BSN.  (2021).  SNI  4869-1:  2021.  Semen  Beku-
Bagian 1: Sapi. Penerbit Jakarta.
Feradis, M. P. (2009). Peranan Antioksidan dalam Pembekuan Semen. Jurnal Peternakan , 6(2),
63-70.
Feradis,  M.  P.  (2014).  Bioteknologi  Reproduksi Pada Ternak. Penerbit Alfabeta. Bandung.
Garner,  D.  L.,  &  Hafez,  E.  S.  E.  (2000). Spermatozoa  and  Seminal  Plasma.  In:  E. S.E.  Hafez  (Ed.).  Reproduction  in  Farm Animal.  7th.  Eed.  Lippomcott  Wiliams  and Wilkins. Philadelphia. pp: 96-106.
Gunawan, I., Laksmi, D. N. D. I., & Trilaksana, I. G. N. B. (2012). Efektivitas Penambahan Β- Karoten  dan  Glutathion  pada  Bahan Pengencer  Terhadap  Motilitas  dan  Daya Hidup Spermatozoa pada Semen Beku Sapi. Indonesia Medicus Veterinus , 1(3), 385-393.
Hafez,  E.  S.  E.  (2000).  Semen  Evaluation.  In:
Reproduction in Farm Animals. 7th Edition. Lippicont Williams and Wilkins. Maryland, USA. pp: 31.
Hanifah,  N.  F.,  Ratnani,  H.,  Purnama,  M. T.  E., Restiadi, T. I., Agustono, B., & Prastiya, R. A.  (2020).  Pengaruh  Konsentrasi  Gliserol dalam  Pengencer  Tris  Kuning  Terhadap Kualitas  Spermatozoa  Kambing  Sapera Before  Freezing. Jurnal  Medik  Veteriner , 3(2), 154-159.
Ihsan,  N.  M.  (2009).  Bioteknologi  Reproduksi Ternak. Universitas Brawijaya. Malang.
Komariah, R. I., Arifiantini, M. A., & Sukmawati, E.  (2020).  Kualitas  Semen  Segar  dan Produksi Semen Beku Sapi Pejantan Madura pada  Musim  yang  Berbeda. Jurnal  Ilmu Produksi  dan  Teknologi  Hasil  Peternakan , 8(1), 15-21.
Kristanto, Y. (2019). Perbedaan Kualitas Semen Sapi  Brahman  dengan  Sapi  Peranakan Ongole  di  Balai  Inseminasi  Buatan  (BBIB) Singosari  Kabupaten  Malang  [Thesis]. Fakultas Peternakan. Universitas Brawijaya.
Martojo,  H.  (2012).  Indigenous  Bali  Cattle  is Most Suitable for Sustainable Small Farming in  Indonesia. Reproduction  in  Domestic Animals , 47, 10-12.
Mukhlis,  Dasrul,  &  Sugito.  (2017).  Analisis
Motilitas  Spermatozoa  Sapi  Aceh  Setelah Pembekuan Berbagai Konsentrasi Andromed ® . Agripet , 17(2), 112-120.
Muzakkir, D., Wahyuni, S., Akmal, M., & Sabri,
M.  2017.  Pengaruh  Lama  Ekuilibrasi terhadap  Kualitas  Spermatozoa  Sapi  Aceh Setelah Pembekuan Menggunakan Pengencer  Andromed ® . Jurnal  Ilmiah Peternakan , 5(2), 115-128.
Noori,  S.  (2012).  An  Overview  of  Oxidative Stress  and  Antioxidant  Defensive  System. Journal  Clinical  and  Cellular  Immunology , 1(8), 1-9.
Prastowo,  S.,  Widu,  T.,  &  Widyas,  N.  (2017).
Preliminary  Analysis  On  Hybrid  Vigor  In Indonesian Indigenous and Crossbred Cattle Population  Using  Data  From  Published Studies. IOP Conference Series , 193(1).
Rahmawati, M. A., Susilawati, T., & Ihsan, M. N. (2015). Kualitas Semen dan Produksi Semen
Beku  pada  Bangsa  Sapi  dan  Bulan Penampungan  yang  Berbeda. Jurnal  Ilmu- Ilmu Peternakan , 25(3), 25-36.
Ratnawati,  D.,  Isnaini,  N.,  &  Susilawati,  T. (2017). Pemanfaatan Casa dalam Observasi
Motilitas  Spermatozoa  Semen  Cair  Sapi Madura  dalam  Pengencer  Berbeda. Jurnal Ilmu-Ilmu Peternakan Universitas Brawijaya , 27(1), 80-95.
Rizal,  M.,  &  Herdis.  (2005).  Daya  Hidup Spermatozoa Epididimis Domba Garut yang Dikriopreservasi  Menggunakan  Modifikasi Pengencerr  Tris. Jurnal  Hayati ,  12(2),  61- 66.
Rizal,  M.,  &  Herdis.  (2008).  Inseminasi  Buatan pada Domba. Rineka Cipta. Jakarta. Hal: 24.
Romadhoni,  I.,  Rachmawati,  A.,  &  Suyadi.
(2014). Kualitas Semen Sapi Madura Setelah Pengenceran  dengan  Tris  Aminomethane Kuning  Telur  yang  disuplementasi  α- tocopherol pada Penyimpanan Suhu Ruang. Jurnal Ilmu-Ilmu Peternakan , 24(1), 39-44.
Roychoudhury, S., Agarwal, A., Virk, G., & Cho,
C.  L.  (2017).  Potential  Role  of  Green  Tea Catechins  in  the  Management  of  Oxidative Stress  Associated  Infertility. Reproduction
Biomedical Online , 34, 487-98.
Sabile, S., Toleng, A. L., Yusuf, M., Firmiaty, S., Idrus,  M.,  Zulkharnaim,  &  Nasriyanto. (2016). Pengaruh Penmabhan Ekstrak Buah Mengkudu  ( Morinda  citrifolia  L. )  dalam Pengencer Terhadap Motilitas  Spermatozoa pada  Semen  Cair  Sapi  Bali. Jurnal  Aves , 10(2), 10-15.
Safitri,  A.  M.,  Sardjito,  T.,  Wibawati,  P.  A., Mustofa, I., Saputro, A. L., & Prastiya, R. A. (2018). Kualitas Semen Segar Sapi Rambon Banyuwangi  dalam  Pengencer  Tris  Kuning Telur  dan  Susu  Skim  Kuning  Telur. Jurnal Medik Veteriner , 1(3), 62-67.
Sekosi,  P.  P.  P.,  Kusumawati,  E.  D.,  &
Krisnaningsih, A. T. N. (2016). Motilitas dan Viabilitas Semen Segar Kambing Peranakan Etawa (PE) dengan Menggunakan
Pengencer Cauda Epididymal Plasma (CEP-
2)  pada  Lama  dan  Suhu  Simpan  yang Berbeda. Jurnal Sains Peternakan , 4(1), 34- 49.
Setyawan, F., Suprayogi, T. W., Prastiya, R. A., Restiadi, T. I., Saputro, A. L., & Agustono,
B.  (2019).  Perbedaan  Waktu  Ekuilibrasi Sebelum  Pembekuan  Terhadap  Kualitas Spermatozoa  Sapi  Rambon  Banyuwangi Menggunakan Pengencer Tris Kuning Telur.
Jurnal Medik Veteriner , 2(2), 101-107.
Sholikah,  N.,  Isnaini,  N.,  Yekti,  A.  P.  A.,  & Susilawati,  T.  (2016).  Pengaruh  Pengganti Bovine Serum Albumin (BSA) dengan putih telur  pada  pengencer  CEP-2  terhadap kualitas semen sapi Peranakan Ongole pada
Suhu Penyimpanan 3-5°C. Jurnal Ilmu-Ilmu Peternakan , 26(1), 7- 15.
Silva, E. C. B., Arruda, L. C. P., Vieira, J. I. T., Soares,  P.  C.,  &  Guerra,  M.  M.  P.  (2019). Catechin  and  epigallocatechin  gallate:  are these  promising  antioxidant  therapies  for frozen  goat  semen?. Arq  Brasilia  Medical
Veterinary Zootechnic , 71, 521-8.
Susilawati,  T.  (2000). Analisa  Membran Spermatozoa  Sapi  Hasil  Filtrasi  Sephadex
G-200  dan  Sentrifugasi  Gradien  Densitas Percoll  pada  Proses  Seleksi  Jenis  Kelamin. Disertasi. Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga Surabaya.
Susilawati, T. (2011). Spermatology. Universitas Brawijaya Press. Hal: 91.
Susilowati, S., Sardjito, T., Mustofa, I., Widodo, O.  S.,  &  Kurnijasanti,  R.  (2021).  Effect  of Green Tea Extract in Extender of Simmental Bull  Semen  on  Pregnancy  Rate  of Recipients. Animal  Bioscience ,  34(2),  198-
204.
Susilowati, S., Hardijanto, T. W., Suprayogi, T.,
& Hermawati, T. (2010). Petunjuk Praktikum  Inseminasi  Buatan.  Airlangga University Press. Hal: 13.
Sutarno,  &  Setyawan,  A.  D.  (2015).  Genetic Diversity  of  Local  and  Exotic  Cattle  and Their  Crossbreeding  Impact  on  the  Quality of  Indonesian  Cattle. Biodiversitas ,  16(2), 327-354.
Tethol,  A.  N.,  Ciptadi,  G.,  Wahjuningsih,  S., Amaliya,  A.,  Sawitri,  W.,  &  Susilawati,  T. (2021). The Influence of Individual Factors on  the  Characterisrics  and  Production  of Frozen  Semen  of  Bali  Cattle. Journal  of Advanced  Veterinary  Research , 11(3),  162- 166.
Towaha,  J.,  &  Balittri.  (2013).  Kandungan Senyawa  Kimia  pada  Daun  Teh  Hijau ( Camellia  sinensis ). Warta  Penelitian  dan Pengembangan  Tanaman  Industri ,  19(3), 12-16.
Yekti,  A.  P.  A.,  Tatulus,  W.  S.,  Ratnawati,  D., Affandhy,  L.,  Kuswati,  A.,  Huda,  N.,  &
Susilawati, T. (2018). Kualitas dan Kapasitasi  Spermatozoa  Sapi  Bali,  Madura, dan Peranakan Ongole. JITRO , 5(2), 34-41.
Zulyazaini,  D.,  Wahyuni,  S.,  Akmal,  M.,  &  N. Abdullah, M. A. (2016). Semen dan Plasma Seminalis  Sapi  Aceh  Yang  Dipelihara  di BIBD Saree Aceh Besar. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala. Agripet , 16(2), 121- 130.