Imunogenisitas Virus Infectious Bronchitis Strain Lokal dan Massachusetts
Immunogenicity of Local and Massachusetts Strains Infectious Bronchitis Virus
Jola Rahmahani 1* , R Zaksara Fero Ali Mutaqin Wudhu 2 , Suwarno 1 ,
Martia Rani Tacharina 1
1 Laboratorium Virologi dan Imunologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia, 2 Pendidikan Profesi Dokter Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia.
* Corresponding author : jola_rahmahani@yahoo.co.id

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan potensi imunogenisitas antara antigen whole virus dan antigen protein S dari strain local I-147 dengan strain Massachusetts virus Infectious bronchitis menggunakan uji indirect ELISA. Pada penelitian ini digunakan 24 mencit yang dibagi menjadi empat kelompok perlakuan yaitu: P1) kelompok mencit yang divaksin menggunakan protein S ( spike glycoprotein ) dari strain local virus Infectious bronchitis ; P2) kelompok  mencit  yang  divaksin  menggunakan protein S (spike glycoprotein) dari strain Massachusetts virus Infectious bronchitis ; P3) kelompok mencit yang divaksin menggunakan whole virus dari strain lokal virus Infectious bronchitis ; P4) kelompok mencit yang divaksin menggunakan whole virus dari strain  Massachusetts  virus Infectious  bronchitis .  Darah  mencit  diambil  pada  minggu  ke-2  dan  ke-4  pasca vaksinasi untuk diperiksa seumnya menggunakan uji indirect ELISA. Hasil yang didapatkan pada penelitian ini berupa nilai Optical Density (OD) pada masing-masing perlakuan, yang selanjutnya dianalisa menggunakan One  Way  ANOVA  dan  dilanjutkan  dengan  Duncan Multiple  Range  Test 5%  dan  uji  T.  Hasil  penelitian  ini menunjukkan  bahwa terdapat perbedaan titer antibodi antara  kelompok  mencit  yang divaksin  menggunakan whole virus dan protein S pada kedua strain virus Infectious bronchitis. Nilai OD whole virus pada kedua strain memiliki perbedaan  yang  nyata dengan nilai OD  antigen protein S pada kedua strain  baik pada serum  yang diambil pada minggu ke-2 maupun minggu ke-4 pasca vaksin.
Kata kunci: penyakit unggas, Infectious Bronchitis , S Protein , whole virus , imunogenisitas

## Abstract
This study aimed to compare the immunogenicity between the whole virus and protein S of both local strain I-147 and Massachusetts strain of Infectious bronchitis virus with indirect ELISA. 24 healthy mice are divided into four groups with six mice in each group that are: P1) a group of mice that are vaccinated with S protein (spike glycoprotein) of local strain Infectious Bronchitis virus; P2) a group of mice that are vaccinated with S protein (spike glycoprotein) of Massachusetts strain Infectious Bronchitis virus; P3) a group of mice that are vaccinated with the whole virus of local strain Infectious Bronchitis virus; P4) a group of mice that are  vaccinated  with  the  whole  virus  of  Massachusetts  strain  Infectious  Bronchitis  virus.  The  results  of  this research are Optical Density (OD) values of each treatment, then to be analyzed using One Way ANOVA and followed  by  Duncan  Multiple  Range  Test  5%  and  T-test.  The  results  show  that  there  are  differences  in immunogenicity between the  whole virus and S protein in  both  the local strain  and Massachusetts strain  of Infectious bronchitis virus. The OD value of the whole virus in the two strains has a significant difference from OD value of the protein S antigen in both strains, both in the serum taken at week 2 and week 4 post-vaccination.
Keywords: poultry disease, Infectious Bronchitis, S Protein, whole virus, immunogenicity
Received: 19 Januari 2022 Revised: 2 Maret 2022 Accepted: 13 April 2022

## PENDAHULUAN
Infectious bronchitis adalah penyakit pernapasan  yang  kontagius  pada  ayam  yang
disebabkan  oleh  virus infectious  bronchitis (IB) yang  bersifat  akut  (Cavanagh  dan  Naqi,  2003). Penyakit  IB  selama  ini  menjadi  masalah  besar yang sering dihadapi oleh peternak  ayam karena
virus  IB  menginfeksi  ayam  dari  segala  umur. Penyakit  ini  menimbulkan  penyakit  pernafasan, menurunkan  kualitas  dan  produksi  telur  serta mengakibatkan kematian sehingga sangat berpengaruh  dalam  dalam  kerugian  ekonomi akibat  gejala  yang  di  timbulkan  menyebabkan keuntugan  peternak  menurun  drastis  (Tabbu, 2000).  Gejala  yang  terlihat  yaitu  keluarnya eksudat dari lubang hidung, kepala membengkak, sering  bersin,  sesak  napas.  Pada  ayam  yang sedang produksi, infeksi penyakit ini menyebabkan  bentuk  telur  tidak  normal, kerabang kasar, dan produksi menurun (Cavanagh et al. , 1992).
Penyakit  yang  pertama  kali  ditemukan  di Amerika pada tahun 1930 ini tersebar di berbagai negara  dunia  termasuk  Indonesia.  Di  Indonesia penyakit  IB  sudah  lama  diduga  ada,  akan  tetapi pembuktiannya secara virologi dengan mengisolasi virus baru dilakukan pada tahun 1977 oleh Purnomo Roonohardjo. Penyakit IB saat ini menjadi  kebingungan  kalangan  praktisi  karena gejala  yang  ditimbulkan  tidak  spesifik  (Tabbu, 2000).
Penularan  virus  IB  dapat  terjadi  secara langsung yaitu melalui kontak antara ayam sakit dengan ayam  yang  sehat sedangkan secara tidak langsung yaitu melalui peralatan kandang, bahan pakan, air, kotoran ayam, anak kandang dan dan alat transportasi. Namun penularan secara vertikal (melalui telur), dari induk ke anak sampai saat ini masih  belum  ada  laporan.  Penyakit  ini  biasanya bersifat endemik pada suatu peternakan tertentu, terutama  jika  faktor  sanitasi  atau  desinfeksi kurang di perhatikan (Tabbu, 2000).
Jenis unggas yang paling peka adalah ayam dan  terjadi  pada  semua  umur,  tetapi  kasus  IB paling banyak terjadi pada anak ayam serta diikuti kematian.  Kasus  kematian  sering  terjadi  pada ayam  yang  berumur  kurang  dari  enam  minggu (Cavanagh,  2003).  Tingkat  mortalitas  pada  anak ayam sangat tinggi (100%). Anak ayam di bawah umur  tiga  minggu  yang  terinfeksi  penyakit  IB memperlihatkan  gejala,  kesulitan  bernafas, ngorok,  batuk-batuk,  bersin  dan  mata  berair (Cavanagh et  al. ,  1992),  Infeksi  IBV  pada  DOC bisa  menimbulkan  kerusakan  permanen  pada
oviduk  sehingga  menurunkan  produksi  dan kualitas telur (Bahri dkk., 2005).
Secara  umum,  strain  virus  yang  berbeda tidak  saling  melindungi.  Beberapa  strain  virus cukup  efektif  untuk  mendorong  perlindungan silang terhadap serotipe lain dan disebut sebagai prototipe.  Banyak  serotipe  atau  genotipe  yang berbeda dari virus IB yang dikenali (Cook et al. , 2012).  Menurut  Indriani  dan  Darminto  (2000), serotipe  virus  IB  lapangan  di  Jawa  Isolat  I.  9 termasuk  dalam  serotipe Mass -41,  sedangkan isolat  1.2,  1.3,  dan  1.7  termasuk  dalam  serotipe Conn -46.  Isolat  1.5,  1.14,  1.24,  dan  1.25  secara serologik  berbeda  dengan  serotipe Mass -41, Conn -46 atau serotipe virus  IB isolat  lokal yang sudah diperoleh dalam penelitian sebelumnya.
Spike  glycoprotein atau  protein  S  IBV terlibat  dalam  induksi  kekebalan  protektif, netralisasi  dan  perlekatan  pada  sel  inang. Komponen  imunogenik  yang  menimbulkan respon  antibodi  dari  IBV  meliputi  protein  S ( Spike )  dan  N  ( Nukleoprotein) (Li et  al. ,  2010), sedangkan  protein  M  IBV  dikenali  sebagai protein imunogenik (Feng et al. , 2015).
Protein  S  diketahui  menimbulkan  respon antibodi tertinggi dibandingkan protein lain, oleh karena itu protein S dipilih sebagai target primer untuk  pengembangan  vaksin  (Jackwood,  2012), protein Spike dipilih sebagai target penting untuk mendeteksi terhadap coronavirus dan pengembangan  anti  virus  (Luo et  al. ,  2012). Bersadarkan  pembahasan  diatas  dapat  dilakukan penelitian untuk melihat perbedaan imunogenitas dari pemberian protein S dan whole virus IBV dua serotipe virus lokal I-147 dan Massachusset yang diinjeksikan  pada  mencit  sehingga  menginduksi pembentukan  antibodi  dan  dilihat  nilai Optical Density (OD)  dengan  menggunakan  uji indirect ELISA.

## METODE PENELITIAN
Vaksinasi Mencit dan Pengambilan Serum 24  ekor  mencit  dibagi  menjadi  empat kelompok perlakuan yang masing-masing kelompok  terdiri  dari  enam  ekor  mencit  sebagai berikut:  (P1)  Kelompok  mencit  yang  divaksin dengan  antigen  protein  S  ( Spike  Glycoprotein )
virus  IB  strain  lokal  (I-147),  (P2)  Kelompok mencit  yang  divaksin  dengan  antigen  protein  S ( Spike Glycoprotein ) virus IB strain Massachusetts,  (P3)  Kelompok  mencit  yang divaksin  dengan  antigen whole virus  IB  strain lokal  (I-147),  dan  (P4)  Kelompok  mencit  yang divaksin  dengan  antigen whole virus  IB  strain Massachusetts.
Darah  mencit  diambil  pada  minggu  kedua dan  minggu  keempat  pasca  vaksinasi  tanpa menggunakan  antikoagulan  untuk  memperoleh serum. Darah yang ditampung pada tabung tanpa antikoagulan  di  pindahkan  ke  tabung  sentrifus untuk dibisingkan pada kecepatan 900rpm selama 10  menit.  Setelah  proses  sentrifus  akan didapatkan  serum  yang  berupa  cairan  berwarna kuning  jernih  pada  bagian  supernatan.  Serum dipisahkan  dan  disimpan  sementara  pada  lemari pendingin 4 o C sampai digunakan.
Uji Indirect ELISA Prosedur indirect ELISA  adalah  sebagai
berikut, coating antigen virus IB dengan konsentrasi 2 µg/ml dan dilapisi sebanyak
100 µl/sumuran mikroplate
yang sudah  diencerkan  dengan  pengenceran  1/100 menggunakan coating buffer dan diinkubasi  pada  suhu  4ºC  selama  18  jam. Selanjutnya mikroplate dicuci dengan
washing  buffer (PZ  dan  triton  0,5  ml)  200 µl/sumuran sebanyak 3x1 menit.
Mikroplate  kemudian  diblok  dengan milk blocking 4%  sebanyak  100  µl/sumuran  dan diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  1  jam. Selanjutnya  mikroplate  dicuci  dengan. washing buffer (PZ  dan  triton  0,5  ml)  200  µl/sumuran sebanyak  3x1  menit.  Antibodi  hasil  vaksinasi virus  IB  diencerkan  1/500  dengan blocking buf fer,  selanjutnya  dimasukkan  sebanyak  100 µl/sumuran dan diinkubasikan selama 1 jam pada suhu  37ºC,  setelah  itu  mikroplate  dicuci  dengan washing  buffer (PZ  dan  triton  0,5  ml)  200 µl/sumuran sebanyak 3x1 menit kemudian diikuti dengan penambahan  konjugat ( Anti Mencit Ig G yang dilabel dengan enzim alkalin fosfatase ) yang diencerkan  dengan blocking  buffer dengan pengenceran  1:  2500  sebanyak  100  µl/sumuran dan diinkubasi selama satu jam pada suhu 37ºC.
Berikutnya  mikroplate  dicuci  kembali  dengan washing  buffer (PZ  dan  triton  0,5  ml)  200 µl/sumuran  sebanyak  3x1  menit,  kemudian ditambahkan  substrat  p-NPP  sebanyak  100  µl pada semua sumuran, ditutup dengan alumunium foil kemudian  didiamkan  selama  30  menit  di ruang  gelap,  segera  ditambahkan  NaOH  3N sebanyak  50  µl  pada  tiap  sumuran  untuk menghentikan  reaksi.  Hasilnya  kemudian  dibaca dengan ELISA reader dengan panjang gelombang  405  nm.  Pembacaan  titer  antibodi dilakukan  dengan  ELISA  Reader,  hasil  yang didapat berupa nilai absorbansi.

## Analisis Data
Data  hasil penelitian  yang diperoleh berupa nilai OD yang dianalisis dengan uji ANOVA dan dilanjutkan Duncan Multiple Range Test 5% yang membandingkan  nilai  OD  dan  uji  T-test  ntuk melihat  perbandingan  di  setiap  minggunya. Software yang digunakan adalah SPSS v.16.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari  hasil  ELISA  dapat  diketahui  bahwa pada minggu ke-2 pasca vaksinasi Kelompok P3 yaitu  kelompok  mencit  yang  divaksin  dengan dengan whole virus IB strain local I-147 memiliki nilai  rata-rata  OD  tertinggi  yang  diikuti selanjutnya secara berurutan yaitu Kelompok P4 yang  divaksin  dengan whole  virus strain Massachusetts,  Kelompok  P2  protein  S  strain Massachusetts dan Kelompok P1 protein S strain lokal (I-147) (Tabel 1).
Tabel 1. Rata-rata dan simpangan baku nilai
OD pada kelompok perlakuan OD Minggu ke-2 OD Minggu ke-4 P1 0,3395ª ± 0,03 0,4041ª ± 0,06 P2 0,3480ª ± 0, 08 0,3950ª ± 0,04 P3 0,5962 𝑏 ± 0,13 0,4701 𝑏 ± 0,03 P4 0,3597ª ± 0,05 0,5073 𝑏 ± 0,09
Superskrip  berbeda  pada  kolom  yang  sama menunjukkan perbedaan signifikan (p<0,05).
Hasil  yang  berbeda  ditunjukkan  pada minggu  ke-4  pasca  vaksinasi  dengan  Kelompok
P4  yang  divaksin  dengan whole  virus strain Massachusetts  memiliki  nilai  OD  tertinggi  yang diikuti oleh Kelompok P3 yang divaksin dengan dengan whole virus  IB strain  local  I-147, Kelompok  P1  protein  S  strain  lokal  (I-147)  dan Kelompok P2 protein S strain Massachusetts.
Gambar . 1. Hasil pengujian antibodi mencit dari Protein S dan whole virus di Minggu ke-2 dan Minggu ke-4.
Rata-rata dan simpangan baku di minggu ke 2 nilai OD pada perlakuan whole virus  IB strain lokal (I-147) menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05)  dengan  perlakuan whole  virus strain Massachusetts , protein S strain lokal (I 147) dan whole virus strain Massachusetts. Dan di minggu ke 4 rata-rata dan simpangan baku nilai OD pada perlakuan Whole virus IB strain lokal (I-147) dan whole virus IB strain Massachusetts menunjukkan  perbedaan  yang  nyata  (p>0,05) dengan perlakuan protein S strain Massachusetts dan protein S strain lokal (I 147).
Hasil  analisis  statistik  menggunakan  uji ANOVA  dan  dilanjutkan  uji Duncan  Multiple Range Test 5% dengan menganalisis nilai optical density (OD)  terhadap setiap perlakuan di  setiap minggunya,  dapat  dilihat  pada  Gambar  1 menunjukkan  perbedaan  yang  signifikan.  Pada minggu ke 2 perlakuan dengan whole virus virus IB strain lokal (I-147) (P3) mempunyai rata-rata dan  simpangan  baku  tertinggi.  dan  minggu  ke  4 perlakuan dengan whole virus virus IB strain lokal (I-147)  (P3)  dan  dengan  whole  virus  virus  IB strain  Massachusetts  (P4)  mempunyai  rata-rata dan simpangan baku tertinggi. Hal ini sependapat dengan  penelitian  sebelumnya  yang  menyatakan bahwa respon imunogenik dari protein S1, S2 , M, dan N yang dapat memicu terbentuk nya antobodi
pada tubuh ayam yang terinfeksi (Dharmayanti et al. , 2005).
Hasil  analisis  statistik  menggunakan  uji ANOVA  dan  dilanjutkan  uji Duncan  Multiple Range  Test 5%  dan  uji  T-test  menunjukkan perbedaan  yang  signifikan.  Perlakuan  dengan whole virus virus strain lokal (I-147) mempunyai rata-rata dan simpangan baku tertinggi di minggu ke  2  dan  ke  4 . Hal  ini  sependapat  dengan penelitian  sebelumnya  yang  menyatakan  bahwa terbentuknya respon imun dari protein S , M, dan N  yang  pada  tubuh  ayam  yang  sudah  terinfeksi virus  IB  (Bahri  dkk.,  2005).  Imunogen merupakan  substansi  yang  menginduksi  respon imun  spesifik,  humoral,  seluler,  atau  keduanya, setelah  diolah  oleh  Antigen  Presenting  Cell (APC),  maka  imunogen  akan  bereaksi  dengan produk respon imun spesifik. Respon imun yang ditimbulkan  dari  IBV  meliputi  protein  S  ( Spike ) yang terdiri dari S1 dan S2, Protein M (Bijlenga et al. , 2004).
Hasil  analisis  statistik  menggunakan  uji  T- test  Independent  dengan  menganalisis  nilai  OD antara minggu ke dua dan minggu ke empat, dapat dilihat  pada  Gambar  1  menunjukkan  tidak terdapat perbedaan yang sangat signifikan. Hal ini diakibatkan  adanya  faktor  immunosuppresi, faktor immunosuppresi juga bisa ikut memperparah  reaksi  setelah  vaksinasi,  faktor  ini bisa  disebabkan  karena  infeksius  atau  faktor noninfeksius  seperti  akibat  hewan  mengalami stres  baik  internal  maupun  eksternal  lingkungan (De Groot , 2012) .
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  nilai OD  pada  perlakuan  dengan whole  virus strain lokal  I-147  lebih  tinggi  dibandingkan  perlakuan lainnya. Komponen imunogenik yang menimbulkan  respon  antibodi  dari  IBV  meliputi protein S ( Spike ) dan N ( Nukleoprotein) (Cook et al. ,  2012),  sedangkan  protein  M  IBV  dikenali sebagai  protein  imunogenik  (Feng et  al. ,  2015). Protein S diketahui menimbulkan respon antibodi tertinggi  dibandingkan  protein  lain,  oleh  karena itu  protein  S  dipilih  sebagai  target  primer  untuk pengembangan vaksin (Jackwood, 2012).
Enzyme  linked  immunoassay (ELISA) merupakan  salah  satu  uji  serologi  dalam mendeteksi adanya antibodi dalam serum mencit
0,2 0,4 0,6 0,8 Minggu ke-2 Minggu ke-4 Protein S 147 Protein S Mass
Whole v I-147 Whole v Mass
ELISA  adalah  salah  satu  metode  yang  sensitif untuk  mendeteksi  antibodi,  antigen  dan  hormon maupun  bahan  toksik.  Metode  ini  merupakan pengembangan  dari  sistem  deteksi  dengan imunofluoresens atau radioaktif (Rantam., 2003). Konfigurasi indirect ELISA  selain  banyak  di manfaatkan untuk deteksi antibodi, penetuan titer maupun  kadar  antibodi,  juga  dapat  digunakan untuk  penentu  kelas  immunoglobulin  pada penyakit  infeksi,  penyakit  auto  imun  atau  faktor penentu faktor rheumatoid (Indriani dan Dharmayanti, 2013).

## KESIMPULAN
Uji  imunogenisitas  dengan  menggunakan ELISA  menunjukkan  bahwa  penggunaan whole virus  IB  menghasilkan  titer  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  antigen  protein  S  pada kedua strain baik lokal I-147 maupun Massachusetts.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Peternakan  Ayam  di  Jawa  Timur  dan  Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.

## DAFTAR PUSTAKA
Bahri , S.,  Masbulan,  E.,  &  Kusumaningsih,  A.
(2005).  Proses  Praproduksi  sebagai  Faktor Penting dalam Menghasilkan Produk Ternak yang Aman untuk Manusia. Hal: 18.
Cavanagh,  D.,  Davis,  P.  J.,  Cook,  J.  K.,  Li,  D., Kant,  A.,  &  Koch.  (1992).  Location  of  the amino  acid  differences  in  the  S1  spike glycoprotein  subunit  of  closely  related serotypes  of  infectious  bronchitis  virus.
Avian Diseases , 21, 33-43.
Cavanagh,  D.,  &  Naqi  S.  (2003).  Infectious Bronchitis. In: Saif YM, Barnes HJ, Glisson
JR,  et  al.,  eds.  Diseases  of  Poultry.  11 th ed. Ames,  IA:  Iowa  State University Press. Pp:
101–119.
Cook,  J.  K.  A.,  Jackwood,  M.,  &  Jones,  R.  C.
(2012).  The  Long  View:  40  Years  of Infectious  Research. Avian  Pathology ,  41, 239-50
De  Groot,  R.  (2012).  Family  Coronaviridae.  In: King,  A.M.Q.,  Adams,  M.J.,  Carstens,E.B., Lefkowitz, E.J. (Eds.), Virus Taxonomy, the 9th Report of the International Committee on Taxonomy  of  Viruses.  Elsevier  Academic Press, San, Diego. Pp: 806–828.
Dharmayanti , N.  L.  P.  I.,  Indriani,  R.,  & Darminto.  (2005).  Hubungan  Kekerabatan Virus  Infectious  Bronchitis  Isolat  Lapang Indonesia. Jurnal  Bioteknologi  Pertanian , 10(1), 15-23.
Indriani, R., & Darminto. (2000). Variasi Serotipe Isolat-Isolat Virus Infectiuos Bronchitis yang Berasal dari Beberapa Daerah di Pulau Jawa. Jurnal Ilmu Ternak Veteriner, 5(4), 234-240.
Indriani,  R.,  &  Dharmayanti,  N.  L.  P.  (2013).
Development of an Enzyme-linked Immunosorbent  Assay  for  Detection  of Infectious  Bronchitis  Antibody  in  Chicken Using Local Isolate Virus. JBI , 9(2).
Rantam,  F.  A.  (2003).  Metode  Imunologi. Airlangga  University  Press.  Surabaya.  Hal: 79-81.
Tabbu,  C.  R.  (2000).  Penyakit  Ayam  dan
Penangulangannya.Penyakit Bakterial,
Mikal  dan  Viral.  Volume  1.  Penerbit Kanisus, Yogayakarta. Hal: 32.