Biosensor Amperometri Untuk Deteksi Glukosa Berbasis Immobilisasi Glukosa Oksidase Dalam Membran Selulosa Asetat Dengan Ferrocene Sebagai Mediator
Amperometric biosensor for glucose detection based-on immobilisation of glucose oxidase in  acetic cellulose  membrane using ferrocene as mediator
Asnawati *) , Dwi Indarti, Tri Mulyono, Gembong Kesuma B Jurusan Kimia FMIPA Universitas Jember
*) Email: asnawati08@yahoo.com

## ABSTRACT
The study reported the development of glucose ampherometric biosensor based on immobilization of  glucose  oxidase  on  cellulose  acetate  membrane  with  ferrocene  as  a  mediator.  Biosensor  was designed with model Fc, GOx, CP / GOx / CA where ferrocene and the enzyme glucose oxidase on carbon paste in immobilizatin on the electrode body in the form of glass tubes and in other parts of  the  enzyme  glucose  oxidase  in  immobilizatin  on  cellulose  acetate  membrane  with  adsorption techniques are placed in electrode tip by using the o-ring. The presence of enzymes immobilization was determined quantitatively by enzyme immobilization was Km value. The results showed the composition  of  acetone-water  in  the  optimum  coagulation  bath  is  0:100%  and  0.0008  g  of Optimum ferrocene. Biosensor for measuring glucose in the area amperometri 0.1 to 3 mM with regression coefficient of 0.996, the detection limit of 0.01 mM, sensitivity of 0.989 μA / mM, the reproducibility of 0.07 to 0.3% and lifetime of 1 day.
Keywords : Biosensor; glucose oxidase ; acetic cellulose; Ferrocene: Ampherometric; Glucose

## PENDAHULUAN
Kadar  glukosa  yang  tinggi  dalam  darah merupakan  indikator  seseorang  sakit  diabetes melitus.  Hasil  penelitian  secara  menyeluruh  di dunia  lebih  dari  30  juta  orang  penderita diabetes melitus. Penentuan kandungan glukosa dalam darah adalah tes yang sangat diperlukan untuk  diagnosis  diabetes  melitus.  Disamping kontrol  diabetes,  alat  yang  sama  memberikan janji  yang  besar  untuk  aplikasi  penting  lain yaitu  monitoring  bioproses  analisis  makanan. Berangkat  dari  fenomena  di  atas,  penelitian yang  mengarah  kepada  pengembangan  sensor untuk  penentuan  glukosa  masih  sangat diperlukan . Dengan  mengeksplorasi  bahan- bahan  baru  sebagai    material  sensor  akan memberikan  perkembangan  ilmu  pengetahuan khususnya di bidang sensor.
Sellulosa  asetat  merupakan  ester  organik turunan  sellulosa,  secara  luas  digunakan sebagai fibres, plastik  dan  membran  dalam beberapa  industri  (Jandura et.  al., 2000). Penggunaan  utama  dalam  industri  tekstil,  film fotografi,  filter  cerutu  (Pauly et  al .,  1995), dalam  industri  makanan,  dan  juga  membran
sebagai dialisis (Kiso et. al ., 1999). Valente et al. , 2005 memodifikasi polyanilin dan selulosa asetat  sebagai  membran  untuk  sodium  dodesil sulfat,  hasilnya  menunjukkan  transport  SDS dan  air  tergantung  densitas  polimer  dan kandungan  PANi.  Membran  sellulosa  asetat yang  mengandung  ferrosen/nafion  untuk biosensor  fruktosa  menghasilkan  limit  deteksi yang  rendah  dan  sangat  efisien  untuk mengeliminasi  interferensi  asam  askorbat  ( Tkac et. al ., 2001).
Kinerja biosensor
amperometri dipengaruhi  oleh  aktivitas  enzym,  konsentrasi sampel,  permeabilitas  membran,  jenis  dan konsentrasi  mediator,  matrik  dalam  sampel. Modifikasi  disain  rangkaian  elektroda  kerja (enzym,  membran,  mediator) merupakan  salah satu  cara  untuk  memperbaiki  kinerja  sensor amperometri.  Nakabayasyi et  al ,  1998 menentukan hydrogen peroksida secara amperometri  berbasiskan  transfer  electron antara  HRP yang diimmobilisasikan pada film polimer  3-amino  phenol  (PAPO)  dan  ferrosen sebagai  mediator  dengan  memodifikasi  disain elektroda  kerja  dengan  3  macam  model  yang berbeda  yaitu  :  Fc,  HRP,CP/HRP/PAPO; Fc,CP/HRP/PAPO  dan  Fc,HRP/CP/PAPO.
Hasil  penelitian  menunjukkan    bahwa  sensor model  Fc,  HRP,CP/HRP/PAPO  memberikan sensitivitas yang paling tinggi. Penelitian  ini  mendisain  model  elektroda kerja  seperti  diatas  untuk  sensor  glukosa dengan  enzim  gluckosa  oksidase  yang diimmobilisasikan  pada  sellulosa  asetat  dan ferrosen sebagai mediator (Fc,GOx,CP/GOx/CA) dengan harapan memiliki  sensitivitas  yang  baik  serta lifetime yang panjang untuk mendeteksi glukosa dalam darah.  Sebagai  acuan  ditetapkan  beberapa tujuan  penelitian  yaitu  mengetahui:  komposisi aseton-air dalam bak koagulasi untuk membran selulosa  asetat  optimum,  jumlah  optimum  Fc, karakteristik  biosensor  glukosa  serta  kinerja biosensor
Fc,GOx,CP/GOx/CA untuk
mendeteksi kadar glukosa secara amperometri.

## METODE
Alat dan Bahan Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian meliputi  peralatan  gelas,  neraca  analitik OHAUS  Pioneer ,  home  made  potensiostat DAQ  PCI  622  NI,  hot  plate  dan  stirer magnetik,  pH  meter  Jenway  3320  dan spektrofotometer 21 D.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi selulosa asetat (Brataco), dimetil  ftalat  (ρ  =  1,19  g/mL),  aseton  (ρ  =  0,79 g/mL),   DMSO   (ρ   =   1,11   g/mL),   Glukosa, nelson A, nelson B, arsenomolibdat, ferrocene , parafin  cair,  glukosa  oksidase  merk  Sigma aldrich,  grafit,  sodium  klorida,  sodium hidroksida, akuademineralisasi dan gas nitrogen.

## Prosedur Penelitian

## Pembuatan Membran Selulosa Asetat
Membran  selulosa  asetat  dibuat  dengan menggunakan metode inversi fasa, yang terdiri dari selulosa asetat, aseton-DMSO dan  dimetil ftalat  dengan  koagulan  campuran  aseton-air. Selulosa  asetat  dengan  berat  1,1  gram dilarutkan  dalam    6,8  mL  DMSO,  2,3  mL aseton   (ρ aseton =  0,79  g/mL)  dan  dimetil  ftalat (ρ Dmp =  1,19  gram/mL)  sebanyak  0,5  mL kemudian diaduk dengan stirer sampai larutan homogen.  Larutan  dicetak  dan    bak  koagulasi terdiri dari : aseton-air 0:100 %,  1:99 %,  3:97 %, 5:95 % dan pada setiap membran dilakukan uji  permeabilitas.  Uji  permeabilitas  dilakukan dengan  melewatkan  glukosa  0,01  M  pada setiap  membran  yang  ditempatkan  pada  sel
permeabilitas.  Larutan  glukosa  yang  telah melewati  membran  dianalisis  konsentrasinya menggunakan  metode  Nelson-Somogyi  dan membaca absorbansinya pada panjang gelombang 690 nm.

## Pembuatan Biosensor Glukosa
Membran  optimum  yang  diperoleh  kemudian dipotong  dengan  ukuran  3  x  3  cm,  ukuran  ini disesuaikan  dengan  elektroda  kerja.  Membran selulosa  asetat  yang  telah  dipotong  kemudian ditetesi  dengan  larutan  buffer  phosphat  0,1  M pH  7  yang  mengandung  2,5  x  10 5 unit/L glukosa  oksidase  kemudian  didiamkan  selama 24  jam  di  dalam  lemari  es.  Serbuk  grafit sebanyak 0,1 g dicampur dengan 1,2 mg GOx, ferrocene (0,4;  0,8;  1,2;  1,6  mg),  dan ditambahkan  parafin  cair  hingga  terbentuk pasta karbon yang tidak terlalu cair. Kemudian pasta  karbon  dimasukkan  ke  body  elektroda (tabung  kaca)  dan  dihubungkan  dengan  kawat tembaga.  Membran  selulosa  asetat-GOx  yang telah  dibuat  ditempelkan  pada  permukaan bawah  body  elektroda  pasta  karbon  dan  diikat menggunakan O-ring.

## HASIL dan PEMBAHASAN

## Permeabilitas Membran Selulosa Asetat
Permeabilitas membran merupakan kemampuan suatu membran dalam melewatkan suatu permeat atau analit. Penentuan permeabilitas  membran  dilakukan  dengan menempatkan membran selulosa asetat diantara sel  permeabilitas.  Sel  permeabilitas  tersebut mempunyai dua tempat larutan yang akan diisi dengan  larutan  glukosa  0,01  M  dan  air.  Sel didiamkan  selama  1  jam  agar  terjadi  difusi glukosa melewati membran, kemudian konsentrasi  glukosa  yang  melewati  membran ditentukan  menggunakan  metode  Nelson- Somogyi pada panjang gelombang 690 nm.
Komposisi aseton-air dalam bak koagulasi yang  optimum  adalah  komposisi  aseton-air 0:100  %  yang  mampu  melewatkan  glukosa dengan  prosentase  berat  sebesar  50  %. Komposisi  aseton-air  0:100  %  mampu melewatkan  konsentrasi  glukosa  lebih  besar dari  komposisi  aseton-air  yang  lain  karena proses pemadatan membran yang terjadi karena interaksi  pendesakan  pelarut  (aseton)  dan  non pelarut  (air)  berlangsung  cepat  atau  terjadi proses instantaneous demixing yang menyebabkan terbentuknya pori membran yang lebih besar, tetapi dengan adanya komposisi
lain yang ada dalam bak koagulasi yaitu aseton (komposisi aseton-air dalam bak koagulasi 1:99 %,  3:97  %,  5:95  %)  maka  proses  pemadatan sesaat  atau instantaneous  demixing tidak  akan terjadi.
Aktivitas  Enzim  Glukosa  Oksidase  Bebas dan Terimmobilisasi
Perbedaan  antara  enzim  bebas  dan  enzim terimmobilisasi  terletak  pada  penempatan enzim, enzim bebas dilarutkan secara langsung pada  larutan  elektrolit  sedangkan  enzim terimmobilisasi  dijebak  dalam  membran dengan  cara  adsorpsi  serta  dicampur  di  dalam pasta  karbon.  Aktifitas  enzim  bebas  dan terimmobilisasi  dapat  ditentukan  melalui  nilai Km  yang    menyatakan  affinitas  enzim  atau kecenderungan  enzim  untuk  membentuk kompleks enzim-substrat.
Gambar  2.  Grafik  Linneweaver-Burk  pada
Enzim  Glukosa  Oksidase  Bebas dan Glukosa Oksidase Terimmobilisas Berdasarkan perhitungan didapatkan  nilai Km untuk  enzim  bebas  sebesar  0,004001  mM sedangkan nilai Km untuk enzim terimmobilisasi sebesar 0,04221 mM. Nilai  Km  enzim  terimmobilisasi  lebih besar dari pada nilai Km enzim bebas,  hal ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim terimmobilisasi  lebih  kecil  dari  pada  enzim bebas.  Nilai  Km  didapat  dari  persamaan K ,  sehingga  nilai  Km  akan berkebalikan  dengan  kecenderungan  enzim membentuk  kompleks  enzim-substrat.  Nilai Km  yang  terukur  pada  bentuk  enzim terimmobilisasi  menunjukkan  bahwa  ada enzim  yang  terimmobilisasi  dalam  biosensor meskipun  terjadi  pengurangan  aktivitas dibandingkan dengan enzim bentuk bebas. Berdasarkan  perhitungan  didapatkan  nilai  Km untuk  enzim  bebas  sebesar  0,004001  mM sedangkan nilai Km untuk enzim
terimmobilisasi sebesar 0,04221 mM. Nilai Km enzim  terimmobilisasi  lebih  besar  dari  pada nilai  Km  enzim  bebas,  hal  ini  menunjukkan bahwa  aktivitas  enzim  terimmobilisasi  lebih kecil dari pada enzim bebas. Nilai Km didapat dari persamaan K
, sehingga nilai Km akan  berkebalikan  dengan  kecenderungan enzim  membentuk  kompleks  enzim-substrat. Nilai  Km  yang  terukur  pada  bentuk  enzim terimmobilisasi menunjukkan bahwa ada enzim yang terimmobilisasi dalam biosensor
meskipun terjadi pengurangan aktivitas dibandingkan dengan enzim bentuk bebas.
Potensial Oksidasi Optimum Ferrocene (Fc) Biosensor Fc, GOx, CP/GOx/CA menggunakan ferrocene sebagai  mediator transfer  elektron,  disini ferrocene akan
teroksidasi lebih dahulu menjadi ion
Tabel 1.  Data konsentrasi glukosa yang melewati membran Komposisi Glukosa yang Melewati Membran Aseton-air Absorbansi Glukosa (%) U1 U2 U3 Rata-rata Prosentase Berat (%) 0:100 0,256 0,25 0,247 0,251 50 1:99 0,162 0,16 0,160 0,161 32 3:97 0,157 0,159 0,197 0,171 34 5:95 0,219 0,225 0,177 0,207 41
ferricinium (Fe + ) sebelum manangkap elektron dari  hasil  oksidasi  glukosa  oleh  enzim  GOx.
Penentuan potensial oksidasi optimum ferrocene dilakukan  menggunakan  metode voltametri  siklik  dengan  potensial  0,1-1,3  V, scanrate 5 mV/s dan 2 kali siklik.
Gambar  3.  menampilkan  voltamogram  siklik berwarna  biru  dan  merah,  warna  biru  adalah arus  dari  glukosa  sedangkan  warna  merah adalah  arus  dari  NaCl.  Pemberian  potensial antara  0,1-1,3  V  akan  membuat ferrocene teroksidasi  menjadi  ion ferricinium (Fc + ). Pemberian  potensial  0,773  V  menyebabkan terjadinya  kenaikan  arus,  hal  ini  disebabkan karena proses oksidasi ferrocene akan melepas elektron  sehingga  penambahan  elektron  dari proses ini akan terukur sebagai arus yang naik. Arus  ini  semakin  bertambah  hingga  mencapai puncaknya di potensial 0,959 V. Nilai potensial ini disebut sebagai potensial oksidasi optimum, dimana ferrocene teroksidasi paling banyak.

## Jumlah Optimum Ferrocene (Fc)
Optimasi  jumlah ferrocene dilakukan  untuk memperoleh  jumlah ferrocene optimum  pada biosensor Fc,GOx,CP/GOx/CA yang digunakan  untuk  pengukuran  selanjutnya. Optimasi  jumlah ferrocene dilakukan  dengan potensial  optimum  0,959  V  dengan  variasi 0,0004; 0,0008; 0,0012 dan 0,0016 g ferrocene .
Jumlah  enzim  GOx  yang  diimmobilisasi  dan jumlah  larutan  glukosa  yang  digunakan  pada optimasi  jumlah ferrocene adalah  sama,  maka enzim  akan  mengoksidasi  substrat  dengan jumlah  yang  sama  pula,  sehingga  jumlah elektron  yang  harus  di  transfer  oleh ferrocene ke elektroda kerja juga sama besarnya.
Dari gambar 5 dapat terlihat kenaikan arus dari Fc  0,0004  g  ke  Fc  0,0008  g,  hal  ini menyatakan bahwa jumlah Fc 0,0004 g masih belum  cukup  untuk  mentransfer  semua elektron yang dihasilkan dari oksidasi glukosa oleh GOx ke elektroda kerja. Pada Fc 0,0008 g didapatkan kenaikan arus optimum sebesar 9,3 µA,  hal  ini  menyatakan  bahwa  pada  titik tersebut  elektron  dapat  ditransfer  secara keseluruhan  ke  elektroda  kerja.  Fc  0,0008  g adalah  jumlah  optimum ferrocene sehingga jumlah ferrocene diatasnya seharusnya mampu mentransfer  seluruh  elektron  dari  hasil oksidasi  glukosa  ke  elektroda  kerja,  namun arus yang didapat dari Fc 0,0012 g dan 0,0016 g mengalami penurunan. Penurunan arus yang dihasilkan  disebabkan  semakin  banyaknya jumlah ferrocene yang  digunakan  akan menghasilkan  ion ferricinium yang  banyak pula,  sedangkan  jumlah  elektron  yang dihasilkan  dari  reaksi  oksidasi  glukosa cenderung  tetap  sehingga  akan  terjadi persaingan  antar  ion ferricinium dalam mentranfer  elektron,  hambatan  ini  yang menyebabkan arus yang dibaca semakin kecil. Dari  gambar  5.  dapat  disimpulkan  bahwa  Fc 0,0008  g  adalah  jumlah  optimum ferrocene dan akan dipakai dalam pengukuran selanjutnya.

## Karakteristik Biosensor Fc, GOx, CP /GOx /CA
Kemampuan  dari  biosensor  Fc,  GOx, CP/GOx/CA  dalam  mendeteksi  glukosa dikarakteristik  berdasarkan  kelinieran  kurva, limit  deteksi,  sensitivitas,  reprodusibilitas  dan lifetime pada kondisi optimum biosensor.
Gambar 3. Voltamogram Siklik Penentuan
Potensial  Oksidasi  Optimum Fc 0,0012 g dengan Menggunakan Enzim GOx dan Membran CA dengan Potensial 0,1-1,3 V dan s weep rate 5 mV/s. Gambar 4 Penentuan Jumlah Fc dengan 2 mM Glukosa, 0,5 M NaCl dalam 0,1 M
Buffer  Phosphat  pH  7,  Potensial 0,959V  vs  Ag/AgCl dan sweeprate 5mV/s
Gambar 5. Kurva Kalibrasi Biosensor
Fc,GOx,CP/GOx/CA  dilakukan  dengan
0,0008  g  Fc,  0,5  M  NaCl  dalam  0,1  M Buffer Phosphat pH 7, Potensial 0,959 V vs
Ag/AgCl dan sweep rate 5 mV/s.
Berdasarkan  gambar  6.  diketahui  bahwa arus  meningkat  sesuai  dengan  peningkatan konsentrasi  glukosa.  Hubungan  linier  ini menunjukkan  bahwa  konsentrasi  sebanding dengan  kenaikan  arus  yang  terukur.  Semakin tinggi konsentrasi glukosa maka semakin tinggi kenaikan  arus  yang  dihasilkan  karena  glukosa yang  dioksidasi  oleh  enzim  GOx  semakin banyak,  dan  elektron  yang  ditransfer  selama pengukuran menjadi semakin besar, ditunjukkan  dengan  arus  yang  semakin  tinggi. Koefisien  regresi  yang  diperoleh.  adalah sebesar 0,996, artinya ± 99,6 % perubahan arus dipengaruhi  oleh  perubahan  konsentrasi glukosa,  sedangkan  ±  0,4  %  dipengaruhi  oleh faktor lain.
Limit  deteksi  suatu  metode  pengukuran adalah  konsentrasi  terkecil  dari  analit  yang dapat  diukur  oleh  alat  dengan  baik.  semakin kecil  konsentrasi  yang  bisa  dideteksi  maka semakin  baik  karakteristik  sensor  tersebut. berdasarkan  kurva  kalibrasi  diperoleh  limit deteksi  pada  0,01  mm.  konsentrasi  terkecil yang bisa
diukur oleh biosensor fc,gox,cp/gox/ca adalah 0,01 mm. Sensitivitas  biosensor  Fc,GOx,CP/GOxCA ditentukan  berdasarkan  nilai slope /kemiringan dari  kurva  kalibrasi.  Sensitivitas  merupakan rasio  perubahan  sinyal  tiap  unit  perubahan konsentrasi  analit.  Berdasarkan  gambar  6. kurva kalibrasi biosensor Fc,GOx,CP/GOx/CA didapatkan  nilai  sensitivitas  sebesar  0,989 µA/mM,  nilai  tersebut  menyatatakan  bahwa dengan  pemberian  konsentrasi  analit  2  mM, biosensor  dapat  menghasilkan  arus  sebesar 1,978  μA.  Nilai  sensitivitas  yang  semakin  besar
menunjukkan semakin sensitiv metode analisis tersebut.
Gambar  6.  Penentuan  Reprodusibilitas  Biosensor Fc,  GOx,  CP/GOx/CA  dilakukan dengan  0,0008  g  Fc,  0,5  M  NaCl dalam  0,1  M  Buffer  Phosphat  pH  7, Potensial  0,959  V  vs  Ag/AgCl  dan sweep rate 5 mV/s.
Reprodusibilitas  merupakan  kemampuan biosensor  menghasilkan  output  yang  sama ketika  diberikan  input  yang  tetap    tanpa me reset ulang  sistem.  Reprodusibilitas  yang dinyatakan  dengan  Kv  (koevisien  variasi) menunjukkan  tingkat  kesalahan  pengukuran akibat  pengulangan.  Reprodusibilitas  sensor dalam  memberikan  respon  dikatakan  baik apabila  nilai  koevisien  variasinya  (Kv)  kurang dari  5  %.  Gambar  7.  menunjukkan reprodusibilitas  pengukuran  kenaikan    arus rata-rata  biosensor  Fc,GOx,CP/GOx/CA.  Nilai Kv  terendah  sebesar  0,07  %  didapatkan  pada saat  pengukuran  larutan  glukosa  2,5  mM sedangkan  Kv  tertinggi  sebesar  0,3  % didapatkan pada pengukuran larutan glukosa 1 mM.  Nilai  Kv  sebesar  0,07  -  0,3  % mengindikasikan  bahwa  setiap  100  kali pengukuran  terdapat  0,07  sampai  0,3  kali kesalahan.
Gambar  8.  Penentuan Lifetime Biosensor Fc,GOx,CP/GOx/CA dilakukan
dengan  0,0008  g  Fc,  0,5  M  NaCl dalam  0,1  M  Buffer  Phosphat  pH  7,
Potensial  0,959  V  vs  Ag/AgCl  dan sweep rate 5 mV/s. Penentuan lifetime biosensor Fc,GOx,CP/GOx/CA dilakukan dengan
potensial  optimum  0,959  V  dan  jumlah  Fc optimum 0,0008 g. Pengukuran dilakukan satu kali setiap hari dengan menggunakan elektroda yang  sama.  Biosensor  Fc,GOx,CP/GOx,CA bila  tidak  digunakan  akan  disimpan  dalam buffer  phosphate  pH  7  dengan  temperatur  4 0 C. Berdasarkan gambar 8. penentuan lifetime biosensor Fc,GOx,CP/GOx/CA dapat diketahui  bahwa  pada  hari  ke  2  dan  ke  3 biosensor  mengalami  penurunan  respon  arus glukosa  lebih  dari  5  %  dibandingkan  dengan hari  pertama,  sehingga  dapat  disimpulkan bahwa lifetime biosensor Fc,GOx,CP/GOx/CA adalah 1 hari.

## KESIMPULAN
Komposisi  aseton-air  dalam  bak  koagulasi untuk  membran  selulosa  asetat  agar  bekerja optimum  adalah  0:100  %.  Jumlah ferrocene optimum yang digunakan biosensor
Fc,GOx,CP/GOx/CA  adalah  0,0008  g.  Hasil karakterisasi  biosensor  Fc,GOx,CP/GOx/CA terhadap  glukosa:  koefisien  regresi  sebesar 0,996  dengan linier  range 0,1-3  mM;  limit deteksi  sebesar  0,01  mM;  sensitivitas  sebesar 0,989  µA/mM;  reprodusibilitas  sebesar  0,07- 0,3 %; lifetime 1 hari.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepeda DP2M,  Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen  Pendidikan  Nasional,  yang  telah membiayai penelitian Hibah Bersaing ini tahun 2008.

## DAFTAR PUSTAKA
Bajpai RN. 1989. Histologi Dasar . Edisi 4. Jakarta. PT Binarupa Aksara.
Bearden HJ. John WF. & Scott TW. 2004. Applied Animal  Reproduction .  Sixth  Edition.  New Jersey: Pearson Prentice Hall.
Bivens CLM. & Olster HO. 1997. Abnormal Estrous
Cyclicity and Behavioral Hyporesponsiveness to Ovarian Hormones in Genetically Obese Zucker Female Rats. Endocrinology 138 (1): 143-148 Chang AS. Dale AN. & Moley KH. 2005. Maternal Diabetes Adversely Affects Preovulatory Oocyte Maturation,  Development  and  Granulosa  Cell Apoptosis. Endocrinology 146 (5): 2445-2453. Colton  SA.  Humpherson  PG.  Leese  HJ.  &  Downs SM.  2003.  Physiological  Changes  in  Oocyte- cumulus  Cell  Complexes  from  Diabetic  Mice that  Potentially  Influence  Meiotic  Regulation. Biology of Reproduction 69 :761-770. Cox  NM.  Meurer  KA.  Carlton  CA.  Tubbs  RC  & Mannis  DP.  1994.  Effect  of  Diabetes  Mellitus during  the  Luteal  Phase  of  Oestrous  Cycle  on Preovulatory Follicular Function, Ovulation and
Gonadotrophins in Gilts. Journal of
Reproduction and Fertility 101 :77-86
Garris DR. Williams SK. Smith-West C. & West L.
1984. Diabetes-Assosiated Endometrial Disruption  in  The  Chinese  Hamster:  Structure Changes in Relation to Progressive
Hyperglycemia .  Experimental  Biology  and Medicine 17 (6): 293-300.
Garris  DR  &  Garris  BL.  2003.  Diabetes-induced. Progressive Endometrial Involution Characterization  of  Periluminal  Epithelial Lipoanathrophy. Experimental  Biology  and
Medicine 52 (1):51-58. Gaspersz V. 1994. Metode Perancangan Percobaan Untuk  Ilmu-ilmu  Pertanian,  Ilmu-ilmu  Teknik, Biologi . Bandung: Armico. Granot  I.  &  Dekel  N.  1998.  Cell-to-Cell Communication  in  The  Ovarian  Follicle: Development  and  Hormonal  Regulation  of  The Expression of Connexin 43. Human
Reproduction 13 Suppl:4.  European  Society  for Human Reproduction and Embryology.
Handari  SS.  1983. Metode  Pewarnaan .  Jakarta: Bhatara Karya Aksara.
Jesionowska  H.  Karelus  K.  &  Nelson  JF.  1990. Effects  of  Chronic  Exposure  to  Estradiol  on Ovarian Cyclicity in C57BL/6J Mice: Potention at  Low  Doses  and  Only  Partial  Suppression  at High  Doses. Biology  of  Reproduction 43 :312- 317.
Johnson  M.  1998. Diabetes; Terapi dan Pencegahannya . Jawa Barat: Indonesia Publishing House Anggota IKAPI.
Junqueira LC. & Carneiro J. 1998. Histologi Dasar. Edisi  3 . Terjemahan  Adji  Dharma  dari Basic
Histology. Jakarta:  Penerbit  Buku  Kedokteran EGC.
Krysko DV. Mussche S. Leybaert L. &  D’Herde  K.
2004.  Gap  junctional  Communication  and Connexin43 Expression in Relation to Apoptotic Cell  Death  and  Survival  of  Granulosa  Cells. Journal  of  Histochemistry  and  Cytochemistry 52 (90):1199-1207. Lumbantobing  SM.  2003. Stroke Bencana Peredaran  Darah  di  Otak .  Jakarta:  Balai penerbit  Fakultas  Kedokteran  Universitas Indonesia. Malole MBM & CSU Pramono. 1989. Penggunaan Hewan-Hewan  Percobaan  Di  Laboratorium. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Nurdiana  PN.  Setyawati  &  Ali  M.  1998.  Efek
Streptozotocin  Sebagai  Bahan  Diabetogenik Pada  Tikus  Wistar  Dengan  Cara  Pemberian Intraperitonial Dan Intravena . Majalah
Kedokteran Unibraw XIV (2): 66-73. Ranakusuma  AB.  1997. Koma  Hiperosmolar Hiperglikemik  Non  Ketotik .  Buku  Ajar  Ilmu Penyakit  Dalam  Jilid  I.  Edisi  3.  Jakarta:  Balai
Penerbit  Fakultas  Kedokteran  Universitas Indonesia.
Rossini  AA.  Like  AA.  Chick  WL.  Appel  MC.  &
Cahili  AFJr.  1977.  Studies  of  Streptozotocin- induced Insulitis and Diabetes. Proc.Natl.Acad.Sci.USA . 74 (6):2485-2489. Second  Annual  Report  on  Carcinogens.  2004. Streptozotocin. www.medicine.uiowa.edu/  frrb/ education, diakses pada tanggal 6 oktober 2004. Soeharto  I.  2001. Pencegahan  dan  Penyembuhan Penyakit  Jantung  Koroner  Panduan  Bagi Masyarakat  Umum .  Jakarta:  Penerbit  PT Gramedia Pustaka Utama. Utami  P.  2003. Tanaman  Obat  untuk  Mengatasi Diabetes Meliltus. Jakarta: Agromedia Pustaka. Wikipedia  2005. Gula  Darah. http:  wikipedia.org/ Gula-darah [20 Desember 2005].