Isolasi dan identifikasi kapang Rhizopus pada tempe gude ( Cajanus cajan L.)
Yuni Sine a dan Endang S. Soetarto b a Biologi, Universitas Timor, Kefamenanu, TTU – NTT, Indonesia, email: Yuni_sine@yahoo.com
b Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Indonesia.
Article Info Abstrak Article history: Received 1 Oktober 2018 Received in revised form 12 Oktober 2018 Accepted 16 Oktober 2018
Penelitian  yang  telah  dilakukan  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  kapang Rhizopus pada  tempe  gude,  seperti  diketahui  bahwa Rhizopus adalah kapang yang sangat penting dalam proses fermentasi tempe. Penelitian ini diawali dengan pembuatan tempe menggunakan biji gude sebagai substrat, yang diinokulasi dengan  inokulum tradisional (usar), diinkubasi pada temperatur kamar sampai  menjadi tempe  (48-72 jam). Kapang tempe gude diisolasi dan diidentifikasi dengan menggunakan metode pengenceran berseri dan spread plate . Hasil penelitian menunjukkan bahwa biji  gude sebagai substrat pertumbuhan Rhizopus sp. Kapang  tempe  gude didominasi oleh kapang  berwarna putih keabu-abuan dan putih abu-abu kecoklatan yang diidentifikasi mirip dengan Rhizopus oligosporus .
DOI: https://doi.org/10.32938/sc.v3i04.487
Keywords: Fermentasi, Gude, Tempe
1. Pendahuluan Rhizopus merupakan  kapang  yang  penting  dalam  industri  makanan sebagai  penghasil  berbagai  macam  enzim  seperti  amilase,  protease,  pektinase dan lipase. Kapang dari Rhizopus juga telah diketahui sejak lama sebagai kapang yang memegang peranan utama pada proses fermentasi kedelai menjadi tempe. Jenis-jenis kapang yang ditemukan diketahui sebagai Rhizopus oligosporus, R. oryzae, R. stolonifer (kapang roti), atau R. arrhizus ( Wipradnyadewi dkk. , 2010 ). Miselium Rhizopus terdiri dari dua jenis, satu tertanam dalam lapisan dan yang  lainnya  seperti  antena  membentuk  stolon.  Sporangiofor  yang  dibentuk biasanya berkelompok dua, tiga, atau lebih tetapi bisa juga hanya satu. Sporangia berbentuk sama, bundar atau hampir bundar dengan bagian tengah yang agak rata ( Gandjar, 2006 )
Dalam  proses  fermentasi  tempe  mikrobia  strain-strain  anggota  spesies Rhizopus yang  terlibat  adalah Rhizopus  oligosporus , R.  oryzae , R.  stolonifer (kapang  roti),  atau R . arrhizus . R.  oligosporus dan R.  oryzae adalah  strain anggota spesies Rhizopus yang paling dominan dan merupakan komponen yang paling  penting  dalam  fermentasi  tempe  ( Rahayu,  1989 ; Wipradnyadewi dkk. , 2010 ; Chutrtong & Bussabun, 2014) , hal ini karena R.oligosporus dan R. oryzae mempunyai  karakteristik  yang  sangat  berperan  dalam  fermentasi  tempe. Rhizopus menghasilkan enzim fitase yang memecah fitat, membuat komponen makro  pada  kedelai  dipecah  menjadi  komponen  mikro  sehingga  tempe  lebih mudah  dicerna  dan  zat  gizinya  lebih  mudah  terserap  tubuh.  Melalui  proses fermentasi, kedelai menjadi lebih enak dan meningkatkan nilai nutrisinya. Rasa dan aroma kedelai memang berubah setelah menjadi tempe. Tempe yang masih baru memiliki rasa dan bau yang spesifik ( Kasmidjo, 1990 ) Rahayu, (1989) menguraikan karakteristik kedua strain anggota Rhizopus tersebut,  yaitu:  tidak  menggunakan  karbohidrat  dari  biji  kacang  tetapi menggunakan  sumber  karbon  dari  glukosa,  mempunyai  aktivitas  enzim  lipase yang tinggi sehingga dapat mendegradasi lemak biji kacang menjadi asam lemak yang  digunakan  sebagai  sumber  energi,  mempunyai  aktivitas  proteolitik  yang tinggi, sehingga dapat mendegradasi protein dalam biji kacang, tidak mempunyai aktivitas  enzim  pektinase  dan  enzim  amilase  rendah,  dapat  mensisntesis komponen antioksidan, menghasilkan aroma yang spesifik.
Rhizopus menghasilkan enzim-enzim protease, protease merupakan enzim yang penting saat fermentasi. Kemampuan Rhizopus untuk memproduksi enzim proteolitik. Sistem enzim proteolitik memiliki pH optimal pada 3.0-5.5, dimana pH 3.0 pada saat perendaman dan 5.5 pada fermentasi tempe, pH stabil pada 3-6 ( Hesseltine,  1976 ),  Pada  kisaran  pH  ini  pertumbuhan  dari  bakteri  kontaminan akan terhambat, tetapi tidak dengan kapang pada tempe. Selain itu R. oligosporus juga  memproduksi  agen  antibakteri  (Wang dkk. ,  1969)  sehingga  bakteri mempunyai  kesempatan  yang  kecil  untuk  tumbuh  sebelum  proses  fermentasi selesai.  pH  terus  meningkat  disebabkan  karena  terjadi  pemecahan  protein ( Hesseltine & Wang, 1972 ).

## 2. Metode
Alat  yang  digunakan  untuk  penelitian  dan  analisis  berupa  seperangkat glassware (alat gelas) untuk mengkulturkan kapang dari tempe gude, mortar dan alu, oven (Hirayama MFG. CORP), inkubator (Despatch), pipet mikro 1000 µl (Eppendorf),  mikroskop  cahaya  (Boeco,  Germany),  lampu  bunsen,  spatula, penggaris, kamera digital.
Bahan yang digunakan untuk membuat tempe adalah: Biji gude ( Cajanus cajan L.) yang berasal dari Desa Binaus Kabupaten Timor Tengah Selatan-Nusa tenggara  Timur.  Mikrobia:  Kultur  campuran  Rhizopus  sp.  yang  berasal  dari kultur  inokulan  tempe  tradisional.  Media  pertumbuhan  kapang:  Media Potato Dextrose  Agar (PDA).  Bahan  kimia  Untuk  pengamatan  morfologi  kapang Pewarna atau cat mikrobia untuk kapang: methylenblue, gliserol, alcohol 70%.
Untuk mengidentifikasi terlebih dahulu dilakukan isolasi kapang yang ada pada  tempe.  Isolasi  kapang  dilakukan  dengan  metode  pengenceran  seri  dan spread  plate .  Sebanyak  10  g  sampel  tempe  yang  telah  dihaluskan  dilarutkan dalam 90 ml aquadest steril dengan cara divorteks (diperoleh pengenceran 10 -1 ). Dari  larutan  tersebut  diambil  1  ml  dan  dilarutkan  dalam  9  ml  aquadest  steril sehingga diperoleh pengenceran 10 -2 dan dilakukan sampai pengenceran 10 -3 dan divorteks hingga homogen. Masing-masing suspensi hasil pengenceran diambil
0,1 ml diinokulasikan ke dalam petridis yang berisi media PDA. Dari masing- masing pengenceran dibuat 3 ulangan dan diinkubasi pada 30 ° C selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan mengamati pertumbuhan koloni pada permukaan media.
Koloni  yang  tumbuh  kemudian  diambil  untuk  dipurifikasi  hingga diperoleh kultur murni. Purifikasi kultur dilakukan dengan cara mengambil hifa atau  spora  dari  koloni  kapang  yang  dipilih  dengan  menggunakan  ose  yang sebelumnya  telah  dipanaskan  terlebih  dahulu  hingga  pijar.  Melakukan pemindahan isolat (pemurnian) diulang sehingga menjadi isolat murni ( Hocking & Pitt, 1984 ).
Biakan mikrobia yang telah murni kemudian diamati secara makroskopis dan  mikroskopis  untuk  proses  identifikasi.  Pengamatan  secara  makroskopis dilakukan  terhadap  warna  dan  diameter  pertumbuhan  koloni  kapang  pada petridis.  Pengamatan  secara  mikroskopis  dilakukan  dengan  membuat  preparat jamur. Disiapkan gelas benda, lalu diberi 1 tetes gliserol. Diambil hifa dan spora dari  petridis  dengan  jarum  ose  dan  diletakkan  pada  tetesan  gliserol,  hifa  yang menggumpal  dipisahkan  dengan  jarum  ose.  Diberi  1  tetes  larutan  pewarna methylenblue dicampur  secara  merata  dengan  gliserol,  didiamkan  selama beberapa menit, kemudian ditutup dengan gelas penutup. Pewarna yang keluar dari gelas penutup dihisap dengan kertas tissue. Pengamatan morfologi seluler kapang  dilakukan  di  bawah  mikroskop  dengan  perbesaran  10  x10.  Dengan melakukan  pengamatan  terhadap  hifa  (sekat  dan  percabangan)  dan  spora  atau konidia  (bentuk,  ornamentasi)  dan  struktur  morfologi  lain  misalnya  rhizoid, stolon,  sel  kaki,  sporangiofor,  konidiofor  dan  sebagainya.  Dilakukan dokumentasi  dengan  foto  dan  gambar  serta  dilakukan  identifikasi  dengan mencocokkan pada gambar atau buku identifikasi ( Wipradnyadewi dkk. , 2010 ). Identifikasi mengacu pada buku Samson, ( Samson dkk. , 1981 ); serta buku Barnet dan Hunter ( Barnet & Hunter, 1998 ).

## 3. Hasil dan Pembahasan
Mikrobia  tempe  yang  telah  diisolasi  dengan  seri  pengenceran  10 -1 -10 -3 diberi kode berdasarkan hasil pengenceran (1, 2, dan 3) dan ujung-ujung tempe (A, B, C, dan D) sehingga didapatkan 12 isolat jamur seperti yang tertera pada Tabel  1. yang  kenampakannya  hampir  sama,  termasuk  kelompok Rhizopus. Pengamatan  mikrobia  yang  tumbuh  paling  awal  pada  tempe  dilakukan  secara makroskopis dan mikroskopis, untuk identifikasi.
Tabel 1. Hasil Pengamatan Karakter Makroskopik Jamur Tempe Gude
No Kode Isolat Warna Konidia Pengamatan pada Media PDA Miring Miselia Konidia 1 JTU1A Abu-abu kecoklatan +++ +++ 2 JTU1B Putih keabu-abuan +++ +++ 3 JTU1C Putih keabu-abuan +++ +++ 4 JTU1D Abu-abu kecoklatan +++ +++ 5 JTU2A Putih keabu-abuan +++ +++ 6 JTU2B Abu-abu kecoklatan +++ +++ 7 JTU2C
Putih keabu-abuan
+++ +++
8
JTU2D
Abu-abu kecoklatan
+++ +++
9
JTU3A
Putih keabu-abuan
+++ +++ 10 JTU3B Putih keabu-abuan +++ +++ 11 JTU3C
Putih keabu-abuan
+++ +++ 12 JTU3D Putih keabu-abuan +++ +++
Keterangan : +++: sangat lebat (menutupi seluruh media PDA miring)
Hasil  isolasi  pada  penelitian  ini  menunjukkan  warna  isolat  jamur  pada tempe berwarna hitam keabu-abuan dan putih keabu-abuan pada waktu 48 jam inkubasi,  setelah  lebih  dari  72  jam  koloni  mulai  berubah  menjadi  abu-abu kecoklatan dan hitam keabu-abuan. Hal ini menunjukkan adanya keterkaitan erat antara jamur berkonidia abu-abu kecoklatan dengan tempe. Dalam Samson dkk., (1981) dijelaskan  bahwa  jamur Rhizopus  oligosporus dan R.  oryzae memiliki konidia dengan warna abu-abu kecoklatan. E.s.s dkk. , (1979 ) menyatakan stok isolat  tersebut  secara  umum dikenal  sebagai  ragi  tempe  adalah R.  oligosporus
dan R. oryzae . Pertumbuhan kapang tempe sangat cepat pada waktu ± 48 sudah memenuhi petridis.
Ciri-ciri Rhizopus oligosporus dan R. oryzae juga dijelaskan oleh Gandjar dkk., (2006) yaitu R . oligosporus koloni berwarna putih abu-abu, dan mencapai tinggi sekitar 1 mm. Sporangiofor dapat tunggal atau berkelompok hingga 4 (6), berwarna subhialin hingga kecoklatan, muncul berlawanan arah dengan rhizoid yang sangat pendek, berdinding halus atau agak kasar, panjang hingga 1000 µm dan  berdiameter  10-18  µm.  sporangia  berbentuk  bulat,  berwarna  hitam kecoklatan  pada  saat  matang,  dan  berdiameter  (50)  100-180  µm.  kolumela berbentuk  bulat  hingga  semi  bulat  dengan  bentuk  apofise  menyerupai  corong. Sporangiaspora berbentuk bulat, elips, atau tidak teratur, memiliki panjang7-10 (24)  mm,  membentuk  massa  berwarna  kecoklatan,  bila  tunggal  berwarna subhialin,  dan  berdinding  halus.  Khlamidiospora  banyak,  dapat  tunggal  atau membentuk  rantai  pendek,  tidak  berwarna,  mengandung  butir-butir  granular, terdapat pada daerah hifa dan sporangiofor, berbentuk bulat elips atau silindris dan  berukuran  7-30  µm  atau  (2-45)  x  (7-35)  µm.  spesies  ini  memiliki  suhu pertumbuhan  optimum  30°-  35°C,  minimum  12°C,  dan  maksimum  42°C. Sedangkan Rhizopus  oryzae koloni  berwarna  keputihan  dan  menjadi  abu-abu kecoklatan dengan bertambahnya usia biakan, serta mencapai tinggi kurang lebih 10  mm.  stolon  berdinding  halus  atau  agak  kasar,  dan  hampir  tidak  berwarna hingga coklat kekuningan. Rhizoid berwarna kecoklatan, bercabang berlawanan arah dengan sporangiofor, atau sporangiofor dapat muncul langsung dari stolon tanpa  adanya  rhizoid.  Sporangiofor  dapat  tunggal  atau  berkelompok  hingga  5, kadang-kadang membentuk struktur sperti percabangan garpu, berdinding halus, memiliki panjang 150-2000 µm dan berdiameter 6-14 µm. sporangia berbentuk bulat  hingga  semi  bulat,  dinding  berduri,  berwarna  coklat  gelap  hingga  coklat
kehitaman,  dan  berdiameter  50-200  µm.  Kolumela  berbentuk  avoid  atau berbentuk  bulat,  avoid  atau  tidak  teratur,  sering  kali  berbentuk  polygonal, bergaris-garis  pada  permukaannya,  dan  memiliki  panjang  sekitar  4-10  µm. khlamidiospora  berbentuk  bulat,  berdiameter  10-35  µm,  atau  berbentuk  elips atau silindris dan berukuran (8-13)x(16-24) µm ( Gandjar, 2006 ). Rhizopus oligosporus dan R. oryzae memiliki suhu optimum, minimum, maksimum berturut-turut adalah 30-35°C, 12°C dan 42°C. Ditemukan di Jepang, China dan Indonesia yang diisolasi dari tempe ( Samson dkk. , 1981 ). Hocking dan Pitt  (1984) R.oligosporus memiliki  panjang  sporangiosfor  150-400  µm  lebih pendek dari R.oryzae yaitu lebih dari 1500 µm. R.oligosporus biasanya memiliki rhizoid yang pendek, sporangium dengan diameter 80 –120 µm dan pada saat 7 hari akan pecah yang menyebabkan spora keluar kolumela dengan diameter 25- 75 µm. Sedangkan R.oryzae memiliki diameter sporangium lebih dari 150 µm, kolumela dengan diameter lebih dari 100 µm.
Beberapa  sifat  penting  dari R.  oligosporus antara  lain  meliputi aktivitas enzimatiknya, kemampuan menghasilkan antibiotika, biosintesa vitamin-vitamin B,  kebutuhannya  akan  senyawa  sumber  karbon  dan  nitrogen,  perkecambahan spora,  dan  penetrasi  miselia  jamur  tempe  ke  dalam  jaringan  biji  kedelai ( Kasmidjo, 1990 ). Proses perebusan dapat mengeliminasi mikroorganisme yang lain,  tetapi  tidak  menutup  kemungkinan  terjadi  kontaminasi  kembali, R. oligosporus mampu  menghambat  pertumbuhan  mikroorganisme  yang  lain ( Anon,  1969 )  dan  mampu  mereduksi  kandungan asam  fitat  ( Feng dkk. , 2006 ). Hasil  identifikasi  isolat  kapang  yang  tumbuh  cepat  dan  dominan  pada  tempe menunjukkan  bahwa  8  dari  12  isolat  memiliki  karakter  yang  mirip  dengan Rhizopus  oligosporus ,  dengan  kode  isolat  JTU1B,  JTU1C,  JTU2C,  JTU3A, JTU3B, JTU3C dan JTU3D ( Tabel 2. ).
Tabel 2. Pengamatan Makroskopik dan Mikroskopik Hasil Isolasi Tempe
Karakter Kode Isolat R. oligosporus R. oryzae JTU1A JTU1B JTU1C JTU1D JTU2A JTU2B JTU2C JTU2D JTU3A JTU3B JTU3C JTU3D Warna konidia Abu-abu kecoklatan Hitam keabu- abuan Hitam keabu-abuan Abu-abu kecoklatan Hitam keabu-abuan Abu-abu kecoklatan Hitam keabu-abuan Abu-abu kecoklatan Hitam keabu-abuan Hitam keabu-abuan Hitam keabu-abuan Hitam keabu-abuan Hitam keabu- abuan* Abu-abu kecoklatan*** Warna miselium Putih Putih Putih Putih Putih Putih Putih Putih Putih Putih Putih Putih Putih* Putih** Panjang sporangiofor 142,33 µm 225,22 µm 240,61 µm 219,81 µm 275,58 µm 268,28 µm 190,47 µm 231,29 µm 238,11 µm 290,96 µm 176,43 µm 104,41 µm 150-400 µm*  150-1000 µm** Diameter sporangium 80µm 80µm 80µm 80µm 80µm 80µm 80µm 80µm 80µm 80µm 80µm 80µm 80-120 µm *  ˃150 µm* Panjang kolumela 40,39 µm 41,61 µm 28,31 µm 41,60 µm 36,33 µm 33,45 µm 24,34 µm 43,59 µm 55,35 µm 45,55 µm 35,68 µm 32,04 µm 25-27 µm* 30-120 µm*** Tekstur sporangiofor Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus** Halus** Bentuk kolumela Globose sampai subglobose Globose Globose Globose subglobose  Globose Globose Globose Globose sampai subglobose Globose Globose Globose sampai subglobose Globose sampai subglobose** Globose*** Bentuk konidia Globose Ellips Globose Ellips Ellips Ellips Ellips Globose Ellips Ellips Ellips Ellips ellips ** Globose *** Diameter konidia 8,55 µm 7,32 µm 8,63 µm 9,94 µm 7,32 µm 7,81 µm 9,55 µm 8,63 µm 9,94 µm 7,32 µm 8,03 µm 9,87 µm 7-10 (24) µm** 4-10 µm*** Rhizoid Berlawanan arah dengan sporangiofor atau terdapat pada stolon tanpa adanya sporangiofor Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek Berlawanan arah dengan sporangiofor atau terdapat pada stolon tanpa adanya sporangiofor Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek Berlawanan arah dengan sporangiofor dan pendek ** Berlawanan arah dengan sporangiofor atau terdapat pada stolon tanpa adanya sporangiofor *** Terindetifikasi sebagai: R.oryzae
R. oligosporus R. oligosporus
R.oryzae/ R. oligosporus R. oligosporus R.oryzae R. oligosporus R.oryzae R. oligosporus R. oligosporus R. oligosporus
R. oligosporus
Sumber: Pitt & Hocking (1997) *, Samson dkk. (1981) **, Watanabe (2010) ***.
4. Simpulan
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  kapang Rhizopus  oligosporus merupakan jenis kapang yang tumbuh lebih awal dalam fermentasi tempe dari biji gude ( C. cajan L.) dan merupakan kapang paling dominan yang melakukan fermentasi tempe dari biji gude ( C. cajan L.).

## Pustaka
Anon,  M.  1969.  Tempeh:  protein-rich  food  may  increase  disease  resistance.
Agricultural Research (Washington) , 17. Barnet,  H.  &  Hunter,  B.  1998. Illustrated  Genera  of  Imperfect  Fungi, .  The American Phytopathological Society Press.
Chutrtong,  J.  &  Bussabun,  T.  2014.  Preparation  of  Tempeh  Spore  Powder  by Freeze Drying. World Academy of Science, Engineering and Technology, International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering , 8(1): 40–43.
E.s.s, H., N, T. & Y, O. 1979. Microflora in Ragi and Usar [cereal and bakery products]. Journal of Fermentation Technology .
Feng,  X.  M.  2006.  Microbial  Dynamics  during  Barley  Tempeh  Fermentation. (Thesis). Acta. Swedish University of Agricultural Sciences Uppsala. Gandjar, I. 2006. Mikologi dasar dan terapan . Yayasan Obor Indonesia. Hesseltine, C.W. 1976. Research at Northern Regional Research Laboratory on Fermented  Foods. Proc.  Conf.  Soybean  Product  for  Protein  in  Human Foods. USDA . Hesseltine,  C.W.  &  Wang,  H.L.  1972.  Fermented  soybean  food  products. Soybeans: chemistry and technology , 1. Hocking, A.D. & Pitt, J.I. 1984. Food spoilage fungi 2. Heat-resistant fungi. Kasmidjo,  R.B.  1990.  Tempe:  Mikrobiologi  dan  biokimia  pengolahan  serta pemanfaatannya. PAU Pangan dan Gizi, UGM, Yogyakarta .
Pitt, J.I. & Hocking, A.D. 1997. Fungi and food spoilage. Blackie Academic & Professional. New South Wales, Australia . Rahayu, K. 1989. Mikrobiologi Pangan. Pengantar universitas pangan dan gizi . Universitas Gadjah Mada.
Samson, R.A., Hoekstra, E.S. & Van Oorschot, C.A. 1981. Introduction to food- borne fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures.
Wang, H.L., Ruttle, D.I. & Hesseltine, C.W. 1969. Antibacterial compound from a soybean product fermented by Rhizopus oligosporus. Proceedings of the Society for Experimental Biology and medicine , 131(2): 579–583. Watanabe,  T.  2010. Pictorial  atlas  of  soil  and  seed  fungi:  morphologies  of cultured fungi and key to species . CRC press. Wipradnyadewi,  P.A.,  Rahayu,  E.S.  &  Sri,  R.  2010. Isolasi  dan  Identifikasi Rhizopus oligosporus Pada Beberapa Inokulum Tempe .