# Korespondensi:  Program  Pascasarjana  Ilmu  Akuakultur, Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,  Insitut  Pertanian  Bogor. Jalan  Agatis,  Kampus  Dramaga,  Bogor  1680,  Jawa  Barat, Indonesia. Tel.  +  62  251  8622935 E-mail:  sukenda@ipb.ac.id
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## TOKSISITAS SEL UTUH DAN EXTRACELLULAR PRODUCT (ECP) Streptococcus agalactiae
 -HEMOLITIK  DAN  NON-HEMOLITIK  PADA  IKAN  NILA  (Oreochromis  niloticus)
Achmad  Suhermanto *)**) ,  Sukenda *)# ,  Muhammad  Zairin  Jr. *) ,  Angela  Mariana  Lusiastuti ***) , dan Sri  Nuryati *)
*) Program Pascasarjana Ilmu Akuakultur, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Insitut Pertanian Bogor Jalan Agatis, Kampus Dramaga, Bogor 1680, Jawa Barat
**) Politeknik Kelautan dan Perikanan Sorong, KKD-BP Kesehatan Ikan dan Lingkungan Jl. K. Pattimura, Tj. Kasuari, Sorong, Papua Barat
***) Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan Jl. Sempur  No. 1, Bogor 16129
(Naskah diterima: 9 Januari 2019; Revisi final: 14 Februari 2019; Disetujui publikasi: 15 Februari 2019)

## ABSTRAK
Bakteri  Streptococcus  agalactiae  tipe  -hemolitik  dan  non-hemolitik  menjadi  agen  penyebab  infeksi streptococcosis yang mengakibatkan kematian dan kerugian besar pada budidaya ikan nila. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan toksisitas sel utuh dan extracellular product (ECP) bakteri  -hemolitik dan non-hemolitik  yang  diinjeksikan  pada  ikan  nila.  Karakterisasi  S.  agalactiae  berdasarkan  SNI  dan  API  20 STREP,  serta  pemisahan  protein  dengan  metode  SDS-PAGE.  Pengujian  toksisitas  dilakukan  dengan  cara menginjeksikan sel utuh dan ECP S. agalactiae secara intraperitoneal (IP) dengan dosis 0,1 mL ekor -1 . Hasil uji biokimia,  dan  konfirmasi  dengan  API  20  STREP  menunjukkan  bahwa  semua  isolat  positif S.  agalactiae. Fraksinasi  protein  pada  sel  utuh  bakteri  diperoleh  pita  protein  masing-masing  sebanyak  sembilan  dan tujuh pita pada tipe  -hemolitik dan non-hemolitik. Fraksinasi ECP teridentifikasi pada  -hemolitik sebanyak tujuh pita dan non-hemolitik empat pita protein. Konsentrasi protein sel utuh dan ECP  -hemolitik lebih besar  dibandingkan  bakteri  non-hemolitik.  Gejala  abnormalitas  lebih  cepat  terjadi  pada  ikan  nila  yang diinjeksi ECP bakteri  -hemolitik dan berbanding lurus dengan kematian sebanyak 91%-100% pada jam ke- 13 pascainjeksi. Hasil ini menunjukkan bahwa ECP bakteri S. agalactiae  -hemolitik lebih virulen dibandingkan tipe non-hemolitik. Hingga akhir pemeliharaan tidak ada kematian pada ikan yang diinjeksi sel utuh bakteri S. agalactiae  -hemolitik dan non-hemolitik. Studi histopatologi ikan yang diinjeksi ECP S. agalactiae pada organ hati, limpa, otak, dan ginjal menunjukkan adanya kongesti, hemoragi, dan nekrosis.
KATA KUNCI: fraksinasi; gejala klinis; Streptococcus agalactiae; sintasan; ikan nila
ABSTRACT: Toxicity of whole cells and extracelluar product (ECP) of  -hemolytic and non-hemolytic Streptococcus agalactiae in tilapia (Oreochromis niloticus). By: Achmad Suhermanto, Sukenda, Muhammad Zairin Jr., Angela Mariana Lusiastuti, and Sri Nuryati
The  -hemolytic and non-hemolytic biotype of Streptococcus agalactiae are the agents that cause streptococcosis infection which resulted in high mortality and major losses in tilapia culture. This study aimed to compare the toxicity of  whole  cell  and  extracellular  product  (ECP)  -hemolytic  and  non-hemolytic  bacteria  from  injected  tilapia. Characterization of S. agalactiae was based on SNI and API 20 STREP and protein separation by SDS-PAGE method. Toxicity test was carried out by injecting whole cells and ECP S. agalactiae intraperitoneally with a dose of 0.1 mL fish- 1. The results of biochemical tests, with confirmation by API 20 STREP showed that all isolates were positive for S. agalactiae. Protein fractionation of whole bacterial cells obtained as many as nine and seven bands of protein in  -hemolytic and non hemolytic biotype, respectively. ECP fractionation was identified in b-hemolytic biotype as many
as seven bands and four protein bands in non-hemolytic. The whole cell protein concentration and ECP  -hemolytic were higher than non-hemolytic bacteria. Symptoms of abnormalities occurred faster in tilapia which was injected with ECP  -hemolytic bacteria and had positive correlation with 91%-100% mortalities at the 13 th hours post-injection. This results indicated that ECP of S. agalactiae b-hemolytic are more virulent than non-hemolytic. Until the end of the trial, there were no deaths in fish injected with whole cells of  -hemolytic and non-hemolytic S. agalactiae. Histopathological studies of ECP-injected fish S. agalactiae in the liver, spleen, brain, and kidneys showed congestion, hemorrhage, and necrosis.
KEYWORDS: fractionation; clinical sign; Streptococcus agalactiae; survival rate; tilapia

## PENDAHULUAN
Infeksi  streptococcosis  yang  disebabkan  bakteri streptococcus  menjadi  permasalahan  besar  dalam budidaya ikan air tawar di dunia termasuk Indonesia terutama  pada  ikan  nila (Amal  &  Zamri-Saad,  2011; Lusiastuti et al., 2014; Pradeep et al., 2016). Ciri khas gejala yang muncul pada ikan positif terinfeksi strep- tococcosis yaitu peradangan otak (meningoensefalitis), mata  menonjol  (pop-eye),  hilangnya  nafsu  makan, eksoptalmia lateral atau bilateral, perdarahan mata, kekeruhan pada kornea, perut buncit, sumsum tulang belakang melengkung membentuk huruf C, kekakuan, berenang tidak menentu (erratic), berputar (whirling), dan  pendarahan  di  dasar  sirip  (Amal  &  Zamri-Saad, 2011; Li et al., 2014). Streptococcus agalactiae merupakan patogen  penting  penyebab  streptococcosis  yang menimbulkan  kematian  dan  kerugian  besar  pada budidaya ikan nila (Sukenda et al., 2015; Kannika et al.,  2017).  Bakteri  S.  agalactiae  Group  B  Strepto- coccus (GBS) termasuk dalam kelompok bakteri Gram positif  yang  tidak  membentuk  spora,  tidak  bersifat asam,  non  motil,  -hemolitik,  dan  non-hemolitik berukuran diameter 0,6-1,2 µm (Pereira et al., 2013).
Identifikasi isolat bakteri S. agalactiae dan S. iniae di berbagai belahan dunia telah dilakukan dan diketahui tingkat prevalensi S. agalactiae lebih besar pada ikan tilapia  dari  pada  S.  iniae  (Sheehan  et  al.,  2009). Berdasarkan  karakteristik  biokimia  dan  fenotip, bakteri ini terbagi dalam dua kluster yaitu biotipe-1 (  -hemolitik) yang banyak menyerang budidaya ikan di kawasan  Asia dan biotipe-2  (non-hemolitik) yang dilaporkan menyebabkan kematian pada budidaya ikan nila  hampir  di  seluruh  dunia  (Sheehan  et  al.,  2009; Delannoy et al., 2014). S. agalactiae tipe  -hemolitik identik dengan serotipe Ia ditemukan di kawasan Asia Tenggara dan tersebar luas di Thailand (Kayansamruaj et al., 2015), Malaysia (Noraini et al., 2013; Amal et al., 2015),  banyak  menyebabkan  kematian  massal  pada budidaya ikan nila. Penelitian terhadap ikan nila dengan gejala streptococcosis di Indonesia mulai dilakukan pada  tahun  2009  dan  diketahui  bakteri  tipe  non- hemolitik lebih dominan dalam memberikan dampak kematian nila hingga 85% (Taukhid & Purwaningsih, 2009).
Beberapa  kajian  tentang  patogenisitas  telah dilakukan  pada  bakteri  S.  agalactiae,  dan  faktor virulensi menjadi salah satu faktor penting penyebab kematian  pada  ikan  nila  (Delannoy  et  al.,  2014; Kayansamruaj  et  al.,  2014,  Kannika  et  al.,  2017). Perbedaan  virulensi  pada  kedua  tipe  ini  belum diketahui dominan faktor penyebabnya. Virulensi pada bakteri  Gram  positif  (S.  agalactiae)  diketahui  pada komponen eksotoksin extracellular product (ECP) dan toksin lainnya, sedangkan pada bakteri Gram negatif adalah lipopolysaccharide (LPS)/endotoksin yang bersifat lebih  virulen  (Williams  et  al.,  2003).  Penelitian  ini bertujuan untuk membandingkan toksisitas sel utuh dan extracellular product (ECP) bakteri  -hemolitik dan non-hemolitik,  gejala  klinis  dan  histopatologi  pada ikan nila.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian dilaksanakan dari bulan November 2017- April  2018  di  Instalasi  Riset  Pengendalian  Penyakit Ikan (IRP2I) Depok, Jawa Barat. Pengujian profil dan konsentrasi protein dilakukan di laboratorium Pusat Antar Universitas (PAU) Institut Pertanian Bogor (IPB).

## Ikan Uji
Ikan  nila  (Oreochromis  niloticus)  strain  Nirwana-III sebagai ikan uji berasal dari Balai Pengembangan dan Pemacuan Stok Ikan Nila dan Mas Wanayasa, Jawa Barat. Ikan  uji  dengan  bobot  17,44  ±  1.400  g;  dipelihara dengan kepadatan 15 ekor akuarium -1 ukuran 60 cm x 35 cm x 35 cm, dan ketinggian air 25 cm. Aklimatisasi dilakukan selama 14 hari hingga ikan siap digunakan. Ikan uji yang digunakan bebas atau specific pathogen free  (SPF)  terhadap  bakteri  S.  agalactiae.  Pengujian dilakukan  pada  lima  ekor  ikan  dengan  mengisolasi organ mata, otak, dan ginjal ikan kemudian dikultur pada media brain heart infussion agar (BHIA), hasilnya tidak ditemukan S. agalactiae pada semua organ.

## Bakteri
Bakteri S. agalactiae berasal dari sampel ikan nila (O.  niloticus)  saat  terjadi  wabah  streptococcosis  di berbagai daerah  dengan organ  target yang  diisolasi berasal dari otak, ginjal anterior, dan mata, kemudian
dikultur pada media BHIA (Oxoid Ltd, UK) (Tabel 1), diinkubasi pada suhu 28°C selama 24 jam (SNI, 2009). Sebelum digunakan, empat isolat dilakukan Postulat koch’s sebanyak dua kali dengan cara menginjeksikan bakteri pada ikan nila secara intraperitoneal (IP) dengan dosis  0,1  mL  ekor -1 .  Isolasi  organ  target  dilakukan ketika ikan sudah mengalami gejala streptococcosis.
Uji  fenotipe  S.  agalactiae  dilakukan  berdasarkan metode standar  (SNI, 2009). Aktivitas  katalase diuji dengan  mereaksikan  bakteri  dengan  hidrogen peroksida  3%.  Katalase  positif  ditunjukkan  dengan adanya gelembung saat terjadi reaksi (Kannika et al., 2017). Uji konfirmasi menggunakan API 20 Strep Sys- tem  (bioMérieux  Industry,  Hazelwood,  USA)  sesuai protokol,  data  yang  diperoleh  diidentifikasi menggunakan software (https://apiweb. biomerieux.com).  Penentuan  biotipe  bakteri dilakukan dengan pengujian aktivitas hemolitik yaitu isolat  dikultur  pada  media  blood  agar  base  yang dicampur dengan 5% (v/v) darah kambing, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Indikator zona lisis pada  media  blood  agar  base  menunjukkan  isolat tersebut  -hemolitik.
Pengujian  Toksisitas  ECP  dan  Sel  Utuh  pada Ikan  Nila
Pengujian toksisitas dilakukan  menggunakan sel utuh dan ECP S. agalactiae, yang dinjeksikan secara IP pada 15  ekor ikan dengan  dosis 0,1  mL ekor -1 ,  dan dilakukan  pemeliharaan  ikan  selama  21  hari. Pengamatan  gejala  klinis  hingga  kematian  ikan  dan perubahan pola renang dilakukan hingga hari terakhir masa pemeliharaan.

## Isolasi  Extracelluar  Product  (ECP)
Isolasi  ECP  mengacu  pada  Hardi  (2011),  bakteri dikultur dalam media cair BHI 10 mL, diinkubasi selama 24  jam  pada  suhu  28°C-30°C.  Bakteri  yang  tumbuh kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 g selama  30  menit.  Supernatan  dan  sel  utuh  bakteri dipisahkan  dengan  penyaringan  menggunakan  filter paper 0,22 µm. Hasil filtrasi digunakan untuk pengujian
toksisitas  ECP,  sedangkan  sel  utuh  bakteri  dibilas sebanyak  tiga  kali  dengan  PBS  sebelum  dilakukan pengujian pada ikan nila. Ikan diinjeksi ECP dan sel utuh bakteri secara IP dengan dosis 0,1 mL ikan -1 .

## Fraksinasi  dan  Konsentrasi  Protein  Sel  Utuh dan ECP
Protein secara umum diukur menggunakan metode Bradford (1976) dan Sugiani (2012). Sebanyak 100 µL sampel ditambahkan 1 mL pereaksi Bradford kemudian di-vortex  dan  diukur  absorbansinya  pada  panjang gelombang 595 nm. Larutan stok pereaksi Bradford dibuat dengan cara melarutkan 350 mg serva blue G ke dalam 100 mL etanol 95% kemudian ditambahkan 200 mL phosphoric acid 88%. Sebanyak 30 mL larutan stok diambil  dan  ditambahkan  425  mL  akuades,  15  mL etanol 95%, dan 30 mL phosphoric acid 88%. Konsentrasi protein  contoh  dihitung  berdasarkan  kurva  standar yang dibuat dari bovine serum albumin (BSA). Protein pada  tahap  pemurnian  diamati  dengan  mengukur serapan pada panjang gelombang 280 nm.
Elektroforesis  dilakukan  mengikuti  metode Laemmli (1970); Zhang & Austin (2000) dengan tahapan persiapan gel pemisah (10%): 3,34 mL larutan A [30% (b/v)  akrilamid  dan  0,8%  (b/v)  bis-akrilamid];  2,5  mL larutan B (1,5 M Tris-Cl pH 8,8; 0,4% SDS) ditambah 50 µL  APS  10%  dan  5  µL  TEMED  dituangkan  ke  dalam cetakan gel. Stacking gel (5%): 0,67 mL larutan C (1 M Tris- Cl pH 6,8 dan 0,4% SDS); 2,3 mL akuades; 30 µL APS 10%; dan 5 µL TEMED dituang di atas gel pemisah yang  sudah  beku  kemudian  dipasang  sisir.  Bufer elektroforesis berisi Tris 25 mM, glisin 192 mM, dan SDS 0,1%, yang diatur pada pH 8,3.
Pemisahan protein dilakukan dengan cara protein sampel (20 µL) dicampur 5 µL bufer sampel (60 mM Tris-Cl  pH  6,8  25%  gliserol;  2%  SDS;  14,4  mM  2- merkaptoetananol;  dan  0,1%  bromfenol  biru), dididihkan selama 2-3 menit dan dimasukkan ke dalam gel.  Protein  dipisahkan  dengan  memberikan  aliran listrik  (125  mA  dan  150  V).  Gel  kemudian  diwarnai dengan perak nitrat.
Tabel 1. Kode dan asal isolat bakteri Table 1. Code and source of bacteria
Kode perlakuan Code of treatments Kode isolat Code of isolates Asal Source B NP105O Danau Sentani, Papua (Sentani Lake, Papua ) E N 14 G Waduk Cirata, Jawa Barat (Cirata Lake, West Java ) G NT01O Tasikmalaya, Jawa Barat (Tasikmalaya, West Java ) I SG01-16 Muaro Jambi, Jambi

## Mortalitas
Perhitungan  jumlah  kematian  ikan  dilakukan menggunakan rumus:
Keterangan (Note): M : mortalitas/mortality (%)
No :  jumlah ikan yang hidup pada awal pengamatan (ekor) Nt :  jumlah ikan yang hidup pada akhir pengamatan (ekor)
Rerata waktu kematian/mean time to death (MTD) dihitung berdasarkan Nitimulyo et al. (2005).

## Gejala  Klinis
Pengamatan  gejala  klinis  makroskopis  berupa perubahan  tingkah  laku  pola  berenang,  perubahan anatomi organ luar (kondisi permukaan tubuh, kondisi mata, dan warna tubuh).

## Histopatologi
Analisis histopatologi dilakukan pada organ hati, limpa, otak, dan ginjal ikan nila. Organ direndam dalam 10% netral buffer formalin (NBF) semalaman pada suhu ruang. Jaringan kemudian didehidrasi, ditanam dalam parafin dan dipotong dengan tebal 5 µm menggunakan Rotary  MicrotomeHisto  Line  MRS  3500.  Pewarnaan menggunakan  hematoxylin  dan  eosin  (HE),  hasil histopatologi dievaluasi sesuai standar.

## Analisis  Data
Penelitian dilakukan dengan metode eksperimental menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) terdiri atas delapan perlakuan. Empat perlakuan menggunakan sel utuh  bakteri dengan  kode B,  E, G,  dan I,  perlakuan lainnya menggunakan ECP bakteri  dengan kode B1, E1, G1, dan I1. Setiap perlakuan dilakukan pengulangan sebanyak tiga kali. Data yang diperoleh ditabulasi dan dianalisis menggunakan program Microsoft excel 2013. Pengaruh  perlakuan  dianalisis  dengan  sidik  ragam (ANOVA) dengan bantuan Software Minitab versi 17. Analisis yang menunjukkan pengaruh nyata, dilanjutkan dengan uji Fisher pada taraf kepercayaan 95%. Hasil uji API  20  STREP  dan  berat  molekul  protein  dianalisis secara deskriptif kualitatif.

## HASIL DAN BAHASAN
Hasil uji biokimia menunjukkan semua isolat yang diuji  katalase  dan  motilitas  diperoleh  hasil  negatif, pewarnaan  Gram  positif  dan  uji  fermentatif  positif. Uji aktivitas hemolitik menunjukkan isolat B (NP105O) dan I (SG01-16) positif  -hemolitik, sedangkan isolat N 14 G dan NT01O tipe non-hemolitik (Gambar 1). Hasil uji  tersebut  sama  dengan  penelitian  yang  telah
dilakukan pada bakteri S. agalactiae yang diisolasi dari ikan  nila  (Al  Harbi,  2016;  Kannika  et  al.,  2017).  Uji konfirmasi terhadap empat isolat dengan API 20 STREP diperoleh hasil  84,6%-98,1% S.  agalactiae. Bakteri  - hemolitik memiliki kemampuan menghidrolisis gula lebih banyak daripada non-hemolitik termasuk Treha- lose,  dan  amidon/starch,  hal  ini  sesuai  penelitian Sheehan et al. (2009) pada S. agalactiae.
Fraksinasi  sel  utuh  bakteri  dan  ECP  S.agalactiae dilakukan menggunakan SDS-PAGE untuk mengetahui berat  molekul  (BM)  protein  pada  sel  utuh  dan  ECP bakteri (Gambar 2). BM protein sel utuh S.agalactiae berada pada kisaran 13.93-150 kDa (Tabel 2), sedangkan sampel ECP bakteri tipe  -hemolitik berkisar antara
    100 x No Nt No % M  
Gambar 1. Aktivitas  bakteri  -hemolitik  (B,  I) (kiri) dan non-hemolitik (E, G).
Figure 1.  -hemolytic  (B,  I)  (left)  and  non- hemolytic (E, G) (right) activity on blood agar.
Keterangan (Note): M: marker; B: NP105O; G: NT01O; I: SG01-16; E: N 14 G; B1: ECP
NP105O; G1: ECP NT01O; I1: ECP SG01-16; E1: ECP N 14 G
Gambar 2. Hasil  fraksinasi  protein dari  sel  utuh  dan  ECP bakteri. Figure 2. Result of protein fractionation of whole cells and ECP.
32.00-85.41 kDa dan 59.43-85.41 kDa pada bakteri non-hemolitik (Tabel 3).
Hasil  fraksinasi  protein  pada  sel  utuh  bakteri  S. agalactiae  menunjukkan  jumlah  pita  protein  yang muncul sebanyak sembilan pita (  -hemolitik) dan tujuh pita  (non-hemolitik).  Bakteri  dan  non-hemolitik memiliki  pita  protein  yang  sama  pada  BM  150  kDa yang diperkirakan identik dengan pili backbone protein (Rosini  &  Margarit,  2015),  dan  BM  24  kDa kemungkinan identik dengan CAMP protein (Doran & Nizet, 2004).
Pili  backbone  protein  berfungsi  meningkatkan penempelan  patogen  pada  permukaan  keras  atau
jaringan inang, sedangkan CAMP factor yang menjadi faktor virulensi penting dan merupakan protein yang disekresikan untuk membentuk pori-pori di sel inang, mempromosikan kerusakan, dan invasi pada jaringan (Rajagopal,  2009).  Penelitian  berat  molekul  protein sel utuh S. agalactiae N 14 G yang diinkubasi selama 72 jam pada suhu 28°C-30°C diperoleh sebanyak 10 pita protein  dengan  berat  molekul  15,97-111,86  kDa (Sugiani, 2012). Lama inkubasi berpengaruh terhadap kepadatan bakteri N 14 G, inkubasi dalam rentang waktu 24 jam pertumbuhan bakteri sebesar 64,13 x 10 9 CFU/ mL; sedangkan pada waktu 72 jam pertumbuhannya mencapai 1,03 x 10 11 CFU/mL, kondisi ini kemungkinan berpengaruh  terhadap  profil  protein  bakteri.  Hasil
Tabel 2. Berat molekul protein sel utuh bakteri Table 2. Molecular weight of protein in whole cell of bacteria
Keterangan (Note): * Rosini & Margarit (2015); ** Doran & Nizet (2004); BL/UD: belum diketahui (undetected)
Tabel 3. Berat molekul protein ECP bakteri Table 3. Molecular weight of protein for ECP bacteria
B
(NP105O) I (SG01-16) E (N 14 G) G (NT01O)
150.00 + + + + Pili backbone protein* 79.00 + + - - CylE protein** 65.92 + + + + BL/UD 38.66 + + + + BL/UD 24.00 + + + + CAMP protein** 19.01 + + + + BL/UD 17.14 + + + + BL/UD 15.45 + + - - C protein alpha** 13.93 + + + + BL/UD Berat molekul Molecular weight (kDa) Protein Perlakuan (kode bakteri) Treatments (Code of bacteria)
B (NP105O) I
(SG01-16) E (N 14 G) G (NT01O)
150.00 + + + + Pili backbone protein* 79.00 + + - - CylE protein** 65.92 + + + + BL/UD 38.66 + + + + BL/UD 24.00 + + + + CAMP protein** 19.01 + + + + BL/UD 17.14 + + + + BL/UD 15.45 + + - - C protein alpha** 13.93 + + + +
BL/UD Perlakuan (kode bakteri) Treatments (code of bacteria) Berat molekul Molecular weight
(kDa) Protein
penghitungan  konsentrasi  protein  menunjukkan konsentrasi  protein  sel  utuh  dan  ECP  bakteri  - hemolitik lebih tinggi daripada non-hemolitik (Tabel 4).
Bakteri  hemolitik memiliki pita protein berbeda dibandingkan non-hemolitik yaitu pita protein dengan BM 79 kDa (cylE protein) diperkirakan identik dengan â-hemolisin/cytolysin  dan  15,45  kDa  (C  protein  alpha) (Doran  &  Nizet,  2004;  Spellerberg  et  al.,  1999). cylEprotein merupakan toksin penting bagi bakteri S. agalactiae  untuk  menginfeksi  inang,  menginduksi respons inflamasi, dan berkontribusi terhadap gejala neurologis (Rajagopal, 2009).
Fraksinasi pada ECP teridentifikasi sebanyak tujuh pita  protein  (  -hemolitik)  dan  empat  pita  protein (non-hemolitik).  Protein  pada  bakteri  -hemolitik dengan BM 79 kDa dan 32 kDa diduga identik dengan gen virulen cylE protein dan cylB protein (Doran & Nizet, 2004; Spellerberg et al., 1999). Semua bakteri memiliki protein dengan BM 85.41 kDa diduga identik dengan gen C protein beta (Doran & Nizet, 2004), merupakan  -protein yang memblokir pemusnahan sel intraseluler oleh netrofil (Doran & Nizet, 2004; Delannoy et  al., 2014).  Penelitian  profil  protein  ECP  NK1  diperoleh sebanyak 13 pita protein dengan BM 18,3-61,33 kDa (Suryadi et al., 2017) sedangkan fraksinasi ECP N 14 G menghasilkan dua pita protein dengan BM 21,99 dan 83,42 kDa (Sugiani, 2012). Perbedaan jumlah pita pro- tein kemungkinan karena perbedaan strain dan biotipe bakteri, media kultur, serta lama inkubasi bakteri.
Terdapat  perbedaan  signifikan  nilai  konsentrasi protein sel utuh semua bakteri, dengan konsentrasi tertinggi sebesar 0,912 mg mL -1 dihasilkan isolat SG- 01-16 dan konsentrasi terendah isolat N 14 G sebesar 0,421 mg mL -1 . Penelitian konsentrasi protein bakteri N 14 G yang dikultur selama 72 jam diperoleh hasil pada sel utuh sebesar 1,37 mg mL -1 dan ECP sebesar 1,89 mg mL -1 (Sugiani, 2012).
Pengujian terhadap abnormalitas dan kematian ikan dilakukan dengan menginjeksikan sel utuh dan ECP bakteri S. agalactiae, hasil pengamatan menunjukkan gejala  abnormalitas  yaitu  melanosis  pada  ikan  nila terjadi  pada  semua  perlakuan  (Tabel  5).  Ikan  yang diinjeksi  ECP  tipe  -hemolitik  dan  non-hemolitik mengalami gejala klinis gasping, ocular opacity, erratic, tubuh membentuk C-shape, whirling, ikan mengalami kekakuan, dan akhirnya mati.
Perbedaan hanya terjadi pada durasi waktu yakni ikan yang diinjeksi ECP bakteri  -hemolitik melano- sis terjadi jam kedua pascainjeksi diikuti gejala lain yaitu  ikan  bernafas  terengah-engah  (gasping), berenang  tidak  menentu  (erratic),  tubuh  ikan membentuk  huruf  C  (C-shape),  berenang  berputar (whirling),  dan  kaku.  Hasil  ini  berbeda  dengan penelitian Pretto-Giordano et al. (2010); Hardi (2011) menunjukkan ECP S. agalactiae yang diinjeksikan pada ikan  nila  menyebabkan  eksoptalmia  di  hari  kedua pasca-penyuntikan,  sedangkan  Suryadi  et  al.  (2017) menyatakan  gejala  klinis  berupa  perubahan  warna tubuh menjadi pucat terjadi pasca-penyuntikan ikan nila pada jam ke-24 dan ke-48.
ECP bakteri non-hemolitik yang diinjeksikan secara IP  reaksinya  lebih  lambat,  melanosis  pada  ikan  nila terjadi pada jam ke-8 pascainjeksi, diikuti gejala lain termasuk mata berwarna putih (ocular opacity). Gejala klinis  ini  hampir  sama  dengan  gejala  klinis  akibat infeksi bakteri yaitu perdarahan mata, kornea opac- ity, perut buncit, sumsum tulang belakang melengkung membentuk  huruf  C,  kekakuan  (Hardi  et  al.,  2011; Sugiani, 2012). ECP bakteri  -hemolitik memberikan reaksi yang cepat dalam menyebabkan abnormalitas pada ikan nila. Ikan nila yang diinjeksi sel utuh dan ECP  menunjukkan  hasil  bervariasi  berdasarkan perlakuan,  kematian  awal  terjadi  pada  enam  jam pascainjeksi  ECP SG01-16.  Mortalitas sebanyak  10% terjadi  pada  ikan  yang  diinjeksi  ECP  N 14 G,  12  jam pasca-penyuntikan (Gambar 3).
Tabel 4. Konsentrasi protein sel utuh dan ECP S.agalactiae Table 4. Protein concentration of whole cells and ECP S. agalactiae
Keterangan: Rerata dengan superscript berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan (p <0,05)
Note: The  mean  value  with  different  superscripts  showed  a  significant  difference  (p<0.05) Kode bakteri
Code of bacteria Konsentrasi protein sel utuh
Protein concentration of whole cells (mg mL -1 )

## Konsentrasi protein ECP
Protein concentration of ECP (mg mL -1 ) NP105O 0.909 ± 0.005 a 0.215 ± 0.009 d N 14 G 0.421 ± 0.007 c 0.146 ± 0.13 d NT01O 0.754 ± 0.006 b 0.207 ± 0.008 d SG01-16 0.912 ± 0.004 a 0.211 ± 0.007 d
Mortalitas  tertinggi  terjadi  pada  perlakuan  ECP SG01-16  dan  ECP  NP105O  sebesar  100%  dan  91%. Rerata  waktu  kematian  mengalami  perbedaan  yang signifikan yaitu kode perlakuan I1 rerata waktu 9,98 jam; B1 11,44 jam; dan  E1 82,29 jam. Hingga masa pemeliharaan selama 21 hari tidak ada kematian pada ikan yang dinjeksi semua sel utuh bakteri S. agalactiae.
ECP  berupa  toksin  yang  dihasilkan  bakteri  S. agalactiae merupakan komponen protein terlarut yang disekresikan  bakteri  pada  fase  pertumbuhan eksponensial,  biasanya  strain  virulen  menghasilkan toksin protein sebagai penentu utama virulensi (Todar, 2012). Aeromonas hydrophila menghasilkan toksin pro- tein  bersifat  sitotoksik,  sitolitik,  hemolitik,  dan enterotoksik;  dan  sangat virulen  terhadap  ikan  nila
(Khalil  &  Mansour,  1997),  Labeo  rohita  (Sahu  et  al., 2011),  dan  ikan  lele  (Pridgeon  et  al.,  2013).  ECP  A. hydrophila menyebabkan kematian sel, sitotoksisitas ginjal,  dan  hemolisis  saat  diinjeksikan  pada  ikan (Grayfer  et  al.,  2014),  serta  menimbulkan  kematian pada ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) dalam rentang  waktu  5-9  jam  pascainjeksi  (Nieto  et  al., 1991).  ECP  Vibrio  harveyi  mengandung  caseinase, gelatinase,  phospholipase,  lipase,  dan  hemolisin menyebabkan kematian sebesar 60%-100% ikan salmon (Salmo salar) (Zhang & Austin, 2000).
Kematian  yang  cepat  dan  banyak  pascainjeksi kemungkinan karena banyaknya produk dari gen virulen yang larut dalam ECP, terutama bakteri  -hemolitik. Penelitian pola kematian pada ikan yang terjadi secara
Tabel 5. Gejala klinis pada ikan nila yang diinjeksi sel utuh dan ECP S. agalactiae Table 5. Clinical signs on tilapia that were injected by whole cells and ECP S. agalactiae
B E G I B1 E1 G1 I1 Melanosis + + + + + + + + Gasping - - - - + + - + Ocular opacity - - - - - + - - Erratic - - - - + + - + C-shape - - - - + + - + Whirling - - - - + + - + Kaku (Rigor ) - - - - + + - + Kode perlakuan (Code of treatments ) Gejala klinis
Clinical signs
Gambar 3. Kurva  Kaplan-Meier  mortalitas  ikan pascainjeksi ECP S. agalactiae.
Figure 3. Kaplan-Meier curve of fish mortality post injection by  ECP  S.  agalactiae.
0    1   3   4   5    6   7    8   9  10 11 12 13 14   15  16 17  18  19 100 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 T in g ka t si n ta sa n ( Su rv iv al r at e) ( % )
Jam ke- pasca injeksi (Hour post injection) NT010         NP1050          N14G         SG01-16
cepat  dan  banyak  kemungkinan  karena  keberadaan beberapa  enzim  seperti  hemolisin,  lipase,  elastase, gelatinase,  chitinase  dalam  ECP  (Austin  &  Austin, 2007).
Konsentrasi  protein  pada  sel  utuh  tidak berpengaruh  terhadap  patogenesitas  terhadap  ikan nila.  Ikan  seperti  hewan  pada  umumnya  memiliki mekanisme pertahanan diri terhadap patogen (Shoe- maker et al., 2015). Sel utuh bakteri yang diinjeksikan ke ikan kemungkinan difagosit oleh sel-sel fagositik yang menghancurkan antigen melalui tiga tahap yaitu pelekatan, fagosit, dan pencernaan.
Toksin protein bakteri masuk ke dalam sel target melalui  dua  mekanisme,  pertama  toksin  langsung berikatan  dengan  reseptor  spesifik  pada  sel  target dan menginduksi pembentukan pori dalam membran melalui aktivitas enzimatik ditransfer ke sitoplasma sel. Mekanisme kedua yaitu alternatif, toksin berikatan dengan sel target dan struktur toksin dibawa ke dalam sel  melalui  proses  selektivitas  dan  efektivitas penangkapan makromolekul atau biasa disebut reseptor- mediated endocytosis (RME) (Todar, 2012). Studi in vitro menggunakan  mutan  group  B  Streptococcus  (GBS) isogenik  bakteri  non-hemolitik  maupun  hiper- hemolitik  menjelaskan  peranan  toksin   hemolysin/ cytolysin (  -h/c) terhadap patogenesis. Produksi  -h/c berkorelasi terhadap kerusakan sitolitik pada sel-sel epitel, sel endotel, dan makrofag, dibuktikan dengan berkurangnya  kepadatan  sitoplasma,  pemisahan sitoplasma, dan membran inti, dan organel membesar karena adanya mekanisme aksi pembentukan pori.  - h/c  menstimulasi  transkripsi  intraseluler  nitric  oxide synthase (iNOS) dan produksi nitric oxide (NO) dalam makrofag  dan  memicu  apoptosis  makrofag  melalui jalur MyD88-independen (Nizet, 2002).
Pengamatan histopatologi pada ikan nila dengan organ target hati, limpa, otak, dan ginjal menunjukkan adanya  abnormalitas  dengan  intensitas  bervariasi. Abnormalitas pada hati berupa peradangan sel secara menyeluruh,  kongesti  sinusoid  dan  hilangnya hepatosit,  nekrosis,  pembuluh  darah  besar  pada parenkima tampak berdilatasi dengan lumen terisi sel- sel  darah  (kongesti),  vakuola-vakuola  kosong  pada sitoplasma  sehingga  mendorong  nukleus  ke  tepi (diduga degenerasi) (Gambar 4). Limpa menunjukkan adanya nekrosis, infiltrasi sel radang, pulpa putih ger- minal centres tidak terlihat, dan degenerasi pulpa merah (Gambar 5), kongesti kapiler pada meninges, pigmen hemosiderin pada sitoplasma di jaringan otak (Gambar 6). Kongesti pembuluh darah tampak pada parenkima secara  menyeluruh  terjadi  di  ginjal,  pendarahan, pembekuan darah di glomeruli dan tubulus, infiltrasi sel-sel radang, serta nekrosis (Gambar 7).
Organ  hati  mengalami  perubahan  histopatologi yang menyebabkan terjadinya disfungsi hati sehingga fungsi utama hati untuk detoksifikasi racun atau benda asing  menjadi  terganggu,  ditunjukkan  adanya degenerasi  yang ditandai  hepatosit  dan kongesti  di sinusoid. Adanya vakuola disebabkan pembengkakan hepatosit,  penyempitan  sinusoid,  akibatnya  terjadi pembengkakan sel hati. Infeksi S. agalactiae pada ikan nila  menunjukkan  pengeluaran  hepatosit  dengan perubahan  lemak  sebagai  respons  terhadap berkurangnya aliran darah karena tersumbatnya aliran darah dan trombosis pembuluh darah portal (Chen et al., 2007; Laith et al., 2017).
Studi  histopatologi  jaringan  otak  menunjukkan adanya  meningitis,  infiltrasi  sel  inflamasi,  disertai pendarahan  seperti  laporan  penelitian  Laith  et  al. (2017).  Hasil  ini  berkorelasi  positif  pada  ikan  yang
Gambar 4. Hati:  peradangan  sel  (A),  nekrosis  (B),  pendarahan  (C),  vakuola  pada sitoplasma (D), kongesti di sinusoid dan hilangnya hepatosit (E).
Figure 4. Liver: inflammatory cells (A), necrosis (B), hemorrhage (C), vacuole in the cyto- plasm (D), congestion of sinusoids and loss of hepatocytes (E).
Gambar 5. Limpa: nekrosis (A), infiltrasi sel radang (B).
Figure 5. Spleen: necrocis (A), infiltration of inflammatory cell (B).
Gambar 6. Otak: kongesti kapiler pada meninges (A), kongesti kapiler (B), pigmen he- mosiderin (C), infiltrasi sel radang (D).
Figure 6. Brain: congestion of the meninges (A), capillary congestion (B), hemosiderin pig- ment (C), infiltration of inflammatory cell (D).
Gambar 7. Ginjal:  pembekuan  darah  (A),  pendarahan  (B),  infiltrasi  sel-sel  radang  (C), nekrosis  (D).
Figure 7. Kidney: thrombosis (A), hemorrhage (B), inflammatory cell infiltration (C), necrosis (D).
diinjeksi  ECP  mengalami  abnormalitas  gejala  klinis yaitu  pola  berenang  tidak  menentu  dan  berenang berputar.  Hasil  penelitian  Hardi  et  al.  (2011) menyatakan  jaringan  otak  ikan  nila  yang  terserang streptococcosis mengalami kerusakan dan berdampak negatif dengan melemahnya fungsi syaraf, akibatnya ikan berenang memutar (whirling) yang pada akhirnya menyebabkan kematian.
Jaringan limpa menunjukkan periarterial lymphoid sheath (PALS) tampak lebih kecil dari normal dan ger- minal centers jarang terlihat karena deplesi degenerasi pulpa  merah,  nekrosis,  dan  infiltrasi  sel  radang. Degenerasi pulpa merah menyebabkan fungsi filtrasi pengangkatan  sel darah  merah yang  tua atau  rusak dari  peredaran  menjadi  terganggu.  Limpa  sebagai tempat  terjadinya  proliferasi  hematopoitik  dan aktivasi  sel  fagositik  utama,  melanomacrophages, mengalami  abnormalitas  kemungkinan  disebabkan peran  bakteri  dan  racun  pada  ikan  yang  terinfeksi (Amyes, 2007). Ginjal mengalami kongesti pembuluh darah  tampak  pada  parenkima  secara  menyeluruh, pendarahan, dan pembekuan darah yang parah disertai infiltrasi  sel  inflamasi.  Kerusakan  jaringan hematopoitik ginjal mirip dengan penelitian pada ikan nila merah (Oreochromis sp.) yang diinfeksi dengan S. agalactiae (Su et al., 2017).

## KESIMPULAN
ECP bakteri  -hemolitik lebih virulen dibandingkan tipe non-hemolitik, sedangkan sel utuh yang diinjeksi pada  ikan  tidak  memberikan  dampak  kematian. Pengamatan histopatologi ikan yang diinjeksi ECP S. agalactiae  pada  organ  hati,  limpa,  otak,  dan  ginjal menunjukkan  adanya  kongesti,  hemoragi,  dan nekrosis.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  Badan  Riset  Sumberdaya Manusia  Kelautan  dan  Perikanan  (BRSDMKP)  KKP, BRPBATPP Bogor, IRP2I Depok, Politeknik KP Sorong, BKIPM 1 Jayapura, dan BPBAT Sungai Gelam Jambi.

## DAFTAR  ACUAN
Al Harbi, A.H. (2016). Phenotypic and genotypic char- acterization  of  Streptococcus  agalactiae  isolated from  hybrid  tilapia  (Oreochromis  niloticus  x  O. aureus). Aquaculture, 464, 515-20.
Amal,  M.N.A.  &  Zamri-Saad,  M.  (2011).  Streptococ- cosis  in  tilapia  (Oreochromis  niloticus):  a  review. Pertanika  Journal  of  Tropical  Agricultural  Science, 34(2), 195-206.
Amal, M.N.A., Zamri-Saad, M., Zahrah, A.S., & Zulkafli, A.R. (2015). Water quality influences the presence
of Streptococcus agalactiae in cage cultured red hy- brid  tilapia,  Oreochromis  niloticus  x  Oreochromis mossambicus. Aquaculture Research, 46(2), 313-23. Amyes,  S.G.  (2007).  Enterococci  and  streptococci.
International Journal of Antimicrobial Agents, 29, S43- S52.
Austin, B. & Austin, D.A. (2007). Bacterial fish patho- gens.  Fourth  Edition.  p.  552.  New  York:  Praxis Publishing Ltd., 552 pp.
Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for  the  quantitation  of  microgram  quantities  of protein utilizing the principle of protein-dye bind- ing. Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248-254.
Chen, C., Chao, C., & Bowser, P.R. (2007). Compara- tive histopathology of Streptococcus iniae and Strep- tococcus agalactiae infected tilapia. Bulletin-European Association of Fish Pathologists, 27(1), 1-9.
Delannoy,  C.M.J.,  Zadoks,  R.N.,  Crumlish,  M., Rodgers,  D.,  Lainson,  F.A.,  Ferguson,  H.W.,  & Fontaine,  M.C.  (2014).  Genomic  comparison  of virulent and non-virulent Streptococcus agalactiae in fish. Journal of Fish Diseases, 39(1), 13-29.
Doran, K.S. & Nizet, V. (2004). Molecular pathogen- esis of neonatal group B streptococcal infection: no  longer  in  its  infancy.  Molecular  Microbiology, 54(1), 23-31.
Grayfer, L., Hodgkinson, J.W., & Belosevic, M. (2014). Antimicrobial responses of teleost phagocytes and innate immune evasion strategies of intracellular bacteria. Developmental & Comparative Immunology, 43(2), 223-242.
Hardi,  E.H.  (2011).  Kandidat  vaksin  potensial  Strepto- coccus agalactiae untuk pencegahan penyakit strep- tococcosis  pada  ikan  nila  (Oreochromis  niloticus). Disertasi. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Hardi,  E.H.,  Sukenda,  Harris,  E.,  &  Lusiastuti,  A.M. (2011). Karakteristik dan patogenisitas Streptococ- cus agalactiae tipe  -hemolitik dan non-hemolitik pada ikan nila. Jurnal Veteriner, 12(2), 152-164.
Kannika,  K.,  Pisuttharachai,  D.,  Srisapoome,  P., Wongtavatchai, J., Kondo, H., Hirono, I., Unajak, S., & Areechon, N. (2017). Molecular serotyping, virulence gene profiling and pathogenicity of Strep- tococcus agalactiae  isolated  from tilapia  farms  in Thailand by multiplex PCR. Journal of Applied Mi- crobiology, 122(6), 1497-1507.
Kayansamruaj,  P.,  Pirarat,  N.,  Katagiri,  T.,  Hirono,  I., & Rodkhum, C. (2014). Molecular characterization and virulence gene profiling of pathogenic Strep- tococcus  agalactiae  populations  from  tilapia (Oreochromis sp.) farms in Thailand. Journal of Vet- erinary Diagnostic Investigation, 26(4), 488-495.
Kayansamruaj,  P.,  Pirarat,  N.,  Kondo,  H.,  Hirono,  I., & Rodkhum, C. (2015). Genomic comparison be- tween pathogenic Streptococcus agalactiae isolated from nile tilapia in Thailand and fish-derived ST7 strains. Infection, Genetics and Evolution, 36,  307- 14.
Khalil, A.H. & Mansour, E.H. (1997). Toxicity of crude extracellular products of Aeromonas hydrophila in tilapia, Tilapia nilotica. Letters in Applied Microbiol- ogy, 25(4), 269-273.
Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.
Laith,  A.A.,  Ambak,  M.A.,  Hassan,  M.,  Sheriff,  S.M., Nadirah,  M.,  Draman,  A.S.,  Wahab,  W.,  Wan Ibrahim,  W.N.,  Aznan,  A.S.,  Amina  Jabar,  A.,  & Najiah,  M.  (2017).  Molecular  identification  and histopathological  study  of  natural  Streptococcus agalactiae infection in hybrid tilapia (Oreochromis niloticus). Veterinary World, 10(1), 101-111
Li, Y.W., Liu, L., Huang, P.R., Fang, W., Luo, Z.P., Peng, H.L.,  &  Li,  A.X.  (2014).  Chronic  streptococcosis in nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.), caused by Streptococcus  agalactiae.  Journal  of  Fish  Diseases, 37(8), 757-763.
Lusiastuti, A.M., Textor, M., Seeger, H., Akineden, Ö., & Zschöck, M. (2014). The occurrence of Strepto- coccus agalactiae sequence tipe 261 from fish dis- ease outbreaks of  tilapia Oreochromis niloticus  in Indonesia. Aquaculture Research, 45, 1260-1263.
Nieto,  T.P.,  Santos,  Y.,  Rodriguez,  L.A.,  &  Ellis,  A.E. (1991). An extracellular acetylcholinesterase pro- duced  by  Aeromonas  hydrophila  is  a  major  lethal toxin for fish. Microbial pathogenesis, 11(2),  101- 110.
Nitimulyo, K.H., Isnansetyo, A., Triyanto, T., Murdjani, M.,  &  Sholichah,  L.  (2005).  Efektivitas  vaksin polivalen untuk pengendalian vibriosis pada kerapu tikus (Cromileptes altivelis). Jurnal Perikanan Univer- sitas Gadjah Mada, 7(1), 95-100.
Nizet,  V. (2002).  Streptococcal  â-hemolysins:  genet- ics  and  role  in  disease  pathogenesis.  Trends  in Microbiology, 10(12), 575-580.
Noraini, O., Sabri, M.Y., & Siti Zahrah, A. (2013). Effi- cacy  of  spray  administration  of  formalin  killed Streptococcus agalactiae in hybrid red tilapia. Jour- nal of Aquatic Animal Health, 25(2), 142-148.
Pereira,  U.P.,  Santos,  A.R.,  Hassan,  S.S.,  Aburjaile, F.F.,  Soares,  S.C.,  Ramos,  R.T.J.,  Carneiro,  A.R., Guimaraes, L.C., Diniz, C.A.A.,  Barbosa, M.S., de Sa,  P.B.,  Ali,  M.,  Bakhtiar,  S.M.,  Dorella,  F.A., Zerlotini, A.,  Araujo, F.M.G.,  Leite, L.R.,  Oliviera, G.,  Miyoshi,  A.,  Silva,  A.,  Azevedo,  V.,  &
Figueiredo,  H.C.P.  (2013).  Complete  genome  se- quence of Streptococcus agalactiae strain SA20-06, a fish pathogen associated to meningoencephali- tis outbreaks. Standards in Genomic Sciences, 8(2), 188.
Pradeep,  P.J.,  Suebsing,  R.,  Sirthammajak,  S., Kampeera,  J.,  Jitrakorn,  S.,  Saksmerprome,  V.,  & Jeffs, A. (2016). Evidence of vertical transmission and tissue tropism of Streptococcosis from natu- rally infected red tilapia (Oreochromis spp.). Aquac- ulture Reports, 3, 58-66.
Pretto-Giordano,  L.G.,  Müller,  E.E.,  Freitas,  J.C.D.,  & Silva, V.G.D. (2010). Evaluation on the pathogen- esis  of  Streptococcus  agalactiae  in  nile  tilapia (Oreochromis niloticus). Brazilian Archives of Biology and Technology, 53(1), 87-92.
Pridgeon,  J.W.,  Klesius,  P.H.,  Song,  L.,  Zhang,  D., Kojima, K.,  & Mobley,  J.A. (2013).  Identification, virulence,  and  mass  spectrometry  of  toxic  ECP fractions of West Alabama isolates of Aeromonas hydrophila obtained from a 2010 disease outbreak. Veterinary Microbiology, 164(3-4), 336-343.
Rajagopal, L. (2009). Understanding the regulation of Group  B  Streptococcal  virulence  factors.  Future Microbiology, 4(2), 201-21.
Rosini, R. & Margarit, I. (2015). Biofilm formation by Streptococcus agalactiae: influence of environmen- tal  conditions  and  implicated  virulence  factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 5(6), 1-4.
Sahu, I., Das, B.K., Marhual, N., Samanta, M., Mishra, B.K., & Eknath, A.E. (2011). Toxicity of crude ex- tracellular  products  of  Aeromonas  hydrophila  on rohu, Labeo rohita (Ham.). Indian Journal of Micro- biology, 51(4), 515-520.
Sheehan, B., Labrie, L., Lee, Y.S., Wong, F.S., Chan, J., Komar,  C.,  Wendover,  N.,  &  Grisez,  L.  (2009). Streptococcal diseases in farmed tilapia. Aquacul- ture Asia Pacific, 5, 26-29.
Shoemaker,  C.,  LaFrentz,  B.,  &  LaPatra,  S.  (2015). Overview of  fish immune  system and  infectious diseases. Dietary nutrients, additives and fish health. Wiley, Canada, p. 1-24.
Standar  Nasional  Indonesia  [SNI].  7545.3.  (2009). Metode  identifikasi  bakteri  pada  ikan  secara konvensional – Bagian 2.
Spellerberg,  B.,  Pohl,  B.,  Haase,  G.,  Martin,  S.,  We- ber-Heynemann, J., & Lütticken, R. (1999). Identi- fication of genetic determinants for the hemolytic activity of  Streptococcus agalactiae  by ISS1  trans- position.  Journal  of  Bacteriology,  181(10),  3212- 3219.
Su, Y., Feng, J., Liu, C., Li, W., Xie, Y., & Li, A. (2017).
Dynamic bacterial  colonization and  microscopic lesions in multiple organs of tilapia infected with low and high pathogenic Streptococcus agalactiae strains. Aquaculture, 471, 190-203.
Sugiani,  D.  (2012).  Vaksin  bivalen  untuk  pencegahan penyakit motile aeromonas septicemia dan streptococ- cosis  pada  ikan  nila  (Oreochromis  niloticus). Disertasi. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Sukenda, Rusli, Nuryati, S., & Hidayatullah, D. (2015).
Durasi  proteksi  vaksin  Streptococcus  agalactiae untuk pencegahan streptococcosis pada ikan nila. Jurnal Akuakultur Indonesia, 14(2), 192-201.
Suryadi,  I.B.B.,  Sukenda,  &  Nur yati,  S.  (2017). Fraksinasi dan uji toksisitas ECP (extracellular prod- uct) Streptococcus agalactiae isolat NK1 pada ikan nila  (Oreochromis  niloticus).  Jurnal  Perikanan Kelautan, 8(1), 122-129.
Taukhid, & Purwaningsih, U. (2009). Penapisan isolat bakteri Streptococcus  spp.  sebagai  kandidat  anti- gen  dalam  pembuatan  vaksin,  serta  efikasinya untuk pencegahan penyakit streptococciasis pada ikan  nila,  Oreochromis  niloticus.  Jurnal  Riset Akuakultur, 6(1), 103-118.
Todar,  K.  (2012).  Bacterial  protein  toxins.  Todar’s Online  Textbook of  Bacteriology. Madison,  Wis- consin.
Williams,  M.L.,  Azadi,  P.,  &  Lawrence,  M.L.  (2003). Comparison of cellular and extracellular products expressed  by  virulent  and  attenuated  strains  of Edwardsiella ictaluri. Journal of Aquatic Animal Health, 15, 264-273.
Zhang, X.H. & Austin, B. (2000). Pathogenicity of Vibrio harveyi to salmonids. Journal of Fish Diseases, 23(2), 93-102.