ISSN : 19790902 E-ISSN : 2503-0426 DOI : https://doi.org/10.22437/biospecies.v17i1.31492
INDUKSI  KALUS  EKSPLAN  DAUN  ANGGREK  PENSIL  ( Papillionanthe hookeriana Rchb.F.)  PADA KOMBINASI ZAT PENGATUR TUMBUH 2,4-D DAN BAP
Callus  induction  Leaf  Explants  Pencil  Orchid  (Papillionanthe hookeriana Rchb.f.) on The Combination of Growth Regulators 2,4-D and BAP
Neliyati 1* dan Lizawati 2
1 2 Program Studi Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Jambi, Muaro Jambi, Jambi 36361
* Email : neliyati.sigan@unja.ac.id
The  formation  of  callus  is  one  of  the  indications  of  success  in  propagation  through  tissue culture.  A  crucial  factor  in  callus  induction  is  the  accuracy  in  determining  the  type  and concentration  of  auxin  and  cytokinin  growth  regulators  in  the  culture  media.  This  research aims  to  obtain  the  appropriate  concentration  of  auxin  (2,4-D)  and  cytokinin  (BAP)  growth regulators that can induce the formation of embryonic callus propagules from pencil orchid plants using tissue culture propagation techniques. The treatments tested in this study were the  application  of  several  concentrations  of  auxin  (2,4-D)  at  0.5;  1.0;  1.5,  and  2.0  ppm combined  with  cytokinin  (BAP)  at  concentrations  of  0.0  and  0.5  ppm.  The  experiment  was arranged  in  a  Completely  Randomized  Design  (CRD)  with  15  explants  for  each  treatment. The parameters observed were the response time of the explant (swelling), the percentage of explants swelling, the appearance of callus, the percentage of explants forming callus, callus structure, and callus color. The results showed that the pencil orchid leaf explants responded by  swelling  and  forming  callus.  Swelling  occurred  fastest  two  weeks  after  culturing.  The highest percentage of swelling and callus formation was obtained from the treatment of MS media  supplemented  with  a  combination  of  2,4-D  2.0  ppm  +  0.5  ppm  cytokinin  BAP,  with 100% of the explants swelling and 26,67% forming callus. The formed callus was friable in structure and white in color.
Keywords : Callus, tissue culture, pencil orchid.
Terbentuknya kalus merupakan salah satu indikasi keberhasilan dalam perbanyakan secara kultur  jaringan.  Faktor  sangat  menentukan  dalam  induksi  kalus  tersebut  adalah  ketepatan dalam  menetukan  jenis  dan  konsentrasi  zat  pengatur  tumbuh  auksin  dan  sitokinin  dalam mendia kultur. Penelitian in bertujuan untuk mendapatkan konsentrasi zat pengatur tumbuh auksin (2,4-D) dan sitokinin (BAP) yang dapat  menginduksi pembentukan propagule berupa kalus  embrionik  dari  tanaman  anggrek  pensil  dengan  menggunakan  teknik  perbanyakan secara  kultur  jaringan.  Perlakuan  yang  diuji  pada  penelitian  ini  adalah  aplikasi  beberapa konsentrasi    zat  pengatur  tumbuh  auksin  (2,4-D)  yaitu  0,5;  1,0;  1,5  dan  2,0  ppm  yang dikombinasikan dengan zat pengatur tumbuh sitokinin (BAP) dengan konsentrasi 0,0 dan 0,5 ppm.  Percobaan  disusun  dalam  pola  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan  15  eksplan setiap  perlakuan.  Parameter  yang  diamati  adalah  waktu  eksplan  berespon  (membengkak), persentase eksplan membengkak, saat muncul kalus, persentase eksplan membentuk kalus, struktur  kalus  dan  warna  kalus.  Hasil  percobaan  diperoleh  bahwa  eksplan  daun  anggrek pensil mengalami respon pembengkakan dan membenuk kalus. Pembengkakan terjadi paling cepat  dua  minggu  setelah  kultur.  Persentase  eksplan  membengkak  dan  berkalus  paling banyak  diperoleh dari perlakuan media MS yang ditambah dengan kombinasi zat pengatur tumbuh  auksin  2,4-D  2,0  ppm  +  0,5  ppm  sitokinin  BAP,  yaitu  eksplan  yang  membengkak sebanyak  100%  dan  eksplan  berkalus  26,67%.  Kalus  yang  terbentuk  berstruktur  remah, berwarna putih.
Kata kunci : Kalus, kultur jaringan, anggrek pensil
Abstract
Abstrak

## PENDAHULUAN
Anggrek  merupakan  tanaman  hortikultura yang  memiliki nilai estetika. Bentuk serta warna bunganya  yang  unik  dan  indah  memiliki  daya tarik  tersendiri  sehingga  menjadikan  anggrek banyak  diminati.  Keragaman  bentuk  bunga  dan warna  merupakan  faktor  penting  pada  tanaman anggrek, semakin unik dan langka semakin tinggi nilai ekonominya (Handoyo dan Prasetya, 2006).
Salah satu anggrek alam yang mempunyai pesona  adalah  anggrek  pensil  ( Papilionanthe hookeriana (Rchb.f.),  dikenal  sebagai  anggrek rawa  dan  mendapat First  Class  Certificate sehingga  dinobatkan  sebagai  Ratu  Anggrek karena  kecantikan  bunganya  oleh  kerajaan Inggris pada th 1882 (Handini, 2019).
Anggrek  pensil  ( Papillionanthe  hookeriana Rchb.f. ) merupakan  salah  satu  jenis  anggrek yang  termasuk  dalam  jenis  tumbuhan  yang dilindungi menurut Peraturan Pemerintah Nomor 77  tahun  1999  tentang  pengawetan  jenis tumbuhan dan satwa, serta spesies ini terancam jurang  kepunahan  karena  degradasi  habitat, pencurian dan perambahan. Ini tercantum dalam Apendiks  II  CITES (Convention  on  International Trade in Endangerred Species of Wild Fauna dan Flora) pada  tahun  2013.  Dalam  Peraturan Pemerintah tersebut dijelaskan bahwa tumbuhan dan satwa adalah bagian dari sumber daya alam yang tidak ternilai harganya sehingga kelestariannya  perlu  dijaga  melalui  upaya pengawetan jenis.
Di Provinsi Jambi anggrek pensil ditemukan dalam  kawasan  Taman  Nasional  Berbak  dan Sembilang  yaitu  hidup  pada  batang  rasau (Pandanus  helicopus) yang  berada  di  tepi sungai.    Dalam  Kawasan  Taman  Nasional Berbak  dan  Sembilang,  tidak  kurang  dari  261 jenis tumbuhan (dari 73 famili) telah teridentifikasi.  23  jenis  Palem,  63  jenis  Anggrek hutan dan 10 jenis Pandan (IMC Campus, 2017).
Perlindungan dan pengembangan terhadap anggrek  pensil  sebagi  potensi  ekonomi  perlu dilakukan.  Hal  ini  dikarenakan  anggrek  pensil memiliki nilai estetika yang tinggi dari bunganya. Hasan  (2016)  menjelaskan  anggrek  pensil memiliki  warna  bunga  yang  menarik  dengan warna petal putih semburat keunguan, bibir ungu bergaris dan bercorak putih, keping sisi berwarna ungu  dan  juga  berpotensi  sebagai  induk  untuk persilangan.  Kesegaran  bunganya  cukup  lama yakni mencapai 22 hari.
Masalah yang dihadapi dalam perbanyakan generative  anggrek  pensil  secara  konvensional adalah  sulitnya  buah  terbentuk  dan  secara
vegetative  melalui  pemisahan  rumpun  akan menghasilkan  anakan  yang  sangat  terbatas jumlahnya  dan butuh waktu  yang  lama.  Metode perbanyakan  dengan  memanfaatkan  Teknik kultur  jaringan  diharapkan  dapat  menjadi  solusi yang tepat dan cepat dalam rangka memperbanyak tanaman anggrek pensil.
Keberhasilan  dari  teknik  kultur  jaringan ditunjukkan  dengan  adanya  pertumbuhan  dan morfogenesis jaringan yang dikulturkan. Pertumbuhan dan morfogenesis jaringan sangat dipengaruhi  diantaranya  oleh  jenis    media  dan zat  pengatur  tumbuh.  Zat  pengatur  tumbuh merupakan  salah  satu  komponen  tumbuh  yang sulit  untuk  ditinggalkan,  terutama  imbangan antara  auksin  dan  sitokinin.  Masalah  yang dihadapi  dalam  penggunaan  zat  pengatur tumbuh  adalah  ketepatan  memilih  jenis  dan konsentrasi  yang  sesuai  dengan  jenis  tanaman dan  fisiologis  dari  jaringan  eksplan  yang ditumbuhkan.  Demikian  pula  dengan  umur fisiologis  jaringan  yang  digunakan  sebagai eksplan sangat menentukan daya totipotensinya untuk  tumbuh  dan  berkembang.  Setiap  jenis tanaman dan jaringan akan memberikan respon yang berbeda terhadap zat pengatur tumbuh.
Sampai saat ini, penelitian mengenai kultur jaringan  anggrek  pensil  masih  sangat  terbatas. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Romeida et al. 2016  pada  anggrek  pensil  yang  berasal  dari endemik  Bengkulu  menggunakan  eksplan  daun diperoleh  kalus  embriogenik  pada  media  yang ditambah  zat  pengatur  tumbuh  2,4-D  1,0  ppm dan  kalus  berproliferasi  membentuk  plb  hanya 11%. Kegiatan Konservasi Papilionanthe hookeriana di  Kebun  Raya-LIPI  dilakukan  oleh Handini  (2019),  meliputi  penyimpanan  biji  dan perbanyakan  secara  kultur  jaringan  dangan tujuan  dari  penyimpanan  biji  adalah  untuk memperpanjang  masa  simpan  biji  dan  menjaga ketersediaan  benih  anggrek  ini.  Sedangkan kegiatan  perbanyakan  secara  kultur  jaringan dilakukan  untuk  dapat  menghasilkan  bibit anggrek  pensil  dalam  jumlah  yang  banyak sehingga  ketersediaan  di  alam  akan  terjaga. Untuk anggrek pensil yang berasal dari Provinsi Jambi sampai saat ini belum ada penelitian untuk memperbanyak tanaman tersebut dengan metode kultur jaringan baik dari eksplan generatif (biji) maupun bagian vegetatif tanaman tersebut.
Berdasarkan  uraian  diatas  perlu  dilakukan penelitian perbanyakan anggrek pensil Papilionanthe      hookeriana melaui  teknik  kultur jaringan.  Sebagai  tahap  awal  perlu  dicari kombinasi  zat  pengatur  tumbuh  auksin  dan sitokinin  yang  tepat  konsentrasinya  yang  dapat
menginduksi kalus pada tanaman anggrek pensil asal  Jambi  secara  kultur  jaringan.  Pada penelitian  ini  zat  pengatur  tumbuh  yang digunakan  adalah  auksin  2,4-D  dan  sitokinin BAP.

## METODE
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium Bioteknologi  Fakultas  Pertanian  Universitas Jambi  dari  bulan  Juni  sampai  November  2019. Bahan  yang  digunakan  sebagai  eksplan  adalah daun anggrek pensil ( Papillionanthe hookeriana) yang berasal Balai Taman Nasional Berbak dan Sembilang  Provinsi  Jambi.  Komposisi  Media dasar Murashige and Skoog (MS), zat pengatur tumbuh    auksin  2,4-D  ( Dichlorophenoxy  acetic Acid) sitokinin BAP ( Benzylamino purine ). Bahan sterilant  (detergen,  aquades,  HgCl2, Natrium hypo chloride , alkohol dan Bethadine ), pembenah  pH  media  yaitu  HCl  1  N,  KOH  1  N. Kemasaman  medium  ditetapkan  5,8  ±  0,02 sebelum  dipadatkan  dengan  agar  ( Difco  Bacto ) 0,8% (w/v) dan dibagi-bagi ke dalam botol kultur sebanyak 20 mL per botol.  Selanjutnya medium
diautoklaf pada tekanan 1,06 kg cm -2 pada suhu 121 o C selama 15 menit.
Perlakuan yang dicobakan adalah
kombinasi zat pengatur tumbuh 2,4-D konsentrasi  0,5;  1,0;  1,5  dan  2,0  ppm  dengan BAP  0,0  dan  0,5  ppm  pada  media  MS. Percobaan disusun dalam pola Rancangan Acak Lengkap, setiap perlakuan terdiri atas 15 eksplan yang ditanam di dalam botol kultur yang terpisah. Eksplan  disterilisasi  dengan  cara  daun  dicuci dengan  deterjen  pada  air  mengalir,  direndam dalam  larutan  HgCl2  0,1%  selama  30  menit. Eksplan  dibilas  dengan  air  steril  dan    direndam dalam larutan NaClO 10% selama 10 menit dan dibilas  dengan  air  steril,  selanjutnya  direndam dalam larutan betadin 10% selama 5 menit dan dibilas 3 kali dengan air steril. Eksplan dipotong 1 cm dan ditanam pada media sesuai perlakuan. Eksplan ditempatkan di dalam kondisi gelap total selama 15 hari sebelum dipindahkanke rak kultur di dalam ruang kultur. Suhu di dalam ruang kultur dipertahankan 25  1 o C  dan fotoperiodesitas 16 jam  per  hari  dengan    intensitas    cahaya    lebih- kurang  50 µmol m -2 s -1 yang  berasal dari  lampu TL  putih.  Prosedur  isolasi  penanaman  eksplan ditampilkan pada Gambar 1.
Gambar 1. Proses penanaman eksplan: a) daun anggrek pensil (eksplan) yang telah dicuci pada air mengalir; b) perendaman eksplan pada larutan NaClO 10%; c) eksplan yang telah steril; d) penanaman eksplan pada media kultur; dan e) pengamatan perkembangan eksplan pada media kultur
Peubah yang diamati adalah jumlah eksplan membengkak,  waktu  eksplan  membengkak, jumlah  eksplan  yang  membentuk  kalus,  saat muncul  kalus,  struktur  kalus,  dan  warna  kalus. Data  yang  diperoleh  dianalisis  secara  statistik dengan standart deviasi dan tabulasi. Di samping disajikan  dalam  bentuk  angka,  data  hasil pengamatan  yang  merupakan  data  kualitatif disajikan  dalam  bentuk  visual  berupa  gambar untuk mendukung data kuantitatif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Persentase eksplan membengkak dan waktu eksplan membengkak
Eksplan daun anggrek pensil Papilionanthe hookeriana yang  dikultur  pada  media  MS ditambah  dengan  kombinasi  zat  pengatur
tumbuh (ZPT) 2,4-D dan BAP dengan konsentrasi  yang  berbeda  memberikan  respon awal yang sama, yaitu terjadinya pembengkakan eksplan. Namun persentase eksplan membengkak  dan  waktu  awal  membengkak berbeda. Rata-rata persentase eksplan membengkak  dan  waktu  mulai  membengkak disajikan  pada  Tabel  1.  Tampilan  eksplan  yang membengkak  disajikan  pada  Gambar  2  dan Gambar 3. Persentase eksplan yang membengkak  paling  banyak  diperoleh  dari perlakuan media MS dengan kombinasi ZPT 2,0 ppm  2,4-D  +  0,5  ppm  BAP  yaitu  100  %  ±  0,0 dengan waktu mulai membengkak rata-rata 19 ± 0,58  HSK.  Persentase  eksplan  membengkak paling  sedikit  diperoleh  dari  perlakuan  0,5  ppm 2,4-D  tanpa  BAP  yaitu  26,67  %  ±  6,67  dengan rata-rata waktu membengkak 26,67±8,74 HSK.
a b c d
e
Tabel 1. Persentase  eksplan  daun  anggrek  Pencil ( Papillionanthe hookeriana ) membengkak  dan waktu awal membengkak pada media MS + 2,4-D dan BAP  30 HSK
Perlakuan Eksplan Membengkak (%) Waktu Membengkak (HSK) MS+0.5 ppm 2.4 D 26,67± 6,67 26,67± 8,74 MS+1,0 ppm 2.4 D 53,33 ± 6,67 22,44 ± 4,73 MS+1.5 ppm 2.4 D 33,33 ± 6,67 16,00 ± 0,00 MS+2,0 ppm 2.4 D 46,67 ± 13,33 19,00± 2,00 MS+0.5 ppm 2.4 D + 0.5 ppm BAP 86,67± 6,67 26,55 ± 2,14 MS+1,0 ppm 2.4 D + 0.5 ppm BAP 60,00 ± 11,55 22,17 ± 2,43 MS+1.5 ppm 2.4 D + 0.5 ppm BAP 53,33 ± 6,67 19,67± 1,33 MS+2,0 ppm 2.4 D + 0.5 ppm BA 100,00 ± 0,0 19,00 ± 0,58 Keterangan:
HSK : Hari Setelah Kultur ±  : Nilai Standard Error
Gambar 2. Perkembangan eksplan anggrek pensil pada media MS + 2,0 ppm 2,4- D + 0,5 ppm BAP: a) minggu ke-1, b) minggu ke-3, c) minggu ke-5, dan d) minggu ke-7
Gambar 3. Perkembangan eksplan anggrek pensil pada media MS+ 0,5 ppm 2,4- D+0,5 ppm BAP: a) minggu ke-1, b) minggu ke-3, c) minggu ke-5, dan d) minggu ke-7
Pembengkakan  terjadi  ditandai  dengan membesarnya eksplan daun yang dikultur. Hal ini diduga  adanya  respon  sel-sel  dari  eksplan terhadap penyerapan air, nutrisi dan zat pengatur tumbuh  pada  media  yang  menyebabkan  sel membesar.  Hasil  penelitian  Ajijah  et  al.  (2010) menjelaskan  bahwa  pembengkakan  ekspan adalah  tahap  awal  pembentukan  kalus  yang mengindikasikan aktifitas sel pada eksplan serta menandakan  sel  pada  eksplan  membesar. Terjadinya pembesaran sel tanaman dipengaruhi oleh  zat  pengatur  tumbuh  auksin.  Mekanisme auksin  dalam  pembesaran  sel  dengan  cara mengaktifkan pompa ion pada plasma membran, mempertahankan  pH  dinding  sel  menjadi  asam (pH4), dinding sel menjadi longgar dan tekanan dinding  sel  menjadi  berkurang  sehingga  air masuk ke dalam sel dan terjadi pembesaran dan elongasi pada sel (Salisbury dan Ross. 1995).
Besarnya persentase eksplan membengkak yang  diperoleh  dari  perlakuan  kombinasi  ZPT
auksin 2,0 ppm 2,4-D dan ZPT sitokinin 0,5 ppm BAP, hal ini mengindikasikan  bahwa konsentrasi kombinasi  auksin  dan  sitokinin  tersebut  sesuai dengan  kebutuhan  sel  untuk  membesar  dari ekspan daun anggrek pensil.

## Persentase eksplan berkalus dan Waktu muncul kalus
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  tidak semua perlakuan media MS dengan ZPT auksin 2,4-D dan sitokinin BAP dapat menginduksi kalus dari eksplan daun anggrek pensil. Pembentukan kalus terjadi pada perlakuan media MS+1,5 ppm 2,4-D, MS+2,0 ppm 2,4 D dan semua kombinasi perlakuan  2,4-D  +  BAP.  Persentase  eksplan membentuk  kalus  dan  waktu  muncul  kalus berdasarkan  perlakuan  disajikan  pada  Tabel  2 dan tampilan kalus yang terbentuk disajikan pada Gambar 4.
a b
c d a b c d
Tabel 2. Persentase eksplan daun anggrek Pencil (Papillionanthe hookeriana) yang membentuk kalus dan rerata waktu berkalus pada media  MS yang diberi ZPT 2,4-D dan BAP delapan minggu setelah kutur.
Perlakuan Eksplan Berkalus Waktu Eksplan Berkalus (HSK) MS+0.5 ppm 2.4 D 0.0    (0/15) 0 MS+1,0 ppm 2.4 D 0,0    (0/15) 0 MS+1.5 ppm 2.4 D 6,67   (1/15) 36 MS+2,0 ppm 2.4 D 6,67   (1/15) 32 MS+0.5 ppm 2.4 D + 0.5 ppm BAP 20,0   (3/15) 31 MS+1,0 ppm 2.4 D + 0.5 ppm BAP 6,67   (1/15) 53 MS+1.5 ppm 2.4 D + 0.5 ppm BAP 6,67   (1/15) 45 MS+2,0 ppm 2.4 D + 0.5 ppm BAP 26,67 (4/15) 31
Gambar 4. Kalus  yang terbentuk pada media  MS dengan kombinasi 2,4-D+BAP:  a) media  MS+ 0,5 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP, b) media MS+ 1,0 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP, c) media MS+ 2,0 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP, dan d) media MS+ 2,0 ppm 2,4-D
Berdasarkan  Tabel  2  dapat  dijelaskan pengaruh  pemberian  kombinasi  zat  pengtur tumbuh 2,4-D dan BAP persentase pembentukan kalus  paling  banyak  terjadi  pada  kombinasi  zat pengtur tumbuh 2,0 ppm 2,4-D 2 + 0,5 ppm BAP yaitu  26,67%.  Waktu  pembentukan  kalus  mulai terjadi  pada  minggu  ke  lima  setelah  kultur. Pembentukan  kalus  terjadi  pada  eksplan  yang telah  membengak  dan  selanjutnya  merekah/ membelah  sehingga  timbul  perlukaan.  Dengan adanya  perlukaan  tanaman  akan  berespon menutupi luka dengan cara terjadinya pembelahan sel yang cepat dan tidak terdiferensiasi,  hal  ini  diistilahkan  dengan terbentuknya kalus. Kalus terbentuk dari proses pembelahan  sel  yang  berada  dibagian  dalam atau  sel-sel  parenkima.  Kalus  terbentuk  pada eksplan  yang  sudah  menbengkak  yang  masih berwarna hijau
Besarnya  persentase  eksplan  membentuk kalus dan waktu yang relative lebih cepat yaitu 31 HSK pada perlakuan media MS + 2,0 ppm 2,4-D +  0,5  ppm  BAP  diduga  pada  kombinasi konsentrasi  zat  pengatur  tumbuh  tersebut memenuhi  kebutuhan  terhadap  zat  pengatur tumbuh  yang  dibutuhkan  untuk  eksplan  daun anggrek  pensil  berespon  meginduksi  kalus. Kombinasi  yang  tepat  serta  seimbang  antara auksin  dan  sitokinin  pada  eksplan  dapat menyebabkan  terjadinya  induksi  kalus  (George
dan  Sherington,  1984).  Dalam  hal  ini  auksin bekerja  dalam  pembengkakan/  pembesaran  sel sedangkan sitokinin berperan dalam pembelahan  sel.  Dengan  demikian,  pada kombinasi auksin dan sitokinin yang tepat maka sel-sel  eksplan  dapat  berdediferensiasi  menjadi kalus.
Perlakuan media  MS +  0,5  ppm 2,4-D  dan perlakuan  media  MS  +  1,0  ppm  2,4-D  tidak terbentuk  kalus  eksplan  daun  angrek  pensil. Tidak terbentuknya kalus diduga tidak cukupnya konsentrasi  zat  pengatrur  tumbuh  dan  belum seimbang  kebutuhan  perbandingan  antara  zat pengatur tumbuh auksin dan sitokin serta adanya perbedaan  kemampuan  jaringan  menyerap unsur  hara  dan  zat  pengatur  tumbuh  dalam media  induksi  kalus  tersebut.  Selanjutnya eksplan yang tidak membentuk kalus mengalami perubahan  warna  dari  hijau  menjadi  coklat kemudian  mati,  hal  ini  diduga  diantaranya disebabkan  oleh  bahan  sterilan  yang  dapat mempengaruhi/ merusak sel sehingga cepatnya eksplan  mencoklat.  sel  yang  meristematik  dan selanjutnya melakukan pembelahan serta terdiferensiasi.
Keberhasilan  eksplan  membentuk  kalus sangat ditentukan oleh beberapa factor, diantaranya  adalah  genotipe  tanaman,  zat pengatur tumbuh baik jenis maupun konsentrasi zat  pengatur  tumbuh  tersebut.  Zat  pengatur
a b c d
tumbuh  memegang  peranan  penting  dalam pertumbuhan  dan  perkembangan  kultur.  Faktor yang perlu mendapat perhatian dalam penggunaan  zat  pengatur  tumbuh  antara  lain jenis  yang  akan  digunakan,  konsentrasi,  urutan penggunaan  dan  periode  masa  induksi  kultur (Gunawan 1995). Menurut George dan Sherrington  (1984),  bahwa  untuk  induksi  kalus tanaman  dikotil  diperlukan  auksin  dengan konsentrasi tinggi dan sitokinin pada konsentrasi rendah  sedangkan  pada  tanaman  monokotil pembentukan kalus hanya membutuhkan auksin yang tinggi tanpa sitokinin. Hal ini mengindikasikan bahwa setiap genotipe tanaman/jenis tanaman tidak selalu sama dalam berespon  terhadap  zat  pengatur  tumbuh  yang diberikan.
Berdasarkan  beberapa  hasil  penelitian terhadap induksi kalus pada beberapa  tanaman menunjukan respon yang berbeda-beda terhadap  jenis  dan  konsentrasi  zat  pengatur tumbuh.  Hasil  penelitian  yang  dilakukan  oleh Romeida et al. (2016) pada anggrek pensil yang berasal  dari  endemik  Bengkulu  menggunakan eksplan daun diperoleh kalus embriogenik pada media yang ditambah zat pengatur tumbuh 2,4-D 1,0 ppm dan kalus berproliferasi membentuk plb hanya  11%.  Hasil  penelitian  Budisantoso  et  al. (2017)  diperoleh  pembentukan  kalus  pada ekspan daun anggrek Vanda terjadi pada media yang diberi zat pengatur tumbuh 2,4-D 2,0 ppm. Pada  penelitian  Mahadi  et  al.  (2017)  induksi kalus  dari  eksplan  jeruk  kasturi  menggunakan 2,4- D dan BAP menunjukkan hasil induksi kalus terbaik  dengan  konsentras  2,0  ppm  2,4-D  +  2 ppm BAP. Hasil penelitian Lizawati et al. (2020) pada  eksplan  daun  muda  Coffea  liberika  L. pembentukan kalus terjadi pada media MS + 1,0 ppm 2,4-D + 1,0 ppm 2iP. Perlakuan pemberian kombinaasi BAP 0.025 ppm + NAA 3 ppm pada media  kultur  memberikan  respon  terbaik  dalam induksi  kalus  anggrek  Dendrobium  Hibrida ( Dendrobium lasianthera x Dendrobium antennatum )  melalui  somatik  embriogenesis dengan  rerata  presentase  pembentukan  kalus sebesar  67%,  dan  waktu  pembentukan  kalus pada 14 hari setelah tanam (Sasmita et al. 2022). Hasil penelitian Hany et al. (2023). konsentrasi 2 mg/L  2,4-D  merupakan  konsentrasi  terbaik dalam  induksi  kalus  dengan  warna  kalus  hijau kekuningan  dengan  tekstur  remah  dan  bersifat meristematik pada anggrek Dendrobium dicolor . Kalus  yang  terbentuk  pada  pada  eksplan daun  anggrek  pensil  pada  semua  perlakuan berwarna  putih  dengan  struktur  remah.  Kalus warna putih menunjukan adanya kandungan pati
dan  belum  mengandung  klorofil.  Lizawati  et  al. (2020),  menjelaskan  bahwa  kalus  berwarna putih,  krem,  atau  kekuningan  menandakan  sel sedang  tumbuh,  sedangkan  kalus  berwarna coklat  menunjukkan  penurunan  pertumbuhan. Kalus  yang  mempunyai  warna  kemerahan  dan kecoklatan  menandakan  kalus  sudah  dewasa, dan kalus berwarna putih transparan menunjukan  kalus  embrionik  (Rahayu  dan Suharyanto, 2020).
Eksplan  yang  telah  membentuk  kalus dengan  perkembangan  kalus  sangat  lambat, sampai  6  minggu  setelah  terbentuknya  kalus, jumlah  kalus  yang  dihasilkan  pada  eksplan tersebut masih sangat sedikit dan sebagian kalus tidak  berkembang  bahkan  mencoklat.  Hal  ini dapat  disebabkan  karena  timbulnya  senyawa fenolik  yang  keluar  dari  eksplan  tersebut. Menurut  Wattimena  (1988)  bahwa,  asam-asam fenolik  bersama-sama  dengan  asam  absisik (ABA)  merupakan  inhibitor  endogen  yang menghambat terbentuknya kalus dan menghambat perkembangan kalus selanjutnya.

## KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang sudah dilakukan  dapat  disimpulkan  bahwa  respon eksplan daun anggrek pensil terhadap beberapa kombinasi  zat  pengatur  tumbuh  auksin  dan sitokinin (2,4-D dan BAP) berupa pembengkakan eksplan  dan  pembentukan  kalus.  Persentase pembengkakan  paling  banyak  yaitu  100%, diperoleh  dari  perlakuan  media  MS  yang ditambah  dengan  kombinasi  zat  pengatur tumbuh  2,4-D  2,0  ppm  +0,5  ppm  BAP.  Induksi kalus  paling  banyak  diperoleh  dari  perlakuan media  MS  ng  ditambah  dengan  kombinasi  zat pengatur  tumbuh  2,4-D  2,0  ppm  dan  0,5  ppm BAP,  yaitu  26,67%,  kalus  yang  terbentuk berwarna putih dengan struktur remah.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Universiatas  Jambi  atas  dukungan  finansial untuk  meaksanakan  penelitian  melalui  Skema Penelitian Dasar tahun anggaran 2019.

## DAFTAR PUSTAKA
Ajijah  N,  IM  Tasma,  E  Hadipoentyanti.  2010. Induksi  kalus  Vanili  (Vanilla  planifolia ANDREW.)  dari  eksplan  daun  dan  buku. Buletin RISTRI I (5).
Budisantoso I, N Amalia dan Kamsiah. 2017. In
Vitro  Callus  Induction  from  Leaf  Explants
of  Vanda  sp  Stimulated  by  2,4-D. Biosaintifika 9 (3) (2017) 492-497 George  E.F,  P.  D.  Sherrington.  1984. Plant propagation  by  tissue  culture:  Handbook and  Directory  of  Comercial  Laboratories . England: Exegetics Limited.
Gunawan, L.W 1995. Teknik Kultur In Vitrodalam
Hortikultura . Jakarta: PT. Penebar Swadaya.
Handini E, 2019. Seed storage and micropropagation of pencil orchid (Papilionanthe  hookeriana)  in  Bogor Botanic  Gardens. Pros  Sem  Nas  Masy Biodiv  Indon 5:  7-12.  ISSN:  2407-8050,
DOI: 10.13057/psnmbi/m050102
Handoyo  dan  Prasetya.  2006. Native  Orchid  of Indonesia. Perhimpunan Anggrek Indonesia.Jakarta.
Hany  I.P.,  Z.A  Noli,  dan  M.  Idris.  2023.  Callus Induction of Dendrobium discolor Through The  Thin  Cell  Layer  (TCL)  Technique Added with 2,4- Dichlorophenoxyaceticacid. Jurnal  Biologi Tropis, 23 (4b): 75 –  80  DOI: http://dx.doi.org/ 10.29303/jbt.v23i4b.5808 Hasan, H. 2016. Berita Resmi PVT Pendaftaran Varietas Lokal. No. Publikasi: 27/BR/PVL/102016, Anggrek Pensil ( Papilionanthe hookeriana ). IMC Campus. 2017. Mengunjungi “Amazonnya” Jambi  di  Taman  Nasional  Berbak  dan
Sembilang Tanjung Jabung Timur ” https://campus.imcnews.id/ read/mengunjungi-amazonnya-jambi-di- taman-nasional-berbak-dan-sembilang- tanjung-jabung-timur, diakses 20 Pebruari 2019.
Irawati.  2009.  Self  and  cross  inoculation  of
Papilionanthe hookeriana and Taeniophyllum
obtusum
orchid
mycorrhiza. Buletin Kebun Raya Indonesia 12 (1): 11-18.
Lizawati, L., Zulkarnain, Z., Neliyati, N. 2020. The effect  of  2,4-D  and  2-iP  on  callus proliferation and development on immature  leaf  explants  of  Liberica  coffee ( Coffea  liberica L.). Analele  Universităţii din  Oradea,  Fascicula  Biologie .  Tom. XXVII, Issue: 1, 2020, pp. 39-42 Mahadi,  I.,  Sy afi’i,  W.,  &  Sari,  Y.  2017.  Induksi kalus  jeruk  kasturi  ( Citrus  microcarpa ) mengguna  kan  2,4-D  dan  BAP  dengan metode  in  vitro. Jurnal  Ilmu  Pertanian Indonesia, 21(2), 84-89.
Rahayu, S. dan Suharyanto. 2020. Induksi Kalus
2,4-D  dan  BAP  pada  Eksplan  Daun Vegetatif dan Generatif Tempuyung ( Sounchus  arvensis L.). Jurnal  Ilmiah Biologi Unsoed , 2(3): 479 – 486.
Romeida, A.,  D. W.  Ganefianti and Rustikawati.
2016.  Embryogenic  callus  induction  of pencil  orchid  ( Papilionanthe  hookeriana Rchb.f.) through in vitro culture.
International Journal on Advanced Science Engineering Information Technology , 6: 196-200 Salisbury,  Frank  B  and  Cleon  W  Ross;  diterje.:
Diah R Lukman; Sumaryono; peny.: Sofia Niksolihin).1995. Fisiologi tumbuhan:
Biokimia tumbuhan. (Ed. ke-4.). Bandung:
Penerbit ITB.
Sasmita H.D., P Dewanti, dan F N Alfian. 2022.
Somatik Embrioge nesis Anggrek
Dendrobium  lasianthera x Dendrobium antennatum dengan penambahan BA dan NAA. J.  Agron.  Indonesia, Agustus  2022, 50(2):202-208
Wattimena  G.  A.  1988. Zat  pengatur  tumbuh . Pusat Antara Universitas. Institut Pertanian Bogor.