Sintesis Gd-DTPA-Folat untuk MRI Contrast Agent dan Karakterisasinya Menggunakan Perunut Radioaktif 153 Gd-DTPA-Folat (Adang H.G.)
Akreditasi LIPI Nomor : 395/D/2012
Tanggal 24 April 2012

## SINTESIS Gd-DTPA-FOLAT UNTUK MAGNETIC RESONANCE IMAGING CONTRAST AGENT DAN KARAKTERISASINYA
MENGGUNAKAN PERUNUT RADIOAKTIF 153 Gd-DTPA-FOLAT
Adang H.G., Yono S. dan Maskur Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka (PRR)-BATAN Kawasan Puspiptek Serpong 15314, Tangerang Selatan
e-mail : adanghg56@yahoo.com Diterima: 4 Juni 2012 Diperbaiki: 8 Agustus 2012 Disetujui: 11 Oktober 2012

## ABSTRAK
SINTESIS Gd-DTPA-FOLAT UNTUK MAGNETIC RESONANCE IMAGING CONTRAST AGENT DAN KARAKTERISASINYA MENGGUNAKAN PERUNUT RADIOAKTIF 153 Gd-DTPA- FOLAT . Senyawa kontras digunakan untuk memperjelas gambaran dari organ yang sukar dibedakan melalui teknik pencitraan Magnetic Resonance Imaging ( MRI ), khususnya pada jaringan lunak sistem saraf pusat, hati, pencernaan, lymphatic system, payudara, kardiovaskular dan paru. Senyawa kontras yang digunakan di rumah sakit pada saat ini adalah Gadolinium-DieThylenetriaminePentaacetic Acid ( Gd-DTPA ). Gd-DTPA merupakan senyawa kontras yang tidak spesifik, oleh karena itu hal tersebut menimbulkan gagasan untuk mengembangkan senyawa kontras yang mampu mencapai target tanpa menyebabkan kerugian pada sel-sel normal disekitarnya. Asam folat merupakan vitamin yang murah, aman, spesifik dan dapat digunakan sebagai drug delivery. Dalam penelitian ini telah dilakukan pengembangan targeted contrast agent MRI dengan pembawa asam folat yang diikatkan dengan logam Gd dan ligand DTPA . Karena Gd-DTPA -folat merupakan senyawa non aktif, maka karakterisasi Gd-DTPA -folat dilakukan menggunakan senyawa radioaktif 153 Gd- DTPA -folat yang diperoleh dari reaksi DTPA -folat dengan radionuklida 153 Gd. Hasil optimasi sintesis 153 Gd- DTPA -folat diperoleh pada perbandingan mol DTPA -folat terhadap Gd = 20 : 1 dan memberikan hasil kemurnian radiokimia > 90 %. Identifikasi terhadap produk Gd- DTPA -folat dilakukan menggunakan alat Spektrofotometer Fourier Transform- Infra Red ( FT-IR ) dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan cara membandingkan Gd- DTPA -folat hasil sintesis dengan zat asalnya yaitu asam folat dan EDA -folat. Hasil karakterisasi menunjukkan bahwa senyawa yang disintesis adalah Gd- DTPA -folat.
Kata kunci : Asam folat, Gd-DTPA , MRI , Senyawa pengkontras, 153 Gd

## ABSTRACT
SYNTHESIS OF Gd-DTPA-FOLAT FOR MAGNETIC RESONANCE IMAGING CONTRAST AGENT AND CHARACTERIZATION BY USING 153 Gd-DTPA-FOLATE RADIOACTIFE . Contrast agent was used to clarify the image of the organ that is difficult to distinguish by MRI (Magnetic Resonance Imaging) techniques, particularly in soft tissues of the central nervous system, liver, digestive system, lymphatic system, breast, cardiovascular and pulmonary systems. One of the commonly used contrast agents in hospitals is Gadolinium-DieThylenetriaminePentaacetic Acid (Gd-DTPA). Gd-DTPA is non specific contrast agent, therefore it has led to develop a contrast agent that is able to achieve the target without defect to the surrounding normal cells. Folic acid as a safe vitamin, inexpensive, specific and also can be used as drug delivery. This study was conducted in the development of targeted MRI contrast agent based of folic acid as a carrier by using Gd metal and DTPA ligand. Since Gd-DTPA-folate is non-active compounds, the characterization of Gd-DTPA-folate was performed using 153 Gd-DTPA-folate, which was obtained by reacting DTPA-folate with radionuclides 153 Gd. The results of optimization reactions of 153 Gd-DTPA-folate was obtained at the mole ratio of DTPA-folate to Gd metal 20: 1 and produced the radiochemical purity more than 90%. Identification of the non active product Gd-DTPA-folate was performed using an Fourier Transform- Infra Red (FT-IR) Spectrophotometer and Thin Layer Chromatography (TLC) compared with folic acid and EDA-folate. The results indicated that the product is Gd-DTPA-folate.
Keywords : Folic acid, Gd-DTPA, MRI, Contrast agent, 153 Gd

## PENDAHULUAN
Teknik-teknik pencitraan untuk diagnostika seperti Magnetic Resonance Imaging ( MRI ), sinar-X, penggunaan radiofarmaka, ultra violet/visible/IR dan ultra sonografi telah digunakan dalam diagnosa medis beberapa tahun belakangan ini. MRI adalah prosedur diagnostik yang menggunakan medan magnet tinggi dan sinyal-sinyal frekuensi radio untuk menghasilkan gambar. Di dalam MRI , sampel ditempatkan dalam medan magnet statis yang kuat (1 Tesla hingga 12 Tesla) dan spin dieksitasi dengan sinyal radiasi frekuensi radio yang akan menimbulkan magnetisasi pada sampel [1].
Dalam prosedur diagnosis dengan MRI , penggunaan senyawa pengkontras dimaksudkan untuk memperjelas gambaran atau citra ( image ) dari organ, khususnya pada jaringan lunak sistem saraf pusat, hati, sistem pencernaan, lymphatic system, payudara, sistem kardiovascular dan paru. Senyawa untuk pengkontras yang paling luas penggunaannya dalam MRI adalah khelat golongan Gadolinium (Gd) yang merupakan campuran senyawa berbobot molekul rendah dengan relaksivitas T1 tinggi. Gd-DTPA yang merupakan salah satu komplek dari logam Gd dengan ligan DTPA telah di approved oleh FDA USA pada tahun 1988 dengan nama dagang Magnevist dan secara luas telah digunakan di berbagai negara di dunia. Hal ini dikarenakan selain senyawa komplek tersebut memiliki kestabilan komplek yang tinggi, aman dan juga memberikan beberapa efek samping yang ringan seperti sakit kepala, mual seperti terbakar pada tempat penyuntikan dan efek yang jarang sekali terjadi adalah reaksi alergi [2-3].
Asam folat merupakan suatu ligan yang mempunyai afinitas tinggi terhadap reseptor folat (Kd hingga 10 -10 M) yang terdapat pada permukaan berbagai jenis kanker. Reseptor folat merupakan protein glycosylphosphatidynilinositol ( GPI ) dengan berat molekul 38 kDa hingga 40 kDa, terdapat pada permukaan membran sel kanker dan dapat mengekspresikan ovarian adenocarcinoma, breast cancer,nasopharingeal tumors dan berbagai jenis kanker ephitel seperti kanker cervic , colorectal dan ginjal [4-8] Dalam penelitian ini akan dilakukan pengembangan suatu zat pengkontras MRI ( Targeted Contrast Agent ) yang berbasis asam folat. Senyawa pengkontras Gd-DTPA-folat sebagai targeted contrast agent diharapkan dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan penyakit kanker ovarian adenocarcinoma, breast cancer,nasopharingeal tumors dan berbagai macam kanker ephitel seperti kanker cervic , colorectal dan ginjal.

## METODE PERCOBAAN

## Bahan dan Alat yang Digunakan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah asam folat, N-HydroxySuccinimide ( NHS ),
DyCyclohexylCarbodiimide ( DCC ), larutan hidrazin dalam THF , DiMethyl Sulfoxide ( DMSO ), THF , t-butil nitril,  (γ)  metil  glutamat, tetramethylguanidine dan EthylenDiAmine ( EDA ) diperoleh dari Sigma Aldrich. Sedangkan eter, asetonitril, HCl, NaOH, metanol, asam nitrat, aseton, TFA dan piridin diperoleh dari E. Merck . Peralatan gelas seperti kolom kromatografi, beaker gelas, gelas ukur, erlenmeyer dan pipet ukur menggunakan bahan dari gelas pyrex . Pengukuran dengan Spektrofotometer FT-IR dilakukan di Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka (PRR)-BATAN menggunakan alat dari Jasco FT-IR -410. Spektrofotometer UV-Vis dari Jasco digunakan untuk membandingkan senyawa asam folat dan EDA -folat dengan DTPA -folat sebagai produk yang akan direaksikan dengan logam Gd. Pengukuran dengan alat LC-MS , 1 H-NMR dan 13 C-NMR dilakukan di Pusat Penelitian Kimia (P2K)-LIPI. Pengukuran dengan metode KCKT dilakukan di PRR dengan menggunakan kolom C18 dan dengan 2 jenis detektor yaitu detektor UV dan detektor radioaktif (NaI).
Sintesis EDA -Folat
EDA -folat sebagai prekursor untuk pembuatan senyawa DTPA -folat yaitu bahan untuk senyawa Magnetic Resonance Imaging ( MRI ) contrast agent Gd- DTPA -folat. Salah satu metode sintesis yang dilakukan adalah metode regiospesifik ( Regiospecific method ) yaitu dilakukan berdasarkan beberapa tahap reaksi yaitu sintesis asam pirofolat, sintesis pteroil hidroksida, sintesis pteroil azid, sintesis γ-folat  metil  ester  dan  tahap  akhir  adalah  sintesis γ- EDA -folat
Sintesis DTPA -Folat
Sebanyak 1,0 g EDA -folat (  ) (2,1 mmol) dilarutkan dalam 50 ml DMSO dengan sonikasi selama semalam. Kemudian larutan kuning gelap yang terjadi ditambahkan pelan-pelan ke dalam supensi 20 g DTPA dianhydride (5,6 mmol) di 10 mL DMSO anhidrat. Campuran menjadi homogen pada akhir penambahan. Analisis dengan HPLC menunjukkan tidak terdapat EDA -folat setelah 30 menit. di mana waktu itu campuran reaksi disaring melalui celite pad untuk menghilangkan padatan halus. Setelah menurunkan suhu campuran reaksi dengan rendaman es, ditambahkan 10 mL 2,4 N NaOH untuk mengendapkan dan menetralkan larutan.
Endapan yang dihasilkan berisi mayoritas DTPA -folat (  ) yang diproduksi dipisahkan oleh sentrifugation dari supernatan. Produk dikumpulkan, dikeringkan dengan vakum dan tingkat kemurniannya diperiksa dengan HPLC menggunakan kolom C-18 pada panjang gelombang 280 nm dengan gradien
Sintesis Gd-DTPA-Folat untuk MRI Contrast Agent dan Karakterisasinya Menggunakan Perunut Radioaktif 153 Gd-DTPA-Folat (Adang H.G.)
menggunakan eluent ACN dan TFA 0,3 % dengan laju alir 1 mL/menit dengan gradien : 0 menit = 0 % B, 20 menit = 60 % B dan 40 menit = 60 % B.
Optimasi Penandaan DTPA -folat dengan Radionuklida 153 Gd
Dalam vial reaksi, sejumlah perbandingan mol tertentu DTPA -folat : Gd (2, 3, 10, 20, 25, 30 dan 40) direaksikan pada pH 5 pada suhu air mendidih selama 30 menit. Setelah 30 menit, vial reaksi didinginkan pada suhu kamar dan masing-masing perbandingan mol DTPA -folat : Gd (25, 20, 10, 3 dan 2) kemurnian radiokimianya diperiksa dengan metode KLT menggunakan silika gel sebagai fasa diam dan metanol sebagai fasa gerak. Dalam menentukan Rf komplek secara bersamaan juga dielusi larutan 153 Gd, sehingga akan dapat dilihat perbedaan Rf komplek dan 153 Gd. Dari hasil observasi awal dapat diketahui bahwa Rf 153 Gd pada posisi penotolan dan komplek naik, oleh karena itu pencacahannya lempeng silika cukup dibagi 2 dan masing-masing diukur aktivitasnya.
Dalam melakukan optimasi penandaan dilakukan pula variasi perubahan pH dari pH 4 sampai pH 7. Parameter yang digunakan untuk menentukan hasil penandaan adalah dengan menentukan kemurnian radiokimia.
Sintesis Gd- DTPA -Folat Non Aktif
Sintesis Gd- DTPA -folat non aktif dilakukan dengan menggunakan formulasi perbandingan DTPA -folat : Gd = 25 :1. Campuran dipanaskan dalam air mendidih selama 30 menit. Terhadap larutan yang terjadi kemudian disaring dengan penyaring 0,22  m dan kemudian dikeringkan dengan alat pengering beku
( freeze dryer ). Terhadap zat padat hasil pengeringan dilakukan identifikasi dengan Spektrofotometer FT-IR dan KLT.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Gd- DTPA -folat adalah merupakan senyawa targeted contrast agent yang akan dikembangkan untuk keperluan deteksi kanker ovarium. Gd- DTPA -folat disintesis dari prekursornya yaitu  - EDA -folat dengan etilendiamin yang akan membentuk DTPA-folat dan kemudian direaksikan dengan logam Gadolinium (Gd) akan menghasilkan Gd- DTPA -folat. Dalam sintesis DTPA -folat peran  - EDA -folat sangat penting sekali karena senyawa ini merupakan prekursor dari senyawa DTPA -folat. EDA -folat mempunyai 2 bentuk isomer yaitu dan  - EDA -folat. Dalam pemakaiannya bentuk  - EDA -folat lebih diharapkan karena bentuk  - DTPA -folat merupakan bentuk yang aktif berinteraksi dengan reseptor folat. Untuk dapat menghasilkan secara langsung  - EDA -folat, telah dilakukan sintesisnya dari asam folat dengan metode regiospesifik yaitu dengan mereaksikan asam folat γ-metil ester dengan etilendiamin ( EDA ). Struktur dari asam folat,  - EDA -folat dan DTPA -folat dapat dilihat pada Gambar 1.
Untuk lebih meyakinkan bahwa yang terbentuk adalah EDA -folat, terhadap hasil sintesis dilakukan pemeriksaan dengan alat Spektrofotometer FT-IR dan pemeriksaan dengan NMR . Hasil pemeriksaan NMR dibandingkan dengan yang terdapat pada penelitian
Gambar 2 . Hasil pemeriksaan FT-IR dari EDA -folat hasil sintesis
Gambar 3 . Hasil pemeriksaan 1 H- NMR terhadap EDA -folat Gambar 1 . Struktur kimia dari (a). asam folat, (b)   - EDA -folat dan (c) . DTPA -folat.
(a)
(b) (c)
sebelumnya. Kesesuaian EDA -folat hasil sintesis dengan penelitian sebelumnya dijadikan acuan untuk menunjukkan hasil sintesis adalah EDA -folat. Hasil pemeriksaan FT-IR dan NMR dari senyawa EDA -folat ditunjukkan pada Gambar 2 dan Tabel 1.
Adanya daerah serapan pada rentang 3000 cm -1 hingga 3600 cm -1 menunjukkan gugus-gugus alkohol, asam karboksilat dan amin; daerah serapan 1650 cm -1 hingga 1750 cm -1 , 1350 cm -1 hingga 1400 cm -1 , 1200 cm -1 hingga 1350 cm -1 , 850 /cm -1 hingga 950 cm -1 menunjukkan gugus karboksilat dan adanya serapan pada 700 cm -1 hingga 900 cm -1 menunjukkan adanya amin primer dan amin sekunder pada 650 cm -1 hingga 800 cm -1 .
Dari Gambar 3 dan Tabel 1 dapat dilihat bahwa spectrum 1 H-NMR dari EDA -folat hasil sintesis mempunyai kesamaan dengan yang terdapat pada penelitian sebelumnya. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang terbentuk adalah benar EDA -folat. DTPA -folat disintesis dengan cara mereaksikan EDA -folat dalam pelarut DMSO dengan DTPA dianhidrid juga dalam DMSO. DTPA-folat akan terbentuk sebagai endapan pada pH 7 dari hasil pengaturan pH dengan larutan NaOH 2,4 N. Karena Gd-DTPA-folat adalah merupakan senyawa non radioaktif, maka untuk melihat terbentuknya senyawa tersebut dilakukan penandaan terhadap DTPA-folat dengan radionuklida 153 Gd. Karena Gd adalah merupakan logam yang toksis, maka dalam formulasi perbandingan DTPA-folat dengan Gd jumlah logam Gd divariasikan dengan asumsi dapat meminimalkan jumlah Gd yang tidak bereaksi sehingga
sediaan akan aman. Optimasi untuk melihat terbentuknya 153 Gd- DTPA -folat dilakukan dengan memvariasikan nilai pH dan perbandingan mol DTPA -folat terhadap 153 Gd (Gambar 4 dan Gambar 5). Perbandingan mol DTPA -folat terhadap logam Gd dilakukan menggunakan perbandingan 2, 3, 5, 10, 25, 30 dan 40.
Parameter yang digunakan untuk melihat terbentuknya senyawa 153 Gd- DTPA -folat adalah dengan menentukan kemurnian radiokimianya. Penentuan kemurnian radiokimia kompleks 153 Gd- DTPA -folat dilakukan dengan metode KLT menggunakan fasa diam silika gel dan fasa gerak metanol. Dari perbandingan ini diharapkan dapat diperoleh jumlah optimum DTPA -folat terhadap Gd yang bisa memberikan kemurnian radiokimia yang tinggi. Persentase kemurnian radiokimia yang diperoleh dari hasil optimasi perbandingan mol DTPA -folat : Gd diatas masing-masing diperoleh 18,5 %, 22 %, 82,5 %, 93,6 %, 92 %, 88,4 % dan 87,7 %. Dari hasil tersebut diatas diperlihatkan bahwa perbandingan mol DTPA -folat : Gd = 20 : 1 memberikan kemurnian radiokimia tertinggi yaitu 93,6 % seperti ditunjukkan pada Gambar 4. Perbandingan mol DTPA -folat terhadap mol Gd < 20 dan mol > 25 memperlihatkan hasil penandaan dibawah 90 %, sehingga untuk variasi nilai pH perbandingan ini yang akan digunakan. Dari hasil variasi pH yang dilakukan pada pH 4, pH 5, pH 6 dan pH 7 telah diperoleh bahwa pH 6 memberikan hasil penandaan yang terbaik dibanding pH lainnya seperti ditunjukkan pada Gambar 5.
Hasil penentuan kemurnian radiokimia dari hasil optimasi yaitu pada pH 7 dengan perbandingan mol DTPA -folat : Gd = 20 : 1, kromatogramnya dapat dilihat pada Gambar 6. Dari Gambar 6, pada spektrum A gambarnya tidak begitu bagus (tidak halus), hal ini terjadi karena aktivitas 153 Gd- DTPA -folat kecil sekali (cacahan bagian vertikal maksimum hanya 150 sangat jauh bila dibanding pada 153 Gd yaitu 4000), tetapi dari profil gambar tersebut dapat disimpulkan bahwa 153 Gd- DTPA -folat telah terbentuk yaitu dengan hanya terjadinya 1 puncak yang Rf nya tidak sama dengan Rf 153 Gd.
Sebagai konfirmasi lebih lanjut untuk meyakinkan bahwa komplek Gd- DTPA -folat benar-benar telah terbentuk (dengan melihat pembentukan
Gambar 5 . Hasil optimasi penandaan 153 Gd- DTPA -folat dengan variasi pH reaksi
Gambar 4 . Hasil optimasi penandaan 153 Gd- DTPA -folat dengan variasi perbandingan mol DTPA -folat terhadap jumlah Gd
Tabel 1 . Hasil pengujian EDA -folat dengan NMR.
Data Acuan [5] Pengukuran Keterangan 8,66 (s, 1H) 8,64 (s, 1H) 7,56 (d, 1H, J=8,8 Hz) 7,6 (d) 6,58-6,56 (d, 1J, J=8,8 Hz) 6,64-6,62 (d) 4,50 (s, 2H) 4,5 (s) 3,25 (m, 2H) 3,2 (m) 2,68-2,65 (m, 2H) 2,66-2,60 (m) 2,25-2,19 ( m, 2H) 2,1-2,07 (m) 2,16-1,8 (m, 2H) 2,07-1.90 (m) NMR : Acuan : 400 MHz, D2O LIPI : 300 MHz, D2O
153 Gd-DTPA-Folat (Adang H.G.)
153 Gd- DTPA -folat), telah dilakukan pengujian dengan alat HPLC yang menggunakan 2 jenis detektor yaitu detektor UV (280 nm) dan detektor radioaktif (NaI-Tl) dan kromatogramnya dapat dilihat pada Gambar 7. Hasil pemantauan menggunakan alat HPLC tersebut
menunjukkan bahwa kemurnian radiokimia kompleks 153 Gd- DTPA -folat sangat tinggi sekali, dimana dalam hal ini ditunjukkan dengan hanya terdapat 1 puncak pada kromatogram untuk zat radioaktif yaitu pada 6,63 menit dan 1 puncak juga terdapat pada kromatogram detektor UV-Vis yaitu pada 6,2 menit. Perbedaan waktu retensi pada kromatogram dari ke 2 detektor tersebut lebih disebabkan karena eluen dan sampel terlebih dahulu melewati detektor UV-Vis , baru setelah itu melewati detektor radioaktif. Bila dilihat dari kromatogram yang terbentuk (pada detektor UV-Vis dan detektor radioaktif), jelas tidak terlihat adanya senyawa lain atau dengan kata lain hanya terbentuk komplek 153 Gd- DTPA -folat.
Gambar 6 . Kromatogram KLT dari 153 GdCl 3 dan 153 Gd- DTPA -folat dengan fasa diam pelat Silika Gel dan fasa gerak Metanol ((a) = 153 Gd- DTPA -folat dan (b) = 153 GdCl 3 ). (b) (a) Gambar 10 . Identifikasi dengan lampu UV dari Gd- DTPA - folat (a), EDA -folat (b) dan asam folat (c) (a) (b) (c) Gd-DTPA-folat Gambar 8 . Hasil pemeriksaan FT-IR dari senyawa kontras Gd- DTPA -folat
Gambar 9 . Kromatogram HPLC dari DTPA-folat dengan alat HPLC merek Shimadzu menggunakan kolom C-18 (250 x 21 mm) (a) = EDA -folat dan (b) = Gd- DTPA -folat. (b) (a) Gambar 7 . Kromatogram HPLC dari 153 Gd- DTPA -folat dengan menggunakan 2 detektor yaitu detektor UV-Vis dan detektor radioaktif. [min.] Time 0 10 20 30 40 [mV] V o lta g e -100 0 100 200 300 400 500 Gd-153DTPAFolat C-18TPB201 A.ACN PANJANGGELOMBANG280nm Lajualir1mL/menit B.TFA0.3% Gradien:0menit=0%B,20menit60%B,40menit60%B,4001menitstop 6 .6 3 1 Gd-153DTPAFOLATSebelumPemurnian2-1227(2011)-DetectorUV Gd-153DTPAFOLATSebelumPemurnian2-1227(2011)-DetectorNaITl 6 .2 0 7 1
Dari hasil optimasi dengan bantuan menggunakan radionuklida 153 Gd sebagai perunut, telah dilakukan pembuatan senyawa kontras Gd- DTPA -folat dengan perbandingan mol DTPA -folat terhadap Gd 20 : 1 pada pH reaksi 6, diperoleh senyawa Gd- DTPA -folat.
Identifikasi terbentuknya senyawa tersebut sebagai Gd- DTPA -folat dilakukan dengan FT-IR , HPLC dan KLT dengan lampu UV . Hasil identifikasi dengan FT-IR menunjukkan tidak adanya perubahan bentuk spektrum seperti yang diberikan oleh DTPA -folat ditunjukkan pada Gambar 8. Hasil pemeriksaan dengan HPLC menggunakan kolom C18 (250 x 21 mm), pada panjang gelombang 280 nm, dengan gradien menggunakan eluent ACN dan TFA 0,3 % ( gradien : 0 menit = 0 % B, 20 menit = 60 % B, 40 menit = 60% B); hasilnya ditunjukkan pada Gambar 9. Dari kromatogram tersebut terlihat bahwa Gd-DTPA- γ-folat yang terbentuk masih dominan (~ 83 %), sisanya kemungkinan dalam bentuk Gd-DTPA- α-folat dan bentuk lain yang belum diketahui.
Identifikasi dengan KLT menggunakan fasa diam silika gel dan fasa gerak metanol, dilakukan menggunakan pembanding asam folat dan EDA -folat, memperlihatkan terdapat pergerakan yang tidak sama dari asam folat, EDA -folat dan Gd- DTPA -folat hasil sintesis seperti yang terlihat pada Gambar 10.

## KESIMPULAN
Dengan melihat hasil yang telah diperoleh dari penelitian diatas, telah dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut :
1. Sintesis EDA -folat dengan metode regiospesifik menghasilkan  - EDA -folat yang bisa diidentifikasi dengan alat HPLC menggunakan kolom C18
(250 x 21 mm), pada panjang gelombang 280 nm,
dengan gradien eluent ACN dan TFA 0,3 % ( gradien : 0 menit = 0 % B, 20 menit = 60 % B, 40 menit = 60 % B).
2. Gd- DTPA -folat disintesis dari DTPA -folat dan logam Gd dengan perbandingan mol sebesar 20 : 1, cukup memberikan hasil yang baik.

## DAFTAR ACUAN
[1]. LOWE M., CONTRAST AGENT FOR RMI, h t t p : / / www. l e . a c . u k / c h e mi s t r y / r e s e a r c h / CHRIMPL10.HTML
[2]. GRIES, HEINZ; ROSENBERG, DOUWE; WEINMANN, HANNS-JOACHIM, Diagnostic media, United States Patent 4647447
[3]. PHILIP L. F., JIN L., DOUGLAS A. L., Folic acid derivatives, US Patent No. 6291673 , Issued on September 18, (2001)
[4]. VLAHOV I.R., LEAMON C.P., PARKER M. A., HOWARD S. J., SANTHAPURAM H.K., SATYAM A., REDDY J. A., Vitamin Receptor Binding Drug Delivery Conjugates, WO/2004/ 069159, (2004)
[5]. J. SUNAMOTO, K. USHIO, M. HIDAKA, Folate- Modified Cholesterol-Bearing Pullulan as a Drug Carrier, United States Patent 20070042970 , (2005) [6]. SE-LIM KIM, HWAN-JEONG JEONG, EUN-MI KIM, CHANG-MOON LEE, TAE-HYOUNG KWON, MYUNG-HEE SOHN, Journal Korean Med. Sci ., 22 (2007) 405-411
[7]. WENJIN GUO, GEORGE H. HINKLE, ROBERT J. LEE, J. Nucl. Med ., 40 (1999) 1563-1569
[8]. CHRYSTAL M. P., JOSEPHA. R., CHRISTOPHER P. L., MARY JO T. and PHILIP S. L. , Mol Pharmacol, 66 (2004) 1406-1414