This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License CC-BY

## Perbandingan Pengaruh Agen Plasmid Curing
Acriflavine dan Acridine Orange (AO) terhadap Laju Plasmid Curing dengan Kuantifikasi Fluoresensi Ekspresi Protein GFP pada Bakteri Escherichia Coli PRSET-emGFP
Jonathan Harris Gultom* Mikrobiologi Institut Teknologi Bandung,
Bandung 10420002@mahasiswa.itb.ac.id *Corresponding Author

## Azka Fathiya
Mikrobiologi Institut Teknologi Bandung, Bandung 10420010@mahasiswa.itb.ac.id

## Ajeng Farahita Auria
Mikrobiologi Institut Teknologi Bandung, Bandung 10420015@mahasiswa.itb.ac.id

## Ayodya Kuncoroadi Y W
Mikrobiologi Institut Teknologi Bandung, Bandung 10420023@mahasiswa.itb.ac.id

## Nadhira Azzahra Arandri
Mikrobiologi Institut Teknologi Bandung, Bandung 10420030@mahasiswa.itb.ac.id Ahmad Hafiz Husamuddin Rahman Mikrobiologi Institut Teknologi Bandung, Bandung 10419004@mahasiswa.itb.ac.id
Abstrak — Plasmid  curing  is  an  activity  to  remove plasmids  in a bacterium. Plasmid  itself  is a structure that can  carry  genes  that  are  beneficial  for  bacteria,  such  as making  the  bacteria  resistant  to  antibiotics.  Acridine Orange (AO) and Acriflavine are intercalating agents that function to break down the super helical shape of plasmid DNA and then form circular or open linear plasmid DNA which  is  used  to  carry  out  Plasmid  Curing  in  this  study and then compare its effect on the rate of plasmid curing by fluorescence quantification of GFP protein expression. on  Escherichia  coli  PRSET-emGFP  bacteria.  The  results obtained  from  this  experiment  were  the  rate  of  plasmid loss per generation obtained by measuring the activity of the GFP reporter on the recombinant E. coli model given the curing agent Acridine Orange was 9.52% for the AO 50  treatment,  44.2%  for  the  AO  100,  10.4%  for  the  AO 50  treatment.  Akriflavina  250,  and  0.836%  for Acriflavine  125.  Therefore,  it  can  be  concluded  that  the Acridine  Orange  treatment  was  more  effective  than  the Acriflavine  treatment  against  the  pRSET-EmGFP recombinant E. coli curing plasmid.
Kata  Kunci — Plasmid,  Plasmid  Curing,  Acridine Orange, Acriflavine, GFP, E. coli PRSET-emGFP.

## I. P ENDAHULUAN
Plasmid  merupakan  elemen  DNA  ekstra-kromosom independen,  melingkar,  mereplikasi  diri  dengan  nomor salinan  karakteristik  di  dalam  inang.  Sifat-sifat  yang dapat  dikodekan  oleh  plasmid  adalah  resistensi  terhadap antibiotik  dan  logam  berat,  degradasi  hidrokarbon,
sintesis bakteriosin dan antibiotik, dan masih banyak lagi. Resistensi  antibiotik  yang  dimediasi  plasmid  dapat ditransfer dengan  mudah dari satu bakteri ke bakteri  lain melalui  transformasi,  konjugasi  atau  mobilisasi  ( Opal  et al .,  2000).  Resistensi  yang  dikodekan  oleh  plasmid terhadap  beberapa  antibiotik  semakin  diakui  sebagai tantangan  utama  dalam  pengobatan  infeksi.  Selain resistensi antibiotik, beberapa plasmid bakteri memberikan patogenisitas ke sel inang (Saunders, 1981). Bahan  plasmid  curing  adalah  bahan  kimia  yang menghambat  replikasi  plasmid  yang  mengakibatkan eliminasi  plasmid  dari  populasi  inang  setelah  beberapa siklus replikasi.
Perbandingan  strain  yang  menyimpan  plasmid  dan turunannya yang disembuhkan memungkinkan penetapan karakter  fenotipik  ke  gen  yang  terletak  pada  plasmid. Hilangnya  suatu  sifat  tertentu  secara  simultan  melalui proses  curing,  memberikan  indikasi  yang  kuat  tentang sifat  genetik  yang  dibawa  oleh  plasmidnya  (Trevors, 1986).  Selanjutnya,  plasmid  curing  akan  mengubah  sel bakteri  yang  resisten  antibiotik  menjadi  sel  yang  sensitif (Molnar,  1988).  Dengan  demikian,  eliminasi  R-plasmid membuat  terapi  antibiotik  menjadi  efektif.  Strategi  baru untuk melawan resistensi multiobat antimikroba diperlukan, dan penyembuhan plasmid, dan strategi anti- plasmid  dapat  mengurangi  frekuensi  gen  resistensi antimikroba  dan  membuat  bakteri  peka  terhadap antibiotik (Michelle et al ., 2018).
Curing  plasmid  adalah  proses  menghilangkan  fungsi yang  dikodekan  plasmid  seperti  resistensi  antibiotik, virulensi, degradasi senyawa aromatik, dan lain-lain pada bakteri.  Beberapa  bahan  untuk  plasmid  curing  telah
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License CC-BY
dilaporkan  dalam  literatur,  namun  tidak  ada  suatu  agen plasmid curing yang dapat menghilangkan semua plasmid dari  inang  yang  berbeda.  Oleh  karena  itu,  selalu  ada kebutuhan  akan  agen  plasmid  curing  baru  yang  dapat digunakan secara efektif untuk membalikkan fungsi yang dikodekan plasmid seperti  virulensi, resistensi  antibiotik, dan lain-lain
Protokol untuk plasmid curing  sering kali terdiri  dari pemaparan  kultur  terhadap  konsentrasi  sub-inhibitor  dari beberapa  bahan  kimia,  seperti  misalnya  acridine  orange, acriflavine,  dan  sodium  dodecyl  sulfate  atau  ke  suhu super-optimal  diikuti  dengan  pemilihan  turunan  yang diawetkan. Agen interkalasi DNA seperti Acridine orange dan  ethidium  bromide  adalah  yang  paling  umum digunakan  karena  terbukti  efektif  melawan  plasmid dalam  berbagai  genera.  Meskipun  semua  agen  ini  telah digunakan  untuk  meningkatkan  pemulihan  turunan kurang  plasmid  dari  berbagai  bakteri,  mereka  secara individual  hanya  efektif  terhadap  beberapa  plasmid  dan kemungkinan responsnya tidak dapat diprediksi. Penghapusan  plasmid  (curing)  dari  kultur  bakteri  adalah metode terbaik untuk membuktikan hubungan antara sifat genetik dan pembawa plasmid spesifik oleh kultur karena karakter  fenotipik  yang  terkait  dengan  plasmid  tidak diekspresikan dalam turunan  yang diawetkan tetapi pada pengenalan  kembali  plasmid  ke  strain  sembuh  fenotipe yang  hilang  muncul kembali. Efisiensi curing  juga dapat sangat  bervariasi  tergantung  pada  plasmid  dan  inang bakteri  tertentu  yang  membawanya.  Dalam  kebanyakan kasus,  mekanisme  yang  mendasari  penyembuhan  tidak diketahui.  Zat  tersebut  dapat  mengganggu  secara langsung  replikasi  plasmid  seperti  yang  terjadi  dengan curing  yang  diinduksi  panas  dari  palsmid  sensitif  suhu tertentu atau curung dengan acridine orange atau etidium bromida.  Alternatifnya,  curing  dapat  mengganggu pertumbuhan bakteri pembawa plasmid sehingga memungkinkan  segregan  tanpa  plasmid  yang  muncul secara  spontan  menjadi  dominan.  Hal  ini  terjadi  pada kasus  tertentu  dari  curing  dengan  acridines,  natrium dodesil  sulfat  dan  urea.  Menyembuhkan  dengan MitomycinC  juga  efektif.  Eksperimen  curing  biasanya dilakukan  di  bawah  kondisi  yang  serupa  dengan  yang digunakan  untuk  kultur  rutin  bakteri  kecuali  pembatasan komponen  esensial  dimaksudkan  secara  khusus.  Bila pengobatan  dilakukan  untuk  jangka  waktu  yang  terus menerus,  zat  tersebut  digunakan  pada  konsentrasi  yang hanya  kurang  dari  yang  dibutuhkan  untuk  menghambat pertumbuhan,  dan  jumlah  bakteri  awalnya  kecil.  Jika acridine digunakan, kultur dipertahankan pada pH 7,6 dan diinkubasi dalam gelap. Agen interkalasi berfungsi untuk memecah  bentuk  superhelikal  DNA  plasmid  kemudian membentuk  DNA  plasmid  bentuk  melingkar  atau  linier terbuka.  Acriflavine  adalah  agen  interkalasi  DNA  yang memiliki  sifat  plasmid  curing.  Acriflavine  selektif menghambat  replikasi  plasmid,  dan  mungkin  memiliki peran  dalam  mengganggu  konjugasi  (Das  et  al.,  2017). Acridine orange (AO) adalah pewarna fluorescent umum yang telah dikenal selama bertahun-tahun dan merupakan agen  interkalasi  pada  plasmid  curing  (Byvaltsev  et  al., 2019).  Penggunaan  antibiotik  secara  berlebihan  dalam
berbagai  kegiatan  manusia  dapat  menghasilkan  sifat resistensi  antibiotik  pada  berbagai  mikroba.  Sifat resistensi  tersebut  dapat  menyebar  antarmikroba  melalui mekanisme  horizontal  gene  transfer.  Hal  tersebut menyebabkan  peningkatan  kekhawatiran  berpindahnya sifat  resistensi  tersebut  kepada  mikroba  yang  patogen pada manusia. Lingkungan yang mengandung kontaminan  berupa  antibiotik  dapat  memiliki  potensi untuk menyeleksi mikroba resisten antibiotik. Menanggapi  hal tersebut, perlu adanya penggunaan agen plasmid curing untuk mengantisipasi sifat resistensi yang dimiliki  mikroba  tersebut.  Namun,  perlu  adanya  analisis konsentrasi  yang  optimal  bagi  agen  plasmid  curing tersebut  menjalankan  tugasnya.  Oleh  karena  itu, penelitian  ini  bertujuan  untuk  menganalisis  secara kuantitatif  laju  kehilangan  plasmid  per  generasi menggunakan  pengukuran  aktivitas  reporter  GFP  pada model E. coli rekombinan.
Mekanisme  horizontal  gene  transfer  dapat  menjadi cara  untuk  penyebaran  antibiotik  antar  mikroba  karena adanya  sifat  resistensi  pada  mikroba  setelah  penggunaan antibiotik  yang  berlebihan  akibat  dari  berbagai  kegiatan manusia. Hal tersebut menyebabkan peningkatan kekhawatiran  atas  perpindahan  sifat  resistensi  tersebut kepada mikroba yang patogen pada manusia. Lingkungan yang  berkontaminan  dapat  memiliki  potensi  untuk menyeleksi  mikroba  yang  resisten  terhadap  antibiotik. Penggunaan  agen  plasmid  curing  dapat  mengantisipasi sifat  resistensi  mikroba,  tetapi  perlu  ada  analisis konsentrasi  lebih  lanjut  bagi  agen  plasmid  curing  agar dapat menjalankan tugasnya secara optimal. Oleh karena itu,  penelitian  ini  bertujuan  untuk  menganalisis  secara kuantitatif  laju  kehilangan  plasmid  per  generasi menggunakan  pengukuran  aktivitas  reporter  GFP  pada model E.  coli rekombinan.  Dengan  tujuan  spesifik menentukan  laju  kehilangan  plasmid  per  generasi menggunakan  pengukuran  aktivitas  reporter  GFP  pada model E.  coli rekombinan  yang  diberi  agen  curing Acridine  Orange, menentukan  laju  kehilangan  plasmid per  generasi  menggunakan  pengukuran  aktivitas  reporter GFP  pada  model E.  coli rekombinan  yang  diberi  agen curing Acriflavin, dan membandingkan  efektivitas perlakuan Acridine  Orange dan Acriflavin terhadap plasmid curing E. coli rekombinan pRSET-EmGFP.

## II. T INJAUAN P USTAKA
Plasmid  merupakan  sebuah  struktur  ekstrakromosom yang  dapat  ditemukan  di  berbagai  mikroorganisme  yang dapat bereplikasi secara mandiri dan tidak terkait dengan replikasi  kromosom.  Plasmid  membawa  sejumlah  kecil gen  dibandingkan  dengan  kromosom.  Plasmid  dapat berfungsi sebagai pembawa materi genetik yang merubah bakteri  menjadi  memiliki  keuntungan  secara  genetik seperti  misalnya  resisten  terhadap  antibiotik.  Plasmid terdiri atas origin of replication (ORI), selectable marker, multiple  cloning  site,  promoter  region,  protein  tag, dan poly-adenylation  signal .  Secara  umum,  plasmid  terdiri atas  lima  tipe  yakni  plasmid  F-,  plasmid  resistensi, plasmid virulensi, plasmid degradative, dan  juga plasmid
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License CC-BY
Col  (Couturir,  1988).  Plasmid  merupakan  komponen pembawa  gen  resisten  antibiotik  dari  bakteri  AMR ( antimicrobial resistance ). Gen tersebut akan dibawa oleh plasmid  yang  kemudian  ditransfer  secara  horizontal  dari suatu  bakteri  ke  bakteri  lainnya.  Ketika  suatu  bakteri memperoleh  plasmid  ini,  terjadi  perubahan  karakteristik gen  di  dalamnya  sehingga  mengakibatkan  mikroba  yang bersangkutan  menjadi  resisten  terhadap  antibiotik  karena sudah  memiliki  gen  resisten  dari  bakteri  AMR (Rozwandowicz et  al ., 2018). Plasmid curing  merupakan proses  ketika  suatu  plasmid  yang  membawa  fungsi sebagai  resisten  antibiotik,  virulens,  metal  resisten, memiliki  sifat  pathogen,  dll.  kehilangan  kemampuannya atau  hilang  dari  suatu  mikroba  secara  keseluruhan  atau sebagian  kecil.  Untuk  mengamati  fenomena  tersebut, dapat digunakan agen curing seperti misalnya acriflavine, ethidium  bromide dan acridine  orange (pewarna interkalasi, dilakukan inhibisi replikasi plasmid), coumermycin dan novobiocin (menginhibisi DNA gyrase - dependent supercoiling dari  plasmid), mitomycin C (aktivasi  metabolik  diikuti  perubahan  pada  basa  purin), rifampicin (menginhibisi RNA polimerase), dan SDS (sel dengan  plasmid  akan  lebih  sensitif  terhadap  SDS  karena adanya plasmid-specified pili di permukaan sel) (Trevors, 1986).
Lysogeny  Broth  merupakan  medium  umum  yang digunakan  untuk  mengkultivasi  kultur  bakteri.  Lysogeny Broth  mengandung  nutrisi  yang  baik  dipakai  untuk mengkultur  bakteri  seperti Escherichia  coli dan  bakteri enterik  lainnya  (MacWilliams  &  Liao,  2006).  Ampisilin merupakan  agen  antimikrobial  kelas  penisilin  yang bekerja  dengan  berinteraksi  langsung  dengan  Penicillin- binding  proteins  (PBP)  dan  menghambat  aktivitas transpeptidase  (Parker,  2012).  Penggunaan  medium LB+Ampisilin dilakukan untuk mengeliminasi mikroorganisme  umum  dan  meningkatkan  pertumbuhan E.coli dengan plasmid pRSET-emGFP yang memiliki gen resisten terhadap antimikroba dan mengekspresi emerald- GFP.
Protokol  untuk  plasmid  curing  sering  kali  terdiri  dari pemaparan  kultur  terhadap  konsentrasi  sub-inhibitor  dari beberapa  bahan kimia, seperti  misalnya acridine  orange , acriflavine ,  dan  sodium  dodecyl  sulfate  atau  ke  suhu super-optimal  diikuti  dengan  pemilihan  turunan  yang diawetkan. Agen interkalasi DNA seperti Acridine orange dan  ethidium  bromide  adalah  yang  paling  umum digunakan  karena  terbukti  efektif  melawan  plasmid dalam  berbagai  genera. Acriflavine adalah  agen interkalasi  DNA  yang  memiliki  sifat  plasmid  curing. Acriflavine selektif  menghambat  replikasi  plasmid,  dan mungkin  memiliki  peran  dalam  mengganggu  konjugasi (Das et al., 2017). Acridine orange (AO) adalah pewarna fluorescent  umum  yang  telah  dikenal  selama  bertahun- tahun  dan  merupakan  agen  interkalasi  pada  plasmid curing (Byvaltsev et al., 2019).
Pada  penelitian  kali  ini,  digunakan  agen  curing Acridine  orange  atau  AO  dan  acriflavine.  Acridine orange yang berfungsi sebagai pewarna fluoresen selektif asam nukleat memiliki sifat kationik sehingga membantu penentuan  siklus  sel.  Agen  curing  ini  bersifat  sel-
permeabel,  sehingga  memungkinkan  pewarna  dapat berinteraksi  dengan  DNA  melalui  interkalasi,  atau  RNA dengan  atraksi  elektrostatik.  Saat terikat  pada  DNA,  AO memiliki  eksitasi  maksimum  pada  520  nm  dan  525  nm. Sedangkan,  saat  berikatan  dengan  ENA  AO  mengalami pergeseran  eksitasi  maksimum  dari  525  nm  menjadi  460 nm  (biru).  AO  juga  mampu  menahan  lingkungan  yang berada  pada  pH  rendah  sehingga  pewarna  dapat menembus  organel  asam  yang  terikat  membrane (Yektaeian  et  al.,  2019).  Nilai  MIC  merupakan  nilai konsentrasi  terendah  antibiotik  yang  menyebabkan terhambatnya  pertumbuhan  bakteri  (Kowalska-Krochmal &  Dudek-Wicher,  2021).  Nilai  MIC  pada  agen  curing acridine  orange  sebesar  4.1  x  104  M  atau  108.8  g/mL, dengan  nilai  sublethal  sebesar  ½  dari  nilai  MIC  yaitu 54.4  g/mL (Spengler, 2006).
Agen  curing  selanjutnya  yang  digunakan  sebagai pembanding  adalah  acriflavine.  Acriflavine  merupakan antiseptic  yang  dapat  berfungsi  dalam  mengurangi transfer  factor  F  dan  R  plasmid.  Mode  of  action  agen curing  ini  adalah  dengan  membuat  lateral  gene  transfer antar  bakteri  enjadi  terhambat  yang  memicu  populasi bakteri  akan  berkurang.  Acriflavine  akan  berikatan dengan  reseptor  spesifik  di  membrane  luar  bakteri  dan masuk  ke  dalam  bakteri  sehingga  dapat  berikatan  pada membrane  plasma  dengan  jenis  ikatan  irreversible binding.  Acriflavine  juga  dapat  mengatur  regulasi  gen- gen  yang  terlibat  pada  beberapa  proses  seluler  seperti reaksi  oksidasi-reduksi,  transportasi  transmembrane, biosintesis  asam  lemak  dan  pengikatan  ion  logam. Regulasi  gen  yang  mengatur  protein  transporter  ABC (ATP-binding cassette) dan MFS (major facilitator super- family)  juga  dapat  dikendalikan  menggunakan  agen curing  acriflavine.  Kedua  protein  transporter  ini,  ABC dan  MFS,  digunakan  dalam  resistansi  antibiotic  mikroba dan  berbagai  proses  sekresi  protein  (Persinoti,  et  al., 2014). Nilai MIC pada agen curing acriglavine sebanyak 250  g/mL.  Sehingga  untuk  perhitungan  sublethal dengan ½ MIC yaitu sebesar 125  g/mL (Villagra, et al., 2008).
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) merupakan  reagen  mimik  dari  alolaktosa,  sebuah metabolit  laktosa  yang  menginduksi  transkripsi  operon lac,  yang  berperan  dalam  ekspresi  protein  E.  coli.  IPTG mengaktifkan operon lac di E. coli dengan  mengikat dan memblokir  represor  lac  tanpa  terdegradasi.  Dengan adanya IPTG, gen yang diatur oleh urutan promotor atau operator  lac  atau  tac  diekspresikan  dengan  tingkat  yang tinggi  (Biologics  International  corp.  2018).  Plasmid  dari prSET-emGFP  adalah  plasmid  tipe  ekspresi  bakteri dengan  ukuran  3600  bp,  plasmid  ini  memiliki kemampuan resistensi antibiotik ampisilin dan merupakan  vektor  untuk  mengekspresikan  Emerald  GFP pada  bakteri.  Plasmid  ini  mengandung  promotor vacteriophage T7 untuk ekspresi Fluorescent Protein (FP) tingkat  tinggi  yang  dapat  diinduksi  dalam  E.  coli,  untuk terjemahan  FP  yang  efisien,  situs  pengikatan  ribosom (RBS)  secara  ideal  diposisikan  dari  awal  ATG,  lalu Xpress  epitop  untuk  mendeteksi  protein  fusi  yang diekspresikan  menggunakan  situs  pengenalan  Anti-
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License CC-BY
Xpress  antibodi  Enterokinase  (EK)  untuk  pembelahan efektif  peptida  fusi  dari  FP,  selanjutnya  ada  protein fluoresen  turunan  eGFP  (EmGFP),  dan  terakhir  ada  gen resistensi  ampisilin  untuk  seleksi  asal  pUC  E.  coli  untuk replikasi salinan tinggi dan pemeliharaan plasmid pada E. coli.  Pada  plasmid  E.  coli  prSET-emGFP,  promotor  T7 mengontrol  ekspresi  10  gen.  Promotor  ini  dikenali  oleh T7 RNA polimerase. Inang bakteri yang dapat digunakan adalah  yang  mengekspresikan  T7  RNA  polimerase  atau menginfeksi  sel  dengan  fag  yang  mengekspresikan  T7 RNA  polimerase  untuk  mengekspresikan  gen  Protein Fluorescent  pada  E.  coli.  Penggunaan  strain  E.  coli turunan BL21 direkomendasikan sebagai inang konstruksi  ekspresi  karena  T7  RNA  polimerase diekspresikan  dalam  strain  ini  dengan  cara  yang terkontrol (Invitrogen, 2010).
Pada  percobaan  ini  dilakukan  pengukuran  OD  pada panjang  gelombang  600  dan  fluoresensi  dengan  Emisi pada  panjang  gelombang  500-550  nm  dan  eksitasi  pada panjang  gelombang  475  nm  menggunakan  GlomaxR Discover Promega. Pengukuran absorbansi pada OD 600 bertujuan untuk menghitung konsentrasi atau jumlah dari bakteri  atau  sel  yang  ada  di  dalam  sampel  cair. Pengukuran  Fluoresensi  dengan  emisi  pada  panjang gelombang  500-550  nm  dan  eksitasi  pada  panjang gelombang  475  nm  dilakukan  karena  range  itu merupakan  range  GFP  dapat  mengeluarkan  sinyal fluoresens.  (Mandelstam,  et.al.,  1982;    Brejc,  et.al., 1997).

## III. M ETODOLOGI

## A. Alat dan Bahan
Kultur  E.  coli  pRSET-emGFP  ditumbuhkan  pada medium  LB+ampisilin  yang  kemudian  melalui  proses curing  menggunakan  agen  Acriflavine  pada  konsentrasi 125  ug/mL  dan  250  ug/ml;  dan  Acridine  Orange  pada konsentrasi  50  ug/mL  dan  100  ug/mL.  Alat  yang digunakan antara lain : mikropipet dengan ukuran 100µL, 1000µL,  falcon  15  mL  dan  30mL,  microtube,  kuvet, microtiter,  spektrofotometer,  tabung  reaksi,  syringe, syringe  filter.  Kemudian  bahan  yang  dibutuhkan  dalam penelitian  ini  antara  lain  :  ampisilin,  agen  curing acriflavine,  agen  curing  acridine  orange  (AO),  kultur  E. coli  pRSET-emGFP,  tips  mikropipet  100µL,  1000µL, NaCl  0.85%,  kapas  lemak,  bahan-bahan  untuk  membuat medium  (tripton,  yeast  extract,  NaCl),  akuades,  alcohol, spiritus.
B. Pembuatan medium
Medium  LB  dibuat  dengan  komposisi  tripton  10 gram,  yeast  extract  5  gram,  NaCl  10  gram.  Untuk medium  padat  ditambahkan  agar  15  gram,  dan  untuk medium  LB+  ampisilin  ditambahkan  ampisilin  0,375 gram, yang merupakan working culture sebesar 0,1% dari stock.
C. Aktivasi kultur Kultur  E.coli  pRSET-emGFP  dalam  medium  cair ditambahkan 2,5 uL larutan IPTG konsentrasi 1 Molar.

## D. Induksi agen curing
Pada  10  ml  kultur  cair E.  coli pRSET-emGFP diinduksi 2,5 uL IPTG kemudian diletakkan di incubator. Kemudian  ditambahkan  agen  curing  Acriflavine  dan Acridine  Orange  pada  volume  tertentu  kedalam  medium sesuai  konsentrasi  yang  diinginkan.  Kultur  kemudian disampling 400 uL kemudian diinkubasi 24 jam.

## E. Perhitungan OD dan Absorbansi
Kultur  hasil  inkubasi  kemudian  disentrifugasi, kemudian  peletnya  dilarutkan  menggunakan  larutan fisiologis  sampai  volume  400  uL.  Fluoresensi  dan Absorbansi  diukur  menggunakan  mikrotiter.  Mikrotiter hitam digunakan untuk pengukuran fluorosensi sedangkan microtiter bening digunakan untuk pengukuran  absorbansi.  Untuk  perhitungan  fluoresensi digunakan  sebanyak  170  uL  kultur  pada  tiap  well,  dan untuk perhitungan absorbansi sebesar 200 uL kultur pada tiap  well.  Hasil  perhitungan  day  1  sampai  day  3  dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2.
Gambar 1. Peta microtiter perhitungan fluoresensi dan absorbansi pada perlakuan day 1 dan day 2 .
Gambar 2. Peta microtit er perhitungan fluoresensi dan absorbansi pada perlakuan day 3 Well/No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Air Air
Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air B Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air C Air AO 100 T0 AO 100 T0 AO 100 T0 AO 100 T24 AO 100 T24 AO 100 T24 Larfis Air Air Air Air
D Air AO 50 T24 AO 50 T24 AO 50 T24 AO 50 T0 AO 50 T0 AO 50 T0 Larfis Air Air Air Air E Air Acri 250 T0 Acri 250 T0 Acri 250 T0 Acri 250 T24 Acri 250 T24 Acri 250 T24 Larfis Air Air Air Air F Air Acri 125 T0 Acri 125 T0 Acri 125 T0 Acri 125 T24 Acri 125 T24 Acri 125 T24 Larfis Air Air Air Air
G Air Air Air Air Air Air Air
Air Air Air Air Air H Air Air Air Air Air Air
Air Air Air Air Air Air Well/No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air B Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air C Air AO 100 T24 AO 100 T24 AO 100 T24 AO 100 T0 AO 100 T0 AO 100 T0 Larfis Air Air Air Air D Air AO 50 T24 AO 50 T24 AO 50 T24 AO 50 T0 AO 50 T0 AO 50 T0 Larfis Air Air Air Air E Air Acri 250 T0 Acri 250 T0 Acri 250 T0 Acri 250 T24 Acri 250 T24 Acri 250 T24 Larfis Air Air Air Air F Air Acri 125 T0 Acri 125 T0 Acri 125 T0 Acri 125 T24 Acri 125 T24 Acri 125 T24 Larfis Air Air Air Air
G Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air H Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air Air
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License CC-BY

## IV. H ASIL DAN P EMBAHASAN
Dari  Gambar  3,  terlihat  bahwa  fluoresensi  Acridine Orange  konsentrasi  50  µg/ml  menunjukkan  peningkatan dari  T0  sampai  T24  jam.  Pada  T48  dan  72  jam  terlihat fluoresensi  berkurang  signifikan.  Acriflavine  konsentrasi 125µg/ml menunjukkan peningkatan pada T0 sampai T24 jam.  Pada  T48  dan  72  jam  terlihat  fluoresensi  berkurang signifikan.  Fluoresensi  dari  Acridine  Orange  100  µg/ml dan  Acriflavine  250  µg/ml  menunjukkan  trend  menurun dari T0 sampai T72 jam.
Fluoresensi  dihasilkan  oleh  protein  emGFP  yang memancarkan  cahaya  hijau  pada  gelombang  508  nm. Ketika  diberikan  perlakuan  agen  curing  dan  plasmid prSET  berhasil  ter- curing menyebabkan  fluoresensi berkurang  seiring  waktu  perlakuan  agen  curing meningkat. Trend Fluoresensi yang berkurang menandakan bahwa ekspresi protein emGFP berkurang.
Dari  grafik  juga  dapat  terlihat  bahwa  kultur E.coli pRSET-emGFP  yang  diberi  perlakuan  Acridine  Orange 50  dan  100  ug/mL  menghasilkan  fluoresensi  yang fluktuatif  pada  T0  sampai  T48  dengan  trend  menurun lambat,  kemudian  mengalami  penurunan  yang  signifikan dan konstan dari awal T48 menghasilkan nilai fluoresensi
lebih  rendah  sampai  T72.  Dapat  dilihat  pada  Tabel  1, Kultur E.  coli pRSET-emGFP  yang  diberi  perlakuan acriflavine  250  ug/mL  menghasilkan  nilai  fluoresensi lebih  tinggi  pada  T0,  yang  menurun  dengan  lambat sampai  T48,  dimana  penurunan  lebih  signifikan  sampai T72.  Hasil  fluoresensi  T0  dari  perlakuan  acriflavine  125 ug/mL  berfluktuasi  sampai  T48  dimana  hasil  mengalami penurunan  drastis  sampai  T72.  Ini  dapat  menjelaskan bahwa  kedua  agen  curing  yang  dipakai  beraktivasi  pada waktu yang bersamaan (48 jam).
Pada  T0  diamati  bahwa  nilai  fluoresensi  antara perlakuan Acridine Orange dan Acriflavine berbeda jauh. Ini  merupakan  sebuah  kejanggalan  yang  tidak  sesuai ekspektasi,  karena  pada  T0  seharusnya  nilai  fluoresensi mirip  karena  baru  mulai  perlakuan.  Hal  ini  dapat  terjadi karena kesalahan dari peneliti berupa aktivasi kultur yang tidak  sama  jumlahnya.  Pada  agen  curing  AO  diperoleh jumlah  kultur  yang  lebih  sedikit  dibandingkan  dengan acriflavine  sehingga  berpengaruh  pada  jumlah  pRSET- emGFP  yang  juga  semakin  sedikit  sehingga  fluoresensi yang  terdeteksi  jauh  lebih  rendah  dibandingkan  dengan agen curing acriflavine.
Tabel 1. Fluorosensi terhadap waktu pemaparan agen curing dari E. coli pRSET-emGFP AO 50 AO 100 Acriflavine 250 Acriflavine 125 Day 1 T-0 29600 48100 278333.3333 236333.3333 Day 1 T-24 33833.3333 29100 253666.6667 261000 Day 2 T-48 27466.6667 20900 213666.6667 252000 Day 3 T-72 5.69E+03 1.74E+03 12266.66667 12433.33333
Gambar 3. Fluoresensi terhadap waktu pemaparan agen curing dari E.coli pRSET-emGFP
Tabel 2. Absorbansi terhadap waktu pemaparan agen curing dari E. coli pRSET-emGFP AO 50 AO 100 Acriflavine 250 Acriflavine 125 Day 1 T-0 1.53E-01 2.25E-01 1.22E-01 1.18E-01 Day 1 T-24 4.33E-01 6.29E-01 2.19E-01 2.31E-01 Day 2 T-48 3.94E-01 2.43E-02 5.01E-02 6.73E-02 Day 3 T-72 6.39E-01 2.76E-01 5.43E-01 3.73E-01
https://doi.org/10.51967/tanesa.v23i2.1041 © 2022 Politeknik Pertanian Negeri Samarinda
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License CC-BY
Gambar 4. Absorbansi terhadap waktu pemaparan agen curing dari E. coli pRSET-emGFP
Berdasarkan  data  yang  didapatkan  dari  Tabel  2  dan Gambar 4, terlihat absorbansi dari E. coli pRSET-emGFP yang  diberikan  perlakuan  Acridine  Orange  dengan konsentrasi  100  mikrogram/mL  mengalami  kenaikan pada  hari  pertama,  dan  mengalami  penurunan  drastis  di hari  kedua,  dan  mengalami  kenaikan  kembali  pada  hari ketiga.  Pada  E.  coli  pRSET-emGFP  yang  diberikan perlakuan  Acridine  Orange  50  mikrogram/mL  terlihat absorbansi  mengalami  kenaikan  pada  hari  pertama, kemudian mengalami sedikit penurunan pada hari kedua, dan  kembali  naik  pada  hari  ketiga.  Pada  E.  coli  pRSET- emGFP yang diberikan dan Acriflavine 250 mikrogram/mL  dan  Acriflavine  125  mikrogram/mL, absorbansi  mengalami  kenaikan  pada  hari  pertama, mengalami  penurunan  pada  hari  kedua,  dan  mengalami kenaikan  pada  hari  ketiga  dengan  konsentrasi  250 mikrogram/mL  memiliki  absorbansi  yang  lebih  tinggi dari konsentrasi 125 mikrogram/mL.
Nilai  absorbansi  menunjukkan  jumlah  sel  dalam kultur.  Absorbansi  dihitung  pada  OD  600  nm  yang digunakan  untuk  menghitung  konsentrasi  total  dari bakteri  dan  sel  lainnya.  Metode  kuantifikasi  ini menyebabkan  kerusakan  minimal  terhadap  kultur  dan tidak menghambat pertumbuhan (Mandelstam & McQuillen,  1968).  Absorbansi  ini  dihitung  dari  kultur yang  ditumbuhkan  pada  medium  LB+ampisilin,  yang memastikan  bahwa  jumlah  sel  yang  terhitung  hanya
organisme E.coli yang  mengandung  plasmid  pRSET- emGFP, yang bersifat resisten terhadap agen antimikrobial ampisilin dalam medium.
Data  pengamatan  menunjukkan  bahwa  perlakuan agen  curing  Acridine  Orange  50  µg/ml,  100  µg/ml, Acriflavine 125 µg/ml, dan 250 µg/ml semua mengalami peningkatan  dari  T0  sampai  T24  jam,  menurun  dari  T24 sampai  T48,  kemudian  menunjukkan  kenaikan  lagi  pada T48 sampai T72. Ini dapat diinterpretasikan sebagai agen curing  belum  bekerja  dengan  efisien  terhadap E.  coli pRSET-emGFP pada waktu 24 jam sehingga E. coli dapat meningkat  jumlah,  yang  menaikkan  nilai  absorbansi. Agen  curing  baru  menunjukkan  hasil  curing  yang signifikan  pada  T=48  jam,  mengurangi  jumlah E.  coli, menurunkan nilai absorbansi.
Kenaikan  nilai  absorbansi  pada  T=72  jam  dapat menandakan  terbentuk  organsime E.coli yang  dapat bertahan  hidup  dalam  kehadiran  agen  curing,  sehingga absorbansi  sel  dapat  naik.  Ini  dapat  dibuktikan  dengan nilai  fluoresensi  menurun  pada  T=72  jam,  pengurangan ekspresi protein dari E. coli pRSET-emGFP menandakan bahwa E.  coli plasmid  pRSET-emGFP  tetap  menurun, dan  jumlah  sel  yang  meningkat  pada  T72  merupakan organisme E. coli yang resisten terhadap agen curing, tapi tidak mengandung plasmid emGFP.
Tabel 3. Fluorosensi/absorbansi terhadap waktu pemaparan agen curing dari E. coli pRSET-emGFP AO 50 AO 100 Acriflavine 250 Acriflavine 125 Day 1 T-0 1.93E+05 2.14E+05 2.28E+06 2.00E+06 Day 1 T-24 7.81E+04 4.63E+04 1.16E+06 1.13E+06 Day 2 T-48 6.98E+04 8.61E+05 4.26E+06 3.75E+06 Day 3 T-72 8.90E+03 6.29E+03 2.26E+04 3.33E+04
Gambar 5. Fluoresensi/absorbansi terhadap waktu pemaparan agen curing dari E.coli pRSET-emGFP
Berdasarkan  pengamatan  yang  dilakukan  pada  Tabel  3 dan  Gambar  5,  perlakuan  menggunakan  agen  curing Acridine  Orange  pada  konsentrasi  50  tidak  mengalami fluoresensi  pada  3  hari  pengamatan.  Berbeda  dengan variasi  konsentrasi  AO  100  yang  mengalami  fluoresensi pada  perlakuan  day  2  pada  waktu  T0  yang  dapat  dilihat pada  grafik.  Namun  tren  ini  menurun  setelah  day  2  T48 dan  menjadi  tidak.  Berfluoresensi  setelah  day  3  dan  di T0.  Untuk  menghitung  %curing,  kami  menghitung  nilai fluoresensi  (T0-T24)  /  T0  ×100%  dari  Day  1  sampai  3, dan dihitung rata-rata. Data yang didapatkan menunjukkan bahwa nilai % curing dari perlakuan AO 50 sebesar  9.52%,  AO  100  sebesar  44.2%,  Acriflavine  250 sebesar  10.4%,  dan  Acriflavine  125  sebesar  0.836%. Nilai  %curing  dari  paling  besar  sampai  paling  kecil berurut  sebagai  berikut:  AO  100  >Acri  250  >  AO  50  > Acri 125.

## V. K ESIMPULAN
Laju  kehilangan  plasmid  per  generasi  yang  didapatkan dengan menggunakan pengukuran aktivitas reporter GFP pada  model E.  coli rekombinan  yang  diberi  agen  curing Acridine  Orange adalah  sebesar  9.52%  untuk  perlakuan AO 50 dan sebesar 44.2% untuk AO 100. Sedangkan laju kehilangan  plasmid  per  generasi  yang  didapatkan menggunakan  pengukuran  aktivitas  reporter  GFP  pada model E.  coli rekombinan  yang  diberi  agen  curing Acriflavine adalah  sebesar  10.4%  untuk Acriflavine 250, dan  sebesar  0.836%  untuk Acriflavine 125.  Perlakuan Acridine  Orange lebih  efektif  daripada  perlakuan Acriflavine terhadap  plasmid  curing E.  coli rekombinan pRSET-EmGFP.

## D AFTAR P USTAKA
Biologics  International  Corp.  2018. IPTG  Induction Theory. https://www.biologicscorp.com/blog/iptg- induction-protein-expression: Diakses pada 12/05/2022 pk. 15:02 WIB Brejc,  K.,  Sixma,  T.  K.,  Kitts,  P.  A.,  Kain,  S.  R.,  Tsien,
R.  Y.,  Ormö,  M.,  &  Remington,  S.  J.  (1997).
Structural basis for dual excitation and
photoisomerization  of  the  Aequorea  victoria  green fluorescent  protein.  Proceedings  of  the  National Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of America, 94(6), 2306–2311.
Byvaltsev,  Vadim  A.;  Bardonova,  Liudmila  A.;  Onaka, Naomi  R.;  Polkin,  Roman  A.;  Ochkal,  Sergey  V.; Shepelev,  Valerij  V.;  Aliyev,  Marat  A.;  Potapov, Alexander A.  (2019). Acridine Orange:  A Review of Novel  Applications  for  Surgical  Cancer  Imaging  and Therapy. Frontiers in Oncology, 9(), 925–.
Couturier, M. A. R. T. I. N. E., Bex, F., Bergquist, P. L., & Maas,  W.  K.  (1988).  Identification  and  classification of bacterial plasmids. Microbiological reviews , 52(3), 375-395.
Das, T., Chakraborty, B., & Ray, R. (2017). In-Vitro Study on Potential Efficacy of Acriflavine in the Prevention of  Conjugational  Transfer  of  Drug  Resistance  in Bacteria. J. Evol. Med. Dent. Sci , 6 , 5540-5547 Invitrogen. (2010). pRSET/CFP, pRSET/EmGFP, pRSET/BFP  Vectors  User  Manual.  Available  from https://assets.thermofisher.com/TFS- Assets/LSG/manuals/prsetfpvectors_man.pdf Kowalska-Krochmal, B., & Dudek-Wicher, R. (2021). The Minimum  Inhibitory  Concentration  of  Antibiotics:
Methods, Interpretation, Clinical Relevance. Pathogens (Basel, Switzerland), 10(2), 165. https://doi.org/10.3390/pathogens10020165.
MacWilliams  MP,  Liao  MK.  2006.  Luria  Broth  (LB)  and Luria  Agar  (LA)  Media  and  Their  Uses  Protocol.
American Society for Microbiology.
www.asmscience.org:  Diakses  pada  12/05/2022  pk.
0:02 WIB
Mandelstam,  J.,  &  McQuillen,  K.  (1968).  Biochemistry  of bacterial  growth.  Biochemistry  of  bacterial  growth. Parker N. 2012. Microbiology. Openstax: p.568-570
Persinoti,  G.  F.,  Peres,  N.  T.  A.,  Jacob,  T.  R.,  Rossi,  A., Vencio, R. Z. dan Martinez-Rossi, N. M. 2014. RNA- sequencing analysis of Trichophyton rubrum Transcriptome  in  Response  to  Sublethal  Doses  of Acriflavin. BioMed Central. 15(7).
Rozwandowicz,  M.,  Brouwer,  M.  S.  M.,  Fischer,  J., Wagenaar,  J.  A.,  Gongalez-Zorn,  B.,  Guerra,  B., Mevius,  D.  J.,  Hordijk,  J.  (2018).  Plasmids  carrying antimicrobial  resistance  genes  in Enterobacteriaceae ,
Journal  of  Antimicrobial  Chemotherapy ,  73  (5),
1121–1137.
Trevors,  J.  T.  (1986).  Plasmid  curing  in  bacteria. FEMS microbiology reviews , 1(3-4), 149-157.
Villagra,  Nicolás  &  Hidalgo,  Alejandro  &  Santiviago, Carlos  &  Saavedra,  Claudia  &  Mora-Longa,  Guido. (2008).  SmvA,  and  not  AcrB,  is  the  major  efflux pump  for  acriflavine  and  related  compounds  in Salmonella  enterica  serovar  Typhimurium.  The Journal  of  antimicrobial  chemotherapy.  62.  1273-6. 10.1093/jac/dkn407.
Yektaeian,  N.,  Mehrabani,  D.,  Sepaskhah,  M.,    Zare,  S., Jamhiri,  I.,  Hatam,  G.    (2019). "Lipophilic  tracer  Dil and  fluorescence  labeling of acridine orange used for Leishmania major tracing in the fibroblast cells". Heliyon . 5 (12): e03073.
0,00E+00 1,00E+06 2,00E+06 3,00E+06 4,00E+06 5,00E+06 Day 1 T0 Day 1 T24 Day 2 T48 Day 3 T72 Fluoresensi/Absorbansi AO 50 AO 100 ACRI 250
ACRI 125