dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016

## ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI PROTEOLITIK LOKAL YANG BERPOTENSI DALAM EKSTRAKSI KOLAGEN DARI SISIK IKAN
GABUS ( Channa striata )
Sugireng
Program Magister Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang
e-mail: sugireng92@gmail.com
Abstrak – Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  untuk  menemukan  bakteri proteolitik  yang  berpotensi  menghasilkan  enzim  protease  yang  dapat diaplikasikan  dalam  proses  ekstraksi  kolagen  dari  sisik  ikan  Gabus ( Channa  striata ).  Isolat  bakteri  proteolitik  diisolasi  dengan  metode  tuang menggunakan  media Skim  Milk  Agar (SMA).  Isolat  bakteri  proteolitik diseleksi berdasarkan aktivitas kualitatif dan kuantitatif serta uji patogenitas untuk  mendapatkan  bakteri  yang  berpotensi  menghasilkan  protease  yang dapat  diaplikasikan  dalam  proses  ekstaksi  kolagen  dari  sisik  ikan  gabus ( Channa  striata ).  Hasil  penelitian  menunjukkan  11  isolat  bakteri  yang memiliki kemampuan proteolitik secara kualitatif. Hasil seleksi berdasarkan uji  patogenitas  dan  kuantitatif  dihasilkan  3  isolat  yang  memiliki  aktivas protease  tertinggi  dan  tidak  bersifat  patogen  yaitu  SB38  (658,3  U/mL), SB16  (618,3  U/mL)  dan  SB23  (613,8  U/mL).  Berdasarkan  data  tersebut, ketiga  isolat  bakteri  tersebut  sangat  potensial  digunakan  dalam  proses ektraksi kolagen sisik ikan gabus ( Channa striata ).
Kata kunci: Bakteri, Protease, Kolagen, Sisik ikan
Abstract – The purpose of study were to find potential proteolytic bacteria produce  protease  enzymes  which  can  be  applied  in  the  process  of extracting  collagen  from  snakehead    fish  scale  ( Channa    striata ). Proteolytic  bacterial  isolates  were    isolated  by  by  the  pour  plate    method using Skim  Milk  Agar (SMA).  Proteolytic  bacterial  isolates  were  selected based on qualitative and quantitative activity and pathogenity test to get a bacteria that could potentially produce proteases that can be applied in the process  of  collagen  from  snakehead    fish  scale  ( Channa  striata ).  Results showed 11 bacterial isolates that have the ability to qualitatively proteolytic. Result  selection  based  on  pathogenity  test  and  quantitative  showed  3 isolates  have  highest  protease  activaties  and  nonpathogenic.This  are SB38  isolates  (658.3  U  /  mL),  SB16  isolates  (618.3  U  /  mL)  and  SB23 isolates (613.8  U  /  mL).  Based on  this  data,  three  isolates  of  bacteria  are potentially used in the extraction process of collagen snakehead  fish scale ( Channa striata ).
Keywords: Bacteria, Protease, Collagen, Fish scale
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454,  Oktober, 2016
dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016

## PENDAHULUAN
Kolagen merupakan protein penghubung jaringan
yang banyak  digunakan  sebagai  aditif pada  makanan,  biomedis,  farmasi dan  kosmetik.  Kolagen  adalah salah satu biomaterial yang paling berguna karena memiliki biokompatibilitas yang sangat baik dan  antigenisitas  lemah  (Lee et al .,  2009).  Sumber  kolagen  dari sisik  ikan  merupakan  salah  satu alternatif yang menjanjikan karena sebagian  besar  berat  badan  ikan terutama  sisik  akan  dibuang.
Sumber kolagen pada ikan banyak  terdapat  pada  kulit  dan sisiknya. Sisik ikan banyak mengandung  senyawa  organik antara  lain  protein  sebesar  41- 84%  berupa  kolagen  (Silva et  al. , 2014).  Pembuatan  kolagen  dari sisik  ikan  dapat  dilakukan  melalui ekstraksi secara
enzimatis.
Ekstraksi  enzimatis  ini  memiliki
beberapa keunggulan dibandingkan  dengan  ekstraksi konvensional,  diantaranya  adalah tidak menggunakan solvent organik, sehingga dampaknya
terhadap lingkungan minimal,
kolagen  yang  dihasilkan  aman untuk  konsumsi  manusia  karena tidak  mengandung  bahan  kimia.
Proses  ekstraksi  enzimatis  ini enzim  yang  digunakan  adalah enzim  protease  yang  berfungsi memecah protein (Hartati, 2010).
Protease merupakan salah  satu  enzim  yang  banyak
dimanfaatkan  untuk  kepentingan komersial.  Protease  merupakan enzim yang mampu menghidrolisis ikatan peptida
pada  substrat  protein.  Enzim protease  dikelompokkan  dalam kelas  hidrolase  karena  didalam aktivitasnya  membutuhkan  H 2 O
(Pant et al. , 2015).
Enzim  protease  secara fisiologis diperlukan oleh organisme  untuk  hidup  sehingga protease dapat diisolasi dari berbagai sumber, seperti tanaman, hewan dan mikroorganisme. Namun, protease
dari  sumber  mikroba  lebih  disukai di  sektor  industri  karena  enzim dari  mikroba  memiliki  hampir
semua
karakteristik yang
dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016
diinginkan untuk
aplikasi
bioteknologi. Kebanyakan
protease komersial diproduksi dari bakteri  proteolitik,  terutama  yang bersifat  netral  dan  basa.  Bakteri- bakteri  tersebut  termasuk  ke dalam  genus Bacillus diantaranya
B.macerans,  B.licheniformis, dan
B.subtilis .  Bakteri Bacillus adalah produsen yang baik untuk
menghasilkan
protease
ekstraseluler  karena  ketahanan mereka  pada  suhu  tinggi  dan rentang  pH  yang  luas  (Olajuyigbe & Ajele, 2005).
Bakteri Bacillus
yang
bersifat  proteolitik  dapat  diisolasi
dari tanah pengolahan ikan. Tempat pengolahan ikan menghasilkan limbah yang berasal  dari  pencucian  ikan  dan perebusan ikan. Limbah pengolahan  ikan  ini  mengandung protein yang cukup tinggi
sehingga  diharapkan  mendapat bakteri  lokal  dengan  aktivitas proteolitik  yang  tinggi  dan  dapat diaplikasikan dalam ekstraksi kolagen dari sisik ikan.

## METODE PENELITIAN
Bahan dan Alat Bahan
yang digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  media SMA  ( Skim  milk  Agar )  untuk proses  isolasi  dan  seleksi  bakteri proteolitik. Alat-alat digunakan
dalam  penelitian  ini  yaitu laminar air-flow , autoklaf, inkubator,
cawan petri dan jangka sorong.
Isolat  bakteri  diisolasi  dari  tanah tempat pengolahan  ikan di pantai Sendang  Biru  Kabupaten  Malang,
Jawa Timur. Bakteri yang berhasil
diisolasi  diseleksi  berdasarkan kemampuannya dalam menghidrolisis protein dalam susu. Gambar  1.  Lokasi  Pengambilan Sampel (TPI Sendang Biru, Kab.Malang) Isolasi Bakteri Proteolitik Sumber isolat yang digunakan pada penelitian berasal dari tanah sekitar tempat pengolahan ikan di Pantai
dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016
Sendang Biru, Kabapaten Malang,
Jawar  Timur.  Sampel  tanah  yang diambil yaitu tanah yang berada di dekat pembuangan limbah pengolahan    ikan.  Selanjutnya,
sampel yang telah diperoleh dibawa ke Laboratorium
Mikrobiologi untuk diisolasi bakteri proteolitiknya.  Bakteri  proteolitik diisolasi  dengan  menggunakan metode  tuang  ( pour  plate) pada media Skim  Milk  Agar (SMA).
Kemudian,  diinkubasi  selama  24- 48 jam (Lay, 1994). Koloni bakteri yang  membentuk  zona  bening  di sekitar koloni dimurnikan kemudian  disimpan  pada  agar slant sebagai  stok  isolat  bakteri
proteolitik
untuk pengujian selanjutnya. Screening Isolat Bakteri proteolitik  sebagai  Penghasil Protease Isolat terbaik dipilih berdasarkan  uji  patogenitas  dan uji aktivitas enzim secara kuantitatif. Uji patogenitas
dilakukan untuk membedakan
bakteri yang bersifat patogen atau non-patogen.  Isolat  bakteri  diuji
dengan  cara  digoreskan  pada media agar darah kemudian diinkubasi  selama  24  jam  pada
suhu 37° C. Isolat dengan aktivitas gamma-hemolisis atau tidak  terbentuknya  zona  bening  di
sekitar  koloni  mengindikasikan
bahwa isolat tersebut non- patogen  (Lay,  1994).  Isolat  yang
non-patogen digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim. Aktivitas  enzim  protease  diukur menggunakan supernatan
sebanyak  500  μL  ditambahkan dengan  500  μL  substrat  μL  (2  % kasein  dalam  0,05  M  buffer  fosfat pH  7).  Suspensi  diinkubasi  pada suhu  37  ºC  selama  10  menit, kemudian  ditambah  1  ml  0,4  M asam  trikhloroasetat  (TCA)  dan didiamkan  selama  30  menit  pada suhu ruang. Larutan disentrifugasi dengan  kecepatan  4000  rpm selama  15  menit  pada  suhu  4  ºC.
Supernatan ( crude enzyme ) diambil 1 ml kemudian
dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi  dan  diencerkan  dengan Tris  HCl  hingga  total  volume menjadi  2  ml.  Larutan  diukur absorbansinya pada panjang
dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016
gelombang  275  nm.  Nilai  aktivitas protease  diukur  dari  kadar  tirosin berdasarkan  pada  kurva  baku tirosin dengan konsentrasi 10-200 ppm (Badriyah & Ardyati, 2013).

## Isolasi  dan  Seleksi  Bakteri Proteolitik
Isolasi  bakteri  proteolitik dilakukan  dengan  metode pour plate menggunakan medium
selektif  yaitu  SMA  ( Skim  Milk
Agar) . diinkubasi  pada  suhu  37 o C selama  24-48  jam.  Setelah  masa inkubasi,  indikasi  bahwa  bakteri yang  tumbuh  merupakan  bakteri proteolitik    dapat  dilihat  melalui isolat  yang  tumbuh  dengan  baik dan memiliki zona bening disekitar koloni.  Isolat  proteolitik  yang diperoleh  dipurifikasi  dengan  cara reisolasi untuk memastikan kemurnian kultur. Isolat yang telah dimurnikan  kemudian  disimpan pada  agar slant sebagai  stok isolat untuk pengujian selanjutnya.
Uji  Aktivitas  Proteolitik  Secara Kualitatif
Uji  proteolitik  atau  uji
kualitatif dilakukan dengan menumbuhkan  isolat  bakteri  pada
media  SMA  ( skim  milk  agar )  2  % dengan  metode  cakram  dengan empat  kali  ulangan.  Kemudian, diinkubasi selama 24-48 jam pada
suhu  37°  C.  Zona  bening  di sekitar koloni bakteri mengindikasikan hasil positif menghasilkan enzim protease (Abdelnasser dkk., 2015). Aktivitas proteolitik dapat diketahui dengan rumus berikut. Aktivitas Proteolitik = Diameter zona bening – Diameter koloni bakteri

## Uji Patogenitas
Uji  patogenitas  dilakukan untuk  membedakan  bakteri  yang
bersifat patogen atau non- patogen. Isolat bakteri diuji dengan  cara  digoreskan  pada media  agar  darah  dan  diinkubasi selama  24  jam  pada  suhu  37°  C.
Isolat  dengan  aktivitas gamma- hemolisis (tidak  terbentuk  zona bening di sekitar koloni) mengindikasikan bahwa isolat tersebut non-patogen (Lay, 1994). Isolat yang non-patogen digunakan untuk pengujian
selanjutnya.
dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016

## Uji  Aktivitas  Enzim  Protease secara Kuantitatif
Pengukuran
aktivitas
protease  dilakukan  pada  isolat
bakteri yang memilki indeks proteolitik tertinggi. Aktivitas enzim protease  diukur  menggunakan supernatan  sebanyak  500  μL ditambahkan  dengan  500  μL substrat  μL  (2  %  kasein  dalam 0,05  M  buffer  fosfat  pH  7).
Suspensi diinkubasi pada suhu 37
ºC  selama  10  menit,    kemudian ditambah  1  ml  0,4  M  asam trikhloroasetat (TCA) dan didiamkan  selama  30  menit  pada suhu ruang. Larutan disentrifugasi dengan  kecepatan  4000  rpm selama  15  menit  pada  suhu  4  ºC.
Supernatan ( crude enzyme ) diambil 1
ml kemudian dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi  dan  diencerkan  dengan Tris  HCl  hingga  total  volume menjadi  2  ml.  Larutan  diukur absorbansinya pada panjang
gelombang  275  nm.  Nilai  aktivitas protease  diukur  dari  kadar  tirosin berdasarkan  pada  kurva  baku tirosin dengan konsentrasi 10-100 ppm  (Badriyah  &  Ardyati,  2013). Satu  unit  protease  didefinisikan sebagai  sejumlah  enzim  yang dibutuhkan  untuk  menghasilkan  1 µmol  tirosin  tiap  menit  dengan substrat  kasein  (Enggel  dkk., 2004).

## HASIL DAN DISKUSI
Screening Bakteri Proteoitik Secara Kualitatif
Seleksi bakteri dilakukan
berdasarkan  aktivitas  proteolitik pada  media  SMA.  Sebanyak  20 isolat bakteri yang berhasil diisolasi  dari  tanah  pengolahan ikan diuji kemampuannya menghidrolisis protein skim secara kualitatif. Berdasarkan hasil pengujian hidrolisis protein secara kualitatif  diperoleh  11  isolat  yang memiliki kemampuan proteolitik.
dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016 a b cd a a ef a a f a d f b bc a ef c e a a 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 SB 1 1 SB 1 2
S B 1 3
S B 1 4
S B 1 5
S B 1 6
S B 2 1
S B 2 2
S B 2 3 S B 2 4 S B 3 1 S B 3 2 S B 3 3 S B 3 4 S B 3 5 S B 3 6 S B 3 7 S B 3 8 S B 3 9 S B 3 1 0 Inde k s Prot e ol it ik Isolat Bakteri Indeks Proteolitik Gambar 2 . Hasil Screening Isolat Bakteri Proteolitik
Berdasarkan hasil isolasi menggunakan  media skim  milk agar diperoleh  sebanyak  20  isolat bakteri.  Namun,  dari  20  isolat tersebut  dihasilkan  11  isolat  yang
memiliki kemampuan
menghasilkan enzim protease secara  kualitatif  yaitu  isolat  SB11, SB33,  SB34,  SB37,  SB13,  SB31, SB38,  SB36,  SB16,  SB32  dan SB23  (Gambar  2).  Isolat  bakteri
yang
memiliki kemampuan proteolitik  diindikasikan  dengan adanya  zona  jernih  di  sekeliling bakteri  yang  ditumbuhkan  pada media skim agar. Zona jernih yang
terbentuk  mengindikasikan  bahwa
isolat  bakteri  yang  ditumbuhkan
pada media tersebut menggunakan  protein  skim  yang terdapat pada media untuk pertumbuhannya sehingga protein di  sekeliling  koloni  habis  terpakai (Lay,  1994).  Hasil  perombakan polimer  protein  hanya  ditunjukkan dengan  adanya  zona  jernih  yang
menandakan protein telah dirombak menjadi senyawa peptide  dan  asam  amino  yang
sifatnya  terlarut  dalam  media,
sehingga  kekeruhan  di  sekeliling koloni
akan terhidrolisis
(Pakpahan, 2009).
dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016

## Patogenitas Bakteri Proteolitik
Isolat bakteri yang memiliki  kemampuan  proteolitik diuji melalui patogenitasnya menggunakan  media  BAP  ( Blood
Agar Plate ).
Gambar  3.  Hasil  uji  patogenitas isolat bakteri proteolitik pada Media  Blood  Agar (BAP) 48 jam. Berdasarkan  hasil  uji patogenitas 11 isolat bakteri proteolitik diperoleh 5 isolat
(SB12,  SB16,  SB23,  SB34  dan SB38) yang tidak bersifat patogen
(Gambar 3). Kelima isolat tersebut tidak  menunjukkan  adanya  zona bening  di  sekitar  koloni  setelah masa  inkubasi  selama  24  jam.
Bakteri  yang  tidak  membentuk
zona  bening  pada  media blood agar termasuk dalam jenis hemolisis ɣ,  yaitu  bakteri  tidak mampu menghemolisis dan
bereaksi  dengan  sel  darah  merah
(Egwuatu  dkk,  2014).  Dengan demikian,  tidak  adanya  reaksi terhadap  sel  darah  merah  maka dapat  dipastikan  isolat  tersebut
dapat  diaplikasikan  dalam  proses ektraksi kolagen dan aman dikonsumsi manusia.

## Hasil Screening Bakteri sebagai Penghasil Protease
Isolat  bakteri  proteolitik  non patogen tersebut diseleksi berdasarkan aktivitas enzim protease  secara  kuantitatif  pada media skim cair. Aktivitas
proteolitik pada media cair,
dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016 a b b b b 0 100 200 300 400 500 600 700 800 SB12 SB16 SB23 SB34 SB38 A k tiv it a s E n zim ( u /m l) Isolat Bakteri Aktivitas Enzim Protease dilakukan berdasarkan kemampuannya membebaskan tirosin. Satu unit aktivitas protease
didefinisikan sebagai jumlah enzim  yang  dibutuhkan  untuk membebaskan  satu ɥmol  tirosin per menit (Pant dkk., 2015).
Gambar  4.  Aktivitas  protease.  a) kualitatif, b) kuantitatif
Berdasarkan  hasil  pada Gambar  4b  dihasilkan  4  isolat
bakteri  proteolitik  yang  memiliki aktivitas  protease  yang  tidak berbeda secara
signifikan
( p> 0,05)  yaitu  isolat  SB38  (658,3
U/ml),  SB16  (618,3  U/ml),  SB23
(613,8  U/ml),  SB34  (595,5  U/ml)
dan isolat dengan aktivitas terendah  yaitu  isolat  SB12  (425 U/ml). Hal ini menunjukkan bahwa kelima  isolat  tersebut  mampu melepaskan  tirosin  selama  masa inkubasi.  Tirosin  merupakan  hasil dari aktivitas enzim protease yang dihasilkan  oleh  bakteri  dalam penguraian  substrat  protein  yang terdapat di media pertumbuhan.
Aktivitas  protease  isolat SB38,  SB23,  SB16  dan  SB34 lebih  tinggi  dibandingkan  dengan
isolat SB12. Hal tersebut disebabkan karena
masing-
masing  jenis  bakteri  memiliki kondisi  optimum  yang  berbeda- beda  dan  juga    dipengaruhi  oleh faktor  lingkungan  yang  berbeda saperti  suhu,  pH,  konsentrasi enzim dan substrat. Setiap bakteri bakteri  memilki  suhu  dan  pH optimum  dalam  pertumbuhannya.
Pengaruh  suhu  pertumbuhan,  pH media  dan  aerasi  merupakan
dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016
parameter penting yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri dan produksi enzim protease (Pathak dkk., 2012).
Suhu  dan  pH    sangat mempengaruhi  aktivitas  enzim pada  waktu  mengkatalisis  suatu reaksi.    Peningkatan  suhu    dan pH      yang  melebihi  kondisi optimumnya menyebabkan lemahnya  ikatan  di  dalam  enzim secara  structural  (Ibrahim  dkk.,
2015). Tiga isolat bakteri proteolitik  yang  memiliki  aktivitas protease  tertinggi  yaitu  SB16,
SB23  dan  SB38  akan  digunakan untuk uji selanjutnya dalam proses ekstraksi kolagen dari sisik ikan gabus.

## KESIMPULAN
1. Sebelas  isolat  bakteri  yang diisolasi dari tempat pengolahan ikan memiliki
aktivitas proteolitik.
2. Isolat  SB16,  SB23  dan  SB38 memiliki  aktivitas  protease tertinggi  dan  tidak  patogen yang  dapat  digunakan  dalam
proses ekstraksi kolagen
sisik ikan gabus.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdelnasser,  S.S.I.,  Ali,  A.A.S., Yahya,  B.  E.,  Mohamed, E. M.A. and Shebl, S.S.I.,  2015,  Production of  Extracellular  Alkaline Protease by New Halotolerant  Alkaliphilic Bacillus sp.  NPST-AK15 Isolated from Hyper Saline Soda Lakes, Electronic Journal of Biotechnology 18:236 – 243. Badriyah,  B.I.  dan  Ardyati,  T., 2013,  Deteksi  Aktivitas Proteolitik  Isolat  Bakteri
Asal  Ampas  Tahu  pada Substrat  Bekatul, Jurnal Biotropika 1(3): 109-113. Egwuatu,  T.O.,  Ogunsola,  F.T.,
Okodugha, I.M., Jide, B., Arewa, D.G., Osinupebi, O.A.,    2014,  Effect  of Blood Agar from Different  Animal  Blood on  Growth  Rates  and Morphology  of  Common Pathogenic Bacteria, Advances in Microbiology 4:  1237- 1241. Hartati, I. dan Kurniasari, L., 2010, Kajian  Produksi  Kolagen dari  Limbah  Sisik  Ikan Secara Ekstraksi Enzimatis, Momentum 6(1): 33 – 35. Lay. W.B., 1994, Analisis Mikroorganisme di Laboratorium,  PT.  Raja Grafindo Persada, Jakarta.
Lee,  K.,  Park,  H.Y.,  Kim,  Y.K., Park,  J.I.  and  Yoon,
dalam Ekstraksi Kolagen dari Sisik Ikan Gabus ( Channa striata )
Sugireng, Biowallacea, Vol. 3 (2), Hal : 444-454 ,  Oktober, 2016
H.D.,  2009,  Biochemical Characterization of Collagen from the Starfish Asterias amurensis,  Journal  of the  Korean  Society  for Applied Biological Chemistry 52(3):221- 226. Olajuyigbe,  F.M.  and    Ojele,  J.O., 2005, Production Dynamics of Extracellular Protease from Bacillus Species, African Journal of Biotechnology 4:776- 779. Pakpahan, R, 2009, Isolasi Bakteri  dan  Uji  Aktivitas Protease  Termofilik  dari Sumber Air Panas Sipoholon Tapanuli Utara  Sumatera  Utara . Tesis Sekolah Pascasarjana USU. Medan. Pant,  G.,  Prakash,  A.,  Pavani, J.V.P., Bera, S., Deviram, G.V.N.S., Kumar,  A.,  Panchpuri, M.  and  Prasuna,  R.G., 2015, Production, Optimization  and  Partial Purification  of  Protease from Bacillus  subtilis. Journal of Taibah University  for  Science 9:50 –55. Pathak,  A.P.  and    Deshmukh, K.B., 2012, Alkaline protease production, extraction and characterization from alkaliphilic Bacillus licheniformis  KBDL4:  A Lonar  soda  lake  isolate, Indian Journal of Experimantal Biology 50:569 –76.