## THE SECOND KISS DAN GPR54 : AMPLIFIKASI DAN
SEKUENSING GEN PENYANDI FAKTOR REPRODUKSI IKAN NILA ( OREOCHROMIS NILOTICUS )
Ricky Febrinaldy Simanjuntak
Staff Pengajar Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Borneo Tarakan Jalan Amal Lama No. 1, Tarakan. Kalimanan Utara. 77123 rickfebrinald@engineer.com

## ABSTRACT
Several years ago since it was first found to play a role in metastasis, Kisspeptin (encoded by Kiss1) that has GPR54 cognitive receptors is known to act as a regulator to initiating reproductive  factors,  involving  GnRH  secretion  in  some  vertebrates,  including  fish. However, each of the other vertebrates will express different kinds of Kisspeptin based on the types and its evolutionary line. The aims of this research is to confirm the Kiss2 type along with the GPR54 receptor on Tilapia. RNA isolation, cDNA cloning and DNA amplification was made from samples of tilapia testes. The DNA amplification result will then be sequenced by MACROGEN. Inc. The amplified results of the Kiss2, GPR54 and β-Actin  (positive  control)  genes  observed  using  agarose  gel  electrophoresis  show  the product  size  of  each  gene  is  199  bp,  155  bp  and  197  bp.  Confirmation  of  sequencing results by the BLAST method for Kiss2, GPR54 and β-Actin genes were: 100%, 97% and 100%, respectively. Based on the research, it can be concluded that the results of each target isolated from the gonad of tilapia indicate the homology/similarity of the sample of each target nucleotide sequence with the world database sequence (gene bank).
Keywords: Kiss2, GPR54, Reproduction, Nile Tilapia

## PENDAHULUAN
Sejak  pertama  kali  ditemukan, Kisspeptin (dikodekan  dengan Kiss1 ) dikenal  sebagai metastin ( metastasis suppressor  gene ),  berperan  menekan penyebaran kanker baik kanker
melanoma  maupun  kanker  payudara (Lee,  1996).  Namun  saat  ini, Kiss1 diketahui  berperan  sebagai  regulator dalam  menginisiasi  tingkat  kematangan reproduksi  dengan  melibatkan  sekresi
GnRH ( Gonadothropin Releasing Hormone ),  baik  perkembangan  gonad maupun sex  steroid pada  mamalia  dan vertebrata  lainnya. Kisspeptin bekerja aktif  dengan  cara  berikatan  dengan reseptor  kognitif G-Protein  Couple
Receptor 54  ( GPR54 )  (Messager et  al .,
2005).
Kisspeptin digolongkan  kedalam berbagai  tipe  peptida  pada  vertebrata . Studi  terbaru  menunjukkan  bahwa Kisspeptin diduga  memiliki  pengaruh terhadap  perkembangan  gonad  dan berinteraksi  pada  jalur  metabolisme (Sjahdan et  al .,  2014;  Clarke et  al ., 2015). Peran, Kisspeptin diduga menjadi prekursor  terhadap  tingkat  kematangan reproduksi,  pembentukan  seks  steroid melalui sumbu Hipotalamus – Pituitari – Gonad  (HPG)  serta  metabolisme  energi (Simanjuntak,  2015).  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengkonfirmasi  gen pengkode Kisspeptin pada  ikan  Nila
melalui metode sekuensing dan memberikan informasi terbaru mengenai profil Kisspeptin sebagai  prekursor faktor reproduksi pada golongan ikan.

## METODE PENELITIAN
Ikan  nila  yang  digunakan  adalah ikan nila jantan yang telah matang gonad (± 4 bulan setelah hatching ) dengan berat badan  awal  30±0,2  gr.  Ikan  nila diperoleh  dari  Balai  Benih  Ikan  (BBI) Air Tawar Ciparay, Kabupaten Bandung. Ikan yang akan digunakan diaklimatisasi terlebih  dahulu  selama  2  minggu kemudian  dipelihara  sistem  resirkulasi tertutup  dan  diberi  pakan  2  kali  sehari. Parameter  abiotik  seperti  suhu,  pH, dissolved oxygen (DO) dikontrol selama pemeliharaan.

## Isolasi Gonad Ikan Nila
Isolasi  gonad  ikan  nila  dilakukan dengan  cara  melakukan  pembedahan pada  bagian  perut  sisi  dalam  dengan menggunakan  seperangkat dissecting set . Sebelum dibedah, ikan nila dipingsankan dahulu dengan menggunakan metode cold shock . Testis ikan  nila  yang  di  isolasi  kemudian  di rendam  dalam  larutan  PBS  ( Phospate Buffer Saline ) selama 1 menit sebelum di simpan  didalam liquid  nitrogen hingga sampel gonad siap di isolasi RNA nya.

## Isolasi RNA Total
Isolasi RNA total dari gonad ikan nila dilakukan  dengan  menggunakan Pure  Link  RNA  Mini  Kit  (Ambion) dan dilanjutkan dengan pengukuran kuantitas dan  kualitas  RNA  total.  Pengukuran kuantitas  RNA  total  ini  dilakukan dengan mengukur absorbansi RNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm menggunakan Spektrofotometer ( Ultraspec  2000,  Pharmacia,  Biotech ).
Pengukuran  kualitas  RNA  dilakukan dengan  elektroforesis  gel  agarosa  1.5%
yang mengandung Gel Red dalam larutan buffer  elektroforesis  TAE  ( Tris-Acetate EDTA ). Hasil Elektroforesis menunjukkan  2  larik  gen:  18s  dan  28s RNA  total  bebas  kontaminasi,  tidak terdegradasi  dan  siap  digunakan  untuk sintesis c DNA ( Reverse Trancriptase ).
Kloning cDNA - Reverse Transcriptase -  Polymerase  Chain  Reaction (RT- PCR)
RNA  total  yang  telah  diisolasi  dan diketahui konsentrasinya, kemudian disintesis menjadi c DNA ( complementar y  DNA)  melalui  proses
Reverse Transcription (RT) PCR menggunakan RevertAid tm First  Strand cDNA  Synthesis  Kit ( Thermo  Scientific ) dengan Oligo dT primer 1μl  dan enzim Reverse Trancriptase 1μl. Hasil sintesis cDNA  siap  digunakan  sebagai  template untuk amplifikasi PCR
Amplifikasi  PCR  ( Polymerase  Chain Reaction ) Sebanyak  1μl  template  cDNA
akan di amplifikasi dengan menggunakan Gotaq Green Master Mix
Kit  (Promega) sesuai  protokol  yang berlaku dengan bantuan Thermalcycler T100 ( Bio-Rad ). Penempelan gen target Kiss2 beserta GPR54 dilakukan dengan menggunakan  primer  spesifik  yang didesain  menggunakan  Primer3  Plus berbasis  web  (www.Primer3plus.ut) (Tabel 1)

## Sekuensing Amplikon
Hasil  amplifikasi  PCR  kemudian akan  disekuensing.  Proses  sekuensing dilakukan oleh MACROGEN.Inc
(Korea  Selatan).  Hasil  sekuensing kemudian  akan  di  BLAST  dengan menggunakan BLASTN
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
5 4 3 2 1 6

## Tabel 1. Urutan sekuens primer

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Secara  umum,  profil  amplikon gen target Kiss2 , GPR54 dan β-actin dari bebagai suhu temperatur melting yang di isolasi  dari  testis  ikan  nila  dapat  dilihat pada Gambar 1 dan 2.
Gambar  1.  Elektroforesis  gel  agarosa.
(1). Ladder ;  (2), Kiss2 58 0 C;  (3), Kiss2 59 0 C;  (4), Kiss2 60 0 C;  (5), Kiss2 61 0 C; (6), NTC Gambar  2.  Elektroforesis  gel  agarosa. (1) Ladder ; (2) Actin 58 0 C;
(3) Actin 59 0 C.  (4) Actin
60 0 C,  (5). Actin 61 0 C,  (6) NTC Actin ;  (7) GPR54 59 0 C;  (8) GPR54 60 0 C  (9)
GPR54 63 0 C  (10)  NTC GPR54 ; (11) GPR54 61 0 C
Optimasi  awal temperatur  melting primer didasarkan pada jumlah masing- masing basa nukleotida.
Hasil amplifikasi yang diamati secara kualitatif dengan menggunakan eletroforesis  gel  agarosa  menunjukkan bahwa,  amplikon  yang  diduga  gen Kiss2 , GPR54 dan β-Actin teramplifikasi  di  masing-masing  suhu uji.  Dimana, gen Kiss2, GPR54 dan β-
Sekuens Primer Product Size Kiss2 199 bp F: 5’CTACTGGCTTTGGCTGTGG- R: 5’-CTGCTCCTGTTGCATGTGTT- GPR54 155 bp F:  5’-GATGGTGGTAGTGATTGTGCTT- 3’ R: 5’-CAGAGGAGTTGGCGTAGGA-3’ β-Actin 197 bp F: 5’-AGCATCCCGTCCTGCTCACA-3’ R:  5’-AGCACAGCCTGGATGGCAAC- 3’ 1 2 3  4  5 6 7 8  9  10  11
Actin yang  berhasil  teramplifikasi memiliki product size berturut-turut 199 bp,  155  bp  dan  197  bp  disemua  suhu yang teramati.
Hasil amplifikasi dari dugaan gen target Kiss2,  GPR54 dan β-Actin kemudian dianalisis sekuens nukleotidanya dengan menggunakan metode sekuensing. Sekuensing dilakukan untuk  menentukan  urutan  sekuens nukleotida  dari  hasil  amplifikasi  PCR. Urutan  hasil  sekuens  nukleotida  dapat
dilihat dibawah ini
Hasil  urutan  sekuens  nukleotida  dugaan gen  target Kiss2,  GPR54 dan β-Actin kemudian di BLAST. BLAST dilakukan untuk  mengkonfirmasi  homologi  dua sekuens sampel dengan sekuens database dunia  ( Gene  Bank )  yang  tersedia.  Hasil analisis  BLAST  dari  dugaan  gen  target dapat dilihat pada Gambar 3.
>150604-02_K13_Kiss2_Kiss2_forward.ab1 504 AAAGGGGCCTTACTGCATCCTGCATGGAGGTAGTGTGGG
AGCTCTGTGCC AGGAGTCGACCCTGCACAGAGAACACATGCAACAGGAG CAGTGTCCTCTG CATTCAGGAGAACAGCAGGCGACTTCCTGGCAGAGGATC CCAGCCTCTGC TTTTCCCTGAGAGAGAACGAGGACCAGAAGTTCATAATA ATATATATCTT CTCATTATATCATAATTTCTTTTCAATATCAATTTCATAATC TATCATTC TATTGATTAATACTTTATCATTTTTCATATATATTCCTTCAT CACATATT CCTTTTTTTTTTTTTTCAAATATTTCTTCTGGACCAATTACT ACAACCAA ACATATTTCTTCTCCCTTTTCCAATTCTTCCACACCTTCTTC TTATGCCC CCACGCTCAATCCCCCTCTCTCTACCTCTACCCTCAGTCCA TCTGTTCTC TTTACTTACCTACTTCCTCTCCTTTTTTCCTTTCCCTCTTTCT TTTTTCCTTAT >1st_BASE_1913473_GPR54_GPR54_F CAGCGAGACAGCTGGGCCATCCAGATCTTTGTCCTCTTC
CAGTCTTTCTATCCTAACTACCAGCCTAACTACGCCACAT
ACAAGATCAAGACGTGGGCCAACTGCATGTCCTACGCC
AACTCCTCT >150623-16_L24_Actin_AF.ab1 498 CCTCCTCGTTGGTGATGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGTATC CTGACCCTGA
AGTACCCCATTGAGCACGGTATTGTGACCAACTGGGATGA CATGGAGAAG ATCTGGCATCACACCTTCTACAACGAGCTGAGAGTTGCCCC TGAGGAGCA TCCCGTCCTGCTCACAAAAACCTTTTTTTTATCCTTACCTTTT TTTTTTT TTTTTTTTTTTTCCCTTCTTTCTTTTTCTTCTTCCTTTTTTTTTTT TTTT TTTTTTTTTCTCTTTTTTTTTTTTTCTTCTTTTTCCTTTTTTTTTT TTTT TTTTTTTTTTTTTTCTTTCTCTTTTTTTTCTCTTTTTTTCCTTTTT TTTT CTTCCTTTTTTCTTTTTCTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTT TTTT TTCTTCTTTTTCTTTCTCTCTTTCTTCTTTTTTTCTTTTCTTTTTT TTTT TCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTCCTTTTTCTTTT TT
Hasil  analisis  BLAST  menunjukkan bahwa  hasil  amplifikasi  PCR  dan elektroforesis gel agarosa dari gen target Kiss2 teridentifikasi  100%  memiliki homologi/kemiripan  dengan  gen  target Kiss2 Ikan  Nila  ( O.  niloticus )  yang berasal dari gene bank. Hasil amplifikasi PCR  dan  elektroforesis  gel  agarosa berdasarkan  Gambar  1  menunjukkan bahwa  pita  DNA  yang  terbentuk  dari keempat suhu yang diujikan menandakan sepenuhnya adalah gen target Kiss2 dari gonad ikan nila ( O. niloticus ). Kisspeptin digolongkan kedalam
berbagai  tipe  pada  vertebrata.  Pada golongan  mamalia, Kisspeptin hanya dikodekan  satu  tipe  gen,  yakni Kiss-1 (Pinilla et  al .,  2012) . Pada  beberapa golongan  ikan, Kisspeptin dikodekan oleh dua tipe gen, yaitu: Kiss-1 dan Kiss-
2 beserta  reseptor  kognitifnya GPR54 (Kitahashi dkk., 2009; Li dkk., 2009).
Beberapa golongan ikan hanya mengekspresikan  salah  satu  dari  kedua tipe  gen Kisspeptin ,  namun  beberapa golongan ikan lainnya mengekspresikan kedua  tipe  gen  tersebut . Ikan  air  tawar seperti: Zebrafish ( Danio  rerio ;  Van Aerle et  al., 2008), Medaka ( Oryzias latipes ;  Kanda  dkk.,  2008;  Kitahashi dkk., 2008), Goldfish ( Carassius auratus ; Li et al ., 2009) dan ikan air laut seperti Seabass ( Dicentrarchus labrax ; Felip et al ., 2009) mengekspreskan Kiss1 dan Kiss2 .  Pada  Fugu  ( Fugu  rubripes ), the green spotted puffer fish (Tetraodon nigrioviridis), Stickleback (Gasterosteus aculeatus ) (Felipe et al ., 2009), dan Nile tilapia ( O. niloticus ; Martines-Chavez et al .,  2008;  Park et  al .,  2012)  hanya mengekspresikan Kiss2 .
Tidak terekspresinya salah satu tipe gen dari Kisspeptin pada  beberapa  spesies ikan  menandakan  dugaan  gen  tersebut hilang seiring berjalannya evolusi
(Mechaly et al ., 2010). Kiss-2
merupakan  peptida  yang  disekresikan pada  gonad  beberapa  jenis  ikan, termasuk  ikan  nila  (Martinez  Chavez et al ., 2008; Park dkk., 2012; Pinilla et al ., 2012). Kiss2 memainkan  peranan penting  dalam  meregulasi  reproduksi dan perkembangan gonad melalui stimulasi GnRH ( Gonadotropin Releasing  Hormone )  (Przekop  dan Ciechanowska.,  2012).  Disamping  itu
Kisspeptin-2 berperan  penting  dalam menstimulasi sekresi GTH ( Gonadotropin ), FSH ( Folicle Stimulating  Hormone ),  LH  ( Leutinizing Hormone )  dan  GH  ( Growth  Hormone ) pada pituitari (Ahmed et al ., 2009) serta ekspresinya tinggi pada sel Leydig yang berperan  terhadap  produksi  testosteron (Selvaraj et al ., 2010).
Kisspeptin ditemukan  pada  bagian sistem  saraf  pusat  dan  sistem  perifer. Pada  vetebrat  Pada  sistem  saraf  pusat, ekspresi Kisspeptin ditemukan  tinggi pada bagian hipotalamus, terutama pada bagian Arcuate  nucleus (ARC)  dan Antroventral  periventricular  nucleus (AVPV)  (Gottsch  dkk.,  2004;  Roseweir dan  Millar,  2009;  Pinilla et  al .,  2012). Pada sistem perifer,  ekspresi Kisspeptin ditemukan  pada  bagian  testis,  ovarium, pituitary,  pankreas,  usus  halus  dan plasenta (Ohtaki et al ., 2001; Ahmed et al ., 2009; Gaytan et al ., 2009; Selvaraj et al ., 2010).
Pada sumbu HPG, Kisspeptin dan GnRH menunjukkan korelasi dalam meregulasi tingkat kematangan reproduksi. Korelasi ini ditandai dengan peningkatan ekspresi mRNA Kisspeptin dan GnRH ( GnRH1, GnRH2,  GnRH3 )  pada  awal  masa pubertas  pada  beberapa  spesies  ikan (Sjahdan et al ., 2014).

## KESIMPULAN
Hasil  amplifikasi  menunjukkan pita DNA yang terbentuk dari kedua gen
target,  yakni: Kiss2 dan GPR54 .  Hasil amplifikasi diperkuat dengan konfirmasi sekuensing yang menunjukkan kemiripan/homologi dari sekuens nukleotida target dengan sekuens
database dunia ( Gene Bank ).

## DAFAR PUSTAKA
Ahmed.  H,  Saito.,  T,  Sawada.,  T, Yaegashi.,  T,  Yamashita.,  TI,
Hirata.,  K,  dan  Sawai.,  T, Hashizume. 2009. Charateristics of the Stimulatory Effect of Kisspeptin-10  the  Secretion  of Luteinizing  Hormone,  Folicle Stimulating Hormone, and Growth Hormone in Prepubertasl  Male  and  Female Cattle. Journal of Reproduction and  Development.  Volume  55
(6): pp 650-654.
Clarke H, Waljit S. Dhillo,  dan  Channa N. Jayasena. 2015. Comprehensive  Review  on Kisspeptin  and  Its  Role  in Reproductive Disorders. Endocrine  and  Metabolism. Korean  Endocrine  Society. 2093-596X. Pp; 124-141.
Felipe. A, Zanuy S, Pineda R, dan Pinilla L,  Carrillo  M.  2009.  Evidence for Two Distinct KiSS Genes in Non-Placental  Vertebrates  that Encode Kisspeptins with Different Gonadotropin Releasing Activities in Fish and Mammals. Molecular Cell Endocrinology 312.
Gaytan, F., Gaytan, M., Castellano, JM.,
Romero, M., Roa, J,, Aparicio, B.,  Garrido, N.,  Sanchez Criado, JE., Millar, RP., Pellicer,  A,  Fraser,  HM.,  dan Tena-Sempere, M. 2009. KISS- 1  in  the  Mammalian  Ovary:
Distribution  of  Kisspeptin  in Human  and  Marmoset  and Alterations  in  KiSS-1  mRNA Levels  in  a  Rat  Model  of Ovulatory Dysfunction. Journal Endocinology Metabolism.  Volume  296:  pp 520-531. Gottsch ML, Cunningham MJ, Smith JT, Popa SM, Acohido BV, Crowley  WF,  Seminara  S, Clifton  DK,  dan  Steiner  RA. 2004.  A  Role  For  Kisspeptins In The Regulation Of Gonadotropin Secretion In The Mouse. Endocrinology 145 (9). pP: 073–4077.
Kanda, S., Y, dan Oka. 2008. Structure,
Synthesis,  and  Phylogeny  of Kisspeptin  and  its  Receptor. Advances in Experimental Medicine  and  Biology  volume 784: pp 9-26. Kitahashi.,  dan  Parhar,  I.S,.  2013. Comparative Aspects of Kisspeptin  Gene  Regulation. General and Comparative Endocrinology  181  (2013): 197-202.
Lee J.H, Miele M.E, Hicks D.J, Phillips K.K, Trent J.M, dan Weissman B.E.  1996.  Kiss-1,  A  Novel
Human  Malignant  Melanoma Metastasis-Suppressor  Gene".
Journal of the National Cancer Institute 88 (23): pp 1731–7.
Li,  S.,  Zhang,  Y.,  Liu,  Y.,  Huang,  X.,
Huang,  W.,  Lu,  D.,  Zhu,  P., Shi,  Y.,  Cheng,  C.H.K.,  Liu, X., dan Lin, H., 2009. Structural and functional multiplicity of the kisspeptin/GPR54  system  in
goldfish  ( Carassius  auratus ). Journal
Endocrinology.
Volume 201 (3): pp 407–418. Martinez  Chavez,  C.C.,  dan  Minghetti, M.,  Migaud,  H.  2008.  GPR54 and  rGnRH  Gene  Expression during the Onset of Puberty in Nile  tilapia.  General  and Comparative Endocrinology.
Volume  156  (2008):  pp  224-
233.
Mechaly,  A.,  Vinas,  J.,  Murphy,  C., Reith,  M.,  dan  Piferrer,  F.
2010.  Gene  Structure  of  the Kiss1 Receptor-2 (Kiss1r-2) in the  Atlantic  Halibut:  Insights into the Evolution and Regulation  of  Kiss1r  Genes. Molecular and Celuller Endocrinology  317  (2010):  pp 78-89. Messager  S,  Chatzidaki  E.E,  Ma  D, Hendrick  AG,  Zahn  D,  dan Dixon  J.  2005.  Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release Via G Protein-Coupled  Receptor  54. Proceedings  of  the  National Academy  of  Sciences  of  the United  States  of  America  102
(5): pp 1761–1766.
Ohtaki,  T.,  Shintani,  Y.,  Honda,  S., Matsumoto,  H.I.,  ,  Hori,  A.,
Kanehashi,  K.,  Terao,  Y.,
Kumano,  S.,  Takatsu,  Y.,
Masuda,  Y.,  Ishibashi,  Y., Watanabe,  T.,    Asada,  M., Yamada,  T.,  Suenaga,  M., Kitada. C., Usuki, S.,
Kurokawa,  T.,  Onda,  H.,
Nishimura,  O.,  dan  Fujino,  M. 2001.  Metastasis  Suppressor
Gene  KiSS-1  Encodes  Peptide Ligand of a G-Protein Coupled
Receptor. Nature Volume 414: pp 613-616.
Park,  J.W.,  Kim,  J.H.,  Jin,  H.Y.,  dan Kwoon, J.Y. 2012. Expression
Profiles  Of  Kiss2,  GPR54 andGnRH Receptors I mRNAs In the Early Life Stage of Nile Tilapia ( Oreochromis niloticus ). Dev, Reprod. Volume 18 (1): pp 31-38. Pinilla,  L.,  Aguilar,  E.,  Dieguez,  C., Millar, RP, dan Tena-Sempere, M.  2012.  Kisspeptin  and Reproduction: Physiological Roles and Regulatory Mechanism. Phisiological Volume 92: pp 1235-1316. Roseweir  A.K.,  dan  Millar.  20909.  The Role  of  Kisspeptin  In  The Control Of Gonadotrophin Secretion. Human Reproduction  Update,  Vol.15, No.2. pP: 203–212. Selvaraj,  S.,  Kitano,  H.,  Fujinaga,  Y., Ohga, H., Yoneda, M., Yamaguchi,  A.,  Shimizu,  A., dan  Matsuyama,  M.  2010. Molecular Characterization, Tissue Distribution, and mRNA Expression Profiles Of Two  Kiss  Genes  In  The  Adult Male and Female Chub Mackerel  ( Scomber  japonicus ) During Different Gonadal Stages.General Comparative Endocrinology.  Volume  169
(2010): pp 28-38.
Simanjuntak,  R.F.  2015.  Hubungan Ekspresi Gen Kisspeptin-2 Dan
Orexin Terhadap  Peningkatan Pertumbuhan Ikan Nila ( Oreochromis  Niloticus )  Yang Diberi Pakan Dengan Penambahan Tepung Biji
Pepaya. Tesis (Tidak Dipublikasi) Sjahdan,  M.D.,  Kitahashi,  T.,  Parhar, I.S.  2014.  Central  Pathways Integrating  Metabolism  and Reproduction in Teleosts. Frontier in Endocrinology. Volume 5 (36): pp 1-17. Van  Aerle.,  Kille,  P.,  Lange,  A.,  dan Tyler, C.R. 2007. Evidence for the Existence Functional Kiss1/Kiss1 Receptor Pathway in Fish. Peptides 2 9 (2008): pp 57 – 64.